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▶ ザ・トラスティーズ・オブ・コロンビア・ユニバーシティ・イン・ザ・シティ・オブ・ニューヨークの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-11-24
(54)【発明の名称】マルチプレックスエピゲノム編集
(51)【国際特許分類】
C12N 15/09 20060101AFI20231116BHJP
C12N 15/55 20060101ALI20231116BHJP
C12N 15/62 20060101ALI20231116BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20231116BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20231116BHJP
C12N 15/867 20060101ALI20231116BHJP
A61K 35/30 20150101ALI20231116BHJP
A61P 25/00 20060101ALI20231116BHJP
A61P 3/00 20060101ALI20231116BHJP
A61P 13/12 20060101ALI20231116BHJP
A61P 27/16 20060101ALI20231116BHJP
A61P 27/02 20060101ALI20231116BHJP
A61P 17/00 20060101ALI20231116BHJP
A61P 9/00 20060101ALI20231116BHJP
A61P 21/00 20060101ALI20231116BHJP
A61P 7/00 20060101ALI20231116BHJP
A61P 25/08 20060101ALI20231116BHJP
A61K 35/545 20150101ALN20231116BHJP
【ＦＩ】
C12N15/09 100
C12N15/55 ZNA
C12N15/62 Z
C12N5/10
C12N15/63 Z
C12N15/867 Z
A61K35/30
A61P25/00
A61P3/00
A61P13/12
A61P27/16
A61P27/02
A61P17/00
A61P9/00
A61P21/00
A61P7/00
A61P25/08
A61K35/545
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023528045
(86)(22)【出願日】2021-11-11
(85)【翻訳文提出日】2023-07-06
(86)【国際出願番号】 US2021058938
(87)【国際公開番号】W WO2022103935
(87)【国際公開日】2022-05-19
(31)【優先権主張番号】63/174,297
(32)【優先日】2021-04-13
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/112,331
(32)【優先日】2020-11-11
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
２．ＴＲＩＴＯＮ
(71)【出願人】
【識別番号】306018457
【氏名又は名称】ザ・トラスティーズ・オブ・コロンビア・ユニバーシティ・イン・ザ・シティ・オブ・ニューヨーク
(74)【代理人】
【識別番号】100114775
【弁理士】
【氏名又は名称】高岡 亮一
(74)【代理人】
【識別番号】100121511
【弁理士】
【氏名又は名称】小田 直
(74)【代理人】
【識別番号】100202751
【弁理士】
【氏名又は名称】岩堀 明代
(74)【代理人】
【識別番号】100208580
【弁理士】
【氏名又は名称】三好 玲奈
(74)【代理人】
【識別番号】100191086
【弁理士】
【氏名又は名称】高橋 香元
(72)【発明者】
【氏名】リウ，エックス．，ショーン
【テーマコード（参考）】
4B065
4C087
【Ｆターム（参考）】
4B065AA93X
4B065AB01
4B065BA02
4B065CA44
4C087AA01
4C087AA02
4C087BB64
4C087NA14
4C087ZA02
4C087ZA06
4C087ZA33
4C087ZA34
4C087ZA36
4C087ZA51
4C087ZA81
4C087ZA89
4C087ZA94
4C087ZC21
(57)【要約】
本開示は、細胞のエピゲノムを改変するためのシステム及び方法を提供する。
【選択図】図１
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
システムであって、（ａ）デオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）デッドＣｐｆ１（ｄＣｐｆ１）及びエフェクタードメインを含む融合タンパク質をコードする第１のポリヌクレオチド配列であって、前記ｄＣｐｆ１が（ｉ）次の変異：Ｄ９０８Ａ、Ｅ９９３Ａ、Ｒ１２２６Ａ、及びＤ１２６３Ａのうちの１つ以上、または（ｉｉ）次の変異：Ｄ８３３Ａを含むＣｐｆ１である、前記第１のポリヌクレオチド配列と、
（ｂ）１つ以上の標的配列にハイブリダイズする１つ以上のガイド配列をコードする第２のポリヌクレオチド配列と、を含む、前記システム。
【請求項2】
前記１つ以上のガイド配列が、１つ以上のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）分子、１つ以上のシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）分子、１つ以上のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子、またはそれらの組み合わせである、請求項１に記載のシステム。
【請求項3】
前記第１のポリヌクレオチド配列及び前記第２のポリヌクレオチド配列が単一のベクター上にある、請求項１に記載のシステム。
【請求項4】
前記第１のポリヌクレオチド配列及び前記第２のポリヌクレオチド配列が異なるベクター上にある、請求項１に記載のシステム。
【請求項5】
前記第２のポリヌクレオチド配列が、２つ以上の標的配列にハイブリダイズする２つ以上のｃｒＲＮＡ分子をコードする、請求項１に記載のシステム。
【請求項6】
前記ｄＣｐｆ１がリボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）活性を有する、請求項１に記載のシステム。
【請求項7】
前記エフェクタードメインがＴＥＴ２、Ｄｎｍｔ３ｂまたはＣＴＣＦである、請求項１に記載のシステム。
【請求項8】
前記エフェクタードメインが、エピゲノムを改変する活性を有する、請求項１に記載のシステム。
【請求項9】
前記エフェクタードメインがヒストンサブユニットを修飾する酵素である、請求項１に記載のシステム。
【請求項10】
前記エフェクタードメインが、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ（ＨＡＴ）、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）、ヒストンメチルトランスフェラーゼ（ＨＭＴ）、またはヒストンデメチラーゼである、請求項１に記載のシステム。
【請求項11】
前記ＨＡＴがｐ３００である、請求項１０に記載のシステム。
【請求項12】
前記エフェクタードメインが、ＤＮＡのメチル化状態を改変する酵素である、請求項１に記載のシステム。
【請求項13】
前記エフェクタードメインが、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＤＮＭＴ）または１０－１１転座（ＴＥＴ）メチルシトシンジオキシゲナーゼタンパク質である、請求項１に記載のシステム。
【請求項14】
前記ＤＮＭＴタンパク質がＤｎｍｔ３ｂである、請求項１３に記載のシステム。
【請求項15】
前記ＴＥＴタンパク質がＴｅｔ２である、請求項１３に記載のシステム。
【請求項16】
前記エフェクタードメインがＣＴＣＦである、請求項１に記載のシステム。
【請求項17】
前記ＣＴＣＦが野生型ＣＴＣＦまたはＤＮＡ結合変異体ＣＴＣＦである、請求項１６に記載のシステム。
【請求項18】
前記ＤＮＡ結合変異体ＣＴＣＦが、次の変異：Ｋ３６５Ａ、Ｒ３６８Ａ、Ｒ３９６Ａ、及びＱ４１８Ａのうちの１つ以上を含む、請求項１７に記載のシステム。
【請求項19】
前記エフェクタードメインが転写活性化ドメインである、請求項１に記載のシステム。
【請求項20】
前記転写活性化ドメインがＶＰ６４またはＮＦ－κＢ ｐ６５に由来する、請求項１９に記載のシステム。
【請求項21】
前記エフェクタードメインが転写サイレンサーまたは転写抑制ドメインである、請求項１に記載のシステム。
【請求項22】
前記転写抑制ドメインが、クルッペル関連ボックス（ＫＲＡＢ）ドメイン、ＥＲＦリプレッサードメイン（ＥＲＤ）、またはｍＳｉｎ３Ａ相互作用ドメイン（ＳＩＤ）である、請求項２１に記載のシステム。
【請求項23】
前記転写サイレンサーがヘテロクロマチンタンパク質１（ＨＰ１）、またはメチルＣｐＧ結合タンパク質２（ＭｅＣＰ２）である、請求項２１に記載のシステム。
【請求項24】
前記Ｃｐｆ１が、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒａｃｈｉｏｐｈｉｌｕｍ、Ｐａｒｃｕｂａｃｔｅｒｉａ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐｅｒｅｇｒｉｎｉｂａｃｔｅｒｉａ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｍａｃａｃａｅ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｃｒｅｖｉｏｒｉｃａｎｉｓ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｄｉｓｉｅｎｓ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｂｏｖｏｃｕｌｉ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｎａｄａｉ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ（ＭＡ２０２０）、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ ｍｅｔｈａｎｏｐｌａｓｍａ ｔｅｒｍｉｔｕｍ、またはＥｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｌｉｇｅｎｓ由来である、請求項１に記載のシステム。
【請求項25】
請求項１に記載のシステムを含む組成物。
【請求項26】
請求項１に記載のシステムを含む細胞。
【請求項27】
請求項１に記載のシステムを含む１つ以上のベクター。
【請求項28】
前記１つ以上のベクターが組換えレンチウイルスベクターを含む、請求項２７に記載の１つ以上のベクター。
【請求項29】
細胞のエピゲノムを改変する方法であって、前記方法が、前記細胞を請求項１に記載のシステムと接触させることを含む、前記方法。
【請求項30】
細胞のエピゲノムを改変する方法であって、前記方法が、前記細胞を、（ａ）デオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）デッドＣｐｆ１（ｄＣｐｆ１）及びエフェクタードメインを含む融合タンパク質をコードする第１のポリヌクレオチド配列であって、前記ｄＣｐｆ１が（ｉ）次の変異：Ｄ９０８Ａ、Ｅ９９３Ａ、Ｒ１２２６Ａ、及びＤ１２６３Ａのうちの１つ以上、または（ｉｉ）次の変異：Ｄ８３３Ａを含む、前記第１のポリヌクレオチド配列と、
（ｂ）１つ以上の標的配列にハイブリダイズする１つ以上のガイド配列をコードする第２のポリヌクレオチド配列と、を含むシステムと接触させることを含む、前記方法。
【請求項31】
前記第１のポリヌクレオチド配列及び前記第２のポリヌクレオチド配列が単一のベクター上にある、請求項３０に記載の方法。
【請求項32】
患者の疾患を治療する方法であって、（ａ）デオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）デッドＣｐｆ１（ｄＣｐｆ１）及びエフェクタードメインを含む融合タンパク質をコードする第１のポリヌクレオチド配列であって、前記ｄＣｐｆ１が（ｉ）次の変異：Ｄ９０８Ａ、Ｅ９９３Ａ、Ｒ１２２６Ａ、及びＤ１２６３Ａのうちの１つ以上、または（ｉｉ）次の変異：Ｄ８３３Ａを含むＣｐｆ１である、前記第１のポリヌクレオチド配列と、
（ｂ）１つ以上の標的配列にハイブリダイズする１つ以上のガイド配列をコードする第２のポリヌクレオチド配列と、を含むシステムを前記患者に投与することを含む方法。
【請求項33】
前記第１のポリヌクレオチド配列及び前記第２のポリヌクレオチド配列が単一のベクター上にある、請求項３２に記載の方法。
【請求項34】
前記１つ以上の標的配列が、ＭＥＣＰ２、ＰＨＥＸ、ＣＯＬ４Ａ５、ＣＯＬ４Ａ３、ＣＯＬ４Ａ１、ＩＫＢＫＧ、ＰＯＲＣＮ、ＤＭＤ／ＤＹＳ、ＲＰＳ６ＫＡ３、ＬＡＭＰ２、ＮＳＤＨＬ、ＰＤＨＡ１、ＨＤＡＣ８、ＳＭＣ１Ａ、ＣＤＫＬ５、ＯＦＤ１、ＷＤＲ４５、ＫＤＭ６Ａ、ＣＡＳＫ、ＦＩＮＡ、ＡＬＡＳ２、ＨＮＲＮＰＨ２、ＭＳＬ３、及びＩＱＳＥＣ２からなる群から選択される１つ以上の遺伝子内にある、請求項３２に記載の方法。
【請求項35】
１つ以上の標的配列が、表１または表２から選択される１つ以上の遺伝子内にある、請求項３２に記載の方法。
【請求項36】
前記疾患が、Ｘ連鎖病である、請求項３２に記載の方法。
【請求項37】
前記Ｘ連鎖病が表１から選択される、請求項３６に記載の方法。
【請求項38】
前記疾患が、インプリンティング関連疾患である、請求項３２に記載の方法。
【請求項39】
前記細胞が誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）またはヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）である、請求項３０に記載の方法。
【請求項40】
前記ｉＰＳＣが対象の線維芽細胞に由来する、請求項３９に記載の方法。
【請求項41】
前記ｉＰＳＣを培養して、ニューロンに分化させることをさらに含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項42】
前記ニューロンを対象に投与することをさらに含む、請求項４１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年１１月１１日出願の米国仮出願第６３／１１２，３３１号及び２０２１年４月１３日出願の米国仮出願第６３／１７４，２９７号の優先権を主張するものであり、これらはそれぞれ、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０２０年１１月１１日出願の米国仮出願第６３／１１２，３３１号及び２０２１年４月１３日出願の米国仮出願第６３／１７４，２９７号の優先権を主張するものであり、これらはそれぞれ、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【0002】
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出され、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる配列表を含む。２０２１年１１月１１日に作成された上記ＡＳＣＩＩコピーは、０１００１－００９１１３－ＷＯ０＿ＳＬ．ｔｘｔという名称であり、３３キロバイトのサイズである。
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出され、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる配列表を含む。２０２１年１１月１１日に作成された上記ＡＳＣＩＩコピーは、０１００１－００９１１３－ＷＯ０＿ＳＬ．ｔｘｔという名称であり、３３キロバイトのサイズである。
【0003】
本開示は、細胞のエピゲノムを改変するためのシステム及び方法に関する。
【背景技術】
【0004】
伝統的に、エピジェネティクスは、細胞の増殖及び発生中にＤＮＡ配列を変更しない場合の遺伝子発現の遺伝的変化の研究を指していた。この定義は、酵母などの単細胞生物からヒトのような多細胞生物で観察されるさまざまなエピジェネティックな表現型の原因となる、ＤＮＡメチル化、ヒストン修飾、非コードＲＮＡ、及び３Ｄクロマチン構造を含むがこれらに限定されない分子メカニズムの理解が進むにつれて急速に進化している（Ｄｅｉｃｈｍａｎｎ，Ｕ．（２０１６）Ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃｓ：ｔｈｅ ｏｒｉｇｉｎｓ ａｎｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｆａｓｈｉｏｎａｂｌｅ ｔｏｐｉｃ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．４１６，２４９－２５４）。エピジェネティックなメカニズムにより、ゲノムが発生シグナルと環境シグナルの両方を統合できるようになることが提案された（Ｊａｅｎｉｓｃｈ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：ｈｏｗ ｔｈｅ ｇｅｎｏｍｅ ｉｎｔｅｇｒａｔｅｓ ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ ａｎｄ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ ｓｉｇｎａｌｓ．Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．３３，２４５－２５４）。
【0005】
ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ及びヒストンアセチルトランスフェラーゼなどのエピジェネティック修飾因子の遺伝学的研究により、発生及び機能の際のエピジェネティック制御の重要な役割が明らかになった。エピジェネティックな修飾の変化は、神経障害（神経発達疾患、精神疾患、及び神経変性疾患など）、がん、循環器疾患を含むさまざまな障害で報告されている。
【0006】
クラスター化等間隔短鎖回文リピート（ＣＲＩＳＰＲ）－Ｃａｓシステムは、プラスミド及びバクテリオファージなどの外来遺伝要素に対する耐性を付与する原核免疫システムである。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムは、標的ＤＮＡのＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合及び配列特異的切断を利用する。ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）は、ＰＡＭ（プロトスペーサー隣接モチーフ）部位の上流の標的ＤＮＡ配列に相補的であり得る。Ｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ関連）９タンパク質はｇＲＮＡと標的ＤＮＡに結合し、ＰＡＭ部位の上流の定義された位置に二本鎖切断（ＤＳＢ）を導入する。Ｇｅｕｒｔｓ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２５，４３３（２００９）；Ｍａｓｈｉｍｏ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ ＯＮＥ ５，ｅ８８７０（２０１０）；Ｃａｒｂｅｒｙ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １８６，４５１－４５９（２０１０）；Ｔｅｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２９，６９５－６９６（２０１１）．Ｗｉｅｄｅｎｈｅｆｔ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ４８２，３３１－３３８（２０１２）；Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３７，８１６－８２１（２０１２）；Ｍａｌｉ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３９，８２３－８２６（２０１３）；Ｃｏｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３９，８１９－８２３（２０１３））。ウイルスＤＮＡだけでなく他の遺伝子も切断するようにプログラムできるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムの能力は、ゲノム工学の新しい場を開いた。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、標的配列を変更せずに、転写の抑制と活性化を含む遺伝子制御にも使用されている。
【0007】
遺伝子発現及び／または３Ｄクロマチン構造を操作するエピゲノム編集ツールの開発は、細胞のエピゲノムを変更し、障害を治療するのに役立ち得る。
【発明の概要】
【0008】
本開示は、システムであって、（ａ）デオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）デッドＣｐｆ１（ｄＣｐｆ１）またはＣａｓ９（ｄＣａｓ９）及びエフェクタードメインを含む融合タンパク質をコードする第１のポリヌクレオチド配列と、（ｂ）１つ以上の標的配列にハイブリダイズする１つ以上のガイド配列をコードする第２のポリヌクレオチド配列と、を含むシステムを提供する。
【0009】
また、本開示に包含されるのは、システムであって、（ａ）デオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）デッドＣｐｆ１（ｄＣｐｆ１）またはＣａｓ９（ｄＣａｓ９）及びエフェクタードメインを含む融合タンパク質、またはデオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）デッドＣｐｆ１（ｄＣｐｆ１）もしくはＣａｓ９（ｄＣａｓ９）及びエフェクタードメインを含む融合タンパク質をコードする第１のポリヌクレオチド配列と、（ｂ）１つ以上の標的配列にハイブリダイズする１つ以上のガイド配列、または１つ以上の標的配列にハイブリダイズする１つ以上のガイド配列をコードする第２のポリヌクレオチド配列と、を含むシステムである。
【0010】
融合タンパク質において、ｄＣｐｆ１（またはｄＣａｓ９）は、エフェクタードメインと直接的または間接的に（例えば、リンカー及び／またはＮＬＳを介して）融合される。
【0011】
ｄＣｐｆ１は、次の変異：Ｄ９０８Ａ、Ｅ９９３Ａ、Ｒ１２２６Ａ、及びＤ１２６３Ａのうちの１つ以上を含むＣｐｆ１であり得る。ｄＣｐｆ１は、次の変異：Ｄ８３３Ａを含むＣｐｆ１であり得る。
【0012】
一実施形態では、ｄＣｐｆ１は、触媒的にデッドなＬｂＣｐｆ１（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ由来）である。一実施形態では、ｄＣｐｆ１は、次の変異：Ｄ８３３Ａを含むＬｂＣｐｆ１である。
【0013】
一実施形態では、ｄＣｐｆ１は、触媒的にデッドなＡｓＣｐｆ１（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．由来）である。一実施形態では、ｄＣｐｆ１は、次の変異：Ｄ９０８Ａ、Ｅ９９３Ａ、Ｒ１２２６Ａ、及びＤ１２６３Ａのうちの１つ以上を含むＡｓＣｐｆ１であり得る。一実施形態では、ｄＣｐｆ１は、次の変異：Ｄ９０８Ａ、Ｅ９９３Ａ、Ｒ１２２６Ａ、及びＤ１２６３Ａを含むＡｓＣｐｆ１であり得る。
【0014】
１つ以上のガイド配列は、１つ以上のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）分子、１つ以上のシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）分子、１つ以上のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子、またはそれらの組み合わせであり得る。
【0015】
第１のポリヌクレオチド配列と第２のポリヌクレオチド配列は、単一のベクター上にあってもよく、または異なるベクター上にあってもよい。
【0016】
第２のポリヌクレオチド配列は、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上、８つ以上、９つ以上、または１０以上の標的配列にハイブリダイズする、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上、８つ以上、９つ以上、または１０以上のガイド配列（例えば、ｃｒＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ、またはｇＲＮＡ分子）をコードしていてもよい。
【0017】
ｄＣｐｆ１は、リボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）活性を有していてもよい。
【0018】
エフェクタードメインは、Ｔｅｔ２、Ｄｎｍｔ３ｂ、ＣＴＣＦ、Ｔｅｔ１、Ｄｎｍｔ３ａ、またはｐ３００であり得る。エフェクタードメインは、Ｔｅｔ２、Ｄｎｍｔ３ｂ、ＣＴＣＦ、Ｔｅｔ１、Ｄｎｍｔ３ａ、またはｐ３００の一部であり得る。エフェクタードメインは、Ｔｅｔ２、Ｄｎｍｔ３ｂ、ＣＴＣＦ、Ｔｅｔ１、Ｄｎｍｔ３ａ、またはｐ３００の生物学的に活性な一部であり得る。
【0019】
エフェクタードメインは、エピゲノムを改変する活性を有し得る。
【0020】
エフェクタードメインは、ヒストンサブユニットを修飾する酵素であり得る。
【0021】
エフェクタードメインは、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ（ＨＡＴ）、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）、ヒストンメチルトランスフェラーゼ（ＨＭＴ）、またはヒストンデメチラーゼであり得る。例えば、ＨＡＴはｐ３００であってよい。
【0022】
エフェクタードメインは、ＤＮＡのメチル化状態を改変する酵素であり得る。
【0023】
エフェクタードメインは、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＤＮＭＴ）または１０－１１転座（ＴＥＴ）メチルシトシンジオキシゲナーゼタンパク質であり得る。例えば、ＤＮＭＴタンパク質はＤｎｍｔ３ｂまたはＤｎｍｔ３ａである。ＴＥＴタンパク質は、Ｔｅｔ２またはＴｅｔ１であり得る。
【0024】
エフェクタードメインは、ＣＣＣＴＣ結合因子（ＣＴＣＦ）であり得る。一実施形態では、ＣＴＣＦはヒトＣＴＣＦである。ＣＴＣＦは、野生型ＣＴＣＦまたはＤＮＡ結合変異体ＣＴＣＦであり得る。ＤＮＡ結合変異体ＣＴＣＦは、次の変異：Ｋ３６５Ａ、Ｒ３６８Ａ、Ｒ３９６Ａ、及びＱ４１８Ａのうちの１つ以上を含み得る。ＣＴＣＦ変異体としては、ＣＴＣＦ（Ｋ３６５Ａ）、ＣＴＣＦ（Ｒ３６８Ａ）、ＣＴＣＦ（Ｋ３６５Ａ、Ｒ３６８Ａ）、ＣＴＣＦ（Ｒ３９６Ａ）、及びＣＴＣＦ（Ｑ４１８Ａ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【0025】
エフェクタードメインは、ＶＰ６４及びＮＦ－κＢ ｐ６５などの転写活性化ドメイン、またはＶＰ６４もしくはＮＦ－κＢ ｐ６５に由来する転写活性化ドメインであり得る。
【0026】
エフェクタードメインは、転写サイレンサーまたは転写抑制ドメインであり得る。転写抑制ドメインは、クルッペル関連ボックス（ＫＲＡＢ）ドメイン、ＥＲＦリプレッサードメイン（ＥＲＤ）、またはｍＳｉｎ３Ａ相互作用ドメイン（ＳＩＤ）であり得る。転写サイレンサーは、ヘテロクロマチンタンパク質１（ＨＰ１）、またはメチルＣｐＧ結合タンパク質２（ＭｅＣＰ２）であり得る。
【0027】
Ｃｐｆ１は、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒａｃｈｉｏｐｈｉｌｕｍ、Ｐａｒｃｕｂａｃｔｅｒｉａ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐｅｒｅｇｒｉｎｉｂａｃｔｅｒｉａ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｍａｃａｃａｅ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｃｒｅｖｉｏｒｉｃａｎｉｓ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｄｉｓｉｅｎｓ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｂｏｖｏｃｕｌｉ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｎａｄａｉ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ ｍｅｔｈａｎｏｐｌａｓｍａ ｔｅｒｍｉｔｕｍ、またはＥｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｌｉｇｅｎｓ由来であり得る。
【0028】
本開示は、本発明のシステムを含む組成物、本発明のシステムを含む細胞、及び本発明のシステムを含む１つ、２つ、またはそれ以上のベクターを提供する。
【0029】
１つ以上のベクターは、組換えレンチウイルスベクターを含み得る。
【0030】
本開示は、細胞のエピゲノムを改変する方法を提供する。この方法は、細胞を本発明のシステムと接触させることを含み得る。
【0031】
また、細胞のエピゲノムを改変するための本発明の方法に包含される。この方法は、細胞を、（ａ）デオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）デッドＣｐｆ１（ｄＣｐｆ１）及びエフェクタードメインを含む融合タンパク質をコードする第１のポリヌクレオチド配列であって、ｄＣｐｆ１が（ｉ）次の変異：Ｄ９０８Ａ、Ｅ９９３Ａ、Ｒ１２２６Ａ、及びＤ１２６３Ａのうちの１つ以上、または（ｉｉ）次の変異：Ｄ８３３Ａを含むＣｐｆ１である、第１のポリヌクレオチド配列と、（ｂ）１つ以上の標的配列にハイブリダイズする１つ以上のガイド配列をコードする第２のポリヌクレオチド配列と、を含むシステムと接触させることを含み得る。
【0032】
本開示は、細胞のエピゲノムを改変する方法を提供する。この方法は、細胞を、（ａ）デオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）デッドＣｐｆ１（ｄＣｐｆ１）及びエフェクタードメインを含む融合タンパク質、またはデオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）デッドＣｐｆ１（ｄＣｐｆ１）及びエフェクタードメインを含む融合タンパク質をコードする第１のポリヌクレオチド配列と、（ｂ）１つ以上の標的配列にハイブリダイズする１つ以上のガイド配列、または１つ以上の標的配列にハイブリダイズする１つ以上のガイド配列をコードする第２のポリヌクレオチド配列と、を含むシステムと接触させることを含み得る。
【0033】
特定の実施形態では、細胞は誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）またはヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）である。例えば、ｉＰＳＣは、対象の線維芽細胞に由来し得る。
【0034】
本発明の方法は、ｉＰＳＣまたはｈＥＳＣを培養して分化細胞（例えばニューロン）に分化させることをさらに含んでもよい。本発明の方法は、分化細胞（例えば、ニューロン）を対象に投与することをさらに含んでもよい。
【0035】
本開示は、患者の疾患を治療する方法を提供する。この方法は、患者に、（ａ）デオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）デッドＣｐｆ１（ｄＣｐｆ１）及びエフェクタードメインを含む融合タンパク質をコードする第１のポリヌクレオチド配列であって、ｄＣｐｆ１が（ｉ）次の変異：Ｄ９０８Ａ、Ｅ９９３Ａ、Ｒ１２２６Ａ、及びＤ１２６３Ａのうちの１つ以上、または（ｉｉ）次の変異：Ｄ８３３Ａを含むＣｐｆ１である、第１のポリヌクレオチド配列と、（ｂ）１つ以上の標的配列にハイブリダイズする１つ以上のガイド配列をコードする第２のポリヌクレオチド配列と、を含むシステムを投与することを含み得る。
【0036】
本開示は、患者の疾患を治療する方法を提供する。この方法は、患者に、（ａ）デオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）デッドＣｐｆ１（ｄＣｐｆ１）及びエフェクタードメインを含む融合タンパク質、またはデオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）デッドＣｐｆ１（ｄＣｐｆ１）及びエフェクタードメインを含む融合タンパク質をコードする第１のポリヌクレオチド配列と、（ｂ）１つ以上の標的配列にハイブリダイズする１つ以上のガイド配列、または１つ以上の標的配列にハイブリダイズする１つ以上のガイド配列をコードする第２のポリヌクレオチド配列と、を含むシステムを投与することを含み得る。
【0037】
１つ以上の標的配列は、ＭＥＣＰ２、ＰＨＥＸ、ＣＯＬ４Ａ５、ＣＯＬ４Ａ３、ＣＯＬ４Ａ１、ＩＫＢＫＧ、ＰＯＲＣＮ、ＤＭＤ／ＤＹＳ、ＲＰＳ６ＫＡ３、ＬＡＭＰ２、ＮＳＤＨＬ、ＰＤＨＡ１、ＨＤＡＣ８、ＳＭＣ１Ａ、ＣＤＫＬ５、ＯＦＤ１、ＷＤＲ４５、ＫＤＭ６Ａ、ＣＡＳＫ、ＦＩＮＡ、ＡＬＡＳ２、ＨＮＲＮＰＨ２、ＭＳＬ３、及びＩＱＳＥＣ２からなる群から選択される１つ以上の遺伝子内にあるか、またはそれらと関連し得る。
【0038】
１つ以上の標的配列は、表１または表２の遺伝子から選択される１つ以上の遺伝子内にあるか、またはそれらと関連し得る。
【0039】
特定の実施形態では、この疾患は、Ｘ連鎖病である。Ｘ連鎖病は、表１の疾患から選択することができる。
【0040】
一実施形態では、疾患はレット症候群（ＲＴＴ）である。
【0041】
特定の実施形態では、疾患はインプリンティング関連疾患である。インプリンティング関連疾患は、表２の疾患から選択することができる。
【0042】
疾患は、神経障害（神経発達障害、精神障害、及び神経変性障害など）、がん、または循環器疾患であり得る。
【0043】
本開示は、本発明のポリヌクレオチド（複数可）及び／または成分（例えば、タンパク質（複数可））を含むシステムを提供する。
【0044】
本開示は、本発明のシステムを含む組成物、または本発明のポリヌクレオチド（複数可）及び／または成分（例えば、タンパク質（複数可））を含む組成物を提供する。
【0045】
本開示は、本発明のシステムを含む細胞、または本発明のポリヌクレオチド（複数可）及び／または成分（例えば、タンパク質（複数可））を含む細胞を提供する。
【0046】
本開示は、本発明のポリヌクレオチド（複数可）または本発明のシステムを含む１つ以上のベクターを提供する。一実施形態では、１つ以上のベクターは組換えレンチウイルスベクターであってもよい。
【0047】
また、本開示に包含されるのは、細胞内または対象内のエンドヌクレアーゼ系を不活性化する方法である。この方法は、細胞を本発明のポリヌクレオチド、ベクター、システム、または組成物と接触させることを含み得る。この方法は、本発明のポリヌクレオチド、ベクター、システム、または組成物を対象に投与することを含み得る。
【0048】
本開示は、細胞または対象におけるエピゲノムを改変するための方法を提供する。この方法は、細胞を本発明のポリヌクレオチド（複数可）、ベクター（複数可）、システム、または組成物と接触させることを含み得る。この方法は、本発明のポリヌクレオチド（複数可）、ベクター（複数可）、システム、または組成物を対象に投与することを含み得る。
【0049】
本開示は、対象における状態を治療する方法を提供する。この方法は、本発明のポリヌクレオチド（複数可）、ベクター（複数可）、システム、または組成物を対象に投与することを含み得る。
【図面の簡単な説明】
【0050】
【図1】ｃｒＲＮＡアレイ、Ｃｐｆ１、及び選択マーカーをコードする「オールインワン」ベクター（例えば、プラスミド）の略図である。
【図2A】異なる直接反復（ＤＲ）を有するＣｐｆ１の変異分析を示す。アレイ１（Ｚｅｔｓｃｈｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｐｆ１ ｉｓ ａ Ｓｉｎｇｌｅ ＲＮＡ－Ｇｕｉｄｅｄ Ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ ｏｆ ａ Ｃｌａｓｓ ２ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ Ｓｙｓｔｅｍ，Ｃｅｌｌ，２０１５，１６３，３：７５９－７７１；Ｙａｍａｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｙｓｔａｌ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ Ｃｐｆ１ ｉｎ Ｃｏｍｐｌｅｘ ｗｉｔｈ Ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ ａｎｄ Ｔａｒｇｅｔ ＤＮＡ，Ｃｅｌｌ，２０１６，１６５：９４９－ ９６２）及びアレイ２（Ｚｅｔｓｃｈｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ｇｅｎｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｂｙ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃｐｆ１ ｔｈｒｏｕｇｈ ａｕｔｏｎｏｍｏｕｓ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｏｆ ａ ｓｉｎｇｌｅ ｃｒＲＮＡ ａｒｒａｙ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１７，３５（１）：３１－３４）の構造を示す。
【図2B】異なる直接反復（ＤＲ）を有するＣｐｆ１の変異分析を示す。ＤＮＭＴ１、ＶＥＧＦＡ、ＧＲＩＮ２Ｂ標的でインデルを誘導する異なるアレイを持つＣｐｆ１の能力を、Ｓｕｒｖｅｙｏｒアッセイで調べた。アレイ１：１９ヌクレオチド（ｎｔ）のＤＲ＋２３ｎｔのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）；アレイ２：３７ｎｔのＤＲ＋２３ｎｔのｇＲＮＡ。Ｃｐｆ１－ＴｅｔＣＤ：Ｔｅｔ触媒ドメインと融合したＣｐｆ１。
【図2C】異なる直接反復（ＤＲ）を有するＣｐｆ１の変異分析を示す。Ｃｐｆ１及びＣｐｆ１－ＴｅｔＣＤの発現レベルを示すウエスタンブロットである。
【図3】Ｃｐｆ１のＲｕｖＣドメインとＮｕｃドメインの重要な残基の変異分析を示す。ＤＮＭＴ１標的でインデルを誘導するＣｐｆ１の能力に対する変異の影響を、Ｓｕｒｖｅｙｏｒアッセイによって調べた。
【図4】ＡｓＣｐｆ１のＲｕｖＣドメインとＮｕｃドメインの重要な残基の親和性分析を示す。ＤＮＭＴ１、ＶＥＧＦＡ、及びＧＲＩＮ２Ｂの標的ＤＮＡ配列に結合するＡｓＣｐｆ１（ＤＮａｓｅ活性の触媒的にデッドなＣｐｆ１）の能力に対する点変異の影響を、クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）－ｑＰＣＲ（ｎ＝３、エラーバーは平均±ＳＥＭを示す）を使用して調べた。値はモック試料に対して正規化された。
【図5A】ｄＣｐｆ１－ｐ３００（ｐ３００と融合した触媒不活性変異体Ｃｐｆ１（ｄＣｐｆ１））システムの、遺伝子活性化のための標的ヒストンのアセチル化を媒介する最適化を示す。モック試料に対して正規化された相対的なＭｙｏＤのｍＲＮＡレベルを示す。
【図5B】ｄＣｐｆ１－ｐ３００（ｐ３００と融合した触媒不活性変異体Ｃｐｆ１（ｄＣｐｆ１））システムの、遺伝子活性化のための標的ヒストンのアセチル化を媒介する最適化を示す。抗ＨＡタグ抗体によって検出される融合タンパク質の発現レベルを示すウエスタンブロットである。ｄＣａｓ９は、次の点変異：Ｄ１０Ａ及びＨ８４０Ａを有するＣａｓ９である：ｄＡｓＣｐｆ１は、次の点変異：Ｄ９０８Ａ、Ｅ９９３Ａ、Ｒ１２２６Ａ、及びＤ１２６３Ａを有するＡｓＣｐｆ１である；ｄＬｂＣｐｆ１は、次の点変異：Ｄ８３３Ａを有するＬｂＣｐｆ１である。「アレイ」という用語は、ｃｒＲＮＡ１～４を指す。
【図6】ｄＣｐｆ１－ｐ３００システムによるＭｙｏＤ遺伝子座でのＨ３Ｋ２７アセチル化の編集の有効範囲を研究した結果を示す。ｄＣａｓ９は、次の点変異：Ｄ１０Ａ及びＨ８４０Ａを有するＣａｓ９である：ｄＡｓＣｐｆ１は、次の点変異：Ｄ９０８Ａ、Ｅ９９３Ａ、Ｒ１２２６Ａ、及びＤ１２６３Ａを有するＡｓＣｐｆ１である；ｄＬｂＣｐｆ１は、次の点変異：Ｄ８３３Ａを有するＬｂＣｐｆ１である。
【図7A】ｄＣｐｆ１－ｐ３００システムによるＭｅＣＰ２遺伝子座でのＨ３Ｋ２７アセチル化の編集の有効範囲を研究した結果を示す。抗Ｈ３Ｋ２７Ａｃ抗体をＣｈＩＰ－ｑＰＣＲに使用した。ｄＣ：ｄＣｄｆｌ。
【図7B】ｄＣｐｆ１－ｐ３００システムによるＭｅＣＰ２遺伝子座でのＨ３Ｋ２７アセチル化の編集の有効範囲を研究した結果を示す。ＣｈＩＰ－ｑＰＣＲに抗ＨＡ抗体を使用した。ｄＬｂＣｐｆ１またはｄＣｐｆ１は、次の点変異：Ｄ８３３Ａを有するＬｂＣｐｆ１である。
【図8】ｄＣｐｆ１－Ｄｎｍｔ３ａ（Ｄｎｍｔ３ａと融合したｄＣｐｆ１）が、ｄＣａｓ９－Ｄｎｍｔ３ａ（Ｄｎｍｔ３ａと融合した触媒不活性変異体Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９））よりも高いＤＮＡメチル化編集効率を提供することを示す。ｄＣｐｆ１－Ｄｎｍｔ３ａ及びｃｒＲＮＡをコードするオールインワンベクターを使用した。ｄＣａｓ９は、次の点変異：Ｄ１０Ａ及びＨ８４０Ａを有するＣａｓ９である。ｄＣｐｆ１は、次の点変異：Ｄ８３３Ａを有するＬｂＣｐｆ１である。
【図9A】ｄＣｐｆ１－ＣＴＣＦが複数の部位に結合できることを示す。レンチウイルスｄＣｐｆ１－ＣＴＣＦの構造の略図である。
【図9B】ｄＣｐｆ１－ＣＴＣＦが複数の部位に結合できることを示す。実験手順を示す。
【図9C】ｄＣｐｆ１－ＣＴＣＦが複数の部位に結合できることを示す。Ｃｐｆ１－ＨＡまたはＣＴＣＦに対する抗体を使用して、ｄＣｐｆ１－ｐ３００及びｄＣｐｆ１－ＣＴＣＦの標的化ＭｅＣＰ２遺伝子座への結合を調べたＣｈＩＰ－ｑＰＣＲの結果を示す。ｄＣｐｆ１は、次の点変異：Ｄ８３３Ａを有するＬｂＣｐｆ１である。
【図10A】ＣＴＣＦのＤＮＡ結合変異体（ＣＴＣＦ＿Ｋ３６５Ａ＆Ｒ３６８Ａ；ＣＴＣＦ＿Ｒ３９６Ａ；ＣＴＣＦ＿Ｑ４１８Ａ）がｄＣｐｆ１－ＣＴＣＦのオフターゲット効果を減少させたことを示す。標的化ＭｅＣＰ２遺伝子座へのｄＣｐｆ１－ＣＴＣＦの結合を調べるために、抗ＨＡ抗体を用いてＣｈＩＰ－ｑＰＣＲを行った。
【図10B】ＣＴＣＦのＤＮＡ結合変異体（ＣＴＣＦ＿Ｋ３６５Ａ＆Ｒ３６８Ａ；ＣＴＣＦ＿Ｒ３９６Ａ；ＣＴＣＦ＿Ｑ４１８Ａ）がｄＣｐｆ１－ＣＴＣＦのオフターゲット効果を減少させたことを示す。抗ＨＡまたは抗ＣＴＣＦ抗体によって検出されたタンパク質の発現レベルを示すウエスタンブロットである。ｄＣｐｆ１は、次の点変異：Ｄ８３３Ａを有するＬｂＣｐｆ１である。
【図11A】ＭｅＣＰ２遺伝子座のｄＣｐｆ１－ＣＴＣＦ媒介ＤＮＡループを示す。ｃｒＲＮＡ－１を使用した場合のＣｈＩＰ－ｑＰＣＲの結果を示す。
【図11B】ＭｅＣＰ２遺伝子座のｄＣｐｆ１－ＣＴＣＦ媒介ＤＮＡループを示す。ｃｒＲＮＡ－２を使用した場合のＣｈＩＰ－ｑＰＣＲの結果を示す。
【図12】ＭＥＣＰ２デュアルカラーレポーターｈＥＳ細胞株の略図である。
【図13A】ｄＣａｓ９－Ｔｅｔ１（Ｔｅｔ１と融合したｄＣａｓ９）によるＭＥＣＰ２プロモーターでのＸｉ特異的ＤＭＲの脱メチル化を示す。ｓｇＲＮＡ－１からｓｇＲＮＡ－１０を含むｓｇＲＮＡ、及びパイロシーケンシング（ｐｙｒｏ－ｓｅｑ）の領域（領域ａ～ｃ）により標的化ＭＥＣＰ２プロモーター（Ｌｉｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｇｌｏｂａｌ Ｅｐｉｇｅｎｏｍｉｃ Ｒｅｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ Ｄｕｒｉｎｇ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｂｒａｉｎ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１３，３４１（６１４６）：１２３７９０５）の略図である。
【図13B】ｄＣａｓ９－Ｔｅｔ１（Ｔｅｔ１と融合したｄＣａｓ９）によるＭＥＣＰ２プロモーターでのＸｉ特異的ＤＭＲの脱メチル化を示す。領域ａ～ｃのパイロシーケンシング（ｐｙｒｏ－ｓｅｑ）の結果を示す。ｄＣ－Ｔ：ｄＣａｓ９－Ｔｅｔ１。ｄＣａｓ９は、次の点変異：Ｄ１０Ａ及びＨ８４０Ａを有するＣａｓ９である。
【図14】メチル化編集がヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）の不活性Ｘ染色体（Ｘｉ）上のＭＥＣＰ２の再活性化をもたらしたことを示唆する免疫蛍光画像を示す。細胞を、ｄＣａｓ９－Ｔｅｔ１－Ｐ２Ａ－ＢＦＰ（ｄＣ－Ｔ）を発現するレンチウイルスとｓｇＲＮＡ－ｍＣｈｅｒｒｙを発現するレンチウイルス（１０個のｓｇＲＮＡを使用した）に感染させた。蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）を使用して、ＢＦＰ＋ｍＣｈｅｒｒｙ＋であった細胞を単離した。感染細胞を免疫蛍光染色した。ｄＣ－Ｔ：ｄＣａｓ９－Ｔｅｔ１。ｄＣａｓ９は、次の点変異：Ｄ１０Ａ及びＨ８４０Ａを有するＣａｓ９である。
【図15】ＭＥＣＰ２の再活性化が、神経前駆細胞（ＮＰＣ）及びニューロンで維持されたことを示す。ｄＣ－Ｔ：ｄＣａｓ９－Ｔｅｔ１。ｄＣａｓ９は、次の点変異：Ｄ１０Ａ及びＨ８４０Ａを有するＣａｓ９である。ｓｇＲＮＡ：上で論じられた１０個のｓｇＲＮＡ。
【図16】単一のｓｇＲＮＡを含むｄＣａｓ９－Ｔｅｔ１がＸｉ上でＭＥＣＰ２を再活性化するのに十分であることを示す。ＭＥＣＰ２変異体８６０番ＲＴＴ様ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）に、ｄＣａｓ９－Ｔｅｔ１－Ｐ２Ａ－ＢＦＰ（ｄＣａｓ９－Ｔｅｔ１）を発現するレンチウイルスとｓｇＲＮＡ－ｍＣｈｅｒｒｙ（１０個のｓｇＲＮＡ）を発現するレンチウイルスを感染させた。蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）を使用して、ＢＦＰ＋ｍＣｈｅｒｒｙ＋である細胞を単離し、培養してＥＳＣコロニーを形成した。次いで、ＥＳＣをニューロンに分化させた。下のパネルは、ＭＥＣＰ２のレベルを示すウエスタンブロットである。ｄＣａｓ９は、次の点変異：Ｄ１０Ａ及びＨ８４０Ａを有するＣａｓ９である。
【図17A】メチル化編集されたニューロンにおけるニューロン細胞体サイズのレスキューを示す。野生型３８番ｈＥＳＣ、変異体８６０番ＲＴＴ様ｈＥＳＣ、及びメチル化編集された８６０番に由来するニューロンを使用して、ＭＥＣＰ２及びＭａｐ２に対する免疫蛍光染色によって細胞体サイズを調べた。ｓｇＲＮＡ：上で論じられた１０個のｓｇＲＮＡ。ｄＣ－Ｔ：ｄＣａｓ９－Ｔｅｔ１。ｄＣａｓ９は、次の点変異：Ｄ１０Ａ及びＨ８４０Ａを有するＣａｓ９である。
【図17B】メチル化編集されたニューロンにおけるニューロン細胞体サイズのレスキューを示す。細胞体のサイズは、Ｉｍａｇｅ Ｊによって定量化された。ｓｇＲＮＡ：上で論じられた１０個のｓｇＲＮＡ。ｄＣ－Ｔ：ｄＣａｓ９－Ｔｅｔ１。ｄＣａｓ９は、次の点変異：Ｄ１０Ａ及びＨ８４０Ａを有するＣａｓ９である。
【図18A】メチル化編集されたニューロンにおけるニューロン活動のレスキューを示す。野生型３８番ｈＥＳＣ、変異体８６０番ＲＴＴ様ｈＥＳＣ、及びメチル化編集された８６０番に由来するニューロンを使用して、多電極アッセイによって分化後の電気物理特性を調べた。ｓｇＲＮＡ：上で論じられた１０個のｓｇＲＮＡ。ｄＣ－Ｔ：ｄＣａｓ９－Ｔｅｔ１。ｄＣａｓ９は、次の点変異：Ｄ１０Ａ及びＨ８４０Ａを有するＣａｓ９である。
【図18B】メチル化編集されたニューロンにおけるニューロン活動のレスキューを示す。分化後６７日平均発火頻度を示す。ｓｇＲＮＡ：上で論じられた１０個のｓｇＲＮＡ。ｄＣ－Ｔ：ｄＣａｓ９－Ｔｅｔ１。ｄＣａｓ９は、次の点変異：Ｄ１０Ａ及びＨ８４０Ａを有するＣａｓ９である。
【図19】ＭＥＣＰ２の再活性化がニューロンで安定していなかったことを示す。野生型３８番ｈＥＳＣ、変異体８６０番ＲＴＴ様ｈＥＳＣ、及びメチル化編集された８６０番に由来するニューロンに、レンチウイルスｄＣａｓ９－Ｔｅｔ１及び１０個のｓｇＲＮＡを感染させ、ｑＰＣＲによってＧＦＰの発現を調べた。ｓｇＲＮＡ：上で論じられた１０個のｓｇＲＮＡ。
【図20】ニューロンにおける再活性化のために、ｄＣｐｆ１－ＣＴＣＦを使用してＸｉ上のＭＥＣＰ２遺伝子座に人工回避物を構築する戦略の略図である。
【図21A】ＲＴＴニューロンにおけるメチル化編集とＤＮＡループの組み合わせがニューロンの活動をレスキューしたことを示す。ＭＥＣＰ２遺伝子座における標的化ＣＴＣＦアンカー部位を示す。上で論じられたｓｇＲＮＡが使用された。ｄＣａｓ９は、次の点変異：Ｄ１０Ａ及びＨ８４０Ａを有するＣａｓ９である。ｄＣｐｆ１は、次の点変異：Ｄ８３３Ａを有するＬｂＣｐｆ１である。ｄＣｐｆ１－ＣＴＣＦは、ＣＴＣＦと融合したｄＣｐｆ１である。
【図21B】ＲＴＴニューロンにおけるメチル化編集とＤＮＡループの組み合わせがニューロンの活動をレスキューしたことを示す。実験計画の略図である。上で論じられたｓｇＲＮＡが使用された。ｄＣａｓ９は、次の点変異：Ｄ１０Ａ及びＨ８４０Ａを有するＣａｓ９である。ｄＣｐｆ１は、次の点変異：Ｄ８３３Ａを有するＬｂＣｐｆ１である。ｄＣｐｆ１－ＣＴＣＦは、ＣＴＣＦと融合したｄＣｐｆ１である。
【図21C】ＲＴＴニューロンにおけるメチル化編集とＤＮＡループの組み合わせがニューロンの活動をレスキューしたことを示す。多電極アッセイによって調べられたニューロンの電気物理学的特性を示す。上で論じられたｓｇＲＮＡが使用された。ｄＣａｓ９は、次の点変異：Ｄ１０Ａ及びＨ８４０Ａを有するＣａｓ９である。ｄＣｐｆ１は、次の点変異：Ｄ８３３Ａを有するＬｂＣｐｆ１である。ｄＣｐｆ１－ＣＴＣＦは、ＣＴＣＦと融合したｄＣｐｆ１である。
【発明を実施するための形態】
【0051】
本発明のシステムは、インビトロとインビボの両方で（例えば、患者において、マウスなどの動物モデルにおいて）、哺乳動物細胞内の１つまたは複数のゲノム遺伝子座において、ＤＮＡメチル化、ヒストンアセチル化、及びＤＮＡループを含むが、これらに限定されないエピゲノムを正確に編集することができる。システムは、ＤＮＡメチル化、ヒストンアセチル化、ＤＮＡループなどの状態を変更することのできる、Ｄｎｍｔ３ａ／ｂ、Ｔｅｔ１／２、ｐ３００、及びＣＴＣＦを含むがこれらに限定されない１つ以上のエフェクタータンパク質／ドメインと融合した、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９のオルソログである、触媒的にデッドなＣｐｆ１（ｄＣｐｆ１）を含み得る。
【0052】
Ｃｐｆ１は、本発明の方法及びシステムにおいて使用することができる（Ｚｅｔｓｃｈｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｐｆ１ Ｉｓ ａ Ｓｉｎｇｌｅ ＲＮＡ－Ｇｕｉｄｅｄ Ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ ｏｆ ａ Ｃｌａｓｓ ２ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ Ｓｙｓｔｅｍ，Ｃｅｌｌ，１６３（３）：７５９－７７１）。
【0053】
本開示は、システムであって、（ａ）デオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）デッドＣｐｆ１（ｄＣｐｆ１）及びエフェクタードメインを含む融合タンパク質をコードする第１のポリヌクレオチド配列であって、ｄＣｐｆ１が（ｉ）次の変異：Ｄ９０８Ａ、Ｅ９９３Ａ、Ｒ１２２６Ａ、及びＤ１２６３Ａのうちの１つ以上、または（ｉｉ）次の変異：Ｄ８３３Ａを含むＣｐｆ１である、第１のポリヌクレオチド配列と、（ｂ）１つ以上の標的配列にハイブリダイズする１つ以上のガイド配列をコードする第２のポリヌクレオチド配列と、を含むシステムを提供する。
【0054】
特定の実施形態では、ＤＮａｓｅの触媒的にデッドなＣｐｆ１（ｄＣｐｆ１）は、ＲＮＡｓｅ活性を有する。
【0055】
標的配列は、遺伝子のメチル化可変領域（ＤＭＲ）、エンハンサー、プロモーター、及び／またはＣＴＣＦ結合部位内またはその近傍に位置し得る。標的配列は、遺伝子のＤＭＲ、エンハンサー、プロモーター、及び／またはＣＴＣＦ結合部位を含み得る。１つ以上の標的配列（例えば、ゲノム配列）は、遺伝子の転写開始部位（ＴＳＳ）の５０ｋＢ以内に位置し得る。
【0056】
標的配列は、疾患関連遺伝子のメチル化可変領域（ＤＭＲ）、エンハンサー、プロモーター、及び／またはＣＴＣＦ結合部位内またはその近傍に位置し得る。標的配列は、疾患関連遺伝子のＤＭＲ、エンハンサー、プロモーター、及び／またはＣＴＣＦ結合部位を含み得る。
【0057】
標的配列はゲノム配列であってもよい。特定の実施形態では、細胞内で、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０の標的配列（例えば、ゲノム配列）が改変されている。
【0058】
本開示は、システムであって、（ａ）デオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）デッドＣｐｆ１（ｄＣｐｆ１）及びエフェクタードメインを含み、ｄＣｐｆ１が、（ｉ）次の変異：Ｄ９０８Ａ、Ｅ９９３Ａ、Ｒ１２２６Ａ、及びＤ１２６３Ａのうちの１つ以上、もしくは（ｉｉ）次の変異：Ｄ８３３Ａを含むＣｐｆ１である融合タンパク質、または該融合タンパク質をコードする第１のポリヌクレオチド配列と；（ｂ）１つ以上の標的配列にハイブリダイズする１つ以上のガイド配列、または１つ以上のガイド配列をコードする第２のポリヌクレオチド配列と、を含む、システムを提供する。
【0059】
特定の実施形態において、触媒的に不活性なＣｐｆ１（ｄＣｐｆ１）またはＣａｓ９（ｄＣａｓ９）は、Ｔｅｔ２、Ｄｎｍｔ３ｂ、ＣＴＣＦ、Ｔｅｔ１、Ｄｎｍｔ３ａ、またはｐ３００と融合される。特定の実施形態では、融合タンパク質をメチル化または非メチル化のプロモーター、またはエンハンサーに標的化することにより、遺伝子の発現を活性化またはサイレンシングすることができる。融合タンパク質によるＣＴＣＦループアンカー部位の標的化されたデノボメチル化は、ＣＴＣＦ結合をブロックしてＤＮＡループを妨害し、隣接するループの遺伝子発現を変更することができる。
【0060】
ガイド配列は、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）分子、単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）分子、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、またはそれらの組み合わせであり得る。
【0061】
第１のポリヌクレオチド配列と第２のポリヌクレオチド配列は、単一のベクター上、または異なるベクター上にあってもよい。
【0062】
第２のポリヌクレオチド配列は、２つ以上の標的配列にハイブリダイズする２つ以上のガイド配列をコードし得る。
【0063】
特定の実施形態では、システムは、キメラタンパク質（または融合タンパク質）を発現するオールインワンベクターと、エピゲノム編集を媒介するためにキメラタンパク質を１つ以上のゲノム遺伝子座に標的化するための１つのｃｒＲＮＡまたはｃｒＲＮＡのアレイを含む。本発明者らの実験結果は、標的遺伝子座でのエピジェネティックな状態の確実な変化を示している本発明の方法及びシステムは、複数のエピジェネティックな事象の生物学的機能を調査し、新規治療戦略のために疾患関連のエピジェネティックな事象を操作することを可能にする。
【0064】
本開示は、ポリヌクレオチドであって、（ａ）デオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）デッドヌクレアーゼ及びエフェクタードメインを含む融合タンパク質をコードする第１の配列と、（ｂ）２つ以上のゲノム配列にハイブリダイズする２つ以上のガイド配列をコードする第２の配列と、を含むポリヌクレオチドを提供する。
【0065】
ヌクレアーゼは、触媒的にデッドなＣｐｆ１（ｄＣｐｆ１）であり得る。ヌクレアーゼは、触媒的にデッドなＣａｓ９（例えば、ｓｐＣａｓ９）であり得る。触媒的にデッドなＣａｓ９（ｄＣａｓ９）は、次の変異：Ｄ１０Ａ及びＨ８４０Ａのうちの１つ以上を含み得る。ｄＣｐｆ１は次の変異：Ｄ９０８Ａ、Ｅ９９３Ａ、Ｒ１２２６Ａ、及びＤ１２６３Ａのうちの１つ以上を含み得る。ｄＣｐｆ１は、次の変異：Ｄ８３３Ａを含むＣｐｆ１であり得る。
【0066】
本開示は、ポリヌクレオチドであって、（ａ）デオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）デッドＣｐｆ１（ｄＣｐｆ１）及びエフェクタードメインを含む融合タンパク質をコードする第１の配列であって、ｄＣｐｆ１が（ｉ）次の変異：Ｄ９０８Ａ、Ｅ９９３Ａ、Ｒ１２２６Ａ、及びＤ１２６３Ａのうちの１つ以上、または（ｉｉ）次の変異：Ｄ８３３Ａを含むＣｐｆ１である、第１の配列と、（ｂ）２つ以上のゲノム配列にハイブリダイズする２つ以上のガイド配列をコードする第２の配列と、を含むポリヌクレオチドを提供する。
【0067】
Ｃｐｆ１は、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒａｃｈｉｏｐｈｉｌｕｍ、Ｐａｒｃｕｂａｃｔｅｒｉａ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐｅｒｅｇｒｉｎｉｂａｃｔｅｒｉａ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｍａｃａｃａｅ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｃｒｅｖｉｏｒｉｃａｎｉｓ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｄｉｓｉｅｎｓ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｂｏｖｏｃｕｌｉ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｎａｄａｉ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ（ＭＡ２０２０）、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ ｍｅｔｈａｎｏｐｌａｓｍａ ｔｅｒｍｉｔｕｍ、またはＥｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｌｉｇｅｎｓ由来であり得る。
【0068】
一実施形態では、ｄＣｐｆ１は、触媒的にデッドなＬｂＣｐｆ１（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ由来）である。別の実施形態では、ｄＣｐｆ１は、触媒的にデッドなＡｓＣｐｆ１（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．由来）である。さらに別の実施形態では、ｄＣｐｆ１は、触媒的にデッドなＦｂＣｐｆ１（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒａｃｈｉｏｐｈｉｌｕｍ由来）である。
【0069】
ＡｓＣｐｆ１は、ＵｎｉＰｒｏｔ番号ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｕ２ＵＭＱ６（ＣＳ１２Ａ＿ＡＣＩＳＢ）を有し、対応するアミノ酸配列を含み得る。ＬｂＣｐｆ１は、ＵｎｉＰｒｏｔ番号ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ａ０Ａ１８２ＤＷＥ３（Ａ０Ａ１８２ＤＷＥ３＿９ＦＩＲＭ）を有し、対応するアミノ酸配列を含み得る。
【0070】
本開示で論じるこれらのタンパク質／ポリペプチドのそれぞれについて、多数の異なるアイソフォームが存在し得、本明細書では、関連する配列を提供するための一般アクセッション番号、ＮＣＢＩ参照配列（ＲｅｆＳｅｑ）アクセッション番号、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号、及び／またはＵｎｉＰｒｏｔ番号が提供される。タンパク質／ポリペプチドはまた、他の配列を含んでもよい。アクセッション番号（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔ番号）が使用されるすべての場合において、アクセッション番号は、本開示のシステム／方法で使用され得るタンパク質または遺伝子の一実施形態を指す。
【0071】
ＡｓＣｐｆ１は、以下のアミノ酸配列を含み得る／有し得る（配列番号４３；Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）：ＭＴＱＦＥＧＦＴＮＬ ＹＱＶＳＫＴＬＲＦＥ ＬＩＰＱＧＫＴＬＫＨ ＩＱＥＱＧＦＩＥＥＤ ＫＡＲＮＤＨＹＫＥＬ ＫＰＩＩＤＲＩＹＫＴ ＹＡＤＱＣＬＱＬＶＱ ＬＤＷＥＮＬＳＡＡＩ ＤＳＹＲＫＥＫＴＥＥ ＴＲＮＡＬＩＥＥＱＡ ＴＹＲＮＡＩＨＤＹＦ ＩＧＲＴＤＮＬＴＤＡ ＩＮＫＲＨＡＥＩＹＫ ＧＬＦＫＡＥＬＦＮＧ ＫＶＬＫＱＬＧＴＶＴ ＴＴＥＨＥＮＡＬＬＲ ＳＦＤＫＦＴＴＹＦＳ ＧＦＹＥＮＲＫＮＶＦ ＳＡＥＤＩＳＴＡＩＰ ＨＲＩＶＱＤＮＦＰＫ ＦＫＥＮＣＨＩＦＴＲ ＬＩＴＡＶＰＳＬＲＥ ＨＦＥＮＶＫＫＡＩＧ ＩＦＶＳＴＳＩＥＥＶ ＦＳＦＰＦＹＮＱＬＬ ＴＱＴＱＩＤＬＹＮＱ ＬＬＧＧＩＳＲＥＡＧ ＴＥＫＩＫＧＬＮＥＶ ＬＮＬＡＩＱＫＮＤＥ ＴＡＨＩＩＡＳＬＰＨ ＲＦＩＰＬＦＫＱＩＬ ＳＤＲＮＴＬＳＦＩＬ ＥＥＦＫＳＤＥＥＶＩ ＱＳＦＣＫＹＫＴＬＬ ＲＮＥＮＶＬＥＴＡＥ ＡＬＦＮＥＬＮＳＩＤ ＬＴＨＩＦＩＳＨＫＫ ＬＥＴＩＳＳＡＬＣＤ ＨＷＤＴＬＲＮＡＬＹ ＥＲＲＩＳＥＬＴＧＫ ＩＴＫＳＡＫＥＫＶＱ ＲＳＬＫＨＥＤＩＮＬ ＱＥＩＩＳＡＡＧＫＥ ＬＳＥＡＦＫＱＫＴＳ ＥＩＬＳＨＡＨＡＡＬ ＤＱＰＬＰＴＴＬＫＫ ＱＥＥＫＥＩＬＫＳＱ ＬＤＳＬＬＧＬＹＨＬ ＬＤＷＦＡＶＤＥＳＮ ＥＶＤＰＥＦＳＡＲＬ ＴＧＩＫＬＥＭＥＰＳ ＬＳＦＹＮＫＡＲＮＹ ＡＴＫＫＰＹＳＶＥＫ ＦＫＬＮＦＱＭＰＴＬ ＡＳＧＷＤＶＮＫＥＫ ＮＮＧＡＩＬＦＶＫＮ ＧＬＹＹＬＧＩＭＰＫ ＱＫＧＲＹＫＡＬＳＦ ＥＰＴＥＫＴＳＥＧＦ ＤＫＭＹＹＤＹＦＰＤ ＡＡＫＭＩＰＫＣＳＴ ＱＬＫＡＶＴＡＨＦＱ ＴＨＴＴＰＩＬＬＳＮ ＮＦＩＥＰＬＥＩＴＫ ＥＩＹＤＬＮＮＰＥＫ ＥＰＫＫＦＱＴＡＹＡ ＫＫＴＧＤＱＫＧＹＲ ＥＡＬＣＫＷＩＤＦＴ ＲＤＦＬＳＫＹＴＫＴ ＴＳＩＤＬＳＳＬＲＰ ＳＳＱＹＫＤＬＧＥＹ ＹＡＥＬＮＰＬＬＹＨ ＩＳＦＱＲＩＡＥＫＥ ＩＭＤＡＶＥＴＧＫＬ ＹＬＦＱＩＹＮＫＤＦ ＡＫＧＨＨＧＫＰＮＬ ＨＴＬＹＷＴＧＬＦＳ ＰＥＮＬＡＫＴＳＩＫ ＬＮＧＱＡＥＬＦＹＲ ＰＫＳＲＭＫＲＭＡＨ ＲＬＧＥＫＭＬＮＫＫ ＬＫＤＱＫＴＰＩＰＤ ＴＬＹＱＥＬＹＤＹＶ ＮＨＲＬＳＨＤＬＳＤ ＥＡＲＡＬＬＰＮＶＩ ＴＫＥＶＳＨＥＩＩＫ ＤＲＲＦＴＳＤＫＦＦ ＦＨＶＰＩＴＬＮＹＱ ＡＡＮＳＰＳＫＦＮＱ ＲＶＮＡＹＬＫＥＨＰ ＥＴＰＩＩＧＩＤＲＧ ＥＲＮＬＩＹＩＴＶＩ ＤＳＴＧＫＩＬＥＱＲ ＳＬＮＴＩＱＱＦＤＹ ＱＫＫＬＤＮＲＥＫＥ ＲＶＡＡＲＱＡＷＳＶ ＶＧＴＩＫＤＬＫＱＧ ＹＬＳＱＶＩＨＥＩＶ ＤＬＭＩＨＹＱＡＶＶ ＶＬＥＮＬＮＦＧＦＫ ＳＫＲＴＧＩＡＥＫＡ ＶＹＱＱＦＥＫＭＬＩ ＤＫＬＮＣＬＶＬＫＤ ＹＰＡＥＫＶＧＧＶＬ ＮＰＹＱＬＴＤＱＦＴ ＳＦＡＫＭＧＴＱＳＧ ＦＬＦＹＶＰＡＰＹＴ ＳＫＩＤＰＬＴＧＦＶ ＤＰＦＶＷＫＴＩＫＮ ＨＥＳＲＫＨＦＬＥＧ ＦＤＦＬＨＹＤＶＫＴ ＧＤＦＩＬＨＦＫＭＮ ＲＮＬＳＦＱＲＧＬＰ ＧＦＭＰＡＷＤＩＶＦ ＥＫＮＥＴＱＦＤＡＫ ＧＴＰＦＩＡＧＫＲＩ ＶＰＶＩＥＮＨＲＦＴ ＧＲＹＲＤＬＹＰＡＮ ＥＬＩＡＬＬＥＥＫＧ ＩＶＦＲＤＧＳＮＩＬ ＰＫＬＬＥＮＤＤＳＨ ＡＩＤＴＭＶＡＬＩＲ ＳＶＬＱＭＲＮＳＮＡ ＡＴＧＥＤＹＩＮＳＰ ＶＲＤＬＮＧＶＣＦＤ ＳＲＦＱＮＰＥＷＰＭ ＤＡＤＡＮＧＡＹＨＩ ＡＬＫＧＱＬＬＬＮＨ ＬＫＥＳＫＤＬＫＬＱ ＮＧＩＳＮＱＤＷＬＡ ＹＩＱＥＬＲＮ
【0072】
特定の実施形態では、ＡｓＣｐｆ１は、配列番号４３に示されるアミノ酸配列に対して、少なくとももしくは約７０％、少なくとももしくは約７５％、少なくとももしくは約８０％、少なくとももしくは約８５％、少なくとももしくは約９０％、少なくとももしくは約９５％、少なくとももしくは約９９％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約１００％同一であるアミノ酸配列を含み得る／有し得る。
【0073】
特定の実施形態では、ＡｓＣｐｆ１は、配列番号４３に示されるアミノ酸配列に対して、少なくとももしくは約７０％、少なくとももしくは約７５％、少なくとももしくは約８０％、少なくとももしくは約８５％、少なくとももしくは約９０％、少なくとももしくは約９５％、少なくとももしくは約９９％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約１００％同一であるアミノ酸配列を含み得／有し得、ＡｓＣｐｆ１は、Ｄ９０８、Ｅ９９３、Ｒ１２２６、及びＤ１２６３を含む。
【0074】
ＬｂＣｐｆ１は、以下のアミノ酸配列を含み得る（配列番号４４；Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）：ＡＡＳＫＬＥＫＦＴＮ ＣＹＳＬＳＫＴＬＲＦ ＫＡＩＰＶＧＫＴＱＥ ＮＩＤＮＫＲＬＬＶＥ ＤＥＫＲＡＥＤＹＫＧ ＶＫＫＬＬＤＲＹＹＬ ＳＦＩＮＤＶＬＨＳＩ ＫＬＫＮＬＮＮＹＩＳ ＬＦＲＫＫＴＲＴＥＫ ＥＮＫＥＬＥＮＬＥＩ ＮＬＲＫＥＩＡＫＡＦ ＫＧＡＡＧＹＫＳＬＦ ＫＫＤＩＩＥＴＩＬＰ ＥＡＡＤＤＫＤＥＩＡ ＬＶＮＳＦＮＧＦＴＴ ＡＦＴＧＦＦＤＮＲＥ ＮＭＦＳＥＥＡＫＳＴ ＳＩＡＦＲＣＩＮＥＮ ＬＴＲＹＩＳＮＭＤＩ ＦＥＫＶＤＡＩＦＤＫ ＨＥＶＱＥＩＫＥＫＩ ＬＮＳＤＹＤＶＥＤＦ ＦＥＧＥＦＦＮＦＶＬ ＴＱＥＧＩＤＶＹＮＡ ＩＩＧＧＦＶＴＥＳＧ ＥＫＩＫＧＬＮＥＹＩ ＮＬＹＮＡＫＴＫＱＡ ＬＰＫＦＫＰＬＹＫＱ ＶＬＳＤＲＥＳＬＳＦ ＹＧＥＧＹＴＳＤＥＥ ＶＬＥＶＦＲＮＴＬＮ ＫＮＳＥＩＦＳＳＩＫ ＫＬＥＫＬＦＫＮＦＤ ＥＹＳＳＡＧＩＦＶＫ ＮＧＰＡＩＳＴＩＳＫ ＤＩＦＧＥＷＮＬＩＲ ＤＫＷＮＡＥＹＤＤＩ ＨＬＫＫＫＡＶＶＴＥ ＫＹＥＤＤＲＲＫＳＦ ＫＫＩＧＳＦＳＬＥＱ ＬＱＥＹＡＤＡＤＬＳ ＶＶＥＫＬＫＥＩＩＩ ＱＫＶＤＥＩＹＫＶＹ ＧＳＳＥＫＬＦＤＡＤ ＦＶＬＥＫＳＬＫＫＮ ＤＡＶＶＡＩＭＫＤＬ ＬＤＳＶＫＳＦＥＮＹ ＩＫＡＦＦＧＥＧＫＥ ＴＮＲＤＥＳＦＹＧＤ ＦＶＬＡＹＤＩＬＬＫ ＶＤＨＩＹＤＡＩＲＮ ＹＶＴＱＫＰＹＳＫＤ ＫＦＫＬＹＦＱＮＰＱ ＦＭＧＧＷＤＫＤＫＥ ＴＤＹＲＡＴＩＬＲＹ ＧＳＫＹＹＬＡＩＭＤ ＫＫＹＡＫＣＬＱＫＩ ＤＫＤＤＶＮＧＮＹＥ ＫＩＮＹＫＬＬＰＧＰ ＮＫＭＬＰＫＶＦＦＳ ＫＫＷＭＡＹＹＮＰＳ ＥＤＩＱＫＩＹＫＮＧ ＴＦＫＫＧＤＭＦＮＬ ＮＤＣＨＫＬＩＤＦＦ ＫＤＳＩＳＲＹＰＫＷ ＳＮＡＹＤＦＮＦＳＥ ＴＥＫＹＫＤＩＡＧＦ ＹＲＥＶＥＥＱＧＹＫ ＶＳＦＥＳＡＳＫＫＥ ＶＤＫＬＶＥＥＧＫＬ ＹＭＦＱＩＹＮＫＤＦ ＳＤＫＳＨＧＴＰＮＬ ＨＴＭＹＦＫＬＬＦＤ ＥＮＮＨＧＱＩＲＬＳ ＧＧＡＥＬＦＭＲＲＡ ＳＬＫＫＥＥＬＶＶＨ ＰＡＮＳＰＩＡＮＫＮ ＰＤＮＰＫＫＴＴＴＬ ＳＹＤＶＹＫＤＫＲＦ ＳＥＤＱＹＥＬＨＩＰ ＩＡＩＮＫＣＰＫＮＩ ＦＫＩＮＴＥＶＲＶＬ ＬＫＨＤＤＮＰＹＶＩ ＧＩＤＲＧＥＲＮＬＬ ＹＩＶＶＶＤＧＫＧＮ ＩＶＥＱＹＳＬＮＥＩ ＩＮＮＦＮＧＩＲＩＫ ＴＤＹＨＳＬＬＤＫＫ ＥＫＥＲＦＥＡＲＱＮ ＷＴＳＩＥＮＩＫＥＬ ＫＡＧＹＩＳＱＶＶＨ ＫＩＣＥＬＶＥＫＹＤ ＡＶＩＡＬＥＤＬＮＳ ＧＦＫＮＳＲＶＫＶＥ ＫＱＶＹＱＫＦＥＫＭ ＬＩＤＫＬＮＹＭＶＤ ＫＫＳＮＰＣＡＴＧＧ ＡＬＫＧＹＱＩＴＮＫ ＦＥＳＦＫＳＭＳＴＱ ＮＧＦＩＦＹＩＰＡＷ ＬＴＳＫＩＤＰＳＴＧ ＦＶＮＬＬＫＴＫＹＴ ＳＩＡＤＳＫＫＦＩＳ ＳＦＤＲＩＭＹＶＰＥ ＥＤＬＦＥＦＡＬＤＹ ＫＮＦＳＲＴＤＡＤＹ ＩＫＫＷＫＬＹＳＹＧ ＮＲＩＲＩＦＡＡＡＫ ＫＮＮＶＦＡＷＥＥＶ ＣＬＴＳＡＹＫＥＬＦ ＮＫＹＧＩＮＹＱＱＧ ＤＩＲＡＬＬＣＥＱＳ ＤＫＡＦＹＳＳＦＭＡ ＬＭＳＬＭＬＱＭＲＮ ＳＩＴＧＲＴＤＶＤＦ ＬＩＳＰＶＫＮＳＤＧ ＩＦＹＤＳＲＮＹＥＡ ＱＥＮＡＩＬＰＫＮＡ ＤＡＮＧＡＹＮＩＡＲ ＫＶＬＷＡＩＧＱＦＫ ＫＡＥＤＥＫＬＤＫＶ ＫＩＡＩＳＮＫＥＷＬ ＥＹＡＱＴＳＶＫ
【0075】
特定の実施形態では、ＬｂＣｐｆ１は、配列番号４４に示されるアミノ酸配列に対して、少なくとももしくは約７０％、少なくとももしくは約７５％、少なくとももしくは約８０％、少なくとももしくは約８５％、少なくとももしくは約９０％、少なくとももしくは約９５％、少なくとももしくは約９９％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約１００％同一であるアミノ酸配列を含み得る。
【0076】
特定の実施形態では、ＬｂＣｐｆ１は、配列番号４４に示されるアミノ酸配列に対して、少なくとももしくは約７０％、少なくとももしくは約７５％、少なくとももしくは約８０％、少なくとももしくは約８５％、少なくとももしくは約９０％、少なくとももしくは約９５％、少なくとももしくは約９９％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約１００％同一であるアミノ酸配列を含み得、ＡｓＣｐｆ１は、Ｄ８３３を含む。
【0077】
特定の実施形態では、エフェクタードメインは、ＴＥＴ２、Ｄｎｍｔ３ｂ、またはＣＴＣＦである。特定の実施形態では、エフェクタードメインは、ポリペプチドがＤＮＡループを改変できるＣＴＣＦである。
【0078】
本開示は、細胞のエピゲノムを改変する方法を提供する。この方法は、細胞を本発明のシステムと接触させることを含み得る。
【0079】
本開示は、患者の疾患を治療する方法を提供する。この方法は、本発明のシステムを患者に投与することを含み得る。
【0080】
本発明のポリペプチド（複数可）／システムは、細胞のエピゲノムまたは細胞内のゲノム配列を改変するための方法において使用され得る。この方法は、細胞を本発明のシステム／ポリヌクレオチド（複数可）と接触させることを含む。ゲノム配列は、任意の適切なゲノム配列であり得る。特定の実施形態では、ゲノム配列は、ＢＤＮＦプロモーターでなくてもよいし、ＢＤＮＦプロモーターであってもよく、またはＭｙｏＤのエンハンサーであってもよい。
【0081】
本発明のシステム／方法は、正確な遺伝子活性化またはサイレンシングを可能にし得る。本発明のシステム／方法は、１つを超えるゲノム遺伝子座の多重編集を可能にすることができる。本発明のシステム／方法は、単一のベクターを使用して複数の部位でエピゲノム編集を可能にすることができる。
【0082】
米国特許出願公開第２０１９０３５９９５９号は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0083】
本開示は、細胞中のＸ連鎖病関連遺伝子またはインプリンティング関連疾患関連遺伝子を改変するための方法を提供する。特定の実施形態では、本発明のシステム／方法を使用して障害／疾患を治療することができる。例えば、システム／方法を適用して、表１から選択されるＸ連鎖病に関連する遺伝子、または表２から選択されるインプリンティング関連疾患に関連する遺伝子の野生型対立遺伝子を、エピジェネティック編集によって再活性化することができる。
【0084】
本発明のシステムは、表１から選択されるＸ連鎖病に関連する遺伝子、または表２から選択されるインプリンティング関連疾患に関連する遺伝子などの疾患関連遺伝子に関連する標的配列を標的とし得る。
【0085】
表１及び表２は、本発明のシステム／方法を使用して治療及び／または修正することができる疾患及び疾患関連遺伝子の例示的なリストを提供する。
【0086】
特定の実施形態では、疾患関連遺伝子は、メチルＣｐＧ結合タンパク質２（ＭｅＣＰ２）である。ＭＥＣＰ２は構成的ヘテロクロマチンの重要な構成要素であり、染色体の維持と転写サイレンシングに重要である（Ｊａｎｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｈｅｔｅｒｏｃｈｒｏｍａｔｉｎ：ｇｕａｒｄｉａｎ ｏｆ ｔｈｅ ｇｅｎｏｍｅ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．３４，２６５－２８８（２０１８）．Ａｌｌｓｈｉｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｎ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｈｅｔｅｒｏｃｈｒｏｍａｔｉｎ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１９，２２９－２４４（２０１８）．Ｌｙｓｔ ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｔｔ ｓｙｎｄｒｏｍｅ：ａ ｃｏｍｐｌｅｘ ｄｉｓｏｒｄｅｒ ｗｉｔｈ ｓｉｍｐｌｅ ｒｏｏｔｓ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．１６，２６１－２７５（２０１５））。ＭＥＣＰ２遺伝子における変異は、進行性の神経発達障害であるレット症候群を引き起こし（Ｉｐ ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｔｔ ｓｙｎｄｒｏｍｅ：ｉｎｓｉｇｈｔｓ ｉｎｔｏ ｇｅｎｅｔｉｃ，ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ ｃｉｒｃｕｉｔ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１９，３６８－３８２（２０１８）．Ａｍｉｒ ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｔｔ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｉｓ ｃａｕｓｅｄ ｂｙ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｘ－ｌｉｎｋｅｄ ＭＥＣＰ２，ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｍｅｔｈｙｌ－ＣｐＧ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ２，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２３，１８５－１８８（１９９９））、これは幼児期の女児に影響を及ぼす重度の精神障害及び自閉症のような症状に関連している。現在、ＲＴＴに対して承認された治療法はない。
【0087】
【表1-1】
【表1-2】
【表1-3】
【表1-4】
【表2-1】
【表2-2】
【表2-3】
【0088】
いくつかの態様では、１つ以上の核局在化配列（ＮＬＳ）が触媒的に不活性な部位特異的ヌクレアーゼ（例えば、ｄＣｐｆ１、ｄＣａｓ９など）とエフェクタードメインとの間に融合されている。
【0089】
特定の態様では、標的配列（例えば、ゲノム配列）の１つ以上は、疾患または状態に関連している。
【0090】
特定の態様では、方法は、細胞を、ＤＮＡメチル化を阻害または増強する薬剤と接触させることをさらに含み得る。薬剤は小分子であってもよい。例えば、薬剤は５－アザシチジンまたは５－アザデオキシシチジンである。
【0091】
特定の態様では、方法は、ＤＮＡメチル化を阻害または増強する薬剤を対象に投与することをさらに含み得る。薬剤は小分子であってもよい。例えば、薬剤は５－アザシチジンまたは５－アザデオキシシチジンである。
【0092】
細胞内の１つ以上の目的の遺伝子の発現を調節する方法であって、メチル化可変領域が、遺伝子の転写開始部位の５０ｋＢ以内に位置する、方法も開示される。この方法は、細胞を本発明のシステムと接触させることを含んでもよく、ガイド配列は、メチル化可変領域を標的とする。
【0093】
いくつかの態様では、メチル化可変領域は細胞内で高メチル化されており、エフェクタードメイン（例えば、Ｔｅｔ２またはＴｅｔ１）は脱メチル化活性を有する。他の態様では、メチル化可変領域は細胞内でメチル化されておらず、エフェクタードメイン（例えば、Ｄｎｍｔ３ａ）はメチル化活性を有する。
【0094】
標的配列は、メチル化可変領域（ＤＭＲ）を含み得る。メチル化可変領域は、異なる細胞型の細胞間（例えば、筋肉細胞対ニューロンまたは皮膚細胞対肝細胞）で可変的にメチル化され得る。メチル化可変領域は、罹患細胞と非罹患細胞との間（例えば、がん対非がん細胞）で可変的にメチル化され得る。メチル化可変領域は、分化状態間（例えば、前駆細胞対最終分化細胞）で可変的にメチル化され得る。１つ以上の遺伝子の発現に対する効果（例えば、改変から最大約０．５、１、２、５、１０、２０、５０、１００、５００ｋｂ以内または約１、２、５、または１０ＭＢ以内）は評価され得る。いくつかの態様では、メチル化可変領域は、高メチル化または非メチル化であり得る。
【0095】
いくつかの態様では、本発明のシステム／方法は、異常に高メチル化されたゲノム配列を脱メチル化することができるか、または異常にメチル化されていないゲノム配列をメチル化することができる。いくつかの態様では、異常に高メチル化された配列または異常にメチル化されていない配列は、疾患または障害において生じ得る。他の態様では、異常にメチル化されていないＣＴＣＦ部位（例えば、ＣＴＣＦ結合部位）をメチル化するか、または異常にメチル化されているＣＴＣＦ部位のメチル化を除去することは重要である。ＣＴＣＦ部位のメチル化または脱メチル化を変更すると、異常にメチル化されていない配列または領域、または異常に高メチル化された配列または領域を示す疾患または障害を治療または予防することができる。例えば、ＣＴＣＦループは、ＣＴＣＦ結合部位をメチル化することによって開かれ得、それにより、その遺伝子の発現を増加させたい場合（例えば、遺伝子の発現が異常に低い、及び／または治療目的またはその他の目的で発現の増加が望まれる場合）、ループの外側にある遺伝子をループ内のエンハンサーの制御下に置く。
【0096】
いくつかの態様では、本発明のシステム／方法は、プロモーター配列を改変し得る。メチル化または非メチル化のプロモーター配列への本発明のシステムの標的化は、遺伝子の発現の活性化またはサイレンシングを引き起こし得る。
【0097】
いくつかの態様では、本発明のシステム／方法は、エンハンサー配列を改変し得る。メチル化または非メチル化のエンハンサー配列への本発明のシステムの標的化は、遺伝子の発現の活性化またはサイレンシングを引き起こし得る。
【0098】
いくつかの態様では、本発明のシステム／方法は、ＣＴＣＦ結合部位を改変し得る。ＣＴＣＦ結合部位への本発明のシステムの標的化は、ＣＴＣＦ結合に影響を及ぼし得、遺伝子発現を変化させ得るＤＮＡループを妨害または増加させ得る（例えば、隣接ループにおいて）。
【0099】
特定の実施形態では、ガイド配列はＲＮＡ配列である。一態様では、単一のＲＮＡ配列は、調節または改変されているゲノム配列の１つ以上（例えば、すべて）に相補的であり得る。一態様では、単一のＲＮＡは、単一の標的ゲノム配列に相補的である。２つ以上の標的ゲノム配列が調節または改変される特定の態様では、複数（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上）のＲＮＡ配列が使用され、それぞれのＲＮＡ配列は、１つの標的ゲノム配列に相補的（特異的）である。いくつかの態様では、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、または６つ以上のＲＮＡ配列は、同じ標的配列の異なる部分に相補的（特異的）である。一態様では、２つ以上のＲＮＡ配列が、ＤＮＡの同じ領域の異なる配列に結合する。いくつかの態様では、単一のＲＮＡ配列は、ゲノム配列の少なくとも２つ以上（例えば、すべて）の標的に相補的である。１つ以上のゲノム配列に相補的なＲＮＡ配列の部分、及び触媒的に不活性な部位特異的ヌクレアーゼに結合するＲＮＡ配列の部分を、細胞、接合体、胚、または非ヒト動物へと、単一の配列または２つ（またはそれ以上）の別個の配列として導入できることも、当業者には明らかであろう。いくつかの実施形態では、触媒的に不活性な部位特異的ヌクレアーゼに結合する配列は、ステムループを含む。
【0100】
特定の実施形態では、システムは、（１つ以上の）調節領域、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ；スプライシング因子）、イントロン配列、細胞内の１つ以上のゲノム配列の染色体領域（例えば、テロメア、セントロメア）の全部または一部に相補的である１つ以上のガイド配列（または１つ以上のガイド配列をコードするポリヌクレオチド配列）を含む。いくつかの態様では、１つ以上のゲノム配列によって標的とされる調節領域は、プロモーター、エンハンサー、及び／またはオペレーター領域である。いくつかの態様では、調節領域の全部または一部が、１つ以上のガイド配列によって標的にされる。１つ以上のガイド配列によって標的とされる領域の全部または一部は、メチル化可変領域であり得る。いくつかの態様では、メチル化可変領域は、１つ以上の遺伝子（例えば、内在性遺伝子、外来性遺伝子）または（１つ以上の）転写開始部位（ＴＳＳ）の、正確に、または約２５塩基、５０塩基、１００塩基、２００塩基、３００塩基、４００塩基、５００塩基、６００塩基、７００塩基、８００塩基、９００塩基、１０００塩基、１５００塩基内、２０００塩基、５０００塩基、１００００塩基、２００００塩基、５００００塩基、またはそれ以内またはそれ以上上流にある。いくつかの態様では、メチル化可変領域は、１つ以上の遺伝子（例えば、内在性遺伝子、外来性遺伝子）またはＴＳＳの、正確に、または約２５塩基、５０塩基、１００塩基、２００塩基、３００塩基、４００塩基、５００塩基、６００塩基、７００塩基、８００塩基、９００塩基、１０００塩基、１５００塩基内、２０００塩基、５０００塩基、１００００塩基、２００００塩基、５００００塩基、またはそれ以内またはそれ以上下流にある。１つ以上のガイド配列によって標的とされる調節領域は、遺伝子（例えば、内在性または外来性）またはＴＳＳの５’末端またはその付近に完全にまたは部分的に存在し得る。遺伝子の５’末端は、非転写（フランキング）領域（例えば、プロモーターの全部または一部）及び転写領域の一部を含み得る。
【0101】
本明細書に記載される場合、１つ以上のガイド配列は、（１つ以上の）触媒的に不活性な部位特異的ヌクレアーゼに対する（１つ以上の）結合部位も含む。触媒的に不活性な部位特異的ヌクレアーゼは、ｄＣｐｆ１などの触媒的に不活性なＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質であり得る。特定の態様では、１つ以上のガイド配列が１つ以上の標的配列にハイブリダイズすると、触媒的に不活性な部位特異的ヌクレアーゼが１つ以上のガイド配列に結合する。
【0102】
一態様では、複数のゲノム配列が調節される（例えば、多重活性化）。
【0103】
特定の実施形態では、方法は、細胞を非ヒト哺乳動物に導入することをさらに含む。非ヒト哺乳動物はマウスであってもよい。
【0104】
この方法は、本発明のシステム／ポリヌクレオチド（複数可）を細胞に導入することを含み得る。
【0105】
本開示は、疾患関連遺伝子を改変する方法を提供する。この方法は、本発明のシステム／ポリヌクレオチド（複数可）を細胞に導入することを含み得る。
【0106】
特定の実施形態では、ガイド配列は、配列番号１４～３３に示されるヌクレオチド配列（または該ヌクレオチド配列の相補的配列）に対して、少なくとももしくは約７０％、少なくとももしくは約７５％、少なくとももしくは約８０％、少なくとももしくは約８５％、少なくとももしくは約９０％、少なくとももしくは約９５％、少なくとももしくは約９９％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約１００％同一であるヌクレオチド配列を含み得る。
【0107】
特定の実施形態では、ガイド配列は、配列番号１４～３３に示されるヌクレオチド配列（または該ヌクレオチド配列の相補的配列）に対して、約８０％～約１００％、少なくとももしくは約７０％、少なくとももしくは約７５％、少なくとももしくは約８０％、少なくとももしくは約８５％、少なくとももしくは約９０％、少なくとももしくは約９５％、少なくとももしくは約９９％、少なくとももしくは約８１％、少なくとももしくは約８２％、少なくとももしくは約８３％、少なくとももしくは約８４％、少なくとももしくは約８５％、少なくとももしくは約８６％、少なくとももしくは約８７％、少なくとももしくは約８８％、少なくとももしくは約８９％、少なくとももしくは約９０％、少なくとももしくは約９１％、少なくとももしくは約９２％、少なくとももしくは約９３％、少なくとももしくは約９４％、少なくとももしくは約９５％、少なくとももしくは約９６％、少なくとももしくは約９７％、少なくとももしくは約９８％、少なくとももしくは約９９％、または約１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。
【0108】
エフェクタードメインは、細胞のエピゲノムを改変する活性を有し得る。エフェクタードメインは、ゲノム配列（例えば、遺伝子）の発現及び／または活性化を調節する分子（例えば、タンパク質またはポリペプチド）であり得る。
【0109】
いくつかの態様では、エフェクタードメインは、遺伝子の一方または両方の対立遺伝子を改変する。エフェクタードメインは、核酸配列及び／またはタンパク質として導入することができる。いくつかの態様では、エフェクタードメインは、構成的または誘導可能なエフェクタードメインであり得る。いくつかの態様では、Ｃａｓ（例えば、ｄＣｐｆ１）核酸配列またはそのバリアント及びエフェクタードメイン核酸配列は、キメラ配列として細胞に導入される。いくつかの態様では、エフェクタードメインは、Ｃａｓタンパク質と会合する（例えば、結合する）分子に融合される（例えば、エフェクター分子は、Ｃａｓタンパク質に結合する抗体またはその抗原結合断片に融合される）。いくつかの態様では、Ｃａｓ（例えば、ｄＣｐｆ１）タンパク質またはそのバリアント及びエフェクタードメインを融合または連結してキメラタンパク質を作成し、キメラタンパク質として細胞に導入する。いくつかの態様では、Ｃａｓ（例えば、ｄＣｐｆ１）タンパク質とエフェクタードメインは、タンパク質－タンパク質相互作用として結合する。いくつかの態様では、Ｃａｓ（例えば、ｄＣｐｆ１）タンパク質とエフェクタードメインは共有結合している。いくつかの態様では、エフェクタードメインは、Ｃａｓ（例えば、ｄＣｐｆ１）タンパク質と非共有結合する。いくつかの態様では、Ｃａｓ（例えば、ｄＣｐｆ１）核酸配列とエフェクタードメイン核酸配列は、別個の配列及び／またはタンパク質として導入される。いくつかの態様では、Ｃａｓ（例えば、ｄＣｐｆ１）タンパク質とエフェクタードメインは、融合も連結もされていない。
【0110】
本明細書に示されるように、（１つ以上の）エフェクタードメイン（例えば、生物学的に活性な部分）の全部または一部と連結された触媒的に不活性なＣａｓタンパク質（例えば、ｄＣｐｆ１）の融合は、１つ以上のゲノム配列の活性及び／または発現を調節する（例えば、転写もしくはクロマチン構成に特定の効果を発揮するか、特定の種類の分子を特定のＤＮＡ座に持ち込むか、または局所ヒストンもしくはＤＮＡ状態のセンサーとして作用する）ための１つ以上のガイド配列によって特異的なＤＮＡ部位に誘導され得るキメラタンパク質を作製する。特定の態様では、エフェクタードメインの全部または一部と連結されたｄＣｐｆ１の融合は、１つ以上のＲＮＡ配列によって特異的なＤＮＡ部位に誘導されて、１つ以上のゲノム配列のメチル化または脱メチル化を調節または改変することができるキメラタンパク質を作製する。本明細書で使用される場合、「エフェクタードメインの生物学的に活性な部分」は、エフェクタードメイン（例えば、「最小」または「コア」ドメイン）の機能を（例えば、完全に、部分的に、最小限に）維持する部分である。
【0111】
エフェクタードメインは、ＤＮＡのメチル化状態を改変する酵素であり得る。エフェクタードメインは、メチル化活性または脱メチル化活性（例えば、ＤＮＡメチル化またはＤＮＡ脱メチル化活性）を有し得る。例えば、エフェクタードメインは、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（Ｄｎｍｔ３ｂ及びＤｍｎｔ３ａなどのＤＮＭＴ）または１０－１１転座（ＴＥＴ）メチルシトシンジオキシゲナーゼタンパク質（Ｔｅｔ２またはＴｅｔ１など）であり得る。エフェクタードメインは、ＡＣＩＤＡ、ＭＢＤ４、Ａｐｏｂｅｃ１、Ａｐｏｂｅｃ２、Ａｐｏｂｅｃ３、Ｔｄｇ、Ｇａｄｄ４５ａ、Ｇａｄｄ４５ｂ、またはＲＯＳ１であってよく、エフェクタードメインは、Ｄｎｍｔ１、Ｄｎｍｔ３ａ、Ｄｎｍｔ３ｂ、ＣｐＧメチルトランスフェラーゼＭ．ＳｓｓＩ、またはＭ．ＥｃｏＨＫ３ ＩＩであり得る。
【0112】
エフェクタードメインは、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ（ＨＡＴ）、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）、ヒストンメチルトランスフェラーゼ（ＨＭＴ）、またはヒストンデメチラーゼ（例えば、ＬＳＤ１）などのヒストンサブユニットを修飾する酵素であり得る。一実施形態では、ＨＡＴはｐ３００である。
【0113】
エフェクタードメインは、野生型ＣＴＣＦまたはＤＮＡ結合変異体ＣＴＣＦを含むＣＴＣＦであり得る。特定の実施形態では、ＤＮＡ結合変異体ＣＴＣＦは、次の変異：Ｋ３６５Ａ、Ｒ３６８Ａ、Ｒ３９６Ａ、及びＱ４１８Ａのうちの１つ以上を含む。
【0114】
エフェクタードメインは、転写活性化ドメイン、例えば、ＶＰ６４、ＶＰＲ、またはＮＦ－κＢ ｐ６５に由来する転写活性化ドメインであり得る。エフェクタードメインは、転写サイレンサー（ヘテロクロマチンタンパク質１（ＨＰ１）、もしくはメチルＣｐＧ結合タンパク質２（ＭｅＣＰ２））、または転写抑制ドメイン（例えば、クルッペル関連ボックス（ＫＲＡＢ）ドメイン、ＥＲＦリプレッサードメイン（ＥＲＤ）、もしくはｍＳｉｎ３Ａ相互作用ドメイン（ＳＩＤ））であり得る。
【0115】
エフェクタードメインの例としてはまた、転写（ａｌ）活性化ドメイン、コアクチベータードメイン、転写因子、転写休止解除因子ドメイン、転写伸長ドメインの負の調節因子、転写リプレッサードメイン、クロマチンオーガナイザードメイン、リモデラードメイン、ヒストン修飾ドメイン、ＤＮＡ修飾ドメイン、及びＲＮＡ結合ドメインが挙げられる。エフェクタードメインの他の例としては、ヒストンマークリーダー／インタラクター、及びＤＮＡ修飾リーダー／インタラクターが挙げられる。
【0116】
本発明の一態様では、ｄＣｐｆ１のエフェクタードメインへの融合は、全長または部分長エフェクタードメインの単一コピーまたは複数／タンデムコピーの融合であり得る。他の融合は、エフェクタードメインの分割（機能的に相補的な）バージョンとの融合であり得る。
【0117】
エフェクタードメインの他の例は、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１４１７２４７０号及び米国出願公開第ＵＳ２０１６０１８６２０８号に記載されており、これらは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【0118】
いくつかの態様では、Ｃａｓ（例えば、ｄＣｐｆ１）タンパク質は、エフェクタードメインのＮ末端またはＣ末端に融合することができる。
【0119】
一態様では、ｄＣｐｆ１と１つ以上のエフェクタードメインの全部または一部との融合は、１つ以上のリンカーを含む。一態様では、リンカーは、１つ以上のアミノ酸を含む。いくつかの態様では、リンカーは、２つ以上のアミノ酸を含む。一態様では、リンカーはアミノ酸配列ＧＳを含む。いくつかの態様では、Ｃａｓ（例えば、ｄＣｐｆ１）と２つ以上のエフェクタードメインとの融合は、ドメイン間に散在する１つ以上のリンカー（例えば、ＧＳリンカー）を含む。いくつかの態様では、１つ以上の核局在化配列は、触媒的に不活性なヌクレアーゼ（例えば、ｄＣｐｆ１）とエフェクタードメインとの間に位置し得る。例えば、融合タンパク質は、ｄＣｐｆ１－ＮＬＳ－Ｔｅｔ２、ｄＣｐｆ１－ＮＬＳ－Ｄｎｍｔ３ｂ、またはｄＣｐｆ１－ＮＬＳ－ＣＴＣＦを含み得る。
【0120】
いくつかの態様では、１つ以上のゲノム配列の１つのコピーが改変される。いくつかの態様では、細胞内の１つ以上のゲノム配列の両方のコピーが改変される。いくつかの態様では、改変される１つ以上のゲノム配列は、細胞にとって内在性である。特定の態様では、ゲノム配列の少なくとも２つは内在性ゲノム配列である。いくつかの態様では、ゲノム配列の少なくとも２つは外来性ゲノム配列である。少なくとも２つのゲノム配列が存在するいくつかの態様では、ゲノム配列の少なくとも１つは内在性ゲノム配列であり、ゲノム配列の少なくとも１つは外来性ゲノム配列である。いくつかの態様では、ゲノム配列の少なくとも２つは内在性遺伝子である。いくつかの態様では、ゲノム配列の少なくとも２つは外来性遺伝子である。少なくとも２つのゲノム配列が存在するいくつかの態様では、ゲノム配列の少なくとも１つは内在性遺伝子であり、ゲノム配列の少なくとも１つは外来性遺伝子である。いくつかの態様では、ゲノム配列の少なくとも２つは、少なくとも１ｋＢ離れている。いくつかの態様では、ゲノム配列の少なくとも２つは異なる染色体上にある。
【0121】
本方法は、細胞における多重エピゲノム編集を提供し得る。いくつかの態様では、本明細書に記載の方法は、本明細書に記載の方法を使用して、（単一の）細胞内のゲノム配列（例えば、遺伝子）の、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０などの改変を可能にする。特定の態様では、１つのゲノム配列が（単一の）細胞において改変される。いくつかの態様では、２つのゲノム配列が（単一の）細胞において改変される。いくつかの態様では、３つのゲノム配列が（単一の）細胞において改変される。いくつかの態様では、４つのゲノム配列が（単一の）細胞において改変される。いくつかの態様では、５つのゲノム配列が（単一の）細胞において改変される。
【0122】
「調節する」または「改変する」とは、目的のレベル（発現レベル）、活性、プロセス、経路、または現象の質的または量的変化、変化、または改変を引き起こすかまたは促進することを意味する。非限定的に、そのような変化は、プロセス、経路、または現象のさまざまな構成要素または枝の相対的な強さまたは活性の増加、減少、または変化であり得る。
【0123】
本発明のシステム／方法は、対象及び／または細胞への投与（または細胞との接触）後、約２時間で、約５時間で、約１０時間で、約２４時間で、約１日間で、約２日間で、約３日間で、約４日間で、約５日間で、約６日間で、約１週間で、約２週間で、約３週間で、約４週間で、約５週間で、約６週間で、約７週間で、約８週間で、約９週間で、約１０週間で、約１１週間で、約１か月間で、約２か月間で、約３か月間で、約４か月間で、約５か月間で、約６か月間で、約１週間～約２週間で、または異なる時間枠内で、少なくとももしくは約１０％、少なくとももしくは約１５％、少なくとももしくは約２０％、少なくとももしくは約２５％、少なくとももしくは約３０％、少なくとももしくは約３５％、少なくとももしくは約４０％、少なくとももしくは約４５％、少なくとももしくは約５０％、少なくとももしくは約５５％、少なくとももしくは約６０％、少なくとももしくは約６５％、少なくとももしくは約７０％、少なくとももしくは約７５％、少なくとももしくは約８０％、少なくとももしくは約８５％、少なくとももしくは約９０％、少なくとももしくは約９１％、少なくとももしくは約９２％、少なくとももしくは約９３％、少なくとももしくは約９４％、少なくとももしくは約９５％、少なくとももしくは約９６％、少なくとももしくは約９７％、少なくとももしくは約９８％、または少なくとももしくは約９９％で、少なくとも１つの（野生型）遺伝子またはタンパク質の発現レベルまたは活性の増加、または少なくとも１つの（変異）遺伝子またはタンパク質の発現レベルまたは活性の減少をもたらし得る。
【0124】
対象及び／または細胞への投与（または細胞との接触）後、約２時間で、約５時間で、約１０時間で、約２４時間で、約１日間で、約２日間で、約３日間で、約４日間で、約５日間で、約６日間で、約１週間で、約２週間で、約３週間で、約４週間で、約５週間で、約６週間で、約７週間で、約８週間で、約９週間で、約１０週間で、約１１週間で、約１か月間で、約２か月間で、約３か月間で、約４か月間で、約５か月間で、約６か月間で、約１週間～約２週間で、または異なる時間枠内で、標的配列（例えば、第１の標的配列）を含まないポリヌクレオチドと比較して、約１％～約１００％、約５％～約９０％、約１０％～約８０％、約５％～約７０％、約５％～約６０％、約１０％～約５０％、約１５％～約４０％、約５％～約２０％、約１％～約２０％、約１０％～約３０％、少なくとももしくは約５％、少なくとももしくは約１０％、少なくとももしくは約１５％、少なくとももしくは約２０％、少なくとももしくは約３０％、少なくとももしくは約４０％、少なくとももしくは約５０％、少なくとももしくは約６０％、少なくとももしくは約７０％、少なくとももしくは約８０％、少なくとももしくは約９０％、少なくとももしくは約１００％、約１０％～約９０％、約１２．５％～約８０％、約２０％～約７０％、約２５％～約６０％、または約２５％～約５０％、少なくとももしくは約２倍、少なくとももしくは約３倍、少なくとももしくは約４倍、少なくとももしくは約５倍、少なくとももしくは約６倍、少なくとももしくは約７倍、少なくとももしくは約８倍、少なくとももしくは約９倍、少なくとももしくは約１０倍、少なくとももしくは約１．５倍、少なくとももしくは約２．５倍、少なくとももしくは約３．５倍、少なくとももしくは約１５倍、少なくとももしくは約２０倍、少なくとももしくは約５０倍、少なくとももしくは約１００倍、少なくとももしくは約１２０倍、約２倍～約５００倍、約１．１倍～約１０倍、約１．１倍～約５倍、約１．５倍～約５倍、約２倍～約５倍、約３倍～約４倍、約５倍～約１０倍、約５倍～約２００倍、約１０倍～約１５０倍、約１０倍～約２０倍、約２０倍～約１５０倍、約２０倍～約５０倍、約３０倍～約１５０倍、約５０倍～約１００倍、約７０倍～約１５０倍、約１００倍～約１５０倍、約１０倍～約１００倍、約１００倍～約２００倍、（野生型）遺伝子またはタンパク質の発現レベル及び／または活性は増加し得るか、または（変異型）遺伝子またはタンパク質の発現レベル及び／または活性は減少し得る。
【0125】
ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムのＣａｓ酵素は、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ１０、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂｌ、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、Ｃｐｆ１、そのホモログ、そのオルソログ、またはその改変版であり得る。
【0126】
一実施形態では、Ｃａｓ酵素はＣｐｆ１である。
【0127】
一例として、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓは、例えば治療用途のためにウイルスベクターによってコードされ得る。
【0128】
ｇＲＮＡ（またはｃｒＲＮＡ、またはｓｇＲＮＡ）は、標的配列（「標的領域」または「標的ＤＮＡ」）に対して、完全に相補的または実質的に相補的（例えば、少なくとも約７０％（例えば、少なくとももしくは約７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上相補的））であり得る。特定の実施形態では、ｇＲＮＡ（またはｃｒＲＮＡ、もしくはｓｇＲＮＡ）配列（またはｇＲＮＡ（またはｃｒＲＮＡ、もしくはｓｇＲＮＡ）の標的化セグメント）は、標的配列に対して１００％の相補性を有する。ｇＲＮＡ（またはｃｒＲＮＡ、もしくはｓｇＲＮＡ）の標的化セグメントは、標的配列と完全な相補性を有し得る。ｇＲＮＡ（またはｃｒＲＮＡ、もしくはｓｇＲＮＡ）の標的化セグメントは、標的配列と部分的な相補性を有し得る。特定の実施形態では、ｇＲＮＡ（またはｃｒＲＮＡ、もしくはｓｇＲＮＡ）の標的化セグメントは、標的配列の対応するヌクレオチドと相補的でない（ミスマッチ）１、２、３、４、５、６、７、または８個のヌクレオチドを有するか、または含む。
【0129】
特定の実施形態では、ｇＲＮＡ（またはｃｒＲＮＡ、もしくはｓｇＲＮＡ）は、約１０ヌクレオチド～約１５０ヌクレオチドの長さである。
【0130】
特定の実施形態では、ｇＲＮＡ（またはｃｒＲＮＡ、もしくはｓｇＲＮＡ）の標的化セグメントは、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６ヌクレオチドの長さである。特定の実施形態では、ｇＲＮＡ（またはｃｒＲＮＡ、もしくはｓｇＲＮＡ）の標的化セグメントは、１０～１００、１０～９０、１０～８０、１０～７０、１０～６０、１０～５０、１０～４０、１０～３０、１０～２０、または１０～１５ヌクレオチドの長さである。特定の実施形態では、ｇＲＮＡ（またはｃｒＲＮＡ、もしくはｓｇＲＮＡ）の標的化セグメントは、２０～１００、２０～９０、２０～８０、２０～７０、２０～６０、２０～５０、２０～４０、２０～３０、または２０～２５ヌクレオチドの長さである。
【0131】
一実施形態では、相補性の程度は、ｇＲＮＡ（またはｃｒＲＮＡ、もしくはｓｇＲＮＡ）の他の特性とともに、標的核酸へのＣａｓ分子の標的化を可能にするのに十分である。
【0132】
いくつかの実施形態では、標的配列は、必須遺伝子または非必須遺伝子内に位置する。一実施形態では、標的配列は、本明細書に記載の遺伝子（例えば、疾患関連遺伝子）に由来し得る。
【0133】
本開示は、本明細書に記載のシステム；本明細書に記載のポリペプチド（複数可）；本明細書に記載の核酸（複数可）；本明細書に記載のベクター（複数可）；または本明細書に記載の組成物を含む細胞を提供する。
【0134】
細胞は、脊椎動物、哺乳動物（例えば、ヒト）、げっ歯類、ヤギ、ブタ、トリ、ニワトリ、シチメンチョウ、ウシ、ウマ、ヒツジ、魚類、または霊長類の細胞であり得る。細胞は植物細胞であってもよい。いくつかの実施形態では、細胞は、ヒト細胞である。
【0135】
細胞は、体細胞、幹細胞、有糸分裂細胞または有糸分裂後の細胞、ニューロン、線維芽細胞、または接合体であり得る。細胞、接合体、胚、または出生後の哺乳動物は、脊椎動物（例えば、哺乳動物）由来であり得る。いくつかの態様では、脊椎動物は哺乳類または鳥類である。特定の例としては、霊長類（例えば、ヒト）、げっ歯類（例えば、マウス、ラット）、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヤギ、ブタ、または鳥類（例えば、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、シチメンチョウ）の細胞、接合体、胚、または出生後の哺乳動物が挙げられる。いくつかの実施形態では、細胞、接合体、胚、または出生後の哺乳動物が単離される（例えば、単離された細胞、単離された接合体、単離された胚）。いくつかの実施形態では、マウス細胞、マウス接合体、マウス胚、またはマウスの出生後の哺乳動物が使用される。いくつかの実施形態では、ラット細胞、ラット接合体、ラット胚、またはラットの出生後の哺乳動物が使用される。いくつかの実施形態では、ヒト細胞、ヒト接合体、またはヒト胚が使用される。
【0136】
細胞は、体細胞、生殖細胞、または出生前細胞であり得る。細胞は、接合体、胚盤胞または胚細胞、幹細胞、有糸分裂コンピテント細胞、減数分裂コンピテント細胞であり得る。
【0137】
本発明のシステムまたは組成物は、細胞、接合体、胚、ヒト対象、または非ヒト哺乳動物に導入され得る。
【0138】
一実施形態では、細胞は、がん細胞または疾患もしくは障害を特徴とする他の細胞である。
【0139】
一実施形態では、標的配列は、ヒト細胞の核酸に由来する。一実施形態では、標的配列は、体細胞、生殖細胞、出生前細胞、例えば、接合体、胚盤胞または胚、胚盤胞細胞、幹細胞、有糸分裂コンピテント細胞、減数分裂コンピテント細胞の核酸に由来する。
【0140】
一実施形態では、標的配列は染色体核酸に由来する。一実施形態では、標的配列はオルガネラ核酸に由来する。一実施形態では、標的配列はミトコンドリア核酸に由来する。一実施形態では、標的配列は葉緑体核酸に由来する。
【0141】
一実施形態では、細胞は、望ましくない増殖を特徴とする細胞、例えば、がん細胞である。一実施形態では、細胞は、ウイルスに感染した細胞、細菌に感染した細胞などの、望ましくないゲノム成分（例えば、ウイルスのゲノム成分）を特徴とする細胞である。
【0142】
本開示は、本明細書に記載のポリペプチド（複数可）；本明細書に記載の核酸（複数可）；本明細書に記載のベクター（複数可）；本明細書に記載のシステム；または本明細書に記載の細胞を含む医薬組成物を提供する。
【0143】
本開示は、細胞のエピゲノムを調節する方法を提供する。この方法は、細胞を本発明のポリヌクレオチド（複数可）（核酸（複数可））、本発明のシステム、または本発明の組成物と接触させることを含み得る。
【0144】
一態様では、本開示は、細胞を改変する方法、例えば細胞の標的核酸の構造、例えば配列を改変する方法であって、細胞を本発明のポリヌクレオチド（複数可）（核酸（複数可））、本発明のシステム、または本発明の組成物と接触させることを含む方法を特徴とする。
【0145】
別の態様では、本開示は、対象を治療する方法を特徴とする。この方法は、有効量の本発明のポリヌクレオチド（複数可）（核酸（複数可））、本発明のシステム、または本発明の組成物を対象に投与する（または対象の細胞に接触させる）ことを含み得る。
【0146】
本開示は、対象における疾患または状態を治療する方法を提供する。この方法は、本発明のポリヌクレオチド（複数可）（核酸（複数可））、本発明の組成物、本発明のシステム、または本発明の細胞を対象に投与することを含み得る。
【0147】
一実施形態では、対象は動物または植物である。一実施形態では、対象は、哺乳動物、霊長類、またはヒトである。
【0148】
本開示は、本明細書に記載のポリペプチド（複数可）；本明細書に記載の核酸（複数可）；本明細書に記載のベクター（複数可）；本明細書に記載のシステム；または本明細書に記載の組成物を含むキットを提供する。キットは、本明細書に記載の方法において、システム、ポリペプチド（複数可）、核酸（複数可）、ベクター（複数可）、または組成物を使用するための使用説明書を含み得る。
【0149】
本発明のシステム／方法は、本明細書に記載のＸ連鎖病または本明細書に記載のインプリンティング関連疾患を治療するために使用することができる。
【0150】
本開示は、細胞中のＸ連鎖病関連遺伝子またはインプリンティング関連疾患関連遺伝子を改変するための方法を提供する。この方法は、細胞を本発明のシステム／ポリヌクレオチド（複数可）または組成物と接触させることを含み得る。
【0151】
細胞は、Ｘ連鎖病またはインプリンティング関連疾患などの疾患を有する対象由来のものであり得る。細胞は、Ｘ連鎖病またはインプリンティング関連疾患などの疾患を有する対象由来の細胞に由来し得る。
【0152】
細胞は、幹細胞、ニューロン、有糸分裂後の細胞、または線維芽細胞であり得る。いくつかの態様では、細胞はヒト細胞またはマウス細胞である。
【0153】
細胞は、例えば対象の線維芽細胞に由来する誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）であり得る。細胞はＥＳＣであってもよい。
【0154】
この方法は、ｉＰＳＣまたはＥＳＣを培養して、例えばニューロンに分化させることをさらに含んでもよい。この方法は、分化細胞（例えば、ニューロン）を対象に投与することをさらに含んでもよい。
【0155】
細胞は、対象にとって自家性または同種異系であり得る。
【0156】
本開示は、対象におけるＸ連鎖病またはインプリンティング関連疾患を治療するための方法を提供する。この方法は、治療有効量の本発明のシステム、ポリヌクレオチド（複数可）、または組成物を対象に投与することを含み得る。
【0157】
「疾患」、「障害」、または「状態」という用語は交換可能に使用され、生物の健康状態及び／または正常な機能からのいずれかの変化、例えば、罹患した個人に対して、疼痛、不快感、機能障害、苦痛、変性、または死を引き起こす身体または心の異常を指し得る。疾患には、当業者に知られている任意の疾患が含まれる。例としては、例えば、パーキンソン病、アルツハイマー病、がん、高血圧、糖尿病（例えば、ＩＩ型糖尿病）、循環器疾患、及び脳卒中（虚血性、出血性）が挙げられる。
【0158】
いくつかの実施形態では、疾患は、精神疾患、神経疾患、神経発達疾患、神経変性疾患、循環器疾患、自己免疫疾患、がん、代謝疾患、または呼吸器疾患である。いくつかの実施形態では、疾患は、精神疾患、神経疾患、または神経発達疾患、例えば、統合失調症、うつ病、双極性障害、てんかん、自閉症、依存症である。神経変性疾患としては、例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、前頭側頭型認知症が挙げられる。
【0159】
いくつかの実施形態では、疾患は、自己免疫疾患、例えば、急性播種性脳脊髄炎、円形脱毛症、抗リン脂質症候群、自己免疫性肝炎、自己免疫性心筋炎、自己免疫性膵炎、自己免疫性多内分泌症候群、自己免疫性ぶどう膜炎、炎症性腸疾患（クローン病、潰瘍性大腸炎）、Ｉ型糖尿病（例えば、若年性糖尿病）、多発性硬化症、強皮症、強直性脊椎炎、サルコイド、尋常性天疱瘡、類天疱瘡、乾癬、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、若年性関節炎、乾癬性関節炎、ベーチェット症候群、ライター病、バーガー病、皮膚筋炎、多発性筋炎、抗好中球細胞質抗体関連血管炎（例えば、多発血管炎性肉芽腫症（ウェゲナー肉芽腫症としても知られる）、顕微鏡的多発血管炎、及びチャーグ・ストラウス症候群）、強皮症、シェーグレン症候群、抗糸球体基底膜疾患（グッドパスチャー症候群を含む）、拡張型心筋症、原発性胆汁性肝硬変、甲状腺炎（例、橋本甲状腺炎、バセドウ病）、横断性脊髄炎、及びギラン・バレー症候群である。
【0160】
いくつかの実施形態では、疾患は呼吸器疾患、例えば、呼吸器系に影響を及ぼすアレルギー、喘息、慢性閉塞性肺疾患、肺高血圧症、肺線維症、及びサルコイドーシスである。
【0161】
いくつかの実施形態では、疾患は腎疾患、例えば、多発性嚢胞腎、ループス、腎症（ネフローゼもしくは腎炎）、または糸球体腎炎（任意の種類）である。
【0162】
いくつかの実施形態では、疾患は、例えば、加齢に関連する視力喪失または難聴である。
【0163】
いくつかの実施形態では、疾患は、感染症、例えば、ウイルス、細菌、真菌、または寄生生物によって引き起こされる任意の疾患である。
【0164】
いくつかの実施形態では、疾患は、ゲノム配列において高メチル化（例えば、異常な高メチル化）または非メチル化（例えば、異常な非メチル化）を示す。例えば、脆弱Ｘ症候群はＦＭＲ－１の高メチル化を示す。本発明のシステムは、ＣＣＧ過剰メチル化を特異的に脱メチル化し、ＦＭＧ－１を再活性化し、それによって脆弱Ｘ症候群を治療するために使用することができる。本明細書に記載の方法は、異常なメチル化（例えば、過剰メチル化または非メチル化）を示す疾患または障害を治療または予防するために使用することができる。
【0165】
ポリヌクレオチド／ベクターは、組換えレンチウイルスベクター、またはＡＡＶ２ベクターもしくはＡＡＶ８ベクターなどのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターであり得る。
【0166】
本発明のシステムは、任意の適切な手段によって送達され得る。特定の実施形態では、システムは、インビボで送達される。他の実施形態では、システムは、対象／患者へのインビボ送達に有用な改変細胞を提供するために、インビトロで単離／培養された細胞（例えば、自家ｉＰＳＣ細胞）に送達される。
【0167】
本開示に記載のウイルス粒子の注射の代替として、細胞補充療法を使用して疾患を予防、是正、または治療することができ、本開示の方法は、単離された患者の細胞（エクスビボ）に適用され、その後に、「修正された」細胞を患者に戻すことが続く。
【0168】
一実施形態では、本開示は、本発明のシステムまたは組成物を真核細胞に導入することを提供する。
【0169】
細胞は幹細胞であってもよい。幹細胞の例としては、多能性、全能性、多分化能、及び単能性幹細胞が挙げられる。多能性幹細胞の例としては、胚性幹細胞、胚性生殖細胞、胎児性幹細胞、成体幹細胞、胚性癌細胞、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）が挙げられる。
【0170】
細胞は体細胞であってもよい。体細胞は、動物から新たに単離されたものなどの初代細胞（非不死化細胞）であってもよく、培養中の長期増殖（例えば、３か月以上）または無限増殖（不死化細胞）が可能な細胞株に由来してもよい。成体の体細胞は、個体、例えばヒト対象から得ることができ、当業者が利用できる標準的な細胞培養プロトコールに従って培養することができる。本発明の態様で使用される体細胞としては、例えば、ヒト細胞、非ヒト霊長類細胞、またはげっ歯類（例えば、マウス、ラット）の細胞などの哺乳動物細胞が挙げられる。それらは、一般に生きた体細胞を含む器官または組織から、例えば、皮膚、肺、膵臓、肝臓、胃、腸、心臓、乳房、生殖器、筋肉、血液、膀胱、腎臓、尿道及び他の泌尿器などのさまざまな器官から周知の方法によって得ることができる。さまざまな実施形態において有用な哺乳動物の体細胞としては、例えば、線維芽細胞、セルトリ細胞、顆粒膜細胞、ニューロン、膵臓細胞、表皮細胞、上皮細胞、内皮細胞、肝細胞、毛包細胞、ケラチノサイト、造血細胞、メラノサイト、軟骨細胞、リンパ球（Ｂリンパ球及びＴリンパ球）、マクロファージ、単球、単核細胞、心筋細胞、骨格筋細胞などが挙げられる。
【0171】
神経疾患の治療のために、患者のｉＰＳＣ細胞を単離し、エクスビボでニューロンに分化させることができる。疾患関連遺伝子の変異によって特徴付けられる患者のｉＰＳＣ細胞またはニューロンは、疾患関連遺伝子の野生型対立遺伝子の発現またはサイレンシング（例えば、疾患関連遺伝子の転写がブロックされている）をもたらす様式で、本開示の方法を用いて操作することができる。
【0172】
「誘導多能性幹細胞」は、一般にｉＰＳ細胞またはｉＰＳＣと略され、非多能性細胞、典型的には成体体細胞、または、再プログラミング因子と呼ばれる特定の因子を導入することにより、線維芽細胞、造血細胞、筋細胞、ニューロン、表皮細胞などの最終分化細胞から人工的に調製されたタイプの多能性幹細胞を指す。
【0173】
本方法は、ｉＰＳ細胞を分化細胞、例えばニューロンに分化させることをさらに含んでもよい。
【0174】
例えば、患者の線維芽細胞を皮膚生検から採取し、ｉＰＳ細胞に形質転換することができる（Ｄｉｍｏｓ ＪＴ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ＡＬＳ ｃａｎ ｂｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ ｉｎｔｏ ｍｏｔｏｒ ｎｅｕｒｏｎｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２１：１２１８－１２２１；Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ４，５８２－５８３（Ｎｏｖｅｍｂｅｒ ２００８）、Ｌｕｏ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ｓｋｉｎ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ ｏｆ ａ ｐａｔｉｅｎｔ ｗｉｔｈ ｏｌｉｖｏｐｏｎｔｏｃｅｒｅｂｅｌｌａｒ ａｔｒｏｐｈｙ，Ｔｏｈｏｋｕ Ｊ．Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．２０１２，２２６（２）：１５１－９）。ＣＲＩＳＰＲを介した改変は、この段階で行うことができる。修正された細胞クローンは、ＲＦＬＰアッセイによってスクリーニング及び選択できる。次いで、修正された細胞クローンを例えばニューロンに分化させ、そのニューロン特異的マーカーについて試験する。十分に分化したニューロンは、ドナー患者に自家移植することができる。
【0175】
細胞は、細胞を投与される対象に対して自家性または同種異系であり得る。
【0176】
「自家性」という用語は、それが後に個体に再導入される同じ個体に由来する任意の材料を指す。
【0177】
「同種異系」という用語は、材料が導入される個体と同じ種の異なる動物に由来する任意の材料を指す。同じ種の２つ以上の個体は、互いに同種異系であると言われる。
【0178】
対象に投与される細胞療法のための修正された細胞。本開示に記載される細胞（例えば、ニューロン）は、薬学的に許容される担体とともに製剤化され得る。例えば、細胞は、単独で、または医薬製剤の成分として投与することができる。細胞（例えば、ニューロン）は、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、溶質もしくは懸濁剤もしくは増粘剤を含んでもよい、１つ以上の薬学的に許容される滅菌等張水溶液もしくは非水溶液（例えば、平衡塩類溶液（ＢＳＳ））、分散液、懸濁液もしくはエマルション、または使用直前の無菌の注射用の溶液または分散液に再構成され得る無菌粉末と組み合わせて投与され得る。
【0179】
本開示に従って治療することができる対象には、本発明から利益を得ることができるすべての動物が含まれる。そのような対象としては、哺乳動物、好ましくはヒト（幼児、小児、青年及び／または成人）が含まれるが、イヌ及びネコなどの動物、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマ、ヤギなどの家畜、及び実験室の動物（例えば、ラット、マウス、モルモットなど）であってもよい。
【0180】
「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド」、「ヌクレオチド配列」、「核酸」、及び「オリゴヌクレオチド」という用語は、交換可能に使用される。これらの用語は、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチド、またはそれらの類似体のいずれかである、任意の長さのポリマー形態のヌクレオチドを指す。ポリヌクレオチドの例としては、ＤＮＡ、遺伝子または遺伝子断片のコード領域または非コード領域、エキソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離ＤＮＡ、任意の配列の単離ＲＮＡ、核酸プローブ、及びプライマーが挙げられるが、これらに限定されない。ポリヌクレオチド配列内の１つ以上のヌクレオチドをさらに修飾することができる。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド構成要素によって中断され得る。ポリヌクレオチドは、標識剤とのコンジュゲーションなどによって、重合後にさらに修飾することができる。
【0181】
「Ｃａｓ９」という用語は、この名前で参照されるＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼを指す。非限定的な例示的なＣａｓ９、例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ｇ３ＥＣＲ１（ＣＡＳ９＿ＳＴＲＴＲ）、またはＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓのＣａｓ９、ならびにヌクレアーゼのデッドなＣａｓ９、オルソログ、及びそれらのそれぞれの生物学的同等物が本明細書に提供される。オルソログとしてはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓのＣａｓ９（「ｓｐＣａｓ９」）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｌａｃｔａｍｉｃａ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ由来のＣａｓ ９、ならびにＡｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．及びＦｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ Ｕ１１２を含む様々な細菌の種由来のＣｐｆ１（Ｃａｓ９と同様の切断機能を実施する）が挙げられるが、これらに限定されない。
【0182】
本明細書で使用される場合、「ｇＲＮＡ」または「ガイドＲＮＡ」という用語は、ＣＲＩＳＰＲ技術を使用する修正のために特定の遺伝子を標的とするために使用されるガイドＲＮＡ配列を指す。標的特異性のためにｇＲＮＡ及びドナー治療用ポリヌクレオチドを設計する技術は、当該技術分野で周知である（例えば、Ｄｏｅｎｃｈ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２０１４；３２（１２）：１２６２－７，Ｍｏｈｒ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．（２０１６）ＦＥＢＳ Ｊｏｕｒｎａｌ ２８３：３２３２－３８，及びＧｒａｈａｍ，Ｄ．，ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ．２０１５；１６：２６０）。ｇＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）とトランス活性化ＣＲＩＰＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を含む融合ポリヌクレオチド、またはＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）とトランス活性化ＣＲＩＰＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を含むポリヌクレオチドを含む、または代替的にそれらから本質的になる、またはさらにそれらからなることができる。いくつかの態様では、ｇＲＮＡは合成である（Ｋｅｌｌｅｙ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｊ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２３３（２０１６）７４－８３）。本明細書で使用される場合、ｇＲＮＡの生物学的等価物としては、Ｃａｓまたはその等価物を細胞ゲノムの特定の領域などの特定のヌクレオチド配列に導くことができるポリヌクレオチドまたは標的化分子が挙げられるが、これらに限定されない。
【0183】
ヌクレアーゼドメインに１つ以上の変異があるヌクレアーゼ欠損またはヌクレアーゼ欠損のＣａｓタンパク質（例えば、ｄＣａｓ９）は、ガイド配列（例えば、ｇＲＮＡ）と複合体を形成した場合、ＤＮＡ結合活性を保持する。ｄＣａｓタンパク質は、エフェクタードメインまたはタンパク質タグを、ｇＲＮＡによって一致する部位へのタンパク質融合によって繋ぎ止め、局在化することができるため、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合酵素を構成する。
【0184】
ｇＲＮＡは、特定の遺伝子、任意で疾患、障害、または状態に関連する遺伝子を標的とするように生成することができる。したがって、Ｃａｓと組み合わせて、ガイドＲＮＡはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの標的特異性を促進する。本明細書で論じるように、プロモーターの選択（例えば、特定の器官または組織における発現を促進するポリヌクレオチドをコードするガイドＲＮＡのプロモーターを選択する）などのさらなる態様は、標的特異性を達成する追加のメカニズムを提供し得る。したがって、特定の疾患、障害、または状態に適したｇＲＮＡの選択が本明細書で企図される。
【0185】
いくつかの実施形態では、Ｃａｓ（例えば、Ｃａｓ９）ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を改変して、タンパク質の活性を変更する。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ（例えば、Ｃａｓ９）ヌクレアーゼは、触媒的に不活性なＣａｓ（例えば、Ｃａｓ９）（または触媒的に不活性化／欠陥のあるＣａｓ９もしくはｄＣａｓ９）である。一実施形態では、ｄＣａｓ（例えば、ｄＣａｓ９）は、野生型Ｃａｓ（例えば、Ｃａｓ９）の一方または両方のエンドヌクレアーゼ触媒部位（ＲｕｖＣ及びＨＮＨ）での点変異のためにエンドヌクレアーゼ活性を欠くＣａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９）である。例えば、ｄＣａｓ９には触媒活性残基（Ｄ１０及びＨ８４０）の変異が含まれており、ヌクレアーゼ活性がない。場合によっては、ｄＣａｓは標的ＤＮＡの相補鎖と非相補鎖の両方を切断する能力が低下している。非限定的な例として、場合によっては、ｄＣａｓ９は、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓのＣａｓ９のアミノ酸配列のＤ１０ＡとＨ８４０Ａの変異の両方を保有する。いくつかの実施形態では、ｄＣａｓ９が触媒活性の低下または欠損を有する場合（例えば、Ｃａｓ９タンパク質がＤ１０、Ｇ１２、Ｇ１７、Ｅ７６２、Ｈ８４０、Ｎ８５４、Ｎ８６３、Ｈ９８２、Ｈ９８３、Ａ９８４、Ｄ９８６、及び／またはＡ９８７変異、例えば、Ｄ１０Ａ、Ｇ１２Ａ、Ｇ１７Ａ、Ｅ７６２Ａ、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、Ｎ８６３Ａ、Ｈ９８２Ａ、Ｈ９８３Ａ、Ａ９８４Ａ、及び／またはＤ９８６Ａを有する場合）、Ｃａｓタンパク質は、対象ポリヌクレオチド（例えば、ｇＲＮＡ）のＣａｓ結合配列と相互作用する能力を保持する限り、対象ポリヌクレオチド（例えば、ｇＲＮＡ）のＤＮＡ標的化配列により標的ポリヌクレオチド配列へと誘導されるために、依然として部位特異的に標的ＤＮＡに結合できる。
【0186】
本開示は、疾患関連遺伝子を改変することができる遺伝子編集方法を提供し、転じてこれは、疾患に苦しむ患者のためのインビボ遺伝子治療に使用することができる。
【0187】
ヌクレアーゼ（例えば、ｄＣｐｆ１）は、ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、またはタンパク質の形態で細胞に導入することができる。配列特異的ヌクレアーゼは、タンパク質の形態で、または配列特異的ヌクレアーゼをコードする核酸、例えば、ｍＲＮＡもしくはｃＤＮＡの形態で細胞に導入することができる。核酸は、プラスミドまたはウイルスのベクターなどのより大きな構築物の一部として、または例えばエレクトロポレーション、脂質小胞、ウイルストランスポーター、マイクロインジェクション、及び微粒子銃によって直接送達することができる。
【0188】
本発明のシステム／方法で使用されるガイド配列（例えば、ｃｒＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ、ｇＲＮＡなど）は、約５～１００のヌクレオチドの長さ、またはそれ以上（例えば、５、６、７、８、９、１０，１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６，３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２，６３、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７，８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００ヌクレオチドの長さ、またはそれ以上）であり得る。一実施形態では、ガイド配列（例えば、ｃｒＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ、ｇＲＮＡなど）は、約１５～約３０ヌクレオチドの長さ（例えば、約１５～２９、１５～２６、１５～２５、１６～３０、１６～２９、１６～２６、１６～２５、または約１８～３０、１８～２９、１８～２６、または１８～２５ヌクレオチドの長さ）であり得る。
【0189】
本開示の方法はまた、腫瘍抑制遺伝子における変異の存在により生じるがんを予防、修正、または治療するために使用することができる。腫瘍抑制遺伝子の例としては、網膜芽細胞腫感受性遺伝子（ＲＢ）遺伝子、ｐ５３遺伝子、結腸癌で欠失した（ＤＣＣ）遺伝子、大腸腺腫様ポリポーシス（ＡＰＣ）遺伝子、ｐｌ６、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＭＳＨ２、及び神経線維腫症タイプ１（ＮＦ－１）腫瘍抑制遺伝子（Ｌｅｅ ａｔ ａｌ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ Ｐｅｒｓｐｅｃｔ Ｂｉｏｌ．２０１０ Ｏｃｔ；２（１０））が挙げられる。
【0190】
本開示の方法は、疾患の異なる段階（例えば、初期、中期、または後期）の患者を治療するために使用され得る。本方法は、患者を１回または複数回治療するために使用され得る。したがって、治療期間はさまざまであり得、複数回の治療が含まれてもよい。
【0191】
さらに、本開示の方法は、特定の遺伝子ヒト化マウスモデルならびに患者由来細胞に適用することができ、設計されたｓｇＲＮＡの効率及び有効性ならびにヒト細胞における部位特異的組換え頻度を決定することを可能にし、それらはその後使用され得る臨床現場でのガイドとなり得る。
【0192】
本発明のシステムを標的化細胞及び／または被対象に送達するために、さまざまなウイルス構築物を使用することができる。そのような組換えウイルスの非限定的な例としては、組換えレンチウイルス、組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、組換えアデノウイルス、組換えレトロウイルス、組換えポックスウイルス、及び当該技術分野で他の既知のウイルス、ならびにプラスミド、コスミド、及びファージが挙げられる。遺伝子送達ウイルス構築物の選択肢は周知である（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９；Ｋａｙ，Ｍ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，２００１ Ｎａｔ．Ｍｅｄｉｃ．７（１）：３３－４０；及びＷａｌｔｈｅｒ Ｗ．ａｎｄ Ｓｔｅｉｎ Ｕ．，２０００ Ｄｒｕｇｓ，６０（２）：２４９－７１を参照されたい）。
【0193】
ＡＡＶウイルスベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０または他の既知及び未知のＡＡＶ血清型を含むがこれらに限定されない任意のＡＡＶ血清型の中から選択され得る。特定の実施形態では、ＡＡＶ２及び／またはＡＡＶ８が使用される。
【0194】
ＡＡＶという用語は、その他の点で要求される場合を除いて、すべてのサブタイプ、血清型、偽型、及び天然に存在する形態と組換え形態の両方を包含する。偽型ＡＡＶは、ある血清型からのキャプシドタンパク質及び第２の血清型のウイルスゲノムを含むＡＡＶを指す。
【0195】
さらに、ナノ粒子ベース及び脂質ベースのｍＲＮＡまたはタンパク質の送達システムなどの送達ビヒクルは、ウイルスベクターの代替として使用できる。代替送達ビヒクルのさらなる例としては、レンチウイルスベクター、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体、脂質ベースの送達システム、遺伝子銃、流体力学的、エレクトロポレーションまたはヌクレオフェクションマイクロインジェクション、及び遺伝子銃が挙げられる。Ｎａｙｅｒｏｓｓａｄａｔ ｅｔ ａｌ．（Ａｄｖ Ｂｉｏｍｅｄ Ｒｅｓ．２０１２；１：２７）及びＩｂｒａｈｅｅｍ ｅｔ ａｌ．（Ｉｎｔ Ｊ Ｐｈａｒｍ．２０１４ Ｊａｎ １；４５９（１－２）：７０－８３）によって、さまざまな遺伝子送達方法が詳細に論じられている。
【0196】
本開示のベクターは、構成的、調節可能もしくは誘導可能、細胞型特異的、組織特異的、または種特異的である、当該技術分野で公知の多数のプロモーターのいずれかを含むことができる。転写を指示するのに十分な配列に加えて、本発明のプロモーター配列は、転写の調節に関与する他の調節エレメント（例えば、エンハンサー、コザック配列、及びイントロン）の配列も含むことができる。遺伝子の構成的発現を駆動するのに有用な多くのプロモーター／調節配列が当該技術分野で利用可能であり、例えば、ＣＭＶ（サイトメガロウイルスプロモーター）、ＥＦ１ａ（ヒト伸長因子１αプロモーター）、ＳＶ４０（サルの空胞化ウイルス４０プロモーター）、ＰＧＫ（哺乳類ホスホグリセリン酸キナーゼプロモーター）、Ｕｂｃ（ヒトユビキチンＣプロモーター）、ヒトβ－アクチンプロモーター、げっ歯類β－アクチンプロモーター、ＣＢｈ（ニワトリβ－アクチンプロモーター）、ＣＡＧ（ＣＭＶエンハンサー、ニワトリベータアクチンプロモーター、及びウサギベータグロビンスプライスアクセプターを含むハイブリッドプロモーター）、ＴＲＥ（テトラサイクリン応答エレメントプロモーター）、Ｈ１（ヒトポリメラーゼＩＩＩ ＲＮＡプロモーター）、Ｕ６（ヒトＵ６小型核プロモーター）などが挙げられるが、これらに限定されない。さらに、ＲＮＡ、膜貫通タンパク質、または他のタンパク質の誘導性及び組織特異的発現は、そのような分子をコードする核酸を誘導性または組織特異的プロモーター／調節配列の制御下に置くことによって達成することができる。この目的に有用な組織特異的または誘導可能なプロモーター／調節配列の例としては、ロドプシンプロモーター、ＭＭＴＶ ＬＴＲ誘導性プロモーター、ＳＶ４０後期エンハンサー／プロモーター、シナプシン１プロモーター、ＥＴ肝細胞プロモーター、ＧＳグルタミン合成酵素プロモーター、及びその他多数が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、金属、グルココルチコイド、テトラサイクリン、ホルモンなどの誘導剤に応答して誘導され得る当該技術分野で周知のプロモーターも、本発明での使用が意図される。したがって、本開示は、それに作動可能に連結された所望のタンパク質の発現を駆動することができる、当該技術分野で知られている任意のプロモーター／調節配列の使用を含むことを理解されたい。
【0197】
本開示によるベクターは、多種多様な宿主細胞に形質転換、トランスフェクト、またはその他の方法で導入することができる。トランスフェクションとは、任意のコード配列が実際に発現されるか否かにかかわらず、宿主細胞によるベクターの取り込みを指す。多数のトランスフェクション方法が当業者に知られており、例えば、リポフェクタミン、リン酸カルシウム共沈、エレクトロポレーション、ＤＥＡＥ－デキストラン処理、マイクロインジェクション、ウイルス感染、及び当該技術分野で知られている他の方法である。形質導入とは、細胞へのウイルスの侵入、及びウイルスベクターゲノムによって送達される配列の発現（例えば、転写及び／または翻訳）を指す。組換えベクターの場合、「形質導入」は、一般に、細胞への組換えウイルスベクターの侵入、及びベクターゲノムによって送達される目的の核酸の発現を指す。
【0198】
所望の組換えＤＮＡを含む組換えウイルスベクター（複数可）は、薬学的組成物へと製剤化することができる。そのような製剤は、ｐＨを適切な生理学的レベルに維持するための緩衝生理食塩水または他の緩衝液、例えばＨＥＰＥＳなどの薬学的及び／または生理学的に許容されるビヒクルまたは担体、ならびに任意選択で、他の薬剤、医薬品、安定剤、緩衝剤、担体、アジュバント、希釈剤などの使用を含む。注射の場合、担体は典型的には液体である。例示的な生理学的に許容される担体としては、無菌で発熱物質を含まない水及び無菌で発熱物質を含まないリン酸緩衝生理食塩水が挙げられる。
【0199】
一実施形態では、担体は等張塩化ナトリウム溶液である。別の実施形態では、担体は平衡塩類溶液である。一実施形態では、担体はＴｗｅｅｎを含む。ウイルスを長期間保存する場合は、グリセロールまたはＴｗｅｅｎ－２０の存在下で凍結することができる。
【0200】
本発明のシステム、細胞、または組成物は、所望の器官または組織への直接送達、注射、経口、吸入、鼻腔内、気管内、静脈内、筋肉内、皮下、皮内、及び他の非経口投与経路によって投与され得る。追加的に、所望であれば、投与経路を組み合わせてもよい。投与は、静脈内、動脈内、筋肉内、心臓内、髄腔内、脳室下、硬膜外、脳内、脳室内、網膜下、硝子体内、関節内、眼内、腹腔内、子宮内、皮内、皮下、経皮、経粘膜、及び吸入を含むが、これらに限定されない、任意の好適な経路を介してなし得る。
【0201】
投与の最も有効な手段及び投与量を決定する方法は、当業者に知られており、治療に使用される組成物、治療の目的、及び治療される対象によって異なる。単回または複数回の投与は、担当医師により選択された用量レベル及びパターンに合わせて行うことができる。用量は投与経路によって影響を受ける可能性があることに留意されたい。薬剤の適切な投与製剤及び投与方法は、当該技術分野で知られている。
【0202】
数値を参照するときに本明細書で使用される場合、「約」という用語は、指定された量の２０％、１０％、５％、１％、０．５％、または０．１％の変動を包含することを意味する。
【0203】
本明細書で使用される場合、対象の疾患または障害を「治療する」またはその「治療」は、（１）疾患になりやすい、もしくは疾患の症状をまだ呈示していない対象において、症状もしくは疾患が発生するのを予防すること；２）疾患を阻害すること、もしくはその発達を阻害すること；または３）疾患もしくは疾患の症状を緩和すること、もしくはそれらの退縮を引き起こすこと、を示す。当該技術分野で理解されるように、「治療」とは、臨床結果を含む有益なまたは所望の結果を得るためのアプローチである。本発明の技術の目的のために、検出可能または検出不可能かにかかわらず、有益なまたは望ましい結果には、１つ以上の病状の緩和または改善、状態（疾患を含む）の程度の減少、状態（疾患を含む）の状態の安定化（すなわち悪化しない）、状態（疾患を含む）の進行の遅延または緩徐化、状態（疾患を含む）、状況の改善または好転、及び緩解（部分的または完全）を含むことができるが、それらに限定されない。一態様では、「治療」という用語は予防を除外する。
【0204】
本発明を実施するための具体的な態様の以下の実施例は、例証目的で提示されるにすぎず、決して本発明の範囲を限定するようには意図されていない。
【実施例】
【0205】
実施例１ ｄＣｐｆ１を使用する多重エピゲノム編集
ｄＣｐｆ１が、標的化ヒストンアセチル化を媒介するｐ３００または標的化ＤＮＡループを媒介するＣＴＣＦなどのエフェクタータンパク質と融合されている、一連の操作されたキメラタンパク質を試験した。遺伝子発現と３Ｄクロマチン構造を操作するこれらのエピゲノム編集ツールを検証した。
ｄＣｐｆ１が、標的化ヒストンアセチル化を媒介するｐ３００または標的化ＤＮＡループを媒介するＣＴＣＦなどのエフェクタータンパク質と融合されている、一連の操作されたキメラタンパク質を試験した。遺伝子発現と３Ｄクロマチン構造を操作するこれらのエピゲノム編集ツールを検証した。
【0206】
Ｃｐｆ１は、単一の転写物（設計されたＣＲＩＳＰＲアレイ）から複数のｃｒＲＮＡを生成して、複数の配列を標的にするのに十分である。本発明の方法では、ｃｒＲＮＡアレイ、Ｃｐｆ１、及び選択マーカーをコードする「オールインワン」ベクター（例えば、プラスミド）を使用することができる（図１）。
【0207】
ＤＮＭＴ１、ＶＥＧＦＡ、ＧＲＩＮ２Ｂ標的でインデルを誘導する異なるアレイを持つＣｐｆ１の能力を、Ｓｕｒｖｅｙｏｒアッセイで調べた（図２Ｂ）。アレイ１には１９ヌクレオチド（ｎｔ）のＤＲと２３ｎｔのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）が含まれ、アレイ２には３７ｎｔのＤＲと２３ｎｔのｇＲＮＡが含まれていた。
【0208】
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を使用して、さまざまな直接反復（ＤＲ）でＡｓＣｐｆ１を試験した。それぞれの構築物プラスミドをＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした後、Ｓｕｒｖｅｙｏｒアッセイ用にゲノムＤＮＡを抽出し、ＤＮＭＴ１、ＶＥＧＦＡ、及びＧＲＩＮ２Ｂ遺伝子座の切断効率を以下に示す標的配列と比較した。本発明者らの結果は、１９ｎｔのＤＲ（ＵＡＡＵＵＵＣＵＡＣＵＣＵＵＧＵＡＧＡＵ；配列番号１）が３７ｎｔのＤＲよりも良好に機能することを示した（図２Ｂ）。それぞれの構築物の発現は、ウエスタンブロットによって検証された（図２Ｃ）。
標的配列：
ＤＮＭＴ１：ＴＴＡＡＴＧＴＴＴＣＣＴＧＡＴＧＧＴＣＣＡＴＧＴＣＴＧＴＴＡＣＴＣＧＣＣＴＧＴＣＡＡ（配列番号２）
ＶＥＧＦＡ：ＴＣＣＣＴＣＴＴＴＧＣＴＡＧＧＡＡＴＡＴＴＧＡＡＧＧＧＧＧＣＡＧＧＧＧＡＡＧＧＣＧＧ（配列番号３）
ＧＲＩＮ２ｂ：ＧＴＴＧＧＧＴＴＴＧＧＴＧＣＴＣＡＡＴＧＡＡＡＧＧＡＧＡＴＡＡＧＧＴＣＣＴＴＧＡＡＴ（配列番号４）
標的配列：
ＤＮＭＴ１：ＴＴＡＡＴＧＴＴＴＣＣＴＧＡＴＧＧＴＣＣＡＴＧＴＣＴＧＴＴＡＣＴＣＧＣＣＴＧＴＣＡＡ（配列番号２）
ＶＥＧＦＡ：ＴＣＣＣＴＣＴＴＴＧＣＴＡＧＧＡＡＴＡＴＴＧＡＡＧＧＧＧＧＣＡＧＧＧＧＡＡＧＧＣＧＧ（配列番号３）
ＧＲＩＮ２ｂ：ＧＴＴＧＧＧＴＴＴＧＧＴＧＣＴＣＡＡＴＧＡＡＡＧＧＡＧＡＴＡＡＧＧＴＣＣＴＴＧＡＡＴ（配列番号４）
【0209】
結果は、Ｃｐｆ１が多重標的化能力を有し、アレイ２のＤＲ配列はアレイ１ほど効果的ではなかったことを示している。さらに、Ｃｐｆ１－ＴｅｔＣＤ融合タンパク質は、Ｃｐｆ１ ＲＮａｓｅとＤＮａｓｅの活性の両方とも維持していた。
【0210】
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を使用して、どの点変異がＡｓＣｐｆ１のＤｎａｓｅ活性を無効にしたかを試験した。それぞれの構築物プラスミドをＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした後、Ｓｕｒｖｅｙｏｒアッセイ用にゲノムＤＮＡを抽出し、ＤＮＭＴ１遺伝子座の切断効率を上に示す標的配列（配列番号２）と比較した。図３の結果は、ＲｕｖＣ及びＮｕＣのドメインの点変異Ｄ９０８Ａ、Ｅ９９３Ａ、Ｒ１２２６Ａ、及びＤ１２６３Ａが、ＡｓＣｐｆ１ ＤＮａｓｅ活性をサイレンシングしたことを示している（ＤＮａｓｅ活性の触媒的にデッドなＣｐｆ１）。
【0211】
ＡｓＣｐｆ１のＲｕｖＣ及びＮｕｃのドメインにおける重要な残基の親和性分析を行った。ＤＮＭＴ１、ＶＥＧＦＡ、及びＧＲＩＮ２Ｂの標的ＤＮＡ配列に結合するＡｓＣｐｆ１（ＤＮａｓｅ活性の触媒的にデッドなＣｐｆ１）の能力に対する点変異の影響を、クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）－ｑＰＣＲ（ｎ＝３、エラーバーは平均±ＳＥＭを示す）を使用して調べた。値はモック試料に対して正規化された。図４の結果は、変異Ｒ１２２６ＡがＤＮＡ標的に対して最も高い親和性を示したことを示している。
【0212】
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を使用して、Ｃｐｆ１のどのオルソログ（複数可）を使用してｐ３００と融合し、遺伝子活性化のための標的ヒストンアセチル化を媒介できるかを試験した。それぞれの構築物プラスミドをＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした後、ＲＮＡを抽出してｑＰＣＲを実行し、標的化ＭｙｏＤ遺伝子座の発現を比較した。ｄＣａｓ９は、次の点変異：Ｄ１０Ａ及びＨ８４０Ａを有するＣａｓ９である：ｄＡｓＣｐｆ１は、次の点変異：Ｄ９０８Ａ、Ｅ９９３Ａ、Ｒ１２２６Ａ、及びＤ１２６３Ａを有するＡｓＣｐｆ１である；ｄＬｂＣｐｆ１は、次の点変異：Ｄ８３３Ａを有するＬｂＣｐｆ１である。本発明者らの結果（図５Ａ～５Ｂ）は、ｄＣａｓ９－ｐ３００と比較して、２７アミノ酸のリンカーを有する触媒的にデッドなＬｂＣｐｆ１が、ＭｙｏＤのｍＲＮＡ発現を活性化するのに最も良好に作用したことを示した。２７アミノ酸リンカーのアミノ酸配列は：ＧＧＧＧＳＰＫＫＫＲＫＶＧＰＫＫＫＲＫＶＤＧＧＧＧＳＥ（配列番号７）である。２７アミノ酸リンカーをコードするヌクレオチド配列は：ｇｇｔｇｇｃｇｇａｇｇｃｔｃｇｃｃａａａａａａｇａａｇａｇａａａｇｇｔａｇｇｔｃｃａａａｇａａａａａａｃｇａａａａｇｔａｇａｔｇｇｔｇｇｃｇｇａｇｇａｔｃｃｇａａ（配列番号８）である。
【0213】
ＭｙｏＤの標的配列を以下に示す。
ＣＸ＿ＡＮＬ０８３－Ｃｐｆ１－ＭｙｏＤ－ｇ１（２３ｎｔ）（プロモーター）：ｔａａａａａａａＴＴＧＧＣＴＣＴＣＣＧＧＣＡＣＧＣＣＣＴＴＴＣＡＴＣＴＡＣＡＡＧＡＧＴＡＧＡＡＡＴＴＧＡＣＧ（配列番号９）
ＣＸ＿ＡＮＬ０８４－Ｃｐｆ１－ＭｙｏＤ－ｇ１（２３ｎｔ）（プロモーター）：
ＣＴＡＧＣＧＴＣＡＡＴＴＴＣＴＡＣＴＣＴＴＧＴＡＧＡＴＧＡＡＡＧＧＧＣＧＴＧＣＣＧＧＡＧＡＧＣＣＡＡｔｔｔｔｔｔｔａａｔ（配列番号１０）
ＣＸ＿ＡＮＬ０８３－Ｃｐｆ１－ＭｙｏＤ－ｇ１（２３ｎｔ）（プロモーター）：ｔａａａａａａａＴＴＧＧＣＴＣＴＣＣＧＧＣＡＣＧＣＣＣＴＴＴＣＡＴＣＴＡＣＡＡＧＡＧＴＡＧＡＡＡＴＴＧＡＣＧ（配列番号９）
ＣＸ＿ＡＮＬ０８４－Ｃｐｆ１－ＭｙｏＤ－ｇ１（２３ｎｔ）（プロモーター）：
ＣＴＡＧＣＧＴＣＡＡＴＴＴＣＴＡＣＴＣＴＴＧＴＡＧＡＴＧＡＡＡＧＧＧＣＧＴＧＣＣＧＧＡＧＡＧＣＣＡＡｔｔｔｔｔｔｔａａｔ（配列番号１０）
【0214】
ｄＬｂＣｐｆ１－ｐ３００の有効範囲も研究された。それぞれの構築物プラスミドをＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした後、抗Ｈ３Ｋ２７Ａｃ抗体を使用するＣｈＩＰ－ｑＰＣＲを実行して、標的化ＭｙｏＤ遺伝子座のアセチル化レベルを比較した。図６の結果は、ｄＬｂＣｐｆ１－ｐ３００の有効範囲がｃｒＲＮＡの約２０００ｂｐ上流とｃｒＲＮＡの約１０００ｂｐ下流であることを示した。ｄＣａｓ９は、次の点変異：Ｄ１０Ａ及びＨ８４０Ａを有するＣａｓ９である；ｄＡｓＣｐｆ１は、次の点変異：Ｄ９０８Ａ、Ｅ９９３Ａ、Ｒ１２２６Ａ、及びＤ１２６３Ａを有するＡｓＣｐｆ１である；ｄＬｂＣｐｆ１は、次の点変異：Ｄ８３３Ａを有するＬｂＣｐｆ１である。
【0215】
図７Ａ～７Ｂは、ｄＣｐｆ１－ｐ３００システムによるＭｅＣＰ２遺伝子座でのＨ３Ｋ２７アセチル化の編集の有効範囲を研究した結果を示す。図７Ａでは、抗Ｈ３Ｋ２７Ａｃ抗体をＣｈＩＰ－ｑＰＣＲに使用した。図７Ｂでは、ＣｈＩＰ－ｑＰＣＲに抗ＨＡ抗体を使用した。ｄＬｂＣｐｆ１またはｄＣｐｆ１は、次の点変異：Ｄ８３３Ａを有するＬｂＣｐｆ１である。
【0216】
図８は、ｄＣｐｆ１－Ｄｎｍｔ３ａがｄＣａｓ９－Ｄｎｍｔ３よりも高いＤＮＡメチル化編集効率を提供することを示している。ｄＣａｓ９は、次の点変異：Ｄ１０Ａ及びＨ８４０Ａを有するＣａｓ９である；ｄＣｐｆ１は、次の点変異：Ｄ８３３Ａを有するＬｂＣｐｆ１である。
【0217】
ｓｇＲＮＡは、ｐ１６遺伝子座を標的とするように設計された（配列番号１１）：
ａｔｔｔｇｇｃａｇｔｔａｇｇａａｇｇｔｔｇｔａｔｃｇｃｇｇａｇｇａａｇｇａａａｃｇｇｇｇｃｇｇｇｇｇｃｇｇａｔｔｔｃｔｔｔｔｔａａｃａｇａｇｔｇａａｃｇｃａｃｔｃａａａｃａｃｇｃｃｔｔｔｇｃｔｇｇｃａｇｇｃｇｇｇｇｇａｇｃｇｃｇｇｃｔｇｇｇａｇｃａｇｇｇａｇｇｃｃｇｇａｇｇｇｃｇｇｔｇｔｇｇｇｇｇｇｃａｇｇｔｇｇｇｇａｇｇａｇｃｃｃａｇｔｃｃｔｃｃｔｔｃｃｔｔｇｃｃａａｃｇｃｔｇｇｃｔｃｔｇｇｃｇａｇｇｇｃｔｇｃｔｔｃｃｇｇｃｔｇｇｔｇｃｃｃｃｃｇｇｇｇｇａｇａｃｃｃａａｃｃｔｇｇｇｇｃｇａｃｔｔｃａｇｇｇｇｔｇｃｃａｃａｔｔｃｇｃｔａａｇｔｇｃｔｃｇｇａｇｔｔａａｔａｇｃａｃｃｔｃｃｔｃｃｇａｇｃａｃｔｃｇｃｔｃａｃｇｇｃｇｔｃｃｃｃｔｔｇｃｃｔｇｇａａａｇａｔａｃｃｇｃｇｇｔｃｃｃｔｃｃａｇａｇｇａｔｔｔｇａｇｇｇａｃａｇｇｇｔｃｇｇａｇｇｇｇｇｃｔｃｔｔｃｃｇｃｃａｇｃａｃｃｇｇａｇｇａａｇａａａｇａｇｇａｇｇｇｇｃｔｇｇｃｔｇｇｔｃａｃｃａｇａｇｇｇｔｇｇｇｇｃｇｇａｃｃｇｃｇｔｇｃｇｃｔｃｇｇｃｇｇｃｔｇｃｇｇａｇａｇｇｇｇｇａｇａｇｃａｇｇｃａｇｃｇｇｇｃｇｇｃｇｇｇｇａｇｃａｇｃＡＴＧＧＡＧＣＣＧＧＣＧＧＣＧ ＧＧＧＡＧＣＡＧＣＡＴＧＧＡＧＣＣＴＴＣＧＧＣＴＧＡＣＴＧＧＣＴＧＧＣＣＡＣＧＧＣＣＧＣＧＧＣＣＣＧＧＧＧＴＣＧ ＧＧＴＡＧＡＧＧＡＧＧＴＧＣＧＧＧＣＧＣＴＧＣＴＧＧＡＧＧＣＧＧＧＧＧＣＧＣＴＧＣＣＣＡＡＣＧＣＡＣＣＧＡＡＴ ＡＧＴＴＡＣＧＧＴＣＧＧＡＧＧＣＣＧＡＴＣＣＡＧＧＴＧＧＧＴＡＧＡＧＧＧＴＣＴＧＣＡＧＣＧＧＧＡＧＣＡＧＧＧＧＡ ＴＧＧＣＧＧＧＣＧＡＣＴＣＴＧＧＡＧＧＡＣＧＡＡＧＴＴＴＧＣＡＧＧＧＧＡＡＴＴＧＧＡＡＴＣＡＧＧＴＡＧＣＧＣＴＴ ＣＧＡＴＴＣＴＣＣＧＧＡＡＡＡＡＧＧＧＧＡＧＧＣＴＴＣＣＴＧＧ。
ａｔｔｔｇｇｃａｇｔｔａｇｇａａｇｇｔｔｇｔａｔｃｇｃｇｇａｇｇａａｇｇａａａｃｇｇｇｇｃｇｇｇｇｇｃｇｇａｔｔｔｃｔｔｔｔｔａａｃａｇａｇｔｇａａｃｇｃａｃｔｃａａａｃａｃｇｃｃｔｔｔｇｃｔｇｇｃａｇｇｃｇｇｇｇｇａｇｃｇｃｇｇｃｔｇｇｇａｇｃａｇｇｇａｇｇｃｃｇｇａｇｇｇｃｇｇｔｇｔｇｇｇｇｇｇｃａｇｇｔｇｇｇｇａｇｇａｇｃｃｃａｇｔｃｃｔｃｃｔｔｃｃｔｔｇｃｃａａｃｇｃｔｇｇｃｔｃｔｇｇｃｇａｇｇｇｃｔｇｃｔｔｃｃｇｇｃｔｇｇｔｇｃｃｃｃｃｇｇｇｇｇａｇａｃｃｃａａｃｃｔｇｇｇｇｃｇａｃｔｔｃａｇｇｇｇｔｇｃｃａｃａｔｔｃｇｃｔａａｇｔｇｃｔｃｇｇａｇｔｔａａｔａｇｃａｃｃｔｃｃｔｃｃｇａｇｃａｃｔｃｇｃｔｃａｃｇｇｃｇｔｃｃｃｃｔｔｇｃｃｔｇｇａａａｇａｔａｃｃｇｃｇｇｔｃｃｃｔｃｃａｇａｇｇａｔｔｔｇａｇｇｇａｃａｇｇｇｔｃｇｇａｇｇｇｇｇｃｔｃｔｔｃｃｇｃｃａｇｃａｃｃｇｇａｇｇａａｇａａａｇａｇｇａｇｇｇｇｃｔｇｇｃｔｇｇｔｃａｃｃａｇａｇｇｇｔｇｇｇｇｃｇｇａｃｃｇｃｇｔｇｃｇｃｔｃｇｇｃｇｇｃｔｇｃｇｇａｇａｇｇｇｇｇａｇａｇｃａｇｇｃａｇｃｇｇｇｃｇｇｃｇｇｇｇａｇｃａｇｃＡＴＧＧＡＧＣＣＧＧＣＧＧＣＧ ＧＧＧＡＧＣＡＧＣＡＴＧＧＡＧＣＣＴＴＣＧＧＣＴＧＡＣＴＧＧＣＴＧＧＣＣＡＣＧＧＣＣＧＣＧＧＣＣＣＧＧＧＧＴＣＧ ＧＧＴＡＧＡＧＧＡＧＧＴＧＣＧＧＧＣＧＣＴＧＣＴＧＧＡＧＧＣＧＧＧＧＧＣＧＣＴＧＣＣＣＡＡＣＧＣＡＣＣＧＡＡＴ ＡＧＴＴＡＣＧＧＴＣＧＧＡＧＧＣＣＧＡＴＣＣＡＧＧＴＧＧＧＴＡＧＡＧＧＧＴＣＴＧＣＡＧＣＧＧＧＡＧＣＡＧＧＧＧＡ ＴＧＧＣＧＧＧＣＧＡＣＴＣＴＧＧＡＧＧＡＣＧＡＡＧＴＴＴＧＣＡＧＧＧＧＡＡＴＴＧＧＡＡＴＣＡＧＧＴＡＧＣＧＣＴＴ ＣＧＡＴＴＣＴＣＣＧＧＡＡＡＡＡＧＧＧＧＡＧＧＣＴＴＣＣＴＧＧ。
【0218】
ｓｇＲＮＡ配列はｔｃｃｔｃｃｔｔｃｃｔｔｇｃｃａａｃｇｃｔｇｇｃｔ（配列番号１２；ｄＣａｓ９－Ｄｎｍｔ３ａとともに使用）及びｇｃｔｇｇｃａｇｇｃｇｇｇｇｇａｇｃｇｃｇｇ（配列番号１３；ｄＣｐｆ１－Ｄｎｍｔ３ａとともに使用）である。
【0219】
ｄＣｐｆ１－ＣＴＣＦが複数のＣＴＣＦアンカー部位を標的にできるかどうかを試験した。それぞれの構築物プラスミドをＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした後、Ｃｐｆ１－ＨＡまたはＣＴＣＦに対する抗体を使用するＣｈＩＰ－ｑＰＣＲを実行して、ｄＣｐｆ１－ＣＴＣＦまたはｄＣｐｆ１－ｐ３００の標的化ＭｅＣＰ２遺伝子座への結合を調べた。本発明者らの結果（図９Ａ～９Ｃ）は、標的化されたゲノム部位でｄＣｐｆ１－ＣＴＣＦを検出できることを示した。ｄＣｐｆ１は、次の点変異：Ｄ８３３Ａを有するＬｂＣｐｆ１である。
【0220】
特定のＣＴＣＦアミノ酸残基の変異により、ＣＴＣＦとＤＮＡの間の親和性を減少させ得ることが報告されている。ＣＴＣＦ変異体としては、ＣＴＣＦ（Ｋ３６５Ａ）、ＣＴＣＦ（Ｒ３６８Ａ）、ＣＴＣＦ（Ｋ３６５Ａ、Ｒ３６８Ａ）、ＣＴＣＦ（Ｒ３９６Ａ）、及びＣＴＣＦ（Ｑ４１８Ａ）が挙げられる（Ｙｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ ＣＴＣＦ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｄｉｖｅｒｓｅ ｒａｎｇｅ ｏｆ ｇｅｎｏｍｉｃ ｓｉｔｅｓ，Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２０１７）：１３６５－１３７７）。
【0221】
ＣＴＣＦのＤＮＡ結合変異体は、ｄＣｐｆ１－ＣＴＣＦのオフターゲット効果を減少させた（図１０Ａ～１０Ｂ）。抗ＨＡ抗体を用いるＣｈＩＰ－ｑＰＣＲを実施し、ｄＣｐｆ１－ＣＴＣＦの標的化ＭｅＣＰ２遺伝子座への結合を調べた（図１０Ａ）。ｄＣｐｆ１は、次の点変異：Ｄ８３３Ａを有するＬｂＣｐｆ１である。
【0222】
【0223】
実施例２ 多重エピゲノム編集はＭｅＣＰ２を再活性化してレット症候群ニューロンをレスキューする
レット症候群は、主に女児（８，５００人に１人）にみられる神経疾患である。症状としては、脳のサイズが小さくなる（小頭症）、話すことができない、手を意図的に使えなくなる、歩行の問題、異常な呼吸パターンなどが挙げられる。
レット症候群は、主に女児（８，５００人に１人）にみられる神経疾患である。症状としては、脳のサイズが小さくなる（小頭症）、話すことができない、手を意図的に使えなくなる、歩行の問題、異常な呼吸パターンなどが挙げられる。
【0224】
レット症候群は、Ｘ染色体上のＭＥＣＰ２のヘテロ接合変異によって引き起こされる。本発明者らは、新しく開発されたツール（ｄＣａｓ９－Ｔｅｔ及びｄＣｐｆ１－ＣＴＣＦを含む）を適用して、レット症候群の治療戦略として不活性Ｘ染色体上のＭＥＣＰ２遺伝子の野生型対立遺伝子を再活性化した。レット症候群様ｈＥＳＣとこのｈＥＳＣ系統に由来するニューロンを使用し、多重エピゲノム編集を行った。
【0225】
結果は、レット症候群様ｈＥＳＣの不活性Ｘ染色体上のＭＥＣＰ２対立遺伝子を特異的に再活性化し、機能的にレスキューされたニューロンを導き出すことができることを示している。また、ｄＣａｓ９－Ｔｅｔを介したＤＮＡメチル化編集とｄＣｐｆ１－ＣＴＣＦを介したＤＮＡループを組み合わせて、ニューロンの不活性Ｘ染色体上の野生型ＭＥＣＰ２対立遺伝子の安定した再活性化を達成することもできる。本発明のシステム／方法はまた、他のＸ連鎖病を治療するために使用され得る。
【0226】
ＭＥＣＰ２デュアルカラーレポーター（図１２）により、１）ＸｉでのＭＥＣＰ２再活性化の検出；２）Ｘａに対する編集効果を調べること；及び３）オフターゲット効果の評価が可能になる。
【0227】
ｄＣａｓ９－Ｔｅｔ１によるＭＥＣＰ２プロモーターでのＸｉ特異的ＤＭＲの脱メチル化を研究した（図１３Ａ～１３Ｂ）。図１３Ａは、ｓｇＲＮＡ－１～ｓｇＲＮＡ－１０を含むｓｇＲＮＡ及びパイロシーケンシング（ｐｙｒｏ－ｓｅｑ）のための領域（領域ａ～ｃ）によって標的化される、ＭＥＣＰ２プロモーターの略図である（Ｌｉｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｇｌｏｂａｌ Ｅｐｉｇｅｎｏｍｉｃ Ｒｅｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ Ｄｕｒｉｎｇ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｂｒａｉｎ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１３，３４１（６１４６）：１２３７９０５）。図１３Ｂは、領域ａ～ｃのパイロシーケンシング（ｐｙｒｏ－ｓｅｑ）の結果を示す。ｄＣａｓ９は、次の点変異：Ｄ１０Ａ及びＨ８４０Ａを有するＣａｓ９である。
【0228】
ヒトＭｅＣＰ２プロモーター領域のＤＭＲを標的とするｓｇＲＮＡ－１～ｓｇＲＮＡ－１０を含むｓｇＲＮＡは以下のとおりである。
ＳＬ－５８６＿ｈＭｅＣＰ２＿ＤＭＲ＿ｓｇＲＮＡ－１＿Ｆｏｒ：ＴＴＧＧ ＡＧＣＡＧＣＡＡＡＧＴＴＧＣＣＣＡＣＣＣ（配列番号１４）
ＳＬ－５８７＿ｈＭｅＣＰ２＿ＤＭＲ＿ｓｇＲＮＡ－１＿Ｒｅｖ：ＡＡＡＣ ＧＧＧＴＧＧＧＣＡＡＣＴＴＴＧＣＴＧＣＴ（配列番号１５）
ＳＬ－５８８＿ｈＭｅＣＰ２＿ＤＭＲ＿ｓｇＲＮＡ－２＿Ｆｏｒ：ＴＴＧＧ ＴＡＧＴＧＡＴＡＴＴＧＡＧＡＡＡＡＴＧＴ（配列番号１６）
ＳＬ－５８９＿ｈＭｅＣＰ２＿ＤＭＲ＿ｓｇＲＮＡ－２＿Ｒｅｖ：ＡＡＡＣ ＡＣＡＴＴＴＴＣＴＣＡＡＴＡＴＣＡＣＴＡ（配列番号１７）
ＳＬ－５９０＿ｈＭｅＣＰ２＿ＤＭＲ＿ｓｇＲＮＡ－３＿Ｆｏｒ：ＴＴＧＧ ＣＡＧＣＣＡＡＴＣＡＡＣＡＧＣＴＧＧＡＧ（配列番号１８）
ＳＬ－５９１＿ｈＭｅＣＰ２＿ＤＭＲ＿ｓｇＲＮＡ－３＿Ｒｅｖ：ＡＡＡＣ ＣＴＣＣＡＧＣＴＧＴＴＧＡＴＴＧＧＣＴＧ（配列番号１９）
ＳＬ－５９２＿ｈＭｅＣＰ２＿ＤＭＲ＿ｓｇＲＮＡ－４＿Ｆｏｒ：ＴＴＧＧ ＧＣＣＡＴＣＡＣＡＧＣＣＡＡＴＧＡＣ（配列番号２０）
ＳＬ－５９３＿ｈＭｅＣＰ２＿ＤＭＲ＿ｓｇＲＮＡ－４＿Ｒｅｖ：ＡＡＡＣ ＧＴＣＡＴＴＧＧＣＴＧＴＧＡＴＧＧＣ（配列番号２１）
ＳＬ－５９４＿ｈＭｅＣＰ２＿ＤＭＲ＿ｓｇＲＮＡ－５＿Ｆｏｒ：ＴＴＧＧ ＡＧＧＡＧＧＡＧＡＧＡＣＴＧＴＧＡＧＴ（配列番号ＮＯ：２２）
ＳＬ－５９５＿ｈＭｅＣＰ２＿ＤＭＲ＿ｓｇＲＮＡ－５＿Ｒｅｖ：ＡＡＡＣ ＡＣＴＣＡＣＡＧＴＣＴＣＴＣＣＴＣＣＴ（配列番号２３）
ＳＬ－５９６＿ｈＭｅＣＰ２＿ＤＭＲ＿ｓｇＲＮＡ－６＿Ｆｏｒ：ＴＴＧＧ ＧＧＡＧＧＧＧＧＡＧＧＧＴＡＧＡＧＡＧＧ（配列番号２４）
ＳＬ－５９７＿ｈＭｅＣＰ２＿ＤＭＲ＿ｓｇＲＮＡ－６＿Ｒｅｖ：ＡＡＡＣ ＣＣＴＣＴＣＴＡＣＣＣＴＣＣＣＣＣＴＣＣ（配列番号２５）
ＳＬ－５９８＿ｈＭｅＣＰ２＿ＤＭＲ＿ｓｇＲＮＡ－７＿Ｆｏｒ：ＴＴＧＧ ＧＧＧＡＧＧＡＡＧＡＧＧＧＧＣＧＴＣ（配列番号２６）
ＳＬ－５９９＿ｈＭｅＣＰ２＿ＤＭＲ＿ｓｇＲＮＡ－７＿Ｒｅｖ：ＡＡＡＣ ＧＡＣＧＣＣＣＣＴＣＴＴＣＣＴＣＣＣ（配列番号２７）
ＳＬ－６００＿ｈＭｅＣＰ２＿ＤＭＲ＿ｓｇＲＮＡ－８＿Ｆｏｒ：ＴＴＧＧ ＴＧＡＧＡＧＣＴＣＡＧＧＡＧＣＣＣＴＴＧ（配列番号２８）
ＳＬ－６０１＿ｈＭｅＣＰ２＿ＤＭＲ＿ｓｇＲＮＡ－８＿Ｒｅｖ：ＡＡＡＣ ＣＡＡＧＧＧＣＴＣＣＴＧＡＧＣＴＣＴＣＡ（配列番号２９）
ＳＬ－６０２＿ｈＭｅＣＰ２＿ＤＭＲ＿ｓｇＲＮＡ－９＿Ｆｏｒ：ＴＴＧＧ ＣＣＴＡＣＴＴＧＴＴＣＣＴＧＣＴＡＧＡＴ（配列番号３０）
ＳＬ－６０３＿ｈＭｅＣＰ２＿ＤＭＲ＿ｓｇＲＮＡ－９＿Ｒｅｖ：ＡＡＡＣ ＡＴＣＴＡＧＣＡＧＧＡＡＣＡＡＧＴＡＧＧ（配列番号３１）
ＳＬ－６０４＿ｈＭｅＣＰ２＿ＤＭＲ＿ｓｇＲＮＡ－１０＿Ｆｏｒ：ＴＴＧＧ ＡＧＧＴＧＧＴＴＡＴＡＧＴＴＣＣＣＡＴＣ（配列番号３２）
ＳＬ－６０５＿ｈＭｅＣＰ２＿ＤＭＲ＿ｓｇＲＮＡ－１０＿Ｒｅｖ：ＡＡＡＣ ＧＡＴＧＧＧＡＡＣＴＡＴＡＡＣＣＡＣＣＴ（配列番号３３）
ＳＬ－５８６＿ｈＭｅＣＰ２＿ＤＭＲ＿ｓｇＲＮＡ－１＿Ｆｏｒ：ＴＴＧＧ ＡＧＣＡＧＣＡＡＡＧＴＴＧＣＣＣＡＣＣＣ（配列番号１４）
ＳＬ－５８７＿ｈＭｅＣＰ２＿ＤＭＲ＿ｓｇＲＮＡ－１＿Ｒｅｖ：ＡＡＡＣ ＧＧＧＴＧＧＧＣＡＡＣＴＴＴＧＣＴＧＣＴ（配列番号１５）
ＳＬ－５８８＿ｈＭｅＣＰ２＿ＤＭＲ＿ｓｇＲＮＡ－２＿Ｆｏｒ：ＴＴＧＧ ＴＡＧＴＧＡＴＡＴＴＧＡＧＡＡＡＡＴＧＴ（配列番号１６）
ＳＬ－５８９＿ｈＭｅＣＰ２＿ＤＭＲ＿ｓｇＲＮＡ－２＿Ｒｅｖ：ＡＡＡＣ ＡＣＡＴＴＴＴＣＴＣＡＡＴＡＴＣＡＣＴＡ（配列番号１７）
ＳＬ－５９０＿ｈＭｅＣＰ２＿ＤＭＲ＿ｓｇＲＮＡ－３＿Ｆｏｒ：ＴＴＧＧ ＣＡＧＣＣＡＡＴＣＡＡＣＡＧＣＴＧＧＡＧ（配列番号１８）
ＳＬ－５９１＿ｈＭｅＣＰ２＿ＤＭＲ＿ｓｇＲＮＡ－３＿Ｒｅｖ：ＡＡＡＣ ＣＴＣＣＡＧＣＴＧＴＴＧＡＴＴＧＧＣＴＧ（配列番号１９）
ＳＬ－５９２＿ｈＭｅＣＰ２＿ＤＭＲ＿ｓｇＲＮＡ－４＿Ｆｏｒ：ＴＴＧＧ ＧＣＣＡＴＣＡＣＡＧＣＣＡＡＴＧＡＣ（配列番号２０）
ＳＬ－５９３＿ｈＭｅＣＰ２＿ＤＭＲ＿ｓｇＲＮＡ－４＿Ｒｅｖ：ＡＡＡＣ ＧＴＣＡＴＴＧＧＣＴＧＴＧＡＴＧＧＣ（配列番号２１）
ＳＬ－５９４＿ｈＭｅＣＰ２＿ＤＭＲ＿ｓｇＲＮＡ－５＿Ｆｏｒ：ＴＴＧＧ ＡＧＧＡＧＧＡＧＡＧＡＣＴＧＴＧＡＧＴ（配列番号ＮＯ：２２）
ＳＬ－５９５＿ｈＭｅＣＰ２＿ＤＭＲ＿ｓｇＲＮＡ－５＿Ｒｅｖ：ＡＡＡＣ ＡＣＴＣＡＣＡＧＴＣＴＣＴＣＣＴＣＣＴ（配列番号２３）
ＳＬ－５９６＿ｈＭｅＣＰ２＿ＤＭＲ＿ｓｇＲＮＡ－６＿Ｆｏｒ：ＴＴＧＧ ＧＧＡＧＧＧＧＧＡＧＧＧＴＡＧＡＧＡＧＧ（配列番号２４）
ＳＬ－５９７＿ｈＭｅＣＰ２＿ＤＭＲ＿ｓｇＲＮＡ－６＿Ｒｅｖ：ＡＡＡＣ ＣＣＴＣＴＣＴＡＣＣＣＴＣＣＣＣＣＴＣＣ（配列番号２５）
ＳＬ－５９８＿ｈＭｅＣＰ２＿ＤＭＲ＿ｓｇＲＮＡ－７＿Ｆｏｒ：ＴＴＧＧ ＧＧＧＡＧＧＡＡＧＡＧＧＧＧＣＧＴＣ（配列番号２６）
ＳＬ－５９９＿ｈＭｅＣＰ２＿ＤＭＲ＿ｓｇＲＮＡ－７＿Ｒｅｖ：ＡＡＡＣ ＧＡＣＧＣＣＣＣＴＣＴＴＣＣＴＣＣＣ（配列番号２７）
ＳＬ－６００＿ｈＭｅＣＰ２＿ＤＭＲ＿ｓｇＲＮＡ－８＿Ｆｏｒ：ＴＴＧＧ ＴＧＡＧＡＧＣＴＣＡＧＧＡＧＣＣＣＴＴＧ（配列番号２８）
ＳＬ－６０１＿ｈＭｅＣＰ２＿ＤＭＲ＿ｓｇＲＮＡ－８＿Ｒｅｖ：ＡＡＡＣ ＣＡＡＧＧＧＣＴＣＣＴＧＡＧＣＴＣＴＣＡ（配列番号２９）
ＳＬ－６０２＿ｈＭｅＣＰ２＿ＤＭＲ＿ｓｇＲＮＡ－９＿Ｆｏｒ：ＴＴＧＧ ＣＣＴＡＣＴＴＧＴＴＣＣＴＧＣＴＡＧＡＴ（配列番号３０）
ＳＬ－６０３＿ｈＭｅＣＰ２＿ＤＭＲ＿ｓｇＲＮＡ－９＿Ｒｅｖ：ＡＡＡＣ ＡＴＣＴＡＧＣＡＧＧＡＡＣＡＡＧＴＡＧＧ（配列番号３１）
ＳＬ－６０４＿ｈＭｅＣＰ２＿ＤＭＲ＿ｓｇＲＮＡ－１０＿Ｆｏｒ：ＴＴＧＧ ＡＧＧＴＧＧＴＴＡＴＡＧＴＴＣＣＣＡＴＣ（配列番号３２）
ＳＬ－６０５＿ｈＭｅＣＰ２＿ＤＭＲ＿ｓｇＲＮＡ－１０＿Ｒｅｖ：ＡＡＡＣ ＧＡＴＧＧＧＡＡＣＴＡＴＡＡＣＣＡＣＣＴ（配列番号３３）
【0229】
ｈＭＥＣＰ２プロモーターのｐｙｒｏ－ｓｅｑでは、領域ａを次のプライマーで増幅し、それに応じて配列決定プライマーによって配列決定した。
ＳＬ－８１３＿ｈＭＥＣＰ２ ｐｒｏｍｏｔｅｒ＿Ｎｏ１＿Ｆｏｒ：ＧＡＧＧＧＧＧＡＧＧＧＴＡＧＡＧＡＧ（配列番号３４）
ＳＬ－８１４＿ｈＭＥＣＰ２ ｐｒｏｍｏｔｅｒ＿Ｎｏ １＿Ｒｅｖ＿Ｂｉｏｔｉｎ：
ＣＴＣＣＣＴＣＣＴＣＴＣＣＡＡＡＡＡＡＡＡＡＣＴＡＴＡＡＴＡ（配列番号３５）
ＳＬ－８１５＿ｈＭＥＣＰ２ ｐｒｏｍｏｔｅｒ＿Ｎｏ１＿Ｓｅｑ：ＧＧＧＡＧＧＧＴＡＧＡＧＡＧＧ（配列番号３６）
ＳＬ－８１３＿ｈＭＥＣＰ２ ｐｒｏｍｏｔｅｒ＿Ｎｏ１＿Ｆｏｒ：ＧＡＧＧＧＧＧＡＧＧＧＴＡＧＡＧＡＧ（配列番号３４）
ＳＬ－８１４＿ｈＭＥＣＰ２ ｐｒｏｍｏｔｅｒ＿Ｎｏ １＿Ｒｅｖ＿Ｂｉｏｔｉｎ：
ＣＴＣＣＣＴＣＣＴＣＴＣＣＡＡＡＡＡＡＡＡＡＣＴＡＴＡＡＴＡ（配列番号３５）
ＳＬ－８１５＿ｈＭＥＣＰ２ ｐｒｏｍｏｔｅｒ＿Ｎｏ１＿Ｓｅｑ：ＧＧＧＡＧＧＧＴＡＧＡＧＡＧＧ（配列番号３６）
【0230】
領域ｂは、以下のプライマーで増幅され、それに応じて配列決定プライマーによって配列決定された。
ＳＬ－８１６＿ｈＭＥＣＰ２ ｐｒｏｍｏｔｅｒ＿Ｎｏ２＿Ｆｏｒ：ＧＧＧＴＡＧＡＧＧＧＧＧＧＴＡＧＡＡＡＴＴ（配列番号３７）
ＳＬ－８１７＿ｈＭＥＣＰ２ ｐｒｏｍｏｔｅｒ＿Ｎｏ２＿Ｒｅｖ＿Ｂｉｏｔｉｎ：ＡＣＣＣＣＣＡＣＣＴＣＴＣＣＣＴＡＡＡＴ（配列番号３８）
ＳＬ－８１８＿ｈＭＥＣＰ２ ｐｒｏｍｏｔｅｒ＿Ｎｏ２＿Ｓｅｑ：ＡＧＡＧＴＴＴＡＧＧＡＧＴＴＴＴＴＧＴ（配列番号３９）
ＳＬ－８１６＿ｈＭＥＣＰ２ ｐｒｏｍｏｔｅｒ＿Ｎｏ２＿Ｆｏｒ：ＧＧＧＴＡＧＡＧＧＧＧＧＧＴＡＧＡＡＡＴＴ（配列番号３７）
ＳＬ－８１７＿ｈＭＥＣＰ２ ｐｒｏｍｏｔｅｒ＿Ｎｏ２＿Ｒｅｖ＿Ｂｉｏｔｉｎ：ＡＣＣＣＣＣＡＣＣＴＣＴＣＣＣＴＡＡＡＴ（配列番号３８）
ＳＬ－８１８＿ｈＭＥＣＰ２ ｐｒｏｍｏｔｅｒ＿Ｎｏ２＿Ｓｅｑ：ＡＧＡＧＴＴＴＡＧＧＡＧＴＴＴＴＴＧＴ（配列番号３９）
【0231】
領域ｃは、以下のプライマーで増幅され、それに応じて配列決定プライマーによって配列決定された。
ＳＬ－８１９＿ｈＭＥＣＰ２ ｐｒｏｍｏｔｅｒ＿Ｎｏ３＿Ｆｏｒ：ＧＡＧＴＴＧＴＧＧＧＡＴＴＴＡＧＡＡＴＡＴＡＡＴＧＴ（配列番号４０）
ＳＬ－８２０＿ｈＭＥＣＰ２ ｐｒｏｍｏｔｅｒ＿Ｎｏ３＿Ｒｅｖ＿Ｂｉｏｔｉｎ：ＣＴＣＣＴＴＣＴＣＣＣＣＣＡＴＴＣＣＡＴＡＡＡＴＴＴＣ（配列番号４１）
ＳＬ－８２１＿ｈＭＥＣＰ２ ｐｒｏｍｏｔｅｒ＿Ｎｏ３＿Ｓｅｑ：ＧＴＴＡＧＡＴＧＧＧＧＡＡＡＧＧ（配列番号４２）
ＳＬ－８１９＿ｈＭＥＣＰ２ ｐｒｏｍｏｔｅｒ＿Ｎｏ３＿Ｆｏｒ：ＧＡＧＴＴＧＴＧＧＧＡＴＴＴＡＧＡＡＴＡＴＡＡＴＧＴ（配列番号４０）
ＳＬ－８２０＿ｈＭＥＣＰ２ ｐｒｏｍｏｔｅｒ＿Ｎｏ３＿Ｒｅｖ＿Ｂｉｏｔｉｎ：ＣＴＣＣＴＴＣＴＣＣＣＣＣＡＴＴＣＣＡＴＡＡＡＴＴＴＣ（配列番号４１）
ＳＬ－８２１＿ｈＭＥＣＰ２ ｐｒｏｍｏｔｅｒ＿Ｎｏ３＿Ｓｅｑ：ＧＴＴＡＧＡＴＧＧＧＧＡＡＡＧＧ（配列番号４２）
【0232】
細胞を、ｄＣａｓ９－Ｔｅｔ１－Ｐ２Ａ－ＢＦＰ（ｄＣ－Ｔ）を発現するレンチウイルスとｓｇＲＮＡ－ｍＣｈｅｒｒｙを発現するレンチウイルス（上記で論述した１０個のｓｇＲＮＡを使用した）に感染させた。蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）を使用して、ＢＦＰ＋ｍＣｈｅｒｒｙ＋であった細胞を単離した。感染細胞を免疫蛍光染色した。免疫蛍光画像は、メチル化編集がｈＥＳＣの不活性Ｘ染色体（Ｘｉ）上のＭＥＣＰ２の再活性化をもたらすことを示唆した（図１４）。ｄＣ－Ｔ：ｄＣａｓ９－Ｔｅｔ１。ｄＣａｓ９は、次の点変異：Ｄ１０Ａ及びＨ８４０Ａを有するＣａｓ９である。
【0233】
ＭＥＣＰ２の再活性化は、神経前駆細胞（ＮＰＣ）及びニューロンで維持された（図１５）。ｄＣａｓ９は、次の点変異：Ｄ１０Ａ及びＨ８４０Ａを有するＣａｓ９である。
【0234】
ＭＥＣＰ２変異体８６０番ＲＴＴ様ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）に、ｄＣａｓ９－Ｔｅｔ１－Ｐ２Ａ－ＢＦＰ（ｄＣａｓ９－Ｔｅｔ１）を発現するレンチウイルスとｓｇＲＮＡ－ｍＣｈｅｒｒｙ（１０個のｓｇＲＮＡ）を発現するレンチウイルスを感染させた。蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）を使用して、ＢＦＰ＋ｍＣｈｅｒｒｙ＋である細胞を単離し、培養してＥＳＣコロニーを形成した。次いで、ＥＳＣをニューロンに分化させた。結果は、単一のｓｇＲＮＡと組み合わせたｄＣａｓ９－Ｔｅｔ１が、ＸｉでＭＥＣＰ２を再活性化するのに十分であることを示している（図１６）。ｄＣａｓ９は、次の点変異：Ｄ１０Ａ及びＨ８４０Ａを有するＣａｓ９である。
【0235】
野生型３８番ｈＥＳＣ、変異体８６０番ＲＴＴ様ｈＥＳＣ、及びメチル化編集された８６０番に由来するニューロンを使用して、ＭＥＣＰ２及びＭａｐ２に対する免疫蛍光染色によって細胞体サイズを調べた（図１７Ａ）。細胞体のサイズは、Ｉｍａｇｅ Ｊ（図１７Ｂ）によって定量化された。結果は、メチル化編集されたニューロンにおけるニューロン細胞体サイズのレスキューを示している。ｓｇＲＮＡ：上で論じられた１０個のｓｇＲＮＡ。ｄＣ－Ｔ：ｄＣａｓ９－Ｔｅｔ１。ｄＣａｓ９は、次の点変異：Ｄ１０Ａ及びＨ８４０Ａを有するＣａｓ９である。
【0236】
野生型３８番ｈＥＳＣ、変異体８６０番ＲＴＴ様ｈＥＳＣ、及びメチル化編集された８６０番に由来するニューロンを使用して、多電極アッセイによって分化後の電気物理特性を調べた（図１８Ａ）。図１８Ａ～１８Ｂは、メチル化編集されたニューロンにおけるニューロン活動のレスキューを示す。ｓｇＲＮＡ：上で論じられた１０個のｓｇＲＮＡ。ｄＣ－Ｔ：ｄＣａｓ９－Ｔｅｔ１。ｄＣａｓ９は、次の点変異：Ｄ１０Ａ及びＨ８４０Ａを有するＣａｓ９である。
【0237】
野生型３８番ｈＥＳＣ、変異体８６０番ＲＴＴ様ｈＥＳＣ、及びメチル化編集された８６０番に由来するニューロンに、レンチウイルスｄＣａｓ９－Ｔｅｔ１及び１０個のｓｇＲＮＡを感染させ、ｑＰＣＲによってＧＦＰの発現を調べた。結果は、ＭＥＣＰ２の再活性化がニューロンにおいて安定していなかったことを示している（図１９）。ｓｇＲＮＡ：上で論じられた１０個のｓｇＲＮＡ。
【0238】
Ｘ染色体の不活性化には、複数層のエピジェネティックなメカニズムがある。ｄＣｐｆ１－ＣＴＣＦを使用して、ｄＣａｓ９－Ｔｅｔ１によるニューロンの再活性化のために、ＸｉのＭＥＣＰ２遺伝子座に人工回避物を構築した。図２１Ａ～２１Ｃは、ＲＴＴニューロンにおけるメチル化編集とＤＮＡループの組み合わせがニューロン活動をレスキューしたことを示す。ｄＣａｓ９は、次の点変異：Ｄ１０Ａ及びＨ８４０Ａを有するＣａｓ９である。ｄＣｐｆ１は、次の点変異：Ｄ８３３Ａを有するＬｂＣｐｆ１である。
【0239】
方法
プラスミドの設計と構築
ｐＪＦＡ３４４Ｃ７（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド：４９２３６）からＰＣＲ増幅されたＴｅｔ１触媒ドメイン、ＭＬＭ３７３９（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド：４９９５９）からのＴｅｔ１不活性触媒ドメイン、及びｔａｇＢＦＰ（合成された遺伝子ブロック）を、レンチウイルスをパッケージ化するためのＦＵＷベクター（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド：１４８８２）にＡｓｃＩ、ＥｃｏＲＩ、及びＰｆＩＭＩによってクローニングした。標的ｓｇＲＮＡ発現プラスミドは、アニーリングしたオリゴを改変されたｐｇＲＮＡプラスミド（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド：４４２４８）にＡａｒＩ部位で挿入することによりクローニングした。ＩＤＴから購入したバクテリオファージＡｃｒＩＩＡ４をコードする合成ｇＢｌｏｃｋを、レンチウイルスをパッケージ化するための改変されたＦＵＷベクターにＡｓｃＩ及びＥｃｏＲＩによってクローニングした。すべての構築物は、トランスフェクションの前に配列決定された。
プラスミドの設計と構築
ｐＪＦＡ３４４Ｃ７（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド：４９２３６）からＰＣＲ増幅されたＴｅｔ１触媒ドメイン、ＭＬＭ３７３９（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド：４９９５９）からのＴｅｔ１不活性触媒ドメイン、及びｔａｇＢＦＰ（合成された遺伝子ブロック）を、レンチウイルスをパッケージ化するためのＦＵＷベクター（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド：１４８８２）にＡｓｃＩ、ＥｃｏＲＩ、及びＰｆＩＭＩによってクローニングした。標的ｓｇＲＮＡ発現プラスミドは、アニーリングしたオリゴを改変されたｐｇＲＮＡプラスミド（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド：４４２４８）にＡａｒＩ部位で挿入することによりクローニングした。ＩＤＴから購入したバクテリオファージＡｃｒＩＩＡ４をコードする合成ｇＢｌｏｃｋを、レンチウイルスをパッケージ化するための改変されたＦＵＷベクターにＡｓｃＩ及びＥｃｏＲＩによってクローニングした。すべての構築物は、トランスフェクションの前に配列決定された。
【0240】
細胞培養とレンチウイルスの生産
ｉＰＳＣは、ｍＴｅＳＲ１培地（ＳＴＥＭＣＥＬＬ、＃８５８５０）または標準ｈＥＳＣ培地：［１５％ウシ胎仔血清（ＧＩＢＣＯ ＨＩ ＦＢＳ、１００８２－１４７）、５％ＫｎｏｃｋＯｕｔ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、２ｍＭのＬ－グルタミン（ＭＰＢｉｏ）、１％非必須アミノ酸（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１％ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｌｏｎｚａ）、０．１ｍＭのｂ－メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ）、及び４ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）を補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）］を含む照射マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）のいずれかで培養した。ｄＣａｓ９－Ｔｅｔ１－Ｐ２Ａ－ＢＦＰ、ｓｇＲＮＡ、及びＡｃｒＩＩＡ４を発現するレンチウイルスは、標準的なパッケージングベクター（ｐＣＭＶ－ｄＲ８．７４及びｐＣＭＶ－ＶＳＶＧ）と一緒にＦＵＷ構築物またはｐｇＲＮＡ構築物をＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトし、続いて超遠心ベースの濃縮によって生成された。ウイルス力価（Ｔ）は、２９３Ｔ細胞の感染効率に基づいて計算された。ここで、Ｔ＝（Ｐ＊Ｎ）／（Ｖ）、Ｔ＝力価（ＴＵ／ｕｌ）、ｐ＝蛍光マーカーによる感染陽性細胞の％、Ｎ＝形質導入時の細胞数、Ｖ＝使用したウイルスの総量。注 ＴＵは変換単位を表す。ＮＰＣを標識するレンチウイルス（ＥＦ１Ａ－ＧＦＰ及びＥＦ１Ａ－ＲＦＰ）は、Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから購入した。
ｉＰＳＣは、ｍＴｅＳＲ１培地（ＳＴＥＭＣＥＬＬ、＃８５８５０）または標準ｈＥＳＣ培地：［１５％ウシ胎仔血清（ＧＩＢＣＯ ＨＩ ＦＢＳ、１００８２－１４７）、５％ＫｎｏｃｋＯｕｔ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、２ｍＭのＬ－グルタミン（ＭＰＢｉｏ）、１％非必須アミノ酸（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１％ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｌｏｎｚａ）、０．１ｍＭのｂ－メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ）、及び４ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）を補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）］を含む照射マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）のいずれかで培養した。ｄＣａｓ９－Ｔｅｔ１－Ｐ２Ａ－ＢＦＰ、ｓｇＲＮＡ、及びＡｃｒＩＩＡ４を発現するレンチウイルスは、標準的なパッケージングベクター（ｐＣＭＶ－ｄＲ８．７４及びｐＣＭＶ－ＶＳＶＧ）と一緒にＦＵＷ構築物またはｐｇＲＮＡ構築物をＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトし、続いて超遠心ベースの濃縮によって生成された。ウイルス力価（Ｔ）は、２９３Ｔ細胞の感染効率に基づいて計算された。ここで、Ｔ＝（Ｐ＊Ｎ）／（Ｖ）、Ｔ＝力価（ＴＵ／ｕｌ）、ｐ＝蛍光マーカーによる感染陽性細胞の％、Ｎ＝形質導入時の細胞数、Ｖ＝使用したウイルスの総量。注 ＴＵは変換単位を表す。ＮＰＣを標識するレンチウイルス（ＥＦ１Ａ－ＧＦＰ及びＥＦ１Ａ－ＲＦＰ）は、Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから購入した。
【0241】
マルチ電極アレイ記録
２週齢または４週齢の分化ニューロン培養物をＡｃｃｕｔａｓｅを使用して解離し、５×１０５個の細胞をＰＥＩコーティングＡｘｉｏｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ＃Ｍ７６８－ＧＬ１－３０Ｐｔ２００アレイのそれぞれの単一ウェルに播種した。５分間の自発活動の記録は、示された日に行われた。ニューロンのそれぞれのタイプの生物学的トリプリケートが含まれていた。
２週齢または４週齢の分化ニューロン培養物をＡｃｃｕｔａｓｅを使用して解離し、５×１０５個の細胞をＰＥＩコーティングＡｘｉｏｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ＃Ｍ７６８－ＧＬ１－３０Ｐｔ２００アレイのそれぞれの単一ウェルに播種した。５分間の自発活動の記録は、示された日に行われた。ニューロンのそれぞれのタイプの生物学的トリプリケートが含まれていた。
【0242】
免疫細胞化学、免疫組織化学、顕微鏡、及び画像解析
ｉＰＳＣとニューロンを４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で室温で１０分間固定した。ＰＢＳＴ中の１０％正常ロバ血清（ＮＤＳ）でブロッキングする前に、細胞をＰＢＳＴ（０．１％トリトンＸ－１００を含む１×ＰＢＳ溶液）で透過処理した。次に、細胞を５％ＮＤＳを含むＰＢＳＴで適切に希釈した一次抗体とともに室温で１時間または４℃で１２時間インキュベートし、ＰＢＳＴで室温で３回洗浄し、次いで５％ＮＤＳ及び核を染色するためのＤＡＰＩを含むＴＢＳＴ中の目的の二次抗体とインキュベートした。この研究では、次の抗体を使用した：ニワトリ抗ＧＦＰ（１：１０００、Ａｖｅｓ Ｌａｂｓ）、ウサギ抗ＦＭＲＰ（１：５０、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、ニワトリ抗ＭＡＰ２（１：１０００、Ｅｎｃｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、ヤギ抗ｍＣｈｅｒｒｙ（１：１０００、ＳＩＣＧＥＮ）。画像は、Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ７１０共焦点顕微鏡でキャプチャされ、Ｚｅｎソフトウェア、ＩｍａｇｅＪ／Ｆｉｊｉ、及びＡｄｏｂｅ Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐで処理された。イメージングベースの定量化では、特に指定のない限り、３～５の代表的な画像を定量化し、ＥｘｃｅｌまたはＧｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍを使用してデータを平均±ＳＤとしてプロットした。
ｉＰＳＣとニューロンを４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で室温で１０分間固定した。ＰＢＳＴ中の１０％正常ロバ血清（ＮＤＳ）でブロッキングする前に、細胞をＰＢＳＴ（０．１％トリトンＸ－１００を含む１×ＰＢＳ溶液）で透過処理した。次に、細胞を５％ＮＤＳを含むＰＢＳＴで適切に希釈した一次抗体とともに室温で１時間または４℃で１２時間インキュベートし、ＰＢＳＴで室温で３回洗浄し、次いで５％ＮＤＳ及び核を染色するためのＤＡＰＩを含むＴＢＳＴ中の目的の二次抗体とインキュベートした。この研究では、次の抗体を使用した：ニワトリ抗ＧＦＰ（１：１０００、Ａｖｅｓ Ｌａｂｓ）、ウサギ抗ＦＭＲＰ（１：５０、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、ニワトリ抗ＭＡＰ２（１：１０００、Ｅｎｃｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、ヤギ抗ｍＣｈｅｒｒｙ（１：１０００、ＳＩＣＧＥＮ）。画像は、Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ７１０共焦点顕微鏡でキャプチャされ、Ｚｅｎソフトウェア、ＩｍａｇｅＪ／Ｆｉｊｉ、及びＡｄｏｂｅ Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐで処理された。イメージングベースの定量化では、特に指定のない限り、３～５の代表的な画像を定量化し、ＥｘｃｅｌまたはＧｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍを使用してデータを平均±ＳＤとしてプロットした。
【0243】
ＦＡＣＳ分析
レンチウイルス形質導入後に感染陽性細胞を単離するために、処理された細胞をトリプシンで解離し、製造者のプロトコールに従ってＢＤ ＦＡＣＳＡｒｉａセルソーターの対象となる増殖培地で単一細胞懸濁液を調製した。ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用してデータを分析した。
レンチウイルス形質導入後に感染陽性細胞を単離するために、処理された細胞をトリプシンで解離し、製造者のプロトコールに従ってＢＤ ＦＡＣＳＡｒｉａセルソーターの対象となる増殖培地で単一細胞懸濁液を調製した。ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用してデータを分析した。
【0244】
ウエスタンブロット
細胞は、プロテイナーゼ阻害剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含むＲＩＰＡバッファーによって溶解され、標準的な免疫ブロット分析にかけられた。マウス抗Ｃａｓ９（１：１０００、Ａｃｔｉｖｅ Ｍｏｔｉｆ）、マウスα－チューブリン（１：１０００、Ｓｉｇｍａ）、マウス抗ＦＭＲ１ｐｏｌｙＧ（１：１０００、ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、ウサギ抗ＦＭＲＰ（１：１００、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）抗体が使用された。
細胞は、プロテイナーゼ阻害剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含むＲＩＰＡバッファーによって溶解され、標準的な免疫ブロット分析にかけられた。マウス抗Ｃａｓ９（１：１０００、Ａｃｔｉｖｅ Ｍｏｔｉｆ）、マウスα－チューブリン（１：１０００、Ｓｉｇｍａ）、マウス抗ＦＭＲ１ｐｏｌｙＧ（１：１０００、ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、ウサギ抗ＦＭＲＰ（１：１００、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）抗体が使用された。
【0245】
ＲＴ－ｑＰＣＲ
製造者の使用説明書に従って、Ｔｒｉｚｏｌ、続いてＤｉｒｅｃｔ－ｚｏｌ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用して細胞を回収した。Ｆｉｒｓｔ－ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ合成（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ）を使用して、ＲＮＡをｃＤＮＡに変換した。ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて定量的ＰＣＲ反応を調製し、７９００ＨＴ Ｆａｓｔ ＡＢＩ装置で実施した。
製造者の使用説明書に従って、Ｔｒｉｚｏｌ、続いてＤｉｒｅｃｔ－ｚｏｌ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用して細胞を回収した。Ｆｉｒｓｔ－ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ合成（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ）を使用して、ＲＮＡをｃＤＮＡに変換した。ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて定量的ＰＣＲ反応を調製し、７９００ＨＴ Ｆａｓｔ ＡＢＩ装置で実施した。
【0246】
クロマチン免疫沈降
クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）は、若干の修正を加えて、（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，２００６ Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ ａｎｄ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ－ｂａｓｅｄ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｌｏｃａｔｉｏｎ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．１，７２９－７４８）に記載されているように実施した。増殖培地に１０分の１容量の新鮮な１１％ホルムアルデヒド溶液（１１％ホルムアルデヒド、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ７．３、１００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ ｐＨ８．０、０．５ｍＭのＥＧＴＡ ｐＨ８．０）を加えることにより、細胞を室温で１５分間架橋させ、続いて１２５ｍＭのグリシンで５分間クエンチングした。細胞を１×ＰＢＳで２回すすぎ、シリコンスクレーパーを使用して回収し、液体窒素で瞬間凍結した。凍結した架橋細胞を－８０℃で保存した。１億個の細胞からの溶解物の免疫沈降のために、５０ｍｌのプロテインＧ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＃１０００９Ｄ）と５ｍｇの抗体を次のように調製した。Ｄｙｎａｂｅａｄｓを、ＰＢＳ中の０．５％ＢＳＡ（ｗ／ｖ）で５分間、３回洗浄した。磁気ビーズを抗体と４℃で一晩結合させ、ＰＢＳ中の０．５％ＢＳＡ（ｗ／ｖ）で３回洗浄した。
クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）は、若干の修正を加えて、（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，２００６ Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ ａｎｄ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ－ｂａｓｅｄ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｌｏｃａｔｉｏｎ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．１，７２９－７４８）に記載されているように実施した。増殖培地に１０分の１容量の新鮮な１１％ホルムアルデヒド溶液（１１％ホルムアルデヒド、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ７．３、１００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ ｐＨ８．０、０．５ｍＭのＥＧＴＡ ｐＨ８．０）を加えることにより、細胞を室温で１５分間架橋させ、続いて１２５ｍＭのグリシンで５分間クエンチングした。細胞を１×ＰＢＳで２回すすぎ、シリコンスクレーパーを使用して回収し、液体窒素で瞬間凍結した。凍結した架橋細胞を－８０℃で保存した。１億個の細胞からの溶解物の免疫沈降のために、５０ｍｌのプロテインＧ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＃１０００９Ｄ）と５ｍｇの抗体を次のように調製した。Ｄｙｎａｂｅａｄｓを、ＰＢＳ中の０．５％ＢＳＡ（ｗ／ｖ）で５分間、３回洗浄した。磁気ビーズを抗体と４℃で一晩結合させ、ＰＢＳ中の０．５％ＢＳＡ（ｗ／ｖ）で３回洗浄した。
【0247】
細胞は、以下のようにＣｈＩＰのために調製された。すべてのバッファーには、新たに調製された１×ｃＯｍｐｌｅｔｅプロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ、１１８７３５８０００１）が含まれていた。凍結した架橋細胞を氷上で解凍し、次いで溶解バッファーＩ（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ、ｐＨ７．５、１４０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、１０％グリセロール、０．５％ＮＰ－４０、０．２５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、１×プロテアーゼ阻害剤）中に再懸濁し、４℃で１０分間回転させ、次いで４℃で５分間１３５０ｒｃｆ．で回転させた。ペレットを溶解バッファーＩＩ（１０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．０、２００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．５ｍＭのＥＧＴＡ、１×プロテアーゼ阻害剤）に再懸濁し、４℃で１０分間回転させ、４℃で５分間１３５０ｒｃｆ．で回転させた。ペレットを超音波処理バッファー（２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．０、１５０ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＥＤＴＡ ｐＨ８．０、０．１％ＳＤＳ、及び１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、１×プロテアーゼ阻害剤）に再懸濁し、氷上（１８－２１Ｗ）でそれぞれ３０秒で１０サイクル、サイクル間に氷上で６０秒でＭｉｓｏｎｉｘ ３０００超音波処理器で超音波処理した。超音波処理された溶解物は、４℃で１０分間１６，０００ｒｃｆでの遠心分離によって１回清澄化された。５０ｕＬを投入用に確保し、次いで残りを抗体に結合した磁気ビーズとともに４℃で一晩インキュベートして、指定の因子が結合したＤＮＡ断片を濃縮した。ビーズを次の緩衝液のそれぞれで２回洗浄した：洗浄緩衝液Ａ（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ ｐＨ７．５、１４０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ ｐＨ８．０、０．１％Ｎａ－Ｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ、１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、０．１％ＳＤＳ）、洗浄緩衝液Ｂ（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ ｐＨ７．９、５００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ ｐＨ８．０、０．１％Ｎａ－Ｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ、１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、０．１％ＳＤＳ）、洗浄緩衝液Ｃ（２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．０、２５０ｍＭのＬｉＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ ｐＨ８．０、０．５％Ｎａ－Ｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ、０．５％ＩＧＥＰＡＬ Ｃ－６３０、０．１％ＳＤＳ）、洗浄緩衝液Ｄ（０．２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を含むＴＥ）、及びＴＥ緩衝液。２００μＬの溶出緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣＬ ｐＨ８．０、１０ｍＭのＥＤＴＡ、１％ＳＤＳ）中で断続的にボルテックスしながら６５℃で１時間インキュベーションすることにより、ＤＮＡをビーズから溶出させた。架橋は、６５℃で一晩逆転させた。溶出したＤＮＡを精製するために、２００ｕＬのＴＥを添加し、次いで２．５ｍＬの３３ｍｇ／ｍＬのＲＮａｓｅ Ａ（Ｓｉｇｍａ、Ｒ４６４２）を添加し、３７℃で２時間インキュベートすることによってＲＮＡを分解した。タンパク質は、１０ｍＬの２０ｍｇ／ｍＬのプロテイナーゼＫ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、２５５３００４９）を添加し、５５℃で２時間インキュベートすることによって分解された。フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール抽出を行った後、エタノール沈殿を行った。次いで、ＤＮＡを５０ｕＬのＴＥに再懸濁し、配列決定に使用した。精製されたＣｈＩＰ ＤＮＡを使用して、イルミナのマルチプレックス配列決定ライブラリを調製した。イルミナ配列決定用のライブラリは、イルミナＴｒｕＳｅｑ ＤＮＡ試料調製ｖ２キットに従って調製された。増幅されたライブラリは、２００～４００ｂｐの断片を捕捉するように設定されたＳａｇｅ ＳｃｉｅｎｃｅのＰｉｐｐｉｎ Ｐｒｅｐシステムで２％ゲルカセットを使用してサイズ選択された。キットのプロトコールに従って、ＫＡＰＡ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎキットを使用して、ｑＰＣＲによってライブラリを定量化した。ライブラリは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ ２５００で４０塩基をシングルリードモードで配列決定した。
【0248】
Ｃａｓ９ ＣｈＩＰ－ｓｅｑピーク呼び出し方法
Ｃａｓ９ ＣｈＩＰ－ｓｅｑデータは次のように分析された。読み取りは、一意のマッピングと完全な一致を要件として、ＳＴＡＲ（Ｄｏｂｉｎ ｅｔ ａｌ．，ＳＴＡＲ：ｕｌｔｒａｆａｓｔ ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＲＮＡ－ｓｅｑ ａｌｉｇｎｅｒ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，２０１３，２９，１５－２１）を使用して逆多重化され、ヒトゲノム（ｈｇ１９）にマッピングされる。ピークは、配列決定深度に一致するようにサンプリングされた同数の折りたたまれた読み取りとともにＭＡＣＳ（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｄｅｌ－ｂａｓｅｄ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＣｈＩＰ－ｓｅｑ（ＭＡＣＳ），Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ．，２００８，９，Ｒ１３７）を使用して呼び出された。
Ｃａｓ９ ＣｈＩＰ－ｓｅｑデータは次のように分析された。読み取りは、一意のマッピングと完全な一致を要件として、ＳＴＡＲ（Ｄｏｂｉｎ ｅｔ ａｌ．，ＳＴＡＲ：ｕｌｔｒａｆａｓｔ ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＲＮＡ－ｓｅｑ ａｌｉｇｎｅｒ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，２０１３，２９，１５－２１）を使用して逆多重化され、ヒトゲノム（ｈｇ１９）にマッピングされる。ピークは、配列決定深度に一致するようにサンプリングされた同数の折りたたまれた読み取りとともにＭＡＣＳ（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｄｅｌ－ｂａｓｅｄ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＣｈＩＰ－ｓｅｑ（ＭＡＣＳ），Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ．，２００８，９，Ｒ１３７）を使用して呼び出された。
【0249】
ＣｈＩＰ－ＢＳ－ｓｅｑ
抗Ｃａｓ９ ＣｈＩＰ実験は、上記のように行った。ＢＳ変換及び配列ライブラリの調製は、使用説明書に従って、ＥｐｉＮｅｘｔ Ｈｉｇｈ－Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ－Ｓｅｑキット（ＥＰＩＧＥＮＴＥＫ、＃Ｐ－１０５６Ａ）及びＥｐｉＮｅｘｔ ＮＧＳ Ｂａｒｃｏｄｅ（ＥＰＩＧＥＮＴＥＫ、＃Ｐ－１０６０）によって行われた。生データを分析するために、ＦａｓｔＱＣで識別されたｉｌｌｕｍｉｎａ読み取り中のアダプター配列は、Ｔｒｉｍ Ｇａｌｏｒｅで削除された。ＢＳ－ＳｅｑアライナーＢｉｓｍａｒｋ（Ｋｒｕｅｇｅｒ ａｎｄ Ａｎｄｒｅｗｓ，Ｂｉｓｍａｒｋ：ａ ｆｌｅｘｉｂｌｅ ａｌｉｇｎｅｒ ａｎｄ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｃａｌｌｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ－Ｓｅｑ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，２０１１，２７，１５７１－１５７２）は、読み取りをヒトゲノムｈｇ１９に割り当て、ｂｉｓｍａｒｋ＿ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ＿ｅｘｔｒａｃｔｏｒでメチル化を呼び出すために使用された。一意にマップされた読み取りの数を増やすために、最初のビスマークアラインメントの後、ＦａｓｔＱＣ分析に基づいて、マッピングされていない読み取りの５０から５塩基と３０から１塩基がトリミングされた。得られたトリミングされた読み取りは、ビスマークを使用してゲノムに整列された。どちらの場合も、ｂｉｓｍａｒｋはオプション「－ｎｏｎ＿ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ －ｕｎ－ａｍｂｉｇｕｏｕｓ－ｂｏｗｔｉｅ２ －Ｎ １ －ｐ ４－ｓｃｏｒｅ＿ｍｉｎ Ｌ，－６，－０．３－ｓｏｌｅｘａ１．３－ｑｕａｌｓ」を使用して実行された。ｄＣ－Ｔ試料とｄＣ－ｄＴ試料の間でｄＣａｓ９－Ｔｅｔ１結合部位のメチル化レベルを比較するために、それぞれのＣｐＧが、ＣｈＩＰ－ＢＳ－ｓｅｑによって、ｉＰＳＣでの少なくとも１０回の読み取りまたはニューロンでの５つの読み取りでカバーされた少なくとも２０個のＣｐＧ部位を含む抗Ｃａｓ９ ＣｈＩＰ－ｓｅｑピークのみを選択して、メチル化レベルを計算した。ｉＰＳＣ細胞の結合部位の数は１０１８であり、ニューロンでは６７０である。ｓｃａｎ＿ｆｏｒ＿ｍａｔｃｈｅｓを使用して、これらの結合部位に由来する配列でＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＮＧＧモチーフを検索した。Ｒスクリプトは、グラフを生成するために作成された。
抗Ｃａｓ９ ＣｈＩＰ実験は、上記のように行った。ＢＳ変換及び配列ライブラリの調製は、使用説明書に従って、ＥｐｉＮｅｘｔ Ｈｉｇｈ－Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ－Ｓｅｑキット（ＥＰＩＧＥＮＴＥＫ、＃Ｐ－１０５６Ａ）及びＥｐｉＮｅｘｔ ＮＧＳ Ｂａｒｃｏｄｅ（ＥＰＩＧＥＮＴＥＫ、＃Ｐ－１０６０）によって行われた。生データを分析するために、ＦａｓｔＱＣで識別されたｉｌｌｕｍｉｎａ読み取り中のアダプター配列は、Ｔｒｉｍ Ｇａｌｏｒｅで削除された。ＢＳ－ＳｅｑアライナーＢｉｓｍａｒｋ（Ｋｒｕｅｇｅｒ ａｎｄ Ａｎｄｒｅｗｓ，Ｂｉｓｍａｒｋ：ａ ｆｌｅｘｉｂｌｅ ａｌｉｇｎｅｒ ａｎｄ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｃａｌｌｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ－Ｓｅｑ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，２０１１，２７，１５７１－１５７２）は、読み取りをヒトゲノムｈｇ１９に割り当て、ｂｉｓｍａｒｋ＿ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ＿ｅｘｔｒａｃｔｏｒでメチル化を呼び出すために使用された。一意にマップされた読み取りの数を増やすために、最初のビスマークアラインメントの後、ＦａｓｔＱＣ分析に基づいて、マッピングされていない読み取りの５０から５塩基と３０から１塩基がトリミングされた。得られたトリミングされた読み取りは、ビスマークを使用してゲノムに整列された。どちらの場合も、ｂｉｓｍａｒｋはオプション「－ｎｏｎ＿ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ －ｕｎ－ａｍｂｉｇｕｏｕｓ－ｂｏｗｔｉｅ２ －Ｎ １ －ｐ ４－ｓｃｏｒｅ＿ｍｉｎ Ｌ，－６，－０．３－ｓｏｌｅｘａ１．３－ｑｕａｌｓ」を使用して実行された。ｄＣ－Ｔ試料とｄＣ－ｄＴ試料の間でｄＣａｓ９－Ｔｅｔ１結合部位のメチル化レベルを比較するために、それぞれのＣｐＧが、ＣｈＩＰ－ＢＳ－ｓｅｑによって、ｉＰＳＣでの少なくとも１０回の読み取りまたはニューロンでの５つの読み取りでカバーされた少なくとも２０個のＣｐＧ部位を含む抗Ｃａｓ９ ＣｈＩＰ－ｓｅｑピークのみを選択して、メチル化レベルを計算した。ｉＰＳＣ細胞の結合部位の数は１０１８であり、ニューロンでは６７０である。ｓｃａｎ＿ｆｏｒ＿ｍａｔｃｈｅｓを使用して、これらの結合部位に由来する配列でＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＮＧＧモチーフを検索した。Ｒスクリプトは、グラフを生成するために作成された。
【0250】
重亜硫酸変換、ＰＣＲ、及び配列決定
ＤＮＡの重亜硫酸変換は、ＥｐｉＴｅｃｔ Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅキット（ＱＩＡＧＥＮ）を製造者の使用説明書に従って使用して確立した。得られた修飾されたＤＮＡは、遺伝子座特異的ＰＣＲプライマーを使用する２番目のラウンドに続いて、ネステッドＰＣＲの最初のラウンドによって増幅された。ネステッドＰＣＲの１番目のラウンドは次のように行われた：９４℃で４分間；５５℃で２分間；７２℃で２分間；ステップ１～３を１回繰り返す；９４℃で１分間；５５℃で２分間；７２℃で２分間；ステップ５～７を３５回繰り返す；７２℃で５分間；１２℃を保つ。２回目のＰＣＲは次のとおりである：９５℃で４分間；９４℃で１分間；５５℃で２分間；７２℃で２分間；ステップ２～４を３５回繰り返す；７２℃で５分間；１２℃を保つ。得られた増幅産物をゲル精製し、ｐＣＲ２．１－ＴＯＰＯ－ＴＡクローニングベクター（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）にサブクローニングし、配列決定した。
ＤＮＡの重亜硫酸変換は、ＥｐｉＴｅｃｔ Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅキット（ＱＩＡＧＥＮ）を製造者の使用説明書に従って使用して確立した。得られた修飾されたＤＮＡは、遺伝子座特異的ＰＣＲプライマーを使用する２番目のラウンドに続いて、ネステッドＰＣＲの最初のラウンドによって増幅された。ネステッドＰＣＲの１番目のラウンドは次のように行われた：９４℃で４分間；５５℃で２分間；７２℃で２分間；ステップ１～３を１回繰り返す；９４℃で１分間；５５℃で２分間；７２℃で２分間；ステップ５～７を３５回繰り返す；７２℃で５分間；１２℃を保つ。２回目のＰＣＲは次のとおりである：９５℃で４分間；９４℃で１分間；５５℃で２分間；７２℃で２分間；ステップ２～４を３５回繰り返す；７２℃で５分間；１２℃を保つ。得られた増幅産物をゲル精製し、ｐＣＲ２．１－ＴＯＰＯ－ＴＡクローニングベクター（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）にサブクローニングし、配列決定した。
【0251】
ＤＮＡメチル化分析
重亜硫酸塩で変換されたすべてのゲノムＤＮＡ試料のＰｙｒｏ－ｓｅｑは、製造者の使用説明書に従ってＰｙｒｏＭａｒｋ Ｑ４８ Ａｕｔｏｐｒｅｐ（ＱＩＡＧＥＮ）で実行された。ＣＧＧトリヌクレオチド反復のメチル化分析：ＣＧＧ反復のメチル化状態は、Ａｓｕｒａｇｅｎ ＡｍｐｌｉｄｅＸ＿ｍＰＣＲアプローチを用いてＣｌａｒｉｔａｓ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｉｎｃ．によって分析された。
重亜硫酸塩で変換されたすべてのゲノムＤＮＡ試料のＰｙｒｏ－ｓｅｑは、製造者の使用説明書に従ってＰｙｒｏＭａｒｋ Ｑ４８ Ａｕｔｏｐｒｅｐ（ＱＩＡＧＥＮ）で実行された。ＣＧＧトリヌクレオチド反復のメチル化分析：ＣＧＧ反復のメチル化状態は、Ａｓｕｒａｇｅｎ ＡｍｐｌｉｄｅＸ＿ｍＰＣＲアプローチを用いてＣｌａｒｉｔａｓ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｉｎｃ．によって分析された。
【0252】
Ｓｕｒｖｅｙｏｒアッセイ
ＣＲＩＳＰＲ複合体の標的配列への配列特異的結合を誘導するｇＲＮＡ、ｃｒＲＮＡ、またはｓｇＲＮＡの能力は、Ｓｕｒｖｅｙｏｒアッセイなどの任意の適切なアッセイによって評価され得る。
ＣＲＩＳＰＲ複合体の標的配列への配列特異的結合を誘導するｇＲＮＡ、ｃｒＲＮＡ、またはｓｇＲＮＡの能力は、Ｓｕｒｖｅｙｏｒアッセイなどの任意の適切なアッセイによって評価され得る。
【0253】
Ｓｕｒｖｅｙｏｒアッセイは、ＤＮＡ混合物中の変異と多型を検出する。Ｓｕｒｖｅｙｏｒヌクレアーゼは、セロリ由来のミスマッチ特異的ヌクレアーゼのＣＥＬファミリーのメンバーである。Ｓｕｒｖｅｙｏｒヌクレアーゼは、一塩基多型（ＳＮＰ）または小さな挿入もしくは欠失の存在によるミスマッチを認識して切断する。Ｓｕｒｖｅｙｏｒヌクレアーゼは、少なくとも１２ヌクレオチドまでのすべての塩基置換及び挿入／欠失を含む、両方のＤＮＡ鎖のミスマッチ部位の３’側を高い特異性で切断する。
【0254】
ＳＵＲＶＥＹＯＲヌクレアーゼは、少なくとも１２ヌクレオチドまでのすべての塩基置換及び挿入／欠失を含む、両方のＤＮＡ鎖のミスマッチ部位の３’側を高い特異性で切断する。Ｓｕｒｖｅｙｏｒヌクレアーゼ技術には、次の４つのステップが含まれる：（ｉ）Ｃａｓ９／Ｃｐｆ１ヌクレアーゼを介した切断を受けた細胞または組織試料から標的ＤＮＡを増幅するためのＰＣＲ；（ｉｉ）影響を受けたＤＮＡと影響を受けていないＤＮＡの間でヘテロ二本鎖を形成するためのハイブリダイゼーション（影響を受けたＤＮＡ配列は影響を受けたＤＮＡ配列とは異なるため、ミスマッチに起因するバルジ構造が変性及び再生後に形成され得る）；（ｉｉｉ）アニーリングしたＤＮＡをＳｕｒｖｅｙｏｒヌクレアーゼで処理してヘテロ二本鎖を切断する（すなわちバルジを切断する）；（ｉｖ）例えばアガロースゲル電気泳動などの最適な検出／分離プラットフォームを使用する、消化されたＤＮＡ産物の分析。Ｃａｓ９ヌクレアーゼを介した切断効率は、Ｓｕｒｖｅｙｏｒヌクレアーゼで消化されたＤＮＡと未消化のＤＮＡの比率によって推定できる。この技術は非常に感度が高く、３２コピーに１コピーという低い頻度で存在する希少な変異体を検出することができる。Ｓｕｒｖｅｙｏｒ変異アッセイキットは、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ），Ｃｏｒａｖｉｌｌｅ，ＩＡから市販されている。
【0255】
本発明の範囲は、上記で具体的に示し記載されたものによって限定されない。当業者は、材料、構成、構造、及び寸法の図示された例に対する適切な代替案があることを認識するであろう。特許及びさまざまな刊行物を含む多数の参考文献が、本発明の説明において引用され、論じられている。そのような参考文献の引用及び考察は、単に本発明の説明を明確にするために提供されるものであり、いかなる参考文献も、本明細書に記載された本発明に対する先行技術であることを認めるものではない。本明細書に引用され、論じられているすべての参考文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。当業者であれば、本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく、本明細書に記載されているものの変形、修正、及び他の実施に想到するであろう。本発明の特定の実施形態を示し説明してきたが、本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく、変更及び修正を行うことができることは当業者には明らかであろう。前述の記載に示される事項は、限定ではなく例示としてのみ提供されている。
【図1】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図3】
【図4】
【図5A】
【図5B】
【図6】
【図7A】
【図7B】
【図8】
【図9A】
【図9B】
【図9C】
【図10A】
【図10B】
【図11A】
【図11B】
【図12】
【図13A】
【図13B】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17A】
【図17B】
【図18A】
【図18B】
【図19】
【図20】
【図21A】
【図21B】
【図21C】
【手続補正書】
【提出日】2023-09-21
【手続補正1】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
【国際調査報告】