特表 2023-549125 プライム編集に基づく精密なゲノムの削除と置換方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-11-22

(54)【発明の名称】プライム編集に基づく精密なゲノムの削除と置換方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/09 20060101AFI20231115BHJP

   C12N 15/113 20100101ALI20231115BHJP

【ＦＩ】

C12N15/09 110

C12N15/113 Z ZNA

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023527355

(86)(22)【出願日】2021-11-04

(85)【翻訳文提出日】2023-07-07

(86)【国際出願番号】 US2021058079

(87)【国際公開番号】W WO2022098885

(87)【国際公開日】2022-05-12

(31)【優先権主張番号】63/110,304

(32)【優先日】2020-11-05

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＰＹＴＨＯＮ

(71)【出願人】

【識別番号】517075883

【氏名又は名称】ユニバーシティ オブ ワシントン

【氏名又は名称原語表記】Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ

【住所又は居所原語表記】４５４５ Ｒｏｏｓｅｖｅｌｔ Ｗａｙ ＮＥ， Ｓｕｉｔｅ ４００， Ｓｅａｔｔｌｅ， Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ ９８１０５ ＵＳ

(74)【代理人】

【識別番号】110001139

【氏名又は名称】ＳＫ弁理士法人

(74)【代理人】

【識別番号】100130328

【弁理士】

【氏名又は名称】奥野 彰彦

(74)【代理人】

【識別番号】100130672

【弁理士】

【氏名又は名称】伊藤 寛之

(72)【発明者】

【氏名】シェンデュア， ジェイ アショク

(72)【発明者】

【氏名】チェン， ウェイ

(72)【発明者】

【氏名】チェ， ジュンホン

(57)【要約】

ゲノム編集のための方法及び関連組成物が開示される。一態様において、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）を編集する方法は、それぞれｄｓＤＮＡ分子のセンス及びアンチセンス鎖上の第１及び第２標的配列に特異的な第１及び第２編集複合体を使用する。各編集複合体は、機能的ニッカーゼドメイン及び機能的逆転写酵素ドメインを含む融合エディタータンパク質に結合した伸長ガイドＲＮＡを含む。それぞれのガイドＲＮＡは、それらに結合した融合エディタータンパク質をｄｓＤＮＡにガイドし、ｄｓＤＮＡの反対側の鎖上の一本鎖切断を実施する。それぞれの逆転写酵素ドメインは、３'オーバーハングを生成する。ｄｓＤＮＡの修復により、２つの一本鎖切断の間に配置されたｄｓＤＮＡの部分が切除される。この方法の様々な構成及び応用が開示されており、遺伝子操作を実施するための柔軟で、容易で、効率的かつ正確な方法を提供する。
【選択図】図１Ｃ

【特許請求の範囲】

【請求項1】

センス鎖とアンチセンス鎖を有する二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）分子の編集方法であって、
前記方法は、前記ｄｓＤＮＡ分子を、前記ｄｓＤＮＡ分子の前記センス鎖上の第１標的配列に特異的な第１編集複合体及び前記ｄｓＤＮＡ分子の前記アンチセンス鎖上の第２標的配列に特異的な第２編集複合体と接触させるステップを含み、
前記第１編集複合体及び前記第２編集複合体は、それぞれ融合エディタータンパク質と、前記融合エディタータンパク質に結合した伸長ガイドＲＮＡ分子とを含み、前記融合エディターは、それぞれ機能的ニッカーゼドメイン及び機能的逆転写酵素ドメインを含み、
前記第１編集複合体の前記伸長ガイドＲＮＡ分子は、前記第１標的配列にハイブリダイズする第１配列を有する第１ガイドドメイン、及び３'端にある第１伸長ドメインを含み、
前記第２編集複合体の前記伸長ガイドＲＮＡ分子は、前記第２標的配列にハイブリダイズする第２配列を有する第２ガイドドメイン、及び３'端にある第２伸長ドメインを含み、
前記方法は、さらに
前記第１編集複合体の機能的ニッカーゼドメイン及び前記第２編集複合体の機能的ニッカーゼドメインが前記第１標的配列及び前記第２標的配列にある前記ｄｓＤＮＡ分子の反対側の鎖に第１一本鎖切断及び第２一本鎖切断を形成できるようにするステップと、
前記第１編集複合体の機能的逆転写酵素ドメインが前記第１伸長ドメインをテンプレートとして使用して前記第１一本鎖切断から第１の３'オーバーハングを生成できるようにし、前記第２編集複合体の機能的逆転写酵素ドメインが前記第２伸長ドメインをテンプレートとして使用して前記第２一本鎖切断から第２の３'オーバーハングを生成できるようにするステップと、
もともと前記第１一本鎖切断と前記第２一本鎖切断との間に配置されるｄｓＤＮＡの部分を切除してｄｓＤＮＡ分子を修復し、前記第１の３'オーバーハング及び第２の３'オーバーハングを修復されたｄｓＤＮＡ分子に組み込むステップと、
を含む、方法。

【請求項2】

前記第１編集複合体の機能的ニッカーゼドメイン及び前記第２編集複合体の機能的ニッカーゼドメインは、それぞれ独立してＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）酵素、ピロコッカス・フリオサス・アルゴノートなど、又はそれらに由来する機能的ニッカーゼドメインである、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記Ｃａｓは、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１２、Ｃａｓ１３、Ｃａｓ３、ＣａｓΦなどである、請求項２に記載の方法。

【請求項4】

前記第１編集複合体の機能的逆転写酵素ドメイン及び前記第２編集複合体の機能的逆転写酵素ドメインは、それぞれ独立してＭ－ＭＬＶ ＲＴ、ＨＩＶ ＲＴ、グループＩＩイントロンＲＴ（ＴＧＩＲＴ）、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＶなど、又はそれらの機能的ドメインである、請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項5】

前記第１標的配列は、前記第２標的配列の逆相補配列よりも前記センス鎖における５'側の位置に配置される、請求項１から４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項6】

前記第１標的配列は、前記第２標的配列の逆相補配列よりも前記センス鎖における３'側の位置に配置される、請求項１から４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項7】

前記第１の３'オーバーハング及び前記第２の３'オーバーハングは、互いに逆相補的であり、修復ステップにおいてハイブリダイズする、請求項１から６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項8】

前記第１の３'オーバーハングは、前記アンチセンス鎖における第２の３'オーバーハングのすぐ５'側に位置する配列に対応する配列を有する第１修復ドメインを含み、
前記第２の３'オーバーハングは、前記センス鎖における第１の３'オーバーハングのすぐ５'側に位置する配列に対応する配列を有する第２修復ドメインを含む、請求項１から６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項9】

前記第１の３'オーバーハングは、前記第１修復ドメインの５'側に位置する挿入配列をさらに含み、
前記第２の３'オーバーハングは、前記第２修復ドメインの５'側に位置する前記挿入配列の逆相補配列を含む、請求項８に記載の方法。

【請求項10】

前記第１の３'オーバーハングは、前記第２一本鎖切断のすぐ３'側に配置される配列に対応する配列を有する第１修復ドメインを含み、
前記第２の３'オーバーハングは、前記第１一本鎖切断のすぐ３'側に配置される配列に対応する配列を有する第２修復ドメインを含み、
前記修復ステップにより、もともと前記第１一本鎖切断と前記第２一本鎖切断との間に配置されるｄｓＤＮＡの部分に対応する配列が反転する、請求項１に記載の方法。

【請求項11】

前記第１の３'オーバーハングは、挿入ＤＮＡ断片の第１端ドメインに対応する配列を有する第１修復ドメインを含み、
前記第２の３'オーバーハングは、前記挿入ＤＮＡ断片の第２端ドメインに対応する配列を有する第２修復ドメインを含み、
前記第１端ドメイン及び前記第２端ドメインは、前記挿入ＤＮＡ断片の反対端に位置するか、又はより大きなｄｓＤＮＡ分子内の異なる部位に位置する、請求項１に記載の方法。

【請求項12】

もともと前記第１一本鎖切断と前記第２一本鎖切断との間に配置される、切除されるｄｓＤＮＡ分子の部分は、少なくとも５ヌクレオチド長である、請求項１に記載の方法。

【請求項13】

もともと前記第１一本鎖切断と前記第２一本鎖切断との間に配置される、切除されるｄｓＤＮＡ分子の部分は、約１０ヌクレオチドから１，０００，０００ヌクレオチド長である、請求項１２に記載の方法。

【請求項14】

前記第１編集複合体及び／又は前記第２編集複合体は、３'－オーバーハング生成の効率を向上させるように構成される追加の機能的ドメインを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項15】

前記第１編集複合体及び／又は前記第２編集複合体の融合エディタータンパク質は、生成した３'オーバーハングを用いてＤＮＡ修復の効率を向上させるように構成される追加の機能的ドメインを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項16】

前記第１ガイドドメイン及び前記第２ガイドドメインは、それぞれ独立して約２０から約２００ヌクレオチド長である、請求項１に記載の方法。

【請求項17】

前記第１ガイドドメイン及び前記第２ガイドドメインは、それぞれ独立して約２５から１００ヌクレオチド長、約２５から５０ヌクレオチド長、又は約２５から４０ヌクレオチド長である、請求項１６に記載の方法。

【請求項18】

前記第１ガイドドメイン及び前記第２ガイドドメインは、それぞれ前記第１編集複合体及び前記第２編集複合体と適合性があるように構成され、及び／又は
前記第１ガイドドメイン及び／又は前記第２ガイドドメインにおける１つ以上のヌクレオチド残基は、２'－Ｏ－メチル化、ロックされた核酸、ペプチド核酸、又は同様の機能的に修飾された核酸部分で修飾されている、請求項１に記載の方法。

【請求項19】

前記第１伸長ドメイン及び前記第２伸長ドメインは、それぞれ独立して少なくとも約１０ヌクレオチド長である、請求項１に記載の方法。

【請求項20】

前記第１伸長ドメイン及び前記第２伸長ドメインは、それぞれ独立して約１０ヌクレオチドから約４０ヌクレオチド長である、請求項１９に記載の方法。

【請求項21】

前記方法は、インビトロの細胞内で実行される、請求項１に記載の方法。

【請求項22】

前記方法は、インビボの細胞内で実行される、請求項１に記載の方法。

【請求項23】

前記方法は、ゲノム配列の削除、ゲノム配列の反転、染色体間再構成、及び／又はゲノムの標的領域若しくは部位への新しい配列の挿入を含む治療法である、請求項２２に記載の方法。

【請求項24】

前記方法は、前記ｄｓＤＮＡを、複数ペアの第１及び第２編集複合体と接触させるステップを含み、ここで、各ペアの第１編集複合体及び第２編集複合体は、前記ｄｓＤＮＡ内の異なるペアの第１標的配列及び第２標的配列を標的とする、請求項１から２３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項25】

前記接触は、複数のｐｅｇＲＮＡ又は前記ｐｅｇＲＮＡをコードする複数の核酸分子をプールし、前記ｄｓＤＮＡ分子を含む細胞を、プールされた複数のｐｅｇＲＮＡ又は前記ｐｅｇＲＮＡをコードする複数の核酸分子と接触させるステップを含む、請求項２４に記載の方法。

【請求項26】

前記細胞を、１つ以上の融合エディタータンパク質又は前記１つ以上の融合エディタータンパク質をコードする１つ以上の核酸分子と接触させ、前記融合エディタータンパク質が発現し及び／又は前記細胞内で複合できるようにするステップをさらに含む、請求項２５に記載の方法。

【請求項27】

細胞において１つ以上の二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）分子を編集する方法であって、
前記方法は、前記細胞を、１ペア以上の第１編集複合体及び第２編集複合体又は１ペア以上の第１複合体及び第２複合体のコンポーネントをコードする１つ以上の核酸と接触させ、前記コンポーネントが細胞内で発現し及び組み立てられるようにするステップを含み、
前記１ペア以上の第１編集複合体及び第２編集複合体の各ペアにおいて、
前記第１編集複合体は、前記ｄｓＤＮＡ分子の前記センス鎖上の第１標的配列に特異的であり、前記第２編集複合体は、前記ｄｓＤＮＡ分子の前記アンチセンス鎖上の第２標的配列に特異的であり、
前記第１編集複合体及び前記第２編集複合体は、それぞれ融合エディタータンパク質と、前記融合エディタータンパク質に結合した伸長ガイドＲＮＡ分子とを含み、前記融合エディターは、それぞれ機能的ニッカーゼドメイン及び機能的逆転写酵素ドメインを含み、
前記第１編集複合体の前記伸長ガイドＲＮＡ分子は、前記第１標的配列にハイブリダイズする第１配列を有する第１ガイドドメイン、及び３'端にある第１伸長ドメインを含み、
前記第２編集複合体の前記伸長ガイドＲＮＡ分子は、前記第２標的配列にハイブリダイズする第２配列を有する第２ガイドドメイン、及び３'端にある第２伸長ドメインを含み、
各ペアの前記第１編集複合体及び第２編集複合体は、
前記第１編集複合体の機能的ニッカーゼドメイン及び前記第２編集複合体の機能的ニッカーゼドメインが前記第１標的配列及び前記第２標的配列にある前記ｄｓＤＮＡ分子の反対側の鎖に第１一本鎖切断及び第２一本鎖切断を形成できるようにし、
前記第１編集複合体の機能的逆転写酵素ドメインが前記第１伸長ドメインをテンプレートとして使用して前記第１一本鎖切断から第１の３'オーバーハングを生成できるようにし、前記第２編集複合体の機能的逆転写酵素ドメインが前記第２伸長ドメインをテンプレートとして使用して前記第２一本鎖切断から第２の３'オーバーハングを生成できるようにし、
もともと前記第１一本鎖切断と前記第２一本鎖切断との間に配置されるｄｓＤＮＡの部分を切除してｄｓＤＮＡ分子を修復し、前記第１の３'オーバーハング及び第２の３'オーバーハングを修復されたｄｓＤＮＡ分子に組み込む、方法。

【請求項28】

前記細胞を、複数ペアの第１編集複合体及び第２編集複合体、又は複数ペアの第１編集複合体及び第２編集複合体のコンポーネントをコードする複数の核酸と接触させ、前記コンポーネントが前記細胞内で発現し組み立てられるようにするステップを含み、
ここで、各ペアの前記第１編集複合体及び第２編集複合体は、前記細胞における１つ以上のｄｓＤＮＡ分子上の異なる前記第１標的配列及び第２標的配列を標的とする、請求項２７に記載の方法。

【請求項29】

請求項１から２０に記載の第１編集複合体及び第２編集複合体を含むキットであって、
前記センス鎖上の前記第１標的配列及び前記アンチセンス鎖上の前記第２標的配列は、介在配列によって区切られ、前記第１編集複合体及び前記第２編集複合体は、標的ｄｓＤＮＡ分子において、前記介在配列を削除し、前記介在配列を反転し、及び／又は前記第１編集複合体及び前記第２編集複合体によって誘導された前記第１一本鎖切断及び／又は前記第２一本鎖切断に１つ以上の新しい配列を挿入するように構成される、キット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照

【0002】

本出願は、２０２０年１１月５日に出願された仮出願第６３／１１０，３０４号の利益を主張し、その開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0003】

配列表に関する声明

【0004】

本願に添付の配列表は、紙のコピーの代わりにテキスト形式で提供され、ここに参照により本明細書に組み込まれる。配列表を含むテキストファイルの名前は、３９１５－Ｐ１１６２ＷＯＵＷ＿Ｓｅｑ＿Ｌｉｓｔ＿ＦＩＮＡＬ＿２０２１１１０１＿ＳＴ２５．ｔｘｔである。このテキストファイルは２８ＫＢで２０２１年１１月１日に作成されたものであり、明細書の提出とともにＥＦＳ－Ｗｅｂ経由で提出されている。

【0005】

政府ライセンス権に関する説明

【0006】

本発明は、国立衛生研究所から授与された助成金番号ＵＭ１ ＨＧ００９４０８の下で政府の支援を受けて行われた。政府は本発明について一定の権利を有している。

【背景技術】

【0007】

ゲノムを精密に操作できることにより、遺伝子や調節エレメントなどの特定のゲノム配列の機能を研究することを可能になる。過去１０年以内に、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ベースのテクノロジーがこの点で革新的であることが証明され、編集又は摂動モダリティのレパートリーが急速に拡大し、ゲノム遺伝子座の精密なターゲティングが可能になった。これらの中でも、特定のゲノム配列を精密かつ無制限に削除することは、機能ゲノミクスと遺伝子治療の両方で使用例があり、特に重要である。

【0008】

現在、ゲノム削除をプログラムするための主要な方法では、それぞれプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列を標的とする１ペアのＣＲＩＳＰＲシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を使用し、隣接する１ペアのＤＮＡ二本鎖切断（ＤＳＢ）が発生する。２つの部位を同時に切断すると、細胞ＤＮＡ損傷修復因子は多くの場合、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）を介して配列を介さずにゲノムの２つの末端を結合させる（図１Ａ）。このアプローチは、強力であるが、いくつかの制限がある。１）削除、特に比較的長い削除を誘導する場合、意図した削除の有無にかかわらず、一方又は両方のＤＳＢ付近に短い挿入又は削除（インデル、通常、１０ｂｐ未満）が生じることがよくある。２）大規模な削除やより複雑な再構成などの他の意図しない変異は、頻繁に発生する可能性があり、技術的な理由により検出されません。３）ＤＳＢは、細胞毒性的な損傷である。４）この方法によってプログラムされたゲノム削除のジャンクションは、天然に存在するＰＡＭ部位の分布によって制限される。これらの制限にもかかわらず、様々な研究（例えば、遺伝子と調節エレメントの機能の調査及び遺伝子治療に向ける研究）ではこの方法を採用して大きな効果を得た。しかし、限られた精度、ＤＳＢ毒性、及び任意の削除をプログラムできないことにより、機能ゲノミクス及び治療ゲノミクスにおけるＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９誘導削除の有用性が損なわれている。

【0009】

最近、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ゲノム編集ツールキットを様々な方法で拡張する「プライム編集」について説明された（ｈｔｔｐｓ：／／ｐａｐｅｒｐｉｌｅ．ｃｏｍ／ｃ／ｇＧｘＲｎＷ／ｔ６ｅｂｌ）。プライム編集では、逆転写酵素と融合したＣａｓ９ニッカーゼ（Ｃａｓ９ Ｈ８４０Ａ）であるＰｒｉｍｅ Ｅｄｉｔｏｒ－２酵素と３'伸長ｓｇＲＮＡ（プライム編集ｓｇＲＮＡ又はｐｅｇＲＮＡ）を利用する。Ｐｒｉｍｅ Ｅｄｉｔｏｒ－２酵素とｐｅｇＲＮＡ複合体は、ゲノムの１本の鎖にニックを入れ、ｐｅｇＲＮＡ分子のテンプレートＲＮＡ配列に従って、ニックが入った部位に３'一本鎖ＤＮＡフラップを結合する。隣接する領域に相同な配列を含めることにより、ＤＮＡ損傷修復因子は３'フラップ配列をゲノムに組み込むことができる。追加のｓｇＲＮＡを使用することで取り込み率をさらに高めることができる。これにより、反対側の鎖にニックが入り、３'フラップ配列によるＤＮＡ修復が促進されるが、精度が低下する場合が多い（ＰＥ３／ＰＥ３ｂと呼ばれる戦略）（図１Ｂ）。プライム編集の利点は、単一分子ｐｅｇＲＮＡ内の標的部位と修復の性質の両方をコード化できることにある。ＰＥ３戦略は、単一のｐｅｇＲＮＡ／ｓｇＲＮＡペアを使用して、５～８０ｂｐの範囲の削除をプログラムすることができ、適切な精度（平均して、意図しないインデルの割合１１％）で高い効率（５２～７８％）を達成できることを示している。しかし、ＰＥ３戦略でも、１００ｂｐを超える削除をプログラムする場合には大きな困難に直面している。さらに、２０ｂｐを超える削除では、効率が急激に低下することが観察された。

【0010】

従って、ゲノム編集技術の進歩にも関わらず、遺伝子操作（例えば、削除や挿入）を実施するための容易で効率的かつ精密な方法を開発する必要がある。本発明は、上記の事情に鑑みてなされたものである。

【発明の概要】

【0011】

この概要は、以下の詳細な説明でさらに説明される概念の選択を簡略化した形式で紹介するために提供される。この概要は、請求された主題の主要な特徴を特定することを意図したものではなく、また、請求された主題の範囲を決定する際の補助として使用されることも意図したものではない。

【0012】

一態様では、本開示は、センス鎖及びアンチセンス鎖を有する二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）分子を編集する方法を提供する。この方法は、ｄｓＤＮＡ分子をｄｓＤＮＡ分子のセンス鎖上の第１標的配列に特異的な第１編集複合体及びｄｓＤＮＡ分子のアンチセンス鎖上の第２標的配列に特異的な第２編集複合体と接触させるステップを含む。第１編集複合体及び第２編集複合体は、それぞれ融合エディタータンパク質及び融合エディタータンパク質に結合した伸長ガイドＲＮＡ分子を含む。融合エディターは、それぞれ機能的ニッカーゼドメイン及び機能的逆転写酵素ドメインを含む。第１編集複合体の伸長ガイドＲＮＡ分子は、第１標的配列にハイブリダイズした第１配列を有する第１ガイドドメイン、及び３'端にある第１伸長ドメインを含む。第２編集複合体の伸長ガイドＲＮＡ分子は、第２標的配列にハイブリダイズする第２配列を有する第２ガイドドメイン、及び３'端にある第２伸長ドメインを含む。前記方法は、第１編集複合体の機能的ニッカーゼドメイン及び第２編集複合体の機能的ニッカーゼドメインが、第１標的配列及び第２標的配列にあるｄｓＤＮＡ分子の反対側の鎖にそれぞれ第１一本鎖切断及び第２一本鎖切断を生成できるようにするステップをさらに含む。次に、前記方法は、第１編集複合体の機能的逆転写酵素ドメインが第１伸長ドメインをテンプレートとして使用して第１一本鎖切断から第１の３'オーバーハングを生成できるようにし、第２編集複合体の機能的逆転写酵素ドメインが第２伸長ドメインをテンプレートとして使用して第２一本鎖切断から第２の３'オーバーハングを生成できるようにするステップを含む。最後に、前記方法は、もともと第１一本鎖切断と第２一本鎖切断との間に配置されるｄｓＤＮＡの部分を切除することでｄｓＤＮＡ分子を修復し、第１の３'オーバーハング及び第２の３'オーバーハングを修復されたｄｓＤＮＡ分子に組み込むステップを含む。

【0013】

いくつかの実施形態において、第１編集複合体の機能的ニッカーゼドメイン及び第２編集複合体の機能的ニッカーゼドメインは、それぞれ独立してＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）酵素ピロコッカス・フリオサス・アルゴノートなど又はそれらに由来する機能的ニッカーゼドメインである。いくつかの実施形態において、Ｃａｓは、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１２、Ｃａｓ１３、Ｃａｓ３、ＣａｓΦなどである。いくつかの実施形態において、第１編集複合体の機能的逆転写酵素ドメイン及び第２編集複合体の機能的逆転写酵素ドメインは、それぞれ独立してＭ－ＭＬＶ ＲＴ、ＨＩＶ ＲＴ、グループＩＩイントロンＲＴ（ＴＧＩＲＴ）、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＶなど又はその機能的ドメインである。

【0014】

いくつかの実施形態において、第１標的配列は、第２標的配列の逆相補配列（Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）よりもセンス鎖内の５'側の位置に配置される。いくつかの実施形態において、第１標的配列は、第２標的配列の逆相補配列よりもセンス鎖内の３'側の位置に配置される。いくつかの実施形態において、第１の３'オーバーハング及び第２の３'オーバーハングは、互いに逆相補的であり、修復ステップでハイブリダイズする。

【0015】

いくつかの実施形態において、第１の３'オーバーハングは、アンチセンス鎖における第２の３'オーバーハングのすぐ５'側に位置する配列に対応する配列を有する第１修復ドメインを含み、第２の３'オーバーハングは、センス鎖における第１の３'オーバーハングのすぐ５'側に位置する配列に対応する配列を有する第２修復ドメインを含む。いくつかの実施形態において、第１の３'オーバーハングは、第１修復ドメインの５'に配置される挿入配列をさらに含む。第２の３'オーバーハングは、第２修復ドメインの５'に配置される挿入配列の逆相補配列を含む。

【0016】

いくつかの実施形態において、第１の３'オーバーハングは、第２一本鎖切断のすぐ３'側に位置する配列に対応する配列を有する第１修復ドメインを含み、第２の３'オーバーハングは、第１一本鎖切断のすぐ３'側に位置する配列に対応する配列を有する第２修復ドメインを含む。これによって、修復ステップでは、もともと第１一本鎖切断と第２一本鎖切断との間に配置されるｄｓＤＮＡの部分に対応する配列が反転する。

【0017】

いくつかの実施形態において、第１の３'オーバーハングは、挿入ＤＮＡ断片の第１端ドメインに対応する配列を有する第１修復ドメインを含み、第２の３'オーバーハングは、挿入ＤＮＡ断片の第２端ドメインに対応する配列を有する第２修復ドメインを含む。第１端ドメイン及び第２端ドメインは、挿入ＤＮＡ断片の反対端に位置するか、又はより大きなｄｓＤＮＡ分子内の異なる部位にある。

【0018】

いくつかの実施形態において、もともと第１一本鎖切断と第２一本鎖切断との間に配置される、切除されるｄｓＤＮＡ分子の部分は、少なくとも５ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態において、切除されたもともと第１一本鎖切断と第２一本鎖切断との間に配置されるｄｓＤＮＡ分子の部分は、約１０ヌクレオチドから１，０００，０００ヌクレオチド長である。

【0019】

いくつかの実施形態において、第１編集複合体及び／又は第２編集複合体は、３'－オーバーハング生成の効率を向上させるように構成される追加の機能的ドメインを含む。いくつかの実施形態において、第１編集複合体及び／又は第２編集複合体の融合エディタータンパク質は、生成した３'オーバーハングを用いたＤＮＡ修復の効率を向上させるように構成される追加の機能的ドメインを含む。

【0020】

いくつかの実施形態において、第１ガイドドメイン及び第２ガイドドメインは、それぞれ独立して約２０から約２００ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態において、第１ガイドドメイン及び第２ガイドドメインは、それぞれ独立して約２５から１００ヌクレオチド長、約２５から５０ヌクレオチド長、又は約２５から４０ヌクレオチド長である。

【0021】

いくつかの実施形態において、第１ガイドドメイン及び第２ガイドドメインは、それぞれ第１編集複合体及び第２編集複合体と互換性があるように構成され、及び／又は第１ガイドドメイン及び／又は第２ガイドドメインにおける１つ以上のヌクレオチド残基は、２'－Ｏ－メチル化、ロックされた核酸、ペプチド核酸又は同様の機能的に修飾された核酸部分で修飾される。

【0022】

いくつかの実施形態において、第１伸長ドメイン及び第２伸長ドメインは、それぞれ独立して少なくとも約１０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態において、第１伸長ドメイン及び第２伸長ドメインは、それぞれ独立して約１０ヌクレオチドから約４０ヌクレオチド長である。

【0023】

いくつかの実施形態において、前記方法は、インビトロで実施される。いくつかの実施形態において、前記方法は、インビボで実施される。いくつかの実施形態において、前記方法は、ゲノム配列の削除、ゲノム配列の反転、染色体間再構成、及び／又はゲノムの標的領域若しくは部位への新しい配列の挿入を含む治療法である。

【0024】

いくつかの実施形態において、この方法は、ｄｓＤＮＡ分子内の複数の位置で編集を実行するために、複数ペアの第１及び第２編集複合体を含むように拡張される。この方法は、ｄｓＤＮＡを複数ペアの第１及び第２編集複合体と接触させることを含み得る。各ペアの第１及び第２編集複合体は、ｄｓＤＮＡ内の異なるペアの第１及び第２標的配列を標的とする。

【0025】

いくつかの実施形態において、前記方法は、複数のｐｅｇＲＮＡ又はｐｅｇＲＮＡをコードする複数の核酸分子をプールするステップ、並びにｄｓＤＮＡ分子を含む細胞を、複数のｐｅｇＲＮＡ又はｐｅｇＲＮＡをコードする複数の核酸分子のプールと接触させるステップを含む。いくつかの実施形態において、前記方法は、をさらに含む。前記細胞を、１つ以上の融合エディタータンパク質又は１つ以上の融合エディタータンパク質をコードする１つ以上の核酸分子と接触させるステップ、並びに、融合エディタータンパク質が前記細胞内で発現及び／又は複合するようにするステップを含む。

【0026】

別の態様において、細胞において１つ以上の二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）分子を編集する方法を提供する。この方法は、細胞を、１ペア以上の第１及び第２編集複合体又は１ペア以上の第１及び第２複合体のコンポーネントをコードする１つ以上の核酸と接触させるステップ、並びに、前記コンポーネントが細胞内で発現し、組み立てられるようにするステップを含む。１ペア以上の第１及び第２編集複合体の各ペアについては、以下が適用される。

【0027】

第１編集複合体は、ｄｓＤＮＡ分子のセンス鎖上の第１標的配列に特異的であり、第２編集複合体は、ｄｓＤＮＡ分子のアンチセンス鎖上の第２標的配列に特異的である。

【0028】

第１編集複合体及び第２編集複合体は、それぞれ融合エディタータンパク質及びそれに結合した伸長ガイドＲＮＡ分子を含み、前記融合エディターは、それぞれ機能的ニッカーゼドメイン及び機能的逆転写酵素ドメインを含む。

【0029】

第１編集複合体の伸長ガイドＲＮＡ分子は、第１標的配列にハイブリダイズする第１配列を有する第１ガイドドメイン、及び３'端にある第１伸長ドメインを含む。

【0030】

第２編集複合体の伸長ガイドＲＮＡ分子は、第２標的配列にハイブリダイズする第２配列を有する第２ガイドドメイン、及び３'端にある第２伸長ドメインを含む。

【0031】

前記方法は、（各ペアの第１及び第２編集複合体）第１編集複合体の機能的ニッカーゼドメイン及び第２編集複合体の機能的ニッカーゼドメインが第１標的配列及び第２標的配列にあるｄｓＤＮＡ分子の反対側の鎖にそれぞれ第１一本鎖切断及び第２一本鎖切断を生成できるようにするステップと；第１編集複合体の機能的逆転写酵素ドメインが第１伸長ドメインをテンプレートとして使用して第１一本鎖切断から第１の３'オーバーハングを生成できるようにするステップと；第２編集複合体の機能的逆転写酵素ドメインが第２伸長ドメインをテンプレートとして使用して第２一本鎖切断から第２の３'オーバーハングを生成できるようにするステップと；もともと第１一本鎖切断と第２一本鎖切断との間に配置されるｄｓＤＮＡの部分を切除することでｄｓＤＮＡ分子を修復し、第１の３'オーバーハング及び第２の３'オーバーハングを修復されたｄｓＤＮＡ分子に組み込むステップと；を含む。

【0032】

いくつかの実施形態において、前記方法は、細胞を、複数ペアの第１及び第２編集複合体又は複数ペアの第１及び第２複合体のコンポーネントをコードする複数の核酸と接触させるステップと；前記コンポーネントが前記細胞内で発現又は組み立てられるようにするステップと；を含む。各ペアの第１及び第２編集複合体は、前記細胞における１つ以上のｄｓＤＮＡ分子上の異なる第１及び第２標的配列を標的とする。

【0033】

別の態様において、本発明は、上記の第１編集複合体及び第２編集複合体を含むキットを提供する。センス鎖上の第１標的配列及びアンチセンス鎖上の第２標的配列は、介在配列によって区切られる。第１編集複合体及び第２編集複合体は、標的ｄｓＤＮＡ分子において、介在配列を削除し、介在配列を反転し、及び／又は１つ以上の新しい配列を第１編集複合体及び第２編集複合体によって誘導された第１及び／又は第２一本鎖切断に挿入するように構成される。

【図面の簡単な説明】

【0034】

本発明の前述の態様及び付随する利点の多くは、添付の図面と併せて以下の詳細な説明を参照することにより、それらがよりよく理解されるにつれて、より容易に理解されるであろう。

【0035】

【図1】図１Ａから図１Ｈは、ＰＲＩＭＥ－Ｄｅｌを用いた精密なエピソーム性削除である。図１Ａから図１Ｃは、Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡペア削除戦略（１Ａ）、ＰＥ３（１Ｂ）及びＰＲＩＭＥ－Ｄｅｌ（１Ｃ）である。図１ＣのＰＲＩＭＥ－Ｄｅｌでは、１ペアのｐｅｇＲＮＡは、反対側の鎖上の意図した削除の各端及び３'フラップにニックを入れる部位をコードする。図示の実施形態において、３'フラップは、他のｐｅｇＲＮＡが標的とする領域に相補的な配列を含む。文字は、フラップがどのように標的のｄｓＤＮＡ配列とハイブリダイズするか、及び修復されかつ編集された配列に組み込まれるかを示す。図１Ｄは、エピソーム的にコードされた化ｅＧＦＰ遺伝子内にプログラムされた削除の漫画表現（一定の縮尺で描かれていない）である。図１Ｅは、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞における２４ｂｐ、９１ｂｐ及び５４６ｂｐの削除実験について、ＰＲＩＭＥ－Ｄｅｌ媒介削除の効率及びエラー頻度（意図的な削除の有無にかかわらず）を測定した（ｎ＝５回のトランスフェクション反復の平均）。シーケンシングリードは、インデル修飾なし（「編集なし」）、意図した削除を伴わないインデルエラー、意図した削除を伴うインデルエラー、及びエラーなしの正確な削除として分類された。図１Ｆでは、３つの方法により５４６ｂｐ削除実験のＰＲＩＭＥ－Ｄｅｌ媒介削除効率を測定した（ｎ＝３回のトランスフェクション反復にわたる平均±ＳＤ）。図１Ｇは、５４６ｂｐ削除実験からのシーケンシング全体の挿入、削除及び置換エラーの頻度を示す。リードは、削除なし（上）又は削除あり（下）のいずれかで参照配列にアラインメントされた。プロットは、シーケンシングエラーを減少させるためにＵＭＩを折り畳んだシングルエンドリードからのものである。図６Ｅは、追加の反復とエラークラス特異的スケールを示す。なお、２つの３'－ＤＮＡフラップのうち１つだけが、削除を欠くアンプリコン（「野生型」として標識）におけるシーケンシングリードによってカバーされる。図１Ｈは、ペアエンドシーケンシングリードをマージした後の５４６ｂｐ削除実験からのアンプリコン全体の挿入、削除及び置換エラーの頻度を示す。

【0036】

【図2】図２Ａから図２Ｆは、ＰＲＩＭＥ－Ｄｅｌを用いた削除と挿入の同時プログラミングを示す。図２Ａは、切断部位間に配列を挿入するように構成された戦略ＰＲＩＭＥ－Ｄｅｌバリエーションの概略図である。コードされた３'フラップは、図１Ｃのように、他のｐｅｇＲＮＡが標的とする領域に相補的な配列を含むが、挿入される追加の配列も含む。追加の配列は、対応する３'フラップのペアに対応する逆相補的形式で提示され、修復ステップ中にアニールし、結果としてｄｓＤＮＡ配列が挿入される。対応する領域は文字で示され、具体的には、挿入配列はＢ／ｂで示される。図２Ｂは、Ｃａｓ９とｓｇＲＮＡペアを用いた従来の削除戦略を示す。潜在的な削除ジャンクションは、ＰＡＭ部位の自然な分布によって制限される。図２Ｃでは、ｐｅｇＲＮＡペアは、ｅＧＦＰにおける５４６ｂｐの削除とともに、サイズが３～３０ｂｐの範囲の５つの挿入をコードするように設計された。図２Ｄは、これらのｐｅｇＲＮＡペアを使用してＨＥＫ２９３Ｔ細胞において削除と挿入を同時に誘導した場合の、推定削除効率とインデルエラー頻度（意図的な削除の有無にかかわらず）を示す（ｎ＝３回のトランスフェクション反復の平均）。図２Ｅは、５４６ｂｐ削除と３０ｂｐ挿入を同時に行った条件下でのシーケンシングリードにわたってプロットされた代表的な挿入、削除、置換エラーの頻度を示す。プロットは、ＵＭＩ補正なしのシングルエンドリードからのものである。なお、２つの３'－ＤＮＡフラップのうち１つだけが、削除を欠くアンプリコン（「野生型」として標識）におけるシーケンシングリードによってカバーされる。図２Ｆは、プログラムされた削除を含み、プログラムされた挿入も含むリードの割合を示す（ｎ≧３回のトランスフェクション反復にわたる平均±ＳＤ）。

【0037】

【図3】図３Ａから３Ｇは、ＰＲＩＭＥ－Ｄｅｌを用いた精密なゲノム削除を示す。図３Ａは、ｅＧＦＰ導入ＨＥＫ２９３Ｔ細胞株の生成の概略図である。図３Ｂは、ＰＲＩＭＥ－Ｄｅｌを用いてＨＥＫ２９３Ｔ細胞のゲノム的に組み込まれたｅＧＦＰに対して削除と挿入を同時に行った場合の推定削除効率とエラー頻度を示す（ｎ＝３回のトランスフェクション反復の平均）。図３Ｃは、ゲノムに組み込まれたｅＧＦＰ上の同時５４６ｂｐ削除と３０ｂｐ挿入条件からのシーケンシングリード全体にわたってプロットされた代表的な挿入、削除及び置換エラーの頻度を示す。プロットは、ＵＭＩ補正なしのシングルエンドリードからのものである。図３Ｄは、ＨＰＲＴ１遺伝子内にプログラムされた削除の漫画表現である。図３Ｅは、ＰＲＩＭＥ－Ｄｅｌ又はＣａｓ９／ｓｇＲＮＡペア（Ｃａｓ９と略称）戦略を用いたＨＥＫ２９３Ｔ細胞における１１８ｂｐ及び２５２ｂｐ削除について測定された削除効率、固有分子識別子（ＵＭＩ）に基づくシーケンシングアッセイ又は液滴デジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）アッセイによる定量化を示す（ｎ＝３回のトランスフェクション反復にわたる平均±ＳＤ）。図３Ｆは、Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡペア戦略を用いた、ＨＰＲＴエクソン１での１１８ｂｐ削除（左）と２５２ｂｐ削除（右）のシーケンシングリードにわたってプロットされた代表的な挿入、削除及び置換エラーの頻度を示す。異なるエラークラスは図３Ｃと同じ色で表示される。図３Ｇは、ＰＲＩＭＥ－Ｄｅｌ戦略を用いた以外、図３Ｆと同じである。

【0038】

【図4】図４Ａから図４Ｅは、ゲノム全体にわたるＰＲＩＭＥ－Ｄｅｌの特徴付けを示す。図４Ａは、ＰＲＩＭＥ－Ｄｅｌ（左）及びＣａｓ９／ｓｇＲＮＡペア法（右）におけるゲノム全体にわたる異なる削除の推定削除効率とインデルエラー頻度（ｎ＝３回のトランスフェクション反復の平均）を示す。ＵＭＩに基づくシーケンシングアッセイにより定量化した（ＦＭＲ１＊のＧＣリッチなアンプリコン（ＤＭＳＯの添加によりＵＭＩ付加反応が妨げられた）を除き）。図４Ｂは、Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡペア媒介削除における既知のエラーモードである配列反転イベントの概略図である。図４Ｃは、ＰＲＩＭＥ－Ｄｅｌ（左）及びＣａｓ９／ｇＲＮＡペア法（右）におけるゲノム全体にわたる異なる削除の推定反転頻度を示す（ｎ＝３回のトランスフェクション反復の平均）。なお、これらは、Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡペア媒介削除の１つを除くすべてでかなりの頻度で観察されたのに対し、ＰＲＩＭＥ－Ｄｅｌでは、これら１０個の削除のいずれについても反転が事実上観察されなかった。図４Ｄは、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるｄｄＰＣＲに基づくアッセイによりＰＲＩＭＥ－Ｄｅｌ（左）又はＣａｓ９／ｓｇＲＮＡペア（右）を用いたＨＰＲＴ１での１ｋｂ及び１０ｋｂ削除について測定した削除効率を示す（ｎ＝３回のトランスフェクション反復にわたる平均±ＳＤ）。図４Ｅは、削除アンプリコンのシーケンシングにより、ＰＲＩＭＥ－Ｄｅｌ（左）又はＣａｓ９／ｓｇＲＮＡペア（右）を用いたＨＰＲＴ１遺伝子での１ｋｂ及び１０ｋｂ削除について測定した精密な削除を持つリードの割合を示す（ｎ＝３回のトランスフェクション反復にわたる平均±ＳＤ）。

【0039】

【図5】様々なゲノム編集応用にＰＲＩＭＥ－Ｄｅｌを使用する潜在的な利点を示す。ＰＲＩＭＥ－Ｄｅｌ戦略は、Ｃａｓ９標的配列で短いインデルエラーを生成することなく、精密なゲノム削除をプログラムすることができる。精密な削除と、削除ジャンクションに短い任意の配列を挿入する機能を組み合わせることで、ナンセンス媒介崩壊（ＮＭＤ）経路を引き起こす可能性がある時期尚早なインフレーム終止コドンを生成することなく、活性タンパク質ドメインの強力な遺伝子ノックアウトを可能にする。ＰＲＩＭＥ－Ｄｅｌは、１０ｋｂまでのゲノム領域をエピトープタグやＲＮＡ転写開始部位などの任意の配列に置換することもできる。複数の領域が並行して編集されて多重化が促進される場合、ＰＲＩＭＥ－Ｄｅｌ中に生成される一本鎖切断は細胞に対する毒性が低くなる可能性がある。

【0040】

【図6】図６Ａから図６Ｅは、エピソーム的にコードされた化ｅＧＦＰを標的とするＰＲＩＭＥ－Ｄｅｌ削除を伴うエラープロファイルを示す。図６Ａは、アンプリコンシーケンシングのためのサンプル調製の概略図である。削除の標的となるセグメントの周囲の領域は、２段階ＰＣＲ増幅によりゲノムＤＮＡから増幅され、２段階目でシーケンシングアダプターが付加される。図６Ｂから図６Ｄは、２４ｂｐ削除（６Ｂ）、９１ｂｐ削除（６Ｃ）及び５４６ｂｐ削除（６Ｄ）のシーケンシングリードにわたる挿入、削除及び置換エラーの頻度を示す。これらは、シングルエンドシーケンシングに基づいており、実験ごとに５つの反復が行われ、すべてが１回の実行でシーケンシングされ、オーバーレイされる。なお、２４ｂｐ削除を除いて、削除を欠くアンプリコン（「野生型」として標識される）では、２つの３'－ＤＮＡフラップのうち１つだけがシーケンシングリードによってカーバーされる。Ｙ軸のスケーリングは、プロットごとに異なる。図６Ｅは、固有分子識別子（ＵＭＩ）補正を可能にするために増幅を繰り返した後の５４６ｂｐ削除にわたるエラー頻度を示す。同じＵＭＩを共有する最も頻度の高い配列を取得することにより、ＵＭＩによって識別されたＰＣＲ反復を単一のリードに折り畳んだ。これらは、シングルエンドシーケンシングに基づいており、実験ごとに３つの反復が行われ、すべてが１回の実行でシーケンシングされ、オーバーレイされる。Ｙ軸のスケーリングは、プロットごとに異なる。

【0041】

【図7】図７Ａから図７Ｃは、エピソーム又はゲノム的にコードされたｅＧＦＰでの同時削除と挿入によるエラープロファイルを示す。図７Ａは、エピソーム的にコードされたｅＧＦＰ（episomally encoded eGFP）を標的とする、同時５４６ｂｐ削除及び様々な挿入条件からのシーケンシングリードにわたってプロットされた挿入、削除及び置換のエラー頻度を示す。これらは、シングルエンドシーケンシングに基づいており、実験ごとに３つの反復が行われ、すべてが１回の実行でシーケンシングされ、オーバーレイされる。なお、削除を欠くアンプリコン（「野生型」として標識される）では、２つの３'－ＤＮＡフラップのうち１つだけがシーケンシングリードによってカーバーされる。削除結合部での挿入に対応するリード内の位置は、ニック部位（黒い点線）と挿入の終わり（赤い点線）の間で強調表示される。Ｙ軸のスケーリングはプロットごとに異なる。図７Ｂは、図７Ａと同じであるが、ゲノム的に組み込まれたｅＧＦＰのコピーを標的とする実験を示す。図７Ｃは、プログラムされた削除を含み、プログラムされた挿入も含む読み取りの割合を示す。図２Ｆと同じであるが、ｅＧＦＰのゲノム的に組み込まれたコピーをターゲットとする実験を示す。エラーバーは、少なくとも３回のトランスフェクション反復の標準偏差を表す。

【0042】

【図8】図８Ａから図８Ｄは、ネイティブＨＰＲＴ１遺伝子の削除効率とエラー頻度を定量化することを示す。図８Ａ及び図８Ｂは、（８Ａ）Ｃａｓ９／ｇＲＮＡペア戦略を用いたＨＰＲＴ１上の１１８ｂｐ又は２５２ｂｐ削除；及び（Ｂ）ＰＲＩＭＥ－Ｄｅｌ戦略を用いたＨＰＲＴ１上の１１８ｂｐ又は２５２ｂｐ削除；からのシーケンシングリードにわたってプロットされた挿入、削除及び置換エラーの頻度を示す。ＨＰＲＴ１条件の「削除」参照に合わせたシーケンシングリードはペアエンドシーケンシングに基づくのに対し、他のすべての条件はシングルエンドシーケンシングに基づく。各実験には、１回の実行でシーケンシングされた３つの反復がある（オーバーレイ）。なお、２つの３'－ＤＮＡフラップのうち１つだけが、削除を欠くアンプリコン（「野生型」として標識される）のシーケンシングリードによってカバーされ、Ｙ軸のスケーリングは、挿入、削除、置換のプロットごとに異なる。図８Ｃ及び図８Ｄは、（Ｃ）１１８ｂｐ削除及び（Ｄ）２５２ｂｐ削除のための液滴デジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）アッセイにおける液滴蛍光レベルを示す。ＦＡＭ陽性液滴（精密な削除の検出、上図）とＨＥＸ陽性液滴（ゲノムＤＮＡ濃度の検出、下図）の比を、ＰＲＩＭＥ－Ｄｅｌ（左側の３つのウェル）及びＣａｓ９／ｇＲＮＡペア法（中央の３つのウェル）を用いた削除の効率の測定に使用した。各プローブセットについて、精密な削除からの特異的シグナルを確保するために陰性対照（ＮＴＣ）を実行した。おそらく液滴内でのＰＣＲ増幅が非効率であるため、ＦＡＭチャネルではＨＥＸチャネルに比べて分離が明確ではない（陰性レベルと陽性レベルの間で実質的な「雨」パターンが見られる）。この現象は、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡペアサンプルでより顕著であり、おそらく上記のように短い（１ｂｐ）ミスマッチを持つ削除結合部へのＦＡＭプローブのアニーリングが原因と考えられる（Watry et al. Rapid, precise quantification of large DNA excisions and inversions by ddPCR, Scientific Reports 2020）。

【0043】

【図9】図９Ａから図９Ｈは、ＨＰＲＴ１エクソン１のＰＲＩＭＥ－Ｄｅｌ編集時のまれな長い挿入を示す。図９Ａでは、削除ジャンクションを双方向でカバーし、１５ｂｐのＵＭＩ配列を使用してＰＣＲ反復の除去を促進するために、ＰＲＩＭＥ－Ｄｅｌで編集されたＨＰＲＴ１遺伝子座に由来するアンプリコンのペアエンドシーケンシングを実行した。これにより、長い挿入が反復して存在することが明らかになり、ＧＣリッチ端で繰り返した２つの３'フラップ配列のキメラのようである（紫色で強調表示）。ここに示されているのは、１１８ｂｐ削除条件での代表的な挿入である。配列識別子が示される。図９から図９Ｄは、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡペアによるＨＰＲＴ１の１１８ｂｐ削除（９Ｂ）、ＰＲＩＭＥ－ＤｅｌによるＨＰＲＴ１の１１８ｂｐ削除（９Ｃ）、又はＰＲＩＭＥ－ＤｅｌによるｅＧＦＰの５４６ｂｐ削除（９Ｄ）のための挿入配列長のヒストグラムである。赤い垂直線は平均挿入長を示す。図９Ｅは、図９Ａと同じであるが、２５２ｂｐ削除条件下での代表的な挿入、及びＧＣリッチ端でオーバーラップした２つの３'フラップ配列のキメラを示す。配列識別子が示される。図９Ｆ及び図９Ｇは、ＰＲＩＭＥ－Ｄｅｌ（９Ｆ）又はＣａｓ９／ｐａｉｒｅｄ－ｇＲＮＡ（９Ｇ）によるＨＰＲＴ１の２５２ｂｐ削除のための挿入配列長のヒストグラムを示す。図９Ｈは、ＰＲＩＭＥ－Ｄｅｌによる長い挿入の潜在的なメカニズムを示す。ｐｅｇＲＮＡペアの３'フラップのＧＣリッチ端（１１８ｂｐ削除の場合はＧＣＣＣＴ、２５２ｂｐ削除の場合はＣＧＧＣ）は、互いにアニールするか、又は別のＧＣリッチなストレッチにアニールし、これによって、修復時に挿入が生じる。

【0044】

【図10】図１０Ａから図１０Ｅ：ＰＲＩＭＥ－Ｄｅｌの効率と精度は、相同性アームの長さに依存する。図１０Ａ：ｐｅｇＲＮＡペアは異なるＲＴ テンプレート長で設計することでき、これにより相同性アームの長さを効果的に変更してＰＲＩＭＥ－Ｄｅｌでの編集をガイドすることができる。図１０Ｂ及び図１０Ｃは、ＨＰＲＴ１エクソン１の（１０Ｂ）１１８ｂｐ及び（１０Ｃ）２５２ｂｐの削除のために異なる相同アーム長を使用した場合の削除効率（標準設計（３２ｂｐのＲＴテンプレート；図３Ａ～３Ｇで使用）に正規化）を示す（ｎ＝３回のトランスフェクション反復にわたる平均±ＳＤ）。ｅＧＦＰ上での５４６ｂｐ削除の作製からの非相同性ＲＴテンプレート配列（図１Ａから図２Ｆで使用；３０／３０ｅＧＦＰとして示す）を使用する場合、削除が生じない。図１０Ｄ及び図１０Ｅは、ＨＰＲＴ１エクソン１の（１０Ｄ）１１８ｂｐ及び（１０Ｅ）２５２ｂｐ削除のために異なる相同性アーム長を使用した場合のＰＲＩＭＥ－Ｄｅｌにおける長挿入頻度（標準設計に正規化）を示す（ｎ＝３回のトランスフェクション反復にわたる平均±ＳＤ）。

【0045】

【図11】図１１Ａから図１１Ｃは、プールされたＰＲＩＭＥ－Ｄｅｌを用いた削除を示す。図１１Ａは、トランスフェクションのために一緒にプールされた、ＨＰＲＴ１遺伝子内にプログラムされた４つの削除の漫画表現を示す。図１１Ｂは、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞においてＰＲＩＭＥ－Ｄｅｌを用いたＨＰＲＴ１遺伝子上の３つのオーバーラップ削除（１１８、２５２及び４６９ｂｐｓ）の削除効率とエラー頻度を示す。３つのトランスフェクション反復は、別々にプロットされる。図１１Ｃは、単一削除（左側の３つのウェル）とプールされたＰＲＩＭＥ－Ｄｅｌ（中央の３つのウェル）の間で比較した１０６４ｂｐ削除効率を示す。プールされたＰＲＩＭＥ－Ｄｅｌにおける１０６４ｂｐ削除の推定編集効率は、３回のトランスフェクション反復で１．７％、１．９％及び２．０％である。

【0046】

【図12】図１２Ａから図１２Ｆ：編集時間窓を延長することにより、プライム編集とＰＲＩＭＥ－Ｄｅｌの効率が向上する。図１２Ａは、２段階のゲノム組み込みを介してＰｒｉｍｅ Ｅｄｉｔｏｒ－２酵素とｐｅｇＲＮＡの両方を安定して発現する概略図である。図１２Ｂ及び図１２Ｃは、Ｋ５６２（ＰＥ２）細胞（１２Ｂ）又はＨＥＫ２９３Ｔ（ＰＥ２）細胞（１２Ｃ）においてＰＲＩＭＥ－Ｄｅｌ（ｐｅｇＲＮＡ構築物）を用いたゲノムＨＰＲＴ１エクソン１での１１８ｂｐ及び２５２ｂｐ削除、又はプライム編集（単一ｐｅｇＲＮＡ構築物）を用いたＣＴＴ挿入について測定された編集効率（ｐｅｇＲＮＡの最初の形質導入後の時間の関数として）を示す（ｎ＝３回のトランスフェクション反復にわたる平均±ＳＤ）。図１２Ｄは、ＰＲＩＭＥ－Ｄｅｌ（ｐｅｇＲＮＡ構築物）を用いたゲノムＨＰＲＴ１エクソン１での１１８ｂｐ及び２５２ｂｐ削除、又はプライム編集（単一ｐｅｇＲＮＡ構築物）を用いたＣＴＴ挿入について測定された編集効率（ｐｅｇＲＮＡの最初の形質導入後の時間の関数として）を示す。ｐｅｇＲＮＡペアとＰｒｉｍｅ Ｅｄｉｔｏｒ－２酵素を有するプラスミドを、Ｐｒｉｍｅ Ｅｄｉｔｏｒ－２酵素発現ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に３回トランスフェクトした（０、９、１８日目；黄色で強調表示）（ｎ＝３回のトランスフェクション反復にわたる平均±ＳＤ）。図１２Ｅは、図１２Ａと同じであるが、まず、０日目にｐｉｇｇｙＢＡＣトランスポゾンシステムを介してｐｅｇＲＮＡをＰＥ２発現ＨＥＫ２９３Ｔに組み込み（緑色で強調表示）、続いて９日目と１８日目にＰｒｉｍｅ Ｅｄｉｔｏｒ－２酵素のみを持つプラスミドをさらに２回トランスフェクトした（黄色で強調表示）（ｎ＝３回のトランスフェクション反復にわたる平均±ＳＤ）。図１２Ｆは、図１２Ｃに示される実験の２回目の反復を示し、ここで、ＰＲＩＭＥ－Ｄｅｌ用いたＨＰＲＴ１エクソン１での１１８ｂｐ及び２５２ｂｐの削除について削除効率をｐｅｇＲＮＡの最初の形質導入後の時間の関数として測定する（ｎ＝３回のトランスフェクション反復にわたる平均±ＳＤ）。

【0047】

【図13】介在配列の除去後に切断部位間に配列を挿入するように構成されたＰＲＩＭＥ－Ｄｅｌの実施形態を概略的に示す。３'フラップは、挿入される配列を有し、各フラップ（Ａ及び ａ）は修復ステップでアニールし、修復ステップ後にｄｓＤＮＡ配列が挿入されるように逆相補的形式の配列を有する。対応する領域は、文字Ａ／ａで示される。

【0048】

【図14】ｄｓＤＮＡの断片を環状化するように構成されたＰＲＩＭＥ－Ｄｅｌの実施形態を模式的に示す。第１標的配列（上部鎖）は、アンチセンス鎖の第２標的配列（下部鎖）に対応するセンス鎖内の逆相補配列よりもセンス鎖に沿って３'側に配置される。本実施形態において、第１の３'オーバーハングフラップ（Ｂ）及び第２の３'オーバーハングフラップ（ａ）は、外側を向いており、互いに離れている。この方向において、修復した結果、一本鎖切断の両側のｄｓＤＮＡ断片が切除され、センス鎖の第１一本鎖切断と第２鎖の第２一本鎖切断の間に配置されるｄｓＤＮＡ配列の部分が保存される。この図示の実施形態では、図２Ａ及び１３のように、追加の挿入配列を含むか又は完全に置換できるが、各３'フラップ（Ｂ及びａ）は、図１Ｃのように、他のｐｅｇＲＮＡが標的とする保存されたｄｓＤＮＡ領域に相補的な配列を含む。

【発明を実施するための形態】

【0049】

ゲノム配列を削除する従来の方法は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９及び複数ペアのシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）に基づくものである。しかし、このような方法は、小さなインデル、及び意図しない大きな削除やより複雑な再配置などのエラーが発生することから非効率的かつ不精密になる可能性がある。本発明は、「ＰＲＩＭＥ－Ｄｅｌ」と呼ばれるプライム編集に基づく方法を提供する。この方法は、反対側のＤＮＡ鎖を標的とする１ペアのプライム編集ｓｇＲＮＡ（ｐｅｇＲＮＡ）を用いて削除を誘導する。ｐｅｇＲＮＡは、ニックが入った部位だけでなく、修復の結果もプログラムする。後述のように、ＰＲＩＭＥ－Ｄｅｌは、最大１０ｋｂの削除のプログラミング（編集効率１－３０％）において、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９及びｓｇＲＮＡペアよりも著しく高い精度を達成する。ＰＲＩＭＥ－Ｄｅｌは、ゲノム削除と挿入を結合するために使用することもできる。これによって、ジャンクションがプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）部位に位置しない削除は可能となる。最後に、プライム編集コンポーネントの拡張発現により、精度を損なうことなく効率を大幅に向上させることができる。ＰＲＩＭＥ－Ｄｅｌは、信頼性が高く、精密かつ柔軟なゲノムの削除と挿入のプログラミング、エピトープのタグ付け、及びゲノムの再構成のプログラミングに広く有用である。

【0050】

上記に従って、一態様では、本発明は、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）分子の編集方法を提供する。標的ｄｓＤＮＡは、互いに逆相補的な配列を有するセンス鎖及びアンチセンス鎖を有することを特徴とする。反対側の鎖はワトソンクリック塩基対形成を介して相互にハイブリダイズし、標準的な二重らせん構造におけるｄｓＤＮＡ分子の安定性をもたらす。本発明の方法は、任意のｄｓＤＮＡ分子を標的とすることができる。例示的なｄｓＤＮＡは、任意の細胞、有機体又はウイルスからのゲノムＤＮＡである。いくつかの実施形態において、ｄｓＤＮＡは、ヒト細胞からのゲノムＤＮＡである。センス及びアンチセンスという用語は、いずれかの鎖に任意に割り当てることができ、特に明記しない限り、単に反対側の鎖を互いに区別するために使用される。

【0051】

本発明の方法は、ｄｓＤＮＡ分子を少なくとも１ペアの編集複合体と接触されるステップを含む。１ペアにおける各編集複合体は、Ａｎｚａｌｏｎｅ ｅｔ ａｌ．によって開示されたプライム編集構築物に基づいている（Search-and-replace genome editing without double-strand breaks or donor DNA. Nature 576, 149-157(2019) and Lin, Q. et al;Prime genome editing in rice and wheat. Nat. Biotechnol. 38, 582-585(2020)；それぞれの内容は、参照によりその全体が明示的に本明細書に組み込まれる）。後述及び図１Ｂに示されるように、プライム編集は、逆転写酵素と融合したニッカーゼ機能を持つエディター酵素を使用する。プライム編集構築物は、３'伸長ｓｇＲＮＡ（プライム編集ｓｇＲＮＡ又はｐｅｇＲＮＡとも呼ばれる）をさらに含む。結合すると、ｐｅｇＲＮＡは標的配列に結合特異性を与え、融合エディターはｄｓＤＮＡ分子の１本の鎖にニックを入れる（即ち、隣接するヌクレオチドを結合するリン酸ジエステル結合の切断を引き起す）。３'一本鎖ＤＮＡフラップは、融合エディタータンパク質の転写酵素ドメインによるｐｅｇＲＮＡの一部の逆転写によってニック部位に結合する。

【0052】

本発明の方法において、それぞれ反対側の鎖上のｄｓＤＮＡの部分を特異的に標的とする１ペアの編集複合体が使用される。このアプローチのいくつかの実施形態を示す概要を図１Ｃに示す。特に、ｄｓＤＮＡは、第１編集複合体及び第２編集複合体に接触する。第１編集複合体は、ｄｓＤＮＡ分子のセンス鎖上の第１標的配列に特異的であり、第２編集複合体は、ｄｓＤＮＡ分子のアンチセンス鎖上の第２標的配列に特異的である。「特異的」という用語は、編集複合体が、通常の条件下で標的配列に選択的に結合（例えば、ハイブリダイズ）できる構造要素（例えば、ＲＮＡ配列）を含むことを意味する。第１編集複合体及び第２編集複合体は、それぞれ独立して融合エディタータンパク質及びそれに結合した伸長ガイドＲＮＡ分子を含む。

【0053】

なお、説明の便宜上、以下、編集複合体のコンポーネント、その実装、及び１ペアの編集複合体の一般的なコンテキストでの使用について説明する。しかし、本発明は、複数の編集複合体ペアの使用を含む実施形態も包含する。これらの実施形態では、各ペアの編集複合体は、他の編集複合体ペアと区別することができるため、異なるターゲティング機能及び／又は編集機能をもたらすことができる。例えば、編集複合体の特定のターゲティングを与える構造（後述）は、編集複合体ペアによって異なる。その結果、同じ環境（同じ細胞の異なる染色体など）内の同じｄｓＤＮＡ分子又は異なるｄｓＤＮＡ分子内の複数の標的位置で、複数の異なる編集が実行される。以下の説明を考慮すると、複数ペアの編集複合体を使用して多重化編集を実行するかが明らかになる。例えば、異なる伸長ガイドＲＮＡ分子（又は伸長ガイドＲＮＡ分子をコードする核酸配列）だけをプールして、それらが融合エディタータンパク質と複合体を形成できるようにする。ここで、融合エディタータンパク質は、すべて同じであっても異なっていてもよい。

【0054】

一般に、融合エディタータンパク質はそれぞれ、機能的能力を保持する限り、機能的ニッカーゼドメインと機能的逆転写酵素ドメインを相互に任意の向きで含む（後述）。理解できるように、第１及び第２の編集複合体に関して、それぞれの機能的ニッカーゼドメイン及び機能的逆転写酵素ドメインは、機能的能力を保持する限り、同じであっても異なっていてもよい。それぞれの伸長ガイドＲＮＡ分子の一般的な構成は、ｄｓＤＮＡにおける所望の標的配列にハイブリダイズする配列を含むガイドドメインと、編集されたＤＮＡに組み込まれるか又は所望の修復モードを促進する所望の配列を有する３'端の伸長ドメインとを含む。いくつかの実施形態において、第１及び／又は第２伸長ドメインは、２つのサブドメインを含む。第１サブドメインは、ニックが入った鎖にハイブリダイズするプライマー結合配列（ＰＢＳ）を含む。第１サブドメインは、伸長ドメインの３'端に位置する（通常、伸長ガイドＲＮＡ分子全体も同様）。第２サブドメインは、３'オーバーハングのテンプレートとして機能する逆転写テンプレート（ＲＴＴ）を含み、これによって、ＲＮＡからＤＮＡに逆転写して３'－オーバーハングを追加する。ＲＴＴは、ＰＢＳとガイドドメインとの間にある。ＲＴＴ配列は、３'オーバーハングの逆相補配列である。

【0055】

いくつかの実施形態において、第１編集複合体及び第２編集複合体のそれぞれの伸長ガイドＲＮＡ分子は、それぞれの標的配列又は３'末端配列に応じて異なる配列を含む。より具体的には、第１編集複合体の伸長ガイドＲＮＡ分子は、第１標的配列にハイブリダイズする第１配列を有する第１ガイドドメインと、３'端にある第１伸長ドメインとを含む。第２編集複合体の伸長ガイドＲＮＡ分子は、第２標的配列にハイブリダイズする第２配列を有する第２ガイドドメインと、３'端にある第２伸長ドメインとを含む。

【0056】

第１編集複合体及び第２編集複合体がそれらのそれぞれのｄｓＤＮＡ分子における標的に特異的に結合した後、前記方法は、第１編集複合体の機能的ニッカーゼドメイン及び第２編集複合体の機能的ニッカーゼドメインが第１標的配列及び第２標的配列にあるｄｓＤＮＡ分子の反対側の鎖にそれぞれ第１一本鎖切断及び第２一本鎖切断（例えば、ニック）を形成できるようにするステップを含む。いくつかの実施形態において、第１編集複合体の機能的ニッカーゼドメインは、第１標的配列内（例えば、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列の上流約３塩基以内）のセンス鎖にニックを入れる。同様に、いくつかの実施形態において、第２編集複合体の機能的ニッカーゼドメインが第２標的配列内（例えば、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列の上流約３塩基以内）のアンチセンス鎖にニックを入れる。

【0057】

第１及び第２一本鎖切断がセンス及びアンチセンス鎖上の第１及び第２編集複合体（即ち、それぞれのニッケーゼドメイン）によって誘導された後、前記方法は、第１編集複合体の機能的逆転写酵素ドメインが第１伸長ドメインをテンプレートとして使用して第１一本鎖切断から第１の３'オーバーハングを生成できるようにするステップを含む。同様に、前記方法は、第２編集複合体の機能的逆転写酵素ドメインが第２伸長ドメインをテンプレートとして使用して第２一本鎖切断から第２の３'オーバーハングを生成できるようにするステップを含む。

【0058】

第１及び第２ニックで第１及び第２の３'オーバーハングが伸長した後、ｄｓＤＮＡ分子は修復される。修復の結果は、第１配列と標的配列の相対位置に依存するため、第１及び第２切断の相対方向並びに第１及び第２の３'オーバーハングの最終的な位置に依存する可能性がある。これらの構成に対処するために、センス鎖の５'から３'軸に関連して相対位置を表現することができる。一実施形態において、第１の標的配列は、アンチセンス鎖の第２の標的配列に対応するセンス鎖内の逆相補配列よりもセンス鎖に沿って５'側の位置に配置される。本実施形態は、図１Ｃに示される。本実施形態において、第１の３'オーバーハング及び第２の３'オーバーハングは、内側を向いており、互いの方向を向いている。この方向では、ｄｓＤＮＡ修復により、もともとセンス鎖の第１一本鎖切断と第２鎖における第２一本鎖切断に配置されたｄｓＤＮＡの部分が切除される。第１の３'オーバーハング及び第２の３'オーバーハングは、修復されたｄｓＤＮＡ分子に組み込まれる。この修復スキームの実施形態は、図１Ｃに示される。いくつかの実施形態において、両方の３'オーバーハングは、このプロセスにおいて自然な細胞ＤＮＡ損傷修復能力によりさらに伸長することができる。

【0059】

別の実施形態において、第１標的配列は、アンチセンス鎖の第２標的配列に対応するセンス鎖における逆相補配列よりもセンス鎖に沿って３'側の位置に配置される。本実施形態において、第１の３'オーバーハング及び第２の３'オーバーハングは、外側を向いており、互いに離れている。この方向では、修復により、一本鎖切断の両側のｄｓＤＮＡ断片が切除され、センス鎖の第１一本鎖切断と第２鎖の第２一本鎖切断との間に配置されるｄｓＤＮＡ配列の部分が保持される。第１の３'オーバーハング及び第２の３'オーバーハングは、修復されたｄｓＤＮＡ分子に組み込むことができる。これによって、センス鎖の第１一本鎖切断と第２鎖の第２一本鎖切断との間に配置されるｄｓＤＮＡ配列の部分が環状化される。図１４は、ＰＲＩＭＥ-ｄｅｌを使用したこの環状化プロセスの一実施形態を表す概略図である。

【0060】

いくつかの実施形態において、第１の３'オーバーハング及び第２の３'オーバーハングは、それぞれ互いに逆相補的でありかつ修復ステップでハイブリダイズする核酸配列を含む。この実施形態は図１３に示される。もともと２つの一本鎖切断点の間に存在したｄｓＤＮＡの部分は、修復中に切除される。逆相補配列を有する２つの前記オーバーハングは、ハイブリダイズして二本鎖分子を形成し、切除された部分の代わりにｄｓＤＮＡに機能的に挿入される。結果として、挿入配列は、第１一本鎖切断の「上流」の元のｄｓＤＮＡ分子配列と、第２一本鎖切断の「下流」（センス鎖の方向に対して）の元のｄｓＤＮＡ分子配列の間に配置されるようになる。

【0061】

他の実施形態において、第１の３'オーバーハングは、アンチセンス鎖における第２の３'オーバーハングのすぐ５'側でそれに隣接する配列に対応する配列を有する第１修復ドメインを含む。同様に、第２の３'オーバーハングは、センス鎖における第１の３'オーバーハングのすぐ５'側でそれに隣接する配列に対応する配列を有する第２修復ドメインを含む。本実施形態において、修復ステップにおいて、反対側の鎖における第１の３'オーバーハング及び第２の３'オーバーハングは、互いに到達し、反対側の切断点に隣接する残りのｄｓＤＮＡ部分にハイブリダイズする。この実施形態の１つのバージョンは図１Ｃに示される。

【0062】

さらなる実施形態において、オーバーハング配列は、複数の配列（例えば、修復を促進するｄｓＤＮＡの一部に対応する配列及び新しい配列として組み込まれる新しい配列を構成する配列）を含んでもよい。例えば、第１の３'オーバーハングは、第１修復ドメインの５'側に配置される挿入配列をさらに含み得る。同様に、第２の３'オーバーハングは、対応する挿入配列（即ち、第１の３'オーバーハングにおける挿入配列と逆相補的であるとともに、第２の３'オーバーハング内の第２修復ドメインの５'側に配置される配列）を含む。修復中において、２つの 挿入配列ドメインは、ハイブリダイズする。第１の３'オーバーハングの第１修復ドメインは、第２切断点に到達し、第２切断点に隣接する残りのｄｓＤＮＡ部分にハイブリダイズする。同様に、第２の３'オーバーハングの第２修復ドメインは、第１切断点に到達し、第１切断点に隣接する残りのｄｓＤＮＡ部分にハイブリダイズする。この実施形態の一例は、図２Ａに示される。

【0063】

この方法は、オーバーハング配列の設計によって実施できる他の変形を含む。例えば、この方法は、第１標的ドメインと第２標的ドメインとの間の不都合な配向順序を反転させる方法で実施することができる。一実施形態において、このような反転を実施するために、第１の３'オーバーハングは、第２一本鎖切断（例えば、アンチセンス鎖における）のすぐ３'側に位置する配列に対応する配列を有する第１修復ドメインを含む。同様に、第２の３'オーバーハングは、第１一本鎖切断（例えば、センス鎖における）のすぐ３'側に位置する配列に対応する配列を有する第２修復ドメインを含む。言い換えれば、３'オーバーハングは、それぞれ介入するｄｓＤＮＡ断片の反対側の端にハイブリダイズする配列を含む。結果として、修復ステップにより、もともと第１一本鎖切断と第２一本鎖切断との間に配置されるｄｓＤＮＡの部分は反転する。いくつかの実施形態において、第１修復ドメインは、第２一本鎖切断のすぐ３'側に位置する配列と同一（又は実質的に同一）の配列を有する。同様に、いくつかの実施形態において、第２修復ドメインは、第１一本鎖切断のすぐ３'側に位置する配列と同一（又は実質的に同一）の配列を有する。

【0064】

いくつかの実施形態において、この方法は、標的ｄｓＤＮＡ分子の第１標的ドメインと第２標的ドメインとの間に外因性供給源からのＤＮＡ断片（「挿入ＤＮＡ断片」）を挿入するために使用することができる。挿入される前記挿入ＤＮＡ断片は、線状ＤＮＡ断片であってもよいか、又は環状ＤＮＡ分子に由来してもよい。挿入を容易にするために、第１の３'オーバーハングは、挿入ＤＮＡ断片の第１ドメインに対応する配列を有する第１修復ドメインを含む。同様に、第２の３'オーバーハングは、挿入ＤＮＡ断片の第２ドメインに対応する配列を有する第２修復ドメインを含む。第１ドメイン及び第２ドメインは、挿入ＤＮＡ断片の反対側の端部にある端部ドメインであってもよい。代替的には、第１ドメイン及び第２ドメインの一方又は両方は、異なる部位、例えば、最終的に挿入ＤＮＡ断片を含むより大きなｄｓＤＮＡ分子内の内部部位にある。この代替的な実施形態において、第１ドメイン及び第２ドメインは、より大きな外因性ｄｓＤＮＡ源分子内の挿入ＤＮＡ断片の部分の端部を定義する。

【0065】

以下に示すように、本発明の方法の様々な実施形態を利用して、標的ｄｓＤＮＡ分子から広範囲の内部ｄｓＤＮＡ断片サイズを削除することができる。本発明の方法により、例えば、約５又は１０ヌクレオチドの短いものから約１００万ヌクレオチド以上の長いものまで、ほぼあらゆる長さの介在配列を削除することができる（なお、削除が長くなると、反応の効率が若干低下する可能性がある）。いくつかの実施形態において、もともと第１一本鎖切断と第２一本鎖切断との間に配置される切除されるｄｓＤＮＡの部分は、約５ヌクレオチドから約１００万ヌクレオチド、約１０ヌクレオチドから約９００，０００ヌクレオチド、約１０ヌクレオチドから約８００，０００ヌクレオチド、約１０ヌクレオチドから約７００，０００ヌクレオチド、約１０ヌクレオチドから約７００，０００ヌクレオチド、約１０ヌクレオチドから約６００，０００ヌクレオチド、約１０ヌクレオチドから約５００，０００ヌクレオチド、約１０ヌクレオチドから約４００，０００ヌクレオチド、約１０ヌクレオチドから約３００，０００ヌクレオチド、約１０ヌクレオチドから約２００，０００ヌクレオチド、約１０ヌクレオチドから約１００，０００ヌクレオチド、約１０ヌクレオチドから約９０，０００ヌクレオチド、約１０ヌクレオチドから約８０，０００ヌクレオチド、約１０ヌクレオチドから約７０，０００ヌクレオチド、約１０ヌクレオチドから約６０，０００ヌクレオチド、約１０ヌクレオチドから約５０，０００ヌクレオチド、約１０ヌクレオチドから約４０，０００ヌクレオチド、約１０ヌクレオチドから約３０，０００ヌクレオチド、約１０ヌクレオチドから約２０，０００ヌクレオチド、約１０ヌクレオチドから約１０，０００ヌクレオチド、約１０ヌクレオチドから約９，０００ヌクレオチド、約１０ヌクレオチドから約８，０００ヌクレオチド、約１０ヌクレオチドから約７，０００ヌクレオチド、約１０ヌクレオチドから約６，０００ヌクレオチド、約１０ヌクレオチドから約５，０００ヌクレオチド、約１０ヌクレオチドから約４，０００ヌクレオチド、約１０ヌクレオチドから約３，０００ヌクレオチド、約１０ヌクレオチドから約２，０００ヌクレオチド、約１０ヌクレオチドから約１，０００ヌクレオチド、又はそれらの範囲内の任意範囲である。例えば、もともと第１一本鎖切断と第２一本鎖切断との間に配置される切除されるｄｓＤＮＡの部分は、長さが少なくとも５ヌクレオチドであり、例えば、約５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、５５００、６０００、６５００、７０００、７５００、８０００、８５００、９０００、９５００、１０，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、６０，０００、７０，０００、８０，０００、９０，０００、１００，０００、２００，０００、３００，０００、４００，０００、５００，０００、６００，０００、７００，０００、８００，０００、９００，０００、１，０００，０００若しくはそれ以上のヌクレオチド、又はその中の任意の数値又は範囲である。

【0066】

いくつかの実施形態において、第１ガイドドメイン及び第２ガイドドメインは、それぞれ独立して約１５と約２００ヌクレオチド長の間である。例示的な非限定的な例では、第１ガイドドメイン及び第２ガイドドメインは、それぞれ独立して約１５と１５０ヌクレオチド長の間、約１５と１２５ヌクレオチド長の間、約１５と７５ヌクレオチド長の間、約１５と５０ヌクレオチド長の間、約１５と約４０ヌクレオチド長の間、約１５と３０ヌクレオチド長の間、約１５と２５ヌクレオチド長の間、約１５と２０ヌクレオチド長の間、約２０と２００ヌクレオチド長の間、約２０と１７５ヌクレオチド長の間、約２０と１５０ヌクレオチド長の間、約２０と１２５ヌクレオチド長の間、約２０と１００ヌクレオチド長の間、約２０と７５ヌクレオチド長の間、約２０と５０ヌクレオチド長の間、約２０と４０ヌクレオチド長の間、約２０と３０ヌクレオチド長の間、約２０と２５ヌクレオチド長の間、約２５と５０ヌクレオチド長の間、約２５と４０ヌクレオチド長の間、約２５と３０ヌクレオチド長との間、又はその中の任意の数値若しくは部分範囲である。例示的な長さは、約１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、２００ヌクレオチド長を含む。

【0067】

いくつかの実施形態において、第１及び第２ガイドドメインの一方又は両方は、それぞれ第１及び第２編集複合体と適合性があるように構成される。ここで、「適合性」とは、編集複合体を形成するために融合エディタータンパク質によって認識されるガイドドメインの能力を指す。例えば、いくつかの実施形態において、ガイドドメインは、２'－Ｏ－メチル化、ロックされた核酸、ペプチド核酸、又は同様の機能的に修飾された核酸部分で修飾された１つ以上のヌクレオチド残基を含んでもよい。これらの例示的な修飾及び他の修飾は、プライム編集における融合エディタータンパク質の認識及び結合を促進することが知られており、本開示に包含される。

【0068】

第１伸長ドメイン及び第２伸長ドメインは、それぞれ独立して少なくとも約１０ヌクレオチド長であってもよい。いずれかの伸長ドメインの長さに対する実際的な上限は、伸長ドメインテンプレートから３'オーバーハングを作成するプライム編集に基づくアプローチにおける機能的な逆転写ドメインの能力によって与えられる可能性がある。このような機能的な逆転写ドメインは、１０００～２０００ヌクレオチド長を容易に逆転写することができる。したがって、伸長ドメインは、長さ独立して約１０から約２０００ヌクレオチドであり得る。特定の応用では、伸長ドメインが範囲の短い端にあることがより一般的である可能性がある。例示的な非限定的な範囲は、約１０と５００ヌクレオチド長の間、約１０と４００ヌクレオチド長の間、約１０と３００ヌクレオチド長の間、約１０と２００ヌクレオチド長の間、約１０と１００ヌクレオチド長の間、約１０と７５ヌクレオチド長の間、約１０と５０ヌクレオチド長の間、約１０と４０ヌクレオチド長の間、約１０と３０ヌクレオチド長、約１０と２０ヌクレオチド長、又はその中の任意の長さ又は部分範囲を含む。例示的な長さは、約１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、２００ヌクレオチド長を含む。

【0069】

いくつかの実施形態において、第１伸長ガイドＲＮＡ分子及び／又は第２伸長ガイドＲＮＡ分子は、追加の機能的ドメインを含むように操作され得る。例えば、（第１及び／又は第２）伸長ガイドＲＮＡ分子は、３'オーバーハング生成の効率を助けるドメインをさらに含むことができる。一実施形態において、伸長ガイドＲＮＡは、構造化ＲＮＡモチーフを３'末端（即ち、本明細書に記載の伸長ドメイン）に組み込んでいることで、その安定性が向上し、３'伸長の分解が防止される。このような「抗分解」構造モチーフは、例えば、「Nelson, J.W., et al. Engineered pegRNAs improve prime editing efficiency. Nat Biotechnol pp. 1-9(2021)」（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されており、修飾プレクオシン１－１リボスイッチアプタマー（evopreQ₁; Roth, A. et al. A riboswitch selective for the queuosine precursor preQ1 contains an unusually small aptamer domain. Nat. Struct. Mol. Biol. 14, 308-317(2007); Anzalone, A. V., et al. Reprogramming eukaryotic translation with ligand-responsive synthetic RNA switches. Nat. Methods 13, 453-458(2016)，それぞれの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）及びシュードノット（例えば、モロニーマウス白血病ウイルス由来）を含む。

【0070】

機能的ニッカーゼドメインは、標的ｄｓＤＮＡ配列において一本鎖切断を触媒する任意の機能的ドメインであり得る。本開示に含まれる機能的ニッカーゼドメインの例として、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）酵素、ピロコッカス・フリオサス・アルゴノートなど、又はそれらに由来する機能的ニッカーゼドメインが挙げられる。いくつかの実施形態において、ニッケーゼドメインは、二本鎖ヌクレアーゼ機能を除去するなど修飾された酵素に由来する。この態様で有用なＣａｓ酵素の非限定的な例として、Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９又はｎＣａｓ９）、Ｃａｓ１２、Ｃａｓ１３、Ｃａｓ３、ＣａｓΦなどが挙げられる（例えば、Pauch, P, et al., CRISPR-CasΦ from huge phages is a hypercompact genome editor, Science, 369(6501):333-337(2020)；WO2020/191242ご参照、それぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。有用なＣａｓ９（ニッカーゼ能力のためのＨ８０４Ａ修飾を有する）及び５つの点変異を持つＭ－ＭＬＶ－ｒｔをコードするプラスミド配列は、Ａｄｄｇｅｎｅ寄託所からカタログ番号１３２７７５として入手できる。本開示に有用な他の有用なＣａｓ９配列、構造、及び最適化は当技術分野で知られている。Ｃａｓ９ヌクレアーゼ配列及び構造は当業者によく知られている（例えば、Ferretti el al. Complete genome sequence of an Ml strain of Streptococcus pyogenes, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98:4658-4663(2001);Deltcheva E., et al. CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNAe III. Nature 471:602-607(2011); Jinek M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science 337:816- 821(2012)を参照。それぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。さらに、Ｃａｓ（例えば、Ｃａｓ９）オルソログは、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ及びＳ．Ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓを含むがこれらに限定されない様々な種で報告されている。上記のように、ニッカーゼドメインは、ドメインが二本鎖切断ではなく一本鎖切断を確実に生じさせる修飾を含むことができる。例示的な修飾には、酵素ドメイン内の（複数の）ヌクレアーゼドメインの１つ（例えば、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ）の不活性化し、一本鎖切断を与える能力のみを残すことが含まれる。

【0071】

融合エディタードメインには、機能的逆転写酵素（ＲＴ）ドメインも含まれる。機能的ＲＴドメインは、逆転写反応を触媒する任意の機能的ドメインであり得る。「逆転写酵素」は一般に、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼとして特徴付けられるポリメラーゼのクラスを指す。歴史的には、逆転写酵素は主にｍＲＮＡをｃＤＮＡに転写するために使用されており、ｃＤＮＡはその後、さらなる操作のためにベクターにクローン化される。多くのこのような酵素（及びその機能ドメイン）が知られており、本開示に含まれる。例えば、鳥骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ）逆転写酵素は、広く使用された最初のＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼである（Verma, Biochem. Biophys. Acta 473:1(1977)）。ＲＮＡｅ Ｈは、ＲＮＡ－ＤＮＡハイブリッドのＲＮＡ鎖に特異的な進行性５'及び３'リボヌクレアーゼである(Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, New York: Wiley & Sons(1984)）。分子生物学で広く使用されている別の逆転写酵素は、モロニーマウス白血病ウイルス(M-MLV)に由来する逆転写酵素である（例えば、Gerard, G. R., DNA 5:271-279(1986)；Kotewicz, M. L., et ah, Gene 35:249-258(1985)を参照）。ＲＮＡｅ Ｈ活性が実質的に欠如しているＭ－ＭＬＶ逆転写酵素も記載されている（例えば、米国特許第５，２４４，７９７号を参照）。他の例示的で非限定的な実施形態において、機能的逆転写酵素ドメインは、ＨＩＶ ＲＴ、グループＩＩイントロンＲＴ（ＴＧＩＲＴ）（InGex, St. Louis, MO）、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＶ（ThermoFisher Scientific, Waltham, MA）など、又はそれらの機能的ドメインを含む。「Anzalone, A. V. et al.Search-and-replace genome editing without double-strand breaks or donor DNA. Nature 576, 149-157(2019)」（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）には、本発明に含まれる機能的ニッカーゼドメイン及びＲＴドメインを有する融合タンパク質が記載されている。例えば、野生型Ｍ－ＭＬＶ ＲＴドメイン及び操作されたＭ－ＭＬＶ ＲＴドメインは有用な実施形態となり得る。さらに、操作されたＲＴドメインは、本明細書に開示されるプライム編集及びプライム削除を改善することができる。ＷＯ２０２０／１９１２４２（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）には、有用なＲＴドメインの他の例が記載されている。本開示は、そのような逆転写酵素、バリアント、変異体又はその断片の使用を意図している。

【0072】

いくつかの実施形態において、融合エディタータンパク質は、追加の機能的ドメインを含んでもよい。例えば、追加の機能的ドメインは、ＤＮＡ修復タンパク質ドメインなどの機能的酵素ドメインであり得る。融合エディタータンパク質にＤＮＡ修復ドメインを含めることにより、３'オーバーハング生成後のＤＮＡ修復の効率を高めることができる。このようなドメインの非限定的な例は、Ｒａｄ１５由来の機能的ＤＮＡ結合ドメイン、又はそのホモログである（例えば、Song, M., et al. Generation of a more efficient prime editor 2 by addition of the Rad51 DNA-binding domain. Nat Commun 12, 5617(2021)を参照。参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。

【0073】

本発明の方法は、特異的に標的化されたｄｓＤＮＡ分子に対する多くの修飾を達成するために使用することができる（例えば、削除、挿入と組み合わせた削除、介在配列の反転、配列の転座（例えば、染色体間再構成）の達成；フレーム保持の配列へのプログラミング；適切なＰＡＭ配列ないため従来のＣＲＩＳＰＲに基づくアプローチではアクセスできない削除境界へのアクセス）。開示された方法は、細胞内、例えば培養下に維持された細胞内で実施することができる。或いは、前述の方法はインビボで実行することもできる。例えば、この方法は、ゲノム配列の削除、ゲノム配列の反転、染色体間再構成及び／又はゲノムの標的領域又は部位への新しい配列の挿入を含む治療法であってもよい。治療的実施形態では、組成物は、当該技術分野における標準的かつ既知の実践に従って、適切な投与（例えば、全身投与）のために製剤化される。

【0074】

編集複合体は細胞に直接送達することができ、又は細胞送達及び発現に適したベクターに組み込まれたコード化核酸の形で送達／投与することができる。したがって、いくつかの実施形態において、この方法は、１つ以上の融合エディタータンパク質及び伸長ガイドＲＮＡ分子をコードするポリヌクレオチド（１つ以上のベクター、その１つ以上の転写物、及び／又はそこから転写された１つ以上のタンパク質に組み込まれた）を標的細胞に送達することを含む。適切なウイルスベクターシステム及び非ウイルスベクターシステムは既知であり、当業者であれば実施することができる。例えば、例示的な非ウイルスベクター送達システムは、ＤＮＡプラスミド、ＲＮＡ（例えば、本明細書に記載のベクターの転写物）、裸の核酸、及びリポソームなどの送達ビヒクルと複合体を形成した核酸を含む。核酸の非ウイルス送達は、リポフェクション、ヌクレオフェクション、マイクロインジェクション、バイオリスティック、ウィロソーム、リポソーム、免疫リポソーム、ポリカチオン又は脂質核酸複合体、裸のＤＮＡ、人工ビリオン、及び薬剤により強化されたＤＮＡの取り込みを含む。

【0075】

ウイルスベクター送達システムには、細胞への送達後にエピソーム性ゲノム又は統合ゲノムのいずれかを有するＤＮＡウイルスとＲＮＡウイルスが含まれる。核酸送達のためのＲＮＡ又はＤＮＡウイルスに基づくシステムの使用は、ウイルスを体内の特定の細胞を標的とし、ウイルスペイロードを核に輸送するための高度に進化したプロセスを利用する。ウイルスベクターは、患者に直接投与することができ（インビボ）、インビトロで細胞を治療するために使用することもでき、必要に応じて改変細胞を患者に投与することもできる（エクスビボ）。従来のウイルスに基づくシステムには、遺伝子導入用のレトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、及び単純ヘルペスウイルスベクターが含まれる。宿主ゲノムへの組み込みは、レトロウイルス、レンチウイルス、及びアデノ随伴ウイルスの遺伝子導入法を使用することができ、多くの場合、挿入された導入遺伝子が長期間発現する。記載された編集複合体、又は融合エディター及び伸長ガイドＲＮＡコンポーネント（又はコード化核酸）に関する本方法の実施に適した様々な送達及び製剤化戦略は、ＷＯ２０２０／１９１２４２に記載されている（その全内容は参照により本明細書に組み込まれる）。

【0076】

別の態様において、本発明は、キットを提供する。前記キットは、本明細書に記載の組成物の任意の組成を含む。いくつかの実施形態において、前記キットは、本明細書に記載の１ペアの異なる編集複合体（即ち、第１及び第２編集複合体）、第１及び第２融合エディタータンパク質をコードする１つ以上の核酸及び／又は第１及び第２伸長ガイドＲＮＡ分子、又は前記核酸を含む１つ以上のベクターを含む。上記のように、第１及び第２編集複合体は、それぞれ第１及び第２伸長ガイドＲＮＡ分子の第１及び第２ガイドドメインによって、標的ｄｓＤＮＡ分子上の第１及び第２標的配列に特異的である。第１標的配列は、標的ｄｓＤＮＡのセンス鎖にあり、第２標的配列は、ｄｓＤＮＡのアンチセンス鎖にある。２つの標的配列は、介在配列によって区切られる。第１編集複合体及び第２編集複合体は、上記のように、介在配列を削除し、介在配列を反転させ、及び／又は標的ｄｓＤＮＡ分子における第１編集複合体及び第２編集複合体によって誘導された第１及び／又は第２一本鎖切断に１つ以上の新しい配列を挿入するように構成される。前記キットは、本明細書に記載の反応を促進するために、必要に応じて、様々な緩衝液及び試薬を含んでもよい。例えば、キットは、ｄＮＴＰ、ＲＮＡｅ阻害剤、補因子（例えば、ＭｇＣｌ_２）などを含むことができる。

【0077】

いくつかの実施形態において、前記キットは、本明細書に記載の基本的な方法を実行するための様々なコンポーネントを収容するための１つ以上の容器を含んでもよい。キットの各コンポーネントは、適用できる場合、液体の形態（例えば、溶液）又は固体の形態（例えば、粉末又は凍結乾燥）で提供することができる。いくつかの実施形態において、一部のコンポーネントは、例えば、適切な溶媒を添加することにより、再構成可能又は加工可能となる。

【0078】

いくつかの実施形態において、前記キットは、本明細書に記載の方法を如何に実施するかについての書面指示をさらに含む。

【0079】

追加の定義

【0080】

本明細書で具体的に定義されない限り、本明細書で使用される全ての用語は、本発明の当業者にとっては同じ意味を有する。専門家は、特に技術の定義と用語のためにSambrook J., et al.(eds.), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Press, Plainsview, New York(2001); Ausubel, F.M., et al.(eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York(2010); Ran, F. A., et al., Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system, Nature Protocols, 8:2281-2308(2013), Jiang, F. and Doudna, J. A., CRISPR-Cas9 Structures and Mechanisms, Annual Review of Biophysics, 46:505-529(2017)を対象にする。

【0081】

特許請求の範囲における用語「又は」の使用は、代替物のみを参照することを明示的に示さない限り、又は代替物が相互に排他的である場合を除き、「及び／又は」を意味するために使用されるが、本明細書の開示は、代替物と「及び／又は」のみを指す定義をサポートする。

【0082】

長年の特許法に従って、特許請求の範囲又は明細書中で「含む」という言葉と一緒に使用される場合、「ａ」及び「ａｎ」という言葉は、特に明記されていない限り、１つ以上のものを意味する。

【0083】

文脈から明らかに別の意味を要求されない限り、本明細書及び特許請求の範囲全体を通して、「含む」、「含有」等の語は、排他的又は徹底的な意味とは対照的に、包括的な意味で解釈される。つまり、「含むが、これに限定されない」という意味である。単数又は複数形の数を使用する単語は、それぞれ、複数形及び単数形の数を含む。さらに、「ここ」、「上」、「下」、及び同様の意味の単語は、本願で使用される場合、本願全体を指し、本願のいかなる特定の部分を指すものではない。「約」という語は、記載された参照数値の上又は下にある微小変化の範囲内の数値を示す。例えば、「約」は、記載された参照数値の上又は下の１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、又は１％の範囲内の数字を指すことができる。

【0084】

「対象」、「個体」、及び「患者」という用語は、本明細書では言い換え可能なものとして使用され、治療のために評価されている及び／又は治療されている哺乳類を指す。特定の実施形態では、哺乳類はヒトである。「対象」、「個体」、及び「患者」という用語は、限定されないが、がん又は遺伝子異常を含む疾患を有する個体を包含する。対象はヒトであってもよいが、この用語は、他の哺乳類、特に、ヒトの疾患の実験モデルとして有用な哺乳類、例えば、マウス、ラット、イヌ、非ヒト霊長類なども包含される。

【0085】

用語「治療する」及びその文法上の変形は、疾患又は状態（例えば、がん、感染症、自己免疫疾患）の治療又は改善又は予防における成功のあらゆる指標を指すことができ、例えば、症状の軽減、寛解、軽減又は患者がより耐えられる状態にすること、変性又は衰退の速度を遅くすること、又は変性の最終点をより衰弱させないことなどの客観的又は主観的なパラメータを含む。

【0086】

症状の治療や改善は、医師による検査結果を含む、客観的又は主観的なパラメータに基づいて行われる。従って、「治療する」という用語は、本明細書に開示の化合物又は薬剤を投与して防止若しくは遅延し、緩和し、臨床転帰を改善し、症状の発生を減少させ、生活の質を向上させ、疾患のない状態を延長させ、安定させ、生存期間を延長させ、疾患又は状態（例えば、がん又は遺伝性疾患）に関連する症状又は状態の発症を阻止又は阻害すること、又はこれらの組み合わせを含む。用語「治療効果」は、対象における疾患又は状態、疾患又は状態の症状、又は疾患又は状態の副作用の軽減、除去、又は予防を指す。

【0087】

本明細書で使用される用語「核酸」は、ヌクレオチドモノマー単位のポリマー又は「残基」を指す。核酸のヌクレオチドモノマーサブユニット又は残基は、それぞれ、窒素塩基（即ち、ヌクレオベース）、５炭糖、及びリン酸基を含む。各残基の同一性は、典型的には、各残基の核酸塩基（又は窒素塩基）構造の同一性を参照して本明細書に示される。カノニカル核酸塩基としては、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、ウラシル（Ｕ）（ＲＮＡにおいてチミン（Ｔ）残基の代わりに）、及びシトシン（Ｃ）を含む。しかしながら、本明細書に開示される核酸は、当技術分野でよく知られているように、任意の修飾ヌクレオベース、ヌクレオベースアナログ、及び／又は非カノニカルヌクレオベースを含むことができる。核酸モノマー又は残基の修飾は、非カノニカルサブユニット構造をもたらす核酸モノマー又は残基の構造における任意の化学変化を包含する。そのような化学変化は、例えば、エピジェネティック修飾（例えば、ゲノムＤＮＡ又はＲＮＡに対する）、又は放射線、化学的、又は他の手段に起因する損傷に起因し得る。修飾に起因し得る非カノニカルサブユニットの例示的かつ非限定的な例としては、ウラシル（ＤＮＡ用）、５－メチルシトシン、５－ヒドロキシメチルシトシン、５－ホルメチルシトシン、５－カルボキシシトシンｂ－グルコシル－５－ヒドロキシ－メチルシトシン、８－オキソグアニン、２－アミノ－アデノシン、２－アミノ－デオキシアデノシン、２－チオチミジン、ピロロ－ピリミジン、２－チオシチジン、又はアベーシックリージョンを含む修飾に起因し得る。アベーシックリージョンは、デオキシリボース骨格に沿った位置にあるが、塩基を欠く。天然ヌクレオチドの既知のアナログは、ペプチド核酸（ＰＮＡｓ）やホスホロチオエートＤＮＡなど、天然に存在するヌクレオチドと同様の方法で核酸にハイブリダイズする。

【0088】

配列同一性は、タンパク質配列などの２つのポリマー配列の類似性の程度をいう。配列同一性の決定は、受け入れられたアルゴリズム及び／及び技術を使用して当業者によって容易に達成され得る。配列同一性は通常、比較ウィンドウ上で２つの最適にアライメントされた配列を比較することによって決定され、比較ウィンドウ内のペプチド及びポリヌクレオチド配列の部分は、２つの配列の最適なアラインメントのための参照配列（付加及び削除を含まない）と比較して、付加及び削除（例えば、ギャップ）を含み得る。百分率は、２つの配列で同一のアミノ酸残基及び核酸塩基が存在する位置の数を決定し、一致した位置の数を生成し、一致した位置の数を比較ウィンドウ内の位置の総数で割り、その結果に１００を掛けて、配列同一性の百分率を算出することによって計算される。そのような比較を実行するためのＢＬＡＳＴ Ｎ及びＢＬＡＳＴ Ｐなどの様々なソフトウェア駆動型アルゴリズムが容易に利用可能である。

【0089】

本明細に開示されたのは、本開示の方法及び組成物に使用でき、本開示の方法及び組成物と組み合わせて使用でき、本開示の組成物の製造に使用できる材料、組成物及びコンポーネントであり、又は本開示の方法及び組成物の製品である。理解できるように、これらの材料の組み合わせ、サブセット、相互作用、グループなどが開示される場合、これらの化合物のすべての単一の組み合わせ及び並べ替えに対する特定の言及が明示的に開示されていない場合でも、様々な個々の及び集合的な組み合わせのそれぞれが具体的に企図されている。この概念は、説明された方法のステップを含むがこれらに限定されず、本開示のすべての態様に適用される。したがって、上述した実施形態の特定の要素は、他の実施形態の要素と組み合わせるか、及び置き換えることができる。例えば、実行できる様々な追加のステップがある場合、理解できるように、これらの追加のステップのそれぞれは、開示された方法の任意の特定の方法ステップ及び方法ステップの組み合わせで実行することができ、このような各組み合わせ及び組み合わせのサブセットは、具体的に企図されており、開示されたものと見なされるべきである。さらに、本明細書に記載の実施形態は、本明細書の他の場所に記載されているもの及び当技術分野で知られているものなどの任意の適切な材料を使用して実施できることが理解される。

【0090】

本明細書で引用された刊行物及び引用された主題は、参照によりその全体が具体的に本明細書に組み込まれる。

【0091】

実施例

【0092】

以下の実施例は、当業者に本開示の様々な態様及び実施形態の生産方法及び使用方法の完全な開示及び説明を提供するために記載されており、本発明者らが本発明とみなす範囲を限定することを意図しておらず、また、以下の実験が実施された全ての実験又は唯一の実験であることを表すことを意図していない。

【0093】

実施例１

【0094】

本実施例は、２つの反対側のＤＮＡ鎖を標的とする１ペアのプライム編集ｇＲＮＡ（ｐｅｇＲＮＡ）を使用して精密な削除を誘導するＰＲＩＭＥ-Ｄｅｌと呼ばれるプライム編集に基づく方法の開発について説明する。

【0095】

序論

【0096】

１ペアのｐｅｇＲＮＡはニックが入った部位の特定だけでなく修復の結果の特定にも適用できるかどうかを判断するために調査を行った。新しいアプローチの結果として、１００ｂｐを超える削除をプログラムできることが実証された（図１Ｃ）。この戦略（ＰＲＩＭＥ－Ｄｅｌと呼ばれる）は、Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡペア戦略又は既存のＰＥ３戦略のいずれかで観察又は予想されるよりもはるかに高い精度で、長さ１０ｋｂまでの配列の効率的な削除を誘導することが実証されている。さらに、ＰＲＩＭＥ－Ｄｅｌは、削除部位での短い挿入を同時にプログラムできることが示されている。同時削除／挿入は、インフレーム削除を導入したり、削除と同時にエピトープタグを導入したり、より一般的には、ＰＡＭ部位の内因性分布によって制限されない削除のプログラミングを促進にするために使用することができる。これらのギャップを埋めることで、ＰＲＩＭＥ－Ｄｅｌは、ゲノム配列の生物学的機能を単一ヌクレオチド分解能で調査するためのツールキットを拡張する。

【0097】

結果と考察

【0098】

ＰＲＩＭＥ－Ｄｅｌはエピソーム性ＤＮＡの精密な削除を誘導する。

【0099】

ＲＩＭＥ－Ｄｅｌ戦略の実現可能性は、エピソーム的にコードされた化ｅＧＦＰ遺伝子の削除をプログラムすることによって試験された。ｐＣＭＶ－ＰＥ２－Ｐ２Ａ－ＧＦＰプラスミド（Ａｄｄｇｅｎｅ＃１３２７７６）のｅＧＦＰコード領域内の２４、９１及び５４６ｂｐの削除を指定するように複数ペアのｐｅｇＲＮＡを設計した（図１Ｄ）。各ペアのｐｅｇＲＮＡを、別々のプロモーター（ヒトＵ６及びＨ１配列）を持つ単一のプラスミドにクローニングした（Gasperini, M. et al. CRISPR/Cas9-Mediated Scanning for Regulatory Elements Required for HPRT1 Expression via Thousands of Large, Programmed Genomic Deletions. Am. J. Hum. Genet. 101, 192-205(2017)）。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、ｅＧＦＰターゲティングペアｐｅｇＲＮＡ及びｐＣＭＶ－ＰＥ２－Ｐ２Ａ－ＧＦＰプラスミドでトランスフェクトした。トランスフェクションの４～５日後に細胞からＤＮＡ（ゲノムＤＮＡと残留プラスミドの両方を含む）を採取し、ＰＣＲでｅＧＦＰ領域を増幅した。次に、ＰＣＲアンプリコンの配列を決定して、プログラムされた削除の効率を定量化し、標的配列に対する意図しない編集を検出した。

【0100】

削除効率は、削除の有無にかかわらず、参照配列にアラインメントするリードの総数のうち、目的の削除の参照配列にアラインメントするリードの数として計算された。推定された削除効率は３８％（２４ｂｐ削除）～７７％（５４６ｂｐ削除）の範囲であり、反復して一貫した（注：本実施例全体を通じて、「反復」という用語は独立したトランスフェクションを指すために使用される）（図１Ｅ）。この結果は、図１Ｃに概要を示したＰＲＩＭＥ－Ｄｅｌ戦略が機能できることを明確に示している。ＰＣＲとイルミナに基づくシーケンシングの両方で特に５４６ｂｐ削除の場合、より短く編集されたテンプレートが好まれるため、これらは効率を過大評価した可能性がある。アンプリコンサイズの差が最も大きいためである（野生型及び削除アンプリコンではそれぞれ７６６ｂｐ対２２０ｂｐ）。これに対処するために、５４６ｂｐの削除実験から得たＤＮＡに対して２ステップＰＣＲで増幅を繰り返し、最初に線形増幅によって１５ｂｐの固有分子識別子（ＵＭＩ）を追加した後、２番目の指数関数的フェーズを追加した。リニアＰＣＲによるＵＭＩの追加は、削除効率の推定におけるＰＣＲ及びシーケンシングのバイアスを最小限に抑えることを目的とした(Kivioja, T. et al. Counting absolute numbers of molecules using unique molecular identifiers. Nat. Methods 9, 72-74(2011))。ＰＲＩＭＥ－Ｄｅｌの効率は、同じＵＭＩを用いてリードを折り畳んだ後のシーケンシングデータと生成物サイズ分布（Ａｇｉｌｅｎｔ ＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎ）に基づいて評価された。複排除後、削除効率のわずかな低下（７３％から６６％）が観察され、ＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎで測定された効率７０％に匹敵した（図１Ｆ）。これらの結果は、効率の初期推定値がサイズ依存のバイアスによってわずかに影響されるだけであることを示唆している。

【0101】

これらのシーケンシングデータのほとんどでは、単一のリードのみが意図した削除部位を超えた。そのため、意図しない編集結果（ニック部位でのインデルなど）をＰＣＲ又はシーケンシングエラーと区別することが困難であった。これに部分的に対処するには、異なるクラスのエラー（置換、挿入、削除）の頻度を、シーケンシングリードの長さに沿って、未編集配列（図１Ｇ、上側）又は意図した削除（図１Ｇ、下側）のいずれかにアライメントする配列についてプロットした。３つの削除実験（図６Ａ～６Ｅ）のすべての反復について、これらのプロファイルでは、特に、ＵＭＩによる折り畳み後（図１Ｇ及び６Ｅ）又はより長いペアエンドシーケンシングリードによるシーケンシングの繰り返し後（図１Ｈ）に、置換とインデルの割合が低く、プロファイルはほぼ同一であり、Ｐｒｉｍｅ Ｅｄｉｔｏｒ－２酵素ニック部位の位置又は３'フラップ端のいずれの位置でも１％を超えるエラーのクラスの割合の一貫した増加は見られなかった。

【0102】

ＰＲＩＭＥ－Ｄｅｌを用いた同時削除と短挿入

【0103】

３'フラップにおける相同配列が削除をプログラムするため、ＰＲＩＭＥ－Ｄｅｌを使用して削除ジャンクションに短い挿入を同時に導入できる可能性があると推測された（図２Ａ）。所望の挿入は、逆相補的な方法で、削除を指定する相同性配列のちょうど５'で、１ペアのｐｅｇＲＮＡにコード化される。削除をプログラムするための従来の戦略、つまりＣａｓ９と１ペアのｓｇＲＮＡを使用する場合、削除ジャンクションはｓｇＲＮＡ標的によって決定され、その選択はＰＡＭ部位の自然な分布によって制限される（図２Ｂ）。ＰＲＩＭＥ－Ｄｅｌによる同時の削除と短い（１００ｂｐｓ未満）挿入は、この従来の戦略に比べて少なくとも３つの利点を提供する。第一に、１～３塩基の任意の挿入により、編集（例えば、タンパク質ドメインの除去を目的とした削除）後も読み取りフレームを維持することができる。第二に、任意の挿入を使用して、ＰＡＭによって決定された切断部位から一方又は両方の削除ジャンクションを効果的に移動させることができ、塩基対の精度で削除をプログラムする柔軟性が向上する。第三に、削除ジャンクションに機能配列を挿入することにより、ＰＲＩＭＥ－Ｄｅｌによるゲノム編集を他の実験目標（タンパク質のタグ付けや転写開始部位の挿入など）と組み合わせることができる。

【0104】

この概念を試験するために、ｅＧＦＰ内の５４６ｂｐのプログラムされた削除のジャンクションで３～３０ｂｐの範囲の５つの挿入をコードするｐｅｇＲＮＡペアを設計した（図２Ｃ）。主な目的は、挿入長が削除効率に及ぼす影響を試験することであるが、３ｂｐの挿入配列がインフレーム終止コドンを生成することを考慮して、分子生物学における重要性に基づいて挿入配列を選択した。６ｂｐの挿入配列には、開始コドンと周辺のコザックコンセンサス配列が含まれる。１２ｂｐの挿入配列には、ＧＧＡＣＡＴのｍ６Ａ転写後修飾コンセンサス配列のタンデムリピートが含まれる（Dominissini, D. et al. Topology of the human and mouse m6A RNA methylomes revealed by m6A-seq. Nature 485, 201-206(2012)）。２１ｂｐの挿入配列には、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列が含まれる。３０ｂｐの挿入配列は、翻訳時にインフレームのＦＬＡＧタグペプチド配列をコードする。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞のエピソーム性ｅＧＦＰ遺伝子内の短い挿入と削除を同時に行う推定効率は、５４６ｂｐの削除のみの場合と同等であり、様々なプログラムされた挿入で８３％～９０％の範囲であった（図２Ｄ）。また、削除ジャンクション及びプログラムされた挿入全体における挿入、削除及び置換のエラー率は、バックグラウンドのエラー頻度と同等であった（図２Ｅ及び７Ａ）。予想通り、プログラムされた削除を含むリードの大部分（＞９９％）には挿入も含まれる（図２Ｆ）。これは、プログラムされたｐｅｇＲＮＡ配列の後に生成される３'－ＤＮＡフラップペアの全長が修復結果を指定することを示している（図２Ａ）。

【0105】

ＰＲＩＭＥ－Ｄｅｌは、ゲノムＤＮＡの精密な削除を誘導する。

【0106】

エピソーム性ＤＮＡの編集に関するこれらの初期結果に勇気づけられて、次に、ゲノムに組み込まれたｅＧＦＰ遺伝子のコピーでＰＲＩＭＥ－Ｄｅｌを試験した。まず、レンチウイルス形質導入した後、フローソーティングによりＧＦＰ陽性細胞を選択することによってｅＧＦＰ遺伝子を保有するポリクローナルＨＥＫ２９３Ｔ細胞を産生した（図３Ａ）。次に、同時の削除と挿入（削除ジャンクションでの短い挿入の有無にかかわらず、５４６ｂｐの削除）をコードする同じｐｅｇＲＮＡペアを、ｐｅｇＲＮＡとｅＧＦＰなしのＰｒｉｍｅ Ｅｄｉｔｏｒ－２酵素（ｐＣＭＶ－ＰＥ２；Ａｄｄｇｅｎｅ＃１３２７７５）をこれらの細胞にトランスフェクトすることによって試験した。編集効率はエピソーム性ｅＧＦＰと比較して大幅に低下したが（７～１７％、図３Ｂ）、編集に明らかに関連するエラーは検出できなかった（図３Ｃ及び７Ｂ）。具体的には、ニック部位又は３'－ＤＮＡフラップの組み込み部位に蓄積するバックグラウンドレベルを超えるエラークラスの一貫したパターンはなかった。また、前述したように、５４６ｂｐ削除のあるリードの大部分には、プログラムされた挿入も含まれた（図７Ｃ）。

【0107】

ネイティブ遺伝子でＰＲＩＭＥ－Ｄｅｌを試験するために、ＨＰＲＴ１のエクソン１内の１１８及び２５２ｂｐの削除をそれぞれ指定する２ペアのｐｅｇＲＮＡを設計した（図３Ｄ）。ＨＰＲＴ１遺伝子座全体にわたる削除スクリーニングのスキャンは、Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡペア戦略を使用して以前に実行された（Gasperini, M. et al. CRISPR/Cas9-Mediated Scanning for Regulatory Elements Required for HPRT1 Expression via Thousands of Large, Programmed Genomic Deletions. Am. J. Hum. Genet. 101, 192-205(2017)）。ゲノム削除のプログラミングにおいてＰＲＩＭＥ－ＤｅｌとＣａｓ９／ｓｇＲＮＡペアを直接比較するために、同じガイドを使用して同じ削除を試みたが、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞のトランスフェクションにおいてＰｒｉｍｅ Ｅｄｉｔｏｒ－２酵素をＣａｓ９に置き換えた。得られた削除効率は、２つの独立した方法により定量化された。第一に、線形ＰＣＲステップにより１５ｂｐの固有分子識別子（ＵＭＩ）配列を付加する前述の戦略を使用した後、標準的なＰＣＲ及びシーケンシング読み出しを行った。得られたシーケンシングリードは、共有ＵＭＩによって折りたたまれ、ＰＣＲ増幅及びシーケンシングクラスター生成ステップで導入される可能性のあるバイアスを最小限に抑える。第二に、ドロップレットデジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）を用い、即ち、ＰＣＲ増幅の前にゲノムＤＮＡをエマルション液滴に分割し、各液滴内のＴａｑＭａｎプローブの蛍光を読み出した。前記プローブは、削除ジャンクションで結合するように設計されており、削除の存在下で特異的に蛍光シグナルを生成する。レポータープローブの設計は、削除ジャンクションに導入されたエラーがＰＣＲ中にプローブの効率的な結合を誘導する可能性が低いため、精密な編集効率を定量化することを目的としている（Watry, H. L. et al. Rapid, precise quantification of large DNA excisions and inversions by ddPCR. Sci. Rep. 10, 14896(2020)）。削除に由来のシグナルは、以前に特徴付けられており、ｄｄＰＣＲアッセイの標準としてよく使用されるＲＰＰ３０遺伝子のコピー数の検出からの参照シグナルに対して正規化された（Watry, H. L. et al., Sci. Rep. 10, 14896(2020), supra）。ＨＰＲＴ１のエクソン１では、ＨＥＫ２９３ＴのＰＲＩＭＥ－Ｄｅｌ戦略とＣａｓ９／ｓｇＲＮＡペア戦略で同等の削除効率が観察され、１１８ｂｐ及び２５２ｂｐの削除では５％～３０％の効率の範囲であった（図３Ｅ）。注目すべきことに、ＵＭＩに基づくシーケンシングアッセイと比較して、ｄｄＰＣＲアッセイでは一貫して低い効率が観察された。これはＵＭＩに基づくアプローチによる効率の過大評価が原因である可能性があるが、ｄｄＰＣＲアッセイでは、陽性液滴と陰性液滴間の蛍光強度が明確に区別されていないため、標的領域のＰＣＲ増幅が非効率である可能性がある（図８Ｃ及び図８Ｄ）。

【0108】

よく知られているように（例えば、Canver, M. C. et al. Characterization of genomic deletion efficiency mediated by clustered regularly interspaced short palindromic repeats(CRISPR)/Cas9 nuclease system in mammalian cells. J. Biol. Chem. 289, 21312-21324(2014); Byrne, S. M., et al. Multi-kilobase homozygous targeted gene replacement in human induced pluripotent stem cells. Nucleic Acids Res. 43; and Gasperini, M. et al. CRISPR/Cas9-Mediated Scanning for Regulatory Elements Required for HPRT1 Expression via Thousands of Large, Programmed Genomic Deletions. Am. J. Hum. Genet. 101, 192-205(2017))、Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡペア戦略は、意図した削除の有無にかかわらず、エラー（ほとんどが短い削除）を引き起こすことがよくあった（図３Ｆ、３Ｇ及び８Ａ）。意図した１１８ｂｐ又は２５２ｂｐの削除を欠くリードのうち、それぞれ１２％又は１２％には観察可能な標的部位に意図しないインデルも含まれた（これらは過小評価であり、２つの標的部位のうちの１つだけを占めるためである）（図３Ｆ、上側）。意図した１１８ｂｐ又は２５２ｂｐの削除を含むリードのうち、それぞれ３８％又は３４％は、削除ジャンクションに意図しないインデルを含んだ（図３Ｆ、下側）。このような接合エラーは、ＮＨＥＪによるエラーが発生しやすい修復の確立した結果である。対照的に、ＰＲＩＭＥ－Ｄｅｌでは、意図しないインデルは、一般的よりもはるかに少なかった（図３Ｇ及び図８Ｂ）。意図した１１８ｂｐ又は２５２ｂｐの削除を欠くリードのうち、１．１％又は０．５％は、それぞれ観察可能な標的部位に意図しない短いインデルを含んだ（図３Ｇ、上側）。意図した１１８ｂｐ又は２５２ｂｐの削除を含むリードのうち、それぞれ１２％又は２．７％は、削除ジャンクションに意図しないインデルをさらに含んだ（図３Ｇ、下側）。Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡペア戦略よりもＰＲＩＭＥ－Ｄｅｌの精密な編集効率が高いパターンは、ｄｄＰＣＲ測定によっても示唆されており、ＰＲＩＭＥ－Ｄｅｌは両方の削除についてほぼ２倍高い精密に編集された集団を報告した。

【0109】

ＰＲＩＭＥ－Ｄｅｌの場合、例えば、ＨＰＲＴ１の１１８ｂｐ削除では、意図した削除に関連した削除ジャンクションでのかなりの割合の挿入の観察（図３Ｇの下側及び図８Ｂ）は、ｅＧＦＰでの以前の観察とは対照的であり、これらの率は一貫してバックグラウンドと同等であった。エラーモードをさらに調査したところ、これらのエラーは長い挿入に対応することが明らかになった（平均４７ｂｐ＋／－１２ｂｐ、図９Ａ～９Ｈ）。１１８ｂｐの削除ジャンクションで最も頻繁的な長挿入は、２つの３２ｂｐの３'－ＤＮＡフラップ配列の間のキメラ配列であり（５５ｂｐ；「ＧＣＣＣＴ」配列でオーバーラップする）、３'－ＤＮＡフラップのＧＣリッチ端のアニーリングに由来することを示唆している。同様のキメラ配列は、３'－ＤＮＡフラップにおいて「ＧＣＣＧ」でオーバーラップする２５２ｂｐ削除ジャンクションでの挿入として観察された。それにもかかわらず、これらの長い挿入があっても、ＰＲＩＭＥ－Ｄｅｌでは、インデルを含む全リードの８２％と９１％は意図した削除と精密に一致したのに対し、Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡペア戦略では、僅か３８％及び４９％であった（図４Ａ）。Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡペア戦略のインデルエラーは過小評価されている可能性がある。これは、このシーケンシング戦略では２つのＣａｓ９切断部位のうち１つだけでのエラーが捕捉されるためである。

【0110】

観察された挿入の構造と、ＰＲＩＭＥ－ＤｅｌをｅＧＦＰ遺伝子座に適用する際に同様のエラーが存在しないことから、この問題は、別のｐｅｇＲＮＡ設計によって解決できることが示唆されている。一つのアプローチとしては、両方のｐｅｇＲＮＡのＲＴテンプレート部分を短縮又は延長させた。両方のｐｅｇＲＮＡに３２ｂｐのＲＴテンプレート長を使用した１１８ｂｐ削除では、相同性アームは１７ｂｐ及び２５ｂｐ長に短縮されるか、又は４２ｂｐ及び４６ｂｐ長に延長された（図１０Ａ）。相同性アームの延長及び短縮の両方により、削除効率は低下した（それぞれ短い及び長い相同性アームの標準設計で観察された効率の２９％及び２６％）（図１０Ｂ）。しかし、削除産物の中では、相同性アームを長くすると、長時間挿入エラーの頻度が減少する傾向があった（標準設計の３０％まで）のに対し、相同性アームを短くすると、挿入エラーの頻度が増加した（標準設計の１２９％まで）（図１０Ｄ）。２５２ｂｐの削除でも同様の傾向が観察された。相同性アームを短縮又は延長すると、削除効率が低下したが（図１０Ｃ）、相同性アームを長くすると、精度が向上した（図１０Ｅ）。さらなる対照として、ＲＴテンプレートの配列を、ｅＧＦＰで５４６ｂｐの削除をプログラムするために使用した配列に置換することにより、ＨＰＲＴ１を標的とする１１８ｂｐ及び２５２ｂｐの両方の構築物のための削除を誘導することができなかった（図１０Ｂ及び１０Ｃ）。これは、ＰＲＩＭＥ－Ｄｅｌ削除が相同性アーム配列によって誘導されるＤＮＡ修復に特異的であるという結論を補強している。

【0111】

ＰＲＩＭＥ－Ｄｅｌにより追加のネイティブ遺伝子座にゲノム削除をさらに実施し、合計７遺伝子座で１０個の異なる削除を試験した（図４Ａ）。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞ですべての削除を実行し、ＵＭＩに基づくシーケンシングアッセイにより削除効率とエラー頻度を定量化し、ＰＲＩＭＥ－ＤｅｌとＣａｓ９／ｓｇＲＮＡペア法を直接比較した（即ち、同じガイドを使用するが、Ｃａｓ９に変更する）。削除サイズは、ＨＰＲＴ１エクソン１の１１８ｂｐからｅ－ＮＭＵ（ＮＭＵ遺伝子のエンハンサー）遺伝子座の７１０ｂｐまでの範囲であった。１０例のすべてにおいて、Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡペア法と比較して、ＰＲＩＭＥ－Ｄｅｌでは大幅に低いエラー率が観察された。１０例中の５例において、Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡペア法と比較して、ＰＲＩＭＥ－Ｄｅｌでは精密な削除がより効率的であることが観察され、一般的に精度が高くても削除効率が損なわれないことが示唆されている。この範囲（１１８～７１０ｂｐｓ）において、削除サイズと効率との強い関係は、どちらの方法でも観察されなかった。

【0112】

Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡペア法を使用した場合の２つのＤＳＢ間の配列の反転は、十分に文書化された現象である(Canver, M. C. et al. Characterization of genomic deletion efficiency mediated by clustered regularly interspaced short palindromic repeats(CRISPR)/Cas9 nuclease system in mammalian cells. J. Biol. Chem. 289, 21312-21324(2014); Mandal, P. K. et al. Efficient ablation of genes in human hematopoietic stem and effector cells using CRISPR/Cas9. Cell Stem Cell 15, 643-652(2014))（図４Ｂ）。ＰＲＩＭＥ－Ｄｅｌを用いた反転イベントの頻度を理解するために、２つのニック部位間の配列を反転することによって生成した参照に合わせてシーケンシングリードをアライメントした。ＰＲＩＭＥ－Ｄｅｌを実行した７遺伝子座の１０個の削除にわたって、反転参照にアライメントされたリードが実質的に存在しないことが観察された（図４Ｃ）のに対し、Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡペア対照では、最大２％のリードで反転が検出された（図４Ｃ）。

【0113】

ＰＲＩＭＥ－Ｄｅｌの長さの限界を評価するために、ＨＰＲＴ１遺伝子座で１，０６４ｂｐｓ（１ｋｂ）及び１０，２０４ｂｐｓ（１０ｋｂ）のサイズの２つの追加削除を設計した。シーケンシングに基づくアッセイは１ｋｂを超えるアンプリコンの検出にはあまり適していないため、シーケンシングにより削除産物のエラー頻度のみを定量化し、ｄｄＰＣＲにより精密な削除効率を測定し、再度Ｐｒｉｍｅ Ｅｄｉｔｏｒ－２とＣａｓ９を並べて比較した。ＰＲＩＭＥ－ＤｅｌとＣａｓ９／ｓｇＲＮＡペア法の削除効率は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞では同等であったが（図４Ｄ）、ＰＲＩＭＥ－Ｄｅｌはより短い削除を誘導しながら観察結果と一致してはるかに高い精度を達成することが観察された。１ｋｂ削除では、ＰＲＩＭＥ－ＤｅｌとＣａｓ９／ｓｇＲＮＡペア法の両方で、ほぼ３％の削除効率を達成した。１０ｋｂ削除では、ＰＲＩＭＥ－Ｄｅｌ及びＣａｓ９／ｓｇＲＮＡペア法は、それぞれ０．８％と１．６％の削除効率を達成した。削除後のジャンクションに特異的なＰＣＲに由来するアンプリコンのシーケンシングを行ったところ、１ｋｂ及び１０ｋｂの削除について、ＰＲＩＭＥ－Ｄｅｌではそれぞれリードの９８％及び９７％はジャンクションにインデルエラーがなかったのに対し、Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡペア戦略では、リードの僅か４７％及び４２％はインデルエラーがなかった（図４Ｅ）。

【0114】

ＰＲＩＭＥ－Ｄｅｌが「多重化」できるかどうかを試験するために、ＨＰＲＴ１遺伝子座の異なるがオーバーラップする４つの削除（１１８、２５２、４６９及び１０６４ｂｐｓ）をプログラムするｐｅｇＲＮＡペアをコードするプラスミドをプールした。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、Ｐｒｉｍｅ Ｅｄｉｔｏｒ－２酵素をコードするプラスミドとともにこれらのプラスミドでトランスフェクトした。細胞を４日間インキュベートし、ゲノムＤＮＡを抽出した後、シーケンシングに基づく定量化により１１８、２５２及び４６９ｂｐ削除の効率が５．１％、８．５％及び２．８％であると推定し、ｄｄＰＣＲにより１０６４ｂｐ削除の効率が２％であると推定した（図１１Ａから１１Ｃ）。合計すると、ＨＰＲＴ１遺伝子座の１８％が４つのプログラムされた削除のうちの１つを有すると推定される。これは、ｐｅｇＲＮＡペアプラスミドの単一構築物を個別にトランスフェクトすることによって実行される４つの削除の平均効率（１２％）に匹敵する。これらの結果は、ＰＲＩＭＥ－Ｄｅｌを使用して、Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡペア法と同様にプールされたｐｅｇＲＮＡペア構築物を使用して複数の削除を同時にプログラムできることを実証している。

【0115】

編集時間を延長することでプライム編集の効率が向上する。

【0116】

Ｃａｓ９媒介ＤＳＢに続いてＮＨＥＪを行うのと対照的に、プライム編集とＰＲＩＭＥ－Ｄｅｌはどちらも高い編集精度を有し、意図した編集を実現したり、元の編集可能な配列を保存したりすることができる。プライム編集とＰＲＩＭＥ－Ｄｅｌの編集効率が細胞内のＰＥ２／ｐｅｇＲＮＡ分子の一時的な利用可能性によって制限される場合、安定したゲノム組み込み又は反復トランスフェクションを通じてＰｒｉｍｅ Ｅｄｉｔｏｒ－２酵素とｐｅｇＲＮＡの発現を拡張することにより、特に、編集不可能な「行き止まり」の結果が同時に発生しない場合、時間の経過とともに編集の成功率が向上する。

【0117】

長期発現を促進するために、Ｐｒｉｍｅ Ｅｄｉｔｏｒ－２酵素を発現するモノクローナルＨＥＫ２９３Ｔ及びＫ５６２細胞株（それぞれＨＥＫ２９３Ｔ（ＰＥ２）及びＫ５６２（ＰＥ２）と呼ばれる）を生成し、ｐｅｇＲＮＡを有するレンチウイルスベクターで形質導入した（図１２Ａ）。ＰＲＩＭＥ－Ｄｅｌ（エクソン１での上記１１８ｂｐ及び２５２ｂｐの削除）と、合成ＨＥＫ３標的配列に３ｂｐ（ＣＴＴ）を挿入する標準プライム編集により、ＨＰＲＴ１での２つの異なる削除を試験した（Anzalone, A. V. et al. Search-and-replace genome editing without double-strand breaks or donor DNA. Nature 576, 149-157(2019)）。Ｋ５６２（ＰＥ２）では、プライム編集を用いたＣＴＴ挿入とＰＲＩＭＥ－Ｄｅｌを用いた１１８又は２５２ｂｐの削除の両方で、正しく編集された集団の安定した増加が時間の経過とともに観察された。ＣＴＴ挿入のエンドポイントプライム編集効率は非常に高く、Ｋ５６２（ＰＥ２）細胞へのｐｅｇＲＮＡの最初の形質導入後１９日までに正しい編集で標的の９０％に達した（図１２Ｂ）。ＰＲＩＭＥ－Ｄｅｌを用いた精密な削除率も、１９日までに、１１８ｂｐ及び２５２ｂｐ削除ではそれぞれほぼ５０％及び２５％に達した。ＨＥＫ２９３Ｔ（ＰＥ２）細胞では、最初の１０日間はＣＴＴ挿入効率の低下が観察されたが、最終的には１９日目までに８０ ～９０％に達した（図１２Ｃ）。予想外なことに、ＨＥＫ２９３Ｔ（ＰＥ２）細胞では、ＰＲＩＭＥ－Ｄｅｌ誘導削除がほぼ存在しないことが観察された（図１２Ｃ）。プライム編集における細胞型特異的な違いは排除できないが、Ｐｒｉｍｅ Ｅｄｉｔｏｒ－２酵素とｐｅｇＲＮＡの発現レベルが編集効率に大きく影響を与えると考えられている。それは、ＨＥＫ２９３Ｔ（ＰＥ２）細胞におけるその後の試みにより、時間の経過とともに削除が蓄積するためである（図１２Ｄ及び図１２Ｆ）。これらの結果は、プライム編集又はＰＲＩＭＥ－Ｄｅｌコンポーネントの拡張発現により、プライム編集のより大きなオフターゲット効果を誘導する可能性があるが、効率を向上できることを確認している。

【0118】

ＰＲＩＭＥ－Ｄｅｌの応用

【0119】

この研究では、プライム編集のためのｐｅｇＲＮＡペア戦略であるＰＲＩＭＥ－Ｄｅｌを紹介し、プログラムされた短い挿入の有無にかかわらず、削除をプログラムするための高精度が達成されることが実証されている。エピソーム性遺伝子座、合成ゲノム遺伝子座、及び天然ゲノム遺伝子座で長さ２０～１０，０００ｂｐの範囲の削除を試験した。プライム編集又はＰＲＩＭＥ－Ｄｅｌコンポーネントの長期高発現がＫ５６２細胞における編集効率を向上したことも観察されたが、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞における１回の一過性トランスフェクションによるネイティブ遺伝子の編集効率は１～３０％の範囲であった。ＰＲＩＭＥ－Ｄｅｌで標的とされた７つのゲノム遺伝子座における１２個の削除では、ＨＰＲＴ１エクソン１を除き、高い編集精度が観察され、削除ジャンクション（総リードの約５％）で長い挿入が観察されることがあった。ＨＰＲＴ１エクソン１で使用されるｐｅｇＲＮＡペアの３'－ＤＮＡフラップ配列のＧＣリッチ端は、長い挿入の基礎となっているようである。ｐｅｇＲＮＡ設計を最適化することによりこのエラーモードを排除することができ、これは、相同性アームを長くすることにより、長挿入エラーの頻度が減少する傾向があることを示している。この特定のエラーモードを容易に回避するために、ＰＲＩＭＥ－ＤｅｌのｐｅｇＲＮＡペア配列を設計するための付属のＰｙｔｈｏｎに基づくＷｅｂツールを開発しており、設計されたｐｅｇＲＮＡペアにそのような配列が存在する場合、ユーザーに通知する。

【0120】

しかし、これらの挿入エラーがあっても、ＰＲＩＭＥ－ＤｅｌはＣａｓ９／ｓｇＲＮＡペア戦略よりも高い精度を一貫して示した。即ち、ここで試験した１２個のゲノム削除のすべてについて、ＰＲＩＭＥ－Ｄｅｌの方が誤った結果がより少なかった。これらの１２例について、ＰＲＩＭＥ－Ｄｅｌは、５例で著しく高い精密な削除効率を示し（係数２を超える）、５例（係数２以内）で同等の効率を示し、２例でＣａｓ９／ｓｇＲＮＡペア法よりも著しく低い効率を示した（半分以下）。全体として、これらの観察は、ＰＲＩＭＥ－Ｄｅｌが編集効率を損なうことなくＣａｓ９／ｓｇＲＮＡペア法よりも高い精度を達成するという知見を裏付けている。

【0121】

ＰＲＩＭＥ－Ｄｅｌの潜在的な設計関連の制限は、従来のＣａｓ９／ｓｇＲＮＡペア戦略と関連し、使用可能なゲノムプロトスペーサーペアを制約する。これは、ゲノムプロトスペーサーが互いに対向するＰＡＭ配列を有する反対側の鎖上に存在する必要があるためである（図１Ｃ）。しかし、ほぼＰＡＭがない（Walton, R. T., et al. Unconstrained genome targeting with near-PAMless engineered CRISPR-Cas9 variants. Science 368, 290-296(2020)）プライム編集酵素（Kweon, J. et al. Engineered prime editors with PAM flexibility. Mol. Ther.(2021) doi:10.1016/j.ymthe.2021.02.022）の開発と最適化により、この制約が緩和される。さらなる制限は、より長い長さのため、１ペアのｐｅｇＲＮＡをタンデムにクローニングすることがｓｇＲＮＡペアのクローニングよりも困難であることである。ここで使用される各ｐｅｇＲＮＡは長さが１３５～１４０ｂｐであるため、それらの独特なコンポーネントを単一の長いオリゴヌクレオチドとしてタンデムに合成することは、特にｐｅｇＲＮＡペアライブラリーのアレイに基づく合成を必要とする目的では、従来のＤＮＡ合成技術の限界に近づく。

【0122】

これらの制限にもかかわらず、ＰＲＩＭＥ－Ｄｅｌは、いくつかの潜在的な応用分野にわたって代替案に比べて大きな利点を提供する（図５）。最も簡単に言えば、ＰＲＩＭＥ－Ｄｅｌは、少なくとも１０ｋｂの削除を精密にプログラミングするために適用でき、まだ上限を設定する兆候がない。Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡペア戦略と比較して、削除ジャンクションで観察されたインデルエラー率がはるかに低いことに加えて、ペアニックの誘導により、局所的な意図しない大規模な削除、ゲノム全体の再構成（クロモトリプシス;Leibowitz, M. L. et al. Chromothripsis as an on-target consequence of CRISPR-Cas9 genome editing. Nature Genetics(2021) doi:10.1038/s41588-021-00838-7）、又はオフターゲット編集が発生する可能性が低くなる（Kosicki, M., et al. Repair of double-strand breaks induced by CRISPR-Cas9 leads to large deletions and complex rearrangements. Nat. Biotechnol. 36, 765-771(2018), Anzalone, A. V. et al. Search-and-replace genome editing without double-strand breaks or donor DNA. Nature 576, 149-157(2019), Schene, I. F. et al. Nature communications 11.1(2020): 1-8, Owens, D. D. G. et al. Microhomologies are prevalent at Cas9-induced larger deletions. Nucleic Acids Res. 47, 7402-7417(2019), and Kim, D. Y. et al. Unbiased investigation of specificities of prime editing systems in human cells. Nucleic Acids Research(2020) doi:10.1093/nar/gkaa764）。これらの特性は、治療アプローチの開発に有利である。例えば、ＰＲＩＭＥ－Ｄｅｌは、近くの又は離れた配列に望ましくない混乱を与えることなくＦＭＲ１の５'－ＵＴＲにおけるＣＧＧリピート拡張などの病原性領域を削除する（Khosravi, M. A. et al. Targeted deletion of BCL11A gene by CRISPR-Cas9 system for fetal hemoglobin reactivation: A promising approach for gene therapy of beta thalassemia disease. Eur. J. Pharmacol. 854, 398-405(2019), Dastidar, S. et al. Efficient CRISPR/Cas9-mediated editing of trinucleotide repeat expansion in myotonic dystrophy patient-derived iPS and myogenic cells. Nucleic Acids Res. 46, 8275-8298(2018)）。

【0123】

ＰＲＩＭＥ－Ｄｅｌでは、効率や精度を実質的に損なうことなく、プログラムされた削除結合部に短い配列を同時に挿入することもできる。短い配列を挿入することで、ネイティブリーディングフレームを維持しながらタンパク質ドメインを精密に削除することができ、つまり、複雑なナンセンス媒介崩壊（ＮＭＤ）応答を誘導する可能性がある中途終止コドンを回避することができる（El-Brolosy, M. A. et al. Genetic compensation triggered by mutant mRNA degradation. Nature 568, 193-197(2019), Ma, Z. et al. PTC-bearing mRNA elicits a genetic compensation response via Upf3a and COMPASS components. Nature 568, 259-263(2019)）。さらに、削除する際に生物学的に活性な配列を挿入することは、ＰＲＩＭＥ－Ｄｅｌをテクノロジーと組み合わせるのに有利である可能性があり、即ち、編集されたゲノム遺伝子座内で分子ハンドルとして使用可能なエピトープタグ又はＴ７プロモーター配列を挿入する。

【0124】

さらに、従来のＣａｓ９／ｓｇＲＮＡペア戦略と比較して、プライム編集に基づくＰＲＩＭＥ－ＤｅｌによるＤＮＡ損傷に起因する毒性が少ないことが期待されており、これにより、ｓｃａｎＤｅｌやｃｒｉｓｐｒＱＴＬなどのフレームワークのプログラムされたゲノム削除の多重化が促進される（Gasperini, M. et al. CRISPR/Cas9-Mediated Scanning for Regulatory Elements Required for HPRT1 Expression via Thousands of Large, Programmed Genomic Deletions. Am. J. Hum. Genet. 101, 192-205(2017), Gasperini, M. et al. A Genome-wide Framework for Mapping Gene Regulation via Cellular Genetic Screens. Cell 176, 1516(2019)）。転写における非コード要素の研究では、約１０ｋｂまでの効率的かつ精密な削除は、標的領域周囲のエピジェネティック修飾の範囲を制御できないＣＲＩＳＰＲ干渉用の非活性化Ｃａｓ９結合ＫＲＡＢドメイン（ＣＲＩＳＰＲｉ）の現在の使用を補完する。したがって、ＰＲＩＭＥ－Ｄｅｌは、塩基対の分解能でネイティブ遺伝要素を特徴付けるための大規模並列機能アッセイに広く適用できることが期待される。

【0125】

方法

【0126】

ｐｅｇＲＮＡ／ｓｇＲＮＡ設計

【0127】

pｅｇＲＮＡ／ｓｇＲＮＡの設計では、ＣＲＩＳＰＯＲ（Concordet, J.-P. & Haeussler, M. CRISPOR: intuitive guide selection for CRISPR/Cas9 genome editing experiments and screens. Nucleic Acids Res. 46, W242-W245(2018)）を最初に使用して特定の関心領域内の２０ｂｐのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９スペーサーを選択した。Ｕ６／Ｈ１ターミネーターやＧＣリッチ配列を含む非効率と注釈付きのスペーサーが回避され、予測効率（Ｕ６転写されたｓｇＲＮＡのＤｏｅｎｃｈスコア(Doench, J. G. et al. Optimized sgRNA design to maximize activity and minimize off-target effects of CRISPR-Cas9. Nat. Biotechnol. 34, 184-191(2016)）がより高いスペーサーが一般的に選択された。ｐｅｇＲＮＡのＲＴテンプレート部分の長さは、最初は３０ｂｐに設定され、Ｇ又はＣで終わる場合、１～２ｂｐ延長された（Kim, Hui Kwon, et al. "Predicting the efficiency of prime editing guide RNAs in human cells." Nature Biotechnology 39.2, 198-206(2021), Anzalone, A. V. et al. Search-and-replace genome editing without double-strand breaks or donor DNA. Nature 576, 149-157(2019)）。

【0128】

ＰＲＩＭＥ－ＤｅｌのｐｅｇＲＮＡペアを設計するためのＷｅｂツール

【0129】

ＰＲＩＭＥ－ＤｅｌのｐｅｇＲＮＡペアの設計を容易にするために、設計プロセスを自動化するＰｙｔｈｏｎに基づくＷｅｂツールを開発した。このソフトウェアは、ＦＡＳＴＡ形式配列ファイルを入力とし、提供された領域内のすべての可能なＰＡＭ配列を特定し、最初にすべての潜在的なｐｅｇＲＮＡペア配列を生成して削除をプログラムする。このソフトウェアは、選択的に、Ｆｌａｓｈｆｒｙ（McKenna, A. & Shendure, J. FlashFry: a fast and flexible tool for large-scale CRISPR target design. BMC Biol. 16, 74(2018)；ｈｔｔｐｓ：／／ｐａｐｅｒｐｉｌｅ．ｃｏｍ／ｃ／ｇＧｘＲｎＷ／ａＹｐ１ｂ）、ＣＲＩＳＰＯＲ又はＧＰＰ ｓｇＲＮＡデザイナー（Concordet, J.-P. & Haeussler, M. CRISPOR: intuitive guide selection for CRISPR/Cas9 genome editing experiments and screens. Nucleic Acids Res. 46, W242-W245(2018)）を使用して生成されたスコア付けされたｓｇＲＮＡファイルを入力することもできる。これは、効果的なＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９スペーサーを特定するために強く推奨される。ＦｌａｓｈＦｒｙ及びＣＲＩＳＰＯＲでは、ＭＩＴ特異性スコア（Hsu, P. D. et al. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nat. Biotechnol. 31, 827-832(2013)）が５０未満のｓｇＲＮＡスペーサーは、ＣＲＩＳＰＯＲの推奨に従って除外される。ソフトウェアは、ユーザーが提供した追加の設計パラメータに基づいて、最初に生成されたｐｅｇＲＮＡペアから関連するペアを選択する。例えば、ユーザーは削除サイズ範囲を定義することができる。ユーザーは、目的の削除の開始位置と終了位置を定義することもでき、ソフトウェアはそれらの座標を中心とするウィンドウを提示するｐｅｇＲＮＡペアにフィルターをかける。ジャンクションがＰＡＭ部位に位置しない削除のｐｅｇＲＮＡは、両方のｐｅｇＲＮＡに挿入配列を追加して所望の編集を容易にするオプション「－－ｐｒｅｃｉｓｅ」（－ｐ）を使用して設計することができる。

【0130】

ＰＲＩＭＥ－Ｄｅｌ設計ソフトウェアは、追加の設計制約を指定することもできる。ｐｅｇＲＮＡ ＲＴテンプレートの長さ（相同性アームとも呼ばれる）は、ユーザーが別途指定しない限り、デフォルトで３０ｂｐに設定される。ユーザーが別途指定しない限り、ｐｅｇＲＮＡ ＰＢＳの長さはデフォルトでＰＥ２ニック部位から１３ｂｐに設定される。ＰＡＭ配列に対するニック位置は、事前に特定されたパラメーターを使用して予測される（Lindel(Chen, W. et al. Massively parallel profiling and predictive modeling of the outcomes of CRISPR/Cas9-mediated double-strand break repair. Nucleic Acids Research vol. 47, 7989-8003(2019))）。非正規の位置にニックが生成される予測可能性が２５％を超える場合、それに応じてＲＴ テンプレートの長さを調整する。ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩターミネーター配列（連続したＴが４つを超える）を含むＰｅｇＲＮＡ配列を排除する。いずれかの３'－ＤＮＡフラップの５ｂｐのうち４ｂｐ以上がＧ又はＣの場合、ソフトウェアは警告メッセージを生成する。コードはｇｉｔｕｈｕｂ（github.com/shendurelab/Prime-del）で入手でき、インタラクティブなＷｅｂページはprimedel.uc.r.appspot.com/で入手できる。

【0131】

ｐｅｇＲＮＡクローニング

【0132】

ｐｅｇＲＮＡペアを設計した後、Ａｎｚａｌｏｎｅらが概説したＧｏｌｄｅｎ－Ｇａｔｅクローニング戦略（Anzalone, A. V. et al. Nature 576, 149-157(2019)）を実施し、３つのｄｓＤＮＡ断片と１つのプラスミドバックボーンを組み立てた。第１のｄｓＤＮＡ断片は、４ｂｐの５'オーバーハングを持つ２つの相補的な合成一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド（ＩＤＴ）からアニールされたｐｅｇＲＮＡ－１スペーサー配列を含む。第２のｄｓＤＮＡ断片は、４ｂｐオーバーハングの端で５'端がリン酸化された２つのＤＮＡオリゴヌクレオチドからアニールされたｐｅｇＲＮＡ－１ ｓｇＲＮＡ足場配列を含む。第３のｄｓＤＮＡ断片は、ｐｅｇＲＮＡ－１ ＲＴテンプレート配列とプライマー結合配列（ＰＢＳ）、ｐｅｇＲＮＡ－１ターミネーター配列（６つの連続したＴ）、及びＨ１プロモーター配列を含むｐｅｇＲＮＡ－２配列を含む。これは、ＰＣＲ増幅によって遺伝子断片（ＩＤＴからｇＢｌｏｃｋとして購入）の両端にｐｅｇＲＮＡ－１部分とｐｅｇＲＮＡ－２部分を付加することによって生成された。この遺伝子断片には、ｐｅｇＲＮＡ－１ターミネーター配列、Ｈ１プロモーター配列、ｐｅｇＲＮＡ－２スペーサー配列、及びｐｅｇＲＮＡ－２ ｓｇＲＮＡ足場配列が含まれた。フォワードプライマーには、ＢｓｍＢＩ又はＢｓａＩ制限部位、ｐｅｇＲＮＡ－１ ＲＴテンプレート配列及びＰＢＳが含まれた。リバースプライマーには、ｐｅｇＲＮＡ－２ ＲＴテンプレート、ＰＢＳ、及びＢｓｍＢＩ又はＢｓａＩ制限部位が含まれた。ＰＣＲ断片（サイズが３００～４００ｂｐ）を１．０Ｘ ＡＭＰｕｒｅ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して精製し、Ｇｏｌｄｅｎ－Ｇａｔｅに基づくａｓｓｅｍｂｌｙ ｍｉｘ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏｌａｂｓからのＢｓｍＢＩ又はＢｓａＩ ｇｏｌｄｅｎ－ｇａｔｅ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｍｉｘ）のために、他の２つのｄｓＤＮＡ断片及び対応するオーバーハングを有する線状バックボーンベクターと混合した。ｐｅｇＲＮＡクローニングバックボーンには、ＧＧアクセプタープラスミド（Ａｄｄｇｅｎｅ＃１３２７７７）又はブラストサイジン耐性遺伝子を有するｐｉｇｇｙＢＡＣ－ｃａｒｇｏベクターを使用した。各構築プラスミドを増幅のためにＳｔｂｌコンピテント大腸菌（ＮＥＢ Ｃ３０４０Ｈ）に形質転換し、ミニプレップキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製した。サンガーシーケンシング法（Ｇｅｎｅｗｉｚ）によりクローニングを検証した。

【0133】

組織培養、トランスフェクション、レンチウイルス形質導入、及びモノクローナル株の生成

【0134】

ＨＥＫ２９３Ｔ及びＫ５６２細胞は、ＡＴＣＣから購入された。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、１０％ウシ胎児血清（Ｒｏｃｋｙ Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）及び１％ペニシリン－ストレプトマイシン（ＧＩＢＣＯ）を補充した高グルコース含有ダルベッコ改変イーグル培地（ＧＩＢＣＯ）中で培養した。Ｋ５６２細胞を、１０％ウシ胎児血清（Ｒｏｃｋｙ Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）及び１％ペニシリン－ストレプトマイシン（ＧＩＢＣＯ）を補充したＬ－グルタミン（Ｇｉｂｃｏ）を含むＲＰＭＩ １６４０中で培養した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞とＫ５６２細胞を５％ＣＯ_２、３７℃で増殖させた。

【0135】

一過性トランスフェクションでは、約５０，０００個の細胞を２４ウェルプレートの各ウェルに播種し、７０～９０％コンフルエンシーまで培養した。プライム編集では、ベンダーの推奨プロトコールに従って、３７５ｎｇのＰｒｉｍｅ Ｅｄｉｔｏｒ－２酵素プラスミド（Ａｄｄｇｅｎｅ＃１３２７７５）と１２５ｎｇのｐｅｇＲＮＡ又はｐｅｇＲＮＡペアプラスミドを混合し、トランスフェクション試薬（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ３０００）で調製した。Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡペアを用いた削除では、Ｐｒｉｍｅ Ｅｄｉｔｏｒ－２酵素プラスミドの代わりに３７５ｎｇのＣａｓ９プラスミド（Ａｄｄｇｅｎｅ＃５２９６２）を使用した。特に明記しない限り、細胞を最初のトランスフェクション後に４～５日間培養し、そのゲノムＤＮＡを、ＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ ＆ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用するか又はＡｎｚａｌｏｎｅらの細胞溶解及びプロテアーゼプロトコール（Anzalone, A. V. et al. Nature 576, 149-157(2019)）に従って収集した。

【0136】

レンチウイルス生成では、約３００，０００個の細胞を６ウェルプレートの各ウェルに播種し、７０～９０％コンフルエントまで培養した。ベンダーが推奨するプロトコールに従って、レンチウイルスプラスミドをＶｉｒａＰｏｗｅｒレンチウイルス発現システム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）と共にトランスフェクトした。レンチウイルスを同じプロトコールに従って収集し、Ｐｅｇ－ｉｔウイルス沈降溶液（ＳＢＩ）を使用して一晩濃縮し、凍結融解サイクルを行わずに１～２日以内にＫ５６２又はＨＥＫ２９３Ｔ細胞への形質導入に使用した。

【0137】

トランスポザーゼの組み込みでは、５００ｎｇのカーゴプラスミドと１００ｎｇのＳｕｐｅｒ ｐｉｇｇｙＢＡＣトランスポザーゼ発現ベクター（ＳＢＩ）を混合し、ベンダーの推奨プロトコールに従ってトランスフェクション試薬（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ３０００）で調製した。Ｐｒｉｍｅ Ｅｄｉｔｏｒ－２酵素を発現する単一細胞クローンを、ｐｉｇｇｙＢＡＣトランスポザーゼシステムを使用してＰＥ２を組み込むことによって生成し、マーカー（ピューロマイシン耐性遺伝子）により選択し、フローソート装置を使用して単一細胞を９６ウェルプレートに選別し、コンフルエントになるまで２～３週間培養し、ＣＴＴ挿入ｐｅｇＲＮＡのみ（Ａｄｄｇｅｎｅ＃１３２７７８）をトランスフェクトし、ＨＥＫ３標的遺伝子座をシーケンシングすることにより、ＰＥ活性についてスクリーニングした。

【0138】

ＤＮＡシーケンシングライブラリーの準備

【0139】

プログラムされた削除効率とＰＲＩＭＥ－Ｄｅｌによって生成される可能性のあるエラーを定量化するために、２段階のＰＣＲにより精製ＤＮＡ（長さ約２００～ 約１０００ｂｐ）から標的領域を増幅し、イルミナシーケンシングプラットフォーム（ＮｅｘｔＳｅｑ又はＭｉＳｅｑ）を使用してシーケンシングした。精製された各ＤＮＡサンプルには野生型ＤＮＡ分子と編集されたＤＮＡ分子が含まれており、各ＰＣＲ反応を通じて同じペアのプライマーを使用して一緒に増幅された。ＰＣＲ増幅では、各ゲノム遺伝子座（アンプリコン）ごとに１ペアのプライマーを設計した。ここで、ＰＣＲ増幅、ＰＣＲ産物の精製、及びシーケンシングフローセル上でのクラスター化における潜在的な問題を回避するために、削除の有無にかかわらず、アンプリコン全体のサイズは２００ｂｐを超えた。

【0140】

第１のＰＣＲ反応（ＫＡＰＡ Ｒｏｂｕｓｔ）には、最終反応容量５０μＬ中に３００ｎｇの精製ゲノムＤＮＡ又は２μＬの細胞溶解物、０．０４～０．４μＭのフォワード及びリバースプライマーが含まれた。第１のＰＣＲ反応は、１）９５℃で３分間；２）９５℃で１５秒間；３）６５℃で１０秒間；４）７２℃で４５秒間、ステップ２～４を２５～２８サイクル繰り返し；及び５）７２℃で１分間となるようにプログラムされた。プライマーは、３'端に、ゲノムＤＮＡを増幅するＰＣＲ産物の両端に付加するシーケンシングアダプターを含んだ。第１のＰＣＲ反応の後に、生成物を６％ＴＢＥゲルで評価し、１．０Ｘ ＡＭＰｕｒｅ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して精製し、デュアルサンプルインデックスとフローセルアダプターを付加する第２のＰＣＲ反応に追加した。第２のＰＣＲ反応プログラムは、５～１０サイクルを実行した以外、第１のＰＣＲプログラムと同じであった。生成物を再度ＡＭＰｕｒｅにより精製し、シーケンシング実行のために変性する前にＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎ（Ａｇｉｌｅｎｔ）で評価した。サイズが２００～３００ｂｐのアンプリコンを生成する長い削除の場合、Ｍｉｓｅｑシーケンシングプラットフォームは、クラスター密度３００～４００ｋ／ｍｍ^２を目指して、クラスター化中に長いアンプリコンを置き換える短いアンプリコンを最小限に抑えるために、低い（８ｐＭ）インプットＤＮＡ濃度で使用された。Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＮｅｘｔＳｅｑ又はＭｉＳｅｑ機器を使用してベンダーのプロトコルに従って変性ライブラリーをシーケンシングした。

【0141】

１５ｂｐの固有分子識別子（ＵＭＩ）を追加するために、第１のＰＣＲ反応は２つのステップで実行された。第一に、ＫＡＰＡ Ｒｏｂｕｓｔポリメラーゼを使用し、２回のＰＣＲサイクルで０．０４～０．４ｕＭの単一フォワードプライマーの存在下でゲノムＤＮＡを直線的に増幅した。ＵＭＩ付加リニアＰＣＲ反応は、１）９５℃で３分１５秒；２）６５℃で１分間；３）７２℃で２分間、ステップ２と３を５サイクル繰り返し；４）９５℃で１５秒間；５）６５℃で１分間；６）７２℃で２分間、さらにステップ５と６を５サイクル繰りし；となるようにプログラムされた。この反応を１．５Ｘ ＡＭＰｕｒｅを使用してクリーンアップし、フォワード及びリバースプライマーを使用した第２のＰＣＲに使用した。この場合、フォワードプライマーはＵＭＩ配列の上流にアニールし、ゲノム遺伝子座に特異的ではない。ＰＣＲ増幅後、生成物をクリーンアップし、他のサンプルと同様にデュアルサンプルインデックスとフローセルアダプターを付加する別のＰＣＲ反応に追加した。

【0142】

シーケンシングデータの処理と分析

【0143】

シーケンシングレイアウトは、各方向で削除ジャンクションから少なくとも５０ｂｐ離れたところをカバーするように設計された（図６Ａ）。ペアエンドシーケンスの場合、ＰＥＡＲ（Zhang, J., et al. PEAR: a fast and accurate Illumina Paired-End reAd mergeR. Bioinformatics 30, 614-620(2014)）を使用してペアエンドリードをデフォルトのパラメーター及び経験的な基本周波数を無効にする「－ｅ」フラグとマージした。１５ｂｐのＵＭＩがシーケンシングリードに存在する場合、カスタムＰｙｔｈｏｎスクリプトを使用して同じＵＭＩを共有するすべてのリードを検索した。これらのリードは、最も頻度の高い配列を持つ１つのリードに折り畳んだ。得られたシーケンシングリードを、一般的にＣＲＩＳＰＲｅｓｓｏ２ソフトウェアを使用して２つの参照配列（削除の有無にかかわらず）にアライメントした（Clement, K. et al. CRISPResso2 provides accurate and rapid genome editing sequence analysis. Nat. Biotechnol. 37, 224-226(2019)；https://paperpile.com/c/gGxRnW/2BRib）。ＣＲＩＳＰＲｅｓｓｏ２にデフォルトのアラインメントパラメーターを使用し、カット／ニック部位でのインデル挿入では、ギャップオープンペナルティ－２０、ギャップ拡張ペナルティ－２、及びギャップインセンティブ値１であった。リードアライメントの最小相同性スコアは、様々なアンプリコンの長さについて５０～９５の間で調査された。カスタムＰｙｔｈｏｎ及びＲスクリプトを使用してＣＲＩＳＰＲｅｓｓｏ２からのアライメント結果を分析した。

【0144】

同じ配列長の２つの参照配列（野生型及び削除）を使用してアライメントを実行し、それぞれの参照配列を含む２セットのリードを生成した。削除効率は、いずれかの参照にアラインメントするリードの総数に対する、削除を有する参照配列にアラインメントするリードの総数の割合として計算された。ゲノム編集には、置換、挿入、削除の３種類のエラーモードがある。各エラー頻度は、２つの参照配列にわたってプロットされ、各プロットにおいてＣａｓ９（Ｈ８４０Ａ）ニック部位と３'－ＤＮＡフラップ組み込み部位が強調表示された。

【0145】

液滴デジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）アッセイ

【0146】

ｄｄＰＣＲプローブは、Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓが推奨するパラメーターに従って設計された。ＲＰＰ３０遺伝子のためのあらかじめ混合された参照プローブ及びプライマーは、Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入された。プローブ及びＰＣＲプライマーは、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ）から購入された。プローブは、５'端がＦＡＭで修飾され、ダブルクエンチャーを含む（ＩＤＴ ＰｒｉｍｅＴｉｍｅ ｑＰＣＲプローブ）。プローブ配列は、精密な削除産物を検出するために削除ジャンクションをカバーするように特別に設計された（Hsu, P. D. et al. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nat. Biotechnol. 31, 827-832(2013)）。各削除を検出するために、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（室温でｐＨ８．０）中の１８ｕＭフォワードプライマー、１８ｕＭリバースプライマー、及び５ｕＭのＦＡＭ標識プローブからなる２０Ｘプライマー混合物を調製した。２５ｕＬのｄｄＰＣＲ反応混合物は、１２．５ｕＬの２Ｘ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ ｆｏｒ Ｐｒｏｂｅｓ（ｎｏ ｄＵＴＰ）（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、１．２５ｕＬの２０Ｘ ＨＥＸ修飾ＲＰＰ３０参照混合物（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、１．２５ｕＬの２０Ｘ ＦＡＭ修飾プライマー混合物、０．５ｕＬのゲノムＤＮＡを含む細胞溶解物、及び９．５ｕＬのＤＮＡｓｅフリー水から構成された。２０μＬのｄｄＰＣＲ反応混合物を７０μＬのプローブ用液滴生成オイルに添加し、ＱＸ２００ Ｄｒｏｐｌｅｔ ｇｅｎｅｒａｔｏｒ（Ｂｉｏ-Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用して液滴を生成した。液滴をｄｄＰＣＲ ９６ウェルプレート（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に移し、次のプログラムにより９６ウェルサーモサイクラー（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）で実行した。１）９５℃で１０分間；２）９４℃で３０秒間；３）５０℃で１分間、ステップ２と３を４１サイクル繰り返し；４）９８℃で１０分間；５）４℃に冷却してＱＸ２００ Ｄｒｏｐｌｅｔ ｒｅａｄｅｒにロード。サーモサイクラーのすべてのステップで、温度勾配は１秒あたり１℃に制限された。ＱＸ２００ Ｄｒｏｐｌｅｔ ｒｅａｄｅｒとＢｉｏ－Ｒａｄ ＱｕａｎｔａＳｏｆｔ Ｐｒｏソフトウェアを使用してｄｄＰＣＲ実験を視覚化して分析した。削除効率は、ＦＡＭ＋（精密な削除）とＨＥＸ＋（ゲノムＤＮＡローディングのためのＲＰＰ３０参照）イベントの比から取得された。

【0147】

データの可用性

【0148】

生シーケンシングデータは、Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｒｅａｄ Ａｒｃｈｉｖｅ（ＳＲＡ）にアップロードされ、関連するＢｉｏＰｒｏｊｅｃｔ ＩＤ ＰＲＪＮＡ６９２６２３で一般公開された。ゲノム削除のプログラミングに使用される選択されたプラスミドは、Ａｄｄｇｅｎｅから入手できる（ＩＤ１７２６５５、１７２６５６、１７２６５７及び１７２６５８）。

【0149】

コードの可用性

【0150】

ＰＲＩＭＥ－Ｄｅｌのソースコードは、github.com/shendurelab/Prime-delで入手できる。ＰＲＩＭＥ－Ｄｅｌ用のｐｅｇＲＮＡを設計するためのインタラクティブなＷｅｂページは、primedel.uc.r.appspot.com/で入手できる。

【0151】

配列表

【0152】

表１：実験に使用されるｐｅｇＲＮＡとｇＲＮＡの配列

【表1】

【0153】

表２：ゲノムＤＮＡ増幅に使用されるプライマーの配列

【表2】

【0154】

表３：液滴デジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）アッセイに使用されるプライマーとプローブの配列
すべてのプローブは、５'端がＦＡＭで修飾された。

【表3】

【0155】

例示的な実施形態を図示及び説明してきたが、本開示の精神及び範囲から逸脱することなく様々な変更を加えることができることが理解されるであろう。

【0156】

排他的財産又は特権が主張される本発明の実施形態は、特許請求の範囲のように定義される。

【図1-1】

【図1-2】

【図1-3】

【図1-4】

【図1-5】

【図1-6】

【図1-7】

【図1-8】

【図2-1】

【図2-2】

【図2-3】

【図2-4】

【図3-1】

【図3-2】

【図3-3】

【図3-4】

【図3-5】

【図3-6】

【図4-1】

【図4-2】

【図4-3】

【図4-4】

【図4-5】

【図5】

【図6-1】

【図6-2】

【図6-3】

【図6-4】

【図7-1】

【図7-2】

【図7-3】

【図8-1】

【図8-2】

【図8-3】

【図8-4】

【図9-1】

【図9-2】

【図9-3】

【図9-4】

【図9-5】

【図9-6】

【図9-7】

【図9-8】

【図10-1】

【図10-2】

【図10-3】

【図11-1】

【図11-2】

【図11-3】

【図12-1】

【図12-2】

【図12-3】

【図12-4】

【図12-5】

【図12-6】

【図13】

【図14】

【配列表】

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【国際調査報告】