特表 2023-549293 直交ＩＬ－２１受容体／サイトカイン系

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-11-22

(54)【発明の名称】直交ＩＬ－２１受容体／サイトカイン系

(51)【国際特許分類】

   C07K 14/54 20060101AFI20231115BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20231115BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20231115BHJP

   C07K 16/00 20060101ALI20231115BHJP

   C07K 14/76 20060101ALI20231115BHJP

   A61K 38/20 20060101ALI20231115BHJP

   A61P 31/00 20060101ALI20231115BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20231115BHJP

   A61P 37/02 20060101ALI20231115BHJP

   C12N 15/24 20060101ALN20231115BHJP

   C12N 15/12 20060101ALN20231115BHJP

【ＦＩ】

C07K14/54 ZNA

C12N5/10

C07K19/00

C07K16/00

C07K14/76

A61K38/20

A61P31/00

A61P35/00

A61P37/02

C12N15/24

C12N15/12

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023549960

(86)(22)【出願日】2021-10-25

(85)【翻訳文提出日】2023-06-15

(86)【国際出願番号】 US2021056439

(87)【国際公開番号】W WO2022093683

(87)【国際公開日】2022-05-05

(31)【優先権主張番号】63/105,414

(32)【優先日】2020-10-26

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/212,547

(32)【優先日】2021-06-18

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】523152134

【氏名又は名称】ネプチューン バイオサイエンシズ エルエルシー

(71)【出願人】

【識別番号】523152145

【氏名又は名称】キリーン、ナイジェル

(71)【出願人】

【識別番号】523152156

【氏名又は名称】ベスケ、オレン

(71)【出願人】

【識別番号】519404931

【氏名又は名称】ボルラース、ベネディクト ケイ．

(71)【出願人】

【識別番号】523152167

【氏名又は名称】ゴビンダラジャン、シュリダール

(74)【代理人】

【識別番号】110000855

【氏名又は名称】弁理士法人浅村特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】キリーン、ナイジェル

(72)【発明者】

【氏名】ベスケ、オレン

(72)【発明者】

【氏名】ボルラース、ベネディクト ケイ．

(72)【発明者】

【氏名】ゴビンダラジャン、シュリダール

【テーマコード（参考）】

4B065

4C084

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B065AA93X

4B065AA93Y

4B065AC20

4B065CA24

4B065CA44

4C084AA02

4C084AA07

4C084BA01

4C084BA08

4C084BA22

4C084BA23

4C084BA44

4C084DA12

4C084NA14

4C084ZB07

4C084ZB26

4C084ZB32

4H045AA10

4H045AA11

4H045AA30

4H045BA10

4H045BA41

4H045CA40

4H045DA02

4H045DA70

4H045DA76

4H045FA74

4H045GA45

(57)【要約】

直交ＩＬ－２１受容体および直交ＩＬ－２１サイトカインが記載される。ＩＬ－２１受容体－サイトカイン対は、ネイティブインターロイキン－２１サイトカイン（「ＩＬ－２１」）への結合が損なわれた直交インターロイキン－２１受容体ａ鎖（「ｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１Ｒα」）およびネイティブＩＬ－２１Ｒａへの結合が損なわれた直交ＩＬ－２１サイトカイン（「ｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１」）を含み得、ｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１Ｒａはｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１に結合する。ＩＬ－２１受容体－サイトカイン対は、ＩＬ－２１シグナル伝達を活性化し得る。直交ＩＬ－２１受容体を発現するように操作された細胞、ならびにそのような細胞を様々な疾患および障害の処置のために使用するための方法も記載される。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

配列番号２に対して番号付けされたアミノ酸置換：
Ｈ６Ｌ；
Ｒ９Ｋ；
Ｍ１０Ｌ；
Ｐ７８Ｌ；
を含み、
Ｇ８４ＥもしくはＰ１０４Ａまたはそれらの組み合わせを任意選択的に含み、
Ｋ７３ＶまたはＫ７３Ｉの１つを任意選択的に含む、
操作されたヒトＩＬ－２１ポリペプチド。

【請求項2】

アミノ酸置換Ｋ７３Ｖを含む、請求項１に記載の操作されたヒトＩＬ－２１ポリペプチド。

【請求項3】

アミノ酸置換Ｋ７３Ｉを含む、請求項１に記載の操作されたヒトＩＬ－２１ポリペプチド。

【請求項4】

アミノ酸置換Ｇ８４Ｅを含む、請求項１に記載の操作されたヒトＩＬ－２１ポリペプチド。

【請求項5】

アミノ酸置換Ｐ１０４Ａを含む、請求項１に記載の操作されたヒトＩＬ－２１ポリペプチド。

【請求項6】

操作されたヒトＣＤ３６０タンパク質外部ドメインに結合する、請求項１に記載の操作されたヒトＩＬ－２１ポリペプチド。

【請求項7】

前記操作されたヒトＣＤ３６０タンパク質外部ドメインが、Ｙ１０、Ｑ３３、Ｑ３５、Ｙ３６、Ｅ３８、Ｌ３９、Ｆ６７、Ｈ６８、Ｆ６９、Ｍ７０、Ａ７１、Ｄ７２、Ｄ７３、Ｉ７４、Ｌ９４、Ａ９６、Ｅ９７、Ｐ１２６、Ａ１２７、Ｙ１２９、Ｍ１３０、Ｋ１３４、Ｓ１９０およびＹ１９１から選択される１つ以上の残基において修飾されている、請求項６に記載の操作されたヒトＩＬ－２１ポリペプチド。

【請求項8】

前記操作されたヒトＣＤ３６０タンパク質外部ドメインが、Ｍ７０において修飾されている、請求項６に記載の操作されたヒトＩＬ－２１ポリペプチド。

【請求項9】

前記操作されたヒトＣＤ３６０タンパク質外部ドメインが、Ｍ７０およびＹ１２９において修飾されている、請求項６に記載の操作されたヒトＩＬ－２１ポリペプチド。

【請求項10】

前記操作されたヒトＣＤ３６０タンパク質外部ドメインが、アミノ酸置換Ｍ７０Ｇを含む、請求項８に記載の操作されたヒトＩＬ－２１ポリペプチド。

【請求項11】

前記操作されたヒトＣＤ３６０タンパク質外部ドメインが、アミノ酸置換Ｍ７０ＧおよびＹ１２９Ｆを含む、請求項９に記載の操作されたヒトＩＬ－２１ポリペプチド。

【請求項12】

アミノ酸置換Ｋ７３ＶおよびＧ８４Ｅを含む、請求項１に記載の操作されたヒトＩＬ－２１ポリペプチド。

【請求項13】

アミノ酸置換Ｋ７３ＩおよびＰ１０４Ａを含む、請求項１に記載の操作されたヒトＩＬ－２１ポリペプチド。

【請求項14】

配列番号２に対して番号付けされたアミノ酸置換のセット：Ｈ６Ｌ、Ｒ９Ｋ、Ｍ１０Ｌ、Ｋ７３Ｖ、Ｐ７８ＬおよびＧ８４Ｅを含む、操作されたヒトＩＬ－２１ポリペプチド。

【請求項15】

配列番号２に対して番号付けされたアミノ酸置換のセット：Ｈ６Ｌ、Ｒ９Ｋ、Ｍ１０Ｌ、Ｋ７３Ｉ、Ｐ７８ＬおよびＰ１０４Ａを含む、操作されたヒトＩＬ－２１ポリペプチド。

【請求項16】

（ａ）Ｍ７０Ｇにおけるアミノ酸置換を含むヒトＣＤ３６０タンパク質外部ドメインを含む操作された受容体、および（ｂ）請求項１に記載の操作されたヒトＩＬ－２１ポリペプチドを含む、細胞における受容体の選択的活性化のための系。

【請求項17】

（ａ）Ｍ７０ＧおよびＹ１２９Ｆにおけるアミノ酸置換を含むヒトＣＤ３６０タンパク質外部ドメインを含む操作された受容体、ならびに（ｂ）請求項１に記載の操作されたヒトＩＬ－２１ポリペプチドを含む、細胞における受容体の選択的活性化のための系。

【請求項18】

前記操作されたヒトＣＤ３６０受容体が哺乳動物細胞によって発現される、請求項１６に記載の系。

【請求項19】

前記操作されたヒトＣＤ３６０受容体が哺乳動物細胞によって発現される、請求項１７に記載の系。

【請求項20】

前記哺乳動物細胞が免疫細胞または幹細胞である、請求項１８に記載の系。

【請求項21】

前記哺乳動物細胞が免疫細胞または幹細胞である、請求項１９に記載の系。

【請求項22】

前記哺乳動物細胞が免疫細胞であり、前記免疫細胞がＴ細胞である、請求項２０に記載の系。

【請求項23】

前記哺乳動物細胞が免疫細胞であり、前記免疫細胞がＴ細胞である、請求項２１に記載の系。

【請求項24】

請求項１に記載の操作されたヒトＩＬ－２１ポリペプチド、および薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物。

【請求項25】

請求項１６に記載の系を含むキット。

【請求項26】

請求項１７に記載の系を含むキット。

【請求項27】

ＩｇＧのＦｃドメインまたはアルブミンに融合されている、請求項１に記載の操作されたヒトＩＬ－２１ポリペプチド。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年１０月２６日に出願された米国仮特許出願第６３／１０５，４１４号、および２０２１年６月１８日に出願された米国仮特許出願第６３／２１２，５４７号の優先権を主張し、その各々は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0002】

配列表
配列表はＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出されており、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。２０２１年１０月２５日に作成されたＡＳＣＩＩコピーの名前はＮｅｐｔｕｎｅ－ＩＬ２１－ＰＣＴ＿ＳＴ２５．ｔｘｔであり、サイズは１２３，５７１バイトである。

【背景技術】

【0003】

サイトカインは、免疫細胞の増殖および分化の強力な天然調節因子である。この効力は、サイトカインを潜在的な治療剤として非常に魅力的にしているが、その臨床的有用性も複雑にしている。これは、複数の細胞標的を有し、したがって多面発現効果の可能性が高いサイトカインに特に当てはまる。一例は、調節性（抑制性）Ｔ細胞の望ましくない増殖および有痛性血管漏出症候群によってその抗がん活性が相殺されるロバストなＴ細胞マイトジェンであるインターロイキン－２（「ＩＬ－２」）である。ＩＬ－２の特定の場合では、タンパク質工学を使用して、臨床的課題のいくつか、例えば、調節性Ｔ細胞に優先的に作用するサイトカインの能力を除去することを解決することができる。別のアプローチは、直交的に拘束された形態のサイトカインおよびそれらの受容体を生成することを含む。以下を参照されたい。米国特許第１０，８６９，８８７号明細書；Ｓｏｃｋｏｌｏｓｋｙ ＪＴ，Ｔｒｏｔｔａ Ｅ，Ｐａｒｉｓｉ Ｇ，ｅｔ ａｌ．Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｕｓｉｎｇ ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ＩＬ－２ ｃｙｔｏｋｉｎｅ－ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１８；３５９（６３７９）：１０３７－１０４２．ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．ａａｒ３２４６。これらの各々の開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0004】

直交サイトカイン系は、サイトカインおよびその受容体が、それらのネイティブ（親）パートナーとの適合性を失うが、互いに生産的に相互作用する能力を保持するように変異している系である。したがって、そのような直交サイトカイン：受容体対は、「特権的」または「私的」相互作用を実証すると言うことができる。直交的に拘束された形態のサイトカインおよびそれらの受容体を生成するアプローチは、サイトカインの活性の範囲を治療（すなわち、養子移入される）細胞のみに限定する方法を提供するので、細胞治療に価値がある。これらの治療細胞は、操作された受容体を発現する唯一の細胞であり、その結果、操作されたサイトカインに応答することができる唯一の細胞である。

【0005】

インターロイキン－２１（「ＩＬ－２１」）は、広範囲のリンパ細胞、骨髄細胞および上皮細胞において作用する別の多面発現サイトカインである。ＩＬ－２１は自然免疫応答および適応免疫応答の両方を調節する。これは、抗腫瘍応答および抗ウイルス応答において重要な役割を有するだけでなく、自己免疫疾患および炎症性障害の発症を促進する炎症性応答にも大きな効果を及ぼす。Ｓｐｏｌｓｋｉ，Ｒ．，Ｌｅｏｎａｒｄ，Ｗ．Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－２１：ａ ｄｏｕｂｌｅ－ｅｄｇｅｄ ｓｗｏｒｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ １３，３７９－３９５（２０１４）．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｎｒｄ４２９６．天然のヒトＩＬ－２１サイトカイン：受容体複合体の三次元構造は公知である。以下を参照されたい。Ｈａｍｍｉｎｇ ＯＪ，Ｋａｎｇ Ｌ，Ｓｖｅｎｓｓｏｎ Ａ，ｅｔ ａｌ．Ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－２１ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＩＬ－２１Ｒ）ｂｏｕｎｄ ｔｏ ＩＬ－２１ ｒｅｖｅａｌｓ ｔｈａｔ ｓｕｇａｒ ｃｈａｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ｗｉｔｈ ＷＳＸＷＳ ｍｏｔｉｆ ｉｓ ｉｎｔｅｇｒａｌ ｐａｒｔ ｏｆ ＩＬ－２１Ｒ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２０１２；２８７（１２）：９４５４－９４６０．ｄｏｉ：１０．１０７４／ｊｂｃ．Ｍ１１１．３１１０８４。この開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0006】

ＩＬ－２１は、ウイルスおよび腫瘍に対する細胞傷害性Ｔ細胞応答を増強し、ＩＬ－２またはＩＬ－１５などの他のサイトカインと相乗的に作用することができるので、特に興味深い。ＩＬ－２１は、部分的には、幹細胞記憶表現型を有するＴ細胞の持続性を促進することによってこれを行い、これは、細胞治療の状況において有益な転帰と関連付けられている。ＩＬ－２１は現在、複数の臨床試験においてがん治療剤として評価されている。ＩＬ－２１はまた、キメラ抗原受容体Ｔ（「ＣＡＲ－Ｔ」）細胞治療において有意な潜在的有用性を有し、増殖不良、抗腫瘍効果、疲弊、抑制および持続性に起因する臨床的失敗を克服するのに役立ち得る。したがって、特に、内因性シグナル伝達経路から保護され、標的化されていない内因性細胞に影響を及ぼさず、患者に投与されると制御され得る所望の挙動を養子移入された細胞に操作することによって、ＩＬ－２１の作用を調節する能力に対する緊急の必要性が存在する。

【発明の概要】

【0007】

一態様では、直交インターロイキン－２１受容体アルファ鎖（「ｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１Ｒα」もしくは「ｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１Ｒα分子」、または本明細書で提供されるように構築された特定のｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１Ｒαに言及する場合、「受容体バリアント」のような「ＲＶ」）が提供され、ｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１Ｒαは、直交インターロイキン－２１サイトカイン（「ｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１」または「ｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１分子」、または本明細書で提供されるように構築された特定のｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１に言及する場合、「サイトカインバリアント」のような「ＣＶ」）に結合するが、ネイティブＩＬ－２１への結合が損なわれた、配列番号４に由来する修飾アミノ酸配列を含む。一態様では、ｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１Ｒαは、ＩＬ－２１と接触する配列番号４の１つ以上のアミノ酸残基、そのような接触残基のすぐ近傍の残基、またはＩＬ－２１結合表面の立体配座に影響を及ぼすＩＬ－２１Ｒαの他の場所の残基の置換を含む修飾アミノ酸配列を含む。一態様では、ｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１Ｒαは、配列番号６（シグナルペプチドを欠く成熟形態のヒトＩＬ－２１α外部ドメイン）に対して番号付けされた、Ｙ１０、Ｑ３３、Ｑ３５、Ｙ３６、Ｅ３８、Ｌ３９、Ｆ６７、Ｈ６８、Ｆ６９、Ｍ７０、Ａ７１、Ｄ７２、Ｄ７３、Ｉ７４、Ｌ９４、Ａ９６、Ｅ９７、Ｐ１２６、Ａ１２７、Ｙ１２９、Ｍ１３０、Ｋ１３４、Ｓ１９０、Ｙ１９１、またはそれらの組み合わせの位置のアミノ酸置換を含む。一態様では、アミノ酸置換は、Ｄ７２Ｅ／Ｙ１２９Ｆ／Ｄ７３Ｅ；Ｍ７０Ｉ／Ｄ７３Ｅ／Ｑ３３Ｈ；Ｄ７２Ｅ／Ｌ９４Ｖ／Ｙ１９１Ｆ；Ｄ７２Ｅ／Ｅ３８Ｄ／Ｍ１３０Ｌ；Ｍ７０Ｇ／Ｙ１２９Ｆ；Ｆ６９Ｌ／Ｍ７０Ｌ／Ｄ７３Ｉ；Ｄ７２Ｋ／Ｄ７３Ｋ；Ｅ３８Ｋ；もしくはＭ７０Ｇ、またはそれらの組み合わせを含むか、それらから本質的になるか、またはそれらからなる。一態様では、アミノ酸置換は、Ｍ７０Ｇ／Ｙ１２９Ｆ（「受容体バリアント１３」の場合の「ＲＶ１３」もしくは配列番号１９）またはＭ７０Ｇ（「ＲＶ２２」もしくは配列番号２７）を含むか、それらから本質的になるか、またはそれらからなる。

【0008】

別の態様では、ｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１が提供され、ｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１は、ｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１Ｒαに結合するが、ネイティブＩＬ－２１Ｒαへの結合が損なわれた、配列番号２に由来する修飾アミノ酸配列を含む。一態様では、ｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１は、ＩＬ－２１Ｒαと接触する配列番号２の１つ以上のアミノ酸残基、そのような接触残基のすぐ近傍の残基、またはＩＬ－２１Ｒα結合表面の立体配座に影響を及ぼすＩＬ－２１の他の場所の残基の置換を含む修飾アミノ酸配列を含む。一態様では、ｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１は、配列番号２に対して番号付けされた、Ｒ５、Ｈ６、Ｉ８、Ｒ９、Ｍ１０、Ｑ１２、Ｌ１３、Ｋ７３、Ｋ７５、Ｒ７６、Ｐ７８、Ｇ８４もしくはＰ１０４、またはそれらの組み合わせの位置のアミノ酸置換を含む。「配列番号２に対して番号付けされた」という語句は、番号付けの目的で、任意のエピトープタグおよびシグナル伝達ペプチドを無視することを意味する。一態様では、アミノ酸置換は、Ｒ５Ｑ、Ｒ５Ｄ、Ｒ５Ｅ、Ｒ５Ｋ、Ｒ５Ｎ、Ｈ６Ｌ、Ｉ８Ｅ、Ｒ９Ｅ、Ｒ９Ｄ、Ｒ９Ｋ、Ｒ９Ｎ、Ｒ９Ｑ、Ｍ１０Ｌ、Ｑ１２Ｖ、Ｌ１３Ｄ、Ｋ７３Ｖ、Ｋ７３Ｄ、Ｋ７３Ｉ、Ｋ７５Ｄ、Ｒ７６Ｅ、Ｒ７６Ｎ、Ｒ７６Ａ、Ｒ５Ｑ／Ｒ７６Ｅ、Ｒ５Ｑ／Ｒ７６Ａ、Ｐ７８Ｌ、Ｇ８４ＥもしくはＰ１０４Ａ、またはそれらの組み合わせを含むか、それらから本質的になるか、またはそれらからなる。一態様では、アミノ酸置換は、Ｈ６Ｌ／Ｒ９Ｋ／Ｍ１０Ｌ／Ｐ７８Ｌを含むか、それらから本質的になるか、またはそれらからなる。

【0009】

例示的な態様では、配列番号２に対して番号付けされたアミノ酸置換：Ｈ６Ｌ；Ｒ９Ｋ；Ｍ１０Ｌ；Ｐ７８Ｌを含み；Ｇ８４ＥもしくはＰ１０４Ａまたはそれらの組み合わせを任意選択的に含み；Ｋ７３ＶまたはＫ７３Ｉの１つを任意選択的に含む、操作されたヒトＩＬ－２１ポリペプチドが提供される。一態様では、そのような操作されたヒトＩＬ－２１ポリペプチドは、配列番号６１（Ｈ６Ｌ／Ｒ９Ｋ／Ｍ１０Ｌ／Ｋ７３Ｖ／Ｐ７８Ｌ／Ｇ８４Ｅ）または配列番号６２（Ｈ６Ｌ／Ｒ９Ｋ／Ｍ１０Ｌ／Ｋ７３Ｉ／Ｐ７８Ｌ／Ｐ１０４Ａ）を含み得る。

【0010】

別の態様では、細胞におけるＩＬ－２１シグナル伝達を活性化するための系が提供され、系は、ＩＬ－２１と接触する配列番号４のアミノ酸残基の１つ以上、そのような接触残基のすぐ近傍の残基、またはＩＬ－２１結合表面の立体配座に影響を及ぼすＩＬ－２１Ｒαの他の場所の残基の置換を含む、配列番号４に由来する修飾アミノ酸配列を含む、ネイティブＩＬ－２１への結合が損なわれたｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１Ｒαと、ＩＬ－２１Ｒαと接触する配列番号２の１つ以上のアミノ酸残基、そのような接触残基のすぐ近傍の残基、またはｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１Ｒαがｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１に結合するＩＬ－２１Ｒα結合表面の立体配座に影響を及ぼすＩＬ－２１の他の場所の残基の置換を含む、配列番号２に由来する修飾アミノ酸配列を含む、ネイティブＩＬ－２１Ｒαへの結合が損なわれたｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１とを含む。一態様では、細胞は、哺乳動物細胞、免疫細胞、幹細胞、またはＴ細胞である。

【0011】

本発明は、以下の図を参照することによってより容易に理解され得る。

【図面の簡単な説明】

【0012】

【図1】直交ＩＬ－２１系の概略図を提供する。一番左側の挿絵は、互いに生産的に相互作用する野生型受容体およびサイトカインを示し、隣接する挿絵は、ｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１Ｒαとネイティブサイトカインとの間の損なわれた相互作用を示す。最も右側の挿絵は、ｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１とネイティブ（野生型）受容体との間の損なわれた相互作用を示し、隣接する挿絵は、２つの直交する分子（ｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１Ｒαおよびｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１）間の生産的な相互作用を示す。

【0013】

【図2】直交ＩＬ－２１系を生成するための経路の概略図を提供する。

【0014】

【図3】単一（準飽和（ｓｕｂ－ｓａｔｕｒａｔｉｎｇ））濃度のＩＬ－２１－ＴＬｕｃ１６を、２０個の候補ｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１Ｒα分子（これらはすべて、飽和濃度でウェルのＳｔｒｅｐｔａｃｔｉｎコーティング表面に結合していた）のパネルへの結合について試験した代表的なアッセイの結果を示す。２０個の候補ｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１Ｒα分子のうちの８個は、ＩＬ－２１－ＴＬｕｃ１６に結合する能力の低下を示した。

【0015】

【図4】図４Ａ～図４Ｅは、ある範囲の（準飽和）濃度のＩＬ－２１－ＴＬｕｃ１６を、一連の候補ｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１Ｒα分子のパネルへの結合について試験した代表的なアッセイの結果を示す。パネルは、対照としての野生型受容体、および、図３において特定された８個の候補ｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１Ｒα分子のうちの７個を含んでいた。パネルはまた、図３に示されるものなどの結果に基づいて設計された１３個のさらなる候補ｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１Ｒα分子を含んでいた。具体的には、８個の候補ｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１Ｒα分子に存在する置換を単独で、または組み合わせて、さらなる１３個の候補ｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１Ｒα分子に導入した。２１個の候補ｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１Ｒα分子を飽和濃度で９６ウェルプレートのＳｔｒｅｐｔａｃｔｉｎコーティングウェルに添加した。図４Ａ～図４Ｅは、各場合において、ＩＬ－２１－ＴＬｕｃ１６の、５個の候補ｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１Ｒα分子および野生型対照ＩＬ－２１Ｒαへの結合を比較した個々のプレートについてのルミノメトリーデータを示す。さらなる１３個の候補ｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１Ｒα分子のうちの１１個は、野生型対照と比較して、ＩＬ－２１－ＴＬｕｃ１６を結合する能力の有意な低下を示した（例外は、それぞれ単一の置換Ｍ７０Ｌ、Ｆ６９ＬおよびＤ７３Ｅを有する受容体ＲＶ２３、ＲＶ２４およびＲＶ２８である）。

【0016】

【図5】図５Ａおよび図５Ｂは、ネイティブＩＬ－２１Ｒα分子および図３に示されるように特定された８個の候補ｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１Ｒα分子を発現するＢａ／Ｆ３細胞によるＩＬ－２１誘導性ＳＴＡＴ３シグナル伝達応答を示す。細胞は、ＳＴＡＴ３調節シプリディナ・ノクティルカ（Ｃｙｐｒｉｄｉｎａ ｎｏｃｔｉｌｕｃａ）ルシフェラーゼレポーター導入遺伝子を有していた。これらを、異なる濃度のネイティブＩＬ－２１に一晩（およそ２０時間）曝露した後、酵素基質としてＶａｒｇｕｌｉｎを用いて、ルミノメトリーによって、上清培地をルシフェラーゼ活性について試験した。その細胞質尾部（Δｃｙｔ）を欠く野生型ＩＬ－２１Ｒαの形態を発現する細胞を含めて、ＩＬ－２１に応答したＳＴＡＴ３シグナル伝達が、予想されるように、受容体の細胞質尾部に依存したことを示した。

【0017】

【図6】図６Ａ～図６Ｔは、ネイティブＩＬ－２１Ｒα分子および図３に示されるように特定された８個の候補ｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１Ｒα分子を介してシグナル伝達を誘導するネイティブＩＬ－２１および候補ｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１分子の能力を示す。図５に関して記載されるように、ルミノメトリーを使用して、ネイティブＩＬ－２１Ｒα分子または候補ｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１Ｒα分子の発現を付与するために使用される同じトランスポゾンに存在するＳＴＡＴ３依存性ルシフェラーゼレポーター導入遺伝子を有するトランスフェクトＢａ／Ｆ３細胞によって産生されるルシフェラーゼを定量した。細胞を、増加する濃度の候補ｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１分子に一晩（およそ２０時間）曝露した後、上清培養培地をルシフェラーゼ活性について試験した。

【0018】

【図7】図７Ａ～図７Ｄは、ネイティブＩＬ－２１Ｒα分子および選択された候補ｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１Ｒα分子を介してシグナル伝達を誘導する、図６に示される集合からのネイティブＩＬ－２１分子および選択された候補ｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１分子の能力を示す。Ｂａ／Ｆ３細胞（ＳＴＡＴ３－ルシフェラーゼレポーター導入遺伝子をさらに有する、トランスポゾンからのネイティブＩＬ－２１Ｒα分子または候補ｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１分子を発現する）を、増加する濃度の示された候補ｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１分子に曝露（およそ２０時間）した後、上清培地を回収し、これを、図５および図６のように、ルミノメトリーによってルシフェラーゼ活性について試験した。

【0019】

【図8】図８Ａ、図８Ｂおよび図８Ｃは、それぞれアミノ酸置換Ｍ７０Ｇ／Ｙ１２９Ｆ（配列番号１９）またはＭ７０Ｉ／Ｄ７３Ｅ／Ｑ３３Ｈ（配列番号１２）を含む野生型ＩＬ－２１Ｒα（図８Ａ）または候補ｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１Ｒα分子ＲＶ１３（図８Ｂ）またはＲＶ６（図８Ｃ）を発現するＢａ／Ｆ３細胞において、ＳＴＡＴ３依存性シグナル伝達応答を誘導する能力について９６個のサイトカインの集合を試験した代表的なスクリーニング実験の結果を示す。図５および図６に関して記載されるように、ルミノメトリーを使用して、ネイティブＩＬ－２１Ｒα分子または候補ｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１Ｒα分子の発現を付与するために使用される同じトランスポゾンに存在するＳＴＡＴ３依存性ルシフェラーゼレポーター導入遺伝子を有するトランスフェクトＢａ／Ｆ３細胞によって産生されるルシフェラーゼを定量した。細胞を、増加する濃度の候補ｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１分子に一晩（およそ２０時間）曝露した後、上清培養培地をルシフェラーゼ活性について試験した。点線はサイトカイン集合についての応答曲線を示し、目的の５種のサイトカイン（野生型ＩＬ－２１、陰性対照ＣＶ２２、ならびに候補ｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１分子ＣＶ２０４、ＣＶ３７４およびＣＶ３８８）によって引き起こされる応答は、実線および記号で強調されている。

【0020】

【図9】図９Ａおよび図９Ｂは、野生型ＩＬ－２１Ｒα（図９Ａ）およびアミノ酸置換Ｍ７０Ｇ／Ｙ１２９Ｆ（配列番号１９）を含む候補ｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１Ｒα ＲＶ１３（図９Ｂ）を介してシグナル伝達を誘導するネイティブＩＬ－２１分子および候補ｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１分子の能力を示す。図５および図６に関して記載されるように、ルミノメトリーを使用して、ネイティブＩＬ－２１Ｒα分子または候補ｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１Ｒα分子の発現を付与するために使用される同じトランスポゾンに存在するＳＴＡＴ３依存性ルシフェラーゼレポーター導入遺伝子を有するトランスフェクトＢａ／Ｆ３細胞によって産生されるルシフェラーゼを定量した。細胞を、増加する濃度の候補ｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１分子に一晩（およそ２０時間）曝露した後、上清培養培地をルシフェラーゼ活性について試験した。

【0021】

【図10】図１０Ａ、図１０Ｂおよび図１０Ｃは、野生型ＩＬ－２１Ｒα（図１０Ａ）、アミノ酸置換Ｍ７０Ｇ／Ｙ１２９Ｆ（配列番号１９）を含む候補ｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１Ｒα ＲＶ１３（図１０Ｂ）、およびアミノ酸置換Ｍ７０Ｇ（配列番号２７）を含む候補ｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１Ｒα ＲＶ２２（図１０Ｃ）を介してシグナル伝達を誘導するネイティブＩＬ－２１分子および候補ｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１分子の能力を示す。図５および図６に関して記載されるように、ルミノメトリーを使用して、ネイティブＩＬ－２１Ｒα分子または候補ｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１Ｒα分子の発現を付与するために使用される同じトランスポゾンに存在するＳＴＡＴ３依存性ルシフェラーゼレポーター導入遺伝子を有するトランスフェクトＢａ／Ｆ３細胞によって産生されるルシフェラーゼを定量した。細胞を、増加する濃度の候補ｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１分子に一晩（およそ２０時間）曝露した後、上清培養培地をルシフェラーゼ活性について試験した。

【発明を実施するための形態】

【0022】

直交ＩＬ－２１受容体および直交ＩＬ－２１サイトカインが提供される。直交ＩＬ－２１受容体：サイトカイン対は、ネイティブＩＬ－２１への結合が損なわれたｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１ＲαおよびネイティブＩＬ－２１Ｒαへの結合が損なわれたｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１を含み得、ｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１Ｒαはｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１に結合する。直交ＩＬ－２１受容体－サイトカイン対は、細胞におけるシグナル伝達応答を活性化するために使用され得る。シグナル伝達応答は、ＩＬ－２１受容体の通常下流にあるネイティブのもの、または非ネイティブＩＬ－２１受容体および／または他の非ネイティブ細胞成分に依存する代替のものであり得る。直交ＩＬ－２１受容体を発現するように操作された細胞、ならびにそのような細胞を様々な疾患および障害の処置のために使用するための方法も提供される。

【0023】

定義
本明細書に記載の用語は、説明のためのものにすぎず、本発明を限定するものとして解釈されるべきではない。明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、特に明記されない限り、それらの複数形を含む。

【0024】

「処置する」、「処置すること」、「処置」などは、少なくとも１つの症候の軽減または抑制による状態の改善、疾患の進行の遅延などを含む、がんなどの疾患または障害に罹患した対象に利益を提供する任意の行為を指す。

【0025】

「有効量」および「治療有効量」という語句は、対象において有効な処置を提供するのに十分な、本発明の実施において使用される組成物の量を指す。

【0026】

「野生型」、「ＷＴ」および「ネイティブ」は、本明細書では互換的に使用され、対立遺伝子変異を含む、自然界に見られるアミノ酸配列またはヌクレオチド配列を意味する。ＷＴタンパク質、ポリペプチド、抗体、免疫グロブリン、ＩｇＧなどは、自然界に通常見られるものに対応するアミノ酸配列またはヌクレオチド配列を有し、意図的に修飾されていない。

【0027】

「ポリヌクレオチド」という用語は、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、もしくはこれらのいずれかの断片；一本鎖もしくは二本鎖であってもよく、センス鎖もしくはアンチセンス鎖を表してもよい、ゲノムもしくは合成起源のＤＮＡもしくはＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ）；ペプチド核酸；または、任意のＤＮＡ様もしくはＲＮＡ様材料を指し、天然由来であるか合成由来であるかを問わない。この用語はまた、天然ヌクレオチドの公知のアナログを含有する核酸、例えばオリゴヌクレオチド、ならびに合成骨格を有する核酸様構造も包含し得る。

【0028】

「ポリペプチド」という用語は、オリゴペプチド、ペプチドもしくはタンパク質配列、またはこれらのいずれかの断片、部分もしくはサブユニット、および天然に存在する分子または合成分子を指す。「ポリペプチド」という用語はまた、ペプチド結合または修飾ペプチド結合によって互いに接合されたアミノ酸、すなわちペプチドアイソスターも含み、任意の種類の修飾アミノ酸を含有し得る。「ポリペプチド」という用語はまた、ペプチドおよびポリペプチド断片、モチーフなども含む。タンパク質またはペプチド「鎖」は、より大きなタンパク質またはタンパク質複合体の別個のサブユニットを指す。

【0029】

「ホモログ」とは、他の種からのものなどの対応するタンパク質（例えば、ＩＬ－２１Ｒα）が、そのようなホモログペプチドがそれらのそれぞれの公知の活性を保持する限り、ヒトタンパク質に対して全体的なタンパク質（すなわち、成熟タンパク質）レベルで実質的に相同であることを意味する。３５％～９９％の様々なレベルの相同性が存在し得る。

【0030】

「アミノ酸修飾」という用語は、ポリペプチド配列におけるアミノ酸の置換、挿入または欠失を含む。「アミノ酸置換」または「置換」とは、親ポリペプチド配列の特定の位置のアミノ酸を別のアミノ酸で置き換えることを意味する。例えば、置換Ｒ９４Ｋは、位置９４のアルギニンがリジンで置き換えられた修飾ポリペプチドを指す。先の例について、９４Ｋは、位置９４のリジンによる置換を示す。複数の置換は、典型的には、スラッシュまたはコンマで区切られる。例えば、Ｒ９４Ｋ／Ｌ７８Ｖおよび［Ｒ９４Ｋ，Ｌ７８Ｖ］は、置換Ｒ９４ＫおよびＬ７８Ｖを含む二重バリアントを指す。「アミノ酸挿入」または「挿入」とは、親ポリペプチド配列の特定の位置にアミノ酸を付加することを意味する。例えば、挿入－９４は、位置９４における挿入を示す。「アミノ酸欠失」または「欠失」とは、親ポリペプチド配列の特定の位置のアミノ酸の除去を意味する。例えば、Ｒ９４－は、位置９４におけるアルギニンの欠失を示す。

【0031】

「保存的修飾」および「保存的配列修飾」という語句は、アミノ酸配列を含有するポリペプチドの結合特性に有意に影響を及ぼさないか、または変化させないアミノ酸修飾を指す。そのような保存的修飾は、アミノ酸の置換、挿入および欠失を含む。修飾は、部位特異的変異誘発およびＰＣＲ媒介変異誘発などの当技術分野で公知の標準的な技術によって、またはＤＮＡ合成によってタンパク質に導入することができる。保存的アミノ酸置換は、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えられたものである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野で定義されている。これらのファミリーは、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、ベータ分岐側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸を含む。

【0032】

通常、ペプチドの保存的置換バリアント、ホモログおよびアナログは、開示された配列と少なくとも約３５％、少なくとも約４５％、少なくとも約５５％、少なくとも約６５％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％～９９％のアミノ酸配列同一性を有する。Ｒｏｓｔ Ｂ．Ｔｗｉｌｉｇｈｔ ｚｏｎｅ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．１９９９；１２（２）：８５－９４．ｄｏｉ：１０．１０９３／ｐｒｏｔｅｉｎ／１２．２．８５．

【0033】

そのような配列に対する同一性または相同性は、本明細書では、最大パーセント相同性を達成するために配列を整列させ、必要に応じてギャップを導入した後、配列同一性の一部として保存的置換を考慮せずに、公知のペプチドと同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。ペプチド配列へのＮ末端、Ｃ末端または内部の伸長、欠失または挿入は、相同性に影響を及ぼすと解釈されるべきではない。

【0034】

ガンマ鎖（γｃ）サイトカインは、同族サイトカイン受容体複合体が共通のサイトカイン受容体ガンマ鎖（γｃ）を含む任意のサイトカインを意味する。γｃサイトカインは、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＩＬ－９、ＩＬ－１５およびＩＬ－２１を含む。

【0035】

直交サイトカイン：受容体対は、互いに効果的に相互作用する（すなわち、細胞において生理学的に必然のシグナル伝達応答を開始するために使用され得るように）が、それらの天然の対応物と相互作用する能力が有意に損なわれている天然のサイトカイン：受容体対のバリアントを指す。直交サイトカインは、変異したもしくは他の方法で修飾された天然サイトカイン（「ムテイン」）、または直交サイトカイン受容体上のアゴニストとして作用する完全合成タンパク質（「シンテキン（ｓｙｎｔｈｅｋｉｎｅ）」と呼ばれることもある）のいずれかであり得る。直交サイトカイン（ムテインであろうとシンテキンであろうと）は、野生型サイトカイン受容体に対するアゴニスト活性を示さないか、または減弱されたアゴニスト活性を示すのみである。

【0036】

したがって、直交サイトカイン：受容体対は、（ａ）ネイティブのサイトカインまたは同族受容体への結合を欠くかまたは低減するように、および（ｂ）操作された（直交）リガンドまたは受容体の対応物に特異的に結合するようにアミノ酸変化によって修飾される遺伝子操作されたタンパク質対を含み得る。直交サイトカインが結合すると、直交受容体は、ネイティブの細胞要素を介して形質導入されるシグナル伝達を活性化して、ネイティブの応答を模倣するが、直交受容体を発現する操作された細胞に特異的な生物学的活性を提供する。非ネイティブ受容体または細胞要素（例えば、受容体中の非ネイティブ細胞質ドメイン）は、シグナル伝達応答を修飾するために含まれ得る。直交受容体は、直交サイトカインのネイティブの対応物を含む、いかなる内因性サイトカインにも結合しないか、または減弱された意欲でのみ結合し、直交サイトカインは、直交受容体のネイティブの対応物を含む、いかなる内因性受容体にも結合しないか、または減弱された意欲でのみ結合する。いくつかの態様では、直交受容体に対する直交サイトカインの親和性は、ネイティブ受容体に対するネイティブサイトカインの親和性に匹敵し、例えば、ネイティブサイトカイン受容体対の親和性の少なくとも約１％、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２５％、少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、少なくとも約１００％であり、ネイティブ受容体に対するネイティブサイトカインの親和性より高い、例えば、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍またはそれ以上であり得る親和性を有する。

【0037】

「候補」という用語は、直交タンパク質（ＩＬ－２１またはＩＬ－２１Ｒα）の認定に使用される場合、原型状態または発達状態を推論する。分析手順は、候補タンパク質が所望の程度の結合特権および直交機能性を有することが分かった場合、認定を除去することができる。

【0038】

本明細書で使用される場合、「結合しない／結合しない」および「結合することができない」という語句は、検出可能な結合がないこと、またはわずかな結合、すなわち天然リガンドの結合親和性よりもはるかに低い結合親和性を有することを指す。「損なわれた結合」とは、対応する野生型成分（例えば、サイトカインおよび受容体）間の結合の正常レベルよりも低い結合を指す。

【0039】

本発明は、サイトカインのγｃファミリーのメンバーであるＩＬ－２１に基づく直交サイトカイン系を含む。ＩＬ－２１は、ＩＬ－２と構造的に関連しており、ＩＬ－２１Ｒαおよびγｃからなる二量体受容体を介してシグナル伝達する。ＩＬ－２受容体はＳＴＡＴ５が支配的なシグナル伝達応答を促進するが、ＳＴＡＴ３はＩＬ－２１応答を支配する。ＩＬ－２１は、養子細胞治療（「ＡＣＴ」）、特にＣＡＲ Ｔ細胞を使用するＡＣＴにおいて良好な転帰と相関するＴ細胞分化の形態を促進し、様々な腫瘍モデル系においてＩＬ－２と比較して増強された抗腫瘍特性を示す。結果として、ＩＬ－２１は、ＩＬ－２よりもＡＣＴのためのより良好な補助剤であることを証明し得る。したがって、一態様では、１）ネイティブＩＬ－２１Ｒαに対する結合が損なわれたｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１、および２）ｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１を結合することができるが、ネイティブＩＬ－２１に対する損なわれた結合を示すｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１Ｒαを含むＩＬ－２１直交系が提供される（図１；図２、経路Ａ）。

【0040】

直交インターロイキン－２１受容体
一態様では、直交インターロイキン－２１受容体が提供される。直交インターロイキン－２１受容体は、タンパク質全体を構成する鎖のいずれかの修飾を含み得る。いくつかの態様では、ｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１Ｒαが提供される。ｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１Ｒαは、野生型ヒトＩＬ－２１Ｒα（配列番号４－シグナルペプチドを欠く成熟形態のヒトＩＬ－２１Ｒα）に由来する修飾アミノ酸配列を含む。ｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１Ｒαは、ｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１に結合するが、ネイティブＩＬ－２１への結合が損なわれている。ヒトＩＬ－２１Ｒαは配列番号３で表される。

【0041】

いくつかの態様では、修飾アミノ酸配列は、ＩＬ－２１と接触する配列番号４のアミノ酸残基、そのような接触残基のすぐ近傍の残基、またはＩＬ－２１結合表面の立体配座に影響を及ぼすＩＬ－２１Ｒαの他の場所の残基のうちの１つ以上の置換を含む。すぐ近傍内のアミノ酸は、一次タンパク質配列中の接触残基の１、２、３、４または５アミノ酸以内のアミノ酸、または三次タンパク質構造中の同様に近くのアミノ酸残基である。いくつかの態様では、ｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１Ｒαは、配列番号６に対して番号付けされた、Ｙ１０、Ｑ３３、Ｑ３５、Ｙ３６、Ｅ３８、Ｌ３９、Ｆ６７、Ｈ６８、Ｆ６９、Ｍ７０、Ａ７１、Ｄ７２、Ｄ７３、Ｉ７４、Ｌ９４、Ａ９６、Ｅ９７、Ｐ１２６、Ａ１２７、Ｙ１２９、Ｍ１３０、Ｋ１３４、Ｓ１９０もしくはＹ１９１、またはそれらの組み合わせの位置のアミノ酸置換を含む。

【0042】

ＩＬ－２１の直交バージョンを作製するための１つの戦略は、ＩＬ－２１Ｒαを、ＩＬ－２１に対する結合能が低減されるように最初に変異させることを含む。２０個のＩＬ－２１Ｒαアミノ酸が、９９０Å^２の結合表面内でＩＬ－２１と有意に直接接触する。これらの２０残基のいずれかを変異させることにより、受容体がＩＬ－２１に正常に結合する能力が損なわれ得る。例えば、ＩＬ－２１Ｒαの位置７０のメチオニン残基は、結合相互作用に対する主要な寄与因子として特定されている。この残基の大きな疎水性側鎖は、大部分が親水性残基（アルギニン－９、グルタミン－１２、アルギニン－７６、リジン－７３、およびイソロイシン－１６）から構成されるＩＬ－２１ポケットに嵌合し、その一部を、ＩＬ－２１Ｒαとの接触を改善するために（特に、ＩＬ－２１のアルギニン－９およびアルギニン－７６は、それぞれＩＬ－２１Ｒαのアスパラギン酸－７２およびアスパラギン酸－７３と接触する）再配置する。メチオニン－７０を異なる残基に変更することにより、これらの接触の一部が減弱または失われるようにこの再配置を調節することができる。ＩＬ－２１Ｒαのアスパラギン酸－７２またはアスパラギン酸－７３を変化させることは、相互作用の結合自由エネルギーも低下させる可能性があり、その結果、ＩＬ－２１（例えば、位置９および７６において）の補償的変化がそれを回復させるために必要とされるであろう。

【0043】

ＩＬ－２１のヘリックスＣは、サイトカインの遊離構造において２つの互換的状態（一方は無秩序であり、他方はα－ヘリックスである）で存在する。α－ヘリックス形態は、ＣＤループの最初の部分と同様に、ＩＬ－２１とＩＬ－２１Ｒαとの複合体において安定化される。ＩＬ－２１のヘリックスＣは、ＩＬ－２１Ｒαのメチオニン－７０に近位の上述のリジン－７３およびアルギニン－７６を含む。ＩＬ－２１のＣＤループは、ＩＬ－２１Ｒαのチロシン－３６のためのポケットを集合的に形成するリジン－７７、プロリン－７９およびセリン－８０を含み、リジン－７７はまた、ＩＬ－２１Ｒαのグルタミン酸－３８とイオン接触する。ＣＤループアミノ酸配列をＩＬ－４に見出される類似の配列に変更することにより、細胞アッセイを使用して測定されるＩＬ－２１効力の１０倍の増強がもたらされる。この観察は、有意な結合エネルギーがＩＬ－２１のヘリックスＣの安定化に費やされることを示唆する。さらに、ＩＬ－２１Ｒαのグルタミン酸－３８およびチロシン－３６への変化は、ヘリックスＣまたはＣＤループにおけるＩＬ－２１への補償的変化によって可逆的であり得る様式でＩＬ－２１結合に有意に影響を及ぼし得ることを示唆する。

【0044】

個別のトリ配列モチーフが直交ＩＬ－２１系の設計に使用され得る。ＩＬ－２１の４４個の利用可能なトリ配列のうち、３９個はヒトおよびマウスと比較して有意に（６残基）短縮されたＣＤループを有する。７４個の利用可能なトリＩＬ－２１Ｒα配列のすべてにチロシン－３６が存在しないことと合わせて、これは、トリＩＬ－２１のヘリックスＣがヒトＩＬ－２１のヘリックスＣとは別個の様式でその受容体と係合する可能性が高いことを示唆する。これはまた、直交ＩＬ－２１系を構築するための上記の結合残基に対する修飾のためのさらなる基礎を提供する。

【0045】

構造的考察に基づいて、ネイティブＩＬ－２１に対するその結合が損なわれるようにＩＬ－２１Ｒαを変化させるように修飾され得る候補アミノ酸が特定され得る。しかしながら、これらの変化は、ＩＬ－２１の補償的変化（すなわち、ｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１Ｒαへの結合を回復させるＩＬ－２１の変化）と非適合性ではない性質のものでなければならない。結合を回復させるために必要とされる補償的変化の数が、あまりに大きい工学的課題を提示するか、またはサイトカイン機能と適合しない可能性があるので（例えば、γｃ結合が失われるため、またはサイトカインもしくはサイトカイン受容体が不安定になるため、発現が困難になるため、免疫原性になるため、もしくは薬理学的に問題になるため）、その立体配座に大きな変化をもたらすＩＬ－２１Ｒαの変化は、望ましくない。

【0046】

ＩＬ－２１への結合の喪失についてｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１Ｒαをスクリーニングするために、少なくとも２種類のアッセイを使用することができる。１つは直接結合アッセイであり、これは精製タンパク質および表面プラズモン共鳴法（「ＳＰＲ」）またはバイオレイヤー干渉法（「ＢＬＩ」）などの高感度の生物物理学的分析手順を使用して実行することができる。別のアッセイは、適切な細胞株を含む機能アッセイである。Ｂａ／Ｆ３細胞は、以下のいくつかの有用な形質を有するため、この目的のために首尾よく使用されている：（ｉ）内因性ＩＬ－２１Ｒαを発現しないこと、（ｉｉ）ヒトＩＬ－２１ＲαおよびヒトＩＬ－２１によるシグナル伝達においてヒトγｃを効果的に置換するマウスγｃを発現すること；（ｉｉｉ）ＳＴＡＴ３をリン酸化し、増殖させることによってＩＬ－２１Ｒシグナル伝達に応答すること；ならびに（ｉｖ）ＩＬ－２１シグナル伝達をモニタリングするための容易かつ魅力的な手段としてのＳＴＡＴ３レポーター導入遺伝子（例えば、ルシフェラーゼを発現するもの）の使用を可能にすること。ＪｕｒｋａｔまたはＭｏｌｔ－３細胞は代替的な選択肢であり、両方とも、内因性ＩＬ－２１Ｒαの発現は最小限であるか、または存在しないが、γｃを発現し、ＩＬ－２１Ｒシグナル伝達適格性である。γｃを発現するようにトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞も使用することができる。

【0047】

候補ｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１Ｒαを単離するための戦略は、トランスフェクションによってバリアントをＢａ／Ｆ３細胞（または直前に述べた代替物の１つ）に個々に発現させることを含む。フローサイトメトリーを使用して、細胞表面上の候補ｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１Ｒα分子の存在および利用可能な抗体によって認識されるエピトープの存在を確認する。一態様では、候補ｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１Ｒαは、Ｙ１０、Ｑ３３、Ｑ３５、Ｙ３６、Ｅ３８、Ｌ３９、Ｆ６７、Ｈ６８、Ｆ６９、Ｍ７０、Ａ７１、Ｄ７２、Ｄ７３、Ｉ７４、Ｌ９４、Ａ９６、Ｅ９７、Ｐ１２６、Ａ１２７、Ｙ１２９、Ｍ１３０、Ｋ１３４、Ｓ１９０もしくはＹ１９１、またはそれらの組み合わせの位置（ここで、数字は、成熟ＩＬ－２１Ｒα外部ドメイン（配列番号６）における残基位置を指し、文字は、一文字コードを使用したアミノ酸同一性を指し、一文字目は野生型残基であり、二文字目は、存在する場合、置換残基である）に、アミノ酸置換を含む。一態様では、アミノ酸置換は、Ｍ７０Ｇ、Ｍ７０Ａ、Ｍ７０Ｉ、Ｍ７０Ｌ、Ｙ１２９Ｆ、Ｙ１２９Ａ、Ｙ１２９Ｓ、Ｙ１２９Ｈ、Ｍ１３０Ｆ、Ｍ１３０Ｓ、Ｙ３６Ｈ、Ｙ３６Ｆ、ＦＭＡＤ（６９～７３）～ＬＬＡＤＩ、ＦＹＭ（１２８～１３０）～ＦＨＦ、Ｄ７２Ｋ、Ｄ７３Ｋ、Ｄ７２Ｅ、Ｄ７３Ｅ、Ｄ７３Ｉ、Ｅ３８Ｋ、Ｅ３８Ｓ、Ｅ３８Ｄ、Ｆ６７Ｌ、Ｆ６７Ｙ、Ｆ６９Ｌ、Ｓ１９０Ｙ、Ｙ１９１Ｆ、Ｑ３５Ｌ、Ｈ６８Ｑ、Ｉ７４Ｖ、Ｌ９４Ｉ、Ｌ９４Ｖ、Ｅ９７Ｄ、Ａ１２７Ｔ、Ｑ３３Ｎ、Ｑ３３Ｈ、Ｋ１３４Ｒ、Ｍ１３０Ｉ、Ｍ１３０Ｌ、Ｓ１９０Ｔまたはそれらの組み合わせを含むか、それらから本質的になるか、またはそれらからなる。一態様では、アミノ酸置換は、Ｄ７２Ｅ／Ｙ１２９Ｆ／Ｄ７３Ｅ；Ｍ７０Ｉ／Ｄ７３Ｅ／Ｑ３３Ｈ；Ｄ７２Ｅ／Ｌ９４Ｖ／Ｙ１９１Ｆ；Ｄ７２Ｅ／Ｅ３８Ｄ／Ｍ１３０Ｌ；Ｍ７０Ｇ／Ｙ１２９Ｆ；Ｆ６９Ｌ／Ｍ７０Ｌ／Ｄ７３Ｉ；Ｄ７２Ｋ／Ｄ７３Ｋ；Ｅ３８Ｋ；もしくはＭ７０Ｇ、またはそれらの組み合わせを含むか、それらから本質的になるか、またはそれらからなる。一態様では、アミノ酸置換は、［Ｈ６８Ｑ，Ｅ３８Ｄ，Ｑ３３Ｈ］、［Ｙ１２９Ｆ，Ｈ６８Ｑ，Ｙ１９１Ｆ］、［Ｙ３６Ｆ，Ｈ６８Ｑ，Ｄ７３Ｅ］、［Ｙ１２９Ｆ，Ｆ６７Ｙ，Ｍ１３０Ｌ］、［Ｌ９４Ｖ，Ｑ３３Ｈ，Ｍ１３０Ｌ］、［Ｙ３６Ｆ，Ｆ６７Ｙ，Ｅ３８Ｄ］、［Ｄ７２Ｅ，Ｅ３８Ｄ，Ｍ１３０Ｌ］、［Ｙ３６Ｆ，Ｍ７０Ｉ，Ｌ９４Ｖ］、［Ｍ７０Ｉ，Ｆ６７Ｙ，Ｙ１９１Ｆ］、［Ｙ１２９Ｈ，Ｍ１３０Ｆ］、［Ｙ１２９Ｆ，Ｍ１３０Ｓ］、［Ｍ７０Ｇ，Ｄ７３Ｅ］、［Ｍ７０Ｇ，Ｄ７３Ｅ，Ｑ３３Ｈ］、［Ｍ７０Ｉ，Ｄ７３Ｅ］、［Ｍ７０Ｉ，Ｅ３８Ｋ］および［Ｍ７０Ｉ，Ｅ３８Ｋ，Ｄ７３Ｅ］を含むか、それらから本質的になるか、またはそれらからなる。一態様では、アミノ酸置換は、Ｍ７０Ｇ／Ｙ１２９ＦまたはＭ７０Ｇを含むか、それらから本質的になるか、またはそれらからなる。

【0048】

候補ｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１Ｒαを発現するＢａ／Ｆ３細胞は、シグナル伝達応答について分析する前に、ネイティブヒトＩＬ－２１と共にインキュベートすることができる。いくつかの実験では、時間経過を使用してアッセイの感度および分解能を改善することができる。他の実験は、用量応答曲線の比較を含む。ＩＬ－２１応答性は、Ｂａ／Ｆ３細胞の増殖、フローサイトメトリーもしくは免疫ブロット法によるＳＴＡＴ３のチロシンリン酸化、または細胞中に存在するＳＴＡＴ３依存性レポーター導入遺伝子からのレポーター（ルシフェラーゼもしくは分泌アルカリホスファターゼなど）の発現をモニタリングすることによって検出される。ネイティブＩＬ－２１Ｒαは、これらの分析技術のいずれかを使用してＩＬ－２１に対するロバストな応答を可能にするが、所望のｏｒｔｈｏ－形態の受容体は、応答が低減されるか、または応答がない。この非応答特性を示すｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１Ｒα分子は、直交的に制限されたＩＬ－２１サイトカイン受容体系の候補である。

【0049】

直交インターロイキン－２１サイトカイン
別の態様は、ｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１Ｒαに結合するが、ネイティブＩＬ－２１Ｒαへの結合が損なわれた、野生型ヒトＩＬ－２１（配列番号２－シグナルペプチドを欠く成熟形態のヒトＩＬ－２１）に由来する修飾アミノ酸配列を有するｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１を提供する。ヒトＩＬ－２１は配列番号１で表される。

【0050】

いくつかの態様では、ｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１は、ｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１Ｒαに結合するが、ネイティブＩＬ－２１Ｒαへの結合が損なわれている。さらなる態様では、修飾アミノ酸配列は、ＩＬ－２１Ｒαと接触する配列番号２の１つ以上のアミノ酸残基、そのような接触残基のすぐ近傍の残基、またはＩＬ－２１α結合表面の立体配座に影響を及ぼすＩＬ－２１Ｒの他の場所の残基の置換を含む。

【0051】

ＩＬ－２１の直交形態を特定するための方法も利用可能である。ＩＬ－２１の１０残基は、ＩＬ－２１Ｒα：アルギニン－５、アルギニン－９、アルギニン－１１、グルタミン－１２、アスパラギン酸－１５、セリン－７０、リジン－７３、アルギニン－７６、リジン－７７およびセリン－８０との極性相互作用に関与する。これらの中で、アルギニン－５、アルギニン－９、アルギニン－１１、グルタミン－１２、リジン－７３、アルギニン－７６およびリジン－７７はまた、ＩＬ－２１Ｒαと有意なファンデルワールス接触も形成する。イソロイシン－８、イソロイシン－１６、グルタミン－１９、チロシン－２３、イソロイシン－６６、バリン－６９およびプロリン－７９は、さらなるファンデルワールス接触を形成する。候補ｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１Ｒα分子に存在する変化を克服し、結合を回復させるために、これらの残基のいずれかに置換を行うことができる。

【0052】

ＩＬ－２１Ｒαによって結合されたＩＬ－２１の結晶構造を使用して、ＩＬ－２１Ｒαに操作された変化の近位にあるＩＬ－２１残基を特定することができる。例えば、ＩＬ－２１Ｒαのメチオニン－７０の変化がＩＬ－２１結合を消失させるのに十分である場合、ＩＬ－２１中の以下のメチオニン－７０接触残基のいずれかに対する補償的変化が結合を回復させ得ることが可能である：アルギニン－９、グルタミン－１２、イソロイシン－１６、リジン－７３およびアルギニン－７６。しかしながら、メチオニン－７０に加えて、これらの５つのＩＬ－２１残基は、以下のＩＬ－２１Ｒα残基と接触する：チロシン－１０、ロイシン－３９、グルタミン酸－３８、フェニルアラニン－６７、アラニン－７１、アスパラギン酸－７２、アスパラギン酸－７３、チロシン－１２９、メチオニン－１３０およびチロシン－１９１。次に、直前に述べた１０個のＩＬ－２１Ｒα残基は、ＩＬ－２１残基であるアルギニン－５、イソロイシン－８、グルタミン－１９、セリン－７０およびリジン－７７とのさらなる接触を媒介する。したがって、ネイティブＩＬ－２１：ＩＬ－２１Ｒα結晶構造中に存在する直接接触を単に考慮すると、ＩＬ－２１Ｒα中の位置メチオニン－７０における単一の置換は、１０個のＩＬ－２１残基（アルギニン－５、イソロイシン－８、アルギニン－９、グルタミン－１２、イソロイシン－１６、グルタミン－１９、セリン－７０、リジン－７３、アルギニン－７６およびリジン－７７）によって媒介される相互作用に影響を及ぼし得る。これは、置換の補償（すなわち、ＩＬ－２１結合の回復）がこれらの１０残基のうちの１つ以上に対する変化によって達成され得ることを推論する。ＩＬ－２１Ｒαと直接接触しない残基に対する変化が、ＩＬ－２１Ｒαのメチオニン－７０置換バリアントに対して結合が回復されることを可能にするようにある距離で働く立体配座調節をもたらし得ることも可能である。

【0053】

ファージディスプレイまたは酵母ディスプレイ技術は、大きな変異空間のスクリーニングを可能にすることができる。これは、典型的には、タンパク質中の少数の残基がランダム（または半ランダム）な組み合わせ様式で変化される、バリアントの非常に多様なライブラリーを作成することによって達成される。次いで、ライブラリーは、所望の特性についてスクリーニングされる。本発明の場合、スクリーニングは、候補ｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１Ｒαに結合することができるＩＬ－２１バリアントのライブラリーのメンバーを特定することを含み得る。直前に記載された例のように、メチオニン－７０における置換が、ネイティブＩＬ－２１へのＩＬ－２１Ｒαの結合を消失させるのに十分である場合、影響を受ける可能性がある１０個の接触残基（アルギニン－５、イソロイシン－８、アルギニン－９、グルタミン－１２、イソロイシン－１６、グルタミン－１９、セリン－７０、リジン－７３、アルギニン－７６およびリジン－７７）におけるランダムな組み合わせ変異を有するＩＬ－２１ライブラリーが構築され得る。そのようなライブラリーの理論的複雑度は、１０^１３を超える可能性がある。１０^８～１０^９を超えるバリアントで構成されるライブラリーを生成することは、典型的には困難であり、非現実的である。そのようなライブラリーのスクリーニングは、その表面に付着したＩＬ－２１のバリアント形態を提示するファージまたは酵母が、候補ｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１Ｒαでコーティングされたマトリックスに（野生型ＩＬ－２１Ｒαでコーティングされたマトリックスにではなく）付着する能力に基づいて分離される、選択プロセスを含み得る。このような選択の反復サイクルを実施して、ＩＬ－２１中の所望の特性を濃縮する。分析スクリーニング手順（ＳＰＲまたはＢＬＩを含む）を使用して、選択の産物を詳細に特徴付け、最適な特性を有するものを特定する。

【0054】

一態様では、ｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１は、ＩＬ－２１Ｒαと接触する配列番号２の１つ以上のアミノ酸残基、そのような接触残基のすぐ近傍の残基、またはＩＬ－２１Ｒα結合表面の立体配座に影響を及ぼすＩＬ－２１の他の場所の残基の置換を含む修飾アミノ酸配列を含む。一態様では、ｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１は、配列番号２に対して番号付けされた、Ｒ５、Ｈ６、Ｉ８、Ｒ９、Ｍ１０、Ｑ１２、Ｌ１３、Ｋ７３、Ｋ７５、Ｒ７６、Ｐ７８、Ｇ８４もしくはＰ１０４、またはそれらの組み合わせの位置のアミノ酸置換を含む。一態様では、アミノ酸置換は、Ｒ５Ｑ、Ｒ５Ｄ、Ｒ５Ｅ、Ｒ５Ｋ、Ｒ５Ｎ、Ｈ６Ｌ、Ｉ８Ｅ、Ｒ９Ｅ、Ｒ９Ｄ、Ｒ９Ｋ、Ｒ９Ｎ、Ｒ９Ｑ、Ｍ１０Ｌ、Ｑ１２Ｖ、Ｌ１３Ｄ、Ｋ７３Ｖ、Ｋ７３Ｄ、Ｋ７３Ｉ、Ｋ７５Ｄ、Ｒ７６Ｅ、Ｒ７６Ｎ、Ｒ７６Ａ、Ｒ５Ｑ／Ｒ７６Ｅ、Ｒ５Ｑ／Ｒ７６Ａ、Ｐ７８Ｌ、Ｇ８４ＥもしくはＰ１０４Ａ、またはそれらの組み合わせを含むか、それらから本質的になるか、またはそれらからなる。一態様では、アミノ酸置換は、Ｈ６Ｌ／Ｒ９Ｋ／Ｍ１０Ｌ／Ｐ７８Ｌを含むか、それらから本質的になるか、またはそれらからなる。

【0055】

直交ＩＬ－２１受容体－サイトカイン対を特定するためのさらなる方法
ｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１分子の特定のための代替的なアプローチは、ＩＬ－２１：ＩＬ－２１Ｒα構造において直接的な分子間接触を行う残基から選択される少数の残基に再び焦点を合わせた、反復的な突然変異誘発サイクルを含む。このアプローチはまた、接触点に近い残基および／または潜在的に関連する構造的特徴の残基を含み得る。このアプローチの広範なバージョンは、ＩＬ－２１Ｒαとの接触領域全体の近位にある残基のいずれか、および近位の構造的特徴におけるさらなる半ランダムに選択された残基を含み得る。より焦点を合わせたバージョンは、候補ｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１Ｒα中に存在する特定の置換によって直接影響を受ける可能性がある残基、例えばメチオニン－７０置換に潜在的に関連する１０個の残基などを含む。代替的な広範なアプローチは、置換が、ＩＬ－２１の構造を考慮するとしても最小限に考慮して、ただし、代わりに、他の種からのＩＬ－２１オルソログにおいて生じる置換に部分的に重点を置いて行われるものである。このアプローチは、ＩＬ－２１の一次配列全体にわたる個々の残基における単一の置換を含む。

【0056】

反復プロセスは、多数（例えば、１０～１００）の候補ｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１形態から始まる。このアプローチのいくつかのバージョンでは、二重変異体または三重変異体が最初の集合に含まれるが、他のバージョンでは、ＩＬ－２１の単一点変異のみが評価される。これらの候補ｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１分子は、上記の細胞アッセイ（例えば、ＳＴＡＴ３依存性ルシフェラーゼレポーター導入遺伝子を有するＢａ／Ｆ３細胞を使用する）を使用して活性について試験される。最小限の２種類の細胞：候補ｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１Ｒαを発現する細胞、およびカウンタースクリーニングとして、野生型ＩＬ－２１Ｒαを発現する細胞がアッセイに使用される。

【0057】

代替アプローチが成功する可能性は、調べられた候補ｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１Ｒα分子の数に対応する。この数を拡大することにより、少数（例えば、３個未満）の置換ではＩＬ－２１結合を容易に（部分的にさえ）回復させることができない候補ｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１Ｒαを不注意に選択する可能性が低減される。この数の拡大することにより、さらに、互いにまたは野生型ＩＬ－２１もしくはＩＬ－２１Ｒαとのクロストークを示さない平行な相互に直交する系を単離することができる可能性が高くなる。

【0058】

最初のスクリーニング回からのデータをデコンボリューションし、単独で候補ｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１Ｒα分子への結合の改善およびネイティブＩＬ－２１Ｒαへの結合の減少を促進するＩＬ－２１における置換の特定に焦点を当てて分析することができる。２回目のスクリーニングが実施される場合があり、この場合、１回目からの陽性スコアリング置換が、新たな候補ｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１分子において組み合わされる。これらの候補ｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１分子（および、望ましいと考えられる場合、保存的または非保存的置換が陽性スコアリング位置で行われるさらなる変形）は、候補ｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１Ｒα分子への結合の改善およびネイティブＩＬ－２１Ｒαへの損なわれた結合について再度試験される。

【0059】

少なくとも１つの候補ｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１が所望の特性（ネイティブＩＬ－２１Ｒαによる活性の欠如および少なくとも１つの候補ｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１Ｒαによるほぼ正常な活性）で単離されるまで、さらなる置換の組み合わせを含むさらなるスクリーニングが実施され得る。

【0060】

代替的なスクリーニングアプローチは、いくつかの状況では、野生型ＩＬ－２１に対する低減された（しかし、完全に存在しないわけではない）結合を保持する候補ｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１Ｒα分子を使用して促進され得る。そのような低減された結合の候補ｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１Ｒα分子は、非結合の候補ｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１Ｒα分子（すなわち、野生型ＩＬ－２１に対するいかなる結合も欠く候補ｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１Ｒα分子）よりも、ＩＬ－２１における少数（例えば、３個未満）の個別の置換によるいくらかのＩＬ－２１結合活性の回復を可能にすることを証明し得る。候補ｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１分子が上記で概説されたスクリーニング手順によって単離されると、さらなる置換が既に存在する置換と組み合わされる、新しい候補ｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１Ｒα分子を含むさらなるスクリーニングステップが実施され得る。いくつかの態様では、これらのさらなる変異は、ｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１を結合する能力を保持しつつ、野生型ＩＬ－２１への結合を完全に排除し得る。この受容体突然変異誘発は複数回、その後の精製サイトカイン突然変異誘発回と共に実施され得る。

【0061】

スクリーニングアプローチの産物の結合特性は、精製タンパク質およびＢＬＩまたはＳＰＲを使用して分析することができる。それらの結合動態において野生型ＩＬ－２１およびＩＬ－２１Ｒαに最もよく似ている産物が、候補直交ＩＬ－２１系として選択され得る。

【0062】

一態様では、候補ｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１分子は、米国特許第８，００５，６２０号、第８，６３５，０２９号および第８，４１２，４６１号、ならびにＧｏｖｉｎｄａｒａｊａｎ Ｓ，Ｍａｎｎｅｒｖｉｋ Ｂ，Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ ＪＡ，ｅｔ ａｌ．Ｍａｐｐｉｎｇ ｏｆ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ ｃｏｎｆｅｒｒｉｎｇ ｈｅｒｂｉｃｉｄｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｉｎ ｗｈｅａｔ ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ．ＡＣＳ Ｓｙｎｔｈ Ｂｉｏｌ．２０１５；４（３）：２２１－２２７．ｄｏｉ：１０．１０２１／ｓｂ５００２４２ｘ；Ｍｕｓｄａｌ Ｙ，Ｇｏｖｉｎｄａｒａｊａｎ Ｓ，Ｍａｎｎｅｒｖｉｋ Ｂ．Ｅｘｐｌｏｒｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ－ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｓｐａｃｅ ｏｆ ａ ｐｏｐｌａｒ ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｕｓｉｎｇ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ－ｒｉｃｈ ｇｅｎｅ ｖａｒｉａｎｔｓ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ Ｄｅｓ Ｓｅｌ．２０１７；３０（８）：５４３－５４９．ｄｏｉ：１０．１０９３／ｐｒｏｔｅｉｎ／ｇｚｘ０４５；ａｎｄ Ｌｉａｏ Ｊ，Ｗａｒｍｕｔｈ ＭＫ，Ｇｏｖｉｎｄａｒａｊａｎ Ｓ，ｅｔ ａｌ．Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ ｕｓｉｎｇ ｍａｃｈｉｎｅ ｌｅａｒｎｉｎｇ ａｎｄ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｇｅｎｅｓ．ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００７；７：１６．Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ２００７ Ｍａｒ ２６．ｄｏｉ：１０．１１８６／１４７２－６７５０－７－１６の１つ以上に記載のプロセスに従って操作することができ、その各々は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0063】

一態様では、候補ｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１分子は、上記の配列番号２に由来する修飾アミノ酸配列と、精製を容易にし、インビボでのｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１分子の安定性および半減期を増加させるか、または患者におけるｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１分子の投与の成功に重要な薬物特性を改善する第２のアミノ酸配列との間の融合タンパク質として発現される。適切な第２のアミノ酸配列は当技術分野で公知であり、限定されないが、血清アルブミン、ＩｇＧのＦｃ断片、一本鎖Ｆｃ抗体断片、ＡＢＤ０３５などを含む。Ｆｃ断片は、ホモ二量体の形成を防止するために、または少なくとも有意に制限するために、例えば静電ステアリング突然変異を用いて修飾することができる。

【0064】

直交ＩＬ－２１受容体－サイトカイン系
別の態様は、細胞においてＩＬ－２１シグナル伝達を活性化するための系を提供する。この系は、ＩＬ－２１と接触する配列番号４のアミノ酸残基の１つ以上、そのような接触残基のすぐ近傍の残基、またはＩＬ－２１結合表面の立体配座に影響を及ぼすＩＬ－２１Ｒαの他の場所の残基の置換を含む、配列番号４に由来する修飾アミノ酸配列を含む、ネイティブＩＬ－２１への結合が損なわれた候補ｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１Ｒαと、ＩＬ－２１Ｒαと接触する配列番号２の１つ以上のアミノ酸残基、そのような接触残基のすぐ近傍の残基、またはｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１Ｒαがｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１に結合するＩＬ－２１Ｒα結合表面の立体配座に影響を及ぼすＩＬ－２１の他の場所の残基の置換を含む、配列番号２に由来する修飾アミノ酸配列を含む、ネイティブＩＬ－２１Ｒαへの結合が損なわれたｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１とを含む。

【0065】

いくつかの態様では、細胞はＴ細胞である。さらなる態様では、細胞はＣＡＲ Ｔ細胞である。直交サイトカインおよび直交受容体は、本明細書に記載の候補ｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１分子および候補ｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１Ｒα分子のいずれかであり得る。例えば、一態様では、ｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１Ｒαは、Ｍ７０Ｇ／Ｙ１２９ＦまたはＭ７０Ｇを含むか、それらから本質的になるか、またはそれらからなる、配列番号６に対して番号付けされたアミノ酸置換を含み、ｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１は、以下のうちの１つを含むか、それらから本質的になるか、またはそれらからなる、配列番号２に対して番号付けされたアミノ酸置換を含む：（１）Ｈ６Ｌ／Ｒ９Ｋ／Ｍ１０Ｌ／Ｐ７８Ｌ；（２）Ｈ６Ｌ／Ｒ９Ｋ／Ｍ１０Ｌ／Ｐ７８Ｌ／Ｋ７３Ｖ；（３）Ｈ６Ｌ／Ｒ９Ｋ／Ｍ１０Ｌ／Ｐ７８Ｌ／Ｋ７３Ｉ；（４）Ｈ６Ｌ／Ｒ９Ｋ／Ｍ１０Ｌ／Ｐ７８Ｌ／Ｋ７３Ｖ／Ｇ８４Ｅ；（５）Ｈ６Ｌ／Ｒ９Ｋ／Ｍ１０Ｌ／Ｐ７８Ｌ／Ｋ７３Ｉ／Ｇ８４Ｅ；（６）Ｈ６Ｌ／Ｒ９Ｋ／Ｍ１０Ｌ／Ｐ７８Ｌ／Ｋ７３Ｖ／Ｐ１０４Ａ；および（７）Ｈ６Ｌ／Ｒ９Ｋ／Ｍ１０Ｌ／Ｐ７８Ｌ／Ｋ７３Ｉ／Ｐ１０４Ａ。

【0066】

直交サイトカインおよび受容体の発現ベクター
別の態様は、本明細書に記載の候補直交ＩＬ－２１タンパク質（例えば、受容体またはサイトカイン）のいずれかをコードする核酸を含む発現ベクターを提供する。ｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１またはｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１Ｒαなどの直交タンパク質は、組換え法によって産生され得る。ｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１Ｒαは、操作される細胞に発現ベクター上で導入され得る。直交タンパク質をコードするＤＮＡは、操作プロセス中に設計された様々な供給源から得ることができる。

【0067】

アミノ酸配列バリアントは、タンパク質をコードする核酸コード配列に適切なヌクレオチド変化を導入することによって調製され得る。アミノ酸をコードする核酸コドンは、当業者に公知である。選択される特定のコドンは、使用される宿主細胞における発現を最適化するように選択され得る。アミノ酸バリアントは、本明細書に記載の残基の挿入、置換、および特定の欠失を表し得る。最終構築物が本明細書に定義される所望の生物学的活性を有することを条件として、挿入、置換および特定の欠失の任意の組み合わせが、最終構築物に到達するために行われ得る。いくつかの態様では、核酸は、本明細書に記載のｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１Ｒαをコードする。

【0068】

核酸は、別の核酸配列と機能的関係に置かれた場合、「動作可能に連結」される。例えば、シグナル配列のＤＮＡがポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現される場合、シグナル配列のＤＮＡはポリペプチドのＤＮＡに動作可能に連結され、プロモーターまたはエンハンサーが配列の転写に影響を及ぼす場合、プロモーターまたはエンハンサーはコード配列に動作可能に連結され、または、リボソーム結合部位が翻訳を促進するように配置されている場合、リボソーム結合部位はコード配列に動作可能に連結される。一般に、「動作可能に連結された」とは、連結されているＤＮＡ配列が連続していることを意味し、分泌リーダーの場合、連続しており、読み取り段階にあることを意味する。しかしながら、エンハンサーなどのいくつかの配列は、有効であるために連続している必要はない。

【0069】

ｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１またはｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１Ｒαをコードする核酸は、発現のために複製可能なベクターに挿入され得る。多くのこのようなベクターが利用可能である。ベクター成分は、一般に、限定されないが、複製起点、１つ以上のマーカー遺伝子、エンハンサー要素、プロモーターおよび転写終結配列のうちの１つ以上を含む。ベクターとしては、ウイルスベクター、プラスミドベクター、組み込みベクター、トランスポゾンなどが挙げられる。例えば、適切なトランスポゾン／トランスポザーゼベースのポリヌクレオチドベクター系は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第１０，０４１，０７７号に記載されている。

【0070】

ｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１またはｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１Ｒαは、修飾することなく、または異種ポリペプチド、例えば、成熟タンパク質またはポリペプチドのＮ末端に特異的切断部位を有するシグナル配列または他のポリペプチドとの融合ポリペプチドとして組換え産生され得る。一般に、シグナル配列は、ベクターの成分であってもよく、またはベクターに挿入されるコード配列の一部であってもよい。選択される異種シグナル配列は、宿主細胞によって認識され処理される（すなわち、シグナルペプチダーゼによって切断される）ものであり得る。哺乳動物細胞の発現では、ネイティブのシグナル配列が使用されてもよく、または同じもしくは関連種の分泌ポリペプチドからのシグナル配列、ならびにウイルス分泌リーダー、例えば単純ヘルペスｇＤシグナルなどの他の哺乳動物シグナル配列が適切であり得る。

【0071】

発現ベクターは、典型的には、選択マーカーとも呼ばれる選択遺伝子を含む。選択遺伝子は、選択培地中で増殖させた形質転換宿主細胞の生存または増殖に必要なタンパク質をコードする。選択遺伝子を含むベクターで形質転換されていない宿主細胞は、培地中で生存しない。典型的な選択遺伝子は、（ａ）抗生物質または他の毒素、例えばアンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサートもしくはテトラサイクリンに対する耐性を付与する、（ｂ）栄養要求性欠乏を補完する、または（ｃ）複合培地から入手できない重要な栄養素を供給するタンパク質をコードする。

【0072】

発現ベクターは、宿主生物によって認識され得、直交タンパク質コード配列に動作可能に連結され得るプロモーターを含み得る。プロモーターは、それらが動作可能に連結されている特定の核酸配列の転写および翻訳を制御する構造遺伝子の開始コドン（一般に約１００～１０００ｂｐ以内）の上流（５’）に位置する非翻訳配列であり得る。そのようなプロモーターは、典型的には、誘導性および構成性の２つのクラスに分類される。誘導性プロモーターは、培養条件のいくらかの変化、例えば栄養素の有無または温度の変化に応答して、ＤＮＡの制御下でＤＮＡからの転写レベルの増加を開始するプロモーターである。

【0073】

哺乳動物宿主細胞におけるベクターからの転写は、例えば、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス（アデノウイルス２など）、ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス（マウス幹細胞ウイルスなど）、Ｂ型肝炎ウイルスおよびシミアンウイルス４０（「ＳＶ４０」）などのウイルスのゲノムから、異種哺乳動物プロモーター、例えばアクチンプロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼ（「ＰＧＫ」）から、または免疫グロブリンプロモーターから、熱ショックプロモーターから得られるプロモーターによって制御され得るが、ただし、そのようなプロモーターは宿主細胞系と適合性である。ＳＶ４０の初期および後期プロモーターは、ＳＶ４０ウイルス複製起点も含むＳＶ４０制限断片として都合よく得られる。

【0074】

発現ベクターはまた、エンハンサー配列を含み得る。エンハンサーは、プロモーターに作用してその転写を増加させる、通常約１０～３００ｂｐのＤＮＡのシス作用要素である。エンハンサーは、比較的、配向および位置非依存性であり、イントロン内ならびにコード配列自体内の転写単位に対して５’および３’に見出されている。多くのエンハンサー配列が哺乳動物遺伝子から公知である（例えば、グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α－フェトプロテインおよびインスリン）。しかしながら、典型的には、真核細胞ウイルスからのエンハンサーを使用する。例としては、複製起点の後期側のＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーが挙げられる。エンハンサーは、コード配列に対して５’または３’の位置で発現ベクターにスプライシングされ得るが、好ましくはプロモーターからの部位５’に位置する。

【0075】

真核生物宿主細胞において使用される発現ベクターはまた、転写の終結およびｍＲＮＡの安定化に必要な配列を含む。そのような配列は、真核生物またはウイルスのＤＮＡまたはｃＤＮＡの５’および３’の非翻訳領域から一般に入手可能である。

【0076】

発現ベクターはまた、導入遺伝子（例えば、ｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１またはｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１Ｒαをコードする）の発現を小分子または他の刺激剤で制御する目的のために、誘導性調節要素から構成され得る。調節要素の例としては、限定されないが、テトラサイクリンまたはその誘導体（ドキシサイクリンなど）による調節に対して感受性にするテトラサイクリンオペレーターを含むプロモーターが挙げられる。プロモーターはまた、転写エフェクターおよび触媒的に死滅したＣａｓ９の融合物を使用して、ＣＲＩＳＰＲａ（クラスター化され規則的に間隔があいた短い回文配列反復の活性化）によって誘導的に調節され得る。そのようなプロモーターは、次に、（抗体ベースおよび／または化学的性質の）二量体化剤またはＮｏｔｃｈ受容体に基づく成分を含むものなどの他の制御系の下流にあり得る。

【0077】

操作された細胞
本発明の一態様は、ｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１Ｒαを発現するように操作された細胞を提供する。細胞は、本明細書に記載の任意の適切な発現ベクターを含むように遺伝子操作され得る。いくつかの態様では、発現ベクターは、直交受容体をコードするコード配列を含み、コード配列は、所望の細胞内で活性なプロモーターに動作可能に連結されている。様々なベクター、例えば、トランスポゾン、ウイルスベクター、プラスミドベクター、およびミニサークルベクターがこの目的のために使用されてもよく、これらは標的細胞ゲノムに組み込まれてもよく、またはエピソーム的に維持されてもよい。一態様では、発現ベクターは、トランスポザーゼ酵素によってゲノムに組み込まれ得る合成トランスポゾンである。トランスポゾン／トランスポザーゼ系の例としては、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙ、ＰｉｇｇｙＢａｃ、ＡＴＵＭ Ｂｉｏ製のＬｅａｐＩｎ（登録商標）およびその誘導体が挙げられる。

【0078】

操作された細胞は、インビトロで組換えタンパク質を調製するための宿主細胞であり得る。直交タンパク質の組換え発現に適した宿主細胞としては、原核生物、酵母、および高等真核細胞、例えば様々な哺乳動物宿主細胞株が挙げられる。

【0079】

いくつかの態様では、操作された細胞は、ｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１Ｒαの発現を超えてさらに修飾される。操作された細胞での使用に適した修飾は、当技術分野で公知であり、ＣＡＲ、Ｔ細胞受容体（「ＴＣＲ」）、または抗原提示細胞上の特異的抗原を認識する他の受容体もしくは受容体誘導体の発現を含む。

【0080】

いくつかの態様では、操作された細胞は、治療的使用が意図された細胞である。治療的な操作された細胞の例としては、幹細胞、例えば造血幹細胞、ナチュラルキラー（「ＮＫ」）細胞またはＴ細胞が挙げられる。いくつかの態様では、操作された細胞はＴ細胞である。「Ｔ細胞」という用語は、ＣＤ３および／またはＴ細胞抗原受容体の発現を特徴とし得る哺乳動物免疫エフェクター細胞を指し、この細胞はｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１Ｒαを発現するように操作され得る。いくつかの態様では、Ｔ細胞は、ナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞、活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞または活性化後ＣＤ８＋Ｔ細胞；細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔ細胞；ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞、活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞または活性化後ＣＤ４＋Ｔ細胞；ヘルパーＴ細胞、例えば、ＴＨ１、ＴＨ２、ＴＨ９、ＴＨ１１、ＴＨ２２およびＴＦＨ；調節性Ｔ細胞、例えばＴＲ１、天然ＴＲｅｇおよび誘導性ＴＲｅｇ；ならびにメモリーＴ細胞、例えば、セントラルメモリーＴ細胞、エフェクターメモリーＴ細胞、ＮＫＴ細胞およびγδ Ｔ細胞から選択される。

【0081】

ｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１は、ＡＣＴに対する補助剤として使用され得る。Ｔ細胞は、遺伝子（ｃＤＮＡ、ミニ遺伝子、または他の核酸構築物）トランスフェクション、形質導入または転位によってｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１Ｒαを発現するように操作され得る。ＡＣＴを受けている患者は、ｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１で処置（および／または前処置）され得、所望のＴ細胞の存在および応答を強化および維持するために必要に応じて繰り返し投与され得る。

【0082】

治療細胞はまた、ｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１を発現するように操作され得る。これは、ｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１Ｒαの異所性発現に適切な方法のいずれかを使用して達成され得る。ｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１は、ｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１Ｒαを発現する細胞と同じまたは異なる細胞で発現させることができ、自己分泌作用または傍分泌作用をそれぞれ可能にする。傍分泌構成の例は、ｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１を発現するＣＤ４＋Ｔ細胞および適合したｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１Ｒαを発現するＣＤ８＋Ｔ細胞であり得る。

【0083】

いくつかの態様では、ｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１は膜テザー形態で発現され得る。これは、それ自体がＣＤ４膜貫通ドメインに融合された、ＩｇＧ４ ＣＨ_２－ＣＨ_３部分のアミノ末端にサイトカインを融合することによって、天然ＩＬ－２１を用いて以前に達成されている。関連する戦略が、他のサイトカインを細胞の膜に繋ぎ止めるために使用されてきた。そのような膜テザリングは、サイトカインの拡散を制限し、その作用を膜結合サイトカインを発現する細胞のすぐ近傍に制限する。インビボでは、このアプローチを利用して、ｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１Ｒα発現細胞が特定のタイプの細胞および／または体内の位置に近接している場合にのみｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１に遭遇することを確実にすることができる。インビトロでは、このアプローチは、ある種の選択的分化プロトコル（例えば、膜結合ＩＬ－２１およびＣＤ１３７Ｌを発現するＫ５６２［または他の］フィーダー細胞の存在下での幹細胞からのＮＫ細胞の分化）を促進し得る。

【0084】

操作された細胞は、治療的使用、例えばヒトの処置に適した医薬組成物で提供され得る。そのような細胞を含む治療製剤は、水溶液の形態で、生理学的に許容される担体、賦形剤、または安定剤と共に投与するために凍結または調製することができる（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０））。細胞は、良好な医療行為と一致する様式で製剤化、用量化、および投与され得る。

【0085】

処置方法
本明細書に記載のｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１Ｒα分子の１つを発現するように操作されたＴ細胞などの細胞は、広範囲の状態を処置するために使用され得る。この治療における操作された特性は、有益なＴ細胞分化、疲弊に対する耐性、長期持続性に対する能力、既往応答、および病原性になったときに応答を停止することを可能にする内蔵安全性特徴を可能にし得る。

【0086】

本発明のｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１Ｒαの導入によってレシピエントまたはドナーからの細胞を操作し、操作された細胞をｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１と接触させることによってｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１Ｒαを刺激することによって、細胞応答を増強するための方法が提供される。主題の方法は、生物学的試料から単離され得るか、または前駆細胞源からインビトロで誘導され得る標的細胞、例えばＴ細胞、造血幹細胞などを得るステップを含み得る。細胞は、ｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１Ｒαをコードする配列を含む発現ベクターで形質導入またはトランスフェクトされてもよく、このステップは、任意の適切な培地中で実施されてもよい。

【0087】

いくつかの態様では、操作されたＴ細胞は、インビボでｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１と接触させることができ、すなわち、操作されたＴ細胞がレシピエントに移入され、有効量のｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１がレシピエントに注射され、それらのネイティブの環境、例えばリンパ節などにおいて操作されたＴ細胞と接触することを可能にする。他の態様では、接触はインビトロで実施される。そのようなインビトロの態様では、接触は、免疫グロブリンＦｃドメインなどの別のタンパク質部分への融合物を含むかまたは含まない可溶性ｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１を使用して達成され得る。さらなるそのようなインビトロの態様では、接触は、分泌されたｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１または膜テザーｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１を発現する他の細胞との遭遇によって達成され得る。

【0088】

別の態様は、ｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１Ｒαを発現する操作された細胞を対象に導入すること、およびそれを有効量のｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１と接触させることによって細胞を活性化することを含む、それを必要とする対象を処置するための方法を提供する。いくつかの態様では、細胞はＴ細胞であり、さらなる態様では、細胞はＣＡＲ－Ｔ細胞である。別の態様では、細胞は、ネイティブまたは修飾ＴＣＲを発現するＴ細胞である。別の態様では、細胞はＮＫ細胞である。別の態様では、細胞はマクロファージもしくは他の骨髄細胞または白血球である。

【0089】

いくつかの態様では、ｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１は、異種ポリペプチドとの融合タンパク質として送達される。適切な異種ポリペプチドは当技術分野で公知であり、血清アルブミン、ＩｇＧのＦｃ断片、一本鎖Ｆｃ抗体断片、ＡＢＤ０３５などを含む。Ｆｃ断片は、ホモ二量体の形成を防止するために、または少なくとも有意に制限するために、例えば、静電ステアリングまたは他の突然変異を用いて修飾することができる。

【0090】

別の態様は、ｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１Ｒαを発現する操作された細胞を対象に導入すること、およびｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１を発現する第２の操作された細胞を導入することを含む、それを必要とする対象を処置するための方法を提供する。いくつかの態様では、細胞はＴ細胞であり、さらなる態様では、細胞はＣＡＲ－Ｔ細胞である。

【0091】

「対象」は、任意の哺乳動物であり得、「患者」とも呼ばれ得る。哺乳動物対象の例としては、研究動物（例えば、マウスまたはラット）、家畜（例えば、牛、馬、豚）、ペット（例えば、犬、猫）およびヒトが挙げられる。いくつかの態様では、対象はヒトである。

【0092】

いくつかの態様では、処置されている対象は、がんを有すると診断されている。「がん」および「悪性腫瘍」は、同義語として使用され、細胞の制御されない異常な増殖、罹患細胞が局所的にまたは血流およびリンパ系を介して身体の他の部分に広がる能力（すなわち、転移する）、ならびにいくつかの特徴的な構造的および分子的特徴のいずれかを特徴とするいくつかの疾患のいずれかを指す。「がん細胞」は、多段階新生物進行の初期、中期または進行段階にある細胞を指す。新生物進行の初期、中期および進行段階の特徴は、顕微鏡法を使用して記載されている。新生物進行の３つの段階の各々におけるがん細胞は、一般に、転座、逆位、欠失、同腕染色体、一染色体性および過剰染色体を含む異常な核型を有する。がん細胞は、「過形成細胞」、すなわち悪性進行の初期段階の細胞、「異形成細胞」、すなわち新生物進行の中期段階の細胞、および「新生物細胞」、すなわち新生物進行の進行段階の細胞を含む。がんの例は、肉腫、乳がん、肺がん、脳がん、骨がん、肝臓がん、腎臓がん、結腸がんおよび前立腺がんである。いくつかの態様では、操作された細胞は、結腸がん、脳がん、乳がん、線維肉腫および扁平上皮癌からなる群から選択されるがんを処置するために使用される。いくつかの態様では、がんは、黒色腫、乳がん、結腸がん、肺がん、および卵巣がんからなる群から選択される。いくつかの態様では、処置されているがんは転移性がんである。

【0093】

がん処置の場合、処置方法は、がんを切除するステップをさらに含み得る。がんの切除は、凍結アブレーション、熱アブレーション、放射線療法、化学療法、高周波アブレーション、エレクトロポレーション、アルコールアブレーション、高密度焦点式超音波、光線力学療法、モノクローナル抗体の投与、および免疫毒素の投与からなる群から選択される方法を使用して達成することができる。

【0094】

いくつかの態様では、処置されている対象は感染症を有すると診断されている。本明細書で使用される場合、「感染」という用語は、感染因子による対象の１つ以上の細胞の感染を指す。感染因子は、限定されないが、細菌、ウイルス、原虫および真菌を含む。細胞内病原体が特に興味深い。感染性疾患は、感染因子によって引き起こされる障害である。いくつかの感染因子は、特定の条件下で認識可能な症候または疾患を引き起こさないが、変化した条件下で症候または疾患を引き起こす可能性がある。主題の方法は、限定されないが、ウイルス感染、例えばレトロウイルス、レンチウイルス、ヘパドナウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、およびヒトパピローマウイルス；細胞内細菌感染、例えば、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）、エーリキア（Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ）、リケッチア（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ）、ブルセラ（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）、レジオネラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）、フランシセラ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、コクシエラ（Ｃｏｘｉｅｌｌａ）、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、エルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）種およびヘリコバクターピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）；および細胞内原虫病原体、例えば、プラスモジウム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）種、トリパノソーマ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ）種、ジアルジア（Ｇｉａｒｄｉａ）種、トキソプラズマ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ）種およびリーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ）種を含む慢性病原体感染の処置に使用され得る。

【0095】

いくつかの態様では、処置されている対象は、自己免疫疾患を有すると診断されている。自己免疫疾患は、自己タンパク質、自己ポリペプチド、自己ペプチド、または他の自己分子を異常に標的とし、体内の器官、組織または細胞型の傷害および／または機能不全を引き起こすＴリンパ球およびＢリンパ球を特徴とする。自己免疫疾患としては、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、自己免疫性肝炎、インスリン依存性糖尿病などの疾患、および変形性関節症、アルツハイマー病、黄斑変性などの変性疾患が挙げられる。

【0096】

処置を行うために、対象の１つ以上の細胞が、ｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１と接触させられ得る。細胞がｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１とインビトロで接触させられる場合、ｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１は、ネイティブの細胞機構、例えば、アクセサリータンパク質、共受容体などを利用し得るｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１Ｒαからのシグナル伝達を活性化するのに十分な用量および期間で、操作された細胞に添加され得る。任意の適切な培地が使用され得る。このようにして活性化された細胞は、抗原特異性の決定、サイトカインプロファイリングなどに関する実験目的を含む任意の所望の目的のために、およびインビボ送達のために使用され得る。

【0097】

接触がインビボで実施される場合、ｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１Ｒαを発現する、有効量の操作された細胞が、ｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１の投与と組み合わせて、または投与前に、レシピエントに注入される。投与量および頻度は、薬剤、投与様式などに応じて変動し得る。投与量はまた、局所投与（例えば、鼻腔内、吸入など）、または全身投与（例えば、筋肉内、腹腔内、静脈内など）に関して、変動し得る。一般に、少なくとも約１０^４個の操作された細胞／ｋｇ、少なくとも約１０^５個の操作された細胞／ｋｇ、少なくとも約１０^６個の操作された細胞／ｋｇ、少なくとも約１０^７個の操作された細胞／ｋｇ、またはそれ以上が投与される。

【0098】

例
例１：ネイティブＩＬ－２１への結合が損なわれた候補Ｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１Ｒα分子の特定のための結合アッセイ
直接相互作用アッセイ（ＩＬ－２１ＲαがＩＬ－２１のネイティブ形態または変異体形態に結合する能力を定量化する）は、ＩＬ－２１結合活性が損なわれたＩＬ－２１Ｒαのバリアント（すなわち、候補直交バリアント）を特定するための細胞ベースアッセイの代替法を提供する。このようなアッセイを利用する実現可能性は、ネイティブ相互作用（ＩＬ－２１Ｒα：ＩＬ－２１）が旺盛である（ＫＤ約７０ｐＭ）という事実によって高められる。結合アッセイの多くの可能な形態のうち、ルシフェラーゼ融合タンパク質を含むものは、その単純さ、および中スループットまたは高スループット形式に適合される可能性のために魅力的である。

【0099】

ＩＬ－２１Ｒα：ＩＬ－２１結合アッセイの１つのバージョンは、受容体外部ドメインを表面に付着させること、コーティングされた表面をＩＬ－２１－ルシフェラーゼ融合タンパク質の溶液に浸すこと、その後、関連するルシフェラーゼ基質が添加されるときの発光に基づいて結合したＩＬ－２１を定量することを含む。あるいは、ＩＬ－２１は固定化してもよく、ＩＬ－２１Ｒα－ルシフェラーゼ融合タンパク質は溶液中で使用してもよい。

【0100】

結合アッセイのいずれの形態においても、固定化された受容体またはサイトカインの所望の配向は、Ｓｔｒｅｐｔａｃｔｉｎタンパク質に対する高親和性ペプチドリガンドであるＴｗｉｎ－Ｓｔｒｅｐ－Ｔａｇ ＩＩなどの親和性タグの使用によって達成することができる。カルボキシ末端Ｔｗｉｎ－Ｓｔｒｅｐ－Ｔａｇ ＩＩペプチドを有するＩＬ－２１Ｒα外部ドメインは、Ｓｔｒｅｐｔａｃｔｉｎタンパク質でプレコーティングされた９６ウェルプレートのウェルの表面に効率的かつ選択的に固定化することができる。このようにして、固定化されたＩＬ－２１Ｒαは、そのサイトカイン結合ドメインがプレート表面から遠位にあるように配向されるべきである。同様に、ＩＬ－２１もまた、アミノ末端またはカルボキシ末端Ｔｗｉｎ－Ｓｔｒｅｐ－Ｔａｇ ＩＩペプチドタグを有する場合、関連する様式で固定化することができる。

【0101】

アッセイは、プレート固定化ヒトＩＬ－２１Ｒα外部ドメイン（カルボキシ末端Ｔｗｉｎ－Ｓｔｒｅｐ－Ｔａｇ ＩＩを介して）および１６ＫＤ Ｔｕｒｂｏ－ルシフェラーゼポリペプチド（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）がヒトＩＬ－２１のカルボキシ末端に（グリシン－セリン含有ペプチドを介して）連結された融合タンパク質（配列番号５）（図３における「ＩＬ－２１－ＴＬｕｃ１６」）を使用して確立した。結合されたＩＬ－２１は、ＴｕｒｂｏＬｕｃ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｏｎｅ－Ｓｔｅｐ Ｇｌｏｗ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）および標準的なルミノメトリーを使用して検出した。このアッセイはまた、ＩＬ－２１のアミノ末端に融合したルシフェラーゼまたは代替形態のルシフェラーゼ（例えば、ＮａｎｏＬｕｃ；ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いて確立することができた。

【0102】

２０個の候補ｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１Ｒα分子を、ＩＬ－２１－ＴＬｕｃ１６に結合するそれらの能力について試験した。野生型ヒトＩＬ－２１Ｒα外部ドメイン（シグナルペプチドを欠く成熟形態）（Ｖ０（配列番号６））および表１に示す２０個の候補ｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１Ｒα分子（配列番号７～２５＆６３）（置換をヘッダーおよび配列内の下線で示す）を分泌タンパク質としてＨＥＫ ２９３細胞において発現させた。

【表1-1】

【表1-2】

【表1-3】

【表1-4】

【0103】

一過性トランスフェクト細胞からの清澄化された上清液を、Ｓｔｒｅｐｔａｃｔｉｎコーティングプレートからなる酵素結合免疫吸着測定法（「ＥＬＩＳＡ」）を用いてＩＬ－２１Ｒαの存在について試験し、上清液を希釈し、ヒトＩＬ－２１Ｒαに特異的なマウスモノクローナル抗体、マウスＩｇＧに特異的な西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート化ラット抗体、およびペルオキシダーゼの発色基質の組み合わせを使用して検出した。このＥＬＩＳＡは、候補ｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１Ｒα分子の各々を用いてＳｔｒｅｐｔａｃｔｉｎコーティングウェルの飽和を確実にするために必要な希釈を確立した。候補ｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１Ｒα飽和ウェルを、ＩＬ－２１－ＴＬｕｃ１６の溶液と４℃（またはいくつかの実験では室温）で１時間（またはいくつかの実験ではそれ以上）インキュベートした。ウェルを洗浄した後、ルシフェラーゼ基質（セレンテラジン）溶液を添加し、ルミノメトリーを行った。

【0104】

図３は、単一（準飽和）濃度のＩＬ－２１－ＴＬｕｃ１６を、２０個の候補ｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１Ｒα分子（配列番号７～２５＆６３）（これらはすべて、飽和濃度でウェルのＳｔｒｅｐｔａｃｔｉｎコーティング表面に結合していた）のパネルへの結合について試験した代表的なアッセイの結果を示す。候補ｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１Ｒα分子のうちの８個は、ＩＬ－２１－ＴＬｕｃ１６に結合する能力の低下を示した。反復実験（ＩＬ－２１－ＴＬｕｃ１６の滴定を含む）により、結果が確認された。

【0105】

ＩＬ－２１－ＴＬｕｃ１６（すなわち、ＲＶ２、ＲＶ６、ＲＶ７、ＲＶ１０、ＲＶ１３、ＲＶ１５、ＲＶ１８およびＲＶ１９）に対する損なわれた結合を示した８個の候補ＩＬ－２１Ｒα分子（「受容体バリアント」または「ＲＶ」）を、候補ｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１Ｒαに（シグナル伝達および免疫学的活性に関して）生産的に結合するが、ネイティブＩＬ－２１Ｒαには結合しないサイトカインの形態を単離するという最終的な目標を伴って、候補ｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１に結合するそれらの能力について試験することができる。

【0106】

８個の候補ｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１Ｒα分子に存在するアミノ酸置換の代替的な組み合わせを有するさらなる１３個の候補ｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１Ｒα分子を、ＩＬ－２１－ＴＬｕｃ１６に結合するそれらの能力について同様に試験した。表２に示す１３個の候補ｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１Ｒα分子（配列番号２６～３８）（置換をヘッダーおよび配列内の下線で示す）を、分泌タンパク質としてＨＥＫ ２９３細胞において発現させた。

【表2-1】

【表2-2】

【表2-3】

【0107】

図４Ａ～図４Ｅに示すように、候補ｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１Ｒα分子のうちの１１個が、ＩＬ－２１－ＴＬｕｃ１６に結合する能力の低下を示した（すなわち、ｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１Ｒα分子ＲＶ２３、ＲＶ２４およびＲＶ２８は、野生型受容体の結合と同等またはほぼ同等の結合を示したが、他のすべてのｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１Ｒα分子は、有意により損なわれた結合を示した）。

【0108】

例２：Ｂａ／Ｆ３細胞アッセイおよびＳＴＡＴ３応答性レポーター構築物を使用して明らかにされた候補Ｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１Ｒα分子によって媒介される減弱されたＩＬ－２１媒介シグナル伝達。
候補ｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１Ｒα候補がＩＬ－２１に結合する能力において損なわれた程度をさらに試験するために、例１および図３からの８個の候補をリンパ系細胞株、すなわちＢａ／Ｆ３細胞（マウスプレＢ細胞リンパ腫株）において発現させた。Ｂａ／Ｆ３細胞は、増殖についてサイトカインＩＬ－３に依存するが、最初にＩＬ－２１Ｒαの発現について陽性にされた場合、同様に、ＩＬ－２１に応答してロバストに増殖する。

【0109】

Ｂａ／Ｆ３細胞に、ＬｅａｐＩｎ Ｔｒａｎｓｐｏｓａｓｅ（登録商標）ｍＲＮＡおよび野生型または候補ｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１Ｒα（ＲＶ２：Ｄ７２Ｅ／Ｙ１２９Ｆ／Ｄ７３Ｅ；ＲＶ６：Ｍ７０Ｉ／Ｄ７３Ｅ／Ｑ３３Ｈ；ＲＶ７：Ｄ７２Ｅ／Ｌ９４Ｖ／Ｙ１９１Ｆ；ＲＶ１０：Ｄ７２Ｅ／Ｅ３８Ｄ／Ｍ１３０Ｌ；ＲＶ１３：Ｍ７０Ｇ／Ｙ１２９Ｆ；ＲＶ１５：Ｆ６９Ｌ／Ｍ７０Ｌ／Ｄ７３Ｉ；ＲＶ１８：Ｄ７２Ｋ／Ｄ７３Ｋ；ＲＶ１９：Ｅ３８Ｋ；および、その細胞質尾部のほとんどすべてを欠くＩＬ－２１Ｒαの形態であるΔｃｙｔ）をコードするトランスポゾンをエレクトロポレートした。トランスポゾンはまた、分泌されたシプリディナ・ノクティルカ（Ｃｙｐｒｉｄｉｎａ ｎｏｃｔｉｌｕｃａ）ルシフェラーゼをコードするＳＴＡＴ－３調節遺伝子、構成的に発現されたサイトゾルコメツキムシルシフェラーゼ、およびピューロマイシンＮ－アセチルトランスフェラーゼをコードする構成的に発現された遺伝子を保有していた。

【0110】

一例として、ＲＶ１３発現構築物を、ＡＴＵＭ（ｗｗｗ．ａｔｕｍ．ｂｉｏ）によるオリゴヌクレオチド依存性ＤＮＡ合成によって調製した。このプラスミドは１３Ｋｂを超えるサイズであり、最初にゲノムインスレーター配列（一方の側のヒトＤ４Ｚ４遺伝子座および他方の側のβ－グロビンをコードするニワトリ遺伝子座から）に、次いでトランスポゾン逆位末端反復配列に挟まれたＤＮＡ片内に４つの独立した遺伝子を含む。インスレーター配列は、発現を低減または多様化し得る位置効果（すなわち、ゲノムにおけるトランスポゾン組み込みの部位に依存する効果）からトランスポゾン内の遺伝子を保護することを意図している。逆位末端反復配列は、ゲノムＤＮＡへのトランスポゾンの組み込みを媒介するＡＴＵＭ専売のＬｅａｐＩｎ（登録商標）トランスポザーゼ酵素によって認識される。トランスポゾン内に存在する４つの遺伝子を表３に記載する（トランスポゾン内に発生する順序で）。遺伝子およびそれらを含むトランスポゾンは、ＡＴＵＭによって日常的に使用される構築物組み立て方法論に適合する標準的な分子生物学原理に従って設計された。野生型または他の候補ｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１Ｒα分子をコードするこのベクターのバリアントを、表３に列挙した第４の遺伝子に適切な変更を加えることによって生成した。

【表3】

【0111】

野生型ＩＬ－２１Ｒαまたは候補ｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１Ｒα分子のいずれかをコードするトランスポゾンベクターを、ＭａｘＣｙｔｅ ＡＴｘまたはＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｎｅｏｎ機器のいずれかを製造者の説明書に従って使用して、関連するＬｅａｐＩｎ（登録商標）トランスポザーゼをコードするインビトロ転写ｍＲＮＡと共にＢａ／Ｆ３細胞にコトランスフェクトした。ピューロマイシン選択（１μｇ／ｍｌ以上）をトランスフェクション後４８時間で課し、トランスフェクトされていない対照培養物中のすべての細胞が死滅した後、少なくとも１週間継続した。フローサイトメトリーを使用して、ピューロマイシン選択細胞がＩＬ－２１Ｒαの均一な発現を示したことを確認した。

【0112】

ＩＬ－２１応答をアッセイするために、Ｂａ／Ｆ３細胞を最初に、血清および外因性サイトカインを欠くＲＰＭＩ－１６４０培地中で２０～２４時間インキュベートした。洗浄後、ＩＬ－２１で（０．４％［ｖｏｌ／ｖｏｌ］血清の存在下で）さらに２０～２４時間、丸底９６ウェルプレート（約１００，０００細胞／ウェル）中様々な濃度のＩＬ－２１（または候補ｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１）で刺激した後、分泌ルシフェラーゼ（トランスポゾン中のＳＴＡＴ３－ｃＬｕｃ遺伝子からの）、細胞内ルシフェラーゼ（トランスポゾン中の構成的に発現させたＥＥＦ２－ｅＬｕｃ遺伝子からの）、またはＡＴＰ蓄積をアッセイした。分泌ルシフェラーゼアッセイを使用して、ＩＬ－２１がその受容体に関与するときに起こるように、細胞におけるＳＴＡＴ３依存性シグナル伝達を知らせた。他の２つのアッセイ（細胞質ｅＬｕｃまたはＡＴＰ蓄積をモニタリングする）を使用して、細胞数（すなわち、増殖）を知らせた。

【0113】

予想されるように、Ｂａ／Ｆ３細胞は、ＩＬ－３が提供されない場合、増殖することができなかった。野生型形態のＩＬ－２１Ｒαを発現する場合、それらはＩＬ－２１用量依存的増殖を示した（上記のＡＴＰまたはｅＬｕｃアッセイによる）。処理された培養物からの上清液中の（ＳＴＡＴ３調節レポーター遺伝子からの）シプリディナ（Ｃｙｐｒｉｄｉｎａ）ルシフェラーゼのＩＬ－２１用量依存的蓄積もあった（図５Ａ～図５Ｂ）。シプリディナ（Ｃｙｐｒｉｄｉｎａ）ルシフェラーゼの分泌はＩＬ－２１Ｒα細胞質ドメインに依存し（なぜなら、ＩＬ－２１Ｒα ［Δｃｙｔ］の尾部のない形態がＩＬ－２１に応答して増殖を誘導しなかったからである；図５Ａ）；細胞質ドメイン中のチロシン残基がフェニルアラニン残基で置き換えられた場合にも、分泌が有意に損なわれた（図示せず）。

【0114】

シプリディナ・ノクティルカ（Ｃｙｐｒｉｄｉｎａ ｎｏｃｔｉｌｕｃａ）ルシフェラーゼ活性は、関連するルシフェラーゼ基質（Ｖａｒｇｕｌｉｎ）を細胞からの上清液の試料に添加し、ルミノメーターを使用して発光を測定することによって容易に検出された。図５Ａおよび図５Ｂは、ウェルの各々からの２０μＬの上清液を、製造業者の推奨濃度でＶａｒｇｕｌｉｎを含有する５０μＬのＶＬＡＲ－２試薬緩衝液（Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ）と混合した後に発光（相対光量単位すなわちＲＬＵ）として検出されたルシフェラーゼ活性を示す。

【0115】

結果は、８個の候補ｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１Ｒα分子によって媒介される損なわれたＩＬ－２１依存性シグナル伝達に関して例１および図３に記載および示した結合アッセイの所見を確認した。

【0116】

例３：候補Ｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１分子のスクリーニング：候補Ｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１Ｒα分子または野生型ＩＬ－２１Ｒαを発現する細胞におけるＳＴＡＴ３依存性シグナル伝達応答についての試験
ＡＴＵＭ（ｗｗｗ．ａｔｕｍ．ｂｉｏ）で日常的に使用されている手順に従って、一過性トランスフェクトＨＥＫ－２９３細胞から野生型または候補ｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１分子を産生した。この目的のための発現ベクターは、最適化されたサイトメガロウイルス前初期遺伝子１プロモーターの下流にＩＬ－２１オープンリーディングフレームを保有していた。ネイティブのものに代えて、ヒトＩＬ－２遺伝子からのシグナルペプチドを使用した。検出、定量、固定化または精製のためのエピトープタグをＩＬ－２１コード配列のアミノ末端またはカルボキシ末端に融合した。１つの一連のベクター（表４に配列番号３９～６０として特定されるＩＬ－２１の形態をコードするものを含む）において、アミノ末端に融合された要素は、Ｔｗｉｎ－Ｓｔｒｅｐ－Ｔａｇとそれに続く３つのコピーのグリシン－グリシン－グリシン－グリシン－セリンリンカー部分であり、カルボキシ末端に融合された要素は、同じグリシン－グリシン－グリシン－グリシン－セリンリンカーの２つのコピーとそれに続くＮ－Ｍｙｃエピトープタグ（９Ｅ１０モノクローナル抗体によって認識される）を含んでいた。第２の一連のベクター（表４に配列番号６１～６２として特定されるＩＬ－２１の形態をコードするものを含む）は、カルボキシ末端のタグを特徴としなかったが、ＩＬ－２１のアミノ末端に以下の要素を有していた：Ｔｗｉｎ－Ｓｔｒｅｐ－Ｔａｇ、直後に続いてＮ－Ｍｙｃエピトープタグ、次いで３つのコピーのグリシン－グリシン－グリシン－グリシン－セリンリンカー部分。

【0117】

トランスフェクト細胞の培養物（１０ｍＬ）をおよそ５日間（生存率が約５０％未満に低下するまで）維持した。上清液を回収し、濾過し、等分した。上清液中に存在するＩＬ－２１の定量を、様々なエピトープタグに対する、またはＩＬ－２１部分に特異的なＥＬＩＳＡ（および場合によってはバイオレイヤー干渉法アッセイ）を使用して達成した。

【0118】

選択された候補ｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１分子（エピトープタグを含むがシグナルペプチドがない成熟タンパク質配列）を表４（配列番号３９～６２）に示す（置換をヘッダーおよび配列内の下線で示す）。

【表4-1】

【表4-2】

【表4-3】

【表4-4】

【表4-5】

【0119】

野生型ＩＬ－２１Ｒαまたは例１および図３からの８個の候補ｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１Ｒα分子を発現するＢａ／Ｆ３細胞を、候補ｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１分子ＣＶ１～ＣＶ２２（配列番号３９～５９）で刺激した。ｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１分子に対するＢａ／Ｆ３細胞のシグナル伝達応答を、ＳＴＡＴ３－ルシフェラーゼアッセイを使用して上記のようにモニタリングした。

【0120】

Ｂａ／Ｆ３細胞を、４つの濃度（１００、５０、２５および１２．５ｎｇ／ｍＬ）の示された候補ｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１分子（図６Ａ～図６Ｊ：Ｒ５Ｑ、Ｒ５Ｄ、Ｒ５Ｅ、Ｒ５Ｋ、Ｒ５Ｎ、Ｉ８Ｅ、Ｒ９Ｅ、Ｒ９Ｄ、Ｒ９Ｋ、Ｒ９Ｎ、Ｒ９Ｑを含む候補ｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１分子および野生型ＩＬ－２１；図６Ｋ～図６Ｔ：Ｑ１２Ｖ、Ｌ１３Ｄ、Ｋ７３Ｖ、Ｋ７３Ｄ、Ｋ７５Ｄ、Ｒ７６Ｅ、Ｒ７６Ｎ、Ｒ７６Ａ、Ｒ５Ｑ／Ｒ７６Ｅ、Ｒ５Ｑ／Ｒ７６Ａを含む候補ｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１分子および野生型ＩＬ－２１）に曝露した。Ｂａ／Ｆ３細胞は、発現したｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１Ｒα分子の形態が異なっていた（ＲＶ２：Ｄ７２Ｅ／Ｙ１２９Ｆ／Ｄ７３Ｅ；ＲＶ６：Ｍ７０Ｉ／Ｄ７３Ｅ／Ｑ３３Ｈ；ＲＶ７：Ｄ７２Ｅ／Ｌ９４Ｖ／Ｙ１９１Ｆ；ＲＶ１０：Ｄ７２Ｅ／Ｅ３８Ｄ／Ｍ１３０Ｌ；ＲＶ１３：Ｍ７０Ｇ／Ｙ１２９Ｆ；ＲＶ１５：Ｆ６９Ｌ／Ｍ７０Ｌ／Ｄ７３Ｉ；ＲＶ１８：Ｄ７２Ｋ／Ｄ７３Ｋ；ＲＶ１９：Ｅ３８Ｋ；および野生型ＩＬ－２１Ｒα）。細胞を無血清培地に２４時間置いた後、丸底９６ウェルプレート中の候補ｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１分子（ウェルあたり約１００，０００細胞）と一晩（約２０時間）インキュベートした。上記のように、ＷＴ分子および候補ｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１Ｒα分子の発現を付与するトランスポゾンは、分泌シプリディナ・ノクティルカ（Ｃｙｐｒｉｄｉｎａ ｎｏｃｔｉｌｕｃａ）ルシフェラーゼをコードするＳＴＡＴ３調節遺伝子も保有していた。図６Ａ～図６Ｔは、ウェルの各々からの２０μＬの上清液を、製造業者の推奨濃度でシプリディナ・ノクティルカ（Ｃｙｐｒｉｄｉｎａ ｎｏｃｔｉｌｕｃａ）ルシフェラーゼ基質（Ｖａｒｇｕｌｉｎ）を含有する５０μＬのＶＬＡＲ－２試薬緩衝液（Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ）と混合した後に発光（相対光量単位）として検出されたこのルシフェラーゼの活性を示す。

【0121】

図６Ａ～図６Ｔに示すように、ｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１Ｒα分子を発現する以下の細胞は、ｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１分子に対する測定可能な応答を行った：

【表5】

【0122】

ＩＬ－２１Ｒα（野生型受容体）を発現する細胞は、大部分のバリアントサイトカインに対して測定可能な応答を行ったが、重要なことに、（４つの比較的高濃度のバリアントサイトカインのみを特徴とする）実験の設計は、野生型ＩＬ－２１と比較してそれらのシグナル伝達活性の程度を定量する可能性を排除した。

【0123】

図６Ａ～図６Ｔおよび表４に表される集合から選択された候補ｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１分子（すなわち、Ｒ５Ｋ（ＣＶ４）、Ｑ１２Ｖ（ＣＶ１２）、Ｒ７６Ａ（ＣＶ１９）およびＫ７３Ｖ（ＣＶ１４））を、野生型ＩＬ－２１Ｒαまたは候補ｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１Ｒα分子ＲＶ６、ＲＶ１０、ＲＶ１３またはＲＶ１５（すなわち、それぞれＭ７０Ｉ／Ｄ７３Ｅ／Ｑ３３Ｈ、Ｄ７２Ｅ／Ｅ３８Ｄ／Ｍ１３０Ｌ、Ｍ７０Ｇ／Ｙ１２９Ｆ、またはＦ６９Ｌ／Ｍ７０Ｌ／Ｄ７３Ｉ）を発現するＢａ／Ｆ３細胞を用いて再試験した。この実験の結果を図７Ａ～図７Ｄに示す。予想されるように、野生型ＩＬ－２１に曝露された場合、候補ｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１Ｒα分子を発現する細胞は、野生型ＩＬ－２１Ｒαを発現する細胞と比較して、シグナル伝達応答を減少させた（各グラフにおいて塗りつぶした記号を有する実線）。さらに、図６Ａ～図６Ｔにおける結果によって予測されるように、３つの場合（候補ｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１Ｒα分子ＲＶ６、ＲＶ１９またはＲＶ１３を発現する細胞）において、細胞は、候補ｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１分子（それぞれＣＶ１２、ＣＶ１９またはＣＶ１４）に曝露された場合、野生型ＩＬ－２１よりも強い応答を行った（図７Ａ、図７Ｃおよび図７Ｄにおいてそれぞれ白抜き菱形記号と黒塗り菱形記号）。４個のすべての候補ｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１分子は、野生型ＩＬ－２１Ｒαを介して応答を引き起こすそれらの能力において様々な程度まで損なわれており、候補ｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１分子ＣＶ１９は、この点で最も深刻に損なわれていた（図７Ｃにおける白丸対黒丸記号）。

【0124】

これらの実験の結果により、野生型ＩＬ－２１Ｒαを介してシグナル伝達する能力を損なうことに関連するＩＬ－２１置換が、場合によっては、特異的候補ｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１Ｒα分子を介してシグナル伝達を誘導する能力が低レベルであると特定した。

【0125】

ＩＬ－２１のＩｎｆｏｌｏｇバリアントを、Ｇｏｖｉｎｄａｒａｊａｎ Ｓ，Ｍａｎｎｅｒｖｉｋ Ｂ，Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ ＪＡ，ｅｔ ａｌ．Ｍａｐｐｉｎｇ ｏｆ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ ｃｏｎｆｅｒｒｉｎｇ ｈｅｒｂｉｃｉｄｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｉｎ ｗｈｅａｔ ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ．ＡＣＳ Ｓｙｎｔｈ Ｂｉｏｌ．２０１５；４（３）：２２１－２２７．ｄｏｉ：１０．１０２１／ｓｂ５００２４２ｘおよびＭｕｓｄａｌ Ｙ，Ｇｏｖｉｎｄａｒａｊａｎ Ｓ，Ｍａｎｎｅｒｖｉｋ Ｂ．Ｅｘｐｌｏｒｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ－ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｓｐａｃｅ ｏｆ ａ ｐｏｐｌａｒ ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｕｓｉｎｇ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ－ｒｉｃｈ ｇｅｎｅ ｖａｒｉａｎｔｓ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ Ｄｅｓ Ｓｅｌ．２０１７；３０（８）：５４３－５４９．ｄｏｉ：１０．１０９３／ｐｒｏｔｅｉｎ／ｇｚｘ０４５に記載の原理に従って生成した。記載のように、ＩＬ－２１のこれらのＩｎｆｏｌｏｇバリアントを、野生型ＩＬ－２１Ｒα分子または候補ｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１Ｒα分子を発現するＢａ／Ｆ３細胞においてシグナル伝達を誘導するそれらの能力についてスクリーニングした。１つのそのようなスクリーニング実験からの代表的なデータを図８Ａ～図８Ｃに提供する。図８Ａ～図８Ｃに示す実験結果は、９６個のサイトカインの分析に由来し、そのうちの１つは、野生型形態のＩＬ－２１を含み、もう１つは、陰性対照バリアント（２つの無効化置換［Ｒ５Ｑ／Ｒ７６Ａ］を有するＣＶ２２；配列番号５９）を含み、９４個のＩｎｆｏｌｏｇバリアントは、その各々が候補ｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１分子であった。図８Ａは、サイトカイン集合に曝露された野生型ＩＬ－２１Ｒαを発現する細胞において誘発されたＳＴＡＴ３応答を示し、一方、図８Ｂおよび図８Ｃは、候補ｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１Ｒα分子ＲＶ１３およびＲＶ６をそれぞれ発現する細胞によって行われた応答を示す。ＲＶ１３は、アミノ酸置換Ｍ７０ＧおよびＹ１２９Ｆ（配列番号１９）から構成され、ＲＶ６は、アミノ酸置換Ｍ７０Ｉ、Ｄ７３ＥおよびＱ３３Ｈ（配列番号１２）から構成される。３つの図における強調された曲線は、５つの選択されたサイトカイン、すなわち、野生型ＩＬ－２１、ＣＶ２２、ＣＶ２０４（配列番号６０、Ｈ６Ｌ／Ｍ１０Ｌ／Ｋ７３Ｖ／Ｐ７８Ｌ／Ｐ１０４Ａから構成される）、ＣＶ３７４（配列番号６１、Ｈ６Ｌ／Ｒ９Ｋ／Ｍ１０Ｌ／Ｋ７３Ｖ／Ｐ７８Ｌ／Ｇ８４Ｅから構成される）およびＣＶ３８８（配列番号６２、Ｈ６Ｌ／Ｒ９Ｋ／Ｍ１０Ｌ／Ｋ７３Ｉ／Ｐ７８Ｌ／Ｐ１０４Ａから構成される）に対する３種類の細胞によって行われた応答を示す。

【0126】

続いて、強調されたサイトカインを、独立した同様の設計に焦点を合わせた実験において再試験した（野生型ＩＬ－２１Ｒαを発現するＢａ／Ｆ３細胞（図９Ａ）または候補ｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１Ｒα ＲＶ１３（図９Ｂ）を含む）。スクリーニング実験（図８Ａ～図８Ｃ）と同様に、ＣＶ２２、すなわち陰性対照サイトカインは、いずれの形態のＩＬ－２１Ｒαを発現する細胞においてもシグナル伝達応答を誘発することができなかった。対照的に、野生型ＩＬ－２１は、野生型形態のＩＬ－２１Ｒαを発現する細胞では強い応答を誘導したが、ＲＶ１３発現細胞でははるかに弱い応答を誘導した。ＣＶ２０４は、野生型ＩＬ－２１Ｒαを発現する細胞（図８Ａおよび図９Ａ）または候補ｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１Ｒα分子のいずれかを発現する細胞（図８Ｂ、図８Ｃおよび図９Ｂ）において応答を誘発した。

【0127】

際立ったことに、ＣＶ３７４およびＣＶ３８８は、野生型ＩＬ－２１Ｒαを発現する細胞においてシグナル伝達を誘導するそれらの能力が有意に損なわれたが（図８Ａおよび図９Ａ）、ＣＶ２０４と同様に、ＲＶ１３を発現する細胞では良好な活性を示した（図８Ｂおよび図９Ｂ）。したがって、このＢａ／Ｆ３アッセイでは、ｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１分子ＣＶ３７４およびＣＶ３８８は、ネイティブＩＬ－２１に対して直交機能性を有するサイトカインから予想される種類のシグナル伝達選択性を示した。

【0128】

候補ｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１Ｒα ＲＶ１３（配列番号１９）は、野生型ＩＬ－２１Ｒαと比較して２つの置換、すなわちＭ７０ＧおよびＹ１２９Ｆを有するが、候補ｏｒｔｈｏ－ＩＬ－２１Ｒα ＲＶ２２（配列番号２７）はＭ７０Ｇのみを有する。これらの２つのバリアント受容体は、ネイティブＩＬ－２１を結合するそれらの能力が同等に損なわれているようである（図４Ｂ）。これらはまた、図９Ａおよび図９Ｂにおいて使用されるＩＬ－２１分子の集合に対する同様の反応性パターンを説明した。具体的には、ＲＶ１３（図１０Ｂ）と同様に、ＲＶ２２は、野生型ＩＬ－２１（および陰性対照分子ＣＶ２２）に対する有意に損なわれたシグナル伝達応答を媒介したが、ＣＶ２０４、ＣＶ３７４およびＣＶ３８８に対して良好な応答を付与した（図１０Ｃ）。図９Ａのように、ＣＶ３７４およびＣＶ３８８の両方が、野生型ＩＬ－２１Ｒαを発現する細胞では損なわれた応答を示したが、ＣＶ２０４は、野生型ＩＬ－２１と同様に挙動した（図１０Ａ）。これらの結果は、ＲＶ２２がＲＶ１３と交換可能であり得ることも示しながら、図９Ａおよび図９Ｂのデータから得られた重要な観察結果を再現する。ＲＶ２２はＲＶ１３よりも１つ少ない置換を有するので、ＲＶ２２は治療目的に好ましいものであり得る。

【0129】

ほとんどの状況において、インビトロアッセイは、インビボでの治療の効果の非常に限られた予測値を有するのみである：多くの治療標的が複数の細胞型で発現されるか（多くの場合、インビボでの応答に相反する効果を有する）、または所与の標的の治療効果が他の補助細胞に依存する。そのような状況では、本質的に極度に単純化されたインビトロモデルは、インビボでのはるかに複雑な状況の特に良好な代理物ではない。これは本出願には当てはまらない：標的受容体は合成であり、そうするように特異的に操作された細胞でのみ発現される。直交サイトカイン－受容体系の特異性を考えると、これは複雑さを有意に低減し、インビトロアッセイにより良好な予測値を与える。

【0130】

本明細書で引用されるすべての特許、特許出願、および刊行物、ならびに電子的に利用可能な資料の完全な開示は、参照により組み込まれる。上記の詳細な説明および例は、理解を明確にするためにのみ与えられている。不必要な制限がそこから理解されるべきではない。化合物が有効である可能な機構を記載する理論が提示され得るが、本発明者らは本明細書に記載の理論に拘束されない。本発明は、図示および記載された正確な詳細に限定されず、当業者に明らかな変形例は、特許請求の範囲によって定義される本発明内に含まれる。

【配列表フリーテキスト】

【0131】

配列表１～６３ ＜２２３＞合成

【図1】

【図2】

【図3】

【図4A】

【図4B】

【図4C】

【図4D】

【図4E】

【図5A】

【図5B】

【図6A】

【図6B】

【図6C】

【図6D】

【図6E】

【図6F】

【図6G】

【図6H】

【図6I】

【図6J】

【図6K】

【図6L】

【図6M】

【図6N】

【図6O】

【図6P】

【図6Q】

【図6R】

【図6S】

【図6T】

【図7A】

【図7B】

【図7C】

【図7D】

【図8A】

【図8B】

【図8C】

【図9A】

【図9B】

【図10A】

【図10B】

【図10C】

【配列表】

2023549293000001.app

【国際調査報告】