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特表2023-549461バキュロウイルス発現ベクター

書誌要約請求の範囲詳細な説明課題実施例実施するための形態図面の説明

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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-11-27

(54)【発明の名称】バキュロウイルス発現ベクター

(51)【国際特許分類】

C12N 15/86 20060101AFI20231117BHJP

C12N 15/42 20060101ALI20231117BHJP

C12N 15/57 20060101ALI20231117BHJP

C12N 5/10 20060101ALI20231117BHJP

C12P 21/02 20060101ALI20231117BHJP

C12N 7/01 20060101ALI20231117BHJP

C12N 7/02 20060101ALI20231117BHJP

A61P 37/04 20060101ALI20231117BHJP

A61K 39/135 20060101ALI20231117BHJP

A61P 31/12 20060101ALI20231117BHJP

【ＦＩ】

C12N15/86 Z

C12N15/42 ZNA

C12N15/57

C12N5/10

C12P21/02 C

C12N7/01

C12N7/02

A61P37/04

A61K39/135

A61P31/12 171

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023524370

(86)(22)【出願日】2021-10-21

(85)【翻訳文提出日】2023-06-14

(86)【国際出願番号】 EP2021079180

(87)【国際公開番号】W WO2022084438

(87)【国際公開日】2022-04-28

(31)【優先権主張番号】20203379.1

(32)【優先日】2020-10-22

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】510000976

【氏名又は名称】インターベットインターナショナルベー．フェー．

(74)【代理人】

【識別番号】100114188

【弁理士】

【氏名又は名称】小野誠

(74)【代理人】

【識別番号】100119253

【弁理士】

【氏名又は名称】金山賢教

(74)【代理人】

【識別番号】100124855

【弁理士】

【氏名又は名称】坪倉道明

(74)【代理人】

【識別番号】100129713

【弁理士】

【氏名又は名称】重森一輝

(74)【代理人】

【識別番号】100137213

【弁理士】

【氏名又は名称】安藤健司

(74)【代理人】

【識別番号】100143823

【弁理士】

【氏名又は名称】市川英彦

(74)【代理人】

【識別番号】100183519

【弁理士】

【氏名又は名称】櫻田芳恵

(74)【代理人】

【識別番号】100196483

【弁理士】

【氏名又は名称】川嵜洋祐

(74)【代理人】

【識別番号】100160749

【弁理士】

【氏名又は名称】飯野陽一

(74)【代理人】

【識別番号】100160255

【弁理士】

【氏名又は名称】市川祐輔

(74)【代理人】

【識別番号】100172683

【弁理士】

【氏名又は名称】綾聡平

(74)【代理人】

【識別番号】100219265

【弁理士】

【氏名又は名称】鈴木崇大

(74)【代理人】

【識別番号】100203208

【弁理士】

【氏名又は名称】小笠原洋平

(74)【代理人】

【識別番号】100146318

【弁理士】

【氏名又は名称】岩瀬吉和

(74)【代理人】

【識別番号】100127812

【弁理士】

【氏名又は名称】城山康文

(72)【発明者】

【氏名】ファン・デン・ボーン，エルヴィン

【テーマコード（参考）】

4B064

4B065

4C085

【Ｆターム（参考）】

4B064AG32

4B064CA19

4B064CC24

4B064DA01

4B065AA90X

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA24

4B065CA45

4B065CA46

4C085AA03

4C085BA54

4C085CC08

4C085DD62

4C085EE01

4C085GG01

(57)【要約】

本発明は、プロモーターの制御下で口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）カプシド前駆体タンパク質を組換え発現させるためのバキュロウイルス発現ベクターに関し、発現ベクターは、ＦＭＤＶカプシド前駆体タンパク質をコードする核酸配列を含み、ＦＭＤＶカプシド前駆体タンパク質をコードするオープンリーディングフレームのＡＴＧ開始コドンは、－４位から－１位で核酸配列５’－ＡＡＡＴ－３’によって先行される。本発明は、バキュロウイルス発現ベクターを含む宿主細胞、ＦＭＤＶウイルス様粒子（ＶＬＰ）の産生方法、およびワクチンの生成方法にさらに関する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

プロモーターの制御下で口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）カプシド前駆体タンパク質を組換え発現させるためのバキュロウイルス発現ベクターであって、前記発現ベクターが、前記ＦＭＤＶカプシド前駆体タンパク質をコードする核酸配列を含み、ここで、前記ＦＭＤＶカプシド前駆体タンパク質をコードするオープンリーディングフレームのＡＴＧ開始コドンが、－４位から－１位で核酸配列５’－ＡＡＡＴ－３’によって先行される、バキュロウイルス発現ベクター。

【請求項2】

－４位から－１位にある５’－ＡＡＡＴ－３’の核酸配列と前記プロモーターとの間に、１つ以上の制限酵素による切断のための１つ以上の制限部位をさらに含む、請求項１に記載のバキュロウイルス発現ベクター。

【請求項3】

－１１位から－１位に核酸配列５’－ＧＧＴＡＡＣＣＡＡＡＴ－３’（配列番号１）を有する、請求項１または２に記載のバキュロウイルス発現ベクター。

【請求項4】

前記ＦＭＤＶカプシド前駆体タンパク質の発現が、バキュロウイルスポリヘドリンプロモーター（ｐｏｌｈ）またはｐ１０プロモーターの制御下で達成される、請求項１～３のいずれか一項に記載のバキュロウイルス発現ベクター。

【請求項5】

前記ＦＭＤＶがＡｓｉａ１血清型である、請求項１～４のいずれか一項に記載のバキュロウイルス発現ベクター。

【請求項6】

前記ＦＭＤＶがＳＡＴ２血清型である、請求項１～４のいずれか一項に記載のバキュロウイルス発現ベクター。

【請求項7】

前記カプシド前駆体タンパク質が、カプシド前駆体Ｐ１を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載のバキュロウイルス発現ベクター。

【請求項8】

前記ベクターが、前記カプシド前駆体タンパク質を１つ以上のカプシドタンパク質に切断することができるプロテアーゼをコードする核酸配列をさらに含む、請求項１～７のいずれか一項に記載のバキュロウイルス発現ベクター。

【請求項9】

前記カプシド前駆体タンパク質が、カプシド前駆体Ｐ１とペプチド２Ａとを含み、そして、前記プロテアーゼが３Ｃである、請求項８に記載のバキュロウイルス発現ベクター。

【請求項10】

請求項１～９のいずれか一項に記載のバキュロウイルス発現ベクターを含む宿主細胞。

【請求項11】

昆虫細胞である、請求項１０に記載の宿主細胞。

【請求項12】

（ｉ）請求項１～７のいずれか一項に記載のバキュロウイルス発現ベクターを宿主細胞に感染させる工程と、
（ｉｉ）前記宿主細胞によって産生されたＦＭＤＶカプシド前駆体タンパク質を採取する工程と
を含む、ＦＭＤＶカプシド前駆体タンパク質を産生する方法。

【請求項13】

（ｉ）請求項８または９に記載のバキュロウイルス発現ベクターを宿主細胞に感染させる工程と、
（ｉｉ）前記宿主細胞によって産生されたＦＭＤＶＶＬＰを採取する工程と
を含む、ＦＭＤＶウイルス様粒子（ＶＬＰ）を産生する方法。

【請求項14】

ＦＭＤＶカプシド前駆体タンパク質の組換え発現のための、請求項１～７のいずれか一項に記載のバキュロウイルス発現ベクターの使用、または、ＦＭＤＶＶＬＰの組換え発現のための、請求項８もしくは９に記載のバキュロウイルス発現ベクターの使用。

【請求項15】

発現が、昆虫細胞内で達成される、請求項１４に記載のバキュロウイルス発現ベクターの使用。

【請求項16】

（ｉ）請求項１３に記載の方法によってＦＭＤＶウイルス様粒子（ＶＬＰ）を産生する工程と、
（ｉｉ）薬学的に許容される担体を加えることによって、前記ＦＭＤＶＶＬＰをワクチンに組み込む工程と
を含む、ワクチンを生成する方法。

【請求項17】

ＦＭＤＶによる感染から対象を保護する方法であって、該方法は、
宿主細胞内で請求項１～９のいずれか一項に記載のバキュロウイルス発現ベクターからＦＭＤＶカプシド前駆体タンパク質を発現させてＶＬＰを産生する工程、薬学的に許容される担体を加えることによって前記ＶＬＰをワクチンに組み込む工程、および、前記ワクチンを前記対象に投与する工程、
を含む、方法。

【請求項18】

ＦＭＤＶによる感染から対象を保護するための医薬の製造に使用するための、請求項１～９のいずれか一項に記載のバキュロウイルス発現ベクター。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）カプシド前駆体タンパク質をプロモーターの制御下で組換え発現させるためのバキュロウイルス発現ベクターに関し、発現ベクターは、ＦＭＤＶカプシド前駆体タンパク質をコードする核酸配列を含む。本発明は、バキュロウイルス発現ベクターを含む宿主細胞、ＦＭＤＶウイルス様粒子（ＶＬＰ）の産生方法、およびワクチンの生成方法にさらに関する。

【背景技術】

【0002】

口蹄疫（ＦＭＤ）は、偶蹄類、家畜および野生動物の高度に伝染性の急性ウイルス性疾患である。口蹄疫（ＦＭＤ）は、国際連合食糧農業機関（ＦＡＯ）によって越境家畜伝染病として分類されている。口蹄疫（ＦＭＤ）はまた、届け出義務のある疾患である。口蹄疫は、アフリカ、南米、中東およびアジアの大部分で流行しており、世界的には家畜の最も経済的に重大な感染性疾患であり、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ならびに、バッファローおよびシカなどの他の偶蹄類種に発症する。ＦＭＤは、かつては世界中に広まっていたが、北米および西ヨーロッパを含むいくつかの地域では根絶されている。流行国では、ＦＭＤは、国際的な家畜取引に経済的制約をもたらし、厳しい予防措置が講じられていない限り、疾患のない地域に容易に再度広まり得る。ＦＭＤは家畜産業全体に影響を及ぼし、地域の農業従事者の収入が失われる。

【0003】

現在のワクチンは、不活化ウイルスから作製されている。ウイルスが不活化される前に、生ＦＭＤウイルスが高度封じ込め施設で産生され、ＦＭＤワクチンの生成は制限されている。ＦＭＤに対する効果的なワクチン接種は、免疫原性が不十分であることが証明されているカプシド構成要素ではなく、インタクトなＦＭＤＶカプシドの存在を必要とする（ＤｏｅｌａｎｄＣｈｏｎｇ，１９８２，ＡｒｃｈｉｖｅｓｏｆＶｉｒｏｌｏｇｙ）。不活化ＦＭＤウイルスは、カプシド構成要素では、酸性ｐＨまたは高温で容易に崩壊する脆弱な構造である。したがって、効果的なＦＭＤワクチンを家畜飼育者に届けるためには、低温流通体系が必要である。

【0004】

現在の不活化ウイルスワクチンの欠点の多くを克服することができる市販のＦＭＤワクチンのための新しいワクチン技術が必要とされている。

【0005】

ウイルス様粒子（ＶＬＰ）技術は、現在、従来の不活化ワクチンの実行可能な代替物となる可能性を有する数少ない技術の１つと考えられている。現在の技術と比較したＶＬＰ技術の利点には、例えば、製品安定性が高まること、産生場所の柔軟性が増大すること（低度封じ込め産生）、および新たな株のアウトブレイクに対するさらに迅速な応答がある。ＶＬＰベースのワクチンは、典型的には、非構造タンパク質を除去するための生成工程を実施する必要性を軽減するマーカーワクチンとして設計される。

【0006】

ＦＭＤＶゲノムは、１２個の成熟ウイルスタンパク質にプロセシングされる前駆体ポリタンパク質を産生する単一のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）をコードする（図１Ａ）（Ｂａｌｉｎｄａｅｔａｌ．ＶｉｒｏｌｏｇｙＪｏｕｒｎａｌ２０１０，７：１９９より）。Ｐ１ポリタンパク質中間体は、翻訳中にＰ１およびＰ２ポリタンパク質の非タンパク質分解的分離を引き起こしてＰ２からＰ１－２Ａを放出する２Ａタンパク質のすぐ上流に位置する４つのカプシド構造タンパク質ＶＰ１～ＶＰ４から構成される。その後、Ｐ１－２Ａポリタンパク質は、ＦＭＤＶ３Ｃプロテアーゼによって、２Ａ、ＶＰ０（１ＡＢとしても知られる）、ＶＰ３（１Ｃ）およびＶＰ１（１Ｄ）にプロセシングされる。ＶＰ０タンパク質は、カプセル化中にＶＰ４およびＶＰ２に分離する。ＦＭＤＶビリオンは、プロセシングされたウイルス構造タンパク質からの自己集合によって形成される。

【0007】

ＶＬＰベースのワクチンに使用するためのＶＬＰは、ＦＭＤＶビリオンの自己集合と同様に、好適な宿主細胞内でＦＭＤＶ前駆体タンパク質を組換え発現させることによって産生することができる。ＦＭＤＶＶＬＰも同様に、プロセシングされたウイルス構造タンパク質からの自己集合によって形成される。

【0008】

ＶＬＰの熱安定性と低ｐＨに対する感受性は、カプシドタンパク質間の共有結合、例えば、システイン架橋の導入によってまたは他の合理的に設計された変異の導入によって、改善することができる（Ｐｏｒｔａｅｔａｌ．（２０１３）ＰＬｏＳＰａｔｈｏｇ）。

【0009】

細胞培養物１ミリリットル当たりのＦＭＤＶＶＬＰの初期収率は典型的には低いため、一般的な成功した発現系を使用する場合であっても、発現レベルを増加させて、ＶＬＰベースのＦＭＤワクチンを現在市販されている従来のＦＭＤワクチンの費用対効果の高い代替物にする必要がある。そのため、バキュロウイルス発現ベクターを最適化してＶＬＰの収率を改善し、抗原収率に関して従来のＦＭＤワクチン生成プロセスと少なくとも同等またはさらにはそれを上回る大規模生成プロセスを達成した。

【0010】

バキュロウイルス発現ベクタープラットフォームは、現在、ＶＬＰの産生のための好ましいプラットフォームの１つとして使用されている。しかし、バキュロウイルス発現プラットフォームによってもたらされるＦＭＤＶＶＬＰの比較的低い発現レベルは、ＶＬＰベースのＦＭＤワクチンの開発を制限する。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0011】

【非特許文献1】ＤｏｅｌａｎｄＣｈｏｎｇ，１９８２，ＡｒｃｈｉｖｅｓｏｆＶｉｒｏｌｏｇｙ

【非特許文献2】Ｂａｌｉｎｄａｅｔａｌ．ＶｉｒｏｌｏｇｙＪｏｕｒｎａｌ２０１０，７：１９９

【非特許文献3】Ｐｏｒｔａｅｔａｌ．（２０１３）ＰＬｏＳＰａｔｈｏｇ

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0012】

本発明では、驚くべきことに、バキュロウイルス発現系を介したＦＭＤＶカプシド前駆体タンパク質の発現が、ＦＭＤＶカプシド前駆体タンパク質をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の開始コドンに先行する核酸開始配列を最適化することによって増強され得ることが見出された。驚くべきことに、開始配列が、－４位から－１位にある５’－ＡＡＡＴ－３’の核酸配列を有する場合、当技術分野で使用されるバキュロウイルス発現系と比較して発現収率が増強され得ることが示され得る。

【課題を解決するための手段】

【0013】

したがって、第１の態様では、本発明は、プロモーターの制御下で口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）カプシド前駆体タンパク質を組換え発現させることができるバキュロウイルス発現ベクターを提供し、ここで、発現ベクターは、ＦＭＤＶカプシド前駆体タンパク質をコードする核酸配列を含み、ＦＭＤＶカプシド前駆体タンパク質をコードするオープンリーディングフレームのＡＴＧ開始コドンは、－４位から－１位で核酸配列５’－ＡＡＡＴ－３’によって先行される。

【0014】

本発明の第２の態様では、本発明のバキュロウイルス発現ベクターを含む宿主細胞が提供される。そのような宿主細胞は、組織培養ではインビトロで使用され得、宿主細胞は典型的には不死化細胞である。

【0015】

第３の態様では、本発明は、ＦＭＤＶカプシド前駆体タンパク質を産生する方法を提供し、該方法は、本明細書に記載のバキュロウイルス発現ベクターを宿主細胞に感染させる工程と、宿主細胞によって産生されたＦＭＤＶカプシド前駆体タンパク質を採取する工程とを含む。

【0016】

本発明は、ＦＭＤＶＶＬＰを産生する方法をさらに提供し、該方法は、本明細書に記載のバキュロウイルス発現ベクターを宿主細胞に感染させ、ここで、発現ベクターが、カプシド前駆体タンパク質を１つ以上のカプシドタンパク質に切断してＶＬＰに集合させることができるプロテアーゼをコードする核酸配列をさらに含み、そして、宿主細胞によって産生されたＶＬＰを採取する、工程を含む。

【0017】

本発明は、ＦＭＤＶカプシド前駆体タンパク質の組換え発現のためのバキュロウイルス発現ベクターの使用にさらに関する。

【0018】

本発明は、ＦＭＤＶＶＬＰを産生し、薬学的に許容される担体を加えることによってＦＭＤＶＶＬＰをワクチンに組み込むことによる、ワクチンを生成する方法にさらに関する。

【0019】

本発明は、宿主細胞内で本発明のバキュロウイルス発現ベクターからＦＭＤＶカプシド前駆体タンパク質を発現させてＶＬＰを産生し、薬学的に許容される担体を加えることによってＶＬＰをワクチンに組み込み、そして、ＶＬＰを対象に投与することによってＦＭＤＶによる感染から対象を保護する方法にさらに関する。

【0020】

本発明は、ＦＭＤＶによる感染から対象を保護するのに使用するための、本発明の第１の態様によるバキュロウイルス発現ベクターにさらに関する。

【0021】

本発明は、ＦＭＤＶによる感染から対象を保護するための医薬の製造に使用するための、本明細書に記載のバキュロウイルス発現ベクターにさらに関する。

【0022】

発明の詳細な説明
用語の定義
用語「核酸配列」は、ＲＮＡ配列またはＤＮＡ配列を含む。ＲＮＡ配列またはＤＮＡ配列は、一本鎖または二本鎖であり得る。ＲＮＡ配列またはＤＮＡ配列は、例えば、ゲノムｍＲＮＡまたはゲノムｃＤＮＡ、組換えｍＲＮＡまたは組換えｃＤＮＡであり得る。

【0023】

本明細書では、用語「開始配列」は、ＦＭＤＶカプシド前駆体タンパク質をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）のＡＴＧ開始コドンの上流に直接近接した、すなわち、５’方向の核酸配列を指す。従来の命名法と一致して、このＡＴＧ開始コドンの「Ａ」ヌクレオチドは、「＋１」として列挙される。さらに具体的には、本発明では、用語「開始配列」は、このＡＴＧ開始コドンに対して－４位から－１位にある核酸配列５’－ＡＡＡＴ－３’を指す。

【0024】

「発現ベクター」（同義語「発現構築物」）は、通常、細胞内の組換え遺伝子発現のために設計されたプラスミドまたはウイルスである。ベクターは、特定の遺伝子を標的細胞に導入するために使用され、該遺伝子によってコードされる目的のタンパク質（ＰＯＩ）を産生するタンパク質合成のための細胞の機構を操作することができる。組換え遺伝子を発現させてＰＯＩを産生するために、発現ベクターは、典型的には、遺伝子発現を開始させるための少なくとも１つのプロモーターを含み、１つ以上の翻訳エンハンサーをさらに含み得る。

【0025】

「バキュロウイルス発現ベクター」は、昆虫細胞などの宿主細胞内の組換え遺伝子発現に使用される、バキュロウイルスに基づく発現ベクターである。バキュロウイルス発現系は、当技術分野で確立されており、Ｂａｃ－ｔｏ－Ｂａｃ発現系（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｇｅｒｍａｎｙ）など、市販されている。これらのバキュロウイルス発現系では、野生型バキュロウイルスゲノム内の天然に存在するポリヘドリン遺伝子は、典型的には組換え遺伝子またはｃＤＮＡによって置換されている。これらの遺伝子は、一般的にポリヘドリンまたはｐ１０バキュロウイルスプロモーターの制御下にある。

【0026】

遺伝子発現に使用される最も一般的なバキュロウイルスは、オートグラファ・カリフォルニカ核多角体病ウイルス（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａｎｕｃｌｅｏｐｏｌｙｈｅｄｒｏｖｉｒｕｓ）（ＡｃＮＰＶ）である。ＡｃＮＰＶは、大きな（１３０ｋｂ）環状二本鎖ＤＮＡゲノムを有する。目的の遺伝子（ＧＯＩ）は、非必須遺伝子座に由来するバキュロウイルスＤＮＡ、例えば、ポリヘドリン遺伝子が隣接するバキュロウイルスプロモーターを含有するトランスファーベクターにクローニングされる。ＧＯＩを含有する組換えバキュロウイルスは、トランスファーベクターと親ウイルス（ＡｃＮＰＶなど）のゲノムとの間の昆虫細胞における相同組換えによって産生される。

【0027】

「翻訳エンハンサー」は、翻訳を促進し、それによってタンパク質産生を増加させることができるエレメントを形成するヌクレオチド配列である。典型的には、翻訳エンハンサーはｍＲＮＡの５’および３’非翻訳領域（ＵＴＲ）に見出され得る。特に、ＧＯＩの開始ＡＴＧコドンのすぐ上流の５’－ＵＴＲ内のヌクレオチドは、翻訳開始のレベルに大きな影響を及ぼし得る。

【0028】

ウイルス「カプシド」は、当技術分野では、典型的にはその遺伝物質を封入するウイルスのタンパク質シェルとして一般的に理解されている。

【0029】

「カプシド前駆体タンパク質」は、ウイルスカプシドまたはその構成要素の形成に関与する、カプシドタンパク質とも呼ばれる１つ以上の構造タンパク質の前駆体である。ＦＭＤＶカプシド前駆体タンパク質は、典型的には、構造タンパク質Ｐ１を含む。タンパク質Ｐ１は、ＦＭＤＶ３Ｃプロテアーゼ（３Ｃｐｒｏ）によって成熟型のＶＰ０、ＶＰ３およびＶＰ１タンパク質にプロセシングされるため、Ｐ１タンパク質は、ポリタンパク質またはプロタンパク質とも呼ばれ得る。本発明に関連して、ＦＭＤＶカプシド前駆体タンパク質は、典型的には、タンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３およびＶＰ４を含む少なくともＰ１を含む。あるいは、ＦＭＤＶカプシド前駆体タンパク質は、タンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３およびＶＰ４のうちの１つ以上を含み得る。ＦＭＤＶカプシド前駆体タンパク質はまた、タンパク質ＶＰ２およびＶＰ４を含むタンパク質ＶＰ０を含み得る。最も好ましくは、ＦＭＤＶカプシド前駆体タンパク質は、Ｐ１および２Ａタンパク質を少なくとも含む（本明細書ではＰ１－２Ａカプシド前駆体とも呼ばれる）。

【0030】

当技術分野では「空カプシド」とも呼ばれ得る「ウイルス様粒子」（ＶＬＰ）は、ウイルスのタンパク質シェルを含むがＲＮＡゲノムまたはＤＮＡゲノムを欠く実体である。ＶＬＰは、同じ構造エピトープを保持するため、野生型ウイルスと同じように抗原性および免疫原性であるはずであるが、ウイルスゲノムの欠如のために感染を生じないはずである。

【0031】

ＦＭＤＶＶＬＰは、典型的には、Ｐ１－２Ａカプシド前駆体から形成される。上記のように、２Ａプロテアーゼは、そのＣ末端でそれ自体を切断して、Ｐ２からＰ１－２Ａを放出する。Ｐ１－２Ａカプシド前駆体のプロセシングは、３Ｃプロテアーゼによって影響を受けて、２Ａならびにカプシドタンパク質ＶＰ０、ＶＰ３およびＶＰ１を産生する。ＶＬＰは、これらのカプシドタンパク質からの自己集合によって形成される。

【0032】

本発明のバキュロウイルス発現系では、昆虫細胞に対して毒性の低い改変３Ｃプロテアーゼを使用してＶＬＰを産生してもよい（Ｐｏｒｔａｅｔａｌ．（２０１３）ＪＶｉｒｏｌＭｅｔｈｏｄｓ）。Ｐ１－２Ａ－３Ｃ発現カセットでは、３Ｃ酵素の中間活性および非毒性活性により、ＶＬＰに集合する構造タンパク質ＶＰ０、ＶＰ１およびＶＰ３へのＰ１－２Ａ前駆体の組換え発現およびプロセシングが可能になる。ＶＬＰの産生は、当技術分野で公知の技術、例えば、スクロース密度遠心分離または電子顕微鏡法を使用して調査または検証され得る（Ａｂｒａｈａｍｓｅｔａｌ（１９９５））。空カプシドの構造および抗原性が保持されているかどうかを調査するために、野生型ウイルス上の立体配座エピトープに特異的なモノクローナル抗体を使用してもよい。

【0033】

本明細書で使用される用語「ワクチン」は、対象に投与された場合、防御免疫応答を誘導または刺激する調製物を指す。ワクチンは、生物を特定の疾患に対して免疫性にすることができる。

【0034】

「ＦＭＤＶによる感染から動物を保護する」とは、ＦＭＤＶによる病原性感染の予防、改善もしくは治癒を補助すること、またはその感染から生じる障害の予防、改善もしくは治癒を補助すること、例えば、ＦＭＤＶによる処置後（すなわち、ワクチン接種後）感染から生じる１つ以上の臨床徴候を予防もしくは低減することを意味する。

【0035】

用語「予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）」または「予防すること（ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ）」は、予防的処置によってＦＭＤＶ感染を回避する、遅延させる、妨げる、または妨害することを指すことを意図している。ワクチンは、例えば、感染性ＦＭＤＶが細胞に入る可能性を予防または低減し得る。

【0036】

バキュロウイルス発現ベクター
本発明の第１の態様のバキュロウイルス発現ベクターは、プロモーターの制御下でＦＭＤＶカプシド前駆体タンパク質を組換え発現させることができる。特に、本発明のバキュロウイルス発現ベクターは、本明細書に記載の開始配列を含み、機能的プロモーターの制御下で宿主細胞内で発現されるＦＭＤＶカプシド前駆体タンパク質をコードする核酸配列を含む発現カセットを含有する。

【0037】

本発明の第１の態様のバキュロウイルス発現ベクターは、プロモーターの制御下でＦＭＤＶカプシド前駆体タンパク質を組換え発現させることができる。発現ベクターは、－４位から－１位にある５’－ＡＡＡＴ－３’の核酸配列を含む。驚くべきことに、本発明では、核酸配列５’－ＡＡＡＴ－３’（本明細書では「開始配列」とも呼ばれるが、宿主細胞内のＦＭＤＶカプシド前駆体タンパク質の組換え発現を増強することができることが見出された。

【0038】

本発明のバキュロウイルス発現ベクターは、－４位から－１位にある５’－ＡＡＡＴ－３’の核酸配列とプロモーターとの間に、１つ以上の制限酵素による切断のための１つ以上の制限部位をさらに含み得る。１つ以上の制限部位は、特に限定されないが、クローニング手順のために当技術分野で従来使用されている任意の制限部位、例えば、ＢｓｔＥＩＩ制限部位であり得る。１つ以上の制限酵素による切断に適した制限部位は、当業者に周知であり、例えば、ＲＥＢＡＳＥ（登録商標）ＲｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎＥｎｚｙｍｅＤａｔａｂａｓｅ（ｈｔｔｐ：／／ｒｅｂａｓｅ．ｎｅｂ．ｃｏｍ／）を介して入手可能である。

【0039】

本発明の好ましい実施形態では、－１１位から－１位で、ＦＭＤＶカプシド前駆体タンパク質をコードするオープンリーディングフレームのＡＴＧ開始コドンに先行する核酸配列は、核酸配列５’－ＧＧＴＡＡＣＣＡＡＡＴ－３’（配列番号１）を有する。

【0040】

本発明のバキュロウイルス発現ベクターは、翻訳エンハンサーなどの１つ以上のシス作用エレメントをさらに含み得る。翻訳エンハンサーは、当技術分野で公知であり、ＦＭＤＶカプシド前駆体タンパク質などのタンパク質の組換え発現を増強するために当該分野で一般的に使用される１つ以上の翻訳エンハンサーから選択され得る。

【0041】

好ましい実施形態では、翻訳エンハンサーは、「Ｂ．Ｄ．Ｐｆｅｉｆｆｅｒｅｔａｌ，ＰＮＡＳ（２０１２），Ｖｏｌ．１０９（１７），ｐ．６６２６－６６３１」に記載されているように、Ｃａｖｅｎｅｒコンセンサス配列をマラコソマ・ネウストリア（Ｍａｌａｃｏｓｏｍａｎｅｕｓｔｒｉａ）核多角体病ウイルス（ＭｎＮＰＶ）ポリヘドリン遺伝子由来のエレメントと組み合わせることによって作製された、２１ヌクレオチド（ｎｔ）のＡＴリッチ合成配列である翻訳エンハンサー「Ｓｙｎ２１」を含む。Ｓｙｎ２１翻訳エンハンサーの核酸配列は、核酸配列５’－ＡＡＣＴＴＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＴＣＡＡＡ－３’（配列番号２）に対応する核酸配列を有し得る。本発明では、翻訳エンハンサーＳｙｎ２１は、典型的には、ＦＭＤＶカプシド前駆体タンパク質をコードする核酸配列の５’非翻訳領域（ＵＴＲ）内に位置する。さらに好ましい実施形態では、配列番号２の核酸配列は、配列番号１の核酸配列に先行する。したがって、本発明のバキュロウイルス発現ベクター内の核酸配列は、以下の順序を有し得る：
５’－配列番号２－配列番号１－ＡＴＧ－ＯＲＦ（ＦＭＤＶコード領域）－３’

【0042】

さらに好ましい実施形態では、翻訳エンハンサーは、典型的には、ＦＭＤＶカプシド前駆体タンパク質をコードする核酸配列の３’ＵＴＲ内に位置する「Ｐ１０ＵＴＲ」を含む。本明細書で使用される用語「Ｐ１０ＵＴＲ」は、「Ｙ．Ｌｉｕｅｔａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．（２０１５），Ｖｏｌ．３７，ｐ．１７６５－１７７１」に記載されているＡｃＮＰＶｐ１０遺伝子由来の３’ＵＴＲに関する。好ましくは、Ｐ１０ＵＴＲは、配列番号３の核酸配列に対応する核酸配列を有する。

【0043】

さらに好ましくは、本発明のバキュロウイルス発現ベクターは、Ｓｙｎ２１およびＰ１０ＵＴＲ翻訳エンハンサーの両方を含む。この好ましい実施形態では、本発明のバキュロウイルス発現ベクター内の核酸配列は、以下の順序を有し得る：
５’－配列番号２－配列番号１－ＡＴＧ－ＯＲＦ（ＦＭＤＶコード領域）－配列番号３－３’

【0044】

用語「Ｓｙｎ２１」および「Ｐ１０ＵＴＲ」には、配列番号２および３のものに対応するが、１つ以上の核酸の変異および／または自然変異などの保存的改変を含む核酸配列が包含される。改変は、１つ以上のヌクレオチドの欠失もしくは付加、または１つ以上の他のヌクレオチドによる１つ以上のヌクレオチドの置換であり得る。保存的改変は、典型的には、翻訳エンハンサーとしての配列の機能を実質的に変化させない改変であり、すなわち、改変された配列は、発現カセットのプロモーターの制御下で依然として発現を増強することができる。

【0045】

ＦＭＤＶカプシド前駆体タンパク質は、好適なプロモーターの制御下で組換え発現される。プロモーターは特に限定されないが、バキュロウイルス発現系におけるＦＭＤＶカプシド前駆体タンパク質の組換え発現が可能な任意のプロモーターであり得る。本発明のバキュロウイルス発現系に使用するのに好ましいプロモーターは、ＡｃＮＰＶのポリヘドリン（ｐｏｌｈ）プロモーター（ＡｙｒｅｓＭ．Ｄ．ｅｔａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９９４），Ｖｏｌ．２０２０，ｐ．５８６－６０５に記載されている）およびｐ１０プロモーター（ＫｎｅｂｅｌＤ．ｅｔａｌ．，ＥＭＢＯＪ．（１９８５）Ｖｏｌ．４（５），１３０１－１３０６に記載されている）である。別の好ましいプロモーターは、Ｓ．エキシグア（Ｓ．ｅｘｉｇｕａ）核多角体病ウイルス（ＳｅＮＰＶ）のｏｒｆ４６ウイルス遺伝子のプロモーター（Ｍ．Ｍａｒｔｉｎｅｚ－Ｓｏｌｉｓｅｔａｌ．，ＰｅｅｒＪ（２０１６），ＤＯＩ１０．７７１７／ｐｅｅｒｊ．２１８３に記載されている）である。

【0046】

タンパク質の組換え発現のためのバキュロウイルス発現系に使用するためのバキュロウイルス発現ベクターは市販されており、タンパク質およびウイルス様粒子の産生では当技術分野で広く使用されている。この系は、例えば、バキュロウイルス発現ベクターが増殖する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞または昆虫細胞などの細胞を形質転換するために使用される１つ以上のトランスファープラスミドを包含し得る。市販のバキュロウイルス発現ベクターには、限定するものではないが、Ｔｏｐ－Ｂａｃ（登録商標）ベクター（ＡＬＧＥＮＥＸ，Ｓｐａｉｎ）、ｐＦａｓｔＢａｃ（登録商標）ベクター（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、ｆｌａｓｈＢＡＣ（登録商標）ベクター（ＯｘｆｏｒｄＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓＬｔｄ，ＵＫ）およびＢｅｓｔＢａｃ（登録商標）ベクター（ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮＳＹＳＴＥＭＳ，ＣＡ）が含まれる。

【0047】

ＦＭＤＶカプシド前駆体タンパク質をコードする核酸配列は、特に限定されず、任意のＦＭＤＶ血清型、例えば、血清型Ａ、Ｏ、Ａｓｉａ１、ＳＡＴ１、ＳＡＴ２、ＳＡＴ３およびＣであり得る。特に好ましい実施形態では、ＦＭＤＶカプシド前駆体タンパク質は、Ａｓｉａ１またはＳＡＴ２血清型に由来する。

【0048】

本発明のバキュロウイルス発現ベクターでは、カプシド前駆体タンパク質は、典型的には、少なくともカプシド前駆体Ｐ１を含む。さらに好ましくは、カプシド前駆体タンパク質は、カプシド前駆体Ｐ１と、２Ａペプチドとを含む。

【0049】

さらに好ましい実施形態では、本発明のバキュロウイルス発現ベクターは、ＦＭＤＶカプシド前駆体タンパク質を１つ以上のカプシドタンパク質に切断することができるプロテアーゼをコードする核酸配列をさらに含む。プロテアーゼは、ＦＭＤＶＶＬＰを産生するために、カプシドの生成および集合の工程としてＦＭＤＶカプシド前駆体タンパク質を切断することができる任意のプロテアーゼであり得る。上述のように、ＦＭＤＶでは、前駆体Ｐ１からＶＰ０（ＶＰ２＋ＶＰ４）、ＶＰ３およびＶＰ１へのタンパク質分解プロセシングは、ウイルス３Ｃプロテアーゼまたはその前駆体３ＣＤによって起こる。したがって、プロテアーゼは、ＦＭＤＶの３Ｃプロテアーゼであることが好ましい。ＦＭＤＶＡ型株由来のＦＭＤＶ野生型３Ｃプロテアーゼの配列は、当技術分野で記載されており、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる国際公開第２０１１／０４８３５３号に開示されている。３Ｃプロテアーゼはまた、そのタンパク質分解活性を低下させる１つ以上の変異、例えば、システイン１４２での変異を含む機能性誘導体であり得る。

【0050】

したがって、さらに好ましい実施形態では、第１の態様のバキュロウイルス発現ベクターは、プロテアーゼをコードする核酸配列をさらに含む核酸配列であり得る。ＦＭＤＶカプシド前駆体タンパク質およびプロテアーゼの核酸配列は、好ましくは連続的に配置される。ＦＭＤＶカプシド前駆体タンパク質およびプロテアーゼをコードする核酸配列間に核酸配列が存在してもよい。参照によりその全体が本明細書に組み込まれる国際公開第２０１１／０４８３５３号に記載されているような制御エレメントなどの制御エレメントが、プロテアーゼの発現を制御するがカプシド前駆体タンパク質の発現を制御するかまたはそれに影響を与えないように、その配列に存在してもよい。

【0051】

カプシド前駆体タンパク質は、プロテアーゼによって１つ以上のカプシドタンパク質に切断されて、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）（の一部）を形成し得る。前駆体タンパク質は、ＶＬＰを形成するのに必要なあらゆるタンパク質を含み得る。

【0052】

カプシド前駆体タンパク質は、３ＣプロテアーゼによってＶＰ０、ＶＰ３およびＶＰ１に切断されるＰ１であり得る。あるいは、カプシド前駆体タンパク質はＰ１－２Ａであり得る。２Ａペプチドは、そのＣ末端でそれ自体を切断して、任意の下流タンパク質配列からＰ１－２Ａを放出する。最も好ましくは、バキュロウイルス発現系は、Ｐ１－２Ａ－３Ｃカセットを発現し、すなわち、タンパク質Ｐ１、２Ａおよび３Ｃのコード領域を同時に発現する。Ｐ１－２Ａ－３Ｃカセットでは、３Ｃ酵素の発現により、ＶＬＰに集合する構造タンパク質へのＰ１－２Ａ前駆体の発現およびプロセシングが可能になる。カプシド前駆体タンパク質およびプロテアーゼは、個々のプロモーターの制御下、または同じプロモーターの制御下で発現され得る。例えば、カプシド前駆体タンパク質は、本明細書に記載の第１のプロモーターの制御下で発現され得、ここで、遺伝子発現は、本明細書に記載の開始配列によって増強され、そして、プロテアーゼは、第１のプロモーターとは異なり得る別個の（第２の）プロモーターの制御下で発現される。

【0053】

カプシド前駆体タンパク質またはＶＬＰの切断は、当技術分野で公知の技術を使用して分析され得る。例えば、バキュロウイルス感染宿主細胞からの抽出物は、ゲル電気泳動によって分離され得、そして、分離されたタンパク質は、ウエスタンブロッティングのためにニトロセルロースメンブランに転写され得る。タンパク質特異的抗体によるウエスタンブロッティングにより、プロテアーゼ媒介性切断の程度が明らかにされるはずである。例えば、ＦＭＤＶの場合、プロセシングされていないカプシド前駆体タンパク質（Ｐ１－２Ａ）は、約８１ｋＤａのバンドとして現れ、切断により、ＶＰ３－１（約４７ｋＤａ）、ＶＰ０（約３３ｋＤａ）、ＶＰ２（約２２ｋＤａ）、ＶＰ３（約２４ｋＤａ）および／またはＶＰ１（約２４ｋＤａ）が産生され得る。

【0054】

宿主細胞
第２の態様では、本発明は、本発明の第１の態様によるバキュロウイルス発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。さらなる実施形態では、宿主細胞は、カプシド前駆体タンパク質を産生することができ、そして、好ましくはＦＭＤＶＶＬＰを産生することができる。

【0055】

宿主細胞は、例えば、細菌細胞、昆虫細胞、植物細胞または哺乳動物細胞であり得る。好ましくは、宿主細胞は、昆虫細胞、例えば、Ｓｆ９細胞（スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）Ｓｆ２１細胞のクローン単離物）またはＴｎｉ細胞（イラクサギンウワバ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａｎｉ）から単離された卵巣細胞）である。最も好ましくは、宿主細胞は、Ｔｎｉ細胞、または、Ｔｎａｏ３８細胞などのＴｎｉ由来細胞株である。

【0056】

昆虫細胞などの宿主細胞の感染は、当業者に周知の標準的な方法によって行われ得る。例えば、バキュロウイルス発現系の商業的供給業者は、典型的には、従うことができる好適な取扱い説明書、例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標）「ＧｕｉｄｅｔｏＢａｃｕｌｏｖｉｒｕｓＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＶｅｃｔｏｒＳｙｓｔｅｍｓ（ＢＥＶＳ）ａｎｄＩｎｓｅｃｔＣｅｌｌＣｕｌｔｕｒｅＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」を提供する。

【0057】

ウイルス様粒子の産生方法
第３の態様では、本発明は、ＦＭＤＶカプシド前駆体タンパク質を産生する方法を提供する。あるいは、本発明は、ＦＭＤＶＶＬＰを産生する方法を提供する。第３の態様による方法は、
（ｉ）第２の態様による宿主細胞に、第１の態様によるバキュロウイルス発現ベクターを感染させる工程、および
（ｉｉａ）宿主細胞によって産生されたＦＭＤＶカプシド前駆体タンパク質を採取する工程、または
（ｉｉｂ）宿主細胞によって産生されたＦＭＤＶＶＬＰを採取する工程、
を含む。

【0058】

したがって、その方法は、カプシド前駆体タンパク質を産生するために、宿主細胞がバキュロウイルス発現ベクターからカプシド前駆体タンパク質を発現するのに適した条件下で宿主細胞を培養することを含む。

【0059】

上記のように、バキュロウイルス発現構築物がＶＬＰに集合する１つ以上のカプシドタンパク質にカプシド前駆体タンパク質を切断することができるプロテアーゼをさらに発現する場合、ＦＭＤＶＶＬＰは宿主細胞によって産生され得る。

【0060】

カプシド前駆体タンパク質またはＶＬＰが宿主細胞によって放出される場合、それらは細胞培養培地から採取され得る。カプシド前駆体タンパク質またはＶＬＰが宿主細胞の内部に保持されている場合、それらは、例えば、
（ｉ）宿主細胞の溶解（例えば、凍結融解による）；ならびに任意で、
（ｉｉ）濃縮（例えば、ＰＥＧ沈殿による）、および／または
（ｉｉｉ）精製、
によって採取され得る。

【0061】

ワクチンおよびその生成
本発明は、ワクチンの生成に使用されるＦＭＤＶＶＬＰの産生にさらに関する。

【0062】

したがって、本発明はまた、ワクチンを生成する方法を提供し、該方法は、第３の態様による方法によってＦＭＤＶＶＬＰを産生する工程と、例えば、薬学的に許容される担体を加えることによってＦＭＤＶＶＬＰをワクチンに組み込む工程とを含む。

【0063】

薬学的に許容される担体は、当技術分野で周知である。単なる例として、そのような担体は、滅菌水、またはＰＢＳなどの緩衝液と、のように単純であり得る。ワクチンは、単一の担体、または２つ以上の担体の組合せを含み得る。ワクチンはまた、１つ以上の薬学的に許容される希釈剤、アジュバントおよび／または賦形剤を含み得る。ワクチンはまた、別の活性剤、例えば、ワクチン接種実体によって誘導される適応免疫応答の前に早期保護を刺激し得るものを含み得るか、または発現させることができ得る。作用物質は、Ｉ型インターフェロンなどの抗ウイルス剤であり得る。代替的にまたはそれに加えて、作用物質は、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）であり得る。

【0064】

ワクチンは、既存のＦＭＤＶ感染を処置するために（特にウイルスが流行している集団または地域で）処置的に使用され得るが、好ましくは、ＦＭＤＶ感染の可能性を阻止もしくは低減するため、および／または疾患を拡大する可能性を防止もしくは低減するために、予防的に使用される。

【0065】

多くの市販のＦＭＤワクチンは、様々なＦＭＤ血清型に対する防御を提供するために多価である。同様に、本発明のワクチンは、各々が所与の血清型内の異なる血清型および／または異なるサブタイプを対象とする複数のワクチン接種実体を含み得る。

【0066】

処置
本発明はまた、本発明のワクチンの有効量の投与によってＦＭＤＶによる感染から対象を保護する方法を提供する。

【0067】

ＦＭＤでは、対象は、偶蹄類であり得る。ＦＭＤに感染しやすい動物には、家畜の中ではウシ、ヒツジ、ブタおよびヤギ、ならびにラクダ科動物（ラクダ、ラマ、アルパカ、グアナコおよびビクーニャ）が含まれる。一部の野生動物、例えば、ハリネズミ、ヌートリア、ならびに任意の野生の偶蹄類、例えば、シカ、およびゾウを含む動物園動物もＦＭＤに感染しやすい。

【0068】

投与
本発明は、本発明によるワクチンの有効量の動物への少なくとも１回の投与を意図する。ワクチンは、任意の局所投与方法または全身投与方法を含む、当技術分野で公知の任意の方法で投与することができる。投与は、例えば、抗原を筋肉組織（筋肉内、ＩＭ）に、真皮（皮内、ＩＤ）に、皮膚の下（皮下、ＳＣ）に、粘膜の下（粘膜下、ＳＭ）に、静脈（静脈内、ＩＶ）に、体腔（腹腔内、ＩＰ）に投与すること、経口、肛門投与することなどによって行うことができる。現在のワクチンの場合、ＩＭ、ＩＤおよびＳＣ投与が好ましい。

【図面の簡単な説明】

【0069】

【図1】標準的なバキュロウイルスベクターが、ＦＭＤＶ関連タンパク質の収率に関してＡＡＡＴ含有ベクターよりも性能が低いことを示し、その差は２倍と推定されることを示す。

【図2】標準的なバキュロウイルスベクターが、ＦＭＤＶ関連タンパク質の収率に関してＡＡＡＴ含有ベクターよりも性能が低いことを示し、その差は２倍と推定されることを示す。

【図3】標準的なバキュロウイルスベクターが、ＦＭＤＶ関連タンパク質の収率に関してＡＡＡＴ含有ベクターよりも良好に機能することを示す。

【図4】標準的なバキュロウイルスベクターが、ＦＭＤＶ関連タンパク質の収率に関してＡＡＡＴ含有ベクターと同等に良好に、またはそれよりもおそらくわずかに良好に機能することを示唆している。

【発明を実施するための形態】

【0070】

［実施例］
本発明は、以下の非限定的な実施例によってさらに説明され、これらの実施例は、本発明を実施する際に当業者を支援するのに役立つように意図されている。

【0071】

Ｐｏｒｔａｅｔａｌ（２０１３；ＪＶｉｒｏｌＭｅｔｈｏｄｓ）によって記載されている標準的なバキュロウイルス発現ベクターは、Ｐ１－２Ａ－３Ｃ発現カセットのＡＴＧ開始コドンの上流にＢｓｔＥＩＩ制限酵素部位を含有する。ＡｃＮＰＶの高発現ポリヘドリン遺伝子に先行する５’－ＡＡＡＴ－３’配列がＰ１－２Ａ－３Ｃ発現カセットの翻訳を改善することができるかどうかを評価した。

【0072】

ＡＴＧ開始コドンの上流の開始配列の２つのバージョンを比較した。比較例として使用したバージョンは、ＡＴＧ開始コドンの上流に特別な配列を含有せず、ＢｓｔＥＩＩ制限酵素部位（ＧＧＴＴＡＣＣＡＴＧＧＧ；以下では「標準」と示す、配列番号４）のみを含有する。本発明によるバージョンは、ＢｓｔＥＩＩ部位とＡＴＧコドンとの間に５’－ＡＡＡＴ－３’配列を有し、ＢｓｔＥＩＩ部位に単一のヌクレオチド変化（ＧＧＴＡＡＣＣＡＡＡＴＡＴＧＧＧ；以下では「ＡＡＡＴ」と示す、配列番号５）を含有する。

【0073】

実施例１～４で使用したバキュロウイルス発現プラスミドは、発現がポリヘドリン（ｐｏｌｈ）プロモーターによって促進される標準的なバキュロウイルストランスファーベクターｐＦａｓｔＢａｃ（登録商標）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に基づいた。当技術分野で周知の標準的なクローニング手順を使用することによって、Ｐ１－２Ａ－３Ｃカプシド前駆体タンパク質をコードする核酸配列を含む発現プラスミドを得た。発現プラスミドの核酸配列は、配列番号６～９に従う。

【0074】

［実施例１］
ＦＭＤＶＡｓｉａ１血清型に基づくＰ１－２Ａ－３Ｃ発現カセットの発現
この実施例では、「ＡＡＡＴ」発現カセットからのＡｓｉａ１血清型のＦＭＤＶカプシド前駆体タンパク質の発現レベルと、ＡＡＡＴ配列を含まない「標準」発現カセットからの発現とを比較する。

【0075】

３．２×１０^５細胞／ｍｌのＴｎｉ細胞を含有する１００ｍｌの三角フラスコに、ＦＭＤＶＡｓｉａ１血清型のＡｓｉａ１／Ｉｒｎ／４９／１１ＶＰ２－Ｓ９３Ｙに基づくＰ１－２Ａ－３Ｃ発現カセットを含有する組換えバキュロウイルスをＭＯＩ＝１で感染させた。培養物を４ｄｐｉで採取し、細胞を遠心分離によって回収し、続いて、元の培養体積の１／１０でＴｒｉｓ－ＫＣｌｐＨ８．０緩衝液中で超音波処理した。

【0076】

ＬｏｕｒｅｉｒｏＳ．ｅｔａｌ．，ＷｅｌｌｃｏｍｅＯｐｅｎＲｅｓ２０１８，３：８８によって記載されるように、抗ＶＰ０モノクローナル抗体を使用するウエスタンブロッティングによって試料を分析した。

【0077】

ウエスタンブロットの目視検査は、標準的なバキュロウイルスベクターが、ＦＭＤＶ関連タンパク質の収率に関してＡＡＡＴ含有ベクターよりも性能が低いことを示し、その差は２倍と推定される（図１）。

【0078】

［実施例２］
ＦＭＤＶＳＡＴ２血清型に基づくＰ１－２Ａ－３Ｃ発現カセットの発現
この実施例では、「ＡＡＡＴ」発現カセットからのＳＡＴ２血清型のＦＭＤＶカプシド前駆体タンパク質の発現レベルと、ＡＡＡＴ配列を含まない「標準」発現カセットからの発現とを比較する。

【0079】

ＦＭＤＶＳＡＴ２血清型のＳＡＴ２／Ｅｇｙ／２／１２ＶＰ２－Ｋ９３Ｙに基づくＰ１－２Ａ－３Ｃ発現カセットを含有する組換えバキュロウイルスに感染させたＴｎｉ細胞を培養し、実施例１に記載されるように培養物を採取した。

【0080】

Ｏｐｐｅｒｍａｎｅｔａｌ．，２０１４，ＪＶｉｒｏｌによって記載されているように、５つのＳＡＴ２特異的モノクローナル抗体：１Ｄ５、ＤＡ１０、ＧＥ１１、ＧＤ１２およびＧＧ１のカクテルを使用するウエスタンブロッティングによって試料を分析した。ウエスタンブロットの目視検査は、標準的なバキュロウイルスベクターが、ＦＭＤＶ関連タンパク質の収率に関してＡＡＡＴ含有ベクターよりも性能が低いことを示し、その差は２倍と推定される（図２；ブロット上の２つのタンパク質、ＶＰ１およびＶＰ１＋ＶＰ３は、サイズおよび反応パターンに基づいて示されているが、どのＦＭＤＶタンパク質が５つのモノクローナル抗体のカクテルによって検出されるかは検証されていないことに留意されたい）。

【0081】

［実施例３］
ＦＭＤＶＯ血清型に基づくＰ１－２Ａ－３Ｃ発現カセットの発現
この実施例では、「ＡＡＡＴ」発現カセットからのＯ血清型のＦＭＤＶカプシド前駆体タンパク質の発現レベルと、ＡＡＡＴ配列を含まない「標準」発現カセットからの発現とを比較する。

【0082】

ＦＭＤＶＯ血清型のＯ／Ｔｕｒ／５／０９ＶＰ２－Ｓ９３Ｆに基づくＰ１－２Ａ－３Ｃ発現カセットを含有する組換えバキュロウイルスに感染させたＴｎｉ細胞を培養し、実施例１に記載されるように培養物を採取した。細胞に加えて、実施例１に記載の遠心分離工程後に上清試料を回収した。上清試料とは、細胞を含まない細胞培養液を表す。

【0083】

ＬｏｕｒｅｉｒｏＳ．ｅｔａｌ．，ＷｅｌｌｃｏｍｅＯｐｅｎＲｅｓ２０１８，３：８８によって記載されるように、抗ＶＰ０モノクローナル抗体を使用するウエスタンブロッティングによって、細胞および上清試料を分析した。ウエスタンブロットの目視検査は、標準的なバキュロウイルスベクターが、ＦＭＤＶ関連タンパク質の収率に関してＡＡＡＴ含有ベクターよりも良好に機能することを示す（図３）。

【0084】

［実施例４］
ＦＭＤＶＡ血清型に基づくＰ１－２Ａ－３Ｃ発現カセットの発現
この実施例では、「ＡＡＡＴ」発現カセットからのＡ血清型のＦＭＤＶカプシド前駆体タンパク質の発現レベルと、ＡＡＡＴ配列を含まない「標準」発現カセットからの発現とを比較する。

【0085】

ＦＭＤＶＡ血清型のＡ／Ｉｒｎ／７／１３ＶＰ２－Ｈ９３Ｆに基づくＰ１－２Ａ－３Ｃ発現カセットを含有する組換えバキュロウイルスに感染させたＴｎｉ細胞を培養し、実施例３に記載されるように培養物を採取した。

【0086】

ポリクローナルウシ血清（ＭＳＤＡｎｉｍａｌＨｅａｌｔｈ，ＮＬ）を使用するウエスタンブロッティングによって、細胞および上清試料を分析した。ウエスタンブロットの目視検査は、標準的なバキュロウイルスベクターが、ＦＭＤＶ関連タンパク質の収率に関してＡＡＡＴ含有ベクターと同等に良好に、またはそれよりもおそらくわずかに良好に機能することを示唆している（図４）。

【0087】

結果の要約：

【表1】