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特表2023-550131Ｌ－グルタミン生産能が向上した微生物及びそれを用いたＬ－グルタミン生産方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-11-30
(54)【発明の名称】Ｌ－グルタミン生産能が向上した微生物及びそれを用いたＬ－グルタミン生産方法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/60 20060101AFI20231122BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20231122BHJP
C12N 1/20 20060101ALI20231122BHJP
C12P 13/14 20060101ALI20231122BHJP
【ＦＩ】
C12N15/60
C12N1/21 ZNA
C12N1/20 A
C12P13/14 A
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023530699
(86)(22)【出願日】2021-11-19
(85)【翻訳文提出日】2023-07-19
(86)【国際出願番号】 KR2021017074
(87)【国際公開番号】W WO2022108383
(87)【国際公開日】2022-05-27
(31)【優先権主張番号】10-2020-0156903
(32)【優先日】2020-11-20
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】508139664
【氏名又は名称】シージェイ チェイルジェダン コーポレーション
【氏名又は名称原語表記】ＣＪ ＣＨＥＩＬＪＥＤＡＮＧ ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ
【住所又は居所原語表記】ＣＪ Ｃｈｅｉｌｊｅｄａｎｇ Ｃｅｎｔｅｒ，３３０，Ｄｏｎｇｈｏ－ｒｏ，Ｊｕｎｇ－ｇｕ，Ｓｅｏｕｌ，Ｒｅｐｕｂｌｉｃ Ｏｆ Ｋｏｒｅａ
(74)【代理人】
【識別番号】110000176
【氏名又は名称】弁理士法人一色国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】チェ，ソ チン
(72)【発明者】
【氏名】ヤン，ソンヨン
(72)【発明者】
【氏名】リ，カン ウ
【テーマコード（参考）】
4B064
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B064AE20
4B064CA02
4B064CA19
4B064CC24
4B064DA01
4B064DA10
4B065AA24X
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA17
4B065CA41
4B065CA44
4B065CA50
(57)【要約】
本出願は、Ｌ－グルタミン生産能が向上した微生物及びそれを用いたＬ－グルタミン生産方法に関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ活性が弱化されてＬ－グルタミン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物。
【請求項2】
前記微生物は、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ活性が弱化されていない親株又は野生型コリネバクテリウム属菌株に比べてＬ－グルタミン生産能が向上したものである、請求項１に記載の微生物。
【請求項3】
前記ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼは内在タンパク質である、請求項１に記載の微生物。
【請求項4】
前記微生物はコリネバクテリウム・グルタミカムである、請求項１に記載の微生物。
【請求項5】
前記ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼは、配列番号１のアミノ酸配列、又はそれと９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるものである、請求項１に記載の微生物。
【請求項6】
請求項１～５のいずれか一項に記載の微生物を培地で培養するステップを含むＬ－グルタミン生産方法。
【請求項7】
前記培養するステップの後に、培地又は微生物からＬ－グルタミンを回収するステップをさらに含む、請求項６に記載のＬ－グルタミン生産方法。
【請求項8】
ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼが弱化されたコリネバクテリウム属微生物のＬ－グルタミン生産への使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本出願は、Ｌ－グルタミン生産能が向上した微生物及びそれを用いたＬ－グルタミン生産方法に関する。
【背景技術】
【0002】
Ｌ－グルタミンは、消化器疾患治療剤、肝機能強化剤、脳機能強化剤、免疫増強剤、胃潰瘍治療剤、アルコール中毒治療剤、化粧品の保湿剤、運動栄養剤、患者用栄養剤などの医薬品、化粧品、健康食品などに広く用いられるアミノ酸である。
【0003】
微生物によるＬ－グルタミン生産には、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）と大腸菌（Escherichia coli）が代表的に用いられている。Ｌ－グルタミン生合成経路においては、解糖過程（Glycolysis）とＴＣＡ回路（Tricarboxylic acid cycle）により生成されるα－ケトグルタミン酸（α-keto glutaric acid）を前駆体とし、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（Glutamate dehydrogenase）によりＬ－グルタミン酸（L-glutamate）が生成され、グルタミンシンテターゼ（Glutamine synthetase）の反応により最終的にＬ－グルタミンが生成される（非特許文献１）。
【0004】
しかし、Ｌ－グルタミンの需要の増加に伴い、効果的にＬ－グルタミンの生産能を向上させるための研究が依然として求められている現状である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0005】
【特許文献1】国際公開第２０２１／１７７７３１号
【特許文献2】韓国登録特許第１０－００４８４４０号公報
【特許文献3】米国特許第７２６２０３５号明細書
【特許文献4】米国特許第７６６２９４３号明細書
【特許文献5】米国特許第１０５８４３３８号明細書
【特許文献6】米国特許第１０２７３４９１号明細書
【特許文献7】韓国公開特許第２００９－００９４４３３号公報
【非特許文献】
【0006】
【非特許文献1】Production of glutamate and glutamate-related aminoacids: Molecular Mechanism Analysis and Metabolic Engineering, Amino acid Biosynthesis-pathways, regulation and metabolic engineering pp1-38
【非特許文献2】Pearson et al (1988)[Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85]: 2444
【非特許文献3】Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277
【非特許文献4】Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453
【非特許文献5】Devereux, J., et al, Nucleic Acids Research 12: 387 (1984)
【非特許文献6】Atschul, [S.] [F.,] [ET AL, J MOLEC BIOL 215]: 403 (1990)
【非特許文献7】Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, [ED.,] Academic Press, San Diego,1994
【非特許文献8】[CARILLO ETA/.](1988) SIAM J Applied Math 48: 1073
【非特許文献9】Smith and Waterman, Adv. Appl. Math (1981) 2:482
【非特許文献10】Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas Of Protein Sequence And Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358 (1979)
【非特許文献11】Gribskov et al(1986) Nucl. Acids Res. 14: 6745
【非特許文献12】J. Sambrook et al.,Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989
【非特許文献13】F.M. Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York, 9.50-9.51, 11.7-11.8
【非特許文献14】Nakashima N et al., Bacterial cellular engineering by genome editing and gene silencing. Int J Mol Sci. 2014;15(2):2773-2793
【非特許文献15】Sambrook et al. Molecular Cloning 2012
【非特許文献16】Weintraub, H. et al., Antisense-RNA as a molecular tool for genetic analysis, Reviews - Trends in Genetics, Vol. 1(1) 1986
【非特許文献17】Sitnicka et al. Functional Analysis of Genes. Advances in Cell Biology. 2010, Vol. 2. 1-16
【非特許文献18】"Manual of Methods for General Bacteriology" by the American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981)
【非特許文献19】Van der Rest et al., Appl. Microbial. Biotechnol. 52:541-545, 1999
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
本発明者らは、Ｌ－グルタミン生産能を向上させるために鋭意努力した結果、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（Phosphoenolpyruvate carboxykinase）を含む微生物においてＬ－グルタミンが高効率で生産されることを確認し、本出願を完成するに至った。
【課題を解決するための手段】
【0008】
本出願は、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（Phosphoenolpyruvate carboxykinase）活性が弱化されてＬ－グルタミン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物を提供することを目的とする。
【0009】
また、本出願は、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ活性が弱化されてＬ－グルタミン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物を培地で培養するステップを含むＬ－グルタミン生産方法を提供することを目的とする。
【0010】
さらに、本出願は、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼを弱化させるステップを含む、Ｌ－グルタミン生産用微生物の製造方法を提供することを目的とする。
【0011】
さらに、本出願は、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼが弱化された微生物、それを培養した培地、又はそれらの組み合わせを含むＬ－グルタミン生産用組成物を提供することを目的とする。
【0012】
さらに、本出願は、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼが弱化されたコリネバクテリウム属微生物のＬ－グルタミン生産への使用を提供することを目的とする。
【発明の効果】
【0013】
本出願による弱化されたホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（Phosphoenolpyruvate carboxykinase）を含む微生物は、Ｌ－グルタミンを高効率で生産することができる。製造されたＬ－グルタミンは、動物飼料又は動物飼料添加剤だけでなく、ヒトの食品又は食品添加剤、医薬品などの様々な製品に応用することができる。
【発明を実施するための形態】
【0014】
以下、これらを具体的に説明する。なお、本出願で開示される各説明及び実施形態はそれぞれ他の説明及び実施形態にも適用される。すなわち、本出願で開示される様々な要素のあらゆる組み合わせが本出願に含まれる。また、以下の具体的な記述に本出願が限定されるものではない。さらに、当該技術分野における通常の知識を有する者であれば、通常の実験のみを用いて本出願に記載された本出願の特定の態様の多くの等価物を認識し、確認することができるであろう。さらに、その等価物も本出願に含まれることが意図されている。さらに、本明細書全体にわたって多くの論文及び特許文献が参照されており、その引用が示されている。引用された論文及び特許文献の開示内容はその全体が本明細書に参照として組み込まれており、それにより本出願の属する技術分野の水準及び本出願の内容がより明確に説明される。
【0015】
上記目的を達成するための本出願の一態様は、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（Phosphoenolpyruvate carboxykinase）活性が弱化されてＬ－グルタミン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物を提供する。
【0016】
本出願における「ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（Phosphoenolpyruvate carboxykinase; PEPCK; EC 4.1.1.32）」とは、グルコース新生（gluconeogenesis）合成過程に関与し、ＧＴＰ存在時に、オキサロ酢酸（Oxaloacetate）をホスホエノールピルビン酸（Phosphoenolpyruvate）と二酸化炭素に変換する酵素を意味する。本出願のホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼは、ＰＥＰＣＫと混用される。
【0017】
前記ＰＥＰＣＫのアミノ酸配列は、公知のデータベースであるＮＣＢＩのＧｅｎｂａｎｋなどから得られる。
【0018】
例えば、本出願のＰＥＰＣＫは、コリネバクテリウム属微生物由来のタンパク質であってもよい。より具体的には、本出願のＰＥＰＣＫは、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）、コリネバクテリウム・デセルティ（Corynebacterium deserti）、コリネバクテリウム・クルジラクチス（Corynebacterium crudilactis）、コリネバクテリウム・エフィシエンス（Corynebacterium efficiens）、コリネバクテリウム・カルナエ（Corynebacterium callunae）などに由来するものであるが、これらに限定されるものではない。
【0019】
本出願のＰＥＰＣＫは、本出願のコリネバクテリウム属微生物の内在タンパク質であってもよい。
【0020】
本出願において、本出願のＰＥＰＣＫは、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するものであってもよく、前記アミノ酸配列を含むものであってもよく、前記アミノ酸配列からなるものであってもよく、前記アミノ酸配列から必須に構成される（essentially consisting of）ものであってもよい。
【0021】
本出願において、配列番号１のアミノ酸配列には、それと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．７％又は９９．９％以上の相同性又は同一性を有するアミノ酸配列が含まれる。また、そのような相同性又は同一性を有し、配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質に相当する効能を示すアミノ酸配列であれば、一部の配列が欠失、改変、置換、保存的置換又は付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質も本出願に含まれることは言うまでもない。
【0022】
例えば、アミノ酸配列のＮ末端、Ｃ末端及び／又は内部における本出願のタンパク質の機能を変更しない配列の付加もしくは欠失、自然に発生し得る突然変異、非表現突然変異（silent mutation）又は保存的置換を有するものが挙げられる。
【0023】
前記「保存的置換（conservative substitution）」とは、あるアミノ酸が類似した構造的及び／又は化学的性質を有する他のアミノ酸に置換されることを意味する。このようなアミノ酸置換は、一般に残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性及び／又は両親媒性（amphipathic nature）における類似性に基づいて発生し得る。通常、保存的置換は、タンパク質又はポリペプチドの活性にほとんど又は全く影響を及ぼさない。
【0024】
本出願における「相同性（homology）」又は「同一性（identity）」とは、２つの与えられたアミノ酸配列又は塩基配列が類似する程度を意味し、百分率で表される。相同性及び同一性は、しばしば互換的に用いられる。
【0025】
保存されている（conserved）ポリヌクレオチド又はポリペプチドの配列相同性又は同一性は標準配列アルゴリズムにより決定され、用いられるプログラムにより確立されたデフォルトギャップペナルティが共に用いられてもよい。実質的には、相同性を有するか（homologous）又は同じ（identical）配列は、中程度又は高いストリンジェントな条件（stringent conditions）下において、一般に配列全部又は一部分とハイブリダイズすることができる。ハイブリダイゼーションには、ポリヌクレオチドにおいて一般のコドン又はコドン縮退を考慮したコドンを有するポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーションも含まれることは言うまでもない。
【0026】
任意の２つのポリヌクレオチド又はポリペプチド配列が相同性、類似性又は同一性を有するか否かは、例えば非特許文献２のようなデフォルトパラメーターと「ＦＡＳＴＡ」プログラムなどの公知のコンピュータアルゴリズムを用いて決定することができる。あるいは、ＥＭＢＯＳＳパッケージのニードルマンプログラム（EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, 非特許文献３）（バージョン５．０．０又はそれ以降のバージョン）で行われるように、ニードルマン＝ウンシュ（Needleman-Wunsch）アルゴリズム（非特許文献４）を用いて決定することができる（ＧＣＧプログラムパッケージ（非特許文献５）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡ（非特許文献６、７及び８）を含む）。例えば、国立生物工学情報センターのＢＬＡＳＴ又はＣｌｕｓｔａｌ Ｗを用いて相同性、類似性又は同一性を決定することができる。
【0027】
ポリヌクレオチド又はポリペプチドの相同性、類似性又は同一性は、例えば非特許文献９に開示されているように、非特許文献４などのＧＡＰコンピュータプログラムを用いて、配列情報を比較することにより決定することができる。要約すると、ＧＡＰプログラムは、２つの配列のうち短いものにおける記号の総数で、類似する配列記号（すなわち、ヌクレオチド又はアミノ酸）の数を割った値と定義している。ＧＡＰプログラムのためのデフォルトパラメーターは、（１）二進法比較マトリックス（同一性は１、非同一性は０の値をとる）及び非特許文献１０に開示されているように、非特許文献１１の加重比較マトリックス（又はＥＤＮＡＦＵＬＬ（ＮＣＢＩ ＮＵＣ４．４のＥＭＢＯＳＳバージョン）置換マトリックス）と、（２）各ギャップに３．０のペナルティ、及び各ギャップの各記号に追加の０．１０ペナルティ（又はギャップオープンペナルティ１０、ギャップ延長ペナルティ０．５）と、（３）末端ギャップに無ペナルティとを含む。
【0028】
本出願のＰＥＰＣＫは、ｐｃｋ遺伝子によりコードされるものであってもよい。本出願のｐｃｋ遺伝子は、ＰＥＰＣＫ活性を有するタンパク質をコードすることが知られている遺伝子であればいかなるものでもよい。
【0029】
具体的には、本出願のｐｃｋ遺伝子は、コリネバクテリウム属微生物由来のｐｃｋであってもよい。より具体的には、本出願のｐｃｋ遺伝子は、コリネバクテリウム・グルタミカム菌株由来のｐｃｋであってもよい。例えば、本出願のｐｃｋ遺伝子は、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２由来のＷＰ＿０１１０１５４４６．１をコードするポリヌクレオチドであってもよい。
【0030】
本出願における「ポリヌクレオチド」とは、ヌクレオチド単量体（monomer）が共有結合により長く鎖状につながったヌクレオチドの重合体（polymer）であって、所定の長さより長いＤＮＡ又はＲＮＡ鎖を意味し、より具体的には前記タンパク質をコードするポリヌクレオチド断片を意味する。
【0031】
本出願のＰＥＰＣＫをコードするポリヌクレオチドは、配列番号１で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むものであってもよい。本出願の一例として、本出願のポリヌクレオチドは、配列番号２の塩基配列を有するものであってもよく、配列番号２の塩基配列を含むものであってもよい。また、本出願のポリヌクレオチドは、配列番号２の配列からなるものであってもよく、配列番号２の配列から必須に構成されるものであってもよい。具体的には、前記ＰＥＰＣＫは、配列番号２の塩基配列で表されるポリヌクレオチドによりコードされるものであってもよい。
【0032】
本出願のポリヌクレオチドは、コドンの縮退（degeneracy）により、又は本出願のＰＥＰＣＫを発現させようとする生物において好まれるコドンを考慮して、ＰＥＰＣＫのアミノ酸配列が変化しない範囲でコード領域に様々な改変を行うことができる。具体的には、本出願のポリヌクレオチドは、配列番号２の配列と相同性もしくは同一性が７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上である塩基配列を有するものであるか、前記塩基配列を含むものであるか、又は配列番号２の配列と相同性もしくは同一性が７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上である塩基配列からなるものであるか、前記塩基配列から必須に構成されるものであるが、これらに限定されるものではない。
【0033】
また、本出願のポリヌクレオチドは、公知の遺伝子配列から調製されるプローブ、例えば本出願のポリヌクレオチド配列の全部又は一部に対する相補配列とストリンジェントな条件下でハイドリダイズする配列であればいかなるものでもよい。前記「ストリンジェントな条件（stringent condition）」とは、ポリヌクレオチド間の特異的ハイブリダイゼーションを可能にする条件を意味する。このような条件は、文献（非特許文献１２、１３参照）に具体的に記載されている。例えば、相同性もしくは同一性の高いポリヌクレオチド同士、７０％以上、７５％以上、７６％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上の相同性もしくは同一性を有するポリヌクレオチド同士をハイブリダイズし、それより相同性もしくは同一性の低いポリヌクレオチド同士をハイブリダイズしない条件、又は通常のサザンハイブリダイゼーション（southern hybridization）の洗浄条件である６０℃、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、具体的には６０℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、より具体的には６８℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度及び温度において、１回、具体的には２回～３回洗浄する条件が挙げられる。
【0034】
ハイブリダイゼーションは、たとえハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに応じて塩基間のミスマッチ（mismatch）が可能であっても、２つの核酸が相補的配列を有することが求められる。「相補的」とは、互いにハイブリダイゼーションが可能なヌクレオチド塩基間の関係を表すために用いられるものである。例えば、ＤＮＡにおいて、アデニンはチミンに相補的であり、シトシンはグアニンに相補的である。よって、本出願のポリヌクレオチドには、実質的に類似する核酸配列だけでなく、全配列に相補的な単離された核酸フラグメントが含まれてもよい。
【0035】
具体的には、本出願のポリヌクレオチドと相同性又は同一性を有するポリヌクレオチドは、５５℃のＴｍ値でハイブリダイゼーションステップが行われるハイブリダイゼーション条件と前述した条件を用いて検知することができる。また、前記Ｔｍ値は、６０℃、６３℃又は６５℃であってもよいが、これらに限定されるものではなく、その目的に応じて当業者により適宜調節される。
【0036】
前記ポリヌクレオチドをハイブリダイズする適切なストリンジェンシーはポリヌクレオチドの長さ及び相補性の程度に依存し、変数は当該技術分野で公知である（例えば、非特許文献１２）。
【0037】
本出願における「微生物（又は菌株）」とは、野生型微生物や自然に又は人為的に遺伝的改変が行われた微生物が全て含まれるものであり、外部遺伝子が挿入されるか、内在性遺伝子の活性が強化又は弱化されるなどの原因により、特定機序が弱化又は強化された微生物であって、目的とするポリペプチド、タンパク質又は産物の生産のために遺伝的改変（modification）が行われた微生物であってもよい。
【0038】
本出願におけるポリペプチド（例えば、各酵素の名称で特定されるタンパク質を含む。）の活性の「弱化」は、内在性活性に比べて活性が低下することや、活性がなくなることが全て含まれる概念である。前記弱化は、不活性化（inactivation）、欠乏（deficiency）、下方調節（down-regulation）、減少（decrease）、低下（reduce）、減衰（attenuation）などと混用される。
【0039】
前記弱化には、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの変異などによりポリペプチド自体の活性が本来微生物が有するポリペプチドの活性に比べて減少又は除去される場合が含まれ、それをコードするポリヌクレオチドの遺伝子の発現阻害やポリペプチドへの翻訳（translation）阻害などにより細胞内での全体的なポリペプチド活性の程度及び／又は濃度（発現量）が天然菌株に比べて低下する場合が含まれ、前記ポリヌクレオチドの発現が全くない場合が含まれ、かつ／又はポリヌクレオチドが発現したとしてもポリペプチドの活性がない場合が含まれてもよい。
【0040】
このようなポリペプチドの活性の弱化は、これらに限定されるものではなく、当該分野で周知の様々な方法を適用することにより達成することができる（例えば、非特許文献１４、１５など）。
【0041】
具体的には、本出願のポリペプチドの活性の弱化は、１）ポリペプチドをコードする遺伝子の全部又は一部を欠失させること、２）ポリペプチドをコードする遺伝子の発現が減少するように発現調節領域（又は発現調節配列）を改変すること、３）ポリペプチドの活性が欠失又は弱化するように前記ポリペプチドを構成するアミノ酸配列を改変すること（例えば、アミノ酸配列の１つ以上のアミノ酸を欠失／置換／付加すること）、４）ポリペプチドの活性が欠失又は弱化するように前記ポリペプチドをコードする核酸塩基配列を改変すること（例えば、ポリペプチドの活性が欠失又は弱化するように改変されたポリペプチドをコードするように前記ポリペプチドをコードする遺伝子の核酸塩基配列の１つ以上の核酸塩基を欠失／置換／付加すること）、５）ポリペプチドをコードする遺伝子転写産物の開始コドン又は５’ＵＴＲ領域の塩基配列を改変すること、６）ポリペプチドをコードする前記遺伝子転写産物に相補的に結合するアンチセンスオリゴヌクレオチド（例えば、アンチセンスＲＮＡ）を導入すること、７）リボソーム（ribosome）の付着を不可能にする２次構造物が形成されるようにポリペプチドをコードする遺伝子のシャイン・ダルガノ（Shine-Dalgarno）配列の前にシャイン・ダルガノ配列と相補的な配列を付加すること、８）ポリペプチドをコードする核酸塩基配列のＯＲＦ（open reading frame）の３’末端に逆転写するようにプロモーターを付加すること（Reverse transcription engineering, RTE）、又は９）それらの組み合わせ（例えば、前記１）～８）から選択される２つ以上の組み合わせ）により行われるが、特に上記例に限定されるものではない。
【0042】
例えば、前記１）ポリペプチドをコードする前記遺伝子の一部又は全部を欠失させることは、染色体内の内在性標的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド全体を欠失させること、一部のヌクレオチドが欠失したポリヌクレオチド又はマーカー遺伝子に置換することにより行われてもよい。
【0043】
前記２）発現調節領域（又は発現調節配列）を改変することは、欠失、挿入、非保存的もしくは保存的置換、又はそれらの組み合わせにより発現調節領域（又は発現調節配列）上の変異を発生させるか、より低い活性を有する配列に置換することにより行われてもよい。前記発現調節領域には、プロモーター、オペレーター配列、リボソーム結合部位をコードする配列、並びに転写及び翻訳の終結を調節する配列が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【0044】
前記３）及び４）のアミノ酸配列又は核酸塩基配列を改変することは、ポリペプチドの活性が弱化するように、前記ポリペプチドのアミノ酸配列又は前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を欠失、挿入、非保存的もしくは保存的置換、又はそれらの組み合わせにより配列上の変異を発生させるか、より低い活性を有するように改良されたアミノ酸配列もしくはポリヌクレオチド配列、又は活性がなくなるように改良されたアミノ酸配列もしくはポリヌクレオチド配列に置換することにより行われるが、これらに限定されるものではない。例えば、ポリヌクレオチド配列に変異を導入して終止コドンを形成することにより、遺伝子の発現を阻害又は弱化させることができるが、これらに限定されるものではない。
【0045】
前記５）ポリペプチドをコードする遺伝子転写産物の開始コドン又は５’ＵＴＲ領域をコードする塩基配列を改変することは、例えば、内在性開始コドンに比べてポリペプチドの発現率が低い他の開始コドンをコードする塩基配列に置換することにより行われるが、これに限定されるものではない。
【0046】
前記６）ポリペプチドをコードする前記遺伝子転写産物に相補的に結合するアンチセンスオリゴヌクレオチド（例えば、アンチセンスＲＮＡ）を導入することは、例えば、非特許文献１６のように行われてもよい。
【0047】
前記７）リボソームの付着を不可能にする２次構造物が形成されるようにポリペプチドをコードする遺伝子のシャイン・ダルガノ配列の前にシャイン・ダルガノ配列と相補的な配列を付加することは、ｍＲＮＡ翻訳を不可能にするか、速度を弱化させることにより行われてもよい。
【0048】
また、前記８）ポリペプチドをコードする核酸塩基配列のＯＲＦの３’末端に逆転写するようにプロモーターを付加することは、前記ポリペプチドをコードする遺伝子の転写産物に相補的なアンチセンスヌクレオチドを形成して活性を弱化させることにより行われてもよい。
【0049】
本出願の微生物において、ポリヌクレオチドの一部又は全部の改変は、（ａ）微生物中の染色体導入用ベクターを用いた相同組換え、もしくは遺伝子はさみ（engineered nuclease, e.g., CRISPR-Cas9）を用いたゲノム編集、並びに／又は（ｂ）紫外線や放射線などの光及び／もしくは化学物質処理により誘導することができるが、これらに限定されるものではない。前記遺伝子の一部又は全部の改変方法には、ＤＮＡ組換え技術による方法が含まれる。例えば、標的遺伝子と相同性のあるヌクレオチド配列が含まれるヌクレオチド配列又はベクターを前記微生物に導入して相同組換え（homologous recombination）を起こすことにより遺伝子の一部又は全部の欠失が行われる。この導入されるヌクレオチド配列又はベクターには、優性選択マーカーが含まれてもよいが、これに限定されるものではない。
【0050】
本出願のベクターとは、好適な宿主内で標的ポリペプチドを発現させることができるように、好適な発現調節領域（又は発現調節配列）に作動可能に連結された前記標的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列を含有するＤＮＡ産物を意味する。前記発現調節領域には、転写を開始するプロモーター、その転写を調節するための任意のオペレーター配列、好適なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、並びに転写及び翻訳の終結を調節する配列が含まれてもよい。ベクターは、好適な宿主細胞内に形質転換されると、宿主ゲノムに関係なく複製又は機能することができ、ゲノム自体に組み込まれてもよい。
【0051】
本出願に用いられるベクターは、特に限定されるものではなく、当該技術分野で公知の任意のベクターが用いられる。通常用いられるベクターの例としては、天然状態又は組換え状態のプラスミド、コスミド、ウイルス及びバクテリオファージが挙げられる。例えば、ファージベクター又はコスミドベクターとしては、ｐＷＥ１５、Ｍ１３、ＭＢＬ３、ＭＢＬ４、ＩＸＩＩ、ＡＳＨＩＩ、ＡＰＩＩ、ｔ１０、ｔ１１、Ｃｈａｒｏｎ４Ａ、Ｃｈａｒｏｎ２１Ａなどを用いることができ、プラスミドベクターとしては、ｐＤＺ系、ｐＢＲ系、ｐＵＣ系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ系、ｐＧＥＭ系、ｐＴＺ系、ｐＣＬ系、ｐＥＴ系などを用いることができる。具体的には、ｐＤＺ、ｐＤＣ、ｐＤＣＭ２、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＣＬ、ｐＥＣＣＧ１１７、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＭＷ１１８、ｐＣＣ１ＢＡＣベクターなどを用いることができる。
【0052】
例えば、細胞内染色体導入用ベクターにより、標的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを染色体内に挿入することができる。前記ポリヌクレオチドの染色体内への挿入は、当該技術分野で公知の任意の方法、例えば相同組換え（homologous recombination）により行うことができるが、これに限定されるものではない。前記染色体に導入されたか否かを確認するための選択マーカー（selection marker）をさらに含んでもよい。前記選択マーカーは、ベクターで形質転換された細胞を選択、すなわち標的核酸分子が挿入されたか否かを確認するためのものであり、薬物耐性、栄養要求性、細胞毒性剤に対する耐性、表面ポリペプチドの発現などの選択可能表現型を付与するマーカーが用いられる。選択剤（selective agent）で処理した環境においては、選択マーカーを発現する細胞のみ生存するか、異なる表現形質を示すので、形質転換された細胞を選択することができる。
【0053】
本出願における「形質転換」とは、標的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを宿主細胞又は微生物内に導入することにより、宿主細胞内で前記ポリヌクレオチドがコードするポリペプチドを発現させることを意味する。形質転換されたポリヌクレオチドは、宿主細胞内で発現するものであれば、宿主細胞の染色体内に挿入されて位置するか、染色体外に位置するかに関係なく、いかなるものでもよい。また、前記ポリヌクレオチドは、標的ポリペプチドをコードするＤＮＡ及び／又はＲＮＡを含むものである。前記ポリヌクレオチドは、宿主細胞内に導入されて発現するものであれば、いかなる形態で導入されるものでもよい。例えば、前記ポリヌクレオチドは、自ら発現する上で必要な全ての要素を含む遺伝子構造体である発現カセット（expression cassette）の形態で宿主細胞に導入されるものでもよい。通常、前記発現カセットは、前記ポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーター（promoter）、転写終結シグナル、リボソーム結合部位及び翻訳終結シグナルを含む。前記発現カセットは、自己複製可能な発現ベクターの形態であってもよい。また、前記ポリヌクレオチドは、それ自体の形態で宿主細胞に導入され、宿主細胞において発現に必要な配列と作動可能に連結されたものであってもよいが、これに限定されるものではない。
【0054】
また、前記「作動可能に連結」されたものとは、本出願の標的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの転写を開始及び媒介するプロモーター配列と前記ポリヌクレオチド配列が機能的に連結されたものを意味する。
【0055】
本出願の微生物は、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ活性が弱化されていない親株又は野生型コリネバクテリウム属菌株に比べてＬ－グルタミン生産能が向上した微生物であってもよい。すなわち、本出願の微生物は、自然にＬ－グルタミン生産能を有する微生物、又はＬ－グルタミン生産能のない親株においてＰＥＰＣＫ又はそれをコードするポリヌクレオチドが弱化された微生物であるが、これらに限定されるものではない。
【0056】
例えば、前記Ｌ－グルタミン生産能が向上するか否かを比較する対象菌株である、ＰＥＰＣＫが弱化されていないＰＥＰＣＫ非改変微生物は、野生型コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２菌株、グルタミンシンテターゼ（Glutamine synthetase, GlnA, EC 6.3.1.2）タンパク質の活性が強化されたコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２菌株、グルタミンシンテターゼをコードするｇｌｎＡ遺伝子に変異（Ｄ４０１Ｎ）を導入することにより微生物中で当該タンパク質の活性を強化した微生物、グルタミン生産菌株であるコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１２６４５Ｐ（特許文献１）、又はグルタミン生産菌株であるコリネバクテリウム・グルタミカムＫＦＣＣ－１０６８０（特許文献２）菌株であるが、これらに限定されるものではない。
【0057】
一例として、前記生産能が向上した組換え菌株は、変異前の親株、非改変微生物又はＰＥＰＣＫ非改変微生物のＬ－グルタミン生産能に比べて、約１％以上、具体的には約２％以上、約５％以上、約６％以上、約７％以上、約７．２％以上、約８％以上、約９％以上又は約９．２％以上（上限値に特に制限はなく、例えば約２００％以下、約１５０％以下、約１００％以下、約５１％以下、約４０％以下、約３０％以下、約２０％以下又は約１５％以下である）増加したものであるが、変異前の親株、非改変微生物又はＰＥＰＣＫ非改変微生物の生産能に比べて、＋値の増加量を示すものであれば、いかなるものでもよい。他の例として、前記Ｌ－グルタミン生産能が向上した微生物は、変異前の親株、非改変微生物又はＰＥＰＣＫ非改変微生物に比べて、Ｌ－グルタミン生産能が約１．０１倍以上、約１．０２倍以上、約１．０５倍以上、約１．０６倍以上、約１．０７倍以上、約１．０７２倍以上、約１．０８倍以上、約１．０９倍以上又は約１．０９２倍以上（上限値に特に制限はなく、例えば約１０倍以下、約５倍以下、約３倍以下又は約２倍以下である）に増加したものであるが、これらに限定されるものではない。
【0058】
本出願における「非改変微生物」とは、微生物に自然に発生し得る突然変異を含む菌株を除外するものではなく、野生型菌株もしくは天然菌株自体、又は自然要因もしくは人為的要因により遺伝的に変異して形質が変化する前の菌株を意味する。また、本出願における「ＰＥＰＣＫ非改変微生物」とは、本明細書に記載されたＰＥＰＣＫ又はそれをコードするポリヌクレオチドが弱化されていないか、弱化される前の菌株を意味する。本出願のＰＥＰＣＫ非改変微生物は、ＰＥＰＣＫ又はそれをコードするポリヌクレオチドの改変以外の他のタンパク質又は他の遺伝子の改変を含む菌株を除外するものではない。
【0059】
本出願における「非改変微生物」は、「改変前の菌株」、「改変前の微生物」、「非変異菌株」、「非改変菌株」、「非変異微生物」又は「基準微生物」と混用される。
【0060】
本出願の微生物は、内在性活性より弱化されたＰＥＰＣＫもしくはそれをコードするポリヌクレオチドを含む微生物、又は内在性活性より弱化されたＰＥＰＣＫもしくはそれをコードするポリヌクレオチドを含むように遺伝的に改変された微生物（例えば、組換え微生物）であるが、これらに限定されるものではない。前記「内在性活性」とは、自然要因又は人為的要因により遺伝的に変異して形質が変化する場合に、形質変化の前の親株、野生型又は非改変微生物が本来有していた特定ポリペプチドの活性を意味する。これは、「改変前の活性」と混用される。ポリペプチドの活性が内在性活性に比べて「弱化、不活性化、欠乏、減少、下方調節、低下、減衰」するとは、形質変化の前の親株又は非改変微生物が本来有していた特定ポリペプチドの活性に比べて低下することを意味する。
【0061】
本出願の他の例として、本出願の微生物は、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）、コリネバクテリウム・スタティオニス（Corynebacterium stationis）、コリネバクテリウム・クルジラクチス（Corynebacterium crudilactis）、コリネバクテリウム・デセルティ（Corynebacterium deserti）、コリネバクテリウム・エフィシエンス（Corynebacterium efficiens）、コリネバクテリウム・カルナエ（Corynebacterium callunae）、コリネバクテリウム・シングラレ（Corynebacterium singulare）、コリネバクテリウム・ハロトレランス（Corynebacterium halotolerans）、コリネバクテリウム・ストリアツム（Corynebacterium striatum）、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Corynebacterium ammoniagenes）、コリネバクテリウム・ポルティソリ（Corynebacterium pollutisoli）、コリネバクテリウム・イミタンス（Corynebacterium imitans）、コリネバクテリウム・テスツディノリス（Corynebacterium testudinoris）又はコリネバクテリウム・フラベッセンス（Corynebacterium flavescens）であり、具体的にはコリネバクテリウム・グルタミカムであるが、これらに限定されるものではない。
【0062】
他の例として、本出願の組換え微生物は、Ｌ－グルタミン生合成経路内のタンパク質の一部の活性がさらに強化されるか、Ｌ－グルタミン分解経路内のタンパク質の一部の活性がさらに弱化されることにより、Ｌ－グルタミン生産能が強化された微生物であってもよい。
【0063】
具体的には、本出願において、コリネバクテリウム属微生物は、前記ｇｌｎＡ強化（例えば、コピー数の増加、プロモーターの変更、アデニリル化による活性調節の解除、ｇｌｎＥの弱化、又はＰＩＩタンパク質の活性弱化；特許文献３）がさらに導入された微生物、ＧＤＨ（glutamate dehydrogenase）強化（例えば、コピー数の増加、又は発現調節配列の改変）がさらに導入された微生物（特許文献３）、ｇｌｎＡ強化の変異がさらに導入された微生物（特許文献１）であるが、これらに限定されるものではない。
【0064】
本出願におけるポリペプチド活性の「強化」とは、ポリペプチドの活性を内在性活性に比べて向上させることを意味する。前記強化は、活性化（activation）、上方調節（up-regulation）、過剰発現（overexpression）、向上（increase）などと混用される。ここで、活性化、強化、上方調節、過剰発現、向上には、本来なかった活性を示すようになることや、内在性活性又は改変前の活性に比べて活性が向上することが全て含まれる。前記「内在性活性」とは、自然要因又は人為的要因により遺伝的に変異して形質が変化する場合に、形質変化の前の親株又は非改変微生物が本来有していた特定ポリペプチドの活性を意味する。これは、「改変前の活性」と混用される。ポリペプチドの活性が内在性活性に比べて「強化」、「上方調節」、「過剰発現」又は「向上」するとは、形質変化の前の親株又は非改変微生物が本来有していた特定ポリペプチドの活性及び／又は濃度（発現量）に比べて向上することを意味する。
【0065】
前記強化は、外来ポリペプチドの導入により達成してもよく、内在性ポリペプチドの活性強化及び／又は濃度（発現量）増加により達成してもよい。前記ポリペプチドの活性が強化されたか否かは、当該ポリペプチドの活性の程度、発現量又は当該ポリペプチドから生産される産物の量の増加により確認することができる。
【0066】
前記ポリペプチド活性の強化には、当該分野で周知の様々な方法を適用することができ、標的ポリペプチドの活性を改変前の微生物より強化できるものであればいかなるものでもよい。具体的には、分子生物学における通常の方法であって、当該技術分野における通常の知識を有する者に周知の遺伝子工学及び／又はタンパク質工学を用いたものであるが、これらに限定されるものではない（例えば、非特許文献１５、１７など）。
【0067】
具体的には、本出願のポリペプチド活性の強化は、１）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの細胞内コピー数を増加させること、２）ポリペプチドをコードする染色体上の遺伝子の発現調節領域を活性が強力な配列に置換すること、３）ポリペプチドをコードする遺伝子転写産物の開始コドン又は５’ＵＴＲ領域をコードする塩基配列を改変すること、４）ポリペプチド活性が強化されるように前記ポリペプチドのアミノ酸配列を改変すること、５）ポリペプチド活性が強化されるように前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を改変すること（例えば、ポリペプチド活性が強化されるように改変されたポリペプチドをコードするように前記ポリペプチド遺伝子のポリヌクレオチド配列を改変すること）、６）ポリペプチドの活性を示す外来ポリペプチド又はそれをコードする外来ポリヌクレオチドを導入すること、７）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのコドンを最適化すること、８）ポリペプチドの三次構造を分析し、露出部分を選択して改変すること、もしくは化学的に修飾すること、又は９）前記１）～８）から選択される２つ以上の組み合わせにより行われるが、特にこれらに限定されるものではない。
【0068】
より具体的には、前記１）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの細胞内コピー数を増加させることは、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが作動可能に連結された、宿主に関係なく複製されて機能するベクターを宿主細胞内に導入することにより行われる。あるいは、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを宿主細胞内の染色体に１コピー又は２コピー以上導入することにより行われてもよい。前記染色体への導入は、宿主細胞内の染色体に前記ポリヌクレオチドを挿入することのできるベクターを宿主細胞内に導入することにより行われるが、これに限定されるものではない。前記ベクターについては前述した通りである。
【0069】
前記２）ポリペプチドをコードする染色体上の遺伝子の発現調節領域（又は発現調節配列）を活性が強力な配列に置換することは、例えば前記発現調節領域の活性がさらに強化されるように、欠失、挿入、非保存的もしくは保存的置換、又はそれらの組み合わせにより配列上の変異を発生させるか、より高い活性を有する配列に置換することにより行われる。前記発現調節領域には、特にこれらに限定されるものではないが、プロモーター、オペレーター配列、リボソーム結合部位をコードする配列、転写及び翻訳の終結を調節する配列などが含まれる。例えば、本来のプロモーターを強力なプロモーターに置換することにより行われるが、これに限定されるものではない。
【0070】
公知の強力なプロモーターの例としては、ＣＪ１～ＣＪ７プロモーター（特許文献４）、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ラムダファージＰＲプロモーター、ＰＬプロモーター、ｔｅｔプロモーター、ｇａｐＡプロモーター、ＳＰＬ７プロモーター、ＳＰＬ１３（ｓｍ３）プロモーター（特許文献５）、Ｏ２プロモーター（特許文献６）、ｔｋｔプロモーター、ｙｃｃＡプロモーターなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【0071】
前記３）ポリペプチドをコードする遺伝子転写産物の開始コドン又は５’ＵＴＲ領域をコードする塩基配列を改変することは、例えば内在性開始コドンに比べてポリペプチドの発現率が高い他の開始コドンをコードする塩基配列に置換することにより行われるが、これに限定されるものではない。
【0072】
前記４）及び５）のアミノ酸配列又はポリヌクレオチド配列を改変することは、ポリペプチドの活性が強化されるように、前記ポリペプチドのアミノ酸配列又は前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を欠失、挿入、非保存的もしくは保存的置換、又はそれらの組み合わせにより配列上の変異を発生させるか、より高い活性を有するように改良されたアミノ酸配列もしくはポリヌクレオチド配列、又は活性が向上するように改良されたアミノ酸配列もしくはポリヌクレオチド配列に置換することにより行われるが、これらに限定されるものではない。具体的には、前記置換は、相同組換えによりポリヌクレオチドを染色体内に挿入することにより行われるが、これに限定されるものではない。ここで、用いられるベクターは、染色体に挿入されたか否かを確認するための選択マーカー（selection marker）をさらに含んでもよい。
【0073】
前記６）ポリペプチドの活性を示す外来ポリヌクレオチドを導入することは、前記ポリペプチドと同一／類似の活性を示すポリペプチドをコードする外来ポリヌクレオチドを宿主細胞内に導入することにより行われる。前記外来ポリヌクレオチドは、前記ポリペプチドと同一／類似の活性を示すものであれば、その由来や配列はいかなるものでもよい。前記導入は、公知の形質転換方法を当業者が適宜選択して行うことができ、宿主細胞内で前述したように導入したポリヌクレオチドが発現することにより、ポリペプチドが生成されてその活性が向上してもよい。
【0074】
前記７）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのコドンを最適化することは、宿主細胞内で転写又は翻訳が増加するように、内在ポリヌクレオチドのコドンを最適化するか、宿主細胞内で最適化された転写、翻訳が行われるように、外来ポリヌクレオチドのコドンを最適化することにより行われる。
【0075】
前記８）ポリペプチドの三次構造を分析し、露出部分を選択して変形すること、もしくは化学的に修飾することは、例えば分析しようとするポリペプチドの配列情報を既知のタンパク質の配列情報が保存されているデータベースと比較し、配列の類似性の程度に応じて鋳型タンパク質の候補を決定し、それを基に構造を確認し、改変又は化学的に修飾する露出部分を選択して改変又は修飾することにより行われてもよい。
【0076】
このようなポリペプチド活性の強化は、対応するポリペプチドの活性又は濃度、発現量が野生型や改変前の微生物菌株で発現するポリペプチドの活性又は濃度に比べて向上するか、当該ポリペプチドから生産される産物の量が増加することにより行われるが、これらに限定されるものではない。
【0077】
本出願の他の態様は、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ活性が弱化されてＬ－グルタミン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物を培地で培養するステップを含むＬ－グルタミン生産方法を提供する。
【0078】
本出願のＬ－グルタミン生産方法は、内在性活性より弱化されたＰＥＰＣＫもしくはそれをコードするポリヌクレオチドを含む微生物、又は内在性活性より弱化されたＰＥＰＣＫもしくはそれをコードするポリヌクレオチドを含むように遺伝的に改変された微生物を培地で培養するステップを含んでもよい。
【0079】
本出願における「培養」とは、本出願の微生物を適宜調節した環境条件で生育させることを意味する。本出願の培養過程は、当該技術分野で公知の好適な培地と培養条件で行うことができる。このような培養過程は、当業者であれば選択される微生物に応じて容易に調整して用いることができる。具体的には、前記培養は、回分、連続及び／又は流加培養であるが、これらに限定されるものではない。
【0080】
本出願における「培地」とは、本出願の微生物を培養するために必要な栄養物質を主成分として混合した物質を意味し、生存及び発育に不可欠な水をはじめとする栄養物質や発育因子などを供給する。具体的には、本出願の微生物の培養に用いられる培地及び他の培養条件は、通常の微生物の培養に用いられるものであればいかなるものでもよく、好適な炭素源、窒素源、リン源、無機化合物、アミノ酸及び／又はビタミンなどを含有する通常の培地中で好気性条件下にて温度、ｐＨなどを調節して本出願の微生物を培養することができる。
【0081】
具体的には、コリネバクテリウム属微生物の培養培地は非特許文献１８に開示されている。
【0082】
本出願における前記炭素源としては、グルコース、サッカロース、ラクトース、フルクトース、スクロース、マルトースなどの炭水化物、マンニトール、ソルビトールなどの糖アルコール、ピルビン酸、乳酸、クエン酸などの有機酸、グルタミン酸、メチオニン、リシンなどのアミノ酸などが挙げられる。また、デンプン加水分解物、糖蜜、ブラックストラップ糖蜜、米糠、キャッサバ、バガス、トウモロコシ浸漬液などの天然の有機栄養源を用いることができ、具体的には、グルコースや殺菌した前処理糖蜜（すなわち、還元糖に変換した糖蜜）などの炭水化物を用いることができ、その他適量の炭素源であればいかなるものでも用いることができる。これらの炭素源は、単独で用いることもでき、２種以上を組み合わせて用いることもできるが、これらに限定されるものではない。
【0083】
前記窒素源としては、アンモニア、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、硝酸アンモニウムなどの無機窒素源と、グルタミン酸、メチオニン、グルタミンなどのアミノ酸、ペプトン、ＮＺ－アミン、肉類抽出物、酵母抽出物、麦芽抽出物、トウモロコシ浸漬液、カゼイン加水分解物、魚類又はその分解生成物、脱脂大豆ケーキ又はその分解生成物などの有機窒素源とを用いることができる。これらの窒素源は、単独で用いることもでき、２種以上を組み合わせて用いることもできるが、これらに限定されるものではない。
【0084】
前記リン源としては、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム又はそれらに相当するナトリウム含有塩などが挙げられる。無機化合物としては、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、塩化鉄、硫酸マグネシウム、硫酸鉄、硫酸マンガン、炭酸カルシウムなどを用いることができ、それ以外に、アミノ酸、ビタミン及び／又は好適な前駆体などを用いることができる。これらの構成成分又は前駆体は、培地に回分式又は連続式で添加することができる。しかし、これらに限定されるものではない。
【0085】
また、本出願の微生物の培養中に水酸化アンモニウム、水酸化カリウム、アンモニア、リン酸、硫酸などの化合物を培地に好適な方法で添加することにより、培地のｐＨを調整することができる。さらに、培養中には、脂肪酸ポリグリコールエステルなどの消泡剤を用いて気泡生成を抑制することができる。さらに、培地の好気状態を維持するために、培地中に酸素又は酸素含有気体を注入してもよく、嫌気及び微好気状態を維持するために、気体を注入しなくてもよく、窒素、水素又は二酸化炭素ガスを注入してもよいが、これらに限定されるものではない。
【0086】
本出願の培養において、培養温度は２０～４５℃、具体的には２５～４０℃に維持し、約１０～１６０時間培養するが、これらに限定されるものではない。
【0087】
本出願の培養により生産されたＬ－グルタミンは、培地中に分泌されるか、細胞内に残留されてもよい。
【0088】
本出願のＬ－グルタミン生産方法は、本出願の微生物を準備するステップ、前記微生物を培養するための培地を準備するステップ、又はそれらの組み合わせ（任意の順序，in any order）を、例えば前記培養するステップの前にさらに含んでもよい。
【0089】
本出願のＬ－グルタミン生産方法は、前記培養に用いた培地（培養が行われた培地）又は培養した微生物からＬ－グルタミンを回収するステップをさらに含んでもよい。前記回収するステップは、前記培養するステップの後にさらに含んでもよい。
【0090】
前記回収は、本出願の微生物の培養方法、例えば回分、連続、流加培養方法などに応じて、当該技術分野で公知の好適な方法を用いて目的とするＬ－グルタミンを回収（collect）するものであってもよい。例えば、遠心分離、濾過、結晶化、タンパク質沈殿剤による処理（塩析法）、抽出、超音波破砕、限外濾過、透析法、分子篩クロマトグラフィー（ゲル濾過）、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどの各種クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ又はそれらの組み合わせが用いられ、当該分野で公知の好適な方法を用いて培地又は微生物から目的とするＬ－グルタミンを回収することができる。
【0091】
また、本出願のＬ－グルタミン生産方法は、精製ステップをさらに含んでもよい。前記精製は、当該技術分野で公知の好適な方法により行うことができる。例えば、本出願のＬ－グルタミン生産方法が回収ステップと精製ステップの両方を含む場合、前記回収ステップと前記精製ステップは、順序に関係なく連続的又は非連続的に行ってもよく、同時に又は１つのステップとして統合して行ってもよいが、これらに限定されるものではない。
【0092】
本出願の方法におけるＰＥＰＣＫ、ポリヌクレオチド、ベクター、微生物などについては前述した通りである。
【0093】
本出願のさらに他の態様は、ＰＥＰＣＫが弱化された微生物、それを培養した培地、又はそれらの組み合わせを含むＬ－グルタミン生産用組成物を提供する。
【0094】
本出願の組成物は、Ｌ－グルタミン生産用組成物に通常用いられる任意の好適な賦形剤をさらに含んでもよい。このような賦形剤としては、例えば保存剤、湿潤剤、分散剤、懸濁化剤、緩衝剤、安定化剤、等張化剤などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【0095】
本出願のさらに他の態様は、ＰＥＰＣＫを弱化させるステップを含む、Ｌ－グルタミン生産用微生物の製造方法を提供する。
【0096】
本出願のさらに他の態様は、ＰＥＰＣＫが弱化されたコリネバクテリウム属微生物のＬ－グルタミン生産への使用を提供する。
【0097】
前記ＰＥＰＣＫ、弱化、コリネバクテリウム属微生物などについては前述した通りである。
【実施例】
【0098】
以下、実施例を挙げて本出願をさらに詳細に説明する。しかし、これらの実施例は本出願を例示する好ましい実施形態にすぎず、本出願がこれらに限定されるものではない。なお、本明細書に記載されていない技術的な事項は、本出願の技術分野又は類似技術分野における熟練した技術者が十分に理解し、容易に実施することのできるものである。
【実施例1】
【0099】
ｐｃｋ遺伝子を弱化させるためのベクターの作製
ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（Phosphoenolpyruvate carboxykinase）をコードするｐｃｋ遺伝子を弱化させるために、遺伝子を欠損させるベクターを作製した。
ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（Phosphoenolpyruvate carboxykinase）をコードするｐｃｋ遺伝子を弱化させるために、遺伝子を欠損させるベクターを作製した。
【0100】
具体的には、ｐｃｋ遺伝子部分が欠損した菌株を作製するために、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２の染色体を鋳型とし、配列番号３及び配列番号４、配列番号１及び配列番号２のプライマーを用いて、ＰＣＲをそれぞれ行った。ここで用いたプライマー配列を表１に示す。
【0101】
【表1】
【0102】
ＰＣＲ反応のためのポリメラーゼとしては、ＰｆｕＵｌｔｒａＴＭハイフィデリティＤＮＡポリメラーゼ（Stratagene）を用いた。ＰＣＲ条件は、９５℃で３０秒間の変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で１分間の重合反応を２８サイクル行うものとした。その結果、ｐｃｋ遺伝子開始コドンを中心とする５’末端上流の９２９ｂｐのＤＮＡ断片と、ｐｃｋ遺伝子終止コドンを中心とする３’末端下流の１０００ｂｐのＤＮＡ断片がそれぞれ得られた。ＰＣＲ精製キット（QUIAGEN）を用いて、増幅した２つのＤＮＡ断片を精製し、プラスミド作製のための挿入ＤＮＡ断片として用いた。一方、制限酵素ｓａｌＩで処理し、その後６５℃で２０分間熱処理したｐＤＺベクター（特許文献７）と、上記ＰＣＲにより増幅した挿入ＤＮＡ断片のモル濃度（Ｍ）の比が１：２になるように、インフュージョンクローニングキット（Infusion Cloning Kit, TaKaRa）を用いて、提供されたマニュアルに従ってクローニングすることにより、ｐｃｋ遺伝子欠損のためのベクターｐＤＺ－△ＰＥＰＣＫを作製した。
【実施例2】
【0103】
野生型ベースＬ－グルタミン生産能を有するコリネバクテリウム属菌株の作製
野生型コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２からＬ－グルタミン生産菌株を見出した。具体的には、生合成経路の最後の酵素であるグルタミンシンテターゼ（Glutamine synthetase）の活性を向上させるために、グルタミンシンテターゼをコードする遺伝子であるｇｌｎＡ（Ｄ４０１Ｎ）変異体（配列番号１１）を導入した菌株（寄託番号ＫＣＣＭ１２６４５Ｐ）を作製した。
野生型コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２からＬ－グルタミン生産菌株を見出した。具体的には、生合成経路の最後の酵素であるグルタミンシンテターゼ（Glutamine synthetase）の活性を向上させるために、グルタミンシンテターゼをコードする遺伝子であるｇｌｎＡ（Ｄ４０１Ｎ）変異体（配列番号１１）を導入した菌株（寄託番号ＫＣＣＭ１２６４５Ｐ）を作製した。
【0104】
より具体的には、ｇｌｎＡ（Ｄ４０１Ｎ）変異を導入した菌株を作製するために、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２の染色体を鋳型とし、配列番号７及び配列番号８、又は配列番号９及び配列番号１０のプライマーを用いて、ＰＣＲをそれぞれ行った。ここで用いたプライマー配列を表２に示す。
【0105】
【表2】
【0106】
ＰＣＲ反応のためのポリメラーゼとしては、ＰｆｕＵｌｔｒａＴＭハイフィデリティＤＮＡポリメラーゼを用いた。ＰＣＲ条件は、９５℃で３０秒間の変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で１分間の重合反応を２８サイクル行うものとした。その結果、ｇｌｎＡ遺伝子Ｄ４０１Ｎ変異を中心とする５’末端上流のＤＮＡ断片と、３’末端下流のＤＮＡ断片がそれぞれ得られた。ＰＣＲ精製キットを用いて、増幅した２つのＤＮＡ断片を精製し、プラスミド作製のための挿入ＤＮＡ断片として用いた。一方、制限酵素ｓｐｅＩで処理し、その後６５℃で２０分間熱処理したｐＤＺベクター（特許文献７）と、上記ＰＣＲにより増幅した挿入ＤＮＡ断片のモル濃度（Ｍ）の比が１：２になるように、インフュージョンクローニングキットを用いて、提供されたマニュアルに従ってクローニングすることにより、ｇｌｎＡ（Ｄ４０１Ｎ）遺伝子変異型挿入のためのｐＤＺ－ｇｌｎＡ（Ｄ４０１Ｎ）を作製した。
【0107】
作製したベクターをエレクトロポレーション、電気パルス法（非特許文献１９）によりコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２に形質転換し、相同染色体組換えにより染色体上にｇｌｎＡ（Ｄ４０１Ｎ）変異を含む菌株を得た。前記菌株をコリネバクテリウム・グルタミカムＣＡ１１－４０２１と命名し、ブダペスト条約上の国際寄託機関である韓国微生物保存センター（Korean Culture Center of Microorganisms,KCCM）に２０１９年１２月１９日付けで寄託番号ＫＣＣＭ１２６４５Ｐとして寄託した。
【実施例3】
【0108】
ｐｃｋ遺伝子が弱化されたＬ－グルタミン生産菌株の作製及び評価
実施例２で作製したＬ－グルタミン生産菌株であるコリネバクテリウム・グルタミカムＣＡ１１－４０２１において、ｐｃｋ遺伝子を弱化させた。より具体的には、実施例１で作製したベクターをエレクトロポレーションによりコリネバクテリウム・グルタミカムＣＡ１１－４０２１に形質転換し、２次交差過程を経て、染色体上でｐｃｋ遺伝子が欠損したＬ－グルタミン生産菌株を得た。これをコリネバクテリウム・グルタミカムＣＡ１１－４０２３と命名した。
実施例２で作製したＬ－グルタミン生産菌株であるコリネバクテリウム・グルタミカムＣＡ１１－４０２１において、ｐｃｋ遺伝子を弱化させた。より具体的には、実施例１で作製したベクターをエレクトロポレーションによりコリネバクテリウム・グルタミカムＣＡ１１－４０２１に形質転換し、２次交差過程を経て、染色体上でｐｃｋ遺伝子が欠損したＬ－グルタミン生産菌株を得た。これをコリネバクテリウム・グルタミカムＣＡ１１－４０２３と命名した。
【0109】
コリネバクテリウム・グルタミカムＣＡ１１－４０２３を次の方法で培養し、グルタミン生産能を測定した。
【0110】
まず、種培地２５ｍｌを含有する２５０ｍｌのコーナーバッフルフラスコに各菌株を接種し、３０℃、２００ｒｐｍで２０時間振盪培養した。次に、生産培地２４ｍｌを含有する２５０ｍｌのコーナーバッフルフラスコに１ｍｌの種培養液を接種し、３２℃、２００ｒｐｍで４８時間振盪培養した。前記種培地及び生産培地の組成は、それぞれ次の通りである。培養終了後に、ＨＰＬＣ（Waters 2478）を用いてＬ－グルタミンの濃度を測定した。グルタミン生産能及び糖消費速度の測定結果を表３に示す。
＜種培地（ｐＨ７．０）＞
グルコース２０ｇ，ペプトン１０ｇ，酵母抽出物５ｇ，尿素１．５ｇ，ＫＨ２ＰＯ４４ｇ，Ｋ２ＨＰＯ４ ８ｇ，ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．５ｇ，ビオチン１００μｇ，チアミンＨＣｌ １０００μｇ，パントテン酸カルシウム２０００μｇ，ニコチンアミド２０００μｇ（蒸留水１リットル中）
＜グルタミン生産培地（ｐＨ８．０）＞
原糖６０ｇ，（ＮＨ４）２ＳＯ４ ４５ｇ，大豆タンパク質０．４８ｇ，ＣａＣＯ３５０ｇ，ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．４ｇ，ＫＨ２ＰＯ４ １ｇ，チアミン塩酸塩０．２ｍｇ，ビオチン０．３ｍｇ，ニコチンアミド６０ｍｇ，ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ １０ｍｇ，ＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ １０ｍｇ（蒸留水１リットル中）
＜種培地（ｐＨ７．０）＞
グルコース２０ｇ，ペプトン１０ｇ，酵母抽出物５ｇ，尿素１．５ｇ，ＫＨ２ＰＯ４４ｇ，Ｋ２ＨＰＯ４ ８ｇ，ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．５ｇ，ビオチン１００μｇ，チアミンＨＣｌ １０００μｇ，パントテン酸カルシウム２０００μｇ，ニコチンアミド２０００μｇ（蒸留水１リットル中）
＜グルタミン生産培地（ｐＨ８．０）＞
原糖６０ｇ，（ＮＨ４）２ＳＯ４ ４５ｇ，大豆タンパク質０．４８ｇ，ＣａＣＯ３５０ｇ，ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．４ｇ，ＫＨ２ＰＯ４ １ｇ，チアミン塩酸塩０．２ｍｇ，ビオチン０．３ｍｇ，ニコチンアミド６０ｍｇ，ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ １０ｍｇ，ＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ １０ｍｇ（蒸留水１リットル中）
【0111】
【表3】
【0112】
その結果、ｐｃｋ遺伝子が弱化されたＣＡ１１－４０２３において、親株であるＣＡ１１－４０２１に比べてグルタミン生産能が７．２％向上することが確認された。
【0113】
前記ＣＡ１１－４０２３菌株をブダペスト条約上の国際寄託機関である韓国微生物保存センター（ＫＣＣＭ）に２０２０年１２月２２日付けで受託番号ＫＣＣＭ１２９１６Ｐとして寄託した。
【実施例4】
【0114】
ｐｃｋ遺伝子が弱化された高濃度Ｌ－グルタミン生産菌株の作製及び評価
公知のグルタミン生産菌株であるコリネバクテリウム・グルタミカムＫＦＣＣ－１０６８０（特許文献２）菌株を対象に、実施例３と同様に、ｐｃｋ遺伝子を弱化した。より具体的には、実施例１で作製したｐＤＺ－△ＰＥＰＣＫベクターをエレクトロポレーションによりコリネバクテリウム・グルタミカムＫＦＣＣ－１０６８０に形質転換し、２次交差過程を経て、染色体上でｐｃｋ遺伝子が欠損した菌株を得た。これをコリネバクテリウム・グルタミカムＫＦＣＣ－１０６８０△ｐｃｋと命名し、次の方法で培養してグルタミン生産能を測定した。
公知のグルタミン生産菌株であるコリネバクテリウム・グルタミカムＫＦＣＣ－１０６８０（特許文献２）菌株を対象に、実施例３と同様に、ｐｃｋ遺伝子を弱化した。より具体的には、実施例１で作製したｐＤＺ－△ＰＥＰＣＫベクターをエレクトロポレーションによりコリネバクテリウム・グルタミカムＫＦＣＣ－１０６８０に形質転換し、２次交差過程を経て、染色体上でｐｃｋ遺伝子が欠損した菌株を得た。これをコリネバクテリウム・グルタミカムＫＦＣＣ－１０６８０△ｐｃｋと命名し、次の方法で培養してグルタミン生産能を測定した。
【0115】
まず、種培地２５ｍｌを含有する２５０ｍｌのコーナーバッフルフラスコに各菌株を接種し、３０℃、２００ｒｐｍで２０時間振盪培養した。次に、生産培地２４ｍｌを含有する２５０ｍｌのコーナーバッフルフラスコに１ｍｌの種培養液を接種し、３２℃、２００ｒｐｍで４８時間振盪培養した。前記種培地及び生産培地の組成は、それぞれ次の通りである。培養終了後にＨＰＬＣ（Waters 2478）を用いてＬ－グルタミンの濃度を測定した。グルタミン生産能及び糖消費速度の測定結果を表４に示す。
＜種培地（ｐＨ７．０）＞
グルコース２０ｇ，ペプトン１０ｇ，酵母抽出物５ｇ，尿素１．５ｇ，ＫＨ２ＰＯ４４ｇ，Ｋ２ＨＰＯ４ ８ｇ，ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．５ｇ，ビオチン１００μｇ，チアミンＨＣｌ １０００μｇ，パントテン酸カルシウム２０００μｇ，ニコチンアミド２０００μｇ（蒸留水１リットル中）
＜グルタミン生産培地（ｐＨ８．０）＞
原糖６０ｇ，（ＮＨ４）２ＳＯ４ ４５ｇ，大豆タンパク質０．４８ｇ，ＣａＣＯ３５０ｇ，ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．４ｇ，ＫＨ２ＰＯ４ １ｇ，チアミン塩酸塩０．２ｍｇ，ビオチン０．３ｍｇ，ニコチンアミド６０ｍｇ，ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ １０ｍｇ，ＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ １０ｍｇ（蒸留水１リットル中）
＜種培地（ｐＨ７．０）＞
グルコース２０ｇ，ペプトン１０ｇ，酵母抽出物５ｇ，尿素１．５ｇ，ＫＨ２ＰＯ４４ｇ，Ｋ２ＨＰＯ４ ８ｇ，ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．５ｇ，ビオチン１００μｇ，チアミンＨＣｌ １０００μｇ，パントテン酸カルシウム２０００μｇ，ニコチンアミド２０００μｇ（蒸留水１リットル中）
＜グルタミン生産培地（ｐＨ８．０）＞
原糖６０ｇ，（ＮＨ４）２ＳＯ４ ４５ｇ，大豆タンパク質０．４８ｇ，ＣａＣＯ３５０ｇ，ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．４ｇ，ＫＨ２ＰＯ４ １ｇ，チアミン塩酸塩０．２ｍｇ，ビオチン０．３ｍｇ，ニコチンアミド６０ｍｇ，ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ １０ｍｇ，ＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ １０ｍｇ（蒸留水１リットル中）
【0116】
【表4】
【0117】
その結果、ｐｃｋ遺伝子が欠損したＫＦＣＣ－１０６８０△ｐｃｋにおいて、親株であるＫＦＣＣ－１０６８０に比べてグルタミン生産能が９．２％向上することが確認された。
【0118】
以上の説明から、本出願の属する技術分野の当業者であれば、本出願がその技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形態で実施できることを理解するであろう。なお、上記実施例はあくまで例示的なものであり、限定的なものでないことを理解すべきである。本出願には、明細書ではなく請求の範囲の意味及び範囲とその等価概念から導かれるあらゆる変更や変形された形態が含まれるものと解釈すべきである。
【0119】
【0120】
【配列表】
【国際調査報告】