特表 2023-549433 プレターゲットイメージングおよび治療用ＰＮＡプローブ

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-11-24

(54)【発明の名称】プレターゲットイメージングおよび治療用ＰＮＡプローブ

(51)【国際特許分類】

   A61K 47/68 20170101AFI20231116BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20231116BHJP

   A61P 31/00 20060101ALI20231116BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20231116BHJP

   A61P 37/02 20060101ALI20231116BHJP

   A61P 35/02 20060101ALI20231116BHJP

   A61K 31/7088 20060101ALI20231116BHJP

   C07K 16/28 20060101ALI20231116BHJP

   C12N 15/11 20060101ALI20231116BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20231116BHJP

   G01N 33/53 20060101ALI20231116BHJP

   G01T 1/161 20060101ALN20231116BHJP

【ＦＩ】

A61K47/68 ZNA

A61P35/00

A61P31/00

A61P29/00

A61P37/02

A61P35/02

A61K31/7088

C07K16/28

C12N15/11 Z

C12N15/13

G01N33/53 M

G01T1/161 D

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023547921

(86)(22)【出願日】2021-10-18

(85)【翻訳文提出日】2023-06-13

(86)【国際出願番号】 EP2021078854

(87)【国際公開番号】W WO2022079321

(87)【国際公開日】2022-04-21

(31)【優先権主張番号】2051204-2

(32)【優先日】2020-10-16

(33)【優先権主張国・地域又は機関】SE

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＷＩＮＤＯＷＳ

２．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】523140072

【氏名又は名称】ザイトックス セラピューティクス アクチボラゲット

(74)【代理人】

【識別番号】110000855

【氏名又は名称】弁理士法人浅村特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】エリクソン カールストーム、アメリ

(72)【発明者】

【氏名】ウェスターランド、クリスティーナ

(72)【発明者】

【氏名】タノ、ハンナ

【テーマコード（参考）】

4C076

4C086

4C188

4H045

【Ｆターム（参考）】

4C076AA95

4C076CC04

4C076CC07

4C076CC27

4C076CC41

4C076EE41

4C076EE59

4C086AA01

4C086AA02

4C086EA16

4C086MA02

4C086MA05

4C086NA13

4C086ZB07

4C086ZB11

4C086ZB26

4C086ZB27

4C086ZB31

4C188EE02

4C188FF04

4C188FF07

4H045AA11

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA10

4H045BA54

4H045CA40

4H045DA76

4H045EA20

4H045FA74

(57)【要約】

本発明は、（ａ）（ｉ）標的部位に選択的に結合することができる標的化部分；および（ｉｉ）ＰＮＡオリゴマーを含む第１のハイブリダイゼーションプローブ部分を含む第１のコンジュゲート；ならびに（ｂ）（ｉ）相補的ＰＮＡオリゴマーを含む第２のハイブリダイゼーションプローブ部分；および（ｉｉ）診断剤または治療剤部分を含む第２のコンジュゲートを含み；第２のハイブリダイゼーションプローブ部分の相補的ＰＮＡオリゴマーの長さは１４塩基以下である、診断剤または治療剤を標的部位に標的化するためのキットに関する。本発明はさらに、診断剤または治療剤を、哺乳動物の標的部位に送達する方法、ならびに哺乳動物における例えばがんなどの病状を診断または処置する方法に関する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

診断剤または治療剤を標的部位に標的化するためのキットであって、
（ａ）
（ｉ）前記標的部位に選択的に結合することができる標的化部分；および
（ｉｉ）第１のＰＮＡオリゴマーを含む第１のハイブリダイゼーションプローブ部分
を含む第１のコンジュゲートと；
（ｂ）
（ｉ）前記第１のＰＮＡオリゴマーに相補的な第２のＰＮＡオリゴマーを含む第２のハイブリダイゼーションプローブ部分；および
（ｉｉ）診断剤または治療剤部分
を含む第２のコンジュゲートと
を含み、
前記第２のハイブリダイゼーションプローブ部分の前記第２のＰＮＡオリゴマーの長さが５～１２塩基である、キット。

【請求項2】

前記標的部位が、細胞、好ましくは腫瘍細胞の表面上に発現される、ヒトを含む哺乳動物タンパク質に存在する、請求項１に記載のキット。

【請求項3】

前記標的部位が、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、ヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）、ヒト上皮増殖因子受容体３（ＨＥＲ３）、インスリン様増殖因子１受容体（ＩＧＦ１Ｒ）、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）、血小板由来増殖因子受容体β（ＰＤＧＦＲ－β）、ネクチン－４、分化抗原群３８（ＣＤ３８）、分化抗原群３３（ＣＤ３３）、分化抗原群３０（ＣＤ３０）、分化抗原群２２（ＣＤ２２）、および分化抗原群７９ｂ（ＣＤ７９ｂ）からなる群から選択されるヒトを含む哺乳動物タンパク質に存在する、請求項２に記載のキット。

【請求項4】

前記標的部位が、ヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）に存在する、請求項３に記載のキット。

【請求項5】

前記標的化部分が、
・抗体；
・抗体フラグメント、例えば単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ；ナノボディ）、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、抗原結合性フラグメント（Ｆａｂ）、ダイアボディ、またはミニボディ；
・工学的足場タンパク質、例えばアフィボディ（登録商標）分子；および
・ペプチド
からなる群から選択される、請求項１から４のいずれか一項に記載のキット。

【請求項6】

前記標的化部分が、アフィボディ（登録商標）分子である、請求項５に記載のキット。

【請求項7】

前記ハイブリダイゼーションプローブの一方または両方が、可溶化部分、好ましくは
（ａ）ＰＥＧベースのリンカー、例えば２－［２－（２－アミノエトキシ）エトキシ］酢酸（ＡＥＥＡ）を含むリンカー；または
（ｂ）荷電もしくは極性アミノ酸を含むペプチドベースのリンカー
を含む、請求項１から６のいずれか一項に記載のキット。

【請求項8】

前記第１のハイブリダイゼーションプローブ部分の前記第１のＰＮＡオリゴマーの長さが、少なくとも前記第２のハイブリダイゼーションプローブ部分の前記第２のＰＮＡオリゴマーの長さであり、１５塩基以下である、請求項１から７のいずれか一項に記載のキット。

【請求項9】

前記第１のハイブリダイゼーションプローブ部分の前記ＰＮＡオリゴマーの長さが１５塩基である、請求項８に記載のキット。

【請求項10】

前記第２のハイブリダイゼーションプローブ部分の前記相補的ＰＮＡオリゴマーの長さが９～１２塩基である、請求項１から９のいずれか一項に記載のキット。

【請求項11】

前記相補的ＰＮＡオリゴマーの長さが９塩基である、請求項１０に記載のキット。

【請求項12】

前記相補的ＰＮＡオリゴマーの長さが１２塩基である、請求項１０に記載のキット。

【請求項13】

前記治療剤が、放射性核種、カリケアマイシン、モノメチルアウリスタチンＥ／Ｆ（ＭＭＡＥ／Ｆ）などのアウリスタチン、およびメイタンシン誘導体ＤＭ０～ＤＭ４などのメイタンシノイドからなる群から選択される、請求項１から１２のいずれか一項に記載のキット。

【請求項14】

前記治療剤が、ルテチウム－１７７（^１７７Ｌｕ）、イットリウム－９０（^９０Ｙ）、ビスマス－２１２（^２１２Ｂｉ）、ビスマス－２１３（^２１３Ｂｉ）、アスタチン－２１１（^２１１Ａｔ）、アクチニウム－２５５（^２５５Ａｃ）、銅－６７（^６７Ｃｕ）、ガリウム－６７（^６７Ｇａ）、およびレニウム－１８６（^１８６Ｒｅ）からなる群から選択される放射性核種である、請求項１３に記載のキット。

【請求項15】

前記診断剤が、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、陽電子放射断層撮影法（ＰＥＴ）、単一光子放射型コンピュータ断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）、コンピュータ断層撮影法（ＣＴ）、Ｘ線イメージング、超音波、および光学的画像法からなる群から選択される方法によって検出可能なシグナルを生成する、請求項１から１４のいずれか一項に記載のキット。

【請求項16】

前記診断剤が放射性核種である、請求項１５に記載のキット。

【請求項17】

前記診断剤または治療剤が放射性核種であり、少なくとも前記第２のハイブリダイゼーションプローブ部分がキレート剤、好ましくは１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－１，４，７，１０－四酢酸（ＤＯＴＡ）を含む、請求項１３または１６に記載のキット。

【請求項18】

診断剤または治療剤を、ヒトを含む哺乳動物の標的部位に送達する方法であって、前記方法が、
（ａ）（ｉ）前記標的部位に選択的に結合する標的化部分；および
（ｉｉ）第１のＰＮＡオリゴマーを含む第１のハイブリダイゼーションプローブ部分
を含む第１のコンジュゲートを前記哺乳動物に投与すること；ならびに
（ｂ）必要に応じて、前記哺乳動物にクリア剤を投与し、前記クリア剤が非局在化した第１のコンジュゲートを血液循環からクリアすることを可能にすること；ならびに
（ｃ）（ｉ）前記第１のＰＮＡオリゴマーに相補的な第２のＰＮＡオリゴマーを含む第２のハイブリダイゼーションプローブ部分；および
（ｉｉ）診断剤または治療剤部分
を含む第２のコンジュゲートを前記哺乳動物に投与すること
を含み、
前記第２のハイブリダイゼーションプローブ部分の前記第２のＰＮＡオリゴマーの長さが５～１２塩基であり、前記第２のＰＮＡオリゴマーが前記第１のコンジュゲートの前記第１のＰＮＡオリゴマーに結合し、それによって前記診断剤または治療剤部分を前記標的部位に標的化する、方法。

【請求項19】

請求項１から１７のいずれか一項に記載のキットの第１および第２のコンジュゲートを含む医薬組成物。

【請求項20】

がん、感染性疾患、炎症性疾患、および自己免疫疾患からなる群から選択され；好ましくは、がんの病状の診断または処置に使用するための、請求項１９に記載の医薬組成物。

【請求項21】

診断剤または治療剤を、ヒトを含む哺乳動物の標的部位に送達する方法における使用のための診断または治療用コンジュゲートであって、前記方法が、
（ａ）
（ｉ）前記標的部位に選択的に結合する標的化部分；および
（ｉｉ）第１のＰＮＡオリゴマーを含む第１のハイブリダイゼーションプローブ部分
を含む標的化コンジュゲートを前記哺乳動物に投与し；
（ｂ）必要に応じて、前記哺乳動物にクリア剤を投与して、前記クリア剤が非局在化した標的化コンジュゲートを血液循環からクリアすることを可能とし；
（ｃ）前記診断または治療用コンジュゲートを前記哺乳動物に投与すること
を含み、
前記診断または治療用コンジュゲートが、
（ｉ）前記第１のＰＮＡオリゴマーに相補的な第２のＰＮＡオリゴマーを含む第２のハイブリダイゼーションプローブ部分；および
（ｉｉ）診断剤または治療剤部分
を含み、
前記第２のハイブリダイゼーションプローブ部分の前記第２のＰＮＡオリゴマーの長さが５～１２塩基であり、前記第２のＰＮＡオリゴマーが前記第１のコンジュゲートの前記第１のＰＮＡオリゴマーに結合し、それによって前記診断剤または治療剤部分を前記標的部位に標的化する、診断または治療用コンジュゲート。

【請求項22】

前記方法が、ヒトを含む哺乳動物における病状の診断、予後診断または処置のための方法である、請求項２１に記載の使用のための診断または治療用コンジュゲート。

【請求項23】

前記病状が、がん、感染性疾患、炎症性疾患、および自己免疫疾患からなる群から選択され；好ましくは、がんである、請求項２２に記載の使用のための診断または治療用コンジュゲート。

【請求項24】

前記病状が、固形腫瘍を形成することができるがんであり、前記がんが、乳がん、前立腺がん、肺がん、頭頸部がん、胃がん、および結腸がんからなる群から選択される、請求項２３に記載の使用のための診断または治療用コンジュゲート。

【請求項25】

前記標的部位が、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、ヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）、ヒト上皮増殖因子受容体３（ＨＥＲ３）、インスリン様増殖因子１受容体（ＩＧＦ１Ｒ）、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）、血小板由来増殖因子受容体β（ＰＤＧＦＲ－β）、およびネクチン－４からなる群から選択されるヒトタンパク質に存在する、請求項２４に記載の使用のための診断または治療用コンジュゲート。

【請求項26】

前記病状が、黒色腫、白血病、および骨髄腫からなる群から選択される血液がんである、請求項２３に記載の使用のための診断または治療用コンジュゲート。

【請求項27】

前記標的部位が、分化抗原群３８（ＣＤ３８）、分化抗原群３３（ＣＤ３３）、分化抗原群３０（ＣＤ３０）、分化抗原群２２（ＣＤ２２）、および分化抗原群７９ｂ（ＣＤ７９ｂ）からなる群から選択されるヒトタンパク質に存在する、請求項２６に記載の使用のための診断または治療用コンジュゲート。

【請求項28】

前記第２のハイブリダイゼーションプローブ部分の前記第２のＰＮＡオリゴマーの長さが９～１２塩基である、請求項２１から２７のいずれか一項に記載の使用のための診断または治療用コンジュゲート。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、（ａ）（ｉ）標的部位に選択的に結合することができる標的化部分；および（ｉｉ）ＰＮＡオリゴマーを含む第１のハイブリダイゼーションプローブ部分を含む第１のコンジュゲート；ならびに（ｂ）（ｉ）相補的ＰＮＡオリゴマーを含む第２のハイブリダイゼーションプローブ部分；および（ｉｉ）診断剤または治療剤部分を含む第２のコンジュゲートを含む、診断剤または治療剤を標的部位に標的化するためのキットに関する。本発明はさらに、診断剤または治療剤を、哺乳動物の標的部位に送達する方法、ならびに哺乳動物における例えばがんなどの病状を診断または処置する方法に関する。

【背景技術】

【0002】

アフィボディ（Ａｆｆｉｂｏｄｙ）（登録商標）分子は、小さい（分子量７ｋＤａ）の工学的足場タンパク質であり、広範囲の生体分子に高い親和性で結合するように選択され得（Ｓｔａｈｌ ２０１７）、がんの診断および治療に対して可能性のある工学的足場タンパク質のクラスに属する（Ｗｅｉｄｌｅ ２０１３）。アフィボディ（登録商標）分子は、サイズが小さく、がん関連標的に対して親和性および選択性が高いため、放射性核種イメージングプローブとしてとても適している（Ｓｔａｈｌ ２０１７）。アフィボディ（登録商標）分子は、原核生物において高収率で容易に組換え産生することができる。上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲまたはＨＥＲ１）、ヒト上皮増殖因子受容体２型（ＨＥＲ２）、ヒト上皮増殖因子受容体３型（ＨＥＲ３）、血小板由来増殖因子受容体β（ＰＤＧＦＲβ）、インスリン様増殖因子１受容体（ＩＧＦ－１Ｒ）、血管内皮増殖因子受容体２（ＶＥＧＦＲ２）およびプログラム死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）のためのアフィボディに基づくイメージングプローブは、前臨床実験において非常に有望な特徴を実証した（Ｔｏｌｍａｃｈｅｖ ２０２０）。さらに、ＨＥＲ２の優れたイメージングが診療所で実証されている（Ｓｏｒｅｎｓｅｎ ２０１４；Ｓｏｒｅｎｓｅｎ ２０１６）。

【0003】

モノクローナル抗体および抗体－薬物コンジュゲートを使用したＨＥＲ２の標的化は、乳がんおよび胃食道がん患者の生存を延ばすが、ＨＥＲ２発現が保持されているにもかかわらず、このような治療に対する耐性の出現は避けられない（Ｋｒｅｕｔｚｆｅｌｄｔ ２０２０；Ｇａｒｃｉａ－Ａｌｏｎｓｏ ２０２０）。この場合、ＨＥＲ２標的化放射性核種療法が解決策となる場合がある。しかしながら、放射性標識されたモノクローナル抗体の使用である標的化放射性核種療法に対する主なアプローチは、血液循環での長い滞留が骨髄への過剰照射を引き起こすため、固形腫瘍では非効率的である（Ｌａｒｓｏｎ ２０１５）。放射性核種療法のためのアフィボディ（登録商標）分子の直接適用は、放射性金属標識の場合の高い腎臓再吸収および活性の長期間保持のために難しい（Ｆｏｒｔｉｎ ２００８）。放射性標識されたタンパク質およびペプチドの腎臓取込みの低減のために適用される一般的な方法は、アフィボディ（登録商標）分子に対して非効率的であることが判明した（Ａｌｔａｉ，２０１３；Ｇａｒｏｕｓｉ ２０２０）。

【0004】

放射性標識されたアフィボディ（登録商標）分子の高い腎臓再吸収の問題に対する解決策は、プレターゲティング、がん関連異常の分子認識および放射性核種送達の作用を分離する方法論を適用することである（Ｆｒａｍｐａｓ ２０１３、Ａｌｔａｉ ２０１７ ＪＮＭ）。プレターゲティングでは、認識タグにカップリングした標的特異的一次薬剤を注射して腫瘍に局在させる。一次薬剤を血液からクリアランスした後、認識タグに対して高い親和性を有する放射性標識された二次プローブを注射する。腎臓における二次プローブの低い取込みは、アフィボディに基づくプレターゲット療法の成功にとって重要である。アフィボディ（登録商標）分子は、血液から迅速にクリアされ、がん細胞によってゆっくりと内在化されるため、一次プローブの魅力的な候補である（Ｗａｌｌｂｅｒｇ ２００８）。

【0005】

異なるアプローチの評価（Ａｌｔａｉ ２０１６；Ｈｏｎａｒｖａｒ ２０１６）後、相補的ペプチド核酸（ＰＮＡ）プローブのハイブリダイゼーションは、それが腫瘍において活性の最良な保持を提供したので、アフィボディに基づくプレターゲティングのために選択された。ＰＮＡは、ワトソン・クリック塩基対合が可能な合成ＤＮＡアナログのクラスである（Ｅｇｈｏｌｍ １９９３；Ｎｉｅｌｓｅｎ１９９４）。ＰＮＡ骨格は、アミド結合によって連結されたＮ－（２－アミノエチル）－グリシン繰返し単位で構築され、プリンおよびピリミジン核酸塩基は、カルボキシメチルリンカーを介してこの足場に連結される。ＰＮＡは、ヌクレアーゼおよびプロテアーゼによる分解に対して耐性であり、ヒト血清において優れた安定性を示した（Ｄｅｍｉｄｏｖ １９９４）。これらは非免疫原性であり、低い一般毒性を有する。第一世代の一次薬剤Ｚ_{ＨＥＲ２：３４２}－ＳＲ－ＨＰ１および二次プローブＨＰ２の分子設計は、ＰＮＡハイブリダイゼーションの高い親和性および特異性、腫瘍における一次プローブの特異的蓄積、ならびに放射性金属の効率的な特異的送達を提供したので成功であった（Ｗｅｓｔｅｒｌｕｎｄ ２０１５、Ｈｏｎａｒｖａｒ ２０１６）。^１７７Ｌｕ（Ａｌｔａｉ ２０１７ ＮＭＢ、Ｗｅｓｔｅｒｌｕｎｄ ２０１８）、^１１１Ｉｎ（Ｗｅｓｔｅｒｌｕｎｄ ２０１５、Ｈｏｎａｒｖａｒ ２０１６）および^６８Ｇａ（Ｖｏｒｏｂｙｅｖａ ２０１８）を用いたＨＰ２の標識化は、腎臓よりも腫瘍においてかなり高い取込みをもたらしたが、腎臓取込みは正常組織の中で最も高かった。

【0006】

Ｚ_{ＨＥＲ２：３４２}－ＳＲ－ＨＰ１／［^１７７Ｌｕ］Ｌｕ－ＨＰ２プレターゲティング系を使用した実験的治療は、ＨＥＲ２を発現する異種移植片を有するマウスの生存期間中央値を有意に増加させ（［^１７７Ｌｕ］Ｌｕ－ＨＰ２のみの場合の３２日間と比較して、処置群では６６日間）、観察可能な骨髄および腎臓毒性はなかった（Ｗｅｓｔｅｒｌｕｎｄ ２０１８）。しかしながら、正常組織、何よりもまず腎臓への線量と比較して、腫瘍に対する吸収線量の比をさらに増加させることが、このような処置での治癒効果を得るためには必要である。

【0007】

可能な最適化パラメータは、二次プローブの長さである。長さの減少は、プローブの流体力学的半径を減少させ得、腫瘍間質におけるその溢出および拡散の両方を促進し、腫瘍における局在化および腫瘍内部の分布の均一性の両方を改善し得る。しかしながら、二次プローブサイズの縮小に関連する明らかなリスクがある。第１に、核酸塩基の数の減少は、一次プローブとのハイブリダイゼーションの強度を低下させる可能性がある。第２に、塩基組成物の改変は、オフターゲット相互作用に影響を及ぼし、正常組織における取込みの増加をもたらし得る。例えば、^１７７Ｌｕを^１１１Ｉｎまたは^６８Ｇａで置換することに関連する小さな構造変化は、腎臓取込み（Ｖｏｒｏｂｙｅｖａ ２０１８）、または血液、肝臓および骨の取込み（Ａｌｔａｉ ２０１７ ＮＭＢ）に有意差をもたらした。生体内分布はさらに、核酸塩基の数および性質だけでなく、ＰＮＡ配列におけるそれらの順序にも依存する。ＭＹＣタンパク質をコードするｍＲＮＡに結合する^９９ｍＴｃ標識されたアンチセンスＰＮＡの核酸塩基のスクランブリングは、正常組織における取込みの２分の１を超える減少をもたらした（Ｒａｏ ２００３、Ｍａｔｈｅｒ ２００４）。したがって、第二世代の二次プローブがより良好な生体内分布および線量測定プロファイルをもたらすかどうかを評価するために、実験的インビボ研究が必要である。

【図面の簡単な説明】

【0008】

【図1】固定化されたＺ_{ＨＥＲ２：３４２}－ＳＲ－ＨＰ１５に結合するＨＰ１６、ＨＰ１７、ＨＰ１８およびＨＰ１９の単回サイクル速度論的滴定のＳＰＲセンサーグラム。各ＰＮＡプローブを２２．６、４５．３、９０．６、１８１．２５および３６２．５ｎＭの濃度で注入した。

【図2a】３つのＰＮＡハイブリダイゼーション複合体ＨＰ１５：ＨＰ１６；ＨＰ１５：ＨＰ１７；およびＨＰ１５：ＨＰ１８について示された正規化した融解温度曲線。

【図2b】ＨＰ１５：ＨＰ１９ ＰＮＡハイブリダイゼーション複合体についての正規化した融解温度曲線。

【図3A】ＳＫＯＶ３およびＢＴ４７４に対する一次薬剤（Ａ）［^１７７Ｌｕ］Ｌｕ－Ｚ_{ＨＥＲ２：３４２}－ＳＲ－ＨＰ１５のインビトロでの結合特異性。データは、３つの試料からの平均値±ＳＤとして示す。

【図3B】ＳＫＯＶ３およびＢＴ４７４に対する一次薬剤（Ｂ）［^１７７Ｌｕ］Ｌｕ－ＨＰ１６のインビトロでの結合特異性。データは、３つの試料からの平均値±ＳＤとして示す。

【図3C】ＳＫＯＶ３およびＢＴ４７４に対する一次薬剤（Ｃ）［^１７７Ｌｕ］Ｌｕ－ＨＰ１７のインビトロでの結合特異性。データは、３つの試料からの平均値±ＳＤとして示す。

【図3D】ＳＫＯＶ３およびＢＴ４７４に対する一次薬剤（Ｄ）［^１７７Ｌｕ］Ｌｕ－ＨＰ１８のインビトロでの結合特異性。データは、３つの試料からの平均値±ＳＤとして示す。

【図4A】Ｚ_{ＨＥＲ２：３４２}－ＳＲ－ＨＰ１５の事前注射ありおよびなしでの、ＳＫＯＶ３異種移植片を有する雌性Ｂａｌｂ／ｃ ｎｕ／ｎｕマウスにおける注射４時間後の（Ａ）［^１７７Ｌｕ］Ｌｕ－ＨＰ１６の生体内分布。取込みを％ＩＤ／ｇとして表し、平均±ＳＤとして表した（ｎ＝５）。

【図4B】Ｚ_{ＨＥＲ２：３４２}－ＳＲ－ＨＰ１５の事前注射ありおよびなしでの、ＳＫＯＶ３異種移植片を有する雌性Ｂａｌｂ／ｃ ｎｕ／ｎｕマウスにおける注射４時間後の（Ｂ）［^１７７Ｌｕ］Ｌｕ－ＨＰ１７の生体内分布。取込みを％ＩＤ／ｇとして表し、平均±ＳＤとして表した（ｎ＝５）。

【図4C】Ｚ_{ＨＥＲ２：３４２}－ＳＲ－ＨＰ１５の事前注射ありおよびなしでの、ＳＫＯＶ３異種移植片を有する雌性Ｂａｌｂ／ｃ ｎｕ／ｎｕマウスにおける注射４時間後の（Ｃ）［^１７７Ｌｕ］Ｌｕ－ＨＰ１８の生体内分布。取込みを％ＩＤ／ｇとして表し、平均±ＳＤとして表した（ｎ＝５）。

【図5A】プレターゲティングのために（Ａ）［^１７７Ｌｕ］Ｌｕ－ＨＰ１６を使用したＨＥＲ２を発現するＳＫＯＶ３異種移植片の、注射４時間後のＳＰＥＣＴ／ＣＴ画像。

【図5B】プレターゲティングのために（Ｂ）［^１７７Ｌｕ］Ｌｕ－ＨＰ１７を使用したＨＥＲ２を発現するＳＫＯＶ３異種移植片の、注射４時間後のＳＰＥＣＴ／ＣＴ画像。

【図5C】プレターゲティングのために（Ｃ）［^１７７Ｌｕ］Ｌｕ－ＨＰ１８を使用したＨＥＲ２を発現するＳＫＯＶ３異種移植片の、注射４時間後のＳＰＥＣＴ／ＣＴ画像。

【図5D】プレターゲティングのために（Ｄ）［^１７７Ｌｕ］Ｌｕ－ＨＰ２を使用したＨＥＲ２を発現するＳＫＯＶ３異種移植片の、注射４時間後のＳＰＥＣＴ／ＣＴ画像。

【図6A】（Ａ）［^１７７Ｌｕ］Ｌｕ－ＨＰ１６の時間－活性プロット。腎臓および腫瘍の両方については、非崩壊補正データを使用した。

【図6B】（Ｂ）［^１７７Ｌｕ］Ｌｕ－ＨＰ１７の時間－活性プロット。腎臓および腫瘍の両方については、非崩壊補正データを使用した。

【図6C】（Ｃ）［^１７７Ｌｕ］Ｌｕ－ＨＰ１８の時間－活性プロット。腎臓および腫瘍の両方については、非崩壊補正データを使用した。

【図6D】（Ｄ）［^１７７Ｌｕ］Ｌｕ－ＨＰ２の時間－活性プロット。腎臓および腫瘍の両方については、非崩壊補正データを使用した。

【発明の概要】

【0009】

本発明の開示
第二世代ハイブリダイゼーションプローブ、一次ＨＰ１５および一組の二次プローブ：ＨＰ１６（９量体ＰＮＡ）、ＨＰ１７（１２量体ＰＮＡ）、ＨＰ１８（１５量体ＰＮＡ）およびＨＰ１９（６量体ＰＮＡ）が本明細書に開示されている（表１）。例に示すように、ＤＯＴＡキレート剤を担持するプローブを設計し、合成し、インビトロで特性評価し、^１７７Ｌｕで標識した。インビトロでのプレターゲティングを、ＨＥＲ２を発現するＳＫＯＶ３およびＢＴ４７４細胞株において研究した。これらの新規プローブの生体内分布プロファイルを、ＳＫＯＶ３異種移植片を有するＢＡＬＢ／Ｃ ｎｕ／ｎｕマウスにおいて評価し、以前に研究された［^１７７Ｌｕ］Ｌｕ－ＨＰ２と比較した。

【0010】

ＳＰＲおよびＵＶ分光法による特性評価により、ＨＰ１５と二次プローブＨＰ１６、ＨＰ１７、ＨＰ１８、およびＨＰ１９との間に高い親和性のデュプレックスの形成が確認され、親和性は相補的ＰＮＡ配列の長さと相関した。３つの試験した（ＨＰ１６、ＨＰ１７、ＨＰ１８）ＰＮＡベースのプローブは、インビトロにおいて高い親和性（１１～１２ｐＭ）でＨＥＲ２を発現する細胞に特異的に結合した。インビボでの研究は、ＨＥＲ２を発現する異種移植片において、すべての［^１７７Ｌｕ］Ｌｕ標識プローブのＨＥＲ２特異的取込みを実証した。腎臓中の放射能に対する腫瘍中の累積放射能の比は、二次プローブのサイズに依存し、核酸塩基の数の増加と共に減少した。インビボで試験した最短のＰＮＡプローブである［^１７７Ｌｕ］Ｌｕ－ＨＰ１６は、最も高い腫瘍対腎臓比を示し、アフィボディ媒介性腫瘍プレターゲティングに対して最も有望な二次プローブである。

【0011】

第１の態様では、本発明は、（ａ）（ｉ）標的部位に選択的に結合することができる標的化部分；および（ｉｉ）第１のＰＮＡオリゴマーを含む第１のハイブリダイゼーションプローブ部分を含む第１のコンジュゲート；ならびに（ｂ）（ｉ）第１のＰＮＡオリゴマーに相補的な第２のＰＮＡオリゴマーを含む第２のハイブリダイゼーションプローブ部分；および（ｉｉ）診断剤または治療剤部分を含む第２のコンジュゲートを含む、診断剤または治療剤を標的部位に標的化するためのキットを提供し、第２のハイブリダイゼーションプローブ部分の第２のＰＮＡオリゴマーの長さは１４塩基以下である。

【0012】

本文脈では、「キット」という用語は、医薬組成物などの化学的および／または生物学的化合物の組成物を意味または含むと理解されるべきである。

【0013】

本発明によれば、１４塩基以下の長さを有する第２のＰＮＡオリゴマーの使用は、第１および第２のコンジュゲートが腫瘍を有する哺乳動物にプレターゲティングプロトコルによって投与される場合、診断剤または治療剤がプレターゲティングプロトコルなしで、すなわち、標的化部分が同じ実体中の治療／診断部分にカップリングされて投与されるという別の同等な状況と比較して、診断剤または治療剤についての改善された（増加した）腫瘍対非腫瘍組織の比をもたらすであろう。

【0014】

関連する非腫瘍組織は、具体的な用途領域に応じて変動し得る。例えば、治療用途では、一般に、許容できない副作用なく患者に投与することができる線量に治療剤が生じる毒性を制限する非腫瘍組織（線量制限組織と呼ばれる）が存在する。本発明は、他の点では同等な状況であるが、プレターゲティングプロトコルを用いない場合、すなわち、標的化部分が同じ実体中の治療／診断部分にカップリングされている場合と比較して、少なくとも２倍（好ましくは少なくとも２．５倍、より好ましくは少なくとも３倍、最も好ましくは少なくとも３．５倍）の腫瘍対線量制限組織の比をもたらし得る。また、具体的な線量を制限する非腫瘍組織は、標的化部分および治療剤部分の性質などの要因に依存し得る。非腫瘍組織は、例えば、腎臓、骨、肝臓または胃、好ましくは腎臓であり得る。診断用途では、調査される腫瘍、特に血液の周囲の組織からの、診断マーカーに対する干渉バックグラウンドシグナルを最小限に抑えることが望ましい。したがって、非腫瘍組織は血液であってもよい。

【0015】

本文脈では、「プレターゲティングプロトコル」という用語は、第１および第２のコンジュゲートの間の会合がインビボで起こるように、第１のコンジュゲートが第２のコンジュゲートの投与前に哺乳動物に投与されることを意味する。

【0016】

第１および第２のＰＮＡオリゴマーに関して、「相補的」ＰＮＡオリゴマーという用語は、塩基対を一致させることによって二本鎖構造を形成することができるＰＮＡオリゴマーを指す。好ましくは、２つのＰＮＡ鎖間に完全な相補性が存在、すなわち、各塩基はその反対物に向かい合う。しかしながら、２つのプローブがハイブリダイズして構造化デュプレックスを形成することができるならば、相補性の程度は完全（１００％）未満であり得る。

【0017】

２つの核酸鎖間の相補性の程度は、完全な相補性（各ヌクレオチドがその反対物に向かい合う）から相補性なし（各ヌクレオチドがその反対物に向かい合わない）まで変動し得る。

【0018】

好ましくは、前記標的部位は、腫瘍細胞の表面上に発現されるヒトを含む哺乳動物タンパク質に存在する。好ましくは、標的タンパク質は、正常な健常組織では発現せず、またはほとんど発現せずに、腫瘍細胞表面上で過剰発現する。例えば、タンパク質は、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、ヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）、ヒト上皮増殖因子受容体３（ＨＥＲ３）、インスリン様増殖因子１受容体（ＩＧＦ１Ｒ）、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）、血小板由来増殖因子受容体β（ＰＤＧＦＲ－β）、ネクチン－４、分化抗原群３８（ＣＤ３８）、分化抗原群３３（ＣＤ３３）、分化抗原群３０（ＣＤ３０）、分化抗原群２２（ＣＤ２２）、および分化抗原群７９ｂ（ＣＤ７９ｂ）からなる群から選択され得る（表７を参照）。好ましくは、標的タンパク質はヒトタンパク質である。好ましくは、前記標的部位はヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）に存在する。

【0019】

前記標的化部分は、好ましくは、
・抗体、例えばモノクローナル抗体；
・抗体フラグメント、例えば単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ；ナノボディ）、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、抗原結合性フラグメント（Ｆａｂ）、ダイアボディ（Ｈｏｌｌｉｇｅｒら、１９９３を参照）、またはミニボディ（Ｈｕら、１９９６を参照）；
・工学的足場タンパク質、例えばアフィボディ（登録商標）分子；および
・ペプチド、例えば、コンビナトリアルライブラリ（Ｌｉｕら、２０１７を参照）から選択される腫瘍標的化ペプチド、またはＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）に結合する内因性ペプチドに基づくペプチドアナログ（Ｈａｕｓｅｒ，２０１７；およびＭｏｏｄｙ，２０１８を参照）
からなる群から選択される。

【0020】

本発明の好ましい態様では、前記標的化部分は、アフィボディ（登録商標）分子、例えばＨＥＲ２を標的化するアフィボディ（登録商標）分子、例えばＺ_{ＨＥＲ２：３４２}と呼ばれる分子、またはＯｒｌｏｖａら、２００６およびＷＯ２００５／００３１５６に開示されている他の同様な分子である。

【0021】

「アフィボディ（登録商標）分子」という用語は、広範囲の生体分子に高い親和性で結合するように選択され得る、小さな工学的足場タンパク質を指す。アフィボディ分子は、ブドウ球菌（ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ）プロテインＡのＩｇＧ結合ドメイン（Ｚドメイン）のうちの１つに由来する小さい（５８アミノ酸残基）タンパク質ドメインである。アフィボディ分子は、コンビナトリアルライブラリを構築するための足場として使用され得る３ヘリックスバンドル構造を有し、コンビナトリアルライブラリから所望の分子を標的化するアフィボディ分子バリアントを選択することができる。総説については、例えば、Ｔｏｌｍａｃｈｅｖ ２０２０を参照されたい。

【0022】

好ましくは、第１のハイブリダイゼーションプローブ部分は、標的化部分に共有結合している。好ましくは、第１のハイブリダイゼーションプローブ部分は、例えばＷｅｓｔｅｒｌｕｎｄ，２０１５に記載されているように、ソルターゼＡ媒介ライゲーションにより標的化部分にコンジュゲートされる。スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）のソルターゼＡは、細胞壁に表面タンパク質を付着させるトランスペプチダーゼである；ＬＰＸＴＧモチーフのＧｌｙおよびＴｈｒの間を切断し、トレオニンのカルボキシル基および細胞壁ペプチドグリカンのアミノ基の間のアミド結合の形成を触媒する。認識モチーフ（ＬＰＸＴＧ）が、目的のタンパク質のＣ末端に付加される一方、遊離Ｎ末端を有する単一のグリシンまたはオリゴグリシンペプチドが、ライゲーションされる第２の分子に付加される。分子にソルターゼを添加すると、２つの分子は天然型のペプチド結合を介して共有結合する。

【0023】

必要に応じて、ハイブリダイゼーションプローブ部分の一方または両方は、溶解度を改善する部分を含む。前記部分は、可溶化部分、例えば、（ＰＥＧ）_２、（ＰＥＧ）_４、（ＰＥＧ）_６などを含むＰＥＧベースのリンカーであり得る。好ましくは、ＰＥＧベースのリンカーは、２－［２－（２－アミノエトキシ）エトキシ］酢酸（ＡＥＥＡ）を含むリンカーである。あるいは、またはさらに、リンカーは、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、ＬｙｓまたはＡｒｇなどの荷電または極性アミノ酸を含む。好ましくは、可溶化部分はＡＥＥＡを含む。

【0024】

本発明によれば、第１のハイブリダイゼーションプローブ部分の第１のＰＮＡオリゴマーの長さは、好ましくは、少なくとも第２のハイブリダイゼーションプローブ部分の第２のＰＮＡオリゴマーの長さであり、１５塩基以下である。より好ましくは、第１のハイブリダイゼーションプローブ部分の前記ＰＮＡオリゴマーの長さは１５塩基である。好ましい１５塩基の配列は、配列ｃ－ｃ－ｔ－ｇ－ｇ－ｔ－ｇ－ｔ－ｔ－ｇ－ａ－ｔ－ｇ－ａ－ｔ（配列番号３）である。本発明の好ましい態様では、前記第１のハイブリダイゼーションプローブ部分は、構造
Ｇ－Ｓ－Ｓ－ｃ－ｃ－ｔ－ｇ－ｇ－ｔ－ｇ－ｔ－ｔ－ｇ－ａ－ｔ－ｇ－ａ－ｔ－Ｅ－Ｋ－［リンカー］－Ｅ－ＮＨ_２
または
Ｇ－Ｓ－Ｓ－ｃ－ｃ－ｔ－ｇ－ｇ－ｔ－ｇ－ｔ－ｔ－ｇ－ａ－ｔ－ｇ－ａ－ｔ－Ｅ－Ｋ（［キレート剤］）－［リンカー］－Ｅ－ＮＨ_２
を有する
（式中、Ｇ、Ｓ、ＥおよびＫは、それぞれアミノ酸Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、ＧｌｕおよびＬｙｓを表す）。一態様では、第１のハイブリダイゼーションプローブ部分は、構造
Ｇ－Ｓ－Ｓ－ｃ－ｃ－ｔ－ｇ－ｇ－ｔ－ｇ－ｔ－ｔ－ｇ－ａ－ｔ－ｇ－ａ－ｔ－Ｅ－Ｋ（ＤＯＴＡ）－ＡＥＥＡ－Ｅ－ＮＨ_２
を有する
（式中、ＤＯＴＡはキレート剤、１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－１，４，７，１０－四酢酸であり、ＡＥＥＡは２－［２－（２－アミノエトキシ）エトキシ］酢酸である）。

【0025】

本発明によれば、第２のハイブリダイゼーションプローブ部分の第２のＰＮＡオリゴマーの長さは、５～１４塩基、例えば好ましくは８～１４もしくは９～１４塩基、またはより好ましくは９～１２塩基である（端点を含む）。第２のＰＮＡオリゴマーは、第１のハイブリダイゼーションプローブ部分の第１のＰＮＡオリゴマーの配列に相補的であり、したがってハイブリダイズする配列を有する。

【0026】

好ましい一態様では、第２のＰＮＡオリゴマーの長さは９塩基である。好ましい９塩基の配列は、配列ａ－ａ－ｃ－ａ－ｃ－ｃ－ａ－ｇ－ｇ（配列番号４）である。好ましい一態様では、第２のハイブリダイゼーションプローブ部分は、構造
［キレート剤］－［リンカー］－Ｓ－Ｓ－ａ－ａ－ｃ－ａ－ｃ－ｃ－ａ－ｇ－ｇ－Ｅ－Ｅ－Ｙ－ＮＨ_２
有する
（式中、Ｓ、ＥおよびＹは、それぞれアミノ酸Ｓｅｒ、ＧｌｕおよびＴｙｒを表す）。一態様では、第２のハイブリダイゼーションプローブ部分は、構造
ＤＯＴＡ－ＡＥＥＡ－Ｓ－Ｓ－ａ－ａ－ｃ－ａ－ｃ－ｃ－ａ－ｇ－ｇ－Ｅ－Ｅ－Ｙ－ＮＨ_２
を有する
（式中、ＤＯＴＡはキレート剤、１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－１，４，７，１０－四酢酸であり、ＡＥＥＡは２－［２－（２－アミノエトキシ）エトキシ］酢酸である）。

【0027】

別の好ましい態様では、第２のＰＮＡオリゴマーの長さは１２塩基である。好ましい１２塩基の配列は、配列ａ－ｔ－ｃ－ａ－ａ－ｃ－ａ－ｃ－ｃ－ａ－ｇ－ｇ（配列番号５）である。好ましい一態様では、第２のハイブリダイゼーションプローブ部分は、構造
［キレート剤］－［リンカー］－Ｓ－Ｓ－ａ－ｔ－ｃ－ａ－ａ－ｃ－ａ－ｃ－ｃ－ａ－ｇ－ｇ－Ｅ－Ｅ－Ｙ－ＮＨ_２
を有する
（式中、Ｓ、ＥおよびＹは、それぞれアミノ酸Ｓｅｒ、ＧｌｕおよびＴｙｒを表す）。一態様では、第２のハイブリダイゼーションプローブ部分は、構造
ＤＯＴＡ－ＡＥＥＡ－Ｓ－Ｓ－ａ－ｔ－ｃ－ａ－ａ－ｃ－ａ－ｃ－ｃ－ａ－ｇ－ｇ－Ｅ－Ｅ－Ｙ－ＮＨ_２
を有する
（式中、ＤＯＴＡはキレート剤、１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－１，４，７，１０－四酢酸であり、ＡＥＥＡは２－［２－（２－アミノエトキシ）エトキシ］酢酸である）。

【0028】

本発明によれば、第１および第２のハイブリダイゼーションプローブ部分は、置換、小さな欠失、挿入または逆位などの改変を有し、配列番号１～３として示されるＰＮＡ配列の生物活性を依然として維持するＰＮＡ配列を含み得る。好ましくは、そのような改変は、配列番号１～３のいずれか１つにおいて１、２または３個を超える塩基に関係しない。

【0029】

例えば、配列番号４として示される９塩基の配列は、１つまたは２つの置換または欠失で改変され得、その結果、配列番号４と少なくとも７５％または少なくとも８５％の同一性を有する配列をもたらす。

【0030】

さらに、配列番号５として示される１２塩基の配列は、１、２または３つの置換または欠失で改変され得、配列番号５と少なくとも７５％、少なくとも８３％、または少なくとも９１％の同一性を有する配列をもたらす。

【0031】

配列番号３として示される１５塩基の配列は、１、２または３つの置換または欠失で改変され得、配列番号３と少なくとも８０％、少なくとも８６％、または少なくとも９３％の同一性を有する配列をもたらす。

【0032】

改変されたＰＮＡオリゴマーは、他のハイブリダイゼーションプローブ部分のＰＮＡオリゴマーの配列に相補的であり、したがってハイブリダイズする配列を有することが理解されよう。上述のように、相補性の程度は完全（１００％）未満であり得る。その結果、そのようなデュプレックスに１つまたは２つのミスマッチは存在し得るが、ハイブリダイズしたコンジュゲートは、本発明によれば依然として有用であろう。

【0033】

第２のコンジュゲートが治療剤部分を含む場合、治療剤は、放射性核種、または抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）もしくは他の薬物含有コンジュゲートでの使用に適した細胞毒性薬物であり得る。（総説については、例えば、Ｓｈｉｍ，２０２０を参照されたい）。例えば、前記細胞毒性薬物は、カリケアマイシン、モノメチルアウリスタチンＥ／Ｆ（ＭＭＡＥ／Ｆ）などのアウリスタチン、およびメイタンシン誘導体ＤＭ０～ＤＭ４などのメイタンシノイドから選択され得る。好ましくは、治療剤は放射性核種である。

【0034】

治療剤が放射性核種である場合、放射性核種は、好ましくは、ルテチウム－１７７（^１７７Ｌｕ）、イットリウム－９０（^９０Ｙ）、ビスマス－２１２（^２１２Ｂｉ）、ビスマス－２１３（^２１３Ｂｉ）、アスタチン－２１１（^２１１Ａｔ）、アクチニウム－２５５（^２５５Ａｃ）、銅－６７（^６７Ｃｕ）、ガリウム－６７（^６７Ｇａ）、およびレニウム－１８６（^１８６Ｒｅ）からなる群から選択され得る。より好ましくは、放射性核種はルテチウム－１７７（^１７７Ｌｕ）である。

【0035】

第２のコンジュゲートが診断剤部分を含む場合、前記診断剤は、好ましくは、陽電子放射断層撮影法（ＰＥＴ）、単一光子放射型コンピュータ断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）、および光学的画像法からなる群から選択される方法によって検出可能なシグナルを生成する。

【0036】

好ましい一態様では、前記診断剤は放射性核種である。シグナル検出の方法がＳＰＥＣＴである場合、放射性核種は、好ましくは、テクネチウム－９９ｍ（^９９ｍＴｃ）、インジウム－１１１（^１１１Ｉｎ）、ルテチウム－１７７（^１７７Ｌｕ）、ヨウ素－１２３（^１２３Ｉ）、ヨウ素－１２５（^１２５Ｉ）、ガリウム－６７（^６７Ｇａ）、および銅－６７（^６７Ｃｕ）からなる群から選択される。より好ましくは、放射性核種はインジウム－１１１（^１１１Ｉｎ）である。

【0037】

方法がＰＥＴである場合、放射性核種は、好ましくは、ガリウム－６８（^６８Ｇａ）、フッ素－１８（^１８Ｆ）、ヨウ素－１２２（^１２２Ｉ）、ヨウ素－１２４（^１２４Ｉ）、および銅－６４（^６４Ｃｕ）からなる群から選択される。より好ましくは、放射性核種はガリウム－６８（^６８Ｇａ）である。

【0038】

シグナル検出の方法が光学的画像法である場合、前記診断剤は、好ましくは、シアニン色素、ポルフィリン誘導体、フタロシアニン、スクアライン誘導体、キサンテン、Ａｌｅｘａアナログ、およびＢＯＤＩＰＹアナログからなる群から選択される蛍光色素である。

【0039】

診断剤または治療剤が放射性核種である場合、第２のハイブリダイゼーションプローブ部分は、好ましくは放射性金属錯化のためのキレート剤を含む。前記キレート剤は、
１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－１，４，７，１０－四酢酸（ＤＯＴＡ）、
１，４，７－トリアザシクロノナン－１，４，７－三酢酸（ＮＯＴＡ）、
１，４，８，１１－テトラアザシクロドデカン－１，４，８，１１－四酢酸（ＴＥＴＡ）、
１，４，７－トリアザシクロノナン，１－グルタル酸－４，７－酢酸（ＮＯＤＡＧＡ）、および
ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）
からなる群から選択され得る。本発明の好ましい一態様では、キレート剤はＤＯＴＡである。

【0040】

しかしながら、フッ素－１８（^１８Ｆ）、ヨウ素－１２２（^１２２Ｉ）、ヨウ素－１２３（^１２３Ｉ）、ヨウ素－１２４（^１２４Ｉ）、およびヨウ素－１２５（^１２５Ｉ）などのいくつかの放射性核種は、キレート剤の助けを借りずに、例えばフッ素化またはヨウ素化によって、ハイブリダイゼーションプローブにコンジュゲートされ得ることが理解されよう。

【0041】

診断剤または治療剤が細胞毒性薬物などの放射性核種以外である場合、診断剤または治療剤は、好ましくは、第２のハイブリダイゼーションプローブ部分に共有結合している。例えば、第２のハイブリダイゼーションプローブ部分は、例えばＷｅｓｔｅｒｌｕｎｄ，２０１５に記載されているように、ソルターゼＡ媒介ライゲーションにより診断剤または治療剤部分にコンジュゲートされ得る。

【0042】

必要に応じて、本発明によるキットは、標的部位に結合していない循環する一次コンジュゲートを除去することができるクリア剤を含む。例えば、国際公開ＷＯ９６／４０２４５に開示されているように、クリア剤は、抗イディオタイプ抗体または抗原結合抗体フラグメントであり得る。

【0043】

さらなる態様では、本発明は、上で定義されるキットを含む医薬組成物を提供する。本発明はさらに、（ａ）診断剤または治療剤を標的部位に標的化するため、および／または（ｂ）ヒトを含む哺乳動物における病状の診断、予後診断または処置するための、上で定義されるキットまたは医薬組成物の使用を提供する。

【0044】

さらに別の態様では、本発明は、診断剤または治療剤を、ヒトを含む哺乳動物の標的部位に送達する方法を提供し、前記方法は、
（ａ）（ｉ）標的部位に選択的に結合する標的化部分；および
（ｉｉ）第１のＰＮＡオリゴマーを含む第１のハイブリダイゼーションプローブ部分
を含む第１のコンジュゲートを前記哺乳動物に投与すること；ならびに
（ｂ）必要に応じて、前記哺乳動物にクリア剤を投与し、前記クリア剤が非局在化した第１のコンジュゲートを血液循環からクリアすることを可能にすること；ならびに
（ｃ）（ｉ）第１のＰＮＡオリゴマーに相補的な第２のＰＮＡオリゴマーを含む第２のハイブリダイゼーションプローブ部分；および
（ｉｉ）診断剤または治療剤部分
を含む第２のコンジュゲートを前記哺乳動物に投与すること
を含み、
第２のハイブリダイゼーションプローブ部分の第２のＰＮＡオリゴマーの長さは１４塩基以下であり、前記第２のＰＮＡオリゴマーは第１のコンジュゲートの第１のＰＮＡオリゴマーに結合し、それによって診断剤または治療剤部分を標的部位に標的化する。

【0045】

好ましい態様では、上で定義される方法は、ヒトを含む哺乳動物における病状の診断、予後診断または処置のための方法を意味する。

【0046】

上記の方法によれば、前記第１および第２のコンジュゲートならびに任意のクリア剤は、好ましくは、本発明により開示されるキットの文脈において上で定義される通りである。

【0047】

さらに別の態様では、本発明は、診断剤または治療剤を、ヒトを含む哺乳動物の標的部位に送達する方法における使用のための診断または治療用コンジュゲートを提供し、前記方法は、
（ａ）（ｉ）標的部位に選択的に結合する標的化部分；および
（ｉｉ）第１のＰＮＡオリゴマーを含む第１のハイブリダイゼーションプローブ部分
を含む標的化コンジュゲートを前記哺乳動物に投与すること；ならびに
（ｂ）必要に応じて、前記哺乳動物にクリア剤を投与し、前記クリア剤が非局在化した標的化コンジュゲートを血液循環からクリアすることを可能にすること；ならびに
（ｃ）前記診断または治療用コンジュゲートを前記哺乳動物に投与すること
を含み、
前記診断または治療用コンジュゲートは、
（ｉ）第１のＰＮＡオリゴマーに相補的な第２のＰＮＡオリゴマーを含む第２のハイブリダイゼーションプローブ部分；および
（ｉｉ）診断剤または治療剤部分
を含み、
第２のハイブリダイゼーションプローブ部分の第２のＰＮＡオリゴマーの長さは１４塩基以下であり、前記第２のＰＮＡオリゴマーは第１のコンジュゲートの第１のＰＮＡオリゴマーに結合し、それによって診断剤または治療剤部分を標的部位に標的化する。

【0048】

好ましい態様では、上で定義される方法は、ヒトを含む哺乳動物における病状の診断、予後診断または処置のための方法を意味する。

【0049】

上記の方法によれば、前記標的化コンジュゲートは、好ましくは、本発明により開示されるキットの文脈において上で定義される第１のコンジュゲートとしてであり、前記診断または治療用コンジュゲートは、好ましくは、本発明により開示されるキットの文脈において上で定義される第２のコンジュゲートとしてである。

【0050】

上記の方法によれば、任意のクリア剤は、好ましくは、本発明により開示されるキットの文脈において上で定義される通りである。

【0051】

本発明による方法および使用では、第１および第２のコンジュゲートは、静脈内、動脈内、胸膜内、腹腔内、髄腔内、皮下または灌流によって投与され得る。

【0052】

本発明による方法および使用では、前記病状は、がん、感染性疾患、炎症性疾患、および自己免疫疾患からなる群から選択され得る。好ましくは、病状はがんである。

【0053】

好ましい一態様では、前記病状は、固形腫瘍を形成することができるがんであり、前記がんは、乳がん、前立腺がん、肺がん、頭頸部がん、胃がん、および結腸がんからなる群から選択される。そのような場合、前記標的部位は、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、ヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）、ヒト上皮増殖因子受容体３（ＨＥＲ３）、インスリン様増殖因子１受容体（ＩＧＦ１Ｒ）、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）、血小板由来増殖因子受容体β（ＰＤＧＦＲ－β）、およびネクチン－４からなる群から選択される、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトタンパク質に存在する（表７を参照）。好ましい一態様では、本発明の方法は、ＨＥＲ２を発現する癌、特に乳がんまたは胃食道がんに関連する癌の体内検出または処置のための方法である。

【0054】

本発明の別の好ましい態様では、病状は、黒色腫、白血病、および骨髄腫からなる群から選択される血液がんである。そのような場合、前記標的部位は、分化抗原群３８（ＣＤ３８）、分化抗原群３３（ＣＤ３３）、分化抗原群３０（ＣＤ３０）、分化抗原群２２（ＣＤ２２）、および分化抗原群７９ｂ（ＣＤ７９ｂ）からなる群から選択される、哺乳動物、より好ましくはヒトタンパク質に存在する（表７を参照）。

【発明を実施するための形態】

【0055】

本発明の番号付けされた項目
本発明の実施形態には、以下の非排他的なリストに要約された項目が含まれる：

【0056】

１．診断剤または治療剤を標的部位に標的化するためのキットであって、
（ａ）（ｉ）標的部位に選択的に結合することができる標的化部分；および
（ｉｉ）第１のＰＮＡオリゴマーを含む第１のハイブリダイゼーションプローブ部分
を含む第１のコンジュゲート；ならびに
（ｂ）（ｉ）第１のＰＮＡオリゴマーに相補的な第２のＰＮＡオリゴマーを含む第２のハイブリダイゼーションプローブ部分；および
（ｉｉ）診断剤または治療剤部分
を含む第２のコンジュゲート
を含み、
第２のハイブリダイゼーションプローブ部分の第２のＰＮＡオリゴマーの長さが１４塩基以下である、キット。

【0057】

２．前記標的部位が、細胞、好ましくは腫瘍細胞の表面上に発現されるヒトを含む哺乳動物タンパク質に存在する、項目１に記載のキット。

【0058】

３．前記標的部位が、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、ヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）、ヒト上皮増殖因子受容体３（ＨＥＲ３）、インスリン様増殖因子１受容体（ＩＧＦ１Ｒ）、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）、血小板由来増殖因子受容体β（ＰＤＧＦＲ－β）、ネクチン－４、分化抗原群３８（ＣＤ３８）、分化抗原群３３（ＣＤ３３）、分化抗原群３０（ＣＤ３０）、分化抗原群２２（ＣＤ２２）、および分化抗原群７９ｂ（ＣＤ７９ｂ）からなる群から選択されるヒトを含む哺乳動物タンパク質に存在する、項目２に記載のキット。

【0059】

４．前記標的部位がヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）に存在する、項目３に記載のキット。

【0060】

５．前記標的化部分が、
・抗体；
・抗体フラグメント、例えば単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ；ナノボディ）、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、抗原結合性フラグメント（Ｆａｂ）、ダイアボディ、またはミニボディ；
・工学的足場タンパク質、例えばアフィボディ（登録商標）分子；および
・ペプチド
からなる群から選択される、項目１から４のいずれか１つに記載のキット。

【0061】

６．前記標的化部分がアフィボディ（登録商標）分子である、項目５に記載のキット。

【0062】

７．ハイブリダイゼーションプローブの一方または両方がリンカーを含む、項目１から６のいずれか１つに記載のキット。

【0063】

８．前記リンカーが可溶化部分、好ましくは（ａ）ＰＥＧベースのリンカー、例えば２－［２－（２－アミノエトキシ）エトキシ］酢酸（ＡＥＥＡ）を含むリンカー；または（ｂ）荷電もしくは極性アミノ酸を含むペプチドベースのリンカーである、項目７に記載のキット。

【0064】

９．第１のハイブリダイゼーションプローブ部分の第１のＰＮＡオリゴマーの長さが、少なくとも第２のハイブリダイゼーションプローブ部分の第２のＰＮＡオリゴマーの長さであり、１５塩基以下である、項目１から８のいずれか１つに記載のキット。

【0065】

１０．第１のハイブリダイゼーションプローブ部分の前記ＰＮＡオリゴマーの長さが１５塩基である、項目９に記載のキット。

【0066】

１１．前記１５塩基が、配列ｃ－ｃ－ｔ－ｇ－ｇ－ｔ－ｇ－ｔ－ｔ－ｇ－ａ－ｔ－ｇ－ａ－ｔ（配列番号３）を有する、項目１０に記載のキット。

【0067】

１２．前記第１のハイブリダイゼーションプローブ部分が以下の構造を有する、項目１１に記載のキット：
Ｇ－Ｓ－Ｓ－ｃ－ｃ－ｔ－ｇ－ｇ－ｔ－ｇ－ｔ－ｔ－ｇ－ａ－ｔ－ｇ－ａ－ｔ－Ｅ－Ｋ（ＤＯＴＡ）－ＡＥＥＡ－Ｅ－ＮＨ_２。

【0068】

１３．第２のハイブリダイゼーションプローブ部分の前記相補的ＰＮＡオリゴマーの長さが５～１４塩基である、項目１から１２のいずれか１つに記載のキット。

【0069】

１４．前記相補的ＰＮＡオリゴマーの長さが９～１２塩基である、項目１３に記載のキット。

【0070】

１５．前記相補的ＰＮＡオリゴマーの長さが９塩基である、項目１４に記載のキット。

【0071】

１６．前記９塩基が、配列ａ－ａ－ｃ－ａ－ｃ－ｃ－ａ－ｇ－ｇ（配列番号４）を有する、項目１５に記載のキット。

【0072】

１７．前記第２のハイブリダイゼーションプローブ部分が以下の構造を有する、項目１６に記載のキット：
ＤＯＴＡ－ＡＥＥＡ－Ｓ－Ｓ－ａ－ａ－ｃ－ａ－ｃ－ｃ－ａ－ｇ－ｇ－Ｅ－Ｅ－Ｙ－ＮＨ_２。

【0073】

１８．前記相補的ＰＮＡオリゴマーの長さが１２塩基である、項目１４に記載のキット。

【0074】

１９．前記１２塩基が、配列ａ－ｔ－ｃ－ａ－ａ－ｃ－ａ－ｃ－ｃ－ａ－ｇ－ｇ（配列番号５）を有する、項目１８に記載のキット。

【0075】

２０．前記第２のハイブリダイゼーションプローブ部分が以下の構造を有する、項目１９に記載のキット：
ＤＯＴＡ－ＡＥＥＡ－Ｓ－Ｓ－ａ－ｔ－ｃ－ａ－ａ－ｃ－ａ－ｃ－ｃ－ａ－ｇ－ｇ－Ｅ－Ｅ－Ｙ－ＮＨ_２。

【0076】

２１．前記治療剤が、放射性核種、カリケアマイシン、モノメチルアウリスタチンＥ／Ｆ（ＭＭＡＥ／Ｆ）などのアウリスタチン、およびメイタンシン誘導体ＤＭ０～ＤＭ４などのメイタンシノイドからなる群から選択される、項目１から２０のいずれか１つに記載のキット。

【0077】

２２．前記治療剤が、ルテチウム－１７７（^１７７Ｌｕ）、イットリウム－９０（^９０Ｙ）、ビスマス－２１２（^２１２Ｂｉ）、ビスマス－２１３（^２１３Ｂｉ）、アスタチン－２１１（^２１１Ａｔ）、アクチニウム－２５５（^２５５Ａｃ）、銅－６７（^６７Ｃｕ）、ガリウム－６７（^６７Ｇａ）、およびレニウム－１８６（^１８６Ｒｅ）からなる群から選択される放射性核種である、項目２１に記載のキット。

【0078】

２３．前記診断剤が、陽電子放射断層撮影法（ＰＥＴ）、単一光子放射型コンピュータ断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）、および光学的画像法からなる群から選択される方法によって検出可能なシグナルを生成する、項目１から２２のいずれか１つに記載のキット。

【0079】

２４．前記診断剤が放射性核種である、項目２３に記載のキット。

【0080】

２５．方法がＳＰＥＣＴであり、放射性核種が、テクネチウム－９９ｍ（^９９ｍＴｃ）、インジウム－１１１（^１１１Ｉｎ）、ルテチウム－１７７（^１７７Ｌｕ）、ヨウ素－１２３（^１２３Ｉ）、ヨウ素－１２５（^１２５Ｉ）、ガリウム－６７（^６７Ｇａ）、および銅－６７（^６７Ｃｕ）からなる群から選択される、項目２４に記載のキット。

【0081】

２６．方法がＰＥＴであり、放射性核種が、ガリウム－６８（^６８Ｇａ）、フッ素－１８（^１８Ｆ）、ヨウ素－１２２（^１２２Ｉ）、ヨウ素－１２４（^１２４Ｉ）、および銅－６４（^６４Ｃｕ）からなる群から選択される、項目２４に記載のキット。

【0082】

２７．診断剤または治療剤が放射性核種であり、少なくとも第２のハイブリダイゼーションプローブ部分がキレート剤を含む、項目２１または２４に記載のキット。

【0083】

２８．前記キレート剤が、以下からなる群から選択される、項目２７に記載のキット：
１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－１，４，７，１０－四酢酸（ＤＯＴＡ）、
１，４，７－トリアザシクロノナン－１，４，７－三酢酸（ＮＯＴＡ）、
１，４，８，１１－テトラアザシクロドデカン－１，４，８，１１－四酢酸（ＴＥＴＡ）、
１，４，７－トリアザシクロノナン，１－グルタル酸－４，７－酢酸（ＮＯＤＡＧＡ）、および
ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）。

【0084】

２９．前記キレート剤が、１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－１，４，７，１０－四酢酸（ＤＯＴＡ）である、項目２８に記載のキット。

【0085】

３０．診断剤または治療剤を、ヒトを含む哺乳動物の標的部位に送達する方法であって、前記方法が、
（ａ）（ｉ）標的部位に選択的に結合する標的化部分；および
（ｉｉ）第１のＰＮＡオリゴマーを含む第１のハイブリダイゼーションプローブ部分
を含む第１のコンジュゲートを前記哺乳動物に投与すること；ならびに
（ｂ）必要に応じて、前記哺乳動物にクリア剤を投与し、前記クリア剤が非局在化した第１のコンジュゲートを血液循環からクリアすることを可能にすること；ならびに
（ｃ）（ｉ）第１のＰＮＡオリゴマーに相補的な第２のＰＮＡオリゴマーを含む第２のハイブリダイゼーションプローブ部分；および
（ｉｉ）診断剤または治療剤部分
を含む第２のコンジュゲートを前記哺乳動物に投与すること
を含み、
第２のハイブリダイゼーションプローブ部分の第２のＰＮＡオリゴマーの長さが１４塩基以下であり、前記第２のＰＮＡオリゴマーが第１のコンジュゲートの第１のＰＮＡオリゴマーに結合し、それによって診断剤または治療剤部分を標的部位に標的化する、方法。

【0086】

３１．ヒトを含む哺乳動物における病状の診断、予後診断または処置のための方法であって、前記方法が、診断剤または治療剤部分を哺乳動物の標的部位に送達するための項目３０に記載の方法を含む、方法。

【0087】

３２．項目１から２９のいずれか１つに記載のキットの第１および第２のコンジュゲートを、ヒトを含む哺乳動物に投与することを含む、病状を診断するための方法。

【0088】

３３．項目１から２９のいずれか１つに記載のキットの第１および第２のコンジュゲートを、その処置を必要とする、ヒトを含む哺乳動物に投与することを含む、病状を処置するための方法。

【0089】

３４．前記病状が、がん、感染性疾患、炎症性疾患、および自己免疫疾患からなる群から選択され；好ましくは、がんである、項目３１から３３のいずれか１つに記載の方法。

【0090】

３５．前記病状が、固形腫瘍を形成することができるがんであり、前記がんが、乳がん、前立腺がん、肺がん、頭頸部がん、胃がん、および結腸がんからなる群から選択される、項目３４に記載の方法。

【0091】

３６．前記標的部位が、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、ヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）、ヒト上皮増殖因子受容体３（ＨＥＲ３）、インスリン様増殖因子１受容体（ＩＧＦ１Ｒ）、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）、血小板由来増殖因子受容体β（ＰＤＧＦＲ－β）、およびネクチン－４からなる群から選択されるヒトタンパク質に存在する、項目３５に記載の方法。

【0092】

３７．前記病状が、黒色腫、白血病、および骨髄腫からなる群から選択される血液がんである、項目３４に記載の方法。

【0093】

３８．前記標的部位が、分化抗原群３８（ＣＤ３８）、分化抗原群３３（ＣＤ３３）、分化抗原群３０（ＣＤ３０）、分化抗原群２２（ＣＤ２２）、および分化抗原群７９ｂ（ＣＤ７９ｂ）からなる群から選択されるヒトタンパク質に存在する、項目３７に記載の方法。

【0094】

３９．項目１から２９のいずれか１つに記載のキットの第１および第２のコンジュゲートを含む医薬組成物。

【0095】

４０．がん、感染性疾患、炎症性疾患、および自己免疫疾患からなる群から選択される病状の診断または処置に使用するための、項目３９に記載の医薬組成物。

【0096】

実験方法
高品質のＭｉｌｌｉ－Ｑ（登録商標）水を使用してすべての緩衝液を調製し、Ｃｈｅｌｅｘ（登録商標）１００樹脂（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＵＳＡ）を使用して金属夾雑物から精製した。キャリアフリーの^１７７ＬｕＣｌ_３は、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ（Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、Ｕ．Ｓ．Ａ．）から購入した。ＮａＩ（ＴＩ）検出器（１４８０ Ｗｉｚａｒｄ、Ｗａｌｌａｃ、Ｆｉｎｌａｎｄ）を備えた自動ガンマ線分光計を使用して、放射能を測定した。

【0097】

ＨＥＲ２を発現する卵巣がんＳＫＯＶ３および乳がんＢＴ４７４細胞（両方ともＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手した）を使用して、インビトロ細胞研究を実施した。細胞を、１０％ウシ胎児血清、２ｍＭのＬ－グルタミン、ならびに１００ＩＵ／ｍＬのペニシリンおよび１００ｍｇ／ｍＬのストレプトマイシンで構成されるＰＥＳＴを補充したＲＰＭＩ培地（Ｆｌｏｗ Ｉｒｖｉｎｅ、ＵＫ）で培養した。

【0098】

インビトロ研究および生体内分布に関するデータを、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（Ｗｉｎｄｏｗｓ用バージョン４．００；ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェア）を使用して、対応のない両側ｔ検定（２セットのデータの比較のため）およびＡＮＯＶＡ（いくつかのセットのデータの比較のため）によって分析して、有意差を判定した。

【0099】

ＰＮＡプレターゲティングプローブの合成および精製
ペプチド核酸モノマー；Ｆｍｏｃ－ＰＮＡ－Ａ（Ｂｈｏｃ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－ＰＮＡ－Ｇ（Ｂｈｏｃ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－ＰＮＡ－Ｃ（Ｂｈｏｃ）－ＯＨおよびＦｍｏｃ－ＰＮＡ－Ｔ－ＯＨは、ＰｏｌｙＯｒｇ，Ｉｎｃ．Ｌｅｏｍｉｎｓｔｅｒ、ＵＳＡまたはＰＮＡ Ｂｉｏ，Ｉｎｃ．Ｔｈｏｕｓａｎｄ Ｏａｋｓ、ＵＳＡから購入した。Ｒｉｎｋ Ａｍｉｄｅ樹脂（ＣｈｅｍＭａｔｒｉｘ、０．５０ｍｍｏｌ／ｇ）は、Ｂｉｏｔａｇｅ（Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）から購入した。１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－１，４，７，１０－四酢酸（ＤＯＴＡ）は、ＣｈｅＭａｔｅｃｈ、Ｄｉｊｏｎ、Ｆｒａｎｃｅから購入した。Ｆｍｏｃ－ＮＨ－（ＰＥＧ）_２－ＣＨ_２ＣＯＯＨ（ＡＥＥＡ）は、Ｍｅｒｃｋ ＫＧａＡ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙから購入した。固相合成のための溶媒および試薬は商業的供給業者から入手し、さらなる精製を行わずに使用した。

【0100】

ＨＰ１５は、Ｒｉｎｋ Ａｍｉｄｅ樹脂（ＣｈｅｍＭａｔｒｉｘ、０．５０ｍｍｏｌ／ｇ）を使用して、Ｂｉｏｔａｇｅ（登録商標）Ｉｎｉｔｉａｔｏｒ＋Ａｌｓｔｒａマイクロ波ペプチド合成装置にて、１０ｍｌ反応器バイアル内で５０μｍｏｌスケールで合成した。Ｆｍｏｃ脱保護は、樹脂をピペリジン－ＤＭＦ（１：４）で３分間、続いてピペリジン－ＤＭＦ（１：４）で１０分間処理する２段階にて、室温で行った。カップリングは、ＤＭＦ中５当量のＰＮＡまたはアミノ酸モノマー、５当量のＯｘｙｍａおよび５当量のＤＩＣを使用して行った。７５℃で１０分のカップリング時間を配列全体にわたって使用し、続いてＮＭＰ－ルチジン－酢酸無水物（８９：６：５）を使用して２分間のキャッピング工程を行った。

【0101】

ＤＯＴＡの部位特異的導入の可能性のために、直交的に保護されたＬｙｓ（Ｍｔｔ）を導入した。５～１０回の新鮮なＴＦＡ：ＴＩＳ：ＤＣＭ（１：２：９７）の添加、続いて１分間のボルテックスによるＬｙｓ（Ｍｔｔ）の選択的な側鎖脱保護のために、４つのカップリング工程（Ｆｍｏｃ－Ｅ－Ｋ（Ｍｔｔ）－［ＡＥＥＡ］－Ｅ－樹脂）の後、自動合成を中断した。ＤＯＴＡのカップリングは、ＤＭＦ中５当量のＤＯＴＡ、５当量のＯｘｙｍａおよび５当量のＤＩＣを使用して、室温で１時間行った。自動合成を再開し、すべてのサイクルを完了した後、樹脂をＤＭＦ、ＤＣＭ、最後にＭｅＯＨで洗浄し、次いで一晩乾燥させた。ＰＮＡ－ペプチドハイブリッドを、ＴＦＡ：Ｈ_２Ｏ：ＴＩＳ（９５：２．５：２．５）の混合物を使用して、室温で４時間固体支持体から切断した。最後に、ＰＮＡ生成物をジエチルエーテルおよび水の間で抽出し、水相から凍結乾燥した。

【0102】

最短の相補的ＰＮＡプローブであるＨＰ１９を、ＨＰ１５と同じマイクロ波ペプチド合成装置で合成した。Ｆｍｏｃ脱保護、カップリングおよびキャッピングは、ＨＰ１５の合成と同様に行った。ＤＯＴＡキレート剤を、ＨＰ１５にカップリングされたＤＯＴＡと同じプロトコルを使用して、合成の最後にＰＮＡプローブに手動でカップリングさせた。最終生成物を樹脂から切断し、ＨＰ１５と同様に抽出した。合成をカイザーテスト（Ｋａｉｓｅｒ ｔｅｓｔ）によって連続的にモニターした。ＨＰ１９の最終生成物の分子量を、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ分析を使用して検証した。

【0103】

他の相補的ＰＮＡプローブ（ＨＰ１６、ＨＰ１７、ＨＰ１８）は、ＨＰ１５の合成に使用したのと同じモノマー、樹脂および溶媒を使用して手動で合成した。各カップリングは、５当量のＰＮＡモノマーを使用して行った。樹脂に添加する前に、ＰＮＡモノマーを、ＮＭＰおよびＤＭＦ中１０当量のＤＩＥＡの存在下で、５当量のベンゾトリアゾール－１－イル－オキシトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスファート（ＰｙＢＯＰ；Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）により１分間予備活性化した。各カップリングは、穏やかに振盪しながら室温で３０分間～１時間行った。未反応ＰＮＡのキャッピングは、ＨＰ１５と同様に行った。Ｆｍｏｃ脱保護は、ＮＭＰ中２０％ピペリジンを使用して、穏やかに振盪しながら室温で２０分間行った。合成をカイザーテストによってモニターし、数ビーズの樹脂の微小切断に続いてＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ分析を行った。合成完了後、樹脂をＮＭＰ、続いてＤＣＭで十分に洗浄し、一晩乾燥させた。その後の相補的ＰＮＡプローブの切断およびエーテル抽出はＨＰ１５と同様に行った。

【0104】

ＲＰ－ＨＰＬＣ精製は、５～５０％Ｂの直線勾配（ここで、Ａ＝０．１％ＴＦＡ－Ｈ_２ＯおよびＢ＝０．１％ＴＦＡ－ＣＨ_３ＣＮ）を用いた半分取Ｚｏｒｂａｘ ３００ ＳＢ－Ｃ１８カラム（９．４×２５０ｍｍ、粒径５μｍ；Ａｇｉｌｅｎｔ、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＵＳＡ）を使用して、２５分間にわたり、３ｍｌ／分の流量、７０℃のカラム温度ならびに２２０および２６０ｎｍでのＵＶ検出を使用して行った。回収した画分を、α－シアノ－４－ヒドロキシ桂皮酸マトリックスを使用してＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ（４８００ ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ／ＴＯＦ、ＡＢＳＣＩＥＸ）によって分析した。正しい生成物を含有すると判定された画分をプールし、凍結乾燥した。

【0105】

ＨＰ１６、ＨＰ１７およびＨＰ１８の純度を、Ｚｏｒｂａｘ ３００ＳＢ－Ｃ１８カラム（４．６×１５０ｍｍ、粒径３．５μｍ；Ａｇｉｌｅｎｔ）での分析ＲＰ－ＨＰＬＣ、続いてＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ分析を用いて確認した。ＨＰ１９のアイデンティティおよび純度を、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ分析を用いて確認した。各ＰＮＡプローブの２６０ｎｍでの吸光係数（ε_２６０）は、ＰＮＡ組成および各ＰＮＡモノマーの吸光係数（Ａ：１３７００Ｍ^－１ｃｍ^－１、Ｃ：６６００Ｍ^－１ｃｍ^－１、Ｇ：１１７００Ｍ^－１ｃｍ^－１、およびＴ：８６００Ｍ^－１ｃｍ^－１）に基づいて推定した。すべての実験を通して、各プローブに対して使用した吸光係数は以下の通りである：ＨＰ１６：９８０００Ｍ^－１ｃｍ^－１、ＨＰ１７：１２６９００Ｍ^－１ｃｍ^－１、ＨＰ１８：１５５８００Ｍ^－１ｃｍ^－１、ＨＰ１９：６４０００Ｍ^－１ｃｍ^－１およびＨＰ１５：１５０７００Ｍ^－１ｃｍ^－１。

【0106】

アフィボディ－ＰＮＡコンジュゲートの作成
ｐＡＹ４３０－Ｚ_{ＨＥＲ２：３４２}－ＳＲ－Ｈ_６プラスミド（Ｗｅｓｔｅｒｌｕｎｄ ２０１５）を、ＢＬ２１（ＤＥ３）化学的コンピテント大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に形質転換し、細胞をカナマイシンを補充した複合培地（酵母抽出物を含むトリプチックソイブロス）中で培養した。タンパク質の発現を１ｍＭのＩＰＴＧ（最終濃度）の添加によって誘導し、培養物を室温、１５０ｒｐｍで一晩維持した。細胞を遠心分離（４０００ｒｃｆ、１０分、４℃）によって収集し、ＩＭＡＣ結合緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、３００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．５）に再懸濁し、その後超音波処理によって溶解した。遠心分離後、清澄化した上清を、Ｚ_{ＨＥＲ２：３４２}－ＳＲ－Ｈ_６を捕捉するＩＭＡＣマトリックス（ＨｉｓＰｕｒ（商標）コバルト樹脂、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に通した。樹脂を洗浄緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、３００ｍＭ ＮａＣｌ、３０ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．５）で洗浄し、タンパク質を溶出緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、３００ｍＭ ＮａＣｌ、３００ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．５）を使用して溶出した。溶出したＺ_{ＨＥＲ２：３４２}－Ｈ_６を、ＰＤ－１０脱塩カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）でソルターゼＡコンジュゲーション緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＣａＣｌ_２ ｐＨ７．５）に緩衝液交換した。Ｚ_{ＨＥＲ２：３４２}－ＳＲ－Ｈ_６の純度および分子量をＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびＭＡＬＤＩ－ＴＯＦを用いて確認した。

【0107】

Ｚ_{ＨＥＲ２：３４２}－ＳＲ－Ｈ_６を、ソルターゼＡ媒介ライゲーション（ＳＭＬ）を用いてＨＰ１５に部位特異的にコンジュゲートした。以下に記載されるＳＭＬ方法は、以前に公開されたアフィボディ－ＰＮＡコンジュゲーション用のプロトコルに基づく（Ａｌｔａｉ ２０１７）。Ｓｒｔ Ａ３^＊と示される、Ｐ９４Ｓ／Ｄ１６０Ｎ／Ｋ１９６Ｔ（Ｃｈｅｎら、２０１１）変異を有するソルターゼＡのバリアントをコンジュゲーションに利用した。グリシン改変したＨＰ１５プローブを１０％ＤＭＳＯに溶解し、８０℃で５分間加熱した後、濃度を２６０ｎｍでの吸光度に基づいて推定した。５００ｎｍｏｌのＨＰ１５、１．２５μｍｏｌのＺ_{ＨＥＲ２：３４２}－ＳＲ－Ｈ_６および１．２５μｍｏｌのＮｉＣｌ_２を、５ｍｌの最終体積のソルターゼＡコンジュゲーション緩衝液中で混合した。Ｓｒｔ Ａ３^＊を最終濃度５μＭまで反応物に添加し、反応を３０分間進行させ、その後、予備平衡化したＩＭＡＣマトリックスを使用した逆ＩＭＡＣ工程に供した。コンジュゲーション生成物、加水分解されたタンパク質副生成物および非コンジュゲートＨＰ１５は、所与のマトリックスとの３０分間のインキュベーション工程後にフロースルーで回収することができた。次いで、回収したフロースルーをＰＤ－１０カラムで１０ｍＭ ＮａＯＡｃ ｐＨ３．６に緩衝液交換し、その後凍結乾燥した。Ｚ_{ＨＥＲ２：３４２}－ＳＲ－ＨＰ１５コンジュゲートを、ＰＮＡプローブの精製と同じカラムおよび溶媒を使用するＲＰ－ＨＰＬＣで精製したが、勾配は２５分で５％～５０％Ｂとし、吸光度を２２０、２６０および２８０ｎｍでモニターした。非コンジュゲートＨＰ１５およびＺ_{ＨＥＲ２：３４２}－ＳＲ－ＨＰ１５コンジュゲート画分を回収し、凍結乾燥し、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦによって分析した。精製したコンジュゲートの純度を確認するために、分析ＨＰＬＣ（Ｚｏｒｂａｘ ３００ＳＢ－Ｃ１８、粒径３．５μｍ、４．６×１５０ｍｍ、Ａｇｉｌｅｎｔ）およびエレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ－ＭＳ、Ｉｍｐａｃｔ ＩＩ、Ｂｒｕｋｅｒ）によって分析した。非コンジュゲートＨＰ１５は、Ｚ_{ＨＥＲ２：３４２}－ＳＲ－Ｈ_６の新しいバッチと一緒に新しいコンジュゲーション反応に使用することができた。

【0108】

ＰＮＡプローブおよびＺ_{ＨＥＲ２：３４２}－ＳＲ－ＨＰ１５の最終濃度を、２６０ｎｍでの吸光度を測定することによって決定した。２６０ｎｍでの総吸光度に対するタンパク質部分からの寄与は無視でき得るので、同じ吸光係数をＨＰ１５およびＺ_{ＨＥＲ２：３４２}－ＳＲ－ＨＰ１５の両方に使用した。

【0109】

ＨＥＲ２受容体へのＺ_{ＨＥＲ２：３４２}－ＳＲ－ＨＰ１５の結合を表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって確認した。

【0110】

ＰＮＡプレターゲティングプローブの特性評価
ＰＮＡプローブのハイブリダイゼーションの速度論的パラメータを、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）８Ｋ装置（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にて表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を用いて分析した。デキストランチップシリーズＳ センサーＣＭ５（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を、標準的なアミンカップリング手順を使用して、３８５、１９４、１８５および３５３のレゾナンスユニット（ＲＵ）まで、４つの表面をＺ_{ＨＥＲ２：３４２}－ＳＲ－ＨＰ１５で官能化した。各チップのリファレンス表面を活性化に供し、続いて非活性化した。相補的ＰＮＡプローブＨＰ１６、ＨＰ１７、ＨＰ１８およびＨＰ１９を５つの濃度：２２．６、４５．３、９０．６、１８１．２５および３６２．５ｎＭで単回サイクル注入を用いて注入した。各濃度に対して３００秒間会合させ、続いて次の注入および会合段階を行った。最終濃度の注入後、解離を１００００秒間（２時間４７分）行った後、１０ｍＭのＨＣｌで３０秒間、続いて１５ｍＭのＮａＯＨで３０秒間再生した。すべてのランは、ＰＢＳＴ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０）ｐＨ７．４で、５０μｌ／分の流速を用いて２５℃で行った。Ｂｉａｃｏｒｅ Ｉｎｓｉｇｈｔ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアの１：１結合モデルを使用して速度論的パラメータを計算した。

【0111】

ＨＰ１５：ＨＰ１６、ＨＰ１５：ＨＰ１７およびＨＰ１５：ＨＰ１８の融解温度は、１℃／分の温度変化を使用して、２０～９５℃の温度範囲で２６０ｎｍのＵＶ吸光度をモニター（Ｃｈｉｒａｓｃａｎ（商標）、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｐｈｏｔｏｐｈｙｓｉｃｓ）することによって決定した。ＰＮＡ複合体を８０℃まで５分間加熱し、次いで室温で５分間ハイブリダイズさせた後、室温で５分間ＵＶモニターした。熱変性の判定前後にＣＤスペクトルを収集した。
ＨＰ１５：ＨＰ１９複合体の融解温度は、シングルセルＰｅｌｔｉｅｒサーモスタット制御キュベットホルダーを備えたＶａｒｉａｎ Ｃａｒｙ ５０ Ｂｉｏ ＵＶ－可視（ｖｉｓｕａｌ）分光光度計を用いて決定した。セル内の温度を０．５℃／分の速度で２０から８０℃の間で調整し、各温度点で６０秒の平衡化後、２６０ｎｍで測定を行った。

【0112】

放射性標識およびインビトロ安定性
^１７７Ｌｕを用いた一次および二次ＰＮＡプローブの放射性標識化を、以前に記載された方法（Ｗｅｓｔｅｒｌｕｎｄ ２０１８）を使用して行った。簡潔には、３０μｇのペプチドを１００μＬのアスコルビン酸（１Ｍ、ｐＨ５．５）に９５℃で１０分間加熱することによって溶解し、続いて５分間超音波処理して確実に完全に溶解させた。３μＬ（６０～１２０ＭＢｑ）の^１７７ＬｕＣｌ_３を添加し、続いてボルテックスした。混合物を９５℃で６０分間インキュベートした。反応混合物を、０．２Ｍクエン酸、ｐＨ２．０で溶出する放射性－ＩＴＬＣによって分析した。

【0113】

緩く結合した^１７７Ｌｕを除去するために、過剰のエチレンジアミン四酢酸四ナトリウム塩（ＥＤＴＡ．Ｎａ_４）による処理を行った。ＥＤＴＡ．Ｎａ_４の新たに調製した溶液（Ｍｉｌｌｉ－Ｑ水中１０ｍｇ／ｍＬ）を１０００倍のモル過剰で反応混合物に添加し、９５℃で１０分間インキュベートした。放射化学収率および純度が高いため、新しい二次プローブに対してさらなる精製は必要なかった。［^１７７Ｌｕ］Ｌｕ－ＨＰ２および［^１７７Ｌｕ］Ｌｕ－Ｚ_{ＨＥＲ２：３４２}－ＳＲ－ＨＰ１５については、ＥＤＴＡ処理後に、使い捨てＮＡＰ－５カラムを使用し、予備平衡化し、１％ＢＳＡ／ＰＢＳで溶出するサイズ排除クロマトグラフィーによって精製を行った。

【0114】

安定性を評価するために、新たに放射性標識されたコンジュゲートの画分（０．４μｇ）を、５００倍のモル過剰のＥＤＴＡと共に３７℃で６０分間インキュベートした。また、対照としてＰＢＳ中でもインキュベーションを行った。試験は３連で行った。

【0115】

放射性－ＩＴＬＣの結果を検証するために、逆相ＨＰＬＣを、直列に連結されたＬ－２１３０ポンプ、ＵＶ検出器（Ｌ－２４００）、および放射線フロー検出器（Ｂｉｏｓｃａｎ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、ＤＣ、ＵＳＡ）からなるＬａＣｈｒｏｍ Ｅｌｉｔｅ（登録商標）システム（Ｈｉｔａｃｈｉ、ＶＷＲ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して行った。分析カラム（Ｐｈｅｎｅｍｅｎｅｘ、Ａｓｃｈａｆｆｅｎｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ；Ｌｕｎａ（登録商標）５μｍ Ｃ１８、１００Å；１５０×４．６ｍｍカラム）を使用して、［^１７７Ｌｕ］Ｌｕ標識された化合物の純度分析を行った。ＨＰＬＣ条件は以下の通りであった：Ａ＝１０ｍＭ ＴＦＡ／Ｈ_２Ｏ；Ｂ＝１０ｍＭ ＴＦＡ／アセトニトリル；２２０ｎｍでのＵＶ検出；溶出勾配：５～７０％Ｂで０～１５分、７０～９５％Ｂで１５～１８分、５％Ｂで１９～２０分；流量は１．０ｍＬ／分であった。

【0116】

インビトロ研究
細胞を、１０^６細胞／ディッシュの密度で細胞培養ディッシュに播種した。３つのディッシュのセットを各データポイントに使用した。

【0117】

ＨＥＲ２を発現する細胞への［^１７７Ｌｕ］Ｌｕ－Ｚ_{ＨＥＲ２：３４２}－ＳＲ－ＨＰ１５の結合の特異性を、細胞を１ｎＭの標識コンジュゲートと３７℃で１時間インキュベーションすることによって試験した。受容体を飽和させるために、放射性標識されたプローブを添加する５分前に、非標識Ｚ_{ＨＥＲ２：３４２}（１０００ｎＭ）を対照セットに添加した。

【0118】

新規の［^１７７Ｌｕ］Ｌｕ－ＨＰ１６、［^１７７Ｌｕ］Ｌｕ－ＨＰ１７および［^１７７Ｌｕ］Ｌｕ－ＨＰ１８に対するプレターゲティング特異性アッセイを、先に記載されるように４セットの細胞ディッシュを使用して行った（Ｈｏｎａｒｖａｒ ２０１６）。プレターゲティングを実証するために、１セットのディッシュをＺ_{ＨＥＲ２：３４２}－ＳＲ－ＨＰ１５（１ｎＭ）と共に３７℃で１時間インキュベートし、洗浄した。^１７７Ｌｕ標識された二次プローブ（１０ｎＭ）を添加し、細胞を３７℃で１時間インキュベートした。プレターゲティングがＨＥＲ２媒介性であったことを示すために、ディッシュの第２のセットを過剰のアフィボディ分子Ｚ_{ＨＥＲ２：３４２}（１０００ｎＭ）と共に５分間インキュベートした後、Ｚ_{ＨＥＲ２：３４２}－ＳＲ－ＨＰ１５を添加した。^１７７Ｌｕ標識された二次プローブ（１０ｎＭ）を添加し、細胞を３７℃で１時間インキュベートした。プレターゲティングがＰＮＡ媒介性であったことを実証するために、ディッシュの第３のセットをＺ_{ＨＥＲ２：３４２}－ＳＲ－ＨＰ１５と共にインキュベートし、続いて過剰の非標識二次プローブ（３００ｎＭ）と共に３０分間インキュベーションし、次いで、^１７７Ｌｕ標識された二次プローブを添加し、続いて１時間インキュベーションした。第４のセットでは、細胞を、^１７７Ｌｕ標識された二次プローブのみと共にインキュベートして非特異的結合を評価した。インキュベーション終了時に、細胞を洗浄し、トリプシンによって剥離し、細胞中の放射能を測定して、細胞に結合した放射能のパーセントを計算した。

【0119】

ＨＥＲ２受容体に対する放射性標識されたコンジュゲートの結合親和性を評価するために、ＬｉｇａｎｄＴｒａｃｅｒ（登録商標）黄色装置（Ｒｉｄｇｅｖｉｅｗ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ ＡＢ、Ｖａｎｇｅ，Ｓｗｅｄｅｎ）を使用して、ＳＫＯＶ３細胞への［^１７７Ｌｕ］Ｌｕ標識されたプローブの結合およびＳＫＯＶ３細胞からのそれらの解離のキネティクスを測定した。ＳＫＯＶ３細胞を細胞培養ディッシュ（Ｎｕｎｃｌｏｎ（商標）、サイズ１００６２０、ＮＵＮＣ Ａ／Ｓ、Ｒｏｓｋｉｌｄｅ、Ｄｅｎｍａｒｋ）のローカルエリアに播種した。ＳＫＯＶ３細胞を２セットのディッシュで２時間Ｚ_{ＨＥＲ２：３４２}－ＳＲ－ＨＰ１５（１ｎＭ）で予備飽和し、その後３回洗浄して未結合の一次薬剤を除去した。漸増濃度の２つの放射性標識された分子（［^１７７Ｌｕ］Ｌｕ－Ｚ_{ＨＥＲ２：３４２}－ＳＲ－ＨＰ：１５については１８０および５４０ｐＭ、［^１７７Ｌｕ］Ｌｕ標識された二次プローブについては、１および５ｎＭ）を添加した。データを、Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ Ｍａｐ（商標）ソフトウェア（Ｒｉｄｇｅｖｉｅｗ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）を使用して分析して、会合速度定数（ｋ_ａ）、解離速度定数（ｋ_ｄ）および平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）を計算した。分析は２連で行った。

【0120】

ＳＫＯＶ３およびＢＴ４７４細胞での細胞プロセシングおよび保持を、酸洗浄法による中断されたインキュベーション中に研究した（Ｗａｌｌｂｅｒｇ ２００８）。

【0121】

インビボ研究
動物実験は、実験動物での作業に関する国の法律に従って行った。承認は、ウプサラ（Ｕｐｐｓａｌａ）の動物研究倫理委員会によって付与された。腫瘍移植のために、１０^７個のＳＫＯＶ３細胞を雌性ＢＡＬＢ／ｃ ｎｕ／ｎｕマウスの右後肢に皮下注射した。生体内分布の実験は、細胞移植の２週間後に行った。平均動物体重は１８±１ｇであった。平均腫瘍重量は０．２３±０．１１ｇであった。生体内分布の測定のために、麻酔（Ｒｏｍｐｕｎ（登録商標）／Ｋｅｔａｌａｒ（登録商標））の過剰投与とそれに続く心臓穿刺によって、マウスを所定の時点で安楽死させた。関心の器官および腫瘍を採取し、秤量し、それらの放射能を測定した。試料１グラムあたりの総注射線量のパーセンテージ（％ＩＤ／ｇ）を計算した。

【0122】

この研究で使用されたプレターゲティングプロトコルは、Ｗｅｓｔｅｒｌｕｎｄら（Ｗｅｓｔｅｒｌｕｎｄ ２０１８）によって［^１７７Ｌｕ］Ｌｕ－ＨＰ２を使用したアフィボディに基づくＰＮＡ媒介療法のために以前に最適化されている。一次および［^１７７Ｌｕ］Ｌｕ－ＨＰ２の両方の注射質量を２倍にした場合、アップスケーリング実験は、［^１７７Ｌｕ］Ｌｕ－ＨＰ２の生体内分布に有意な変化を示さなかった。この研究に基づいて、マウスあたり５０μｇの一次薬剤および等モル量の二次薬剤（ＨＰ１６、ＨＰ１７、ＨＰ１８およびＨＰ２についてそれぞれ０．６９、０．８９、１および１μｇ）を注射した。

【0123】

生体内分布の研究のために、マウスを５つの群に無作為化した。３０匹のマウスに、Ｚ_{ＨＥＲ２：３４２}－ＳＲ－ＨＰ１５（マウスあたり１００μＬのＰＢＳ中４ｎｍｏｌ）を静脈内注射した。１６時間後、すべてのマウスに［^１７７Ｌｕ］－ＨＰ１６、［^１７７Ｌｕ］－ＨＰ１７または［^１７７Ｌｕ］－ＨＰ１８（１００μＬのＰＢＳ中２％ＢＳＡに１９４ｐｍｏｌ、１２０ｋＢｑ）を注射した。二次プローブの注射４時間および１４４時間後に生体内分布を測定した。比較のために、第一世代［^１７７Ｌｕ］Ｌｕ－ＨＰ２の生体内分布を、Ｚ_{ＨＥＲ２：３４２}－ＳＲ－ＨＰ：１を一次薬剤として使用したのと同じ方法で測定した。

【0124】

インビボ特異性を評価するために、［^１７７Ｌｕ］Ｌｕ－二次プローブの生体内分布を、一次薬剤の事前注射なしで注射４時間後に測定した。

【0125】

ガンマカウンター測定が完了した後、腫瘍をクライオメジウム（Ｎｅｇ－５０（商標）、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳＡ）に包埋し、－８０℃で凍結した。凍結腫瘍をクライオミクロトーム（ＣｒｙｏＳｔａｒ（商標）ＮＸ７０、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳＡ）を使用して連続切片（厚さ３０μｍ）に切断し、スライドガラス上に解凍マウントした。デジタルオートラジオグラフィーのために、切片を含むスライドをカセットに入れ、蛍光体スクリーンに一晩曝露した。蛍光体スクリーンを、Ｃｙｃｌｏｎｅ（登録商標）ストレージ蛍光体システム、６００ｄｐｉの解像度でスキャンし、ＯｐｔｉＱｕａｎｔソフトウェア（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、ＵＳＡ）を使用して分析した。

【0126】

腫瘍および腎臓における吸収線量の比を推定するために、腎臓および腫瘍における累積活性を評価した。推定は、臨床的に検証された二時点アプローチに基づいた（Ｆｒｅｅｄｍａｎ ２０２０）。生体内分布データを非崩壊補正し、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して時間－活性プロット下の面積を計算した。交差線量は無視でき、吸収率は１に等しいであろうため、主な吸収線量はベータ粒子に起因すると仮定した。

【0127】

ＳＰＥＣＴ／ＣＴイメージング
ＳＫＯＶ３異種移植片を有するマウスに、二次^１７７Ｌｕ標識されたプローブ（６８０ｐｍｏｌ、９～１３ＭＢｑ）の注射の１６時間前に、７ｎｍｏｌの一次薬剤を静脈内注射した。イメージング（注射４時間後）の直前に、動物をＣＯ_２窒息によって屠殺した。ＳＰＥＣＴイメージングを、ｎａｎｏＳｃａｎ ＳＣ（Ｍｅｄｉｓｏ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｈｕｎｇａｒｙ）を用いて行った。ＣＴの取得は、５０ｋｅＶのＸ線エネルギーを用いて行った。２０分間のＳＰＥＣＴヘリカルスキャンを、エネルギーウインドウ５０～６２、１０３～１２４、および１８８～２３０ｋｅＶを使用して取得した。データを、Ｔｅｒａ－Ｔｏｍｏ（商標）３Ｄ ＳＰＥＣＴソフトウェアを使用して再構成した。

【0128】

発明の例
例１：アフィボディ－ＰＮＡコンジュゲートおよび相補的ＰＮＡプローブの作成および特性評価
ＰＮＡプレターゲティングプローブＨＰ１５、ＨＰ１６、ＨＰ１７、ＨＰ１８およびＨＰ１９（表１）を上記の実験方法のように調製した。プローブを、自己相補的な配列ならびにプリン（ＡおよびＧ）の伸長したストレッチ（これらは凝集を促進することが公知であり、したがってＰＮＡベースのプローブを合成および精製することを困難にし得る）を回避するように設計した（Ｚｈａｏ ２０２０）。

【0129】

アフィボディ（登録商標）分子Ｚ_{ＨＥＲ２：３４２}－ＳＲ－Ｈ_６およびＨＰ１５を、Ｓｒｔ Ａ３^＊を使用してコンジュゲートした（実験方法を参照）。反応のライゲーション効率は、ＲＰ－ＨＰＬＣにおける２６０ｎｍでのピーク下の積分面積に基づいて４０％と推定された。４０％のライゲーション効率は、ＨＰ１のＺ_{ＨＥＲ２：３４２}－ＳＲ－Ｈ_６へのコンジュゲーションに関して以前に報告された７０％のライゲーション効率（Ａｌｔａｉ ２０１７）よりも低い。しかしながら、ＨＰ１５は、ＨＰ１のＮ末端の３つのグリシン残基に対して、Ｎ末端に１つのグリシン残基を有し、これはライゲーション効率に影響を及ぼす可能性がある。４０％のライゲーション効率は、４５％と報告された野生型ソルターゼＡを使用したＨＰ１のコンジュゲーションと同じ範囲内にある（Ｗｅｓｔｅｒｌｕｎｄ、２０１５）。

【0130】

固定化されたＺ_{ＨＥＲ２：３４２}－ＳＲ－ＨＰ１５への４つの相補的ＰＮＡプローブのハイブリダイゼーションをＳＰＲによって分析した。単回サイクル注入を用いて分析した相互作用の代表的なセンサーグラムを図１に示す。会合速度定数ｋ_ａは、ＨＰ１６、ＨＰ１７およびＨＰ１８について、それぞれ４．６×１０^４、４．３×１０^４および５．７×１０^４Ｍ^－１ｓ^－１と推定された。したがって、ＨＰ１５と相互作用するこれら３つのＰＮＡプローブすべてのオン速度は同じ範囲内にある。ｋ_ａは、ＨＰ１９について２．１×１０^７Ｍ^－１ｓ^－１と推定された。解離速度定数ｋ_ｄは、ＨＰ１６については１．２×１０^－５ｓ^－１、ＨＰ１９については７．２×１０^－２ｓ^－１と推定されたが、他の２つの相補的ＰＮＡプローブ（ＨＰ１７およびＨＰ１８）については、ｋ_ｄをＢｉａｃｏｒｅを使用して決定するには遅すぎた。ＨＰ１６の平衡解離定数は約２８０ｐＭであると計算されたが（表２）、Ｚ_{ＨＥＲ２：３４２}－ＳＲ－ＨＰ１５に対するＨＰ１７およびＨＰ１８の親和性はより高いと推定された。

【0131】

ＨＰ１５とＨＰ１６（９量体）との間の相互作用に対して決定されたＫ_Ｄ（２８０ｐＭ）は、意図されたプレターゲティング用途に対して十分に高い親和性を示すようである。ＨＰ１５とＨＰ１９（６量体）との間の相互作用に対して決定されたＫ_Ｄ（３．４ｎＭ）はより高いが、このより低い親和性も用途に対して十分であると予想される。腫瘍関連抗原および放射性標識されたハプテンの両方に結合する二重特異性抗体構築物を使用したプレターゲティングの成功が以前に実証されており、二機能性抗体と^１１１Ｉｎ標識されたベンジルＥＤＴＡ誘導体との間の相互作用はわずか１０^－９～１０^－１０Ｍの推定Ｋ_Ｄであった（Ｓｔｉｃｋｎｅｙ １９９１）。

【0132】

ＨＰ１５と二次プローブＨ１６、ＨＰ１７またはＨＰ１８との間のハイブリダイゼーションは、約２１５ｎｍおよび２６０ｎｍに最小値を有するＣＤスペクトルを生じた。誘導されたシグナルは、Ｃ末端Ｌアミノ酸を有する相補的ＰＮＡプローブ間のハイブリダイゼーション時のＰＮＡ：ＰＮＡ二重らせん形成の結果である（Ｃｏｒｒａｄｉｎｉ ２０１２）。ＨＰ１５とのデュプレックス形成後の各ハイブリダイゼーションプローブの融解温度を２６０ｎｍでモニターし、ＨＰ１６、ＨＰ１７およびＨＰ１８についてはそれぞれ７３℃、７５℃および８７℃（図２ａ）、ＨＰ１９については５５℃（図２ｂ）と推定された。分光学的特性は、ＨＰ１６、ＨＰ１７およびＨＰ１８がすべて、一次ＰＮＡプローブＨＰ１５と高い熱安定性のデュプレックスを形成することを示している。ＨＰ１６、ＨＰ１７およびＨＰ１９の融解温度は、ＨＰ１８と比較してオリゴマー長が短いため、より低いと予想される。ＨＰ１６、ＨＰ１７およびＨＰ１８の融解温度よりも有意に低いが、ＨＰ１９の融解温度は依然としてヒトの体温をはるかに上回っている。

【0133】

例２：放射性標識化およびインビトロ安定性
表３は、^１７７Ｌｕを用いたすべてのプローブの放射性標識の結果を示す。ＥＤＴＡ処理後、新しい二次薬剤の放射化学収率は９８％を超えた。したがって、ＮＡＰ－５を使用するさらなる精製は、インビトロおよびインビボ研究のためには行わなかった。ＮＡＰ－５カラムを使用した［^１７７Ｌｕ］Ｌｕ－Ｚ_{ＨＥＲ２：３４２}－ＳＲ－ＨＰ１５および［^１７７Ｌｕ］Ｌｕ－ＨＰ２の精製により、両方の標識について１００±０％の放射化学純度が得られた。^１７７Ｌｕで標識されたすべてのプローブは、ＰＢＳ中およびＥＤＴＡの存在下で最大１時間のインキュベーションの間安定であった。

【0134】

放射性ＩＴＬＣの結果を検証するために、放射性ＨＰＬＣのアイデンティティを行い、標識化および精製後に断片化が起こらなかったことを実証した。すべてのプローブの放射性ＨＰＬＣ保持時間は約５．８分であった。非標識プローブの保持時間は標識プローブと同じであった。

【0135】

例３：インビトロ研究
一次薬剤［^１７７Ｌｕ］Ｌｕ－Ｚ_{ＨＥＲ２：３４２}－ＳＲ－ＨＰ１５のＨＥＲ２結合特異性を飽和実験を用いて試験した。細胞を抗ＨＥＲ２アフィボディ分子で事前飽和させた場合、結合は有意に（ｐ＜０．０００５）減少し（図３Ａ）、結合がＨＥＲ２媒介性であることを実証した。［^１７７Ｌｕ］Ｌｕ－Ｚ_{ＨＥＲ２：３４２}－ＳＲ－ＨＰ１５の遅い内在化は、これが標的細胞の表面上の一次ハイブリダイゼーションプローブの長い持続を可能にするので、プレターゲティング用途に有利である。

【0136】

Ｚ_{ＨＥＲ２：３４２}－ＳＲ－ＨＰ１５で前処理したＨＥＲ２を発現する細胞への［^１７７Ｌｕ］Ｌｕ－ＨＰ１６、［^１７７Ｌｕ］Ｌｕ－ＨＰ１７および［^１７７Ｌｕ］Ｌｕ－ＨＰ１８のインビトロでの結合の特異性を評価した（図３Ｂ、図３Ｃ、図３Ｄ）。ＨＥＲ２受容体を抗ＨＥＲ２アフィボディ分子で飽和させた場合、またはＺ_{ＨＥＲ２：３４２}－ＳＲ－ＨＰ１５処理した細胞を大過剰の非標識二次薬剤と共にプレインキュベートした場合、すべての二次薬剤の結合が有意に（ｐ＜０．０００５）減少した。一次薬剤とのプレインキュベーションなしの細胞へのすべての二次薬剤の結合は、プレターゲティングと比較して有意に（ｐ＜０．０００５）低かった。［^１７７Ｌｕ］Ｌｕ－ＨＰ２の特異性は以前に実証されている（Ａｌｔａｉ ２０１７ ＮＭＢ）。

【0137】

Ｚ_{ＨＥＲ２：３４２}－ＳＲ－ＨＰ１５で事前処理した生ＳＫＯＶ３細胞への結合のキネティクスのＬｉｇａｎｄＴｒａｃｅｒ（登録商標）測定は、すべての二次プローブの結合が極めて強いことを実証した。Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ Ｍａｐ（商標）の計算は、［^１７７Ｌｕ］Ｌｕ－Ｚ_{ＨＥＲ２：３４２}－ＳＲ－ＨＰ１５およびプレターゲットした［^１７７Ｌｕ］Ｌｕ－二次プローブについて迅速な会合とそれに続く非常に遅い解離を示し、平衡時のピコモル解離定数（Ｋ_Ｄ）をもたらした。Ｋ_Ｄ値は１１～１２ｐＭであった。二次プローブ間で見かけの解離定数に差はなかった。したがって、１５から９個の窒素塩基へのＰＮＡの長さの減少は、細胞アッセイにおける一次プローブへのそれらの結合の観察可能な低下と関連しなかった。

【0138】

中断されたインキュベーション後、ＳＫＯＶ３およびＢＴ４７４細胞によるすべての放射性標識の細胞プロセシングおよび保持を求めた。［^１７７Ｌｕ］Ｌｕ－Ｚ_{ＨＥＲ２：３４２}－ＳＲ－ＨＰ１５の場合、内在化は遅く、これはＨＥＲ２結合アフィボディ分子およびその誘導体に典型的である。［^１７７Ｌｕ］Ｌｕ－Ｚ_{ＨＥＲ２：３４２}－ＳＲ－ＨＰ１５の内在化割合は、ＳＫＯＶ３細胞においてＢＴ４７４細胞よりもわずかに高かった（２４時間の時点で、ＳＫＯＶ３については１８±２％対ＢＴ４７４については１２±２％）。標識された二次プローブの内在化のパターンは、［^１７７Ｌｕ］Ｌｕ－Ｚ_{ＨＥＲ２：３４２}－ＳＲ－ＨＰ１５のパターンと類似していた。経時的な放射能の保持は、［^１７７Ｌｕ］Ｌｕ－Ｚ_{ＨＥＲ２：３４２}－ＳＲ－ＨＰ１５についてが最も高かったが、［^１７７Ｌｕ］Ｌｕ－二次プローブは、結合した放射能のより速い放出を経時的に示した。

【0139】

例４：インビボ研究
一次プローブの事前注射なしでの［^１７７Ｌｕ］Ｌｕ標識された二次プローブの生体内分布に関するデータを表４に提供する。［^１７７Ｌｕ］－ＨＰ１６および［^１７７Ｌｕ］－ＨＰ１７の生体内分布は、骨取込みにおけるわずかだが有意な差を除いて、非常に類似していた。［^１７７Ｌｕ］－ＨＰ１８と比較して、より短いバリアントは、血液、肝臓および腎臓で有意に低い取込みであった。［^１７７Ｌｕ］－ＨＰ１７はまた、肺および骨における取込みが有意に低い。

【0140】

Ｚ_{ＨＥＲ２：３４２}－ＳＲ－ＨＰ１５（４ｎｍｏｌ）の事前注射の有無による［^１７７Ｌｕ］Ｌｕ－二次プローブのインビボ特異性の結果（注射４時間後）を図４に示す。マウスにＺ_{ＨＥＲ２：３４２}－ＳＲ－ＨＰ１５を事前注射した場合、すべての［^１７７Ｌｕ］Ｌｕ－二次プローブの腫瘍取込みは、事前注射なしよりも有意に（ｐ＜０．００００５）高かった。興味深いことに、正常組織における取込みもまた、一次プローブの事前注射の場合に有意により高かった。

【0141】

一次薬剤の事前注射後の腫瘍における二次プローブの取込みの劇的な増加は、プレターゲティングの特異性を説得力をもって証明している。興味深いことに、Ｚ_{ＨＥＲ２：３４２}－ＳＲ－ＨＰ１５の注射後の二次プローブの取込みの増加も、血液、腎臓、脾臓、および筋肉で観察された。これは、二次プローブと、血液循環から完全にはクリアされなかったか、または腫瘍内の受容体から解離した後に血流に再進入した一次薬剤との会合によって説明され得る。この効果は、［^１７７Ｌｕ］－ＨＰ１６については、あまり顕著ではなかった。

【0142】

ＳＫＯＶ３を有するマウスにおける一次プローブの注射後の［^１７７Ｌｕ］Ｌｕ－ＨＰ１６、［^１７７Ｌｕ］Ｌｕ－ＨＰ１７、［^１７７Ｌｕ］Ｌｕ－ＨＰ１８と［^１７７Ｌｕ］Ｌｕ－ＨＰ２との比較生体内分布の結果を表５に示す。

【0143】

生体内分布の測定は、すべての研究したＰＮＡベースのプローブに対して、血液および正常器官および組織からの迅速なクリアランスを示している。コンジュゲート間で生体内分布のいくらかの違いが観察された。血中濃度は、注射４時間後に他の二次プローブよりも［^１７７Ｌｕ］Ｌｕ－ＨＰ１８の方が有意に（ｐ＜０．０００１）高かった。この時点で、［^１７７Ｌｕ］Ｌｕ－ＨＰ１６、［^１７７Ｌｕ］Ｌｕ－ＨＰ１７および［^１７７Ｌｕ］Ｌｕ－ＨＰ２（０．１±０．０％ＩＤ／ｇ）についての肝臓取込みは同等であったが、［^１７７Ｌｕ］Ｌｕ－ＨＰ１８（０．２±０．１％ＩＤ／ｇ）よりも有意に（ｐ＜０．０５）低かった。顕著な取込みのある組織は腎臓および腫瘍のみであった。［^１７７Ｌｕ］Ｌｕ－ＨＰ１６の腎臓での取込み（６±１％ＩＤ／ｇ）は、［^１７７Ｌｕ］Ｌｕ－ＨＰ１８（１２±２％ＩＤ／ｇ）および［^１７７Ｌｕ］Ｌｕ－ＨＰ２（１０±２％ＩＤ／ｇ）に対してよりも有意に（ｐ＜０．０５）低かった。［^１７７Ｌｕ］Ｌｕ－ＨＰ１６は、最も高い平均腫瘍取込み（２４±６％ＩＤ／ｇ）を示したが、他のプローブの取込みに対する差は有意ではなかった。より低い腎臓取込みと腫瘍における高い取込みの組み合わせは、注射４時間後に［^１７７Ｌｕ］Ｌｕ－ＨＰ１６のより高い腫瘍対腎臓比（腎臓取込みより４倍高い）をもたらした。［^１７７Ｌｕ］Ｌｕ－ＨＰ１６および［^１７７Ｌｕ］Ｌｕ－ＨＰ１７の腎臓取込みは、［^１７７Ｌｕ］Ｌｕ－ＨＰ１８よりも有意に（ｐ＜０．００５）低かった。腫瘍取込みの順序は、注射１４４時間後、［^１７７Ｌｕ］Ｌｕ－ＨＰ１７および［^１７７Ｌｕ］Ｌｕ－ＨＰ１８（両方とも５±１％ＩＤ／ｇ）＞［^１７７Ｌｕ］Ｌｕ－ＨＰ２（４±１％ＩＤ／ｇ）＞［^１７７Ｌｕ］Ｌｕ－ＨＰ１６（３±１％ＩＤ／ｇ）であった。［^１７７Ｌｕ］Ｌｕ－ＨＰ１７は、腫瘍における放射能のより良好な保持および腎臓におけるより速いクリアランスを示し（腫瘍取込みは腎臓取込みよりも７倍高かった）、注射１４４時間後でより高い腫瘍対腎臓比をもたらした。

【0144】

例５：ＳＰＥＣＴ／ＣＴイメージング
ＳＰＥＣＴ／ＣＴイメージングの結果（図５）により、すべてのバリアントに対する効率的なアフィボディ分子ベースのＰＮＡ媒介性プレターゲティングを確認した。腫瘍は、最も高い取込みのある部位であった。顕著な取込みがある組織は腎臓および腫瘍のみであった。腫瘍における放射能取込みは、各動物において腎臓よりもかなり高かった。

【0145】

腫瘍における放射能の分布を、オートラジオグラフィーを使用して評価した。注射４時間後の活性の分布は非常に均一であり、異種移植片のクラスター特性を反映していた。その後の時点で、腫瘍コアからリムへの放射能濃度の勾配がより顕著であった。

【0146】

腎臓および腫瘍に対する推定線量測定の結果を表６および図６に示す。腫瘍および腎臓についての時間－活性プロット下の面積の比は、ＨＰ１６、ＨＰ１７、ＨＰ１８およびＨＰ２についてそれぞれ３．８、２．８、２．０および２．０であった。これは、［^１７７Ｌｕ］Ｌｕ－ＨＰ１６が治療用途に最も好ましい線量測定を提供し得ることを示している。

【0147】

【表1A】

【0148】

【表1B】

【0149】

【表2】

【0150】

【表3】

【0151】

【表4】

^ａ［^１７７Ｌｕ］－ＨＰ１６および［^１７７Ｌｕ］－ＨＰ１７の間の有意差
^ｂ［^１７７Ｌｕ］－ＨＰ１６および［^１７７Ｌｕ］－ＨＰ１８の間の有意差
^ｃ［^１７７Ｌｕ］－ＨＰ１７および［^１７７Ｌｕ］－ＨＰ１８の間の有意差
^＊内容物を含むＧＩ管およびカーカスのデータは、全試料あたりの注射量の％として示されている。

【0152】

【表5】

^ａ［^１７７Ｌｕ］Ｌｕ－ＨＰ１６および［^１７７Ｌｕ］Ｌｕ－ＨＰ１８の間の有意差（ｐ＜０．０５）
^ｂ［^１７７Ｌｕ］Ｌｕ－ＨＰ１７および［^１７７Ｌｕ］Ｌｕ－ＨＰ１８の間の有意差（ｐ＜０．０５）
^Ｃ［^１７７Ｌｕ］Ｌｕ－ＨＰ１８および［^１７７Ｌｕ］Ｌｕ－ＨＰ２の間の有意差（ｐ＜０．０５）
^ｄ［^１７７Ｌｕ］Ｌｕ－ＨＰ１６および［^１７７Ｌｕ］Ｌｕ－ＨＰ２の間の有意差（ｐ＜０．０５）

【0153】

【表6】

【0154】

【表7】

【配列表フリーテキスト】

【0155】

配列表１～７ ＜２２３＞合成ＰＮＡ配列

【0156】

【化1-1】

【化1-2】

【図1】

【図2a】

【図2b】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図3D】

【図4A】

【図4B】

【図4C】

【図5】

【図6A】

【図6B】

【図6C】

【図6D】

【配列表】

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【国際調査報告】