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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-11-27
(54)【発明の名称】骨折修復用の無痛神経成長因子
(51)【国際特許分類】
A61K 38/18 20060101AFI20231117BHJP
A61P 19/08 20060101ALI20231117BHJP
A61L 31/02 20060101ALI20231117BHJP
A61L 31/10 20060101ALI20231117BHJP
C07K 14/48 20060101ALN20231117BHJP
【ＦＩ】
A61K38/18 ZNA
A61P19/08
A61L31/02
A61L31/10
C07K14/48
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023553167
(86)(22)【出願日】2021-11-17
(85)【翻訳文提出日】2023-07-14
(86)【国際出願番号】 US2021059794
(87)【国際公開番号】W WO2022109073
(87)【国際公開日】2022-05-27
(31)【優先権主張番号】63/114,921
(32)【優先日】2020-11-17
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】522057766
【氏名又は名称】ステッドマン・フィリポン・リサーチ・インスティテュート
(71)【出願人】
【識別番号】523183770
【氏名又は名称】チェルシー・バーニー
(71)【出願人】
【識別番号】523183781
【氏名又は名称】テジャル・デサイ
(71)【出願人】
【識別番号】523183792
【氏名又は名称】ケヴィン・リベラ
(71)【出願人】
【識別番号】523183806
【氏名又は名称】チョンビアオ・ウー
(74)【代理人】
【識別番号】100127926
【弁理士】
【氏名又は名称】結田 純次
(74)【代理人】
【識別番号】100140132
【弁理士】
【氏名又は名称】竹林 則幸
(74)【代理人】
【識別番号】100216105
【弁理士】
【氏名又は名称】守安 智
(72)【発明者】
【氏名】チェルシー・バーニー
(72)【発明者】
【氏名】テジャル・デサイ
(72)【発明者】
【氏名】ケヴィン・リベラ
(72)【発明者】
【氏名】チョンビアオ・ウー
【テーマコード（参考）】
4C081
4C084
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C081AB02
4C081AC06
4C081BA05
4C081CE02
4C081CE03
4C084AA02
4C084BA01
4C084BA08
4C084BA22
4C084CA53
4C084DB59
4C084MA17
4C084MA66
4C084NA14
4C084ZA961
4H045AA10
4H045AA30
4H045CA40
4H045DA21
4H045EA20
(57)【要約】
本開示は、骨折治癒を刺激するための方法であって、無痛神経成長因子（ＮＧＦ）を含む生体材料担体を含む医薬組成物を投与することを含む、方法に関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
対象において骨治癒を刺激するための、対象において骨治癒を促進するための、および／または対象において骨治癒を改善するための方法であって、神経成長因子（ＮＧＦ）を含む医薬組成物を対象に投与することを含む、方法。
【請求項2】
対象において骨治癒を刺激するための、対象において骨治癒を促進するための、および／または対象において骨治癒を改善するための方法であって、神経成長因子（ＮＧＦ）を含む生体材料担体を含む医薬組成物を対象に投与することを含む、方法。
【請求項3】
骨治癒は骨折治癒である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項4】
ＮＧＦは変異ＮＧＦである、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項5】
ＮＧＦは、成熟ＮＧＦタンパク質の１００番アミノ酸において変異を有する、請求項４に記載の方法。
【請求項6】
ＮＧＦはＮＧＦＲ１００Ｗである、請求項４または５に記載の方法。
【請求項7】
対象において軟骨から骨への変換が促進される、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項8】
生体材料担体は生体適合性である、請求項２～７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項9】
生体材料担体は生分解性である、請求項２～８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項10】
生体材料担体はナノワイヤ、ナノチューブ、ナノロッド、マイクロワイヤ、マイクロチューブ、およびマイクロロッドからなる群から選択される、請求項２～９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項11】
生体材料担体はマイクロロッドである、請求項２～１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項12】
生体材料担体はナノワイヤである、請求項２～１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項13】
ナノワイヤはヘパリンでコーティングされている、請求項１２に記載の方法。
【請求項14】
組成物は皮下注射または経皮注射によって投与される、請求項１～１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項15】
投与は局所投与である、請求項１～１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項16】
骨折部中で骨形成が増加する、請求項４～１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項17】
骨治癒は軟骨内治癒である、請求項１～１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項18】
対象は正常な骨治癒を示す、請求項１～１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項19】
対象は遷延癒合または偽関節の骨治癒を示す、請求項１～１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項20】
組成物の投与時に血清コラーゲンＸ（Ｃｘｍ）の発現が早期化および／または増加する、請求項１～１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項21】
ＮＧＦ関連侵害受容が最小化される、請求項１～２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項22】
組成物は骨治癒の軟骨内期または軟骨期に投与される、請求項１～２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項23】
組成物は骨折の約２カ月後～約３カ月後に投与される、請求項３～２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項24】
対象は、二次治癒または軟骨内修復を通じて治癒する骨中で骨折を示す、請求項１～２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項25】
対象は長管骨骨折を示す、請求項１～２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項26】
新たに形成された骨は、より高い骨梁数、連結性密度、および／または骨塩量を含む、請求項１～２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項27】
組成物の投与時に、対象における軟骨量が減少し、対象における骨量が増加する、請求項１～２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項28】
ｉ）神経成長因子（ＮＧＦ）およびｉｉ）薬学的に許容される担体を含む、対象において骨治癒を刺激すること、対象において骨治癒を促進すること、および／または対象において骨治癒を改善することにおける使用のための医薬組成物。
【請求項29】
ｉ）神経成長因子（ＮＧＦ）を含む生体材料担体およびｉｉ）薬学的に許容される担体を含む、対象において骨治癒を刺激すること、対象において骨治癒を促進すること、および／または対象において骨治癒を改善することにおける使用のための医薬組成物。
【請求項30】
ｉ）神経成長因子（ＮＧＦ）およびｉｉ）薬学的に許容される担体を含む、対象において骨折を処置することにおける使用のための医薬組成物。
【請求項31】
ｉ）神経成長因子（ＮＧＦ）を含む生体材料担体およびｉｉ）薬学的に許容される担体を含む、対象において骨折を処置することにおける使用のための医薬組成物。
【請求項32】
ＮＧＦは変異ＮＧＦである、請求項２８～３１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項33】
ＮＧＦは、成熟ＮＧＦタンパク質の１００番アミノ酸において変異を有する、請求項３２に記載の組成物。
【請求項34】
ＮＧＦはＮＧＦＲ１００Ｗである、請求項３２または３３に記載の組成物。
【請求項35】
生体材料担体は生体適合性である、請求項２９および３１～３４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項36】
生体材料担体は生分解性である、請求項２９および３１～３５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項37】
生体材料担体はナノワイヤ、ナノチューブ、ナノロッド、マイクロワイヤ、マイクロチューブ、およびマイクロロッドからなる群から選択される、請求項２９および３１～３６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項38】
生体材料担体はマイクロロッドである、請求項２９および３１～３７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項39】
生体材料担体はナノワイヤである、請求項２９および３１～３７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項40】
ナノワイヤはヘパリンでコーティングされている、請求項３９に記載の組成物。
【請求項41】
骨治癒は骨折治癒である、請求項２８、２９、および３２～４０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項42】
組成物は皮下注射または経皮注射によって対象に投与される、請求項２８～４１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項43】
投与は局所投与である、請求項４２に記載の組成物。
【請求項44】
骨治癒は軟骨内治癒である、請求項２８、２９、および３２～４３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項45】
対象は正常な骨治癒を示す、請求項２８～４４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項46】
対象は遷延癒合または偽関節の骨治癒を示す、請求項２８～４４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項47】
組成物は骨治癒の軟骨内期／軟骨期に対象に投与される、請求項２８～４６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項48】
組成物は骨折の約２カ月後～約３カ月後に対象に投与される、請求項２８～４６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項49】
対象は、二次治癒または軟骨内修復を通じて治癒する骨中で骨折を示す、請求項２８～４８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項50】
対象は長管骨骨折を示す、請求項２８～４９のいずれか１項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本開示は、骨折治癒を刺激するための方法であって、無痛神経成長因子（ＮＧＦ）を含む生体材料担体を含む医薬組成物を投与することを含む、方法に関する。
【0002】
関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年１１月１７日に出願の米国仮特許出願第６３／１１４，９２１号の優先権を主張するものであり、その内容全体が参照によって本明細書に組み入れられる。
本出願は、２０２０年１１月１７日に出願の米国仮特許出願第６３／１１４，９２１号の優先権を主張するものであり、その内容全体が参照によって本明細書に組み入れられる。
【0003】
配列に関する記載
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された、その全体が参照によって本明細書に組み入れられる、配列表を含む。２０２１年１１月１６日に作られた前記ＡＳＣＩＩコピーは、１８４７２－００１４ＷＯＵ１＿ＳＥＱＬＩＳＴＩＮＧ．ｔｘｔと命名され、サイズが９キロバイトである。
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された、その全体が参照によって本明細書に組み入れられる、配列表を含む。２０２１年１１月１６日に作られた前記ＡＳＣＩＩコピーは、１８４７２－００１４ＷＯＵ１＿ＳＥＱＬＩＳＴＩＮＧ．ｔｘｔと命名され、サイズが９キロバイトである。
【背景技術】
【0004】
米国（ＵＳ）では毎年約１５００万件の骨折損傷が発生している。健康集団内の骨折の推定１０～１５％において遷延癒合または偽関節が生じている。しかし、血管損傷、または高併存症負荷、例えば糖尿病、加齢、喫煙、および肥満を有する患者では、遷延治癒率は約５０％に増加する。遷延癒合または偽関節に対する現行の標準治療は、移植骨の適用を通じて安定性を増加させるかまたは治癒を促進するための外科的介入である。しかし、外科的介入では、長期的な患者の身体障害が生じることがあり、また、癒合を実現するために複数回の手術が必要になることがある。骨自家移植は依然としてこれらの場合において骨治癒を増大させるためのゴールドスタンダートの臨床技術であり、また、自家移植は良好な治癒結果を伴ってはいるが、骨採取は手術時間を増加させ、合併症の危険性を約６０％増加させ、供与部位の罹患の高い発生率を伴っており、また、大きな欠損部を埋め合わせるために利用可能な骨は十分には存在しない。
【0005】
骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）は、骨折修復における使用に関してＦＤＡの承認を受けた唯一のバイオ医薬品であるが、非常に狭い指示ウィンドウの範囲内でのみ「オンラベルで」使用される。しかし、ＢＭＰは、外科的埋め込みを必要とするものであり、また、コストが高いこと、臨床的効能のエビデンスが限られていること、および重度のオフターゲット作用の危険性があることが理由で、通常は最も危険性の高い骨折にのみ限定される。したがって、非外科的送達プラットフォームで骨再生を刺激する可能性があるバイオ医薬品の満たされていない臨床上の必要性が存在する。
【0006】
骨折は、無血管で無神経の中間軟骨を血管新生化および神経支配された骨に変換するプロセスである軟骨内骨化（ＥＯ）を通じて主に治癒する。骨修復の成功に軟骨内骨化が重要であるにもかかわらず、骨再生に対する治療アプローチは伝統的に、骨軟骨前駆細胞の直接的な骨芽細胞分化を通じて骨を形成する、ＢＭＰの使用を通じた膜内骨化を促進することに重点を置いている。
【0007】
骨が高度に神経支配された器官系であることは長く理解されているが、骨成長、骨恒常性、および骨折修復における神経支配の機能的役割は複雑かつ進化中である。神経成長因子（ＮＧＦ）は、１９５０年代初頭に最初に発見され、数十年の研究を経て、現在では中枢系および末梢系中のコリン作動性神経の分化、成長、生存、および可塑性を制御する上での役割が証明されている。ＮＧＦは、主に高親和性トロポミオシン受容体キナーゼＡ（ＴｒｋＡ）受容体に対する結合を通じて栄養機能を発揮する。骨が高度に神経支配された器官系であることは長く理解されているが、骨成長、骨恒常性、および骨疾患における神経支配の機能的役割は複雑かつ進化中である。
【0008】
交感神経および感覚神経の生存および分化に対するＮＧＦの強力な栄養作用を理由として、アルツハイマー病、糖尿病神経障害、化学療法誘発性末梢神経障害、およびＨＩＶ関連末梢神経障害に関するＮＧＦの安全性および効能を試験する重要な基礎科学研究およびいくつかの臨床試験が行われた。しかしながら、ＴｒｋＡ受容体に対するＮＧＦの高親和性結合に加えて、ＮＧＦは、痛覚に著しく寄与することが最近の研究において示唆されている７５ｋＤａ神経栄養因子受容体（ｐ７５ＮＴＲ）に対する低親和性結合も示す。残念ながら、ＮＧＦの用量依存的臨床試験において、背痛および注射部位痛覚過敏を含む重大な副作用が指摘され、その後、ほぼすべての試験が中断された。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0009】
１つの態様では、本開示は、対象において骨治癒を刺激するための、対象において骨治癒を促進するための、および／または対象において骨治癒を改善するための方法であって、神経成長因子（ＮＧＦ）を含む医薬組成物を該対象に投与することを含む、方法を提供する。
【0010】
別の態様では、本開示は、対象において骨治癒を刺激するための、対象において骨治癒を促進するための、および／または対象において骨治癒を改善するための方法であって、神経成長因子（ＮＧＦ）を含む生体材料担体を含む医薬組成物を該対象に投与することを含む、方法を提供する。特定の実施形態では、ＮＧＦを「含む」生体材料担体とは、ＮＧＦが生体材料担体、例えばマイクロロッドまたはナノワイヤに加えられて、実質的に吸着されていることを意味する。さらなる実施形態では、生体材料担体はＮＧＦの吸着後に保存安定性のために凍結または凍結乾燥される。他の実施形態では、生体材料担体およびＮＧＦはポイントオブケア設定で構築／混合される。
【0011】
本発明の方法の１つの実施形態では、骨治癒は骨折治癒である。
【0012】
本開示の方法の１つの実施形態では、ＮＧＦは変異ＮＧＦである。別の実施形態では、ＮＧＦは、成熟ＮＧＦタンパク質の１００番アミノ酸において変異を有する。さらに別の実施形態では、（成熟）ＮＧＦは「無痛ＮＧＦ」であり、ＮＧＦＲ１００Ｗとも呼ばれる。野生型ＮＧＦアミノ酸配列は配列番号１（ヒト）および３（マウス）で示される。無痛ＮＧＦ／ＮＧＦＲ１００Ｗアミノ酸配列は配列番号２（ヒト）および４（マウス）で示される。
【0013】
本開示の方法の１つの実施形態では、対象において軟骨から骨への変換が促進される。
【0014】
本開示の方法の１つの実施形態では、生体材料担体は生体適合性である。別の実施形態では、生体材料担体は生分解性である。さらに別の実施形態では、生体材料担体はナノワイヤ、ナノチューブ、ナノロッド、マイクロワイヤ、マイクロチューブ、およびマイクロロッドからなる群から選択される。１つの実施形態では、生体材料担体はマイクロロッドである。さらに別の実施形態では、生体材料担体はナノワイヤである。さらなる実施形態では、ナノワイヤはヘパリンでコーティングされている。
【0015】
本開示の方法の１つの実施形態では、組成物は皮下注射または経皮注射によって投与される。別の実施形態では、投与は局所投与である。さらに別の実施形態では、投与は損傷部位および／または骨折部位に対する局所投与である。
【0016】
本開示の方法の１つの実施形態では、骨折部中で骨形成が増加する。
【0017】
本開示の方法の別の実施形態では、骨治癒は軟骨内治癒である。
【0018】
本開示の方法のさらに別の実施形態では、対象は正常な骨治癒を示す。別の実施形態では、対象は遷延癒合または偽関節の骨治癒を示す。
【0019】
本開示の方法の１つの実施形態では、組成物の投与時に血清コラーゲンＸ（Ｃｘｍ）の発現が早期化および／または増加する。
【0020】
本開示の方法の別の実施形態では、ＮＧＦ関連侵害受容が最小化される。
【0021】
本開示の方法の１つの実施形態では、組成物は骨治癒の軟骨内期または軟骨期に投与される。さらなる実施形態では、組成物は軟骨形成期に、または軟骨が骨に変換される時期に投与される。これらは真に別々の時点というわけではなく、重複した時点で発生する。別の実施形態では、組成物は骨折の約１カ月後～約４カ月後に投与される。さらに別の実施形態では、組成物は骨折の約２カ月後～約３カ月後に投与される。さらなる実施形態では、治癒が遷延する／遷延癒合が観察される場合、本開示の組成物が少なくとも再度投与され、場合によっては３回以上投与される。
【0022】
本開示の方法の１つの実施形態では、対象は、二次治癒または軟骨内修復を通じて治癒する骨中で骨折を示す。別の実施形態では、対象は長管骨骨折を示す。
【0023】
本開示の方法の１つの実施形態では、新たに形成された骨は、より高い骨梁数、連結性密度、および／または骨塩量を含む。
【0024】
本開示の方法の１つの実施形態では、組成物の投与時に、対象における軟骨量が減少し、対象における骨量が増加する。別の実施形態では、組成物の投与時に、対象における軟骨量が少なくとも約１０％減少し、対象における骨量が少なくとも約１０％増加する。さらに別の実施形態では、組成物の投与時に、対象における軟骨量が少なくとも約２５％減少し、対象における骨量が少なくとも約２５％増加する。
【0025】
さらなる実施形態では、本開示の方法は骨粗鬆症の徴候において有用である。さらなる実施形態では、骨粗鬆症の徴候は骨粗鬆症性骨折である。なおさらなる実施形態では、骨粗鬆症性骨折は非定型大腿骨頸部骨折である。
【0026】
さらなる実施形態では、本開示の方法は頭蓋顔面徴候において有用である。さらなる実施形態では、頭蓋顔面徴候は狭頭症／頭蓋縫合早期癒合症、口蓋裂、下顎骨骨折、頭蓋骨骨折、および頭蓋骨欠損からなる群から選択される。
【0027】
１つの態様では、本開示は、ｉ）神経成長因子（ＮＧＦ）およびｉｉ）薬学的に許容される担体を含む、対象において骨治癒を刺激すること、対象において骨治癒を促進すること、および／または対象において骨治癒を改善することにおける使用のための医薬組成物を提供する。１つの実施形態では、骨治癒は骨折治癒である。
【0028】
別の態様では、本開示は、ｉ）神経成長因子（ＮＧＦ）を含む生体材料担体およびｉｉ）薬学的に許容される担体を含む、対象において骨治癒を刺激すること、対象において骨治癒を促進すること、および／または対象において骨治癒を改善することにおける使用のための医薬組成物を提供する。１つの実施形態では、骨治癒は骨折治癒である。
【0029】
１つの態様では、本開示は、ｉ）神経成長因子（ＮＧＦ）およびｉｉ）薬学的に許容される担体を含む、対象において骨折を処置することにおける使用のための医薬組成物を提供する。
【0030】
別の態様では、本開示は、ｉ）神経成長因子（ＮＧＦ）を含む生体材料担体およびｉｉ）薬学的に許容される担体を含む、対象において骨折を処置することにおける使用のための医薬組成物を提供する。
【0031】
本開示の医薬組成物の１つの実施形態では、ＮＧＦは変異ＮＧＦである。別の実施形態では、ＮＧＦは、成熟ＮＧＦタンパク質の１００番アミノ酸において変異を有する。さらに別の実施形態では、成熟ＮＧＦはＮＧＦＲ１００Ｗである。
【0032】
本開示の医薬組成物の１つの実施形態では、生体材料担体は生体適合性である。別の実施形態では、生体材料担体は生分解性である。さらに別の実施形態では、生体材料担体はナノワイヤ、ナノチューブ、ナノロッド、マイクロワイヤ、マイクロチューブ、およびマイクロロッドからなる群から選択される。別の実施形態では、生体材料担体はマイクロロッドである。さらに別の実施形態では、生体材料担体はナノワイヤである。さらなる実施形態では、ナノワイヤはヘパリンでコーティングされている。
【0033】
１つの実施形態では、本開示の医薬組成物は皮下注射または経皮注射によって対象に投与される。別の実施形態では、投与は局所投与である。さらに別の実施形態では、投与は損傷部位および／または骨折部位に対する局所投与である。
【0034】
本開示の組成物の１つの実施形態では、骨治癒は軟骨内治癒である。別の実施形態では、対象は正常な骨治癒を示す。さらに別の実施形態では、対象は遷延癒合または偽関節の骨治癒を示す。
【0035】
１つの実施形態では、本開示の医薬組成物は骨治癒の軟骨内期／軟骨期に投与される。別の実施形態では、組成物は骨折の約１カ月後～約４カ月後に投与される。さらに別の実施形態では、組成物は骨折の約２カ月後～約３カ月後に投与される。さらなる実施形態では、治癒が遷延する／遷延癒合が観察される場合、本開示の組成物が少なくとも再度投与される。
【0036】
本開示の組成物の１つの実施形態では、対象は、二次治癒または軟骨内修復を通じて治癒する骨中で骨折を示す。別の実施形態では、対象は長管骨骨折を示す。
【0037】
さらなる実施形態では、本開示の組成物は骨粗鬆症の徴候において有用である。さらなる実施形態では、骨粗鬆症の徴候は骨粗鬆症性骨折である。なおさらなる実施形態では、骨粗鬆症性骨折は非定型大腿骨頸部骨折である。
【0038】
さらなる実施形態では、本開示の組成物は頭蓋顔面徴候において有用である。さらなる実施形態では、頭蓋顔面徴候は狭頭症／頭蓋縫合早期癒合症、口蓋裂、下顎骨骨折、頭蓋骨骨折、および頭蓋骨欠損からなる群から選択される。
【0039】
他の実施形態は、後続する詳細な説明を精査することで明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【0040】
【図1】脛骨骨折のマウスモデルにおける軟骨内骨折修復の時期およびタイムラインの模式図を示す。ＮＧＦまたは無痛ＮＧＦは、軟骨から骨への変換（紫色）を促進することで膜内骨形成または軟骨内骨形成を促進することにより作用することができる。タイムラインはマウスの治癒に関するものである。ヒトスケールは通常治癒に関して約４～６倍の長さである。
【図2】図２Ａおよび図２Ｂは、無痛ＮＧＦが熱痛覚過敏を誘発しないことを示す。（図２Ａ）５５℃での足引っ込め潜時（平均値±ＳＥＭ、ＡＮＯＶＡに続いてベースラインに対するダネット多重比較）；（図２Ｂ）ベースラインからの侵害受容閾値の減少。
【図3-1】図３Ａ～図３Ｌは、ＮＧＦＲ１００ＷがＣＭＴ２Ｂ変異マウスにおいて足皮膚感覚神経の再生を促進することを示す。ＣＭＴ２Ｂ変異マウスに野生型ＮＧＦ（同側、図３Ｂ、対側、図３Ｅ）もしくはＮＧＦＲ１００Ｗ（同側、図３Ｃ、対側、図３Ｆ）を週２回皮内注射したか、または該マウスを未処置のままとした（図３Ａ）。（図３Ｄ）棒グラフ形式での染色切片におけるＩＥＮＦの相対密度（平均グレイ値／単位面積）。注射の６週間後、マウスを屠殺し、後足皮膚を抽出し、固定し、切片にし、ＰＧＰ９．５について染色した。Ｅｐｉ：表皮；ＳＮＰ：表皮下神経叢；赤色矢印：ＩＥＮＦ（上皮内神経線維）。ＡＮＯＶＡ 平均値±ＳＥＭ、＊＊＊ｐ＜０．００５；＊＊＊＊ｐ＜０．００１（ダネット検定）。無痛ＮＧＦは、無痛および野生型ＮＧＦによるＡＴＤＣ５細胞中での軟骨内骨化の同様のインビトロ刺激を示す。軟骨形成細胞をＮＧＦまたはＮＧＦＲ１００Ｗ ２０ｇ／ｍＬで処理し、処理の１時間後または２４時間後に遺伝子発現を（図３Ｇ）Ｖｅｇｆ、（図３Ｈ）Ａｘｉｎ ２、および（図３Ｉ）ＩｈｈについてｑＲＴ－ＰＣＲにより測定した。（Ｎ＝３、＊＊＝ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００５、チューキーＨＳＤによる）。ＮＧＦＲ１００Ｗは軟骨細胞中で栄養活性を示す。ＮＧＦＲ１００Ｗ（緑色）は濃度０．２ｍｇで上方制御軟骨内（インディアンヘッジホッグ、Ｉｈｈ）ならびに骨形成（アルカリホスファターゼおよびオステオカルシン）遺伝子を通じてＮＧＦＷＴ（青色）に比べて強化された生物活性を示した。ＡＴＤＣ５軟骨形成細胞を軟骨形成培地中で７日間培養した後、ＮＧＦまたはＮＧＦＲ１００Ｗ ０．２または２０ｍｇを２４時間かけて加えた。ｍＲＮＡを単離し、（図３Ｊ）インディアンヘッジホッグ、ｉｈｈ、（図３Ｋ）アルカリホスファターゼ、ａｌｐ、および（図３Ｌ）オステオカルシンを含む多くの遺伝子についてｑＲＴ－ＰＣＲを行った。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊ｐ＜０．００５。
【図4-1】図４Ａ～図４Ｈは、軟骨内修復中の骨折仮骨内での神経成長因子（ＮＧＦ）およびその受容体トロポミオシン受容体キナーゼＡ（ＴＲＫＡ）の内在性発現を示す。（図４Ａ）脛骨全体の肉眼的蛍光透視画像。赤色の枠は不安定型中央骨幹骨折を示す。（図４Ｂ）骨折１４日後の脛骨骨折仮骨のＨＢＱ染色切片の代表画像（ｎ＝４）。スケールバー：１ｍｍ（図４Ｃ）骨折１４日後の軟骨・骨移行部（ＴＺ）のＮＧＦ－ｅＧＦＰとＤＡＰＩによる蛍光画像（ｎ＝４）。スケールバー：２００μｍ（図４Ｄ）骨折１４日後のＸ－ＧＡＬ染色仮骨の明視野画像（ｎ＝４）。矢印は仮骨内のＬＡＣＺ＋細胞のさらなる領域を示す。スケールバー：５００μｍ（図４Ｅ）骨折仮骨内のＴＺの高倍率画像。（図４Ｆ）皮質骨の高倍率画像は染色を示さない。（図４Ｅ、図４Ｆ）スケールバー：２００μｍ（図４Ｇ、図４Ｈ）骨折７日後、１０日後、および１４日後に骨折仮骨から採取された（図４Ｇ）Ｎｇｆおよび（図４Ｈ）ＴｒｋＡのＧａｐｄｈに対して正規化された相対発現（２－ΔＣＴ）。エラーバーはＳＥＭを表す。＊ｐ＜０．０５；ＡＮＯＶＡおよびチューキー多重比較検定により確定。
【図5-1】図５Ａ～図５Ｄは、肥大軟骨期の局所β－ＮＧＦ注射が骨形成マーカー発現を促進することを示す。（図５Ａ）骨折、および骨折４日後に開始するβ－ＮＧＦまたは対照（培地注射）０．５μｇの１日３回の注射のタイムラインの模式図。（図５Ｂ）最終注射の２４時間後に採取された全仮骨組織に由来する選択された骨形成マーカーおよび血管新生マーカーの発現レベル。（図５Ｃ）骨折、および骨折７日後に開始するβ－ＮＧＦまたは対照０．５μｇの１日３回の注射のタイムライン。（図５Ｄ）最終注射の２４時間後に採取された全仮骨組織に由来する骨形成マーカーおよび血管新生マーカーの発現レベル。すべての発現レベルはＧａｐｄｈに対して相対的であり、２－ΔＣＴにより計算される。エラーバーはＳＥＭを表す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１；両側ｔ検定により確定。
【図6-1】図６Ａ～図６Ｃ組換えヒトβ－ＮＧＦ（β－ＮＧＦ）が軟骨内骨形成に関する遺伝子発現プロファイルを促進することを示す。（図６Ａ）β－ＮＧＦで刺激された肥大軟骨中の異なって発現された遺伝子のボルケーノプロット。閾値を≧１ｌｏｇ２倍変化（≧２倍変化に等しい）に設定し、軟骨内骨化関連マーカーを記載する（ｎ＝３）。（図６Ｂ）上方制御分子機能カテゴリーはＥｎｒｉｃｈＲ（ｍａａｙａｎｌａｂ．ｃｌｏｕｄ／Ｅｎｒｉｃｈｒ／）により作成され、遺伝子オントロジー項目をｐ値ならびに対応する調整済みｐ値およびオッズ比によって分類する。（図６Ｃ）Ｗｎｔ活性化、ＰＤＧＦ結合、およびインテグリン結合に関連する遺伝子の相対発現を示すヒートマップ。ｐ＜０．０５、Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ－Ｈｏｃｈｂｅｒｇ法。第１のパネルをＲパッケージｇｇｐｌｏｔ２（バージョン３．２．１）により作成した（Ｇｉｎｅｓｔｅｔ ２０２０ Ｊ Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ Ｒｅｓ ３５：１４３－１５４）。第３のパネルをＢｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ（Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ．ｏｒｇ）上でＣｏｍｐｌｅｘｈｅａｔｍａｐ（バージョン２．０）により作成した。
【図7】ＲＮＡ配列決定により作成された、β－ＮＧＦ刺激軟骨外植片または無刺激軟骨外植片に由来する関心対象の遺伝子の発現レベルを列挙する表を示す。
【図8】図８Ａおよび図８Ｂは、β－ＮＧＦ刺激肥大軟骨外植片のエンリッチメント解析を示す。（図８Ａ）β－ＮＧＦおよび無刺激対照の各生物学的複製に関する主成分解析（ＰＣＡ）。（図８Ｂ）下方制御分子機能に関する遺伝子オントロジー（ＧＯ）カテゴリカルグリッド。データを作成するために、軟骨組織を骨折の７日後に脛骨骨折部から切除し、肥大化まで７日間培養した後、組換えヒトβ－ＮＧＦありまたはなしで刺激した。２４時間後、試料をＲＮＡ－ｓｅｑ解析（ｎ＝３）のために収集した。ＧＯ項目、ｐ値、およびオッズ比をＥｎｒｉｃｈｒによって作成およびコンピュータ計算した。ＧＯ項目をｐ値、Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ－Ｈｏｃｈｂｅｒｇ法により確定される調整済みｐ値によって分類する。
【図9-1】図９Ａ～図９Ｋは、β－ＮＧＦの局所注射がＴＺにおけるＷｎｔ活性化、および軟骨仮骨の内皮細胞浸潤の僅かな増加を誘導することを示す。（図９Ａ）骨折およびそれに続くβ－ＮＧＦの毎日の注射のタイムラインの模式図。（図９Ｂ）対照群（培地注射）に由来する軟骨・骨移行部（ＴＺ）のＨＢＱ染色切片の代表画像、および（図９Ｃ）対応する隣接スライドの蛍光ＤＡＰＩ染色画像。（図９Ｄ）β－ＮＧＦ処置マウスに由来するＨＢＱ染色ＴＺの画像、および対応する（図９Ｅ）隣接スライドの蛍光ＤＡＰＩ染色画像。（図９Ｆ）面積パーセント（％）としての骨折仮骨のＴＺ内のＡｘｉｎ２－ｅＧＦＰの存在の定量化。（図９Ｇ）対照群に由来する骨折仮骨内の軟骨組織のＨＢＱ染色切片の画像、および（図９Ｈ）対応する抗ＣＤ３１ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）染色切片の画像。（図９Ｉ）β－ＮＧＦ処置群に由来するＨＢＱ染色切片、および対応する（図９Ｊ）ＣＤ３１－ＤＡＢ染色切片。（図９Ｋ）面積パーセント（％）としての軟骨組織内のＤＡＢ染色の定量化。すべてのスケールバー＝５００μｍ。エラーバーはＳＥＭを表す。＊＊ｐ＜０．０１；両側ｔ検定により確定。
【図10-1】図１０Ａ～図１０Ｉは、β－ＮＧＦの局所注射が軟骨の減少および骨の増加を生じさせることを示す。骨折１４日後の（図１０Ａ）対照群および（図１０Ｂ）β－ＮＧＦ群に由来する骨折仮骨のＨＢＱ染色切片の代表画像。スケールバー：５００μｍ。（図１０Ｃ）絶対量および（図１０Ｄ）総仮骨量の組成パーセントとして示される、両処置群における軟骨量の定量化。（図１０Ｅ）絶対量および（図１０Ｆ）組成パーセントとして示される、両処置群における骨量の定量化。（図１０Ｇ）全仮骨量、（図１０Ｈ）骨髄、および（図１０Ｉ）線維組織の定量化。すべて立体解析学的に測定。エラーバーはＳＥＭを表す。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；両側ｔ検定により確定。
【図11-1】図１１Ａ～図１１Ｆは、β－ＮＧＦの局所注射が高度に接続された骨梁骨を生じさせることを示す。骨折１４日後の（図１１Ａ）対照および（図１１Ｂ）β－ＮＧＦ処置マウスに由来する脛骨のμＣＴ画像。スケールバー：１ｍｍ。（図１１Ｃ）骨梁間隔、（図１１Ｄ）骨梁数、（図１１Ｅ）骨梁連結性密度、および（図１１Ｆ）骨塩量の定量化。エラーバーはＳＥＭを表す。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；両側ｔ検定により確定。
【図12】図１２Ａ～図１２Ｃは、骨折仮骨内の骨梁骨のさらなるμＣＴ解析を示す。骨折の７日後、８日後、および９日後に培地（対照）または０．５μｇのβ－ＮＧＦの局所注射液を１日１回投与した後、骨折の１４日後に脛骨をμＣＴ解析のために採取した。（図１２Ａ）組成パーセントとしての骨量、（図１２Ｂ）平均骨梁厚、および（図１２Ｃ）組織塩量の定量化を対照（ｎ＝１０）およびβ－ＮＧＦ（ｎ＝５）処置マウスについて示す。＃＝ｐ＜０．１、両側ｔ検定により確定。
【図13】フォトリソグラフィーによるＰＥＧＤＭＡマイクロロッド作製の模式図を示す。
【図14-1】図１４Ａ～図１４Ｄは、凍結乾燥ＰＥＧＤＭＡマイクロロッドにタンパク質が容易に添加されることを示す。（図１４Ａ）添加効率はＰＥＧＤＭＡ濃度（％ ＰＥＧＤＭＡ ｖ／ｖ）の増加に伴って有意に増加する。データを、ＳＥＭを表すエラーバー付きの平均値として示す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、ＡＮＯＶＡ、および多重比較用のチューキー事後検定（ｎ＝３）により確定。（図１４Ｂ）ＤＡＰＩ添加９０％ ＰＥＧＤＭＡマイクロロッド、スケールバー＝２５μｍ。（図１４Ｃ）０分後（上部）および室温で６０分間のインキュベーション後（下部）に撮影された、９０％ ＰＥＧＤＭＡマイクロロッド中に添加されたＦＩＴＣ－ＢＳＡの蛍光顕微鏡写真。スケールバー＝５０μｍ。（図１４Ｄ）マイクロＢＣＡ（ｎ＝３）により測定された、９０％ ＰＥＧＤＭＡ（ｖ／ｖ）マイクロロッドに対するβ－ＮＧＦの添加効率。データを、ＳＥＭを表すエラーバー付きの平均値として示す。
【図15】図１５Ａ～図１５Ｃは、ＰＥＧＤＭＡマイクロロッドに添加されたβ－ＮＧＦが生物活性を保持することを示す。（図１５Ａ）各実験群におけるＴＦ－１細胞増殖の相対変化倍率（４日目対０日目）。＊ｐ＜０．０５、ＡＮＯＶＡ、および多重比較用のチューキー事後検定（ｎ＝４）により確定。９０％ ＰＥＧＤＭマイクロロッドから時単位で示される７日間にわたって放出されるβＮＧＦの（図１５Ｂ）累積質量（ｎｇ単位）および（図１５Ｃ）毎日の質量（ｎｇ単位）（ｎ＝４）。すべてのデータを、ＳＥＭを表すエラーバー付きの平均値として示す。
【図16-1】図１６Ａ～図１６Ｇは、脛骨骨折仮骨内のＰＥＧＤＭＡマイクロロッドの局在化を示す。マイクロロッド注射の５日後のＨＢＱ染色骨折仮骨の（図１６Ａ）低倍率および（図１６Ｂ）高倍率の代表的顕微鏡写真。マイクロロッド注射の７日後の骨折仮骨の（図１６Ｃ）低倍率および（図１６Ｄ）高倍率の代表的顕微鏡写真。矢印は仮骨内のＰＥＧＤＭＡマイクロロッドを示す。（図１６Ａ、図１６Ｃ）スケールバー＝１ｍｍ、（図１６Ｂ、図１６Ｄ）スケールバー＝１００μｍ。（図１６Ｅ）注射１４日後の骨折仮骨の代表的顕微鏡写真、スケールバー＝１ｍｍ。（図１６Ｆ）マウス脛骨で不安定型閉鎖骨折を作り出すために使用される３点骨折装置。（図１６Ｇ）脛骨全体の肉眼的蛍光透視画像。黄色の枠は中央骨幹骨折を示す。
【図17-1】図１７Ａ～図１７Ｊは、骨折仮骨内の新たに形成された骨のマイクロＣＴ解析を示す。骨折の１４日後に（図１７Ａ）対照としての生理食塩水、（図１７Ｂ）１回量のβ－ＮＧＦ（２０００ｎｇ）、（図１７Ｃ）無添加ＰＥＧＤＭＡマイクロロッド、および（図１７Ｄ）β－ＮＧＦ（１８ｎｇ）が添加されたＰＥＧＤＭＡマイクロロッドで処置されたマウスに由来する脛骨骨折仮骨の代表的三次元画像。スケールバー：１ｍｍ。（図１７Ｅ）骨量分率、（図１７Ｆ）骨梁連結性密度、および（図１７Ｇ）骨塩量の定量化。エラーバーはＳＥＭを表す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、ＡＮＯＶＡ、および多重比較用のチューキー事後検定により確定。骨折仮骨内の骨梁骨のマイクロＣＴ解析。生理食塩水（対照としての）、１回量のβ－ＮＧＦ（２０００ｎｇ）、無添加ＰＥＧＤＭＡマイクロロッド、およびβ－ＮＧＦ（１８ｎｇ）が添加されたＰＥＧＤＭＡマイクロロッドで処置されたマウスにおける（図１７Ｈ）骨梁間隙、（図１７Ｉ）骨梁数、および（図１７Ｊ）骨梁厚の定量化。エラーバーはＳＥＭを表す。非有意性はＡＮＯＶＡ、および多重比較用のチューキー事後検定により確定される。
【図18-1】図１８Ａ～図１８Ｊは、β－ＮＧＦが添加されたＰＥＧＤＭＡマイクロロッドの単回注射の結果が軟骨内骨修復を促進することを示す。骨折の１４日後に（図１８Ａ）対照としての生理食塩水、（図１８Ｂ）１回量のβ－ＮＧＦ（２０００ｎｇ）、（図１８Ｃ）無添加ＰＥＧＤＭＡマイクロロッド、および（図１８Ｄ）β－ＮＧＦ（１８ｎｇ）が添加されたＰＥＧＤＭＡマイクロロッドで処置されたマウスに由来するＨＢＱ染色骨折仮骨の代表的顕微鏡写真。左列のスケールバー＝２ｍｍ、中列および右列のスケールバー＝５００μｍ。いずれも骨折仮骨の組成パーセントとして示される、（図１８Ｅ）軟骨量および（図１８Ｆ）骨量の定量化。骨折仮骨の組織形態計測的解析。生理食塩水（対照としての）、１回量のβ－ＮＧＦ（２０００ｎｇ）、無添加ＰＥＧＤＭＡマイクロロッド、およびβ－ＮＧＦ（１８ｎｇ）が添加されたＰＥＧＤＭＡマイクロロッドで処置されたマウスにおける（図１８Ｇ）総仮骨量、（図１８Ｈ）線維組織の絶対量、（図１８Ｉ）軟骨の絶対量、および（図１８Ｊ）骨の絶対量の定量化。エラーバーはＳＥＭを表す。＊ｐ＜０．０５、ＡＮＯＶＡ、および多重比較用のチューキー事後検定により確定。
【図19】ポリマーナノワイヤの作製技術を示す。２００ｎｍ孔を有する陽極酸化アルミニウム（ＡＡＯ）テンプレートを使用してナノワイヤを作製する。ポリマー材料を融点を超えて加熱することで毛管作用を通じたナノワイヤ形成を引き起こす。ナノワイヤの凝固後、膜を剥離し、エッチングしてナノワイヤを離型する。ナノワイヤは、幅が２００ｎｍである一方で、長さはポリマー膜厚に依存し、長さは２～２０ミクロンの範囲で調整可能である。
【図20】図２０Ａ～図２０Ｃは、ＮＧＦ機能化ナノワイヤの積層構築を示す。（図２０Ａ）ＰＣＬナノワイヤを積層（ＬｂＬ）構築およびヘパリンに対するＮＧＦの添加のために荷電ポリマーで機能化することができる。（図２０Ｂ）ゼータ電位はナノワイヤに対するキトサンおよびヘパリンの堆積を示す。（図２０Ｃ）ＬｂＬ層とＮＧＦ放出速度との仮定上の関係性。
【図21】図２１Ａ～図２１Ｄは、生物活性ＮＧＦの持続放出のために生体材料プラットフォームが調整可能であることを示す。（図２１Ａ）ＰＥＧＤＭマイクロロッド中に添加されたＮＧＦの吸着効率をｍＢＣＡアッセイを使用して計算した。（図２１Ｂ）９０％ ＰＥＧＤＭマイクロロッド中に加えられたＮＧＦ約２０ｎｇを用いて、タンパク質放出を７日間にわたって特徴づけた。（図２１Ｃ）ＮＧＦを７５％の効率でナノワイヤに約５μｇ ＮＧＦ／ｍｇナノワイヤで添加した後、１つのキトサン層を添加した。持続的な一次ＮＧＦ放出が８日間にわたって観察された（Ｒ２＝０．９９９）。（図２１Ｄ）ＰＥＧＤＭマイクロロッドから放出されたＮＧＦの生物活性をＴＦ１細胞増殖アッセイを使用して確認した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１
【発明を実施するための形態】
【0041】
本方法を説明する前に、記載される特定の方法および実験条件が変動することがあることから、本開示が当該の方法および条件に限定されないということを理解すべきである。また、本開示の範囲が添付の特許請求の範囲によってのみ限定されることから、本明細書において使用される用語が、特定の実施形態を記述することのみを目的としており、限定を行うようには意図されていないということを理解するべきである。
【0042】
別途定義がない限り、本明細書において使用されるすべての技術用語および科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者が一般的に理解する意味と同じ意味を有する。本明細書に記載の方法および材料と同様または同等である任意の方法および材料を本開示の実施または試験において使用することができるが、ここでは好ましい方法および材料を記載する。本明細書において言及されるすべての刊行物は、その全体が参照によって本明細書に組み入れられる。
【0043】
定義
本明細書において使用される「骨折」という用語は、骨の連続性の部分的または完全な中断を意味する。骨折は閉鎖骨折または開放（複雑）骨折であることがある。骨折は置換することができる。毛髪様骨折とも呼ばれる疲労骨折もやはり骨折である。骨折は横骨折、らせん骨折、斜骨折、圧迫骨折、粉砕骨折、剥離骨折、嵌入骨折などであることがある。骨折はＸ線画像診断、磁気共鳴画像診断（ＭＲＩ）、骨スキャン、コンピュータ断層撮影スキャン（ＣＴ／ＣＡＴスキャン）、または他の公知の方法によって診断することができる。
本明細書において使用される「骨折」という用語は、骨の連続性の部分的または完全な中断を意味する。骨折は閉鎖骨折または開放（複雑）骨折であることがある。骨折は置換することができる。毛髪様骨折とも呼ばれる疲労骨折もやはり骨折である。骨折は横骨折、らせん骨折、斜骨折、圧迫骨折、粉砕骨折、剥離骨折、嵌入骨折などであることがある。骨折はＸ線画像診断、磁気共鳴画像診断（ＭＲＩ）、骨スキャン、コンピュータ断層撮影スキャン（ＣＴ／ＣＡＴスキャン）、または他の公知の方法によって診断することができる。
【0044】
本開示の方法、使用、および組成物の特定の実施形態では、骨折は、二次治癒または軟骨内修復を通じて治癒する任意の骨中での骨折である。さらなる実施形態では、骨折は長管骨骨折である。
【0045】
骨折処置は伝統的に骨折の位置、種類、および重症度に依存する。処置としては、骨を整復した後、プラスターまたはガラス繊維ギプスで固定化すること、骨を整復した後、機能的ギプスまたはブレースにより部分固定化すること、スプリントによる支持／部分固定化、内固定による観血的整復、外固定による観血的整復、および臨床医に公知である他の方法を挙げることができる。
【0046】
さらに、本開示の方法および組成物は骨粗鬆症の徴候において有用であることがある。１つの骨粗鬆症の徴候は骨粗鬆症性骨折である。骨粗鬆症性骨折は例えば非定型大腿骨頸部骨折であることがある。
【0047】
さらに、本開示の方法および組成物は頭蓋顔面徴候において有用であることがある。頭蓋顔面徴候は例えば狭頭症／頭蓋縫合早期癒合症、口蓋裂、下顎骨骨折、頭蓋骨骨折、および頭蓋骨欠損からなる群から選択可能である。
【0048】
「治療有効量」という語句は、投与される目的である所望の作用を生じさせる量を意味する。正確な量は処置の目的に依存するものであり、当業者が公知の技術を使用して確定する（例えばＬｌｏｙｄ（１９９９年）、Ｔｈｅ Ａｒｔ、ｋＳｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｉｎｇを参照）。
【0049】
本明細書において使用される「対象」という用語は動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトを意味する。したがって、本開示の対象としては、ヒト、ならびにチンパンジーならびに他の類人猿およびサル種などの他の霊長類；ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、およびウマなどの家畜；イヌおよびネコなどの飼育哺乳動物；マウス、ラット、およびモルモットなどのげっ歯類を含む実験動物；ニワトリ、シチメンチョウ、および他の家禽類、アヒル、ガチョウなどの飼育鳥、野鳥、および猟鳥を含む鳥類を挙げることができるがそれに限定されない。特定の実施形態では、対象はヒトである。この用語は、骨折を有するヒト対象を含む哺乳動物対象を含む。
【0050】
本明細書において使用される「処置する」、「処置すること」、または「処置」という用語は、それを必要とする対象における骨折の治癒を意味する。これらの用語は、実際の骨折の治癒を含み、さらにまたは代わりに、骨折に関連する症状、例えば疼痛、炎症、可動性低下などを改善することを含むことがある。
【0051】
骨折治癒
骨折治癒とは、損傷骨の本来の形態および機能を改善に回復させることができる動的再生プロセスのことである。骨折の大部分は、骨成長において軟骨内骨化（ＥＯ）と類似したプロセスにおいて中間軟骨を通じて間接的に治癒する（図１）。長管骨骨折の後、血腫が形成されて出血を止め、デブリを収容し、修復を開始させる炎症性応答を引き起こす（Ｋｏｌａｒら、２０１０年、Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｐａｒｔ Ｂ，Ｒｅｖｉｅｗｓ １６：４２７～４３４頁；Ｘｉｎｇら、２０１０年、Ｊ Ｏｒｔｈｏｐａｅｄｉｃ Ｒｅｓ ２８：１０００～１００６頁）。骨膜および骨内膜の前駆細胞は、骨形成分化を経ることで、骨折に隣接する既存の骨端に沿って膜内骨化を通じて新たな骨を形成する（Ｃｏｌｎｏｔら、２００９年、Ｊ Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ Ｒｅｓ ２４：２７４～２８２頁）。骨折間隙中で、骨膜前駆細胞は軟骨細胞に分化して、ＥＯによって間接的に骨を生じさせる暫定的な軟骨基質を生成する（Ｌｅら、２００１年、Ｊ Ｏｒｔｈｏｐａｅｄ Ｒｅｓ １９：７８～８４頁）。ｌ軟骨仮骨は軟骨細胞から骨芽細胞への変換を通じて骨に成熟する（Ｈｕら、２０１７年、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １４４：２２１～２３４頁；Ｚｈｏｕら、２０１４年、ＰｌｏＳ ｇｅｎｅｔｉｃｓ １０：ｅ１００４８２０；Ｙａｎｇら、２０１４年、ＰＮＡＳ ＵＳＡ １３０２７０３１１１）。次に、新たに形成された骨梁骨は皮質骨にリモデリングされる（Ｄｒｉｓｓｉら、２０１６年、Ｊ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍ １１７：１７５３～１７５６頁）。
骨折治癒とは、損傷骨の本来の形態および機能を改善に回復させることができる動的再生プロセスのことである。骨折の大部分は、骨成長において軟骨内骨化（ＥＯ）と類似したプロセスにおいて中間軟骨を通じて間接的に治癒する（図１）。長管骨骨折の後、血腫が形成されて出血を止め、デブリを収容し、修復を開始させる炎症性応答を引き起こす（Ｋｏｌａｒら、２０１０年、Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｐａｒｔ Ｂ，Ｒｅｖｉｅｗｓ １６：４２７～４３４頁；Ｘｉｎｇら、２０１０年、Ｊ Ｏｒｔｈｏｐａｅｄｉｃ Ｒｅｓ ２８：１０００～１００６頁）。骨膜および骨内膜の前駆細胞は、骨形成分化を経ることで、骨折に隣接する既存の骨端に沿って膜内骨化を通じて新たな骨を形成する（Ｃｏｌｎｏｔら、２００９年、Ｊ Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ Ｒｅｓ ２４：２７４～２８２頁）。骨折間隙中で、骨膜前駆細胞は軟骨細胞に分化して、ＥＯによって間接的に骨を生じさせる暫定的な軟骨基質を生成する（Ｌｅら、２００１年、Ｊ Ｏｒｔｈｏｐａｅｄ Ｒｅｓ １９：７８～８４頁）。ｌ軟骨仮骨は軟骨細胞から骨芽細胞への変換を通じて骨に成熟する（Ｈｕら、２０１７年、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １４４：２２１～２３４頁；Ｚｈｏｕら、２０１４年、ＰｌｏＳ ｇｅｎｅｔｉｃｓ １０：ｅ１００４８２０；Ｙａｎｇら、２０１４年、ＰＮＡＳ ＵＳＡ １３０２７０３１１１）。次に、新たに形成された骨梁骨は皮質骨にリモデリングされる（Ｄｒｉｓｓｉら、２０１６年、Ｊ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍ １１７：１７５３～１７５６頁）。
【0052】
骨折治癒は、炎症期（骨折血腫の形成）、修復期（その間に身体が骨折部位の中および周囲に軟骨および組織を発生させ、仮骨が成長して骨折を安定化し、骨梁骨が組織仮骨を置き換える）、および骨リモデリング期（その間に海綿骨が固形骨で置き換えられる）を含む。骨折治癒／修復の炎症期に、生物学的プロセスである血腫、炎症、および間葉系幹細胞の動員が生じる。骨折治癒／修復の軟骨形成および骨膜応答期に、生物学的プロセスである軟骨形成および軟骨内骨化、膜内骨化中の細胞増殖、血管成長、ならびに血管新生が生じる。骨折治癒／修復の軟骨吸収および一次骨形成期に、生物学的プロセスである活発な骨形成、骨細胞動員および網状骨形成、軟骨細胞アポトーシスおよび基質タンパク質分解、破骨細胞動員および軟骨吸収、ならびに血管新生が生じる。最後に、骨折治癒／修復の二次骨形成およびリモデリング期に、生物学的プロセスである骨リモデリングと骨芽細胞活動との組み合わせ、および骨髄の確立が生じる（Ａｌ－Ａｑｌら、２００８年、Ｊ Ｄｅｎｔ Ｒｅｓ ８７（２）：１０７～１１８頁）。
【0053】
特定の実施形態では、対象は正常な骨折治癒を経験していない。特定の実施形態では、このような対象は変形癒合（変形した非解剖学的な位置における骨折治癒；機能的および／もしくは美容的に許容できないことがある）、遷延癒合（予想／平均骨折治癒時間よりも有意に長い、例えば約２倍長い）、または偽関節（壊れた骨が合体できないこと）の骨折治癒を経験していることがある。
【0054】
平均骨折治癒時間は特定の骨、および／または骨の領域中の血液供給のレベルに応じて異なることがある。例えば、脊椎、手首などのような高血液供給領域に存在する骨折は、舟状骨（手根骨）、脛骨（脚骨）などのような低血液供給領域に存在する骨折よりも早く治癒する。また、平均骨折治癒時間は対象の年齢に応じて異なることもあり、同じ骨折が治癒するまでの時間は高齢者では子どもの２倍になることがある。臨床医は、一般的な治癒時間の範囲を承知しており、対象において骨折治癒の遷延を同定することができる。
【0055】
骨折治癒を遷延させることがある要因としてはグルココルチコイド過剰、糖尿病、ホルモン不均衡、ビタミンＤ欠乏症、重症貧血、傷害、感染症、新生物、代謝疾患、喫煙、骨折部位における過可動性、骨端の分離、および滑液による薄弱化が挙げられるがそれに限定されない。
【0056】
１つの態様では、本開示は、対象において骨折治癒を刺激するための方法であって、神経成長因子（ＮＧＦ）を含む生体材料担体を含む医薬組成物を該対象に投与することを含む、方法を提供する。１つの実施形態では、骨折治癒を刺激することは、軟骨から骨にいっそう速やかに変換すること、ならびに骨の質を改善すること、および／またはより良い骨構造を形成することを含む。
【0057】
別の態様では、本開示は、対象において骨折治癒を促進するための方法であって、神経成長因子（ＮＧＦ）を含む生体材料担体を含む医薬組成物を該対象に投与することを含む、方法を提供する。１つの実施形態では、骨折治癒を促進することは、軟骨から骨にいっそう速やかに変換することを含む。
【0058】
別の態様では、本開示は、対象において骨折治癒を改善するための方法であって、神経成長因子（ＮＧＦ）を含む生体材料担体を含む医薬組成物を該対象に投与することを含む、方法を提供する。１つの実施形態では、骨折治癒を改善することは、骨の質を改善すること、および／またはより良い骨構造を形成することを含む。
【0059】
別の態様では、本開示は、骨折を有する対象を処置するための方法であって、本開示の医薬組成物を該対象に投与することを含む、方法を提供する。本開示の方法の特定の実施形態では、骨折部中で骨形成が増加する。
【0060】
本開示の方法、使用、および組成物の特定の実施形態では、骨折治癒は軟骨内治癒である。骨折治癒は軟骨内骨化の間に刺激、促進、および／または改善される。したがって、特定の実施形態では、少なくとも１つの生物活性化合物を含む生体材料担体を含む組成物は、骨折治癒の軟骨内期／軟骨期に投与される。特定の実施形態では、臨床医は、本開示の組成物の投与のために、経験的判断、患者の報告による疼痛の減少、骨折部の剛性／可動性の増加、および軟仮骨期がいつピークに達するかを推定するためのＸ線中の「かすんだ」外見を使用する。さらなる実施形態では、組成物は骨折の約１カ月後～約４カ月後に投与される。さらに別の実施形態では、組成物は骨折の約２カ月後～約３カ月後に投与される。さらなる実施形態では、治癒が遷延する／遷延癒合が観察される場合、本開示の組成物が少なくとも再度投与される。
【0061】
無痛ＮＧＦ
本開示の方法、組成物、および使用の１つの実施形態では、生物活性化合物はＮＧＦである。本開示の方法、組成物、および使用の別の実施形態では、生物活性化合物は変異ＮＧＦである。本開示の方法、組成物、および使用のさらに別の実施形態では、生物活性化合物はＮＧＦＲ１００Ｗまたは無痛ＮＧＦである。したがって、対象に投与される生体材料担体に変異ＮＧＦ、具体的にはＮＧＦＲ１００Ｗが含まれる実施形態では、ＮＧＦ関連侵害受容が最小化される。
本開示の方法、組成物、および使用の１つの実施形態では、生物活性化合物はＮＧＦである。本開示の方法、組成物、および使用の別の実施形態では、生物活性化合物は変異ＮＧＦである。本開示の方法、組成物、および使用のさらに別の実施形態では、生物活性化合物はＮＧＦＲ１００Ｗまたは無痛ＮＧＦである。したがって、対象に投与される生体材料担体に変異ＮＧＦ、具体的にはＮＧＦＲ１００Ｗが含まれる実施形態では、ＮＧＦ関連侵害受容が最小化される。
【0062】
遺伝性感覚自律神経性ニューロパチーＶ型を有する患者における、成熟ＮＧＦβ配列中で１００番残基においてアルギニンからトリプトファンへの変化を生じさせる天然点変異（ＮＧＦＲ１００Ｗ）の最近の発見は、侵害受容機能から栄養作用を切り離すことが可能であることを示唆している（Ｓｕｎｇら、２０１８年、Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ３８：３３９４～３４１３頁）。野生型ＮＧＦと同様に、ＮＧＦＲ１００Ｗ変異体も、ＴｒｋＡ受容体に結合し、その下流シグナル伝達経路を活性化することで、ＮＧＦに関連する栄養機能を支えることが可能である。しかし、ＮＧＦＲ１００Ｗは、ｐ７５ＮＴＲシグナル伝達経路に関与することで急性の熱痛覚過敏および機械痛覚過敏を除去することができない。同様に、Ｒ１００位における他の変異（ＮＧＦＲ１００ＥおよびＮＧＦＰ６１ＳＲ１００Ｅ）も、これらの変異ＮＧＦをＴｒｋＡに有効に結合させるが、ｐ７５ＮＴＲに対するＮＧＦ結合は無効になる（Ｃａｐｓｏｎｉら、２０１１年、ＰｌｏＳ ｏｎｅ ６：ｅ１７３２１；Ｃｏｖａｃｅｕｓｚａｃｈら、２０１０年、Ｂｉｏｃｈｅｍ ｂｉｏｐｈｙｓ ｒｅｓ ｃｏｍｍ ３９１：８２４～８２９頁）。非遺伝的アプローチを使用する研究では、ｐ７５ＮＴＲ中和抗体を注射することで、ＮＧＦ誘発性痛覚過敏が遮断される一方で、感覚神経中の活動電位のＮＧＦ媒介性感作が可能になることが発見された（Ｗａｔａｎａｂｅら、２００８年、Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｒｅｓ ８６：３５６６～３５７４頁；Ｚｈａｎｇら、２００４年、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｌｅｔｔ ３６６：１８７～１９２頁）。
【0063】
【0064】
骨折修復を刺激するための新規バイオ医薬品としての無痛ＮＧＦ（ＮＧＦＲ１００Ｗ）の評価が本明細書に開示される。
【0065】
生体材料担体
本開示の方法、使用、または組成物の１つの実施形態では、生体材料担体は生体適合性である。本明細書において使用される「生体適合性」という用語は、生体系または生組織、例えば動物または動物組織、例えばヒトまたはヒト組織との適合性があること、毒性がなく、傷害性がなく、もしくは生理学的反応性がなく、かつ／または有害な免疫反応を引き起こすことがないことを含意する。
本開示の方法、使用、または組成物の１つの実施形態では、生体材料担体は生体適合性である。本明細書において使用される「生体適合性」という用語は、生体系または生組織、例えば動物または動物組織、例えばヒトまたはヒト組織との適合性があること、毒性がなく、傷害性がなく、もしくは生理学的反応性がなく、かつ／または有害な免疫反応を引き起こすことがないことを含意する。
【0066】
本開示の方法、使用、または組成物の別の実施形態では、生体材料担体は生分解性である。本明細書において使用される「生分解性」という用語は、例えば動物対象において、例えばヒト対象において、天然系またはその天然成分によって無害な産物に特に分解される能力を含意する。
【0067】
さらに別の実施形態では、生体材料担体の構造はナノワイヤ、ナノチューブ、ナノロッド、マイクロワイヤ、マイクロチューブ、およびマイクロロッドからなる群から選択される。棒状の形状を有する生体材料担体（例えばチューブ、ロッド、ワイヤ）は高アスペクト比の利点を享受する。
【0068】
いくつかの実施形態では、生体材料担体は組織適合性物質でコーティングされている。特定の実施形態では、組織適合性物質は抗炎症性物質および／または抗凝固性物質である。さらなる特定の実施形態では、組織適合性物質はキトサンである。さらなる特定の実施形態では、組織適合性物質は、成長因子の放出を遅延させかつ／または延期する物質である。なおさらなる実施形態では、組織適合性物質はヘパリン、ヘパリン硫酸、ヒアルロン酸、およびヘパリン＋ヒアルロン酸の組み合わせから選択される。
【0069】
無痛ＮＧＦの局所制御送達に関する翻訳的に適切なマイクロテクノロジーおよびナノテクノロジープラットフォームの開発が本明細書に開示される。ナノワイヤとして作製されたポリカプロラクトン（ＰＣＬ）ポリマーをベースとする注射式バイオインスパイアード薬物送達プラットフォームが、サイトカイン媒介性疾患に関して局所受容体－リガンド相互作用を調節するために、また、全身サイトカイン療法に比べて改善された薬物動態を実現するために使用されている（Ｚａｍｅｃｎｉｋら、２０１７年、ＡＣＳ Ｎａｎｏ １１：１１４３３～１１４４０頁）。注射時に、これらのナノワイヤは、緩やかな網目構造に自己構築されて、皮下マウスモデルでは定位置に少なくとも９日間とどまることが可能になる。
【0070】
これらのナノワイヤ、ナノチューブ、ナノロッド、マイクロワイヤ、マイクロチューブ、およびマイクロロッドは、非外科的送達技術を高い臨床的関連性で可能にするように設計された。それらは、サイズが小さいことから、骨折部位に対する経皮送達のために容易に注射可能であり、正常な治癒プロセスに干渉しないはずである。
【0071】
他の実施形態では、ナノワイヤ、ナノチューブ、ナノロッド、マイクロワイヤ、マイクロチューブ、およびマイクロロッドは、その形状が理由でマクロファージによって容易には貪食されず、結果として線維化組織の形成を減少させる。
【0072】
さらなる実施形態では、生物活性化合物を含む生体材料担体は該化合物を安定化する。例えば、マイクロロッドまたはナノワイヤは、それらが含むＮＧＦまたは無痛ＮＧＦを安定化することができる。おそらく、この安定化は、生体材料が化合物を分解から保護することに関連している。さらに、生体材料担体により実現される制御放出では、生物活性化合物を減らすことが必要になる。というのも、後者がゆっくりと送達されて、速やかには分解されないからである。したがって、特定の実施形態では、ＮＧＦまたは無痛ＮＧＦがマイクロワイヤまたはナノロッドに含まれる場合、その生物活性を実現するために必要な量は、それ自体で投与される場合よりも少なくなる。
【0073】
ナノワイヤ
本開示の方法、使用、および組成物の特定の実施形態では、生体材料担体は個々のポリマーナノワイヤ（「ナノワイヤ」）を含む。さらなる実施形態では、ナノワイヤは少なくとも１つの生物活性化合物、例えば無痛ＮＧＦを含む。本明細書において使用される「個々のポリマーナノワイヤ」という用語は、個々の各ナノワイヤが溶液中の任意の他のナノワイヤに接合しない流体溶液中に、別々の浮動するポリマーナノワイヤを含む、組成物を意味する。特に、本組成物の個々のポリマーナノワイヤは、互いに一緒に接続（例えば共有結合）されていることも、共通の基材に固定されていることもない。個々のポリマーナノワイヤは、テンプレート構造の平行孔の垂直整列中に形成されており、各ポリマーナノワイヤ間の恒久的な接続、またはポリマーナノワイヤと基材との結合が存在しないように取り除かれる。
本開示の方法、使用、および組成物の特定の実施形態では、生体材料担体は個々のポリマーナノワイヤ（「ナノワイヤ」）を含む。さらなる実施形態では、ナノワイヤは少なくとも１つの生物活性化合物、例えば無痛ＮＧＦを含む。本明細書において使用される「個々のポリマーナノワイヤ」という用語は、個々の各ナノワイヤが溶液中の任意の他のナノワイヤに接合しない流体溶液中に、別々の浮動するポリマーナノワイヤを含む、組成物を意味する。特に、本組成物の個々のポリマーナノワイヤは、互いに一緒に接続（例えば共有結合）されていることも、共通の基材に固定されていることもない。個々のポリマーナノワイヤは、テンプレート構造の平行孔の垂直整列中に形成されており、各ポリマーナノワイヤ間の恒久的な接続、またはポリマーナノワイヤと基材との結合が存在しないように取り除かれる。
【0074】
制御局所ＮＧＦ送達のためのナノワイヤプラットフォーム
骨折修復を刺激するための新規生物学的薬剤としての無痛ＮＧＦ（ＮＧＦＲ１００Ｗ）を検証することに加えて、制御局所送達のための翻訳的に適切なナノテクノロジープラットフォームが本明細書に開示される。これを達成するために、ナノワイヤとして作製されたポリカプロラクトン（ＰＣＬ）ポリマーをベースとするバイオインスパイアード薬物送達プラットフォームを調整する。この注射式ナノ材料を、サイトカイン媒介性疾患に関して局所受容体－リガンド相互作用を調節するために、また、全身サイトカイン療法に比べて改善された薬物動態を実現するために使用することができる（Ｋｒｏｎｅｎｂｅｒｇ、２００３年、Ｎａｔｕｒｅ ４２３：３３２～３３６頁）。注射時に、これらのナノワイヤは、緩やかな網目構造に自己構築されて、皮下マウスモデルでは定位置に少なくとも９日間とどまることが可能になる（データは示さず）。ＰＣＬがベースポリマーとして選択されたのは、この高度に調整可能で生分解性の熱可塑性材料がナノ作製技術に適しており、この材料が既に縫合術においてＦＤＡの承認を得ているからである（Ｂａｈｎｅｙら、２０１４年 Ｊ Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒａｌ Ｒｅｓ ２９（５）ｄｏｉ：１０．１００２／ｊｂｍｒ．２１４８）。さらに、ＰＣＬは、比較的大きな医療用インプラント中で使用される際に誘発する局所免疫応答が最小限であることが示されており（Ｓｈｉｎｏｄａら、２０１１年 Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ３１（１９）：７１４５～７１５５頁）、これは、有意な非特異的免疫応答を示したポリプロピレンおよびポリラクチド－ｃｏ－グリコリド（ＰＬＧＡ）とは対照的である（Ｈｏｐｋｉｎｓ ａｎｄ Ｓｌａｃｋ、１９８４年、Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ １３（３）：９５１～９５６；Ｓｏｎｎｅｔら、２０１３年、Ｊ Ｏｒｔｈｏｐａｅｄｉｃ Ｒｅｓ ３１：１５９７～１６０４年；Ｓｔｕｋｅｌら、２０１５年、Ｊ Ｂｉｏｍｅｄ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ Ｒｅｓ Ｐａｒｔ Ａ １０３：６０４～６１３頁）。
骨折修復を刺激するための新規生物学的薬剤としての無痛ＮＧＦ（ＮＧＦＲ１００Ｗ）を検証することに加えて、制御局所送達のための翻訳的に適切なナノテクノロジープラットフォームが本明細書に開示される。これを達成するために、ナノワイヤとして作製されたポリカプロラクトン（ＰＣＬ）ポリマーをベースとするバイオインスパイアード薬物送達プラットフォームを調整する。この注射式ナノ材料を、サイトカイン媒介性疾患に関して局所受容体－リガンド相互作用を調節するために、また、全身サイトカイン療法に比べて改善された薬物動態を実現するために使用することができる（Ｋｒｏｎｅｎｂｅｒｇ、２００３年、Ｎａｔｕｒｅ ４２３：３３２～３３６頁）。注射時に、これらのナノワイヤは、緩やかな網目構造に自己構築されて、皮下マウスモデルでは定位置に少なくとも９日間とどまることが可能になる（データは示さず）。ＰＣＬがベースポリマーとして選択されたのは、この高度に調整可能で生分解性の熱可塑性材料がナノ作製技術に適しており、この材料が既に縫合術においてＦＤＡの承認を得ているからである（Ｂａｈｎｅｙら、２０１４年 Ｊ Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒａｌ Ｒｅｓ ２９（５）ｄｏｉ：１０．１００２／ｊｂｍｒ．２１４８）。さらに、ＰＣＬは、比較的大きな医療用インプラント中で使用される際に誘発する局所免疫応答が最小限であることが示されており（Ｓｈｉｎｏｄａら、２０１１年 Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ３１（１９）：７１４５～７１５５頁）、これは、有意な非特異的免疫応答を示したポリプロピレンおよびポリラクチド－ｃｏ－グリコリド（ＰＬＧＡ）とは対照的である（Ｈｏｐｋｉｎｓ ａｎｄ Ｓｌａｃｋ、１９８４年、Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ １３（３）：９５１～９５６；Ｓｏｎｎｅｔら、２０１３年、Ｊ Ｏｒｔｈｏｐａｅｄｉｃ Ｒｅｓ ３１：１５９７～１６０４年；Ｓｔｕｋｅｌら、２０１５年、Ｊ Ｂｉｏｍｅｄ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ Ｒｅｓ Ｐａｒｔ Ａ １０３：６０４～６１３頁）。
【0075】
ＰＣＬナノワイヤプラットフォーム技術は、積層（ＬｂＬ）静電構築アプローチを使用して、ＮＧＦＲ１００Ｗの結合を通じて生物活性に関して機能化される（Ｋｒｏｎｅｎｂｅｒｇ、２００３年、Ｎａｔｕｒｅ ４２３：３３２～３３６頁）。ＰＣＬナノワイヤは、キトサン（正電荷）およびヘパリン（負電荷）を該ナノワイヤに静電的に集合させるために利用される強力な負電荷を有している。キトサンは、負電荷に加えて、抗菌性を有しており、したがって、医療機器コーティングおよび薬物送達システムにおいて順調に使用されている（Ｏｌａｂｉｓｉら、２０１０年、Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｐａｒｔ Ａ １６：３７２７～３７３６頁；Ｘｕら、２０１７年、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ １４７：１～１３頁；Ｒｏｔら、２０１４年、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｃｅｌｌ ３１：１５９～１７０頁）。ヘパリンは、中程度～高い親和性でＮＧＦを含む種々の成長因子に結合しかつそれを安定化する能力が理由で選択されたものであり、成長因子カーゴをナノワイヤに添加するモジュール式の手段を提供する。
【0076】
本開示の方法および組成物のナノワイヤは、非外科的送達技術を高い臨床的関連性で可能にするように設計されている。特定の実施形態では、ＰＣＬナノワイヤは直径約２００ｎｍおよび長さ約１５～２０μｍである。それらは、サイズが小さいことから、いくつかの現行の材料がそうであると示されたように、骨折部位に対する経皮送達のために容易に注射可能であり、正常な治癒プロセスに干渉しない（Ｐａｒｅｋｈら、２０１１年、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ３２：２２５６～２２６４頁）。
【0077】
少なくとも１つの生物活性化合物は例えば非共有結合性相互作用（例えばイオン力、双極子－双極子相互作用、水素結合）によって、または１つもしくはそれ以上の共有結合によって、ポリマーナノワイヤの孔部に吸着可能であり、またはポリマーナノワイヤの表面に固定可能である。本ポリマーナノワイヤは、例えば組成物を標的部位に注射することによって、経口摂取、経鼻吸入、もしくは静脈内送達の後にポリマーナノワイヤを局在化することによって、またはインプラント装置からポリマーナノワイヤを標的部位において放出することを通じて、少なくとも１つの生物活性化合物を標的部位に送達するように構成されている。ポリマーナノワイヤ、およびポリマーナノワイヤを含む組成物を調製するための方法は、例えばＵＳ２０２０００２３０６８に記載されている。
【0078】
生物活性化合物の量は適用部位、処置される状態、および所望の生物活性の種類に依存する。いくつかの実施形態では、個々のポリマーナノワイヤは０．００１ｎｇ以上の生物活性剤、例えば０．０１ｎｇ以上、０．０００１μｇ以上、例えば０．００１μｇ以上、例えば０．０１μｇ以上、例えば０．１μｇ以上、例えば１μｇ以上、例えば１０μｇ以上、例えば２５μｇ以上、例えば５０μｇ以上、例えば１００μｇ以上、例えば５００μｇ以上、例えば１０００μｇ以上、例えば５０００μｇ以上、例えば１０，０００μｇ以上の生物活性化合物を含むことができる。生物活性化合物をポリマーナノワイヤに液体として組み入れる場合、生物活性化合物の濃度は０．０００１ｎｇ／ｍＬ以上、例えば０．００１ｎｇ／ｍＬ以上、例えば０．０１ｎｇ／ｍＬ以上、例えば０．１ｎｇ／ｍＬ以上、例えば０．５ｎｇ／ｍＬ以上、例えば１ｎｇ／ｍＬ以上、例えば２ｎｇ／ｍＬ以上、例えば５ｎｇ／ｍＬ以上、例えば１０ｎｇ／ｍＬ以上、例えば２５ｎｇ／ｍＬ以上、例えば５０ｎｇ／ｍＬ以上、例えば１００ｎｇ／ｍＬ以上、例えば５００ｎｇ／ｍＬ以上、例えば１０００ｎｇ／ｍＬ以上、例えば５０００ｎｇ／ｍＬ以上、例えば１０，０００ｎｇ／ｍＬ以上とすることができる。
【0079】
個々のポリマーナノワイヤに結合する生物活性化合物の量に応じて、個々のポリマーナノワイヤの組成物は、０．００１ｎＭ以上、例えば０．００５ｎＭ以上、例えば０．０１ｎＭ以上、例えば０．０５ｎＭ以上、例えば０．１ｎＭ以上、例えば０．５ｎＭ以上、例えば１ｎＭ以上、例えば５ｎＭ以上、例えば１０ｎＭ以上、例えば５０ｎＭ以上、例えば１００ｎＭ以上、例えば２５０ｎＭ以上、例えば５００ｎＭ以上である生物活性化合物の濃度を有する。
【0080】
特定の実施形態では、ポリマーナノワイヤは、少なくとも１つの生物活性化合物を標的部位において放出するように調製されている。１つの実施形態では、少なくとも１つの生物活性化合物は、本組成物中の個々の各ポリマーナノワイヤの孔部内から放出される。別の実施形態では、少なくとも１つの生物活性化合物は、ポリマーナノワイヤと生物活性化合物との間のリンカーの切断によって放出される。例えば、リンカーは酵素的に切断されるかまたは加水分解により切断されることがある。リンカーが酵素的に切断される場合、関心対象のリンカーは酵素的に切断可能な部分を含むことがある。
【0081】
ポリマーナノワイヤによる生物活性化合物の放出は持続放出またはパルス放出であることがある。「持続放出」とは、生物活性化合物が、ポリマーナノワイヤが投与部位との接触を維持している期間全体にわたって、例えば１分以上、例えば５分以上、例えば１０分間以上、例えば１５分間以上、例えば３０分間以上、例えば４５分間以上、例えば１時間以上、例えば６時間以上、例えば１２時間以上、例えば１日間以上、例えば２日間以上、例えば５日間以上、例えば１０日間以上、例えば１５日間以上、例えば３０日間以上、例えば１００日間以上にわたって、少なくとも１つの生物活性化合物の恒常的および連続的な送達を行うように、ポリマーナノワイヤと結合していることを意味する。例えば、生物活性化合物は、上記範囲、例えば１日間～３０日間、例えば２日間～２８日間、例えば３日間～２１日間、例えば４日間～１４日間、例えば５日間～１０日間にわたって、恒常的および連続的な送達を行うように、ポリマーナノワイヤと結合していることがある。
【0082】
他の実施形態では、個々のポリマーナノワイヤは、少なくとも１つの生物活性化合物のパルス放出を行うように構成されている。「パルス放出」とは、ポリマーナノワイヤが少なくとも１つの生物活性化合物を投与部位中に逐次（例えば別々の時点で）、例えば１分毎に、例えば５分毎に、例えば１０分毎に、例えば１５分毎に、例えば３０分毎に、例えば４５分毎に、１時間毎に、例えば２時間毎に、例えば５時間毎に、例えば１２時間毎に、例えば２４時間毎に、例えば３６時間毎に、例えば４８時間毎に、例えば７２時間毎に、例えば９６時間毎に、例えば１２０時間毎に、例えば１４４時間毎に、例えば１６８時間毎に、または何らかの他の一定間隔で放出することを意味する。
【0083】
他の実施形態では、本ポリマーナノワイヤは経時的に分解性であり、特定の量のポリマーナノワイヤが分解された後に少なくとも１つの生物活性化合物を送達する。例えば、投与部位において１０％毎のポリマーナノワイヤが分解された後に、例えば１５％毎のポリマーナノワイヤが分解された後に、例えば２０％毎のポリマーナノワイヤが分解された後に、例えば２５％毎のポリマーナノワイヤが分解された後に、例えば３０％毎のポリマーナノワイヤが分解された後に、例えば３３％毎のポリマーナノワイヤが分解された後に、ある量の少なくとも１つの生物活性化合物が送達されることがある。
【0084】
さらに他の実施形態では、本開示において使用される個々のポリマーナノワイヤは、標的部位において投与後直ちに、大量の少なくとも１つの生物活性化合物を放出し、例えば５０％以上、例えば６０％以上、例えば７０％以上、例えば９０％以上の少なくとも１つの生物活性化合物が投与後直ちに放出される。さらに他の実施形態では、個々のポリマーナノワイヤは少なくとも１つの生物活性化合物を所定の速度で、例えば実質的にゼロ次の放出速度で、例えば実質的に一次の放出速度で、または実質的に二次の放出速度で放出する。
【0085】
特定の実施形態では、個々のポリマーナノワイヤは、１０ｎｍ～５００ｎｍ、例えば１５ｎｍ～４００ｎｍ、例えば２０ｎｍ～３００ｎｍ、例えば２５ｎｍ～２００ｎｍ、例えば５０ｎｍ～１００ｎｍの範囲の直径、例えば２００ｎｍの直径を有することがあり、また、０．０１μｍ以上、例えば０．０５μｍ以上、例えば０．１μｍ以上、例えば０．５μｍ以上、例えば１μｍ以上、例えば２μｍ以上、例えば３μｍ以上、例えば５μｍ以上、例えば１０μｍ以上、例えば１５μｍ以上、例えば２０μｍ以上、例えば２５μｍ以上、例えば３０μｍ以上、例えば５０μｍ以上、例えば１００μｍ以上、例えば１５０μｍ以上、例えば２００μｍ以上、および２５０μｍ以上、またはそれ以上である長さを有することがある。さらなる実施形態では、少なくとも１つの生物活性化合物を有する個々のポリマーナノワイヤは約１０μｍ～約２０μｍの長さおよび約１０ｎｍ～約５００ｎｍの直径を有する。
【0086】
マイクロロッド
本開示の方法、使用、および組成物の特定の実施形態では、生体材料担体はマイクロロッドを含む。さらなる実施形態では、マイクロロッドは少なくとも１つの生物活性化合物、例えば無痛ＮＧＦを含む。マイクロロッドは任意の三次元形状を有することができる。いくつかの実施形態では、マイクロロッドは任意の正多面体、任意の不規則多面体、およびその組み合わせの三次元形状を有する。いくつかの実施形態では、マイクロロッドの形状は特定の組織によって、特定の組織中の特定の位置によって、または特定の投与様式もしくは埋め込み様式によって規定される。例えば、注射用スキャフォールドは、注射流中の流動に適した形状のマイクロロッドを必要とすることがある。
本開示の方法、使用、および組成物の特定の実施形態では、生体材料担体はマイクロロッドを含む。さらなる実施形態では、マイクロロッドは少なくとも１つの生物活性化合物、例えば無痛ＮＧＦを含む。マイクロロッドは任意の三次元形状を有することができる。いくつかの実施形態では、マイクロロッドは任意の正多面体、任意の不規則多面体、およびその組み合わせの三次元形状を有する。いくつかの実施形態では、マイクロロッドの形状は特定の組織によって、特定の組織中の特定の位置によって、または特定の投与様式もしくは埋め込み様式によって規定される。例えば、注射用スキャフォールドは、注射流中の流動に適した形状のマイクロロッドを必要とすることがある。
【0087】
特定の実施形態では、表面積が増加したマイクロロッドが有利である。任意のマイクロロッドの表面積を、例えばテクスチャード加工表面を有するマイクロロッドを合成することで、かつ／または、例えば多孔質であるようにして、増加させることができる。マイクロロッドおよびそれらの調製は米国特許第８，５９１，９３３号に記載されている。
【0088】
特定の実施形態では、本明細書において生体材料担体として使用されるマイクロロッドは１つまたはそれ以上のポリマー、１つまたはそれ以上の共重合体、１つまたはそれ以上のブロックポリマー（ジブロックポリマー、トリブロックポリマー、および／または高次マルチブロックポリマーを含む）、ならびにその組み合わせから合成される。有用なポリマーとしてはポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ポリ（ε－カプロラクトン）（ＰＣＬ）、ポリ（エチレングリコール）ジアクリレート（ＰＥＧＤＡ）、ポリ（エチレングリコール）ジメタクリレート（ＰＥＧＤＭＡ）、ＳＵ－８、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリ（ラクチド－ｃｏ－グリコリド）、ポリ－カプロラクトン、およびエラスチン／カプロラクトン、コラーゲン－ＧＡＧ、コラーゲン、フィブリン、ポリ（無水物）、ポリ（ヒドロキシ酸）、ポリ（オルトエステル）、ポリ（プロピルフラメート）、ポリアミド、ポリアミノ酸、ポリアセタール、生分解性ポリシアノアクリレート、生分解性ポリウレタンおよび多糖、ポリピロール、ポリアニリン、ポリチオフェン、ポリスチレン、ポリエステル、非生分解性ポリウレタン、ポリ尿素、ポリ（エチレン酢酸ビニル）、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリカーボネート、ポリ（エチレンオキシド）、ポリジオキサノン、チロシンをベースとする「疑似ポリアミノ酸」、チロシン由来ポリカーボネート、ポリ（ＤＴＥ－ｃｏ－ＤＴカーボネート）、チロシン由来ポリアクリレート、ポリ無水物、トリメチレンカーボネート、ポリ（β－ヒドロキシブチレート）、ポリ（ｇ－エチルグルタメート）、ポリ（ＤＴＨイミノカーボネート）、ポリ（ビスフェノールＡイミノカーボネート）、ポリ（オルトエステル）、ポリシアノアクリレート、およびポリホスファゼン、ポリ（ラクチド－ｃｏ－グリコリド）（ＰＬＧＡ）、ポリ（ＤＬ－ラクチド－ｃｏ－ε－カプロラクトン）（ＤＬＰＬＣＬ）、修飾多糖（セルロース、キチン、デキストラン）、修飾タンパク質、カゼインおよび大豆をベースとする生分解性熱可塑性材料、コラーゲン、ポリヒドロキシブチレート（ＰＨＢ）、ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ）とポリ（ブチレンテレフタレート）（ＰＢＴ）とのマルチブロック共重合体、ポリロタキサンが挙げられるがそれに限定されない。他の実施形態では、マイクロロッドは１つまたはそれ以上のリン脂質から形成される。２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（ＭＰＣ）、１つもしくはそれ以上のカチオン性ポリマー（ポリ（ａ－［４－アミノブチル］－Ｌ－グリコール酸）、または１つもしくはそれ以上のシリコーン－ウレタン共重合体。さらに他の実施形態では、マイクロロッドは上記ポリマーのいずれかの共重合体、上記ポリマーの混合物、および／または上記ポリマーの付加物から形成される。当業者は、本スキャフォールドのマイクロロッドを作製するために任意の他の公知のポリマーが好適であることを容易に認識するであろう。特定の実施形態では、ＰＥＧ組成物が、孔径を制御することで薬物放出を制御するために有意義である。
【0089】
フォトリソグラフィーを使用することで、ＰＥＧＤＭＡマイクロロッドを高スループットで製造することができる。さらに、９０％（ｖ／ｖ）ＰＥＧＤＭＡマクロマーを使用することで、ＰＥＧＤＭＡマイクロロッドに対するβ－ＮＧＦ添加量を増加させることができる。架橋密度を調整することで、ヒドロゲル内のポリマーメッシュサイズ、ならびに引き続く薬物の添加および放出を変化させることができる（ＨｏａｒｅおよびＫｏｈａｎｅ、２００８年、Ｐｏｌｙｍｅｒ ４９：１９９３～２００７頁；ＬｉおよびＭｏｏｎｅｙ、２０１６年、Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ １：１～１７頁）。ＰＥＧの濃度増加は添加能力の増加を示した（Ｓｔｕｋｅｌら、２０１５年、Ｊ Ｂｉｏｍｅｄ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ Ｒｅｓ Ｐａｒｔ Ａ １０３：６０４～６１３頁）。ＤＡＰＩなどの低分子量分子とＦＩＴＣ－ＢＳＡなどの高分子量分子との間で、添加に関する著しい目視差は明らかである。ＤＡＰＩはＰＥＧＤＭＡマイクロロッドを均一に染色し、一方、ＦＩＴＣ－ＢＳＡは添加後直ちにＰＥＧＤＭＡマイクロロッドの表面で大部分が可視化される。ＤＡＰＩが分子量０．２７７ｋＤａを有し、これに比べてＦＩＴＣ－ＢＳＡが６７ｋＤａサイズであるという前提で、サイズが小さい分子の方がＰＥＧＤＭＡポリマーメッシュ網目構造を横切ってまたはその中に容易に拡散可能であることが、顕微鏡写真により確認された（データは示さず）。
【0090】
添加β－ＮＧＦがその生物活性を保持したことを示すために、ＴｒｋＡ発現ＴＦ－１細胞株を使用してインビトロ増殖アッセイを行った（ＭａおよびＺｏｕ、２０１３年、Ｊ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２（２）：３２）。添加アッセイで１００，０００個が使用されたのに対し、このアッセイは１６，０００個のＰＥＧＤＭＡマイクロロッドで行われた。これは、１６，０００個のみが、インビボ実験に使用される２０μＬシリンジ中で有効に吸引可能であったからである。マイクロロッド１００，０００個中に加えられた総タンパク質の約３０～４０％が約１～２ｍｇであると計算された。したがって、最高計算値２μｇ（２０００ｎｇ）をマイクロロッド１６，０００個中に添加し、すべての並行実験について可溶性ＮＧＦ量として設定した。しかし、高度に特異的なＥＬＩＳＡアッセイでは１６，０００個のＰＥＧＤＭＡマイクロロッド中で約１８ｎｇのβ－ＮＧＦしか測定されなかった。このことは、一部のβ－ＮＧＦタンパク質が添加または溶出中に天然の分子配置を失い、それにより生物活性を減少させることがあるということを示唆している。おそらく、マイクロＢＣＡアッセイとＥＬＩＳＡ計算値との間の矛盾は、β－ＮＧＦの非共有結合性ホモ二量体高次構造の妨害、またはマイクロＢＣＡアッセイの非特異性に起因する可能性がある。にもかかわらず、生物活性β－ＮＧＦ １８ｎｇを含む１６，０００個のＰＥＧＤＭＡマイクロロッドは、おそらくは９６時間の実験期間にわたるβ－ＮＧＦの持続放出を動因とする、ＴＦ－１細胞増殖に対する強力な作用を示した。無添加ＰＥＧＤＭＡマイクロロッドと共に培養された細胞の増殖の僅かな増加も観察された。本明細書ではＰＥＧＤＭＡマイクロロッドの分解産物は評価しなかったが、低濃度のＰＥＧが細胞増殖を僅かに上昇させ、これがＴＦ－１細胞増殖の一因となっている可能性があるということは既に示されている（Ｂａｈｎｅｙら、２０１４年、Ｊ Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒａｌ Ｒｅｓ ２９（５））。
【0091】
特定の実施形態では、マイクロロッドは平均でそれぞれ約０．０１ミクロン、約０．０５ミクロン、約０．１ミクロン、約０．５ミクロン、約１ミクロン、約５ミクロン、約１０ミクロン、約１５ミクロン、約２０ミクロン、約２５ミクロン、約３０ミクロン、約３５ミクロン、約４０ミクロン、約４５ミクロン、約５０ミクロン、約５５ミクロン、約６０ミクロン、約６５ミクロン、約７０ミクロン、約７５ミクロン、約８０ミクロン、約８５ミクロン、約９０ミクロン、約９５ミクロン、約１００ミクロン、約１０５ミクロン、約１１０ミクロン、約１１５ミクロン、約１２０ミクロン、約１２５ミクロン、約１３０ミクロン、約１３５ミクロン、約１４０ミクロン、約１４５ミクロン、約１５０ミクロン、約１５５ミクロン、約１６０ミクロン、約１６５ミクロン、約１７０ミクロン、約１７５ミクロン、約１８０ミクロン、約１８５ミクロン、約１９０ミクロン、約１９５ミクロン、約２００ミクロン、約２０５ミクロン、約２１０ミクロン、約２１５ミクロン、約２２０ミクロン、約２２５ミクロン、約２３０ミクロン、約２３５ミクロン、約２４０ミクロン、約２４５ミクロン、約２５０ミクロン、約２５５ミクロン、約２６０ミクロン、約２６５ミクロン、約２７０ミクロン、約２７５ミクロン、約２８０ミクロン、約２８５ミクロン、約２９０ミクロン、約２９５ミクロン、約３００ミクロン、約３０５ミクロン、約３１０ミクロン、約３１５ミクロン、約３２０ミクロン、約３２５ミクロン、約３３０ミクロン、約３３５ミクロン、約３４０ミクロン、約３４５ミクロン、約３５０ミクロン、約３５５ミクロン、約３６０ミクロン、約３６５ミクロン、約３７０ミクロン、約３７５ミクロン、約３８０ミクロン、約３８５ミクロン、約３９０ミクロン、約３９５ミクロン、約４００ミクロン、約４０５ミクロン、約４１０ミクロン、約４１５ミクロン、約４２０ミクロン、約４２５ミクロン、約４３０ミクロン、約４３５ミクロン、約４４０ミクロン、約４４５ミクロン、約４５０ミクロン、約４５５ミクロン、約４６０ミクロン、約４６５ミクロン、約４７０ミクロン、約４７５ミクロン、約４８０ミクロン、約４８５ミクロン、約４９０ミクロン、約４９５ミクロン、約５００ミクロン、約５０５ミクロン、約５１０ミクロン、約５１５ミクロン、約５２０ミクロン、約５２５ミクロン、約５３０ミクロン、約５３５ミクロン、約５４０ミクロン、約５４５ミクロン、約５５０ミクロン、約５５５ミクロン、約５６０ミクロン、約５６５ミクロン、約５７０ミクロン、約５７５ミクロン、約５８０ミクロン、約５８５ミクロン、約５９０ミクロン、約５９５ミクロン、約６００ミクロン、約６０５ミクロン、約６１０ミクロン、約６１５ミクロン、約６２０ミクロン、約６２５ミクロン、約６３０ミクロン、約６３５ミクロン、約６４０ミクロン、約６４５ミクロン、約６５０ミクロン、約６５５ミクロン、約６６０ミクロン、約６６５ミクロン、約６７０ミクロン、約６７５ミクロン、約６８０ミクロン、約６８５ミクロン、約６９０ミクロン、約６９５ミクロン、約７００ミクロン、約７０５ミクロン、約７１０ミクロン、約７１５ミクロン、約７２０ミクロン、約７２５ミクロン、約７３０ミクロン、約７３５ミクロン、約７４０ミクロン、約７４５ミクロン、約７５０ミクロン、約７５５ミクロン、約７６０ミクロン、約７６５ミクロン、約７７０ミクロン、約７７５ミクロン、約７８０ミクロン、約７８５ミクロン、約７９０ミクロン、約７９５ミクロン、約８００ミクロン、約８０５ミクロン、約８１０ミクロン、約８１５ミクロン、約８２０ミクロン、約８２５ミクロン、約８３０ミクロン、約８３５ミクロン、約８４０ミクロン、約８４５ミクロン、約８５０ミクロン、約８５５ミクロン、約８６０ミクロン、約８６５ミクロン、約８７０ミクロン、約８７５ミクロン、約８８０ミクロン、約８８５ミクロン、約８９０ミクロン、約８９５ミクロン、約９００ミクロン、約９０５ミクロン、約９１０ミクロン、約９１５ミクロン、約９２０ミクロン、約９２５ミクロン、約９３０ミクロン、約９３５ミクロン、約９４０ミクロン、約９４５ミクロン、約９５０ミクロン、約９５５ミクロン、約９６０ミクロン、約９６５ミクロン、約９７０ミクロン、約９７５ミクロン、約９８０ミクロン、約９８５ミクロン、約９９０ミクロン、約９９５ミクロン、または約１０００ミクロン以上の長さである。
【0092】
さらなる実施形態では、マイクロロッドは約Ａミクロン×Ｂミクロンの断面積を有し、ここでＡおよびＢは独立して約１ミクロン、約５ミクロン、約１０ミクロン、約１５ミクロン、約２０ミクロン、約２５ミクロン、約３０ミクロン、約３５ミクロン、約４０ミクロン、約４５ミクロン、約５０ミクロン、約５５ミクロン、約６０ミクロン、約６５ミクロン、約７０ミクロン、約７５ミクロン、約８０ミクロン、約８５ミクロン、約９０ミクロン、約９５ミクロン、約１００ミクロン、約１０５ミクロン、約１１０ミクロン、約１１５ミクロン、約１２０ミクロン、約１２５ミクロン、約１３０ミクロン、約１３５ミクロン、約１４０ミクロン、約１４５ミクロン、約１５０ミクロン、約１５５ミクロン、約１６０ミクロン、約１６５ミクロン、約１７０ミクロン、約１７５ミクロン、約１８０ミクロン、約１８５ミクロン、約１９０ミクロン、約１９５ミクロン、約２００ミクロン、約２０５ミクロン、約２１０ミクロン、約２１５ミクロン、約２２０ミクロン、約２２５ミクロン、約２３０ミクロン、約２３５ミクロン、約２４０ミクロン、約２４５ミクロン、約２５０ミクロン、約２５５ミクロン、約２６０ミクロン、約２６５ミクロン、約２７０ミクロン、約２７５ミクロン、約２８０ミクロン、約２８５ミクロン、約２９０ミクロン、約２９５ミクロン、約３００ミクロン、約３０５ミクロン、約３１０ミクロン、約３１５ミクロン、約３２０ミクロン、約３２５ミクロン、約３３０ミクロン、約３３５ミクロン、約３４０ミクロン、約３４５ミクロン、約３５０ミクロン、約３５５ミクロン、約３６０ミクロン、約３６５ミクロン、約３７０ミクロン、約３７５ミクロン、約３８０ミクロン、約３８５ミクロン、約３９０ミクロン、約３９５ミクロン、約４００ミクロン、約４０５ミクロン、約４１０ミクロン、約４１５ミクロン、約４２０ミクロン、約４２５ミクロン、約４３０ミクロン、約４３５ミクロン、約４４０ミクロン、約４４５ミクロン、約４５０ミクロン、約４５５ミクロン、約４６０ミクロン、約４６５ミクロン、約４７０ミクロン、約４７５ミクロン、約４８０ミクロン、約４８５ミクロン、約４９０ミクロン、約４９５ミクロン、約５００ミクロン、約５０５ミクロン、約５１０ミクロン、約５１５ミクロン、約５２０ミクロン、約５２５ミクロン、約５３０ミクロン、約５３５ミクロン、約５４０ミクロン、約５４５ミクロン、約５５０ミクロン、約５５５ミクロン、約５６０ミクロン、約５６５ミクロン、約５７０ミクロン、約５７５ミクロン、約５８０ミクロン、約５８５ミクロン、約５９０ミクロン、約５９５ミクロン、約６００ミクロン、約６０５ミクロン、約６１０ミクロン、約６１５ミクロン、約６２０ミクロン、約６２５ミクロン、約６３０ミクロン、約６３５ミクロン、約６４０ミクロン、約６４５ミクロン、約６５０ミクロン、約６５５ミクロン、約６６０ミクロン、約６６５ミクロン、約６７０ミクロン、約６７５ミクロン、約６８０ミクロン、約６８５ミクロン、約６９０ミクロン、約６９５ミクロン、約７００ミクロン、約７０５ミクロン、約７１０ミクロン、約７１５ミクロン、約７２０ミクロン、約７２５ミクロン、約７３０ミクロン、約７３５ミクロン、約７４０ミクロン、約７４５ミクロン、約７５０ミクロン、約７５５ミクロン、約７６０ミクロン、約７６５ミクロン、約７７０ミクロン、約７７５ミクロン、約７８０ミクロン、約７８５ミクロン、約７９０ミクロン、約７９５ミクロン、約８００ミクロン、約８０５ミクロン、約８１０ミクロン、約８１５ミクロン、約８２０ミクロン、約８２５ミクロン、約８３０ミクロン、約８３５ミクロン、約８４０ミクロン、約８４５ミクロン、約８５０ミクロン、約８５５ミクロン、約８６０ミクロン、約８６５ミクロン、約８７０ミクロン、約８７５ミクロン、約８８０ミクロン、約８８５ミクロン、約８９０ミクロン、約８９５ミクロン、約９００ミクロン、約９０５ミクロン、約９１０ミクロン、約９１５ミクロン、約９２０ミクロン、約９２５ミクロン、約９３０ミクロン、約９３５ミクロン、約９４０ミクロン、約９４５ミクロン、約９５０ミクロン、約９５５ミクロン、約９６０ミクロン、約９６５ミクロン、約９７０ミクロン、約９７５ミクロン、約９８０ミクロン、約９８５ミクロン、約９９０ミクロン、約９９５ミクロン、または約１０００ミクロン以上から選択される。
【0093】
特定の実施形態では、少なくとも１つの生物活性化合物、例えば無痛ＮＧＦは共有結合性相互作用によってマイクロロッドと結合している。他の特定の実施形態では、少なくとも１つの生物活性化合物、例えば無痛ＮＧＦは非共有結合性結合によってマイクロロッドと結合している。共有結合性相互作用では、少なくとも１つの生物活性化合物は任意の好適な手段を通じてマイクロロッドに直接結合している。あるいは、少なくとも１つの生物活性化合物は、それ自体生物活性を有さないスペーサーもしくはリンカーを通じて、または第１の生物活性化合物に比べて同じまたは異なる生物活性を有する第２の生物活性化合物を通じて、マイクロロッドに結合している。さらに別の実施形態では、少なくとも１つの生物活性化合物はマイクロロッドから溶出可能である。溶出可能であるとは、少なくとも１つの生物活性化合物が例えば単純拡散、共有結合の切断、解離、または何らかの他の種類の相互作用を通じてマイクロロッドから分離可能であることを意味する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの生物活性化合物は制御放出が可能であり、他の実施形態では、放出は本質的にボーラスである。
【0094】
さらに別の実施形態では、生体材料担体は、標的化分子の結合パートナーを発現する標的細胞または標的組織と相互作用する標的化分子と結合している。特定の実施形態では、標的化分子は細胞接着分子、細胞接着分子リガンド、標的細胞型の表面で発現されるエピトープに対して免疫特異的な抗体、および、結合対の１つのメンバーが関心対象の標的細胞または標的組織で発現される結合対の任意のメンバーから選択されるがそれに限定されない。
【0095】
投与
本開示の１つの態様は、少なくとも１つの生物活性化合物、例えば無痛神経成長因子（ＮＧＦ）を含む医薬組成物を対象に投与することを含む。本開示のさらなる態様は、少なくとも１つの生物活性化合物、例えば無痛神経成長因子（ＮＧＦ）を含む生体材料担体を含む医薬組成物を対象に投与することを含む。本開示の特定の実施形態の方法および使用を実施する上で、生物活性化合物、例えば無痛ＮＧＦを有する複数の個々のナノワイヤ、マイクロロッド、または他の生体材料担体の組成物が対象に投与される。
本開示の１つの態様は、少なくとも１つの生物活性化合物、例えば無痛神経成長因子（ＮＧＦ）を含む医薬組成物を対象に投与することを含む。本開示のさらなる態様は、少なくとも１つの生物活性化合物、例えば無痛神経成長因子（ＮＧＦ）を含む生体材料担体を含む医薬組成物を対象に投与することを含む。本開示の特定の実施形態の方法および使用を実施する上で、生物活性化合物、例えば無痛ＮＧＦを有する複数の個々のナノワイヤ、マイクロロッド、または他の生体材料担体の組成物が対象に投与される。
【0096】
特定の実施形態では、少なくとも１つの生物活性化合物を含む生体材料担体を含む医薬組成物は局所投与される。本明細書において使用される「局所的な」および「局所的に」という用語は、骨折間隙中、骨折部位の隣、骨折仮骨の隣、骨膜沿い、および／または髄内管内を意味する。さらなる実施形態では、組成物は骨折仮骨において、骨折仮骨の隣で、または骨折仮骨の近くで対象の組織に投与されることがある。
【0097】
任意の好都合な投与様式を使用することができる。投与様式としては注射（例えば経皮、皮下、静脈内、筋肉内、またはくも膜下腔内）を挙げることができるがそれに限定されない。組成物は、単独で投与されるか、または移植骨もしくはスキャフォールド、例えばスポンジ、例えばコラーゲンスポンジに適用されることがある。特定の実施形態では、組成物は、少なくとも１つの生物活性化合物を含む生体材料担体（例えばＮＧＦ溶出マイクロロッド）を骨折部位に標的化する作用物質をさらに含む。さらなる実施形態では、作用物質は骨自家移植片、同種移植片、または抗生剤セメントビーズである。
【0098】
特定の実施形態では、個々の生体材料担体は所定の期間にわたって標的位置に局在化する。本明細書において、「局在化する」という用語は、通常の意味で使用され、投与される個々のナノワイヤまたはナノロッドを、例えば標的部位の所定の領域内に、例えば５０ｍｍ２以下、例えば４０ｍｍ２以下、例えば３０ｍｍ２以下、例えば２５ｍｍ２以下、例えば２０ｍｍ２以下、例えば１５ｍｍ２以下、例えば１０ｍｍ２以下、例えば９ｍｍ２以下、例えば８ｍｍ２以下、例えば７ｍｍ２以下、例えば６ｍｍ２以下、例えば５ｍｍ２以下、例えば４ｍｍ２以下、例えば３ｍｍ２以下、例えば２ｍｍ２以下、例えば１ｍｍ２以下、例えば０．５ｍｍ２以下、例えば０．１ｍｍ２以下、例えば０．０５ｍｍ２以下の領域、例えば０．００１ｍｍ２以下の所定の領域内に集中させるかまたは集積することを意味する。いくつかの場合では、組成物中の投与される個々のナノワイヤまたはマイクロロッドの１０％以上が標的部位の１つの領域内に局在化し、例えば、投与される組成物中の個々のナノワイヤまたはマイクロロッドの２５％以上、例えば５０％以上、例えば５５％以上、例えば６０％以上、例えば６５％以上、例えば７０％以上、例えば７５％以上、例えば８０％以上、例えば８５％以上、例えば９０％以上、例えば９５％以上、例えば９６％以上、例えば９７％以上、例えば９８％以上、例えば９９％以上、および９９．９％以上が標的部位の１つの領域内に、例えば５０ｍｍ２以下、例えば４０ｍｍ２以下、例えば３０ｍｍ２以下、例えば２５ｍｍ２以下、例えば２０ｍｍ２以下、例えば１５ｍｍ２以下、例えば１０ｍｍ２以下、例えば９ｍｍ２以下、例えば８ｍｍ２以下、例えば７ｍｍ２以下、例えば６ｍｍ２以下、例えば５ｍｍ２以下、例えば４ｍｍ２以下、例えば３ｍｍ２以下、例えば２ｍｍ２以下、例えば１ｍｍ２以下、例えば０．５ｍｍ２以下、例えば０．１ｍｍ２以下、例えば０．０５ｍｍ２以下の領域、例えば０．００１ｍｍ２以下の所定の領域内に局在化する。
【0099】
医薬組成物
本開示は、ｉ）神経成長因子（ＮＧＦ）およびｉｉ）薬学的に許容される担体を含む、対象において骨治癒を刺激すること、対象において骨治癒を促進すること、および／または対象において骨治癒を改善することにおける使用のための医薬組成物を提供する。本開示はまた、ｉ）神経成長因子（ＮＧＦ）を含む生体材料担体およびｉｉ）薬学的に許容される担体を含む、対象において骨治癒を刺激すること、対象において骨治癒を促進すること、および／または対象において骨治癒を改善することにおける使用のための医薬組成物を提供する。本開示はまた、ｉ）神経成長因子（ＮＧＦ）およびｉｉ）薬学的に許容される担体を含む、対象において骨折を処置することにおける使用のための医薬組成物を提供する。本開示はまた、ｉ）神経成長因子（ＮＧＦ）を含む生体材料担体およびｉｉ）薬学的に許容される担体を含む、対象において骨折を処置することにおける使用のための医薬組成物を提供する。本開示の医薬組成物は、運搬性、送達性、忍容性などを改善するように製剤に組み入れられる好適な賦形剤および／または他の薬剤と共に投与される。多数の適切な製剤を、すべての薬剤師に公知の処方集にみることができる：Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ。これらの製剤としては例えば散剤、ペースト剤、軟膏剤、ゼリー剤、ワックス剤、油剤、脂質剤、脂質（カチオン性またはアニオン性）含有ベシクル（例えばＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（商標））、ＤＮＡ結合体、無水吸収ペースト、水中油型および油中水型乳剤、乳剤カーボワックス（様々な分子量のポリエチレングリコール）、半固体ゲル、およびカーボワックスを含む半固体混合物が挙げられる。Ｐｏｗｅｌｌら、「Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ ｆｏｒ ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ」、ＰＤＡ（１９９８年）、Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ Ｔｅｃｈｎｏｌ ５２：２３８～３１１頁も参照。
本開示は、ｉ）神経成長因子（ＮＧＦ）およびｉｉ）薬学的に許容される担体を含む、対象において骨治癒を刺激すること、対象において骨治癒を促進すること、および／または対象において骨治癒を改善することにおける使用のための医薬組成物を提供する。本開示はまた、ｉ）神経成長因子（ＮＧＦ）を含む生体材料担体およびｉｉ）薬学的に許容される担体を含む、対象において骨治癒を刺激すること、対象において骨治癒を促進すること、および／または対象において骨治癒を改善することにおける使用のための医薬組成物を提供する。本開示はまた、ｉ）神経成長因子（ＮＧＦ）およびｉｉ）薬学的に許容される担体を含む、対象において骨折を処置することにおける使用のための医薬組成物を提供する。本開示はまた、ｉ）神経成長因子（ＮＧＦ）を含む生体材料担体およびｉｉ）薬学的に許容される担体を含む、対象において骨折を処置することにおける使用のための医薬組成物を提供する。本開示の医薬組成物は、運搬性、送達性、忍容性などを改善するように製剤に組み入れられる好適な賦形剤および／または他の薬剤と共に投与される。多数の適切な製剤を、すべての薬剤師に公知の処方集にみることができる：Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ。これらの製剤としては例えば散剤、ペースト剤、軟膏剤、ゼリー剤、ワックス剤、油剤、脂質剤、脂質（カチオン性またはアニオン性）含有ベシクル（例えばＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（商標））、ＤＮＡ結合体、無水吸収ペースト、水中油型および油中水型乳剤、乳剤カーボワックス（様々な分子量のポリエチレングリコール）、半固体ゲル、およびカーボワックスを含む半固体混合物が挙げられる。Ｐｏｗｅｌｌら、「Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ ｆｏｒ ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ」、ＰＤＡ（１９９８年）、Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ Ｔｅｃｈｎｏｌ ５２：２３８～３１１頁も参照。
【0100】
特定の実施形態では、賦形剤は単に水であり、１つの実施形態では、薬学グレードの水である。他の実施形態では、賦形剤は緩衝液であり、１つの実施形態では、緩衝液は薬学的に許容される。また、緩衝液としては生理食塩水、グリシン、ヒスチジン、グルタミン酸、コハク酸、リン酸、酢酸、アスパラギン酸塩、または任意の２つ以上の緩衝液の組み合わせを挙げることができるがそれに限定されない。
【0101】
他の実施形態では、基質が組成物に含まれる。さらなる実施形態では、基質は粘稠性であるがなお流動可能であり、他の実施形態では、基質は固体、半固体、ゼラチン状、またはそれらの間の任意の密度である。したがって、様々な実施形態では、非限定的に、基質はコラーゲン、ゼラチン、グルテン、エラスチン、アルブミン、キチン、ヒアルロン酸、セルロース、デキストラン、ペクチン、ヘパリン、アガロース、フィブリン、アルギネート、カルボキシメチルセルロース、Ｍａｔｒｉｇｅ（商標）（Ｅｎｇｅｌｂｒｅｔｈ－Ｈｏｌｍ－Ｓｗａｒｍ（ＥＨＳ）マウス肉腫から抽出された可溶化基底膜調製品により形成されるヒドロゲル）、ヒドロゲル－オルガノゲル、またはその混合物および／もしくは組み合わせである。当業者は、任意の薬学グレード基質が本開示の組成物中での使用に適していることを改めて認識するであろう。
【0102】
特定の実施形態では、少なくとも１つの生物活性化合物を含む生体材料担体の用量は固定されている（すなわち、それが投与される対象の体重には基づかない）。さらなる実施形態では、用量は約１ｎｇ／日～約５００ｎｇ／日、約５ｎｇ／日～約２５０ｎｇ／日、約１０ｎｇ／日～約１００ｎｇ／日、または約２５ｎｇ／日～約５０ｎｇ／日である。特定の実施形態では、生体材料担体からの少なくとも１つの生物活性化合物の放出は非線形バースト放出である。他の実施形態では、少なくとも１つの生物活性化合物を含む生体材料担体の用量は投与される対象の年齢およびサイズ、骨折の種類／重症度、骨折位置、状態、投与経路などに応じて異なることがある。本明細書に開示される少なくとも１つの生物活性化合物を含む生体材料担体が患者において骨折を処置するために使用される場合、少なくとも１つの生物活性化合物を含む生体材料担体を通常は約０．１～約１００ｍｇ／ｋｇ体重の単回量で投与することが有利である。特定の実施形態では、用量／投与量は投与部位／標的部位における担体からの生物活性化合物の平均放出量に基づく。
【0103】
特定の実施形態では、処置（投与）の頻度および期間を調整することができる。特定の実施形態では、本明細書に開示される少なくとも１つの生物活性化合物を含む生体材料担体を初回投与として投与した後、少なくとも１つの生物活性化合物を含む生体材料担体の２回目の投与または複数回の後続の投与を初回投与の量とほぼ同じまたはそれ未満である量で実行することができ、ここで後続の投与は、十分な治癒進行パラメータの欠如に基づいて、少なくとも１週間、少なくとも２週間；少なくとも３週間；少なくとも１カ月；またはそれ以上の間隔で行われる。特定の実施形態では、十分な治癒進行パラメータの欠如は、Ｘ線像での石灰化がないこと、Ｘ線像での石灰化の低さ、疼痛減少がないこと、疼痛減少が最低限であること、安定性の増加がないこと、および／または安定性の増加が最小限であることを含む。臨床医は、診断および固有の条件に基づいて患者毎に処置の頻度および期間を変更することができるであろう。
【0104】
特定の実施形態では、医薬組成物を制御放出システムで送達することができる。１つの実施形態では、ポンプを使用することができる。別の実施形態では、ポリマー材料を使用することができる。さらに別の実施形態では、制御放出システムを組成物の標的の近傍に配置することができ、したがって全身用量の一部しか必要にならない。
【0105】
注射用製剤は静脈内注射、皮下注射、経皮注射、筋肉内注射、点滴などのための剤形を含むことができる。これらの注射用製剤は公知の方法により調製可能である。
【0106】
特定の実施形態では、本開示の医薬組成物を標準的なニードルおよびシリンジによって皮下的または経皮的に送達することができる。さらに、ペン送達装置が本開示の医薬組成物を送達することに容易に適用される。このペン送達装置は再使用可能または使い捨て可能である。一般に、再使用可能なペン送達装置は、医薬組成物を収容する交換可能なカートリッジを利用する。カートリッジ内の全部の医薬組成物が投与されて、カートリッジが空になったときに、空のカートリッジを容易に廃棄して、医薬組成物を収容する新たなカートリッジと交換することができる。次にペン送達装置を再使用することができる。使い捨て可能なペン送達装置には交換可能なカートリッジが存在しない。むしろ、使い捨て可能なペン送達装置は、装置内のリザーバ中に保持される医薬組成物で予め満たされている。リザーバの医薬組成物が空になったとき、装置全体が廃棄される。
【0107】
特定の実施形態では、本開示の医薬組成物は、骨折治癒を刺激することにおける使用のための、骨折治癒を促進することにおける使用のための、骨折治癒を改善するための、および対象において骨折を処置することにおける使用のための組成物である。
【0108】
治療的使用
特定の実施形態では、本開示の生体材料担体に含まれる生物活性化合物、例えばマイクロロッド中の無痛ＮＧＦが、それを必要とする対象において、骨折の処置のために、骨折治癒の刺激のために、骨折治癒の促進のために、および骨折治癒の改善のために有用である。特定の実施形態では、生物活性化合物それ自体、例えばＮＧＦまたは無痛ＮＧＦが、それを必要とする対象において、骨折の処置のために、骨折治癒の刺激のために、骨折治癒の促進のために、および骨折治癒の改善のために有用である。
特定の実施形態では、本開示の生体材料担体に含まれる生物活性化合物、例えばマイクロロッド中の無痛ＮＧＦが、それを必要とする対象において、骨折の処置のために、骨折治癒の刺激のために、骨折治癒の促進のために、および骨折治癒の改善のために有用である。特定の実施形態では、生物活性化合物それ自体、例えばＮＧＦまたは無痛ＮＧＦが、それを必要とする対象において、骨折の処置のために、骨折治癒の刺激のために、骨折治癒の促進のために、および骨折治癒の改善のために有用である。
【0109】
本開示のさらなる実施形態では、生体材料担体に含まれる生物活性化合物は、患者において骨折を処置するための、骨折治癒を刺激するための、骨折治癒を促進するための、骨折治癒を改善するための、医薬組成物または医薬の調製に使用される。本開示のさらに別の実施形態では、生体材料担体に含まれる生物活性化合物は、補助療法として、骨折を処置するために有用であることが当業者に知られている任意の他の薬剤または任意の他の療法と共に使用される。
【0110】
組み合わせ療法
組み合わせ療法は、生体材料担体に含まれる生物活性化合物、ならびに該化合物および担体と有利に組み合わせることができる任意のさらなる治療剤を含むことができる。生体材料担体に含まれる生物活性化合物を、骨折、および／または骨折に関連する症状を処置するために使用される１つまたはそれ以上の薬物または療法と相乗的に組み合わせることができる。
組み合わせ療法は、生体材料担体に含まれる生物活性化合物、ならびに該化合物および担体と有利に組み合わせることができる任意のさらなる治療剤を含むことができる。生体材料担体に含まれる生物活性化合物を、骨折、および／または骨折に関連する症状を処置するために使用される１つまたはそれ以上の薬物または療法と相乗的に組み合わせることができる。
【0111】
いくつかの実施形態では、生体材料担体に含まれる生物活性化合物を、タンパク質サプリメント（例えばリジン、アルギニン、プロリン、グリシン、システイン、グルタミンを含む）、抗酸化剤（例えばビタミンＥ、ビタミンＣ、リコピン、α－リポ酸）、ミネラルサプリメント（例えばカルシウム、鉄、カリウム、亜鉛、銅、リン、生物活性ケイ素）、ビタミンサプリメント（例えばＢ（Ｂ６）、Ｃ、Ｄ、および／またはＫ）、生薬サプリメント（例えばコンフリー、アルニカ、ツクシ草、シッサス・クアドラングラリス（Ｃｉｓｓｕｓ ｑｕａｄｒａｎｇｕｌａｒｉｓ））、抗炎症栄養素（例えばケルセチン、フラボノイド、オメガ３脂肪酸、タンパク質分解酵素）、ならびに運動を含むがそれに限定されない、１つまたはそれ以上のさらなる治療剤／療法との組み合わせで使用することができる。さらに他の実施形態では、生体材料担体に含まれる生物活性化合物を、変異ＮＧＦの前に別の薬物、例えば軟骨形成促進剤（例えばＴＧＦｂ、さらには場合によってはＰＴＨ／ＰＴＨｒＰ）と共に順次投与することで、軟骨から骨への変換を引き起こすことができる。
【0112】
本明細書において使用される「～との組み合わせで」という用語は、少なくとも１つの治療剤／療法が、生体材料担体に含まれる生物活性化合物の投与の前に、それと同時に、またはその後に投与可能であることを意味する。「～との組み合わせで」という用語は、生体材料担体に含まれる生物活性化合物、および少なくとも１つのさらなる治療剤／療法の順次投与または同時投与も含む。
【0113】
本開示において、「同時」投与は、例えば、生体材料担体に含まれる生物活性化合物、および少なくとも１つのさらなる治療剤／療法を対象に１つの剤形で投与すること、または互いに約３０分以内に対象に投与される別々の剤形で投与することを含む。別々の剤形で投与される場合、各剤形は同じ経路によって投与されることがあり（例えば、生体材料担体に含まれる生物活性化合物、および少なくとも１つのさらなる治療剤／療法はいずれも経皮投与などされることがあり）；あるいは、各剤形は異なる経路によって投与されることがある（例えば、生体材料担体に含まれる生物活性化合物は経皮投与されることがあり、少なくとも１つのさらなる治療有効成分は経口投与されることがある）。いずれにせよ、本開示の目的のためには、成分を１つの剤形で投与すること、別々の剤形で同じ経路によって投与すること、または別々の剤形で別々の経路によって投与することはいずれも「同時投与」と考慮される。本開示の目的のためには、少なくとも１つのさらなる治療剤／療法の投与の「前の」、それと「同時の」、またはその「後の」（これらの用語は上記で定義されている）、生体材料担体に含まれる生物活性化合物の投与は、少なくとも１つのさらなる治療剤／療法「との組み合わせでの」生体材料担体に含まれる生物活性化合物の投与と考慮される。
【0114】
キット
さらなる態様では、本開示は、本明細書に開示される少なくとも１つの生物活性化合物を含む生体材料担体の組成物を調製するために必要な少なくとも１つまたはそれ以上の構成要素、例えば複数の構成要素を含む、キットを提供する。特定の実施形態では、１つまたはそれ以上の各構成要素を包装キットとして、例えば個々の容器（例えばパウチ）中で提供することができる。キットは、本方法を実施するための他の構成要素、例えば測定装置および適用装置（例えばシリンジ）、ならびに、ビーカーおよびメスフラスコなどの溶液用容器をさらに含むことができる。
さらなる態様では、本開示は、本明細書に開示される少なくとも１つの生物活性化合物を含む生体材料担体の組成物を調製するために必要な少なくとも１つまたはそれ以上の構成要素、例えば複数の構成要素を含む、キットを提供する。特定の実施形態では、１つまたはそれ以上の各構成要素を包装キットとして、例えば個々の容器（例えばパウチ）中で提供することができる。キットは、本方法を実施するための他の構成要素、例えば測定装置および適用装置（例えばシリンジ）、ならびに、ビーカーおよびメスフラスコなどの溶液用容器をさらに含むことができる。
【0115】
さらに、キットは、本方法をどのようにして実施するかに関する順を追った説明書を含むことができる。したがって、キットには、説明書が、包装インサートとして存在するか、キットまたはその構成要素の容器のラベリング中に存在する（すなわち包装またはサブ包装に付随する）ことなどがある。他の実施形態では、説明書は、好適なコンピュータ可読記憶媒体、例えばＣＤ－ＲＯＭ、フロッピーディスクなどに存在する電子記憶データファイルとして存在する。さらに他の実施形態では、実際の説明書はキットには存在しないが、リモートソースから例えばインターネットを通じて説明書を得るための手段が提供される。
【0116】
実施例
以下の実施例は、本開示の方法および組成物をどのようにして作製および使用するかに関する完全な開示および記載を当業者に提供するように記載されており、本発明者らが自らの開示と見なしているものの範囲を限定するようには意図されていない。使用される数字（例えば量、温度など）に関して正確さを確保するように努めたが、いくつかの実験上の誤差および偏差を考慮すべきである。別途指示がない限り、部は重量部であり、分子量は平均分子量であり、温度は摂氏度であり、室温は約２５℃であり、圧力は大気圧またはその近傍である。
以下の実施例は、本開示の方法および組成物をどのようにして作製および使用するかに関する完全な開示および記載を当業者に提供するように記載されており、本発明者らが自らの開示と見なしているものの範囲を限定するようには意図されていない。使用される数字（例えば量、温度など）に関して正確さを確保するように努めたが、いくつかの実験上の誤差および偏差を考慮すべきである。別途指示がない限り、部は重量部であり、分子量は平均分子量であり、温度は摂氏度であり、室温は約２５℃であり、圧力は大気圧またはその近傍である。
【実施例1】
【0117】
無痛ＮＧＦ
１．１ 無痛ＮＧＦは熱痛覚過敏を誘発しない
ＮＧＦＷＴナノワイヤまたはＮＧＦＲ１００Ｗナノワイヤに関連する痛覚を特徴づけるために、痛覚過敏を最初にＮＧＦＲ１００Ｗについて評価する必要があった。可溶性ＮＧＦＲ１００Ｗ ２００ｎｇの皮内送達は、Ｒａｎｄａｌ－Ｓｅｌｉｔｔｏ試験によれば急性機械痛覚過敏を誘発せず、Ｈａｒｇｒｅａｖｅｓ試験によれば急性熱痛覚過敏を誘発しなかった（Ｓｕｎｇら、２０１８年、Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ３８：３３９４～３４１３頁）。新たな用量漸増試験は、ＮＧＦＲ１００Ｗが野生型ＮＧＦよりも１０倍高い用量で疼痛感作を誘発しないことを示す（図２Ａおよび図２Ｂ）。具体的には、野生型ＮＧＦ ０．５ｍｇは注射の２０分後および４５分後に有意な熱疼痛を引き起こし、一方、ＮＧＦＲ１００Ｗは５．０ｍｇでそれを引き起こさなかった（図２Ａ）。無痛ＮＧＦが誘発した侵害受容閾値の減少は用量依存的効果を示唆するものであるが、予備試験では統計的有意性に到達しなかった（図２Ｂ）。また、タンパク質０．５～５ｍｇが添加されたナノワイヤ２００ｍｇの皮内注射を行うことで、ＮＧＦＷＴナノワイヤおよびＮＧＦＲ１００Ｗナノワイヤの侵害受容閾値を試験する。上記と同様に、Ｈａｒｇｒｅａｖｅｓ技術およびＲａｎｄａｌ－Ｓｅｌｉｔｔｏ閾値試験を使用して熱痛覚過敏および機械痛覚過敏を測定する。ＮＧＦでの臨床試験において、痛覚は早期発症を伴った（Ｓｕｎｇら、２０１９年、Ｎｅｕｒａｌ Ｒｅｇｅｎ Ｒｅｓ １４：５７０～５７３頁）；したがって、図２Ｂに示すように、試験を注射の２０分後および４５分後に行う。ＮＧＦＲ１００Ｗによる疼痛感作が野生型ＮＧＦに比べて統計的に有意に減少していることが一次成功判定基準である。図２Ａおよび図２Ｂに示されるデータセットの平均値および標準偏差に基づいて、検出力分析は、検出力レベル＞８０％を効果量ｄ＝１．５および有意性レベル５％で実現するためにマウス６匹／群が必要であることを示す。
１．１ 無痛ＮＧＦは熱痛覚過敏を誘発しない
ＮＧＦＷＴナノワイヤまたはＮＧＦＲ１００Ｗナノワイヤに関連する痛覚を特徴づけるために、痛覚過敏を最初にＮＧＦＲ１００Ｗについて評価する必要があった。可溶性ＮＧＦＲ１００Ｗ ２００ｎｇの皮内送達は、Ｒａｎｄａｌ－Ｓｅｌｉｔｔｏ試験によれば急性機械痛覚過敏を誘発せず、Ｈａｒｇｒｅａｖｅｓ試験によれば急性熱痛覚過敏を誘発しなかった（Ｓｕｎｇら、２０１８年、Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ３８：３３９４～３４１３頁）。新たな用量漸増試験は、ＮＧＦＲ１００Ｗが野生型ＮＧＦよりも１０倍高い用量で疼痛感作を誘発しないことを示す（図２Ａおよび図２Ｂ）。具体的には、野生型ＮＧＦ ０．５ｍｇは注射の２０分後および４５分後に有意な熱疼痛を引き起こし、一方、ＮＧＦＲ１００Ｗは５．０ｍｇでそれを引き起こさなかった（図２Ａ）。無痛ＮＧＦが誘発した侵害受容閾値の減少は用量依存的効果を示唆するものであるが、予備試験では統計的有意性に到達しなかった（図２Ｂ）。また、タンパク質０．５～５ｍｇが添加されたナノワイヤ２００ｍｇの皮内注射を行うことで、ＮＧＦＷＴナノワイヤおよびＮＧＦＲ１００Ｗナノワイヤの侵害受容閾値を試験する。上記と同様に、Ｈａｒｇｒｅａｖｅｓ技術およびＲａｎｄａｌ－Ｓｅｌｉｔｔｏ閾値試験を使用して熱痛覚過敏および機械痛覚過敏を測定する。ＮＧＦでの臨床試験において、痛覚は早期発症を伴った（Ｓｕｎｇら、２０１９年、Ｎｅｕｒａｌ Ｒｅｇｅｎ Ｒｅｓ １４：５７０～５７３頁）；したがって、図２Ｂに示すように、試験を注射の２０分後および４５分後に行う。ＮＧＦＲ１００Ｗによる疼痛感作が野生型ＮＧＦに比べて統計的に有意に減少していることが一次成功判定基準である。図２Ａおよび図２Ｂに示されるデータセットの平均値および標準偏差に基づいて、検出力分析は、検出力レベル＞８０％を効果量ｄ＝１．５および有意性レベル５％で実現するためにマウス６匹／群が必要であることを示す。
【0118】
１．２ ＮＧＦＲ１００ＷはＣＭＴ２Ｂ変異マウスにおいて足皮膚感覚神経の再生を促進する
ＮＧＦＲ１００Ｗナノワイヤの栄養機能性を、末梢感覚神経障害のシャルコー・マリー・トゥース２Ｂ（ＣＭＴ２Ｂ）マウスモデルにおける表皮内神経線維（ＩＥＮＦｓ）および表皮下神経叢（ＳＮＰ）の再生を定量化することによってインビボで確認する。ＣＭＴ２Ｂは、感覚線維の軸索長依存的変性を生じさせるＲａｂ７ ＧＴＰアーゼのミスセンス変異により引き起こされる。変異マウスが９月齢で有意な末梢感覚消失を発生させるＣＭＴ２Ｂノックインマウスモデルを作出した。この遺伝子モデルは神経再生を定量化するための有効な手段である。
ＮＧＦＲ１００Ｗナノワイヤの栄養機能性を、末梢感覚神経障害のシャルコー・マリー・トゥース２Ｂ（ＣＭＴ２Ｂ）マウスモデルにおける表皮内神経線維（ＩＥＮＦｓ）および表皮下神経叢（ＳＮＰ）の再生を定量化することによってインビボで確認する。ＣＭＴ２Ｂは、感覚線維の軸索長依存的変性を生じさせるＲａｂ７ ＧＴＰアーゼのミスセンス変異により引き起こされる。変異マウスが９月齢で有意な末梢感覚消失を発生させるＣＭＴ２Ｂノックインマウスモデルを作出した。この遺伝子モデルは神経再生を定量化するための有効な手段である。
【0119】
ＮＧＦＲ１００Ｗは、神経再生を促進する上でＮＧＦと同程度に有効であることが確認された（図３Ａ～図３Ｆ）。同様に、ＮＧＦＷＴナノワイヤおよびＮＧＦＲ１００Ｗナノワイヤの用量依存的再生能力をＣＭＴ２Ｂマウスにおいて試験することを、２回の治療的注射を３週間空けて行い、次に注射の６週間後に汎神経ＰＧＰ９．５マーカーに対する定量的免疫組織化学的検査を使用してＩＥＮＦおよびＳＮＰ密度を測定することで行う（Ｙａｎｇら、２０２０年、Ｐｒｏｇ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ １９４：１０１８６６）。ＮＧＦ／ＮＧＦＲ１００Ｗナノワイヤを可溶性ＮＧＦ／ＮＧＦＲ１００Ｗ、空のナノワイヤ、およびプラセボ注射と比較する。ＩｍａｇｅＪにより定量化された図３Ｄに示されるＰＧＰ９．５密度データからの平均値および標準偏差を使用して、Ｇ＊Ｐｏｗｅｒを用いる検出力分析を行うことで、検出力レベル＞８０％を効果サイズｄ＝１．５および有意性レベル５％で実現するためにマウス３匹／群が必要であることを確認した。良好な栄養機能性を、ＮＧＦ／ＮＧＦＲ１００Ｗナノワイヤによる神経密度の、可溶性タンパク質送達および陰性対照（ＰＢＳ、空のナノワイヤ）の両方に対する統計的に有意な増加により判定する。
【0120】
１．３ ＮＧＦＲ１００Ｗが軟骨形成細胞中での骨形成を活性化することの確認
これまで、ＮＧＦＲ１００Ｗの栄養活性は神経組織中でしか確認されていない（図３Ａ～図３Ｆ）。インビトロ用量０．０２～２０，０００ｎｇ／ｍＬを軟骨形成細胞株（ＡＴＤＣ５）について試験し、ＮＧＦの用量が高くなるほどオステオカルシンの発現が増加することがわかった（データは示さず）。ＮＧＦＲ１００Ｗ変異体は、神経細胞中でＴｒｋＡ受容体に結合し、下流シグナル伝達経路を活性化することが可能であることが示された（Ｓｕｎｇら、２０１８年、Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ３８：３３９４～３４１３頁）。上記で言及したように、培養および成熟ＡＴＤＣ５細胞を漸増用量のＮＧＦｗｔで２４時間処理し、古典的な骨芽細胞遺伝子のオステオカルシンによる骨形成変化を測定することで作成された用量反応曲線に基づいて、用量２０μｇ／ｍＬのＮＧＦまたはＮＧＦＲ１００Ｗを、ＡＴＤＣ５の処理のために、次にｃＦｏｓを使用する下流活性化を探るために使用した。ＮＧＦＲ１００Ｗが軟骨細胞中でＴｒｋＡシグナル伝達を活性化することが、ＴｒｋＡ活性化の下流マーカーとしてのｃＦＯＳ発現を使用してわかった（データは示さず）。
これまで、ＮＧＦＲ１００Ｗの栄養活性は神経組織中でしか確認されていない（図３Ａ～図３Ｆ）。インビトロ用量０．０２～２０，０００ｎｇ／ｍＬを軟骨形成細胞株（ＡＴＤＣ５）について試験し、ＮＧＦの用量が高くなるほどオステオカルシンの発現が増加することがわかった（データは示さず）。ＮＧＦＲ１００Ｗ変異体は、神経細胞中でＴｒｋＡ受容体に結合し、下流シグナル伝達経路を活性化することが可能であることが示された（Ｓｕｎｇら、２０１８年、Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ３８：３３９４～３４１３頁）。上記で言及したように、培養および成熟ＡＴＤＣ５細胞を漸増用量のＮＧＦｗｔで２４時間処理し、古典的な骨芽細胞遺伝子のオステオカルシンによる骨形成変化を測定することで作成された用量反応曲線に基づいて、用量２０μｇ／ｍＬのＮＧＦまたはＮＧＦＲ１００Ｗを、ＡＴＤＣ５の処理のために、次にｃＦｏｓを使用する下流活性化を探るために使用した。ＮＧＦＲ１００Ｗが軟骨細胞中でＴｒｋＡシグナル伝達を活性化することが、ＴｒｋＡ活性化の下流マーカーとしてのｃＦＯＳ発現を使用してわかった（データは示さず）。
【0121】
無痛ＮＧＦが軟骨細胞の標的細胞集団中で野生型ＮＧＦと同様の栄養能力を示したことを確認するために、既存のＡＴＤＣ５軟骨形成細胞株を利用し、０．２μｇまたは２０μｇのＮＧＦまたはＮＧＦＲ１００Ｗで処理し、比較として陰性対照でも処理した（図３Ｇ～図３Ｌ）。データは、２４時間のＮＧＦおよびＮＧＦＲ１００Ｗ処理によってＶｅｇｆが有意に上方制御される（図３Ｇ）が、Ａｘｉｎ２はそうならなかったことを示す（データは示さず）。ＳｕｐｅｒＦｅｃｔ遺伝子導入試薬を使用してＷｎｔ応答性ＴＯＰＦｌａｓｈ（Ｍ５０ Ｓｕｐｅｒ ８ｘ ＴＯＰＦｌａｓｈ、Ａｄｄｇｅｎｅ ＃１２４５６）または変異ＦＯＰＦｌａｓｈプラスミドベクター（Ｍ５１ Ｓｕｐｅｒ ８ｘ ＦＯＰＦｌａｓｈ、Ａｄｄｇｅｎｅ、＃１２４５７）をＡＴＤＣ５細胞に遺伝子導入することで、Ｗｎｔ経路活性化をさらに厳密に試験する。構成的活性化ウミシイタケルシフェラーゼ（ｐＬＸ３１３－ウミシイタケルシフェラーゼ、Ａｄｄｇｅｎｅ ＃１１８０１６）を同時遺伝子導入することで、遺伝子導入を確認する。ＮＧＦおよびＮＧＦＲ１００Ｗに対するＷｎｔ応答を蛍光／ルシフェラーゼプレートリーダーで定量化する。
【0122】
次に、ｑＲＴ－ＰＣＲ（Ｉｈｈ、ｇｌｉ１、ｐｔｃｈ１）およびＧｌｉ－レポーター（７Ｇｌｉ：：ＧＦＰ Ａｄｄｇｅｎｅ ＃１１０４９４）を上記と同様に使用して、ＡＴＤＣ５軟骨細胞中でのＩｈｈ経路のＮＧＦ媒介活性化を測定する。データは、処理の１時間後の無痛ＮＧＦ変異体によるＩｈｈの強力な活性化を示唆するものであり（図３Ｉ）、このことは、該無痛ＮＧＦが下流ＥＯを刺激する上で早期の役割を果たすことがあることを示唆しており、これは候補経路のＧｌｉレポーターアッセイおよび経時的試験によってさらに確認することができる。ＮＧＦＲ１００Ｗ（緑色）は濃度０．２ｍｇで上方制御軟骨内（インディアンヘッジホッグ、Ｉｈｈ）ならびに骨形成（アルカリホスファターゼおよびオステオカルシン）遺伝子を通じてＮＧＦＷＴ（青色）に比べて強化された生物活性を示した（図３Ｊ～図３Ｌ）。インビトロでは、［ＮＧＦ］が多くなるほど骨形成性が高まるということは判明しなかった。これらのデータは、本明細書において使用される骨折モデルにおいて、ＮＧＦＲ１００ＷがＮＧＦに比べて最低限、栄養的に等価であるはずであることを裏付けている。
【0123】
注射時に侵害受容を最小化しながらＮＧＦＲ１００Ｗの骨形成用量を最大化するために、修復の軟骨内期（７～９日目）に送達される０．５μｇ ＮＧＦＲ１００Ｗ／日を５μｇおよび５０μｇ ＮＧＦＲ１００Ｗ／日と比較する。ＮＧＦまたはＮＧＦＲ１００Ｗの注射後、痛覚を熱的（ホットプレート、冷アセトン）および機械的（電子的Ｖｏｎ Ｆｒａｙｓ）アロディニア試験によって試験する。ＴｒｋＡ経路活性化を１０日目、最終ＮＧＦ投与の２４時間後にｃＦＯＳ ｑＲＴ－ＰＣＲによって測定する。
【0124】
痛覚
ＮＧＦでの臨床試験において、痛覚は早期発症を伴った（Ｓｕｎｇら、２０１９年、Ｎｅｕｒａｌ Ｒｅｇｅｎ Ｒｅｓ １４：５７０～５７３頁）。したがって、侵害受容を注射の３０分後、６０分後、および９０分後に熱的および機械的アロディニアに関する標準化アッセイを使用して評価する（Ｄｅｉｕｓら、２０１４年、Ｎｅｕｒｏ Ｏｎｃｏｌ １６：１３２４～１３３２頁）。ホットプレート技術を、ＮＧＦＲ１００Ｗの侵害受容をＮＧＦとの比較で試験すること（Ｓｕｎｇら、２０１８年、Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ３８：３３９４～３４１３頁；Ｙａｎｇら、２０１９年、ｂｉｏＲｘｉｖ ７８４６６０）、および後肢に対するアセトンによる冷試験（Ｃｈｏｉら、１９９４，Ｐａｉｎ ５９：３６９～３７６頁）に既に使用したように使用する。機械的刺激に対する嫌悪を電子Ｖｏｎ Ｆｒｅｙ法を使用して測定する（Ｄｅｉｕｓら、２０１４年、Ｎｅｕｒｏ Ｏｎｃｏｌ １６：１３２４～１３３２頁）。
ＮＧＦでの臨床試験において、痛覚は早期発症を伴った（Ｓｕｎｇら、２０１９年、Ｎｅｕｒａｌ Ｒｅｇｅｎ Ｒｅｓ １４：５７０～５７３頁）。したがって、侵害受容を注射の３０分後、６０分後、および９０分後に熱的および機械的アロディニアに関する標準化アッセイを使用して評価する（Ｄｅｉｕｓら、２０１４年、Ｎｅｕｒｏ Ｏｎｃｏｌ １６：１３２４～１３３２頁）。ホットプレート技術を、ＮＧＦＲ１００Ｗの侵害受容をＮＧＦとの比較で試験すること（Ｓｕｎｇら、２０１８年、Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ３８：３３９４～３４１３頁；Ｙａｎｇら、２０１９年、ｂｉｏＲｘｉｖ ７８４６６０）、および後肢に対するアセトンによる冷試験（Ｃｈｏｉら、１９９４，Ｐａｉｎ ５９：３６９～３７６頁）に既に使用したように使用する。機械的刺激に対する嫌悪を電子Ｖｏｎ Ｆｒｅｙ法を使用して測定する（Ｄｅｉｕｓら、２０１４年、Ｎｅｕｒｏ Ｏｎｃｏｌ １６：１３２４～１３３２頁）。
【0125】
骨折治癒
最も決定的に重要な治癒点を捕捉し、総動物数を最小化することを目的として、損傷の１４日後および２８日後にのみ、骨折治癒の機能的帰結を測定する（組織形態計測、定量的μＣＴ、生体力学）。骨治癒を異なる用量で定量化する以外に、脾臓、肝臓、および血液を安楽死時に採取して、任意の負の全身性炎症作用を点検する（Ｍｏｒｉｏｋａら、２０１９年、Ｓｃｉ Ｒｅｐｏｒｔｓ ９：１２１９９）。
最も決定的に重要な治癒点を捕捉し、総動物数を最小化することを目的として、損傷の１４日後および２８日後にのみ、骨折治癒の機能的帰結を測定する（組織形態計測、定量的μＣＴ、生体力学）。骨治癒を異なる用量で定量化する以外に、脾臓、肝臓、および血液を安楽死時に採取して、任意の負の全身性炎症作用を点検する（Ｍｏｒｉｏｋａら、２０１９年、Ｓｃｉ Ｒｅｐｏｒｔｓ ９：１２１９９）。
【実施例2】
【0126】
β－ＮＧＦの局所注射は軟骨から骨への変換を促進することで軟骨内骨折修復を促進する
脛骨骨折モデル
簡潔に言えば、成体（１０～１６週齢）雄マウスを吸入イソフルランで麻酔し、３点曲げ骨折装置によって脛骨の中央骨幹に不安定型閉鎖骨折を作り出した（Ｂａｈｎｅｙら、２０１４年、Ｊ Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ Ｒｅｓ ２９：１２６９～１２８２頁）。この方法が強力な軟骨内修復を促進することから、骨折は不安定型とした。骨折が作り出された後、動物に術後鎮痛薬（ブプレノルフィン持続放出）を与えた。動物を社会的に収容し、自由に動き回らせた。
脛骨骨折モデル
簡潔に言えば、成体（１０～１６週齢）雄マウスを吸入イソフルランで麻酔し、３点曲げ骨折装置によって脛骨の中央骨幹に不安定型閉鎖骨折を作り出した（Ｂａｈｎｅｙら、２０１４年、Ｊ Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ Ｒｅｓ ２９：１２６９～１２８２頁）。この方法が強力な軟骨内修復を促進することから、骨折は不安定型とした。骨折が作り出された後、動物に術後鎮痛薬（ブプレノルフィン持続放出）を与えた。動物を社会的に収容し、自由に動き回らせた。
【0127】
マウス
野生型マウスを包含する試験を、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓから得たＣ５７ＢＬ／６Ｊ系統（ストック＃０００６６４）について行った。ＮＧＦ－ｅＧＦＰはマウスＮＧＦプロモーターの制御下でｅＧＦＰを発現する（Ｋａｗａｊａら、２０１１年、Ｊ Ｃｏｍｐ Ｎｅｕｒｏｌ ５１９：２５２２～２５４５頁）。ＴｒｋＡ－ＬａｃＺマウスは、マウスＮｔｒｋ１遺伝子のエキソン１中のＡＴＧの直後に挿入されたＬａｃＺ配列を有する（Ｍｏｑｒｉｃｈら、２００４年、Ｎａｔ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ７：８１２～８１８頁）。Ａｘｉｎ２－ｅＧＦＰマウスはＡｘｉｎ２プロモーター／イントロン１配列下でｅＧＦＰを発現する（Ｊｈｏら、２００２年、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２２：１１７２～１１８３頁）。
野生型マウスを包含する試験を、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓから得たＣ５７ＢＬ／６Ｊ系統（ストック＃０００６６４）について行った。ＮＧＦ－ｅＧＦＰはマウスＮＧＦプロモーターの制御下でｅＧＦＰを発現する（Ｋａｗａｊａら、２０１１年、Ｊ Ｃｏｍｐ Ｎｅｕｒｏｌ ５１９：２５２２～２５４５頁）。ＴｒｋＡ－ＬａｃＺマウスは、マウスＮｔｒｋ１遺伝子のエキソン１中のＡＴＧの直後に挿入されたＬａｃＺ配列を有する（Ｍｏｑｒｉｃｈら、２００４年、Ｎａｔ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ７：８１２～８１８頁）。Ａｘｉｎ２－ｅＧＦＰマウスはＡｘｉｎ２プロモーター／イントロン１配列下でｅＧＦＰを発現する（Ｊｈｏら、２００２年、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２２：１１７２～１１８３頁）。
【0128】
β－ＮＧＦおよび対照の注射
骨折仮骨内の骨形成マーカーの発現を比較するために２つの時点を最初に試験した。骨折の４日後または７日後から３日間、注射液を１日１回投与した（図５Ｃ、図５Ｄ）。実験群は、蛍光透視によりガイドされるＨａｍｉｌｔｏｎシリンジを使用する、組換えヒトβ－ＮＧＦ ０．５μｇの基本培地２０μＬ中注射液、または基本培地のみの対照注射液（ＤＭＥＭ基本培地、Ｇｉｂｃｏ ｃａｔ ＃Ａ１４４３００１）からなった。用量を０．１～１．４μｇ／日とする以前のプロトコルから投与量０．５μｇ／日を導出した（Ｇｒｉｌｌｓら、１９９７年、Ｊ Ｏｒｔｈｏｐｅｄ Ｒｅｓ １５：２３５～２４２頁；Ｓｈｉｎｏｄａら、２０１１年、Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ３１：７１４５～７１５５頁）。
骨折仮骨内の骨形成マーカーの発現を比較するために２つの時点を最初に試験した。骨折の４日後または７日後から３日間、注射液を１日１回投与した（図５Ｃ、図５Ｄ）。実験群は、蛍光透視によりガイドされるＨａｍｉｌｔｏｎシリンジを使用する、組換えヒトβ－ＮＧＦ ０．５μｇの基本培地２０μＬ中注射液、または基本培地のみの対照注射液（ＤＭＥＭ基本培地、Ｇｉｂｃｏ ｃａｔ ＃Ａ１４４３００１）からなった。用量を０．１～１．４μｇ／日とする以前のプロトコルから投与量０．５μｇ／日を導出した（Ｇｒｉｌｌｓら、１９９７年、Ｊ Ｏｒｔｈｏｐｅｄ Ｒｅｓ １５：２３５～２４２頁；Ｓｈｉｎｏｄａら、２０１１年、Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ３１：７１４５～７１５５頁）。
【0129】
ｍＲＮＡ単離およびＲＴ－ｑＰＣＲ
β－ＮＧＦ投与後、仮骨を最終注射の２４時間後に採取した。仮骨切離の後、組織試料をＴｒｉｚｏｌ中で均質化し、次にＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ ｃａｔ＃７４１０４）を製造業者の説明書に従って使用することでｍＲＮＡを組織溶解液から抽出した。ｃＤＮＡをＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｃａｔ＃１８０８０）で逆転写し、ＲＴ－ｑＰＣＲを行った。相対遺伝子発現をＧａｐｄｈに対する正規化により計算した。これを２－ΔＣＴとして示す（図５Ｃ、図５Ｄ）。
β－ＮＧＦ投与後、仮骨を最終注射の２４時間後に採取した。仮骨切離の後、組織試料をＴｒｉｚｏｌ中で均質化し、次にＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ ｃａｔ＃７４１０４）を製造業者の説明書に従って使用することでｍＲＮＡを組織溶解液から抽出した。ｃＤＮＡをＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｃａｔ＃１８０８０）で逆転写し、ＲＴ－ｑＰＣＲを行った。相対遺伝子発現をＧａｐｄｈに対する正規化により計算した。これを２－ΔＣＴとして示す（図５Ｃ、図５Ｄ）。
【0130】
組織診断
骨折脛骨を４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）中に固定した後、１９％エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）中で１４日間脱灰した。マウスをエタノール段階系列を通じてパラフィン組織診断のために処理し、キシレン中で透明にした後、パラフィン組織ブロックに包埋した。一連の切片を組織学的解析のために８～１０μｍで切断した。１０番毎のスライドをＨａｌｌ－Ｂｒｕｎｔ四重染色（ＨＢＱ）用の標準的な組織学的プロトコルで染色して骨（赤色）および軟骨（青色）を可視化した。ＮＧＦ－ｅＧＦＰおよびＡｘｉｎ２－ｅＧＦＰレポーター株に由来する組織をＯＣＴに包埋し、クリオスタットを使用して切片化した。Ａｘｉｎ２－ｅＧＦＰ蛍光を、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８に結合した抗体を利用して増幅した。Ｘ－Ｇａｌ染色を以下のように行った：試料を４％ ＰＦＡ中に固定し、ＰＢＳ中で洗浄した後、試料を新たなＸ－Ｇａｌ染色溶液中、３２℃で３６時間インキュベートした。ＰＢＳ洗浄後、試料を４％ ＰＦＡ中、４℃で１６～２４時間にわたって後固定し、脱灰し、既に記載のように凍結切片化および染色のためにＯＣＴに包埋した（Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎら、２０１７年 ＰＮＡＳ ＵＳＡ １１４：Ｅ３６３２～Ｅ３６４１頁）。
骨折脛骨を４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）中に固定した後、１９％エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）中で１４日間脱灰した。マウスをエタノール段階系列を通じてパラフィン組織診断のために処理し、キシレン中で透明にした後、パラフィン組織ブロックに包埋した。一連の切片を組織学的解析のために８～１０μｍで切断した。１０番毎のスライドをＨａｌｌ－Ｂｒｕｎｔ四重染色（ＨＢＱ）用の標準的な組織学的プロトコルで染色して骨（赤色）および軟骨（青色）を可視化した。ＮＧＦ－ｅＧＦＰおよびＡｘｉｎ２－ｅＧＦＰレポーター株に由来する組織をＯＣＴに包埋し、クリオスタットを使用して切片化した。Ａｘｉｎ２－ｅＧＦＰ蛍光を、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８に結合した抗体を利用して増幅した。Ｘ－Ｇａｌ染色を以下のように行った：試料を４％ ＰＦＡ中に固定し、ＰＢＳ中で洗浄した後、試料を新たなＸ－Ｇａｌ染色溶液中、３２℃で３６時間インキュベートした。ＰＢＳ洗浄後、試料を４％ ＰＦＡ中、４℃で１６～２４時間にわたって後固定し、脱灰し、既に記載のように凍結切片化および染色のためにＯＣＴに包埋した（Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎら、２０１７年 ＰＮＡＳ ＵＳＡ １１４：Ｅ３６３２～Ｅ３６４１頁）。
【0131】
インビトロ軟骨外植片培養
軟骨外植片を、７日目の骨折仮骨の中心部分から、あらゆる付着した非軟骨組織を除去するために解剖顕微鏡を使用することで単離した。外植片を切り刻み、プールした後、処置群にランダムに分けた。外植片をインビトロで１週間、無血清肥大軟骨形成培地［高グルコースＤＭＥＭ、１％ペニシリン－ストレプトマイシン、１％ ＩＴＳ＋Ｐｒｅｍｉｘ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃａｔ ＃３５４３５２）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、１００ｎｇ／ｍｌアスコルビン酸－２－リン酸、および１０－７Ｍデキサメタゾン］中で成長させて、肥大成熟を促進した（Ｂａｈｎｅｙら、２０１４年、Ｊ Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ Ｒｅｓ ２９：１２６９～１２８２頁；Ｈｕら、２０１７年、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １４４：２２１～２３４頁）。次に肥大軟骨外植片を２００ｎｇ／ｍＬ組換えヒトβ－ＮＧＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ ｃａｔ＃４５０－０１）ありまたはなしで２４時間刺激し、ＴＲＩｚｏｌ中に収集した後、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ ｃａｔ＃ ７４１０４）を製造業者の説明書に従って使用することでｍＲＮＡを抽出した。
軟骨外植片を、７日目の骨折仮骨の中心部分から、あらゆる付着した非軟骨組織を除去するために解剖顕微鏡を使用することで単離した。外植片を切り刻み、プールした後、処置群にランダムに分けた。外植片をインビトロで１週間、無血清肥大軟骨形成培地［高グルコースＤＭＥＭ、１％ペニシリン－ストレプトマイシン、１％ ＩＴＳ＋Ｐｒｅｍｉｘ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃａｔ ＃３５４３５２）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、１００ｎｇ／ｍｌアスコルビン酸－２－リン酸、および１０－７Ｍデキサメタゾン］中で成長させて、肥大成熟を促進した（Ｂａｈｎｅｙら、２０１４年、Ｊ Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ Ｒｅｓ ２９：１２６９～１２８２頁；Ｈｕら、２０１７年、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １４４：２２１～２３４頁）。次に肥大軟骨外植片を２００ｎｇ／ｍＬ組換えヒトβ－ＮＧＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ ｃａｔ＃４５０－０１）ありまたはなしで２４時間刺激し、ＴＲＩｚｏｌ中に収集した後、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ ｃａｔ＃ ７４１０４）を製造業者の説明書に従って使用することでｍＲＮＡを抽出した。
【0132】
遺伝子発現
骨折仮骨を脛骨および周囲の筋肉から切除する。次にｍＲＮＡを標準的ＴｒｉＺＯＬ抽出技術を使用して採取する。ｃＤＮＡを逆転写し、ｑＲＴ－ＰＲＣをＴｒｋＡ指示薬（ｃＦＯＳ）（Ｓｕｎｇら、２０１８年、Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ３８：３３９４～３４１３頁）ならびに標準的な軟骨形成マーカー（ｃｏｌ２ａ１、ｃｏｌ１０ａ１、アグリカン）および骨形成マーカー（ｃｏｌ１ａ１、オステオカルシン、オステオポンチン）について検証済みＳｙｂｅｒＧｒｅｅｎプライマーを使用して行う。既に公開されたｑＲＴ－ＰＣＲデータセットからの平均値および標準偏差を利用して（Ｍｏｒｉｏｋａら、２０１９年、Ｓｃｉ Ｒｅｐｏｒｔｓ ９：１２１９９）、ＧＰｏｗｅｒを使用する検出力分析を行って、有意な検出力を得るにはマウス３匹／時間が必要であることを確定する（検出力＝０．８、ａ＝０．０５）。薬物処置に関連する潜在的なさらなる変動を説明するためにマウス５匹／群／時間が含まれる。ＡＮＯＶＡおよびチューキーＨＳＤ事後検定を使用して有意性を評価する。
骨折仮骨を脛骨および周囲の筋肉から切除する。次にｍＲＮＡを標準的ＴｒｉＺＯＬ抽出技術を使用して採取する。ｃＤＮＡを逆転写し、ｑＲＴ－ＰＲＣをＴｒｋＡ指示薬（ｃＦＯＳ）（Ｓｕｎｇら、２０１８年、Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ３８：３３９４～３４１３頁）ならびに標準的な軟骨形成マーカー（ｃｏｌ２ａ１、ｃｏｌ１０ａ１、アグリカン）および骨形成マーカー（ｃｏｌ１ａ１、オステオカルシン、オステオポンチン）について検証済みＳｙｂｅｒＧｒｅｅｎプライマーを使用して行う。既に公開されたｑＲＴ－ＰＣＲデータセットからの平均値および標準偏差を利用して（Ｍｏｒｉｏｋａら、２０１９年、Ｓｃｉ Ｒｅｐｏｒｔｓ ９：１２１９９）、ＧＰｏｗｅｒを使用する検出力分析を行って、有意な検出力を得るにはマウス３匹／時間が必要であることを確定する（検出力＝０．８、ａ＝０．０５）。薬物処置に関連する潜在的なさらなる変動を説明するためにマウス５匹／群／時間が含まれる。ＡＮＯＶＡおよびチューキーＨＳＤ事後検定を使用して有意性を評価する。
【0133】
ＲＮＡの配列決定および解析
単離された骨折仮骨／肥大軟骨からのｍＲＮＡ抽出の後、試料を酢酸ナトリウムおよびイソプロパノール沈殿によってさらに精製した。各試料からのＲＮＡ入力量２００ｎｇをＱｕａｎｔｓｅｑ ３’ｍＲＮＡ－ｓｅｑ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔ ＦＷＤ（Ｌｅｘｏｇｅｎ、ＳＫＵ：０１５．２４）と共に使用した。約２０００万個のシングルエンド５０ｂｐリードを各ライブラリーについてＨｉＳｅｑ ４０００で作った。リードを最初にＣｕｔａｄａｐｔバージョン２．５付きのアダプターのためにトリミングした後、ＳＴＡＲバージョン２．５．３ａを使用してマウスｍｍ１０ゲノムに対してマッピングした。アラインメントの後、リードをｆｅａｔｕｒｅＣｏｕｎｔバージョン１．６．４を使用してカウントした。次に差次的遺伝子発現解析をＤＥＳｅｑ２パッケージバージョン１．２４およびＲバージョン３．６．１を使用して行った。処置時に有意に上方制御または下方制御された遺伝子（Ｐ＜０．０５、Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ－Ｈｏｃｈｂｅｒｇ補正済み）を遺伝子オントロジー分類のためにＥｎｒｉｃｈｒ（ｈｔｔｐｓ：／／ａｍｐ．ｐｈａｒｍ．ｍｓｓｍ．ｅｄｕ／Ｅｎｒｉｃｈｒ／）に入力した。差次的発現遺伝子および関心対象の遺伝子をＲ、ｇｇｐｌｏｔ２バージョン３．２．１、ＥｎｈａｎｃｅｄＶｏｌｃａｎｏ、およびＣｏｍｐｌｅｘｈｅａｔｍａｐバージョン２．０８４の組み合わせを使用して可視化した。
単離された骨折仮骨／肥大軟骨からのｍＲＮＡ抽出の後、試料を酢酸ナトリウムおよびイソプロパノール沈殿によってさらに精製した。各試料からのＲＮＡ入力量２００ｎｇをＱｕａｎｔｓｅｑ ３’ｍＲＮＡ－ｓｅｑ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔ ＦＷＤ（Ｌｅｘｏｇｅｎ、ＳＫＵ：０１５．２４）と共に使用した。約２０００万個のシングルエンド５０ｂｐリードを各ライブラリーについてＨｉＳｅｑ ４０００で作った。リードを最初にＣｕｔａｄａｐｔバージョン２．５付きのアダプターのためにトリミングした後、ＳＴＡＲバージョン２．５．３ａを使用してマウスｍｍ１０ゲノムに対してマッピングした。アラインメントの後、リードをｆｅａｔｕｒｅＣｏｕｎｔバージョン１．６．４を使用してカウントした。次に差次的遺伝子発現解析をＤＥＳｅｑ２パッケージバージョン１．２４およびＲバージョン３．６．１を使用して行った。処置時に有意に上方制御または下方制御された遺伝子（Ｐ＜０．０５、Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ－Ｈｏｃｈｂｅｒｇ補正済み）を遺伝子オントロジー分類のためにＥｎｒｉｃｈｒ（ｈｔｔｐｓ：／／ａｍｐ．ｐｈａｒｍ．ｍｓｓｍ．ｅｄｕ／Ｅｎｒｉｃｈｒ／）に入力した。差次的発現遺伝子および関心対象の遺伝子をＲ、ｇｇｐｌｏｔ２バージョン３．２．１、ＥｎｈａｎｃｅｄＶｏｌｃａｎｏ、およびＣｏｍｐｌｅｘｈｅａｔｍａｐバージョン２．０８４の組み合わせを使用して可視化した。
【0134】
免疫組織化学的検査（ＩＨＣ）
β－ＮＧＦまたは対照の注射液を骨折の７日後から３日間、１日１回Ａｘｉｎ２－ｅＧＦＰマウスに投与した。骨折脛骨を最終注射（骨折の１０日後）の２４時間後に採取し、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）中に固定し、１９％エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）中で５日間脱灰した。試料にＯＣＴを包埋した後、凍結切片を幅８～１０μｍで作った。凍結切片をＰＢＳ中で慎重にリンスし、５％骨血清アルブミンで１時間ブロッキングした。一次抗体を切片に終夜適用した。種特異的二次抗体をＶｅｃｔａＳｔａｉｎ ＡＢＣキット（Ｖｅｃｔｏｒ、ＰＫ－４０００）を使用して検出し、３，３’－ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）比色反応を使用してＣＤ３１＋細胞を可視化した。（ｄ２）ｅＧＦＰが急速に分解されることから、種特異的Ａｌｅｘａ－Ｆｌｕｏｒ－４８８結合二次抗体（例えば宿主／標的：ラット抗マウスＣＤ３１、ヤギ抗ラットＩｇ（ビオチン化）、ウサギ抗ＧＦＰ、ヤギ抗ウサギＩｇＧ）を使用することでＡｘｉｎ２－ｅＧＦＰ蛍光を安定化した。
β－ＮＧＦまたは対照の注射液を骨折の７日後から３日間、１日１回Ａｘｉｎ２－ｅＧＦＰマウスに投与した。骨折脛骨を最終注射（骨折の１０日後）の２４時間後に採取し、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）中に固定し、１９％エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）中で５日間脱灰した。試料にＯＣＴを包埋した後、凍結切片を幅８～１０μｍで作った。凍結切片をＰＢＳ中で慎重にリンスし、５％骨血清アルブミンで１時間ブロッキングした。一次抗体を切片に終夜適用した。種特異的二次抗体をＶｅｃｔａＳｔａｉｎ ＡＢＣキット（Ｖｅｃｔｏｒ、ＰＫ－４０００）を使用して検出し、３，３’－ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）比色反応を使用してＣＤ３１＋細胞を可視化した。（ｄ２）ｅＧＦＰが急速に分解されることから、種特異的Ａｌｅｘａ－Ｆｌｕｏｒ－４８８結合二次抗体（例えば宿主／標的：ラット抗マウスＣＤ３１、ヤギ抗ラットＩｇ（ビオチン化）、ウサギ抗ＧＦＰ、ヤギ抗ウサギＩｇＧ）を使用することでＡｘｉｎ２－ｅＧＦＰ蛍光を安定化した。
【0135】
組織形態計測
β－ＮＧＦおよび対照の注射液を骨折の７日後から３日間、１日１回投与した。脛骨を骨折の１４日後に採取し、４％ ＰＦＡ中に固定し、１９％ ＥＤＴＡ中で５日間脱灰した。マウスをパラフィンによる組織診断のために処理し、一連の切片を立体解析学的原理を使用する組織形態計測的解析のために８～１０μｍで切断した。仮骨組成（軟骨、骨、線維、髄空間）の定量化をＯｌｙｍｐｕｓ ＣＡＳＴシステム（ペンシルベニア州Ｃｅｎｔｅｒ Ｖａｌｌｅｙ）およびＶｉｓｉｏｐｈａｒｍ（デンマークＨｏｒｓｈｏｌｍ）によるソフトウェアを使用して確定した。組織の定量化のために、１０μｍの一連の切片（スライド当たり３つ）を脚全体を通じて取得した。組織を上記のようにＨＢＱで染色し、各切片を３００μｍ間隔とした１０番毎のスライドからの第１の切片を解析した。全体に対する個々の組成を合計することで、特定の組織型の量を骨折仮骨全体に関して確定した。
β－ＮＧＦおよび対照の注射液を骨折の７日後から３日間、１日１回投与した。脛骨を骨折の１４日後に採取し、４％ ＰＦＡ中に固定し、１９％ ＥＤＴＡ中で５日間脱灰した。マウスをパラフィンによる組織診断のために処理し、一連の切片を立体解析学的原理を使用する組織形態計測的解析のために８～１０μｍで切断した。仮骨組成（軟骨、骨、線維、髄空間）の定量化をＯｌｙｍｐｕｓ ＣＡＳＴシステム（ペンシルベニア州Ｃｅｎｔｅｒ Ｖａｌｌｅｙ）およびＶｉｓｉｏｐｈａｒｍ（デンマークＨｏｒｓｈｏｌｍ）によるソフトウェアを使用して確定した。組織の定量化のために、１０μｍの一連の切片（スライド当たり３つ）を脚全体を通じて取得した。組織を上記のようにＨＢＱで染色し、各切片を３００μｍ間隔とした１０番毎のスライドからの第１の切片を解析した。全体に対する個々の組成を合計することで、特定の組織型の量を骨折仮骨全体に関して確定した。
【0136】
マイクロコンピュータ断層撮影（μＣＴ）
μＣＴ解析：骨折脛骨を骨折の１４日後に付着筋肉なしで切除し、４％ ＰＦＡ中に固定し、７０％エタノール中で保管した。骨折仮骨をＳｃａｎｃｏ μＣＴ５０スキャナ（Ｓｃａｎｃｏ Ｍｅｄｉｃａｌ ＡＧ、スイスＢａｓｓｅｒｄｏｒｆ）をボクセルサイズ１０μｍならびにＸ線エネルギー５５ｋＶｐおよび１０９μＡで使用して解析した。対照マウスおよびβ－ＮＧＦ処置マウスの試験において軟部組織から総石灰化骨基質をセグメント化するために、比較的低い排除閾値の４００ｍｇヒドロキシアパタイト（ＨＡ）／ｍｍ３を適用した。線状減衰をＳｃａｎｃｏヒドロキシアパタイトファントムを使用して較正した。関心対象領域（ＲＯＩ）は、解剖学的位置およびはるかに高い骨塩量によって明確に識別される既存の皮質を伴わない、仮骨全体を含んだ。μＣＴ再構築および定量的解析を行って以下の構造パラメータを得た：骨梁間隔（ｍｍ）、骨梁数（＃／ｍｍ）、骨梁分岐としての骨梁連結性密度（＃／ｍｍ３）、骨塩量（ｍｇ ＨＡ／ｃｍ３）、骨量（％として）、骨梁厚（ｍｍ）、および組織塩量（ｍｇ ＨＡ／ｃｍ３）。
μＣＴ解析：骨折脛骨を骨折の１４日後に付着筋肉なしで切除し、４％ ＰＦＡ中に固定し、７０％エタノール中で保管した。骨折仮骨をＳｃａｎｃｏ μＣＴ５０スキャナ（Ｓｃａｎｃｏ Ｍｅｄｉｃａｌ ＡＧ、スイスＢａｓｓｅｒｄｏｒｆ）をボクセルサイズ１０μｍならびにＸ線エネルギー５５ｋＶｐおよび１０９μＡで使用して解析した。対照マウスおよびβ－ＮＧＦ処置マウスの試験において軟部組織から総石灰化骨基質をセグメント化するために、比較的低い排除閾値の４００ｍｇヒドロキシアパタイト（ＨＡ）／ｍｍ３を適用した。線状減衰をＳｃａｎｃｏヒドロキシアパタイトファントムを使用して較正した。関心対象領域（ＲＯＩ）は、解剖学的位置およびはるかに高い骨塩量によって明確に識別される既存の皮質を伴わない、仮骨全体を含んだ。μＣＴ再構築および定量的解析を行って以下の構造パラメータを得た：骨梁間隔（ｍｍ）、骨梁数（＃／ｍｍ）、骨梁分岐としての骨梁連結性密度（＃／ｍｍ３）、骨塩量（ｍｇ ＨＡ／ｃｍ３）、骨量（％として）、骨梁厚（ｍｍ）、および組織塩量（ｍｇ ＨＡ／ｃｍ３）。
【0137】
統計解析
グラフ上の個々のドットは生物学的複製を表し、エラーバーは平均値の標準誤差（ＳＥＭ）を表す。測定値を別々の試料から取得した。すべてのインビボデータをＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（バージョン８、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、カリフォルニア州サンジエゴ）を使用して解析した。群間を比較するために使用される統計検定を対応する図の説明文中で指定し、有意差をｐ＜０．０５で規定した。
グラフ上の個々のドットは生物学的複製を表し、エラーバーは平均値の標準誤差（ＳＥＭ）を表す。測定値を別々の試料から取得した。すべてのインビボデータをＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（バージョン８、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、カリフォルニア州サンジエゴ）を使用して解析した。群間を比較するために使用される統計検定を対応する図の説明文中で指定し、有意差をｐ＜０．０５で規定した。
【0138】
結果
２．１ ＮＧＦおよびＴＲＫＡは内在性軟骨内骨折修復の間に軟骨・骨移行部中で発現される
長管骨治癒のマウスモデルにおいて内因性ＮＧＦおよびＴｒｋＡの発現の軟骨内骨折修復の間の空間時間的パラメータを確定するために、成体野生型マウスの右脛骨に中央軸閉鎖骨折を作り出すための既存の３点曲げ装置を使用して、成体雄および雌野生型マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ、１０～１４週齢Ｃ５７Ｂｌ６／Ｊ）の右脛骨の中央軸において閉鎖骨折を作り出した（図４Ａ）。皮膚を破ることなく骨折を作り出すために、約１４ｃｍの距離を落下する４６０ｇの重りからなる２ｃｍ鈍頭ドロップアームを備えた特注の装置を設計した。骨折の１４日後に採取された脛骨のＨａｌｌ－Ｂｒｕｎｔ四重染色（ＨＢＱ）切片（軟骨＝青色、骨＝赤色）によって可視化されるように、これらの不安定型骨折は強固な軟骨仮骨を生じさせる（図４Ｂ）。ＮＧＦ－ｅＧＦＰレポーターマウスを利用することで、骨折仮骨の軟骨・骨移行部（ＴＺ）内のＮＧＦの発現ドメインを蛍光顕微鏡法で可視化することが可能になった（図４Ｃ）。ＴｒｋＡ発現は、比較的少ない細胞中で出現したが、ＴｒｋＡ－ＬａｃＺレポーターマウスを利用することで、この移行部における細胞内にも発見することができた（図４Ｄ～図４Ｆ）。組織診断を使用してＴＺにおけるＮＧＦおよびＴｒｋＡ空間的発現パターンを確立した後、遺伝子発現を使用してＮＧＦおよびＴｒｋＡの時間的発現パターンを確定した。骨折仮骨を骨折の７日後、１０日後、および１４日後に単離し、ｍＲＮＡをＴＲＩｚｏｌを使用して単離し、ＲＴ－ＰＣＲを使用してＮＧＦおよびＴｒｋＡの発現を定量化した。データは、ＮＧＦおよびＴｒｋＡの同様の時間的発現パターンを、骨折１０日後のピークと共に示す（図４Ｇ、４Ｈ）。
２．１ ＮＧＦおよびＴＲＫＡは内在性軟骨内骨折修復の間に軟骨・骨移行部中で発現される
長管骨治癒のマウスモデルにおいて内因性ＮＧＦおよびＴｒｋＡの発現の軟骨内骨折修復の間の空間時間的パラメータを確定するために、成体野生型マウスの右脛骨に中央軸閉鎖骨折を作り出すための既存の３点曲げ装置を使用して、成体雄および雌野生型マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ、１０～１４週齢Ｃ５７Ｂｌ６／Ｊ）の右脛骨の中央軸において閉鎖骨折を作り出した（図４Ａ）。皮膚を破ることなく骨折を作り出すために、約１４ｃｍの距離を落下する４６０ｇの重りからなる２ｃｍ鈍頭ドロップアームを備えた特注の装置を設計した。骨折の１４日後に採取された脛骨のＨａｌｌ－Ｂｒｕｎｔ四重染色（ＨＢＱ）切片（軟骨＝青色、骨＝赤色）によって可視化されるように、これらの不安定型骨折は強固な軟骨仮骨を生じさせる（図４Ｂ）。ＮＧＦ－ｅＧＦＰレポーターマウスを利用することで、骨折仮骨の軟骨・骨移行部（ＴＺ）内のＮＧＦの発現ドメインを蛍光顕微鏡法で可視化することが可能になった（図４Ｃ）。ＴｒｋＡ発現は、比較的少ない細胞中で出現したが、ＴｒｋＡ－ＬａｃＺレポーターマウスを利用することで、この移行部における細胞内にも発見することができた（図４Ｄ～図４Ｆ）。組織診断を使用してＴＺにおけるＮＧＦおよびＴｒｋＡ空間的発現パターンを確立した後、遺伝子発現を使用してＮＧＦおよびＴｒｋＡの時間的発現パターンを確定した。骨折仮骨を骨折の７日後、１０日後、および１４日後に単離し、ｍＲＮＡをＴＲＩｚｏｌを使用して単離し、ＲＴ－ＰＣＲを使用してＮＧＦおよびＴｒｋＡの発現を定量化した。データは、ＮＧＦおよびＴｒｋＡの同様の時間的発現パターンを、骨折１０日後のピークと共に示す（図４Ｇ、４Ｈ）。
【0139】
２．２ β－ＮＧＦの軟骨内送達は骨折修復の早期よりも骨形成性が高い
長管骨骨折治癒における外来性β－ＮＧＦの治療効能を試験した。骨折治癒用の新規療法を開発する場合、大部分の薬物はデフォルトでは骨折の直後に投与される。しかし、軟骨から骨への変換に相関するＮＧＦ－ＴｒｋＡの内在性空間時間的発現パターンに基づいて、この内在性発現パターンのタイミングに治療的送達を合わせる方が効能が高いのか否かを調査した。したがって、２つの異なる時点のβ－ＮＧＦ注射を試験した：早期、すなわち修復の炎症期および膜内期（４～６日目、図５Ａ）、または後期、すなわち軟骨成熟の軟骨内期（７～９日目、図５Ｃ）。局所送達をイソフルラン麻酔動物に対して０．５μｇのβ－ＮＧＦ、または対照としての基本培地を注射することで行った。早期β－ＮＧＦ注射によってコラーゲン１（Ｃｏｌ１）の相対発現が有意に増加した（図５Ｂ）。しかし、骨形成マーカーであるオステオカルシン（Ｏｃ）およびオステオポンチン（Ｏｐ）；ならびに血管新生促進性の血管内皮成長因子（Ｖｅｇｆ）が有意に減少した（図５Ｂ）。興味深いことに、後期β－ＮＧＦ注射は骨形成マーカーＯｃおよびＯｐの発現を強力に刺激した（図５Ｄ）。軟骨内レジメンでのβ－ＮＧＦ注射後のＣｏｌ１（ｐ＝０．０６）およびＶｅｇｆ（ｐ＝０．０６）のｍＲＮＡ発現において、有意ではない変化が観察された（図５Ｄ）。
長管骨骨折治癒における外来性β－ＮＧＦの治療効能を試験した。骨折治癒用の新規療法を開発する場合、大部分の薬物はデフォルトでは骨折の直後に投与される。しかし、軟骨から骨への変換に相関するＮＧＦ－ＴｒｋＡの内在性空間時間的発現パターンに基づいて、この内在性発現パターンのタイミングに治療的送達を合わせる方が効能が高いのか否かを調査した。したがって、２つの異なる時点のβ－ＮＧＦ注射を試験した：早期、すなわち修復の炎症期および膜内期（４～６日目、図５Ａ）、または後期、すなわち軟骨成熟の軟骨内期（７～９日目、図５Ｃ）。局所送達をイソフルラン麻酔動物に対して０．５μｇのβ－ＮＧＦ、または対照としての基本培地を注射することで行った。早期β－ＮＧＦ注射によってコラーゲン１（Ｃｏｌ１）の相対発現が有意に増加した（図５Ｂ）。しかし、骨形成マーカーであるオステオカルシン（Ｏｃ）およびオステオポンチン（Ｏｐ）；ならびに血管新生促進性の血管内皮成長因子（Ｖｅｇｆ）が有意に減少した（図５Ｂ）。興味深いことに、後期β－ＮＧＦ注射は骨形成マーカーＯｃおよびＯｐの発現を強力に刺激した（図５Ｄ）。軟骨内レジメンでのβ－ＮＧＦ注射後のＣｏｌ１（ｐ＝０．０６）およびＶｅｇｆ（ｐ＝０．０６）のｍＲＮＡ発現において、有意ではない変化が観察された（図５Ｄ）。
【0140】
２．３ 骨折仮骨由来の軟骨外植片のβ－ＮＧＦ刺激は軟骨内骨化に関連するプログラムを促進する
長管骨骨折治癒においてＮＧＦにより活性化される分子経路は試験しなかった。無痛ＮＧＦ療法の作用機序（ＭＯＡ）を理解するために、骨折後にＴｒｋＡ受容体（ＴｒｋＡｆｌ／ｆｌまたはｐ７５ＮＴＲｆｌ／ｆｌ）を条件付きで肥大軟骨細胞（Ｃｏｌ１０ＣｒｅＥＲＴもしくはＣｏｌ２ＣｒｅＥＲＴ）中でまたは包括的に（Ｒ２６ＣｒｅＥＲＴ２）ノックアウト（ＫＯ）して、この経路が軟骨内骨修復に必要とされる程度を確定する。次に対照マウスまたはＫＯマウスをＮＧＦＲ１００Ｗで処理して、軟骨細胞がＮＧＦＲ１００Ｗに対する栄養応答を媒介するか否かを試験する。インビトロ細胞培養物とＲＮＡｓｅｑとの組み合わせを使用して、どの骨形成経路がＮＧＦ－ＴｒｋＡ活性化の下流で応答するかを調査する。ＴＺ中でのＮＧＦ－ＴｒｋＡの内在性空間時間的発現パターン、およびβ－ＮＧＦに対する軟骨の強化された骨形成応答は、肥大軟骨がＮＧＦに対して応答性がある可能性があることを示唆した。
長管骨骨折治癒においてＮＧＦにより活性化される分子経路は試験しなかった。無痛ＮＧＦ療法の作用機序（ＭＯＡ）を理解するために、骨折後にＴｒｋＡ受容体（ＴｒｋＡｆｌ／ｆｌまたはｐ７５ＮＴＲｆｌ／ｆｌ）を条件付きで肥大軟骨細胞（Ｃｏｌ１０ＣｒｅＥＲＴもしくはＣｏｌ２ＣｒｅＥＲＴ）中でまたは包括的に（Ｒ２６ＣｒｅＥＲＴ２）ノックアウト（ＫＯ）して、この経路が軟骨内骨修復に必要とされる程度を確定する。次に対照マウスまたはＫＯマウスをＮＧＦＲ１００Ｗで処理して、軟骨細胞がＮＧＦＲ１００Ｗに対する栄養応答を媒介するか否かを試験する。インビトロ細胞培養物とＲＮＡｓｅｑとの組み合わせを使用して、どの骨形成経路がＮＧＦ－ＴｒｋＡ活性化の下流で応答するかを調査する。ＴＺ中でのＮＧＦ－ＴｒｋＡの内在性空間時間的発現パターン、およびβ－ＮＧＦに対する軟骨の強化された骨形成応答は、肥大軟骨がＮＧＦに対して応答性がある可能性があることを示唆した。
【0141】
これを試験するために、既に行ったように軟骨を骨折７日目の仮骨から単離した（Ｂａｈｎｅｙら、２０１４年、Ｊ Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ Ｒｅｓ ２９：１２６９～１２８２頁；Ｈｕら、２０１７年、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １４４：２２１～２３４頁）。外植片をインビトロで肥大化まで培養し、ＮＧＦ４０の生物活性形態である組換えヒトβ－ＮＧＦ ０．５μｇ／ｍＬありまたはなしで２４時間処理した後、ＲＮＡ配列決定（ＲＮＡｓｅｑ）を行った。インビボ試験と同様に、軟骨外植片試験においても骨形成マーカーＯｃが有意に上方制御された（ｐ＝１．８８Ｅ－２４、図７）。さらなる解析は、軟骨内骨化において役割を果たすことが証明されたいくつかの他の有意に上方制御される遺伝子、例えばインディアンヘッジホッグ（Ｉｈｈ）、アルカリホスファターゼ（Ａｌｐｌ）、副甲状腺ホルモン１受容体（Ｐｔｈ１ｒ）、Ｗｎｔ受容体（Ｌｒｐ５、Ｆｒｚｄ５）、および血管新生受容体（Ｐｄｇｆｒｂ）を明らかにした（図６Ａ）。下方制御遺伝子のうち、形質細胞腫変異体転座１（Ｐｖｔ１）およびカスパーゼ４（Ｃａｓｐ４）（図６Ａ）はいずれもアポトーシスを調節することが知られている。
【0142】
引き続き行ったＥｎｒｉｃｈＲを使用する機能エンリッチメント解析は、軟骨内骨化、骨折修復、および組織リモデリングに関連する分子機能の複数のカテゴリーを示した。最も有意に上方制御された３つの分子機能カテゴリーはＷｎｔ活性化（ｐ＝０．００６７）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）結合（ｐ＝０．００５１）、およびインテグリン結合（ｐ＝０．０１３）であった（図６Ｂ）。さらなるエンリッチメント解析によって、差次的発現遺伝子のヒートクラスターマップをこれらの分子機能カテゴリーに従って作り出した（図６Ｃ）。
【0143】
β－ＮＧＦおよび無刺激対照の各生物学的複製に関する主成分解析（ＰＣＡ）（図８Ａ）ならびに下方制御分子機能に関する遺伝子オントロジー（図８Ｂ）を含む、β－ＮＧＦ刺激肥大軟骨外植片のエンリッチメント解析のために、データを作成した。具体的には、軟骨組織を骨折の７日後に脛骨骨折部から切除し、肥大化まで７日間培養した後、組換えヒトβ－ＮＧＦありまたはなしで刺激した。２４時間後、試料をＲＮＡｓｅｑ解析（ｎ＝３）のために収集した。さらなるエンリッチメント解析によって、差次的発現遺伝子のヒートクラスターマップをこれらの分子機能カテゴリーに従って作り出した。
【0144】
２．４ ＮＧＦ送達後のＷｎｔ／β－カテニン経路調節の評価
エクスビボでの軟骨のβ－ＮＧＦ処理後にＷｎｔが最も有意に上方制御された分子機能であったことを示唆するＲＮＡｓｅｑデータを確認するために（図６Ｂ、図６Ｃ）／ＮＧＦがＷｎｔ／β－ｃａｔシグナル伝達を上方制御することのさらなる証拠を提供するために、マウスＡｘｉｎ２－ｅＧＦＰレポーターモデルを利用して、β－ＮＧＦで処置されたマウスにおけるインビボでのＷｎｔ発現を処置されなかったマウスと比較した。脛骨骨折を既に記載のようにＡｘｉｎ２－ｅＧＦＰマウスにおいて作り出し、骨折後７～９日目、修復の軟骨内期にβ－ＮＧＦを骨折仮骨に局所注射した（図９Ａ）。目視では、対照マウスはＴＺ中にＡｘｉｎ２－ｅＧＦＰ陽性細胞の大きな存在を示さなかった（図９Ｂ、９Ｃ）。しかし、β－ＮＧＦ処置マウスのＴＺにおける細胞中でＡｘｉｎ２－ｅＧＦＰが誘導された（図９Ｄ、９Ｅ）。Ｉｍａｇｅ－Ｊによる定量化では、β－ＮＧＦ処置後にＡｘｉｎ２－ｅＧＦＰが誘導され、これに比べて、対照群にはＡｘｉｎ２－ｅＧＦＰが存在しなかったことが確認された（図９Ｆ）。軟骨細胞中でのβ－カテニン発現が軟骨内骨折修復に決定的に重要であるという知見を考慮すれば、ＮＧＦとＷｎｔ／β－ｃａｔ活性化との間の関連は有意であった（Ｗｏｎｇら、２０２０年、ｂｉｏＲｘｉｖ ９８６１４１）。
エクスビボでの軟骨のβ－ＮＧＦ処理後にＷｎｔが最も有意に上方制御された分子機能であったことを示唆するＲＮＡｓｅｑデータを確認するために（図６Ｂ、図６Ｃ）／ＮＧＦがＷｎｔ／β－ｃａｔシグナル伝達を上方制御することのさらなる証拠を提供するために、マウスＡｘｉｎ２－ｅＧＦＰレポーターモデルを利用して、β－ＮＧＦで処置されたマウスにおけるインビボでのＷｎｔ発現を処置されなかったマウスと比較した。脛骨骨折を既に記載のようにＡｘｉｎ２－ｅＧＦＰマウスにおいて作り出し、骨折後７～９日目、修復の軟骨内期にβ－ＮＧＦを骨折仮骨に局所注射した（図９Ａ）。目視では、対照マウスはＴＺ中にＡｘｉｎ２－ｅＧＦＰ陽性細胞の大きな存在を示さなかった（図９Ｂ、９Ｃ）。しかし、β－ＮＧＦ処置マウスのＴＺにおける細胞中でＡｘｉｎ２－ｅＧＦＰが誘導された（図９Ｄ、９Ｅ）。Ｉｍａｇｅ－Ｊによる定量化では、β－ＮＧＦ処置後にＡｘｉｎ２－ｅＧＦＰが誘導され、これに比べて、対照群にはＡｘｉｎ２－ｅＧＦＰが存在しなかったことが確認された（図９Ｆ）。軟骨細胞中でのβ－カテニン発現が軟骨内骨折修復に決定的に重要であるという知見を考慮すれば、ＮＧＦとＷｎｔ／β－ｃａｔ活性化との間の関連は有意であった（Ｗｏｎｇら、２０２０年、ｂｉｏＲｘｉｖ ９８６１４１）。
【0145】
ＮＧＦシグナル伝達が骨組織の血管新生化に先行しかつそれを調整するという文献上の証拠を考慮して（Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎら、２０１６年、Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ １６：２７２３～２７３５頁）、局所β－ＮＧＦ注射が軟骨仮骨に対する内皮細胞の浸潤を促進するか否かを測定した。β－ＮＧＦの軟骨内送達を受け取った野生型マウスにおける骨折後１０日目のＣＤ３１内皮細胞マーカーに対して行った免疫組織化学的検査を使用して、血管新生を定量化した。軟骨仮骨への血管侵入が両対照において観察され（図９Ｇ、図９Ｈ）、β－ＮＧＦ群では染色の強度が僅かに高かった（図９Ｉ、図９Ｊ）。Ｉｍａｇｅ－Ｊによる定量化は、β－ＮＧＦ処置マウスの軟骨組織中のＣＤ３１陽性細胞の僅かな増加（ｐ＝０．１２）のみを示す（図９Ｋ）。
【0146】
２．５ 局所β－ＮＧＦ注射は骨折の１４日後までに軟骨内骨形成を促進する
次に、治療用β－ＮＧＦの軟骨内送達による骨折治癒の機能的帰結を、骨折の１４日後の処置脛骨および対照脛骨に対する組織形態計測的および定量的μＣＴ解析を使用して試験した。組織診断は、β－ＮＧＦを受け取った骨折において、対照に比べて骨梁骨の形成が増加していること（赤色）および軟骨が減少していること（青色）を明らかに示す（図１０Ａ、図１０Ｂ）。軟骨組織の定量化は、β－ＮＧＦ処置マウスの仮骨内の絶対量（図１０Ｃ）および組成パーセント（軟骨量／総量）（図１０Ｄ）の約５０％の減少を示した。逆に、骨梁骨の定量化は、β－ＮＧＦ処置後の骨の絶対量（図１０Ｅ）および仮骨の組成（骨量／総量）（図１０Ｆ）の同様の増加を確認した。全体として、対照とβ－ＮＧＦ処置マウスとの間で仮骨の量に差はなかった（図１０Ｇ）。また、群間で骨髄の量（ｐ＝０．５９）（図１０Ｈ）または線維組織の量（ｐ＝０．４０）（図１０Ｉ）に差はなかった。このことは、軟骨から骨への変換が実験群において促進されたことを示唆している。
次に、治療用β－ＮＧＦの軟骨内送達による骨折治癒の機能的帰結を、骨折の１４日後の処置脛骨および対照脛骨に対する組織形態計測的および定量的μＣＴ解析を使用して試験した。組織診断は、β－ＮＧＦを受け取った骨折において、対照に比べて骨梁骨の形成が増加していること（赤色）および軟骨が減少していること（青色）を明らかに示す（図１０Ａ、図１０Ｂ）。軟骨組織の定量化は、β－ＮＧＦ処置マウスの仮骨内の絶対量（図１０Ｃ）および組成パーセント（軟骨量／総量）（図１０Ｄ）の約５０％の減少を示した。逆に、骨梁骨の定量化は、β－ＮＧＦ処置後の骨の絶対量（図１０Ｅ）および仮骨の組成（骨量／総量）（図１０Ｆ）の同様の増加を確認した。全体として、対照とβ－ＮＧＦ処置マウスとの間で仮骨の量に差はなかった（図１０Ｇ）。また、群間で骨髄の量（ｐ＝０．５９）（図１０Ｈ）または線維組織の量（ｐ＝０．４０）（図１０Ｉ）に差はなかった。このことは、軟骨から骨への変換が実験群において促進されたことを示唆している。
【0147】
骨折１４日後の対照およびβ－ＮＧＦ処置マウスに対して、μＣＴ解析を組織形態計測と並行して行った。μＣＴ画像の肉眼検査は処置群間の明白な差を示さない（図１１Ａ、図１１Ｂ）。しかし、構造インデックスの定量的評価は骨構造の明瞭な差を示した。β－ＮＧＦ処置マウスは、対照に比べて、骨梁間隔（図１１Ｃ）の３５％の減少を示し、一方、骨梁数（図１１Ｄ）および骨梁連結性密度（図１１Ｅ）の４０％超の劇的な増加を示した。β－ＮＧＦ処置マウスの骨折仮骨では骨塩量測定値も有意に約２０％増加した（図１１Ｆ）。骨折仮骨内の骨梁骨のμＣＴ解析のさらなる結果を図１２Ａ～図１２Ｃに示す。骨折の７日後、８日後、および９日後に培地（対照）または０．５μｇのβ－ＮＧＦの局所注射液を１日１回投与した後、骨折の１４日後に脛骨をμＣＴ解析のために採取した。まとめると、μＣＴデータは、軟骨内修復の後期を示す、β－ＮＧＦ処置マウスにおける高度に接続された構造的に優れた骨構造を示す。
【0148】
したがって、骨折後７～９日目、修復の軟骨期にβ－ＮＧＦが投与される場合、該薬物は長管骨骨折治癒を促進する上で最も有効であった。これは、内在性ＮｇｆおよびＴｒｋＡの遺伝子発現の上方制御が観察されたことを反映している。ＮＧＦ－ｅＧＦＰおよびＴｒｋＡ－ＬａｃＺレポーターマウスを利用する組織学的データは、脛骨骨折の仮骨内の発現パターンの第１の遺伝子標識化を示す。軟骨が肥大化を経て骨に変換される、侵入血管系に隣接する軟骨・骨移行部中で、ＮＧＦおよびＴｒｋＡが主に局在化された。
【0149】
内因性ＮＧＦおよびＴｒｋＡ局在化の遺伝子モデルは、修復の肥大軟骨期にニューロトロフィンおよびその受容体のピーク発現が観察されることを裏付けるものである（Ａｓａｕｍｉら、２０００年、Ｂｏｎｅ ２６：６２５～６３３頁；Ｓｕｎら、２０２０年、Ｂｏｎｅ １３１：１１５１０９；ＧｒｉｌｌｓおよびＳｃｈｕｉｊｅｒｓ、１９９８年、Ａｃｔａ Ｏｒｔｈｏｐ Ｓｃａｎ ６９：４１５～４１９頁）。ｍＲＮＡ発現データは１０日目にピークを示すが、試料を１４日目に組織学的解析のために採取する場合は、ｍＲＮＡからタンパク質への合成の遅延の可能性を考慮した。この時点でのＮＧＦおよびＴｒｋＡ発現の組織学的可視化によって、軟骨・骨移行部における脛骨骨折仮骨の広範かつ強力な存在が示される。
【0150】
骨成長および骨折修復の間の軟骨細胞から骨芽細胞への骨形成変換は、骨形成および石灰化を制御する伝統的プログラムの上方制御に関連している。遺伝子オントロジーを通じて、Ｗｎｔ活性化に関連する分子機能を、β－ＮＧＦ処置後に最も有意に上方制御される分子機能として同定した。さらに、本実施例は、β－ＮＧＦでのインビトロ刺激後の軟骨中でＮＧＦシグナル伝達とＷｎｔ活性化との間の関係性が認められた最初の試験となる。また、Ｗｎｔ活性化を、局所β－ＮＧＦ注射後のＡｘｉｎ２－ｅＧＦＰマウスを使用する組織学的解析によってインビボで確認した。したがって、β－ＮＧＦ処置はおそらく、軟骨内骨折修復の間のＷｎｔが媒介する軟骨から骨への変換を刺激するとみられる。
【0151】
さらに、本実施例においては、β－ＮＧＦの最良の治療ウィンドウを規定する上で注射のタイミングが重要であることが示された。β－ＮＧＦは、修復の軟骨内期に送達される場合、早期、すなわち炎症性応答および膜内治癒の間に比べて強力な骨形成作用を示すことが発見された。β－ＮＧＦの軟骨内送達では、仮骨組織の組織形態計測的解析によれば、対照に比べて軟骨が減少し、骨組織が増加した。さらに、骨折仮骨の総量の変化は認められなかった。このことは、β－ＮＧＦが軟骨から骨への変換を促進するという知見を裏付けている。組織形態計測に加えて、μＣＴデータは、新たに形成された骨梁骨の高い連結性および高い塩量をさらに示した。
【0152】
実際、遺伝子発現解析、組織形態計測、およびμＣＴデータは一致して、骨折修復の軟骨内期のβ－ＮＧＦ処置が骨形成を刺激することでより多くの骨組織を生じさせること、および、新たに形成される骨がより連結性が高く、より構造の質が高いことを示した。ＮＧＦの臨床応用に関する限界はその痛覚過敏作用にある。
【実施例3】
【0153】
神経成長因子の治療的送達は骨折治癒の間に軟骨から骨への変換を促進する
骨折は主に軟骨内骨化のプロセスを通じて治癒する。軟骨内骨化、または間接的な骨形成は、軟骨が骨間隙の間に形成された後、骨に置き換えられる際に生じる。骨折仮骨中での軟骨から骨への変換は、侵入する神経血管束に隣接して生じる。軟骨内骨化の間の血管新生および関連因子が真摯に研究されてきたが、このプロセスにおける神経シグナル伝達の役割を調査した研究は限られている。肥大軟骨細胞部の血管新生化および神経化がいずれも適切な出生後の骨成長のために決定的に重要であることから、神経成長因子（ＮＧＦ）発現およびその受容体ＴｒｋＡの誘導が骨折治癒の間に生じるか否か、ならびにＮＧＦの局所注射がマウスの骨折脛骨中で軟骨から骨への変換を促進することで骨折修復を強化するか否かを調査した。
骨折は主に軟骨内骨化のプロセスを通じて治癒する。軟骨内骨化、または間接的な骨形成は、軟骨が骨間隙の間に形成された後、骨に置き換えられる際に生じる。骨折仮骨中での軟骨から骨への変換は、侵入する神経血管束に隣接して生じる。軟骨内骨化の間の血管新生および関連因子が真摯に研究されてきたが、このプロセスにおける神経シグナル伝達の役割を調査した研究は限られている。肥大軟骨細胞部の血管新生化および神経化がいずれも適切な出生後の骨成長のために決定的に重要であることから、神経成長因子（ＮＧＦ）発現およびその受容体ＴｒｋＡの誘導が骨折治癒の間に生じるか否か、ならびにＮＧＦの局所注射がマウスの骨折脛骨中で軟骨から骨への変換を促進することで骨折修復を強化するか否かを調査した。
【0154】
方法
骨折治癒の間のＮＧＦ発現：１０～１４週齢の雄Ｃ５７Ｂｌ６／Ｊ野生型マウスに対して３点骨折装置を使用して右脛骨の中央軸に不安定型閉鎖骨折を作り出した。仮骨を骨折後７日目、１０日目、および１４日目に採取して神経栄養遺伝子発現を測定した。試料をＲＴ－ｑＰＣＲ（Ｎ＝４）のためにＴｒｉｚｏｌ中で収集してｍＲＮＡを単離した。
骨折治癒の間のＮＧＦ発現：１０～１４週齢の雄Ｃ５７Ｂｌ６／Ｊ野生型マウスに対して３点骨折装置を使用して右脛骨の中央軸に不安定型閉鎖骨折を作り出した。仮骨を骨折後７日目、１０日目、および１４日目に採取して神経栄養遺伝子発現を測定した。試料をＲＴ－ｑＰＣＲ（Ｎ＝４）のためにＴｒｉｚｏｌ中で収集してｍＲＮＡを単離した。
【0155】
遺伝子発現に対するＮＧＦの作用：骨折の３日後または７日後に３日連続で骨折仮骨へのＮＧＦ（ＤＭＥＭ ２０ｕＬ中０．５ｕｇ）の注射を開始した。対照にはＤＭＥＭのみを注射した。次に、骨折仮骨を、最終ＮＧＦ注射の２４時間後に採取し、骨形成マーカーおよび軟骨形成マーカーのＲＴ－ｑＰＣＲ解析（Ｎ＝３）のために、Ｔｒｉｚｏｌ中で収集して、次にｍＲＮＡを単離した。ｍＲＮＡ発現の有意差をＡＮＯＶＡ、続いてチューキー・クレーマー事後ＨＳＤ（α＝０．０５）を使用して確定した。
【0156】
骨折仮骨組織の組成に対するＮＧＦの作用：ＮＧＦおよび対照の注射を骨折後７～９日目に行った後、脛骨を骨折の１４日後に採取した。骨折脛骨を４％パラホルムアルデヒド中に２４時間固定した後、１９％ ＥＤＴＡ中、４℃で１４日間脱灰し、次にパラフィン包埋および立体解析学的解析のために処理した（Ｈｕら、２０１７年、Ｄｅｖ １４４：２２１～２３４頁）。一連の切片を１０μｍで切断し、Ｈａｌｌ－Ｂｒｕｎｔ四重染色（ＨＢＱ）プロトコルを使用して骨（赤色）および軟骨（青色）を可視化した。仮骨組成の定量化をＯｌｙｍｐｕｓ ＣＡＳＴシステムおよびＶｉｓｉｏｐｈａｒｍによるソフトウェアを使用して確定した（Ｎ＝８）。有意性をＷｉｌｃｏｘｏｎ／Ｋｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ検定（α＝０．０５）を使用して確定した。
【0157】
結果
骨折治癒の間の血管新生遺伝子および神経栄養遺伝子（ＴｒｋＡ、ＶＥＧＦ、ＮＧＦ）の発現の誘導が、骨折後１０日目の発現ピークと共に観察された（データは示さず）。骨折治癒の膜内期（３～５日目）または骨折治癒の軟骨内期（７～９日目）のＮＧＦ注射後、最終注射の２４時間後の骨形成遺伝子発現の定量化は、修復の軟骨期の注射によってのみ、ＤＭＥＭ処置対照に比べて強力にｃｏｌ Ｉ、オステオカルシン（ｏｃ）、およびオステオポンチン（ｏｐ）が活性化されることを示す（データは示さず）。治癒の膜内期に注射される場合、ＮＧＦ処置マウスの仮骨ではｃｏｌ Ｉ発現のみが対照に比べて異なったが、軟骨内期に注射される場合、ＮＧＦ処置マウスの仮骨ではｃｏｌ ２、ｃｏｌ Ｉ、ｏｃ、およびｏｐの発現が対照に比べて異なった。ＮＧＦをこの後期の時点で送達する場合、組織診断は骨折の１４日後に、より多くの新たに形成された骨梁骨、およびより少ない軟骨を示す。立体解析学的定量化は群間で仮骨サイズの差を明らかにしなかったが、骨量はＮＧＦ処置マウスの方が有意に高く、このことは、骨折仮骨中の骨の割合が増加していることを意味する（データは示さず）。逆に、軟骨量および組成はＮＧＦ処置マウスの方が有意に低かった（データは示さず）。
骨折治癒の間の血管新生遺伝子および神経栄養遺伝子（ＴｒｋＡ、ＶＥＧＦ、ＮＧＦ）の発現の誘導が、骨折後１０日目の発現ピークと共に観察された（データは示さず）。骨折治癒の膜内期（３～５日目）または骨折治癒の軟骨内期（７～９日目）のＮＧＦ注射後、最終注射の２４時間後の骨形成遺伝子発現の定量化は、修復の軟骨期の注射によってのみ、ＤＭＥＭ処置対照に比べて強力にｃｏｌ Ｉ、オステオカルシン（ｏｃ）、およびオステオポンチン（ｏｐ）が活性化されることを示す（データは示さず）。治癒の膜内期に注射される場合、ＮＧＦ処置マウスの仮骨ではｃｏｌ Ｉ発現のみが対照に比べて異なったが、軟骨内期に注射される場合、ＮＧＦ処置マウスの仮骨ではｃｏｌ ２、ｃｏｌ Ｉ、ｏｃ、およびｏｐの発現が対照に比べて異なった。ＮＧＦをこの後期の時点で送達する場合、組織診断は骨折の１４日後に、より多くの新たに形成された骨梁骨、およびより少ない軟骨を示す。立体解析学的定量化は群間で仮骨サイズの差を明らかにしなかったが、骨量はＮＧＦ処置マウスの方が有意に高く、このことは、骨折仮骨中の骨の割合が増加していることを意味する（データは示さず）。逆に、軟骨量および組成はＮＧＦ処置マウスの方が有意に低かった（データは示さず）。
【0158】
したがって、骨折後７～１４日目の間に脛骨中でＮＧＦおよびＴｒｋＡの発現が誘導された。さらに、ＮＧＦ／ＴｒｋＡシグナル伝達と並行して、骨折後１０日目にＶＥＧＦ発現もピークに達した。ＮＧＦ処置骨折のＲＴ－ｑＰＣＲデータは、軟骨内修復の軟骨期（骨折後７～９日目）に処置されたコホートにおいて骨形成マーカーがより強力に促進されることを示した。これにより、骨折の１４日後に対照群に比べて骨量が増加し、軟骨量が減少した。このことは、ＮＧＦ送達が軟骨から骨への変換を促進したことを示している。この局所ＮＧＦ投与は軟骨仮骨中で骨形成を活性化するようである。
【実施例4】
【0159】
注射用マイクロロッドによるβ－ＮＧＦの局在化送達は軟骨内骨折修復を促進する
ＰＥＧＤＭＡマイクロロッドの作製
操作されたＰＥＧＤＭＡマイクロロッドがＮＧＦの持続放出を生じさせることで軟骨内修復を促進するか否かを確定するために、既に記載（Ａｙａｌａら、２０１０年、Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｐａｒｔ Ａ １６：２５１９～２５２７頁）のようにマイクロロッドを作製した。簡潔に言えば、ポリ（エチレングリコール）ジメタクリレート（ＰＥＧＤＭＡ）分子量７５０、光重合開始剤２，２－ジメトキシ－２－フェニルアセトフェノン（ＤＭＰＡ）を１－ビニル－ｎ－ピロリドン（ＮＶＰ）に、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中１００ｍｇ／ｍＬの濃度まで溶解させた。この溶液を室温で１５分間超音波処理して均質化した。ＰＢＳに対するＰＥＧＤＭＡの％ ｖ／ｖを変化させることで２５％、７５％、および９０％ ＰＥＧＤＭＡマイクロロッドを作り出した。既存の方法（Ｙａｎｇら、２０１４年、ＰＮＡＳ ＵＳＡ １３０２７０３１１１）を使用して、フォトリソグラフィーを使用することで、寸法１００ｘ１５ｘ１５μｍを有するように設計されて、３インチシリコンウェハに微細作製された、マイクロロッドを作り出した。簡潔に言えば、ウェハをピラニア溶液（３：１ Ｈ２ＳＯ４：Ｈ２Ｏ２）中で２０分間クリーニングし、ＤＩ－Ｈ２Ｏで３回リンスした。次にウェハをアセトン、メタノール、およびイソプロパノールでリンスした後；２００℃で２分間ベーキングした。ＰＥＧＤＭＡ前駆体溶液を各ウェハに堆積させた。これらのウェハは、ＳＵ－８ ２０１５で予め作製された奥行き１５μｍのベベルを有していた。ウェハを、Ｋａｒｌ Ｓｕｓｓ ＭＪＢ３マスクアライナーを使用してマイクロロッドのパターンを有するフォトマスクを通じて９ｍＷ／ｃｍ２で４０５ｎｍ光源に曝露した。ウェハ上のマイクロロッドをリンスし、セルスクレーパーによって穏やかに擦過しながら７０％エタノールで取り除いた。収集したマイクロロッドを遠心し、７０％エタノール中で３回リンスした後、１０％スクロースおよび０．０５％ ｔｗｅｅｎ－２０が入った滅菌脱イオン水（ｄｉＨ２Ｏ）に再懸濁させて凝集を防止した。次に約１００，０００個のＰＥＧＤＭＡマイクロロッドのアリコートを凍結乾燥させ、密封し、さらなる使用まで４℃で保管した。ＰＥＧＤＭＡマイクロロッドのサブセットをＰＢＳに再懸濁させ、明視野（ＢＦ）下で顕微鏡写真撮影した。別のサブセットをＰＢＳ中で低分子量色素４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）１μｇ／ｍＬによって５分間染色し、ＰＢＳで穏やかに３回洗浄した後、直ちにＮｉｋｏｎ Ｔｉ顕微鏡を使用して画像化した。
ＰＥＧＤＭＡマイクロロッドの作製
操作されたＰＥＧＤＭＡマイクロロッドがＮＧＦの持続放出を生じさせることで軟骨内修復を促進するか否かを確定するために、既に記載（Ａｙａｌａら、２０１０年、Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｐａｒｔ Ａ １６：２５１９～２５２７頁）のようにマイクロロッドを作製した。簡潔に言えば、ポリ（エチレングリコール）ジメタクリレート（ＰＥＧＤＭＡ）分子量７５０、光重合開始剤２，２－ジメトキシ－２－フェニルアセトフェノン（ＤＭＰＡ）を１－ビニル－ｎ－ピロリドン（ＮＶＰ）に、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中１００ｍｇ／ｍＬの濃度まで溶解させた。この溶液を室温で１５分間超音波処理して均質化した。ＰＢＳに対するＰＥＧＤＭＡの％ ｖ／ｖを変化させることで２５％、７５％、および９０％ ＰＥＧＤＭＡマイクロロッドを作り出した。既存の方法（Ｙａｎｇら、２０１４年、ＰＮＡＳ ＵＳＡ １３０２７０３１１１）を使用して、フォトリソグラフィーを使用することで、寸法１００ｘ１５ｘ１５μｍを有するように設計されて、３インチシリコンウェハに微細作製された、マイクロロッドを作り出した。簡潔に言えば、ウェハをピラニア溶液（３：１ Ｈ２ＳＯ４：Ｈ２Ｏ２）中で２０分間クリーニングし、ＤＩ－Ｈ２Ｏで３回リンスした。次にウェハをアセトン、メタノール、およびイソプロパノールでリンスした後；２００℃で２分間ベーキングした。ＰＥＧＤＭＡ前駆体溶液を各ウェハに堆積させた。これらのウェハは、ＳＵ－８ ２０１５で予め作製された奥行き１５μｍのベベルを有していた。ウェハを、Ｋａｒｌ Ｓｕｓｓ ＭＪＢ３マスクアライナーを使用してマイクロロッドのパターンを有するフォトマスクを通じて９ｍＷ／ｃｍ２で４０５ｎｍ光源に曝露した。ウェハ上のマイクロロッドをリンスし、セルスクレーパーによって穏やかに擦過しながら７０％エタノールで取り除いた。収集したマイクロロッドを遠心し、７０％エタノール中で３回リンスした後、１０％スクロースおよび０．０５％ ｔｗｅｅｎ－２０が入った滅菌脱イオン水（ｄｉＨ２Ｏ）に再懸濁させて凝集を防止した。次に約１００，０００個のＰＥＧＤＭＡマイクロロッドのアリコートを凍結乾燥させ、密封し、さらなる使用まで４℃で保管した。ＰＥＧＤＭＡマイクロロッドのサブセットをＰＢＳに再懸濁させ、明視野（ＢＦ）下で顕微鏡写真撮影した。別のサブセットをＰＢＳ中で低分子量色素４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）１μｇ／ｍＬによって５分間染色し、ＰＢＳで穏やかに３回洗浄した後、直ちにＮｉｋｏｎ Ｔｉ顕微鏡を使用して画像化した。
【0160】
ＰＥＧＤＭＡマイクロロッドのタンパク質添加
ウシα－キモトリプシノーゲンＡ（Ｓｉｇｍａ）を、２５％、７５％、および９０％ ＰＥＧＤＭＡマイクロロッドの間で添加効率を比較するための代理として使用した。これは、ウシα－キモトリプシノーゲンＡの分子量（２５．７ｋＤａ）がβ－神経成長因子の分子量（β－ＮＧＦ、２７ｋＤａ）と同様であるからである。凍結乾燥ＰＥＧＤＭＡマイクロロッドアリコート（マイクロロッド約１００，０００個／アリコート）をｄｉＨ２Ｏ中１ｍｇ／ｍＬ α－キモトリプシノーゲンＡ ２０μＬに再懸濁させた。再懸濁後、マイクロロッドにタンパク質を４℃で３０時間受動的に吸収させた。添加後、マイクロロッドをｄｉＨ２Ｏに再懸濁させ、管中で穏やかに遠心沈殿してペレット化し、上澄み液を使用してマイクロビシンコニン酸（μＢＣＡ）タンパク質アッセイを行うことで、溶液に残存するタンパク質の量を定量化した。添加効率を確定するために下記式を使用した：添加効率％＝（（Ｘｉ－Ｘｔ）／Ｘｉ）＊１００；式中、Ｘｔは３０時間後の上澄み液中のタンパク質の量であり、Ｘｉは調製中に最初に加えられる薬物の量である。後続のアッセイにおいて、ＰＥＧＤＭＡマイクロロッドに対するβ－ＮＧＦの添加、および添加効率の計算を同様に行った。
ウシα－キモトリプシノーゲンＡ（Ｓｉｇｍａ）を、２５％、７５％、および９０％ ＰＥＧＤＭＡマイクロロッドの間で添加効率を比較するための代理として使用した。これは、ウシα－キモトリプシノーゲンＡの分子量（２５．７ｋＤａ）がβ－神経成長因子の分子量（β－ＮＧＦ、２７ｋＤａ）と同様であるからである。凍結乾燥ＰＥＧＤＭＡマイクロロッドアリコート（マイクロロッド約１００，０００個／アリコート）をｄｉＨ２Ｏ中１ｍｇ／ｍＬ α－キモトリプシノーゲンＡ ２０μＬに再懸濁させた。再懸濁後、マイクロロッドにタンパク質を４℃で３０時間受動的に吸収させた。添加後、マイクロロッドをｄｉＨ２Ｏに再懸濁させ、管中で穏やかに遠心沈殿してペレット化し、上澄み液を使用してマイクロビシンコニン酸（μＢＣＡ）タンパク質アッセイを行うことで、溶液に残存するタンパク質の量を定量化した。添加効率を確定するために下記式を使用した：添加効率％＝（（Ｘｉ－Ｘｔ）／Ｘｉ）＊１００；式中、Ｘｔは３０時間後の上澄み液中のタンパク質の量であり、Ｘｉは調製中に最初に加えられる薬物の量である。後続のアッセイにおいて、ＰＥＧＤＭＡマイクロロッドに対するβ－ＮＧＦの添加、および添加効率の計算を同様に行った。
【0161】
マイクロロッドを濃度１ｘ１０６／ｍＬで１ｍｇ／ｍＬ ＮＧＦ－ＰＢＳ溶液に４℃で２４時間入れることで、ＮＧＦを該マイクロロッド中に吸収を通じて添加した。次にＮＧＦ添加マイクロロッドを４℃での遠心分離により収集し、吸収効率を上澄み液中の［ＮＧＦ］を通じて計算した。放出動態を計算するために、マイクロロッドをＰＢＳアリコート１００μＬに再懸濁させ（マイクロロッド１ｘ１０６個／ｍＬ）、３７℃で穏やかに撹拌し、１日目、３日目、５日目、７日目、および１４日目に上澄み液を収集し、タンパク質含有量をマイクロＢＣＡタンパク質アッセイによって測定した。７日間にわたる放出速度０．５０μｇ／日を目標とした。
【0162】
赤芽球（ＴＦ－１）細胞増殖
ＴＦ－１細胞増殖アッセイは既存の方法（ＭａおよびＺｏｕ、２０１３年、Ｊ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｖｉｒｏｌ ２（２）：３２）を改変したものである。簡潔に言えば、２ｎｇ／ｍｌ組換えヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）および１０％ウシ胎仔血清を補充した、２ｍＭ Ｌ－グルタミン、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、４５００ｍｇ／Ｌグルコース、および炭酸水素ナトリウム１５００ｍｇ／Ｌで改変されたＲＰＭＩ １６４０培地（ＡＴＣＣ ３０－２００１）中で、ＴＦ－１細胞（ＡＴＣＣ）を７日間培養した。７日間の細胞増殖後、コンフルエントＴＦ－１細胞を、遠心分離により収集し、２４ウェルマイクロプレート中に、無血清培地６００μｌを収容するウェル１個当たり細胞３０，０００個で再懸濁させた。細胞を無血清培地中で２４時間培養して細胞を同期させた後、処理群を加えた。２４時間後、無血清培地１００μｌ、空のマイクロロッド１６，０００個、可溶性β－ＮＧＦ ２０００ｎｇ、またはβ－ＮＧＦ １８ｎｇを含むマイクロロッド１６，０００個を収容する高細孔密度（０．４ミクロン）トランスウェルインサートを各ウェルに挿入し、これらの条件でさらに９６時間培養した。ウェル１個当たり３０，０００個の細胞を収容する２４ウェルプレートを取り外し、２４時間の無血清培地インキュベーション後に０日対照として分析した（下記参照）。９６時間後、トランスウェルインサートを取り外し、各ウェルから３００μｌを吸引した。この収集された３００μｌをアリコートして、各１００μｌを収容する９６ウェルマイクロプレート中の個々のウェル（２４ウェルプレート中の単一のウェルに関して合計３個のウェル）に入れ、製造業者のプロトコルに従ってＣｙＱｕａｎｔ（商標）直接増殖アッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）に供した。データは０日目の細胞数に対する変化倍率として表される。
ＴＦ－１細胞増殖アッセイは既存の方法（ＭａおよびＺｏｕ、２０１３年、Ｊ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｖｉｒｏｌ ２（２）：３２）を改変したものである。簡潔に言えば、２ｎｇ／ｍｌ組換えヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）および１０％ウシ胎仔血清を補充した、２ｍＭ Ｌ－グルタミン、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、４５００ｍｇ／Ｌグルコース、および炭酸水素ナトリウム１５００ｍｇ／Ｌで改変されたＲＰＭＩ １６４０培地（ＡＴＣＣ ３０－２００１）中で、ＴＦ－１細胞（ＡＴＣＣ）を７日間培養した。７日間の細胞増殖後、コンフルエントＴＦ－１細胞を、遠心分離により収集し、２４ウェルマイクロプレート中に、無血清培地６００μｌを収容するウェル１個当たり細胞３０，０００個で再懸濁させた。細胞を無血清培地中で２４時間培養して細胞を同期させた後、処理群を加えた。２４時間後、無血清培地１００μｌ、空のマイクロロッド１６，０００個、可溶性β－ＮＧＦ ２０００ｎｇ、またはβ－ＮＧＦ １８ｎｇを含むマイクロロッド１６，０００個を収容する高細孔密度（０．４ミクロン）トランスウェルインサートを各ウェルに挿入し、これらの条件でさらに９６時間培養した。ウェル１個当たり３０，０００個の細胞を収容する２４ウェルプレートを取り外し、２４時間の無血清培地インキュベーション後に０日対照として分析した（下記参照）。９６時間後、トランスウェルインサートを取り外し、各ウェルから３００μｌを吸引した。この収集された３００μｌをアリコートして、各１００μｌを収容する９６ウェルマイクロプレート中の個々のウェル（２４ウェルプレート中の単一のウェルに関して合計３個のウェル）に入れ、製造業者のプロトコルに従ってＣｙＱｕａｎｔ（商標）直接増殖アッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）に供した。データは０日目の細胞数に対する変化倍率として表される。
【0163】
マイクロロッドから溶出するＮＧＦの生物活性の確認
ＰＥＧＤＭＡマイクロロッドへの添加およびＰＥＧＤＭＡマイクロロッドからの放出後のＮＧＦの生物活性を評価するために、既存のＴＦ１増殖アッセイを使用した（Ｍａｌｅｒｂａら、２０１５年、ＰＬｏＳ ＯＮＥ １０：ｅ０１３６４２５）。ＴＦ１細胞（ＴｒｋＡを発現する）を１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）入りのＤＭＥＭ中で２ｎｇ／ｍＬ ｒｈＧＭ－ＣＳＦと共に１週間培養した。培養後、細胞を９６ウェルマイクロプレートに細胞３００，０００個／ｍＬ（５０μｌ中にウェル１個当たり細胞１５，０００個）の濃度でプレーティングした。プレーティングの６０分後、細胞をＤＭＥＭ １０％ ＦＢＳ中のＮＧＦ－マイクロロッド上澄み液に曝露した。４０時間のインキュベーション後、試薬ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６ Ａｑｕｅｏｕｓ １ Ｓｔｅｐ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、米国マジソン）６０μｌをピペットで各ウェルに入れた。さらに１時間のインキュベーション後、４９０ｎｍの吸光度をＥｌｉｓａプレートリーダー（Ｗａｌｌａｃ Ｖｉｃｔｏｒ Ｖ２１４２０分光光度計）を使用して記録した。ＰＥＧＤＭＡマイクロロッドから放出されたＮＧＦはＴＦ１細胞の増殖を増加させた（データは示さず）。
ＰＥＧＤＭＡマイクロロッドへの添加およびＰＥＧＤＭＡマイクロロッドからの放出後のＮＧＦの生物活性を評価するために、既存のＴＦ１増殖アッセイを使用した（Ｍａｌｅｒｂａら、２０１５年、ＰＬｏＳ ＯＮＥ １０：ｅ０１３６４２５）。ＴＦ１細胞（ＴｒｋＡを発現する）を１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）入りのＤＭＥＭ中で２ｎｇ／ｍＬ ｒｈＧＭ－ＣＳＦと共に１週間培養した。培養後、細胞を９６ウェルマイクロプレートに細胞３００，０００個／ｍＬ（５０μｌ中にウェル１個当たり細胞１５，０００個）の濃度でプレーティングした。プレーティングの６０分後、細胞をＤＭＥＭ １０％ ＦＢＳ中のＮＧＦ－マイクロロッド上澄み液に曝露した。４０時間のインキュベーション後、試薬ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６ Ａｑｕｅｏｕｓ １ Ｓｔｅｐ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、米国マジソン）６０μｌをピペットで各ウェルに入れた。さらに１時間のインキュベーション後、４９０ｎｍの吸光度をＥｌｉｓａプレートリーダー（Ｗａｌｌａｃ Ｖｉｃｔｏｒ Ｖ２１４２０分光光度計）を使用して記録した。ＰＥＧＤＭＡマイクロロッドから放出されたＮＧＦはＴＦ１細胞の増殖を増加させた（データは示さず）。
【0164】
ＰＥＧＤＭＡマイクロロッドからのβ－ＮＧＦ溶出
マイクロロッドアリコート約１００，０００（１００ｋ）個を１ｍｇ／ｍＬ組換えヒトβ－ＮＧＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）２０μＬに再懸濁させることで凍結乾燥９０％ ＰＥＧＤＭＡマイクロロッドに添加した。添加後、マイクロロッドをＰＢＳで穏やかに３回リンスした。次にＰＥＧＤＭＡマイクロロッドをさらに分割し、試料は１６ｋマイクロロッド／マイクロチューブのＰＢＳ（ｐＨ７．４）２５０μＬ懸濁液で構成された。試料をインキュベーター（３７℃）内のオービタルシェーカー（１００ＲＰＭ）に置いた。ＰＥＧＤＭＡマイクロロッドを穏やかに遠心沈殿させ、６時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１２０時間、１４４時間、および１６８時間の時点で上澄み液を収集し、補充した。収集した上澄み液を直ちに急速冷凍し、さらなる使用まで－８０℃で保管した。ヒトβ－ＮＧＦ用のＥＬＩＳＡ（ＲａｙＢｉｏｔｅｃｈ）を製造業者の説明書に従って行い、毎日の放出量を既存の検量線により計算した。
マイクロロッドアリコート約１００，０００（１００ｋ）個を１ｍｇ／ｍＬ組換えヒトβ－ＮＧＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）２０μＬに再懸濁させることで凍結乾燥９０％ ＰＥＧＤＭＡマイクロロッドに添加した。添加後、マイクロロッドをＰＢＳで穏やかに３回リンスした。次にＰＥＧＤＭＡマイクロロッドをさらに分割し、試料は１６ｋマイクロロッド／マイクロチューブのＰＢＳ（ｐＨ７．４）２５０μＬ懸濁液で構成された。試料をインキュベーター（３７℃）内のオービタルシェーカー（１００ＲＰＭ）に置いた。ＰＥＧＤＭＡマイクロロッドを穏やかに遠心沈殿させ、６時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１２０時間、１４４時間、および１６８時間の時点で上澄み液を収集し、補充した。収集した上澄み液を直ちに急速冷凍し、さらなる使用まで－８０℃で保管した。ヒトβ－ＮＧＦ用のＥＬＩＳＡ（ＲａｙＢｉｏｔｅｃｈ）を製造業者の説明書に従って行い、毎日の放出量を既存の検量線により計算した。
【0165】
ＮＧＦＲ１００Ｗ溶出ＰＥＧＤＭＡマイクロロッドのインビボでの治療効能の確定
脛骨骨折および骨折仮骨組成：この系の前臨床的検証のために、強力な軟骨内骨化を促進するマウス脛骨骨折モデルを利用し（Ｈｕら、２０１７年、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １４４：２２１～２３４頁；Ｌｅら、２００１年、Ｊ ｏｒｔｈｏｐａｅｄ ｒｅｓ １９：７８～８４頁；Ｌｕら、２００６，Ｔｈｅ Ｉｏｗａ ｏｒｔｈｏｐａｅｄｉｃ ｊｏｕｒｎａｌ ２６：１７～２６頁）、１０～１４週齢のＣ５７Ｂｌ６／Ｊ野生型マウスに対して３点骨折装置を使用して右脛骨の中央軸に閉鎖骨折を作り出す。４つの処置群は（１）ＤＭＥＭ、（２）ＤＭＥＭ中ＮＧＦＲ１００Ｗ、（３）ＤＭＥＭ中マイクロロッド、および（４）ＤＭＥＭ中ＮＧＦＲ１００Ｗ添加マイクロロッドとする。ＮＧＦ投与が骨折の７日後から修復の軟骨期に最も有効であることを予備データが示したことから、処置薬を骨折の７日後に骨折仮骨に１回経皮注射する。骨折の１４日後、２１日後、および２８日後に組織を機能評価のために採取する（ｎ＝１０／時間／群、合計ｎ＝１２０）。骨折仮骨組成を立体解析学的解析により定量化する。簡潔に言えば、仮骨を４％パラホルムアルデヒド中に固定し、１９％ ＥＤＴＡ中で２週間脱灰し、パラフィン包埋のために処理する。一連の切片（１０μｍ）をスライドに装着し、Ｈａｌｌ－Ｂｒｕｎｔ四重染色（ＨＢＱ）で染色する。組織を自動Ｏｌｙｍｐｕｓ ＣａｓｔシステムおよびＶｉｓｏｐｈａｒｍソフトウェアを使用して定量化する。
脛骨骨折および骨折仮骨組成：この系の前臨床的検証のために、強力な軟骨内骨化を促進するマウス脛骨骨折モデルを利用し（Ｈｕら、２０１７年、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １４４：２２１～２３４頁；Ｌｅら、２００１年、Ｊ ｏｒｔｈｏｐａｅｄ ｒｅｓ １９：７８～８４頁；Ｌｕら、２００６，Ｔｈｅ Ｉｏｗａ ｏｒｔｈｏｐａｅｄｉｃ ｊｏｕｒｎａｌ ２６：１７～２６頁）、１０～１４週齢のＣ５７Ｂｌ６／Ｊ野生型マウスに対して３点骨折装置を使用して右脛骨の中央軸に閉鎖骨折を作り出す。４つの処置群は（１）ＤＭＥＭ、（２）ＤＭＥＭ中ＮＧＦＲ１００Ｗ、（３）ＤＭＥＭ中マイクロロッド、および（４）ＤＭＥＭ中ＮＧＦＲ１００Ｗ添加マイクロロッドとする。ＮＧＦ投与が骨折の７日後から修復の軟骨期に最も有効であることを予備データが示したことから、処置薬を骨折の７日後に骨折仮骨に１回経皮注射する。骨折の１４日後、２１日後、および２８日後に組織を機能評価のために採取する（ｎ＝１０／時間／群、合計ｎ＝１２０）。骨折仮骨組成を立体解析学的解析により定量化する。簡潔に言えば、仮骨を４％パラホルムアルデヒド中に固定し、１９％ ＥＤＴＡ中で２週間脱灰し、パラフィン包埋のために処理する。一連の切片（１０μｍ）をスライドに装着し、Ｈａｌｌ－Ｂｒｕｎｔ四重染色（ＨＢＱ）で染色する。組織を自動Ｏｌｙｍｐｕｓ ＣａｓｔシステムおよびＶｉｓｏｐｈａｒｍソフトウェアを使用して定量化する。
【0166】
マウス脛骨骨折モデル
試験をＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓから得たＣ５７ＢＬ６／Ｊ野生型系統（ストック＃０００６６４）について行った。簡潔に言えば、成体（１０～１６週齢）雄マウスを吸入イソフルランで麻酔し、３点曲げ骨折装置によって脛骨の中央骨幹に不安定型閉鎖骨折を作り出した（Ｂａｈｎｅｙら、２０１４年、Ｊ Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒａｌ Ｒｅｓ ｄｏｉ：１０．１００２／ｊｂｍｒ．２１４８）。この方法が強力な軟骨内修復を促進することから、骨折は不安定型とした。骨折が作り出された後、動物に術後鎮痛薬（ブプレノルフィン持続放出）を与えた。動物を社会的に収容し、自由に動き回らせた。
試験をＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓから得たＣ５７ＢＬ６／Ｊ野生型系統（ストック＃０００６６４）について行った。簡潔に言えば、成体（１０～１６週齢）雄マウスを吸入イソフルランで麻酔し、３点曲げ骨折装置によって脛骨の中央骨幹に不安定型閉鎖骨折を作り出した（Ｂａｈｎｅｙら、２０１４年、Ｊ Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒａｌ Ｒｅｓ ｄｏｉ：１０．１００２／ｊｂｍｒ．２１４８）。この方法が強力な軟骨内修復を促進することから、骨折は不安定型とした。骨折が作り出された後、動物に術後鎮痛薬（ブプレノルフィン持続放出）を与えた。動物を社会的に収容し、自由に動き回らせた。
【0167】
局所注射
骨折の７日後にマウスの脛骨骨折仮骨に経皮注射液を投与した。正確なマイクロリットルＨａｍｉｌｔｏｎ（商標）シリンジをすべての注射に使用し、ここでは実験剤をＰＢＳ ２０μＬに入れて注射した。実験群は以下の通りである：滅菌ＰＢＳを注射した対照、ＰＢＳ中β－ＮＧＦ ５００ｎｇを注射したβ－ＮＧＦ群、ＰＢＳ中ＰＥＧＤＭＡマイクロロッド１６，０００個を注射した無添加マイクロロッド群、およびβ－ＮＧＦ １８ｎｇを添加したＰＥＧＤＭＡマイクロロッド１６，０００個を注射したβ－ＮＧＦマイクロロッド群。
骨折の７日後にマウスの脛骨骨折仮骨に経皮注射液を投与した。正確なマイクロリットルＨａｍｉｌｔｏｎ（商標）シリンジをすべての注射に使用し、ここでは実験剤をＰＢＳ ２０μＬに入れて注射した。実験群は以下の通りである：滅菌ＰＢＳを注射した対照、ＰＢＳ中β－ＮＧＦ ５００ｎｇを注射したβ－ＮＧＦ群、ＰＢＳ中ＰＥＧＤＭＡマイクロロッド１６，０００個を注射した無添加マイクロロッド群、およびβ－ＮＧＦ １８ｎｇを添加したＰＥＧＤＭＡマイクロロッド１６，０００個を注射したβ－ＮＧＦマイクロロッド群。
【0168】
生体力学試験およびμＣＴ解析
立体解析学的結果に基づいて骨折治癒の結果の包括的分析を得るために、仮骨骨折の最大差を伴う時点を選択することで、生体力学強度試験およびμＣＴ解析を含むパイロット試験を完了する（おそらく骨折の１４日後または２１日後、ｎ＝１０／群、合計ｎ＝４０）。これらの試料では、脛骨を採取し、７０％エタノールに移して、骨密度（ＢＭＤ）および骨量（ＢＶ）を確定するためのＵＣＳＦ Ｓｋｅｌｅｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｅ（「ＳＢＢ」）内のＳｃａｎｃｏ μＣＴ５０スキャナでのμＣＴ解析に供する。続いて試料をＣＣＭＢＭ Ｓｋｅｌｅｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｂｉｏｍｅｃｈａｎｉｃｓ Ｃｏｒｅに移して３点曲げに供する（Ｂｏｓｅ Ｃｏｒｐ．、米国ミネソタ州Ｅｄｅｎ Ｐｒａｉｒｉｅ）。
立体解析学的結果に基づいて骨折治癒の結果の包括的分析を得るために、仮骨骨折の最大差を伴う時点を選択することで、生体力学強度試験およびμＣＴ解析を含むパイロット試験を完了する（おそらく骨折の１４日後または２１日後、ｎ＝１０／群、合計ｎ＝４０）。これらの試料では、脛骨を採取し、７０％エタノールに移して、骨密度（ＢＭＤ）および骨量（ＢＶ）を確定するためのＵＣＳＦ Ｓｋｅｌｅｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｅ（「ＳＢＢ」）内のＳｃａｎｃｏ μＣＴ５０スキャナでのμＣＴ解析に供する。続いて試料をＣＣＭＢＭ Ｓｋｅｌｅｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｂｉｏｍｅｃｈａｎｉｃｓ Ｃｏｒｅに移して３点曲げに供する（Ｂｏｓｅ Ｃｏｒｐ．、米国ミネソタ州Ｅｄｅｎ Ｐｒａｉｒｉｅ）。
【0169】
マイクロコンピュータ断層撮影（μＣＴ）
μＣＴ解析を既に記載のように行った（Ｃｈｅｎｇら、２０２０年、Ｊ Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒａｌ Ｒｅｓ ｄｏｉ：１０．１００２／ｊｂｍｒ．３８６４；Ｈｕら、２０１７年、Ｄｅｖ （Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ）１４４（２）：２２１～２３４頁）。骨折脛骨を骨折の１４日後に付着筋肉なしで切除し、４％ ＰＦＡ中に固定し、７０％エタノール中で保管した。骨折仮骨をＵＣＳＦ Ｃｏｒｅ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｍｕｓｃｕｌｏｓｋｅｌｅｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＣＣＭＢＭ、ＮＩＨ Ｐ３０ 資金拠出コア）においてＳｃａｎｃｏ μＣＴ５０スキャナ（Ｓｃａｎｃｏ Ｍｅｄｉｃａｌ ＡＧ、スイスＢａｓｓｅｒｄｏｒｆ）をボクセルサイズ１０μｍならびにＸ線エネルギー５５ｋＶｐおよび１０９μＡで使用して解析した。対照マウスおよび処置マウスの試験において軟部組織から総石灰化骨基質をセグメント化するために、比較的低い排除閾値の４００ｍｇヒドロキシアパタイト（ＨＡ）／ｍｍ３を適用した。線状減衰をＳｃａｎｃｏヒドロキシアパタイトファントムを使用して較正した。関心対象領域（ＲＯＩ）は、解剖学的位置およびはるかに高い骨塩量によって明確に識別される既存の皮質を伴わない、仮骨全体を含んだ。μＣＴ再構築および定量的解析を行って以下の構造パラメータを得た：骨量分率（骨量／総量％）、骨梁分岐としての骨梁連結性密度（＃／ｍｍ３）、および骨塩量（ｍｇ ＨＡ／ｃｍ３）。
μＣＴ解析を既に記載のように行った（Ｃｈｅｎｇら、２０２０年、Ｊ Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒａｌ Ｒｅｓ ｄｏｉ：１０．１００２／ｊｂｍｒ．３８６４；Ｈｕら、２０１７年、Ｄｅｖ （Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ）１４４（２）：２２１～２３４頁）。骨折脛骨を骨折の１４日後に付着筋肉なしで切除し、４％ ＰＦＡ中に固定し、７０％エタノール中で保管した。骨折仮骨をＵＣＳＦ Ｃｏｒｅ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｍｕｓｃｕｌｏｓｋｅｌｅｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＣＣＭＢＭ、ＮＩＨ Ｐ３０ 資金拠出コア）においてＳｃａｎｃｏ μＣＴ５０スキャナ（Ｓｃａｎｃｏ Ｍｅｄｉｃａｌ ＡＧ、スイスＢａｓｓｅｒｄｏｒｆ）をボクセルサイズ１０μｍならびにＸ線エネルギー５５ｋＶｐおよび１０９μＡで使用して解析した。対照マウスおよび処置マウスの試験において軟部組織から総石灰化骨基質をセグメント化するために、比較的低い排除閾値の４００ｍｇヒドロキシアパタイト（ＨＡ）／ｍｍ３を適用した。線状減衰をＳｃａｎｃｏヒドロキシアパタイトファントムを使用して較正した。関心対象領域（ＲＯＩ）は、解剖学的位置およびはるかに高い骨塩量によって明確に識別される既存の皮質を伴わない、仮骨全体を含んだ。μＣＴ再構築および定量的解析を行って以下の構造パラメータを得た：骨量分率（骨量／総量％）、骨梁分岐としての骨梁連結性密度（＃／ｍｍ３）、および骨塩量（ｍｇ ＨＡ／ｃｍ３）。
【0170】
局在化組織診断
骨折の１２日後、１４日後、および２１日後（マイクロロッドの注射の５日後、７日後、および１４日後）に脛骨を採取してマイクロロッドの局在化を観察した。収集時に、脛骨を４％ ＰＦＡ中に固定し、１９％ ＥＤＴＡ中、４℃で１４日間脱灰し、揺動および溶解を隔日で交互に行った。脛骨をパラフィン包埋のために処理し、一連の切片を１０μｍで切断し（スライド１個当たり切片３個）、ＰＥＧＤＭＡマイクロロッドを局在化することに関して既に記載のように（Ｒｉｖｅｒａら、２０２０年、Ｓｃｉ Ｒｅｐｏｒｔｓ １０：２２２４１；Ｈｕら、２０１７年、Ｄｅｖ （Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ）１４４（２）：２２１～２３４頁）、Ｈａｌｌ－Ｂｒｕｎｄｔ四重染色（ＨＢＱ）プロトコルを行って骨（赤色）および軟骨（青色）を可視化した。切片をＰｅｒｍｏｕｎｔ（商標）装着媒体によってスライドに装着し、明視野画像をＬｅｉｃａ ＤＭＲＢ顕微鏡で捕捉した。
骨折の１２日後、１４日後、および２１日後（マイクロロッドの注射の５日後、７日後、および１４日後）に脛骨を採取してマイクロロッドの局在化を観察した。収集時に、脛骨を４％ ＰＦＡ中に固定し、１９％ ＥＤＴＡ中、４℃で１４日間脱灰し、揺動および溶解を隔日で交互に行った。脛骨をパラフィン包埋のために処理し、一連の切片を１０μｍで切断し（スライド１個当たり切片３個）、ＰＥＧＤＭＡマイクロロッドを局在化することに関して既に記載のように（Ｒｉｖｅｒａら、２０２０年、Ｓｃｉ Ｒｅｐｏｒｔｓ １０：２２２４１；Ｈｕら、２０１７年、Ｄｅｖ （Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ）１４４（２）：２２１～２３４頁）、Ｈａｌｌ－Ｂｒｕｎｄｔ四重染色（ＨＢＱ）プロトコルを行って骨（赤色）および軟骨（青色）を可視化した。切片をＰｅｒｍｏｕｎｔ（商標）装着媒体によってスライドに装着し、明視野画像をＬｅｉｃａ ＤＭＲＢ顕微鏡で捕捉した。
【0171】
組織形態計測
骨折の１４日後に採取された脛骨の定量的組織形態計測を使用して骨折仮骨組成を確定した。各切片を３００μｍ間隔とした１０番毎のスライドからの第１の切片を使用して、組織形態計測的解析の標準的原理を利用することで骨折仮骨中の骨分率および軟骨分率を定量化した。Ｎｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｎｉ－Ｕ顕微鏡をＮｉｋｏｎ ＮＩＳ Ｂａｓｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｅｌｅｍｅｎｔｓソフトウェアバージョン４．３０と共に使用して画像を捕捉した。Ｆｉｊｉ ＩｍａｇｅＪ（バージョン１．５１．２３；ＮＩＨ、米国メリーランド）５０中でＴｒａｉｎａｂｌｅ Ｗｅｋａ Ｓｅｇｍｅｎｔａｔｉｏｎアドオンを使用して仮骨組成（軟骨、骨、線維組織、バックグラウンド）の定量化を確定した。全体に対する個々の組成を合計することで、特定の組織型の量を骨折仮骨全体に関して確定した。
骨折の１４日後に採取された脛骨の定量的組織形態計測を使用して骨折仮骨組成を確定した。各切片を３００μｍ間隔とした１０番毎のスライドからの第１の切片を使用して、組織形態計測的解析の標準的原理を利用することで骨折仮骨中の骨分率および軟骨分率を定量化した。Ｎｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｎｉ－Ｕ顕微鏡をＮｉｋｏｎ ＮＩＳ Ｂａｓｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｅｌｅｍｅｎｔｓソフトウェアバージョン４．３０と共に使用して画像を捕捉した。Ｆｉｊｉ ＩｍａｇｅＪ（バージョン１．５１．２３；ＮＩＨ、米国メリーランド）５０中でＴｒａｉｎａｂｌｅ Ｗｅｋａ Ｓｅｇｍｅｎｔａｔｉｏｎアドオンを使用して仮骨組成（軟骨、骨、線維組織、バックグラウンド）の定量化を確定した。全体に対する個々の組成を合計することで、特定の組織型の量を骨折仮骨全体に関して確定した。
【0172】
統計解析
グラフ上の個々のドットは生物学的複製を表し、エラーバーは平均値の標準誤差（ＳＥＭ）を表す。測定値を別々の試料から取得した。データをＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（バージョン８、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、カリフォルニア州サンジエゴ）を使用して解析した。ＡＮＯＶＡを使用して複数群間の統計差を確定した後、チューキーＨＳＤ事後比較試験を行った。統計差はｐ＜０．０５で確定した。
グラフ上の個々のドットは生物学的複製を表し、エラーバーは平均値の標準誤差（ＳＥＭ）を表す。測定値を別々の試料から取得した。データをＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（バージョン８、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、カリフォルニア州サンジエゴ）を使用して解析した。ＡＮＯＶＡを使用して複数群間の統計差を確定した後、チューキーＨＳＤ事後比較試験を行った。統計差はｐ＜０．０５で確定した。
【0173】
結果
４．１ フォトリソグラフィーによる注射用ＰＥＧＤＭＡマイクロロッド作製
先に言及したように、ＰＥＧＤＭＡマイクロロッドをフォトリソグラフィーのプロセスを通じて作製する（図１３）。ＰＥＧＤＭＡマイクロロッドの正確な寸法はフォトマスクによって慎重に制御可能である（長さおよび幅）。マイクロロッドの高さを、シリコンウェハと、マスクアライナーの使用によって手動で制御されるフォトマスクとの間の距離によって確定する。次にＰＥＧＤＭＡマイクロロッドを紫外線照射により架橋させ、セルスクレーパーによってシリコンウェハから剥離し、収集する。個々の各ＰＥＧＤＭＡマイクロロッドは以下の寸法を有した：Ｈ＝１５μｍ、Ｗ＝１５μｍ、Ｌ＝１００μｍ。各７５０ＭＷ ＰＥＧモノマー単位の各末端におけるメタクリレート基のフリーラジカル鎖光重合を通じてマイクロロッドの３Ｄ構造を形成する。この系によって、高度に均一なＰＥＧＤＭＡマイクロロッドを製造するための高スループット方法が得られる。
４．１ フォトリソグラフィーによる注射用ＰＥＧＤＭＡマイクロロッド作製
先に言及したように、ＰＥＧＤＭＡマイクロロッドをフォトリソグラフィーのプロセスを通じて作製する（図１３）。ＰＥＧＤＭＡマイクロロッドの正確な寸法はフォトマスクによって慎重に制御可能である（長さおよび幅）。マイクロロッドの高さを、シリコンウェハと、マスクアライナーの使用によって手動で制御されるフォトマスクとの間の距離によって確定する。次にＰＥＧＤＭＡマイクロロッドを紫外線照射により架橋させ、セルスクレーパーによってシリコンウェハから剥離し、収集する。個々の各ＰＥＧＤＭＡマイクロロッドは以下の寸法を有した：Ｈ＝１５μｍ、Ｗ＝１５μｍ、Ｌ＝１００μｍ。各７５０ＭＷ ＰＥＧモノマー単位の各末端におけるメタクリレート基のフリーラジカル鎖光重合を通じてマイクロロッドの３Ｄ構造を形成する。この系によって、高度に均一なＰＥＧＤＭＡマイクロロッドを製造するための高スループット方法が得られる。
【0174】
４．２ ＰＥＧＤＭＡマイクロロッドのマクロマー濃度はタンパク質添加効率を変化させる
第１の目的はＰＥＧＤＭＡマイクロロッドのポリマー網目構造の密度を調整することでタンパク質添加効率を最大化させることにあった。フォトリソグラフィーの前に、ＰＥＧＤＭＡマクロマー濃度を低度（２５％）、中程度（７５％）、または高度（９０％）の体積（ｖ／ｖ）量を含むように調整した（図１４Ａ）。作製後、ＰＥＧＤＭＡマイクロロッドを凍結乾燥させて、タンパク質添加を変化させる可能性があるすべての残留液体を除去した後、その分子量がβ－ＮＧＦの分子量（２６ｋＤａ）と同様であることから、α－キモトリプシノーゲンＡを代理タンパク質として添加した。低度および中程度のマクロマー量のＰＥＧＤＭＡマイクロロッドはそれぞれ５％未満および１５％未満という中程度の添加効率を示した。高マクロマー量のＰＥＧＤＭＡマイクロロッドは、他のＰＥＧＤＭＡ濃度に比べて有意に大きい３０％超という添加効率を示した。９０％ ＰＥＧＤＭＡ（ｖ／ｖ）マイクロロッドが最良の添加効率を示したことから、この製剤をすべての後続の実験のために選択した。次に高マクロマーＰＥＧＤＭＡマイクロロッドにβ－ＮＧＦを添加することでβ－ＮＧＦ添加効率を確認したところ、４０％超の添加効率が得られた（図１４Ｄ）。一般的に使用されている核対比染色であるＤＡＰＩは、ＰＥＧＤＭＡマイクロロッドに容易に吸収されて蛍光顕微鏡法で可視化されることが可能である（図１４Ｂ）。ＤＡＰＩ染色マイクロロッドはサイズが均一であり、凝集を示さない。これは、いっそう最適なタンパク質添加を可能にする良好な分散性を示すものである。タンパク質添加が物理吸着を動因とすることを考慮して、マイクロロッドでのタンパク質の吸収、および添加後にタンパク質溶出が生じる速度を定量的に調査した。ＦＩＴＣ－ＢＳＡをモデルタンパク質として使用して、ＰＥＧＤＭＡマイクロロッドの表層を蛍光タグ化タンパク質でコーティングする。ゼロ時点での拡散はない（図１４Ｃ、上部）。６０分間のインキュベーション後、拡散が劇的に増加して、ＦＩＴＣ－ＢＳＡがＰＥＧＤＭＡマイクロロッドの周囲空間に溶出することが観察可能になる（図１４Ｃ、下部）。
第１の目的はＰＥＧＤＭＡマイクロロッドのポリマー網目構造の密度を調整することでタンパク質添加効率を最大化させることにあった。フォトリソグラフィーの前に、ＰＥＧＤＭＡマクロマー濃度を低度（２５％）、中程度（７５％）、または高度（９０％）の体積（ｖ／ｖ）量を含むように調整した（図１４Ａ）。作製後、ＰＥＧＤＭＡマイクロロッドを凍結乾燥させて、タンパク質添加を変化させる可能性があるすべての残留液体を除去した後、その分子量がβ－ＮＧＦの分子量（２６ｋＤａ）と同様であることから、α－キモトリプシノーゲンＡを代理タンパク質として添加した。低度および中程度のマクロマー量のＰＥＧＤＭＡマイクロロッドはそれぞれ５％未満および１５％未満という中程度の添加効率を示した。高マクロマー量のＰＥＧＤＭＡマイクロロッドは、他のＰＥＧＤＭＡ濃度に比べて有意に大きい３０％超という添加効率を示した。９０％ ＰＥＧＤＭＡ（ｖ／ｖ）マイクロロッドが最良の添加効率を示したことから、この製剤をすべての後続の実験のために選択した。次に高マクロマーＰＥＧＤＭＡマイクロロッドにβ－ＮＧＦを添加することでβ－ＮＧＦ添加効率を確認したところ、４０％超の添加効率が得られた（図１４Ｄ）。一般的に使用されている核対比染色であるＤＡＰＩは、ＰＥＧＤＭＡマイクロロッドに容易に吸収されて蛍光顕微鏡法で可視化されることが可能である（図１４Ｂ）。ＤＡＰＩ染色マイクロロッドはサイズが均一であり、凝集を示さない。これは、いっそう最適なタンパク質添加を可能にする良好な分散性を示すものである。タンパク質添加が物理吸着を動因とすることを考慮して、マイクロロッドでのタンパク質の吸収、および添加後にタンパク質溶出が生じる速度を定量的に調査した。ＦＩＴＣ－ＢＳＡをモデルタンパク質として使用して、ＰＥＧＤＭＡマイクロロッドの表層を蛍光タグ化タンパク質でコーティングする。ゼロ時点での拡散はない（図１４Ｃ、上部）。６０分間のインキュベーション後、拡散が劇的に増加して、ＦＩＴＣ－ＢＳＡがＰＥＧＤＭＡマイクロロッドの周囲空間に溶出することが観察可能になる（図１４Ｃ、下部）。
【0175】
４．３ β－ＮＧＦの生物活性保持およびＰＥＧＭＤＡマイクロロッドからの持続放出
次に、β－ＮＧＦがＰＥＧＭＤＡマイクロロッドから放出される際に生物活性を保持するか否かを試験した。これを行うために、赤白血病Ｔｒｋ－Ａ発現細胞株ＴＦ－１を培地（対照）、可溶性β－ＮＧＦ ２０００ｎｇ、無添加マイクロロッド、またはβ－ＮＧＦ １８ｎｇを添加した１６，０００個のＰＥＧＤＭＡマイクロロッドの存在下で利用した（図１５Ａ）。４日間の培養後に、β－ＮＧＦマイクロロッドからの持続放出が他の処理群に比べてＴＦ－１細胞の増殖を増加させると仮定した。可溶性ＮＧＦ処理細胞は対照に対して２倍の増殖増加を示した。無添加マイクロロッドも可溶性ＮＧＦ処理細胞と同様の増殖増加を示した。しかし、β－ＮＧＦマイクロロッドによる統計的に有意な４倍の増殖増加によって、仮説が裏付けられた。増殖増加は、１６８時間（７日間）にわたって観察されたβ－ＮＧＦの持続放出に起因する可能性がある（図１５Ｂ、図１５Ｃ）。ＥＬＩＳＡにより測定されたように（図１５Ｂ）、β－ＮＧＦマイクロロッドは最初の２４～４８時間以内のβ－ＮＧＦの初期バースト放出、続いて次の１２０時間（２～７日目）にわたる持続放出を示した。溶出β－ＮＧＦの総一日量は経時的に減少した。これはＰＥＧＤＭＡマイクロロッドからの濃度依存的な（一次）放出動態を示す。にもかかわらず、β－ＮＧＦの溶出が７日間（１６８時間）にわたって検出および定量化された（図１５Ｃ）。
次に、β－ＮＧＦがＰＥＧＭＤＡマイクロロッドから放出される際に生物活性を保持するか否かを試験した。これを行うために、赤白血病Ｔｒｋ－Ａ発現細胞株ＴＦ－１を培地（対照）、可溶性β－ＮＧＦ ２０００ｎｇ、無添加マイクロロッド、またはβ－ＮＧＦ １８ｎｇを添加した１６，０００個のＰＥＧＤＭＡマイクロロッドの存在下で利用した（図１５Ａ）。４日間の培養後に、β－ＮＧＦマイクロロッドからの持続放出が他の処理群に比べてＴＦ－１細胞の増殖を増加させると仮定した。可溶性ＮＧＦ処理細胞は対照に対して２倍の増殖増加を示した。無添加マイクロロッドも可溶性ＮＧＦ処理細胞と同様の増殖増加を示した。しかし、β－ＮＧＦマイクロロッドによる統計的に有意な４倍の増殖増加によって、仮説が裏付けられた。増殖増加は、１６８時間（７日間）にわたって観察されたβ－ＮＧＦの持続放出に起因する可能性がある（図１５Ｂ、図１５Ｃ）。ＥＬＩＳＡにより測定されたように（図１５Ｂ）、β－ＮＧＦマイクロロッドは最初の２４～４８時間以内のβ－ＮＧＦの初期バースト放出、続いて次の１２０時間（２～７日目）にわたる持続放出を示した。溶出β－ＮＧＦの総一日量は経時的に減少した。これはＰＥＧＤＭＡマイクロロッドからの濃度依存的な（一次）放出動態を示す。にもかかわらず、β－ＮＧＦの溶出が７日間（１６８時間）にわたって検出および定量化された（図１５Ｃ）。
【0176】
４．４ β－ＮＧＦ添加ＰＥＧＤＭＡマイクロロッドは軟骨内骨形成を促進する
これまでのデータは、ＰＥＧＤＭＡマイクロロッドにβ－ＮＧＦを添加可能であり、β－ＮＧＦが生物活性を示し、７日間にわたって放出されることを示している。これらの知見を考慮して、β－ＮＧＦ添加ＰＥＧＤＭＡマイクロロッドの持続放出により軟骨内骨折修復を促進することができると仮定された。この仮説を試験するために、成体野生型マウスの右脛骨に中央軸閉鎖骨折が作り出された長管骨治癒のマウスモデルを利用した（図１６Ｆ、図１６Ｇ）。これらの不安定型骨折は強力な軟骨内修復を刺激することが既に示されている（Ｂａｈｎｅｙら、２０１４年、Ｊ Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒａｌ Ｒｅｓ ２９（５））。以前の試験によれば、ＮＧＦは、損傷の７日後、骨治癒の軟骨期に送達される際に、骨折治癒を促進する上で最も有効であった。（Ｒｉｖｅｒａら、２０２０年、Ｓｃｉ Ｒｅｐｏｒｔｓ １０：２２２４１）。したがって、ＰＥＧＤＭＡマイクロロッドを損傷の７日後にＨａｍｉｌｔｏｎシリンジを使用して骨折部位に直接経皮送達した。最初に、Ｈａｌｌ Ｂｒｕｎｔ四重染色（ＨＢＱ）（軟骨＝青色、骨＝赤色）によって可視化されるように、生理食塩水（軽く青色に染色）２０μＬに懸濁したマイクロロッド１６，０００個が、骨折仮骨に有効に送達されたことが示され（図１６Ａ～図１６Ｄ）、１４日間の修復期間全体にわたってなお局在化していた（図１６Ｃ～図１６Ｅ）。
これまでのデータは、ＰＥＧＤＭＡマイクロロッドにβ－ＮＧＦを添加可能であり、β－ＮＧＦが生物活性を示し、７日間にわたって放出されることを示している。これらの知見を考慮して、β－ＮＧＦ添加ＰＥＧＤＭＡマイクロロッドの持続放出により軟骨内骨折修復を促進することができると仮定された。この仮説を試験するために、成体野生型マウスの右脛骨に中央軸閉鎖骨折が作り出された長管骨治癒のマウスモデルを利用した（図１６Ｆ、図１６Ｇ）。これらの不安定型骨折は強力な軟骨内修復を刺激することが既に示されている（Ｂａｈｎｅｙら、２０１４年、Ｊ Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒａｌ Ｒｅｓ ２９（５））。以前の試験によれば、ＮＧＦは、損傷の７日後、骨治癒の軟骨期に送達される際に、骨折治癒を促進する上で最も有効であった。（Ｒｉｖｅｒａら、２０２０年、Ｓｃｉ Ｒｅｐｏｒｔｓ １０：２２２４１）。したがって、ＰＥＧＤＭＡマイクロロッドを損傷の７日後にＨａｍｉｌｔｏｎシリンジを使用して骨折部位に直接経皮送達した。最初に、Ｈａｌｌ Ｂｒｕｎｔ四重染色（ＨＢＱ）（軟骨＝青色、骨＝赤色）によって可視化されるように、生理食塩水（軽く青色に染色）２０μＬに懸濁したマイクロロッド１６，０００個が、骨折仮骨に有効に送達されたことが示され（図１６Ａ～図１６Ｄ）、１４日間の修復期間全体にわたってなお局在化していた（図１６Ｃ～図１６Ｅ）。
【0177】
β－ＮＧＦの有効性を評価するために、β－ＮＧＦ １８ｎｇを含むマイクロロッド１６，０００個を骨折仮骨に注射した。比較のために、さらなるマウスを３つの実験群（注射群）に分けた：骨折仮骨に生理食塩水２０μＬ、単回量のβ－ＮＧＦ（２０００ｎｇ）、または無添加ＰＥＧＤＭＡマイクロロッドを皮下注射した。すべての経皮注射液を骨折の７日後に投与し、７日間治癒させ（骨折の１４日後）、その時点で仮骨を採取して、骨折仮骨内の石灰化組織を定量化しかつ骨組織微小構造を解析するためのマイクロコンピュータ断層撮影（μＣＴ）解析に供した。画像の肉眼検査によれば、β－ＮＧＦマイクロロッド群はすべての他の群に比べて大きく、また強固になった仮骨を示すようであった（図１７Ａ～１７Ｄ）。骨量分率（ＢＦＶ）の定量化により、β－ＮＧＦマイクロロッド群における最高のＢＶＦ、および生理食塩水対照に比べて有意に高いＢＶＦ（約５２％増加）が確認された（図１７Ｅ）。さらに、β－ＮＧＦマイクロロッドで処置された骨折において、いっそう成熟した骨折仮骨が生じた。β－ＮＧＦマイクロロッド処置は、生理食塩水対照に比べて骨梁分岐（ＴＢ）を有意に増加させ（約９５％の増加）、骨塩量（ＢＭＤ）を有意に増加させた（約３４％の増加）（図１７Ｆ、図１７Ｇ）。骨折仮骨内の骨梁骨のマイクロＣＴ解析を図１７Ｈ～図１７Ｊにさらに示す。興味深いことに、可溶性β－ＮＧＦは骨形成をβ－ＮＧＦマイクロロッドと同程度には改善せず、生理食塩水対照とは統計的に差がなかった。統計的に差はないものの、無添加マイクロロッドは可溶性ＮＧＦ処置群および生理食塩水処置群に比べて多い量のＢＶＦ、ＴＢ、およびＢＭＤを示す。
【0178】
４．５ Ｂ－ＮＧＦ添加ＰＥＧＤＭＡマイクロロッドは骨折仮骨中の軟骨組織量を減少させる
μＣＴにより認められた差をいっそう詳しい組織レベルで理解するために、定量的組織診断を使用して骨折仮骨内の軟骨分率および骨分率を識別した。骨折の１４日後に採取されてＨＢＱ（軟骨＝青色、骨＝赤色）で染色された脛骨切片の組織学的画像は、β－ＮＧＦマイクロロッドが最高の骨量を示すことを視覚的に示す（図１８Ａ～図１８Ｄ）。生理食塩水で処置された骨折仮骨は、他の処置群に比べて高い軟骨量を仮骨の組成パーセント（３２±２％）として示し、最低の骨量を組成パーセント（６７±２％）として示した。これは治癒が最も進行していないことを示すものである（図１８Ａ～図１８Ｆ）。高倍率画像によって骨折仮骨中の軟骨細胞の割合が大きいことが確認される。これは骨折が軟骨内修復における軟骨から骨への移行期に近づいているのみであることを示唆している（図１８Ａ）。空のマイクロロッドで処置された骨折仮骨では、ほぼ同一の結果が観察され、軟骨量および骨量はそれぞれ３２±２．７％および６８±２．７％であった（図１８Ｃ、図１８Ｅ、および図１８Ｆ）。可溶性ＮＧＦで処置された骨折仮骨では、空のマイクロロッドおよび未処置対照に比べて骨量が僅かに上昇し（７１±３．２％）、軟骨量が低下した（２９±３．２％）が、この効果は統計的に差がなかった。β－ＮＧＦ添加マイクロロッドが、骨折仮骨組成を有意に変化させて強固な骨形成（７９±３％）を生じさせた唯一の処置群であった（図１８Ｄおよび図１８Ｆ）。また、β－ＮＧＦマイクロロッド処置試料は、生理食塩水対照に比べて有意な軟骨の視覚的減少および統計的に異なる軟骨量（２１±３％）を示す（図１８Ｄ、図１８Ｅ）。骨折仮骨の組織形態計測的解析を図１８Ｇ～図１８Ｊに示す。
μＣＴにより認められた差をいっそう詳しい組織レベルで理解するために、定量的組織診断を使用して骨折仮骨内の軟骨分率および骨分率を識別した。骨折の１４日後に採取されてＨＢＱ（軟骨＝青色、骨＝赤色）で染色された脛骨切片の組織学的画像は、β－ＮＧＦマイクロロッドが最高の骨量を示すことを視覚的に示す（図１８Ａ～図１８Ｄ）。生理食塩水で処置された骨折仮骨は、他の処置群に比べて高い軟骨量を仮骨の組成パーセント（３２±２％）として示し、最低の骨量を組成パーセント（６７±２％）として示した。これは治癒が最も進行していないことを示すものである（図１８Ａ～図１８Ｆ）。高倍率画像によって骨折仮骨中の軟骨細胞の割合が大きいことが確認される。これは骨折が軟骨内修復における軟骨から骨への移行期に近づいているのみであることを示唆している（図１８Ａ）。空のマイクロロッドで処置された骨折仮骨では、ほぼ同一の結果が観察され、軟骨量および骨量はそれぞれ３２±２．７％および６８±２．７％であった（図１８Ｃ、図１８Ｅ、および図１８Ｆ）。可溶性ＮＧＦで処置された骨折仮骨では、空のマイクロロッドおよび未処置対照に比べて骨量が僅かに上昇し（７１±３．２％）、軟骨量が低下した（２９±３．２％）が、この効果は統計的に差がなかった。β－ＮＧＦ添加マイクロロッドが、骨折仮骨組成を有意に変化させて強固な骨形成（７９±３％）を生じさせた唯一の処置群であった（図１８Ｄおよび図１８Ｆ）。また、β－ＮＧＦマイクロロッド処置試料は、生理食塩水対照に比べて有意な軟骨の視覚的減少および統計的に異なる軟骨量（２１±３％）を示す（図１８Ｄ、図１８Ｅ）。骨折仮骨の組織形態計測的解析を図１８Ｇ～図１８Ｊに示す。
【0179】
したがって、毎日の注射に関する１００ｎｇ以上という閾値を下回る投与量で持続薬物放出を行うことにより、β－ＮＧＦ治療の痛覚過敏作用を最小化しながらその栄養的利点を平衡化することができる。反復投与を回避するために、ＰＥＧＤＭＡマイクロロッドを臨床的に適切な薬物送達プラットフォームとして使用した。ＰＥＧＤＭＡ微小粒子送達プラットフォームの大部分では球形粒子が骨修復用途に使用される（Ｓｏｎｎｅｔら ２０１３年 Ｊ Ｏｒｔｈｏｐａｅｄ Ｒｅｓ ３１：１５９７～１６０４頁；Ｓｔｕｋｅｌら、２０１５年、Ｊ Ｂｉｏｍｅｄ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ Ｒｅｓ Ｐａｒｔ Ａ １０３：６０４～６１３頁；Ｏｌａｂｉｓｉら、２０１０年、Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｐａｒｔ Ａ １６：３７２７～３７３６頁）。本試験では、高アスペクト比粒子が比較的長い滞留時間を示し、食作用または細胞内部移行を回避する傾向があるということを考慮して、骨折修復のための高アスペクト比マイクロロッドの使用が示される。本試験は、骨折修復にＰＥＧＤＭＡマイクロロッドを初めて使用するものである。
【0180】
フォトリソグラフィーを使用することで、ＰＥＧＤＭＡマイクロロッドを高スループットで製造することができる。さらに、９０％（ｖ／ｖ）ＰＥＧＤＭＡマクロマーを使用することで、ＰＥＧＤＭＡマイクロロッドに対するβ－ＮＧＦ添加量が増加した。最後に、顕微鏡写真によって、分子のサイズが小さいほどＰＥＧＤＭＡポリマーメッシュ網目構造を横切ってまたはその中に拡散しやすくなることが確認された。
【0181】
添加アッセイで１００，０００個が使用されたのに対し、１６，０００個のＰＥＧＤＭＡマイクロロッドで行われた（これは、１６，０００個のみが、インビボ実験に使用される２０μＬシリンジ中で有効に吸引可能であったからである）、ＴｒｋＡ発現ＴＦ－１細胞株を使用するインビトロ増殖アッセイで示されたように、添加β－ＮＧＦはその生物活性を保持した。マイクロロッド１００，０００個中に添加された総タンパク質の約３０～４０％が約１～２ｍｇであると計算された。したがって、最高計算値２μｇ（２０００ｎｇ）をマイクロロッド１６，０００個中に添加し、すべての並行実験についてそれを可溶性ＮＧＦ量として設定した。β－ＮＧＦタンパク質のうち一部は添加または溶出の間に本来の分子配置を失い、したがって生物活性を減少させることがある。にもかかわらず、生物活性β－ＮＧＦ １８ｎｇを含む１６，０００個のＰＥＧＤＭＡマイクロロッドは、おそらくは９６時間の実験期間にわたるβ－ＮＧＦの持続放出を動因とする、ＴＦ－１細胞増殖に対する強力な作用を示した。無添加ＰＥＧＤＭＡマイクロロッドと共に培養された細胞の増殖の僅かな増加も観察された。
【0182】
マウス骨折モデルにおいて軟骨内骨折修復の間にＰＥＧＤＭＡマイクロロッドの局在化を調査することで、注射の５日後および７日後の両方においてＰＥＧＤＭＡマイクロロッドを組織学的に局在化することが可能になった。しかし、ＰＥＧＤＭＡマイクロロッドは１４日後にはもはや目視できなかった。このことは、ＰＥＧＤＭＡマイクロロッドが経時的におそらく物理的に分解されることを示唆している。ＰＥＧＤＭＡマイクロロッドの分解産物は、既知の生体適合性および細胞無毒性に基づき、インビボでは関心対象とならない。また、効能試験では、ＰＥＧＤＭＡマイクロロッドが治療ペイロードを実現するために十分な長さで骨折仮骨に局在化されており、したがって、β－ＮＧＦの骨折仮骨注射における適用に好適であることが確認される。
【0183】
ＰＥＧＤＭＡマイクロロッドによるβ－ＮＧＦ送達の治療効能を、マウスにおける不安定型脛骨骨折、続いてμＣＴ解析および定量的組織形態計測を使用して確認した。軟骨量の減少、ならびに骨量分率（ＢＶＦ）、骨梁分岐（ＴＢ）、および骨塩量（ＢＭＤ）の統計的に有意な増加により証明されるように、β－ＮＧＦ添加マイクロロッドは軟骨内骨折修復を強化した。さらに、骨折仮骨内での織布状の骨形状および最小限の肥大軟骨細胞は、おそらくは遊離／注射β－ＮＧＦからの大量ボーラス投与ではなくＰＥＧＤＭＡマイクロロッドからのβ－ＮＧＦの持続放出を行ったことによる、持続放出型β－ＮＧＦ添加ＰＥＧＤＭＡマイクロロッドの注射後の仮骨形成への速やかな移行を示すものである。大量ボーラス投与はオフターゲット作用および毒性の危険性がある。
【0184】
ＰＥＧＤＭＡマイクロロッドが実現するβ－ＮＧＦの高度な局在化は、β－ＮＧＦの半減期を潜在的に延長したことに加えて、β－ＮＧＦ添加マイクロロッドで処置されるマウスにみられる強力な軟骨内骨折応答に相乗的に寄与した可能性がある。
【実施例5】
【0185】
ナノワイヤ
５．１ ナノワイヤ作製
機能化ナノワイヤの経皮注射による骨折へのＮＧＦＲ１００Ｗの持続局所送達のための臨床的に適切な薬物送達プラットフォームを試験する目的で、ＰＣＬナノワイヤを無痛ＮＧＦの親和性結合のためにヘパリンでコーティングした後、積層（ＬｂＬ）静電コーティングを使用して放出動態を調整する。ナノワイヤＮＧＦＲ１００Ｗの生物活性をインビトロで既存の生物増殖アッセイを使用して確認する。インビトロでの放出動態の最適化後、ＮＧＦＲ１００Ｗナノワイヤの効能を骨折した野生型または糖尿病マウスにおいて試験する。注射用ＮＧＦＲ１００Ｗナノワイヤは、ＮＧＦＲ１００Ｗの持続局所送達を通じて軟骨内修復を促進すると予想される。
５．１ ナノワイヤ作製
機能化ナノワイヤの経皮注射による骨折へのＮＧＦＲ１００Ｗの持続局所送達のための臨床的に適切な薬物送達プラットフォームを試験する目的で、ＰＣＬナノワイヤを無痛ＮＧＦの親和性結合のためにヘパリンでコーティングした後、積層（ＬｂＬ）静電コーティングを使用して放出動態を調整する。ナノワイヤＮＧＦＲ１００Ｗの生物活性をインビトロで既存の生物増殖アッセイを使用して確認する。インビトロでの放出動態の最適化後、ＮＧＦＲ１００Ｗナノワイヤの効能を骨折した野生型または糖尿病マウスにおいて試験する。注射用ＮＧＦＲ１００Ｗナノワイヤは、ＮＧＦＲ１００Ｗの持続局所送達を通じて軟骨内修復を促進すると予想される。
【0186】
ナノワイヤをナノテンプレート化技術を使用してポリカプロラクトン（ＰＣＬ）ポリマーから作製する（図１９）。ＰＣＬは生物医学的用途に関して明確な利点を示す。これは、該ポリマーが生分解性かつ非免疫原性であるからである。孔径が制御された陽極酸化アルミニウム（ＡＡＯ）基材をナノワイヤ形成のテンプレートとして使用する（Ｚａｍｅｃｎｉｋら、２０１７年、ＡＣＳ Ｎａｎｏ １１：１１４３３～１１４４０頁）。ＰＣＬフィルムをガラス基材に流延し、ＡＡＯテンプレートと接触させながら融点を超える温度に加熱する。これにより毛管作用を通じてＡＡＯ孔部中にナノワイヤが速やかに形成される。ポリマー材料のテンプレート化および冷却後、膜剥離および水酸化ナトリウムでの選択的ＡＡＯエッチングによってナノワイヤを浄化する。ナノワイヤの幅はＡＡＯ鋳型の孔径によって制御され、一方、ナノワイヤの長さはポリマーフィルムの厚さを変化させることで調整可能である。２～２０μｍの範囲の長さを有するナノワイヤが作製され、２００ｎｍの幅がこれまで一貫して使用されている。ポリマー骨格にカーゴを例えばナノワイヤのインビトロおよびインビボでの可視化のための疎水性蛍光色素と共に組み込むことで、ＰＣＬナノワイヤを機能化する。
【0187】
５．２ 制御送達のためのＮＧＦによるナノワイヤ機能化
無痛ＮＧＦ成長因子カーゴをナノワイヤスキャフォールドに取り付けるために、積層（ＬｂＬ）静電構築アプローチを利用した（Ｚａｍｅｃｎｉｋら、２０１７年、ＡＣＳ Ｎａｎｏ １１：１１４３３～１１４４０頁）（図２０Ａ）。ＬｂＬ構築は、薬物送達用途で広範に使用されており、層を増加させることで成長因子の保持が増加するように、生物学的カーゴをナノ材料に取り付ける、容易でモジュール式の手段を提供するものである（図２０Ｃ）。ＰＣＬナノワイヤは、作製プロセスにおいて使用されるアルカリエッチング法の結果として強力な負電荷を有する。この負電荷により、ナノワイヤの表面にバイオポリマーを静電的に構築することが可能になった。キトサン（正電荷）およびヘパリン（負電荷）が、それらの生体適合性およびヘパリンの成長因子親和性を理由として、ＬｂＬ構築のために選択された。ナノワイヤ表面電荷のゼータ電位測定により確定されたように、キトサンおよびヘパリンはいずれもナノワイヤの表面にうまく堆積された（図２０Ｂ）。複数の層が堆積されることで、正に帯電（キトサン）したナノワイヤと負に帯電（ヘパリンコーティング）したナノワイヤとの間で電荷振動が観察された。電荷以外にも、キトサンは抗菌性によっても有利であり（Ｊｉａｎｇら、２０１４年、Ｎａｔｕｒａｌ ａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ ｃｈ．５：９１～１１３頁）、ヘパリンはＮＧＦを含む複数の成長因子に対する高い親和性を示す（Ｍａｒｔｉｎｏら、２０１３年、ＰＮＡＳ ＵＳＡ １１０：４５６３～４５６８頁；Ｈｕら、２０２０年、Ｊ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｍｅｄ ２４：８１６６～８１７８頁）。
無痛ＮＧＦ成長因子カーゴをナノワイヤスキャフォールドに取り付けるために、積層（ＬｂＬ）静電構築アプローチを利用した（Ｚａｍｅｃｎｉｋら、２０１７年、ＡＣＳ Ｎａｎｏ １１：１１４３３～１１４４０頁）（図２０Ａ）。ＬｂＬ構築は、薬物送達用途で広範に使用されており、層を増加させることで成長因子の保持が増加するように、生物学的カーゴをナノ材料に取り付ける、容易でモジュール式の手段を提供するものである（図２０Ｃ）。ＰＣＬナノワイヤは、作製プロセスにおいて使用されるアルカリエッチング法の結果として強力な負電荷を有する。この負電荷により、ナノワイヤの表面にバイオポリマーを静電的に構築することが可能になった。キトサン（正電荷）およびヘパリン（負電荷）が、それらの生体適合性およびヘパリンの成長因子親和性を理由として、ＬｂＬ構築のために選択された。ナノワイヤ表面電荷のゼータ電位測定により確定されたように、キトサンおよびヘパリンはいずれもナノワイヤの表面にうまく堆積された（図２０Ｂ）。複数の層が堆積されることで、正に帯電（キトサン）したナノワイヤと負に帯電（ヘパリンコーティング）したナノワイヤとの間で電荷振動が観察された。電荷以外にも、キトサンは抗菌性によっても有利であり（Ｊｉａｎｇら、２０１４年、Ｎａｔｕｒａｌ ａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ ｃｈ．５：９１～１１３頁）、ヘパリンはＮＧＦを含む複数の成長因子に対する高い親和性を示す（Ｍａｒｔｉｎｏら、２０１３年、ＰＮＡＳ ＵＳＡ １１０：４５６３～４５６８頁；Ｈｕら、２０２０年、Ｊ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｍｅｄ ２４：８１６６～８１７８頁）。
【0188】
５．３ 無痛ＮＧＦの吸着効率および放出動態の確定
ポリ（エチレン）グリコールジメチルアクリレート（ＰＥＧＤＭ）マイクロロッド（１５ｘ１００ｍｍ）をＮＧＦの制御放出に使用して、ＰＥＧＤＭの吸着効率を該モノマーの濃度を変化させることで改変することができた（図２１Ａ）。９０％（ｖ／ｖ）濃度の凍結乾燥ＰＥＤＭＡは、ＮＧＦ ２０ｎｇが添加され、制御放出を示すことができた（図２１Ｂ）。ＮＧＦ放出をさらに調整する能力、およびナノスケール性（幅２００ｎｍ×長さ２０μｍ）を理由として、ＰＥＧＤＭマイクロロッドからＰＣＬナノワイヤへの移行が行われた。ＮＧＦをナノワイヤに添加するために、ＮＧＦをモル比１：２のｐＨ６ 酢酸ナトリウム緩衝液およびヘパリン中で可溶化する。そこで、負に帯電したヘパリンはＮＧＦを正に帯電したキトサンナノワイヤに固定する。本明細書に記載のナノワイヤシステムを使用して、ＮＧＦ ５μｇ（マイクロロッドの２５０倍）が７５％超の効率でうまく添加された。ＮＧＦの持続的な一次放出が８日間にわたって実現された（図２１Ｃ）。これらのデータはキトサンの１つの層のみを使用して作成した；いっそう線形になるようにＮＧＦ放出動態をさらに調整することを、静電ポリマーの複数の層を加えることで実現することができる（Ｚａｍｅｃｎｉｋら、２０１７年、ＡＣＳ Ｎａｎｏ １１：１１４３３～１１４４０頁；ＷｏｏｄｒｕｆｆおよびＨｕｔｍａｃｈｅｒ、２０１０年、Ｔｈｅ ｒｅｔｕｒｎ ｏｆ ａ ｆｏｒｇｏｔｔｅｎ ｐｏｌｙｍｅｒ－Ｐｏｌｙｃａｐｒｏｌａｃｔｏｎｅ ｉｎ ｔｈｅ ２１ｓｔｃｅｎｔｕｒｙ ３５：１２１７～１２５６頁；Ｘｕｅら、２０１３，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ３４：２６２４～２６３１頁）。放出動態をｍＢＣＡアッセイを使用して確定した。これらの予備データに厳密さを負荷するために、タンパク質放出の特異性をＮＧＦ－ＥＬＩＳＡを使用して確認する。
ポリ（エチレン）グリコールジメチルアクリレート（ＰＥＧＤＭ）マイクロロッド（１５ｘ１００ｍｍ）をＮＧＦの制御放出に使用して、ＰＥＧＤＭの吸着効率を該モノマーの濃度を変化させることで改変することができた（図２１Ａ）。９０％（ｖ／ｖ）濃度の凍結乾燥ＰＥＤＭＡは、ＮＧＦ ２０ｎｇが添加され、制御放出を示すことができた（図２１Ｂ）。ＮＧＦ放出をさらに調整する能力、およびナノスケール性（幅２００ｎｍ×長さ２０μｍ）を理由として、ＰＥＧＤＭマイクロロッドからＰＣＬナノワイヤへの移行が行われた。ＮＧＦをナノワイヤに添加するために、ＮＧＦをモル比１：２のｐＨ６ 酢酸ナトリウム緩衝液およびヘパリン中で可溶化する。そこで、負に帯電したヘパリンはＮＧＦを正に帯電したキトサンナノワイヤに固定する。本明細書に記載のナノワイヤシステムを使用して、ＮＧＦ ５μｇ（マイクロロッドの２５０倍）が７５％超の効率でうまく添加された。ＮＧＦの持続的な一次放出が８日間にわたって実現された（図２１Ｃ）。これらのデータはキトサンの１つの層のみを使用して作成した；いっそう線形になるようにＮＧＦ放出動態をさらに調整することを、静電ポリマーの複数の層を加えることで実現することができる（Ｚａｍｅｃｎｉｋら、２０１７年、ＡＣＳ Ｎａｎｏ １１：１１４３３～１１４４０頁；ＷｏｏｄｒｕｆｆおよびＨｕｔｍａｃｈｅｒ、２０１０年、Ｔｈｅ ｒｅｔｕｒｎ ｏｆ ａ ｆｏｒｇｏｔｔｅｎ ｐｏｌｙｍｅｒ－Ｐｏｌｙｃａｐｒｏｌａｃｔｏｎｅ ｉｎ ｔｈｅ ２１ｓｔｃｅｎｔｕｒｙ ３５：１２１７～１２５６頁；Ｘｕｅら、２０１３，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ３４：２６２４～２６３１頁）。放出動態をｍＢＣＡアッセイを使用して確定した。これらの予備データに厳密さを負荷するために、タンパク質放出の特異性をＮＧＦ－ＥＬＩＳＡを使用して確認する。
【0189】
５．４ ＮＧＦＲ１００Ｗナノワイヤのインビボ生物活性
放出動態を特徴づけることに加えて、ナノワイヤから放出されたＮＧＦが生物活性を維持することを確認した。ＮＧＦに関する古典的な生物活性試験はＴＦ１赤芽球細胞増殖アッセイである（Ｃｈｅｖａｌｉｅｒら、１９９４年Ｂｌｏｏｄ ８３：１４７９～１４８５頁）。様々な濃度のＮＧＦナノワイヤおよびＮＧＦＲ１００ＷナノワイヤをＴＦ１赤芽球と共に３～５日間にわたってインキュベートし、細胞増殖をＣｙＱｕａｎｔまたはＰｒｅｓｔｏＢｌｕｅアッセイを使用して定量化し、可溶性ＮＧＦ／ＮＧＦＲ１００Ｗおよび空のキトサンのナノワイヤ対照による増殖速度と比較する。ＰＥＧＤＭＡマイクロロッドからの放出後、ＮＧＦは生物活性を保持する（図２１Ｄ）。ＴＦ１細胞増殖を測定することに加えて、処置の１時間後、２４時間後、および４８時間後にｃＦＯＳをｑＲＴ－ＰＣＲで測定し、ホスホ－ＴｒｋＡ／ＡＫＴ／Ｅｒｋ／ＰＬＣｇをウエスタンブロット法で測定することで細胞中でのＮＧＦ／ＴｒｋＡ経路活性化を定量化する（Ｓｕｎｇら、２０１８年、Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ３８：３３９４～３４１３頁；Ｙａｎｇら、２０２０年、Ｐｒｏｇ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ １９４：１０１８６６）。
放出動態を特徴づけることに加えて、ナノワイヤから放出されたＮＧＦが生物活性を維持することを確認した。ＮＧＦに関する古典的な生物活性試験はＴＦ１赤芽球細胞増殖アッセイである（Ｃｈｅｖａｌｉｅｒら、１９９４年Ｂｌｏｏｄ ８３：１４７９～１４８５頁）。様々な濃度のＮＧＦナノワイヤおよびＮＧＦＲ１００ＷナノワイヤをＴＦ１赤芽球と共に３～５日間にわたってインキュベートし、細胞増殖をＣｙＱｕａｎｔまたはＰｒｅｓｔｏＢｌｕｅアッセイを使用して定量化し、可溶性ＮＧＦ／ＮＧＦＲ１００Ｗおよび空のキトサンのナノワイヤ対照による増殖速度と比較する。ＰＥＧＤＭＡマイクロロッドからの放出後、ＮＧＦは生物活性を保持する（図２１Ｄ）。ＴＦ１細胞増殖を測定することに加えて、処置の１時間後、２４時間後、および４８時間後にｃＦＯＳをｑＲＴ－ＰＣＲで測定し、ホスホ－ＴｒｋＡ／ＡＫＴ／Ｅｒｋ／ＰＬＣｇをウエスタンブロット法で測定することで細胞中でのＮＧＦ／ＴｒｋＡ経路活性化を定量化する（Ｓｕｎｇら、２０１８年、Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ３８：３３９４～３４１３頁；Ｙａｎｇら、２０２０年、Ｐｒｏｇ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ １９４：１０１８６６）。
【0190】
５．５ 正常骨折治癒におけるＮＧＦナノワイヤのインビボ評価
上記で詳述した既存のマウス脛骨骨折モデルを使用してＮＧＦナノワイヤの治療効能を評価する。予備データは、骨折の７日後、骨折治癒の軟骨内期にＮＧＦ注射を開始した際に最適な治癒が生じることを示す（データは示さず）。次に、全身（腹腔内）ＮＧＦＲ１００Ｗを、骨折の７日後に仮骨に経皮注射した以下の６つの処置群と比較する：（ｉ）ＰＢＳ対照、（ｉｉ）可溶性ＮＧＦ（単回注射）、（ｉｉｉ）可溶性ＮＧＦＲ１００Ｗ（単回注射）、（ｉｖ）空のナノワイヤ、（ｖ）ＮＧＦナノワイヤ、（ｖｉ）ＮＧＦＲ１００Ｗナノワイヤ。骨折仮骨への注射を蛍光透視によりガイドし、正確な量の送達をＨａｍｉｌｔｏｎシリンジシステムを使用して実現する。予備試験では、注射の７日後に骨折部位の近傍でナノ材料の有効な注射および同定が示される（データは示さず）。さらに、定量的μＣＴにより測定されるように、骨折の１４日後の骨折仮骨中で、これらのナノ材料からのＮＧＦの局所持続送達により、ＮＧＦの単回注射に比べて骨質が増加する（データは示さず）。
上記で詳述した既存のマウス脛骨骨折モデルを使用してＮＧＦナノワイヤの治療効能を評価する。予備データは、骨折の７日後、骨折治癒の軟骨内期にＮＧＦ注射を開始した際に最適な治癒が生じることを示す（データは示さず）。次に、全身（腹腔内）ＮＧＦＲ１００Ｗを、骨折の７日後に仮骨に経皮注射した以下の６つの処置群と比較する：（ｉ）ＰＢＳ対照、（ｉｉ）可溶性ＮＧＦ（単回注射）、（ｉｉｉ）可溶性ＮＧＦＲ１００Ｗ（単回注射）、（ｉｖ）空のナノワイヤ、（ｖ）ＮＧＦナノワイヤ、（ｖｉ）ＮＧＦＲ１００Ｗナノワイヤ。骨折仮骨への注射を蛍光透視によりガイドし、正確な量の送達をＨａｍｉｌｔｏｎシリンジシステムを使用して実現する。予備試験では、注射の７日後に骨折部位の近傍でナノ材料の有効な注射および同定が示される（データは示さず）。さらに、定量的μＣＴにより測定されるように、骨折の１４日後の骨折仮骨中で、これらのナノ材料からのＮＧＦの局所持続送達により、ＮＧＦの単回注射に比べて骨質が増加する（データは示さず）。
【0191】
ＮＧＦ送達の投与量およびタイミングを、ＮＧＦ／ＮＧＦＲ１００Ｗ ２．５μｇ（１日当たりＮＧＦ ０．５μｇ、５日間に対応する）、骨折の７日後の送達に標準化する。この添加値は必要に応じて調整可能であるが、この用量の効能、およびＬＢＬ技術を利用してナノワイヤにこの所要量を超える量のＮＧＦを添加する能力を示す。空のナノワイヤの用量をＮＧＦナノワイヤの注射量に対して標準化する。骨折の１０日後、１４日後、２１日後、および２８日後に脛骨を採取して骨折治癒を調査する。痛覚、骨折治癒の機能試験、およびバイオマーカー解析を上記のように完了する。組織形態計測が一次的な成功判定基準である。平均値および標準偏差は、検出力８０％に到達するために８匹のマウスしか必要ではないことを示す（ａ＝０．０５、ＧＰｏｗｅｒ＊で計算）；一貫性を維持するために、サンプルサイズ設計Ｎ＝１０を選択して変動性増加の可能性を許容する。
【実施例6】
【0192】
バイオマーカーに基づく骨折治癒の定量化
骨折バイオマーカー
コラーゲンＸ（「Ｃｘｍ」）バイオマーカーは、軟骨細胞肥大化の古典的なマーカーであり、軟骨が骨になる際に一次的に発現される（図１）。ＣｘｍレベルはコラーゲンＸ遺伝子発現および骨折治癒１における免疫組織化学的検査に相関していた（図２２Ａ～図２２Ｃ）。この血清バイオアッセイは、骨折仮骨における生物学的反応の新規の非破壊的で長期的な測定法であり、対照とＮＧＦ処置マウスとの間で軟骨細胞肥大化の分子シグネチャーの比較を可能にする。骨折の３日前および１４日後に血液を尾静脈から採取した後（約２５μｌ、非破壊）、試験の最終時点で安楽死後に心穿孔によって血液を採取する。血液をバッチ試験のために血清として保存する。
骨折バイオマーカー
コラーゲンＸ（「Ｃｘｍ」）バイオマーカーは、軟骨細胞肥大化の古典的なマーカーであり、軟骨が骨になる際に一次的に発現される（図１）。ＣｘｍレベルはコラーゲンＸ遺伝子発現および骨折治癒１における免疫組織化学的検査に相関していた（図２２Ａ～図２２Ｃ）。この血清バイオアッセイは、骨折仮骨における生物学的反応の新規の非破壊的で長期的な測定法であり、対照とＮＧＦ処置マウスとの間で軟骨細胞肥大化の分子シグネチャーの比較を可能にする。骨折の３日前および１４日後に血液を尾静脈から採取した後（約２５μｌ、非破壊）、試験の最終時点で安楽死後に心穿孔によって血液を採取する。血液をバッチ試験のために血清として保存する。
【0193】
こうして、無痛ＮＧＦ（ＮＧＦＲ１００Ｗ）が軟骨内骨修復を促進するための新規療法として確立される。治療的開発を支援するために、骨折治癒を促進するが侵害受容を最小化するＮＧＦＲ１００Ｗのタイミングおよび用量を確定する。組織形態計測、定量的μＣＴ、および力学試験の上記技術、ならびにＣｘｍバイオマーカーを使用して、骨折治癒の結果を厳密に評価する。
【0194】
ＮＧＦ／ＮＧＦＲ１００Ｗの送達が早期よりも後期（軟骨内期）の方が有効である理由を理解する目的で、予備データに基づいて、特定の骨形成経路、ならびに抗アポトーシス経路および増殖経路が後期の送達によっていっそう有意に上方制御されると予想して、差次的遺伝子発現をＲＮＡｓｅｑを使用して確定する。野生型ＮＧＦ対無痛ＮＧＦの効能比は１：１であると仮定する。
【実施例7】
【0195】
軟骨内骨折修復における役割を試験するためのＴｒｋＡ受容体の遺伝子ノックアウト
ＮＧＦ－ＴｒｋＡシグナル伝達が軟骨内骨折修復に必要となる程度を、骨折修復の間に特に軟骨細胞中の、またはすべての細胞中のＴｒｋＡ受容体を条件的にノックアウト（ＫＯ）することで確定するために、ＴｒｋＡｆｌ／ｆｌマウス（Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎら、２０１７年、ＰＮＡＳ ＵＳＡ １１４：Ｅ３６３２～Ｅ３６４１頁）を軟骨細胞特異的（Ｃｏｌ１０）または全般的（Ｒ２６）タモキシフェン誘導型Ｃｒｅドライバーと交雑させ、得られたマウスを６～１０日目にタモキシフェンで処置する（Ｗｏｎｇら、２０２０年、ｂｉｏＲｘｉｖ ９８６１４１；Ｈｕら、２０１７年、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １４４：２２１～２３４頁）。肥大軟骨細胞に特異的であることから、Ｃｏｌ１０ＣｒｅＥＲＴマウスが使用される。上記で詳述した標準的結果（組織形態計測、μＣＴ、Ｃｘｍバイオマーカー、生体力学）を使用して、Ｃｏｌ１０ＣｒｅＥＲＴ：：ＴｒｋＡｆｌ／ｆｌおよびＲ２６ＣｒｅＥＲＴ２：：ＴｒｋＡｆｌ／ｆｌマウスにおける骨折治癒をタモキシフェン処置野生型マウスと比較する。これにより、ＴｒｋＡ受容体が内在性骨折治癒に決定的に重要であるか否か、およびそのシグナル伝達機能が主に肥大軟骨細胞または別の細胞集団を通じて機能するか否かが直接試験される。
ＮＧＦ－ＴｒｋＡシグナル伝達が軟骨内骨折修復に必要となる程度を、骨折修復の間に特に軟骨細胞中の、またはすべての細胞中のＴｒｋＡ受容体を条件的にノックアウト（ＫＯ）することで確定するために、ＴｒｋＡｆｌ／ｆｌマウス（Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎら、２０１７年、ＰＮＡＳ ＵＳＡ １１４：Ｅ３６３２～Ｅ３６４１頁）を軟骨細胞特異的（Ｃｏｌ１０）または全般的（Ｒ２６）タモキシフェン誘導型Ｃｒｅドライバーと交雑させ、得られたマウスを６～１０日目にタモキシフェンで処置する（Ｗｏｎｇら、２０２０年、ｂｉｏＲｘｉｖ ９８６１４１；Ｈｕら、２０１７年、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １４４：２２１～２３４頁）。肥大軟骨細胞に特異的であることから、Ｃｏｌ１０ＣｒｅＥＲＴマウスが使用される。上記で詳述した標準的結果（組織形態計測、μＣＴ、Ｃｘｍバイオマーカー、生体力学）を使用して、Ｃｏｌ１０ＣｒｅＥＲＴ：：ＴｒｋＡｆｌ／ｆｌおよびＲ２６ＣｒｅＥＲＴ２：：ＴｒｋＡｆｌ／ｆｌマウスにおける骨折治癒をタモキシフェン処置野生型マウスと比較する。これにより、ＴｒｋＡ受容体が内在性骨折治癒に決定的に重要であるか否か、およびそのシグナル伝達機能が主に肥大軟骨細胞または別の細胞集団を通じて機能するか否かが直接試験される。
【0196】
長管骨骨折治癒において無痛および野生型ＮＧＦがＴｒｋＡ受容体を通じて作用することを確認するために、治癒の軟骨内期（７～９日目）にＣｏｌ１０ＣｒｅＥＲＴ：：ＴｒｋＡｆｌ／ｆｌおよびＲ２６ＣｒｅＥＲＴ２：：ＴｒｋＡｆｌ／ｆｌに治療用ＮＧＦＲ１００ＷまたはＮＧＦを投与し、ｑＲＴ－ＰＣＲおよびＲＮＡｓｅｑ解析を上記のように使用して、遺伝子発現パターンがどのようにして差次的に影響されるかを確定する。ＮＧＦはおそらく軟骨細胞中のＴｒｋＡ受容体を通じて骨折修復を刺激し、したがって、ｃＦＯＳおよび軟骨内遺伝子発現はＫＯ動物において野生型マウスに比べて有意に下方制御される。ＮＧＦ／ＮＧＦＲ１００Ｗ治療はおそらくＫＯの作用をレスキューすることができない。このことは、微量のＮＧＦ受容体がＮＧＦ／ＮＧＦＲ１００Ｗの栄養作用にそれほど有意には寄与しないことを示している。
【実施例8】
【0197】
ｂ延骨折治癒におけるＮＧＦナノワイヤのインビボ評価
治療が遷延骨折治癒のシナリオにおいて機能する可能性を評価するために、併存症を動因とする遷延癒合も分析する。骨折を上記のように作り出すが、Ｃ５７Ｂｌ６／Ｊ野生型マウスの代わりにＬｅｐｏｂ糖尿病マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ、Ｂ６．Ｃｇ－Ｌｅｐｏｂ／Ｊ）または加齢もしくは骨粗鬆症のマウスモデルを使用する（Ｒｏｓｚｅｒら、２０１４年、Ｃｅｌｌ Ｔｉｓｓｕｅ Ｒｅｓ ３５６：１９５～２０６頁；Ｇａｏら、２０１８年、Ｏｒｔｈｏｐ Ｓｕｒｇ Ｒｅｓ １３：１４５；Ｋｈａｎら、２０１３年、Ｊ ｏｒｔｈｏｐａｅｄ ｔｒａｕｍａ ２７：６５６～６６２頁）。糖尿病マウスを選択するのは、糖尿病が、血管流の減少および全身性炎症誘発性状態の持続による骨折治癒不良に関連する既知の併存症であるからである。さらに、Ｌｅｐｏｂマウスは野生型と同じＢ６／Ｊバックグラウンドにあり、したがってこれら２つの系統の間での比較が可能になる。
治療が遷延骨折治癒のシナリオにおいて機能する可能性を評価するために、併存症を動因とする遷延癒合も分析する。骨折を上記のように作り出すが、Ｃ５７Ｂｌ６／Ｊ野生型マウスの代わりにＬｅｐｏｂ糖尿病マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ、Ｂ６．Ｃｇ－Ｌｅｐｏｂ／Ｊ）または加齢もしくは骨粗鬆症のマウスモデルを使用する（Ｒｏｓｚｅｒら、２０１４年、Ｃｅｌｌ Ｔｉｓｓｕｅ Ｒｅｓ ３５６：１９５～２０６頁；Ｇａｏら、２０１８年、Ｏｒｔｈｏｐ Ｓｕｒｇ Ｒｅｓ １３：１４５；Ｋｈａｎら、２０１３年、Ｊ ｏｒｔｈｏｐａｅｄ ｔｒａｕｍａ ２７：６５６～６６２頁）。糖尿病マウスを選択するのは、糖尿病が、血管流の減少および全身性炎症誘発性状態の持続による骨折治癒不良に関連する既知の併存症であるからである。さらに、Ｌｅｐｏｂマウスは野生型と同じＢ６／Ｊバックグラウンドにあり、したがってこれら２つの系統の間での比較が可能になる。
【0198】
先に記載のように、骨折の７日後にＬｅｐｏｂマウスまたは加齢もしくは骨粗鬆症のマウスモデルの骨折仮骨に（ｉ）ＰＢＳ対照、（ｉｉ）可溶性ＮＧＦ、（ｉｉｉ）可溶性ＮＧＦＲ１００Ｗ、（ｉｖ）空のナノワイヤ、（ｖ）ＮＧＦナノワイヤ、および（ｖｉ）ＮＧＦＲ１００Ｗナノワイヤを含む６つの実験群を経皮注射する。動物の総数を減少させるために、Ｌｅｐｏｂマウスの治癒を修復後１４日目の野生型とのみ比較する。というのも、この早期の時点が骨折仮骨組成の最大差を示す時点だからである。ナノワイヤによる治癒パターンの任意の差が生じると見込まれる場合、２１日および２８日というさらなる時点を追加することがある。痛覚、骨折治癒の機能試験、およびバイオマーカー解析を上記のように完了し、変動性、検出力、および成功判定基準は以前の実施例と同じであると仮定する。糖尿病マウスからの骨折治癒結果を以前の実施例による正常治癒と比較する。Ｌｅｐｏｂマウスの作用機序が野生型に比べて異ならないことを確認するために、上記のように骨折の１４日後に各遺伝子型について追加のマウス５匹／群を定量的ＲＴ－ＰＣＲ解析のために採取し、主要経路の評価を確定する。
【0199】
したがって、ナノワイヤは、正常および遷延の両方のマウス骨折モデルにおいて骨折修復を促進するための無痛ＮＧＦの持続局所送達のための注射用生体適合性スキャフォールド材料の役割を果たす。特定の実施形態では、ナノワイヤは、可溶性ＮＧＦ送達に比べて優れてはいないにしても同等である骨折修復の機能的帰結を生じさせる。図２１Ａ～図２１Ｄに示されるデータを含む予備データは、ＬＢＬプラットフォームを調整することで、５日間にわたって制御放出を実現するために十分な無痛および野生型ＮＧＦを効率的にナノワイヤに添加することができることを示す。ヘパリンが異なるシグナル伝達タンパク質と相互作用し、望ましくない内在性タンパク質を隔離して下流作用を改変する場合、特定の実施形態では、ヘパリンおよびＮＧＦのプレインキュベーションを１：１比で行って未結合ヘパリンの量を制限するか、またはポリ（グルタミン酸）またはポリ（アクリル酸）などの他の負に帯電するポリマーを後続の構築層に使用する。別の実施形態では、成長因子添加のためにＮＧＦ結合ペプチドまたは抗体をナノワイヤに共有結合させる固定方法を使用する。さらに別の実施形態では、成長因子が結合していないヘパリンコーティングナノワイヤが本実施例および以前の実施例に追加の群として追加されることがある。
【0200】
本開示の範囲は、本明細書に記載の特定の実施形態に限定されるものではない。実際、本明細書に記載の実施形態以外に、本開示の様々な変形形態が、上記の記載および添付の図面より当業者には明らかであろう。これらの変形形態は添付の特許請求の範囲内にあるものとする。
【図1】
【図2】
【図3-1】
【図3-2】
【図3-3】
【図4-1】
【図4-2】
【図5-1】
【図5-2】
【図6-1】
【図6-2】
【図7】
【図8】
【図9-1】
【図9-2】
【図9-3】
【図10-1】
【図10-2】
【図11-1】
【図11-2】
【図12】
【図13】
【図14-1】
【図14-2】
【図15】
【図16-1】
【図16-2】
【図16-3】
【図17-1】
【図17-2】
【図17-3】
【図18-1】
【図18-2】
【図18-3】
【図18-4】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2023-07-18
【手続補正1】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図1】
【図2】
【図3-1】
【図3-2】
【図3-3】
【図4-1】
【図4-2】
【図5-1】
【図5-2】
【図6-1】
【図6-2】
【図7】
【図8】
【図9-1】
【図9-2】
【図9-3】
【図10-1】
【図10-2】
【図11-1】
【図11-2】
【図12】
【図13】
【図14-1】
【図14-2】
【図15】
【図16-1】
【図16-2】
【図16-3】
【図17-1】
【図17-2】
【図17-3】
【図18-1】
【図18-2】
【図18-3】
【図18-4】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【国際調査報告】