特表 2023-549174 クロルプロマジンを含む神経炎症性疾患の予防または治療用組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-11-22

(54)【発明の名称】クロルプロマジンを含む神経炎症性疾患の予防または治療用組成物

(51)【国際特許分類】

   A61K 31/5415 20060101AFI20231115BHJP

   A61P 25/00 20060101ALI20231115BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20231115BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20231115BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20231115BHJP

   A61P 9/10 20060101ALI20231115BHJP

   A61P 25/28 20060101ALI20231115BHJP

   A61P 25/16 20060101ALI20231115BHJP

   A61P 21/00 20060101ALI20231115BHJP

   A61P 25/14 20060101ALI20231115BHJP

   A61P 25/18 20060101ALI20231115BHJP

   A61P 25/24 20060101ALI20231115BHJP

   A61P 25/04 20060101ALI20231115BHJP

   A61P 25/02 20060101ALI20231115BHJP

   A61P 37/06 20060101ALI20231115BHJP

【ＦＩ】

A61K31/5415 ZNA

A61P25/00

A61P29/00

A61P43/00 105

A61P35/00

A61P9/10

A61P25/28

A61P25/16

A61P21/00

A61P25/14

A61P25/18

A61P25/24

A61P25/04

A61P25/02

A61P37/06

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023527997

(86)(22)【出願日】2021-11-04

(85)【翻訳文提出日】2023-06-28

(86)【国際出願番号】 KR2021015855

(87)【国際公開番号】W WO2022098106

(87)【国際公開日】2022-05-12

(31)【優先権主張番号】10-2020-0146060

(32)【優先日】2020-11-04

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(31)【優先権主張番号】10-2021-0150049

(32)【優先日】2021-11-03

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＲＩＴＯＮ

(71)【出願人】

【識別番号】523165891

【氏名又は名称】グリアセルテック・インコーポレイテッド

【氏名又は名称原語表記】ＧＬＩＡＣＥＬＬＴＥＣＨ ＩＮＣ．

(71)【出願人】

【識別番号】516280679

【氏名又は名称】テグ・ギョンブク・インスティテュート・オブ・サイエンス・アンド・テクノロジー

(74)【代理人】

【識別番号】110001195

【氏名又は名称】弁理士法人深見特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】ユ，ソン－ウン

(72)【発明者】

【氏名】ナム，ヒェリ

(72)【発明者】

【氏名】イ，ヨンファン

【テーマコード（参考）】

4C086

【Ｆターム（参考）】

4C086AA01

4C086AA02

4C086BC89

4C086MA01

4C086MA04

4C086NA14

4C086ZA01

4C086ZA02

4C086ZA08

4C086ZA12

4C086ZA15

4C086ZA16

4C086ZA18

4C086ZA21

4C086ZA36

4C086ZA94

4C086ZB08

4C086ZB11

4C086ZB21

4C086ZB26

(57)【要約】

本発明は神経炎症性疾患の予防または治療用組成物に関するものであって、より具体的には、クロルプロマジンまたはその塩を含む神経炎症性疾患の予防、改善または治療用途に関するものである。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

クロルプロマジン（Ｃｈｌｏｒｐｈｒｏｍａｚｉｎｅ）またはその薬学的に許容可能な塩を含む、対象の神経炎症性疾患の予防または治療用薬学的組成物。

【請求項2】

前記疾患は、正常対象に比べて概日時計性炎症性サイトカイン（Ｃｉｒｃａｄｉａｎ ｃｌｏｃｋ－ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ）の過発現特性を有する、請求項１に記載の薬学的組成物。

【請求項3】

前記概日時計性炎症性サイトカインは、ＩＬ－６、ＣＸＣＬ１、ＣＣＬ２、およびＣＣＬ５からなる群より選択された１種以上である、請求項２に記載の薬学的組成物。

【請求項4】

前記疾患は、正常対象に比べて中枢神経系（ｃｅｎｔｒａｌ ｎｅｒｖｅ ｓｙｓｔｅｍ）神経膠細胞で概日時計性炎症性サイトカイン（Ｃｉｒｃａｄｉａｎ ｃｌｏｃｋ－ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ）の過発現特性を有する、請求項２に記載の薬学的組成物。

【請求項5】

前記疾患は、正常対象に比べてＮｕｃｌｅａｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｓｕｂｆａｍｉｌｙ １ Ｇｒｏｕｐ Ｄ Ｍｅｍｂｅｒ １（Ｎｒ１ｄ１）遺伝子の低発現特性を有する、請求項１に記載の薬学的組成物。

【請求項6】

前記疾患は、Ｐｒｅｓｅｎｉｌｉｎ ２（ＰＳＥＮ）２突然変異を含む疾患である、請求項１に記載の薬学的組成物。

【請求項7】

前記ＰＳＥＮ２突然変異は、ＰＳＥＮ２ Ｎ１４１Ｉ外Ａ８５Ｖ、Ｎ１４１Ｙ、Ｍ１７４Ｉ、Ｇ２１２Ｖ、Ａ２３７Ｖ、Ｍ２３９Ｉ、およびＭ２３９Ｖからなる群より選択された１種以上を含む、請求項６に記載の薬学的組成物。

【請求項8】

前記神経炎症性疾患は、多発性硬化症、神経芽細胞腫、脳卒中、アルツハイマー病、パキスン病、ルゲリック病、ハンチントン病、クロイツフェルトヤコブ病、心的外傷後ストレス障害、うつ病、精神分裂病、神経障害性疼痛、および筋萎縮性側索硬化症からなる群より選択される、請求項１に記載の薬学的組成物。

【請求項9】

前記疾患はＰｒｅｓｅｎｉｌｉｎ２遺伝子変異があるアルツハイマー疾患またはアルツハイマー関連認知症である、請求項８に記載の薬学的組成物。

【請求項10】

前記疾患は、家族性アルツハイマー病である、請求項８に記載の薬学的組成物。

【請求項11】

前記対象は、Ｐｓｅｎｉｌｉｎ２遺伝子変異、概日時計性サイトカインの過発現およびＮｒ１ｄ１遺伝子の低発現からなる群より選択された１種以上の特性を有する、請求項１に記載の薬学的組成物。

【請求項12】

前記組成物は、正常対象に比べて概日時計性炎症性サイトカインの過発現を抑制する、請求項２に記載の薬学的組成物。

【請求項13】

前記組成物は、ＴＮＦ－ａｌｐｈａの過発現を抑制しない、請求項１に記載の薬学的組成物。

【請求項14】

前記組成物は、神経炎症の抑制、概日時計性炎症性サイトカインの過発現を抑制、ＲＥＶ－ＥＲＶａ発現回復、記憶力回復、および認知改善からなる１種以上の特性を有する、請求項１に記載の薬学的組成物。

【請求項15】

前記クロルプロマジン（Ｃｈｌｏｒｐｈｒｏｍａｚｉｎｅ）またはその薬学的に許容可能な塩を神経炎症を減少させるのに十分な量で投与する、請求項１に記載の薬学的組成物。

【請求項16】

前記クロルプロマジン（Ｃｈｌｏｒｐｈｒｏｍａｚｉｎｅ）またはその薬学的に許容可能な塩は、クロルプロマジン ｆｒｅｅ ｂａｓｅとして０．０００１～１．０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙである、請求項１に記載の薬学的組成物。

【請求項17】

クロルプロマジン（Ｃｈｌｏｒｐｈｒｏｍａｚｉｎｅ）またはその薬学的に許容可能な塩を含む薬学的組成物をこれを必要とする対象に投与する段階を含む、対象の神経炎症性疾患の予防または治療方法。

【請求項18】

対象の神経炎症性疾患の予防または治療で使用される、クロルプロマジン（Ｃｈｌｏｒｐｈｒｏｍａｚｉｎｅ）またはその薬学的に許容可能な塩。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は神経炎症性疾患の予防または治療用組成物に関するものであって、より具体的には、クロルプロマジンまたはその塩を含む神経炎症性疾患の予防または治療用組成物に関するものである。

【背景技術】

【0002】

神経炎症は神経系の免疫反応の一種で、アルツハイマー、パーキンソン病、多発性硬化症を含む多くの退行性神経疾患と非常に密接に関連しており、現在退行性神経疾患の典型的特徴と考えられている。神経炎症反応は先天性免疫細胞（小膠細胞）の活性化、炎症媒介体、例えば酸化窒素（ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ；ＮＯ）、サイトカインおよびケモカインの放出、大食細胞浸潤を含み、これは神経細胞の死滅を誘導する。小膠細胞および星状細胞の炎症活性化は、病理学的マーカおよび退行性神経疾患の進行において重要なメカニズムと考えられる。小膠細胞活性の厳格な調節は脳恒常性を維持し感染および炎症疾患を予防するのに必須的であるため、小膠細胞の活性を調整して神経炎症を緩和させるための物質の発掘が必要である。

【0003】

神経炎症性疾患の一種であるアルツハイマーは認知症の発病形態の一つと知られており、認知症（ｄｅｍｅｎｔｉａ）は記憶力障害、判断力喪失など精神機能の全般的な障害を伴う疾患である。認知症の発病形態は非常に多様であり、約５０％程度はアルツハイマー型認知症（ｄｅｍｅｎｔｉａ ｏｆ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ ｔｙｐｅ）であり、約３０％程度は血管性認知症（ｄｅｍｅｎｔｉａ ｏｆ Ｖａｓｃｕｌａｒ ｔｙｐｅ）、アルコール性認知症、およびパーキンソン病認知症であり、約２０％程度はアルツハイマー型認知症および血管性認知症など両側性で発病すると知られている。アルツハイマー認知症のうち、多数は特別な遺伝的要因がない散発性（ｓｐｏｒａｄｉｃ）アルツハイマー認知症であるが、一部はａｍｙｌｏｉｄ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＡＰＰ）、ｐｒｅｓｅｎｉｌｉｎ １（Ｐｓｅｎ１）、そしてＰｓｅｎ２遺伝子の突然変異による家族性（ｆａｍｉｌｉａｌ）アルツハイマー認知症に分類される。

【0004】

アルツハイマーは、疾病特性上患者本人だけでなく家族の精神的、肉体的負担が非常に深刻な疾病である。アルツハイマー病は６５～７４才で１０％、７５～８４才で１９％、８５才以上で４７％が発病し、毎年発病率が増加しており、大韓民国で１９９５年６５才以上と登録されたアルツハイマー病患者数は２４１，０００人で、老人全体人口の８．３％を占めており、２０２０年には６１９，０００人になると予測されたことがあって大きな社会的問題として浮上している。現在まで知られたアルツハイマー病の予防はもちろん確立された早期診断方法もない。また、治療剤も現在まで開発されたものがなく、ただ症状を緩和させる薬物のみ使用されているだけである。

【0005】

一方、クロルプロマジン（Ｃｈｌｏｒｐｒｏｍａｚｉｎｅ）はフェノチアジン（Ｐｈｅｎｏｔｈｉａｚｉｎｅ（ＦＥＥＮ－ｏｈ－ＴＨＹＥ－ａ－ｚｅｅｎ））系で、統合失調症治療のために１９５０年代にＲｈｏｎｅ－Ｐｏｕｌｅｎｃ Ｌａｂで合成された１世代薬剤と知られており、大脳で感情または嘔吐を統制する部分に作動して神経が過度に興奮するようになると発生される物質、例えばドーパミン、セロトニンなどの生産と分泌を統制することによって興奮を抑制し不安、緊張、心配、悪心、嘔吐などを鎮静させる薬物と知られている。現在市販濃度で長期服用時、統合失調症がある老年層で死亡率が増加するという副作用があるのが知られている。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

前記のような問題点を解決するために、本発明は、クロルプロマジン（Ｃｈｌｏｒｐｈｒｏｍａｚｉｎｅ）、その誘導体、その代謝産物またはその塩を含む、神経炎症性疾患の予防、改善または治療用薬学的組成物を提供することを目的とする。

【0007】

本発明の追加一例は、クロルプロマジン、その誘導体、その代謝産物またはその薬学的に許容可能な塩を含む薬学的組成物をこれを必要とする対象に投与する段階を含む、対象の神経炎症性疾患の予防または治療方法に関するものである。

【0008】

本発明の追加一例は、対象の神経炎症性疾患の予防または治療用に使用される、クロルプロマジン（Ｃｈｌｏｒｐｈｒｏｍａｚｉｎｅ）またはその薬学的に許容可能な塩に関するものである。

【0009】

本発明の一実施形態で、前記組成物は、概日時計性神経炎症性サイトカインＩＬ－６（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｃｋｉｎｅ－６）、ＣＸＣＬ１、ＣＣＬ２、ＣＣＬ５の発現を抑制することができる。本発明の他の実施形態で、前記組成物は、神経炎症を抑制して記憶力を回復させることができる。

【課題を解決するための手段】

【0010】

本発明は、クロルプロマジン（Ｃｈｌｏｒｐｈｒｏｍａｚｉｎｅ）、その誘導体、その代謝産物またはその塩を含む、神経炎症性疾患の予防、改善または治療用薬学的組成物および健康機能食品組成物を提供する。

【0011】

本発明の“クロルプロマジン（Ｃｈｌｏｒｐｒｏｍａｚｉｎｅ、ＣＰＺ）”は化学式Ｃ１７Ｈ１９ＣｌＮ２Ｓで構成され、ＩＵＰＡＣ命名法によって３－（２－ｃｈｌｏｒｏ－１０Ｈ－ｐｈｅｎｏｔｈｉａｚｉｎ－１０－ｙｌ）－Ｎ，Ｎ－ｄｉｍｅｔｈｙｌ－ｐｒｏｐａｎ－１－ａｍｉｎｅと命名され、下記［化学式Ｉ］の構造を有する化合物を意味し、本発明で神経炎症性疾患の予防、改善または治療用薬学的組成物において有効成分は、クロルプロマジン、その誘導体、代謝産物および薬学的に許容可能な塩を含む群より選択された１種以上であってもよい。
［化学式Ｉ］

【化1】

【0012】

前記クロルプロマジン代謝物質（Ｃｈｌｏｐｒｏｍａｚｉｎｅ Ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ）であって、クロルプロマジンは強い代謝変異（ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）を経て治療学的に活性がある多数の代謝物質に変わるため、このような代謝物質が本発明の神経炎症性疾患でクロルプロマジンの代わりをすることができる。クロルプロマジンの物質代謝率は、例えば、対応する一級および二級アミンを得るための酸化性Ｎ－脱メチル化（ｏｘｉｄａｔｉｖｅ Ｎ－ｄｅｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ）、フェノールを得るための芳香族酸化（ａｒｏｍａｔｉｃ ｏｘｉｄａｔｉｏｎ）、Ｎ－酸化物（Ｎ－ｏｘｉｄｅ）を得るためのＮ－酸化（Ｎ－ｏｘｉｄａｔｉｏｎ）、スルホキシドまたはスルホンを得るためのＳ－酸化（Ｓ－ｏｘｉｄａｔｉｏｎ）、フェノチアジン細胞核（ｐｈｅｎｏｔｈｉａｚｉｎｅ ｎｕｃｌｅｉ）を得るためのアミノプロピル側チェーンの酸化性脱アミン化（ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｄｅａｍｉｎａｔｉｏｎ）、および４級アンモニウムグルクロニド（ｑｕａｔｅｒｎａｒｙ ａｍｍｏｎｉｕｍ ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄｅ）を得るためのフェノールヒドロキシ基（ｐｈｅｎｏｌｉｃ ｈｙｄｒｏｘｙ ｇｒｏｕｐ）および３級アミノ基のグルクロン酸塩化（ｔｅｒｔｉａｒｙ ａｍｉｎｏ ｇｒｏｕｐ ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｔｉｏｎ）を含む。

【0013】

本発明によるクロルプロマジンは、薬学的に許容可能な塩の形態で使用できる。前記塩としては、薬学的に許容される多様な有機酸または無機酸によって形成された酸付加塩を使用することができる。酸付加塩は、塩酸、硝酸、リン酸、硫酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、亜硝酸または亜リン酸のような無機酸類と脂肪族モノおよびジカルボキシレート、フェニル－置換されたアルカノエート、ヒドロキシアルカノエート、およびアルカンジオエート、芳香族酸類、脂肪族および芳香族スルホン酸類のような無毒性有機酸から得ることができる。このような無毒性塩類としては、スルフェート、ピロスルフェート、ビスルフェート、スルファート、ビスルファート、ニトレート、ホスフェート、モノヒドロゲンホスフェート、ジヒドロゲンホスフェート、メタホスフェート、ピロホスフェートクロリド、ブロミド、ヨージド、フルオリド、アセテート、プロピオネート、デカノエート、カプリレート、アクリレート、ホルメート、イソブチレート、カプレート、ヘプタノエート、プロピオン酸、シュウ酸、マロン酸、琥珀酸、スベレート、セバケート、フマレート、マレエート、ブチン－１，４－ジオエート、ヘキサン－１，６－ジオン酸、安息香酸、クロロ安息香酸、メチル安息香酸、ジニトロ安息香酸、ヒドロキシベンゾエート、メトキシ安息香酸、フタル酸、テレフタレート、ベンゼンスルホン酸、トルエンスルホン酸、クロロベンゼンスルホン酸、キシレンスルホン酸、フェニル酢酸、フェニルプロピオン酸、フェニルブチレート、シトレート、ラクテート、β－ヒドロキシブチレート、グリコレート、マレート、タルトレート、メタンスルホネート、プロパンスルホネート、ナフタレン－１－スルホネート、ナフタレン－２－スルホネート、マンデレート、トリフルオロ酢酸などを使用して製造することができる。

【0014】

前記クロルプロマジンの酸付加塩は、通常の方法、例えばクロルプロマジンを過量の酸水溶液に溶解させ、この塩を水混和性有機溶媒、例えばメタノール、エタノール、アセトンまたはアセトニトリルを使用して沈殿させて製造することができる。また、この混合物で溶媒や過量の酸を増発させた後に乾燥させるか、または析出された塩を吸入ろ過させて製造することもできる。

【0015】

クロルプロマジンは、塩基を使用して薬学的許容可能な塩を作ることができる。アルカリ金属またはアルカリ土類金属塩は例えば、化合物を過量のアルカリ金属水酸化物またはアルカリ土類金属水酸化物溶液中に溶解し、非溶解化合物塩をろ過し、濾液を蒸発、乾燥させて得る。この時、金属塩としては、リチウム、ナトリウム、カリウムまたはカルシウム塩を製造することが農薬学上適合する。また、これに対応する銀塩は、アルカリ金属またはアルカリ土類金属塩を適当な銀塩（例えば、硝酸銀）と反応させて得ることができる。

【0016】

本発明で使用される用語、“神経炎症性疾患”は神経系の炎症によって発生する疾患を全て含む意味であり、詳しくは、正常対象と比較して概日時計性サイトカインの過発現によって発生する神経炎症性疾患を含む意図である。

【0017】

例えば、前記疾患は、多発性硬化症、神経芽細胞腫、脳卒中、アルツハイマー病、パキスン病、ルゲリック病、ハンチントン病、クロイツフェルトヤコブ病、心的外傷後ストレス障害、うつ病、精神分裂病、神経障害性疼痛、および筋萎縮性側索硬化症を含むが、これに制限されない。

【0018】

前記疾患は、神経炎症誘導によって発生される認知障害、記憶力低下、アルツハイマー病またはその関連症状であってもよく、老化、遺伝的変異、頭部外傷、うつ病または高血圧による合併症症状などと共に発生するか悪化することがある。前記アルツハイマー疾病（ＡＤ）、例えば、特発性アルツハイマー疾病（ｓｐｏｒａｄｉｃ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ、ＳＡＤ）、または家族性アルツハイマー認知症（（Ｆａｍｉｌｉａｌ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ、ＦＡＤ）などを含む。ＦＡＤの主原因はＰＳＥＮ遺伝子のためであると知られており、ＰＳＥＮ遺伝子は膜貫通タンパク質であるｐｒｅｓｅｎｉｌｉｎを発現する遺伝子でありｇａｍｍａ－ｓｅｃｒｅｔａｓｅの触媒部位を発現させる。

【0019】

本発明で使用される用語“神経炎症誘導によるアルツハイマー”は神経炎症反応を人為的に発生させて誘導された認知症を意味し、老化による認知症モデルと異なり短期間内に認知症を発現させることができる。本発明で使用される用語“神経炎症誘導によるアルツハイマー”は神経炎症反応を人為的に発生させて誘導された認知症を意味する。

【0020】

さらに詳しくは、本発明による対象および／または疾患は、正常対象または正常疾患と比較して概日時計性サイトカイン暗号化遺伝子の過発現、Ｎｒ１ｄ１（Ｎｕｃｌｅａｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｓｕｂｆａｍｉｌｙ １ Ｇｒｏｕｐ Ｄ Ｍｅｍｂｅｒ １）遺伝子の低発現およびＰｓｅｎｉｌｉｎ２遺伝子変異からなる群より選択された１種以上の特性を有するものであってもよい。

【0021】

前記対象および／または疾患は、正常対象に比べて概日時計性炎症性サイトカイン（Ｃｉｒｃａｄｉａｎ ｃｌｏｃｋ－ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ）の過発現特性を有するものであってもよい。

【0022】

また、前記対象および／または疾患は、正常対象または疾患に比べて中枢神経系（ｃｅｎｔｒａｌｎｅｒｖｅｓｙｓｔｅｍ）神経膠細胞で概日時計性炎症性サイトカイン（Ｃｉｒｃａｄｉａｎ ｃｌｏｃｋ－ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ）の過発現特性を有するものである。前記中枢神経系神経膠細胞は放射状神経膠細胞（ｒａｄｉａｌ ｇｌｉａ）、星状膠細胞（ａｓｔｒｏｃｙｔｅｓ）、乏突起神経膠細胞（ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅ）、乏突起神経膠細胞の前駆細胞（ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ）、および小膠細胞（ｍｉｃｒｏｇｌｉａ）を含むことができ、詳しくは、小膠細胞と星状膠細胞であってもよく、さらに詳しくは、小膠細胞であってもよい。

【0023】

前記概日時計性炎症性サイトカインは、ＩＬ－６、ＣＸＣＬ１、ＣＣＬ２、およびＣＣＬ５からなる群より選択された１種以上である。

【0024】

具体的に、本発明者らは、神経炎症性疾患、例えば、神経炎症性アルツハイマーが発病したマウスモデルに由来した小膠細胞にクロルプロマジンを処理する場合、概日時計性炎症性サイトカインの発現を抑制することによって抗炎症効果および記憶力回復効果が示されることを確認した。

【0025】

前記対象および／または疾患は、正常対象または正常疾患と比較してＮｒ１ｄ１遺伝子の低発現された特性を有するものであってもよく、詳しくは、Ｎｒ１ｄ１遺伝子またはそのタンパク質（ＲＥＶ－ＥＲＢα）の低発現による概日時計性サイトカイン暗号化遺伝子の過発現を誘発したものであってもよい。

【0026】

前記対象および／または疾患は、正常対象または正常疾患と比較してＰＳＥＮ２遺伝子の変異を有するものであってもよく、詳しくは、ＰＳＥＮ２遺伝子の変異によってＮｒ１ｄ１遺伝子またはタンパク質発現が減少または阻害されたものであってもよく、また、Ｎｒ１ｄ１遺伝子またはタンパク質発現が減少または阻害によって概日時計性サイトカイン暗号化遺伝子の過発現を誘発したものであってもよい。

【0027】

プレセニリン（ＰＳ）は、アミロイド－βタンパク質前駆体（ＡβＰＰ）を切断してアミロイド－β（Ａβ）ペプチドを生成する膜結合γ－セクレターゼ複合体の酵素成分である。Ｐｒｅｓｅｎｉｌｉｎ２遺伝子（ＰＳＥＮ２）突然変異は全ての早期発症型家族性アルツハイマー病（ＥＯＦＡＤ）事例の５％未満を占めると知られている。

【0028】

早期発症型家族性アルツハイマー病（ＥＯＦＡＤ）は、プレセニリン１（ＰＳＥＮ１）、プレセニリン２（ＰＳＥＮ２）、およびＡＰＰ遺伝子の異形変異体によって発生するものと知られている。このような遺伝子がアルツハイマー病（ＡＤ）を誘発するかＡＤ進行を促進するメカニズムは完全に糾明されていない。プレセニリン（ＰＳ）酵素活性がアミロイド－β（Ａβ）を生成するということが知られている。

【0029】

本明細書で“ＰＳＥＮ２遺伝子”は、本明細書でＰＳＥＮ２ポリペプチドを暗号化する遺伝子を称する。ＰＳＥＮ２遺伝子はＮＣＢＩ基準配列でヒトＰＳＥＮ２遺伝子はＮＣ＿０００００１．１１（２２６８７０５９４．．２２６９０３８２９））に位置し、マウスＰＳＥＮ２遺伝子はＮＣ＿００００６７．７に位置し、これら配列だけでなく公知されたオルソログで含む。“ＰＳＥＮ２ポリペプチド”はヒトＰＳＥＮ２タンパク質はＮＣＢＩ基準配列でＮＰ＿０００４３８．２に位置し、マウスＰＳＥＮ２タンパク質はＮＰ＿００１１２２０７７に位置し、これら配列だけでなく公知されたオルソログで含む

【0030】

本発明による神経炎症および／またはアルツハイマー病と関連性を有するＰＳＥＮ２遺伝子の変異としてはＡ８５Ｖ、Ｎ１４１Ｉ、Ｎ１４１Ｙ、Ｍ１７４Ｉ、Ｇ２１２Ｖ、Ａ２３７Ｖ、Ｍ２３９Ｉ、またはＭ２３９Ｖが知られているが、これら変異を１種以上含むことができる（Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．、“Ａ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｔｈｅ Ｆａｍｉｌｉａｌ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｌｏｃｕｓ ＰＲＥＳＥＮＩＬＩＮ ２ ａｎｄ Ｉｔｓ Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｔｏ ＰＲＥＳＥＮＩＬＩＮ １．”Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ ６６（２０１８）１２２３－１３３９）。

【0031】

本発明者らは、家族性アルツハイマー突然変異のうちの一つであってｐｒｅｓｅｎｉｌｉｎ２遺伝子の１４１番アミノ酸Ｎ（アルギニン）がＩ（イソロイシン）で置換されたＰｓｅｎ２ Ｎ１４１Ｉ ｋｎｏｃｋ－ｉｎ（ＫＩ）動物モデルに、クロルプロマジンを処理する場合、概日時計調節を受ける炎症性サイトカインＩＬ－６（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｃｋｉｎｅ－６）、ＣＸＣＬ１、ＣＣＬ２、そしてＣＣＬ５の発現を抑制し、これによって抗炎症効果および記憶力回復効果が示されるのを確認することによって本発明を完成した。

【0032】

本発明による組成物は神経炎症の抑制、概日時計性炎症性サイトカインの過発現を抑制、ＲＥＶ－ＥＲＶａ発現回復、記憶力回復、および認知改善からなる１種以上の効能を有するものであってもよく、したがって神経炎症性疾患を予防、改善または治療する効能を有することができる。具体的に、本発明は具体的な実施例を通じて本発明による組成物が神経炎症性サイトカインの発現を抑制して動物モデルの記憶力回復および抗炎症効果を通じてアルツハイマーの予防、改善または治療効果を確認した。

【0033】

本発明で使用される用語、“予防”とは、本発明による組成物の投与によって神経炎症性疾患を抑制させるか発病を遅延させる全ての行為を意味する。本発明で使用される用語“改善”とは、本発明による組成物の投与によって神経炎症性疾患の症状程度を減少させる全ての行為を意味する。

【0034】

本発明で使用される用語、“治療”とは、本発明による組成物の投与によって神経炎症性疾患に対する症状が好転するか有利に変更される全ての行為を意味する。詳しくは、本明細書で使用される用語“治療”は、治療中の状態、障害または疾患と関連するかまたはこれによって引き起こされる少なくとも一つの症状の減少または緩和を含む。治療された対象体は症状（例えば、アルツハイマー病または関連した病態）の部分的または全体的緩和を示すことができるか、または症状は本発明による治療後に静的に残っていることがある。用語“治療“は、予防、療法および治癒を含むものと意図される。

【0035】

さらに詳しくは、本発明者らは、クロルプロマジン処理によるＲＥＶ－ＥＲＢαの発現復原およびアルツハイマー動物モデル（Ｐｓｅｎ２ Ｎ１４１Ｉ ＫＩ／＋マウス）の免疫抑制および認知低下予防効果を確認した。本発明の組成物は、前記サイトカインの発現抑制などの機序で神経炎症を抑制させることによって記憶力を回復させることができる。

【0036】

本発明の一実施形態では、アルツハイマーを誘発させた動物モデルの小膠細胞で概日時計性炎症サイトカインであるＩＬ－６、ＣＸＣＬ１、ＣＣＬ２、ＣＣＬ５の発現が高く示され、クロルプロマジンを処理する場合、概日時計性炎症サイトカインの分泌および発現が効果的に低減されることを確認した。また、ＬＰＳ注入前にクロルプロマジンを前処理する場合、概日時計性炎症サイトカインの血中濃度を減少させることを確認し、Ｙ－ｍａｚｅテストを通じてクロルプロマジンを処理した動物モデルの記憶力回復効果を確認した結果、アーム交代回数が正常対照群と類似しているように維持されることを確認した。

【0037】

本発明者らは相同組換え方法を通じてマウスのＰｓｅｎ２を人間ＡＤ患者で家族性ＡＤ（ｆａｍｉｌｉａｌ ＡＤ、ＦＡＤ）を起こすと報告されたＮ１４１Ｉで置換させる場合、神経炎症誘導によって認知症を誘発させて短期間内にマウスで認知症をさらに正確にモデリングすることができるのを確認し、野生型のＰｓｅｎ２遺伝子がＰｓｅｎ２ Ｎ１４１Ｉで置換されたアルツハイマー動物モデルを用いて、クロルプロマジンの効能および濃度を確認した。また、前記動物モデルは、（ａ）標的化ベクターにＰｓｅｎ２ Ｎ１４１Ｉ突然変異遺伝子を挿入させる段階；（ｂ）前記遺伝子が挿入されたベクターを宿主動物に挿入する段階；および（ｃ）前記ベクターが挿入された宿主動物をＣｒｅマウスと交配して後代動物を収得する段階で得ることができる。

【0038】

動物自体の正常遺伝子の発現に加えてＦＡＤヒト遺伝子を過発現する既存の形質転換方式の動物モデルに比べて、マウスの正常Ｐｓｅｎ２遺伝子を人間で報告された認知症突然変異と同一な変異を発現するように置換し、またアルツハイマー患者の突然変異と同一に異型接合（ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｕｓ）突然変異（ＫＩ／＋）を導入することによって自然的な発現水準を維持するようにして人間アルツハイマー病または関連認知症をさらに正確にモデリングが可能で認知症発病機序に対する精密な分析に活用できる。また、ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ（ＬＰＳ）を動物モデルに腹腔注射するか、ＬＰＳまたはアルツハイマー認知症の直接的病因である凝集された（ｆｉｂｒｉｌｉｚｅｄ）アミロイドベータ１－４２（ｆＡβ４２）を小膠細胞に処理して炎症性サイトカインの発現を通じた神経炎症性疾患、例えば、アルツハイマー病を誘導することによってクロルプロマジンの効能を立証した。

【0039】

本発明による組成物が薬学的組成物の形態である場合、薬学的に有効な量のクロルプロマジンを単独で含むか一つ以上の薬学的に許容される担体を含むことができる。

【0040】

本発明によるクロルプロマジンなどは現在錠剤、カプセル、座薬、経口用濃縮液およびシロップ、および注射用配合のような形態で入手することができる。

【0041】

前記薬学的に許容される担体は、製剤時に通常用いられるものであって、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、滑石、ステアリン酸マグネシウム、およびミネラルオイルなどを含むが、これに限定されるのではない。また、前記成分以外に潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤などを追加的に含むことができる。

【0042】

本発明の薬学的組成物は目的とする方法によって経口投与するか非経口投与（例えば、静脈内、皮下、腹腔内または局所に適用）することができ、投与量は患畜の状態および体重、疾病の程度、薬物形態、投与経路および時間によって異なるが、当業者によって適切に選択できる。

【0043】

本発明で“個体”、“対象”または“患者”は、ラット（ｒａｔ）、家畜、マウス（ｍｏｕｓｅ）、人間など哺乳類であってもよく、具体的に、神経炎症性疾患の治療が必要な伴侶犬、競走馬、人間などであってもよく、好ましくは人間であってもよい。
本発明の薬学的組成物は、薬学的に有効な量で投与する。本発明において用語“治療的有効量”は、治療的効果を達成するのに必要な量を意味する。治療的効果は、予防、症状改善、症状治療から疾患終結または治癒、例えば、アルツハイマー病または関連した病態の治療までの範囲にある任意の治療効果であってもよい。

【0044】

具体的に、本発明者らは、Ｐｓｅｎ２家族性アルツハイマーマウスモデルにクロルプロマジンを処理する場合、炎症性サイトカインのうちの概日時計調節を受けるＩＬ－６、ＣＸＣＬ１、ＣＣＬ２、ＣＣ５の発現抑制を通じて抗炎症効果および記憶力回復効果が示されることを確認した。本発明で使用されたクロルプロマジン濃度は既存臨床で抗精神病治療剤として使用される濃度より顕著に低い安全な濃度でも効果的であることを確認した。

【0045】

本発明の一例で、経口投与のために採択されたクロルプロマジンの人間に提供される１日投与量は、既存の抗精神病薬物の投与量より１０倍または１００倍より低い含量であり、具体的に、クロルプロマジンｆｒｅｅ ｂａｓｅを基準にして１．０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ以下、０．８ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ以下、０．６ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ以下、０．５ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ以下、０．２５ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ以下、または０．１ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ以下であってもよく、クロルプロマジンの人間に提供される１日投与量の下限線は目的とする効能を達成することができる最小限に使用することが好ましく、例えば、約０．００００１または０．０００１ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙであってもよい。例えば、クロルプロマジンの人間に提供される１日投与量は、クロルプロマジンｆｒｅｅ ｂａｓｅを基準にして０．００００１～１．０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ、または約０．０００１～１．０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙであってもよい。前記薬物は、１回または数回に分割して投与することもできる。現在市販濃度で長期服用時、統合失調症がある老年層で死亡率が増加するという副作用があることが知られていて、以前に知られた抗精神病薬物に比べて本願神経炎症性疾患の薬物に使用する有効量が低いということは非常に優れた特性を有するのである。

【0046】

本発明の薬剤学的組成物において、クロルプロマジンの含量は特に制限されず、投与対象の状態、具体的な病症の種類、進行程度などによって多様に変更できる。必要な場合、組成物の全体含量で含まれてもよい。

【0047】

本発明の他の実施形態では、野生型およびＫＩ／＋マウスに１８：００基準で多様な容量のＬＰＳを腹腔内（ｉ．ｐ．）注入し２０時間後に炎症反応をモニタリングした結果、野生型マウスと比較してＫＩ／＋マウスはテストされた全てのＬＰＳ容量でＩＬ－６の循環水準が高く示され、低濃度のＬＰＳでＫＩ／＋マウスでｃｌｏｃｋ－ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄサイトカインの血中濃度を増加させることによって、低い容量のＬＰＳは免疫反応の過活性を誘導しＰｓｅｎ２ Ｎ１４１Ｉ／＋マウスで概日時計性炎症性サイトカインの過発現を通じて記憶力欠乏を誘発させることを確認した。

【0048】

本発明者らは、相同組換え方法を通じてマウスの正常Ｐｓｅｎ２を人間アルツハイマー疾病（ＡＤ）患者で家族性ＡＤ（ｆａｍｉｌｉａｌ ＡＤ、ＦＡＤ）を引き起こすと報告されたＮ１４１Ｉで置換させる場合、神経炎症誘導によって認知症を誘発させて短期間内にマウスで認知症をさらに正確にモデリングすることができる動物モデルを製造した。

【0049】

本発明で使用される用語“相同組換え（Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）”とは遺伝子が置換挿入ベクターの相同性部位を宿主動物の対立遺伝子に挿入し、ベクターが挿入された宿主動物をＣｒｅマウスと交配して後代に動物モデルを製造する方法であって、本発明でベクターはエクソン４部位のＰｓｅｎ２ Ｎ１４１Ｉ遺伝子およびＮｅｏｒ－ｌｏｘｐ配列を含むことができ、Ｐｓｅｎ２ Ｎ１４１Ｉ遺伝子が置換挿入されたマウスモデルを生成するためにＣｒｅ－ｌｏｘｐシステムを使用してＣｒｅマウスと交配できる。

【0050】

マウスの正常Ｐｓｅｎ２遺伝子を人間で報告された認知症突然変異と同一な変異を発現するように置換し、またアルツハイマー患者の突然変異と同一に異型接合（ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｕｓ）突然変異を導入することによって自然的な発現水準を維持するようにして人間認知症をさらに正確にモデリングが可能で認知症発病機序に対する精密な分析に活用できる。また、ＬＰＳ腹腔注射を通じて炎症性サイトカインの発現を通じた神経炎症誘導アルツハイマーモデルを製造することによって老化による認知症モデルと異なり短期間内（２か月）認知症動物モデルを実現することができて活用度が高いことと期待される。

【0051】

本発明は具体的な実施形態を通じて本発明による動物モデルを製造し、サイトカイン発現、ｃｌｏｃｋ－ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ遺伝子発現などを分析することによって人間ＰＳＥＮ２ Ｎ１４１Ｉ認知症突然変異を再現することを確認した。

【0052】

図１２は、野生型およびＰｓｅｎ２ Ｎ１４１Ｉ／＋アルツハイマー疾病マウスモデルの小膠細胞で概日時計性炎症性サイトカインの発現機序と、クロルプロマジン処理による変化を示した概略図である。

【発明の効果】

【0053】

本発明は、本発明者らが製作したＰｓｅｎ２ Ｎ１４１Ｉ変異家族性アルツハイマーマウスモデルが過度な神経炎症反応を起こすということを確認した後、クロルプロマジンがアルツハイマーマウスモデルの過度な神経炎症反応を抑制する抗炎症性効能および記憶力回復効果を確認したところ、認知症発明機序に対する詳しい機序糾明のための追加的研究を通じて新たな認知症治療法設計に寄与できることと期待される。

【図面の簡単な説明】

【0054】

【図1a】本発明の一実施形態によってＰｓｅｎ２ Ｎ１４１Ｉ変異アルツハイマー疾病マウスモデルの製作に関するものであって、図１ａはＮ１４１Ｉ標的挿入のための模式図を示したものであり、図１ｂは正常（野生型）、ＫＩ／＋、ＫＩ／ＫＩマウスのＳａｎｇｅｒシーケンシングクロマトグラム結果である。

【図1b】本発明の一実施形態によってＰｓｅｎ２ Ｎ１４１Ｉ変異アルツハイマー疾病マウスモデルの製作に関するものであって、図１ａはＮ１４１Ｉ標的挿入のための模式図を示したものであり、図１ｂは正常（野生型）、ＫＩ／＋、ＫＩ／ＫＩマウスのＳａｎｇｅｒシーケンシングクロマトグラム結果である。

【図2a】本発明の一実施形態によってＰｓｅｎ２ Ｎ１４１Ｉ変異アルツハイマー疾病マウスモデルが正常（野生型）マウスに比べて過度に炎症反応を起こすということを確認したものであって、図２ａは多様な濃度のｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ（ＬＰＳ）腹腔注射による神経炎症を誘導した動物でＩＬ－６の血中濃度を示す。多様な濃度のＬＰＳ腹腔注射によってＩＬ－６は全てのＬＳＰ濃度でＰｓｅｎ２変異アルツハイマーマウスで過発現され、正常マウスとアルツハイマーモデルの発現差は低濃度でますます広がる。図２ｂはＬＰＳ腹腔注射によるＴＮＦ－αの生成を示し、全てのＬＰＳ濃度でＴＮＦ－αは正常マウスとＰｓｅｎ２ Ｎ１４１Ｉ変異アルツハイマーマウス間に同一な血中濃度を示す。図２ｃは概日時計調節を受けると知られた炎症性サイトカインであるＩＬ－６、ＣＸＣＬ１、ＣＣＬ２、ＣＣＬ５の血中濃度の変化を示す。野生型マウスでは炎症反応を起こさない低濃度のＬＰＳ（０．３５μｇ／ｋｇ）を注射した時Ｐｓｅｎ２ Ｎ１４１Ｉ変異マウスのみでＴＮＦ－αと異なり概日時計性炎症サイトカインが顕著に増加するのを示す。

【図2b】本発明の一実施形態によってＰｓｅｎ２ Ｎ１４１Ｉ変異アルツハイマー疾病マウスモデルが正常（野生型）マウスに比べて過度に炎症反応を起こすということを確認したものであって、図２ａは多様な濃度のｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ（ＬＰＳ）腹腔注射による神経炎症を誘導した動物でＩＬ－６の血中濃度を示す。多様な濃度のＬＰＳ腹腔注射によってＩＬ－６は全てのＬＳＰ濃度でＰｓｅｎ２変異アルツハイマーマウスで過発現され、正常マウスとアルツハイマーモデルの発現差は低濃度でますます広がる。図２ｂはＬＰＳ腹腔注射によるＴＮＦ－αの生成を示し、全てのＬＰＳ濃度でＴＮＦ－αは正常マウスとＰｓｅｎ２ Ｎ１４１Ｉ変異アルツハイマーマウス間に同一な血中濃度を示す。図２ｃは概日時計調節を受けると知られた炎症性サイトカインであるＩＬ－６、ＣＸＣＬ１、ＣＣＬ２、ＣＣＬ５の血中濃度の変化を示す。野生型マウスでは炎症反応を起こさない低濃度のＬＰＳ（０．３５μｇ／ｋｇ）を注射した時Ｐｓｅｎ２ Ｎ１４１Ｉ変異マウスのみでＴＮＦ－αと異なり概日時計性炎症サイトカインが顕著に増加するのを示す。

【図2c】本発明の一実施形態によってＰｓｅｎ２ Ｎ１４１Ｉ変異アルツハイマー疾病マウスモデルが正常（野生型）マウスに比べて過度に炎症反応を起こすということを確認したものであって、図２ａは多様な濃度のｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ（ＬＰＳ）腹腔注射による神経炎症を誘導した動物でＩＬ－６の血中濃度を示す。多様な濃度のＬＰＳ腹腔注射によってＩＬ－６は全てのＬＳＰ濃度でＰｓｅｎ２変異アルツハイマーマウスで過発現され、正常マウスとアルツハイマーモデルの発現差は低濃度でますます広がる。図２ｂはＬＰＳ腹腔注射によるＴＮＦ－αの生成を示し、全てのＬＰＳ濃度でＴＮＦ－αは正常マウスとＰｓｅｎ２ Ｎ１４１Ｉ変異アルツハイマーマウス間に同一な血中濃度を示す。図２ｃは概日時計調節を受けると知られた炎症性サイトカインであるＩＬ－６、ＣＸＣＬ１、ＣＣＬ２、ＣＣＬ５の血中濃度の変化を示す。野生型マウスでは炎症反応を起こさない低濃度のＬＰＳ（０．３５μｇ／ｋｇ）を注射した時Ｐｓｅｎ２ Ｎ１４１Ｉ変異マウスのみでＴＮＦ－αと異なり概日時計性炎症サイトカインが顕著に増加するのを示す。

【図3a】図３ａは正常マウスとＰｓｅｎ２ Ｎ１４１Ｉ変異アルツハイマーマウスの海馬でＩｂａ－１（小膠細胞標識抗体）染色イメージを示し、図３ｂはＩＭＡＲＩＳソフトウェアを使用してＩｂａ－１信号を３Ｄフィラメントイメージ化した図であり、図３ｃはＩＭＡＲＩＳソフトウェアのＦｉｌａｍｅｎｔＴｒａｃｋｅｒ分析を通じてｄｅｎｄｒｉｔｅ長さと枝数データを示す。これによって、Ｐｓｅｎ２ Ｎ１４１Ｉ変異アルツハイマーマウスは低濃度の炎症刺激にも概日時計性サイトカインを生成して過度に免疫反応を起こすということが分かる。

【図3b】図３ａは正常マウスとＰｓｅｎ２ Ｎ１４１Ｉ変異アルツハイマーマウスの海馬でＩｂａ－１（小膠細胞標識抗体）染色イメージを示し、図３ｂはＩＭＡＲＩＳソフトウェアを使用してＩｂａ－１信号を３Ｄフィラメントイメージ化した図であり、図３ｃはＩＭＡＲＩＳソフトウェアのＦｉｌａｍｅｎｔＴｒａｃｋｅｒ分析を通じてｄｅｎｄｒｉｔｅ長さと枝数データを示す。これによって、Ｐｓｅｎ２ Ｎ１４１Ｉ変異アルツハイマーマウスは低濃度の炎症刺激にも概日時計性サイトカインを生成して過度に免疫反応を起こすということが分かる。

【図3c】図３ａは正常マウスとＰｓｅｎ２ Ｎ１４１Ｉ変異アルツハイマーマウスの海馬でＩｂａ－１（小膠細胞標識抗体）染色イメージを示し、図３ｂはＩＭＡＲＩＳソフトウェアを使用してＩｂａ－１信号を３Ｄフィラメントイメージ化した図であり、図３ｃはＩＭＡＲＩＳソフトウェアのＦｉｌａｍｅｎｔＴｒａｃｋｅｒ分析を通じてｄｅｎｄｒｉｔｅ長さと枝数データを示す。これによって、Ｐｓｅｎ２ Ｎ１４１Ｉ変異アルツハイマーマウスは低濃度の炎症刺激にも概日時計性サイトカインを生成して過度に免疫反応を起こすということが分かる。

【図4a】Ｐｓｅｎ２ Ｎ１４１Ｉ変異アルツハイマーマウスモデルが低濃度のＬＰＳ腹腔注射によって記憶力悪化を示すことを確認した結果であって、図４ａはＹ－ｍａｚｅ分析を通じて神経炎症誘導されたＰｓｅｎ２ Ｎ１４１Ｉ変異マウスは記憶力悪化を示すのを確認したものである。図４ｂはＹ－ｍａｚｅ分析でマウスの運動性に差がないのを示すものである。図４ｃはＴ－ｍａｚｅ分析実験方法に対する模式図であり、図４ｄはＴ－ｍａｚｅ分析を通じて神経炎症誘導されたＰｓｅｎ２ Ｎ１４１Ｉ変異マウスは成功率が顕著に低下して記憶力悪化を示すのを確認したものである。

【図4b】Ｐｓｅｎ２ Ｎ１４１Ｉ変異アルツハイマーマウスモデルが低濃度のＬＰＳ腹腔注射によって記憶力悪化を示すことを確認した結果であって、図４ａはＹ－ｍａｚｅ分析を通じて神経炎症誘導されたＰｓｅｎ２ Ｎ１４１Ｉ変異マウスは記憶力悪化を示すのを確認したものである。図４ｂはＹ－ｍａｚｅ分析でマウスの運動性に差がないのを示すものである。図４ｃはＴ－ｍａｚｅ分析実験方法に対する模式図であり、図４ｄはＴ－ｍａｚｅ分析を通じて神経炎症誘導されたＰｓｅｎ２ Ｎ１４１Ｉ変異マウスは成功率が顕著に低下して記憶力悪化を示すのを確認したものである。

【図4c】Ｐｓｅｎ２ Ｎ１４１Ｉ変異アルツハイマーマウスモデルが低濃度のＬＰＳ腹腔注射によって記憶力悪化を示すことを確認した結果であって、図４ａはＹ－ｍａｚｅ分析を通じて神経炎症誘導されたＰｓｅｎ２ Ｎ１４１Ｉ変異マウスは記憶力悪化を示すのを確認したものである。図４ｂはＹ－ｍａｚｅ分析でマウスの運動性に差がないのを示すものである。図４ｃはＴ－ｍａｚｅ分析実験方法に対する模式図であり、図４ｄはＴ－ｍａｚｅ分析を通じて神経炎症誘導されたＰｓｅｎ２ Ｎ１４１Ｉ変異マウスは成功率が顕著に低下して記憶力悪化を示すのを確認したものである。

【図4d】Ｐｓｅｎ２ Ｎ１４１Ｉ変異アルツハイマーマウスモデルが低濃度のＬＰＳ腹腔注射によって記憶力悪化を示すことを確認した結果であって、図４ａはＹ－ｍａｚｅ分析を通じて神経炎症誘導されたＰｓｅｎ２ Ｎ１４１Ｉ変異マウスは記憶力悪化を示すのを確認したものである。図４ｂはＹ－ｍａｚｅ分析でマウスの運動性に差がないのを示すものである。図４ｃはＴ－ｍａｚｅ分析実験方法に対する模式図であり、図４ｄはＴ－ｍａｚｅ分析を通じて神経炎症誘導されたＰｓｅｎ２ Ｎ１４１Ｉ変異マウスは成功率が顕著に低下して記憶力悪化を示すのを確認したものである。

【図5a】低濃度のＬＰＳで神経炎症を誘導したＰｓｅｎ２変異アルツハイマーモデルでクロルプロマジン処理による抗炎症効果を確認したものであって、図５ａは一次培養した小膠細胞でクロルプロマジン処理有無による概日時計を有する炎症性サイトカインＩＬ－６、ＣＸＣＬ１、ＣＣＬ２、ＣＣＬ５の生成減少を示したものであり、図５ｂはクロルプロマジン処理有無による概日時計性炎症性サイトカインのｍＲＮＡ発現抑制を示したものである。概日時計性サイトカインと異なり、ＴＮＦ－αの生成とｍＲＮＡ発現はクロルプロマジンによって影響を受けなかった。図５ｃは概日時計調節を受けないと知られた他の例であるＩＬ－１βの生成とｍＲＮＡ発現がＬＰＳによって正常細胞とＰｓｅｎ２ Ｎ１４１Ｉ変異小膠細胞間に同一な程度に誘導されるということを示し、クロルプロマジン処理によってＩＬ－１β生成が影響を受けないということを示す。

【図5b】低濃度のＬＰＳで神経炎症を誘導したＰｓｅｎ２変異アルツハイマーモデルでクロルプロマジン処理による抗炎症効果を確認したものであって、図５ａは一次培養した小膠細胞でクロルプロマジン処理有無による概日時計を有する炎症性サイトカインＩＬ－６、ＣＸＣＬ１、ＣＣＬ２、ＣＣＬ５の生成減少を示したものであり、図５ｂはクロルプロマジン処理有無による概日時計性炎症性サイトカインのｍＲＮＡ発現抑制を示したものである。概日時計性サイトカインと異なり、ＴＮＦ－αの生成とｍＲＮＡ発現はクロルプロマジンによって影響を受けなかった。図５ｃは概日時計調節を受けないと知られた他の例であるＩＬ－１βの生成とｍＲＮＡ発現がＬＰＳによって正常細胞とＰｓｅｎ２ Ｎ１４１Ｉ変異小膠細胞間に同一な程度に誘導されるということを示し、クロルプロマジン処理によってＩＬ－１β生成が影響を受けないということを示す。

【図5c】低濃度のＬＰＳで神経炎症を誘導したＰｓｅｎ２変異アルツハイマーモデルでクロルプロマジン処理による抗炎症効果を確認したものであって、図５ａは一次培養した小膠細胞でクロルプロマジン処理有無による概日時計を有する炎症性サイトカインＩＬ－６、ＣＸＣＬ１、ＣＣＬ２、ＣＣＬ５の生成減少を示したものであり、図５ｂはクロルプロマジン処理有無による概日時計性炎症性サイトカインのｍＲＮＡ発現抑制を示したものである。概日時計性サイトカインと異なり、ＴＮＦ－αの生成とｍＲＮＡ発現はクロルプロマジンによって影響を受けなかった。図５ｃは概日時計調節を受けないと知られた他の例であるＩＬ－１βの生成とｍＲＮＡ発現がＬＰＳによって正常細胞とＰｓｅｎ２ Ｎ１４１Ｉ変異小膠細胞間に同一な程度に誘導されるということを示し、クロルプロマジン処理によってＩＬ－１β生成が影響を受けないということを示す。

【図6】ＬＰＳの代わりにアルツハイマー認知症の直接的病因である凝集された（ｆｉｂｒｉｌｉｚｅｄ）アミロイドベータ１－４２（ｆＡβ４２）を小膠細胞で処理した時、概日時計性炎症性サイトカインＩＬ－６、ＣＸＣＬ１、ＣＣＬ２、ＣＣＬ５の生成がＰｓｅｎ２ Ｎ１４１Ｉ変異小膠細胞のみで過度に増加し、クロルプロマジンが生成を抑制するということを示す。反面、ＴＮＦ－αは正常小膠細胞とＰｓｅｎ２ Ｎ１４１Ｉ変異小膠細胞で全て同一に生成され、クロルプロマジンによって影響を受けなかった。

【図7a】図７ａはＰｓｅｎ２ Ｎ１４１Ｉ遺伝子変異によって小膠細胞でＲＥＶ－ＥＲＢαタンパク質の遺伝子であるＮｒ１ｄ１のｍＲＮＡ発現が低下しており、クロルプロマジン処理によるＮｒ１ｄ１ ｍＲＮＡ発現回復を示したものであり、図７ｂはクロルプロマジン処理によるＲＥＶ－ＥＲＢαタンパク質発現回復を確認したものである。

【図7b】図７ａはＰｓｅｎ２ Ｎ１４１Ｉ遺伝子変異によって小膠細胞でＲＥＶ－ＥＲＢαタンパク質の遺伝子であるＮｒ１ｄ１のｍＲＮＡ発現が低下しており、クロルプロマジン処理によるＮｒ１ｄ１ ｍＲＮＡ発現回復を示したものであり、図７ｂはクロルプロマジン処理によるＲＥＶ－ＥＲＢαタンパク質発現回復を確認したものである。

【図8a】ＲＥＶ－ＥＲＢα ａｇｏｎｉｓｔと知られたＳＲ９００９薬物の抗炎症効果を確認したものであって、ＳＲ９００９は正常小膠細胞では時間によってＩＬ－６の生成（図８ａ）とｍＲＮＡ発現水準（図８ｂ）を抑制するが、Ｐｓｅｎ２ Ｎ１４１Ｉ変異小膠細胞ではＬＰＳによるＩＬ－６過発現を抑制することができないということを示す。これによって、Ｐｓｅｎ２ Ｎ１４１Ｉ変異による過度な神経炎症反応抑制のためにはＲＥＶ－ＥＲＢαの発現回復が先決されなければならないのが分かる。また、ＲＥＶ－ＥＲＢα活性薬物が正常小膠細胞で抗炎症効能があってもＰｓｅｎ２家族性認知症では認知症治療効果がないことがあるのを提示する。

【図8b】ＲＥＶ－ＥＲＢα ａｇｏｎｉｓｔと知られたＳＲ９００９薬物の抗炎症効果を確認したものであって、ＳＲ９００９は正常小膠細胞では時間によってＩＬ－６の生成（図８ａ）とｍＲＮＡ発現水準（図８ｂ）を抑制するが、Ｐｓｅｎ２ Ｎ１４１Ｉ変異小膠細胞ではＬＰＳによるＩＬ－６過発現を抑制することができないということを示す。これによって、Ｐｓｅｎ２ Ｎ１４１Ｉ変異による過度な神経炎症反応抑制のためにはＲＥＶ－ＥＲＢαの発現回復が先決されなければならないのが分かる。また、ＲＥＶ－ＥＲＢα活性薬物が正常小膠細胞で抗炎症効能があってもＰｓｅｎ２家族性認知症では認知症治療効果がないことがあるのを提示する。

【図9a】ＲＥＶ－ＥＲＢα発現減少が概日時計性サイトカインの過発現原因であるということを立証するための実験であって、図９ａは正常小膠細胞でＲＥＶ－ＥＲＢα ｋｎｏｃｋｄｏｗｎを確認したものであり、図９ｂはＲＥＶ－ＥＲＢα ｋｎｏｃｋｄｏｗｎがＬＰＳ処理によるＩＬ－６、ＣＸＣＬ１、ＣＣＬ２、ＣＣＬ５の生成をさらに増加させ、図９ｃはＲＥＶ－ＥＲＢα ｋｎｏｃｋｄｏｗｎがＬＰＳ処理によるＩＬ－６、ＣＸＣＬ１、ＣＣＬ２、ＣＣＬ５のｍＲＮＡ発現をさらに増加させるということを示す。図９ｄはＰｓｅｎ２ Ｎ１４１Ｉ変異小膠細胞でＲＥＶ－ＥＲＢαを過発現を確認したものであり、図９ｅはＲＥＶ－ＥＲＢα過発現がＬＰＳによるＩＬ－６、ＣＸＣＬ１、ＣＣＬ２、ＣＣＬ５の生成を減少させ、図９ｆはＲＥＶ－ＥＲＢα過発現がＬＰＳによるＩＬ－６、ＣＸＣＬ１、ＣＣＬ２、ＣＣＬ５のｍＲＮＡ発現水準を顕著に減少させることを示す。反面、概日時計調節を受けないＴＮＦ－αは、ＲＥＶ－ＥＲＢαの発現調節に影響を受けなかった。これによって、ＲＥＶ－ＥＲＢαの発現低下がＰｓｅｎ２ Ｎ１４１Ｉ変異小膠細胞で概日時計性サイトカインの過発現の原因であるのが分かる。

【図9b】ＲＥＶ－ＥＲＢα発現減少が概日時計性サイトカインの過発現原因であるということを立証するための実験であって、図９ａは正常小膠細胞でＲＥＶ－ＥＲＢα ｋｎｏｃｋｄｏｗｎを確認したものであり、図９ｂはＲＥＶ－ＥＲＢα ｋｎｏｃｋｄｏｗｎがＬＰＳ処理によるＩＬ－６、ＣＸＣＬ１、ＣＣＬ２、ＣＣＬ５の生成をさらに増加させ、図９ｃはＲＥＶ－ＥＲＢα ｋｎｏｃｋｄｏｗｎがＬＰＳ処理によるＩＬ－６、ＣＸＣＬ１、ＣＣＬ２、ＣＣＬ５のｍＲＮＡ発現をさらに増加させるということを示す。図９ｄはＰｓｅｎ２ Ｎ１４１Ｉ変異小膠細胞でＲＥＶ－ＥＲＢαを過発現を確認したものであり、図９ｅはＲＥＶ－ＥＲＢα過発現がＬＰＳによるＩＬ－６、ＣＸＣＬ１、ＣＣＬ２、ＣＣＬ５の生成を減少させ、図９ｆはＲＥＶ－ＥＲＢα過発現がＬＰＳによるＩＬ－６、ＣＸＣＬ１、ＣＣＬ２、ＣＣＬ５のｍＲＮＡ発現水準を顕著に減少させることを示す。反面、概日時計調節を受けないＴＮＦ－αは、ＲＥＶ－ＥＲＢαの発現調節に影響を受けなかった。これによって、ＲＥＶ－ＥＲＢαの発現低下がＰｓｅｎ２ Ｎ１４１Ｉ変異小膠細胞で概日時計性サイトカインの過発現の原因であるのが分かる。

【図9c】ＲＥＶ－ＥＲＢα発現減少が概日時計性サイトカインの過発現原因であるということを立証するための実験であって、図９ａは正常小膠細胞でＲＥＶ－ＥＲＢα ｋｎｏｃｋｄｏｗｎを確認したものであり、図９ｂはＲＥＶ－ＥＲＢα ｋｎｏｃｋｄｏｗｎがＬＰＳ処理によるＩＬ－６、ＣＸＣＬ１、ＣＣＬ２、ＣＣＬ５の生成をさらに増加させ、図９ｃはＲＥＶ－ＥＲＢα ｋｎｏｃｋｄｏｗｎがＬＰＳ処理によるＩＬ－６、ＣＸＣＬ１、ＣＣＬ２、ＣＣＬ５のｍＲＮＡ発現をさらに増加させるということを示す。図９ｄはＰｓｅｎ２ Ｎ１４１Ｉ変異小膠細胞でＲＥＶ－ＥＲＢαを過発現を確認したものであり、図９ｅはＲＥＶ－ＥＲＢα過発現がＬＰＳによるＩＬ－６、ＣＸＣＬ１、ＣＣＬ２、ＣＣＬ５の生成を減少させ、図９ｆはＲＥＶ－ＥＲＢα過発現がＬＰＳによるＩＬ－６、ＣＸＣＬ１、ＣＣＬ２、ＣＣＬ５のｍＲＮＡ発現水準を顕著に減少させることを示す。反面、概日時計調節を受けないＴＮＦ－αは、ＲＥＶ－ＥＲＢαの発現調節に影響を受けなかった。これによって、ＲＥＶ－ＥＲＢαの発現低下がＰｓｅｎ２ Ｎ１４１Ｉ変異小膠細胞で概日時計性サイトカインの過発現の原因であるのが分かる。

【図9d】ＲＥＶ－ＥＲＢα発現減少が概日時計性サイトカインの過発現原因であるということを立証するための実験であって、図９ａは正常小膠細胞でＲＥＶ－ＥＲＢα ｋｎｏｃｋｄｏｗｎを確認したものであり、図９ｂはＲＥＶ－ＥＲＢα ｋｎｏｃｋｄｏｗｎがＬＰＳ処理によるＩＬ－６、ＣＸＣＬ１、ＣＣＬ２、ＣＣＬ５の生成をさらに増加させ、図９ｃはＲＥＶ－ＥＲＢα ｋｎｏｃｋｄｏｗｎがＬＰＳ処理によるＩＬ－６、ＣＸＣＬ１、ＣＣＬ２、ＣＣＬ５のｍＲＮＡ発現をさらに増加させるということを示す。図９ｄはＰｓｅｎ２ Ｎ１４１Ｉ変異小膠細胞でＲＥＶ－ＥＲＢαを過発現を確認したものであり、図９ｅはＲＥＶ－ＥＲＢα過発現がＬＰＳによるＩＬ－６、ＣＸＣＬ１、ＣＣＬ２、ＣＣＬ５の生成を減少させ、図９ｆはＲＥＶ－ＥＲＢα過発現がＬＰＳによるＩＬ－６、ＣＸＣＬ１、ＣＣＬ２、ＣＣＬ５のｍＲＮＡ発現水準を顕著に減少させることを示す。反面、概日時計調節を受けないＴＮＦ－αは、ＲＥＶ－ＥＲＢαの発現調節に影響を受けなかった。これによって、ＲＥＶ－ＥＲＢαの発現低下がＰｓｅｎ２ Ｎ１４１Ｉ変異小膠細胞で概日時計性サイトカインの過発現の原因であるのが分かる。

【図9e】ＲＥＶ－ＥＲＢα発現減少が概日時計性サイトカインの過発現原因であるということを立証するための実験であって、図９ａは正常小膠細胞でＲＥＶ－ＥＲＢα ｋｎｏｃｋｄｏｗｎを確認したものであり、図９ｂはＲＥＶ－ＥＲＢα ｋｎｏｃｋｄｏｗｎがＬＰＳ処理によるＩＬ－６、ＣＸＣＬ１、ＣＣＬ２、ＣＣＬ５の生成をさらに増加させ、図９ｃはＲＥＶ－ＥＲＢα ｋｎｏｃｋｄｏｗｎがＬＰＳ処理によるＩＬ－６、ＣＸＣＬ１、ＣＣＬ２、ＣＣＬ５のｍＲＮＡ発現をさらに増加させるということを示す。図９ｄはＰｓｅｎ２ Ｎ１４１Ｉ変異小膠細胞でＲＥＶ－ＥＲＢαを過発現を確認したものであり、図９ｅはＲＥＶ－ＥＲＢα過発現がＬＰＳによるＩＬ－６、ＣＸＣＬ１、ＣＣＬ２、ＣＣＬ５の生成を減少させ、図９ｆはＲＥＶ－ＥＲＢα過発現がＬＰＳによるＩＬ－６、ＣＸＣＬ１、ＣＣＬ２、ＣＣＬ５のｍＲＮＡ発現水準を顕著に減少させることを示す。反面、概日時計調節を受けないＴＮＦ－αは、ＲＥＶ－ＥＲＢαの発現調節に影響を受けなかった。これによって、ＲＥＶ－ＥＲＢαの発現低下がＰｓｅｎ２ Ｎ１４１Ｉ変異小膠細胞で概日時計性サイトカインの過発現の原因であるのが分かる。

【図9f】ＲＥＶ－ＥＲＢα発現減少が概日時計性サイトカインの過発現原因であるということを立証するための実験であって、図９ａは正常小膠細胞でＲＥＶ－ＥＲＢα ｋｎｏｃｋｄｏｗｎを確認したものであり、図９ｂはＲＥＶ－ＥＲＢα ｋｎｏｃｋｄｏｗｎがＬＰＳ処理によるＩＬ－６、ＣＸＣＬ１、ＣＣＬ２、ＣＣＬ５の生成をさらに増加させ、図９ｃはＲＥＶ－ＥＲＢα ｋｎｏｃｋｄｏｗｎがＬＰＳ処理によるＩＬ－６、ＣＸＣＬ１、ＣＣＬ２、ＣＣＬ５のｍＲＮＡ発現をさらに増加させるということを示す。図９ｄはＰｓｅｎ２ Ｎ１４１Ｉ変異小膠細胞でＲＥＶ－ＥＲＢαを過発現を確認したものであり、図９ｅはＲＥＶ－ＥＲＢα過発現がＬＰＳによるＩＬ－６、ＣＸＣＬ１、ＣＣＬ２、ＣＣＬ５の生成を減少させ、図９ｆはＲＥＶ－ＥＲＢα過発現がＬＰＳによるＩＬ－６、ＣＸＣＬ１、ＣＣＬ２、ＣＣＬ５のｍＲＮＡ発現水準を顕著に減少させることを示す。反面、概日時計調節を受けないＴＮＦ－αは、ＲＥＶ－ＥＲＢαの発現調節に影響を受けなかった。これによって、ＲＥＶ－ＥＲＢαの発現低下がＰｓｅｎ２ Ｎ１４１Ｉ変異小膠細胞で概日時計性サイトカインの過発現の原因であるのが分かる。

【図10a】図１０ａは５ｘＦＡＤアルツハイマーマウスモデルの小膠細胞でＮｒ１ｄ１ ｍＲＮＡ発現水準が正常マウス細胞と同一であるという結果である。図１０ｂは５ｘＦＡＤアルツハイマーマウスモデルで炎症性サイトカインＩＬ－６とＴＮＦ－αの血中濃度は差がないのを示す結果である。５ｘＦＡＤマウスは総５個の認知症関連突然変異があるＡＰＰおよびＰＳＥＮ１遺伝子（ＡＰＰ；Ｓｗｅｄｉｓｈ（Ｋ６７０Ｎ／Ｍ６７１Ｌ）、Ｆｌｏｒｉｄａ（Ｉ７１６Ｖ）、ａｎｄ Ｌｏｎｄｏｎ（Ｖ７１７Ｉ） ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ａｎｄ ＰＳＥＮ１；Ｍ１４６Ｌ ａｎｄ Ｌ２８６Ｖ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ）を発現するマウスモデルであって、この結果はＲＥＶ－ＥＲＢα発現低下による過度な免疫反応がＰｓｅｎ２家族性アルツハイマーの特性であり得るのを提示する。

【図10b】図１０ａは５ｘＦＡＤアルツハイマーマウスモデルの小膠細胞でＮｒ１ｄ１ ｍＲＮＡ発現水準が正常マウス細胞と同一であるという結果である。図１０ｂは５ｘＦＡＤアルツハイマーマウスモデルで炎症性サイトカインＩＬ－６とＴＮＦ－αの血中濃度は差がないのを示す結果である。５ｘＦＡＤマウスは総５個の認知症関連突然変異があるＡＰＰおよびＰＳＥＮ１遺伝子（ＡＰＰ；Ｓｗｅｄｉｓｈ（Ｋ６７０Ｎ／Ｍ６７１Ｌ）、Ｆｌｏｒｉｄａ（Ｉ７１６Ｖ）、ａｎｄ Ｌｏｎｄｏｎ（Ｖ７１７Ｉ） ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ａｎｄ ＰＳＥＮ１；Ｍ１４６Ｌ ａｎｄ Ｌ２８６Ｖ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ）を発現するマウスモデルであって、この結果はＲＥＶ－ＥＲＢα発現低下による過度な免疫反応がＰｓｅｎ２家族性アルツハイマーの特性であり得るのを提示する。

【図11a】クロルプロマジン処理によって生体内で概日時計性炎症サイトカインの発現と記憶力回復を確認するための実験であって、図１１ａは実験概略図を示したものである。この実験でのクロルプロマジン濃度（０．２５ｍｇ／ｋｇ）は既存の知られたクロルプロマジンの用途である抗精神病に使用される濃度（２５ｍｇ／回、３回／日）より数十倍～数百倍低い濃度である。図１１ｂは図１１ａの概略図に示された実験を行った結果の血中サイトカイン濃度を示したものであり、図１１ｃはＹ－ｍａｚｅ分析を通じて神経炎症誘導マウスにクロルプロマジン処理による記憶力回復効果を確認したものである。図１１ｄはＹ－ｍａｚｅ分析でマウスの運動性には差がないのを確認したものである。

【図11b】クロルプロマジン処理によって生体内で概日時計性炎症サイトカインの発現と記憶力回復を確認するための実験であって、図１１ａは実験概略図を示したものである。この実験でのクロルプロマジン濃度（０．２５ｍｇ／ｋｇ）は既存の知られたクロルプロマジンの用途である抗精神病に使用される濃度（２５ｍｇ／回、３回／日）より数十倍～数百倍低い濃度である。図１１ｂは図１１ａの概略図に示された実験を行った結果の血中サイトカイン濃度を示したものであり、図１１ｃはＹ－ｍａｚｅ分析を通じて神経炎症誘導マウスにクロルプロマジン処理による記憶力回復効果を確認したものである。図１１ｄはＹ－ｍａｚｅ分析でマウスの運動性には差がないのを確認したものである。

【図11c】クロルプロマジン処理によって生体内で概日時計性炎症サイトカインの発現と記憶力回復を確認するための実験であって、図１１ａは実験概略図を示したものである。この実験でのクロルプロマジン濃度（０．２５ｍｇ／ｋｇ）は既存の知られたクロルプロマジンの用途である抗精神病に使用される濃度（２５ｍｇ／回、３回／日）より数十倍～数百倍低い濃度である。図１１ｂは図１１ａの概略図に示された実験を行った結果の血中サイトカイン濃度を示したものであり、図１１ｃはＹ－ｍａｚｅ分析を通じて神経炎症誘導マウスにクロルプロマジン処理による記憶力回復効果を確認したものである。図１１ｄはＹ－ｍａｚｅ分析でマウスの運動性には差がないのを確認したものである。

【図11d】クロルプロマジン処理によって生体内で概日時計性炎症サイトカインの発現と記憶力回復を確認するための実験であって、図１１ａは実験概略図を示したものである。この実験でのクロルプロマジン濃度（０．２５ｍｇ／ｋｇ）は既存の知られたクロルプロマジンの用途である抗精神病に使用される濃度（２５ｍｇ／回、３回／日）より数十倍～数百倍低い濃度である。図１１ｂは図１１ａの概略図に示された実験を行った結果の血中サイトカイン濃度を示したものであり、図１１ｃはＹ－ｍａｚｅ分析を通じて神経炎症誘導マウスにクロルプロマジン処理による記憶力回復効果を確認したものである。図１１ｄはＹ－ｍａｚｅ分析でマウスの運動性には差がないのを確認したものである。

【図12】正常対照群および神経炎症性アルツハイマー動物モデルの小膠細胞で炎症性サイトカインの発現機序と、クロルプロマジン処理による変化を示した概略図である。

【発明を実施するための形態】

【0055】

以下、本発明の理解のために好ましい実施例を提示する。しかし、下記の実施例は本発明をより容易に理解するために提供させるものに過ぎず、下記の実施例によって本発明の内容が限定されるのではない。

【実施例】

【0056】

実施例１：疾患動物モデルの製造
動物の管理および使用に関する全ての手続は動物管理機関（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ ｃａｒｅ）およびＤＧＩＳＴ使用委員会（Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｆ ＤＧＩＳＴ）の承認を受けて行った。動物はＤＧＩＳＴ動物施設（ＤＧＩＳＴ ａｎｉｍａｌ ｆａｃｉｌｉｔｙ）で１２時間の明周期、１２時間の暗周期下に無菌環境で維持された。

【0057】

人間神経炎症性疾患、例えば、アルツハイマー疾患をより正確に再現し、内因性発現水準を維持するために異型接合Ｐｓｅｎ２^{Ｎ１４１Ｉ／＋}（ＫＩ／＋）マウスを使用した。Ｐｓｅｎ２^{Ｎ１４１Ｉ／＋}マウスは相同組換えを使用して生成された。

【0058】

具体的に、家族性アルツハイマー突然変異のうちの一つであってｐｒｅｓｅｎｉｌｉｎ２遺伝子の１４１番アミノ酸Ｎ（アルギニン）がＩ（イソロイシン）で置換されたＰｓｅｎ２ Ｎ１４１Ｉ ｋｎｏｃｋ－ｉｎ（ＫＩ）動物モデルを製作しようとした。標的化ベクターはエクソン４部位のＩ１４１突然変異およびＮｅｏ^ｒ－ｌｏｘｐ配列を含む。標的化ベクターの相同性部位は野生型（ＷＴ）対立遺伝子のＰｓｅｎ２に挿入された。Ｐｓｅｎ２^{Ｎ１４１Ｉ／Ｎ１４１Ｉ}；ｌｏｘｐ－Ｎｅｏ^ｒ－ｌｏｘｐマウスはＰｓｅｎ２^{Ｎ１４１Ｉ}突然変異ｋｎｏｃｋ－ｉｎマウスモデルを生成するためにＣｒｅ－ｌｏｘｐシステムを使用してＣｒｅマウスと交配された。

【0059】

本実施例で“Ｐｓｅｎ２^{Ｎ１４１Ｉ}”とは動物モデルの正常Ｐｓｅｎ２遺伝子を人間で報告された認知症突然変異と同一な変異を発現するように置換したことを意味し、より具体的には、マウスＰｒｅｓｅｎｉｌｉｎ２遺伝子の１４１番アミノ酸をＮからＩに置換されたことを意味する。本発明では、Ｐｓｅｎ２^{Ｎ１４１Ｉ}遺伝子として配列番号１のポリヌクレオチドを使用し、野生型Ｐｓｅｎ２遺伝子は配列番号２に示す。

【0060】

図１ａのようにＰｓｅｎ２^{Ｎ１４１Ｉ}対立遺伝子（Ｐｓｅｎ２^{Ｎ１４１Ｉ／＋} ａｎｄ Ｐｓｅｎ２^{Ｎ１４１Ｉ／Ｎ１４１Ｉ}）を保有したＫＩマウスを生成した。図１ｂに示したように、ＡＡＣ配列からなるＡｓｐａｒａｇｉｎｅ（Ｎ）でＡＡＣとＡＴＣへの置換はＡｓｐａｒａｇｉｎｅ（Ｎ）とＩｓｏｌｅｕｃｉｎｅ（Ｉ）を全て有するＫＩ／＋モデル、全てＡＴＣで置換されたＩ１４１を有するＫＩ／ＫＩモデルをマウスの尾から抽出したＤＮＡのゲノム配列分析を通じて確認した。

【0061】

実施例２：ＬＰＳによる疾患動物モデルの炎症誘発
本実施例は、Ｐｓｅｎ２ Ｎ１４１Ｉ変異アルツハイマー疾病マウスモデルが正常（野生型）マウスに比べて過度に炎症反応を起こすということを確認するために行った。

【0062】

２－１：炎症誘発ＬＰＳ濃度分析
Ｐｓｅｎ２^{Ｎ１４１Ｉ／＋}マウスから派生した小膠細胞の免疫反応が悪化するにつれて動物が炎症および認知機能低下を示す傾向があるのを確認するために、多様なＬＰＳ濃度で野生型およびＰｓｅｎ２^{Ｎ１４１Ｉ／＋}マウス間の免疫反応を比較した。

【0063】

マウスの免疫反応は活動が始まる頃から数時間内に最高潮に達する傾向を示すところ、８週齢の野生型およびＰｓｅｎ２^{Ｎ１４１Ｉ／＋}マウスに１８：００時基準でＬＰＳを腹腔内（ｉ．ｐ．）注入し（Ｚｅｉｔｇｅｂｅｒ時間１１：００、０７：００に点灯、１９：００に消灯）２０時間後、翌日１４：００時に炎症反応をモニターした。ＬＰＳはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ０１１１：Ｂ４ ｓｔｒａｉｎから得たものであって、Ｔｏｌｌ様受容体４のリガンドとして作用して細胞の免疫反応を誘導する。Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ－ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ（ＰＢＳ）に濃度に合わせて希釈したＬＰＳを１００μＬずつマウス腹腔内に注入する。

【0064】

具体的に、前記実施例１で得られたＰｓｅｎ２^{Ｎ１４１Ｉ}変異アルツハイマー疾病マウスモデルに１．４、３．６、４．０、２５、および５，０００μｇ／ｋｇ濃度のＬＰＳ腹腔注射によって神経炎症を誘導した。

【0065】

対照実験として、前記アルツハイマー疾病マウスモデルの代わりに、野生型マウスモデルを使用して同一にＬＰＳを注入して神経炎症誘発試験を行った。また、対照実験としてＬＰＳを注入しない野生型マウスとＰｓｅｎ２ Ｎ１４１Ｉ変異アルツハイマー疾病マウスモデルを準備した。したがって、グループ１はＬＰＳを注入しない野生型マウス（ＷＴ（ＬＰＳ（－）））、グループ２は多様なＬＰＳを投入した野生型マウス（ＷＴ（ＬＰＳ（＋）））、グループ３はＬＰＳを注入しないアルツハイマー疾病マウスモデル（ＫＩ／＋（ＬＰＳ（－）））、グループ４は多様なＬＰＳを投入したアルツハイマー疾病マウスモデル（ＫＩ／＋（ＬＰＳ（＋）））を準備した。一つグループ当りマウスはそれぞれ５～８匹を使用した。

【0066】

多様な濃度のＬＰＳ注入による神経炎症を調査するために、前記ＬＰＳを注入して約２０時間が経過した後に、グループ２の野生型マウスおよびグループ４のアルツハイマー疾病マウスモデルの頬静脈から血液を抽出し、遠心分離を通じて得られた血清でそれぞれＩＬ－６、ＴＮＦα、ＣＣＬ２、ＣＸＣＬ１、ＣＣＬ５用ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて製造会社の指針に従って各タンパク質量をＥＬＩＳＡ方法で測定した。また、グループ１のＬＰＳを注入しない野生型マウスとグループ３のＰｓｅｎ２ Ｎ１４１Ｉ変異アルツハイマー疾病マウスモデルで同一に血清を抽出してキット製造会社の指針に従って各タンパク質量をＥＬＩＳＡ方法で測定した。

【0067】

前記グループ１～グループ４のマウスの血清で分析したＩＬ－６とＴＮＦ－α濃度を下記表１に示す。

【0068】

【表1】

【0069】

表１は、各グループでＬ－６とＴＮＦ－αの血中濃度の平均値（ｍｅａｎ±ＳＥＭ）を示す。ＬＰＳ注入したグループ２の野生型マウスおよびグループ４のアルツハイマー疾病マウスモデルで多様な濃度のＬＰＳ腹腔注射によってＩＬ－６は全て過発現され、野生型マウスとアルツハイマー疾病マウスモデルの発現差は低濃度でますます広がる。ＬＰＳによってＴＮＦ－αは野生型マウスとアルツハイマー疾病マウスモデル間に同一な血中濃度を示す。グループ１のＬＰＳを注入しない野生型マウスとグループ３のＰｓｅｎ２ Ｎ１４１Ｉ変異アルツハイマー疾病マウスモデルではＩＬ－６とＴＮＦ－αの両方とも分泌量が非常に少なくて同一である。

【0070】

その結果、図２ａは野生型マウスと比較してＫＩ／＋アルツハイマー疾病マウスはテストされた全てのＬＰＳ容量でＩＬ－６の循環水準が高く、遺伝子型間の差は低い容量でさらに著しく示されることを確認し、ＴＮＦ－αの血中濃度は全ての容量で遺伝子型間に同一に示されることを確認した。

【0071】

２－２：低濃度のＬＰＳ処理による疾病動物の炎症誘発
前記実施例２－１と同様な方法でグループ１～グループ４の動物を準備し、但しグループ２およびグループ４では多様な濃度のＬＰＳ処理の代わりに、野生型マウスでは炎症反応を起こさない低濃度のＬＰＳ（０．３５μｇ／ｋｇ）を使用した。

【0072】

マウスモデルで同一に血清を抽出しキット製造会社の指針に従って各タンパク質量をＥＬＩＳＡ方法で測定した。前記グループ１～グループ４のマウスの血清で分析した概日時計調節を受けると知られた炎症性サイトカインであるＩＬ－６、ＣＸＣＬ１、ＣＣＬ２、ＣＣＬ５の血中濃度を下記表２に示す。

【0073】

【表2】

【0074】

上記表２に概日時計調節を受けると知られた炎症性サイトカインであるＩＬ－６、ＣＸＣＬ１、ＣＣＬ２、ＣＣＬ５の血中濃度の変化（ｍｅａｎ±ＳＥＭ）を示す。グループ２で、野生型マウスでは炎症反応を起こさない低濃度のＬＰＳ（０．３５μｇ／ｋｇ）を注射した時、グループ４のＰｓｅｎ２アルツハイマー疾病マウスのみでＴＮＦ－αと異なり炎症性サイトカインが顕著に増加するのを確認した。

【0075】

図２ｂに示したように、最も低いＬＰＳ容量（０．３５μｇ／体重ｋｇ）は野生型マウスで炎症を起こさなかったが、Ｐｓｅｎ２アルツハイマー疾病マウスで概日時計調節を受けるサイトカイン（ＩＬ－６、ＣＸＣＬ１、ＣＣＬ２そしてＣＣＬ５）の血中濃度が顕著に増加するのを示す。

【0076】

実施例３：小膠細胞形態分析を用いた神経炎症動物モデルの炎症悪化確認
小膠細胞の形態はその機能と密接な関連があり、小膠細胞の活性化は形状変化と関連することを特徴とし、概日時計調節を受けるサイトカインの増加された生産が小膠細胞の形態に反映されるかどうかを確認するために、免疫組織化学分析を通じて、小膠細胞特異的マーカであるＩｂａ－１に対抗する抗体を使用して野生型およびＰｓｅｎ２変異アルツハイマー疾病マウスの海馬で小膠細胞の形状を調査した。

【0077】

前記実施例２－２で準備されたグループ１～グループ４のマウスに対して免疫組織化学分析および共焦点分析を行った。前記グループ２およびグループ４に注入されたＬＰＳ濃度は野生型マウスで炎症反応を起こさない低濃度のＬＰＳ（０．３５μｇ／ｋｇ）を使用したのである。

【0078】

免疫組織化学分析は具体的に、マウスはゾレチル（Ｖｉｒｂａｃ、５０ｍｇ／ｋｇ）とロムプン（Ｂａｙｅｒ、１０ｍｇ／ｋｇ）混合物を注入して麻酔した。その後、マウスにＰＢＳを灌流し、４％のｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ（ＰＦＡ）を灌流して固定した。脳を採取して４％ＰＦＡで１６時間固定させた後、チューブ底に沈むまで３０％のスクロースに移した後ｆｒｏｚｅｎ溶液を用いて保管した。Ｃｏｒｏｎａｌ方向に５０μｍ厚さでスライスした脳試料を９５℃で抗原復旧（ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｔｒｉｅｖａｌ）過程を経た後、４℃で２４時間３％ウシ血清アルブミンが含有されたＰＢＳでＩＢＡ－１抗体（１：２５０）を処理後、常温で２時間２次抗体を処理した。イメージはＬＳＭ７およびＬＳＭ７００共焦点レーザスキャン顕微鏡を用いた。

【0079】

図３ａに示したように、グループ１の野生型マウスの海馬にある小膠細胞は高度に分派した過程を有する小さな細胞体を有しており、サイトカイン放出誘導がないものと一致して低容量のＬＰＳはグループ２の野生型マウス海馬の小膠細胞の形態を変更しない反面、ＬＰＳ注入がない場合にもグループ３のＰｓｅｎ２変異アルツハイマー疾病マウスの海馬小膠細胞はさらに短い丸い形状の拡大された体細胞を示し、このような形態学的特徴はグループ４でＬＰＳ注入によってさらに増加することを確認した。

【0080】

図３ｂに示したように、グループ１～グループ４のマウス海馬の小膠細胞の組織学的共焦点イメージを３Ｄ形態に再構成しＩＭＡＲＩＳソフトウェアを使用して多様な形態学的媒介変数を測定した。具体的に、共焦点顕微鏡で無作為に選択されたフィールドの全体Ｚ軸を合わせてイメージを得た後、ＩＭＡＲＩＳソフトウェア（ｖ９．２．１、ｂｉｔｐｌａｎｅ ＡＧ）を使用して３Ｄイメージング化した。

【0081】

【表3】

【0082】

上記表３は、ｄｅｎｄｒｉｔｅ長さ、ｄｅｎｄｒｉｔｅ枝数の定量値（ｍｅａｎ±ＳＥＭ）を整理した。

【0083】

その結果、図３ｃに示したように、各小膠細胞の総樹状突起長さと樹状突起末端地点はグループ１と２の野生型マウスに比べてグループ３と４のアルツハイマー疾病マウスおよびＬＰＳ注入によってさらに減少することを確認した。前記結果から、形態学に基づいた時、小膠細胞活性化はＰｓｅｎ２変異アルツハイマー疾病マウスで明らかに示され、軽いＬＰＳ注入によって追加的に誘導されるのを確認した。

【0084】

実施例４：神経炎症動物モデルの記憶力減退確認
４－１．Ｙ－ｍａｚｅ分析
前記実施例２－２で準備されたグループ１～グループ４のマウスの空間学習能力および記憶能力を検査するためにＬＰＳ注入２０時間後、Ｙ－ｍａｚｅテストを行った。前記グループ２およびグループ４に注入されたＬＰＳ濃度は野生型マウスで炎症反応を起こさない低濃度のＬＰＳ（０．３５μｇ／ｋｇ）を使用したのである。

【0085】

具体的に、Ｙ－ｍａｚｅは空間作業記憶能力を評価するのに使用される。Ｙ字形態の迷路の白いプラスチックアームで行い、マウスをアームに入れて５分間自由にアームを探索することができるようにした。実験はＥｔｈｏＶｉｓｉｏｎソフトウェア（Ｎｏｌｄｕｓ）で記録された。エントリーの数とトライアド数を分析して３個の連続エントリーの数を可能なトライアド数×１００（総アームエントリー－２）で割って交代比率（ａｌｔｅｒｎａｔｉｏｎ）を計算した。

【0086】

【表4】

【0087】

上記表４は各グループのＹ－ｍａｚｅの交代比率とアームエントリー数の平均値（ｍｅａｎ±ＳＥＭ）を示したものである。その結果、図４ａおよび４ｂに示したように、Ｙ－ｍａｚｅでアーム交代はグループ１の野生型マウス（１３匹）とＬＰＳを注入した野生型マウスグループ２（１３匹）では炎症性サイトカイン分泌と比例して記憶能力の差はない。ＬＰＳ注入ないグループ１の野生型マウスとグループ３のＰｓｅｎ２変異アルツハイマー疾病マウス（１２匹）でも記憶能力の差を示さないが、ＬＰＳを注入したグループ４のＰｓｅｎ２変異アルツハイマー疾病マウスグループ（１５匹）では有意味に減少した。アームエントリー総数は全てのグループで同一なので正常的な運動機能を示すことを確認した。

【0088】

４－２．Ｔ－ｍａｚｅ分析
前記実施例２－２で準備されたグループ１～グループ４のマウスの学習記憶力を追加的に分析するためにＬＰＳ注入２０時間後に食品報酬を通じたＴ－ｍａｚｅテストを行った。前記グループ２およびグループ４に注入されたＬＰＳ濃度は野生型マウスで炎症反応を起こさない低濃度のＬＰＳ（０．３５μｇ／ｋｇ）を使用したのである。

【0089】

具体的に、Ｔ－ｍａｚｅは、報酬に対する空間学習と記憶を評価するのに使用された。図４ｃで示したように、Ｔ字形状の迷路の白いプラスチックアームで行われ、実験前５分間マウスを迷路と餌報酬に適応させ、その次の施行では両アームに一側アームを遮断し一側に報酬を与えた。マウスは開放されたアームに到着して報酬を確認し、次の施行では以前に閉鎖したアームを開放して、マウスを再び出発させて、新しく開放されたアームを選択すれば報酬を確認することができるようにする。もしマウスが以前に訪問したアームを誤って選択したとすれば、報酬を受けることができない。数回の施行を通じて正しいアームを訪問した施行回数は全体施行の百分率で計算する。

【0090】

【表5】

【0091】

上記表５は、各グループのＴ－ｍａｚｅ遂行結果成功率の平均値（ｍｅａｎ±ＳＥＭ）を示す。その結果、図４ｄに示したようにグループ１の野生型マウス（１１匹）とＬＰＳを注入したグループ２（１１匹）では炎症性サイトカイン分泌と比例して学習および記憶能力の差はない。ＬＰＳ注入ないグループ１の野生型マウスとグループ３のアルツハイマー疾病マウス（１０匹）でも学習および記憶能力の差を示さないが、ＬＰＳを注入したグループ４のアルツハイマー疾病マウスグループ（１０匹）では有意味に減少した。

【0092】

前記結果から、低い容量のＬＰＳは免疫反応の過活性を誘導しＰｓｅｎ２ Ｎ１４１Ｉ ＫＩ／＋アルツハイマー疾病マウスでＩＬ－６を含む概日時計調節を受けるサイトカインの過量生産を通じて記憶力欠乏を誘発する反面、同一な容量のＬＰＳは野生型マウスには無害であるということを確認した。

【0093】

実施例５：疾患動物の小膠細胞を用いた薬物の神経炎症抑制効能
５－１：マウスで一次培養した小膠細胞準備
野生型マウスとＰｓｅｎ２^{Ｎ１４１Ｉ／＋}アルツハイマー疾病マウスで一次培養した小膠細胞を準備した。具体的に、１～３日齢の新生マウスから脳を抽出した後、細胞を分離し、１０％熱－不活性化させたウシ胎児血清（ＨＩ－ＦＢＳ、Ｈｙｃｌｏｎｅ）および１％ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｈｙｃｌｏｎｅ）が補充されたＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ、Ｃｏｒｎｉｎｇ）で培養した。１次小膠細胞は試験管内でタッピング（ｔａｐｐｉｎｇ）して１２日に分離された。１次小膠細胞の純度は小膠細胞マーカである抗－Ｉｂａ－１抗体で免疫染色して推定した。

【0094】

５－２：小膠細胞を用いたクロルプロマジン処理による概日時計性サイトカイン生成および発現分析
前記実施例５－１で得られた、野生型マウスとＰｓｅｎ２変異アルツハイマー疾病マウスに由来した一次培養した小膠細胞に全てＬＰＳ（１μｇ／ｍＬ）を１２時間処理し、この時、クロルプロマジンを処理しない実験群と、クロルプロマジンを小膠細胞のメディアに０．５μＭ容量で３０分から前処理を行った実験群で抗炎症効果を比較分析した。具体的に、前記実施例５－１で得られた野生型マウスに由来した一次培養した小膠細胞にクロルプロマジンを処理しないグループをグループ５（ＷＴ／ＬＰＳ（＋）／ＣＰＺ（－））と、クロルプロマジンを処理したグループをグループ６（ＷＴ／ＬＰＳ（＋）／ＣＰＺ（＋））と、前記実施例５－１で得られたＰｓｅｎ２変異アルツハイマー疾病マウスに由来した一次培養した小膠細胞にクロルプロマジンを処理しないグループをグループ７（ＫＩ／＋／ＬＰＳ（＋）／ＣＰＺ（－））と、クロルプロマジンを処理したグループをグループ８（ＫＩ／＋／ＬＰＳ（＋）／ＣＰＺ（＋））と命名した。

【0095】

概日時計サイトカイン生成を測定するためには、処理した細胞の培養液を集めてそれぞれＩＬ－６、ＴＮＦα、ＣＣＬ２、ＣＸＣＬ１、ＣＣＬ５用ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて製造会社の指針に従って各サイトカイン量をＥＬＩＳＡ方法で測定した。

【0096】

前記各グループから培養液を採取した後、小膠細胞から分析対象サイトカインのｍＲＮＡ発現水準をｑＲＴ－ＰＣＲ（Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＲＴ－ＰＣＲ）方法で測定した。具体的に、小膠細胞からＲＮＡを分離しＩｍＰｒｏｍ－ＩＩ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用してｃＤＮＡを合成した。ＰＣＲプライマーは商業的に合成した（Ｃｏｓｍｏ Ｇｅｎｅｔｅｃｈ）。ｑＲＴ－ＰＣＲはマウスｃＤＮＡに特異的なＴａｑ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および下記表６に開示されたプライマーを使用して実施した。また、ＴＯＰｒｅａｌ^ＴＭ ｑＰＣＲ ２×ＰｒｅＭＩＸ（ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ｗｉｔｈ ｌｏｗ ＲＯＸ）（Ｅｎｚｙｎｏｍｉｃｓ）を使用し、ＣＦＸ９６ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を使用して全てのプライマーに対して５０－ｃｙｃｌｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎを適用した。Ａｃｔｂは正規化のための参照遺伝子として使用された。

【0097】

【表6】

【0098】

【表7】

【0099】

【表8】

【0100】

上記表７は図５ａの小膠細胞の培養液で測定した概日時計調節炎症性サイトカイン分泌量に対する平均値（ｍｅａｎ±ＳＥＭ）、表８は図５ｂの小膠細胞から抽出したｍＲＮＡで測定した概日時計調節炎症性サイトカイン発現量に対する平均値（ｍｅａｎ±ＳＥＭ）を示したものである。

【0101】

図５ａは、ＬＰＳ処理によって、前記実施例２－２のマウス血清の炎症性サイトカイン分析のように、グループ５の野生型に比べてグループ７のＰｓｅｎ２変異小膠細胞で概日時計調節炎症性サイトカイン（ＩＬ－６、ＣＸＣＬ１、ＣＣＬ２、ＣＣＬ５）が増加するということを示す。そして、グループ７に比べてクロルプロマジン０．５μＭ容量が処理されたグループ８のＰｓｅｎ２変異小膠細胞でＩＬ－６、ＣＸＣＬ１、ＣＣＬ２、ＣＣＬ５の生成減少を示している。グループ５とグループ６の比較を通じて野生型の小膠細胞でクロルプロマジン処理による効果は見られない。また、全てのグループの一次培養した小膠細胞で概日時計調節サイトカインと異なりＴＮＦ－αの生成量は同一であり、クロルプロマジンによって影響を受けなかった。

【0102】

図５ｂは、図５ａの分泌量と同様に、ＬＰＳ処理によってグループ５の野生型に比べてグループ７のＰｓｅｎ２変異アルツハイマー疾病マウスに由来した一次培養小膠細胞で概日時計調節炎症性サイトカイン（ＩＬ－６、ＣＸＣＬ１、ＣＣＬ２、ＣＣＬ５）のｍＲＮＡ発現が増加する。そして、グループ７に比べてクロルプロマジン０．５μＭ容量が処理されたグループ８のＰｓｅｎ２変異小膠細胞でＩＬ－６、ＣＸＣＬ１、ＣＣＬ２、ＣＣＬ５のｍＲＮＡ発現が減少するのを示している。グループ５とグループ６の比較を通じて野生型の小膠細胞でクロルプロマジン処理による効果は見られない。また、全てのグループの一次培養した小膠細胞で概日時計調節サイトカインと異なりＴＮＦ－αのｍＲＮＡ発現水準は同一であり、クロルプロマジンによって影響を受けなかった。

【0103】

５－３：小膠細胞でクロルプロマジン処理による非概日時計性サイトカインＩＬ－１β生成および発現分析
前記実施例５－２で、全てのグループで概日時計調節サイトカインと異なりＴＮＦ－αの生成と発現はクロルプロマジンの影響を受けない。同様に、概日時計調節を受けないと知られた他の例であるＩＬ－１βの生成と発現を本実施例５－３で比較した。

【0104】

ＩＬ－１βは小膠細胞のインフラマソーム活性化によって分泌されるサイトカインであって、ＬＰＳで炎症反応を誘導した後、インフラマソーム活性化を誘導する薬物の追加処理が必要である。野生型とＰｓｅｎ２変異アルツハイマー疾病マウスに由来した一次培養した小膠細胞の培養液にクロルプロマジンを処理しない実験群とクロルプロマジンを０．５μＭ容量で処理する実験群を分け、クロルプロマジンを３０分前処理し、ウシ胎児血清（ＨＩ－ＦＢＳ）を除いた培養液でＬＰＳ（１μｇ／ｍＬ）を３時間処理する。その後、培養液にｎｉｇｅｒｉｃｉｎ（１０μＭ）とＡＴＰ（５ｍＭ）を４０分処理した後、培養液を集めてＩＬ－１β用ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて製造会社の指針に従ってタンパク質量をＥＬＩＳＡ方法で測定した。その結果得られた実験群は、実施例５－２で得られたグループ５～８に対して、それぞれＮｉｇｅｒｉｃｉｎおよびＡＴＰ処理有無によって１０個下位グループに細分でき、それぞれ下位グループは下記表１１に示す。

【0105】

そして、培養液を除いた小膠細胞からＲＮＡを抽出して前記実施例５－２のようにｍＲＮＡをｑＲＴ－ＰＣＲ分析で測定した。プライマーは表９に開示した。

【0106】

【表9】

【0107】

下記表１０および表１１は、野生型とＰｓｅｎ２変異アルツハイマー疾病マウスに由来した一次培養小膠細胞にＬＰＳ処理とインフラマソーム活性化によるＩＬ－１β生成と発現に対する各グループの平均値（ｍｅａｎ±ＳＥＭ）を示したものである。

【0108】

【表10】

【0109】

【表11】

【0110】

図５ｃは概日時計調節を受けないと知られた他の例であるＩＬ－１βの生成とｍＲＮＡ発現がＬＰＳによる炎症反応と二種類のインフラマソーム活性化誘導薬物によって野生型とＰｓｅｎ２変異アルツハイマー疾病マウス由来一次培養小膠細胞間に同一な程度のみ誘導されるということを示し、クロルプロマジンによっても全てのグループがＩＬ－１β生成に影響を受けないということを示す。

【0111】

実施例６：疾患動物の小膠細胞でアミロイドベータで神経炎症誘発および薬物による神経炎症抑制効果
前記実施例５は、野生型とＰｓｅｎ２変異アルツハイマー疾病マウスで一次培養した小膠細胞の培養液にＬＰＳを処理して神経炎症反応を誘発しクロルプロマジンの抑制効果を比較した。

【0112】

本実施例６では、疾病条件をさらによく模写することができるように、神経炎症反応を誘導する人工的な物質ＬＰＳの代わりに、アルツハイマーの直接病因である凝集されたアミロイドベータを野生型とＫＩ／＋アルツハイマー疾病マウスで一次培養した小膠細胞に処理して神経炎症反応を誘導した時にクロルプロマジンの効果を比較しようとした。

【0113】

具体的に、ＦＩＴＣ信号が結合されたアミロイドベータ１－４２は下記参照に従って製造した（Ｃｈｏ， Ｍ．－Ｈ．ｅｔ ａｌ． “Ａｕｔｏｐｈａｇｙ ｉｎ ｍｉｃｒｏｇｌｉａ ｄｅｇｒａｄｅｓ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ β－ａｍｙｌｏｉｄ ｆｉｂｒｉｌｓ ａｎｄ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｔｈｅ ＮＬＲＰ３ ｉｎｆｌａｍｍａｓｏｍｅ．”Ａｕｔｏｐｈａｇｙ １０， １７６１－１７７５（２０１４））。

【0114】

前記実施例５－１で準備したＰｓｅｎ２変異アルツハイマー疾病マウスモデル（ＫＩ／＋）および野生型マウス（ＷＴ）に由来した一次培養小膠細胞に、前記製造された凝集された（ｆｉｂｒｉｌｉｚｅｄ）アミロイドベータ１－４２（ｆＡβ４２）を４μＭ濃度で小膠細胞の培養液に直接処理した。前記ｆＡβ４２処理された小膠細胞にクロルプロマジンを処理しない実験群と、クロルプロマジン０．５μＭ容量で処理した実験群で培養液を集めて前記実施例５－２のようにそれぞれＩＬ－６、ＴＮＦα、ＣＣＬ２、ＣＸＣＬ１、ＣＣＬ５用ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて製造会社の指針に従って各タンパク質量をＥＬＩＳＡ方法で測定した。

【0115】

【表12】

【0116】

上記表１２は、ｆＡβ４２処理によって誘導された神経炎症反応とクロルプロマジン処理による炎症抑制反応に対するグループの各概日時計性炎症サイトカインの平均値（ｍｅａｎ±ＳＥＭ）を示したものである。

【0117】

図６は、人工的誘導物質であるＬＰＳの代わりにアルツハイマー認知症の直接的病因である凝集された（ｆｉｂｒｉｌｉｚｅｄ）アミロイドベータ１－４２（ｆＡβ４２）を処理したグループ２３と２５で野生型小膠細胞に比べてＰｓｅｎ２アルツハイマー疾病マウスモデルの小膠細胞で概日時計性炎症サイトカインであるＩＬ－６、ＣＸＣＬ１、ＣＣＬ２、ＣＣＬ５の生成が顕著に増加することを示す。そして、グループ２４と２６でクロルプロマジンを処理した時、野生型小膠細胞（グループ２４）ではクロルプロマジンの効果がないが、Ｐｓｅｎ２変異アルツハイマー疾病マウスモデルの小膠細胞（グループ２６）で炎症抑制効果があるのを示している。

【0118】

反面、ＴＮＦ－αは、前記実施例５と同様に、野生型小膠細胞とＰｓｅｎ２変異アルツハイマー疾病マウス由来小膠細胞で全て同一に生成され、クロルプロマジンによって影響を受けなかった。このような結果から、Ｐｓｅｎ２家族性アルツハイマー病が正常グループには無害の程度の低い免疫刺激にも過敏に免疫反応を起こし、その結果、概日時計性サイトカインが過発現されるということが主な特徴であり、概日時計性サイトカインのみを選択的に抑制しても神経炎症を減らすことができるのを確認することができた。これによって、正常グループには影響を与えず、Ｐｓｅｎ２家族性認知症特異的に過活性化された炎症反応を調節して副作用の少ない認知症治療開発の可能性を提示する。

【0119】

実施例７：病気モデルの小膠細胞を用いた薬物のＲＥＶ－ＥＲＢα発現回復試験
前記実施例５－１の細胞培養方法を使用し、野生型マウスとＰｓｅｎ２アルツハイマー疾病マウスモデルに由来した一次培養小膠細胞を得た後、ＬＰＳ処理なく試験に使用した。得られた小膠細胞にクロルプロマジンを処理しない実験群と、クロルプロマジン０．５μＭ容量で処理した実験群で効果を分析した。

【0120】

前記実施例で確認した概日時計調節炎症サイトカイン（ＩＬ－６、ＣＸＣＬ１、ＣＣＬ２、ＣＣＬ５）を調節する概日リズムと関連するタンパク質と知られたＲＥＶ－ＥＲＢαの遺伝子であるＮｒ１ｄ１のｍＲＮＡ発現は、実施例５と実質的に同一な方法でｑＲＴ－ＰＣＲ分析を行った。但し、ｑＲＴ－ＰＣＲに使用されたプライマーセットは下記表１３に示す。

【0121】

【表13】

【0122】

【表14】

【0123】

上記表１４は、野生型とＰｓｅｎ２変異アルツハイマー疾病マウス由来一次培養した小膠細胞でクロルプロマジンの処理有無に対するＲＥＶ－ＥＲＢαタンパク質の遺伝子であるＮｒ１ｄ１のｍＲＮＡ発現量とＲＥＶ－ＥＲＢαタンパク質発現量に対する平均値（ｍｅａｎ±ＳＥＭ）を示したものである。

【0124】

ＲＥＶ－ＥＲＢαタンパク質の遺伝子であるＮｒ１ｄ１のｍＲＮＡ発現分析結果を、図７ａに示した。グループ２７の野生型小膠細胞に対比してグループ２９のＰｓｅｎ２変異アルツハイマー疾病マウス由来小膠細胞でＮｒ１ｄ１のｍＲＮＡ発現量が非常に減少しているのを示す。グループ３０のクロルプロマジンを０．５μＭを処理したＰｓｅｎ２変異アルツハイマー疾病マウス由来小膠細胞で野生型小膠細胞の発現量だけ回復した。反面、グループ２８のようにクロルプロマジンは野生型で発現量に影響を与えなかった。

【0125】

また、ＲＥＶ－ＥＲＢαタンパク質発現量を比較するためにウェスタンブロット方法で分析した。具体的に、一次培養した小膠細胞を１％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００溶解緩衝液（１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、２５０ ｍＭ ｓｕｃｒｏｓｅ、１ ｍＭ ＥＤＴＡ、１ ｍＭ ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｎｙｌ ｆｌｕｏｒｉｄｅ、ａｎｄ ５０ ｍＭ ＮａＣｌ ｉｎ ２０ ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ ７．４）で１×ｐｒｏｔｅａｓｅ ａｎｄ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）および０．１ Ｍ ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）と共に溶解した。細胞溶解液をｓｏｄｉｕｍ ｄｏｄｅｃｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ－ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅゲルで電気泳動し、ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｉｄｅｎｅ ｆｌｕｏｒｉｄｅメンブレインにトランスファした。前記メンブレインに適切な１次抗体を処理して培養し、結合された抗体に対する種特異的ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）が接合された２次抗体を処理した。その後、タンパク質バンドを分析するために化学発光検出（Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｓｃｅｎｃｅ）を行った。

【0126】

前記ウェスタンブロット分析結果、図７ｂは、図７ａのｍＲＮＡ発現量と同様にグループ２７の野生型小膠細胞のＲＥＶ－ＥＲＢαタンパク質発現量に比べてグループ２９のＰｓｅｎ２変異アルツハイマー疾病マウスモデルに由来した小膠細胞で顕著に減少しているのを示す。グループ３０のクロルプロマジンを０．５μＭを処理したアルツハイマー疾病マウス由来小膠細胞で野生型小膠細胞の発現量だけ回復した。そして、グループ２８でクロルプロマジンの処理は野生型小膠細胞では影響を与えない。

【0127】

前記結果、前記実施例で確認した概日時計調節炎症サイトカイン（ＩＬ－６、ＣＸＣＬ１、ＣＣＬ２、ＣＣＬ５）を調節する概日リズムと関連するタンパク質と知られたＲＥＶ－ＥＲＢαの発現量はＰｓｅｎ２ Ｎ１４１Ｉ変異アルツハイマー疾病マウスモデルで顕著に減少しており、これに対するクロルプロマジンの回復効能を確認した。

【0128】

実施例８：疾病動物の小膠細胞でＲＥＶ－ＥＲＢα活性薬物の効果
前記実施例５－１と同様に、野生型マウスとＰｓｅｎ２変異アルツハイマー疾病マウスモデルに由来した一次培養小膠細胞を得て試験に使用した。

【0129】

前記準備した野生型とＰｓｅｎ２変異アルツハイマー疾病マウスモデルに由来した一次培養小膠細胞の培養液にＬＰＳ（１μｇ／ｍＬ）を２、６、１２、２４時間処理し、各グループのＬＰＳ処理前にＲＥＶ－ＥＲＢα ａｇｏｎｉｓｔと知られたＳＲ９００９薬物を１０μＭ容量で処理した実験群と、ＳＲ９００９薬物を処理していない実験群を準備し、ＬＰＳ処理以後２、６、１２、２４時間によってＩＬ－６の生成量とｍＲＮＡ発現量を実施例５のＥＬＩＳＡ方法とｑＲＴ－ＰＣＲ方法と実質的に同様な方法で分析して、ＳＲ９００９薬物の効果を分析した。

【0130】

【表15】

【0131】

【表16】

【0132】

上記表１５および表１６は、野生型とＰｓｅｎ２変異アルツハイマー疾病マウス由来一次培養した小膠細胞でクロルプロマジンの処理有無によるＩＬ－６の生成とｍＲＮＡ発現量に対する平均値（ｍｅａｎ±ＳＥＭ）を示したものである。

【0133】

図８ａに示したように、ＳＲ９００９は一次培養した野生型小膠細胞では時間（２、６、１２、２４時間）によってグループ３１に比べてＳＲ０９００９を処理したグループ３２でＩＬ－６の生成を抑制するが、グループ３３のＰｓｅｎ２変異アルツハイマー疾病マウスモデル由来小膠細胞で過発生するＩＬ－６に比べてＳＲ９００９を処理したグループ４で抑制できないことを示す。

【0134】

図８ｂに示したように、ＳＲ９００９は一次培養した野生型小膠細胞では時間（２、６、１２、２４時間）によってグループ３１に比べてＳＲ０９００９を処理したグループ３２でＩＬ－６のｍＲＮＡ発現を抑制するが、グループ３３のＰｓｅｎ２変異アルツハイマー疾病マウスモデル由来小膠細胞で過発現するＩＬ－６に比べてＳＲ９００９を処理したグループ３４で抑制できないことを示す。

【0135】

ＲＥＶ－ＥＲＢα ａｇｏｎｉｓｔと知られたＳＲ９００９薬物の抗炎症効果がＰｓｅｎ２ Ｎ１４１Ｉアルツハイマー疾病マウスモデル由来小膠細胞で効果がないのを確認した。これによって、Ｐｓｅｎ２ Ｎ１４１Ｉ変異による過度な神経炎症反応抑制のためにはＲＥＶ－ＥＲＢαの発現回復が先決されなければならないのが分かる。また、ＲＥＶ－ＥＲＢα活性薬物が正常小膠細胞で抗炎症効能があってもＰｓｅｎ２家族性認知症では認知症治療効果がないことがあるのを提示する。

【0136】

実施例９：疾病動物の小膠細胞でＲＥＶ－ＥＲＢα発現減少が概日時計性サイトカインの過発現原因であるのを立証
９－１：野生型マウス由来小膠細胞でＲＥＶ－ＥＲＢα ｋｎｏｃｋｄｏｗｎ
ＲＥＶ－ＥＲＢα ｋｎｏｃｋｄｏｗｎされた小膠細胞を製造するために、ｓｈＮｒ１ｄ１（２２７４７）をＡｄｄｇｅｎｅで購入した。レンチウイルスは伝達ベクター（ＰＬＫＯ．１－ｓｈＮｒ１ｄ１）、包装ベクター（ｐｓＰＡＸ２、Ａｄｄｇｅｎｅ）、およびＶＳＶ－Ｇ外皮発現ベクター（ＰＭ２）を使用して生成した。各ベクターをＨＥＫ２９３Ｔ細胞にｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎし、３日後に上澄み液を採取しウイルス収得のために２時間Ｏｐｔｉｍａ ＸＰＮ－１００（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いて２５，０００ｘｇで高速遠心分離した。前記準備したレンチウイルスを、前記一次培養した小膠細胞に臭化ヘキサジメトリン（８μｇ／ｍＬ）と共に処理した。レンチウイルス伝達効率を推定するために７２時間後に蛍光顕微鏡を使用してｅＧＦＰ発現をモニターした。

【0137】

前記実施例５－１と同様に、野生型マウスに由来した一次培養小膠細胞を得て試験に使用した。前記野生型マウスから得られた小膠細胞に前記の方法を用いてレンチウイルスを通じてｓｈＮｒ１ｄ１を発現させてＲＥＶ－ＥＲＢα ｋｎｏｃｋｄｏｗｎを誘導した。

【0138】

図９ａは、野生型マウスで一次培養した野生型小膠細胞でＲＥＶ－ＥＲＢα ｋｎｏｃｋｄｏｗｎがＲＥＶ－ＥＲＢαタンパク質量を減少させたのを、前記実施例７のようにウェスタンブロット法を用いて確認した。

【0139】

図９ｂは、正常野生型小膠細胞とＲＥＶ－ＥＲＢα ｋｎｏｃｋｄｏｗｎした野生型小膠細胞を培養液にＬＰＳ（１μｇ／ｍＬ）を１２時間処理して炎症性サイトカインＩＬ－６、ＣＸＣＬ１、ＣＣＬ２、ＣＣＬ５とＴＮＦ－αの生成を前記実施例５のような方法でＥＬＳＩＡを用いて施行し、Ｐｓｅｎ２変異アルツハイマー疾病マウスモデル由来小膠細胞にＬＰＳ処理した結果のようにＴＮＦ－αを除いたＩＬ－６、ＣＸＣＬ１、ＣＣＬ２、ＣＣＬ５の生成をさらに増加させるということを示す。

【0140】

図９ｃは、野生型マウスに由来した小膠細胞とＲＥＶ－ＥＲＢα ｋｎｏｃｋｄｏｗｎした野生型マウスに由来した小膠細胞を培養液にＬＰＳ（１μｇ／ｍＬ）を１２時間処理して炎症性サイトカインＩＬ－６、ＣＸＣＬ１、ＣＣＬ２、ＣＣＬ５とＴＮＦ－αのｍＲＮＡ発現を前記実施例５のｑＲＴ－ＰＣＲで分析した。前記分析結果、Ｐｓｅｎ２変異アルツハイマー疾病マウスモデル由来小膠細胞にＬＰＳ処理した結果のように、野生型マウスに由来した小膠細胞でもＴＮＦ－αを除いたＩＬ－６、ＣＸＣＬ１、ＣＣＬ２、ＣＣＬ５のｍＲＮＡ発現をさらに増加させるということを確認した。

【0141】

９－２：Ｐｓｅｎ２変異アルツハイマー疾病マウスモデル由来小膠細胞でＲＥＶ－ＥＲＢαを過発現
ＲＥＶ－ＥＲＢαを過発現する小膠細胞を製造するために、人間ＮＲ１Ｄ１ ｃＤＮＡをレンチウイルスを生成するためのＰＬＪＭ１－ＥＧＦＰベクターに挿入した。レンチウイルスは伝達ベクター（ＰＬＪＭ１－ＮＲ１Ｄ１－ＥＧＦＰ）、包装ベクター（ｐｓＰＡＸ２、Ａｄｄｇｅｎｅ）、およびＶＳＶ－Ｇ外皮発現ベクター（ＰＭ２）を使用して生成した。その後の方法は前記実施例９－１のような方法で行った。

【0142】

前記実施例５－１と同様にＰｓｅｎ２変異アルツハイマー疾病マウスに由来した一次培養小膠細胞を得て試験に使用した。前記Ｐｓｅｎ２変異一次培養小膠細胞に実施例９－１の方法を用いてレンチウイルスを通じてＮＲ１Ｄ１を過発現させた。

【0143】

図９ｄは、Ｐｓｅｎ２変異アルツハイマー疾病マウスで一次培養した小膠細胞でＲＥＶ－ＥＲＢα過発現がＲＥＶ－ＥＲＢαタンパク質量を増加させたのを前記実施例７のようにウェスタンブロット法を用いて確認した。

【0144】

図９ｅは、Ｐｓｅｎ２ Ｎ１４１Ｉ変異アルツハイマー疾病マウスに由来した小膠細胞とＲＥＶ－ＥＲＢα過発現したＰｓｅｎ２ Ｎ１４１Ｉ変異アルツハイマー疾病マウスに由来した小膠細胞の培養液にＬＰＳ（１μｇ／ｍＬ）を１２時間処理して炎症性サイトカインＩＬ－６、ＣＸＣＬ１、ＣＣＬ２、ＣＣＬ５とＴＮＦ－αのタンパク質生成を実施例５のＥＬＳＩＡ方法で確認した。その結果、Ｐｓｅｎ２ Ｎ１４１Ｉ変異アルツハイマー疾病マウスに由来した小膠細胞は、野生型マウス由来小膠細胞にＬＰＳ処理した結果のようにＴＮＦ－αを除いたＩＬ－６、ＣＸＣＬ１、ＣＣＬ２、ＣＣＬ５の生成が顕著に減少することを確認した。

【0145】

図９ｆは、Ｐｓｅｎ２ Ｎ１４１Ｉ変異アルツハイマー疾病マウス由来小膠細胞とＲＥＶ－ＥＲＢα過発現したＰｓｅｎ２ Ｎ１４１Ｉ変異小膠細胞の培養液にＬＰＳ（１μｇ／ｍＬ）を１２時間処理して炎症性サイトカインＩＬ－６、ＣＸＣＬ１、ＣＣＬ２、ＣＣＬ５とＴＮＦ－αのｍＲＮＡ発現を、実施例５のｑＲＴ－ＰＣＲ方法で分析した。その結果、Ｐｓｅｎ２ Ｎ１４１Ｉ変異アルツハイマー疾病マウスに由来した小膠細胞は、野生型マウス由来小膠細胞にＬＰＳ処理した結果のようにＴＮＦ－αを除いたＩＬ－６、ＣＸＣＬ１、ＣＣＬ２、ＣＣＬ５のｍＲＮＡ発現が顕著に減少することを確認した。

【0146】

これによって、Ｐｓｅｎ２変異アルツハイマー疾病マウス由来小膠細胞でＲＥＶ－ＥＲＢαの発現低下が、疾病マウス由来小膠細胞の概日時計性サイトカイン過発現の原因であるのが分かる。

【0147】

実施例１０：５ｘＦＡＤアルツハイマー疾病動物の比較を通じたＰｓｅｎ２家族性アルツハイマー疾患の特性分析
１０－１：５ｘＦＡＤマウスモデル
アルツハイマー病研究に用いられる動物モデルのうちの一つであって、総５個のＡＤ関連突然変異があるＡＰＰおよびＰＳＥＮ１遺伝子（ＡＰＰ；Ｓｗｅｄｉｓｈ（Ｋ６７０Ｎ／Ｍ６７１Ｌ）、Ｆｌｏｒｉｄａ（Ｉ７１６Ｖ）、ａｎｄ Ｌｏｎｄｏｎ（Ｖ７１７Ｉ） ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ａｎｄ ＰＳＥＮ１；Ｍ１４６Ｌ ａｎｄ Ｌ２８６Ｖ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ）を発現する５ＸＦＡＤマウスモデルを用いた。Ｔｈｙ１（ｍａｔｕｒｅニューロン特異的標識）プロモーターによってＡＰＰおよびＰＳＥＮ１突然変異遺伝子が発現され、半接合マウスでも深刻なアミロイド病理と行動欠乏を示す。（Ｊａｗｈａｒ Ｓ． ｅｔ ａｌ． “Ｍｏｔｏｒ ｄｅｆｉｃｉｔｓ， ｎｅｕｒｏｎ ｌｏｓｓ， ａｎｄ ｒｅｄｕｃｅｄ ａｎｘｉｅｔｙ ｃｏｉｎｃｉｄｉｎｇ ｗｉｔｈ ａｘｏｎａｌ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｎｔｒａｎｅｕｒｏｎａｌ Ａβ ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ５ＸＦＡＤ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ ｏｆ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ．” Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ａｇｉｎｇ １９６． ｅ２９－４０（２０１２））

【0148】

１０－２：Ｐｓｅｎ２家族性アルツハイマーの特性
前記実施例５－１と同様に、野生型マウスと５ｘＦＡＤアルツハイマーマウスモデルに由来した一次培養した小膠細胞を得て試験に使用した。前記野生型マウスと５ｘＦＡＤアルツハイマーマウスモデルで得られた小膠細胞に前記実施例７のように表１３のＮｒ１ｄ１プライマーを用いたｑＲＴ－ＰＣＲ方法を用いてＮｒ１ｄ１ ｍＲＮＡ発現量を比較した。下記表１７は、野生型マウスと５ｘＦＡＤアルツハイマーマウスモデルに由来した一次培養した小膠細胞のＮｒ１ｄ１ ｍＲＮＡ発現量に対する平均値（ｍｅａｎ±ＳＥＭ）を示したものである。

【0149】

【表17】

【0150】

また、実施例２のように、野生型マウスと５ｘＦＡＤアルツハイマー疾病マウスの頬から血液を抽出して遠心分離を通じて血清を得てＥＬＩＳＡ方法を用いて炎症サイトカイン生成量を測定した。下記表１８は、野生型マウスと５ｘＦＡＤアルツハイマーマウスモデルに由来した一次培養した小膠細胞の炎症サイトカインＩＬ－６、ＴＮＦ－αの生成に対する平均値（ｍｅａｎ±ＳＥＭ）を示したものである。

【0151】

【表18】

【0152】

図１０ａは、野生型マウスと５ｘＦＡＤアルツハイマーマウスモデルで一次培養した小膠細胞でＮｒ１ｄ１ ｍＲＮＡ発現水準が野生型マウスの小膠細胞と同一であるのを確認した。図１０ｂは、野生型マウスと５ｘＦＡＤアルツハイマーマウスで炎症性サイトカインＩＬ－６とＴＮＦ－αタンパク質の血中濃度は差がないのを示す結果である。５ｘＦＡＤマウスはＡＰＰおよびＰＳＥＮ１遺伝子変異を発現するマウスモデルであって、この結果はＲＥＶ－ＥＲＢα発現低下による過度な免疫反応がＰｓｅｎ２ Ｎ１４１Ｉ家族性アルツハイマーの特性であり得るのを提示する。

【0153】

実施例１１：疾患動物モデルの生体内概日時計性サイトカインの発現と記憶力回復に対する薬物の効果比較
１１－１：ＬＰＳによる疾患動物モデルの炎症誘発に対する薬物の効果
実施例１で得られた野生型およびＰｓｅｎ２変異アルツハイマー疾病マウスに１４：００時にクロルプロマジン（０．２５ｍｇ／体重ｋｇ）を腹腔注入し免疫反応活性化のために前記実施例２のように野生型マウスでは炎症反応を起こさない低濃度のＬＰＳ（０．３５μｇ／ｋｇ）を１８：００時に野生型およびＰｓｅｎ２変異アルツハイマー疾病マウスに腹腔注入し（Ｚｅｉｔｇｅｂｅｒ時間１１：００、０７：００に点灯）２０時間後に炎症反応および記憶行動をモニタリングした。この実験でのクロルプロマジン濃度（０．２５ｍｇ／体重ｋｇ）は既存の知られたクロルプロマジンの用途である抗精神病に使用される濃度（２５ｍｇ／回、３回／日）より数十倍～数百倍低い濃度である。上記の内容に対する概略図を図１１ａに開示した。

【0154】

図１１ａの概略図のように実験を行った後、ＬＰＳを腹腔注入した野生型およびＰｓｅｎ２ Ｎ１４１Ｉ ＫＩ／＋アルツハイマー疾病マウスでクロルプロマジン注入有無による炎症反応程度を前記実施例２のように血清でＥＬＩＳＡ方法で概日時計性サイトカイン（ＩＬ－６、ＣＸＣＬ１、ＣＣＬ２、ＣＣＬ５）のタンパク質生成量を分析して確認した。下記表１９は野生型およびＰｓｅｎ２変異アルツハイマー疾病マウスの血清で測定した概日時計性炎症サイトカインの生成量に対する平均値（ｍｅａｎ±ＳＥＭ）を示したものである。

【0155】

【表19】

【0156】

表１９および図１１ｂに示したように、野生型マウスでは炎症反応を起こさない低濃度のＬＰＳ（０．３５μｇ／ｋｇ）を注入したグループ３７と３８ではクロルプロマジンの注入は概日時計性サイトカイン生成抑制に影響を与えなかった。反面、グループ３９のようにＰｓｅｎ２変異アルツハイマー疾病マウスでは低濃度のＬＰＳが概日時計性サイトカインの過発現を誘導し、クロルプロマジンを注入したＰｓｅｎ２変異アルツハイマーマウス（グループ４０）では生成を顕著に抑制するのを示している。

【0157】

１１－２：ＬＰＳによる疾患動物モデルの炎症誘発による記憶力減退に対する薬物の効果
ＬＰＳによって疾患動物モデルで誘導された炎症反応が記憶力減退を起こし、クロルプロマジンの注入がそれを回復するか確認した。前記実施例４のように記憶力行動能力測定のためにＹ－ｍａｚｅを施行した。下記表２０は、野生型およびＰｓｅｎ２変異アルツハイマー疾病マウスでＬＰＳ腹腔注入による記憶力減退に対してクロルプロマジンの影響に対するＹ－ｍａｚｅ測定値（ｍｅａｎ±ＳＥＭ）を示したものである。

【0158】

【表20】

【0159】

その結果、図１１ｃに示したように、Ｙ－ｍａｚｅでアーム交代は何らの薬物処理もしていない野生型グループ４１と比較してクロルプロマジンのみを注入した野生型マウス（グループ４２）やＬＰＳのみを注入した野生型マウス（グループ４３）、そしてＬＳＰとクロルプロマジンを共に注入したマウス（グループ４４）が全て正常的な記憶能力を示した。また、何らの薬物処理もしていないグループ４５のＰｓｅｎ２変異アルツハイマーマウス（７匹）とグループ４６のクロルプロマジンのみを注入したＰｓｅｎ２変異アルツハイマーマウス（７匹）も記憶能力の差がない。反面、グループ４７のＬＰＳを注入したＰｓｅｎ２変異アルツハイマー疾病マウス（９匹）は記憶力の減退が顕著に示され、グループ４８のクロルプロマジンを注入したＰｓｅｎ２変異アルツハイマー疾病マウスはクロルプロマジン注入がＬＰＳによって誘導された記憶能力低下が十分に回復することを示している。

【0160】

図１１ｄは、アームエントリー総数は全てのグループで同一なので正常的な運動機能を示すことを示す。

【0161】

前記の結果、Ｐｓｅｎ２ Ｎ１４１Ｉアルツハイマー疾病マウスにクロルプロマジンの生体内注入は疾患マウスの神経炎症過発現と記憶力減退を十分に回復させることができるのを示している。

【図1a】

【図1b】

【図2a】

【図2b】

【図2c】

【図3a】

【図3b】

【図3c】

【図4a】

【図4b】

【図4c】

【図4d】

【図5a】

【図5b】

【図5c】

【図6】

【図7a】

【図7b】

【図8a】

【図8b】

【図9a】

【図9b】

【図9c】

【図9d】

【図9e】

【図9f】

【図10a】

【図10b】

【図11a】

【図11b】

【図11c】

【図11d】

【図12】

【配列表】

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【国際調査報告】