特表 2023-549787 キメラコロナウイルススパイクタンパク質をコードする組換えベクターおよびその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-11-29

(54)【発明の名称】キメラコロナウイルススパイクタンパク質をコードする組換えベクターおよびその使用

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/85 20060101AFI20231121BHJP

   C12N 15/50 20060101ALI20231121BHJP

   C12N 15/62 20060101ALI20231121BHJP

   C12N 15/869 20060101ALI20231121BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20231121BHJP

   A61K 39/215 20060101ALI20231121BHJP

   A61K 39/265 20060101ALI20231121BHJP

   A61P 31/14 20060101ALI20231121BHJP

   A61K 35/76 20150101ALI20231121BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20231121BHJP

   A61P 37/04 20060101ALI20231121BHJP

   C07K 14/165 20060101ALN20231121BHJP

   C07K 14/145 20060101ALN20231121BHJP

【ＦＩ】

C12N15/85 Z

C12N15/50 ZNA

C12N15/62 Z

C12N15/869 Z

C07K19/00

A61K39/215

A61K39/265

A61P31/14

A61K35/76

A61K48/00

A61P37/04

C07K14/165

C07K14/145

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023528137

(86)(22)【出願日】2021-11-11

(85)【翻訳文提出日】2023-07-07

(86)【国際出願番号】 EP2021081311

(87)【国際公開番号】W WO2022101307

(87)【国際公開日】2022-05-19

(31)【優先権主張番号】20207302.9

(32)【優先日】2020-11-12

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(31)【優先権主張番号】21166533.6

(32)【優先日】2021-04-01

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】510000976

【氏名又は名称】インターベット インターナショナル ベー． フェー．

(74)【代理人】

【識別番号】100114188

【弁理士】

【氏名又は名称】小野 誠

(74)【代理人】

【識別番号】100119253

【弁理士】

【氏名又は名称】金山 賢教

(74)【代理人】

【識別番号】100124855

【弁理士】

【氏名又は名称】坪倉 道明

(74)【代理人】

【識別番号】100129713

【弁理士】

【氏名又は名称】重森 一輝

(74)【代理人】

【識別番号】100137213

【弁理士】

【氏名又は名称】安藤 健司

(74)【代理人】

【識別番号】100143823

【弁理士】

【氏名又は名称】市川 英彦

(74)【代理人】

【識別番号】100183519

【弁理士】

【氏名又は名称】櫻田 芳恵

(74)【代理人】

【識別番号】100196483

【弁理士】

【氏名又は名称】川嵜 洋祐

(74)【代理人】

【識別番号】100160749

【弁理士】

【氏名又は名称】飯野 陽一

(74)【代理人】

【識別番号】100160255

【弁理士】

【氏名又は名称】市川 祐輔

(74)【代理人】

【識別番号】100146318

【弁理士】

【氏名又は名称】岩瀬 吉和

(74)【代理人】

【識別番号】100127812

【弁理士】

【氏名又は名称】城山 康文

(72)【発明者】

【氏名】ランゲレイス，マルティン・アレクサンダー

(72)【発明者】

【氏名】デ・グルーフ，アド

(72)【発明者】

【氏名】フェルメイ，ポール

(72)【発明者】

【氏名】ボッシュ，ベレンド・ジャン

【テーマコード（参考）】

4C084

4C085

4C087

4H045

【Ｆターム（参考）】

4C084AA13

4C084MA17

4C084MA52

4C084MA59

4C084MA65

4C084NA14

4C084ZB09

4C084ZB33

4C085AA03

4C085AA38

4C085BA71

4C085BA82

4C085CC08

4C085EE01

4C085EE06

4C085GG03

4C085GG04

4C085GG05

4C085GG08

4C085GG10

4C087AA01

4C087AA02

4C087BC83

4C087MA17

4C087MA52

4C087MA59

4C087MA65

4C087NA14

4C087ZB09

4C087ZB33

4H045AA10

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA10

4H045BA41

4H045CA01

4H045EA31

4H045FA74

(57)【要約】

本発明は、キメラコロナウイルススパイクタンパク質をコードする組換えベクターを提供する。本発明はさらに、これらの組換えベクターを含む新規免疫原性組成物およびワクチンを提供する。コロナウイルスに対して動物対象を保護するために、これらの免疫原性組成物およびワクチンをヒト、ネコおよびトリを含む動物対象に投与する方法も含まれる。免疫原性組成物およびワクチンを単独でまたは他の保護剤と組み合わせて作製する方法も提供される。
【選択図】図７

【特許請求の範囲】

【請求項1】

コロナウイルスに由来するスパイクタンパク質と、前記コロナウイルススパイクタンパク質の膜貫通ドメイン（ＴＭＤ）およびＣ末端ドメイン（ＣＴＤ）の代わりに、宿主細胞の細胞膜から出芽する出芽ウイルス（ＢＶ_ｐｍ）に由来する表面糖タンパク質のＴＭＤおよびＣＴＤとを含むキメラコロナウイルススパイクタンパク質をコードする組換えベクターであって、前記組換えベクターが組換えＢＶ_ｐｍである場合、前記表面糖タンパク質の前記ＴＭＤおよび前記ＣＴＤは、前記組換えＢＶ_ｐｍのウイルス種とは異なるウイルス種に由来する、組換えベクター。

【請求項2】

組換え発現ベクターおよび合成メッセンジャーＲＮＡ（合成ｍＲＮＡ）からなる群から選択される、請求項１に記載の組換えベクター。

【請求項3】

前記表面糖タンパク質が、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）の糖タンパク質（Ｇタンパク質）、インフルエンザウイルスのヘマグルチニン、インフルエンザウイルスのノイラミニダーゼ、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）のヘマグルチニン－ノイラミニダーゼ（ＨＮ）タンパク質、ＮＤＶの融合（Ｆ）タンパク質、ヒト免疫不全ウイルスの糖タンパク質１２０（ｇｐ１２０）、ラッサウイルスの糖タンパク質（ＧＰ）、エボラウイルスのＧＰ、麻疹ウイルス（ＭＶ）のＦタンパク質およびＭＶのＨＮタンパク質からなる群から選択されるＢＶ_ｐｍ種に由来する、請求項１または２に記載の組換えベクター。

【請求項4】

前記表面糖タンパク質が前記ＶＳＶの前記Ｇタンパク質である、請求項３に記載の組換えベクター。

【請求項5】

前記キメラコロナウイルススパイクタンパク質が不活化されたフューリン切断部位を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の組換えベクター。

【請求項6】

前記キメラコロナウイルススパイクタンパク質が、中央ヘリックスであって、前記中央ヘリックスの最初の２つの連続するアミノ酸残基が一対のプロリン残基（２Ｐ）によって置き換えられているために、前融合状態でさらに安定化されている、中央ヘリックスを含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の組換えベクター。

【請求項7】

前記コロナウイルススパイクタンパク質が、ヒトコロナウイルス、伝染性気管支炎ウイルス（ＩＢＶ）、ウシコロナウイルス、イヌコロナウイルス、ネココロナウイルス、ブタコロナウイルスおよびコウモリコロナウイルスからなる群から選択されるコロナウイルスに由来する、請求項１～６のいずれか一項に記載の組換えベクター。

【請求項8】

前記コロナウイルススパイクタンパク質がヒトコロナウイルスに由来する、請求項７に記載の組換えベクター。

【請求項9】

前記ヒトコロナウイルスが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ＳＡＲＳ－ＣｏＶおよびＭＥＲＳからなる群から選択される、請求項８に記載の組換えベクター。

【請求項10】

前記ヒトコロナウイルスが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２である、請求項９に記載の組換えベクター。

【請求項11】

前記キメラコロナウイルススパイクタンパク質が、アミノ酸残基の同じ範囲にわたって、配列番号１０のアミノ酸配列のアミノ酸残基１４～１２１１と９０％以上の同一性を含み、前記キメラコロナウイルススパイクタンパク質が不活化されたフューリン切断部位を含む、請求項１０に記載の組換えベクター。

【請求項12】

前記キメラコロナウイルススパイクタンパク質が、アミノ酸残基の同じ範囲にわたって、配列番号１２のアミノ酸配列のアミノ酸残基１４～１２１１と９０％以上の同一性を含み、前記キメラコロナウイルススパイクタンパク質が不活化されたフューリン切断部位を含み、配列番号１２の位置９８６のリジン（Ｋ）残基と位置９８７のバリン（Ｖ）残基が一対のプロリン残基（２Ｐ）によって置き換えられている、請求項１０に記載の組換えベクター。

【請求項13】

前記キメラコロナウイルススパイクタンパク質が、アミノ酸残基の同じ範囲にわたって、配列番号１０または１２のアミノ酸配列のアミノ酸残基１２１２～１２６０と９０％以上の同一性をさらに含む、請求項１１または１２に記載の組換えベクター。

【請求項14】

前記コロナウイルススパイクタンパク質がＩＢＶに由来する、請求項７に記載の組換えベクター。

【請求項15】

前記ＩＢＶが、マサチューセッツ血清型、４／９１血清型およびＱＸ血清型からなる群から選択される血清型のメンバーである、請求項１４に記載の組換えベクター。

【請求項16】

前記ＩＢＶがＩＢＶ－Ｍａ５株である、請求項１４に記載の組換えベクター。

【請求項17】

前記キメラコロナウイルススパイクタンパク質が、アミノ酸残基の同じ範囲にわたって、配列番号４のアミノ酸配列のアミノ酸残基１９～１０９１と９０％以上の同一性を含み、前記キメラコロナウイルススパイクタンパク質が不活化されたフューリン切断部位を含む、請求項１６に記載の組換えベクター。

【請求項18】

前記キメラコロナウイルススパイクタンパク質が、アミノ酸残基の同じ範囲にわたって、配列番号６のアミノ酸配列のアミノ酸残基１９～１０９１と９０％以上の同一性を含み、前記キメラコロナウイルススパイクタンパク質が不活化されたフューリン切断部位を含み、配列番号６の位置８５９のアラニン（Ａ）残基と位置８６０のイソロイシン（Ｉ）残基が一対のプロリン残基（２Ｐ）によって置き換えられている、請求項１６に記載の組換えベクター。

【請求項19】

前記キメラコロナウイルススパイクタンパク質が、アミノ酸残基の同じ範囲にわたって、配列番号４または６のアミノ酸配列のアミノ酸残基１０９２～１１４０と９０％以上の同一性をさらに含む、請求項１７または１８に記載の組換えベクター。

【請求項20】

組換えウイルスベクターおよびＤＮＡ発現プラスミドからなる群から選択される組換え発現ベクターである、請求項１～１９のいずれか一項に記載の組換えベクター。

【請求項21】

シチメンチョウの組換えヘルペスウイルス（ＨＶＴ）、組換え弱毒化マレック病ウイルス１型（ＭＤＶ１）、組換えマレック病ウイルス２型（ＭＤＶ２）、組換えＭＶ、組換えＮＤＶおよびアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子（ＲＰ）からなる群から選択される組換えウイルスベクターである、請求項２０に記載の組換え発現ベクター。

【請求項22】

ＨＶＴである、請求項２１に記載の組換えウイルスベクター。

【請求項23】

前記アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子がベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）レプリコン粒子である、請求項２１に記載の組換えウイルスベクター。

【請求項24】

ＤＮＡ発現プラスミドである、請求項２０に記載の組換え発現ベクター。

【請求項25】

ＲＮＡレプリコンをコードする、請求項２４に記載の組換え発現ベクター。

【請求項26】

前記ＲＮＡレプリコンがＶＥＥＶ ＲＮＡレプリコンである、請求項２５に記載の組換え発現ベクター。

【請求項27】

合成ｍＲＮＡである、請求項１～１９のいずれか一項に記載の組換えベクター。

【請求項28】

請求項１～２０のいずれか一項に記載の組換えベクター、請求項２１～２３のいずれか一項に記載の組換えウイルスベクター、請求項２４～２６のいずれか一項に記載のＤＮＡ発現プラスミドまたは請求項２７に記載の合成ｍＲＮＡと、薬学的に許容され得る担体とを含む免疫原性組成物。

【請求項29】

請求項１～１３もしくは２０のいずれか一項に記載の組換えベクター、請求項２３に記載の組換えウイルスベクター、請求項２４～２６のいずれか一項に記載のＤＮＡ発現プラスミドまたは請求項２７に記載の合成ｍＲＮＡと、薬学的に許容され得る担体とを含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による感染からの哺乳動物の保護を補助するためのワクチン。

【請求項30】

前記ワクチンが、ワクチン接種された哺乳動物において殺菌免疫を誘導するか、前記ワクチン接種された哺乳動物からナイーブ哺乳動物へのコロナウイルスの伝染を防止するか、または前記ワクチン接種された哺乳動物において殺菌免疫を誘導し、かつ前記ワクチン接種された哺乳動物からナイーブ哺乳動物へのコロナウイルスの伝染を防止する、請求項２９に記載のワクチン。

【請求項31】

前記ワクチン接種された哺乳動物がネコであるか、前記ナイーブ哺乳動物がネコであるか、または前記ワクチン接種された哺乳動物および前記ナイーブ哺乳動物の両方がネコである、請求項３０に記載のワクチン。

【請求項32】

アジュバントを含む、請求項２９～３１のいずれか一項に記載のワクチン。

【請求項33】

アジュバントを含まないワクチンである、請求項２９～３１のいずれか一項に記載のワクチン。

【請求項34】

請求項１～７もしくは１４～２０のいずれか一項に記載の組換えベクター、請求項２１～２３のいずれか一項に記載の組換えウイルスベクター、請求項２４～２６のいずれか一項に記載のＤＮＡ発現プラスミドまたは請求項２７に記載の合成ｍＲＮＡと、薬学的に許容され得る担体とを含む、トリにおけるＩＢＶの感染による伝染性気管支炎からの前記トリの保護を補助するためのワクチン。

【請求項35】

非ＩＢＶトリ病原体に対する防御免疫を誘発するための少なくとも１つの非ＩＢＶ抗原をさらに含む、請求項３４に記載のワクチン。

【請求項36】

アジュバントを含む、請求項３４または３５に記載のワクチン。

【請求項37】

アジュバントを含まないワクチンである、請求項３４または３５に記載のワクチン。

【請求項38】

有効量の請求項２９～３７のいずれか一項に記載のワクチンを哺乳動物またはトリに投与することを含む、コロナウイルスに対する前記哺乳動物または前記トリにおける免疫応答を誘導する方法。

【請求項39】

哺乳動物においてコロナウイルスに対する殺菌免疫を誘導するか、ワクチン接種された哺乳動物からナイーブ哺乳動物へのコロナウイルスの伝染を防止するか、または前記哺乳動物において前記コロナウイルスに対する殺菌免疫を誘導し、かつ前記ワクチン接種された哺乳動物から前記ナイーブ哺乳動物への前記コロナウイルスの伝染を防止する方法であって、有効量の請求項３０～３３のいずれか一項に記載のワクチンを前記哺乳動物に投与することを含む、方法。

【請求項40】

前記ワクチン接種された哺乳動物がネコであるか、前記ナイーブ哺乳動物がネコであるか、または前記ワクチン接種された哺乳動物および前記ナイーブ哺乳動物の両方がネコである、請求項３９に記載の方法。

【請求項41】

前記投与することが、筋肉内投与（ＩＭ）、皮下投与（ＳＣ）、皮内投与（ＩＤ）、経口、鼻腔内または卵内投与からなる群から選択される投与の様式によって行われる、請求項３８～４０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項42】

少なくとも１回の追加免疫投与が投与される、請求項３８～４１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項43】

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に由来するスパイクタンパク質と、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質のＴＭＤおよびＣＴＤの代わりに、水疱性口内炎ウイルスに由来する表面糖タンパク質のＴＭＤおよびＣＴＤとを含むキメラコロナウイルススパイクタンパク質。

【請求項44】

前記キメラコロナウイルススパイクタンパク質が不活化されたフューリン切断部位を含む、アミノ酸残基の同じ範囲にわたって、配列番号１０のアミノ酸配列のアミノ酸残基１４～１２１１と９０％以上の同一性を含む、請求項４３に記載のキメラコロナウイルススパイクタンパク質。

【請求項45】

前記キメラコロナウイルススパイクタンパク質が不活化されたフューリン切断部位を含み、配列番号１２の位置９８６のリジン（Ｋ）残基と位置９８７のバリン（Ｖ）残基が一対のプロリン残基（２Ｐ）によって置き換えられている、アミノ酸残基の同じ範囲にわたって、配列番号１２のアミノ酸配列のアミノ酸残基１４～１２１１と９０％以上の同一性を含む、請求項４３に記載のキメラコロナウイルススパイクタンパク質。

【請求項46】

前記キメラコロナウイルススパイクタンパク質が、アミノ酸残基の同じ範囲にわたって、配列番号１０または１２のアミノ酸配列のアミノ酸残基１２１２～１２６０と９０％以上の同一性をさらに含む、請求項４４または４５に記載のキメラコロナウイルススパイクタンパク質。

【請求項47】

ＩＢＶに由来するスパイクタンパク質と、前記ＩＢＶスパイクタンパク質のＴＭＤおよびＣＴＤの代わりに、水疱性口内炎ウイルスに由来する表面糖タンパク質のＴＭＤおよびＣＴＤとを含むキメラコロナウイルススパイクタンパク質。

【請求項48】

前記キメラコロナウイルススパイクタンパク質が、アミノ酸残基の同じ範囲にわたって、配列番号４のアミノ酸配列のアミノ酸残基１９～１０９１と９０％以上の同一性を含み、前記キメラコロナウイルススパイクタンパク質が不活化されたフューリン切断部位を含む、請求項４７に記載のキメラコロナウイルススパイクタンパク質。

【請求項49】

前記キメラコロナウイルススパイクタンパク質が、アミノ酸残基の同じ範囲にわたって、配列番号６のアミノ酸配列のアミノ酸残基１９～１０９１と９０％以上の同一性を含み、前記キメラコロナウイルススパイクタンパク質が不活化されたフューリン切断部位を含み、配列番号６の位置８５９のアラニン（Ａ）残基と位置８６０のイソロイシン（Ｉ）残基が一対のプロリン残基（２Ｐ）によって置き換えられている、請求項４８に記載のキメラコロナウイルススパイクタンパク質。

【請求項50】

前記キメラコロナウイルススパイクタンパク質が、アミノ酸残基の同じ範囲にわたって、配列番号４または６のアミノ酸配列のアミノ酸残基１０９２～１１４０と９０％以上の同一性をさらに含む、請求項４８または４９に記載のキメラコロナウイルススパイクタンパク質。

【請求項51】

請求項４３～５０のいずれか一項に記載のキメラコロナウイルススパイクタンパク質をコードする核酸。

【請求項52】

ワクチンが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による感染からの哺乳動物の保護を補助するものであるか、または前記ワクチンが、伝染性気管支炎からのトリの保護を補助するものである、ワクチンとして使用するための、請求項１～２０のいずれか一項に記載の組換えベクター。

【請求項53】

前記組換えベクターが、請求項２１および２４～２６のいずれか一項に記載の組換え発現ベクター、請求項２２および２３に記載の組換えウイルスベクター、ＤＮＡ発現プラスミド、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子ならびに合成ｍＲＮＡから選択される、請求項５２に記載のワクチンとして使用するための組換えベクター。

【請求項54】

ワクチンが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による感染からの哺乳動物の保護を補助するものであるか、または前記ワクチンが、伝染性気管支炎からのトリの保護を補助するものである、ワクチンの製造のための、請求項１～２０のいずれか一項に記載の組換えベクターの使用。

【請求項55】

前記組換えベクターが、請求項２１および２４～２６のいずれか一項に記載の組換え発現ベクター、請求項２２および２３に記載の組換えウイルスベクター、ＤＮＡ発現プラスミド、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子ならびに合成ｍＲＮＡから選択される、請求項５４に記載のワクチンの製造のための組換えベクターの使用。

【請求項56】

請求項１～２０のいずれか一項に記載の組換えベクターと、薬学的に許容され得る担体とを混合する工程を含む、請求項２９～３７のいずれか一項に記載のワクチンの製造方法。

【請求項57】

前記組換えベクターが、請求項２１および２４～２６のいずれか一項に記載の組換え発現ベクター、請求項２２および２３に記載の組換えウイルスベクター、ＤＮＡ発現プラスミド、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子ならびに合成ｍＲＮＡから選択される、請求項５６に記載の製造方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、キメラコロナウイルススパイクタンパク質をコードする組換えベクターに関する。本発明はさらに、これらの組換えベクターを含む新しい免疫原性組成物およびワクチンに関する。本発明はさらに、コロナウイルスに対して動物を保護するために、ヒトを含む動物対象にこれらの免疫原性組成物およびワクチンを投与する方法に関する。さらに、本発明は、単独でまたは他の保護剤と組み合わせて免疫原性組成物およびワクチンを作製する方法に関する。

【背景技術】

【0002】

コロナウイルスは、１６個の非構造タンパク質と、数個のアクセサリータンパク質と、（ｉ）ウイルスの表面から突出する大きな糖タンパク質であるスパイク表面タンパク質（スパイクタンパク質またはＳタンパク質）；（ｉｉ）内在性膜（またはマトリックス）タンパク質（Ｍ）；（ｉｉｉ）小膜エンベロープタンパク質（Ｅ）；および（ｉｖ）ヌクレオカプシドタンパク質（Ｎ）という４つの主要な構造タンパク質とをコードする、エンベロープを有する一本鎖非分節型ポジティブセンスＲＮＡウイルスである。コロナウイルスのスパイクタンパク質は、感染される動物の宿主細胞の膜を貫通する宿主標的タンパク質の特定の細胞外ドメインに結合することによって、コロナウイルスの指向性を決定する。標的タンパク質は、受容体と称される。

【0003】

すべてのコロナウイルスＳ糖タンパク質は、合成中に切除されるシグナル配列、ビリオン粒子の外側に存在する外部ドメイン、ビリオン粒子の脂質二重層中へＳタンパク質を固定する役割を担う膜貫通領域、ならびに膜タンパク質（Ｅ）および内在性膜タンパク質（Ｍ）などの他のコロナウイルスタンパク質と相互作用し得る細胞質尾部という４つのドメインからなる。コロナウイルススパイクタンパク質は、電子顕微鏡によってコロナウイルスビリオンスパイクとして観察可能なＩ型糖タンパク質である。Ｓタンパク質は、おそらくＭタンパク質との非共有結合相互作用を介してビリオン膜内に集合するが、コロナウイルス様粒子の形成には必要とされない。カルボキシ末端ドメインによって決定されるコロナウイルス粒子内への組み込み後、Ｓ糖タンパク質は、標的細胞受容体への結合およびウイルス膜と細胞膜の融合を担い、感受性細胞の感染において主要な役割を果たす。

【0004】

コロナウイルスは、トリコロナウイルス、ウシコロナウイルス、イヌコロナウイルス、ネココロナウイルス、ブタコロナウイルス、コウモリコロナウイルスおよびヒトコロナウイルスを含むウイルスの大きなファミリーである。トリコロナウイルスである伝染性気管支炎ウイルス（Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｂｒｏｎｃｈｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ）（ＩＢＶ）は、家禽（ニワトリ）の急性で、伝染性の高い呼吸器疾患である伝染性気管支炎を引き起こす。伝染性気管支炎の臨床徴候には、くしゃみ／スニッキング、気管ラ音、鼻汁および喘鳴が含まれ、成鳥よりも雛においてより明白である。鳥はまた、抑うつ状態であるように見え、食物消費量が減少することがある。肉用鳥は低下した体重増加を有するのに対して、産卵鳥は卵を産む数が少なくなる。呼吸器感染症は、ニワトリを二次的な細菌感染症に罹りやすくし、これは雛では致命的であり得る。ウイルスはまた、特に雛において卵管に永続的な損傷を引き起こすことがあり、産卵および卵の品質の低下をもたらし、腎臓に永続的な損傷を引き起こすことがあり、時には腎臓疾患をもたらし、これは致命的であり得る。

【0005】

新型コロナウイルス感染症（Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ ２０１９）（ＣＯＶＩＤ－１９）と呼ばれている２０１９年～２０２０年の世界的なヒトパンデミックの病原体は、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（Ｓｅｖｅｒｅ Ａｃｕｔｅ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ ２）（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）と呼ばれる呼吸器の（および場合によっては腸の）コロナウイルスである。ヒトにおけるコロナウイルス感染症は、前世紀に報告されていたが、これらは一般に、風邪のような症候群に関連しているのに対して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、２０００年以降３番目の大きなベータコロナウイルスの流行として、２００３年のＳＡＲＳの流行（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）および２０１２年の中東呼吸器症候群コロナウイルス（Ｍｉｄｄｌｅ Ｅａｓｔ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ）（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）に続いている。

【0006】

ＳＡＲＳ－ＣｏＶとＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の両方に対する宿主受容体は、モノカルボキシペプチダーゼとして機能し、血管の健康において重要な役割を果たす亜鉛金属酵素であるＩ型内在性膜タンパク質であるアンジオテンシン変換酵素２（ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ－ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ ２）（ＡＣＥ２）である。ＡＣＥ２の主な機能は、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）の効果を相殺することである。ＡＣＥは、アンジオテンシンＩホルモンを血管収縮性ペプチドアンジオテンシンＩＩに切断するのに対して、ＡＣＥ２は、アンジオテンシンＩＩのＣ末端アミノ酸を切断し、最終的に、反対の作用を有する血管拡張性ペプチドの形成をもたらす。ＡＣＥ２へのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質の結合は、エンドサイトーシスおよび細胞内に位置するエンドソーム内へのウイルスの移行をもたらす。

【0007】

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は人畜共通感染源を有すると考えられており、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、直接または中間動物を介して、コウモリコロナウイルス（コウモリＣｏＶ）から進化した［Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｈｏｓｔ＆Ｍｉｃｒｏｂｅ ２７：１－４（２０２０）］。実際、ＳＡＲＳ－ＣｏＶとＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２はいずれも、潜在的に中間宿主が関与して、ヒトに侵入した様々なＳＡＲＳ様コウモリＣｏＶから進化したと考えられている。ＳＡＲＳ－ＣｏＶは、捕獲されたハクビシン（Ｐａｇｕｍａ ｌａｒｖａｔａ）を介して、コウモリからヒトに侵入したことが示唆されている［Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，前出；Ｇｕａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３０２：２７６－２７８（２００３）］。注目すべきことに、ハクビシンも、ＳＡＲＳ－ＣｏＶに極めて感受性であることが示されている［Ｋａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．ｏｆ Ｖｉｒｏｌ ７９（１８）：１１８９２－１１９００（２００５）；Ｇｕａｎ ｅｔ ａｌ．，前出］。一貫して、それらの全ゲノムのヌクレオチド配列を比較することは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２がＳＡＲＳ－ＣｏＶよりもＳＡＲＳ様コウモリＣｏＶに遺伝的により密接に関連していることを示す［Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，前出］。

【0008】

ＳＡＲＳ－ＣｏＶと同様に、動物園のライオンおよびトラならびにイエネコがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する検査で陽性となったという多数の報告が一般的な報道機関に存在している。イエネコを含むこれらのネコ科動物のいくつかは、感染の臨床徴候および有意な死後肺病変を実証している。最近の報告は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２がフェレット、ハムスターおよびミンクに感染し得ることも示している。

【0009】

今日まで、ヒトがイエネコからＣＯＶＩＤ－１９に罹患したという報告は存在しないが、そのような伝染が起こり得るという大きな不安が残っている。この不安の１つの根拠は、感染したイエネコがエアロゾルによって十分なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を放出して、物理的に離されていた他のネコに感染し得ることを報告する研究から得られる。さらに、それらの抗体陽転率に基づいて、研究は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のネコ間伝染が自然な状況で起こり得ることを示唆している。さらに、最近の研究では、感染したミンクがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２をヒトに伝染させたことが示されている［Ｏｒｅｓｈｋｏｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒｏｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ ２５（２３）（２０２０）：ｐｉｉ＝２００１００５；ｄｏｉ：１０．２８０７／１５６０－７９１７．ＥＳ．２０２０．２５．２３．２００１００５］。

【0010】

若干勇気づけられることに、予備研究において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は比較的少ない遺伝的多様性を示しており、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する適切なネコ科動物ワクチンが成功し得ることを示唆している。理想的には、そのようなワクチンは、ネコへのウイルスの伝染を予防し、ネコがウイルスの保有宿主になるのを予防し、および／または感染したネコによるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の排出を低下させるであろう。現在、２００を超える潜在的なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチンがヒト用に開発されており、研究者は多くの異なるワクチン戦略を採用している。しかしながら、この前例のない努力によってさえ、これらのワクチン戦略の任意の１つがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の拡散またはＣＯＶＩＤ－１９の作用を打ち消す上で大きく前進するワクチンをもたらすかどうかはなお不確実なままである。

【0011】

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する最近の興奮の前でさえ、宿主免疫系に対するヒトコロナウイルススパイクタンパク質の免疫原性および／または利用可能性を増加させるためのヒトコロナウイルススパイクタンパク質の改変は、既にいくらか興味深いものとなっていた。第１の７つ組リピート（ＨＲ１）と中央ヘリックスの間のループ中でのプロリン置換が、融合タンパク質の早期のトリガリングを制限し、残基Ｖ１０６０およびＬ１０６１における２つの連続するプロリン置換（２Ｐと呼ばれる）の導入により、外胚葉収量の５０倍を超える改善をもたらすことを示した、ＨＩＶ－１および呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）由来の融合タンパク質での以前の知見に依拠して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶおよびＨＣｏＶ－ＨＫＵ１由来のスパイクタンパク質中での相同的な置換も、外部ドメインの発現レベルを増加させ、立体構造の均一性を改善したことが実証された［Ｐａｌｌｅｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ １１４：Ｅ７３４８－ｅ７３５７，ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０７３／ｐｎａｓ．１７０７３０４１１４（２０１７）］。さらに、中央ヘリックスの先頭への２つの連続するプロリン残基（２Ｐ）の導入は、ベータコロナウイルスＳタンパク質を原型の前融合立体構造に保持するための一般的な戦略であることが示唆された［Ｐａｌｌｅｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，前出］。より最近では、Ａｍａｎａｔ ｅｔ ａｌ．，［ｄｏｉ：ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１０１／２０２０．０９．１６．３００９７０，（２０２０）］は、２つのプロリンの導入および多塩基性切断部位の除去が、マウスモデルにおいて組換えスパイクをベースとしたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチンの最適な有効性をもたらすことを報告した。ヒトコロナウイルススパイクタンパク質の他の修飾も議論されてきた［Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ ａｎｄ Ｎａｕｊｏｋａｔ，Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２５７：１１８０５６（２０２０）；Ｌｉ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｖｉｏｌ．，３（１）：２３７－２６１（２０１６）；およびＷｉｃｋｒａｍａｓｉｎｇｈｅ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １９４：３７－４８（２０１４）を参照］。

【0012】

ブタにおける致死的なブタ急性下痢症候群（ＳＡＤＳ）の原因因子は、コウモリコロナウイルスであるＨＫＵ２とゲノム配列が９８．４８％同一の新規コロナウイルスである。ＨＫＵ２関連コロナウイルスは、養豚場付近の洞窟内のコウモリ中に、２０１６年に検出された。この新しいコロナウイルスであるブタ急性下痢症候群コロナウイルス（ＳＡＤＳ－ＣｏＶ）は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶと同じキクガシラコウモリ（Ｒｈｉｎｏｌｏｐｈｕｓ）の属に由来する［Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，５５６：２５５－２５８（２０１８）；ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｓ４１５８６－０１８－００１０－９］。

【0013】

水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）は、狂犬病ウイルスを含むラブドウイルス科（Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ）に属する、非分節型マイナス鎖ＲＮＡウイルスである。ＶＳＶは、極性上皮細胞の基底外側表面から優先的に出芽する。この出芽選好は、その糖タンパク質の基底外側局在化と相関する［例えば、Ｄｒｏｋｈｌｙａｎｓｋｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，８９（２２）：１１７１８－１１７２２（２０１５）を参照］。このような細胞膜出芽は、ウイルスが宿主細胞から出ることを可能にし、ウイルスの外側エンベロープを形成するためにウイルスタンパク質が濃縮された宿主由来の膜を獲得しなければならないエンベロープを有するウイルスによって主に使用される。組み立てられたまたは構築されている過程のヌクレオカプシドは、宿主細胞膜における膜湾曲の形成を誘導し、形成している出芽中に包まれ、これは最終的には膜切断によってくびれ切れてエンベロープに包まれた粒子を放出する。

【0014】

アルファウイルス由来のＲＮＡレプリコン粒子（ＲＰ）の使用は、特定の動物病原体に対して保護するために長年にわたってワクチンにおいて使用されてきた多数のベクター戦略の１つである［Ｖａｎｄｅｒ Ｖｅｅｎ，ｅｔ ａｌ．，Ａｎｉｍ Ｈｅａｌｔｈ Ｒｅｓ Ｒｅｖ．１３（１）：１－９．（２０１２）ｄｏｉ：１０．１０１７／Ｓ１４６６２５２３１２００００１１；Ｋａｍｒｕｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．９１（Ｐｔ７）：１７２３－１７２７（２０１０）］。アルファウイルス由来のＲＰは、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）［Ｐｕｓｈｋｏ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２３９：３８９－４０１（１９９７）］、シンドビス（ＳＩＮ）［Ｂｒｅｄｅｎｂｅｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ６７：６４３９－６４４６（１９９３）］およびセムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）［Ｌｉｌｊｅｓｔｒｏｍ ａｎｄ Ｇａｒｏｆｆ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＮＹ）９：１３５６－１３６１（１９９１）］を含むいくつかの異なるアルファウイルスに対して開発されている。アルファウイルスＲＰワクチンは、増殖欠損アルファウイルスＲＮＡレプリコンを宿主細胞中に送達し、インビボで（１または複数の）所望の免疫原性導入遺伝子の発現をもたらす［Ｐｕｓｈｋｏ ｅｔ ａｌ．，前出］。インビトロで検出可能なスパイクタンパク質を発現するＳＡＲＳ－ＣｏＶスパイクタンパク質をコードするハイブリッドＶＥＥＶ／ＳＩＮ複製粒子の構築が報告されている［米国特許第９，７３０，９９７号］。ＲＰはまた、いくつかの伝統的なワクチン製剤と比較した場合、魅力的な安全性および有効性プロファイルを有する［Ｖａｎｄｅｒ Ｖｅｅｎ，ｅｔ ａｌ．Ａｎｉｍ Ｈｅａｌｔｈ Ｒｅｓ Ｒｅｖ．１３（１）：１－９（２０１２）］。さらに、ＶＥＥＶ ＲＰプラットフォームは、イヌおよびネコ由来の病原性抗原をコードするために使用されており［例えば、国際公開第２０１９／０８６６４５号、国際公開第２０１９／０８６６４６号および国際公開第２０１９／１１５０９０号を参照されたい。］、ブタおよび家禽用のいくつかのＵＳＤＡ認可ワクチンの基礎である。

【0015】

本明細書における任意の参考文献の引用は、そのような参考文献が本出願に対する「従来技術」として利用可能であることの承認として解釈されるべきではない。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0016】

【特許文献1】米国特許第９，７３０，９９７号

【特許文献2】国際公開第２０１９／０８６６４５号

【特許文献3】国際公開第２０１９／０８６６４６号

【特許文献4】国際公開第２０１９／１１５０９０号

【非特許文献】

【0017】

【非特許文献1】Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｈｏｓｔ＆Ｍｉｃｒｏｂｅ ２７：１－４（２０２０）

【非特許文献2】Ｇｕａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３０２：２７６－２７８（２００３）

【非特許文献3】Ｋａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．ｏｆ Ｖｉｒｏｌ ７９（１８）：１１８９２－１１９００（２００５）

【非特許文献4】Ｏｒｅｓｈｋｏｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒｏｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ ２５（２３）（２０２０）：ｐｉｉ＝２００１００５；ｄｏｉ：１０．２８０７／１５６０－７９１７．ＥＳ．２０２０．２５．２３．２００１００５

【非特許文献5】Ｐａｌｌｅｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ １１４：Ｅ７３４８－ｅ７３５７，ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０７３／ｐｎａｓ．１７０７３０４１１４（２０１７）

【非特許文献6】Ａｍａｎａｔ ｅｔ ａｌ．，［ｄｏｉ：ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１０１／２０２０．０９．１６．３００９７０，（２０２０）］

【非特許文献7】Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ ａｎｄ Ｎａｕｊｏｋａｔ，Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２５７：１１８０５６（２０２０）；Ｌｉ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｖｉｏｌ．，３（１）：２３７－２６１（２０１６）

【非特許文献8】Ｗｉｃｋｒａｍａｓｉｎｇｈｅ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １９４：３７－４８（２０１４）

【非特許文献9】Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，５５６：２５５－２５８（２０１８）；ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｓ４１５８６－０１８－００１０－９

【非特許文献10】Ｄｒｏｋｈｌｙａｎｓｋｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，８９（２２）：１１７１８－１１７２２（２０１５）

【非特許文献11】Ｖａｎｄｅｒ Ｖｅｅｎ，ｅｔ ａｌ．，Ａｎｉｍ Ｈｅａｌｔｈ Ｒｅｓ Ｒｅｖ．１３（１）：１－９．（２０１２）ｄｏｉ：１０．１０１７／Ｓ１４６６２５２３１２００００１１

【非特許文献12】Ｋａｍｒｕｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．９１（Ｐｔ７）：１７２３－１７２７（２０１０）

【非特許文献13】Ｐｕｓｈｋｏ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２３９：３８９－４０１（１９９７）

【非特許文献14】Ｂｒｅｄｅｎｂｅｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ６７：６４３９－６４４６（１９９３）

【非特許文献15】Ｌｉｌｊｅｓｔｒｏｍ ａｎｄ Ｇａｒｏｆｆ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＮＹ）９：１３５６－１３６１（１９９１）

【非特許文献16】Ｖａｎｄｅｒ Ｖｅｅｎ，ｅｔ ａｌ．Ａｎｉｍ Ｈｅａｌｔｈ Ｒｅｓ Ｒｅｖ．１３（１）：１－９（２０１２）

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0018】

したがって、本発明は、修飾されたコロナウイルススパイクタンパク質をコードする組換えベクターを提供する。特定の態様において、修飾されたコロナウイルススパイクタンパク質は、キメラコロナウイルススパイクタンパク質である。修飾されたコロナウイルススパイクタンパク質（例えば、キメラコロナウイルススパイクタンパク質）をコードするベクターは、免疫原性組成物においておよび／またはワクチンにおいて使用することができる。具体的な態様において、組換えベクターは組換え発現ベクターである。他の態様において、組換えベクターは合成メッセンジャーＲＮＡ（合成ｍＲＮＡ）である。

【0019】

本発明の一局面は、コロナウイルスに由来するスパイクタンパク質と、前記コロナウイルススパイクタンパク質の膜貫通ドメイン（ＴＭＤ）およびＣ末端ドメイン（ＣＴＤ）の代わりに、宿主細胞の細胞膜から出芽する出芽ウイルス（ＢＶ_ｐｍ）に由来する表面糖タンパク質からのＴＭＤおよびＣＴＤとを含むキメラコロナウイルススパイクタンパク質をコードする組換えベクターを提供する。この種類の特定の態様において、組換えベクターは組換えＢＶ_ｐｍであり、表面糖タンパク質のＴＭＤおよびＣＴＤは、組換えＢＶ_ｐｍのウイルス種とは異なるウイルス種に由来する。

【0020】

組換えベクターのある態様において、ＢＶ_ｐｍに由来する表面糖タンパク質は、ＶＳＶからの糖タンパク質（Ｇタンパク質）である。組換えベクターの他の態様において、ＢＶ_ｐｍに由来する表面糖タンパク質は、インフルエンザウイルスのヘマグルチニンである。組換えベクターのさらに他の態様において、ＢＶ_ｐｍに由来する表面糖タンパク質は、インフルエンザウイルスのノイラミニダーゼである。組換えベクターのさらに他の態様において、ＢＶ_ｐｍに由来する表面糖タンパク質は、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）のヘマグルチニン－ノイラミニダーゼ（ＨＮ）タンパク質である。組換えベクターのさらに他の態様において、ＢＶ_ｐｍに由来する表面糖タンパク質は、ＮＤＶの融合（Ｆ）タンパク質である。組換えベクターのさらに他の態様において、ＢＶ_ｐｍに由来する表面糖タンパク質は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）の糖タンパク質１２０（ｇｐ１２０）である。組換えベクターのさらに他の態様において、ＢＶ_ｐｍに由来する表面糖タンパク質は、ラッサウイルスの糖タンパク質（ＧＰ）である。組換えベクターのさらに他の態様において、ＢＶ_ｐｍに由来する表面糖タンパク質は、エボラウイルスのＧＰである。組換えベクターのさらに他の態様において、ＢＶ_ｐｍに由来する表面糖タンパク質は、麻疹ウイルス（ＭＶ）のＦタンパク質である。組換えベクターのさらに他の態様において、ＢＶ_ｐｍに由来する表面糖タンパク質は、ＭＶのＨＮタンパク質である。

【0021】

関連する局面において、本発明は、キメラコロナウイルススパイクタンパク質のフューリン切断部位が不活化されているキメラコロナウイルススパイクタンパク質をコードする組換えベクターを提供する。他の態様において、キメラコロナウイルススパイクタンパク質の中央ヘリックスの最初の２つの連続するアミノ酸残基が一対のプロリン残基（２Ｐ）によって置き換えられているために、前融合状態でさらに安定化されているキメラコロナウイルススパイクタンパク質をコードする組換えベクター。

【0022】

関連する態様において、組換えベクターは、キメラコロナウイルススパイクタンパク質のフューリン切断部位が不活化されており、かつコロナウイルススパイクタンパク質の中央ヘリックスの最初の２つの連続するアミノ酸残基が一対のプロリン残基（２Ｐ）によって置き換えられているために、キメラコロナウイルススパイクタンパク質が前融合状態でさらに安定化されている、キメラコロナウイルススパイクタンパク質をコードする。

【0023】

特定の態様において、組換えベクターは、キメラコロナウイルススパイクタンパク質のコロナウイルススパイクタンパク質部分が哺乳動物コロナウイルスに由来するキメラコロナウイルススパイクタンパク質を含む。組換えベクターのある態様において、キメラコロナウイルススパイクタンパク質のコロナウイルススパイクタンパク質部分は、ウシコロナウイルスに由来する。組換えベクターのさらに他の態様において、キメラコロナウイルススパイクタンパク質のコロナウイルススパイクタンパク質部分は、イヌコロナウイルスに由来する。組換えベクターのさらに他の態様において、キメラコロナウイルススパイクタンパク質のコロナウイルススパイクタンパク質部分は、ネココロナウイルスに由来する。組換えベクターのさらに他の態様において、キメラコロナウイルススパイクタンパク質のコロナウイルススパイクタンパク質部分は、ブタコロナウイルスに由来する。この種類の組換えベクターの特定の態様において、ブタコロナウイルスはＳＡＤＳ－ＣｏＶである。この種類の組換えベクターの他の特定の態様において、ブタコロナウイルスはブタ流行性下痢ウイルス（ＰＥＤＶ）である。組換えベクターのさらに他の態様において、キメラコロナウイルススパイクタンパク質のコロナウイルススパイクタンパク質部分は、コウモリコロナウイルスに由来する。

【0024】

組換えベクターのさらに特定の態様において、キメラコロナウイルススパイクタンパク質のコロナウイルススパイクタンパク質部分は、ヒトリコロナウイルスに由来する。この種類の組換えベクターの具体的な態様において、キメラコロナウイルススパイクタンパク質のコロナウイルススパイクタンパク質部分は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶに由来する。この種類の組換えベクターのさらに他の態様において、キメラコロナウイルススパイクタンパク質のコロナウイルススパイクタンパク質部分は、ＭＥＲＳに由来する。この種類の組換えベクターのさらにより特定の態様において、キメラコロナウイルススパイクタンパク質のコロナウイルススパイクタンパク質部分は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に由来する。

【0025】

組換えベクターの具体的な態様において、キメラコロナウイルススパイクタンパク質は、アミノ酸残基の同じ範囲にわたって、配列番号１０のアミノ酸配列のアミノ酸残基１４～１２１１と８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、９９．５％またはそれを超える同一性を含み、キメラコロナウイルススパイクタンパク質は、不活化されたフューリン切断部位を含む。この種類の組換えベクターのより具体的な態様において、キメラコロナウイルススパイクタンパク質は、アミノ酸残基の同じ範囲にわたって、配列番号１０のアミノ酸配列のアミノ酸残基１２１２～１２６０と８０％、８５％、９０％、９５％、９７％またはそれを超える同一性をさらに含む。組換えベクターのさらにより具体的な態様において、キメラコロナウイルススパイクタンパク質は、配列番号１０のアミノ酸配列を含む。

【0026】

組換えベクターの他の具体的な態様において、キメラコロナウイルススパイクタンパク質は、アミノ酸残基の同じ範囲にわたって、配列番号１２のアミノ酸配列のアミノ酸残基１４～１２１１と８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、９９．５％またはそれを超える同一性を含み、キメラコロナウイルススパイクタンパク質は、不活化されたフューリン切断部位の両方を含み、配列番号１２の位置９８６のリジン（Ｋ）残基および位置９８７のバリン（Ｖ）残基は、一対のプロリン残基（２Ｐ）によって置き換えられている。この種類の組換えベクターのより具体的な態様において、キメラコロナウイルススパイクタンパク質は、アミノ酸残基の同じ範囲にわたって、配列番号１２のアミノ酸配列のアミノ酸残基１２１２～１２６０と８０％、８５％、９０％、９５％、９７％またはそれを超える同一性をさらに含む。組換えベクターのさらにより具体的な態様において、キメラコロナウイルススパイクタンパク質は、配列番号１２のアミノ酸配列を含む。

【0027】

組換えベクターのさらに他の態様において、キメラコロナウイルススパイクタンパク質のコロナウイルススパイクタンパク質部分は、トリコロナウイルスに由来する。この種類の組換えベクターの特定の態様において、トリコロナウイルスはＩＢＶである。組換えベクターのより具体的な態様において、ＩＢＶはマサチューセッツ血清型である。組換えベクターのこの種類のさらにより特定の態様において、キメラコロナウイルススパイクタンパク質のコロナウイルススパイクタンパク質部分は、ＩＢＶ－Ｍａ５に由来する。組換えベクターの他の態様において、キメラコロナウイルススパイクタンパク質のコロナウイルススパイクタンパク質部分は、血清型４／９１ＩＢＶに由来する。組換えベクターのさらに他の関連する態様において、キメラコロナウイルススパイクタンパク質のコロナウイルススパイクタンパク質部分は、血清型ＱＸ ＩＢＶに由来する。

【0028】

これらの組換えベクターの具体的な態様において、キメラコロナウイルススパイクタンパク質は、アミノ酸残基の同じ範囲にわたって、配列番号４のアミノ酸配列のアミノ酸残基１９～１０９１と８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、９９．５％またはそれを超える同一性を含み、キメラコロナウイルススパイクタンパク質は、不活化されたフューリン切断部位を含む。この種類の組換えベクターのより具体的な態様において、キメラコロナウイルススパイクタンパク質は、アミノ酸残基の同じ範囲にわたって、配列番号４のアミノ酸配列のアミノ酸残基１０９２～１１４０と８０％、８５％、９０％、９５％、９７％またはそれを超える同一性をさらに含む。組換えベクターのさらにより具体的な態様において、キメラコロナウイルススパイクタンパク質は、配列番号４のアミノ酸配列を含む。

【0029】

組換えベクターの他の具体的な態様において、キメラコロナウイルススパイクタンパク質は、アミノ酸残基の同じ範囲にわたって、配列番号６のアミノ酸配列のアミノ酸残基１９～１０９１と８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、９９．５％またはそれを超える同一性を含み、キメラコロナウイルススパイクタンパク質は、不活化されたフューリン切断部位の両方を含み、配列番号６の位置８５９のアラニン（Ａ）残基および位置８６０のイソロイシン（Ｉ）残基は、一対のプロリン残基（２Ｐ）によって置き換えられている。この種類の組換えベクターのより具体的な態様において、キメラコロナウイルススパイクタンパク質は、アミノ酸残基の同じ範囲にわたって、配列番号６のアミノ酸配列のアミノ酸残基１０９２～１１４０と８０％、８５％、９０％、９５％、９７％またはそれを超える同一性をさらに含む。組換えベクターのさらにより具体的な態様において、キメラコロナウイルススパイクタンパク質は、配列番号６のアミノ酸配列を含む。

【0030】

本発明の一局面において、本発明の組換えベクターは、組換え発現ベクターである。この種類の特定の態様において、組換え発現ベクターは組換えウイルスベクターである。他の態様において、組換え発現ベクターはＤＮＡ発現プラスミドである。

【0031】

特定の態様において、組換えウイルスベクターは組換えトリウイルスベクターである。この種類のより特定の態様において、組換えウイルスベクターはシチメンチョウの組換えヘルペスウイルス（ＨＶＴ）である。さらに他の態様において、組換えウイルスベクターは組換え弱毒化マレック病ウイルス１型（ＭＤＶ１）である。さらに他の態様において、組換えウイルスベクターは組換え弱毒化マレック病ウイルス２型（ＭＤＶ２）である。さらに他の態様において、組換えウイルスベクターは組換え弱毒化ＮＤＶである。

【0032】

他の態様において、組換えウイルスベクターは組換え弱毒化ＭＶである。さらに他の態様において、組換えウイルスベクターはアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子（ＲＰ）である。この種類の具体的な態様において、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子はＶＥＥＶ ＲＮＡレプリコン粒子である。さらにより特定の態様において、アルファウイルスＲＮＡ ＲＰは、ＶＥＥＶの非病原性ＴＣ－８３株のカプシドタンパク質および糖タンパク質を含む。

【0033】

具体的な態様において、組換えウイルスベクターは、本発明のキメラコロナウイルススパイクタンパク質をコードするＶＥＥＶ ＲＮＡレプリコン粒子である。より具体的な態様において、キメラコロナウイルススパイクタンパク質は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＶＳＶスパイクタンパク質である。

【0034】

他の具体的な態様において、組換えウイルスベクターは、本発明のキメラコロナウイルススパイクタンパク質をコードする組換えＨＶＴベクターである。より具体的な態様において、キメラコロナウイルススパイクタンパク質は、本発明のキメラＩＢＶ－ＶＳＶスパイクタンパク質である。

【0035】

さらに他の態様において、組換え発現ベクターはＤＮＡ発現プラスミドである。この種類の特定の態様において、ＤＮＡ発現プラスミドはＲＮＡレプリコンをコードする。さらにより特定の態様において、ＲＮＡレプリコンはＶＥＥＶ ＲＮＡレプリコンである。

【0036】

さらに他の態様において、組換えベクターは合成ｍＲＮＡである。

【0037】

特定の態様において、組換えベクターは、１つまたは複数の他の抗原をさらにコードする。この種類のある態様において、組換えベクターは、キメラコロナウイルススパイクタンパク質を含み、第２のコロナウイルス抗原をさらにコードする。この種類の具体的な態様において、キメラコロナウイルススパイクタンパク質は、キメラＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質であり、第２のコロナウイルス抗原は、第２のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質抗原である。より特定の態様において、第２のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質抗原は、内在性膜（またはマトリックス）タンパク質（Ｍ）である。他の態様において、第２のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質抗原は、小膜エンベロープタンパク質（Ｅ）である。さらに他の態様において、第２のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質抗原はヌクレオカプシドタンパク質（Ｎ）である。より特定の態様において、第２のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質抗原は、２つのキメラＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質のスパイクタンパク質部分がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の異なる株に由来する第２のキメラＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質である。

【0038】

他の態様において、組換えベクターは、必要に応じて第２のキメラＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質および／または第２のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原ならびに非ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２からの抗原と一緒に、第１のキメラＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質をコードする。ある態様において、非ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原は、ネコカリシウイルス（ＦＣＶ）カプシドタンパク質である。さらに他の態様において、非ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原は狂犬病ウイルス糖タンパク質（Ｇ）である。さらに他の態様において、非ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原は、ネコ白血病ウイルス（ＦｅＬＶ）エンベロープタンパク質である。さらに他の態様において、非ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原はヒトインフルエンザウイルスタンパク質である。この種類の特定の態様において、ヒトインフルエンザウイルスタンパク質はヘマグルチニンである。別の態様において、ヒトインフルエンザウイルスタンパク質はノイラミニダーゼである。

【0039】

本発明はさらに、本発明の組換えベクターの１つまたは複数を含む免疫原性組成物を提供する。特定の態様において、免疫原性組成物は、薬学的に許容され得る担体を含む。組換えベクターは、組換え発現ベクター、例えば組換えウイルスベクターおよびＤＮＡ発現プラスミド、または合成ｍＲＮＡであり得る。本発明はさらに、免疫原性組成物の１つまたは複数と薬学的に許容され得る担体とを含むワクチンを提供する。

【0040】

したがって、本発明の免疫原性組成物および／またはワクチンは、任意の組換えウイルスベクター、本発明の任意のＤＮＡ発現プラスミドおよび／または本発明の任意の合成ｍＲＮＡを含む、本発明の任意の組換えベクターの１つまたは複数を含むことができる。ある態様において、免疫原性組成物および／またはワクチンは、薬学的に許容され得る担体をさらに含む。

【0041】

ある態様において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による感染からの哺乳動物の保護を補助するワクチンは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に由来するスパイクタンパク質と、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質のＴＭＤおよびＣＴＤの代わりに、宿主細胞の細胞膜から出芽する出芽ウイルス（ＢＶ_ｐｍ）に由来する表面糖タンパク質からのＴＭＤおよびＣＴＤとを含むキメラＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質をコードする組換えベクターを含む。この種類の特定の態様において、組換えベクターは組換えＢＶ_ｐｍであり、表面糖タンパク質のＴＭＤおよびＣＴＤは、組換えＢＶ_ｐｍのウイルス種とは異なるウイルス種に由来する。より具体的な態様において、ＢＶ_ｐｍの表面糖タンパク質は、水疱性口内炎ウイルスのＧタンパク質である。この種類のある態様において、哺乳動物はヒトである。他の態様において、ワクチンは、ネコ科動物またはフェレットにおけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の感染に起因する、ネコ科動物またはフェレットにおけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の排出を低減させることを補助するためのものである。

【0042】

したがって、ある態様において、本発明のワクチンは、ワクチン接種された哺乳動物において殺菌免疫を誘導する。さらに他の態様において、本発明のワクチンは、ワクチン接種された哺乳動物からナイーブ哺乳動物へのコロナウイルスの伝染を防止する。関連する態様において、本発明のワクチンは、ワクチン接種された哺乳動物において殺菌免疫を誘導し、かつワクチン接種された哺乳動物からナイーブ哺乳動物へのコロナウイルスの伝染を防止する。この種類の特定の態様において、ワクチン接種された哺乳動物はネコ科動物である。この種類のより特定の態様において、ワクチン接種された哺乳動物はネコ（例えば、イエネコ）である。さらに他の態様において、ナイーブ哺乳動物はネコ科動物である。この種類のより特定の態様において、ネコ科動物はネコ（例えば、イエネコ）である。関連する態様において、ワクチン接種された哺乳動物とナイーブ哺乳動物の両方がネコ（例えば、イエネコ）である。ある態様において、このような哺乳動物（例えば、ネコ科動物）ワクチンは、アジュバントを含む。他のこのような態様において、哺乳動物（例えば、ネコ科動物）ワクチンはアジュバントを含まないワクチンである。

【0043】

代替の態様において、ワクチンは、トリにおけるＩＢＶの感染に起因するトリにおける伝染性気管支炎の保護を補助するためのものであり、ＩＢＶに由来するスパイクタンパク質と、コロナウイルススパイクタンパク質のＴＭＤおよびＣＴＤの代わりに、宿主細胞の細胞膜から出芽する出芽ウイルス（ＢＶ_ｐｍ）に由来する表面糖タンパク質からのＴＭＤおよびＣＴＤとを含むキメラＩＢＶスパイクタンパク質をコードする組換えベクターを含む。この種類の特定の態様において、組換えベクターは組換えＢＶ_ｐｍであり、表面糖タンパク質のＴＭＤおよびＣＴＤは、組換えＢＶ_ｐｍのウイルス種とは異なるウイルス種に由来する。より具体的な態様において、ＢＶ_ｐｍの表面糖タンパク質は、水疱性口内炎ウイルスのＧタンパク質である。関連する態様において、ワクチンは、ニワトリにおけるＩＢＶの感染に起因する伝染性気管支炎からのニワトリの保護を補助するためのものである。

【0044】

本発明はさらに、本発明のワクチンの免疫学的有効量を哺乳動物に投与することを含む、コロナウイルス、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対して哺乳動物を免疫する方法を提供する。ある態様において、投与する方法は筋肉内投与（ＩＭ）によって行われる。ある態様において、投与する方法は皮下投与（ＳＣ）によって行われる。さらに他の態様において、投与する方法は皮内投与（ＩＤ）によって行われる。さらに他の態様において、投与する方法は経口投与によって行われる。さらに他の態様において、投与する方法は鼻腔内投与によって行われる。本発明のワクチンは、単回用量投与として（例えば、単回用量ワクチンとして）または１もしくは複数のその後の追加免疫投与のいずれかで投与することができる。

【0045】

特定の態様において、哺乳動物はネコ科動物である。より特定の態様において、ネコ科動物はイエネコである。さらに他の態様において、ネコ科動物はライオンである。さらに他の態様において、ネコ科動物はトラである。関連する態様において、哺乳動物はフェレットである。代替の態様において、哺乳動物はヒトである。

【0046】

本発明はさらに、有効量の本発明のワクチンの１つを哺乳動物に投与し、これにより哺乳動物ワクチンを提供することを含む、哺乳動物においてコロナウイルスに対する殺菌免疫を誘導する方法を提供する。さらに他の態様において、本発明は、有効量の本発明の哺乳動物ワクチンの１つを哺乳動物に投与することを含む、ワクチン接種された哺乳動物からナイーブ哺乳動物へのコロナウイルスの伝染を防止する方法を提供する。関連する態様において、本発明は、有効量の本発明の哺乳動物ワクチンの１つを哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物においてコロナウイルスに対する殺菌免疫を誘導し、かつワクチン接種された哺乳動物からナイーブ哺乳動物へのコロナウイルスの伝染を防止する方法を提供する。この種類の特定の態様において、ワクチン接種された哺乳動物はネコ科動物である。この種類のより特定の態様において、ワクチン接種される哺乳動物はネコ（例えば、イエネコ）である。さらに他の態様において、ナイーブ哺乳動物はネコ科動物である。この種類のより特定の態様において、ネコ科動物はネコ（例えば、イエネコ）である。関連する態様において、ワクチン接種される哺乳動物およびナイーブ哺乳動物はいずれもネコ（例えば、イエネコ）である。ある態様において、このような哺乳動物（例えば、ネコ科動物）ワクチンは、アジュバントを含む。他のこのような態様において、哺乳動物（例えば、ネコ科動物）ワクチンはアジュバントを含まないワクチンである。

【0047】

本発明はさらに、本発明のワクチンの免疫学的有効量をトリに投与することを含む、ＩＢＶに対してトリを免疫する方法を提供する。したがって、本発明のワクチンは、非経口投与によってトリに投与することができる。特定の態様において、ワクチンは、筋肉内投与（ＩＭ）によってトリに投与される。さらに他の態様において、ワクチンは皮下投与（ＳＣ）によってトリに投与される。さらに他の態様において、ワクチンは、皮内投与（ＩＤ）によってトリに投与される。さらに他の態様において、ワクチンは経口投与によってトリに投与される。さらに他の態様において、ワクチンは、鼻腔内投与によってトリに投与される。さらに他の態様において、ワクチンは、卵内投与によってトリに投与される。さらに他の態様において、ワクチンは、乱切によってトリに投与される。より具体的な態様において、トリはニワトリである。本発明のワクチンは、単回用量投与として（例えば、単回用量ワクチンとして）または１もしくは複数のその後の追加免疫投与のいずれかで投与することができる。

【0048】

本発明の組換えベクター、例えば、キメラＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質をコードするアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子またはキメラＩＢＶスパイクタンパク質をコードする組換えＨＶＴを含む免疫原性組成物および／またはワクチン（多価ワクチンを含む）は、アジュバントの存在下または非存在下で投与することができる。

【0049】

特定の態様において、アジュバントは、２種以上の油、例えば鉱油と１つまたは複数の非鉱油を含むオイルアジュバントである。この種類のある態様において、オイルアジュバントは、鉱油として流動パラフィン油と、スクアラン、スクアレン、ビタミンＥ、ビタミンＥ－アセタート、オレアートおよびオレイン酸エチルから選択される１つまたは複数の非鉱油とを含む。より特定の態様において、オイルアジュバントは、流動パラフィン油およびビタミンＥ－アセタートを含む。代替の態様において、ワクチンはアジュバントを含まず、アジュバントを含まないワクチンである。

【0050】

さらに別の局面において、本発明は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に由来するスパイクタンパク質と、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質のＴＭＤおよびＣＴＤの代わりに、水疱性口内炎ウイルスに由来する表面糖タンパク質のＴＭＤおよびＣＴＤとを含むキメラコロナウイルススパイクタンパク質を提供する。具体的な態様において、キメラコロナウイルススパイクタンパク質は、アミノ酸残基の同じ範囲にわたって、配列番号１０のアミノ酸配列のアミノ酸残基１４～１２１１と８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、９９．５％またはそれを超える同一性を含み、キメラコロナウイルススパイクタンパク質は、不活化されたフューリン切断部位を含む。この種類のより具体的な態様において、キメラコロナウイルススパイクタンパク質は、アミノ酸残基の同じ範囲にわたって、配列番号１０のアミノ酸配列のアミノ酸残基１２１２～１２６０と８０％、８５％、９０％、９５％、９７％またはそれを超える同一性をさらに含む。さらにより具体的な態様において、キメラコロナウイルススパイクタンパク質は、配列番号１０のアミノ酸配列を含む。

【0051】

具体的な態様において、キメラコロナウイルススパイクタンパク質は、アミノ酸残基の同じ範囲にわたって、配列番号１２のアミノ酸配列のアミノ酸残基１４～１２１１と８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、９９．５％またはそれを超える同一性を含み、キメラコロナウイルススパイクタンパク質は、不活化されたフューリン切断部位の両方を含み、配列番号１２の位置９８６のリジン（Ｋ）残基および位置９８７のバリン（Ｖ）残基は、一対のプロリン残基（２Ｐ）によって置き換えられている。この種類のある態様において、キメラコロナウイルススパイクタンパク質は、アミノ酸残基の同じ範囲にわたって、配列番号１２のアミノ酸配列のアミノ酸残基１２１２～１２６０と８０％、８５％、９０％、９５％、９７％またはそれを超える同一性をさらに含む。さらにより具体的な態様において、キメラコロナウイルススパイクタンパク質は、配列番号１２のアミノ酸配列を含む。

【0052】

本発明はさらに、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に由来するスパイクタンパク質と、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質のＴＭＤおよびＣＴＤの代わりに、水疱性口内炎ウイルスに由来する表面糖タンパク質のＴＭＤおよびＣＴＤとを含むキメラコロナウイルススパイクタンパク質の１つまたは複数をコードする核酸を提供する。

【0053】

さらに別の局面において、本発明は、ＩＢＶに由来するスパイクタンパク質と、ＩＢＶスパイクタンパク質のＴＭＤおよびＣＴＤの代わりに、水疱性口内炎ウイルスに由来する表面糖タンパク質のＴＭＤおよびＣＴＤとを含むキメラコロナウイルススパイクタンパク質を提供する。具体的な態様において、キメラコロナウイルススパイクタンパク質は、アミノ酸残基の同じ範囲にわたって、配列番号４のアミノ酸配列のアミノ酸残基１９～１０９１と８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、９９．５％またはそれを超える同一性を含み、キメラコロナウイルススパイクタンパク質は、不活化されたフューリン切断部位を含む。より具体的な態様において、キメラコロナウイルススパイクタンパク質は、アミノ酸残基の同じ範囲にわたって、配列番号４のアミノ酸配列のアミノ酸残基１０９２～１１４０と８０％、８５％、９０％、９５％、９７％またはそれを超える同一性をさらに含む。さらにより具体的な態様において、キメラコロナウイルススパイクタンパク質は、配列番号４のアミノ酸配列を含む。

【0054】

具体的な態様において、キメラコロナウイルススパイクタンパク質は、アミノ酸残基の同じ範囲にわたって、配列番号６のアミノ酸配列のアミノ酸残基１９～１０９１と８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、９９．５％またはそれを超える同一性を含み、キメラコロナウイルススパイクタンパク質は、不活化されたフューリン切断部位の両方を含み、配列番号６の位置８５９のアラニン（Ａ）残基および位置８６０のイソロイシン（Ｉ）残基は、一対のプロリン残基（２Ｐ）によって置き換えられている。この種類のある態様において、キメラコロナウイルススパイクタンパク質は、アミノ酸残基の同じ範囲にわたって、配列番号６のアミノ酸配列のアミノ酸残基１０９２～１１４０と８０％、８５％、９０％、９５％、９７％またはそれを超える同一性をさらに含む。さらにより具体的な態様において、キメラコロナウイルススパイクタンパク質は、配列番号６のアミノ酸配列を含む。

【0055】

本発明はさらに、ＩＢＶに由来するスパイクタンパク質と、ＩＢＶスパイクタンパク質のＴＭＤおよびＣＴＤの代わりに、水疱性口内炎ウイルスに由来する表面糖タンパク質のＴＭＤおよびＣＴＤとを含むキメラコロナウイルススパイクタンパク質の１つまたは複数をコードする核酸を提供する。

【0056】

本発明のこれらおよび他の局面は、以下の図面の簡単な説明および詳細な説明を参照することによってよりよく理解されよう。

【図面の簡単な説明】

【0057】

【図1】市販のＩＤ Ｓｃｒｅｅｎ（登録商標）Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｂｒｏｎｃｈｉｔｉｓ Ｉｎｄｉｒｅｃｔ（ＩＤＶｅｔ）試験からの結果を示す。

【図2】修飾されたＩＢＶスパイクタンパク質をコードする組換えウイルス構築物を用いた線毛運動障害アッセイからの結果を示す。

【図3】ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ Ｓｕｒｒｏｇａｔｅ Ｐｓｅｕｄｏ－ＶＮ試験の結果を示す。

【図4】初回ワクチン接種から３週間後の追加免疫ワクチン接種後のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ Ｓｕｒｒｏｇａｔｅ Ｐｓｅｕｄｏ－ＶＮ試験の結果を示す。

【図5A】モルモットモデルにおけるワクチン候補の免疫原性研究を示す。図５Ａは、動物取扱の概要を提供する：Ｖ＝ワクチン接種およびＢ＝採血。

【図5B】モルモットモデルにおけるワクチン候補の免疫原性研究を示す。図５Ｂは、２１日目（Ｄ２１）からの１０倍希釈血清試料を使用して実施されたサロゲートＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス中和（ＶＮ）試験を示す。

【図5C】モルモットモデルにおけるワクチン候補の免疫原性研究を示す。図５Ｃは、初回ワクチン接種から３５、４９および６３／６４日後（ｄ．ｐ．ｖ．）からの１，０００倍希釈血清試料を使用して実施されたサロゲートＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＶＮ試験を示す。円を伴う黒い線はスパイク－ｗｔ抗原によって誘導された抗体レベルを示し、四角を伴う灰色の線はスパイク－ＦＣＳ－２Ｐ－ＶＳＶ抗原によって誘導された抗体レベルを示す。

【図5D】モルモットモデルにおけるワクチン候補の免疫原性研究を示す。図５Ｄは、抗原としてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ スパイク ＲＢＤ（左）または外部ドメイン（右）を使用した間接的ＥＬＩＳＡの結果を示す。スパイク－ｗｔ抗原（円を伴う黒い線）またはスパイク－ＦＣＳ－２Ｐ－ＶＳＶ抗原（四角を伴う灰色の線）に曝露されたネコからの血清のＥＣ５０値（希釈倍率として表される）が示されている。

【図5E】モルモットモデルにおけるワクチン候補の免疫原性研究を示す。図５Ｅは、７０／７１日目に採取した血液からのリンパ球刺激試験（ＬＳＴ）の結果を提供する。精製されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ１抗原を使用して単離されたリンパ球を刺激し、刺激の９６時間後に増殖を測定した。

【図5F】モルモットモデルにおけるワクチン候補の免疫原性研究を示す。図５Ｆは、７０／７１日目に採取した２倍希釈されたスワブ試料を使用して実施したサロゲートＶＮ試験を提供する。

【図6A】ネコにおけるワクチン接種－攻撃誘発実験を示す。図６Ａは、動物取扱の概要を提供する：Ｖ＝ワクチン接種、Ｂ＝採血、Ｏ＝中咽頭スワブ、Ｎ＝鼻洗浄、（ａｌｌ）＝すべての動物、（ｃｈ）＝攻撃誘発された動物のみ、（ｓｅｎ）＝歩哨動物のみ。

【図6B】ネコにおけるワクチン接種－攻撃誘発実験を示す。図６Ｂは、ワクチン接種の２１および４５日後（ｄ．ｐ．ｖ．）にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＶＮ試験を用いて決定された血清中和抗体価を示す。白抜き四角を伴う黒い線は対照ワクチン接種動物における抗体レベルを示し、黒三角を伴う黒い線は非ワクチン接種歩哨動物における抗体レベルを示し、塗りつぶされた四角を伴う灰色の線はスパイク－ＦＣＳ－２Ｐ－ＶＳＶ抗原によって誘導される抗体価を示す。

【図6C】ネコにおけるワクチン接種－攻撃誘発実験を示す。図６Ｃは、攻撃誘発の日、ワクチン接種の４５日後（白抜き四角）および攻撃誘発の１２日後（攻撃誘発）または１４日後（歩哨）（黒塗りの四角）にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＶＮ試験を用いて決定された血清中和抗体価を示す。

【図6D】ネコにおけるワクチン接種－攻撃誘発実験を示す。図６Ｄは、攻撃誘発の１日後から８日後（ｄ．ｐ．ｃ．）までの中咽頭スワブにおけるｐｆｕ／ｍｌでのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス力価を示す白抜きの四角を伴う黒い線は、攻撃誘発された対照ワクチン接種動物におけるウイルス力価を示し、三角を伴う黒い線は、対照ワクチン接種動物と一緒に飼育された非ワクチン接種歩哨動物におけるウイルス力価を示し、塗りつぶされた四角を伴う灰色の線は、スパイク－ＦＣＳ－２Ｐ－ＶＳＶ抗原でワクチン接種された動物におけるウイルス力価を示し、下向きの三角を伴う黒い線は、スパイク－ＦＣＳ－２Ｐ－ＶＳＶ抗原でワクチン接種された動物と一緒に飼育された非ワクチン接種歩哨動物におけるウイルス力価を示す。

【図6E】ネコにおけるワクチン接種－攻撃誘発実験を示す。図６Ｅは、攻撃誘発後の鼻腔洗浄におけるプラーク形成単位（ｐｆｕ）／ｍｌでのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス力価を示す。図６Ｅの線および記号は、図６Ｄと同じである。

【図7】野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク抗原（スパイク－ｗｔ）および安定化されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク抗原（スパイク－ＦＣＳ－２Ｐ－ＶＳＶ）の概略図を提供する。異なるスパイクタンパク質ドメインは、異なる灰色の陰影で示されている。また、フューリン切断部位変異（ΔＦＣＳ、Ｒ６８２Ａ／Ｒ６８３Ａ）、２Ｐ置換（Ｋ９８６Ｐ／Ｖ９８７Ｐ）およびＴＭ－ＣＴＤ置換が示されている。

【図8】Ｖｅｒｏ宿主細胞に対するＦＡＣＳによって試験した場合の、それぞれＢＣｏＶ由来のキメラスパイクタンパク質の総発現レベルおよび表面発現レベルに対する効果を記載する。

【図9】Ｖｅｒｏ宿主細胞に対するＦＡＣＳによって試験した場合の、それぞれＳＡＤＳ－ＣｏＶ由来のキメラスパイクタンパク質の総発現レベルおよび表面発現レベルに対する効果を記載する。詳細は実施例１１に示されている。

【発明を実施するための形態】

【0058】

本発明は、ヒト、ネコ科動物およびフェレットなどの哺乳動物において、ニワトリなどのトリ、ブタ、ウシおよびイヌにおいて、コロナウイルスによって引き起こされる疾患の予防を補助する、またはいくつかの場合においては疾患を予防する免疫原性組成物およびワクチンを提供する。さらに、以下の実施例１０に示されるように、本発明はさらに、哺乳動物において殺菌免疫を誘導する免疫原性組成物およびワクチンを提供する。

【0059】

本発明の一局面において、コロナウイルスはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２であり、疾患はヒト、ネコおよび／またはフェレットにおける疾患である。これらのワクチンは、ワクチン接種されたヒト、ネコおよび／またはフェレットに有益であり得るだけでなく、特にネコおよびフェレットの場合には、ネコおよびフェレットがさらに未知の潜在的に有害な変異が生じ得るウイルスの保有宿主になることも防止し得る。さらに、このようなワクチンは、ネコおよび／またはフェレットにおけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のウイルス排出の低下または排除にさえつながり得る。このようなウイルス排出は、ヒトを含む他の動物へのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の伝染をもたらし得る。したがって、本発明はさらに、感染した動物からナイーブ動物へのコロナウイルスの伝染を防止する免疫原性組成物およびワクチンを提供する。

【0060】

本発明の別の局面において、コロナウイルスはＩＢＶであり、疾患はニワトリなどの家禽における疾患である。本発明の別の局面において、コロナウイルスはＩＢＶであり、疾患はブタにおける疾患である。この種類の特定の態様において、コロナウイルスはＳＡＤＳ－ＣｏＶである。この種類の特定の態様において、コロナウイルスはＰＥＤＶであり、疾患はブタにおける疾患である。

【0061】

したがって、本発明は、キメラコロナウイルススパイクタンパク質をコードする組換えベクターを含む免疫原性組成物および／またはワクチン（多価ワクチンを含む）を提供する。ある態様において、キメラコロナウイルススパイクタンパク質は、コロナウイルススパイクタンパク質の受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）、コロナウイルススパイクタンパク質のフューリン切断部位およびコロナウイルススパイクタンパク質の中央ヘリックスを含むが、例えば、コロナウイルススパイクタンパク質のＴＭＤおよびＣＴＤがＢＶ_ｐｍの表面糖タンパク質のＴＭＤおよびＣＴＤによって置き換えられている、宿主細胞の細胞膜から出芽する出芽ウイルス（ＢＶ_ｐｍ）の表面糖タンパク質のＴＭＤおよびＣＴＤを含む。この種類の特定の態様において、組換えベクターは組換えＢＶ_ｐｍであり、表面糖タンパク質のＴＭＤおよびＣＴＤは、組換えＢＶ_ｐｍのウイルス種とは異なるウイルス種に由来する。

【0062】

本発明をより十分に理解するために、以下の定義を提供する。

【0063】

説明における便宜のための単数形の用語の使用は、決してそのように限定することを意図するものではない。したがって、例えば、「ポリペプチド（ａ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）」を含む組成物への言及は、そのようなポリペプチドの１つまたは複数への言及を含む。さらに、「アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子」への言及は、特に明記しない限り、複数のこのようなアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子への言及を含む。

【0064】

本明細書で使用される場合、「およそ」という用語は、「約」という用語と互換的に使用され、値が示された値の５０％以内であることを意味する、すなわち、１ミリリットル当たり「およそ」１×１０^８個のアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子を含有する組成物は、１ミリリットル当たり５×１０^７～１．５×１０^８個のアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子を含有する。

【0065】

本明細書で使用される場合、「組換えベクター」は、異種遺伝子によってコードされるタンパク質を産生するために、単離された宿主細胞または宿主生物の宿主細胞中に異種遺伝子を導入することができるベクターである。宿主細胞は、標的動物内にあり得る。組換えベクターの例としては、組換え発現ベクターおよび合成メッセンジャーＲＮＡが挙げられる。

【0066】

本明細書で使用される場合、「組換え発現ベクター」は、宿主細胞または宿主生物において適切な条件下で、コードされたタンパク質、例えばキメラコロナウイルススパイクタンパク質の発現を可能にする適切なシグナルを含有する組換えベクターである。組換え発現ベクターの例としては、組換え哺乳動物およびトリウイルス、ＲＮＡレプリコンおよびＲＮＡレプリコン粒子を含むＤＮＡ発現プラスミドおよび組換えウイルスが挙げられる。

【0067】

ＤＮＡ発現プラスミドは、異種遺伝子を宿主細胞または宿主生物中に導入して、その異種遺伝子によってコードされるタンパク質を産生するために使用することができる組換え発現ベクターの一種である。次いで、何らかの形質移入の方法によって、例えば、生化学物質を担体として使用して、機械的手段によって、または電気穿孔によって、真核宿主細胞または真核宿主生物中にＤＮＡ発現プラスミドを挿入することができる。典型的には、ＤＮＡ発現プラスミドは宿主細胞のゲノム中への安定な組み込みのためのシグナルを欠くので、異種タンパク質の発現は一過性であろう。その結果、ＤＮＡ発現プラスミドは、宿主細胞または宿主生物を形質転換または不死化しないであろう。ＤＮＡ発現プラスミドの例は、ｐｃＤＮＡ（商標）、ｐＣＲ３．１（商標）、ｐＣＭＶ（商標）、ｐＦＲＴ（商標）、ｐＶＡＸ１（商標）、ｐＣＩ（商標）、Ｎａｎｏｐｌａｓｍｉｄ（商標）、ｐＦＲＴ（商標）およびｐＣＡＧＧＳ［Ｎｉｗａ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ，１０８：１９３－１９９（１９９１）］である。

【0068】

本明細書で使用される場合、「ＲＮＡレプリコン」という用語は、「レプリコンＲＮＡ（ｒｅｐｌｉｃｏｎ ＲＮＡ）」または「レプリコンＲＮＡ（Ｒｅｐｌｉｃｏｎ ＲＮＡ）」という用語と互換的に使用され、存在すれば、細胞培養物または動物宿主での親ウイルスの増殖の成功を可能にする１つまたは複数の要素（例えば、構造タンパク質のコード配列）を欠く修飾されたＲＮＡウイルスゲノムを指す。適切な細胞状況において、ＲＮＡレプリコンはそれ自体を増幅し、１つまたは複数のサブゲノムＲＮＡ種を産生し得る。ＲＮＡレプリコン粒子とは対照的に、ＲＮＡレプリコンはウイルス構造タンパク質でパッケージされておらず、その結果、宿主細胞への侵入効率がより低い。

【0069】

本明細書で使用される場合、「ＲＰ」と略される「ＲＮＡレプリコン粒子」という用語は、ウイルスに由来する構造タンパク質、例えばカプシドおよび糖タンパク質にパッケージングされたＲＮＡレプリコンである。本明細書で使用される場合、「アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子」という用語は、例えばＰｕｓｈｋｏら［前出］によって記載されているように、同じくアルファウイルスに由来する構造タンパク質、例えば、カプシドおよび糖タンパク質にパッケージングされたアルファウイルス由来のＲＮＡレプリコンである。ＲＮＡレプリコンはアルファウイルス構造成分（例えば、カプシドおよび糖タンパク質）をコードしないので、ＲＮＡレプリコン粒子は、（ヘルパープラスミドまたは類似の成分なしに）細胞培養物または動物宿主中で増殖することができない。

【0070】

本明細書で使用される場合、「合成メッセンジャーＲＮＡ」または「合成ｍＲＮＡ」という用語は、選択されたタンパク質をコードし、ｍＲＮＡを安定化させ、タンパク質翻訳を増加させる５’および３’非翻訳領域（ＵＴＲ）に隣接するｍＲＮＡのヌクレオチド配列を含むように構築されている、それにより真核細胞の細胞質中に天然に存在する成熟ｍＲＮＡ分子に類似するｍＲＮＡの組換え一本鎖分子を指す。これらの調節配列は、ウイルス遺伝子または真核生物遺伝子に由来し得る。本発明の場合、合成ｍＲＮＡは、キメラコロナウイルススパイクタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。合成メッセンジャーＲＮＡは、本発明のキメラコロナウイルススパイクタンパク質を合成する過程においてリボソームによって読み取られる。典型的には、合成ｍＲＮＡの５’－ＵＴＲは、天然では転写の開始直後に真核生物メッセンジャーＲＮＡの５’末端に付加される修飾されたグアニンヌクレオチドである５’ＲＮＡｍ^７Ｇキャップなどの「５’キャップ」構造を含む。５’キャップは、５’－５’－三リン酸結合を介して最初の転写されたヌクレオチドに連結されている末端７－メチルグアノシン残基からなり得る。その存在は、リボソームによる認識およびＲＮａｓｅからの保護にとって極めて重要である。合成ｍＲＮＡは、典型的には、３’末端におけるポリアデニリル部分のメッセンジャーＲＮＡ分子への共有結合である３’ポリＡ尾部も有する。合成ｍＲＮＡは、形質移入によって、および／または適切な担体、例えばポリマーもしくはカチオン性脂質を使用することによって、真核生物宿主生物または宿主細胞に送達することができる。ｍＲＮＡ安定性および翻訳の開始のために通常必須であるキャップおよびポリ（Ａ）尾部とは対照的に、天然に存在するｍＲＮＡ中に見られる他の核外輸送シグナルは専ら細胞質中に存在するように設計されているので、合成ｍＲＮＡベクターにとって必要ではない。本発明において使用されるべき合成メッセンジャーＲＮＡ分子の様々な構造およびそれらの合成に関する詳細は、当技術分野で周知である［例えば、総説Ｐａｒｄｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ １７：２６１－２７９，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｒｄ．２０１７．２４３（２０１８）を参照］。同様に、合成ｍＲＮＡを細胞質中に直接送達するには、スプライシングされた形態での合成ｍＲＮＡの合成が必要であり、天然のｍＲＮＡにおいて見られる冗長なスプライシングシグナルの可能性が合成ｍＲＮＡでは省略されることを可能にする［Ｔｏｌｍａｃｈｏｖ ａｎｄ Ｔｏｌｍａｃｈｏｖａ，Ｇｅｎｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，４（１）：１０００１７（２０１５），米国特許第９，４２８，５３５号およびＳｃｌａｋｅ ｅｔ ａｌ．ＲＮＡ Ｂｉｏｌ．９（１１）：１３１９－１３３０（２０１２）ｄｏｉ：１０．４１６１／ｒｎａ．２２２６９を参照］。

【0071】

上で定義された合成ｍＲＮＡは、裸のｍＲＮＡ分子の形態であり得、またはｍＲＮＡ分子が合成ｍＲＮＡ分子の細胞取り込みを促進する１つまたは複数の担体分子と会合し、もしくはそれに複合体化している形態であり得る。この目的のために、多種多様なインビボ形質移入試薬が開発されている（例えば、上記の総説Ｐａｒｄｉらを参照されたい。）。

【0072】

本明細書中で使用される場合、「Ｙ^１１４４Ａ」は、配列番号２のアミノ酸配列を含むＩＢＶコロナウイルススパイクタンパク質のアミノ酸配列への修飾を表す。したがって、ＣＴＤ中の配列番号２の位置１１４４のチロシン残基（Ｙ）はアラニン残基（Ａ）で置き換えられている。このアミノ酸置換は、ＩＢＶコロナウイルススパイクタンパク質のＣＴＤ中のＥＲ保持シグナルを機能的に除去する。非修飾ＩＢＶコロナウイルススパイクタンパク質では、ＥＲ保持シグナルは、スパイクタンパク質をＥＲまたは他の細胞内区画中に保持するのに役立つ。

【0073】

本明細書で使用される場合、宿主細胞の細胞膜から出芽する出芽ウイルスは、「ＢＶ_ｐｍ」と表記され、細胞膜から優先的に出芽するが、小胞体（ＥＲ）、小胞体－ゴルジ中間区画およびトランスゴルジネットワークのような細胞内区画からはあまり優先的に出芽しないこともあり得るウイルスである。したがって、ＢＶ_ｐｍは、宿主細胞の細胞膜から出芽することによって宿主細胞から自然に出るウイルスである。宿主細胞の細胞膜からのこのような出芽は、ＢＶ_ｐｍが宿主細胞から出ることを可能にし、ウイルスの外側エンベロープを形成するためにウイルスタンパク質が濃縮された宿主由来の膜を獲得しなければならないエンベロープを有するウイルスによって主に使用される。本発明のＢＶ_ｐｍは、好ましくは動物ウイルス、例えばトリまたは哺乳動物ウイルスである。ＢＶ_ｐｍの例は、ＶＳＶ、インフルエンザウイルス、ＮＤＶ、ＨＩＶ、ラッサウイルス、エボラウイルスおよびＭＶである。注意すべきことに、コロナウイルスはＢＶ_ｐｍではない。コロナウイルススパイクタンパク質は、ＣＴＤ中にＥＲ保持シグナルを含有し、ＥＲ保持シグナルはスパイクタンパク質をＥＲまたは他の細胞内区画中に保持する［Ｗｅｌｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｆｅｂｓ Ｌｅｔｔｅｒｓ ５８１：２０８９－２０９７（２００７）、およびＷｉｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８２（６）：２７６５－２７７７１（２００８）を参照］。

【0074】

ＴＭＤおよびＣＴＤを含むＢＶ_ｐｍ表面糖タンパク質に関する詳細な構造情報は、ＮＣＢＩゲノムデータベース、ＵｎｉＰｒｏｔおよびＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋなどの様々な公開の核酸およびタンパク質配列データベースに見出すことができる。

【0075】

「に由来する（ｏｒｉｇｉｎａｔｅ ｆｒｏｍ）」、「に由来する（ｏｒｉｇｉｎａｔｅｓ ｆｒｏｍ）」および「に由来する（ｏｒｉｇｉｎａｔｉｎｇ ｆｒｏｍ）」という用語は、所与のタンパク質またはそのタンパク質の一部およびそれを自然にコードする病原体またはその病原体の株に関して互換的に使用され、本明細書で使用される場合、その病原体またはその病原体の株によってコードされるその所与のタンパク質またはそのタンパク質の一部の修飾されていないおよび／または切断されたアミノ酸配列を意味する。病原体に由来するタンパク質またはそのタンパク質の一部に対する本発明の核酸構築物内のコード配列は、そのタンパク質の対応する配列が由来する病原体または病原体の株（天然に弱毒化された株を含む）中のそのタンパク質の対応する配列と比較して、発現されたタンパク質のアミノ酸配列の修飾および／または切断をもたらすように遺伝子操作されていてもよい。

【0076】

ウイルスの「表面糖タンパク質」は、宿主の膜上の受容体部位を同定し、これに結合する役割を果たすウイルスエンベロープの表面上に見られる糖タンパク質である。次いで、ウイルスエンベロープは宿主の膜と融合し、カプシドおよびウイルスゲノムが宿主に侵入して感染することを可能にする。表面糖タンパク質の例としては、コロナウイルスのスパイクタンパク質および水疱性口内炎ウイルスの表面糖タンパク質が挙げられる。

【0077】

ＶＳＶは、狂犬病ウイルスを含むラブドウイルス科に属する非分節型マイナス鎖ＲＮＡウイルスである。ＶＳＶは、極性上皮細胞の基底外側表面から優先的に出芽する。この出芽選好は、その糖タンパク質の基底外側局在化と相関する［例えば、Ｄｒｏｋｈｌｙａｎｓｋｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，８９（２２）：１１７１８－１１７２２（２０１５）を参照］。このような細胞膜出芽は、ウイルスが宿主細胞から出ることを可能にし、ウイルスの外側エンベロープを形成するためにウイルスタンパク質が濃縮された宿主由来の膜を獲得しなければならないエンベロープを有するウイルスによって主に使用される。

【0078】

ＩＢＶはコロナウイルスである、すなわち、ガンマコロナウイルス属、コロナウイルス科、ニドウイルス目のメンバーである。ＩＢＶ Ｓ糖タンパク質、すなわちスパイクタンパク質は、約１１６２のアミノ酸残基を含み、２つのサブユニットＳ１（約５３５アミノ酸残基および約９０ｋＤａのＭＷ）およびＳ２（約６２７アミノ酸残基および約８４ｋＤａのＭＷ）に切断される。Ｃ末端Ｓ２サブユニットは、Ｎ末端Ｓ１サブユニットと非共有結合的に会合し、膜貫通ドメインおよびＣ末端細胞質尾部ドメインを含有する。Ｓ１サブユニットは、スパイクタンパク質の受容体結合活性を含む。さらに、ＩＢＶスパイクタンパク質は、ニワトリに接種された場合に、防御免疫応答の誘導に関与する［総説については、Ｃａｖａｎａｇｈ，Ｖｅｔ．Ｒｅｓ．３８：２８１－２９７（２００７）を参照；欧州特許出願公開第０４２３８６９号；国際公開第２００４／０７８２０３号；および国際公開第２０１２／１１０７４５号も参照］。

【0079】

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、ニドウイルス目のコロナウイルス科のベータコロナウイルス属のメンバーである。コロナウイルスのスパイクタンパク質は、宿主受容体の特定の細胞外ドメインに結合することによってウイルスの指向性を決定する、ウイルスの表面から突出する大きな糖タンパク質である。ヒトアンジオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２およびＳＡＲＳ－ＣｏＶスパイクタンパク質の両方に対する宿主受容体として働く。コロナウイルスゲノムの最も可変な部分は、コロナウイルススパイクタンパク質のＲＢＤである。しかしながら、注目すべきことに、ＲＢＤの６つの極めて重要なアミノ酸残基のうちの５つは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質とＳＡＲＳ－ＣｏＶスパイクタンパク質との間で異なる。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質はスパイクタンパク質の２つのサブユニット、Ｓ１およびＳ２の接合部に多塩基性切断部位（ＲＲＡＲ、配列番号１３）を含むのに対して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶスパイクタンパク質は含まないことにより、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶスパイクタンパク質とさらに異なる［Ａｎｄｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２６：４５０－４５５（２０２０）を参照］。この多塩基性切断部位は、プロテアーゼによる効果的な切断を可能にし、これはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の感染力において役割を果たす。ＳＡＲＳ－ＣｏＶのように、他のヒトベータコロナウイルスのいくつかのスパイクタンパク質はこのような構造を含むので、多塩基性切断部位はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質に特有ではないが、最も密接に関連するコウモリコロナウイルスのスパイクタンパク質も、この多塩基性切断部位を含むことは見出されていない。ＴＭＤおよびＣＴＤを含む、動物およびヒトコロナウイルスのスパイクタンパク質に関する詳細な構造情報は、ＮＣＢＩゲノムデータベース、ＵｎｉＰｒｏｔおよびＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋなどの様々な公開の核酸およびタンパク質配列データベースに見出すことができる。

【0080】

本明細書で使用される場合、「膜貫通ドメイン」または「ＴＭＤ」は、細胞膜中に挿入されるかまたは挿入されるべきタンパク質の疎水性領域である。タンパク質の膜貫通ドメインのいずれかの側の一部は、膜の反対側にある。［例えば、Ｔｈｅ Ｓｅｎｓｅｓ：Ａ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，Ｍａｓｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｉｔｏｒｓ；第２版（２００８）を参照］。コロナウイルススパイクタンパク質の膜貫通ドメインは、カルボキシ末端部分の近く、このタンパク質のカルボキシ末端にある細胞質尾部のすぐ隣に存在する。動物およびヒトコロナウイルスのスパイクタンパク質のＴＭＤに関する詳細な構造情報は、ＮＣＢＩゲノムデータベース、ＵｎｉＰｒｏｔおよびＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋなどの様々な公開の核酸およびタンパク質配列データベースに見出すことができる。

【0081】

本明細書で使用される場合、「Ｃ末端ドメイン」または「ＣＴＤ」という用語は、「細胞質尾部」または「ＣＴ」という用語と互換的に使用され、細胞質中に突出する、エンベロープを有するウイルスの表面糖タンパク質、例えばコロナウイルスのスパイクタンパク質の一部である。Ｉ型膜糖タンパク質のＣＴＤは、表面糖タンパク質のカルボキシ末端にある。動物およびヒトコロナウイルスのスパイクタンパク質のＣＴＤに関する詳細な構造情報は、ＮＣＢＩゲノムデータベース、ＵｎｉＰｒｏｔおよびＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋなどの様々な公開の核酸およびタンパク質配列データベースに見出すことができる。

【0082】

本明細書で使用される場合、略語「２Ｐ」は、エンベロープを有するウイルスの表面糖タンパク質、例えばコロナウイルスのスパイクタンパク質の中央ヘリックスの最初の２つの連続するアミノ酸残基を置換して原型前融合立体構造における表面糖タンパク質をさらに安定化する一対の連続するプロリン残基を表す。［Ｐａｌｌｅｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，前出を参照］。

【0083】

「キメラタンパク質」は、２つ以上のタンパク質の一部から構成されるタンパク質である［例えば、ＭｃＱｕｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８３：９３１８－９３２２（１９８６）を参照］。

【0084】

本明細書で使用される場合、「キメラコロナウイルススパイクタンパク質」は、コロナウイルススパイクタンパク質（ＣＳＰ）の一部およびＢＶ_ｐｍの表面糖タンパク質の一部から構成されるタンパク質、例えば、コロナウイルススパイクタンパク質のＴＭＤおよびＣＴＤに代わるＢＶ_ｐｍの表面糖タンパク質からのＴＭＤおよびＣＴＤとともに、コロナウイルススパイクタンパク質の２つのサブユニット：コロナウイルススパイクタンパク質の受容体結合ドメインを含むＳ１およびＳ２を含む組換えタンパク質である。特定の態様において、ＢＶ_ｐｍは水疱性口内炎ウイルスである。

【0085】

本明細書で使用される場合、例えば、配列番号１２のアミノ酸残基１４～１２１１のように、所定のアミノ酸配列に対してアミノ酸残基の特定の範囲が与えられているパーセント同一性決定を行うことに関する「アミノ酸残基の同じ範囲にわたって」という用語は、そのパーセント同一性の決定がその特定のアミノ酸範囲にわたって行われることを示す。

【0086】

本明細書で使用される場合、コロナウイルススパイクタンパク質の「フューリン切断部位」は、ＩＢＶおよびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質を含む多くのコロナウイルススパイクタンパク質の感染力において役割を果たすプロテアーゼ、例えば宿主細胞のフューリンによる効果的な切断を可能にする多塩基性フューリン切断部位である［Ａｎｄｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２６：４５０－４５５（２０２０）を参照］。注目すべきことに、他のヒトベータコロナウイルスのいくつか、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶのスパイクタンパク質はこのような構造を含まず、最も密接に関連するコウモリコロナウイルスのスパイクタンパク質も、この多塩基性切断部位を含むことは見出されていない。

【0087】

本明細書で使用される場合、コロナウイルススパイクタンパク質の「不活化されたフューリン切断部位」または「ΔＦＣＳ」は、宿主細胞のフューリンプロテアーゼによる切断を受けにくいように遺伝子改変されたコロナウイルススパイクタンパク質のフューリン切断部位である。以下の例では、ＩＢＶのスパイクタンパク質についてフューリン切断部位が不活化されている、すなわち、配列番号４および６の位置５３３～５３７のアミノ酸残基ＲＲＦＲＲがＡＡＦＡＡ（配列番号１４）に変異され、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質についてフューリン切断部位が不活化されており、配列番号８および１０の位置６８２～６８５のアミノ酸残基ＲＲＡＲがＡＡＡＲ（配列番号１５）に変異された。

【0088】

「非ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２」という用語は、病原体および／または抗原もしくはその免疫原性断片などの用語を修飾して、それぞれの病原体および／または抗原がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２でもＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質抗原またはその免疫原性断片でもないこと、および非ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に由来しないことを表すために使用される。

【0089】

「非ＩＢＶ」という用語は、病原体および／または抗原もしくはその免疫原性断片などの用語を修飾して、それぞれの病原体および／または抗原がＩＢＶでもＩＢＶタンパク質抗原またはその免疫原性断片でもないこと、および非ＩＢＶ抗原がＩＢＶに由来しないことを表すために使用される。

【0090】

本明細書で使用される場合、「改変生」および「弱毒化」という用語は、所与の生きたウイルスおよび／または生きた微生物に関して交換可能に使用される。

【0091】

本明細書で使用される場合、「保護する」、および／または「～に保護を提供する」、および／または「～に防御免疫を誘発する」、および／または「疾患の予防を補助する」、および／または「保護を補助する」、および／または「ウイルス量を低下させる」、および／または「ウイルス血症を軽減する」という用語は、感染の任意の徴候からの完全な保護を必要としない。例えば、「保護を補助する」は、攻撃誘発後に、根底にある感染の症候が少なくとも軽減され、および／もしくはウイルス排出の軽減を補助するように保護が十分であること、ならびに／または症候を引き起こす根底にある細胞的、生理学的もしくは生化学的原因もしくは機構の１つもしくは複数が軽減および／もしくは除去されることを意味し得る。この文脈で使用される「軽減した」とは、感染の生理学的状態だけでなく、感染の分子的状態を含む感染の状態に対する比較を意味することが理解される。

【0092】

本明細書で使用される場合、「ワクチン」は、典型的には水を含有する液体などの薬学的に許容され得る担体と組み合わされた１つまたは複数の抗原を含む、動物、例えばニワトリまたはネコ科動物（動物という用語は、ある態様においてはヒトを含むが、他の態様においては明確にヒトを除外する）への適用に適した組成物であり、動物に投与すると、野生型ウイルスおよび／または野生型微生物による感染から生じる疾患からの保護を最小限補助するのに十分強力な、すなわち、疾患の予防を補助し、および／または疾患を予防、改善もしくは治癒するのに十分強力な免疫応答を誘導する。

【0093】

本明細書で使用される場合、「殺菌免疫」は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（またはその特定の株）などの特定の疾患を引き起こす病原体の検出可能な複製を防止し、したがってその特定の疾患を引き起こす病原体による動物における生産的感染の確立を防止する免疫の種類である。

【0094】

本明細書で使用される場合、ワクチン接種を通じて、動物において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（またはその特定の株）などの特定の疾患を引き起こす病原体に対して「殺菌免疫を誘導する」ワクチンは、ワクチン接種の結果として、ワクチン接種された動物がその特定の疾患を引き起こす病原体に対する殺菌免疫を達成することを意味する。殺菌免疫を誘導するには、１回より多くのワクチン投与が必要であることがあり得る。

【0095】

本明細書で使用される場合、「コロナウイルスの伝染を予防する」ワクチンは、ワクチン接種された動物におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（またはその特定の株）などの特定の疾患を引き起こす病原体に対する免疫応答が、特定の疾患を引き起こす病原体の任意の排出が他の動物において疾患を引き起こすのに不十分である程度まで、ワクチン接種された動物におけるその特定の疾患を引き起こす病原体の複製の量を低下させることを意味する。

【0096】

本明細書で使用される場合、「哺乳動物」という用語は、子供が母親の特別な乳腺からの乳によって栄養を与えられる脊椎動物である。哺乳動物の例としては、ヒト、イヌ、ネコ科動物、ヒツジ、フェレットおよびブタが挙げられる。

【0097】

本明細書で使用される場合、「イヌ」という用語は、特に明記しない限り、すべての家畜犬、カニス・ルプス・ファミリアリス（Ｃａｎｉｓ ｌｕｐｕｓ ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ）またはカニス・ファミリアリス（Ｃａｎｉｓ ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ）を含む。

【0098】

本明細書で使用される場合、「ネコ科動物」という用語は、ネコ科（Ｆｅｌｉｄａｅ ｆａｍｉｌｙ）の任意のメンバーを指す。この科のメンバーには、ネコ亜科の任意のメンバー、例えば、ネコ、ライオン、トラ、ピューマ、ジャガー、レパード、ユキヒョウ、ヒョウ、北アメリカマウンテンライオン、チーター、オオヤマネコ、ボブキャット、カラカルまたはこれらの任意の雑種などの、野生、動物園および家庭のメンバーが含まれる。ネコには、純血種および／または雑種のペットネコ、ショーキャット、研究用ネコ、クローンネコおよび野生のまたは野生化したネコを含むイエネコ（フェリス・カトゥス（Ｆｅｌｉｓ ｃａｔｕｓ））も含まれる。

【0099】

本明細書で使用される場合、「フェレット」は、イタチ科（ｍｕｓｔｅｌｉｄ ｆａｍｉｌｙ）に属する哺乳動物の１つである哺乳動物である。

【0100】

典型的には、本発明のワクチンは、コロナウイルスからのワクチン接種された動物の保護を補助する、例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２からのヒトもしくはネコ科動物の保護を補助する、ネコ科動物もしくはフェレットにおけるウイルスの排出の防止を補助する、またはＩＢＶからのトリの保護を補助する有効な量、すなわち「有効量」で投与される。

【0101】

本明細書で使用される場合、多価ワクチンは、２つ以上の異なる抗原を含むワクチンである。この種類の特定の態様において、多価ワクチンは、２つ以上の異なる病原体に対してレシピエントの免疫系を刺激する。

【0102】

「アジュバント」および「免疫刺激物質」という用語は、本明細書では互換的に使用され、免疫系の刺激を引き起こす１つまたは複数の物質として定義される。この文脈において、アジュバントは、１つまたは複数のワクチン抗原／単離物に対する免疫応答を増強するために使用される。したがって、「アジュバント」は、特定の抗原に対する免疫応答を非特異的に増加させ、これにより任意の所与のワクチンにおいて必要な抗原の量および／または関心対象の抗原に対する十分な免疫応答を生成するために必要な注射の頻度を低下させる作用物質である。この文脈において、アジュバントは、１つまたは複数のワクチン抗原／単離物に対する免疫応答を増強するために使用される。

【0103】

本明細書で使用される場合、「アジュバントを含まないワクチン」は、アジュバントを含有しないワクチンまたは多価ワクチンである。

【0104】

本明細書で使用される場合、「薬学的に許容され得る」という用語は、修飾される名詞が医薬品における使用に適していることを意味するために形容詞的に使用される。例えば、医薬ワクチン中の賦形剤を記載するためにこの用語を使用する場合、この用語は、組成物の他の成分と適合性であり、意図されたレシピエント動物、例えばネコ科動物に対して不都合に有害ではないものとして賦形剤を特定する。

【0105】

「担体」という用語は、組換えベクター、例えばアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子が一緒に投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤またはビヒクルを指す。薬学的に許容され得る担体は、落花生油、大豆油、鉱油、ゴマ油などの、石油、動物、植物または合成起源のものを含む水および／または油などの無菌の液体であり得る。水または水溶液の生理食塩水および糖水溶液、例えばデキストロースおよび／またはグリセロール溶液を、特に注射用溶液のための担体として使用することができる。アジュバントを含まないワクチンの場合、担体はアジュバントではあり得ない。

【0106】

「非経口投与」には、皮下注射、粘膜下注射、静脈内注射、筋肉内注射、皮内注射、経口、鼻腔内および注入が含まれる。

【0107】

本明細書で使用される場合、特定のタンパク質（例えば、タンパク質抗原）に関する「免疫原性断片」という用語は、免疫原性である、すなわち免疫グロブリン（抗体）またはＴ細胞抗原受容体などの免疫系の抗原認識分子と特異的に相互作用することができるそのタンパク質の断片である。好ましくは、本発明の免疫原性断片は、抗体および／またはＴ細胞受容体認識に対して免疫優性である。特定の態様において、所与のタンパク質抗原に関する免疫原性断片は、完全長タンパク質ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質またはＩＢＶスパイクタンパク質の抗原性の少なくとも２５％を保持するそのタンパク質の断片である。好ましい態様において、免疫原性断片は、完全長タンパク質ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質またはＩＢＶスパイクタンパク質の抗原性の少なくとも５０％を保持する。さらに好ましい態様において、免疫原性断片は、完全長タンパク質ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質またはＩＢＶスパイクタンパク質の抗原性の少なくとも７５％を保持する。免疫原性断片は、完全長キメラスパイクタンパク質の少なくとも１つの保存された領域を含む１００アミノ酸残基以上であり得、またはその一方で、完全長タンパク質からわずかに単一のアミノ酸が喪失した大きな断片であり得る。特定の態様において、免疫原性断片は、完全長タンパク質キメラスパイクタンパク質の１２５～１０００アミノ酸残基を含む。他の態様において、免疫原性断片は、完全長キメラスパイクタンパク質の２５０～７５０アミノ酸残基を含む。

【0108】

本明細書で使用される場合、両配列のアミノ酸残基が同一である場合に、１つのアミノ酸配列は第２のアミノ酸配列に対して１００％「同一」であり、または１００％の「同一性」を有する。したがって、２つのアミノ酸配列のアミノ酸残基の５０％が同一である場合に、アミノ酸配列は第２のアミノ酸配列に対して５０％「同一」である。配列比較は、所与のタンパク質、またはキメラタンパク質の場合には、比較されているポリペプチドの一部によって含まれるアミノ酸残基の連続するブロックにわたって行われる。

【0109】

したがって、本発明のキメラコロナウイルススパイクタンパク質の同一性パーセントは、キメラスパイクタンパク質中の異なるタンパク質のそれぞれについて個別に行われる。例えば、（ｉ）ＩＢＶスパイクタンパク質のＴＭＤおよびＣＴＤを除くＩＢＶスパイクタンパク質のすべて、ならびに（ｉｉ）水疱性口内炎ウイルスの表面タンパク質のＴＭＤおよびＣＴＤのみから構成される本発明のキメラコロナウイルススパイクタンパク質の場合には、ＩＢＶスパイクタンパク質に対するアミノ酸配列比較は、（一般にシグナル配列を含まない）ＩＢＶスパイクタンパク質に由来するキメラコロナウイルススパイクタンパク質のアミノ酸配列にわたって行われ、水疱性口内炎ウイルスの表面タンパク質に対するアミノ酸配列比較は、水疱性口内炎ウイルスタンパク質の表面タンパク質に由来するキメラコロナウイルススパイクタンパク質のアミノ酸配列にわたって行われる。ここでも、コロナウイルススパイクタンパク質の一部のパーセント同一性の決定は、タンパク質の対応する一部によって含まれるアミノ酸残基の連続するブロックにわたって行われる。

【0110】

特定の態様において、さもなければ２つのアミノ酸配列間の対応関係を変化させ得る選択された欠失または挿入が考慮される。重要なことに、本発明のキメラコロナウイルススパイクタンパク質の所定のアミノ酸配列と所定のパーセント（％）またはそれを超える同一性を有するキメラコロナウイルススパイクタンパク質は、キメラコロナウイルススパイクタンパク質のその所定のアミノ酸配列の特定の機能的特性を保持しなければならない。したがって、キメラコロナウイルススパイクタンパク質のフューリン切断部位が不活化されている、本発明のキメラコロナウイルススパイクタンパク質の所定のアミノ酸配列とパーセント（％）またはそれを超える同一性を有するキメラコロナウイルススパイクタンパク質は、全体のアミノ酸配列の残りの可変性にかかわらず、不活化された切断部位を有するという特性を保持しなければならない。同様に、コロナウイルススパイクタンパク質の中央ヘリックスの最初の２つの連続するアミノ酸残基の一対のプロリン残基（２Ｐ）による置換によって、前融合状態においてさらに安定化されているキメラコロナウイルススパイクタンパク質は、全体のアミノ酸配列の残りの可変性にかかわらず、プロリン残基のこの対を保持しなければならない。

【0111】

本明細書で使用される場合、ヌクレオチドおよびアミノ酸配列のパーセント同一性は、整列初期設定パラメータおよび同一性の初期設定パラメータを用いて、Ｃ、ＭａｃＶｅｃｔｏｒ（商標）（ＭａｃＶｅｃｔｏｒ，Ｉｎｃ．Ｃａｒｙ，ＮＣ ２７５１９）、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩ（商標）（Ｉｎｆｏｒｍａｘ，Ｉｎｃ．ＭＤ）、Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｒｏｕｐ ＰＬＣ（１９９６）およびＣｌｕｓｔａｌ Ｗアルゴリズムを使用して決定することができる。同じまたは類似の初期設定パラメータを使用して配列類似性を決定するために、これらの市販のプログラムを使用することもできる。あるいは、例えば、初期設定パラメータを使用するＧＣＧ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、Ｐｒｏｇｒａｍ Ｍａｎｕａｌ ｆｏｒ ｔｈｅ ＧＣＧ Ｐａｃｋａｇｅ、Ｖｅｒｓｉｏｎ ７、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）Ｐｉｌｅｕｐプログラムを使用して、初期設定フィルター条件下でのＡｄｖａｎｃｅｄ Ｂｌａｓｔ検索を使用することができる。

【0112】

本発明において、「不活化された」ウイルスまたは微生物は、動物において免疫応答を誘発することができるが、動物に感染することはできないウイルスまたは微生物である。例えば、不活化されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、バイナリーエチレンイミン、ホルマリン、β－プロピオラクトン、チメロサールまたは熱からなる群から選択される因子によって不活化され得る。

【0113】

組換えベクター
「ベクター」は、宿主細胞中などの適切な条件下でその発現を可能にするための適切なシグナルとともに、ポリペプチドをコードするための遺伝情報（ヌクレオチド配列）を保有する分子構造として本発明の分野で周知である。本発明について、「発現」は、転写および／または翻訳による遺伝情報からのタンパク質の発現の周知の原理に関する。ＤＮＡまたはＲＮＡのような核酸分子から、ウイルス様粒子およびレプリコン粒子などのより複雑な構造、組換えウイルスベクターなどの複製する組換え微生物にまで及ぶ、組換えベクターの多くの種類およびバリアントが公知であり、本発明において使用することができる。使用されるベクターの種類に応じて、シス（すなわち、組換えベクター自体の中に提供される）またはトランス（すなわち、別個の供給源から提供される）のいずれかで、より多くのまたはより少ない発現シグナルを提供する必要がある。

【0114】

本発明の「組換えベクター」は、その遺伝的構成がその天然の対応物の遺伝的構成と完全には一致しないベクターである。したがって、このようなベクターは、典型的には分子クローニングおよび組換えタンパク質発現技術によるその遺伝情報のインビトロ操作によって変更された分子構成を有する。行われた変更は、ベクターおよび／またはベクターが発現するタンパク質の発現、操作、精製、安定性および／または免疫学的挙動を提供し、改善し、または適合させる役割を果たすことができる。これらおよび他の技術は、標準的なテキストブック［Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（２００１）；ＩＳＢＮ：０８７９６９５７７３）；Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｉｎ：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，（Ｊ．Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ Ｉｎｃ，ＮＹ，（２００３），ＩＳＢＮ：０４７１５０３３８Ｘ）；Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ ａｎｄ Ｄｖｅｋｓｌｅｒ：“ＰＣＲ ｐｒｉｍｅｒｓ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ”（ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ，ＩＳＢＮ ０８７９６９６５４０）；およびＢａｒｔｌｅｔｔ ａｎｄ Ｓｔｉｒｌｉｎｇ，“ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ”，（Ｈｕｍａｎａ ｐｒｅｓｓ，ＩＳＢＮ：０８９６０３６４２１）］において極めて詳細に説明されている。

【0115】

組換えベクターの１つの種類は組換え発現ベクターであり、これには、主にニワトリワクチンにおいて使用される、組換えＨＶＴベクターなどの組換えウイルスベクター［例えば、米国特許第５，８５３，７３３号を参照］、およびより幅広い範囲の動物対象を有するＲＮＡレプリコン粒子［例えば、Ｐｕｓｈｋｏ ｅｔ ａｌ．，前出を参照］が含まれる。

【0116】

組換えシチメンチョウのヘルペスウイルスベクター
クローニングされた重複するサブゲノム断片の同時形質移入によってヘルペスウイルスを生成できることが、仮性狂犬病ウイルスに対して最初に実証された［ｖａｎ Ｚｉｊｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ６２：２１９１－２１９５（１９８８）］。その後、この手順は、組換えＨＶＴベクターを構築するために使用され［組換えＨＶＴベクターの構築に関して開示された方法に関して参照により本明細書に組み入れられる米国特許第５，８５３，７３３号を参照］、本発明のキメラコロナウイルススパイクタンパク質をコードする組換えＨＶＴベクターを構築するために使用することができる。この方法では、標準的な組換えＤＮＡ技術［Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．，（１９８２）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８２）；およびＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９）］を利用して構築されたいくつかの大きな重複するサブゲノム断片として細菌ベクター中に、ＨＶＴゲノム全体がクローニングされる。ＨＶＴ株ＦＣ１２６コスミドライブラリーは、コスミドベクターｐＷＥ１５（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡの現Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中にクローニングされた剪断されたウイルスＤＮＡに由来した。さらに、酵素ＢａｍＨＩでの制限消化によっていくつかの大きなゲノムＤＮＡ断片を単離し、ｐＷＥ１５またはプラスミドベクターｐＳＰ６４（Ｐｒｏｍｅｇ、Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）のいずれかにクローニングした。米国特許第５，８５３，７３３号に記載されているように、ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）細胞中へのこれらの断片の同時形質移入は、断片の重複する領域にわたる相同組換えによって媒介されるＨＶＴゲノムの再生をもたらす。同時形質移入の前にサブゲノム断片の１つまたは複数中に挿入が直接操作されれば、この手順は、挿入を含有するウイルスの高い頻度をもたらす。例えば、ＦＣ１２６ＨＶＴを生成するために５つの重複するサブゲノムクローンが必要とされ、一連のＨＶＴ／ＮＤＶ／ＩＬＴＶ組換えウイルスを作製するための基礎としての役割を果たした［米国特許第８，９３２，０６４号を参照］。コスミド再生組換えＨＶＴ構築物は、本質的に米国特許第５，８５３，７３３号に記載されているように行うことができる［例えば、米国特許第５，８５３，７３３号の図８を参照］。あるいは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系を用いて、所望の組換えトリヘルペスウイルスウイルスを構築することもできる［Ｔａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ，３６（５）：７１６～７２２（２０１８）を参照］。

【0117】

組換えＲＮＡウイルス、ＲＮＡレプリコンおよびＲＮＡレプリコン粒子
ＲＮＡウイルスは、それらのゲノム中に遺伝子操作された、ワクチン抗原をコードするヌクレオチド、例えば、本発明のキメラコロナウイルススパイクタンパク質をコードするヌクレオチド配列を導入するためのベクタービヒクルとして使用することができる。しかしながら、これまでのＲＮＡウイルスの使用は、主にウイルス抗原をＲＮＡウイルス中に組み込み、次いでウイルスをレシピエント宿主中に導入することに限定されてきた。その結果、組み込まれたウイルス抗原に対する保護抗体が誘導される。アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子は、病原性抗原をコードするために使用されてきた。このようなアルファウイルスレプリコンプラットフォームは、ＶＥＥＶ［Ｐｕｓｈｋｏ ｅｔ ａｌ．，前出］、シンドビス（ＳＩＮ）［Ｂｒｅｄｅｎｂｅｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ６７：６４３９－６４４６（１９９３）その内容はその全体が本明細書に組み入れられる］、およびセムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）［Ｌｉｌｊｅｓｔｒｏｍ ａｎｄ Ｇａｒｏｆｆ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＮＹ）９：１３５６－１３６１（１９９１）、その内容はその全体が本明細書に組み入れられる］を含むいくつかの異なるアルファウイルスから開発されてきた。さらに、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子は、ブタおよび家禽用のいくつかのＵＳＤＡ認可ワクチンの基礎である。これらには、ブタ流行性下痢ワクチン、ＲＮＡ粒子（製品コード１９Ｕ５．Ｐ１）、ブタインフルエンザワクチン、ＲＮＡ（製品コード１９Ａ５．Ｄ０）、トリインフルエンザワクチン、ＲＮＡ（製品コード１９Ｏ５．Ｄ０）および処方製品、ＲＮＡ粒子（製品コード９ＰＰ０．００）が含まれる。

【0118】

本発明のアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子は、凍結乾燥され、無菌水希釈剤で再水和され得る。他方、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子が別々に保存されるが、投与前に他のワクチン成分と混合されることが意図される場合、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子は、それらの成分の安定化溶液、例えば高スクロース溶液中に保存することができる。

【0119】

したがって、本発明の一局面において、ワクチンは、ＶＥＥＶのカプシドタンパク質および糖タンパク質を含むアルファウイルスＲＮＡ ＲＰを含む。さらにより具体的な態様において、ワクチンは、ＶＥＥＶの非病原性ＴＣ－８３株のカプシドタンパク質および糖タンパク質を含み、キメラコロナウイルススパイクタンパク質をコードするアルファウイルスＲＮＡ ＲＰを含む。キメラコロナウイルススパイクタンパク質をコードするアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子を含む免疫原性組成物および／またはワクチン（多価ワクチンを含む）は、アジュバントの存在下または非存在下で投与することができる。ある態様において、免疫原性組成物および／またはワクチンはヒト用である。他の態様において、免疫原性組成物および／またはワクチンは、ネコ科動物用である。さらに他の態様において、免疫原性組成物および／またはワクチンはフェレット用である。さらに他の態様において、免疫原性組成物および／またはワクチンはニワトリ用である。ワクチンおよび／または免疫原性組成物を単独で、または他の保護剤と組み合わせて作製および使用する方法も提供される。

【0120】

プロモーター
本発明の組換えウイルスベクター中のタンパク質抗原をコードする異種遺伝子の発現を駆動するために、所与の組換えベクター、例えば組換えウイルスベクターの天然のプロモーターを使用することとは別に、多くの代替のプロモーター、例えば、仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）ｇｐＸプロモーター［国際公開第８７／０４４６３号 を参照］、ラウス肉腫ウイルスＬＴＲプロモーター、ＳＶ４０初期遺伝子プロモーター、ヒトサイトメガロウイルス前初期１（ｈＣＭＶ ＩＥ１）遺伝子プロモーター［米国特許第５，８３０，７４５号；米国特許第５，９８０，９０６号］およびニワトリβ－アクチン遺伝子プロモーター［欧州特許公開第１２９８１３９号］を組換えウイルスベクター中で使用することもできる。コードするヌクレオチド配列の転写を終結させるために、ヌクレオチドコード領域の下流にポリアデニル化調節エレメントを含めることがしばしば必要とされる。したがって、多くの遺伝子は、それらのコード配列の下流端にポリアデニル化調節エレメントを含む。多くのこのような調節エレメントが同定されており、本発明の組換え発現ベクターにおいて使用することができる。

【0121】

合成メッセンジャーＲＮＡ
本発明のキメラコロナウイルススパイクタンパク質をコードする合成ｍＲＮＡの作製は、例えばＭｅｇａＳｃｒｉｐｔ（登録商標）Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼおよびキャップ類似体を使用するインビトロランオフ転写の前に、制限酵素を使用するプラスミドＤＮＡ直鎖化によって開始することができる。（この過程は、ＲＮＡレプリコン産生において見られるＲＮＡ転写のために使用される過程に類似している）。合成ｍＲＮＡ分子は、ＲＮＡｓｅから保護されるように、および真核細胞中での効率的な送達のためにパッケージングされるべきである。送達のために、カチオン性ポリマー、デンドリマー、または脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）などの異なる技術を使用することができる。［例えば、Ｐａｒｄｉ ｅｔ ａｌ．，上記を参照］組換えベクターとして使用するための合成ｍＲＮＡは、機械的もしくは化学的手段によること、形質移入によること、またはタンパク質、多糖、カチオン性脂質もしくはポリマーなどの適切な（ナノ粒子）担体で包むことを含む多くの方法で、その標的動物または宿主細胞に送達することができる。合成ｍＲＮＡを安定化するために、例えばヌクレオチドに、それらの骨格に、またはヌクレオチド類似体の組み込みによって、ある種の化学修飾が適用され得る。［例えば、米国特許第９，４４７，１６４号を参照］
ワクチンおよび多価ワクチン
本発明はさらに、本発明の組換えベクターと薬学的に許容され得る担体とを含むワクチンを提供する。本発明の一局面において、ワクチンは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による感染からの、ヒト、ネコ科動物またはフェレットの保護を補助する。この種類の特定の態様において、ワクチンは、ネコ科動物におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の排出を低減させることを補助する。本発明はさらに、フェレットにおけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の排出を低減させることを補助するワクチンを提供する。他の態様において、ネコ科動物ワクチンは、感染したネコ科動物における１つまたは複数の臨床徴候の重症度を軽減させることを補助する。さらに他の態様において、フェレットワクチンは、感染したフェレットにおける１つまたは複数の臨床徴候の重症度を軽減させることを補助する。さらに他の態様において、ワクチンは、ニワトリの保護を補助する。

【0122】

本発明はまた、多価ワクチンおよび免疫原性組成物を提供する。哺乳動物またはトリ免疫原性組成物またはワクチンにおいて有用な任意の抗原またはこのような抗原の組み合わせを、本発明の任意のそれぞれの哺乳動物ワクチンもしくは免疫原性組成物、またはトリワクチンもしくは免疫原性組成物にそれぞれ添加することができる。このような多価ワクチンおよび／または免疫原性組成物は、本発明に含まれる。特定の態様において、多価ワクチンは、キメラＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質および１つもしくは複数の他のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質抗原、および／もしくは１つもしくは複数の非ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質抗原をコードするアルファウイルスＲＮＡ ＲＰを含み、ならびに／または例えば１つもしくは複数の他のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質抗原、および／もしくは１つもしくは複数の非ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質抗原をコードする１つもしくは複数の追加のアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子をさらに含む。同様の態様において、１つまたは複数のキメラコロナウイルススパイクタンパク質、例えばキメラＩＢＶスパイクタンパク質をコードするアルファウイルスＲＮＡ ＲＰを含む多価ワクチンは、例えば１つまたは複数の他の１つまたは複数の非ＩＢＶタンパク質抗原をコードする１つまたは複数の追加のアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子をさらに含む。

【0123】

したがって、本発明のキメラＩＢＶスパイクタンパク質をコードする組換えベクターを含む本発明のトリワクチンは、非ＩＢＶ病原体に対する防御免疫を誘発するための少なくとも１つの非ＩＢＶ抗原をさらに含むことができる。この種類のある態様において、ワクチンは、非ＩＢＶ病原体に由来する少なくとも１つの抗原またはその免疫原性断片をコードするヌクレオチド配列を含む組換えベクターをさらに含む。この種類の特定の態様において、組換えベクターはＨＶＴである。代替の態様において、組換えベクターはＶＥＥＶ ＲＮＡレプリコン粒子である。

【0124】

したがって、ある態様において、組換えベクターは、１つまたは複数の他の抗原をさらにコードする組換えウイルスベクターである。この種類の特定の態様において、組換えウイルスベクターは、第２のＩＢＶタンパク質抗原をさらにコードする。より特定の態様において、第２のＩＢＶタンパク質抗原は、第１のキメラＩＢＶスパイクタンパク質が由来するＩＢＶとは異なるＩＢＶの株に由来するＩＢＶスパイクタンパク質を含む第２のキメラＩＢＶスパイクタンパク質である。他の態様において、組換えベクターは、必要に応じて第２のキメラＩＢＶスパイクタンパク質と一緒に第１のキメラＩＢＶスパイクタンパク質、および非ＩＢＶ由来の１つまたは複数の抗原をコードすることができる。ある態様において、非ＩＢＶ抗原は、ＮＤＶ抗原である。この種類のある態様において、ＮＤＶ抗原は、Ｆタンパク質である。さらに他の態様において、非ＩＢＶ抗原は、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス（ＩＢＤＶ）抗原である。この種類のある態様において、ＩＢＤＶ抗原は、ウイルスタンパク質２（ＶＰ２）である。さらに他の態様において、非ＩＢＶ抗原は、伝染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＴＶ）タンパク質である。この種類のある態様において、ＩＬＴＶタンパク質は、糖タンパク質Ｂ（ｇＢ）である。他のこのような態様において、ＩＬＴＶタンパク質は、糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）である。さらに他の態様において、ＩＬＴＶタンパク質は、糖タンパク質Ｉ（ｇＩ）である。さらに他の態様において、組換えウイルスベクターは、ＩＬＴＶｇＤ、ｇＩおよびｇＢのうちの２つ以上の任意の組み合わせをコードする。他の態様において、非ＩＢＶ抗原は、トリインフルエンザウイルス（ＡＩＶ）タンパク質である。この種類のある態様において、ＡＩＶタンパク質は、ＡＩＶヘマグルチニン（ＨＡ）である。他の態様において、ＡＩＶタンパク質は、ＡＩＶノイラミニダーゼ（ＮＡ）である。さらに他の態様において、組換えウイルスベクターは、ＡＩＶ ＨＡとＡＩＶ ＮＡの両方をコードする。

【0125】

例えば、組換えＨＶＴは、キメラＩＢＶスパイクタンパク質を単独で、または例えば１つもしくは複数のトリインフルエンザ抗原を含む多価ＨＶＴベクター中でコードおよび発現するように構築され得る。多価ＨＶＴベクターは当分野で周知である［例えば、米国特許第８，９３２，０６４号を参照］。さらに他の態様において、組換えウイルスベクターは、組換え弱毒化ＭＤＶ１であり得る。さらに他の態様において、組換えウイルスベクターは、組換え弱毒化ＭＤＶ２であり得る。さらに他の態様において、組換えウイルスベクターは、組換え弱毒化ＮＤＶであり得る。

【0126】

同様に、１つまたは複数の生弱毒化ウイルス分離株、例えば生弱毒化ＮＤＶ、および／または生弱毒化ＩＢＤＶ、および／または生弱毒化ＩＬＴＶ、および／またはＨＶＴを含む生弱毒化マレック病ウイルス（ＭＤＶ）、天然に弱毒化されたウイルス、および／または生弱毒化トリインフルエンザウイルス（ＡＩＶ）と一緒に、トリワクチン中のキメラＩＢＶスパイクタンパク質をコードする組換えベクターを添加することができる。

【0127】

代替のワクチン態様において、非ＩＢＶ抗原は不活化された非ＩＢＶ病原体である。

【0128】

特定のワクチン態様において、非ＩＢＶ病原体は不活化されたＮＤＶであり得る。他のワクチン態様において、非ＩＢＶ病原体は不活化されたＩＢＤＶである。さらに他のワクチン態様において、非ＩＢＶ病原体は不活化されたＩＬＴＶである。さらに他のワクチン態様において、非ＩＢＶ病原体は不活化されたＭＤＶ１である。さらに他のワクチン態様において、非ＩＢＶ病原体はＨＶＴである。さらに他のワクチン態様において、非ＩＢＶ病原体は不活化されたトリインフルエンザウイルスである。あるワクチン態様において、ワクチンは、複数の非ＩＢＶ病原体由来の非ＩＢＶ抗原を含む。

【0129】

キメラＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質および非ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２病原体抗原の両方をコードする組換えベクターを含む多価哺乳動物ワクチンおよび／または免疫原性組成物が本発明に含まれる。特定のワクチン態様において、非ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２病原体はネコカリシウイルス（ＦＣＶ）である。他のワクチン態様において、非ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２病原体はネコ白血病ウイルス（ＦｅＬＶ）である。さらに他のワクチン態様において、非ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２病原体は、ネコ汎白血球減少症ウイルス（ＦＰＬＶ）である。さらに他のワクチン態様において、非ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２病原体はネコ鼻気管炎ウイルス（ＦＶＲ）である。さらに他のワクチン態様において、非ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２病原体はネコ免疫不全症（ＦＩＶ）である。特定のワクチン態様において、非ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２病原体はクラミドフィラ・フェリス（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ ｆｅｌｉｓ）である。さらに他のワクチン態様において、非ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２病原体はイヌインフルエンザウイルス（ＣＩＶ）である。さらに他のワクチン態様において、非ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２病原体はイヌパルボウイルス（ＣＰＶ）である。さらに他のワクチン態様において、非ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２病原体はイヌジステンパーウイルス（ＣＤＶ）である。さらに他のワクチン態様において、非ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２病原体は狂犬病ウイルスである。あるワクチン態様において、ワクチンは、複数の非ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２病原体由来の非ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原由来の抗原を含む。

【0130】

さらに、例えば、不活化されたＦＣＶ株および／または不活化されたネコヘルペスウイルスおよび／または不活化されたネコパルボウイルスおよび／または不活化されたネコ白血病ウイルスおよび／または不活化されたネコ伝染性腹膜炎ウイルスおよび／または不活化されたネコ免疫不全ウイルスおよび／または不活化された狂犬病ウイルスおよび／または不活化されたネコインフルエンザウイルスおよび／または不活化されたイヌインフルエンザウイルスなどの１つまたは複数の他の不活化されたウイルス分離株と一緒に、ヒト、ネコ科動物またはフェレットワクチンおよび／または対応する免疫原性組成物中の１つまたは複数のキメラコロナウイルススパイクタンパク質、例えばキメラＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質をコードするアルファウイルスＲＮＡ ＲＰを添加することができる。さらに、クラミドフィラ・フェリス、および／またはボルデテラ・ブロンキセプチカ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）および／またはバルトネラ属種（Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ ｓｐｐ．）（例えば、Ｂ．ヘンセラ（Ｂ．ｈｅｎｓｅｌａｅ））のバクテリン（またはバクテリンの細画分、例えば線毛細画分）も、このような多価ワクチン中に含めることができる。

【0131】

さらに、１つまたは複数の生弱毒化ウイルス分離株、例えば生弱毒化ＦＣＶウイルスおよび／または生弱毒化ネコ白血病ウイルスおよび／または生弱毒化ネコ伝染性腹膜炎ウイルスおよび／または生弱毒化ネコ免疫不全ウイルスおよび／または生弱毒化狂犬病ウイルスおよび／または生弱毒化ネコインフルエンザウイルスおよび／または生弱毒化イヌインフルエンザウイルスと一緒に、ヒト、ネコ科動物またはフェレット免疫原性組成物および／またはワクチン中のキメラコロナウイルススパイクタンパク質をコードするアルファウイルスＲＮＡ ＲＰを添加することができる。さらに、生弱毒化クラミドフィラ・フェリスおよび／または生弱毒化ボルデテラ・ブロンキセプチカおよび／または生弱毒化バルトネラ属種（例えば、Ｂ．ヘンセラ）も、このような多価ワクチン中に含めることができる。

【0132】

したがって、本発明は、第２のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質抗原をコードする１つまたは複数のＶＥＥＶ ＲＮＡレプリコン粒子を含むワクチンを提供する。特定の態様において、第１のＶＥＥＶ ＲＮＡレプリコン粒子は、第１のキメラＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質をコードし、第２のＶＥＥＶ ＲＮＡレプリコン粒子は、第１のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質が由来するものとは異なるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の株に由来する第２のキメラＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質をコードする。

【0133】

特定のワクチンにおいては、組換えウイルスベクターはアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子である。この種類のより特定の態様において、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子はＶＥＥＶ ＲＮＡレプリコン粒子である。さらにより具体的な態様において、ワクチンは、ＶＥＥＶの非病原性ＴＣ－８３株のカプシドタンパク質および糖タンパク質を含み、キメラコロナウイルススパイクタンパク質をコードするアルファウイルスＲＮＡ ＲＰを含む。

【0134】

アジュバント：
本発明の一局面において、ワクチンはアジュバントなしである、すなわちアジュバントを含まない。他方、ある態様において、ワクチンはアジュバントを含有する。本発明のワクチンにおいて使用され得るアジュバントの例としては、ＣＡＲＢＯＰＯＬ（登録商標）［例えば、ポリアルケニルエーテルまたはジビニルグリコールで架橋されたアクリル酸のポリマー、Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ＋ＱｕｉｌＡ、水酸化アルミニウム、Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ、Ｅｍｕｌｓｉｇｅｎ＋ＥＭＡ３１＋Ｎｅｏｃｒｙｌ ＸＫ６２、Ｃａｒｂｏｍｅｒ、Ｃａｒｂｏｍｅｒ ９７４Ｐ、Ａｄｊｕｐｈｏｓ、Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ＋ＱＳ２１（サポニン）Ｃａｒｂｉｇｅｎが挙げられる。特定の態様において、アジュバントは、２種以上の油、例えば鉱油と１つまたは複数の非鉱油を含むオイルアジュバントである。この種類のある態様において、オイルアジュバントは、鉱油として流動パラフィン油と、スクアラン、スクアレン、ビタミンＥ、ビタミンＥ－アセタート、オレアートおよびオレイン酸エチルから選択される１つまたは複数の非鉱油とを含む。より特定の態様において、オイルアジュバントは、流動パラフィン油およびビタミンＥ－アセタートを含む。さらにより特定の態様において、オイルアジュバントは、ＸＳＯＬＶＥ（商標）である。

【0135】

投与：
本発明のワクチンは、非経口投与、より具体的には静脈内、筋肉内、皮下、経口、鼻腔内、皮内および／または腹腔内ワクチン接種を含む任意の標準的な経路によって容易に投与することができる。当業者は、ワクチン組成物が、好ましくはレシピエント動物の各種類および投与経路に対して適切に製剤化されることを理解するであろう。したがって、本発明はまた、コロナウイルスおよび／または他の動物病原体に対して哺乳動物を免疫する方法を提供する。１つのこのような方法は、ヒト、ネコ科動物またはフェレットがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質に対する適切な抗体を産生するように、哺乳動物に免疫学的有効量の本発明のヒト、ネコ科動物またはフェレットワクチンを注射することを含む。別のこのような方法は、ニワトリがＩＢＶスパイクタンパク質に対する適切な抗体を産生するように、ニワトリに免疫学的有効量の本発明のトリワクチンを注射することを含む。この方法において、「ニワトリ」は、任意の年齢のニワトリであり得る。一態様において、ニワトリを免疫するいわゆる卵内法を適用する場合、ニワトリは胚である。

【0136】

以下の実施例は、本発明のさらなる理解を提供する役割を果たすが、本発明の有効な範囲を制限することを決して意図するものではない。

【0137】

さらなる方法および使用：
上に概説したように、本発明の組換えベクターは、周知の方法によって製造することができる本発明によるワクチンまたは免疫原性組成物において有利に使用することができる。これらの局面および態様はまた、異なる管轄では異なる言葉で表現され得る。

【0138】

したがって、さらなる局面において、本発明は、ワクチンとして使用するための本発明による組換えベクターであって、前記ワクチンはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による感染からの哺乳動物の保護を補助するものであるか、または前記ワクチンは伝染性気管支炎からのトリの保護を補助するものである、組換えベクターに関する。ワクチンとして使用するための組換えベクターの一態様において、組換えベクターは、すべて本明細書で定義されるとおりの組換え発現ベクター、組換えウイルスベクター、ＤＮＡ発現プラスミド、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子および合成ｍＲＮＡから選択される。

【0139】

さらなる局面において、本発明は、ワクチンの製造のための本発明による組換えベクターの使用であって、前記ワクチンはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による感染からの哺乳動物の保護を補助するものであるか、または前記ワクチンは伝染性気管支炎からのトリの保護を補助するものである、組換えベクターの使用に関する。ワクチンの製造のための組換えベクターの使用の一態様において、組換えベクターは、すべて本明細書で定義されるとおりの組換え発現ベクター、組換えウイルスベクター、ＤＮＡ発現プラスミド、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子および合成ｍＲＮＡから選択される。

【0140】

さらなる局面において、本発明は、本発明によるワクチンの製造のための方法であって、本発明による組換えベクターと薬学的に許容され得る担体とを混合することを含む、方法に関する。ワクチンの製造のための方法の一態様において、組換えベクターは、すべて本明細書で定義されるとおりの組換え発現ベクター、組換えウイルスベクター、ＤＮＡ発現プラスミド、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子および合成ｍＲＮＡから選択される。

【0141】

［実施例］
以下の略語は、以下の実施例で使用されるコロナウイルススパイクタンパク質およびキメラコロナウイルススパイクタンパク質ならびにそれらのそれぞれのヌクレオチドおよびアミノ酸配列の標識に使用される。

【0142】

ＷＴまたはｗｔ：野生型タンパク質
ＳＰ：シグナルペプチド
ＲＢＤ 受容体結合ドメイン
ΔＦＣＳ：フューリン切断部位の不活化
ΔＣＴＤ：ＣＴＤの除去
ＶＳＶ：水疱性口内炎ウイルスの表面糖タンパク質のＴＭＤおよびＣＴＤによるスパイクタンパク質のＴＭＤおよびＣＴＤの置換。

【0143】

２Ｐ：原型の前融合立体構造を安定化するための２Ｐ修飾の追加。

【0144】

Ｙ^１１４４Ａ：ＥＲ保持シグナルの機能的除去
３Ｍ：三量体化ドメインの付加
［実施例１］
ヌクレオチドおよびアミノ酸配列
ＩＢＶ－Ｍａ５－スパイク［配列番号１］

ＩＢＶ－Ｍａ５－スパイク［配列番号２］

１－１８ シグナルペプチド（ＳＰ）
１９－５３２ Ｓ１
５３３－５３７ フューリン切断部位（ＦＣＳ）
５３８－１１６２ Ｓ２
１０９２－１１４０ 膜貫通ドメイン（ＴＭＤ）
１１４１－１１６２ Ｃ末端ドメイン（ＣＴＤ）
ＩＢＶ－Ｍａ５－スパイク－ΔＦＣＳ－ＶＳＶ［配列番号３］

ＩＢＶ－Ｍａ５－Ｓ－ΔＦＣＳ－ＶＳＶ［配列番号４］

１－１８ シグナルペプチド（ＳＰ）
１９－５３２ Ｓ１
５３３－５３７ 変異されたＦＣＳ ＲＲＦＲＲ－＞ＡＡＦＡＡ
５３８－１０９１ Ｓ２
１０９２－１１１６ ＶＳＶ膜貫通ドメイン（ＴＭＤ）
１１１７－１１４０ ＶＳＶ Ｃ末端ドメイン（ＣＴＤ）
ＩＢＶ－Ｍａ５－スパイク－ΔＦＣＳ－２Ｐ－ＶＳＶ［配列番号５］

ＩＢＶ－Ｍａ５－Ｓ－ΔＦＣＳ－２Ｐ－ＶＳＶ［配列番号６］

１－１８ シグナルペプチド（ＳＰ）
１９－５３２ Ｓ１
５３３－５３７ 変異されたＦＣＳ ＲＲＦＲＲ－＞ＡＡＦＡＡ
５３８－１０９１ Ｓ２
８５９－８６０ Ａ８５９Ｐ＋Ｉ８６０Ｐ置換
１０９２－１１１６ ＶＳＶ膜貫通ドメイン（ＴＭＤ）
１１１７－１１４０ ＶＳＶ Ｃ末端ドメイン（ＣＴＤ）
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－スパイク［配列番号７］

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－スパイク［配列番号８］

１－１３ シグナルペプチド（ＳＰ）
１４－６８１ Ｓ１
３３３－５２７ 受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）
６８２－６８５ フューリン切断部位（ＦＣＳ）
６８６－１２１１ Ｓ２
１２１２－１２５５ 膜貫通ドメイン（ＴＭＤ）
１２５６－１２７３ Ｃ末端ドメイン（ＣＴＤ）
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－スパイク－ΔＦＣＳ－ＶＳＶ［配列番号９］

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－スパイク－ΔＦＣＳ－ＶＳＶ［配列番号１０］

１－１３ シグナルペプチド（ＳＰ）
１４－６８１ Ｓ１
３３３－５２７ 受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）
６８２－６８５ 変異されたＦＣＳ ＲＲＡＲ－＞ＡＡＡＲ
６８６－１２１１ Ｓ２
１２１２－１２３６ ＶＳＶ膜貫通ドメイン（ＴＭＤ）
１２３７－１２６０ ＶＳＶ Ｃ末端ドメイン（ＣＴＤ）
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－スパイク－ΔＦＣＳ－２Ｐ－ＶＳＶ［配列番号１１］

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－スパイク－ΔＦＣＳ－２Ｐ－ＶＳＶ［配列番号１２］

１－１３ シグナルペプチド（ＳＰ）
１４－６８１ Ｓ１
３３３－５２７ 受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）
６８２－６８５ 変異されたＦＣＳ ＲＲＡＲ－＞ＡＡＡＲ
６８６－１２１１ Ｓ２
９８６－９８７ Ｋ９８６Ｐ＋Ｖ９８７Ｐ置換
１２１２－１２３６ ＶＳＶ膜貫通ドメイン（ＴＭＤ）
１２３７－１２６０ ＶＳＶ Ｃ末端ドメイン（ＣＴＤ）

【表1】

［実施例２］
ＶＥＥＶ ＲＮＡレプリコン粒子中へのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２およびＩＢＶスパイクタンパク質のコード配列の組み込み
アルファウイルスＲＮＡレプリコン構築
コドン最適化されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓ－ｗｔ）、対応するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクキメラスパイクタンパク質（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓ－ΔＦＣＳ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓ－ΔＦＣＳ－２Ｐ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓ－ΔＦＣＳ－ΔＣＴＤ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓ－ΔＦＣＳ－ＶＳＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓ－ΔＦＣＳ－２Ｐ－ＶＳＶ）、およびコドン最適化されたＩＢＶスパイク（ＩＢＶ－Ｓ－ｗｔ）、および対応するＩＢＶスパイクキメラスパイクタンパク質（ＩＢＶ－Ｓ－２Ｐ－ΔＣＴＤ、ＩＢＶ－Ｓ－２Ｐ－Ｙ１１４４Ａ、ＩＢＶ－Ｓ－２Ｐ－ＶＳＶ）をコードするアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子を含むワクチンを調製した。

【0145】

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質遺伝子ＲＰの作製。

【0146】

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク遺伝子を発現するために使用するためのＶＥＥＶレプリコンベクターは、以下の修正を加えて、前述のように構築される［米国特許第９，４４１，２４７号を参照；その内容は参照により本明細書に組み入れられる。］。ＶＥＥＶ ＴＣ－８３由来のレプリコンベクター「ｐＶＥＫ」［米国特許第９，４４１，２４７号に開示および記載されている］を制限酵素ＡｓｃＩおよびＰａｃＩで消化して、ベクター「ｐＶＨＶ」を作製する。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、２０１９－ｎＣｏＶ／ＵＳＡ－ＷＩ１／２０２０株（ＧｅｎＢａｎｋアクセッションＭＴ０３９８８７）由来のスパイクタンパク質遺伝子配列をネコのコドン使用表の方向にコドン最適化し、隣接するＡｓｃＩおよびＰａｃＩ部位とともに合成した。それぞれＡｓｃＩおよびＰａｃＩ酵素で合成遺伝子およびｐＶＨＶベクターを消化し、連結してベクター「ｐＶＨＶ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－スパイク」を作製する。正しいベクターおよび挿入断片の同一性を確認するために、プラスミドバッチを配列決定する。

【0147】

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質遺伝子ＲＮＡ ＲＰの作製。

【0148】

以下の修正を加えて、以前に記載されたように［米国特許第９，４４１，２４７号を参照；その内容は参照により本明細書に組み入れられる。］、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓ－ｗｔ）遺伝子および対応するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクキメラスパイクタンパク質（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓ－ΔＦＣＳ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓ－ΔＦＣＳ－２Ｐ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓ－ΔＦＣＳ－ΔＣＴＤ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓ－ΔＦＣＳ－ＶＳＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓ－ΔＦＣＳ－２Ｐ－ＶＳＶ）を発現させるために使用するためのＶＥＥＶレプリコンベクターを構築した。ＶＥＥＶ ＴＣ－８３由来のレプリコンベクター「ｐＶＥＫ」［米国特許第９，４４１，２４７号に開示および記載されている］を制限酵素ＡｓｃＩおよびＰａｃＩで消化して、ベクター「ｐＶＨＶ」を作製する。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、２０１９－ｎＣｏＶ／ＵＳＡ－ＷＩ１／２０２０株（ＧｅｎＢａｎｋアクセッションＭＴ０３９８８７）からのスパイクタンパク質遺伝子配列、および対応するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクキメラスパイクタンパク質）をコドン最適化し、隣接するＡｓｃＩおよびＰａｃＩ部位とともに合成した。それぞれＡｓｃＩおよびＰａｃＩ酵素で合成遺伝子およびｐＶＨＶベクターを消化し、連結してベクター「ｐＶＨＶ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－スパイク」を作製する。正しいベクターおよび挿入断片の同一性を確認するために、プラスミドバッチを配列決定する。

【0149】

ＩＢＶスパイクタンパク質遺伝子ＲＮＡ ＲＰの作製。

【0150】

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２からのスパイクタンパク質遺伝子配列と同様に、ＩＢＶ、Ｍａ５株（ＧｅｎＢａｎｋアクセッションＫＹ６２６０４５）からのスパイクタンパク質遺伝子配列をコドン最適化し、隣接するＡｓｃＩおよびＰａｃＩ部位とともに合成した。上記のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質について上述したように、ＩＢＶスパイク（ＩＢＶ－Ｓ－ｗｔ）遺伝子および対応するＩＢＶスパイクキメラスパイクタンパク質（ＩＢＶ－Ｓ－２Ｐ－ＣＴＤ、ＩＢＶ－Ｓ－２Ｐ－Ｙ１１４４Ａ、ＩＢＶ－Ｓ－２Ｐ－ＶＳＶ、ＩＢＶ－Ｓ－ΔＦＣＳ、ＩＢＶ－Ｓ－ΔＦＣＳ－２Ｐ、ＩＢＶ－Ｓ－ΔＦＣＳ－ΔＣＴＤ、ＩＢＶ－Ｓ－ΔＦＣＳ－ＶＳＶ、ＩＢＶ－Ｓ－ΔＦＣＳ－２Ｐ－ＶＳＶ）を発現させるために使用するためのＶＥＥＶレプリコンベクターを構築した。したがって、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２からのスパイクタンパク質遺伝子配列と同様に、ＩＢＶ、Ｍａ５株（ＧｅｎＢａｎｋアクセッションＫＹ６２６０４５）からのスパイクタンパク質遺伝子配列をコドン最適化し、隣接するＡｓｃＩおよびＰａｃＩ部位とともに合成する。それぞれＡｓｃＩおよびＰａｃＩ酵素で合成遺伝子およびｐＶＨＶベクターを消化し、連結してベクター「ｐＶＨＶ－ＩＢＶ－Ｍａ５－スパイク」を作製する。正しいベクターおよび挿入断片の同一性を確認するために、プラスミドバッチを配列決定する。

【0151】

ＶＥＥＶ ＴＣ－８３ＲＮＡ ＲＰの作製は、以前に記載された方法に従って行われる［米国特許第９，４４１，２４７号および米国特許第８，４６０，９１３号；これらの内容は参照により本明細書に組み入れられる。］。手短に言えば、ＭｅｇａＳｃｒｉｐｔ Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼおよびキャップ類似体を使用したインビトロ転写の前に、ＮｏｔＩ制限酵素でｐＶＨＶ－スパイクレプリコンベクターＤＮＡおよびヘルパーＤＮＡプラスミドを直鎖化する。重要なことに、作製において使用されるヘルパーＲＮＡは、以前に記載されたように、ＶＥＥＶサブゲノムプロモーター配列を欠く［Ｋａｍｒｕｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．９１（Ｐｔ７）：１７２３－１７２７（２０１０）］。レプリコン成分およびヘルパー成分についての精製されたＲＮＡを合わせ、ベロ細胞の懸濁液と混合し、４ｍｍキュベット中で電気穿孔し、無血清培養培地に戻す。一晩のインキュベーション後、懸濁液をデプスフィルターに通し、５％スクロース（ｗ／ｖ）を含有するリン酸緩衝生理食塩水で洗浄し、最後に保持されたＲＰを４００ｍＭＮａＣｌ＋５％スクロース（ｗ／ｖ）緩衝液で溶出することによって、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子を細胞および培地から精製する。溶出されたＲＰを０．２２ミクロンのメンブレンフィルターに通し、保存のために一定分量に分配した。感染したベロ細胞単層に対する免疫蛍光アッセイによって、機能的ＲＰの力価を決定する。次いで、コドン最適化されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質をコードする得られた増殖欠陥アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子を、アジュバントを含まないまたはアジュバントを含むワクチン製剤に入れ、動物対象に投与することができる。

【0152】

［実施例３］
ＩＦＡを使用した培養細胞中でのＩＢＶスパイク抗原の発現
宿主細胞中でのＩＢＶスパイク抗原の発現を調べるために、本発明によるポリペプチドを宿主細胞に送達するための異なる形態を使用して一連の実験を行った。異なる染色技術を適用して、それらの発現の種類および位置を可視化した。

【0153】

ベロ細胞中のプラスミドＤＮＡからのＩＢＶスパイク抗原
フューリン切断部位の不活化（ΔＦＣＳ）、Ｃ末端ドメインの除去（ΔＣＴＤ）、またはＶＳＶの表面糖タンパク質ＴＭＤおよびＣＴＤによるスパイクタンパク質ＴＭＤおよびＣＴＤの置き換え、プロリン変異（２Ｐ）、三量体化ドメインの付加（３Ｍ）、またはＥＲ保持シグナルの変異（Ｙ^１１４４Ａ）がＩＢＶスパイク抗原の発現レベルに対して何らかの影響を有するかどうかを決定するために、ＩＢＶスパイク抗原の産生を誘導するｐＣＡＧＧＳ発現プラスミドでベロ細胞を形質移入し、免疫蛍光アッセイ（ＩＦＡ）のために使用した。

【0154】

材料および方法
１０％ＦＣＳ、Ｌ－グルタミンおよび１％非必須アミノ酸を補充したＤＭＥＭ中でベロ細胞を培養した。０．５ｍｌの培養培地中の２４ウェルクラスタ中に、２５．０００細胞／ｃｍ^２の密度で形質移入のための細胞を播種し、３７℃、５％ＣＯ_２でインキュベートした。翌日、製造者の説明書に従って、ウェル当たり、５０μｌの形質移入ミックス中のＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００（商標）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して、５００ｎｇのｐＣＡＧＧＳプラスミドＤＮＡでベロ細胞の半コンフルエントな単層を形質移入した。形質移入／感染の２４時間後、ウェルあたり約１ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で細胞を１回洗浄し、ウェルあたり０．５ｍｌの９６％エタノールを用いて－２０℃で３０分間固定した。ウェルあたり約１ｍｌの洗浄緩衝液（ＰＢＳ＋０．１５％ポリソルベート２０）を使用して細胞を３回洗浄し、室温で１時間、０．２５ｍｌのＩＢＥＩＡ緩衝液（ＰＢＳ＋０．０５％ポリソルベート２０＋０．１％ＢＳＡ）中の、ＣｈａｒｌｅｓＲｉｖｅｒからのＩＮＴ－Ｍ４１－０１－０３マウスモノクローナル抗体またはニワトリポリクローナル抗体血清のいずれかを使用してスパイク抗原を可視化した。０．２５ｍｌのＩＢＥＩＡ緩衝液中、二次ヤギ抗マウスＩｇＧ Ａｌｅｘａ４８８またはヤギ抗ニワトリＩｇＧ Ａｌｅｘａ５６８抗体（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して、結合した抗体を室温で１時間染色した。染色の間および最終染色後に、細胞を洗浄緩衝液で３回洗浄した。蛍光顕微鏡を使用して、染色された細胞を分析した。

【0155】

結果
ＩＢＶ－Ｍａｓｓに対して作られたマウスモノクローナル抗体およびニワトリポリクローナル抗体血清はいずれも、ベロ細胞中でのスパイク抗原発現を可視化することができた。Ｃ末端ドメインまたはＥＲ保持シグナルを改変することは、染色パターンを細胞膜より細胞膜の方向に変化させるようである。他のスパイク変異体抗原からは、この分析技術を使用して発現レベルの差を適切に評価することができなかった。

【0156】

ＨＥＬＡ細胞中のプラスミドＤＮＡからのＩＢＶスパイク抗原
フューリン切断部位の不活化（ΔＦＣＳ）、Ｃ末端ドメインの除去（ΔＣＴＤ）、またはＶＳＶの表面糖タンパク質ＴＭＤおよびＣＴＤによるスパイクタンパク質ＴＭＤおよびＣＴＤの置き換え、プロリン変異（２Ｐ）、三量体化ドメインの付加（３Ｍ）、またはＥＲ保持シグナルの変異（Ｙ^１１４４Ａ）またはこれらの組み合わせがＩＢＶスパイク抗原の発現レベルに対して何らかの影響を有するかどうかを決定するために、ＩＢＶスパイク抗原の産生を誘導するｐＣＡＧＧＳ発現プラスミドでＨｅＬａ細胞を形質移入し、免疫蛍光アッセイ（ＩＦＡ）のために使用する。

【0157】

材料および方法
２４ウェルクラスタ中に、１００，０００細胞／ｃｍ２の密度で、ＨＥＬＡ細胞をＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳ／ＰＳ中に播種した。翌日、ポリエチレンイミン（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ．）を使用して、１：１０のＤＮＡ：ＰＥＩ比で、６２５ｎｇのｐＣＡＧＧＳ２プラスミドＤＮＡで細胞を形質移入した。形質移入ミックスをＯｐｔｉＭＥＭ（Ｌｏｎｚａ）中で調製し、１５秒間ボルテックス撹拌し、次いで室温で２０分間インキュベートした。その後、ウェルあたり５０μＬのミックスを添加し、細胞との７時間のインキュベーション後に培地を交換した。形質移入の２４時間後に、ＤＡＰＩを含有する５０μＬの培養培地（ウェルあたりの最終希釈率１：４０００）を各ウェルに添加し、１５～３０分間インキュベートし、その後培地を除去し、単層をＤＰＢＳ（カルシウムおよびマグネシウムを含まない１×ＤＰＢＳ、Ｌｏｎｚａ）で１回洗浄し、続いて３％ＰＦＡで固定した。１時間固定した後、細胞をＤＰＢＳで再び洗浄し、０．５％サポニンで、４℃で１５分間透過処理し（または透過処理せず）、３％ＢＳＡ（ブロッキング溶液）中で１時間ブロッキングした。その後、抗ＩＢＶ Ｓ ｍＡｂ（ＩＮＴ－Ｍ４１－０１－０３、ＭＳＤ Ａｎｉｍａｌ Ｈｅａｌｔｈ）と共にガラススライドを室温で１時間インキュベートし、ブロッキング緩衝液で１：１００に希釈した。その後、５分間の３回の洗浄工程を０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０溶液で行い、二次抗体（ロバ抗マウスＩｇＧ Ａｌｅｘａ４８８、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｒｏｂｅｓ）をブロッキング緩衝液中に１：４００希釈で添加した。さらに１時間のインキュベーション後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０溶液で３回およびＤＰＢＳで１回、細胞を再度洗浄した。１０μＬのＦｌｕｏｒＰｒｏｔｅｃｔ（商標）試薬（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用してスライドをマウントし、室温で一晩保存した後、Ｏｌｙｍｐｕｓ ＢＸ６０蛍光顕微鏡を用いて画像を収集した。特に明記しない限り、ＤＰＢＳ中ですべての溶液を調製した。

【0158】

結果
Ｃ末端ドメインを欠失させることまたはＩＢＶ ＴＭ－ＣＴＤでＶＳＶのその対応物を置き換えることは、細胞表面発現を強く増強する。さらに、ＥＲ保持シグナル中の単一のアミノ酸置換は、細胞表面局在化の同じ増加をもたらすようである。２Ｐ置換を導入することまたはフューリン切断部位を変異させることは、全体的な抗原発現レベルを増強するのに対して、さらなる三量体化ドメイン（３Ｍ）を導入することによってＩＢＶスパイク三量体を安定化させることは、スパイク発現レベルを低下させる。注目すべきことに、フューリン切断部位および２Ｐに対する修飾はいずれも発現レベルに影響を及ぼしたのに対して、Ｙ^１１４４Ａ、ＣＴＤおよびＶＳＶ修飾はタンパク質局在化に影響を及ぼした（下記の表１を参照）。このことは、これらの修飾の組み合わせが有益であることを示唆した。

【表2】

ベロ細胞中のＰＶＡＸプラスミドＤＮＡワクチンからのＩＢＶスパイク抗原
フューリン切断部位の不活化（ΔＦＣＳ）、ＣＴＤの修飾［ＩＢＶスパイクタンパク質のＣＴＤを欠失させることによって（ΔＣＴＤ）、またはスパイクタンパク質のＴＭＤおよびＣＴＤをＶＳＶの表面糖タンパク質のＴＭＤおよびＣＴＤによって置き換えることによって］、プロリン変異（２Ｐ）、またはＥＲ保持シグナルの変異（Ｙ^１１４４Ａ）の組み合わせが、ＩＢＶスパイク抗原の発現レベルおよび／または細胞表面局在化に対して何らかの影響を及ぼすかどうかを決定するために、ＩＢＶスパイク抗原の産生を誘導するｐＶＡＸプラスミドＤＮＡワクチンでベロ細胞を形質移入し、免疫蛍光アッセイ（ＩＦＡ）に使用した。

【0159】

材料および方法
１０％ＦＣＳ、Ｌ－グルタミンおよび１％非必須アミノ酸を補充したＤＭＥＭ中でベロ細胞を培養した。０．５ｍｌの培養培地中の２４ウェルクラスタ中に、２５．０００細胞／ｃｍ^２の密度で形質移入のための細胞を播種し、３７℃、５％ＣＯ_２でインキュベートした。翌日、製造者の説明書に従って、ウェル当たり、５０μｌの形質移入ミックス中のＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して、５００ｎｇのｐＶＡＸプラスミドＤＮＡでベロ細胞の半コンフルエントな単層を形質移入した。形質移入／感染の２４時間後、ウェルあたり約１ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で細胞を１回洗浄し、－２０℃で３０分間ウェルあたり０．５ｍｌの９６％エタノールまたは室温で１５分間０．５ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中４％ＰＦＡのいずれかを用いて固定した。後者の種類の固定は、細胞膜がなお無傷であることを保証し、その結果、観察されるシグナルはいずれも細胞表面に発現されるはずである。ウェルあたり約１ｍｌの洗浄緩衝液（ＰＢＳ＋０．１５％ポリソルベート２０）を使用して細胞を３回洗浄し、室温で１時間、０．２５ｍｌのＩＢＥＩＡ緩衝液（ＰＢＳ＋０．０５％ポリソルベート２０＋０．１％ＢＳＡ）中の、ＣｈａｒｌｅｓＲｉｖｅｒからのＩＮＴ－Ｍ４１－０１－０３マウスモノクローナル抗体またはニワトリポリクローナル抗体血清のいずれかを使用してスパイク抗原を可視化した。０．２５ｍｌのＩＢＥＩＡ緩衝液中、二次ヤギ抗マウスＩｇＧ Ａｌｅｘａ４８８またはヤギ抗ニワトリＩｇＧ Ａｌｅｘａ５６８抗体（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して、結合した抗体を室温で１時間染色した。染色の間および最終染色後に、細胞を洗浄緩衝液で３回洗浄した。蛍光顕微鏡を使用して、染色された細胞を分析した。

【0160】

結果
２Ｐ置換（２Ｐ）およびフューリン切断部位変異（ΔＦＣＳ）と組み合わせたＣ末端ドメインの欠失（ΔＣＴＤ）またはＥＲ保持シグナル中の単一アミノ酸置換（Ｙ^１１４４Ａ）は、細胞表面発現のみならず最も最適な発現レベルをもたらすようである。ΔＦＣＳ－２Ｐ変化と組み合わせたＶＳＶのＴＭ－ＣＴＤによるＴＭ－ＣＴＤ置換の組み合わせは、タンパク質の局在化のみならず発現レベルを増加させるが、他の２つの組み合わせよりも程度は低い。この最初のインビトロデータは、Ｃ末端ドメインの除去、ＥＲ保持シグナル中のアミノ酸置換（Ｙ^１１４４Ａ）またはＶＳＶのＣＴＤによるＩＢＶ ＣＴＤの置換とのΔＦＣＳ－２Ｐ修飾の組み合わせはすべて、ＩＢＶスパイクタンパク質の細胞表面発現と総発現の両方の増加をもたらしたことを示す。しかしながら、興味深いことに、対応するインビボデータで見出された他の２つの修飾されたＩＢＶスパイクタンパク質に対する、ＶＳＶのＣＴＤによるＩＢＶ ＣＴＤの置換の優位性（下記参照）は、このインビトロデータでは観察されなかった。

【表3】

［実施例４］
ＨＥＫ２９３細胞中でのＩＢＶスパイク抗原の発現のフローサイトメトリー分析
フューリン切断部位への修飾（ΔＦＣＳ）、Ｃ末端ドメインの修飾（ΔＣＴＤまたはＶＳＶ）、プロリン変異（２Ｐ）、三量体化ドメインの付加（３Ｍ）、またはＥＲ保持シグナルの変異（Ｙ^１１４４Ａ）がＩＢＶスパイク抗原の発現レベルに対して何らかの影響を有するかどうかを決定するために、フローサイトメトリーで分析されるようにＩＢＶスパイク抗原の産生を誘導するｐＣＡＧＧＳ発現プラスミドでＨＥＫ２９３細胞を形質移入した。

【0161】

材料および方法
ＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳ／ＰＳ中でＨＥＫ２９３Ｔ細胞を培養し、６ウェルクラスタ中に１００．０００細胞／ｃｍ２の密度で播種した。翌日、ポリエチレンイミン（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ．）を使用して、１：１０のＤＮＡ：ＰＥＩ比で、２．５μｇのｐＣＡＧＧＳ２プラスミドＤＮＡで細胞を形質移入した。形質移入ミックスをＯｐｔｉＭＥＭ（商標）（Ｌｏｎｚａ）中で調製し、１５秒間ボルテックス撹拌し、次いで室温で２０分間インキュベートした。その後、ウェルあたり２００μＬのミックスを添加し、細胞との７時間のインキュベーション後に培地を交換した。形質移入後２４時間に、ＤＰＢＳ（カルシウムおよびマグネシウムを含まない１×ＤＰＢＳ、Ｌｏｎｚａ）で単層を１回洗浄し、細胞を解離させ、０．３２ｍＬのＴｒｙｐＬＥ（商標）（トリプシン置換試薬、Ｇｉｂｃｏ）を室温で３～５分間添加した。次に、細胞をＤＭＥＭ（最大１ｍＬ）と混合し、１０μＬの懸濁液を計数のために使用し（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣｏｕｎｔｅｓｓＩＩ）、一方、残りを５分／１０００ｒｐｍの遠心分離によってペレット化した。培地を除去し、氷上で２０分間、２％ＰＦＡで細胞を固定した。固定後、細胞をペレット化し（５分／２５００ｒｐｍ／４℃）、０．５％サポニンで、氷上で２０分間透過処理し（または透過処理せず）、氷上の３％ＢＳＡ（ブロッキング溶液）中で１時間ブロッキングした。各試料から二連で、約４×１０Ｅ５の細胞を分析のためにさらに使用した。ブロッキングされた細胞を丸底９６ウェルクラスタに移し、ペレット化し、一次抗体（ｍＡｂ ＩＮＴ－ｍ４１－０１－０３またはＩＮＴ－ｍ４１－０１－０８、ＭＳＤ Ａｎｉｍａｌ Ｈｅａｌｔｈ）とインキュベートし、ブロッキング緩衝液で１：２００に希釈した。その後、５分間の３回の洗浄工程を０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０溶液で行い、二次抗体（ヤギ抗マウスまたはロバ抗マウスＩｇＧ Ａｌｅｘａ４８８、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｒｏｂｅｓ）をブロッキング緩衝液中に１：２００希釈で添加した。１時間のインキュベーション後、細胞を０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０溶液で再び３回洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液（２％ＢＳＡ、５ｍＭＥＤＴＡ、０．０２％ＮａＮ３）中に再懸濁した後、ＣｙｔｏＦＬＥＸ ＬＸ（商標）（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）で分析した。

【0162】

結果
ＦＡＣＳ分析は、ＩＦＡの結果を補強する：フューリン切断部位変異（ΔＦＣＳ）に加えて、ＥＲ保持シグナルの変異（Ｙ^１１４４Ａ）、Ｃ末端ドメインの欠失（ΔＣＴＤ）およびＶＳＶ ＴＭＤ－ＣＴＤの存在は、ＩＢＶ Ｓ変異体の表面発現を改善する。ΔＦＣＳ－２Ｐに加えてＶＳＶ ＴＭ－ＣＴドメインを含有する変異体によって、最も高い表面発現および総発現が得られた。３Ｍ変異体は、最も低い表面発現を有していた。

【表4】

［実施例５］
ＩＦＡを使用した培養細胞中でのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク抗原の発現
宿主細胞中でのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク抗原の発現を調べるために、本発明によるポリペプチドを宿主細胞に送達するための異なる形態を使用して一連の実験を行った。異なる染色技術を適用して、それらの発現の種類および位置を可視化した。

【0163】

ベロ細胞中でＰＶＡＸプラスミドＤＮＡおよびＶＥＥＶ ＲＰワクチンを使用するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク抗原
フューリン切断部位の不活化（ΔＦＣＳ）、Ｃ末端ドメインの修飾（ΔＣＴＤまたはＶＳＶ）またはプロリン変異（２Ｐ）の組み合わせがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク抗原の発現レベルおよび／または細胞表面局在化に対して何らかの影響を有するかどうかを決定するために、ｐＶＡＸプラスミドＤＮＡワクチンでベロ細胞を形質移入するか、またはスパイク抗原の産生を誘導するＶＥＥＶ ＲＰを感染させ、免疫蛍光アッセイ（ＩＦＡ）のために使用した。

【0164】

材料および方法
１０％ＦＣＳ、Ｌ－グルタミンおよび１％非必須アミノ酸を補充したＤＭＥＭ中でベロ細胞を培養した。０．５ｍｌの培養培地中の２４ウェルクラスタ中に、２５．０００細胞／ｃｍ^２の密度で形質移入のための細胞を播種し、３７℃、５％ＣＯ_２でインキュベートした。翌日、製造者の説明書に従って、５０μｌの形質移入ミックス中のＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して、５００ｎｇのｐＶＡＸプラスミドＤＮＡでベロ細胞の半コンフルエントな単層を形質移入するか、またはウェル当たり５．０×１０Ｅ５のＶＥＥＶ ＲＰを感染させた。形質移入／感染の２４時間後、ウェルあたり約１ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で細胞を１回洗浄し、ウェルあたり０．５ｍｌの９６％エタノールを用いて－２０℃で３０分間固定した。ウェルあたり約１ｍｌの洗浄緩衝液（ＰＢＳ＋０．１５％ポリソルベート２０）を使用して細胞を３回洗浄し、０．２５ｍｌのＩＢＥＩＡ緩衝液（ＰＢＳ＋０．０５％ポリソルベート２０＋０．１％ＢＳＡ）中の、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳ１Ａドメインに対して作られたＣＲ３０２２ヒトモノクローナル抗体またはウサギポリクローナル抗体のいずれかを使用して室温で１時間、スパイク抗原を可視化した。０．２５ｍｌのＩＢＥＩＡ緩衝液中、二次ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ａｌｅｘａ４８８およびヤギ抗ウサギＩｇＧ Ａｌｅｘａ５６８抗体（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して、結合した抗体を室温で１時間染色した。染色の間および最終染色後に、細胞を洗浄緩衝液で３回洗浄した。蛍光顕微鏡を使用して、染色された細胞を分析した。

【0165】

結果
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳ１Ａドメインに対して作られたＣＲ３０２２ヒトモノクローナル抗体およびウサギポリクローナル抗体はいずれも、ベロ細胞中でのスパイク抗原発現を可視化することができた。フューリン切断部位を不活化させること（ΔＦＣＳ）は、ｐＶＡＸプラスミドＤＮＡワクチンプラットフォームおよびＶＥＥＶ－ＲＰワクチンプラットフォームから抗原が産生されるときに抗原発現レベルを増加させる。他のスパイク変異体抗原からは、この分析技術を使用して発現レベルおよび／または局在化に明確な差を観察することができなかった。

【表5】

ＨＥＬＡ細胞中でＰＶＡＸプラスミドＤＮＡおよびＶＥＥＶ ＲＰワクチンを使用するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク抗原
不活化されたフューリン切断部位（ΔＦＣＳ）、Ｃ末端ドメインの修飾（ΔＣＴＤまたはＶＳＶ）またはプロリン変異（２Ｐ）の組み合わせがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク抗原の発現レベルおよび／または細胞表面局在化に対して何らかの影響を有するかどうかを決定するために、スパイク抗原の産生を誘導するｐＣＡＧＧＳ発現プラスミドでＨＥＬＡ細胞を形質移入し、免疫蛍光アッセイ（ＩＦＡ）のために使用した。

【0166】

材料および方法
ガラススライド（１ｃｍの直径）を含有する２４ウェルクラスタ中に４０．０００細胞／ｃｍ^２の密度で、ＨｅＬａ細胞をＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳ／ＰＳ中に播種した。翌日、ポリエチレンイミン（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ．）を使用して、１：１０のＤＮＡ：ＰＥＩ比で、６２５ｎｇのｐＣＡＧＧＳ２プラスミドＤＮＡで細胞を形質移入した。形質移入ミックスをＯｐｔｉＭＥＭ（Ｌｏｎｚａ）中で調製し、１５秒間ボルテックス撹拌し、次いで室温で２０分間インキュベートした。その後、ウェルあたり５０μＬのミックスを添加し、細胞との７時間のインキュベーション後に培地を交換した。形質移入の２４時間後に、ＤＡＰＩを含有する５０μＬの培養培地（ウェルあたりの最終希釈率１：４０００）を各ウェルに添加し、１５～３０分間インキュベートし、その後培地を除去し、単層をＤＰＢＳ（カルシウムおよびマグネシウムを含まない１×ＤＰＢＳ、Ｌｏｎｚａ）で１回洗浄し、続いて３％ＰＦＡで固定した。１時間固定した後、細胞をＤＰＢＳで再度洗浄し、３％ＢＳＡ（ブロッキング溶液）中で１時間ブロッキングした。その後、抗ＳＡＲＳ ＣｏＶ２ ＳヒトｍＡｂ（ＲＢＤを標的とする）とともにガラススライドを室温で１時間インキュベートし、ブロッキング緩衝液で１０μｇ／ｍＬに希釈した。その後、５分間の３回の洗浄工程を０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０溶液で行い、二次抗体（ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ａｌｅｘａ４８８、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｒｏｂｅｓ）をブロッキング緩衝液中に１：４００希釈で添加した。さらに１時間のインキュベーション後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０溶液で３回およびＤＰＢＳで１回、細胞を再度洗浄した。１０μＬのＦｌｕｏｒＰｒｏｔｅｃｔ試薬（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用してスライドをマウントし、室温で一晩保存した後、Ｏｌｙｍｐｕｓ ＢＸ６０蛍光顕微鏡を用いて画像を収集した。特に明記しない限り、ＤＰＢＳ中ですべての溶液を調製した。

【0167】

結果
フューリン切断部位を不活化すること（ΔＦＣＳ）は、抗原がｐＣＡＧＧＳ発現プラスミドから産生されるときに抗原発現レベルをわずかに増加させる。また、２Ｐ置換は、ＶＳＶのＴＭ－ＣＴＤのＴＭ－ＣＴＤ置換との組み合わせありまたはなしで、発現レベルをわずかに増加させる。ＶＳＶのＴＭ－ＣＴＤのＴＭ－ＣＴＤ置換単独（ＶＳＶ）のＣＴＤ欠失（ΔＣＴＤ）は、発現レベルに対してあまり影響を有さない。

【表6】

［実施例６］
ＨＥＫ２９３細胞中でのＳＡＲＳ－ＣｏＶスパイク抗原の発現のフローサイトメトリー分析
不活化されたフューリン切断部位（ΔＦＣＳ）、Ｃ末端ドメインの修飾（ΔＣＴＤまたはＶＳＶ）およびプロリン変異（２Ｐ）の組み合わせがスパイク抗原の発現レベルおよび局在化に対して何らかの影響を有するかどうかを決定するために、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク抗原の産生を誘導するｐＣＡＧＧＳ発現プラスミドでＨＥＫ２９３細胞を形質移入し、フローサイトメトリー分析のために使用した。

【0168】

材料および方法
ＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳ／ＰＳ中でＨＥＫ２９３Ｔ細胞を培養し、６ウェルクラスタ中に１×１０Ｅ５細胞／ｃｍ^２の密度で播種した。翌日、ポリエチレンイミン（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ．）を使用して、１：１０のＤＮＡ：ＰＥＩ比で、２．５μｇのｐＣＡＧＧＳ２プラスミドＤＮＡで細胞を形質移入した。形質移入ミックスをＯｐｔｉＭＥＭ（Ｌｏｎｚａ）中で調製し、１５秒間ボルテックス撹拌し、次いで室温で２０分間インキュベートした。その後、ウェルあたり２００μＬのミックスを添加し、細胞との７時間のインキュベーション後に培地を交換した。形質移入後２４時間に、ＤＰＢＳ（カルシウムおよびマグネシウムを含まない１×ＤＰＢＳ、Ｌｏｎｚａ）で単層を１回洗浄し、０．３２ｍＬのＴｒｙｐＬＥ（トリプシン置換試薬、Ｇｉｂｃｏ）を室温で３～５分間添加することによって細胞を解離させた。次に、ピペット操作によって細胞をＤＭＥＭ（最大１ｍＬ）と混合し、１０μＬの懸濁液を計数のために使用し（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣｏｕｎｔｅｓｓＩＩ）、一方、残りを５分／１０００ｒｐｍの遠心分離によってペレット化した。培地を除去し、氷上で２０分間、３％ＰＦＡで細胞を固定した。固定後、細胞をペレット化し（５分／２５００ｒｐｍ／４℃）、０．５％サポニンで、氷上で２０分間透過処理し（または透過処理せず）、氷上の３％ＢＳＡ（ブロッキング溶液）中で１時間ブロッキングした。各試料から二連で、約４×１０Ｅ５の細胞を分析のためにさらに使用した。ブロッキングされた細胞を丸底９６ウェルクラスタに移し、ペレット化し、一次抗体（ヒトＭＡｂ４７Ｄ１１またはＣＲ３０２２）と共にインキュベートし、ブロッキング緩衝液で１０μｇ／ｍＬに希釈した。その後、５分間の３回の洗浄工程を０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０溶液で行い、二次抗体（ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ａｌｅｘａ４８８、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｒｏｂｅｓ）をブロッキング緩衝液中に１：４００希釈で添加した。１時間のインキュベーション後、細胞を０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０溶液で再び３回洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液（２％ＢＳＡ、５ｍＭＥＤＴＡ、０．０２％ＮａＮ３）中に再懸濁した後、ＣｙｔｏＦＬＥＸ ＬＸ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）で分析した。ＦｌｏｗＪｏｖ．９ソフトウェアで結果を分析した。特に明記しない限り、ＤＰＢＳ中ですべての溶液を調製した。

【0169】

結果
結果は、検出のために使用されるｈＭＡｂおよび特定のＲＢＤエピトープの接近可能性に応じて変化する傾向がある。ｈＭＡｂ４７Ｄ１１を検出のために使用すると、ΔＦＣＳを有する変異体は、特にＶＳＶ ＴＭＤが存在する場合に、改善された発現を有する。ΔＦＣＳおよびΔＣＴＤを有する変異体は、より低い発現を有する。このアッセイで得られたデータは、ＨｅＬａ細胞における免疫蛍光分析によって裏付けられる。

【表7】

［実施例７］
ニワトリにおけるＩＢＶスパイク抗原の免疫原性
修飾されたＩＢＶスパイクタンパク質を使用した上記インビトロ研究をニワトリにおけるインビボ研究に拡張した。上記のように、修飾されたＩＢＶ Ｍａ５スパイク抗原は、感染細胞の細胞表面上でより効率的に発現されるように設計された。ＶＥＥＶ ＲＮＡ ＲＰワクチンプラットフォームで例示される、修飾されたＩＢＶ Ｍａ５抗原をコードするウイルスベクターの保護効力を、ＩＢＶ Ｍ４１攻撃誘発に対して評価した。ワクチン接種の３週間後に攻撃誘発によってワクチンの有効性を決定し、次いで、気管外植片の線毛運動の程度および血清学データに基づいて評価した。

【0170】

材料および方法
以下の表７に従って、１日齢の６６羽（ｎ＝６６）の鳥を７つの群（群１～７）に割り当てた。１日目に、眼鼻腔（ＯＣＮ）投与による市販のワクチンおよび筋肉内（ＩＭ）投与による表７に列記されている実験ワクチンのいずれかを群２～８のニワトリにワクチン接種した。２２日目に、ＩＢＶ血清学を決定するために、群２、４、５、６および７のニワトリから血液を採取した。２３日目に、ニワトリを眼（ＯＣ）接種によるＩＢＶ Ｍ４１攻撃誘発に供した。２８、２９および３０日目に、ニワトリを安楽死させ、それらの気管を線毛運動障害アッセイにおいて使用してワクチンの有効性を決定した。

【表8】

ワクチン接種のためのすべての材料は、予定されたワクチン接種の直前に調製した。ワクチンを周囲温度で調製し、調製の２時間以内に投与した。１日目に、右眼および右鼻孔開口部にわたって分割された０．１ｍｌのワクチンを眼鼻腔経路によってまたは脚に０．２５ｍｌのワクチンをＩＭ経路によって、群３～７のニワトリにワクチン接種した。

【0171】

ワクチン接種されたら、ワクチン接種の日から研究の終了まで、疾患の臨床徴候または死亡の発生についてニワトリのすべての群を毎日モニタリングした。性質的に非一過性であると考えられるか、またはより重症になる可能性が高い疼痛および不快感を示すニワトリを動物福祉の理由で安楽死させた。

【0172】

２２日目に、群２、４、５、６および７のニワトリのすべての翼静脈から血液試料（約２ｍｌ）を採取した。血液試料を評価のために周囲温度で輸送した。室温で凝固させた後、血液試料を３０００ｘｇで１０分間遠心分離することにより血清を採取した。血清試料を２つの組に分け、続いて５６℃で３０分間熱不活化し、次いでさらなる使用まで－２０℃で保存した。２０日目に採取した血液試料を血清学的アッセイに供し、市販のＩＤ Ｓｃｒｅｅｎ（登録商標）Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｂｒｏｎｃｈｉｔｉｓ Ｉｎｄｉｒｅｃｔ（ＩＤＶｅｔ）試験を用いてＩＢＶ Ｍａ５に対する抗体価を決定した。

【0173】

２３日目、ワクチン接種の３週間後に、ＩＢＶ Ｍ４１攻撃誘発ウイルスを、スケジュールされた攻撃誘発の直前に、Ｎｏｂｉｌｉｓ（登録商標）Ｏｃｕｌｏ鼻希釈液で希釈した。その後、攻撃誘発される必要があるニワトリがその中で飼育される各アイソレータに対して別々のアリコートを調製した。攻撃誘発材料は、バイオセーフティ輸送ボックスに入れて氷上で輸送された。２３日目に、眼経路によって、攻撃誘発株（４．５Ｌｏｇ１０、０．１ｍｌ／ニワトリ）で群３～７のすべての鳥を攻撃誘発した。材料を両眼にわたって等しく分割した。攻撃誘発後、攻撃誘発ウイルスの残量を逆滴定によって分析した。

【0174】

ニワトリを安楽死させた後の気管単離のために、予定された死後検査を行った。従前にＺｏｌｅｔｉｌ（商標）の筋肉内注射を行い、頸椎脱臼によって４週齢のニワトリを安楽死させた。ニワトリの安楽死の直後に、１組の無菌器具を用いて１つの群のニワトリの全気管のサンプリングを行った。気管を切除し、予め加温した（３７℃）培地を含むチューブに個々に集めて、線毛運動障害試験のために輸送するまで断熱箱の中に保った。集めた気管を処理し、繊毛運動性について調べた。気管は、手に入るにつれて処理した。各気管から１０個の輪、すなわち、上（喉頭蓋のすぐ下）から３個、中央から４個および下から３個を切断した。切断されたら、無血清培地中で輪を洗浄して粘液を除去し、読み取りのために２４ウェルプレートに配置した。低倍率顕微鏡を用いて輪を読み取った。気管輪の少なくとも５０％が激しい線毛運動を示した場合、非罹患として気管輪にスコアを与えた（「＋」と表記）。５０％を下回る線毛運動を有する気管輪には「罹患」としてスコアを与え、「－」と表記した。環の９０％以上が罹患していなければ、ニワトリは保護されているとみなされた。

【0175】

結果
Ｎｏｂｉｌｉｓ（登録商標）ＩＢ Ｍａ５ワクチンを接種されたニワトリは、１０匹中６匹の動物で８８９の閾値を超える堅牢な抗体陽転を示し、この群は１２４２の平均ＥＬＩＳＡ力価を有した。ｗｔ ＩＢＶ Ｍａ５スパイク抗原を発現するＶＥＥＶ ＲＰをワクチン接種された１匹のニワトリのみが、抗体陽転を示し、この群は３３６の平均ＥＬＩＳＡ力価を有した。ΔＦＣＳ＋ＣＴＤ＋２Ｐ適応またはΔＦＣＳ＋Ｙ^１１４４Ａ＋２Ｐ適応の組み合わせは、ＩＢＶスパイク抗原の免疫原性に対して影響を及ぼさなかった。著しく対照的に、ΔＦＣＳ＋２Ｐ＋ＶＳＶ適応は、１０匹の動物のうち４匹が明確な抗体陽転を示すより免疫原性の高い抗原をもたらし、この群は６１７の平均ＥＬＩＳＡ力価を有した（図１参照）。

【0176】

平均ＥＬＩＳＡ力価は、Ｎｏｂｉｌｉｓ ＩＢ Ｍａ５ワクチンが１００％の保護をもたらし、ｗｔ ＩＢＶスパイク抗原を発現するＶＥＥＶ ＲＰワクチンは２０％の保護に過ぎなかったのに対して、ΔＦＣＳ＋２Ｐ＋ＶＳＶ適応は５５％の保護をもたらしたワクチン有効性と良好に相関した（図２参照）。

【0177】

［実施例８］
モルモットにおけるＶＥＥＶ ＲＰワクチンを使用したＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２スパイク抗原の免疫原性
修飾されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク変異体がインビボにおいて改善された免疫原性を与えるかどうかを試験するために、異なるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク抗原をコードするＶＥＥＶ ＲＰワクチンを接種されたモルモットで実験を行った。本研究の目的は、モルモットにおけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイク糖タンパク質をコードするＶＥＥＶ ＲＰの血清学的有効性を評価することであった。

【0178】

材料および方法
本研究では、研究日（ＳＤ）０、２１および４２に、ワクチン接種のためにｎ＝３５匹のモルモットを使用した。０．３ｍｌ中１．０Ｅ７ｐｆｕの用量でワクチンを筋肉内に与えた。動物の１つの群には、ＸＳＯＬＶＥ（商標）１００アジュバントと混合されたワクチンを接種した。ＳＤ５９で血液を採取し、血清学的分析のために使用した。

【表9】

凍結したアルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子をワクチン接種前に室温で解凍した。すべてのモルモットの大腿部または臀部に、およそ０．３ｍＬの適切なワクチン調製物を筋肉内（ＩＭ）接種した。その後のワクチン接種については別の部位を使用した。群２には、注射前にＲＮＡ－Ｐワクチンと混合されたＸＳＯＬＶＥ（商標）１００アジュバントを、約０．６ｍＬの得られた注射体積でワクチン接種した。

【0179】

研究の終了時に、８～１０ｍＬの血清という目標最低収量のために、モルモットを最終的に採血した。ＡＶＭＡによって承認された方法を使用して、採血前に動物を麻酔した。採取後、血液試料を４時間以下室温に保った後、４℃で３０分間、１２５７ｘｇでの遠心分離によって分離した。試験まで、すべての血清試料を－２０℃以下で凍結保存した。市販のサロゲート擬似ＶＮ試験（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）を使用して、すべての血清試料をＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体についてアッセイした。

【0180】

結果
野生型（ｗｔ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク抗原を発現するＶＥＥＶ ＲＰをワクチン接種されたモルモットは７％の阻害しかもたらさず、極めて不良な抗体陽転を示した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク抗原のフューリン切断部位（ΔＦＣＳ）を不活化すると、平均して３９％の阻害がもたらされたが、ΔＦＣＳ＋ＶＳＶとΔＦＣＳ＋２Ｐ＋ＶＳＶを組み合わせると、それぞれ５２および５４％の阻害がもたらされた（図３参照）。したがって、ＩＢＶスパイク抗原について観察されたように、２Ｐ変異ありまたはなしで、ＶＳＶ修飾と組み合わされたフューリン切断部位（ΔＦＣＳ）の不活化は、極めて高い免疫原性の抗原をもたらす。

【0181】

初回ワクチン接種の３週間後に、モルモットに追加ワクチン接種を行った。モルモットから採取した血液を用いたサロゲートＶＮ試験からの結果を以下の図４に示す。これらのデータからは、２つの点が顕著である。第１に、スパイク－２Ｐ－ＶＳＶ変異体は、スパイク－ｗｔ抗原よりもはるかに免疫原性が高い。本条件下では、スパイク－２Ｐ－ＶＳＶ試験はほぼ１００％の阻害を示す。ＶＥＥＶ ＲＰは、驚くべきことに、ＤＮＡ発現プラスミドワクチンよりもはるかに免疫原性が高かった。

【0182】

［実施例９］
モルモットにおけるＶＥＥＶ ＲＰワクチンを使用したＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２スパイク抗原によって誘導される液性および細胞性免疫応答
材料および方法
動物および飼育
Ｅｎｖｉｇｏから、雌のＳＰＦモルモット（Ｄｕｎｋｉｎ Ｈａｒｔｌｅｙ）を３５０グラムの最小体重で入手し、実験群にランダムに割り当て、色分けされたタグを使用して個別に印を付けた。研究期間全体を通じて、ベースライン臨床所見を記録した。研究期間全体を通じて、体温を含むベースライン臨床所見を記録した。

【0183】

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク遺伝子ＲＰワクチンの作製。

【0184】

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクｗｔまたはスパイク－ＦＣＳ－２Ｐ－ＶＳＶ遺伝子のいずれかを産生するために使用されるＶＥＥＶレプリコンベクターを、上記の実施例２に以前に記載されたように構築した（図７も参照）。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、２０１９－ｎＣｏＶ／ＵＳＡ－ＷＩ１／２０２０株からのスパイク＿ｗｔ遺伝子配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッションＭＴ０３９８８７）、ならびにＲ^６８２Ａ／Ｒ^６８３Ａ（ΔＦＣＳ）Ｋ^９８６Ｐ／Ｖ^９８７Ｐ（２Ｐ）置換およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク残基１２１２～１２７３のＶＳＶ糖タンパク質の残基４６３～５１１への置き換えを有するスパイク－ＦＣＳ－２Ｐ－ＶＳＶ誘導体（ＧｅｎＢａｎｋアクセッションＹＰ＿００９５０５３２５）をコドン最適化し、隣接するＡｓｃＩおよびＰａｃＩ部位とともに合成した（ＡＴＵＭ、Ｎｅｗａｒｋ、ＣＡ）。合成遺伝子およびｐＶＨＶベクターをそれぞれＡｓｃＩおよびＰａｃＩ酵素で消化し、連結して、上記の実施例２に記載されているようにベクター「ｐＶＨＶ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－スパイク＿ｗｔ」および「ｐＶＨＶ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－スパイク－ＦＣＳ－２Ｐ－ＶＳＶ」を作製した。

【0185】

ＴＣ－８３ ＲＮＡ ＲＰの作製は、上記の方法によって行った（上記の実施例２を参照）。簡潔には、ｐＶＨＶ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－スパイク＿ｗｔおよびｐＶＨＶ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－スパイク－ＦＣＳ－２Ｐ－ＶＳＶレプリコンベクターＤＮＡおよびヘルパーＤＮＡプラスミドを、ＲｉｂｏＭＡＸ（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼおよびキャップ類似体（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を使用したインビトロ転写の前にＮｏｔＩ制限酵素で直鎖化した。重要なことに、作製において使用されるヘルパーＲＮＡは、ＶＥＥサブゲノムプロモーター配列を欠く。レプリコン成分およびヘルパー成分についての精製されたＲＮＡを合わせ、ベロ細胞の懸濁液と混合し、４ｍｍキュベット中で電気穿孔し、無血清培養培地に戻した。一晩のインキュベーション後、懸濁液をデプスフィルターに通し、５％スクロース（ｗ／ｖ）を含有するリン酸緩衝生理食塩水で洗浄し、最後に保持されたＲＰを４００ｍＭＮａＣｌ＋５％スクロース（ｗ／ｖ）緩衝液または２００ｍＭＮａ_２ＳＯ_４＋５％スクロース（ｗ／ｖ）で溶出することによって、アルファウイルスＲＮＡレプリコン粒子を細胞および培地から精製した。溶出されたＲＰを０．２２ミクロンのメンブレンフィルターに通し、アッセイおよび凍結乾燥の前に、保存のために一定分量に分配した。緑色蛍光タンパク質を発現する対照ワクチンも調製した。

【0186】

スクロース、ＮＺ ＡｍｉｎｅおよびＤＭＥＭを含有する安定剤中での凍結乾燥および２～８℃での保存後に、感染したベロ細胞単層に対する免疫蛍光アッセイによって、機能的ＲＰ－スパイクワクチンの力価を決定した。簡潔には、ワクチンを連続希釈し、９６ウェルプレート中のベロ細胞単層培養物に添加し、３７℃で１８～２４時間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を固定し、一次抗体（抗ＶＥＥＶ ｎｓｐ２モノクローナル抗体）、続いてＦＩＴＣコンジュゲート抗マウスＩｇＧ二次抗体で染色した。Ｂｉｏｔｅｋ（登録商標）Ｃｙｔａｔｉｏｎ（商標）５ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｒｅａｄｅｒを使用して、希釈当たり２つのウェル中ですべての陽性の、蛍光染色された細胞を計数することによって、ＲＮＡ粒子を定量した。

【0187】

モルモット研究
３５０グラムの最小体重を有するＳＰＦモルモットを、非ワクチン接種対照群、ＲＰ－スパイク－ｗｔワクチン接種群およびＲＰ－スパイク－ＦＣＳ－２Ｐ－ＶＳＶワクチン接種群にわたって無作為に分割した（群あたりｎ＝６）。配置の１週間後、動物は非ワクチン接種の状態を保つか、または筋肉内に１×１０Ｅ７のＲＰ用量（各脚の筋肉中に０．１ｍｌ）の初回ワクチン接種を受けた。初回ワクチン接種の３週間後、動物は１×１０Ｅ７のＲＰ用量筋肉内（各脚の筋肉に０．１ｍｌ）の追加ワクチン接種を受けた。追加免疫の６週間後、ワクチン接種動物は２回目の追加ワクチン接種を受け、７日後に動物を屠殺した。リンパ球刺激試験（ＬＳＴ）のために終末血液を採取し、出血を引き起こすことなく気管を慎重に切開した。スワブを用いて気管内から粘液を採取し、１ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水に溶解し、粘膜抗体価を決定するために使用した。追加ワクチン接種の日に、および追加ワクチン接種後６週間まで２週間間隔で、心臓穿刺を用いて、凝固した血液を採取し、全身抗体価を決定するために血清を使用した。

【0188】

サロゲートウイルス中和アッセイモルモット血清
ＧｅｎＳｃｒｉｐｔからのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓｕｒｒｏｇａｔｅ Ｖｉｒｕｓ Ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ Ｔｅｓｔ Ｋｉｔを製造者の説明書に従って使用した。簡単に説明すると、血清を試料希釈緩衝液で希釈し、ＨＲＰ－ＲＢＤと１：１で混合し、３７℃で３０分間インキュベートした。次に、表面にコーティングされたＡＣＥ２受容体を含有する９６ウェルプレートに試料を入れ、３７℃で１５分間インキュベートした。結合していないＨＲＰ－ＲＢＤを洗い流し、３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質を使用して残存する西洋ワサビ過酸化物（ＨＲＰ）を可視化し、ＯＤ４５０で測定した。

【0189】

血清中の抗ＲＢＤおよびスパイク外部ドメイン抗体価を推定するためのＥＬＩＳＡ
精製されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤおよびスパイク外部ドメインをダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）［ＣａおよびＭｇなし、Ｌｏｎｚａ、１７～５１２Ｆ］に希釈し、１０ｎＭ（１０ｐｍｏｌ／ｍＬ）を使用して９６ウェルプレート（ＭａｘｉＳｏｒｐ－ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、またはＨｉｇｈ ｂｉｎｄｉｎｇ－Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ－ｏｎｅ）上にコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。翌朝、０．２５ｍＬ洗浄溶液／ウェル（ＤＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）を使用してＥＬＩＳＡプレートウォッシャ（ＩｍｍｕｎｏＷａｓｈ １５７５、ＢｉｏＲａｄ）でプレートを３回洗浄し、次いで、２５０μＬのブロッキング溶液（５％ミルク－Ｐｒｏｔｉｆａｒ、Ｎｕｔｒｉｃｉａ、ＤＰＢＳ中０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）で、室温で２時間ブロッキングした。その後、ブロッキング溶液を廃棄した。次いで、（ブロッキング溶液中に、２連または３連で調製した）血清の４倍連続希釈物を対応するウェルに添加し、室温で１時間インキュベートした。各プレートは、陽性対照（約２のＯＤ４５０を得るために希釈したモルモット血清）および陰性対照ウェルを含有した。プレートを再度３回洗浄した後、ＨＲＰ含有抗体－ヤギ抗モルモット（ＩｇＧ－ＨＲＰＯ、ＪａｃｋｓｏｎＬａｂ １０６－０３５－００３、１：８０００）と室温で１時間インキュベートした。最後の洗浄工程を実施した後、１００μＬ／ウェルのＳｕｐｅｒ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ＴＭＢ（Ｓｕｒｍｏｄｉｃｓ、ＴＭＢＳ－１０００－０１）と共に室温で１０分間インキュベートした。１００μＬ／ウェルの１２．５％Ｈ_２ＳＯ_４（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、１．００７１６．１０００）を添加することによって反応を停止した。ＥＬｘ８０８ＢｉｏＴｅｋプレートリーダーを用いて、４５０ｎｍでの吸光度を３０分で測定した。

【0190】

Ｔ細胞刺激試験（ＬＳＴ）
血液を採取し、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ１０８３を含有するＳｅｐｍａｔｅチューブ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ）を製造者の説明書に従って使用してリンパ球を単離した。簡潔には、Ｋ３－ＥＤＴＡ血液をＲＰＭＩ－１６４０培地で１：２に希釈し、１２００×ｇで１０分間ペレット化した。チューブの最上層中の細胞を収集し、ＲＰＭＩ－１６４０を含有する清浄なチューブに入れ、４００×ｇで７分間ペレット化した。細胞をＲＰＭＩ－１６４０培地で１回洗浄し、４００×ｇで７分間ペレット化した。細胞濃度を計数し、３７℃で２０分間、カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）で１×１０Ｅ７の細胞を染色した。細胞をＲＰＭＩ－１６４０で１回洗浄し、各動物からの５×１０Ｅ５の細胞を、培地、ＣｏｎＡ（１０μｇ／ｍｌ）、または精製されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ１抗原（５、２．５、１．２５、０．６２、０．３１または０．１５μｇ／ｍｌ）のいずれかで２連で刺激した。刺激の３日後に、ＦＡＣＳ－Ｖｅｒｓｅを用いて細胞増殖を測定した。

【0191】

結果
スパイク－ｗｔおよびスパイク－ＦＣＳ－２Ｐ－ＶＳＶ抗原（図７の概略図を参照）の免疫原性を、ＶＥＥＶ ＲＰベクターワクチンが筋肉内投与されたモルモットモデルにおいて評価した（図５Ａ）。初回ワクチン接種後、すべての動物は、スパイク受容体結合を妨害する抗体価を測定する市販のサロゲートＶＮ試験によって評価されるように、抗体陽転を示した。スパイク－ｗｔ抗原と比較した場合、スパイク－ＦＣＳ－２Ｐ－ＶＳＶ抗原によって、明らかにより高いサロゲートＶＮ力価が誘導された（図５Ｂ）。２回目のワクチン接種後に、これらの力価は、実験の終了までより高い力価で強化された。一貫して、スパイク－ＦＣＳ－２Ｐ－ＶＳＶ抗原によって誘導された力価は、スパイク－ｗｔ抗原を産生するＲＰワクチンと比較してより高かった（図５Ｃ～Ｄ）。

【0192】

ＶＥＥＶ ＲＰベクタープラットフォームは、液性応答および細胞性応答の両方の効率的な誘導で知られている。ＲＰワクチン候補によって誘導された細胞性応答のレベルを評価するために、第３の免疫化を行い、７日後に、リンパ球刺激試験（ＬＳＴ）のためにリンパ球を単離した。ＣｏｎＡで刺激したすべての単離されたリンパ球は、＞８０％の増殖力価をもたらした。スパイク－ｗｔ抗原とスパイク－ＦＣＳ－２Ｐ－ＶＳＶ抗原の間での液性応答の差とは対照的に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ１特異的Ｔ細胞分化のレベルに差は観察されなかった（図５Ｅ）。液性応答が粘膜免疫ももたらすかどうかを決定するために、実験の最後に気管スワブを採取した。興味深いことに、サロゲートＶＮ力価は気管スワブ中にも検出され、レベルは全身抗体レベルと相関し、スパイク－ｗｔ抗原と比較してスパイク－ＦＣＳ－２Ｐ－ＶＳＶ抗原について優れた力価を有していた（図５Ｆ）。これらの抗体価は、親ワクチン接種が防御粘膜免疫を誘導することができることを示唆する。

【0193】

［実施例１０］
安定化されたスパイク抗原を発現するアルファウイルスレプリコンに基づくワクチンは、殺菌免疫を誘導し、ネコ間でのＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２の伝染を防止する
材料および方法
動物および飼育
短毛の雄および雌のＳＰＦイエネコをＭａｒｓｈａｌｌ ＢｉｏＲｅｓｏｕｒｃｅｓ（Ｗａｖｅｒｌｙ、ＮＹ）から入手し、マイクロチップによって同定し、実験群にランダムに割り当てた。研究期間全体を通じて、体温を含むベースライン臨床所見を記録した。

【0194】

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク遺伝子ＲＰワクチンの作製。

【0195】

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクｗｔまたはスパイク－ＦＣＳ－２Ｐ－ＶＳＶ遺伝子のいずれかを産生するために使用されるＶＥＥＶレプリコンベクターを、上記の実施例２に以前に記載されたように構築した（上記実施例９および図７も参照）。

【0196】

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２攻撃誘発ウイルスおよび細胞培養
中国の流行地域への旅行から帰国し、米国のワシントンで２０２０年１月に臨床疾患（ＣＯＶＩＤ－１９）を発症した呼吸器疾患を有する患者からの中咽頭スワブから、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株ＵＳＡ－ＷＡ１／２０２０（ＧｅｎＢａｎｋアクセションＱＨＯ６０５９４．１）が単離された。ウイルスをベロ細胞上で１継代増殖させた。ウイルス力価を決定するために、ベロ細胞上でウイルスの連続希釈を行い、２４時間でのニュートラルレッド含有二次オーバーレイによる対比染色および４８時間のインキュベーション後の可視化によってプラーク形成単位を定量した。

【0197】

プラセボ対照ワクチン
緑色蛍光タンパク質（ｇｆｐまたはＧＦＰ）を発現するＲＮＡ粒子からなるプラセボワクチンを、上記のようにアッセイし、凍結乾燥し、２～８℃で保存した。使用後、ワクチン接種用量を確認するために、試験ワクチンの各々を滴定した。

【0198】

ネコ血清学
インビトロプラーク減少中和試験（ＰＲＮＴ）を使用して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する血清学的応答を調べた。手短に言えば、血清を５６℃で３０分間不活化し、ネコ血清の段階希釈物を調製し、１００ｐｆｕのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２と共に３７℃で１時間インキュベートした。次いで、ウイルス血清混合物をベロ細胞上に播種し、２４時間でニュートラルレッド含有二次オーバーレイで対比染色し、４８時間後に可視化することによってプラークの数を読み取った。９０％以上のウイルスが中和された最高希釈の逆数として、抗体価を決定した。

【0199】

有効性試験
１０匹の１１週齢ＳＰＦネコの２つの群を形成し、別々に飼育した。一方の群には皮下経路（０．５ｍｌ／用量）によって投与される５×１０Ｅ７のＲＰ－スパイク－ＦＣＳ－２Ｐ－ＶＳＶをワクチン接種し、他方の群には同じ用量のＲＰ－ｇｆｐを与えた。３週間後、各群は同じ処置を受けた。２回目のワクチン接種の２５日後、軽い鎮静状態下で３．１×１０Ｅ５ｐｆｕのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を用いて鼻腔内経路および経口経路の両方を使用することによって、ネコに攻撃誘発を行った。攻撃誘発の１日後に各群と一緒に飼育することによって、ワクチン接種も攻撃誘発も受けなかった５匹のＳＰＦネコのさらに２つの群を歩哨として使用した。攻撃誘発後１０日間毎日、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の指標となる臨床徴候について、すべての動物を観察した。確認された臨床徴候には、うつ、呼吸困難、鼻汁、眼漏、咳、結膜炎および／またはくしゃみが含まれた。攻撃誘発後／混合後研究の１～１１日目に体温を記録した。

【0200】

中咽頭スワブ
攻撃誘発後研究の１～７日目に、攻撃誘発されたネコからウイルス単離のための中咽頭スワブを収集し、ゲンタマイシン、ペニシリン、ストレプトマイシンおよびアムホテリシンＢを含有する１％ウシ血清アルブミンを含有するトリス緩衝ＭＥＭ（ＢＡ－１培地）中にスワブを配置した。接触伝播を評価するために、攻撃誘発後研究の２～８日目に、接触歩哨から輸送培地中にもスワブを収集した。試験まで試料を－５０℃で凍結した。

【0201】

鼻洗浄
攻撃誘発後１、２、３、５および７日目に、１ｍｌのＢＡ－１培地をネコの鼻孔中に滴下し、ペトリ皿に鼻汁を採取することによって、ウイルス単離のための鼻洗浄試料を採取した。接触を評価するために、攻撃誘発後２、３、４、６および８日目に、接触歩哨からも鼻洗浄液を採取した。試験まで試料を－５０℃で凍結した。

【0202】

血液試料
一次ワクチン接種前および３週間後の血清のために血液試料を採取した。さらに、攻撃誘発の前および１４日後に血液試料を採取した。

【0203】

ウイルス再単離
すべての中咽頭スワブおよび鼻洗浄液をウイルス再単離のために試験した。６ウェルプレート中のベロＥ６細胞のコンフルエントな単層をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で１回洗浄し、スワブ／洗浄試料の連続１０倍希釈物１００μｌを播種し、３７℃で１時間インキュベートし、次いで、２％ＦＢＳを含有するＭＥＭ中の０．５％アガロースを重層した。ニュートラルレッド色素を含有する第２のオーバーレイを２４時間後に添加し、プラークを４８時間でカウントした。ウイルス力価をＬｏｇ１０ｐｆｕ／ｍｌで記録した。

【0204】

結果
ワクチンの有効性を決定するために、対照としての高感度緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）を産生するＲＰワクチン、最適化されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク抗原（スパイク－ＦＣＳ－２Ｐ－ＶＳＶ）をネコにワクチン接種するか、またはネコをワクチン接種されていない状態に保った（歩哨）。追加ワクチン接種の３週間後、ネコを粘膜ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２攻撃誘発に曝露し、図６Ａに概説されるように試料を採取した。

【0205】

ワクチン接種後、いずれの時点においても、いずれのネコにも有害反応は検出されなかった。スパイク－ＦＣＳ－２Ｐ－ＶＳＶ抗原を産生するＲＰワクチンは、単回のワクチン接種後にすべてのネコにおいてウイルス中和抗体価を誘導することが可能であり、これは２回目のワクチン接種後に強化され、３．５週間後の攻撃誘発までレベルを維持した（図６Ｂ）。ワクチン接種されていない歩哨動物は、攻撃誘発まで常に陰性を保った。攻撃誘発されたネコも歩哨ネコも、攻撃誘発後にいかなる臨床徴候も示さなかった。しかしながら、ワクチン接種されず、攻撃誘発を受けたネコ１０匹のうち９匹が、攻撃誘発の１日後、および観察期間中少なくとも３日間、経口的に（図６Ｄ）および経鼻的に（図６Ｅ）ウイルスを排出した。これらのデータは、粘膜ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２攻撃誘発が気道における効率的なウイルス複製をもたらすことを示している。より高く、より一貫したウイルス排出が鼻洗浄液から検出されたのに対して、中咽頭スワブはより一貫性の低いパターンを示した。興味深いことに、攻撃誘発の１日後に、非ワクチン接種対照と一緒に配置された非ワクチン接種歩哨のうちの２匹で鼻洗浄液からもウイルス排出が検出された。さらに、５匹の歩哨動物すべてが、少なくとも２日間、経口経路を介してウイルスを排出し、これは、ワクチン接種されず、攻撃誘発された動物から歩哨動物へのウイルスの効率的な拡散を実証している（図６Ｄ）。

【0206】

ワクチン接種されたネコはいずれも、攻撃誘発後の任意の時点で、検出可能なウイルスを経口的に（図６Ｄ）または経鼻的に（図６Ｅ）排出しなかった。結果は、ワクチンが感染を予防したことを示している。また、ワクチン接種されたネコにおける攻撃誘発ウイルス複製の欠如を考慮すると予想されるとおり、ワクチン接種されたネコとともに飼育された非ワクチン接種歩哨ではウイルスは検出されなかった。攻撃誘発後のウイルス中和抗体価の分析により、ワクチン接種されていない、攻撃誘発された動物および歩哨動物の両方が効率的に感染したことが確認された（図６Ｃ）。これと好対照に、ワクチン接種されたネコとともに飼育された歩哨動物では、抗体陽転は観察されなかった。したがって、スパイク－ＦＣＳ－２Ｐ－ＶＳＶ抗原を産生するＶＥＥＶ ＲＰワクチンは、（ｉ）殺菌免疫を誘導し、かつ（ｉｉ）ウイルスの伝染がナイーブネコに感染することを予防する。

【0207】

一方、これらの結果は、Ｌａｎｇｅｒｅｉｓ ｅｔ ａｌ．，２０２１，ｎｐｊ Ｖａｃｃｉｎｅｓ ｖｏｌ．６，ｎｏ．１２２；ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｓ４１５４１－０２１－００３９０－９として公開されている。

【0208】

本発明は、本明細書に記載される具体的な態様によって範囲が限定されるものではない。実際に、本明細書に記載されたものに加えて、本発明の様々な修正が、前述の説明から当業者には明らかになるであろう。そのような修正は、添付の特許請求の範囲内に含まれることが意図されている。

【0209】

さらに、核酸またはポリペプチドについて与えられるすべての塩基サイズまたはアミノ酸サイズ、およびすべての分子量または分子質量値は近似値であり、説明のために提供されることを理解されたい。

【0210】

［実施例１１］
さらなるコロナウイルススパイク抗原の変異
さらなるコロナウイルス由来のキメラスパイクタンパク質の発現を調べるために、さらにいくつかの実験を行った。とりわけ、ウシコロナウイルス（ＢＣｏＶ）およびＳＡＤＳを引き起こすブタコロナウイルスのスパイクタンパク質をコードする遺伝子を、それらの安定性および（表面）発現を改善するために変異させた。

【0211】

材料および方法
ＦＡＣＳによる発現を示すための実験を本質的に上記のように行った：ベロ細胞を増幅し、播種した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅを用いて、試験されるべき（変異された）スパイク遺伝子を含有するプラスミドをベロ細胞中に形質移入し、培養した。次に、細胞を採取し、固定した。それぞれ、総発現／内部または表面発現を区別することを可能にするために、細胞を界面活性剤で透過処理するか、または透過処理しなかった。使用した抗体は、ＢＣｏＶについては、マウスモノクローナル抗ＢＣｏＶスパイクおよびヤギ抗マウスＩｇＧ－Ａ４８８コンジュゲート抗体であり、ＳＡＤＳ－ＣｏＶについては、ポリクローナルウサギ抗ＳＡＤＳ－ＣｏＶ Ｓ１抗体およびヤギ抗ウサギＩｇＧ－Ａ４８８コンジュゲート抗体であった。

【0212】

使用されるＢＣｏＶスパイクタンパク質遺伝子（配列番号１７中の翻訳とともに配列番号１６を参照）は、公のデータベースで利用可能な２０１６－２０２１からの１３０個のＢＣｏＶスパイク配列から組み立てられたコンセンサス配列である。

【0213】

ＳＡＤＳ－ＣｏＶスパイク遺伝子（配列番号１９中の翻訳とともに配列番号１８を参照）は、ＧＤＳ０４株のブタ腸アルファコロナウイルスに由来し、そのゲノムはＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃ．ｎｒ．：ＭＦ１６７４３４から入手可能である。

【0214】

ＢＣｏＶ（コンセンサス）スパイクについて試験されたスパイクタンパク質変異は、上記ＩＢＶおよびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質について試験したものと同様であった：ＦＣＳ、２ＰおよびＶＳＶ－ＴＭ／ＣＴ。さらに、ＨＡ遺伝子配列がＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃ．ｎｒ．：Ｖ０１０８８から入手可能であるインフルエンザウイルスＨＡタンパク質、Ａ／プエルトリコ／８／１９３４（Ｈ１Ｎ１）株由来のコンセンサスＴＭＤ－ＣＴＤ領域によって、ＢＣｏＶコンセンサスＴＭＤ－ＣＴＤ領域を置き換えた。

【0215】

ＳＡＤＳ－ＣｏＶスパイクのＴＭＤ－ＣＴＤ領域をＶＳＶ Ｇタンパク質由来のＴＭＤ－ＣＴＤ領域によって置き換えることによって、ＳＡＤＳ－ＣｏＶスパイクを変異させた。

【0216】

ＢＣｏＶスパイクに対して行われた特定の変異：
－「ＦＣＳ」を変異されたＢＣｏＶコンセンサススパイク遺伝子は、変異された（不活化された）フューリン切断部位を有し、配列番号２０に示されており、そのヌクレオチド２２９０～２２９５および２２９９～２３０４に変異を組み込む。

【0217】

－「ＦＣＳ－２Ｐ」変異されたＢＣｏＶコンセンサススパイク遺伝子は、不活化されたフューリン切断部位の隣に、安定化する２つのプロリンも組み込んでいる。配列は、配列番号２１に示されており、そのヌクレオチド３２３８～３２４３に２Ｐ変異を有する。

【0218】

－「ＦＣＳ－ＩＡＶ－ＴＭ／ＣＴ」変異されたＢＣｏＶコンセンサススパイク遺伝子は、そのヌクレオチド３９２２～４０２９にインフルエンザＨＡ ＴＭ／ＣＴ領域を有する配列番号２２に示されるように、不活化されたフューリン切断部位の隣に、インフルエンザウイルスＨＡタンパク質からのコンセンサスＴＭＤ－ＣＴＤ領域によるＢＣｏＶコンセンサスＴＭＤ－ＣＴＤ領域の置換も組み込んでいる。

【0219】

－「ＦＣＳ－ＶＳＶ－ＴＭ／ＣＴ」変異されたＢＣｏＶコンセンサススパイク遺伝子は、不活化されたフューリン切断部位の隣に、ＶＳＶ Ｇタンパク質からのコンセンサスＴＭＤ－ＣＴＤ領域によるＢＣｏＶスパイクタンパク質コンセンサスＴＭＤ－ＣＴＤ領域の置換も組み込んでおり、そのヌクレオチド３９２２～４０６８にＶＳＶ Ｇタンパク質ＴＭ／ＣＴ領域を有する配列番号２３を参照されたい。

【0220】

－構築物「ＦＣＳ－２Ｐ－ＶＳＶ－ＴＭ／ＣＴ」は、上記の変異を組み合わせる。

【0221】

ＳＡＤＳ－ＣｏＶスパイクに対して行われた特定の変異：
「ＶＳＶ－ＴＭ／ＣＴ」変異されたＳＡＤＳ－ＣｏＶスパイク遺伝子は、ＶＳＶ Ｇタンパク質からのＴＭＤ－ＣＴＤ領域によるＳＡＤＳ－ＣｏＶ ＴＭＤ－ＣＴＤ領域の置換を組み込んでおり、そのヌクレオチド３２０５～３３５１にＶＳＶ ＴＭ／ＣＴ領域を有する配列番号２４を参照されたい。

【0222】

結果
ＢＣｏＶおよびＳＡＤＳ－ＣｏＶ由来のスパイクタンパク質の発現に対する異なる変異の効果を、１００％に設定されたそれらのそれぞれの非変異スパイクタンパク質（「ｗｔ」）の発現レベルと比較した。ＢＣｏＶ由来のキメラスパイクタンパク質についての結果を図８に示し、ＳＡＤＳ－ＣｏＶについての結果を図９に示す。

【0223】

図８および図９から明らかなように、ＢＣｏＶおよびＳＡＤＳ－ＣｏＶスパイクタンパク質についての結果は、上記のＩＢＶおよびＳＡＲＳ－ＣｏＶ２スパイクタンパク質について見られた結果と同様である。すべてのスパイクタンパク質について、出芽ウイルスの表面糖タンパク質（例えば、ＶＳＶ Ｇタンパク質）からのＴＭＤ－ＣＴＤ領域によるＴＭＤ－ＣＴＤ領域の置換は、総発現レベルにとって有益であるが、宿主細胞の表面上での発現のレベルにとって特に有利である。これは、インフルエンザウイルスＨＡタンパク質由来のＴＭＤ－ＣＴＤ領域の使用後にも観察された。フューリン切断シグナル（「ＦＣＳ」）の除去および融合前立体構造の安定化（「２Ｐ」）などの他の修飾も同様の効果、すなわち、総スパイクタンパク質発現レベルのいくらかの増加、および細胞表面上でのスパイクタンパク質発現の強いないし非常に強い増加を有する。

【0224】

したがって、ＢＣｏＶおよびＳＡＤＳ－ＣｏＶスパイクタンパク質についてのこれらの結果は、本明細書に記載されている本発明の有利な効果を確認し、拡張する。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【配列表】

2023549787000001.app

【国際調査報告】