特表 2023-549287 核酸検出及び疾患診断のための、質量分析に基づく方法及びキット

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-11-22

(54)【発明の名称】核酸検出及び疾患診断のための、質量分析に基づく方法及びキット

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/10 20060101AFI20231115BHJP

   C12Q 1/6872 20180101ALI20231115BHJP

   C12Q 1/6853 20180101ALI20231115BHJP

   C12N 15/11 20060101ALN20231115BHJP

【ＦＩ】

C12N15/10 110Z

C12Q1/6872 Z

C12N15/10 112Z

C12Q1/6853 Z

C12N15/11 Z ZNA

【審査請求】未請求

【予備審査請求】有

(21)【出願番号】P 2023548980

(86)(22)【出願日】2021-10-26

(85)【翻訳文提出日】2023-05-01

(86)【国際出願番号】 CA2021051510

(87)【国際公開番号】W WO2022087730

(87)【国際公開日】2022-05-05

(31)【優先権主張番号】63/105,554

(32)【優先日】2020-10-26

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＢＲＩＪ

２．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】523152514

【氏名又は名称】ワイワイゼット ファーマテック インコーポレイティド

(74)【代理人】

【識別番号】100099759

【弁理士】

【氏名又は名称】青木 篤

(74)【代理人】

【識別番号】100123582

【弁理士】

【氏名又は名称】三橋 真二

(74)【代理人】

【識別番号】100117019

【弁理士】

【氏名又は名称】渡辺 陽一

(74)【代理人】

【識別番号】100141977

【弁理士】

【氏名又は名称】中島 勝

(74)【代理人】

【識別番号】100138210

【弁理士】

【氏名又は名称】池田 達則

(74)【代理人】

【識別番号】100134784

【弁理士】

【氏名又は名称】中村 和美

(72)【発明者】

【氏名】ジョン ジー．マーシャル

(72)【発明者】

【氏名】ミン ミャオ

【テーマコード（参考）】

4B063

【Ｆターム（参考）】

4B063QA01

4B063QA18

4B063QQ42

4B063QQ52

4B063QR08

4B063QR56

4B063QR62

4B063QS25

4B063QS34

4B063QS36

4B063QX02

(57)【要約】

本開示は、質量分析を使用して核酸を検出する方法に関する。本開示は更に、試料中の標的核酸分子の存在を検出することによって、ＨＩＶ及びＣＯＶＩＤ－１９などの疾患の核酸を検出及び／又は診断する方法に関する。本開示はまた、ＨＩＶ及びＣＯＶＩＤ－１９などの疾患の核酸の検出及び核酸の検出及び／又は診断のためのキットに関する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

標的核酸分子を検出する方法であって、
ａ．
ｉ．前記標的核酸分子を含むと推定される試料を、前記標的核酸分子に相補的な配列を含み、かつ固相に付着している捕捉オリゴヌクレオチドプローブと共に、第１の結合溶液中で、インキュベートすることであって、任意選択的に、前記固相がリンカーを介して前記捕捉オリゴヌクレオチドプローブに付着している、インキュベートすること、又は
ｉｉ．前記標的核酸分子を含むと推定される試料を、前記固相と共にインキュベートして、第１の結合溶液中で、前記試料／標的核酸分子を前記固相に付着させることであって、任意選択的に、前記固相がリンカーを介して前記試料／標的核酸分子に付着している、インキュベートすることと、
ｂ．標的：検出複合体を形成するための条件下で、第２の結合溶液中で、任意の標的核酸分子を検出オリゴヌクレオチドプローブに結合させることと、
ｃ．標的：検出：酵素複合体を形成するための条件下で、第３の結合溶液中で、任意の標的：検出複合体をレポーター酵素検出プローブと共にインキュベートすることと、
ｄ．洗浄溶液で前記固相を洗浄して、任意の未結合のレポーター酵素検出プローブを除去することと、
ｅ．基質反応溶液中で、任意の標的：検出：酵素複合体を、レポーター酵素検出プローブ基質と共にインキュベートして、１つ以上のイオン化可能な生成物を生成することと、
ｆ．質量分析（ＭＳ）を使用して、前記１つ以上のイオン化可能な生成物のうちの少なくとも１つを検出することと、を含み、
ｉ．前記第１の結合溶液、前記第２の結合溶液、及び前記第３の結合溶液のうちの少なくとも前記第３の結合溶液が、無機塩を実質的に含まず、
ｉｉ．前記洗浄溶液が、無機塩を実質的に含まず、
ｉｉｉ．前記方法が、任意の標的：検出：酵素複合体の成分と、捕捉オリゴヌクレオチドプローブとを、任意選択的なステップｄ）及びステップｅ）の前に、架橋することを更に含み、かつ／又は
ｉｖ．前記方法が、ＭＳを使用して検出する前に、前記１つ以上のイオン化可能な生成物を分離することを更に含み、
前記１つ以上のイオン化可能な生成物のうちの前記少なくとも１つの検出が、前記試料が前記標的核酸分子を含むことを示す、方法。

【請求項2】

前記第２の結合溶液、前記第３の結合溶液及び前記基質反応溶液が、トリス緩衝液を各々含む、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記捕捉オリゴヌクレオチドプローブが、任意選択的に前記固相への非共有結合若しくは共有結合によって前記固相に直接固定化されるか、又は前記検出オリゴヌクレオチドプローブが、検出オリゴヌクレオチドプライマーであり、前記ステップが、増幅溶液中で、検出オリゴヌクレオチドプライマーを用いて前記標的核酸分子を増幅することと、標的：検出複合体を形成するための条件下で、前記第２の結合溶液中で、任意の増幅された標的を前記検出オリゴヌクレオチドプローブに結合させることとを含む、請求項１又は２に記載の方法。

【請求項4】

前記方法が、ＭＳを使用する検出の前に前記１つ以上のイオン化可能な生成物を分離することを含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項5】

前記分離が、液体クロマトグラフィーによるものである、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項6】

前記液体クロマトグラフィーが、順相クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、及び高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）から選択される、請求項５に記載の方法。

【請求項7】

前記液体クロマトグラフィーが、アイソクラチックである、請求項６に記載の方法。

【請求項8】

ＭＳを使用して前記１つ以上のイオン化可能な生成物を検出する前記ステップが、任意選択的にエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）、ＭＡＬＤＩ、化学イオン化、電子衝撃、レーザー脱離、電気イオン化、又は熱イオン化によって前記１つ以上のイオン化可能な生成物をイオン化して１つ以上の生成物イオンを生成することと、前記１つ以上の生成物イオンを、ＭＳ、任意選択的にタンデムＭＳ（ＭＳ／ＭＳ）に供することとを含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項9】

前記イオン化が、正イオン化又は負イオン化である、請求項８に記載の方法。

【請求項10】

前記生成された１つ以上の生成物イオンが、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、又は少なくとも１０である選択されたシグナル対ノイズ比を有する、請求項８又は９に記載の方法。

【請求項11】

前記ＭＳが、エレクトロスプレーイオン化タンデムＭＳ（ＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳ）、マトリックス支援レーザー脱着／イオン化飛行時間型（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ）、タンデムＭＳ（ＭＳ／ＭＳ）、複数ラウンドのフラグメンテーションＭＳＮ、ＭＡＬＤＩ、エレクトロスプレー、ナノスプレー、表面イオン化、レーザー脱着及びイオン化、大気イオン化、真空イオン化、並びにキャピラリー電気泳動、超音波又は音波又は振動、ナノ液滴又はマイクロ液滴試料導入システムを備えたＭＳから選択される、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項12】

ＭＳを使用して検出することが、単一イオンモニタリング（ＳＩＭ）による生成物イオン強度及び／又は単一試薬モニタリング（ＳＲＭ）による生成物イオン親からフラグメントへの遷移を記録することを含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項13】

前記捕捉オリゴヌクレオチドプローブが、少なくとも２５ヌクレオチド長、少なくとも３５ヌクレオチド長である前記標的核酸分子の一部に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドを含み、任意選択的に、前記捕捉オリゴヌクレオチドプローブが、約３０ヌクレオチド～約６０ヌクレオチド長、又は約４０ヌクレオチド～約５５ヌクレオチド長である前記標的核酸分子の配列の一部に相補的な配列を有する、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項14】

前記検出オリゴヌクレオチドプローブが、ビオチン、ＡＬＦＡ－タグ、Ａｖｉタグ、Ｃ－タグ、カルモジュリン－タグ、ポリグルタミン酸タグ、Ｅ－タグ、Ｆｌａｇ－タグ、ＨＡ－タグ、Ｈｉｓ－タグ、ｍｙｃ－タグ、ＮＥ－タグ、Ｒｈｏ１Ｄ４－タグ、Ｓ－タグ、ＳＢＰ－タグ、Ｓｏｆタグ１、Ｓｏｆタグ３、Ｓｐｏｔ－タグ、Ｓｔｒｅｐｔ－タグ、Ｔ７－タグ、ＴＣ－タグ、Ｔｙ１タグ、Ｖ５タグ、ＶＳＶ－タグ、Ｘｐｒｅｓｓタグ、Ｉｓｏｐｅｐタグ、Ｓｐｙタグ、Ｓｎｏｏｐタグ、Ｄｏｇタグ、Ｓｄｙタグ、ビオチンカルボキシルキャリアタンパク質、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼタス、ＧＦＰタグ、Ｈａｌｏタグ、ＳＮＡＰ－タグ、ＣＬＩＰ－タグ、ＨＵＨ－タグ、マルトース結合タンパク質タグ、Ｎｕｓ－タグ、チオレドキシン－タグ、Ｆｃ－タグ、及びＣＲＤＳＡＴ－タグから選択される二次標的部分を含み、任意選択的に、前記二次標的部分がビオチンである、請求項１３に記載の方法。

【請求項15】

前記標的核酸分子の他の部分に相補的な前記検出オリゴヌクレオチドプローブの前記オリゴヌクレオチドの前記配列が、少なくとも２５ヌクレオチド長、少なくとも３５ヌクレオチド長であり、任意選択的に、検出オリゴヌクレオチドプローブが、約３０ヌクレオチド～約６０ヌクレオチド長、又は約４０ヌクレオチド～約５５ヌクレオチド長である、請求項１４に記載の方法。

【請求項16】

前記捕捉オリゴヌクレオチドプローブ及び前記検出オリゴヌクレオチドプローブが、両方、非重複領域で前記標的核酸分子に結合することができ、任意選択的に、前記非重複領域が隣接し、任意選択的に、前記非重複領域が少なくとも１ヌクレオチド離れ、任意選択的に、前記非重複領域が少なくとも５ヌクレオチド離れ、任意選択的に、前記非重複領域が約２ヌクレオチド、約５ヌクレオチド、約１０ヌクレオチド、約２０ヌクレオチド、又は約２５ヌクレオチド離れている、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項17】

前記レポーター酵素検出プローブが、レポーター酵素及び任意選択的に二次標的結合部分を含み、前記二次標的結合部分が、前記レポーター酵素に共有結合している、請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項18】

前記二次標的結合部分が、前記検出オリゴヌクレオチドプローブの前記二次標的部分に結合し、アビジン、ストレプトアビジン、カルモジュリン、陰イオン交換樹脂、Ｍｏｎｏ－Ｑ、陽イオン交換樹脂、抗Ｅ－タグ抗体、抗ＦＬＡＧ－タグ抗体、抗ＨＡ－タグ抗体、ニッケル又はコバルトキレート、抗Ｍｙｃ－タグ抗体、抗ＮＥ－タグ抗体、抗Ｒｈｏ１Ｄ４－タグ抗体、抗Ｓ－タグ抗体、抗Ｓｏｆタグ１抗体、抗Ｓｏｆタグ３抗体、ナノボディ、ストレプタクチン、抗Ｔ７－タグ抗体、ＦＩＡｓＨ二ヒ素化合物、ＲｅＡｓＨ二ヒ素化合物、抗Ｔｙ１タグ抗体、抗Ｖ５タグ抗体、抗ＶＳＶタグ抗体、抗Ｘｐｒｅｓｓタグ抗体、ピリン－Ｃタンパク質、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒタンパク質、ＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒタンパク質、ＳｎｏｏｐタグＪｒタンパク質、ＳｄｙＣａｔｃｈｅｒタンパク質、グルタチオン、ＧＦＰ抗体、ハロアルカン基質、ベンジルグアニン誘導体、ベンジルシトシン誘導体、ＨＵＨ特異的ＤＮＡ配列、アミロースアガロース、Ｎｕｓ－タグ抗体、抗チオレドキシン－タグ抗体、プロテイン－Ａセファロース、ラクトース、アガロースから選択され、任意選択的に、前記二次標的結合部分が、前記二次標的部分がビオチンであるとき、アビジン及びストレプトアビジンから選択される、請求項１７に記載の方法。

【請求項19】

前記レポーター酵素が、ホスファターゼ、任意選択的にアルカリホスファターゼ、リアーゼ、ヒドロラーゼ、シンターゼ、シンテターゼ、オキシドレダクターゼ、デヒドロゲナーゼ、オキシダーゼ、トランスフェラーゼ、イソメラーゼ、リガーゼ、プロテアーゼ、例えばトリプシン、プロテイナーゼ、ペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、ミエロペルオキシダーゼ、オキシダーゼ、モノオキシゲナーゼ、シトクロム、デカルボキシラーゼ、リパーゼ、カスパーゼ、アミラーゼ、ペプチダーゼ、トランスアミナーゼ、キナーゼ、ＤＮＡ又はＲＮＡポリメラーゼ、任意選択的にＴＡＱ、制限酵素、クレノーフラグメント、及びＤＮＡリガーゼから選択される、請求項１７又は１８に記載の方法。

【請求項20】

前記レポーター酵素が、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、トリプシン、シトクロムＣモノオキシゲナーゼ、及びミエロペルオキシダーゼから選択され、任意選択的に、前記レポーター酵素が、アルカリホスファターゼ又は西洋ワサビペルオキシダーゼである、請求項１９に記載の方法。

【請求項21】

前記１つ以上のイオン化可能な生成物が、ＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳ又はＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ下で容易にイオン化可能であり、高いシグナル対ノイズ比によって特徴付けられる生成物イオンを生成し、前記基質が、任意選択的に、
ａ．前記酵素がアルカリホスファターゼ（ＡＰ）であるとき、リン酸化ヌクレオシド、任意選択的にＡＭＰ若しくはＣＭＰ、又はヌクレオチド、任意選択的にＡＴＰ若しくはＣＴＰ、リン酸化アルカロイド、リン酸化アミノ酸、リン酸化アミノ酸ポリマー、及びリン酸化代謝生成物、
ｂ．前記レポーター酵素が西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）であるとき、フェノール、アミン、任意選択的にフェノールアミン、芳香族化合物、オレフィンハロゲン化物、ルミノール、ピロガロール、２，２’－アジノ－ビス（３－エチルベンゾチアゾリン－６－スルホン酸（ＡＢＴＳ）、及びＡｍｐｌｅｘ（登録商標）Ｒｅｄから選択される化合物、あるいは
ｃ．オピエート、洗剤、染料前駆体、アルコール、及びマトリックス、から選択される、請求項１～２０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項22】

前記レポーター酵素検出プローブ基質が、ピリドキサミン－５－リン酸（ＰＡ５Ｐ）、ｐ－ニトロフェニルホスフェート（ＰＮＰＰ）、Ａｍｐｌｅｘ（登録商標）Ｒｅｄ（ＡＲ）、ナフトールＡＳＭＸホスフェート、ルミノール、Ｌｕｍｉｇｅｎ（登録商標）ＴＭＡ３、Ｌｕｍｉｇｅｎ（登録商標）ＴＭＡ６、スフィンゴシン、４ＭＵＰ、Ｌ－（＋）－２－アミノ－６－ホスホノヘキサン酸、５－ブロモ－４－クロロ－３－インドリルホスフェート（ＢＣＩＰ）、ＢｌｕｅＰｈｏｓ（登録商標）、フェニルベンゼンωホスホノ－α－アミノ酸、Ｏ－ホスホ－ＤＬ－スレオニン、アデノシンモノホスフェート（ＡＭＰ）、ＡＲ（３－アミノ－９－エチルカルバゾール）、４－ＣＮ（４－クロロ－１－ナフトール）、ＤＡＢ（３，３’－ジアミノベンジミジン）、ＯＰＤ（ｏ－フェニレンジアミン）、ＴＭＢ（３，３’’，５，５’’－テトラメチルベンジジン）、ｐＮＰＰ（ｐ－ニトロフェニルホスフェート）、ＮＢＴ（ニトロブルーテトラゾリウム）、ＩＮＴ（ｐ－インドニトロテトラゾリウム）、ＭＵＰ（４－メチルウンベリフェリルホスフェート）、及びＦＤＰ（フルオレセインジホスフェート）、ピロガロールから選択される、請求項２１に記載の方法。

【請求項23】

前記レポーター酵素検出プローブ基質が、
ａ．前記レポーター酵素検出プローブがＨＲＰを含むとき、ＡＲ、ルミノール、Ｌｕｍｉｇｅｎ（登録商標）ＴＭＡ３、及びＬｕｍｉｇｅｎ（登録商標）ＴＭＡ６、又は
ｂ．前記レポーター酵素検出プローブがＡＰを含むとき、ナフトールＡＳＭＸホスフェート、及びＰＮＰＰ、から選択される、請求項２２に記載の方法。

【請求項24】

前記第１の結合溶液、前記第２の溶液、前記第３の結合溶液、及び／又は前記洗浄溶液が無機塩を実質的に含まないとき、前記第１の結合溶液、前記第２の溶液、前記第３の結合溶液、及び／又は前記洗浄溶液が各々独立して、エタノールアミン、重炭酸アンモニウム、ギ酸アンモニウム、ギ酸ピリジニウム、トリアルキルアンモニウム／ギ酸、酢酸アンモニウム、重炭酸トリアルキルアンモニウム、Ｎ－エチルモルホリン／アセテート、酢酸トリアルキルアンモニウム、又はそれらの組み合わせから選択される揮発性緩衝液を含む揮発性溶液である、請求項１～２３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項25】

前記揮発性緩衝液が、エタノールアミン、酢酸アンモニウム、重炭酸トリアルキルアンモニウム、又はそれらの組み合わせから選択される、請求項２４に記載の方法。

【請求項26】

前記トリアルキルアンモニウムが、トリメチルアンモニウム、トリエチルアンモニウム、又はそれらの組み合わせから選択される、請求項２４又は２５に記載の方法。

【請求項27】

前記揮発性緩衝液が、エタノールアミンである、請求項２４又は２５に記載の方法。

【請求項28】

前記第１の結合溶液、前記第２の結合溶液、前記第３の結合溶液、及び／又は前記洗浄溶液が無機塩を実質的に含まないとき、前記第１の結合溶液、前記第２の結合溶液、前記第３の結合溶液、及び／又は前記洗浄溶液が、各々独立してエタノールアミンを含み、任意選択的に前記第２の結合溶液及び前記第３の結合溶液が、各々エタノールアミンを含み、任意選択的に前記第１の結合溶液、前記第２の結合溶液、及び前記第３の結合溶液が、各々エタノールアミンを含み、任意選択的に前記洗浄溶液が、エタノールアミンを含む、請求項２４～２７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項29】

ステップａ）及びステップｂ）が、同時に行われ、ステップａ）の前記第１の結合溶液が、ステップｂ）の前記第２の結合溶液である、請求項１～２８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項30】

前記標的：検出複合体を前記レポーター酵素検出プローブとインキュベートする前に、前記固相を前記第２の結合溶液で洗浄することを更に含む、請求項１～２９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項31】

前記標的核酸分子を前記捕捉オリゴヌクレオチドプローブと共にインキュベートする前に、前記固相をブロッキング剤、任意選択的にウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で洗浄することを更に含む、請求項１～３０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項32】

前記第１の結合溶液、前記第２の結合溶液、前記第３の結合溶液、及び前記基質反応溶液が、各々独立して、約７～約１０、任意選択的に約７～約８、任意選択的に約８．８のｐＨを有する、請求項１～３１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項33】

前記基質反応溶液が、Ｎ－オクチルグルコシド、デオキシコレート、ラピゲスト、オクチル－ベータ－グルコピラノシド、オクチルグルコピラノシド、チャップ、ビッグチャップ、非イオン性酸不安定性界面活性剤、グルコシド、ｎ－オクチル－β－Ｄ－グルコピラノシド、ｎ－ノニル－β－Ｄ－グルコピラノシドチオグルコシド、ｎ－オクチル－β－Ｄ－チオグルコピラノシドマルトシド、ｎ－デシル－β－Ｄ－マルトピラノシド、ｎ－ドデシル－β－Ｄ－マルトピラノシド、ｎ－ウンデシル－β－Ｄ－マルトピラノシド、ｎ－トリデシル－β－Ｄ－マルトピラノシド、シマル－５、シマル－６、チオマルトシド、ｎ－ドデシル－β－Ｄ－チオマルトピラノシド、アルキルグリコシド、オクチルグルコースネオペンチルグリコール、ポリオキシエチレングリコール、トリトン、ＮＰ４０、ツイーン（商標）、ツイーン（商標）２０、トリトンＸ－１００、トリトンｘ－４５、Ｃ８Ｅ４、Ｃ８Ｅ５、Ｃ１０Ｅ５、Ｃ１２Ｅ８、Ｃ１２Ｅ９、Ｂｒｉｊ、Ａｎａｐｏｅ－５８、Ｂｒｉｊ－５８、及びそれらの組み合わせから任意選択的に選択される非イオン性非ポリマー洗剤を含む、請求項１～３２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項34】

前記基質がルミノールを含むとき、前記基質反応溶液が４－ヨードフェニルボロン酸を更に含む、請求項２３～３３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項35】

前記固相が、反応容器、任意選択的にビーズ、プレート、キャピラリー、フィルター、又はナノ／マイクロ／ミリウェル反応容器であり、前記表面が、紙、ニトロセルロース、アクリレート、プラスチック、ポリスチレン、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）、メラミン、シリカ、ポリリジン被覆ガラス、３－アミノプロピル－トリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）処理ガラス、及び３－アミノプロピル－トリメトキシシラン（ＡＰＴＭＳ）処理ガラスから選択される、請求項１～３４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項36】

前記捕捉オリゴヌクレオチドプローブの前記固相への前記付着が、Ｈ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、Ｎ－オキシスクシンイミド（ＮＯＳ）、マレイミド、ヒドラジド、グルタルアルデヒドカップリング、又はＰＥＧ架橋を介するものである、請求項１～３５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項37】

前記標的：検出：酵素複合体が、７２時間未満、２４時間未満、１２時間未満、６０分未満、５０分未満、４０分未満、３０分未満、２０分未満、１５分未満、１０分未満、５分未満、２分未満、又は１分未満の期間、前記基質反応溶液中で、前記レポーター酵素検出プローブ基質と共にインキュベートされて、前記１つ以上のイオン化可能な生成物を生成する、請求項１～３６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項38】

前記生成物イオンが、最適化されたフラグメンテーションエネルギー及びｍ／ｚ範囲を使用して、ＳＩＭ及び／又はＳＲＭによってアッセイされる、請求項１２～３７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項39】

前記基質が、ＡＭＰ、ＡＤＰ若しくはＡＴＰであり、生成された１つ若しくは前記イオン化可能な生成物が、アデノシンを含み、その生成物イオンが、２６８ｍ／ｚにおけるＳＩＭによってアッセイされるか、又は、前記基質がＣＭＰ、ＣＤＰ若しくはＣＴＰであり、生成された１つ若しくは前記イオン化可能な生成物が、シトシンを含み、その生成物イオンが、２８３ｍ／ｚにおけるＳＩＭによってアッセイされるか、又は、前記基質がＡＲであり、生成された前記１つ以上のイオン化可能な生成物のうちの１つが、レゾルフィンを含み、その生成物イオンが、２１４ｍ／ｚにおけるＳＩＭ及び２１４～１８６ｍ／ｚにおける主要な強いフラグメントを使用するＳＲＭによってアッセイされる、請求項２１に記載の方法。

【請求項40】

前記基質が、ナフトールＡＳＭＸホスフェートであり、生成された前記１つ以上のイオン化可能な生成物のうちの１つが、脱リン酸化ナフトールＡＳＭＸを含み、その生成物イオンが、２９２ｍ／ｚにおけるＳＩＭ及び２９２～１７１ｍ／ｚにおける主要な強いフラグメントを使用するＳＲＭによってアッセイされるか、又は前記基質が、ＰＡ５Ｐであり、生成された１つ若しくは前記イオン化可能な生成物が、ＰＡを含み、その生成物イオンが、１６９ｍ／ｚにおけるＳＩＭによってアッセイされる、請求項２２に記載の方法。

【請求項41】

前記イオン化可能な生成物が、イオン化溶液中で生成物イオンにイオン化される、請求項１～４０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項42】

前記第１の結合溶液、前記第２の結合溶液、及び前記第３の結合溶液のうちの少なくとも前記第３の結合溶液が、無機塩を実質的に含まず、請求項２４～２７のいずれか一項に記載の揮発性緩衝液を含む、請求項１～４１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項43】

前記方法が、前記固相を前記洗浄溶液で洗浄して、任意の未結合のレポーター酵素検出プローブを除去することを含み、前記洗浄溶液が、無機塩を実質的に含まず、請求項２４～２７のいずれか一項に記載の揮発性緩衝液を含む、請求項１～４１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項44】

任意の標的：検出：酵素複合体の前記成分及び前記捕捉オリゴヌクレオチドプローブが、任意選択的なステップｄ）及びステップｅ）の前に架橋され、前記架橋が、Ｈ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、Ｎ－オキシスクシンイミド（ＮＯＳ）、マレイミド、ヒドラジド、グルタルアルデヒドカップリング、スベリン酸ジスクシンイミジル（ＤＳＳ）架橋又はＰＥＧ架橋を介するものである、請求項１～４１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項45】

任意の標的：検出：酵素複合体の前記成分及び前記捕捉オリゴヌクレオチドプローブの前記架橋が、グルタルアルデヒドカップリング、ＤＳＳ架橋、又はＰＥＧ架橋を介するものである、請求項４３に記載の方法。

【請求項46】

試料中の標的核酸分子の量を定量化する方法であって、
ａ．請求項１～４５のいずれか一項に記載の方法に従って標的核酸分子を検出するステップと、
ｂ．質量分析によって検出された前記イオン化可能な生成物のうちの１つ以上についての前記シグナルの強度に基づいて、前記試料中の標的核酸分子の量を定量化するステップと、を含む、方法。

【請求項47】

前記定量化が、同様の条件下で、既知量の標的物質を使用して生成されたシグナル強度に対して、１つ以上の生成物についての前記シグナルの前記強度を比較することを含む、請求項４６に記載の方法。

【請求項48】

前記標的核酸分子が、ピコモル、フェムトモル、若しくはアトモルの範囲内で、又はそれらの範囲までで、前記試料中に存在するか、又は存在すると疑われる、請求項４６又は４７に記載の方法。

【請求項49】

前記標的核酸分子が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、並びにそれらの組み合わせ及び誘導体から選択される、請求項１～４８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項50】

前記試料が、生物学的試料、工業生成物、環境試料、又はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）反応生成物である、請求項４６～４９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項51】

前記生物学的試料が、血液試料、尿試料、糞便試料、滲出液、組織試料又は痰試料である、請求項５０に記載の方法。

【請求項52】

標的核酸分子を検出する方法であって、
修飾プライマー及び第２のプライマーを用いて、前記標的核酸分子を含むと推定される試験試料に対して、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）又はハイブリダイゼーション連鎖反応（ＨＣＲ）又はローリングサークル反応又は他の核酸反応などの核酸増幅を実施して、前記修飾プライマーを含む増幅された核酸生成物、任意選択的にＰＣＲ生成物を得ることであって、前記修飾プライマーが、二次標的部分又はレポーター酵素で官能化されている、実施することと、
前記増幅された核酸生成物を、任意の未反応修飾プライマーから分離することと、
前記修飾プライマーが、前記二次標的部分で官能化されているとき、前記増幅された核酸生成物を、第１の結合溶液中で、レポーター酵素検出プローブと共に、増幅された核酸生成物：レポーター酵素複合体を形成する条件下でインキュベートして、結合していないレポーター酵素検出プローブを洗浄溶液で除去することであって、前記レポーター酵素検出プローブが、二次標的結合部分及びレポーター酵素を含む、インキュベートすることと、
前記増幅された核酸生成物又は前記増幅された核酸生成物：レポーター酵素基質複合体を、基質反応溶液中で、レポーター酵素基質とインキュベートして、１つ以上のイオン化可能な生成物を生成することと、
質量分析（ＭＳ）を使用して、前記１つ以上のイオン化可能な生成物を検出することであって、
前記修飾プライマーがフォワードプライマーであるとき、前記第２のプライマーがリバースプライマーであり、前記修飾プライマーがリバースプライマーであるとき、前記第２のプライマーがフォワードプライマーである、検出することと、を含む、方法。

【請求項53】

前記第２のプライマーが固相に結合され、任意選択的に、前記第２のプライマーがリンカーを介して前記固相に結合される、請求項５２に記載の方法。

【請求項54】

前記第２のプライマーが、任意選択的に、前記固相への非共有結合又は共有結合によって、前記固相に直接結合されている、請求項５３に記載の方法。

【請求項55】

前記増幅された核酸生成物からの前記未反応修飾プライマーの分離が、遠心分離、濾過及び／又は溶媒洗浄によるものである、請求項５３又は５４に記載の方法。

【請求項56】

前記増幅された核酸生成物を前記レポーター酵素検出プローブと共にインキュベートする前に、前記修飾プライマーを含む前記増幅された核酸生成物を固相と共に第２の結合溶液中で、前記増幅された核酸生成物を前記固相上に結合させる条件下でインキュベートすることを更に含み、前記固相が、前記増幅された核酸生成物に相補的な配列を含む捕捉オリゴヌクレオチドプローブをその上に付着させており、任意選択的に、前記固相が、リンカーを介して捕捉オリゴヌクレオチドプローブに付着されている、請求項５２に記載の方法。

【請求項57】

前記捕捉オリゴヌクレオチドプローブが、任意選択的に、前記固相への非共有結合又は共有結合によって、前記固相に直接結合されている、請求項５６に記載の方法。

【請求項58】

前記第１の結合溶液及び／又は前記洗浄溶液が、揮発性であり、ＮａＣｌを実質的に含まない、請求項５２～５７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項59】

前記第２の結合溶液が、揮発性であり、ＮａＣｌを実質的に含まない、請求項５６又は５７に記載の方法。

【請求項60】

前記第１の結合溶液又は前記第２の結合溶液が、揮発性緩衝液を各々含む、請求項５８又は５９に記載の方法。

【請求項61】

前記揮発性緩衝液が、エタノールアミン、重炭酸アンモニウム、ギ酸アンモニウム、ギ酸ピリジニウム、トリアルキルアンモニウム／ギ酸、酢酸アンモニウム、重炭酸トリアルキルアンモニウム、Ｎ－エチルモルホリン／アセテート、酢酸トリアルキルアンモニウム、及びそれらの組み合わせから選択される、請求項６０に記載の方法。

【請求項62】

前記揮発性緩衝液が、エタノールアミン、酢酸アンモニウム、重炭酸トリアルキルアンモニウム、及びそれらの組み合わせから選択される、請求項６１に記載の方法。

【請求項63】

前記トリアルキルアンモニウムが、トリメチルアンモニウム、トリエチルアンモニウム、及びそれらの組み合わせから選択される、請求項６０又は６１に記載の方法。

【請求項64】

前記揮発性緩衝液が、エタノールアミンである、請求項６２又は６３に記載の方法。

【請求項65】

前記増幅された核酸生成物を前記固相に結合させる前に、ブロッキング剤、任意選択的にウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で前記固相を洗浄することを更に含む、請求項５６に記載の方法。

【請求項66】

前記第１の結合溶液又は前記第２の結合溶液が、各々独立して、約７～約１０、任意選択的に約７～約８、任意選択的に約８．８のｐＨを有する、請求項６０に記載の方法。

【請求項67】

前記増幅された核酸生成物：レポーター酵素複合体からの任意の未結合のレポーター酵素検出プローブを除去することが、遠心分離、濾過及び／又は溶媒洗浄によるものである、請求項５２～６６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項68】

ＭＳを使用する検出の前に、前記１つ以上のイオン化可能な生成物を分離することを更に含む、請求項５２～６７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項69】

前記分離が、液体クロマトグラフィー、任意選択的に順相クロマトグラフィー又は逆相クロマトグラフィーによるものであり、任意選択的にクロマトグラフィーがアイソクラチックである、請求項６８に記載の方法。

【請求項70】

前記液体クロマトグラフィーが、サイズ排除クロマトグラフィー、ゲル浸透クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、順相クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、電気泳動分離、キャピラリー電気泳動、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、及びそれらの組み合わせである、請求項６９に記載の方法。

【請求項71】

前記ＨＰＬＣが、ナノフロー液体クロマトグラフィーである、請求項７０に記載の方法。

【請求項72】

ＭＳを使用して前記１つ以上のイオン化可能な生成物を検出する前記ステップが、任意選択的にエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）、ＭＡＬＤＩ、化学イオン化、電子衝撃、レーザー脱離、電気イオン化、又は熱イオン化によって、前記１つ以上のイオン化可能な生成物をイオン化して、選択されたシグナル対ノイズ比を有する１つ以上の生成物イオンを生成することと、前記１つ以上の生成物イオンを、ＭＳ、任意選択的にタンデムＭＳ（ＭＳ／ＭＳ）に供することとを含む、請求項５２～７１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項73】

前記イオン化が、正イオン化又は負イオン化である、請求項７２に記載の方法。

【請求項74】

前記選択されたシグナル対ノイズ比が、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、又は少なくとも１０である、請求項７３に記載の方法。

【請求項75】

前記ＭＳが、エレクトロスプレーイオン化タンデムＭＳ（ＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳ）、マトリックス支援レーザー脱着／イオン化飛行時間型（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ）、タンデムＭＳ（ＭＳ／ＭＳ）、複数ラウンドのフラグメンテーションＭＳＮ、ＭＡＬＤＩ、エレクトロスプレー、ナノスプレー、表面イオン化、レーザー脱着及びイオン化、大気イオン化、真空イオン化、並びにキャピラリー電気泳動、超音波又は音波又は振動、ナノ液滴又はマイクロ液滴試料導入システムを備えたＭＳから選択される、請求項５２～７４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項76】

ＭＳを使用する検出が、単一イオンモニタリング（ＳＩＭ）による生成物イオン強度及び／又は単一試薬モニタリング（ＳＲＭ）による生成物イオン親からフラグメントへの遷移を記録することを含む、請求項５２～７５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項77】

前記二次標的部分が、ビオチン、ＡＬＦＡ－タグ、Ａｖｉタグ、Ｃ－タグ、カルモジュリン－タグ、ポリグルタミン酸タグ、Ｅ－タグ、Ｆｌａｇ－タグ、ＨＡ－タグ、Ｈｉｓ－タグ、ｍｙｃ－タグ、ＮＥ－タグ、Ｒｈｏ１Ｄ４－タグ、Ｓ－タグ、ＳＢＰ－タグ、Ｓｏｆタグ１、Ｓｏｆタグ３、Ｓｐｏｔ－タグ、Ｓｔｒｅｐｔ－タグ、Ｔ７－タグ、ＴＣ－タグ、Ｔｙ１タグ、Ｖ５タグ、ＶＳＶ－タグ、Ｘｐｒｅｓｓタグ、Ｉｓｏｐｅｐタグ、Ｓｐｙタグ、Ｓｎｏｏｐタグ、Ｄｏｇタグ、Ｓｄｙタグ、ビオチンカルボキシルキャリアタンパク質、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼタス、ＧＦＰタグ、Ｈａｌｏタグ、ＳＮＡＰ－タグ、ＣＬＩＰ－タグ、ＨＵＨ－タグ、マルトース結合タンパク質タグ、Ｎｕｓ－タグ、チオレドキシン－タグ、Ｆｃ－タグ、及びＣＲＤＳＡＴ－タグから選択され、任意選択的に、前記二次標的部分がビオチンである、請求項５２～７６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項78】

前記二次標的結合部分が、前記二次標的部分に結合し、アビジン、ストレプトアビジン、カルモジュリン、陰イオン交換樹脂、Ｍｏｎｏ－Ｑ、陽イオン交換樹脂、抗Ｅ－タグ抗体、抗ＦＬＡＧ－タグ抗体、抗ＨＡ－タグ抗体、ニッケル又はコバルトキレート、抗Ｍｙｃ－タグ抗体、抗ＮＥ－タグ抗体、抗Ｒｈｏ１Ｄ４－タグ抗体、抗Ｓ－タグ抗体、抗Ｓｏｆタグ１抗体、抗Ｓｏｆタグ３抗体、ナノボディ、ストレプタクチン、抗Ｔ７－タグ抗体、ＦＩＡｓＨ二ヒ素化合物、ＲｅＡｓＨ二ヒ素化合物、抗Ｔｙ１タグ抗体、抗Ｖ５タグ抗体、抗ＶＳＶタグ抗体、抗Ｘｐｒｅｓｓタグ抗体、ピリン－Ｃタンパク質、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒタンパク質、ＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒタンパク質、ＳｎｏｏｐタグＪｒタンパク質、ＳｄｙＣａｔｃｈｅｒタンパク質、グルタチオン、ＧＦＰ抗体、ハロアルカン基質、ベンジルグアニン誘導体、ベンジルシトシン誘導体、ＨＵＨ特異的ＤＮＡ配列、アミロースアガロース、Ｎｕｓ－タグ抗体、抗チオレドキシン－タグ抗体、プロテイン－Ａセファロース、ラクトース、アガロース、及びセファロースから選択され、任意選択的に、前記二次標的結合部分が、アビジン及びストレプトアビジンから選択される、請求項５２～７７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項79】

前記レポーター酵素が、ホスファターゼ、任意選択的にアルカリホスファターゼ、リアーゼ、ヒドロラーゼ、シンターゼ、シンテターゼ、オキシドレダクターゼ、デヒドロゲナーゼ、オキシダーゼ、トランスフェラーゼ、イソメラーゼ、リガーゼ、プロテアーゼ、例えばトリプシン、プロテイナーゼ、ペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、ミエロペルオキシダーゼ、オキシダーゼ、モノオキシゲナーゼ、シトクロム、デカルボキシラーゼ、リパーゼ、カスパーゼ、アミラーゼ、ペプチダーゼ、トランスアミナーゼ、キナーゼ活性、ＤＮＡ又はＲＮＡポリメラーゼ、任意選択的にＴＡＱ、制限酵素、クレノーフラグメント、及びＤＮＡリガーゼから選択される、請求項５２～７８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項80】

前記レポーター酵素が、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、トリプシン、シトクロムＣモノオキシゲナーゼ、及びミエロペルオキシダーゼから選択される、請求項７９に記載の方法。

【請求項81】

前記１つ以上のイオン化可能な生成物が、ＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳ又はＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ下で容易にイオン化可能であり、高いシグナル対ノイズ比によって特徴付けられる生成物イオンを生成し、前記基質が、任意選択的に、
ａ．前記酵素がアルカリホスファターゼ（ＡＰ）であるとき、リン酸化ヌクレオシド、任意選択的にＡＭＰ若しくはＣＭＰ、又はヌクレオチド、任意選択的にＡＴＰ若しくはＣＴＰ、リン酸化アルカロイド、リン酸化アミノアミノ酸、リン酸化アミノ酸ポリマー、及びリン酸化代謝生成物；
ｂ．前記レポーター酵素が西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）であるとき、フェノール、アミン、任意選択的にフェノールアミン、芳香族化合物、オレフィンハロゲン化物、ルミノール、ピロガロール、２，２’－アジノ－ビス（３－エチルベンゾチアゾリン－６－スルホン酸（ＡＢＴＳ）、及びＡｍｐｌｅｘ（登録商標）Ｒｅｄから選択される化合物、あるいは
ｃ．オピエート、洗剤、染料前駆体、アルコール、及びマトリックス、から選択される、請求項５２～８０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項82】

前記レポーター酵素基質が、ピリドキサミン－５－リン酸（ＰＡ５Ｐ）、ｐ－ニトロフェニルホスフェート（ＰＮＰＰ）、Ａｍｐｌｅｘ（登録商標）Ｒｅｄ（ＡＲ）、ナフトールＡＳＭＸホスフェート、ルミノール、Ｌｕｍｉｇｅｎ（登録商標）ＴＭＡ３、Ｌｕｍｉｇｅｎ（登録商標）ＴＭＡ６、スフィンゴシン、４ＭＵＰ、Ｌ－（＋）－２－アミノ－６－ホスホノヘキサン酸、５－ブロモ－４－クロロ－３－インドリルホスフェート（ＢＣＩＰ）、ＢｌｕｅＰｈｏｓ（登録商標）、フェニルベンゼンωホスホノ－α－アミノ酸、Ｏ－ホスホ－ＤＬ－スレオニン、アデノシンモノホスフェート（ＡＭＰ）、ＡＲ（３－アミノ－９－エチルカルバゾール）、４－ＣＮ（４－クロロ－１－ナフトール）、ＤＡＢ（３，３’－ジアミノベンジミジン）、ＯＰＤ（ｏ－フェニレンジアミン）、ＴＭＢ（３，３’’，５，５’’－テトラメチルベンジジン）、ｐＮＰＰ（ｐ－ニトロフェニルホスフェート）、ＮＢＴ（ニトロブルーテトラゾリウム）、ＩＮＴ（ｐ－インドニトロテトラゾリウム）、ＭＵＰ（４－メチルウンベリフェリルホスフェート）、及びＦＤＰ（フルオレセインジホスフェート）、ピロガロールから選択される、請求項７９に記載の方法。

【請求項83】

前記レポーター酵素基質が、
ａ．前記レポーター酵素検出プローブがＨＲＰを含むとき、ＡＲ、ルミノール、Ｌｕｍｉｇｅｎ（登録商標）ＴＭＡ３、及びＬｕｍｉｇｅｎ（登録商標）ＴＭＡ６、又は
ｂ．前記レポーター酵素検出プローブがＡＰを含むとき、ナフトールＡＳＭＸホスフェート、及びＰＮＰＰ、から選択される、請求項８２に記載の方法。

【請求項84】

前記基質反応溶液が、Ｎ－オクチルグルコシド、デオキシコレート、ラピゲスト、オクチル－ベータ－グルコピラノシド、オクチルグルコピラノシド、チャップ、ビッグチャップ、非イオン性酸不安定性界面活性剤、グルコシド、ｎ－オクチル－β－Ｄ－グルコピラノシド、ｎ－ノニル－β－Ｄ－グルコピラノシドチオグルコシド、ｎ－オクチル－β－Ｄ－チオグルコピラノシドマルトシド、ｎ－デシル－β－Ｄ－マルトピラノシド、ｎ－ドデシル－β－Ｄ－マルトピラノシド、ｎ－ウンデシル－β－Ｄ－マルトピラノシド、ｎ－トリデシル－β－Ｄ－マルトピラノシド、シマル－５、シマル－６、チオマルトシド、ｎ－ドデシル－β－Ｄ－チオマルトピラノシド、アルキルグリコシド、オクチルグルコースネオペンチルグリコール、ポリオキシエチレングリコール、トリトン、ＮＰ４０、ツイーン（商標）、ツイーン（商標）２０、トリトンＸ－１００、トリトンｘ－４５、Ｃ８Ｅ４、Ｃ８Ｅ５、Ｃ１０Ｅ５、Ｃ１２Ｅ８、Ｃ１２Ｅ９、Ｂｒｉｊ、Ａｎａｐｏｅ－５８、Ｂｒｉｊ－５８、及びそれらの組み合わせから任意選択的に選択される非イオン性非ポリマー洗剤を含む、請求項５２～８３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項85】

前記基質がルミノールを含むとき、前記基質反応溶液が４－ヨードフェニルボロン酸を更に含む、請求項５２～８４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項86】

前記固相が、反応容器、任意選択的にビーズ、プレート、キャピラリー、フィルター、又はナノ／マイクロ／ミリウェル反応容器であり、前記表面が、紙、ニトロセルロース、アクリレート、プラスチック、ポリスチレン、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）、メラミン、シリカ、ポリリジン被覆ガラス、３－アミノプロピル－トリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）処理ガラス、及び３－アミノプロピル－トリメトキシシラン（ＡＰＴＭＳ）処理ガラスから選択される、請求項５２～８５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項87】

前記捕捉オリゴヌクレオチドプローブの前記固相への前記付着が、Ｈ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、Ｎ－オキシスクシンイミド（ＮＯＳ）、マレイミド、ヒドラジド、又はグルタルアルデヒドカップリングを介するものである、請求項５６～８６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項88】

前記増幅された核酸生成物又は前記増幅された核酸生成物：レポーター酵素複合体が、７２時間未満、２４時間未満、１２時間未満、６０分未満、５０分未満、４０分未満、３０分未満、２０分未満、１５分未満、１０分未満、５分未満、２分未満、又は１分未満の期間、前記基質反応溶液中で、前記レポーター酵素基質と共にインキュベートされて、前記１つ以上のイオン化可能な生成物を生成する、請求項５２～８７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項89】

前記生成物イオンが、最適化されたフラグメンテーションエネルギー及びｍ／ｚ範囲を使用して、ＳＩＭ及び／又はＳＲＭによってアッセイされる、請求項７６～８８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項90】

前記基質が、ＡＭＰ、ＡＤＰ若しくはＡＴＰであり、生成された１つ若しくは前記イオン化可能な生成物が、アデノシンを含み、その生成物イオンが、２６８ｍ／ｚにおけるＳＩＭによってアッセイされるか、又は、前記基質がＣＭＰ、ＣＤＰ若しくはＣＴＰであり、生成された１つ若しくは前記イオン化可能な生成物が、シトシンを含み、その生成物イオンが、２８３ｍ／ｚにおけるＳＩＭによってアッセイされるか、又は、前記基質がＡＲであり、生成された前記１つ以上のイオン化可能な生成物のうちの１つが、レゾルフィンを含み、その生成物イオンが、２１４ｍ／ｚにおけるＳＩＭ及び２１４～１８６ｍ／ｚにおける主要な強いフラグメントを使用するＳＲＭによってアッセイされる、請求項８１に記載の方法。

【請求項91】

前記基質が、ナフトールＡＳＭＸホスフェートであり、生成された前記１つ以上のイオン化可能な生成物のうちの１つが、脱リン酸化ナフトールＡＳＭＸを含み、その生成物イオンが、２９２ｍ／ｚにおけるＳＩＭ及び２９２～１７１ｍ／ｚにおける主要な強いフラグメントを使用するＳＲＭによってアッセイされるか、又は前記基質が、ＰＡ５Ｐであり、生成された１つ若しくは前記イオン化可能な生成物が、ＰＡを含み、その生成物イオンが、１６９ｍ／ｚにおけるＳＩＭによってアッセイされる、請求項８１に記載の方法。

【請求項92】

前記イオン化可能な生成物が、イオン化溶液中で生成物イオンにイオン化される、請求項５２～９１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項93】

前記試験試料が、生物学的試料、工業生成物、又は環境試料である、請求項５２～９１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項94】

前記生物学的試料が、血液試料、尿試料、糞便試料、滲出液、組織試料又は痰試料である、請求項９３に記載の方法。

【請求項95】

前記ＰＣＲが、リアルタイムＰＣＲ（ｒｔＰＣＲ）、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）、逆転写ＰＣＲ、ネステッドＰＣＲ、ハイブリダイゼーション連鎖反応、ローリングサークルＰＣＲ、及び基質リサイクリング反応から選択される、請求項５２～９３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項96】

試験試料中の標的核酸分子の量を定量化する方法であって、
ａ．請求項１～５１のいずれか一項に記載の方法に従って前記標的核酸分子を検出するステップと、
ｂ．質量分析によって検出された前記イオン化可能な生成物のうちの１つ以上についてのシグナルの強度に基づいて、前記試験試料中の標的核酸分子の量を定量化するステップと、を含む、方法。

【請求項97】

前記定量化が、同様の条件下で、既知量の前記標的核酸分子を使用して生成されたシグナル強度に対して、１つ以上の生成物についてのシグナルの強度を比較することを含む、請求項９６に記載の方法。

【請求項98】

前記標的核酸分子が、ピコモル、フェムトモル、若しくはアトモルの範囲内で、又はそれらの範囲までで、前記試料中に存在するか、又は存在すると疑われる、請求項９６又は９７に記載の方法。

【請求項99】

１つ以上の標的オリゴヌクレオチドテンプレートが検出される、請求項１～９８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項100】

前記標的核酸分子が、プラスミドＤＮＡ、又は細菌、ウイルス、真菌、哺乳動物若しくは植物ゲノムに含まれる配列である、請求項１～９９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項101】

前記細菌ゲノムが、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ、Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｉ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、ａｎａｅｒｏｂｉｃ ｂａｃｉｌｌｉ、Ｇｒａｍ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｃｃｉ、Ｇｒａｍ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｂａｃｉｌｌｉ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ、Ｂｏｒｒｅｌｉａ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｓｐｉｒｏｃｈａｅｔｅｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、及びＹｅｒｓｉｎｉａのゲノムから選択され、任意選択的に、前記細菌ゲノムが、Ｅ．ｃｏｌｉ及びＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓから選択され、かつ／又は前記真菌ゲノムが、Ｃａｎｄｉｄａゲノムから選択される、請求項１００に記載の方法。

【請求項102】

前記ウイルスゲノムが、ＨＩＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＭＥＲＳ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、エボラウイルス、インフルエンザウイルス、コロナウイルスゲノム、エンテロウイルス、肝炎ウイルス、ヘルペスウイルス、ＨＰＶ、ノロウイルス、パラインフルエンザ、ライノウイルス、及び水痘ウイルスゲノムから選択され、任意選択的に、前記ウイルスゲノムが、ＨＩＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＭＥＲＳ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、エボラウイルス、インフルエンザウイルス、及びコロナウイルスゲノムから選択される、請求項１００に記載の方法。

【請求項103】

前記哺乳動物ゲノムが、ヒトゲノムである、請求項１００に記載の方法。

【請求項104】

前記標的核酸分子が、前記ＨＩＶゲノムに含まれる配列を有する、請求項１００に記載の方法。

【請求項105】

前記標的核酸分子が、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムに含まれる配列を有する、請求項１００に記載の方法。

【請求項106】

前記標的核酸分子が、ＨＩＶ核酸分子である、請求項１～５１のいずれか一項に記載の方法を含む、ＨＩＶを検出する方法。

【請求項107】

前記捕捉オリゴヌクレオチドプローブが、配列番号１４、配列番号１７、配列番号２０、及び配列番号２３から選択される配列を有する、請求項１０６に記載の方法。

【請求項108】

前記検出オリゴヌクレオチドプローブオリゴヌクレオチドが、配列番号１６、配列番号１９、配列番号２２、及び配列番号２５から選択される配列を有する、請求項１０６又は１０７に記載の方法。

【請求項109】

前記標的核酸分子が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２核酸分子である、請求項１～５１のいずれか一項に記載の方法を含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出する方法。

【請求項110】

前記捕捉オリゴヌクレオチドプローブが、配列番号６及び配列番号１３から選択される配列を有する、請求項１０９に記載の方法。

【請求項111】

前記検出オリゴヌクレオチドプローブオリゴヌクレオチドが、配列番号５及び配列番号１２から選択される配列を有する、請求項１０９又は１１０に記載の方法。

【請求項112】

前記標的核酸分子が、ＨＩＶ核酸分子である、請求項５２～９８のいずれか一項に記載の方法を含む、ＨＩＶを検出する方法。

【請求項113】

前記捕捉オリゴヌクレオチドプローブが、配列番号１４、配列番号１７、配列番号２０、及び配列番号２３から選択される配列を有する、請求項５７～９８が請求項５６に従属する場合の請求項５６～９８のいずれか一項に記載の方法を含む、請求項１１２に記載の方法。

【請求項114】

前記標的核酸分子が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２核酸分子である、請求項５２～９８のいずれか一項に記載の方法を含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出する方法。

【請求項115】

前記修飾プライマーが、配列番号２、配列番号３、配列番号７、配列番号８、配列番号９、及び配列番号１０から選択される配列を有する、請求項１１４に記載の方法。

【請求項116】

前記第２のプライマーが、配列番号２、配列番号３、配列番号７、配列番号８、配列番号９、及び配列番号１０から選択される配列を有する、請求項１１４に記載の方法。

【請求項117】

前記修飾プライマーが、配列番号２の配列を有し、前記第２のプライマーが、配列番号３又は配列番号８の配列を有する、請求項１１４に記載の方法。

【請求項118】

前記修飾プライマーが、配列番号３の配列を有し、前記第２のプライマーが、配列番号２又は配列番号７の配列を有する、請求項１１４に記載の方法。

【請求項119】

前記修飾プライマーが、配列番号７の配列を有し、前記第２のプライマーが、配列番号３又は配列番号８の配列を有する、請求項１１４に記載の方法。

【請求項120】

前記修飾プライマーが、配列番号８の配列を有し、前記第２のプライマーが、配列番号２、配列番号７の配列を有する、請求項１１４に記載の方法。

【請求項121】

前記修飾プライマーが、配列番号９の配列を有し、前記第２のプライマーが、配列番号１０の配列を有する、請求項１１４に記載の方法。

【請求項122】

前記修飾プライマーが、配列番号１０の配列を有し、前記第２のプライマーが、配列番号９の配列を有する、請求項１１４に記載の方法。

【請求項123】

請求項５７～９８が請求項５６に従属する場合の請求項５６～９８のいずれか一項に記載の方法を含み、前記捕捉オリゴヌクレオチドプローブが、配列番号６及び配列番号１３から選択される配列を有する、請求項１１１１４１に記載の方法。

【請求項124】

キットであって、
ｉ．捕捉オリゴヌクレオチドプローブであって、任意選択的にリンカーを介して、任意選択的に固相に結合されている、捕捉オリゴヌクレオチドプローブ、
ｉｉ．揮発性緩衝液を含み、ＮａＣｌ又は架橋剤を実質的に含まない、揮発性結合溶液、
ｉｉｉ．オリゴヌクレオチドと二次標的部分とを含む検出オリゴヌクレオチドプローブ、
ｉｖ．レポーター酵素検出プローブであって、レポーター酵素と、前記二次標的部分に結合することができる二次標的結合部分とを含む、レポーター酵素検出プローブ、並びに／又は
ｖ．請求項１～５１のいずれか一項に記載の、基質、固相、標準物質、任意選択的に標準曲線を調製するため又は較正物質を調整するための任意選択的な生成物イオン標準物質、第２の結合溶液、第３の結合溶液、基質反応溶液、イオン化溶液、クエンチ溶液、任意選択的な第２の結合溶液、検出プローブ溶液、基質反応溶液、クエンチ溶液、イオン化溶液のうちの１つ以上、を含む、キット。

【請求項125】

前記第２の結合緩衝液及び前記基質反応緩衝液が、各々揮発性であり、各々独立して揮発性緩衝液を含む、請求項１２４に記載のキット。

【請求項126】

前記揮発性緩衝液が、エタノールアミン、重炭酸アンモニウム、ギ酸アンモニウム、ギ酸ピリジニウム、トリアルキルアンモニウム／ギ酸、酢酸アンモニウム、重炭酸トリアルキルアンモニウム、Ｎ－エチルモルホリン／アセテート、酢酸トリアルキルアンモニウム、及びそれらの組み合わせである、請求項１２５に記載のキット。

【請求項127】

前記揮発性緩衝液が、エタノールアミン、酢酸アンモニウム、重炭酸トリアルキルアンモニウム、及びそれらの組み合わせから選択される、請求項１２５又は１２６に記載のキット。

【請求項128】

前記トリアルキルアンモニウムが、トリメチルアンモニウム、トリエチルアンモニウム、及びそれらの組み合わせから選択される、請求項１２６又は１２７に記載のキット。

【請求項129】

前記揮発性緩衝液が、エタノールアミンである、請求項１２５～１２７のいずれか一項に記載のキット。

【請求項130】

前記捕捉オリゴヌクレオチドプローブ及び前記検出オリゴヌクレオチドプローブの両方が、標的核酸分子に結合する、請求項１２４～１２９のいずれか一項に記載のキット。

【請求項131】

前記標的核酸分子が、細菌、ウイルス、真菌、哺乳動物又は植物ゲノムに含まれる配列を有する、請求項１３０に記載のキット。

【請求項132】

前記レポーター酵素検出プローブの酵素が、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、トリプシン、シトクロムＣモノオキシゲナーゼ、及びミエロペルオキシダーゼから選択される、請求項１２４～１３１のいずれか一項に記載のキット。

【請求項133】

前記基質が、アデノシン一リン酸（ＡＭＰ）、ＣＭＰ、ＡＴＰ、ＣＭＰ、Ｐ５ＡＰ、ｐ－ニトロフェニルホスフェート（ＰＮＰＰ）、Ａｍｐｌｅｘ（登録商標）Ｒｅｄ（ＡＲ）、ナフトールＡＳＭＸホスフェート、ルミノール、Ｌｕｍｉｇｅｎ（登録商標）ＴＭＡ３、Ｌｕｍｉｇｅｎ（登録商標）ＴＭＡ６、スフィンゴシン、４ＭＵＰ、Ｌ－（＋）－２－アミノ－６－ホスホノヘキサン酸、５－ブロモ－４－クロロ－３－インドリルホスフェート（ＢＣＩＰ）、ＢｌｕｅＰｈｏｓ（登録商標）、フェニルベンゼンωホスホノ－α－アミノ酸、Ｏ－ホスホ－ＤＬ－スレオニン、ＡＲ（３－アミノ－９－エチルカルバゾール）、４－ＣＮ（４－クロロ－１－ナフトール）、ＤＡＢ（３，３’－ジアミノベンジミジン）、ＯＰＤ（ｏ－フェニレンジアミン）、ＴＭＢ（３，３’’，５，５’’－テトラメチルベンジジン）、ｐＮＰＰ（ｐ－ニトロフェニルホスフェート）、ＮＢＴ（ニトロブルーテトラゾリウム）、ＩＮＴ（ｐ－インドニトロテトラゾリウム）、ＭＵＰ（４－メチルウンベリフェリルホスフェート）、及びＦＤＰ（フルオレセインジホスフェート）、及びピロガロールから選択される、請求項１２４～１３２のいずれか一項に記載のキット。

【請求項134】

前記イオン化溶液が、ギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、水酸化アンモニウム、メチルアミン、エチルアミン、又はプロピルアミンから任意選択的に選択される酸又は塩基を含む、請求項１２４～１３３のいずれか一項に記載のキット。

【請求項135】

前記クエンチ溶液が、正イオン化のために５０％アセトニトリル、０．１％酢酸若しくは０．１％ギ酸若しくは０．１％トリフルオロ酢酸を、又は負イオン化のために０．１％水酸化アンモニウムを、任意選択的に含む、請求項１２４～１３４のいずれか一項に記載のキット。

【請求項136】

前記二次標的部分が、ビオチン、ＡＬＦＡ－タグ、Ａｖｉタグ、Ｃ－タグ、カルモジュリン－タグ、ポリグルタミン酸タグ、Ｅ－タグ、Ｆｌａｇ－タグ、ＨＡ－タグ、Ｈｉｓ－タグ、ｍｙｃ－タグ、ＮＥ－タグ、Ｒｈｏ１Ｄ４－タグ、Ｓ－タグ、ＳＢＰ－タグ、Ｓｏｆタグ１、Ｓｏｆタグ３、Ｓｐｏｔ－タグ、Ｓｔｒｅｐｔ－タグ、Ｔ７－タグ、ＴＣ－タグ、Ｔｙ１タグ、Ｖ５タグ、ＶＳＶ－タグ、Ｘｐｒｅｓｓタグ、Ｉｓｏｐｅｐタグ、Ｓｐｙタグ、Ｓｎｏｏｐタグ、Ｄｏｇタグ、Ｓｄｙタグ、ビオチンカルボキシルキャリアタンパク質、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼタス、ＧＦＰタグ、Ｈａｌｏタグ、ＳＮＡＰ－タグ、ＣＬＩＰ－タグ、ＨＵＨ－タグ、マルトース結合タンパク質タグ、Ｎｕｓ－タグ、チオレドキシン－タグ、Ｆｃ－タグ、及びＣＲＤＳＡＴ－タグから選択され、任意選択的に、前記二次標的部分がビオチンである、請求項１２４～１３５のいずれか一項に記載のキット。

【請求項137】

前記二次標的結合部分が、アビジン、ストレプトアビジン、カルモジュリン、陰イオン交換樹脂、Ｍｏｎｏ－Ｑ、陽イオン交換樹脂、抗Ｅ－タグ抗体、抗ＦＬＡＧ－タグ抗体、抗ＨＡ－タグ抗体、ニッケル又はコバルトキレート、抗Ｍｙｃ－タグ抗体、抗ＮＥ－タグ抗体、抗Ｒｈｏ１Ｄ４－タグ抗体、抗Ｓ－タグ抗体、抗Ｓｏｆタグ１抗体、抗Ｓｏｆタグ３抗体、ナノボディ、ストレプタクチン、抗Ｔ７－タグ抗体、ＦＩＡｓＨ二ヒ素化合物、ＲｅＡｓＨ二ヒ素化合物、抗Ｔｙ１タグ抗体、抗Ｖ５タグ抗体、抗ＶＳＶタグ抗体、抗Ｘｐｒｅｓｓタグ抗体、ピリン－Ｃタンパク質、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒタンパク質、ＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒタンパク質、ＳｎｏｏｐタグＪｒタンパク質、ＳｄｙＣａｔｃｈｅｒタンパク質、グルタチオン、ＧＦＰ抗体、ハロアルカン基質、ベンジルグアニン誘導体、ベンジルシトシン誘導体、ＨＵＨ特異的ＤＮＡ配列、アミロースアガロース、Ｎｕｓ－タグ抗体、抗チオレドキシン－タグ抗体、プロテイン－Ａセファロース、ラクトース、アガロース、及びセファロースから選択され、任意選択的に、前記二次標的結合部分が、アビジン及びストレプトアビジンから選択される、請求項１２４～１３６のいずれか一項に記載のキット。

【請求項138】

前記検出オリゴヌクレオチドプローブが、前記標的核酸分子の一部に相補的な配列を含むビオチン化オリゴヌクレオチドプローブである、請求項１３６又は１３７に記載のキット。

【請求項139】

前記レポーター酵素検出プローブが、アルカリホスファターゼストレプトアビジン（ＡＰＳＡ）酵素である、請求項１３７又は１３８に記載のキット。

【請求項140】

前記捕捉オリゴヌクレオチドプローブが、配列番号６、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１７、配列番号２０、配列番号２３、配列番号２６、配列番号２９、配列番号３２、及び配列番号３５から選択される配列を含む、請求項１３４～１３９のいずれか一項に記載のキット。

【請求項141】

前記検出オリゴヌクレオチドプローブのオリゴヌクレオチドが、配列番号５、配列番号１２、配列番号１６、配列番号１９、配列番号２２、配列番号２５、配列番号２８、配列番号３１、配列番号３４、及び配列番号３７から選択される配列を含む、請求項１２４～１３９のいずれか一項に記載のキット。

【請求項142】

前記捕捉オリゴヌクレオチドプローブが、配列番号１４の配列を含み、前記検出オリゴヌクレオチドプローブのオリゴヌクレオチドが、配列番号１６の配列を有する、請求項１２４～１３９のいずれか一項に記載のキット。

【請求項143】

前記捕捉オリゴヌクレオチドプローブが、配列番号６の配列を含み、前記検出オリゴヌクレオチドプローブのオリゴヌクレオチドが、配列番号５の配列を有する、請求項１２４～１３９のいずれか一項に記載のキット。

【請求項144】

前記捕捉オリゴヌクレオチドプローブが、配列番号１３の配列を含み、前記検出オリゴヌクレオチドプローブのオリゴヌクレオチドが、配列番号１２の配列を有する、請求項１２４～１３９のいずれか一項に記載のキット。

【請求項145】

前記捕捉オリゴヌクレオチドプローブが、配列番号１７の配列を含み、前記検出オリゴヌクレオチドプローブのオリゴヌクレオチドが、配列番号１９の配列を有する、請求項１２４～１３９のいずれか一項に記載のキット。

【請求項146】

前記捕捉オリゴヌクレオチドプローブが、配列番号２０の配列を含み、前記検出オリゴヌクレオチドプローブのオリゴヌクレオチドが、配列番号２２の配列を有する、請求項１２４～１３９のいずれか一項に記載のキット。

【請求項147】

前記捕捉オリゴヌクレオチドプローブが、配列番号２３の配列を含み、前記検出オリゴヌクレオチドプローブのオリゴヌクレオチドが、配列番号２５の配列を有する、請求項１２４～１３９のいずれか一項に記載のキット。

【請求項148】

前記捕捉オリゴヌクレオチドプローブが、配列番号２６の配列を含み、前記検出オリゴヌクレオチドプローブのオリゴヌクレオチドが、配列番号２８の配列を有する、請求項１２４～１３９のいずれか一項に記載のキット。

【請求項149】

前記捕捉オリゴヌクレオチドプローブが、配列番号２９の配列を含み、前記検出オリゴヌクレオチドプローブのオリゴヌクレオチドが、配列番号３１の配列を有する、請求項１２４～１３９のいずれか一項に記載のキット。

【請求項150】

前記捕捉オリゴヌクレオチドプローブが、配列番号３２の配列を含み、前記検出オリゴヌクレオチドプローブのオリゴヌクレオチドが、配列番号３４の配列を有する、請求項１２４～１３９のいずれか一項に記載のキット。

【請求項151】

前記捕捉オリゴヌクレオチドプローブが、配列番号３５の配列を含み、前記検出オリゴヌクレオチドプローブのオリゴヌクレオチドが、配列番号３７の配列を有する、請求項１２４～１３９のいずれか一項に記載のキット。

【請求項152】

キットであって、
ｉ．二次標的部分又はレポーター酵素で官能化されている修飾プライマーと、
ｉｉ．第２のプライマーと、
ｉｉｉ．前記修飾プライマーが前記二次標的部分で官能化されているとき、レポーター酵素検出プローブであって、レポーター酵素及び前記二次標的部分に結合することができる二次標的結合部分を含む、レポーター酵素検出プローブと、
ｉｖ．請求項１～９５のいずれか一項に記載の、基質、固相、標準物質、任意選択的に標準曲線を調製するため又は較正物質を調整するための任意選択的な生成物イオン標準物質、結合溶液、第２の結合溶液、基質反応溶液、イオン化溶液、クエンチ溶液、任意選択的な結合溶液、第２の結合溶液、検出プローブ溶液、洗浄溶液、基質反応溶液、クエンチ溶液、イオン化溶液のうちの１つ以上と、を含み、
前記修飾プライマーがフォワードプライマーであるとき、前記第２のプライマーはリバースプライマーであり、前記修飾プライマーがリバースプライマーであるとき、前記第２のプライマーはフォワードプライマーである、キット。

【請求項153】

前記第２のプライマーが、前記固相に付着している、請求項１５２に記載のキット。

【請求項154】

前記固相が、任意選択的にリンカーを介して、捕捉オリゴヌクレオチドプローブに付着している、請求項１５２に記載のキット。

【請求項155】

前記結合溶液及び前記第２の結合溶液が、各々独立して揮発性であり、ＮａＣｌを実質的に含まない、請求項１５２～１５４のいずれか一項に記載のキット。

【請求項156】

前記結合溶液、前記第２の結合溶液及び前記洗浄溶液が、各々独立して揮発性緩衝液を含む、請求項１５５に記載のキット。

【請求項157】

前記揮発性緩衝液が、エタノールアミン、重炭酸アンモニウム、ギ酸アンモニウム、ギ酸ピリジニウム、トリアルキルアンモニウム／ギ酸、酢酸アンモニウム、重炭酸トリアルキルアンモニウム、Ｎ－エチルモルホリン／アセテート、酢酸トリアルキルアンモニウム、及びそれらの組み合わせである、請求項１５６に記載のキット。

【請求項158】

前記揮発性緩衝液が、エタノールアミン、酢酸アンモニウム、重炭酸トリアルキルアンモニウム、及びそれらの組み合わせから選択される、請求項１５６又は１５７に記載のキット。

【請求項159】

前記トリアルキルアンモニウムが、トリメチルアンモニウム、トリエチルアンモニウム、及びそれらの組み合わせから選択される、請求項１５７又は１５８に記載のキット。

【請求項160】

前記揮発性緩衝液が、エタノールアミンである、請求項１５５～１５９のいずれか一項に記載のキット。

【請求項161】

前記レポーター酵素検出プローブの酵素が、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、トリプシン、シトクロムＣモノオキシゲナーゼ、及びミエロペルオキシダーゼから選択される、請求項１５２～１６０のいずれか一項に記載のキット。

【請求項162】

前記基質が、アデノシン一リン酸（ＡＭＰ）、ＣＭＰ、ＡＴＰ、ＣＭＰ、Ｐ５ＡＰ、ｐ－ニトロフェニルホスフェート（ＰＮＰＰ）、Ａｍｐｌｅｘ（登録商標）Ｒｅｄ（ＡＲ）、ナフトールＡＳＭＸホスフェート、ルミノール、Ｌｕｍｉｇｅｎ（登録商標）ＴＭＡ３、Ｌｕｍｉｇｅｎ（登録商標）ＴＭＡ６、スフィンゴシン、４ＭＵＰ、Ｌ－（＋）－２－アミノ－６－ホスホノヘキサン酸、５－ブロモ－４－クロロ－３－インドリルホスフェート（ＢＣＩＰ）、ＢｌｕｅＰｈｏｓ（登録商標）、フェニルベンゼンωホスホノ－α－アミノ酸、Ｏ－ホスホ－ＤＬ－スレオニン、ＡＲ（３－アミノ－９－エチルカルバゾール）、４－ＣＮ（４－クロロ－１－ナフトール）、ＤＡＢ（３，３’－ジアミノベンジミジン）、ＯＰＤ（ｏ－フェニレンジアミン）、ＴＭＢ（３，３’’，５，５’’－テトラメチルベンジジン）、ｐＮＰＰ（ｐ－ニトロフェニルホスフェート）、ＮＢＴ（ニトロブルーテトラゾリウム）、ＩＮＴ（ｐ－インドニトロテトラゾリウム）、ＭＵＰ（４－メチルウンベリフェリルホスフェート）、及びＦＤＰ（フルオレセインジホスフェート）、及びピロガロールから選択される、請求項１５２～１６１のいずれか一項に記載のキット。

【請求項163】

前記イオン化溶液が、ギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、水酸化アンモニウム、メチルアミン、エチルアミン、又はプロピルアミンから任意選択的に選択される酸又は塩基を含む、請求項１５２～１６２のいずれか一項に記載のキット。

【請求項164】

前記クエンチ溶液が、正イオン化のために５０％アセトニトリル、０．１％酢酸若しくは０．１％ギ酸若しくは０．１％トリフルオロ酢酸を、又は負イオン化のために０．１％水酸化アンモニウムを、任意選択的に含む、請求項１５２～１６３のいずれか一項に記載のキット。

【請求項165】

前記二次標的部分が、ビオチン、ＡＬＦＡ－タグ、Ａｖｉタグ、Ｃ－タグ、カルモジュリン－タグ、ポリグルタミン酸タグ、Ｅ－タグ、Ｆｌａｇ－タグ、ＨＡ－タグ、Ｈｉｓ－タグ、ｍｙｃ－タグ、ＮＥ－タグ、Ｒｈｏ１Ｄ４－タグ、Ｓ－タグ、ＳＢＰ－タグ、Ｓｏｆタグ１、Ｓｏｆタグ３、Ｓｐｏｔ－タグ、Ｓｔｒｅｐｔ－タグ、Ｔ７－タグ、ＴＣ－タグ、Ｔｙ１タグ、Ｖ５タグ、ＶＳＶ－タグ、Ｘｐｒｅｓｓタグ、Ｉｓｏｐｅｐタグ、Ｓｐｙタグ、Ｓｎｏｏｐタグ、Ｄｏｇタグ、Ｓｄｙタグ、ビオチンカルボキシルキャリアタンパク質、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼタス、ＧＦＰタグ、Ｈａｌｏタグ、ＳＮＡＰ－タグ、ＣＬＩＰ－タグ、ＨＵＨ－タグ、マルトース結合タンパク質タグ、Ｎｕｓ－タグ、チオレドキシン－タグ、Ｆｃ－タグ、及びＣＲＤＳＡＴ－タグから選択され、任意選択的に、前記二次標的部分がビオチンである、請求項１５２～１６４のいずれか一項に記載のキット。

【請求項166】

前記二次標的結合部分が、アビジン、ストレプトアビジン、カルモジュリン、陰イオン交換樹脂、Ｍｏｎｏ－Ｑ、陽イオン交換樹脂、抗Ｅ－タグ抗体、抗ＦＬＡＧ－タグ抗体、抗ＨＡ－タグ抗体、ニッケル又はコバルトキレート、抗Ｍｙｃ－タグ抗体、抗ＮＥ－タグ抗体、抗Ｒｈｏ１Ｄ４－タグ抗体、抗Ｓ－タグ抗体、抗Ｓｏｆタグ１抗体、抗Ｓｏｆタグ３抗体、ナノボディ、ストレプタクチン、抗Ｔ７－タグ抗体、ＦＩＡｓＨ二ヒ素化合物、ＲｅＡｓＨ二ヒ素化合物、抗Ｔｙ１タグ抗体、抗Ｖ５タグ抗体、抗ＶＳＶタグ抗体、抗Ｘｐｒｅｓｓタグ抗体、ピリン－Ｃタンパク質、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒタンパク質、ＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒタンパク質、ＳｎｏｏｐタグＪｒタンパク質、ＳｄｙＣａｔｃｈｅｒタンパク質、グルタチオン、ＧＦＰ抗体、ハロアルカン基質、ベンジルグアニン誘導体、ベンジルシトシン誘導体、ＨＵＨ特異的ＤＮＡ配列、アミロースアガロース、Ｎｕｓ－タグ抗体、抗チオレドキシン－タグ抗体、プロテイン－Ａセファロース、ラクトース、アガロース、及びセファロースから選択され、任意選択的に、前記二次標的結合部分が、アビジン及びストレプトアビジンから選択される、請求項１５２～１６５のいずれか一項に記載のキット。

【請求項167】

前記レポーター酵素検出プローブが、アルカリホスファターゼストレプトアビジン（ＡＰＳＡ）酵素である、請求項１６５又は１６６に記載のキット。

【請求項168】

前記修飾プライマー及び前記第２のプライマーが、細菌、ウイルス、真菌、哺乳動物又は植物ゲノムに含まれる配列を有する標的核酸分子に対するプライマーである、請求項１５２～１６７のいずれか一項に記載のキット。

【請求項169】

前記修飾プライマーが、配列番号２、配列番号３、配列番号７、配列番号８、配列番号９、及び配列番号１０から選択される配列を有する、請求項１５２～１６８のいずれか一項に記載のキット。

【請求項170】

前記第２のプライマーが、配列番号２、配列番号３、配列番号７、配列番号８、配列番号９、及び配列番号１０から選択される配列を有する、請求項１５２～１６８のいずれか一項に記載のキット。

【請求項171】

前記修飾プライマーが、配列番号２の配列を有し、前記第２のプライマーが、配列番号３又は配列番号８の配列を有する、請求項１５２～１６８のいずれか一項に記載のキット。

【請求項172】

前記修飾プライマーが、配列番号３の配列を有し、前記第２のプライマーが、配列番号２又は配列番号７の配列を有する、請求項１５２～１６８のいずれか一項に記載のキット。

【請求項173】

前記捕捉オリゴヌクレオチドが、配列番号６の配列を有する、請求項１７１又は１７２に記載のキット。

【請求項174】

前記修飾プライマーが、配列番号７の配列を有し、前記第２のプライマーが、配列番号８の配列を有する、請求項１５２～１６８のいずれか一項に記載のキット。

【請求項175】

前記修飾プライマーが、配列番号８の配列を有し、前記第２のプライマーが、配列番号７の配列を有する、請求項１５２～１６８のいずれか一項に記載のキット。

【請求項176】

前記修飾プライマーが、配列番号９の配列を有し、前記第２のプライマーが、配列番号１０の配列を有する、請求項１５２～１６８のいずれか一項に記載のキット。

【請求項177】

前記修飾プライマーが、配列番号１０の配列を有し、前記第２のプライマーが、配列番号９の配列を有する、請求項１５２～１６８のいずれか一項に記載のキット。

【請求項178】

前記捕捉オリゴヌクレオチドが、配列番号１３の配列を有する、請求項１７６又は１７７に記載のキット。

【請求項179】

配列番号２～４６から選択される配列の核酸。

【請求項180】

前記核酸が、固体支持体に、任意選択的に、請求項８６又は８７に記載の固体支持体に結合される、請求項１７９に記載の核酸。

【請求項181】

請求項７７に記載の第２の標的部分に結合している、請求項１７９に記載の核酸。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

（関連出願の相互参照）
本ＰＣＴ出願は、２０２０年１０月２６日に出願された米国特許出願第６３／１０５，５５４号の優先権を主張するものであり、この出願は参照により本明細書に組み込まれる。

【0002】

（発明の分野）
本開示は、質量分析法を用いて標的核酸を検出及び測定するための方法及びキットに関する。更に、本開示は、疾患診断のための方法及びキットに関する。

【背景技術】

【0003】

（序論）
生体分子を正確に検出及び定量する能力は、基礎的な生化学研究、診断及び治療医学、並びに水及び食品の安全性を含む、複数の分野において非常に重要である。本方法による検出の限界にある多くの潜在的な診断用ＤＮＡ分子及び治療用タンパク質は、絶対的に定量化される必要がある。ポリスチレンオリゴ合成マイクロビーズ上でのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅及びＤＮＡ配列決定などの半定量的「計数」法による生物学的に重要な核酸の発見は、線形及びガウスハイブリダイゼーションアッセイによって標準と共に絶対的に定量化される必要がある重要な分子を明らかにした（Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ，２０１１）。ＰＣＲなどの現在の技術は、アッセイ下でゼプトモル（１０^－２１）～ヨクトモル（１０^－２４）の量のそれらのレベルで分子を正確に定量することができない（Ｒｕｔｌｅｄｇｅ，２００３）。

【0004】

ＰＣＲ（Ｃｈｉｎ，２０１３）は、わずか１つのポリメラーゼテンプレートを検出するために使用されているが、非線形であり、偽陰性の結果を示し得、大きな定量誤差を有し、そしてＰＣＲ反応から絶対的定量性を抽出するための数学的手順は困難である（Ｒｕｔｌｅｄｇｅ，２００３）。ＰＣＲによるＨＩＶ及び他の動物ウイルスの分析は、顕著な偽陰性率を有する（Ｘｉｅ，２０２０、Ｘｉａｏ，２０２０）。ハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーション連鎖反応について広範囲の感度値が報告されている（Ｂａｓｉｒｉ，２０２０、Ｓａｎｔｈａｎａｍ，２０２０、Ｄｏｄｄａｐａｎｅｎｉ，２０２０、Ｊｉａｏ，２０２０、Ｖｅｒｍｉｓｏｇｌｏｕ，２０２０）。固体支持体上での定量的ＤＮＡベースのアッセイの最近の適用は、ピコモル（ｐＭ）濃度範囲に達したようであり、その際、広い吸収範囲を使用する蛍光を使用して、本質的に線形及びガウス型ではない電気化学的検出若しくはＴＩＲＦを使用して、又はＰＣＲ若しくはＨＣＲによる複数ラウンドの増幅を使用して、それに続いて酵素的な増幅を伴うスキーム、及び／又は超感受性の参照を使用するが、それはエラーが増加し得る（Ｘｕ、２０１６年）。Ｓｈｉ、Ｇｕｏ、Ｘｉｏｎｇ。対照的に、質量分析は、広いスペクトルの代わりに単一の質量電荷比に対してより特異的であり、本質的に線形かつガウス型であり、ｐＭ以下の濃度範囲に達するように１回の酵素増幅で増幅することができる。

【0005】

蛍光の全内部反射率（ＴＩＲＦ）は、ＤＮＡ配列中のヌクレオチドの定性的検出において使用され得る（Ｖａｎｄａｍｍｅ，１９９５）。しかしながら、シグナルは非線形であるため、その較正では１０００倍に逸脱し得（Ｔｏｂｏｓ，２０１９、Ｔａｎｇｅｍａｎｎ，１９９５）、安全検出限界の計算を妨げる定性的データの集約に依存している（Ｒｉｓｓｉｎ，２０１０）。ＴＩＲＦからの定量化には実用上の限界があり、最近、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を用いた酵素増幅と同様の結果が得られることが示されている（Ｌｉ，２０１７）。

【0006】

質量分析は、線形かつガウス型の分析技術であり（Ｒａｚｕｍｉｅｎｋｏ，２００８年、Ｂｏｗｄｅｎ，２０１２）、そこでは、１００ピコモル濃度（１００ｐＭ）でアデノシンを検出する（注入された１マイクロリットル（１μＬ）は、酵素増幅前においてカラム上で１００アトモル（１００ａｍｏｌ）に相当する（Ｆｌｏｒｅｎｔｉｎｕｓ，２０１１、Ｏｎｉｓｋｏ，２００７））。

【0007】

液体クロマトグラフィーエレクトロスプレーイオン化タンデム質量分析（ＬＣ－ＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳ）は、他の方法と比較して、いくつかの強力な利点を有し、免疫学的又は酵素的増幅なしに、血液からｎｇ／ｍｌレベルまでのタンパク質を直接検出することができる（Ｍｕｎｇｅ，２００５）。

【0008】

免疫マトリックス支援レーザー脱離／イオン化（ＭＡＬＤＩ）は、タンパク質又はペプチドの免疫複合体を直接分析するが（Ｌｉ，２０１７）、ＤＮＡには有用ではなかった。更に、そのシグナルは酵素的な増幅を利用できず、ｎｇ／ｍｌ感度がやっとである。

【0009】

同様に、液体クロマトグラフィー誘導結合プラズマ質量分析（ＬＣ－ＩＣＰ－ＭＳ）は、一般に、ＥＬＩＳＡの既存の検出限界と同様のｎｇ／ｍｌレベルに達し得る（Ｓｈｕｋｌａ，２０１３）。

【0010】

既存の電気化学的方法は、ヨクトモル範囲に達することが報告されている。しかしながら、シグナルは本質的に線形又はガウス型ではない（Ｓａｉｋｉ，１９８５、Ｒｉｓｓｉｎ，２０１０）。

【0011】

ＵＶ／ＶＩＳ検出は、質量分析ほど高感度又は特異的ではない。しかしながら、酵素的増幅とＵＶ／ＶＩＳ検出との組み合わせは、ＵＶ／ＶＩＳ分析の感度を顕著に向上させた。アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、ＤＮＡポリメラーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ又はルシフェラーゼによる酵素的増幅の使用は、ＵＶ－ＶＩＳ、ＥＣＬ又は蛍光検出などの方法の有用な感度を向上させた（Ｒｏｎａｇｈｉ，１９９６、Ｃｈｅｎ，１９９４、Ｆｌｏｒｅｎｔｉｎｕｓ－Ｍｅｆａｉｌｏｓｋｉ，２０１４、Ｗａｌｔ，２０１３、Ｍｕｎｇｅ，２００５、Ｓａｉｋｉ，１９８５、Ｓｕｎ，２００６、Ｓｈｕｋｌａ，２０１３、Ｃｈｉｎ，２０１３、Ｔｏｂｏｓ，２０１９、Ｖａｎｄａｍｍｅ，１９９５、Ｔａｎｇｅｍａｎｎ，１９９５、Ｔｕｃｈｏｌｓｋａ，２００９、Ｌｉ，２０１７、Ｒａｚｕｍｉｅｎｋｏ，２００８、Ｂｏｗｄｅｎ，２０１２、Ｆｌｏｒｅｎｔｉｎｕｓ－Ｍｅｆａｉｌｏｓｋｉ，２０１５、Ｆｌｏｒｅｎｔｉｎｕｓ，２０１１、Ｏｎｉｓｋｏ，２００７）。

【0012】

タンパク質及び抗体は、酵素免疫質量分析アッセイ（ＥＬｉＭＳＡ）を使用して、デオキシコレート又はＮ－オクチルグルコシド修飾されたＬＣ－ＥＳＩ－ＭＳ適合性タンパク質相互作用緩衝液と共に９６ウェルプレートを使用して、ポリスチレン担体上で絶対的な定量化が行われていた（Ｆｌｏｒｅｎｔｉｎｕｓ－Ｍｅｆａｉｌｏｓｋｉ，２０１４、Ｆｌｏｒｅｎｔｉｎｕｓ－Ｍｅｆａｉｌｏｓｋｉ，２０１６、Ｆｌｏｒｅｎｔｉｎｕｓ－Ｍｅｆａｉｌｏｓｋｉ，２０１４、Ｆｌｏｒｅｎｔｉｎｕｓ－Ｍｅｆａｉｌｏｓｋｉ，２０１５）。ＥＬｉＭＳＡアッセイは、米国特許第９，９６４，５３８号に記載されている。ナノグラム量のタンパクに達する従来の比色酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）による直接測定と比較して、ＥＬｉＭＳＡは、５０フェムトグラムまで検出できるアルカリホスファターゼストレプトアビジン（ＡＰＳＡ）酵素結合体を用いたタンパクの検出に対してピコグラム感度に達している（Ｆｌｏｒｅｎｔｉｎｕｓ－Ｍｅｆａｉｌｏｓｋｉ，２０１５）。

【0013】

ＡＰＳＡ酵素結合体を使用したＰＳＡ及び抗体の検出は、順相シリカ固定相上で高いヨクトモル範囲に達している（Ｆｌｏｒｅｎｔｉｎｕｓ－Ｍｅｆａｉｌｏｓｋｉ，２０１４、Ｆｌｏｒｅｎｔｉｎｕｓ－Ｍｅｆａｉｌｏｓｋｉ，２０１５、Ｆｌｏｒｅｎｔｉｎｕｓ－Ｍｅｆａｉｌｏｓｋｉ，２０１６）。ＥＬｉＭＳＡによるタンパク検出は、ブラインド試験の結果、高濃度で市販の蛍光及びＥＣＬシステムと一致する結果を示したが、はるかに感度が高く、１ｎｇ／ｍｌ（フェムトモル範囲）をはるかに下回る線形的な定量性を示し続けた（Ｆｌｏｒｅｎｔｉｎｕｓ－Ｍｅｆａｉｌｏｓｋｉ，２０１５）。

【0014】

質量分析による核酸の定量化は困難であり得る。例えば、核酸結合、ハイブリダイゼーション及び反応で典型的に使用される緩衝液は、核酸相互作用を促進するためにＮａＣｌなどの塩を含有する。しかしながら、ＮａＣｌなどの無機塩は、質量分析測定において安易に使用できない。

【0015】

したがって、例えば、核酸がフェムトモル～アトモルの濃度範囲で存在するとき、低濃度で感受性であり、かつ／又は好ましくはＭＳに適合する、核酸の検出及び定量化のための線形及びガウス型のアッセイが求められている。

【発明の概要】

【0016】

例えば生物学的試料又はＰＣＲ反応生成物からの低濃度の標的核酸分子が、高感度かつ特異的に検出及び定量され得ることが本発明で示された。本明細書に記載される方法は、質量分析（ＭＳ）法による検出のための、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）などのレポーター酵素の酵素活性の測定と組み合わせた、選択的捕捉及び／又は検出オリゴヌクレオチドプローブを使用する増幅を伴う方法を含む。更に、ＰＣＲ反応の少なくとも１つのプライマーがビオチンなどの二次標的部分で官能化されるとき、二次標的部分に結合し、ＭＳによる検出のためにＰＣＲ生成物の存在を増幅する酵素活性を有するレポーター酵素検出プローブを用いて、ＰＣＲ生成物を直接検出及び定量することができることが示された。

【0017】

更に、揮発性緩衝液を使用して、１つ以上の緩衝液中のＮａＣｌなどの塩を置き換えて、ＭＳ分析における残留塩を最小限に抑えることができることが示された。

【0018】

本開示の方法は、選択的かつ高感度の診断方法として有用である。

【0019】

したがって、一態様では、本開示は、以下を含む、標的核酸分子を検出する方法を含む：
ａ．
ｉ．標的核酸分子を含むと推定される試料を、標的核酸分子に相補的な配列を含み、かつ固相に付着している捕捉オリゴヌクレオチドプローブと共に、第１の結合溶液中で、インキュベートすることであって、任意選択的に、固相がリンカーを介して捕捉オリゴヌクレオチドプローブに付着している、インキュベートすること、又は
ｉｉ．標的核酸分子を含むと推定される試料を、固相と共にインキュベートして、第１の結合溶液中で、当該試料／標的核酸分子を当該固相に付着させることであって、任意選択的に、固相がリンカーを介して試料／標的核酸分子に付着している、インキュベートすることと、
ｂ．標的：検出複合体を形成するための条件下で、第２の結合溶液中で、任意の標的核酸分子を検出オリゴヌクレオチドプローブに結合させることと、
ｃ．標的：検出：酵素複合体を形成するための条件下で、第３の結合溶液中で、任意の標的：検出複合体をレポーター酵素検出プローブと共にインキュベートすることであって、第３の揮発性結合溶液がＮａＣｌなどの無機塩を実質的に含まない、インキュベートすることと、
ｄ．洗浄溶液で固相を洗浄して、任意の未結合のレポーター酵素検出プローブを除去することと、
ｅ．基質反応溶液中で、任意の標的：検出：酵素複合体を、レポーター酵素検出プローブ基質と共にインキュベートして、１つ以上のイオン化可能な生成物を生成することと、
ｆ．質量分析（ＭＳ）を使用して、１つ以上のイオン化可能な生成物のうちの少なくとも１つを検出することと、を含み、
ｉ．第１の結合溶液、第２の結合溶液、及び第３の結合溶液のうちの少なくとも第３の結合溶液が、無機塩を実質的に含まず、
ｉｉ．洗浄溶液が、無機塩を実質的に含まず、
ｉｉｉ．方法が、任意の標的：検出：酵素複合体の成分と、捕捉オリゴヌクレオチドプローブとを、任意選択的なステップｄ）及びステップｅ）の前に、架橋することを更に含み、かつ／又は
ｉｖ．方法が、ＭＳを使用して検出する前に、１つ以上のイオン化可能な生成物を分離することを更に含み、
１つ以上のイオン化可能な生成物のうちの少なくとも１つの検出が、試料が標的核酸分子を含むことを示す。

【0020】

検出オリゴヌクレオチドプローブは、検出オリゴヌクレオチドプライマーであり得る。かかる場合、ステップは、増幅溶液中で検出オリゴヌクレオチドプライマーを用いて標的核酸分子を増幅することと、標的：検出複合体を形成するための条件下で、第２の結合溶液中で、任意の増幅された標的を検出オリゴヌクレオチドプローブに結合させることとを含む。

【0021】

別の態様では、本開示は、以下のステップを含む、試料中の標的核酸分子の量を定量化する方法を含む：
ａ．本開示の方法に従って標的核酸分子を検出するステップ、及び
ｂ．質量分析によって検出されたイオン化可能な生成物のうちの１つ以上についてのシグナルの強度に基づいて、試料中の標的核酸分子の量を定量化するステップ。

【0022】

別の態様では、本開示は、本開示は、以下を含む、標的核酸分子を検出する方法を含む：
修飾プライマー及び第２のプライマーを用いて、標的核酸分子を含むと推定される試験試料に対して、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）又はハイブリダイゼーション連鎖反応（ＨＣＲ）又はローリングサークル反応又は他の核酸反応などの核酸増幅を実施して、修飾プライマーを含む増幅された核酸生成物、任意選択的にＰＣＲ生成物を得ることであって、修飾プライマーが、二次標的部分又はレポーター酵素で官能化されている、実施することと、
増幅された核酸生成物を、任意の未反応修飾プライマーから分離することと、
修飾プライマーが、二次標的部分で官能化されているとき、増幅された核酸生成物を、第１の結合溶液中で、レポーター酵素検出プローブと共に、増幅された核酸生成物：レポーター酵素複合体を形成する条件下でインキュベートして、結合していないレポーター酵素検出プローブを洗浄溶液で除去することであって、レポーター酵素検出プローブが、二次標的結合部分及びレポーター酵素を含む、インキュベートすることと、
増幅された核酸生成物又は増幅された核酸生成物：レポーター酵素基質複合体を、基質反応溶液中で、レポーター酵素基質とインキュベートして、１つ以上のイオン化可能な生成物を生成することと、
質量分析（ＭＳ）を使用して、１つ以上のイオン化可能な生成物を検出することであって、
修飾プライマーがフォワードプライマーであるとき、第２のプライマーがリバースプライマーであり、修飾プライマーがリバースプライマーであるとき、第２のプライマーがフォワードプライマーである、検出すること。

【0023】

別の態様では、本開示は、以下のステップを含む、試験試料中の標的核酸分子の量を定量化する方法を含む：
ａ．本開示の標的核酸分子を検出する方法に従って標的核酸分子を検出するステップ、及び
ｂ．質量分析によって検出されたイオン化可能な生成物のうちの１つ以上についてのシグナルの強度に基づいて、試験試料中の標的核酸分子の量を定量化するステップ。

【0024】

別の態様では、本開示は、本開示の標的核酸分子を検出する方法を含む、ＨＩＶを検出する方法を含み、標的核酸分子は、ＨＩＶ核酸分子である。

【0025】

別の態様では、本開示は、本開示の標的核酸分子を検出する方法を含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２を検出する方法を含み、標的核酸分子は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２核酸分子である。

【0026】

別の態様では、本開示は、以下を含むキットを含む：
ｉ．捕捉オリゴヌクレオチドプローブであって、任意選択的にリンカーを介して、任意選択的に固相に結合されている、捕捉オリゴヌクレオチドプローブ、
ｉｉ．揮発性緩衝液を含み、ＮａＣｌを実質的に含まないか、又は架橋剤を含む結合溶液、
ｉｉｉ．オリゴヌクレオチドと二次標的部分とを含む検出オリゴヌクレオチドプローブ、
ｉｖ．レポーター酵素検出プローブであって、レポーター酵素と、二次標的部分に結合することができる二次標的結合部分とを含む、レポーター酵素検出プローブ、並びに／又は
ｖ．本明細書で定義される、基質、固相、標準物質、任意選択的に標準曲線を調製するため又は較正物質を調整するための任意選択的な生成物イオン標準物質、第２の結合溶液、第３の結合溶液、基質反応溶液、イオン化溶液、クエンチ溶液、任意選択的な第２の結合溶液、検出プローブ溶液、基質反応溶液、クエンチ溶液、イオン化溶液のうちの１つ以上。

【0027】

別の態様では、本態様は、
ｉ．二次標的部分又はレポーター酵素で官能化されている修飾プライマーと、
ｉｉ．第２のプライマーと、
ｉｉｉ．修飾プライマーが二次標的部分で官能化されているとき、レポーター酵素検出プローブであって、レポーター酵素及び二次標的部分に結合することができる二次標的結合部分を含む、レポーター酵素検出プローブと、
ｉｖ．本明細書で定義される、基質、固相、標準物質、任意選択的に標準曲線を調製するため又は較正物質を調整するための任意選択的な生成物イオン標準物質、結合溶液、第２の結合溶液、洗浄溶液、基質反応溶液、イオン化溶液、クエンチ溶液、任意選択的な結合溶液、第２の結合溶液、検出プローブ溶液、基質反応溶液、クエンチ溶液、イオン化溶液のうちの１つ以上と、を含むキットを含み、
修飾プライマーがフォワードプライマーであるとき、第２のプライマーはリバースプライマーであり、修飾プライマーがリバースプライマーであるとき、第２のプライマーはフォワードプライマーである。

【0028】

別の態様では、本開示は、配列番号２～３７から選択される配列の核酸を含む。

【0029】

本開示の他の特徴及び利点は、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。しかしながら、詳細な説明及び具体例は、本開示の好ましい実施形態を示しているが、本開示の趣旨及び範囲内の様々な変更及び修飾が本詳細な説明から当業者に明らかとなるため、例示のためにのみ与えられるものであることを理解されたい。
次に、本開示の実施形態を、図面を参照しながら説明する。

【図面の簡単な説明】

【0030】

【図1】真空なしで０．４５ミクロンＰＶＤＦ ９６ウェルフィルタープレートに吸収された捕捉オリゴヌクレオチドプローブを用いて行われた、ウイルスＤＮＡの検出を示す一連のグラフである。パネルＡは、ブランク（トリス緩衝液）、標的核酸分子なし（０標的）及び１００ｆｍｏｌ標的核酸分子（１００ｆｍｏｌ標的）を用いた場合の２６８［Ｍ＋Ｈ］^＋でのＭＳシグナル強度を示す。パネルＢ及びＣは、ｍ／ｚ ２００～４００のスキャンを示す。パネルＤは、１００ｆｍｏｌの標的核酸分子と比較した、標的核酸分子なしのシグナル強度を示す。

【図2】ポリリジン被覆９６ウェルポリスチレンプレートにおいて、プレートにＮＨＳ－ＰＥＧ－ＮＨＳ架橋している捕捉オリゴヌクレオチドプローブによって行われたウイルスＤＮＡの検出を示す一連のグラフである。パネルＡは、ブランク（トリス緩衝液）、標的核酸分子なし（０標的）及び１００ｆｍｏｌ標的核酸分子（１００ｆｍｏｌ標的）を用いた場合の２６８［Ｍ＋Ｈ］^＋でのＭＳシグナル強度を示す。パネルＢ及びＣは、ｍ／ｚ ２００～４００のスキャンを示す。パネルＤは、１００ｆｍｏｌの標的核酸分子と比較した、標的核酸分子なしのシグナル強度を示す。

【図3】アミン反応性Ｎｕｎｃ Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｒ（商標）Ａｍｉｎｏ ９６ウェルポリスチレンプレート上に固定化された捕捉オリゴヌクレオチドプローブを用いて行われたウイルスＤＮＡの検出を示す一連のグラフである。パネルＡは、ブランク（トリス緩衝液）、標的核酸分子なし（０標的）及び１００ｆｍｏｌ標的核酸分子（１００ｆｍｏｌ標的）を用いた場合の２６８［Ｍ＋Ｈ］^＋でのＭＳシグナル強度を示す。パネルＢ及びＣは、ｍ／ｚ ２００～４００のスキャンを示す。パネルＤは、１００ｆｍｏｌの標的核酸分子と比較した、標的核酸分子なしのシグナル強度を示す。

【図4】ＮＯＳ表面化学９６ウェルポリスチレン反応性プレート上に固定化された捕捉オリゴヌクレオチドプローブを用いて行われたウイルスＤＮＡの検出を示す一連のグラフである。パネルＡは、ブランク（トリス緩衝液）、標的核酸分子なし（０標的）及び１００ｆｍｏｌ標的核酸分子（１００ｆｍｏｌ標的）を用いた場合の２６８［Ｍ＋Ｈ］^＋でのＭＳシグナル強度を示す。パネルＢ及びＣは、ｍ／ｚ ２００～４００のスキャンを示す。パネルＤは、１００ｆｍｏｌの標的核酸分子と比較した、標的核酸分子なしのシグナル強度を示す。

【図5】９６ウェルＰＶＤＦフィルタープレート中のポリスチレンオリゴ合成ビーズへの３’結合を有する捕捉オリゴヌクレオチドプローブによって行われたウイルスＤＮＡの検出を示す一連のグラフである。パネルＡは、ブランク（トリス緩衝液）、標的核酸分子なし（０標的）及び１００ｆｍｏｌ標的核酸分子（１００ｆｍｏｌ標的）を用いた場合の２６８［Ｍ＋Ｈ］^＋でのＭＳシグナル強度を示す。パネルＢ及びＣは、ｍ／ｚ ２００～４００のスキャンを示す。パネルＤは、１００ｆｍｏｌの標的核酸分子と比較した、標的核酸分子なしのシグナル強度を示す。

【図6】ガラスにＮＨＳ－ＰＥＧ－ＮＨＳ架橋させた捕捉オリゴヌクレオチドプローブによる、アミノシリル化カバーガラス上で行われたウイルスＤＮＡの検出を示す一連のグラフである。パネルＡは、ブランク（トリス緩衝液）、標的核酸分子なし（０標的）及び１００ｆｍｏｌ標的核酸分子（１００ｆｍｏｌ標的）を用いた場合の２６８［Ｍ＋Ｈ］^＋でのＭＳシグナル強度を示す。パネルＢ及びＣは、ｍ／ｚ ２００～４００のスキャンを示す。パネルＤは、１００ｆｍｏｌの標的核酸分子と比較した、標的核酸分子なしのシグナル強度を示す。

【図7】９６ウェルプレートにおいてポリスチレンオリゴ合成ビーズに結合した捕捉オリゴヌクレオチドプローブを用いてＨＩＶ ＤＮＡを検出するための結合緩衝液中の、ＮａＣｌの最適化から得られた結果を示す一連のグラフである。パネルＡは、異なる濃度のＮａＣｌについての２６８．２ｍ／ｚにおける２回の注入の平均シグナル強度を示す。パネルＢは、各ランのシグナル強度を示す。（Ｂはトリス緩衝液を用いたブランクであり、０、０．０５、０．１、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．５、２．０はＮａＣｌのモル濃度を示し、０ ｔｇｔは標的核酸分子を含まない）。

【図8】９６ウェル０．４５ｕｍ高結合ＰＶＤＦフィルタープレート中のポリスチレンオリゴ合成ビーズに連結された捕捉オリゴヌクレオチドプローブとのハイブリダイゼーション中及びハイブリダイゼーション後における、ＨＩＶ ＤＮＡを検出するための結合緩衝液中の重炭酸アンモニウムの最適化から得られた結果を示す一連のグラフである。パネルＡは、比較として、異なる濃度の重炭酸アンモニウム及び１ Ｍ ＮａＣｌについての、２６８．２ｍ／ｚにおける２回の注入の平均シグナル強度を示す。パネルＢは、各ランのシグナル強度を示す。（Ｂはトリス緩衝液を用いたブランクであり、０、０．１、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．５、２．０、２．５は重炭酸アンモニウムのモル濃度を示す）。

【図9】９６ウェル０．４５ｕｍ高結合ＰＶＤＦフィルタープレート中のポリスチレンオリゴ合成ビーズに連結された捕捉オリゴヌクレオチドプローブによる、ＨＩＶ ＤＮＡとのハイブリダイゼーション後の、１．５Ｍ ＮａＣｌの代わりに異なる揮発性緩衝液、すなわちエタノールアミン、酢酸アンモニウム、重炭酸アンモニウム及び重炭酸トリエチルアンモニウムを用いた結果を示す一連のグラフである。パネルＡは、Ｘ軸上に示された濃度の様々な揮発性緩衝液及び比較としての１．５Ｍ ＮａＣｌの異なる濃度についての、２６８．２ｍ／ｚにおける２回の注入の平均シグナル強度を示す。パネルＢは、各ランのシグナル強度を示す。（Ｒｘｎ Ｂは、トリス緩衝液を用いたブランクである）。

【図10】１０～５５％の異なるパーセンテージのエタノールを、検出酵素（ＡＰＳＡ）結合ステップ及び洗浄ステップにおいて使用した場合の、ＨＩＶ標的ＤＮＡ検出のＭＳシグナル強度を示すグラフを示す（カラム５～１０）。列１～３は、反応緩衝液対照（列１）、検出酵素（ＡＰＳＡ）結合ステップ又は洗浄ステップのいずれかにおいて塩を含まない対照（列２）、並びにハイブリダイゼーションステップにおいて１．５Ｍ ＮａＣｌを使用し、検出酵素（ＡＰＳＡ）結合ステップ及び洗浄ステップにおいてＮａＣｌを使用しなかった対照（列３）を含む、陰性対照についての結果を示す。列４は、陽性対照を示し、１．５Ｍ ＮａＣｌをハイブリダイゼーションステップ並びに検出酵素（ＡＰＳＡ）結合ステップ及び洗浄ステップに使用した。

【図11】ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ ＤＮＡ検出アッセイにおいてｍ／ｚ＝２６７．７４～２６８．７４で測定されたＭＳシグナル強度のグラフを示し、ここで、１．５Ｍ ＮａＣｌ、２Ｍエタノールアミン、０．５Ｍ炭酸水素トリエチルアンモニウム、２Ｍスクロース又は２Ｍグリシンを、ハイブリダイゼーションステップ、検出酵素（ＡＰＳＡ）結合ステップ及び洗浄ステップで使用し、あるいは、１．５Ｍ ＮａＣｌをハイブリダイゼーションステップで使用し、２Ｍエタノールアミン、０．５Ｍ炭酸水素トリエチルアンモニウム、２Ｍスクロース又は２ＭグリシンをＮａＣｌなしで検出酵素（ＡＰＳＡ）結合ステップ及び洗浄ステップで使用した。

【図12】実施例１１のＰＣＲ生成物を示すポリアクリルアミドゲルを示し、ここで、レーン１は、直接ロード広範囲分子量マーカー（５μｌ）に対応し、レーン２は、プライマーコンビネーション１を用いて得られたＰＣＲ生成物に対応し、レーン４は、プライマーコンビネーション２を用いて得られたＰＣＲ生成物に対応し、レーン６は、プライマーコンビネーション３を用いて得られたＰＣＲ生成物に対応し、レーン４は、プライマーコンビネーション４を用いて得られたＰＣＲ生成物に対応し、レーン３、５、７及び９は、テンプレートプラスミドＤＮＡを使用しなかったコントロールランに対応し、レーン１０は、ネガティブコントロール（４μｌのＤＮＡローディング緩衝液）に対応する。

【図13】ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２セット１ ＰＣＲプライマー（配列番号２及び３）並びに０テンプレート（レーン０）、微量テンプレート（レーン１）及び線形希釈系列（０．１ｎｇ、１ｎｇ、１０ｎｇ、５０ｎｇ、レーン２～５）の異なる量のテンプレート、を使用したＳＡＲＳ－ＣｏＶ２のＰＣＲ増幅生成物を示すポリアクリルアミドゲルを示す。レーン６～１０は、１０ｎｇのテンプレート及び異なる量のＭｇ^２＋を使用したＰＣＲ生成物を示す（それぞれ２ｍＭ、２．５ｍＭ、３．０ｍＭ、３．５ｍＭ、又は４．０ｍＭのＭｇ^２＋）。

【図14】テンプレートＤＮＡなし（０ ＮＣ）、テンプレートＤＮＡとしてＰｕＣ１９（ＰＣＲの陰性対照）、微量のＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ヌクレオキャプシド遺伝子（Ｔ）を有するプラスミド、及び異なる量のＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ヌクレオキャプシド遺伝子を有するプラスミド（１０ｆｇ、１００ｆｇ、１ｐｇ、１０ｐｇ、及び１００ｐｇ、それぞれ１０、１００、１０００、１０，０００、及び１００，０００に対応する）を用いて、３’で固体支持体に結合した捕捉オリゴヌクレオチドプローブ（配列番号６）及び５’－ビオチン化検出オリゴヌクレオチド（配列番号５）を使用する本開示のＤＮＡ検出アッセイによって、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ヌクレオキャプシド遺伝子のＰＣＲ生成物を検出したときの、ｍ／ｚ＝２６７．７４～２６８．７４で観察されたＭＳシグナルの相対存在量のグラフを示す。

【図15A】例えば、仮想ＰＣＲ又は他の生成物の検出を示す例示的な概略図を示す。核酸標的は、ＤＮＡ又はＲＮＡとすることができる。

【図15B】例えば、ＰＣＲ生成物の検出を例示する概略図を示す。プライマーは、Ａ／Ｂによって表され得、それは、それがタグ付けされていないか、又は例えばビオチンでタグ付けされていてもよく、あるいはＣ／Ｄによって表されてもよく、それは、それが固体表面に結合していないか、又は結合していてもよいことを示す。

【図16】ＤＮＡ検出アッセイのｍ／ｚ＝２６７．７４～２６８．７４で測定されたＭＳシグナル強度のグラフを示し、ここで、（ｉ）ハイブリダイゼーションステップ及び洗浄ステップは、塩の存在下で行われ、（ｉｉ）ハイブリダイゼーションステップ及びＡＰＳＡの結合は、塩の存在下で行われ、続いて標的：検出：酵素複合体を、Ｔｒｉｓ緩衝液中での酵素反応の前にグルタルアルデヒド（ＧＡ）と架橋し、（ｉｉｉ）ハイブリダイゼーションステップ及びＡＰＳＡの結合を塩の存在下で行い、続いて重炭酸アンモニウム緩衝液（ＡＭＢＩＣ）又はエタノールアミン緩衝液（ＥＡ）のいずれかを含む揮発性洗浄溶液で洗浄し、酵素反応を重炭酸アンモニウム緩衝液（ＡＭＢＩＣ）又はエタノールアミン緩衝液（ＥＡ）のいずれかを含む揮発性基質反応用緩衝液中で行い、あるいは（ｉｖ）ハイブリダイゼーションステップ及びＡＰＳＡの結合を塩の存在下で行い、続いて酵素反応を（ポリマー（ＰＥＧ）又はデキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）の存在下で行った。１０ｍＭ ＴｒｉｓをＭＳ測定の陰性対照として使用した。０標的核酸（０）を、ＤＮＡ検出アッセイの陰性対照として使用する。

【図17】本開示の例示的な方法を示すフローチャートを示す。

【図18】ｌｏｇ１０（アトモル＋１）の異なる濃度（ｌｏｇスケール、ｘ軸）の標的ヌクレオチド酸分子（１μＬを注入した場合の０～１００ピコモル濃度）におけるＨＩＶ ＤＮＡ検出アッセイのＭＳシグナル強度（ｌｏｇスケール、ｙ軸、強度ｍ／ｚ＝２６８）のグラフを示す。

【図19】０～１００ｎＭ濃度のｌｏｇ１０（ピコモル＋１）の異なる濃度の標的核酸（ｌｏｇスケール、ｘ軸）におけるＳＡＲＣ－ＣｏＶ２ ＤＮＡ検出アッセイのＭＳシグナル強度（ｌｏｇスケール、ｙ軸、ｍ／ｚ＝２６８）のグラフを示し、ここで、１マイクロリットルをＨＰＬＣカラムに（すなわち、カラム上に０～１００フェムトモルを）注入した。

【図20】異なる濃度のＨＩＶ ＤＮＡ標的核酸分子（１ｐＭ～５００ｐＭ）におけるｍ／ｚ １３６でのＭＳシグナル強度のグラフを示す。

【図21】異なる濃度のＳＡＲＳ－ＣｏＶ ２標的核酸分子（１００ｆＭ～１０ｎＭ）におけるｍ／ｚ １３６でのＭＳシグナル強度のグラフを示す。

【図22】異なる濃度のＳＴＥＣ標的核酸分子（１ｐＭ～１ｎＭ）におけるｍ／ｚ １３６でのＭＳシグナル強度のグラフを示す。

【図23】異なる濃度の溶血素標的核酸分子（１ｐＭ～１ｎＭ）におけるｍ／ｚ １３６でのＭＳシグナル強度のグラフを示す。

【図24A】異なる濃度のＨＩＶ ２５８ｎｔ ＰＣＲ生成物標的核酸分子におけるｍ／ｚ １３６でのＭＳシグナル強度のグラフを示す。

【図24B】漸増量のＨＩＶプラスミドを使用したＰＣＲ反応を示すＧｅｌＲｅｄ染色アガロースゲルの画像を示す。

【図24C】図２４Ｂにおけるバンドの定量化のグラフを示す。

【図25】異なる濃度のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２標的核酸分子におけるｍ／ｚ １３６でのＭＳシグナル強度のグラフを示す。

【図26】異なる濃度のＨＩＶ標的核酸分子（１００ｆＭ～１００ｎＭ）におけるｍ／ｚ １３６でのＭＳシグナル強度のグラフを示す。

【図27】異なる濃度のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２標的核酸分子（１ｐＭ～１μＭ）におけるｍ／ｚ ２６８でのＭＳシグナル強度のグラフを示し、ここで、捕捉物はＰＶＤＦに結合している。

【図28A】ゲルの画像を示し、上のパネルは、ビオチン化ＨＩＶフォワードプライマー３及び非標識ＨＩＶリバースプライマー３を用いて生成されたＰＣＲ生成物を示し、下のパネルは、非標識ＨＩＶフォワードプライマー３及びビオチン化ＨＩＶリバースプライマー３を用いて生成されたＰＣＲ生成物を示す。

【図28B】ビオチン標識ＨＩＶフォワードプライマー及び非標識ＨＩＶリバースプライマーを使用した、異なる濃度のＨＩＶテンプレートにおけるｍ／ｚ １３６でのＭＳシグナル強度のグラフを示す。

【図28C】非標識ＨＩＶフォワードプライマー及びビオチン標識ＨＩＶリバースプライマーを使用した、異なる濃度のＨＩＶテンプレートにおけるｍ／ｚ １３６でのＭＳシグナル強度のグラフを示す。

【図29】ＰＤＶＦ上に固定化されたＨＩＶ合成標的についてのｍ／ｚ １３６でのＭＳシグナル強度のグラフを示す。

【図30A】様々なＣＯＶＩＤ－１９ ＰＣＲ反応を示すゲルの画像を示す。

【図30B】異なる濃度のＣＯＶＩＤ－１９テンプレートでのＣＯＶＩＤ－１９ ＰＣＲ反応を示すゲルの画像を示す。

【発明を実施するための形態】

【0031】

Ｉ．定義
別段の指示がない限り、本セクション及び他のセクションに記載される定義及び実施形態は、当業者によって理解されるように、それらが適切である、本明細書に記載される本開示の全ての実施形態及び態様に適用可能であることが意図される。

【0032】

本明細書で使用される「又は」、「及び／又は」という用語は、列挙された項目が個別に又は組み合わせて存在する、又は使用されることを意味する。実際には、この用語は、列挙された項目「のうちの少なくとも１つ」又は「１つ以上」が使用又は存在することを意味する。

【0033】

本開示において使用されるとき、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、その内容が明らかに他を指示しない限り、複数の言及を含む。例えば、「化合物」を含む実施形態は、１つの化合物又は２つ以上の更なる化合物を有する特定の態様を提示すると理解されるべきである。

【0034】

追加の又は第２の化合物などの、「追加の」又は「第２の」成分を含む実施形態では、本明細書で使用される第２の成分は、他の成分又は第１の成分とは化学的に異なる。「第３の」成分は、他の成分、第１の成分、及び第２の成分とは異なり、更に列挙された成分又は「追加の」成分も同様に異なる。

【0035】

本開示及び特許請求の範囲で使用されるとき、用語「含む（comprising）」（及び「含む（comprise）」及び「含む（comprises）」などの任意の形態の、含む）、「有する（having）」（及び「有する（have）」及び「有する（has）」などの任意の形態の、有する）、「含む（including）」（及び「含む（include）」及び「含む（includes）」などの任意の形態の、含む）、又は「含有する（containing）」（及び「含有する（contain）」及び「含有する（contains）」などの任意の形態の、含有する）は、包括的又はオープンエンドであり、追加の列挙されていない要素又はプロセスステップを除外しない。

【0036】

本明細書で使用される「からなる」という用語及びその派生語は、述べられた特徴、要素、構成要素、群、整数、及び／又はステップの存在を指定し、また、他の述べられていない特徴、要素、構成要素、群、整数、及び／又はステップの存在は除外する、クローズドエンドの用語であることが意図される。

【0037】

本明細書で使用される「から本質的になる」という用語は、述べられた特徴、要素、構成要素、群、整数、及び／又はステップ、並びに、それらの特徴、要素、構成要素、群、整数、及び／又はステップの基本的かつ新規な特性に実質的に影響を及ぼさないものの存在を指定することが意図される。

【0038】

本明細書で使用される「適切な」という用語は、特定の化合物又は条件の選択が、行われる特定の合成操作、形質転換される分子の同一性、及び／又は化合物の特定の使用に依存するが、選択が、十分に当業者の技能の範囲内であることを意味する。

【0039】

本明細書で使用される「アミン」又は「アミノ」という用語は、それが単独で使用されるか別の基の一部として使用されるかに拘わらず、一般式ＮＲ’Ｒ’’ここで、Ｒ’及びＲ’’は、水素又はＣ_１～６アルキルから各々独立して選択される。

【0040】

本明細書で使用される「ａｔｍ」という用語は、大気を指す。

【0041】

本明細書で使用される「ＭＳ」という用語は、質量分析を指す。

【0042】

本明細書で使用される「ａｑ．」という用語は、水性を指す。

【0043】

本明細書で使用されるＭｅＯＨはメタノールを指す。

【0044】

本明細書で使用されるＭｅＣＮは、アセトニトリルを指す。

【0045】

本明細書で使用されるＨＣｌは、塩酸を指す。

【0046】

本明細書で使用されるμ波は、マイクロ波反応容器を指す。

【0047】

ＬＣＭＳは、本明細書で使用するとき、液体クロマトグラフィー－質量分析を指す。

【0048】

本明細書で使用されるＴＲＩＳは、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを指す。

【0049】

本明細書で使用されるＥＤＴＡは、エチレンジアミン四酢酸を指す。

【0050】

本明細書で使用される「アデノシン一リン酸」又は「ＡＭＰ」という用語は、以下の構造を有する化合物：

【0051】

【化1】

【0052】

又はその薬学的に許容される塩若しくは溶媒和物並びにそれらの混合物を意味する。ＡＭＰは、例えばＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから入手することができる。

【0053】

［００１３３］本明細書で使用される「Ａｍｐｌｅｘ（登録商標）Ｒｅｄ」又は「ＡＲ」という用語は、

【0054】

【化2】

【0055】

又はその薬学的に許容される塩若しくは溶媒和物並びにそれらの混合物を意味する。Ａｍｐｌｅｘ（登録商標）Ｒｅｄは、例えば、構造的に関連し、式７－ヒドロキシ－３Ｈ－フェノキサジン－３－オン１０－オキシドを有するレサズリン（Resazurin）から得ることができ、Ａｍｐｌｅｘ（登録商標）Ｒｅｄとも呼ばれる。したがって、本明細書で使用されるＡｍｐｌｅｘ（登録商標）Ｒｅｄは、ＡＲ及びレサズリンの両方を含む。

【0056】

「５－ブロモ－４－クロロ－３－インドリルホスフェート」又は「ＢＣＩＰ」という用語は、本明細書で使用されるとき、以下の構造：を有する化合物：

【0057】

【化3】

【0058】

又はその薬学的に許容される塩若しくは溶媒和物並びにそれらの混合物を意味する。ＢＣＩＰは、例えばＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから入手することができる。

【0059】

本明細書中で使用されるとき、用語「イオン化可能な生成物」は、レポーター酵素によって生成される、１つ以上のイオン化可能な基を含む生成物を意味する。例えば、イオン化可能な生成物は、正のイオン化のための１つ以上の塩基性又はアミン基、及び負のイオン化のための１つ以上の酸性又はヒドロキシル基を有し得る。イオン化可能な基としては、＝ＮＨ、－ＮＨ２、グアニジニウム、メチル、エチル、アルキル、フェニル、リボース、イノシトール、リン脂質、炭水化物、核酸、カルボニル、アルデヒド、ケトン、カルボキシル、ヒドロキシル、エノール、グアニジウム、イミダゾール、スルフヒドリル、ジスルフィド、スルフェート、ホスフェート、スルホニル、ニトレート、一酸化窒素、チオエステル、エステル、エーテル、無水物、ホスホリル、混合無水物、及び／又は当該分野で公知の他のイオン化可能な基が挙げられ得る。評価されたイオン化可能な生成物は、任意選択的に、エレクトロスプレーイオン化によって気相に効率的に入る。

【0060】

本明細書で使用される用語「Ｌ－（＋）－２－アミノ－６－ホスホノヘキサン酸」は、

【0061】

【化4】

【0062】

又はその薬学的に許容される塩若しくは溶媒和物並びにそれらの混合物を意味する。Ｌ－（＋）－２－アミノ－６－ホスホノヘキサン酸は、例えば、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから得ることができる。

【0063】

本明細書で使用される「Ｌｕｍｉｇｅｎ（登録商標）ＴＭＡ－３」又は「ＴＭＡ－３」という用語は、

【0064】

【化5】

【0065】

又はその薬学的に許容される塩若しくは溶媒和物並びにそれらの混合物を意味する。ＴＭＡ－３は、例えばＢｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｃｏｍｐａｎｙから入手することができる。

【0066】

本明細書で使用される「Ｌｕｍｉｇｅｎ（登録商標）ＴＭＡ－６」又は「ＴＭＡ－６」という用語は、

【0067】

【化6】

【0068】

又はその薬学的に許容される塩若しくは溶媒和物並びにそれらの混合物を意味する。ＴＭＡ－６は、例えばＢｅｃｋｍａｎｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｃｏｍｐａｎｙから入手することができる。

【0069】

本明細書で使用される「４－メチルウンベリフェリルホスフェート」又は「４－ＭＵＰ」という用語は、以下の構造を有する化合物：

【0070】

【化7】

【0071】

又はその薬学的に許容される塩若しくは溶媒和物並びにそれらの混合物を意味する。４－ＭＵＰは、例えばＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから入手することができる。

【0072】

本明細書で使用される「ナフトールＡＳＭＸホスフェート」という用語は、以下の構造：を有する化合物：

【0073】

【化8】

【0074】

又はその薬学的に許容される塩若しくは溶媒和物並びにそれらの混合物を意味する。ナフトールＡＳＭＸホスフェートは、例えばＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから得ることができる。

【0075】

用語「Ｏ－ホスホ－ＤＬ－スレオニン」という用語は、以下の構造：を有する化合物：

【0076】

【化9】

【0077】

又はその薬学的に許容される塩若しくは溶媒和物並びにそれらの混合物を意味する。Ｏ－ホスホ－ＤＬ－スレオニンは、例えば、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから得ることができる。

【0078】

本明細書で使用される「パラニトロフェノールホスフェート」又は「ＰＮＰＰ」という用語は、以下の構造を有する化合物：

【0079】

【化10】

【0080】

又はその薬学的に許容される塩若しくは溶媒和物並びにそれらの混合物を意味する。パラニトロフェノールホスフェートは、例えば、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから得ることができる。

【0081】

本明細書で使用される用語「フェニルベンゼンωホスホノ－α－アミノ酸」は、以下の構造：を有する化合物：

【0082】

【化11】

【0083】

又はその薬学的に許容される塩若しくは溶媒和物並びにそれらの混合物を意味する。ホスホノ－ａ－アミノ酸を有するフェニルベンゼンは、例えばＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから得ることができる。

【0084】

本明細書で使用される「ピリドキサミン５－リン酸」又は「ＰＡ５Ｐ」という用語は、以下の構造を有する化合物：

【0085】

【化12】

【0086】

又はその薬学的に許容される塩若しくは溶媒和物並びにそれらの混合物を意味する。ＰＡ５Ｐは、例えばＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから入手することができる。

【0087】

本明細書で使用される「スフィンゴシン－１リン酸」という用語は、以下の構造を有する化合物：

【0088】

【化13】

【0089】

又はその薬学的に許容される塩若しくは溶媒和物並びにそれらの混合物を意味する。スフィンゴシン－１リン酸は、例えば、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから得ることができる。

【0090】

用語「検出オリゴヌクレオチドプローブ」は、本明細書中で使用されるとき、二次標的部分（例えば、ビオチン）に結合されたオリゴヌクレオチドを含み、ここで、このオリゴヌクレオチド又はその一部は、標的核酸分子（例えば、細菌、ウイルス又は真菌の核酸配列が挙げられるが、これらに限定されない）に相補的であり、そして選択的に結合する。検出オリゴヌクレオチドプローブは、いくつかの実施形態では、検出オリゴヌクレオチドプライマーとすることができる。検出オリゴヌクレオチドプローブはまた、任意選択的に、二次標的部分（例えば、ビオチン）に結合させることができる。検出オリゴヌクレオチドプローブはまた、任意選択的に、レポーター酵素のような酵素に結合させることができる。例えば、検出オリゴヌクレオチドは、リボザイム、ドナザイム（ＤＮＡｚｙｍｅ）、ホスファターゼ（例えば、ＡＰ）、ペルオキシダーゼ（例えば、ＨＲＰ）、ＤＮＡポリメラーゼ、又はグルコースオキシダーゼを含むがこれらに限定されない酵素又は触媒に任意に結合させることができる。例えば、検出オリゴヌクレオチドプローブは、標的核酸分子の配列に相補的な一本鎖オリゴヌクレオチド配列を含むことができ、ハイブリダイゼーションを介して標的核酸分子に選択的に結合することができる。

【0091】

二次標的部分及び二次標的結合部分は、二次標的部分及び二次標的結合部分が互いに選択的に結合するように、高い相互親和性を有することを、当業者は理解することができる。したがって、適切な二次標的結合部分は、二次標的部分の性質に基づいて当業者によって選択され得、逆もまた同様であることを、当業者は理解することができる。以下のリストは、選択的に結合する化学物質のペアの非限定的な例を含む。二次標的部分及び二次標的結合部分は、以下に列挙される化学物質のペアから選択することができる。例えば、二次標的部分はビオチンとすることができる。例えば、二次標的結合部分は、アビジン又はストレプトアビジンとすることができる。

【0092】

化学物質同士の高親和性選択的結合ペアのリスト：

【0093】

【表1】

【0094】

本明細書で使用される「オリゴヌクレオチド」という用語は、天然に存在する塩基、糖及び糖間結合（骨格）からなるヌクレオシド又はヌクレオチドモノマーの配列を指す。この用語はまた、天然に存在しないモノマー又はその一部を含む、改変又は置換された配列を含む。本出願の核酸配列は、デオキシリボ核酸配列（ＤＮＡ）又はリボ核酸配列（ＲＮＡ）であってもよく、アデニン、グアニン、シトシン、チミジン及びウラシルを含む天然に存在する塩基を含み得る。配列は修飾塩基を含んでいてもよい。かかる修飾塩基の例としては、アザ及びデアザアデニン、グアニン、シトシン、チミジン及びウラシル、並びにキサンチン及びヒポキサンチンが挙げられる。核酸は、二本鎖又は一本鎖のいずれかとすることができ、センス鎖又はアンチセンス鎖を表す。例えば、捕捉配列、検出配列、標的配列又はプライマー配列はオリゴヌクレオチドとすることができる。

【0095】

用語「レポーター酵素検出プローブ」は、本明細書中で使用されるとき、二次標的結合部分（例えば、二次標的部分がビオチンであるとき、アビジン又はストレプトアビジン）を含む検出プローブ成分に結合された、酵素活性を含むレポーター酵素成分を含む。レポーター酵素は、任意選択的に、ペルオキシダーゼ（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ）又はホスファターゼ（例えば、アルカリホスファターゼ）であるが、イオン化可能な生成物を生成し得る任意の安定な酵素（例えば、リアーゼ、ヒドロラーゼ、シンターゼ、シンテターゼ、オキシドレダクターゼ、デヒドロゲナーゼ、オキシダーゼ、トランスフェラーゼ、イソメラーゼ、リガーゼ、プロテアーゼ（例えば、トリプシン）、プロテイナーゼ、ペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、ミエロペルオキシダーゼ、オキシダーゼ、モノオキシゲナーゼ、シトクロム、ホスファターゼ（例えば、アルカリホスファターゼ）、デカルボキシラーゼ、リパーゼ、カスパーゼ、アミラーゼ、ペプチダーゼ、トランスアミナーゼ、及びキナーゼを含む）を使用することができる。更なる酵素としては、ＤＮＡ又はＲＮＡポリメラーゼ、ＴＡＱ、制限酵素、クレノーフラグメント、ＤＮＡリガーゼを挙げることができる。二次標的結合部分は、検出オリゴヌクレオチドプローブの二次標的部分に選択的に結合する。例えば、二次標的結合部分は、ビオチン化検出オリゴヌクレオチドプローブに選択的に結合するアビジン又はストレプトアビジンを含む（例えば、二次標的部分はビオチンを含む）。

【0096】

プローブ、任意選択的にオリゴヌクレオチドに関して本明細書で使用される「選択的」という用語は、プローブ、任意選択的にオリゴヌクレオチドの結合特性を特徴付けるために文脈上使用される。例えば、所定の標的核酸分子に選択的に結合するオリゴヌクレオチドプローブは、別の異なる標的核酸分子と比較して、より高いアビディティ又はより高い特異性のいずれかでその標的核酸分子に結合する。一実施形態では、プローブ、任意選択的にオリゴヌクレオチドプローブは、少なくとも２倍、３倍、又は５倍の効率で、任意選択的に３～５倍、５～７倍、７～１０、１０～１５、５～１５、又は５～３０倍の効率で、結合する。

【0097】

本明細書で使用される「標的核酸分子」という用語は、検出オリゴヌクレオチドプローブのオリゴヌクレオチド部分に相補的な配列を含む任意の核酸ポリマーを指す。例えば、標的核酸分子は、ＲＮＡ若しくはＤＮＡ、又はそれらの誘導体とすることができる。標的核酸は、少なくとも３０ヌクレオチド長である任意の核酸とすることができる。例えば、標的核酸分子は、約若しくは少なくとも３０ヌクレオチド、約若しくは少なくとも４０ヌクレオチド、約若しくは少なくとも５０ヌクレオチド、約若しくは少なくとも８０ヌクレオチド、約若しくは少なくとも１００ヌクレオチド、約若しくは少なくとも１３０ヌクレオチド、約若しくは少なくとも１８０ヌクレオチド、約２００ヌクレオチド、約２５０ヌクレオチド、約３００ヌクレオチド、約３５０ヌクレオチド、約４５０ヌクレオチド、約６００ヌクレオチド、約７００ヌクレオチド、約８５０ヌクレオチド、又は約１０００ヌクレオチドとすることができる。いくつかの実施形態では、標的核酸分子は、約３０ヌクレオチド～約１５００ヌクレオチド長である。例えば、標的核酸分子は、約３０ヌクレオチド～約１０００ヌクレオチド長、約３０ヌクレオチド～約３００ヌクレオチド長、約１００ヌクレオチド～約５００ヌクレオチド長、約１００ヌクレオチド～約６００ヌクレオチド長、約１００ヌクレオチド～約７００ヌクレオチド長、約１００ヌクレオチド～約８００ヌクレオチド長、約１００ヌクレオチド～約９００ヌクレオチド長、又は約１００ヌクレオチド～約１０００ヌクレオチド長である。例えば、標的核酸分子は、一本鎖又は二本鎖とすることができる。例えば、標的核酸分子は、プラスミドＤＮＡ、細菌、ウイルス若しくは真菌の核酸分子、又は例えば哺乳動物若しくは植物の遺伝子若しくはｍＲＮＡ中の核酸であり得る。標的核酸はまた、核酸タグを有する化合物などの検出のための合成核酸とすることができる。

【0098】

ＩＩ．方法及びキット
本明細書に記載されるのは、フェムトモルからピコモル範囲及び／又はそれ未満の核酸分子の検出を可能にする変革的技術である。ゼプトモルからアトモルの範囲での測定が達成できることが本明細書において実証されている。

【0099】

酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）は、生物医学的に重要なポリペプチド分子の反復定量分析のための好ましい分析方法であり、すなわちＥＬＩＳＡは、重要な各分析物を捕捉して結合する特異的検出抗体に結合された西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）及び／又はアルカリホスファターゼ（ＡＰ）などのレポーター酵素を使用し得る（Ｅｎｇｖａｌｌ，１９７１；Ｖａｎ Ｗｅｅｍｅｎ １９７１）。

【0100】

現在、レポーター酵素である西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）又はアルカリホスファターゼ（ＡＰ）の基質は、着色、蛍光又は発光生成物を生じる。本開示は、質量分析によって測定される高いシグナル対ノイズ比で効率的にイオン化するレポーター酵素の酵素生成物を検出するための方法を提供する。質量分析は、ＥＣＬ、蛍光又は比色法よりはるかに低い量での検出を可能にするのに十分な感度であるのみならず、別個のｍ／ｚ値での複数の基質及び生成物のモニタリングも可能にする。本明細書に記載の方法を用いて、通常の産業用レポーター酵素の生成物を、アトモル量以下の定量限界でゼプトモル量以下まで測定することが可能である。

【0101】

小分子を測定するための質量分析の使用は、一般に、高いシグナル対ノイズ比で、フェムトからピコモルレベルに達し得る。例えば、産業用酵素ＨＲＰ又はＡＰは、頑丈で耐久性があり、新しい小分子生成物の生成のための高い触媒速度を有する。ＡＰ又はＨＲＰ酵素は、例えばポリペプチド又は抗体などの特異的検出プローブに共有結合され、それらの標的に結合し、次いで短時間のインキュベーションの過程で多くの異なる生成物反応を触媒し得る。したがって、アトモル、又は更にはアトモル未満の量の酵素－プローブの結合は、ＬＣ－ＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳによる検出可能な範囲内に十分にあるフェムトモルからピコモルの範囲で蓄積する小分子生成物の量を生じる。

【0102】

液体クロマトグラフィーエレクトロスプレーイオン化及びタンデム質量分析（ＬＣ－ＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳ）は、比色検出、蛍光検出又はＥＣＬ検出よりも感度が高い。報告された分子の酵素的生成と、高度にイオン化可能な基質についての高感度質量分析との組み合わせは、同位体で標識された標準又は同位体で標識されたプローブを必要とせずに、ＲＩＡを超える感度を提供するはずである。

【0103】

ＨＲＰ及びＡＰの定量は、ＡＰ及びＨＲＰレポーター酵素反応の生成物を検出するためのＬＣ－ＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳを使用して実証されている。質量分析計はまた、抗体のような特異的分子プローブに結合したレポーター酵素活性の小分子生成物を検出し得ることが、本明細書中で実証されている。検出抗体などの特異的分子プローブに結合したＡＰ又はＨＲＰなどの１アトモル以下のレポーター酵素は、ＬＣ－ＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳの信頼できる検出及び定量限界内で十分に、フェムトモルからピコモル量のレポーター酵素反応生成物を迅速に形成する。したがって、ＥＬｉＭＳＡ及び関連するＤＮＡ方法（例えば、ＤＮＡ ＥＬｉＭＳＡ）において、ＨＲＰ又はＡＰのようなレポーター酵素は、質量分析によって容易に区別及び検出され得る範囲の生成物を生成し得る。生物医学的用途及び環境的用途において広く使用されているレポーター酵素に結合した抗体は、現在、高感度で柔軟な系を作製するために、非常に高感度の質量分析を使用して検出及び定量することができる。質量分析計は、多くの分析物を同時に分離及び分析し得るので、本明細書中に記載される方法を使用して、多くの異なる抗原の同定及び定量化を、直接質量分析によって可能であるレベルよりもはるかに低いレベルまで同時に可能にし得る。

【0104】

この反応はレポーター酵素依存的である。例えば、レポーター酵素検出プローブによって作用され得る基質を適切な基質反応溶液中でインキュベートすることは、レポーター酵素検出プローブの非存在下でシグナルをほとんど又は全く生成しないことが本明細書において実証されている。対照的に、ＨＲＰ又はＡＰを含むレポーター酵素検出プローブの添加は、ＥＬｉＭＳＡ生成物イオンの強い検出をもたらした。生成物イオンは、酵素の存在に依存し、時間及び濃度の両方に依存することが示されている。したがって、ＥＬｉＭＳＡ生成物イオンは、酵素依存アッセイの全ての特徴を示す。

【0105】

レポーター酵素又は酵素基質に依存して、異なるイオン化可能な生成物が検出され得る。それらのフラグメントも検出することができる。例えば、アデノシンはイオン化され得、２６８ｍ／ｚで検出され得るか、又はフラグメント化され得、フラグメントは１３６ｍ／ｚで検出され得る。

【0106】

実施例に示すように、捕捉オリゴヌクレオチドプローブを使用して、標的核酸分子を捕捉することができる。他の例において、標的核酸分子は、固体支持体（例えば、固相）に直接的に共有結合又は非共有結合され得、標識された検出プローブ、任意選択的に標識されたプライマーが、結合された標的核酸分子を検出するために使用され得る。

【0107】

一態様では、本開示は、
ａ．
ｉ．標的核酸分子を含むと推定される試料を、標的核酸分子に相補的な配列を含み、かつ固相に付着している捕捉オリゴヌクレオチドプローブと共に、第１の結合溶液中で、インキュベートすることであって、任意選択的に、固相がリンカーを介して捕捉オリゴヌクレオチドプローブに付着している、インキュベートすること、又は
ｉｉ．標的核酸分子を含むと推定される試料を、固相と共にインキュベートして、第１の結合溶液中で、当該試料／標的核酸分子を当該固相に付着させることであって、任意選択的に、固相がリンカーを介して試料／標的核酸分子に付着している、インキュベートすることと、
ｂ．標的：検出複合体を形成するための条件下で、第２の結合溶液中で、任意の標的核酸分子を検出オリゴヌクレオチドプローブに結合させることと、
ｃ．標的：検出：酵素複合体を形成するための条件下で、第３の結合溶液中で、任意の標的：検出複合体をレポーター酵素検出プローブと共にインキュベートすることと、
ｄ．洗浄溶液で固相を洗浄して、任意の未結合のレポーター酵素検出プローブを除去することと、
ｅ．基質反応溶液中で、任意の標的：検出：酵素複合体を、レポーター酵素検出プローブ基質と共にインキュベートして、１つ以上のイオン化可能な生成物を生成することと、
ｆ．質量分析（ＭＳ）を使用して、１つ以上のイオン化可能な生成物のうちの少なくとも１つを検出することと、を含み、
ｉ．第１の結合溶液、第２の結合溶液、及び第３の結合溶液のうちの少なくとも第３の結合溶液が、無機塩を実質的に含まず、
ｉｉ．洗浄溶液が、無機塩を実質的に含まず、
ｉｉｉ．方法が、任意の標的：検出：酵素複合体の成分と、捕捉オリゴヌクレオチドプローブとを、任意選択的なステップｄ）及びステップｅ）の前に、架橋することを更に含み、かつ／又は
ｉｖ．方法が、ＭＳを使用して検出する前に、１つ以上のイオン化可能な生成物を分離することを更に含み、
１つ以上のイオン化可能な生成物のうちの少なくとも１つの検出が、試料が標的核酸分子を含むことを示す、標的核酸分子を検出する方法を含む。

【0108】

検出オリゴヌクレオチドプローブは、検出オリゴヌクレオチドプライマーであり得る。かかる場合、ステップは、増幅溶液中で検出オリゴヌクレオチドプライマーを用いて標的核酸分子を増幅することと、標的：検出複合体を形成するための条件下で、第２の結合溶液中で、任意の増幅された標的を検出オリゴヌクレオチドプローブに結合させることとを含む。

【0109】

検出オリゴヌクレオチドプローブは、共有結合を介して直接、任意選択的にリンカーを介して、レポーター酵素に共有結合することができることも企図される。かかる場合、標的：検出複合体は、レポーター酵素検出プローブ基質と反応するのに十分である。したがって、二次標的部分及び二次標的結合部分は必要とされない。したがって、別の態様では、本開示は、
ａ．
ｉ．標的核酸分子を含むと推定される試料を、標的核酸分子に相補的な配列を含み、かつ固相に付着している捕捉オリゴヌクレオチドプローブと共に、第１の結合溶液中で、インキュベートすることであって、任意選択的に、固相がリンカーを介して捕捉オリゴヌクレオチドプローブに付着している、インキュベートすること、又は
ｉｉ．標的核酸分子を含むと推定される試料を、固相と共にインキュベートして、第１の結合溶液中で、当該試料／標的核酸分子を当該固相に付着させることであって、任意選択的に、固相がリンカーを介して試料／標的核酸分子に付着している、インキュベートすることと、
ｂ．標的：検出複合体を形成するための条件下で、第２の結合溶液中で任意の標的核酸分子を検出オリゴヌクレオチドプローブに結合させることと、
ｃ．固相を洗浄溶液で洗浄して、任意の未結合の検出オリゴヌクレオチドプローブを除去することと、
ｄ．標的：検出複合体を基質反応溶液中でレポーター酵素検出プローブ基質とインキュベートして、１つ以上のイオン化可能な生成物を生成することと、
ｅ．質量分析（ＭＳ）を使用して、１つ以上のイオン化可能な生成物のうちの１つ以上を検出することと、を含む、標的核酸分子を検出する方法を含み、
ｉ．第１の結合溶液及び第２の結合溶液のうちの少なくとも第２の結合溶液が、無機塩を実質的に含まず、
ｉｉ．洗浄溶液が、無機塩を実質的に含まず、
ｉｉｉ．方法が、任意の標的：検出複合体の成分と、捕捉オリゴヌクレオチドプローブとを、任意選択的なステップｃ）及びステップｄ）の前に、架橋することを更に含み、かつ／又は
ｉｖ．方法が、ＭＳを使用して検出する前に、１つ以上のイオン化可能な生成物を分離することを更に含み、
１つ以上のイオン化可能な生成物のうちの少なくとも１つの検出が、試料が標的核酸分子を含むことを示す。

【0110】

検出オリゴヌクレオチドプローブは、検出オリゴヌクレオチドプライマーであり得る。かかる場合、ステップは、増幅溶液中で検出オリゴヌクレオチドプライマーを用いて標的核酸分子を増幅することと、標的：検出複合体を形成するための条件下で、第２の結合溶液中で、任意の増幅された標的を検出オリゴヌクレオチドプローブに結合させることとを含む。

【0111】

いくつかの実施形態は、第２の結合溶液、第３の結合溶液及び基質反応溶液は、トリス緩衝液を各々含む。

【0112】

いくつかの実施形態では、捕捉オリゴヌクレオチドプローブは、任意選択的に固相への非共有結合又は共有結合によって、固相に直接固定化されている。

【0113】

いくつかの実施形態では、捕捉オリゴヌクレオチドプローブは、少なくとも２５ヌクレオチド長、少なくとも３５ヌクレオチド長である標的核酸分子の一部に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドを含み、任意選択的に、捕捉オリゴヌクレオチドプローブは、約３０ヌクレオチド長～約６０ヌクレオチド長、又は約４０ヌクレオチド長～約５５ヌクレオチド長である標的核酸分子の配列の一部に相補的な配列を有する。

【0114】

いくつかの実施形態では、検出オリゴヌクレオチドプローブは、標的核酸分子の別の部分に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドと、ビオチンから選択される二次標的部分とを含む。

【0115】

いくつかの実施形態では、標的核酸分子の配列の他の部分に相補的な検出オリゴヌクレオチドプローブのオリゴヌクレオチドの配列は、少なくとも２５ヌクレオチド長、少なくとも３５ヌクレオチド長であり、任意選択的に、検出オリゴヌクレオチドプローブは、約３０ヌクレオチド～約６０ヌクレオチド長、又は約４０ヌクレオチド～約５５ヌクレオチド長である。

【0116】

いくつかの実施形態では、捕捉オリゴヌクレオチドプローブ及び検出オリゴヌクレオチドプローブは、両方とも、非重複領域で標的核酸分子に結合することができ、任意選択的に、非重複領域は直接隣接し、任意選択的に、非重複領域は少なくとも１ヌクレオチド離れ、任意選択的に、非重複領域は少なくとも５ヌクレオチド離れ、任意選択的に、非重複領域は約２ヌクレオチド、約５ヌクレオチド、約１０ヌクレオチド、約２０ヌクレオチド、約２５ヌクレオチド、約５０ヌクレオチド、約１００ヌクレオチド、約５００ヌクレオチド、又は約１０００ヌクレオチド離れている。いくつかの実施形態では、非重複領域は、約１ｋｂ離れている。いくつかの実施形態では、非重複領域は、１ｋｂを超えて離れている。

【0117】

いくつかの実施形態では、結合溶液及び／又は洗浄溶液が無機塩を実質的に含まないとき、結合溶液及び／又は洗浄溶液は各々独立して揮発性溶液である。いくつかの実施形態では、揮発性溶液は揮発性緩衝液を含む。いくつかの実施形態では、揮発性緩衝液は、エタノールアミン、重炭酸アンモニウム、ギ酸アンモニウム、ギ酸ピリジニウム、トリアルキルアンモニウム／ギ酸、酢酸アンモニウム、重炭酸トリアルキルアンモニウム、Ｎ－エチルモルホリン／アセテート、酢酸トリアルキルアンモニウム、又はそれらの組み合わせから選択される。いくつかの実施形態では、揮発性緩衝液は、エタノールアミン、酢酸アンモニウム、重炭酸トリアルキルアンモニウム、又はそれらの組み合わせから選択される。いくつかの実施形態では、トリアルキルアンモニウムは、トリメチルアンモニウム、トリエチルアンモニウム、又はそれらの組み合わせから選択される。いくつかの実施形態では、揮発性緩衝液はエタノールアミンである。重炭酸アンモニウムが熱に対して安定でないことは、当業者によって理解され得る。例えば、重炭酸アンモニウムは約９０℃又はそれ以上で分解する。したがって、加熱を含むステップについては、エタノールアミンのような他の揮発性緩衝液が好ましい。

【0118】

いくつかの実施形態では、第１の結合溶液、第２の溶液、第３の結合溶液、及び／又は洗浄溶液が無機塩を実質的に含まないとき、第１の結合溶液、第２の溶液、第３の結合溶液、及び／又は洗浄溶液は各々独立してエタノールアミンを含み、任意選択的に第２の結合溶液及び第３の結合溶液はそれぞれエタノールアミンを含み、任意選択的に第１の結合溶液、第２の結合溶液、及び第３の結合溶液はそれぞれエタノールアミンを含み、任意選択的に洗浄溶液はエタノールアミンを含む。

【0119】

いくつかの実施形態では、ステップａ）及びステップｂ）は同時に行われ、ステップａ）の第１の結合溶液はステップｂ）の第２の結合溶液である。

【0120】

いくつかの実施形態は、第１の結合溶液、第２の結合溶液、第３の結合溶液、及び基質反応溶液は、各々独立して、約７～約１０、任意選択的に約７～約８、任意選択的に約８．８のｐＨを有する。

【0121】

いくつかの実施形態では、揮発性結合溶液のいずれかを使用して、固体支持体を洗浄し、任意選択的に、存在し得る任意の無機塩を除去することができる。

【0122】

いくつかの実施形態では、標的：検出：酵素複合体は、７２時間未満、２４時間未満、１２時間未満、６０分未満、５０分未満、４０分未満、３０分未満、２０分未満、１５分未満、１０分未満、５分未満、２分未満、又は１分未満の期間、基質反応溶液中でレポーター検出プローブ基質と共にインキュベートされて、１つ以上のイオン化可能な生成物を生成する。

【0123】

いくつかの実施形態では、第１の結合溶液、第２の結合溶液、及び第３の結合溶液のうちの少なくとも第３の結合溶液は、無機塩を実質的に含まず、本明細書に記載される揮発性緩衝液を含む。

【0124】

いくつかの実施形態では、本方法は、固相を洗浄溶液で洗浄して任意の未結合レポーター酵素検出プローブを除去することを含み、洗浄溶液は、無機塩を実質的に含まず、本明細書に記載される揮発性緩衝液を含む。

【0125】

いくつかの実施形態では、標的：検出：酵素複合体の任意の成分、及び捕捉オリゴヌクレオチドプローブは、任意選択的なステップｄ）及びステップｅ）の前に架橋され、架橋は、Ｈ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、Ｎ－オキシスクシンイミド（ＮＯＳ）、マレイミド、ヒドラジド、グルタルアルデヒドカップリング、スベリン酸ジスクシンイミジル（ＤＳＳ）架橋又はＰＥＧ架橋を介するものである。

【0126】

いくつかの実施形態では、標的検出：酵素複合体の任意の成分と捕捉オリゴヌクレオチドプローブとの架橋は、グルタルアルデヒドカップリング、ＤＳＳ架橋、又はＰＥＧ架橋を介するものである。

【0127】

別の態様では、本開示は、以下のステップを含む、試料中の標的核酸分子の量を定量化する方法を含む：
ａ．本開示の方法に従って標的核酸分子を検出するステップ、及び
ｂ．質量分析によって検出されたイオン化可能な生成物のうちの１つ以上についてのシグナルの強度に基づいて、試料中の標的核酸分子の量を定量化するステップ。

【0128】

いくつかの実施形態では、定量化は、同様の条件下で、既知量の標的物質を使用して生成されたシグナル強度に対して、１つ以上の生成物についてのシグナル強度を比較することを含む。

【0129】

いくつかの実施形態では、標的核酸分子は、ピコモル、フェムトモル、若しくはアトモルの範囲で、又はそれらの範囲までで試料中に存在するか、又は存在することが疑われる。

【0130】

いくつかの実施形態では、標的核酸分子は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、並びにそれらの組み合わせ及び誘導体から選択される。

【0131】

いくつかの実施形態では、試料は、生体試料、工業生成物、環境試料、又はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）反応生成物である。いくつかの実施形態では、生体試料は、血液試料、尿試料、糞便試料、滲出液、組織試料又は痰試料である。

【0132】

別の態様では、本開示は、本開示は、以下を含む、標的核酸分子を検出する方法を含む：
修飾プライマー及び第２のプライマーを用いて、標的核酸分子を含むと推定される試験試料に対して、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）又はハイブリダイゼーション連鎖反応（ＨＣＲ）又はローリングサークル反応又は他の核酸反応などの核酸増幅を実施して、修飾プライマーを含む増幅された核酸生成物、任意選択的にＰＣＲ生成物を得ることであって、修飾プライマーが、二次標的部分又はレポーター酵素で官能化されている、実施することと、
増幅された核酸生成物を、任意の未反応修飾プライマーから分離することと、
修飾プライマーが、二次標的部分で官能化されているとき、増幅された核酸生成物を、第１の結合溶液中で、レポーター酵素検出プローブと共に、増幅された核酸生成物：レポーター酵素複合体を形成する条件下でインキュベートして、結合していないレポーター酵素検出プローブを洗浄溶液で除去することであって、レポーター酵素検出プローブが、二次標的結合部分及びレポーター酵素を含む、インキュベートすることと、
増幅された核酸生成物又は増幅された核酸生成物：レポーター酵素基質複合体を、基質反応溶液中で、レポーター酵素基質とインキュベートして、１つ以上のイオン化可能な生成物を生成することと、
質量分析（ＭＳ）を使用して、１つ以上のイオン化可能な生成物を検出することであって、
修飾プライマーがフォワードプライマーであるとき、第２のプライマーがリバースプライマーであり、修飾プライマーがリバースプライマーであるとき、第２のプライマーがフォワードプライマーである、検出すること。

【0133】

いくつかの実施形態では、第２のプライマーは固相に結合され、任意選択的に、第２のプライマーはリンカーを介して固相に結合される。

【0134】

いくつかの実施形態では、第２のプライマーは、任意選択的に固相への非共有結合又は共有結合によって、固相に直接付着される。

【0135】

いくつかの実施形態では、増幅された核酸生成物からの未反応修飾プライマーの分離は、遠心分離、濾過及び／又は溶媒洗浄によるものである。

【0136】

いくつかの実施形態では、本方法は、増幅された核酸生成物をレポーター酵素検出プローブとインキュベートする前に、修飾プライマーを含む増幅された核酸生成物を固相と第２の結合溶液中で、増幅された核酸生成物を固相に結合させる条件下でインキュベートするステップを更に含み、固相は、増幅された核酸生成物に相補的な配列を含む捕捉オリゴヌクレオチドプローブが結合しており、任意選択的に、固相はリンカーを介して捕捉オリゴヌクレオチドプローブに結合している。

【0137】

いくつかの実施形態では、捕捉オリゴヌクレオチドプローブは、任意選択的に固相への非共有結合又は共有結合によって、固相に直接結合される。

【0138】

例えば、様々な実施形態が図１５Ａ及び図１５Ｂに示されている。図１５Ａ及びＢは、いくつかの実施形態では、増幅、例えば、ＰＣＲ生成物の生成を伴う、「全サンドイッチ」又は「半サンドイッチ」と称され得る実施形態、及び固体支持体への吸着等の共有結合若しくは化学結合又は非共有結合の実施形態を示す。具体的には、ビオチン化プライマー及び任意選択的に捕捉オリゴヌクレオチドプローブの５’結合又は３’結合を使用する、例えばＮＯＳ化学結合プレートを使用する「ハーフサンド」実施形態が示されている。標的核酸分子がＰＶＤＦに吸着され、ビオチン化検出プローブで検出される実施形態も示されている。捕捉オリゴヌクレオチドプローブ及び検出オリゴヌクレオチドプローブが使用される「完全サンドイッチ」の実施形態も示されている。標的核酸試料は化学的に付着又は吸着し、タグ付き検出プローブを使用して検出することができる。他の実施形態及び組み合わせも本明細書に記載されている。

【0139】

図１５Ａに示される「Ｒ」は、アミン若しくは他のリンカー、ビオチン若しくは他のタグ、又は固体支持体への付着のうちの任意の１つ以上とすることができる。例えば、アミンは、オリゴヌクレオチド中に存在するか又はオリゴヌクレオチドに付加されたアミン基であり得る。

【0140】

リンカーは、化学結合であってもよく、又は例えば、アミンで終わるＰＥＧ鎖などの部分を含んでもよい。アミンを含む炭素鎖などの他の部分。

【0141】

リンカーは、アミン（又は一旦連結されたアミン結合）、又はＮＨＳ、又はカルボキシル結合若しくはシステイン結合、又は例えばアミン若しくはアミン反応性基を有するＰＥＧ、又は任意の他の適切な結合とすることができる。本明細書又は以下の表に記載される他のものを含む他のものを使用することができる。

【0142】

【表2】

【0143】

様々なタグを使用することができる。例えば、タグは、ビオチン、ＡＬＦＡ－タグ、Ａｖｉタグ、Ｃ－タグ、カルモジュリン－タグ、ポリグルタミン酸タグ、Ｅ－タグ、Ｆｌａｇ－タグ、ＨＡ－タグ、Ｈｉｓ－タグ、ｍｙｃ－タグ、ＮＥ－タグ、Ｒｈｏ１Ｄ４－タグ、Ｓ－タグ、ＳＢＰ－タグ、Ｓｏｆタグ１、Ｓｏｆタグ３、Ｓｐｏｔ－タグ、Ｓｔｒｅｐｔ－タグ、Ｔ７－タグ、ＴＣ－タグ、Ｔｙ１タグ、Ｖ５タグ、ＶＳＶタグ、Ｘｐｒｅｓｓタグ、Ｉｓｏｐｅｐタグ、Ｓｐｙタグ、Ｓｎｏｏｐタグ、Ｄｏｇタグ、Ｓｄｙタグ、ビオチンカルボキシルキャリアタンパク質、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼタス、ＧＦＰタグ、Ｈａｌｏタグ、ＳＮＡＰ－タグ、ＣＬＩＰ－タグ、ＨＵＨ－タグ、マルトース結合タンパク質タグ、Ｎｕｓ－タグ、チオレドキシン－タグ、Ｆｃ－タグ、又はＣＲＤＳＡＴ－タグとし得る。例えば本明細書の他の箇所に記載されている他のものも使用することができる。タグは、いくつかの実施形態ではビオチンである。

【0144】

説明したように、共有結合及び非共有結合による結合を使用することができる。例えば、支持体への結合は、共有結合（例えば、［Ｈ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、Ｎ－オキシスクシンイミド（ＮＯＳ）、マレイミド、ヒドラジド、グルタルアルデヒドカップリング、若しくはＰＥＧ架橋）又は非共有結合（ＰＶＤＦ、シリカ、ポリスチレン、ナイロンなどへの吸着）であり得る。これは、リンカーを介して又はリンカーなしで行われ得る。例えば、ＰＶＤＦ、ポリスチレン又はシリカ又はナイロン、アクリルアミド、アルギネート、メラミン又は任意の他の支持体への吸着である。

【0145】

固体支持体は、例えば、ポリスチレンプレート、又は化学的に反応性のＮＯＳポリスチレンプレートなどのプレートとすることができ、またプレートは、９６ウェルプレート、マイクロウェル若しくはナノウェルプレート、例えば９６ウェルプレート中のＰＶＤＦ膜などの膜、又はビーズなどのマイクロ若しくはナノサイズの粒子であり得る。他の結合としては、例えば、シリカ、ＰＶＤＦ、ポリスチレン、ナイロン、アクリルアミド、アルギン酸塩、メラミンによるものが挙げられる。

【0146】

より具体的な例を図１５Ｂに示す。この図において、Ｐはホスフェートを指し、Ｎはアミンを指す。プライマーＡ／Ｂは、ビオチンなどのタグを有するプライマー及び有さないプライマーを指す。プライマーＣ／Ｄは、プライマーを含まないか又は表面支持体に固定されたプライマーを指す。

【0147】

いくつかの実施形態では、捕捉オリゴヌクレオチドプローブは、修飾プライマーを含む増幅された核酸生成物の配列の一部に相補的な配列を有する。

【0148】

いくつかの実施形態では、第１の結合溶液及び／又は洗浄溶液は揮発性であり、ＮａＣｌを実質的に含まない。

【0149】

いくつかの実施形態では、第２の結合溶液は揮発性であり、ＮａＣｌを実質的に含まない。

【0150】

いくつかの実施形態では、第１の結合溶液又は第２の結合溶液は、それぞれ揮発性緩衝液を含む。

【0151】

いくつかの実施形態では、揮発性緩衝液は、エタノールアミン、重炭酸アンモニウム、ギ酸アンモニウム、ギ酸ピリジニウム、トリアルキルアンモニウム／ギ酸、酢酸アンモニウム、重炭酸トリアルキルアンモニウム、Ｎ－エチルモルホリン／アセテート、酢酸トリアルキルアンモニウム、及びそれらの組み合わせから選択される。

【0152】

いくつかの実施形態では、揮発性緩衝液は、エタノールアミン、酢酸アンモニウム、重炭酸トリアルキルアンモニウム、及びそれらの組み合わせから選択される。

【0153】

いくつかの実施形態では、トリアルキルアンモニウムは、トリメチルアンモニウム、トリエチルアンモニウム、及びそれらの組み合わせから選択される。

【0154】

いくつかの実施形態では、揮発性緩衝液はエタノールアミンである。

【0155】

いくつかの実施形態は、本方法は、増幅された核酸生成物を固相に結合させる前に、ブロッキング剤、任意選択的にウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で、固相を洗浄するステップを更に含む。

【0156】

いくつかの実施形態では、第１の結合溶液又は第２の結合溶液は、各々独立して、約７～約１０、任意選択的に約７～約８、任意選択的に約８．８のｐＨを有する。

【0157】

いくつかの実施形態では、増幅された核酸生成物：レポーター酵素複合体からの任意の非結合のレポーター酵素検出プローブの除去は、遠心分離、濾過及び／又は溶媒洗浄によるものである。

【0158】

いくつかの実施形態では、増幅された核酸生成物又は増幅された核酸生成物：レポーター酵素複合体は、７２時間未満、２４時間未満、１２時間未満、６０分未満、５０分未満、４０分未満、３０分未満、２０分未満、１５分未満、１０分未満、５分未満、２分未満、又は１分未満の期間、基質反応溶液中でレポーター酵素基質と共にインキュベートされて、１つ以上のイオン化可能な生成物を生成する。

【0159】

いくつかの実施形態では、試験試料は、生物学的試料、工業生成物、又は環境試料である。

【0160】

いくつかの実施形態では、生体試料は、血液試料、尿試料、糞便試料、滲出液、組織試料又は痰試料である。

【0161】

いくつかの実施形態は、ＰＣＲは、リアルタイムＰＣＲ（ｒｔＰＣＲ）、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）、逆転写ＰＣＲ、ネステッドＰＣＲ、ハイブリダイゼーション連鎖反応、ローリングサークルＰＣＲ、及び基質リサイクリング反応から選択される。

【0162】

レポーター酵素検出プローブは、任意選択的に、共有結合により互いに結合されたレポーター酵素成分及び検出プローブ成分を含むことができる。いくつかの実施形態では、検出オリゴヌクレオチドプローブは、共有結合を介して直接、任意選択的にリンカーを介して、レポーター酵素に結合され得ることも企図される。検出オリゴヌクレオチドプローブがすでにレポーター酵素に結合しているとき、レポーター酵素検出プローブは必要ではない。一実施形態では、レポーター酵素は、ペルオキシダーゼ活性、モノオキシゲナーゼ活性、ホスファターゼ活性、グルコースオキシダーゼ、プロテアーゼ又はカスパーゼ活性を含み、例えば、レポーター酵素は、ペルオキシダーゼ、モノオキシゲナーゼ、ホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、プロテアーゼ、エンドプロテイナーゼ、エキソペプチダーゼ又はカスパーゼである。別の実施形態では、レポーター酵素は、リアーゼ、ヒドロラーゼ、シンターゼ、シンテターゼ、オキシドレダクターゼ、デヒドロゲナーゼ、オキシダーゼ、トランスフェラーゼ、イソメラーゼ、リガーゼ、プロテアーゼ、例えばトリプシン、エンドプロテイナーゼ、エキソペプチダーゼ、プロテイナーゼ、ペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、ミエロペルオキシダーゼ、オキシダーゼ、モノオキシゲナーゼ、シトクロム、ホスファターゼ、アルカリホスファターゼ、デカルボキシラーゼ、リパーゼ、カスパーゼ、アミラーゼ、ペプチダーゼ、トランスアミナーゼ、及びキナーゼから選択される。更なる酵素としては、ＤＮＡ又はＲＮＡポリメラーゼ、ＴＡＱ、制限酵素、クレノーフラグメント、ＤＮＡリガーゼを挙げることができる。更に別の実施形態では、レポーター酵素は、ＨＲＰ、ＡＰ、リガーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、クレノー又はＴＡＱ）、制限酵素、及びプロテアーゼ、シトクロムモノオキシゲナーゼ、グルコースオキシダーゼ、ＧＡＰＤＨ、並びに他の解糖酵素及びＴＣＡ回路酵素から選択される。

【0163】

固相は、任意の反応容器、任意選択的にビーズ、ロッド又はプレート、例えばポリスチレン表面を有するマイクロタイタープレートとすることができる。固相は、金属、金、ステンレス鋼、プラスチック、ガラス、シリカ、順相、逆相、ポリカーボネート、ポリエステル、ＰＶＤＦ、ニトロセルロース、セルロース、ポリスチレン、ポリマー、鉄、磁性、被覆磁性、マイクロビーズ、ナノビーズ、ナノチューブ、ナノファイバー又はフラーレンを含む任意の表面であり得る。８～１２個の突出シリンダーを有する免疫吸着ポリスチレンロッドが、例えば米国特許第７５１０６８７号に記載されている。

【0164】

標的核酸分子の検出オリゴヌクレオチドプローブへの結合、及び検出オリゴヌクレオチドプローブのレポーター酵素検出プローブへの結合は、緩衝溶液中で起こすことができる。レポーター酵素検出プローブによる基質の変換は、基質反応緩衝液中で起こすことができる。適切な緩衝液は、ＮａＣｌを実質的に含まない揮発性緩衝液を含み、質量分析の条件に適合する揮発性緩衝液である。かかる適切な緩衝液としては、重炭酸アンモニウム、ギ酸アンモニウム、ギ酸ピリジニウム、トリメチルアミン／ギ酸、酢酸アンモニウム、重炭酸トリメチルアミン、Ｎ－エチルモルホリン／アセテート、トリエチルアミン／ギ酸、重炭酸トリエチルアミン、又はポリマー（例えば、ポリエチレングリコール又は硫酸デキストラン）及びそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。溶液のｐＨをレポーター酵素の最大活性に最適な付近に維持する緩衝液が好ましい。それらの同じ緩衝液は、試験物質又は反応緩衝液の結合のために使用され得る。

【0165】

同じ結合緩衝液が、標的核酸分子の検出オリゴヌクレオチドプローブへの結合、及び検出オリゴヌクレオチドプローブのレポーター酵素検出プローブへの結合のために使用され得る。任意選択的に、基質反応緩衝液は、結合緩衝液と同じであり得る。

【0166】

増幅を含む実施形態では、結合緩衝液は、増幅のための試薬を含み得、例えば、増幅に適した緩衝液中にポリメラーゼ、ヌクレオチドなどを含む増幅溶液と称され得る。

【0167】

本明細書に開示される方法はまた、固相の非存在下で溶液中で行われ得、ここで、標的物質は、固定化されないが、マイクロビーズ若しくは磁性マイクロビーズ上に懸濁されるか、又はコロイド懸濁液中に懸濁されるか、あるいはそうでなければ完全に固定化されずに溶液中で自由に移動する。

【0168】

高いシグナル対ノイズ比を提供するイオン化可能な生成物を生成する基質が望ましい。例えば、選択されたシグナル対ノイズ比は、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも１０である。一実施形態では、シグナル対ノイズ比は５以上である。シグナル対ノイズ比は、質量シグナル（ピーク高さ）対ノイズ（ベースレベル変動の振幅）の比である。シグナル対ノイズ比は、例えば、ＭＳを使用して、既知量の分析物又は試料のシグナル強度と比較した、ブランク試料又はベースラインからのシグナル強度の比を測定することによって決定することができる。イオン化されて生成物イオンになったときに高いシグナル対ノイズ比を有するイオン化可能な生成物を生成する基質の例は、ナフトールＡＳＭＸホスフェートであり、これは脱リン酸化される。高いシグナル対ノイズ比は、本明細書で使用されるとき、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも１０より大きいシグナル対ノイズ比である。

【0169】

基質は、例えばエレクトロスプレー又はＭＡＬＤＩによってイオン化可能な、例えばＮＯ_２、ＳＯ_４、ＰＯ_３、ＮＨ_２、＝ＮＨ－、ＣＯＯＨ、ＮＨ－ＮＨＲ－、ＮＨ_２－ＮＲ－ＮＨ_２のうちの少なくとも１つを含む少なくとも１つのイオン化可能な基を含み、選択されたレポーター酵素の基質となるものである。例えばＨＲＰの場合、適切な基質は、Ｈ_２Ｏ_２に電子を供与することができるものである。別の例として、ＡＰなどのホスファターゼの場合、基質は、酵素によって切断され得る少なくとも１つのリン酸基を有する。

【0170】

いくつかの実施形態では、本開示の方法は、ＭＳを使用する検出の前に、１つ以上のイオン化可能な生成物を分離するステップを更に含む。いくつかの実施形態では、分離は、液体クロマトグラフ、遠心分離、濾過、溶媒洗浄、及び／又は塩転換による。いくつかの実施形態では、分離は、液体クロマトグラフィー、任意選択的にアイソクラチック順相クロマトグラフィーによる。いくつかの実施形態では、液体クロマトグラフィーは、逆相クロマトグラフィーによる。いくつかの実施形態では、逆相クロマトグラフィーは、Ｃ１８クロマトグラフィーである。いくつかの実施形態では、液体クロマトグラフィーは、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）である。いくつかの実施形態では、ＨＰＬＣは、ナノフロー液体クロマトグラフィーである。

【0171】

いくつかの実施形態では、ＭＳを使用して１つ以上のイオン化可能な生成物を検出するステップは、任意選択的に、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）、ＭＡＬＤＩ、化学イオン化、電子衝撃、レーザー脱離、電気イオン化、又は熱イオン化によって、１つ以上のイオン化可能な生成物をイオン化して、１つ以上の生成物イオンを生成することと、１つ以上の生成物イオンをＭＳ、任意選択的に、タンデムＭＳ（ＭＳ／ＭＳ）に供することとを含む。

【0172】

いくつかの実施形態では、イオン化は、正イオン化又は負イオン化である。

【0173】

いくつかの実施形態では、生成された１つ以上の生成物イオンは、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、又は少なくとも１０である選択されたシグナル対ノイズ比を有する。

【0174】

いくつかの実施形態では、ＭＳは、エレクトロスプレーイオン化タンデムＭＳ（ＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳ）、マトリックス支援レーザー脱着／イオン化飛行時間型（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ）、タンデムＭＳ（ＭＳ／ＭＳ）、複数ラウンドのフラグメンテーションＭＳＮ、ＭＡＬＤＩ、エレクトロスプレー、ナノスプレー、表面イオン化、レーザー脱着及びイオン化、大気イオン化、真空イオン化、並びにキャピラリー電気泳動、超音波又は音波又は振動、ナノ液滴又はマイクロ液滴試料導入システムを備えたＭＳから選択される。

【0175】

いくつかの実施形態では、ＭＳを使用して検出するステップは、単一イオン監視（ＳＩＭ）によって生成物イオン強度を記録するステップ及び／又は単一試薬監視（ＳＲＭ）によって生成物イオン親からフラグメントへの遷移を記録するステップを含む。

【0176】

いくつかの実施形態は、レポーター酵素検出プローブは、レポーター酵素及び任意選択的に二次標的結合部分を含み、二次標的結合部分は、レポーター酵素に共有結合している。

【0177】

いくつかの実施形態では、二次標的部分は、ビオチン、ＡＬＦＡ－タグ、Ａｖｉタグ、Ｃ－タグ、カルモジュリン－タグ、ポリグルタミン酸タグ、Ｅ－タグ、Ｆｌａｇ－タグ、ＨＡ－タグ、Ｈｉｓ－タグ、ｍｙｃ－タグ、ＮＥ－タグ、Ｒｈｏ１Ｄ４－タグ、Ｓ－タグ、ＳＢＰ－タグ、Ｓｏｆタグ１、Ｓｏｆタグ３、Ｓｐｏｔ－タグ、Ｓｔｒｅｐｔ－タグ、Ｔ７－タグ、ＴＣ－タグ、Ｔｙ１タグ、Ｖ５タグ、ＶＳＶ－タグ、Ｘｐｒｅｓｓタグ、Ｉｓｏｐｅｐタグ、Ｓｐｙタグ、Ｓｎｏｏｐタグ、Ｄｏｇタグ、Ｓｄｙタグ、ビオチンカルボキシルキャリアタンパク質、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼタス、ＧＦＰタグ、Ｈａｌｏタグ、ＳＮＡＰ－タグ、ＣＬＩＰ－タグ、ＨＵＨ－タグ、マルトース結合タンパク質タグ、Ｎｕｓ－タグ、チオレドキシン－タグ、Ｆｃ－タグ、及びＣＲＤＳＡＴ－タグから選択され、任意選択的に、第２の標的部分はビオチンである。

【0178】

いくつかの実施形態では、二次標的結合部分は、二次標的部分に結合し、アビジン、ストレプトアビジン、カルモジュリン、陰イオン交換樹脂、Ｍｏｎｏ－Ｑ、陽イオン交換樹脂、抗Ｅ－タグ抗体、抗ＦＬＡＧ－タグ抗体、抗ＨＡ－タグ抗体、ニッケル又はコバルトキレート、抗Ｍｙｃ－タグ抗体、抗ＮＥ－タグ抗体、抗Ｒｈｏ１Ｄ４－タグ抗体、抗Ｓ－タグ抗体、抗Ｓｏｆタグ１抗体、抗Ｓｏｆタグ３抗体、ナノボディ、ストレプタクチン、抗Ｔ７－タグ抗体、ＦＩＡｓＨ二ヒ素化合物、ＲｅＡｓＨ二ヒ素化合物、抗Ｔｙ１タグ抗体、抗Ｖ５タグ抗体、抗ＶＳＶタグ抗体、抗Ｘｐｒｅｓｓタグ抗体、ピリン－Ｃタンパク質、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒタンパク質、ＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒタンパク質、ＳｎｏｏｐタグＪｒタンパク質、ＳｄｙＣａｔｃｈｅｒタンパク質、グルタチオン、ＧＦＰ抗体、ハロアルカン基質、ベンジルグアニン誘導体、ベンジルシトシン誘導体、ＨＵＨ特異的ＤＮＡ配列、アミロースアガロース、Ｎｕｓ－タグ抗体、抗チオレドキシン－タグ抗体、プロテイン－Ａセファロース、ラクトース、アガロース、及びセファロースから選択され、任意選択的に、二次標的結合部分が、アビジン及びストレプトアビジンから選択される。

【0179】

いくつかの実施形態では、二次標的結合部分は、検出オリゴヌクレオチドプローブの二次標的部分に結合し、二次標的部分がビオチンであるとき、アビジン及びストレプトアビジンから選択される。

【0180】

いくつかの実施形態では、レポーター酵素は、ホスファターゼ、任意でアルカリホスファターゼ、リアーゼ、ヒドロラーゼ、シンターゼ、シンテターゼ、オキシドレダクターゼ、デヒドロゲナーゼ、オキシダーゼ、トランスファーゼ、イソメラーゼ、リガーゼ、プロテアーゼ、例えばトリプシン、プロテイナーゼ、ペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、ミエロペルオキシダーゼ、オキシダーゼ、モノオキシゲナーゼ、シトクロム、デカルボキシラーゼ、リパーゼ、カスパーゼ、アミラーゼ、ペプチダーゼ、トランスアミナーゼ、キナーゼ活性、ＤＮＡ又はＲＮＡポリメラーゼ、任意選択的にＴＡＱ、制限酵素、クレノーフラグメント、及びＤＮＡリガーゼから選択される。

【0181】

いくつかの実施形態では、レポーター酵素は、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、トリプシン、シトクロムＣモノオキシゲナーゼ、及びミエロペルオキシダーゼから選択され、任意選択的に、レポーター酵素は、アルカリホスファターゼ又は西洋ワサビペルオキシダーゼである。

【0182】

いくつかの実施形態では、１つ以上のイオン化可能な生成物は、ＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳ又はＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ下で容易にイオン化可能であり、高いシグナル対ノイズ比によって特徴付けられる生成物イオンを生成し、基質は、任意選択的に、
ａ．酵素がアルカリホスファターゼ（ＡＰ）であるとき、リン酸化ヌクレオシド、任意選択的にＡＭＰ若しくはＣＭＰ、又はヌクレオチド、任意選択的にＡＴＰ若しくはＣＴＰ、リン酸化アルカロイド、リン酸化アミノ酸、リン酸化アミノ酸ポリマー、及びリン酸化代謝生成物、
ｂ．レポーター酵素が西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）であるとき、フェノール、アミン、任意選択的にフェノールアミン、芳香族化合物、オレフィンハロゲン化物、ルミノール、ピロガロール、２，２’－アジノ－ビス（３－エチルベンゾチアゾリン－６－スルホン酸（ＡＢＴＳ）、及びＡｍｐｌｅｘ（登録商標）Ｒｅｄから選択される化合物、あるいは
ｃ．オピエート、洗剤、染料前駆体、アルコール、及びマトリックス、から選択される。

【0183】

いくつかの実施形態では、レポーター酵素検出プローブ基質は、ピリドキサミン－５－リン酸（ＰＡ５Ｐ）、ｐ－ニトロフェニルホスフェート（ＰＮＰＰ）、Ａｍ－ｐｌｅｘ（登録商標）Ｒｅｄ（ＡＲ）、ナフトールＡＳＭＸホスフェート、ルミノール、Ｌｕｍｉｇｅｎ（登録商標）ＴＭＡ３、Ｌｕｍｉｇｅｎ（登録商標）ＴＭＡ６、スフィンゴシン、４ＭＵＰ、Ｌ－（＋）－２－アミノ－６－ホスホノヘキサン酸、５－ブロモ－４－クロロ－３－インドリルホスフェート（ＢＣＩＰ）、ＢｌｕｅＰｈｏｓ（登録商標）、フェニルベンゼンωホスホノ－α－アミノ酸、Ｏ－ホスホ－ＤＬ－スレオニン、アデノシンモノホスフェート（ＡＭＰ）、ＡＲ（３－アミノ－９－エチルカルバゾール）、４－ＣＮ（４－クロロ－１－ナフトール）、ＤＡＢ（３，３’－ジアミノベンジミジン）、ＯＰＤ（ｏ－フェニレンジアミン）、ＴＭＢ（３，３’’，５，５’’－テトラメチルベンジジン）、ｐＮＰＰ（ｐ－ニトロフェニルホスフェート）、ＮＢＴ（ニトロブルーテトラゾリウム）、ＩＮＴ（ｐ－インドニトロテトラゾリウム）、ＭＵＰ（４－メチルウンベリフェリルホスフェート）、及びＦＤＰ（フルオレセインジホスフェート）、ピロガロールから選択される。

【0184】

いくつかの実施形態では、レポーター酵素検出プローブ基質は、
ａ．レポーター酵素検出プローブがＨＲＰを含むとき、ＡＲ、ルミノール、Ｌｕｍｉｇｅｎ（登録商標）ＴＭＡ３、及びＬｕｍｉｇｅｎ（登録商標）ＴＭＡ６、又は
ｂ．レポーター酵素検出プローブがＡＰを含むとき、ナフトールＡＳＭＸホスフェート、及びＰＮＰＰ、から選択される。

【0185】

いくつかの実施形態では、本開示の標的核酸分子を検出する方法は、標的：検出複合体をレポーター酵素検出プローブとインキュベートする前に、固相を第２の結合溶液で洗浄することを更に含む。

【0186】

いくつかの実施形態では、本開示の標的核酸分子を検出する方法は、標的核酸分子を固相に結合させる前に、ブロッキング剤、任意選択的にウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で固相を洗浄することを更に含む。

【0187】

いくつかの実施形態では、基質反応溶液は、Ｎ－オクチルグルコシド、デオキシコレート、ラピゲスト、オクチル－ベータ－グルコピラノシド、オクチルグルコピラノシド、チャップ、ビッグチャップ、非イオン性酸不安定性界面活性剤、グルコシド、ｎ－オクチル－β－Ｄ－グルコピラノシド、ｎ－ノニル－β－Ｄ－グルコピラノシドチオグルコシド、ｎ－オクチル－β－Ｄ－チオグルコピラノシドマルトシド、ｎ－デシル－β－Ｄ－マルトピラノシド、ｎ－ドデシル－β－Ｄ－マルトピラノシド、ｎ－ウンデシル－β－Ｄ－マルトピラノシド、ｎ－トリデシル－β－Ｄ－マルトピラノシド、シマル－５、シマル－６、チオマルトシド、ｎ－ドデシル－β－Ｄ－チオマルトピラノシド、アルキルグリコシド、オクチルグルコースネオペンチルグリコール、ポリオキシエチレングリコール、トリトン、ＮＰ４０、ツイーン（商標）、ツイーン（商標）２０、トリトンＸ－１００、トリトンｘ－４５、Ｃ８Ｅ４、Ｃ８Ｅ５、Ｃ１０Ｅ５、Ｃ１２Ｅ８、Ｃ１２Ｅ９、Ｂｒｉｊ、Ａｎａｐｏｅ－５８、Ｂｒｉｊ－５８、及びそれらの組み合わせから任意選択的に選択される非イオン性非ポリマー洗剤を含む。

【0188】

いくつかの実施形態では、基質反応溶液は、基質がルミノールを含むとき、４－ヨードフェニルボロン酸を更に含む。

【0189】

いくつかの実施形態は、固相は、反応容器、任意選択的にビーズ、プレート、キャピラリー、フィルター、又はナノ／マイクロ／ミリウェル反応容器であり、表面は、紙、ニトロセルロース、アクリレート、プラスチック、ポリスチレン、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）、メラミン、シリカ、ポリリジンコーティングガラス、３－アミノプロピル－トリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）処理ガラス、及び３－アミノプロピル－トリメトキシシラン（ＡＰＴＭＳ）処理ガラスから選択される。

【0190】

いくつかの実施形態では、捕捉オリゴヌクレオチドプローブの固相への付着は、Ｈ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、Ｎ－オキシスクシンイミド（ＮＯＳ）、マレイミド、ヒドラジド、グルタルアルデヒドカップリング、又はＰＥＧ架橋を介するものである。

【0191】

いくつかの実施形態では、生成物イオンは、最適化されたフラグメンテーションエネルギー及びｍ／ｚ範囲を使用して、ＳＩＭ及び／又はＳＲＭによってアッセイされる。

【0192】

いくつかの実施形態では、基質はＡＭＰ、ＡＤＰ若しくはＡＴＰであり、生成された１つ若しくはイオン化可能な生成物はアデノシンを含み、その生成物イオンはＳＩＭによって２６８ｍ／ｚでアッセイされるか、又は、基質はＣＭＰ、ＣＤＰ若しくはＣＴＰであり、生成された１つ若しくはイオン化可能な生成物はシトシンを含み、その生成物イオンはＳＩＭによって２８３ｍ／ｚでアッセイされるか、又は、基質はＡＲであり、生成された１つ以上のイオン化可能な生成物のうちの１つは、レゾルフィンを含み、その生成物イオンは、２１４ｍ／ｚにおけるＳＩＭ及び２１４～１８６ｍ／ｚにおける主要な強いフラグメントを使用するＳＲＭによってアッセイされる。

【0193】

いくつかの実施形態では、基質はナフトールＡＳＭＸホスフェートであり、生成された１つ以上のイオン化可能な生成物の１つは脱リン酸化ナフトールＡＳＭＸを含み、その生成物イオンは２９２ｍ／ｚにおけるＳＩＭ及び２９２～１７１ｍ／ｚにおける主要な強いフラグメントを用いるＳＲＭによってアッセイされるか、又は基質はＰＡ５Ｐであり、生成された１つ若しくはイオン化可能な生成物はＰＡを含み、その生成物イオンは１６９ｍ／ｚにおけるＳＩＭによってアッセイされる。

【0194】

いくつかの実施形態では、イオン化可能な生成物は、イオン化溶液中でイオン化してイオンを生成する。

【0195】

別の態様では、本開示は、以下のステップを含む、試験試料中の標的核酸分子の量を定量化する方法を含む：
ａ．本開示の標的核酸分子を検出する方法に従って標的核酸分子を検出するステップ、及び
ｂ．質量分析によって検出されたイオン化可能な生成物のうちの１つ以上についてのシグナルの強度に基づいて、試験試料中の標的核酸分子の量を定量化するステップ。

【0196】

いくつかの実施形態では、定量化は、１つ以上の生成物についてのシグナルの強度を、同様の条件下で既知量の標的核酸分子を使用して生成されたシグナル強度と比較するステップを含む。

【0197】

いくつかの実施形態では、標的核酸分子は、ピコモル、フェムトモル、若しくはアトモルの範囲で、又はそれらの範囲までで試料中に存在するか、又は存在することが疑われる。

【0198】

いくつかの実施形態では、１つ以上の標的オリゴヌクレオチドテンプレートが検出される。

【0199】

いくつかの実施形態では、標的核酸分子は、プラスミドＤＮＡ、又は細菌、ウイルス、真菌、哺乳動物、若しくは植物ゲノムに含まれる配列である。

【0200】

いくつかの実施形態では、細菌ゲノムは、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ、Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｉ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、ａｎａｅｒｏｂｉｃ ｂａｃｉｌｌｉ、Ｇｒａｍ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｃｃｉ、Ｇｒａｍ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｂａｃｉｌｌｉ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ、Ｂｏｒｒｅｌｉａ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｓｐｉｒｏｃｈａｅｔｅｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、及びＹｅｒｓｉｎｉａのゲノムから選択される。

【0201】

いくつかの実施形態では、細菌ゲノムは、Ｅ．ｃｏｌｉ及びＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓから選択される。

【0202】

いくつかの実施形態では、ウイルスゲノムは、ＨＩＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＭＥＲＳ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、エボラウイルス、インフルエンザウイルス、コロナウイルスゲノム、エンテロウイルス、肝炎ウイルス、ヘルペスウイルス、ＨＰＶ、ノロウイルス、パラインフルエンザ、ライノウイルス、及び水痘ウイルスのゲノムから選択される。

【0203】

いくつかの実施形態では、ウイルスゲノムは、ＨＩＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＭＥＲＳ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、エボラウイルス、インフルエンザウイルス、及びコロナウイルスのゲノムから選択される。

【0204】

いくつかの実施形態では、真菌ゲノムは、カンジダのゲノムから選択される。

【0205】

いくつかの実施形態では、哺乳動物ゲノムはヒトのゲノムである。

【0206】

いくつかの実施形態では、標的核酸分子は、ＨＩＶゲノムに含まれる配列を有する。いくつかの実施形態では、標的核酸分子は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムに含まれる配列を有する。

【0207】

別の態様では、本開示は、本開示の標的核酸分子を検出する方法を含む、ＨＩＶを検出する方法を含み、標的核酸分子は、ＨＩＶ核酸分子である。

【0208】

いくつかの実施形態では、ＨＩＶを検出する方法は、本開示の標的核酸分子を検出する方法を含み、捕捉オリゴヌクレオチドプローブは、配列番号１４、配列番号１７、配列番号２０、及び配列番号２３から選択される配列を有する。

【0209】

いくつかの実施形態では、ＨＩＶを検出する方法は、本開示の標的核酸分子を検出する方法を含み、検出オリゴヌクレオチドプローブオリゴヌクレオチドは、配列番号１６、配列番号１９、配列番号２２、及び配列番号２５から選択される配列を有する。

【0210】

いくつかの実施形態では、ＨＩＶを検出する方法は、本開示の標的核酸分子を検出する方法を含み、捕捉オリゴヌクレオチドプローブは、配列番号１４、配列番号１７、配列番号２０、及び配列番号２３から選択される配列を有する。

【0211】

別の態様では、本開示は、本開示の標的核酸分子を検出する方法を含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２を検出する方法を含み、標的核酸分子は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２核酸分子である。

【0212】

いくつかの実施形態では、本開示のＳＡＲＳ－ＣｏＶ２を検出する方法は、本開示の標的核酸分子を検出する方法を含み、捕捉オリゴヌクレオチドプローブは、配列番号６及び配列番号１３から選択される配列を有する。

【0213】

いくつかの実施形態では、本開示のＳＡＲＳ－ＣｏＶ２を検出する方法は、本開示の標的核酸分子を検出する方法を含み、検出オリゴヌクレオチドプローブオリゴヌクレオチドは、配列番号５及び配列番号１２から選択される配列を有する。

【0214】

本開示のＳＡＲＳ－ＣｏＶ２を検出する方法のいくつかの実施形態では、修飾プライマーは、配列番号２、配列番号３、配列番号７、配列番号８、配列番号９、及び配列番号１０から選択される配列を有する。

【0215】

本開示のＳＡＲＳ－ＣｏＶ２を検出する方法のいくつかの実施形態では、第２のプライマーは、配列番号２、配列番号３、配列番号７、配列番号８、配列番号９、及び配列番号１０から選択される配列を有する。

【0216】

本開示のＳＡＲＳ－ＣｏＶ２を検出する方法のいくつかの実施形態では、修飾プライマーは、配列番号２の配列を有し、第２のプライマーは、配列番号３又は配列番号８の配列を有する。

【0217】

本開示のＳＡＲＳ－ＣｏＶ２を検出する方法のいくつかの実施形態では、修飾プライマーは、配列番号３の配列を有し、第２のプライマーは、配列番号２又は配列番号７の配列を有する。

【0218】

本開示のＳＡＲＳ－ＣｏＶ２を検出する方法のいくつかの実施形態では、修飾プライマーは、配列番号７の配列を有し、第２のプライマーは、配列番号３又は配列番号８の配列を有する。

【0219】

本開示のＳＡＲＳ－ＣｏＶ２を検出する方法のいくつかの実施形態では、修飾プライマーは、配列番号８の配列を有し、第２のプライマーは、配列番号２、配列番号７の配列を有する。

【0220】

本開示のＳＡＲＳ－ＣｏＶ２を検出する方法のいくつかの実施形態では、修飾プライマーは、配列番号９の配列を有し、第２のプライマーは、配列番号１０の配列を有する。

【0221】

本開示のＳＡＲＳ－ＣｏＶ２を検出する方法のいくつかの実施形態では、修飾プライマーは、配列番号１０の配列を有し、第２のプライマーは、配列番号９の配列を有する。

【0222】

本開示のＳＡＲＳ－ＣｏＶ２を検出する方法のいくつかの実施形態では、修飾プライマーは、配列番号３８の配列を有し、第２のプライマーは、配列番号３９の配列を有する。

【0223】

本開示のＳＡＲＳ－ＣｏＶ２を検出する方法のいくつかの実施形態では、修飾プライマーは、配列番号３９の配列を有し、第２のプライマーは、配列番号３８の配列を有する。

【0224】

本開示のＳＡＲＳ－ＣｏＶ２を検出する方法のいくつかの実施形態では、修飾プライマーは、配列番号４１の配列を有し、第２のプライマーは、配列番号４２の配列を有する。

【0225】

本開示のＳＡＲＳ－ＣｏＶ２を検出する方法のいくつかの実施形態では、修飾プライマーは、配列番号４２の配列を有し、第２のプライマーは、配列番号４１の配列を有する。

【0226】

他のプライマーも使用することができる。

【0227】

別の態様では、本開示は、以下を含むキットを含む：
ｉ．捕捉オリゴヌクレオチドプローブであって、任意選択的にリンカーを介して、任意選択的に固相に結合されている、捕捉オリゴヌクレオチドプローブ、
ｉｉ．揮発性緩衝液を含み、ＮａＣｌを実質的に含まないか、又は架橋剤を含む結合溶液、
ｉｉｉ．オリゴヌクレオチドと二次標的部分とを含む検出オリゴヌクレオチドプローブ、
ｉｖ．レポーター酵素検出プローブであって、レポーター酵素と、二次標的部分に結合することができる二次標的結合部分とを含む、レポーター酵素検出プローブ、及び／又は
ｖ．本明細書で定義される、基質、固相、標準物質、任意選択的に標準曲線を調製するため又は較正物質を調整するための任意選択的な生成物イオン標準物質、第２の結合溶液、第３の結合溶液、基質反応溶液、イオン化溶液、クエンチ溶液、任意選択的な第２の結合溶液、検出プローブ溶液、基質反応溶液、クエンチ溶液、イオン化溶液のうちの１つ以上。

【0228】

別の態様では、本態様は、以下を含むキットを含む：
ｉ．二次標的部分又はレポーター酵素で官能化されている修飾プライマー、
ｉｉ．第２のプライマー、
ｉｉｉ．修飾プライマーが二次標的部分で官能化されているとき、レポーター酵素検出プローブであって、レポーター酵素及び二次標的部分に結合することができる二次標的結合部分を含む、レポーター酵素検出プローブ、並びに
ｉｖ．本明細書で定義される、基質、固相、標準物質、任意選択的に標準曲線を調製するため又は較正物質を調整するための任意選択的な生成物イオン標準物質、結合溶液、第２の結合溶液、基質反応溶液、イオン化溶液、クエンチ溶液、洗浄溶液、架橋剤、任意選択的に結合溶液、第２の結合溶液、検出プローブ溶液、基質反応溶液、クエンチ溶液、イオン化溶液のうちの１つ又は複数、
ここで、修飾プライマーがフォワードプライマーであるとき、第２のプライマーはリバースプライマーであり、修飾プライマーがリバースプライマーであるとき、第２のプライマーはフォワードプライマーである。

【0229】

いくつかの実施形態では、イオン化溶液は、ギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、水酸化アンモニウム、メチルアミン、エチルアミン、又はプロピルアミンから任意選択的に選択される酸又は塩基を含む。

【0230】

いくつかの実施形態では、クエンチ溶液は、任意選択的に、正のイオン化のために５０％アセトニトリル、０．１％酢酸若しくは０．１％ギ酸若しくは０．１％トリフルオロ酢酸、又は負のイオン化のために０．１％水酸化アンモニウムを含む。

【0231】

いくつかの実施形態では、捕捉オリゴヌクレオチドプローブは、配列番号６、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１７、配列番号２０、配列番号２３、配列番号２６、配列番号２９、配列番号３２、及び配列番号３５から選択される配列を含む。

【0232】

いくつかの実施形態では、検出オリゴヌクレオチドプローブのオリゴヌクレオチドは、配列番号５、配列番号１２、配列番号１６、配列番号１９、配列番号２２、配列番号２５、配列番号２８、配列番号３１、配列番号３４、及び配列番号３７から選択される配列を含む。

【0233】

いくつかの実施形態では、捕捉オリゴヌクレオチドプローブは、配列番号１４の配列を含み、検出オリゴヌクレオチドプローブのオリゴヌクレオチドは、配列番号１６の配列を有する。

【0234】

いくつかの実施形態では、捕捉オリゴヌクレオチドプローブは、配列番号６の配列を含み、検出オリゴヌクレオチドプローブのオリゴヌクレオチドは、配列番号５の配列を有する。

【0235】

いくつかの実施形態では、捕捉オリゴヌクレオチドプローブは、配列番号１３の配列を含み、検出オリゴヌクレオチドプローブのオリゴヌクレオチドは、配列番号１２の配列を有する。

【0236】

いくつかの実施形態では、捕捉オリゴヌクレオチドプローブは、配列番号１７の配列を含み、検出オリゴヌクレオチドプローブのオリゴヌクレオチドは、配列番号１９の配列を有する。

【0237】

いくつかの実施形態では、捕捉オリゴヌクレオチドプローブは、配列番号２０の配列を含み、検出オリゴヌクレオチドプローブのオリゴヌクレオチドは、配列番号２２の配列を有する。

【0238】

いくつかの実施形態では、捕捉オリゴヌクレオチドプローブは、配列番号２３の配列を含み、検出オリゴヌクレオチドプローブのオリゴヌクレオチドは、配列番号２５の配列を有する。

【0239】

いくつかの実施形態では、捕捉オリゴヌクレオチドプローブは、配列番号２６の配列を含み、検出オリゴヌクレオチドプローブのオリゴヌクレオチドは、配列番号２８の配列を有する。

【0240】

いくつかの実施形態では、捕捉オリゴヌクレオチドプローブは、配列番号２９の配列を含み、検出オリゴヌクレオチドプローブのオリゴヌクレオチドは、配列番号３１の配列を有する。

【0241】

いくつかの実施形態では、捕捉オリゴヌクレオチドプローブは、配列番号３２の配列を含み、検出オリゴヌクレオチドプローブのオリゴヌクレオチドは、配列番号３４の配列を有する。

【0242】

いくつかの実施形態では、捕捉オリゴヌクレオチドプローブは、配列番号３５の配列を含み、検出オリゴヌクレオチドプローブのオリゴヌクレオチドは、配列番号３７の配列を有する。

【0243】

いくつかの実施形態では、捕捉プローブは、配列番号４４又は４５である。

【0244】

捕捉オリゴヌクレオチドプローブはまた、例えばプローブ配列の少なくとも７０％、８０％又は９０％を含む、本明細書に記載の捕捉プローブのフラグメントであってもよい。

【0245】

いくつかの実施形態では、修飾プライマー及び第２のプライマーは、細菌、ウイルス、真菌、哺乳動物又は植物ゲノムに含まれる配列を有する標的核酸分子に対するプライマーである。

【0246】

いくつかの実施形態では、修飾プライマーは、配列番号２、配列番号３、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４１及び配列番号４２から選択される配列を有する。

【0247】

いくつかの実施形態では、第２のプライマーは、配列番号２、配列番号３、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４１及び配列番号４２から選択される配列を有する。

【0248】

いくつかの実施形態では、修飾プライマーは、配列番号２の配列を有し、第２のプライマーは、配列番号３又は、配列番号８の配列を有する。

【0249】

いくつかの実施形態では、修飾プライマーは、配列番号３の配列を有し、第２のプライマーは、配列番号２又は、配列番号７の配列を有する。

【0250】

いくつかの実施形態では、捕捉オリゴヌクレオチドは、配列番号６の配列を有する。

【0251】

いくつかの実施形態では、修飾プライマーは、配列番号７の配列を有し、第２のプライマーは、配列番号８の配列を有する。

【0252】

いくつかの実施形態では、修飾プライマーは、配列番号８の配列を有し、第２のプライマーは、配列番号７の配列を有する。

【0253】

いくつかの実施形態では、修飾プライマーは、配列番号９の配列を有し、第２のプライマーは、配列番号１０の配列を有する。

【0254】

いくつかの実施形態では、修飾プライマーは、配列番号１０の配列を有し、第２のプライマーは、配列番号９の配列を有する。

【0255】

いくつかの実施形態では、捕捉オリゴヌクレオチドは、配列番号１３の配列を有する。

【0256】

いくつかの実施形態では、修飾プライマーは、配列番号３８の配列を有し、第２のプライマーは、配列番号３９の配列を有する。

【0257】

いくつかの実施形態では、修飾プライマーは、配列番号３９の配列を有し、第２のプライマーは、配列番号３８の配列を有する。

【0258】

いくつかの実施形態では、修飾プライマーは、配列番号４１の配列を有し、第２のプライマーは、配列番号４２の配列を有する。

【0259】

いくつかの実施形態では、修飾プライマーは、配列番号４２の配列を有し、第２のプライマーは、配列番号４１の配列を有する。

【0260】

プライマーはまた、本明細書中で提供されるプライマーのフラグメントであり得るか、又は更なる相補的配列を含み得る。例えば、フラグメントは、本明細書に記載されるプライマーの配列の少なくとも７０％、８０％、又は９０％であり得る。

【0261】

いくつかの実施形態では、捕捉オリゴヌクレオチドは、配列番号４４又は４５の配列を有する。

【0262】

別の態様では、本開示は、配列番号２～４６から選択される配列の核酸を含む。

【0263】

配列番号２～４６から選択される配列の核酸の１つ又は複数を含むベクター、キット又は組成物も提供される。

【0264】

核酸は、いくつかの実施形態では、タグで標識され得る。それらはまた、標識されていない状態で、任意選択的に、標識及び標識された核酸を生成するための試薬と組み合わせて（例えば、キットにおいて）提供され得る。

【実施例】

【0265】

以下の非限定的な実施例は、本開示の例示である。

【0266】

一般的方法
１９５，０００ｋＤａの公称質量を有するアルカリホスファターゼストレプトアビジンコンジュゲート（ＡＰＳＡ）（１５ｍｇ／ｍＬウシ血清アルブミンを含む１ｍＬの０．０１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、０．２５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ ８．０中、１ｍｇ）は、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ，ＵＳＡ）から入手した。ＡＭＰ基質及びトリス緩衝液は、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ ＭＯ，ＵＳＡ）製を用いた。ＮＨＳ－ＰＥＧ １２－ビオチンは、Ｐｉｅｒｃｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）製を用いた。ＮＨＳ－ＰＥＧ－ＮＨＳは、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ製のＯ，Ｏ’－ビス［２－（Ｎ－スクシンイミジル－スクシニルアミノ）エチル］ポリエチレングリコール、２０００を用いた。９６ウェル反応性プレートは、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製のＮｕｎｃ（商標）Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｒアミノプレート及びＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ製のＣｏｒｎｉｎｇ（登録商標）ＤＮＡ－ＢＩＮＤ（登録商標）９６ウェルプレートを用いた。円形カバーガラス（直径５ｍｍ、厚さ０．１６～０．１９ｍｍ）は、Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ製を用いた。３－アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）はＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製を用いた。

【0267】

ＰＶＤＦ膜は、例えばウェスタンブロットに使用される任意の一般的なＰＶＤＦ転写膜とすることができる。例えば、適切なＰＶＤＦ膜としては、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ－Ｐ（商標）転写膜が挙げられる。例えば、適切なＰＶＤＦ膜は、０．４５μｍの孔径を有することができる。例えば、ＰＶＤＦ膜は、フィルタープレート、任意選択的にマルチウェルフィルタープレートの形態とすることができる。例えば、プレートの各ウェルの底にＰＶＤＦ膜を取り付けることができる。例えば、マルチウェルプレートは、９６ウェルフィルタープレートとすることができる。

【0268】

以下で使用されるポリスチレン支持体は、ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ Ｃｏｐｏｒａｔｉｏｎ（カタログ番号Ｎ－４５４５－１０ｂ）製の、１０００Å、Ｃ－１８リンカーが結合された非切断性スペーサーポリスチレン支持体である。ポリスチレン支持体は以下の構造を有し、式中、ＤＭＴｒはジメチルトリチルを指す：

【0269】

【化14】

【0270】

長鎖アルキルアミンカルボキシル制御細孔ガラス（ＣＰＧ長鎖アルキルアミン支持体、細孔サイズ５００Ａ、直径１２５～１７７ミクロン）は、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．製から得ることができる。Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ－５００は、Ｐｈａｒｍａｃｉａから得ることができる。１２％架橋ポリスチレンジビニルベンゼン（１２％ポリスチレン－ジビニルベンゼン）樹脂（２００～４００メッシュ）をＰｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓから購入した。

【0271】

ヌクレオキャプシドプラスミドをＩＤＴ ２０１９－ｎＣｏＶ＿Ｎ＿陽性対照プラスミド（カタログ番号１０００６６２５）から得て、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎからのＤＨ５αに形質転換し、アンピシリンプレート上に播種し、ストリークし、一晩培養し、次いでＱｉａｇｅｎ ｍａｘｉ－ｐｒｅｐｓのために増殖させ、次いで２６０／２８０比によって定量した。ＰＣＲ反応は、ＲＯＣＨＥ ＰＣＲ緩衝液を使用して、Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｔ１００ Ｔｈｅｒｍｏ Ｃｙｃｌｅｒにおける３５サイクルの反応当たりのプラスミドから得られたヌクレオキャプシドプラスミドの１、１０、１００ゼプトモル、１、１０、１００アトモル、１、１０、１００フェムトモル、１、１０ピコモルからの対数滴定を用いて作製される。３００塩基未満のＰＣＲ生成物をＴＢＥ－ＰＡＧＥによって分離し、標準と並べてＧｅｌｒｅｄによって定量し、ゲルにかけたプラスミド定量標準曲線を切断した。

【0272】

モデル１１００ ＨＰＬＣは、Ａｇｉｌｅｎｔ（Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ，ＵＳＡ）製であった。モデル７７２５注入器は、Ｒｈｅｏｄｙｎｅ（ＩＤＥＸ、Ｒｏｈｎｅｒｔ Ｐａｒｋ，ＣＡ）製であった。ＬＴＱ ＸＬ線形四重極イオントラップは、Ｔｈｅｒｍｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）製であった。Ｚｏｒｂａｘ ３．５ミクロン３００ÅＣ１８樹脂は、Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ Ｓｐｅｃｉａｌｔｉｅｓ（Ｂｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＯＮ，ＣＡＮＡＤＡ）から入手した。

【0273】

ユニバーサルビオチン結合シグナル増幅酵素コンジュゲートであるＡＰＳＡ酵素は、６００ｎｍ付近でのＵＶ／ＶＩＳ検出により、ｐＨ ８．８５ ２０ｍＭトリス中のＢＣＩＰ／ＮＢＴで９６ウェル当たり１ｐｇ～５０ｐｇの直線範囲を示した。

【0274】

ＡＰＳＡを、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ色素基質との比色反応によるアッセイのために反応緩衝液（２０ｍＭトリス、ｐＨ ８．８５）に溶解させて、０．１％Ｔｗｅｅｎ ２０中でインディゴブルーを形成し、９６ウェルプレートリーダー（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）で５９５ｎｍで測定した。アデノシンは、ＬＣ－ＥＳＩ－ＭＳ反応の絶対標準として機能させ、０．１％酢酸を含む７０％アセトニトリル（ＡＣＮ）に溶解させた。並行して、ＡＰＳＡをＡＭＰと反応させて、ＬＣ－ＥＳＩ－ＭＳによって高感度で検出することができるアデノシンを形成させた。「ＤＮＡ ＥＬｉＭＳＡ」アッセイのために、ＡＰＳＡを１０ｍｌの２０ｍＭトリス（ｐＨ ８．８５）の反応緩衝液に溶解させて、１ｎｇ／μＬストックを得た。ＡＰＳＡ １ｎｇ／μＬを、１０μＬを１０ｍｌの反応緩衝液に溶解させることによって連続希釈して、１ｐｇ／μＬ、次いで１ｆｇ／μＬ（１０００ ａｇ／μＬ）の作業ストックを得た。１ｆｇ／μＬのワーキングストックを使用して、緩衝液１ｍｌ当たり０．１～１０００フェムトグラムの線形希釈系列を作製し、３７℃で１μＭ～１ｍＭのＡＭＰと２時間反応させた。ＬＣ－ＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳアッセイのために、反応を氷上で０．２％酢酸を含むアセトニトリル中１：１（ＤＦ ２）でクエンチし、次いで、アデノシンを２６８．２［Ｍ＋Ｈ］^＋に調整した線形四重極イオントラップ（Ｔｈｅｒｍｏ）を用いたＬＣ－ＥＳＩ－ＭＳのために２０μＬ／分で０．１％酢酸を含む７．５％又は９５％アセトニトリル中の５ミクロンＣ１８（２．１ｍｍ×１５０ｍｍ）上のＡｇｉｌｅｎｔ １１００ ＨＰＬＣを用いて、２μＬを注入する９６ウェルプレートオートサンプラーに装填し、２００μＬ／分でアイソクラチック分離した。酵素コンジュゲートＡＰＳＡからのＡＭＰ基質及びアデノシン生成物をＳＩＭモードで定量し、約１．２分での２６８．２４［Ｍ＋Ｈ］^＋ｍ／ｚクロマトグラフィーピークに隣接する局所バックグラウンドを減算及び平均した後、アデノシンピークデータを抽出した。あるいは、ＭＳ／ＭＳ：フルスキャン：ｍ／ｚ １２０～４００ｍ／ｚ ＳＲＭ：２６８→１３６、分離ウィンドウ：２Ｄａ、衝突エネルギー３５ＣＩＤのＳＲＭ生成物をモニターした。

【0275】

ブロッキング緩衝液は、血清ベース、ＢＳＡ若しくはアルブミンベース、ポリリジンベース、フィブロネクチンベース、ゼラチンベース、又は脱脂粉乳ベースの緩衝液とすることができるが、これらに限定されない。ブロッキング緩衝液は、デオキシコール酸塩、ｎ－オクチルグルコシドＮ－オクチル－β－グルコピラノシド、Ｂｉｇ ＣＨＡＰデオキシ、酸切断性界面活性剤、ＥＤＴＡを含む非イオン性界面活性剤などの界面活性剤を更に含むことができる。ブロッキング緩衝液は、ＴＲＩＳなどの緩衝剤を更に含むことができる。当業者であれば、本開示の方法の特定の用途に応じて、上述したものと同様の他のブロッキング緩衝液も使用できることを理解するであろう。

【0276】

結合緩衝液は、ＴＲＩＳ、ＰＢＳ、ＨＥＰＥＳ、ＭＥＳ又はＭＯＰＳベースの緩衝液とすることができるが、これらに限定されない。当業者であれば、本開示の方法の特定の用途に応じて、上記のものと同様の他の結合緩衝液も使用できることを理解するであろう。場合によっては、結合緩衝液は、塩などの他の成分を更に含むことができる。結合緩衝液が塩を含むとき、ＭＳ分析のために、１つ以上のイオン化可能な生成物を含有する試料は、塩がイオン化源に到達するのを防ぐために、任意選択的に塩迂回弁を用いてランを行うことができる。代替的又は追加的に、１つ以上のイオン化可能な生成物を含有する試料はまた、ＭＳ分析の前にクロマトグラフィーによって（例えば、Ｃ_１８クロマトグラフィーカラムを使用して）脱塩され得る。更に、１つ以上のイオン化可能な生成物を含む試料はまた、有機溶媒中で希釈され得、そして注射前に遠心分離され得る。

【0277】

実施例１ 高結合０．４５ミクロンＰＶＤＦ ９６ウェルフィルタープレート上での核酸の検出
以下は、ＰＶＤＦフィルタープレート上での核酸吸着及び検出の一般的な方法を示す。
●ＰＶＤＦフィルタープレートへの捕捉オリゴヌクレオチドプローブ吸着：ＰＶＤＦをメタノールで予め湿らせる。１ウェル当たり１０μＬの１００μＭ捕捉オリゴヌクレオチドプローブをスポットする。それをドラフト下で１時間乾燥させる。
●ブロッキング：ウェル当たり２００μＬのブロッキング溶液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．００＋１ｍＭ ＥＤＴＡ中３％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ）を添加し、３７℃で１時間インキュベートし、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．００＋１ｍＭ ＥＤＴＡで３×２分間洗浄する（以下の洗浄ステップについても同じ）。
●洗浄：ウェルを結合緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．００＋１Ｍ ＮａＣｌ＋１ｍＭ ＥＤＴＡ）で３回洗浄する。
●標的核酸分子のハイブリダイゼーション：
○標的核酸分子（１μＭ）及び検出オリゴヌクレオチドプローブを結合緩衝液中で１／１０に希釈する。１００μＬの結合緩衝液＋検出オリゴヌクレオチドプローブ１／１０ １０μＬ（０標的核酸分子の場合）、あるいは、１００ｕＬの１μＭ標的核酸分子＋検出オリゴヌクレオチドプローブ１／１０ １０μＬ（１μＭ標的核酸分子の場合）（１００ｆｍｏｌ標的を注入）を添加し、そして９０℃で１５分間インキュベートする。
○プレートをハイブリダイゼーション温度、６０℃でプレインキュベートする。ウェル当たり１１０μＬの標的核酸分子及び検出オリゴヌクレオチドプローブ混合溶液を添加し、１時間インキュベートする。
●洗浄任意：２００μＬの結合緩衝液で３回洗浄する。
●レポーター酵素検出プローブ結合：１０μｇ（１０μＬ）のレポーター酵素検出プローブ（例えばＡＰＳＡ）を１ｍＬの結合緩衝液に溶解し、更にレポーター酵素検出プローブを結合緩衝液で１／１００に希釈する１０ｎｇ／ｍｌ。レポーター酵素検出プローブ希釈物１００μＬ／ウェル（１ｎｇ）を添加し、３７℃で１５分間インキュベートする。
●洗浄：２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．００＋１Ｍ ＮａＣｌ（ＥＤＴＡなし）で９回洗浄し、ウェル中の最後の少量の溶液を除去する。
●レポーター酵素反応：１００μＬの１ｍＭレポーター酵素検出プローブ基質（例えばＡＭＰ）を基質溶液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ ８．８５）に加え、３７℃で２時間インキュベートする。
●ウェル当たり５０μＬの反応物を回収し、それを新しいチューブに移す。
●１００％アセトニトリル（ＡＣＮ）（ＨＰＬＣ）中の０．２％酢酸５０μＬで反応を１：１でクエンチし、次いでスキャンモードでのＭＳ分析のために１：１０に希釈する（最終ＤＦ２０）。

【0278】

例として表６に列挙したＨＩＶウイルスＤＮＡの標的核酸分子、捕捉オリゴヌクレオチド及び検出オリゴヌクレオチド配列を使用して、９６ウェルプレート中のＩｍｍｏｂｉｌｏｎ－Ｐ（商標）ＰＶＤＦ膜への吸着による特異的捕捉オリゴヌクレオチドプローブの固定化は、特異的検出ＤＮＡからの７，０００カウント未満のバックグラウンドに対して５５，０００任意カウントを超えるシグナル強度を生じた。カラム４の独立した複製における１００ｆｍｏｌの標的ウイルスＤＮＡについてのシグナルを図１に示す。

【0279】

実施例２ ９６ウェルポリスチレンプレートにおけるポリリジンコーティングに架橋された核酸の検出
以下は、ポリリジン被覆ポリスチレンプレート上での核酸吸着及び検出の一般的方法を示す。
●ポリスチレンプレートをコーティングするポリリジン０．０１％ポリ－Ｌ－リジン溶液（Ｓｉｇｍａ Ｐ４７０７）１００μＬ／ウェルを添加し、４℃で一晩（１６～１８時間）インキュベートする。傾斜シェーカー上で２００μＬの１×ＰＢＳ、ｐＨ７．２で３×２分間洗浄した（以下の洗浄ステップと同じ）。
●捕捉オリゴヌクレオチドプローブ架橋：１ｍＭのＮＨＳ－ＰＥＧ－ＮＨＳ １×ＰＢＳ溶液を、１×ＰＢＳ中に溶解した１μＭのアミノ化捕捉オリゴヌクレオチドプローブ溶液に、１０μＭの最終濃度で添加する（ＤＦ１００、１ｍｌの捕捉オリゴヌクレオチドプローブ溶液当たり１０μＬ）。１００μＬを各ウェルに移し、３７℃で３０分間インキュベートする；１×ＰＢＳで３回洗浄する。
●クエンチング及びブロッキング：ウェル当たり２００μＬの２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．００＋１ｍＭ ＥＤＴＡ中３％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを添加し、３７℃で１時間インキュベートし、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．００＋１ｍＭ ＥＤＴＡで３回洗浄する。
●洗浄任意：ウェルを結合緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．００＋１Ｍ ＮａＣｌ＋１ｍＭ ＥＤＴＡ）で３回洗浄する。
●標的核酸分子ハイブリダイゼーション：（実施例１と同じ）
●洗浄：（実施例１と同じ）
●レポーター酵素検出プローブ結合：（実施例１と同じ）
●洗浄（任意）：（実施例１と同じ）
●レポーター酵素反応：（実施例１と同じ）

【0280】

実施例として表６に列挙されるＨＩＶウイルスＤＮＡの標的核酸分子、捕捉オリゴヌクレオチド及び検出オリゴヌクレオチド配列を使用して、ウイルス標的核酸分子が、ポリリジンでコーティングされ、ＮＨＳ－ＰＥＧ－ＮＨＳによって５’－又は３’－アミノ化ウイルス捕捉オリゴヌクレオチドプローブで架橋されたポリスチレンプレート上に捕捉され、１００ｆｍｏｌの捕捉された標的核酸分子の等量がカラムに注入されたとき、約８，０００カウントのバックグラウンドに対して４２，０００カウントのシグナル強度が観察された。３つの独立した複製物からカラムに注入された１００ｆｍｏｌの標的核酸分子の等量からの結果を図２に示す。

【0281】

実施例３ アミン反応性Ｎｕｎｃ Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｒアミノ９６ウェルポリスチレンプレート上での核酸の検出
以下は、アミン反応性Ｎｕｎｃ Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｒ（商標）アミノポリスチレンプレート上での核酸吸着及び検出の一般的方法を示す。
●捕捉オリゴヌクレオチドプローブのプレートへの固定化：捕捉オリゴヌクレオチドプローブストック（１００μＭ）を表面結合緩衝液（１００ｍＭ炭酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ ９．６）で１／１０に希釈し、ウェル当たり１００μＬの希釈液を添加する。４℃で一晩インキュベートする。ティルトテーブルの上で２００μＬの表面結合緩衝液で３×２分間洗浄する（以下の洗浄ステップと同じ）。
●クエンチング及びブロッキング：ウェル当たり２００μＬの２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．００＋１ｍＭ ＥＤＴＡ中３％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを添加し、３７℃で１時間インキュベートし、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．００＋１ｍＭ ＥＤＴＡで３回洗浄する。
●洗浄：結合緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．００＋１Ｍ ＮａＣｌ＋１ｍＭ ＥＤＴＡ）で３回洗浄
●標的核酸分子ハイブリダイゼーション（実施例１と同じ）
●洗浄（任意）：（実施例１と同じ）
●レポーター酵素検出プローブ結合：（実施例１と同じ）
●洗浄：（実施例１と同じ）
●レポーター酵素反応：（実施例１と同じ）

【0282】

例として表６に列挙されるＨＩＶウイルスＤＮＡの標的核酸分子、捕捉オリゴヌクレオチド及び検出オリゴヌクレオチド配列を使用して、９６ウェルＮｕｎｃ Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｒアミノプレートにおけるアミン反応性官能基（反応性カルボン酸官能基）を介した５’－又は３’－アミノ化ウイルス捕捉オリゴヌクレオチドプローブの固定化は、３，０００カウントのバックグラウンドに対して２７，０００カウントを生じた。カラムに注入された１００ｆｍｏｌの標的核酸分子の等量からの結果を図３に示す。

【0283】

実施例４ ＮＯＳ表面化学９６ウェルポリスチレン反応性プレート上での核酸の検出
以下は、Ｎ－オキシスクシンイミド（ＮＯＳ）表面化学ポリスチレンプレート上での核酸吸着及び検出の一般的方法を示す。
●捕捉オリゴヌクレオチドプローブのプレートへの固定化：捕捉ＤＮＡストック（１００ｕｍ）を表面結合緩衝液（１０ｍＭ Ｎａ_２ＰＯ_４＋１ｍＭ ＥＤＴＡ緩衝液、ｐＨ ８．５）で１／１０に希釈し、ウェル当たり１００μＬを添加し、４℃で一晩インキュベートし、溶液をデカントし、表面結合緩衝液で３×２分間洗浄する。
●クエンチング及びブロッキング：ウェル当たり２００μＬの２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．００＋１ｍＭ ＥＤＴＡ中３％（ｗ／ｖ）ＢＳＡで表面をブロック及びクエンチし、３７℃で１時間インキュベートし、デカントし、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．００＋１ｍＭ ＥＤＴＡで３回洗浄する。
●洗浄：結合緩衝液２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．００＋１Ｍ ＮａＣｌ＋１ｍＭ ＥＤＴＡ）で３回洗浄。
●標的核酸分子ハイブリダイゼーション（実施例１と同じ）
●洗浄：（実施例１と同じ）
●レポーター酵素検出プローブ結合：（実施例１と同じ）
●洗浄（任意）：（実施例１と同じ）
●レポーター酵素反応：（実施例１と同じ）

【0284】

実施例として表６に列挙されたＨＩＶウイルスの標的核酸配列、捕捉オリゴヌクレオチド及び検出オリゴヌクレオチド配列を使用して、標的核酸を捕捉するためのＣｏｒｎｉｎｇ（登録商標）ＤＮＡ－ＢＩＮＤ（登録商標）９６ウェルプレートにおけるＮ－オキシスクシンイミド（ＮＯＳ）表面化学による５’－又は３’－アミノ化ウイルス捕捉オリゴヌクレオチドプローブの固定化は、約３，０００カウントのバックグラウンドと比較して、２２，０００の特異的カウントをもたらした。３つの独立した複製からカラムに注入された１００ｆｍｏｌの標的ＤＮＡの等量からの結果を図４に示す。

【0285】

実施例５ ９６ウェルＰＶＤＦフィルタープレート中のポリスチレンオリゴ合成ビーズに３’結合した核酸の検出
以下は、捕捉オリゴヌクレオチドプローブが、ＰＶＤＦフィルタープレート中の３’結合ポリスチレンオリゴ合成ビーズである、核酸検出の一般的方法を示す。
●フィルタープレートのブロッキング：ウェル当たり２００μＬのブロッキング溶液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．００＋１ｍＭ ＥＤＴＡ中３％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ）を添加し、３７℃で１時間インキュベートし、デカントし、真空マニホールド設定を使用して２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．００＋１ｍＭ ＥＤＴＡで３回洗浄する（以下の洗浄ステップも同じ）。
●洗浄：結合緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．００＋１Ｍ ＮａＣｌ＋１ｍＭ ＥＤＴＡ）で３回洗浄。
●標的核酸ハイブリダイゼーション：
○ウェル当たり１０μＬの捕捉オリゴヌクレオチドプローブビーズ懸濁液を使用する。遠心管中でビーズをペレット化し（１６，０００ ＲＣＦで５分間）、上清を除去する。
○捕捉ビーズを５００μＬのブロッキング溶液中に室温で１５分間、大観覧車（Ｆｅｒｒｉｓ Ｗｈｅｅｌ）で再懸濁する。
○ビーズを１ｍＬの２０ｍＭトリスｐＨ ８．００＋１ｍＭ ＥＤＴＡ中で２回洗浄し、１６，０００ ＲＣＦで５分間遠心分離して上清を除去する。
○捕捉ビーズを結合緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．００＋１Ｍ ＮａＣｌ＋１ｍＭ ＥＤＴＡ）に再懸濁する。
○標的核酸分子（１μＭ）及び捕捉オリゴヌクレオチドプローブを結合緩衝液中で１／１０に希釈し、反応当たり、１００μＬの結合緩衝液＋捕捉オリゴヌクレオチドプローブ１／１０ １０μＬ（０標的核酸分子の場合）、あるいは、１００μＬの１μＭ標的核酸分子＋捕捉オリゴヌクレオチドプローブ１／１０（１０μＬの１μＭ標的核酸分子の場合）を、捕捉ビーズを含む各チューブに添加する。
○９０℃で１５分間、次いで６０℃で１時間インキュベートする。
○ＤＮＡ混合物をフィルタープレートに移す。
●洗浄（任意選択）：ウェル当たり２００μＬの結合緩衝液で３回洗浄する。
●レポーター酵素検出プローブ結合：（実施例１と同じ）
●洗浄：（実施例１と同じ）
●レポーター酵素反応：（実施例１と同じ）

【0286】

例として表６に列挙されるＨＩＶウイルスＤＮＡの標的核酸分子、捕捉オリゴヌクレオチド及び検出オリゴヌクレオチド配列を使用して、９６ウェルＰＶＤＦフィルタープレート中のポリスチレンオリゴ合成ビーズへの３’結合を有する捕捉オリゴヌクレオチドプローブによって捕捉されたウイルスＤＮＡは、約８，０００カウントのバックグラウンドと比較して、４２，０００の特異的カウントのシグナルを生じた。３つの独立した複製物からカラムに注入された１００ｆｍｏｌの標的核酸分子の等量からの結果を図５に示す。

【0287】

実施例６ アミノシリル化カバーガラス表面に架橋された捕捉オリゴヌクレオチドプローブを用いた核酸の検出
以下は、捕捉オリゴヌクレオチドプローブがアミノシリル化カバーガラス表面に架橋された核酸検出の一般的な方法を示す。
●カバーガラスのアミノシリル化：
○カバーガラスを２．５Ｍ ＮａＯＨに一晩浸漬することによって完全に洗浄し、ＤＩ水で洗浄し、１０％ＨＣｌに浸漬し、ＤＩ水及びメタノールでリンスし、表面を空気乾燥させる。
○アセトン中のＡＴＰＥＳの２％溶液を調製し、カバーガラスを溶液中に１５分間浸漬する。カバーガラスをアセトンでリンスし、空気乾燥させる。
○９６ウェルポリスチレンプレートのウェルにカバーガラスを注意深く入れる。
●捕捉オリゴヌクレオチドプローブの架橋：１ｍＭ ＮＨＳ－ＰＥＧ－ＮＨＳ １×ＰＢＳ溶液を、１×ＰＢＳ中に溶解させた１μＭ捕捉オリゴヌクレオチドプローブ溶液に、１０μＭ最終濃度で添加する（１ｍｌ捕捉オリゴヌクレオチドプローブ溶液当たり１０ｕＬ）。ウェル当たり１００μＬを移し、３７℃で３０分間インキュベートする；１×ＰＢＳで３回洗浄する。
●クエンチング及びブロッキング：ウェル当たり２００μＬの２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．００＋１ｍＭ ＥＤＴＡ中３％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを添加し、３７℃で１時間インキュベートし、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．００＋１ｍＭ ＥＤＴＡで３回洗浄する。
●洗浄：ウェルを結合緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．００＋１Ｍ ＮａＣｌ＋１ｍＭ ＥＤＴＡ）で３回洗浄する。
●標的核酸分子ハイブリダイゼーション（上記実施例１と同じ）
●洗浄（任意）：（実施例１と同じ）
●レポーター酵素検出プローブ結合：（実施例１と同じ）
●洗浄：（実施例１と同じ）
●レポーター酵素反応：（実施例１と同じ）

【0288】

例として表６に列挙されるＨＩＶウイルスＤＮＡの標的核酸分子、捕捉オリゴヌクレオチド及び検出オリゴヌクレオチド配列を使用して、５’－又は３’－アミノ化ウイルス捕捉オリゴヌクレオチドプローブを、ガラスのアミノ－シリル化及びＮＨＳ－ＰＥＧ－ＮＨＳによる架橋を介してガラス表面に固定化すると、６，０００カウントのバックグラウンドに対して３５，０００カウントとなった。３つの独立した複製物からカラムに注入された１００ｆｍｏｌの標的核酸分子の等量からの結果を図６に示す。

【0289】

実施例７ ＤＮＡのための結合緩衝液中のＮａＣｌの最適化
緩衝液最適化
実施例５で先に記載したものにわずかな変更を加えて、９６ウェル０．４５μｍ ＰＶＤＦフィルタープレート中のポリスチレンオリゴ合成ビーズに連結された捕捉オリゴヌクレオチドプローブを使用した、緩衝液の最適化実験を、実施例７及び８に記載する。

【0290】

ＰＶＤＦフィルタープレートを３％ＢＳＡで１時間ブロッキングし、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０で３回洗浄し、様々なＮａＣｌ濃度：０、０．０５、０．１、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．５及び２．０Ｍの結合緩衝液中で平衡化した。別に、捕捉ビーズを３％ＢＳＡで１５分間ブロッキングし、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ中で遠心分離により洗浄し、様々な結合緩衝液中で平衡化した。捕捉オリゴヌクレオチドプローブ及び標的核酸分子を種々の結合緩衝液中のビーズにアプライし、９０℃で１５分間、続いて６０℃で１時間ＤＮＡハイブリダイゼーションさせた。ビーズをＰＶＤＦフィルタープレートに移し、種々の結合緩衝液で３回洗浄し、ＡＰＳＡと共に３７℃で１５分間インキュベートした。未結合ＡＰＳＡを種々の結合緩衝液で９回洗浄して洗い流し、ビーズを１ｍＭ ＡＭＰ基質と共に２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ ８．８５中で２時間インキュベートした。反応を停止させ、１００％で１：２０に希釈し、最終濃度を０．１％酢酸とした。１００％アセトニトリル、０．１％酢酸の移動相を用いたＣ１８逆相３．５ｕｍカラムによって試料を分離し、ＬＴＱリニアイオントラップによって２６８．２ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］^＋でアデノシン生成物を検出した。各試料を２回注入し、ＮａＣｌ最適値を１．５Ｍで同定した。異なる濃度のＮａＣｌにおけるＭＳシグナル強度の結果を図７に示す。

【0291】

実施例８ ＤＮＡのための結合緩衝液中の重炭酸アンモニウムの最適化
ＰＶＤＦフィルタープレートを３％ＢＳＡで１時間ブロッキングし、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０で３回洗浄し、様々な重炭酸アンモニウム濃度：０、０．１、０．５、１．０、１．５、２．０、２．５Ｍの結合緩衝液中で平衡化した。別に、捕捉ビーズを３％ＢＳＡで１５分間ブロッキングし、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ中で遠心分離により洗浄し、様々な結合緩衝液中で平衡化した。捕捉オリゴヌクレオチドプローブ及び標的核酸分子を種々の結合緩衝液中のビーズにアプライし、９０℃で１５分間、続いて６０℃で１時間ＤＮＡハイブリダイゼーションさせた。ビーズをＰＶＤＦフィルタープレートに移し、種々の結合緩衝液で３回洗浄し、ＡＰＳＡと共に３７℃で１５分間インキュベートした。未結合ＡＰＳＡを種々の結合緩衝液で９回洗浄して洗い流し、ビーズを１ｍＭ ＡＭＰ基質と共に２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ ８．８５中で２時間インキュベートした。反応を停止させ、１００％で１：２０に希釈し、最終濃度を０．１％酢酸とした。１００％アセトニトリル、０．１％酢酸の移動相を用いたＣ１８逆相３．５ｕｍカラムによって試料を分離し、ＬＴＱリニアイオントラップによって２６８．２ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］^＋でアデノシン生成物を検出した。各試料を２回注入し、最適な重炭酸アンモニウムを１．５Ｍで同定した。結果を図８に示す。

【0292】

標的核酸分子、捕捉オリゴヌクレオチドプローブ及び検出オリゴヌクレオチドプローブは、表６に示されるＨＩＶ配列である。

【0293】

実施例９ ハイブリダイゼーション後の結合緩衝液中の揮発性緩衝液の比較
ＰＶＤＦフィルタープレートを３％ＢＳＡで１時間ブロッキングし、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０で３回洗浄し、１．５Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０（結合緩衝液）中で平衡化した。別個に、捕捉ビーズを３％ＢＳＡで１５分間ブロックし、遠心分離によって２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ中で洗浄し、結合緩衝液中で平衡化した。捕捉オリゴヌクレオチドプローブ及び標的核酸分子を結合緩衝液中のビーズにアプライし、９０℃で１５分間、続いて６０℃で１時間ＤＮＡハイブリダイゼーションさせた。ビーズをＰＶＤＦフィルタープレートに移し、１．５Ｍ ＮａＣｌを０．５、１．０、１．５、２．０、２．５Ｍエタノールアミン、０．５、１．０、１．５、２．０、２．５Ｍ酢酸アンモニウム、０．５Ｍ重炭酸トリエチルアンモニウム、０．５、１．０、１．５、２．０、２．５Ｍ重炭酸アンモニウム又は標準１．５Ｍ ＮａＣｌのいずれかで置き換えた結合緩衝液中で３回洗浄した。ＡＰＳＡを種々の結合緩衝液中のビーズにアプライし、３７℃で１５分間インキュベートした。未結合ＡＰＳＡを種々の結合緩衝液で９回洗浄して洗い流し、ビーズを１ｍＭ ＡＭＰ基質と共に２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ ８．８５中で２時間インキュベートした。反応を停止させ、１００％で１：２０に希釈し、最終濃度を０．１％酢酸とした。１００％アセトニトリル、０．１％酢酸の移動相を用いたＣ１８逆相３．５ｕｍカラムによって試料を分離し、ＬＴＱリニアイオントラップによって２６８．２ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］^＋でアデノシン生成物を検出した。各試料を２回注入し、最も性能の良い揮発性緩衝液は２Ｍエタノールアミンであった。結果を図９に示す。

【0294】

実施例１０ ＰＣＲプライマー、オリゴヌクレオチド捕捉プローブ及びオリゴヌクレオチド検出プローブ配列
ＰＣＲプライマー並びにオリゴ捕捉及び検出ＤＮＡ配列を、ｍｉＲＮＡ及びｎｃＲＮＡの干渉効果を考慮しつつ、ＮＣＢＩ ＰＣＲ及びオリゴＤＮＡアルゴリズムＰＣＲ－ＢＬＡＳＴを使用して設計した（表１～６）。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のｒｔＰＣＲ反応において高い偽陰性率が観察された（Ｘｉｅ，２０２０）。アルカリホスファターゼによる第２段階増幅及びＬＣ－ＥＳＩ－ＭＳ検出のために、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＰＣＲ生成物を増幅し、次いで捕捉するように、ＰＣＲプライマー及び／又はネステッドオリゴ捕捉配列の柔軟なセットを設計した。プライマーを、世界保健機関によって対照として推奨されたものと比較する。

【0295】

ＮＣ＿０４５５１２．２：２８２７４－２９５３３武漢海鮮市場肺炎ウイルス分離株Ｗｕｈａｎ－Ｈｕ－１、ヌクレオキャプシド遺伝子におけるＮＣＢＩ Ｐｒｉｍｅｒ－ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって標的とされる領域を示すＳＡＲＳ及びＭＥＲＳに相同であるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオキャプシド遺伝子（配列番号１）に特異的なオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブの設計を考察する。表１において、捕捉オリゴ部位及び検出オリゴ部位を太字の下線で示す。

【0296】

【表3】

捕捉領域及び検出領域に下線を付す。イタリック体はプライマー領域を示す。

【0297】

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオキャプシドに対するＰＣＲプライマーの第１のセット（ＳＡＲＳ ＣｏＶ２セット１）を表２に示す。略語：ＦＰフォワードプライマー；ＲＰリバースプライマー；Ｐ／Ｎポリスチレンオリゴ合成ビーズ／共有結合アミンリンク９６ウェルプレート；Ｂビオチン。任意選択的に、プライマー（例えば、配列番号２）は、ビオチンで官能化され得、そして／又はポリスチレンオリゴ合成ビーズにコンジュゲートされ得る。

【0298】

【表4】

【0299】

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオキャプシド遺伝子に対するＰＣＲプライマーの第２のセット（ＳＡＲＳ ＣｏＶ２セット２）、対応する標的核酸分子配列の例、並びに対応する捕捉及び検出オリゴヌクレオチドプローブの例示的なセットを、表３に示す。略語：Ｃキャプチャーオリゴ；Ｄ検出オリゴ；ＦＰフォワードプライマー；ＲＰリバースプライマー；Ｐ／Ｎポリスチレンオリゴ合成ビーズ／共有結合アミンリンク９６ウェルプレート；ｂビオチン；ＰＣＲ反応生成物。

【0300】

【表5】

【0301】

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオキャプシド配列に対するＰＣＲプライマーの第３のセット（ＳＡＲＳ ＣｏＶ２セット３）を表４に示す。略語：ＦＰフォワードプライマー；ＲＰリバースプライマー；Ｐ／Ｎポリスチレンオリゴ合成ビーズ／共有結合アミンリンク９６ウェルプレート；Ｂビオチン。

【0302】

【表6】

【0303】

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のためのＰＣＲプライマー設計の別のセット（ＳＡＲＳ ＣｏＶ２セット４）、対応する標的核酸分子配列の例、並びに対応する捕捉及び検出オリゴヌクレオチドプローブの例示的なセットを表５に示す。略語：ＦＰフォワードプライマー；ＲＰリバースプライマー；Ｐ／Ｎポリスチレンオリゴ合成ビーズ／アミンリンク；ｂビオチン。同じ捕捉及び検出オリゴヌクレオチド（表３）を有するより長い反応生成物は、プライマー：フォワード、５’－ＴＧＧＡＣＣＣＣＡＡＡＡＴＣＡＧＣＧＡＡ－３’（配列番号７）、リバース、５’－ＴＧＣＣＧＴＣＴＴＴＧＴＴＡＧＣＡＣＣＡ－３’（配列番号８）から生じる。

【0304】

【表7】

【0305】

ＨＩＶ特異的捕捉及び検出オリゴヌクレオチドプローブ配列（ＨＩＶセット１）及び可能な対応する標的核酸分子を表６に列挙する。ＨＩＶ特異的捕捉及び検出オリゴヌクレオチドプローブ配列並びに可能な対応する標的核酸分子の他のセット（ＨＩＶセット２～４）を、それぞれ表７～９に列挙する。標的核酸分子配列中の太字の配列は、捕捉及び検出オリゴヌクレオチドプローブ配列との重複に対応する。

【0306】

【表8】

【0307】

【表9】

【0308】

【表10】

【0309】

【表11】

【0310】

志賀毒素生成大腸菌（ＳＴＥＣ）特異的捕捉及び検出オリゴヌクレオチドプローブ配列（ＳＴＥＣセット１～３）及び可能な対応する標的核酸分子を、それぞれ表１０～１２に列挙する。標的核酸分子配列中の太字の配列は、捕捉及び検出オリゴヌクレオチドプローブ配列との重複に対応する。

【0311】

【表12】

【0312】

【表13】

【0313】

【表14】

【0314】

α溶血素生成Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ特異的捕捉及び検出オリゴヌクレオチドプローブ配列（ＳＡＵＲＥＵＳセット１）及び可能な対応する標的核酸分子を表１３に列挙する。標的核酸分子配列中の太字の配列は、捕捉及び検出オリゴヌクレオチドプローブ配列との重複に対応する。

【0315】

【表15】

【0316】

表６、７、８、９について、ＰＣＲプライマーは、少なくとも１００ｂｐ又はより最適には１５０、２００若しくは３００ｂｐの生成物を生成する標的を増幅する５’側又はいずれかの隣接配列上の最初の３６塩基中にあってもよい。

【0317】

Ｐ／Ｎは、配列が、例えば、固体支持体への結合のために、ホスフェート末端（ヌクレオチドにおいて見出される）又はアミンを含み得ることを示す。

【0318】

実施例１１ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２のＰＣＲ検出
ＰＣＲ反応は、１０ｎｇのテンプレートプラスミドＤＮＡ（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ヌクレオキャプシドプラスミド）を用いて、以下のプライマーのコンビネーションで開始した。
１．フォワードプライマー配列番号２及びリバースプライマー配列番号３（１３８ｂｐのＰＣＲ生成物）；
２．フォワードプライマー配列番号２及びリバースプライマー配列番号８（２７９ｂｐのＰＣＲ生成物）；
３．フォワードプライマー配列番号７及びリバースプライマー配列番号３（２３６ｂｐのＰＣＲ生成物）；及び
４．フォワードプライマー配列番号７及びリバースプライマー配列番号８（３７７ｂｐのＰＣＲ生成物）。

【0319】

各プライマーコンビネーションの対応するＰＣＲ生成物の予想される長さは、表１に示すＳＡＲＳ－ＣｏＶ２のヌクレオキャプシド遺伝子配列を用いて計算することができる。ＰＣＲ生成物の予想される長さを上記の括弧内に列挙する。ＰＣＲ反応は、リッド温度１０５℃、反応体積１００μｌ、融解温度９４℃（３０秒）、アニーリング温度５５℃（３０秒）、伸長温度７２℃（１分）で３５サイクル行った。ＰＣＲ生成物を、分子量マーカーと共に１００ボルトで１６％ＴＢＥポリアクリルアミドゲル中を泳動させることによって分離した。得られたゲルを図１０に示す。ゲルは、各プライマーの組み合わせにおいて、予想される長さに対応するＰＣＲ生成物が観察されたことを示し、ＰＣＲ反応がＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ヌクレオキャプシド遺伝子における所望の配列を首尾よく増幅したことを確認した。

【0320】

図１１は、テンプレートとしてＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ヌクレオキャプシド遺伝子を含有するプラスミド及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ２セット１ ＰＣＲプライマー（配列番号２及び３）を使用したＰＣＲ結果を示す。０テンプレート、微量検出量のテンプレート、並びに異なる量のテンプレート（０．１ｎｇ、１ｎｇ、１０ｎｇ、５０ｎｇ）を含む異なる量のテンプレートを使用した。図１３はまた、レーン６～１０において、異なる濃度のＭｇ（２ｍＭ、２．５ｍＭ、３．０ｍＭ、３．５ｍＭ、又は４．０ｍＭ）を使用して生成されたＰＣＲ生成物を示す。ＰＣＲは、ホットスタートを使用して５５℃のアニーリング温度で３５サイクル行った。プライマーを、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ中に再懸濁して、Ｑｉａｇｅｎマスターミックスを使用するＰＣＲ ｒｘｎにおいて０．２ｕｍの最終濃度にした。プラスミド濃度は、１００ボルト泳動の１６％ＴＢＥポリアクリルアミドゲルによって分離された１００μＬのＰＣＲ生成物の範囲であった。最大量のＰＣＲ生成物は、５０ｎｇの出発プラスミドＤＮＡ及び１．５～４ｍＭのＭｇ^２＋を用いることで生成された。顕著かつ観察可能な量のＰＣＲ生成物が、微量検出量のテンプレート（レーン１）、サブナノグラム（レーン２）及びナノグラム量（レーン３）のテンプレートＤＮＡにより得られた。

【0321】

図１２は、本開示のＤＮＡ検出方法を使用したＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ヌクレオキャプシド遺伝子のＰＣＲ生成物の検出結果を示す。固体支持体に結合した３’を有する捕捉オリゴヌクレオチドプローブ配列番号６及び５’－ビオチン化検出オリゴヌクレオチド配列番号５を用いて検出を行った。０テンプレートＤＮＡ及びＰｕＣ１９プラスミドＤＮＡを陰性対照として使用した。微量、１０ｆｇ、１００ｆｇ、１ｐｇ、１０ｐｇ～１００ｐｇの範囲の様々な量のテンプレートＤＮＡを使用した。テンプレートＤＮＡの全ての量についてＭＳシグナルが観察された。テンプレートなし又はＰｕｃ１９プラスミドについてはシグナルは観察されなかった。増幅された標的核酸生成物は、配列番号４の長さ１３８ｎｔである。

【0322】

本明細書に記載される方法は、捕捉オリゴが固体状態に固定化され、ＡＭＰとＡＰＳＡとの反応による二次酵素増幅のための独立したビオチン化検出オリゴヌクレオチドプローブを用いるとき、高度に選択的なハイブリダイゼーション法によってウイルス標的核酸分子を検出するために適用することができる。本明細書中に示されるように、ウイルスＤＮＡは、捕捉オリゴヌクレオチドプローブ、その後の選択的ハイブリダイゼーション及びＡＰＳＡ増幅による、種々の固定化方法を使用して、例えば、ＰＶＤＦ膜に非共有結合した捕捉オリゴヌクレオチドプローブ、９６ウェルフィルタープレート中のポリスチレンビーズに３’カップリングした捕捉オリゴヌクレオチドプローブ、９６ウェル反応性プレートに共有結合した捕捉オリゴヌクレオチドプローブ、ポリリジンコーティングを介して９６ウェルポリスチレンプレートに、及びアミノシリル化及び架橋によってカバーガラス（ＳｉＯ２）に、共有結合した捕捉オリゴヌクレオチドプローブを使用して検出することができる。

【0323】

実施例１２ オリゴヌクレオチドプローブの調製
本開示のオリゴヌクレオチドプローブは、当業者に公知の方法に従って調製してもよく、又は既存の供給業者から市販品を購入してもよいことが理解され得る。

【0324】

例えば、捕捉オリゴヌクレオチドは、シリカ、ポリスチレン、アガロース、メラミン、ＰＶＤＦ、又は他の支持体上に配置し得る。シリカ、ポリスチレン、アガロース、メラミン、ＰＶＤＦ、又は他の支持体は、マイクロ粒子又はナノ粒子の形態とすることができる。任意選択的に、シリカ、ポリスチレン、アガロース、メラミン、ＰＶＤＦ、又は他の支持体は、２次元表面、３次元表面、又は１次元繊維若しくはフィラメントとすることができる。

【0325】

例えば、シリカマイクロ粒子又はナノ粒子を官能化して、オリゴヌクレオチドの結合のための反応性部位を生成させ得る。例えば、シリカマイクロ粒子又はナノ粒子は、３－アミノプロピルトリメトキシシランを用いてアミン基で、又は３’グリシドキシプロピルトリメトキシシランを用いてエポキシド基で、官能化され得る。このとき、アミン又はエポキシドは、オリゴヌクレオチドの結合のための反応部位として機能することができる。他の反応性部位又は官能性部位としては、シラノール、ヒドロキシル、カルボン酸、アミン基又はカルボキシル基と反応する任意のもの、マレイミド、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、Ｎ－オキシスクシミド（ＮＯＳ）、Ｈ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、Ｎ－オキシスクシンイミド（ＮＯＳ）、マレイミド、ヒドラジド、グルタルアルデヒドカップリング、又はＰＥＧ架橋などが挙げられる。

【0326】

捕捉又はプライマーがアミン基を含み、固体支持体がそれと反応することができる基を含むことが典型的であるが、他の構成を使用することができる。例えば、ＮＨＳ基又は他のＮＯＳリンカーを捕捉オリゴヌクレオチド又はプライマーに付加して固体表面に付着させることができ、固体表面は官能化可能なアミンを含むことができる。

【0327】

例えば、オリゴヌクレオチドは、一度に１つのヌクレオチドの反応部位に結合され得る。例えば、第１のヌクレオチドは、Ｃ１位、３’－ＯＨ基、又は５’－ＯＨ基を介して結合され得る。任意選択的に、第１のヌクレオチドは、リンカーを介して固体支持体に結合され得る。例えば、アミンオリゴヌクレオチドは、任意選択的にその活性化エステルを介して、カルボキシル基（例えば、カルボン酸基）に結合され得る。例えば、第１のヌクレオチドは、３’－ＯＨ位を介して結合され得、５’－ＯＨは、ジメチルトリチル（ＤＭＴ）基で保護され得る。

【0328】

例えば、オリゴヌクレオチドは、ヌクレオチドのオリゴマーの部分で結合され得るか、又は１つのオリゴヌクレオチドとして結合され得る。

【0329】

オリゴヌクレオチドは、当業者に公知の従来のヌクレオチド合成法によって合成され得る。有機合成の間、合成中間体は、当業者に公知の従来の保護基を用いて保護することができる。例えば、ヌクレオチド塩基は、ベンゾイル基又はイソブチリル基を使用して保護され得る。更に、有機合成中に、当業者に公知の方法を使用して官能基を修飾してそれらの反応性を増加させ得る。例えば、カルボン酸は、スクシンイミドエステルなどの活性化エステルを介して活性化することができる。例えば、チオール、メルカプト又はスルフィド又はＳＨ－オリゴヌクレオチドは、ヨードアセトアミドなどのアルキル化剤を介して共有結合され得る。

【0330】

オリゴヌクレオチドは、当業者に公知の方法によって酵素に共有結合されることができることが理解され得る。例えば、検出オリゴヌクレオチドは、ＡＰＳＡなどの検出酵素に共有結合され得る。

【0331】

例えば、タンパク質、ペプチド、酵素、ＤＮＡ、ＲＮＡ又は抗体、オリゴマー又はポリマーは、Ｎ末端及び多くのアミノ酸に見出される一級アミン（－ＮＨ２）、各ポリペプチド鎖のＣ末端並びにアスパラギン酸（Ａｓｐ、Ｄ）及びグルタミン酸（Ｇｌｕ、Ｅ）の側鎖におけるカルボキシル（－ＣＯＯＨ）、システイン（Ｃｙｓ、Ｃ）の側鎖におけるスルフヒドリル（－ＳＨ）、並びにケトン又はアルデヒド基などのカルボニル（－ＣＨＯ）とカップリング又は架橋され得る。例えば、ＮＨＳ－活性化酸は、無水溶媒中で有機塩基の存在下でカルボン酸にカップリングされ得る。次いで、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）又はエチル（ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）のようなカップリング試薬を添加して、第一級アミンとの安定な結合を形成する。

【0332】

任意選択的に、架橋剤が使用され得る。例えば、一官能性、二官能性又は多官能性架橋試薬が使用され得る。例えば、ＮＨＳ、スルホ－ＮＨＳ、ＤＳＳ、ＢＳ３（スルホ－ＤＳＳ）、アミン－アミン架橋剤が使用され得る。例えば、水溶性アナログスルホ－ＮＨＳ、ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、１－ヒドロキシ－７－アザベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ）、及びペンタフルオロフェノールはいずれも、核酸、ペプチド及びタンパク質又は抗体のための連結試薬として使用され得る。例えば、マレイミドは、例えばシステイン中のチオール基を架橋するために使用され得る。

【0333】

タンパク質、ペプチド及び核酸は、第一級アミン及び／又はヒドロキシル基を提示し、第一級アミン及び／又はヒドロキシル基を介して修飾又は架橋され得ることが、当業者によって理解され得る。

【0334】

例えば、スルホ－ＳＭＣＣ（スルホスクシンイミジル４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシレート）、ＥＤＣ １－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド、スルホ－ＮＨＳ（Ｎ－ヒドロキシスルホスクシンイミド）、ＢＳ３（ビス（スルホスクシンイミジル）スベラート）、ＤＳＴ（ジスクシンイミジルタルタレート）、ＳＰＤＰ（スクシンイミジル３－（２－ジピリジジル）プロピオネート）を架橋剤として用いてもよい。例えば、ジチオビススクシンイミジルプロピオネートは、アミンをアミンに架橋するために使用され得る。例えば、ＢＭＨビスマレイミドヘキサンは、スルフヒドリルをスルフヒドリル（例えば、タンパク質又はペプチド中のシステイン残基において）に架橋するために使用され得る。

【0335】

例えば、スルホ－ＥＧＳ（エチレングリコールビス（スルホスクシンイミジルスクシナート）を使用して、アミンをアミンに架橋することができる。

【0336】

例えば、ＳＭ（ＰＥＧ）４（ＰＥＧ化ＳＭＣＣ架橋剤）を使用して、アミンをスルフヒドリルに架橋することができる。それらの架橋剤は、水溶性ポリエチレングリコールスペーサーアーム（１７．６～９５．２Ａ）の末端にＮＨＳ－エステル及びマレイミド基を含有する。

【0337】

例えば、スルホ－ＥＭＣＳ（Ｎ－ε－マレイミドカプロイル－オキシスルホスクシンイミドエステル）を使用して、アミンをスルフヒドリルに架橋することができる。

【0338】

例えば、スルホ－ＳＭＰＢ（スルホスクシンイミジル４－（Ｎ－マレイミドフェニル）ブチレート）を使用して、アミンをスルフヒドリルに架橋することができる。

【0339】

タンパク質、ペプチド、又はアミン含有分子は、当業者に公知の方法を使用してビオチン化され得ることが理解され得る。例えば、ＮＨＳ－ＰＥＧ ４－ビオチンＮ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）は、ビオチン標識化のためのペグ化水溶性試薬である。

【0340】

任意選択的に、リンカーは、オリゴヌクレオチドとタンパク質（例えば、酵素）との間で使用され得る。

【0341】

例えば、１％架橋ポリスチレン樹脂の誘導体化は、Ｈｏｒｉｋｉ ｅｔ ａｌ．（１５）の手順に従って行うことができる。

【0342】

例えば、ポリスチレンカルボキシル樹脂：は、Ｂａｙｅｒ ｅｔ ａｌ．（１６）の方法によって調製され得る。

【0343】

例えば、セファクリルＳ－５００の臭化シアン活性化は、Ｂｉｉｎｅｍａｎｎ（８）によって記載されているように実施され得る。

【0344】

例えば、硫酸コンドロイチン被覆ＣＰＧ支持体は、硫酸コンドロイチン（タイプＡ又はタイプＣ）の長鎖アルキルアミンをＥＤＣ（Ｇｈｏｓｈ Ｍｕｓｓｏ ＮＡＲ １９８７）でＣＰＧ化することによって調製され得る。

【0345】

例えば、オリゴヌクレオチドは、５’－アミノヘキシル及び５’－シスタミニルホスホルアミデート又はオリゴヌクレオチドの他の誘導体でブロックすることによって調製され得る。例えば、０．１Ｍ Ｎ－メチルイミダゾール（ｐＨ ６．０）中の０．１Ｍ ＥＤＣの存在下での５’－リン酸化オリゴヌクレオチドと１，６－ジアミノヘキサンとの反応は、Ｃｈｕら（２０）によって記載された直接カップリングプロトコルに従って行われ得る。

【0346】

例えば、オリゴヌクレオチドは、０．２Ｍ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ ７．７）中の５’－アミノヘキシル又は５’－シスタミニルホスホルアミデート又は他の保護オリゴヌクレオチドを有するＮ－ヒドロキシスクシンイミド活性化カルボキシルセファクリル支持体を使用して、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド活性化に結合され得る。

【0347】

実施例１３ アトモル濃度でのＤＮＡ検出
本明細書に記載のＤＮＡ検出方法（実施例５）に従って、ＤＮＡ検出アッセイを行った。ＨＩＶ ＤＮＡを標的として使用した。標的核酸分子は、配列番号１５の配列を有する。固体支持体としてのポリスチレンに３’を結合させた配列番号１４の捕捉オリゴヌクレオチドプローブを使用した。配列番号１６の検出オリゴヌクレオチドプローブを、５’をビオチン化して使用した。異なる濃度の標的核酸分子を使用した：０アトモル（陰性対照）、１アトモル、２アトモル、３アトモル、４アトモル、５アトモル、及び６アトモル。標的核酸分子への捕捉及び検出オリゴヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーションは、ＮａＣｌの存在下で行った。固体支持体（ポリスチレンビーズ）を、ＮａＣｌを含有する緩衝液で洗浄し、遠心分離によって分離した。ＡＰＳＡ酵素反応は、ＮａＣｌの存在下で行った。反応混合物を、移動相として７０％アセトニトリル／水を使用するＣ１８逆相クロマトグラフィーで処理した。１μＬの反応生成物をＭＳに注入した。ｍ／ｚ＝２６８でＭＳ検出を行った。

【0348】

図１８は、ＭＳシグナル強度に対するＤＮＡ標的核酸の濃度の標準化曲線を示す。結果は、ＤＮＡ検出アッセイがアトモル範囲の感度であることを示す。

【0349】

実施例１４ アトモル濃度でのＤＮＡ検出
本明細書に記載のＤＮＡ検出方法（実施例５）に従って、ＤＮＡ検出アッセイを行った。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ ＤＮＡを標的として使用した。標的核酸分子は、配列番号１１の配列を有する。固体支持体としてのポリスチレンに３’を結合させた配列番号１３の捕捉オリゴヌクレオチドプローブを使用した。配列番号１２の検出オリゴヌクレオチドプローブを、５’をビオチン化して使用した。１ピコモル～１マイクロモル（０．１アトモル、１アトモル、１０アトモル、１００アトモル、１フェムトモル、１０フェムトモル、１００フェムトモル）の異なる濃度の標的核酸分子を使用した。トリス緩衝液をＭＳ検出用のブランク陰性対照として使用した。ゼロＤＮＡ標的核酸を検出アッセイの陰性対照として使用した。標的核酸分子への捕捉及び検出オリゴヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーションは、ＮａＣｌの存在下で行った。固体支持体（ポリスチレンビーズ）を、ＮａＣｌを含有する緩衝液で洗浄し、遠心分離によって分離した。ＡＰＳＡ酵素反応は、ＮａＣｌの存在下で行った。反応混合物を、移動相として９５％アセトニトリル／水、０．１％酢酸、２０μＬ／分を使用するＣ１８逆相クロマトグラフィーで処理した。１μＬの反応生成物をＭＳに注入した。ｍ／ｚ＝２６８でＭＳ検出を行った。

【0350】

図１９は、ＭＳシグナル強度に対するＤＮＡ標的核酸の濃度の標準化曲線を示す。結果は、ＤＮＡ検出アッセイがピコモル～マイクロモルの範囲の感度であることを示す。

【0351】

実施例１５ 低濃度合成ＤＮＡ標的の検出
合成ＤＮＡ、ＰＣＲ生成物及びプラスミドＤＮＡをそれぞれ標的核酸分子として使用した。ＰＣＲ生成物及びプラスミドＤＮＡアッセイは、実施例１６に更に記載する。合成ＤＮＡは、これらの実施例で使用された場合、合成された一本鎖ＤＮＡを指す。ＰＣＲ生成物は、増幅されたＤＮＡ（任意選択的にＲＮＡから開始）を指し、プラスミドＤＮＡは、より大きなプラスミドの内部に対象となる標的を含むものである。

【0352】

実施例１０で設計したＰＣＲプライマー、オリゴヌクレオチド捕捉及び検出プローブを、本実施例及び実施例１６で使用した。合成標的並びにＨＩＶ及びＣＯＶＩＤプラスミド由来のＨＩＶ、ＣＯＶＩＤ、志賀毒素生成Ｅ．ｃｏｌｉ（ＳＴＥＣ）、及び溶血素ＤＮＡを、以下に記載される本開示の様々な方法を使用して検出した。

【0353】

捕捉オリゴヌクレオチドプローブを、ＮＯＳ表面化学９６ウェルポリスチレン反応性プレート上に固定化した。

【0354】

一般に、表面結合緩衝液（１０ｍＭ Ｎａ_２ＰＯ_４＋１ｍＭ ＥＤＴＡ緩衝液、ｐＨ ８．５）中の捕捉オリゴヌクレオチドプローブをプレートに添加し、４℃で一晩インキュベートした。次いで、ウェルを追加の表面結合緩衝液で３回洗浄し、クエンチし、３％ＢＳＡで１時間ブロッキングした。クエンチし、ブロッキングしたプレートを、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．００＋１ｍＭ ＥＤＴＡで３回、続いて結合緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．００＋１Ｍ ＮａＣｌ＋１ｍＭ ＥＤＴＡ）で３回洗浄した。

【0355】

合成標的並びにＨＩＶ及びＣＯＶＩＤプラスミドからのＨＩＶ、ＣＯＶＩＤ、志賀及び溶血素ＤＮＡを、本明細書に記載の捕捉オリゴヌクレオチドプローブを用いて検出した。

【0356】

適切な捕捉オリゴヌクレオチドプローブを、ＮＯＳ表面化学９６ウェルポリスチレン反応性プレート上に、前述のようにアミン官能基を介して３’末端又は５’末端に固定化した。各実験を三連（ｎ＝３）で行った。

【0357】

合成（結果は下記）、ＰＣＲ又はプラスミドウイルスＤＮＡ（結果は実施例１６に記載）（例えば、標的核酸分子）及び対応する検出オリゴヌクレオチドプローブを、プレートの各ウェル（捕捉オリゴヌクレオチドプローブを含む）に添加して、約１．５時間のＤＮＡハイブリダイゼーションを開始させた。次いで、ウェルを結合緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．００＋１Ｍ ＮａＣｌ＋１ｍＭ ＥＤＴＡ）で３回洗浄した。プレートを１％ＢＳＡで５分間ブロックし、次いで１％ＢＳＡ中のＡＰＳＡ溶液と１５分間インキュベートし、指定された緩衝液で１１回（結合緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．００＋１Ｍ ＮａＣｌ＋１ｍＭ ＥＤＴＡ）で６回、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．００＋１Ｍ ＮａＣｌ（ＥＤＴＡなし）で３×５分間、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．００＋２Ｍ ＡＭＢＩＣで２回（１×５分間及び１×１５分間）洗浄した。次いで、プレートを１ｍＭ ＡＭＰと共に２時間インキュベートした後、アッセイ生成物を回収した。回収した試料を、質量分析（ｍ／ｚ １３６）を使用して分析した。

【0358】

図２０、２１、２２及び２３は、標的の一本鎖合成ＤＮＡの結果を示す。

【0359】

ＨＩＶオリゴヌクレオチド標的
図２０は、異なる濃度のＨＩＶ合成ＤＮＡ標的核酸分子（１ｐＭ～５００ｐＭ）におけるｍ／ｚ １３６でのＭＳシグナル強度のグラフを示す。

【0360】

使用したＨＩＶ ＤＮＡ配列を表９に示す。標的核酸分子は、配列番号２４の配列を有する。３’がアミン官能基を介して固体支持体としてのＮＯＳ表面ポリスチレンに結合した、配列番号２３の捕捉オリゴヌクレオチドプローブを使用した。配列番号２５の検出オリゴヌクレオチドプローブを、５’をビオチン化して使用した。

【0361】

図２０は、本明細書に記載される検出方法が、１ｐＭという低い濃度でＨＩＶ ＤＮＡ標的核酸分子を検出することができたことを示す。１ｕＬの１ｐＭ溶液の注入は、アトモル量での検出に対応する。このレベルの検出は、ＰＣＲなしで達成される。

【0362】

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ ２（ＣＯＶＩＤ）ＤＮＡオリゴヌクレオチド標的検出
図２１は、異なる濃度のＳＡＲＳ－ＣｏＶ ２合成標的核酸分子（１００ｆＭ～１０ｎＭ）におけるｍ／ｚ １３６でのＭＳシグナル強度のグラフを示す。本明細書で使用した方法は、１００ｆＭという低い濃度でＳＡＲＳ－ＣｏＶ ２標的オリゴヌクレオチドを検出することができた。検出された配列は、ヌクレオキャプシドリンタンパク質の一部である。

【0363】

図２１のアッセイで使用したＳＡＲＳ－Ｃｏ－Ｖ ２ ＤＮＡ配列を表３に示す。標的核酸分子は、配列番号４の配列を有する。３’がアミン官能基を介して固体支持体としてのＮＯＳ表面ポリスチレンに結合した、配列番号６の捕捉オリゴヌクレオチドプローブを使用した。配列番号５の検出オリゴヌクレオチドプローブを、５’をビオチン化して使用した。

【0364】

志賀毒素生成大腸菌（ＳＴＥＣ）ＤＮＡ検出
図２２は、異なる濃度の合成ＳＴＥＣ標的核酸分子（１ｐＭ～１ｎＭ）におけるｍ／ｚ １３６でのＭＳシグナル強度のグラフを示す。本明細書で使用される方法は、１ｐＭという低い濃度でＳＴＥＣ標的核酸分子を検出することができた。

【0365】

使用したＳＴＥＣ ＤＮＡ配列を表１１に示す。標的核酸分子は、配列番号３０の配列を有する。３’がアミン官能基を介して固体支持体としてのＮＯＳ表面ポリスチレンに結合した、配列番号２９の捕捉オリゴヌクレオチドプローブを使用した。配列番号３１の検出オリゴヌクレオチドプローブを、５’をビオチン化して使用した。

【0366】

Ｓ．ａｕｒｅｕｓ溶血素ＤＮＡ検出
図２３は、異なる濃度の溶血素合成標的核酸分子（１ｐＭ～１ｎＭ）におけるｍ／ｚ １３６でのＭＳシグナル強度のグラフを示す。本明細書で使用される方法は、１Ｐｍという低い濃度で溶血素標的核酸分子を検出することができた（例えば、１ｕＬの１ｐＭ溶液又は１アトモルが検出可能であった）。

【0367】

使用した溶血素ＤＮＡ配列を表１３に示す。標的核酸分子は、配列番号３６の配列を有する。３’がアミン官能基を介して固体支持体としてのＮＯＳ表面ポリスチレンに結合した、配列番号３５の捕捉オリゴヌクレオチドプローブを使用した。配列番号３７の検出オリゴヌクレオチドプローブを、５’をビオチン化して使用した。

【0368】

実施例１６ 低濃度ＰＣＲ及びプラスミドＤＮＡ標的の検出
実施例１５は、本明細書中で更に記載されるＰＣＲ生成物及びプラスミドＤＮＡ生成物の検出に関するいくつかの詳細を提供する。

【0369】

ＰＣＲ標的については、ＰＣＲ反応を用いてプラスミドを増幅することによって標的核酸を調製した。ＨＩＶプラスミドから増幅されたＰＣＲ生成物をアガロースゲル泳動して可視化し、本明細書に記載の方法との感度比較を行った。

【0370】

本明細書に記載され示されるように、質量分析を使用する記載された方法は、感度の増強をもたらした。

【0371】

１ｎｇ～１アトグラム（ｒｅｐ１及びｒｅｐ２）を用いてＰＣＲ反応を行った。反応は１μｌのＨＩＶプラスミドＤＮＡで開始した。ＰＣＲ ３５サイクル、リッド温度１０５℃、２５μＬ反応体積、９４℃融解（３０秒）、５８℃アニーリング（３０秒）、７２℃伸長（３０秒）。生成物を、２％アガロースゲルを１００ボルトで２時間泳動することにより分離した（大きなゲルタンク、ラダーは直線的に泳動する）。５μｌの試料をロードした。３μｌのラダーをロードした。ＧｅｌＲｅｄ（商標）でのＩｎＧｅｌ染色。

【0372】

ＰＣＲテンプレートを使用する実験において、５μｌのＰＣＲ試料（ゲル上にロードされたものと同じ）もまた、本明細書中に記載されるハイブリダイゼーションステップに供した。

【0373】

プラスミドを用いた実験では、プラスミドを９６ウェルフォーマット中のＰＶＤＦにＮＯＳを介して結合させるか、又はその上に吸着させた。

【0374】

更なる詳細について以下に示す。

【0375】

ＨＩＶ ＤＮＡ検出
ＨＩＶ Ｇａｇ Ｐｒ５５コードプラスミド（例えば、アクセッション番号ＧＱ４３２５５４．１）を、捕捉オリゴヌクレオチドプローブ領域内でハイブリダイズするプライマーと捕捉オリゴヌクレオチドプローブのプローブ領域の外側でハイブリダイズするプライマーとを比較するアッセイにおいて使用した。異なる長さの２つのＰＣＲ生成物を生成する２セットのプライマー（１つは１３３ｂｐフラグメント（捕捉プローブの領域内のプライマー）及びもう１つは２５８ｂｐフラグメント（捕捉プローブの領域外のプライマー））を使用し、ＰＣＲ生成物を標的核酸分子（例えば、ＰＣＲテンプレート）として使用した。アッセイは、捕捉プローブ及び検出プローブ（例えば、完全サンドイッチ法）の使用を含み、ゲルによって示されるＰＣＲ増幅プラスミドの感度と比較し、画像分析を使用して定量化した。図２４Ａ、Ｂ及び２４Ｃを参照されたい。

【0376】

ＰＣＲ反応は、アト、フェムト、ピコ又はナノｇ量のテンプレートＨＩＶプラスミドＤＮＡを用いて行った。反応は１μｌのＨＩＶプラスミドＤＮＡで開始した。ＰＣＲ ３５サイクル、リッド温度１０５℃、２５μＬ反応体積、９４℃融解（３０秒）、５８℃アニーリング（３０秒）、７２℃伸長（３０秒）。ＰＣＲ生成物を精製せずに使用（例えば、反応物の５μｌアリコートを直接使用）した（ゲル可視化のため、又は記載されるアッセイ及び質量分析における使用のためのいずれか）。

【0377】

２５８ｂｐ標的についての捕捉オリゴヌクレオチドプローブ（配列番号２３）及び検出オリゴヌクレオチドプローブ（配列番号２５）を表９に示す。ＰＣＲ生成物を生成するために使用したフォワードプライマーは、配列５’－ＣＣＡＧＧＣＣＡＧＡＴＧＡＧＡＧＡＡＣＣ－３’（配列番号３８）を有していた。ＰＣＲ生成物を生成するために使用したリバースプライマーは、配列５’－ＴＧＡＡＧＣＴＴＧＣＴＣＧＧＣＴＣＴＴＡ－３’（配列番号３９）を有していた。２５８標的核酸分子は、以下の配列を有する。
５’－
ＣＣＡＧＧＣＣＡＧＡＴＧＡＧＡＧＡＡＣＣＡＡＧＧＧＧＡＡＧＴＧＡＣＡＴＡＧＣＡＧＧＡＡＣＴＡＣＴＡＧＴＡＣＣＣＴＴＣＡＧＧＡＡＣＡＡＡＴＡＧＧＡＴＧＧＡＴＧＡＣＡＡＡＴＡＡＴＣＣＡＣＣＴＡＴＣＣＣＡＧＴＡＧＧＡＧＡＡＡＴＴＴＡＴＡＡＡＡＧＡＴＧＧＡＴＡＡＴＣＣＴＧＧＧＡＴＴＡＡＡＴＡＡＡＡＴＡＧＴＡＡＧＡＡＴＧＴＡＴＡＧＣＣＣＴＡＣＣＡＧＣＡＴＴＣＴＧＧＡＣＡＴＡＡＧＡＣＡＡＧＧＡＣＣＡＡＡＡＧＡＡＣＣＣＴＴＴＡＧＡＧＡＣＴＡＴＧＴＡＧＡＣＣＧＧＴＴＣＴＡＴＡＡＡＡＣＴＣＴＡＡＧＡＧＣＣＧＡＧＣＡＡＧＣＴＴＣＡ－３’（配列番号４０）。

【0378】

２５８ｂｐのＰＣＲ生成物標的について、ＰＣＲプライマーは、捕捉配列及び検出配列の外側又は外側に隣接していた。検出は以下のように行った。

【0379】

５μＬのＰＣＲ試料溶液を、結合緩衝液で１００μＬに希釈し、各「ＤＮＡ ＥＬｉＭＳＡ反応」（例えば、捕捉プローブ及び検出プローブとのインキュベーション、レポーター酵素検出プローブ及び基質とのインキュベーション、並びに質量分析）に使用した。捕捉オリゴヌクレオチドプローブを、捕捉オリゴプローブ上の３’アミンを介してＮＯＳ表面化学９６ウェルポリスチレン反応性プレート（ｎ＝３）上に共有結合的に固定化した。表面結合緩衝液（１０ｍＭ Ｎａ２ＰＯ４＋１ｍＭ ＥＤＴＡ緩衝液、ｐＨ ８．５）中の捕捉オリゴヌクレオチドプローブ（捕捉ＤＮＡとも呼ばれる）をプレートに添加し、４℃で一晩インキュベートした。表面結合緩衝液で３回洗浄し、次いでクエンチし、プレートを３％ＢＳＡで１時間ブロッキングし、２０ｍＭトリスｐＨ８．００＋１ｍＭ ＥＤＴＡで３回洗浄し、続いて結合緩衝液（２０ｍＭトリスｐＨ８．００＋１Ｍ ＮａＣｌ＋１ｍＭ ＥＤＴＡ）で３回洗浄した。標的核酸分子及び検出プローブＤＮＡをプレートの各ウェルに添加して、約１．５時間のＤＮＡハイブリダイゼーションを開始し、結合緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．００＋１Ｍ ＮａＣｌ＋１ｍＭ ＥＤＴＡ）で３回洗浄した。プレートを１％ＢＳＡで５分間ブロックし、次いで１％ＢＳＡ中のＡＰＳＡ溶液と１５分間インキュベートし、指定された緩衝液で１０回（結合緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．００＋１Ｍ ＮａＣｌ＋１ｍＭ ＥＤＴＡ）で６回、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．００＋１Ｍ ＮａＣｌ（ＥＤＴＡなし）で３×５分間、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．００＋２Ｍ ＡＭＢＩＣで２回（１×５分間及び１×１５分間）洗浄した。次いで、プレートを１ｍＭ ＡＭＰと共に２時間インキュベートした後、アッセイ生成物を回収した。ＮＴＣは、ＰＣＲ反応の非テンプレート対照を表す。エラーバー＝ＳＴＤＥＶ。

【0380】

図２４Ａは、フェムトグラム量のＨＩＶプラスミドＤＮＡ配列からの２５８ｎｔのＰＣＲ生成物の質量分析による検出を示し、ここで、ＰＣＲプライマーは、捕捉配列及び検出配列の外側又は外側に隣接していた。上述のように、粗製のＰＣＲ生成物をアッセイに使用した。

【0381】

図２４Ｂは、１００ｆｇのみ、かすかに見えることを実証するアガロースゲルを示す。図２４Ｃは、図２４Ｂのゲル上に見られる量を定量化する。

【0382】

１３３ｂｐ標的についての捕捉オリゴヌクレオチドプローブ（配列番号２３）及び検出オリゴヌクレオチドプローブ（配列番号２５）は、２５８ ｎｐ ＰＣＲ生成物についてのものと同じであり、表９に示す。ＰＣＲ生成物を生成するために使用したフォワードプライマーは、配列５’－ＣＣＡＣＣＴＡＴＣＣＣＡＧＴＡＧＧＡＧＡＡＡＴＣＴＡＴＡＡＡＡＧＡＴＧＧ－３’（配列番号４１）を有していた。ＰＣＲ生成物を生成するために使用したリバースプライマーは、配列５’－ＣＴＡＣＡＴＡＧＴＣＴＣＴＡＡＡＧＧＧＴＴＣＴＴＴＴＧＧＴＣＣＴＴＧＴＣ－３’（配列番号４２）を有していた。標的核酸分子は、以下の配列を有する：
５’－
ＣＣＡＣＣＴＡＴＣＣＣＡＧＴＡＧＧＡＧＡＡＡＴＴＴＡＴＡＡＡＡＧＡＴＧＧＡＴＡＡＴＣＣＴＧＧＧＡＴＴＡＡＡＴＡＡＡＡＴＡＧＴＡＡＧＡＡＴＧＴＡＴＡＧＣＣＣＴＡＣＣＡＧＣＡＴＴＣＴＧＧＡＣＡＴＡＡＧＡＣＡＡＧＧＡＣＣＡＡＡＡＧＡＡＣＣＣＴＴＴＡＧＡＧＡＣＴＡＴＧＴＡＧ－３’（配列番号４３）。

【0383】

Ｃｏｖｉｄ検出
Ｃｏｖｉｄ ＰＣＲ生成物もまた、本明細書に記載のプライマー及びプローブを用いてアッセイした。

【0384】

ＳＡＲＳ－Ｃｏ－Ｖ ２標的核酸分子ＰＣＲ生成物を、以下のＰＣＲ条件によって調製した。ＰＣＲ反応は、１０ｎｇのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２陽性対照プラスミドで開始した。（３５サイクル、リッド温度１０５℃、５０μＬ反応体積、９４℃融解（３０秒）、５８℃アニーリング（３０秒）、７２℃伸長（１分））。５μｌの生成物を分離し、５μｌを本明細書に記載のアッセイに供した。具体的には、次いで、２５ｕＬのＰＣＲ反応物を、ＧＥＬ分析のために５ｕＬに、ハイブリダイゼーション及び質量分析のために５ｕＬに等分した。

【0385】

図２５は、ＰＣＲプライマーが捕捉及び検出配列内にあった、Ｃｏｖｉｄ ＤＮＡプラスミドＤＮＡ配列からの１３８ｎｔのＰＣＲ生成物の検出を示す。

【0386】

本記載の方法は、総反応体積のうちの少量のみが質量分析に供されることを特に考慮すると、高感度である。典型的には、２００μｌの最終反応容量のうち１～２μｌを質量分析に供した。各場合において、本明細書中に記載される「ＤＮＡ ＥｌｉＭＳＡ」は、１０～１００倍高い感度で標的を検出した。反応物容量の１／１００又は１／２００のみが質量分析によってアッセイされたため、同じレベルのテンプレートについての本明細書中に記載されるようなＤＮＡ ＥｌｉＭＳＡアッセイは、１０，０００～２０，０００倍より感受性であり得る。

【0387】

ＰＣＲは、非常に高感度であると考えられているが、典型的には手動のゲルローディング、ゲル染色及び定量化を伴うため、労働集約的であるか又は時間がかかり得る。本記載の方法は自動化することができる。例えば、本明細書に記載のアッセイは９６ウェルプレートで行うことができるため、９６ウェル注入ロボットを使用して自動化することができる。

【0388】

プラスミドＤＮＡの直接検出も実証した。図２６は、ヌクレオチドアミンを介してＮＯＳプレートに付着したＨＩＶプラスミドの検出を示す。試験したプラスミドの濃度は、１００ｆＭ～１００ｎＭであった。他のステップ及び使用した検出プローブは上記の通りである。図２６は、試料操作（例えば、切断）なしで検出可能であったスーパーコイルプラスミドのピコモル範囲での検出を示す。

【0389】

実施例１７ ＰＶＤＦ上のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡの検出
捕捉オリゴプローブはまた、非共有結合的に付着させることができる。

【0390】

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２プラスミド、ＩＤＴ ＣＡＴ１０００６６２５を、Ｈｉｇｈ Ｂｉｎｄｉｎｇ ０．４５マイクロＰＶＤＦ ９６ウェルフィルタープレートに吸着させた捕捉オリゴヌクレオチドプローブで検出した。吸着により固定されたＣａｐｔｕｒｅ ＤＮＡにより「ＤＮＡ ＥＬｉＭＳＡ」を実施した（ｎ＝３）。捕捉ＤＮＡをＰＶＤＦに添加した。ＰＶＤＦを３％ＢＳＡで１時間ブロックし、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．００＋１ｍＭ ＥＤＴＡで３回、続いて結合緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．００＋１Ｍ ＮａＣｌ＋１ｍＭ ＥＤＴＡ）で３回洗浄した。標的核酸（例えばＣｏｖｉｄプラスミド）及び検出オリゴヌクレオチドプローブＤＮＡを９５Ｃに加熱し、プレートの各ウェルに添加して約１．５時間ＤＮＡハイブリダイゼーションを開始し、結合緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．００＋１Ｍ ＮａＣｌ＋１ｍＭ ＥＤＴＡ）で３回洗浄した。プレートを１％ＢＳＡで５分間ブロックし、次いで１％ＢＳＡ中のＡＰＳＡ溶液と１５分間インキュベートし、指定された緩衝液で１０回（結合緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．００＋１Ｍ ＮａＣｌ＋１ｍＭ ＥＤＴＡ）で６回、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．００＋１Ｍ ＮａＣｌ（ＥＤＴＡなし）で３×５分間、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．００＋２Ｍ ＡＭＢＩＣで２回（１×５分間及び１×１５分間）洗浄した。次いで、プレートを１ｍＭ ＡＭＰと共に２時間インキュベートした後、アッセイ生成物を回収した。

【0391】

図２７は、異なる濃度のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２標的核酸分子（１ｐＭ～１μＭ）（例えば二本鎖コイルプラスミド）におけるｍ／ｚ ２６８でのＭＳシグナル強度のグラフを示す。本明細書で使用される方法は、１ｐＭ程度の低い濃度でＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２標的核酸分子を検出することができた。約６ｌｏｇにわたる線形検出が可能であった。この実施形態では、標的はＣｏｖｉｄプラスミドであり、標的をＰＶＤＦに吸着させた（例えば、二本鎖プラスミドの非共有結合）。

【0392】

実施例１８
捕捉プローブ及びタグ化プライマーを使用する、図１５Ａに示されるいくつかの方法を、本明細書に例示する。それらのアッセイでは検出プローブが使用されないため、これらはハーフサンド法と呼ぶことができる。

【0393】

様々な一本鎖捕捉オリゴヌクレオチドプローブを、アミン官能基を介してＮＯＳプレートに結合させた。他の結合を使用することもできる。固体表面への結合は、捕捉オリゴヌクレオチドプローブの３’末端又は５’末端のいずれかを介したものであった（例えば、アミン官能基は、３’末端若しくは５’末端又はその両方に存在し得る）。３’及び５’結合の両方を試験し、両方とも検出が可能であることが示された。アンチセンス鎖及びセンス鎖の両方が結合され、両方とも検出が可能であることが示された。アンチセンス鎖を固体支持体に結合させたとき、５’ビオチン化フォワードプライマーを使用した。センス鎖を固体支持体に結合させたとき、５’ビオチン化リバースプライマーを使用した。センス鎖及びアンチセンス鎖の両方を結合させることができ、かかる場合、５’ビオチン標識フォワード及びリバースプライマーを使用することができる。

【0394】

一例では、ビオチン化ＰＣＲプライマー配列を、ＮＯＳプレートに対する３’ＡＭＩＮＥ捕捉プローブと共に使用した。

【0395】

ビオチン化ＨＩＶ＿プライマー＿３＿フォワード ５’ビオチン－ＣＣＡＧＧＣＣＡＧＡＴＧＡＧＡＧＡＡＣＣ（配列番号３８）。

【0396】

ビオチン化ＨＩＶ＿プライマー＿３＿リバース ５’ビオチン－ＴＧＡＡＧＣＴＴＧＣＴＣＧＧＣＴＣＴＴＡ（配列番号３９）。

【0397】

別の例では、ビオチン化ＰＣＲプライマー配列を、ＮＯＳプレートへの５’アミン捕捉と共に使用した。

【0398】

ＨＩＶプライマー３を使用する反応のための捕捉プローブは、５’アミンを介して繋がれ得るＣＣＡＣＣＴＡＴＣＣＣＡＧＴＡＧＧＡＧＡＡＡＴＣＴＡＴＡＡＡＡＧＡＴＧＧＡＴＡＡＴＣＣＴＧＧＧＡＴ（配列番号４５）であり得る。示されるように、５’連結及び３’連結を有利に使用することができる。

【0399】

図２８Ａ及びＢは、ビオチン化フォワードプライマー及びビオチン化リバースプライマーを使用したアッセイからの結果を示す。

【0400】

図２８Ａは、ＨＩＶプラスミドからのＰＣＲ反応を示す。１ｎｇ～１アトグラムのプラスミドをテンプレートとして使用した。反応は１μｌのＨＩＶプラスミドＤＮＡで開始した。ＰＣＲ ３５サイクル、リッド温度１０５Ｃ、反応体積２５ｕＬ、９４Ｃ融解（３０秒）、５８Ｃアニーリング（３０秒）、７２Ｃ伸長（１分）。１００ボルトで１時間２０分間泳動させる２％アガロースゲルによって生成物を分離した。５ｕｌの試料をロードした。３ｕｌラダーをロードした。ＧｅｌＲｅｄによるゲル内染色を行った。図２８Ａの上のゲル：ＢＨＩＶ＿プライマー＿３＿フォワード＋ＨＩＶ＿プライマー＿３＿リバースＰＣＲセット。下のゲル：ＨＩＶ＿プライマー＿３＿フォワード＋ＢＨＩＶ＿プライマー＿３＿リバースＰＣＲセット。

【0401】

増幅されたアンチセンス鎖（捕捉オリゴプローブ）は、ＮＯＳプレート上に捕捉された３’ＡＭＩＮＥであった。アンチセンス鎖をＮＯＳプレートに共有結合させたため、ビオチン化フォワードプライマーを用いて、捕捉オリゴヌクレオチドプローブに接着することができる標識センス鎖を調製する。増幅されるＰＣＲ鎖はプライマーを介してビオチン化されるため、検出プローブはそれ自体必要ではない。

【0402】

これは、ＮＯＳ＿３’－アミン捕捉プローブを用いたハーフサンドイッチアッセイと呼ぶことができる。粗ビオチン－ＰＣＲ ２５８ｎｔを、本明細書中に記載されるように質量分析に供する。

【0403】

生成されるＨＩＶ ＰＣＲ生成物は、ビオチン５’末端を含む配列番号４０（２５８ｎｔ）である（例えば、ビオチン－５’－配列番号４０）。

【0404】

本実施例で使用したＨＩＶ捕捉ＩＩＩプローブは、（５０ｎｔ）：５’－ＡＡＴＣＣＣＡＧＧＡＴＴＡＴＣＣＡＴＣＴＴＴＴＡＴＡＧＡＴＴＴＣＴＣＣＴＡＣＴＧＧＧＡＴＡＧＧＴＧＧ－３’－アミン（配列番号４４）である。

【0405】

上述のように、ビオチン標識－フォワードプライマー＋非標識リバースプライマーを使用した。

【0406】

図２８Ｂは、以下に記載の方法を用いた質量分析による検出後の結果を示す。

【0407】

ビオチン標識フォワードプライマーは、２５８ｎｔであるＨＩＶビオチン化ＰＣＲ生成物を生成した。ＰＣＲ生成物を含むＰＣＲ反応物を精製せずに、ＮＯＳ表面化学９６ウェルポリスチレン反応性プレート（ｎ＝３）上に固定されたＣａｐｔｕｒｅ ＤＮＡによって実施されたハーフサンドイッチＨＩＶ ＰＣＲ ＤＮＡ ＥＬｉＭＳＡ（例えば、捕捉プローブ、ビオチン化プライマー、レポーター酵素検出プローブとの反応、及び１つ以上のイオン化可能な生成物の検出）によって検出した。５ｕＬのＰＣＲ試料溶液を、結合緩衝液で１００ｕＬに希釈し、各ＤＮＡ ＥＬｉＭＳＡ反応に使用した。０は、標的ＤＮＡ配列の付加がないことを表す。ＮＴＣは、ＰＣＲ反応の非テンプレート対照を表す。１００ｎＭの合成標的ＤＮＡ配列を有する全サンドイッチＨＩＶ ＤＮＡ ＥＬｉＭＳＡを陽性対照として使用した。エラーバー＝ＳＴＤＥＶ。

【0408】

ＮＯＳ表面化学９６ウェルポリスチレン反応性プレート上に固定されたＣａｐｔｕｒｅ ＤＮＡによってＤＮＡ ＥＬｉＭＳＡを行った。表面結合緩衝液（１０ｍＭ Ｎａ２ＰＯ４＋１ｍＭ ＥＤＴＡ緩衝液、ｐＨ ８．５）中の捕捉ＤＮＡをプレートに添加し、４℃で一晩インキュベートした。結合緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．００＋１Ｍ ＮａＣｌ＋１ｍＭ ＥＤＴＡ）で３回洗浄し、次いで、プレートを３％ＢＳＡで１時間クエンチ及びブロッキングし、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．００＋１ｍＭ ＥＤＴＡで３回洗浄し、続いて結合緩衝液で３回洗浄した。ＰＣＲ生成物並びに合成標的及び検出ＤＮＡ配列を変性させ、プレートの各ウェルに添加して約１．５時間のＤＮＡハイブリダイゼーションを開始し、結合緩衝液で３回洗浄した。プレートを１％ＢＳＡで５分間ブロックし、次いで１％ＢＳＡ中のＡＰＳＡ溶液と１５分間インキュベートし、指定された緩衝液で１０回（結合緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．００＋１Ｍ ＮａＣｌ＋１ｍＭ ＥＤＴＡ）で６回、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．００＋１Ｍ ＮａＣｌ（ＥＤＴＡなし）で３×５分間、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．００＋２Ｍ ＡＭＢＩＣで２回（１×５分間及び１×１５分間）洗浄した。次いで、プレートを１ｍＭ ＡＭＰと共に２時間インキュベートした後、アッセイ生成物を回収した。１又は２μｌのアッセイ生成物（２００μｌ）を質量分析に供し、１又は２ｕＬを注入した（図２８Ｂ参照）。図２８Ａに示すゲルでは、１００ｆｇの標的の検出はほとんど検出できなかった。本明細書に記載される方法を使用して、図２８Ｂに示されるように、１００ｆｇテンプレートが明確に検出可能である。更に言及したように、ゲルが完全に等量の試料を使用するとき、アッセイ生成物のわずかな画分（１／１００、１／２００）のみが質量分析を使用して泳動される。

【0409】

捕捉プローブの５’アミン結合及びビオチン化リバースプライマーを用いて同様のアッセイを行った。

【0410】

このアッセイでは、一本鎖センス鎖ＨＩＶ捕捉プローブを、その５’末端のアミンを介してＮＯＳプレートに共有結合させた。

【0411】

ＨＩＶ捕捉ＩＩＩ（５０ｎｔ）は、アミン－５’－ＣＣＡＣＣＴＡＴＣＣＣＡＧＴＡＧＧＡＧＡＡＡＴＣＴＡＴＡＡＡＡＧＡＴＧＧＡＴＡＡＴＣＣＴＧＧＧＡＴＴ－３’（配列番号４５）である。

【0412】

このアッセイにおいて、粗ＰＣＲ生成物（「生の」生成物とも呼ばれる）は、本方法の堅牢性を実証する。

【0413】

ＨＩＶ ＰＣＲ生成物（２５８ｎｔ）：ビオチン－５’－ＴＧＡＡＧＣＴＴＧＣＴＣＧＧＣＴＣＴＴＡＧＡＧＴＴＴＴＡＴＡＧＡＡＣＣＧＧＴＣＴＡＣＡＴＡＧＴＣＴＣＴＡＡＡＧＧＧＴＴＣＴＴＴＴＧＧＴＣＣＴＴＧＴＣＴＴＡＴＧＴＣＣＡＧＡＡＴＧＣＴＧＧＴＡＧＧＧＣＴＡＴＡＣＡＴＴＣＴＴＡＣＴＡＴＴＴＴＡＴＴＴＡＡＴＣＣＣＡＧＧＡＴＴＡＴＣＣＡＴＣＴＴＴＴＡＴＡＡＡＴＴＴＣＴＣＣＴＡＣＴＧＧＧＡＴＡＧＧＴＧＧＡＴＴＡＴＴＴＧＴＣＡＴＣＣＡＴＣＣＴＡＴＴＴＧＴＴＣＣＴＧＡＡＧＧＧＴＡＣＴＡＧＴＡＧＴＴＣＣＴＧＣＴＡＴＧＴＣＡＣＴＴＣＣＣＣＴＴＧＧＴＴＣＴＣＴＣＡＴＣＴＧＧＣＣＴＧＧ－３（配列番号４６）、配列番号４０に対する相補性

【0414】

結果を図２８Ｃに示す。

【0415】

図２８Ｃは、精製されていない２５８ｎｔのＨＩＶビオチン化ＰＣＲ生成物が、ＮＯＳ表面化学９６ウェルポリスチレン反応性プレート（ｎ＝３）上に固定されたＣａｐｔｕｒｅ ＤＮＡによって行われたハーフサンドイッチＨＩＶ ＰＣＲ ＤＮＡ ＥＬｉＭＳＡによって検出されたことを示す。５ｕＬのＰＣＲ試料溶液を、結合緩衝液で１００ｕＬに希釈し、各ＤＮＡ ＥＬｉＭＳＡ反応に使用した。０は、標的ＤＮＡ配列の付加がないことを表す。ＮＴＣは、ＰＣＲ反応の非テンプレート対照を表す。１００ｎＭの合成標的ＤＮＡ配列を有する全サンドイッチＨＩＶ ＤＮＡ ＥＬｉＭＳＡを陽性対照として使用した。エラーバー＝ＳＴＤＥＶ。

【0416】

ＮＯＳ表面化学９６ウェルポリスチレン反応性プレート上に固定されたＣａｐｔｕｒｅ ＤＮＡによってＤＮＡ ＥＬｉＭＳＡを行った。表面結合緩衝液（１０ｍＭ Ｎａ２ＰＯ４＋１ｍＭ ＥＤＴＡ緩衝液、ｐＨ ８．５）中の捕捉ＤＮＡをプレートに添加し、４℃で一晩インキュベートした。結合緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．００＋１Ｍ ＮａＣｌ＋１ｍＭ ＥＤＴＡ）で３回洗浄し、次いで、プレートを３％ＢＳＡで１時間クエンチ及びブロッキングし、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．００＋１ｍＭ ＥＤＴＡで３回洗浄し、続いて結合緩衝液で３回洗浄した。ＰＣＲ生成物並びに合成標的及び検出ＤＮＡ配列を熱により変性させ、プレートの各ウェルに添加して約１．５時間のＤＮＡハイブリダイゼーションを開始し、結合緩衝液で３回洗浄した。プレートを１％ＢＳＡで５分間ブロックし、次いで１％ＢＳＡ中のＡＰＳＡ溶液と１５分間インキュベートし、指定された緩衝液で１０回（結合緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．００＋１Ｍ ＮａＣｌ＋１ｍＭ ＥＤＴＡ）で６回、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．００＋１Ｍ ＮａＣｌ（ＥＤＴＡなし）で３×５分間、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．００＋２Ｍ ＡＭＢＩＣで２回（１×５分間及び１×１５分間）洗浄した。次いで、プレートを１ｍＭ ＡＭＰと共に２時間インキュベートした後、アッセイ生成物を回収した。

【0417】

このアッセイにおいて、出発テンプレート１０ｆｇ程度の少量であっても再現性のあるシグナルを生成した。

【0418】

更なるアッセイは、非共有結合及びＰＶＤＦを使用した。本実施例では、一本鎖ＨＩＶ標的配列をＰＶＤＦに吸着させ、相補的でタグで標識された検出プローブを用いて標的配列を検出するハーフサンドイッチアッセイを用いてＨＩＶを検出した。捕捉プローブを使用しないアッセイでは、０ｐｍｏｌ対１００ｐｍｏｌの標的を比較した。

【0419】

ＨＩＶ検出ＩＩＩ（５０ｎｔ）：ビオチン－５’－ＣＴＡＣＡＴＡＧＴＣＴＣＴＡＡＡＧＧＧＴＴＣＴＴＴＴＧＧＴＣＣＴＴＧＴＣＴＴＡＴＧＴＣＣＡＧＡＡＴＧ－３’（配列番号２５）。

【0420】

ＨＩＶオリゴ標的ＩＩＩ：（１３３ｎｔ）：
ＣＣＡＣＣＴＡＴＣＣＣＡＧＴＡＧＧＡＧＡＡＡＴＣＴＡＴＡＡＡＡＧＡＴＧＧＡＴＡＡＴＣＣＴＧＧＧＡＴＴＡＡＡＴＡＡＡＡＴＡＧＴＡＡＧＡＡＴＧＴＡＴＡＧＣＣＣＴＡＣＣＡＧＣＡＴＴＣＴＧＧＡＣＡＴＡＡＧＡＣＡＡＧＧＡＣＣＡＡＡＡＧＡＡＣＣＣＴＴＴＡＧＡＧＡＣＴＡＴＧＴＡＧ（配列番号２４）。

【0421】

０．４５ミクロンＰＶＤＦ ９６ウェルフィルタープレート（ｎ＝３）に吸着させた合成標的ＤＮＡによって、ＨＩＶハーフサンドイッチ法ＤＮＡ ＥＬｉＭＳＡを行った。ＰＶＤＦフィルタープレートをメタノールで予め湿らせ、標的ＤＮＡをスポットし、３％ＢＳＡで１時間ブロックし、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．００＋１ｍＭ ＥＤＴＡで３回洗浄し、続いて結合緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．００＋１Ｍ ＮａＣｌ＋１ｍＭ ＥＤＴＡ）で３回洗浄した。変性検出ＤＮＡ配列をプレートの各ウェルに添加して、約１．５時間のＤＮＡハイブリダイゼーションを開始し、結合緩衝液で３回洗浄した。プレートを１％ＢＳＡで５分間ブロックし、次いで１％ＢＳＡ中のＡＰＳＡ溶液と１５分間インキュベートし、指定された緩衝液で１０回（結合緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．００＋１Ｍ ＮａＣｌ＋１ｍＭ ＥＤＴＡ）で６回、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．００＋１Ｍ ＮａＣｌ（ＥＤＴＡなし）で３×５分間、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．００＋２Ｍ ＡＭＢＩＣで２回（１×５分間及び１×１５分間）洗浄した。次いで、プレートを１ｍＭ ＡＭＰと共に２時間インキュベートした後、アッセイ生成物を回収した。

【0422】

図２９に示すように、非共有結合したＨＩＶ標的配列は、本明細書に記載の「ＤＮＡ ＥＬＩＭＳＡ」法を用いて検出することができた。

【0423】

実施例１９
本方法の堅牢性を評価するために、ＳＤＳ又は非関連核酸を添加して追加のアッセイを行った。

【0424】

ＮＯＳ表面化学９６ウェルポリスチレン反応性プレート上に固定化された５’Ｎ Ｃａｐｔｕｒｅ ＤＮＡによってＣｏｖｉｄ ＤＮＡ ＥＬｉＭＳＡを行った。表面結合緩衝液（１０ｍＭ Ｎａ２ＰＯ４＋１ｍＭ ＥＤＴＡ緩衝液、ｐＨ ８．５）中の捕捉ＤＮＡをプレートに添加し、４℃で一晩インキュベートした。表面結合緩衝液で３回洗浄し、次いで２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ ８．５中でクエンチした。プレートを３％ＢＳＡでブロックし、及び／又はＢＳＡの前、その間若しくはその後若しくはその後、又は標的ハイブリダイゼーションの間に１時間、５μｇのサケ精子ＤＮＡでブロックし、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．００＋１ｍＭ ＥＤＴＡで３回、続いて結合緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．００＋１Ｍ ＮａＣｌ＋１ｍＭ ＥＤＴＡ）で３回洗浄した。プレートを１％ＢＳＡで５分間ブロックし、次いで、１％ＢＳＡ中のＡＰＳＡ溶液と共に１５分間インキュベートし、指定された緩衝液で１０回洗浄した（結合緩衝液で６回迅速洗浄、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．００＋１Ｍ ＮａＣｌ（ＥＤＴＡなし）で３×５分間、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ＋２Ｍ ＡＭＢＩＣで２回（１回５分間及び１回１５分間）。次いで、プレートを１ｍＭ ＡＭＰと共に２時間インキュベートした後、アッセイ生成物を回収した。アッセイ生成物を、質量分析ｍ／ｚ １３６を用いて測定した。

【0425】

サケ精子ＤＮＡの添加は、ＢＳＡの前に、又はＢＳＡと組み合わせて、又はハイブリダイゼーションステップの間に添加したとき、アッセイに感知できるほどの影響を及ぼさなかった。

【0426】

他の試験においてもＳＤＳを添加した。

【0427】

標的及びプローブＤＮＡを、プレートの指定ウェルに添加した０、０．１、０．５、１及び２％ｗ／ｖドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）と共にインキュベートして、ＤＮＡハイブリダイゼーションを約１．５時間開始した。ＳＤＳの添加は、長いテンプレートの濃度で非特異的結合を減少させるようであった。アッセイは、高濃度のＳＤＳ又は非イオン性界面活性剤に耐えることができる。

【0428】

実施例２０
ＰＣＲプライマーを、ＰＣＲにおいて非常によく機能するＣＯＶＩＤのために設計した。それらはまた、本明細書中に記載される方法において使用され得る。

【0429】

ＳＡＲＳ－Ｃｏ－Ｖ２ ＰＣＲ反応物を、以下のＰＣＲ条件を使用して、ヌクレオキャプシドを含むＳＡＲＳ－Ｃｏ－Ｖ２プラスミドを使用して調製した。ＰＣＲ反応は、１０ｎｇのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２陽性対照プラスミドで開始した。（３５サイクル、リッド温度１０５℃、５０μＬ反応体積、９４℃融解（３０秒）、５８℃アニーリング（３０秒）、７２℃伸長（１分））。

【0430】

図３０に示すように、１０μｌのＰＣＲ反応物をＷＨＯプライマー（ＷＨＯ Ｎ１（７２ｎｔ）及びＷＨＯ Ｎ２（６７ｎｔ生成物））にロードし、５μｌのＰＣＲ試料を試験したプライマー（実施例１１参照、配列番号２及び３は１３８ｎｔ生成物を生成し、配列番号７及び８は３７７ｎｔ生成物を生成した。４μｌラダーをロードした。次にＧｅｌＲｅｄで３０分間染色した。テンプレートの非存在下又は増幅されるＤＮＡテンプレートの非存在下ではバンドは存在しなかった。使用したプライマー対に応じて６７～３７７ｎｔの範囲の予想サイズの断片が得られた。配列番号２及び３並びに７及び８のプライマー対によって生成された生成物は、ＷＨＯプライマーのいずれかの対よりも強いバンドを生成した。図３０を参照のこと。

【0431】

本開示を実施例を参照して説明してきたが、特許請求の範囲は、実施例に記載された実施形態によって限定されるべきではなく、全体として説明と一致する最も広い解釈が与えられるべきであることを理解されたい。

【0432】

全ての刊行物、特許及び特許出願は、それぞれ個々の刊行物、特許又は特許出願が、その全体が参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示されているのと同程度に、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。本開示における用語が、参照により本明細書に組み込まれる文書において異なって定義されることが見出されるとき、本明細書において提供される定義は、その用語の定義としての役割を果たす。

【0433】

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【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15A】

【図15B】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24A】

【図24B】

【図24C】

【図25】

【図26】

【図27】

【図28A】

【図28B】

【図28C】

【図29】

【図30A】

【図30B】

【配列表】

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【国際調査報告】