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特表2023-550083Ｔ細胞及びＢ細胞介在性障害、ならびにＴ細胞及びＢ細胞癌を治療するための抗ＣＤ６抗体複合体
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-11-30
(54)【発明の名称】Ｔ細胞及びＢ細胞介在性障害、ならびにＴ細胞及びＢ細胞癌を治療するための抗ＣＤ６抗体複合体
(51)【国際特許分類】
A61K 47/68 20170101AFI20231122BHJP
A61K 38/05 20060101ALI20231122BHJP
A61P 25/00 20060101ALI20231122BHJP
A61P 37/02 20060101ALI20231122BHJP
A61P 37/06 20060101ALI20231122BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20231122BHJP
A61P 19/02 20060101ALI20231122BHJP
A61P 17/02 20060101ALI20231122BHJP
A61P 3/10 20060101ALI20231122BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20231122BHJP
A61K 31/4745 20060101ALI20231122BHJP
A61K 31/337 20060101ALI20231122BHJP
A61K 31/565 20060101ALI20231122BHJP
A61K 31/7048 20060101ALI20231122BHJP
A61K 31/395 20060101ALI20231122BHJP
A61K 31/427 20060101ALI20231122BHJP
A61K 31/4741 20060101ALI20231122BHJP
A61K 31/475 20060101ALI20231122BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20231122BHJP
A61K 31/357 20060101ALI20231122BHJP
A61K 31/661 20060101ALI20231122BHJP
C12N 15/13 20060101ALN20231122BHJP
【ＦＩ】
A61K47/68
A61K38/05
A61P25/00
A61P37/02
A61P37/06
A61P29/00 101
A61P19/02
A61P17/02
A61P3/10
A61K39/395 N
A61K31/4745
A61K31/337
A61K31/565
A61K31/7048
A61K31/395
A61K31/427
A61K31/4741
A61K31/475
A61K45/00
A61K31/357
A61K31/661
C12N15/13 ZNA
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023529056
(86)(22)【出願日】2021-11-16
(85)【翻訳文提出日】2023-06-15
(86)【国際出願番号】 US2021059482
(87)【国際公開番号】W WO2022104247
(87)【国際公開日】2022-05-19
(31)【優先権主張番号】63/114,300
(32)【優先日】2020-11-16
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】595033056
【氏名又は名称】ザ クリーブランド クリニック ファウンデーション
【氏名又は名称原語表記】Ｔｈｅ Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ ＣｌｉｎｉｃＦｏｕｎｄａｔｉｏｎ
【住所又は居所原語表記】９５００ Ｅｕｃｌｉｄ Ａｖｅｎｕｅ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，Ｏｈｉｏ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ
(74)【代理人】
【識別番号】110000338
【氏名又は名称】弁理士法人 ＨＡＲＡＫＥＮＺＯ ＷＯＲＬＤ ＰＡＴＥＮＴ ＆ ＴＲＡＤＥＭＡＲＫ
(72)【発明者】
【氏名】リン，フェン
【テーマコード（参考）】
4C076
4C084
4C085
4C086
【Ｆターム（参考）】
4C076AA95
4C076EE59
4C076FF67
4C084AA02
4C084AA17
4C084BA01
4C084BA32
4C084CA59
4C084NA05
4C084NA06
4C084NA13
4C084ZA011
4C084ZA012
4C084ZA961
4C084ZA962
4C084ZB021
4C084ZB022
4C084ZB071
4C084ZB072
4C084ZB151
4C084ZB152
4C084ZC351
4C084ZC352
4C085AA14
4C085AA22
4C085AA25
4C085BB11
4C085EE01
4C085GG02
4C086AA01
4C086AA02
4C086BA02
4C086BC14
4C086CA01
4C086CB20
4C086CB22
4C086DA34
4C086EA11
4C086MA01
4C086MA04
4C086NA05
4C086NA06
4C086NA13
4C086ZA01
4C086ZA96
4C086ZB02
4C086ZB07
4C086ZB15
4C086ZC35
(57)【要約】
本明細書に提供するのは、抗ＣＤ６抗体（またはそのＣＤ６結合部分）及び有糸分裂阻害薬（例えば、モノメチルオーリスタチンＥ（ＭＭＡＥ））で構成される抗体薬物複合体（ＡＤＣ）により、Ｔ細胞介在性障害、Ｂ１細胞介在性障害、Ｔ細胞リンパ腫、またはＢ細胞リンパ腫を有する対象を治療するための組成物、システム、キット、及び方法である。ある特定の実施形態では、該ＡＤＣは、さらに、該抗体成分を該有糸分裂阻害薬成分に接続する切断可能なリンカー（例えば、プロテアーゼで切断可能なリンカー）を含む。いくつかの実施形態では、該対象は、自己免疫性ブドウ膜炎またはマントル細胞リンパ腫を有するヒトである。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
対象を治療する方法であって、障害を有する対象に対して、抗体薬物複合体（ＡＤＣ）を投与することを含む前記方法であり、前記障害が、Ｔ細胞介在性障害、Ｂ１細胞介在性障害、Ｔ細胞リンパ腫、またはＢ細胞リンパ腫であり、
前記ＡＤＣが、
ａ）抗ＣＤ６抗体、またはそのＣＤ６結合部分、及び
ｂ）有糸分裂阻害薬
を含む、前記方法。
【請求項2】
前記有糸分裂阻害薬が、モノメチルオーリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記有糸分裂阻害薬が、ビンクリスチン、エリブリン、パクリタキセル、タンパク質結合パクリタキセル、ドセタキセル、エストラムスチン、エトポシド、イクサベピロン、カバジタキセル、ビンクリスチンリポソーム、ビノレルビン、ビンクリスチン、パクリタキセル、エトポシド、ビンブラスチン、エトポシド、及びテニポシドからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
前記対象が、前記Ｔ細胞介在性障害を有し、前記Ｔ細胞介在性障害が、自己免疫性ブドウ膜炎を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項5】
前記対象が、前記Ｔ細胞介在性障害を有し、前記Ｔ細胞介在性障害が、関節リウマチ（ＲＡ）、１型糖尿病、多発性硬化症、移植片対宿主病、セリアック病、及びシェーグレン症候群からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項6】
前記ＡＤＣがさらに、切断可能なリンカーを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項7】
前記抗ＣＤ６抗体、またはそのＣＤ６結合部分が、表１から１つ以上のＣＤＲを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項8】
前記抗ＣＤ６抗体、またはそのＣＤ６結合部分が、図１８～２１及び３０に示される１つ以上の可変領域を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項9】
前記対象がヒトである、請求項１に記載の方法。
【請求項10】
前記ＡＤＣが、前記対象に対して、約０．１～２ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項11】
前記対象が、前記Ｂ細胞リンパ腫を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項12】
前記Ｂ細胞リンパ腫が、マントル細胞リンパ腫である、請求項１１に記載の方法。
【請求項13】
前記対象が、前記Ｔ細胞リンパ腫を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項14】
抗体薬物複合体（ＡＤＣ）を含む組成物であって、前記ＡＤＣが、ａ）抗ＣＤ６抗体、またはそのＣＤ６結合部分、及び
ｂ）有糸分裂阻害薬
を含む、前記組成物。
【請求項15】
前記有糸分裂阻害薬が、モノメチルオーリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）を含む、請求項１４に記載の組成物。
【請求項16】
前記有糸分裂阻害薬が、ビンクリスチン、エリブリン、パクリタキセル、タンパク質結合パクリタキセル、ドセタキセル、エストラムスチン、エトポシド、イクサベピロン、カバジタキセル、ビンクリスチンリポソーム、ビノレルビン、ビンクリスチン、パクリタキセル、エトポシド、ビンブラスチン、エトポシド、及びテニポシドからなる群から選択される、請求項１４に記載の組成物。
【請求項17】
前記ＡＤＣがさらに、切断可能なリンカーを含む、請求項１４に記載の組成物。
【請求項18】
前記抗ＣＤ６抗体、またはそのＣＤ６結合部分が、表１から１つ以上のＣＤＲを含む、請求項１４に記載の組成物。
【請求項19】
前記抗ＣＤ６抗体、またはそのＣＤ６結合部分が、図１８～２１及び３０に示される１つ以上の可変領域を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項20】
インビトロシステムであって、ａ）ｉ）抗ＣＤ６抗体、またはそのＣＤ６結合部分、及びｉｉ）有糸分裂阻害薬を含む、抗体薬物複合体（ＡＤＣ）、ならびに
ｂ）Ｔ細胞リンパ腫細胞、またはＢ細胞リンパ腫細胞
を含む、前記インビトロシステム。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【0001】
〔技術分野〕
本出願は、２０２０年１１月１６日に出願された米国仮出願第６３／１１４，３００号の優先権を主張するものであり、当該仮出願は、参照により全体として本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０２０年１１月１６日に出願された米国仮出願第６３／１１４，３００号の優先権を主張するものであり、当該仮出願は、参照により全体として本明細書に組み込まれる。
【0002】
配列表
２０２１年１１月１６日に作成され、２２，３２２バイトのファイルサイズを有する「３８９６８－６０１＿ＳＥＱＵＥＮＣＥ＿ＬＩＳＴＩＮＧ＿ＳＴ２５」と題する、本明細書とともに出願されたコンピュータ可読配列表のテキストは、参照により全体として本明細書に組み込まれる。
２０２１年１１月１６日に作成され、２２，３２２バイトのファイルサイズを有する「３８９６８－６０１＿ＳＥＱＵＥＮＣＥ＿ＬＩＳＴＩＮＧ＿ＳＴ２５」と題する、本明細書とともに出願されたコンピュータ可読配列表のテキストは、参照により全体として本明細書に組み込まれる。
【0003】
連邦政府の支援に関する記述
本発明は、国立衛生研究所により付与されたＥＹ０２５３７３及びＥＹ０３３２４３の下、政府の支援を受けて行われた。政府は、本発明においてある特定の権利を有する。
本発明は、国立衛生研究所により付与されたＥＹ０２５３７３及びＥＹ０３３２４３の下、政府の支援を受けて行われた。政府は、本発明においてある特定の権利を有する。
【0004】
本明細書に提供するのは、抗ＣＤ６抗体（またはそのＣＤ６結合部分）及び有糸分裂阻害薬（例えば、モノメチルオーリスタチンＥ（ＭＭＡＥ））で構成される抗体薬物複合体（ＡＤＣ）により、Ｔ細胞もしくはＢ１細胞介在性障害、またはＴ細胞もしくはＢ１細胞腫瘍を有する対象を治療するための組成物、システム、キット、及び方法である。ある特定の実施形態では、該ＡＤＣは、さらに、該抗体成分を該有糸分裂阻害薬成分に接続する切断可能なリンカー（例えば、プロテアーゼで切断可能なリンカー）または切断不可能なリンカーを含む。いくつかの実施形態では、該対象は、自己免疫性ブドウ膜炎またはＧＶＨＤまたはＴ細胞リンパ腫またはＢ細胞リンパ腫を有するヒトである。
【0005】
〔背景技術〕
病原性Ｔ細胞は、ほとんどの自己免疫疾患、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、及び移植拒絶反応を含め、多くの疾患を引き起こす。正常なＴ細胞及び他の組織を温存しながら、これらの病原性Ｔ細胞を選択的に標的とすることは、現代医学における治療法開発の「究極の理想」である。これまでのところ、コルチコステロイド等の汎免疫抑制薬がこれらの患者の治療に使用されているが、効果は限定的であり、重篤な副作用がある。
病原性Ｔ細胞は、ほとんどの自己免疫疾患、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、及び移植拒絶反応を含め、多くの疾患を引き起こす。正常なＴ細胞及び他の組織を温存しながら、これらの病原性Ｔ細胞を選択的に標的とすることは、現代医学における治療法開発の「究極の理想」である。これまでのところ、コルチコステロイド等の汎免疫抑制薬がこれらの患者の治療に使用されているが、効果は限定的であり、重篤な副作用がある。
【0006】
自己抗原または同種異系抗原に反応するこれらの病原性Ｔ細胞は、いったん活性化されると、活発に増殖を開始して組織損傷を引き起こすが、他の正常なＴ細胞は静止したままであることもまた確立されている。したがって、静止状態のＴ細胞のみを残し、増殖性Ｔ細胞を選択的に排除することは、病原性Ｔ細胞が介在する疾患に対する新たな標的薬を開発するための効果的な戦略となる。
【0007】
〔発明の概要〕
本明細書に提供するのは、抗ＣＤ６抗体（またはそのＣＤ６結合部分）及び有糸分裂阻害薬（例えば、モノメチルオーリスタチンＥ（ＭＭＡＥ））で構成される抗体薬物複合体（ＡＤＣ）により、Ｔ細胞介在性障害、Ｂ１細胞介在性障害、Ｔ細胞リンパ腫、またはＢ細胞リンパ腫を有する対象を治療するための組成物、システム、キット、及び方法である。ある特定の実施形態では、該ＡＤＣは、さらに、該抗体成分を該有糸分裂阻害薬成分に接続する切断可能なリンカー（例えば、プロテアーゼで切断可能なリンカー）を含む。いくつかの実施形態では、該対象は、自己免疫性ブドウ膜炎またはマントル細胞リンパ腫を有するヒトである。
本明細書に提供するのは、抗ＣＤ６抗体（またはそのＣＤ６結合部分）及び有糸分裂阻害薬（例えば、モノメチルオーリスタチンＥ（ＭＭＡＥ））で構成される抗体薬物複合体（ＡＤＣ）により、Ｔ細胞介在性障害、Ｂ１細胞介在性障害、Ｔ細胞リンパ腫、またはＢ細胞リンパ腫を有する対象を治療するための組成物、システム、キット、及び方法である。ある特定の実施形態では、該ＡＤＣは、さらに、該抗体成分を該有糸分裂阻害薬成分に接続する切断可能なリンカー（例えば、プロテアーゼで切断可能なリンカー）を含む。いくつかの実施形態では、該対象は、自己免疫性ブドウ膜炎またはマントル細胞リンパ腫を有するヒトである。
【0008】
いくつかの実施形態では、本明細書に提供するのは、障害を有する対象に対して、抗体薬物複合体（ＡＤＣ）を投与することを含む、対象の治療方法であり、前述の障害は、Ｔ細胞介在性障害、Ｂ１細胞介在性障害、Ｔ細胞リンパ腫、またはＢ細胞リンパ腫であり、前述のＡＤＣは、ａ）抗ＣＤ６抗体、またはそのＣＤ６結合部分、及びｂ）有糸分裂阻害薬を含む。
【0009】
ある特定の実施形態では、本明細書に提供するのは、ａ）抗ＣＤ６抗体、またはそのＣＤ６結合部分、及びｂ）有糸分裂阻害薬を含む抗体薬物複合体（ＡＤＣ）を含む組成物である。
【0010】
特定の実施形態では、該有糸分裂阻害薬は、モノメチルオーリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）を含む。他の実施形態では、該有糸分裂阻害薬は、ビンクリスチン、エリブリン、パクリタキセル、タンパク質結合パクリタキセル、ドセタキセル、エストラムスチン、エトポシド、イクサベピロン、カバジタキセル、ビンクリスチンリポソーム、ビノレルビン、ビンクリスチン、パクリタキセル、エトポシド、ビンブラスチン、エトポシド、及びテニポシドからなる群から選択される。
【0011】
いくつかの実施形態では、該Ｔ細胞介在性障害は、自己免疫性ブドウ膜炎を含む。他の実施形態では、該Ｔ細胞介在性障害は、関節リウマチ（ＲＡ）、１型糖尿病、多発性硬化症、セリアック病、移植片対宿主病及びシェーグレン症候群からなる群から選択される。さらなる実施形態では、該ＡＤＣは、さらに、切断可能なリンカー（例えば、プロテアーゼで切断可能なリンカー）を含む。他の実施形態では、抗ＣＤ６抗体またはそのＣＤ６結合部分は、表１から（例えば、抗体１、２、３、４、５、６、７、または８から）１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、または６個）のＣＤＲを含む。ある特定の実施形態では、該抗ＣＤ６抗体、またはそのＣＤ６結合部分は、図１８～２１または３０に示される１つ以上の可変領域を含む。他の実施形態では、該対象は、ヒトである。
【0012】
ある特定の実施形態では、該ＡＤＣは、前述の対象に対して、約０．１～２０ｍｇ／ｋｇ（例えば、約０．１、０．５、０．８、１．０、１．３、１．５、１．７、５．．．１０．．．１５または２０ｍｇ／ｋｇ対象）の用量で投与される。さらなる実施形態では、該対象は、前述のＢ１細胞リンパ腫を有する。他の実施形態では、該Ｂ１細胞リンパ腫はマントル細胞リンパ腫である。さらなる実施形態では、該対象は、前述のＴ細胞リンパ腫を有する。
【0013】
いくつかの実施形態では、本明細書に提供するのは、ａ）ｉ）抗ＣＤ６抗体、またはそのＣＤ６結合部分、及びｉｉ）有糸分裂阻害薬を含む抗体薬物複合体（ＡＤＣ）、ならびにｂ）Ｔ細胞リンパ腫細胞、またはＢ細胞（例えば、Ｂ１細胞）リンパ腫細胞を含むインビトロシステムである。特定の実施形態では、該細胞は、培養皿に存在する。
【0014】
さらなる実施形態では、本明細書で使用するのは、ａ）ｉ）抗ＣＤ６抗体、またはそのＣＤ６結合部分、及びｉｉ）有糸分裂阻害薬を含む抗体薬物複合体（ＡＤＣ）ならびにｂ）前述のＡＤＣで対象を治療するための指示を含むシステムであり、前述の対象は、Ｔ細胞介在性障害、Ｂ１細胞介在性障害、Ｔ細胞リンパ腫、またはＢ細胞リンパ腫を有する。
【0015】
本特許または出願書類は、カラーで作成された少なくとも１つの図面を含む。カラー図面を有する本特許または特許出願公開のコピーは、要請に応じて、必要な料金を支払うことにより、特許局により提供される。
【0016】
〔図面の簡単な説明〕
〔図１〕ＡＤＣの図を示す。
〔図１〕ＡＤＣの図を示す。
【0017】
〔図２〕ＣＤ６が確立されたＴ細胞の細胞表面マーカーであり、そのリガンドであるＣＤ１６６及びＣＤ３１８に結合することを示す。
【0018】
〔図３〕高親和性抗ＣＤ６ｍＡｂの同定及びヒト化を示す。
【0019】
〔図４〕３７℃で４時間インキュベーションした後、フローサイトメーターを使用して、活性化されたｐＨＡｍｉｎｅ蛍光を検出することによって測定して、抗ＣＤ６ｍＡｂがＴ細胞によって効率的に内在化されることを示す。
【0020】
〔図５〕ＣＤ６標的化ＡＤＣの開発を示す。Ａ．切断可能なリンカーを介してＭＭＡＥがコンジュゲートしたＣＤ６標的化ＡＤＣの図。Ｂ．ＣＤ６－ＡＤＣは、増殖性Ｔ細胞をインビトロで０．５ｎＭのＩＣ５０で強力に殺傷する。Ｔ細胞株（ＨＨ細胞）を、様々な濃度のＣＤ６－ＡＤＣ（ＡＤＣ）、または抗ＣＤ６ｍＡｂ（ＣＤ６）、または対照ＩｇＧ（ＩｇＧ）とインキュベートした。細胞死を異なる時点で評価した。４つの実験の代表的な結果。
【0021】
〔図６〕ＣＤ６－ＡＤＣは、ＭＴＴアッセイによって測定して、インビトロで増殖性Ｔ細胞を殺傷する。様々な濃度のＣＤ６－ＡＤＣを、Ｔ細胞株であるＨＨ細胞とインビトロでインキュベートした。Ｔ細胞の生存を、ＭＴＴアッセイによって異なる時点で定量化した。
【0022】
〔図７〕ＣＤ６－ＡＤＣは、ＰＩ組み込みアッセイによって測定して、インビトロで増殖性Ｔ細胞を殺傷する。様々な濃度のＣＤ６－ＡＤＣを、Ｔ細胞株であるＨＨ細胞とインビトロでインキュベートした。Ｔ細胞の生存を、ＰＩアッセイによって異なる時点で定量化した。
【0023】
〔図８〕ＣＤ６－ＡＤＣは、ＭＴＴアッセイによって測定して、インビトロで増殖性Ｔ細胞を殺傷する。７２時間でのＩＣ５０は、約０．４ｎＭと計算された。
【0024】
〔図９〕ＣＤ６－ＡＤＣは、トリパンブルーアッセイによって測定して、インビトロで増殖性Ｔ細胞を殺傷する。様々な濃度のＣＤ６－ＡＤＣ（ＡＤＣ）、裸の抗ＣＤ６ｍＡｂ（ＣＤ６）及び対照ＩｇＧ（ＩｇＧ）を、Ｔ細胞株であるＨＨ細胞とインビトロでインキュベートした。Ｔ細胞の生存を、トリパンブルーアッセイによって異なる時点で定量化した。
【0025】
〔図１０〕「裸の」抗ＣＤ６ｍＡｂは、低濃度ではインビトロで増殖性Ｔ細胞を殺傷しない。様々な濃度の抗ＣＤ６ｍＡｂ（ＵＭＣＤ６）を、Ｔ細胞株であるＨＨ細胞とインビトロでインキュベートした。Ｔ細胞の生存を、ＰＩアッセイによって異なる時点で定量化した。
【0026】
〔図１１〕対照非特異的ＩｇＧは、低濃度ではインビトロで増殖性Ｔ細胞を殺傷しない。様々な濃度の対照ＩｇＧ（ＩｇＧ）を、Ｔ細胞株であるＨＨ細胞とインビトロでインキュベートした。Ｔ細胞の生存を、ＰＩアッセイによって異なる時点で定量化した。
【0027】
〔図１２〕ＷＴマウスをレチナール抗原ＩＲＢＰで免疫し、ＥＡＵ（実験的自己免疫性ブドウ膜炎）を誘導した。脾細胞を１０日後に収集し、ＢｒｄＵの組み込みに基づく抗原特異的Ｔ細胞増殖アッセイに供した。すべての対照がここに示される。
【0028】
〔図１３〕マウス番号１９３の脾細胞を、様々な濃度の対照ＩｇＧ（ＩｇＧ）、裸の抗ＣＤ６ｍＡｂ（ＵＭＣＤ６）及びＣＤ６－ＡＤＣ（ＡＤＣ）の存在下で培養した。抗原特異的増殖性Ｔ細胞（ＢｒｄＵ＋）をフローで定量したところ、対照ＩｇＧでもＵＭＣＤ６でも見られなかったが、ＣＤ６－ＡＤＣは抗原特異的（ブドウ膜炎形成性Ｔ細胞）を濃度依存的に排除したことが示された。
【0029】
〔図１４〕マウス番号１９５の脾細胞を、様々な濃度の対照ＩｇＧ（ＩｇＧ）、裸の抗ＣＤ６ｍＡｂ（ＵＭＣＤ６）及びＣＤ６－ＡＤＣ（ＡＤＣ）の存在下で培養した。抗原特異的増殖性Ｔ細胞（ＢｒｄＵ＋）をフローで定量したところ、対照ＩｇＧでもＵＭＣＤ６でも見られなかったが、ＣＤ６－ＡＤＣは抗原特異的（ブドウ膜炎形成性Ｔ細胞）を濃度依存的に排除したことが示された。
【0030】
〔図１５〕マウス番号１９７の脾細胞を、様々な濃度の対照ＩｇＧ（ＩｇＧ）、裸の抗ＣＤ６ｍＡｂ（ＵＭＣＤ６）及びＣＤ６－ＡＤＣ（ＡＤＣ）の存在下で培養した。抗原特異的増殖性Ｔ細胞（ＢｒｄＵ＋）をフローで定量したところ、対照ＩｇＧでもＵＭＣＤ６でも見られなかったが、ＣＤ６－ＡＤＣは抗原特異的（ブドウ膜炎形成性Ｔ細胞）を濃度依存的に排除したことが示された。
【0031】
〔図１６〕インビトロ殺傷の結果のまとめ。
【0032】
〔図１７〕裸の抗ＣＤ６ｍＡｂでも対照ＩｇＧでも見られないが、ＣＤ６－ＡＤＣは、インビボでブドウ膜炎形成性Ｔ細胞によって誘導されるＥＡＵからマウスを保護する。インビトロで増殖させたブドウ膜形成性Ｔ細胞を、本発明者らの確立されたプロトコルに従ってナイーブレシピエントマウスに養子移入した。次いで、これらのレシピエントマウスをランダムに３群に分け、０．５ｍｇ／ｋｇのＣＤ６－ＡＤＣ（ＡＤＣ）、裸の抗ＣＤ６ｍＡｂ（ＵＭＣＤ６）または対照ＩｇＧ（ＩｇＧ）で処理した。ＥＡＵの発症及び重症度を、間接検眼法によって毎日観察した。
【0033】
〔図１８〕ＶＨ２－ｈＩｇＧ１ＣＨ抗体断片の（Ａ）ＤＮＡ及び（Ｂ）アミノ酸配列を提供する（参照により本明細書に組み込まれる米国特許第１０，５６２，９７５号参照）。
【0034】
〔図１９〕ＶＨ４－ｈＩｇＧ１ＣＨ抗体断片の（Ａ）ＤＮＡ及び（Ｂ）アミノ酸配列を提供する（参照により本明細書に組み込まれる米国特許第１０，５６２，９７５号参照）。
【0035】
〔図２０〕ＶＨ４－ｈＩｇＧ１ＣＨ抗体断片の（Ａ）ＤＮＡ及び（Ｂ）アミノ酸配列を提供する（参照により本明細書に組み込まれる米国特許第１０，５６２，９７５号参照）。
【0036】
〔図２１〕ＶＬ－ｈＩｇＫＣＬ抗体断片の（Ａ）ＤＮＡ及び（Ｂ）アミノ酸配列を提供する（参照により本明細書に組み込まれる米国特許第１０，５６２，９７５号参照）。
【0037】
〔図２２〕ＣＤ６－ＡＤＣは増殖性ヒトＴ細胞を排除する。Ａ．ＣＤ６－ＡＤＣは増殖性Ｔ細胞を殺傷するが、Ｂ細胞は殺傷しない。ＨＨ細胞（Ｔヒト細胞株）及びＲａｊｉ細胞（ヒトＢ細胞株）を様々な濃度のＣＤ６－ＡＤＣまたは抗ＣＤ６ＩｇＧと６時間インキュベートした。細胞をＰＢＳで洗浄し、４８または７２時間培養し、トリパンブルー染色により死細胞を検出した。Ｂ．ＣＤ６－ＡＤＣは、用量依存的にヒトＣＤ４及びＣＤ８の両Ｔ細胞の数を有意に減少させる。Ｂ１．健康なドナーのＰＢＭＣを、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８Ａｂによって５日間活性化した。活性化中に、様々な濃度（０．５、２、４ｎＭ）のＣＤ６－ＡＤＣ、抗ＣＤ６ＩｇＧ、及びｍＩｇＧを添加した。ＣＤ４／ＣＤ８陽性細胞の頻度を、フローサイトメトリーによって検出した。Ｂ２．５日目の細胞収集の１６時間前にＢｒｄＵを培地に添加した。細胞を抗ＢｒｄＵ Ａｂで染色し、ＢｒｄＵの組み込みをフローサイトメトリーで分析した。Ｂ３．ＣＦＳＥを使用して、細胞増殖を追跡するためにＰＢＭＣを標識し、ＣＦＳＥ分裂細胞をフローサイトメーターによって検出した。各細胞型の数は、次のように計算した：各ウェルの総細胞数×陽性細胞の頻度。Ｃ．４ｎＭのＣＤ６－ＡＤＣ及び対照によるＣＤ４及びＣＤ８Ｔ細胞へのＢｒｄＵの組み込みの代表的な結果。
【0038】
〔図２３〕ＣＤ６－ＡＤＣは、活性化された抗原特異的Ｔ細胞を殺傷する。ａＥＡＵモデルのマウスの脾細胞を、様々な濃度（０．５、２、４ｎＭ）のＣＤ６－ＡＤＣ、抗ＣＤ６ＩｇＧ及びｍＩｇＧの存在下、ＩＲＢＰペプチドで３日間再刺激した。細胞採取の１６時間前にＢｒｄＵを添加した。ＢｒｄＵの組み込みをフローサイトメトリーによって検出した。Ａ．ＢｒｄＵ組み込みＣＤ４陽性細胞の代表的な結果。Ｂ．３匹のマウスの結果のまとめ。
【0039】
〔図２４〕０．５ｍｇ／ｋｇのＣＤ６－ＡＤＣは、インビボで休止中のＴ細胞に有意な影響を与えない。ナイーブｈｔｇＣＤ６マウスに、０．５ｍｇ／ｋｇのＣＤ６－ＡＤＣを静脈内注射した。末梢血中のＴ細胞の頻度を、フローサイトメトリーによって観察した。Ａ１．リンパ球中のＣＤ３Ｔ細胞のパーセンテージ。Ａ２及びＡ３．ＣＤ３Ｔ細胞におけるＣＤ４及びＣＤ８Ｔ細胞のパーセンテージ。Ｎ＝３。
【0040】
〔図２５〕ＣＤ６－ＡＤＣ処理により、ブドウ膜炎形成性Ｔ細胞（ｔＥＡＵ）の養子移入によって誘導される実験的自己免疫性ブドウ膜炎が軽減される。０．５ｍｇ／ｋｇのＣＤ６－ＡＤＣまたは対照を、誘導と同じ日にｈｔｇ ＣＤ６ ｔＥＡＵマウスに投与した。Ａ及びＢ．ＣＤ６－ＡＤＣ処理マウスは、臨床及び組織学的スコアの低下を示した。Ｎ＝５／群。Ｃ．移入後８日目のＣＤ６－ＡＤＣ処理マウス及び対照マウスにおける局所内視鏡眼底画像（ＴＥＦＩ）、共焦点走査型レーザー検眼鏡（ｃＳＬＯ）及びスペクトル領域光干渉断層撮影（ＳＤ－ＯＣＴ）の代表的な画像。ＣＤ６－ＡＤＣ処理ｔＥＡＵマウスは、対照マウスよりもはるかに少ない異常を示した。Ｄ．眼底画像に表示される炎症を定量化した。Ｅ．１８日目のｔＥＡＵのＣＤ６－ＡＤＣ処理マウス及び対照マウスの代表的な組織病理学的画像。ｍＩｇＧ及び抗ＣＤ６ＩｇＧ処理マウスは、有意な網膜ひだ及び硝子体の浸潤細胞を示したが、組織病理学的変化はＣＤ６－ＡＤＣ処理マウスで緩和された。
【0041】
〔図２６〕ＣＤ６－ＡＤＣ処理により、能動実験的自己免疫ブドウ膜炎（ａＥＡＵ）が減少する。ｈｔｇＣＤ６マウスをＩＲＢＰペプチドで免疫し、ａＥＡＵを誘導した。Ａ．６日目に、共焦点走査型レーザー検眼鏡（ｃＳＬＯ）の画像は、網膜に浸潤細胞を示し、これが、処理の開始に対する論理的根拠を与えた。Ｂ．０．５ｍｇ／ｋｇのＣＤ６－ＡＤＣまたはｍＩｇＧ－ＡＤＣ処理を、６日目から３日ごとにａＥＡＵのマウスに施した。ＣＤ６－ＡＤＣ処理マウスは、ＩｇＧ－ＡＤＣ処理マウスと比較して低い臨床スコアを示した。Ｎ＝６／群。Ｃ．免疫後１４日目のＣＤ６－ＡＤＣ処理マウス及び対照マウスにおける共焦点走査型レーザー検眼鏡（ｃＳＬＯ）及びスペクトル領域光干渉断層撮影（ＳＤ－ＯＣＴ）の代表的な画像。Ｄ．画像定量化。Ｅ１．ＣＤ６－ＡＤＣ処理マウスは、組織学的スコアの減少を示した。Ｅ２．２０日目のｔＥＡＵのＣＤ６－ＡＤＣ処理及び対照マウスの代表的な組織病理学的画像。ａＥＡＵは、ＣＤ６－ＡＤＣ処理によって緩和され、網膜のひだ及び細胞浸潤が少なくなった。
【0042】
〔図２７〕ＣＤ６－ＡＤＣ処理により、ヒトＰＢＭＣによって誘導されるＧＶＨＤの重症度が低下する。ＧＶＨＤモデルを、ヒトＰＢＭＣの注射によりＮＳＧマウスで誘導した。０．５ｍｇ／ｋｇのＣＤ６－ＡＤＣまたはｍＩｇＧ－ＡＤＣを３日目から３日ごとにＧＶＨＤマウスに投与した。Ａ．ヒトＣＤ４５及びＣＤ３陽性細胞の頻度（Ａ１及びＡ２）ならびに絶対数（Ａ３及びＡ４）は、ＣＤ６－ＡＤＣ処理マウスの末梢血で減少した。各図中の小挿入図は、接種後最初の３日間のヒトＣＤ４５及びＣＤ３陽性細胞の増加を示した。Ｎ＝５／群。Ｂ．２７日目のヒトＣＤ４５及びＣＤ３陽性細胞の代表的なフローの結果。Ｃ．ＣＤ６－ＡＤＣ処理マウスは、最終的に体重が増加したが、ｍＩｇＧ－ＡＤＣ処理マウスは、ＧＶＨＤの進行中に体重が減少した。Ｄ．ＣＤ６－ＡＤＣ処理マウスは、２７日目に脾臓（Ｄ１）と骨髄（Ｄ２）の両方でヒトＣＤ４５及びＣＤ３陽性細胞が対照より減少した。Ｅ．ＣＤ６－ＡＤＣ処理マウスは、１２日目に血漿中のＩＦＮ－ガンマのレベルが対照マウスより低かった。
【0043】
〔図２８〕抗ＣＤ６ｍＡｂで染色された、実施例２からのＭＣＬ組織アレイの代表的な走査画像を示す。Ａ．組織アレイの一部であるスライド。Ｂ．ＣＤ６染色のＭＣＬ生検標本。Ｃ．より高い倍率の同じ標本。
【0044】
〔図２９〕Ａは、ＭＣＬ細胞株ＳＰ５３がＣＤ６＋であることを示す。ピンク：アイソタイプ対照で染色。青：抗ＣＤ６ＩｇＧで染色。Ｂは、ＣＤ６－ＡＤＣがインビトロでＭＣＬ細胞を強力に殺傷することを示す。ＳＰ５３ＭＣＬ細胞を、様々な濃度のＣＤ６－ＡＤＣまたは対照ＩｇＧ－ＡＤＣと７２時間インキュベートした。細胞死をトリパンブルー染色によって評価した。
【0045】
〔図３０〕Ａは、モノクローナル抗体ＵＭＣＤ６の重鎖の核酸配列（配列番号１８）を示し、フレームワーク領域を赤で、３つのＣＤＲを青で示す。Ｂは、モノクローナル抗体ＵＭＣＤ６の重鎖のアミノ酸配列（配列番号１９）を示し、フレームワーク領域を赤で、３つのＣＤＲを青で示す。Ｃは、モノクローナル抗体ＵＭＣＤ６の軽鎖の核酸配列（配列番号２０）を示し、フレームワーク領域を赤で、３つのＣＤＲを青で示す。Ｄは、モノクローナル抗体ＵＭＣＤ６の軽鎖のアミノ酸配列（配列番号２１）を示し、フレームワーク領域を赤で、３つのＣＤＲを青で示す。ある特定の実施形態では、ＵＭＣＤ６の可変領域が、本明細書のシステム、組成物、及び方法において（例えば、ヒト－マウスキメラ抗体において）使用される。他の実施形態では、６つのＣＤＲのみ（例えば、ヒトフレームワークに移植されたもの）が、本明細書のシステム、組成物、及び方法で使用される。
【0046】
〔発明を実施するための形態〕
本明細書に提供するのは、抗ＣＤ６抗体（またはそのＣＤ６結合部分）及び有糸分裂阻害薬（例えば、モノメチルオーリスタチンＥ（ＭＭＡＥ））で構成される抗体薬物複合体（ＡＤＣ）により、Ｔ細胞介在性障害、Ｂ細胞介在性障害、Ｔ細胞リンパ腫、またはＢ細胞リンパ腫を有する対象を治療するための組成物、システム、キット、及び方法である。ある特定の実施形態では、該ＡＤＣは、さらに、該抗体成分を該有糸分裂阻害薬成分に接続する切断可能なリンカー（例えば、プロテアーゼで切断可能なリンカー）を含む。いくつかの実施形態では、該対象は、自己免疫性ブドウ膜炎またはマントル細胞リンパ腫を有するヒトである。
本明細書に提供するのは、抗ＣＤ６抗体（またはそのＣＤ６結合部分）及び有糸分裂阻害薬（例えば、モノメチルオーリスタチンＥ（ＭＭＡＥ））で構成される抗体薬物複合体（ＡＤＣ）により、Ｔ細胞介在性障害、Ｂ細胞介在性障害、Ｔ細胞リンパ腫、またはＢ細胞リンパ腫を有する対象を治療するための組成物、システム、キット、及び方法である。ある特定の実施形態では、該ＡＤＣは、さらに、該抗体成分を該有糸分裂阻害薬成分に接続する切断可能なリンカー（例えば、プロテアーゼで切断可能なリンカー）を含む。いくつかの実施形態では、該対象は、自己免疫性ブドウ膜炎またはマントル細胞リンパ腫を有するヒトである。
【0047】
本明細書に記載の実施形態の開発中に行われた研究において、本発明者らは、Ｔ細胞標的化抗体薬物複合体（ＡＤＣ）を、臨床的に証明された抗有糸分裂薬である潜在性ＭＭＡＥ（モノメチルオーリスタチンＥ）を、米国特許第１０，５６２，９７５号及び図１８～２１に記載されているＣＤ６に対するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）にコンジュゲートすることによって開発した。
【0048】
いくつかの実施形態では、米国特許第１０，５６２，９７５号及び図１８～２１に記載されている抗体からの軽鎖及び重鎖可変領域のみ、またはＣＤＲのみが使用される。ある特定の実施形態では、本明細書のＡＤＣは、他の抗ＣＤ６抗体及びその抗原結合部分、例えば、当技術分野で既知のもの（例えば、ＬＳ Ｂｉｏ製ＩｔｏｌｉｚｕｍａｂまたはＬＳ－Ｂ９８２９、ＵＭＣＤ６またはそのキメラ型、Ｓｉｎｇｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ８８（４）：５３７－５４３（１９９６）参照、参照により全体として本明細書に組み込まれる）を使用する。他の抗ＣＤ６抗体及びその断片、特にヒトまたはヒト化抗体を見出すためにＰｕｂＭｅｄ及びＵＳＰＴＯ特許文献のインターネット検索を使用することができる。他の実施形態では、以下の表１に示す、米国特許第１０，５６２，９７５号からの８つのＶＨ鎖または８つのＶＬ鎖のいずれかから１、２、３、４、５、または６つのＣＤＲ（下線部）が使用される。該ヒト化抗体は、以下の表１で１～８の番号が付けられており、各々重鎖及び軽鎖を含む。ある特定の実施形態では、本明細書のＡＤＣは、抗体１、２、３、４、５、６、７、または８からの６つのＣＤＲ（下線付き）のコレクションを使用する。
【0049】
【表1】
【0050】
ある特定の実施形態では、該抗体は、モノクローナル抗体、またはその抗原結合断片、例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）２、またはｓｃＦｖである。ある特定の実施形態では、本明細書のＡＤＣは、コンジュゲートされたＭＭＡＥを、ＣＤ６に対して陽性であるＴ細胞に選択的に送達し（例えば、ヒトの眼に送達された場合、または腫瘍にもしくは全身的に送達された場合）、自己反応性Ｔ細胞のみが増殖性であり、正常なＴ細胞は静止しているため、活性化されたＭＭＡＥは選択的に自己反応性Ｔ細胞を中から殺傷する一方、正常なＴ細胞及び他の非Ｔ細胞に影響を与えずにおく。いくつかの実施形態では、様々なＡＤＣを、疾患Ｔ細胞（例えば、ブドウ膜炎形成性Ｔ細胞）を除去し、それによってＴ細胞介在性障害（例えば、実験的自己免疫性ブドウ膜炎（ＥＡＵ）をＣＤ６ヒト化マウスのモデルとして用いた自己免疫性ブドウ膜炎）を治療することにおける選択性及び有効性について試験することができる。
【0051】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載のＡＤＣは、自己反応性Ｔ細胞（例えば、眼のブドウ膜内）を選択的に標的とする一方で、正常なＴ細胞及び他の細胞を概して温存する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＡＤＣは、任意のＴ細胞介在性障害、及びＴ細胞リンパ腫を治療するために対象に投与される。ある特定の実施形態では、本明細書のＡＤＣは、抗有糸分裂ＭＭＡＥ薬物ペイロードをＴ細胞に選択的に送達するための抗ＣＤ６ｍＡｂ（またはその抗原結合断片）を提供し、コンジュゲートされた抗有糸分裂薬ＭＭＡＥは、一般に、活発に増殖中の細胞のみを殺傷する。これらの２つの選択的アプローチを組み合わせることにより、病原性増殖性Ｔ細胞のみが除去され、静止状態の正常なＴ細胞及び他の増殖性非Ｔ細胞は影響を受けないままであるか、または一般に影響を受けない。
【0052】
３つの細胞外スカベンジャー受容体システインリッチ（ＳＲＣＲ）ドメインを含むタンパク質であるＣＤ６（図２）は、Ｔ細胞のマーカーとして３０年以上前に発見され、多発性硬化症（ＭＳ）、関節リウマチ、及びシェーグレン症候群を含めたＴ細胞介在性自己免疫疾患の治療の標的として提案されている。いくつかのグループにより、ＣＤ６がＭＳ１６－１８のリスク遺伝子であることが発見され、キューバで開発された抗ＣＤ６ｍＡｂであるｉｔｏｌｉｚｕｍａｂがインドで乾癬及びＣＯＶＩＤ－１９の治療に承認されたことで、この分野への最近の関心が大幅に高まった（１９、２０）。過去１０年間、ＣＤ６ノックアウト（ＫＯ）マウスの開発及び研究により、本発明者らは、自己免疫性ブドウ膜炎、ＭＳ及びＲＡのモデルを含めたいくつかのＴ細胞介在性自己免疫疾患モデルにおいて、ＣＤ６活性の欠如がマウスを保護することを発見した。これらのデータは、ＣＤ６が病原性Ｔ細胞応答の重要な調節因子であり、ひいては潜在的な治療標的であることを強く主張している。実際、本発明者らは、Ｔ細胞応答を直接抑制することにより、これらのＴ細胞介在性疾患モデルの治療に効果的な抗ヒトＣＤ６ｍＡｂを特定し、ヒト化し、特許を取得した（米国特許第１０，５６２，９７５号）。以下に記載の通り、本発明者らは、このヒト化ｍＡｂが、有効なＡＤＣに重要である極めて高い親和性で（ピコモル域で）ＣＤ６に結合することを実証した。さらに、本発明者らは、Ｔ細胞上のＣＤ６に結合した後、このｍＡｂが、迅速に内在化され得ることを見出した。これは、有効なＡＤＣのための別の重要な特徴である。
【0053】
本明細書の実施形態の開発中に行われた研究において、本発明者らは、ＡＤＣを、抗有糸分裂薬であるＭＭＡＥの不活化型を、本発明者らが同定した抗ＣＤ６ｍＡｂに切断可能なＶＣ－ＰＡＢリンカーを介してコンジュゲートすることによって生成した（図５）。このＡＤＣは、意図的に、正常なＴ細胞及び他の組織細胞を温存しながら、増殖性自己反応性Ｔ細胞を選択的に殺傷するはずである。本発明者らは、この新規なＡＤＣが、活発に増殖中のＴ細胞をインビトロで効率的に殺傷すると判断し（図５）、自己免疫性ブドウ膜炎に対する効果的な新薬としてのその可能性を示した。
【0054】
抗ヒトＣＤ６ｍＡｂのヒト化及び特性評価。臨床開発プロセスの一環として、本発明者らは、本発明者らが同定したマウス抗ヒトＣＤ６ｍＡｂを従来の相補性決定領域（ＣＤＲ）移植技術によってヒト化し、表面プラズモン共鳴によってヒト化前後のｍＡｂの親和性を比較した。図３に示すように、親及びヒト化抗ＣＤ６の両ｍＡｂは、ＣＤ６に対して非常に高いＫＤ１０－１１Ｍの親和性を有する。対照的に、他の抗ＣＤ６ｍＡｂであるｉｔｏｌｉｚｕｍａｂの親和性は、１０－８Ｍであると報告されている。
【0055】
該抗ＣＤ６ｍＡｂは、Ｔ細胞によって効率的に内在化される。高い親和性を有することに加えて、Ｔ細胞標的化ＡＤＣに使用されるｍＡｂの別の重要な特徴は、それがＴ細胞によって内在化される能力である。本発明者らは次に、ｍＡｂを、細胞内の酸性コンパートメント内で活性化された後にのみ蛍光を発するｐＨ感受性色素であるｐＨＡｍｉｎｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ）で第一に標識し、ヒトＴ細胞株ＨＨとインキュベートした後、フローサイトメトリー分析を行った。図４に示すように、本発明者らは、ｐＨＡｍｉｎｅ標識抗ＣＤ６ｍＡｂとインキュベートしたＴ細胞のほとんどが、インキュベーション後に蛍光を発することを見出し、該抗ＣＤ６ｍＡｂが、Ｔ細胞表面上のＣＤ６に結合した後に効率的に内在化されることを実証した。
【0056】
本明細書の実施形態の開発中に行われた研究において、本発明者らは、ＣＤ６標的化ＡＤＣを、抗有糸分裂薬であるＭＭＡＥを、同定された抗ＣＤ６ｍＡｂにコンジュゲートすることによって開発した（図５）。ＯＤ４１８／ＯＤ２８０を測定する分光分析によれば、標的薬対抗体比は、４と推定される。増殖性Ｔ細胞を殺傷するこの新規なＡＤＣを試験するため、本発明者らは、該ＨＨ Ｔ細胞を様々な濃度のＡＤＣ、または親抗ＣＤ６ｍＡｂもしくは対照ＩｇＧとインキュベートし、トリパンブルー染色によって２４、４８、及び７２時間の細胞死を評価した。本発明者らは、これらのインビトロアッセイにおいて、抗ＣＤ６ｍＡｂでも対照ＩｇＧでも見られないが、ＣＤ６標的化ＡＤＣは、増殖性Ｔ細胞を０．５ｎＭのＩＣ５０で強力に殺傷することを見出し（図５）、それがインビボで分裂中の自己反応性Ｔ細胞を殺傷するのに使用され得ることを示した。
【0057】
〔実施例〕
実施例１
Ｔ細胞介在性障害の治療法としてのＣＤ６標的化抗体薬物複合体
病原性Ｔ細胞の選択的標的化は、多くの自己免疫疾患及び移植片対宿主病を含めたＴ細胞介在性障害の新たな治療法の開発における「究極の理想」である。本実施例では、本発明者らは、強力な有糸分裂毒素であるモノメチルオーリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）の不活性型を、確立されたＴ細胞の表面マーカーであるＣＤ６に対するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）にコンジュゲートすることによる、例示的なＣＤ６標的化抗体薬物複合体（ＣＤ６－ＡＤＣ）の開発を記載する。ＣＤ６はすべてのＴ細胞に存在するが、ＣＤ６－ＡＤＣは、活発に分裂中であるために抗有糸分裂ＭＭＡＥ介在性の殺傷の影響を受けやすい病原性Ｔ細胞を選択的に殺傷するように設計されている。本発明者らは、ヒトとマウスの両方で、ＣＤ６－ＡＤＣが実際に活性化された増殖性Ｔ細胞を選択的に殺傷し、正常なＴ細胞を温存することを見出した。さらに、同じ用量のＣＤ６－ＡＤＣは、自己免疫性ブドウ膜炎の２つの前臨床モデル及び移植片対宿主病モデルを効果的に治療したが、裸の親抗ＣＤ６ｍＡｂもＩｇＧ対照も非結合対照ＩｇＧ－ＡＤＣも治療しなかった。これらの結果は、このＣＤ６－ＡＤＣが病原性Ｔ細胞の選択的排除、ひいては多くのＴ細胞介在性障害の治療のための医薬品として使用され得るという明確な証拠を提供する。
実施例１
Ｔ細胞介在性障害の治療法としてのＣＤ６標的化抗体薬物複合体
病原性Ｔ細胞の選択的標的化は、多くの自己免疫疾患及び移植片対宿主病を含めたＴ細胞介在性障害の新たな治療法の開発における「究極の理想」である。本実施例では、本発明者らは、強力な有糸分裂毒素であるモノメチルオーリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）の不活性型を、確立されたＴ細胞の表面マーカーであるＣＤ６に対するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）にコンジュゲートすることによる、例示的なＣＤ６標的化抗体薬物複合体（ＣＤ６－ＡＤＣ）の開発を記載する。ＣＤ６はすべてのＴ細胞に存在するが、ＣＤ６－ＡＤＣは、活発に分裂中であるために抗有糸分裂ＭＭＡＥ介在性の殺傷の影響を受けやすい病原性Ｔ細胞を選択的に殺傷するように設計されている。本発明者らは、ヒトとマウスの両方で、ＣＤ６－ＡＤＣが実際に活性化された増殖性Ｔ細胞を選択的に殺傷し、正常なＴ細胞を温存することを見出した。さらに、同じ用量のＣＤ６－ＡＤＣは、自己免疫性ブドウ膜炎の２つの前臨床モデル及び移植片対宿主病モデルを効果的に治療したが、裸の親抗ＣＤ６ｍＡｂもＩｇＧ対照も非結合対照ＩｇＧ－ＡＤＣも治療しなかった。これらの結果は、このＣＤ６－ＡＤＣが病原性Ｔ細胞の選択的排除、ひいては多くのＴ細胞介在性障害の治療のための医薬品として使用され得るという明確な証拠を提供する。
【0058】
材料及び方法
ＣＤ６－ＡＤＣ及び対照ＡＤＣの生成：ＭＭＡＥを、キット（ＣｅｌｌＭｏｓａｉｃ Ｉｎｃ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）を使用し、製造業者が提供するプロトコルに従って、ＶＣ－ＰＡＢリンカーを介して精製マウス抗ヒトＣＤ６ＩｇＧ（ＵＭＣＤ６）及び対照マウスＩｇＧにコンジュゲートした。得られた生成物の標的薬対抗体比を、ＯＤ４１８／ＯＤ２８０を測定することにより推定した。
ＣＤ６－ＡＤＣ及び対照ＡＤＣの生成：ＭＭＡＥを、キット（ＣｅｌｌＭｏｓａｉｃ Ｉｎｃ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）を使用し、製造業者が提供するプロトコルに従って、ＶＣ－ＰＡＢリンカーを介して精製マウス抗ヒトＣＤ６ＩｇＧ（ＵＭＣＤ６）及び対照マウスＩｇＧにコンジュゲートした。得られた生成物の標的薬対抗体比を、ＯＤ４１８／ＯＤ２８０を測定することにより推定した。
【0059】
ヒト初代Ｔ細胞殺傷アッセイ：ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を使用して、ヒトＴ細胞殺傷アッセイを実施した。非標識またはカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）標識ＰＢＭＣを、Ｕ底９６ウェルプレートに、最終濃度５×１０５細胞／ｍｌにてＲＰＭＩ１６４０培地（ＦＢＳ１０％、Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ１００μ／ｍｌ、Ｌ－グルタミン２ｍＭ、ＨＥＰＥ２５ｍＭ、ピルビン酸ナトリウム１ｍＭ、β－メルカプトエタノール５０μＭ、ｈＩＬ－２ １００Ｕ／ｍｌ）中に播種した。Ｔ細胞を活性化、または抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８抗体（Ａｂ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＵＳＡ）と結合したＤｙｎａｂｅａｄｓでビーズ対細胞比１：１で活性化し、それぞれ、０．５、２、及び４ｎＭのＣＤ６－ＡＤＣ、親マウス抗ＣＤ６ＩｇＧまたはマウスＩｇＧとともに５日間インキュベートした。非標識ＰＢＭＣの場合、細胞を採取する１６時間前に１０μＭのブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）を培地に添加した。ＰＢＭＣの数を顕微鏡下でカウントし、ＣＤ４及びＣＤ８Ｔ細胞の頻度を、フローサイトメトリーによって、抗マウスＣＤ４及び抗マウスＣＤ８ｍＡｂ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，ＵＳＡ）で検出した。Ｔ細胞の増殖を評価するため、ＢｒｄＵの組み込み（非標識ＰＢＭＣの場合）及びＣＦＳＥ希釈（ＣＦＳＥ標識ＰＢＭＣの場合）を、フローサイトメトリーを使用して分析した。
【0060】
ヒトＴ細胞株ＭＯＬＴ－４殺傷アッセイ：通常の培養条件下で活発に増殖するヒトＴ細胞株ＭＯＬＴ－４（ＡＴＣＣ）を、０、０．１、０．５、２．５もしくは１２．５ｎＭのＣＤ６－ＡＤＣまたは対照ＡＤＣを含む完全ＲＰＭＩ培地中、４０，０００細胞／ウェルで９６ウェルプレートに播種した。６時間のインキュベーション後、細胞を洗浄し、通常の完全ＲＰＭＩ培地でさらに７２時間培養した後、各ウェルの生細胞及び死細胞を、トリパンブルー染色後にＣｏｕｎｔｅｓｓ Ａｕｔｏｍａｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してカウントした。
【0061】
抗原特異的Ｔ細胞殺傷アッセイ：ＣＤ６ヒト化マウス（８～１２週齢）の各々を、２００μｇのブドウ膜炎形成性ＩＲＢＰ１６１－１８０ペプチド（ＳＧＩＰＹＩＩＳＹＬＨＰＧＮＴＩＬＨＶＤ、配列番号１７、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ ＵＳＡ Ｉｎｃ．，ＵＳＡによりカスタム合成されたもの）及び２５０μｇのＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ Ｈ３７Ｒａ（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）を含む２００ｕｌの完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ、Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で皮下的に免疫した。この免疫化ＣＤ６ヒト化マウスから脾細胞を１２日後に単離した。次に、４×１０５個の脾細胞を、ＲＰＭＩ１６４０培地（ＦＢＳ１０％、Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ １００μ／ｍｌ、Ｌ－グルタミン２ｍＭ）中、それぞれ０．５、２、及び４ｎＭのＣＤ６－ＡＤＣ、抗ＣＤ６ＩｇＧまたはマウスＩｇＧの存在下、２０μｇ／ｍｌのＩＲＢＰ１６１－１８０ペプチドで３日間再刺激した。細胞を収集する１６時間前にＢｒｄＵを培地に添加した。細胞を抗マウスＣＤ４及び抗ＢｒｄＵ ｍＡｂ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）で染色した後、フローサイトメーターを使用してＣＤ４＋Ｔ細胞へのＢｒｄＵの組み込みを分析した。
【0062】
ＥＡＵの能動及び受動モデルのＣＤ６－ＡＤＣ処理：ＥＡＵの能動及び受動モデルの誘導を、以前に文献に記載された通りに行った。能動ＥＡＵの処理の場合、ブドウ膜炎の臨床徴候が免疫化後６日目に現れた時点で、０．５ｍｇ／ｋｇのＣＤ６－ＡＤＣ、抗ＣＤ６ＩｇＧまたは対照ＩｇＧを腹腔内注射することにより、免疫化マウスを処理した。受動ＥＡＵの処理の場合、レシピエントマウスを、同数の予備活性化ブドウ膜形成性Ｔ細胞の養子移入後、同じ方法で処理した。ＥＡＵの発症及び重症度を、間接検眼鏡を使用して毎日観察し、以前に公開された基準に従って０～４の臨床スコアを割り当てた（Ｃａｓｐｉ，Ｒ．Ｒ．（２００３）Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ ｕｖｅｏｒｅｔｉｎｉｔｉｓ ｉｎ ｔｈｅ ｒａｔ ａｎｄ ｍｏｕｓｅ．Ｃｕｒｒ．Ｐｒｏｔｏｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｃｈａｐｔｅｒ １５，Ｕｎｉｔ １５．６．）。
【0063】
眼球撮像及び組織病理学的分析：眼球の撮像を以前に記載された通りに行った（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｌｅｕｋｏｃ Ｂｉｏｌ．２０１６ Ｍａｒ；９９（３）：４４７－５４、及びＺｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ａｕｔｏｉｍｍｕｎ．２０１８ Ｊｕｎ；９０：８４－９３．）。簡潔には、麻酔及び瞳孔拡張下、マウスをＳＤ－ＯＣＴ（Ｂｉｏｐｔｉｇｅｎ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）及びｃＳＬＯ（ＨＲＡ２／Ｓｐｅｃｔｒａｌｉｓ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で撮像した。ＳＤ－ＯＣＴ撮像は、網膜の断面画像を取得するために、５０ｏの視野（ＦＯＶ）で行った。視神経を中央に配置して、５５ｏのＦＯＶのｃＳＬＯ画像を取得した。ｃＳＬＯを実行して、網膜及び網膜色素上皮等の網膜の外側の位置で赤外線（ＩＲ）反射率及び自己蛍光（ＡＦ）を測定した。ＥＡＵ試験の最後に、眼球全体を採取し、１０％ホルマリン溶液で４８時間固定し、パラフィンに包埋した。５μｍの切片を瞳孔と視神経軸で切断し、ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色した。切片には、網膜の炎症性浸潤及び構造的損傷に基づいて、以前に公開された基準に従って０～４の組織病理学的スコアを割り当てた（Ｃａｓｐｉ，２００３）。
【0064】
ＧＶＨＤのモデルのＣＤ６－ＡＤＣ処理：ＮＳＧマウス（Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＵＳＡ、８週齢）に放射線を照射（２００ｒａｄ）し、３×１０６個のヒトＰＢＭＣを尾静脈注射により静脈内投与し、ＧＶＨＤを誘導した。誘導後、３日ごとに末梢血を採取した。細胞を抗マウスＣＤ４５、抗ヒトＣＤ４５、及び抗ヒトＣＤ３ｍＡｂで染色した後、フローサイトメトリー分析を行った。０．５ｍｇ／ｋｇのＣＤ６－ＡＤＣ及びｍＩｇＧ－ＡＤＣの処理は、ＧＶＨＤ発症の開始を示す末梢血中のヒトＰＢＭＣ数の増加が見られたＤ３から３日ごとに腹腔内に施した。２７日後、脾細胞及び骨髄からの細胞を単離し、全白血球中のｈＣＤ４５及びｈＣＤ３陽性細胞（ｍＣＤ４５及びｈＣＤ４５陽性細胞）のパーセンテージをフローサイトメーターで検出した。皮膚、脾臓、肝臓、腸、及び結腸を採取し、１０％ホルマリン溶液で固定し、パラフィンに包埋し、Ｈ＆Ｅで染色した。
【0065】
結果
ペイロードとしてＭＭＡＥを使用したＣＤ６－ＡＤＣ及び非結合対照ＡＤＣの開発：
本発明者らは、これらのＡＤＣを、市販のキットを使用し、製造業者が提供するプロトコルに従って、ＶＣ－ＰＡＢリンカーを介してＭＭＡＥを精製抗ＣＤ６ＩｇＧまたはマウスＩｇＧにコンジュゲートすることにより生成した。ＯＤ４１８／ＯＤ２８０を測定する分光分析によれば、標的ペイロード対抗体比は、約３：１と推定される。調製されたＣＤ６－ＡＤＣ及び対照ＡＤＣをアリコートに分け、凍結乾燥し、実験まで－８０℃の冷凍庫に保存した。
ペイロードとしてＭＭＡＥを使用したＣＤ６－ＡＤＣ及び非結合対照ＡＤＣの開発：
本発明者らは、これらのＡＤＣを、市販のキットを使用し、製造業者が提供するプロトコルに従って、ＶＣ－ＰＡＢリンカーを介してＭＭＡＥを精製抗ＣＤ６ＩｇＧまたはマウスＩｇＧにコンジュゲートすることにより生成した。ＯＤ４１８／ＯＤ２８０を測定する分光分析によれば、標的ペイロード対抗体比は、約３：１と推定される。調製されたＣＤ６－ＡＤＣ及び対照ＡＤＣをアリコートに分け、凍結乾燥し、実験まで－８０℃の冷凍庫に保存した。
【0066】
ＣＤ６－ＡＤＣは、インビトロで活性化された増殖性ヒトＴ細胞を殺傷する：
ＣＤ６－ＡＤＣが活性化されたヒトＴ細胞を殺傷することを実証するために、本発明者らは、健康なドナーの正常なＰＢＭＣを使用してＴ細胞殺傷アッセイを設定し、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８ｍＡｂとコンジュゲートしたＤｙｎｅａｂｅａｄｓを使用してＴ細胞を内部で活性化した。本発明者らは、次に、これらの細胞を、それぞれ、０．５、２、及び４ｎＭのＣＤ６－ＡＤＣ、裸の親抗ＣＤ６ＩｇＧまたは対照ＩｇＧとともにインキュベートした。５日目に、本発明者らは、組み込まれたＢｒｄＵをマーカーとして使用し、フローサイトメトリーにより、各ウェルの増殖性ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージ及び絶対数を定量化し、増殖性ヒトＴ細胞を特定した。図２２を参照されたい。これらの試験により、対照ＡＤＣ、親抗ＣＤ６ＩｇＧ、または対照ＩｇＧが、調べたすべての濃度で増殖性ＣＤ４＋またはＣＤ８＋ヒトＴ細胞のパーセンテージ及び数に測定可能な影響を与えなかった一方で、ＣＤ６－ＡＤＣは、濃度０．５ｎＭでも濃度依存的に、これらの増殖性（ＢｒｄＵ＋）ヒトＴ細胞のパーセンテージ及び絶対数の両方を内部で著しく減少させることが分かった（図２２ｃ）。
ＣＤ６－ＡＤＣが活性化されたヒトＴ細胞を殺傷することを実証するために、本発明者らは、健康なドナーの正常なＰＢＭＣを使用してＴ細胞殺傷アッセイを設定し、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８ｍＡｂとコンジュゲートしたＤｙｎｅａｂｅａｄｓを使用してＴ細胞を内部で活性化した。本発明者らは、次に、これらの細胞を、それぞれ、０．５、２、及び４ｎＭのＣＤ６－ＡＤＣ、裸の親抗ＣＤ６ＩｇＧまたは対照ＩｇＧとともにインキュベートした。５日目に、本発明者らは、組み込まれたＢｒｄＵをマーカーとして使用し、フローサイトメトリーにより、各ウェルの増殖性ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージ及び絶対数を定量化し、増殖性ヒトＴ細胞を特定した。図２２を参照されたい。これらの試験により、対照ＡＤＣ、親抗ＣＤ６ＩｇＧ、または対照ＩｇＧが、調べたすべての濃度で増殖性ＣＤ４＋またはＣＤ８＋ヒトＴ細胞のパーセンテージ及び数に測定可能な影響を与えなかった一方で、ＣＤ６－ＡＤＣは、濃度０．５ｎＭでも濃度依存的に、これらの増殖性（ＢｒｄＵ＋）ヒトＴ細胞のパーセンテージ及び絶対数の両方を内部で著しく減少させることが分かった（図２２ｃ）。
【0067】
ＣＤ６－ＡＤＣは、インビトロで正常なヒトＴ細胞を殺傷しない
本発明者らのＣＤ６－ＡＤＣが静止状態の正常なＴ細胞を温存することを実証するため、本発明者らは、健康なドナーのＰＢＭＣを、０～１２．５ｎＭのＣＤ６－ＡＤＣまたは対照ＩｇＧ－ＡＤＣと直接インキュベートし、次いでフローサイトメトリーにより、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ色素（Ｔｈｅｒｍａｌ Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して、Ｔ細胞（ＣＤ３＋）でゲーティングした後にＴ細胞殺傷を測定した。図２２を参照されたい。これらの試験により、対照（緑のバー、Ｔ細胞のみ）と比較して、調べた最も高い濃度（１２．５ｎＭ）であっても、対照ＡＤＣもＣＤ６－ＡＤＣもこれらの正常な初代ヒトＴ細胞に有意な悪影響を与えないことが分かった。さらに、調べたすべての濃度で、対照ＡＤＣ（グレーのバー）またはＣＤ６－ＡＤＣ（黒のバー）で処理したサンプル間で得られた死Ｔ細胞のパーセンテージまたは絶対数に差はなかった。これらの試験は、本発明者らのＣＤ６－ＡＤＣが正常なヒトＴ細胞を殺傷しないことを示す直接の証拠を提供した。
本発明者らのＣＤ６－ＡＤＣが静止状態の正常なＴ細胞を温存することを実証するため、本発明者らは、健康なドナーのＰＢＭＣを、０～１２．５ｎＭのＣＤ６－ＡＤＣまたは対照ＩｇＧ－ＡＤＣと直接インキュベートし、次いでフローサイトメトリーにより、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ色素（Ｔｈｅｒｍａｌ Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して、Ｔ細胞（ＣＤ３＋）でゲーティングした後にＴ細胞殺傷を測定した。図２２を参照されたい。これらの試験により、対照（緑のバー、Ｔ細胞のみ）と比較して、調べた最も高い濃度（１２．５ｎＭ）であっても、対照ＡＤＣもＣＤ６－ＡＤＣもこれらの正常な初代ヒトＴ細胞に有意な悪影響を与えないことが分かった。さらに、調べたすべての濃度で、対照ＡＤＣ（グレーのバー）またはＣＤ６－ＡＤＣ（黒のバー）で処理したサンプル間で得られた死Ｔ細胞のパーセンテージまたは絶対数に差はなかった。これらの試験は、本発明者らのＣＤ６－ＡＤＣが正常なヒトＴ細胞を殺傷しないことを示す直接の証拠を提供した。
【0068】
ＣＤ６－ＡＤＣはインビトロで増殖性Ｔ細胞を殺傷するが、増殖性非Ｔ細胞は温存する：
ＣＤ６－ＡＤＣが増殖性Ｔ細胞を殺傷するが、ＣＤ６を発現しない他の増殖性細胞は殺傷しないことを実証するために、本発明者らは、ヒトＴ細胞株ＭＯＬＴ－４及びヒトＢ細胞株Ｒａｊｉを使用した細胞殺傷アッセイを再度設定した。これらは両方とも通常の培養条件下で活発に分裂するが、Ｔ細胞株のみがＣＤ６を発現し、Ｒａｊｉは発現しない。本発明者らは、細胞を０、０．１、０．５、２．５または１２．５ｎＭのＣＤ６－ＡＤＣとインキュベートし、次いでトリパンブルー染色後に死細胞をカウントすることによって細胞殺傷を評価した。これらの実験により、ＣＤ６－ＡＤＣが濃度依存的に増殖性ＭＯＬＴ－４ Ｔ細胞を殺傷する一方で、ＣＤ６を発現しない増殖性Ｒａｊｉ Ｂ細胞には有意な悪影響を与えないことが分かった。これらの結果は、ＣＤ６－ＡＤＣが、活発に分裂中であっても、非ＣＤ６発現細胞を温存しながら増殖性Ｔ細胞を選択的に殺傷したことを示している。
ＣＤ６－ＡＤＣが増殖性Ｔ細胞を殺傷するが、ＣＤ６を発現しない他の増殖性細胞は殺傷しないことを実証するために、本発明者らは、ヒトＴ細胞株ＭＯＬＴ－４及びヒトＢ細胞株Ｒａｊｉを使用した細胞殺傷アッセイを再度設定した。これらは両方とも通常の培養条件下で活発に分裂するが、Ｔ細胞株のみがＣＤ６を発現し、Ｒａｊｉは発現しない。本発明者らは、細胞を０、０．１、０．５、２．５または１２．５ｎＭのＣＤ６－ＡＤＣとインキュベートし、次いでトリパンブルー染色後に死細胞をカウントすることによって細胞殺傷を評価した。これらの実験により、ＣＤ６－ＡＤＣが濃度依存的に増殖性ＭＯＬＴ－４ Ｔ細胞を殺傷する一方で、ＣＤ６を発現しない増殖性Ｒａｊｉ Ｂ細胞には有意な悪影響を与えないことが分かった。これらの結果は、ＣＤ６－ＡＤＣが、活発に分裂中であっても、非ＣＤ６発現細胞を温存しながら増殖性Ｔ細胞を選択的に殺傷したことを示している。
【0069】
ＣＤ６－ＡＤＣは、インビトロで抗原特異的自己反応性Ｔ細胞を排除する
抗原特異的病原性Ｔ細胞の排除におけるＣＤ６－ＡＤＣの可能性を調べるために、本発明者らは、ブドウ膜炎形成性ＩＲＢＰペプチドでＣＤ６ヒト化マウスを免疫し、次いで１２日後に脾臓を採取した。本発明者らは、その脾細胞を使用した、様々な濃度のＣＤ６－ＡＤＣ、抗ＣＤ６ｍＡｂまたは対照ＩｇＧの存在下での抗原特異的リコールアッセイを設定した。増殖細胞を特定するため、本発明者らは、培養物にＢｒｄＵも添加した。３日後に、本発明者らは、各ウェルの全ＣＤ４＋Ｔ細胞及び増殖性ＢｒｄＵ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞のパーセンテージをフローサイトメトリーによって定量化した。図２３を参照されたい。これらの実験により、分析された脾細胞において、ＣＤ４＋Ｔ細胞が全細胞の３０～３５％を占め、このＣＤ４＋Ｔ細胞の４～５％のみがＩＲＢＰ応答性増殖細胞（ＢｒｄＵ＋）であることが分かった。これは、以前の報告と一致する。さらに、抗ＣＤ６ｍＡｂでもＩｇＧでも見られなかったが、ＣＤ６－ＡＤＣは、培養物に含まれる増殖性ＢｒｄＵ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の数を濃度依存的に有意に減少させた。これらの結果は、ＣＤ６－ＡＤＣが、自己免疫性ブドウ膜炎を引き起こすＩＲＢＰ特異的増殖性ＣＤ４＋Ｔ細胞を選択的に殺傷することを実証した。
抗原特異的病原性Ｔ細胞の排除におけるＣＤ６－ＡＤＣの可能性を調べるために、本発明者らは、ブドウ膜炎形成性ＩＲＢＰペプチドでＣＤ６ヒト化マウスを免疫し、次いで１２日後に脾臓を採取した。本発明者らは、その脾細胞を使用した、様々な濃度のＣＤ６－ＡＤＣ、抗ＣＤ６ｍＡｂまたは対照ＩｇＧの存在下での抗原特異的リコールアッセイを設定した。増殖細胞を特定するため、本発明者らは、培養物にＢｒｄＵも添加した。３日後に、本発明者らは、各ウェルの全ＣＤ４＋Ｔ細胞及び増殖性ＢｒｄＵ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞のパーセンテージをフローサイトメトリーによって定量化した。図２３を参照されたい。これらの実験により、分析された脾細胞において、ＣＤ４＋Ｔ細胞が全細胞の３０～３５％を占め、このＣＤ４＋Ｔ細胞の４～５％のみがＩＲＢＰ応答性増殖細胞（ＢｒｄＵ＋）であることが分かった。これは、以前の報告と一致する。さらに、抗ＣＤ６ｍＡｂでもＩｇＧでも見られなかったが、ＣＤ６－ＡＤＣは、培養物に含まれる増殖性ＢｒｄＵ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の数を濃度依存的に有意に減少させた。これらの結果は、ＣＤ６－ＡＤＣが、自己免疫性ブドウ膜炎を引き起こすＩＲＢＰ特異的増殖性ＣＤ４＋Ｔ細胞を選択的に殺傷することを実証した。
【0070】
ＣＤ６標的化ＡＤＣは、予備活性化ブドウ膜炎形成性Ｔ細胞の養子移入によって誘導されるブドウ膜炎の発症を抑制する
本発明者らは次に、予備活性化ブドウ膜炎形成性Ｔ細胞の養子移入によって誘導されるブドウ膜炎の治療におけるＣＤ６－ＡＤＣの治療効果を調べた。簡潔には、以前に公開された本発明者らのプロトコルに従って、本発明者らは、インビトロでＩＲＢＰ免疫化ＣＤ６ヒト化マウスから自己反応性Ｔ細胞を増幅し、その後予備活性化ブドウ膜炎形成性Ｔ細胞をナイーブマウスに養子移入し、ブドウ膜炎を誘導した。養子移入後、本発明者らは、マウスをランダムに３群に分け、０．５ｍｇ／ｋｇの抗ＣＤ６ ＡＤＣ、抗ＣＤ６ｍＡｂまたは対照ＩｇＧで処理した。この場合もやはり、本発明者らは、ブドウ膜炎の発症を間接検眼法によって毎日観察し、マウスの網膜をＯＣＴ及びＳＬＯによって、８日目に眼球の組織病理学的分析とともに分析した。図２４を参照されたい。これらすべての試験により、この投与量で抗ＣＤ６ＩｇＧでの処理がわずかに疾患の発症を遅らせたものの、親抗ＣＤ６ＩｇＧや対照ＩｇＧでは見られないが、この投与量のＣＤ６－ＡＤＣは、ブドウ膜炎形成性Ｔ細胞によって誘導される網膜炎症からマウスを有意に保護することが分かった。
本発明者らは次に、予備活性化ブドウ膜炎形成性Ｔ細胞の養子移入によって誘導されるブドウ膜炎の治療におけるＣＤ６－ＡＤＣの治療効果を調べた。簡潔には、以前に公開された本発明者らのプロトコルに従って、本発明者らは、インビトロでＩＲＢＰ免疫化ＣＤ６ヒト化マウスから自己反応性Ｔ細胞を増幅し、その後予備活性化ブドウ膜炎形成性Ｔ細胞をナイーブマウスに養子移入し、ブドウ膜炎を誘導した。養子移入後、本発明者らは、マウスをランダムに３群に分け、０．５ｍｇ／ｋｇの抗ＣＤ６ ＡＤＣ、抗ＣＤ６ｍＡｂまたは対照ＩｇＧで処理した。この場合もやはり、本発明者らは、ブドウ膜炎の発症を間接検眼法によって毎日観察し、マウスの網膜をＯＣＴ及びＳＬＯによって、８日目に眼球の組織病理学的分析とともに分析した。図２４を参照されたい。これらすべての試験により、この投与量で抗ＣＤ６ＩｇＧでの処理がわずかに疾患の発症を遅らせたものの、親抗ＣＤ６ＩｇＧや対照ＩｇＧでは見られないが、この投与量のＣＤ６－ＡＤＣは、ブドウ膜炎形成性Ｔ細胞によって誘導される網膜炎症からマウスを有意に保護することが分かった。
【0071】
ＣＤ６－ＡＤＣは、能動免疫化によって誘導されるブドウ膜炎の進行を逆転させる
上記のＥＡＵの養子移入誘導受動モデルに加えて、本発明者らは、能動免疫化によって誘導される自己免疫性ブドウ膜炎モデルにおけるＣＤ６－ＡＤＣの治療効果も調べた。簡潔には、本発明者らは、ＣＤ６ヒト化マウスをＩＲＢＰペプチドで免疫し、６日後、本発明者らは、ＳＬＯによって、すべてのマウスが網膜での過蛍光白血球の存在よって示されるブドウ膜炎を発症したことを確認した。したがって、本発明者らは、これらマウスをランダムに分け、ＣＤ６－ＡＤＣまたは対照ＡＤＣ（０．５ｍｇ／ｋｇ）のいずれかで処理し、間接検眼法によってブドウ膜炎の進行を毎日観察し、臨床スコアを記録した。さらに、本発明者らは、１４日目にＯＣＴ及びＳＬＯによってマウスの網膜も分析した。最後に、実験の終わりに、本発明者らは、組織病理学的分析用の眼球、及び抗原特異的Ｔｈ１／Ｔｈ１７応答アッセイ用の脾臓を収集した。本発明者らは、対照ＡＤＣでは見られないが、ＣＤ６－ＡＤＣは、すべての眼球撮像技術によって分析して、処理マウスにおいてブドウ膜炎を有意に減弱することを見出した。図２５を参照されたい。その上、自己抗原特異的Ｔｈ１及びＴｈ１７細胞は、ＣＤ６－ＡＤＣ処理マウスにおいて、対照ＡＤＣ処理マウスよりも著しく減少した。
上記のＥＡＵの養子移入誘導受動モデルに加えて、本発明者らは、能動免疫化によって誘導される自己免疫性ブドウ膜炎モデルにおけるＣＤ６－ＡＤＣの治療効果も調べた。簡潔には、本発明者らは、ＣＤ６ヒト化マウスをＩＲＢＰペプチドで免疫し、６日後、本発明者らは、ＳＬＯによって、すべてのマウスが網膜での過蛍光白血球の存在よって示されるブドウ膜炎を発症したことを確認した。したがって、本発明者らは、これらマウスをランダムに分け、ＣＤ６－ＡＤＣまたは対照ＡＤＣ（０．５ｍｇ／ｋｇ）のいずれかで処理し、間接検眼法によってブドウ膜炎の進行を毎日観察し、臨床スコアを記録した。さらに、本発明者らは、１４日目にＯＣＴ及びＳＬＯによってマウスの網膜も分析した。最後に、実験の終わりに、本発明者らは、組織病理学的分析用の眼球、及び抗原特異的Ｔｈ１／Ｔｈ１７応答アッセイ用の脾臓を収集した。本発明者らは、対照ＡＤＣでは見られないが、ＣＤ６－ＡＤＣは、すべての眼球撮像技術によって分析して、処理マウスにおいてブドウ膜炎を有意に減弱することを見出した。図２５を参照されたい。その上、自己抗原特異的Ｔｈ１及びＴｈ１７細胞は、ＣＤ６－ＡＤＣ処理マウスにおいて、対照ＡＤＣ処理マウスよりも著しく減少した。
【0072】
ＣＤ６－ＡＤＣはＧＶＨＤの前臨床モデルを治療する
自己免疫性ブドウ膜炎等の自己免疫疾患に加えて、他のＴ細胞介在性障害の治療におけるＣＤ６－ＡＤＣの有効性を調べるため、本発明者らは、異種ＧＶＨＤモデルを使用した。簡潔には、本発明者らは、照射ＮＳＧマウスに新鮮ヒトＰＢＭＣを注入し、フローサイトメトリーによって注入したヒトＴ細胞が活性化されることを検出し、血中での増殖まで３日待った。本発明者らは、したがって、マウスの半数をＣＤ６－ＡＤＣ（０．５ｍｇ／ｋｇ）で処理し、残りの半数を同じ用量の対照ＡＤＣで処理し、循環ヒトＴ細胞のパーセンテージ及び絶対数をフローサイトメトリーで週２回観察し、２７日目までのＧＶＨＤの発症を評価した。実験の最後に、本発明者らは、組織病理学的分析用の異なる組織も収集した。図２６を参照されたい。これらの試験により、血中の白血球の８０％超がヒトＣＤ４５＋ＣＤ３＋Ｔ細胞である対照ＡＤＣで処理したマウスと比較して、ＣＤ６－ＡＤＣで処理したマウスは、血中のヒトＣＤ４５＋ＣＤ３＋Ｔ細胞が１％未満しかないことが分かった。末梢血中のヒトＴ細胞のパーセンテージ及び数の顕著な差異に加えて、ＣＤ６－ＡＤＣで処理したマウスは、骨髄及び脾臓に含まれるヒトＴ細胞のパーセンテージの大幅な減少も示した。異なる組織の組織病理学的検査により、これらの血液学的分析結果が確認され、ＣＤ６－ＡＤＣ処理により、皮膚や肝臓等の複数の臓器におけるヒトＴ細胞浸潤が著しく減少し、ひいてはＧＶＨＤが大幅に減弱されることが示された。図２７を参照されたい。
自己免疫性ブドウ膜炎等の自己免疫疾患に加えて、他のＴ細胞介在性障害の治療におけるＣＤ６－ＡＤＣの有効性を調べるため、本発明者らは、異種ＧＶＨＤモデルを使用した。簡潔には、本発明者らは、照射ＮＳＧマウスに新鮮ヒトＰＢＭＣを注入し、フローサイトメトリーによって注入したヒトＴ細胞が活性化されることを検出し、血中での増殖まで３日待った。本発明者らは、したがって、マウスの半数をＣＤ６－ＡＤＣ（０．５ｍｇ／ｋｇ）で処理し、残りの半数を同じ用量の対照ＡＤＣで処理し、循環ヒトＴ細胞のパーセンテージ及び絶対数をフローサイトメトリーで週２回観察し、２７日目までのＧＶＨＤの発症を評価した。実験の最後に、本発明者らは、組織病理学的分析用の異なる組織も収集した。図２６を参照されたい。これらの試験により、血中の白血球の８０％超がヒトＣＤ４５＋ＣＤ３＋Ｔ細胞である対照ＡＤＣで処理したマウスと比較して、ＣＤ６－ＡＤＣで処理したマウスは、血中のヒトＣＤ４５＋ＣＤ３＋Ｔ細胞が１％未満しかないことが分かった。末梢血中のヒトＴ細胞のパーセンテージ及び数の顕著な差異に加えて、ＣＤ６－ＡＤＣで処理したマウスは、骨髄及び脾臓に含まれるヒトＴ細胞のパーセンテージの大幅な減少も示した。異なる組織の組織病理学的検査により、これらの血液学的分析結果が確認され、ＣＤ６－ＡＤＣ処理により、皮膚や肝臓等の複数の臓器におけるヒトＴ細胞浸潤が著しく減少し、ひいてはＧＶＨＤが大幅に減弱されることが示された。図２７を参照されたい。
【0073】
病原性Ｔ細胞が介在する自己免疫疾患の治療の「究極の理想」は、正常な静止状態のＴ細胞及び他の組織細胞を温存しながら、これらの自己反応性Ｔ細胞を選択的に標的とすることである。本実施例におけるＣＤ６－ＡＤＣは、１）ＣＤ６が、ほぼＴ細胞上でのみ発現され、ＣＤ６を発現することが知られている他の細胞は、全Ｂ細胞の１％未満を構成するＢ１ａ細胞及び一部のナチュラルキラー（ＮＫ）細胞であること、ならびに２）抗有糸分裂薬であるＭＭＡＥが、活発に増殖中の細胞を殺傷することから、この目標を達成するように思われる。ＣＤ６はすべてのＴ細胞上に存在するが、通常の条件下では、休止状態のＴ細胞は活発に増殖中ではないため、これら静止状態のＴ細胞は、ＭＭＡＥ介在性の殺傷に感受性がない。それに対して、自己反応性病原性Ｔ細胞は活発に分裂しており、ＣＤ６－ＡＤＣ介在性の殺傷の餌食になる。
【0074】
本発明者らの知る限り、これまでのところ、自己免疫疾患を治療するために積極的に開発されているＡＤＣは１つだけである。このＡＤＣは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ阻害剤であるアマニチンを、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、好酸球、好塩基球、単球、マクロファージ及び好中球を含めたすべての白血球に存在するＣＤ４５に対するｍＡｂにコンジュゲートすることによって生成される。このＡＤＣは、ＭＳ及びＧＶＨＤのモデル、ならびに炎症性関節炎の治療に非常に効果的であり、同社のウェブサイトでは、このＡＤＣは現在、臨床評価のためのＩＮＤ－ｅｎａｂｌｉｎｇ試験中であると報告されている。このＣＤ４５標的化ＡＤＣは、ＡＤＣの適用が実際に腫瘍免疫療法に限定されず、自己免疫疾患治療に拡張され得ることを示しているものの、本発明者らのＣＤ６－ＡＤＣとは大きく異なる。第一に、すべての白血球及び一部の幹細胞で発現するＣＤ４５とは異なり、ＣＤ６は主にＴ細胞で発現する。したがって、すべての白血球を標的とするＣＤ４５指向ＡＤＣの非特異的細胞毒性とは異なり、本発明者らの治療法は、Ｔ細胞を標的とするため、全身性の免疫抑制及びそれに関連する重度の副作用につながらないはずである。第二に、このＣＤ４５標的化ＡＤＣで使用されるペイロードであるアマニチンは、増殖細胞と静止細胞の両方を殺傷するが、本発明者らのＣＤ６－ＡＤＣで使用されるＭＭＡＥは有糸分裂毒素であるため、増殖細胞のみを殺傷する。抗ＣＤ６ｍＡｂのＴ細胞選択性とペイロードＭＭＡＥの増殖細胞選択性を組み合わせることにより、本発明者らのＣＤ６－ＡＤＣは、概して、増殖性Ｔ細胞のみを選択的に標的とすることで、良好な安全性プロファイルを有し、副作用が少ないはずである。実際、本発明者らの試験において処理したマウスはすべて、明らかな問題なくＣＤ６－ＡＤＣに耐容性良好であった。
【0075】
ＣＤ６－ＡＤＣの開発に使用される親抗ＣＤ６ｍＡｂは、単独で、ＣＤ６＋Ｔ細胞を枯渇させることなくＴ細胞応答を抑制することにより、多発性硬化症（ＭＳ）及び関節リウマチ（ＲＡ）等の自己免疫疾患のマウスモデルの治療に有効であることが以前に報告された。ＣＤ６－ＡＤＣは、強力なペイロードがコンジュゲートされているため、その親の「裸の」ｍＡｂよりも有意に高い治療効果を有するはずである。実際、以前の報告では、約４ｍｇ／ｋｇ（約１００μｇ／マウス）で投与された場合、抗ＣＤ６ｍＡｂは、ＭＳ及びＲＡのモデルの治療に非常に効果的であったが、本実施例に記載の処理実験で、本発明者らは、０．５ｍｇ／ｋｇ（約１２μｇ／マウス）の投与量で、ＣＤ６－ＡＤＣは予備活性化ブドウ膜炎形成性Ｔ細胞の養子移入後にブドウ膜炎の発症を有意に抑制したが、同じ用量の「裸の」抗ＣＤ６ｍＡｂでは、ブドウ膜炎発症を遅らせ、ブドウ膜炎発症の最初の１週間以内で、処理したマウスの網膜炎症を中程度に減弱したのみであることを見出した。これらのデータは、ＣＤ６－ＡＤＣが、自己免疫疾患の治療において、親抗ＣＤ６ｍＡｂよりも治療効果が大幅に向上していることを示しており、有効性に必要な用量ははるかに少なく、コストの削減及び潜在的な副作用の減少を含め、多くの利点につながる可能性がある。
【0076】
ブドウ膜炎患者の来院時には、患者はすでにブドウ膜炎形成性Ｔ細胞を発達させており、及び／またはブドウ膜炎の徴候を示している。本発明者らは、受動モデルにおいて予備活性化ブドウ膜炎形成性Ｔ細胞の養子移入後、または能動モデルにおいてマウスがブドウ膜炎の徴候を示した後に、処理試験を開始した。これら両モデルは、来院患者の状況を忠実に模倣している。本発明者らがマウスの網膜を検査するために使用したすべての眼球撮像技術（ＳＬＯ、ＯＣＴ、及び間接検眼法）は、診療所でのブドウ膜炎の診断及び評価にも一般に使用されている。したがって、これらの自己免疫性ブドウ膜炎の前臨床モデルから得られた肯定的な治療データは、ＣＤ６－ＡＤＣについて、ヒト患者用の薬物としての強力な根拠を提供する。
【0077】
自己免疫性ブドウ膜炎等の多くの自己免疫疾患に加えて、ＧＶＨＤは、病原性Ｔ細胞が介在する別の障害である。ＧＶＨＤは、鎌状赤血球貧血、発作性夜間ヘモグロビン尿症及び多くの血液悪性腫瘍等の疾患に対する最後の手段である同種骨髄（ＢＭ）移植後の患者のほとんどで生じる。活性化及び増殖したドナーＴ細胞が宿主組織を損傷してＧＶＨＤを引き起こすことが理解されているにもかかわらず、現在利用可能な治療選択は限られており、満足のいくものではなく、深刻な副作用を伴う。本発明者らは、ヒトのＧＶＨＤを治療するための潜在的な候補薬物を評価するために一般に使用される異種ＧＶＨＤモデルを使用した。このＧＶＨＤの前臨床モデルでは、本発明者らは、病原性Ｔ細胞がインビボで活性化され、増殖した後、投与が０．５ｍｇ／ｋｇの低用量であっても、対照ＡＤＣでは見られないが、ＣＤ６－ＡＤＣは、病原性増殖性ヒトＴ細胞を効率的に殺傷し、インビボでのヒトＴ細胞数の大幅な減少がもたらされ、その結果、肝臓、脾臓及び皮膚等の複数の臓器の病理が著しく減弱され、またはさらに減少することを見出した。これらのデータは、自己免疫性ブドウ膜炎のような自己免疫疾患に加えて、ＣＤ６－ＡＤＣが、ＧＶＨＤの治療選択になる可能性があることを示唆する。
【0078】
患者が感染すると、病原体特異的Ｔ細胞が活性化され、増殖し始める。これらの患者が依然としてＣＤ６－ＡＤＣの治療中の場合、病原体特異的Ｔ細胞もＣＤ６－ＡＤＣ介在性の殺傷の影響を受け、これが日和見感染症につながる可能性がある。これらの合併症を軽減するため、その場合は、抗生物質及び／または抗ウイルス薬が投与され、患者の侵入病原体制御が促進されるまで、ＣＤ６－ＡＤＣ治療レジメンを停止することができる。
【0079】
要約すると、本発明者らが開発したＣＤ６－ＡＤＣは、増殖性病原性Ｔ細胞を選択的に殺傷し、自己免疫性ブドウ膜炎の２つの前臨床モデル及びＧＶＨＤの前臨床モデルにおいて、低用量で投与された場合であっても疾患の進行を逆転させるのに非常に効果的である。これらの結果は、ＣＤ６－ＡＤＣが、自己免疫性ブドウ膜炎、多発性硬化症、関節リウマチ、ＧＶＨＤ、及び移植拒絶反応のような疾患が挙げられるがこれらに限定されない病原性Ｔ細胞介在性障害を治療するための薬物であることを示唆する。
【0080】
実施例２
Ｂ１細胞介在性障害の治療法としてのＣＤ６標的化抗体薬物複合体
マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）は、侵攻性Ｂ１細胞非ホジキンリンパ腫であり、臨床予後が悪く、治癒しない（１）。これらの腫瘍細胞は転移し、リンパ節、脾臓、血液、骨髄、及びその他の組織に侵入し、通常は診断から２～３年以内に患者は死亡する（２）。現在の最前線の治療としては、細胞傷害性化学療法剤または粘り強い化学免疫療法とその後の幹細胞移植の組み合わせが挙げられる（３、４）。これらの利用可能な治療選択による深刻な副作用にもかかわらず、ＭＣＬ患者はこれらの治療に最初は応答する傾向があるものの、患者のほとんどは後に再発するか、難治性になる（５、６）。したがって、これらの悪性Ｂ細胞腫瘍を標的とする新薬を開発することは、臨床的に非常に重要であり、緊急性がある。
Ｂ１細胞介在性障害の治療法としてのＣＤ６標的化抗体薬物複合体
マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）は、侵攻性Ｂ１細胞非ホジキンリンパ腫であり、臨床予後が悪く、治癒しない（１）。これらの腫瘍細胞は転移し、リンパ節、脾臓、血液、骨髄、及びその他の組織に侵入し、通常は診断から２～３年以内に患者は死亡する（２）。現在の最前線の治療としては、細胞傷害性化学療法剤または粘り強い化学免疫療法とその後の幹細胞移植の組み合わせが挙げられる（３、４）。これらの利用可能な治療選択による深刻な副作用にもかかわらず、ＭＣＬ患者はこれらの治療に最初は応答する傾向があるものの、患者のほとんどは後に再発するか、難治性になる（５、６）。したがって、これらの悪性Ｂ細胞腫瘍を標的とする新薬を開発することは、臨床的に非常に重要であり、緊急性がある。
【0081】
標的療法の開発における第一のかつ最も重要なステップの１つは、ＭＣＬ細胞上の標的分子の同定である。調べたすべての患者のＭＣＬ検体が高レベルでＣＤ６を発現していることが発見され、ＣＤ６がＭＣＬの新規な治療標的である可能性が示唆された。試験において、本発明者らは、有糸分裂毒素であり臨床的に証明されたペイロード（７，８）であるモノメチルオーリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）の不活化型を、本発明者らのＣＤ６に対する高親和性モノクローナル抗体（ｍＡｂ）に結合することにより、ＣＤ６標的化抗体薬物複合体（ＡＤＣ）を開発した（図５参照）。このＡＤＣは、ＭＭＡＥをＣＤ６＋ＭＣＬ腫瘍細胞に送達するように設計されている。重要なことには、有糸分裂毒素であるため、コンジュゲートされたＭＭＡＥは、活発に増殖中の細胞のみを殺傷する。ＣＤ６＋細胞に対する抗ＣＤ６ｍＡｂの選択性と、増殖細胞に対する有糸分裂毒素ＭＭＡＥの選択性を組み合わせることにより、この新規なＡＤＣは、増殖性ＣＤ６＋悪性腫瘍細胞のみを殺傷し、正常な静止状態のＣＤ６＋細胞及びその他の増殖性非ＣＤ６発現細胞を温存するように設計されている。
【0082】
ＣＤ６は、主に、Ｔ細胞及びＢ１細胞と呼ばれるＢ細胞の小群で発現される。３つの細胞外スカベンジャー受容体システインリッチ（ＳＲＣＲ）ドメインを含むタンパク質であるＣＤ６は、Ｔ細胞のマーカーとして３０年以上前に発見された（１９）。後の研究で、ＣＤ６がＢ１細胞と呼ばれるＢ細胞の小群に存在することも示唆された（２０）。ＣＤ６は、多発性硬化症（ＭＳ）、関節リウマチ、及びシェーグレン症候群を含めたＴ細胞介在性自己免疫疾患の治療の標的であることが示唆されている（２２）。いくつかのグループが、ＣＤ６がＭＳのリスク遺伝子であることを発見した際、この分野への関心が著しく高まった（２３～２５）。最近、キューバで開発された抗ＣＤ６ｍＡｂであるｉｔｏｌｉｚｕｍａｂが、インドで乾癬及びＣＯＶＩＤ－１９の治療に承認された（２６、２７）。過去１０年間、ＣＤ６ノックアウト（ＫＯ）マウスの開発及び研究により、本発明者らは、自己免疫性ブドウ膜炎（１１）、ＭＳ（９）及びＲＡ（１３）のモデルを含めたいくつかのＴ細胞介在性自己免疫疾患モデルにおいて、ＣＤ６活性の欠如がマウスを保護することを発見した。本発明者らはまた、ＣＤ６ＫＯマウスを使用して、ＣＤ６が実際にＢ１細胞に存在するが、他のＢ細胞や骨髄細胞には存在しないことを確認した（１４）。
【0083】
本発明者らが調べたすべてのＭＣＬ患者のサンプルが高レベルでＣＤ６を発現することを示すデータ（図２８）を使用して、患者に含まれる正常なＴ細胞はたとえそれらがＣＤ６＋であっても増殖性ではなく、ＭＣＬ細胞は活発に分裂するため、本発明者らは、本発明者らが同定した抗ＣＤ６ｍＡｂを利用して、ＭＣＬ細胞を選択的に殺傷するためのＡＤＣを、ＭＣＬ患者のための新たな治療アプローチとして開発することができた。したがって、本発明者らは、同じ切断可能なＶＣ－ＰＡＢリンカー（図５）を介して、有糸分裂毒素ＭＭＡＥの不活化型を、本発明者らが同定した抗ＣＤ６ｍＡｂにコンジュゲートすることにより、ＡＤＣを生成した。このＡＤＣは、意図的に、正常なＴ細胞及び他の組織細胞を温存しながら、増殖性ＭＣＬ細胞を選択的に殺傷するはずである。本発明者らはさらに、親の「裸の」抗ＣＤ６ｍＡｂでも対照ＩｇＧでも見られないが、この新規なＡＤＣは、活発に増殖中のＭＣＬ細胞をインビトロで効率的に殺傷することを示し（図２９）、ＭＣＬ用の新薬としての可能性を実証した。
【0084】
調べたすべてのＭＣＬ患者検体はＣＤ６＋である。約２００の腫瘍サンプルを含むＭＣＬ患者の組織マイクロアレイを使用した。そのアレイを本発明者らの抗ＣＤ６ｍＡｂで染色し、染色したスライドを調べた。腫瘍組織を欠いたいくつかを除いて、すべてのサンプルがＣＤ６に関して強く染色されている（図２８）。これらの結果は、ＭＣＬ細胞が高レベルで表面にＣＤ６を発現することを初めて実証するだけでなく、ＣＤ６がＭＣＬ患者、特に現在利用可能な治療法に抵抗性の患者の新規な治療標的であることを示唆している。
【0085】
本発明者らは、ＭＭＡＥの不活性型を、本発明者らが同定した抗ＣＤ６ｍＡｂに、ＣｅｌｌＭｏｓａｉｃ Ｉｎｃ（Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）によって開発されたキットを使用してコンジュゲートすることにより、ＣＤ６標的化ＡＤＣを開発した（図５Ａ）。ＯＤ４１８／ＯＤ２８０を測定する分光分析によれば、標的ペイロード対抗体比は、４：１と推定される。ＭＣＬ細胞を殺傷するこの新規なＡＤＣの可能性を調べるために、本発明者らは第一に、確立されたヒトＭＣＬ細胞株（３０、３１）であるＳＰ５３がＣＤ６＋であることを確認した。本発明者らは次に、ＳＰ５３ＭＣＬ細胞を様々な濃度のＣＤ６－ＡＤＣ、または対照ＡＤＣ（同じキットを使用してＭＭＡＥとコンジュゲートした非特異的マウスＩｇＧ）とインキュベートし、トリパンブルー染色によって７２時間のＭＣＬ細胞死を評価した。本発明者らは、抗ＣＤ６ｍＡｂでも対照ＩｇＧでも見られないが、ＣＤ６標的化ＡＤＣは、これらのインビトロアッセイでＭＣＬ細胞を強力に殺傷することを見出した（図２９）。
【0086】
参考文献：
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３０．Ｄａｉｂａｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ．１９９６；７０（１２）：９００３－９００７．
３１．Ａｍｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｒｃｈ Ｐａｔｈｏｌ Ｌａｂ Ｍｅｄ．２００３；１２７（４）：４２４－４３１．
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３３．Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２０１６；７６（２１）：６４１０－６４２３．
３４．Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｌｅｕｋｅｍｉａ．２００８；２２（１）：１７９－１８５．
３５．Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．２０１７；１３０（６）：７６３－７７６．
本明細書で言及される、及び／または以下に列挙されるすべての刊行物及び特許は、参照により本明細書に組み込まれる。本発明の記載された方法及びシステムの様々な修正及び変形は、本発明の範囲及び趣旨から逸脱することなく当業者に明白であろう。本発明は、特定の実施形態に関連して説明されてきたが、請求される本発明は、かかる特定の実施形態に過度に限定されるべきではないことを理解されたい。実際に、関連分野の当業者にとって明白な、本発明を実施するための記載された様式の様々な修正は、本明細書に記載される範囲内であることが意図される。
１．Ｃｏｒｔｅｌａｚｚｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｏｎｃｏｌ Ｈｅｍａｔｏｌ．２０２０；１５３：１０３０３８．
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３３．Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２０１６；７６（２１）：６４１０－６４２３．
３４．Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｌｅｕｋｅｍｉａ．２００８；２２（１）：１７９－１８５．
３５．Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．２０１７；１３０（６）：７６３－７７６．
本明細書で言及される、及び／または以下に列挙されるすべての刊行物及び特許は、参照により本明細書に組み込まれる。本発明の記載された方法及びシステムの様々な修正及び変形は、本発明の範囲及び趣旨から逸脱することなく当業者に明白であろう。本発明は、特定の実施形態に関連して説明されてきたが、請求される本発明は、かかる特定の実施形態に過度に限定されるべきではないことを理解されたい。実際に、関連分野の当業者にとって明白な、本発明を実施するための記載された様式の様々な修正は、本明細書に記載される範囲内であることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【0087】
【図1】ＡＤＣの図を示す。
【図2】ＣＤ６が確立されたＴ細胞の細胞表面マーカーであり、そのリガンドであるＣＤ１６６及びＣＤ３１８に結合することを示す。
【図3】高親和性抗ＣＤ６ｍＡｂの同定及びヒト化を示す。
【図4】３７℃で４時間インキュベーションした後、フローサイトメーターを使用して、活性化されたｐＨＡｍｉｎｅ蛍光を検出することによって測定して、抗ＣＤ６ｍＡｂがＴ細胞によって効率的に内在化されることを示す。
【図5】ＣＤ６標的化ＡＤＣの開発を示す。Ａ．切断可能なリンカーを介してＭＭＡＥがコンジュゲートしたＣＤ６標的化ＡＤＣの図。Ｂ．ＣＤ６－ＡＤＣは、増殖性Ｔ細胞をインビトロで０．５ｎＭのＩＣ５０で強力に殺傷する。Ｔ細胞株（ＨＨ細胞）を、様々な濃度のＣＤ６－ＡＤＣ（ＡＤＣ）、または抗ＣＤ６ｍＡｂ（ＣＤ６）、または対照ＩｇＧ（ＩｇＧ）とインキュベートした。細胞死を異なる時点で評価した。４つの実験の代表的な結果。
【図6】ＣＤ６－ＡＤＣは、ＭＴＴアッセイによって測定して、インビトロで増殖性Ｔ細胞を殺傷する。様々な濃度のＣＤ６－ＡＤＣを、Ｔ細胞株であるＨＨ細胞とインビトロでインキュベートした。Ｔ細胞の生存を、ＭＴＴアッセイによって異なる時点で定量化した。
【図7】ＣＤ６－ＡＤＣは、ＰＩ組み込みアッセイによって測定して、インビトロで増殖性Ｔ細胞を殺傷する。様々な濃度のＣＤ６－ＡＤＣを、Ｔ細胞株であるＨＨ細胞とインビトロでインキュベートした。Ｔ細胞の生存を、ＰＩアッセイによって異なる時点で定量化した。
【図8】ＣＤ６－ＡＤＣは、ＭＴＴアッセイによって測定して、インビトロで増殖性Ｔ細胞を殺傷する。７２時間でのＩＣ５０は、約０．４ｎＭと計算された。
【図9】ＣＤ６－ＡＤＣは、トリパンブルーアッセイによって測定して、インビトロで増殖性Ｔ細胞を殺傷する。様々な濃度のＣＤ６－ＡＤＣ（ＡＤＣ）、裸の抗ＣＤ６ｍＡｂ（ＣＤ６）及び対照ＩｇＧ（ＩｇＧ）を、Ｔ細胞株であるＨＨ細胞とインビトロでインキュベートした。Ｔ細胞の生存を、トリパンブルーアッセイによって異なる時点で定量化した。
【図10】「裸の」抗ＣＤ６ｍＡｂは、低濃度ではインビトロで増殖性Ｔ細胞を殺傷しない。様々な濃度の抗ＣＤ６ｍＡｂ（ＵＭＣＤ６）を、Ｔ細胞株であるＨＨ細胞とインビトロでインキュベートした。Ｔ細胞の生存を、ＰＩアッセイによって異なる時点で定量化した。
【図11】対照非特異的ＩｇＧは、低濃度ではインビトロで増殖性Ｔ細胞を殺傷しない。様々な濃度の対照ＩｇＧ（ＩｇＧ）を、Ｔ細胞株であるＨＨ細胞とインビトロでインキュベートした。Ｔ細胞の生存を、ＰＩアッセイによって異なる時点で定量化した。
【図12】ＷＴマウスをレチナール抗原ＩＲＢＰで免疫し、ＥＡＵ（実験的自己免疫性ブドウ膜炎）を誘導した。脾細胞を１０日後に収集し、ＢｒｄＵの組み込みに基づく抗原特異的Ｔ細胞増殖アッセイに供した。すべての対照がここに示される。
【図13】マウス番号１９３の脾細胞を、様々な濃度の対照ＩｇＧ（ＩｇＧ）、裸の抗ＣＤ６ｍＡｂ（ＵＭＣＤ６）及びＣＤ６－ＡＤＣ（ＡＤＣ）の存在下で培養した。抗原特異的増殖性Ｔ細胞（ＢｒｄＵ＋）をフローで定量したところ、対照ＩｇＧでもＵＭＣＤ６でも見られなかったが、ＣＤ６－ＡＤＣは抗原特異的（ブドウ膜炎形成性Ｔ細胞）を濃度依存的に排除したことが示された。
【図14】マウス番号１９５の脾細胞を、様々な濃度の対照ＩｇＧ（ＩｇＧ）、裸の抗ＣＤ６ｍＡｂ（ＵＭＣＤ６）及びＣＤ６－ＡＤＣ（ＡＤＣ）の存在下で培養した。抗原特異的増殖性Ｔ細胞（ＢｒｄＵ＋）をフローで定量したところ、対照ＩｇＧでもＵＭＣＤ６でも見られなかったが、ＣＤ６－ＡＤＣは抗原特異的（ブドウ膜炎形成性Ｔ細胞）を濃度依存的に排除したことが示された。
【図15】マウス番号１９７の脾細胞を、様々な濃度の対照ＩｇＧ（ＩｇＧ）、裸の抗ＣＤ６ｍＡｂ（ＵＭＣＤ６）及びＣＤ６－ＡＤＣ（ＡＤＣ）の存在下で培養した。抗原特異的増殖性Ｔ細胞（ＢｒｄＵ＋）をフローで定量したところ、対照ＩｇＧでもＵＭＣＤ６でも見られなかったが、ＣＤ６－ＡＤＣは抗原特異的（ブドウ膜炎形成性Ｔ細胞）を濃度依存的に排除したことが示された。
【図16】インビトロ殺傷の結果のまとめ。
【図17】裸の抗ＣＤ６ｍＡｂでも対照ＩｇＧでも見られないが、ＣＤ６－ＡＤＣは、インビボでブドウ膜炎形成性Ｔ細胞によって誘導されるＥＡＵからマウスを保護する。インビトロで増殖させたブドウ膜形成性Ｔ細胞を、本発明者らの確立されたプロトコルに従ってナイーブレシピエントマウスに養子移入した。次いで、これらのレシピエントマウスをランダムに３群に分け、０．５ｍｇ／ｋｇのＣＤ６－ＡＤＣ（ＡＤＣ）、裸の抗ＣＤ６ｍＡｂ（ＵＭＣＤ６）または対照ＩｇＧ（ＩｇＧ）で処理した。ＥＡＵの発症及び重症度を、間接検眼法によって毎日観察した。
【図18】ＶＨ２－ｈＩｇＧ１ＣＨ抗体断片の（Ａ）ＤＮＡ及び（Ｂ）アミノ酸配列を提供する（参照により本明細書に組み込まれる米国特許第１０，５６２，９７５号参照）。
【図19】ＶＨ４－ｈＩｇＧ１ＣＨ抗体断片の（Ａ）ＤＮＡ及び（Ｂ）アミノ酸配列を提供する（参照により本明細書に組み込まれる米国特許第１０，５６２，９７５号参照）。
【図20】ＶＨ４－ｈＩｇＧ１ＣＨ抗体断片の（Ａ）ＤＮＡ及び（Ｂ）アミノ酸配列を提供する（参照により本明細書に組み込まれる米国特許第１０，５６２，９７５号参照）。
【図21】ＶＬ－ｈＩｇＫＣＬ抗体断片の（Ａ）ＤＮＡ及び（Ｂ）アミノ酸配列を提供する（参照により本明細書に組み込まれる米国特許第１０，５６２，９７５号参照）。
【図22】ＣＤ６－ＡＤＣは増殖性ヒトＴ細胞を排除する。Ａ．ＣＤ６－ＡＤＣは増殖性Ｔ細胞を殺傷するが、Ｂ細胞は殺傷しない。ＨＨ細胞（Ｔヒト細胞株）及びＲａｊｉ細胞（ヒトＢ細胞株）を様々な濃度のＣＤ６－ＡＤＣまたは抗ＣＤ６ＩｇＧと６時間インキュベートした。細胞をＰＢＳで洗浄し、４８または７２時間培養し、トリパンブルー染色により死細胞を検出した。Ｂ．ＣＤ６－ＡＤＣは、用量依存的にヒトＣＤ４及びＣＤ８の両Ｔ細胞の数を有意に減少させる。Ｂ１．健康なドナーのＰＢＭＣを、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８Ａｂによって５日間活性化した。活性化中に、様々な濃度（０．５、２、４ｎＭ）のＣＤ６－ＡＤＣ、抗ＣＤ６ＩｇＧ、及びｍＩｇＧを添加した。ＣＤ４／ＣＤ８陽性細胞の頻度を、フローサイトメトリーによって検出した。Ｂ２．５日目の細胞収集の１６時間前にＢｒｄＵを培地に添加した。細胞を抗ＢｒｄＵ Ａｂで染色し、ＢｒｄＵの組み込みをフローサイトメトリーで分析した。Ｂ３．ＣＦＳＥを使用して、細胞増殖を追跡するためにＰＢＭＣを標識し、ＣＦＳＥ分裂細胞をフローサイトメーターによって検出した。各細胞型の数は、次のように計算した：各ウェルの総細胞数×陽性細胞の頻度。Ｃ．４ｎＭのＣＤ６－ＡＤＣ及び対照によるＣＤ４及びＣＤ８Ｔ細胞へのＢｒｄＵの組み込みの代表的な結果。
【図23】ＣＤ６－ＡＤＣは、活性化された抗原特異的Ｔ細胞を殺傷する。ａＥＡＵモデルのマウスの脾細胞を、様々な濃度（０．５、２、４ｎＭ）のＣＤ６－ＡＤＣ、抗ＣＤ６ＩｇＧ及びｍＩｇＧの存在下、ＩＲＢＰペプチドで３日間再刺激した。細胞採取の１６時間前にＢｒｄＵを添加した。ＢｒｄＵの組み込みをフローサイトメトリーによって検出した。Ａ．ＢｒｄＵ組み込みＣＤ４陽性細胞の代表的な結果。Ｂ．３匹のマウスの結果のまとめ。
【図24】０．５ｍｇ／ｋｇのＣＤ６－ＡＤＣは、インビボで休止中のＴ細胞に有意な影響を与えない。ナイーブｈｔｇＣＤ６マウスに、０．５ｍｇ／ｋｇのＣＤ６－ＡＤＣを静脈内注射した。末梢血中のＴ細胞の頻度を、フローサイトメトリーによって観察した。Ａ１．リンパ球中のＣＤ３Ｔ細胞のパーセンテージ。Ａ２及びＡ３．ＣＤ３Ｔ細胞におけるＣＤ４及びＣＤ８Ｔ細胞のパーセンテージ。Ｎ＝３。
【図25】ＣＤ６－ＡＤＣ処理により、ブドウ膜炎形成性Ｔ細胞（ｔＥＡＵ）の養子移入によって誘導される実験的自己免疫性ブドウ膜炎が軽減される。０．５ｍｇ／ｋｇのＣＤ６－ＡＤＣまたは対照を、誘導と同じ日にｈｔｇ ＣＤ６ ｔＥＡＵマウスに投与した。Ａ及びＢ．ＣＤ６－ＡＤＣ処理マウスは、臨床及び組織学的スコアの低下を示した。Ｎ＝５／群。Ｃ．移入後８日目のＣＤ６－ＡＤＣ処理マウス及び対照マウスにおける局所内視鏡眼底画像（ＴＥＦＩ）、共焦点走査型レーザー検眼鏡（ｃＳＬＯ）及びスペクトル領域光干渉断層撮影（ＳＤ－ＯＣＴ）の代表的な画像。ＣＤ６－ＡＤＣ処理ｔＥＡＵマウスは、対照マウスよりもはるかに少ない異常を示した。Ｄ．眼底画像に表示される炎症を定量化した。Ｅ．１８日目のｔＥＡＵのＣＤ６－ＡＤＣ処理マウス及び対照マウスの代表的な組織病理学的画像。ｍＩｇＧ及び抗ＣＤ６ＩｇＧ処理マウスは、有意な網膜ひだ及び硝子体の浸潤細胞を示したが、組織病理学的変化はＣＤ６－ＡＤＣ処理マウスで緩和された。
【図26】ＣＤ６－ＡＤＣ処理により、能動実験的自己免疫ブドウ膜炎（ａＥＡＵ）が減少する。ｈｔｇＣＤ６マウスをＩＲＢＰペプチドで免疫し、ａＥＡＵを誘導した。Ａ．６日目に、共焦点走査型レーザー検眼鏡（ｃＳＬＯ）の画像は、網膜に浸潤細胞を示し、これが、処理の開始に対する論理的根拠を与えた。Ｂ．０．５ｍｇ／ｋｇのＣＤ６－ＡＤＣまたはｍＩｇＧ－ＡＤＣ処理を、６日目から３日ごとにａＥＡＵのマウスに施した。ＣＤ６－ＡＤＣ処理マウスは、ＩｇＧ－ＡＤＣ処理マウスと比較して低い臨床スコアを示した。Ｎ＝６／群。Ｃ．免疫後１４日目のＣＤ６－ＡＤＣ処理マウス及び対照マウスにおける共焦点走査型レーザー検眼鏡（ｃＳＬＯ）及びスペクトル領域光干渉断層撮影（ＳＤ－ＯＣＴ）の代表的な画像。Ｄ．画像定量化。Ｅ１．ＣＤ６－ＡＤＣ処理マウスは、組織学的スコアの減少を示した。Ｅ２．２０日目のｔＥＡＵのＣＤ６－ＡＤＣ処理及び対照マウスの代表的な組織病理学的画像。ａＥＡＵは、ＣＤ６－ＡＤＣ処理によって緩和され、網膜のひだ及び細胞浸潤が少なくなった。
【図27】ＣＤ６－ＡＤＣ処理により、ヒトＰＢＭＣによって誘導されるＧＶＨＤの重症度が低下する。ＧＶＨＤモデルを、ヒトＰＢＭＣの注射によりＮＳＧマウスで誘導した。０．５ｍｇ／ｋｇのＣＤ６－ＡＤＣまたはｍＩｇＧ－ＡＤＣを３日目から３日ごとにＧＶＨＤマウスに投与した。Ａ．ヒトＣＤ４５及びＣＤ３陽性細胞の頻度（Ａ１及びＡ２）ならびに絶対数（Ａ３及びＡ４）は、ＣＤ６－ＡＤＣ処理マウスの末梢血で減少した。各図中の小挿入図は、接種後最初の３日間のヒトＣＤ４５及びＣＤ３陽性細胞の増加を示した。Ｎ＝５／群。Ｂ．２７日目のヒトＣＤ４５及びＣＤ３陽性細胞の代表的なフローの結果。Ｃ．ＣＤ６－ＡＤＣ処理マウスは、最終的に体重が増加したが、ｍＩｇＧ－ＡＤＣ処理マウスは、ＧＶＨＤの進行中に体重が減少した。Ｄ．ＣＤ６－ＡＤＣ処理マウスは、２７日目に脾臓（Ｄ１）と骨髄（Ｄ２）の両方でヒトＣＤ４５及びＣＤ３陽性細胞が対照より減少した。Ｅ．ＣＤ６－ＡＤＣ処理マウスは、１２日目に血漿中のＩＦＮ－ガンマのレベルが対照マウスより低かった。
【図28】抗ＣＤ６ｍＡｂで染色された、実施例２からのＭＣＬ組織アレイの代表的な走査画像を示す。Ａ．組織アレイの一部であるスライド。Ｂ．ＣＤ６染色のＭＣＬ生検標本。Ｃ．より高い倍率の同じ標本。
【図29】Ａは、ＭＣＬ細胞株ＳＰ５３がＣＤ６＋であることを示す。ピンク：アイソタイプ対照で染色。青：抗ＣＤ６ＩｇＧで染色。Ｂは、ＣＤ６－ＡＤＣがインビトロでＭＣＬ細胞を強力に殺傷することを示す。ＳＰ５３ＭＣＬ細胞を、様々な濃度のＣＤ６－ＡＤＣまたは対照ＩｇＧ－ＡＤＣと７２時間インキュベートした。細胞死をトリパンブルー染色によって評価した。
【図30】Ａは、モノクローナル抗体ＵＭＣＤ６の重鎖の核酸配列（配列番号１８）を示し、フレームワーク領域を赤で、３つのＣＤＲを青で示す。Ｂは、モノクローナル抗体ＵＭＣＤ６の重鎖のアミノ酸配列（配列番号１９）を示し、フレームワーク領域を赤で、３つのＣＤＲを青で示す。Ｃは、モノクローナル抗体ＵＭＣＤ６の軽鎖の核酸配列（配列番号２０）を示し、フレームワーク領域を赤で、３つのＣＤＲを青で示す。Ｄは、モノクローナル抗体ＵＭＣＤ６の軽鎖のアミノ酸配列（配列番号２１）を示し、フレームワーク領域を赤で、３つのＣＤＲを青で示す。ある特定の実施形態では、ＵＭＣＤ６の可変領域が、本明細書のシステム、組成物、及び方法において（例えば、ヒト－マウスキメラ抗体において）使用される。他の実施形態では、６つのＣＤＲのみ（例えば、ヒトフレームワークに移植されたもの）が、本明細書のシステム、組成物、及び方法で使用される。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
【図28A】
【図28B】
【図28C】
【図29】
【図30】
【配列表】
【国際調査報告】