特表 2023-549788 製剤、方法、キット、および剤形

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-11-29

(54)【発明の名称】製剤、方法、キット、および剤形

(51)【国際特許分類】

   A61K 31/706 20060101AFI20231121BHJP

   A61K 47/22 20060101ALI20231121BHJP

   A61K 47/10 20170101ALI20231121BHJP

   A61K 47/02 20060101ALI20231121BHJP

   A61K 9/08 20060101ALI20231121BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20231121BHJP

   A61K 31/395 20060101ALI20231121BHJP

   A61P 37/06 20060101ALI20231121BHJP

【ＦＩ】

A61K31/706

A61K47/22

A61K47/10

A61K47/02

A61K9/08

A61P43/00 111

A61K31/395

A61P43/00 121

A61P37/06

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023528146

(86)(22)【出願日】2021-11-10

(85)【翻訳文提出日】2023-06-27

(86)【国際出願番号】 US2021058727

(87)【国際公開番号】W WO2022103798

(87)【国際公開日】2022-05-19

(31)【優先権主張番号】63/111,895

(32)【優先日】2020-11-10

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】518014748

【氏名又は名称】メドレジェン，リミティド ライアビリティ カンパニー

(74)【代理人】

【識別番号】100099759

【弁理士】

【氏名又は名称】青木 篤

(74)【代理人】

【識別番号】100123582

【弁理士】

【氏名又は名称】三橋 真二

(74)【代理人】

【識別番号】100117019

【弁理士】

【氏名又は名称】渡辺 陽一

(74)【代理人】

【識別番号】100141977

【弁理士】

【氏名又は名称】中島 勝

(74)【代理人】

【識別番号】100138210

【弁理士】

【氏名又は名称】池田 達則

(72)【発明者】

【氏名】チャオリー サン

(72)【発明者】

【氏名】ジョン サン

(72)【発明者】

【氏名】ジャレッド グリフィン

(72)【発明者】

【氏名】クリスティ イートモン

(72)【発明者】

【氏名】レイチェル ラベル

(72)【発明者】

【氏名】チーミン リウ

(72)【発明者】

【氏名】リチャード ブレワー

(72)【発明者】

【氏名】アイザック アギェマン

(72)【発明者】

【氏名】ミッチェル ウィリアムズ

【テーマコード（参考）】

4C076

4C086

【Ｆターム（参考）】

4C076AA11

4C076BB11

4C076CC07

4C076DD22

4C076DD23

4C076DD37

4C076DD38

4C076DD60

4C076FF36

4C086AA01

4C086AA02

4C086BC58

4C086EA04

4C086MA03

4C086MA05

4C086MA16

4C086MA66

4C086NA03

4C086ZC75

(57)【要約】

本開示の実施形態は、概して、少なくとも２つの有効成分、ＡＭＤ３１００または類似の幹細胞動員剤、およびタクロリムスまたはＦＫ５０６誘導体またはアナログ、ならびに一つまたは複数の賦形剤を含む、安定性を改善するための製剤、方法、キット、および剤形に関する。製剤は、単回投与の皮下注射として投与することができる。この製剤は、様々な疾患、障害、または損傷の治療に有用である可能性がある。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

以下を含む、医薬製剤：
ＡＭＤ３１００または類似の幹細胞動員剤；
タクロリムスまたはＦＫ５０６誘導体またはアナログ；および
一つまたは複数の賦形剤

【請求項2】

前記ＡＭＤ３１００または類似の幹細胞動員剤の濃度が約１６～約４８ｍｇ／ｍＬである、請求項１に記載の医薬製剤。

【請求項3】

前記タクロリムスまたはＦＫ５０６誘導体またはアナログの濃度が約０．３～約１．６ｍｇ／ｍＬである、請求項１に記載の医薬製剤。

【請求項4】

前記賦形剤が、１－Ｎ－メチル－２－ピロリドン（ＮＭＰ）、グリセリン、無水エタノール、塩化ナトリウム、注射用水、塩酸、および水酸化ナトリウムのうちの一つまたは複数を含む、請求項１に記載の医薬製剤。

【請求項5】

前記ＮＭＰの濃度が約２００～約４５０ｍｇ／ｍＬである、請求項１に記載の医薬製剤。

【請求項6】

前記グリセリンの濃度が約１５０～約３５０ｍｇ／ｍＬである、請求項１に記載の医薬製剤。

【請求項7】

前記無水エタノールの濃度が約２０～約７０ｍｇ／ｍＬである、請求項１に記載の医薬製剤。

【請求項8】

前記塩化ナトリウムの濃度が約１～約３ｍｇ／ｍＬである、請求項１に記載の医薬製剤。

【請求項9】

前記製剤が室温で少なくとも１０日間、または摂氏２～８℃または摂氏約マイナス２０℃下で（under 2 to 8 degrees Celsius or about minus 20 degrees Celsius）少なくとも９カ月間安定である、請求項１に記載の医薬製剤。

【請求項10】

前記製剤が単回投与の皮下注射に適している、請求項１に記載の医薬製剤。

【請求項11】

請求項１に記載の医薬製剤を、それを必要とする対象または患者に投与することを含む、一つまたは複数の障害、疾患、または損傷を治療するための方法。

【請求項12】

請求項１に記載の医薬製剤を製造する方法。

【請求項13】

請求項１に記載の医薬製剤の少なくとも一つの剤形、およびそれを必要とする対象または患者に該少なくとも一つの剤形を投与するための説明書を含むキット。

【請求項14】

前記一つまたは複数の障害、疾患、または損傷が、心筋梗塞、角膜損傷、急性呼吸促迫症候群、または関節炎を含む、請求項１１に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本開示の実施形態は、概して、皮下注射用の改良された医薬製剤の製剤、方法、キット、および剤形に関する。

【背景技術】

【0002】

ＡＭＤ３１００は、幹細胞ドナーにおける幹細胞の動員において使用されるＣＸＣＲ４アンタゴニストである。ＦＫ５０６は、臓器拒絶反応を防ぐために固形臓器移植において高用量で広く使用されている免疫抑制薬である。現在、モゾビル（登録商標）（プレリキサホル、ＡＭＤ３１００）注射は、非ホジキンリンパ腫および多発性骨髄腫の患者における採取およびその後の自家移植のために造血幹細胞（ＨＳＣ）を末梢血に動員するために、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）と併用して適応されている。プログラフ（タクロリムス、ＦＫ５０６）は、他の免疫抑制剤と組み合わせて、同種異系の肝臓、腎臓、または心臓移植を受ける成人および小児患者の臓器拒絶反応の予防に適応されるカルシニューリン阻害剤免疫抑制剤である。プログラフ（タクロリムス）カプセルは経口使用のためのもの、プログラフ（タクロリムス）注射は静脈内使用のためのものである。現在のところ、プログラフは皮下注射には使用できない可能性がある。

【0003】

幹細胞の動員（ｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）および補充（ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ）において有用な、単回投与の皮下注射用の医薬製剤の必要性が依然として存在する。

【発明の概要】

【0004】

本開示は、様々な疾患、障害、および／または損傷を治療するための製剤、方法、キット、および剤形に関する。一実施形態では、本開示は、有効医薬成分ＡＭＤ３１００およびタクロリムス（ＦＫ５０６）を含む医薬製剤を提供する。一実施形態では、有効医薬成分は、ＡＭＤ３１００と類似である任意の幹細胞動員剤を含んでもよい。一実施形態では、有効医薬成分は、任意のＦＫ５０６誘導体またはアナログを含んでもよい。一実施形態では、製剤は一つまたは複数の賦形剤をさらに含む。一実施形態では、製剤は単回投与の皮下注射として製剤化される。

【0005】

本開示は、ＡＭＤ３１００、またはＡＭＤ３１００に類似の任意の幹細胞動員剤、およびタクロリムス、または任意のＦＫ５０６誘導体またはアナログを含む医薬製剤を製造するための方法を提供する。一実施形態では、本開示は、本明細書に開示される有効成分および一つまたは複数の賦形剤を含む医薬製剤を含む剤形を提供し、ここで、該医薬製剤は、所定の時間および所定の条件下で安定なままである。

【0006】

一実施形態では、本開示は、医薬製剤を製造または安定化する方法を提供する。一実施形態では、本開示は、一つまたは複数の剤形および対象に剤形を投与するための説明書を含むキットを提供し、ここで、該剤形は、少なくとも２つの有効成分および一つまたは複数の賦形剤を含む医薬製剤を含み、ここで該有効成分は、ＡＭＤ３１００、またはＡＭＤ３１００に類似の任意の幹細胞動員剤、およびタクロリムス（ＦＫ５０６）、もしくは任意のＦＫ５０６誘導体もしくはアナログを含み、ここで該剤形は、所定の時間および所定の条件下で安定なままである。

【0007】

上記の発明の概要および以下の詳細な説明は、添付の図面と併せて読むとよりよく理解される。例示的な実施形態を図面に示す。しかしながら、実施形態は、本明細書に示される特定の構造に限定されないことが理解される。図面は以下のとおりである。

【図面の簡単な説明】

【0008】

【図1】図１Ａは、本開示の例示的な実施形態による、ラットにおけるＡＭＤ３１００およびＦＫ５０６の線形スケールでの経時的な平均血漿中濃度を示す。図１Ｂは、本開示の例示的な実施形態による、ラットにおけるＡＭＤ３１００およびＦＫ５０６の片対数スケールでの経時的な平均血漿中濃度を示す。

【図2】図２Ａは、本開示の例示的な実施形態による、ミニブタにおけるＡＭＤ３１００およびＦＫ５０６の線形スケールでの経時的な平均血中濃度を示す。図２Ｂは、本開示の例示的な実施形態による、ミニブタにおけるＡＭＤ３１００およびＦＫ５０６の片対数スケールでの経時的な平均血中濃度を示す。

【図3】本開示の例示的な実施形態による、ＡＭＤ３１００＋ＦＫ５０６または本開示の製剤の投与についての経時的（治療後の日数）な疾患活動性指数（ＤＡＩ）を示す図である。

【図4-1】図４Ａは、本開示の例示的な実施形態による、本開示の製剤で治療された結腸の長さの絵を示す。

【図4-2】図４Ｂは、本開示の例示的な実施形態による、本開示の製剤で治療された結腸の長さの定量的データを示す。

【図5-1】図５Ａは、本開示の例示的な実施形態による、本開示の製剤で治療された０日目のブタモデルを示す。

【図5-2】図５Ｂは、本開示の例示的な実施形態による、本開示の製剤で治療されたブタモデルにおける皮膚創傷治癒の肉眼的分析（ｍａｃｒｏｓｃｏｐｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ）を示す。

【図5-3】本開示の例示的な実施形態による、本開示の製剤で治療されたブタモデルにおける皮膚創傷治癒の再上皮化時間を示す図である。

【図6-1】図６Ａは、本開示の例示的な実施形態による、１カ月後の損傷した脊髄の組織像を示す。図６Ｂは、本開示の例示的な実施形態による、本開示の製剤で治療した後のラットのＳＣＩ後の骨髄由来ＧＦＰ細胞を示す。

【図6-2】図６Ｃは、本開示の例示的な実施形態による、本開示の製剤での治療後のラットにおける急性脊髄損傷（ＳＣＩ）の経時的なＢＢＢスコア（Ｂａｓｓｏ， Ｂｅａｔｔｉｅ ａｎｄ Ｂｒｅｓｎａｈａｎ Ｓｃｏｒｅ）を示す。

【図7-1】図７Ａは、本開示の例示的な実施形態による、本開示の製剤による治療後のラットの心筋梗塞後の手術後の左室駆出率（ＬＶＥＦ）を示す。

【図7-2】図７Ｂは、本開示の例示的な実施形態による、本開示の製剤による治療後のラットの心筋梗塞後の手術後の瘢痕形成を示すマッソントリクローム染色（Ｍａｓｓｏｎ‘ｓ ｔｒｉｃｈｏｍｅ ｓｔａｉｎｉｎｇ）を示す。

【図8-1】図８Ａは、本開示の例示的な実施形態による、本開示の製剤で治療した後のマウスの眼熱傷後の眼の角膜の写真を示す。

【図8-2】図８Ｂは、本開示の例示的な実施形態による、本開示の製剤で治療した後のマウスの眼熱傷後のマウス角膜透明度スコアを示す。

【図9-1】図９Ａは、本開示の例示的な実施形態による、ブタの皮膚の創傷治癒の肉眼的分析（ｍａｃｒｏｓｃｏｐｉｃ ａｎａｌｙｓｉs）を示す。

【図9-2】図９Ｂは、本開示の例示的な実施形態による、１型ブタにおける創傷治癒時間を示す。

【図10】図１０Ａは、本開示の例示的な実施形態による、連鎖球菌（ストレプトコッカス・ニューモニエ；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ Ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）が誘発するＡＲＤＳのマウスモデルにおける死亡率の減少および生存の改善における、製剤Ａの研究のための実験プロトコールを示す。図１０Ｂは、本開示の例示的な実施形態による、連鎖球菌（ストレプトコッカス・ニューモニエ）が誘発するＡＲＤＳのマウスモデルにおける死亡率の減少および生存の改善における、製剤Ａの研究における動物の生存を示す。

【図11-1】図１１Ａは、本開示の例示的な実施形態による、プラセボ対照群（生理食塩水で治療）を示し、ここで上のパネルは生存動物の肺のＣＴスキャンを示し、中央のパネルは肺の肉眼写真を示し、下のパネルは肺のＨ＆Ｅ染色を示す。

【図11-2】図１１Ｂは、製剤Ａで治療した群を示し、ここで上のパネルは生存動物の肺のＣＴスキャンを示し、中央のパネルは肺の肉眼写真を示し、下のパネルは肺のＨ＆Ｅ染色を示す。

【図12-1】図１２Ａは、本開示の例示的な実施形態による、生理食塩水での治療または製剤Ａでの治療後の血清ＴＮＦ－αレベルを示す。図１２Ｂは、本開示の例示的な実施形態による、生理食塩水での治療または製剤Ａでの治療後の血清ＩＬ－４レベルを示す。

【図12-2】図１２Ｃは、本開示の例示的な実施形態による、生理食塩水での治療または製剤Ａでの治療後の血清ＩＬ－２レベルを示す。図１２Ｄは、本開示の例示的な実施形態による、生理食塩水での治療または製剤Ａでの治療後の血清ＩＬ－６レベルを示す。

【図12-3】図１２Ｅは、本開示の例示的な実施形態による、生理食塩水での治療または製剤Ａでの治療後の血清ＩＬ－１βレベルを示す。図１２Ｆは、本開示の例示的な実施形態による、生理食塩水での治療または製剤Ａでの治療後の血清ＩＦＮ－γレベルを示す。

【図13-1】図１３Ａは、本開示の例示的な実施形態による、生理食塩水での治療または製剤Ａでの治療後の血清乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）レベルを示す。図１３Ｂは、本開示の例示的な実施形態による、生理食塩水での治療または製剤Ａでの治療後のアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）レベルを示す。

【図13-2】図１３Ｃは、本開示の例示的な実施形態による、生理食塩水での治療または製剤Ａでの治療後のアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）レベルを示す。

【図14-1】図１４Ａは、本開示の例示的な実施形態による、感染後５日目の単離された肺細胞のサイトスピンスライドの免疫蛍光染色を示す。

【図14-2】図１４Ｂは、本開示の例示的な実施形態による、正常な肺、生理食塩水で治療した肺、および製剤Ａで治療した肺におけるＣＤ１３３＋細胞のパーセントを示す。

【図15】本開示の例示的な実施形態による、製剤Ａで治療した連鎖球菌（ストレプトコッカス・ニューモニエ）感染ＣＤ１３３＋／Ｃ－ＬマウスにおけるＣＤ１３３＋幹細胞による気管支上皮の生成を示す。

【図16】本開示の例示的な実施形態による、製剤Ａによる経時的な治療後のコラーゲン誘発性関節炎ラットにおける関節炎の臨床徴候の写真を示す。

【発明を実施するための形態】

【0009】

発明の詳細な説明
以下の発明の詳細な説明は例示的かつ説明的なものであり、本明細書に記載の本開示をさらに説明することを目的としている。他の利点および新規な特徴は、本開示の以下の発明の詳細な説明から当業者には容易に明らかになるであろう。

【0010】

一実施形態では、本開示の医薬製剤は、Ａを含む。
「患者」または「対象」は、哺乳動物、たとえば、ヒトもしくは動物の患者もしくは対象、たとえば、マウス、ラット、モルモット、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、またはヒト以外の霊長類、たとえば、サル、チンパンジー、ヒヒ、もしくはゴリラである。

【0011】

一実施形態では、「アナログ」という用語は、構造的アナログ（たとえば、別の化合物の構造と類似した構造を有するが、特定の態様では異なる構造を有する化合物）、または機能的敵アナログ（たとえば、別の化合物の同様の物理的、化学的、生化学的、および／または薬理学的特性を有する化合物）を意味することができる。

【0012】

一実施形態では、「誘導体」という用語は、たとえば化学反応によって類似の化合物から誘導される化合物を意味することができる。

【0013】

用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、排他的ではなく包括的に解釈されるべきである。「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔ）」、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」という用語、およびその変形は、包括的に解釈されるのではなく、排他的に解釈されるべきである。

【0014】

本明細書で使用する場合、「約」という用語は、特に指定しない限り、与えられた参照からの１０％の変動を意味する。

【0015】

本開示は、治療有効量のＡＭＤ３１００、またはＡＭＤ３１００に類似の任意の幹細胞動員剤、およびタクロリムスまたは任意のＦＫ５０６誘導体またはアナログを含む医薬製剤を提供する。一実施形態では、製剤は、患者または対象への単回投与の皮下注射用に製剤化される。驚くべきことに、そして予期せぬことに、幹細胞の動員（ｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）および補充（ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ）におけるＡＭＤ３１００（または任意の類似の幹細胞動員剤）と低用量タクロリムス（または任意のＦＫ５０６誘導体または類似体）（たとえば、拒絶反応を防ぐ有効薬量の１０分の１）の相乗効果が見出された。一実施形態では、低用量タクロリムスは、ＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ）に結合する可能性があるが、カルシニューリン経路（その免疫抑制効果のメカニズム）には作用しない可能性がある。いかなる免疫抑制効果からも独立していることは、発見され、タクロリムスと同じまたは同様の利点を与えるタクロリムスの非免疫抑制同族体によって確認することができる。カルシニューリン経路の代わりに、低用量タクロリムスは、代替の骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達経路を通じて作用する可能性がある。同種移植寛容を生み出す移植片キメラ現象に加えて、ＡＭＤ３１００とタクロリムスの組み合わせによる幹細胞の動員および損傷組織へのホーミングは、皮膚の創傷治癒、ＩＢＤの治療、術後の腹膜癒着の予防、肝臓再生の促進、動物の重度の糖尿病における創傷治癒、および微小血管系の改善等、様々な疾患、障害、または損傷の治療に安全かつ効果的である可能性がある。ＡＭＤ３１００が幹細胞を骨髄から循環系に動員できるＣＸＣＲ４のアンタゴニストであるのに対し、タクロリムスは臓器拒絶反応の予防に使用される免疫抑制薬であることを考えると、当業者であれば、これら２つの無関係な薬剤が、幹細胞の動員（ｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）および補充（ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ）において相乗効果を有するとは考えなかったであろう。本発明者らは、皮下注射用のタクロリムス（ＦＫ５０６）とＡＭＤ３１００の固定用量の組み合わせに基づく予期せぬ驚くべき相乗効果を発見し、低用量（非免疫抑制用量）のタクロリムスが損傷部位への幹細胞補充を促進することができることを見出した。

【0016】

ＡＭＤ３１００およびタクロリムスを含む配合剤の開発には課題および／または困難があった。たとえば、ＡＭＤ３１００八塩酸塩水和物は２２ｍｇ／ｍｌで水に溶解するが、ＦＫ５０６（タクロリムス）は水への溶解度が低い。タクロリムスは、水溶解度が低く、Ｐ－ｇｐの流出、および広範な全身循環以前の代謝（ｐｒｅｓｙｓｔｅｍｉｃ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ）を示す可能性があり、その結果、経口投与後の生物学的利用能が低下する可能性がある。タクロリムスは温度およびｐＨに非常に感受性であり、分解して再配列によって非常に密接に関連した構造を有する不純物を形成する可能性がある。タクロリムスの水への相対的な不溶性に基づき、タクロリムスを含む適切な配合剤を実現するのは困難である可能性がある。たとえば、２つのＡＰＩの溶解度により、ＦＫ５０６が不安定になる可能性がある。ＦＫ５０６の約５０％が分解される可能性があり、これらの分解物は、動物または対象の幹細胞の動員（ｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）および補充（ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ）における２つの薬剤、ＡＭＤ３１００とタクロリムスとの相乗効果を低下させる可能性がある。本発明者らは、驚くべきことに、予期せぬことに、ＡＰＩの相乗効果をもたらし、タクロリムスおよび／または製剤の安定性も高める新規の製剤および製造プロセスを発見した。本発明者らは、低用量、たとえば現在食品医薬品局（ＦＤＡ）によって承認されているタクロリムスの用量（経口または静脈内注射によって投与される）よりも約１５分の１の用量でタクロリムスを含む新規製剤を発見した。さらに、本開示の新規製剤は、皮下投与した場合に検出不可能な血中トラフレベルをもたらす可能性がある。

【0017】

本開示は、治療有効量のＡＭＤ３１００、または任意の類似の幹細胞動員剤、およびおよびタクロリムスまたは任意のＦＫ５０６誘導体またはアナログを含む、一つまたは複数の医薬製剤を提供する。一実施形態では、製剤はさらに一つまたは複数の賦形剤を含む。賦形剤は、可溶化剤、浸透促進剤、皮膚軟化剤、溶媒、塩、浸透圧剤、ｐＨ調整剤、および／または注射用水のうちの一つまたは複数を含んでもよい。

【0018】

一つ以上の有効成分、たとえば、ＡＭＤ３１００または類似の幹細胞動員剤は、約１ｍｇ／ｍＬ～約４８ｍｇ／ｍＬの濃度であってもよい。一実施形態では、一つ以上の有効成分、たとえばＡＭＤ３１００または類似の幹細胞動員剤は、約１６ｍｇ／ｍＬ～約４８ｍｇ／ｍＬの濃度であってもよい。一実施形態では、ＡＭＤ３１００または類似の幹細胞動員剤は、約１ｍｇ／ｍＬ、約２ｍｇ／ｍＬ、約２ｍｇ／ｍＬ、約３ｍｇ／ｍＬ、約４ｍｇ／ｍＬ、約５ｍｇ／ｍＬ、約６ｍｇ／ｍＬ、約７ｍｇ／ｍＬ、約８ｍｇ／ｍＬ、約９ｍｇ／ｍＬ、約１０ｍｇ／ｍＬ、約１１ｍｇ／ｍＬ、約１２ｍｇ／ｍＬ、約１３ｍｇ／ｍＬ、約１４ｍｇ／ｍＬ、約１５ｍｇ／ｍＬ、約１６ｍｇ／ｍＬ、約１７ｍｇ／ｍＬ、約１８ｍｇ／ｍＬ、約１９ｍｇ／ｍＬ、約２０ｍｇ／ｍＬ、約２１ｍｇ／ｍＬ、約２２ｍｇ／ｍＬ、約２３ｍｇ／ｍＬ、約２４ｍｇ／ｍＬ、約２５ｍｇ／ｍＬ、約２６ｍｇ／ｍＬ、約２７ｍｇ／ｍＬ、約２８ｍｇ／ｍＬ、約２９ｍｇ／ｍＬ、約３０ｍｇ／ｍＬ、約３１ｍｇ／ｍＬ、約３２ｍｇ／ｍＬ、約３３ｍｇ／ｍＬ、約３４ｍｇ／ｍＬ、約３５ｍｇ／ｍＬ、約３６ｍｇ／ｍＬ、約３７ｍｇ／ｍＬ、約３８ｍｇ／ｍＬ、約３９ｍｇ／ｍＬ、約４０ｍｇ／ｍＬ、約４１ｍｇ／ｍＬ、約４２ｍｇ／ｍＬ、約４３ｍｇ／ｍＬ、約４４ｍｇ／ｍＬ、約４５ｍｇ／ｍＬ、約４６ｍｇ／ｍＬ、約４７ｍｇ／ｍＬ、または約４８ｍｇ／ｍＬの濃度であってもよい。

【0019】

一つ以上の有効成分、たとえば、タクロリムス（ＦＫ５０６）または任意のＦＫ５０６誘導体またはアナログは、約０．０５ｍｇ／ｍＬ～約２ｍｇ／ｍＬの濃度であってもよい。一実施形態では、一つ以上の有効成分、たとえば、タクロリムス（ＦＫ５０６）または任意のＦＫ５０６誘導体またはアナログは、約０．３ｍｇ／ｍＬ～約１．６ｍｇ／ｍＬの濃度であってもよい。一実施形態では、タクロリムス（ＦＫ５０６）は、約０．０５ｍｇ／ｍＬ、約０．０６ｍｇ／ｍＬ、約０．０７ｍｇ／ｍＬ、約０．０８ｍｇ／ｍＬ、約０．０９ｍｇ／ｍＬ、約０．１ｍｇ／ｍＬ、約０．２ｍｇ／ｍＬ、約０．３ｍｇ／ｍＬ、約０．４ｍｇ／ｍＬ、約０．５ｍｇ／ｍＬ、約０．６ｍｇ／ｍＬ、約０．７ｍｇ／ｍＬ、約０．８ｍｇ／ｍＬ、約０．９ｍｇ／ｍＬ、約１．０ｍｇ／ｍＬ、約１．１ｍｇ／ｍＬ、約１．１ｍｇ／ｍＬ、約１．２ｍｇ／ｍＬ、約１．３ｍｇ／ｍＬ、約１．４ｍｇ／ｍＬ、約１．５ｍｇ／ｍＬ、約１．６ｍｇ／ｍＬ、約１．７ｍｇ／ｍＬ、約１．８ｍｇ／ｍＬ、約１．９ｍｇ／ｍＬ、または約２．０ｍｇ／ｍＬの濃度であってもよい。

【0020】

一つまたは複数の可溶化剤は、任意の適切な可溶化剤を含んでもよい。一実施形態では、一つまたは複数の可溶化剤は、（限定されないが）、１－Ｎ－メチル－２－ピロリドン（ＮＭＰ）、プロピレングリコール、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ポリエチレングリコール、 テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコールエーテル、および／またはＮ，Ｎ－ジメチルアセトアミドを含んでもよい。一実施形態では、可溶化剤は１－Ｎ－メチル－２－ピロリドン（ＮＭＰ）である。一つまたは複数の可溶化剤は、約２００ｍｇ／ｍＬ～約８００ｍｇ／ｍＬ、または約２００ｍｇ／ｍＬ～約４５０ｍｇ／ｍＬの濃度であってもよい。一実施形態では、可溶化剤、たとえばＮＭＰの濃度は、約２００ｍｇ／ｍＬ、約２１０ｍｇ／ｍＬ、約２２０ｍｇ／ｍＬ、約２３０ｍｇ／ｍＬ、約２４０ｍｇ／ｍＬ、約２５０ｍｇ／ｍＬ、約２６０ｍｇ／ｍＬ、約２７０ｍｇ／ｍＬ、約２８０ｍｇ／ｍＬ、約２９０ｍｇ／ｍＬ、３００ｍｇ／ｍＬ、約３１０ｍｇ／ｍＬ、約３２０ｍｇ／ｍＬ、約３３０ｍｇ／ｍＬ、約３４０ｍｇ／ｍＬ、約３５０ｍｇ／ｍＬ、約３６０ｍｇ／ｍＬ、約３７０ｍｇ／ｍＬ、約３８０ｍｇ／ｍＬ、約３９０ｍｇ／ｍＬ、約４００ｍｇ／ｍＬ、約４１０ｍｇ／ｍＬ、約４２０ｍｇ／ｍＬ、約４３０ｍｇ／ｍＬ、約４４０ｍｇ／ｍＬ、約４５０ｍｇ／ｍＬ、約４６０ｍｇ／ｍＬ、約４７０ｍｇ／ｍＬ、約４８０ｍｇ／ｍＬ、約４９０ｍｇ／ｍＬ、約５００ｍｇ／ｍＬ、約５１０ｍｇ／ｍＬ、約５２０ｍｇ／ｍＬ、約５３０ｍｇ／ｍＬ、約５４０ｍｇ／ｍＬ、約５５０ｍｇ／ｍＬ、約５６０ｍｇ／ｍＬ、約５７０ｍｇ／ｍＬ、約５８０ｍｇ／ｍＬ、約５９０ｍｇ／ｍＬ、約６００ｍｇ／ｍＬ、約６１０ｍｇ／ｍＬ、約６２０ｍｇ／ｍＬ、約６３０ｍｇ／ｍＬ、約６４０ｍｇ／ｍＬ、約６５０ｍｇ／ｍＬ、約６６０ｍｇ／ｍＬ、約６７０ｍｇ／ｍＬ、約６８０ｍｇ／ｍＬ、約６９０ｍｇ／ｍＬ、約７００ｍｇ／ｍＬ、約７１０ｍｇ／ｍＬ、約７２０ｍｇ／ｍＬ、約７３０ｍｇ／ｍＬ、約７４０ｍｇ／ｍＬ、約７５０ｍｇ／ｍＬ、約７６０ｍｇ／ｍＬ、約７７０ｍｇ／ｍＬ、約７８０ｍｇ／ｍＬ、約７９０ｍｇ／ｍＬ、または約８００ｍｇ／ｍＬであってもよい。一実施形態では、ＮＭＰは、たとえば１つ以上の有効成分の吸収を促進するために、溶媒および浸透促進剤として機能することができる。一実施形態では、ＮＭＰに加えて、一つまたは複数の溶媒または浸透促進剤を使用することができる。

【0021】

一つまたは複数の皮膚軟化剤および／または溶媒は、任意の適切な皮膚軟化剤および／または溶媒を含んでもよい。一実施形態では、一つまたは複数の皮膚軟化剤および／または溶媒は、グリセリン、プロピレングリコール、エチレングリコール、および／またはエタノールを含む。一実施形態では、溶媒はグリセリンである。皮膚軟化剤および／または溶媒は、約１３０ｍｇ／ｍＬ～約３５０ｍｇ／ｍＬの濃度であってもよい。一実施形態では、皮膚軟化剤および／または溶媒、たとえばグリセリンの濃度は、約１３０ｍｇ／ｍＬ、約１４０ｍｇ／ｍＬ、約１５０ｍｇ／ｍＬ、約１６０ｍｇ／ｍＬ、約１７０ｍｇ／ｍＬ、約１８０ｍｇ／ｍＬ、約１９０ｍｇ／ｍＬ、約２００ｍｇ／ｍＬ、約２１０ｍｇ／ｍＬ、約２２０ｍｇ／ｍＬ、約２３０ｍｇ／ｍＬ、約２４０ｍｇ／ｍＬ、約２５０ｍｇ／ｍＬ、約２６０ｍｇ／ｍＬ、約２７０ｍｇ／ｍＬ、約２８０ｍｇ／ｍＬ、約２９０ｍｇ／ｍＬ、約３００ｍｇ／ｍＬ、約３１０ｍｇ／ｍＬ、約３２０ｍｇ／ｍＬ、約３３０ｍｇ／ｍＬ、約３４０ｍｇ／ｍＬ、または約３５０ｍｇ／ｍＬであってもよい。

【0022】

一つまたは複数の溶媒は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、脱水エタノール、もしくは無水エタノールを含んでもよい。一つまたは複数の溶媒は、約２０ｍｇ／ｍＬ～約７０ｍｇ／ｍＬの濃度であってもよい。一実施形態では、溶媒、たとえば無水エタノールまたは無水エタノールの濃度は、約２０ｍｇ／ｍＬ、約２５ｍｇ／ｍＬ、約３０ｍｇ／ｍＬ、約３５ｍｇ／ｍＬ、約４０ｍｇ／ｍＬ、約４５ｍｇ／ｍＬ、約５０ｍｇ／ｍＬ、約５５ｍｇ／ｍＬ、約６０ｍｇ／ｍＬ、約６５ｍｇ／ｍＬ、または約７０ｍｇ／ｍＬであってもよい。

【0023】

一つまたは複数の塩は、任意の適切な塩および／または浸透圧剤を含んでもよい。一実施形態では、一つまたは複数の塩および／または浸透圧剤は、塩化ナトリウム（ＮａＣＬ）、酢酸塩、リン酸塩もしくは二リン酸塩、クエン酸塩、メシル酸塩、硝酸塩、酒石酸塩、またはグルコン酸塩を含んでもよい。一つまたは複数の塩および／または浸透圧剤は、約１ｍｇ／ｍＬ～約３ｍｇ／ｍＬの濃度であってもよい。一実施形態では、塩および／または浸透圧剤、たとえば塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）の濃度は、約１ｍｇ／ｍＬ、約１．５ｍｇ／ｍＬ、約２ｍｇ／ｍＬ、約２．５ｍｇ／ｍＬ、または約３ｍｇ／ｍＬであってもよい。

【0024】

一つまたは複数のｐＨ調整剤は、任意の適切なｐＨ調整剤を含んでもよい。一実施形態では、一つまたは複数のｐＨ調整剤は、塩酸（ＨＣｌ）および／または水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）を含む。一つまたは複数のｐＨ調整剤、たとえば、塩酸（ＨＣｌ）および／または水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）は、適切なｐＨ調整に十分な濃度とすることができる。一実施形態では、ｐＨ調整剤の濃度は約１Ｎ～約８Ｎであってもよい。一実施形態では、ｐＨ調整剤、たとえば塩酸（ＨＣｌ）および／または水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）は、約２Ｎの濃度であってもよい。

【0025】

一実施形態では、製剤は注射用水（ＷＦＩ）を含んでもよい。ＷＦＩはＱ．Ｓ．に適した濃度にしてもよい。一実施形態では、ＷＦＩ濃度は約５～１５％または約５０～１５０ｍｇ／ｍＬであってもよい。

【0026】

一実施形態では、製剤は以下の成分を含むことができ、本明細書では「製剤Ａ（Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ Ａ）」または「ＦＯＲＭ．Ａ」と称する場合がある。

【0027】

【表1】

【0028】

本明細書に開示される医薬製剤は、改善された安定性プロフィールを有する製剤を含んでもよい。製剤は、注射送達、たとえば皮下注射に適していてもよい。一実施形態では、本開示の製剤は、タクロリムス（ＦＫ５０６）および／またはＡＭＤ３１００の安定性において驚くべき予期せぬ改善を提供した。一実施形態では、製剤、たとえば、有効成分、タクロリムス（ＦＫ５０６）またはＦＫ５０６誘導体またはアナログ、およびＡＭＤ３１００もしくは類似の幹細胞動員剤を含む注射剤は、２～８℃または－２０℃下で（ｕｎｄｅｒ ２－８℃ ｏｒ －２０℃）少なくとも９カ月間安定であることを可能にする。一実施形態では、製剤、たとえば注射により、有効成分、タクロリムス（ＦＫ５０６）またはＦＫ５０６誘導体またはアナログおよびＡＭＤ３１００または類似の幹細胞動員剤を室温で少なくとも１０日間安定させることができる。

【0029】

一実施形態では、本開示の製剤は、約１～約３時間で４～２５ｎｇ／ｍＬのタクロリムス（ＦＫ５０６）またはＦＫ５０６誘導体またはアナログのピーク血中レベルをもたらし得る。一実施形態では、トラフレベルは５ｎｇ／ｍＬ未満であってもよい。一実施形態では、有効成分ＡＭＤ３１００およびタクロリムスは、実質的に同時に、たとえば約１～３時間でピークレベルに達してもよく、これにより、循環幹細胞の活性化等、有効成分の驚くべき予期せぬ相乗効果が得られる可能性がある。本開示の製剤の皮下注射は、相乗効果をもたらし得る。一実施形態では、末梢血中の幹細胞は、約２～約３時間でピークレベルに達することができ、動員された幹細胞は、比較的短時間、比較的低レベルのタクロリムスに曝露され得る。

【0030】

一実施形態では、本開示の製剤および方法に１－Ｎ－メチル－２－ピロリドン（ＮＭＰ）を含めることにより、予期しない効果および／または相乗効果が得られる可能性がある。たとえば、本開示の製剤中の治療有効量、たとえば、約２００ｍｇ／ｍＬ～約８００ｍｇ／ｍＬまたは約２００ｍｇ／ｍＬ～約４５０ｍｇ／ｍＬのＮＭＰは、予期せぬ効果および／または相乗効果をもたらし得る方法で、患者または対象における骨形成タンパク質（ＢＭＰ）経路を調節、活性化、または別の効果を有する可能性がある。一実施形態では、ＮＭＰ、タクロリムスまたはその誘導体またはアナログ、および／またはＡＭＤ３１００もしくは類似の幹細胞動員剤の組み合わせは、たとえば、患者または対象のＢＭＰ経路を調節、活性化、またはその他の方法で影響を与えることによって、本明細書に開示されるものを含む様々な状態もしくは疾患の治療において予期せぬ効果および／または相乗効果を提供する可能性がある。

【0031】

本明細書に開示される方法および製剤は、皮下注射用に製剤される医薬製剤をもたらす。一実施形態では、ＡＭＤ３１００、または類似の幹細胞動員剤、およびタクロリムス（ＦＫ５０６）、またはＦＫ５０６誘導体またはアナログを含む医薬製剤は、単回投与の皮下注射用である。一実施形態では、医薬製剤は改善された安定性を示す。一実施形態では、本開示は、開示された医薬製剤を安定化するための方法をさらに含む。

【0032】

一実施形態では、本開示の製剤は、一つまたは複数の治療適応症を治療するために利用することができる。一実施形態では、本開示の製剤は、様々なタイプの組織損傷、脊髄損傷、心筋梗塞、角膜損傷、皮膚創傷等を治療するために使用することができる。一実施形態では、本開示の製剤は、様々な種類の組織損傷、たとえば一つまたは複数の組織損傷、火傷および損傷、自己免疫疾患、炎症性疾患、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、クローン病、臓器移植（肝臓、心臓、肺、腎臓または角膜移植または皮膚移植を含む）、角膜損傷、角膜の疾患および障害、角膜の創傷、裂傷（ｌａｃｅｒａｔｉｏｎ）、裂傷（ｔｅａｒ）、創傷、穿刺またはそれらの組み合わせ、糖尿病に関連または起因する損傷、脊髄損傷、神経損傷および／もしくは変性、全層性熱傷（ｆｕｌｌ－ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ ｂｕｒｎ）または軟組織損傷、潰瘍、糖尿病性潰瘍、虚血による臓器損傷、手術／外傷、感染／炎症、心臓、肺、肝臓、腎臓、胃、腸管、腎臓、皮膚、脳、脊髄、筋骨格系および血管系を含む自己免疫、術後の癒着（たとえば、術後の腹腔内癒着）等を治療するために使用することができる。一実施形態では、本開示の製剤は、急性呼吸促迫症候群（ＡＲＤＳ）治療するために使用することができ、あるいは、急性呼吸促迫症候群（ＡＲＤＳ）の免疫調節療法および／または再生療法として使用することができる。一実施形態では、本開示の製剤は、関節炎および／または関節損傷を治療、寛解、または改善するために使用することができる。

【0033】

一実施形態では、本開示は、医薬製剤を製造するための方法を含む。一実施形態では、医薬製剤、例えば製剤Ａを製造するための方法は、以下の工程のうちの一つまたは複数を順番にまたは順不同で含んでもよい： （ｉ）原薬を２～８℃で除去する工程；（ｉｉ）原薬を例えば最低３０分間平衡化する工程；（ｉｉｉ）バッチサイズの３～５％のＷＦＩを分注する工程；（ｉｖ）適切な量の塩、例えば塩化ナトリウムを添加して、２ｍｇ／ｍＬ溶液を得る工程；（ｖ）均一になるまで溶液を混合する工程；（ｖｉ）適切な量の溶媒、たとえばグリセリンを加えて、１８９．１５ｍｇ／ｍＬ溶液を得る工程；（ｖｉｉ）均一になるまで溶液を混合する工程；（ｖｉｉｉ）所望の４１２ｍｇ／ｍＬ溶液の可溶化剤、たとえばＮＭＰの総量の半分を添加する工程；（ｉｘ）均一になるまで溶液を混合する工程；（ｘ）別の配合容器（ｃｏｍｐｏｕｎｄｉｎｇ ｖｅｓｓｅｌ）に、２４ｍｇ／ｍＬを達成するために、適切な量の有効成分、たとえば、ＡＭＤ３１００または任意の類似の幹細胞動員剤を添加する工程；（ｘｉ）適切な量の溶媒、たとえば無水エタノールを添加して３９．４５ｍｇ／ｍＬを達成し、容器に蓋をする工程；（ｘｉｉ）有効成分、たとえばＡＭＤ３１００または類似の幹細胞動員剤が完全に溶解するまで混合する工程；（ｘｉｉｉ）溶解した有効成分（たとえばＡＭＤ３１００または類似の幹細胞動員剤）の溶液を賦形剤溶液に添加し、すすぎにＷＦＩを使用する工程；（ｘｉｖ）視覚的に均一になるまで混合する工程；（ｘｖ）ｐＨを測定する／ｐＨ調整剤（たとえば２Ｎ ＨＣｌおよび／または２Ｎ ＮａＯＨ）を使用してｐＨを５．５～６．０の目標範囲に調整する工程；（ｘｖｉ）別の配合容器に、適切な量の有効成分（たとえばＦＫ５０６またはＦＫ５０６誘導体またはアナログ）を添加して、０．５ｍｇ／ｍＬの所望の濃度を達成する工程；（ｘｖｉｉ）可溶化剤、たとえばＮＭＰの総量の残り半分を加えて、所望の濃度４１２ｍｇ／ｍＬを達成する工程；（ｘｖｉｉｉ）有効成分（たとえばＦＫ５０６またはＦＫ５０６誘導体もしくはアナログ）が視覚的に溶解するまで溶液を混合する工程；（ｘｉｘ）有効成分溶液（たとえばＦＫ５０６溶液またはＦＫ５０６誘導体もしくはアナログ）を、他の有効成分、たとえばＡＭＤ３１００または類似の幹細胞動員剤を含む配合容器に移す工程；（ｘｘ）視覚的に均一になるまで溶液を混合する工程；（ｘｘｉ）ｐＨを測定する／ｐＨ調整剤、たとえば最小限の２Ｎ ＨＣｌおよび／または２Ｎ ＮａＯＨを使用して５．５～６．０の目標範囲に調整する工程；（ｘｘｉｉ）適量のＷＦＩを使用して目標の重量とする工程（Ｑ．Ｓ． ｔｏ ｔａｒｇｅｔ ｗｅｉｇｈｔ ｕｓｉｎｇ ＷＦＩ）；（ｘｘｉｉｉ）最終製剤（ｆｉｎａｌ ｄｒｕｇ ｐｒｏｄｕｃｔ）を混合する工程；（ｘｘｉｖ）滅菌フィルタ、例えばポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）０．２２μｍ滅菌フィルタを使用する滅菌フィルタ（ｓｔｅｒｉｌｅ ｆｉｌｔｅｒ ｕｓｉｎｇ ｓｔｅｒｉｌｉｚｉｎｇ ｆｉｌｔｅｒ， ｆｏｒ ｅｘａｍｐｌｅ， ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｉｄｅｎｅ ｆｌｕｏｒｉｄｅ （ＰＶＤＦ） ０．２２μｍ ｓｔｅｒｉｌｉｚｉｎｇ ｆｉｌｔｅｒ）；（ｘｘｖ）完成した製剤（ｆｉｎｉｓｈｅｄ ｄｒｕｇ ｐｒｏｄｕｃｔ）を－２０℃で保管する工程。

【0034】

一実施形態では、本開示の医薬製剤は、それを必要とする対象に医薬製剤を投与することを含み、ここで医薬製剤は、少なくとも２つの有効成分、たとえば、ＡＭＤ３１００または類似の幹細胞動員剤、およびタクロリムスまたはＦＫ５０６誘導体もしくはアナログを含む。ここで、投与計画（ｄｏｓｉｎｇ ｒｅｇｉｍｅｎ）治療すべき状態または症状の診断または特定後の複数日、例えば、１日目、２日目または３日目に固定用量の皮下注射を投与すること、および追加の適用を含む。一実施形態では、本開示の医薬製剤の投与計画は、少なくとも２つの有効成分、たとえばＡＭＤ３１００または類似の幹細胞動員剤、およびタクロリムスまたはＦＫ５０６誘導体またはアナログを１日おきに皮下投与することを含む。一実施形態では、本開示の医薬製剤の投与計画は、ＡＭＤ３１００、または類似の幹細胞動員剤、およびタクロリムスまたはＦＫ５０６誘導体またはアナログを、少なくとも６日間、または治療中の創傷、損傷、または疾患が治癒するまで隔日で皮下投与することを含む。

【0035】

また、本開示の少なくとも１つの剤形、例えば単回投与の皮下注射、および少なくとも一つの剤形を対象に投与するための説明書を含むキットも提供される。キットはまた、本開示の少なくとも一つの剤形を収容するパッケージングまたは容器を含んでもよく、保管、投与、投薬等に関する説明書および／または有効成分に関する挿入物を含んでもよい。キットはまた、投与後の有効成分（またはその代謝産物）の循環レベルをモニタリングするための説明書、および場合により、たとえば試薬、ウェルプレート、容器、マーカー、またはラベル等を含むそのようなアッセイを実施するための材料を含んでもよい。本開示のキットに含める他の適切な成分は、所望の適応症、投与計画、保存条件および投与経路を考慮すれば、当業者には容易に明らかであろう。

【0036】

一部の実施形態では、本開示の製剤は、所定の時間、所定の条件にさらされた場合に安定である。たとえば、本開示の医薬製剤は、様々な所定の温度および相対湿度で、規定または所定の期間、たとえば開放または密閉容器内で保管することができる。一部の実施形態では、本開示の製剤は、摂氏約２、３、４、５、６、または８度、および相対湿度約［０％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％］で、少なくとも約０．５、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０、１０．５、１１、１１．５、１２、１２．５、１３、１３．５、１４、１４．５、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、４８、５０、５１、５２、５３、５５、または６０時間、１週間、２週間、３週間、または４週間；１カ月、２カ月、３カ月、４カ月、５カ月、６カ月、７カ月、８カ月、または９カ月の期間保存しても安定である。一実施形態では、本開示の製剤は、室温で少なくとも０．５、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０、１０．５、１１、１１．５、１２、１２．５、１３、１３．５、１４、１４．５、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、４８、５０、５１、５２、５３、５５、または６０時間、１日、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、または１０日間安定である。一部の実施形態では、本開示の製剤は、約－２０℃で長期間、たとえば２年以上安定である。

【0037】

有効成分および賦形剤の例示的な量または範囲が示されているが、本開示の医薬製剤は、本明細書に記載される望ましい薬理学的特性および安定性特性を得る目的に適した任意の量のこれらの成分を含んでもよい。

【0038】

本開示の医薬製剤は、２つ以上のＡＰＩ、たとえばＡＭＤ３１００または類似の幹細胞動員剤、およびタクロリムス（ＦＫ５０６）またはＦＫ５０６誘導体またはアナログを含む固定用量の配合剤として投与するために製剤化することができる。一実施形態では、本開示の製剤は、連続投与または定期的な不連続投与のための固定単回投与の皮下注射として製剤化することができる。連続投与のために、キットは、個々の単位剤形（たとえば、別々の単回使用チューブ等）の本開示の医薬製剤、および場合により、個々の単位剤形をたとえば１日２回以上、毎日、毎週、または毎月、所定の期間にわたって、または処方に従って投与するための説明書を含んでもよい。

【0039】

皮下注射用の医薬製剤を保持および分配するための適切なパッケージまたは容器が当技術分野で知られている。一実施形態では、パッケージは、各投与期間のインジケーターを含む。別の実施形態では、パッケージは、ラベルを付けた注射用チューブを含む。本開示のキットはまた、単位剤形を収容する任意のタイプの包装を含むための手段、たとえばパッチ、注射管を含むことができ、これらは、（たとえば）密封パウチが保持される射出成形またはブロー成形プラスチック等の商業販売のために厳重に保管することができる。一実施形態では、本開示の製剤の投与にプレフィルドシリンジを使用することができる。

【0040】

対象に提供される本開示の医薬製剤の治療有効量は、投与の目的、患者の状態、痛みおよび／またはかゆみのレベル等に応じて変化するであろう。本明細書で使用される場合、「対象」は、本開示の医薬製剤による治療を必要とする任意のヒトまたは非ヒト動物を含む。一実施形態では、対象は、本開示の製剤による治療を必要とする任意のヒトである（本明細書では「患者」と呼ばれることもある）。本開示の医薬製剤中の有効成分の治療上有効量は、特定の状態および体格、年齢、体重、性別、疾患の浸透、対象の以前の治療および応答パターンを含む特定の変数を考慮して、通常の技術を有する医師、獣医師または他の医療専門家によって決定することができる。

【0041】

以下の実施例は、本開示の例示的な実施形態を説明するために与えられる。しかしながら、本開示は、これらの実施例に記載された特定の条件または詳細に限定されるものではないことを理解されたい。

【0042】

実施例
本開示を特定の実施形態に関して論じてきたが、本開示がそれに限定されないことを理解されたい。実施形態は本明細書では例として説明されており、依然として本開示の範囲内にある使用可能な多数の改変、変形、および他の実施形態が存在する。

【0043】

実施例１－製剤Ａの薬物動態および薬力学、ならびにラットおよびブタにおける毒性
薬物動態／薬力学（ＰＫ／ＰＤ）研究： ＳＤラット（２００～３００グラム）には０．７４４ｍｌ／ｋｇの製剤A（ＡＭＤ３１００ １７．８５６ｍｇ／ｋｇ、ＦＫ５０６ ０．３７２ｍｇ／ｋｇ）を、ミニブタ（９～１０ｋｇ）には０．１３２ｍｌ／ｋgの製剤Ａ（ＡＭＤ３１００ ３．１６８ｍｇ／ｋｇ、ＦＫ５０６ ０．０６６ｍｇ／ｋｇ）を皮下注射で投与した。用量はヒト（０．０１ｍｇ／ｋｇ：ＡＭＤ３１００ ０．２４ｍｇ／ｋｇ、ＦＫ５０６ ０．００５ｍｇ／ｋｇ）の１２倍に相当した。

【0044】

血漿ＡＭＤ３１００およびＦＫ５０６濃度を測定するための血液試料を、投与直前、ならびに投与後１、２、３、６、１２、および２４時間後に採取した。生物分析法の検証に関する食品医薬品局のガイドラインに従って、血漿試料をＡＭＤ３１００およびＦＫ５０６について分析した。すべての試料は受け取り時に冷凍され、－７０℃で保管された。試料は、タンデム質量スペクトル検出を備えた液体クロマトグラフィーによって分析された。

【0045】

結果： 図１Ａおよび１Ｂは、ＳＤ速度（ｎ＝１２）における製剤Ａの皮下注射後の時間の関数としての、ラットにおける線形スケール（図１Ａ）および片対数スケール（図１Ｂ）における経時的な平均ＡＭＤ３１００およびＦＫ５０６血漿濃度を示す。ＡＭＤ３１００およびＦＫ５０６は皮下注射投与後、観察できる遅延もなく急速に吸収され、ラットでは両方のＡＰＩの血漿濃度のピークは投与後１時間で発生し、３時間でも高レベルのままであった。薬物動態および薬力学は、ＡＭＤ３１００とＦＫ５０６の間で類似していた。ＡＭＤ３１００とＦＫ５０６は両方とも１２時間以内にクリアされた。

【0046】

図２Ａおよび２Ｂは、製剤Ａの皮下注射後の時間の関数として、ミニブタにおける線形スケール（図２Ａ）および片対数スケール（図２Ｂ）での経時的な平均ＡＭＤ３１００およびＦＫ５０６血中濃度を示す（ｎ＝６）。どちらのＡＰＩも投与後１～２時間でピークレベルに達し、３時間後も高レベルを維持していた。ＡＭＤ３１００とＦＫ５０６は両方とも１２時間後に急速にクリアされた。

【0047】

毒性研究： ＧＬＰ研究では、ラットおよびミニブタにおける製剤Ａの毒性効果を調べた。動物にはヒトの１２倍に相当する用量が投与され、２日目、４日目、６日目、８日目および１０日目に反復投与された。処理濃度では肝臓（ＡＳＴ、ＡＬＴ、ビリルビン、アルブミン）または腎臓（クレアチニンおよびＢＵＮ）の損傷は見出されなかった。ＡＭＤ３１００の一般的な副作用である脾臓肥大は、製剤Ａを投与したラットとミニブタの両方で観察されなかった。１０日間毎日製剤Ａを投与された動物では、他の器官系は正常であった。

【0048】

実施例２－製剤Ａは、マウスの炎症性腸疾患（ＩＢＤ）の治療のために別々に注射された２つの薬剤よりも優れていると思われる
ＩＬ－１０ノックアウトマウスは、自然発生的に慢性炎症性腸疾患（ＩＢＤ）を発症する。ＡＭＤ３１００＋低用量ＦＫ５０６での治療は、ＩＬ－１０欠損マウスＩＢＤ（６）モデルにおける結腸炎症を軽減することができる。製剤ＡがＡＭＤ３１００＋低用量ＦＫ５０６よりも優れているかどうかを決定するために、ＩＬ－１０欠損マウスにおける製剤Ａの有効性を試験した。

【0049】

方法： ＩＢＤの兆候がある生後５カ月のＩＬ－１０欠損マウス（オスおよびメス）をこの研究に使用し、ＩＢＤの臨床進行をモニタリングした。疾患活動性指数（ＤＡＩ）を薬物治療の前後に測定した。ＤＡＩに基づいて、動物を次の３つの治療群に分けた： １）生理食塩水対照； ２）ＡＭＤ３１００（２．４ｍｇ／ｋｇ）＋ＦＫ５０６ （０．０５ｍｇ／ｋｇ）； および３）製剤Ａ。

【0050】

ＤＡＩは以下のように計算した： 体重減少 （０ポイント＝なし、１ポイント＝１～５％の体重減少、２ポイント＝５～１０％の体重減少、３ポイント＝１０～１５％の体重減少、および４ポイント＝１５％以上以上の体重減少）、便の硬さ／下痢 （０ポイント＝正常、２ポイント＝軟便だがまだ形成されている、３ポイント＝非常に柔らかい、４ポイント＝水様の下痢）、出血 （０ポイント＝出血なし、２ポイント＝わずかな出血、３ポイント＝便中の血液の跡が見える、４ポイント＝ひどい出血｛ＣｏｌｏＳｃｒｅｅｎ潜血検査（Ｈｅｌｅｎａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，テキサス州ビューモント）による｝。体重減少、下痢、出血の合計により、ＤＡＩスコアの合計は０（影響なし）から１２（重度の大腸炎）の範囲になる。図３は、ＡＭＤ３１００＋低用量のＦＫ５０６または製剤Ａの投与が、ＩＬ－１０ノックアウトマウスにおける疾患活動性指数の有意な改善をもたらしたことを示している（＊ｐ＜０．０１ 生理食塩水対照対Ａ＋Ｆまたは製剤Ａ群； ＊＊ｐ＜０．０５Ａ＋Ｆ対製剤A)。

【0051】

製剤Ａを注射前に生理食塩水（１００倍）で希釈し、１０μｌ／グラムの希釈製剤Ａ（ＡＭＤ３１００ ２．４ｍｇ／ｋｇ、ＦＫ５０６ ０．０５ｍｇ／ｋｇ）を１日おきに２８日間、皮下注射した。ＡＭＤ３１００ （２．４ｍｇ／ｋｇ）およびＦＫ５０６ （０．０５ｍｇ／ｋｇ）も注射前に生理食塩水で希釈し、各薬剤を別々に注射した。同量の生理食塩水を対照動物に投与した。

【0052】

結果： ＡＭＤ３１００＋ＦＫ５０６または製剤Ａの投与は、ＩＬ－１０ノックアウトマウスにおける疾患活動性指数の改善をもたらした。ＤＡＩは、生理食塩水で治療した動物では時間に依存して徐々に増加したが、ＡＭＤ３１００と低用量のＦＫ５０６を投与した動物では１２日目に大幅に減少し、低レベルのままであった（図３を参照）。驚くべきことに、そして予期せぬことに、製剤Ａを投与された動物は、１６日間の治療後に最も低いＤＡＩを示した。ＤＡＩは、１６日目、２０日目および２８日目にＡＭＤ３１００＋ＦＫ５０６群と比較して、製剤Ａで治療した動物で有意に低かった。これらの結果は、固定用量の配合剤である製剤Ａが、ＩＢＤの治療のために別々に注射された２種類の薬剤よりも優れている可能性があることを示唆している。

【0053】

ＩＢＤマウスにおける結腸の長さの短縮は、結腸炎症の評価における生物学的マーカーの１つである。図４Ａおよび４Ｂは、製剤Ａの治療が、生後５カ月のＩＬ－１０ノックアウトマウスにおける結腸短縮を阻止できることを示す。図４Ａは結腸の写真を示し、図４Ｂは結腸の長さの定量的データを示す。図４Ａおよび４Ｂは、ＩＬ－１０ノックアウトマウスがＩＢＤを発症し、老齢の対応する野生型マウスと比較して有意な結腸短縮を示し、この効果が製剤Ａの治療によって予想外に除去されたことを実証する（an effective which was unexpectedly eliminated by Formulation A treatment）。

【0054】

要約： 製剤Ａ（２つのＡＰＩ ＡＭＤ３１００およびＦＫ５０６を含む固定用量の配合剤）は、ＩＢＤの治療のために別々に投与される２つの薬剤よりも優れている可能性がある。２つの薬剤に対する製剤Ａの利点は、本開示で開示されるように、新規製剤、薬剤吸収および製剤Ａの薬物動態および薬力学に関連する。

【0055】

実施例３：製剤Ａは、ブタの全層皮膚切除後の創傷治癒を促進した
外科的切除創傷： 生後４～６カ月、到着時の体重４０～５０ｋｇのメスのヨークシャーブタを、実験手順の前に約１～２週間順応させた。創傷を作るために、導入のためにブタをテラゾールとキシラジンの組み合わせ１．１～２．２ｍｇ／ｋｇの筋肉内投与で鎮静させ、その後挿管し、セボフルランまたはイソフルラン１～４％の連続吸入で維持した。ブタの剃毛した背中に直径４ｃｍの円形切除により６つの全層創傷を作成した（図５Ａを参照）。各創傷部位を指定の時間間隔でデジタル撮影し、Ａｄｏｂｅ Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ（登録商標）ソフトウェアを使用して創傷面積を計算した。経時的な創傷面積の変化は、最初の創傷面積のパーセンテージとして表した。

【0056】

治療： 負傷させたブタはランダムに２つの実験群に分けられ、負傷直後から完全に治癒するまで生理食塩水または製剤Ａ（０．０４ｍｌ／ｋｇ）の皮下注射を受けた。すべての創傷評価は二重盲検法で行った。

【0057】

結果： 図５Ａ、５Ｂおよび５）は、製剤Ａで治療したブタにおける促進された創傷治癒を示す。図５Ａは、モデル上に６つの円形切除創傷が作成された０日目のブタモデルを示す。図５Ｂは、ブタモデルにおける皮膚創傷治癒の肉眼的分析を示す。図５（Ｃ）は、再上皮化時間を示す（ｎ＝３）。生理食塩水で治療したブタ（ｎ＝３）では、手術後４９日目に創傷が完全に閉鎖した。製剤Ａで治療した３頭のブタは、３５日目に創傷が完全に閉鎖し、生理食塩水対照群と比較して有意に速い治癒を示した（図５Ｂおよび５Ｃを参照）。要約すると、製剤Ａによる治療は前臨床大型動物モデルの創傷治癒を促進する可能性がある。

【0058】

実施例４：製剤Ａは、ラットにおける急性脊髄損傷（ＳＣＩ）後の回復を改善する
要約： 図６Ａ、６Ｂおよび６Ｃは、製剤Ａが急性脊髄損傷（ＳＣＩ）後の機能回復を改善することを示す。脊髄挫傷損傷モデルは、骨髄移植ルイスラット（野生型ルイスへのＧＦＰ＋ルイス）で作成した。損傷した動物に、ＳＣＩ後２４時間および１日おきに１カ月間で生理食塩水（ｎ＝７）または製剤Ａ（ｎ＝８）の皮下注射を投与した。図６Ａは、１カ月後の損傷した脊髄の組織像を示す。図６Ｂは、生理食塩水で治療したラットの脊髄の損傷領域に骨髄由来のＧＦＰ細胞がほとんど存在せず、大きな空洞を伴うことを示しているが、製剤Ａで処置したラットの脊髄の損傷領域には多数の骨髄由来のＧＦＰ＋細胞が出現し、空洞は確認されなかった。図６Ｃは、ＳＣＩ後の時間に対するＢＢＢスコアを示す。

【0059】

ラットにおける挫傷性脊髄損傷モデル： 身長１２．５ｍｍから体重が減少したＳＣＩの挫傷性ラットモデルを、５～６カ月齢のルイスラットで実施した。ＳＣＩにおける骨髄由来幹細胞の役割を決定するために、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）トランスジェニックルイスラット由来の骨髄を、致死量の放射線を照射された野生型ルイスレシピエントに移植した。３カ月後、骨髄を移植したラットをＳＣＩに使用した。イソフルラン吸入（２～４％）により動物に麻酔を導入し、維持した。椎弓切除術を胸椎Ｔ８で行い、脊髄の背側表面を露出させた。安定化クランプは、衝撃時にＴ５およびＴ１２椎骨を固定して柱（ｃｏｌｕｍｎ）をサポートする役割を果たした。次に、Ｔ８の脊髄をメカニカルインパクターＮＹＵデバイスの垂直シャフトの真下に置き、先端が脊髄に接触するまでシャフト（先端直径、１ｍｍ）をゆっくりと下げた。次に、インパクタープローブを所望の衝撃落下距離（１２．５ｍｍ）まで引き出した。インパクトシャフトを吊り下げているピンが解放され、重力によって下降し、コードに当たった。次に、インパクターを引き抜き、動物を装置から取り出し、筋肉層および皮膚を４－０吸収性縫合糸で閉じた。次に、泌尿器系感染症を防ぐために、抗生物質（ゲンタマイシン）をラットに毎日投与した。痛み止めも投与した。７～１０日後に、麻酔下で縫合糸を除去する。

【0060】

治療： 手術から回復し、手術後２４時間で後肢麻痺を示した動物をランダムに２つの群に分け、１日おきに２８日間、生理食塩水または製剤Ａ（０．１ｍｌ／ｋｇ）の皮下注射を投与した。

【0061】

測定： 損傷後の運動行動は、Ｂａｓｓｏ、Ｂｅａｔｔｉｅ、およびＢｒｅｓｎａｈａｎ（ＢＢＢ）運動器スケール法（ｌｏｃｏｍｏｔｏｒ ｓｃａｌｅ ｍｅｔｈｏｄ）によって評価した。ＢＢＢを使用して、関節の動き、後肢の動き、ステップ、四肢の調整、体幹の位置、足の配置、および尾の位置を評価した。ラットのＳＣＩ後の回復は０から２１のスケールで評価された。

【0062】

結果： 研究の最後に、すべての動物の脊髄を組織像で調査した。縦切片のヘマトキシリン／エオシン染色により、生理食塩水で治療したラットの挫傷による広範な組織損傷が明らかになった(図６Ａを参照)。病変中心では、すべてのケースでほとんどの組織が破壊された。空洞形成が発生し、残った組織の大部分は非神経性瘢痕、壊死組織、および炎症細胞の浸潤を含んでいた。対照的に、製剤Ａで１日おきに治療した場合、損傷領域は小さくなり、空胞化および細胞死がはるかに少なくなった。免疫蛍光染色により、生理食塩水で治療したラットでは、少数の骨髄由来ＧＦＰ＋細胞が病変領域に出現し、病変中心に大きな空洞が形成されていることが示された。製剤Ａで治療したラットでは、多数の骨髄由来ＧＦＰ陽性細胞が病変中心に存在した。興味深いことに、大きなＧＦＰ＋細胞の一部は、ニューロンに見られる大きな顆粒体であるニッスル体（赤色）を含んでいた（図６Ｂを参照）。これらの結果は、動員された骨髄幹細胞が脊髄のニューロン細胞になる可能性を示唆している。

【0063】

手術後１日目では、すべての動物がＢＢＢ運動機能スケールで２未満のスコアを示し、ＳＣＩラットモデルの妥当な程度の信頼性を示した。自然回復のため、時間はすべての治療群の運動機能に有意な影響を及ぼし（図６Ｃ）、経時的に生理食塩水対照と治療との間に有意な差が見出された。重要なことは、製剤Ａで治療したラットは運動機能（ＢＢＢスコア）が著しく優れていたことである。

【0064】

製剤Ａの治療は、損傷した脊髄に骨髄幹細胞を動員して補充し、これらの幹細胞は損傷した脊髄組織を修復／再生し、運動機能を改善した。

【0065】

実施例５：製剤Ａの治療は、ラットの心筋梗塞後の心臓機能を改善する
要約： 図７Ａおよび７Ｂは、製剤Ａの治療がラットの心機能を改善し、心筋梗塞後の線維症を改善することを示す。図７Ａは、術後１４日目および２８日目の左室駆出率（ＬＶＥＦ）を示す。図７Ｂは、各群の５匹のラットからの代表的な写真を示し、マッソントリクローム染色（Ｍａｓｓｏｎ’ｓ ｔｒｉｃｈｏｍｅ ｓｔａｉｎｉｎｇ）が生理食塩水治療ラットの左室前壁における瘢痕形成を示したことを示す。

【0066】

ラットにおける心筋梗塞の誘発： ＬＡＤ結紮によりＭＩを誘発するために、８～１０週齢、体重２２０～２５０ｇの範囲の１０匹のオスルイスラットを選択した。ケタミンおよびキシラジンの腹腔内注射により動物に麻酔を導入し、維持した。麻酔後、動物に挿管し、１６ゲージの静脈内カテーテルで換気し、温度制御パッド上に仰臥位に置いた。第５肋間腔で肋骨に平行な切開によって胸を開き、肋骨を広げて心臓を露出させた。心臓にアクセスするために、鋭利な鉗子で心膜を開いた。左前下行枝（ＬＡＤ）の結紮部位が起始部から５ｍｍ離れていることが確認されたら、綿製のイヤフォンを使用して結紮部位の少し下の動脈を軽く押し、心臓を固定し、また動脈を目立たせて識別しやすくした。先細の無傷針を使用して、６－０絹結紮をＬＡＤの下に通し、３つの結び目で結んだ。左室の前壁の目に見える白化およびチアノーゼ、および左心房の腫脹は、結紮が成功したことを示していた。肺を再び膨張させ、胸壁を閉じ、自発呼吸が生じたときにラットを抜管した。

【0067】

治療： 手術から回復した動物をランダムに２つの群に分け、手術後６時間目に生理食塩水または製剤Ａ（０．１ｍｌ／ｋｇ）を皮下注射し、１日おきに２８日間投与した。

【0068】

測定： 心エコー検査は、ラットの左前下行枝の結紮による誘発心筋梗塞後日目および２８日目に実施した（Ｅｃｈｏｃａｒｄｉｏｇｒａｐｈｙ ｗａｓ ｐｅｒｆｏｒｍｅｄ ａｔ ｄａｙ ａｎｄ ｄａｙ ２８）。動物はＭＩ後1ヶ月で屠殺され、心臓の組織像が研究された。

【0069】

結果： 左室駆出率（ＬＶＥＦ）は、ＭＩ後の心機能を判定するための主要な検査の一つであり、５０％～７０％の範囲のＬＶＥＦが正常であると考えられる。術後（ＰＯＤ）１４日目および２８日目に行われた心エコー検査では、左前下行枝の結紮による誘発心筋梗塞後に生理食塩水で治療したラットのＬＶＥＦの平均が約２０％であることが示された。対照的に、製剤Ａで治療したラットにおけるＬＶＥＦレベルは、ＰＯＤ１４では有意に高く（約５０％）、ＰＯＤ２８では正常範囲に近い高いレベルを維持した（図７Ａ）。生理食塩水で治療したＭＩのラットの心臓の１カ月後の組織病理学検査では、左心室前壁が心尖部付近で青白く薄いことが示された。マッソントリクローム染色により、左心室前壁に瘢痕形成が示された。興味深いことに、左心室前壁は厚いままであり、均一な赤みを帯びた色を示していた。心臓平滑筋では、青色に染色された線維化組織はほとんど見られなかった（図７Ｂ）。これらの結果は、製剤Ａによる内因性幹細胞の動員および補充が、心虚血損傷の寛解、修復／再生の促進、瘢痕形成の防止を通じてＭＩ後の心臓機能を改善することを示唆している。

【0070】

実施例６：製剤Ａは、マウスにおける角膜アルカリ熱傷後の角膜線維症を予防する
実質混濁（ｓｔｒｏｍａｌ ｏｐａｃｉｔｙ）の発生を含む角膜創傷治癒反応は、角膜への損傷、手術、または感染の後に生じる瘢痕化／線維症を引き起こすことが多い過程である。角膜線維症は角膜の透明性を低下させることにより、その機能を損なうか完全に低下させ、視力障害および失明につながる可能性がある。骨髄幹細胞の動員および補充は、角膜上皮修復を促進し、間質線維症を寛解させる可能性がある。

【0071】

要約： 図８Ａおよび８Ｂは、製剤Ａによる治療がマウスの眼熱傷後の角膜瘢痕化を防止することを示す。Ｃ５７／Ｂ６マウスの片目を０．５Ｎ ＮａＯＨで２０秒間焼いた。眼熱傷後、動物を生理食塩水または製剤Ａの皮下注射で１日おきに２週間治療した。角膜瘢痕形成を損傷後４２日目に測定した。図８Ａは、目の角膜の写真（ｎ＝５）を示し、図８（Ｂ）は、４が最悪である、０から４までのマウス角膜透明度スコアを示す。

【0072】

方法： 角膜アルカリ熱傷（０．５Ｎ ＮａＯＨで２０秒間）をＣ５７／Ｂ６マウスの片目の角膜に誘発した。製剤Ａは注射前に生理食塩水で１０倍に希釈した。損傷の日から、化学熱傷を負ったマウスを生理食塩水または製剤Ａ（１ｍｌ／ｋｇ）で１日おきに治療した。眼表面の状況を、１日目、３日目、７日目、１４日目、２１日目、３０日目、３７日目、および４２日目に評価した。病理組織学的評価のために角膜を採取した。骨髄由来幹細胞が角膜に再増殖（ｒｅｐｏｐｕｌａｔｅ）できるかどうかを決定するために、ＧＦＰトランスジェニック骨髄移植ルイスラットを研究した。

【0073】

結果： 骨髄由来幹細胞が角膜に再増殖できるかどうかを決定するために、ＧＦＰトランスジェニック骨髄移植ルイスラットを研究した。ＧＦＰ骨髄移植４カ月の時点で、ＧＦＰ陽性細胞が角膜実質層および角膜上皮層で同定されたことは、角膜は骨髄由来細胞の相当数を含んでおり、骨髄幹細胞が創傷に対する角膜の反応において役割を果たしている可能性があることを示している。

【0074】

これらの発見に基づいて、製剤Ａによる骨髄幹細胞の動員および補充によるアルカリ熱傷後の角膜治癒の改善を試験した。角膜は、製剤Ａ治療群のアルカリ熱傷モデルにおいて、再上皮形成率の上昇、角膜混濁スコアの低下を示し、および角膜新生血管形成を示さなかった（図８Ａを参照）。ＨＥ染色および免疫染色では、実験角膜における筋線維芽細胞の活性化が低下し、眼内炎症および血管新生が減少していることが示された。

【0075】

要約すると、この研究は、製剤Ａが治癒を促進し、角膜アルカリ熱傷後の線維症を予防することを実証することができる。製剤Ａは、患者の角膜線維症の効果的な治療法となる可能性がある。

【0076】

実施例７：ＮＭＰと製剤Ａとの相乗効果
この研究は、Ｎ－メチル－２－ピロリドン（ＮＭＰ）がブタモデルにおける創傷治癒のためのＡＭＤ３１００とタクロリムスの併用（ＡＦ併用）治療の有効性を高めるかどうかを試験した。１型糖尿病のブタは、膵臓β細胞がんの治療における化学療法剤として臨床的に使用されているストレプトマイセス・アクロモゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）由来のグルコサミン－ニトロソウレア化合物であるストレプトゾトシン （ＳＴＺ）によって誘発された。ＳＴＺは膵臓β細胞を損傷し、低インスリン血症および高血糖症を引き起こす。続いて、臨床状況（末梢動脈疾患を伴う潰瘍患者）を模倣するためにアテローム性動脈硬化を誘発するために、ブタにコレステロールが豊富な飼料（コレステロール ２．０％、ラード ２０％、Ｅｎｖｉｇｏから市販）を２０週間給餌した。

【0077】

２０週間後、ブタの剃毛した背中に直径４ｃｍの円形切除によって６つの全層創傷を生成した。負傷したブタを以下の４つの実験群にランダムに分け、負傷直後および完全に治癒するまで１日おきに生理食塩水または薬物の皮下注射を行った： １）生理食塩水で治療した対照群； ２）ＡＭＤ３１００（０．５ｍｇ／ｋｇ）および低用量のＦＫ５０６（０．０１ｍｇ／ｋｇ）で治療したＡＦ併用群； ３）ＮＭＰ（８ｍｇ／ｋｇ）および４）ＡＦ併用およびＮＭＰ（８ｍｇ／ｋｇ）。

【0078】

図９Ａおよび９Ｂは、ＮＭＰがブタの全層切除後の創傷治癒におけるＡＦ併用の有効性を高めることを実証している。図９Ａは、ブタの皮膚創傷治癒の肉眼的分析を示す。各創傷部位を指定された時間間隔でデジタル撮影し、ＰｈｏｔｏＳｈｏｐ（登録商標）ソフトウェアを使用して創傷面積を計算した。１群当たり３頭のブタからの２４個の傷（ブタ当たり６個の傷）の代表的な写真を図９Ａに示す。図９Ｂは、創傷治癒時間を示す。生理食塩水対照群では、手術後５９日目に創傷が完全に閉鎖した。ＡＦの併用で治療した３頭の豚は、４８日目に創傷が完全に閉鎖し、生理食塩水対照群と比較してより速い治癒を示した。ＡＦの併用およびＮＭＰで治療した群の３頭の豚では、治癒時間が４３日に、または２７％短縮された（図９Ｂ）。治癒時間は、生理食塩水対照群（ｐ＝０．０３３）またはＮＭＰで治療した群（ｐ＝０．０４０）とは統計的に異なった。デジタル画像は、ＡＦおよびＮＭＰ療法による治療が、早ければ１４日目で皮膚欠損のサイズを縮小する顕著な効果をもたらしたことを示した。これらの結果は、ＮＭＰとＡＦの併用が予想外に相乗的にブタの創傷治癒を促進したことを示唆している。

【0079】

この研究は、ＮＭＰが、マイトジェン活性化プロテインキナーゼシグナル伝達経路の抑制を介して創傷の炎症を阻害すること、および骨形成タンパク質（ＢＭＰ）の発現を増強することによって、創傷治癒におけるＡＦ併用療法の有効性を促進する可能性があることを実証している。ＮＭＰは、マイトジェン活性化プロテインキナーゼシグナル伝達経路の抑制を通じて炎症を抑制し、ＢＭＰ発現を増強することにより、抗炎症機能を示し、足関節骨折の治癒および骨組織の再生を促進すると考えられる。

【0080】

実施例８：急性呼吸促迫症候群に対する免疫調節および再生療法としての製剤Ａ
急性呼吸促迫症候群（ＡＲＤＳ）は、肺における広範な炎症の急速な発症を特徴とする呼吸不全の一種である。ＡＲＤＳは、重篤な疾病の人または重傷を負った人に発生する可能性がある。多くの場合致命的であり、年齢および疾病の重症度に応じてリスクは増加する。原因は、敗血症、膵炎、外傷、肺炎、および誤嚥を含むだろう。ウイルス性肺炎に続発するＡＲＤＳは、ＣＯＶＩＤ－１９患者の高い死亡率の主な原因の一つである。ＡＲＤＳを伴うＣＯＶＩＤ－１９患者の死亡率は約 ３９％（９５％ ＣＩ： ２３～５６％）である。ＡＲＤＳ患者に対する証明された特定の薬理学的治療法はない。デキサメタゾンはＣＯＶＩＤ－１９（ＡＲＤＳ）患者に使用されているが、証明されておらず、感染性合併症のリスク増加と関連している。

【0081】

製剤Ａは、連鎖球菌（ストレプトコッカス・ニューモニエ；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ Ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）誘発性急性呼吸促迫症候群（ＡＲＤＳ）のマウスモデルにおいて死亡率を低下させ、生存率を改善した
図１０Ａおよび１０Ｂは、製剤Ａが、連鎖球菌（ストレプトコッカス・ニューモニエ；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ Ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）誘発性ＡＲＤＳのマウスモデルにおいて予想外に死亡率を低下させ、生存率を改善したことを実証する。図１０Ａは実験プロトコールを示し、図１０Ｂは動物の生存率を示す。製剤ＡがＡＲＤＳを寛解させることができるかどうかを試験するために、４．５×１０^６ ＣＦＵのストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ Ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の気管内点滴注入によってＡＲＤＳを誘発する標準モデルで、Ｃ５７／Ｂ６マウスをストレプトコッカス・ニューモニエに感染させた。感染した動物はランダムに２つの群に分けられ、感染後２４時間でプラセボまたは製剤Ａ（０．１ｍｌ／ｋｇ）による治療を受け、１４日目または２８日目まで１日おきにプラセボまたは製剤Ａ（０．１ｍｌ／ｋｇ）による治療を受けた（図１（Ａ））。動物は治療前に体重減少（～１０％）と呼吸困難を示し、これはすべての動物が順調に感染したことを示している。プラセボ（生理食塩水）対照群では、感染２週間以内に３９匹中１１匹（２８．２％）が死亡した。これは、この確立されたモデルにおける既知の死亡率と一致している（６）。製剤Ａで治療したマウスでは、死亡率が７％（４３匹中３匹）まで、または７５％減少した（図１０Ｂ）。

【0082】

製剤Ａは、大葉性肺炎球菌性肺炎（ｌｏｂａｒ ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）を改善し、肺の炎症を軽減した
図１１Ａおよび１１Ｂは、製剤Ａが大葉性肺炎球菌性肺炎（ｌｏｂａｒ ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ）を寛解させ、連鎖球菌肺炎球菌の気管内投与（ｉｎｔｒａｔｒａｃｈｅａｌ ｉｎｓｔａｌｌａｔｉｏｎ）後５日目にマウス（ｍｉｎｅ）の炎症を軽減したことを実証している。図１１Ａは、プラセボ対照群を示す。図１１Ａの上のパネルは、生き残った動物の肺のＣＴスキャンを示し、中央パネルは肺の肉眼写真を示し、下パネルは肺のＨ＆Ｅ染色を示す。図１１Ｂは、製剤Ａで治療された群を示す。図１１Ｂの上のパネルは、生き残った動物の肺のＣＴスキャンを示し、中央パネルは肺の肉眼写真を示し、下パネルは肺のＨ＆Ｅ染色を示す。

【0083】

感染後５日目に、プラセボ対照群のすべての生存マウス（７匹中６匹）の肺のＣＴスキャンは、大気道は比較的少ないものの、葉（ｌｏｂｅ）全体の大部分の局所的な濃密な不透明化および／または葉または分節パターンのスリガラス状不透明化が示され（図１１Ａ、上のパネル）、大葉性肺炎球菌性肺炎（ｌｏｂａｒ ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）を示唆している。対照的に、製剤Ａで治療した７匹のマウスのうち２匹だけが、葉全体の大部分または一部の局所的な濃密な不透明化を示した（図１１Ｂ、上のパネル）。プラセボ対照群の同じ動物の肺の肉眼写真では、５匹の動物が両肺に広がり／びまん性の炎症を示し、１匹の動物が両肺に限定的な斑状病変（ｐａｔｃｈ ｌｅｓｉｏｎ）を示し、重度の肺損傷を負った１匹の動物が４日目に死亡した（図１１Ａ、中央パネル）。しかしながら、製剤Ａ治療群では、３匹の動物の肺はほぼ完全に回復し、２匹の動物の肺は葉に限定された斑状病変を示し、２匹の動物だけが両肺にびまん性炎症を示した（図１１Ｂ、中央パネル）。Ｈ＆Ｅ染色は、プラセボ対照群における葉または肺の全体または大部分の急性炎症を実証した（図１１Ａ、中央パネル）。製剤Ａ治療群では、２匹のマウスが葉の大部分または部分の急性炎症を示し、他の５匹のマウスが小さな細気管支および隣接する肺胞のみに関与する急性炎症を示した（図１１Ｂ、下のパネル）。

【0084】

連鎖球菌（ストレプトコッカス・ニューモニエ；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ Ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）に感染したマウスにおける製剤Ａによるサイトカインストームの改善
図１２Ａ～１２Ｆは、製剤Ａがストレプトコッカス・ニューモニエによって誘発されるサイトカインストームを改善したことを示す。末梢血血清を感染後５日目に採取し、サイトカインレベルをＥＬＩＳＡによって測定した。

【0085】

ストレプトコッカス・ニューモニエ感染が「サイトカインストーム」を引き起こしたかどうかを決定するために、感染後５日目にＥＬＩＳＡを使用してマウスから血清中のいくつかの重要なサイトカインを測定した。対照では、ＴＮＦ－α、ＩＬ－６、およびＩＬ－ベータの血清レベルは２４時間で増加し、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＦＮ－ｒを含む他のサイトカインとともに、感染後５日目にピークレベルに達した（図１２Ａ～１２Ｆ）。これは、肺感染症に関連したサイトカインストームを示唆している。製剤Ａの治療は、ＴＮＦ－α、ＩＬ－２およびＩＬ－４の血清レベルを有意に減少させた（図１２Ａ、１２Ｂおよび１２Ｃ）。感染後５日目の対照群と製剤Ａ群の間のＩＬ－６の血清レベルには統計的な差は観察されなかったがプラセボ対照群の７匹中５匹の動物は、より高いＩＬ－６レベルを示したが、治療した動物の８匹中６匹は、２４時間のレベルと比較して、より低いＩＬ－６レベルを示した（図１２Ｄ、丸）。

【0086】

製剤Ａは、血清ＬＤＨレベルを低下させ、肝損傷を改善した
図１３Ａ～１３Ｃは、製剤Ａが血清ＬＤＨを減少させ、肝損傷を改善したことを示す。感染したマウスを１日目または５日目に屠殺した。血液化学検査を行った。図１３Ａは血清乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）の結果を示し、図１３Ｂはアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）の結果を示し、図１３（Ｃ）はアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）の結果を示す。

【0087】

乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）は、体のほぼすべての細胞に存在するエネルギー産生に関与する酵素であり、肺、心臓、肝臓、筋肉、腎臓の細胞、および血球に最も高いレベルで存在する。これらの組織が損傷すると、血流中にＬＤＨが放出される。ＬＤＨは、組織損傷を検出するために最もよく使用される。さらに４２匹のマウスについて、感染後５日目の血清ＬＤＨレベルを調べた。特に、製剤Ａ群（ｎ＝２１）の動物はすべて生存したが、プラセボ対照群では３日目に １匹のマウスが死亡し、５日目に１匹のマウスが死亡した。生理食塩水で治療した動物では、感染後５日目に血清ＬＤＨレベルが約1２００Ｕ／Ｌに増加した（図１３Ａ）。製剤Ａでの治療後、血中ＬＤＨレベルは６４０Ｕ／Ｌまで低下した。さらに、肝酵素ＡＳＴおよびＡＬＴも感染試験マウスで増加したが、感染後５日目のＡＳＴおよびＡＬＴの血清レベルは、プラセボ対照群と比較して製剤Ａ治療群で有意に低かった（図１３Ｂおよび１３Ｃ）。

【0088】

ＬＤＨの血漿レベルの上昇は、ＣＯＶＩＤ－１９感染患者の転帰の悪化と関連している。発表された研究では、ＬＤＨレベルの上昇は、ＣＯＶＩＤ－１９患者の重症化の確率の６倍増加と死亡率の１６倍増加に関連していると報告されている。ＬＤＨの上昇は、軽度の ＣＯＶＩＤ－１９患者における増悪の独立した危険因子である可能性もある。この研究は、製剤Ａによる治療が損傷した肺の幹細胞の数を増加させるだけでなく、組織の損傷を軽減することを示している。

【0089】

製剤Ａ治療による損傷した肺におけるＣＤ１３３＋幹細胞およびＹｍ１／２＋ＣＤ６８＋Ｍ２マクロファージの補充
図１４Ａおよび１４Ｂは、製剤Ａがストレプトコッカス・ニューモニエ感染後５日目に損傷した肺においてＣＤ１３３＋幹細胞を増加させたことを実証する。感染マウスから単離した肺細胞のサイトスピン スライドをＣＤ１３３抗体（緑色）で染色した。４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）染色（青）を使用して核の数を決定した。ＣＤ１３３＋幹細胞は、生理食塩水で治療されたマウスから回収された肺細胞で同定された。ＣＤ１３３＋幹細胞は、製剤Ａで治療したマウスから単離された肺細胞において有意に増加した。画像は１群あたり６匹または７匹のマウスを表す。

【0090】

製剤Ａ治療が損傷した肺においてＣＤ１３３＋（前駆）幹細胞を増加させるかどうかを決定するために、動物を５日目に屠殺し、血液および肺組織試料を収集した。肺細胞は、コラゲナーゼ消化を使用して単離した。単離された肺細胞のサイトスピンスライドをＣＤ１３３抗体で染色した。損傷のない正常な肺では、ＣＤ１３３＋幹細胞はほとんど確認されなかった。単離された肺細胞のサイトスピンスライドの免疫蛍光染色は、生理食塩水で治療された感染マウスから回収された肺細胞においてＣＤ１３３＋細胞の数が増加していることを示し、これは肺損傷後に幹細胞を補充するための自然ではあるが不十分なプロセスを示した（図１４Ａおよび１４Ｂ）。予想外にも、感染後５日目に製剤Ａで治療を受けた動物の単離された肺細胞では、ＣＤ１３３＋細胞が有意に多かった。これらのＣＤ１３３＋細胞の一部は二重核を示しており、これは増殖を示している可能性がある。

【0091】

系統追跡は、製剤Ａによる気管支気道上皮治癒の改善におけるＣＤ１３３幹細胞の重要な役割を実証した
図１５は、製剤Ａで治療したストレプトコッカス・ニューモニエ感染ＣＤ１３３＋／Ｃ－ＬマウスにおいてＣＤ１３３＋幹細胞が気管支上皮を生成することを示す。損傷した肺組織は、細気管支で顕著なＧＦＰ発現を示した。気管支上皮細胞の一部は、ＧＦＰ陽性ＣＤ１３３子孫細胞によって再増殖された（右パネル）。

【0092】

損傷した肺の治癒におけるＣＤ１３３幹細胞の重要な役割を確認するために、系統追跡研究を行った。Ｒｏｓａ２６ＧＦＰレポーターアレルを含む成体ＣＤ１３３陽性Ｃｒｅ－ｎｕｃｌｅａｒ（ｎ）ＬａｃＺ （ＣＤ１３３＋／Ｃ－Ｌ）マウス（ＣＤ１３３＋／Ｃ－Ｌ Ｘ ｍＴｍＧ 子孫）に、４．５×１０^６ ＣＦＵのストレプトコッカス・ニューモニエの気管内点滴注入によりストレプトコッカス・ニューモニエを感染させた。感染動物はランダムに２つの群に分けられ、感染後２４時間目にプラセボまたは製剤Ａ（０．１ｍｌ／ｋｇ）による治療を受け、２８日目まで１日おきに治療した。屠殺の５日前にタモキシフェンを用いてＣｒｅＥＲＴ２活性を誘導した（図１０Ａ）。このマウスモデルでは、ＣＤ１３３子孫はＧＦＰ陽性であった。

【0093】

ＧＦＰ陽性細胞は、非感染マウスまたは対照治療マウスの肺では観察されなかった（図１５）。しかし、製剤Ａ群のマウスでは、ＧＦＰ陽性細胞が細気管支の一部、特に気管支上皮に認められた（図１５）。これらの結果は、薬理学的に動員されたＣＤ１３３幹細胞およびその子孫が気管支上皮再生の主な寄与者であることを示唆している。気道上皮細胞は、ＣＯＶＩＤ－１９患者が感染する最も初期の細胞タイプの一つであり、免疫介在上皮損傷は、ＣＯＶＩＤ－１９の重症度と相関する（９）。損傷した気管支上皮細胞を薬理学的に動員されたＣＤ１３３幹細胞で修復および／または置換すると、回復が改善され、慢性肺機能不全が予防される可能性がある。

【0094】

マウスにおける製剤Ａの治療は、急性肺損傷およびストレプトコッカス・ニューモニエの気管内投与によって誘発されたＡＲＤＳ後の死亡率を７５％（７％対２８．２％）有意に低下させ、生存率を改善した（９３％対７１．８％）。これらのデータを総合すると、製剤Ａによる治療により臓器組織の損傷が軽減され、ＡＲＤＳに罹患しているストレプトコッカス・ニューモニエ感染マウスの生存率が向上したことが実証された。薬理学的に動員された幹細胞および活性化されたＭ２表現型マクロファージは、炎症性免疫反応およびサイトカインストームを改善するだけでなく、肺の修復／再生を促進する可能性がある。

【0095】

実施例９：関節炎に対する免疫調節および再生療法としての製剤Ａ
関節炎は、一つまたは複数の関節の腫脹および圧痛であり、通常、関節の炎症または変性（破壊）を伴う。関節炎は、米国における障害の最も一般的な原因であり、約５，０００万人の成および３０万人の小児が何らかの関節炎に苦しんでいる。

【0096】

図１６は、製剤Ａの治療がコラーゲン誘発性関節炎ラットにおける関節炎の臨床徴候を寛解させたことを実証している。ＭＲＧ－００１が関節の炎症を改善できるかどうかを試験するために、ラットのコラーゲン誘発性関節炎モデルが開発された。コラーゲン誘発性関節炎（ＣＩＡ）は、複数の遺伝的および環境的要因によって制御される自己免疫介在性関節炎の複雑なモデルである。ＣＩＡは、天然のＩＩ型コラーゲンによる免疫によってラットに誘導され、関節リウマチと同様の関節の病変（ｊｏｉｎｔ ｐａｔｈｏｌｏｇｙ）を発症する。

【0097】

１２～１５週齢のメスのＤＡラットを、ラテックスフリーの１ｍｌシリンジおよび２７ゲージを使用して、尾の付け根の３つの部位に皮内注射（０日目）によってＩＩ型コラーゲン／不完全フロイントアジュバントで免疫化し、免疫応答を高めるために１２日目にリポ多糖類（ＬＰＳ、３ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内注射により投与した。次の５日間で動物は関節炎を発症した。関節炎に罹患しているラットは、２０日目にランダムに２つの実験群に分けられ、２０日間、１日おきに生理食塩水または製剤Ａの皮下注射を受けた。

【0098】

免疫化により、後足のびらん性関節炎が誘発された。ＣＩＡの肉眼的証拠は、最初の注射後１７～２０日目までに後足の関節周囲の紅斑および浮腫として初めて現れ、２４日目までに発生率１００％となった。生理食塩水を投与したラットでは、３６日目まで後足の紅斑および浮腫が残存した。対照的に、関節炎の発症時（２０日目）から開始した製剤Ａによる治療は、２４～３６日目に臨床徴候を寛解させ、後足の活動を改善した。したがって、この研究は、製剤Ａを使用して患者の関節炎を治療または寛解させられることを実証している。

【0099】

本開示を特定の実施形態に関して論じてきたが、本開示がそれに限定されないことを理解されたい。実施形態は本明細書では例として説明されており、依然として本開示の範囲内にある使用可能な多数の改変、変形、および他の実施形態が存在する。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4-1】

【図4-2】

【図5-1】

【図5-2】

【図5-3】

【図6-1】

【図6-2】

【図7-1】

【図7-2】

【図8-1】

【図8-2】

【図9-1】

【図9-2】

【図10】

【図11-1】

【図11-2】

【図12-1】

【図12-2】

【図12-3】

【図13-1】

【図13-2】

【図14-1】

【図14-2】

【図15】

【図16】

【国際調査報告】