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特表2023-549160神経変性疾患の治療のために神経細胞におけるＣＨＭＰ７発現を阻害するための方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-11-22
(54)【発明の名称】神経変性疾患の治療のために神経細胞におけるＣＨＭＰ７発現を阻害するための方法
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/02 20060101AFI20231115BHJP
A61P 25/00 20060101ALI20231115BHJP
A61P 25/14 20060101ALI20231115BHJP
A61P 25/28 20060101ALI20231115BHJP
A61P 25/16 20060101ALI20231115BHJP
A61P 21/00 20060101ALI20231115BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20231115BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20231115BHJP
A61K 31/7105 20060101ALI20231115BHJP
A61K 31/713 20060101ALI20231115BHJP
A61K 31/7088 20060101ALI20231115BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20231115BHJP
G01N 33/50 20060101ALI20231115BHJP
G01N 33/15 20060101ALI20231115BHJP
C12N 15/113 20100101ALN20231115BHJP
C07K 16/18 20060101ALN20231115BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/02
A61P25/00 ZNA
A61P25/14
A61P25/28
A61P25/16
A61P21/00
A61K45/00
A61K48/00
A61K31/7105
A61K31/713
A61K31/7088
A61P43/00 111
A61P43/00 105
G01N33/50 Z
G01N33/15 Z
C12N15/113 Z
C07K16/18
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023527808
(86)(22)【出願日】2021-11-10
(85)【翻訳文提出日】2023-07-06
(86)【国際出願番号】 US2021058780
(87)【国際公開番号】W WO2022103838
(87)【国際公開日】2022-05-19
(31)【優先権主張番号】63/111,882
(32)【優先日】2020-11-10
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＲＩＴＯＮ
２．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】501335771
【氏名又は名称】ザ・ジョンズ・ホプキンス・ユニバーシティ
(74)【代理人】
【識別番号】100147485
【弁理士】
【氏名又は名称】杉村 憲司
(74)【代理人】
【識別番号】230118913
【弁護士】
【氏名又は名称】杉村 光嗣
(74)【代理人】
【識別番号】100167623
【弁理士】
【氏名又は名称】塚中 哲雄
(72)【発明者】
【氏名】ジェフリー ディー ロススタイン
(72)【発明者】
【氏名】アリッサ コイン
【テーマコード（参考）】
2G045
4B063
4C084
4C086
4H045
【Ｆターム（参考）】
2G045AA40
4B063QA01
4B063QA18
4B063QQ08
4B063QQ42
4B063QQ52
4B063QQ79
4B063QR32
4B063QR35
4B063QR48
4B063QR77
4C084AA13
4C084AA17
4C084NA14
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4C084ZA152
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4C084ZA162
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4C084ZC411
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4C086AA01
4C086AA02
4C086EA16
4C086MA01
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4C086ZA01
4C086ZA02
4C086ZA15
4C086ZA16
4C086ZA94
4C086ZB21
4C086ZC41
4H045AA10
4H045AA11
4H045AA30
4H045BA10
4H045CA40
4H045DA75
4H045DA76
4H045EA20
4H045EA21
4H045EA50
(57)【要約】
【課題】
【解決手段】本開示は、神経細胞または細胞の集団におけるＣＨＭＰ７を低減または阻害する化合物をスクリーニングする方法、および細胞におけるＣＨＭＰ７発現を阻害して１つまたは複数の神経変性疾患に罹患している１または複数の被験者を治療する方法に関する。
【選択図】なし
【解決手段】本開示は、神経細胞または細胞の集団におけるＣＨＭＰ７を低減または阻害する化合物をスクリーニングする方法、および細胞におけるＣＨＭＰ７発現を阻害して１つまたは複数の神経変性疾患に罹患している１または複数の被験者を治療する方法に関する。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
神経細胞または細胞の集団におけるＣＨＭＰ７を低減または阻害する化合物をスクリーニングする方法であって、神経細胞または細胞の集団に少なくとも１つの化合物を投与し、前記化合物が前記細胞または細胞の集団におけるＣＨＭＰ７の発現を低減または阻害するか否かを決定することを含む、方法。
【請求項2】
請求項１に記載の方法において、前記化合物は、小分子もしくはその薬学的に許容される塩、抗体もしくはその抗原結合断片、オリゴヌクレオチド、短鎖干渉ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ペプチド、ペプチドミメティック、またはそれらの任意の組み合わせである、方法。
【請求項3】
請求項２に記載の方法において、前記オリゴヌクレオチドはアンチセンスオリゴヌクレオチドである、方法。
【請求項4】
請求項１に記載の方法に従って決定された化合物を含む、医薬組成物。
【請求項5】
神経細胞または細胞の集団におけるＣＨＭＰ７発現を阻害する方法であって、有効量のＣＨＭＰ７阻害剤を前記細胞または細胞の集団に投与することを含む、方法。
【請求項6】
請求項５に記載の方法において、前記ＣＨＭＰ７阻害剤は、小分子もしくはその薬学的に許容される塩、抗体もしくはその抗原結合断片、オリゴヌクレオチド、短鎖干渉ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ペプチド、ペプチドミメティック、またはそれらの任意の組み合わせである、方法。
【請求項7】
請求項６に記載の方法において、前記オリゴヌクレオチドはアンチセンスオリゴヌクレオチドである、方法。
【請求項8】
その治療を必要とする被験体における神経変性疾患を治療する方法であって、治療上有効量のＣＨＭＰ７阻害剤を前記被験体に投与することを含む、方法。
【請求項9】
請求項８に記載の方法において、前記ＣＨＭＰ７阻害剤は、約０．００１ｍｇ／ｋｇ～約１０００ｍｇ／ｋｇの量で被験体に投与される、方法。
【請求項10】
請求項８または９に記載の方法において、前記被験体はヒトである、方法。
【請求項11】
請求項８～１０のうちいずれか一項に記載の方法において、前記ＣＨＭＰ７阻害剤は、小分子もしくはその薬学的に許容される塩、抗体もしくはその抗原結合断片、オリゴヌクレオチド、短鎖干渉ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ペプチド、ペプチドミメティック、またはそれらの任意の組み合わせである、方法。
【請求項12】
請求項１１に記載の方法において、前記オリゴヌクレオチドはアンチセンスオリゴヌクレオチドである、方法。
【請求項13】
請求項８～１２のうちいずれか一項に記載の方法において、前記神経変性疾患は、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン病、アルツハイマー病、パーキンソン病、レビー小体型認知症、多発性硬化症、または前頭側頭型変性症である、方法。
【請求項14】
請求項１３に記載の方法において、前記神経変性疾患は、筋萎縮性側索硬化症または前頭側頭型変性症である、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
（関連出願情報）
本出願は、２０２０年１１月１０日に出願された米国特許出願第６３／１１１，８８２号に対する優先権を主張し、その内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０２０年１１月１０日に出願された米国特許出願第６３／１１１，８８２号に対する優先権を主張し、その内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【0002】
（電子的に提出された資料の参照による組込み）
即日出願は、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介してＡＳＣＩＩフォーマットで提出された配列表を含み、その全体が参照によりここに組み込まれる。２０２１年１１月１０日に作成された当該ＡＳＣＩＩコピーは、３８９２２－６０１＿ＳＴ２５．ｔｘｔと命名され、サイズは４，８２４バイトである。
即日出願は、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介してＡＳＣＩＩフォーマットで提出された配列表を含み、その全体が参照によりここに組み込まれる。２０２１年１１月１０日に作成された当該ＡＳＣＩＩコピーは、３８９２２－６０１＿ＳＴ２５．ｔｘｔと命名され、サイズは４，８２４バイトである。
【0003】
（政府声明）
本発明は、国立衛生研究所から与えられた助成金ＡＧ０６２１７１の下、政府の支援を受けて行われたものである。政府は、本発明に対して一定の権利を有する。
本発明は、国立衛生研究所から与えられた助成金ＡＧ０６２１７１の下、政府の支援を受けて行われたものである。政府は、本発明に対して一定の権利を有する。
【背景技術】
【0004】
運動ニューロン疾患である筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）は、運動皮質および脊髄内の複数のニューロンおよびグリアサブタイプに影響を及ぼす、破壊的な神経変性疾患である。ＡＬＳ症例の約１０％は家族性（ｆＡＬＳ）であり、今日までに２０超の家族性変異が同定されている。ＡＬＳの最も一般的な遺伝的原因は、Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子のＧＧＧＧＣＣ（Ｇ４Ｃ２）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）ヘキサヌクレオチド反復伸長（ＨＲＥ）で、家族性ＡＬＳの約４０％、散発性ＡＬＳの８％を占める。しかし、ＡＬＳ症例の９０％は散発性（ｓＡＬＳ）であり、根底にある原因遺伝子変異は知られていない。ＡＬＳの病因は異質であるにもかかわらず、ＴＡＲ ＤＮＡ結合タンパク質（ＴＤＰ－４３）の核からの排除ならびに細胞質への誤局在化および／または凝集は、末期の家族性および散発性疾患の顕著な病理学的特徴として浮上してきた（３６－３８）。
【0005】
Ｃ９ｏｒｆ７２を含むＡＬＳの遺伝的形態の研究は、根底にある疾患メカニズムおよび可能性のある治療戦略について新しい洞察を提供したが、これらの発見は、必ずしもｓＡＬＳに適用できない。ヒトのＡＬＳの異質性を忠実に再現する前臨床動物モデル系がないことは、ＡＬＳの病態生理の９０％を理解する上での大きな課題を強調している。しかし、患者由来の線維芽細胞および末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）へとリプログラミングし、神経細胞およびグリア細胞に分化させることで、ヒト疾患のモデル化が行われている（３９－４０）。Ｃ９ｏｒｆ７２ ｉＰＳＣ由来運動ニューロン（ｉＰＳＮ）は、死後のヒト神経系で見られる疾患の主要な病理学的特徴を再現することが研究によって示されている（４１－４２）。まとめると、ｉＰＳＮは、ＡＬＳおよび他の神経変性疾患の根底にあるメカニズムを研究するための有用かつ重要なプラットフォームを提供する。
【0006】
核膜孔複合体（ＮＰＣ）の組成の分子変化は、Ｃ９ｏｒｆ７２疾患における初期の重要な病理メカニズムとして同定されている（４３）。ＮＰＣは、最大３０の異なるＮｕｐの多重コピーからなり、骨格Ｎｕｐ（ヌクレオポリン）および可動性Ｎｕｐのいずれかに分類することができる。骨格Ｎｕｐは、ＮＰＣの８回対称の放射状構造を構築し、核膜に固定する。ＮＰＣの骨格は、中央輸送チャネルを満たし、高分子の核細胞質間交換を媒介するＦＧ－Ｎｕｐにアンカーポイントを提供する。いくつかのＮｕｐはまた、遺伝子の転写に影響を与える可能性がある（４４－４７）。細胞機能全体の維持におけるＮＰＣの重要な役割を考えると、特定のＮｕｐの変化は、ニューロンの生存率に影響を与え、その後、疾患病態を生じさせ得る。
【0007】
８つのＮｕｐのサブセットは、Ｃ９ｏｒｆ７２および単離された死後の核のＮＰＣおよび核質内で著しく減少している。さらに、定常状態のＮｕｐ ｍＲＮＡレベル、ならびにＮｕｐ ｍＲＮＡの安定性および翻訳中のポリリボソーム画分との会合は、Ｃ９ｏｒｆ７２ ｉＰＳＮにおいて変化していない（４３）。まとめると、これらのデータから、Ｎｕｐタンパク質の恒常性維持における初期の変化が、Ｃ９ｏｒｆ７２ ＡＬＳ／ＦＴＤの発病におけるＮｕｐおよび機能的輸送の減少の根底にあり得ることが示唆された。しかし、ニューロンＮＰＣの破壊の根底にある分子経路、およびこの病態生理が散発性疾患により広く当てはまるか否かは、依然として不明である。
【0008】
酵母を含むいくつかのモデル系における研究によって、核膜および核質内のＮｕｐおよびＮＰＣの恒常性維持に影響を与えることが可能な分子経路の存在が裏付けられている。ＬＥＭファミリー核内膜（ＩＮＭ）タンパク質によるエンドソーム選別輸送複合体（ＥＳＣＲＴ）機構の動員は、誤って組み立てられたＮｕｐのプロテアソーム分解（４８）および欠陥ＮＰＣのシーリング（４９－５０）に関連付けられてきた。非神経系の哺乳類細胞でも類似のメカニズムが働き、ＮｕｐｓとＮＰＣの除去が促進されていると考えられる（５１）。酵母の最近の研究では、個々のＮｕｐおよびＮＰＣもまたともに、オートファジーの標的になる可能性があることが明らかにされている（５２－５３）。重要なことに、ＣＨＭＰ７の核内動員および／または保持は、適切なＮｕｐおよびＮＰＣの恒常性維持における開始ステップであると考えられるが（４９、５０、５４）、ヒトのニューロンにおけるＣＨＭＰ７を媒介としたＮｕｐプロテオスタシス、および神経変性におけるＮｕｐレベルの変化については、ほとんど知られていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0009】
本発明者らは、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）由来の脊髄ニューロン（ｉＰＳＮ）および死後のヒト組織を用いて、核膜特異的ＥＳＣＲＴタンパク質ＣＨＭＰ７およびその下流エフェクターＡＡＡ－ＡＴＰａｓｅ ＶＰＳ４が、Ｃ９ｏｒｆ７２およびｓＡＬＳ核において増加していることを示す。Ｇ４Ｃ２反復ＲＮＡが主要なＮｕｐｓの減少を開始させることを示唆する本発明者らの以前の研究に一致して、Ｇ４Ｃ２反復ＲＮＡの過剰発現のみによって、ｉＰＳＮにおいてＣＨＭＰ７およびＶＰＳ４の核の増加がもたらされる。
【0010】
重要なことに、トリムアウェイ（２５）およびアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）を使用して、本発明者らは、ＣＨＭＰ７のノックダウンが、Ｃ９ｏｒｆ７２ ｉＰＳＮにおける核質およびＮＰＣからの特定Ｎｕｐの減少を緩和するという複数の証拠を提供する。その上、ＣＨＭＰ７ ＡＳＯは、スタスミン－２スプライシングの欠陥を緩和し、下流のニューロン毒性を緩和する。機構的に、ＣＨＭＰ７の核内動員の増加ではなく、核外輸送障害が、特定のＮｕｐｓおよびヒトニューロンの発現の減少につながる。さらに、ＣＨＭＰ７の核外輸送障害は、Ｇ４Ｃ２の媒介によって、ニューロン核内のＸＰＯ１複合体におけるＣＨＭＰ７の存在量が減少した結果であり得る。その上、ＣＨＭＰ７が媒介する特定のＮｕｐの減少は、スタスミン－２のスプライシングの変化およびＴＤＰ－４３の誤局在をもたらすことがわかった。まとめると、これらのデータから、ヒトのニューロンにおいて、病的なＧ４Ｃ２反復ＲＮＡのためにＥＳＣＲＴ－ＩＩＩ経路が異常に活性化することが、ＡＬＳにおけるＮｕｐの変化の実質的かつ早期の要因であることが示された。さらに、これらの知見は、家族性および散発性ＡＬＳ／ＦＴＤ、ならびにＮｕｐの減少およびＴＤＰ－４３病態を特徴とする関連神経変性疾患における治療標的としてのＣＨＭＰ７の可能性を強調する。
【課題を解決するための手段】
【0011】
したがって、一実施形態として本開示は、神経細胞または神経細胞の集団などの細胞または細胞の集団においてＣＨＭＰ７を低減または阻害する化合物をスクリーニングする方法を提供する。該方法は、細胞または細胞の集団（神経細胞または神経細胞の集団など）に少なくとも１つの化合物を投与することと、化合物が細胞または細胞の集団におけるＣＨＭＰ７発現を低減または阻害するかどうかを判定することとを含む。その後、ＣＨＭＰ７発現を低減または阻害する化合物が選択される。上記の方法に従ってスクリーニングし、その後選択することが可能な化合物は、小分子もしくはその薬学的に許容される塩、抗体（モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、完全ヒト抗体など）もしくはその抗原結合断片、オリゴヌクレオチド（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドもしくはその薬学的に許容される塩）、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ペプチド、ペプチドミメティック、またはそれらの任意の組合せのうちの１つまたは複数を含む可能性がある。
【0012】
別の実施形態において、本開示は、細胞または細胞の集団（神経細胞または神経細胞の集団など）においてＣＨＭＰ７発現を阻害する方法を提供する。該方法は、有効量のＣＨＭＰ７阻害剤を細胞に投与することを含む。本態様において、ＣＨＭＰ７阻害剤は、小分子もしくはその薬学的に許容される塩、抗体（モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、完全ヒト抗体など）もしくはその抗原結合断片、オリゴヌクレオチド（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドもしくはその薬学的に許容される塩）、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ペプチド、ペプチドミメティック、またはそれらの任意の組合せのうちの１つまたは複数とすることができる。さらなる態様においては、ＣＨＭＰ７阻害剤は、１つまたは複数のアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその薬学的に許容される塩である。
【0013】
さらに別の実施形態において、本開示は、その治療を必要とする被験体において１つまたは複数の神経変性疾患を治療する方法を提供する。該方法は、その治療を必要とする被験体に、有効量または治療上有効量の少なくとも１つのＣＨＭＰ７阻害剤を投与することを含む。本態様において、ＣＨＭＰ７阻害剤は、小分子もしくはその薬学的に許容される塩、抗体（モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、完全ヒト抗体など）もしくはその抗原結合断片、オリゴヌクレオチド（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドもしくはその薬学的に許容される塩）、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ペプチド、ペプチドミメティック、またはそれらの任意の組合せのうちの１つまたは複数とすることができる。さらに他の態様においては、ＣＨＭＰ７阻害剤は、１つまたは複数のアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその薬学的に許容される塩である。本方法の他のさらなる態様においては、処置される被験体は、ヒトである。さらに他の態様においては、ＣＨＭＰ７阻害剤は、約０．００１ｍｇ／ｋｇ～約１０００ｍｇ／ｋｇの量で被験体に投与される。さらなる態様においては、治療される神経変性疾患は、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、ハンチントン病、アルツハイマー病、パーキンソン病、レビー小体型認知症、多発性硬化症、または前頭側頭型変性症（ＦＴＤ）である。さらなる態様においては、神経変性疾患は、ＡＬＳまたはＦＴＤである。
【図面の簡単な説明】
【0014】
【図1】ＣＨＭＰ７およびＶＰＳ４の核発現が、Ｃ９ｏｒｆ７２ ｉＰＳＮおよび死後の核において増加することを示す図である。図１Ａは、コントロールおよびＣ９ｏｒｆ７２ ｉＰＳＮから単離した核におけるＣＨＭＰ７およびＶＰＳ４のＳＩＭイメージングからの最大強度投影を示す図である。遺伝子型を左側に、抗体および時点を上側に示す。図１ＢはＣＨＭＰ７スポットの定量化を、図１ＣはＶＰＳ４スポットの定量化を示す図である。ｎ＝８コントロールおよび８ Ｃ９ｏｒｆ７２ ｉＰＳＣ株（１つのアイソジェニックペアを含む）、１株あたり５０ＮｅｕＮ＋核／時点。統計的有意性の算出には、Ｔｕｋｅｙの多重比較検定つき二元配置分散分析を使用した。＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。図１Ｄは３２日目のコントロールおよびＣ９ｏｒｆ７２ ｉＰＳＮから単離した核におけるＣＨＭＰ７およびＶＰＳ４レベルのウェスタンブロットを示す図、図１Ｅはその定量化を示す図である。抗体を右側に、遺伝子型を下側に示す。ｎ＝４コントロールおよび４ Ｃ９ｏｒｆ７２ ｉＰＳＣ株。統計的有意性の算出にはＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定を使用した。＊ｐ＜０．０５。図１ＦはコントロールおよびＣ９ｏｒｆ７２の死後組織から単離した核におけるＣＨＭＰ７およびＶＰＳ４のＳＩＭイメージングからの最大強度投影を示す図である。遺伝子型を左側に、抗体およびＣＮＳ領域を上側に示す。図１ＧはＣＨＭＰ７スポットの定量化を、図１ＨはＶＰＳ４スポットの定量化を示す図である。ｎ＝３コントロールおよび３ Ｃ９ｏｒｆ７２症例、１症例あたり５０ＮｅｕＮ＋核／ＣＮＳ領域。統計的有意性の算出には、Ｔｕｋｅｙの多重比較検定つき二元配置分散分析を使用した。＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。スケールバー＝５μｍ。
【図2】ＣＨＭＰ７の核局在および発現が、死後のＣ９ｏｒｆ７２患者の運動皮質の薄切片において増加していたことを示す図である。図２Ａは、パラフィン包埋した死後の運動皮質および後頭部皮質におけるＣＨＭＰ７に対する免疫染色を示す図である。遺伝子型を左側に、脳領域および抗体を上側に示した。図２ＢはＣＨＭＰ７免疫染色の核／細胞質比の定量化を示す図である。ｎ＝７コントロールおよび７ Ｃ９ｏｒｆ７２症例、１症例および脳領域あたり少なくとも５０Ｍａｐ２＋細胞。統計的有意性の算出にはＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定を使用した。＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。スケールバー＝１０μｍ。
【図3】ＣＨＭＰ７のノックダウンが、Ｃ９ｏｒｆ７２ ｉＰＳＮにおける特定のＮｕｐの核発現を回復させることを示す。図３Ａは、コントロールおよびＣ９ｏｒｆ７２ ｉＰＳＮにおけるＴｒｉｍ２１ ＧＦＰの媒介によるＣＨＭＰ７の減少のウェスタンブロットを示す図、図３ＢおよびＣは、その定量化を示す図である。統計的有意性の算出にはＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定を使用した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。図３Ｄは、ＣＨＭＰ７のノックダウン後にコントロールおよびＣ９ｏｒｆ７２ ｉＰＳＮから単離した核のＳＩＭイメージングからの最大強度投影を示す図である。Ｔｒｉｍ２１ ＧＦＰ媒介ノックダウンに使用された抗体を左側に、遺伝子型および抗体を上側に示す。図３Ｅ～Ｊは、スポットおよび体積の定量化を示す図である。ｎ＝３コントロールおよび３ Ｃ９ｏｒｆ７２ ｉＰＳＣ株、１株あたり５０ＧＦＰ＋核／ノックダウン。統計的有意性の算出にはＴｕｋｅｙの多重比較検定つき二元配置分散分析を使用した。＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。スケールバー＝５μｍ。
【図4】ＣＨＭＰ７のＡＳＯ媒介ノックダウンが、Ｃ９ｏｒｆ７２ ＩＰＳＮにおいて、特定のＮｕｐの核発現を回復させ、グルタミン酸誘導興奮毒性を緩和することを示す図である。図４Ａは、５μＭスクランブルコントロールＡＳＯまたはＣＨＭＰ７ ＡＳＯ２に２週間曝露した後のコントロールおよびＣ９ｏｒｆ７２ ｉＰＳＮから単離した核のＳＩＭイメージングからの最大強度投影を示す図である。処理を左側に、遺伝子型および抗体を上側に示した。図４Ｂ～Ｇは、スポットおよび体積の定量化を示す図である。ｎ＝４コントロールおよび４ Ｃ９ｏｒｆ７２ ｉＰＳＣ株、１株あたり５０ＮｅｕＮ＋核／処理。統計的有意性の算出には、Ｔｕｋｅｙの多重比較検定つき二元配置分散分析を用いた。統計的有意性の算出にはＴｕｋｅｙの多重比較検定つき二元配置分散分析を使用した。＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。図４Ｈは、５μＭスクランブルコントロールＡＳＯまたはＣＨＭＰ７ ＡＳＯ２に２週間曝露した後のコントロールおよびＣ９ｏｒｆ７２ ｉＰＳＮにおける、グルタミン酸への曝露後のヨウ化プロピジウム（ＰＩ）取り込みによって測定したパーセント細胞死の定量化を示す図である。ｎ＝４コントロールおよび４ Ｃ９ｏｒｆ７２ ｉＰＳＣ株、ウェル当たり５フレーム。統計的有意性の算出にはＴｕｋｅｙの多重比較検定つき二元配置分散分析を使用した。＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。スケールバー＝５μｍ。
【図5】ＬＥＭＤ２のノックダウンが、Ｃ９ｏｒｆ７２ ｉＰＳＮにおける特定のＮｕｐの核発現を回復させないことを示す図である。図５ＡはコントロールおよびＣ９ｏｒｆ７２ ｉＰＳＮにおけるＴｒｉｍ２１ ＧＦＰの媒介によるＬＥＭＤ２の減少のウェスタンブロットを示す図、図５Ｂ～Ｃはその定量化を示す図である。統計的有意性の算出にはＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定を使用した。＊ｐ＜０．０５。図５Ｄは、ＬＥＭＤ２のノックダウン後のコントロールおよびＣ９ｏｒｆ７２ ｉＰＳＮから単離した核のＳＩＭイメージングからの最大強度投影を示す図である。Ｔｒｉｍ２１ ＧＦＰ媒介ノックダウンに使用された抗体を左側に、遺伝子型および抗体を上側に示した。図５Ｅ～Ｋは、スポットおよび体積の定量化を示す図である。ｎ＝３コントロールおよび３ Ｃ９ｏｒｆ７２ ｉＰＳＣ株、１株あたり５０ＧＦＰ＋核／ノックダウン。統計的有意性の算出にはＴｕｋｅｙの多重比較検定つき二元配置分散分析を使用した。＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。スケールバー＝５μｍ。
【図6】野生型ｉＰＳＮにおけるＣＨＭＰ７核外輸送の阻害が、Ｃ９ｏｒｆ７２に媒介されるＮｕｐの変化を再現することを示す。図６Ａは、レプトマイシンＢ処理後のコントロールｉＰＳＮから単離した核のＳＩＭイメージングからの最大強度投影を示す図である。処理を左側に、抗体を上側に示した。ＬＭＢ＝レプトマイシンＢ。図６Ｂは、スポットおよび体積の定量化を示す図である。ｎ＝３コントロールｉＰＳＣ株、１株あたり５０ＮｅｕＮ＋核／処理。統計的有意性を算出には、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定を使用した。＊ｐ＜０．０５、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。図６Ｃは、ＧＦＰタグ付きＣＨＭＰ７バリアントを過剰発現させたコントロールｉＰＳＮから単離した核のＳＩＭイメージングからの最大強度投影を示す図である。過剰発現を左側に、抗体を上側に示した。図６Ｄ～Ｉは、スポットおよび体積の定量化を示す図である。ｎ＝４コントロールｉＰＳＣ株、１株あたり５０ＧＦＰ＋核／過剰発現。統計的有意性の算出にはＴｕｋｅｙの多重比較検定つき一元配置分散分析を使用した。＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。スケールバー＝５μｍ。
【図7】Ｇ４Ｃ２反復ＲＮＡが、ＸＰＯ１複合体中のＣＨＭＰ７の存在量を減少させることを示す図である。図７Ａは、ＸＰＯ１免疫沈降後のウェスタンブロットを示す図である。遺伝子型および処理を上側に、免疫沈降用の抗体を下側に、ウェスタンブロット用の抗体を右側に示した。図７ＢはＣＨＭＰ７の、図７ＣはＮＸＦ３の、図７ＤはＨｕＲ、図７ＥはＤＤＸ３Ｘの、図７ＦはＲａｎＢＰ１の定量化を示す図である。ＸＰＯ１ ＩＰにおける濃縮は、インプットに対して正規化され、ＸＰＯ１濃縮度に対して相対化されている。ｎ＝４コントロールおよび４ Ｃ９ｏｒｆ７２ ｉＰＳＣ株。統計的有意性の算出にはＴｕｋｅｙの多重比較検定つき一元配置分散分析を使用した。＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。図７ＧはＸＰＯ１免疫沈降後の示されたＲＮＡについてのｑＲＴ－ＰＣＲを示す図である。ｎ＝４コントロールおよび４ Ｃ９ｏｒｆ７２ ｉＰＳＣ株。
【図8】ｉＰＳＮにおけるＧ４Ｃ２反復ＲＮＡ発現の結果として、ＣＨＭＰ７およびＶＰＳ４の核発現が増加することを示す図である。図８Ａは、Ｇ４Ｃ２反復ＲＮＡ発現のみを過剰発現させたコントロールｉＰＳＮから単離した核におけるＣＨＭＰ７およびＶＰＳ４のＳＩＭイメージングからの最大強度投影を示す図である。抗体を左側に、過剰発現を上側に示した。図８ＢはＣＨＭＰ７スポットの定量化を、図８ＣはＶＰＳ４スポットの定量化を、図８ＤはＣＨＭＰ７スポットのヒストグラム分布を、図８ＥはＶＰＳ４スポットのヒストグラム分布を示す図である。ｎ＝４コントロールｉＰＳＣ株、１株あたり１００ＮｅｕＮ＋核／過剰発現。統計的有意性の算出にはＴｕｋｅｙの多重比較検定つき一元配置分散分析を使用した。＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。スケールバー＝５μｍ。
【図9】ドミナントネガティブＶＰＳ４が核内ＰＯＭ１２１発現の変化を部分的に緩和することを示す図である。図９Ａは、ＧＦＰタグ付きＶＰＳ４バリアントを過剰発現させたコントロールおよびＣ９ｏｒｆ７２ ｉＰＳＮから単離した核におけるＣＨＭＰ７、ＶＰＳ４およびＰＯＭ１２１のＳＩＭイメージングからの最大強度投影を示す図である。過剰発現を左側に、遺伝子型および抗体を上側に示した。図９ＢはＣＨＭＰ７スポットの、図９ＣはＶＰＳ４スポットの、図９ＤはＰＯＭ１２１スポットの定量化を示す図である。ｎ＝４コントロールおよび４ Ｃ９ｏｒｆ７２ ｉＰＳＣ株、１株あたり５０ＧＦＰ＋核／過剰発現。統計的有意性の算出にはＴｕｋｅｙの多重比較検定つき二元配置分散分析を使用した。＊ｐ＜０．０５、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。スケールバー＝５μｍ。
【図10】ＣＨＭＰ７ ＡＳＯが用量依存的にｉＰＳＮにおけるＣＨＭＰ７タンパク質を減少させることを示す図である。図１０ＡはスクランブルコントロールまたはＣＨＭＰ７標的化ＡＳＯに２週間曝露した後のコントロールｉＰＳＮおよびＣ９ｏｒｆ７２ ｉＰＳＮにおけるＣＨＭＰ７タンパク質についてのウェスタンブロットを、図１０ＢはスクランブルコントロールまたはＣＨＭＰ７標的化ＡＳＯに２週間曝露した後のコントロールｉＰＳＮにおけるＣＨＭＰ７タンパク質についての定量化を、図１０ＣはスクランブルコントロールまたはＣＨＭＰ７標的化ＡＳＯに２週間曝露した後のＣ９ｏｒｆ７２ ｉＰＳＮにおけるＣＨＭＰ７タンパク質についての定量化を示す図である。遺伝子型を上側に、濃度およびＡＳＯを下側に示した。ｎ＝４コントロールおよび４ Ｃ９ｏｒｆ７２ ＩＰＳＣ株。統計的有意性の算出にはＴｕｋｅｙの多重比較検定つき二元配置分散分析を使用した。＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。
【図11】野生型ｉＰＳＮにおけるＸＰＯ１のＴｒｉｍ２１媒介ノックダウンが、Ｃ９ｏｒｆ７２に媒介されるＣＨＭＰ７、ＶＰＳ４、および特定のＮｕｐの核発現の変化を再現することを示す図である。図１１Ａは野生型ｉＰＳＮにおけるＴｒｉｍ２１ ＧＦＰの媒介によるＸＰＯ１の減少のウェスタンブロットを、図１１Ｂはその定量化を示す図である。ｎ＝３コントロールｉＰＳＣ株。統計的有意性の算出にはＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定を使用した。＊ｐ＜０．０５。図１１Ｃは、ＸＰＯ１のＴｒｉｍ２１ ＧＦＰ媒介ノックダウン後のコントロールｉＰＳＮから単離した核のＳＩＭイメージングからの最大強度投影を示す図である。ノックダウン用の抗体を左側に、抗体を上側に示した。図１１Ｄは、スポットおよび体積の定量化を示す図である。ｎ＝３コントロールｉＰＳＣ株、１株あたり５０ＧＦＰ＋核／ノックダウン。統計的有意性の算出にはＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定を使用した。＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。スケールバー＝５μｍ。
【図12】レプトマイシンＢ処理がＣ９ｏｒｆ７２ ｉＰＳＮの核にＧ４Ｃ２反復ＲＮＡを保持することを示す図である。図１２Ａは、Ｃ９ｏｒｆ７２ ｉＰＳＮの核／細胞質分画後のウェスタンブロットを示す図である。分画および処理を下側に、抗体を右側に示した。Ｉｎ＝インプット、Ｎｕｃ＝核、Ｃｙｔｏ＝細胞質、ＬＭＢ＝レプトマイシンＢ。図１２ＢはレプトマイシンＢ処理後の核および細胞質画分におけるＲａｎＢＰ１タンパク質濃縮の定量化を、図１２ＣはレプトマイシンＢ処理後の核および細胞質画分におけるＤＤＸ３Ｘタンパク質濃縮の定量化を示す図である。ｎ＝３ Ｃ９ｏｒｆ７２ ｉＰＳＣ株。統計的有意性の算出にはＴｕｋｅｙの多重比較検定つき二元配置分散分析を使用した。＊ｐ＜０．０５。図１２Ｄは核／細胞質分画後のＧ４Ｃ２反復ＲＮＡの、図１２Ｅは核／細胞質分画後のＧ２Ｃ４反復ＲＮＡの、図１２Ｆは核／細胞質分画後のＣ９ｏｒｆ７２ ＲＮＡのｑＲＴ－ＰＣＲを示す図である。ｎ＝３ Ｃ９ｏｒｆ７２ ｉＰＳＣ株。
【図13】Ｇ４Ｃ２反復ＲＮＡがＮＸＦ１との複合体中に存在しないことを示す図である。図１３ＡはＮＸＦ１免疫沈降後のウェスタンブロットを示す図である。免疫沈降用の抗体を下側に、ウェスタンブロット用の抗体を右側に示した。Ｉｎ＝インプット。図１３ＢはＮＸＦ１免疫沈降後の示されたＲＮＡについてのｑＲＴ－ＰＣＲを示す図である。ｎ＝４コントロールおよび４ Ｃ９ｏｒｆ７２ ｉＰＳＣ株。
【図14】Ｃ９ｏｒｆ７２ ＡＬＳ／ＦＴＤにおけるＣＨＭＰ７に媒介されるＮｕｐの変化のモデルを示す図である。伸長したＣ９ｏｒｆ７２反復ＲＮＡは、ＸＰＯ１とＣＨＭＰ７との間の会合を妨害するが、他のＮＥＳを有する積荷タンパク質は妨害せず、核ＣＨＭＰ７レベルの上昇につながる。ＣＨＭＰ７はＶＰＳ４を動員し、その後、Ｃ９ｏｒｆ７２ニューロン核およびＮＰＣにおけるヌクレオポリンレベルの低下につながる。
【図15】特定のヌクレオポリンの減少が、Ｃ９ｏｒｆ７２およびｓＡＬＳ ｉＰＳＮ核におけるＣＨＭＰ７の核発現の増加と相関することを示す図である。図１５ａは分化３２日目にコントロールおよびｓＡＬＳ ｉＰＳＮから単離した核におけるＮｕｐのＳＩＭイメージングからの最大強度投影を示す図である。遺伝子型を左側に、抗体を上側に示した。図１５ｂは、Ｎｕｐスポットの定量化を示す図である。ｎ＝１０コントロールおよび１７ ｓＡＬＳ ｉＰＳＣ株、１株あたり５０ＮｅｕＮ＋核。統計的有意性の算出にはＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定を使用した。＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。図１５ｃは、コントロール、Ｃ９ｏｒｆ７２、およびｓＡＬＳ ｉＰＳＮから単離した核におけるＣＨＭＰ７のＳＩＭイメージングからの最大強度投影を示す図である。時点を左側に、遺伝子型を上側に示した。図１５ｄは、ＣＨＭＰ７スポットの定量化を示す図である。ｎ＝１０コントロール、８ Ｃ９ｏｒｆ７２、および１７ ｓＡＬＳ ｉＰＳＣ株、１株あたり５０ＮｅｕＮ＋核。統計的有意性の算出にはＴｕｋｅｙの多重比較検定つき一元配置分散分析を使用した。＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。図１５ｅは３２日目のコントロール、Ｃ９ｏｒｆ７２、およびｓＡＬＳ ｉＰＳＮから単離した核におけるＣＨＭＰ７レベルのウェスタンブロットを、図１５ｆ～ｇは、それらの定量化を示す図である。抗体を右側に、遺伝子型を下側に示した。注：２つの独立したＣＨＭＰ７抗体を使用した。ラミンＢ１はローディングコントロールとして使用した。ｎ＝８コントロール、８ Ｃ９ｏｒｆ７２，および８ ｓＡＬＳ ｉＰＳＣ株。統計的有意性の算出にはＴｕｋｅｙの多重比較検定つき一元配置分散分析を使用した。＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。スケールバー＝５μｍ。
【図16】ＣＨＭＰ７の核局在が、Ｃ９ｏｒｆ７２およびｓＡＬＳ ｉＰＳＮならびに死後患者の運動皮質において増加することを示す図である。図１６ａは、分化２５日目のｉＰＳＮにおけるＣＨＭＰ７に対する免疫染色および共焦点イメージングを示す図である。遺伝子型を左側に、抗体を上側に示した。図１６ｂはＣＨＭＰ７免疫染色の核／細胞質比の定量化を、図１６ｃはＣＨＭＰ７免疫染色の核強度の定量化を示す図である。ｎ＝７コントロール、５Ｃ９ｏｒｆ７２、および７ｓＡＬＳ ｉＰＳＣ株、１株あたり少なくとも５０Ｍａｐ２＋ニューロン。統計的有意性の算出にはＴｕｋｅｙの多重比較検定つき一元配置分散分析を使用した。＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。図１６ｄは、パラフィン包埋した死後の運動皮質におけるＣＨＭＰ７に対する免疫染色を示す図である。遺伝子型を左側に、抗体を上側に示した。矢印は、細胞質ＣＨＭＰ７免疫染色を示す。アスタリスクは核ＣＨＭＰ７免疫染色を示す。図１６ｅはＣＨＭＰ７免疫染色の核／細胞質比の定量化を、図１６ｆは核強度の定量化を示す図である。ｎ＝１３コントロール、１７ Ｃ９ｏｒｆ７２、および３０ ｓＡＬＳ症例、1症例あたり少なくとも１００Ｍａｐ２＋細胞。統計的有意性の算出にはＴｕｋｅｙの多重比較検定つき一元配置分散分析を使用した。＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。スケールバー＝１０μｍ。
【図17】野生型ｉＰＳＮにおけるＣＨＭＰ７核外輸送の阻害が、疾患に関連するＮｕｐ変化を再現することを示す図である。図１７ａは、１週間のＧＦＰタグ付きＣＨＭＰ７バリアントの過剰発現後に、分化２５日目にコントロールｉＰＳＮから単離した核のＳＩＭイメージングからの最大強度投影を示す図である。過剰発現を左側に、抗体を上側に示した。図１７ｂ～ｆは、ＣＨＭＰ７およびＮｕｐのスポットおよび体積の定量化を示す図である。ｎ＝４コントロールｉＰＳＣ株、１株あたり５０ＧＦＰ＋核／過剰発現。統計的有意性の算出にはＴｕｋｅｙの多重比較検定つき一元配置分散分析を使用した。＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。スケールバー＝５μｍ。
【図18】ＣＨＭＰ７核外輸送の阻害がＴＤＰ－４３の局在化および機能に影響を与えることを示す図である。図１８ａは、ＧＦＰタグ付きＣＨＭＰ７バリアントの２週間の過剰発現後の、分化３２日目のコントロールｉＰＳＮにおけるＴＤＰ－４３に対する免疫染色および共焦点イメージングを示す図である。過剰発現を左側に、抗体を上側に示した。図１８ｂはＴＤＰ－４３免疫染色の核／細胞質比の定量化を、図１８ｃはＴＤＰ－４３免疫染色の核強度の定量化を示す図である。ｎ＝３コントロールｉＰＳＣ株、１株あたり少なくとも５０Ｍａｐ２＋およびＧＦＰ＋ニューロン／過剰発現。統計的有意性の算出にはＴｕｋｅｙの多重比較検定つき一元配置分散分析を使用した。＊ｐ＜０．０５、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。図１８ｄはＧＦＰタグ付きＣＨＭＰ７バリアントの２週間の過剰発現後の、分化３２日目のコントロールｉＰＳＮにおける、スタスミン－２ ｍＲＮＡの全長のｑＲＴ－ＰＣＲを、図１８ｅはＧＦＰタグ付きＣＨＭＰ７バリアントの２週間の過剰発現後の、分化３２日目のコントロールｉＰＳＮにおける、切断型スタスミン－２ ｍＲＮＡのｑＲＴ－ＰＣＲを示す図である。ＧＡＰＤＨを正規化に使用した。統計的有意性の算出には、統計的有意性の算出にはＴｕｋｅｙの多重比較検定つき一元配置分散分析を使用した。＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１。スケールバー＝１０μｍ。
【図19】ＣＨＭＰ７およびＴＤＰ－４３の共病態が、死後患者の運動皮質におけるニューロンのサブセットに存在することを示す図である。図１９ａは、パラフィン包埋した死後運動皮質におけるＴＤＰ－４３およびＣＨＭＰ７に対する免疫染色を示す図である。遺伝子型を左側に、抗体を上側に示した。矢印は、細胞質ＣＨＭＰ７免疫染色を示す。アスタリスクは、核ＣＨＭＰ７免疫染色を示す。図１９ｂはコントロールの運動皮質におけるＴＤＰ－４３の核／細胞質比対ＣＨＭＰ７の細胞質／核比の定量化を、図１９ｃはＣ９ｏｒｆ７２の運動皮質におけるＴＤＰ－４３の核／細胞質比対ＣＨＭＰ７の細胞質／核比の定量化を、図１９ｄはｓＡＬＳの運動皮質におけるＴＤＰ－４３の核／細胞質比対ＣＨＭＰ７の細胞質／核比の定量化を示す図である。分析した各Ｍａｐ２＋ニューロンの個々のデータポイントを示す。ｎ＝１０コントロール、１０ Ｃ９ｏｒｆ７２、および２０ ｓＡＬＳ症例。注：赤色は高核ＣＨＭＰ７／低核ＴＤＰ－４３、黄色は高核ＣＨＭＰ７／高核ＴＤＰ－４３、青色は低核ＣＨＭＰ７／低核ＴＤＰ－４３、緑色は低核ＣＨＭＰ７／高核ＴＤＰ－４３を示す。スケールバー＝１０μｍ。
【図20】ＣＨＭＰ７のＡＳＯ媒介ノックダウンが、特定のＮｕｐの核発現を回復させ、Ｃ９ｏｒｆ７２およびｓＡＬＳ ｉＰＳＮにおけるＴＤＰ－４３媒介スプライシングの欠陥およびグルタミン酸誘導興奮毒性を緩和させることを示す図である。図２０ａは、５μＭスクランブルコントロールＡＳＯまたはＣＨＭＰ７ ＡＳＯ２に２週間曝露した後の、分化４０日目のコントロール、Ｃ９ｏｒｆ７２、およびｓＡＬＳ ｉＰＳＮから単離した核のＳＩＭイメージングからの最大強度投影を示す図である。処理を左側に、遺伝子型および抗体を上側に示した。図２０ｂ～ｆはスポットおよび体積の定量化を示す図である。ｎ＝６コントロール、４ Ｃ９ｏｒｆ７２、８ ｓＡＬＳ ｉＰＳＣ株、１株あたり５０ＮｅｕＮ＋核／処理。統計的有意性の算出には、統計的有意性の算出にはＴｕｋｅｙの多重比較検定つき二元配置分散分析を使用した。＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。図２０ｇは、５μＭスクランブルコントロールＡＳＯまたはＣＨＭＰ７ ＡＳＯ２に３週間曝露した後の、分化４６日目のコントロール、Ｃ９ｏｒｆ７２およびｓＡＬＳ ｉＰＳＮにおけるスタスミン－２ ｍＲＮＡの全長のｑＲＴ－ＰＣＲを、図２０ｈは、５μＭスクランブルコントロールＡＳＯまたはＣＨＭＰ７ ＡＳＯ２に３週間曝露した後の、分化４６日目のコントロール、Ｃ９ｏｒｆ７２およびｓＡＬＳ ｉＰＳＮにおける切断型スタスミン－２ ｍＲＮＡのｑＲＴ－ＰＣＲを示す図である。ＧＡＰＤＨを正規化に使用した。ｎ＝８コントロール、６ Ｃ９ｏｒｆ７２、および６ ｓＡＬＳ ｉＰＳＣ株。統計的有意性の算出にはＴｕｋｅｙの多重比較検定つき一元配置分散分析を使用した。＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。図２０ｉは、５μＭスクランブルコントロールＡＳＯまたはＣＨＭＰ７ ＡＳＯ２に２週間曝露した後のコントロールおよびＣ９ｏｒｆ７２ ｉＰＳＮにおける、グルタミン酸への曝露後のヨウ化プロピジウム（ＰＩ）取り込みによって測定したパーセント細胞死の定量化を示す図である。ｎ＝７コントロール、５ Ｃ９ｏｒｆ７２ および６ ｓＡＬＳ ｉＰＳＣ株、１ウェルあたり５フレーム。統計的有意性の算出にはＴｕｋｅｙの多重比較検定つき二元配置分散分析を使用した。＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。スケールバー＝５μｍ。
【図21】ＣＨＭＰ７がＣ９ｏｒｆ７２およびｓＡＬＳ ｉＰＳＮの核内で増加することを示す図である。図２１ａ～ｂは、分化３２日目にコントロールおよびｓＡＬＳ ｉＰＳＮから単離した核におけるＣＨＭＰ７のＳＩＭイメージングからの最大強度投影を示す図である。遺伝子型を左側に、抗体を上側に示した。注：２つの独立したＣＨＭＰ７抗体を使用した。シングルＺおよび挿入画像はＣＨＭＰ７が主に核内に存在するが、ｉＰＳＮにおいてはＮＰＣと近接して会合する可能性があることを示す（Ｎｕｐ６２の染色によって評価）。スケールバー＝５μｍ。
【図22】ＰＯＭ１２１のノックダウンが核ＣＨＭＰ７の増加をもたらさないことを示す図である。図２２ａは、４８時間のＴｒｉｍ２１ ＧＦＰ媒介ＰＯＭ１２１ノックダウン後のコントロールｉＰＳＮから単離した核における、ＣＨＭＰ７およびＰＯＭ１２１のＳＩＭイメージングからの最大強度投影を示す図である。ノックダウン用の抗体を左側に、免疫染色用の抗体を上側に示した。図２２ｂはＰＯＭ１２１およびＣＨＭＰ７スポットの定量化を示す図である。ｎ＝３コントロールｉＰＳＣ株、１株あたり５０ＧＦＰ＋核。統計的有意性の算出にはＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定を使用した。＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。
【図23】ＬＥＭＤ２のノックダウンおよび過剰発現が、ｉＰＳＮにおけるＣＨＭＰ７またはＰＯＭ１２１の核発現に影響を与えないことを示す図である。図２３ａはコントロールｉＰＳＮにおける、Ｔｒｉｍ２１ ＧＦＰに媒介されるＬＥＭＤ２の減少のウェスタンブロットを、図２３ｂはその定量化を示す図である。ｎ＝３コントロールｉＰＳＣ株。統計的有意性の算出にはＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定を使用した。＊ｐ＜０．０５。図２３ｃは、ＬＥＭＤ２のＴｒｉｍ２１ ＧＦＰ媒介ノックダウン後のコントロールｉＰＳＮから単離した核のＳＩＭイメージングからの最大強度投影を示す図である。ノックダウンに使用した抗体を左側に、免疫染色に使用した抗体を上側に示した。図２３ｄ～ｇは、ＬＥＭＤ２、ＣＨＭＰ７、ＰＯＭ１２１、および４１４スポットの定量化を示す図である。ｎ＝３コントロールｉＰＳＣ株、１株あたり５０ＧＦＰ＋核／ノックダウン。統計的有意性の算出にはＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定を使用した。＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。図２３ｆは、ＧＦＰタグ付きＬＥＭＤ２の２週間の過剰発現後のコントロールｉＰＳＮから単離した核のＳＩＭイメージングからの最大強度投影を示す図である。過剰発現を左側に、免疫染色用の抗体を上側に示した。図２３ｉ～ｌは、ＬＥＭＤ２、ＣＨＭＰ７、ＰＯＭ１２１、および４１４スポットの定量化を示す図である。ｎ＝３コントロールｉＰＳＣ株、１株あたり５０ＧＦＰ＋核／過剰発現。統計的有意性の算出にはＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定を使用した。＊ｐ＜０．０５、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。スケールバー＝５μｍ。
【図24】ＣＨＭＰ７ ＡＳＯが用量依存的にｉＰＳＮにおけるＣＨＭＰ７タンパク質を減少させることを示す図である。図２４ａはスクランブルコントロールまたはＣＨＭＰ７標的化ＡＳＯに２週間曝露した後のコントロールｉＰＳＮ、Ｃ９ｏｒｆ７２ ｉＰＳＮおよびｓＡＬＳ ｉＰＳＮにおけるＣＨＭＰ７タンパク質についてのウェスタンブロットを、図２４ｂはスクランブルコントロールまたはＣＨＭＰ７標的化ＡＳＯに２週間曝露した後のコントロールｉＰＳＮにおけるＣＨＭＰ７タンパク質についての定量化を、図２４ｃはスクランブルコントロールまたはＣＨＭＰ７標的化ＡＳＯに２週間曝露した後のＣ９ｏｒｆ７２ ｉＰＳＮにおけるＣＨＭＰ７タンパク質についての定量化を、図２４ｄはスクランブルコントロールまたはＣＨＭＰ７標的化ＡＳＯに２週間曝露した後のｓＡＬＳ ｉＰＳＮにおけるＣＨＭＰ７タンパク質についての定量化を示す図である。遺伝子型を上側に、濃度およびＡＳＯを下側に示した。ｎ＝６コントロール、４ Ｃ９ｏｒｆ７２、および６ ｓＡＬＳ ｉＰＳＣ株。統計的有意性の算出にはＴｕｋｅｙの多重比較検定つき二元配置分散分析を使用した。＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。
【図25】ＣＨＭＰ７のＡＳＯ媒介ノックダウンが、Ｃ９ｏｒｆ７２およびｓＡＬＳ ｉＰＳＮにおける核へのＲａｎ ＧＴＰａｓｅの局在を回復させることを示す図である。図２５ａは、５μＭスクランブルコントロールまたはＣＨＭＰ７標的ＡＳＯに３週間曝露した後の分化４６日目のコントロール、Ｃ９ｏｒｆ７２、およびｓＡＬＳ ｉＰＳＮにおけるＲａｎ ＧＴＰａｓｅに対する免疫染色および共焦点イメージングを示す図である。処理を左側に、遺伝子型および抗体を上側に示した。図２５ｂは、Ｒａｎ ＧＴＰａｓｅ免疫染色の核／細胞質比の定量化を示す図である。ｎ＝４コントロール、４ Ｃ９ｏｒｆ７２、および６ ｓＡＬＳ ｉＰＳＣ株、１株あたり少なくとも５０Ｍａｐ２＋ニューロン／処理。統計的有意性の算出にはＴｕｋｅｙの多重比較検定つき二元配置分散分析を使用した。＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。スケールバー＝１０μｍ。
【図26】ＣＨＭＰ７のＡＳＯ媒介ノックダウンが、ｓＡＬＳ ｉＰＳＮにおいてＴＤＰ－４３の核への局在を回復させることを示す図である。図２６ａは、５μＭスクランブルコントロールまたはＣＨＭＰ７標的ＡＳＯに３週間曝露した後の分化４６日目のコントロール、Ｃ９ｏｒｆ７２、およびｓＡＬＳ ｉＰＳＮにおけるＴＤＰ－４３に対する免疫染色および共焦点イメージングを示す図である。処理を左側に、遺伝子型および抗体を上側に示した。図２６ｂはＴＤＰ－４３免疫染色の核／細胞質比の定量化を示す図である。ｎ＝４コントロール、４ Ｃ９ｏｒｆ７２、および６ ｓＡＬＳ ｉＰＳＣ株、１株あたり少なくとも５０Ｍａｐ２＋ニューロン／処理。統計的有意性の算出にはＴｕｋｅｙの多重比較検定つき二元配置分散分析を使用した。＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。スケールバー＝１０μｍ。
【図27】ＣＨＭＰ４ＢおよびＣＨＭＰ２Ｂではなく、ＶＰＳ４がＣ９ｏｒｆ７２およびｓＡＬＳ ｉＰＳＮの核で増加することを示す図である。図２７ａは、分化１８日目のコントロール、Ｃ９ｏｒｆ７２、およびｓＡＬＳ ｉＰＳＮから単離した核におけるＣＨＭＰ４Ｂ、ＣＨＭＰ２Ｂ、およびＶＰＳ４のＳＩＭイメージングからの最大強度投影を、図２７ｂは、分化３２日目のコントロール、Ｃ９ｏｒｆ７２、およびｓＡＬＳ ｉＰＳＮから単離した核におけるＣＨＭＰ４Ｂ、ＣＨＭＰ２Ｂ、およびＶＰＳ４のＳＩＭイメージングからの最大強度投影を示す図である。遺伝子型を左側に、時点および抗体を上側に示した。図２７ｃは、ＣＨＭＰ４Ｂのスポットの定量化を、図２７ｄは、ＣＨＭＰ２Ｂのスポットの定量化を、図２７ｅは、ＶＰＳ４のスポットの定量化を示す図である。ｎ＝１０コントロール、１０ Ｃ９ｏｒｆ７２、および１０ｓＡＬＳ ｉＰＳＣ株、１株あたり５０ＮｅｕＮ＋核／時点。統計的有意性の算出にはＴｕｋｅｙの多重比較検定つき一元配置分散分析を使用した。＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。スケールバー＝５μｍ。
【図28】ＣＨＭＰ４ＢおよびＣＨＭＰ２Ｂではなく、ＶＰＳ４がＣ９ｏｒｆ７２およびｓＡＬＳの死後の運動野皮質において増加していることを示す。図２８ａは、死後のコントロール、Ｃ９ｏｒｆ７２、およびｓＡＬＳの運動皮質組織から単離した核におけるＣＨＭＰ４Ｂ、ＣＨＭＰ２ＢおよびＶＰＳ４のＳＩＭイメージングからの最大強度投影を、図２８ｂは死後のコントロール、Ｃ９ｏｒｆ７２、およびｓＡＬＳの後頭部皮質組織から単離した核におけるＣＨＭＰ４Ｂ、ＣＨＭＰ２ＢおよびＶＰＳ４のＳＩＭイメージングからの最大強度投影を示す図である。遺伝子型を左側に、脳領域および抗体を上側に示した。図２８ｃはＣＨＭＰ４Ｂのスポットの定量化を、図２８ｄはＣＨＭＰ２Ｂのスポットの定量化を、図２８ｅはＶＰＳ４のスポットの定量化を示す。ｎ＝６コントロール、６ Ｃ９ｏｒｆ７２、および９ ｓＡＬＳ症例、１症例あたり５０ＮｅｕＮ＋核／脳領域。統計的有意性の算出にはＴｕｋｅｙの多重比較検定つき一元配置分散分析を使用した。＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。スケールバー＝５μｍ。
【図29】Ｃ９ｏｒｆ７２およびｓＡＬＳ ｉＰＳＮにおいて、ＶＰＳ４の核発現がＣＨＭＰ７に依存することを示す図である。図２９ａは、５μＭスクランブルコントロールまたはＣＨＭＰ７ ＡＳＯに２週間曝露した後のコントロール、Ｃ９ｏｒｆ７２およびｓＡＬＳ ｉＰＳＮから単離した核におけるＣＨＭＰ４ＢのＳＩＭイメージングからの最大強度投影を、図２９ｃは、５μＭスクランブルコントロールまたはＣＨＭＰ７ ＡＳＯに２週間曝露した後のコントロール、Ｃ９ｏｒｆ７２およびｓＡＬＳ ｉＰＳＮから単離した核におけるＣＨＭＰ２ＢのＳＩＭイメージングからの最大強度投影を、図２９ｅは、５μＭスクランブルコントロールまたはＣＨＭＰ７ ＡＳＯに２週間曝露した後のコントロール、Ｃ９ｏｒｆ７２およびｓＡＬＳ ｉＰＳＮから単離した核におけるＶＰＳ４のＳＩＭイメージングからの最大強度投影を示す図である。処理を左側に、遺伝子型および抗体を上側に示した。図２９ｂはＣＨＭＰ４Ｂのスポットの定量化を、図２９ｅはＣＨＭＰ２Ｂのスポットの定量化を、図２９ｆはＶＰＳ４のスポットの定量化を示す図である。ｎ＝５コントロール、５ Ｃ９ｏｒｆ７２および５ ｓＡＬＳ ｉＰＳＣ株、１株あたり５０ＮｅｕＮ＋核／処理。統計的有意性の算出にはＴｕｋｅｙの多重比較検定つき二元配置分散分析を使用した。＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。スケールバー＝５μｍ。
【図30】ドミナントネガティブＶＰＳ４の過剰発現が、Ｃ９ｏｒｆ７２およびｓＡＬＳ ｉＰＳＮにおいて核ＰＯＭ１２１スポットを増加させるが、その分布を回復させないことを示す図である。図３０ａは、ＧＦＰまたはＧＦＰタグ付きＶＰＳ４バリアントを過剰発現させたコントロール、Ｃ９ｏｒｆ７２、およびｓＡＬＳ ｉＰＳＮから単離した核におけるＶＰＳ４のＳＩＭイメージングからの最大強度投影を、図３０ｃは、ＧＦＰまたはＧＦＰタグ付きＶＰＳ４バリアントを過剰発現させたコントロール、Ｃ９ｏｒｆ７２、およびｓＡＬＳ ｉＰＳＮから単離した核におけるＰＯＭ１２１のＳＩＭイメージングからの最大強度投影を示す図である。過剰発現を左側に、遺伝子型および抗体を上側に示した。矢印（図３０ｃ）は、ＡＬＳ核におけるドミナントネガティブＶＰＳ４（ＶＰＳ４Ｅ２２８Ｑ）の過剰発現後に観察されるＰＯＭ１２１の不均一な分布を示す。図３０ｂはＶＰＳ４スポットの定量化を、図３０ｄはＰＯＭ１２１スポットの定量化を示す図である。ｎ＝４コントロール、４ Ｃ９ｏｒｆ７２、および４ ｓＡＬＳ ｉＰＳＣ株、１株あたり５０ＧＦＰ＋核／過剰発現。統計的有意性の算出にはＴｕｋｅｙの多重比較検定つき二元配置分散分析を使用した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。スケールバー＝５μｍ。
【図31】ＶＰＳ４の発現が、Ｃ９ｏｒｆ７２およびｓＡＬＳ ｉＰＳＮ核において増加するが、全ｉＰＳＮ溶解物においては増加しないことを示す図である。図３１ａはコントロール、Ｃ９ｏｒｆ７２およびｓＡＬＳ ｉＰＳＮ溶解物におけるＣＨＭＰ４Ｂ、ＣＨＭＰ２Ｂ、およびＶＰＳ４の発現のウェスタンブロットを、図３１ｂはコントロール、Ｃ９ｏｒｆ７２およびｓＡＬＳ ｉＰＳＮ溶解物におけるＣＨＭＰ４Ｂの発現の定量化を、図３１ｃはコントロール、Ｃ９ｏｒｆ７２およびｓＡＬＳ ｉＰＳＮ溶解物におけるＣＨＭＰ２Ｂの発現の定量化を、図３１ｄはコントロール、Ｃ９ｏｒｆ７２およびｓＡＬＳ ｉＰＳＮ溶解物におけるＶＰＳ４の発現の定量化を示す図である。抗体を右側に、遺伝子型を下側に示した。ＧＡＰＤＨをローディングコントロールとして使用した。ｎ＝４コントロール、４ Ｃ９ｏｒｆ７２、４ ｓＡＬＳ ｉＰＳＣ株。統計的有意性の算出にはＴｕｋｅｙの多重比較検定つき一元配置分散分析を使用した。図３１ｅはコントロール、Ｃ９ｏｒｆ７２およびｓＡＬＳ ｉＰＳＮから単離した核におけるＣＨＭＰ４Ｂ、ＣＨＭＰ２Ｂ、およびＶＰＳ４の発現のウェスタンブロットを、図３１ｆはコントロール、Ｃ９ｏｒｆ７２およびｓＡＬＳ ｉＰＳＮから単離した核におけるＣＨＭＰ４Ｂの発現の定量化を、図３１ｇはコントロール、Ｃ９ｏｒｆ７２およびｓＡＬＳ ｉＰＳＮから単離した核におけるＣＨＭＰ２Ｂの発現の定量化を、図３１ｈはコントロール、Ｃ９ｏｒｆ７２およびｓＡＬＳ ｉＰＳＮから単離した核におけるＶＰＳ４の発現の定量化を示す図である。抗体を右側に、遺伝子型を下側に示した。ラミンＢ１をローディングコントロールとして使用した。ｎ＝４コントロール、４ Ｃ９ｏｒｆ７２、および４ ｓＡＬＳ ｉＰＳＣ株。統計的有意性の算出にはＴｕｋｅｙの多重比較検定つき一元配置分散分析を使用した。＊＊ｐ＜０．０１。
【発明を実施するための形態】
【0015】
本節および本明細書の開示全体において使用される節見出しは、単に構成上の目的のためであり、限定することを意図するものではない。
【0016】
１．定義
【0017】
本明細書で使用される用語「備える（comprise(s)）」、「含む（include(s)）」、「有する（having）」、「有する（has）」、「可能性がある／できる／し得る（can）」、「含有する（contain(s)）」、およびその変形は、追加の行為または構造の可能性を排除しない、制約のない推移的な語句、用語または単語であることを意図するものである。単数形「a」、「および（and）」、および「the」は、文脈によって明確に指示されない限り、複数の参照を含む。本開示はまた、本明細書に提示された実施形態または要素「を含む」、「からなる」、および「から本質的になる」他の実施形態を、明示的に記載されているか否かにかかわらず、企図するものである。
【0018】
本明細書における数値範囲の記載については、その間に介在する、同程度の精度を有する各数値が明示的に企図される。例えば、６～９の範囲については、６および９に加えて７および８の数字が企図され、６．０～７．０の範囲については、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、および７．０の数字が明示的に企図される。
【0019】
本明細書で使用される「投与する（administering）」という用語は、ＣＨＭＰ７阻害剤（例えば、ＣＨＭＰ７アンチセンスオリゴヌクレオチドなど）などの医薬剤または組成物を被験体に提供することを意味し、医療従事者による投与、自己投与、またはそれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。本明細書で使用される場合、被験体の疾患を「治療する（treating）」または疾患を有する被験体を「治療する（treating）」という用語は、被験体を医薬治療に供すること、例えば、ＣＨＭＰ７阻害剤（例えば、ＣＨＭＰ７アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドの薬学的に許容される塩など）、またはｓｉＲＮＡなどの薬剤を、疾患（例えば、神経変性疾患など）の少なくとも一つの症状を減少させる、または悪化を予防するように、投与することである。
【0020】
本明細書で使用される用語「抗体（antibody）」は、何らかの方法で抗原と特異的に反応することを特徴とする分子を指し、ここで、抗体と抗原はそれぞれ他方の観点から定義される。抗体は、完全な抗体分子、または重鎖、軽鎖、Ｆａｂ領域、およびＦｃ領域などのその任意の断片もしくは領域を指し得る。
【0021】
本明細書で使用される「抗原結合断片（antigen-binding fragment）」という用語は、全長抗体によって結合される抗原に特異的に結合する能力を保持する抗体断片、例えば、１つまたは複数のＣＤＲ領域を保持する断片を指す。抗原結合断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ′、Ｆ（ａｂ′）２、およびＦｖ断片；ダイアボディ；単鎖抗体分子、例えばｓｃ－Ｆｖ；ナノボディ、および抗体断片から形成される多特異性抗体などが挙げられるが、これらに限定されない。
【0022】
本明細書で互換的に使用される用語「ＣＨＭＰ７」または「荷電多胞体タンパク質７（charged multivesicular body protein 7）」は、長さが４５３アミノ酸のヒトＥＳＣＲＴ－ＩＩＩ関連タンパク質を指す（ＧＥＮＢＡＮＫ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｑ８ＷＵＸ９を参照）。ＣＨＭＰ７は、そのＣ端側およびＮ端側にＳＮＦ７ドメインおよびＳＮＦ７遠位関連ドメインを含む。本明細書で使用する「ＣＨＭＰ７」という用語は、４５３アミノ酸のタンパク質だけでなく、このタンパク質の断片（例えば、そのような断片は、５アミノ酸～４００アミノ酸、１０アミノ酸～３５０アミノ酸、１０アミノ酸～３００アミノ酸、１０アミノ酸～２５０アミノ酸、１０アミノ酸～２００アミノ酸、１０アミノ酸～１５０アミノ酸、１０アミノ酸～１００アミノ酸、１０アミノ酸～７５アミノ酸、１０アミノ酸～５０アミノ酸、１０アミノ酸～４０アミノ酸、１０アミノ酸～３０アミノ酸、または１０アミノ酸～２０アミノ酸の長さを有する可能性がある）、およびＣＨＭＰ７ ＤＮＡ、ＣＨＭＰ７ ｃＤＮＡ、ＣＨＭＰ７ ＲＮＡなどを指す。
【0023】
本明細書で使用される用語「ＣＨＭＰ７阻害剤（CHMP7 inhibiting agent）」は、ＣＨＭＰ７（ＣＨＭＰ７タンパク質またはその断片など（例えば、そのような断片は、５アミノ酸～４００アミノ酸、１０アミノ酸～３５０アミノ酸、１０アミノ酸～３００アミノ酸、１０アミノ酸～２５０アミノ酸、１０アミノ酸～２００アミノ酸、１０アミノ酸～１５０アミノ酸、１０アミノ酸～１００アミノ酸、１０アミノ酸～７５アミノ酸、１０アミノ酸～５０アミノ酸、１０アミノ酸～４０アミノ酸、１０アミノ酸～３０アミノ酸、または１０アミノ酸～２０アミノ酸の長さを有する可能性がある）、ＣＨＭＰ７ ＤＮＡ、ＣＨＭＰ７ ｃＤＮＡ、ＣＨＭＰ７ ｓｉＲＮＡ、ＣＨＭＰ７ ｍｉＲＮＡなど）を神経細胞または神経細胞の集団などの、細胞または細胞の集団において阻害または低減することが可能な、任意の化合物または分子を指す。ＣＨＭＰ７阻害剤の例としては、小分子（その薬学的に許容される塩を含む）、抗体（モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、完全ヒト抗体など）もしくはその抗原結合断片、オリゴヌクレオチド（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドの薬学的に許容される塩）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ペプチド、ペプチドミメティック、またはそれらの任意の組合せのうちの一つまたは複数が挙げられるが、これらに限定されない。
【0024】
本明細書で使用される「連続する（contiguous）」という用語は、互いにすぐに隣り合っていることを意味する。
【0025】
本明細書で使用される「すぐに隣り合っている（immediately adjacent）」という用語は、すぐに隣り合っている要素の間に介在する要素がないことを意味する。
【0026】
用語「阻害する（inhibit）」または「阻害する（inhibits）」は、疾患、障害、または状態、生物学的経路の活性、または生物学的活性の進展または進行、例えば固形悪性腫瘍の成長などを、治療していないコントロール被験体、細胞、生物学的経路、もしくは生物学的活性と比較して、または被験体が治療される前の被験体における固形悪性腫瘍の成長などの標的と比較して、例えば少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、またはさらには１００％低減、抑制、減衰、軽減、停止、または安定化することを意味する。「低減する（decrease）」という用語によって、がん疾患、障害、または状態の症状を阻害、抑制、減衰、軽減、停止、または安定化することを意味する。排除されるわけではないが、疾患、障害または状態を治療することは、疾患、障害、状態またはそれらに関連する症状が完全に取り除かれることを必要としないことが理解されよう。
【0027】
本明細書で使用される「神経変性疾患（neurodegenerative disease）」という語句は、ニューロンまたは網膜神経節細胞などの他の神経細胞の変性または機能不全に関連する障害（ニューロパシーを含む）を指す。神経変性疾患または障害は、ニューロンの機能低下または機能不全、あるいはニューロンまたは他の神経細胞の喪失が起こり得る、任意の疾患または状態とすることができる。そのような状態には、限定されないが、緑内障、およびアルコール依存症、アレキサンダー病、アルパー病、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症（ルー・ゲーリッグ病）、血管拡張性失調症、バッテン病（スピールマイヤー－ボッグ－シェーグレン－バッテン病としても知られる）、牛海綿状脳症（ＢＳＥ）、カナヴァン病、コケイン症候群、皮質基底核変性症、クロイツフェルト・ヤコブ病、糖尿病性ニューロパシー、前頭側頭型変性症（ＦＴＤ）、ハンチントン病、ＨＩＶ関連認知症、ケネディー病、クラッベ病、レビー小体型認知症、神経ボレリア症、マチャド・ジョセフ病（３型脊髄小脳失調症）、湿性または乾性黄斑変性症、多系統萎縮症、多発性硬化症、ニーマンピック病、パーキンソン病、ペリザエウス－メルツバッハー病、網膜色素変性症および関連疾患などの視細胞変性疾患、ピック病、原発性側索硬化症、プリオン病、進行性核上性麻痺、レフスム病、サンドホフ病、シルダー病、悪性貧血による亜急性脊髄複合変性症、スピールマイヤー－フォクト－シェーグレン－バッテン病（バッテン病としても知られる）、脊髄小脳失調症（様々な特徴を有する複数の型）、脊髄性筋萎縮症、スティール－リチャードソン－オルゼウスキ病、および脊髄癆などの、またはそれらに関連する神経変性障害が含まれる。神経細胞に対する外傷または他の損傷（例えば、事故による外傷、鈍器による損傷、銃による損傷、脊髄損傷、脳卒中などの神経系の虚血状態、老化または酸化ストレスによる細胞損傷など）も、「神経変性疾患または障害（neurodegenerative disease or disorder）」という言葉の中に含まれることを意図している。特定の実施形態において、神経変性疾患または障害は、過剰な血管新生に関連しない疾患または障害、例えば、血管新生緑内障でない緑内障である。
【0028】
いくつかの態様において、神経変性疾患は、筋萎縮性側索硬化症（ルー・ゲーリッグ病）である。他の態様においては、神経変性疾患はハンチントン病である。別の態様においては、神経変性疾患は、アルツハイマー病である。別の態様においては、神経変性疾患は、パーキンソン病である。さらに別の態様において、神経変性疾患は、レビー小体型認知症である。またさらに別の態様において、神経変性疾患は、多発性硬化症である。またさらに別の態様において、神経変性疾患は、前頭側頭型変性症（ＦＴＤ）である。
【0029】
本明細書で使用される用語「核酸（nucleic acid）」は、単量体ヌクレオチドから構成される分子を指す。核酸は、リボ核酸（ＲＮＡ）、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、一本鎖核酸、二本鎖核酸、短鎖干渉リボ核酸（ｓｉＲＮＡ）、およびマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を含むが、これらに限定されない。
【0030】
本明細書で使用される用語「核酸塩基（nucleobase）」は、別の核酸の塩基と対合することが可能な複素環部分を意味する。
【0031】
本明細書で使用される「オリゴヌクレオチド（oligonucleotide）」という用語は、リボ核酸またはデオキシリボ核酸のオリゴマーまたはポリマーを指す。この用語は、天然に存在する核酸塩基、糖および糖間（主鎖）共有結合から構成されるオリゴヌクレオチド、ならびに同様に機能する天然に存在しない部分を有するオリゴヌクレオチドを含む。このような修飾または置換されたオリゴヌクレオチドは、例えば、細胞への取り込みの促進、標的への結合の促進、およびヌクレアーゼの存在下での安定性の増加などの望ましい特性のために、しばしば天然型よりも好まれる。本開示のオリゴヌクレオチドは、約５～約５０個の連続した核酸塩基からなる。別の態様において、オリゴヌクレオチドは、約８～約５０個の連続する核酸塩基からなる。さらに別の態様においては、オリゴヌクレオチドは、約１０～約５０個の連続する核酸塩基からなる。またさらに別の態様においては、オリゴヌクレオチドは、約１５～約５０個の連続する核酸塩基からなる。またさらなる態様においては、オリゴヌクレオチドは、約２０～約５０の連続する核酸塩基からなる。
【0032】
オリゴヌクレオチドの一例は、アンチセンス連続オリゴヌクレオチドである。薬学的に許容されるその塩を含む本開示のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、約５～約５０個の連続する核酸塩基からなる。別の態様においては、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、約８～約５０個の連続する核酸塩基からなる。さらに別の態様においては、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、約１０～約５０の連続する核酸塩基からなる。またさらに別の態様においては、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、約１５～約５０の連続する核酸塩基からなる。またさらなる態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、約２０～約５０の連続した核酸塩基からなる。
【0033】
当技術分野で知られているように、ヌクレオシドは塩基と糖の組み合わせである。ヌクレオシドの塩基部分は、通常、複素環式塩基である。そのような複素環式塩基の２つの最も一般的なクラスは、プリンおよびピリミジンである。ヌクレオチドは、ヌクレオシドの糖部分に共有結合で結合したリン酸基をさらに含むヌクレオシドである。ペントフラノシル糖を含むヌクレオシドでは、リン酸基は糖の２＝、３＝または５＝水酸基部分のいずれかに結合することができる。オリゴヌクレオチドを形成する場合、リン酸基は隣り合ったヌクレオシドを互いに共有結合して直鎖状の高分子化合物を形成する。この直鎖状高分子構造のそれぞれの末端は、同様に、さらに結合して円形構造を形成することができるが、一般的には開口した直鎖状構造が好ましい。オリゴヌクレオチド構造において、リン酸基は一般にオリゴヌクレオチドのヌクレオシド間主鎖を形成すると言われる。ＲＮＡおよびＤＮＡの通常の結合または主鎖は、３＝－５＝ホスホジエステル結合である。
【0034】
さらに、本開示のアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその薬学的に許容される塩は、一本鎖または二本鎖（ｄｓＲＮＡ分子など）であってもよい。
【0035】
本明細書で使用される用語「非経口投与（parenteral administration）」および「非経口的に投与される（administered parenterally）」は、通常注射による、経腸および局所投与以外の投与様式を意味し、通常注射によるものであり、限定されないが、静脈内、筋肉内．動脈内、髄腔内、嚢内、眼窩内、眼内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、嚢下、くも膜下、脊髄内および胸骨内注射および点滴を含む。
【0036】
用語「ペプチド（peptide）」は、少なくとも２つのアミノ酸をアミド結合で結合することによって形成される分子を意味する。限定されないが、本明細書で使用される場合、ペプチドはポリペプチドおよびタンパク質を指す。本開示において使用するためのペプチドは、５アミノ酸～５００アミノ酸、１０アミノ酸～４００アミノ酸、１０アミノ酸～３００アミノ酸、１０アミノ酸～２００アミノ酸、１０アミノ酸～１００アミノ酸、１０アミノ酸～９０アミノ酸、１０アミノ酸～８０アミノ酸、１０アミノ酸～７０アミノ酸、１０アミノ酸～６０アミノ酸、１０アミノ酸～５０アミノ酸または１０アミノ酸～４０アミノ酸の長さを有する可能性がある。「ペプチドミメティック（peptidomimetic）」は、アミド結合または他の結合、例えば、エステル、エーテルなどによって結合されたＤおよびＬ異性体およびアミノ酸類似体を含む非天然または合成アミノ酸を含むペプチドの種類である。「ペプチドミメティック（peptidomimetic）」はまた、例えばアプタマーを含む、ペプチドに明らかに類似してはいない有機分子も含む。
【0037】
本明細書において、「薬学的に許容される（pharmaceutically acceptable）」という用語は、正当な医学的判断の範囲内で、過剰な毒性、刺激、アレルギー反応、または他の問題もしくは合併症を伴わず、ヒトおよび動物の組織と接触して使用するのに適している、妥当な利益／リスク比に見合った化合物、材料、組成物、および／または剤形を指すものとして用いられる。
【0038】
本明細書で使用する「薬学的に許容される担体（pharmaceutically acceptable carrier）」という用語は、対象化合物をある器官または体の一部から別の器官または体の一部へ運ぶ、または輸送することに関与する、液体または固体の充填剤、希釈剤、賦形剤、または溶媒封入材料などの薬学的に許容できる材料、組成物または溶媒を意味する。各担体は、製剤の他の成分と適合し、患者に有害でないという意味で、「許容できる（acceptable）」ものでなければならない。薬学的に許容される担体として機能することが可能な材料の例としては、以下のものが挙げられる：（１）ラクトース、グルコース、およびスクロースなどの糖；（２）コーンスターチおよびジャガイモデンプンなどのデンプン；（３）セルロース、ならびにカルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロースおよび酢酸セルロースなどのその誘導体；（４）トラガカント粉末；（５）麦芽；（６）ゼラチン；（７）タルク；（８）ココアバターおよび坐剤ワックスなどの賦形剤；（９）ピーナッツ油、綿実油、サフラワー油、ごま油、オリーブ油、コーン油および大豆油などの油；（１０）プロピレングリコールなどのグリコール；（１１）グリセリン、ソルビトール、マンニトール、およびポリエチレングリコールなどのポリオール；（１２）オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチルなどのエステル；（１３）寒天；（１４）水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウムなどの緩衝剤；（１５）アルギン酸；（１６）ピロゲンフリー水；（１７）等張食塩水；（１８）リンガー液；（１９）エチルアルコール；（２０）ｐＨ緩衝液；（２１）ポリエステル、ポリカーボネートおよび／またはポリ酸無水物；ならびに（２２）医薬製剤に用いられる他の非毒性の適合物質。
【0039】
用語「薬学的に許容される塩（pharmaceutically acceptable salts）」は、小分子およびアンチセンスオリゴヌクレオチドなどのオリゴヌクレオチドを含む化合物の比較的無毒な、無機および有機塩を意味する。
【0040】
「予防する（prevent）」、「予防すること（preventing）」、「予防（prevention）」、「予防的治療（prophylactic treatment）」などの用語は、疾患、障害、または状態を有してはいないが、疾患、障害、または状態を発症するリスクがあるまたは発症しやすい被験体において、疾患、障害、または状態を発症する確率を低減することを指す。
【0041】
「被験体（subject）」は、既存の疾患、障害、状態の治療、または疾患、障害、もしくは状態の発症を予防するための予防治療などの医療目的のヒト被験体、または医療目的、獣医学的目的、もしくは開発目的の動物被験体を含む可能性がある。適切な動物被験体としては、霊長類、例えば、ヒト、サル、類人猿、テナガザル、チンパンジー、オランウータン、マカクなど；ウシ類、例えば、畜牛、雄牛など；ヒツジ類、例えば、羊など；ヤギ類、例えば、山羊など；ブタ類、例えば、豚、雄豚など；ウマ類、例えば、馬、ロバ、シマウマなど；野生猫および家猫を含むネコ科；犬を含むイヌ科；家ウサギ、ノウサギなどを含むウサギ類；およびマウス、ラット、モルモットなどを含むげっ歯類を含むがこれらに限定されない、哺乳類が含まれる。動物は、遺伝子導入動物であってもよい。いくつかの実施形態においては、被験体は、胎児、新生児、乳児、若年、および成人の被験体を含むがこれらに限定されない、ヒトである。さらに、「被験体」は、疾患、障害、または状態に罹患している、または罹患している疑いのある患者を含む可能性がある。したがって、「被験体（subject）」および「患者（patient）」という用語は、本明細書において互換的に使用される。被験体はまた、動物疾患モデル（例えば、実験に使用されるラットまたはマウスなど）も含む。
【0042】
「有する疑いのある被験体（subject suspected of having）」という用語は、疾患または状態の１つまたは複数の臨床指標を示す被験体を意味する。特定の実施形態において、疾患または状態は、神経変性疾患である。
【0043】
「それを必要とする被験体（subject in need thereof）」という用語は、療法または治療を必要とするものとして特定された被験体を意味する。
【0044】
用語「全身投与（systemic administration）」、「全身投与される（administered systemically）」、「末梢投与（peripheral administration）」、および「末梢投与される（administered peripherally）」は、患者の体に入り、したがって代謝および他の同様のプロセスの対象となるような、中枢神経系への直接以外の化合物、薬剤または他の物質の投与、例えば、皮下投与を意味する。
【0045】
本明細書で互換的に使用される用語「治療上有効量（therapeutically effective amount）」または「有効量（effective amount）」は、所望の効果、例えば、疾患、状態、または障害（例えば、神経変性疾患など、神経細胞または細胞機能の喪失に関連する疾患、状態、または障害）またはその１つもしくは複数の症状の、重症度、期間、進行または発症を低減または改善すること、疾患、状態、または障害の進行を予防すること、疾患、状態、または障害の退行を起こすこと、疾患、状態、または障害に伴う症状の再発、進展、発症、または進行を予防すること、または別の療法の予防または治療効果を促進または改善すること、をもたらすのに十分な量を指す。
【0046】
いくつかの態様において、化合物（ＣＨＭＰ７阻害剤など）の有効量または治療上有効量は、その治療指数、溶解度などに依存する。例えば、本開示の方法によって発見された特定の化合物は、そのような治療に適用可能な妥当な利益／リスク比をもたらすのに十分な量で投与され得る。例として、ＣＨＭＰ７阻害剤は、そのような治療に適用可能な妥当な利益／リスク比をもたらすのに十分な量で投与され得る。
【0047】
いくつかの他の態様において、本開示によるＣＨＭＰ７阻害剤（例えば、ＣＨＭＰ７アンチセンスオリゴヌクレオチドおよび／またはｓｉＲＮＡなど）の有効量または治療上有効量は、例えば、約０．００１ｍｇ／ｋｇ～約１０００ｍｇ／ｋｇ、または特定の実施形態においては約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約１００ｍｇ／ｋｇ、または特定の実施形態においては約０．１ｍｇ／ｋｇ～約５０ｍｇ／ｋｇの範囲にわたることがあり得る。有効用量もまた、当業者によって認識されるように、治療される障害、投与経路、賦形剤の使用、被験体の年齢および性別、ならびに他の薬剤の使用などの他の治療的処置との共用の可能性に依存して変化するであろう。
【0048】
用語「治療効果（therapeutic effect）」は、例えばＣＨＭＰ７阻害剤のような薬理学的に活性な物質によって引き起こされる、動物、特に哺乳類、より特にヒトにおける局所的または全身的効果を指す。したがって、この用語は、ヒトなどの動物における疾患の診断、治癒、緩和、治療もしくは予防、または望ましい身体的もしくは精神的発達および状態の促進における使用を意図した任意の物質（例えば、ＣＨＭＰ７阻害剤など）を意味する。
【0049】
被験体における疾患を「治療する（treating）」または疾患を有する被験体を「治療する（treating）」という用語は、疾患の少なくとも一つの症状を減少させる、または悪化を予防するように、被験体を医薬治療、例えば、薬剤の投与に供することを指す。
【0050】
以下の例は、本開示の主題の代表的な実施形態を実践するためのガイダンスを当業者に提供するために含まれたものである。本開示および当業者の一般的なレベルに照らして、当業者は、以下の実施例が例示的であることのみを意図しており、本開示の主題の範囲から逸脱することなく多数の変更、修正および改変を採用し得ることを理解することができる。以下に続く総合的な記載および具体例は、例示の目的のみを意図しており、他の方法によって本開示の化合物を製造することを、いかなる方法でも制限するものとして解釈されることはない。
【0051】
２．スクリーニング方法
【0052】
一実施形態において、本開示は、以下の化合物をスクリーニングするための方法に関する：（ａ）ＣＨＭＰ７（ＣＨＭＰ７タンパク質、ＣＨＭＰ７ ＤＮＡ、ＣＨＭＰ７ ｃＤＮＡ、ＣＨＭＰ７ ＲＮＡなど）に一定の結合親和性で結合する化合物；（ｂ）ＣＨＭＰ７の重合を阻害する化合物;（ｃ）ＣＨＭＰ７の核内蓄積を阻害する化合物；および／または（ｄ）少なくとも１つの細胞または細胞の集団、例えば、少なくとも１つの神経細胞もしくは神経細胞の集団またはアストロサイト、オリゴデンドログリア、もしくはミクログリアなどの他の神経系細胞の集団においてＣＨＭＰ７の発現を低減または阻害する化合物。本明細書に記載の方法に従ってスクリーニングおよび選択することが可能な化合物は、小分子もしくはその薬学的に許容される塩、抗体（モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、完全ヒト抗体など）、もしくはその抗原結合断片、オリゴヌクレオチド（アンチセンスオリゴヌクレオチドもしくはその薬学的に許容される塩など）、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ペプチド、ペプチドミメティックまたはそれらの任意の組み合わせの、少なくとも一つである。
【0053】
１つの態様において、スクリーニング方法は、ＣＨＭＰ７に対する化合物の結合を測定することを含む。この方法では、試験する化合物をＣＨＭＰ７（ＣＨＭＰ７タンパク質またはその断片、ＣＨＭＰ７ ＤＮＡ、ＣＨＭＰ７ ｃＤＮＡ、ＣＨＭＰ７ ＲＮＡなど）と接触させ、当技術分野において既知の慣行技術を使用して、結合（またはその欠如）を測定する。化合物は、ＣＨＭＰ７に対して特定の結合親和性を有する場合、ＣＨＭＰ７（ＣＨＭＰ７タンパク質またはその断片、ＣＨＭＰ７ ＤＮＡ、ＣＨＭＰ７ ｃＤＮＡ、ＣＨＭＰ７ ＲＮＡなど）に結合する化合物として同定（および選択）され得る。いくつかの態様において、化合物は、ＣＨＭＰ７（ＣＨＭＰ７タンパク質、ＣＨＭＰ７ ＤＮＡ、ＣＨＭＰ７ ｃＤＮＡ、ＣＨＭＰ７ ＲＮＡなど）に特異的に結合する化合物として同定され得る。例えば、ＣＨＭＰ７に結合する化合物は、マイクロモル範囲、または、好ましくは１００ｎＭ～１ｐＭの範囲の解離定数（Ｋｄ）を有し得る。前述のように、ＣＨＭＰ７に対する化合物の結合は、例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ、ケモプロテオミクス、マイクロスケール熱泳動、または当該技術分野において既知の任意の他の技術もしくは技術の組み合わせなど、当該技術分野における慣行技術を使用して測定することができる。
【0054】
別の態様において、スクリーニング方法は、ＣＨＭＰ７を発現する少なくとも１つの細胞または細胞の集団（例えば、神経細胞または神経細胞の集団）と化合物を接触させ、化合物が細胞または細胞の集団におけるＣＨＭＰ７の発現を低減または阻害するか否か判定することを含む。試験化合物の存在下および非存在下におけるＣＨＭＰ７の発現は、例えば、（ｑ）ＰＣＲ、ウェスタンブロット、質量分析法、または当該技術分野において既知の任意の他の技術もしくは技術の組み合わせなど、当該技術分野における慣行技術を使用して測定することができる。ＣＨＭＰ７を低減または阻害する化合物は、さらなる試験および本明細書に記載の他の方法における使用のために選択することができる。
【0055】
本明細書に記載のスクリーニング方法は、試験される化合物をコントロールと比較するステップを追加で含んでもよい。前記コントロールは、不活性試験化合物であってもよく、前記不活性試験化合物は、（ａ）ＣＨＭＰ７の発現および／もしくは活性を低減しない；ならびに／または（ｂ）ＣＨＭＰ７に結合しない化合物である。
【0056】
別の態様において、細胞または細胞の集団（例えば、神経細胞または神経細胞の集団）におけるＣＨＭＰ７の発現を低減する化合物が、神経変性疾患を予防、改善および／または阻害する（すなわち、治療する）化合物として同定される（そして、選択される可能性がある）。別の態様では、ＣＨＭＰ７の活性を低減する化合物が、神経変性疾患を予防、改善および／または阻害する（すなわち、治療する）化合物として同定される（そして、選択される可能性がある）。
【0057】
上記のスクリーニング方法によって、神経変性疾患を予防、改善および／または阻害する化合物を同定することが可能になる。そのような化合物を選択および使用して、神経変性疾患を改善および／または阻害する（すなわち、治療する）ことができる。したがって、本明細書で提供されるスクリーニング方法は、神経変性疾患を治療するための化合物を同定および選択するのに有用である。
【0058】
３．ＣＨＭＰ７阻害剤およびＣＨＭＰ７阻害剤を含む医薬組成物
【0059】
別の実施形態において、本開示は、少なくとも１つのＣＨＭＰ７阻害剤に関する。ＣＨＭＰ７阻害剤は、ＣＨＭＰ７（ＣＨＭＰ７タンパク質、ＣＨＭＰ７ ＤＮＡ、ＣＨＭＰ７ ｃＤＮＡ、ＣＨＭＰ７ ＲＮＡなど）に一定の結合親和性で結合する化合物；および／または（ｂ）少なくとも一つの細胞または細胞の集団におけるＣＨＭＰ７（ＣＨＭＰ７タンパク質、ＣＨＭＰ７ ＤＮＡ、ＣＨＭＰ７ ｃＤＮＡ、ＣＨＭＰ７ ＲＮＡなど）発現を低減または阻害する化合物とすることができる。そのような化合物は、本明細書の節２．において同定および選択された化合物を含む可能性がある。別の態様において、ＣＨＭＰ７阻害剤は、当技術分野において既知のＣＨＭＰ７阻害剤である。
【0060】
ＣＨＭＰ７阻害剤は、小分子もしくはその薬学的に許容される塩、抗体（モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、完全ヒト抗体など）もしくはその抗原結合断片、オリゴヌクレオチド（アンチセンスオリゴヌクレオチドもしくはその薬学的に許容される塩など）、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ペプチド、ペプチドミメティック、またはそれらの任意の組み合わせのうち、少なくとも１つとすることができる。一態様において、ＣＨＭＰ７阻害剤は、小分子またはその薬学的に許容される塩である。別の態様においては、ＣＨＭＰ７阻害剤は、抗体またはその抗原結合断片である。さらに別の態様においては、ＣＨＭＰ７阻害剤はオリゴヌクレオチドである。さらに別の態様においては、ＣＨＭＰ７阻害剤はアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその薬学的に許容される塩である。また別の態様では、ＣＨＭＰ７阻害剤はｓｉＲＮＡである。また別の態様においては、ＣＨＭＰ７阻害剤は、短鎖干渉ＲＮＡである。また別の態様においては、ＣＨＭＰ７阻害剤は、マイクロＲＮＡである。さらなる態様においては、ＣＨＭＰ７阻害剤はペプチドである。またさらなる態様においては、ＣＨＭＰ７阻害剤は、ペプチドミメティックである。いくつかの態様においては、ＣＨＭＰ７阻害剤はオリゴヌクレオチドである。別の態様においては、ＣＨＭＰ７阻害剤は、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその薬学的に許容される塩である。ＣＨＭＰ７阻害剤であり、本明細書に記載の方法で使用可能なアンチセンスオリゴヌクレオチドの例としては、Coyne et al., “Nuclear accumulation of CHMP7 initiates nuclear pore complex injury and subsequent TDP-43 dysfunction in sporadic and familial ALS,” Science Translational Medicine, Vol.13, No.604 (2021)に記載のものが含まれ、以下の１つまたは複数が含まれる：ＣＣＴＡＴＡＧＧＡＣＴＡＴＣＣＡＧＧＡＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）、ＧＡＡＡＡＣＧＧＴＴＴＣＣＡＣＴＧＴＡＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）、ＴＧＴＴＡＣＣＣＴＣＡＧＡＴＡＣＣＧＣＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）、ＡＴＧＴＧＡＴＧＣＴＡＴＴＡＡＴＡＧＧＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）およびその任意の組み合わせ。
【0061】
いくつかの態様において、ＣＨＭＰ７阻害剤は、ｓｉＲＮＡである。ＣＨＭＰ７阻害剤であるｓｉＲＮＡ配列の例には、以下の１つまたは複数が含まれる：
【0062】
ｓｉＲＮＡ：ＣＧＡＣＣＵＵＧＧＵＡＡＡＣＧＧＡＡＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２）
【0063】
ｓｉＲＮＡ：ＧＧＧＵＵＵＡＵＣＣＵＧＵＣＧＣＵＡＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３）
【0064】
ｓｉＲＮＡ：ＧＧＡＧＧＵＧＵＡＵＣＧＵＣＵＧＵＡＵ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４）
【0065】
ｓｉＲＮＡ：ＧＵＡＡＣＡＡＡＵＧＧＣＵＵＡＧＡＵＵ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５）
【0066】
別の態様において、本開示は、１つまたは複数の薬学的に許容される担体（添加剤）および／または希釈剤とともに処方された、上記の１つまたは複数のそのようなＣＨＭＰ７阻害剤（例えば、活性剤または第１の活性剤）の治療上有効量を含む、薬学的に許容できる組成物を提供する。
【0067】
以下に詳細に記載するように、本開示の医薬組成物は、以下のために適合されたものを含む、固体または液体形態での投与のために特別に処方され得る：（１）経口投与、例えば、水薬（水性または非水性溶液または懸濁液）、錠剤、例えば、錠剤、例えば、頬、舌下、全身吸収を目的としたもの、ボーラス、粉末、顆粒、舌に塗布するためのペーストなど；（２）非経口投与、例えば、無菌溶液もしくは懸濁液、または徐放性製剤として、皮下、筋肉内、静脈内、髄腔内、または硬膜外注射により投与される；（３）局所塗布、例えば、クリーム、軟膏、または皮膚に適用される制御放出パッチもしくはスプレーとして；（４）膣内または直腸内、例えば、ペッサリー、クリームまたはフォームとして；（５）舌下；（６）眼内；（７）経皮；または（８）経鼻。
【0068】
湿潤剤、乳化剤および潤滑剤、例えばラウリル硫酸ナトリウムおよびステアリン酸マグネシウム、ならびに着色剤、放出剤、コーティング剤、甘味料、調味料および香料、保存剤および酸化防止剤も組成物中に存在することができる。
【0069】
薬学的に許容される酸化防止剤の例としては、以下のものが挙げられる：（１）水溶性酸化防止剤、例えばアスコルビン酸、塩酸システイン、重硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウムなど；（２）油溶性酸化防止剤、例えばパルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、没食子酸プロピル、アルファトコフェロールなど；および（３）金属キレート剤、例えば、クエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸など。
【0070】
ＣＨＭＰ７阻害剤組成物は、経口、鼻腔、局所（頬、舌下を含む）、直腸、膣および／または非経口投与に適したものを含む。製剤は、単位用量剤形で好都合に提示され得、薬学の技術分野において周知の任意の方法によって調製され得る。担体材料と組み合わせて単一用量剤形を製造することが可能なＣＨＭＰ７阻害剤の量は、治療される宿主および特定の投与様式に依存して変化する。担体材料と組み合わせて単一用量剤形を製造することが可能なＣＨＭＰ７阻害剤の量は、一般に、治療効果をもたらす化合物の量である。
【0071】
特定の実施形態においては、ＣＨＭＰ７阻害剤組成物の製剤は、より高い安定性、ｉｎ ｖｉｖｏでの異なる放出特性、特定の部位への標的化、または被験体もしくは被験体内の標的への複合体のより効果的な送達を可能にする任意の他の所望の特性を可能にするため、例えば、限定されないが、リポソーム、ミクロスフェア、ナノスフィア、ナノ粒子、泡、ミセル形成剤、例えば胆汁酸、およびポリマー担体、例えば、ポリエステルおよびポリ酸無水物などの他の担体を含む可能性がある。特定の実施形態において、前述の組成物は、本開示のＣＨＭＰ７阻害剤を経口的に生体利用可能にする。
【0072】
ＣＨＭＰ７阻害剤組成物の液体剤形は、薬学的に許容されるエマルション、マイクロエマルション、溶液、懸濁液、シロップおよびエリキシル剤を含む。活性成分に加えて、液体剤形は、例えば、水または他の溶媒、可溶化剤および乳化剤など、例えば、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル．ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３－ブチレングリコール、油（特に、綿実油、落花生油、コーン油、胚芽油、オリーブ油、ひまし油、およびごま油）、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ソルビタンのポリエチレングリコールおよび脂肪酸エステル、ならびにこれらの混合物などの、当該技術分野で一般的に使用される不活性な希釈剤を含み得る。
【0073】
不活性な希釈剤の他に、経口組成物は、湿潤剤、乳化剤および懸濁剤、甘味剤、調味料、着色剤、香料および保存剤などの補助剤も含む可能性がある。
【0074】
活性化合物に加えて、懸濁液は、例えば、エトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールおよびソルビタンエステル、微結晶セルロース、メタ水酸化アルミニウム、ベントナイト、寒天およびトラガカント、ならびにそれらの混合物として、懸濁剤を含んでもよい。
【0075】
経口投与に適した製剤は、カプセル、カシェ、ピル、錠剤、トローチ（味付けされた基材、通常はスクロースおよびアカシアまたはトラガカントを使用）、粉末、顆粒、または水性もしくは非水性液体中の溶液もしくは懸濁液、または水中油型もしくは油中水型の液体エマルジョン、またはエリキシル剤もしくはシロップ、またはパスティーユ（ゼラチンおよびグリセリン、スクロースおよびアカシアなどの不活性基材を使用）、マウスウォッシュなどの形態であってよく、それぞれ所定量の活性成分を含む。本開示のＣＨＭＰ７阻害剤組成物はまた、ボーラス、舐剤またはペーストとして投与され得る。
【0076】
固体剤形（例えば、カプセル、錠剤、ピル、糖衣錠、粉末、顆粒など）において、クエン酸ナトリウムまたはリン酸二カルシウムなどの１つまたは複数の薬学的に許容される担体、および／または以下のいずれかと混合される：（１）例えば、デンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトール、および／またはケイ酸などの充填剤または増量剤；（２）例えば、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、スクロースおよび／またはアカシアなどの結合剤；（３）グリセロールなどの保湿剤；（４）寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモまたはタピオカデンプン、アルギン酸、特定のケイ酸塩、および炭酸ナトリウムなどの崩壊剤；（５）パラフィンなどの溶解遅延剤；（６）第４級アンモニウム化合物などの吸収促進剤；（７）例えば、セチルアルコール、グリセロールモノステアレート、および非イオン性界面活性剤などの湿潤剤；（８）カオリンおよびベントナイトクレーなどの吸着剤；（９）タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム、およびこれらの混合物などの潤滑剤；ならびに（１０）着色剤。カプセル、錠剤およびピルの場合、組成物はまた、緩衝剤を含んでもよい。また、同様の種類の固体組成物は、ラクトースまたは乳糖、ならびに高分子量ポリエチレングリコールなどの賦形剤を用いて、軟殻および硬殻ゼラチンカプセルの充填材として採用することができる。
【0077】
錠剤は、加圧または成形により、任意に１つまたは複数の副成分を用いて製造することができる。加圧錠剤は、結合剤（例えば、ゼラチンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース）、潤滑剤、不活性希釈剤、保存剤、崩壊剤（例えば、デンプングリコール酸ナトリウムまたは架橋カルボキシメチルセルロースナトリウム）、表面活性剤または分散剤を使用して調製することができる。成形錠剤は、不活性液体希釈剤で湿らせた粉末化合物の混合物を適切な機械で成形することにより製造することができる。
【0078】
錠剤、および糖衣錠、カプセル、ピルおよび顆粒などの他の固体剤形は、任意に、腸溶性コーティングおよび医薬製剤技術において周知の他のコーティングなどのコーティングおよびシェルにより、得るまたは調製することができる。また、例えば、比率を変えたヒドロキシプロピルメチルセルロース、他のポリマーマトリックス、リポソームおよび／またはミクロスフェアを使用して、その中の活性成分が徐放または制御放出されるように処方され、所望の放出特性を提供してもよい。組成物はまた、迅速な放出のために処方され、例えば、凍結乾燥され得る。これらは、例えば、細菌捕捉フィルターによる濾過、または使用直前に滅菌水または他の滅菌注射媒体に溶解することが可能な滅菌固体組成物の形態で滅菌剤を組み込むことによって滅菌され得る。これらの組成物は、任意に乳白剤を含んでもよく、消化管の特定の部分においてのみ、または優先的に、任意に遅延して、有効成分を放出する組成であってもよい。使用可能な包埋組成物の例としては、高分子物質およびワックスなどが挙げられる。活性成分はまた、適切であれば、１つまたは複数の上記の賦形剤と共にマイクロカプセル化された形態とすることができる。
【0079】
直腸または膣投与のための製剤は、坐剤として提示することができ、これは、本開示の１つまたは複数の化合物を、例えばココアバター、ポリエチレングリコール、坐剤ワックスまたはサリチル酸塩を含む１つまたは複数の適切な非刺激性賦形剤または担体と混合することによって調製することができ、室温では固体であるが体温では液体であるため、直腸または膣内で溶けて活性化合物を放出する。
【0080】
膣投与に適した製剤には、当技術分野で適切であることが知られている担体を含むペッサリー、タンポン、クリーム、ゲル、ペースト、フォームまたはスプレー製剤も含まれる。
【0081】
本開示のＣＨＭＰ７阻害剤組成物の局所的または経皮的投与のための剤形には、粉末、スプレー、軟膏、ペースト、クリーム、ローション、ゲル、溶液、パッチおよび吸入剤が含まれる。活性化合物は、無菌条件下で、薬学的に許容される担体、および必要とされ得る任意の保存剤、緩衝剤、または噴霧剤と混合することができる。
【0082】
軟膏、ペースト、クリームおよびゲルは、本開示の活性化合物に加えて、動物性および植物性の脂肪、油、ワックス、パラフィン、デンプン、トラガカント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコン、ベントナイト、ケイ酸、タルクおよび酸化亜鉛、またはこれらの混合物などの賦形剤を含んでもよい。
【0083】
粉末およびスプレーは、ラクトース、タルク、ケイ酸、水酸化アルミニウム、ケイ酸カルシウム、ポリアミド粉末、またはこれらの物質の混合物などの賦形剤を含むことができる。スプレーは、さらに、クロロフルオロ炭化水素、ならびにブタンおよびプロパンなどの揮発性非置換炭化水素などの慣用噴霧剤を含むことができる。
【0084】
経皮パッチは、身体への送達が制御されるという追加の利点を有する。このような剤形は、化合物を適切な媒体に溶解または分散させることによって作ることができる。また、吸収促進剤を使用して、皮膚を通過する化合物の流入を増加させることもできる。このような流入の速度は、速度制御膜を設けるか、またはポリマーマトリックスまたはゲルに化合物を分散させることによって制御することができる。
【0085】
点眼用製剤、眼軟膏、粉末、溶液なども、本開示の範囲内にあるものとして企図される。
【0086】
非経口投与に適した医薬組成物は、滅菌等張水性もしくは非水性溶液、分散液、懸濁液またはエマルション、または使用直前に滅菌注射溶液もしくは分散液で戻すことができる滅菌粉末を含むことが可能であり、これらは糖、アルコール、酸化防止剤、緩衝液、静菌剤、製剤を対象とする受容者の血液と等張にする溶質、または懸濁剤もしくは増粘剤を含み得る。
【0087】
本開示の医薬組成物に採用され得る適切な水性および非水性担体の例としては、水、エタノール、ポリオール（グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、およびそれらの適切な混合物、植物油、例えばオリーブオイル、および注射用有機エステル、例えばオレイン酸エチルなどが挙げられる。適切な流動性は、例えば、レシチンのようなコーティング材料の使用、分散液の場合は必要な粒径の維持、および界面活性剤の使用によって維持することができる。
【0088】
特定の実施形態において、上記の医薬組成物は、本明細書に提供される方法および組成物に従って、当該技術分野において既知の他の薬理学的に活性な化合物（「第２の活性剤」）と組み合わせることができる。第２の活性剤は、大型分子（例えば、タンパク質）または小分子（例えば、合成無機分子、有機金属分子、もしくは有機分子）とすることができる。一実施形態においては、第２の活性剤は、独立して、または相乗的に、がんを治療するのに役立つ。ＣＨＭＰ７阻害とは独立したメカニズムを有する第２の活性剤の例としては、免疫療法、ホルモン療法、放射線療法、ＨＥＲ２／ｎｅｕ受容体拮抗薬、ビンクリスチン、シクロホスファミド、シタラビン、エトポシド、および／またはドキサルビシンの１つまたは複数が挙げられる。
【0089】
４．ＣＨＭＰ７の発現を阻害する方法
【0090】
別の実施形態において、本開示は、その治療を必要とする被験体において、神経細胞または神経細胞の集団などの細胞または細胞の集団におけるＣＨＭＰ７発現を阻害する方法に関する。一態様においては、該方法は、有効量もしくは治療上有効量の少なくとも１つのＣＨＭＰ７阻害剤を細胞または細胞の集団に投与し、または有効量もしくは治療上有効量の少なくとも１つのＣＨＭＰ７阻害剤を含む組成物を、治療を必要とする被験体に投与し、その後、例えば（ｑ）ＰＣＲ、ウェスタンブロット、質量分光法または当該分野において既知の任意の他の技術もしくは技術の組み合わせなどの、当該分野において既知の慣行技術を使用して、ＣＨＭＰ７発現の阻害を判定、検出および／または測定することを含む。いくつかの態様においては、被験体は、少なくとも１つの神経変性疾患に罹患している。
【0091】
前記方法において使用される、有効量もしくは治療上有効量のＣＨＭＰ７阻害剤（例えば、ＣＨＭＰ７アンチセンスオリゴヌクレオチドおよび／またはｓｉＲＮＡなど）、または有効量もしくは治療上有効量のＣＨＭＰ７阻害剤を含む組成物は、約０．００１ｍｇ／ｋｇ～約１０００ｍｇ／ｋｇ、または特定の実施形態においては約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約１００ｍｇ／ｋｇ、または特定の実施形態においては約０．１ｍｇ／ｋｇ～約５０ｍｇ／ｋｇの範囲にわたることができる。
【0092】
本明細書の方法で使用される、有効量もしくは治療上有効量のＣＨＭＰ７阻害剤（例えば、ＣＨＭＰ７アンチセンスオリゴヌクレオチドおよび／またはｓｉＲＮＡなど）、または有効量もしくは治療上有効量のＣＨＭＰ７阻害剤を含む組成物は、当該分野において既知の慣行技術を使用して、経口、非経口、局所、膣内もしくは直腸内、舌下、眼内、経皮または経鼻投与することができる。
【0093】
４．神経変性疾患を治療する方法
【0094】
別の実施形態においては、本開示は、その治療を必要とする被験体において、少なくとも１つの神経変性疾患を治療する方法に関する。一態様においては、この方法は、少なくとも１つの神経変性疾患に罹患している、または罹患していると考えられる（およびその治療を必要としている）被験体に、有効量もしくは治療上有効量の少なくとも１つのＣＨＭＰ７阻害剤、または有効量もしくは治療上有効量の少なくとも１つのＣＨＭＰ７阻害剤を含む組成物を投与して、神経変性疾患を治療することを含む。本明細書に記載の方法に従って、任意の神経変性疾患を治療することができる。いくつかの態様においては、神経変性疾患は、筋萎縮性側索硬化症（ルー・ゲーリッグ病）である。他の態様においては、神経変性疾患は、ハンチントン病である。別の態様においては、神経変性疾患は、アルツハイマー病である。別の態様においては、神経変性疾患は、パーキンソン病である。さらに別の態様においては、神経変性疾患は、レビー小体型認知症である。またさらに別の態様においては、神経変性疾患は、多発性硬化症である。またさらに別の態様においては、神経変性疾患は、前頭側頭型変性症（ＦＴＤ）である。
【0095】
前記方法において使用される、有効量もしくは治療有効量のＣＨＭＰ７阻害剤（例えば、ＣＨＭＰ７アンチセンスオリゴヌクレオチドおよび／またはｓｉＲＮＡなど）、または有効量もしくは治療有効量のＣＨＭＰ７阻害剤を含む組成物は、約０．００１ｍｇ／ｋｇ～約１０００ｍｇ／ｋｇ、または特定の実施形態においては約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約１００ｍｇ／ｋｇ、または特定の実施形態においては約０．１ｍｇ／ｋｇ～約５０ｍｇ／ｋｇの範囲にわたるものであり得る。
【0096】
本明細書の方法で使用される、有効量もしくは治療有効量のＣＨＭＰ７阻害剤（例えば、ＣＨＭＰ７アンチセンスオリゴヌクレオチドおよび／またはｓｉＲＮＡなど）、または有効量もしくは治療上有効量のＣＨＭＰ７阻害剤を含む組成物は、当該分野において既知の慣行技術を使用して、経口、非経口、局所、膣内もしくは直腸内、舌下、眼内、経皮または経鼻投与することができる。
【実施例】
【0097】
（実施例１）
【0098】
｛材料および方法｝
【0099】
実施例２～７には、以下の材料および方法を使用した。
【0100】
［ｉＰＳＣ由来の神経細胞の分化］
Ｃ９ｏｒｆ７２および非神経性コントロールｉＰＳＣ株は、Ｃｅｄａｒｓ－ＳｉｎａｉのＡｎｓｗｅｒ ＡＬＳリポジトリから入手した（人口統計については表Ａを参照）。フィーダーフリーｉＰＳＣは、ＭＴｅＳＲを含むマトリゲル上で維持し、Ｃｅｄａｒｓ Ｓｉｎａｉ ＳＯＰに従って維持した。ｉＰＳＣは、以前に記載された直接誘導運動ニューロン（ｄｉＭＮ）プロトコル（６）を用いて脊髄ニューロンに分化した。すべての細胞は、３７℃、５％ＣＯ２で維持した。ｉＰＳＣおよびｉＰＳＮは、定期的にマイコプラズマについて陰性であることを確認した。
Ｃ９ｏｒｆ７２および非神経性コントロールｉＰＳＣ株は、Ｃｅｄａｒｓ－ＳｉｎａｉのＡｎｓｗｅｒ ＡＬＳリポジトリから入手した（人口統計については表Ａを参照）。フィーダーフリーｉＰＳＣは、ＭＴｅＳＲを含むマトリゲル上で維持し、Ｃｅｄａｒｓ Ｓｉｎａｉ ＳＯＰに従って維持した。ｉＰＳＣは、以前に記載された直接誘導運動ニューロン（ｄｉＭＮ）プロトコル（６）を用いて脊髄ニューロンに分化した。すべての細胞は、３７℃、５％ＣＯ２で維持した。ｉＰＳＣおよびｉＰＳＮは、定期的にマイコプラズマについて陰性であることを確認した。
【0101】
【表1】
【0102】
［ｉＰＳＣ由来ニューロンのレプトマイシンＢおよびＡＳＯ処理］
レプトマイシンＢ：分化１８日目に、１０ｎＭのレプトマイシンＢ（ＬＭＢ、Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を培地に加え、ｉＰＳＮをインキュベーターに戻して最大１８時間置き、その後下流分析を行った。エタノールは、溶媒コントロールとして使用した。
レプトマイシンＢ：分化１８日目に、１０ｎＭのレプトマイシンＢ（ＬＭＢ、Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を培地に加え、ｉＰＳＮをインキュベーターに戻して最大１８時間置き、その後下流分析を行った。エタノールは、溶媒コントロールとして使用した。
【0103】
Ｃ９ｏｒｆ７２反復ＡＳＯ：センス鎖標的化Ｇ４Ｃ２ ＡＳＯ（６１９２５１）（１３）は、Ｉｏｎｉｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓによって寛大に提供された。分化２０日目に、５μＭのセンス標的化ＡＳＯを培地に添加した。分化２２日目に培地交換とＡＳＯ交換を行い、分化２５日目に下流分析を実施した。ＣＨＭＰ７ ＡＳＯ：非標的化スクランブルコントロール（６７６６３０）：ＣＣＴＡＴＡＧＧＡＣＴＡＴＣＣＡＧＧＡＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）、ＣＨＭＰ７ ＡＳＯ１（１５０８９１６）：ＧＡＡＡＡＣＧＧＴＴＴＣＣＡＣＴＧＴＡＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）、ＣＨＭＰ７ ＡＳＯ２（１５０８９１７）：ＴＧＴＴＡＣＣＣＴＣＡＧＡＴＡＣＣＧＣＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）、およびＣＨＭＰ７ ＡＳＯ３（１５０８９１８）：ＡＴＧＴＧＡＴＧＣＴＡＴＴＡＡＴＡＧＧＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）は、Ｉｏｎｉｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓによって寛大に提供された。分化２５日目に、ＡＳＯを図面の説明に示したように、１、５、または１０μＭの濃度で培地に添加した。分化４０日目まで、３日ごとに培地を交換し、ＡＳＯを交換した。
【0104】
［核の単離］
【0105】
核は、ｉＰＳＮならびに死後のヒト脳および脊髄組織から、Ｎｕｃｌｅｉ Ｐｕｒｅ Ｐｒｅｐ核単離キット（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて、以前に記載されたメーカーのプロトコルに従って単離した（１３）。簡潔には、ｉＰＳＮを１×ＰＢＳで洗浄し、ＤＴＴおよびＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を添加した付属の溶解バッファーを各ウェルに直接ｍＬ添加し、セルスクレーパーでｉＰＳＮを回収することによりｉＰＳＮ溶解液を調製した。死後の脳および脊髄の溶解液は、１５０ｍｇの新鮮な凍結組織を付属の溶解バッファーで直接、ダウンスホモジナイザーでホモジナイズして調製した。すべての溶解液を５０ｍＬコニカルチューブに移し、ボルテックスした。スクロース勾配は、メーカーのプロトコルに従って構築した。１．８５Ｍのスクロース勾配を使用して、神経細胞核を濃縮した。サンプルは、Ｓｗｉ３２ＴスイングバケットローターおよびＢｅｃｋｍａｎ超遠心機（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いて、１５，６００ｒｐｍ、４℃で４５分間遠心分離した。上清を捨て、残りの核ペレットを付属の核保存バッファー１ｍＬに再懸濁し、核に残っているスクロースを洗浄した。再懸濁した核を、２５００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離した。上清をもう一度捨て、得られた核ペレットを付属の核保存バッファー１ｍＬでボルテックスし、下流の画像分析のために再懸濁した。ウェスタンブロットのために、洗浄した核を、以下に記載するようにＲＩＰＡバッファーで溶解させた。
【0106】
［超解像構造化照明顕微鏡法］
【0107】
核染色および超解像イメージングを、以前に記載されたように行った（６）。核の単離後、１０～５０μＬの最終核／保存バッファー懸濁液を、ＣｙｔｏＳｐｉｎ ４遠心分離機（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてコラーゲンコーティング（１ｍｇ／ｍＬ；Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｂｉｏｍａｔｒｉｘ）スライド上に遠心分離した。核を直ちに４％ＰＦＡで５分間固定し、１×ＰＢＳで３×１０分間洗浄し、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を含む１×ＰＢＳＴで１５分間透過処理した。その後、１×ＰＢＳで希釈した１０％正常ヤギ血清で、室温で１時間核をブロックし、ブロック（１×ＰＢＳ中の１０％正常ヤギ血清）で希釈した一次抗体で、４℃で一晩インキュベートした（抗体情報については表Ｂを参照）。１６～１８時間後、核を１×ＰＢＳで３×１０分間洗浄し、ブロック（１×ＰＢＳ中の１０％正常ヤギ血清）で希釈した二次抗体で、室温で１時間インキュベートした（抗体情報については表Ｂを参照）。核を１×ＰＢＳで３×１０分間洗浄し、Ｐｒｏｌｏｎｇ Ｇｏｌｄ Ａｎｔｉｆａｄｅ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および１８ｍｍ×１８ｍｍ １．５ ｈｉｇｈ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｃｏｖｅｒｓｌｉｐｓ（ＭａｔＴｅｋ）を用いてカバースリップした。ＮｅｕＮまたはＧＦＰ陽性核（図面の説明を参照）は、顕微鏡のアイピースを介して同定した。ＮｅｕＮまたはＧＦＰ陽性を確認するため、ワイドフィールドイメージングにより厚さ最大１１０ｎｍの単一のｚ切片を取得した。免疫染色したＮｕｐまたはＥＳＣＲＴ－ＩＩＩタンパク質は、その後、Ｚｅｉｓｓ ＥＬＹＲＡ Ｓ１を用いた超解像構造化照明顕微鏡（ＳＩＭ）によって画像化した。各画像について、５グリッド回転と最適なｚセクショニングパラメータを採用した。画像取得後、Ｚｅｉｓｓ Ｚｅｎ Ｂｌａｃｋ ２．３ ＳＰ１ソフトウェアでデフォルトのＳＩＭ処理パラメータを使用してＳＩＭ画像を再構築した。Ｉｍａｒｉｓバージョン９．２．０（Ｂｉｔｐｌａｎｅ）およびＦＩＪＩバージョン１．５２ｐの３Ｄスイートプラグインを使用して、自動ヌクレオポリンスポットおよび体積分析を、以前に記載されたように行った（６、２６）。ヌクレオポリンスポットは、自動スポット検出を使用してカウントした。体積、平均強度、およびコントラストの特徴を考慮したベイズ分類器を適用して、個々のスポットを検出し分割した。各核の全深度を含む分割されたＳＩＭ画像の３Ｄレンダリングにより、ヌクレオポリンスポットの総数が決定された。
【0108】
免疫蛍光ＳＩＭの解像度の限界のために個々のヌクレオポリンスポットが解像できなかった場合、ヌクレオポリンが占める全核体積の割合を算出した。全核体積を算出するために、各核について中央のｚスライスにおけるＸ軸とＹ軸の長さを測定し、Ｚ軸の長さは取得した画像の全ｚ深さから推定した。ヌクレオポリン体積を算出するために、画像スタックを自動閾値処理し、ＦＩＪＩの３Ｄスイートプラグインの自動閾値処理を使用して、各核の閾値領域の体積を決定した。代表的な画像は、Ｚｅｉｓｓ Ｚｅｎ Ｂｌａｃｋ ２．３ ＳＰ１で生成した３Ｄ最大強度投影として提示した。画像は、コントラストおよび表示のためにフェイクで緑色に着色した。
【0109】
［ヒト組織免疫蛍光法］
【0110】
非神経性コントロール、ならびにＣ９ｏｒｆ７２患者の死後パラフィン包埋運動および後頭部皮質切片は、Ｔａｒｇｅｔ ＡＬＳ Ｈｕｍａｎ Ｐｏｓｔｍｏｒｔｅｍ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｏｒｅを通じて入手した（人口統計情報については表Ｃを参照）。
【0111】
【表2】
【0112】
組織切片を、キシレン３×５分間、１００％エタノール２×５分間、９０％エタノール５分間、７０％エタノール５分間、最後にｄＨ２Ｏで３×５分間、徐々に再水和した。Ｔｉｓｓｕｅ－Ｔｅｋ抗原回収溶液（ＩＨＣ Ｗｏｒｌｄ）を用いて、スチーマーで１時間抗原回収を実施した。スライドを１０分間冷却し、ｄＨ２Ｏで３×５分間、１×ＰＢＳで２×５分間洗浄し、１×ＰＢＳで希釈した０．４％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を用いて１０分間シェーカー上で透過処理を行った。その後、スライドを１×ＰＢＳで３×５分間洗浄し、ＤＡＫＯプロテインフリー血清ブロック（ＤＡＫＯ）で４℃にて一晩ブロックした。組織切片を、バックグラウンド低減成分を含むＤＡＫＯ抗体希釈試薬で希釈した一次抗体（抗体情報については表Ｂを参照）と共に、４℃で合計２晩インキュベートした。２晩のインキュベーションの間に、スライドを一次抗体とともに、室温で穏やかに攪拌しながら１０時間インキュベートした。一次抗体の後、組織切片を１×ＰＢＳで３×５分間洗浄し、その後バックグラウンド低減成分を含むＤＡＫＯ抗体希釈試薬（ＤＡＫＯ）で希釈した二次抗体（抗体情報については表Ｂを参照）と共に、室温で穏やかに攪拌しながら１時間インキュベートした。
【0113】
【表3】
【0114】
次に、スライドを１×ＰＢＳで３×５分間洗浄し、２－３滴の自家蛍光除去試薬（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）でかるくすすぎ、１×ＰＢＳで５×５分間さらに洗浄して細片を除去した。組織切片を１×ＰＢＳで１：１０００に希釈したＨｏｅｓｃｈｔで２０分間染色し、１×ＰＢＳで３×５分間洗浄した。スライドを、ＤＡＰＩを含むＰｒｏｌｏｎｇ Ｇｏｌｄ Ａｎｔｉｆａｄｅ試薬を用いてカバースリップし、Ｍａｐ２陽性Ｌａｙｅｒ Ｖニューロンからの核を、２０×対物レンズおよびアポトーム２モジュールを備えたＺｅｉｓｓ Ａｘｉｏｉｍａｇｅｒ Ｚ２蛍光顕微鏡を用いて画像化した。
【0115】
ＣＨＭＰ７核／細胞質比は、ＦＩＪＩを使用して定量化した。簡潔には、可視核を有する焦点のニューロンを、Ｍａｐ２陽性およびＨｏｅｓｃｈｔシグナルによって同定した。小さなピクセルボックスを使用してＣＨＭＰ７チャンネルの蛍光強度を測定した。各細胞区画（核と細胞質）から２つの積分密度測定を行い、その平均値をその後の分析に使用した。細胞のない領域でバックグラウンド蛍光強度平均を５回測定し、その平均値を分析に使用した。核および細胞質の強度は、以下のように算出した：強度＝積分密度－（バックグラウンド強度平均＊細胞内の測定領域）。核／細胞質ＣＨＭＰ７比は、各細胞について、得られた核強度を細胞質強度で割ることにより算出した。画像は、Ｚｅｉｓｓ Ｚｅｎ Ｂｌｕｅ ２．３で生成されたデフォルトのアポトーム処理画像として提示した。
【0116】
［免疫沈降法］
【0117】
ＸＰＯ１：抗体をビーズに結合させるため、５０μＬのＭａｇｎｅｔｉｃ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇを１×ＰＢＳＴ（０．０２％Ｔｗｅｅｎ－２０）ですすぎ、平衡化した。ＰＢＳＴ洗浄液をビーズから除去して捨てた。次に、ビーズを、１×ＰＢＳＴで希釈（最終容量２００μＬ）した１０μｇのマウス抗ＸＰＯ１抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）またはマウスＩｇＧアイソタイプコントロール（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）抗体とともに、転倒回転させながら室温で１０分間インキュベートした。上清を捨て、抗体結合ビーズを２００μＬの１×ＰＢＳＴで洗浄した。その後、抗体結合ビーズを２００μＬの結合バッファー（２０ｍＭ ＮａＰＯ４、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）で２回洗浄した。その後、結合バッファーで希釈した２５０μＬの５ｍＭ ＢＳ３（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で、転倒回転させながら３０分間室温でインキュベートすることにより、抗体を磁気ダイナビーズに結合させた。カップリング反応は、１２．５μＬの１Ｍ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ ｐＨ７．５を加えて、転倒回転させながら室温で１５分間インキュベートさせることによってクエンチした。抗体結合ビーズをＩＰバッファー（ＩＰ溶解バッファー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、１×プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ）、０．４Ｕ／μＬ ＲＮａｓｉｎ Ｐｌｕｓ（Ｐｒｏｍｅｇａ））で３回洗浄した。
【0118】
核は、上記のようにｉＰＳＮから単離した。得られた核ペレットを、３０～４５秒間ボルテックスすることにより、１ｍＬのＩＰバッファーに溶解させた。核溶解液を、２５００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離し、細片を除去した。遠心分離後、上清を清潔なエッペンドルフチューブに移した。上清の２５μＬを２５μＬの２×レムリバッファー（Ｂｉｏｒａｄ）に加え、タンパク質インプットとして確保し、さらに２５μＬの上清をＲＮＡインプットとして氷上に確保した。残りの溶解液は、ＩｇＧおよびＸＰＯ１抗体結合ビーズチューブに均等に分けた。溶解液は、ビーズともに転倒回転させながら４℃で２時間インキュベートした。未結合の上清を捨て、４℃で転倒回転させながら、免疫沈降複合体を２００μＬのＩＰバッファーで３×５分間洗浄した。ビーズ－ＩＰ複合体を２００μＬのＩＰバッファーに再懸濁した。各ビーズ－ＩＰ複合体サンプルの１００μＬをＲＮＡ分析用に確保した。残りの１００μＬについては、上清を捨て、５０μＬの１×レムリバッファーをビーズ－ＩＰ複合体に添加した。すべてのＲＮＡサンプル（インプットを含む）を５００μＬのＲＬＴバッファー（ＱＩＡＧＥＮ）に加え、ＲＮＡ単離、ｃＤＮＡ合成、およびｑＲＴ－ＰＣＲを以下に記載するように実施した。タンパク質サンプルは、以下に記載するようにウェスタンブロットで分析した。各サンプルの等量（１０μＬ）をアクリルアミドゲルにロードした。
【0119】
ＮＸＦ１：ＮＸＦ１免疫沈降は、抗体－ビーズ結合を行わず、上記のように実施した。ウサギ抗ＮＸＦ１（Ａｂｃａｍ）およびウサギＩｇＧアイソタイプコントロール（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）抗体を使用した。
【0120】
［核／細胞質分画］
【0121】
ｉＰＳＮを１×ＰＢＳで洗浄し、核／細胞質分画をＮＥ－ＰＥＲ核および細胞質抽出キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてメーカーのプロトコルに従って実施した。Ｃ２バッファーの添加後、２５μＬのサンプルを２５μＬの２×レムリバッファー（Ｂｉｏｒａｄ）に添加し、タンパク質インプットとして確保した。さらに２５μＬをＲＮＡインプットとして氷上に確保した。得られた核および細胞質画分それぞれから、タンパク質分析のために２５μＬのサンプルを２５μＬの２×レムリバッファーに添加した。さらに２５μＬをＲＮＡ分析のために５００μＬのＲＬＴバッファー（ＱＩＡＧＥＮ）に添加した。各画分の残りは、－８０℃で保存した。分画の完了時に、５００μＬのＲＬＴバッファーをＲＮＡインプットサンプルに添加した。ＲＮＡ単離、ｃＤＮＡ合成、およびｑＲＴ－ＰＣＲは、以下に記載するように実施した。ウェスタンブロット分析は、以下に記載するように行った。各サンプルの等量（１０μＬ）をアクリルアミドゲルにロードした。
【0122】
［ｑＲＴ－ＰＣＲ］
【0123】
免疫沈降複合体または核および細胞質細胞画分からのＲＮＡを、メーカーのプロトコルに従ってＲＮｅａｓｙキット（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて単離した。ＲＮＡ濃度は、ＮａｎｏＤｒｏｐ１０００分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて決定した。免疫沈降複合体または核および細胞質細胞画分からのｍＲＮＡ転写物の検出のために、１μｇのＲＮＡをランダムヘキサマーおよびＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＶ第一鎖ｃＤＮＡ合成キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いたｃＤＮＡ合成に使用した。ｑＲＴ－ＰＣＲ反応は、ＴａｑＭａｎ遺伝子発現マスターミックス（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｓｔｅｐ Ｏｎｅ ＰｌｕｓリアルタイムＰＣＲ機（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、およびＴａｑＭａｎ遺伝子発現アッセイ（表Ｄを参照、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して行った。
【0124】
【表4】
【0125】
免疫沈降複合体または核および細胞質細胞画分からのＣ９ｏｒｆ７２ ＲＮＡの検出のために、１μｇのＲＮＡを、遺伝子特異的プライマーおよびＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＶ第一鎖ｃＤＮＡ合成キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いたｃＤＮＡ合成に使用した。ｑＲＴ－ＰＣＲ反応は、ＴａｑＭａｎ遺伝子発現マスターミックス（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、およびＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｓｔｅｐ Ｏｎｅ ＰｌｕｓリアルタイムＰＣＲ機（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、および以前に記載されたプライマー／プローブセット（６、３４）（配列については表Ｅを参照）を使用して実施した。すべての実験において、ＧＡＰＤＨを正規化に使用した。
【0126】
【表5】
【0127】
［ウェスタンブロット］
【0128】
核溶解液：核の単離後、核ペレットを、１×プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ）を含む２５μＬのＲＩＰＡバッファー（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）中に再懸濁した。ホモジネートを１２，０００ｇで１５分間遠心し、４℃でデブリを除去した。上清を新しいエッペンドルフチューブに移し、ＢＣＡタンパク質推定アッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、タンパク質濃度を決定した。４×レムリバッファー（Ｂｉｏｒａｄ）を各サンプルに１×の最終濃度になるように加え、サンプルを１００℃で５分間加熱し、５μｇのタンパク質を４－２０％アクリルアミドゲル（Ｂｉｏｒａｄ）にロードした。ゲルは、色素の前面が底に達するまで泳動した。Ｔｒａｎｓ－Ｂｌｏｔ Ｔｕｒｂｏ Ｔｒａｎｓｆｅｒシステム（Ｂｉｏｒａｄ）を用いて、タンパク質をニトロセルロース膜上に転写した。ブロットを１×ＴＢＳＴ（０．１％Ｔｗｅｅｎ－２０）中で５％脱脂乳を用いて３０分間ブロックし、ブロックで希釈した一次抗体とともに４℃で一晩インキュベートした（抗体情報については表Ｂを参照）。翌日、ブロットを１×ＴＢＳＴで４×１０分間洗浄し、ブロックで希釈した２次抗体（抗体情報については表Ｂを参照）を用いて室温で１時間プロービングした。続いてブロットを１×ＴＢＳＴで４×１０分間洗浄し、ＥＣＬ基質（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を３０秒間塗布した。化学発光画像は、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ ＬＡＳ ４０００システムで取得した。剥離せずに膜を順次プロービングするため、ブロットを室温の３０％Ｈ２Ｏ２で１５分間インキュベートすることで化学発光シグナルをクエンチした（３５）。分析はＦＩＪＩで行った。正規化にはラミンＢ１を使用した。
【0129】
ＡＳＯ処理したｉＰＳＮ溶解液：分化４０日目に、ｉＰＳＮを、Ｃａ２＋およびＭｇ２＋を含む氷冷１×ＤＰＢＳで洗浄した。各ウェルに１ｍＬの新鮮な１×ＤＰＢＳを加え、セルスクレーパーでｉＰＳＮを回収し、エッペンドルフチューブに移した。次に、細胞を２５００ｒｐｍ、４℃で５分間、ペレット化した。上清を吸引し、得られた細胞ペレットを、１×プロテアーゼ阻害剤カクテルを含む５０μＬのＲＩＰＡバッファーに溶解させた。ウェスタンブロットおよび分析は、上記のように実施した。ＧＡＰＤＨを正規化のために使用した。
【0130】
トリムアウェイサンプル：培地の吸引後、ｉＰＳＮを、Ｃａ２＋およびＭｇ２＋を含む氷冷１×ＤＰＢＳで洗浄した。各ウェルに１ｍＬの新鮮な１×ＤＰＢＳを加え、セルスクレーパーでｉＰＳＮを回収し、エッペンドルフチューブに移した。サンプルを２５００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離し、細胞をペレット化した。上清を吸引し、得られた細胞ペレットを、１×プロテアーゼ阻害剤カクテルを含む２５μＬのＲＩＰＡバッファーに溶解させた。ウェスタンブロットおよび分析は、上記のように実施した。ＧＡＰＤＨを正規化のために使用した。
【0131】
［ＣＨＭＰ７およびＶＰＳ４過剰発現のためのプラスミドおよびヌクレオフェクション］
【0132】
ＧＦＰタグ付きＣＨＭＰ７プラスミドは、Ｏｒｉｇｅｎｅ社から入手した。ＣＨＭＰ７ ＮＥＳ変異体（ＣＨＭＰ７ ＮＥＳ＊）プラスミドを生成するために、Ｑ５部位特異的変異誘発キット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）を用いて、ＣＨＭＰ７ ＧＦＰプラスミド（Ｏｒｉｇｅｎｅ）に１アミノ酸置換（アミノ酸４３０、ＬからＡ）を作製した。ＶＰＳ４ ＧＦＰおよびＶＰＳ４Ｅ２２８ＱＧＦＰプラスミドは、Ａｄｄｇｅｎｅ社から入手した。ＧＦＰコントロールプラスミドは、Ｏｒｉｇｅｎｅ社およびＡｄｄｇｅｎｅ社から入手した。ＲＮＡ Ｏｎｌｙプラスミド（１２）はＡｄｒｉａｎ Ｉｓｓａｃｓからの親切な贈り物であった。プラスミド情報については表Ｆを参照されたい。
【0133】
【表6】
【0134】
分化１８日目に、ｉＰＳＮをアキュターゼで解離させて単細胞解離を補助し、Ｌｏｎｚａ Ｐ３ Ｐｒｉｍａｒｙ Ｃｅｌｌ ４Ｄ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒキット（Ｌｏｎｚａ）およびＬｏｎｚａヌクレオフェクションシステムのプログラムＤＣ１０４を用いて、懸濁液にヌクレオフェクションした。各キュベットには、５×１０６個のｉＰＳＮおよび４μｇのプラスミドＤＮＡが含まれるようにした。ヌクレオフェクション後、ｉＰＳＮはＬｏｎｚａのプロトコルに従ってマトリゲル（Ｃｏｒｎｉｎｇ）コーティングされた細胞培養皿に播種した。分化１９日目および２２日目に培地を交換した。下流の実験は、分化２５日目に実施された。
【0135】
［トリムアウェイによるＣＨＭＰ７、ＬＥＭＤ２、およびＸＰＯ１のノックダウン］
【0136】
内在性ＣＨＭＰ７、ＬＥＭＤ２、およびＸＰＯ１のノックダウンは、修正したトリムアウェイプロトコル（１１）を使用して実施した。ＣＨＭＰ７（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ＬＥＭＤ２（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、およびＸＰＯ１（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）抗体は、Ｓｌｉｄｅ－Ａ－Ｌｙｚｅｒ ＭＩＮＩ透析装置、２０Ｋ ＭＷＣＯ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて１×ＰＢＳ中で透析した。ＰＢＳを２時間後に交換し、透析は室温で一晩穏やかに攪拌しながら進めた。透析した抗体をＵｌｔａｃｅｌｌ－１００膜付きＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔａ－０．５遠心式フィルターユニット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で濃縮した。得られた抗体濃度は、ＮａｎｏＤｒｏｐ１０００分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、以前に記載されたように算出した（１１）。分化１８日目に、ｉＰＳＮをアキュターゼで解離させた。懸濁液ベースのヌクレオフェクションは、Ｌｏｎｚａ Ｐ３ Ｐｒｉｍａｒｙ Ｃｅｌｌ ４Ｄ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒキット（Ｌｏｎｚａ）およびプログラムＤＣ１５４を用いて実施された。各キュベットには、５×１０６個のｉＰＳＮ、５μｇの抗体、および４μｇのＴｒｉｍ２１ ＧＦＰプラスミドＤＮＡ（Ｏｒｉｇｅｎｅ、表Ｆを参照）が含まれるようにした。ヌクレオフェクション後、ｉＰＳＮはＬｏｎｚａのプロトコルに従ってマトリゲル（Ｃｏｒｎｉｎｇ）コーティングされた細胞培養皿に再播種し、分化２０日目に下流分析に使用した。
【0137】
［グルタミン酸毒性］
【0138】
分化１２日目に、ｉＰＳＮを２４ウェル光学底プレート（Ｃｅｌｌｖｉｓ）に、１ウェルあたり２５０，０００ニューロンの密度で播種した。ニューロンを１×ＰＢＳで洗浄し、分化２５日目まで毎日、死細胞および細片を除去した新鮮なステージ３培地を供給した。分化２５日目に、上記のようにＡＳＯ処理を開始した。３日ごとに、ｉＰＳＮを１×ＰＢＳで３回洗浄し、培地およびＡＳＯを交換した。分化４０日目に、ｉＰＳＮを１×ＰＢＳで洗浄し、残った細片および死細胞を除去した。培地は、０または１０μＭのグルタミン酸（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を含むＡＣＳＦ（Ｔｏｃｒｉｓ）に交換した。ｉＰＳＮは、３７℃、５％ＣＯ２で４時間インキュベートした。３．５時間後、ＮｕｃＢｌｕｅ Ｌｉｖｅ ＲｅａｄｙＰｒｏｂｅｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）および１μＭヨウ化プロピジウム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を１滴加え、インキュベーターに３０分間戻した。ｉＰＳＮを、Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ８００共焦点顕微鏡を用いて環境制御チャンバー内で画像化した。１０倍の対物レンズで１ウェルあたり５枚の画像を取得した。ＰＩおよびＤＡＰＩスポットは、ＦＩＪＩを使用してカウントした。
【0139】
＜統計分析＞
すべてのデータ分析は、上記の各実験セクションに記載したように、ＩｍａｒｉｓまたはＦＩＪＩを用いて行い、完全に自動化または盲検化した。すべての統計分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍバージョン８（ＧｒａｐｈＰａｄ）を用いて実施した。ｉＰＳＣ株または患者ごとに複数の細胞または核を定量化したイメージング実験では、ｉＰＳＣ株または患者ごとに評価したすべての核または細胞の平均がＮ＝１となるように統計分析を実施し、実験およびグループごとの合計Ｎは「図面の説明」に示したとおりとした。Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定、Ｔｕｋｅｙの多重比較検定つき一元配置分散分析、またはＴｕｋｅｙの多重比較検定つき二元配置分散分析を、「図面の説明」に記載したように用いた。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５、＊＊＊ｐ＜０．０００５、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。バイオリンプロットを使用して、大規模なデータセット（＞１０データポイント）の完全な広がりとばらつきを表示した。中央の点線は中央値を示す。さらに２本の点線は、第一四分位数および第三四分位数を示す。より小さなデータセットでは、個々のデータポイントを表示する棒グラフを示し、エラーバーは＋／－ＳＥＭを示す。
すべてのデータ分析は、上記の各実験セクションに記載したように、ＩｍａｒｉｓまたはＦＩＪＩを用いて行い、完全に自動化または盲検化した。すべての統計分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍバージョン８（ＧｒａｐｈＰａｄ）を用いて実施した。ｉＰＳＣ株または患者ごとに複数の細胞または核を定量化したイメージング実験では、ｉＰＳＣ株または患者ごとに評価したすべての核または細胞の平均がＮ＝１となるように統計分析を実施し、実験およびグループごとの合計Ｎは「図面の説明」に示したとおりとした。Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定、Ｔｕｋｅｙの多重比較検定つき一元配置分散分析、またはＴｕｋｅｙの多重比較検定つき二元配置分散分析を、「図面の説明」に記載したように用いた。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５、＊＊＊ｐ＜０．０００５、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。バイオリンプロットを使用して、大規模なデータセット（＞１０データポイント）の完全な広がりとばらつきを表示した。中央の点線は中央値を示す。さらに２本の点線は、第一四分位数および第三四分位数を示す。より小さなデータセットでは、個々のデータポイントを表示する棒グラフを示し、エラーバーは＋／－ＳＥＭを示す。
【0140】
（実施例２）
｛ＣＨＭＰ７およびＶＰＳ４の核発現は、Ｇ４Ｃ２反復ＲＮＡの結果、Ｃ９ｏｒｆ７２ ｉＰＳＮおよび死後のヒト脳において増加する｝
最近、８つの特定のＮｕｐのタンパク質発現が、Ｃ９ｏｒｆ７２ヒトニューロンの核質およびＮＰＣ内で減少していることが立証された（１３）。酵母のＮＰＣ恒常性にＣＨＭＰ７およびＶＰＳ４が重要に関わっていることから（７－９）、これらのタンパク質の発現がＣ９ｏｒｆ７２核で病的に変化しているか否かが調べられた。超解像構造化照明顕微鏡（ＳＩＭ）を用いて核の分布および発現を視覚的に調べたところ、コントロールおよびＣ９ｏｒｆ７２ ｉＰＳＮから単離したＮｅｕＮ陽性核において、ＣＨＭＰ７およびＶＰＳ４の両方の免疫反応性が著しく増加した（図１Ａ～Ｃ）。興味深いことに、この増加は、Ｎｕｐの減少が以前に観察された時点（６）より前の時点でも観察された（分化１８日目、図１Ａ～Ｃ）。このことは、ＣＨＭＰ７がＮＰＣの損傷に反応するのではなく、その開始においてより直接的な役割を担い得ることを示唆している。さらに、ウェスタンブロット分析は、Ｃ９ｏｒｆ７２核におけるＣＨＭＰ７およびＶＰＳ４タンパク質レベルの増加を定量的に確認した（図１Ｄ～Ｅ）。
｛ＣＨＭＰ７およびＶＰＳ４の核発現は、Ｇ４Ｃ２反復ＲＮＡの結果、Ｃ９ｏｒｆ７２ ｉＰＳＮおよび死後のヒト脳において増加する｝
最近、８つの特定のＮｕｐのタンパク質発現が、Ｃ９ｏｒｆ７２ヒトニューロンの核質およびＮＰＣ内で減少していることが立証された（１３）。酵母のＮＰＣ恒常性にＣＨＭＰ７およびＶＰＳ４が重要に関わっていることから（７－９）、これらのタンパク質の発現がＣ９ｏｒｆ７２核で病的に変化しているか否かが調べられた。超解像構造化照明顕微鏡（ＳＩＭ）を用いて核の分布および発現を視覚的に調べたところ、コントロールおよびＣ９ｏｒｆ７２ ｉＰＳＮから単離したＮｅｕＮ陽性核において、ＣＨＭＰ７およびＶＰＳ４の両方の免疫反応性が著しく増加した（図１Ａ～Ｃ）。興味深いことに、この増加は、Ｎｕｐの減少が以前に観察された時点（６）より前の時点でも観察された（分化１８日目、図１Ａ～Ｃ）。このことは、ＣＨＭＰ７がＮＰＣの損傷に反応するのではなく、その開始においてより直接的な役割を担い得ることを示唆している。さらに、ウェスタンブロット分析は、Ｃ９ｏｒｆ７２核におけるＣＨＭＰ７およびＶＰＳ４タンパク質レベルの増加を定量的に確認した（図１Ｄ～Ｅ）。
【0141】
ｉＰＳＮにおける我々の結果がヒトの疾患病態を再現していることを検証するために、コントロールおよびＣ９ｏｒｆ７２死後脊髄、ならびに運動皮質および後頭部皮質組織から核を単離し、ＣＨＭＰ７およびＶＰＳ４についてＳＩＭを実施した。健常な後頭皮質ではなく、疾患関連ＣＮＳ領域（胸髄および運動皮質）において、ＣＨＭＰ７およびＶＰＳ４の核発現に同様の増加が観察された（図１Ｆ～Ｈ）。さらに、薄切片の免疫蛍光染色により、死後患者の、後頭皮質ではなく運動皮質のＭａｐ２陽性ニューロンにおいて、ＣＨＭＰ７の核への著しい再局在化が明らかになった（図２）。
【0142】
Ｎｕｐの変化は、ＤＰＲまたはＣ９ＯＲＦ７２タンパク質の損失ではなく、Ｇ４Ｃ２反復ＲＮＡの伸長の病的な結果であることが知られている（６）。ＣＨＭＰ７およびＶＰＳ４の核内増加が、同様にＧ４Ｃ２反復ＲＮＡによって媒介されるか否かを決定するために、Ｇ４Ｃ２反復ＲＮＡのみを生産する停止コドン最適化構築物を過剰発現するコントロールｉＰＳＮから単離した核に対して、ＳＩＭを実施した（１２）。３６個ではなく、１０６個または２８８個のＧ４Ｃ２反復を過剰発現させると、核内ＣＨＭＰ７およびＶＰＳ４免疫反応性が有意に増加した（図８）。まとめると、これらのデータは、ＣＨＭＰ７およびＶＰＳ４の核局在が、Ｇ４Ｃ２反復ＲＮＡの伸長の結果、Ｃ９ｏｒｆ７２ニューロン核において病的に増加することを示唆している。
【0143】
（実施例３）
｛ＣＨＭＰ７タンパク質のノックダウンは、Ｃ９ｏｒｆ７２ ｉＰＳＮにおける特定のＮｕｐの核発現を回復させる｝
ＣＨＭＰ７は、ＮｕｐおよびＮＰＣの分解を媒介する初期作用因子として以前に関連付けられているため（７－９）、ＣＨＭＰ７の核内増加は、Ｃ９ｏｒｆ７２ニューロン核およびＮＰＣにおけるＮｕｐ発現の減少につながるかもしれないと仮定した。これを確認するため、トリムアウェイ法（１１）を用いて、コントロールおよびＣ９ｏｒｆ７２ ｉＰＳＮの内在性ＣＨＭＰ７タンパク質を急速に分解した（図３Ａ～Ｃ）。ＳＩＭを使用して、ＣＨＭＰ７のＴｒｉｍ２１ＧＦＰ媒介ノックダウン（図３Ｄ～Ｅ）は、Ｃ９ｏｒｆ７２ ｉＰＳＮ核におけるＮｕｐ５０、ＰＯＭ１２１、およびＮｕｐ１３３免疫反応性の減少を有意に緩和したことが明らかになった（図３Ｄ、３Ｇ～Ｉ）。重要なことに、ＣＨＭＰ７のノックダウンは、ｍＡｂ４１４染色によってアッセイされたように、Ｎｕｐを含むＦＧ反復には影響を与えなかった（図３Ｄ、３Ｊ）ことから、核内ＣＨＭＰ７の増加は、ヒトニューロンにおけるＮｕｐのサブセットの核レベルにのみ影響を与え得ることが示唆された。さらに、一般にＥＳＣＲＴに媒介される細胞プロセスの末端工程で作用するＶＰＳ４は（１３）、ＣＨＭＰ７ノックダウンによりＣ９ｏｒｆ７２ ｉＰＳＮ核で減少した（図３Ｄ、３Ｆ）。ＣＨＭＰ７の下流のＶＰＳ４の機能と一致して、ＶＰＳ４のＧＦＰタグ付きドミナントネガティブバリアント（ＶＰＳ４Ｅ２２８Ｑ、図９Ａ、９Ｃ）の過剰発現は、ＰＯＭ１２１の核発現を一部のみ回復させ（図９Ａ、９Ｄ）、Ｃ９ｏｒｆ７２ ｉＰＳＮ核における核内ＣＨＭＰ７の増加に対して影響を与えなかった（図９Ａ～Ｂ）。興味深いことに、ＰＯＭ１２１の分布は、ＶＰＳ４Ｅ２２８Ｑを過剰発現するＣ９ｏｒｆ７２核において異常であるようである（図９Ａ）。これらのデータから、核内ＣＨＭＰ７の増加は、Ｃ９ｏｒｆ７２核内の神経細胞ＮＰＣの複数のサブ複合体にまたがる特定のＮｕｐの核内レベルに影響を与える病理的カスケードを開始することができると示唆される。
｛ＣＨＭＰ７タンパク質のノックダウンは、Ｃ９ｏｒｆ７２ ｉＰＳＮにおける特定のＮｕｐの核発現を回復させる｝
ＣＨＭＰ７は、ＮｕｐおよびＮＰＣの分解を媒介する初期作用因子として以前に関連付けられているため（７－９）、ＣＨＭＰ７の核内増加は、Ｃ９ｏｒｆ７２ニューロン核およびＮＰＣにおけるＮｕｐ発現の減少につながるかもしれないと仮定した。これを確認するため、トリムアウェイ法（１１）を用いて、コントロールおよびＣ９ｏｒｆ７２ ｉＰＳＮの内在性ＣＨＭＰ７タンパク質を急速に分解した（図３Ａ～Ｃ）。ＳＩＭを使用して、ＣＨＭＰ７のＴｒｉｍ２１ＧＦＰ媒介ノックダウン（図３Ｄ～Ｅ）は、Ｃ９ｏｒｆ７２ ｉＰＳＮ核におけるＮｕｐ５０、ＰＯＭ１２１、およびＮｕｐ１３３免疫反応性の減少を有意に緩和したことが明らかになった（図３Ｄ、３Ｇ～Ｉ）。重要なことに、ＣＨＭＰ７のノックダウンは、ｍＡｂ４１４染色によってアッセイされたように、Ｎｕｐを含むＦＧ反復には影響を与えなかった（図３Ｄ、３Ｊ）ことから、核内ＣＨＭＰ７の増加は、ヒトニューロンにおけるＮｕｐのサブセットの核レベルにのみ影響を与え得ることが示唆された。さらに、一般にＥＳＣＲＴに媒介される細胞プロセスの末端工程で作用するＶＰＳ４は（１３）、ＣＨＭＰ７ノックダウンによりＣ９ｏｒｆ７２ ｉＰＳＮ核で減少した（図３Ｄ、３Ｆ）。ＣＨＭＰ７の下流のＶＰＳ４の機能と一致して、ＶＰＳ４のＧＦＰタグ付きドミナントネガティブバリアント（ＶＰＳ４Ｅ２２８Ｑ、図９Ａ、９Ｃ）の過剰発現は、ＰＯＭ１２１の核発現を一部のみ回復させ（図９Ａ、９Ｄ）、Ｃ９ｏｒｆ７２ ｉＰＳＮ核における核内ＣＨＭＰ７の増加に対して影響を与えなかった（図９Ａ～Ｂ）。興味深いことに、ＰＯＭ１２１の分布は、ＶＰＳ４Ｅ２２８Ｑを過剰発現するＣ９ｏｒｆ７２核において異常であるようである（図９Ａ）。これらのデータから、核内ＣＨＭＰ７の増加は、Ｃ９ｏｒｆ７２核内の神経細胞ＮＰＣの複数のサブ複合体にまたがる特定のＮｕｐの核内レベルに影響を与える病理的カスケードを開始することができると示唆される。
【0144】
（実施例４）
｛ＣＨＭＰ７のＡＳＯ媒介ノックダウンは、Ｎｕｐの変化を緩和し、神経細胞の生存を改善する。｝
ＡＳＯは、現在、目的の遺伝子のｍＲＮＡおよびタンパク質レベルを低減する治療戦略として一般的に使用されている（１４、１５）。この治療戦略がＮＰＣ損傷を効果的に軽減するかどうかを評価するために、ヒトＣＨＭＰ７のｍＲＮＡ前駆体を特異的に標的とし、ＲＮａｓｅ Ｈベースのメカニズムでその分解を誘導するＡＳＯを設計した。スクランブルコントロールＡＳＯと比較して、３種類の異なるＣＨＭＰ７標的ＡＳＯに２週間曝露すると、コントロールおよびＣ９ｏｒｆ７２ ｉＰＳＮにおけるＣＨＭＰ７タンパク質レベルが用量依存的に有意に減少した（図１０）。我々のトリムアウェイ実験（図３）と一致して、ＣＨＭＰ７ ＡＳＯ処理は、コントロールおよびＣ９ｏｒｆ７２ ｉＰＳＮにおいて、ＥＳＣＲＴ－ＩＩＩタンパク質ＣＨＭＰ７およびＶＰＳ４の両方の核レベルを有意に低減した（図４Ａ～Ｃ）。さらに、スクランブルコントロールＡＳＯと比較して、５μＭのＣＨＭＰ７ ＡＳＯ２は、ＳＩＭによって評価されるように、Ｃ９ｏｒｆ７２ ｉＰＳＮ核およびＮＰＣにおけるＰＯＭ１２１、Ｎｕｐ１３３、およびＮｕｐ５０発現を有意に回復した（図４Ａ、４Ｄ～Ｆ）。重要なことに、ＣＨＭＰ７ ＡＳＯで処理したコントロールｉＰＳＮ（図４Ａ、４Ｄ～Ｇ）でも、Ｃ９ｏｒｆ７２ ｉＰＳＮのＦＧ Ｎｕｐ（図４Ａ、４Ｇ）でも、Ｎｕｐの破壊は観察されず、ＣＨＭＰ７タンパク質レベルのＡＳＯ媒介ノックダウンがｉＰＳＮにおける疾患に関連するＮｕｐの変化を特異的に軽減させることを示唆した。さらに、ＣＨＭＰ７ ＡＳＯは、以前に記載されたように（６、１６）、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）取り込みによって測定されるグルタミン酸誘導興奮毒性に対するＣ９ｏｒｆ７２ ｉＰＳＮの感受性（図４Ｈ）を有意に低下させた。まとめると、これらのデータは、ＣＨＭＰ７ ＡＳＯが、Ｃ９ｏｒｆ７２ ｉＰＳＮにおけるＮｕｐ欠陥および下流の神経細胞死を効果的に軽減できることを示唆する。
｛ＣＨＭＰ７のＡＳＯ媒介ノックダウンは、Ｎｕｐの変化を緩和し、神経細胞の生存を改善する。｝
ＡＳＯは、現在、目的の遺伝子のｍＲＮＡおよびタンパク質レベルを低減する治療戦略として一般的に使用されている（１４、１５）。この治療戦略がＮＰＣ損傷を効果的に軽減するかどうかを評価するために、ヒトＣＨＭＰ７のｍＲＮＡ前駆体を特異的に標的とし、ＲＮａｓｅ Ｈベースのメカニズムでその分解を誘導するＡＳＯを設計した。スクランブルコントロールＡＳＯと比較して、３種類の異なるＣＨＭＰ７標的ＡＳＯに２週間曝露すると、コントロールおよびＣ９ｏｒｆ７２ ｉＰＳＮにおけるＣＨＭＰ７タンパク質レベルが用量依存的に有意に減少した（図１０）。我々のトリムアウェイ実験（図３）と一致して、ＣＨＭＰ７ ＡＳＯ処理は、コントロールおよびＣ９ｏｒｆ７２ ｉＰＳＮにおいて、ＥＳＣＲＴ－ＩＩＩタンパク質ＣＨＭＰ７およびＶＰＳ４の両方の核レベルを有意に低減した（図４Ａ～Ｃ）。さらに、スクランブルコントロールＡＳＯと比較して、５μＭのＣＨＭＰ７ ＡＳＯ２は、ＳＩＭによって評価されるように、Ｃ９ｏｒｆ７２ ｉＰＳＮ核およびＮＰＣにおけるＰＯＭ１２１、Ｎｕｐ１３３、およびＮｕｐ５０発現を有意に回復した（図４Ａ、４Ｄ～Ｆ）。重要なことに、ＣＨＭＰ７ ＡＳＯで処理したコントロールｉＰＳＮ（図４Ａ、４Ｄ～Ｇ）でも、Ｃ９ｏｒｆ７２ ｉＰＳＮのＦＧ Ｎｕｐ（図４Ａ、４Ｇ）でも、Ｎｕｐの破壊は観察されず、ＣＨＭＰ７タンパク質レベルのＡＳＯ媒介ノックダウンがｉＰＳＮにおける疾患に関連するＮｕｐの変化を特異的に軽減させることを示唆した。さらに、ＣＨＭＰ７ ＡＳＯは、以前に記載されたように（６、１６）、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）取り込みによって測定されるグルタミン酸誘導興奮毒性に対するＣ９ｏｒｆ７２ ｉＰＳＮの感受性（図４Ｈ）を有意に低下させた。まとめると、これらのデータは、ＣＨＭＰ７ ＡＳＯが、Ｃ９ｏｒｆ７２ ｉＰＳＮにおけるＮｕｐ欠陥および下流の神経細胞死を効果的に軽減できることを示唆する。
【0145】
（実施例５）
｛ＬＥＭＤ２は、Ｃ９ｏｒｆ７２ ｉＰＳＮにおける核内ＣＨＭＰ７の増加を媒介しない｝
核内ＣＨＭＰ７の増加がＶＰＳ４および特定のＮｕｐの核発現に影響を与え得ることを立証したので、次に、この病態がＣ９ｏｒｆ７２核において生じるメカニズムを決定することが求められた。酵母およびヒトＣＨＭＰ７オーソログがともに、内在性ＩＮＭタンパク質ＬＥＭＤ２によって核膜に動員されるため（９、１７）、トリムアウェイ法を用いて、コントロールおよびＣ９ｏｒｆ７２ ｉＰＳＮにおいてＬＥＭＤ２を内因的にノックダウンした（図５Ａ～Ｃ）。ＣＨＭＰ７のノックダウンとは対照的に、核内ＬＥＭＤ２のわずかではあるが有意な減少は、ＣＨＭＰ７、ＶＰＳ４、または特定のＮｕｐの核内免疫反応性に影響を与えないことがＳＩＭを用いて判明した（図５Ｄ～Ｋ）。したがって、このデータは、ＬＥＭＤ２が媒介するＣＨＭＰ７の核膜への動員が、Ｃ９ｏｒｆ７２ ｉＰＳＮにおけるＣＨＭＰ７の核発現の増加の原因ではないことを示唆する。
｛ＬＥＭＤ２は、Ｃ９ｏｒｆ７２ ｉＰＳＮにおける核内ＣＨＭＰ７の増加を媒介しない｝
核内ＣＨＭＰ７の増加がＶＰＳ４および特定のＮｕｐの核発現に影響を与え得ることを立証したので、次に、この病態がＣ９ｏｒｆ７２核において生じるメカニズムを決定することが求められた。酵母およびヒトＣＨＭＰ７オーソログがともに、内在性ＩＮＭタンパク質ＬＥＭＤ２によって核膜に動員されるため（９、１７）、トリムアウェイ法を用いて、コントロールおよびＣ９ｏｒｆ７２ ｉＰＳＮにおいてＬＥＭＤ２を内因的にノックダウンした（図５Ａ～Ｃ）。ＣＨＭＰ７のノックダウンとは対照的に、核内ＬＥＭＤ２のわずかではあるが有意な減少は、ＣＨＭＰ７、ＶＰＳ４、または特定のＮｕｐの核内免疫反応性に影響を与えないことがＳＩＭを用いて判明した（図５Ｄ～Ｋ）。したがって、このデータは、ＬＥＭＤ２が媒介するＣＨＭＰ７の核膜への動員が、Ｃ９ｏｒｆ７２ ｉＰＳＮにおけるＣＨＭＰ７の核発現の増加の原因ではないことを示唆する。
【0146】
（実施例６）
｛ＣＨＭＰ７核外輸送の阻害は、特定のヌクレオポリンにおける、Ｃ９ｏｒｆ７２に媒介される減少を再現する｝
摂動を受けない状態では、酵母およびヒトＣＨＭＰ７はともに、ＸＰＯ１／ＣＲＭ１による核外輸送のため核内に蓄積できない（８、１８）。そこで、レプトマイシンＢ（ＬＭＢ）を用いてＸＰＯ１機能全体を強力に阻害し（１９）、ＣＨＭＰ７、ＶＰＳ４、および特定のヌクレオポリンについてＳＩＭを実施した。発表されたデータと一致して（８、１８）、ＬＭＢ処理は核内のＣＨＭＰ７の有意な増加をもたらした（図６Ａ～Ｂ）。驚くべきことに、これは、野生型ｉＰＳＮから単離した核において、ＶＰＳ４の増加、ならびにそれに伴うＮｕｐ５０、ＰＯＭ１２１、およびＮｕｐ１３３の減少と同時に起こり、しかしＦＧ－Ｎｕｐ免疫反応性の減少は伴わなかった（図６Ａ－６Ｂ）。これらの結果は、トリムアウェイを用いたＸＰＯ１レベルの直接の低減によっても再現された（図１１）。したがって、ＸＰＯ１に媒介される核外輸送を全体的に阻害することにより、疾患表現型を野生型ヒトニューロンにおいて再現することができた。
｛ＣＨＭＰ７核外輸送の阻害は、特定のヌクレオポリンにおける、Ｃ９ｏｒｆ７２に媒介される減少を再現する｝
摂動を受けない状態では、酵母およびヒトＣＨＭＰ７はともに、ＸＰＯ１／ＣＲＭ１による核外輸送のため核内に蓄積できない（８、１８）。そこで、レプトマイシンＢ（ＬＭＢ）を用いてＸＰＯ１機能全体を強力に阻害し（１９）、ＣＨＭＰ７、ＶＰＳ４、および特定のヌクレオポリンについてＳＩＭを実施した。発表されたデータと一致して（８、１８）、ＬＭＢ処理は核内のＣＨＭＰ７の有意な増加をもたらした（図６Ａ～Ｂ）。驚くべきことに、これは、野生型ｉＰＳＮから単離した核において、ＶＰＳ４の増加、ならびにそれに伴うＮｕｐ５０、ＰＯＭ１２１、およびＮｕｐ１３３の減少と同時に起こり、しかしＦＧ－Ｎｕｐ免疫反応性の減少は伴わなかった（図６Ａ－６Ｂ）。これらの結果は、トリムアウェイを用いたＸＰＯ１レベルの直接の低減によっても再現された（図１１）。したがって、ＸＰＯ１に媒介される核外輸送を全体的に阻害することにより、疾患表現型を野生型ヒトニューロンにおいて再現することができた。
【0147】
ＬＭＢ処理をしたｉＰＳＮにおけるＮｕｐレベルの低下が、ＣＨＭＰ７の核外輸送を特異的に阻害したことによる直接的な結果であるかどうかを判定するために、ＣＨＭＰ７の核外輸送配列（ＮＥＳ）を、ＣＨＭＰ７ ＮＥＳ配列（ＬＥＡＥＬＥＫＬＳＬＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１））に１アミノ酸置換（ＬからＡ、アミノ酸４３０）を行うことで変異させた。以前に記載されたように（８）、この単一点変異は、ＸＰＯ１に媒介されるＣＨＭＰ７の核外輸送を抑制するのに十分である（３４）。野生型ｉＰＳＮにおいて、野生型ＧＦＰタグ付きＣＨＭＰ７ではなく、ＧＦＰタグ付きＣＨＭＰ７ ＮＥＳ変異体（ＣＨＭＰ７ ＮＥＳ＊）を過剰発現させると、ＳＩＭによって評価されたように、Ｃ９ｏｒｆ７２に媒介される核ＣＨＭＰ７、ＶＰＳ４、Ｎｕｐ５０、ＰＯＭ１２１およびＮｕｐ１３３レベルの変化が再現された（図６Ｃ～Ｉ）。まとめると、このデータは、ＣＨＭＰ７の異常な核蓄積は、Ｃ９ｏｒｆ７２ ｉＰＳＮ核におけるＮｕｐレベルの変化を促進するのに十分であることを示唆する。
【0148】
（実施例７）
｛Ｇ４Ｃ２反復ＲＮＡは、核内ＸＰＯ１複合体におけるＣＨＭＰ７の存在量を低減する｝
データは、病的なＧ４Ｃ２反復ＲＮＡの発現が、核内ＣＨＭＰ７およびＶＰＳ４レベルの増加をもたらし（図８）、野生型ｉＰＳＮにおけるＣＨＭＰ７の核外輸送障害が、特定のＮｕｐにおけるＣ９ｏｒｆ７２に媒介される変化を再現できる（図６）ことを立証した。したがって、Ｇ４Ｃ２反復ＲＮＡがＣＨＭＰ７とＸＰＯ１との間の会合を破壊し、ＣＨＭＰ７の核内蓄積をもたらすかもしれないと仮定した。これを確認するために、共免疫沈降を実施してヒトニューロンのＸＰＯ１複合体中に存在する核タンパク質およびＲＮＡプールの比率を調べた。ウェスタンブロット分析により、既知のＸＰＯ１相互作用タンパク質ＮＸＦ３およびＨｕＲ（２１－２３）を含む核関連ＸＰＯ１複合体を効率的に免疫沈降させたことが確認された（図７Ａ、７Ｃ～Ｄ）。ＬＥＭＤ２およびラミンＢ１を含まないが（図７Ａ）、これらの免疫沈降複合体はＤＤＸ３ＸおよびＲａｎＢＰ１を含む（図７Ａ、７Ｅ～Ｆ）。ＤＤＸ３ＸおよびＲａｎＢＰ１がともに予測されるＮＥＳを含み、ＬＭＢ処理は非神経細胞株（２４）およびｉＰＳＮ（図１２Ａ～Ｃ）においてそれらの核内レベルを増加させることから、両方のタンパク質がＸＰＯ１の積荷であることが示唆された。興味深いことに、これらの特定の積荷タンパク質の核プールと、ＸＰＯ１複合体との会合は、Ｃ９ｏｒｆ７２ ＨＲＥにおいては破壊されない（図７Ａ、７Ｅ～Ｆ）。対照的に、Ｃ９ｏｒｆ７２ ｉＰＳＮ核において、ＣＨＭＰ７の核プールと免疫沈降ＸＰＯ１複合体との会合（図７Ａ～Ｂ）は、コントロールと比較して有意に減少していた。
｛Ｇ４Ｃ２反復ＲＮＡは、核内ＸＰＯ１複合体におけるＣＨＭＰ７の存在量を低減する｝
データは、病的なＧ４Ｃ２反復ＲＮＡの発現が、核内ＣＨＭＰ７およびＶＰＳ４レベルの増加をもたらし（図８）、野生型ｉＰＳＮにおけるＣＨＭＰ７の核外輸送障害が、特定のＮｕｐにおけるＣ９ｏｒｆ７２に媒介される変化を再現できる（図６）ことを立証した。したがって、Ｇ４Ｃ２反復ＲＮＡがＣＨＭＰ７とＸＰＯ１との間の会合を破壊し、ＣＨＭＰ７の核内蓄積をもたらすかもしれないと仮定した。これを確認するために、共免疫沈降を実施してヒトニューロンのＸＰＯ１複合体中に存在する核タンパク質およびＲＮＡプールの比率を調べた。ウェスタンブロット分析により、既知のＸＰＯ１相互作用タンパク質ＮＸＦ３およびＨｕＲ（２１－２３）を含む核関連ＸＰＯ１複合体を効率的に免疫沈降させたことが確認された（図７Ａ、７Ｃ～Ｄ）。ＬＥＭＤ２およびラミンＢ１を含まないが（図７Ａ）、これらの免疫沈降複合体はＤＤＸ３ＸおよびＲａｎＢＰ１を含む（図７Ａ、７Ｅ～Ｆ）。ＤＤＸ３ＸおよびＲａｎＢＰ１がともに予測されるＮＥＳを含み、ＬＭＢ処理は非神経細胞株（２４）およびｉＰＳＮ（図１２Ａ～Ｃ）においてそれらの核内レベルを増加させることから、両方のタンパク質がＸＰＯ１の積荷であることが示唆された。興味深いことに、これらの特定の積荷タンパク質の核プールと、ＸＰＯ１複合体との会合は、Ｃ９ｏｒｆ７２ ＨＲＥにおいては破壊されない（図７Ａ、７Ｅ～Ｆ）。対照的に、Ｃ９ｏｒｆ７２ ｉＰＳＮ核において、ＣＨＭＰ７の核プールと免疫沈降ＸＰＯ１複合体との会合（図７Ａ～Ｂ）は、コントロールと比較して有意に減少していた。
【0149】
ｑＲＴ－ＰＣＲを使用して、病的Ｇ４Ｃ２およびＧ２Ｃ４反復ＲＮＡの両方が、正規のＮＸＦ－ＮＸＴ１ ｍＲＮＡ輸送経路（２１～２３）の主要構成要素であるＮＸＦ１ではなく（図１３）、ＸＰＯ１との複合体にも存在する（図７Ｇ）ことを発見した。特に、Ｇ４Ｃ２およびＧ２Ｃ４反復ＲＮＡのＸＰＯ１複合体との会合が、核外輸送が少なくとも部分的にＸＰＯ１によって支配され得るＲＮＡ（１８Ｓ ｒＲＮＡ、ならびにＲＮＡ ＭＡＰ１ＢおよびＥＬＡＶＬ３を含むＡＲＥ配列）（３５－３７）のそれと比較して増加した（図７Ｇ）。
【0150】
センス鎖Ｇ４Ｃ２反復上流のイントロンを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）で５日間処理すると、Ｇ４Ｃ２反復ＲＮＡは減少するがＤＰＲレベルは減少せず、ＰＯＭ１２１の変化が緩和されることが以前に立証されている（６）。そこで、Ｇ４Ｃ２反復ＲＮＡの減少が、ＣＨＭＰ７とＸＰＯ１複合体との会合に影響を与えるか否かを評価した。短期のＡＳＯ処理の後、ＸＰＯ１複合体中のＧ４Ｃ２およびＧ２Ｃ４反復ＲＮＡの両方の存在量の減少が確認された（図７Ｇ）。さらに、ウェスタンブロット分析により、ＣＨＭＰ７と核内ＸＰＯ１複合体との会合が回復したことが明らかになった（図７Ａ～Ｂ）。まとめると、これらのデータは、Ｇ４Ｃ２反復ＲＮＡが、全体的な積荷輸送を妨害することなく、ＣＨＭＰ７のＸＰＯ１複合体との会合を特異的に破壊して、Ｃ９ｏｒｆ７２ ＡＬＳ／ＦＴＤの発病におけるＮｕｐの変化を開始し得ることを示唆している。
【0151】
病的なＮｕｐの変化は、ＡＬＳ、ＡＤ、およびＨＤを含む複数の神経変性疾患において広く見られる（１、２５－２７）。しかし、これらの破壊が起こる分子メカニズムは、まだ十分に理解されていない。Ｃ９ｏｒｆ７２ ＡＬＳ／ＦＴＤの人工過剰発現マウスモデルで観察されたＮｕｐの誤局在とは対照的に（２－５）、ヒトニューロンにおいては、ＮＰＣの複数のサブ複合体にまたがる８つの特定のＮｕｐの核内レベルが低下しており、対応する細胞質への蓄積は起こらないことが以前に示されている（６）。その結果、Ｃ９ｏｒｆ７２ ｉＰＳＮにおけるＮｕｐ発現の低下には、Ｎｕｐの監視および恒常性の変化が寄与し得ると仮定された。
【0152】
酵母および非神経細胞系における最近の研究により、ＣＨＭＰ７およびＥＳＣＲＴ－ＩＩＩに媒介される分解が、ＮＰＣ、Ｎｕｐ、および核膜の恒常性の重要なメディエータであることが明らかになった（７、９、１０、２８）。しかし、この経路の神経生物学および疾患の病態生理に対する寄与は、依然として不明である。Ｃ９ｏｒｆ７２ ＡＬＳのｉＰＳＮモデルを用いて、ＣＨＭＰ７が疾患の発病の初期段階において、ＮＰＣの３つの異なるドメイン内に位置する主要なＮｕｐの核内レベルの低下に寄与することが明らかになった。これらのデータは、ＣＨＭＰ７およびＥＳＣＲＴ－ＩＩＩが媒介するＮｕｐプロテオスタシスの、ヒトニューロンおよび神経変性における機能的な役割を定義している。これらのデータをまとめると、病的なＧ４Ｃ２反復ＲＮＡがＣＨＭＰ７とＸＰＯ１との会合を妨害するというモデルが裏付けられる（図１４参照）。注目すべきことに、積荷タンパク質ＤＤＸ３ＸおよびＲａｎＢＰ１を含む他のＮＥＳとＸＰＯ１との会合は、Ｃ９ｏｒｆ７２核において変化しておらず、Ｇ４Ｃ２反復ＲＮＡの伸長が、全体ではなく、特定のＸＰＯ１積荷の核外輸送に影響を与え得ることが示唆された。同様にＣＨＭＰ７の核外輸送が特異的に阻害されることで、下流の病的カスケードが開始され、それに引き続いてＶＰＳ４が動員され、それがヒトニューロンにおける特定のＮｕｐの核内レベルの減少を媒介し得る（図１４参照）。今後、内在性Ｇ４Ｃ２反復ＲＮＡがＣＨＭＰ７および／またはＸＰＯ１の特定のドメインに直接結合し、ＸＰＯ１積荷全体の会合を明白に破壊することなく、この特定のタンパク質－タンパク質相互作用を妨害するか否かを判定するために、さらなる実験が必要である。
【0153】
以前の研究では、ＮＸＴ１のノックダウンが、人工過剰発現の非ＣＮＳ細胞系において核内Ｇ４Ｃ２反復ＲＮＡレベルを増加させることが示唆されている（２９）。興味深いことに、ＮＸＴ１はＮＸＦ１－ＮＸＴ１核外ＲＮＡ輸送経路の重要な構成要素であるが（２１－２３）、ＮＸＴ１はＣＲＭ１／ＸＰＯ１とも会合することが示されている（４４）。ここで、内在性レベルのＣ９ｏｒｆ７２ ＨＲＥを発現するヒトｉＰＳＮにおいて、Ｇ４Ｃ２およびＧ２Ｃ４反復ＲＮＡはＸＰＯ１と強く会合するが、ＮＸＦ１核複合体とは会合しないことが示された（図７Ｇ、図１３）。さらに、Ｃ９ｏｒｆ７２ ｉＰＳＮをＸＰＯ１阻害剤であるＬＭＢで処理すると、核画分中のＧ４Ｃ２およびＧ２Ｃ４反復ＲＮＡの存在量が強く増加する（図１２Ｄ～Ｅ）。これらのデータから、Ｇ４Ｃ２およびＧ２Ｃ４反復ＲＮＡの核外輸送は、ヒトニューロンにおいて少なくとも部分的にＸＰＯ１複合体によって媒介され得ることが示唆される。注目すべきことに、ＮＸＦ１－ＮＸＴ１経路が複数の細胞種における主要なｍＲＮＡ輸送経路である一方で、ＸＰＯ１は、異なる「アダプタ（adapter）」タンパク質と組み合わせて、いくつかの特定のイントロンを含むｍＲＮＡを含む様々なＲＮＡ種の輸送において機能できることが示されている（２１、２３）。
【0154】
ＥＳＣＲＴ－ＩＩＩに媒介されるＮＰＣおよび核膜修復は、核特異的ＥＳＣＲＴアダプタタンパク質ＣＨＭＰ７（３１）によって開始され、ＶＰＳ４によって触媒されるが（７－９、１３、３１、３２）、このプロセスにおける他のＣＨＭＰの動員および関与は、ヒトニューロンを含む複数の細胞系において依然として不明である。ＥＳＣＲＴ－ＩＩＩ経路の構成要素であるＣＨＭＰ２Ｂの変異がＦＴＤに関連付けられていることから（３３）、これらの変異が、Ｃ９ｏｒｆ７２ ＡＬＳ／ＦＴＤ ｉＰＳＮで観察されたのと同様の方法でヌクレオポリン減少を誘導するのに十分か否かを評価することは興味深いであろう。
【0155】
まとめると、本データは、核内ＣＨＭＰ７の増加が、最終的にＣ９ｏｒｆ７２ニューロンの核質およびＮＰＣにおけるＮｕｐの減少につながる、発病性カスケードの重要なイニシエータであることを示唆している。さらに、本データは、ＣＨＭＰ７が、核内Ｎｕｐの減少を特徴とする神経変性疾患におけるＮＰＣ損傷を緩和するための潜在的な治療標的であることを強調する。
【0156】
（実施例８）
【0157】
実施例９～１５には、以下の材料および方法を使用した。
【0158】
＜ｉＰＳＣ由来の神経細胞の分化＞
【0159】
Ｃ９ｏｒｆ７２および非神経性コントロールｉＰＳＣ株は、Ｃｅｄａｒｓ－ＳｉｎａｉのＡｎｓｗｅｒ ＡＬＳリポジトリから入手した（人口統計については表Ｇを参照）。フィーダーフリーｉＰＳＣは、ＭＴｅＳＲを含むマトリゲル上で維持し、Ｃｅｄａｒｓ Ｓｉｎａｉ ＳＯＰに従って維持した。ｉＰＳＣは、以前に記載された直接誘導運動ニューロン（ｄｉＭＮ）プロトコル（４３）を用いて脊髄ニューロンに分化した。すべての細胞は、３７℃、５％ＣＯ２で維持した。ｉＰＳＣとｉＰＳＮは、定期的にマイコプラズマについて陰性であることを確認した。
【0160】
【表7-1】
【表7-2】
【表7-3】
【0161】
＜ｉＰＳＣ由来の神経細胞のＡＳＯ処理＞
非標的化スクランブルコントロール（６７６６３０）：ＣＣＴＡＴＡＧＧＡＣＴＡＴＣＣＡＧＧＡＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）、ＣＨＭＰ７ ＡＳＯ１（１５０８９１６）：ＧＡＡＡＡＣＧＧＴＴＴＣＣＡＣＴＧＴＡＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）、ＣＨＭＰ７ Ａｓｏ２（１５０８９１７）：ＴＧＴＴＡＣＣＣＴＣＡＧＡＴＡＣＣＧＣＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）、およびＣＨＭＰ７ ＡＳＯ３（１５０８９１８）：ＡＴＧＴＧＡＴＧＣＴＡＴＴＡＡＴＡＧＧＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）は、Ｉｏｎｉｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓによって寛大に提供された。分化２５日目に、ＡＳＯを、図面の説明に示したように、１、５、または１０μＭの濃度で培地に添加した。分化４０日目にｉＰＳＮ下流分析に供してウェスタンブロット、ＳＩＭ、およびグルタミン酸興奮毒性、分化４６日目にスタスミン－２ ｑＲＴ－ＰＣＲ、Ｒａｎ ＧＴＰａｓｅ局在、およびＴＤＰ－４３局在の分析を行うまで、３日ごとに培地交換およびＡＳＯ交換を行った。
非標的化スクランブルコントロール（６７６６３０）：ＣＣＴＡＴＡＧＧＡＣＴＡＴＣＣＡＧＧＡＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）、ＣＨＭＰ７ ＡＳＯ１（１５０８９１６）：ＧＡＡＡＡＣＧＧＴＴＴＣＣＡＣＴＧＴＡＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）、ＣＨＭＰ７ Ａｓｏ２（１５０８９１７）：ＴＧＴＴＡＣＣＣＴＣＡＧＡＴＡＣＣＧＣＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）、およびＣＨＭＰ７ ＡＳＯ３（１５０８９１８）：ＡＴＧＴＧＡＴＧＣＴＡＴＴＡＡＴＡＧＧＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）は、Ｉｏｎｉｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓによって寛大に提供された。分化２５日目に、ＡＳＯを、図面の説明に示したように、１、５、または１０μＭの濃度で培地に添加した。分化４０日目にｉＰＳＮ下流分析に供してウェスタンブロット、ＳＩＭ、およびグルタミン酸興奮毒性、分化４６日目にスタスミン－２ ｑＲＴ－ＰＣＲ、Ｒａｎ ＧＴＰａｓｅ局在、およびＴＤＰ－４３局在の分析を行うまで、３日ごとに培地交換およびＡＳＯ交換を行った。
【0162】
＜核の単離＞
核は、ｉＰＳＮならびに死後のヒト脳および脊髄組織から、Ｎｕｃｌｅｉ Ｐｕｒｅ Ｐｒｅｐ核単離キット（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて、以前に記載されたメーカーのプロトコルに従って単離した（４３）。簡潔には、ｉＰＳＮを１×ＰＢＳで洗浄し、ＤＴＴおよびＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を添加した付属の溶解バッファーを各ウェルに直接ｍＬ添加し、セルスクレーパーでｉＰＳＮを回収することによりｉＰＳＮ溶解液を調製した。死後の脳および脊髄の溶解液は、１５０ｍｇの新鮮な凍結組織を付属の溶解バッファーで直接、ダウンスホモジナイザーでホモジナイズして調製した。すべての溶解液を５０ｍＬコニカルチューブに移し、ボルテックスした。スクロース勾配は、メーカーのプロトコルに従って構築した。１．８５Ｍのスクロース勾配を使用して、神経細胞核を濃縮した。サンプルは、Ｓｗｉ３２ＴスイングバケットローターおよびＢｅｃｋｍａｎ超遠心機（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いて、１５，６００ｒｐｍ、４℃で４５分間遠心分離した。上清を捨て、残りの核ペレットを付属の核保存バッファー１ｍＬに再懸濁し、核に残っているスクロースを洗浄した。再懸濁した核を、２５００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離した。上清をもう一度捨て、得られた核ペレットを付属の核保存バッファー１ｍＬでボルテックスし、下流の画像分析のために再懸濁した。ウェスタンブロットのために、洗浄した核を、以下に記載するようにＲＩＰＡバッファーで溶解させた。
核は、ｉＰＳＮならびに死後のヒト脳および脊髄組織から、Ｎｕｃｌｅｉ Ｐｕｒｅ Ｐｒｅｐ核単離キット（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて、以前に記載されたメーカーのプロトコルに従って単離した（４３）。簡潔には、ｉＰＳＮを１×ＰＢＳで洗浄し、ＤＴＴおよびＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を添加した付属の溶解バッファーを各ウェルに直接ｍＬ添加し、セルスクレーパーでｉＰＳＮを回収することによりｉＰＳＮ溶解液を調製した。死後の脳および脊髄の溶解液は、１５０ｍｇの新鮮な凍結組織を付属の溶解バッファーで直接、ダウンスホモジナイザーでホモジナイズして調製した。すべての溶解液を５０ｍＬコニカルチューブに移し、ボルテックスした。スクロース勾配は、メーカーのプロトコルに従って構築した。１．８５Ｍのスクロース勾配を使用して、神経細胞核を濃縮した。サンプルは、Ｓｗｉ３２ＴスイングバケットローターおよびＢｅｃｋｍａｎ超遠心機（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いて、１５，６００ｒｐｍ、４℃で４５分間遠心分離した。上清を捨て、残りの核ペレットを付属の核保存バッファー１ｍＬに再懸濁し、核に残っているスクロースを洗浄した。再懸濁した核を、２５００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離した。上清をもう一度捨て、得られた核ペレットを付属の核保存バッファー１ｍＬでボルテックスし、下流の画像分析のために再懸濁した。ウェスタンブロットのために、洗浄した核を、以下に記載するようにＲＩＰＡバッファーで溶解させた。
【0163】
＜超解像構造化照明顕微鏡法＞
核染色および超解像イメージングを、以前に記載されたように行った（４３）。核の単離後、１０～５０μＬの最終核／保存バッファー懸濁液を、ＣｙｔｏＳｐｉｎ ４遠心分離機（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてコラーゲンコーティング（１ｍｇ／ｍＬ；Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｂｉｏｍａｔｒｉｘ）スライド上に遠心分離した。核を直ちに４％ＰＦＡで５分間固定し、１×ＰＢＳで３×１０分間洗浄し、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を含む１×ＰＢＳＴで１５分間透過処理した。その後、１×ＰＢＳで希釈した１０％正常ヤギ血清で、室温で１時間核をブロックし、ブロック（１×ＰＢＳ中の１０％正常ヤギ血清）で希釈した一次抗体で、４℃で一晩インキュベートした（抗体情報については表Ｈを参照）。１６～１８時間後、核を１×ＰＢＳで３×１０分間洗浄し、ブロック（１×ＰＢＳ中の１０％正常ヤギ血清）で希釈した二次抗体で、室温で１時間インキュベートした（抗体情報については表Ｈを参照）。核を１×ＰＢＳで３×１０分間洗浄し、Ｐｒｏｌｏｎｇ Ｇｏｌｄ Ａｎｔｉｆａｄｅ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および１８ｍｍ×１８ｍｍ １．５ ｈｉｇｈ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｃｏｖｅｒｓｌｉｐｓ（ＭａｔＴｅｋ）を用いてカバースリップした。
核染色および超解像イメージングを、以前に記載されたように行った（４３）。核の単離後、１０～５０μＬの最終核／保存バッファー懸濁液を、ＣｙｔｏＳｐｉｎ ４遠心分離機（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてコラーゲンコーティング（１ｍｇ／ｍＬ；Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｂｉｏｍａｔｒｉｘ）スライド上に遠心分離した。核を直ちに４％ＰＦＡで５分間固定し、１×ＰＢＳで３×１０分間洗浄し、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を含む１×ＰＢＳＴで１５分間透過処理した。その後、１×ＰＢＳで希釈した１０％正常ヤギ血清で、室温で１時間核をブロックし、ブロック（１×ＰＢＳ中の１０％正常ヤギ血清）で希釈した一次抗体で、４℃で一晩インキュベートした（抗体情報については表Ｈを参照）。１６～１８時間後、核を１×ＰＢＳで３×１０分間洗浄し、ブロック（１×ＰＢＳ中の１０％正常ヤギ血清）で希釈した二次抗体で、室温で１時間インキュベートした（抗体情報については表Ｈを参照）。核を１×ＰＢＳで３×１０分間洗浄し、Ｐｒｏｌｏｎｇ Ｇｏｌｄ Ａｎｔｉｆａｄｅ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および１８ｍｍ×１８ｍｍ １．５ ｈｉｇｈ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｃｏｖｅｒｓｌｉｐｓ（ＭａｔＴｅｋ）を用いてカバースリップした。
【0164】
ＮｅｕＮまたはＧＦＰ陽性核（図面の簡単な説明を参照）は、顕微鏡のアイピースを介して同定した。ＮｅｕＮまたはＧＦＰ陽性を確認するため、ワイドフィールドイメージングにより厚さ最大１１０ｎｍの単一のｚ切片を取得した。免疫染色したタンパク質は、その後、Ｚｅｉｓｓ ＥＬＹＲＡ Ｓ１を用いた超解像構造化照明顕微鏡（ＳＩＭ）によって画像化した。各画像について、５グリッド回転と最適なｚセクショニングパラメータを採用した。各免疫染色タンパク質について、すべての画像を同一のレーザー出力および露光時間で取得した。画像取得後、Ｚｅｉｓｓ Ｚｅｎ Ｂｌａｃｋ ２．３ ＳＰ１ソフトウェアでデフォルトのＳＩＭ処理パラメータを使用してＳＩＭ画像を再構築した。Ｉｍａｒｉｓバージョン９．２．０（Ｂｉｔｐｌａｎｅ）およびＦＩＪＩバージョン１．５２ｐの３Ｄスイートプラグインを使用して、自動ヌクレオポリンスポットおよび体積分析を、以前に記載されたように行った（４３、７８）。ヌクレオポリンスポットは、自動スポット検出を使用してカウントした。体積、平均強度、およびコントラストの特徴を考慮したベイズ分類器を適用して、個々のスポットを検出し分割した。各核の全深度を含む分割されたＳＩＭ画像の３Ｄレンダリングにより、ヌクレオポリンスポットの総数が決定された。免疫蛍光ＳＩＭの解像度の限界のために個々のヌクレオポリンスポットが解像できなかった場合、ヌクレオポリンが占める全核体積の割合を算出した。全核体積を算出するために、各核について中央のｚスライスにおけるＸ軸とＹ軸の長さを測定し、Ｚ軸の長さは取得した画像の全ｚ深さから推定した。ヌクレオポリン体積を算出するために、画像スタックを自動閾値処理し、ＦＩＪＩの３Ｄスイートプラグインの自動閾値処理を使用して、各核の閾値領域の体積を決定した。代表的な画像は、Ｚｅｉｓｓ Ｚｅｎ Ｂｌａｃｋ ２．３ ＳＰ１で生成した３Ｄ最大強度投影として提示した。画像は、コントラストおよび表示のためにフェイクで緑色に着色した。
【0165】
【表8-1】
【表8-2】
【0166】
＜ｉＰＳＮの免疫染色および共焦点画像化＞
分化１２日目に、ｉＰＳＮを２４ウェル光学底プレート（Ｃｅｌｌｖｉｓ）に播種した。分化３２日目（ＣＨＭＰ７ ＯＥ）または４６日目（ＣＨＭＰ７ ＡＳＯ）に、ｉＰＳＮを４％ＰＦＡで１５分間固定し、１×ＰＢＳで３×１０分間洗浄し、０．３％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を含む１×ＰＢＳＴで１５分間透過化し、１×ＰＢＳで希釈した１０％正常ヤギ血清で１時間ブロックし、一次抗体中で、室温で２時間インキュベートした（抗体情報については表Ｈを参照）。その後、ｉＰＳＮを１×ＰＢＳで３×１０分間洗浄し、二次抗体中（抗体情報については表Ｈを参照）で、室温で１時間インキュベートし、１×ＰＢＳで２×１０分間洗浄し、１×ＰＢＳで１：１０００に希釈したＨｏｅｓｃｈｔで１０分間インキュベートし、１×ＰＢＳで２×１０分間洗浄した。ｉＰＳＮは、ＤＡＰＩを含むＰｒｏｌｏｎｇ Ｇｏｌｄ Ａｎｔｉｆａｄｅ試薬を使用してマウントした。ｉＰＳＮは、Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ８００またはＺｅｉｓｓ ＬＳＭ９８０共焦点顕微鏡を使用して画像化した。すべての画像を、同一の画像化パラメータ（例えば、レーザー出力、ゲイン）を使用して取得した。核強度およびＮ／Ｃ比は、以前に記載されたようにＦＩＪＩを用いて算出した（８０）。提示した画像は、Ｚｅｉｓｓ Ｚｅｎ Ｂｌｕｅ ２．３で生成した最大強度投影図である。
分化１２日目に、ｉＰＳＮを２４ウェル光学底プレート（Ｃｅｌｌｖｉｓ）に播種した。分化３２日目（ＣＨＭＰ７ ＯＥ）または４６日目（ＣＨＭＰ７ ＡＳＯ）に、ｉＰＳＮを４％ＰＦＡで１５分間固定し、１×ＰＢＳで３×１０分間洗浄し、０．３％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を含む１×ＰＢＳＴで１５分間透過化し、１×ＰＢＳで希釈した１０％正常ヤギ血清で１時間ブロックし、一次抗体中で、室温で２時間インキュベートした（抗体情報については表Ｈを参照）。その後、ｉＰＳＮを１×ＰＢＳで３×１０分間洗浄し、二次抗体中（抗体情報については表Ｈを参照）で、室温で１時間インキュベートし、１×ＰＢＳで２×１０分間洗浄し、１×ＰＢＳで１：１０００に希釈したＨｏｅｓｃｈｔで１０分間インキュベートし、１×ＰＢＳで２×１０分間洗浄した。ｉＰＳＮは、ＤＡＰＩを含むＰｒｏｌｏｎｇ Ｇｏｌｄ Ａｎｔｉｆａｄｅ試薬を使用してマウントした。ｉＰＳＮは、Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ８００またはＺｅｉｓｓ ＬＳＭ９８０共焦点顕微鏡を使用して画像化した。すべての画像を、同一の画像化パラメータ（例えば、レーザー出力、ゲイン）を使用して取得した。核強度およびＮ／Ｃ比は、以前に記載されたようにＦＩＪＩを用いて算出した（８０）。提示した画像は、Ｚｅｉｓｓ Ｚｅｎ Ｂｌｕｅ ２．３で生成した最大強度投影図である。
【0167】
＜ヒト組織免疫蛍光法＞
非神経性コントロール、ならびにＣ９ｏｒｆ７２患者の死後パラフィン包埋運動および後頭部皮質切片は、Ｔａｒｇｅｔ ＡＬＳ Ｈｕｍａｎ Ｐｏｓｔｍｏｒｔｅｍ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｏｒｅを通じて入手した（人口統計情報については表Ｉを参照）。組織切片を、キシレン３×５分、１００％エタノール２×５分、９０％エタノール５分、７０％エタノール５分、最後にｄＨ２Ｏ ３×５分で徐々に再水和した。Ｔｉｓｓｕｅ－Ｔｅｋ抗原回収溶液（ＩＨＣ Ｗｏｒｌｄ）を用いて、スチーマーで１時間抗原回収を実施した。スライドを１０分間冷却し、ｄＨ２Ｏで３×５分、１×ＰＢＳで２×５分洗浄し、１×ＰＢＳで希釈した０．４％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を用いて１０分間シェーカー上で透過処理を行った。その後、スライドを１×ＰＢＳで３×５分間洗浄し、ＤＡＫＯプロテインフリー血清ブロック（ＤＡＫＯ）で４℃にて一晩ブロックした。組織切片を、バックグラウンド低減成分を含むＤＡＫＯ抗体希釈試薬で希釈した一次抗体（抗体情報については表Ｈを参照）と共に、４℃で合計２晩インキュベートした。２晩のインキュベーションの間に、スライドを一次抗体とともに、室温で穏やかに攪拌しながら１０時間インキュベートした。一次抗体の後、組織切片を１×ＰＢＳで３×５分間洗浄し、その後バックグラウンド低減成分を含むＤＡＫＯ抗体希釈試薬（ＤＡＫＯ）で希釈した二次抗体（抗体情報については表Ｈを参照）と共に、室温で穏やかに攪拌しながら１時間インキュベートした。次に、スライドを１×ＰＢＳで３×５分洗浄し、２－３滴の自家蛍光除去試薬（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）でかるくすすぎ、１×ＰＢＳで５×５分さらに洗浄して細片を除去した。組織切片を１×ＰＢＳで１：１０００に希釈したＨｏｅｓｃｈｔで２０分間染色し、１×ＰＢＳで３×５分間洗浄した。スライドを、ＤＡＰＩを含むＰｒｏｌｏｎｇ Ｇｏｌｄ Ａｎｔｉｆａｄｅ試薬を用いてカバースリップし、Ｍａｐ２陽性Ｌａｙｅｒ Ｖニューロンからの核を、２０×対物レンズおよびアポトーム２モジュールを備えたＺｅｉｓｓ Ａｘｉｏｉｍａｇｅｒ Ｚ２蛍光顕微鏡を用いて画像化した。すべての画像を同一の露光時間で取得した。
非神経性コントロール、ならびにＣ９ｏｒｆ７２患者の死後パラフィン包埋運動および後頭部皮質切片は、Ｔａｒｇｅｔ ＡＬＳ Ｈｕｍａｎ Ｐｏｓｔｍｏｒｔｅｍ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｏｒｅを通じて入手した（人口統計情報については表Ｉを参照）。組織切片を、キシレン３×５分、１００％エタノール２×５分、９０％エタノール５分、７０％エタノール５分、最後にｄＨ２Ｏ ３×５分で徐々に再水和した。Ｔｉｓｓｕｅ－Ｔｅｋ抗原回収溶液（ＩＨＣ Ｗｏｒｌｄ）を用いて、スチーマーで１時間抗原回収を実施した。スライドを１０分間冷却し、ｄＨ２Ｏで３×５分、１×ＰＢＳで２×５分洗浄し、１×ＰＢＳで希釈した０．４％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を用いて１０分間シェーカー上で透過処理を行った。その後、スライドを１×ＰＢＳで３×５分間洗浄し、ＤＡＫＯプロテインフリー血清ブロック（ＤＡＫＯ）で４℃にて一晩ブロックした。組織切片を、バックグラウンド低減成分を含むＤＡＫＯ抗体希釈試薬で希釈した一次抗体（抗体情報については表Ｈを参照）と共に、４℃で合計２晩インキュベートした。２晩のインキュベーションの間に、スライドを一次抗体とともに、室温で穏やかに攪拌しながら１０時間インキュベートした。一次抗体の後、組織切片を１×ＰＢＳで３×５分間洗浄し、その後バックグラウンド低減成分を含むＤＡＫＯ抗体希釈試薬（ＤＡＫＯ）で希釈した二次抗体（抗体情報については表Ｈを参照）と共に、室温で穏やかに攪拌しながら１時間インキュベートした。次に、スライドを１×ＰＢＳで３×５分洗浄し、２－３滴の自家蛍光除去試薬（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）でかるくすすぎ、１×ＰＢＳで５×５分さらに洗浄して細片を除去した。組織切片を１×ＰＢＳで１：１０００に希釈したＨｏｅｓｃｈｔで２０分間染色し、１×ＰＢＳで３×５分間洗浄した。スライドを、ＤＡＰＩを含むＰｒｏｌｏｎｇ Ｇｏｌｄ Ａｎｔｉｆａｄｅ試薬を用いてカバースリップし、Ｍａｐ２陽性Ｌａｙｅｒ Ｖニューロンからの核を、２０×対物レンズおよびアポトーム２モジュールを備えたＺｅｉｓｓ Ａｘｉｏｉｍａｇｅｒ Ｚ２蛍光顕微鏡を用いて画像化した。すべての画像を同一の露光時間で取得した。
【0168】
ＣＨＭＰ７およびＴＤＰ－４３核／細胞質比は、ＦＩＪＩを使用して定量化した。簡潔には、可視核を有する焦点のニューロンを、Ｍａｐ２陽性およびＨｏｅｓｃｈｔシグナルによって同定した。小さなピクセルボックスを使用してＣＨＭＰ７チャンネルの蛍光強度を測定した。各細胞区画（核と細胞質）から２つの積分密度測定を行い、その平均値をその後の分析に使用した。細胞のない領域でバックグラウンド蛍光強度平均を５回測定し、その平均値を分析に使用した。核および細胞質の強度は、以下のように算出した：強度＝積分密度－（バックグラウンド強度平均＊細胞内の測定領域）。核／細胞質ＣＨＭＰ７比は、各細胞について、得られた核強度を細胞質強度で割ることにより算出した。画像は、Ｚｅｉｓｓ Ｚｅｎ Ｂｌｕｅ ２．３で生成されたデフォルトのアポトーム処理画像として提示した。
【0169】
【表9-1】
【表9-2】
【表9-3】
【0170】
ｉＰＳＮからのＲＮＡは、ＲＮｅａｓｙキット（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて、メーカーのプロトコルに従って単離した。ＲＮＡ濃度は、ＮａｎｏＤｒｏｐ１０００分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて決定した。ＣＨＭＰ７ ＡＳＯ実験においては、５μＭのＣＨＭＰ７ ＡＳＯ２またはスクランブルコントロールＡＳＯに３週間曝露した後、分化４６日目にＲＮＡを単離した。ＣＨＭＰ７過剰発現実験においては、ＲＮＡは分化３２日目（プラスミドヌクレオフェクションから２週間後）に単離された。１μｇのＲＮＡをランダムヘキサマーおよびＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＶ第一鎖ｃＤＮＡ合成キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いたｃＤＮＡ合成に使用した。ｑＲＴ－ＰＣＲ反応は、Ｓｙｂｒ Ｇｒｅｅｎマスターミックス（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）およびＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｓｔｅｐ Ｏｎｅ ＰｌｕｓリアルタイムＰＣＲ機（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて以前に記載されたように行った（７０、７１）。プライマー配列は表Ｊを参照されたい。すべての実験において、ＧＡＰＤＨを正規化に使用した。
【0171】
【表10】
【0172】
＜ウェスタンブロット＞
核溶解液：核の単離後、核ペレットを、１×プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ）を含む２５μＬのＲＩＰＡバッファー（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）中に再懸濁した。ホモジネートを１２，０００ｇで１５分間回転させ、４℃で細片を除去した。上清を新しいエッペンドルフチューブに移し、ＢＣＡタンパク質推定アッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、タンパク質濃度を決定した。４×レムリバッファー（Ｂｉｏｒａｄ）を各サンプルに１×の最終濃度になるように加え、サンプルを１００℃で５分間加熱し、５μｇのタンパク質を４～２０％アクリルアミドゲル（Ｂｉｏｒａｄ）にロードした。ゲルは、色素の前面が底に達するまで泳動した。Ｔｒａｎｓ－Ｂｌｏｔ Ｔｕｒｂｏ Ｔｒａｎｓｆｅｒシステム（Ｂｉｏｒａｄ）を用いて、タンパク質をニトロセルロース膜上に転写した。ブロットを１×ＴＢＳＴ（０．１％Ｔｗｅｅｎ－２０）中で５％脱脂乳を用いて３０分間ブロックし、ブロックで希釈した一次抗体とともに４℃で一晩インキュベートした（抗体情報については表Ｈを参照）。翌日、ブロットを１×ＴＢＳＴで４×１０分間洗浄し、ブロックで希釈した二次抗体（抗体情報については表Ｈを参照）を用いて室温で１時間プロービングした。続いてブロットを１×ＴＢＳＴで４×１０分間洗浄し、ＥＣＬ基質（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を３０秒間塗布した。化学発光画像は、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ ＬＡＳ ４０００システムで取得した。剥離せずに膜を順次プロービングするため、ブロットを室温の３０％Ｈ２Ｏ２で１５分間インキュベートすることで化学発光シグナルをクエンチした（９０）。分析はＦＩＪＩで行った。正規化にはラミンＢ１を使用した。
核溶解液：核の単離後、核ペレットを、１×プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ）を含む２５μＬのＲＩＰＡバッファー（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）中に再懸濁した。ホモジネートを１２，０００ｇで１５分間回転させ、４℃で細片を除去した。上清を新しいエッペンドルフチューブに移し、ＢＣＡタンパク質推定アッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、タンパク質濃度を決定した。４×レムリバッファー（Ｂｉｏｒａｄ）を各サンプルに１×の最終濃度になるように加え、サンプルを１００℃で５分間加熱し、５μｇのタンパク質を４～２０％アクリルアミドゲル（Ｂｉｏｒａｄ）にロードした。ゲルは、色素の前面が底に達するまで泳動した。Ｔｒａｎｓ－Ｂｌｏｔ Ｔｕｒｂｏ Ｔｒａｎｓｆｅｒシステム（Ｂｉｏｒａｄ）を用いて、タンパク質をニトロセルロース膜上に転写した。ブロットを１×ＴＢＳＴ（０．１％Ｔｗｅｅｎ－２０）中で５％脱脂乳を用いて３０分間ブロックし、ブロックで希釈した一次抗体とともに４℃で一晩インキュベートした（抗体情報については表Ｈを参照）。翌日、ブロットを１×ＴＢＳＴで４×１０分間洗浄し、ブロックで希釈した二次抗体（抗体情報については表Ｈを参照）を用いて室温で１時間プロービングした。続いてブロットを１×ＴＢＳＴで４×１０分間洗浄し、ＥＣＬ基質（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を３０秒間塗布した。化学発光画像は、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ ＬＡＳ ４０００システムで取得した。剥離せずに膜を順次プロービングするため、ブロットを室温の３０％Ｈ２Ｏ２で１５分間インキュベートすることで化学発光シグナルをクエンチした（９０）。分析はＦＩＪＩで行った。正規化にはラミンＢ１を使用した。
【0173】
ＡＳＯ処理したｉＰＳＮ溶解液：分化４０日目に、ｉＰＳＮを、Ｃａ２＋およびＭｇ２＋を含む氷冷１×ＤＰＢＳで洗浄した。各ウェルに１ｍＬの新鮮な１×ＤＰＢＳを加え、セルスクレーパーでｉＰＳＮを回収し、エッペンドルフチューブに移した。次に、細胞を２５００ｒｐｍ、４℃で５分間、ペレット化した。上清を吸引し、得られた細胞ペレットを、１×プロテアーゼ阻害剤カクテルを含む５０μＬのＲＩＰＡバッファーに溶解させた。ウェスタンブロットおよび分析は、上記のように実施した。ＧＡＰＤＨを正規化のために使用した。
【0174】
＜ＣＨＭＰ７過剰発現のためのプラスミドおよびヌクレオフェクション＞
ＧＦＰタグ付きＣＨＭＰ７プラスミドは、Ｏｒｉｇｅｎｅ社から入手した。ＣＨＭＰ７ ＮＥＳ変異体（ＣＨＭＰ７ ＮＥＳ＊）プラスミドを生成するために、Ｑ５部位特異的変異誘発キット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）を用いて、ＣＨＭＰ７ ＧＦＰプラスミド（Ｏｒｉｇｅｎｅ）に１アミノ酸置換（アミノ酸４３０、ＬからＡ）を作製した。ＧＦＰコントロールプラスミドは、Ｏｒｉｇｅｎｅ社から入手した。プラスミド情報については表Ｋを参照されたい。分化１８日目に、ｉＰＳＮをアキュターゼで解離させて単細胞解離を補助し、Ｌｏｎｚａ Ｐ３ Ｐｒｉｍａｒｙ Ｃｅｌｌ ４Ｄ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒキット（Ｌｏｎｚａ）およびＬｏｎｚａヌクレオフェクションシステムのプログラムＤＣ１０４を用いて、懸濁液にヌクレオフェクションした。各キュベットには、５×１０６個のｉＰＳＮおよび４μｇのプラスミドＤＮＡが含まれるようにした。ヌクレオフェクション後、ｉＰＳＮはＬｏｎｚａのプロトコルに従ってマトリゲル（Ｃｏｒｎｉｎｇ）コーティングされた細胞培養皿に播種した。分化１９日目および２２日目に培地を交換した。ＣＨＭＰ７バリアントの過剰発現については、分化２５日目に下流ＳＩＭ実験を行い、分化３２日目にＴＤＰ－４３の局在およびスタスミン－２分析を行った。ＬＥＭＤ２の過剰発現については、分化３２日目にＳＩＭ実験を行った。
ＧＦＰタグ付きＣＨＭＰ７プラスミドは、Ｏｒｉｇｅｎｅ社から入手した。ＣＨＭＰ７ ＮＥＳ変異体（ＣＨＭＰ７ ＮＥＳ＊）プラスミドを生成するために、Ｑ５部位特異的変異誘発キット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）を用いて、ＣＨＭＰ７ ＧＦＰプラスミド（Ｏｒｉｇｅｎｅ）に１アミノ酸置換（アミノ酸４３０、ＬからＡ）を作製した。ＧＦＰコントロールプラスミドは、Ｏｒｉｇｅｎｅ社から入手した。プラスミド情報については表Ｋを参照されたい。分化１８日目に、ｉＰＳＮをアキュターゼで解離させて単細胞解離を補助し、Ｌｏｎｚａ Ｐ３ Ｐｒｉｍａｒｙ Ｃｅｌｌ ４Ｄ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒキット（Ｌｏｎｚａ）およびＬｏｎｚａヌクレオフェクションシステムのプログラムＤＣ１０４を用いて、懸濁液にヌクレオフェクションした。各キュベットには、５×１０６個のｉＰＳＮおよび４μｇのプラスミドＤＮＡが含まれるようにした。ヌクレオフェクション後、ｉＰＳＮはＬｏｎｚａのプロトコルに従ってマトリゲル（Ｃｏｒｎｉｎｇ）コーティングされた細胞培養皿に播種した。分化１９日目および２２日目に培地を交換した。ＣＨＭＰ７バリアントの過剰発現については、分化２５日目に下流ＳＩＭ実験を行い、分化３２日目にＴＤＰ－４３の局在およびスタスミン－２分析を行った。ＬＥＭＤ２の過剰発現については、分化３２日目にＳＩＭ実験を行った。
【0175】
【表11】
【0176】
＜トリムアウェイによるＰＯＭ１２１およびＬＥＭＤ２のノックダウン＞
内在性ＰＯＭ１２１およびＬＥＭＤ２のノックダウンは、以前に記載されたように（４３）修正したトリムアウェイプロトコル（５８）を使用して行った。ＰＯＭ１２１（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、およびＬＥＭＤ２（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）抗体は、Ｓｌｉｄｅ－Ａ－Ｌｙｚｅｒ ＭＩＮＩ透析装置、２０Ｋ ＭＷＣＯ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて１×ＰＢＳ中で透析した。ＰＢＳを２時間後に交換し、透析は室温で一晩穏やかに攪拌しながら進めた。透析した抗体をＵｌｔａｃｅｌｌ－１００膜付きＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔａ－０．５遠心式フィルターユニット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で濃縮した。得られた抗体濃度は、ＮａｎｏＤｒｏｐ１０００分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、以前に記載されたように算出した（５８）。分化１８日目に、ｉＰＳＮをアキュターゼで解離させた。懸濁液ベースのヌクレオフェクションは、Ｌｏｎｚａ Ｐ３ Ｐｒｉｍａｒｙ Ｃｅｌｌ ４Ｄ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒキット（Ｌｏｎｚａ）およびプログラムＤＣ１５４を用いて実施された。各キュベットには、５×１０６個のｉＰＳＮ、５μｇの抗体、および４μｇのＴｒｉｍ２１ ＧＦＰプラスミドＤＮＡ（Ｏｒｉｇｅｎｅ、表Ｋを参照）が含まれるようにした。ヌクレオフェクション後、ｉＰＳＮはＬｏｎｚａのプロトコルに従ってマトリゲル（Ｃｏｒｎｉｎｇ）コーティングされた細胞培養皿に再播種し、分化２０日目に下流分析に使用した。
内在性ＰＯＭ１２１およびＬＥＭＤ２のノックダウンは、以前に記載されたように（４３）修正したトリムアウェイプロトコル（５８）を使用して行った。ＰＯＭ１２１（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、およびＬＥＭＤ２（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）抗体は、Ｓｌｉｄｅ－Ａ－Ｌｙｚｅｒ ＭＩＮＩ透析装置、２０Ｋ ＭＷＣＯ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて１×ＰＢＳ中で透析した。ＰＢＳを２時間後に交換し、透析は室温で一晩穏やかに攪拌しながら進めた。透析した抗体をＵｌｔａｃｅｌｌ－１００膜付きＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔａ－０．５遠心式フィルターユニット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で濃縮した。得られた抗体濃度は、ＮａｎｏＤｒｏｐ１０００分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、以前に記載されたように算出した（５８）。分化１８日目に、ｉＰＳＮをアキュターゼで解離させた。懸濁液ベースのヌクレオフェクションは、Ｌｏｎｚａ Ｐ３ Ｐｒｉｍａｒｙ Ｃｅｌｌ ４Ｄ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒキット（Ｌｏｎｚａ）およびプログラムＤＣ１５４を用いて実施された。各キュベットには、５×１０６個のｉＰＳＮ、５μｇの抗体、および４μｇのＴｒｉｍ２１ ＧＦＰプラスミドＤＮＡ（Ｏｒｉｇｅｎｅ、表Ｋを参照）が含まれるようにした。ヌクレオフェクション後、ｉＰＳＮはＬｏｎｚａのプロトコルに従ってマトリゲル（Ｃｏｒｎｉｎｇ）コーティングされた細胞培養皿に再播種し、分化２０日目に下流分析に使用した。
【0177】
＜グルタミン酸毒性＞
分化１２日目に、ｉＰＳＮを２４ウェル光学底プレート（Ｃｅｌｌｖｉｓ）に、１ウェルあたり２５０，０００ニューロンの密度で播種した。ニューロンを１×ＰＢＳで洗浄し、分化２５日目まで毎日、死細胞および細片を除去した新鮮なステージ３培地を供給した。分化２５日目に、上記のようにＡＳＯ処理を開始した。３日ごとに、ｉＰＳＮを１×ＰＢＳで３回洗浄し、培地およびＡＳＯを交換した。分化４０日目に、ｉＰＳＮを１×ＰＢＳで洗浄し、残った細片および死細胞を除去した。培地は、０または１０μＭのグルタミン酸（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を含むＡＣＳＦ（Ｔｏｃｒｉｓ）に交換した。ｉＰＳＮは、３７℃、５％ＣＯ２で４時間インキュベートした。３．５時間後、ＮｕｃＢｌｕｅ Ｌｉｖｅ ＲｅａｄｙＰｒｏｂｅｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）および１μＭヨウ化プロピジウム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を１滴加え、インキュベーターに３０分間戻した。ｉＰＳＮを、Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ８００共焦点顕微鏡を用いて環境制御チャンバー内で画像化した。１０倍の対物レンズで１ウェルあたり５枚の画像を取得した。ＰＩおよびＤＡＰＩスポットは、ＦＩＪＩを使用してカウントした。
分化１２日目に、ｉＰＳＮを２４ウェル光学底プレート（Ｃｅｌｌｖｉｓ）に、１ウェルあたり２５０，０００ニューロンの密度で播種した。ニューロンを１×ＰＢＳで洗浄し、分化２５日目まで毎日、死細胞および細片を除去した新鮮なステージ３培地を供給した。分化２５日目に、上記のようにＡＳＯ処理を開始した。３日ごとに、ｉＰＳＮを１×ＰＢＳで３回洗浄し、培地およびＡＳＯを交換した。分化４０日目に、ｉＰＳＮを１×ＰＢＳで洗浄し、残った細片および死細胞を除去した。培地は、０または１０μＭのグルタミン酸（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を含むＡＣＳＦ（Ｔｏｃｒｉｓ）に交換した。ｉＰＳＮは、３７℃、５％ＣＯ２で４時間インキュベートした。３．５時間後、ＮｕｃＢｌｕｅ Ｌｉｖｅ ＲｅａｄｙＰｒｏｂｅｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）および１μＭヨウ化プロピジウム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を１滴加え、インキュベーターに３０分間戻した。ｉＰＳＮを、Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ８００共焦点顕微鏡を用いて環境制御チャンバー内で画像化した。１０倍の対物レンズで１ウェルあたり５枚の画像を取得した。ＰＩおよびＤＡＰＩスポットは、ＦＩＪＩを使用してカウントした。
【0178】
＜統計分析＞
すべてのデータ分析は、上記の各実験セクションに記載したように、ＩｍａｒｉｓまたはＦＩＪＩを用いて行い、完全に自動化または盲検化した。すべての統計分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍバージョン８（ＧｒａｐｈＰａｄ）を用いて実施した。ｉＰＳＣ株または患者ごとに複数の細胞または核を定量化したイメージング実験では、ｉＰＳＣ株または患者ごとに評価したすべての核または細胞の平均がＮ＝１となるように統計分析を実施し、実験およびグループごとの合計Ｎは「図面の説明」に示したとおりとした。Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定、Ｔｕｋｅｙの多重比較検定つき一元配置分散分析、またはＴｕｋｅｙの多重比較検定つき二元配置分散分析を、「図面の説明」に記載したように用いた。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５、＊＊＊ｐ＜０．０００５、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。バイオリンプロットを使用して、大規模なデータセット（＞１０データポイント）の完全な広がりとばらつきを表示した。中央の点線は中央値を示す。さらに２本の点線は、第一四分位数および第三四分位数を示す。より小さなデータセットでは、個々のデータポイントを表示する棒グラフを示し、エラーバーは＋／－ＳＥＭを示す。
すべてのデータ分析は、上記の各実験セクションに記載したように、ＩｍａｒｉｓまたはＦＩＪＩを用いて行い、完全に自動化または盲検化した。すべての統計分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍバージョン８（ＧｒａｐｈＰａｄ）を用いて実施した。ｉＰＳＣ株または患者ごとに複数の細胞または核を定量化したイメージング実験では、ｉＰＳＣ株または患者ごとに評価したすべての核または細胞の平均がＮ＝１となるように統計分析を実施し、実験およびグループごとの合計Ｎは「図面の説明」に示したとおりとした。Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定、Ｔｕｋｅｙの多重比較検定つき一元配置分散分析、またはＴｕｋｅｙの多重比較検定つき二元配置分散分析を、「図面の説明」に記載したように用いた。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５、＊＊＊ｐ＜０．０００５、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。バイオリンプロットを使用して、大規模なデータセット（＞１０データポイント）の完全な広がりとばらつきを表示した。中央の点線は中央値を示す。さらに２本の点線は、第一四分位数および第三四分位数を示す。より小さなデータセットでは、個々のデータポイントを表示する棒グラフを示し、エラーバーは＋／－ＳＥＭを示す。
【0179】
（実施例９）
｛ｓＡＬＳ ｉＰＳＮ核において特定のヌクレオポリンが減少する｝
最近、８つの特定のＮｕｐのタンパク質発現が、Ｃ９ｏｒｆ７２ヒトニューロンの核質およびＮＰＣ内で減少していることが立証された（４３）。複数の病態および分子経路が家族性疾患および散発性疾患の両方に共通して関連していることから（３６、３８、５５）、Ｎｕｐの減少も散発性疾患における顕著な病理学的特徴であり得ると仮定された。そこで、Ｃ９ｏｒｆ７２疾患における先行研究に基づき、ＮＰＣの複数のサブドメインにまたがる候補Ｎｕｐのサブセットを選択し、ｓＡＬＳ ｉＰＳＮから単離した核において、超解像度構造化照明顕微鏡（ＳＩＭ）を用いてその核分布および発現を視覚的に調べた。ＳＩＭは、個々のヒトＮＰＣの大きさに近い推定１００ｎｍの解像度を得ることができるため（４５、５６、５７）、従来の免疫染色法による候補ＮｕｐｓのＮＰＣ局在および発現を確実に評価し確認する比類ない機会を得られた。この方法を用いて、ＮｅｕＮ陽性ｓＡＬＳ ｉＰＳＮ核の核質およびＮＰＣからＮｕｐのサブセットが減少していることを見出した（図１５ａ～ｂ）。一方、複数のＦＧを含むＮｕｐを認識する抗体、ｍＡｂ４１４による免疫染色で評価すると、ＦＧ－Ｎｕｐの分布または発現に明白な変化は観察されなかった（図１５ａ～ｂ）。注目すべきことに、ｓＡＬＳ神経細胞核におけるＮｕｐ５０、ＴＰＲ、ＰＯＭ１２１、およびＮｕｐ１３３の病的減少（図１５ａ～ｂ）は、Ｃ９ｏｒｆ７２疾患における我々の観察を強く想起させるものであり（４３）、家族性および散発性疾患におけるＮｕｐ減少の根底に共通の分子現象があり得ることを示唆した。
｛ｓＡＬＳ ｉＰＳＮ核において特定のヌクレオポリンが減少する｝
最近、８つの特定のＮｕｐのタンパク質発現が、Ｃ９ｏｒｆ７２ヒトニューロンの核質およびＮＰＣ内で減少していることが立証された（４３）。複数の病態および分子経路が家族性疾患および散発性疾患の両方に共通して関連していることから（３６、３８、５５）、Ｎｕｐの減少も散発性疾患における顕著な病理学的特徴であり得ると仮定された。そこで、Ｃ９ｏｒｆ７２疾患における先行研究に基づき、ＮＰＣの複数のサブドメインにまたがる候補Ｎｕｐのサブセットを選択し、ｓＡＬＳ ｉＰＳＮから単離した核において、超解像度構造化照明顕微鏡（ＳＩＭ）を用いてその核分布および発現を視覚的に調べた。ＳＩＭは、個々のヒトＮＰＣの大きさに近い推定１００ｎｍの解像度を得ることができるため（４５、５６、５７）、従来の免疫染色法による候補ＮｕｐｓのＮＰＣ局在および発現を確実に評価し確認する比類ない機会を得られた。この方法を用いて、ＮｅｕＮ陽性ｓＡＬＳ ｉＰＳＮ核の核質およびＮＰＣからＮｕｐのサブセットが減少していることを見出した（図１５ａ～ｂ）。一方、複数のＦＧを含むＮｕｐを認識する抗体、ｍＡｂ４１４による免疫染色で評価すると、ＦＧ－Ｎｕｐの分布または発現に明白な変化は観察されなかった（図１５ａ～ｂ）。注目すべきことに、ｓＡＬＳ神経細胞核におけるＮｕｐ５０、ＴＰＲ、ＰＯＭ１２１、およびＮｕｐ１３３の病的減少（図１５ａ～ｂ）は、Ｃ９ｏｒｆ７２疾患における我々の観察を強く想起させるものであり（４３）、家族性および散発性疾患におけるＮｕｐ減少の根底に共通の分子現象があり得ることを示唆した。
【0180】
（実施例１０）
｛ＣＨＭＰ７の核局在および発現は、Ｃ９ｏｒｆ７２およびｓＡＬＳ ｉＰＳＮならびに死後のヒト運動皮質において増加する｝
酵母において、ＮＰＣ恒常性にＣＨＭＰ７が重要に関与していることから（４８－５０）、このタンパク質の発現がＣ９ｏｒｆ７２およびｓＡＬＳ核において病的に変化しているかどうかを調べた。ＳＩＭを用いて、コントロールならびにＣ９ｏｒｆ７２およびｓＡＬＳのｉＰＳＮから単離したＮｅｕＮ陽性核において、ＣＨＭＰ７免疫反応性が有意に増加していることを見出した（図１５ｃ～ｄ）。ＣＨＭＰ７は、Ｎｕｐ６２陽性ＮＰＣおよびスポットの近傍にまれに局在するが、２つの独立した抗体を用いた免疫染色によって評価されたように、その発現の増加は、Ｃ９ｏｒｆ７２およびｓＡＬＳ ｉＰＳＮにおいて主に核質に現れる（図２１）。さらに、２つの抗ＣＨＭＰ７抗体を用いたウェスタンブロット分析により、Ｃ９ｏｒｆ７２およびｓＡＬＳの核におけるＣＨＭＰ７タンパク質レベルの増加が定量的に確認された（図１５ｅ～ｇ）。興味深いことに、この増加は、Ｎｕｐの減少が以前に観察された時点（図１５ａ～ｂ）より前の時点でも観察された（分化１８日目、図１５ｃ～ｄ）。我々は、疾患関連ＮＰＣ損傷が、膜貫通型Ｎｕｐ ＰＯＭ１２１の急速なＴｒｉｍ２１ ＧＦＰに媒介される分解（５８）によって開始される可能性があることを以前に実証した（４３）。ここでは、野生型ｉＰＳＮ核からＰＯＭ１２１が急速に減少しても、核内ＣＨＭＰ７発現が増加しないことを発見した（図２２）。これらのデータを合わせると、ＣＨＭＰ７がＮＰＣの損傷に反応するのではなく、その開始においてより直接的な役割を担い得ることを示唆している。
｛ＣＨＭＰ７の核局在および発現は、Ｃ９ｏｒｆ７２およびｓＡＬＳ ｉＰＳＮならびに死後のヒト運動皮質において増加する｝
酵母において、ＮＰＣ恒常性にＣＨＭＰ７が重要に関与していることから（４８－５０）、このタンパク質の発現がＣ９ｏｒｆ７２およびｓＡＬＳ核において病的に変化しているかどうかを調べた。ＳＩＭを用いて、コントロールならびにＣ９ｏｒｆ７２およびｓＡＬＳのｉＰＳＮから単離したＮｅｕＮ陽性核において、ＣＨＭＰ７免疫反応性が有意に増加していることを見出した（図１５ｃ～ｄ）。ＣＨＭＰ７は、Ｎｕｐ６２陽性ＮＰＣおよびスポットの近傍にまれに局在するが、２つの独立した抗体を用いた免疫染色によって評価されたように、その発現の増加は、Ｃ９ｏｒｆ７２およびｓＡＬＳ ｉＰＳＮにおいて主に核質に現れる（図２１）。さらに、２つの抗ＣＨＭＰ７抗体を用いたウェスタンブロット分析により、Ｃ９ｏｒｆ７２およびｓＡＬＳの核におけるＣＨＭＰ７タンパク質レベルの増加が定量的に確認された（図１５ｅ～ｇ）。興味深いことに、この増加は、Ｎｕｐの減少が以前に観察された時点（図１５ａ～ｂ）より前の時点でも観察された（分化１８日目、図１５ｃ～ｄ）。我々は、疾患関連ＮＰＣ損傷が、膜貫通型Ｎｕｐ ＰＯＭ１２１の急速なＴｒｉｍ２１ ＧＦＰに媒介される分解（５８）によって開始される可能性があることを以前に実証した（４３）。ここでは、野生型ｉＰＳＮ核からＰＯＭ１２１が急速に減少しても、核内ＣＨＭＰ７発現が増加しないことを発見した（図２２）。これらのデータを合わせると、ＣＨＭＰ７がＮＰＣの損傷に反応するのではなく、その開始においてより直接的な役割を担い得ることを示唆している。
【0181】
複数の神経変性疾患において、複数のタンパク質の核／細胞質分配が阻害されることから（５９－６２）、次に、疾患ｉＰＳＮにおけるＣＨＭＰ７の核および細胞質分配を評価した。免疫染色および共焦点イメージングを用いて、Ｃ９ｏｒｆ７２およびｓＡＬＳ ｉＰＳＮにおいて、ＣＨＭＰ７が細胞質から核へと有意に再局在化することを確認した（図１６ａ～ｂ）。その結果、単離された核における観察（図１５ｃ～ｄ）と同様に、これは、コントロールと比較して、Ｃ９ｏｒｆ７２およびｓＡＬＳ ｉＰＳＮにおいてＣＨＭＰ７核強度が全体的に増加することに一致した（図１６ａ～ｃ）。ｉＰＳＮにおける結果がヒトの疾患病態を再現していることを検証するために、薄いパラフィン包埋切片で免疫蛍光染色を実施した。この結果、死後患者の運動皮質のＭａｐ２陽性ニューロンにおけるＣＨＭＰ７の核への有意な再局在（図１６ｄ～ｅ）およびＣＨＭＰ７核強度（図１６ｄ、１６ｆ）の全体的な増加が、ｉＰＳＮで得られた我々のデータを模倣することが明らかになった。
【0182】
（実施例１１）
｛ＬＥＭＤ２レベルの操作は、ｉＰＳＮにおけるＣＨＭＰ７の核局在または発現に影響を与えない｝
核内ＣＨＭＰ７の増加が、散発性ＡＬＳおよび家族性ＡＬＳ／ＦＴＤの強力かつ顕著な分子的特徴であることを立証したので、次に、この病態がヒト神経細胞核で発生するメカニズムを決定することを試みた。酵母およびヒトのＣＨＭＰ７オルソログはともに、非神経細胞系では内在性ＩＮＭタンパク質であるＬＥＭＤ２によって核膜に動員されるため（５０、６３）、コントロールｉＰＳＮにおいて、トリムアウェイ法を用いて内在性ＬＥＭＤ２レベルを低減し、またはＧＦＰタグ付き発現プラスミドを用いてＬＥＭＤ２を過剰発現させ、ＬＥＭＤ２レベルを遺伝的に操作した。ＳＩＭを用いて、核内ＬＥＭＤ２のわずかではあるが有意な減少（図２３ａ～ｂ）も、ＧＦＰタグ付きＬＥＭＤ２の過剰発現も、ＣＨＭＰ７または特定のＮｕｐの核内免疫反応性に影響を及ぼさないことがわかった（図２３ｃ～ｌ）。まとめると、このデータは、ＬＥＭＤ２に媒介されるＣＨＭＰ７の核膜への動員が、疾患ｉＰＳＮにおけるＣＨＭＰ７の核発現の増加の原因ではないことを示唆する。さらに、ＣＨＭＰ７の核内動員は、酵母および非神経性哺乳類細胞と比較して、ヒトニューロンでは異なる分子メカニズムを介して調節され得る。
｛ＬＥＭＤ２レベルの操作は、ｉＰＳＮにおけるＣＨＭＰ７の核局在または発現に影響を与えない｝
核内ＣＨＭＰ７の増加が、散発性ＡＬＳおよび家族性ＡＬＳ／ＦＴＤの強力かつ顕著な分子的特徴であることを立証したので、次に、この病態がヒト神経細胞核で発生するメカニズムを決定することを試みた。酵母およびヒトのＣＨＭＰ７オルソログはともに、非神経細胞系では内在性ＩＮＭタンパク質であるＬＥＭＤ２によって核膜に動員されるため（５０、６３）、コントロールｉＰＳＮにおいて、トリムアウェイ法を用いて内在性ＬＥＭＤ２レベルを低減し、またはＧＦＰタグ付き発現プラスミドを用いてＬＥＭＤ２を過剰発現させ、ＬＥＭＤ２レベルを遺伝的に操作した。ＳＩＭを用いて、核内ＬＥＭＤ２のわずかではあるが有意な減少（図２３ａ～ｂ）も、ＧＦＰタグ付きＬＥＭＤ２の過剰発現も、ＣＨＭＰ７または特定のＮｕｐの核内免疫反応性に影響を及ぼさないことがわかった（図２３ｃ～ｌ）。まとめると、このデータは、ＬＥＭＤ２に媒介されるＣＨＭＰ７の核膜への動員が、疾患ｉＰＳＮにおけるＣＨＭＰ７の核発現の増加の原因ではないことを示唆する。さらに、ＣＨＭＰ７の核内動員は、酵母および非神経性哺乳類細胞と比較して、ヒトニューロンでは異なる分子メカニズムを介して調節され得る。
【0183】
（実施例１２）
｛ＣＨＭＰ７の核外輸送の阻害は、特定のヌクレオポリンにおける疾患に関連する減少を再現し、ＴＤＰ－４３の誤局在化およびスタスミン－２スプライシングの変化を誘導する｝
摂動を受けない状態では、酵母およびヒトＣＨＭＰ７はともに、ＸＰＯ１／ＣＲＭ１による核外輸送のため核内に蓄積できない（４９、６４）。そこで、ＣＨＭＰ７の核外輸送を特異的に阻害することで、ｉＰＳＮにおけるＮｕｐレベルの低下を開始することが可能か否かを判定するため、ＣＨＭＰ７のＮＥＳ配列に１つのアミノ酸置換（ＬからＡ、アミノ酸４３０）を行うことで核外輸送配列（ＮＥＳ）を変異させた（ＬＥＡＥＬＥＫＬＳＬＳ）。以前に記載されたように（４９）、この単一点変異は、ＸＰＯ１に媒介されるＣＨＭＰ７の核外輸送を抑制するのに十分である（６５）。野生型ｉＰＳＮにおいて、野生型ＧＦＰタグ付きＣＨＭＰ７ではなく、ＧＦＰタグ付きＣＨＭＰ７ ＮＥＳ変異体（ＣＨＭＰ７ ＮＥＳ＊）を過剰発現させると、ＳＩＭによって評価されたように、Ｃ９ｏｒｆ７２およびｓＡＬＳ疾患に関連する核ＣＨＭＰ７、Ｎｕｐ５０、ＰＯＭ１２１、およびＮｕｐ１３３レベルの変化が再現された（図１７）。ＮｕｐおよびＮＰＣの分解を媒介する初期作用因子としての役割（４８～５０）と一致して、これらのデータは、ＣＨＭＰ７の異常な核蓄積は、ｉＰＳＮ核におけるＮｕｐレベルの変化を促進するのに十分であることを示唆している。
｛ＣＨＭＰ７の核外輸送の阻害は、特定のヌクレオポリンにおける疾患に関連する減少を再現し、ＴＤＰ－４３の誤局在化およびスタスミン－２スプライシングの変化を誘導する｝
摂動を受けない状態では、酵母およびヒトＣＨＭＰ７はともに、ＸＰＯ１／ＣＲＭ１による核外輸送のため核内に蓄積できない（４９、６４）。そこで、ＣＨＭＰ７の核外輸送を特異的に阻害することで、ｉＰＳＮにおけるＮｕｐレベルの低下を開始することが可能か否かを判定するため、ＣＨＭＰ７のＮＥＳ配列に１つのアミノ酸置換（ＬからＡ、アミノ酸４３０）を行うことで核外輸送配列（ＮＥＳ）を変異させた（ＬＥＡＥＬＥＫＬＳＬＳ）。以前に記載されたように（４９）、この単一点変異は、ＸＰＯ１に媒介されるＣＨＭＰ７の核外輸送を抑制するのに十分である（６５）。野生型ｉＰＳＮにおいて、野生型ＧＦＰタグ付きＣＨＭＰ７ではなく、ＧＦＰタグ付きＣＨＭＰ７ ＮＥＳ変異体（ＣＨＭＰ７ ＮＥＳ＊）を過剰発現させると、ＳＩＭによって評価されたように、Ｃ９ｏｒｆ７２およびｓＡＬＳ疾患に関連する核ＣＨＭＰ７、Ｎｕｐ５０、ＰＯＭ１２１、およびＮｕｐ１３３レベルの変化が再現された（図１７）。ＮｕｐおよびＮＰＣの分解を媒介する初期作用因子としての役割（４８～５０）と一致して、これらのデータは、ＣＨＭＰ７の異常な核蓄積は、ｉＰＳＮ核におけるＮｕｐレベルの変化を促進するのに十分であることを示唆している。
【0184】
ＴＤＰ－４３はＤＮＡおよびＲＮＡに結合するタンパク質であり、通常は主に核にあるが、ＡＬＳの最大９７％の神経細胞のサブセットにおいて、核から排除され、および／または細胞質に誤局在する（そして場合によってはその後蓄積する）ことが観察されている。この核からの排除および細胞質への誤局在が、散発性ＡＬＳを含む複数の神経変性疾患における病的現象としてＴＤＰ－４３の機能喪失につながると考えられている（３６、６６）。カリオフェリンと呼ばれる核輸送受容体との会合により、ＮＰＣとその個々のＮｕｐ構成要素は、核内および核外へのタンパク質およびＲＮＡ種の核細胞質輸送（ＮＣＴ）を決定的に支配することが知られている（４５、４６、６５）。ＴＤＰ－４３は核と細胞質との間を行き来してそのｍＲＮＡ標的の代謝を調節していることから（６８、６９）、ヒトニューロンにおけるＴＤＰ－４３の誤局在および機能不全に、少なくとも部分的にＮＰＣ損傷が寄与しているかもしれないと仮定した。これを確認するために、まず野生型ｉＰＳＮにＧＦＰタグ付きＣＨＭＰ７バリアントを過剰発現させ、免疫染色および共焦点顕微鏡によって内在性ＴＤＰ－４３の局在をモニタリングした。ＧＦＰタグ付き野生型ＣＨＭＰ７の過剰発現は、内在性ＴＤＰ－４３の細胞内局在に影響を与えなかった（図１８ａ～ｃ）。一方、ＧＦＰタグ付きＣＨＭＰ７ ＮＥＳ変異体（ＣＨＭＰ７ ＮＥＳ＊）の過剰発現は、ＴＤＰ－４３の核／細胞質比の減少およびＴＤＰ－４３免疫染色の核強度の減少によって示されるように、コントロールｉＰＳＮにおいてＴＤＰ－４３の核から細胞質への有意な再局在化をもたらす（図１８ａ～ｃ）。最近、スタスミン－２ ｍＲＮＡスプライシングにおける変化が、ＴＤＰ－４３機能喪失の顕著な病的結果として同定された（７０、７１）。ＧＦＰタグ付きＣＨＭＰ７ ＮＥＳ＊構築物の過剰発現によりＴＤＰ－４３が破壊されたか否かを評価するため、全長および切断型スタスミン－２ ｍＲＮＡ種についてｑＲＴ－ＰＣＲを実施した。野生型ＣＨＭＰ７の過剰発現は、スタスミン－２ ｍＲＮＡスプライシングに影響を与えなかったが、ＣＨＭＰ７ ＮＥＳ＊の過剰発現は、全長のスタスミン－２ ｍＲＮＡの有意な減少および切断型スタスミン－２ ｍＲＮＡの対応する増加（図１８ｄ～ｅ）をもたらし、ＴＤＰ－４３機能の喪失と一致した（７０、７１）。まとめると、これらのデータは、ＣＨＭＰ７の核内保持が、ヒトニューロンにおける核内Ｎｕｐ発現、ならびにＴＤＰ－４３の局在および機能に影響を与える病的カスケードを開始するのに十分であることを示す。
【0185】
次に、ＣＨＭＰ７およびＴＤＰ－４３の共病態が実際のヒトの疾患で観察できるか否かを調べるために、死後患者の運動皮質からのパラフィン包埋薄切片における二重免疫染色を実施した（図１９ａ）。免疫染色および画像化の後、個々のＭａｐ２陽性ニューロンにおいて、ＴＤＰ－４３免疫染色の核／細胞質比を、ＣＨＭＰ７免疫染色の細胞質／核比と定量的に比較した（図１９ｂ～１９ｂ）。ＴＤＰ－４３の誤局在が正常な老化（７２）または非変性神経細胞損傷の結果として（７３、７４）観察される可能性があるという報告と一致して、非神経性コントロール運動皮質組織のニューロンのサブセットは、ＣＨＭＰ７病態とは独立して核／細胞質ＴＤＰ－４３免疫反応性の減少を示した（図１９ｂ、青枠）。一方、疾患運動皮質においては、Ｃ９ｏｒｆ７２およびｓＡＬＳ患者運動皮質におけるＭａｐ２陽性ニューロンの約８０～９０％が、核ＣＨＭＰ７免疫染色の増加を示すことが明らかになった（図１９）。これらのＣＨＭＰ７病態陽性ニューロンのサブセットはまた、ＴＤＰ－４３免疫染色の核／細胞質比の減少も示した（図１９ａ、１９ｃ～ｄ）。注目すべきことに、細胞質ＴＤＰ－４３の凝集は、核／細胞質ＣＨＭＰ７免疫反応性が増加した少数のニューロンで観察された（図１９ａ）。興味深いことに、評価したニューロンの大部分は、ＣＨＭＰ７病態は陽性であったが、ＴＤＰ－４３病態は陰性であり（図１９）、核内ＣＨＭＰ７の増加が神経変性における神経細胞損傷の開始現象であるという仮説と一致した。
【0186】
（実施例１３）
｛ＣＨＭＰ７のＡＳＯ媒介ノックダウンは、Ｎｕｐの変化を緩和し、スタスミン－２スプライシングの欠損を軽減し、神経細胞の生存を改善する。｝
我々のデータは、治療的にＣＨＭＰ７を減少させることが、Ｎｕｐの変化およびＴＤＰ－４３の機能不全を特徴とする神経変性疾患に有益なものとなり得ることを示唆する。ＡＳＯは現在、目的の遺伝子のｍＲＮＡおよびタンパク質レベルを低減する治療戦略として一般的に使用されている（７５、７６）。この治療戦略がＮＰＣ損傷を効果的に軽減するか否かを評価するために、ヒトＣＨＭＰ７のｍＲＮＡ前駆体を特異的に標的とし、ＲＮａｓｅ Ｈベースのメカニズムを介してその分解を誘導するＡＳＯを設計した。スクランブルコントロールＡＳＯと比較して、３種類の異なるＣＨＭＰ７標的ＡＳＯに２週間曝露すると、コントロールおよびＣ９ｏｒｆ７２ ｉＰＳＮにおけるＣＨＭＰ７タンパク質レベルが、用量依存的に有意に減少した（図２４）。全ｉＰＳＮ溶解物を用いたウェスタンブロット実験（図２４）と一致して、ＳＩＭ分析によって、ＣＨＭＰ７ ＡＳＯ処理は、コントロール、Ｃ９ｏｒｆ７２、およびｓＡＬＳ ｉＰＳＮにおいてＣＨＭＰ７の核レベルを有意に低減したことが明らかになった（図２０ａ～ｂ）。さらに、スクランブルコントロールＡＳＯと比較して、５μＭのＣＨＭＰ７ ＡＳＯ２は、ＳＩＭによって評価されるように、Ｃ９ｏｒｆ７２およびｓＡＬＳ ｉＰＳＮの核ならびにＮＰＣにおけるＰＯＭ１２１、Ｎｕｐ１３３、およびＮｕｐ５０発現を有意に回復した（図２０ａ、２０ｃ～ｆ）。重要なことに、ＣＨＭＰ７ ＡＳＯで処理したコントロールｉＰＳＮにおけるＮｕｐ（図２０ａ、２０ｃ～ｆ）でも、Ｃ９ｏｒｆ７２またはｓＡＬＳ ｉＰＳＮにおけるＦＧ Ｎｕｐ（図２０ａ、２０ｆ）でも破壊は観察されず、ＣＨＭＰ７タンパク質レベルのＡＳＯ媒介ノックダウンがｉＰＳＮにおける疾患に関連するＮｕｐの変化を特異的に軽減させることを示唆した。
｛ＣＨＭＰ７のＡＳＯ媒介ノックダウンは、Ｎｕｐの変化を緩和し、スタスミン－２スプライシングの欠損を軽減し、神経細胞の生存を改善する。｝
我々のデータは、治療的にＣＨＭＰ７を減少させることが、Ｎｕｐの変化およびＴＤＰ－４３の機能不全を特徴とする神経変性疾患に有益なものとなり得ることを示唆する。ＡＳＯは現在、目的の遺伝子のｍＲＮＡおよびタンパク質レベルを低減する治療戦略として一般的に使用されている（７５、７６）。この治療戦略がＮＰＣ損傷を効果的に軽減するか否かを評価するために、ヒトＣＨＭＰ７のｍＲＮＡ前駆体を特異的に標的とし、ＲＮａｓｅ Ｈベースのメカニズムを介してその分解を誘導するＡＳＯを設計した。スクランブルコントロールＡＳＯと比較して、３種類の異なるＣＨＭＰ７標的ＡＳＯに２週間曝露すると、コントロールおよびＣ９ｏｒｆ７２ ｉＰＳＮにおけるＣＨＭＰ７タンパク質レベルが、用量依存的に有意に減少した（図２４）。全ｉＰＳＮ溶解物を用いたウェスタンブロット実験（図２４）と一致して、ＳＩＭ分析によって、ＣＨＭＰ７ ＡＳＯ処理は、コントロール、Ｃ９ｏｒｆ７２、およびｓＡＬＳ ｉＰＳＮにおいてＣＨＭＰ７の核レベルを有意に低減したことが明らかになった（図２０ａ～ｂ）。さらに、スクランブルコントロールＡＳＯと比較して、５μＭのＣＨＭＰ７ ＡＳＯ２は、ＳＩＭによって評価されるように、Ｃ９ｏｒｆ７２およびｓＡＬＳ ｉＰＳＮの核ならびにＮＰＣにおけるＰＯＭ１２１、Ｎｕｐ１３３、およびＮｕｐ５０発現を有意に回復した（図２０ａ、２０ｃ～ｆ）。重要なことに、ＣＨＭＰ７ ＡＳＯで処理したコントロールｉＰＳＮにおけるＮｕｐ（図２０ａ、２０ｃ～ｆ）でも、Ｃ９ｏｒｆ７２またはｓＡＬＳ ｉＰＳＮにおけるＦＧ Ｎｕｐ（図２０ａ、２０ｆ）でも破壊は観察されず、ＣＨＭＰ７タンパク質レベルのＡＳＯ媒介ノックダウンがｉＰＳＮにおける疾患に関連するＮｕｐの変化を特異的に軽減させることを示唆した。
【0187】
ＮＰＣの重要な機能は、核細胞質輸送（ＮＣＴ）を制御することである。双方向のＮＣＴを駆動するのに十分なエネルギーを供給するために、Ｒａｎ ＧＴＰａｓｅが核内で高レベルに維持されることが必要である（４６、７７）。そのため、Ｒａｎ ＧＴＰａｓｅの局在は、しばしばＮＣＴの変化を評価するための静的な測定基準として用いられ、ＡＬＳ／ＦＴＤ ｉＰＳＮを含む複数の神経変性疾患モデルは、細胞質のＲａｎ ＧＴＰａｓｅ免疫染色の増加を示す（４３、７８－８０）。核内のＮｕｐレベルを回復させると、Ｃ９ｏｒｆ７２ ｉＰＳＮにおいてＲａｎ ＧＴＰａｓｅの核への局在が有意に回復することが、以前に立証されている（４３）。この報告と一致して、ノックダウンならびにＣＨＭＰ７発現、およびその後の核質およびＮＰＣ内のＮｕｐ発現の回復は、免疫染色および共焦点イメージングによって評価されるように、Ｃ９ｏｒｆ７２およびｓＡＬＳ ｉＰＳＮ（図２５）におけるＲａｎ ＧＴＰａｓｅの適切な細胞内分布を回復させる。
【0188】
ＣＨＭＰ７のノックダウン、ならびにその後のＣ９ｏｒｆ７２およびｓＡＬＳ ｉＰＳＮ核の核質およびＮＰＣ内のＮｕｐレベルの回復が、ＴＤＰ－４３媒介スプライシング機能不全を緩和するのに十分であるかどうかを決定するために、全長および切断型スタスミン－２ ｍＲＮＡについてｑＲＴ－ＰＣＲを実施した。分化４６日目、核Ｎｕｐ減少の出現の約２週間後に、スクランブルコントロールＡＳＯ処理Ｃ９ｏｒｆ７２およびｓＡＬＳ ｉＰＳＮにおいて、全長スタスミン－２ ｍＲＮＡの有意な減少および切断型スタスミン－２ ｍＲＮＡの対応する増加が観察された（図２０ｇ～ｈ）。ＣＨＭＰ７ ＡＳＯ２への３週間の曝露後、全長および切断型スタスミン－２ ｍＲＮＡレベルは、コントロールｉＰＳＮにおいて観察されたレベルに回復した（図２０ｇ～ｈ）。さらに、評価したｓＡＬＳ ｉＰＳＣ株のサブセットにおいて、分化４６日目に、ＴＤＰ－４３の核から細胞質へのわずかだが有意な誤局在が観察された（図２６）。ＴＤＰ－４３機能の喪失を緩和する役割と一致して、ＣＨＭＰ７ ＡＳＯ２を用いた３週間の処理は、ｓＡＬＳ ｉＰＳＮｓにおける核ＴＤＰ－４３局在化を回復させた（図２６）。
【0189】
まとめると、観察されたＮｕｐの変化は、神経細胞の生存に重要な複数の細胞機能および経路に影響を与える可能性があると考えられる。その結果、次に、ストレス要因によって誘発された神経細胞生存の欠陥を緩和するためのＣＨＭＰ７ ＡＳＯの有効性を評価した。ＣＨＭＰ７ ＡＳＯ２を用いて２週間処理すると、Ｃ９ｏｒｆ７２およびｓＡＬＳ ｉＰＳＮのグルタミン酸誘導興奮毒性に対する感受性が有意に低下し（図２０ｉ）、以前に記載されたようにヨウ化プロピジウム（ＰＩ）取り込みによって測定した（４１、４３）。これらのデータは、Ｃ９ｏｒｆ７２およびｓＡＬＳ ｉＰＳＮにおけるＮｕｐおよびＮＰＣの欠陥、下流のＴＤＰ－４３機能不全、ならびに神経細胞死を軽減するためのＣＨＭＰ７ ＡＳＯの治療可能性を強調するものである。
【0190】
（実施例１４）
｛神経変性におけるＣＨＭＰ７に媒介されるＮｕｐの変化｝
病的なＮｕｐの変化は、ＡＬＳ、ＡＤ、およびＨＤを含む複数の神経変性疾患に広くみられる（７８－８１）。しかし、これらの破壊が起こる分子メカニズムはまだ十分に理解されていない。Ｃ９ｏｒｆ７２ ＡＬＳ／ＦＴＤの人工過剰発現マウスモデルで観察されたＮｕｐの誤局在とは対照的に（８２－８５）、我々は以前に、ヒトニューロンにおいて、ＮＰＣの複数のサブ複合体にまたがる８つの特定のＮｕｐの核内レベルが低下しており、対応する細胞質への蓄積は起こらないことを示した（４３）。その結果、Ｃ９ｏｒｆ７２ ｉＰＳＮにおけるＮｕｐ発現の低下には、Ｎｕｐの監視および恒常性の変化が寄与し得ると仮定された。
｛神経変性におけるＣＨＭＰ７に媒介されるＮｕｐの変化｝
病的なＮｕｐの変化は、ＡＬＳ、ＡＤ、およびＨＤを含む複数の神経変性疾患に広くみられる（７８－８１）。しかし、これらの破壊が起こる分子メカニズムはまだ十分に理解されていない。Ｃ９ｏｒｆ７２ ＡＬＳ／ＦＴＤの人工過剰発現マウスモデルで観察されたＮｕｐの誤局在とは対照的に（８２－８５）、我々は以前に、ヒトニューロンにおいて、ＮＰＣの複数のサブ複合体にまたがる８つの特定のＮｕｐの核内レベルが低下しており、対応する細胞質への蓄積は起こらないことを示した（４３）。その結果、Ｃ９ｏｒｆ７２ ｉＰＳＮにおけるＮｕｐ発現の低下には、Ｎｕｐの監視および恒常性の変化が寄与し得ると仮定された。
【0191】
酵母および非神経細胞系における最近の研究により、ＣＨＭＰ７が、ＮＰＣ、Ｎｕｐ、および核膜の恒常性の重要なメディエータであることが明らかになった（４８、５０、５１、８６）。しかし、この経路の神経生物学および疾患の病態生理に対する寄与は、依然として不明である。散発性ＡＬＳおよび家族性ＡＬＳ／ＦＴＤのｉＰＳＮモデルを用いて、疾患発病の初期現象として、疾患と関連したＣＨＭＰ７の核内発現の増加が、ＮＰＣの３つの異なるドメインに位置する主要なＮｕｐの核内レベルの低下に寄与しているという証拠を得た。これらのデータは、ＣＨＭＰ７が媒介するＮｕｐ恒常性の、ヒトニューロンおよび神経変性における機能的な役割を定義している。
【0192】
ＥＳＣＲＴ－ＩＩＩに媒介されるＮＰＣおよび核膜修復は、核特異的ＥＳＣＲＴアダプタタンパク質ＣＨＭＰ７によって開始されるが（８７）、このプロセスにおける他のＣＨＭＰの動員および関与は、ヒトニューロンを含む複数の細胞系において依然として不明である。ＥＳＣＲＴ－ＩＩＩ経路の構成要素であるＣＨＭＰ２Ｂの変異がＦＴＤに関連付けられていることから（８８）、これらの変異が、Ｃ９ｏｒｆ７２およびｓＡＬＳ ｉＰＳＮで観察されたのと同様の方法でヌクレオポリン減少を誘導するのに十分か否かを評価することは興味深いであろう。
【0193】
（実施例１５）
｛神経変性におけるＴＤＰ－４３病態へのＮｕｐの変化の寄与｝
ＴＤＰ－４３の核からの排除および誤局在は、ＡＬＳならびにＡＤおよびＦＴＤを含む関連する神経変性疾患の顕著な病理学的特徴としてみなされてきた（３６、７２、８９）。しかし、この病態および／または疾患におけるＴＤＰ－４３の機能喪失に寄与し得る生物学的現象は十分に理解されていない。本明細書では、ＣＨＭＰ７の核内保持が、疾患におけるＴＤＰ－４３の誤局在および機能不全に少なくとも部分的に寄与する可能性があることを示す複数の証拠を提供する。興味深いことに、Ｃ９ｏｒｆ７２およびｓＡＬＳ ｉＰＳＮならびに核内保持されるＣＨＭＰ７を人工的に過剰発現させたコントロールｉＰＳＮでは、ＴＤＰ－４３の局在の変化およびスタスミン２のｍＲＮＡプロセシングの欠陥およびＴＤＰ－４３の誤局在化は、Ｎｕｐ変化の出現後かなり時間が経ってから起こる。これらのデータは、死後の疾患ニューロンの８０～９０％がＣＨＭＰ７免疫反応性の増加を示すが、それらのサブセットのみがＴＤＰ－４３病態も陽性であるという我々の共病態分析を裏付けるものである。
｛神経変性におけるＴＤＰ－４３病態へのＮｕｐの変化の寄与｝
ＴＤＰ－４３の核からの排除および誤局在は、ＡＬＳならびにＡＤおよびＦＴＤを含む関連する神経変性疾患の顕著な病理学的特徴としてみなされてきた（３６、７２、８９）。しかし、この病態および／または疾患におけるＴＤＰ－４３の機能喪失に寄与し得る生物学的現象は十分に理解されていない。本明細書では、ＣＨＭＰ７の核内保持が、疾患におけるＴＤＰ－４３の誤局在および機能不全に少なくとも部分的に寄与する可能性があることを示す複数の証拠を提供する。興味深いことに、Ｃ９ｏｒｆ７２およびｓＡＬＳ ｉＰＳＮならびに核内保持されるＣＨＭＰ７を人工的に過剰発現させたコントロールｉＰＳＮでは、ＴＤＰ－４３の局在の変化およびスタスミン２のｍＲＮＡプロセシングの欠陥およびＴＤＰ－４３の誤局在化は、Ｎｕｐ変化の出現後かなり時間が経ってから起こる。これらのデータは、死後の疾患ニューロンの８０～９０％がＣＨＭＰ７免疫反応性の増加を示すが、それらのサブセットのみがＴＤＰ－４３病態も陽性であるという我々の共病態分析を裏付けるものである。
【0194】
まとめると、このデータは、核内ＣＨＭＰ７の増加が、Ｃ９ｏｒｆ７２およびｓＡＬＳ核内の神経細胞ＮＰＣの複数のサブコンプレックスにまたがる特定のＮｕｐｓの核レベルに影響を与える病的カスケードの、重要なイニシエータであることを示唆している。最終的には、このＮＰＣへの複合的な「損傷」がＴＤＰ－４３の機能不全および下流の神経細胞生存の欠陥に寄与していると考えられる。さらに、このデータは、ＣＨＭＰ７が、核内Ｎｕｐの減少およびＴＤＰ－４３病態を特徴とする神経変性疾患における潜在的な治療標的であることを強調する。
【0195】
（実施例１６）
【0196】
＜材料および方法＞
【0197】
［ｉＰＳＣ由来の神経細胞の分化］
【0198】
変異型Ｃ９ｏｒｆ７２、ｓＡＬＳ、および非神経性コントロールｉＰＳＣ株は、Ｃｅｄａｒｓ－ＳｉｎａｉのＡｎｓｗｅｒ ＡＬＳリポジトリから入手し（人口統計については下記の表Ｌを参照）、Ｃｅｄａｒｓ Ｓｉｎａｉ標準操作手順に従ってＭＴｅＳＲを含むマトリゲル上で維持した。
【0199】
【表12-1】
【表12-2】
【表12-3】
【0200】
ｉＰＳＣは、Coyne AN, Baskerville V, Zaepfel BL, Dickson DW, Rigo F, Bennett F, Patrick Lusk C, Rothstein JD, “Nuclear accumulation of CHMP7 initiates nuclear pore complex injury and subsequent TDP-43 dysfunction in sporadic and familial ALS”, Sci Translat. Med. (2021) およびCoyne AN, Zaepfel BL, Hayes L, Fitchman B, Salzberg Y, Luo EC, Bowen K, Trost H, Aigner S, Rigo F et al. “G(4)C(2) repeat RNA initiates a POM121-mediated reduction in specific nucleoporins in C9orf72 ALS/FTD, Neuron (2020).に以前記載されたように、直接誘導運動ニューロン（ｄｉＭＮ）プロトコルを用いて混合脊髄神経細胞集団に分化した。すべての細胞は、３７℃、５％ＣＯ２で維持した。ｉＰＳＣおよびｉＰＳＮは、定期的にマイコプラズマについて陰性であることを確認した。
【0201】
［ｉＰＳＮのＡＳＯ処理］
【0202】
Coyne AN, Baskerville V, Zaepfel BL, Dickson DW, Rigo F, Bennett F, Patrick Lusk C, Rothstein JD, “Nuclear accumulation of CHMP7 initiates nuclear pore complex injury and subsequent TDP-43 dysfunction in sporadic and familial ALS”, Sci Translat. Med. (2021) に以前に記載されたように、分化２５日目に、５μＭスクランブルコントロール（６７６６３０）：ＣＣＴＡＴＡＧＧＡＣＴＡＴＣＣＡＧＧＡＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）またはＣＨＭＰ７標的化（１５０８９１７）：ＴＧＴＴＡＣＣＣＴＣＡＧＡＴＡＣＣＧＣＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）ＡＳＯを培地に添加した。分化４０日目にｉＰＳＮ分析を行うまで、培地およびＡＳＯを３日ごとに交換した。ＡＳＯはＩｏｎｉｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社によって寛大に提供された。
【0203】
［ｉＰＳＮのヌクレオフェクション］
【0204】
分化１８日目に、ｉＰＳＮをメーカーのプロトコルに従ってアキュターゼで解離させて単細胞解離を補助し、Ｌｏｎｚａ Ｐ３ Ｐｒｉｍａｒｙ Ｃｅｌｌ ４Ｄ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒキット（Ｌｏｎｚａ）およびプログラムＤＣ１０４を用いた懸濁液ベースのヌクレオフェクションに供した。各ヌクレオフェクション反応には、５００万個のｉＰＳＮおよび４μｇのプラスミドＤＮＡを使用した。使用したプラスミドは以下のとおりである：ＧＦＰ（Ａｄｄｇｅｎｅ５４７５９）、ＶＰＳ４ ＧＦＰ（Ａｄｄｇｅｎｅ１１６９２４）、およびＶＰＳ４Ｅ２２８ＱＧＦＰ（Ａｄｄｇｅｎｅ８０３５１）。ヌクレオフェクションしたｉＰＳＮを、マトリゲル（Ｃｏｒｎｉｎｇ）コーティングされた細胞培養皿に播種し、翌日に培地を交換し、その後、分化４０日目の下流分析まで３日ごとに培地を交換した。
【0205】
［核の単離および超解像構造化照明顕微鏡法］
【0206】
核は、ｉＰＳＮならびに死後のヒト運動皮質および後頭部皮質組織から、Ｎｕｃｌｅｉ Ｐｕｒｅ Ｐｒｅｐ核単離キット（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて、Coyne AN, Baskerville V, Zaepfel BL, Dickson DW, Rigo F, Bennett F, Patrick Lusk C, Rothstein JD, “Nuclear accumulation of CHMP7 initiates nuclear pore complex injury and subsequent TDP-43 dysfunction in sporadic and familial ALS”, Sci Translat. Med. (2021) およびCoyne AN, Zaepfel BL, Hayes L, Fitchman B, Salzberg Y, Luo EC, Bowen K, Trost H, Aigner S, Rigo F et al. “G(4)C(2) repeat RNA initiates a POM121-mediated reduction in specific nucleoporins in C9orf72 ALS/FTD, Neuron (2020)に以前に記載されたようにわずかに修正したメーカーのプロトコルに従って単離した。約１０００万個のｉＰＳＮまたは１００ｍｇの凍結死後運動皮質組織（Ｔａｒｇｅｔ ＡＬＳ Ｈｕｍａｎ Ｐｏｓｔｍｏｒｔｅｍ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｏｒｅから入手（人口統計については表Ｍを参照））を核単離に使用した。
【0207】
【表13】
【0208】
１．８５Ｍスクロース勾配を使用して、神経細胞核を濃縮した。単離後、核を遠心分離機でコラーゲンコーティング（１ｍｇ／ｍＬ；Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｂｉｏｍａｔｒｉｘ）スライド上にＣｙｔｏＳｐｉｎ ４遠心分離機（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて遠心分離し、以前にCoyne AN, Baskerville V, Zaepfel BL, Dickson DW, Rigo F, Bennett F, Patrick Lusk C, Rothstein JD, “Nuclear accumulation of CHMP7 initiates nuclear pore complex injury and subsequent TDP-43 dysfunction in sporadic and familial ALS”, Sci Translat. Med. (2021) およびCoyne AN, Zaepfel BL, Hayes L, Fitchman B, Salzberg Y, Luo EC, Bowen K, Trost H, Aigner S, Rigo F et al. “G(4)C(2) repeat RNA initiates a POM121-mediated reduction in specific nucleoporins in C9orf72 ALS/FTD, Neuron (2020) に記載されたように免疫染色をした（以下の表Ｎを参照）。
【0209】
【表14】
【0210】
単離された核は、その後、Coyne AN, Baskerville V, Zaepfel BL, Dickson DW, Rigo F, Bennett F, Patrick Lusk C, Rothstein JD, “Nuclear accumulation of CHMP7 initiates nuclear pore complex injury and subsequent TDP-43 dysfunction in sporadic and familial ALS”, Sci Translat. Med. (2021) およびCoyne AN, Zaepfel BL, Hayes L, Fitchman B, Salzberg Y, Luo EC, Bowen K, Trost H, Aigner S, Rigo F et al. “G(4)C(2) repeat RNA initiates a POM121-mediated reduction in specific nucleoporins in C9orf72 ALS/FTD, Neuron (2020)に以前記載されたように、Ｚｅｉｓｓ ＥＬＹＲＡ Ｓ１を用いて超解像構造化照明顕微鏡（ＳＩＭ）で画像化した。すべての画像は、同一の画像化パラメーター（例えば、レーザー出力、ゲイン）を使用して取得し、Ｚｅｉｓｓ Ｚｅｎ Ｂｌａｃｋ ２．３ ＳＰ１でデフォルトＳＩＭデコンボリューションおよび処理に供した。代表的な画像は、Ｚｅｉｓｓ Ｚｅｎ Ｂｌａｃｋ ２．３ ＳＰ１で生成した３Ｄ最大強度投影として提示した。画像は、コントラストおよび表示のためにフェイクで緑色に着色した。
【0211】
［ウェスタンブロット］
【0212】
核およびｉＰＳＮ溶解液は、ＲＩＰＡ溶解バッファーを用いてCoyne AN, Baskerville V, Zaepfel BL, Dickson DW, Rigo F, Bennett F, Patrick Lusk C, Rothstein JD, “Nuclear accumulation of CHMP7 initiates nuclear pore complex injury and subsequent TDP-43 dysfunction in sporadic and familial ALS”, Sci Translat. Med. (2021) およびCoyne AN, Zaepfel BL, Hayes L, Fitchman B, Salzberg Y, Luo EC, Bowen K, Trost H, Aigner S, Rigo F et al. “G(4)C(2) repeat RNA initiates a POM121-mediated reduction in specific nucleoporins in C9orf72 ALS/FTD, Neuron (2020)に以前記載されたように作製した。５μｇのタンパク質を、４～２０％アクリルアミドゲル（Ｂｉｏｒａｄ）を用いてＳＤＳ－ＰＡＧＥに供し、Ｔｒａｎｓ－Ｂｌｏｔ Ｔｕｒｂｏ Ｔｒａｎｓｆｅｒシステムを用いてニトロセルロース膜上に、Coyne AN, Baskerville V, Zaepfel BL, Dickson DW, Rigo F, Bennett F, Patrick Lusk C, Rothstein JD, “Nuclear accumulation of CHMP7 initiates nuclear pore complex injury and subsequent TDP-43 dysfunction in sporadic and familial ALS”, Sci Translat. Med. (2021)およびCoyne AN, Zaepfel BL, Hayes L, Fitchman B, Salzberg Y, Luo EC, Bowen K, Trost H, Aigner S, Rigo F et al. “G(4)C(2) repeat RNA initiates a POM121-mediated reduction in specific nucleoporins in C9orf72 ALS/FTD, Neuron (2020)に以前記載されたように転写したブロック（０．１％Ｔｗｅｅｎ－２０を含む１×ＴＢＳ中の５％脱脂乳）で、３０分間室温でインキュベートした後、ブロットを、ブロックで希釈した一次抗体中で（表Ｎを参照）、回転させながら４℃で一晩インキュベートした。１６～１８時間後、ブロットを１×ＴＢＳＴで４×１０分間洗浄し、次にブロックで希釈した二次抗体中で（表Ｎを参照）、室温で１時間、回転させながらインキュベートした。次いで、ブロットを１×ＴＢＳＴで４×１０分間洗浄し、ＥＣＬ基質（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）とともに３０秒間インキュベートした。化学発光画像の取得には、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ ＬＡＳ ４００システムを使用した。剥離せずに膜を順次プロービングするのを容易にするため、ブロットを３０％Ｈ２Ｏ２とともに室温で１５分間インキュベートした（Sennepin AD, Charpentier S, Normand T, Sarre C, Legrand A, Mollet LM, Multiple reprobing of Western blots after inactivation of peroxidase activity by its substrate, hydrogen peroxide, Anal Biochem, 393:129-131 (2009)）。分析はＦＩＪＩソフトウェアで行った。ＧＡＰＤＨおよびラミンＢ１を正規化に使用した。
【0213】
［統計分析］
【0214】
全てのデータ分析は、Coyne AN, Baskerville V, Zaepfel BL, Dickson DW, Rigo F, Bennett F, Patrick Lusk C, Rothstein JD, “Nuclear accumulation of CHMP7 initiates nuclear pore complex injury and subsequent TDP-43 dysfunction in sporadic and familial ALS”, Sci Translat. Med. (2021) およびCoyne AN, Zaepfel BL, Hayes L, Fitchman B, Salzberg Y, Luo EC, Bowen K, Trost H, Aigner S, Rigo F et al. “G(4)C(2) repeat RNA initiates a POM121-mediated reduction in specific nucleoporins in C9orf72 ALS/FTD, Neuron (2020)に以前記載されたように、ＦＩＪＩまたはＩｍａｒｉｓを用いて実施した。分析者は、遺伝子型／治療／時点／脳領域情報に対して完全に盲検化した。すべての統計分析は、Ｐｒｉｓｍバージョン９（ＧｒａｐｈＰａｄ）を用いて実施した。イメージング実験では、各ｉＰＳＣ株、患者、および治療条件ごとに評価したすべての核または細胞の平均がｎ＝１となるように統計分析を実施した。実験ごとに評価した核または細胞の総数は、図の説明に示した。両側Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定、Ｔｕｋｅｙの多重比較検定つき一元配置分散分析、またはＴｕｋｅｙの多重比較検定つき二元配置分散分析は、実験設計に応じて、図の説明で示されたとおりに使用した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。バイオリンプロットを使用して、大規模なデータセット（＞１０データポイント）の完全な広がりとばらつきを表示した。中央の点線は中央値を示す。さらに２本の点線は、第一四分位数および第三四分位数を示す。個々のデータ点を持つ棒グラフを使用して、１０データポイント未満のデータセットを要約して表示した。
【0215】
＜結果＞
【0216】
［ＥＳＣＲＴ－ＩＩＩタンパク質ＶＰＳ４の発現は、Ｃ９ｏｒｆ７２およびｓＡＬＳ神経細胞核で増加する］
【0217】
ＥＳＣＲＴ－ＩＩＩタンパク質ＣＨＭＰ７の核局在および発現の増加は、Ｃ９ｏｒｆ７２ ＡＬＳ／ＦＴＤおよびｓＡＬＳにおけるＮＰＣ損傷につながる、初期および結果的な病的現象として以前に特定された（Coyne AN, Baskerville V, Zaepfel BL, Dickson DW, Rigo F, Bennett F, Patrick Lusk C, Rothstein JD, “Nuclear accumulation of CHMP7 initiates nuclear pore complex injury and subsequent TDP-43 dysfunction in sporadic and familial ALS”, Sci Translat. Med. (2021)）。ＮＰＣおよびＮＥの監視および恒常性における追加のＥＳＣＲＴ－ＩＩＩタンパク質（ＣＨＭＰ４Ｂ、ＣＨＭＰ２Ｂ、およびＶＰＳ４）の関与が以前に報告されていることから（Denais CM, Gilbert RM, Isermann P, McGregor AL, te Lindert M, Weigelin B, Davidson PM, Friedl P, Wolf K, Lammerding J, Nuclear envelope rupture and repair during cancer cell migration, Science(New York, NY) 352:353-358, (2016)、Toyama BH, Arrojo EDR, Lev-Ram V, Ramachandra R, Deerinck TJ, Lechene C, Ellisman MH, Hetzer MW, Visualization of long-lived proteins reveals age mosaicism within nuclei of postmitotic cells, J Cell Biol. (2018)、Vietri M, Radulovic M, Stenmark H, The many functions of ESCRTs, Nat Rev Mol Cell Biol. (2019)、Vietri M, Schultz SW, Bellanger A, Jones CM, Petersen LI, Raiborg C, Skarpen E, Pedurupillay CRJ, Kjos I, Kip E et al, Unrestrained ESCRT-III drives micronuclear catastrophe and chromosome fragmentation, Nat Cell Biol., 22:856-867 (2020)）、ＡＬＳ神経細胞核においてＣＨＭＰ４Ｂ、ＣＨＭＰ２Ｂ、およびＶＰＳ４の核内分布および細胞内発現が変化しているか否かを決定するための検討を行った。免疫染色ＳＩＭを用いて、Ｃ９ｏｒｆ７２ ＡＬＳ／ＦＴＤおよびｓＡＬＳ ｉＰＳＮから単離した核において、ＣＨＭＰ４ＢおよびＣＨＭＰ２Ｂではなく、ＶＰＳ４の量がコントロールと比較して増加していることが明らかになった（図２７）。発表されたＣＨＭＰ７についての観察と同様に（(Coyne AN, Baskerville V, Zaepfel BL, Dickson DW, Rigo F, Bennett F, Patrick Lusk C, Rothstein JD, “Nuclear accumulation of CHMP7 initiates nuclear pore complex injury and subsequent TDP-43 dysfunction in sporadic and familial ALS”, Sci Translat. Med. (2021)）、核ＶＰＳ４スポットの増加は、ＮＰＣ損傷の開始前の時点で起こった（図２７ａ、２７ｅ）。重要なことに、Ｃ９ｏｒｆ７２ ＡＬＳ／ＦＴＤまたはｓＡＬＳ全細胞ｉＰＳＮ溶解液におけるＶＰＳ４、ＣＨＭＰ４Ｂ、またはＣＨＭＰ２Ｂレベルの全体的な増加は検出されなかった（図３１ａ－３１ｄ）。ウェスタンブロット分析により、Ｃ９ｏｒｆ７２ ＡＬＳ／ＦＴＤおよびｓＡＬＳ ｉＰＳＮから単離した核において、ＣＨＭＰ４ＢおよびＣＨＭＰ２Ｂタンパク質ではなく、ＶＰＳ４が増加していることを定量的に確認し、タンパク質の分布だけでなく発現も評価できるＳＩＭの有用性が強調された（図３１ｅ～ｈ）。これらのデータは、ＣＨＭＰ７と同様（Coyne AN, Baskerville V, Zaepfel BL, Dickson DW, Rigo F, Bennett F, Patrick Lusk C, Rothstein JD, “Nuclear accumulation of CHMP7 initiates nuclear pore complex injury and subsequent TDP-43 dysfunction in sporadicand familial ALS”, Sci Translat. Med. (2021)）、ＶＰＳ４がＡＬＳニューロンにおいて細胞質から核に再局在化し得ることを示唆する。
【0218】
ｉＰＳＮからの結果が実際のヒト疾患組織における観察を再現していることを検証するため、死後のヒト運動皮質および後頭部皮質組織から単離した核において、ＣＨＭＰ４Ｂ、ＣＨＭＰ２Ｂ、およびＶＰＳ４の免疫染色およびＳＩＭを実施した。ｉＰＳＮにおけるデータと一致して、Ｃ９ｏｒｆ７２ ＡＬＳ／ＦＴＤおよびｓＡＬＳ運動皮質の神経細胞核において、ＣＨＭＰ４ＢおよびＣＨＭＰ２Ｂではなく、ＶＰＳ４が増加した（図２８ａ、図２８ｃ～ｅ）。一方、ＡＬＳにおいて健常なコントロール脳領域である後頭部皮質では、Ｃ９ｏｒｆ７２ ＡＬＳ／ＦＴＤおよびｓＡＬＳの神経細胞核におけるＣＨＭＰ４Ｂ、ＣＨＭＰ２Ｂ、およびＶＰＳ４の発現の変化は観察されなかった（図２８ｂ～ｅ）。
【0219】
［ＣＨＭＰ７のＡＳＯ媒介ノックダウンは、Ｃ９ｏｒｆ７２およびｓＡＬＳ神経細胞核においてＶＰＳ４病態を緩和する］
【0220】
ＣＨＭＰ７の細胞質から核への核再局在化は、ＶＰＳ４によるＮＰＣおよびＮＥ成分の切断および除去をもたらす、追加のＥＳＣＲＴ－ＩＩＩ経路構成要素の動員を開始することが提唱されている（Denais CM, Gilbert RM, Isermann P, McGregor AL, te Lindert M, Weigelin B, Davidson PM, Friedl P, Wolf K, Lammerding J, Nuclear envelope rupture and repair during cancer cell migration, Science(New York, NY) 352:353-358 (2016)、Thaller DJ, Allegretti M, Borah S, Ronchi P, Beck M, Lusk CP, An ESCRT-LEM protein surveillance system is poised to directly monitor the nuclear envelope and nuclear transport system, Elife (2019)、Toyama BH, Arrojo EDR, Lev-Ram V, Ramachandra R, Deerinck TJ, Lechene C, Ellisman MH, Hetzer MW Visualization of long-lived proteins reveals age mosaicism within nuclei of postmitotic cells, J Cell Biol., (2018)、Vietri M, Radulovic M, Stenmark H, The many functions of ESCRTs, Nat Rev Mol Cell Biol. (2019)、Vietri M, Schultz SW, Bellanger A, Jones CM, Petersen LI, Raiborg C, Skarpen E, Pedurupillay CRJ, Kjos I, Kip E et al., Unrestrained ESCRT-III drives micronuclear catastrophe and chromosome fragmentation, Nat Cell Biol., 22:856-867 (2020)、Webster BM, Colombi P, Jager J, Lusk CP, Surveillance of nuclear pore complex assembly by ESCRT-III/Vps4, Cell 159:388-401 (2014)、Webster BM, Thaller DJ, Jager J, Ochmann SE, Borah S, Lusk CP, Chm7 and Heh1 collaborate to link nuclear pore complex quality control with nuclear envelope sealing, EMBO J, 35:2447-2467 (2016)）。ＣＨＭＰ７のアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）媒介ノックダウンが、ＣＨＭＰ７の異常な核蓄積を軽減するだけでなく、Ｃ９ｏｒｆ７２およびｓＡＬＳ ｉＰＳＮｓにおけるＮＰＣ損傷ならびに下流のＮＰＣおよびＴＤＰ－４３機能不全を強力に緩和することは以前には示されていなかった（Coyne AN, Baskerville V, Zaepfel BL, Dickson DW, Rigo F, Bennett F, Patrick Lusk C, Rothstein JD, “Nuclear accumulation of CHMP7 initiates nuclear pore complex injury and subsequent TDP-43 dysfunction in sporadic and familial ALS”, Sci Translat. Med. (2021)）。核内ＣＨＭＰ７の増加が、ヒトニューロンにおけるＥＳＣＲＴ－ＩＩＩ経路の下流構成要素の核内分布および発現に影響を与えたか否かを確認するために、ＣＨＭＰ７標的化ＡＳＯを有するコントロールおよびＡＬＳ ｉＰＳＮ（(Coyne AN, Baskerville V, Zaepfel BL, Dickson DW, Rigo F, Bennett F, Patrick Lusk C, Rothstein JD, “Nuclear accumulation of CHMP7 initiates nuclear pore complex injury and subsequent TDP-43 dysfunction in sporadic and familial ALS”, Sci Translat. Med. (2021))を、ＣＨＭＰ７（Coyne AN, Baskerville V, Zaepfel BL, Dickson DW, Rigo F, Bennett F, Patrick Lusk C, Rothstein JD, “Nuclear accumulation of CHMP7 initiates nuclear pore complex injury and subsequent TDP-43 dysfunction in sporadic and familial ALS”, Sci Translat. Med. (2021)）およびＶＰＳ４（図２７ａ、２７ｄ）の病態の出現後２週間処理した（上記「材料および方法」を参照）。ＳＩＭを使用して、ＡＳＯ媒介ＣＨＭＰ７ノックダウンが核ＣＨＭＰ４ＢおよびＣＨＭＰ２Ｂ免疫反応性に影響を与えないことが明らかになった（図２９ａ～ｄ）。対照的に、ＣＨＭＰ７レベルの低下（Coyne AN, Baskerville V, Zaepfel BL, Dickson DW, Rigo F, Bennett F, Patrick Lusk C, Rothstein JD, “Nuclear accumulation of CHMP7 initiates nuclear pore complex injury and subsequent TDP-43 dysfunction in sporadic cand familial ALS”, Sci Translat. Med. (2021)を参照）は、核ＶＰＳ４免疫反応性を有意に減少させ（図２９ｅ、２９ｆ）、核ＶＰＳ４発現の増加がＣＨＭＰ７に依存することが示唆される。
【0221】
［ＶＰＳ４機能障害は、Ｃ９ｏｒｆ７２およびｓＡＬＳ神経細胞核におけるＮＰＣの変化を軽減するのに十分ではない］
【0222】
ＮＰＣおよび核質からのＮｕｐ ＰＯＭ１２１の大幅な減少は、ＮＰＣに対する早期かつ着実な損傷であり（Coyne AN, Zaepfel BL, Hayes L, Fitchman B, Salzberg Y, Luo EC, Bowen K, Trost H, Aigner S, Rigo F et al. “G(4)C(2) repeat RNA initiates a POM121-mediated reduction in specific nucleoporins in C9orf72 ALS/FTD, Neuron (2020)）、ＣＨＭＰ７の異常な核蓄積の結果である（Coyne AN, Baskerville V, Zaepfel BL, Dickson DW, Rigo F, Bennett F, Patrick Lusk C, Rothstein JD, “Nuclear accumulation of CHMP7 initiates nuclear pore complex injury and subsequent TDP-43 dysfunction in sporadic and familial ALS”, Sci Translat. Med. (2021)）ことが以前に報告されているＶＰＳ４は、核および核膜からのＮＰＣおよびＮＥ成分の除去を促進するＡＡＡ－ＡＴＰａｓｅであるため（Thaller DJ, Allegretti M, Borah S, Ronchi P, Beck M, Lusk CP, Vietri M, Radulovic M, Stenmark H, The many functions of ESCRTs, Nat Rev Mol Cell Biol. (2019)、Webster BM, Colombi P, Jager J, Lusk CP, Surveillance of nuclear pore complex assembly by ESCRT-III/Vps4, Cell, 159:388-401 (2014)、An ESCRT-LEM protein surveillance system is poised to directly monitor the nuclear envelope and nuclear transport system, Elife (2019)、Webster BM, Lusk CP, Border safety: quality control at the nuclear envelope, Trends Cell Biol., 26:29-39 (2016)、Webster BM, Thaller DJ, Jager J, Ochmann SE, Borah S, Lusk CP, Chm7 and Heh1 collaborate to link nuclear pore complex quality control with nuclear envelope sealing, EMBO J, 35:2447-246 (2016)）、核内ＶＰＳ４発現の増加がＣ９ｏｒｆ７２ ＡＬＳ／ＦＴＤおよびｓＡＬＳニューロンにおけるＮＰＣ損傷にも機能的に寄与するかもしれないと仮定された。これを確認するために、ＧＦＰタグ付き野生型ＶＰＳ４、または、以前にＥＳＣＲＴ依存性の放出現象を損なうことが示されたＧＦＰタグ付きＶＰＳ４のドミナントネガティブバリアント（ＶＰＳ４Ｅ２２８Ｑ）（Votteler J, Ogohara C, Yi S, Hsia Y, Nattermann U, Belnap DM, King NP, Sundquist WI, Designed proteins induce the formation of nanocage-containing extracellular vesicles, Nature, 540:292-295 (2016)）を過剰発現させ、コントロールおよびＡＬＳ ｉＰＳＮから単離した核において、ＰＯＭ１２１についてＳＩＭおよび免疫染色を実施した。
【0223】
ＶＰＳ４バリアントの過剰発現は、Ｃ９ｏｒｆ７２およびｓＡＬＳにおいて免疫染色によって検出されるＶＰＳ４の核発現を増加させたが、コントロールｉＰＳＮ（図３０ａ、図３０ｂ）においては増加せず、ＶＰＳ４の核内動員が野生型ヒトニューロンにおいて「過活性」ではないことが示唆された。ＣＨＭＰ７の下流にあるＶＰＳ４の機能と一致して、ＶＰＳ４Ｅ２２８Ｑの過剰発現は、Ｃ９ｏｒｆ７２およびｓＡＬＳ ｉＰＳＮにおけるＰＯＭ１２１の核発現を、部分的にのみ回復させた（図３０ｃ、図３０ｄ）。興味深いことに、野生型ＶＰＳ４の過剰発現は、Ｃ９ｏｒｆ７２およびｓＡＬＳ ｉＰＳＮにおける核ＰＯＭ１２１免疫反応性に影響を与えなかった（図３０ｃ、図３０ｄ）ことから、単に核ＶＰＳ４レベルを増加させるだけではＮＰＣ損傷を増強するには十分でないことが示唆された。コントロール核と比較して、ＶＰＳ４Ｅ２２８Ｑを過剰発現するＣ９ｏｒｆ７２ ＡＬＳ／ＦＴＤおよびｓＡＬＳ核では、ＰＯＭ１２１の分布が異常であるように見えるが（図３０ｃ）、その理由は依然として不明である。注目すべきことに、内在性ＶＰＳ４タンパク質のＴｒｉｍ２１媒介ノックダウン（トリムアウェイ、(Clift D, McEwan WA, Labzin LI, Konieczny V, Mogessie B, James LC, Schuh M, A method for the acute and rapid degradation of endogenous proteins, Cell 171:1692-1706.e1618 (2017)）は、おそらく核膜およびＮＰＣの恒常性を超える機能の結果、ｉＰＳＮｓに有毒であった（McCullough J, Frost A, Sundquist WI, Structures, functions, and dynamics of ESCRT-III/Vps4 membrane remodeling and fission complexes, Annu Rev Cell Dev Biol., 34:85-109 (2018)、Vietri M, Radulovic M, Stenmark H, The many functions of ESCRTs, Nat Rev Mol Cell Biol., (2019)）。まとめると、これらのデータは、ＣＨＭＰ７ノックダウンとは対照的に（Coyne AN, Baskerville V, Zaepfel BL, Dickson DW, Rigo F, Bennett F, Patrick Lusk C, Rothstein JD, “Nuclear accumulation of CHMP7 initiates nuclear pore complex injury and subsequent TDP-43 dysfunction in sporadic and familial ALS”, Sci Translat. Med. (2021)）、ＶＰＳ４機能障害は、Ｃ９ｏｒｆ７２ ＡＬＳ／ＦＴＤおよびｓＡＬＳ核内の特定のＮｕｐの発現および分布を回復させるのに十分ではないことを示唆している。
【0224】
核膜孔複合体の損傷、特定のＮｕｐの病的な細胞質蓄積、および核細胞質輸送の欠陥は、ＡＬＳ／ＦＴＤ、ＡＤおよびＨＤを含む複数の神経変性疾患の顕著な病理学的特徴として現在報告されている（Coyne AN, Baskerville V, Zaepfel BL, Dickson DW, Rigo F, Bennett F, Patrick Lusk C, Rothstein JD, “Nuclear accumulation of CHMP7 initiates nuclear pore complex injury and subsequent TDP-43 dysfunction in sporadic and familial ALS”, Sci Transla.t Med. (2021)、Coyne AN, Zaepfel BL, Hayes L, Fitchman B, Salzberg Y, Luo EC, Bowen K, Trost H, Aigner S, Rigo F et al. “G(4)C(2) repeat RNA initiates a POM121-mediated reduction in specific nucleoporins in C9orf72 ALS/FTD, Neuron (2020)、Eftekharzadeh B, Daigle JG, Kapinos LE, Coyne A, Schiantarelli J, Carlomagno Y, Cook C, Miller SJ, Dujardin S, Amaral AS et al., Tau protein disrupts nucleocytoplasmic transport in Alzheimer’s disease, Neuron 99:925-940.e927 (2018)、Grima JC, Daigle JG, Arbez N, Cunningham KC, Zhang K, Ochaba J, Geater C, Morozko E, Stocksdale J, Glatzer JC et al., Mutant huntingtin disrupts the nuclear pore complex, Neuron 94:93-107.e106 (2017)、およびZhang K, Donnelly CJ, Haeusler AR, Grima JC, Machamer JB, Steinwald P, Daley EL, Miller SJ, Cunningham KM, Vidensky S et al., The C9orf72 repeat expansion disrupts nucleocytoplasmic transport, Nature 525:56-61 (2015)）。しかし、これらの破壊につながる分子メカニズムはまだ十分に理解されていない。最近、ＥＳＣＲＴ－ＩＩＩタンパク質ＣＨＭＰ７の異常な核内蓄積が、Ｃ９ｏｒｆ７２ ＡＬＳ／ＦＴＤおよびｓＡＬＳヒト神経細胞核のＮＰＣおよび核質からの、ＰＯＭ１２１を始めとする特定のＮｕｐｓの減少を開始するのに十分であることが立証された（Coyne AN, Baskerville V, Zaepfel BL, Dickson DW, Rigo F, Bennett F, Patrick Lusk C, Rothstein JD, “Nuclear accumulation of CHMP7 initiates nuclear pore complex injury and subsequent TDP-43 dysfunction in sporadic and familial ALS”, Sci Translat. Med. (2021)）。最終的に、この核孔損傷は、ＮＣＴおよびそれに続くＴＤＰ－４３の機能および局在、ならびに下流の神経細胞のグルタミン酸ストレスに対する生存に影響を与える（Coyne AN, Zaepfel BL, Hayes L, Fitchman B, Salzberg Y, Luo EC, Bowen K, Trost H, Aigner S, Rigo F et al. “G(4)C(2) repeat RNA initiates a POM121-mediated reduction in specific nucleoporins in C9orf72 ALS/FTD, Neuron (2020)）。ＥＳＣＲＴ－ＩＩＩタンパク質の病態ならびに家族性および散発性ＡＬＳにおけるＮＰＣ損傷への寄与の特性をさらに明らかにするために、本研究は、ＣＨＭＰ４ＢおよびＣＨＭＰ２ＢではなくＶＰＳ４が、Ｃ９ｏｒｆ７２ ＡＬＳ／ＦＴＤおよびｓＡＬＳヒト神経細胞核においてＣＨＭＰ７依存的に増加することを示す。まとめると、このデータは、ＡＬＳ／ＦＴＤのＮＰＣ損傷におけるＥＳＣＲＴ－ＩＩＩ経路の重要な役割を裏付け、その複雑さを強調するものである。本明細書で引用した出版物、特許出願、および特許を含むすべての文献は、各文献が個別に具体的に記載されているのと同じ程度に、参照によりここに組み込まれ、その全体が本明細書に記載される。
【0225】
本開示を説明する文脈における（特に、以下の請求項の文脈における）用語「a」および「an」ならびに「the」および同様の参照語の使用は、本明細書において特に示されない限り、または文脈によって明らかに矛盾しない限り、単数と複数の双方を包含すると解釈する。用語「備える（comprising）」、「有する（having）」、「含む（including）」、および「含有する（containing）」は、特に断らない限り、制約のない用語として解釈すべきである（すなわち、これに限定されないが、「含む（including）」という意味）。本明細書における値の範囲の記載は、本明細書で特に指示しない限り、単に範囲内の各別の値を個別に述べるための略記法として機能することを意図しており、各別の値は、本明細書に個別に記載されているかのように本明細書に組み込まれる。本明細書に記載される全ての方法は、本明細書で特に示されない限り、または文脈によって明らかに矛盾しない限り、任意の適切な順序で実施することができる。本明細書における任意の、およびすべての例、または例示的な言語（例えば、「など」）の使用は、単に本開示をより明らかにすることを意図しており、特に主張しない限り、本開示の範囲に対して制限するものでない。本明細書におけるいかなる言語も、請求されていない要素を本開示の実施に必須であると示すものとして解釈されるべきではない。
【0226】
本開示の好ましい実施形態は、本発明者らに知られている本開示を実施するための最良の様式を含めて、本明細書に記載される。それらの好ましい実施形態の変形形態は、前述の記載を読むことで当業者にとって明らかになり得る。本発明者らは、当業者がそのような変形形態を適宜採用することを期待しており、本発明者らは、本開示が本明細書に具体的に記載されている以外の方法で実施されることを意図している。したがって、本開示は、適用される法律によって許可される、本明細書に添付された請求項に記載された主題のすべての修正形態および均等物を含む。さらに、上述の要素の任意の組み合わせのすべての可能な変形形態は、本明細書で特に示されない限り、または文脈によって明らかに矛盾しない限り、本開示によって包含される。
【0227】
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【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
【図28】
【図29】
【図30】
【図31】
【配列表】
【国際調査報告】