▶ ウィスコンシン アルムニ リサーチ ファンデイションの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-11-27
(54)【発明の名称】併用免疫療法のためのモジュール式デンドロンミセル
(51)【国際特許分類】
A61K 47/60 20170101AFI20231117BHJP
A61K 47/10 20170101ALI20231117BHJP
A61K 47/34 20170101ALI20231117BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20231117BHJP
A61K 9/51 20060101ALI20231117BHJP
A61K 45/06 20060101ALI20231117BHJP
A61K 9/107 20060101ALI20231117BHJP
A61K 38/17 20060101ALI20231117BHJP
A61K 31/337 20060101ALI20231117BHJP
【ＦＩ】
A61K47/60
A61K47/10
A61K47/34
A61P35/00
A61K9/51
A61K45/06
A61K9/107
A61K38/17
A61K31/337 ZNA
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023524322
(86)(22)【出願日】2021-10-26
(85)【翻訳文提出日】2023-06-16
(86)【国際出願番号】 US2021056547
(87)【国際公開番号】W WO2022093744
(87)【国際公開日】2022-05-05
(31)【優先権主張番号】63/106,070
(32)【優先日】2020-10-27
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】506097988
【氏名又は名称】ウィスコンシン アルムニ リサーチ ファンデイション
(74)【代理人】
【識別番号】110002217
【氏名又は名称】弁理士法人矢野内外国特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】ホン，センピョ
(72)【発明者】
【氏名】ウィーラー，デリク エル．
【テーマコード（参考）】
4C076
4C084
4C086
【Ｆターム（参考）】
4C076AA65
4C076AA95
4C076BB01
4C076BB11
4C076BB24
4C076BB31
4C076CC27
4C076EE24
4C076EE59
4C076FF70
4C084AA02
4C084AA03
4C084AA24
4C084BA44
4C084MA05
4C084MA16
4C084MA27
4C084MA34
4C084MA52
4C084MA55
4C084MA58
4C084MA63
4C084MA66
4C084NA13
4C084ZB261
4C086AA01
4C086AA02
4C086BA02
4C086MA03
4C086MA04
4C086MA05
4C086NA13
4C086ZB26
(57)【要約】
自己集合型免疫療法用デンドロンミセルは、第１の両親媒性デンドロンコイルと、第２の両親媒性デンドロンコイルと、第３の両親媒性デンドロンコイルとを含む。第１及び第２の両親媒性デンドロンコイルは、それにコンジュゲートされた免疫療法用ペプチドを有する。デンドロンミセルを含有する医薬組成物、デンドロンミセルを作製する方法、及びそれを必要とする対象にデンドロンミセルを投与することを含む免疫療法の方法も含まれる。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
自己集合型免疫療法用デンドロンミセルであって、第１の両親媒性デンドロンコイルと、第２の両親媒性デンドロンコイルと、第３の両親媒性デンドロンコイルと、を含み、
前記第１の両親媒性デンドロンコイルは、第１のポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）部分に共有結合した第１のポリエステルデンドロンに共有結合した第１の非ペプチジル疎水性コア形成成分を含み、前記第１のＰＥＧ部分は第１のコンジュゲート化免疫療法用ペプチドを含み、
前記第２の両親媒性デンドロンコイルは、第２のポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）部分に共有結合した第２のポリエステルデンドロンに共有結合した第２の非ペプチジル疎水性コア形成成分を含み、前記第２のＰＥＧ部分は第２のコンジュゲート化免疫療法用ペプチドを含み、
前記第３の両親媒性デンドロンコイルは、第３のポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）部分に共有結合した第３のポリエステルデンドロンに共有結合した第３の非ペプチジル疎水性コア形成成分を含み、前記第３のＰＥＧ部分はコンジュゲート化免疫療法用ペプチドを含まない、自己集合型免疫療法用デンドロンミセル。
【請求項2】
カプセル化された化学療法薬、抗炎症薬、又は放射線増感分子を更に含む、請求項１に記載の自己集合型免疫療法用デンドロンミセル。
【請求項3】
第４のポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）部分に共有結合した第４のポリエステルデンドロンに共有結合した第４の非ペプチジル疎水性コア形成成分を含む第４の両親媒性デンドロンコイルを更に含み、前記第４のＰＥＧ部分は、第３のコンジュゲート化免疫療法用ペプチド、イメージング造影剤又は化学療法薬を含む、請求項１又は２に記載の自己集合型免疫療法用デンドロンミセル。
【請求項4】
前記第１のコンジュゲート化免疫療法用ペプチドは第１の細胞発現受容体に結合し、前記第２のコンジュゲート化免疫療法用ペプチドは第２の細胞発現受容体に結合し、前記第１及び第２の細胞発現受容体は前記免疫療法用デンドロンミセルに対する同じ又は異なるタイプの標的細胞上にある、請求項１～３のいずれか一項に記載の自己集合型免疫療法用デンドロンミセル。
【請求項5】
前記第１及び第２の細胞発現受容体は、免疫チェックポイント受容体、成長因子受容体、細胞表面受容体、及び細胞内受容体から選択される、請求項１～４のいずれか一項に記載の自己集合型免疫療法用デンドロンミセル。
【請求項6】
前記第１の細胞発現受容体は免疫チェックポイント受容体であり、前記第２の細胞発現受容体は増殖因子受容体である、請求項１～５のいずれか一項に記載の自己集合型免疫療法用デンドロンミセル。
【請求項7】
前記免疫チェックポイント受容体は、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－１、ＯＸ４０、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ－４、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＣＤ２８、又はＣＤ２７を含む、請求項４～６のいずれか一項に記載の自己集合型免疫療法用デンドロンミセル。
【請求項8】
前記成長因子受容体は、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、インスリン様成長因子受容体（ＩＧＦＲ）、トランスフォーミング成長因子ベータ受容体（ＴＧＦ－βＲ）、ヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）、血管内皮成長因子受容体（ＶＥＧＦＲ）、血小板由来成長因子受容体（ＰＤＧＦＲ）、又は線維芽細胞成長因子受容体（ＦＧＦＲ）を含む、請求項４～６のいずれか一項に記載の自己集合型免疫療法用デンドロンミセル。
【請求項9】
前記第１及び第２の非ペプチジル疎水性コア形成成分は、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）、ポリ（グリコール酸）（ＰＧＡ）及びポリ（乳酸－ｃｏ－グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、具体的にはポリ（ε－カプロラクトン）から選択される、請求項１～８のいずれか一項に記載の自己集合型免疫療法用デンドロンミセル。
【請求項10】
前記第１及び第２の非ペプチジル疎水性コア形成成分は、０．５ｋＤａ～約２０ｋＤａの分子量を有し、前記第１及び第２の非ペプチジル疎水性コア形成成分の分子量は、同じであるか、又は異なり、好ましくは異なる、請求項１～９のいずれか一項に記載の自己集合型免疫療法用デンドロンミセル。
【請求項11】
前記第１及び第２のポリエステルデンドロンは、アセチレン又はカルボキシレートコアを有する第３世代～第５世代のデンドロン、具体的には第３世代のポリエステル－８－ヒドロキシル－１－アセチレンビス－ＭＰＡデンドロンを含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の自己集合型免疫療法用デンドロンミセル。
【請求項12】
前記第１及び第２のＰＥＧ部分は、独立して、メトキシＰＥＧ（ｍＰＥＧ）部分、アミン末端ＰＥＧ（ＰＥＧ－ＮＨ２）部分、アセチル化ＰＥＧ（ＰＥＧ－Ａｃ）部分、カルボキシル化ＰＥＧ（ＰＥＧ－ＣＯＯＨ）部分、チオール末端ＰＥＧ（ＰＥＧ－ＳＨ）部分、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド活性化ＰＥＧ（ＰＥＧ－ＮＨＳ）部分、ＮＨ２－ＰＥＧ－ＮＨ２部分又はＮＨ２－ＰＥＧ－ＣＯＯＨ部分を含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載の自己集合型免疫療法用デンドロンミセル。
【請求項13】
前記第１及び第２のＰＥＧ部分はそれぞれ、約０．２ｋＤａ～約５ｋＤａの分子量を有する、請求項１～１２のいずれか一項に記載の自己集合型免疫療法用デンドロンミセル。
【請求項14】
癌細胞結合リガンド（例えば、葉酸、黄体形成ホルモン放出ホルモン、レチノイド、トランスフェリン、ＲＧＤペプチド、ハーセプチン、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）標的化アプタマー、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、レクチン又は抗体）等のリガンド、又はイメージング剤、又は放射線増感分子を更に含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載の自己集合型免疫療法用デンドロンミセル。
【請求項15】
請求項１～１４のいずれか一項に記載の自己集合型免疫療法用デンドロンミセルと、薬学的に許容され得る賦形剤とを含む、医薬組成物。
【請求項16】
自己集合型免疫療法用デンドロンミセルを作製する方法であって、第１の非ペプチジル疎水性コア形成成分を第１のポリエステルデンドロンに共有結合させ、前記第１のポリエステルデンドロンを第１のポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）部分に共有結合させ、第１の治療用ペプチドを前記第１のＰＥＧ部分にコンジュゲートさせることによって、第１の両親媒性デンドロンコイルを合成することと、
第２の非ペプチジル疎水性コア形成成分を第２のポリエステルデンドロンに共有結合させ、前記第２のポリエステルデンドロンを第２のポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）部分に共有結合させ、第２の治療用ペプチドを前記第２のＰＥＧ部分にコンジュゲートさせることによって、第２の両親媒性デンドロンコイルを合成することと、
第３の非ペプチジル疎水性コア形成成分を第３のポリエステルデンドロンに共有結合させ、前記第３のポリエステルデンドロンを第３のポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）部分に共有結合させることによって、第３の両親媒性デンドロンコイルを合成することであって、前記第３のＰＥＧ部分が、コンジュゲート化免疫療法用ペプチドを含まない、合成することと、
前記自己集合型免疫療法用デンドロンミセルの自己集合のための条件下で、前記第１の両親媒性デンドロンコイル、前記第２の両親媒性デンドロンコイル、及び任意に、前記第３の両親媒性デンドロンコイルをインキュベートすることと、を含む、方法。
【請求項17】
前記第１及び第２の両親媒性デンドロンコイルは、５～８０ｗｔ％の前記自己集合型免疫療法用デンドロンミセルを含み、前記第３の両親媒性デンドロンコイルは、２０～９５ｗｔ％の前記自己集合型免疫療法用デンドロンミセルを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項18】
免疫療法の方法であって、治療有効量の請求項１～１４のいずれか一項に記載の自己集合型免疫療法用デンドロンミセルを、それを必要とする対象に投与することを含む、方法。
【請求項19】
前記対象は癌の治療を必要としており、前記癌はトリプルネガティブ乳癌、頭頸部扁平上皮癌、黒色腫、結腸直腸癌、前立腺癌、腎細癌、又は膀胱癌である、請求項１８に記載の方法。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
［関連出願の相互参照］
本出願は、２０２０年１０月２７日に出願された米国仮出願第６３／１０６，０７０号の優先権を主張し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本開示は、併用免疫療法のための薬物送達システムに関する。
本出願は、２０２０年１０月２７日に出願された米国仮出願第６３／１０６，０７０号の優先権を主張し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本開示は、併用免疫療法のための薬物送達システムに関する。
【背景技術】
【0002】
乳癌は、米国人女性の中で最も一般的に診断される癌であり（毎年２６０，０００例超）、米国では癌による死亡の主な原因の一つである（年間４０，０００例超）。特に、トリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）は、全乳癌のおよそ１０～１５％を占め、これは典型的には、乳癌の他のサブタイプよりも不良な臨床転帰に関連する。パクリタキセルは、ＴＮＢＣに対して一般的に使用されるアジュバント化学療法薬の１つであり、腫瘍細胞上に発現されるプログラム死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）等の免疫チェックポイントを標的とする新たに登場した免疫療法は、臨床試験において有望な結果を示している。しかしながら、両方の治療の主な障害は、腫瘍細胞に対する特異性が欠如しているか、又は良くても制限されており、望ましくない副作用を引き起こすことである。
【0003】
頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）は、世界中で６番目に多い一般的な癌であり、毎年６００，０００を超える新規症例が診断される。ＨＮＳＣＣ患者のため標準治療の処置には、手術、放射線及び化学療法が含まれる。さらに、抗上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）モノクローナル抗体セツキシマブ（ＣＴＸ）は、これらの治療様式と組み合わせて使用されることが多く、新たに登場したプログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ１）／ＰＤリガンド１（ＰＤ－Ｌ１）チェックポイント阻害剤であるニボルマブ及びペンブロリズマブは、転移状況において現在承認されている。これらの治療薬による臨床的応答にもかかわらず、これらの治療を標的細胞に適切に送達することは依然として課題である。
【0004】
必要とされているのは、ＴＮＢＣ及びＨＮＳＣＣ等の癌を治療するための化学療法剤を送達する新規な方法及び組み合わせである。
【発明の概要】
【0005】
或る態様では、自己集合型免疫療法用デンドロンミセルは、第１の両親媒性デンドロンコイルと、第２の両親媒性デンドロンコイルと、第３の両親媒性デンドロンコイルとを含み、第１の両親媒性デンドロンコイルは、第１のポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）部分に共有結合した第１のポリエステルデンドロンに共有結合した第１の非ペプチジル疎水性コア形成成分を含み、第１のＰＥＧ部分は第１のコンジュゲート化免疫療法用ペプチドを含み、第２の両親媒性デンドロンコイルは、第２のポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）部分に共有結合した第２のポリエステルデンドロンに共有結合した第２の非ペプチジル疎水性コア形成成分を含み、第２のＰＥＧ部分は第２のコンジュゲート化免疫療法用ペプチドを含み、第３の両親媒性デンドロンコイルは、第３のポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）部分に共有結合した第３のポリエステルデンドロンに共有結合した第３の非ペプチジル疎水性コア形成成分を含み、第３のＰＥＧ部分はコンジュゲート化免疫療法用ペプチドを含まない。
【0006】
別の態様では、医薬組成物は、上記の自己集合型免疫療法用デンドロンミセルを含む。
【0007】
治療有効量の上記の自己集合型免疫療法用デンドロンミセルを投与することを含む免疫療法方法も含まれる。
【0008】
別の態様では、自己集合型免疫療法用デンドロンミセルを作製する方法は、第１の非ペプチジル疎水性コア形成成分を第１のポリエステルデンドロンに共有結合させ、第１のポリエステルデンドロンを第１のポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）部分に共有結合させ、第１の治療用ペプチドを第１のＰＥＧ部分にコンジュゲートさせることによって、第１の両親媒性デンドロンコイルを合成することと、第２の非ペプチジル疎水性コア形成成分を第２のポリエステルデンドロンに共有結合させ、第２のポリエステルデンドロンを第２のポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）部分に共有結合させ、第２の治療用ペプチドを第２のＰＥＧ部分にコンジュゲートさせることによって、第２の両親媒性デンドロンコイルを合成することと、第３の非ペプチジル疎水性コア形成成分を第３のポリエステルデンドロンに共有結合させ、第３のポリエステルデンドロンを第３のポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）部分に共有結合させることによって、第３の両親媒性デンドロンコイルを合成することであって、第３のＰＥＧ部分が、コンジュゲート化免疫療法用ペプチドを含まない、合成することと、自己集合型免疫療法用デンドロンミセルの自己集合のための条件下で、第１の両親媒性デンドロンコイル、第２の両親媒性デンドロンコイル、及び第３の両親媒性デンドロンコイルをインキュベートすること、とを含む。
【図面の簡単な説明】
【0009】
【0010】
【0011】
【0012】
【0013】
【0014】
【0015】
【0016】
【0017】
【0018】
【0019】
【図11A】図１１Ａ～図１１Ｃは、ペプチド及び抗体を比較する様々なアッセイ結果を示す。１１Ａ）デンドリマー－ｐＰＤ－１（Ｇ７－βＨ２＿ｍｔ）、遊離ａＰＤＬ１及び遊離ｐＰＤ－１（βＨ２＿ｍｔ）のＳＰＲセンソグラム。デンドリマー－ペプチドコンジュゲートは、遊離ペプチドよりも５桁強い全抗体（ａＰＤ－Ｌ１）に匹敵するＫＤを示す。
【図11B】１１Ｂ）高ＰＤ－Ｌ１発現７８６Ｏ細胞との特異的相互作用を示すデンドリマー－ペプチドコンジュゲート（下の画像）。
【図11C】１１Ｃ）ａＥＧＦＲ、ＥＧ１、ＥＧ２及びＥＧ１／２混合物で固定化した表面からの細胞保持アッセイ。ＥＧ１／２混合物は、ａＥＧＦＲの細胞保持と同等の細胞保持を示すことに留意されたい。
【0020】
【0021】
【0022】
【0023】
【0024】
上記及び他の特徴は、以下の詳細な説明、図面、及び添付の特許請求の範囲から当業者によって正しく認識され、理解されるであろう。
【発明を実施するための形態】
【0025】
本明細書に記載されるのは、２つ以上の免疫療法用ペプチド、及び任意に化学療法薬又は抗炎症薬等の薬物を組み込む併用送達系である。癌細胞に特異的ではない治療からの副作用を考慮すると、例えば、癌標的化、免疫療法、及び化学療法を統合することができる薬物送達システムは、治療有効性を実質的に高めるための有望なアプローチである。この必要性に対処するために、本明細書に記載のモジュール式送達システムは、毒性のバイスタンダー効果を最小限に抑えながら治療有効性を最大にするために、免疫療法薬及び化学療法薬を癌細胞に特異的に運ぶことができる。この目的を実現するために、本明細書に記載のナノ粒子系は、治療用ペプチド（腫瘍細胞及び／又は免疫細胞に選択的なペプチド）及び任意に薬物カーゴ（腫瘍及び／又は化学療法薬に対して免疫系をブーストする薬剤）を含む。ナノ粒子系は、超分岐デンドロン、線形疎水性ポリマー、及びポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）コロナに基づく。
【0026】
トリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）は、全乳癌のおよそ１０～１５％を占め、これは典型的には、乳癌の他のサブタイプよりも不良な臨床転帰に関連する。パクリタキセルは、ＴＮＢＣに対して一般的に使用されるアジュバント化学療法薬の１つであり、腫瘍細胞上に発現されるプログラム死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）等の免疫チェックポイントを標的とする新たに登場した免疫療法は、臨床試験において有望な結果を示している。さらに、ＴＮＢＣの大部分によって過剰発現される上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）は、ナノキャリアを使用したそのような治療薬の特異的送達のための特有の機会となる。しかしながら、ＥＧＦＲ標的化、ＰＤ－Ｌ１阻害、及び化学療法の統合は依然として解明されていない。これに対処するために、ＥＧＦＲ及びＰＤ－Ｌ１過剰発現ＴＮＢＣ細胞を二重特異的に標的化することによって化学療法剤及び免疫療法剤を同時に送達するための新規なナノスケール送達系が本明細書に記載される。
【0027】
頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）は、世界中で６番目に多い一般的な癌であり、毎年６００，０００を超える新規症例が診断される。抗上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）モノクローナル抗体セツキシマブ（ＣＴＸ）は、従来の治療様式（化学療法薬）と組み合わせて使用されることが多く、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１チェックポイント阻害剤ニボルマブ等の新たに登場した免疫療法は、転移状況において現在承認されている。これらの治療薬による臨床的応答にもかかわらず、ＨＮＳＣＣを有効に治療することは依然として困難である。これらの治療選択肢を相乗的に利用するために、ＥＧＦＲ及びＰＤ－Ｌ１過剰発現ＨＮＳＣＣ細胞を二重特異的に標的化することによって化学療法剤及び免疫療法剤を同時に送達するためのナノスケール送達系が本明細書に記載される。複数の薬剤の容易な統合は、ミックスアンドマッチアプローチによって多官能化することができるデンドロンミセル（ＤＭ）によって達成される。
【0028】
具体的には、本明細書では、ミックスアンドマッチアプローチを介してモジュール式多官能化することができるデンドロンミセル（ＤＭ）を介した複数の薬剤の容易な統合について説明する。提案されたＤＭ系は、ＰＥＧ化デンドロンコポリマー（例えば、ＰＥＧ－ポリエステルデンドロンポリ－ｅ－カプロラクトン、又はＰＤＣ）の自己集合によって調製される。ＰＥＧ化デンドロンコポリマーは、疎水性コアに封入された任意の化学療法薬（例えば、パクリタキセル又はドセタキセル）と共に、ｉ）ＰＤ－１模倣ペプチド（ｐＰＤ－１）及び／又はｉｉ）ＥＧＦ模倣ペプチド（ＥＧ１及びＥＧ２）等の治療用ペプチドとコンジュゲートされる。ナノスケール送達系は、ＥＧＦＲ及びＰＤ－Ｌ１過剰発現ＴＮＢＣ細胞を非常に特異的な様式で二重特異的に標的化することによって、化学療法剤及び免疫療法剤を同時に送達することができる。
【0029】
クリックケミストリーによって合成されたデンドロンミセルの調製、並びに多官能性デンドロンミセルの提案される標的化及び治療作用を図１及び図２に示す。第１に、デンドロンによって課される事前に組織化された円錐構造は、最小限の（プリペイド）エントロピーコストのために、優れた熱力学的安定性を有する自己集合を可能にする。第２に、デンドロンの超分岐構造は、標的化リガンドの結合速度論を劇的に改善する多価結合効果を促進する（例えば、対応する抗体の結合強度のレベル（又はそれより高いレベル）までのペプチド）。第３に、高密度ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）外層は、より長い血漿循環のための最大ステルス効果、並びに細胞相互作用に対するＰＥＧ配置効果に対するモジュール式制御を提供する。最後に、生分解性生体適合性ポリマー成分（コア形成ポリ－カプロラクトン（ＰＣＬ）及びポリエステルデンドロン）は、ＤＭのコアにカプセル化された薬物分子の制御放出を可能にし、毒性の懸念を軽減する。ＤＭのこれらの特徴は、ミセル内に組み込まれた分子の官能性に直接影響する。熱力学的安定性は、注入時の循環中のＤＭの構造的完全性を改善する。多価結合は、ＥＧＦＲ結合ペプチド及びＰＤ－Ｌ１結合ペプチドの結合速度論を最大化し（図１（ｉ）及び（ｉｉ））、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との間の結合の標的化有効性及び阻害を実質的に増加させる。制御された生分解により、パクリタキセルを長期間にわたってゆっくりと放出させることができる（図２（ｉｉｉ））。
【0030】
有利には、治療用ペプチドを自己集合したデンドロンミセルに組み込むことによって、異なるペプチド間の空間的距離を維持することができ、これは細胞上の異なる標的への結合を促進し、それらの生物学的効果（例えば、疾患細胞に対する免疫療法の有効性又は特異性）を最大化する。
【0031】
２つ以上の化学的に異なる両親媒性デンドロンコイル（ＤＣ）を含む自己集合デンドロンミセルが本明細書に記載される。各両親媒性デンドロンコイルは、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）部分に共有結合したポリエステルデンドロンに共有結合した非ペプチジル疎水性コア形成成分を含む。デンドロンコイルの疎水性コア形成成分は非ペプチジルであり、すなわち、疎水性コア形成ブロックはペプチドではない。或る態様では、ＤＣのＰＥＧ部分は、β－ヘアピンペプチド等の治療用ペプチドにコンジュゲートされる。したがって、或る態様では、自己集合したデンドロンミセルの化学的に異なるＤＣの各々は、β－ヘアピンペプチド等の異なるコンジュゲート化治療用ペプチドを含む。
【0032】
或る態様では、自己集合型免疫療法用デンドロンミセルは、第１の両親媒性デンドロンコイルと、第２の両親媒性デンドロンコイルと、第３の両親媒性デンドロンコイルとを含み、第１の両親媒性デンドロンコイルは、第１のポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）部分に共有結合した第１のポリエステルデンドロンに共有結合した第１の非ペプチジル疎水性コア形成成分を含み、第１のＰＥＧ部分は第１のコンジュゲート化免疫療法用ペプチドを含み、第２の両親媒性デンドロンコイルは、第２のポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）部分に共有結合した第２のポリエステルデンドロンに共有結合した第２の非ペプチジル疎水性コア形成成分を含み、第２のＰＥＧ部分は第２のコンジュゲート化免疫療法用ペプチドを含み、第３の両親媒性デンドロンコイルは、第３のポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）部分に共有結合した第３のポリエステルデンドロンに共有結合した第３の非ペプチジル疎水性コア形成成分を含み、第３のＰＥＧ部分はコンジュゲート化免疫療法用ペプチドを含まない。
【0033】
或る態様では、第１及び第２の免疫療法用ペプチドは異なるペプチドであるが、同じ細胞標的に結合することができる。或る態様では、第１及び第２の免疫療法用ペプチドはそれぞれ、異なる細胞標的に結合する。
【0034】
或る態様では、第３の両親媒性デンドロンコイルは、本明細書に記載の薬物、リガンド又は標識を含むことができる。
【0035】
或る態様では、免疫療法用ペプチドを含む第１及び第２の両親媒性デンドロンコイルは、５～８０ｗｔ％の自己集合型免疫療法用デンドロンミセルを含み、一方、第３の両親媒性デンドロンコイルは、２０～９５ｗｔ％の自己集合型免疫療法性デンドロンミセルを含む。コンジュゲートペプチドを含まない第３の両親媒性デンドロンコイルは、ミセルの基底構造を提供し、ミセルの有効性を改善し得る免疫療法用ペプチド間の間隔を提供する。
【0036】
或る態様では、自己集合型免疫療法用デンドロンミセルは、第４のポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）部分に共有結合した第４のポリエステルデンドロンに共有結合した第４の非ペプチジル疎水性コア形成成分を含む第４の両親媒性デンドロンコイルを更に含み、第４のＰＥＧ部分は、第３のコンジュゲート化免疫療法用ペプチド、イメージング造影剤、又は化学療法薬若しくは免疫療法薬を含む。
【0037】
ＤＣの例示的な非ペプチジル疎水性コア形成成分は、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）、ポリ（グリコール酸）（ＰＧＡ）、ポリ（乳酸－ｃｏ－グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、又はそれらの組み合わせを含む。或る態様では、非ペプチジル疎水性コア形成成分は、ポリ（ε－カプロラクトン）等のＰＣＬである。或る態様では、非ペプチジル疎水性コア形成成分は、約０．５ｋＤａ～約２０ｋＤａの分子量を有する。特定の態様では、非ペプチジル疎水性コア形成成分は、約３．５ｋＤａの分子量を有するポリ（ε－カプロラクトン）又は１４ｋＤａの分子量を有するポリ（ε－カプロラクトン）である。
【0038】
両親媒性デンドロンコイルの例示的なポリエステルデンドロンは、アセチレン又はカルボキシレートコアのいずれかを有するポリエステルデンドロンを含む第３世代～第５世代［すなわち、第３世代（Ｇ３）、第４世代（Ｇ４）又は第５世代（Ｇ５）］のポリエステルデンドロンが挙げられるが、これらに限定されない。特定の態様では、ポリエステルデンドロンは、第３世代ポリエステル－８－ヒドロキシル－１－アセチレンビス－ＭＰＡデンドロンである。デンドロンを調製及び特性評価する方法は当技術分野で周知であり、様々なポリエステルデンドロンを商業的実体から購入してもよい。
【0039】
両親媒性デンドロンコイルの例示的なＰＥＧ部分には、メトキシＰＥＧ（ｍＰＥＧ）部分、アミン末端ＰＥＧ（ＰＥＧ－ＮＨ２）部分、アセチル化ＰＥＧ（ＰＥＧ－Ａｃ）部分、カルボキシル化ＰＥＧ（ＰＥＧ－ＣＯＯＨ）部分、チオール末端ＰＥＧ（ＰＥＧ－ＳＨ）部分、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド活性化ＰＥＧ（ＰＥＧ－ＮＨＳ）部分、ＮＨ２－ＰＥＧ－ＮＨ２部分及びＮＨ２－ＰＥＧ－ＣＯＯＨ部分が含まれる。或る態様では、ＰＥＧ部分は、それだけに限らないが、約０．２ｋＤａ～約５ｋＤａの分子量を含む分子量を有する。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ部分は、約２ｋＤａの分子量を有するｍＰＥＧ部分である。特定の態様では、ＰＥＧ部分は、約５ｋＤａの分子量を有するｍＰＥＧ部分である。
【0040】
或る態様では、第１のコンジュゲート化免疫療法用ペプチドが第１の細胞発現受容体に結合し、第２のコンジュゲート化免疫療法用ペプチドが第２の細胞発現受容体に結合し、第１及び第２の細胞発現受容体が免疫療法用デンドロンミセルの同じ又は異なるタイプの標的細胞上にある。例えば、一方の治療用ペプチドはＴ細胞発現受容体を標的とすることができ、他方の治療用ペプチドは腫瘍細胞発現受容体を標的とすることができる。
【0041】
或る態様では、治療用ペプチドは、免疫チェックポイント受容体、成長因子受容体、細胞表面受容体、細胞内受容体、又は細胞外マトリックスに対して高い親和性を有するペプチドを含む。
【0042】
例示的な免疫チェックポイント受容体には、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－１、ＯＸ４０、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ－４、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＣＤ２８及びＣＤ２７が含まれる。
【0043】
免疫チェックポイント阻害剤β－ヘアピンペプチドは、免疫チェックポイント受容体表面と高い親和性で相互作用する免疫チェックポイント阻害剤リガンドペプチド、例えば表面ペプチドを同定することによって同定することができる。例えば、ＰＤ－Ｌ１と高親和性で相互作用する表面β－ヘアピンＰＤ－１ペプチドが本明細書において同定されている。本明細書で使用される場合、高親和性は、０．１～１，０００ｎＭのＫＤを意味する。そのようなペプチドは、５～５０アミノ酸長を有することができ、免疫チェックポイント阻害剤全体に対応しない。
【0044】
例示的なβ－ヘアピンＰＤ－１ペプチドには、以下が含まれる：
配列番号１：ＴＹＬＣＧＡＩＳＬＡＰＫＬＱＩＫＥＳＬＲＡ（βＨ１－ｗｔ配列）
配列番号２：ＴＹＶＣＧＶＩＳＬＡＰＲＩＱＩＫＥＳＬＲＡ（βＨ１－変異体配列）
配列番号３：ＶＬＮＷＹＲＭＳＰＳＮＱＴＤＲＫＡＡ（βＨ２－ｗｔ配列）
配列番号４：ＨＶＶＷＨＲＥＳＰＳＧＱＴＤＴＫＡＡ（βＨ２変異体配列）
配列番号１：ＴＹＬＣＧＡＩＳＬＡＰＫＬＱＩＫＥＳＬＲＡ（βＨ１－ｗｔ配列）
配列番号２：ＴＹＶＣＧＶＩＳＬＡＰＲＩＱＩＫＥＳＬＲＡ（βＨ１－変異体配列）
配列番号３：ＶＬＮＷＹＲＭＳＰＳＮＱＴＤＲＫＡＡ（βＨ２－ｗｔ配列）
配列番号４：ＨＶＶＷＨＲＥＳＰＳＧＱＴＤＴＫＡＡ（βＨ２変異体配列）
【0045】
或る態様では、治療用ペプチドは成長因子受容体に結合する。例示的な成長因子受容体としては、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、インスリン様成長因子受容体（ＩＧＦＲ）、トランスフォーミング成長因子β受容体（ＴＧＦ－βＲ）、ヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）、血管内皮成長因子受容体（ＶＥＧＦＲ）、血小板由来成長因子受容体（ＰＤＧＦＲ）、及び線維芽細胞成長因子受容体（ＦＧＦＲ）が挙げられる。
【0046】
上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）ファミリーは、細胞表面に発現し、チロシンキナーゼ活性を示す４つの受容体タンパク質、すなわちＥｒｂＢ－１／ＥＧＦＲ－１～－４（ＨＥＲ１～４とも呼ばれる）を包含する。これらのタンパク質は類似の構造を有し、３つのドメイン、すなわち、リガンド結合部位を有する細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及びキナーゼ活性を有する細胞内ドメインで構成される。
【0047】
インスリン様成長因子受容体（ＩＧＦＲ）ファミリーは、２つの細胞膜受容体、ＩＧＦ１Ｒ及びＩＧＦ２Ｒからなる。ＩＧＦ１Ｒ（インスリン受容体［ＩＲ］とヘテロ二量体も形成する）は、より高い親和性でインスリン様成長因子１（ＩＧＦ１）に結合し、比較的低い親和性でＩＧＦ２に結合して、胎児及び出生後の発達に必要な成長シグナルを誘発する。
【0048】
トランスフォーミング成長因子－ベータ受容体（ＴＧＦ－βＲ）ファミリーは、多様なタイプの細胞で発現され、ＴＧＦ－βリガンド結合時に伝達されるシグナルによって異なる細胞機能を調節する３つの膜受容体（ＴβＲＩ、ＴβＲＩＩ及びＴβＲＩＩＩ）を含む。
【0049】
ヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）受容体は、いくつかのヒト癌の病因において中心的な役割を果たす。それらは、複数のシグナル伝達経路を介して細胞増殖、生存及び分化を調節し、細胞増殖及び分化に関与する。ファミリーは、４つの主要メンバー：ＨＥＲ－１、ＨＥＲ－２、ＨＥＲ－３、及びＨＥＲ－４で構成され、ＥｒｂＢ１、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、及びＥｒｂＢ４とも呼ばれる。
【0050】
血管内皮増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）ファミリーは、主に内皮細胞上に発現される３つの膜受容体（ＶＥＧＦＲ １～３）と、少数の追加の細胞型とからなる。ＶＥＧＦＲは、細胞外部位に７つの免疫グロブリン（Ｉｇ）様ドメインを有し、細胞内部位に２つの分割チロシンキナーゼドメインを有する一回貫通タンパクである。
【0051】
血小板由来成長因子受容体（ＰＤＧＦＲ）ファミリーは、２つの異なる遺伝子によってコードされ、異なる細胞型の膜上に発現される２つの受容体（ＰＤＧＦＲ－α及びβ）を含む。これらの一本鎖受容体タンパク質は、５つのＩｇ様細胞外ドメインと、チロシンキナーゼドメインとを有する。
【0052】
線維芽細胞増殖因子受容体（ＦＧＦＲ）ファミリーは、４つの密接に関連する膜貫通タンパク質（ＦＧＦＲ１～４）と、ＦＧＦＲ ｍＲＮＡの差次的スプライシングによりリガンド特異性が変化したそれらの異なるアイソフォームとからなる。これらの一本鎖受容体は、リガンド結合能を有する３つの免疫グロブリンリピート（Ｉｇ Ｉ～ＩＩＩ）を有する１つの細胞外ドメイン、１つの膜貫通ドメイン及びカルボキシ末端にキナーゼ活性を有する１つの細胞内ドメインを含む。
【0053】
細胞表面受容体に結合する腫瘍標的化ペプチドである例示的な治療用ペプチドには、ＲＧＤ結合モチーフを有するαｖβ３インテグリン、並びに結腸、肝臓、卵巣、膵臓及び扁平上皮の癌細胞の表面に発現されるαｖβ６インテグリン等のインテグリンに結合するペプチドが含まれる。腫瘍標的化ペプチドの更なる標的としては、アミノペプチダーゼＮ、ペプチドトランスポーター１、上皮成長因子受容体、前立腺特異的膜抗原、ムチン１、ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子受容体、胃放出ペプチド受容体、ソマトスタチン受容体、コレシストキニン受容体、ニューロテンシン受容体、トランスフェリン受容体、血管内皮成長因子受容体、インスリン、エフリン受容体等が挙げられる。
【0054】
細胞内受容体に結合する治療用ペプチドには、ＢＣＲ／ＡＢＬ、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）の慢性期を担う病原性融合タンパク質、サイクリンＡ、ＣＤＫ、ミトコンドリア等に結合するペプチドが含まれる。
【0055】
細胞外マトリックスを標的とする治療用ペプチドには、フィブロネクチン、線維芽細胞増殖因子、マトリックスメタロプロテイナーゼ、前立腺特異的抗原、カテプシン（ｃａｔｈｅｐｓｉｓ）等に結合するペプチドが含まれる。
【0056】
或る態様では、ミセルは、１つ以上の薬物をカプセル化するか、又は言い換えれば、１つ以上の薬物が充填される。薬物には、化学療法剤とも呼ばれる癌薬物（すなわち、癌を治療するために使用される薬物）が含まれる。いくつかの実施形態では、薬物は、インドメタシンを含むがこれに限定されない抗炎症薬である。
【0057】
「薬物」は、治療有効量で患者（ヒト又は他の動物を含むが、これらに限定されない）に投与すると、患者に治療上の利益を提供する化合物である。
【0058】
或る態様では、治療剤は化学療法剤である。化学療法剤としては、以下のクラスが含まれるが、これらに限定されない：アルキル化剤、代謝拮抗物質、アントラサイクリン、植物アルカロイド、トポイソメラーゼ阻害剤、モノクローナル抗体、及び他の抗腫瘍剤。上記の化学療法薬、すなわちドキソルビシン、パクリタキセルに加えて、他の適切な化学療法薬としては、チロシンキナーゼ阻害剤メシル酸イマチニブ（Ｇｌｅｅｖｅ（登録商標）又はＧｌｉｖｅｃ（登録商標））、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、メクロエタミン、シクロホスファミド、クロラムブシル、アザチオプリン、メルカプトプリン、ピリミジン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビノレルビン、ビンデシン、ポドフィロトキシン（Ｌ０１ＣＢ）、エトポシド、ドセタキセル、トポイソメラーゼ阻害剤（Ｌ０１ＣＢ及びＬ０１ＸＸ）イリノテカン、トポテカン、アムサクリン、エトポシド、リン酸エトポシド、テニポシド、ダクチノマイシン、ロニダミン、及びモノクローナル抗体、とりわけ、例えばトラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標））、セツキシマブ、ベバシズマブ及びリツキシマブ（Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標））が挙げられる。
【0059】
ミセル中に存在する薬物の量は、広範囲にわたって変化し得る。薬物は、ミセルの総質量（ここで、薬物の質量はミセルの総質量に含まれる）の約１％～約３０％（重量／重量）であり得る。いくつかの態様では、薬物は、ミセルの総質量（同じ基準）の約２％～約２５％ｗ／ｗであり得る。いくつかの態様では、薬物は、ミセルの総質量（同じ基準）の約３％～約２０％ｗ／ｗであり得る。
【0060】
或る態様では、ミセルは、１つ以上のＰＥＧ部分にコンジュゲートした１つ以上のリガンドを更に含む。例示的なリガンドは、葉酸である。
【0061】
「リガンド」という用語は、特定の標的器官、組織又は細胞に対して結合選択性を示す化合物を指す。或る態様では、リガンドは癌細胞に結合する。リガンドの一例はビタミンである葉酸（ＦＡ）であり、これはヒト卵巣癌のおよそ９０％で過剰発現される葉酸受容体に結合する。黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）は、別の例示的なリガンドである。ＬＨＲＨは比較的小分子（ＭＷ １，１８２Ｄａ）であり、受容体は乳癌細胞、卵巣癌細胞及び前立腺癌細胞によって過剰発現される。別の例示的なリガンドは、レチノイド、例えばレチノール、レチナール、レチノイン酸、レチノイド、又はそれらの誘導体若しくは類縁体である。更なるリガンドとしては、トランスフェリン、ＲＧＤペプチド、ハーセプチン、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）標的化アプタマー、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）等が挙げられるが、これらに限定されない。他のリガンドとしては、様々な抗体、例えば、抗ＣＤ１９、抗ＣＤ２０、抗ＣＤ２４、抗ＣＤ３３、抗ＣＤ４４、ルイスＹ抗体、シアリルルイスＸ抗体、ＬＦＡ－１抗体、リツキシマブ、ベバシズマブ、抗ＶＥＧＦ ｍＡｂ、及びそれらの断片、二量体、及び他の修飾形態が挙げられる。他の態様では、リガンドは免疫細胞を標的とする。免疫細胞を標的化するために、リガンドは、例えばＴ細胞表面受容体のリガンドであり得る。レクチンを、ムチン及び粘膜細胞層を標的とするリガンドとして使用することができる。レクチンには、トウアズキ（Ａｂｒｕｓ ｐｒｅｃａｔｒｏｉｕｓ）、ツクリタケ（Ａｇａｒｉｃｕｓ ｂｉｓｐｏｒｕｓ）、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）、トマト（Ｌｙｓｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）、マイコプラズマ・ガリセプティクム（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ）、及びナジャ・モザンビーク（Ｎａｊａ ｍｏｃａｍｂｉｑｕｅ）から単離されたもの、並びにコンカナバリンＡ及びスクシニル－コンカナバリンＡ等のレクチンが含まれる。
【0062】
或る態様では、リガンドは、特定の標的器官、組織又は細胞へのミセルの選択的送達を増加させる。標的器官には、例えば、肝臓、膵臓、腎臓、肺、食道、喉頭、骨髄及び脳が含まれ得る。いくつかの態様では、選択的送達の増加は、標的化剤を欠く他の点では同等の組成物のそれと比較して少なくとも約２倍であり得る。いくつかの態様では、標的器官、組織又は細胞へのリガンドを含有するミセルの送達は、リガンドを欠く他の点で同等の組成物の送達と比較して、少なくとも１０％又は２５％増加する。
【0063】
ミセル中に存在するリガンドの量は、広範囲にわたって変化し得る。いくつかの態様では、リガンドは、ミセルの総質量（リガンドの質量はナノコアの総質量に含まれる）の約１％～約８０％（重量／重量）、具体的には約１０％～約５０％ｗ／ｗ、より具体的には約２０％～約４０％ｗ／ｗであり得る。
【0064】
態様では、リガンドは、ＰＥＧへの共有結合を介してミセルにコンジュゲートされ得る。当技術分野で公知の様々な機構（例えば縮合反応）を使用して、リガンドとＰＥＧとの間に共有結合を形成することができる。１つ以上のリガンドをＰＥＧに直接結合させるための更なる方法は、当技術分野において公知である。化学としては、チオエーテル、チオエステル、マレイミド（ｍａｌｉｍｉｄｅ）及びチオール、アミン－カルボキシル、アミン－アミン、及び有機化学マニュアルに列挙されているその他のものが挙げられるが、これらに限定されない。リガンドは、架橋試薬［例えば、グルタルアルデヒド（ＧＡＤ）、二官能性オキシラン（ＯＸＲ）、エチレングリコールジグリシジルエーテル（ＥＧＤＥ）、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、及び水溶性カルボジイミド、例えば１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）］を使用してＰＥＧに付着させることもできる。本明細書の組成物は、治療剤と足場及び／又は標的化剤と足場との間に少なくとも１つの加水分解性リンカーを更に有することができる。
【0065】
或る態様では、ミセルは、１つ以上のイメージング剤又は放射線増感分子を含むことができる。イメージング剤として潜在的に使用される常磁性イオンの非限定的な例としては、クロム（ＩＩＩ）、マンガン（ＩＩ）、鉄（ＩＩＩ）、鉄（ＩＩ）、コバルト（ＩＩ）、ニッケル（ＩＩ）、銅（ＩＩ）、ネオジム（ＩＩＩ）、サマリウム（ＩＩＩ）、イッテルビウム（ＩＩＩ）、ガドリニウム（ＩＩＩ）、バナジウム（ＩＩ）、テルビウム（ＩＩＩ）、ジスプロシウム（ＩＩＩ）、ホルミウム（ＩＩＩ）及びエルビウム（ＩＩＩ）が挙げられ、ガドリニウムが特に好ましい。Ｘ線撮像等の他の状況で有用なイオンとしては、ランタン（ＩＩＩ）、金（ＩＩＩ）、鉛（ＩＩ）、特にビスマス（ＩＩＩ）が挙げられるが、これらに限定されない。イメージング剤又は治療剤としての潜在的な使用の放射性同位体としては、アスタチン２１１、炭素１４、クロム５１、塩素３６、コバルト５７、コバルト５８、銅５２、銅６４、銅６７、フッ素１８、ガリウム６７、ガリウム６８、水素３、ヨウ素１２３、ヨウ素１２４、ヨウ素１２５、ヨウ素１３１、インジウム１１１、鉄５２、鉄５９、ルテチウム１７７、リン３２、リン３３、レニウム１８６、レニウム１８８、及びセレン７５、Ｉ１２５がいくつかの実施形態で使用され、インジウム１１１は、その低エネルギー及び長領域検出への適合性のためにいくつかの実施形態でも使用される。
【0066】
いくつかの態様では、イメージング剤は、発色基質と接触すると着色生成物を生成する二次結合リガンド又は酵素（酵素タグ）である。酵素の例としては、ウレアーゼ、アルカリホスファターゼ、（西洋ワサビペルオキシダーゼ）水素ペルオキシダーゼ、及びグルコースオキシダーゼが挙げられる。二次結合リガンドは、ビオチン及びアビジン又はストレプトアビジン化合物である。このような標識の使用は当技術分野で周知である。
【0067】
いくつかの態様では、イメージング剤は蛍光標識である。光検出可能な標識の非限定的な例としては、ＡＬＥＸＡ ＦＬＵＯＲ（登録商標）３５０、ＡＬＥＸＡ ＦＬＵＯＲ（登録商標）４３０、ＡＭＣＡ、アミノアクリジン、ＢＯＤＩＰＹ ６３０／６５０、ＢＯＤＩＰＹ ６５０／６６５、ＢＯＤＩＰＹ－ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹ－Ｒ６Ｇ、ＢＯＤＩＰＹ－ＴＭＲ、ＢＯＤＩＰＹ－ＴＲ、５－カルボキシ－４１，５’－ジクロロ－２１，７１－ジメトキシフルオレセイン、５－カルボキシ－２’，４’，５’，７’－テトラクロロフルオレセイン、５－カルボキシフルオレセイン、５－カルボキシローダミン、６－カルボキシローダミン、６－カルボキシテトラメチルアミノ、カスケードブルー、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ５、６－ＦＡ、塩化ダンシル、フルオレセイン、ＨＥＸ、６－ＪＯＥ、ＮＢＤ（７－ニトロベンゼン－２－オキサ－１，３－ジアゾール）、オレゴングリーン４８８、オレゴングリーン５００、オレゴングリーン５１４、パシフィックブルー、フタル酸、テレフタル酸、イソフタル酸、クレジルファーストバイオレット、クレジルブルーバイオレット、ブリリアントクレジルブルー、パラ－アミノ安息香酸、エリスロシン、フタロシアニン、アゾメチン、シアニン、キサンチン、スクシニルフルオレセイン、希土類金属クリプテート、ユーロピウムトリスビピリジンジアミン、ユウロピウムクリプテート又はキレート、ジアミン、ジシアニン、ラホヤブルー色素、アロピコシアニン、アロコシアニンＢ、フィコシアニンＣ、フィコシアニンＲ、チアミン、フィコエリスロシアニン、フィコエリトリンＲ、ＲＥＧ、ローダミングリーン、ローダミンイソチオシアネート、ローダミンレッド、ＲＯＸ、ＴＡＭＲＡ、ＴＥＴ、ＴＲＩＴ（テトラメチルローダミンイソチオール）、テトラメチルローダミン、Ｅｄａｎｓ及びＴＥＸＡＳ ＲＥＤが挙げられる。これら及び他の発光標識は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ（オレゴン州ユージーン）及びＥＭＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（カリフォルニア州サンディエゴ）等の商業的供給源から得ることができる。
【0068】
化学発光剤としては、ルミノール、イソルミノール、芳香族アクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩及びシュウ酸エステル、又はルシフェリン、ルシフェラーゼ及びエクオリン等の生物発光化合物が挙げられる。診断用コンジュゲートは、例えば、術中、内視鏡、又は血管内の腫瘍若しくは疾患の診断において使用され得る。
【0069】
いくつかの態様では、ミセルの外表面が修飾される。そのような修飾の一例は、長時間循環する薬剤、例えばグリコサミノグリカンによるミセルの外表面の修飾である。グリコサミノグリカンの例としては、ヒアルロン酸が挙げられる。ミセルはまた、又は代替的に、凍結保護剤、例えば糖（トレハロース、スクロース、マンノース、グルコース又はＨＡ等）で修飾されてもよい。「凍結保護剤」という用語は、脱水－再水和、凍結－解凍、又は凍結乾燥－再水和に供された脂質粒子を小胞の融合及び／又は小胞内容物の漏出から保護する薬剤を指す。
【0070】
本明細書に記載のミセルを含む医薬組成物も含まれる。
【0071】
本明細書で使用される場合、「医薬組成物」は、希釈剤、防腐剤、可溶化剤、乳化剤、及びアジュバント等の薬学的に許容され得る賦形剤と共に治療有効量のナノ粒子を意味する。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容され得る賦形剤」は当業者に周知である。
【0072】
経口投与のための錠剤及びカプセルは、単位用量形態であり得、結合剤、例えばシロップ、アカシア、ゼラチン、ソルビトール、トラガカント又はポリビニルピロリドン；充填剤、例えばラクトース、糖、トウモロコシデンプン、リン酸カルシウム、ソルビトール又はグリシン；打錠潤滑剤、例えばステアリン酸マグネシウム、タルク、ポリエチレングリコール又はシリカ；崩壊剤、例えばジャガイモデンプン、又はラウリル硫酸ナトリウム等の許容され得る湿潤剤等の従来の賦形剤を含有し得る。錠剤は、通常の製薬実務において周知の方法に従ってコーティングされ得る。経口液体製剤は、例えば、水性又は油性の懸濁液、溶液、エマルジョン、シロップ若しくはエリキシルの形態であってもよく、又は使用前に水若しくは他の適切なビヒクルで再構成するための乾燥製品として提供されてもよい。そのような液体調製物は、懸濁化剤、例えばソルビトール、シロップ、メチルセルロース、グルコースシロップ、ゼラチン水素化食用脂肪；乳化剤、例えばレシチン、ソルビタンモノオレエート、又はアカシア；非水性ビヒクル（食用油を含み得る）、例えばアーモンド油、分留ヤシ油、グリセリン、プロピレングリコール又はエチルアルコール等の油性エステル；防腐剤、例えばｐ－ヒドロキシ安息香酸メチル若しくはプロピル、又はソルビン酸、並びに所望であれば従来の香味剤又は着色剤等の従来の添加剤を含有し得る。
【0073】
皮膚への局所適用の場合、ミセルをクリーム、ローション又は軟膏に構成することができる。ミセルに使用され得るクリーム又は軟膏製剤は、当技術分野で周知の従来の製剤である。局所投与には、パッチ等の経皮製剤が含まれる。
【0074】
眼への局所適用の場合、ミセルは、適切な滅菌水性又は非水性ビヒクル中の溶液又は懸濁液に構成され得る。添加剤、例えば、メタ重亜硫酸ナトリウム又はエデト酸（ｅｄｅａｔｅ）二ナトリウム等の緩衝液；酢酸水銀フェニル又は硝酸塩、塩化ベンザルコニウム又はクロルヘキシジン等の殺菌剤及び殺真菌剤、並びにヒプロメロース等の増粘剤を含む防腐剤も含まれ得る。
【0075】
ミセルはまた、滅菌注射用水性又は油性懸濁液の形態で、滅菌媒体中で非経口的に、皮下若しくは静脈内、又は筋肉内若しくは胸骨内に、又は注入技術によって投与され得る。使用されるビヒクル及び濃度に応じて、ミセルをビヒクル中に懸濁させることができる。有利には、アジュバント、例えば局所麻酔薬、防腐剤及び緩衝剤をビヒクルに溶解することができる。
【0076】
医薬組成物は、単位剤形で好都合に提供され得、薬学の分野で周知の方法のいずれかによって調製され得る。「単位投与量」又は「単位用量」という用語は、示された活性又は状態を治療するのに有効となるのに十分な有効成分の所定量を意味する。各タイプの医薬組成物を製造することは、活性化合物を担体及び１つ以上の任意の補助成分と会合させる工程を含む。一般に、製剤は、活性化合物を液体又は固体の担体と均一かつ密接に会合させ、次いで、必要に応じて、生成物を所望の単位剤形に成形することによって調製される。
【0077】
或る態様では、自己集合型免疫療法用デンドロンミセルを作製する方法は、第１の非ペプチジル疎水性コア形成成分を第１のポリエステルデンドロンに共有結合させ、第１のポリエステルデンドロンを第１のポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）部分に共有結合させ、第１の治療用ペプチドを第１のＰＥＧ部分にコンジュゲートさせることによって、第１の両親媒性デンドロンコイルを合成することと、第２の非ペプチジル疎水性コア形成成分を第２のポリエステルデンドロンに共有結合させ、第２のポリエステルデンドロンを第２のポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）部分に共有結合させ、第２の治療用ペプチドを第２のＰＥＧ部分にコンジュゲートさせることによって、第２の両親媒性デンドロンコイルを合成することと、第３の非ペプチジル疎水性コア形成成分を第３のポリエステルデンドロンに共有結合させ、第３のポリエステルデンドロンを第３のポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）部分に共有結合させることによって、第３の両親媒性デンドロンコイルを合成することであって、第３のＰＥＧ部分が、コンジュゲート化免疫療法用ペプチドを含まない、合成することと、自己集合型免疫療法用デンドロンミセルの自己集合のための条件下で、第１の両親媒性デンドロンコイル、第２の両親媒性デンドロンコイル、及び第３の両親媒性デンドロンコイルをインキュベートすること、とを含む。
【0078】
或る態様では、第１、第２及び／又は第３の両親媒性デンドロンコイルを、疎水性コア形成成分とポリエステルデンドロンとの間のクリックケミストリーを使用して合成することができる。他の当技術分野で公知の化学を使用してもよい。
【0079】
或る態様では、第１及び第２の治療用ペプチドのコンジュゲート化は、ＮＨ２－ＰＥＧ－ｔＢＯＣコンジュゲーションと、それに続くＴＦＡによる脱保護とを含む。他の当技術分野で公知の化学を使用してもよい。
【0080】
別の態様では、免疫療法方法は、対象、例えばヒト対象に、本明細書に記載のナノ粒子系を投与することを含む。例示的なヒト対象としては、癌患者、並びに多発性硬化症及び関節リウマチ等の免疫障害を有する患者が挙げられる。ナノ粒子は、Ｔ細胞、癌細胞及び／又は抗原提示細胞と相互作用することによって免疫系を標的とすることができる。
【0081】
治療用ペプチドが免疫チェックポイント阻害剤ペプチドである場合、本明細書に記載の組成物及び方法は、トリプルネガティブ乳癌、頭頸部扁平上皮癌、黒色腫、結腸直腸癌、前立腺癌、腎細胞癌、又は膀胱癌を含む全ての癌に適用可能である。
【0082】
本明細書に記載の方法は、放射線療法、化学療法、外科手術、及びそれらの組み合わせ等の追加の癌治療法と更に組み合わせることができる。
【0083】
本発明は、以下の非限定的な実施例によって更に説明される。
【実施例】
【0084】
実施例１：ＤＭの合成及び調製
一連のＰＥＧ化デンドロンコイル（ＰＤＣ）を、ＰＣＬ、Ｇ３デンドロン及びＰＥＧからなるモジュール式薬物送達ビヒクルとして設計した。ＰＣＬ（３．５及び１４ｋＤａ）及びｍＰＥＧ（２及び５ｋＤａ）の２つの異なる分子量（ＭＷ）を使用して、得られたＰＤＣの親水性親油性バランス（ＨＬＢ）を変化させた。ＰＤＣの合成経路及び特性を図３に要約する。ＰＣＬの末端ヒドロキシル基を、その後のデンドロンとのクリックケミストリーのため最初にアジド基（ＰＣＬＮ３）に変換し、１Ｈ－ＮＭＲを使用して確認した（図３Ｂ）。
一連のＰＥＧ化デンドロンコイル（ＰＤＣ）を、ＰＣＬ、Ｇ３デンドロン及びＰＥＧからなるモジュール式薬物送達ビヒクルとして設計した。ＰＣＬ（３．５及び１４ｋＤａ）及びｍＰＥＧ（２及び５ｋＤａ）の２つの異なる分子量（ＭＷ）を使用して、得られたＰＤＣの親水性親油性バランス（ＨＬＢ）を変化させた。ＰＤＣの合成経路及び特性を図３に要約する。ＰＣＬの末端ヒドロキシル基を、その後のデンドロンとのクリックケミストリーのため最初にアジド基（ＰＣＬＮ３）に変換し、１Ｈ－ＮＭＲを使用して確認した（図３Ｂ）。
【0085】
焦点にアセチレン基を有するＧ３デンドロンを「クリックケミストリー」によってＰＣＬ－Ｎ３と反応させて、ＰＣＬ－Ｇ３コポリマー（図３Ｂ／Ｄ）を得た。次いで、ｐ－ニトロフェニルクロロホルメート（ｐ－ＮＰＣ）によるデンドロンの表面ヒドロキシル基の活性化に続いて、ＰＣＬ－Ｇ３コポリマーをメトキシ末端ＰＥＧ（ｍＰＥＧ）とコンジュゲート化した。図３Ｃに示すように、ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）を使用して、全ての中間生成物及び最終生成物のＭＷ及び分子量分布（ＭＷＤ＝Ｍｗ／Ｍｎ、１．０は完全に単分散であることを意味する）を測定した。並行して、デンドロンを含まない同じＭＷポリマーを有する線形コポリマー対応物も、ＰＣＬ上のヒドロキシル基のｐ－ＮＰＣ活性化、続いてｍＰＥＧコンジュゲーションを使用する同様のプロトコルによって調製した。８種類全ての両親媒性コポリマー（４種類のデンドロン系及び４種類の線形）を、低ＭＷＤ（１．４未満）での合成に成功した。
【0086】
フルオロフォアとしてローダミン及びモデル標的化剤として葉酸（ＦＡ）を含有する官能化ＰＤＣも合成した。簡潔には、ＰＣＬ１４Ｋ－Ｇ３をモル過剰（２０×）のＰＥＧジアミンと反応させて、ＰＣＬ－Ｇ３－ＰＥＧ－ＮＨ２を得た。次いで、当該分野で公開されている化学を使用して、コポリマーをｎ－スクシンイミジルエステル（ＮＨＳ）官能化ローダミン（Ｒｈｏ）又はＦＡのいずれかとコンジュゲートさせた。２つのコポリマーの合成を、１Ｈ－ＮＭＲ及びＵＶ／Ｖｉｓを使用して確認し、ＰＣＬ－Ｇ３－ＰＥＧ－Ｒｈｏ及びＰＣＬ－Ｇ３－ＰＥＧ－ＦＡが、当該分野で記載されるように、ＰＤＣあたりそれぞれ約１個のＲｈｏ及び約２個のＦＡ分子を含有したことを明らかにした。
【0087】
実施例２：低ＣＭＣ、高ＰＥＧ表面被覆率、及びＤＭの制御された薬物放出
様々なＭＷを有するＰＤＣの自己集合挙動を調べるために、それらの臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）値を測定し（図４）、ＴＥＭを使用してそれらの自己集合構造を観察し、これを線形コポリマー対応物のものと比較した。低ＣＭＣは、血流中への注射時の即時希釈係数のために、薬物送達ビヒクルの重要な要件である。図４は、両方のセットのコポリマーについて観察された、ＣＭＣと親油性バランス（ｈｙｐｏｐｈｉｌｉｃ ｌｉｐｏｐｈｉｌｉｃ ｂａｌａｎｃｅｓ）（ＨＬＢ）との間のほぼ線形の相関を示す。同じポリマーブロックから構成される線形コポリマーのＣＭＣの文献値を含めて、ＰＤＣのＣＭＣが同じＨＬＢの線状コポリマーのＣＭＣよりも１～２桁低いことが観察された。これらのデータは、デンドロンを介して化学的に組み合わされた複数のＰＥＧ及び単一のＰＣＬの事前に組織化された分子構造が、大きな親水性割合を有する著しく安定なＰＤＣ自己集合体の形成を促進するという堅固な証拠を提供する。
様々なＭＷを有するＰＤＣの自己集合挙動を調べるために、それらの臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）値を測定し（図４）、ＴＥＭを使用してそれらの自己集合構造を観察し、これを線形コポリマー対応物のものと比較した。低ＣＭＣは、血流中への注射時の即時希釈係数のために、薬物送達ビヒクルの重要な要件である。図４は、両方のセットのコポリマーについて観察された、ＣＭＣと親油性バランス（ｈｙｐｏｐｈｉｌｉｃ ｌｉｐｏｐｈｉｌｉｃ ｂａｌａｎｃｅｓ）（ＨＬＢ）との間のほぼ線形の相関を示す。同じポリマーブロックから構成される線形コポリマーのＣＭＣの文献値を含めて、ＰＤＣのＣＭＣが同じＨＬＢの線状コポリマーのＣＭＣよりも１～２桁低いことが観察された。これらのデータは、デンドロンを介して化学的に組み合わされた複数のＰＥＧ及び単一のＰＣＬの事前に組織化された分子構造が、大きな親水性割合を有する著しく安定なＰＤＣ自己集合体の形成を促進するという堅固な証拠を提供する。
【0088】
図５に示すように、分子動力学（ＭＤ）を用いて構造をシミュレートした場合にも、ＰＤＣ由来のミセルと線形コポリマーとの間に明確な差が見られた。ＤＭ（図５Ａ）の表面は、デンドロンがＰＥＧ表面密度を最大にするため、ＰＥＧ層によってほぼ完全に覆われている。しかしながら、線形コポリマーから集合したミセルは、疎水性部分が露出している（図５Ｂ）。ＰＥＧ層によるナノキャリアの全表面被覆率は、細網内皮クリアランス（ＲＥＳ）等の非特異的相互作用を最小限に抑えながら体内循環時間を最大化する「ステルス効果」を利用するために重要である。
【0089】
様々なＤＭからのインドメタシン（モデル薬物として）の放出プロファイルも測定した。図６に示すように、ＤＭは、７日間にわたって持続的に薬物分子を放出した。最初の１２時間では、放出動態はより線形であり、続いて２～８日目までに更に遅い放出が起こり、ＰＣＬのＭＷによって制御される遅い放出プロファイルが達成された。
【0090】
実施例３：デンドリマーによって送達されるａＰＤ－Ｌ１及びａＥＧＦＲのｉｎ ｖｉｔｒｏ／ｉｎ ｖｉｖｏ検証
次いで、ＥＧＦＲ又はＰＤ－Ｌ１に結合する抗体をｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏの両方で試験した。このために、第７世代のポリアミドアミン（Ｇ７ ＰＡＭＡＭ）デンドリマーを使用して、ＤＭナノキャリアの樹状構造を介して課され得る多価結合の効果を調べた。Ｇ７ ＰＡＭＡＭデンドリマーを、当技術分野からの改変されたプロトコルを使用してａＰＤ－Ｌ１とコンジュゲートさせた。簡潔には、最初に無水酢酸を用いて約５０％の第一級アミン基をアセチル化し、続いてＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）６４７とコンジュゲートした。次いで、蛍光標識デンドリマーを無水コハク酸との反応によって完全にカルボキシル化し、続いて１：５のデンドリマー：ａＰＤ－Ｌ１の比でａＰＤ－Ｌ１とコンジュゲートさせた。最終的なＧ７－ａＰＤ－Ｌ１コンジュゲートは、デンドリマー分子あたりおよそ３．８個のａＰＤ－Ｌ１を有すると分析された。図７に要約されるように、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）及び原子間力顕微鏡法（ＡＦＭ）を使用して、解離速度論（ＫＤ）に関してコンジュゲートを遊離ａＰＤ－Ｌ１と比較した。３つの独立した測定は全て、Ｇ７－ａＰＤ－Ｌ１コンジュゲートが、遊離ａＰＤ－Ｌ１と比較して、２桁の有意に増強された結合動態を達成したことを明らかにした。デンドリマーコンジュゲートの結合動態の増強は、細胞（腫瘍細胞と共インキュベート－７８６Ｏ対ＭＣＦ－７）をデンドリマーコンジュゲートで処理した場合にＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞からの最も高いインターロイキン－２（ＩＬ－２）分泌が観察されるｉｎ ｖｉｔｒｏ結果に首尾よく変換された（図８）。実験は、当技術分野で以前に公開された実験条件に従って実施した。ｉｎ ｖｉｖｏ試験のため、ＢＡＬＢ／ｃマウス（７～８週齢；雌）をＥｎｖｉｇｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（米国インディアナ州インディアナポリス）から購入した。マウスにＴＮＢＣ細胞株４Ｔ１（２．０×１０５細胞）を注射した。腫瘍が成長して３００ｍｍ３に達すると、ａＰＤ－Ｌ１、Ｇ７－ＩｇＧ又はＧ７－ａＰＤ－Ｌ１（全てＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）６４７又はＡＦ６４７とコンジュゲート）のいずれかを尾静脈から注射した。蛍光強度に基づいて正規化した後、ａＰＤ－Ｌ１及びＧ７－ａＰＤ－Ｌ１の濃度（１２８ｎＭ、５０μＬ）を決定した。画像（図９）を注射後４８時間の時点で撮影した。結果は、デンドリマーコンジュゲート（Ｇ７－ａＰＤ－Ｌ１、図９Ａ）が遊離ａＰＤ－Ｌ１及びＧ７－ＩｇＧよりも優先的に腫瘍部位に到達したことを明確に示している（図９Ｂ及びＣ）。蛍光強度の定量的測定はまた、４倍を超える量のＧ７－ａＰＤ－Ｌ１が遊離ａＰＤ－Ｌ１よりも腫瘍部位に蓄積されたことを示した（図９Ｄ）。
次いで、ＥＧＦＲ又はＰＤ－Ｌ１に結合する抗体をｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏの両方で試験した。このために、第７世代のポリアミドアミン（Ｇ７ ＰＡＭＡＭ）デンドリマーを使用して、ＤＭナノキャリアの樹状構造を介して課され得る多価結合の効果を調べた。Ｇ７ ＰＡＭＡＭデンドリマーを、当技術分野からの改変されたプロトコルを使用してａＰＤ－Ｌ１とコンジュゲートさせた。簡潔には、最初に無水酢酸を用いて約５０％の第一級アミン基をアセチル化し、続いてＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）６４７とコンジュゲートした。次いで、蛍光標識デンドリマーを無水コハク酸との反応によって完全にカルボキシル化し、続いて１：５のデンドリマー：ａＰＤ－Ｌ１の比でａＰＤ－Ｌ１とコンジュゲートさせた。最終的なＧ７－ａＰＤ－Ｌ１コンジュゲートは、デンドリマー分子あたりおよそ３．８個のａＰＤ－Ｌ１を有すると分析された。図７に要約されるように、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）及び原子間力顕微鏡法（ＡＦＭ）を使用して、解離速度論（ＫＤ）に関してコンジュゲートを遊離ａＰＤ－Ｌ１と比較した。３つの独立した測定は全て、Ｇ７－ａＰＤ－Ｌ１コンジュゲートが、遊離ａＰＤ－Ｌ１と比較して、２桁の有意に増強された結合動態を達成したことを明らかにした。デンドリマーコンジュゲートの結合動態の増強は、細胞（腫瘍細胞と共インキュベート－７８６Ｏ対ＭＣＦ－７）をデンドリマーコンジュゲートで処理した場合にＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞からの最も高いインターロイキン－２（ＩＬ－２）分泌が観察されるｉｎ ｖｉｔｒｏ結果に首尾よく変換された（図８）。実験は、当技術分野で以前に公開された実験条件に従って実施した。ｉｎ ｖｉｖｏ試験のため、ＢＡＬＢ／ｃマウス（７～８週齢；雌）をＥｎｖｉｇｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（米国インディアナ州インディアナポリス）から購入した。マウスにＴＮＢＣ細胞株４Ｔ１（２．０×１０５細胞）を注射した。腫瘍が成長して３００ｍｍ３に達すると、ａＰＤ－Ｌ１、Ｇ７－ＩｇＧ又はＧ７－ａＰＤ－Ｌ１（全てＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）６４７又はＡＦ６４７とコンジュゲート）のいずれかを尾静脈から注射した。蛍光強度に基づいて正規化した後、ａＰＤ－Ｌ１及びＧ７－ａＰＤ－Ｌ１の濃度（１２８ｎＭ、５０μＬ）を決定した。画像（図９）を注射後４８時間の時点で撮影した。結果は、デンドリマーコンジュゲート（Ｇ７－ａＰＤ－Ｌ１、図９Ａ）が遊離ａＰＤ－Ｌ１及びＧ７－ＩｇＧよりも優先的に腫瘍部位に到達したことを明確に示している（図９Ｂ及びＣ）。蛍光強度の定量的測定はまた、４倍を超える量のＧ７－ａＰＤ－Ｌ１が遊離ａＰＤ－Ｌ１よりも腫瘍部位に蓄積されたことを示した（図９Ｄ）。
【0091】
ａＥＧＦＲの場合、得られたコンジュゲートを、ＡＦ６４７とのコンジュゲーション後にＧ７：ａＥＧＦＲの比がおよそ１：１０となるように調製した。ＥＧＦＲを過剰発現するＭＤＡ－ＭＢ－４６８を使用してｉｎ ｖｉｔｒｏ特異性を測定した。図１０Ａ／Ｂに示すように、Ｇ７－ａＥＧＦＲ（１０Ａ）は細胞との有意な相互作用を示したが、Ｇ７（１０Ｂ）自体は示さず、特異性がａＥＧＦＲを介して方向付けられたことを示している。ｉｎ ｖｉｖｏ結果はまた、Ｇ７－ａＥＧＦＲコンジュゲートから得られる一貫した特異性を明らかにした（図１０Ｃ）。簡潔には、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（７～８週齢；雌）をＥｎｖｉｇｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手した。マウスＴＮＢＣ細胞株４Ｔ１（５．０×１０５細胞）をマウスに接種し、続いて遊離デンドリマー又はＧ７－ａＥＧＦＲのいずれかを尾静脈を通して静脈内注射した。
【0092】
実施例４：抗体を置き換えるためのペプチド
それぞれＥＧ１／ＥＧ２及びｂＨ２＿ｍｔと示されるＥＧＦＲ及びＰＤ－Ｌ１に結合するペプチドを、当技術分野のプロトコルに従って合成した。ＰＤ－Ｌ１結合ペプチド（ｂＨ２＿ｍｔ）については、文献から最適化された次のペプチド配列：ＨＶＶＷＨＲＥＳＰＳＧＱＴＤＴＬＡＡ配列番号５を使用した。ＥＧＦＲ結合ペプチドについて、２つのペプチド配列：ＹＨＷＹＧＹＴＰＱＮＶＩ（ＥＧ１）配列番号６及びＬＡＲＬＬＴ（ＥＧ２）配列番号７を試験した。上記のように、ペプチドを使用する主な課題は、それらの小さいＭＷ、及びより良好に操作される柔軟性／能力に起因する利点にもかかわらず、それらの対応する抗体に対するそれらの劣った結合動態である。ペプチドのＰＡＭＡＭデンドリマーへのコンジュゲーションが、以前に公開されたプロトコルに従って、多価結合効果を介してそれらの結合動態を有意に増強するかどうかを試験した。ＳＰＲ結果（図１１Ａ）に示すように、デンドリマー－ペプチドコンジュゲート（Ｇ７－βＨ２＿ｍｔ）は、遊離ペプチド（βＨ２＿ｍｔ）よりも５桁有意に強い完全抗体（ａＰＤ－Ｌ１）の解離定数（ＫＤ）に匹敵するＫＤを達成した。デンドリマー－ペプチドコンジュゲート（図１１Ｂ、右下パネル）はまた、ＰＤ－Ｌ１発現が低いＭＣＦ－７細胞との明らかな相互作用がないのとは対照的に、ＰＤ－Ｌ１発現細胞（７８６Ｏ）への選択的結合を示した（図１１Ｂ、右上パネル）。ＥＧＦＲ結合ペプチドを、ＥＧＦＲ過剰発現ＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞を使用して細胞保持に関して、表面固定化した後にも試験した。細胞を、ａＥＧＦＲ又はペプチドのいずれかを含む官能化表面上で３０分間インキュベートし、続いて２５ｓ－１の剪断速度で２０分間洗浄した。図１１Ｃに示されるように、ＥＧ１及びＥＧ２の混合物を有する表面は、全抗体（ａＥＧＦＲ）と同様のレベルの細胞保持能力を示し、２つのペプチドの混合物の使用がより強い結合を達成することを示した。
それぞれＥＧ１／ＥＧ２及びｂＨ２＿ｍｔと示されるＥＧＦＲ及びＰＤ－Ｌ１に結合するペプチドを、当技術分野のプロトコルに従って合成した。ＰＤ－Ｌ１結合ペプチド（ｂＨ２＿ｍｔ）については、文献から最適化された次のペプチド配列：ＨＶＶＷＨＲＥＳＰＳＧＱＴＤＴＬＡＡ配列番号５を使用した。ＥＧＦＲ結合ペプチドについて、２つのペプチド配列：ＹＨＷＹＧＹＴＰＱＮＶＩ（ＥＧ１）配列番号６及びＬＡＲＬＬＴ（ＥＧ２）配列番号７を試験した。上記のように、ペプチドを使用する主な課題は、それらの小さいＭＷ、及びより良好に操作される柔軟性／能力に起因する利点にもかかわらず、それらの対応する抗体に対するそれらの劣った結合動態である。ペプチドのＰＡＭＡＭデンドリマーへのコンジュゲーションが、以前に公開されたプロトコルに従って、多価結合効果を介してそれらの結合動態を有意に増強するかどうかを試験した。ＳＰＲ結果（図１１Ａ）に示すように、デンドリマー－ペプチドコンジュゲート（Ｇ７－βＨ２＿ｍｔ）は、遊離ペプチド（βＨ２＿ｍｔ）よりも５桁有意に強い完全抗体（ａＰＤ－Ｌ１）の解離定数（ＫＤ）に匹敵するＫＤを達成した。デンドリマー－ペプチドコンジュゲート（図１１Ｂ、右下パネル）はまた、ＰＤ－Ｌ１発現が低いＭＣＦ－７細胞との明らかな相互作用がないのとは対照的に、ＰＤ－Ｌ１発現細胞（７８６Ｏ）への選択的結合を示した（図１１Ｂ、右上パネル）。ＥＧＦＲ結合ペプチドを、ＥＧＦＲ過剰発現ＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞を使用して細胞保持に関して、表面固定化した後にも試験した。細胞を、ａＥＧＦＲ又はペプチドのいずれかを含む官能化表面上で３０分間インキュベートし、続いて２５ｓ－１の剪断速度で２０分間洗浄した。図１１Ｃに示されるように、ＥＧ１及びＥＧ２の混合物を有する表面は、全抗体（ａＥＧＦＲ）と同様のレベルの細胞保持能力を示し、２つのペプチドの混合物の使用がより強い結合を達成することを示した。
【0093】
このデータは、ｉ）ＰＤＣの合成及びそれらのＤＭへの自己集合；ｉｉ）ａＰＤ－Ｌ１及びａＥＧＦＲの選択性の増強；並びにｉｉｉ）ペプチドの合成及び多価結合効果によるそれらの有意に増強された結合速度論を実証する。
【0094】
実施例５：一連の官能化ＰＤＣを調製し、それらの結合速度論及び自己集合をＤＭに操作する
官能価の数に基づいてグループ化された一連のＰＤＣを調製する。このアプローチは、最も単純なグループから始まって、より複雑な物質に進み、提案された研究の各段階の成功の可能性を高める。以下のＰＤＣを合成する：アセチル化ＰＤＣ（ＰＣＬ－Ｇ３－ＰＥＧ－Ａｃ）（図１２のＩ）、ＥＧ１／２コンジュゲートＰＤＣ（ＰＣＬ－Ｇ３－ＰＥＧ－ＥＧ１／２）（図１２のＩＩ、図１３）、ＰＤ－Ｌ１結合ペプチド（ｐＰＤ１）とコンジュゲートしたＰＤＣ（ＰＣＬ－Ｇ３－ＰＥＧ－ｐＰＤ１）（図１２のＩＩＩ、図１３）、及びＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７を有するＰＤＣ（ＰＣＬＧ３－ＰＥＧ－ＡＦ）（図１２のＩＶ、図１３）。
官能価の数に基づいてグループ化された一連のＰＤＣを調製する。このアプローチは、最も単純なグループから始まって、より複雑な物質に進み、提案された研究の各段階の成功の可能性を高める。以下のＰＤＣを合成する：アセチル化ＰＤＣ（ＰＣＬ－Ｇ３－ＰＥＧ－Ａｃ）（図１２のＩ）、ＥＧ１／２コンジュゲートＰＤＣ（ＰＣＬ－Ｇ３－ＰＥＧ－ＥＧ１／２）（図１２のＩＩ、図１３）、ＰＤ－Ｌ１結合ペプチド（ｐＰＤ１）とコンジュゲートしたＰＤＣ（ＰＣＬ－Ｇ３－ＰＥＧ－ｐＰＤ１）（図１２のＩＩＩ、図１３）、及びＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７を有するＰＤＣ（ＰＣＬＧ３－ＰＥＧ－ＡＦ）（図１２のＩＶ、図１３）。
【0095】
ＰＤＣの各ポリマー成分のＭＷの選択：各ポリマーブロックの分子量（ＭＷ）は、得られるＰＤＣの物理的及び生物学的特性に大きく影響する。結果に基づいて、実験は、３．５ｋＤａのＰＣＬ、ＩＩ及びＩＩＩについては２ｋＤａのＰＥＧ、並びにＩ及びＩＶについては６００ＤａのＰＥＧ、並びにＧ３デンドロン（８７０Ｄａ）から開始する。ＰＥＧのＭＷは、テザリングされた構成がＤＭ上の標的化リガンドと細胞表面との間の最大特異的相互作用を助けることから重要であり得る。以前の研究は、標的化リガンド及びＰＥＧ０．６ＫでテザリングされたＰＥＧ２Ｋから自己集合したＤＭが特異的相互作用を有意に増幅することを明らかにした。Ｇ３ポリエステルデンドロンは、複数（８個）の官能性末端基を提供するのに十分大きいが、ＭＷＤを最小に維持するのに十分小さいため選択される。初期結果に応じて、ＭＷを変化させて放出プロファイル及びＨＬＢを制御する。
【0096】
ペプチド合成：合計４つのペプチド配列を合成する。ＰＤ－Ｌ１結合ペプチドについては、最近の研究に使用されたヒト配列に加えて、マウス配列：ＩＹＬＣＧＡＩＳＬＨＰＫＡＫＩＥＥＳＰＧＡ配列番号８をその後のｉｎ ｖｉｖｏマウスモデル研究のために調製する。マウスとヒトとの間の８９％の重複を考慮すると、同じＥＧ １／ＥＧ２ペプチドをｉｎ ｖｉｔｒｏ及びマウスｉｎ ｖｉｖｏの両方に使用する。これらのペプチドは、９－フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）ベースの固相合成技術及びＲｉｎｋ Ａｍｉｄｅ ＭＢＨＡ樹脂ＬＬ上の標準的なアミノ酸保護基を使用して合成される。合成後、ペプチドを、切断カクテル［トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）／トリイソプロピルシラン（ＴＩＳ）／水＝９５：２．５：２．５］の３時間の処理によって樹脂から切断する。次いで、ｔｅｒｔ－ブチルメチルエーテル（ＴＢＭＥ）を用いて混合物を沈殿させる。粗ペプチド溶液を、Ｃ１８セミ分取カラムを用いた逆相ＨＰＬＣを用いて精製する。ＨＰＬＣ条件は以下の通りである：溶離液（溶媒Ａ、０．１％ＴＦＡを含む水；溶媒Ｂ、０．１％ＴＦＡを含むアセトニトリル）、流速（２ｍＬ／分）、及びＵＶ検出のための波長（２３０ｎｍ）。ペプチドの分子量は、α－シアノ－４－ヒドロキシ桂皮酸（ＣＨＣＡ）マトリックスとの共結晶化後に、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化飛行時間型質量分析（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳ）によって確認される。それらの濃度は、トリプトファン（５６９０Ｍ－１ｃｍ－１）及びチロシン（１２８０Ｍ－１ｃｍ－１）のモル吸光係数を使用しながら、水／アセトニトリル（１：１）中での分光光度測定によって決定される。
【0097】
ＰＤＣと機能性薬剤とのコンジュゲーション：官能化ＰＤＣの合成経路を図１３に示す。簡潔には、ｐ－ＮＰＣ活性化ＰＣＬ－Ｇ３（ＭＷ５，６９０Ｄａ）をＮＨ２－ＰＥＧ－ｔＢＯＣとコンジュゲートさせ、続いてＴＦＡで脱保護し、ＰＣＬ－Ｇ３－ＰＥＧ－ＮＨ２を得る。アミン基は、ＥＧ１／２及びｐＰＤ－１ペプチド並びにイメージング剤ＡＦ６４７（ＡＦ）等の様々な生物活性剤に対する反応部位を提供する。ペプチド及びＡＦとのコンジュゲーションは、当技術分野で公開されているのと同じ化学を利用する。全てのコンジュゲーション反応の後、残りのアミン基はアセチル化されて、潜在的な非特異的相互作用を保護する。完全なアセチル化は、非特異的相互作用なしに特異的標的化を達成するために重要である。対照群として、ＰＤＣと同一のＭＷを有する線形ブロックコポリマー（ＰＣＬ－ＰＥＧ）も調製して、結合及び生物学的挙動に対するデンドロンの役割を調べる。
【0098】
自己集合によるＤＭ形成：図１２及び図１３に示すように、様々なタイプのＰＤＣがミセルに自己集合する。定量的蛍光分析のため、ＰＣＬ－Ｇ３－ＰＥＧ－ＡＦ（ＰＤＣ＿ＦＬ）の含有量を５％に固定し、他の全ての機能的成分を最小（５％）から最大（３０％）まで様々な比で混合する。パクリタキセルを用いないＤＭの場合、種々の比の２０ｍｇのＰＤＣを２ｍＬのジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解する。溶液を蒸留水に対して１日間透析し（ＭＷＣＯ ３．５Ｋ）、２日間凍結乾燥させる。パクリタキセルのカプセル化のため、同じ様々な比の２０ｍｇのＰＤＣを２～４ｍｇのパクリタキセルと共に４ｍＬのＤＭＦに溶解する。次いで、ＰＤＣ－薬物溶液を透析膜に移し、２Ｌの蒸留水に対して２４時間透析し、２日間凍結乾燥して薬物担持ミセルを生成する。全てのミセルを、ＡＦＭ、ＴＥＭ、及びＤＬＳを使用して、それらの形態、サイズ、及び表面電荷に関して特性評価する。ＣＭＣ及びカプセル化効率も、当技術分野の方法を使用して測定される。
【0099】
ＥＧ１／２及びｐＰＤ－１結合速度論の最適化：ミセルあたりのＰＣＬ－Ｇ３－ＰＥＧ－ＥＧ１／２（ＰＤＣ＿ＥＧ１／２）及びＰＣＬ－Ｇ３－ＰＥＧ－ｐＰＤ－１（ＰＤＣ＿ｐＰＤ－１）の混合比は、当技術分野で公知の方法に従って、ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）Ｘ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、ＢＬＩ、ＡＦＭ（Ａｓｙｌｕｍ ＭＦＰ－３Ｄ ＢｉｏＩｎｆｉｎｉｔｙ）を使用してＳＰＲによって測定された結合速度論によって最適化される。簡潔には、ＥＧＦＲ及びＰＤ－Ｌ１を個々に又は一緒に基質上に固定化し、様々な量のＰＤＣ＿ＥＧ１／２、ＰＤＣ＿ｐＰＤ－１、又はその両方（総含有量で５～３０％）を含有するＤＭの結合挙動を測定する。結合パラメータ（ｋａ、ｋｄ、ＫＡ、及びＫＤ）を定量的に計算し、その値をｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞取り込みと比較して、最大多価結合効果のためのＰＤＣと標的化ペプチドとの最適比を最終決定する。
【0100】
ＰＤＣ及びＤＭの調製及び特性評価：調製された全てのＰＤＣの化学構造を確認した後、ＰＤＣの大きなライブラリを確立する。理論上のＭＷから１０％の偏差内のＰＤＣを使用し、それらの分子量分布（ＭＷＤ）は１．２未満に維持される。ＭＷ及びＭＷＤの両方における厳密な閾値は、バッチ間の変動及びＰＤＣの構造的不均一性を最小限に抑える。調製されたＤＭは、直径が約５０ｎｍのサイズを有し、ＰＥＧ外層による９０％超の表面被覆率と共に少なくとも１０ｗｔ％のパクリタキセルを含有する。
【0101】
官能基の数：予備研究に基づいて、ＰＤＣの構造的規則性を維持するために、官能基ｂをデンドロンあたり３分子（ペプチド）未満に維持することが好ましい。
【0102】
実施例６：ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏでの化学療法のためのＥＧＦＲ標的化の利点の検証
ｉｎ ｖｉｔｒｏ放出及び選択性試験を行い、続いて、ＤＭ１を用いた広範なｉｎ ｖｉｖｏ試験（図１２で定義される）を行う。図１１Ｃに示す本発明者らの予備データに基づいて、ＥＧ１及びＥＧ２ペプチドの混合物をＤＭ１製剤に使用すると、ＥＧ１／２混合物は、別々に使用するよりも有意に改善された細胞保持能力を示したことに留意されたい。
ｉｎ ｖｉｔｒｏ放出及び選択性試験を行い、続いて、ＤＭ１を用いた広範なｉｎ ｖｉｖｏ試験（図１２で定義される）を行う。図１１Ｃに示す本発明者らの予備データに基づいて、ＥＧ１及びＥＧ２ペプチドの混合物をＤＭ１製剤に使用すると、ＥＧ１／２混合物は、別々に使用するよりも有意に改善された細胞保持能力を示したことに留意されたい。
【0103】
パクリタキセルの放出動態及びＤＭのｉｎ ｖｉｔｒｏ特異性：パクリタキセルを含有するＤＭを、当技術分野で記載されているように、血清の存在下で透析方法を使用してそれらの放出動態に関して試験する。簡潔には、パクリタキセル（１ｍｇ／ｍＬ）を含む１．５ｍＬのＤＭを１．５ｍＬのＦＢＳと混合し、透析膜（ＭＷ ＣＯ ３．５ｋＤａ）に入れて、穏やかに振盪しながら（１００ｒｐｍ）３７°Ｃで５０％ＦＢＳ２７ｍＬに対して透析し、続いて様々な時点で透析液を収集する。収集された試料中のパクリタキセル含有量を、ＵＶ／Ｖｉｓ検出によって定量する。ＤＭ１のｉｎ ｖｉｔｒｏ選択性及び細胞傷害性を、ＥＧＦＲ陽性（４Ｔ１、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、及びＭＤＡ－ＭＢ－４６８）及びＥＧＦＲ陰性（ＭＤＡ－ＭＢ－４３５及びＳＵＭ５２）のＴＮＢＣ細胞株を使用して、ＥＧ１／２ペプチドを含まないＤＭと比較して試験する。
【0104】
ＤＭ１のｉｎ ｖｉｖｏ腫瘍保持特性：この実験の目的は、ＤＭ１が腫瘍でより長い保持を示すかどうかを決定することである。この実験を実施するため、ＢＡＬＢ／ｃマウスに異種移植されたマウスＴＮＢＣ細胞株４Ｔ１を使用する。様々なＤＭをＡＦ及びパクリタキセルと集合させて、ｉｎ ｖｉｖｏ実験を通して化学的性質を一定に保つ。パクリタキセルを含まない空のＤＭをアスタリスク＊（ＤＭ＊）で示す。簡潔には、４Ｔ１腫瘍細胞を調製し、１００μＬ中１．５～２×１０６個の生細胞をマウスの背側腹部に注射する。腫瘍を、Ｖｅｒｎｉｅｒノギスを用いて週に２回測定し、Ｖ＝（π／６）（大径）×（小径）２の式に従って計算する。平均腫瘍体積が１００～２００ｍｍ３に達すると、マウスを３つの群（ｎ＝１２、単一腫瘍／マウス）に無作為化する：１）治療無し、２）ＤＭ＊、３）ＤＭ１。１０ｍｇ／ｋｇの各ＤＭを５０～１００μＬで尾静脈によって送達する。主要エンドポイント：ＩＶＩＳ Ｓｐｅｃｔｒｕｍシステム（ＵＷ Ｓｍａｌｌ Ａｎｉｍａｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｆａｃｉｌｉｔｙ）を使用して、注射後０時間、６時間、１２時間、２４時間、３日間、５日間及び７日間に腫瘍を撮像する。ＩＶＩＳ Ｓｐｅｃｔｒｕｍ ＳｅｒｉｅｓのＬｉｖｉｎｇ Ｉｍａｇｅ Ｓｏｆｔｗａｒｅを使用して、取り込み及び保持のための全放射効率を測定及び定量する。
【0105】
ＤＭ１及びパクリタキセルのｉｎ ｖｉｖｏ体内分布：この実験の目標は、ＤＭ１が、標準的な遊離パクリタキセルと比較して、物理的腫瘍へのパクリタキセルの優れた送達を有するかどうかを決定することである。同じ４Ｔ１異種移植ＢＡＬＢ／ｃマウスを使用する。平均腫瘍体積が１００～２００ｍｍ３に達すると、マウスを４つの群（ｎ＝１２、単一腫瘍／マウス）に無作為化する：１）治療無し、２）遊離パクリタキセル、３）パクリタキセルを含むＤＭ、及び４）ＤＭ１。２２．５ｍｇ／ｋｇのパクリタキセルを送達する５０～１００μＬの各ＤＭを尾静脈によって送達する。パクリタキセルのＤＭ送達の体内分布及びｉｎ ｖｉｖｏ運命を決定するために、従来の蛍光に基づく技術に加えて、マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析イメージング（ＭＡＬＤＩ－ＭＳＩ）を使用する。ＭＡＬＤ－ＭＳＩを利用して、組織切片のプロテオームをｉｎ ｓｉｔｕで決定して、組織における示差的なタンパク質発現を示す画像を生成することができる（図１４）。ＭＡＬＤＩ－ＭＳＩは標識不要であり、優れた感度、定量及び化学特異性で組織試料中の多数の分子の同時マッピングを可能にする。ＭＡＬＤＩ－ＭＳＩは、その高い化学特異性、空間分解能及び感度のために、送達された薬物化合物、薬物代謝産物、及び可能性のある薬物標的の空間分布をマッピングすることができる偏りのないハイスループット技術である。腫瘍及び組織（血液、肝臓、肺、脳及び腎臓）を収集し、それに応じてＭＡＬＤＩ－ＭＳＩ定量分析の準備として固定する。
【0106】
遊離パクリタキセルと比較したＤＭ１のｉｎ ｖｉｖｏ有効性：この実験は、ＤＭ１から放出されたパクリタキセルが、パクリタキセルの標準的な送達と比較してより良好な腫瘍増殖制御をもたらすことができるかどうかを調べるために設計されている。同じ４Ｔ１異種移植ＢＡＬＢ／ｃマウスを使用する。４Ｔ１細胞の接種後、腫瘍を上記のように測定する。ここでも、平均体積が１００～２００ｍｍ３に達すると、マウスを５つの群（ｎ＝１６、単一腫瘍／マウス）に無作為化する：１）治療無し、２）ＤＭ＊、３）遊離パクリタキセル、４）パクリタキセルを含むＤＭ、及び５）ＤＭ１。同じ用量（２２．５ｍｇ／ｋｇのパクリタキセル）を４～５週間にわたって週に２回尾静脈によって送達する。主要エンドポイント：腫瘍成長が主要エンドポイントとなる。腫瘍を毎週３回測定し、プロットし、続いて有意性について統計分析する。
【0107】
本発明者らは、ＤＭ１が、非標的ＤＭと比較して、選択的な細胞相互作用（ＥＧＦＲ＋細胞のみに対する）、並びに改善されたｉｎ ｖｉｖｏ腫瘍蓄積及びより長い保持を示すと予想する。さらに、ＤＭ１は、遊離パクリタキセル及び非標的ＤＭと比較して、より高い濃度のパクリタキセルを腫瘍に送達し、より少ない量を正常組織に送達し、より大きな腫瘍制御をもたらす。
【0108】
実施例７：ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏでの併用免疫療法及び化学療法のためのＥＧＦＲ及びＰＤ－Ｌ１標的化の相乗的利点の検証
種々のＤＭの選択性及び細胞傷害性のｉｎ ｖｉｔｒｏ確認研究を行い、続いて、同じマウスモデルを用いた広範なｉｎ ｖｉｖｏ研究を行って、ＤＭ１～３の有効性を比較する。
種々のＤＭの選択性及び細胞傷害性のｉｎ ｖｉｔｒｏ確認研究を行い、続いて、同じマウスモデルを用いた広範なｉｎ ｖｉｖｏ研究を行って、ＤＭ１～３の有効性を比較する。
【0109】
様々なＤＭのｉｎ ｖｉｔｒｏ選択性及び細胞傷害性：ＰＤ－Ｌ１及びＥＧＦＲを過剰発現する３つのＴＮＢＣ細胞株、例えばＭＤＡ－ＭＢ－２３１及びＭＤＡ－ＭＢ－４６８、低レベルのＰＤ－Ｌ１及びＥＧＦＲのみを発現するＴＮＢＣ細胞株、例えばＭＤＡ－ＭＢ－４３５を使用する。ＤＭ２及びＤＭ３のｉｎ ｖｉｔｒｏ特異性は、当該分野で公知のプロトコルを使用して、蛍光顕微鏡法及びフローサイトメトリーを使用して確認される。様々な製剤の細胞傷害性も細胞に対して試験し、顕微鏡観察に加えて、ＬＤＨ及びＭＴＴアッセイ等の酵素アッセイを使用して測定する。
【0110】
ＤＭ２及びＤＭ３のｉｎ ｖｉｖｏ腫瘍保持特性：この実験の目的は、ＤＭ１及びＤＭ２と比較して、ＤＭ３が腫瘍でより長い保持を示すかどうかを決定することである。この実験はまた、図１５に示すように、同じ４Ｔ１異種移植ＢＡＬＢ／ｃマウスを使用して実施される。簡潔には、同じ数の４Ｔ１腫瘍細胞（１００μＬ中１．５～２×１０６個の生細胞）をマウスの背側腹部に注射する。腫瘍を１００～２００ｍｍ３に達するまで測定する。次いで、マウスを５つの群（ｎ＝１２、単一腫瘍／マウス）に無作為化する：１）治療無し、２）ＤＭ（標的化剤なし）、３）ＤＭ１、４）ＤＭ２、及び５）ＤＭ３。１０ｍｇ／ｋｇの各ＤＭを５０～１００μＬで尾静脈によって送達する。上記の腫瘍保持実験の時点で、ＩＶＩＳシステムを使用して腫瘍を撮像する。
【0111】
遊離パクリタキセルと比較したＤＭ２及びＤＭ３のｉｎ ｖｉｖｏ体内分布：この実験は、ＤＭ３が、１）標準的な遊離パクリタキセル、２）ＤＭ１及び３）ＤＭ２と比較して、物理的腫瘍へのパクリタキセルの優れた送達を有するかどうかを決定するように設計されている。実験手順は、平均腫瘍体積が１００～２００ｍｍ３に達するまで上記の手順と同一である。マウスを６つの群（ｎ＝１２、単一腫瘍／マウス）に無作為化する：１）治療無し、２）遊離パクリタキセル、３）ＤＭ、４）ＤＭ１、５）ＤＭ２、及び６）ＤＭ３。同じ用量の２２．５ｍｇ／ｋｇのパクリタキセルを静脈内に送達する。ＭＡＬＤＩ－ＭＳＩは、上記のような従来の蛍光ベースの技術に加えて、様々なＤＭを介したパクリタキセル送達の体内分布及び腫瘍蓄積に使用される。
【0112】
ＤＭ１、ＤＭ２及び遊離パクリタキセルと比較したＤＭ３のｉｎ ｖｉｖｏ有効性：この実験の目標は、ＰＤ１／ＰＤＬ１遮断 ＤＭ３）と組み合わせたパクリタキセル送達が、ＤＭ送達パクリタキセル単独（ＤＭ１）又はＥＧＦＲ標的化なしのＤＭ（ＤＭ２）よりも優れているかどうかを調べることである。同じ実験条件を使用する。平均体積が１００～２００ｍｍ３に達すると、マウスを６つの群（ｎ＝１６、単一腫瘍／マウス）に無作為化する：１）治療無し、２）遊離パクリタキセル、３）ＤＭ１、４）ＤＭ２、５）ＤＭ１／ＤＭ２混合物、６）ＤＭ３。ＤＭ１／ＤＭ２の物理的混合物をこの実験に含めて、単一のナノ粒子内に全ての成分を組み込んだＤＭ３が真に相乗効果を示すかどうかを調べる。同じ用量のパクリタキセルを４～５週間にわたって週に２回尾静脈によって送達する。腫瘍成長が主要エンドポイントとなる。腫瘍を毎週３回測定し、プロットし、続いて有意性について統計分析する。
【0113】
ＤＭ３は、非標的ＤＭ、ＤＭ１及びＤＭ２と比較して、選択的な細胞相互作用（ＥＧＦＲ＋／ＰＤ－Ｌ１＋細胞のみに対する）、並びに改善されたｉｎ ｖｉｖｏ腫瘍蓄積及びより長い保持を示すと予想される。重要なことに、他の製剤及び遊離パクリタキセルと比較して、有意に増加した腫瘍蓄積、治療指数及び全マウス生存率がＤＭ３から予想される。増強された結果は、同時に免疫チェックポイントを遮断してパクリタキセルを送達するＤＭに起因すると考えられる。
【0114】
実施例８：ＨＮＳＣＣを治療するためのＤＭの確認
実施例５と同様に、ＤＭは、パクリタキセルの代わりにドセタキセルをカプセル化して作製される。（図１２及び図１３を参照）。ＦａＤｕ及びＭＯＣ１等のＰＤ－Ｌ１及びＥＧＦＲを過剰発現し、ＲＰＭＩ２６５０等の低レベルのＥＧＦＲのみを発現する３つのＨＮＳＣＣ細胞株を使用する。ＤＭ１－３のｉｎ ｖｉｔｒｏ特異性を、蛍光顕微鏡法及びフローサイトメトリーを使用して確認する。様々な製剤の細胞傷害性も細胞に対して試験し、顕微鏡観察に加えて、ＬＤＨ及びＭＴＴアッセイ等の酵素アッセイを使用して測定する。
実施例５と同様に、ＤＭは、パクリタキセルの代わりにドセタキセルをカプセル化して作製される。（図１２及び図１３を参照）。ＦａＤｕ及びＭＯＣ１等のＰＤ－Ｌ１及びＥＧＦＲを過剰発現し、ＲＰＭＩ２６５０等の低レベルのＥＧＦＲのみを発現する３つのＨＮＳＣＣ細胞株を使用する。ＤＭ１－３のｉｎ ｖｉｔｒｏ特異性を、蛍光顕微鏡法及びフローサイトメトリーを使用して確認する。様々な製剤の細胞傷害性も細胞に対して試験し、顕微鏡観察に加えて、ＬＤＨ及びＭＴＴアッセイ等の酵素アッセイを使用して測定する。
【0115】
一連のｉｎ ｖｉｖｏ実験を行って、ＤＭ１及びＤＭ２と比較して、ＤＭ３が腫瘍でより長い保持及び治療有効性の増強を示すかどうかを決定する。この実験を、ＭＯＣ１異種移植された同系ＢＡＬＢ／ｃマウスを使用して行う。簡潔には、ＭＯＣ１腫瘍細胞（１００μＬ中１．５～２×１０６個の生細胞）をマウスの背側腹部に注射する。腫瘍を１００～２００ｍｍ３に達するまで測定する。マウスを６つの群（ｎ＝６、単一腫瘍／マウス）に無作為化する：１）治療無し、２）遊離ドセタキセル、３）ＤＭ１、４）ＤＭ２、５）ＤＭ１／ＤＭ２混合物、及び６）ＤＭ３。マウス及び治療群の数を、ＳＰＯＲＥ Ｓｔａｔｓコアに相談した後に確認する。ＤＭ１／ＤＭ２の物理的混合物をこの実験に含めて、単一のナノ粒子内に全ての成分を組み込んだＤＭ３が真に相乗効果を示すかどうかを調べる。同じ用量のドセタキセルを４～５週間にわたって週に２回尾静脈によって送達する。腫瘍成長が主要エンドポイントとなる。ＩＶＩＳシステムを使用して腫瘍を画像化し、週に３回測定し、プロットし、続いて有意性について統計分析する。
【0116】
調製された全てのＰＤＣの化学構造を確認した後、ＰＤＣの大きなライブラリが確立される。理論上のＭＷから１０％の偏差内のＰＤＣを使用し、それらの分子量分布（ＭＷＤ）は１．２未満に維持される。ＭＷ及びＭＷＤの両方における厳密な閾値は、バッチごとの変動及びＰＤＣの構造的不均一性を最小限に抑える。調製されたＤＭは、直径が約５０ｎｍのサイズを有し、ＰＥＧ外層による９０％超の表面被覆率と共に少なくとも１０ｗｔ％のドセタキセルを含有する。ＤＭ３は、非標的ＤＭ、ＤＭ１、ＤＭ２、及びＤＭ１／ＤＭ２混合物と比較して、選択的な細胞相互作用（ＥＧＦＲ＋／ＰＤ－Ｌ１＋細胞のみに対する）、並びに改善されたｉｎ ｖｉｖｏ腫瘍蓄積及びより長い保持を示すと予想される。重要なことに、ＤＭ３からの有意に増加した腫瘍蓄積、治療指数及び全マウス生存率が予想される。
【0117】
「１つの（ａ）」及び「１つの（ａｎ）」及び「その（ｔｈｅ）」という用語、並びに同様の指示対象（特に以下の特許請求の範囲の文脈における）の使用は、本明細書で特に指示されない限り、又は文脈と明らかに矛盾しない限り、単数及び複数の両方を包含すると解釈されるべきである。本明細書で使用される場合、第１、第２等の用語は、特定の順序を示すことを意味するのではなく、単に便宜上、複数の、例えば層を示すことを意味する。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、及び「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」という用語は、特に明記しない限り、非限定的な用語（すなわち、「～を含むが、限定されない」を意味する）として解釈されるべきである。本明細書で使用される場合、「約」又は「およそ」は、記載された値を含み、問題の測定値及び特定の量（すなわち、測定システムの制限）の測定に関連する誤差を考慮して、当業者によって決定される特定の値の許容可能な偏差範囲内を意味する。例えば、「約」は、１つ以上の標準偏差の範囲内、又は記載された値の±１０％若しくは５％の範囲内を意味することができる。値の範囲の列挙は、本明細書に別段の指示がない限り、その範囲内に入る各別個の値を個別に参照する簡略方法として役立つことを意図しているにすぎず、各別個の値は、あたかもそれが本明細書に個別に列挙されているかのように本明細書に組み込まれる。全ての範囲の端点は、範囲内に含まれ、独立して組み合わせることができる。本明細書に記載の全ての方法は、本明細書に別段の指示がない限り、又は文脈と明らかに矛盾しない限り、適切な順序で実施することができる。任意の及び全ての例又は例示的な言語（例えば、「等」）の使用は、単に本発明をよりよく説明することを意図しており、別段の請求がない限り、本発明の範囲を限定するものではない。本明細書のいかなる言語も、本明細書で使用される本発明の実施に不可欠な特許請求されていない要素を示すと解釈されるべきではない。
【0118】
例示的な実施形態を参照して本発明を説明したが、本発明の範囲から逸脱することなく、様々な変更を行うことができ、その要素を等価物で置き換えることができることが当業者には理解されよう。さらに、本発明の本質的な範囲から逸脱することなく、特定の状況又は材料を本発明の教示に適合させるために多くの修正を行うことができる。したがって、本発明は、本発明を実施するために企図される最良の形態として開示された特定の実施形態に限定されず、本発明は、添付の特許請求の範囲内に入る全ての実施形態を含むことが意図される。その全ての可能な変形における上述の要素の任意の組み合わせは、本明細書で特に指示されない限り、又は文脈と明らかに矛盾しない限り、本発明に包含される。
【図1】
【図2】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図3D】
【図4】
【図5A】
【図5B】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11A】
【図11B】
【図11C】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【配列表】
【国際調査報告】