特表2023-549124難聴の治療のためのバリアントアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドポリペプチド、及びその遺伝子治療薬
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-11-22
(54)【発明の名称】難聴の治療のためのバリアントアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドポリペプチド、及びその遺伝子治療薬
(51)【国際特許分類】
A61K 35/76 20150101AFI20231115BHJP
C12N 15/12 20060101ALI20231115BHJP
C12N 15/864 20060101ALI20231115BHJP
C12N 15/35 20060101ALI20231115BHJP
C12N 15/62 20060101ALI20231115BHJP
C12N 7/01 20060101ALI20231115BHJP
C12N 15/44 20060101ALI20231115BHJP
A61P 27/16 20060101ALI20231115BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20231115BHJP
A61K 31/7088 20060101ALI20231115BHJP
【ＦＩ】
A61K35/76
C12N15/12
C12N15/864 100Z
C12N15/35
C12N15/62 Z
C12N7/01
C12N15/44
A61P27/16
A61K48/00
A61K31/7088
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023527351
(86)(22)【出願日】2021-11-05
(85)【翻訳文提出日】2023-06-23
(86)【国際出願番号】 US2021058255
(87)【国際公開番号】W WO2022099007
(87)【国際公開日】2022-05-12
(31)【優先権主張番号】63/110,697
(32)【優先日】2020-11-06
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/146,269
(32)【優先日】2021-02-05
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】594197872
【氏名又は名称】イーライ リリー アンド カンパニー
(74)【代理人】
【識別番号】100092783
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 浩
(74)【代理人】
【識別番号】100095360
【弁理士】
【氏名又は名称】片山 英二
(74)【代理人】
【識別番号】100103182
【弁理士】
【氏名又は名称】日野 真美
(72)【発明者】
【氏名】ペノック，スティーブン
(72)【発明者】
【氏名】ティマース，アドリアン，エム．
(72)【発明者】
【氏名】シアマン，マーク
(72)【発明者】
【氏名】バルトロメ，クリストファー
(72)【発明者】
【氏名】ワン，シャオボー
(72)【発明者】
【氏名】メイサー，プラナフ，ディネシュ
(72)【発明者】
【氏名】ウリベ，フィリップ エム．
(72)【発明者】
【氏名】スゾボタ，ステファニー
(72)【発明者】
【氏名】ジャックス，ボニー，イー．
(72)【発明者】
【氏名】フォスター，アラン，シー．
(72)【発明者】
【氏名】ピウ，ファブリス
【テーマコード（参考）】
4B065
4C084
4C086
4C087
【Ｆターム（参考）】
4B065AA93Y
4B065AA95X
4B065AB01
4B065AC14
4B065AC20
4B065BA01
4B065BA02
4B065CA24
4B065CA44
4C084AA13
4C084NA13
4C084ZA34
4C086AA01
4C086AA02
4C086EA16
4C086MA02
4C086MA04
4C086NA13
4C086ZA34
4C087AA01
4C087AA02
4C087BC83
4C087ZA34
(57)【要約】
本明細書に記載されるのは、難聴の治療または予防に使用するためのバリアントアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドポリペプチド、及びその遺伝子治療薬である。
【選択図】図１Ａ
【選択図】図１Ａ
【特許請求の範囲】
【請求項1】
遺伝子欠失に関連する難聴を治療または予防するための組成物であって、前記組成物は、（ｉ）任意選択で、非バリアントＡＡＶカプシドポリペプチドと比較して、内耳組織または内耳細胞において増加した向性を示すバリアントＡＡＶカプシドポリペプチドと、
（ｉｉ）前記遺伝子をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドと、を含む、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオンを含む、前記組成物。
【請求項2】
前記バリアントＡＡＶカプシドポリペプチドは、バリアントＡＡＶ１カプシドポリペプチド、バリアントＡＡＶ２カプシドポリペプチド、バリアントＡＡＶ３カプシドポリペプチド、バリアントＡＡＶ４カプシドポリペプチド、バリアントＡＡＶ５カプシドポリペプチド、バリアントＡＡＶ６カプシドポリペプチド、バリアントＡＡＶ７カプシドポリペプチド、バリアントＡＡＶ８カプシドポリペプチド、バリアントＡＡＶ９カプシドポリペプチド、バリアントｒｈ－ＡＡＶ１０カプシドポリペプチド、バリアントＡＡＶ１０カプシドポリペプチド、バリアントＡＡＶ１１カプシドポリペプチド及びバリアントＡＡＶ１２カプシドポリペプチドからなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項3】
前記バリアントＡＡＶカプシドポリペプチドはバリアントＡＡＶ２カプシドポリペプチドである、請求項１に記載の組成物。
【請求項4】
前記バリアントＡＡＶカプシドポリペプチドは、表１に列挙されたアミノ酸配列、または表１に列挙された前記アミノ酸配列に対して少なくとも約８５％、９０％、９５％もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、任意選択で、前記ＡＡＶカプシドは、ＶＰ１、ＶＰ２またはＶＰ３カプシドポリペプチドからなる群から選択される、請求項３に記載の組成物。
【請求項5】
前記バリアントＡＡＶカプシドポリペプチドは、野生型ＡＡＶ２カプシドポリペプチド（配列番号１）に対して１つ以上のアミノ酸置換、挿入及び／または欠失を有するアミノ酸配列を含み、任意選択で、前記１つ以上のアミノ酸置換、挿入及び／または欠失は、Ｑ２６３、Ｓ２６４、Ｙ２７２、Ｙ４４４、Ｒ４８７、Ｐ４５１、Ｔ４５４、Ｔ４５５、Ｒ４５９、Ｋ４９０、Ｔ４９１、Ｓ４９２、Ａ４９３、Ｄ４９４、Ｅ４９９、Ｙ５００、Ｔ５０３、Ｋ５２７、Ｅ５３０、Ｅ５３１、Ｑ５４５、Ｇ５４６、Ｓ５４７、Ｅ５４８、Ｋ５４９、Ｔ５５０、Ｎ５５１、Ｖ５５２、Ｄ５５３、Ｅ５５５、Ｋ５５６、Ｒ５８５、Ｒ５８８及びＹ７３０からなる群から選択されるアミノ酸残基において生じる、請求項４に記載の組成物。
【請求項6】
前記バリアントＡＡＶカプシドポリペプチドは、Ｑ２６３Ｎ、Ｑ２６３Ａ、Ｓ２６４Ａ、Ｙ２７２Ｆ、Ｙ４４４Ｆ、Ｒ４８７Ｇ、Ｐ４５１Ａ、Ｔ４５４Ｎ、Ｔ４５５Ｖ、Ｒ４５９Ｔ、Ｋ４９０Ｔ、Ｔ４９１Ｑ、Ｓ４９２Ｄ、Ａ４９３Ｇ、Ｄ４９４Ｅ、Ｅ４９９Ｄ、Ｙ５００Ｆ、Ｔ５０３Ｐ、Ｋ５２７Ｒ、Ｅ５３０Ｄ、Ｅ５３１Ｄ、Ｑ５４５Ｅ、Ｇ５４６Ｄ、Ｇ５４６Ｓ、Ｓ５４７Ａ、Ｅ５４８Ｔ、Ｅ５４８Ａ、Ｋ５４９Ｅ、Ｋ５４９Ｇ、Ｔ５５０Ｎ、Ｔ５５０Ａ、Ｎ５５１Ｄ、Ｖ５５２Ｉ、Ｄ５５３Ａ、Ｅ５５５Ｄ、Ｋ５５６Ｒ、Ｋ５５６Ｓ、Ｒ５８５Ｓ、Ｒ５８８Ｔ及びＹ７３０Ｆからなる群から選択される、野生型ＡＡＶ２カプシドポリペプチド（配列番号１）に対する１つ以上のアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む、請求項４に記載の組成物。
【請求項7】
前記バリアントＡＡＶカプシドポリペプチドは、（ｉ）配列番号２７、２９、３１、３３または３５のいずれか１つのアミノ酸配列、
（ｉｉ）配列番号２７、２９、３１、３３または３５のいずれか１つに対して少なくとも約８５％、９０％、９５％または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列、または、
（ｉｉｉ）配列番号２６、２８、３０、３２または３４のいずれか１つの核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項8】
前記バリアントＡＡＶカプシドポリペプチドは、配列番号２７、２９、３１、３３または３５のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項9】
前記バリアントＡＡＶカプシドポリペプチドは配列番号２９のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項10】
前記バリアントＡＡＶカプシドポリペプチドは配列番号３１のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項11】
前記バリアントＡＡＶカプシドポリペプチドは配列番号３３のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項12】
前記バリアントＡＡＶカプシドポリペプチドは配列番号３５のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項13】
前記遺伝子はＧＪＢ２である、請求項１に記載の組成物。
【請求項14】
ＧＪＢ２をコードする前記核酸配列は、天然に存在しない配列である、請求項１３に記載の組成物。
【請求項15】
ＧＪＢ２をコードする前記核酸配列は、哺乳動物ＧＪＢ２をコードする、請求項１３に記載の組成物。
【請求項16】
ＧＪＢ２をコードする前記核酸配列は、ヒト、マウス、非ヒト霊長類、ミニブタまたはラットＧＪＢ２をコードする、請求項１３に記載の組成物。
【請求項17】
ＧＪＢ２をコードする前記核酸配列は、配列番号１０を含む、請求項１３に記載の組成物。
【請求項18】
ＧＪＢ２をコードする前記核酸配列は、哺乳動物発現のために最適化されたコドンである、請求項１３に記載の組成物。
【請求項19】
ＧＪＢ２をコードする前記核酸配列は、配列番号１１、配列番号１２または配列番号１３を含む、請求項１８に記載の組成物。
【請求項20】
ＧＪＢ２をコードする前記核酸配列は、ヒト、ラット、非ヒト霊長類、モルモット、ミニブタ、ブタ、ネコ、ヒツジまたはマウス細胞における発現のために最適化されたコドンである、請求項１８に記載の組成物。
【請求項21】
ＧＪＢ２をコードする前記核酸配列は、ｃＤＮＡ配列である、請求項１３に記載の組成物。
【請求項22】
ＧＪＢ２をコードする前記核酸配列は、作動可能に連結されたＣ末端タグまたはＮ末端タグを更に含む、請求項１３に記載の組成物。
【請求項23】
前記タグはＦＬＡＧタグまたはＨＡタグである、請求項２２に記載の組成物。
【請求項24】
ＧＪＢ２をコードする前記核酸配列は、プロモーターに作動可能に連結されている、請求項１３に記載の組成物。
【請求項25】
前記プロモーターは、遍在的活性ＣＢＡ、小型ＣＢＡ（ｓｍＣＢＡ）、ＥＦ１ａ、ＣＡＳＩプロモーター、蝸牛支持細胞プロモーター、ＧＪＢ２発現特異的ＧＦＡＰプロモーター、小型ＧＪＢ２プロモーター、中型ＧＪＢ２プロモーター、大型ＧＪＢ２プロモーター、２～３個の個々のＧＪＢ２発現特異的プロモーターの連続した組み合わせ、または合成プロモーターである、請求項２４に記載の組成物。
【請求項26】
前記プロモーターは、難聴を治療または予防するのに十分なＧＪＢ２発現を駆動するように最適化される、請求項２４に記載の組成物。
【請求項27】
ＧＪＢ２をコードする前記核酸配列は、作動可能に連結された３’ＵＴＲ調節領域を更に含む、請求項１３に記載の組成物。
【請求項28】
ＧＪＢ２をコードする前記核酸配列は、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）を含む作動可能に連結された３’ＵＴＲ調節領域を更に含む、請求項１３に記載の組成物。
【請求項29】
ＧＪＢ２をコードする前記核酸配列は、作動可能に連結されたポリアデニル化シグナルを更に含む、請求項１３に記載の組成物。
【請求項30】
前記ポリアデニル化シグナルは、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルまたはヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）ポリアデニル化シグナルである、請求項２９に記載の組成物。
【請求項31】
前記ポリヌクレオチドは、高ＧＪＢ２発現を駆動するために最適化された以下のプロモーターエレメントのうちの１つに作動可能に連結されている、：（ａ）遍在的活性ＣＢＡ、小型ＣＢＡ（ｓｍＣＢＡ）、ＥＦ１ａまたはＣＡＳＩプロモーター；（ｂ）蝸牛支持細胞またはＧＪＢ２発現特異的１．６８ｋｂ ＧＦＡＰ、小型／中型／大型ＧＪＢ２プロモーター、２～３個の個々のＧＪＢ２発現特異的プロモーターの連続した組み合わせまたは合成プロモーター；後にＳＶ４０またはヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）ポリアデニル化シグナルのいずれかが続くウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）を含む３’－ＵＴＲ調節領域に作動可能に連結されている、２７ヌクレオチドのヘマグルチニンＣ末端タグまたは２４ヌクレオチドのＦｌａｇタグを更に含む、請求項１３に記載の組成物。
【請求項32】
前記ポリヌクレオチドはＡＡＶゲノムカセットを更に含み、任意選択で、（ｉ）前記ＡＡＶゲノムカセットは、好ましくは約１４３塩基の長さの２つの配列変調逆方向末端反復と隣接しているか、または、
（ｉｉ）前記ＡＡＶゲノムカセットは、約１１３塩基のｓｃＡＡＶ有効化ＩＴＲ（ＩＴＲΔｔｒｓ）によって分離されかつ約１４３塩基の配列変調ＩＴＲと両端で隣接している、好ましくは２．４ｋｂ以下の２つの逆方向同一反復からなる自己相補的ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）ゲノムカセットと隣接している、請求項１３に記載の組成物。
【請求項33】
前記ポリヌクレオチドは、好ましくは長さ約２７ヌクレオチドの長さ、任意選択で約０．６８キロベース（ｋｂ）のサイズのヘマグルチニンＣ末端タグもしくはＦｌａｇタグを含むかまたは含まない；高ＧＪＢ２発現を駆動するように最適化された以下のプロモーター要素のうちの１つに作動可能に連結されている：（ａ）好ましくはサイズ約１．７ｋｂの遍在的活性ＣＢＡ、好ましくはサイズ約０．９６ｋｂの小型ＣＢＡ（ｓｍＣＢＡ）、好ましくは約０．８１ｋｂサイズのＥＦ１ａまたは好ましくはサイズ約１．０６ｋｂのＣＡＳＩプロモーター；（ｂ）好ましくはサイズ約１．６８ｋｂの蝸牛支持細胞またはＧＪＢ２発現特異的ＧＦＡＰプロモーター、好ましくはサイズ約０．１３ｋｂの小型ＧＪＢ２プロモーター、好ましくはサイズ約０．５４ｋｂの中型ＧＪＢ２プロモーター、好ましくはサイズ約１．０ｋｂの大型ＧＪＢ２プロモーター、または２～３個の個々のＧＪＢ２発現特異的プロモーターの連続した組み合わせ；後にＳＶ４０またはヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）ポリアデニル化シグナルのいずれかが続くウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）を含み、及びＡＡＶゲノムカセット、または約１１３塩基のｓｃＡＡＶ有効化ＩＴＲ（ＩＴＲΔｔｒｓ）によって分離されかつ約１４３塩基の配列変調ＩＴＲと両端で隣接している、好ましくは２．４ｋｂ以下の２つの逆方向同一反復からなる自己相補的ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）ゲノムカセットと隣接する２つの約１４３塩基配列変調逆方向末端反復（ＩＴＲ）のいずれかを更に含む、０．９ｋｂの３’－ＵＴＲ調節領域に作動可能に連結されている、コドン／配列最適化ヒトＧＪＢ２ ｃＤＮＡを含む、請求項１３に記載の組成物。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本発明は、米国特許法第１１９条（ｅ）に基づき、２０２０年１１月６日に出願された米国仮出願第６３／１１０，６９７号、及び２０２１年２月５日に出願された米国仮出願６３／１４６，２６９号の利益を主張し、そのそれぞれの全内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本発明は、米国特許法第１１９条（ｅ）に基づき、２０２０年１１月６日に出願された米国仮出願第６３／１１０，６９７号、及び２０２１年２月５日に出願された米国仮出願６３／１４６，２６９号の利益を主張し、そのそれぞれの全内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【0002】
本明細書に開示されるのは、難聴の治療または予防に使用するためのバリアントアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドポリペプチド、及びその遺伝子治療薬である。
【発明の概要】
【0003】
一態様によれば、本開示は、遺伝子欠失に関連する難聴を治療または予防する方法を提供し、この方法は、それを必要とする対象に、（ｉ）任意選択で非バリアントＡＡＶカプシドポリペプチドと比較して、内耳組織または細胞において増加した向性を示すバリアントＡＡＶカプシドポリペプチドと、（ｉｉ）遺伝子をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドと、を含む、有効量の組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオンを投与することを含む。
【0004】
別の態様によれば、本開示は、難聴に関連する遺伝子をコードする拡散配列を内耳組織または細胞に送達する方法を提供し、この方法は、それを必要とする対象に、（ｉ）非バリアントＡＡＶカプシドポリペプチドと比較して、内耳組織または細胞において増加した向性を示すバリアントＡＡＶカプシドポリペプチドと、（ｉｉ）遺伝子をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドと、を含む、有効量の組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオンを投与することを含む。
【0005】
いくつかの実施形態によれば、内耳組織または細胞は、蝸牛組織もしくは細胞、または前庭組織または細胞である。特定の実施形態によれば、内耳組織または細胞は、蝸牛組織または細胞である。
【0006】
いくつかの実施形態によれば、バリアントＡＡＶカプシドポリペプチドは、任意選択で、バリアントＡＡＶ１カプシドポリペプチド、バリアントＡＡＶ２カプシドポリペプチド、バリアントＡＡＶ３カプシドポリペプチド、バリアントＡＡＶ４カプシドポリペプチド、バリアントＡＡＶ５カプシドポリペプチド、バリアントＡＡＶ６カプシドポリペプチド、バリアントＡＡＶ７カプシドポリペプチド、バリアントＡＡＶ８カプシドポリペプチド、バリアントＡＡＶ９カプシドポリペプチド、バリアントｒｈ－ＡＡＶ１０カプシドポリペプチド、バリアントＡＡＶ１０カプシドポリペプチド、バリアントＡＡＶ１１カプシドポリペプチド、バリアントＡＡＶ１２カプシドポリペプチド及びバリアントＡｎｃ８０カプシドポリペプチドからなる群から選択される任意のバリアントＡＡＶカプシドポリペプチドである。特定の実施形態によれば、バリアントＡＡＶカプシドポリペプチドは、バリアントＡＡＶ２カプシドポリペプチドである。
【0007】
いくつかの実施形態によれば、バリアントＡＡＶカプシドポリペプチドは、表１に列挙されたアミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも約８５％、９０％、９５％もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、任意選択で、ＡＡＶカプシドは、ＶＰ１、ＶＰ２またはＶＰ３カプシドポリペプチドからなる群から選択される。
【0008】
いくつかの実施形態によれば、バリアントＡＡＶカプシドポリペプチドは、表１に列挙されたアミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも約８５％、９０％、９５％もしくは９９％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含み、任意選択で、ＡＡＶカプシドは、ＶＰ１、ＶＰ２またはＶＰ３カプシドポリペプチドからなる群から選択される。
【0009】
いくつかの実施形態によれば、バリアントＡＡＶカプシドポリペプチドは、野生型ＡＡＶ２カプシドポリペプチド（配列番号１８）に対して１つ以上のアミノ酸置換、挿入及び／または欠失を有するアミノ酸配列を含み、任意選択で、１つ以上のアミノ酸置換、挿入及び／または欠失は、Ｑ２６３、Ｓ２６４、Ｙ２７２、Ｙ４４４、Ｒ４８７、Ｐ４５１、Ｔ４５４、Ｔ４５５、Ｒ４５９、Ｋ４９０、Ｔ４９１、Ｓ４９２、Ａ４９３、Ｄ４９４、Ｅ４９９、Ｙ５００、Ｔ５０３、Ｋ５２７、Ｅ５３０、Ｅ５３１、Ｑ５４５、Ｇ５４６、Ｓ５４７、Ｅ５４８、Ｋ５４９、Ｔ５５０、Ｎ５５１、Ｖ５５２、Ｄ５５３、Ｅ５５５、Ｋ５５６、Ｒ５８５、Ｒ５８８及びＹ７３０からなる群から選択されるアミノ酸残基において生じる。特定の実施形態によれば、バリアントＡＡＶカプシドポリペプチドは、Ｑ２６３Ｎ、Ｑ２６３Ａ、Ｓ２６４Ａ、Ｙ２７２Ｆ、Ｙ４４４Ｆ、Ｒ４８７Ｇ、Ｐ４５１Ａ、Ｔ４５４Ｎ、Ｔ４５５Ｖ、Ｒ４５９Ｔ、Ｋ４９０Ｔ、Ｔ４９１Ｑ、Ｓ４９２Ｄ、Ａ４９３Ｇ、Ｄ４９４Ｅ、Ｅ４９９Ｄ、Ｙ５００Ｆ、Ｔ５０３Ｐ、Ｋ５２７Ｒ、Ｅ５３０Ｄ、Ｅ５３１Ｄ、Ｑ５４５Ｅ、Ｇ５４６Ｄ、Ｇ５４６Ｓ、Ｓ５４７Ａ、Ｅ５４８Ｔ、Ｅ５４８Ａ、Ｋ５４９Ｅ、Ｋ５４９Ｇ、Ｔ５５０Ｎ、Ｔ５５０Ａ、Ｎ５５１Ｄ、Ｖ５５２Ｉ、Ｄ５５３Ａ、Ｅ５５５Ｄ、Ｋ５５６Ｒ、Ｋ５５６Ｓ、Ｒ５８５Ｓ、Ｒ５８８Ｔ及びＹ７３０Ｆからなる群から選択される野生型ＡＡＶ２カプシドポリペプチド（配列番号１８）に対して１つ以上のアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む。
【0010】
いくつかの実施形態によれば、バリアントＡＡＶカプシドポリペプチドは、（ｉ）配列番号２７、２９、３１、３３または３５のうちのいずれか１つのアミノ酸配列；（ｉｉ）配列番号２７、２９、３１、３３または３５のうちのいずれか１つに対して少なくとも約８５％、９０％、９５％または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列；または（ｉｉｉ）配列番号２６、２８、３０、３２または３４のうちのいずれか１つの核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を含む。特定の実施形態によれば、バリアントＡＡＶカプシドポリペプチドは、配列番号２７のアミノ酸配列を含む。特定の実施形態によれば、バリアントＡＡＶカプシドポリペプチドは、配列番号２９のアミノ酸配列を含む。特定の実施形態によれば、バリアントＡＡＶカプシドポリペプチドは、配列番号３１のアミノ酸配列を含む。特定の実施形態によれば、バリアントＡＡＶカプシドポリペプチドは、配列番号３３のアミノ酸配列を含む。特定の実施形態によれば、バリアントＡＡＶカプシドポリペプチドは、配列番号３５のアミノ酸配列を含む。
【0011】
いくつかの実施形態によれば、バリアントＡＡＶカプシドポリペプチドは、任意選択で、非バリアントＡＡＶカプシドポリペプチドと比較して、任意選択で、少なくとも約１倍、１．２５倍、１．５倍、１．７５倍、２倍、２．５倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１２倍、１４倍、１６倍、１８倍、２０倍の内耳組織または細胞におけるｒＡＡＶ向性レベルの増加をもたらす。
【0012】
いくつかの実施形態によれば、バリアントＡＡＶカプシドポリペプチドは、任意選択で、非バリアントＡＡＶカプシドポリペプチドと比較して、任意選択で、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％の内耳組織または細胞におけるｒＡＡＶ向性レベルの増加をもたらす。
【0013】
いくつかの実施形態によれば、バリアントＡＡＶカプシドポリペプチドは、任意選択で、非バリアントＡＡＶカプシドポリペプチドと比較して、任意選択で、少なくとも約１倍、１．２５倍、１．５倍、１．７５倍、２倍、２．５倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１２倍、１４倍、１６倍、１８倍、２０倍の内耳組織または細胞におけるｒＡＡＶ形質導入効率レベルの増加をもたらす。
【0014】
いくつかの実施形態によれば、バリアントＡＡＶカプシドポリペプチドは、任意選択で、非バリアントＡＡＶカプシドポリペプチドと比較して、任意選択で、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％の内耳組織または細胞におけるｒＡＡＶ形質導入効率レベルの増加をもたらす。
【0015】
いくつかの実施形態によれば、本方法は、任意選択で、遺伝子の通常の発現と比較して、任意選択で、少なくとも約１倍、１．２５倍、１．５倍、１．７５倍、２倍、２．５倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１２倍、１４倍、１６倍、１８倍、２０倍の内耳組織または細胞における遺伝子の発現の増加をもたらす。
【0016】
いくつかの実施形態によれば、本方法は、任意選択で、遺伝子の正常な発現と比較して、必要に応じて、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％の内耳組織または細胞における遺伝子の発現の増加をもたらす。
【0017】
いくつかの実施形態によれば、本方法は、内耳組織または細胞におけるＧＪＢ２（コネキシン２６）発現の過剰発現をもたらす。
【0018】
いくつかの実施形態によれば、本方法は、任意選択で、対照レベルと比較して、任意選択で、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％のｒＡＡＶ中和抗体（ＮＡｂ）力価レベルの低下をもたらす。
【0019】
いくつかの実施形態によれば、本方法は、任意選択で、投与前の内耳炎症または毒性レベルと比較して、任意選択で、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％の内耳炎症または毒性レベルの低下をもたらす。特定の実施形態によれば、内耳炎症または毒性レベルの低下は、非バリアントＡＡＶカプシドポリペプチドと比較したものである。特定の実施形態によれば、内耳炎症または毒性レベルの低下は、難聴に関連する疾患または障害によって引き起こされるものと比較したものである。
【0020】
いくつかの実施形態によれば、本方法は、任意選択で、投与前の内耳炎症または毒性の進行と比較して、任意選択で、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％の内耳炎症または毒性の進行の遅延をもたらす。
【0021】
いくつかの実施形態によれば、本方法は、任意選択で、投与前の有毛細胞の喪失、変性及び／または死滅レベルと比較して、任意選択で、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％の有毛細胞の喪失、変性及び／または死滅レベルの低下をもたらす。
【0022】
いくつかの実施形態によれば、本方法は、任意選択で、投与前のらせん神経節細胞の喪失、変性及び／または死滅レベルと比較して、任意選択で、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％のらせん神経節細胞の喪失、変性及び／または死滅レベルの低下をもたらす。
【0023】
いくつかの実施形態によれば、本方法は、任意選択で、投与前の聴覚脳幹反応（auditory brainstem response、ＡＢＲ）閾値レベルと比較して、例えば、１ｋＨｚ周波数、４ｋＨｚ周波数、８ｋＨｚ周波数及び／または１６ｋＨｚ周波数での、任意選択で、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％のＡＢＲ閾値の減少をもたらす。
【0024】
いくつかの実施形態によれば、本方法は、歪成分耳音響放射（Distortion Product Otoacoustic Emissions、ＤＰＯＡＥ）プロファイルの改善をもたらす。特定の実施形態によれば、本方法は、ＤＰＯＡＥプロファイルの悪化の防止、遅延または減速をもたらす。
【0025】
いくつかの実施形態によれば、本方法は、改善された音声理解をもたらす。特定の実施形態によれば、本方法は、音声理解の悪化の防止、遅延または減速をもたらす。
【0026】
いくつかの実施形態によれば、対照レベルは、ｒＡＡＶの投与前に対象から得られたレベル、任意選択で対象からの試料に基づく。
【0027】
いくつかの実施形態によれば、対照レベルは、バリアントＡＡＶカプシドポリペプチドを含まないｒＡＡＶの投与から得られるレベルに基づき、任意選択で、バリアントＡＡＶカプシドポリペプチドを含まないｒＡＡＶは、ＡＡＶ２及びＡｎｃ８０Ｌ６５から選択されるｒＡＡＶカプシドポリペプチドを含む。
【0028】
いくつかの実施形態によれば、本方法は、側壁またはらせん靭帯の細胞、コルチ器の支持細胞、らせん靭帯の線維細胞、クラウジウス細胞、ベッチェル細胞、らせん隆起の細胞、前庭支持細胞、ヘンゼン細胞、ダイテルス細胞、柱細胞、内指節細胞、外指骨細胞、境界細胞、内蝸牛有毛細胞、外蝸牛有毛細胞、らせん神経節細胞、前庭有毛細胞、前庭支持細胞、及び／または前庭神経節細胞におけるＧＪＢ２などの難聴に関連する遺伝子をコードする核酸配列への送達及びその発現をもたらす。
【0029】
いくつかの実施形態によれば、本方法は、細胞側壁またはらせん靭帯の支持細胞、コルチ器の支持細胞、らせん靭帯の線維細胞、クラウジウス細胞、ベッチェル細胞、らせん突起の細胞、前庭支持細胞、ヘンゼン細胞、ダイテルス細胞、柱細胞、内指節骨細胞、外側指節細胞、境界細胞、内及び外蝸牛有毛細胞、らせん神経節細胞、前庭有毛細胞、前庭支持細胞、及び／または前庭神経節細胞の少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％のＧＪＢ２などの難聴に関連する遺伝子をコードする核酸配列への送達及びその発現をもたらす。
【0030】
いくつかの実施形態によれば、遺伝子はＧＪＢ２である。
【0031】
いくつかの実施形態によれば、ＧＪＢ２をコードする核酸配列は、天然に存在しない配列である。いくつかの実施形態によれば、ＧＪＢ２をコードする核酸配列は、哺乳動物ＧＪＢ２をコードする。いくつかの実施形態によれば、ＧＪＢ２をコードする核酸配列は、ヒト、マウス、非ヒト霊長類またはラットＧＪＢ２をコードする。いくつかの実施形態によれば、ＧＪＢ２をコードする核酸配列は、配列番号１０を含む。いくつかの実施形態によれば、ＧＪＢ２をコードする核酸配列は、哺乳動物発現のために最適化されたコドンである。いくつかの実施形態によれば、ＧＪＢ２をコードする核酸配列は、配列番号１１、配列番号１２または配列番号１３を含む。いくつかの実施形態によれば、ＧＪＢ２をコードする核酸配列は、ヒト、ラット、非ヒト霊長類、モルモット、ミニブタ、ブタ、ネコ、ヒツジまたはマウス細胞における発現のために最適化されたコドンである。いくつかの実施形態によれば、ＧＪＢ２をコードする核酸配列はｃＤＮＡ配列である。いくつかの実施形態によれば、ＧＪＢ２をコードする核酸配列は、作動可能に連結されたＣ末端タグまたはＮ末端タグを更に含む。いくつかの実施形態によれば、タグはＦＬＡＧタグまたはＨＡタグである。
【0032】
いくつかの実施形態では、ＧＪＢ２をコードする核酸配列は、プロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態によれば、プロモーターは、遍在的活性ＣＢＡ、小型ＣＢＡ（ｓｍＣＢＡ）、ＥＦ１ａ、ＣＡＳＩプロモーター、蝸牛支持細胞プロモーター、ＧＪＢ２発現特異的ＧＦＡＰプロモーター、小型ＧＪＢ２プロモーター、中型ＧＪＢ２プロモーター、大型ＧＪＢ２プロモーター、２～３個の個々のＧＪＢ２発現特異的プロモーターの連続した組み合わせ、または合成プロモーターである。いくつかの実施形態によれば、プロモーターは、難聴を治療または予防するのに十分なＧＪＢ２発現を駆動するように最適化される。
【0033】
いくつかの実施形態によれば、ＧＪＢ２をコードする核酸配列は、作動可能に連結された３’ＵＴＲ調節領域を更に含む。いくつかの実施形態によれば、ＧＪＢ２をコードする核酸配列は、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（Woodchuck Hepatitis Virus Postranscriptional Regulatory Element、ＷＰＲＥ）を含む作動可能に連結された３’ＵＴＲ調節領域を更に含む。
【0034】
いくつかの実施形態によれば、ＧＪＢ２をコードする核酸配列は、作動可能に連結されたポリアデニル化シグナルを更に含む。いくつかの実施形態によれば、ポリアデニル化シグナルはＳＶ４０ポリアデニル化シグナルである。いくつかの実施形態によれば、ポリアデニル化シグナルは、ヒト成長ホルモン（human growth hormone、ｈＧＨ）ポリアデニル化シグナルである。
【0035】
いくつかの実施形態によれば、ポリヌクレオチドは、高ＧＪＢ２発現を駆動するために最適化された以下のプロモーターエレメントのうちの１つに作動可能に連結されている、：（ａ）遍在的活性ＣＢＡ、小型ＣＢＡ（ｓｍＣＢＡ）、ＥＦ１ａまたはＣＡＳＩプロモーター；（ｂ）蝸牛支持細胞またはＧＪＢ２発現特異的１．６８ｋｂ ＧＦＡＰ、小型／中型／大型ＧＪＢ２プロモーター、２～３個の個々のＧＪＢ２発現特異的プロモーターの連続した組み合わせまたは合成プロモーター；後にＳＶ４０またはヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）ポリアデニル化シグナルのいずれかが続くウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）を含む３’－ＵＴＲ調節領域に作動可能に連結されている、２７ヌクレオチドのヘマグルチニンＣ末端タグまたは２４ヌクレオチドのＦｌａｇタグを更に含む。
【0036】
いくつかの実施形態によれば、ポリヌクレオチドは、ＡＡＶゲノムカセットを更に含み、任意選択で、（ｉ）ＡＡＶゲノムカセットは、好ましくは約１４３塩基の長さの２つの配列変調逆方向末端反復と隣接しているか、または（ｉｉ）ＡＡＶゲノムカセットは、約１１３塩基のｓｃＡＡＶ有効化ＩＴＲ（ＩＴＲΔｔｒｓ）によって分離されかつ約１４３塩基の配列変調ＩＴＲと両端で隣接している、好ましくは２．４ｋｂ以下の２つの逆方向同一反復からなる自己相補的ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）ゲノムカセットと隣接している。
【0037】
いくつかの実施形態によれば、ポリヌクレオチドは、好ましくは長さ約２７ヌクレオチドの長さ、任意選択で約０．６８キロベース（ｋｂ）のサイズタグのヘマグルチニンＣ末端タグもしくは２４ヌクレオチドのＦｌａｇタグを含むかまたは含まない；高ＧＪＢ２発現を駆動するように最適化された以下のプロモーター要素のうちの１つに作動可能に連結されている：（ａ）好ましくはサイズ約１．７ｋｂの遍在的活性ＣＢＡ、好ましくはサイズ約０．９６ｋｂの小型ＣＢＡ（ｓｍＣＢＡ）、好ましくは約０．８１ｋｂサイズのＥＦ１ａまたは好ましくはサイズ約１．０６ｋｂのＣＡＳＩプロモーター；（ｂ）好ましくはサイズ約１．６８ｋｂの蝸牛支持細胞またはＧＪＢ２発現特異的ＧＦＡＰプロモーター、好ましくはサイズ約０．１３ｋｂの小型ＧＪＢ２プロモーター、好ましくはサイズ約０．５４ｋｂの中型ＧＪＢ２プロモーター、好ましくはサイズ約１．０ｋｂの大型ＧＪＢ２プロモーター、または２～３個の個々のＧＪＢ２発現特異的プロモーターの連続した組み合わせ；後にＳＶ４０またはヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）ポリアデニル化シグナルのいずれかが続くウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）を含み、及びＡＡＶゲノムカセット、または約１１３塩基のｓｃＡＡＶ有効化ＩＴＲ（ＩＴＲΔｔｒｓ）によって分離されかつ約１４３塩基の配列変調ＩＴＲと両端で隣接している、好ましくは２．４ｋｂ以下の２つの逆方向同一反復からなる自己相補的ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）ゲノムカセットと隣接する２つの約１４３塩基配列変調逆方向末端反復（ＩＴＲ）のいずれかを更に含む、０．９ｋｂの３’－ＵＴＲ調節領域に作動可能に連結されている、コドン／配列最適化ヒトＧＪＢ２ ｃＤＮＡを含む。
【0038】
いくつかの実施形態によれば、難聴は遺伝的難聴である。いくつかの実施形態によれば、難聴はＤＦＮＢ１難聴である。いくつかの実施形態によれば、難聴は、ＧＪＢ２における突然変異によって引き起こされる。いくつかの実施形態によれば、難聴は、常染色体劣性ＧＪＢ２突然変異体（ＤＦＮＢ１）によって引き起こされる。いくつかの実施形態によれば、難聴は、常染色体優性ＧＪＢ２突然変異体（ＤＦＮＡ３Ａ）によって引き起こされる。
【0039】
いくつかの実施形態によれば、投与は、蝸牛または前庭系への投与であり、任意選択で、送達は、正円窓膜（ＲＷＭ）、卵円窓、もしくは半規管を介した蝸牛または前庭系への直接投与を含む。いくつかの実施形態によれば、直接投与は注射である。いくつかの実施形態によれば、投与は、静脈内、脳室内、蝸牛内、髄腔内、筋肉内、皮下またはこれらの組み合わせである。
【0040】
別の態様によれば、本開示は、遺伝子欠失に関連する難聴を治療または予防する方法で使用する組成物を提供し、この組成物は、（ｉ）任意選択で非バリアントＡＡＶカプシドポリペプチドと比較して、内耳組織または細胞において増加した向性を示すバリアントＡＡＶカプシドポリペプチドと、（ｉｉ）遺伝子をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドと、を含む、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオンを含む。
【0041】
別の態様によれば、本開示は、難聴に関連する遺伝子をコードする拡散配列を内耳組織または細胞に送達する方法で使用する組成物を提供し、この方法は、それを必要とする対象に、（ｉ）任意選択で、非バリアントＡＡＶカプシドポリペプチドと比較して、内耳組織または細胞において増加した向性を示すバリアントＡＡＶカプシドポリペプチドと、（ｉｉ）ギャップ結合タンパク質ベータ２（gap junction protein beta2、ＧＪＢ２）をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドと、を含む、有効量の組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオンを投与することを含む。
【0042】
前述の組成物のいくつかの実施形態によれば、内耳組織または細胞は、蝸牛組織もしくは細胞、または前庭組織または細胞である。いくつかの実施形態によれば、内耳組織または細胞は、蝸牛組織または細胞である。
【0043】
前述の組成物のいくつかの実施形態によれば、バリアントＡＡＶカプシドポリペプチドは、バリアントＡＡＶ１カプシドポリペプチド、バリアントＡＡＶ２カプシドポリペプチド、バリアントＡＡＶ３カプシドポリペプチド、バリアントＡＡＶ４カプシドポリペプチド、バリアントＡＡＶ５カプシドポリペプチド、バリアントＡＡＶ６カプシドポリペプチド、バリアントＡＡＶ７カプシドポリペプチド、バリアントＡＡＶ８カプシドポリペプチド、バリアントＡＡＶ９カプシドポリペプチド、バリアントｒｈ－ＡＡＶ１０カプシドポリペプチド、バリアントＡＡＶ１０カプシドポリペプチド、バリアントＡＡＶ１１カプシドポリペプチド及びバリアントＡＡＶ１２カプシドポリペプチドからなる群から選択される。いくつかの実施形態によれば、バリアントＡＡＶカプシドポリペプチドは、バリアントＡＡＶ２カプシドポリペプチドである。いくつかの実施形態によれば、バリアントＡＡＶカプシドポリペプチドは、表１に列挙されたアミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも約８５％、９０％、９５％もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、任意選択で、ＡＡＶカプシドは、ＶＰ１、ＶＰ２またはＶＰ３カプシドポリペプチドからなる群から選択される。いくつかの実施形態によれば、バリアントＡＡＶカプシドポリペプチドは、表１に列挙されたアミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも約８５％、９０％、９５％もしくは９９％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含み、任意選択で、ＡＡＶカプシドは、ＶＰ１、ＶＰ２またはＶＰ３カプシドポリペプチドからなる群から選択される。いくつかの実施形態によれば、バリアントＡＡＶカプシドポリペプチドは、野生型ＡＡＶ２カプシドポリペプチド（配列番号１）に対して１つ以上のアミノ酸置換、挿入及び／または欠失を有するアミノ酸配列を含み、任意選択で、１つ以上のアミノ酸置換、挿入及び／または欠失は、Ｑ２６３、Ｓ２６４、Ｙ２７２、Ｙ４４４、Ｒ４８７、Ｐ４５１、Ｔ４５４、Ｔ４５５、Ｒ４５９、Ｋ４９０、Ｔ４９１、Ｓ４９２、Ａ４９３、Ｄ４９４、Ｅ４９９、Ｙ５００、Ｔ５０３、Ｋ５２７、Ｅ５３０、Ｅ５３１、Ｑ５４５、Ｇ５４６、Ｓ５４７、Ｅ５４８、Ｋ５４９、Ｔ５５０、Ｎ５５１、Ｖ５５２、Ｄ５５３、Ｅ５５５、Ｋ５５６、Ｒ５８５、Ｒ５８８及びＹ７３０からなる群から選択されるアミノ酸残基において生じる。いくつかの実施形態によれば、バリアントＡＡＶカプシドポリペプチドは、Ｑ２６３Ｎ、Ｑ２６３Ａ、Ｓ２６４Ａ、Ｙ２７２Ｆ、Ｙ４４４Ｆ、Ｒ４８７Ｇ、Ｐ４５１Ａ、Ｔ４５４Ｎ、Ｔ４５５Ｖ、Ｒ４５９Ｔ、Ｋ４９０Ｔ、Ｔ４９１Ｑ、Ｓ４９２Ｄ、Ａ４９３Ｇ、Ｄ４９４Ｅ、Ｅ４９９Ｄ、Ｙ５００Ｆ、Ｔ５０３Ｐ、Ｋ５２７Ｒ、Ｅ５３０Ｄ、Ｅ５３１Ｄ、Ｑ５４５Ｅ、Ｇ５４６Ｄ、Ｇ５４６Ｓ、Ｓ５４７Ａ、Ｅ５４８Ｔ、Ｅ５４８Ａ、Ｋ５４９Ｅ、Ｋ５４９Ｇ、Ｔ５５０Ｎ、Ｔ５５０Ａ、Ｎ５５１Ｄ、Ｖ５５２Ｉ、Ｄ５５３Ａ、Ｅ５５５Ｄ、Ｋ５５６Ｒ、Ｋ５５６Ｓ、Ｒ５８５Ｓ、Ｒ５８８Ｔ及びＹ７３０Ｆからなる群から選択される野生型ＡＡＶ２カプシドポリペプチド（配列番号１）に対して１つ以上のアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態によれば、バリアントＡＡＶカプシドポリペプチドは、（ｉ）配列番号２７、２９、３１、３３または３５のうちのいずれか１つのアミノ酸配列；（ｉｉ）配列番号２７、２９、３１、３３または３５のうちのいずれか１つに対して少なくとも約８５％、９０％、９５％または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列；または（ｉｉｉ）配列番号２６、２８、３０、３２または３４のうちのいずれか１つの核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態によれば、バリアントＡＡＶカプシドポリペプチドは、配列番号２７のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態によれば、バリアントＡＡＶカプシドポリペプチドは、配列番号２９のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態によれば、バリアントＡＡＶカプシドポリペプチドは、配列番号３１のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態によれば、バリアントＡＡＶカプシドポリペプチドは、配列番号３３のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態によれば、バリアントＡＡＶカプシドポリペプチドは、配列番号３５のアミノ酸配列を含む。
【0044】
前述のいくつかの実施形態によれば、遺伝子はＧＪＢ２である。いくつかの実施形態によれば、ＧＪＢ２をコードする核酸配列は、天然に存在しない配列である。いくつかの実施形態によれば、ＧＪＢ２をコードする核酸配列は、哺乳動物ＧＪＢ２をコードする。いくつかの実施形態によれば、ＧＪＢ２をコードする核酸配列は、ヒト、マウス、非ヒト霊長類またはラットＧＪＢ２をコードする。いくつかの実施形態によれば、ＧＪＢ２をコードする核酸配列は、配列番号１０を含む。いくつかの実施形態によれば、ＧＪＢ２をコードする核酸配列は、哺乳動物発現のために最適化されたコドンである。いくつかの実施形態によれば、ＧＪＢ２をコードする核酸配列は、配列番号１１、配列番号１２または配列番号１３を含む。いくつかの実施形態によれば、ＧＪＢ２をコードする核酸配列は、ヒト、ラット、非ヒト霊長類、モルモット、ミニブタ、ブタ、ネコ、ヒツジまたはマウス細胞における発現のために最適化されたコドンである。いくつかの実施形態によれば、ＧＪＢ２をコードする核酸配列はｃＤＮＡ配列である。前述の組成物のいくつかの実施形態によれば、ＧＪＢ２をコードする核酸配列は、作動可能に連結されたＣ末端タグまたはＮ末端タグを更に含む。いくつかの実施形態によれば、タグはＦＬＡＧタグまたはＨＡタグである。
【0045】
前述の組成物のいくつかの実施形態では、ＧＪＢ２をコードする核酸配列は、プロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態によれば、プロモーターは、遍在的活性ＣＢＡ、小型ＣＢＡ（ｓｍＣＢＡ）、ＥＦ１ａ、ＣＡＳＩプロモーター、蝸牛支持細胞プロモーター、ＧＪＢ２発現特異的ＧＦＡＰプロモーター、小型ＧＪＢ２プロモーター、中型ＧＪＢ２プロモーター、大型ＧＪＢ２プロモーター、２～３個の個々のＧＪＢ２発現特異的プロモーターの連続した組み合わせ、または合成プロモーターである。いくつかの実施形態によれば、プロモーターは、難聴を治療または予防するのに十分なＧＪＢ２発現を駆動するように最適化される。
【0046】
前述の組成物のいくつかの実施形態によれば、ＧＪＢ２をコードする核酸配列は、作動可能に連結された３’ＵＴＲ調節領域を更に含む。いくつかの実施形態によれば、ＧＪＢ２をコードする核酸配列は、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）を含む作動可能に連結された３’ＵＴＲ調節領域を更に含む。
【0047】
いくつかの実施形態によれば、ＧＪＢ２をコードする核酸配列は、作動可能に連結されたポリアデニル化シグナルを更に含む。いくつかの実施形態によれば、ポリアデニル化シグナルはＳＶ４０ポリアデニル化シグナルである。いくつかの実施形態によれば、ポリアデニル化シグナルは、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）ポリアデニル化シグナルである。
【0048】
前述の組成物のいくつかの実施形態によれば、ポリヌクレオチドは、高ＧＪＢ２発現を駆動するために最適化された以下のプロモーターエレメントのうちの１つに作動可能に連結されている、：（ａ）遍在的活性ＣＢＡ、小型ＣＢＡ（ｓｍＣＢＡ）、ＥＦ１ａまたはＣＡＳＩプロモーター；（ｂ）蝸牛支持細胞またはＧＪＢ２発現特異的１．６８ｋｂ ＧＦＡＰ、小型／中型／大型ＧＪＢ２プロモーター、２～３個の個々のＧＪＢ２発現特異的プロモーターの連続した組み合わせまたは合成プロモーター；後にＳＶ４０またはヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）ポリアデニル化シグナルのいずれかが続くウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）を含む３’－ＵＴＲ調節領域に作動可能に連結されている、２７ヌクレオチドのヘマグルチニンＣ末端タグまたは２４ヌクレオチドのＦｌａｇタグを更に含む。
【0049】
前述の組成物のいくつかの実施形態によれば、ポリヌクレオチドは、ＡＡＶゲノムカセットを更に含み、任意選択で、（ｉ）ＡＡＶゲノムカセットは、好ましくは約１４３塩基の長さの２つの配列変調逆方向末端反復と隣接しているか、または（ｉｉ）ＡＡＶゲノムカセットは、約１１３塩基のｓｃＡＡＶ有効化ＩＴＲ（ＩＴＲΔｔｒｓ）によって分離されかつ約１４３塩基の配列変調ＩＴＲと両端で隣接している、好ましくは２．４ｋｂ以下の２つの逆方向同一反復からなる自己相補的ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）ゲノムカセットと隣接している。
【0050】
前述の組成物のいくつかの実施形態によれば、ポリヌクレオチドは、好ましくは長さ約２７ヌクレオチドの長さ、任意選択で約０．６８キロベース（ｋｂ）のサイズのヘマグルチニンＣ末端タグもしくは２４ヌクレオチドのＦｌａｇタグを含むかまたは含まない；高ＧＪＢ２発現を駆動するように最適化された以下のプロモーター要素のうちの１つに作動可能に連結されている：（ａ）好ましくはサイズ約１．７ｋｂの遍在的活性ＣＢＡ、好ましくはサイズ約０．９６ｋｂの小型ＣＢＡ（ｓｍＣＢＡ）、好ましくは約０．８１ｋｂサイズのＥＦ１ａまたは好ましくはサイズ約１．０６ｋｂのＣＡＳＩプロモーター；（ｂ）好ましくはサイズ約１．６８ｋｂの蝸牛支持細胞またはＧＪＢ２発現特異的ＧＦＡＰプロモーター、好ましくはサイズ約０．１３ｋｂの小型ＧＪＢ２プロモーター、好ましくはサイズ約０．５４ｋｂの中型ＧＪＢ２プロモーター、好ましくはサイズ約１．０ｋｂの大型ＧＪＢ２プロモーター、または２～３個の個々のＧＪＢ２発現特異的プロモーターの連続した組み合わせ；後にＳＶ４０またはヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）ポリアデニル化シグナルのいずれかが続くウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）を含み、及びＡＡＶゲノムカセット、または約１１３塩基のｓｃＡＡＶ有効化ＩＴＲ（ＩＴＲΔｔｒｓ）によって区切られかつ約１４３塩基の配列調節ＩＴＲと隣接している、好ましくは２．４ｋｂ以下の２つの逆方向同一反復からなる自己相補的ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）ゲノムカセットと隣接する２つの約１４３塩基配列変調逆方向末端反復（ＩＴＲ）のいずれかを更に含む、０．９ｋｂの３’－ＵＴＲ調節領域に作動可能に連結されている、コドン／配列最適化ヒトＧＪＢ２ ｃＤＮＡを含む。
【0051】
別の態様によれば、本開示は、有効量の本明細書に記載の組成物をそれを必要とする対象に投与することを含む、難聴を治療または予防する方法を提供する。
【0052】
別の態様によれば、本開示は、有効量の本明細書に記載の組成物をそれを必要とする対象に投与することを含む、難聴に関連する遺伝子をコードする核酸配列を内耳組織または細胞に送達する方法を提供する。
【0053】
別の態様によれば、本開示は、有効量の本明細書に記載の組成物をそれを必要とする対象に投与することを含む、ＧＪＢ２をコードする核酸配列を内耳組織または細胞に送達する方法を提供する。
【0054】
別の態様によれば、本開示は、本明細書に記載の組成物及び使用説明書を含む、キットを提供する。
【図面の簡単な説明】
【0055】
【図1A】蝸牛の解剖学的構造及び細胞型の概略図である。
【図1B】支持細胞の詳細を示す。外有毛細胞（０１、０２、０３）、内有毛細胞（ＩＨＣ）、ヘンゼン細胞（ｈ１、ｈ２、ｈ３、ｈ４）、ダイテルス細胞（ｄ１、ｄ２、ｄ３）、柱細胞（ｐ）、内指節細胞（ＩＰＣ）、外指節細胞／境界細胞（ｂｃ）を示す。
【図1C】ＧＪＢ２発現の領域を示す蝸牛解剖学的構造及び細胞型の概略図である。
【図2】一本鎖（ｓｓ）ＡＡＶ－ＧＪＢ２及び自己相補的ｓｃＡＡＶ－ＧＪＢ２のＧＪＢ２ベクター（ゲノム）構築物の概略図を示す。
【図3】ＣＢＡプロモーターの核酸配列（配列番号１）を示す。
【図4】ＥＦ１ａプロモーターの核酸配列（配列番号２）を示す。
【図5】ＣＡＳＩプロモーターの核酸配列（配列番号３）を示す。
【図6】ｓｍＣＢＡプロモーターの核酸配列（配列番号４）を示す。
【図7】ＧＦＡＰプロモーターの核酸配列（配列番号５）を示す。
【図8】ＧＪＢ２プロモーターの核酸配列（配列番号６）を示す。このプロモーターは３つの異なる反復：下線を引いた配列（１２８ｂｐ）、緑色の網掛け部分（５３９ｂｐ）、及び全配列（１０００ｂｐ）を有し得る。
【図9】以下のＩＴＲ（ＡＡＶ２）５’－３’：一本鎖（ｓｓ）及び自己相補的（ｓｃ）ＡＡＶゲノム（配列番号７）；３’－５’：一本鎖（ｓｓ）ＡＡＶゲノムのみ（配列番号８）；３’－５’：自己相補的（ｓｃ）ＡＡＶゲノムのみ（配列番号９）の核酸配列を示す。
【図10】ヒト野生型ＧＪＢ２（ｈＧＪＢ２ｗｔ）の核酸配列（配列番号１０）を示す。
【図11】ヒトコドン最適化ＧＪＢ２（ｈＧＪＢ２ｃｏ３）の核酸配列（配列番号１１）を示す。
【図12】ヒトコドン最適化ＧＪＢ２（ｈＧＪＢ２ｃｏ６）の核酸配列（配列番号１２）を示す。
【図13】ヒトコドン最適化ＧＪＢ２（ｈＧＪＢ２ｃｏ９）の核酸配列（配列番号１３）を示す。
【図14】ＨＡタグの核酸配列（配列番号１４）を示す。
【図15】ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）の核酸配列（配列番号１５）を示す。
【図16】ＳＶ４０ポリ（Ａ）転写終結配列の核酸配列（配列番号１６）を示す。
【図17】ｂＧＨポリ（Ａ）転写終結配列の核酸配列（配列番号１７）を示す。
【図18】ＦＬＡＧタグの核酸配列（配列番号１８）を示す。
【図19】らせん板縁におけるＯＭＹ－９０６に対して正規化されたＯＭＹ－９０３、ＯＭＹ－９０７、ＯＭＹ－９１１、ＯＭＹ－９１２、ＯＭＹ－９１３、ＯＭＹ－９１４、ＯＭＹ－９１５、ＯＭＹ－９１６、ＯＭＹ－９１７、ＡＡＶ２及びＡｎｃ８０のＧＦＰカバー度を比較する棒グラフ（灰色の棒）を示す。
【図20】コルチ器におけるＯＭＹ－９０６に対して正規化されたＯＭＹ－９０３、ＯＭＹ－９０７、ＯＭＹ－９１１、ＯＭＹ－９１２、ＯＭＹ－９１３、ＯＭＹ－９１４、ＯＭＹ－９１５、ＯＭＹ－９１６、ＯＭＹ－９１７、ＡＡＶ２及びＡｎｃ８０のＧＦＰカバー度を比較する棒グラフ（灰色の棒）を示す。
【図21】らせん靭帯におけるＯＭＹ－９０６に対して正規化されたＯＭＹ－９０３、ＯＭＹ－９０７、ＯＭＹ－９１１、ＯＭＹ－９１２、ＯＭＹ－９１３、ＯＭＹ－９１４、ＯＭＹ－９１５、ＯＭＹ－９１６、ＯＭＹ－９１７、ＡＡＶ２及びＡｎｃ８０のＧＦＰカバー度を比較する棒グラフ（灰色の棒）を示す。
【図22】Ａ～Ｂは、ＯＭＹ－９０３、Ａｎｃ８０、ＯＭＹ－９１２及び野生型ＡＡＶ２で処理した後のらせん靭帯、コルチ器及びらせん板縁を含む、蝸牛の中央領域におけるＧＦＰレポーター発現の代表的なＺスタック画像を示す。
【図23】２つの用量：２ｅ９ｖｇ及び２ｅ１０ｖｇでのＯＭＹ－９１２ＧＦＰカバー度を比較する蛍光画像を示す。
【図24】２つの用量：２ｅ９ｖｇ及び２ｅ１０ｖｇでのＯＭＹ－９１５ＧＦＰカバー度を比較する蛍光画像を示す。
【図25】２つの用量：２ｅ９ｖｇ及び２ｅ１０ｖｇでらせん板縁におけるＯＭＹ－９１２及びＯＭＹ－９１５ＧＦＰカバー度を比較する棒グラフを示す。
【図26】２つの用量：２ｅ９ｖｇ及び２ｅ１０ｖｇでコルチ器におけるＯＭＹ－９１２及びＯＭＹ－９１５ＧＦＰカバー度を比較する棒グラフを示す。
【図27】ＡＡＶ誘導コネキシン２６発現を示すラット蝸牛移植片の支持細胞におけるＦＬＡＧ抗体染色の蛍光画像を示す。ＦＬＡＧ染色は、コネキシン２６発現の領域と明らかに重複しており、ＦＬＡＧ標識タンパク質がコネキシン２６発現の正常な部位を標的としていることを示す。ＦＬＡＧ抗体は緑色、コネキシン２６は深紅色、ＤＡＰＩによる核染色は青色で示される。左のパネルはすべての色がマージされていることを示し、中央のパネルはコネキシン２６染色のみを示し、右のパネルはＦＬＡＧ染色を示す。
【図28】ＡＡＶ誘導コネキシン２６発現を示すＡＡＶ－ＧＪＢ２－Ｆｌａｇの蝸牛内注射から２～６週間後のマウス蝸牛の支持細胞におけるＦＬＡＧ抗体染色の蛍光画像を示す。蝸牛の基底（底）、中間（中間）及び先端（頂点）の順番の代表的な画像を示す。ＦＬＡＧ抗体は赤色で、ＤＡＰＩによる核染色は青色で示される。
【図29】ＡＡＶ誘導コネキシン２６発現を示すＡＡＶ－ＧＪＢ２－Ｆｌａｇの蝸牛内注射後の成体マウス蝸牛の支持細胞におけるＦＬＡＧ抗体染色の蛍光画像を示す。蝸牛の基底（底）、中間（中間）及び先端（頂点）の順番の代表的な画像を示す。ＦＬＡＧ抗体は赤色で、ＤＡＰＩによる核染色は青色で示される。
【図30】ＯＭＹ－９１３の蝸牛内注射の１２週間後に免疫組織化学によって評価された非ヒト霊長類（ＮＨＰ）の蝸牛切片の画像を示す。ＧＦＰ発現のＤＡＢ染色は疑似的に赤く着色されている。図３０（上のパネル）は蝸牛全体の低倍率画像を示し、正円窓膜注射を介して基部付近にＯＭＹ－９１３を１回注射した後、蝸牛全体にわたって基部から頂点まで一貫した発現を観察できることを実証している。図３０（下のパネル）は、ＯＭＹ－９１３発現が、側壁（ＬＷ）、コルチ器（ＯＣ）支持細胞及びらせん板縁（ＳＬ）を含む、ＧＪＢ２レスキューに関連する領域で観察されることを示す。
【図31】生後３０日目及び生後６０日目に測定された、Ｃｘ２６を発現する野生型（ＷＴ）マウス及びＣｘ２６ノックアウト（ＫＯ）を有する誘導性ｃｒｅマウスにおける異なる周波数にわたる聴覚脳幹反応（ＡＢＲ）によって測定された聴覚閾値を有する折れ線グラフを示す。
【図32】生後３０日目に測定された、Ｃｘ２６を発現する野生型（ＷＴ）マウス及びＣｘ２６ノックアウト（ＫＯ）を有する恒常的ｃｒｅマウスにおける異なる周波数にわたる聴覚脳幹反応（ＡＢＲ）によって測定された聴覚閾値を有する折れ線グラフを示す。
【図33】Ａは、生後３０日目に測定された、ビヒクル（黒色線）または治療薬Ａ（青色線）で処理したＣｘ２６ノックアウト（ＫＯ）を有する誘導性ｃｒｅマウス、またはＣｘ２６を発現し、ビヒクル（緑色の線）で処理された野生型（ＷＴ）マウスにおける異なる周波数にわたる聴覚脳幹反応（ＡＢＲ）によって測定された聴覚閾値を有する折れ線グラフを示す。Ｂは、ビヒクルまたは治療薬Ａで処理されたＣｘ２６ノックアウト（ＫＯ）を有する誘導性ｃｒｅマウスにおけるＣｘ２６発現の棒グラフを示す。Ｃは、ビヒクルまたは治療薬Ａで処理されたＣｘ２６ノックアウト（ＫＯ）を有する誘導性ｃｒｅマウスにおけるＣｘ２６発現の画像を示す。Ｄは、ビヒクルまたは治療薬Ａで処理されたＣｘ２６ノックアウト（ＫＯ）を有する誘導性ｃｒｅマウスにおける蝸牛損傷（平坦な上皮）の棒グラフを示す。
【図34】各ＦＲＡＰ試験についての光退色及び画像取得のタイムライン（上部パネル）、ならびに治療薬Ａ及び治療薬Ａ－ＦＬＡＧが、形質導入されていないＨｅＬａ細胞よりも速く蛍光を回復することを示すグラフ（下部パネル）を示し、導入遺伝子駆動タンパク質が機能的ギャップ結合を形成する可能性が高いことを示す。
【図35A】治療薬Ａ－ＦＬＡＧ発現が蝸牛の長さ全体にわたって高レベルで存在し、内溝（Ａ）において膜状のプラーク様構造を形成することを示す一連の画像である。
【図35B】治療薬Ａ－ＦＬＡＧ発現が蝸牛の長さ全体にわたって高レベルで存在し、クラウジウス細胞（Ｂ）において膜状のプラーク様構造を形成することを示す一連の画像である。
【図35C】治療薬Ａ－ＦＬＡＧ発現が蝸牛の長さ全体にわたって高レベルで存在し、他の支持細胞型（Ｃ）において膜状のプラーク様構造を形成することを示す一連の画像である。
【図35D】治療薬Ａ－ＦＬＡＧ発現が蝸牛の長さ全体にわたって高レベルで存在し、他の支持細胞型において膜状のプラーク様構造を形成することを示す一連の画像である。
【図36】Ｐ３０齢の成体Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおける後半規管の開窓による正円窓膜を介した治療薬Ａまたは治療薬Ａ－ＦＬＡＧの蝸牛内注射が安全であり、手術後４２日目の内有毛細胞または外有毛細胞に損傷を引き起こさなかったことを示す一連の画像である。
【図37】成体（Ｐ３０）Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおける治療薬Ａ－ＦＬＡＧ投与後、手術後１４日目の内溝、クラウジウス細胞及び側壁線維細胞におけるＣＸ２６－ＦＬＡＧ形質導入（緑色）を示す一連の画像である。
【図38】成体（Ｐ３０）Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおける治療薬Ａ－ＦＬＡＧ投与後、手術後１４日目の内溝、クラウジウス細胞及び側壁線維細胞におけるＣＸ２６－ＦＬＡＧ形質導入（緑色）を示す一連の画像である。
【図39A】ＧＪＢ２先天性難聴の誘導性マウスモデル（Ｒｏｓａ－ｃｒｅ）を示す。
【図39B】ＧＪＢ２先天性難聴の誘導性マウスモデル（Ｒｏｓａ－ｃｒｅ）を示す。
【図39C】出生後の野生型マウスへの治療薬Ａ－ＦＬＡＧの蝸牛内注射が、ＣＸ２６を天然に発現するすべての細胞型を含む広範な蝸牛カバー度を提供することを示す。蝸牛内注射は、Ｒｏｓａ－ｃｒｅ動物モデルでレスキュー研究を実施した年齢で行われた。
【図39D】治療薬Ａが、Ｒｏｓａ－ｃｒｅ動物モデルにおいて、複数の周波数にわたるＡＢＲ閾値の実質的なレスキュー、ＣＸ２６発現の回復、及び蝸牛形態の保存を実証したことを示す。
【図39E】治療薬Ａが、Ｒｏｓａ－ｃｒｅ動物モデルにおいて、複数の周波数にわたるＡＢＲ閾値の実質的なレスキュー、ＣＸ２６発現の回復、及び蝸牛形態の保存を実証したことを示す。
【図40A】Ｃｘ２６ｌｏｘｐ／ｌｏｘｐマウスを、内耳特異的プロモーターＰ０によって駆動されるＣｒｅを発現するマウス（Ｐ０－Ｃｒｅ）と交配することによる、ＧＪＢ２の内耳欠失を有するマウスモデルを示す。
【図40B】Ｃｘ２６ｌｏｘｐ／ｌｏｘｐマウスを、内耳特異的プロモーターＰ０によって駆動されるＣｒｅを発現するマウス（Ｐ０－Ｃｒｅ）と交配することによる、ＧＪＢ２の内耳欠失を有するマウスモデルを示す。
【図40C】出生後の野生型マウスへの治療薬Ａ－ＦＬＡＧの蝸牛内注射が、ＣＸ２６を天然に発現するすべての細胞型を含む広範な蝸牛カバー度を提供することを示す。蝸牛内注射は、Ｐ０－ｃｒｅ動物モデルでレスキュー研究を実施した年齢で行われた。
【図40D】治療薬Ａが、Ｐ０－ｃｒｅ動物モデルにおいて、複数の周波数にわたるＡＢＲ閾値の実質的なレスキュー、ＣＸ２６発現の回復、及び蝸牛形態の保存を実証したことを示す。
【図40E】治療薬Ａが、Ｐ０－ｃｒｅ動物モデルにおいて、複数の周波数にわたるＡＢＲ閾値の実質的なレスキュー、ＣＸ２６発現の回復、及び蝸牛形態の保存を実証したことを示す。
【図41】治療薬Ａ－ＦＬＡＧの蝸牛内注射が、非ヒト霊長類（ＮＨＰ）において高度の形質導入及び良好な向性を示すことを示す。
【発明を実施するための形態】
【0056】
非症候性難聴及び聴覚消失（ＤＦＮＢ１；コネキシン２６聴覚消失としても知られる）は、常染色体劣性遺伝であり、先天性非進行性の軽度から重度の感音難聴によって特徴付けられる。ＧＪＢ２遺伝子は、有毛細胞の生存と機能及び正常な聴力に重要な役割を果たすカリウム勾配の制御を含む、蝸牛の恒常性にとって重要な細胞間コミュニケーションに関与するギャップ結合を形成する、蝸牛支持細胞で発現するコネキシン２６をコードする。ＧＪＢ２の突然変異は、ギャップ結合と蝸牛の恒常性を損ない、有毛細胞の機能不全及び難聴を引き起こす。
【0057】
ＮＩＤＣＤによると、米国では１，０００人の子供のうち２～３人がある程度の難聴を持って生まれており、半数以上が遺伝的要因によるものである。ギャップ結合タンパク質であるコネキシン２６（ＣＸ２６）をコードするＧＪＢ２遺伝子の突然変異は、遺伝性難聴の最も一般的な形態であり、様々な民族群の症例の５０％超を占めている。ほとんどの対象では、難聴の発症は言語修得前で中度から重度であるが、一部の対象では、ＣＸ２６の喪失による難聴は軽度かつ進行性である。内耳では、ＣＸ２６の発現は、支持細胞及び線維細胞を含む、様々な非感覚細胞型の機能に不可欠である。
【0058】
遺伝子検査を使用して、ギャップ結合ベータ－２タンパク質（コネキシン２６）の発現を変化させる、配列バリアント及び上流のｃｉｓ調節エレメントのバリアントを含む、ＧＪＢ２の両アレル性病原バリアントを特定することにより、ＤＦＮＢ１を診断することができる。ＤＦＮＢ１の原因となるＧＪＢ２病原バリアントが罹患した家族で検出された場合、リスクのある近親者の保因者検査、リスクが高い妊娠の出生前検査、及び着床前の遺伝子診断が可能である。Ｓｍｉｔｈ＆Ｊｏｎｅｓ．Ｎｏｎｓｙｎｄｒｏｍｉｃ Ｈｅａｒｉｎｇ Ｌｏｓｓ ａｎｄ Ｄｅａｆｎｅｓｓ，ＤＦＮＢ１．１９９８．Ｉｎ：Ａｄａｍ，ｅｔ ａｌ．Ｅｄｓ．ＧｅｎｅＲｅｖｉｅｗｓ．Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｓｅａｔｔｌｅ；Ｋｅｍｐｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｒｏｙａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ２００２ ９５：１７１－１７７。本開示は、蝸牛が外科的にアクセス可能であり、比較的免疫保護された環境への局所適用が可能であること、及びウイルスベクターを使用する遺伝子治療が難聴の治療に有用であることを認識する。本開示はまた、内耳組織及び細胞における向性ならびに形質導入を増加させることができる遺伝子治療が、遺伝子の欠失に関連する難聴を効果的に治療できることを認識する。
【0059】
本開示は、例えば、非バリアントＡＡＶカプシドポリペプチドと比較して、内耳組織または細胞において増加した向性を示すバリアントアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドポリペプチドに関する。本明細書に記載のバリアントＡＡＶカプシドポリペプチドは、ｒＡＡＶベクター及び／またはｒＡＡＶビリオンに組み込むことができ、それを介して、遺伝子の常染色体変異（劣性または優性）を有する患者を含む、遺伝子の欠失に関連する難聴を患う患者への標的送達のために遺伝子をパッケージ化することができる。特定の実施形態では、遺伝子はギャップ結合タンパク質ベータ２（ＧＪＢ２）である。ＧＪＢ２の突然変異は、ギャップ結合と蝸牛の恒常性を損ない、蝸牛構造の破損、有毛細胞の機能不全及び難聴を引き起こす。本明細書に記載のＧＪＢ２遺伝子治療の目標は、機能的なギャップ結合を回復させ、有毛細胞を保存して聴力を改善することである。
【0060】
定義
別段の定義がない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有する。以下の参考文献は、本開示で使用される多くの用語の一般的な定義を当業者に提供する。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（２ｎｄ Ｅｄ．１９９４）；Ｔｈｅ Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｗａｌｋｅｒ ｅｄ．，１９８８）；Ｔｈｅ Ｇｌｏｓｓａｒｙ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，５ｔｈ Ｅｄ．，Ｒ．Ｒｉｅｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ｅｄｓ．），Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ（１９９１）；及びＨａｌｅ＆Ｍａｒｈａｍ，Ｔｈｅ Ｈａｒｐｅｒ Ｃｏｌｌｉｎｓ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９１）。本明細書で使用される場合、以下の用語は、別段の指定がない限り、以下の用語に帰する意味を有する。
別段の定義がない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有する。以下の参考文献は、本開示で使用される多くの用語の一般的な定義を当業者に提供する。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（２ｎｄ Ｅｄ．１９９４）；Ｔｈｅ Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｗａｌｋｅｒ ｅｄ．，１９８８）；Ｔｈｅ Ｇｌｏｓｓａｒｙ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，５ｔｈ Ｅｄ．，Ｒ．Ｒｉｅｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ｅｄｓ．），Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ（１９９１）；及びＨａｌｅ＆Ｍａｒｈａｍ，Ｔｈｅ Ｈａｒｐｅｒ Ｃｏｌｌｉｎｓ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９１）。本明細書で使用される場合、以下の用語は、別段の指定がない限り、以下の用語に帰する意味を有する。
【0061】
冠詞「ａ」及び「ａｎ」は、本明細書では、冠詞の文法的対象の１つ以上（すなわち、少なくとも１つ）を指すように使用している。例として、「（ａｎ）要素」は、１つの要素または１つを超える要素を意味する。
【0062】
「含む」という用語は、本明細書では、「含むがこれに限定されない」という語句を意味し、それと互換可能に使用される。
【0063】
「または」という用語は、文脈が別段明確に示さない限り、「及び／または」という用語を意味するために本明細書で使用され、これと互換可能に使用される。
【0064】
「など」という用語は、本明細書では「などであるがこれに限定されない」という語句を意味するために使用され、これと互換可能に使用される。
【0065】
本明細書で使用される「投与する」、「投与すること」、「投与」などの用語は、所望の生物作用部位への治療薬または医薬組成物の送達を可能にするために使用される方法を指すことを意味する。
【0066】
本明細書で使用される「ＡＡＶ」という用語は、アデノ関連ウイルスの略語であり、ウイルス自体またはその誘導体、例えば、ＡＡＶベクター、ＡＡＶウイルス粒子及び／またはＡＡＶビリオンを指すために使用され得る。本用語は、他の点で要求される場合を除いて、すべてのサブタイプ、ならびに天然に存在する形態及び組換え形態の両方を包含する。いくつかの実施形態では、ＡＡＶは、そのカプシドポリペプチドによって、例えば、そのバリアントカプシドポリペプチドによって言及され得る。例えば、ＯＭＹ－９１３バリアントカプシドポリペプチドを含むＡＡＶは、本明細書において「ＯＭＹ－９１３」と称され得る。
【0067】
本明細書で使用される「ＡＡＶビリオン」または「ＡＡＶウイルス」または「ＡＡＶウイルス粒子」または「ＡＡＶベクター粒子」という用語は、例えば、野生型ＡＡＶビリオン粒子などの完全なウイルス粒子を広く指すことを意味し、それは、ＡＡＶカプシドタンパク質にパッケージ化された一本鎖ゲノムＤＮＡを含む。一本鎖核酸分子は、センス鎖またはアンチセンス鎖のいずれかであり、どちらの鎖も等しく感染性がある。「ｒＡＡＶウイルス粒子」という用語は、組換えＡＡＶウイルス粒子、すなわち、感染性であるが複製欠損のある粒子を指す。ｒＡＡＶウイルス粒子は、ＡＡＶカプシドタンパク質にパッケージ化された一本鎖ゲノムＤＮＡを含む。特定の実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質は、例えば、非バリアントＡＡＶカプシドタンパク質と比較して、内耳組織または細胞において増加した向性を示すバリアントＡＡＶカプシドタンパク質である。例示的なバリアントＡＡＶカプシドタンパク質のアミノ酸配列及びヌクレオチド配列を表１に提供する。
【0068】
本明細書で使用する「バイオリアクター」という用語は、細胞を培養する目的で使用できる任意の装置を広く指すことを意味する。
【0069】
本明細書で使用する「遺伝子」または「コード配列」という用語は、タンパク質をコードするＤＮＡ領域（転写領域）を広く指すことを意味する。コード配列は、プロモーターなどの適切な調節領域の制御下に置かれると、ポリペプチドに転写（ＤＮＡ）及び翻訳（ＲＮＡ）される。遺伝子は、プロモーター、５’－リーダー配列、コード配列、及びポリアデニル化部位を含む３’－非翻訳配列などのいくつかの作動可能に連結された断片を含み得る。「遺伝子の発現」という語句は、遺伝子がＲＮＡに転写される、及び／または活性タンパク質に翻訳されるプロセスを指す。
【0070】
本明細書で使用される「目的の遺伝子（gene of interest、ＧＯＩ）」という用語は、本明細書で使用される場合、ＡＡＶ発現ベクターに導入される異種配列を広く指し、典型的には、ヒトまたは動物における治療用途のタンパク質をコードする核酸配列を指す。いくつかの実施形態では、ＧＯＩは難聴に関連する遺伝子である。特定の実施形態では、遺伝子はギャップ結合タンパク質ベータ２（ＧＪＢ２）である。本明細書に記載の方法に従って使用することができる難聴（例えば、遺伝子欠失に関連する難聴）に関連する他の遺伝子は、当技術分野で知られており、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｓｈｅａｒｅｒ ｅｔ ａｌ．，“Ｈｅｒｅｄｉｔａｒｙ Ｈｅａｒｉｎｇ Ｌｏｓｓ ａｎｄ Ｄｅａｆｎｅｓｓ Ｏｖｅｒｖｉｅｗ”，２０１７に記載されている。難聴（例えば、遺伝子欠失に関連する難聴）に関連する遺伝子の例には、ＡＣＴＧ１、ＡＤＣＹ１、ＡＤＧＲＶ１、ＡＩＦＭ１、ＢＤＰ１、ＢＳＮＤ、ＢＴＤ、ＣＡＢＰ２、ＣＣＤＣ５０、ＣＤ１６４、ＣＤＣ１４Ａ、ＣＤＨ２３、ＣＥＡＣＡＭ１６、ＣＩＢ２、ＣＬＤＮ１４、ＣＬＩＣ５、ＣＬＲＮ１、ＣＯＣＨ、ＣＯＬ１１Ａ１、ＣＯＬ１１Ａ２、ＣＯＬ２Ａ１、ＣＯＬ４Ａ３、ＣＯＬ４Ａ４、ＣＯＬ４Ａ５、ＣＯＬ４Ａ６、ＣＯＬ９Ａ１、ＣＯＬ９Ａ２、ＣＯＬ９Ａ３、ＤＣＤＣ２、ＤＩＡＰＨ１、ＤＭＸＬ２、ＤＳＰＰ、ＥＤＮ３、ＥＤＮＲＢ、ＥＬＭＯＤ３、ＥＰＳ８、ＥＰＳ８Ｌ２、ＥＳＰＮ、ＥＳＲＲＢ、ＥＹＡ１、ＥＹＡ４、ＦＡＭ１８９Ａ２、ＧＩＰＣ３、ＧＪＢ２、ＧＪＢ３、ＧＪＢ６、ＧＰＳＭ２、ＧＲＨＬ２、ＧＲＸＣＲ１、ＧＲＸＣＲ２、ＧＳＤＭＥ、ＨＡＲＳ１、ＨＧＦ、ＨＯＭＥＲ２、ＩＬＤＲ１、ＫＡＲＳ１、ＫＣＮＥ１、ＫＣＮＱ１、ＫＣＮＱ４、ＬＨＦＰＬ５、ＬＯＸＨＤ１、ＬＲＴＯＭＴ、ＭＡＲＶＥＬＤ２、ＭＣＭ２、ＭＥＴ、ＭＩＲ９６、ＭＩＴＦ、ＭＳＲＢ３、ＭＴ－ＣＯ１、ＭＴ－ＲＮＲ１、ＭＴ－ＴＳ１、ＭＹＨ１４、ＭＹＨ９、ＭＹＯ１５Ａ、ＭＹＯ１Ａ、ＭＹＯ３Ａ、ＭＹＯ６、ＭＹＯ７Ａ、ＭＹＯ７Ａ、ＮＡＲＳ２、ＮＦ２、ＯＳＢＰＬ２、ＯＴＯＡ、ＯＴＯＦ、ＯＴＯＧ、ＯＴＯＧＬ、Ｐ２ＲＸ２、ＰＡＸ３、ＰＣＤＨ１５、ＰＥＸ７、ＰＨＹＨ、ＰＪＶＫ、ＰＮＰＴ１、ＰＯＵ３Ｆ４、ＰＯＵ４Ｆ３、ＰＲＰＳ１、ＰＴＰＲＱ、ＲＤＸ、ＲＩＰＯＲ２、ＲＯＲ１、Ｓ１ＰＲ２、ＳＥＲＰＩＮＢ６、ＳＩＸ１、ＳＩＸ５、ＳＬＣ１７Ａ８、ＳＬＣ２２Ａ４、ＳＬＣ２６Ａ４、ＳＬＣ２６Ａ５、ＳＭＰＸ、ＳＯＸ１０、ＳＴＲＣ、ＳＹＮＥ４、ＴＢＣ１Ｄ２４、ＴＥＣＴＡ、ＴＩＭＭ８Ａ、ＴＪＰ２、ＴＭＣ１、ＴＭＥＭ１３２Ｅ、ＴＭＩＥ、ＴＭＰＲＳＳ３、ＴＰＲＮ、ＴＲＩＯＢＰ、ＴＳＰＥＡＲ、ＵＳＨ１Ｃ、ＵＳＨ１Ｇ、ＵＳＨ２Ａ、ＷＢＰ２、ＷＦＳ１及びＷＨＲＮが含まれるが、これらに限定されない。
【0071】
本明細書で使用される「難聴」という用語は、対象が通常聞く音に対する感度の低下を指すことを意味する。難聴の程度は、聴取者がそれを感知できる前に必要な通常レベルを超える音量の増加に従って分類される。いくつかの実施形態では、難聴は、個人が異なる周波数でトーンを知覚する閾値音量の増加によって特徴付けられ得る。特定の実施形態では、聴力はデシベル（ｄＢ）で測定することができる。特定の実施形態では、各周波数の閾値または０ｄＢマークは、正常な対象、例えば、正常なヒト対象が５０％の時間でトーンバーストを知覚するレベルを指す。特定の実施形態では、対象の閾値が正常閾値の１５ｄＢ以内である場合、聴力は正常であるとみなされる。特定の実施形態では、難聴の程度は、軽度が２６～４０ｄＢ、中度が４１～５５ｄＢ、中重度が５６～７０ｄＢ、重度が７１～９０ｄＢ、最重度が９０ｄＢのように段階付けされる。特定の実施形態では、本明細書に記載の方法は、対象における難聴の進行を、あるレベル（例えば、軽度）から別のレベル（例えば、中度、中重度、重度及び／または最重度）に軽減及び／または遅延させることができる。特定の実施形態では、本明細書に記載の方法は、対象における難聴の進行を、あるレベル（例えば、中度、中重度、重度及び／または最重度）から別のレベル（例えば、軽度）に改善及び／または逆転させることができる。特定の実施形態では、難聴は遺伝子欠失に関連する。特定の実施形態では、難聴は、ＡＣＴＧ１、ＡＤＣＹ１、ＡＤＧＲＶ１、ＡＩＦＭ１、ＢＤＰ１、ＢＳＮＤ、ＢＴＤ、ＣＡＢＰ２、ＣＣＤＣ５０、ＣＤ１６４、ＣＤＣ１４Ａ、ＣＤＨ２３、ＣＥＡＣＡＭ１６、ＣＩＢ２、ＣＬＤＮ１４、ＣＬＩＣ５、ＣＬＲＮ１、ＣＯＣＨ、ＣＯＬ１１Ａ１、ＣＯＬ１１Ａ２、ＣＯＬ２Ａ１、ＣＯＬ４Ａ３、ＣＯＬ４Ａ４、ＣＯＬ４Ａ５、ＣＯＬ４Ａ６、ＣＯＬ９Ａ１、ＣＯＬ９Ａ２、ＣＯＬ９Ａ３、ＤＣＤＣ２、ＤＩＡＰＨ１、ＤＭＸＬ２、ＤＳＰＰ、ＥＤＮ３、ＥＤＮＲＢ、ＥＬＭＯＤ３、ＥＰＳ８、ＥＰＳ８Ｌ２、ＥＳＰＮ、ＥＳＲＲＢ、ＥＹＡ１、ＥＹＡ４、ＦＡＭ１８９Ａ２、ＧＩＰＣ３、ＧＪＢ２、ＧＪＢ３、ＧＪＢ６、ＧＰＳＭ２、ＧＲＨＬ２、ＧＲＸＣＲ１、ＧＲＸＣＲ２、ＧＳＤＭＥ、ＨＡＲＳ１、ＨＧＦ、ＨＯＭＥＲ２、ＩＬＤＲ１、ＫＡＲＳ１、ＫＣＮＥ１、ＫＣＮＱ１、ＫＣＮＱ４、ＬＨＦＰＬ５、ＬＯＸＨＤ１、ＬＲＴＯＭＴ、ＭＡＲＶＥＬＤ２、ＭＣＭ２、ＭＥＴ、ＭＩＲ９６、ＭＩＴＦ、ＭＳＲＢ３、ＭＴ－ＣＯ１、ＭＴ－ＲＮＲ１、ＭＴ－ＴＳ１、ＭＹＨ１４、ＭＹＨ９、ＭＹＯ１５Ａ、ＭＹＯ１Ａ、ＭＹＯ３Ａ、ＭＹＯ６、ＭＹＯ７Ａ、ＭＹＯ７Ａ、ＮＡＲＳ２、ＮＦ２、ＯＳＢＰＬ２、ＯＴＯＡ、ＯＴＯＦ、ＯＴＯＧ、ＯＴＯＧＬ、Ｐ２ＲＸ２、ＰＡＸ３、ＰＣＤＨ１５、ＰＥＸ７、ＰＨＹＨ、ＰＪＶＫ、ＰＮＰＴ１、ＰＯＵ３Ｆ４、ＰＯＵ４Ｆ３、ＰＲＰＳ１、ＰＴＰＲＱ、ＲＤＸ、ＲＩＰＯＲ２、ＲＯＲ１、Ｓ１ＰＲ２、ＳＥＲＰＩＮＢ６、ＳＩＸ１、ＳＩＸ５、ＳＬＣ１７Ａ８、ＳＬＣ２２Ａ４、ＳＬＣ２６Ａ４、ＳＬＣ２６Ａ５、ＳＭＰＸ、ＳＯＸ１０、ＳＴＲＣ、ＳＹＮＥ４、ＴＢＣ１Ｄ２４、ＴＥＣＴＡ、ＴＩＭＭ８Ａ、ＴＪＰ２、ＴＭＣ１、ＴＭＥＭ１３２Ｅ、ＴＭＩＥ、ＴＭＰＲＳＳ３、ＴＰＲＮ、ＴＲＩＯＢＰ、ＴＳＰＥＡＲ、ＵＳＨ１Ｃ、ＵＳＨ１Ｇ、ＵＳＨ２Ａ、ＷＢＰ２、ＷＦＳ１及びＷＨＲＮからなる群から選択される遺伝子の欠失に関連する。特定の実施形態では、難聴は、本明細書に記載の遺伝子における置換、欠失、挿入及び／または重複などの突然変異に関連する。特定の実施形態では、難聴は、本明細書に記載の遺伝子における２つ以上の突然変異（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９または１０以上の突然変異）に関連する。いくつかの実施形態では、２つ以上の突然変異は、同じ遺伝子または異なる遺伝子で起こり得る。いくつかの実施形態では、２つ以上の突然変異は、遺伝子の同じ対立遺伝子または異なる対立遺伝子で起こり得る。いくつかの実施形態では、難聴は、本明細書に記載の遺伝子におけるヘテロ接合変異に関連し得る。いくつかの実施形態では、難聴は、本明細書に記載の遺伝子におけるホモ接合変異に関連し得る。特定の実施形態では、難聴は症候性であり、聴覚障害と共に他の提示異常を伴う。特定の実施形態では、難聴は非症候性であり、難聴以外の個人に関連する他の問題がない場合に発生する。特定の実施形態では、優性難聴及び劣性難聴は、いくつかの遺伝子における対立遺伝子変異に起因し、症候性及び非症候性難聴は、同じ遺伝子における突然変異によって引き起こされ、劣性難聴は、異なる機能群からの異なる遺伝子における２つの突然変異の組み合わせによって引き起こされ得る。特定の実施形態では、難聴は遺伝性である。特定の実施形態では、難聴は、常染色体優性非症候性難聴である。特定の実施形態では、難聴は、常染色体劣性非症候性難聴である。特定の実施形態では、難聴は、Ｘ連鎖非症候性難聴である。特定の実施形態では、難聴は、ミトコンドリア症候性難聴である。特定の実施形態では、難聴は後天性難聴である。特定の実施形態では、難聴は進行性難聴である。特定の実施形態では、対象における難聴は、基礎疾患または障害、例えば、ワールデンブルグ症候群（ＷＳ）、鰓弓耳腎スペクトラム疾患、神経線維腫症２（ＮＦ２）、スティックラー症候群、アッシャー症候群Ｉ型、アッシャー症候群ＩＩ型、アッシャー症候群ＩＩＩ型、ペンドレッド症候群、ジャーベル・ランゲニールセン症候群、ビオチニダーゼ欠損症、レフサム病、アルポート症候群、及び／または聴覚消失・ジストニア・視神経細胞障害症候群（Ｍｏｈｒ－Ｔｒａｎｅｂｊａｅｒｇ症候群）に関連し得る。
【0072】
本明細書で使用される「ヘルペスウイルス」または「ヘルペスウイルス科」という用語は、比較的大きなゲノムを有するエンベロープ二本鎖ＤＮＡウイルスの一般的な科を広く指すことを意味する。この科は、広範囲の脊椎動物及び無脊椎動物の宿主、好ましい実施形態では、哺乳動物宿主、例えば、ヒト、ウマ、ウシ、マウス及びブタの核で複製する。ヘルペスウイルス科の例示的なメンバーには、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、単純ヘルペスウイルス１型及び２型（ＨＳＶ１及びＨＳＶ２）ならびに水痘帯状疱疹（ＶＺＶ）及びエプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）が含まれる。
【0073】
本明細書で使用される「異種」という用語は、比較される、またはその中で誘導されるかもしくは組み込まれる実体の残りのものとは遺伝子型が異なる実体に由来することを意味する。例えば、遺伝子工学技術によって異なる細胞型に導入されたポリヌクレオチドは、異種ポリヌクレオチドである（そして、発現された場合、異種ポリペプチドをコードすることができる）。同様に、ウイルスベクターに組み込まれる細胞配列（例えば、遺伝子またはその一部）は、ベクターに関して異種ヌクレオチド配列である。
【0074】
本明細書で使用される「感染」という用語は、ウイルスによる異種ＤＮＡの細胞への送達を広く指すことを意味する。本明細書で使用される「共感染」という用語は、２つ以上のウイルスによる「同時感染」、「二重感染」、「多重感染」または「逐次感染」を意味する。２つ（またはそれ以上）のウイルスによる産生細胞の感染は、「共感染」と称される。「トランスフェクション」という用語は、電気穿孔、リン酸カルシウム沈殿、または当技術分野で周知の他の方法によって細胞に導入される、プラスミドＤＮＡなどの物理的または化学的方法によって異種ＤＮＡを細胞に送達するプロセスを指す。
【0075】
本明細書で使用される「内耳細胞」または「内耳の細胞」という用語は、内有毛細胞（ＩＨＣ）及び外有毛細胞（ＯＨＣ）、らせん神経節細胞、前庭有毛細胞、前庭神経節細胞、支持細胞、らせん血管条、らせん靭帯またはらせん板縁の細胞を指す。支持細胞とは、興奮性ではない耳の細胞、例えば、有毛細胞または神経細胞ではない細胞を指す。いくつかの実施形態では、内耳組織及び細胞には、側壁またはらせん靭帯の細胞、コルチ器の支持細胞、らせん靭帯の線維細胞、クラウジウス細胞、ベッチャー細胞、らせん突起の細胞、前庭支持細胞、ヘンゼン細胞、ダイタース細胞、柱細胞、内指節細胞、外指節細胞、及び／または境界細胞が含まれる。
【0076】
本明細書で使用される「逆位末端反復」または「ＩＴＲ」配列という用語は、反対方向にあるウイルスゲノムの末端に見られる比較的短い配列を指すことを意味する。「ＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）」配列は、当技術分野でよく理解されている用語であり、天然の一本鎖ＡＡＶゲノムの両末端に存在する約１４５ヌクレオチドの配列である。ＩＴＲの最も外側のヌクレオチドは、異なるＡＡＶゲノム間及び単一のＡＡＶゲノムの両端間に不均一性をもたらす、２つの代替方向のいずれかで存在し得る。
【0077】
本明細書で使用される「単離された」分子（例えば、単離された核酸またはタンパク質または細胞）という用語は、その天然環境の成分から同定及び分離され及び／または回収されたものである。
【0078】
本明細書で使用される「中耳」という用語は、鼓膜と内耳との間の空間を指すことを意味する。
【0079】
本明細書で使用する「最小調節エレメント」という用語は、標的細胞における遺伝子の効果的な発現に必要な調節エレメントを指すことを意味し、したがって導入遺伝子発現カセットに含まれるべきである。そのような配列は、例えば、プロモーターまたはエンハンサー配列、プラスミドベクター内へのＤＮＡ断片の挿入を促進するポリリンカー配列、ならびにｍＲＮＡ転写物のイントロンスプライシング及びポリアデン化に関与する配列を含み得る。
【0080】
本明細書で使用される「天然に存在しない」という用語は、天然に存在しないタンパク質、核酸、リボ核酸、またはウイルスを広く指すことを意味する。例えば、それは、遺伝子改変バリアント、例えば、ｃＤＮＡまたはコドン最適化核酸であり得る。
【0081】
本明細書で使用される場合、「核酸」または「核酸分子」は、例えば、ＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）などの単量体ヌクレオチドの鎖からなる分子を指すことを意味する。核酸は、例えば、プロモーター、目的遺伝子もしくはその一部（例えば、ＧＪＢ２遺伝子またはその一部）、または調節エレメントをコードし得る。核酸分子は、一本鎖または二本鎖であり得る。「ＧＪＢ２核酸」とは、ＧＪＢ２遺伝子もしくはその一部、またはＧＪＢ２遺伝子もしくはその一部の機能的バリアントを含む核酸を指す。遺伝子の機能的バリアントには、例えば、サイレント変異、一塩基多型、ミスセンス変異、及び遺伝子機能を有意に変化させない他の変異または欠失などの軽微な変異を伴う遺伝子のバリアントが含まれる。
【0082】
ＤＮＡ及びＲＮＡ鎖の非対称末端は、５’（５プライム）及び３’（３プライム）末端と呼ばれ、５’末端は末端リン酸基を有し、３’末端は末端ヒドロキシル基を有する。５プライム（５’）末端は、デオキシリボースまたはリボースの糖環の５番目の炭素を末端に有する。核酸は、新しい鎖を組み立てるために使用されるポリメラーゼがホスホジエステル結合を介して３’－ヒドロキシル（－ＯＨ）基にそれぞれの新しいヌクレオチドを結合するため、ｉｎ ｖｉｖｏで５’から３’方向に合成される。
【0083】
本明細書で使用される「作動可能に連結される」または「作動的に連結される」または「連結した」という用語は、遺伝要素の並列を指し、これらの要素は、それらが予想される様式で作動することを可能にする関係にある。例えば、プロモーターは、プロモーターがコード配列の転写を開始する助けとなる場合、コード領域に作動可能に連結され得る。この機能的関係が維持される限り、プロモーターとコード領域との間に介在残基が存在し得る。
【0084】
本明細書で使用される、参照ポリペプチド配列または核酸配列に関する「配列同一性パーセント（％）」は、配列をアライメントし、配列同一性最大パーセントを得るのに必要な場合はギャップを導入した後に、配列同一性の部分としていかなる保存的置換も考慮に入れずに、参照ポリペプチドまたは核酸配列におけるアミノ酸残基またはヌクレオチドと同一である、候補配列におけるアミノ酸残基またはヌクレオチドの割合として定義される。アミノ酸または核酸配列同一性パーセントを決定する目的のためのアライメントは、当技術分野における技術の範囲内である種々の方式で、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，１９８７），Ｓｕｐｐ．３０，ｓｅｃｔｉｏｎ７．７．１８，Ｔａｂｌｅ７．７．１に記載されるもの、及びＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮまたはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアを含む、公的に利用可能なコンピュータソフトウェアプログラムを使用して達成することができる。アライメントプログラムの例としては、ＡＬＩＧＮ Ｐｌｕｓ（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ａｎｄ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ）がある。当業者は、比較される配列の全長にわたって最大のアライメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アライメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。本明細書の目的のために、所与のアミノ酸配列Ａの、所与のアミノ酸配列Ｂへの、それとの、またはそれに対するアミノ酸配列同一性の割合（これは、所与のアミノ酸配列Ｂへの、それとの、またはそれに対する特定のアミノ酸配列同一性の割合を有するかまたは含む、所与のアミノ酸配列Ａとして代替的に言い換えることができる）は、分数Ｘ／Ｙの１００倍、のように計算され、ここで、Ｘは、ＡとＢのプログラムのアライメントにおいて配列アライメントプログラムにより同一一致としてスコア付けされたアミノ酸残基の数であり、Ｙは、Ｂ内のアミノ酸残基の総数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと等しくない場合、ＢへのＡのアミノ酸配列同一性の割合は、ＡへのＢのアミノ酸配列同一性の割合と等しくないことが理解されよう。本明細書の目的のために、所与の核酸配列Ｃの、所与の核酸配列Ｄへの、それとの、またはそれに対する核酸配列同一性の割合（これは、所与の核酸Ｄへの、それとの、またはそれに対する特定の核酸配列同一性の割合を有するかまたは含む、所与の核酸酸配列Ｃとして代替的に言い換えることができる）は、分数Ｗ／Ｚの１００倍、のように計算され、Ｗは、ＣとＤのプログラムのアライメントにおいて配列アライメントプログラムにより同一一致としてスコア付けされたヌクレオチドの数であり、Ｚは、Ｄ内のヌクレオチドの総数である。核酸配列Ｃの長さが核酸配列Ｄの長さと等しくない場合、ＤへのＣの核酸配列同一性の割合は、ＣへのＤの核酸配列同一性の割合と等しくないことが理解されよう。
【0085】
同様に、本明細書で使用される「配列相同性」はまた、２つの配列の関連性を決定する方法を指す。配列の相同性を決定するために、２つ以上の配列が上記のように最適に整列され、必要に応じてギャップが導入される。ただし、「配列同一性」とは対照的に、保存的アミノ酸置換は、配列相同性を決定する際に一致としてカウントされる。換言すれば、参照配列と９５％の配列相同性を有するポリペプチドまたはポリヌクレオチドを得るために、参照配列中のアミノ酸残基またはヌクレオチドの９５％が、別のアミノ酸もしくはヌクレオチドとの保存的置換と一致するか、またはそれらを含まなければならない、または、参照配列中の保存的置換を含まない全アミノ酸残基またはヌクレオチドの５％を上限とする数のアミノ酸またはヌクレオチドは、参照配列に挿入され得る。
【0086】
本明細書で使用される「医薬組成物」または「組成物」という用語は、本明細書に記載の組成物または薬剤（例えば、組換えアデノ随伴（ｒＡＡＶ）発現ベクター及び／またはｒＡＡＶビリオン）を指すことを意味し、任意選択で、限定されないが、担体、安定剤、希釈剤、分散剤、懸濁化剤、増粘剤、賦形剤などの少なくとも１つの薬学的に許容される化学成分と混合される。
【0087】
本明細書で使用される「ポリペプチド」及び「タンパク質」という用語は、本明細書では互換可能に使用され、アミノ酸残基の重合体を指し、最小の長さに限定されない。アミノ酸残基のそのようなポリマーは、天然または非天然のアミノ酸残基を含むことができ、アミノ酸残基のペプチド、オリゴペプチド、二量体、三量体及び多量体を含むが、これらに限定されない。完全長タンパク質及びその断片の両方は、定義に含まれる。この用語には、ポリペプチドの発現後修飾、例えば、グリコシル化、シアリル化、アセチル化、リン酸化なども含まれる。更に、本開示の目的のために、「ポリペプチド」は、タンパク質が所望の活性を維持する限り、天然配列に対する、欠失、付加及び置換（一般的に本質的に保存的）などの修飾を含むタンパク質を指す。これらの修飾は、部位特異的突然変異誘発などによる計画的なものであり得るか、またはタンパク質を生成する宿主の突然変異、もしくはＰＣＲ増幅によるエラーなどによる偶発的なものであり得る。
【0088】
本明細書で使用される場合、「プロモーター」は、特定の遺伝子の転写を促進するＤＮＡの領域を指すことを意味する。転写プロセスの一部として、ＲＮＡポリメラーゼとして知られるＲＮＡを合成する酵素は、遺伝子の近くのＤＮＡに結合する。プロモーターには、ＲＮＡポリメラーゼとＲＮＡポリメラーゼを動員する転写因子の初期結合部位を提供する、特定のＤＮＡ配列及び応答エレメントが含まれる。いくつかの実施形態によれば、プロモーターは、蝸牛における支持細胞発現に対して高度に特異的である。いくつかの実施形態によれば、プロモーターは内在性ＧＪＢ２プロモーターである。いくつかの実施形態によれば、プロモーターは合成プロモーターである。いくつかの実施形態によれば、プロモーターは、ＣＢＡプロモーター、ｓｍＣＢＡプロモーター、ＣＡＳＩプロモーター、ＧＦＡＰプロモーター、及び伸長因子－１アルファ（ＥＦ１ａ）プロモーターからなる群から選択される。「ニワトリベータ－アクチン（ＣＢＡ）プロモーター」とは、ニワトリベータ－アクチン遺伝子（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ Ｅｎｔｒｅｚ遺伝子ＩＤ３９６５２６で表されるＧａｌｌｕｓ ｇａｌｌｕｓベータアクチン）に由来するポリヌクレオチド配列を指す。「ｓｍＣＢＡ」プロモーターは、ハイブリッドＣＭＶ－ニワトリベータ－アクチンプロモーターの小型バージョンを指す。「ＣＡＳＩ」プロモーターは、ＣＭＶエンハンサーの一部、ニワトリベータ－アクチンプロモーターの一部、及びＵＢＣエンハンサーの一部を含むプロモーターを指す。
【0089】
本明細書で使用される「組換え体」という用語は、（１）その天然の環境から取り出された、（２）遺伝子が天然に見出されるポリヌクレオチドの全部もしくは一部と関連していない、（３）天然では連結していないポリヌクレオチドと作動可能に連結された、または（４）天然に存在しない、生体分子、例えば、遺伝子もしくはタンパク質を指すことができる。「組換え体」という用語は、クローン化ＤＮＡ単離体、化学的に合成されたポリヌクレオチド類似体、または異種系によって生物学的に合成されるポリヌクレオチド類似体、ならびにそのような核酸によってコードされるタンパク質及び／またはｍＲＮＡに関連して使用することができる。
【0090】
本明細書で使用される「組換えＨＳＶ」、「ｒＨＳＶ」及び「ｒＨＳＶベクター」という用語は、ウイルスゲノムに組み込まれた異種遺伝子を含む、単離された遺伝子改変型単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ）を広く指すことを意味する。「ｒＨＳＶ－ｒｅｐ２ｃａｐ２」または「ｒＨＳＶ－ｒｅｐ２ｃａｐ１」という用語は、ＡＡＶ血清型１または２のいずれかに由来するＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子がｒＨＳＶゲノムに組み込まれているｒＨＳＶを意味し、特定の実施形態では、目的の治療遺伝子をコードするＤＮＡ配列は、ウイルスゲノムに組み込まれている。
【0091】
本明細書で使用される場合、本開示の方法によって治療される「対象」または「患者」または「個体」は、ヒトまたは非ヒト動物のいずれかを指すことを意味する。いくつかの実施形態によれば、対象は子供である。いくつかの実施形態によれば、対象は乳児である。「非ヒト動物」には、任意の脊椎動物または無脊椎動物が含まれる。いくつかの実施形態では、対象は、ＧＪＢ２遺伝子などの遺伝子欠失に関連する難聴を患っている。
【0092】
本明細書で使用される「導入遺伝子」という用語は、細胞内に導入されて、ＲＮＡに転写され、任意選択で適切な条件下で翻訳及び／または発現されることができるポリヌクレオチドを指すことを意味する。諸態様では、それは、それが導入された細胞に所望の特性を付与するか、さもなければ所望の治療または診断結果をもたらす。特定の実施形態では、細胞へのＧＪＢ２導入遺伝子の導入は、機能的なギャップ結合の形成をもたらす。
【0093】
本明細書で使用される場合、「導入遺伝子発現カセット」または「発現カセット」は、核酸ベクターが標的細胞に送達する遺伝子配列を含む。これらの配列には、目的の遺伝子（例えば、ＧＪＢ２核酸またはそのバリアント）、１つ以上のプロモーター、及び最小限の調節エレメントが含まれる。
【0094】
本明細書で使用される、疾患または障害を「治療」または「治療する」という用語は、検出可能かまたは検出不可能かにかかわらず、疾患または障害の１つ以上の徴候または症状の軽減、疾患または障害の程度の低減、疾患または障害の状態の安定化（例えば、悪化しない）、疾患または障害の拡大の防止、疾患もしくは障害の進行の遅延または減速、疾患もしくは障害の状態の改善または緩和及び寛解（部分的または全体的）を指すことを意味する。例えば、ＧＪＢ２などの目的の遺伝子は、有効量（または投与量）で発現させた場合、異常な生理学的反応を予防、修正及び／または正常化するのに十分であり、例えば、疾患または障害の臨床的に重要な特徴を少なくとも約３０％、より好ましくは少なくとも５０％、最も好ましくは少なくとも９０％低減するのに十分な治療効果である。「治療」はまた、治療を受けていなかった場合に予想される生存期間と比較して、生存期間を延長することも指し得る。
【0095】
本明細書で使用される「ベクター」という用語は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏのいずれかで宿主細胞に送達される核酸を含む、組換えプラスミドまたはウイルスを指すことを意味する。
【0096】
本明細書で使用する「組換えウイルスベクター」という用語は、１つ以上の異種配列（すなわち、ウイルス起源でない核酸配列）を含む組換えポリヌクレオチドベクターを指すことを意味する。組換えＡＡＶベクターの場合、組換え核酸は、少なくとも１つの逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）に隣接する。いくつかの実施形態では、組換え核酸は、２つのＩＴＲに隣接する。
【0097】
本明細書で使用される「組換えＡＡＶベクター（ｒＡＡＶベクター）」という用語は、少なくとも１つのＡＡＶ反転末端反復配列（ＩＴＲ）に隣接する１つ以上の異種配列（すなわち、ＡＡＶ起源ではない核酸配列）を含むポリヌクレオチドベクターを指すことを意味する。そのようなＡＡＶベクターは、適切なヘルパーウイルスに感染し（または、適切なヘルパー機能を発現している）、ＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子産物（すなわち、ＡＡＶ Ｒｅｐ及びＣａｐタンパク質）を発現している宿主細胞内に存在する場合、感染性ウイルス粒子に複製及びパッケージ化され得る。ｒＡＡＶベクターがより大きなポリヌクレオチド（例えば、染色体中、またはクローニングもしくはトランスフェクションに使用されるプラスミドなどの別のベクター中）に組み込まれる場合、ｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶパッケージング機能と適切なヘルパー機能の存在下での複製及びカプシド形成によって「レスキュー」され得る「プロベクター（pro-vector）」と称され得る。ｒＡＡＶベクターは、脂質と複合体を形成し、リポソーム内に封入化され、ウイルス粒子、例えばＡＡＶ粒子内に封入化されたプラスミド、線状人工染色体を含むがこれらに限定されない、多数の形態のいずれかであり得る。ｒＡＡＶベクターをＡＡＶウイルスカプシドにパッケージ化し、「組換えアデノ随伴ウイルス粒子（ｒＡＡＶ粒子）」を生成することができる。特定の実施形態では、ＡＡＶウイルスカプシドは、本明細書に記載のバリアントＡＡＶカプシドである。
【0098】
本明細書で使用される「ｒＡＡＶウイルス」または「ｒＡＡＶウイルス粒子」または「ｒＡＡＶビリオン」という用語は、少なくとも１つのＡＡＶカプシドタンパク質及びカプシド化ｒＡＡＶベクターゲノムからなるウイルス粒子を指すことを意味する。特定の実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質は、例えば、非バリアントＡＡＶカプシドタンパク質と比較して、内耳組織または細胞において増加した向性を示すバリアントＡＡＶカプシドタンパク質などのバリアントＡＡＶカプシドタンパク質である。本明細書に記載の方法に従って使用することができる例示的なバリアントＡＡＶカプシドタンパク質のアミノ酸配列及びヌクレオチド配列を表１に提供する。
【0099】
カプシドポリペプチドなどのポリペプチドに関する「バリアント」という用語は、非バリアントポリペプチド配列とも称される、親ポリペプチド配列とは少なくとも１つのアミノ酸が異なるポリペプチド配列を指す。いくつかの実施形態では、ポリペプチドはカプシドポリペプチドであり、バリアントは少なくとも１つのアミノ酸置換によって異なる。アミノ酸にはまたは、天然及び非天然のアミノ酸ならびにその誘導体も含まれる。アミノ酸にはまた、Ｄ型及びＬ型の両方が含まれる。
【0100】
「向性」と「形質導入」という用語は相互に関連しているが、違いはある。本明細書で使用される「向性」という用語は、ＡＡＶベクターまたはビリオンが１つ以上の特定の細胞型に感染する能力を指すが、１つ以上の特定の細胞型において細胞を形質導入するためにベクターがどのように機能するかを包含することもできる。すなわち、向性とは、ＡＡＶベクターまたはビリオンの特定の細胞または組織型（複数可）への優先的な侵入、及び／または特定の細胞または組織型への侵入を促進する細胞表面との優先的な相互作用、任意選択で及び好ましくは、その後の細胞内でＡＡＶベクターまたはビリオンによって運ばれる配列の発現（例えば、転写及び任意選択で翻訳）、例えば、組換えウイルスの場合は、異種ヌクレオチド配列（複数可）の発現を指す。本明細書で使用される「形質導入」という用語は、ＡＡＶベクターまたはビリオンが１つ以上の特定の細胞型に感染する能力を指す。すなわち、形質導入は、ＡＡＶベクターまたはビリオンの細胞への侵入、及びベクターゲノムからの発現を得るようにＡＡＶベクターまたはビリオン内に含まれる遺伝物質の細胞への移動を指す。場合によっては、すべての場合ではないが、形質導入と向性は相関し得る。特定の実施形態では、本明細書に記載のバリアントＡＡＶカプシドポリペプチドは、例えば、非バリアントＡＡＶカプシドポリペプチドと比較して、内耳組織または細胞において増加した向性を示す。特定の実施形態では、本明細書に記載のバリアントＡＡＶカプシドポリペプチドは、例えば、非バリアントＡＡＶカプシドポリペプチドと比較して、内耳組織または細胞において増加した形質導入を示す。特定の実施形態では、本明細書に記載のバリアントＡＡＶカプシドポリペプチドは、例えば、非バリアントＡＡＶカプシドポリペプチドと比較して、内耳組織または細胞において増加した向性及び／または形質導入を示す。特定の実施形態では、例えば、非バリアントＡＡＶカプシドポリペプチドと比較して、内耳組織または細胞において増加した向性及び／または形質導入を示すバリアントＡＡＶカプシドポリペプチドを、表１に提供する。
【0101】
核酸
本開示は、難聴、例えば、遺伝子欠失に関連する難聴の治療に使用できるプロモーター、発現カセット、ベクター、キット及び方法を提供する。いくつかの実施形態では、難聴は遺伝性難聴である。本開示の特定の態様は、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクター及び／またはビリオンを投与することを含む、対象の内耳組織及び細胞に異種核酸を送達することに関する。いくつかの態様によれば、本開示は、本明細書に記載のｒＡＡＶベクター及び／またはｒＡＡＶビリオンを含む組成物を対象に送達することを含む、難聴、例えば、遺伝子欠失に関連する難聴を治療または予防する方法を提供し、ここで、ｒＡＡＶベクター及び／またはｒＡＡＶビリオンは異種核酸（例えば、ＧＪＢ２をコードする核酸）を含む。
本開示は、難聴、例えば、遺伝子欠失に関連する難聴の治療に使用できるプロモーター、発現カセット、ベクター、キット及び方法を提供する。いくつかの実施形態では、難聴は遺伝性難聴である。本開示の特定の態様は、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクター及び／またはビリオンを投与することを含む、対象の内耳組織及び細胞に異種核酸を送達することに関する。いくつかの態様によれば、本開示は、本明細書に記載のｒＡＡＶベクター及び／またはｒＡＡＶビリオンを含む組成物を対象に送達することを含む、難聴、例えば、遺伝子欠失に関連する難聴を治療または予防する方法を提供し、ここで、ｒＡＡＶベクター及び／またはｒＡＡＶビリオンは異種核酸（例えば、ＧＪＢ２をコードする核酸）を含む。
【0102】
特定の実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、難聴に関連する遺伝子をコードする異種核酸を含む。難聴（例えば、遺伝子欠失に関連する難聴）に関連する遺伝子の例には、ＡＣＴＧ１、ＡＤＣＹ１、ＡＤＧＲＶ１、ＡＩＦＭ１、ＢＤＰ１、ＢＳＮＤ、ＢＴＤ、ＣＡＢＰ２、ＣＣＤＣ５０、ＣＤ１６４、ＣＤＣ１４Ａ、ＣＤＨ２３、ＣＥＡＣＡＭ１６、ＣＩＢ２、ＣＬＤＮ１４、ＣＬＩＣ５、ＣＬＲＮ１、ＣＯＣＨ、ＣＯＬ１１Ａ１、ＣＯＬ１１Ａ２、ＣＯＬ２Ａ１、ＣＯＬ４Ａ３、ＣＯＬ４Ａ４、ＣＯＬ４Ａ５、ＣＯＬ４Ａ６、ＣＯＬ９Ａ１、ＣＯＬ９Ａ２、ＣＯＬ９Ａ３、ＤＣＤＣ２、ＤＩＡＰＨ１、ＤＭＸＬ２、ＤＳＰＰ、ＥＤＮ３、ＥＤＮＲＢ、ＥＬＭＯＤ３、ＥＰＳ８、ＥＰＳ８Ｌ２、ＥＳＰＮ、ＥＳＲＲＢ、ＥＹＡ１、ＥＹＡ４、ＦＡＭ１８９Ａ２、ＧＩＰＣ３、ＧＪＢ２、ＧＪＢ３、ＧＪＢ６、ＧＰＳＭ２、ＧＲＨＬ２、ＧＲＸＣＲ１、ＧＲＸＣＲ２、ＧＳＤＭＥ、ＨＡＲＳ１、ＨＧＦ、ＨＯＭＥＲ２、ＩＬＤＲ１、ＫＡＲＳ１、ＫＣＮＥ１、ＫＣＮＱ１、ＫＣＮＱ４、ＬＨＦＰＬ５、ＬＯＸＨＤ１、ＬＲＴＯＭＴ、ＭＡＲＶＥＬＤ２、ＭＣＭ２、ＭＥＴ、ＭＩＲ９６、ＭＩＴＦ、ＭＳＲＢ３、ＭＴ－ＣＯ１、ＭＴ－ＲＮＲ１、ＭＴ－ＴＳ１、ＭＹＨ１４、ＭＹＨ９、ＭＹＯ１５Ａ、ＭＹＯ１Ａ、ＭＹＯ３Ａ、ＭＹＯ６、ＭＹＯ７Ａ、ＭＹＯ７Ａ、ＮＡＲＳ２、ＮＦ２、ＯＳＢＰＬ２、ＯＴＯＡ、ＯＴＯＦ、ＯＴＯＧ、ＯＴＯＧＬ、Ｐ２ＲＸ２、ＰＡＸ３、ＰＣＤＨ１５、ＰＥＸ７、ＰＨＹＨ、ＰＪＶＫ、ＰＮＰＴ１、ＰＯＵ３Ｆ４、ＰＯＵ４Ｆ３、ＰＲＰＳ１、ＰＴＰＲＱ、ＲＤＸ、ＲＩＰＯＲ２、ＲＯＲ１、Ｓ１ＰＲ２、ＳＥＲＰＩＮＢ６、ＳＩＸ１、ＳＩＸ５、ＳＬＣ１７Ａ８、ＳＬＣ２２Ａ４、ＳＬＣ２６Ａ４、ＳＬＣ２６Ａ５、ＳＭＰＸ、ＳＯＸ１０、ＳＴＲＣ、ＳＹＮＥ４、ＴＢＣ１Ｄ２４、ＴＥＣＴＡ、ＴＩＭＭ８Ａ、ＴＪＰ２、ＴＭＣ１、ＴＭＥＭ１３２Ｅ、ＴＭＩＥ、ＴＭＰＲＳＳ３、ＴＰＲＮ、ＴＲＩＯＢＰ、ＴＳＰＥＡＲ、ＵＳＨ１Ｃ、ＵＳＨ１Ｇ、ＵＳＨ２Ａ、ＷＢＰ２、ＷＦＳ１及びＷＨＲＮが含まれるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、ｒＡＡＶベクター及び／またはｒＡＡＶビリオンは、ＧＪＢ２をコードする異種核酸を含む。
【0103】
遺伝性難聴（hereditary hearing impairment、ＨＩ）を持つ対象の間で最も一般的に変異している遺伝子であるＧＪＢ２は、支持細胞間の細胞間コミュニケーションと蝸牛液、内リンパ及び外リンパの恒常性の両方の根底にあるコネキシン－２６（Ｃｘ２６）ギャップ結合チャネルタンパク質をコードする。ＧＪＢ２は、１３ｑ１２のＤＦＮＢ１遺伝子座にある。ＧＪＢ２は５５１３ｂｐの長さであり、３１７９ｂｐのイントロンで区切られた２つのエクソン（それぞれ１９３ｂｐと２１４１ｂｐの長さ）を含む（Ｋｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９７）。転写は単一の開始部位から開始され、基準とみなされる２３３４ヌクレオチドのｍＲＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ ＮＭ＿００４００４．５）の合成をもたらす。
【0104】
いくつかの実施形態によれば、目的の遺伝子（例えば、ＧＪＢ２）は、野生型遺伝子（例えば、野生型ＧＪＢ２）よりも発現（及び／または機能）において優れているように最適化され、更に野生型（例えば、野生型ＧＪＢ２）から（ＤＮＡ／ＲＮＡにおいて）識別する能力を有する。
【0105】
図２は、一本鎖（ｓｓ）ＡＡＶ－ＧＪＢ２及び自己相補的ｓｃＡＡＶ－ＧＪＢ２の例示的なＧＪＢ２ベクター（ゲノム）構築物の概略図を示す。
【0106】
ヒト野生型ＧＪＢ２は、正常な聴覚に必要な主要なギャップ結合タンパク質をコードする重要な要素である。ＧＪＢ２の損失は、聴覚の発症に続く内耳の様々な細胞型の大量の細胞死を引き起こす。「ＧＪＢ２核酸」とは、ＧＪＢ２遺伝子もしくはその一部、またはＧＪＢ２遺伝子もしくはその一部の機能的バリアントを含む核酸を指す。遺伝子の機能的バリアントには、例えば、サイレント変異、一塩基多型、ミスセンス変異、及び遺伝子機能を有意に変化させない他の変異または欠失などの軽微な変異を伴う遺伝子のバリアントが含まれる。
【0107】
いくつかの実施形態によれば、本開示は、哺乳動物ＧＪＢ２タンパク質をコードする核酸を提供する。いくつかの実施形態によれば、本開示は、野生型ＧＪＢ２タンパク質をコードする核酸を提供する。いくつかの実施形態によれば、本開示は、野生型ヒト、マウス、非ヒト霊長類、またはラットＧＪＢ２タンパク質をコードする核酸を提供する。いくつかの実施形態によれば、本開示は、ヒト野生型ＧＪＢ２タンパク質をコードする核酸を提供する。いくつかの実施形態によれば、ヒト野生型ＧＪＢ２タンパク質をコードする核酸配列は、長さが６７８ｂｐである。一実施形態によれば、ヒト野生型ＧＪＢ２タンパク質をコードする核酸は、配列番号１０を含む。一実施形態によれば、核酸は、配列番号１０と少なくとも８５％同一である。一実施形態によれば、核酸は、配列番号１０と少なくとも９０％同一である。一実施形態によれば、核酸は、配列番号１０と少なくとも９５％同一である。一実施形態によれば、核酸は、配列番号１０と少なくとも９９％同一である。一実施形態によれば、核酸は配列番号１０からなる。
【0108】
図１０は、ヒト野生型ＧＪＢ２（ｈＧＪＢ２ｗｔ）の核酸配列（配列番号１０）を示す。
【0109】
いくつかの実施形態によれば、本開示は、ＧＪＢ２タンパク質をコードする核酸を提供し、ここで、核酸配列は、哺乳動物発現のために最適化されたコドンである。特定の実施形態によれば、本開示は、ＧＪＢ２タンパク質をコードする核酸を提供し、ここで、核酸配列は、ヒト、ラット、非ヒト霊長類、モルモット、ミニブタ、ブタ、ネコ、ヒツジまたはマウス細胞における発現のために最適化されたコドンである。ヒトコドン最適化ＧＪＢ２は、正常な聴覚に必要な主要なギャップ結合タンパク質をコードする重要な要素である。ＧＪＢ２のタンパク質発現を増強するためにコドン最適化が行われる。
【0110】
いくつかの実施形態によれば、本開示は、ＧＪＢ２タンパク質をコードする核酸配列を提供し、ここで、ＧＪＢ２タンパク質をコードする核酸配列は、天然に存在しない配列である。
【0111】
いくつかの実施形態によれば、本開示は、ヒトコドン最適化ＧＪＢ２タンパク質をコードする核酸を提供する。
【0112】
いくつかの実施形態によれば、ヒトコドン最適化ＧＪＢ２タンパク質をコードする核酸配列は、長さが６７８ｂｐである。一実施形態によれば、ヒトコドン最適化ＧＪＢ２タンパク質をコードする核酸は、配列番号１１を含む。一実施形態によれば、核酸は、配列番号１１と少なくとも８５％同一である。一実施形態によれば、核酸は、配列番号１１と少なくとも９０％同一である。一実施形態によれば、核酸は、配列番号１１と少なくとも９５％同一である。一実施形態によれば、核酸は、配列番号１１と少なくとも９９％同一である。一実施形態によれば、核酸は配列番号１１からなる。
【0113】
図１１は、ヒトコドン最適化ＧＪＢ２（ｈＧＪＢ２ｃｏ３）の核酸配列（配列番号１１）を示す。
【0114】
いくつかの実施形態によれば、ヒトコドン最適化ＧＪＢ２タンパク質をコードする核酸配列は、長さが６７８ｂｐである。一実施形態によれば、ヒトコドン最適化ＧＪＢ２タンパク質をコードする核酸は、配列番号１２を含む。一実施形態によれば、核酸は、配列番号１２と少なくとも８５％同一である。一実施形態によれば、核酸は、配列番号１２と少なくとも９０％同一である。一実施形態によれば、核酸は、配列番号１２と少なくとも９５％同一である。一実施形態によれば、核酸は、配列番号１２と少なくとも９９％同一である。一実施形態によれば、核酸は配列番号１２からなる。
【0115】
図１２は、ヒトコドン最適化ＧＪＢ２（ｈＧＪＢ２ｃｏ６）の核酸配列（配列番号１２）を示す。
【0116】
いくつかの実施形態によれば、ヒトコドン最適化ＧＪＢ２タンパク質をコードする核酸配列は、長さが６７８ｂｐである。一実施形態によれば、ヒトコドン最適化ＧＪＢ２タンパク質をコードする核酸は、配列番号１３を含む。一実施形態によれば、核酸は、配列番号１３と少なくとも８５％同一である。一実施形態によれば、核酸は、配列番号１３と少なくとも９０％同一である。一実施形態によれば、核酸は、配列番号１３と少なくとも９５％同一である。一実施形態によれば、核酸は、配列番号１３と少なくとも９９％同一である。一実施形態によれば、核酸は配列番号１３からなる。
【0117】
図１３は、ヒトコドン最適化ＧＪＢ２（ｈＧＪＢ２ｃｏ９）の核酸配列（配列番号１３）を示す。
【0118】
特定の実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、バリアントＡＡＶカプシドポリペプチドをコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態によれば、ｒＡＡＶベクターは、例えば、非バリアントＡＡＶカプシドポリペプチドと比較して、内耳組織または細胞において増加した向性を示すバリアントＡＡＶカプシドポリペプチドをコードする核酸配列を含む。
【0119】
いくつかの実施形態によれば、ｒＡＡＶベクターは、バリアントＡＡＶ１カプシドポリペプチド、バリアントＡＡＶ２カプシドポリペプチド、バリアントＡＡＶ３カプシドポリペプチド、バリアントＡＡＶ４カプシドポリペプチド、バリアントＡＡＶ５カプシドポリペプチド、バリアントＡＡＶ６カプシドポリペプチド、バリアントＡＡＶ７カプシドポリペプチド、バリアントＡＡＶ８カプシドポリペプチド、バリアントＡＡＶ９カプシドポリペプチド、バリアントｒｈ－ＡＡＶ１０カプシドポリペプチド、バリアントＡＡＶ１０カプシドポリペプチド、バリアントＡＡＶ１１カプシドポリペプチド及びバリアントＡＡＶ１２カプシドポリペプチドから選択されるバリアントＡＡＶカプシドポリペプチドをコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態によれば、ｒＡＡＶベクターは、バリアントＡＡＶ２カプシドポリペプチドをコードする核酸配列を含む。
【0120】
いくつかの実施形態によれば、ｒＡＡＶベクターは、表１に列挙されるバリアントＡＡＶカプシドポリペプチドをコードする核酸配列、またはそれに対して少なくとも約８５％、９０％、９５％もしくは９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
【0121】
いくつかの実施形態によれば、ｒＡＡＶベクターは、表１に列挙されるアミノ酸配列を含むバリアントＡＡＶカプシドポリペプチドをコードする核酸配列、またはそれに対して少なくとも約８５％、９０％、９５％もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0122】
いくつかの実施形態によれば、ｒＡＡＶベクターは、ＶＰ１、ＶＰ２またはＶＰ３カプシドポリペプチドからなる群から選択されるＡＡＶカプシドをコードする核酸配列を含む。
【0123】
いくつかの実施形態によれば、ｒＡＡＶベクターは、野生型ＡＡＶ２カプシドポリペプチド（配列番号１８）に対して１つ以上のアミノ酸置換、挿入及び／または欠失を有するアミノ酸配列を含む、バリアントＡＡＶカプシドポリペプチドをコードする核酸配列を含み、任意選択で、１つ以上のアミノ酸置換、挿入及び／または欠失は、Ｑ２６３、Ｓ２６４、Ｙ２７２、Ｙ４４４、Ｒ４８７、Ｐ４５１、Ｔ４５４、Ｔ４５５、Ｒ４５９、Ｋ４９０、Ｔ４９１、Ｓ４９２、Ａ４９３、Ｄ４９４、Ｅ４９９、Ｙ５００、Ｔ５０３、Ｋ５２７、Ｅ５３０、Ｅ５３１、Ｑ５４５、Ｇ５４６、Ｓ５４７、Ｅ５４８、Ｋ５４９、Ｔ５５０、Ｎ５５１、Ｖ５５２、Ｄ５５３、Ｅ５５５、Ｋ５５６、Ｒ５８５、Ｒ５８８及びＹ７３０からなる群から選択されるアミノ酸残基において生じる。
【0124】
いくつかの実施形態によれば、ｒＡＡＶベクターは、Ｑ２６３Ｎ、Ｑ２６３Ａ、Ｓ２６４Ａ、Ｙ２７２Ｆ、Ｙ４４４Ｆ、Ｒ４８７Ｇ、Ｐ４５１Ａ、Ｔ４５４Ｎ、Ｔ４５５Ｖ、Ｒ４５９Ｔ、Ｋ４９０Ｔ、Ｔ４９１Ｑ、Ｓ４９２Ｄ、Ａ４９３Ｇ、Ｄ４９４Ｅ、Ｅ４９９Ｄ、Ｙ５００Ｆ、Ｔ５０３Ｐ、Ｋ５２７Ｒ、Ｅ５３０Ｄ、Ｅ５３１Ｄ、Ｑ５４５Ｅ、Ｇ５４６Ｄ、Ｇ５４６Ｓ、Ｓ５４７Ａ、Ｅ５４８Ｔ、Ｅ５４８Ａ、Ｋ５４９Ｅ、Ｋ５４９Ｇ、Ｔ５５０Ｎ、Ｔ５５０Ａ、Ｎ５５１Ｄ、Ｖ５５２Ｉ、Ｄ５５３Ａ、Ｅ５５５Ｄ、Ｋ５５６Ｒ、Ｋ５５６Ｓ、Ｒ５８５Ｓ、Ｒ５８８Ｔ及びＹ７３０Ｆからなる群から選択される野生型ＡＡＶ２カプシドポリペプチド（配列番号１８）に対して１つ以上のアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む、バリアントＡＡＶカプシドポリペプチドをコードする核酸配列を含む。
【0125】
いくつかの実施形態によれば、ｒＡＡＶベクターは、（ｉ）配列番号２７、２９、３１、３３または３５のうちのいずれか１つのアミノ酸配列；（ｉｉ）配列番号２７、２９、３１、３３または３５のうちのいずれか１つに対して少なくとも約８５％、９０％、９５％または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列；または（ｉｉｉ）配列番号２６、２８、３０、３２または３４のうちのいずれか１つの核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を含む、バリアントＡＡＶカプシドポリペプチドをコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態によれば、ｒＡＡＶベクターは、配列番号２７のアミノ酸配列を含むバリアントＡＡＶカプシドポリペプチドをコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態によれば、ｒＡＡＶベクターは、配列番号２９のアミノ酸配列を含むバリアントＡＡＶカプシドポリペプチドをコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態によれば、ｒＡＡＶベクターは、配列番号３１のアミノ酸配列を含むバリアントＡＡＶカプシドポリペプチドをコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態によれば、ｒＡＡＶベクターは、配列番号３３のアミノ酸配列を含むバリアントＡＡＶカプシドポリペプチドをコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態によれば、ｒＡＡＶベクターは、配列番号３５のアミノ酸配列を含むバリアントＡＡＶカプシドポリペプチドをコードする核酸配列を含む。
【0126】
プロモーター
様々なプロモーターは、本開示における使用のために想到される。
様々なプロモーターは、本開示における使用のために想到される。
【0127】
いくつかの実施形態によれば、プロモーターは内因性ＧＪＢ２プロモーターである。ＧＪＢ２プロモーターは支持細胞特異的プロモーターであり、ＧＪＢ２遺伝子を発現する内耳の細胞に形質導入できる。このプロモーターは、その短い長さを考えるとｓｃＡＡＶの産生に使用できる。いくつかの実施形態によれば、プロモーターは配列番号６を含む。いくつかの実施形態によれば、プロモーターは配列番号６からなる。図８は、ＧＪＢ２プロモーターの核酸配列（配列番号６）を示す。
【0128】
いくつかの実施形態によれば、プロモーターはＣＢＡプロモーターである。ＣＢＡプロモーターは、内耳の複数の細胞型に形質導入できる強力なユビキタスプロモーターである。いくつかの実施形態によれば、プロモーターは配列番号１を含む。いくつかの実施形態によれば、プロモーターは配列番号１からなる。図３は、ＣＢＡプロモーターの核酸配列（配列番号１）を示す。
【0129】
いくつかの実施形態によれば、プロモーターはＥＦ１ａプロモーターである。ＥＦ１ａプロモーターは、内耳の複数の細胞型に形質導入することができる、哺乳動物由来の強力なユビキタスプロモーターであり、その短い長さを考えるとｓｃＡＡＶの産生に使用できる。いくつかの実施形態によれば、プロモーターは配列番号２を含む。いくつかの実施形態によれば、プロモーターは配列番号２からなる。図４は、ＥＦ１ａプロモーターの核酸配列（配列番号２）を示す。
【0130】
いくつかの実施形態によれば、プロモーターはＣＡＳＩプロモーターである。ＣＡＳＩプロモーターは、内耳の複数の細胞型に形質導入することができる、強力なユビキタスプロモーターであり、その短い長さを考えるとｓｃＡＡＶの産生に使用できる。いくつかの実施形態によれば、プロモーターは配列番号３を含む。いくつかの実施形態によれば、プロモーターは配列番号３からなる。図５は、ＣＡＳＩプロモーターの核酸配列（配列番号３）を示す。
【0131】
いくつかの実施形態によれば、プロモーターはｓｍＣＢＡプロモーターである。ｓｍＣＢＡプロモーターは、内耳の複数の細胞型に形質導入することができる、強力なユビキタスプロモーターであり、その短い長さを考えるとｓｃＡＡＶの産生に使用できる。いくつかの実施形態によれば、プロモーターは配列番号４を含む。いくつかの実施形態によれば、プロモーターは配列番号４からなる。図６は、ｓｍＣＢＡプロモーターの核酸配列（配列番号４）を示す。
【0132】
いくつかの実施形態によれば、プロモーターはＧＦＡＰプロモーターである。ＧＦＡＰプロモーターは細胞特異的であり、内耳の支持細胞で活性を有する。いくつかの実施形態によれば、プロモーターは配列番号５を含む。いくつかの実施形態によれば、プロモーターは配列番号５からなる。図７は、ＧＦＡＰプロモーターの核酸配列（配列番号５）を示す。
【0133】
いくつかの実施形態によれば、プロモーターは合成プロモーターである。特定の実施形態では、合成プロモーターは、天然には存在せず、標的遺伝子、例えば、ＧＪＢ２の遺伝子発現を制御するように設計されたＤＮＡの配列である。
【0134】
逆方向末端反復
逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列は、２番目のＤＮＡ鎖の合成を可能にするヘアピン構造を形成する能力があるため、ＡＡＶゲノムの効率的な増殖に必要である。ｓｃＡＡＶ短縮型ＩＴＲ（ＴＲＳ）は分子内二本鎖ＤＮＡテンプレートを形成し、したがって、二本鎖合成の律速段階を取り除く。
逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列は、２番目のＤＮＡ鎖の合成を可能にするヘアピン構造を形成する能力があるため、ＡＡＶゲノムの効率的な増殖に必要である。ｓｃＡＡＶ短縮型ＩＴＲ（ＴＲＳ）は分子内二本鎖ＤＮＡテンプレートを形成し、したがって、二本鎖合成の律速段階を取り除く。
【0135】
図９は、以下のＩＴＲ（ＡＡＶ２）５’－３’：一本鎖（ｓｓ）及び自己相補的（ｓｃ）ＡＡＶゲノム（配列番号７）；３’－５’：一本鎖（ｓｓ）ＡＡＶゲノムのみ（配列番号８）；３’－５’：自己相補的（ｓｃ）ＡＡＶゲノムのみ（配列番号９）の核酸配列を示す。
【0136】
難聴の遺伝子治療
本開示は、一般に、遺伝子構築物（例えば、ＧＪＢ２遺伝子構築物）を含む組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ウイルス粒子を産生する方法、及び難聴、例えば、遺伝子欠失に関連する難聴のための遺伝子治療の方法におけるそれらの使用を提供する。本明細書に記載のＡＡＶベクター及びＡＡＶビリオンは、核酸（例えば、ＧＪＢ２遺伝子構築物）を内耳組織及び細胞に送達するのに特に効率的である。ＧＪＢ２などの遺伝子を発現及びその後の分泌のために細胞内に効率的に送達することができる組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）治療用ベクターを作成、評価及び利用する方法を、本明細書に記載する。難聴、例えば、遺伝子欠失に関連する難聴のための組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）に基づく遺伝子治療で使用するための、最適に改変された目的の遺伝子（ＧＯＩ）ｃＤＮＡ及び関連する遺伝因子を、本明細書に記載する。より具体的には、ＤＦＮＢ１及びＤＦＮＡ３Ａ関連の先天性難聴の治療及び／または予防を含む、遺伝的難聴のための組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）に基づく遺伝子治療で使用するための、最適に改変されたＧＪＢ２／コネキシン２６（Ｃｘ２６）ｃＤＮＡ及び関連する遺伝因子を、本明細書に記載する。
本開示は、一般に、遺伝子構築物（例えば、ＧＪＢ２遺伝子構築物）を含む組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ウイルス粒子を産生する方法、及び難聴、例えば、遺伝子欠失に関連する難聴のための遺伝子治療の方法におけるそれらの使用を提供する。本明細書に記載のＡＡＶベクター及びＡＡＶビリオンは、核酸（例えば、ＧＪＢ２遺伝子構築物）を内耳組織及び細胞に送達するのに特に効率的である。ＧＪＢ２などの遺伝子を発現及びその後の分泌のために細胞内に効率的に送達することができる組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）治療用ベクターを作成、評価及び利用する方法を、本明細書に記載する。難聴、例えば、遺伝子欠失に関連する難聴のための組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）に基づく遺伝子治療で使用するための、最適に改変された目的の遺伝子（ＧＯＩ）ｃＤＮＡ及び関連する遺伝因子を、本明細書に記載する。より具体的には、ＤＦＮＢ１及びＤＦＮＡ３Ａ関連の先天性難聴の治療及び／または予防を含む、遺伝的難聴のための組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）に基づく遺伝子治療で使用するための、最適に改変されたＧＪＢ２／コネキシン２６（Ｃｘ２６）ｃＤＮＡ及び関連する遺伝因子を、本明細書に記載する。
【0137】
組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターは、標的遺伝子、例えば、ＧＪＢ２標的遺伝子、及び関連する遺伝因子の両方を効率的に収容することができる。更に、そのようなベクターは、蝸牛の支持細胞などの治療的に関連する内耳組織及び細胞において遺伝子、例えば、ＧＪＢ２を特異的に発現するように設計することができる。本開示は、目的の機能的遺伝子、例えば、ＧＪＢ２遺伝子を患者に効率的に送達することができるｒＡＡＶ治療用ベクター及びｒＡＡＶビリオンを作成、評価ならびに利用する方法を記載する。
【0138】
いくつかの実施形態では、ＧＪＢ２遺伝子構築物は、（１）２７ヌクレオチドヘマグルチニン（ＨＡ）Ｃ末端タグを含むかまたは含まないコドン／配列最適化０．６８ｋｂヒトＧＪＢ２ ｃＤＮＡ、（２）高ＧＪＢ２発現を駆動するために最適化された以下のプロモーター要素のうちの１つ：（ａ）遍在的に活性な１．７ｋｂ ＣＢＡ、０．９６ｋｂ小型ＣＢＡ（ｓｍＣＢＡ）、０．８１ｋｂ ＥＦ１ａまたは１．０６ｋｂ ＣＡＳＩプロモーター；（ｂ）蝸牛支持細胞、またはＧＪＢ２発現特異的１．６８ｋｂ ＧＦＡＰ、０．１３／０．５４／１．０ｋｂ小型／中型／大型ＧＪＢ２プロモーター、または２～３個の個々のＧＪＢ２発現特異的プロモーターの連続した組み合わせ、または合成プロモーター、（３）後にＳＶ４０またはヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）ポリアデニル化シグナルのいずれかが続くウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）を含む０．９ｋｂの３’－ＵＴＲ調節領域、（４）ＡＡＶゲノムカセット、または約１１３塩基のｓｃＡＡＶ有効化ＩＴＲ（ＩＴＲΔｔｒｓ）によって区切られかつ約１４３塩基の配列調節ＩＴＲと両端で隣接している２つの逆方向同一反復からなる自己相補的ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）ゲノムカセットと隣接する２つの約１４３塩基配列変調逆方向末端反復（ＩＴＲ）のいずれか、及び（５）蝸牛への送達に最適化されたタンパク質カプシドバリアントを含む。いくつかの実施形態では、ＧＪＢ２をコードする核酸配列は、ＦＬＡＧタグまたはＨＡタグなどの作動可能に連結されたＣ末端タグまたはＮ末端タグを含み得る。
【0139】
ＨＡタグはヒトインフルエンザヘマグルチニンであり、発現ベクターの一般的なエピトープタグとして使用される表面糖タンパク質であり、目的のタンパク質の検出を容易にする。ＦＬＡＧタグ（ペプチド配列ＤＹＫＤＤＤＤＫ）は、発現ベクターで一般的なエピトープタグとして一般的に使用される短い親水性タンパク質タグであり、目的のタンパク質の検出を容易にする。ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）は、そのｍＲＮＡを安定させる三次構造を生成することにより、目的のタンパク質の発現を増強するＤＮＡ配列である。特定の実施形態によれば、他の調節配列を使用することができる。特定の実施形態では、本開示に従って使用され得る調節配列は、転写されると、ＧＪＢ２などの標的遺伝子の発現を増強する三次構造を作成するＤＮＡ配列を含む。ポリ（Ａ）配列は、ＲＮＡプロセッシングと転写産物の安定性を促進する重要な要素である。ＳＶ４０及びｂＧＨポリＡ配列は、転写単位の終わりを知らせる転写終結配列である。特定の実施形態によれば、他のポリＡ転写終結配列を使用することができる。
【0140】
いくつかの実施形態によれば、本明細書に記載のＡＡＶベクター及びＡＡＶビリオンは、蝸牛支持細胞を含む内耳組織または細胞にＧＪＢ２などの遺伝子を送達及び発現するのに特に適している。いくつかの実施形態によれば、本明細書に記載のＡＡＶベクター及びＡＡＶビリオンは、外部支持細胞及び／またはコルチ支持細胞の器官のうちの１つ以上において、ＧＪＢ２などの遺伝子を送達及び発現するのに特に適している。いくつかの実施形態によれば、本明細書に記載のＡＡＶベクター及びＡＡＶビリオンは、ＧＪＢ２などの遺伝子を、外有毛細胞、内有毛細胞、ヘンゼン細胞、ダイテルス細胞、柱細胞、内指節細胞及び／または外指節細胞／境界細胞のうちの１つ以上において送達及び発現するのに特に適している。
【0141】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、非病原性の一本鎖ＤＮＡパルボウイルスである。ＡＡＶは、約２０ｎｍのカプシド直径を有する。一本鎖ＤＮＡゲノムの両端には逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）が含まれ、これは、ゲノムの複製とパッケージングに必要な唯一のシス作用エレメントである。ＡＡＶゲノムには、ｒｅｐとｃａｐという２つのウイルス遺伝子がある。このウイルスは、複製に必要な４つのタンパク質（Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２及びＲｅｐ４０）を生成するために、２つのプロモーターと選択的スプライシングを利用する。３番目のプロモーターは、選択的スプライシングと選択的翻訳開始コドンの組み合わせを介して、３つの構造ウイルスカプシドタンパク質１、２及び３（ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３）の転写産物を生成する。Ｂｅｒｎｓ＆Ｌｉｎｄｅｎ Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ１９９５；１７：２３７－４５。３つのカプシドタンパク質は同じＣ末端の５３３アミノ酸を共有するが、ＶＰ２とＶＰ１は、それぞれ、６５と２０２アミノ酸の追加のＮ末端配列を含む。ＡＡＶビリオンには、ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３の合計６０コピーが１：１：２０の比率で含まれ、Ｔ－１正二十面体対称に配置されている。Ｒｏｓｅ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ．１９７１；８：７６６－７０。ＡＡＶは、その溶解ライフサイクルを完了させるために、ヘルパーウイルスとしてアデノウイルス（Ａｄ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）または他のウイルスを必要とする。Ａｔｃｈｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９６５；１４９：７５４－６；Ｈｏｇｇａｎ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，１９６６；５５：１４６７－７４。ヘルパーウイルスの不存在下で、野生型ＡＡＶは、ＩＴＲと染色体の相互作用を通じてＲｅｐタンパク質の補助によって統合することにより、潜在を確立する。Ｂｅｒｎｓ＆Ｌｉｎｄｅｎ（１９９５）。特定の実施形態では、本明細書に記載のＡＡＶは、例えば、非バリアントＡＡＶカプシドポリペプチドと比較して、内耳組織または細胞において増加した向性及び／または形質導入を示すバリアントＡＡＶカプシドポリペプチドを含む。例示的なバリアントＡＡＶカプシドポリペプチドを、表１に提供する。
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、非病原性の一本鎖ＤＮＡパルボウイルスである。ＡＡＶは、約２０ｎｍのカプシド直径を有する。一本鎖ＤＮＡゲノムの両端には逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）が含まれ、これは、ゲノムの複製とパッケージングに必要な唯一のシス作用エレメントである。ＡＡＶゲノムには、ｒｅｐとｃａｐという２つのウイルス遺伝子がある。このウイルスは、複製に必要な４つのタンパク質（Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２及びＲｅｐ４０）を生成するために、２つのプロモーターと選択的スプライシングを利用する。３番目のプロモーターは、選択的スプライシングと選択的翻訳開始コドンの組み合わせを介して、３つの構造ウイルスカプシドタンパク質１、２及び３（ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３）の転写産物を生成する。Ｂｅｒｎｓ＆Ｌｉｎｄｅｎ Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ１９９５；１７：２３７－４５。３つのカプシドタンパク質は同じＣ末端の５３３アミノ酸を共有するが、ＶＰ２とＶＰ１は、それぞれ、６５と２０２アミノ酸の追加のＮ末端配列を含む。ＡＡＶビリオンには、ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３の合計６０コピーが１：１：２０の比率で含まれ、Ｔ－１正二十面体対称に配置されている。Ｒｏｓｅ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ．１９７１；８：７６６－７０。ＡＡＶは、その溶解ライフサイクルを完了させるために、ヘルパーウイルスとしてアデノウイルス（Ａｄ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）または他のウイルスを必要とする。Ａｔｃｈｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９６５；１４９：７５４－６；Ｈｏｇｇａｎ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，１９６６；５５：１４６７－７４。ヘルパーウイルスの不存在下で、野生型ＡＡＶは、ＩＴＲと染色体の相互作用を通じてＲｅｐタンパク質の補助によって統合することにより、潜在を確立する。Ｂｅｒｎｓ＆Ｌｉｎｄｅｎ（１９９５）。特定の実施形態では、本明細書に記載のＡＡＶは、例えば、非バリアントＡＡＶカプシドポリペプチドと比較して、内耳組織または細胞において増加した向性及び／または形質導入を示すバリアントＡＡＶカプシドポリペプチドを含む。例示的なバリアントＡＡＶカプシドポリペプチドを、表１に提供する。
【0142】
ＡＡＶ血清型
ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ１０、Ａｎｃ８０Ｌ６５及びこれらの変異体またはハイブリッドを含む、多数の異なるＡＡＶ血清型が存在する。ｉｎ ｖｉｖｏ実験では、様々なＡＡＶ血清型が異なる組織または細胞向性を示すことが示される。例えば、ＡＡＶ１とＡＡＶ６は、骨格筋の形質導入に効率的な２つの血清型である。Ｇａｏ，ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，２００２；９９：１１８５４－１１８５９；Ｘｉａｏ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ．１９９９；７３：３９９４－４００３；Ｃｈａｏ，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２０００；２：６１９－６２３。ＡＡＶ－３は、巨核球の形質導入に優れていることが示されている。Ｈａｎｄａ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．２０００；８１：２０７７－２０８４。ＡＡＶ５とＡＡＶ６は、頂端気道細胞に効率的に感染する。Ｚａｂｎｅｒ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ．２０００；７４：３８５２－３８５８；Ｈａｌｂｅｒｔ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ．２００１；７５：６６１５－６６２４。ＡＡＶ２、ＡＡＶ４及びＡＡＶ５は、中枢神経系の様々なタイプの細胞に形質導入する。Ｄａｖｉｄｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２０００；９７：３４２８－３４３２。ＡＡＶ８とＡＡＶ５は、ＡＡＶ－２よりも一層、肝細胞に形質導入できる。ＡＡＶ－５ベースのベクターは、特定の細胞型（培養気道上皮細胞、培養横紋筋細胞、及び培養ヒト臍帯静脈内皮細胞）にＡＡＶ２よりも高い効率で形質導入したが、ＡＡＶ２とＡＡＶ５の両方は、ＮＩＨ３Ｔ３、ｓｋｂｒ３及びｔ－４７Ｄ細胞株に対して低い形質導入効率を示した。Ｇａｏ，ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２００２；９９：１１８５４－１１８５９；Ｍｉｎｇｏｚｚｉ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ．２００２；７６：１０４９７－１０５０２。ＷＯ９９／６１６０１。ＡＡＶ４は、最も効率的にラット網膜に形質導入することが判明し、ＡＡＶ５とＡＡＶ１がそれに続いた。Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ．２００２；７６：７９１－８０１；Ｗｅｂｅｒ，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２００３；７：７７４－７８１。要約すると、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ８及びＡＡＶ９は、ＣＮＳ組織に対する向性を示す。ＡＡＶ１、ＡＡＶ８及びＡＡＶ９は、心臓組織に対する向性を示す。ＡＡＶ２は、腎臓組織に対する向性を示す。ＡＡＶ７、ＡＡＶ８及びＡＡＶ９は、肝臓組織に対する向性を示す。ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６及びＡＡＶ９は、肺組織に対する向性を示す。ＡＡＶ８は、膵臓細胞に対する向性を示す。ＡＡＶ３、ＡＡＶ５及びＡＡＶ８は、視細胞に対する向性を示す。ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５及びＡＡＶ８は、網膜色素上皮（retinal pigment epithelium、ＲＰＥ）細胞に対して向性を示す。ＡＡＶ１、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８及びＡＡＶ９は、骨格筋に対する向性を示す。
ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ１０、Ａｎｃ８０Ｌ６５及びこれらの変異体またはハイブリッドを含む、多数の異なるＡＡＶ血清型が存在する。ｉｎ ｖｉｖｏ実験では、様々なＡＡＶ血清型が異なる組織または細胞向性を示すことが示される。例えば、ＡＡＶ１とＡＡＶ６は、骨格筋の形質導入に効率的な２つの血清型である。Ｇａｏ，ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，２００２；９９：１１８５４－１１８５９；Ｘｉａｏ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ．１９９９；７３：３９９４－４００３；Ｃｈａｏ，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２０００；２：６１９－６２３。ＡＡＶ－３は、巨核球の形質導入に優れていることが示されている。Ｈａｎｄａ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．２０００；８１：２０７７－２０８４。ＡＡＶ５とＡＡＶ６は、頂端気道細胞に効率的に感染する。Ｚａｂｎｅｒ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ．２０００；７４：３８５２－３８５８；Ｈａｌｂｅｒｔ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ．２００１；７５：６６１５－６６２４。ＡＡＶ２、ＡＡＶ４及びＡＡＶ５は、中枢神経系の様々なタイプの細胞に形質導入する。Ｄａｖｉｄｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２０００；９７：３４２８－３４３２。ＡＡＶ８とＡＡＶ５は、ＡＡＶ－２よりも一層、肝細胞に形質導入できる。ＡＡＶ－５ベースのベクターは、特定の細胞型（培養気道上皮細胞、培養横紋筋細胞、及び培養ヒト臍帯静脈内皮細胞）にＡＡＶ２よりも高い効率で形質導入したが、ＡＡＶ２とＡＡＶ５の両方は、ＮＩＨ３Ｔ３、ｓｋｂｒ３及びｔ－４７Ｄ細胞株に対して低い形質導入効率を示した。Ｇａｏ，ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２００２；９９：１１８５４－１１８５９；Ｍｉｎｇｏｚｚｉ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ．２００２；７６：１０４９７－１０５０２。ＷＯ９９／６１６０１。ＡＡＶ４は、最も効率的にラット網膜に形質導入することが判明し、ＡＡＶ５とＡＡＶ１がそれに続いた。Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ．２００２；７６：７９１－８０１；Ｗｅｂｅｒ，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２００３；７：７７４－７８１。要約すると、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ８及びＡＡＶ９は、ＣＮＳ組織に対する向性を示す。ＡＡＶ１、ＡＡＶ８及びＡＡＶ９は、心臓組織に対する向性を示す。ＡＡＶ２は、腎臓組織に対する向性を示す。ＡＡＶ７、ＡＡＶ８及びＡＡＶ９は、肝臓組織に対する向性を示す。ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６及びＡＡＶ９は、肺組織に対する向性を示す。ＡＡＶ８は、膵臓細胞に対する向性を示す。ＡＡＶ３、ＡＡＶ５及びＡＡＶ８は、視細胞に対する向性を示す。ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５及びＡＡＶ８は、網膜色素上皮（retinal pigment epithelium、ＲＰＥ）細胞に対して向性を示す。ＡＡＶ１、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８及びＡＡＶ９は、骨格筋に対する向性を示す。
【0143】
ウイルスへの更なる改変を行って、例えば、各血清型の向性を改善することにより、遺伝子導入の効率を高めることができる。１つの方法は、１つの血清型カプシドから別の血清型カプシドにドメインを交換し、それぞれの親から所望の品質を備えたハイブリッドベクターを作成することである。ウイルスカプシドは細胞受容体結合に関与しているため、結合に重要なウイルスカプシドドメイン（複数可）を理解することが重要である。結晶構造が利用可能になる前に行われたウイルスカプシド（主にＡＡＶ２）の変異研究は、ほとんどが外因性部分の吸着、ランダムな位置でのペプチドの挿入、またはアミノ酸レベルでの包括的な変異誘発によるカプシド表面の機能化に基づいていた。Ｃｈｏｉ，ｅｔ ａｌ．Ｃｕｒｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２００５Ｊｕｎｅ；５（３）：２９９－３１０は、ハイブリッド血清型の様々なアプローチと考慮事項について説明する。
【0144】
他のＡＡＶ血清型からのカプシドは、特定のｉｎ ｖｉｖｏ用途において、ＡＡＶ２カプシドに基づくｒＡＡＶベクターよりも優れている。第１に、特定の血清型を有するｒＡＡＶベクターを適切に使用することにより、ＡＡＶ２に基づくベクターによる感染が不十分であるか、またはまったく感染していない特定の標的細胞へのｉｎ ｖｉｖｏでの遺伝子送達の効率が高まり得る。第２に、ｒＡＡＶベクターの再投与が臨床的に必要になった場合、他のＡＡＶ血清型に基づくｒＡＡＶベクターを使用することが有利であり得る。同じカプシドを含む同じｒＡＡＶベクターの再投与は、おそらくベクターに対して生成された中和抗体の生成により、無効であり得ることが実証されている。Ｘｉａｏ，ｅｔ ａｌ．１９９９；Ｈａｌｂｅｒｔ，ｅｔ ａｌ．１９９７。この問題は、カプシドが異なるＡＡＶ血清型からのタンパク質からなり、最初のｒＡＡＶベクターに対する中和抗体の存在によって影響を受けないｒＡＡＶ粒子の投与によって回避され得る。Ｘｉａｏ，ｅｔ ａｌ．１９９９。上記の理由から、ＡＡＶ２を含みかつＡＡＶ２に加えて、血清型からのｃａｐ遺伝子を使用して構築された組換えＡＡＶベクターが望ましい。ｒＨＳＶと同様であるが、他のＡＡＶ血清型、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ５～ＡＡＶ９からのｃａｐ遺伝子をコードする組換えＨＳＶベクターの構築は、ｒＨＳＶを産生するために本明細書に記載の方法を使用して達成可能であることが認識される。本明細書に記載の本開示の特定の好ましい実施形態では、異なるＡＡＶからのｃａｐ遺伝子を使用して構築された組換えＡＡＶベクターが、好ましい。これらの追加のｒＨＳＶベクターの構築の重要な利点は、ｒＡＡＶの大規模生産に使用される代替方法と比較して、容易さと時間の節約である。特に、各異なるカプシド血清型に新しいｒｅｐ及びｃａｐ誘導細胞株を構築するという困難なプロセスが回避される。
【0145】
本明細書に記載の本開示の特定の好ましい実施形態では、例えば、非バリアントＡＡＶカプシドと比較して、内耳組織または細胞において向性及び／または形質導入の増加を示すバリアントＡＡＶカプシドポリペプチドをコードするｃａｐ遺伝子を使用して構築された組換えＡＡＶベクターが、好ましい。そのようなバリアントバリアントＡＡＶカプシドポリペプチドは、本明細書に記載されている。例示的なバリアントＡＡＶカプシドポリペプチドを表１に提供する。
【0146】
バリアントＡＡＶカプシドポリペプチド
本開示は、一般に、例えば、非バリアントＡＡＶカプシドポリペプチドと比較して、内耳組織または細胞において向性及び／または形質導入の増加を示すバリアントアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドポリペプチド、及び難聴、例えば、遺伝子欠失に関連する難聴の治療または予防で使用するための方法を提供する。
本開示は、一般に、例えば、非バリアントＡＡＶカプシドポリペプチドと比較して、内耳組織または細胞において向性及び／または形質導入の増加を示すバリアントアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドポリペプチド、及び難聴、例えば、遺伝子欠失に関連する難聴の治療または予防で使用するための方法を提供する。
【0147】
いくつかの実施形態によれば、バリアントＡＡＶカプシドポリペプチドは、バリアントＡＡＶ１カプシドポリペプチド、バリアントＡＡＶ２カプシドポリペプチド、バリアントＡＡＶ３カプシドポリペプチド、バリアントＡＡＶ４カプシドポリペプチド、バリアントＡＡＶ５カプシドポリペプチド、バリアントＡＡＶ６カプシドポリペプチド、バリアントＡＡＶ７カプシドポリペプチド、バリアントＡＡＶ８カプシドポリペプチド、バリアントＡＡＶ９カプシドポリペプチド、バリアントｒｈ－ＡＡＶ１０カプシドポリペプチド、バリアントＡＡＶ１０カプシドポリペプチド、バリアントＡＡＶ１１カプシドポリペプチド及びバリアントＡＡＶ１２カプシドポリペプチドからなる群から選択される。いくつかの実施形態によれば、バリアントＡＡＶカプシドポリペプチドは、バリアントＡＡＶ２カプシドポリペプチドである。
【0148】
いくつかの実施形態によれば、バリアントＡＡＶカプシドポリペプチドは、表１に列挙されたアミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも約８５％、９０％、９５％もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、任意選択で、ＡＡＶカプシドは、ＶＰ１、ＶＰ２またはＶＰ３カプシドポリペプチドからなる群から選択される。
【0149】
いくつかの実施形態によれば、バリアントＡＡＶカプシドポリペプチドは、野生型ＡＡＶ２カプシドポリペプチド（配列番号１８）に対して１つ以上のアミノ酸置換、挿入及び／または欠失を有するアミノ酸配列を含み、任意選択で、１つ以上のアミノ酸置換、挿入及び／または欠失は、Ｑ２６３、Ｓ２６４、Ｙ２７２、Ｙ４４４、Ｒ４８７、Ｐ４５１、Ｔ４５４、Ｔ４５５、Ｒ４５９、Ｋ４９０、Ｔ４９１、Ｓ４９２、Ａ４９３、Ｄ４９４、Ｅ４９９、Ｙ５００、Ｔ５０３、Ｋ５２７、Ｅ５３０、Ｅ５３１、Ｑ５４５、Ｇ５４６、Ｓ５４７、Ｅ５４８、Ｋ５４９、Ｔ５５０、Ｎ５５１、Ｖ５５２、Ｄ５５３、Ｅ５５５、Ｋ５５６、Ｒ５８５、Ｒ５８８及びＹ７３０からなる群から選択されるアミノ酸残基において生じる。
【0150】
いくつかの実施形態によれば、バリアントＡＡＶカプシドポリペプチドは、Ｑ２６３Ｎ、Ｑ２６３Ａ、Ｓ２６４Ａ、Ｙ２７２Ｆ、Ｙ４４４Ｆ、Ｒ４８７Ｇ、Ｐ４５１Ａ、Ｔ４５４Ｎ、Ｔ４５５Ｖ、Ｒ４５９Ｔ、Ｋ４９０Ｔ、Ｔ４９１Ｑ、Ｓ４９２Ｄ、Ａ４９３Ｇ、Ｄ４９４Ｅ、Ｅ４９９Ｄ、Ｙ５００Ｆ、Ｔ５０３Ｐ、Ｋ５２７Ｒ、Ｅ５３０Ｄ、Ｅ５３１Ｄ、Ｑ５４５Ｅ、Ｇ５４６Ｄ、Ｇ５４６Ｓ、Ｓ５４７Ａ、Ｅ５４８Ｔ、Ｅ５４８Ａ、Ｋ５４９Ｅ、Ｋ５４９Ｇ、Ｔ５５０Ｎ、Ｔ５５０Ａ、Ｎ５５１Ｄ、Ｖ５５２Ｉ、Ｄ５５３Ａ、Ｅ５５５Ｄ、Ｋ５５６Ｒ、Ｋ５５６Ｓ、Ｒ５８５Ｓ、Ｒ５８８Ｔ及びＹ７３０Ｆからなる群から選択される野生型ＡＡＶ２カプシドポリペプチド（配列番号１８）に対して１つ以上のアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む。
【0151】
いくつかの実施形態によれば、バリアントＡＡＶカプシドポリペプチドは、（ｉ）配列番号２７、２９、３１、３３または３５のうちのいずれか１つのアミノ酸配列；（ｉｉ）配列番号２７、２９、３１、３３または３５のうちのいずれか１つに対して少なくとも約８５％、９０％、９５％または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列；または（ｉｉｉ）配列番号２６、２８、３０、３２または３４のうちのいずれか１つの核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態によれば、バリアントＡＡＶカプシドポリペプチドは、配列番号２７のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態によれば、バリアントＡＡＶカプシドポリペプチドは、配列番号２９のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態によれば、バリアントＡＡＶカプシドポリペプチドは、配列番号３１のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態によれば、バリアントＡＡＶカプシドポリペプチドは、配列番号３３のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態によれば、バリアントＡＡＶカプシドポリペプチドは、配列番号３５のアミノ酸配列を含む。
【0152】
いくつかの実施形態によれば、バリアントＡＡＶカプシドポリペプチドは、非バリアントＡＡＶカプシドポリペプチドと比較して、任意選択で、少なくとも約１倍、１．２５倍、１．５倍、１．７５倍、２倍、２．５倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１２倍、１４倍、１６倍、１８倍、２０倍の内耳組織または細胞におけるｒＡＡＶ向性レベルの増加をもたらす。特定の実施形態では、バリアントＡＡＶカプシドポリペプチドは、側壁またはらせん靭帯の細胞、コルチ器官の支持細胞、らせん靭帯の線維細胞、クラウジウス細胞、ベッチャー細胞、らせん隆起の細胞、前庭支持細胞、ヘンゼン細胞、ダイタース細胞、柱細胞、内指節細胞、外指節細胞、及び／または境界細胞からなる群から選択される内耳組織または細胞におけるｒＡＡＶ向性レベルの増加をもたらす。
【0153】
いくつかの実施形態によれば、バリアントＡＡＶカプシドポリペプチドは、任意選択で、非バリアントＡＡＶカプシドポリペプチドと比較して、任意選択で、少なくとも約１倍、１．２５倍、１．５倍、１．７５倍、２倍、２．５倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１２倍、１４倍、１６倍、１８倍、２０倍の内耳組織または細胞におけるｒＡＡＶ形質導入効率レベルの上昇をもたらす。特定の実施形態では、バリアントＡＡＶカプシドポリペプチドは、側壁またはらせん靭帯の細胞、コルチ器官の支持細胞、らせん靭帯の線維細胞、クラウジウス細胞、ベッチャー細胞、らせん隆起の細胞、前庭支持細胞、ヘンゼン細胞、ダイタース細胞、柱細胞、内指節細胞、外指節細胞、及び／または境界細胞、内蝸牛有毛細胞、外蝸牛有毛細胞、らせん神経節細胞、前庭有毛細胞、前庭支持細胞、及び／または前庭神経節細胞からなる群から選択される内耳組織または細胞におけるｒＡＡＶ形質導入効率レベルの増加をもたらす。
【0154】
組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターの作成
本開示のｒＡＡＶベクターの産生、精製及び特徴付けは、当技術分野で公知の多くの方法のいずれかを使用して実施することができる。いくつかの実施形態によれば、ｒＡＡＶベクターは、例えば、非バリアントＡＡＶカプシドポリペプチドと比較して、内耳組織または細胞において向性及び／または形質導入の増加を示す、本明細書（例えば、表１）に記載のＡＡＶバリアントカプシドポリペプチドをコードする。実験室規模の産生方法の概説については、例えば、Ｃｌａｒｋ ＲＫ，Ｒｅｃｅｎｔ ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ．６１ｓ：９－１５（２００２）；Ｃｈｏｉ ＶＷ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ ｕｓｅ．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ１６．２５．１－１６．２５．２４（２００７）（以下Ｃｈｏｉら）；Ｇｒｉｅｇｅｒ ＪＣ＆Ｓａｍｕｌｓｋｉ ＲＪ，Ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ａｓ ａ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｖｅｃｔｏｒ：Ｖｅｃｔｏｒ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ａｄｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｅｎｇｉｎ／Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ９９：１１９－１４５（２００５）（以下Ｇｒｉｅｇｅｒ＆Ｓａｍｕｌｓｋｉ）；Ｈｅｉｌｂｒｏｎｎ Ｒ＆Ｗｅｇｅｒ Ｓ，Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｓｔａｔｕｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，ｉｎ Ｍ．Ｓｃｈａｆｅｒ－Ｋｏｒｔｉｎｇ（ｅｄ．），Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，１９７：１４３－１７０（２０１０）（以下Ｈｅｉｌｂｒｏｎｎ）；Ｈｏｗａｒｔｈ ＪＬ ｅｔ ａｌ．，Ｕｓｉｎｇ ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ ａｓ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｔｏｏｌｓ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ Ｔｏｘｉｃｏｌ２６：１－１０（２０１０）（以下Ｈｏｗａｒｔｈ）を参照のこと。以下に記載される産生方法は、非限定的な例として意図されている。
本開示のｒＡＡＶベクターの産生、精製及び特徴付けは、当技術分野で公知の多くの方法のいずれかを使用して実施することができる。いくつかの実施形態によれば、ｒＡＡＶベクターは、例えば、非バリアントＡＡＶカプシドポリペプチドと比較して、内耳組織または細胞において向性及び／または形質導入の増加を示す、本明細書（例えば、表１）に記載のＡＡＶバリアントカプシドポリペプチドをコードする。実験室規模の産生方法の概説については、例えば、Ｃｌａｒｋ ＲＫ，Ｒｅｃｅｎｔ ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ．６１ｓ：９－１５（２００２）；Ｃｈｏｉ ＶＷ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ ｕｓｅ．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ１６．２５．１－１６．２５．２４（２００７）（以下Ｃｈｏｉら）；Ｇｒｉｅｇｅｒ ＪＣ＆Ｓａｍｕｌｓｋｉ ＲＪ，Ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ａｓ ａ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｖｅｃｔｏｒ：Ｖｅｃｔｏｒ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ａｄｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｅｎｇｉｎ／Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ９９：１１９－１４５（２００５）（以下Ｇｒｉｅｇｅｒ＆Ｓａｍｕｌｓｋｉ）；Ｈｅｉｌｂｒｏｎｎ Ｒ＆Ｗｅｇｅｒ Ｓ，Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｓｔａｔｕｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，ｉｎ Ｍ．Ｓｃｈａｆｅｒ－Ｋｏｒｔｉｎｇ（ｅｄ．），Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，１９７：１４３－１７０（２０１０）（以下Ｈｅｉｌｂｒｏｎｎ）；Ｈｏｗａｒｔｈ ＪＬ ｅｔ ａｌ．，Ｕｓｉｎｇ ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ ａｓ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｔｏｏｌｓ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ Ｔｏｘｉｃｏｌ２６：１－１０（２０１０）（以下Ｈｏｗａｒｔｈ）を参照のこと。以下に記載される産生方法は、非限定的な例として意図されている。
【0155】
ＡＡＶベクターの産生は、パッケージングプラスミドの同時形質導入によって達成され得る。Ｈｅｉｌｂｒｏｎｎ。細胞株は、削除されたＡＡＶ遺伝子のｒｅｐとｃａｐ及び必要なヘルパーウイルス機能を提供する。アデノウイルスヘルパー遺伝子、ＶＡ－ＲＮＡ、Ｅ２Ａ及びＥ４は、２つの別個のプラスミドまたは単一のヘルパー構築物のいずれかで、ＡＡＶのｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子と一緒に形質導入される。ＡＡＶカプシド遺伝子が導入遺伝子発現カセット（目的の遺伝子、例えば、ＧＪＢ２核酸；プロモーター；及び最小調節エレメントを含む）で置換され、ＩＴＲによって挟まれた組換えＡＡＶベクタープラスミドも形質導入される。これらのパッケージングプラスミドは通常、残りの必要なＡｄヘルパー遺伝子であるＥ１Ａ及びＥ１Ｂを構成的に発現する、ヒト細胞株である２９３細胞に形質導入される。これにより、目的の遺伝子を運ぶＡＡＶベクターの増幅とパッケージングが行われる。
【0156】
現在、１２のヒト血清型とヒト以外の霊長類の１００を超える血清型を含む、ＡＡＶの複数の血清型が特定されている。Ｈｏｗａｒｔｈ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ Ｔｏｘｉｃｏｌ２６：１－１０（２０１０）。本開示のＡＡＶベクターは、任意の既知の血清型のＡＡＶに由来するカプシド配列を含み得る。本明細書で使用される場合、「既知の血清型」は、当技術分野で既知の方法を使用して生成できるカプシド変異体を包含する。そのような方法には、例えば、ウイルスカプシド配列の遺伝子操作、異なる血清型のカプシド領域の露出表面のドメイン交換、及びマーカーレスキューなどの技術を使用したＡＡＶキメラの生成が含まれる。Ｂｏｗｌｅｓ ｅｔ ａｌ． Ｍａｒｋｅｒ ｒｅｓｃｕｅ ｏｆ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ（ＡＡＶ）ｃａｐｓｉｄ ｍｕｔａｎｔｓ：Ａ ｎｏｖｅｌ ａｐｐｒｏａｃｈ ｆｏｒ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ＡＡＶ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，７７（１）：４２３－４３２（２００３）、及びそこで引用されている参考文献を参照のこと。更に、本開示のＡＡＶベクターは、任意の既知の血清型のＡＡＶに由来するＩＴＲを含み得る。好ましくは、ＩＴＲは、ヒト血清型ＡＡＶ１～ＡＡＶ１２のうちの１つに由来する。本開示のいくつかの実施形態では、１つのＩＴＲ血清型のゲノムが異なる血清型カプシドにパッケージ化される、シュードタイピング方法が使用される。
【0157】
いくつかの実施形態によれば、カプシド配列は、ヒト血清型ＡＡＶ１～ＡＡＶ１２のうちの１つに由来する。いくつかの実施形態によれば、カプシド配列は血清型ＡＡＶ２に由来する。いくつかの実施形態によれば、カプシド配列は、内耳組織または細胞、例えば、支持細胞（例えば、外有毛細胞、内有毛細胞、ヘンゼン細胞、ダイテルス細胞、柱細胞、内指節細胞、外指節細胞／境界細胞、内及び外蝸牛有毛細胞、らせん神経節細胞、前庭有毛細胞、前庭支持細胞ならびに前庭神経節細胞）を標的とする高い向性を有するＡＡＶ２バリアントに由来する。特定の実施形態では、バリアントＡＡＶカプシドポリペプチドは、側壁またはらせん靭帯の細胞、コルチ器官の支持細胞、らせん靭帯の線維細胞、クラウジウス細胞、ベッチャー細胞、らせん隆起の細胞、前庭支持細胞、ヘンゼン細胞、ダイタース細胞、柱細胞、内指節細胞、外指節細胞、境界細胞、内蝸牛有毛細胞、外蝸牛有毛細胞、らせん神経節細胞、前庭有毛細胞、前庭支持細胞、及び／または前庭神経節細胞からなる群から選択される内耳組織または細胞におけるｒＡＡＶ向性及び／または形質導入効率レベルの増加をもたらす。この目的に適したカプシドは、ＡＡＶ２－ｔＹＦ、ＡＡＶ２－ＭｅＢ、ＡＡＶ２－Ｐ２Ｖ２、ＡＡＶ２－ＭｅＢｔＹＦＴＶ、ＡＡＶ２－Ｐ２Ｖ６ならびにＡＡＶ５、ＡＡＶ８及びＡｎｃ８０Ｌ６５を含む、ＡＡＶ２ならびにＡＡＶ２バリアントを含む。いくつかの実施形態によれば、バリアントＡＡＶカプシドポリペプチドは、表１に列挙されるアミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも約８５％、９０％、９５％もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0158】
いくつかの実施形態によれば、組換えＡＡＶベクターは、特にＡＡＶ三次元構造のループアウト領域におけるウイルスカプシド配列の遺伝子操作によって、または異なる血清型のカプシド領域の露出表面のドメイン交換によって、またはマーカーレスキューなどの技術を使用してＡＡＶキメラの生成によって直接標的とすることができる。Ｂｏｗｌｅｓ ｅｔ ａｌ． Ｍａｒｋｅｒ ｒｅｓｃｕｅ ｏｆ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ（ＡＡＶ）ｃａｐｓｉｄ ｍｕｔａｎｔｓ：Ａ ｎｏｖｅｌ ａｐｐｒｏａｃｈ ｆｏｒ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ＡＡＶ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，７７（１）：４２３－４３２（２００３）、及びそこで引用されている参考文献を参照のこと。
【0159】
組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターの産生、精製及び特徴付けのための可能なプロトコルの１つが、Ｃｈｏｉらに提供されている。一般に、次の工程：導入遺伝子発現カセットの設計、特定の受容体を標的とするためのカプシド配列の設計、アデノウイルスを含まないｒＡＡＶベクターの産生、精製及び力価が含まれる。これらの工程を以下に要約し、Ｃｈｏｉらで詳細に説明する。
【0160】
導入遺伝子発現カセットは、一本鎖ＡＡＶ（ｓｓＡＡＶ）ベクター、または偽二本鎖導入遺伝子としてパッケージ化された「二量体」もしくは自己相補的ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）ベクターであり得る。Ｃｈｏｉら、Ｈｏｗａｒｔｈら。従来のｓｓＡＡＶベクターを使用すると、一般に、一本鎖ＡＡＶ ＤＮＡから二本鎖ＤＮＡへの変換が必要なため、遺伝子発現の開始が遅くなる（導入遺伝子発現がプラトーに達するまで数日から数週間）。対照的に、ｓｃＡＡＶベクターは、静止細胞の形質導入後数日以内にプラトーになる、数時間以内に遺伝子発現の開始を示す。Ｈｅｉｌｂｒｏｎｎ。いくつかの実施形態によれば、ｓｃＡＡＶが使用され、ｓｃＡＡＶは、一本鎖ＡＡＶと比較して急速な形質導入開始、及び増加した安定性を有する。あるいは、導入遺伝子発現カセットを２つのＡＡＶベクターの間に分割し得、より長い構築物の送達を可能にする。例えば、Ｄａｙａ Ｓ．ａｎｄ Ｂｅｒｎｓ，Ｋ．Ｉ．，Ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｕｓｉｎｇ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ，２１（４）：５８３－５９３（２００８）（以下、Ｄａｙａら）を参照のこと。ｓｓＡＡＶベクターは、適切なプラスミド（例えば、ＧＪＢ２遺伝子を含むプラスミドなど）を制限エンドヌクレアーゼで消化してｒｅｐ及びｃａｐ断片を除去し、ＡＡＶｗｔ－ＩＴＲを含むプラスミド骨格をゲル精製することによって構築することができる。Ｃｈｏｉら。続いて、所望の導入遺伝子発現カセットを適切な制限部位の間に挿入して、一本鎖ｒＡＡＶベクタープラスミドを構築することができる。ｓｃＡＡＶベクターは、Ｃｈｏｉらに記載されているように構築できる。
【0161】
次に、ｒＡＡＶベクター及び適切なＡＡＶヘルパープラスミド及びｐＸＸ６ Ａｄヘルパープラスミドの大規模なプラスミド調製物（少なくとも１ｍｇ）を、二重ＣｓＣｌ勾配分画によって精製できる。Ｃｈｏｉら。適切なＡＡＶヘルパープラスミドは、ｐＸＲシリーズ、ｐＸＲ１～ｐＸＲ５から選択され得、これらは、それぞれ、ＡＡＶ２ ＩＴＲゲノムのＡＡＶ血清型１～５のカプシドへのクロスパッケージングを可能にする。適切なカプシドは、カプシドの目的の細胞、例えば、内耳組織または細胞への標的化の効率に基づいて選択することができる。ゲノム（すなわち、導入遺伝子発現カセット）の長さ及びＡＡＶカプシドを変化させる既知の方法を使用して、特定の細胞型（例えば、網膜錐体細胞）への発現及び／または遺伝子導入を改善することができる。例えば、Ｙａｎｇ ＧＳ， Ｖｉｒｕｓ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｒｉｎｅ ｒｅｔｉｎａ ｗｉｔｈ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ：Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｖｉｒａｌ ｃａｐｓｉｄ ａｎｄ ｇｅｎｏｍｅ ｓｉｚｅ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，７６（１５）：７６５１－７６６０を参照のこと。いくつかの実施形態によれば、バリアントＡＡＶカプシドポリペプチドは、表１に列挙されるアミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも約８５％、９０％、９５％もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0162】
次に、２９３細胞に、ｐＸＸ６ヘルパープラスミド、ｒＡＡＶベクタープラスミド及びＡＡＶヘルパープラスミドをトランスフェクトする。Ｃｈｏｉら。その後、分画された細胞可溶化物は、ｒＡＡＶ精製の多段階プロセスを受け、続いてＣｓＣｌ勾配精製またはヘパリンセファロースカラム精製のいずれかが行われる。ｒＡＡＶビリオンの産生及び定量は、ドットブロットアッセイを使用して決定することができる。細胞培養におけるｒＡＡＶのｉｎ ｖｉｔｒｏ形質導入は、ウイルスの感染性と発現カセットの機能を検証するために使用できる。
【0163】
Ｃｈｏｉらに記載されている方法に加えて、ＡＡＶの産生のための様々な他のトランスフェクション方法が、本開示の文脈において使用され得る。例えば、リン酸カルシウム沈殿プロトコルに依存する方法を含む、一過性トランスフェクション方法が利用可能である。
【0164】
ｒＡＡＶベクターを産生するための実験室規模の方法に加えて、本開示は、例えば、Ｈｅｉｌｂｒｏｎｎ、Ｃｌｅｍｅｎｔ，Ｎらを含む、ＡＡＶベクターのバイオリアクター規模の製造のための当技術分野で公知の技術を利用することができる。ヘルペスウイルスベースの系を使用した大規模なアデノ随伴ウイルスベクターの産生は、臨床研究のための製造を可能にする。Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，２０：７９６－６０６。
【0165】
臨床グレードのＲＡＡＶベクターを大量に得られる拡張可能な生産系という望ましい目標の達成に向けて、ｒＡＡＶ産生に必要な遺伝要素を細胞に送達する手段としてトランスフェクションを利用する生産系で大きく前進してきた。例えば、汚染アデノウイルスヘルパーの除去は、第３のプラスミドがアデノウイルスヘルパータンパク質をコードする核酸配列を含む、３プラスミドトランスフェクション系において、アデノウイルス感染をプラスミドトランスフェクションに置き換えることによって回避されてきた（Ｘｉａｏ，ｅｔ ａｌ．１９９８）。また、２プラスミドトランスフェクション系の改良により、製造工程が簡略化され、ｒＡＡＶベクターの生産効率も向上した（Ｇｒｉｍｍ，ｅｔ ａｌ．１９９８）。
【0166】
培養された哺乳動物細胞からのｒＡＡＶの収量を改善するためのいくつかの戦略は、遺伝子工学によって作成された特殊な産生細胞の開発に基づいている。１つの方法では、細胞をヘルパーアデノウイルスまたはＨＳＶに感染させることにより、挿入されたＡＡＶゲノムを「レスキュー」できる遺伝子操作された「プロウイルス」細胞株を使用して、大規模なｒＡＡＶの生産が達成されている。プロウイルス細胞株は、単純なアデノウイルス感染によってレスキューすることができ、トランスフェクションプロトコルに比べて効率が向上する。
【0167】
細胞からのｒＡＡＶの収量を改善するための２番目の細胞に基づく方法には、ＡＡＶのｒｅｐ遺伝子とｃａｐ遺伝子、または目的のｒｅｐ－ｃａｐとＩＴＲ遺伝子の両方をゲノムに保有する、遺伝子操作された「パッケージング」細胞株の使用が含まれる（Ｑｉａｏ，ｅｔ ａｌ．２００２）。前者の方法では、ｒＡＡＶを生成するために、パッケージング細胞株にヘルパー機能、及びＡＡＶ ＩＴＲ－ＧＯＩエレメントを感染またはトランスフェクトする。後者の方法は、ヘルパー機能のみを持つ細胞の感染またはトランスフェクションを必要とする。通常、パッケージング細胞株を使用したｒＡＡＶの生産は、細胞を野生型アデノウイルスまたは組換えアデノウイルスに感染させることによって開始される。パッケージング細胞はｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子を含むため、これらの要素を外因的に供給する必要はない。
【0168】
パッケージング細胞株からのｒＡＡＶ収量は、プロウイルス細胞株レスキューまたはトランスフェクションプロトコルによって得られる収量よりも高いことが示されている。
【0169】
ｒＡＡＶの収量の改善は、組換えＨＳＶ増幅産物系を使用した単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）からのヘルパー機能の送達に基づく方法を使用して行われた。細胞あたり１５０～５００ウイルスゲノム（ｖｇ）程度の適度なレベルのｒＡＡＶベクター収量が最初に移植されたが（Ｃｏｎｗａｙ，ｅｔ ａｌ．１９９７）、ｒＨＳＶ増幅産物ベースの系の最近の改良により、実質的により高い収量の細胞あたりのｒＡＡＶ ｖ．ｇ．及び感染性粒子（ｉｐ）が提供された（Ｆｅｕｄｎｅｒ，ｅｔ ａｌ．２００２）。増幅産物システムは本質的に複製欠損であるが、「ガッティド」ベクター、複製コンピテント（ｒｃＨＳＶ）、または複製欠損ｒＨＳＶを使用すると、依然として免疫原性ＨＳＶ成分がｒＡＡＶ生産系に導入される。したがって、これらの成分の適切なアッセイと、それらを除去するための対応する精製プロトコルが実行される。
【0170】
これらの方法に加えて、目的遺伝子のパッケージングを容易にするため、懸濁液中で増殖可能である哺乳動物細胞を、ＡＡＶ逆方向末端反復で挟まれた、それぞれプロモーターに作動可能に連結したＡＡＶ ｒｅｐ及びＡＡＶ ｃａｐ遺伝子をコードする核酸配列を含む第１の組換えヘルペスウイルスと、遺伝子、例えば、ＧＪＢ２遺伝子、及び前記遺伝子、例えば、ＧＪＢ２遺伝子に作動可能に連結されたプロモーターを含む第２の組換えヘルペスウイルスと、共感染させることと、哺乳動物細胞にウイルスを感染させ、哺乳動物細胞内で組換えＡＡＶウイルス粒子を生成させることと、を含む、哺乳動物細胞において組換えＡＡＶウイルス粒子を産生するための方法が、本明細書に記載される。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子は、例えば、非バリアントＡＡＶカプシドポリペプチドと比較して、内耳組織または細胞において増加した向性を示す、本明細書（例えば、表１）に記載のＡＡＶバリアントカプシドポリペプチドをコードする。
【0171】
ヘルペスウイルスの複製を支持することができる任意の種類の哺乳動物細胞が、本明細書に記載の本開示の方法による使用に適している。したがって、哺乳動物細胞は、本明細書の方法に記載されているように、ヘルペスウイルスの複製のための宿主細胞とみなすことができる。細胞がヘルペスウイルスの複製を支持できる限り、宿主細胞として使用するための任意の細胞型が本開示によって想到される。適切な遺伝子改変されていない哺乳動物細胞の例には、ＨＥＫ－２９３（２９３）、Ｖｅｒｏ、ＲＤ、ＢＨＫ－２１、ＨＴ－１０８０、Ａ５４９、Ｃｏｓ－７、ＡＲＰＥ－１９及びＭＲＣ－５などの細胞株が含まれるが、これらに限定されない。
【0172】
本開示の様々な実施形態で使用される宿主細胞は、例えば、ヒト胚腎臓細胞または霊長類細胞などの哺乳動物細胞に由来し得る。他の細胞型には、細胞がヘルペスウイルス許容性である限り、ＢＨＫ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＣＨＯ細胞、または組織培養技術が確立されている任意の真核細胞が含まれるが、これらに限定されない。「ヘルペスウイルス許容性」という用語は、ヘルペスウイルスまたはヘルペスウイルスベクターが細胞環境内で細胞内ウイルスのライフサイクル全体を完了することができることを意味する。特定の実施形態では、記載される方法は、懸濁液中で増殖する哺乳動物細胞株ＢＨＫにおいて行われる。宿主細胞は、既存の細胞株、例えば、ＢＨＫ細胞株に由来するか、または新規に開発されたものであり得る。
【0173】
本明細書に記載のｒＡＡＶ遺伝子構築物の製造方法はまた、懸濁液中で増殖可能である哺乳動物細胞を、それぞれプロモーターに作動可能に連結したＡＡＶ ｒｅｐ及びＡＡＶ ｃａｐ遺伝子をコードする核酸を含む第１の組換えヘルペスウイルスと、（ｉｉ）遺伝子、例えば、ＧＪＢ２、及び前記遺伝子、例えば、ＧＪＢ２遺伝子に作動可能に連結されたプロモーターを含む第２の組換えヘルペスウイルスと、共感染させて、哺乳動物細胞を感染させることと、それによって哺乳類細胞内で組換えＡＡＶウイルス粒子を生産することと、を含む方法によって哺乳動物細胞で生産された組換えＡＡＶウイルス粒子を含む。本明細書に記載されるように、ヘルペスウイルスは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、単純ヘルペス（ＨＳＶ）及び水痘帯状疱疹（ＶＺＶ）及びエプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）からなる群から選択されるウイルスである。組換えヘルペスウイルスは複製欠損である。いくつかの実施形態によれば、ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子は、変異体またはハイブリッド（例えば、２つ以上の血清型のカプシドハイブリッド）を含む、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ１０、Ａｎｃ８０Ｌ６５からなる群から選択される血清型を有する。いくつかの実施形態によれば、ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子は、例えば、非バリアントＡＡＶカプシドポリペプチドと比較して、内耳組織または細胞において増加した向性を示す、本明細書（例えば、表１）に記載のＡＡＶバリアントカプシドポリペプチドをコードする。
【0174】
参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００７／０２０２５８７号は、ｒＡＡＶ産生系の必要な要素を記載している。組換えＡＡＶは、産生細胞として公知の細胞に遺伝子構築物を導入することにより、ｉｎ ｖｉｔｒｏで生成される。ｒＡＡＶの生成のための公知の系は、３つの基本的な要素：（１）目的の遺伝子を含む遺伝子カセット、（２）ＡＡＶのｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子を含む遺伝子カセット、ならびに（３）「ヘルパー」ウイルスタンパク質の供給源を使用する。
【0175】
最初の遺伝子カセットは、ＡＡＶの逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）が隣接する目的の遺伝子で構築される。ＩＴＲは、目的の遺伝子を宿主細胞ゲノムに統合するように機能し、組換えゲノムのカプシド形成に重要な役割を果たす。Ｈｅｒｍｏｎａｔ ａｎｄ Ｍｕｚｙｃｚｋａ，１９８４；Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．１９８３。２番目の遺伝子カセットには、ｒＡＡＶの複製とパッケージングに必要なタンパク質をコードするＡＡＶ遺伝子である、ｒｅｐとｃａｐが含まれる。ｒｅｐ遺伝子は、ＤＮＡ複製に必要な４つのタンパク質（Ｒｅｐ７８、６８、５２及び４０）をコードする。ｃａｐ遺伝子は、ウイルスカプシドを構成する３つの構造タンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３）をコードする。Ｍｕｚｙｃｚｋａ ａｎｄ Ｂｅｒｎｓ，２００１。
【0176】
ＡＡＶは単独では複製しないため、３番目の要素が必要である。ヘルパー機能は、ｒＡＡＶの効率的な複製とパッケージングを促進する細胞環境を作成するヘルパーＤＮＡウイルスからのタンパク質産物である。従来、ｒＡＡＶにヘルパー機能を提供するためにアデノウイルス（Ａｄ）が使用されてきたが、ヘルペスウイルスも本明細書で説明するようにこれらの機能を提供できる。
【0177】
遺伝子治療のためのｒＡＡＶベクターの産生は、懸濁液中で増殖させたＢＨＫ細胞などの適切な産生細胞株を使用して、ｉｎ ｖｉｔｒｏで実施される。本開示での使用に適した他の細胞株には、ＨＥＫ－２９３（２９３）、Ｖｅｒｏ、ＲＤ、ＢＨＫ－２１、ＨＴ－１０８０、Ａ５４９、Ｃｏｓ－７、ＡＲＰＥ－１９及びＭＲＣ－５が含まれる。
【0178】
細胞がヘルペスウイルスの複製を支持できる限り、任意の細胞型を宿主細胞として使用することができる。当業者は、宿主細胞からのヘルペスウイルスの産生に使用できる広範囲の宿主細胞に精通しているであろう。適切な遺伝子改変されていない哺乳動物宿主細胞の例には、例えば、ＨＥＫ－２９３（２９３）、Ｖｅｒｏ、ＲＤ、ＢＨＫ－２１、ＨＴ－１０８０、Ａ５４９、Ｃｏｓ－７、ＡＲＰＥ－１９及びＭＲＣ－５などの細胞株が含まれるが、これらに限定されない。
【0179】
宿主細胞は、懸濁培養での増殖に適合させることができる。宿主細胞は、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞であってもよい。懸濁液中で増殖するＢＨＫ細胞株は、接着ＢＨＫ細胞株の適応に由来する。両方の細胞株は市販されている。
【0180】
ｒＡＡＶの生成に必要なすべての要素を提供するための１つの戦略は、２つのプラスミドとヘルパーウイルスを利用する。この方法は、必要な遺伝子産物をコードする遺伝子カセットを含むプラスミドによる産生細胞のトランスフェクション、及びヘルパー機能を提供するためのＡｄによる細胞の感染に依存する。この系は、２つの異なる遺伝子カセットを有するプラスミドを採用する。１番目は、ｒＡＡＶとしてパッケージ化される組換えＤＮＡをコードするプロウイルスプラスミドである。２番目は、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子をコードするプラスミドである。これらの様々な要素を細胞に導入するために、細胞にＡｄを感染させ、２つのプラスミドをトランスフェクトする。Ａｄによって提供される遺伝子産物は、遺伝子Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ２ａ、Ｅ４ｏｒｆ６及びＶａによってコードされる。Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．１９９８：Ｈａｕｓｗｉｒｔｈ ｅｔ ａｌ．２０００；Ｍｕｚｙｃｚｋａ ａｎｄ Ｂｕｒｎｓ，２００１。あるいは、より最近のプロトコルでは、Ａｄ感染工程を、ＶＡ、Ｅ２Ａ及びＥ４遺伝子を含むアデノウイルス「ヘルパープラスミド」でのトランスフェクションに置き換えることができる。Ｘｉａｏ ｅｔ ａｌ．１９９８；Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａ，ｅｔ ａｌ．１９９８。
【0181】
従来、ｒＡＡＶ産生のヘルパーウイルスとしてＡｄが使用されてきたが、単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ－１）などの他のＤＮＡウイルスも同様に使用できる。ＡＡＶ２の複製とパッケージングに必要なＨＳＶ－１遺伝子の最小セットが特定されており、初期遺伝子ＵＬ５、ＵＬ８、ＵＬ５２及びＵＬ２９が含まれる。Ｍｕｚｙｃｚｋａ ａｎｄ Ｂｕｒｎｓ，２００１。これらの遺伝子は、ＨＳＶ－１コア複製機構の成分、すなわち、ヘリカーゼ、プライマーゼ、プライマーゼアクセサリータンパク質、及び一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質をコードする。Ｋｎｉｐｅ，１９８９；Ｗｅｌｌｅｒ，１９９１。ＨＳＶ－１のこのｒＡＡＶヘルパー特性は、ｒＡＡＶ産生に必要なヘルパーウイルス遺伝子産物を提供できる組換えヘルペスウイルスベクターの設計及び構築に利用されてきた。Ｃｏｎｗａｙ ｅｔ ａｌ．１９９９。
【0182】
遺伝子治療のためのｒＡＡＶベクターの産生は、懸濁液中で増殖させたＢＨＫ細胞などの適切な産生細胞株を使用して、ｉｎ ｖｉｔｒｏで実施される。本開示での使用に適した他の細胞株には、ＨＥＫ－２９３（２９３）、Ｖｅｒｏ、ＲＤ、ＢＨＫ－２１、ＨＴ－１０８０、Ａ５４９、Ｃｏｓ－７、ＡＲＰＥ－１９及びＭＲＣ－５が含まれる。
【0183】
細胞がヘルペスウイルスの複製を支持できる限り、任意の細胞型を宿主細胞として使用することができる。当業者は、宿主細胞からのヘルペスウイルスの産生に使用できる広範囲の宿主細胞に精通しているであろう。適切な遺伝子改変されていない哺乳動物宿主細胞の例には、例えば、ＨＥＫ－２９３（２９３）、Ｖｅｒｏ、ＲＤ、ＢＨＫ－２１、ＨＴ－１０８０、Ａ５４９、Ｃｏｓ－７、ＡＲＰＥ－１９及びＭＲＣ－５などの細胞株が含まれるが、これらに限定されない。
【0184】
宿主細胞は、懸濁培養での増殖に適合させることができる。本開示の特定の実施形態では、宿主細胞はベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞である。懸濁液中で増殖するＢＨＫ細胞株は、接着ＢＨＫ細胞株の適応に由来する。両方の細胞株は市販されている。
【0185】
ｒＨＳＶベースのｒＡＡＶ製造プロセス
懸濁液中で増殖する細胞における組換えＡＡＶウイルス粒子の産生のための方法は、本明細書に記載される。いくつかの実施形態によれば、ＡＡＶ粒子は、例えば、非バリアントＡＡＶカプシドポリペプチドと比較して、内耳組織または細胞において向性及び／または形質導入の増加を示す、本明細書（例えば、表１）に記載のＡＡＶバリアントカプシドポリペプチドを含む。連続的に確立された細胞株からの懸濁培養または非足場依存培養は、細胞及び細胞製品の大規模生産の最も広く使用されている手段である。発酵技術に基づく大規模な懸濁培養は、哺乳動物細胞製品の製造に明らかな利点を有する。温度、溶存酸素及びｐＨの正確な監視と制御を可能にし、培養の代表的な試料を確実に採取できるように、バイオリアクター内で均一な条件を提供できる。使用されるｒＨＳＶベクターは、組織培養フラスコとバイオリアクターの両方で許容細胞株で高力価まで容易に増殖し、臨床及び市場生産に必要なウイルス生産レベルの規模拡大に適した生産プロトコルを提供する。
懸濁液中で増殖する細胞における組換えＡＡＶウイルス粒子の産生のための方法は、本明細書に記載される。いくつかの実施形態によれば、ＡＡＶ粒子は、例えば、非バリアントＡＡＶカプシドポリペプチドと比較して、内耳組織または細胞において向性及び／または形質導入の増加を示す、本明細書（例えば、表１）に記載のＡＡＶバリアントカプシドポリペプチドを含む。連続的に確立された細胞株からの懸濁培養または非足場依存培養は、細胞及び細胞製品の大規模生産の最も広く使用されている手段である。発酵技術に基づく大規模な懸濁培養は、哺乳動物細胞製品の製造に明らかな利点を有する。温度、溶存酸素及びｐＨの正確な監視と制御を可能にし、培養の代表的な試料を確実に採取できるように、バイオリアクター内で均一な条件を提供できる。使用されるｒＨＳＶベクターは、組織培養フラスコとバイオリアクターの両方で許容細胞株で高力価まで容易に増殖し、臨床及び市場生産に必要なウイルス生産レベルの規模拡大に適した生産プロトコルを提供する。
【0186】
撹拌槽バイオリアクターでの細胞培養は、非常に高い容積比培養表面積を提供し、ウイルスワクチンの生産に使用されてきた（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，１９８６）。更に、撹拌槽バイオリアクターは、工業的に拡張可能であることが証明されている。その一例がマルチプレートＣＥＬＬ ＣＵＢＥ細胞培養システムである。感染性ウイルスベクターを生成する能力は、特に遺伝子治療の文脈において、製薬業界にとってますます重要になっている。
【0187】
本明細書に記載の方法による細胞の増殖は、本開示のヘルペスベクターに感染可能な完全に生物学的に活性な細胞の大規模生産を可能にするバイオリアクターで行うことができる。バイオリアクターは、懸濁液及び足場に依存する動物細胞培養の両方から生物学的産物を生産するために広く使用されてきた。ほとんどの大規模な懸濁培養は、操作と規模拡張が最も簡単であるため、バッチまたは流加プロセスとして行われる。ただし、ケモスタットまたは灌流の原理に基づく連続プロセスが利用可能である。バイオリアクターシステムは、培地交換を可能にするシステムを含むように設定することができる。例えば、フィルターをバイオリアクターシステムに組み込んで、使用済み培地から細胞を分離して培地交換を容易にすることができる。ヘルペスウイルスを産生するための本方法のいくつかの実施形態では、培地交換及び灌流は、細胞増殖の特定の日に開始して実施される。例えば、培地交換と灌流は、細胞増殖の３日目に開始できる。フィルターは、バイオリアクターの外部にあってもよいし、バイオリアクターの内部にあってもよい。
【0188】
組換えＡＡＶウイルス粒子を産生するための方法は、懸濁細胞を、それぞれプロモーターに作動可能に連結したＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子をコードする核酸を含む第１の組換えヘルペスウイルスと、遺伝子構築物、例えば、ＧＪＢ２遺伝子構築物及び目的の前記遺伝子に作動可能に連結したプロモーターを含む第２の組換えヘルペスウイルスと共感染させることと、それによって組換えＡＡＶウイルス粒子を生成することと、を含み得る。細胞は、ＨＥＫ－２９３（２９３）、Ｖｅｒｏ、ＲＤ、ＢＨＫ－２１、ＨＴ－１０８０、Ａ５４９、Ｃｏｓ－７、ＡＲＰＥ－１９及びＭＲＣ－５であり得る。いくつかの実施形態によれば、ｃａｐ遺伝子は、その変異体またはハイブリッド（例えば、２つ以上の血清型のカプシドハイブリッド）を含む、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ－、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ１０、Ａｎｃ８０Ｌ６５からなる群から選択される血清型を有するＡＡＶから選択され得る。いくつかの実施形態によれば、ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子は、例えば、非バリアントＡＡＶカプシドポリペプチドと比較して、内耳組織または細胞において向性及び／または形質導入の増加を示す、本明細書（例えば、表１）に記載のＡＡＶバリアントカプシドポリペプチドをコードする。細胞は、３～１４の間の結合感染多重度（ＭＯＩ）で感染し得る。第１のヘルペスウイルス及び第２のヘルペスウイルスは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、単純ヘルペス（ＨＳＶ）及び水痘帯状疱疹（ＶＺＶ）及びエプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）からなる群から選択されるウイルスであり得る。ヘルペスウイルスは複製欠損であり得る。共感染は、同時感染であり得る。
【0189】
哺乳動物細胞の組換えＡＡＶウイルス粒子を産生するための方法は、懸濁細胞を、それぞれプロモーターに作動可能に連結したＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子をコードする核酸を含む第１の組換えヘルペスウイルスと、遺伝子構築物、例えば、ＧＪＢ２遺伝子構築物及び前記遺伝子構築物、例えば、ＧＪＢ２遺伝子構築物に作動可能に連結したプロモーターを含む第２の組換えヘルペスウイルスと共感染させることと、細胞の増殖を可能にすることと、それによって組換えＡＡＶウイルス粒子を生成することと、を含み得、ここで、産生されたウイルス粒子の数は、接着条件下で同数の細胞で増殖したウイルス粒子の数と同じか、またはそれ以上である。細胞は、ＨＥＫ－２９３（２９３）、Ｖｅｒｏ、ＲＤ、ＢＨＫ－２１、ＨＴ－１０８０、Ａ５４９、Ｃｏｓ－７、ＡＲＰＥ－１９及びＭＲＣ－５であり得る。ｃａｐ遺伝子は、その変異体またはハイブリッド（例えば、２つ以上の血清型のカプシドハイブリッド）を含む、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ１０、Ａｎｃ８０Ｌ６５からなる群から選択される血清型を有するＡＡＶから選択され得る。いくつかの実施形態によれば、ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子は、例えば、非バリアントＡＡＶカプシドポリペプチドと比較して、内耳組織または細胞において増加した向性及び／または形質導入を示す、本明細書（例えば、表１）に記載のＡＡＶバリアントカプシドポリペプチドをコードする。細胞は、３～１４の間の結合感染多重度（ＭＯＩ）で感染し得る。第１のヘルペスウイルス及び第２のヘルペスウイルスは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、単純ヘルペス（ＨＳＶ）及び水痘帯状疱疹（ＶＺＶ）及びエプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）からなる群から選択されるウイルスであり得る。ヘルペスウイルスは複製欠損であり得る。共感染は、同時感染であり得る。
【0190】
治療用タンパク質をコードする核酸配列を懸濁細胞に送達する方法であって、前記方法は、ＢＨＫ細胞を、それぞれプロモーターに作動可能に連結したＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子をコードする核酸を含む第１の組換えヘルペスウイルスと、遺伝子構築物、例えば、ＧＪＢ２遺伝子構築物（目的の遺伝子は配列を治療用タンパク質をコードする核酸を含む）及び前記遺伝子、例えば、ＧＪＢ２遺伝子に作動可能に連結したプロモーターを含む第２の組換えヘルペスウイルスと共感染させることであって、ここで、前記細胞は、３と１４の間の結合感染多重度（ＭＯＩ）で感染する、共感染させることと、ウイルスが細胞に感染し、治療用タンパク質を発現することを可能にすることと、それにより治療用タンパク質をコードする核酸配列が細胞に送達されることと、を含む。細胞は、ＨＥＫ－２９３（２９３）、Ｖｅｒｏ、ＲＤ、ＢＨＫ－２１、ＨＴ－１０８０、Ａ５４９、Ｃｏｓ－７、ＡＲＰＥ－１９及びＭＲＣ－５であり得る。例えば、米国特許第９，７８３，８２６号を参照のこと。いくつかの実施形態によれば、ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子は、例えば、非バリアントＡＡＶカプシドポリペプチドと比較して、内耳組織または細胞において増加した向性及び／または形質導入を示す、本明細書（例えば、表１）に記載のＡＡＶバリアントカプシドポリペプチドをコードする。
【0191】
治療の方法
ＡＡＶと遺伝子治療
遺伝子治療とは、疾患の原因となる遺伝子を置換、変更または補足することによる、遺伝性疾患または後天性疾患の治療を指す。これは、一般にビヒクルまたはベクターを用いて、修正遺伝子（複数可）を宿主細胞に導入することによって達成される。いくつかの実施形態によれば、本明細書に記載のｒＡＡＶは、例えば、非バリアントＡＡＶカプシドポリペプチドと比較して、内耳組織または細胞において増加した向性及び／または形質導入を示す、ＡＡＶバリアントカプシドポリペプチドを含む（例えば、表１）。
ＡＡＶと遺伝子治療
遺伝子治療とは、疾患の原因となる遺伝子を置換、変更または補足することによる、遺伝性疾患または後天性疾患の治療を指す。これは、一般にビヒクルまたはベクターを用いて、修正遺伝子（複数可）を宿主細胞に導入することによって達成される。いくつかの実施形態によれば、本明細書に記載のｒＡＡＶは、例えば、非バリアントＡＡＶカプシドポリペプチドと比較して、内耳組織または細胞において増加した向性及び／または形質導入を示す、ＡＡＶバリアントカプシドポリペプチドを含む（例えば、表１）。
【0192】
いくつかの実施形態によれば、ＧＪＢ２ ＡＡＶ構築物は、ＤＦＮＢ１聴覚消失表現型の治療のための遺伝子治療ビヒクルを提供する。本明細書に記載のＧＪＢ２ ＡＡＶ遺伝子治療構築物及び使用方法は、患者が利用できる遺伝子治療に基づく治療がないため、長い間必要性が対処されていない、ＤＦＮＢ１聴覚消失の治療を提供する。
【0193】
難聴の治療方法
本明細書では、対象の聴覚障害を治療するため、または難聴（または更なる難聴）を予防するために使用できる方法が提供される。本明細書に記載の核酸の１つ以上の内耳内、例えば、蝸牛の細胞（または、蝸牛の細胞または蝸牛細胞）への送達を使用して、典型的には部分難聴または完全な聴覚消失によって定義される聴覚障害を治療することができる。
本明細書では、対象の聴覚障害を治療するため、または難聴（または更なる難聴）を予防するために使用できる方法が提供される。本明細書に記載の核酸の１つ以上の内耳内、例えば、蝸牛の細胞（または、蝸牛の細胞または蝸牛細胞）への送達を使用して、典型的には部分難聴または完全な聴覚消失によって定義される聴覚障害を治療することができる。
【0194】
いくつかの実施形態によれば、先天性の進行性及び非進行性の軽度から重度の感音難聴によって特徴付けられる非症候性難聴ならびに聴覚消失を治療するためにＧＪＢ２ ＡＡＶベースの遺伝子治療を用いる方法が、本明細書で提供される。本明細書に記載のＧＪＢ２ ＡＡＶ遺伝子治療構築物及び使用方法は、遺伝子補充によって先天性聴覚消失を矯正するための長期（例えば、生涯）治療の例を提供する。重要なことに、本明細書に記載のＧＪＢ２ ＡＡＶ遺伝子治療構築物及び使用方法は、自然の聴力を維持するが、人工内耳はそうではない。
【0195】
本明細書に記載の方法は、哺乳動物細胞における組換えＡＡＶウイルス粒子の産生を可能にし、これは、懸濁液中で増殖することができる哺乳動物細胞を、第１の組換えヘルペスウイルス、及び遺伝性聴覚消失の治療において治療価値を有するＧＪＢ２遺伝子構築物を含む第２の組換えヘルペスウイルスを共感染させることを含む。
【0196】
ＧＪＢ２は、他のギャップ結合タンパク質と関連する主要なギャップ結合タンパク質であるコネキシン２６（Ｃｘ２６）をコードし、蝸牛の非感覚細胞間の細胞間結合を可能にする広範なネットワークを提供する。更に、ＧＪＢ２／Ｃｘ２６は、コルチ器のカリウム勾配恒常性を維持することにより、正常な聴力に必要なギャップ結合ネットワークの形成に重要な役割を果たすことができる。ＧＪＢ２に常染色体劣性突然変異を有する個人はＤＦＮＢ１聴覚消失表現型を示し、これは遺伝的難聴の全症例のほぼ半分を占め、１０００人の出生ごとに約２～３人の有病率を示す。これらは、ホモ接合性または複合ヘテロ接合性の突然変異として現れる（ｄｅｌ Ｃａｓｔｉｌｌｏ＆ｄｅｌ Ｃａｓｔｉｌｌｏ，Ｆｒｏｎｔ Ｍｏｌ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２０１７；１０：４２８）。更に、加齢に関連する難聴が加速するリスクがあるヘテロ接合保因者がいる（ｄｅｌ Ｃａｓｔｉｌｌｏ＆ｄｅｌ Ｃａｓｔｉｌｌｏ，Ｆｒｏｎｔ Ｍｏｌ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２０１７；１０：４２８）。
【0197】
一態様では、本開示は、先天性聴覚消失の全症例の約４５％を占める、ＧＪＢ２突然変異による遺伝的難聴を治療または予防するための新規のｒＡＡＶベースの遺伝子治療に関する。更に、本開示は、ヘテロ接合変異に関連する難聴の治療または予防に関する。本開示で詳述されるｒＡＡＶ構築物は、常染色体劣性ＧＪＢ２突然変異体（ＤＦＮＢ１）及び常染色体優性ＧＪＢ２突然変異体（ＤＦＮＡ３Ａ）の両方の予防または治療のための言語修得前または言語後療法に対応し、蝸牛内送達に必要な任意の方法によって投与される。本明細書に記載の遺伝子構築物は、ＤＦＮＢ１聴覚消失を治療及び／または予防するための方法及び／または組成物において使用され得る。
【0198】
いくつかの実施形態によれば、ＧＪＢ２ ＡＡＶ遺伝子治療は、重大な難聴を既に発症している対象に投与される。いくつかの実施形態によれば、ＧＪＢ２ ＡＡＶ遺伝子治療は、対象が難聴を発症する前に投与される。いくつかの実施形態によれば、対象は、ＧＪＢ２における難聴の原因となる突然変異を同定するための分子遺伝学的検査によってＤＦＮＢ１と診断される。いくつかの実施形態によれば、対象は、非症候性難聴及び聴覚消失を有する家族を有する。いくつかの実施形態によれば、対象は子供である。いくつかの実施形態によれば、対象は乳児である。
【0199】
本明細書に記載のｒＡＡＶ構築物は、内耳細胞及び組織、例えば、蝸牛細胞に、従来のＡＡＶベクターよりも高い効率で形質導入する。いくつかの実施形態によれば、本明細書に記載の組成物及び方法は、内耳細胞、例えば、蝸牛細胞への核酸の非常に効率的な送達を可能にする。いくつかの実施形態によれば、本明細書に記載の組成物及び方法は、少なくとも３０％（例えば、少なくとも３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％）の内耳細胞、例えば、蝸牛細胞への導入遺伝子の送達及び発現を可能にする。いくつかの実施形態によれば、本明細書に記載の組成物及び方法は、少なくとも５０％（例えば、少なくとも５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％）の内耳細胞、例えば、蝸牛細胞への導入遺伝子の送達及び発現を可能にする。いくつかの実施形態によれば、本明細書に記載の組成物及び方法は、少なくとも７０％（例えば、少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％）の内耳細胞、例えば、蝸牛細胞への導入遺伝子の送達及び発現を可能にする。いくつかの実施形態によれば、本明細書に記載の組成物及び方法は、少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％）の内耳細胞、例えば、蝸牛細胞への導入遺伝子の送達及び発現を可能にする。
【0200】
本明細書に記載のｒＡＡＶ構築物は、従来のＡＡＶベクターよりも高い効率で、聴覚有毛細胞、例えば、内有毛細胞及び／または外有毛細胞に形質導入する。いくつかの実施形態によれば、本明細書に記載の組成物及び方法は、聴覚有毛細胞、例えば、内有毛細胞及び／または外有毛細胞への核酸の非常に効率的な送達を可能にする。いくつかの実施形態によれば、本明細書に記載の組成物及び方法は、少なくとも３０％（例えば、少なくとも３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％）の内有毛細胞への導入遺伝子の送達及び発現、または少なくとも３０％（例えば、少なくとも３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％）の外有毛細胞への導入遺伝子の送達及び発現を可能にする。いくつかの実施形態によれば、本明細書に記載の組成物及び方法は、少なくとも５０％（例えば、少なくとも５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％）の内有毛細胞への導入遺伝子の送達及び発現、または少なくとも５０％（例えば、少なくとも５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％）の外有毛細胞への導入遺伝子の送達及び発現を可能にする。いくつかの実施形態によれば、本明細書に記載の組成物及び方法は、少なくとも７０％（例えば、少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％）の内有毛細胞への導入遺伝子の送達及び発現、または少なくとも７０％（例えば、少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％）の外有毛細胞への導入遺伝子の送達及び発現を可能にする。いくつかの実施形態によれば、本明細書に記載の組成物及び方法は、少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％）の内有毛細胞への導入遺伝子の送達及び発現、または少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％）の外有毛細胞への導入遺伝子の送達及び発現を可能にする。
【0201】
本明細書に記載のｒＡＡＶ構築物は、内耳支持細胞に、従来のＡＡＶベクターよりも高い効率で形質導入する。いくつかの実施形態によれば、本明細書に記載の組成物及び方法は、内耳細胞支持細胞への核酸の非常に効率的な送達を可能にする。いくつかの実施形態によれば、本明細書に記載の組成物及び方法は、少なくとも３０％（例えば、少なくとも３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％）の内耳支持細胞への導入遺伝子の送達及び発現を可能にする。いくつかの実施形態によれば、本明細書に記載の組成物及び方法は、少なくとも５０％（例えば、少なくとも５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％）の内耳支持細胞への導入遺伝子の送達及び発現を可能にする。いくつかの実施形態によれば、本明細書に記載の組成物及び方法は、少なくとも７０％（例えば、少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％）の内耳支持細胞への導入遺伝子の送達及び発現を可能にする。いくつかの実施形態によれば、本明細書に記載の組成物及び方法は、少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％）の内耳支持細胞への導入遺伝子の送達及び発現を可能にする。
【0202】
いくつかの実施形態によれば、本明細書に記載の核酸配列は細胞内に直接導入され、ここで、核酸配列は発現され、コードされた産物を産生させた後、得られた組換え細胞をｉｎ ｖｉｖｏで投与する。これは、当技術分野で公知の多数の方法のいずれかによって、例えば、電気穿孔、リポフェクション、リン酸カルシウム媒介トランスフェクションなどの方法によって達成することができる。
【0203】
したがって、ＧＪＢ２などの遺伝子の欠損に関連する難聴を治療または予防するための方法が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、方法は、それを必要とする対象に、（ｉ）任意選択で、非バリアントＡＡＶカプシドポリペプチドと比較して、内耳組織または細胞において増大した向性を示すバリアントＡＡＶカプシドポリペプチド、及び（ｉｉ）遺伝子をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドを含む有効量の組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオンを投与することを含む。
【0204】
更に、難聴に関連するＧＪＢ２などの遺伝子をコードする核酸配列を内耳組織または細胞に送達するための方法が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、方法は、それを必要とする対象に、（ｉ）任意選択で、非バリアントＡＡＶカプシドポリペプチドと比較して、内耳組織または細胞において増大した向性を示すバリアントＡＡＶカプシドポリペプチド、及び（ｉｉ）遺伝子をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドを含む有効量の組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオンを投与することを含む。
【0205】
本明細書で提供される方法は、内耳組織または細胞における遺伝子の発現の増加をもたらすことができる。いくつかの実施形態によれば、本方法は、任意選択で、遺伝子の通常の発現と比較して、遺伝子、例えば、ＧＪＢ２の発現を少なくとも約１倍、１．２５倍、１．５倍、１．７５倍、２倍、２．５倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１２倍、１４倍、１６倍、１８倍、２０倍増加させる。いくつかの実施形態では、本方法は、内耳組織または細胞における遺伝子、例えば、ＧＪＢ２の過剰発現をもたらすことができる。
【0206】
本明細書で提供される方法は、ｒＡＡＶ中和抗体（ＮＡｂ）力価のレベルの低下をもたらし得る。いくつかの実施形態によれば、本明細書に記載の方法は、任意選択で、対照レベルと比較して、ｒＡＡＶ Ｎａｂ力価のレベルを少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％低下させる。
【0207】
本明細書で提供される方法は、内耳の炎症及び／または毒性のレベルを低下させることができる。いくつかの実施形態によれば、本方法は、任意選択で、投与前の内耳炎症または毒性レベルと比較して、内耳炎症または毒性レベルを少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％低下させる。いくつかの実施形態では、本方法は、任意選択で、投与前の内耳炎症または毒性の進行と比較して、任意選択で、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％の内耳炎症または毒性の進行の遅延をもたらす。特定の実施形態では、内耳炎症及び／または毒性のレベルは、非バリアントＡＡＶカプシドを含むＡＡＶビリオンの投与に関連する内耳炎症及び／または毒性のレベルである。特定の実施形態では、内耳炎症及び／または毒性のレベルは、対象における難聴により特徴付けられる基礎疾患及び／または障害に関連する内耳炎症及び／または毒性のレベルである。
【0208】
本明細書で提供される方法は、有毛細胞の喪失、変性及び／または死滅レベルの低下をもたらすことができる。いくつかの実施形態によれば、本方法は、任意選択で、投与前の有毛細胞の喪失、変性及び／または死滅レベルと比較して、有毛細胞の損失、変性及び／または死滅レベルを少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％低下させる。
【0209】
本明細書で提供される方法は、らせん神経節細胞の喪失、変性及び／または死滅レベルの低下をもたらすことができる。いくつかの実施形態によれば、本方法は、任意選択で、投与前のらせん神経節細胞の損失、変性及び／または死滅レベルと比較して、らせん神経節細胞の損失、変性及び／または死滅レベルを少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％低下させる。
【0210】
本明細書で提供される方法は、聴力の様々な改善をもたらすことができる。聴力の改善は、当技術分野で公知の多くの方法で評価することができる。例えば、生理学的検査は、聴覚系の機能状態を客観的に判断するために使用することができ、年齢を問わず実施することができる。生理学的検査の例としては、聴覚脳幹反応検査（ＡＢＲ；ＢＡＥＲ、ＢＳＥＲとも称される）、聴覚定常状態反応検査（ＡＳＳＲ）、誘発耳音響放射（ＥＯＡＥ）、イミタンス検査（ティンパノメトリー、音響反射閾値、音響反射減衰）を含む。
【0211】
聴性脳幹反応検査（ＡＢＲ；ＢＡＥＲ、ＢＳＥＲとも称される）は、刺激（クリック音または純音）を使用して、第８脳神経及び聴性脳幹に由来し、表面電極で記録される電気生理学的反応を誘発する。
【0212】
聴覚定常状態反応検査（ＡＳＳＲ）は、どちらも聴覚誘発電位であり、同様の方法で測定されるという点でＡＢＲに似ている。ＡＳＳＲは、客観的な統計ベースの数学的検出アルゴリズムを使用して、聴覚閾値を検出及び定義する。ＡＳＳＲは、広帯域または周波数固有の刺激を使用して取得でき、重度から最重度の範囲で聴覚閾値の区別を提供できる。それは、ＡＢＲが提供しない周波数固有の情報を提供するためによく使用される。５００、１０００、２０００及び４０００Ｈｚの検査周波数が一般的に使用される。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、ＡＳＳＲ応答の改善をもたらす。
【0213】
誘発耳音響放射（ＥＯＡＥ）は、マイクロフォンとトランスデューサを備えたプローブを使用して外耳道で測定される、蝸牛内で発生する音である。ＥＯＡＥは主に、広い周波数範囲にわたる蝸牛の外有毛細胞の活動を反映し、４０～５０ｄＢ ＨＬよりも優れた聴力を有する耳に存在する。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、ＥＯＡＥ応答の改善をもたらす。
【0214】
イミタンス検査（ティンパノメトリー、音響反射閾値、音響反射減衰）では、中耳圧、鼓膜の可動性、耳管機能、中耳小骨の可動性を含む末梢聴覚系を評価する。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、イミタンス検査応答の改善をもたらす。
【0215】
本明細書で提供される方法は、歪成分耳音響放射（ＤＰＯＡＥ）プロファイルの改善をもたらすことができる。例えば、ＤＰＯＡＥは、外耳道内に提示される所与の周波数及び音圧レベルの２つのトーンに応答して蝸牛内で生成され得る。特定の実施形態では、ＤＰＯＡＥは、正常に機能する蝸牛外有毛細胞の客観的指標として役立ち得る。いくつかの実施形態によれば、本明細書に記載する方法は、ＤＰＯＡＥプロファイルの悪化の防止、遅延または減速をもたらす。
【0216】
本明細書で提供される方法は、改善された音声理解をもたらすことができる。いくつかの実施形態では、本方法の結果は、音声理解の低下を防止、遅延または減速をもたらすことができる。
【0217】
本明細書で使用する場合、対照レベルは、例えば、ｒＡＡＶの投与前に、対象から得られたレベル、任意選択で、対象からの試料に基づくことができる。いくつかの実施形態では、対照レベルは、バリアントＡＡＶカプシドポリペプチドを含まないｒＡＡＶの投与から得られるレベルに基づき、任意選択で、バリアントＡＡＶカプシドポリペプチドを含まないｒＡＡＶは、ＡＡＶ２及びＡｎｃ８０Ｌ６５から選択されるｒＡＡＶカプシドポリペプチドを含む。
【0218】
本方法は、側壁またはらせん靭帯の細胞、コルチ器の支持細胞、らせん靭帯の線維細胞、クラウジウス細胞、ベッチェル細胞、らせん隆起の細胞、前庭支持細胞、ヘンゼン細胞、ダイテルス細胞、柱細胞、内指節細胞、外指骨細胞、境界細胞、内蝸牛有毛細胞、外蝸牛有毛細胞、らせん神経節細胞、前庭有毛細胞、前庭支持細胞、及び／または前庭神経節細胞におけるＧＪＢ２などの目的の遺伝子をコードする核酸配列への送達及びその発現をもたらすことができる。特定の実施形態では、本方法は、細胞側壁またはらせん靭帯の支持細胞、コルチ器の支持細胞、らせん靭帯の線維細胞、クラウジウス細胞、ベッチェル細胞、らせん突起の細胞、前庭支持細胞、ヘンゼン細胞、ダイテルス細胞、柱細胞、内指節骨細胞、外側指節細胞、境界細胞、内及び外蝸牛有毛細胞、らせん神経節細胞、前庭有毛細胞、前庭支持細胞、及び／または前庭神経節の神経細胞の少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％のＧＪＢ２などの目的の遺伝子をコードする核酸配列への送達及びその発現をもたらす。
【0219】
医薬組成物
いくつかの態様によれば、本開示は、任意選択で、薬学的に許容される賦形剤中に、本明細書に記載のＡＡＶのいずれかを含む医薬組成物を提供する。例えば、本開示は、（ｉ）任意選択で、非バリアントＡＡＶカプシドポリペプチドと比較して、内耳組織または細胞において増大した向性を示すバリアントＡＡＶカプシドポリペプチド、及び（ｉｉ）目的の遺伝子、例えば、ＧＪＢ２をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドを含む有効量の組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオンを含む、様々な組成物を提供する。
いくつかの態様によれば、本開示は、任意選択で、薬学的に許容される賦形剤中に、本明細書に記載のＡＡＶのいずれかを含む医薬組成物を提供する。例えば、本開示は、（ｉ）任意選択で、非バリアントＡＡＶカプシドポリペプチドと比較して、内耳組織または細胞において増大した向性を示すバリアントＡＡＶカプシドポリペプチド、及び（ｉｉ）目的の遺伝子、例えば、ＧＪＢ２をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドを含む有効量の組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオンを含む、様々な組成物を提供する。
【0220】
当技術分野で周知のように、薬学的に許容される賦形剤は、薬理学的に有効な物質の投与を容易にする比較的不活性な物質であり、液体溶液もしくは懸濁液として、エマルションとして、または使用前に液体に溶解もしくは懸濁するのに適した固体形態として供給することができる。例えば、賦形剤は、形態または一貫性を付与することができるか、または希釈剤として機能することができる。適切な賦形剤には、安定化剤、湿潤剤及び乳化剤、浸透圧を変えるための塩、封入剤、ｐＨ緩衝物質、ならびに緩衝剤が含まれるが、これらに限定されない。このような賦形剤には、過度の毒性なしに投与することができる耳（例えば、内耳）への直接送達に適した任意の医薬品が含まれる。薬学的に許容される賦形剤には、ソルビトール、様々なＴＷＥＥＮ化合物のうちのいずれか、ならびに水、生理食塩水、グリセロール及びエタノールなどの液体を含むが、これらに限定されない。薬学的に許容される塩、例えば、塩酸塩、水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩などの鉱酸塩、及び酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩などの有機酸塩をその中に含んでもよい。薬学的に許容される賦形剤の詳細な議論は、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂ．Ｃｏ．，ＮＪ１９９１）で入手できる。
【0221】
いくつかの実施形態によれば、医薬組成物は、ＢＳＳＴ、ＰＢＳまたはＢＳＳのうちの１つ以上を含む。
【0222】
いくつかの実施形態によれば、医薬組成物は、ヒスチジン緩衝液を更に含む。
【0223】
必須ではないが、組成物は、正確な量の投与に適した単位剤形で任意選択で供給されてもよい。
【0224】
いくつかの実施形態によれば、組成物は、人工内耳の前に対象に投与される。
【0225】
投与方法
一般に、本明細書に記載の組成物は、耳への投与のために処方される。いくつかの実施形態によれば、組成物は、蝸牛のコルチ器（ＯＣ）の細胞への投与のために処方される。ＯＣの細胞には、ヘンゼン細胞、ダイテルス細胞、柱細胞、内指節細胞及び／または外指節細胞／境界細胞が含まれる。ＯＣには、２つの種類の感覚有毛細胞：音によって運ばれる力学的な情報を神経細胞構造に伝わる電気信号に変換する内有毛細胞（ＩＨＣ）、及び複雑な聴覚機能に必要な蝸牛応答を増幅かつ調整する役割を担う外有毛細胞（ＯＨＣ）が含まれる。いくつかの実施形態によれば、組成物は、ＩＨＣ及び／またはＯＨＣへの投与のために処方される。
一般に、本明細書に記載の組成物は、耳への投与のために処方される。いくつかの実施形態によれば、組成物は、蝸牛のコルチ器（ＯＣ）の細胞への投与のために処方される。ＯＣの細胞には、ヘンゼン細胞、ダイテルス細胞、柱細胞、内指節細胞及び／または外指節細胞／境界細胞が含まれる。ＯＣには、２つの種類の感覚有毛細胞：音によって運ばれる力学的な情報を神経細胞構造に伝わる電気信号に変換する内有毛細胞（ＩＨＣ）、及び複雑な聴覚機能に必要な蝸牛応答を増幅かつ調整する役割を担う外有毛細胞（ＯＨＣ）が含まれる。いくつかの実施形態によれば、組成物は、ＩＨＣ及び／またはＯＨＣへの投与のために処方される。
【0226】
高カリウム内リンパ液で満たされた蝸牛管への注射は、有毛細胞への直接アクセスを提供する可能性がある。しかし、このデリケートな液体環境の変化は、蝸牛内電位を混乱させ、注射関連毒性のリスクを高める可能性がある。蝸牛管、鼓室階及び前庭階を取り囲む外リンパで満たされた空間には、楕円または正円窓膜を通してアクセスできる。内耳への非骨性開口部である正円窓膜は、多くの動物モデルでアクセス可能であり、この経路を使用したウイルスベクターの投与は十分に許容される。ヒトでは、人工内耳の留置は通常、正円窓膜を介した外科用電極の挿入に依存する。いくつかの実施形態によれば、組成物は、正円窓膜を介した注射によって投与される。いくつかの実施形態によれば、組成物は、鼓室階または中心階への注射によって投与される。いくつかの実施形態によれば、組成物は、外科手術中、例えば、人口内耳手術中または管手術中に投与される。
【0227】
いくつかの実施形態によれば、組成物は、蝸牛または前庭系へ投与され、任意選択で、送達は、正円窓膜（ＲＷＭ）、卵円窓、もしくは半規管を介した蝸牛または前庭系への直接投与を含む。いくつかの実施形態では、直接投与は注射による。いくつかの実施形態では、投与は、静脈内、脳室内、蝸牛内、髄腔内、筋肉内、皮下またはこれらの組み合わせである。
【0228】
本明細書に記載の蝸牛細胞を安全かつ効果的に形質導入することにより、本開示の方法を使用して、例えば、ヒトなどの個体を治療することができ、ここで、形質導入された細胞は、聴力または前庭機能を長期間（例えば、数か月、数年、数十年、生涯）にわたって回復させるのに十分な量のＧＪＢ２を産生する。
【0229】
本開示の治療方法によれば、送達されるベクターの量は、対象の年齢など治療を受ける対象の特徴、及びベクターが送達される領域の容積に基づいて決定され得る。いくつかの実施形態によれば、注入される組成物の量は、約１０μｌと約１０００μｌの間、または約１０μｌと約５０μｌの間、または約２５μｌと約３５μｌの間、または約１００μｌと約１０００μｌの間、または約１００μｌと約５００μｌの間、または約５００μｌと約１０００μｌの間である。いくつかの実施形態によれば、注入される組成物の体積は、約１μｌ、２μｌ、３μｌ、４μｌ、５μｌ、６μｌ、７μｌ、８μｌ、９μｌ、１０μｌ、１５μｌ、２０μｌ、２５μｌ、３０μｌ、３５μｌ、４０μｌ、４５μｌ、５０μｌ、７５μｌ、１００μｌ、２００μｌ、３００μｌ、４００μｌ、５００μｌ、６００μｌ、７００μｌ、８００μｌ、９００μｌもしくは１ｍＬ、またはその間の任意の量のうちのいずれか１つ程度より多い。いくつかの実施形態によれば、注入される組成物の体積は、少なくとも約１μｌ、２μｌ、３μｌ、４μｌ、５μｌ、６μｌ、７μｌ、８μｌ、９μｌ、１０μｌ、１５μｌ、２０μｌ、２５μｌ、３０μｌ、３５μｌ、４０μｌ、４５μｌ、５０μｌ、７５μｌ、１００μｌ、２００μｌ、３００μｌ、４００μｌ、５００μｌ、６００μｌ、７００μｌ、８００μｌ、９００μｌもしくは１ｍＬ、またはその間の任意の量のうちのいずれか１つ程度である。いくつかの実施形態によれば、注入される組成物の体積は、約１μｌ、２μｌ、３μｌ、４μｌ、５μｌ、６μｌ、７μｌ、８μｌ、９μｌ、１０μｌ、１５μｌ、２０μｌ、２５μｌ、３０μｌ、３５μｌ、４０μｌ、４５μｌ、５０μｌ、７５μｌ、１００μｌ、２００μｌ、３００μｌ、４００μｌ、５００μｌ、６００μｌ、７００μｌ、８００μｌ、９００μｌもしくは１ｍＬ、またはその間の任意の量のうちのいずれか１つ程度である。
【0230】
本開示の治療方法によれば、投与されるベクターの濃度は、製造方法に応じて異なり得、特定の投与経路に対して治療上有効であると決定された濃度に基づいて選択または最適化され得る。いくつかの実施形態によれば、１ミリリットル当たりのベクターゲノムにおける濃度（ｖｇ／ｍｌ）は、約１０８ｖｇ／ｍｌ、約１０９ｖｇ／ｍｌ、約１０１０ｖｇ／ｍｌ、約１０１１ｖｇ／ｍｌ、約１０１２ｖｇ／ｍｌ、約１０１３ｖｇ／ｍｌ、及び約１０１４ｖｇ／ｍｌからなる群から選択される。好ましい態様では、濃度は１０１０ｖｇ／ｍｌ～１０１３ｖｇ／ｍｌの範囲である。
【0231】
本明細書に記載の組成物の有効性は、いくつかの基準によって監視することができる。例えば、本開示の方法を用いて対象を治療した後、対象は、例えば、疾患状態の１つ以上の徴候または症状の進行の改善及び／または安定化及び／または遅延について、本明細書に記載されているものを含む１つ以上の臨床パラメータによって評価され得る。このような試験の例は、当技術分野で公知であり、客観的及び主観的な（例えば、対象が報告した）尺度を含む。いくつかの実施形態によれば、これらの試験は、聴覚脳幹反応（ＡＢＲ）測定、音声知覚、コミュニケーションモード、及び聴覚反応認識の主観的評価を含み得るが、これらに限定されない。
【0232】
いくつかの実施形態によれば、無症候性難聴及び聴覚消失（ＤＦＮＢ１）を示す対象を最初に試験し、可聴範囲にわたる対象の閾値聴力感度を決定した。次いで、対象は、本明細書に記載のｒＡＡＶ組成物で治療された。ｄＢで測定された周波数に応じて閾値聴力レベルの変化が決定される。いくつかの実施形態によれば、聴力の改善は、任意の周波数での少なくとも１つの耳における閾値聴力感度の５ｄＢ～５０ｄＢの改善として決定される。いくつかの実施形態によれば、聴力の改善は、任意の周波数での少なくとも１つの耳における閾値聴力感度の１０ｄＢ～３０ｄＢの改善として決定される。いくつかの実施形態によれば、聴力の改善は、任意の周波数での少なくとも１つの耳における閾値聴力感度の１０ｄＢ～２０ｄＢの改善として決定される。
【0233】
非限定的な実施形態
１．遺伝子欠失に関連する難聴を治療または予防する方法であって、前記方法は、それを必要とする対象に、
（ｉ）任意選択で、非バリアントＡＡＶカプシドポリペプチドと比較して、内耳組織または細胞において増加した向性を示すバリアントＡＡＶカプシドポリペプチドと、
（ｉｉ）前記遺伝子をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドと、を含む、有効量の組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオンを投与することを含む、前記方法。
１．遺伝子欠失に関連する難聴を治療または予防する方法であって、前記方法は、それを必要とする対象に、
（ｉ）任意選択で、非バリアントＡＡＶカプシドポリペプチドと比較して、内耳組織または細胞において増加した向性を示すバリアントＡＡＶカプシドポリペプチドと、
（ｉｉ）前記遺伝子をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドと、を含む、有効量の組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオンを投与することを含む、前記方法。
【0234】
２．難聴に関連する遺伝子をコードする核酸配列を内耳組織または細胞に送達する方法であって、それを必要とする対象に、
（ｉ）任意選択で、非バリアントＡＡＶカプシドポリペプチドと比較して、内耳組織または細胞において増加した向性を示すバリアントＡＡＶカプシドポリペプチドと、
（ｉｉ）前記遺伝子をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドと、を含む、有効量の組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオンを投与することを含む、前記方法。
（ｉ）任意選択で、非バリアントＡＡＶカプシドポリペプチドと比較して、内耳組織または細胞において増加した向性を示すバリアントＡＡＶカプシドポリペプチドと、
（ｉｉ）前記遺伝子をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドと、を含む、有効量の組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオンを投与することを含む、前記方法。
【0235】
３．前記内耳組織または前記内耳細胞は、蝸牛組織もしくは蝸牛細胞、または前庭組織もしくは前庭細胞である、実施形態１または２に記載の方法。
【0236】
４．前記内耳組織または前記内耳細胞は、蝸牛組織もしくは蝸牛細胞である、実施形態１または２に記載の方法。
【0237】
５．前記バリアントＡＡＶカプシドポリペプチドは、任意選択で、バリアントＡＡＶ１カプシドポリペプチド、バリアントＡＡＶ２カプシドポリペプチド、バリアントＡＡＶ３カプシドポリペプチド、バリアントＡＡＶ４カプシドポリペプチド、バリアントＡＡＶ５カプシドポリペプチド、バリアントＡＡＶ６カプシドポリペプチド、バリアントＡＡＶ７カプシドポリペプチド、バリアントＡＡＶ８カプシドポリペプチド、バリアントＡＡＶ９カプシドポリペプチド、バリアントｒｈ－ＡＡＶ１０カプシドポリペプチド、バリアントＡＡＶ１０カプシドポリペプチド、バリアントＡＡＶ１１カプシドポリペプチド、バリアントＡＡＶ１２カプシドポリペプチド及びバリアントＡｎｃ８０カプシドポリペプチドからなる群から選択される任意のバリアントＡＡＶカプシドポリペプチドである、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。
【0238】
６．前記バリアントＡＡＶカプシドポリペプチドはバリアントＡＡＶ２カプシドポリペプチドである、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物。
【0239】
７．（ｉ）前記バリアントＡＡＶカプシドポリペプチドは、表１に列挙されたアミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも約８５％、９０％、９５％もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、任意選択で、前記ＡＡＶカプシドは、ＶＰ１、ＶＰ２またはＶＰ３カプシドポリペプチドからなる群から選択され、及び／または、
（ｉｉ）前記バリアントＡＡＶカプシドポリペプチドは、表１に列挙されたアミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも約８５％、９０％、９５％もしくは９９％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含み、任意選択で、前記ＡＡＶカプシドは、ＶＰ１、ＶＰ２またはＶＰ３カプシドポリペプチドからなる群から選択される、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。
（ｉｉ）前記バリアントＡＡＶカプシドポリペプチドは、表１に列挙されたアミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも約８５％、９０％、９５％もしくは９９％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含み、任意選択で、前記ＡＡＶカプシドは、ＶＰ１、ＶＰ２またはＶＰ３カプシドポリペプチドからなる群から選択される、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。
【0240】
８．前記バリアントＡＡＶカプシドポリペプチドは、野生型ＡＡＶ２カプシドポリペプチド（配列番号１８）に対して１つ以上のアミノ酸置換、挿入及び／または欠失を有するアミノ酸配列を含み、任意選択で、１つ以上のアミノ酸置換、挿入及び／または欠失は、Ｑ２６３、Ｓ２６４、Ｙ２７２、Ｙ４４４、Ｒ４８７、Ｐ４５１、Ｔ４５４、Ｔ４５５、Ｒ４５９、Ｋ４９０、Ｔ４９１、Ｓ４９２、Ａ４９３、Ｄ４９４、Ｅ４９９、Ｙ５００、Ｔ５０３、Ｋ５２７、Ｅ５３０、Ｅ５３１、Ｑ５４５、Ｇ５４６、Ｓ５４７、Ｅ５４８、Ｋ５４９、Ｔ５５０、Ｎ５５１、Ｖ５５２、Ｄ５５３、Ｅ５５５、Ｋ５５６、Ｒ５８５、Ｒ５８８及びＹ７３０からなる群から選択されるアミノ酸残基において生じる、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。
【0241】
９．前記バリアントＡＡＶカプシドポリペプチドは、Ｑ２６３Ｎ、Ｑ２６３Ａ、Ｓ２６４Ａ、Ｙ２７２Ｆ、Ｙ４４４Ｆ、Ｒ４８７Ｇ、Ｐ４５１Ａ、Ｔ４５４Ｎ、Ｔ４５５Ｖ、Ｒ４５９Ｔ、Ｋ４９０Ｔ、Ｔ４９１Ｑ、Ｓ４９２Ｄ、Ａ４９３Ｇ、Ｄ４９４Ｅ、Ｅ４９９Ｄ、Ｙ５００Ｆ、Ｔ５０３Ｐ、Ｋ５２７Ｒ、Ｅ５３０Ｄ、Ｅ５３１Ｄ、Ｑ５４５Ｅ、Ｇ５４６Ｄ、Ｇ５４６Ｓ、Ｓ５４７Ａ、Ｅ５４８Ｔ、Ｅ５４８Ａ、Ｋ５４９Ｅ、Ｋ５４９Ｇ、Ｔ５５０Ｎ、Ｔ５５０Ａ、Ｎ５５１Ｄ、Ｖ５５２Ｉ、Ｄ５５３Ａ、Ｅ５５５Ｄ、Ｋ５５６Ｒ、Ｋ５５６Ｓ、Ｒ５８５Ｓ、Ｒ５８８Ｔ及びＹ７３０Ｆからなる群から選択される野生型ＡＡＶ２カプシドポリペプチド（配列番号１８）に対して１つ以上のアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む、実施形態８に記載の方法。
【0242】
１０．前記バリアントＡＡＶカプシドポリペプチドは、
（ｉ）配列番号２７、２９、３１、３３または３５のいずれか１つのアミノ酸配列、
（ｉｉ）配列番号２７、２９、３１、３３または３５のいずれかに対して少なくとも約８５％、９０％、９５％または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列、または、
（ｉｉｉ）配列番号２６、２８、３０、３２または３４のいずれか１つの核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。
（ｉ）配列番号２７、２９、３１、３３または３５のいずれか１つのアミノ酸配列、
（ｉｉ）配列番号２７、２９、３１、３３または３５のいずれかに対して少なくとも約８５％、９０％、９５％または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列、または、
（ｉｉｉ）配列番号２６、２８、３０、３２または３４のいずれか１つの核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。
【0243】
１１．前記バリアントＡＡＶカプシドポリペプチドは配列番号２７のアミノ酸配列を含む、実施形態１～１０のいずれか１つに記載の方法。
【0244】
１２．前記バリアントＡＡＶカプシドポリペプチドは配列番号２９のアミノ酸配列を含む、実施形態１～１０のいずれか１つに記載の方法。
【0245】
１３．前記バリアントＡＡＶカプシドポリペプチドは配列番号３１のアミノ酸配列を含む、実施形態１～１０のいずれか１つに記載の方法。
【0246】
１４．前記バリアントＡＡＶカプシドポリペプチドは配列番号３３のアミノ酸配列を含む、実施形態１～１０のいずれか１つに記載の方法。
【0247】
１５．前記バリアントＡＡＶカプシドポリペプチドは配列番号３５のアミノ酸配列を含む、実施形態１～１０のいずれか１つに記載の方法。
【0248】
１６．前記バリアントＡＡＶカプシドポリペプチドは、任意選択で、非バリアントＡＡＶカプシドポリペプチドと比較して、任意選択で、少なくとも約１倍、１．２５倍、１．５倍、１．７５倍、２倍、２．５倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１２倍、１４倍、１６倍、１８倍、２０倍の前記内耳組織または前記内耳細胞におけるｒＡＡＶ向性レベルの増加をもたらす、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。
【0249】
１７．前記バリアントＡＡＶカプシドポリペプチドは、任意選択で、非バリアントＡＡＶカプシドポリペプチドと比較して、任意選択で、少なくとも約１倍、１．２５倍、１．５倍、１．７５倍、２倍、２．５倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１２倍、１４倍、１６倍、１８倍、２０倍の前記内耳組織または前記内耳細胞におけるｒＡＡＶ形質導入効率レベルの増加をもたらす、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。
【0250】
１８．前記方法は、任意選択で、前記遺伝子の 通常の発現と比較して、任意選択で、少なくとも約１倍、１．２５倍、１．５倍、１．７５倍、２倍、２．５倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１２倍、１４倍、１６倍、１８倍、２０倍の前記内耳組織または前記内耳細胞における前記遺伝子の発現の増加をもたらす、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。
【0251】
１９．前記方法は、前記内耳組織または前記内耳細胞におけるＧＪＢ２発現の過剰発現をもたらす、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。
【0252】
２０．前記方法は、任意選択で、対照レベルと比較して、任意選択で、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％のｒＡＡＶ中和抗体（ＮＡｂ）力価レベルの低下をもたらす、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。
【0253】
２１．前記方法は、任意選択で、投与前の内耳炎症または毒性レベルと比較して、任意選択で、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％の内耳炎症または内耳毒性レベルの低下をもたらす、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。
【0254】
２２．前記方法は、任意選択で、投与前の内耳炎症または毒性の進行と比較して、任意選択で、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％の内耳炎症または内耳毒性の進行の遅延をもたらす、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。
【0255】
２３．前記方法は、任意選択で、投与前の有毛細胞の喪失、変性及び／または死滅レベルと比較して、任意選択で、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％の有毛細胞の喪失、変性及び／または死滅レベルの低下をもたらす、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。
【0256】
２４．前記方法は、任意選択で、投与前のらせん神経節細胞の喪失、変性及び／または死滅レベルと比較して、任意選択で、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％のらせん神経節細胞の喪失、変性及び／または死滅レベルの低下をもたらす、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。
【0257】
２５．前記方法は、任意選択で、投与前の聴覚脳幹反応（ＡＢＲ）閾値レベルと比較して、任意の周波数での、任意選択で、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％のＡＢＲ閾値の減少をもたらす、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。
【0258】
２６．前記方法は、歪成分耳音響放射（ＤＰＯＡＥ）プロファイルの改善をもたらす、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。
【0259】
２７．前記方法は、ＤＰＯＡＥプロファイルの悪化の防止、遅延または減速をもたらす、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。
【0260】
２８．前記方法は、音声理解及び／または音声明瞭の改善をもたらす、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。
【0261】
２９．前記方法は、音声理解及び／または音声明瞭の低下の防止、遅延または減速をもたらす、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。
【0262】
３０．前記制御レベルは、
前記ｒＡＡＶの投与前に、前記対象から得られたレベル、任意選択で、前記対象からの試料に基づく、実施形態１６～２９のいずれか１つに記載の方法。
前記ｒＡＡＶの投与前に、前記対象から得られたレベル、任意選択で、前記対象からの試料に基づく、実施形態１６～２９のいずれか１つに記載の方法。
【0263】
３１．前記制御レベルは、
前記バリアントＡＡＶカプシドポリペプチドを含まないｒＡＡＶの前記投与から得られるレベルに基づき、任意選択で、前記バリアントＡＡＶカプシドポリペプチドを含まないｒＡＡＶは、ＡＡＶ２及びＡｎｃ８０Ｌ６５から選択されるｒＡＡＶカプシドポリペプチドを含む、実施形態１６～２９のいずれか１つに記載の方法。
前記バリアントＡＡＶカプシドポリペプチドを含まないｒＡＡＶの前記投与から得られるレベルに基づき、任意選択で、前記バリアントＡＡＶカプシドポリペプチドを含まないｒＡＡＶは、ＡＡＶ２及びＡｎｃ８０Ｌ６５から選択されるｒＡＡＶカプシドポリペプチドを含む、実施形態１６～２９のいずれか１つに記載の方法。
【0264】
３２．前記方法は、側壁またはらせん靭帯の細胞、コルチ器の支持細胞、らせん靭帯の線維細胞、クラウジウス細胞、ベッチェル細胞、らせん隆起の細胞、前庭支持細胞、ヘンゼン細胞、ダイテルス細胞、柱細胞、内指節細胞、外指骨細胞及び／または境界細胞におけるＧＪＢ２をコードする核酸配列への送達及びその発現をもたらす、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。
【0265】
３３．前記方法は、細胞側壁またはらせん靭帯の支持細胞、コルチ器の支持細胞、らせん靭帯の線維細胞、クラウジウス細胞、ベッチェル細胞、らせん突起の細胞、前庭支持細胞、ヘンゼン細胞、ダイテルス細胞、柱細胞、内指節骨細胞、外側指節細胞、境界細胞、内蝸牛有毛細胞、外蝸牛有毛細胞、らせん神経節細胞、前庭有毛細胞、前庭支持細胞、及び／または前庭神経節細胞の少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％のＧＪＢ２をコードする核酸配列への送達及びその発現をもたらす、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。
【0266】
３４．前記遺伝子はＧＪＢ２である、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。
【0267】
３５．ＧＪＢ２をコードする前記核酸配列は、天然に存在しない配列である、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。
【0268】
３６．ＧＪＢ２をコードする前記核酸配列は、哺乳動物ＧＪＢ２をコードする、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。
【0269】
３７．ＧＪＢ２をコードする前記核酸配列は、ヒト、マウス、非ヒト霊長類またはラットＧＪＢ２をコードする、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。
【0270】
３８．ＧＪＢ２をコードする前記核酸配列は、配列番号１０を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。
【0271】
３９．ＧＪＢ２をコードする前記核酸配列は、哺乳動物発現のために最適化されたコドンである、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。
【0272】
４０．ＧＪＢ２をコードする前記核酸配列は、配列番号１１、配列番号１２または配列番号１３を含む、実施形態３９に記載の方法。
【0273】
４１．ＧＪＢ２をコードする前記核酸配列は、ヒト、ラット、非ヒト霊長類、モルモット、ミニブタ、ブタ、ネコ、ヒツジまたはマウス細胞における発現のために最適化されたコドンである、実施形態４０に記載の方法。
【0274】
４２．ＧＪＢ２をコードする前記核酸配列は、ｃＤＮＡ配列である、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。
【0275】
４３．ＧＪＢ２をコードする前記核酸配列は、作動可能に連結されたＣ末端タグまたはＮ末端タグを更に含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。
【0276】
４４．前記タグはＦＬＡＧタグまたはＨＡタグである、実施形態４３に記載の方法。
【0277】
４５．ＧＪＢ２をコードする前記核酸配列は、プロモーターに作動可能に連結されている、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。
【0278】
４６．前記プロモーターは、遍在的活性ＣＢＡ、小型ＣＢＡ（ｓｍＣＢＡ）、ＥＦ１ａ、ＣＡＳＩプロモーター、蝸牛支持細胞プロモーター、ＧＪＢ２発現特異的ＧＦＡＰプロモーター、小型ＧＪＢ２プロモーター、中型ＧＪＢ２プロモーター、大型ＧＪＢ２プロモーター、２～３個の個々のＧＪＢ２発現特異的プロモーターの連続した組み合わせ、または合成プロモーターである、実施形態４５に記載の方法。
【0279】
４７．前記プロモーターは、難聴を治療または予防するのに十分なＧＪＢ２発現を駆動するように最適化される、実施形態４５または４６に記載の方法。
【0280】
４８．ＧＪＢ２をコードする前記核酸配列は、作動可能に連結された３’ＵＴＲ調節領域を更に含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。
【0281】
４９．ＧＪＢ２をコードする前記核酸配列は、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）を含む作動可能に連結された３’ＵＴＲ調節領域を更に含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。
【0282】
５０．ＧＪＢ２をコードする前記核酸配列は、作動可能に連結されたポリアデニル化シグナルを更に含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。
【0283】
５１．前記ポリアデニル化シグナルは、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルである、実施形態５０に記載の方法。
【0284】
５２．前記ポリアデニル化シグナルは、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）ポリアデニル化シグナルである、実施形態５０に記載の方法。
【0285】
５３．前記ポリヌクレオチドは、高ＧＪＢ２発現を駆動するために最適化された以下のプロモーターエレメントのうちの１つに作動可能に連結されている、：（ａ）遍在的活性ＣＢＡ、小型ＣＢＡ（ｓｍＣＢＡ）、ＥＦ１ａまたはＣＡＳＩプロモーター；（ｂ）蝸牛支持細胞またはＧＪＢ２発現特異的１．６８ｋｂ ＧＦＡＰ、小型／中型／大型ＧＪＢ２プロモーター、２～３個の個々のＧＪＢ２発現特異的プロモーターの連続した組み合わせまたは合成プロモーター；後にＳＶ４０またはヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）ポリアデニル化シグナルのいずれかが続くウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）を含む３’－ＵＴＲ調節領域に作動可能に連結されている、２７ヌクレオチドのヘマグルチニンＣ末端タグまたは２４ヌクレオチドのＦｌａｇタグを更に含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。
【0286】
５４．前記ポリヌクレオチドはＡＡＶゲノムカセットを更に含み、任意選択で、
（ｉ）前記ＡＡＶゲノムカセットは、好ましくは約１４３塩基の長さの２つの配列変調逆方向末端反復と隣接しているか、または
（ｉｉ）前記ＡＡＶゲノムカセットは、約１１３塩基のｓｃＡＡＶ有効化ＩＴＲ（ＩＴＲΔｔｒｓ）によって分離されかつ約１４３塩基の配列変調ＩＴＲと両端で隣接している、好ましくは２．４ｋｂ以下の２つの逆方向同一反復からなる自己相補的ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）ゲノムカセットと隣接している、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。
（ｉ）前記ＡＡＶゲノムカセットは、好ましくは約１４３塩基の長さの２つの配列変調逆方向末端反復と隣接しているか、または
（ｉｉ）前記ＡＡＶゲノムカセットは、約１１３塩基のｓｃＡＡＶ有効化ＩＴＲ（ＩＴＲΔｔｒｓ）によって分離されかつ約１４３塩基の配列変調ＩＴＲと両端で隣接している、好ましくは２．４ｋｂ以下の２つの逆方向同一反復からなる自己相補的ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）ゲノムカセットと隣接している、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。
【0287】
５５．前記ポリヌクレオチドは、好ましくは長さ約２７ヌクレオチドの長さ、任意選択で約０．６８キロベース（ｋｂ）のサイズのヘマグルチニンＣ末端タグもしくはＦｌａｇタグを含むかまたは含まない；高ＧＪＢ２発現を駆動するように最適化された以下のプロモーター要素のうちの１つに作動可能に連結されている：（ａ）好ましくはサイズ約１．７ｋｂの遍在的活性ＣＢＡ、好ましくはサイズ約０．９６ｋｂの小型ＣＢＡ（ｓｍＣＢＡ）、好ましくは約０．８１ｋｂサイズのＥＦ１ａまたは好ましくはサイズ約１．０６ｋｂのＣＡＳＩプロモーター；（ｂ）好ましくはサイズ約１．６８ｋｂの蝸牛支持細胞またはＧＪＢ２発現特異的ＧＦＡＰプロモーター、好ましくはサイズ約０．１３ｋｂの小型ＧＪＢ２プロモーター、好ましくはサイズ約０．５４ｋｂの中型ＧＪＢ２プロモーター、好ましくはサイズ約１．０ｋｂの大型ＧＪＢ２プロモーター、または２～３個の個々のＧＪＢ２発現特異的プロモーターの連続した組み合わせ；後にＳＶ４０またはヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）ポリアデニル化シグナルのいずれかが続くウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）を含み、及びＡＡＶゲノムカセット、または約１１３塩基のｓｃＡＡＶ有効化ＩＴＲ（ＩＴＲΔｔｒｓ）によって分離されかつ約１４３塩基の配列変調ＩＴＲと両端で隣接している、好ましくは２．４ｋｂ以下の２つの逆方向同一反復からなる自己相補的ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）ゲノムカセットと隣接する２つの約１４３塩基配列変調逆方向末端反復（ＩＴＲ）のいずれかを更に含む、任意選択で０．９ｋｂの３’－ＵＴＲ調節領域に作動可能に連結されている、コドン／配列最適化ヒトＧＪＢ２ ｃＤＮＡを含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。
【0288】
５６．前記難聴は遺伝的難聴である、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。
【0289】
５７．前記難聴はＤＦＮＢ１難聴である、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。
【0290】
５８．前記難聴は、ＧＪＢ２における突然変異によって引き起こされ、任意選択で、前記突然変異は、ホモ接合性突然変異またはヘテロ接合性突然変異である、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。
【0291】
５９．前記難聴は、常染色体劣性ＧＪＢ２変異体（ＤＦＮＢ１）によって引き起こされる、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。
【0292】
６０．前記難聴は、常染色体優性ＧＪＢ２突然変異体（ＤＦＮＡ３Ａ）によって引き起こされる、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。
【0293】
６１．前記投与は、前記蝸牛系または前記前庭系への投与であり、任意選択で、前記送達は、前記正円窓膜（ＲＷＭ）、前記卵円窓もしくは前記半規管を介した前記蝸牛系または前記前庭系への直接投与を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。
【0294】
６２．前記直接投与は注射である、実施形態６１に記載の方法。
【0295】
６３．前記投与は、静脈内、脳室内、蝸牛内、髄腔内、筋肉内、皮下またはこれらの組み合わせである、実施形態１～６０のいずれか１つに記載の方法。
【0296】
６４．遺伝子欠失に関連する難聴を治療または予防することを必要とする対象における、前記遺伝子の欠乏に関連する前記難聴を治療または予防するのに使用するための組成物であって、前記組成物は、
（ｉ）任意選択で、非バリアントＡＡＶカプシドポリペプチドと比較して、内耳組織または内耳細胞において増加した向性を示すバリアントＡＡＶカプシドポリペプチドと、
（ｉｉ）前記遺伝子をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドと、を含む、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオンを含む、前記組成物。
（ｉ）任意選択で、非バリアントＡＡＶカプシドポリペプチドと比較して、内耳組織または内耳細胞において増加した向性を示すバリアントＡＡＶカプシドポリペプチドと、
（ｉｉ）前記遺伝子をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドと、を含む、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオンを含む、前記組成物。
【0297】
６５．難聴に関連する遺伝子をコードする核酸配列を、前記核酸配列を必要とする対象の内耳組織または内耳細胞に送達するための組成物であって、前記組成物は、
（ｉ）任意選択で、非バリアントＡＡＶカプシドポリペプチドと比較して、内耳組織または内耳細胞において増加した向性を示すバリアントＡＡＶカプシドポリペプチドと、
（ｉｉ）前記遺伝子をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドと、を含む、有効量の組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオンを含む、前記組成物。
（ｉ）任意選択で、非バリアントＡＡＶカプシドポリペプチドと比較して、内耳組織または内耳細胞において増加した向性を示すバリアントＡＡＶカプシドポリペプチドと、
（ｉｉ）前記遺伝子をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドと、を含む、有効量の組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオンを含む、前記組成物。
【0298】
６６．前記内耳組織または前記内耳細胞は、蝸牛組織もしくは蝸牛細胞、または前庭組織もしくは前庭細胞である、実施形態６４または６５に記載の組成物。
【0299】
６７．前記内耳組織または前記内耳細胞は、蝸牛組織もしくは蝸牛細胞である、実施形態６４または６５に記載の組成物。
【0300】
６８．前記バリアントＡＡＶカプシドポリペプチドは、バリアントＡＡＶ１カプシドポリペプチド、バリアントＡＡＶ２カプシドポリペプチド、バリアントＡＡＶ３カプシドポリペプチド、バリアントＡＡＶ４カプシドポリペプチド、バリアントＡＡＶ５カプシドポリペプチド、バリアントＡＡＶ６カプシドポリペプチド、バリアントＡＡＶ７カプシドポリペプチド、バリアントＡＡＶ８カプシドポリペプチド、バリアントＡＡＶ９カプシドポリペプチド、バリアントｒｈ－ＡＡＶ１０カプシドポリペプチド、バリアントＡＡＶ１０カプシドポリペプチド、バリアントＡＡＶ１１カプシドポリペプチド及びバリアントＡＡＶ１２カプシドポリペプチドからなる群から選択される、実施形態６４～６７のいずれか１つに記載の組成物。
【0301】
６９．前記バリアントＡＡＶカプシドポリペプチドはバリアントＡＡＶ２カプシドポリペプチドである、実施形態６４～６８のいずれか１つに記載の組成物。
【0302】
７０．前記バリアントＡＡＶカプシドポリペプチドは、表１に列挙されたアミノ酸配列、または表１に列挙された前記アミノ酸配列に対して少なくとも約８５％、９０％、９５％もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、任意選択で、前記ＡＡＶカプシドは、ＶＰ１、ＶＰ２またはＶＰ３カプシドポリペプチドからなる群から選択される、実施形態６４～６９のいずれか１つに記載の組成物。
【0303】
７１．前記バリアントＡＡＶカプシドポリペプチドは、野生型ＡＡＶ２カプシドポリペプチド（配列番号１）に対して１つ以上のアミノ酸置換、挿入及び／または欠失を有するアミノ酸配列を含み、任意選択で、前記１つ以上のアミノ酸置換、挿入及び／または欠失は、Ｑ２６３、Ｓ２６４、Ｙ２７２、Ｙ４４４、Ｒ４８７、Ｐ４５１、Ｔ４５４、Ｔ４５５、Ｒ４５９、Ｋ４９０、Ｔ４９１、Ｓ４９２、Ａ４９３、Ｄ４９４、Ｅ４９９、Ｙ５００、Ｔ５０３、Ｋ５２７、Ｅ５３０、Ｅ５３１、Ｑ５４５、Ｇ５４６、Ｓ５４７、Ｅ５４８、Ｋ５４９、Ｔ５５０、Ｎ５５１、Ｖ５５２、Ｄ５５３、Ｅ５５５、Ｋ５５６、Ｒ５８５、Ｒ５８８及びＹ７３０からなる群から選択されるアミノ酸残基において生じる、実施形態６４～７０のいずれか１つに記載の組成物。
【0304】
７２．前記バリアントＡＡＶカプシドポリペプチドは、Ｑ２６３Ｎ、Ｑ２６３Ａ、Ｓ２６４Ａ、Ｙ２７２Ｆ、Ｙ４４４Ｆ、Ｒ４８７Ｇ、Ｐ４５１Ａ、Ｔ４５４Ｎ、Ｔ４５５Ｖ、Ｒ４５９Ｔ、Ｋ４９０Ｔ、Ｔ４９１Ｑ、Ｓ４９２Ｄ、Ａ４９３Ｇ、Ｄ４９４Ｅ、Ｅ４９９Ｄ、Ｙ５００Ｆ、Ｔ５０３Ｐ、Ｋ５２７Ｒ、Ｅ５３０Ｄ、Ｅ５３１Ｄ、Ｑ５４５Ｅ、Ｇ５４６Ｄ、Ｇ５４６Ｓ、Ｓ５４７Ａ、Ｅ５４８Ｔ、Ｅ５４８Ａ、Ｋ５４９Ｅ、Ｋ５４９Ｇ、Ｔ５５０Ｎ、Ｔ５５０Ａ、Ｎ５５１Ｄ、Ｖ５５２Ｉ、Ｄ５５３Ａ、Ｅ５５５Ｄ、Ｋ５５６Ｒ、Ｋ５５６Ｓ、Ｒ５８５Ｓ、Ｒ５８８Ｔ及びＹ７３０Ｆからなる群から選択される野生型ＡＡＶ２カプシドポリペプチド（配列番号１）に対して１つ以上のアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む、実施形態７１に記載の組成物。
【0305】
７３．前記バリアントＡＡＶカプシドポリペプチドは、
（ｉ）配列番号２７、２９、３１、３３または３５のいずれか１つのアミノ酸配列、
（ｉｉ）配列番号２７、２９、３１、３３または３５のいずれかに対して少なくとも約８５％、９０％、９５％または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列、または、
（ｉｉｉ）配列番号２６、２８、３０、３２または３４のいずれか１つの核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を含む、実施形態６４～７２のいずれか１つに記載の組成物。
（ｉ）配列番号２７、２９、３１、３３または３５のいずれか１つのアミノ酸配列、
（ｉｉ）配列番号２７、２９、３１、３３または３５のいずれかに対して少なくとも約８５％、９０％、９５％または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列、または、
（ｉｉｉ）配列番号２６、２８、３０、３２または３４のいずれか１つの核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を含む、実施形態６４～７２のいずれか１つに記載の組成物。
【0306】
７４．前記バリアントＡＡＶカプシドポリペプチドは配列番号２７のアミノ酸配列を含む、実施形態６４～７３のいずれか１つに記載の組成物。
【0307】
７５．前記バリアントＡＡＶカプシドポリペプチドは配列番号２９のアミノ酸配列を含む、実施形態６４～７３のいずれか１つに記載の組成物。
【0308】
７６．前記バリアントＡＡＶカプシドポリペプチドは配列番号３１のアミノ酸配列を含む、実施形態６４～７３のいずれか１つに記載の組成物。
【0309】
７７．前記バリアントＡＡＶカプシドポリペプチドは配列番号３３のアミノ酸配列を含む、実施形態６４～７３のいずれか１つに記載の組成物。
【0310】
７８．前記バリアントＡＡＶカプシドポリペプチドは配列番号３５のアミノ酸配列を含む、実施形態６４～７３のいずれか１つに記載の組成物。
【0311】
７９．前記遺伝子はＧＪＢ２である、実施形態６４～７８のいずれか１つに記載の組成物。
【0312】
８０．ＧＪＢ２をコードする前記核酸配列は、天然に存在しない配列である、実施形態６４～７９のいずれか１つに記載の組成物。
【0313】
８１．ＧＪＢ２をコードする前記核酸配列は、哺乳動物ＧＪＢ２をコードする、実施形態６４～８０のいずれか１つに記載の組成物。
【0314】
８２．ＧＪＢ２をコードする前記核酸配列は、ヒト、マウス、非ヒト霊長類、ミニブタまたはラットＧＪＢ２をコードする、実施形態６４～８１のいずれか１つに記載の組成物。
【0315】
８３．ＧＪＢ２をコードする前記核酸配列は、配列番号１０を含む、実施形態６４～８２のいずれか１つに記載の組成物。
【0316】
８４．ＧＪＢ２をコードする前記核酸配列は、哺乳動物発現のために最適化されたコドンである、実施形態６４～８３のいずれか１つに記載の組成物。
【0317】
８５．ＧＪＢ２をコードする前記核酸配列は、配列番号１１、配列番号１２または配列番号１３を含む、実施形態８４に記載の組成物。
【0318】
８６．ＧＪＢ２をコードする前記核酸配列は、ヒト、ラット、非ヒト霊長類、モルモット、ミニブタ、ブタ、ネコ、ヒツジまたはマウス細胞における発現のために最適化されたコドンである、実施形態８４に記載の組成物。
【0319】
８７．ＧＪＢ２をコードする前記核酸配列は、ｃＤＮＡ配列である、実施形態６４～８６のいずれか１つに記載の組成物。
【0320】
８８．ＧＪＢ２をコードする前記核酸配列は、作動可能に連結されたＣ末端タグまたはＮ末端タグを更に含む、実施形態６４～８７のいずれか１つに記載の組成物。
【0321】
８９．前記タグはＦＬＡＧタグまたはＨＡタグである、実施形態８８に記載の組成物。
【0322】
９０．ＧＪＢ２をコードする前記核酸配列は、プロモーターに作動可能に連結されている、実施形態６４～８９のいずれか１つに記載の組成物。
【0323】
９１．前記プロモーターは、遍在的活性ＣＢＡ、小型ＣＢＡ（ｓｍＣＢＡ）、ＥＦ１ａ、ＣＡＳＩプロモーター、蝸牛支持細胞プロモーター、ＧＪＢ２発現特異的ＧＦＡＰプロモーター、小型ＧＪＢ２プロモーター、中型ＧＪＢ２プロモーター、大型ＧＪＢ２プロモーター、２～３個の個々のＧＪＢ２発現特異的プロモーターの連続した組み合わせ、または合成プロモーターである、実施形態９０に記載の組成物。
【0324】
９２．前記プロモーターは、難聴を治療または予防するのに十分なＧＪＢ２発現を駆動するように最適化される、実施形態９０または９１に記載の組成物。
【0325】
９３．ＧＪＢ２をコードする前記核酸配列は、作動可能に連結された３’ＵＴＲ調節領域を更に含む、実施形態６４～９２のいずれか１つに記載の組成物。
【0326】
９４．ＧＪＢ２をコードする前記核酸配列は、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）を含む作動可能に連結された３’ＵＴＲ調節領域を更に含む、実施形態６４～９３のいずれか１つに記載の組成物。
【0327】
９５．ＧＪＢ２をコードする前記核酸配列は、作動可能に連結されたポリアデニル化シグナルを更に含む、実施形態６４～９４のいずれか１つに記載の組成物。
【0328】
９６．前記ポリアデニル化シグナルは、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルである、実施形態９５に記載の組成物。
【0329】
９７．前記ポリアデニル化シグナルは、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）ポリアデニル化シグナルである、実施形態９５に記載の組成物。
【0330】
９８．前記ポリヌクレオチドは、高ＧＪＢ２発現を駆動するために最適化された以下のプロモーターエレメントのうちの１つに作動可能に連結されている、：（ａ）遍在的活性ＣＢＡ、小型ＣＢＡ（ｓｍＣＢＡ）、ＥＦ１ａまたはＣＡＳＩプロモーター；（ｂ）蝸牛支持細胞またはＧＪＢ２発現特異的１．６８ｋｂ ＧＦＡＰ、小型／中型／大型ＧＪＢ２プロモーター、２～３個の個々のＧＪＢ２発現特異的プロモーターの連続した組み合わせまたは合成プロモーター；後にＳＶ４０またはヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）ポリアデニル化シグナルのいずれかが続くウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）を含む３’－ＵＴＲ調節領域に作動可能に連結されている、２７ヌクレオチドのヘマグルチニンＣ末端タグまたは２４ヌクレオチドのＦｌａｇタグを更に含む、実施形態６４～９７のいずれか１つに記載の組成物。
【0331】
９９．前記ポリヌクレオチドはＡＡＶゲノムカセットを更に含み、任意選択で、
（ｉ）前記ＡＡＶゲノムカセットは、好ましくは約１４３塩基の長さの２つの配列変調逆方向末端反復と隣接しているか、または
（ｉｉ）前記ＡＡＶゲノムカセットは、約１１３塩基のｓｃＡＡＶ有効化ＩＴＲ（ＩＴＲΔｔｒｓ）によって分離されかつ約１４３塩基の配列変調ＩＴＲと両端で隣接している、好ましくは２．４ｋｂ以下の２つの逆方向同一反復からなる自己相補的ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）ゲノムカセットと隣接している、実施形態６４～９８のいずれか１つに記載の組成物。
（ｉ）前記ＡＡＶゲノムカセットは、好ましくは約１４３塩基の長さの２つの配列変調逆方向末端反復と隣接しているか、または
（ｉｉ）前記ＡＡＶゲノムカセットは、約１１３塩基のｓｃＡＡＶ有効化ＩＴＲ（ＩＴＲΔｔｒｓ）によって分離されかつ約１４３塩基の配列変調ＩＴＲと両端で隣接している、好ましくは２．４ｋｂ以下の２つの逆方向同一反復からなる自己相補的ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）ゲノムカセットと隣接している、実施形態６４～９８のいずれか１つに記載の組成物。
【0332】
１００．前記ポリヌクレオチドは、好ましくは長さ約２７ヌクレオチドの長さ、任意選択で約０．６８キロベース（ｋｂ）のサイズのヘマグルチニンＣ末端タグもしくはＦｌａｇタグを含むかまたは含まない；高ＧＪＢ２発現を駆動するように最適化された以下のプロモーター要素のうちの１つに作動可能に連結されている：（ａ）好ましくはサイズ約１．７ｋｂの遍在的活性ＣＢＡ、好ましくはサイズ約０．９６ｋｂの小型ＣＢＡ（ｓｍＣＢＡ）、好ましくは約０．８１ｋｂサイズのＥＦ１ａまたは好ましくはサイズ約１．０６ｋｂのＣＡＳＩプロモーター；（ｂ）好ましくはサイズ約１．６８ｋｂの蝸牛支持細胞またはＧＪＢ２発現特異的ＧＦＡＰプロモーター、好ましくはサイズ約０．１３ｋｂの小型ＧＪＢ２プロモーター、好ましくはサイズ約０．５４ｋｂの中型ＧＪＢ２プロモーター、好ましくはサイズ約１．０ｋｂの大型ＧＪＢ２プロモーター、または２～３個の個々のＧＪＢ２発現特異的プロモーターの連続した組み合わせ；後にＳＶ４０またはヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）ポリアデニル化シグナルのいずれかが続くウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）を含み、及びＡＡＶゲノムカセット、または約１１３塩基のｓｃＡＡＶ有効化ＩＴＲ（ＩＴＲΔｔｒｓ）によって分離されかつ約１４３塩基の配列変調ＩＴＲと両端で隣接している、好ましくは２．４ｋｂ以下の２つの逆方向同一反復からなる自己相補的ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）ゲノムカセットと隣接する２つの約１４３塩基配列変調逆方向末端反復（ＩＴＲ）のいずれかを更に含む、任意選択で０．９ｋｂの３’－ＵＴＲ調節領域に作動可能に連結されている、コドン／配列最適化ヒトＧＪＢ２ ｃＤＮＡを含む、実施形態６４～９９のいずれか１つに記載の組成物。
【0333】
１０１．有効量の実施形態６４～１００のいずれか１つに記載の組成物を、前記組成物を必要とする対象に投与することを含む、難聴を治療または予防する方法。
【0334】
１０２．有効量の実施形態６４～１００のいずれか１つに記載の組成物を、前記組成物を必要とする対象に投与することを含む、難聴に関連する遺伝子をコードする核酸配列を内耳組織または内耳細胞に送達する方法。
【0335】
１０３．有効量の実施形態６４～１００のいずれか１つに記載の組成物を、前記組成物を必要とする対象に投与することを含む、ＧＪＢ２をコードする核酸配列を内耳組織または内耳細胞に送達する方法。
【0336】
１０４．前記対象は哺乳動物である、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物の方法。
【0337】
１０５．前記対象は霊長類である、先行実施形態のいずれか１つに記載の組成物の方法。
【0338】
次に、本開示の更なる実施形態は、以下の実施例を参照して説明される。本明細書に含有される実施例は、例示として示されており、いかなる限定のために示されているものではない。
【実施例】
【0339】
非限定的な実施例
実施例１．先天性難聴のためのＧＪＢ２遺伝子治療の送達のための新規ＡＡＶカプシドバリアントの特徴付け
遺伝子治療に最適なカプシドを特定するために、ラット及びマウスの内耳組織におけるｅｘ ｖｉｖｏならびに非ヒト霊長類（ＮＨＰ）におけるｉｎ ｖｉｖｏでの発現について、新規及び以前に記載されたＡＡＶカプシドバリアントを評価した。例示的なＡＡＶカプシド配列を表１に提供する。
実施例１．先天性難聴のためのＧＪＢ２遺伝子治療の送達のための新規ＡＡＶカプシドバリアントの特徴付け
遺伝子治療に最適なカプシドを特定するために、ラット及びマウスの内耳組織におけるｅｘ ｖｉｖｏならびに非ヒト霊長類（ＮＨＰ）におけるｉｎ ｖｉｖｏでの発現について、新規及び以前に記載されたＡＡＶカプシドバリアントを評価した。例示的なＡＡＶカプシド配列を表１に提供する。
【表1-1】
【表1-2】
【表1-3】
【表1-4】
【表1-5】
【表1-6】
【表1-7】
【表1-8】
【表1-9】
【表1-10】
【表1-11】
【表1-12】
【表1-13】
【表1-14】
【表1-15】
【表1-16】
【表1-17】
【0340】
方法
動物：Ｐ３－Ｐ５スプラーグドーリーラットの仔をすべての外植実験に使用した。カニクイザル（非ヒト霊長類、「ＮＨＰ」）、年齢３～５歳をＡＡＶ中和抗体について事前にスクリーニングし、正円窓膜（ＲＷＭ）を介して蝸牛に注入することにより、両側に（３０μＬ容量で１０１０ｖｇ／耳）投与した。ＮＨＰを安楽死させ、蝸牛切片をＡＡＶ投与の１２週間後に免疫組織化学によるＧＦＰの発現について評価した。
動物：Ｐ３－Ｐ５スプラーグドーリーラットの仔をすべての外植実験に使用した。カニクイザル（非ヒト霊長類、「ＮＨＰ」）、年齢３～５歳をＡＡＶ中和抗体について事前にスクリーニングし、正円窓膜（ＲＷＭ）を介して蝸牛に注入することにより、両側に（３０μＬ容量で１０１０ｖｇ／耳）投与した。ＮＨＰを安楽死させ、蝸牛切片をＡＡＶ投与の１２週間後に免疫組織化学によるＧＦＰの発現について評価した。
【0341】
蝸牛外植片：０日目：解剖した蝸牛全体をＣｅｌｌ－Ｔａｋでコーティングしたメッシュインサート上に載せ、抗生物質を含む増殖培地で一晩インキュベートした。１日目：蝸牛を２％ＦＢＳを添加した抗生物質を含まない培地に移し、ＡＡＶ（濃度範囲）で１２０時間連続処理した。６日目：蝸牛を４％ＰＦＡで一晩固定し、次いで、ファロイジン、抗ＧＦＰ及びＤＡＰＩで免疫染色した。
【0342】
アデノ随伴ウイルス：すべてのカプシドバリアントは、ＣＢＡプロモーターを使用して緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）レポーター構築物の発現を駆動し、向性の迅速かつ容易に定量化可能な評価を可能にした。
【0343】
ＧＦＰの定量化：蝸牛の中央領域のＺスタックを６３倍で撮影し、Ｚｅｉｓｓ Ｚｅｎ Ｂｌａｃｋソフトウェアを使用してつなぎ合わせた。３つの関連領域（らせん靭帯、コルチ器、らせん板縁）の関心領域ボックスが描かれた。閾値を超えるＧＦＰ／抗ＧＦＰピクセル密度を、３つの領域のそれぞれについて測定した。ピクセル密度の測定単位は任意である。
【0344】
ラット外植片におけるカプシドバリアント向性の比較
蝸牛外植片の方法：Ｐ３－Ｐ５スプラーグドーリーラットの仔をすべてのｅｘ ｖｉｖｏ実験に使用した。０日目：解剖した蝸牛全体をＣｅｌｌ－Ｔａｋでコーティングしたメッシュインサート上に載せ、抗生物質を含む増殖培地で一晩インキュベートした。１日目：蝸牛を１０％ＦＢＳを添加した抗生物質を含まない培地に移し、２ｅ１０ｖｇのＡＡＶで１２０時間連続処理した。６日目：蝸牛を４％ＰＦＡで一晩固定し、以下：ファロイジン（１：５００）、抗ＧＦＰ（１：２５０）及びＤＡＰＩ（１：１０００）を使用して免疫組織化学的に処理し、抗退色搭載培地に載せた。ＧＦＰ形質導入は、コルチ器、らせん板縁またはらせん靭帯の上に配置された３つの関心領域から測定された。閾値を超える抗ＧＦＰピクセル密度は、ｚシリーズの各領域について測定され、提示されたデータは任意の単位である。
蝸牛外植片の方法：Ｐ３－Ｐ５スプラーグドーリーラットの仔をすべてのｅｘ ｖｉｖｏ実験に使用した。０日目：解剖した蝸牛全体をＣｅｌｌ－Ｔａｋでコーティングしたメッシュインサート上に載せ、抗生物質を含む増殖培地で一晩インキュベートした。１日目：蝸牛を１０％ＦＢＳを添加した抗生物質を含まない培地に移し、２ｅ１０ｖｇのＡＡＶで１２０時間連続処理した。６日目：蝸牛を４％ＰＦＡで一晩固定し、以下：ファロイジン（１：５００）、抗ＧＦＰ（１：２５０）及びＤＡＰＩ（１：１０００）を使用して免疫組織化学的に処理し、抗退色搭載培地に載せた。ＧＦＰ形質導入は、コルチ器、らせん板縁またはらせん靭帯の上に配置された３つの関心領域から測定された。閾値を超える抗ＧＦＰピクセル密度は、ｚシリーズの各領域について測定され、提示されたデータは任意の単位である。
【0345】
結果：図１９～図２１は、らせん板縁（図１９）、コルチ器（図２０）及びらせん靭帯（図２１）におけるＯＭＹ－９０６（灰色の棒）に対して正規化されたＡＡＶカプシドバリアントＧＦＰカバー度の比較を示す。すべてのカプシドバリアントは、２ｅ１０ｖｇの用量で処理された。図２２Ａ～図２２Ｂは、らせん靭帯、コルチ器支持細胞層及びらせん板縁を強調するためにブレンドされたｚスタックとして代表的な画像を示す。カプシドＯＭＹ－９１１、ＯＭＹ－９１２、ＯＭＹ－９１４及びＯＭＹ－９１５は、全体的に優秀であった。
【0346】
全体として、これらのデータは、蝸牛外植片において、新規のＡＡＶカプシドがＡＡＶ－Ａｎｃ８０及び野生型ＡＡＶ２と比較して高レベルの形質導入を示すことを示す。
【0347】
異なる用量でのカプシドバリアント向性の比較
図２３～図２６は、異なる投与量でのＡＡＶカプシドバリアントＧＦＰカバー度の比較を示す。図２３は、２つの用量：２ｅ９ｖｇ及び２ｅ１０ｖｇでのＯＭＹ－９１２カプシドバリアントＧＦＰカバー度を比較する蛍光画像を示す。図２４は、２つの用量：２ｅ９ｖｇ及び２ｅ１０ｖｇでのＯＭＹ－９１５カプシドバリアントＧＦＰカバー度を比較する蛍光画像を示す。図２５は、ＯＭＹ－９１２とＯＭＹ－９１５カプシドバリアントＧＦＰカバー度をらせん板縁で比較する棒グラフを示す。図２６は、コルチ器におけるＯＭＹ－９１２及びＯＭＹ－９１５カプシドバリアントＧＦＰカバー度を比較する棒グラフを示す。これらのデータは、試験した両方の用量でＯＭＹ－９１５の全体的なＧＦＰカバー度が高いことを示す。
図２３～図２６は、異なる投与量でのＡＡＶカプシドバリアントＧＦＰカバー度の比較を示す。図２３は、２つの用量：２ｅ９ｖｇ及び２ｅ１０ｖｇでのＯＭＹ－９１２カプシドバリアントＧＦＰカバー度を比較する蛍光画像を示す。図２４は、２つの用量：２ｅ９ｖｇ及び２ｅ１０ｖｇでのＯＭＹ－９１５カプシドバリアントＧＦＰカバー度を比較する蛍光画像を示す。図２５は、ＯＭＹ－９１２とＯＭＹ－９１５カプシドバリアントＧＦＰカバー度をらせん板縁で比較する棒グラフを示す。図２６は、コルチ器におけるＯＭＹ－９１２及びＯＭＹ－９１５カプシドバリアントＧＦＰカバー度を比較する棒グラフを示す。これらのデータは、試験した両方の用量でＯＭＹ－９１５の全体的なＧＦＰカバー度が高いことを示す。
【0348】
ＡＡＶ－ＧＪＢ２－Ｆｌａｇに曝露したラット蝸牛外植片におけるコネキシン２６タンパク質の発現
方法：Ｐ２－Ｐ８ラットからの蝸牛外植片を、ＧＪＢ２遺伝子のＦＬＡＧ標識バージョンを持つＡＡＶベクターを含有する培地で処理した。外植片は処理後４８～９６時間で固定され、コネキシン２６及びＦＬＡＧに対する抗体で免疫染色された。組織はまた、核を標識するためにファロイジン及びＤＡＰＩで染色された。
方法：Ｐ２－Ｐ８ラットからの蝸牛外植片を、ＧＪＢ２遺伝子のＦＬＡＧ標識バージョンを持つＡＡＶベクターを含有する培地で処理した。外植片は処理後４８～９６時間で固定され、コネキシン２６及びＦＬＡＧに対する抗体で免疫染色された。組織はまた、核を標識するためにファロイジン及びＤＡＰＩで染色された。
【0349】
結果：図２７は、ＦＬＡＧ標識コネキシン２６を発現するＯＭＹ－９１４カプシドバリアントに曝露された蝸牛外植片の代表的な画像を示し、これは、このウイルスが、コネキシン２６タンパク質を、コルチ器、らせん板縁及びらせん靭帯などの蝸牛支持細胞の膜ならびにギャップ結合プラークに適切に送達することを示している。ＦＬＡＧ染色は、コネキシン２６発現の領域と明らかに重複しており、ＦＬＡＧ標識タンパク質がコネキシン２６発現の正常な部位を標的としていることを示す。これらのデータは、ＡＡＶ－ＧＪＢ２－Ｆｌａｇが、ＦＬＡＧ標識コネキシン２６タンパク質をｅｘ ｖｉｖｏで蝸牛の支持細胞に正しく送達し、内因性コネキシン２６発現と重複することを示す。
【0350】
ＡＡＶ－ＧＪＢ２－Ｆｌａｇをｉｎ ｖｉｖｏで幼若マウスまたは成体マウスに蝸牛内注射した後のコネキシン２６タンパク質の発現
方法：深く麻酔した生後８日目（Ｐ８）または成体Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに、ＧＪＢ２遺伝子のＦＬＡＧ標識バージョンを１ｅ１２ｖｇ／ｍＬの力価で含む１．０μｌのＡＡＶを正円窓膜を通して蝸牛内注射した。注射後２～６週間でマウスを安楽死させ、蝸牛を固定し、コネキシン２６及びＦＬＡＧに対する抗体で免疫染色した。組織はまた、核を標識するためにファロイジン及びＤＡＰＩで染色された。
方法：深く麻酔した生後８日目（Ｐ８）または成体Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに、ＧＪＢ２遺伝子のＦＬＡＧ標識バージョンを１ｅ１２ｖｇ／ｍＬの力価で含む１．０μｌのＡＡＶを正円窓膜を通して蝸牛内注射した。注射後２～６週間でマウスを安楽死させ、蝸牛を固定し、コネキシン２６及びＦＬＡＧに対する抗体で免疫染色した。組織はまた、核を標識するためにファロイジン及びＤＡＰＩで染色された。
【0351】
結果：図２８は、若年マウス（Ｐ８）における蝸牛内注射の代表例を示し、ＦＬＡＧ標識コネキシン２６を含有するＯＭＹ－９１４カプシドバリアントは、この遺伝子治療生成物が、コネキシン２６タンパク質を、コルチ器、らせん板縁及びらせん靭帯などの蝸牛支持細胞の膜ならびにギャップ結合プラークに適切に送達することを示している。
【0352】
図２９は、成年マウス（２～３ヶ月齢）における蝸牛内注射の代表例を示し、ＦＬＡＧ標識コネキシン２６を含有するＯＭＹ－９１４カプシドバリアントは、この遺伝子治療生成物が、コネキシン２６タンパク質を、コルチ器、らせん板縁及びらせん靭帯などの蝸牛支持細胞の膜ならびにギャップ結合プラークに適切に送達することを示している。
【0353】
これらのデータは、ＡＡＶ－ＧＪＢ２－Ｆｌａｇが、コネキシン２６タンパク質をｉｎ ｖｉｖｏで蝸牛の支持細胞に正しく送達することを示す。
【0354】
非ヒト霊長類におけるｉｎ ｖｉｖｏでのＡＡＶ送達と向性
非ヒト霊長類（ＮＨＰ）向性実験の方法：カニクイザル（「ＮＨＰ」）、年齢３～５歳をＡＡＶ中和抗体について事前にスクリーニングし、正円窓膜（ＲＷＭ）を介して蝸牛に注入することにより、両側に（３０μＬ容量で１０１０ｖｇ／耳）投与した。ＮＨＰを安楽死させ、蝸牛切片をＡＡＶ投与の１２週間後に免疫組織化学によるＧＦＰの発現について評価した。
非ヒト霊長類（ＮＨＰ）向性実験の方法：カニクイザル（「ＮＨＰ」）、年齢３～５歳をＡＡＶ中和抗体について事前にスクリーニングし、正円窓膜（ＲＷＭ）を介して蝸牛に注入することにより、両側に（３０μＬ容量で１０１０ｖｇ／耳）投与した。ＮＨＰを安楽死させ、蝸牛切片をＡＡＶ投与の１２週間後に免疫組織化学によるＧＦＰの発現について評価した。
【0355】
結果：非ヒト霊長類（ＮＨＰ）の蝸牛を、ＡＡＶの蝸牛内注射の１２週間後に免疫組織化学によって評価した（図３０）。図３０では、ＧＦＰ発現のＤＡＢ染色は、赤色に疑似着色されている。図３０（上のパネル）は、蝸牛全体の低倍率画像を示し、正円窓膜（ＲＷＭ）注射を介して基部付近に投与された単回ＡＡＶ蝸牛内注射後に、蝸牛全体にわたって基部から頂点まで観察され得るＯＭＹ－９１３からの一貫した発現を実証する。図３０（下のパネル）は、ＯＭＹ－９１３発現が、側壁（ＬＷ）、コルチ器（ＯＣ）支持細胞及びらせん板縁（ＳＬ）を含む、ＧＪＢ２レスキューに関連する領域で観察されることを示す。
【0356】
全体として、これらのデータは、本明細書に記載のＡＡＶが、いくつかの実施形態では、正円窓膜（ＲＷＭ）を介した単回蝸牛内注射後に、ＮＨＰ蝸牛全体にＧＪＢ２関連細胞を形質導入できることを実証している。
【0357】
これらの結果に基づき、いかなる特定の理論にも束縛されるものではないが、本明細書では、高用量で同様の形質導入効率を有するＡＡＶカプシドバリアントが、低用量で異なる形質導入効率を示し得ることが想到された。更に、ＡＡＶカプシドバリアントは、ＡＡＶ－Ａｎｃ８０と比較して、蝸牛外植片で高レベルのＧＦＰカバー度を示す。Ａｎｃ８０は、マウスの外植片と比較して、ラットで異なる向性パターンを示す。更に、ＡＡＶカプシドバリアントは、単回ＲＷＭ注射後に、コルチ器及びらせん板縁の支持細胞、ならびにらせん靭帯の線維細胞を含む、ＮＨＰ蝸牛全体にＧＪＢ２関連細胞を形質導入することができた。
【0358】
実施例２：ＡＡＶ媒介ＧＪＢ２遺伝子治療は、コンディショナルなコネキシン２６ノックアウトによって引き起こされる先天性難聴のマウスモデルにおける難聴及び蝸牛損傷をレスキューする
様々なマウス及びヒト実験の結果から、Ｃｘ２６の変異が最終的に蝸牛有毛細胞のほぼ完全な変性につながる可能性があることが明らかになった。構成的ホモ接合性Ｃｘ２６ノックアウトは胚性致死であるため、コンディショナルなノックアウトを利用して、内耳細胞でＣＸ２６タンパク質を失うことの影響を実験した。Ｃｘ２６ｌｏｘｐ／ｌｏｘｐマウスを誘導性ｃｒｅマウス株または構成的ｃｒｅマウス株と交配することによって生成された２つの異なるコンディショナルなノックアウト株（Ｃｘ２６ ｃＫＯ）を利用した。誘導性ｃｒｅ株を使用して、時間的制御でＣｘ２６をノックアウトし、ｃｒｅ誘導の時間に応じて様々な程度の難聴と発育障害を観察した。生後早期のｃｒｅ誘導は、生後３０日目に評価した場合、Ｃｘ２６ ｃＫＯマウスにおいて重度から最重度の難聴を引き起こしたが（図３１）、その後のｃｒｅ誘導は、本質的に進行性の軽度から中度の難聴をもたらした。構成的ｃｒｅ Ｃｘ２６ ｃＫＯ動物は、内耳組織における胚性ｃｒｅ発現により、４、８、１６、３２及び４８ｋＨｚの周波数にわたって重度から最重度の難聴を示した（図３２）。これらの様々なマウスモデルが利用可能になったことで、既知のヒト表現型を模倣する様々な難聴の重症度スペクトルにわたって、ＡＡＶを介したＧＪＢ２遺伝子治療を評価することができた。例示的なＡＡＶ－ＧＪＢ２遺伝子治療（「治療薬Ａ」）は、実施例３のトップＡＡＶカプシドパフォーマーの１つ、配列番号１～６から選択されるプロモーター及び送達される遺伝子としてのＧＪＢ２ｃｏ３６９を用いて構築された。
様々なマウス及びヒト実験の結果から、Ｃｘ２６の変異が最終的に蝸牛有毛細胞のほぼ完全な変性につながる可能性があることが明らかになった。構成的ホモ接合性Ｃｘ２６ノックアウトは胚性致死であるため、コンディショナルなノックアウトを利用して、内耳細胞でＣＸ２６タンパク質を失うことの影響を実験した。Ｃｘ２６ｌｏｘｐ／ｌｏｘｐマウスを誘導性ｃｒｅマウス株または構成的ｃｒｅマウス株と交配することによって生成された２つの異なるコンディショナルなノックアウト株（Ｃｘ２６ ｃＫＯ）を利用した。誘導性ｃｒｅ株を使用して、時間的制御でＣｘ２６をノックアウトし、ｃｒｅ誘導の時間に応じて様々な程度の難聴と発育障害を観察した。生後早期のｃｒｅ誘導は、生後３０日目に評価した場合、Ｃｘ２６ ｃＫＯマウスにおいて重度から最重度の難聴を引き起こしたが（図３１）、その後のｃｒｅ誘導は、本質的に進行性の軽度から中度の難聴をもたらした。構成的ｃｒｅ Ｃｘ２６ ｃＫＯ動物は、内耳組織における胚性ｃｒｅ発現により、４、８、１６、３２及び４８ｋＨｚの周波数にわたって重度から最重度の難聴を示した（図３２）。これらの様々なマウスモデルが利用可能になったことで、既知のヒト表現型を模倣する様々な難聴の重症度スペクトルにわたって、ＡＡＶを介したＧＪＢ２遺伝子治療を評価することができた。例示的なＡＡＶ－ＧＪＢ２遺伝子治療（「治療薬Ａ」）は、実施例３のトップＡＡＶカプシドパフォーマーの１つ、配列番号１～６から選択されるプロモーター及び送達される遺伝子としてのＧＪＢ２ｃｏ３６９を用いて構築された。
【0359】
Ｃｘ２６ ｃＫＯ表現型をレスキューする治療薬Ａの能力を評価するために設計された実験では、出生後にＣｘ２６ ｃＫＯマウスの両方のモデルに治療薬Ａまたはビヒクルの後半規管（ＰＳＣＣ）経路を介して蝸牛内注射を行った。ビヒクルと比較して、誘導性ｃｒｅ Ｃｘ２６ ｃＫＯ動物への治療薬Ａの投与は、ＣＸ２６発現を実質的に回復させ、ＡＢＲによって測定されるように複数の周波数にわたって聴力の顕著な改善をもたらした（図３３Ａ）。更に、治療薬Ａを注射したＣｘ２６ｃＫＯマウスは、ビヒクルを注射したものと比較して蝸牛の形態が大幅に改善され、ＡＢＲデータと一致した（図３３Ａ～図３３Ｄ）。レスキューされた動物におけるＣＸ２６タンパク質の細胞内局在は正常であり、内溝、クラウジウス、ヘンゼン、柱及びダイテルス細胞、ならびにらせん隆起、ならびにらせん板縁及び側壁の線維細胞において明らかであり、これらの動物は、ビヒクルで処理された対照と比較して、生存する有毛細胞の数の増加を示した。
【0360】
実施例３．先天性難聴のためのＧＪＢ２遺伝子治療の送達のための新規ＡＡＶカプシドバリアントの更なる特徴付け
１００以上の遺伝子の変異が難聴と因果関係があるとされている。アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、遺伝子治療の安全で効果的な送達ベクターであることが示されており、良好な臨床結果の実績がある。ＡＡＶカプシドは、向性に影響を与える重要な調節エレメントを表す。この実験では、ＧＪＢ２遺伝子治療に最適なカプシドを特定するために、蝸牛外植片及び非ヒト霊長類（ＮＨＰ）実験における理想的な向性について、新規及び以前に説明されたＡＡＶカプシドバリアントを評価する。最適化されたカプシド、プロモーター及びヒトＧＪＢ２遺伝子要素（治療薬Ａ）を備えたＡＡＶベクターを設計し、蝸牛支持細胞及び線維細胞でＣＸ２６の優れた発現を提供する。また、ウイルスで発現したＣＸ２６の識別を可能にするＦＬＡＧタグで、ＣＸ２６を発現する同一のＡＡＶベクターを生成した（治療薬Ａ－ＦＬＡＧ）。次に、最高性能のカプシドをＧＪＢ２導入遺伝子と共にパッケージ化し（治療薬Ａ）、ｉｎ ｖｉｖｏ投与後にコネキシン２６（ＣＸ２６）タンパク質の薬力学を評価した。本明細書に記載されるように、通常はＣＸ２６を発現しないＨｅＬａ細胞を利用する細胞ベースのアッセイでは、治療薬Ａ及び治療薬Ａ－ＦＬＡＧの両方が、細胞膜に正しく輸送されたＣＸ２６の発現を誘導した。更に、マウスの蝸牛への治療薬Ａ－ＦＬＡＧの注射は、蝸牛全体（基部から頂点まで）の目的の細胞でＣＸ２６－ＦＬＡＧのほぼ完全な発現を提供した。
１００以上の遺伝子の変異が難聴と因果関係があるとされている。アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、遺伝子治療の安全で効果的な送達ベクターであることが示されており、良好な臨床結果の実績がある。ＡＡＶカプシドは、向性に影響を与える重要な調節エレメントを表す。この実験では、ＧＪＢ２遺伝子治療に最適なカプシドを特定するために、蝸牛外植片及び非ヒト霊長類（ＮＨＰ）実験における理想的な向性について、新規及び以前に説明されたＡＡＶカプシドバリアントを評価する。最適化されたカプシド、プロモーター及びヒトＧＪＢ２遺伝子要素（治療薬Ａ）を備えたＡＡＶベクターを設計し、蝸牛支持細胞及び線維細胞でＣＸ２６の優れた発現を提供する。また、ウイルスで発現したＣＸ２６の識別を可能にするＦＬＡＧタグで、ＣＸ２６を発現する同一のＡＡＶベクターを生成した（治療薬Ａ－ＦＬＡＧ）。次に、最高性能のカプシドをＧＪＢ２導入遺伝子と共にパッケージ化し（治療薬Ａ）、ｉｎ ｖｉｖｏ投与後にコネキシン２６（ＣＸ２６）タンパク質の薬力学を評価した。本明細書に記載されるように、通常はＣＸ２６を発現しないＨｅＬａ細胞を利用する細胞ベースのアッセイでは、治療薬Ａ及び治療薬Ａ－ＦＬＡＧの両方が、細胞膜に正しく輸送されたＣＸ２６の発現を誘導した。更に、マウスの蝸牛への治療薬Ａ－ＦＬＡＧの注射は、蝸牛全体（基部から頂点まで）の目的の細胞でＣＸ２６－ＦＬＡＧのほぼ完全な発現を提供した。
【0361】
治療薬ＡはＨｅＬａ細胞のＦＲＡＰシグナルを増強する
ＦＲＡＰアッセイの方法：ＨｅＬａ細胞を２０，０００細胞／ウェルの密度で９６ウェルプレートに播種した。２４時間後、細胞にＡＡＶベクター（ＭＯＩ＝１０，０００）及びアデノウイルス血清型５（ＭＯＩ＝５）を形質導入した。導入遺伝子を発現させるために、更に４８時間後にＦＲＡＰアッセイを行った。ＦＲＡＰアッセイでは、細胞をカルセイン－ＡＭ（２．５ｕＭ）で３０分間インキュベートし、ＨＢＳＳで洗浄した後、Ｏｐｅｒｅｔｔａハイコンテンツ撮像システムで撮像した。センターフィールドは、４０倍の対物レンズと４８８ｎｍの蛍光照明（５０００ｍｓ×１２回の繰り返し）への露出を使用して光退色した。その直後に、ウェルを１０倍の倍率で３０分間撮像した。蛍光回復は、光退色領域と周囲の未退色領域との間の４８８ｎｍ強度の差として測定され、キセノンアークランプ蛍光光源からの光強度の変動を考慮して、周囲の未退色領域に対して正規化された。
ＦＲＡＰアッセイの方法：ＨｅＬａ細胞を２０，０００細胞／ウェルの密度で９６ウェルプレートに播種した。２４時間後、細胞にＡＡＶベクター（ＭＯＩ＝１０，０００）及びアデノウイルス血清型５（ＭＯＩ＝５）を形質導入した。導入遺伝子を発現させるために、更に４８時間後にＦＲＡＰアッセイを行った。ＦＲＡＰアッセイでは、細胞をカルセイン－ＡＭ（２．５ｕＭ）で３０分間インキュベートし、ＨＢＳＳで洗浄した後、Ｏｐｅｒｅｔｔａハイコンテンツ撮像システムで撮像した。センターフィールドは、４０倍の対物レンズと４８８ｎｍの蛍光照明（５０００ｍｓ×１２回の繰り返し）への露出を使用して光退色した。その直後に、ウェルを１０倍の倍率で３０分間撮像した。蛍光回復は、光退色領域と周囲の未退色領域との間の４８８ｎｍ強度の差として測定され、キセノンアークランプ蛍光光源からの光強度の変動を考慮して、周囲の未退色領域に対して正規化された。
【0362】
以下の実験では、蝸牛内投与用の治療薬Ａの緩衝溶液を使用する。治療薬Ａ構築物には、任意選択で、ＦＬＡＧタグを含めることができる。
【0363】
結果：ＣＸ２６を自然に発現しないＨｅＬａ細胞を使用して、治療薬ＡによるＣＸ２６発現の機能性を評価した。光退色の前に、ＨｅＬａ細胞を治療薬Ａ及びＡｄ５と共に５時間共培養し、その後４８時間回復させて導入遺伝子を発現させた。カルセイン－ＡＭは、細胞に取り込まれると加水分解し、蛍光を発し、膜不透過性になる。細胞内カルセイン色素は、機能的なギャップ結合を介して隣接する細胞に移動することが知られている。汎ギャップ結合阻害剤カルベノキソロン（ＣＢＸ）を使用して、非ギャップ結合媒介蛍光回復の寄与を決定した。図３４（上部パネル）は、各ＦＲＡＰ試験の光退色及び画像取得のタイムラインを示す。光退色後３０分間の蛍光回復を測定した。図３４（下のパネル）は、治療薬Ａ及び治療薬Ａ－ＦＬＡＧの両方が、形質導入されていないＨｅＬａ細胞よりも速く蛍光を回復することを示しており、導入遺伝子駆動タンパク質が機能的ギャップ結合を形成している可能性が高いことを示している。カルベノキソロンの添加は、機能するギャップ結合が細胞から細胞への色素移動の主な原因であることを示す蛍光回復のほとんどを減少させる。
【0364】
全体として、これらのデータは、ＧＪＢ２またはＧＪＢ２－ＦＬＡＧの治療薬Ａを介したＨｅＬａ細胞への送達（ＣＸ２６を自然に発現しない）が、カルセインＡＭ色素ＦＲＡＰシグナルを増強し、ＧＪＢ２導入遺伝子が機能的なギャップ結合を形成することを示している。
【0365】
Ｐ６仔マウスにおけるＰＳＣＣ送達後の治療薬Ａの向性
仔注射の方法：Ｐ６ Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ仔マウスを軽度の低体温で麻酔し、後半規管（ＰＳＣＣ）を介して１μＬの治療薬Ａ－ＦＬＡＧを注射した。注射後２５日目にマウスを屠殺し、灌流し、下流の免疫組織化学的処理のために蝸牛を採取した。ＦＬＡＧ抗体を用いてウイルス性発現ＣＸ２６－ＦＬＡＧの検出を行った。蝸牛は、以下の抗体または染色：ファロイジン（１：５００）、抗ＦＬＡＧ（１：２５０）、抗ＣＸ２６（１：２５０）及びＤＡＰＩ（１：１０００）で処理した。
仔注射の方法：Ｐ６ Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ仔マウスを軽度の低体温で麻酔し、後半規管（ＰＳＣＣ）を介して１μＬの治療薬Ａ－ＦＬＡＧを注射した。注射後２５日目にマウスを屠殺し、灌流し、下流の免疫組織化学的処理のために蝸牛を採取した。ＦＬＡＧ抗体を用いてウイルス性発現ＣＸ２６－ＦＬＡＧの検出を行った。蝸牛は、以下の抗体または染色：ファロイジン（１：５００）、抗ＦＬＡＧ（１：２５０）、抗ＣＸ２６（１：２５０）及びＤＡＰＩ（１：１０００）で処理した。
【0366】
結果：図３５のＡ～Ｃは、Ｐ６仔マウスにおける後半規管（ＰＳＣＣ）を介した治療用Ａ－ＦＬＡＧ（緑色）の蝸牛内注射が、内因性ＣＸ２６発現（深紅色）と比較して高度の形質導入を示すことを示す。ＣＸ２６－ＦＬＡＧ発現が蝸牛の長さ全体にわたって高レベルで存在し、内溝（Ａ）、クラウジウス細胞（Ｂ）及び他の支持細胞型（Ｃ）において膜状のプラーク様構造を形成することを示す一連の画像である。ＣＸ２６－ＦＬＡＧ発現はまた、らせん板縁及び側壁の線維細胞にも存在し、内因性ＣＸ２６発現の形態及びパターンと一致する。
【0367】
全体として、これらのデータは、ＰＳＣＣ注射を介したＰ６仔マウスへの治療薬Ａ－ＦＬＡＧの蝸牛内直接送達により、ＣＸ２６を天然に発現する細胞型で広範なＣＸ２６－ＦＬＡＧ形質導入が生じることを示す。
【0368】
Ｐ３０成体マウスにおけるＲＷＭ＋ＰＳＣＣ開窓蝸牛内送達後の治療薬Ａの安全性及び向性プロファイル
成体注射の方法：成体（Ｐ３０）Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに、正円窓膜（ＲＷＭ）を介して直接蝸牛内注射により、１μＬの治療薬Ａまたは治療薬Ａ－ＦＬＡＧを注射した。注射の前に、流体の流れを可能にするために、後半規管（ＰＳＣＣ）に開窓を作成した。マウスを屠殺し、注射後１４日目または４２日目に組織を固定するために４％ＰＦＡで心臓を灌流し、下流の免疫組織化学的処理のために蝸牛を採取した。蝸牛は、以下の抗体または染色：ファロイジン（１：５００）、抗ＦＬＡＧ（１：２５０）、抗ＣＸ２６（１：２５０）及びＤＡＰＩ（１：１０００）で処理した。
成体注射の方法：成体（Ｐ３０）Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに、正円窓膜（ＲＷＭ）を介して直接蝸牛内注射により、１μＬの治療薬Ａまたは治療薬Ａ－ＦＬＡＧを注射した。注射の前に、流体の流れを可能にするために、後半規管（ＰＳＣＣ）に開窓を作成した。マウスを屠殺し、注射後１４日目または４２日目に組織を固定するために４％ＰＦＡで心臓を灌流し、下流の免疫組織化学的処理のために蝸牛を採取した。蝸牛は、以下の抗体または染色：ファロイジン（１：５００）、抗ＦＬＡＧ（１：２５０）、抗ＣＸ２６（１：２５０）及びＤＡＰＩ（１：１０００）で処理した。
【0369】
結果：図３６は、Ｐ３０齢の成体マウスの後半規管の開窓による正円窓膜を介した治療薬Ａまたは治療薬Ａ－ＦＬＡＧの蝸牛内注射が安全であり、手術後４２日目の内有毛細胞または外有毛細胞に損傷を引き起こさなかったことを示す。図３７及び図３８は、手術後１４日目の内溝、クラウジウス細胞及び側壁線維細胞におけるＣＸ２６－ＦＬＡＧ形質導入（緑色）を示す。内溝及びクラウジウス細胞におけるＣＸ２６－ＦＬＡＧの発現は膜状であり、内因性ＣＸ２６と同様のプラーク様構造を形成する。
【0370】
全体として、これらのデータは、後半規管（ＰＳＣＣ）開窓を伴う正円窓膜（ＲＷＭ）を介した直接蝸牛内注射による治療薬Ａ－ＦＬＡＧの成体蝸牛内送達が、クリーンな安全性プロファイルでＣＸ２６－ＦＬＡＧの形質導入をもたらすことを示す。
【0371】
実施例４．ＧＪＢ２先天性難聴の臨床的に関連する誘導性マウスモデルにおける難聴及び蝸牛変性のレスキュー
ＧＪＢ２遺伝子変異は、ヒトの先天性非症候性聴覚消失の最も一般的な形態を引き起こす。ＧＪＢ２は、支持細胞及び線維細胞などの非感覚細胞の機能のために内耳で必要とされるギャップ結合タンパク質コネキシン２６（ＣＸ２６）をコードする。一般に、難聴の発症は言語取得前で中度から重度だが、一部の対象では、ＣＸ２６の喪失による難聴が軽度で進行性であり得る。ヒトの側頭骨実験では、ＧＪＢ２変異蝸牛における有毛細胞及び支持細胞の変性が明らかになったが、らせん神経節細胞は主に影響を受けない。この実験では、ＡＡＶベースの遺伝子治療候補である治療薬Ａが、ＧＪＢ２欠損の誘導性マウスモデルで評価される。
ＧＪＢ２遺伝子変異は、ヒトの先天性非症候性聴覚消失の最も一般的な形態を引き起こす。ＧＪＢ２は、支持細胞及び線維細胞などの非感覚細胞の機能のために内耳で必要とされるギャップ結合タンパク質コネキシン２６（ＣＸ２６）をコードする。一般に、難聴の発症は言語取得前で中度から重度だが、一部の対象では、ＣＸ２６の喪失による難聴が軽度で進行性であり得る。ヒトの側頭骨実験では、ＧＪＢ２変異蝸牛における有毛細胞及び支持細胞の変性が明らかになったが、らせん神経節細胞は主に影響を受けない。この実験では、ＡＡＶベースの遺伝子治療候補である治療薬Ａが、ＧＪＢ２欠損の誘導性マウスモデルで評価される。
【0372】
方法：ホモ接合性Ｃｘ２６ノックアウトはマウスの胚致死性であるため、Ｃｘ２６ｌｏｘｐ／ｌｏｘｐマウスとタモキシフェン誘導性ｃｒｅ（Ｒｏｓａ－ｃｒｅＥＲ）マウス株を交配することによって生成されたＣｘ２６コンディショナルノックアウト（Ｃｘ２６ｃＫＯ）を利用して、図３９Ａ及び図３９Ｂに示すように、内耳の細胞内のタンパク質Ｃｘ２６を失うことの影響を実験した。Ｃｘ２６フロックス動物では、エクソン２のコード領域は、イントロン１のｌｏｘＰ部位に隣接し、フロックス化されたｎｅｏカセットがエクソン２に挿入された。更に、本出願人は、様々なカプシド、プロモーター及び最適化されたＧＪＢ２コドンをスクリーニングした後、ＡＡＶベースの遺伝子療法候補（治療薬Ａ）を開発した。また、ＦＬＡＧタグＣＸ２６を発現する治療薬Ａ－ＦＬＡＧを作成し、野生型動物の蝸牛内（ＩＣ）経路を介して投与し、ＦＬＡＧ発現を追跡することにより、内耳におけるＡＡＶ由来のＣＸ２６の向性を決定した。遺伝子治療の有効性を実験するために、治療薬Ａまたはビヒクルを出生後にＩＣ経路を介してＣｘ２６ ｃＫＯマウスに投与した。生後（Ｐ）３０日目に聴覚脳幹反応を測定し、蝸牛を組織学的に処理して、形態及びＣＸ２６発現を決定した。
【0373】
結果：タモキシフェン投与のタイミングを調整することで、Ｃｘ２６ノックアウトの時間的制御が可能になり、その結果、ｃｒｅ活性化の時間に応じて様々な程度の難聴と蝸牛異常が生じた。Ｃｘ２６ ｃＫＯマウスでは、出生後早期のｃｒｅ活性化により、Ｐ３０で重度から最重度の難聴が引き起こされたが、その後のｃｒｅ活性化では進行性の軽度から中度の種類の難聴を引き起こした。組織学的検査では、Ｃｘ２６ ｃＫＯマウスではＣｘ２６の発現がほとんどまたはまったくないことが明らかになった。図３９のＣで示すように、出生後の野生型マウスへの治療薬Ａ－ＦＬＡＧの蝸牛内注射が、ＣＸ２６を天然に発現するすべての細胞型を含む広範な蝸牛カバー度を提供する。ナイーブマウスへの治療薬Ａ－ＦＬＡＧの蝸牛内（ＩＣ）投与により、支持細胞及び線維細胞におけるＡＡＶ形質導入が確認された。図３９のＤ及びＥに示すように、治療薬Ａを注射したＣｘ２６ ｃＫＯ動物は、ビヒクルを注射したＣｘ２６ ｃＫＯと比較して、複数の周波数にわたるＡＢＲ閾値の実質的なレスキュー、ＣＸ２６発現の回復、及び蝸牛の形態の保存を実証した。
【0374】
これらの結果に基づき、いかなる特定の理論にも束縛されるものではないが、本開示では、治療薬Ａの蝸牛内投与が、ヒトＧＪＢ２患者に見られる聴覚欠損を部分的に模倣するＣｘ２６ ｃＫＯマウスモデルにおける聴力、関連する蝸牛細胞型におけるＣＸ２６の発現、及び蝸牛の形態の回復に成功したことが想到される。
【0375】
実施例５．ＧＪＢ２先天性難聴の臨床的に関連するマウスモデルにおける難聴及び蝸牛変性のレスキュー
ＧＪＢ２変異は、ヒトの遺伝的難聴の最も一般的な原因を表す。ＧＪＢ２は、コネキシン２６（ＣＸ２６）をコードし、らせん板縁及びらせん靭帯の線維細胞、ならびにコルチ器内の支持細胞で天然に発現されるギャップ結合タンパク質である。マウスとヒトの実験の結果は、ＧＪＢ２変異が聴覚脳反応（ＡＢＲ）閾値の上昇と支持細胞及び有毛細胞の変性につながることを示す。このＧＪＢ２欠失表現型をレスキューするために、本出願人は、ＡＡＶの蝸牛内投与を介してＧＪＢ２の機能コピーを送達しようとした。最初に、ＣＸ２６を天然に発現する蝸牛細胞型を効率的に形質導入するＡＡＶカプシドの新しい種類を特定した。次に、新規のカプシド、プロモーター及びＦｌａｇタグ有無のヒトＧＪＢ２遺伝子要素（それぞれ、治療薬Ａ－Ｆｌａｇ及び治療薬Ａ）をパッケージングすることにより、ＡＡＶ構築物を更に最適化した。ここでは、ＧＪＢ２難聴の構成的Ｃｒｅマウスモデルを利用して、治療薬Ａの治療の可能性を評価した。
ＧＪＢ２変異は、ヒトの遺伝的難聴の最も一般的な原因を表す。ＧＪＢ２は、コネキシン２６（ＣＸ２６）をコードし、らせん板縁及びらせん靭帯の線維細胞、ならびにコルチ器内の支持細胞で天然に発現されるギャップ結合タンパク質である。マウスとヒトの実験の結果は、ＧＪＢ２変異が聴覚脳反応（ＡＢＲ）閾値の上昇と支持細胞及び有毛細胞の変性につながることを示す。このＧＪＢ２欠失表現型をレスキューするために、本出願人は、ＡＡＶの蝸牛内投与を介してＧＪＢ２の機能コピーを送達しようとした。最初に、ＣＸ２６を天然に発現する蝸牛細胞型を効率的に形質導入するＡＡＶカプシドの新しい種類を特定した。次に、新規のカプシド、プロモーター及びＦｌａｇタグ有無のヒトＧＪＢ２遺伝子要素（それぞれ、治療薬Ａ－Ｆｌａｇ及び治療薬Ａ）をパッケージングすることにより、ＡＡＶ構築物を更に最適化した。ここでは、ＧＪＢ２難聴の構成的Ｃｒｅマウスモデルを利用して、治療薬Ａの治療の可能性を評価した。
【0376】
方法：ＣＸ２６欠失のｉｎ ｖｉｖｏレスキューを評価するために、本出願人は、Ｃｘ２６ｌｏｘｐ／ｌｏｘｐマウスを、図４０Ａ及び図４０Ｂに示すように、内耳特異的プロモーターＰ０（Ｐ０－Ｃｒｅ）によって駆動されるＣｒｅを発現するマウスと交配させることによって、ＧＪＢ２の内耳欠失を有するマウスモデルを作製した。Ｃｘ２６フロックス動物では、エクソン２のコード領域は、イントロン１のｌｏｘＰ部位に隣接し、フロックス化ｎｅｏカセットがエクソン２に挿入されていた。Ｐ０－Ｃｒｅの発症は胎生期に起こり、これまでの実験では、このモデルではＥ１４．５という早い時期にプラーク形成が阻害されることが報告されている。出生後のマウスに、後半規管を介して１μＬの治療薬Ａ、治療薬Ａ－ＦＬＡＧまたはビヒクルを注射し、その後、Ｐ３０という早い時期に様々な有効性エンドポイントについて評価した。聴覚感度はＡＢＲによって測定され、その後、蝸牛が収集され、免疫組織化学的に抗ＣＸ２６、抗ＦＬＡＧ及びファロイジンで処理され、向性及び蝸牛の形態を評価した。向性を評価するために、蝸牛及び側壁のホールマウントをＺｅｉｓｓ ＬＳＭ８８０共焦点顕微鏡で撮像し、ＦＬＡＧまたはＣＸ２６のカバー度を定量化した。
【0377】
結果：図４０Ｃで示すように、出生後の野生型マウスへの治療薬Ａ－ＦＬＡＧの蝸牛内注射が、ＣＸ２６を天然に発現するすべての細胞型を含む広範な蝸牛カバー度を提供する。Ｐ０－Ｃｒｅマウスは、ＣＸ２６発現の実質的な減少と、有毛細胞と支持細胞の完全な喪失、重度から最重度の難聴がある平らな上皮表現型の存在を示す。図４０Ｄ及び図４０Ｅに示すように、Ｐ０－Ｃｒｅマウスへの治療薬Ａの蝸牛内投与は、ＣＸ２６発現を実質的に回復し、平坦な上皮表現型の発生を大幅に減少させ、存在する有毛細胞の数を増加させ、更に重要なことに、ＡＢＲを使用して測定された複数の周波数にわたる聴力の機能的改善を実証した。
【0378】
これらの結果に基づき、いかなる特定の理論にも束縛されるものではないが、本開示では、治療薬Ａの蝸牛内注射がＣＸ２６欠失難聴及び蝸牛病態をレスキューすることができると想到する。
【0379】
実施例６．非ヒト霊長類における治療薬Ａの送達及び向性
非ヒト霊長類（ＮＨＰ）向性実験の方法：カニクイザル（「ＮＨＰ」）、年齢３～５歳をＡＡＶ中和抗体について事前にスクリーニングし、正円窓膜（ＲＷＭ）を介して蝸牛に注入することにより、両側に（３０μＬ容量で１０１０ｖｇ／耳）投与した。ＮＨＰを安楽死させ、蝸牛切片を治療薬Ａ－ＦＬＡＧ投与の１２週間後に免疫組織化学によるＣＸ２６－ＦＬＡＧの発現について評価した。蝸牛は、以下の抗体または染色：ファロイジン（１：５００）、抗ＦＬＡＧ（１：２５０）、抗ＣＸ２６（１：２５０）及びＤＡＰＩ（１：１０００）で処理した。
非ヒト霊長類（ＮＨＰ）向性実験の方法：カニクイザル（「ＮＨＰ」）、年齢３～５歳をＡＡＶ中和抗体について事前にスクリーニングし、正円窓膜（ＲＷＭ）を介して蝸牛に注入することにより、両側に（３０μＬ容量で１０１０ｖｇ／耳）投与した。ＮＨＰを安楽死させ、蝸牛切片を治療薬Ａ－ＦＬＡＧ投与の１２週間後に免疫組織化学によるＣＸ２６－ＦＬＡＧの発現について評価した。蝸牛は、以下の抗体または染色：ファロイジン（１：５００）、抗ＦＬＡＧ（１：２５０）、抗ＣＸ２６（１：２５０）及びＤＡＰＩ（１：１０００）で処理した。
【0380】
結果：図４１は、治療薬Ａ－ＦＬＡＧの蝸牛内注射が、高度の形質導入を示すことを示す。ＣＸ２６－ＦＬＡＧ発現は、側壁（ＬＷ）、コルチ器（ＯＣ）支持細胞及びらせん板縁（ＳＬ）を含む、ＧＪＢ２レスキューに関連する領域で高いレベルで存在する。ＣＸ２６－ＦＬＡＧ発現は、内因性ＣＸ２６発現の形態及びパターンと一致する。
【0381】
これらの結果に基づいて、いかなる特定の理論にも束縛されるものではないが、本明細書では、治療薬Ａ－ＦＬＡＧは、蝸牛内投与後にＮＨＰ蝸牛全体にわたってＧＪＢ２関連細胞を形質導入することができると想到する。
【0382】
本開示を、理解の明確化を目的として、例示及び例としてある程度詳細に説明してきたが、特定の変更及び改変を添付の特許請求の範囲内で実施し得ることは理解されるべきである。前述の開示を考慮して理解されるか、または遺伝子治療、分子生物学、耳科学及び／または関連する分野の当業者に本開示の日常的な実践または実施によって明らかにされる、本開示を実行するための上記のモードの改変は、以下の特許請求の範囲内にあることを意図している。
【0383】
本明細書で述べられるすべての刊行物（例えば、非特許文献）、特許、特許出願公開、及び特許出願は、本開示が属する技術分野の当業者の技術レベルを示す。すべてのそのような刊行物（例えば、非特許文献）、特許、特許出願公開、及び特許出願は、それぞれ個々の公開、特許、特許出願公開、または特許出願が、参照により特異的かつ個々に組み込まれることが示されるのと同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
【0384】
前述の開示は、特定の好ましい実施形態に関連して説明されてきたが、それによって限定されるべきではない。
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
【図28】
【図29】
【図30】
【図31】
【図32】
【図33】
【図34】
【図35A】
【図35B】
【図35C】
【図35D】
【図36】
【図37】
【図38】
【図39A】
【図39B】
【図39C】
【図39D】
【図39E】
【図40A】
【図40B】
【図40C】
【図40D】
【図40E】
【図41】
【国際調査報告】