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特表2023-550121銅および／または鉄を捕捉することによって腫瘍を治療するための方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-11-30
(54)【発明の名称】銅および／または鉄を捕捉することによって腫瘍を治療するための方法
(51)【国際特許分類】
A61K 31/80 20060101AFI20231122BHJP
A61K 31/395 20060101ALI20231122BHJP
A61K 33/244 20190101ALI20231122BHJP
A61K 51/06 20060101ALI20231122BHJP
A61K 49/10 20060101ALI20231122BHJP
【ＦＩ】
A61K31/80
A61K31/395
A61K33/244
A61K51/06 100
A61K49/10
A61K51/06 200
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023530633
(86)(22)【出願日】2021-11-19
(85)【翻訳文提出日】2023-07-14
(86)【国際出願番号】 FR2021052040
(87)【国際公開番号】W WO2022106787
(87)【国際公開日】2022-05-27
(31)【優先権主張番号】2011903
(32)【優先日】2020-11-19
(33)【優先権主張国・地域又は機関】FR
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】519433399
【氏名又は名称】エヌアッシュ テラギ
(71)【出願人】
【識別番号】511196870
【氏名又は名称】ユニベルシテ クロード ベルナール リヨン プルミエ
(71)【出願人】
【識別番号】523185257
【氏名又は名称】メックスブレイン
(71)【出願人】
【識別番号】513015441
【氏名又は名称】サントゥル ナシオナル ドゥ ラ ルシェルシュ シアンティフィック － セーエヌエールエス
【氏名又は名称原語表記】ＣＥＮＴＲＥ ＮＡＴＩＯＮＡＬ ＤＥ ＬＡ ＲＥＣＨＥＲＣＨＥ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＱＵＥ － ＣＮＲＳ
【住所又は居所原語表記】３，ｒｕｅ Ｍｉｃｈｅｌ Ａｎｇｅ，Ｆ－７５０１６ Ｐａｒｉｓ １６，Ｆｒａｎｃｅ
(71)【出願人】
【識別番号】514282002
【氏名又は名称】アンセルム（アンスティチュ ナシオナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシュ メディカル）
(71)【出願人】
【識別番号】508277405
【氏名又は名称】ホスピス・シビル・ドゥ・リヨン
【氏名又は名称原語表記】ＨＯＳＰＩＣＥＳ ＣＩＶＩＬＳ ＤＥ ＬＹＯＮ
(71)【出願人】
【識別番号】522116993
【氏名又は名称】アンスティチュ ナシオナル ドゥ ルシェルシュ プー ラグリキュルチュール，ラリモンタシオン エ ロンヴィロンヌモン
(74)【代理人】
【識別番号】110000338
【氏名又は名称】弁理士法人 ＨＡＲＡＫＥＮＺＯ ＷＯＲＬＤ ＰＡＴＥＮＴ ＆ ＴＲＡＤＥＭＡＲＫ
(72)【発明者】
【氏名】ティユモン，オリヴィエ
(72)【発明者】
【氏名】リュクス，フランソワ
(72)【発明者】
【氏名】ヴェルノ，デルフィヌ
(72)【発明者】
【氏名】ロドリゲス－ラフラス，クレール
(72)【発明者】
【氏名】ブリシャー，トマ
(72)【発明者】
【氏名】ナテュツィ，マルコ
(72)【発明者】
【氏名】グロン，アラン
(72)【発明者】
【氏名】シャンパーニュ，シモン
(72)【発明者】
【氏名】マルティニ，マテオ
(72)【発明者】
【氏名】ロッチ，ポール
【テーマコード（参考）】
4C084
4C085
4C086
【Ｆターム（参考）】
4C084AA12
4C084MA17
4C084MA56
4C084MA66
4C084NA14
4C084ZB261
4C084ZC711
4C085HH03
4C085HH07
4C085KA09
4C085KA28
4C085KA29
4C085KB07
4C085KB12
4C085KB56
4C085KB72
4C085LL18
4C086AA01
4C086AA02
4C086BC58
4C086FA05
4C086HA05
4C086MA01
4C086MA04
4C086MA17
4C086MA41
4C086MA56
4C086MA66
4C086NA14
4C086ZB26
4C086ZC71
(57)【要約】
本開示は、医薬における、特に腫瘍の治療のためのナノ粒子およびその使用に関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
下記式のナノ粒子であって：［Ｃｈ１］ｎ－ＰＳ－［Ｃｈ２］ｍ，
式中；
ＰＳは、有機または無機のポリマーマトリックスであり、
Ｃｈ１は、錯体を形成していないか、または金属カチオンＭ１と錯体を形成しているキレート基であり、
Ｍ１は、存在しないか、または、Ｃｈ１との錯体形成定数が、銅の錯体形成定数よりも小さく、特に少なくとも１０分の１よりも小さい金属カチオンから選択され、例えば、Ｍ１は、亜鉛またはアルカリ土類金属から選択され、特にカルシウムまたはマグネシウムであり、
Ｃｈ２は、前記キレート基Ｃｈ１と同一であるかまたは異なり、４０を超え、好ましくは５０を超える高い原子番号Ｚを有する金属カチオンＭ２と錯体を形成するキレート基であり、
（ｉ）前記キレート剤Ｃｈ１およびＣｈ２は、前記ポリマーマトリックスにグラフトされており、
（ｉｉ）ｎ／（ｎ＋ｍ）比率は１０％～１００％であり、かつ、
（ｉｉｉ）前記ナノ粒子の平均流体力学的直径は、１～５０ｎｍ、好ましくは２～２０ｎｍ、より好ましくは２～８ｎｍであることを特徴とする、ナノ粒子。
【請求項2】
少なくとも５０％の前記Ｃｈ１が、亜鉛、カルシウムまたはマグネシウムと錯体を形成していることを特徴とする、請求項１に記載のナノ粒子。
【請求項3】
前記キレート基Ｃｈ１、および、必要に応じてＣｈ２は、大環状物質、好ましくは１，４，７－トリアザシクロノナン三酢酸（ＮＯＴＡ）、１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－１，４，７，１０－四酢酸（ＤＯＴＡ）、１，４，７－トリアザシクロノナン－１－グルタル－４，７－二酢酸（ＮＯＤＡＧＡ）、および、１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン，１－（グルタル酸）－４，７，１０－三酢酸（ＤＯＴＡＧＡ）、２，２'，２''，２'''－（１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－１，４，７，１０－テトライル）テトラアセトアミド（ＤＯＴＡＭ）、および、１，４，８，１１－テトラアザシクロテトラデカン（サイクラム）、１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン（シクレン）、デフェロキサミン（ＤＦＯ）から選択されることを特徴とする、前記請求項のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項4】
前記金属カチオンＭ２が、放射線感受性増強物質および／または磁気共鳴画像法造影物質、特にガドリニウムまたはビスマスから選択されることを特徴とする、請求項１～３のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項5】
請求項１～４のいずれか一項に記載のナノ粒子であって、（ｉ）ＰＳは、ポリシロキサンマトリクスであり、
（ｉｉ）Ｃｈ１およびＣｈ２は、下記式（Ｉ）に示すＤＯＴＡＧＡキレート基であり、
【化1】
Ｓｉ－Ｃ結合によって前記ポリシロキサンマトリックスにグラフトされており、
（ｉｉｉ）Ｍ１は存在せず、Ｍ２はガドリニウムカチオンＧｄ３＋であり、
（ｉｖ）ｎ＋ｍは、５～５０、好ましくは１０～３０であり、かつ、
（ｉｖ）平均流体力学的直径は、２～８ｎｍであることを特徴とする、ナノ粒子。
【請求項6】
請求項１～５のいずれか一項に記載のナノ粒子のコロイド溶液。
【請求項7】
請求項１～５のいずれか一項に記載のナノ粒子のコロイド溶液と、１種以上の薬学的に許容される賦形剤とを含む、医薬組成物。
【請求項8】
対象における静脈内、腫瘍内または肺内投与のための注射用組成物であり、特に腫瘍における銅のインビボでの捕捉のための有効量のキレート基Ｃｈ１を含み、遊離した前記キレート剤は、例えば、組成物中において、少なくとも１０ｍＭの濃度であることを特徴とする、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項9】
対象における癌の治療、特に腫瘍における銅および／または鉄の前記インビボでの捕捉に使用するための、請求項７または８に記載の医薬組成物。
【請求項10】
前記組成物は、放射線感受性増強物質として使用するための有効量の金属カチオンＭ２、好ましくはガドリニウムを含み、前記対象は、前記組成物を投与した後に、放射線療法によって治療されることを特徴とする、請求項９に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【0001】
［技術分野］
本開示は、医薬の分野、特に銅および／または鉄を捕捉することによる腫瘍の治療のためのナノ粒子、およびその使用に関する。
本開示は、医薬の分野、特に銅および／または鉄を捕捉することによる腫瘍の治療のためのナノ粒子、およびその使用に関する。
【0002】
［従来技術］
生物中の銅および／または鉄の含有量を減少させることは、転移性癌を治療する際の興味深い戦略である。この減少は単純な治療計画によって提案されているが（Counter CM, Brady DC, Turski ML, & Thiele DJ (2015) Methods of treating and preventing cancer by disrupting the binding of copper in the map-kinase pathway 1(19) 0-4）、その考えは銅を錯体化できる薬剤の投与に注目している。いくつかの銅キレート剤：ペニシラミン、トリエンチン、ジスルフィラム、クリオキノール、およびテトラモリブデン酸塩、並びに鉄キレート剤も、これまで評価されており、銅に関しては、金属中毒：デフェロキサミン（ＤＦＯ）、デフェリプロン（ＤＦＰ）、デフェラシロクスを治療するために使用されている（Gaur et al, Inorganics, 2018, 6, 126）。興味深い前臨床的および臨床的結果が達成されているが、それらはしばしば制限されているか、またはそれらを使用することを妨げる可能性がある副作用と関連している。
生物中の銅および／または鉄の含有量を減少させることは、転移性癌を治療する際の興味深い戦略である。この減少は単純な治療計画によって提案されているが（Counter CM, Brady DC, Turski ML, & Thiele DJ (2015) Methods of treating and preventing cancer by disrupting the binding of copper in the map-kinase pathway 1(19) 0-4）、その考えは銅を錯体化できる薬剤の投与に注目している。いくつかの銅キレート剤：ペニシラミン、トリエンチン、ジスルフィラム、クリオキノール、およびテトラモリブデン酸塩、並びに鉄キレート剤も、これまで評価されており、銅に関しては、金属中毒：デフェロキサミン（ＤＦＯ）、デフェリプロン（ＤＦＰ）、デフェラシロクスを治療するために使用されている（Gaur et al, Inorganics, 2018, 6, 126）。興味深い前臨床的および臨床的結果が達成されているが、それらはしばしば制限されているか、またはそれらを使用することを妨げる可能性がある副作用と関連している。
【0003】
銅および／または鉄は、生命に不可欠な金属カチオンであるが、多くの他の金属カチオンもまた同様である。したがって、強力すぎるキレート剤の使用は、患者を、彼らの身体の他の部分において弱体化させる危険性があり、これは、化学療法に薬剤を使用するときにおける一般的な問題である。
【0004】
逆に言えば、十分に特異的ではなく、それ故、亜鉛、または、さらにはマンガン等の他の生体必須金属に対して大きな親和性を有するキレート剤の使用は、問題のある副作用をもたらす可能性がある。
【0005】
したがって、銅または鉄の減少に基づく治療戦略の１つの目的は、銅および／または鉄に対するキレート定数および特異性をますます大きくすることである。その結果、良好な有効性を確保しつつ、副作用を抑制することができる。別の目的はこの抽出の位置を標的することと、腫瘍環境中の銅および／または鉄を高度に正確に捕捉することである。
【0006】
インビトロで非常に効果的な銅キレート剤であるテトラチオモリブデン酸塩は、使用し得る銅の減少を誘導することにより、血管形成および腫瘍増殖の抑制に特に効果を示している（Alvarez HM, Xue Y, Robinson CD, Canalizo-Hernandez MA, Marvin RG, Kelly RA, Mondrag-n A, Penner-Hahn JE, & O’Halloran T V. (2010) Tetrathiomolybdate inhibits copper trafficking proteins through metal cluster formation Science (80-) 327(5963) 331-334, https://doi.org/10.1126/science.1179907）。
【0007】
しかしながら、この使用は依然として制限されており、治療中に、紅斑、視神経炎、嘔吐および白血球減少症などの望ましくない副作用が観察され、おそらく、体全体にわたる銅の非選択的抽出に関連している。
【0008】
Ｚｈｏｕらは、集合してカプセルを形成するポリマー内のキレート剤の組み合わせが、別の薬剤（レシキモド－Ｒ８４８）との結合を可能にすることを提案した。使用されるキレート剤はＴＥＴＡである。形成された粒子はサイズが大きく（ＲＰＴＤＨの分子量が４００ｋＤａを超える）、抽出能力が比較的限られており、錯化剤は、銅に対して比較的特異的であるが、安定性が低い。このように、５０μｇ／ｍｌ、すなわち５０ｐｐｍを超える銅イオンの含有量に対する銅の抽出能力（我々の体内の自然濃度よりも１桁以上高い）が実証されている（Zhou P, Qin J, Zhou C, Wan G, Liu Y, Zhang M, Yang X, Zhang N, & Wang Y (2019) Multifunctional nanoparticles based on a polymeric copper chelator for combination treatment of metastatic breast cancer Biomaterials 195 86-99, https://doi.org/10.1016/j.biomaterials.2019.01.007）。さらに、前臨床実験では、注射後、粒子による腫瘍の良好な標的化にもかかわらず、有意な割合のナノ粒子が６時間後に肝臓、脾臓、腎臓および肺において、さらに２４時間後に肺において見出されたことが観察された。
【0009】
近年、Ｗｕらは、銅を担持したナノ粒子の使用を提案しており、塩析し、次いで銅を捕捉する可能性を利用し、抗腫瘍効果を起こしている（Wu W, Yu L, Jiang Q, Huo M, Lin H, Wang L, Chen Y, & Shi J (2019) Enhanced Tumor-Specific Disulfiram Chemotherapy by in Situ Cu2+ Chelation-Initiated Nontoxicity-to-Toxicity Transition J Am Chem Soc 141(29) 11531-11539, https://doi.org/10.1021/jacs.9b03503）。表面ペグ化メソポーラスシリカに基づくこれらの粒子のサイズは、約１６５ｎｍである。しかしながら、これらの大きな粒子の生体内分布研究は、肺、脾臓、肝臓および心臓における高度の捕捉を実証した。銅捕捉という元来の可逆的な態様とは別に、当該粒子は、生体内の銅カチオンをキレート化する能力が低い。
【0010】
Ｆｅｎｇらは、銅（ブレオマイシン）を錯化する能力が知られている薬剤を充填したメソ多孔性硫化銅粒子の使用を提案した。このアプローチは赤外領域での吸収を開始するための硫化銅の光学特性のため有益であるが、それにもかかわらず、硫化銅の使用は錯化剤によって充填されていても、いくつかの領域に過剰量の銅を導入する危険性があることに留意すべきである。また、この使用にとって、該粒子は十分な分子を封入することができるように、サイズが大きく、平均で１１９．８ｎｍである。Feng Q, Zhang W, Li Y, Yang X, Hao Y, Zhang H, Li W, Hou L, & Zhang Z (2017) An intelligent NIR-responsive chelate copper-based anticancer nanoplatform for synergistic tumor targeted chemo-phototherapy Nanoscale 9(40) 15685-15695, https://doi.org/10.1039/c7nr05003h。
【0011】
デフェロキサミン（ＤＦＯ）は、鉄金属中毒の治療にも使用されており、鉄隔離による治療のために腫瘍学で使用された最初のキレート剤であった。したがって、ＤＦＯは、予備臨床試験において白血病および神経芽細胞腫を治療するための有望な結果を与えた（Wang et al., Iron and Leukemia, 2019, 38, 406）。
【0012】
しかしながら、これらの分子キレートの使用は、それらの迅速な排除、腫瘍を標的とすることの欠如、高用量でのそれらの毒性、およびそれらが引き起こす副作用によって制限されている。
【0013】
これらの様々な問題を克服するために、多くのチームが、鉄キレート剤をナノ粒子と組み合わせること、または鉄を本質的にキレートするナノ粒子を使用することを提案している。これによると、Ｊ．Ｐｅｒｒｉｎｇらは、鉄を本質的にキレート化するメラニンのナノ粒子の形成を提案した（Journal of Materials Science: Materials in medicine 2018, 29, 181）。これらの粒子はサイズが２２０ｎｍに近く、鉄を捕捉し、癌細胞死（横紋筋肉腫および神経膠芽腫）をもたらす能力が実証されている。しかしながら、ナノ粒子のサイズが大きいと、臨床使用にあまり適していない生体内分布を誘発する危険性がある。
【0014】
ＤＦＯの生体内分布を改善するために、従来のリポソームベースの薬物送達システムも提案されている。これは、Ｌａｎｇらによって提案された（ACS Nano, 2019, 13, 2176-2189）。彼らは、また、ＤＦＯを、このリポソーム内にて、ＨＩＦ１α（低酸素誘導因子１α）阻害剤と組み合わせ、通常、ＤＦＯとともに観察されるＨＩＦ１αの過剰発現を制限した。リポソーム内への封入が、約１００ｎｍのナノ粒子を得ることを可能にした。げっ歯類モデルにおけるインビトロおよびインビボの前臨床試験は、抗腫瘍作用を実証することを可能にした。それにもかかわらず、ナノ粒子のサイズのために、肝臓および脾臓における高度の蓄積が観察された。
【0015】
同じ推論に従い、Ｍ．Ｔｈｅｅｒａｓｉｌｐらは、ポリマーミセル内への異なる鉄キレート剤のカプセル化を提案した（RSC Advances, 2017, 7, 11158）。これらのミセルは当該ミセルのコアを形成する疎水性部分と、コロイド安定性をもたらす親水性部分とを有するポリマーから形成されている。これらのミセルは、異なる細胞株において抗癌活性を示し、サイズが約２５ｎｍであり、キレート剤に基づき、ｐＨに基づいて塩析を示した。
【0016】
これら全ての研究から、現在のところ、腫瘍の治療に使用するためにおける、腫瘍の効果的かつ特異的な標的化と、特に、およそｍｇ／Ｌ程度という有効濃度においてナノ粒子を投与することによる、生体内の銅および／または鉄の十分な局所でのキレート化との両方を可能にする解決策は存在しないことが明らかである。
【0017】
本開示の別の目的は、銅および／または鉄が一般に血液中を循環するときだけでなく、より具体的には腫瘍環境内でも捕捉されることを可能にする化合物を提供することである。特に、本開示の１つの目的は、腫瘍環境において、１リットル当たり１０μｍｏｌを超える銅および／または鉄、またはさらには１００μｍｏｌを超える銅および／または鉄を捕捉すること、すなわち、１００～１００００ｐｐｂの銅または鉄を局所的に捕捉することを可能にする化合物を提供することである。
【0018】
本開示の別の目的は、銅および／または鉄に対する高度の特異性を有するキレート化と、腫瘍環境における特に数日間または数週間の十分に長い滞留時間とを可能にする化合物を提供することである。
【0019】
本開示の別の目的は、体内の銅および／または鉄に取って代わるイオンを局所的に放出することができ、それによってその効果を中和することである。
【0020】
本開示の別の目的は、十分に小さく、転移、特に骨転移を含む多数の固形腫瘍を標的とすることを可能にする化合物を提供することである。
【0021】
本開示の別の目的は、腫瘍中の銅および／または鉄の両方を捕捉することと、放射線療法による治療のための放射線増感効果を提供することとの両方を可能する化合物を提供することである。このようにして、照射中、生体金属の局所的な捕捉が細胞修復機構を破壊し、放射線療法の効果を増幅するはずである。
【0022】
本開示は、これらの上述の目的のうちの１つ以上に関する状況を改善する。
【0023】
実際、腫瘍、特に原発性および／または転移性腫瘍の治療に適した、適切な生体分布および熱力学的および動力学的特性を有するキレートナノ粒子の使用が提案されている。
【0024】
第１の態様によれば、以下の式のナノ粒子が提案される：
［Ｃｈ１］ｎ－ＰＳ－［Ｃｈ２］ｍ，式中：
ＰＳは、有機または無機のポリマーマトリックスであり、
Ｃｈ１は、錯体を形成していないか、または金属カチオンＭ１と錯体を形成しているキレート基であり、
Ｍ１は、存在しないか、または、Ｃｈ１との錯体形成定数が、銅の錯体形成定数よりも小さく、特に少なくとも１０分の１よりも小さい金属カチオンから選択され、例えば、Ｍ１は、亜鉛またはアルカリ土類金属から選択され、特にカルシウムまたはマグネシウムであり、
Ｃｈ２は、前記キレート基Ｃｈ１と同一であるかまたは異なり、４０を超え、好ましくは５０を超える高い原子番号Ｚを有する金属カチオンＭ２と錯体を形成するキレート基であり、
（ｉ）前記キレート基Ｃｈ１およびＣｈ２は、前記ポリマーマトリックスＰＳにグラフトされており、
（ｉｉ）ｎ／（ｎ＋ｍ）比率は１０％～１００％、好ましくは４０％～６０％であり、かつ、
（ｉｉｉ）前記ナノ粒子の平均流体力学的直径は、１～５０ｎｍ、好ましくは２～２０ｎｍ、より好ましくは２～８ｎｍであることを特徴とする。
［Ｃｈ１］ｎ－ＰＳ－［Ｃｈ２］ｍ，式中：
ＰＳは、有機または無機のポリマーマトリックスであり、
Ｃｈ１は、錯体を形成していないか、または金属カチオンＭ１と錯体を形成しているキレート基であり、
Ｍ１は、存在しないか、または、Ｃｈ１との錯体形成定数が、銅の錯体形成定数よりも小さく、特に少なくとも１０分の１よりも小さい金属カチオンから選択され、例えば、Ｍ１は、亜鉛またはアルカリ土類金属から選択され、特にカルシウムまたはマグネシウムであり、
Ｃｈ２は、前記キレート基Ｃｈ１と同一であるかまたは異なり、４０を超え、好ましくは５０を超える高い原子番号Ｚを有する金属カチオンＭ２と錯体を形成するキレート基であり、
（ｉ）前記キレート基Ｃｈ１およびＣｈ２は、前記ポリマーマトリックスＰＳにグラフトされており、
（ｉｉ）ｎ／（ｎ＋ｍ）比率は１０％～１００％、好ましくは４０％～６０％であり、かつ、
（ｉｉｉ）前記ナノ粒子の平均流体力学的直径は、１～５０ｎｍ、好ましくは２～２０ｎｍ、より好ましくは２～８ｎｍであることを特徴とする。
【0025】
別の態様によれば、上記で定義されたナノ粒子のコロイド溶液が提案される。
【0026】
別の態様によれば、前記ナノ粒子のコロイド溶液および１つ以上の薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物が提案される。
【0027】
以下の段落に記載された特徴は、任意選択的に実施することができる。それらは、独立して、または互いに組み合わせて実施することができる：
一実施形態では、キレート基Ｃｈ１は、銅（ＩＩ）に対して１０１５を超える錯体形成定数を有するものから選択される。
一実施形態では、キレート基Ｃｈ１は、銅（ＩＩ）に対して１０１５を超える錯体形成定数を有するものから選択される。
【0028】
一実施形態では、キレート基Ｃｈ１は、銅（ＩＩ）との錯体形成の定数が、亜鉛との錯体形成の定数よりも少なくとも１０倍大きく、マグネシウムおよびカルシウムとの錯体形成の定数よりも少なくとも１０６倍大きいものから選択される。
【0029】
別の実施形態では、キレート基Ｃｈ１は、鉄（ＩＩ）との錯体形成の定数が亜鉛との錯体形成の定数よりも少なくとも１０倍大きく、マグネシウムおよびカルシウムとの錯体形成の定数よりも少なくとも１０６倍大きいものから選択される。
【0030】
一実施形態において、Ｃｈ１の少なくとも５０％は、アルカリ土類金属から選択される金属カチオンと錯体を形成している。
【0031】
一実施形態において、Ｃｈ１の少なくとも５０％は、亜鉛、カルシウムまたはマグネシウムと錯体を形成している。
【0032】
一実施形態では、前記キレート基Ｃｈ１、および、必要に応じてＣｈ２は、大環状物質、好ましくは１，４，７－トリアザシクロノナン三酢酸（ＮＯＴＡ）、１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－１，４，７，１０－四酢酸（ＤＯＴＡ）、１，４，７－トリアザシクロノナン－１－グルタル－４，７－二酢酸（ＮＯＤＡＧＡ）、および、１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン１－（グルタル酸）－４，７，１０－三酢酸（ＤＯＴＡＧＡ）、２，２'，２''，２'''－（１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－１，４，７，１０－テトライル）テトラアセトアミド（ＤＯＴＡＭ）、および、１，４，８，１１－テトラアザシクロテトラデカン（サイクラム）、１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン（シクレン）、およびデフェロキサミン（ＤＦＯ）または他の鉄キレート剤から選択される。
【0033】
一実施形態において、キレート基Ｃｈ１は、下記式（Ｉ）に示すＤＯＴＡＧＡである。
【0034】
【化1】
【0035】
一実施形態において、ＰＳは、ポリシロキサンマトリックスである。
【0036】
一実施形態において、前記ナノ粒子は、
ナノ粒子の総重量に対するケイ素の重量比率が５％～２５％の間であり、
ポリマーにグラフトされるキレート基の総数ｎ＋ｍは、ナノ粒子あたり５～５０、好ましくは１０～３０であり、かつ、
ナノ粒子は、２～８ｎｍの平均直径を有していることを特徴とする。
ナノ粒子の総重量に対するケイ素の重量比率が５％～２５％の間であり、
ポリマーにグラフトされるキレート基の総数ｎ＋ｍは、ナノ粒子あたり５～５０、好ましくは１０～３０であり、かつ、
ナノ粒子は、２～８ｎｍの平均直径を有していることを特徴とする。
【0037】
一実施形態において、前記ナノ粒子は、標的化剤、特にペプチド、免疫グロブリン、ナノボディ、抗体、アプタマーまたは標的化蛋白質で官能化されている。
【0038】
一実施形態において、金属カチオンＭ２は、放射線感受性増強物質および／または磁気共鳴画像法造影物質、特にガドリニウムまたはビスマスから選択される。
一実施形態において、前記ナノ粒子は、
（ｉ）ＰＳは、ポリシロキサンマトリクスであり、
（ｉｉ）Ｃｈ１およびＣｈ２は、下記式（Ｉ）のＤＯＴＡＧＡキレート基であり、
一実施形態において、前記ナノ粒子は、
（ｉ）ＰＳは、ポリシロキサンマトリクスであり、
（ｉｉ）Ｃｈ１およびＣｈ２は、下記式（Ｉ）のＤＯＴＡＧＡキレート基であり、
【0039】
【化2】
【0040】
共有結合によってポリシロキサンマトリックスにグラフトされており、
（ｉｉｉ）Ｍ１は存在せず、Ｍ２はガドリニウムカチオンＧｄ３＋であり、
（ｉｖ）ｎ＋ｍは、５～５０、好ましくは１０～３０であり、かつ、
（Ｖ）平均流体力学的直径は、２～８ｎｍであることを特徴とする。
（ｉｉｉ）Ｍ１は存在せず、Ｍ２はガドリニウムカチオンＧｄ３＋であり、
（ｉｖ）ｎ＋ｍは、５～５０、好ましくは１０～３０であり、かつ、
（Ｖ）平均流体力学的直径は、２～８ｎｍであることを特徴とする。
【0041】
一実施形態において、医薬組成物は、対象における静脈内、腫瘍内又は肺内投与のための注射用組成物であり、特に、腫瘍における銅および／又は鉄のインビボでの捕捉のための有効量のキレート基Ｃｈ１を含み、遊離したキレート剤は、例えば、前記組成物中において、少なくとも１０ｍＭの濃度である。
【0042】
一実施形態において、本開示は、対象における癌の治療、特に腫瘍における銅および／または鉄のインビボでの捕捉に使用するための医薬組成物を提供する。特に、この実施形態では、前記医薬組成物は、放射線感受性増強物質として使用するための有効量の金属カチオンＭ２、好ましくはガドリニウムを含んでもよく、前記対象は、前記組成物を投与した後に、放射線療法によって治療される。
【0043】
〔図面の簡単な説明〕
他の特徴、詳細、および利点は以下の詳細な説明を読み、添付の図面を検討することによって明らかになるのであろう：
図１
［図１］図１は、反応媒体中における遊離ガドリニウムのＨＰＬＣ－ＩＣＰ／ＭＳクロマトグラムを、保持時間Ｔｒ（ｍｉｎ）の関数として示している。
他の特徴、詳細、および利点は以下の詳細な説明を読み、添付の図面を検討することによって明らかになるのであろう：
図１
［図１］図１は、反応媒体中における遊離ガドリニウムのＨＰＬＣ－ＩＣＰ／ＭＳクロマトグラムを、保持時間Ｔｒ（ｍｉｎ）の関数として示している。
【0044】
図２
［図２］図２は、１ｍｇのＣｕＰＲｉＸ２０（３９５ｎｍでの励起）あたりに添加されたユウロピウムの量の関数として、５９０ｎｍでの発光強度を測定することにより、遊離ＤＯＴＡのＣｕＰＲｉＸ２０を滴定した結果を示している。
［図２］図２は、１ｍｇのＣｕＰＲｉＸ２０（３９５ｎｍでの励起）あたりに添加されたユウロピウムの量の関数として、５９０ｎｍでの発光強度を測定することにより、遊離ＤＯＴＡのＣｕＰＲｉＸ２０を滴定した結果を示している。
【0045】
【0046】
図４
［図４］図４は、Ａ５４９細胞の細胞運動性に対するＣｕＰＲｉＸ２０の濃度増加（０、５０、１００、５００、１０００μＭの遊離キレート、約０、１５０、３００、６００、９００、１２００、１５００および３０００μＭのガドリニウムに相当）の効果を示している。（Ａ）時間の関数としての創傷閉鎖の定量的分析。創傷の相対密度は、領域の密度に対する創傷の領域の密度の尺度である。
［図４］図４は、Ａ５４９細胞の細胞運動性に対するＣｕＰＲｉＸ２０の濃度増加（０、５０、１００、５００、１０００μＭの遊離キレート、約０、１５０、３００、６００、９００、１２００、１５００および３０００μＭのガドリニウムに相当）の効果を示している。（Ａ）時間の関数としての創傷閉鎖の定量的分析。創傷の相対密度は、領域の密度に対する創傷の領域の密度の尺度である。
【0047】
図５
［図５］図５は、Ａ５４９細胞の細胞運動性に対するＣｕＰＲｉＸ２０の濃度増加（０、１００、２００、３００、４００および５００μＭの遊離キレート、約０、３００、６００、９００、１２００および１５００μＭのガドリニウムに相当）の効果を示している。（Ａ）時間の関数としての創傷閉鎖の定量的分析。創傷の相対密度は、細胞領域の密度（％）に対する創傷の領域の密度の尺度である。データは平均±ＳＥＭ（ｎ＝６）として示す。（Ｂ）画像は、それぞれの状態が、元の創傷、並びにその２４時間後および４８時間後を示していることを示す。スケールバーは３００μｍを示している。
［図５］図５は、Ａ５４９細胞の細胞運動性に対するＣｕＰＲｉＸ２０の濃度増加（０、１００、２００、３００、４００および５００μＭの遊離キレート、約０、３００、６００、９００、１２００および１５００μＭのガドリニウムに相当）の効果を示している。（Ａ）時間の関数としての創傷閉鎖の定量的分析。創傷の相対密度は、細胞領域の密度（％）に対する創傷の領域の密度の尺度である。データは平均±ＳＥＭ（ｎ＝６）として示す。（Ｂ）画像は、それぞれの状態が、元の創傷、並びにその２４時間後および４８時間後を示していることを示す。スケールバーは３００μｍを示している。
【0048】
図６
［図６］図６は、Ａ５４９細胞の細胞運動性に対するＣｕＰＲｉＸ２０（０および５００μＭの遊離キレート，約０および１５００μＭのガドリニウムに相当する）の効果を示している。細胞をＣｕＰＲｉＸ２０で７２時間処理した後、創傷を作製した。（Ａ）時間の関数としての創傷閉鎖の定量的分析。創傷の相対密度は、細胞領域の密度（％）に対する創傷の領域の密度の尺度である。データは平均±ＳＥＭ（ｎ＝６）として示している。（Ｂ）画像は、それぞれの状態が、元の創傷、並びにその２４時間後および４８時間後を示していることを示す。スケールバーは３００μｍを示している。
［図６］図６は、Ａ５４９細胞の細胞運動性に対するＣｕＰＲｉＸ２０（０および５００μＭの遊離キレート，約０および１５００μＭのガドリニウムに相当する）の効果を示している。細胞をＣｕＰＲｉＸ２０で７２時間処理した後、創傷を作製した。（Ａ）時間の関数としての創傷閉鎖の定量的分析。創傷の相対密度は、細胞領域の密度（％）に対する創傷の領域の密度の尺度である。データは平均±ＳＥＭ（ｎ＝６）として示している。（Ｂ）画像は、それぞれの状態が、元の創傷、並びにその２４時間後および４８時間後を示していることを示す。スケールバーは３００μｍを示している。
【0049】
図７
［図７］図７は、Ａ５４９細胞の細胞浸潤に対するＣｕＰＲｉＸ２０（０および５００μＭの遊離キレート，約０および１５００μＭのガドリニウムに相当する）の効果を示している。（Ａ）時間の関数としての創傷閉鎖の定量的分析。創傷の相対密度は、細胞領域の密度（％）に対する創傷の領域の密度の尺度である。データは平均±ＳＥＭ（ｎ＝６）として示している。（Ｂ）画像は、それぞれの状態が、元の創傷、並びにその２４時間後および４８時間後を示していることを示す。スケールバーは３００μｍを示している。
［図７］図７は、Ａ５４９細胞の細胞浸潤に対するＣｕＰＲｉＸ２０（０および５００μＭの遊離キレート，約０および１５００μＭのガドリニウムに相当する）の効果を示している。（Ａ）時間の関数としての創傷閉鎖の定量的分析。創傷の相対密度は、細胞領域の密度（％）に対する創傷の領域の密度の尺度である。データは平均±ＳＥＭ（ｎ＝６）として示している。（Ｂ）画像は、それぞれの状態が、元の創傷、並びにその２４時間後および４８時間後を示していることを示す。スケールバーは３００μｍを示している。
【0050】
図８
［図８］図８は、Ａ５４９細胞の走化性遊走に対するＣｕＰＲｉＸ２０の効果を示している。遊走は、膜上に播種された最初の細胞のコンフルエンスに対しての、膜を通過した細胞のコンフルエンスの比として表されている。データは平均±ＳＥＭ（ｎ＝５）として示している。
［図８］図８は、Ａ５４９細胞の走化性遊走に対するＣｕＰＲｉＸ２０の効果を示している。遊走は、膜上に播種された最初の細胞のコンフルエンスに対しての、膜を通過した細胞のコンフルエンスの比として表されている。データは平均±ＳＥＭ（ｎ＝５）として示している。
【0051】
図９
［図９］図９は、Ａ５４９細胞の運動性に対するＣｕＰＲｉＸ３０と光照射との併用の効果を示している。創傷の相対密度は、細胞領域の密度（％）に対する創傷の領域の密度の尺度である。データは平均±ＳＥＭ（ｎ＝６）として示している。
［図９］図９は、Ａ５４９細胞の運動性に対するＣｕＰＲｉＸ３０と光照射との併用の効果を示している。創傷の相対密度は、細胞領域の密度（％）に対する創傷の領域の密度の尺度である。データは平均±ＳＥＭ（ｎ＝６）として示している。
【0052】
【0053】
【0054】
図１２
［図１２］図１２は、トリプルネガティブ乳癌マウスモデルにおけるＣｕＰＲｉＸ３０の（Ａ）腫瘍増殖および（Ｂ）転移に対する有効性を示している。（Ａ）腫瘍増殖は腫瘍の体積（１／２＊Ｌ＊Ｗ２、ここで、Ｌは腫瘍の長さであり、Ｗは腫瘍の幅である）として、時間の関数として、表される。データは平均値±標準偏差、＊ｐ＝０．０３８として示している。ＡＵＣ比較：Ｋｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ試験。（Ｂ）治療群別の肺からのコロニー数。ＮａＣｌ ｎ＝４、ＣｕＰＲｉＸ３０ ｎ＝６。
［図１２］図１２は、トリプルネガティブ乳癌マウスモデルにおけるＣｕＰＲｉＸ３０の（Ａ）腫瘍増殖および（Ｂ）転移に対する有効性を示している。（Ａ）腫瘍増殖は腫瘍の体積（１／２＊Ｌ＊Ｗ２、ここで、Ｌは腫瘍の長さであり、Ｗは腫瘍の幅である）として、時間の関数として、表される。データは平均値±標準偏差、＊ｐ＝０．０３８として示している。ＡＵＣ比較：Ｋｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ試験。（Ｂ）治療群別の肺からのコロニー数。ＮａＣｌ ｎ＝４、ＣｕＰＲｉＸ３０ ｎ＝６。
【0055】
【0056】
【0057】
〔発明の概要〕
図面および以下の説明は、実質的に明確な性質の要素を含む。したがって、それらは、本開示をより良く理解することのみならず、必要に応じ、それらの定義に寄与することにも役立つ。
図面および以下の説明は、実質的に明確な性質の要素を含む。したがって、それらは、本開示をより良く理解することのみならず、必要に応じ、それらの定義に寄与することにも役立つ。
【0058】
ナノ粒子
したがって、本開示は、下記式のナノ粒子であって：
［Ｃｈ１］ｎ－ＰＳ－［Ｃｈ２］ｍ、
ＰＳは、有機または無機のポリマーマトリックスであり、
Ｃｈ１は、錯体を形成していないか、または金属カチオンＭ１と錯体を形成しているキレート基であり、
Ｍ１は、存在しないか、または、Ｃｈ１との錯体形成定数が、銅、および／または鉄の錯体形成定数よりも小さく、特に少なくとも１０分の１よりも小さい金属カチオンから選択され、例えば、Ｍ１は、亜鉛またはアルカリ土類金属から選択され、特にカルシウムまたはマグネシウムであり、
Ｃｈ２は、前記キレート基Ｃｈ１と同一であるかまたは異なり、４０を超え、好ましくは５０を超える高い原子番号Ｚを有する金属カチオンＭ２と錯体を形成するキレート基であり、
（ｉ）前記キレート基Ｃｈ１およびＣｈ２は、前記ポリマーマトリックスＰＳにグラフトされており、
（ｉｉ）ｎ／（ｎ＋ｍ）比率は１０％～１００％であり、好ましくは、４０％～６０％であり、かつ、
（ｉｉｉ）前記ナノ粒子の平均流体力学的直径は、１～５０ｎｍ、好ましくは２～２０ｎｍ、より好ましくは２～８ｎｍであることを特徴とする、ナノ粒子に関する。
したがって、本開示は、下記式のナノ粒子であって：
［Ｃｈ１］ｎ－ＰＳ－［Ｃｈ２］ｍ、
ＰＳは、有機または無機のポリマーマトリックスであり、
Ｃｈ１は、錯体を形成していないか、または金属カチオンＭ１と錯体を形成しているキレート基であり、
Ｍ１は、存在しないか、または、Ｃｈ１との錯体形成定数が、銅、および／または鉄の錯体形成定数よりも小さく、特に少なくとも１０分の１よりも小さい金属カチオンから選択され、例えば、Ｍ１は、亜鉛またはアルカリ土類金属から選択され、特にカルシウムまたはマグネシウムであり、
Ｃｈ２は、前記キレート基Ｃｈ１と同一であるかまたは異なり、４０を超え、好ましくは５０を超える高い原子番号Ｚを有する金属カチオンＭ２と錯体を形成するキレート基であり、
（ｉ）前記キレート基Ｃｈ１およびＣｈ２は、前記ポリマーマトリックスＰＳにグラフトされており、
（ｉｉ）ｎ／（ｎ＋ｍ）比率は１０％～１００％であり、好ましくは、４０％～６０％であり、かつ、
（ｉｉｉ）前記ナノ粒子の平均流体力学的直径は、１～５０ｎｍ、好ましくは２～２０ｎｍ、より好ましくは２～８ｎｍであることを特徴とする、ナノ粒子に関する。
【0059】
本開示によるナノ粒子は、有利にはナノメートル範囲のサイズの粒子である。特に、ナノ粒子は、血管系を介したＥＰＲ効果を用いて腫瘍細胞を標的とし、静脈内投与後に腎臓で迅速に排除されるのに十分小さい。
【0060】
本開示によれば、好ましくは、例えば１～１０ｎｍ、好ましくは２～８ｎｍの非常に小さい直径を有するナノ粒子が使用される。
【0061】
ナノ粒子の粒度分布は、例えば、ＰＣＳ（光子相関分光法）に基づくＭａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ－Ｓなどの市販の粒度分析器を用いて測定される。この分布は、平均流体力学的直径によって特徴付けられる。
【0062】
したがって、本発明の目的のために、ナノ粒子の「直径」は、平均流体力学的直径、すなわち、粒子の直径の調和平均を測定する。このパラメータを測定する方法は、ＩＳＯ規格１３３２１：１９９６にも記載されている。
【0063】
本開示によるナノ粒子は、有機または無機のポリマーマトリックスＰＳを含むナノ粒子である。
【0064】
いくつかの実施形態では、マトリックスＰＳのポリマーは、ポリエチレングリコール、ポリエチレンオキシド、ポリアクリルアミド、バイオポリマー、多糖類もしくはポリシロキサンまたはそれらの混合物などの生体適合性ポリマーから選択され、好ましくは、ポリマーＰＳはポリシロキサンである。
【0065】
「ポリシロキサンポリマーマトリクスを含むナノ粒子」は、特に、ナノ粒子の総重量の少なくとも５重量％、例えば、５～２０重量％のケイ素の重量パーセントを特徴とするナノ粒子を意味する。
【0066】
「ポリシロキサン」は、シロキサンの鎖からなる無機架橋ポリマーを意味する。ポリシロキサンの構造単位は、同一であるかまたは異なり、次の式：
Ｓｉ（ＯＳｉ）ｎＲ４－ｎ；式中
Ｒは、Ｓｉ－Ｃ共有結合を介してケイ素に結合した有機分子であり、
ｎは、１～４の整数である。
Ｓｉ（ＯＳｉ）ｎＲ４－ｎ；式中
Ｒは、Ｓｉ－Ｃ共有結合を介してケイ素に結合した有機分子であり、
ｎは、１～４の整数である。
【0067】
好ましい例として、用語「ポリシロキサン」は特に、ゾル－ゲル法によるテトラエチルオルトシリケート（ＴＥＯＳ）とアミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）との縮合から得られるポリマーを包含する。
【0068】
本開示の目的において、「キレート基」は、金属カチオンを錯体することができる有機基を意味する。好ましくは、上述のキレート基は、ナノ粒子のマトリックスＰＳのポリシロキサンのケイ素に、共有結合を介して、直接的または間接的に結合される。「間接的」結合は、ナノ粒子とキレート基との間の「リンカー」または「スペーサー」分子の存在を意味し、上述のリンカーまたはスペーサーはナノ粒子の構成成分の１つに共有結合している。
【0069】
キレート基Ｃｈ１の特定の役割は、内因性銅または内因性鉄を捕捉することである。一実施形態では、銅のインビボでの捕捉を可能にするために、キレート基Ｃｈ１は、有利には銅（ＩＩ）に関して、１０１５超、例えば１０２０超の錯体生成定数を有するものから選択される。
【0070】
一実施形態では、鉄のインビボでの捕捉を可能にするために、キレート基Ｃｈ１は有利には鉄（ＩＩ）に関して、１０１５超、例えば１０２０超の錯体生成定数を有するものから選択される。
【0071】
一実施形態では、キレート基Ｃｈ１は遊離しているか、または少なくとも部分的に金属カチオンＭ１と錯体形成している。この場合、金属カチオンＭ１は、注意深く選択されたキレート基と錯体形成し、銅および／または鉄との、インビボでの金属カチオンＭ１のトランスメタル化を可能にする。したがって、具体的な実施形態では、キレート基Ｃｈ１は、有利には、銅（ＩＩ）または鉄との錯体形成の定数が、亜鉛との錯体形成の定数よりも少なくとも１０倍大きく、マグネシウムおよびカルシウムとの錯体形成の定数よりも少なくとも１０６倍大きいものから選択される。
【0072】
キレート基Ｃｈ１は、好ましくは、ＤＯＴＡ（１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－Ｎ，Ｎ'，Ｎ''，Ｎ'''－四酢酸）、ＮＯＴＡ（１，４，７－トリアザシクロノナン－１，４，７－三酢酸）、ＮＯＤＡＧＡ（１，４，７－トリアザシクロノナン－１－グルタル酸－４，７－二酢酸）、ＤＯＴＡＧＡ（２－（４，７，１０－トリス（カルボキシメチル）－１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－１－イル）ペンタン二酸）、ＤＯＴＡＭ（１，４，７，１０－テトラキス（カルバモイルメチル）－１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン）、および１，４，８，１１－テトラアザシクロテトラデカン（サイクラム）、１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン（シクレン）、デフェロキサミンから選択される大環状物質の、ナノ粒子へのグラフト（共有結合）によって得られる。デフェロキサミンは、鉄の捕捉を目的として、より特に有益である。
【0073】
一実施形態では、特に２つの前述の段落に記載の実施形態において、キレート基Ｃｈ１と錯体を形成する金属カチオンＭ１は、亜鉛またはアルカリ土類金属、特にマグネシウムまたはカルシウムから選択される。好ましくは、Ｃｈ１の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、またはさらに少なくとも９０％が亜鉛、カルシウム、マグネシウムまたは別のアルカリ土類金属と錯体を形成している。
【0074】
好ましい実施形態において、キレート基Ｃｈ１は、以下の式（Ｉ）のＤＯＴＡＧＡである：
【0075】
【化3】
【0076】
本開示によれば、Ｃｈ１と同一または異なるキレート基Ｃｈ２は、４０を超える、好ましくは５０を超える高い原子番号Ｚを有する金属カチオンＭ２と錯体形成されている。したがって、ナノ粒子は、ポリマーマトリックスＰＳにグラフトされ、金属カチオンＭ１、例えば、亜鉛、マグネシウム、カルシウムまたは他のアルカリ土類金属と錯体化しているか、または錯体化していない１つ以上のＣｈ１基と、４０を超える高い原子番号Ｚを有する金属カチオンＭ２と錯体化している１つ以上のＣｈ２基とを含んでいる。
【0077】
したがって、キレート基Ｃｈ２は、好ましくは金属カチオンＭ２との錯体生成定数が１０１５より大きいか、または１０２０より大きいキレート基から選択される。具体的な実施形態において、金属カチオンＭ２は、前記ナノ粒子を放射線感受性増強物質として使用することを可能にするものから選択される。
【0078】
本発明の範囲において、「放射線感受性増強物質」は、放射線療法に使用される放射線に対してがん細胞をより感受性にすることを可能にする化合物を意味する。
【0079】
キレート基Ｃｈ２はまた、Ｃｈ１と同一であるかまたは異なり、大環状物質、好ましくはＤＯＴＡ（１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－Ｎ，Ｎ'，Ｎ''，Ｎ'''－四酢酸）、ＮＯＴＡ（１，４，７－トリアザシクロノナン－１，４，７－三酢酸）、ＮＯＤＡＧＡ（１，４，７－トリアザシクロノナン－１－グルタル酸－４，７－二酢酸）、ＤＯＴＡＧＡ（２－（４，７，１０－トリス（カルボキシメチル）－１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－１－イル）ペンタン二酸）、ＤＯＴＡＭ（１，４，７，１０－テトラキス（カルバモイルメチル）－１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン）、および１，４，８，１１－テトラアザシクロテトラデカン（サイクラム）、１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン（シクレン）、およびデフェロキサミン（ＤＦＯ）から選択され得る。
【0080】
より詳細には、金属カチオンＭ２は、重金属から選択され、好ましくはＰｔ、Ｐｄ、Ｓｎ、Ｔａ、Ｚｒ、Ｔｂ、Ｔｍ、Ｃｅ、Ｄｙ、Ｅｒ、Ｅｕ、Ｌａ、Ｎｄ、Ｐｒ、Ｌｕ、Ｙｂ、Ｂｉ、Ｈｆ、Ｈｏ、Ｓｍ、ＩｎおよびＧｄ、またはそれらの混合物からなる群から選択される。金属カチオンＭ２は、好ましくはＢｉおよび／またはＧｄである。
【0081】
特定の実施形態では、本発明において使用されるナノ粒子は、３～１００個、好ましくは５～２０個の金属カチオンＭ２、特にＢｉおよび／またはＧｄを含む。
【0082】
本発明によるナノ粒子は、キレート基Ｃｈ１による銅および／または鉄の捕捉、ならびに／または、造影剤、放射線感受性増強物質または近接照射療法剤の特性を有する金属カチオンＭ２と錯体形成したキレート基Ｃｈ２による腫瘍の画像化若しくは治療の両方を可能にする。
【0083】
ＭＲＩ造影剤として使用することができる金属カチオンＭ２の例として、Ｇｄ、Ｄｙ、ＭｎおよびＦｅが挙げられる。
【0084】
放射線感受性増強物質として使用することができる金属カチオンＭ２の例として、Ｇｄ、Ｌｕ、ＹｂおよびＢｉ、ＨｆおよびＨｏ、好ましくはガドリニウムまたはビスマスが挙げられる。
【0085】
当業者は所望の効果に基づいて、特に、所望の治療、患者のタイプ、使用される用量および／または治療される患者に基づいて、ｎ／（ｎ＋ｍ）比率を選択するのであろう。例えば、ｎ／（ｎ＋ｍ）比率は、２０％以上、特に２０％～１００％、好ましくは４０％～６０％である。一実施形態では、ｎ／（ｎ＋ｍ）は１００％に等しい。言い換えれば、金属カチオンＭ２と錯体を形成するキレート剤Ｃｈ２の数を表すｍは０に等しく、キレート基Ｃｈの１００％が金属カチオンＭ１と錯体を形成しているか、または錯体を形成していない。
【0086】
より具体的な実施形態では、キレート基Ｃｈ１はキレート基Ｃｈ２と同一であり、下記式（Ｉ）のＤＯＴＡＧＡに対応し：
【0087】
【化4】
【0088】
ナノ粒子のマトリクスＰＳ、例えばポリシロキサンマトリクスにグラフトされている。
【0089】
別のより具体的な実施形態では、キレート基Ｃｈ１はキレート基Ｃｈ２と同一であり、以下の式（ＩＩ）のＤＯＴＡに対応し：
【0090】
【化5】
【0091】
ナノ粒子のマトリクスＰＳ、例えばポリシロキサンマトリクスにグラフトされている。
【0092】
したがって、一実施形態において、本開示は、
ナノ粒子［Ｃｈ１］ｎ－ＰＳ－［Ｃｈ２］ｍに関し：
式中
ＰＳは有機または無機のポリマーマトリックスであり、
Ｃｈ１はＤＯＴＡまたはＤＯＴＡＧＡであり、錯体を形成していないか、または金属カチオンＭ１と錯体を形成しており、
Ｍ１は存在しないか、またはＣｈ１との錯体形成の定数が銅および／または鉄の錯体形成定数よりも小さく、特に少なくとも１０分の１よりも小さい金属カチオンから選択され、例えば、Ｍ１は亜鉛またはアルカリ土類金属、特にカルシウムまたはマグネシウムから選択され、
Ｃｈ２は、Ｃｈ１と同一であり、ＤＯＴＡまたはＤＯＴＡＧＡであり、４０を超え、好ましくは５０を超える高い原子番号Ｚを有する金属カチオンＭ２、好ましくはＧｄと錯体を形成し、
（ｉ）キレート基Ｃｈ１およびＣｈ２は、ポリマーマトリックスにグラフトされ、
（ｉｉ）ｎ／（ｎ＋ｍ）比率は１０％～１００％、好ましくは４０％～６０％であり、
（ｉｉｉ）ナノ粒子の平均流体力学的直径は、１～５０ｎｍ、好ましくは２～２０ｎｍ、より好ましくは２～８ｎｍである、
ことを特徴とするナノ粒子に関する。
ナノ粒子［Ｃｈ１］ｎ－ＰＳ－［Ｃｈ２］ｍに関し：
式中
ＰＳは有機または無機のポリマーマトリックスであり、
Ｃｈ１はＤＯＴＡまたはＤＯＴＡＧＡであり、錯体を形成していないか、または金属カチオンＭ１と錯体を形成しており、
Ｍ１は存在しないか、またはＣｈ１との錯体形成の定数が銅および／または鉄の錯体形成定数よりも小さく、特に少なくとも１０分の１よりも小さい金属カチオンから選択され、例えば、Ｍ１は亜鉛またはアルカリ土類金属、特にカルシウムまたはマグネシウムから選択され、
Ｃｈ２は、Ｃｈ１と同一であり、ＤＯＴＡまたはＤＯＴＡＧＡであり、４０を超え、好ましくは５０を超える高い原子番号Ｚを有する金属カチオンＭ２、好ましくはＧｄと錯体を形成し、
（ｉ）キレート基Ｃｈ１およびＣｈ２は、ポリマーマトリックスにグラフトされ、
（ｉｉ）ｎ／（ｎ＋ｍ）比率は１０％～１００％、好ましくは４０％～６０％であり、
（ｉｉｉ）ナノ粒子の平均流体力学的直径は、１～５０ｎｍ、好ましくは２～２０ｎｍ、より好ましくは２～８ｎｍである、
ことを特徴とするナノ粒子に関する。
【0093】
特に、好ましい実施形態では、ナノ粒子当たりにグラフトされるキレート基Ｃｈ１およびＣｈ２（任意でＣｈ１およびＣｈ２はＤＯＴＡまたはＤＯＴＡＧＡである）の数に対応する（ｎ＋ｍ）は、３～１００、好ましくは５～５０、例えば１０～３０である。
【0094】
キレート化機能とは別に、本開示によるナノ粒子は、親水性化合物（ＰＥＧ）によって表面修飾（官能化）することができ、および／または、それとは別に充填することで、体内での生体内分布を適合させることができ、および／または、分子を標的化することにより、特定の細胞を標的化し、特に特定の組織、または腫瘍細胞を標的化することを可能にする。標的化は、ポリマーマトリックスにグラフトされ、ナノ粒子あたり１～２０個の標的化剤、好ましくは１～５個の標的化剤の割合で優先的に存在する。
【0095】
標的化分子の表面グラフトのための使用は、存在する反応性基との従来のカップリングによりなされてよく、場合により活性化工程が先行してもよい。カップリング反応は当業者に公知であり、ナノ粒子の表面層の構造および標的化分子の官能基に基づいて選択されるであろう。例えば、"Bioconjugate Techniques" G.T Hermanson、Academic Press、１９９６、"Fluorescent and Luminescent Probes for Biological Activity" Second Edition, W.T. Mason, ed. Academic Press, 1999.を参照のこと。好ましいカップリング方法を後述する。好ましくは、これらの標的化分子が次の段落に記載されるように、超微細またはＡＧｕＩＸのいずれかのナノ粒子の変異体に応じて、ナノ粒子のアミン結合にグラフトされる。標的化分子は、想定される用途に基づいて選択される。
【0096】
特定の実施形態において、ナノ粒子は、ペプチド、免疫グロブリン、ナノボディ、ＶＨＨ、もしくは単一ドメイン断片、抗体、アプタマー、または、例えば、腫瘍環境を標的とするその他の蛋白質、典型的には抗体、免疫グロブリン、または、腫瘍に関連する抗原、もしくは、公知の特定の癌マーカーを標的化するナノボディで機能化される。
【0097】
超微細ナノ粒子およびＡＧｕＩＸナノ粒子
より特に好適な実施形態において、特に、それらの極めて小さいサイズおよびそれらの安定性のために、使用され得るナノ粒子は、ポリシロキサンマトリックスＰＳを含み、金属酸化物ベースのコアを含まず、金属酸化物ベースのコアおよびポリシロキサンコーティングを含むコア－シェルタイプのナノ粒子（特に、ＷＯ２００５／０８８３１４およびＷＯ２００９／０５３６４４に記載されている）とは異なっている。
より特に好適な実施形態において、特に、それらの極めて小さいサイズおよびそれらの安定性のために、使用され得るナノ粒子は、ポリシロキサンマトリックスＰＳを含み、金属酸化物ベースのコアを含まず、金属酸化物ベースのコアおよびポリシロキサンコーティングを含むコア－シェルタイプのナノ粒子（特に、ＷＯ２００５／０８８３１４およびＷＯ２００９／０５３６４４に記載されている）とは異なっている。
【0098】
したがって、具体的な実施形態において、本開示に係るナノ粒子は、ガドリニウムでキレート化されたポリシロキサンに基づく、式［Ｃｈ１］ｎ－ＰＳ－［Ｃｈ２］ｍのナノ粒子であり、
式中
（ｉ）ＰＳはポリシロキサンマトリクスであり、
（ｉｉ）Ｃｈ１およびＣｈ２は、下記式（Ｉ）のＤＯＴＡＧＡキレート基であり、
式中
（ｉ）ＰＳはポリシロキサンマトリクスであり、
（ｉｉ）Ｃｈ１およびＣｈ２は、下記式（Ｉ）のＤＯＴＡＧＡキレート基であり、
【0099】
【化6】
【0100】
共有結合によってポリシロキサンマトリックスにグラフトされており、
（ｉｉｉ）Ｍ１は存在せず、Ｍ２はガドリニウムカチオンＧｄ３＋であり、
（ｉｖ）ｎ＋ｍは、５～５０、好ましくは１０～３０であり、かつ、
（ｉｖ）平均流体力学的直径は２～８ｎｍである。
（ｉｉｉ）Ｍ１は存在せず、Ｍ２はガドリニウムカチオンＧｄ３＋であり、
（ｉｖ）ｎ＋ｍは、５～５０、好ましくは１０～３０であり、かつ、
（ｉｖ）平均流体力学的直径は２～８ｎｍである。
【0101】
より具体的には、ガドリニウムでキレート化されたポリシロキサンをベースとするこれらのナノ粒子は、出発材料としてＡＧｕＩＸナノ粒子から得られる超微細ナノ粒子である。
【0102】
このような超微細ＡＧｕＩＸナノ粒子は、トップ－ダウン合成法によって得ることができ、特に、Ｍｉｇｎｏｔらによる、Chem Eur J 2013 “A top-down synthesis route to ultrasmall multifunctional Gd-based silica nanoparticles for theranostic applications”DOI: 10.1002/chem.201203003に記載されている。
【0103】
超微細ナノ粒子を合成するための他の方法も、ＷＯ２０１１／１３５１０１、ＷＯ２０１８／２２４６８４およびＷＯ２０１９／００８０４０に記載されている。
【0104】
ＡＧｕＩＸナノ粒子は、本開示によるナノ粒子を得るための出発材料として役立ち得、特に下記式（ＩＩＩ）のものである。
【0105】
【化7】
【0106】
式中、ＰＳはポリシロキサンマトリックスであり、ｎは平均で１０～５０であり、ナノ粒子は４±２ｎｍの平均流体力学的直径、および約１０ｋＤａの重量を有している。
【0107】
ＡＧｕＩＸナノ粒子は、下記式（ＩＶ）によっても特徴付けることができる。
【0108】
（ＧｄＳｉ４－７Ｃ２４－３０Ｎ５－８Ｏ１５－２５Ｈ４０－６０、５～１０Ｈ２Ｏ）ｘ （ＩＶ）
本開示によるナノ粒子の合成方法
本開示によるナノ粒子は、キレート基の一部のみが金属カチオンと錯体を形成し、他の部分は錯体を形成しないという、ポリマーマトリックスにグラフトされたキレート基を含むナノ粒子のコロイド溶液を調製する製造方法によって得ることができ、上述の製造方法は、
（１）次の式［Ｃｈ２］ｎ－ＰＳのナノ粒子ＮＰ１のコロイド溶液を出発物質として合成または提供し、
ＰＳは有機または無機のポリマーマトリックスであり、
Ｃｈ２は４０より大きい、好ましくは５０より大きい高い原子番号Ｚを有する金属カチオンＭ２と錯体形成されたキレート基であり、
（ｉ）Ｃｈ２は、ポリマーマトリックスにグラフトされており、
（ｉｉ）ｎは５～１００であり、かつ、
（ｉｉｉ）ナノ粒子ＮＰ１の平均流体力学的直径は、１～５０ｎｍ、好ましくは２～２０ｎｍ、より優先的には２～８ｎｍであることを特徴とすること；と、
（２）例えば、塩酸の溶液を添加することによって、２．０未満、好ましくは１．０未満のｐＨを得て、酸性媒体中でナノ粒子ＮＰ１のコロイド溶液を、金属カチオンＭ２の部分的または完全な塩析を得るための十分な継続時間、処理する工程；と、
（３）必要に応じて、前記溶液を例えば水で希釈する工程；と、
（４）工程（２）で得られたナノ粒子を遊離金属カチオンＭ２から分離することで精製する工程；と、
（５）必要に応じて、工程（４）で得られたナノ粒子の溶液を濃縮する工程；と、
（６）必要に応じて、工程（３）、（４）および（５）を繰り返すこと；と、
（７）必要に応じて、工程（４）、（５）または（６）の１つで得られたナノ粒子の溶液を凍結および／または凍結乾燥すること；とを含んでいる。
本開示によるナノ粒子の合成方法
本開示によるナノ粒子は、キレート基の一部のみが金属カチオンと錯体を形成し、他の部分は錯体を形成しないという、ポリマーマトリックスにグラフトされたキレート基を含むナノ粒子のコロイド溶液を調製する製造方法によって得ることができ、上述の製造方法は、
（１）次の式［Ｃｈ２］ｎ－ＰＳのナノ粒子ＮＰ１のコロイド溶液を出発物質として合成または提供し、
ＰＳは有機または無機のポリマーマトリックスであり、
Ｃｈ２は４０より大きい、好ましくは５０より大きい高い原子番号Ｚを有する金属カチオンＭ２と錯体形成されたキレート基であり、
（ｉ）Ｃｈ２は、ポリマーマトリックスにグラフトされており、
（ｉｉ）ｎは５～１００であり、かつ、
（ｉｉｉ）ナノ粒子ＮＰ１の平均流体力学的直径は、１～５０ｎｍ、好ましくは２～２０ｎｍ、より優先的には２～８ｎｍであることを特徴とすること；と、
（２）例えば、塩酸の溶液を添加することによって、２．０未満、好ましくは１．０未満のｐＨを得て、酸性媒体中でナノ粒子ＮＰ１のコロイド溶液を、金属カチオンＭ２の部分的または完全な塩析を得るための十分な継続時間、処理する工程；と、
（３）必要に応じて、前記溶液を例えば水で希釈する工程；と、
（４）工程（２）で得られたナノ粒子を遊離金属カチオンＭ２から分離することで精製する工程；と、
（５）必要に応じて、工程（４）で得られたナノ粒子の溶液を濃縮する工程；と、
（６）必要に応じて、工程（３）、（４）および（５）を繰り返すこと；と、
（７）必要に応じて、工程（４）、（５）または（６）の１つで得られたナノ粒子の溶液を凍結および／または凍結乾燥すること；とを含んでいる。
【0109】
このような製造方法により、Ｃｈ１およびＣｈ２が同一であるナノ粒子［Ｃｈ１］ｎ－ＰＳ－［Ｃｈ２］ｍを得ることができる。したがって、この製造方法は、有利には、ナノ粒子ＮＰ１上のキレート基Ｃｈ２と最初に錯化された金属カチオンＭ２の部分的または完全な塩析を得ることを可能にする。当業者は、金属カチオンＭ２の塩析の程度、ひいては、最終的な溶液中の平均ｎ／（ｎ＋ｍ）比を、特に、処理工程（２）のｐＨおよび継続時間を調節することによって調節することができる。
【0110】
好ましい実施形態において、ナノ粒子ＮＰ１は、前述のセクションで定義された超微細またはＡＧｕＩＸナノ粒子であり、ガドリニウムカチオンと錯化している。具体的な実施形態は実施例に示されている。典型的には、工程（２）における処理の持続時間は０．５～８時間、例えば１．０未満のｐＨで２～６時間であり得る。
【0111】
上記の製造方法に従って得られたナノ粒子は、必要に応じて、次いで、Ｃｈ２、および／または、標的化剤、または親水性分子とは異なる他のキレート基によって官能化することができる。
【0112】
一実施形態において、上記の製造方法に従って得られたナノ粒子は、金属カチオンＭ１に接触することで、遊離キレート基の少なくとも一部分と金属カチオンＭ１との錯化を達成することができ、下記式：
［Ｃｈ１］ｎ－ＰＳ－［Ｃｈ２］ｍ、
式中：
ＰＳは、有機または無機のポリマーマトリックスであり、
Ｃｈ１は、金属カチオンＭ１と部分的に錯体を形成するキレート基であり、
Ｍ１は、Ｃｈ１との錯体形成の定数が銅および／または鉄の定数よりも小さい、特に少なくとも１０分の１よりも小さい金属カチオンから選択され、例えば、Ｍ１は、亜鉛、カルシウム、マグネシウムまたは他のアルカリ土類金属から選択され、
Ｃｈ２は、Ｃｈ１と同一のキレート基であり、４０を超え、好ましくは５０を超える高い原子番号Ｚを有する金属カチオンＭ２と錯体を形成し、
（ｉ）キレート基Ｃｈ１およびＣｈ２は、ポリマーマトリックスにグラフトされており、
（ｉｉ）ｎ／（ｎ＋ｍ）比率は、１０％～１００％、好ましくは４０％～６０％であり、かつ、
（ｉｉｉ）ナノ粒子の平均流体力学的直径は、１～５０ｎｍ、好ましくは２～２０ｎｍ、より好ましくは２～８ｎｍである、ナノ粒子が得られる。
［Ｃｈ１］ｎ－ＰＳ－［Ｃｈ２］ｍ、
式中：
ＰＳは、有機または無機のポリマーマトリックスであり、
Ｃｈ１は、金属カチオンＭ１と部分的に錯体を形成するキレート基であり、
Ｍ１は、Ｃｈ１との錯体形成の定数が銅および／または鉄の定数よりも小さい、特に少なくとも１０分の１よりも小さい金属カチオンから選択され、例えば、Ｍ１は、亜鉛、カルシウム、マグネシウムまたは他のアルカリ土類金属から選択され、
Ｃｈ２は、Ｃｈ１と同一のキレート基であり、４０を超え、好ましくは５０を超える高い原子番号Ｚを有する金属カチオンＭ２と錯体を形成し、
（ｉ）キレート基Ｃｈ１およびＣｈ２は、ポリマーマトリックスにグラフトされており、
（ｉｉ）ｎ／（ｎ＋ｍ）比率は、１０％～１００％、好ましくは４０％～６０％であり、かつ、
（ｉｉｉ）ナノ粒子の平均流体力学的直径は、１～５０ｎｍ、好ましくは２～２０ｎｍ、より好ましくは２～８ｎｍである、ナノ粒子が得られる。
【0113】
本開示によるナノ粒子の医薬製剤
本開示によるナノ粒子を含む組成物は、ナノ粒子のコロイド懸濁液の形態で投与される。それらは、本明細書に記載されるように、または当業者に公知の他の方法に従って調製することができ、処置および処置される領域に応じて、異なる局所または全身経路によって投与され得る。
本開示によるナノ粒子を含む組成物は、ナノ粒子のコロイド懸濁液の形態で投与される。それらは、本明細書に記載されるように、または当業者に公知の他の方法に従って調製することができ、処置および処置される領域に応じて、異なる局所または全身経路によって投与され得る。
【0114】
したがって、本開示は、前述のセクションに記載されているような、式［Ｃｈ１］ｎ－ＰＳ－［Ｃｈ２］ｍのナノ粒子のコロイド懸濁液と、必要に応じ、１つ以上の薬学的に許容される賦形剤と組み合わせた、これらのコロイド懸濁液を含む医薬組成物とに関する。
【0115】
前記医薬組成物は特に、静脈内注射用の凍結乾燥粉末または水溶液の形態で製剤化してもよい。好ましい実施形態において、前記医薬組成物は、前述のセクションに記載されているような式［Ｃｈ１］ｎ－ＰＳ－［Ｃｈ２］ｍの治療有効量のナノ粒子、特に、ガドリニウムでキレート化されたポリシロキサンをベースとするナノ粒子、より具体的には上述のようなＡＧｕＩＸナノ粒子から得られるナノ粒子を含むコロイド溶液を含んでいる。
【0116】
いくつかの実施形態において、前記医薬組成物は、バイアル当たり２００ｍｇ～１５ｇ、好ましくは２５０～１２５０ｍｇのナノ粒子を含む凍結乾燥粉末である。当該粉末は、他の賦形剤、特にＣａＣｌ２をさらに含んでいてもよい。
【0117】
前記凍結乾燥粉末は、水溶液、典型的には注射用の滅菌水中で再構成することができる。したがって、本開示は、前述のセクションに記載の式［Ｃｈ１］ｎ－ＰＳ－［Ｃｈ２］ｍのナノ粒子、特にガドリニウムでキレート化されたポリシロキサンをベースとするナノ粒子、より具体的には前述のＡＧｕＩＸナノ粒子から得られるナノ粒子を活性成分として含む、注射用液剤としてのその使用のための医薬組成物に関する。
【0118】
一実施形態において、前記医薬組成物は、静脈内もしくは腫瘍内投与のための注射用組成物、又は肺内投与のためのエアロゾルであり、特に、腫瘍中の銅および／又は鉄のインビボでの捕捉のためのキレート基Ｃｈ１を有効量含み、キレート剤Ｃｈ１が、例えば、前記組成物中で少なくとも１０ｍＭの濃度であることを特徴としている。
【0119】
例えば、後述するようなその使用、特に銅および／または鉄のインビボでの捕捉による腫瘍の治療のため、前記組成物は、ガドリニウムでキレート化されたポリシロキサンをベースとするナノ粒子を５０～２００ｍｇ／ｍｌ、例えば８０～１２０ｍｇ／ｍｌの濃度で含む注射可能な溶液である。
【0120】
ナノ粒子の使用
遊離するか、または金属カチオンＭ１と錯化するキレート基Ｃｈ１の存在により、本発明によるナノ粒子は、それを必要とする対象に投与された後、内因性銅および／または鉄の捕捉を可能にする。内因性銅の捕捉は、好ましくは１００ｐｐｂ（０．１ｍｇの銅／リットル）～１００００ｐｐｂ（１０ｍｇの銅／リットル）の内因性銅の局所捕捉を意味する。したがって、本開示は、より具体的には、一対象、特に癌に罹患している対象における内因性銅を捕捉するためのプロセスを標的とする。
遊離するか、または金属カチオンＭ１と錯化するキレート基Ｃｈ１の存在により、本発明によるナノ粒子は、それを必要とする対象に投与された後、内因性銅および／または鉄の捕捉を可能にする。内因性銅の捕捉は、好ましくは１００ｐｐｂ（０．１ｍｇの銅／リットル）～１００００ｐｐｂ（１０ｍｇの銅／リットル）の内因性銅の局所捕捉を意味する。したがって、本開示は、より具体的には、一対象、特に癌に罹患している対象における内因性銅を捕捉するためのプロセスを標的とする。
【0121】
内因性鉄の捕捉は、好ましくは１００ｐｐｂ（１リットルあたり０．１ｍｇの鉄）と１００００ｐｐｂ（１リットルあたり１０ｍｇの鉄）との間の量の内因性鉄の局所捕捉を意味する。したがって、本開示は、より具体的には、一対象、特に癌に罹患している対象における内因性鉄を捕捉するためのプロセスを標的とする。
【0122】
ナノ粒子は、静脈内または肺内に投与される場合、銅および／または鉄は、一般的な血液循環内、その後、腫瘍内において、ナノ粒子が腫瘍内に蓄積した後、特にＥＰＲ効果に関連する受動的標的化によって捕捉されることができる。腫瘍および蓄積の受動的標的化のこの効果は、特に、ＡＧｕＩＸタイプの超微細ナノ粒子によって明確に実証されている。
【0123】
したがって、本開示は、対象における腫瘍を治療するための方法にも関し、当該方法は、上述の対象に、上記のセクションに記載されている式［Ｃｈ１］ｎ－ＰＳ－［Ｃｈ２］ｍのナノ粒子、特に、ガドリニウムでキレート化されたポリシロキサンに基づくナノ粒子、より具体的には、上述のように、ＡＧｕＩＸナノ粒子から得られるナノ粒子を有効量投与することを含み、当該ナノ粒子は内因性の銅および／または鉄を部分的に捕捉することによって、腫瘍の治療を可能にすることを特徴とする。
【0124】
上述の方法における特定の実施形態では、前記組成物は、放射線感受性増強物質として使用するための金属カチオンＭ２、好ましくはガドリニウムまたはビスマスも有効量含み、当該方法は、前記組成物を投与した後に、放射線療法による腫瘍の治療のための有効用量とともに、対象に照射する工程を含む。
【0125】
「患者」または「対象」は、好ましくは哺乳動物またはヒトを意味し、例えば、腫瘍を有する対象を含んでいる。
【0126】
「治療」および「療法」という用語は、治療、阻止、予防、および疾患の進行の遅延など、患者の健康を改善することを目的とする任意の行為に関する。場合によっては、これらの用語は、疾患、または疾患に関連する症状の改善または根絶に関する。他の実施形態において、これらの用語は、そのような疾患に罹患している対象への１つ以上の治療薬の投与に起因する、疾患の広がりまたは悪化の低減に関する。腫瘍の治療の文脈において、用語「治療」は、典型的には腫瘍の成長を停止させること、腫瘍のサイズを縮小させること、および／または腫瘍を除去することを可能にする治療を包含することができる。
【0127】
特に、ナノ粒子は、固形腫瘍、例えば、脳癌（原発性および続発性、膠芽腫など）、肝臓癌（原発性および続発性）、骨盤領域の癌（子宮頸癌、前立腺癌、肛門直腸癌、結腸直腸癌）、上部気道消化管の癌、肺癌、食道がん、乳癌、膵癌の治療に使用される。
【0128】
ナノ粒子の「有効量」は患者に投与された場合に、腫瘍内に位置し、内因性銅および／または鉄を捕捉し、必要に応じ、放射線増感効果および放射線療法治療と組み合わせることによって腫瘍の治療を可能にするのに十分な上記のナノ粒子の量を指す。
【0129】
この量は、対象の年齢、性別および体重などの因子に基づいて決定および調整される。
【0130】
上記のナノ粒子は、腫瘍内、皮下、筋肉内、静脈内、皮内、腹腔内、経口、舌下、直腸、膣内、鼻腔内、吸入または経皮適用によって投与することができる。それらは、好ましくは腫瘍内および／または静脈内に投与される。
【0131】
放射線感受性増強物質としてのナノ粒子の投与後の腫瘍の治療のための照射方法は、当業者にとって公知であり、特に次の刊行物：ＷＯ２０１８／２２４６８４、ＷＯ２０１９／００８０４０、および、「C. Verry et al., Science Advances, 2020, 6, eaay 5279; and C. Verry et al., “NANO-RAD, a phase I study protocol”, BMJ Open, 2019, 9, e023591」に記載されている。
【0132】
放射線療法中の総照射線量は、癌の種類、ステージおよび治療される対象に応じて調整される。治癒線量については、固形腫瘍のための典型的な総線量は約２０～１２０Ｇｙである。化学療法による治療、併存症、および／または放射線療法が外科的介入の前または後に行われるという事実などの他の因子が考慮され得る。総線量は、一般的に画分される。本開示による方法における放射線治療のステップは、例えば、１日当たり２～６Ｇｙの数画分、例えば、１週間に５日、特に２～８週間連続して含むことができ、総線量は２０～４０Ｇｙ、例えば、３０Ｇｙであることが可能である。
【0133】
本開示によるナノ粒子は、単独で、または１つ以上の他の活性成分、特に細胞毒性もしくは抗増殖性薬剤または他の抗癌剤、特に免疫チェックポイント阻害剤などの他の薬剤と組み合わせて投与され得る。併用投与は、同時または逐次（様々な時点で）投与を意味する。
【0134】
〔実施例〕
材料および方法
ＣｕＰＲｉＸｘ生成物は、Ｎｈ ＴｈｅｒＡｇｕｉｘ（仏）によって提供される出発生成物ＡＧｕＩＸ（登録商標）を、ＣａｒｌＲｏｔｈが製造元である３７％の超純粋な塩酸から得られる高酸性媒体に導入することによって得られる。
材料および方法
ＣｕＰＲｉＸｘ生成物は、Ｎｈ ＴｈｅｒＡｇｕｉｘ（仏）によって提供される出発生成物ＡＧｕＩＸ（登録商標）を、ＣａｒｌＲｏｔｈが製造元である３７％の超純粋な塩酸から得られる高酸性媒体に導入することによって得られる。
【0135】
濾過工程は蠕動ポンプおよびＳａｒｔｏｒｉｕｓ Ｓｔｅｄｉｍ Ｂｉｏｔｅｃｈ（仏）製のＶｉｖａｆｌｏｗ２００（登録商標）－５ｋＤａカセットを使用して実施し、Ｖｉｖａｆｌｏｗ２００（登録商標）のマニュアルに記載された条件に従って使用している。
【0136】
流体力学的直径の測定、および等電点の滴定は、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（米国）製のＺｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ－Ｓ（６３３ｎｍＨｅ－Ｎｅレーザー）を用いて実施している。等電点の測定のために、この装置は、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（米国）製のＭＰＴ－２自動滴定装置と連結する。
【0137】
ＨＰＬＣ－ＵＶは、ＤＡＤ検出器を備えたＡｇｉｌｅｎｔ１２００を用いて実施する。使用した逆相カラムは、Ｊｕｐｉｔｅｒ社製のＣ４，５μｍ、３００Å、１５０×４．６ｍｍである。検出は、２９５ｎｍの波長のＵＶ検出器によって行われている。相Ａ（Ｈ２Ｏ／ＡＣＮ／ＴＦＡ：９８．９／１／０．１）およびＢ（Ｈ２Ｏ／ＡＣＮ／ＴＦＡ：１０／８９．９／０．１）の勾配は、９５／５で５分、続いて１０分にわたって直線勾配であり、１５分間維持される比率１０／９０に達することができる。これらの１５分の終わりに、Ａの含有量を１分間で９５％に戻し、その後、９５／５で７分間のプラトーを行う。溶離液相の組成に使用される製品は、全て、認定されたＨＰＬＣグレードである。
【0138】
元素分析は、Ｉｎｓｔｉｔｕｔ ｄｅｓ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ａｎａｌｙｔｉｑｕｅｓ－ＵＭＲ５２８０，Ｐｏｌｅ Ｉｓｏｔｏｐｅｓ ＆ Ｏｒｇａｎｉｑｕｅ（５区 ドゥラ通り、６９１００ ビルールバンヌ）で行った。
【0139】
ＨＰＬＣ－ＩＣＰ／ＭＳは、Ｐｅｒｋｉｎ‐Ｅｌｍｅｒ（米国）製のＮｅｘｉｏｎ２０００を用いて実施している。媒体中の遊離要素は以下の組成：９５％Ａおよび５％Ｂを有する溶出相を使用して、アイソクラティックモードで測定されている。相ＡおよびＢの組成はＨＰＬ－ＵＶ方法と同一である。使用した逆相カラムは、Ｊｕｐｉｔｅｒ社製のＣ４，５μｍ、３００Å、１５０×４．６ｍｍである。溶離液相の組成に使用される製品は、全て、認定されたＨＰＬＣグレードである。
【0140】
粒子は、「一次乾燥」プログラムに従って、Ｃｈｒｉｓｔ（独）製のＡｌｐｈａ ２－４ ＬＳＣ凍結乾燥機を介して凍結乾燥している。
【0141】
Ａ５４９細胞（ＥＣＡＣＣ ８６０１２８０４）を、１０％ウシ胎児血清（Ｄｕｔｓｃｈｅｒ製）および１％ペニシリン－ストレプトマイシン（ＧｉｂｃｏＴＭ、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｃｈｅｒ）を補充したＦ１２－Ｋ媒体（ＧｉｂｃｏＴＭ、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｃｈｅｒ製）中で培養している。それぞれの試験について、細胞をＰＢＳ １Ｘ（ＧｉｂｃｏＴＭ、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｃｈｅｒ製）中で２回すすぎ、３７℃、５％ＣＯ２、トリプシン－ＥＤＴＡとともにインキュベーター中で５分間インキュベートし、次いで完全培地に取っている。
【0142】
試験の少なくとも１時間前に、ＣｕＰＲｉＸ２０およびＣｕＰＲｉＸ３０の製品を、１０ｍＭ（それぞれ、３０ｍＭおよび１６．７ｍＭのガドリニウム）に等しい遊離ＤＯＴＡ濃度で滅菌蒸留水中に取り込み、４℃で保存している。
【0143】
遊走および浸潤試験のため、Ａ５４９細胞をＩｍａｇｅＬｏｃｋ９６ウェルプレート（Ｅｓｓｅｎ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ製）に播種し（５００００細胞／ウェル）、９０～１００％のコンフルエンスに達するまで、３７℃、５％ＣＯ２で１６時間インキュベートしている。ＷｏｕｎｄＭａｋｅｒＴＭ（Ｅｓｓｅｎ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ製）が、それぞれのウェルの細胞単層に創傷を作り出すために使用されている。次いで、各ウェルをＰＢＳ １Ｘで２回すすぎ、浸潤のために、１ｍｇ／ｍｌの最終濃度のＣｕＰＲｉＸ２０を含んでいるか、または含んでいないＦ１２－Ｋ媒体中で予め希釈したマトリゲル（Ｃｏｒｎｉｎｇ製）５０μＬを、それぞれのウェルに添加している。当該プレートを３７℃で３０分間インキュベートし、マトリゲルの重合を可能にしている。最後に、増加濃度のＣｕＰＲｉＸを含有する培地１００μＬを、各ウェル（マトリゲルを含んでいるか、または含有していない）に添加する。当該プレートを、Ｉｎｃｕｃｙｔｅ（１０ｘ対象）に置き、ＣＯ２を含むインキュベーター内にて、Ｚｏｏｍ Ｉｎｃｕｃｙｔｅソフトウェア（Ｅｓｓｅｎ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ製）により、創傷の中身の画像を２時間毎に自動的に撮影している。データは当該ソフトウェアによって分析され、結果は創傷のコンフルエンス割合として表されている。
【0144】
走化性遊走試験のために、Ａ５４９細胞をトリプシン処理し、遠心分離し、次いで希釈媒体（ＦＣＳ非含有のＦ１２－Ｋ）に再懸濁した。続いて、当該細胞を、ＩｎｃｕＣｙｔｅ（登録商標）クリアビューインサート（Ｅｓｓｅｎ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ製）に播種した（ウェルあたり１０００細胞、ウェルあたり４０μＬ）。対応するウェルに、ＣｕＰＲｉＸ２０（５００μＭの遊離キレート）を含んでいるか、または含んでいない２０μＬの枯渇した媒体を添加している。最後に、１０％ＦＣＳを含有し、ＣｕＰＲｉＸ２０（５００μＭの遊離キレート）を含有しているか、または含有していない２００μＬのＦ－１２Ｋ媒体を、走化性チャンバーの下部区画に添加する。各インサートの画像を１時間ごとに撮影している。上部リザーバから下部リザーバへの走化性遊走は、膜の上に播種された細胞の初期コンフルエンスと比較して、膜の下における細胞コンフルエンスとして定量化している。計算は、ＩｎｃｕＣｙｔｅ ＺＯＯＭ ２０１５Ａ顕微鏡ソフトウェアを使用して自動的に実行している。
【0145】
照射後の遊走試験のために、Ａ５４９細胞を、ＩｍａｇｅＬｏｃｋ（登録商標）９６ウェル培養プレート（Ｅｓｓｅｎ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ製）にて、１ウェル当たり２００００細胞、３７℃、５％ＣＯ２で一晩培養する。当該細胞を、ＣｕＰＲｉＸ３０（５００μＭの遊離キレート、８００μＭのガドリニウムに相当する）を含んでいるか、または含んでいないＦＣＳ－ｆｒｅｅ－Ｆ－１２Ｋで２４時間処理し、次いでそれらを８Ｇｙで照射している（Ｘ－Ｒａｄ３２０照射器、２５０ｋＶ、１５ｍＡ）。照射後、９６－ウェルＷｏｕｎｄＭａｋｅｒＴＭ（Ｅｓｓｅｎ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ製）を用いて創傷を作製している。細胞をＰＢＳ １Ｘで２回すすぎ、浮遊細胞を除去し、ＣｕＰＲｉＸ３０（０および５００μＭの遊離キレート、約０および８００μＭのガドリニウムに相当する）を含む培地１００μＬをそれぞれの対応するウェルに添加している。
【0146】
クローン原性生存を評価するために、上記細胞を４００００細胞／ｃｍ２、すなわち１００万細胞にて２５ｃｍ2フラスコ（Ｄｕｔｓｃｈｅｒ製）に播種し、３７℃、５％ＣＯ２で一晩インキュベートしている。当該細胞を、ＣｕＰＲｉＸ３０（５００μＭの遊離キレート、８００μＭのガドリニウムに相当）を含んでいるか、または含んでいない、ＦＣＳ非含有の培地で２４時間処理している。次いで、当該細胞を、異なる線量（０、２、３、４、６および８Ｇｙ）で照射した。照射後、細胞をＰＢＳ １Ｘ中で洗浄し、トリプシン処理し、計数している。次いで、細胞を２５ｃｍ２フラスコ中に再播種し、固定し、染色する前に、６回の分割（７日間）にわたって増殖させている。コロニーを、９６％エタノール溶液（ＶＷＲ）を用いて３０分間固定し、次いで１／２０に希釈したギムザ溶液（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）で３０分間染色している。次いで、フラスコをすすぎ、次いで、６４個以上の細胞を含むコロニーを、ＣｏｌｃｏｕｎｔＴＭコロニーカウンター（Ｏｘｆｏｒｄ Ｏｐｔｒｏｎｉｘ製）を用いてデジタルで計数した。ＳＦが生存率であり、αおよびβがそれぞれ致死的および亜致死的損傷の確率を表す、線形二次モデルの形式：
【0147】
【数1】
【0148】
を使用して、クローン原性生存を決定した。
【0149】
４Ｔ１株は、ＢＡＬＢ／ｃマウス株の乳腺から抽出した乳癌細胞株である。当該細胞を、１０％ＦＣＳおよび１％ペニシリン－ストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ培地（ＧｉｂｃｏＴＭ、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｃｈｅｒ製）中で培養している。
【0150】
上部気道消化管（ＵＡＴ）癌細胞株ＳＱ２０Ｂは、再発喉頭癌から抽出している。フローサイトメトリーを用いた細胞選別（Ｈｏｅｃｈｓｔ ｅｆｆｌｕｘおよびＣＤ４４標識）の２つの連続ステップを実施した後、対象の亜集団ＳＱ２０Ｂ／ＣＳＣ（幹細胞様癌細胞）を回収した。この集団は、ＥＧＦＲおよび間葉表現型の発現が低く、遊走性および侵襲性の特性の獲得に関連している。これらの細胞、ＳＱ２０Ｂ－ＣＳＣを、５％ＦＣＳ、１％ＰＳ、０．０４ｍｇ／ｍＬヒドロコルチゾンおよび２０ｎｇ／ｍＬの上皮増殖因子（ＥＧＦ）を補充したＤＭＥＭ：Ｆ１２媒体（３：１，ｖ：ｖ）中で培養している。
【0151】
インビボ研究プロトコール（２０２１０２１７１４５６９２６４）は、ベルナール大学，リヨン１区の倫理委員会によって承認された。当該試験は、トリプルネガティブ乳癌マウスモデル（細胞株４Ｔ１）で実施された。７週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｊａｎｖｉｅｒ Ｌａｂｓ）を使用した。４Ｔ１細胞（５×１０５、マトリゲル５０：５０）を、イソフルラン麻酔のもとで４つ目の乳房に皮下注射した。この位置は、放射線治療中に生命維持に必要な組織を確保するために選択された。移植１０日後、マウスを無作為に２群に分けた：ＮａＣｌ（対照）群（ｎ＝４）およびＣｕＰＲｉＸ群（ｎ＝６）。マウスに、４８時間隔で、ＮａＣｌ ０．９％（対照）またはＣｕＰＲｉＸ（２００ｍｇ／ｋｇ）を５０μＬ、それぞれ静脈内に３回注射した。マウスの体重を測定し、その全身状態を評価し、腫瘍を週３回測定した。最終注射の５日後にマウスを安楽死させ、転移を標的器官（肺および肝臓）において定量化した。
【0152】
Ｐｕｌａｓｋｉら（２０００）のプロトコールに従って転移を定量化した。この目的のために、マウスをイソフルラン麻酔下で頸椎脱臼により安楽死させた後、肺および肝臓を摘出した。当該臓器をＨＢＳＳで洗浄し、機械的に切断し、次いで、肺についてはＤＮアーゼＩ（Ｒｏｃｈｅ）に関連するＩＶタイプコラゲナーゼ（２ｍｇ／ｍＬ）、肝臓についてはＩタイプコラゲナーゼ（２ｍｇ／ｍＬ）、ＢＳＡ（１ｍｇ／ｍＬ）およびヒアルロニダーゼ（２ｍｇ／ｍＬ）カクテルにより、酵素消化に供している。この消化は、回転ホイール上、３７℃にて、２時間（肺）および４０分間（肝臓）行なわれている。消化された臓器を、その後、７０μｍのナイロンフィルターを通して濾過している。それらを１５００Ｇで５分間遠心分離し、ＨＢＳＳで２回洗浄している。クローン原性成長の研究のために、細胞ペレットを６０μＭの６－チオグアニンを含有するＲＰＭＩ培地に再懸濁している。懸濁液を培養に戻し、１０ｃｍのペトリ皿上で、肺については１／６に希釈し、肝臓については純粋（pure）にする。８日後、細胞を９６％エタノールで固定し、ギムザ（蒸留水で１／２０に希釈）で染色している。続いて、ＣｏｌｃｏｕｎｔＴＭコロニーカウンター（Ｏｘｆｏｒｄ Ｏｐｔｒｏｎｉｘ製）を用いて、クローンをデジタルで計数している。
【0153】
実施例１：培地の酸性化およびＧｄ３＋イオンの塩析
放射線感受性増強物質としてのその特性を保持しながら銅イオンを錯化することができるナノ粒子を得るために、製品ＡＧｕＩＸ（登録商標）を、ＤＯＴＡ基をプロトン化し、それにより最初に錯化したＧｄ３＋イオンの一部を放出する目的で酸性媒体中に置いた。
放射線感受性増強物質としてのその特性を保持しながら銅イオンを錯化することができるナノ粒子を得るために、製品ＡＧｕＩＸ（登録商標）を、ＤＯＴＡ基をプロトン化し、それにより最初に錯化したＧｄ３＋イオンの一部を放出する目的で酸性媒体中に置いた。
【0154】
まず、１０ｇの製品を５０ｍＬの超純水に溶解することにより、２００ｇ／ＬのＡＧｕＩＸ（登録商標）溶液を調製した。当該溶液を周囲温度で１時間撹拌下に置いた。並行して、１０ｍＬの３７％塩酸（３７％塩酸、超純粋、２．５Ｌ，プラスチック，ＣａｒｌＲｏｔｈ製）を５０ｍＬの超純水に添加することによって、２Ｍ塩酸溶液を調製した。
【0155】
１時間撹拌した後、５０ｍＬの２Ｍ塩酸溶液を５０ｍＬのＡＧｕＩＸ（登録商標）に添加している。次いで、ｐＨを測定し、０．５未満である。得られた溶液は橙褐色である。セットアップを５０℃に予熱した乾燥炉に４時間放置している。ＨＰＬＣ－ＩＣＰ／ＭＳにより、ガドリニウムイオンの塩析を観察するために、サンプルを毎時間取り出した（図１）。保持時間Ｔｒ＝２．３ｍｉｎでの媒体中の遊離Ｇｄ３＋のピークは反応時間と共に増加することが分かった。
【0156】
実施例２：ＣｕＰＲｉＸ２０：４時間の反応
４時間後、溶液を超純水で１０倍に希釈した。次いで、ｐＨを測定し、必要に応じて、濾過膜を破壊しないように１Ｍ水酸化ナトリウムを用いて１±０．２にしている。このようにして得られた５００ｍＬの溶液を、ペリスタルティックポンプとＳａｒｔｏｒｉｕｓ製のＶｉｖａｆｌｏｗ２００－５ｋＤａカセットという手段によって精製し、放出されたＧｄ３＋から微粒子を分離して、これらのイオンが再錯化するのを防止した。
４時間後、溶液を超純水で１０倍に希釈した。次いで、ｐＨを測定し、必要に応じて、濾過膜を破壊しないように１Ｍ水酸化ナトリウムを用いて１±０．２にしている。このようにして得られた５００ｍＬの溶液を、ペリスタルティックポンプとＳａｒｔｏｒｉｕｓ製のＶｉｖａｆｌｏｗ２００－５ｋＤａカセットという手段によって精製し、放出されたＧｄ３＋から微粒子を分離して、これらのイオンが再錯化するのを防止した。
【0157】
５００ｍＬの初期容量を５０ｍＬに濃縮し、操作を繰り返している。全体として、希釈／濃縮操作を４回繰り返し、最終容量を５０ｍＬにしている。精製後、５０ｍＬの溶液を、それぞれ２ｍｌの溶液を含有するバイアル中に分配した。溶液を凍結させるためにバイアルを－８０℃に置いた後、凍結乾燥して、褐色の粉末形態の最終生成物を得ている。
【0158】
生成物が得られたら、生成物を特徴付けるためにバイアルをバッチから取り出している。１００ｇ／Ｌの新規製品の溶液１ｍＬを、超純水を添加することによって調製している。１時間後、溶液中で、ＤＬＳ装置を用いて直径を測定し、４．４ｎｍ±１．２ｎｍの直径が示された。ＨＰＬＣ－ＵＶ／Ｖｉｓクロマトグラムを実施し、１１分±０．１分の保持時間を示しており、元の粒子と同じであった。ＣｕＰＲｉＸ２０の等電点も測定され、６．２９に等しく、７．１５に等しいＡＧｕＩＸ（登録商標）の等電点よりも優れている（superior）。ガドリニウムは磁気特性を有するので、ＣｕＰＲｉＸ２０の緩和係数ｒ１を測定したところ、ガドリニウム原子１個当たり１８．９ｍＭ－１．ｓ－１に等しい。
【0159】
実施例３：ユーロピウムのキレート化および蛍光による遊離ＤＯＴＡＧＡの数のアッセイ
ＣｕＰＲｉＸ２０中に存在する遊離キレートの量は、ユウロピウムのキレート化と、それに続く発光の観察とによって決定することができる。これは、ユーロピウムが主に５９０ｎｍ（５Ｄ０→７Ｆ１）および６１５ｎｍ（５Ｄ０→７Ｆ２）付近を中心とする発光を有するからである。この発光は、水分子の存在下で抑制される。アッセイの原理は増加する量のユウロピウムを添加することであり：それがキレート化されるにつれて、発光は増加し、次いで、全てのキレート化部位が満たされると、発光は図２に示されているように、プラトーに達している。
ＣｕＰＲｉＸ２０中に存在する遊離キレートの量は、ユウロピウムのキレート化と、それに続く発光の観察とによって決定することができる。これは、ユーロピウムが主に５９０ｎｍ（５Ｄ０→７Ｆ１）および６１５ｎｍ（５Ｄ０→７Ｆ２）付近を中心とする発光を有するからである。この発光は、水分子の存在下で抑制される。アッセイの原理は増加する量のユウロピウムを添加することであり：それがキレート化されるにつれて、発光は増加し、次いで、全てのキレート化部位が満たされると、発光は図２に示されているように、プラトーに達している。
【0160】
アッセイを実施するために、ＣｕＰＲｉＸ２０をｐＨ５の酢酸緩衝液に入れ、酢酸緩衝液に溶解したユーロピウムクロリド塩を添加する。次いで、３９６ｎｍで励起を行い、５９０ｎｍで発光を読み取り、定量曲線をプロットしている。このアッセイにより、１ｍｇのＣｕＰＲｉＸ２０あたり０．１６μｍｏｌのキレートを算出することができる。最初のＡＧｕＩＸ（登録商標）製品中のガドリニウムの量がゼロ、または最大でも無視できる量であると仮定すると、ガドリニウムの最初の量は、ＤＯＴＡの量に等しい。元素分析によって測定された出発生成物中の初期ガドリニウム含有量は、１ｍｇのＡＧｕＩＸ（登録商標）当たり０．８１μｍｏｌであった。
【0161】
したがって、製品ＣｕＰＲｉＸ２０は、そのＤＯＴＡ基の２０％が遊離している。
【0162】
実施例４：銅のキレート化
したがって、遊離ＤＯＴＡの存在は、キレート化療法の文脈における有力なキレート剤としてのＣｕＰＲｉＸ２０の潜在的な使用を示している。ＣｕＰＲｉＸ２０の錯体形成能を銅のキレート化とそれに続くＨＰＬＣ－ＵＶ／Ｖｉｓを用いた吸光度の観察とにより決定した。このＤＯＴＡ＠Ｃｕは２９５ｎｍでの吸光度を有し、これはＤＯＴＡ＠Ｇｄ錯体、溶体中のＤＯＴＡおよび銅イオンの吸光度よりもはるかに大きい。
したがって、遊離ＤＯＴＡの存在は、キレート化療法の文脈における有力なキレート剤としてのＣｕＰＲｉＸ２０の潜在的な使用を示している。ＣｕＰＲｉＸ２０の錯体形成能を銅のキレート化とそれに続くＨＰＬＣ－ＵＶ／Ｖｉｓを用いた吸光度の観察とにより決定した。このＤＯＴＡ＠Ｃｕは２９５ｎｍでの吸光度を有し、これはＤＯＴＡ＠Ｇｄ錯体、溶体中のＤＯＴＡおよび銅イオンの吸光度よりもはるかに大きい。
【0163】
ＣｕＰＲｉＸ２０の吸光度は、追加の銅の付加が吸光度の増加をもたらさないであろうプラトーに達するまで、遊離ＤＯＴＡ基が利用可能な銅イオンと錯体を形成することにつれて増加するであろう。この実験を行うために、一連の試料を、一定量のＣｕＰＲｉＸ２０と、量を増大させた塩化銅の溶液を用いて調製した。すべてのサンプルの体積を等化している。この実験により、１ｍｇのＣｕＰＲｉＸ２０あたり、０．１８μｍｏｌの錯化可能な銅の量を算出することができる。出発物質ＡＧｕＩＸ（登録商標）について実施された同一の試験は、ＣｕＰＲｉＸ２０のキレート化能力の大幅な増大を示している（図３）。
【0164】
実施例５:ＣｕＰＲｉＸ３０：５時間の反応
遊離ＤＯＴＡの含有量は、酸性媒体中のＡＧｕＩＸの反応時間に基づいて変更することができる。５時間後、溶液をＵｌｔｒａＰｕｒｅ水で１０倍に希釈した。次いで、ｐＨを測定し、必要に応じて、濾過膜を破壊しないように１Ｍ水酸化ナトリウムを用いて１±０．２にした。このようにして得られた５００ｍｌの溶液を、ペリスタルティックポンプ、および、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ製のＶｉｖａｆｌｏｗ２００－５ｋＤａカセットという手段によって精製しており、放出されたＧｄ３＋から微粒子を分離し、これらのイオンが再錯化するのを防止した。５００ｍＬの初期容量を５０に濃縮し、操作を繰り返している。
遊離ＤＯＴＡの含有量は、酸性媒体中のＡＧｕＩＸの反応時間に基づいて変更することができる。５時間後、溶液をＵｌｔｒａＰｕｒｅ水で１０倍に希釈した。次いで、ｐＨを測定し、必要に応じて、濾過膜を破壊しないように１Ｍ水酸化ナトリウムを用いて１±０．２にした。このようにして得られた５００ｍｌの溶液を、ペリスタルティックポンプ、および、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ製のＶｉｖａｆｌｏｗ２００－５ｋＤａカセットという手段によって精製しており、放出されたＧｄ３＋から微粒子を分離し、これらのイオンが再錯化するのを防止した。５００ｍＬの初期容量を５０に濃縮し、操作を繰り返している。
【0165】
全体として、希釈／濃縮操作を４回繰り返し、最終容量は５０ｍＬとした。精製後、５０ｍＬの溶液を、各バイアルに２ｍＬの溶液を含有するようにして分配した。バイアルを－８０℃に置き、凍結させた後、凍結乾燥し、最終生成物ＣｕＰＲｉＸ３０を褐色の粉末の形態で得ている。生成物が得られたら、生成物を特徴付けるためにバイアルをバッチから取り出した。
【0166】
１００ｇ／Ｌの新規製品の溶液１ｍＬを、超純水を添加することによって調製した。１時間後、溶液中で、ＤＬＳ装置を用いて直径を測定しており、５．７ｎｍ±１ｎｍの直径を示していた。ＨＰＬＣ－ＵＶ／Ｖｉｓクロマトグラムを実施しており、１０．８分±０．１分の保持時間を示し、元の粒子と同一であった。
【0167】
実施例６：ＣｕＰＲｉＸ３０：ＣｕＰＲｉＸ２０と比較した錯体形成ポテンシャルの改善
このように、遊離ＤＯＴＡの存在は、キレート化療法の文脈における有力なキレート剤としてのＣｕＰＲｉＸ３０の潜在的な使用を示している。ＣｕＰＲｉＸ２０の潜在的な錯化ポテンシャルを、銅のキレート化と、それに続くＨＰＬＣ－ＵＶ／Ｖｉｓを用いた吸光度の観察とにより決定した。このＤＯＴＡ＠Ｃｕは２９５ｎｍでの吸光度を有し、これはＤＯＴＡ＠Ｇｄ錯体、溶体中のＤＯＴＡおよび銅イオンの吸光度よりもはるかに大きい。生成物の吸光度は、追加の銅の付加が吸光度の増加をもたらさないであろうプラトーに達するまで、遊離ＤＯＴＡ基が利用可能な銅イオンと錯体を形成することにつれて増加するであろう。
このように、遊離ＤＯＴＡの存在は、キレート化療法の文脈における有力なキレート剤としてのＣｕＰＲｉＸ３０の潜在的な使用を示している。ＣｕＰＲｉＸ２０の潜在的な錯化ポテンシャルを、銅のキレート化と、それに続くＨＰＬＣ－ＵＶ／Ｖｉｓを用いた吸光度の観察とにより決定した。このＤＯＴＡ＠Ｃｕは２９５ｎｍでの吸光度を有し、これはＤＯＴＡ＠Ｇｄ錯体、溶体中のＤＯＴＡおよび銅イオンの吸光度よりもはるかに大きい。生成物の吸光度は、追加の銅の付加が吸光度の増加をもたらさないであろうプラトーに達するまで、遊離ＤＯＴＡ基が利用可能な銅イオンと錯体を形成することにつれて増加するであろう。
【0168】
この実験を行うために、一連の試料を、量を増大させた塩化銅の溶液と、一定量のＣｕＰＲｉＸ２０とを用いて調製した。すべてのサンプルの体積を等化している。これにより、１ｍｇのＣｕＰＲｉＸ３０あたり０．２４μｍｏｌの錯化可能な銅の量を算出することができる。これにより、製品ＣｕＰＲｉＸ３０は、そのＤＯＴＡ基の３０％が遊離している。
【0169】
実施例７：Ａ５４９細胞の運動性に対するＣｕＰＲｉＸ２０の効果の分析
細胞の遊走は、腫瘍転移を含む多くの生物学的処理と疾患処理とにおける基本的な構成要素である多段階処理である。インビトロにおいて、創傷試験は、細胞芝上の創傷の形成と、細胞運動性との研究、すなわち、処理において、細胞が密度の変化に応答して表面上を移動し、創傷を閉鎖する能力に基づく。これは、固体２Ｄ基板上における細胞の運動性の直接的な測定である。
細胞の遊走は、腫瘍転移を含む多くの生物学的処理と疾患処理とにおける基本的な構成要素である多段階処理である。インビトロにおいて、創傷試験は、細胞芝上の創傷の形成と、細胞運動性との研究、すなわち、処理において、細胞が密度の変化に応答して表面上を移動し、創傷を閉鎖する能力に基づく。これは、固体２Ｄ基板上における細胞の運動性の直接的な測定である。
【0170】
この実施例の目的は、ＣｕＰＲｉＸ２０が細胞の運動性を低下させる能力を示すことであった。Ａ５４９細胞を、８ｎＭのＣｕＳＯ４－５Ｈ２Ｏを含むＦ１２－Ｋ媒体（Ｇｉｂｃｏ）中で培養した。ＣｕＰＲｉＸ２０（５００μＭの遊離キレート）の有無にかかわらず、７２時間培養した後、細胞をトリプシン処理しており、次いで、ＩｍａｇｅＬｏｃｋ（登録商標）９６ウェル培養プレート（Ｅｓｓｅｎ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ製）に４００００細胞／ウェルで播種した。当該プレートを３７℃、５％ＣＯ２に一晩置いた。次いで、ＩｎｃｕＣｙｔｅ（登録商標）ＷｏｕｎｄＭａｋｅｒ（Ｅｓｓｅｎ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ製）を用いて創傷を作製した。細胞をＰＢＳで２回リンスして浮遊細胞を除去しており、次いで、増加濃度のＣｕＰＲｉＸ２０（０、５０、１００、２００、３００、４００、５００および１０００μＭの遊離キレート，約０、１５０、３００、６００、９００、１２００、１５００および３０００μＭのガドリニウムに相当する）を含んでいる１００μＬの培地で処理した。
【0171】
ＣＯ２を含むインキュベーター内で、Ｚｏｏｍ Ｉｎｃｕｃｙｔｅソフトウェア（Ｅｓｓｅｎ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ製）により、創傷の充満の画像を２時間ごとに７２時間、自動的に撮影した。データはソフトウェアによって分析されており、結果は創傷のコンフルエンス割合として表されている。得られた結果は、異なる濃度のＣｕＰＲｉＸ２０での処理により、Ａ５４９細胞の細胞運動性の減速を実証することを可能にしている（図４、図５および図６）。
【0172】
実施例８：Ａ５４９細胞の運動性に対するＣｕＰＲｉＸ２０およびＣｕＰＲｉＸ３０の効果の比較
この実施例の目的は、ＣｕＰＲｉＸ２０およびＣｕＰＲｉＸ３０が細胞運動性を低下させる能力を示すこと、およびそれらの効果を比較することである。Ａ５４９細胞を、ＩｍａｇｅＬｏｃｋ（登録商標）９６ウェル培養プレート（Ｅｓｓｅｎ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ製）中で、４００００細胞／ウェルで、３７℃、５％ＣＯ２で一晩培養した。創傷試験は、９６ウェルＩｎｃｕＣｙｔｅ（登録商標）ＷｏｕｎｄＭａｋｅｒ（Ｅｓｓｅｎ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ製）を用いて行った。細胞をＰＢＳで２回洗浄して浮遊細胞を除去しており、次いで、ＣｕＰＲｉＸ２０（０、１２５、２５０および５００μＭの遊離キレート，約０、３７５、７５０および１５００μＭのガドリニウムに相当する）またはＣｕＰＲｉＸ３０（０、１２５、２５０および５００μＭの遊離キレート，約０、２００、４００および８００μＭのガドリニウムに相当する）を含有する１００μＬの培地で処理した。
この実施例の目的は、ＣｕＰＲｉＸ２０およびＣｕＰＲｉＸ３０が細胞運動性を低下させる能力を示すこと、およびそれらの効果を比較することである。Ａ５４９細胞を、ＩｍａｇｅＬｏｃｋ（登録商標）９６ウェル培養プレート（Ｅｓｓｅｎ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ製）中で、４００００細胞／ウェルで、３７℃、５％ＣＯ２で一晩培養した。創傷試験は、９６ウェルＩｎｃｕＣｙｔｅ（登録商標）ＷｏｕｎｄＭａｋｅｒ（Ｅｓｓｅｎ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ製）を用いて行った。細胞をＰＢＳで２回洗浄して浮遊細胞を除去しており、次いで、ＣｕＰＲｉＸ２０（０、１２５、２５０および５００μＭの遊離キレート，約０、３７５、７５０および１５００μＭのガドリニウムに相当する）またはＣｕＰＲｉＸ３０（０、１２５、２５０および５００μＭの遊離キレート，約０、２００、４００および８００μＭのガドリニウムに相当する）を含有する１００μＬの培地で処理した。
【0173】
創傷の充満の画像を、ＣＯ２を含有しているインキュベーター中で、Ｚｏｏｍ Ｉｎｃｕｃｙｔｅソフトウェア（Ｅｓｓｅｎ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ製）によって２時間毎に自動的に撮影した。データをソフトウェアによって分析し、結果を創傷のコンフルエンスの割合として表す。
【0174】
得られた結果は、一定濃度の遊離キレートにおいて、２タイプのＣｕＰＲｉＸの効果が同等であることを示すことを可能にしている。
【0175】
実施例９：Ａ５４９細胞の浸潤に対するＣｕＰＲｉＸ２０の効果の分析
細胞浸潤は癌の特性の１つである。それは、細胞遊走に関連し、転移の発生において中心的な役割を果たす。腫瘍細胞の転移を形成する能力は主に、細胞のその細胞形態を変化させ、再編成し、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）を分解する細胞の能力によって決定される。インビトロでの侵襲試験は創傷試験アプローチに基づくが、ＥＣＭを模倣するゲルマトリックスの添加を含む。３Ｄマトリックスの追加は、移動するために細胞がこのマトリックスを劣化させなければならないことを意味している。
細胞浸潤は癌の特性の１つである。それは、細胞遊走に関連し、転移の発生において中心的な役割を果たす。腫瘍細胞の転移を形成する能力は主に、細胞のその細胞形態を変化させ、再編成し、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）を分解する細胞の能力によって決定される。インビトロでの侵襲試験は創傷試験アプローチに基づくが、ＥＣＭを模倣するゲルマトリックスの添加を含む。３Ｄマトリックスの追加は、移動するために細胞がこのマトリックスを劣化させなければならないことを意味している。
【0176】
この実施例の目的は、細胞浸潤を減少させるＣｕＰＲｉＸ２０の能力、すなわち細胞外マトリックスを分解し、移動する細胞の能力を示すことである。Ａ５４９細胞を、ＩｍａｇｅＬｏｃｋ（登録商標）９６ウェル培養プレート中で、１ウェルあたり４００００細胞、３７℃、５％ＣＯ２で一晩にて培養した。次いで、ＩｎｃｕＣｙｔｅ（登録商標）ＷｏｕｎｄＭａｋｅｒ（Ｅｓｓｅｎ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ製）を用いて創傷を作製し、次いで、細胞をＰＢＳで２回すすいだ。１ｍｇ／ｍＬの最終濃度のＣｕＰＲｉＸ２０を含んでいるか、または含んでいないＦ１２－Ｋ媒体中で事前に希釈したマトリゲル（Ｃｏｒｎｉｎｇ製）５０μＬをそれぞれのウェルに添加した。当該プレートを、３７℃で３０分間インキュベートし、マトリゲルの重合を可能にした。最後に、ＣｕＰＲｉＸ２０（０および５００μＭの遊離キレート）を含有しているか、または含有していない培地１００μｌを添加した。ＣＯ２を含有するインキュベーター中で、Ｚｏｏｍ Ｉｎｃｕｃｙｔｅソフトウェア（Ｅｓｓｅｎ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ製）により、創傷の中身の画像を２時間ごとに７２時間自動的に撮影した。データをＺｏｏｍ Ｉｎｃｕｃｙｔｅソフトウェア（Ｅｓｓｅｎ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ製）によって分析し、結果を創傷のコンフルエンス割合として表している。得られた結果は、ＣｕＰＲｉＸ２０処理によりＡ５４９細胞の細胞浸潤が遅くなることを示すことができている（図７）。
【0177】
実施例１０：Ａ５４９細胞の走化性遊走に対するＣｕＰＲｉＸ２０の効果
走化性移動は、刺激に応答する細胞の方向性移動である。この試験は、細胞培養プレートのウェル内に配置された培養インサートからなっている。当該細胞をインサートに播種する。該インサートは規定された孔径を有する膜を含んでおり、これらを飢餓状態にするために無血清培地を含んでいる。化学誘引媒体は、その下のウェルに配置される。この化学的勾配によって、遊走することができる細胞は、化学誘引媒体によって誘引され、細孔を通過する。この実施例の目的は、走化性分析を用いてＣｕＰＲｉＸ２０が細胞の運動性を低下させる能力を示すことである。この目的のために、ＩｎｃｕＣｙｔｅ ＺＯＯＭの走化性モジュールを使用した。Ａ５４９細胞（１０００細胞／ウェル）を、０％ＦＣＳを含有するＦ－１２Ｋ媒体に再懸濁し、８μｍの細孔（４０μｌ／ウェル）を有する９６ウェル細胞移動Ｉｎｃｕｃｙｔｅクリアビュープレートの上部区画に播種した。適切であると判断されるウェルには、ＣｕＰＲｉＸ２０（５００μＭの最終遊離キレート）を含有しているか、または含有していない、ＦＣＳ非含有のＦ１２－Ｋ培地２０μＬを添加した。最後に、１０％ＦＣＳを含有しており、かつ、ＣｕＰＲｉＸ２０（５００μＭの遊離キレート）を含有しているか、または含有していない２００μＬのＦ－１２Ｋ媒体を、走化性チャンバーの下部区画に添加した。各インサートの画像を１時間ごとに撮影した。上部リザーバから下部リザーバへの走化性移動を、膜の上に播種された細胞の初期コンフルエンスと比較して、膜の下における細胞コンフルエンスとして定量化した。計算は、ＩｎｃｕＣｙｔｅ ＺＯＯＭ ２０１５Ａ顕微鏡ソフトウェアを使用して自動的に行った。
走化性移動は、刺激に応答する細胞の方向性移動である。この試験は、細胞培養プレートのウェル内に配置された培養インサートからなっている。当該細胞をインサートに播種する。該インサートは規定された孔径を有する膜を含んでおり、これらを飢餓状態にするために無血清培地を含んでいる。化学誘引媒体は、その下のウェルに配置される。この化学的勾配によって、遊走することができる細胞は、化学誘引媒体によって誘引され、細孔を通過する。この実施例の目的は、走化性分析を用いてＣｕＰＲｉＸ２０が細胞の運動性を低下させる能力を示すことである。この目的のために、ＩｎｃｕＣｙｔｅ ＺＯＯＭの走化性モジュールを使用した。Ａ５４９細胞（１０００細胞／ウェル）を、０％ＦＣＳを含有するＦ－１２Ｋ媒体に再懸濁し、８μｍの細孔（４０μｌ／ウェル）を有する９６ウェル細胞移動Ｉｎｃｕｃｙｔｅクリアビュープレートの上部区画に播種した。適切であると判断されるウェルには、ＣｕＰＲｉＸ２０（５００μＭの最終遊離キレート）を含有しているか、または含有していない、ＦＣＳ非含有のＦ１２－Ｋ培地２０μＬを添加した。最後に、１０％ＦＣＳを含有しており、かつ、ＣｕＰＲｉＸ２０（５００μＭの遊離キレート）を含有しているか、または含有していない２００μＬのＦ－１２Ｋ媒体を、走化性チャンバーの下部区画に添加した。各インサートの画像を１時間ごとに撮影した。上部リザーバから下部リザーバへの走化性移動を、膜の上に播種された細胞の初期コンフルエンスと比較して、膜の下における細胞コンフルエンスとして定量化した。計算は、ＩｎｃｕＣｙｔｅ ＺＯＯＭ ２０１５Ａ顕微鏡ソフトウェアを使用して自動的に行った。
【0178】
得られた結果は、ＣｕＰＲｉＸ２０による細胞の走化性遊走の大幅な減少を実証することを可能にした（図８）。
【0179】
実施例１１：ＣｕＰＲｉＸ３０と光照射との組み合わせがＡ５４９細胞の運動性に及ぼす効果
この実施例の目的は、光子照射後の細胞の運動性を低減するＣｕＰＲｉＸ３０の能力を示すことである。Ａ５４９細胞を、ＩｍａｇｅＬｏｃｋ（登録商標）９６ウェル培養プレート中、１ウェルあたり２００００細胞、３７℃、５%ＣＯ２にて一晩培養した。当該細胞を、ＣｕＰＲｉＸ３０（５００μＭの遊離キレート、８００μＭのガドリニウムに相当）を含有しているか、または含有していない、ＦＣＳ非含有のＦ－１２Ｋを用いて２４時間インキュベートした。続いて、細胞を８Ｇｙ（Ｘ－Ｒａｄ３２０照射器、２５０ｋＶ）で照射し、次いで創傷を作製した。細胞をＰＢＳで２回すすぎ、浮遊細胞を除去し、ＣｕＰＲｉＸ３０（０および５００μＭの遊離キレート，約０および８００μＭのガドリニウムに相当する）を含有する培地１００μＬを各対応するウェルに添加した。
この実施例の目的は、光子照射後の細胞の運動性を低減するＣｕＰＲｉＸ３０の能力を示すことである。Ａ５４９細胞を、ＩｍａｇｅＬｏｃｋ（登録商標）９６ウェル培養プレート中、１ウェルあたり２００００細胞、３７℃、５%ＣＯ２にて一晩培養した。当該細胞を、ＣｕＰＲｉＸ３０（５００μＭの遊離キレート、８００μＭのガドリニウムに相当）を含有しているか、または含有していない、ＦＣＳ非含有のＦ－１２Ｋを用いて２４時間インキュベートした。続いて、細胞を８Ｇｙ（Ｘ－Ｒａｄ３２０照射器、２５０ｋＶ）で照射し、次いで創傷を作製した。細胞をＰＢＳで２回すすぎ、浮遊細胞を除去し、ＣｕＰＲｉＸ３０（０および５００μＭの遊離キレート，約０および８００μＭのガドリニウムに相当する）を含有する培地１００μＬを各対応するウェルに添加した。
【0180】
創傷の中身の画像は、ＣＯ２を含有するインキュベーター内のＺｏｏｍ Ｉｎｃｕｃｙｔｅソフトウェアによって２時間毎に自動的に撮影された。データをソフトウェアによって分析し、結果を創傷のコンフルエンス割合として表している。得られた結果は、照射単独またはＣｕＰＲｉＸ３０単独による治療と比較して、制限運動性におけるＣｕＰＲｉＸ３０／照射併用の優れた有効性（相加効果）を示すことを可能にした（図９）。
【0181】
実施例１２：ＣｕＰＲｉＸ３０と光子照射との組み合わせがＡ５４９細胞の生存に及ぼす効果
Ａ５４９細胞を、４００００細胞／ｃｍ２、すなわち１００万細胞でＴ２５ｃｍ２のフラスコに播種し、３７℃、５％ＣＯ２で一晩インキュベートした。当該細胞を、ＣｕＰＲｉＸ３０（５００μＭの遊離キレート、８００μＭのガドリニウムに相当）を含有しているか、または含有していない、ＦＣＳ非含有のＦ－１２Ｋ媒体で２４時間処理した。次いで、当該細胞を異なる線量（０、２、３、４、６および８Ｇｙ）で照射した。照射後、細胞をＰＢＳ中で洗浄し、トリプシン処理し、計数した。次いで、当該細胞を２５ｃｍ２のフラスコ中で再播種し、固定および染色する前に６分割（７日間）にわたって増殖させることができた。６４個以上の細胞を含むコロニーをデジタルで計数した。ＳＦが生存率であり、αおよびβがそれぞれ致死的および亜致死的損傷の確率を表す、形式：
Ａ５４９細胞を、４００００細胞／ｃｍ２、すなわち１００万細胞でＴ２５ｃｍ２のフラスコに播種し、３７℃、５％ＣＯ２で一晩インキュベートした。当該細胞を、ＣｕＰＲｉＸ３０（５００μＭの遊離キレート、８００μＭのガドリニウムに相当）を含有しているか、または含有していない、ＦＣＳ非含有のＦ－１２Ｋ媒体で２４時間処理した。次いで、当該細胞を異なる線量（０、２、３、４、６および８Ｇｙ）で照射した。照射後、細胞をＰＢＳ中で洗浄し、トリプシン処理し、計数した。次いで、当該細胞を２５ｃｍ２のフラスコ中で再播種し、固定および染色する前に６分割（７日間）にわたって増殖させることができた。６４個以上の細胞を含むコロニーをデジタルで計数した。ＳＦが生存率であり、αおよびβがそれぞれ致死的および亜致死的損傷の確率を表す、形式：
【0182】
【数2】
【0183】
の線形二次モデルを使用して、クローン原性生存を決定した。得られた結果は、ＣｕＰＲｉＸ３０存在下での照射後の細胞生存率の低下を示している（図１０）。
【0184】
実施例１３：Ａ５４９、ＳＱ２０Ｂ－ＣＤ４４＋および４Ｔ１細胞の生残に及ぼすＣｕＰＲｉＸ３０および光照射の組合せの影響
それぞれの細胞株について、細胞を４００００細胞／ｃｍ２、すなわち２５ｃｍ２のフラスコ中１００万細胞で播種し、３７℃、５％ＣＯ２で一晩インキュベートした。次いで、培地を除去し、ＦＣＳ非含有の培地のみ、ＣｕＰＲｉＸ３０（５００μＭの遊離キレート，８００μＭのガドリニウムに相当する）を含んでいるもの、または、ＡＧｕＩＸ（登録商標）（８００μＭのガドリニウム）を含むＦＣＳ非含有の培地のみで２４時間置換する。次いで、細胞を異なる線量（０、２、３、４、および６Ｇｙ）で照射する。照射後、細胞をＰＢＳ中で洗浄し、トリプシン処理し、計数する。次いで、それらを２５ｃｍ２のフラスコ中で再播種し、９６％エタノールで固定し、ギムザで染色する前に、６つの分割（７日間）にわたって増殖させることができる。６４個以上の細胞を含むコロニーをデジタルで計数する。ＳＦが生存率であり、αおよびβがそれぞれ致死的および亜致死的損傷の確率を表す、形式：
それぞれの細胞株について、細胞を４００００細胞／ｃｍ２、すなわち２５ｃｍ２のフラスコ中１００万細胞で播種し、３７℃、５％ＣＯ２で一晩インキュベートした。次いで、培地を除去し、ＦＣＳ非含有の培地のみ、ＣｕＰＲｉＸ３０（５００μＭの遊離キレート，８００μＭのガドリニウムに相当する）を含んでいるもの、または、ＡＧｕＩＸ（登録商標）（８００μＭのガドリニウム）を含むＦＣＳ非含有の培地のみで２４時間置換する。次いで、細胞を異なる線量（０、２、３、４、および６Ｇｙ）で照射する。照射後、細胞をＰＢＳ中で洗浄し、トリプシン処理し、計数する。次いで、それらを２５ｃｍ２のフラスコ中で再播種し、９６％エタノールで固定し、ギムザで染色する前に、６つの分割（７日間）にわたって増殖させることができる。６４個以上の細胞を含むコロニーをデジタルで計数する。ＳＦが生存率であり、αおよびβがそれぞれ致死的および亜致死的損傷の確率を表す、形式：
【0185】
【数3】
【0186】
の線形二次モデルを使用して、クローン原性生存を決定した。３つの細胞株については、ＡＧｕＩＸおよびＣｕＰＲｉＸ３０を用いた照射後および処理後における細胞生存率の低下が示されている。Ａ５４９およびＳＱ２０Ｂ－ＣＤ４４＋細胞株の場合、ＣｕＰＲｉＸ３０の有効性はＡＧｕＩＸの有効性と同等であると思われるが、４Ｔ１細胞株の場合、ＡＧｕＩＸよりも優れている（図１１）。
【0187】
実施例１４：転移性乳癌マウスモデルにおける腫瘍増殖および転移の形成に対するＣｕＰＲｉＸ３０の有効性
本実施例の目的は、腫瘍増殖を遅らせ、転移の形成を減少させるＣｕＰＲｉＸ３０の能力を示すことである。この目的のために、１０匹の８週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスに、５００００個の４Ｔ１細胞（トリプルネガティブ乳癌細胞、５０：５０のＰＢＳ：マトリゲル）を皮下注射した。１０日間後（Ｄ１０）、腫瘍が平均して１００ｍｍ３に達したとき、５０μＬのＣｕＰＲｉＸ３０（２００ｍｇ／ｋｇ，ｎ＝６）またはＮａＣｌ（０．９％，ｎ＝４）を静脈内注射した。さらに２回の注射を、１回目の４８時間後（Ｄ１２）および９６時間後（Ｄ１４）に注射した。腫瘍接種の１９日後、すなわち最後の注射の５日後、マウスをイソフルラン麻酔下で頸椎脱臼により安楽死させ、転移を有する可能性がある臓器（肺および肝臓）を除去した。
本実施例の目的は、腫瘍増殖を遅らせ、転移の形成を減少させるＣｕＰＲｉＸ３０の能力を示すことである。この目的のために、１０匹の８週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスに、５００００個の４Ｔ１細胞（トリプルネガティブ乳癌細胞、５０：５０のＰＢＳ：マトリゲル）を皮下注射した。１０日間後（Ｄ１０）、腫瘍が平均して１００ｍｍ３に達したとき、５０μＬのＣｕＰＲｉＸ３０（２００ｍｇ／ｋｇ，ｎ＝６）またはＮａＣｌ（０．９％，ｎ＝４）を静脈内注射した。さらに２回の注射を、１回目の４８時間後（Ｄ１２）および９６時間後（Ｄ１４）に注射した。腫瘍接種の１９日後、すなわち最後の注射の５日後、マウスをイソフルラン麻酔下で頸椎脱臼により安楽死させ、転移を有する可能性がある臓器（肺および肝臓）を除去した。
【0188】
転移を定量化するために、肺および肝臓を機械的に分解し、次いで、濾過する前に酵素消化に供した。続いて、６０μＭの６－チオグアニン（４Ｔ１細胞の選択剤）を含む培地中で、細胞懸濁液を純粋（肝臓）または希釈（肺臓）培養し、ＣＯ２を含むインキュベーター中、３７℃でインキュベートした。８日後、細胞を固定し、染色し、コロニーを自動的に計数しており、その結果を表１に示す。
【0189】
【表1】
【0190】
マウスにＣｕＰＲｉＸ３０を投与すると、腫瘍成長が遅くなり、肺転移が減少することが分かった。対照群の４匹のマウスは肺に転移を有していたが、ＣｕＰＲｉＸで処置した６匹のうち２匹は転移を有しなかった。いずれの状態においても肝転移は認められなかった（図１２）。
【0191】
実施例１５：転移性乳癌マウスモデルにおける腫瘍増殖および生存に対するＣｕＰＲｉＸ３０および放射線療法の組み合わせの有効性
この実施例の目的は、腫瘍の増殖および生存に対する放射線療法の有効性を増大させるＣｕＰＲｉＸ３０の能力を示すことである。この目的のために、４２匹の８週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスに、５００００個の４Ｔ１細胞（トリプルネガティブ乳癌細胞、５０：５０のＰＢＳ：マトリゲル）を皮下注射した。腫瘍移植の１０日後、マウスは無作為に４群：ＮａＣｌ群（対照、ｎ＝１２）、ＣｕＰＲｉＸ群（ｎ＝１０）、ＮａＣｌ＋放射線療法群（ＲＴ、ｎ＝９）、およびＣｕＰＲｉＸ＋ＲＴ群（ｎ＝１１）に分けられ、治療を受けた。
この実施例の目的は、腫瘍の増殖および生存に対する放射線療法の有効性を増大させるＣｕＰＲｉＸ３０の能力を示すことである。この目的のために、４２匹の８週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスに、５００００個の４Ｔ１細胞（トリプルネガティブ乳癌細胞、５０：５０のＰＢＳ：マトリゲル）を皮下注射した。腫瘍移植の１０日後、マウスは無作為に４群：ＮａＣｌ群（対照、ｎ＝１２）、ＣｕＰＲｉＸ群（ｎ＝１０）、ＮａＣｌ＋放射線療法群（ＲＴ、ｎ＝９）、およびＣｕＰＲｉＸ＋ＲＴ群（ｎ＝１１）に分けられ、治療を受けた。
【0192】
マウスに、５０μｌのＣｕＰＲｉＸ（２００ｍｇ／ｍＬ）またはＮａＣｌ（０．９％）を４８時間間隔で計３回注射し、５×２Ｇｙ（２Ｇｙ／日を５日間）の割合で放射線療法と併用した（図１３）。照射は、イソフルラン麻酔下で、治療の投与の１時間後に行った。
【0193】
腫瘍の進展をモニターし、Ｋａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ生存曲線を確立するために、マウスの体重を測定し、腫瘍を１週間に６回測定した。治療計画の最後に、２日間連続して、次の限界点：その重量の１５％の喪失；≧１０００ｍｍ３の腫瘍体積；持続性潰瘍形成；苦痛の徴候の観察（衰弱、粗毛、背部弓状）；のうちの１つに達したマウスを安楽死させた。
【0194】
腫瘍体積の進展は、以下のように計算された：（時間ｔにおける腫瘍体積）／（基準時間における腫瘍体積）、ここで、基準時間は治療の最初の日、すなわち、Ｄ１０に対応している。得られた結果は、ＲＴ単独またはＣｕＰＲｉＸ単独による治療後よりも、ＣｕＰＲｉＸ＋ＲＴの治療組み合わせ後の腫瘍増殖のより大きな減少を示している。ＣｕＰＲｉＸとＲＴとの併用はまた、ＲＴ単独と比較して動物の生存を延長することを可能にした（図１４）。
【0195】
〔産業上の利用可能性〕
本発明の技術的解決策は特に、医学の分野、特に、腫瘍の治療に適用することができる。
本発明の技術的解決策は特に、医学の分野、特に、腫瘍の治療に適用することができる。
【0196】
本開示は、例としてのみ与えられる上述の例に限定されず、探求される保護の文脈において当業者によって想定され得る全ての変形を包含する。
【図面の簡単な説明】
【0197】
【図2】図２は、１ｍｇのＣｕＰＲｉＸ２０（３９５ｎｍでの励起）あたりに添加されたユウロピウムの量の関数として、５９０ｎｍでの発光強度を測定することにより、遊離ＤＯＴＡのＣｕＰＲｉＸ２０を滴定した結果を示している。
【図4】図４は、Ａ５４９細胞の細胞運動性に対するＣｕＰＲｉＸ２０の濃度増加（０、５０、１００、５００、１０００μＭの遊離キレート、約０、１５０、３００、６００、９００、１２００、１５００および３０００μＭのガドリニウムに相当）の効果を示している。（Ａ）時間の関数としての創傷閉鎖の定量的分析。創傷の相対密度は、領域の密度に対する創傷の領域の密度の尺度である。
【図5】図５は、Ａ５４９細胞の細胞運動性に対するＣｕＰＲｉＸ２０の濃度増加（０、１００、２００、３００、４００および５００μＭの遊離キレート、約０、３００、６００、９００、１２００および１５００μＭのガドリニウムに相当）の効果を示している。（Ａ）時間の関数としての創傷閉鎖の定量的分析。創傷の相対密度は、細胞領域の密度（％）に対する創傷の領域の密度の尺度である。データは平均±ＳＥＭ（ｎ＝６）として示す。（Ｂ）画像は、それぞれの状態が、元の創傷、並びにその２４時間後および４８時間を示していることを示す。スケールバーは３００μｍを示している。
【図6】図６は、ＣｕＰＲｉＸ２０（０および５００μＭの遊離キレート，約０および１５００μＭのガドリニウムに相当する）がＡ５４９細胞の細胞運動性に及ぼす影響を示している。細胞をＣｕＰＲｉＸ２０で７２時間処理した後、創傷を作製した。（Ａ）時間の関数としての創傷閉鎖の定量的分析。創傷の相対密度は、細胞領域の密度（％）に対する創傷の領域の密度の尺度である。データは平均±ＳＥＭ（ｎ＝６）として示している。（Ｂ）画像は、それぞれの状態が、元の創傷、並びにその２４時間後および４８時間後を示していることを示す。スケールバーは３００μｍを示している。
【図7】図７は、Ａ５４９細胞の細胞浸潤に対するＣｕＰＲｉＸ２０（０および５００μＭの遊離キレート，約０および１５００μＭのガドリニウムに相当する）の効果を示している。（Ａ）時間の関数としての創傷閉鎖の定量的分析。創傷の相対密度は、細胞領域の密度（％）に対する創傷の領域の密度の尺度である。データは平均±ＳＥＭ（ｎ＝６）として示している。（Ｂ）画像は、それぞれの状態が、元の創傷、並びにその２４時間後および４８時間後を示していることを示す。スケールバーは３００μｍを示している。
【図8】図８は、Ａ５４９細胞の走化性遊走に対するＣｕＰＲｉＸ２０の効果を示している。遊走は、膜上に播種された最初の細胞コンフルエンスに対しての、膜を通過した細胞のコンフルエンスとの比として表されている。データは平均±ＳＥＭ（ｎ＝５）として示している。
【図9】図９は、Ａ５４９細胞の運動性に対するＣｕＰＲｉＸ３０と光照射との併用の効果を示している。創傷の相対密度は、細胞領域の密度（％）に対する創傷の領域の密度の尺度である。データは平均±ＳＥＭ（ｎ=６）として示している。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【国際調査報告】