特表 2023-550077 安定した合成フィターゼバリアント

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-11-30

(54)【発明の名称】安定した合成フィターゼバリアント

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/55 20060101AFI20231122BHJP

   C12N 9/16 20060101ALI20231122BHJP

   C12N 15/31 20060101ALI20231122BHJP

   C12N 15/62 20060101ALI20231122BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20231122BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20231122BHJP

   C07K 14/195 20060101ALI20231122BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20231122BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20231122BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20231122BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20231122BHJP

   C12P 21/02 20060101ALI20231122BHJP

   C12Q 1/42 20060101ALI20231122BHJP

   A23K 20/189 20160101ALI20231122BHJP

【ＦＩ】

C12N15/55

C12N9/16 B ZNA

C12N15/31

C12N15/62 Z

C12N15/63 Z

C07K19/00

C07K14/195

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

C12P21/02 C

C12Q1/42

A23K20/189

【審査請求】未請求

【予備審査請求】有

(21)【出願番号】P 2023528946

(86)(22)【出願日】2021-11-17

(85)【翻訳文提出日】2023-07-06

(86)【国際出願番号】 EP2021082016

(87)【国際公開番号】W WO2022106483

(87)【国際公開日】2022-05-27

(31)【優先権主張番号】20208205.3

(32)【優先日】2020-11-17

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＲＩＴＯＮ

(71)【出願人】

【識別番号】519225657

【氏名又は名称】イーダブル ニュートリション ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング

(74)【代理人】

【識別番号】110000109

【氏名又は名称】弁理士法人特許事務所サイクス

(72)【発明者】

【氏名】ミヒェルス アンドレアス

(72)【発明者】

【氏名】シャイディク アンドレアス

(72)【発明者】

【氏名】ホルン トーマス

(72)【発明者】

【氏名】メッテン アレクサンダー

【テーマコード（参考）】

2B150

4B063

4B064

4B065

4H045

【Ｆターム（参考）】

2B150AA03

2B150AA05

2B150AB01

2B150DF09

4B063QA20

4B063QQ13

4B063QQ33

4B063QR13

4B063QR80

4B063QS36

4B063QS38

4B063QX01

4B064AG01

4B064CA19

4B064CC24

4B064DA11

4B065AA01X

4B065AA01Y

4B065AA57X

4B065AA72X

4B065AA87X

4B065AB01

4B065AC14

4B065AC20

4B065BA02

4B065CA31

4B065CA43

4H045AA10

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA10

4H045BA41

4H045CA11

4H045DA89

4H045EA50

4H045EA60

4H045FA74

(57)【要約】

本発明は、オベサムバクテリウム属および／またはハフニア属の少なくとも２つの参照フィターゼのバイオブリックを含むシャッフリング生成物である合成フィターゼに関する（図１）。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

オベサムバクテリウム属および／またはハフニア属の少なくとも２つの参照フィターゼのバイオブリックを含むシャッフリング生成物である合成フィターゼ。

【請求項2】

少なくとも１つの参照フィターゼが、ハフニア・アルベイおよび／またはオベサムバクテリウム・プロテウスの野生型フィターゼであるか、または野生型フィターゼに由来する、請求項１に記載の合成フィターゼ。

【請求項3】

少なくとも１つの参照フィターゼが、以下の少なくとも１つを含む、請求項１または２に記載の合成フィターゼ。
ａ） 配列番号１または２に記載のアミノ酸配列（「野生型フィターゼ」）
ｂ） 選択肢ａ）に記載のアミノ酸配列であって、但し、そのフィターゼ活性を維持しながら、ａ）で規定されるそれぞれの 配列番号に対して少なくとも１個のアミノ酸置換を有する、アミノ酸配列
ｃ） 選択肢ａ）に記載のアミノ酸配列であって、但し、そのフィターゼ活性を維持しながら、ａ）で規定されるそれぞれの配列番号に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する、アミノ酸配列。

【請求項4】

Ｎ－＞Ｃ方向に示される以下のシャッフリング構造のいずれかを有する、前記請求項のいずれか１項に記載の合成フィターゼ：
Ｏ／Ｈ／Ｏ
Ｈ／Ｈ／Ｏ、および／または
Ｏ／Ｈ／Ｈ
ここで、Ｏはオベサムバクテリウム属参照フィターゼからのバイオブリックを表し、Ｈはハフニア属参照フィターゼからのバイオブリックを表す。

【請求項5】

以下のうちの１つを含む、前記請求項のいずれか１項に記載の合成フィターゼ。
ａ） 配列番号３～５のいずれか１つに記載のアミノ酸配列（「シャッフル配列）
ｂ） 選択肢ａ）に記載のアミノ酸配列であって、但し、そのフィターゼ活性を維持しながら、ａ）で規定されるそれぞれの配列番号に対して少なくとも１個のアミノ酸置換を有する、アミノ酸配列
ｃ） 選択肢ａ）に記載のアミノ酸配列であって、但し、そのフィターゼ活性を維持しながら、その配列がａ）で規定されるそれぞれの配列番号に対して８０％以上の配列同一性を有する、アミノ酸配列。

【請求項6】

前記請求項のいずれか１項に記載の合成フィターゼであって、このフィターゼは、参照フィターゼの１つと比較して増加した安定性を有する、合成フィターゼ。

【請求項7】

前記増加した安定性が、参照フィターゼの１つと比較して増加した耐熱性（ＩＴ₅₀）である、請求項６に記載の合成フィターゼ。

【請求項8】

ＩＴ₅₀が６０℃以上１００℃以下である、請求項７に記載の合成フィターゼ。

【請求項9】

前記増加した安定性が、参照フィターゼの１つと比較してプロテアーゼ消化に対する増加した安定性である、請求項６に記載の合成フィターゼ。

【請求項10】

前記増加した安定性が、参照フィターゼの１つと比較して増加したｐＨ安定性である、請求項７に記載の合成フィターゼ。

【請求項11】

前記請求項のいずれか１項に記載の合成フィターゼをコードする核酸分子。

【請求項12】

請求項１１に記載の核酸分子を含むプラスミドまたはベクター系。

【請求項13】

異種タンパク質発現が可能な宿主細胞であって、前記宿主細胞は、請求項１２に記載のプラスミドもしくはベクター系、または請求項１１に記載の核酸分子を含む宿主細胞。

【請求項14】

請求項１～１０のいずれか１項に記載の合成フィターゼを含む、飼料添加物、飼料原料、飼料サプリメント、および／または飼料。

【請求項15】

飼料の製造のための請求項１～１０のいずれか１項に記載の合成フィターゼの使用。

【請求項16】

請求項１～１０のいずれか１項に記載の合成フィターゼを開発する方法であって、該方法は
ａ） オベサムバクテリウム属および／またはハフニア属由来の少なくとも２つの参照フィターゼをコードする２つ以上のＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡまたはｍＲＮＡ配列を提供すること、
ｂ） ２つ以上のＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡまたはｍＲＮＡ配列をＩＩ型制限酵素で消化し、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡまたはｍＲＮＡストレッチを作成すること、
ｃ） シャッフルされたフィターゼ酵素をコードする少なくとも１つのシャッフルされたＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡまたはｍＲＮＡ配列を作成するように、リガーゼ酵素を用いてＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡまたはｍＲＮＡサブストレッチをライゲーションすること、および
ｄ） 任意選択で、前記シャッフルされたＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡまたはｍＲＮＡ配列を適切な発現系で発現させること
を含む方法。

【請求項17】

以下をさらに含む、請求項１６に記載の方法。
ｅ） 請求項１～１０のいずれか１項に記載のシャッフルされたフィターゼ酵素をコードするＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡまたはｍＲＮＡ配列を変異させて、１つ以上の変異フィターゼ配列を得ること、
ｆ） このようにして得られた１種以上の変異フィターゼ配列を、適切な発現系で発現させて、１種以上の変異フィターゼ酵素を得ること、および
ｇ） １種以上の変異フィターゼ酵素配列の安定性、好ましくは耐熱性を試験すること。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明はフィターゼの分野に関する。

【背景技術】

【0002】

フィターゼ（ｍｙｏ－イノシトール六リン酸ホスホヒドロラーゼ）は、フィチン酸（ｍｙｏ－イノシトール六リン酸）の加水分解を触媒するホスファターゼ酵素で、使用可能な形態の無機リンを放出する。フィチン酸は穀物や油糧種子に含まれる難消化性の有機リンである。フィターゼは動物、植物、菌類、バクテリアに存在することが発見されている。飼料用途に使用されるフィターゼは、当初は真菌由来であったが、今日では細菌性酵素が主流となっている。フィターゼは、酸性またはアルカリ性フィターゼとしてのｐＨ活性至適値、ヒスチジン酸、システインもしくは紫酸性ホスファターゼ、またはβ－プロペラフィターゼとしての触媒機構および酵素フォールド、あるいは３－または６－フィターゼとしてのフィチン酸分解の立体選択性に基づいてグループ分けすることができる。ＥＣデータベースは、３．１．３．８と３．１．３．２６という２つのクラスを定義することで、この立体選択性を考慮している。この２つのクラスは商業的に使用されている。グループ３．１．３．７２（ＰＴＰ様フィターゼ）および３．１．３．２（紫酸性ホスファターゼ）に属するフィターゼは希少で、商業的に利用されていない。

【0003】

フィチン酸とその代謝産物は種子や穀物においていくつかの重要な役割を担っており、特にフィチン酸はリンの貯蔵、エネルギーの貯蔵、陽イオンの供給源、ｍｙｏイノシトール（細胞壁の前駆体）の供給源として機能している。フィチン酸は植物種子に含まれるリンの主要な貯蔵形態であり、集約的な家畜飼育で使用される穀物ベースの飼料に含まれるリンの主な供給源である。フィチン酸に含まれる有機リン酸は、それを摂取する動物にはほとんど利用できないが、フィターゼが放出する無機リン酸は容易に吸収される。反芻動物がフィチン酸をリン源として利用できるのは、腸内に生息する細菌が多くの種類のフィターゼを産生することがよく知られているからである。

【0004】

しかし、単胃動物は、胃腸微生物叢が産生するフィターゼが十分でないため、フィチン酸を主要なリン源として利用できず、糞便中に排泄される。

【0005】

反芻動物（牛、羊）では、腸内細菌によってフィターゼが産生され、穀物に含まれるフィチン酸をリン源として利用することができる。人間、犬、鳥などの非反芻動物（単胃動物）はフィターゼを生成しない。動物栄養学分野の研究では、カルシウム、リン、その他のミネラル、炭水化物、タンパク質など、フィチン酸で結合した栄養素を動物が利用できるようにするため、飼料にフィターゼを添加するという考えが提唱されている。

【0006】

フィターゼは、フィチン酸（ｍｙｏ－イノシトール六リン酸）から無機リン酸を遊離させることにより、植物原料の栄養価を高めるために、家禽や豚の飼料添加物として使用されることが多い。フィターゼは遺伝子組み換え微生物から精製することができ、最近では遺伝子組み換えの菜種、アルファルファ、イネ植物で生産されている。フィターゼは、遺伝子組み換え（ＧＭ）酵母を用いたセルロース系バイオマス発酵によって大規模に生産することもできる。

【0007】

多くの用途において、酵素の安定性の向上は重要な利点である。フィターゼは製造過程で熱処理を受けることが多いため、耐熱性の向上はフィターゼの加工性を高めるのに役立つ。

【0008】

これは特に、動物飼料におけるフィターゼの使用に当てはまる。飼料の加工中、飼料はしばしば熱に供される。例えば蒸気の適用により、病原体を減少または除去し、飼料の貯蔵寿命を延ばし、飼料転換率の改善につながる成分の利用を最適化するためである。調整時間は、飼料の種類や配合によって数秒から数分まで変化する。調整中の温度は通常７０℃から１００℃の範囲である。調整後、飼料はペレット化金型を通して押し出されることもあるが、この場合、摩擦による放熱のため、短時間で飼料の温度が段階的に上昇する。

【0009】

しかし他の用途では、フィターゼ酵素は熱にもさらされる。フィターゼはタンパク質なので、熱や圧力で変性しやすい。変性は本質的に酵素の構造を変化させ、その結果、活性レベルが低下し、酵素の効力が低下する。

【0010】

フィターゼの安定性を向上させたり、熱影響からフィターゼを保護したりするには、さまざまな方法がある。動物飼料の用途では、ペレット後の液体散布が一つの選択肢であるが、専用の装置の購入と設置、液体酵素を保管するスペース、散布する酵素量の慎重な計算が必要なため、比較的複雑で高価である。

【0011】

もう一つの選択肢は、合成フィターゼを他の成分（飼料など）と一緒にペレット化する前に、保護コーティングを施すことである。この方法は、例えばＰａｒｔｒｉｄｇｅ（２００７）に記載されているが、コーティングが動物の消化管などで完全に溶解しない可能性があるため、酵素の効力が低下する可能性がある。さらに、ペレット化工程の高熱と水分含量に耐え、その後、より低温で高水分の条件、例えば動物の腸内で溶解するようなコーティング設計を実現するのは困難である。

【0012】

もう一つの選択肢は、本質的に耐熱性のフィターゼを使用することである。これらのフィターゼは、理論的には好熱菌や超好熱菌に由来し、高い耐熱性というユニークな構造と機能を持つ。しかし、これらのフィターゼは、活性、特異性、生物学的利用能、ｐＨ範囲、加工性などが最適でないなどの制限を受けることがある。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0013】

従って、本発明の一つの目的は、上述した制限を受けない安定なフィターゼ変異体を提供することである。

【0014】

これらおよび他の目的は、本発明の独立した請求項に記載の方法および手段によって達成される。従属請求項は、具体的な実施形態に関連する。

【図面の簡単な説明】

【0015】

【図1】フィチン酸の構造

【図2】フィターゼが触媒する反応のスキーム

【図3】本発明によるいくつかの合成（シャッフル）フィターゼ酵素とそれぞれの野生型（参照）フィターゼの特性を示す概略図。それぞれの実験説明については、実施例２～５を参照のこと。本発明の一実施態様では、耐熱性がプロテアーゼ安定性やｐＨ安定性よりも優先される場合がある。このことは、所定のシャッフリング生成物において、ＩＴ５０の大幅な増加が達成される場合、プロテアーゼ安定性またはｐＨ安定性のわずかな損失は許容されうることを意味する（例えば、－１０％または－２０％の損失）。例えば、ＯＨＯは優れた耐熱性（ＩＴ５０）を持つが、ペプシン消化に対する耐性はわずかに低下している。

【図4】シャッフリングプロセスとそれに続く突然変異誘発の２つのスキーム

【図5】Ｈａｆｎｉａ ａｌｖｅｉ（ハフニア・アルベイ）（配列番号１）とＯｂｅｓｕｍｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｒｏｔｅｕｓ（オベサムバクテリウム・プロテウス）（配列番号２）のフィターゼのアミノ酸配列のアラインメント。配列同一性７３．８％を示す。 オベサムバクテリウム・プロテウスの他にも、ハフニア・アルベイのフィターゼと進化的に近い細菌性フィターゼがあり、同一性の範囲内にある。これら類似のフィターゼは腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）に属し、ブチアウセラ属（Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ）の細菌と大腸菌種の細菌を含む。これらの進化的に近いフィターゼのうち、オベサムバクテリウム・プロテウスのフィターゼは、ハフニア・アルベイのフィターゼとのシャッフリングプロセスのために特別に選択された。

【図6】ハフニア・アルベイのフィターゼ（配列番号１）とシャッフリング生成物ＯＨＯ（配列番号３）のアミノ酸配列のアラインメント。下線を引いたアミノ酸はオベサムバクテリウム・プロテウス（Ｏｂｅｓｕｍｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｒｏｔｅｕｓ）由来のバイオブリックを、太字のアミノ酸はハフニア・アルベイ（Ｈａｆｎｉａ ａｌｖｅｉ）由来のバイオブリックを示す。

【図7】図３に実験結果をグラフで示す。

【発明を実施するための形態】

【0016】

本発明を詳細に説明する前に、本発明は、記載された装置や組成物の特定の構成部分や構造的特徴、または記載された方法の方法工程に限定されるものではなく、そのような装置や方法は変化し得ることを理解されたい。また、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態のみを記載する目的のためであり、限定することを意図したものではないことも理解されたい。特定の手段が相互に異なる従属請求項に列挙されているという単なる事実は、これらの手段の組合せを使用して利益を得ることができないことを示すものではない。特許請求の範囲のどの引用符号も、範囲を限定すると解釈するべきではない。明細書および添付の請求項において使用されるように、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は文脈が明確に別途指示しない限り、単数形および／または複数形の参照を含むことに留意されたい。さらに、特許請求の範囲において、「含む」という語は、他の要素やステップを排除するものではない。

【0017】

さらに、数値によって区切られるパラメータ範囲が与えられる場合、その範囲は、これらの限界値を含むものとみなされることを理解されたい。

【0018】

さらに、本明細書に開示される実施形態は、互いに関連しない個々の実施形態として理解されることを意味しないことを理解されたい。一実施形態で議論される特徴は、本明細書に示される他の実施形態に関連しても開示されることを意味する。１つの場合において、特定の特徴が１つの実施形態で開示されず、別の実施形態で開示される場合、当業者は、前記特徴が前記他の実施形態で開示されることを意味しないことを必ずしも意味しないことを理解するのであろう。当業者であれば、他の実施形態についても前記特徴を開示することが本出願の主旨であるが、単に明瞭にするため、及び本明細書を管理可能な量に維持するために、これが行われていないことを理解されよう。

【0019】

本発明の一態様によればオベサムバクテリウム属および／またはハフニア属の少なくとも２つの参照フィターゼのバイオブリックを含むシャッフリング生成物である合成フィターゼが提供される。

【0020】

本発明者らは、本明細書で開示する分子モデリングプロセスに基づいて、オベサムバクテリウム属およびハフニア属のフィターゼが、安定性が向上する可能性のある機能的シャッフリング構築物を得るための出発点（ドメイン構造、配列類似性など）として非常に有望であることを見出した。

【0021】

本明細書で使用する「バイオブリック」という用語は、特定の定義された機能を持つタンパク質をコードする、より大きなＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡまたはｍＲＮＡ配列の断片であるＤＮＡ配列からなる標準化された構築物に関する。「バイオブリック」は同じ切断部位を示すため、組み合わせが容易である。ここで、使用されるＤＮＡ配列はフィターゼ酵素をコードし、合成された「シャッフルされた」フィターゼ酵素をコードするＤＮＡを再び組み立てるためのビルディングブロックとして使用される。より正確には、それぞれのフィターゼ酵素をコードするオベサムバクテリウム属および／またはハフニア属のＤＮＡ配列がビルディングブロックとして使用され、合成「シャッフル」フィターゼ酵素に再構築される。

【0022】

「参照フィターゼ」という用語は、本明細書で使用される場合、方法の出発点として、そのようなバイオブリックの供給源として使用されるフィターゼ酵素をコードするＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡまたはｍＲＮＡ配列、またはそのコードされるフィターゼ酵素に関する。

【0023】

本明細書で使用する「シャッフリング生成物」とは、少なくとも２つの異なる参照フィターゼからの２つ以上のそのようなバイオブリックからなる酵素である。シャッフリング生成物では、参照フィターゼの特性を変更するために、異なる参照フィターゼのバイオブリックが特定の順序またはランダムな順序で再組み立てされている。

【0024】

一実施形態において、異なる参照フィターゼは、対応する機能、参照フィターゼにおける配向、および／または類似の長さのバイオブリックを得るために断片化された。

【0025】

例えば、参照フィターゼＡを断片化するとバイオブリック１、２、３が得られ、参照フィターゼＢを断片化すると対応するバイオブリック１’、２’、３’が得られる。

【0026】

バイオブリック１および１’、バイオブリック２および２’、バイオブリック３および３’は、それぞれ、対応する機能、参照フィターゼにおける配向、および／または類似の長さを有するので、「対応バイオブリック」と呼ばれる。

【0027】

一実施形態では、再組立時に、対応するバイオブリックの各セットのうち１つのメンバーが選択され、選択されたバイオブリックが、例えば１’－２－３、１－２’－３などのような参照フィターゼの１つにおける異なるバイオブリックの配向を再現するように組み合わされる。

【0028】

一実施形態では、このプロセス自体は、単なるシャッフリングプロセスで行われていることを超える「新しい」アミノ酸残基やアミノ酸置換を導入することはない。その結果、得られたシャッフリング生成物は、単なるシャッフリングプロセスで行われていることを超える「新しい」アミノ酸残基やアミノ酸置換を含んでいない。

【0029】

酵素シャッフリング法は、例えばＥｎｇｌｅｒら（２００９）に開示されており、その内容は参照により本明細書に援用される。

【0030】

オベサムバクテリウム属とハフニア属は、ともにグラム陰性菌であるエンテロバクター目ハフニア科の属である。

【0031】

一実施形態において、参照フィターゼは、オベサムバクテリウム属および／またはハフニア属の野生型フィターゼである。別の実施形態において、「参照フィターゼ」は、前記野生型フィターゼに由来する変異フィターゼ、例えば、フィターゼ活性を維持しながら、そのような野生型フィターゼと比較して少なくとも１個のアミノ酸置換を有するか、またはそのような野生型フィターゼと少なくとも８０％の配列同一性を有するバリアントである。

【0032】

好ましい実施形態において、変異フィターゼは、前記野生型フィターゼと、≧８１、≧８２、≧８３、≧８４、≧８５、≧８６、≧８７、≧８８、≧８９、≧９０、≧９１、≧９２、≧９３、≧９４、≧９５、≧９６、≧９７、≧９８、最も好ましくは≧９９％の配列同一性を有する。

【0033】

好ましい実施形態において、変異フィターゼは、前記野生型フィターゼと比較して、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２または８３のアミノ酸置換を有する。

【0034】

一実施形態によれば、少なくとも１つの参照フィターゼは、ハフニア・アルベイおよび／またはオベサムバクテリウム・プロテウスの野生型フィターゼであるか、または野生型フィターゼに由来する。

【0035】

由来」という用語は、フィターゼ活性を維持しながら、野生型フィターゼと比較して少なくとも１個のアミノ酸置換を有するか、またはそのような野生型フィターゼと少なくとも８０％の配列同一性を有する酵素バリアントに関する。

【0036】

好ましい実施形態において、酵素バリアントは、前記野生型フィターゼと≧８１、≧８２、≧８３、≧８４、≧８５、≧８６、≧８７、≧８８、≧８９、≧９０、≧９１、≧９２、≧９３、≧９４、≧９５、≧９６、≧９７、≧９８、最も好ましくは≧９９％の配列同一性を有する。

【0037】

好ましい実施形態において、酵素バリアントは、前記野生型フィターゼと比較して２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２または８３のアミノ酸置換を有する。

【0038】

一実施形態によれば、少なくとも１つの参照フィターゼは、以下の少なくとも１つを含む。
ａ） 配列番号１または２に記載のアミノ酸配列（「野生型フィターゼ」）
ｂ） 選択肢ａ）に記載のアミノ酸配列であって、但し、そのフィターゼ活性を維持しながら、ａ）で規定されるそれぞれの 配列番号に対して少なくとも１個のアミノ酸置換を有する、
ｃ） 選択肢ａ）に記載のアミノ酸配列であって、但し、そのフィターゼ活性を維持しながら、ａ）で規定されるそれぞれの配列番号に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する。

【0039】

好ましい実施形態において、酵素バリアントは、ａ）で規定されるそれぞれの配列番号に対して、≧８１、≧８２、≧８３、≧８４、≧８５、≧８６、≧８７、≧８８、≧８９、≧９０、≧９１、≧９２、≧９３、≧９４、≧９５、≧９６、≧９７、≧９８、最も好ましくは≧９９％の配列同一性を有する。

【0040】

好ましい実施形態において、酵素バリアントは、ａ）で規定されるそれぞれの配列番号に対して２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２または８３個のアミノ酸置換を有する。

【0041】

「配列同一性のパーセンテージ」は、比較窓上で２つの最適に並べられた配列を比較することによって決定され、ここで、比較窓におけるポリヌクレオチド配列の部分は、２つの配列の最適なアラインメントのために、付加または欠失を含まない参照配列（例えば、ポリペプチド）と比較して、付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。パーセンテージは、両配列において同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が生じる位置の数を決定して一致位置の数を得、一致位置の数を比較窓における位置の総数で除し、結果に１００を乗じて配列同一性のパーセンテージを得ることによって計算される。

【0042】

用語「同一」又は「同一性」パーセントは、２つ以上の核酸又はポリペプチド配列に関して、同じ配列である２つ以上の配列若しくはサブ配列を指す。 ２つの配列が、下記の配列比較アルゴリズムの１つを用いて、または手動アラインメントと目視検査によって測定された比較ウィンドウ、または指定領域にわたって最大対応となるように比較およびアラインメントしたときに、同じアミノ酸残基またはヌクレオチドが指定された割合（すなわち、指定領域にわたって少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性、または指定しない場合は、参照配列全体）であれば「実質同一」であるとする。

【0043】

配列の同一性を判断するのに適したアルゴリズムの一つに、ＢＬＡＳＴアルゴリズムがある。また、配列の同一性を判断するアルゴリズムとして、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａアルゴリズムがある。

【0044】

開示は、本明細書に例示される、それぞれポリペプチドまたはポリヌクレオチドと実質的に同一であるポリペプチドまたはポリヌクレオチドを提供する。場合により、同一性は、長さが少なくとも約１５、２５または５０ヌクレオチドである領域にわたって、またはより好ましくは長さが１００～５００または１０００またはそれ以上のヌクレオチドである領域にわたって、または参照配列の完全長にわたって存在する。アミノ酸配列に関して、同一性または実質的同一性は、長さが少なくとも５、１０、１５または２０アミノ酸、場合によっては長さが少なくとも約２５、３０、３５、４０、５０、７５または１００アミノ酸、場合によっては長さが少なくとも約１５０、２００または２５０アミノ酸、または参照配列の全長にわたる領域にわたって存在することができる。より短いアミノ酸配列、例えば２０以下のアミノ酸配列に関しては、本明細書で定義される保存的置換に従って、１または２個のアミノ酸残基が保存的に置換された場合、実質的な同一性が存在する。

【0045】

本発明の一以上の実施形態によれば、上記で議論された少なくとも１つのアミノ酸置換は、保存的アミノ酸置換である。

【0046】

「保存的アミノ酸置換」は、非保存的置換よりも酵素機能への影響が小さい。アミノ酸の分類にはいろいろな方法があるが、それらの構造とＲ基の全般的な化学的性質に基づいて、しばしば６つの主要な群に分類される。

【0047】

一実施形態では、「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基に置換されたものである。例えば、類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーが当技術分野で定義されている。これらのファミリーには、
塩基性側鎖（リジン、アルギニン、ヒスチジンなど）、
酸性側鎖（アスパラギン酸、グルタミン酸など）、
非荷電極性側鎖（グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システインなど）、
非極性側鎖（アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファンなど）、
β分岐側鎖（スレオニン、バリン、イソロイシンなど）、
芳香族側鎖（チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジンなど）を有するアミノ酸が含まれる。

【0048】

他の保存されたアミノ酸置換は、ペプチドの電荷を修飾するためにアスパラギンをアスパラギン酸に置換する場合のように、アミノ酸側鎖ファミリーを横切って起こることもできる。したがって、例えば、ＨＲドメインポリペプチド中の予測される非必須アミノ酸残基は、ファミリーを越えて同じ側鎖ファミリーまたはホモログ由来の別のアミノ酸残基（例えば、アスパラギン酸についてはアスパラギン、グルタミン酸についてはグルタミン）と置換されることが好ましい。保存的変化には、さらに、化学的に相同な非天然アミノ酸（すなわち、ロイシンの代わりに合成非天然疎水性アミノ酸、トリプトファンの代わりに合成非天然芳香族アミノ酸）の置換を含むことができる。

【0049】

本明細書において、「フィターゼ活性を維持する」という用語は、例えば、それぞれのバリアントが野生型フィターゼ配列のフィターゼ活性と比較して５０％以上のフィターゼ活性を有することを意味する。
一実施形態によれば、合成フィターゼは、Ｎ－＞Ｃ方向に示される以下のシャッフリング構造のいずれかを有する：
Ｏ／Ｈ／Ｏ
Ｈ／Ｈ／Ｏ、および／または
Ｏ／Ｈ／Ｈ
ここで、Ｏはオベサムバクテリウム属参照フィターゼからのバイオブリックを表し、Ｈはハフニア属参照フィターゼからのバイオブリックを表す。

【0050】

次の表は、望ましいビルディング・ブロックの長さの概要である：

【0051】

一実施形態によれば、合成フィターゼは以下のうちの１つを含む。
ａ） 配列番号３～５のいずれか１つに記載のアミノ酸配列（「シャッフル配列）
ｂ） 選択肢ａ）に記載のアミノ酸配列であって、但し、そのフィターゼ活性を維持しながら、ａ）で規定されるそれぞれの配列番号に対して少なくとも１個のアミノ酸置換を有する、
ｃ） 選択肢ａ）に記載のアミノ酸配列であって、但し、そのフィターゼ活性を維持しながら、その配列がａ）で規定されるそれぞれの配列番号に対して８０％以上の配列同一性を有する。

【0052】

上記の合成フィターゼは、オベサムバクテリウム属参照フィターゼとハフニア属参照フィターゼのバイオブリックを含むシャッフリング生成物である。驚くべきことに、合成されたフィターゼは、参照フィターゼに比べて耐熱性（ＩＴ₅₀）が向上していた。ハフニア属参照フィターゼのＩＴ₅₀値は約６３℃であり、オベサムバクテリウム属参照フィターゼのＩＴ₅₀値は約６０℃であるが、３つのシャッフリング生成物はいずれもハフニア属参照フィターゼの耐熱性を上回り、ＩＴ ₅₀値の平均値を示さなかった。

【0053】

好ましい実施形態において、酵素バリアントは、ａ）で規定されるそれぞれの配列番号に対して、≧８１、≧８２、≧８３、≧８４、≧８５、≧８６、≧８７、≧８８、≧８９、≧９０、≧９１、≧９２、≧９３、≧９４、≧９５、≧９６、≧９７、≧９８、最も好ましくは≧９９％の配列同一性を有する。

【0054】

好ましい実施形態において、酵素バリアントは、ａ）で規定されるそれぞれの配列番号に対して２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２または８３個のアミノ酸置換を有する。

【0055】

本発明の一以上の実施形態によれば、上記で議論された少なくとも１つのアミノ酸置換は、保存的アミノ酸置換である。

【0056】

一実施形態によれば、合成フィターゼは、参照フィターゼの１つと比較して安定性が向上している。

【0057】

一実施形態によれば、前記増加した安定性は、参照フィターゼの１つと比較して増加した耐熱性（ＩＴ₅₀）である。
なお、参照フィターゼのＩＴ５０は以下の通りである：

【0058】

本明細書で使用する「耐熱性」という用語は、酵素が標準的な条件下で野生型と比較して同等以上の活性を有する能力、および高温に曝された後に活性を保持する能力の増大を指す。

【0059】

一実施形態によれば、合成フィターゼは６０℃以上のＩＴ₅₀を有する。さらなる実施形態によれば、合成フィターゼは、≧６５℃、≧７０℃、≧７５℃、≧８０℃、または≧８５℃のＩＴ₅₀を有する。

【0060】

一実施形態によれば、合成フィターゼは１１０℃以下のＩＴ₅₀を有する。さらなる実施形態によれば、合成フィターゼは、≦１０５℃；≦１００℃；または≦９８℃のＩＴ₅₀を有する。

【0061】

一実施形態によれば、合成フィターゼは、６０℃以上１１０℃以下のＩＴ₅₀を有する。さらなる実施形態によれば、合成フィターゼは、≧６５℃と≦１０５℃との間、≧７０℃と≦１００℃との間、≧７５℃と≦９８℃との間、≧８０℃と≦９８℃との間、または≧８５℃と≦９８℃との間のＩＴ₅₀を有する。

【0062】

一実施形態によれば、前記増加した安定性は、参照フィターゼの１つと比較して、プロテアーゼ消化に対する増加した安定性（「プロテアーゼ耐性」とも呼ばれる）である。

【0063】

プロテアーゼ消化に対する安定性は、プロテアーゼＫ１（クマモリシンＡＳ１、ＷＯ２０１７２２０７７６Ａ１に記載）への暴露により測定できる。フィターゼはしばしばプロテアーゼと組み合わされ、特定の目的に使用されるため、このような安定性は非常に重要である。したがって、プロテアーゼが、同時に添加されたフィターゼを不活性化、あるいは消化する危険性がある。

【0064】

加えて、あるいは別の方法として、プロテアーゼ消化に対する安定性は、プロテアーゼであるペプシンへの暴露によって測定することができる。飼料に使用する場合、フィターゼはペプシンが存在し活性のある胃環境で生き残り、活性を維持しなければならないため、このような安定性は非常に重要である。したがって、プロテアーゼが、同時に添加されたフィターゼを不活性化、あるいは消化する危険性がある。

【0065】

酵素の最適化プロセスの結果、あるパラメーターの最適化が他のパラメーターに影響を与えることがある。例えば、耐熱性を高めると同時に、プロテアーゼの安定性やｐＨ安定性を高めたり、下げたりすることができる。

【0066】

動物飼料用フィターゼの場合、一実施形態では、プロテアーゼ安定性やｐＨ安定性よりも耐熱性が優先されることがある。このことは、所定のシャッフリング生成物において、ＩＴ５０の大幅な増加が達成される場合、プロテアーゼ安定性またはｐＨ安定性のわずかな損失は許容されうることを意味する（例えば、－１０％または－２０％の損失）。

【0067】

一実施形態によれば、前記増加した安定性は、参照フィターゼの１つと比較して増加したｐＨ安定性（「ｐＨ耐性」とも呼ばれる）である。

【0068】

本明細書で使用する「ｐＨ安定性」という用語は、酵素が標準的な条件下で野生型と比較して同等以上の活性を有し、酸性条件下（例えば、ｐＨ４．０以下）に曝された後に活性を保持する能力が増大することを意味する。

【0069】

本発明の他の一態様によれば、上記の説明による合成フィターゼをコードする核酸分子が提供される。

【0070】

一つの実施形態において、このような核酸分子は、真核宿主、好ましくは酵母および真菌の群からの発現、最も好ましくはピキア・パストリス、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐ．およびＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｓｐ．における発現のためにコドン最適化される。

【0071】

コドン最適化は、異種タンパク質発現を向上させる有用な技術である。実際、宿主細胞のゲノム配列とネイティブな異種タンパク質コード配列のコドン用法には大きな違いがあり、これは組換えタンパク質の発現に明らかに影響する。宿主細胞のコドンの偏りに基づいて異種タンパク質コード配列を最適化することで、標的タンパク質の生産量が平均１～５倍に増加することが多いという報告もある。

【0072】

コドン最適化は生物種特異的なプロセスであり、当業者はそれぞれの文献から、与えられた発現宿主に適したコドン最適化スキームを導き出すことができる。それぞれの教示は、例えば、Ｙｕ ｅｔ ａｌ（２０１３）、Ｒｏｓｅｍａｒｙ ｅｔ ａｌ（２０１７）、およびＹａｎｇ ａｎｄ Ｌｉｕ（２０１０）に提供されており、これらの内容は、有効化の目的で参照により本明細書に組み込まれる。

【0073】

本発明の他の一態様によれば、核酸分子を含むプラスミドまたはベクター系が提供される。

【0074】

本発明の他の１つの態様によれば、異種タンパク質発現が可能な宿主細胞が提供され、前記宿主細胞は、上記の説明による核酸分子を含むプラスミドまたはベクター系を含む。

【0075】

本発明のさらに他の１つの態様によれば、異種タンパク質発現は、前記核酸分子を前記宿主細胞のゲノムに挿入することによって達成される。ゲノム挿入は、相同組換えに基づく最先端の技術や、プログラム可能なヌクレアーゼ、例えばＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ、Ｚｎ－フィンガー、ＴＡＬエンドヌクレアーゼを用いたゲノム編集を用いて達成される。

【0076】

異なる実施形態では、このような宿主細胞は、細菌細胞、真菌細胞または酵母細胞から選択される少なくとも１つである。

【0077】

例示的な細菌細胞としては、大腸菌および他の腸内細菌科細菌、エシェリヒア属、カンピロバクター属、ウォリネーラ属（Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ）、デスルフォビブリオ属、ビブリオ属、シュードモナス属、バチルス属、バクテロイデス属、リステリア属、ブドウ球菌属、連鎖球菌属、ペプトストレプトコッカス属、メガスファエラ属、ペクチナタス属、セレノモナス属、ザイモフィラス属、アクチノマイセス属、アルスロバクター属、フランキア属、ミクロモノスポラ属、ノカルジア属、プロピオニバクテリウム属、ストレプトマイセス属、ラクトバチルス属、ラクトコッカス属、ロイコノストック属、ペディオコッカス属、アセトバクテリウム属、アグロバクテリウム属、アリビブリオ属、ユーバクテリウム属、ハロアルクラ属、ハロバクテリウム属、ヘリオバクテリウム属、ヘリオスピリラム属、スポロムサ属、スピロプラズマ属、ウレアプラズマ属、うどんこ病属（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ）、コリネバクテリウム属、腸球菌属、クロストリジウム属、マイコプラズマ属、マイコバクテリウム属、アクチノバクテリア属、サルモネラ属、赤痢菌属、モラクセラ属、ヘリコバクター属、パラコクシジオイデス属、ステノトロフォモナス属、ミクロコッカス属、ナイセリア属、ブデロビブリオ属、ヘモフィルス属、サーマス属、クレブシエラ属、プロテウス属、エンテロバクター属、セラチア属、シトロバクター属 、シュードモナス属、プロテウス属、ロドバクター属、ロドシュードモナス属、ロドスピリラム属、セラチア属、エルシニア属、アシネトバクター属、アクチノバチルス属ボルデテラ属、ブルセラ属、カプノサイトファーガ属、カルディオバクテリウム属、エイケネラ属、フランシセラ属、ヘモフィルス属、キンゲラ属、パスツレラ属、フラボバクテリウム属、キサントモナス属、バークホルデリア属、アエロモナス属、プレシオモナス属、レジオネラ属、ウォルバキア属菌などのα－プロテオバクテリア、コマモナス属、ピロバキュラム属、シノリゾビウム属、シアノバクテリア、スピロヘータ、緑色硫黄細菌、緑色非硫黄細菌、グラム陰性球菌、グラム陰性桿菌の種を挙げることができる。好ましい実施形態では、細菌細胞は枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）である。

【0078】

例示的な真菌または酵母細胞にはピキア属、アスペルギルス属、クルイベロマイセス属、サッカロマイセス属、カンジダ属、トリコデルマ属、ペニシリウム属、ニューロスポラ属、クリソスポリウム属、クラドスポリウム属、フィトフトラ属、Ｓｃｙｔａｌｉｄｉｕｍ属の種が含まれ、より好ましくは、サッカロマイセス・セレビシエピキア・パストリス、アスペルギルス・ニデュランス、アスペルギルス・ニガー 、トリコデルマ・リーゼイ、クルイベロマイセス・ラクティス、クルイベロマイセス・マルシアヌス、および ニューロスポラ・クラッサを含む。

【0079】

好ましい実施形態では、酵母細胞はピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）である。このメタノール資化性酵母は、組換えタンパク質発現のための真核生物生産宿主として広く用いられており、コマガタエラ・ファフィイ（Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ ｐｈａｆｆｉｉ）としても知られている。

【0080】

さらなる実施形態において、そのような宿主細胞は、植物細胞、昆虫細胞または哺乳動物細胞からなる群から選択される真核宿主細胞である。

【0081】

本発明の他の一態様によれば、上記の説明による合成フィターゼを含む飼料添加物、飼料原料、飼料サプリメント、および／または飼料が提供される。

【0082】

本発明の他の一態様によれば、上記の説明による合成フィターゼの使用が、飼料の製造のために提供される。
本発明の他の１つの態様によれば、上記の説明による合成フィターゼを開発するプロセスが提供され、このプロセスは以下の工程を含む：
ａ） オベサムバクテリウム属および／またはハフニア属由来の少なくとも２つの参照フィターゼをコードする２つ以上のＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡまたはｍＲＮＡ配列を提供すること、
ｂ） ２つ以上のＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡまたはｍＲＮＡ配列をＩＩ型制限酵素によって消化し、工程ａ）のＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡまたはｍＲＮＡ配列の断片であるＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡまたはｍＲＮＡストレッチを作成すること、
ｃ） シャッフルされたフィターゼ酵素をコードする少なくとも１つのシャッフルされたＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡまたはｍＲＮＡ配列を作成するように、リガーゼ酵素を用いてＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡまたはｍＲＮＡサブストレッチをライゲーションすること、および
ｄ） 任意選択で、前記シャッフルされたＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡまたはｍＲＮＡ配列を適切な発現系で発現させること。

【0083】

一実施形態では、工程ｂ）～ｃ）を２回以上繰り返す。

【0084】

ＩＩ型制限酵素は好ましくはＩＩＳ型制限酵素であり、好ましくはＢｓａＩ、ＢｓｍＢＩ、ＢｂｓＩである。ＥｃｏＲＩやＢａｍＨＩのような標準的なＩＩ型制限酵素とは異なり、これらの酵素は認識部位の外側でＤＮＡを切断するため、パリンドロームでないオーバーハングを作ることができる。２５６のオーバーハング配列が可能であるため、オーバーハング配列の組み合わせによって複数のＤＮＡ断片を組み立てることができる。

【0085】

リガーゼは好ましくはＴ４ ＤＮＡリガーゼである。

【0086】

制限工程ｂ）は好ましくは３５～４０℃（好ましくは３７℃）の温度で行われ、ライゲーション工程ｃ）は好ましくは１０～２０℃（好ましくは１６℃）の温度で行われる。

【0087】

一実施形態では、このプロセスはサーマルサイクラーで行われ、例えば３７℃（制限のため）と例えば１６℃（ライゲーションのため）の間で何度も振動するプロトコルで行われる。

【0088】

一実施形態によれば、プロセスはさらに以下の工程を含む。
ｅ） 上記の説明に従って、シャッフルされたフィターゼ酵素をコードするＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡまたはｍＲＮＡ配列を変異させて、１種以上の変異フィターゼ配列を得ること、
ｆ） このようにして得られた１種以上の変異フィターゼ配列を、適切な発現系で発現させて、１種以上の変異フィターゼ酵素を得ること、および
ｇ） １種以上の変異フィターゼ酵素配列の安定性、好ましくは耐熱性を試験すること。

【0089】

実験及び図面
本発明は図面および前記の説明において詳細に図示および説明されてきたが、そのような図示および説明は例示または例示的であり、限定的ではないと考えられるべきであり、本発明は開示された実施形態に限定されない。開示される実施形態に対する他の変形形態は、図面、開示、及び添付の特許請求の範囲の研究から、請求される発明を実施する際に当業者によって理解され、実施され得る。いかなる参照符号も、その範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。本明細書に開示される全てのアミノ酸配列は、Ｎ末端からＣ末端まで示される；本明細書に開示される全ての核酸配列は、５’－＞３’で示される。

【0090】

実施例１シャッフル酵素の半合理的ライブラリーの設計
３ＤＭシステム（Ｂｉｏ Ｐｒｏｄｉｃｔ， ＮｉｊｍｅｇｅｎＮＬ）を用いたヒスチジン酸フィターゼスーパーファミリーの多重構造に基づくアラインメントに基づき、同じタンパク質ファミリーに属し、異なる有益な形質を有するフィターゼをクラスタリングした。このフィターゼクラスターは、断片化の可能性のある部位について分析された。これらの断片化部位は、クラスターの全タンパク質で保存されているアミノ酸位置で、ヘリックスとβシートの外側にあり、プロリンまたはプロリンに近接した位置（３アミノ酸）に選ばれた。ライブラリーは、少なくとも２つのタンパク質から構成され、最終的には２つ以上の、バイオブリックと呼ばれる断片から構成される。

【0091】

この過程で、オベサムバクテリウム属とハフニア属のフィターゼが、安定性を高めた機能的なシャッフリング構築物を得るための最も有望な出発点（ドメイン構造、配列の類似性など）であることが判明した。

【0092】

バイオブリックは、配列特異的なオーバーハングを生成するＩＩｓ型制限部位を導入したＰＣＲによって生成される。これらのバイオブリックの組み換えは、構造要素の配列を維持し、バイオブリックにアミノ酸の変化や余分なアミノ酸を導入しない。この手順ではさらに、異なる親バックボーンからのバイオブリックが差別されたり優先的に統合されたりすることがないため、プロセスによってすべての可能な組み合わせが得られることが保証された。

【0093】

この方法は一般に、相同タンパク質同士の組み換えに使用できる。タンパク質の少なくとも１つは結晶構造が解明されているはずで、そこから相同タンパク質の構造を、構造に基づくアラインメントなどの相同性比較によって導き出すことができる。

【0094】

異なる細菌フィターゼの組み換えにおいて、３つのドメインが選択された。選択されたタンパク質ドメインの終端であるプロリンが、組換え部位として選択された。

【0095】

実施例２：フィターゼ活性測定

【0096】

サンプルは容積活性に応じて０．０１％ Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ－１００を含むｄｄＨ₂Ｏで希釈した。希釈したサンプルをＮｕｎｃ ３８４ ｗｅｌｌ ｃｌｅａｒ ｆｌａｔ ｂｏｔｔｏｍ ｐｌａｔｅで測定した。希釈サンプル１部にアッセイバッファー１部を加えて反応を開始し、サーモシェーカーで３７℃、３０分間インキュベートした。その後、等容量の停止液を加えて反応を停止させた。発色反応は、等容量の発色試薬溶液を加え、暗所２５℃で２０分間インキュベートすることで開始した。６５０ｎｍの吸光度を測定し、フィターゼによって遊離されたリン酸の量を、同じ条件で測定した無機リン酸標準曲線に対して評価した。

【0097】

実施例３： ＩＴ５０
ＩＴ５０は、以下に示す条件下で活性の５０％が不活化される温度を定義する。これと同等ではないが、ペレット化条件などの用途における熱安定性の指標となる。

【0098】

目的のフィターゼまたはフィターゼバリアントを産生する細菌株または真菌株の水中培養の上清を、熱インキュベーションバッファーで希釈した。５０μｌのアリコートをＰＣＲ装置で適切な温度勾配で１０分間インキュベートした。もう１つのアリコートは２５℃でインキュベートした。熱インキュベーション後、サンプルは２５℃に保たれ、実施例２で説明したフィターゼ活性測定法で残存活性を測定する。結果を表／図３および図７Ａに示す。

【0099】

実施例４：ｐＨ活性プロファイル

【0100】

目的のフィターゼまたはフィターゼバリアントを産生する細菌または真菌の沈降培養の上清を、希釈バッファーで容量活性に応じて希釈した。活性は、必要なｐＨにアッセイバッファーを変更した上で、実施例１に記載したアッセイに従って測定した。ｐＨ２．０から７．０までの周囲ｐＨで活性測定ができるように、上記の緩衝液のいずれかを８部加えて反応を開始した。反応を停止し、無機リン酸を実施例２に記載の方法で測定した。結果を表／図３に示す。

【0101】

実施例５：ｐＨ／ペプシン／Ｋ１の安定性
この手順により、酸性プロテアーゼに対する耐性に関する情報が、残存活性として得られる。試験した酸性プロテアーゼは、プロテアーゼファミリーＳ５３およびＧ１の酸性プロテアーゼの代表として、ペプシンおよび酸性プロテアーゼＫｕｍａｍｏｌｉｓｉｎ ＡＳ（Ｋ１；例えば欧州特許公開ＥＰ１６２０６３６７、ＥＰ１６１７６０４４参照、その内容は参照により本明細書に組み込まれる）である。

【0102】

目的のフィターゼまたはフィターゼバリアントを産生する細菌株または真菌株の水中培養の上清の１部を上記の緩衝液の１部で希釈し、酸性ｐＨ、酸性ｐＨとペプシン、または酸性ｐＨとプロテアーゼＫ１に対する安定性を試験した。アッセイは３７℃で３０分間インキュベートした。残留活性は、実施例２に記載したように、培養直後に測定する。結果を表／図３および図７Ａに示す。

【0103】

参照文献
本明細書で参照される先行技術文献の内容は、参照により援用される。これは、特に、標準的または通常方法を開示する先行技術文献を指す。その場合、参照による援用は、十分に実施可能な開示を可能にし、長い反復を避ける目的がある。

【0104】

配列表
下記の配列は、本出願の開示の一部を形成する。ＷＩＰＯ ＳＴ ２５互換性のある電子化配列表もまた、この出願と共に提供される。疑義を避けるため、以下の表中の配列と電子化配列表中の配列との間に齟齬が存在する場合、この表中の配列は正しいものとみなされるものとする。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4-1】

【図4-2】

【図5】

【図6】

【図7】

【配列表】

2023550077000001.app

【国際調査報告】