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特表2023-550090生体細胞へのメカノポレーションベースのペイロード送達のための方法及びシステム
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-11-30
(54)【発明の名称】生体細胞へのメカノポレーションベースのペイロード送達のための方法及びシステム
(51)【国際特許分類】
C12M 1/00 20060101AFI20231122BHJP
C12N 1/00 20060101ALI20231122BHJP
【ＦＩ】
C12M1/00 A
C12N1/00 K
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023529914
(86)(22)【出願日】2021-11-18
(85)【翻訳文提出日】2023-05-30
(86)【国際出願番号】 US2021059856
(87)【国際公開番号】W WO2022109113
(87)【国際公開日】2022-05-27
(31)【優先権主張番号】63/115,507
(32)【優先日】2020-11-18
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】523180300
【氏名又は名称】セルフィー、インク．
【氏名又は名称原語表記】ＣＥＬＬＦＥ，ＩＮＣ．
【住所又は居所原語表記】９８０ Ａｔｌａｎｔｉｃ Ａｖｅｎｕｅ， Ｓｕｉｔｅ ＃１１０，Ａｌａｍｅｄａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ９４５０１ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ
(74)【代理人】
【識別番号】100101801
【弁理士】
【氏名又は名称】山田 英治
(74)【代理人】
【識別番号】100086531
【弁理士】
【氏名又は名称】澤田 俊夫
(74)【代理人】
【識別番号】100093241
【弁理士】
【氏名又は名称】宮田 正昭
(74)【代理人】
【識別番号】100095496
【弁理士】
【氏名又は名称】佐々木 榮二
(74)【代理人】
【識別番号】110000763
【氏名又は名称】弁理士法人大同特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】ハン、セウーン
(72)【発明者】
【氏名】サイチャー、イアン
(72)【発明者】
【氏名】アレクセーエフ、アレクサンダー
(72)【発明者】
【氏名】キム、オクチョル
【テーマコード（参考）】
4B029
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B029AA23
4B029BB01
4B029CC01
4B029DC05
4B029HA05
4B065AA01X
(57)【要約】
本明細書では、生体細胞へのメカノポレーションベースの高スループットペイロード送達のための方法及びシステムについて説明する。例えば、１つのシステムは１分当たり少なくとも１０億個の細胞、又は１分当たり少なくとも２５０億個の細胞を処理でき、これは従来の方法よりも大幅に多い。細胞処理装置は、複数の処理コンポーネントを積み重ねて形成された処理アセンブリを備える。各処理コンポーネントは、細胞培地中の細胞の濾過、メカノポレーション、及び／又は分離に使用できるチャネルを備える。この機能は、各チャネルの構成によって異なる。例えば、各チャネルは、各リッジが隣接する処理コンポーネントの１つと処理ギャップを形成するように、１つ又は複数のリッジを備える。リッジは側壁まで延びることも、壁とのバイパスギャップを形成することもできる。処理ギャップは、とりわけ、細胞がこれらのギャップを通過するときに細胞を圧縮し、それによってメカノポレーションプロセスが開始されるように構成できる。
【選択図】 図１Ｂ
【選択図】 図１Ｂ
【特許請求の範囲】
【請求項1】
主軸に沿って積み重ねられた複数の処理コンポーネントを含む処理アセンブリを具備し、各々の処理コンポーネントは、主軸に垂直な方向に延在し、細胞集団を含む細胞培地を流すように構成された複数のチャネルを備え、
各々のチャネルは１つ又は複数のリッジを備え、１つ又は複数のリッジの各々は隣接する処理コンポーネントの１つとギャップを形成し、そのギャップが細胞集団中の少なくとも１つの細胞の直径よりも小さいため、細胞集団がギャップを通過する間に少なくとも１つの細胞が圧縮される、
メカノポレーションを使用して細胞を処理する細胞処理装置。
【請求項2】
各々の処理コンポーネントがリング状になっており、主軸はリングの中心軸であり、
各々のチャネルは主軸から放射状に延びている、
請求項１に記載の細胞処理装置。
【請求項3】
処理コンポーネントのチャネルは互いに平行に伸びている、請求項１に記載の細胞処理装置。
【請求項4】
さらに、入口コンポーネントと、入口コンポーネントに対してシールされ内部キャビティを形成する出口コンポーネントとを備え、処理アセンブリは内部キャビティ内に配置される、
請求項１に記載の細胞処理装置。
【請求項5】
処理コンポーネントは、入口開口と出口開口とを備えるプレートであり、複数のチャネルが入口開口と出口開口との間に延在する、請求項１に記載の細胞処理装置。
【請求項6】
入口開口と出口開口の各々は主軸に垂直な平面内に三角形の境界を有する、請求項５に記載の細胞処理装置。
【請求項7】
入口プレートと出口プレートとをさらに備え、入口プレートと出口プレートとの間で主軸に沿って複数の処理コンポーネントが積み重ねられており、入口プレートは、各々の処理コンポーネントの出口開口内に延在し、異なる処理コンポーネントの出口開口内で異なる体積を占める入口突出部を備え、
出口プレートは、各々の処理コンポーネントの入口開口内に延在し、異なる処理コンポーネントの出口開口部内で異なる体積を占める出口突出部を備える、
請求項６に記載の細胞処理装置。
【請求項8】
入口開口及び出口開口の各々は、細胞集団を含む細胞培地の流れ方向に沿って変化する断面積を有し、それによって細胞培地の実質的に一定の線形流量を維持する、請求項５に記載の細胞処理装置。
【請求項9】
入口開口は、入口と各々のチャネルとの間に樹状ネットワークを形成する複数の分岐チャネルによって形成される、請求項５に記載の細胞処理装置。
【請求項10】
複数の処理コンポーネントの各々は複数の試薬分配経路を備え、複数の試薬分配経路の各々はチャネルのうちの１つの中に１つ又は複数のリッジに近接した試薬分配経路開口を含む、請求項１に記載の細胞処理装置。
【請求項11】
各々の処理コンポーネントは、第１の表面と、第１の表面の反対側の第２の表面を備え、処理コンポーネントのうちの１つの第１の表面は、隣接する処理コンポーネントのうちの1つの第２の表面と接合する、
請求項１に記載の細胞処理装置。
【請求項12】
処理コンポーネントのうちの1つの各々のチャネルは、処理コンポーネントのうちの１つの第１の隔壁と、
第１の分離壁の反対側にあり、第１の分離壁に平行な、処理コンポーネントのうちの１つの第２の分離壁と、
処理コンポーネントのうちの1つのチャネル壁と、
隣接する処理コンポーネントのうちの1つの第２の表面と、
で形成される、請求項１１に記載の細胞処理装置。
【請求項13】
処理アセンブリの少なくとも一部は、一次フィルター、メカノポレーター、又はセパレーターのうちの１つ又は複数として動作可能である。請求項１に記載の細胞処理装置。
【請求項14】
処理アセンブリは、細胞集団を含む細胞培地の線形流量が一次フィルターを通過するよりもメカノポレーターを通過する方が高くなるように、一次フィルターとメカノポレーターの両方として動作可能である、請求項１３に記載の細胞処理装置。
【請求項15】
処理コンポーネント全体の圧力降下を監視するための入口圧力センサーと出口圧力センサーをさらに備える、請求項１に記載の細胞処理装置。
【請求項16】
細胞媒体源への接続に使用される入口と、複数のチャネルの各々に流体結合され、細胞培地レシーバーへの接続に使用される出口と、
コレクタキャビティ及びコレクタポートを備え、コレクタキャビティは、コレクタポート、入口、及び複数のチャネルの各々と流体に結合されている、細胞培地コレクタと、
をさらに備え、
コレクタポートは、ガス流源への接続に使用されます。
請求項１に記載の細胞処理装置。
【請求項17】
入口はコレクタポートよりも処理アセンブリの近くに配置されている、請求項１６に記載の細胞処理装置。
【請求項18】
入口は処理アセンブリよりもコレクタポートの近くに配置されている、請求項１６に記載の細胞処理装置。
【請求項19】
細胞培地コレクタは、コレクタキャビティ内の細胞培地の１つ又はそれ以上のレベルを測定するための１つ又はそれ以上のレベルセンサをさらに備える、請求項１６に記載の細胞処理装置。
【請求項20】
細胞集団を含む細胞培地を細胞処理装置の入口を通して流すステップと、細胞処理装置内の細胞媒体を、細胞処理装置の主軸に沿って積み重ねられた各処理コンポーネント内の複数のチャネルに分配するステップと、
複数のチャネルを通して細胞培地を流すステップであって、複数のチャネルの各々は１つ又は複数のリッジを備え、１つ又は複数のリッジの各々は隣接する処理コンポーネントの１つと細胞の直径よりも小さくなるようにギャップを形成する、ステップと、
を有し、
細胞培地を複数のチャネルに流すことにより、細胞集団がギャップを通過する間に細胞集団内の少なくとも１つの細胞が圧縮され、
細胞培地の一部が複数のチャネルのそれぞれに入る際に実質的に同じ圧力を受ける間に、複数のチャネルを通して細胞培地を流す、
細胞処理装置を用いて細胞を処理するメカノポレーション方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【0001】
本出願は、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．セクション１１９（ｅ）に基づく２０２０年１１月１８日に出願された米国仮特許出願第６３／１１５，５０７号の利益を主張し、その開示内容全体をあらゆる目的で参照により本明細書に組み込む。
【背景技術】
【0002】
細胞内送達には、遺伝子トランスフェクション、編集、細胞標識、細胞調査など、多くの貴重な用途がある。しかし、従来の送達方法（例えば、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、ケミカルポレーション、及びソノポレーション）は、特に大きな分子（例えば、少なくとも２０００ｋＤａのサイズを有する分子）及び大きな粒子（例えば、少なくとも５０ナノメートルのサイズの粒子）の場合、送達効率及び細胞生存率が低いことが実証されている。さらに、従来の送達方法の多くは細胞を高速で処理できない。例えば、多くの場合、細胞は個別に処理する必要があるため、処理速度が大幅に低下します。必要とされているのは、生体細胞への高スループットのペイロード送達のための新しい方法及びシステムである。さらに、多くの従来の送達方法は細胞を高速で処理することができない。例えば、多くの場合、細胞は個別に処理する必要があるため、処理速度が大幅に低下する。必要とされているのは、生体細胞への高スループットのペイロード送達のための新しい方法及びシステムである。
【発明の概要】
【0003】
本明細書では、生体細胞へのメカノポレーションに基づく高スループットペイロード送達のための方法及びシステムについて説明する。例えば、１つのシステムは１分当たり少なくとも１０億個の細胞、又は１分当たり少なくとも２５０億個の細胞を処理でき、これは従来の方法よりも大幅に多くなる。細胞処理装置は、複数の処理コンポーネントを積み重ねて形成された処理アセンブリを備える。各処理コンポーネントは、細胞培地中の細胞の濾過、メカノポレーション、及び／又は分離に使用できるチャネルを備える。この機能は、各チャネルの構成によって異なる。例えば、各チャネルは、各リッジが隣接する処理コンポーネントと処理ギャップを形成するように、１つ又は複数のリッジを備える。リッジは側壁まで延びることも、壁とのバイパスギャップを形成することもできる。処理ギャップは、細胞がこれらのギャップを通過するときに細胞を圧縮するように特別に構成でき、それによってメカノポレーションプロセスが開始される。
【図面の簡単な説明】
【0004】
【発明を実施するための形態】
【0005】
以下の説明では、本発明の完全な理解を提供するために、多くの具体的な詳細が概説される。本発明は、これらの特定の詳細の一部又は全部がなくても実施することができる。場合によっては、本発明を分かり難くすることを避けるために、よく知られたプロセス動作については詳細に説明していない。本発明を特定の実施例と併せて説明するが、本発明を実施例に限定することを意図したものではないことが理解されるであろう。
序論
序論
【0006】
マイクロ流体技術は、遺伝子工学及び他の応用のための細胞へのペイロードの送達など、生物学的細胞の処理及び操作のための新たな機会を提供する。本開示の目的上、「マイクロ流体」技術は、１ミリメートル未満の最小寸法を有するチャネルに流体を通過させるプロセスとして定義される。例えば、装置は、１ミリメートル未満のギャップを形成する１つ以上のくびれを含む場合がある。
【0007】
マイクロ流体技術の具体例は、細胞内にペイロードを送達するために細胞に対する機械的作用を伴うメカノポレーションである。例えば、細胞は狭いギャップ（狭窄とも呼ばれる）を通過する。ギャップは、例えば、ある壁から別の壁に向かって延びるリッジによって形成される。リッジ（及び結果としてギャップ）は、特定の形状（例えば、鋭いリッジ）を有することができる。さらに、細胞は特定の処理条件（例えば、高い線形流量）で飛行させることができる。これらの構造条件と加工条件のさまざまな組み合わせにより、細胞の急速な圧縮が発生し、細胞の体積がいくらか失われる可能性がある。細胞が各狭窄を通過して回復すると、細胞はペイロードを構成する周囲の培地を吸収して元の体積に戻る。したがって、体積損失とそれに続く体積増加の組み合わせにより、細胞へのペイロードの転送が非常に効率的に行われる。このペイロードの移動は、例えばペイロードが濃度勾配によって細胞膜を通って駆動される拡散ベースの送達と区別するために、対流送達と呼ぶことができる。しかし、拡散ベースの配送は時間がかかり、また小さなペイロードに限定される。メカノポレーションは大幅に高速な転送を実現し、ペイロードサイズによる影響が少なくなる。
【0008】
細胞圧縮は、それぞれが１つ又は複数のリッジを含むフローチャネル内で達成される。上述したように、各リッジはギャップを形成し、少なくとも弛緩状態／非圧縮状態の細胞では、ギャップサイズ（Ｇ）が細胞直径（Ｄ）より小さくなる。ギャップサイズ、リッジの形状、線形流量の組み合わせにより、細胞の圧縮と体積損失が発生する。体積変化を伴うメカノポレーションは、体積変化に基づいていない、そのうちの１つが上記で簡単に説明されている他のマイクロ流体技術とは区別されるべきである。例えば、他のマイクロ流体技術（例えば、膜剪断）は、細胞膜の多孔性を変化させることを伴い、それによって拡散ベースのペイロード送達を可能にする。より具体的には、膜の剪断には急速な圧縮や体積の変化は伴わない。代わりに、細胞は、細胞膜と全周接触を形成する先細の漏斗を通過する。この全周接触により、細胞膜の大部分が確実に剪断を受け、その結果、細胞内部でペイロードが拡散するのに十分な大きさの孔を有する膜孔が形成される。
【0009】
マイクロ流体技術の一態様は、フローチャネルのサイズが小さく、その結果、低いレイノルズ数（例えば、１未満）で表される流れ状態が得られる。したがって、流体の粘度はこれらの流動条件の支配的な要因となる。さらに、単一チャネルの全体的なスループットは制限される。例えば、幅１ミリメートルの単一チャネルの体積流量は１ｍｌ／分未満となり得る。この流量は、１時間当たり約１０7個の細胞の処理速度に相当します。同時に、産業用途では、１時間当たり１０9個又は１０10個の細胞など、はるかに高速な処理速度が必要であり、これにより、これまでマイクロ流体技術の採用が大幅に制限されてきた。
【0010】
さらに、処理速度は、あらゆる可能なプロセス及び材料の変動にかかわらず、設定値又は設定値に近い値に維持されるべきである。例えば、細胞培地に望ましくない粒子、異常細胞、及びその他の同様の成分が含まれることが多く、これらはマイクロチャネル、特にチャネル内のリッジによって形成されるギャップを通過することができない。このような培地成分は一部のチャネルに蓄積し、チャネルを通る流れをブロックする可能性があり、それによって装置全体の処理能力が低下する。
【0011】
チャネルの処理速度を向上させるために、さまざまなアプローチが利用できる。例えば、チャネルを通って流れる提供された細胞培地中の細胞濃度を増加させることができる。但し、細胞濃度が高くなると（例えば、１，０００万細胞／ｍＬ以上）、望ましくない細胞間の衝突が発生する可能性がある。これらの細胞間の衝突は細胞に損傷を与える可能性があり、それにより細胞の回復と生存率が低下する。さらに、これらの衝突によりチャネルの詰まりが発生し、処理速度が低下する可能性がある。
【0012】
別のアプローチは、チャネルにわたる圧力差を増加させることによって線形流速を増加させることである。例えば、１ｍ／ｓの線速度では、チャネルによっては１０6Ｐａもの高い圧力差が必要になる場合がある。このような高圧差動装置には、複雑で高価な装置が必要である。さらに、流速が速いと細胞に損傷を与える可能性がある。
【0013】
処理速度を向上させるための別のアプローチには、複数の並列チャネルを使用することが含まれる。このアプローチは、線形流速／圧力差、細胞濃度、及び他の同様の方法の増加を必要とせずに、体積流量を比例的に増加させる。但し、このマルチチャネルのアプローチでは、すべてのチャネルで同じ又は類似の条件を保ち、並行して動作させるための特別な考慮が必要である。この処理条件の均一性を維持するのは困難な場合がある。例えば、すべてのチャネルは、培地の線形流速、培地中の細胞濃度、培地中のペイロード濃度などを同様に有する必要がある。さらに、これらの条件は複数の処理実行／異なるバッチにわたって保たれる必要がある。
【0014】
本明細書では、上述のさまざまな課題に対処する、生物学的細胞の集団へのメカノポレーションに基づく高スループットペイロード送達のための方法及びシステムについて説明する。具体的には、細胞処理装置は、いくつかの例では交換可能及び／又は使い捨てであり得る処理アセンブリを含む。処理アセンブリの少なくとも個々のコンポーネントは、例えば、場合によってはチャネルの部分的な詰まりを引き起こす可能性がある処理後に、容易に交換することができる。例えば、（所与の体積流量に対する）圧力差が処理アセンブリ及び処理アセンブリ全体にわたって測定されるか、又はこの圧力差が特定の閾値に達するかそれを超えると、アセンブリの一部のコンポーネントが交換される。さらに、処理アセンブリのコンポーネントを交換して、処理アセンブリの異なる構成、例えば、異なるメカノポレーション特性を形成することができる。最後に、個々のコンポーネントは、射出成形などを使用して簡単に製造できる。
細胞処理装置例
細胞処理装置例
【0015】
図１Ａ及び図１Ｂは、いくつかの例による、細胞処理装置１００の概略図（組み立てられた形態及び分解図）である。細胞処理装置１００は、処理アセンブリ１１０、入口コンポーネント１０２、及びストッパー１０４を備える。処理アセンブリ１１０は、入口コンポーネント１０２とストッパー１０４との間に配置される。より具体的には、各入口コンポーネント１０２及びストッパー１０４は、処理アセンブリ１１０に対して密閉される。集合的に、アセンブリ１１０、入口コンポーネント１０２、及びストッパー１０４は、細胞処理装置１００のキャビティ１０７を画定し、取り囲む。キャビティ１０７は入口開口とも呼ばれる。いくつかの例では、細胞処理装置１００は、キャビティ１０７内に配置された分配コンポーネント１０６も備える。
【0016】
図１Ａ及び図１Ｂを参照すると、入口コンポーネント１０２は、キャビティ１０７への流体アクセスを提供する入口１０３を備える。細胞処理装置１００の動作中、細胞の集団を含む細胞培地は入口１０３を通ってキャビティ１０７内に送達される。その後、分配コンポーネント１０６が送達される。細胞培地をキャビティ１０７の異なる部分に、且つ処理アセンブリ１１０に向かって均一に分配する。
【0017】
処理アセンブリ１１０は、複数のチャネル１３９を備え、各チャネル内でメカノポレーションを受けながら細胞培地が処理アセンブリ１１０を通過できるようにする。いくつかの例では、処理アセンブリ１１０は、少なくとも約１００のチャネル、少なくとも約５００のチャネル、さらには少なくとも約１０００のチャネルを備える。図１Ａ及び図１Ｂの例を参照すると、各チャネル１３９は、細胞処理装置１００の主軸１０１から処理アセンブリ１１０を通って放射状に延在する。しかしながら、他の例（例えば、チャネル１３９が互いに平行に延在する場合）もまた、本発明の範囲内にある。
【0018】
図２Ａは、底面斜視図とも称される、異なる角度からの細胞処理装置１００の別の概略図である。この例では、ストッパー１０４は出口を含まない。その代わりに、筐体内に出口が設けられてもよい（図１Ａ、１Ｂ、及び２Ａには示されていない）。及び出口のさまざまな例を以下にさらに説明する。
【0019】
図２Ｂは、図２Ａの処理アセンブリ１１０の拡大図であり、処理アセンブリ１１０を形成する処理コンポーネント１１９を示す。例えば、処理コンポーネント１１９は、細胞処理装置１００の主軸１０１に沿って（Ｚ方向に）一体的に積み重ねられる。この例では、主軸１０１は中心軸とも呼ばれる。具体的には、処理コンポーネント１１９は、主軸１０１がこれらのリングの中心を通って延びるリングの形状をしている。
【0020】
より具体的には、図２Ｂは、Ｚ軸に沿って積み重ねられた処理コンポーネント１１１、第２の処理コンポーネント１１２、及び第３の処理コンポーネント１１３を示す。処理コンポーネント１１９は、任意の数（例えば、１、２、３、４、５、又はそれ以上）の処理コンポーネントを含むことができる。この数は、以下でさらに説明するように、細胞処理装置１００の所望の処理速度／処理スループットに依存する。処理コンポーネント１１９の数が多いほど、細胞処理装置１００をより長期間使用することも可能になることに留意されたい。具体的には、これらの処理コンポーネント１１９のチャネルは、時間の経過とともに詰まる可能性がある。処理コンポーネント１１９の数が多いほど、チャネルの数が多くなり、詰まりが生じるまでに時間がかかることになる（例えば、チャネルが詰まり続けても、能力が低下した細胞処理装置１００は動作し続けることができる）。しかしながら、処理コンポーネント１１９の数を増やすと、各チャネルへの細胞培地の均一な分布に関してさまざまな課題が生じる可能性がある。上述したように、各チャネルは、実質的に同じ方法で、例えば同じ流量、圧力、培地濃度などで細胞を処理する必要がある。
【0021】
図２Ｃを参照すると、処理コンポーネント１１１はチャネル１３９を含む。各処理コンポーネント１１１は、任意の数のチャネルを含むことができる。処理コンポーネントの数と同様に、このチャネル数は、細胞処理装置１００の所望の処理速度／スループットに依存する。したがって、細胞処理装置１００の全体の処理スループットは、各チャネルのスループット、各処理コンポーネントのチャネル数、及び装置内の処理コンポーネントの数に依存する（次の式で示す）：
装置スループット＝チャネルスループット×コンポーネント当たりのチャネル数×コンポーネント数
装置スループット＝チャネルスループット×コンポーネント当たりのチャネル数×コンポーネント数
【0022】
いくつかの例では、各々の処理コンポーネント１１９は、例えば処理の一貫性及び相互運用性を確保するために、同じ設計を有する。例えば、処理コンポーネント１１９は、消耗品として供給され、細胞処理装置１００の使用前に処理コンポーネント１１１に組み込まれてもよい。
【0023】
いくつかの例では、各処理コンポーネント１１９は、例えば射出成形及び／又は熱エンボス加工を使用して個別に製造される。射出成形ツールは、ＣＮＣ機械加工及び／又はニッケルメッキによって形成することができる（例えば、リッジ１４０を形成するために使用されるツール部分）。処理コンポーネント１１９の他のコンポーネントとは異なり、リッジ１４０は、かなりの精度を必要とする多くの小さな特徴を有する。
【0024】
これらの処理コンポーネント１１９を積み重ねる前に、各処理コンポーネント１１９は、チャネルの底部に位置し、開口に向かって延びるリッジ１４０を有する開放チャネルを備える。この処理コンポーネント１１９が別の処理コンポーネント１１９と積み重ねられると、チャネルは閉じられ、リッジ１４０は他の処理コンポーネント１１９に面し、各々のこれらリッジ１４０とのギャップを形成する。いくつかの例では、各処理コンポーネント１１９は、すべてのチャネル壁を例えば図２Ｆに概略的に示されているように備える。例えば、各々の処理コンポーネント１１９は、互いに結合される２つの部分から形成されて、密閉されたチャネル１３０を形成することができる。これらの処理コンポーネント１１９は、一体的に積み重ねられて、細胞処理装置１００を形成することができる。いくつかの例では、それぞれが複数の密閉チャネルを備える個別に形成された処理コンポーネント１１９を使用して、チャネル寸法の均一性を改善することができる。チャネル１３９に使用される材料は、環状オレフィンコポリマー（ＣＯＣ）、環状オレフィンポリマー（ＣＯＰ）、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、及びポリスチレン（ＰＳ）などの熱可塑性プラスチックであってもよい。さらに、ガラス、シリコン、金属などの非熱可塑性材料を使用することもできる。
【0025】
いくつかの例では、２つの隣接する処理コンポーネント１１９は、熱接着、接着接着、溶剤接着、超音波接着、レーザー溶接、感圧接着剤、及び紫外線（ＵＶ）接着剤などの異なる方法を使用して一体的に接着される。さらに、いくつかの例では、２つの隣接する処理コンポーネント１１９の間にシールが形成され、これらのコンポーネント間で細胞培地が流れるのを防止する。シールは、コンポーネントを結合することに加えて、又はその代わりに形成されてもよい。いくつかの例では、シールは接着によって形成される。いくつかの例では、シールはガスケットによって形成される。図２Ｄ及び図２Ｅにシールの一例が示されている。具体的には、処理コンポーネント１１１はシールチャネル１２５を備え、第２の処理コンポーネント１１２はシール突出部１２６を備える。処理コンポーネント１１１が第２の処理コンポーネント１１２と積み重ねられるとき、シール突出部１２６はシールチャネル１２５に挿入され、シールを形成する。シール突出部１２６及びシール溝１２５の各々は（これらのコンポーネントによって形成されるシールと同様に）、周方向に閉じられていることに留意されたい。図２Ｂは、処理コンポーネント１１９のうちの２つの隣接する処理コンポーネントが、中間コンポーネントなしで直接相互にインターフェースする例を示す。
各チャネルに配置されたメカノポレーション機能の例
各チャネルに配置されたメカノポレーション機能の例
【0026】
図２Ｃを参照すると、各チャネル１３０は１つ以上のリッジ１４０を含む。これらのリッジ１４０のそれぞれは、細胞がこのリッジによって形成されたギャップを通過するときに細胞を圧縮するように構成される。いくつかの例では、リッジ１４０は、１つの細胞から１００の細胞、又は１００を超える細胞のよう、リッジの長さに沿って分布する複数の細胞を同時に圧縮するように構成されている。換言すれば、リッジの長さはリッジの直径よりもはるかに大きいので、複数の細胞を同じもので圧縮することができる。したがって、各チャネル１３０内のリッジ１４０の数は、細胞処理装置１００を通過する際に必要な圧縮の数に依存する。いくつかの例では、各チャネル１３０内のリッジ１４０の数は１から５０、より具体的には、５から１５などの２から２０である。いくつかの例では、各チャネル１３０のリッジの数は、細胞処理装置１００のすべてのチャネルで同じである。いくつかの例では、各チャネル１３０の全長は約０．０５ミリメートルから１００ミリメートルの間、より具体的には約１ミリメートルと１０ミリメートルの間である。チャネルの長さが短いと、所望の流速を生み出すために必要な圧力を下げるのに有利である。いくつかの例では、リッジ１４０はチャネルの長さに沿って均一に分布している。あるいは、リッジ１４０は、例えば細胞がリッジ１４０と相互作用する前に細胞の集束を可能にするために、チャネル出口の近くに集合させることができる。いくつかの例では、例えばリッジ１４０との相互作用後に細胞がより高速の流体中に留まる時間を長くするために、リッジ１４０はチャネル入口の近くに集合する。いくつかの例では、チャネル入口及び／又はチャネル出口は、処理コンポーネント１１９の前端及び後端に配置される。いくつかの例では、例えば製造プロセスにより各チャネル１３０に入る塵の量を減らすために、チャネル入口及び／又は出口は、処理コンポーネント１１９のチャネル壁１３２を通って配置され得る。
【0027】
さらに図２Ｃを参照すると、各チャネル１３０は、２つの隔壁１２０の間に配置されている。いくつかの例では、隔壁１２０の幅は、１マイクロメートルから１００マイクロメートル、又は０．１ｍｍから０．５ｍｍ、又は０．５ｍｍから１０ｍｍである。さらに、各チャネル１３０は、第１の隔壁１２１、第２の隔壁１２２、及びチャネル壁１３２によって画定される。リッジ１４０は、チャネル壁１３２から突出し、第１の隔壁１２１と第２の隔壁１２２との間に延びることができる。しかし、リッジ１４０の高さは、第１の隔壁１２１及び第２の隔壁１２２の高さよりも小さい。いくつかの例では、第１の隔壁１２１の高さは、第２の隔壁１２２の高さと同じである。いくつかの例では、隔壁１２０の高さは、１マイクロメートルから５０マイクロメートル、又は２０マイクロメートルから５００マイクロメートル、又は０．１ミリメートルから１０ミリメートル、又は１０ミリメートルを超える。Ｙ方向のチャネル幅は、圧縮リッジ１４０によって同時に処理される細胞の数を定義する。チャネルが広いと、より多くの細胞を並行して圧縮することができる。しかしながら、より広いチャネルは、（例えば、チャネル内の内圧により）変形し易く、リッジ１４０によって形成されるギャップの均一性に影響を与える。一方、狭いチャネルは、より詰まり易い。いくつかの例では、チャネル幅は約１０マイクロメートルから約１ミリメートル、より具体的には約０．１ミリメートルから０．５ミリメートル、又は約０．４ミリメートルから０．８ミリメートルである。いくつかの例では、チャネル幅は約１ミリメートルから約１０ミリメートル、又は５ミリメートルより広い。
【0028】
図２Ｄは、処理コンポーネント１１１及び第２の処理コンポーネント１１２を積み重ねる前の側断面図を示す。処理コンポーネント１１１は、隔壁１２０によって形成され、第２の処理コンポーネント１１２に面する第１の表面１２３を備える。第２の処理コンポーネント１１２は、このコンポーネントの隔壁１２０とは反対側を向き、第１の処理コンポーネント１１１に面する第２の表面１２４を備える。
【0029】
図２Ｅは、処理コンポーネント１１１及び第２の処理コンポーネント１１２の、これらのコンポーネントを積み重ねた後／処理アセンブリ１１０を形成した後の側断面図を示す。この段階で、処理コンポーネント１１１の第１の表面１２３は、第２の処理コンポーネント１１２の第２の表面１２４と接触し、それによって隣接するチャネル１３０を隔離する。いくつかの例では、第１の表面１２３は、第２の表面１２４に接着及び／又は封止される。これらのチャネルの高さ（Ｚ方向）は、隔壁（例えば、図２Ｄに示す第１の隔壁１２１）の高さによって画定される。リッジ１４０は隔壁よりも短いため、処理コンポーネント１１１のリッジ１４０は、第２の処理コンポーネント１１２の第２の表面１２４とのギャップ１４１を形成する。これらのギャップ１４１は、とりわけ、これらの細胞がギャップ１４１のそれぞれを通過するときに細胞を圧縮し、各細胞の体積変化を引き起こすように構成されている。次に、図２Ｆを参照して、追加のギャップ特徴について説明する。
【0030】
図２Ｆを参照すると、各ギャップ１４１は、「Ｈ」とラベル付けされた対応する高さで識別される。ギャップの高さは、細胞が圧縮されてギャップ１４１を通過するように選択される。換言すれば、ギャップの高さは細胞のサイズよりも小さい（Ｈ＜Ｄ）。図２Ｆは、リッジ１４０の断面輪郭が長方形である例を示していることに留意されたい。しかしながら、プロファイルの他の形状、例えば、円筒形、台形、又は三角形も範囲内である。いくつかの実施形態では、複数の圧縮面は直交していてもよい。
【0031】
少なくとも長方形のリッジ１４０の別の特徴は、Ｘ方向（「Ｌ」として識別される）におけるリッジ表面１４２の長さであり、これはリッジの厚さとも呼ばれる。いくつかの例では、リッジ表面の長さは約１マイクロメートルと１００マイクロメートルの間、より具体的には約２０マイクロメートルと５０マイクロメートルの間である。この長さは、線流量とともに、細胞がリッジによって圧縮される期間を定義する。いくつかの例では、リッジ表面１４２は第２の表面１２４に平行である。換言すれば、ギャップ１４１は２つの平行な表面によって画定される。これらの平行な圧縮面により、細胞全体の均一な圧縮が可能になる。さらに、圧縮面は収束及び／又は発散することができる。細胞の圧縮に加えて、リッジ１４０は細胞培地内で流体力学的混合も引き起こすことに留意すべきである。
【0032】
図２Ｆを参照すると、ギャップ１４１は、細胞サイズ、必要な圧縮、及びメカノポレーションの他の特性に基づいて選択される。いくつかの例では、ギャップ高さ（Ｈ）は、１マイクロメートルと２０マイクロメートルの間、又は１０マイクロメートルと１００マイクロメートルの間、又はより具体的には３マイクロメートルと８マイクロメートルの間である。さらに、ギャップ高さ（Ｈ）は、細胞の平均最大断面寸法として定義される細胞サイズ（Ｄ）に対して定義することもできる。より具体的には、細胞サイズに対するギャップ高さの比（Ｈ／Ｄ）が細胞の圧縮を定義する。いくつかの例では、このＨ／Ｄ比は２５％から７５％の間、より具体的には３０％から６０％の間である。内部チャネル高さ（ＩＨ）は、リッジ間の流速と細胞が連続する圧縮の間に費やす時間を定義する。いくつかの例では、ＩＨは約２マイクロメートルと１００マイクロメートルの間、より具体的には５マイクロメートルと１０マイクロメートルの間、又は１０マイクロメートルと１５マイクロメートルの間である。いくつかの例では、ＩＨは約１０マイクロメートルと１ｍｍの間、より具体的には５０マイクロメートルと１００マイクロメートルの間である。
【0033】
ギャップ高さ（Ｈ）は、同じチャネル内のすべてのリッジ１４０について同じであってもよい。あるいは、図２Ｆを参照すると、ギャップ高さ（Ｈ）は、異なるリッジ１４０に対して異なっていてもよい。例えば、ギャップの高さは、流れの方向に沿って減少し、それにより、細胞が細胞処理装置１００を通って流れるにつれて、細胞はより高い圧縮を受ける。いくつかの例では、より大きな細胞がより大きなギャップで圧縮されると、これらの細胞は（パンケーキのような）平らな形状を保持し、再び流れから除去されることなく小さなギャップを通過することができる。この機能は段階的圧縮と呼ばれる場合がある。さらに、より小さなギャップが（例えば、多様な集団内に）存在する場合、より小さな細胞の処理を開始する可能性がある。したがって、チャネルに沿って変化するギャップサイズを使用すると、不均一な細胞集団への対流細胞内送達を向上させることができる。さらに、さまざまな圧縮ギャップを持つこのようなチャネルを使用すると、細胞サイズの不均一性の影響を軽減することで細胞の選別を向上させることができる。
【0034】
細胞内送達は、細胞圧縮率によって制御される。細胞圧縮率は、リッジによって形成されたギャップを通過するために細胞が体積を失う割合である。細胞圧縮率は、流量、リッジの形状、細胞サイズに対するギャップ高さの比、リッジの幅、リッジの角度、及び圧縮表面コーティングによって決定することができる。さらに、細胞圧縮率の増加に伴って体積損失（Ｖloss）が増加することが判明した。所望の細胞圧縮率を達成するために、さまざまな処理及びデバイス特性を具体的に選択することができる。いくつかの例では、リッジ１４０は、例えば図２Ｇ～～２Ｊに概略的に示されるように、各流路の中心流れ軸１０９に対して０度～９０度の角度（α）で配向される。より具体的には、リッジ角度（α）は、１０度から３０度の間、又は３０度から９０度の間、より具体的には約４５度である。いくつかの例では、リッジ１４０は、例えば図２Ｇに示すように山形を形成する。あるいは、リッジ１４０は、例えば図２Ｈに示すように真っ直ぐである。いくつかの例では、隆起部１４０は、例えば図２Ｉ及び２Ｊに示されるように湾曲している。さらに、いくつかの例では、リッジ１４０は、例えば図２Ｇに示すように両方の側壁に延在することができ、又は、例えば図２Ｈ－２Ｊに示すように側壁の少なくとも一方と側壁ギャップを形成することができる。この側壁ギャップはガターと呼ばれることがあり、非圧縮細胞（例えば、リッジ１４０に沿って側壁ギャップに押し込まれる）を受け入れることができ、それによってチャネルが詰まる危険性が低減される。
【0035】
リッジ１４０の断面形状（図２Ｆに示す）が細胞圧縮プロファイルを画定することに留意されたい。いくつかの例では、形状は長方形（図２Ｆに示す）、台形、又は三角形である。いくつかの例では、圧縮ギャップ１４１を形成するリッジ表面１４２は、実質的に平坦（例えば、第２の表面１２４に平行）であるか、又はＸ軸に沿って変化するギャップを形成して傾斜している。いくつかの例では、リッジ面１４２はほぼ円筒形である。
【0036】
図２Ｆを参照すると、隣接するリッジ１４０の間、及び最後のリッジ及び出口の後のチャネル内の空間は、回復空間１４５とも呼ばれる場合。２つの隣接するリッジの間の回復空間１４５の（Ｘ方向における）長さは、リッジ間隔（Ｓ）とも呼ばれる。リッジ間隔は、流量、細胞の特性、前の圧縮のレベルなどによって異なる。いくつかの例では、リッジ間隔は、１マイクロメートルと１００マイクロメートルの間、又は５０マイクロメートルと１００００ミクロンの間、例えば２００マイクロメートルと５００マイクロメートルの間である。各回復空間１４５の体積及び流量は、平均回復時間、すなわち細胞が別の圧縮を受ける前に回復空間１４５内で費やす時間を決定する。回復時間が増加すると、体積ゲイン（Ｖgain）が増加することが分かっている。回復空間１４５の長さを長くすることによって回復時間を長くすることができる。
処理アセンブリのエンクロージャの例
処理アセンブリのエンクロージャの例
【0037】
上述したように、処理アセンブリ１１０は、主軸１０１に沿って積み重ねた複数の処理コンポーネント１１９を備える。各々の処理コンポーネント１１９は、主軸１０１に垂直な方向に延在し、細胞を流すように構成される複数のチャネル１３９を備える。処理アセンブリ１１０は、処理アセンブリ１１０を環境から隔離し、処理アセンブリ１１０に支持を提供し、各チャネル１３９への細胞培地の均一な流れを保証する、さまざまな筐体の例に封入することができる。
【0038】
図３Ａは、互いにシールされ、複数の処理コンポーネント１１９を備える処理アセンブリ１１０を封入する入口コンポーネント３１０（入口１０３を備える）及び出口コンポーネント３２０（出口１０５を備える）を備える細胞処理装置１００の一例の概略分解図である。図３Ｂは、図３Ａの細胞処理装置１００の概略断面図である。具体的には、入口コンポーネント３１０及び出口コンポーネント３２０は、処理アセンブリ１１０を収容する内部キャビティ３３０を画定する。内部キャビティ３３０の形状は、とりわけ、細胞培地（一般にＺ軸に沿って細胞処理装置１００を通って流れる）が処理アセンブリ１１０の各チャネル１３９に確実に均一に分配されるように特に規定される。複数のチャネル１３９が各処理コンポーネント１１９上に配置され、Ｘ軸に沿って互いにオフセットしていることに留意されたい。さらに、複数の処理コンポーネント１１９がＹ軸に沿って一体的に積み重ねられて、処理アセンブリ１１０を形成する。したがって、内部キャビティ３３０の形状は、細胞培地が入口１０３から各チャネル１３９に送達される間に、Ｘ軸並びにＹ軸に沿って均一な細胞培地分布を提供して、例えば各チャネル１３９を通る同じ流れを確保する。同様に、内部キャビティ３３０の形状は、細胞培地が各チャネル１３９から出て出口１０５に導かれる間に、Ｘ軸並びにＹ軸に沿って均一な細胞培地の収集を提供する（例えば、全体の流れに対する均一な抵抗を確保するために）。細胞培地は一般にＺ軸に沿って流れることに留意されさい。内部キャビティ３３０及びチャネル１３９の追加の特徴が、入口コンポーネント３１０を図解する図３Ｃ～３Ｆに示されている。入口コンポーネント３１０及び出口コンポーネント３２０は、例えば図３Ｂに示されているように、対称的な設計を有することができることに留意されたい。
【0039】
図３Ｃは、図３Ａの細胞処理装置１００の入口コンポーネント３１０の概略上面図である。入口コンポーネント３１０は、処理アセンブリ１１０を支持するように示されている。例えば、処理アセンブリ１１０は、細胞処理装置１００の組立中に入口コンポーネント３１０及び出口コンポーネント３２０を互いに取り付けて密封する前に、入口コンポーネント３１０（又は出口コンポーネント３２０）内に挿入することができる。図３Ｄは、図３Ｃの入口コンポーネント３１０の一部の拡大上面図であり、処理コンポーネント１１９内のチャネル１３９及びリッジ１４０を示す。図３Ｃ及び３Ｄでは最上部の処理コンポーネント１１９のみが示されているが、任意の数の処理コンポーネント１１９をＹ軸に沿って積み重ねることができる。図３Ｅ及び３Ｆは、いくつかの例による、内部キャビティ３３０の一部及び内部キャビティ３３０内に配置された処理コンポーネント１１９を示す、図３Ｃの入口コンポーネント３１０の概略断面図である。
【0040】
図４Ａは、入口プレート４３０と出口プレート４４０との間に積み重ねられた処理コンポーネント１１９によって形成される細胞処理装置１００のさらに別の例の概略斜視図である。図４Ｂは、図４Ａの細胞処理装置１００の概略分解図である。この例では、処理アセンブリ１１０は８つの処理コンポーネント１１９によって形成される。しかしながら、任意の数の処理コンポーネント１１９が本発明の範囲内である。図４Ｃは、図４Ａの細胞処理装置で使用される処理コンポーネント１１９の上面概略図であり、入口開口４１０及び出口開口４２０を示している。図４Ｃは、入口開口４１０と出口開口４２０との間に延びる複数のチャネル１３９も示す。この例では、各入口開口４１０及び出口開口４２０は、主軸１０１に垂直な（及び図４ＣのＸ－Ｚ平面に平行な）平面内に三角形の境界を有する。いくつかの例では、三角形の境界形状により、流れにおける停滞ゾーンの形成が防止される。
【0041】
細胞処理装置１００の動作中、細胞培地は入口プレート４３０を通って細胞処理装置１００に入り、入口プレート４３０に隣接する処理コンポーネント１１９の入口開口４１０に向けられる。すべての処理コンポーネント１１９の入口開口４１０が一致し、入口プレート４３０と出口プレート４４０との間で細胞処理装置１００を通る連続したトンネルを形成することができることに留意されたい。同様に、すべての処理コンポーネント１１９の出口開口４２０は一致し、入口プレート４３０と出口プレート４４０との間で細胞処理装置１００を通る連続的なトンネルを形成することができる。いくつかの例では、入口開口４１０の断面は同じであり、例えば図４Ｃに示されるように、出口開口４２０の断面の鏡像である。
【0042】
動作例に戻ると、細胞培地が入口プレート４３０に隣接した処理コンポーネント１１９の入口開口４１０内に入ると、細胞培地の一部がこの処理コンポーネント１１９のチャネル１３９を通って出口開口４２０に流れる。残りの細胞培地は、他の処理コンポーネント１１９の入口開口４１０に向けられる。最終的に、すべての細胞培地は、処理コンポーネント１１９のチャネル１３９を通って、処理コンポーネント１１９の出口開口４２０によって形成されるトンネルに入り、その後、細胞処理装置１００から除去される。
【0043】
いくつかの例では、細胞処理装置１００は、いくつかの実質的に同一の細胞処理コンポーネント１１９を積み重ねることによって組み立てられる。処理コンポーネント１１９の入口開口４１０及び出口開口４２０によって形成されるトンネルは、細胞培地の均一な分布及び収集を提供するが、これらのトンネルはまたトンネルを満たすためにかなりの量の細胞培地が必要である。この細胞培地の少なくとも一部（又はすべて）はトンネルから回収できない。したがって、トンネルは、細胞処理装置１００内の「デッドボリューム」を表す。この「デッドボリューム」を、これらのトンネル内に延びる特別な突起によって減少させることができる。具体的には、これらの外部突出（例えば、入口プレート４３０及び出口プレート４４０の一部として設けられる）により、処理コンポーネント１１９を同一にすることができ、必要なときに（例えば、処理コンポーネント１１９のチャネル１３９が詰まった場合）交換することができる。これらの突起の特徴について、図４Ｄ～４Ｇを参照して説明する。
【0044】
具体的には、図４Ｄは、入口プレート４３０と出口プレート４４０との間に処理コンポーネント１１９が積み重ねられた細胞処理装置１００の概略斜視図である。図４Ｅは、図４Ｄの細胞処理装置１００の概略断面図である。図４Ｆは、図４Ｄの細胞処理装置１００の分解断面図であり、いくつかのコンポーネント及び特徴をさらに示している。入口プレート４３０は、各処理コンポーネント１１９の出口開口４２０内に延在し、異なる処理コンポーネント１１９の出口開口内で異なる体積を占める入口突出部４３２を備える。具体的には、入口突出部４３２は先細りであり、最も近い（隣接する）処理コンポーネント１１９の出口開口部４２０の最大体積及び最も遠い処理コンポーネント１１９の出口開口部４２０の最小体積を遮断する。したがって、出口開口部４２０は（すべての処理コンポーネント１１９から）最少量の細胞培地、すなわち最も近い（隣接する）処理コンポーネント１１９を通って流れた細胞培地のみを運ぶため、最も近い（隣接する）処理コンポーネント１１９でブロックされていない体積は最大である。次の処理コンポーネント１１９の出口開口部４２０は、この次の処理コンポーネント１１９が最も近い（隣接する）処理コンポーネント１１９から受け取って流れてきて細胞培地を運ぶ。最後に、最も遠い処理コンポーネント１１９の出口開口部４２０は、すべての処理コンポーネント１１９を通過するすべての細胞培地を運び、それによって最も遮断されていない体積を必要とする。同様の方法で、図４Ｇを参照すると、出口プレート４４０は、各処理コンポーネント１１９の入口開口部４１０内に延在し、異なる１つの処理コンポーネント１１９の出口開口部４２０内で異なる体積を占める出口突出部４４２を備える。各入口開口４１０を通る異なる体積流量という同じ原理が入口側にも適用される。図４Ｈを参照して以下で説明するように、（入口及び出口トンネル内の異なる位置での）異なる体積流量とこれらのトンネルの（入口突出部４３２及び出口突出部４４２による異なる遮断体積によってもたらされる）異なる断面積とのマッチングにより、細胞処理装置１００内でより均一な線形流量が生成される。
【0045】
細胞培地は、さまざまな分配経路を使用して、それぞれのチャネル１３９に供給される。これらの経路は、とりわけ、各チャネル１３９を通る線形流量が実質的に同じになるように設計されている。この流量の均一性により、すべての細胞が同様の方法で処理され、例えば同じ圧縮率で同じ期間処理され、同じ緩和時間が許容されることが確保される。これらの経路は、分配コンポーネント１０６、処理アセンブリ１１０、及び／又は他のコンポーネントなどの細胞処理装置１００のさまざまなコンポーネントによって提供される。
【0046】
図４Ｈは、いくつかの例による、細胞処理装置１００の一部の断面図を示す。具体的には、図４Ｈは、分配コンポーネント１０６、外壁１５０、及び分配コンポーネント１０６と外壁１５０との間に配置された処理アセンブリ１１０を示す。分配コンポーネント１０６と処理アセンブリ１１０との間の空間は、処理アセンブリ１１０内のチャネル１３９に細胞培地を供給するために使用される。外壁１５０と処理アセンブリ１１０との間の空間は、チャネル１３９を通過した細胞培地を除去するために使用される。図４Ｈはまた、入口コンポーネント１０２に隣接している、細胞処理装置１００の上部にある分配コンポーネント１０６と処理アセンブリ１１０との間の空間に、細胞培地が送達されることを示す。細胞培地は、ストッパー１０４に隣接している、細胞処理装置１００の底部の外壁１５０と処理アセンブリ１１０との間の空間から除去されている。
【0047】
図４Ｈの断面図は、入口コンポーネント１０２とストッパー１０４との間に垂直に積み重ねられた６つのチャネル１３９を示す。細胞培地が分配コンポーネント１０６と処理アセンブリ１１０の間の空間に入るとき、細胞培地はチャネル１３９内に導かれる。明確化のため、処理コンポーネント１１１と第２の処理コンポーネント１１２によって形成されるチャネルを第１のチャネルと呼ぶことができ、第２の処理コンポーネント１１２と第３の処理コンポーネント１１３との間に形成されるチャネルを第２のチャネルと呼ぶことができる。細胞培地が第１のチャネルに入るにつれて、第１のチャネルを通過して分配コンポーネント１０６と処理アセンブリ１１０との間の空間に移動する細胞培地の体積流量は少なくなる。各チャネルが細胞培地の一部をチャネル内に流すことができるため、新しいチャネル毎に体積流量のさらなる減少が見られる。分配コンポーネント１０６と処理アセンブリ１１０との間の空間の断面積が一定のままである場合、細胞培地の線流量は体積流量に比例して低下する。図４Ｈに示される幅減少（Ｗ1＞Ｗ2＞Ｗ3）により、分配コンポーネント１０６と処理アセンブリ１１０との間の空間内で細胞培地の線形流速を実質的に一定に維持することが可能になる。同様であるが、逆のプロセスが外壁１５０と処理アセンブリ１１０の間の空間で起こる。追加の細胞培地が各新しいチャネルから受け取られるにつれて、その空間の体積流量は上から下に増加する。したがって、このスペースの幅は上から下に増加する（Ｗ'1＜Ｗ'2＜Ｗ'3）。全体として、線流速が細胞処理装置１００のすべての部分にわたって均一になるように、供給チャネルの断面積はチャネル層間で変化する。これにより、流れにおける停滞ゾーンの形成を防ぐことができる。
【0048】
いくつかの例では、処理コンポーネントのうちの１つ又は複数は、配布経路及び／又は収集経路を含む。これらの経路は、圧縮リッジを構成する処理チャネルとは区別される必要がある。図５Ａは、ツリー状構造に配置された分配経路１６０の一例を示す。各分配経路チャネルは、各分岐レベルで２つの同一のサブ経路に分岐し、各分岐に等しい流れ条件を提供する(例えば、これらの経路の各分岐に特定の直径を使用する)。これらのサブ経路は、分岐経路とも呼ばれる。この分岐構造により、各々のチャネル１３９のそれぞれが同じ線形流量を有することが保証される。さらに、すべてのチャネル１３９の断面積が同じである場合、体積流量も同じである。図５Ａは二方向分岐を示しているが、当業者であれば、分岐には任意の数のサブ経路（２、３、４など）が含まれることを理解できるであろう。さらに、図５Ａは２つのレベルの分割を示しているが、当業者であれば、任意の分割にはこれらの分割レベルの任意の数（２、３、４など）が含まれることが理解できるであろう。
【0049】
全体として、構成は図５Ａに示されており、他の同様の構成を使用して、すべての処理チャネルに、製品の品質と一貫性を維持するために必要な同量の培地、試薬、及び細胞が確実に供給されるようにすることができる。分配チャネルと収集チャネルで同様の流速を維持するには、Ａ＝Ｈ×Ｗで且つＮをチャネル数とした場合にＡtotal＝Ｎ×Ａとなるように、チャネルの総断面積（つまり、分岐の各レベルでのチャネル断面積の合計）を各分岐レベル（分配及び収集）で一定に保つことができる。チャネルの寸法は、チャネルが広すぎる場合の壁のたるみなどの製造上の制約により、Ｗ／Ｈが２０を超えないように設定することができる。平行なマイクロチャネルの数は、製造プロセス、分配及び収集チャネルネットワークを備えたマイクロチャネルレイアウトの設置面積、流体の流れを妨げたり変更したりするマイクロチャネル内の気泡の形成、及び供給チャネルの断面寸法によって制限される可能性があります。同様に、分岐チャネル構造を出口で使用して、培地及び処理された細胞を収集することができる。出口セクションのこのような配置を使用して、各処理チャネル１３９にわたって同様の流れ抵抗を確保することができる。
【0050】
図５Ｂは、処理コンポーネント、より具体的には、処理コンポーネント１１１と第３の処理コンポーネント１１３との間に積み重ねられた第２の処理コンポーネント１１２に設けられた、分配経路１６０の別の例を示す。この例では、分配経路１６０は、２つのチャネルと流体連通しており、処理コンポーネント１１１と第２の処理コンポーネント１１２によって形成されるチャネル１３０と、第２の処理コンポーネント１１２と第３の処理コンポーネント１１３によって形成されるチャネル１３０とである。したがって、分配経路１６０は、他のすべての処理コンポーネントに設けることができる。図５Ｃは、分配経路１６０が各処理コンポーネントに設けられている別のコンポーネントを示している。
【0051】
分配経路１６０は、図５Ｂ及び５Ｃに示されており、試薬のより効率的な使用（例えば、必要とされる高価な試薬の量を減らす）のために使用することができる。これらの例では、試薬は、細胞を含む培地と予備混合することなく、少なくとも処理アセンブリ１１０の予備混合の外側で、分配経路１６０を使用して処理チャネル１３０に直接供給することができる。このアプローチは、試薬が不安定で細胞培地中で分解する場合にも使用することができる。いくつかの例では、試薬の流速は、細胞培地の流速よりも少なくとも約１０倍、１００倍、さらには１０００倍低い。これらの例では、分配経路１６０は、処理チャネル１３０と比較してはるかに小さい断面積を有することができる。さらに、分配経路１６０内の圧力は、細胞培地の分配経路１６０への逆流を防ぐために、処理チャネル１３０内の圧力と一致するか、又はそれを超える。
【0052】
処理コンポーネント１１９における処理チャネル１３０の配置は、処理コンポーネント１１９及び処理アセンブリ１１０全体の形状に依存し得る。例えば、図２Ａは円形の処理コンポーネント１１９を示す。この例では、処理チャネル１３０は、例えば細胞処理装置１００の主軸１０１から放射状に延びる。処理コンポーネントが長方形である場合、処理チャネル１３０は互いに平行に延びることができる。円形層の使用には、個々の層の間に配置されたリング状のゴム製ガスケットを使用して漏れを防止できるという、より単純なスタック設計の利点がある。対照的に、長方形の層を使用すると、漏れが発生し易いアセンブリの角で流体が流れるのを防ぐためにガスケットの使用が必要になる場合がある。
【0053】
いくつかの例では、リッジ１４０を備える処理コンポーネント１１９は、リッジを有さない試薬送達コンポーネントと交互に配置される。これらの例では、処理チャネル１３０は、全体が処理コンポーネント１１９によって、又は処理コンポーネント１１９を試薬送達コンポーネントと積み重ねることによって形成され得る。
【0054】
チャネル設計には、ピラー、リッジ、チャネル狭窄などの試薬と培地の混合を促進する構造要素を含めることができる。磁気ビーズ、磁性フィラメント、音響駆動フィラメントなどの作動混合要素を含めることができる。混合により培地の均一性が保証される。
【0055】
いくつかの例では、装置は、並列に配置された複数の細胞処理装置１００を含むことができる。複数の並列デバイスの同時使用は、装置内の全体の流量の要件によって制限される可能性がある。いくつかの例では、フローは異なる装置に連続的に供給される。流量を減少させる重大な詰まりが検出されると、フローは次のデバイスに送られる。いくつかの例では、ある装置から別の装置へのフローの切り替えは、供給チャネル内の流量を監視することによって制御される。いくつかの例では、複数の細胞処理装置１００が直列に接続されて、多段階のメカノポレーションを提供する。いくつかの例では、複数の細胞処理装置１００の直列接続は、送達効率を向上させるため、又は異なるペイロードを細胞集団に順次送達するために実装される。
フィルターと分離の統合例
フィルターと分離の統合例
【0056】
いくつかの例では、細胞処理装置１００は、メカノポレーション以外の追加機能を実行するように構成されている。さらに、これらの追加機能の１つは、メカノポレーションが実行される同じ処理アセンブリ内で実行できる。例えば、処理コンポーネントは、フィルタリング及び細胞分離を実行するように構成され得る。
【0057】
図６Ａは、処理アセンブリ１１０を備える細胞処理装置１００の概略図であり、処理アセンブリ１１０は、一次フィルター５１０、メカノポレーション５２０、及びセパレーター５３０を備える。一次フィルター５１０、メカノポレーター５２０、及びセパレーター５３０の各々は、１つ又は複数の処理コンポーネントによって形成される。しかしながら、これらの処理コンポーネントの構成は、図６Ｂ及び６Ｃを参照して以下でさらに説明するように、一次フィルター５１０、メカノポレーター５２０、及びセパレーター５３０のそれぞれで異なる。図６Ａはまた、細胞処理装置１００の追加構成要素としてプレフィルター５０２及びミキサー５０４を示す。これらのコンポーネントは、処理アセンブリ１１０から分離されていてもよい。
【0058】
細胞は最初にプレフィルター５０２に送られる。プレフィルターの目的は、平均細胞サイズより著しく大きく、処理マイクロチャネルの詰まりを引き起こす可能性がある合成粒子及び生物学的粒子を（培地から）除去することである。プレフィルターのいくつかの例には、平均セルサイズに匹敵する分離を備えたポストのアレイ、処理チャネルのギャップと同様のギャップを形成するクロスチャネルリッジが含まれるが、これらに限定されない。
【0059】
次いで、前濾過された細胞が、プレフィルター５０２からミキサー５０４に送られる。いくつかの例では、培地（例えば、液体ベース）及び／又はペイロードもミキサー５０４に送られる。ミキサー５０４は、細胞を培地及びペイロードと混合して、細胞培地を形成する。次いで、細胞培地は処理アセンブリ１１０に送られる。より具体的には、細胞培地はまず一次フィルター５１０に送られ、そこで細胞はその圧縮性に基づいて濾過される。いくつかの例では、細胞は、一次フィルター５１０の後にミキサー５０４を使用してペイロードと混合される。一次フィルター５１０を通過した細胞は、その後メカノポレーター５２０に送られる。メカノポレーターの機能は上で説明されている。次いで、処理された細胞は、メカノポレーター５２０からセパレーター５３０に送られる。これらのコンポーネントのそれぞれについて、より詳細に説明する。
【0060】
メカノポレーター５２０と同様に、一次フィルター５１０は、細胞処理装置１００の主軸１０１に沿って積み重ねられる処理コンポーネントから形成される。一次フィルター５１０の処理コンポーネントは、メカノポレーター５２０の処理コンポーネントとともに積み重ねられてもよい。しかしながら、一次フィルター５１０の処理コンポーネントは、図６Ｂ及び６Ｃを参照して以下でさらに説明するように、メカノポレーター５２０の処理コンポーネントとは異なる。一次フィルター５１０は、サイズ又は機械的特性のせいでメカノポレーター５２０の隙間を通過できず、メカノポレーター５２０の処理チャネルに詰まり、メカノポレーター５２０の詰まりを引き起こす可能性がある異常な細胞及び他の粒子を捕捉するように構成されている。
【0061】
いくつかの例では、一次フィルター５１０を通る細胞培地の線形流速は、メカノポレーター５２０を通る線形流速よりも小さい（例えば、少なくとも約２倍小さい、少なくとも約５倍小さい、又はさらに約１０倍小さい）。一次フィルター５１０を通るより低い流速は、細胞が一次フィルター５１０内の捕捉された粒子及び非圧縮細胞の近くを通過するときの細胞の損傷を防ぐために使用される。いくつかの例では、線形流速の差は、例えば図６Ｂに概略的に示されるように、メカノポレーター５２０よりも一次フィルター５１０においてより多くの処理コンポーネント（及び対応するチャネル）を使用することによって達成される。図６Ｂは、一次フィルター５１０及びメカノポレーター５２０によって形成される処理アセンブリ１１０を備える細胞処理装置１００を示す。一次フィルター５１０の処理コンポーネントの数は、メカノポレーター５２０よりも多く、例えば、少なくとも約２倍、少なくとも約５倍、さらには約１０倍である。一次フィルター５１０及びメカノポレーター５２０の各処理コンポーネントが同じ数のチャネルを有し、これらのチャネルが同じ平均断面積を有すると仮定すると、一次フィルター５１０の各チャネルを通る線形流量とメカノポレーター５２０の各チャネルを通る線形流量の比は、一次フィルター５１０の処理コンポーネントの数とメカノポレーター５２０の処理コンポーネントの数の比に反比例する。したがって、一次フィルター５１０、メカノポレーター５２０、及び処理アセンブリ１１０の他のサブアセンブリの処理コンポーネントの数を使用して、これらのサブアセンブリのそれぞれを通る線形流量を制御することができる。これらの各サブアセンブリを通過する体積流量は同じであることに留意されたい。全体として、一次フィルター５１０、メカノポレーター５２０、及び他のサブアセンブリは、同じ処理アセンブリ１１０に統合することができる。あるいは、これらのサブアセンブリはスタンドアロンのコンポーネントとすることもできる。
【0062】
図６Ａを参照すると、細胞培地は、メカノポレーター５２０を通過した後、処理された細胞と残りの細胞培地（例えば、培地及び残りのペイロード）から分離するセパレーター５３０に供給され得る。これらの培地及び残りのペイロードは、リサイクル（例えば、ミキサー５０４に供給し戻す）することができ、これらのコンポーネントは、（例えば、処理アセンブリに供給される細胞培地の所望の組成を達成するために）新しい細胞、追加のペイロード、及び／又は追加の培地と組み合わされる。新しい試薬の量は、セパレーター５３０の分離効率に基づいて定義できる。
【0063】
図６Ｃを参照すると、いくつかの例では、セパレーター５３０は、チャネルの一方の側、例えば、第１の隔壁１２１に沿って細胞を集中させる斜めのリッジ１４０を備える。リッジ１４０の端部と第１の隔壁１２１との間の間隔は、側壁ギャップ１４３（又は「ガター」）と呼ばれることがある。細胞がチャネルを通って流れてリッジ１４０に遭遇すると、リッジ１４０は細胞を側壁ギャップ１４３に向ける一方、残りの培地（残りのペイロードを含む）がリッジ１４０とチャネルの別の壁との間の分離ギャップを通って流れることを許容する。分離ギャップは、図２Ｆを参照して上述したギャップ１４１と同様であり、細胞を圧縮するために使用される。セパレーター５３０はまた、側壁ギャップ１４３と位置合わせされ、セパレーター５３０から処理細胞を除去するために使用される第１の出口１４６を備える。さらに、セパレーター５３０は、（処理された細胞から分離された）残りの培地を除去するための第２の出口１４７を備える。上で述べたように、この培地はミキサー５０４に戻すことができます。
【0064】
いくつかの例では、細胞処理装置１００は、圧力、温度、酸素センサーなどのプロセス制御用のセンサーを備える。例えば、圧力センサーは、入口（処理チャネルの前）及び出口（処理チャネルの後）に配置され、処理チャネル全体にわたる、又はより具体的には、一次フィルター５１０全体にわたる及び／又はメカノポレーター５２０全体にわたる圧力降下を決定する。圧力差の監視を使用して詰まりを判断できる。いくつかの例では、細胞の状態を制御するために化学センサーが使用される。流量センサーを使用して流量を制御できる。センサーからの信号は、さまざまなデバイス（ポンプ、細胞培地供給など）の動作を制御するために使用できる。例えば、圧力と流量のデータを使用して、濾過エレメントの機能を制御できる。濾過エレメントが大量の粒子や異常な細胞を捕捉した場合、流量の低下又は圧力の増加を利用して処理を中断し、濾過エレメントを交換又は洗い流すことができる。
【0065】
図７Ａは、細胞処理装置１００を備える処理システム１９０の別の例の概略図である。細胞処理装置１００は、入口１０３及び出口１０５を備える。入口１０３は、滅菌バッグなどの細胞培地源１９１に接続するために使用される。出口１０５は、滅菌バッグなどの細胞培地レシーバー１９２に接続するために使用される。図７Ａには特に示されていないが、処理システム１９０は、さまざまなバルブ、コネクタなどを含むこともできる。
【0066】
図７Ｂ及び７Ｃを参照すると、細胞処理装置１００は、コレクタキャビティ７１２及びコレクタポート７２０を備える細胞培地コレクタ７１０を備える。処理システム１９０の動作中、コレクタキャビティ７１２は、まず（例えば、細胞培地供給源１９１からの）細胞培地で満たされる。例えば、コレクタポート７２０に流体的に結合されたデバイス（例えば、真空ポンプ）を使用して、コレクタキャビティ７１２内に減圧（例えば、１Ｐａと１ｋＰａの間）を作り出すことができる。この減圧により、細胞培地がコレクタポート７２０を満たす。このキャビティ充填動作中、出口１０５を通る流れは（例えば、出口バルブを使用して）遮断されることに留意されたい。コレクタキャビティ７１２が満たされると、フロースルー入口１０３は（例えば、入口バルブを使用して）ブロックされ、フロースルー出口１０５は使用可能になる。コレクタキャビティ７１２は、コレクタポート７２０に流体的に結合された同じ又は異なるデバイスを使用して、（例えば、１０５Ｐａ～１０６Ｐａの間に）加圧することができる。この圧力により、細胞培地は処理コンポーネント１１９を通って、又はより具体的には処理コンポーネント１１９内のチャネル１３９を通って流れる。
【0067】
図７Ｃを参照すると、出口１０５は、複数のチャネル１３９の各々に流体的に結合されている。コレクタキャビティ７１２は、コレクタポート７２０、入口１０３、及び複数のチャネル１３９の各々に流体的に結合されている。コレクタポート７２０は、ガス流源への接続に使用することができる。この例では、入口１０３は、コレクタポート７２０よりも処理アセンブリ１１０の近くに配置される。このアプローチは、上部充填と比較して、細胞培地に及ぼす機械的ストレスが少ない（穏やかな充填）。さらに、底部充填により泡立ちが少なくなる。いくつかの例では、上部充填デバイスには、細胞培地（液体）がコレクタキャビティ内で落ちる／飛び散るのを防ぐための液体ガイド機能が装備されている。
【0068】
図７Ｄ及び７Ｅは、図８Ａ及び８Ｂと同様に、細胞処理装置１００の追加の例の概略図であり、入口１０３は、処理アセンブリ１１０よりもコレクタポート７２０の近くに配置されている。充填中に、いくらかの気泡が細胞処理装置１００に導入される可能性があることに留意されたい。上部充填アプローチは、上部から空気を放出することによって気泡の形成を最小限に抑える。液体を下から充填し、最初に液体内に空気が残っている場合、空気を逃がすために液体を通過する必要があり、気泡が発生して液面センサーが混乱する可能性がある。上部充填アプローチは、例えば上部から空気を逃がして気泡の捕捉を避けるなど、気泡の形成を防ぐのに役立つ。
【0069】
図７Ｅを参照すると、いくつかの例では、細胞培地コレクタ７１０は、コレクタキャビティ７１２内の細胞培地の１つ以上のレベルを測定するための１つ以上のレベルセンサ７１４をさらに備える。レベルセンサ７１４のいくつかの例には、静電容量センサー、超音波センサー、及び磁気センサーが含まれるが、これらに限定されない。磁気センサーを使用する場合、キャビティ内に磁石を備えたフローターを配置できる。フローターは細胞培地のレベルに応じて位置を変更する。
動作方法例
動作方法例
【0070】
図９は、いくつかの例による、細胞処理装置１００を使用して細胞を処理するメカノポレーション方法９００に対応するプロセスフローチャートである。細胞処理装置１００のさまざまな例を上記で説明した。
【0071】
メカノポレーション方法９００は、細胞処理装置１００の入口１０３を通して細胞を含む細胞培地を流すステップ（ブロック９１０）を含む。いくつかの例では、細胞培地は、細胞の重力沈降を防ぐために細胞培地源１９１内で撹拌される。このような撹拌は、細胞培地源１９１内で一時的又は連続的な培地運動を引き起こす機械的又は磁気撹拌機によって達成することができる。
【0072】
メカノポレーション方法９００はまた、細胞処理装置１００の主軸１０１に沿って積み重ねられた処理コンポーネント１１９のそれぞれにおける複数のチャネル１３９の間で細胞処理装置１００内の細胞培地を分配するステップ（ブロック９２０）を含む。
【0073】
メカノポレーション法９００は、複数のチャネル１３９を通して細胞培地を流すステップ（ブロック９３０）をさらに含む。各チャネル１３９は、１つ又は複数のリッジ１４０を含む。各リッジ１４０は、ギャップ１４１が細胞培地中の細胞の直径よりも小さくなるように、処理コンポーネント１１９のうちの隣接するものと間隙１４１を形成する。例えば図２Ｆを参照して上述したように、細胞培地が複数のチャネル１３９を通って流れると、細胞がギャップ１４１を通過する間に細胞の圧縮が生じる。
【0074】
さらに、細胞培地の一部が複数のチャネル１３９の各々に入る際に同じ圧力を受ける間に、複数のチャネル１３９を通して細胞培地を流すことが実行される。この同じ加圧機能は、エアポンプ又は別の圧力源によって達成される。
結論
結論
【0075】
上記の概念は、理解を明確にするためにある程度詳細に説明されているが、特定の変更及び修正が添付の特許請求の範囲内で実施され得ることは明らかであろう。プロセス、システム、及び装置を実装するには多くの代替方法があることに留意されたい。したがって、本実施例は例示的なものであり、限定的なものではないと考えられる。
【図1A】
【図1B】
【図2A-2C】
【図2D】
【図2E】
【図2F】
【図2G】
【図2H】
【図2I】
【図2J】
【図3A】
【図3B】
【図3C-3D】
【図3E】
【図3F】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図4D-4G】
【図4H】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図6A】
【図6B】
【図6C】
【図7A】
【図7B】
【図7C】
【図7D】
【図7E】
【図8A】
【図8B】
【図9】
【国際調査報告】