特表 2023-550181 方法及び細胞構造体

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-11-30

(54)【発明の名称】方法及び細胞構造体

(51)【国際特許分類】

   C12N 5/00 20060101AFI20231122BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20231122BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20231122BHJP

   C12N 7/01 20060101ALI20231122BHJP

   C12N 5/02 20060101ALI20231122BHJP

【ＦＩ】

C12N5/00

C12N15/09 110

C12N15/63 Z ZNA

C12N7/01

C12N5/02

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023530985

(86)(22)【出願日】2021-11-24

(85)【翻訳文提出日】2023-07-21

(86)【国際出願番号】 AU2021051402

(87)【国際公開番号】W WO2022109667

(87)【国際公開日】2022-06-02

(31)【優先権主張番号】2020904338

(32)【優先日】2020-11-24

(33)【優先権主張国・地域又は機関】AU

(31)【優先権主張番号】2021900685

(32)【優先日】2021-03-10

(33)【優先権主張国・地域又は機関】AU

(31)【優先権主張番号】2021902865

(32)【優先日】2021-09-03

(33)【優先権主張国・地域又は機関】AU

(31)【優先権主張番号】2021903427

(32)【優先日】2021-10-26

(33)【優先権主張国・地域又は機関】AU

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】594202523

【氏名又は名称】モナシュ ユニバーシティ

(74)【代理人】

【識別番号】100145403

【弁理士】

【氏名又は名称】山尾 憲人

(74)【代理人】

【識別番号】100106518

【弁理士】

【氏名又は名称】松谷 道子

(74)【代理人】

【識別番号】100138911

【弁理士】

【氏名又は名称】櫻井 陽子

(72)【発明者】

【氏名】ポロ，ジョセ

(72)【発明者】

【氏名】リュ－，シャオドン

(72)【発明者】

【氏名】タン，ジアピン

【テーマコード（参考）】

4B065

【Ｆターム（参考）】

4B065AA90X

4B065AB01

4B065BA02

4B065BA24

4B065BB19

4B065CA44

(57)【要約】

本発明は、再プログラム化された体細胞の細胞集団から多層細胞構造体又は胚盤胞様構造体を作製するための方法及び組成物を提供する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

多層細胞構造体又は胚盤胞様構造体を作製する方法であって、
ａ）胚盤葉上層（ＥＰＩ）、栄養外胚葉（ＴＥ）及び／又は原始内胚葉（ＰＥ）転写シグネチャを呈する再プログラム化された体細胞の細胞集団を入手すること；及び
ｂ）凝集又は自己組織化を可能にする条件下において、前記再プログラム化された体細胞を培養して、多層三次元細胞構造体又は胚盤胞様構造体を入手すること
を含み、それにより多層細胞構造体又は胚盤胞様構造体を作製する方法。

【請求項2】

胚盤葉上層（ＥＰＩ）、栄養外胚葉（ＴＥ）及び／又は原始内胚葉（ＰＥ）転写シグネチャを呈する再プログラム化された体細胞の細胞集団を入手することは、
－ 体細胞の集団中における１つ以上の因子のタンパク質発現又は量を増加させることであって、前記因子は、前記体細胞を脱分化状態又は多能性状態に向けて再プログラム化するためのものである、増加させること；及び
－ 多能性状態に向けた前記細胞の前記再プログラム化を可能にするのに十分な時間にわたって且つそのための条件下において前記細胞を培養すること
を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

胚盤胞様構造体を作製する方法であって、
ａ）体細胞の集団中における１つ以上の因子のタンパク質発現又は量を増加させるステップであって、前記因子は、前記体細胞を脱分化状態又は多能性状態に向けて再プログラム化するためのものである、ステップ；
ｂ）脱分化状態又は多能性状態に向けた前記細胞の前記再プログラム化を可能にするのに十分な時間にわたって且つそのための条件下において前記細胞を培養するステップ；
ｃ）凝集を可能にする条件下において、前記細胞を、ＷＮＴ経路シグナル伝達の活性化薬（好ましくはＧＳＫ－３阻害薬）、少なくとも１つのＴＧＦ－β阻害薬、ＨＤＡＣ阻害薬、ＥＧＦ及びＢＭＰ４を含む培養培地と接触させるステップ；
ｄ）凝集を可能にし、且つ／又は前記細胞が、本明細書に記載されるとおりの胚盤胞様構造体の少なくとも１つの特徴を呈することを可能にする十分な時間にわたって且つそのような条件下において、前記細胞を前記培養培地で培養するステップ
を順番に含み、それにより胚盤胞様構造体を作製する方法。

【請求項4】

ステップｃ）の前記培養培地は、少なくとも２つのＴＧＦ－β阻害薬を含む、請求項３に記載の方法。

【請求項5】

ステップｃ）の前記培養培地は、Ｒｈｏキナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害薬を更に含む、請求項３又は４に記載の方法。

【請求項6】

前記細胞が、その後、前記ＲＯＣＫ阻害薬のない前記培養培地と接触される前に、前記細胞は、前記ＲＯＣＫ阻害薬を含む前記培養培地と約２４時間の期間にわたって接触される、請求項５に記載の方法。

【請求項7】

前記体細胞を脱分化状態又は多能性状態に向けて再プログラム化するための前記因子は、転写因子である、請求項３～６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項8】

前記転写因子は、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４及びＭＹＣの１つ以上又はその変異体を含む、請求項７に記載の方法。

【請求項9】

前記転写因子は、前記因子ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４及びＭＹＣ（ＯＳＫＭ）の４つ全て又はその変異体を含む、請求項８に記載の方法。

【請求項10】

前記転写因子は、因子ＳＯＸ２、ＫＬＦ４及びＯＣＴ４（ＳＫＯ）の４つ全て又はその変異体を含む、請求項７に記載の方法。

【請求項11】

前記転写因子は、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４及びＧＬＩＳ１の１つ以上又はその変異体を含む、請求項７に記載の方法。

【請求項12】

前記転写因子は、前記因子ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４及びＧＬＩＳ１（ＯＳＫＧ）の４つ全てを含む、請求項１１に記載の方法。

【請求項13】

前記転写因子は、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ及びＬＩＮ２８（ＯＳＮＬ）の１つ以上を含む、請求項７に記載の方法。

【請求項14】

前記転写因子は、前記因子ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ及びＬＩＮ２８（ＯＳＮＬ）の４つ全てを含む、請求項１３に記載の方法。

【請求項15】

前記転写因子は、因子ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ｃ－ＭＹＣ、ＮＡＮＯＧ及びＬＩＮ２８（ＯＫＳＭＮＬ）の６つ全てを含む、請求項７に記載の方法。

【請求項16】

前記体細胞を多能性状態に向けて再プログラム化するための前記因子のタンパク質発現又は量は、前記体細胞を、前記因子の発現を増加させる薬剤と接触させることによって増加される、請求項２～１５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項17】

前記薬剤は、ヌクレオチド配列、タンパク質、アプタマー及び小分子、リボソーム、ＲＮＡｉ剤及びペプチド核酸（ＰＮＡ）並びにその類似体又は変異体からなる群から選択される、請求項１６に記載の方法。

【請求項18】

前記体細胞を多能性状態に向けて再プログラム化するための前記因子のタンパク質発現又は量は、前記体細胞を多能性状態に向けて再プログラム化するための少なくとも１つの因子をコードするか、又はその機能断片をコードするヌクレオチド配列を含む少なくとも１つの核酸を前記細胞に導入することによって増加される、請求項２～１６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項19】

前記核酸は、ＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡである、請求項１８に記載の方法。

【請求項20】

前記核酸配列は、プラスミド、ウイルスベクター又は非ウイルスベクターによって細胞に導入される、請求項１８に記載の方法。

【請求項21】

前記プラスミド又はベクターは、エピソームプラスミド又はベクターである、請求項２０に記載の方法。

【請求項22】

前記因子のタンパク質発現又は量は、前記転写因子をコードする１つ以上のベクターを前記体細胞に形質導入又はトランスフェクトすることによって前記体細胞において増加される、請求項２～１６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項23】

前記ベクターは、組込み型又は非組込み型ウイルスベクターを含むウイルスベクターである、請求項２２に記載の方法。

【請求項24】

前記体細胞は、本明細書に定義されるとおりの再プログラム化中間体である、請求項１～２３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項25】

前記細胞は、ステップｂ）の前記条件下で少なくとも１日間、若しくは少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１日間、若しくは少なくとも２２、少なくとも２４、少なくとも２８日間又はそれを超える日数にわたって培養される、請求項２～２４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項26】

前記体細胞に特徴的なマーカーは、凝集を可能にする条件下において、前記再プログラム化された体細胞を培養して、多層細胞構造体又は胚盤胞様構造体を入手する前記ステップ前又はステップｃ）において前記細胞を培養培地と接触させる前記ステップ前に減少される、請求項１～２５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項27】

前記ＥＰＩ、ＴＥ及びＰＥ系統転写シグネチャの上方制御を誘導する培地で前記細胞を脱分化状態又は多能性状態に向けて培養することを含む、請求項２～２６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項28】

前記培地は、線維芽細胞培地、例えば表３ａ又は表３ｂにおけるものを含む、本明細書に定義される線維芽細胞培地である、請求項２７に記載の方法。

【請求項29】

前記細胞は、ステップｃ）の前記培養培地で少なくとも約１、少なくとも約２、少なくとも約３、少なくとも約４、少なくとも約５、少なくとも約６、少なくとも約８、少なくとも約１０、少なくとも約１５、少なくとも約２０、少なくとも約２４日間又はそれを超える期間にわたって培養される、請求項２～２８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項30】

前記凝集を可能にする条件は、細胞の三次元凝集を可能にする任意の培養プレート、培養ベッセル又は培養システムで培養することを含み得る、請求項１～２９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項31】

前記細胞は、前記培養プレート、培養ベッセル又は培養システムにおいて、１ウェル当たり０．５～２×１０^５若しくは約０．５～２×１０^５細胞、１ウェル当たり０．６～２×１０^５若しくは約０．６～２×１０^５細胞、１ウェル当たり０．８～２×１０^５若しくは約０．８～２×１０^５細胞、１ウェル当たり１～２×１０^５若しくは約１～２×１０^５細胞、１ウェル当たり０．６×１０^５若しくは約０．６×１０^５細胞、１ウェル当たり０．８×１０^５若しくは約０．８×１０５細胞、１ウェル当たり１×１０^５若しくは約１×１０^５細胞、１ウェル当たり１．２×１０^５若しくは約１．２×１０^５細胞、１ウェル当たり１．４×１０^５若しくは約１．４×１０^５細胞、１ウェル当たり１．６×１０^５若しくは約１．６×１０^５細胞、１ウェル当たり１．８×１０^５若しくは約１．８×１０^５細胞又は１ウェル当たり２×１０^５若しくは約２×１０^５細胞の密度で播種される、請求項３０に記載の方法。

【請求項32】

前記体細胞は、疾患又は病態、例えば異数性、単一遺伝子疾患、嚢胞性線維症、胞状奇胎又はコルネリアデランゲ症候群の１つ以上の検出可能な特徴を任意選択で示す疾患遺伝子型を有する、請求項１～３１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項33】

前記体細胞は、線維芽細胞、好ましくは皮膚線維芽細胞、最も好ましくはヒト線維芽細胞である、請求項１～３２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項34】

前記体細胞は、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）、好ましくはヒトＰＢＭＣである、請求項１～３２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項35】

前記体細胞は、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、好ましくはヒトＭＳＣである、請求項１～３２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項36】

前記多層細胞構造体又は胚盤胞様構造体は、内細胞層と外細胞層とを含み、前記内細胞層は、胚盤葉上層（ＥＰＩ）及び／又は原始内胚葉（ＰＥ）系統の細胞の１つ以上の特徴を呈する細胞を含み、及び前記外細胞層は、栄養外胚葉（ＴＥ）の細胞の１つ以上の特徴を呈する細胞を含む、請求項１～３５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項37】

前記内細胞層は、ＰＥの１つ以上の特徴を呈する細胞塊を更に含み、好ましくは、ＰＥの１つ以上の特徴を呈する前記細胞は、胚盤葉上層の細胞の１つ以上の特徴を呈する前記細胞の周囲にあるか又は主にその周囲にある、請求項３６に記載の方法。

【請求項38】

ＥＰＩ細胞の前記特徴は、マーカーＮＡＮＯＧ、ＯＣＴ４（別名ＰＯＵ５Ｆ１）又はＳＯＸ２のいずれか１つ以上の存在である、請求項３６に記載の方法。

【請求項39】

ＥＰＩ細胞の前記特徴は、円柱状外観の形態である、請求項３６～３８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項40】

ＴＥ細胞の前記特徴は、マーカーＣＤＸ２及びＧＡＴＡ２の１つ以上の存在並びに／又は扁平な若しくは細長い上皮形態である、請求項３６～３９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項41】

ＰＥ細胞の前記特徴は、マーカーＳＯＸ１７又はＧＡＴＡ６の存在である、請求項３６～４０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項42】

前記多層細胞構造体又は胚盤胞様構造体のより多くの細胞は、ＮＡＮＯＧを発現するよりもＯＣＴ４を発現する、請求項１～４１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項43】

前記多層細胞構造体又は胚盤胞様構造体は、ＯＣＴ４陽性細胞に隣接するＧＡＴＡ６陽性細胞（任意選択でＣＤＸ２低染色又は弱染色を伴う）を更に含む、請求項１～４２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項44】

前記多層細胞構造体又は胚盤胞様構造体は、Ｅ５～７、好ましくはＥ６～７のヒト胚盤胞の主要な形態学的特徴を呈する、請求項１～４３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項45】

前記多層細胞構造体又は胚盤胞様構造体は、胚盤葉上層、原始内胚葉及び栄養外胚葉細胞の細胞の１つ以上の特徴を呈する細胞を含み、前記細胞は、Ｅ５～７、好ましくはＥ６～７のヒト胚盤胞におけるそれぞれ胚盤葉上層、原始内胚葉及び栄養外胚葉細胞と同じ又は類似した相対的空間配置をとる、請求項１～４４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項46】

前記多層細胞構造体又は胚盤胞様構造体は、無細胞の空洞又は胞胚腔様の空洞を含む、請求項１～４５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項47】

前記多層細胞構造体又は胚盤胞様構造体は、受精後胚齢５～７日目（Ｅ５～７）のヒト胚盤胞の既発表の測定値と同等のサイズのｘ軸及びｙ軸直径、ｘ：ｙアスペクト比並びに／又は投影面積を有する、請求項１～４６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項48】

前記多層細胞構造体又は胚盤胞様構造体が、本明細書に定義されるとおりのＩＶＣ１培地で１日間培養され、且つ続いて、本明細書に定義されるとおりのＩＶＣ２培地で２日目から４．５日目まで培養されるとき、前記多層細胞構造体又は胚盤胞様構造体は、
ａ）サイズの増加、扁平化及び増殖体の形成に至るまでの進行；
ｂ）ＮＡＮＯＧ及びＯＣＴ４／ＳＯＸ２陽性細胞数の増加；
ｃ）ＣＤＸ２及び／又はＧＡＴＡ２陽性細胞の広がり；
ｄ）前記ＮＡＮＯＧ又はＯＣＴ４陽性細胞の周囲にＳＯＸ１７及びＧＡＴＡ６陽性細胞が局在すること；
ｅ）前記外細胞層又はＴＥ細胞の少なくとも１つの特徴を呈する細胞におけるケラチンＫＲＴ７又は他の栄養膜細胞マーカーの発現；
ｆ）合胞体栄養膜細胞（ＳＴ）及び絨毛外栄養膜細胞（ＥＶＴ）に形態学的に似た細胞（例えば、それぞれＳＴ及びＥＶＴ様細胞）の存在、例えば多核性表現型及び紡錘様形態；
ｇ）ｈＣＧ（例示的ＳＴマーカー）及びＭＭＰ２（例示的ＥＶＴマーカー）を発現する細胞の存在；及び
ｈ）ＳＴマーカーＣＳＨ１及びＥＶＴマーカーＩＴＧＡ１の上方制御を呈する細胞の存在
の１つ以上を呈する、請求項１～４７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項49】

多層細胞構造体又は胚盤胞様構造体を作製する方法であって、
ｉＰＳＣ及びｉＴＳＣ細胞を、前記細胞の集合及び凝集を可能にする条件下で培養して、多層細胞構造体を入手すること
を含み、それにより多層細胞又は胚盤胞様構造体を作製する方法。

【請求項50】

前記ｉＰＳＣ及びｉＴＳＣは、ヒト細胞から、好ましくはヒト体細胞の再プログラム化によって得られる、請求項４９に記載の方法。

【請求項51】

前記細胞の集合及び凝集を可能にする前記条件は、前記細胞の自己組織化及び集合を促進する任意の培養ベッセルにおいて前記ｉＰＳＣ及びｉＴＳＣを共培養することを含む、請求項４９又は５０に記載の方法。

【請求項52】

前記細胞は、細胞が胚盤胞様構造体の少なくとも１つの特徴を呈することを促進するための任意の培養培地で培養される、請求項４９～５１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項53】

前記培養培地は、本明細書の表３ａに示されるとおりのｉＢｌａｓｔｏｉｄ培地である、請求項５２に記載の方法。

【請求項54】

前記ｉＰＳＣ及びｉＴＳＣは、同じウェル内において、それぞれ１：２．５の比で、１ウェル当たり１．２×１０^５個の総細胞数又は１マイクロウェル当たり約１０～２００個の細胞として共培養される、請求項４９～５３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項55】

多層細胞構造体又は胚盤胞様構造体であって、好ましくは、請求項１～５４のいずれか一項に記載の方法によって入手されるか又は入手可能である多層細胞構造体又は胚盤胞様構造体。

【請求項56】

インビトロ由来の又はインビトロで作成された多層細胞構造体又は胚盤胞様構造体であって、内細胞層と外細胞層とを含み、前記内細胞層は、ヒト胚盤葉上層（ＥＰＩ）及び／又はヒト原始内胚葉（ＰＥ）系統の細胞の１つ以上の特徴を呈する細胞を含み、及び前記外細胞層は、ヒト栄養外胚葉（ＴＥ）の細胞の１つ以上の特徴を呈する細胞を含む、インビトロ由来の又はインビトロで作成された多層細胞構造体又は胚盤胞様構造体。

【請求項57】

透明帯を有しない、請求項５６に記載の多層細胞構造体又は胚盤胞様構造体。

【請求項58】

前記内細胞層は、ＰＥの１つ以上の特徴を呈する細胞塊を更に含み、好ましくは、ＰＥの１つ以上の特徴を呈する前記細胞は、胚盤葉上層の細胞の１つ以上の特徴を呈する前記細胞の周囲にあるか又は主にその周囲にある、請求項５６又は５７に記載の多層細胞構造体又は胚盤胞様構造体。

【請求項59】

ＥＰＩ細胞の前記特徴は、マーカーＮＡＮＯＧ、ＯＣＴ４（別名ＰＯＵ５Ｆ１）又はＳＯＸ２のいずれか１つ以上の存在である、請求項５６～５８のいずれか一項に記載の多層細胞構造体又は胚盤胞様構造体。

【請求項60】

ＥＰＩ細胞の前記特徴は、円柱状外観の形態である、請求項５６～５９のいずれか一項に記載の多層細胞構造体又は胚盤胞様構造体。

【請求項61】

ＴＥ細胞の前記特徴は、マーカーＣＤＸ２及びＧＡＴＡ２の１つ以上の存在並びに／又は扁平な若しくは細長い上皮形態である、請求項５６～６０のいずれか一項に記載の多層細胞構造体又は胚盤胞様構造体。

【請求項62】

ＰＥ細胞の前記特徴は、マーカーＳＯＸ１７又はＧＡＴＡ６の存在である、請求項５６～６１のいずれか一項に記載の多層細胞構造体又は胚盤胞様構造体。

【請求項63】

前記多層細胞構造体又は胚盤胞様構造体のより多くの細胞は、ＮＡＮＯＧを発現するよりもＯＣＴ４を発現する、請求項５６～６２のいずれか一項に記載の多層細胞構造体又は胚盤胞様構造体。

【請求項64】

ＯＣＴ４陽性細胞に隣接するＧＡＴＡ６陽性細胞（任意選択でＣＤＸ２低染色又は弱染色を伴う）を更に含む、請求項５６～６３のいずれか一項に記載の多層細胞構造体又は胚盤胞様構造体。

【請求項65】

Ｅ５～７、好ましくはＥ６～７のヒト胚盤胞の主要な形態学的特徴を呈する、請求項５６～６４のいずれか一項に記載の多層細胞構造体又は胚盤胞様構造体。

【請求項66】

胚盤葉上層、原始内胚葉及び栄養外胚葉細胞の細胞の１つ以上の特徴を呈する細胞を含み、前記細胞は、Ｅ５～７、好ましくはＥ６～７のヒト胚盤胞におけるそれぞれ胚盤葉上層、原始内胚葉及び栄養外胚葉細胞と同じ又は類似した相対的空間配置をとる、請求項５６～６５のいずれか一項に記載の多層細胞構造体又は胚盤胞様構造体。

【請求項67】

無細胞の空洞又は胞胚腔様の空洞を含む、請求項５６～６６のいずれか一項に記載の多層細胞構造体又は胚盤胞様構造体。

【請求項68】

受精後胚齢５～７日目（Ｅ５～７）のヒト胚盤胞の既発表の測定値と同等のサイズのｘ軸及びｙ軸直径、ｘ：ｙアスペクト比並びに／又は投影面積を有する、請求項５６～６７のいずれか一項に記載の多層細胞構造体又は胚盤胞様構造体。

【請求項69】

前記多層細胞構造体又は胚盤胞様構造体が、本明細書に定義されるとおりのＩＶＣ１培地で１日間培養され、且つ続いて、本明細書に定義されるとおりのＩＶＣ２培地で２日目から４．５日目まで培養されるとき、
ａ）サイズの増加、扁平化及び増殖体の形成に至るまでの進行；
ｂ）ＮＡＮＯＧ及びＯＣＴ４／ＳＯＸ２陽性細胞数の増加；
ｃ）ＣＤＸ２及び／又はＧＡＴＡ２陽性細胞の広がり；
ｄ）前記ＮＡＮＯＧ又はＯＣＴ４陽性細胞の周囲にＳＯＸ１７及びＧＡＴＡ６陽性細胞が局在すること；
ｅ）前記外細胞層又はＴＥ細胞の少なくとも１つの特徴を呈する細胞におけるケラチンＫＲＴ７又は他の栄養膜細胞マーカーの発現；
ｆ）合胞体栄養膜細胞（ＳＴ）及び絨毛外栄養膜細胞（ＥＶＴ）に形態学的に似た細胞（例えば、それぞれＳＴ及びＥＶＴ様細胞）の存在、例えば多核性表現型及び紡錘様形態；
ｇ）ｈＣＧ（例示的ＳＴマーカー）及びＭＭＰ２（例示的ＥＶＴマーカー）を発現する細胞の存在；及び
ｈ）ＳＴマーカーＣＳＨ１及びＥＶＴマーカーＩＴＧＡ１の上方制御を呈する細胞の存在
の１つ以上を呈する、請求項５６～６８のいずれか一項に記載の多層細胞構造体又は胚盤胞様構造体。

【請求項70】

請求項１～５４のいずれか一項に記載の方法に従って作製される多細胞構造体又は胚盤胞様構造体に由来するか、それから単離されるか又はそれから入手される細胞。

【請求項71】

請求項５６～６９のいずれか一項に記載の多細胞構造体又は胚盤胞様構造体に由来するか、それから単離されるか又はそれから入手される細胞。

【請求項72】

請求項１～５４のいずれか一項に記載の方法に従って作製される多細胞構造体又は胚盤胞様構造体に由来するか、それから単離されるか又はそれから入手される細胞の集団。

【請求項73】

請求項５６～６９のいずれか一項に記載の多細胞構造体又は胚盤胞様構造体に由来するか、それから単離されるか又はそれから入手される細胞の集団。

【請求項74】

ＥＰＩ系統の１つ以上の特徴を呈する細胞である、請求項７０又は７１に記載の細胞。

【請求項75】

ＰＥ系統の１つ以上の特徴を呈する細胞である、請求項７０又は７１に記載の細胞。

【請求項76】

ＴＥ系統の１つ以上の特徴を呈する細胞である、請求項７０又は７１に記載の細胞。

【請求項77】

請求項５５～６９のいずれか一項に記載の多層細胞構造体若しくは胚盤胞様構造体又は請求項７０～７６のいずれか一項に記載の細胞若しくは細胞の集団に由来するか又はそれから入手されるオルガノイド。

【請求項78】

細胞、好ましくは再プログラム化中間体細胞が胚盤胞様構造体の少なくとも１つの特徴を呈することを促進するための培養培地であって、
－ ＷＮＴ経路シグナル伝達の活性化薬（好ましくはＧＳＫ－３阻害薬）；
－ 少なくとも１つ、好ましくは２つのＴＧＦ－β阻害薬、
－ ＨＤＡＣ阻害薬、
－ ＥＧＦ、及び
－ ＢＭＰ４
を含む培養培地。

【請求項79】

－ ＩＴＳ－Ｘ；
－ Ｌ－グルタミン；
－ Ｎ－アセチル－Ｌ－システイン；
－ β－エストラジオール；
－ プロゲステロン；
－ ２－メルカプトエタノール；
－ Ｌ－アスコルビン酸；
－ トランスフェリン（例えば、ヒト）、
－ インスリン（例えば、ヒト）、
－ Ｎ２サプリメント；及び
－ Ｂ２７サプリメント
を更に含む、請求項７８に記載の培養培地。

【請求項80】

前記プロゲステロン、トランスフェリン及びインスリンは、本明細書に記載されるとおりの、プトレシン及び亜セレン酸塩を更に含むＮ２サプリメントで提供される、請求項７９に記載の培養培地。

【請求項81】

前記Ｂ２７サプリメントは、ビオチン、ＤＬα酢酸トコフェロール、ＤＬαトコフェロール、ビタミンＡ（酢酸塩）、ＢＳＡ、カタラーゼ、インスリン（ヒト）、スーパーオキシドジスムターゼ、コルチコステロン、Ｄ－ガラクトース、エタノールアミンＨＣＬ、グルタチオン、Ｌ－カルニチンＨＣＬ、リノール酸、リノレン酸、プロゲステロン、プトレシン２ＨＣｌ、亜セレン酸ナトリウム、Ｔ３（トリヨード－ｌ－チロニン）を含む、請求項７９に記載の培養培地。

【請求項82】

抗生物質、例えばペニシリン－ストレプトマイシンを更に含む、請求項７８～８１のいずれか一項に記載の培養培地。

【請求項83】

－ それぞれ２：１：１の比の、本明細書に定義されるとおりのＩＶＣ１培地、Ｎ２Ｂ２７基本培地及びＴＳＣ基本培地、
－ ＷＮＴ経路の活性化薬（任意選択でＧＳＫ－３阻害薬）、
－ 少なくとも１つ、好ましくは２つのＴＧＦ－β阻害薬、
－ ＨＤＡＣ阻害薬、
－ ＥＧＦ、及び
－ ＢＭＰ４
を含む、請求項７８～８２のいずれか一項に記載の培養培地。

【請求項84】

前記ＴＧＦ－β経路阻害薬は、ＳＢ４３１５４２及びＡ８３－０１から選択され、前記ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）１阻害薬は、ＶＰＡ（バルプロ酸）であり、前記ＧＳＫ－３阻害薬は、ＣＨＩＲ９９０２１である、請求項７８～８３のいずれか一項に記載の培養培地。

【請求項85】

前記ＧＳＫ－３阻害薬は、２μＭ又は約２μＭの濃度であり、前記ＴＧＦ－β経路阻害薬は、０．５μＭ若しくは１μＭ又は約０．５μＭ若しくは１μＭの濃度であり、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）１阻害薬は、０．８ｍＭ又は約０．８ｍＭの濃度であり、ＥＧＦは、５０ｎｇ／ｍｌ又は約５０ｎｇ／ｍｌの濃度であり、及びＢＭＰ４は、１０ｎｇ／ｍｌ又は約１０ｎｇ／ｍｌの濃度である、請求項７８～８３のいずれか一項に記載の培養培地。

【請求項86】

ＲＯＣＫ阻害薬を更に含み、好ましくは、前記ＲＯＣＫ阻害薬は、Ｙ－２７６３２であり、より好ましくは、前記ＲＯＣＫ阻害薬は、１０μＭ又は約１０μＭの濃度である、請求項７８～８５のいずれか一項に記載の培養培地。

【請求項87】

胚盤胞の発生及び／又は活性を調節する能力を有する薬剤を同定する方法であって、
－ 請求項１～５４のいずれか一項に記載の方法に従って作り出された多層細胞構造体又は胚盤胞様構造体を候補薬剤と接触させること；
－ 前記薬剤との前記接触後の前記多層細胞構造体又は胚盤胞様構造体の発生及び／又は活性を、前記薬剤なしでの多層細胞構造体又は胚盤胞様構造体の発生及び／又は活性と比較すること
を含み、前記多層細胞構造体又は胚盤胞様構造体の前記発生及び／又は活性に対する前記薬剤の効果が、前記薬剤なしでの前記多層細胞構造体又は胚盤胞様構造体の前記発生に対して所定のレベルだけ上回ることは、前記薬剤が栄養膜細胞の発生及び／又は活性を調節することを示す、方法。

【請求項88】

胚盤胞の発生及び／又は活性を調節する能力を有する薬剤を同定する方法であって、
－ ５６～６９に従う多層細胞構造体又は胚盤胞様構造体を候補薬剤と接触させること；
－ 前記薬剤との前記接触後の前記多層細胞構造体又は胚盤胞様構造体の発生及び／又は活性を、前記薬剤なしでの多層細胞構造体又は胚盤胞様構造体の発生及び／又は活性と比較すること
を含み、前記多層細胞構造体又は胚盤胞様構造体の前記発生及び／又は活性に対する前記薬剤の効果が、前記薬剤なしでの前記多層細胞構造体又は胚盤胞様構造体の前記発生に対して所定のレベルだけ上回ることは、前記薬剤が栄養膜細胞の発生及び／又は活性を調節することを示す、方法。

【請求項89】

多層細胞構造体又は胚盤胞様構造体によって作製される化合物又は粒子を入手する方法であって、請求項１～５４のいずれか一項に記載の方法に従って多層細胞構造体又は胚盤胞様構造体を培養することと、前記細胞によって分泌される化合物又は粒子を前記培養培地から単離することとを含み、それにより前記多層細胞構造体又は胚盤胞様構造体によって作製される前記化合物を入手する方法。

【請求項90】

多層細胞構造体又は胚盤胞様構造体によって作製される化合物又は粒子を入手する方法であって、請求項５６～６９のいずれか一項に記載の多層細胞構造体又は胚盤胞様構造体を培養することと、前記細胞によって分泌される化合物又は粒子を前記培養培地から単離することとを含み、それにより前記多層細胞構造体又は胚盤胞様構造体によって作製される前記化合物を入手する方法。

【請求項91】

前記化合物は、ホルモン若しくは成長因子であり、及び／又は前記粒子は、エキソソームなどの細胞外小胞である、請求項８９又は９０に記載の方法。

【請求項92】

多層細胞構造体又は胚盤胞様構造体を作製するためのキットであって、体細胞、再プログラム化因子及び請求項７８～８６のいずれか一項に記載の培養培地を含み、任意選択で、本明細書に開示されるとおりの方法に従って体細胞を多層細胞構造体又は胚盤胞様構造体に再プログラム化するための説明書を含むキット。

【請求項93】

請求項１～５４のいずれか一項に記載の方法で使用されるときの、請求項９２に記載のキット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ヒト胚盤胞様構造体を作成するための方法及び組成物に関する。

【0002】

関連出願
本願は、オーストラリア仮特許出願オーストラリア特許出願公開第２０２０９０４３３８号明細書、同第２０２１９００６８５号明細書、同第２０２１９０２８６５号明細書及び同第２０２１９０３４２７号明細書からの優先権を主張するものであり、これらの全ての内容全体が参照により本明細書に援用される。

【背景技術】

【0003】

哺乳類胚発生は、全能性の接合子から始まり、これは、桑実胚に発生し、続いて胚盤胞を形成する能力を有する。胚着床に伴い、胚盤胞内にある胚盤葉上層（ＥＰＩ）系統の細胞が胚体及び羊膜に発生する一方、栄養外胚葉（ＴＥ）及び原始内胚葉（ＰＥ）の細胞は、最終的にそれぞれ胎盤及び卵黄嚢を生じる。

【0004】

胚盤葉上層の細胞を単離してインビトロで培養すると、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）が生じる。代わりに、転写因子の媒介による再プログラム化により、成熟細胞をヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）に再プログラム化することができる。このような多能性インビトロ培養細胞は、身体のあらゆる細胞型に分化することができ、そのため、これは、ヒト「ミニ臓器」又はオルガノイドモデルの開発の中枢を担ってきた。更に、ｈＥＳＣ／ｈｉＰＳＣを使用して、マイクロパターニングした胚盤様構造体、胚包様構造体及びヒトガストルロイドを含め、初期ヒト発生の研究のために幾つものインビトロモデルが開発されている。この技術的及び医学的革命は、疾患のモデル化、薬物スクリーニング並びに幾つかの疾患、胚及び臓器発生の分子機構に関する本発明者らの理解にとって非常に重要となっている。

【0005】

しかしながら、個体の将来全般にとって、胚盤胞発生の初期相における複雑な時空間／細胞及び分子の変化が重要であるにも関わらず、ヒト胚盤胞のＥＰＩ／ＴＥ／ＰＥ統合インビトロモデルは、報告されていない。現在までのところ、ヒト発生の決定的に重要な最初の数日を研究する唯一の方法は、体外受精（ＩＶＦ）後に調査研究への同意が得られたドナー胚盤胞を使用して行うものである。ＩＶＦの目的がほとんどの場合に生殖目的で胚を作成することであり、調査研究に使用されるのは、余剰の（潜在的に低品質の）胚に限られるため、これは、非常に多くの課題をもたらす。このため、世界各国の異なる無数の倫理的、法的及び政策上の制約も相まって、ヒト胚盤胞での作業を許可される研究室の数、従って初期ヒト胚発生に関する理解も極めて限られることになる。

【0006】

ここ数年で、異なるグループが、ブラストイドと呼ばれるインビトロマウス胚盤胞モデルの作成に成功している。これらのマウスブラストイドは、２つの異なる手法：（１）マウス胚性幹細胞（ＥＳＣ）と栄養膜幹細胞（ＴＳＣ）；ＥＳＣ、ＴＳＣ及び胚体外内胚葉（ＸＥＮ）幹細胞；増量した（又は増大させた）多能性幹細胞（ＥＰＳＣ）とＴＳＣを含め、異なる胚盤胞様細胞を一緒に集合させることによる手法、又は（２）ＥＰＳＣを胚盤胞様構造体に分化させることによる手法を用いて作成されている。

【0007】

しかしながら、恐らくヒト胚盤胞の幹細胞型を誘導して培養下に維持するという課題に起因して、ヒトブラストイドの作成についての報告はない。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0008】

このように、ヒトブラストイド又はヒト胚盤胞をモデル化するヒト細胞の構造体を作製することが必要とされている。

【課題を解決するための手段】

【0009】

本明細書中のいずれの先行技術に関する参照も、その先行技術が何らかの法的権限内で技術常識の一部を成すこと又はその先行技術が当業者によって理解され、関連性があると見なされ、且つ／若しくは先行技術の他の一部と組み合わされると合理的に期待し得ることを認めるか又は示唆するものではない。

【0010】

一態様において、本発明は、多層細胞構造体を作製する方法であって、
ａ）胚盤葉上層（ＥＰＩ）、栄養外胚葉（ＴＥ）及び／又は原始内胚葉（ＰＥ）転写シグネチャを呈する再プログラム化された体細胞の細胞集団を入手すること；及び
ｂ）凝集を可能にする条件下において、再プログラム化された体細胞を培養して、多層細胞構造体を入手すること
を含み、それにより多層細胞構造体を作製する方法を提供する。

【0011】

一態様において、本発明は、胚盤胞様構造体を作製する方法であって、
ａ）胚盤葉上層（ＥＰＩ）、栄養外胚葉（ＴＥ）及び／又は原始内胚葉（ＰＥ）転写シグネチャを呈する再プログラム化された体細胞の細胞集団を入手すること；及び
ｂ）再プログラム化された体細胞を、凝集を可能にする条件下で培養して胚盤胞様構造体を入手すること
を含み、それにより胚盤胞様構造体を作製する方法を提供する。

【0012】

任意の態様において、胚盤葉上層（ＥＰＩ）、栄養外胚葉（ＴＥ）及び原始内胚葉（ＰＥ）転写シグネチャを呈する再プログラム化された体細胞の細胞集団を入手することは、
－ 体細胞の集団中における１つ以上の因子のタンパク質発現又は量を増加させることであって、因子は、体細胞を脱分化状態又は多能性状態に向けて再プログラム化するためのものである、増加させること；及び
－ 脱分化状態又は多能性状態に向けた細胞の再プログラム化を可能にするのに十分な時間にわたって且つそのための条件下において細胞を培養すること
を含む。

【0013】

任意の態様において、胚盤葉上層（ＥＰＩ）、栄養外胚葉（ＴＥ）及び／又は原始内胚葉（ＰＥ）系統の転写シグネチャを呈する細胞の集団は、好ましくは、胚盤葉上層（ＥＰＩ）、栄養外胚葉（ＴＥ）及び原始内胚葉（ＰＥ）系統の各々の転写シグネチャを呈する。

【0014】

任意の態様において、ＥＰＩ、ＴＥ又はＰＥ系統の転写シグネチャを呈する細胞の集団は、本明細書の表１に掲載されるマーカーの少なくとも１つを発現する細胞の集団を含む。より好ましくは、ＥＰＩ系統の転写シグネチャは、本明細書の表１に掲載されるとおりのＥＰＩ系統のマーカーの少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０個若しくはそれを超えるもの又は全ての発現を含む。より好ましくは、ＴＥ系統の転写シグネチャは、本明細書の表１に掲載されるとおりのＴＥ系統のマーカーの少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０個若しくはそれを超えるもの又は全ての発現を含む。より好ましくは、ＰＥ系統の転写シグネチャは、本明細書の表１に掲載されるとおりのＰＥ系統のマーカーの少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０個若しくはそれを超えるもの又は全ての発現を含む。

【0015】

一態様において、本発明は、胚盤胞様構造体を作製する方法であって、
ａ）体細胞の集団中における１つ以上の因子のタンパク質発現又は量を増加させることであって、因子は、体細胞を脱分化状態又は多能性状態に向けて再プログラム化するためのものである、ステップ；
ｂ）細胞の脱分化した多能性状態に向けた再プログラム化を可能にするのに十分な時間にわたって且つそのための条件下において細胞を培養して、ＥＰＩ、ＴＥ及びＰＥ系統の１つ以上の特徴を呈する細胞の集団を入手するステップ；
ｃ）凝集を可能にする条件下において、細胞を、ＷＮＴ経路シグナル伝達を活性化させる薬剤（任意選択でＧＳＫ－３阻害薬）、少なくとも１つ、好ましくは２つのＴＧＦ－β阻害薬、ＨＤＡＣ阻害薬、ＥＧＦ及びＢＭＰ４を含む培養培地と接触させるステップ；
ｄ）細胞が、本明細書に記載されるとおりの胚盤胞様構造体の少なくとも１つの特徴を呈することを可能にするのに十分な時間にわたって且つそのための条件下において細胞を培養培地で培養するステップ
を順番に含み、それにより胚盤胞様構造体を作製する方法を提供する。

【0016】

好ましくは、ステップｃ）の培養培地は、Ｒｈｏキナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害薬を更に含む。好ましくは、細胞が、その後、ＲＯＣＫ阻害薬のない培養培地と接触される前に、細胞は、ＲＯＣＫ阻害薬を含む培養培地と少なくとも約６時間、少なくとも約１２時間又は少なくとも約２４時間の期間にわたって接触される。

【0017】

本発明の方法によれば、体細胞を脱分化状態又は多能性状態に向けて再プログラム化する任意の方法を使用し得ることが理解されるであろう。このように、本発明は、関連性のある因子のタンパク質発現若しくは量を増加させる特定の方法又は体細胞が可塑性若しくは多能性に向けた再プログラム化を開始することを可能にする培養条件に限定されない。かかる方法は、当技術分野において公知であり、本明細書に更に記載される。

【0018】

好ましい実施形態において、体細胞を脱分化状態又は多能性状態に向けて再プログラム化するための因子は、転写因子である。転写因子は、因子：ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４及びＭＹＣ（ＯＳＫＭ）；ＳＯＸ２、ＫＬＦ４及びＯＣＴ４（ＳＫＯ）；ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４及びＧＬＩＳ１（ＯＳＫＧ）；ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ及びＬＩＮ２８（ＯＳＮＬ）；又はＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ｃ－ＭＹＣ、ＮＡＮＯＧ及びＬＩＮ２８（ＯＫＳＭＮＬ）の１つ以上を含み得るか、又はそれからなり得るか若しくは本質的になり得る。特に好ましい実施形態において、転写因子は、因子ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４及びＭＹＣ（ＯＳＫＭ）の４つ全て又はその変異体を含む。別の実施形態において、転写因子は、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４及びＯＣＴ４（ＳＫＯ）を含むか、それからなるか又は本質的になる。別の実施形態において、転写因子は、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４及びＧＬＩＳ１（ＯＳＫＧ）を含むか、それからなるか又は本質的になる。別の実施形態において、転写因子は、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ及びＬＩＮ２８（ＯＳＮＬ）を含むか、それからなるか又は本質的になる。別の実施形態において、転写因子は、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ｃ－ＭＹＣ、ＮＡＮＯＧ及びＬＩＮ２８（ＯＫＳＭＮＬ）を含むか、それからなるか又は本質的になる。

【0019】

このように、別の態様において、本発明は、胚盤胞様構造体を作製する方法であって、
ａ）体細胞の集団中における、転写因子ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４及びＭＹＣ（ＯＳＫＭ）、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４及びＯＣＴ４（ＳＫＯ）、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４及びＧＬＩＳ１又はＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ及びＬＩＮ２８（ＯＳＮＬ）の１つ以上又は本明細書に記載される転写因子の任意の他の組み合わせのタンパク質発現又は量を増加させるステップ；
ｂ）細胞の脱分化した多能性状態に向けた再プログラム化を可能にするのに十分な時間にわたって且つそのための条件下において細胞を培養するステップであって、好ましくは、細胞の培養は、体細胞の維持に好適な培地中である、ステップ；
ｃ）凝集を可能にする条件下において、細胞を、ＷＮＴ経路シグナル伝達を活性化させる薬剤（任意選択でＧＳＫ－３阻害薬）、少なくとも１つ、好ましくは２つのＴＧＦ－β阻害薬、ＨＤＡＣ阻害薬、ＥＧＦ及びＢＭＰ４を含む培養培地と接触させるステップ；
ｄ）細胞が、本明細書に記載されるとおりの胚盤胞様構造体の少なくとも１つの特徴を呈することを可能にするのに十分な時間にわたって且つそのための条件下において細胞を培養培地で培養するステップ
を順番に含み、それにより胚盤胞様構造体を作製する方法を提供する。

【0020】

典型的には、本明細書に記載されるとおりの転写因子のタンパク質発現又は量は、細胞を、転写因子の発現を増加させる薬剤と接触させることによって増加される。好ましくは、薬剤は、ヌクレオチド配列、タンパク質、アプタマー及び小分子、リボソーム、ＲＮＡｉ剤、マイクロＲＮＡ、長鎖非コードＲＮＡ及びペプチド核酸（ＰＮＡ）並びにその類似体又は変異体からなる群から選択される。一部の実施形態において、薬剤は、外因性である。本発明は、１つ以上の転写因子の発現を増加させるための転写活性化システム（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９又はＴＡＬＥＮなどの遺伝子活性化システムでの使用のためのｇＲＮＡ）の使用も企図する。

【0021】

典型的には、本明細書に記載されるとおりの転写因子のタンパク質発現又は量は、転写因子をコードするか、又はその機能断片をコードするヌクレオチド配列を含む少なくとも１つの核酸（例えばｍＲＮＡ）を細胞に導入することによって増加される。転写因子をコードする少なくとも１つの核酸は、体細胞集団に複数回、例えば２、３、４、５又は６回、例えばそれぞれ２、３、４、５又は６日間にわたって毎日トランスフェクトされ得る。

【0022】

本発明の好ましい実施形態において、転写因子タンパク質をコードする核酸配列は、プラスミドによって細胞に導入される。１つ以上の転写因子をコードする１つ以上の核酸が使用され得る。従って、必要とされる１つ以上の転写因子の発現又は量を増加させる目的で１つ以上のプラスミドを使用し得ることが明らかである。換言すれば、核酸配列は、単一のプラスミド内若しくはその上にあり得るか、又は体細胞に２つ以上のプラスミドで提供され得る。

【0023】

本発明の任意の実施形態において、本発明に従う使用のための１つ以上の転写因子をコードする核酸を含有するプラスミドは、エピソームプラスミドであり得る。

【0024】

好ましくは、核酸は、異種プロモーターを更に含む。好ましくは、核酸は、ウイルスベクター又は非ウイルスベクターなどのベクターにある。好ましくは、ベクターは、宿主細胞ゲノムに組み込まれないゲノムを含むウイルスベクターである。ウイルスベクターは、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルス又はセンダイウイルスであり得る。

【0025】

特定の実施形態において、因子のタンパク質発現又は量は、前記転写因子をコードする１つ以上のベクターを体細胞に形質導入又はトランスフェクトすることによって体細胞において増加される。ベクターは、組込み型又は非組込み型ウイルスベクターを含むウイルスベクターであり得る。更なる実施形態において、ベクターは、エピソームベクターであり得る。

【0026】

体細胞は、ステップｃ）に定義される、細胞を培養培地と接触させるステップ前に多能性状態への再プログラム化が完了している必要がないことも理解されるであろう。換言すれば、細胞は、好ましくは、中間状態にあり、それを培養培地と接触させる時点で、分化した状態からより可塑性の高い状態又は多能性状態に向けて移行中である。従って、ステップｂ）の終了時、ステップｃ）で培養する前の細胞は、「再プログラム化中間体」と称され得る。本明細書に記載されるとおり、再プログラム化中間体の集団は、胚盤葉上層（ＥＰＩ）、栄養外胚葉（ＴＥ）及び／又は原始内胚葉（ＰＥ）転写シグネチャを呈する。本発明に従って作り出される再プログラム化中間体の集団は、本明細書の図２ｈに示されるとおり、マーカーＯＣＴ４、ＧＡＴＡ６及びＣＤＸ２に関して陽性又は陰性染色される異なる細胞集団の比率を参照することによっても特徴付けられ得る。

【0027】

特定の実施形態において、脱分化状態又は多能性状態に向けた再プログラム化を開始させるための細胞の培養期間は、１つ以上の因子のタンパク質発現若しくは量の増加後又は１つ以上の因子のタンパク質発現若しくは量を増加させるために細胞を薬剤と接触させたときから始まって少なくとも１日である。この期間は、１つ以上の因子のタンパク質発現又は量が増加した後の２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０若しくは２１日又はそれを超えるものであり得る。任意の実施形態において、脱分化状態又は多能性状態に向けた再プログラム化を開始させるための細胞の培養期間は、任意の期間であり得、但し、それは、体細胞に関連するマーカーの減少を実現可能であり、且つ／又は体細胞アイデンティティの減少又は喪失及び細胞可塑性の獲得を引き起こすものとする。

【0028】

一実施形態において、脱分化状態又は多能性状態に向けた細胞の再プログラム化を可能にするのに十分な時間にわたって且つそのための条件下において細胞を培養するステップは、体細胞を培養下に維持するための培地で細胞を培養することを含む。好ましくは、このステップは、多能性を促進することを意図しない培地で細胞を培養することを含む。換言すれば、再プログラム化される体細胞が線維芽細胞である場合、好ましくは、細胞は、線維芽細胞の維持に好適な培地で培養される。再プログラム化される体細胞が上皮細胞である場合、好ましくは、細胞は、上皮細胞の維持に好適な培地で培養される。様々な体細胞型の培養及び維持に好適な培地が当業者に公知であり、本明細書の表３ｂにも更に定義される。

【0029】

別の実施形態において、脱分化状態又は多能性状態に向けた細胞の再プログラム化を可能にするのに十分な時間にわたって且つそのための条件下において細胞を培養するステップは、多能性のみの促進を意図するものではない培地で細胞を培養することを含む。例示的培地としては、表３ａにあるものを含め、本明細書に定義されるＮＡＣＬ、ＰＡ又はｔ２ｉＬＧｏ培地が挙げられる。

【0030】

本発明の更なる実施形態において、上記の方法は、ＥＰＩ、ＴＥ及びＰＥ系統転写シグネチャの上方制御を誘導する培地で体細胞を脱分化状態又は多能性状態に向けて培養することを含む。好ましくは、体細胞が線維芽細胞であるとき、培地は、線維芽細胞培地、例えば表３ａ又は表３ｂにおけるものを含む、本明細書に定義される線維芽細胞培地である。

【0031】

任意の実施形態において、因子のタンパク質発現又は量を増加させることと、ステップｃ）で細胞を培養培地と接触させることとの間の期間は、任意の期間であり得、但し、それは、体細胞に関連するマーカーの減少を実現可能であるものとする。更なる例において、因子のタンパク質発現又は量を増加させることと、ステップｃ）で細胞を培養培地と接触させることとの間の期間は、任意の期間であり得、但し、それは、細胞が間葉上皮移行状態を進行することを実現可能であるものとする。更なる又は代替的な実施形態において、この期間は、任意の期間であり得、但し、それは、胚盤葉上層（ＥＰＩ）、栄養外胚葉（ＴＥ）及び原始内胚葉（ＰＥ）転写シグネチャの発現を実現可能であるものとする。

【0032】

本明細書で使用されるとき、ステップｃ）の培養培地（即ちＥＰＩ、ＴＥ及びＰＥ系統転写シグネチャを呈する再プログラム化中間体を接触させる培養培地）は、胚盤胞促進培地又は「ｉＢｌａｓｔｏｉｄ」培地とも称され得る。好ましくは、胚盤胞促進培地又はｉＢｌａｓｔｏｉｄ培地は、本明細書に定義されるとおりのいずれかである。任意の実施形態において、細胞は、ステップｃ）において、少なくとも約１、少なくとも約２、少なくとも約３、少なくとも約４、少なくとも約５、少なくとも約６、少なくとも約７、少なくとも約９、少なくとも約１２、少なくとも約１４、少なくとも約１６、少なくとも約２０、少なくとも約２４若しくは少なくとも約２８日間又はそれを超える期間にわたって培養培地で培養される。

【0033】

任意の態様において、凝集又は自己組織化を可能にする条件は、細胞の三次元凝集又は自己組織化を可能にする任意の培養プレート、培養ベッセル、マイクロ流体デバイス又は培養システムで培養することを含み得る。例えば、細胞は、１ウェル当たり０．５～２×１０^５若しくは約０．５～２×１０^５細胞、１ウェル当たり０．６～２×１０^５若しくは約０．６～２×１０^５細胞、１ウェル当たり０．８～２×１０^５若しくは約０．８～２×１０^５細胞、１ウェル当たり１～２×１０^５若しくは約１～２×１０^５細胞、１ウェル当たり０．６×１０^５若しくは約０．６×１０^５細胞、１ウェル当たり０．８×１０^５若しくは約０．８×１０^５細胞、１ウェル当たり１×１０^５若しくは約１×１０^５細胞、１ウェル当たり１．２×１０^５若しくは約１．２×１０^５細胞、１ウェル当たり１．４×１０^５若しくは約１．４×１０^５細胞、１ウェル当たり１．６×１０^５若しく約１．６×１０^５細胞、１ウェル当たり１．８×１０^５若しくは約１．８×１０^５細胞又は１ウェル当たり２×１０^５若しくは約２×１０^５細胞の密度で播種され得る。１つのウェル（２４ウェルフォーマットＡｇｇｒｅＷｅｌｌにおける）中に１２００マイクロウェルがあることが理解されるであろう。このように、細胞は、１マイクロウェル当たり１～１００又は約１～１００細胞、好ましくは１マイクロウェル当たり約１０～２００細胞の密度、より好ましくは１マイクロウェル当たり約５０～１００細胞の密度で播種され得る。一実施形態において、培養プレート又は培養ベッセルは、本明細書に記載されるいずれか１つである。特定の実施形態において、培養プレート又は培養ベッセルは、２４ウェルＡｇｇｒｅＷｅｌｌである。

【0034】

体細胞は、罹患細胞を含め、本明細書に記載される任意の細胞型であり得る。好ましくは、体細胞は、ヒト体細胞である。体細胞は、成熟細胞又は成熟若しくは非胚細胞の１つ以上の検出可能な特徴を示す成人に由来する細胞であり得る。罹患細胞は、疾患又は病態の１つ以上の検出可能な特徴、例えば異数性、胞状奇胎又はコルネリアデランゲ症候群を示す細胞であり得る。更に、体細胞は、例えば、ＣＲＩＳＰＲ技術（例えば、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９、－Ｃａｓ１２ａ、－Ｃａｓ１３又は関連するＣＲＩＳＰＲ／ヌクレアーゼシステム）による遺伝子編集を受けたものであり得る。

【0035】

好ましい実施形態において、体細胞は、線維芽細胞、好ましくは皮膚線維芽細胞、最も好ましくはヒト線維芽細胞である。

【0036】

更なる態様において、本発明は、多層細胞構造体又は胚盤胞様構造体を作製する方法であって、
－ 細胞の集合及び凝集を可能にする条件下でｉＰＳＣ及びｉＴＳＣ細胞を培養して、多層細胞構造体を入手すること
を含み、それにより多層細胞又は胚盤胞様構造体を作製する方法を提供する。

【0037】

好ましくは、ｉＰＳＣ及びｉＴＳＣは、ヒト細胞に由来する（例えば、ヒト体細胞の再プログラム化により入手される）。好ましくは、ｉＰＳＣ及びｉＴＳＣは、線維芽細胞の再プログラム化に由来する。

【0038】

本発明のこの態様において、ｉＰＳＣ及びｉＴＳＣは、当技術分野において公知の及び本明細書に更に記載されるとおりの任意の方法によって作成され得る。

【0039】

本発明のこの態様において、細胞の集合及び凝集を可能にする条件は、好ましくは、細胞の自己組織化及び集合を促進する、本明細書に記載される任意の培養ベッセルにおいてｉＰＳＣ及びｉＴＳＣを共培養することを含む。好ましくは、細胞は、細胞が、本明細書に記載されるとおりの胚盤胞様構造体の少なくとも１つの特徴を呈することを促進するための任意の培養培地（例えば、胚盤胞促進培地又はｉＢｌａｓｔｏｉｄ培地）で培養される。好ましくは、培養培地は、表３ａに示されるとおりのｉＢｌａｓｔｏｉｄ培地である。

【0040】

好ましくは、ｉＰＳＣ及びｉＴＳＣは、同じウェル内において、それぞれ１：２．５の比で、１ウェル当たり１．２×１０^５個の総細胞数として共培養される。１つのウェル（２４ウェルフォーマットＡｇｇｒｅＷｅｌｌにおける）中に１２００マイクロウェルがあることが理解されるであろう。このように、細胞は、１マイクロウェル当たり１０～２００又は約１０～２００細胞の密度、好ましくは１マイクロウェル当たり約５０～１００細胞の密度で播種され得る。

【0041】

本発明は、多層細胞構造体又は胚盤胞様構造体も提供し、好ましくは、多層細胞構造体は、本明細書に記載されるとおりの任意の方法によって入手されるか又は入手可能である。かかる多層細胞構造体又は胚盤胞様構造体は、インビトロ由来の又はインビトロで作成されたブラストイド若しくは胚盤胞様構造体又は「ｉＢｌａｓｔｏｉｄ」とも称され得る。このように、本発明は、インビトロ由来の又はインビトロで作成されたブラストイド又は胚盤胞様構造体も提供する。好ましくは、インビトロ由来の又はインビトロで作成されたブラストイド又は胚盤胞様構造体は、本明細書に記載される任意の方法によって入手可能であるか又は入手される。任意の実施形態において、多層細胞構造体又は胚盤胞様構造体は、ヒト多層細胞構造体又はヒト胚盤胞様構造体（又はヒトブラストイド若しくはｉＢｌａｓｔｏｉｄ）である。好ましくは、多層細胞構造体又は胚盤胞様構造体は、ヒト細胞のみを含有するか、又はそれに由来するか若しくはそれから作成される。

【0042】

本明細書に記載される任意の態様において、多層細胞構造体又は胚盤胞様構造体は、内細胞層と外細胞層とを含み、内細胞層は、胚盤葉上層及び／又は原始内胚葉系統の細胞の１つ以上の特徴を呈する細胞を含み、及び外細胞層は、栄養外胚葉の細胞の１つ以上の特徴を呈する細胞を含む。好ましくは、特徴は、細胞形態、遺伝子発現プロファイル、活性アッセイ、タンパク質発現プロファイル、表面マーカープロファイル、分化能力又はこれらの組み合わせの分析によって決定され得る。特徴又はマーカーの例には、本明細書に記載されるもの及び当業者に公知のものが含まれる。

【0043】

任意の態様において、内細胞層は、ＰＥの１つ以上の特徴を呈する細胞塊を更に含む。好ましくは、ＰＥの１つ以上の特徴を呈する細胞は、胚盤葉上層の細胞の１つ以上の特徴を呈する細胞の周辺にあるか又は主にその周辺にある。

【0044】

任意の態様において、ＥＰＩ細胞の特徴は、マーカーＮＡＮＯＧ、ＯＣＴ４（別名ＰＯＵ５Ｆ１）又はＳＯＸ２のいずれか１つ以上の存在である。一実施形態において、多層細胞構造体又は胚盤胞様構造体のより多くの細胞は、ＮＡＮＯＧを発現するよりもＯＣＴ４を発現する。

【0045】

任意の態様において、ＥＰＩ細胞の特徴は、円柱状外観の形態である。

【0046】

任意の態様において、ＴＥ細胞の特徴は、マーカーＣＤＸ２及びＧＡＴＡ２の１つ以上の存在である。

【0047】

任意の態様において、ＴＥ細胞の特徴は、扁平な又は細長い上皮形態である。

【0048】

任意の態様において、ＰＥ細胞の特徴は、マーカーＳＯＸ１７又はＧＡＴＡ６の存在である。

【0049】

任意の態様において、ＥＰＩ、ＰＥ又はＴＥ系統のマーカーは、Ｐｅｔｒｏｐｏｕｌｏｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １６５，１０１２－１０２６（２０１６）に記載されるとおりであるか、又は本明細書の表１に示されるとおりである。

【0050】

任意の態様において、多層細胞構造体又は胚盤胞様構造体は、ＯＣＴ４陽性細胞に隣接するＧＡＴＡ６陽性細胞（任意選択でＣＤＸ２低染色又は弱染色を伴う）を更に含み得る。

【0051】

任意の態様において、多層細胞構造体又は胚盤胞様構造体は、Ｅ５～７の着床前ヒト胚盤胞の主要な形態学的特質を呈する。更に、多層細胞構造体又は胚盤胞様構造体は、胚盤葉上層、原始内胚葉及び栄養外胚葉細胞の細胞の１つ以上の特徴を呈する細胞も含み得、これらの細胞は、Ｅ５～７、好ましくはＥ６～７のヒト胚盤胞におけるそれぞれ胚盤葉上層、原始内胚葉及び栄養外胚葉細胞と同じ又は類似した相対的空間配置をとる。

【0052】

任意の態様において、多層細胞構造体又は胚盤胞様構造体は、無細胞の空洞又は胞胚腔様の空洞も含む。

【0053】

任意の態様において、多層細胞構造体又は胚盤胞様構造体は、自然発生の胚によって形成される卵黄嚢と同じように、原始卵黄嚢を形成する能力を有する。

【0054】

任意の態様において、多層細胞構造体又は胚盤胞様構造体は、受精後胚齢５～７日目（Ｅ５～７）のヒト胚盤胞の既発表の測定値の約５０％～２００％のサイズのｘ軸及びｙ軸直径、ｘ：ｙアスペクト比並びに／又は投影面積を有する。例えば、多層細胞構造体又は胚盤胞様構造体のｘ軸及び／又はｙ軸直径は、約１００～約３００μｍである。好ましくは、ｘ／ｙ軸比は、約１である。多層細胞構造体又は胚盤胞様構造体の投影面積は、約５，０００～約１０，０００μｍ^２、約１０，０００～約４０，０００μｍ^２、約４０，０００μｍ^２～約６０，０００μｍ^２、好ましくは約２０，０００～約４０，０００μｍ^２である。

【0055】

任意の態様において、多層細胞構造体又は胚盤胞様構造体は、少なくとも約１００～４００個の総細胞又は少なくとも約３００～約６００個の細胞を含む。

【0056】

任意の態様において、ＩＶＣ１培地（本明細書に定義されるとおり）で１日間培養し、続いてＩＶＣ２培地（本明細書に定義されるとおり）で２日目から４．５日目まで培養されたとき、多層細胞構造体又は胚盤胞様構造体は、表面（ガラス表面など）に付着し、
ａ）サイズの増加、扁平化及び増殖体の形成に至るまでの進行
ｂ）ＮＡＮＯＧ及びＯＣＴ４／ＳＯＸ２陽性細胞数の増加；
ｃ）ＣＤＸ２及びＧＡＴＡ２陽性細胞の広がり；
ｄ）ＮＡＮＯＧ又はＯＣＴ４陽性細胞の周囲にＳＯＸ１７及びＧＡＴＡ６陽性細胞が局在すること；
ｅ）外細胞層又はＴＥ細胞の少なくとも１つの特徴を呈する細胞におけるケラチンＫＲＴ７又は他の栄養膜細胞マーカーの発現；
ｆ）合胞体栄養膜細胞（ＳＴ）及び絨毛外栄養膜細胞（ＥＶＴ）に形態学的に似た細胞（例えば、それぞれＳＴ及びＥＶＴ様細胞）の存在、例えば多核性表現型及び紡錘様形態；
ｇ）ｈＣＧ（例示的ＳＴマーカー）及びＭＭＰ２（例示的ＥＶＴマーカー）を発現する細胞の存在；
ｈ）ＳＴマーカーＣＳＨ１及びＥＶＴマーカーＩＴＧＡ１の上方制御を呈する細胞の存在
の１つ以上を呈し得る。

【0057】

別の態様において、本発明は、細胞が胚盤胞様構造体の少なくとも１つの特徴を呈することを促進するための培養培地（例えば、胚盤胞促進培地又はｉＢｌａｓｔｏｉｄ培地）であって、
－ ＷＮＴ経路のシグナル伝達を活性化させる薬剤、任意選択でＧＳＫ－３阻害薬；
－ 少なくとも１つ、好ましくは２つのＴＧＦ－β阻害薬、
－ ＨＤＡＣ阻害薬、
－ ＧＳＫ－３阻害薬、
－ ＥＧＦ、及び
－ ＢＭＰ４
を含む培養培地を提供する。

【0058】

この態様において、ＷＮＴ経路シグナル伝達の活性化薬、１つ又は複数のＴＧＦ－β阻害薬及びＨＤＡＣ阻害薬は、本明細書に記載されるいずれか１つを含め、当技術分野において公知のいずれか１つであり得る。

【0059】

好ましくは、培養培地は、
－ ＩＴＳ－Ｘ；
－ Ｌ－グルタミン；
－ Ｎ－アセチル－Ｌ－システイン；
－ β－エストラジオール；
－ プロゲステロン；
－ ２－メルカプトエタノール；
－ Ｌ－アスコルビン酸；
－ トランスフェリン（例えば、ヒト）、
－ インスリン（例えば、ヒト）、
－ Ｎ２サプリメント；及び
－ Ｂ２７サプリメント
を更に含む。

【0060】

好ましくは、プロゲステロン、トランスフェリン及びインスリンは、本明細書に記載されるとおりの、プトレシン及び亜セレン酸塩を更に含むＮ２サプリメントで提供される。

【0061】

好ましくは、Ｂ２７サプリメントは、ビオチン、ＤＬα酢酸トコフェロール、ＤＬαトコフェロール、ビタミンＡ（酢酸塩）、ＢＳＡ、カタラーゼ、インスリン（ヒト）、スーパーオキシドジスムターゼ、コルチコステロン、Ｄ－ガラクトース、エタノールアミンＨＣＬ、グルタチオン、Ｌ－カルニチンＨＣＬ、リノール酸、リノレン酸、プロゲステロン、プトレシン２ＨＣｌ、亜セレン酸ナトリウム、Ｔ３（トリヨード－ｌ－チロニン）を含む。

【0062】

任意の実施形態において、培養培地は、抗生物質、例えばペニシリン－ストレプトマイシンを更に含む。

【0063】

一実施形態において、培養培地は、
－ それぞれ２：１：１の比の、本明細書に定義されるとおりのＩＶＣ１培地、Ｎ２Ｂ２７基本培地及びＴＳＣ基本培地、
－ ＷＮＴ経路シグナル伝達の活性化薬（任意選択でＧＳＫ－３阻害薬）、
－ 少なくとも１つ、好ましくは２つのＴＧＦ－β阻害薬、
－ ＨＤＡＣ阻害薬、
－ ＥＧＦ、及び
－ ＢＭＰ４
を含む。

【0064】

本明細書における任意の態様において、ＷＮＴ経路シグナル伝達を活性化させる薬剤は、ＷＮＴシグナル伝達を直接又は間接的に活性化させる任意の小分子を含み得る。特定の実施形態において、ＷＮＴ経路シグナル伝達を活性化させる薬剤は、ＧＳＫ－３阻害薬であり得る。

【0065】

任意の態様において、ＴＧＦ－β経路阻害薬は、ＳＢ４３１５４２及びＡ８３－０１から選択され、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）１阻害薬は、ＶＰＡ（バルプロ酸）であり、ＧＳＫ－３阻害薬は、ＣＨＩＲ９９０２１である。

【0066】

任意の態様において、ＧＳＫ－３阻害薬は、２μＭ又は約２μＭの濃度であり、ＴＧＦ－β経路阻害薬は、０．５μＭ若しくは１μＭ又は約０．５μＭ若しくは１μＭの濃度であり、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）１阻害薬は、０．８ｍＭ又は約０．８ｍＭの濃度であり、ＥＧＦは、５０ｎｇ／ｍｌ又は約５０ｎｇ／ｍｌの濃度であり、及びＢＭＰ４は、１０ｎｇ／ｍｌ又は約１０ｎｇ／ｍｌの濃度である。

【0067】

任意の態様又は実施形態において、培養培地は、ＲＯＣＫ阻害薬又は単一細胞解離後の細胞生存を促進する能力を有する任意の成長因子若しくはキナーゼ阻害薬を更に含む。好ましくは、ＲＯＣＫ阻害薬は、Ｙ－２７６３２である。好ましくは、ＲＯＣＫ阻害薬は、１０μＭ又は約１０μＭの濃度である。

【0068】

別の態様において、ステップｃ）で使用する培養培地は、表３ａに定義されるとおりの線維芽細胞培地、Ｎ２Ｂ２７基本培地、ＴＳＣ基本培地、ＩＶＣ１培地、ＩＶＣ２培地又はヒトｉＢｌａｓｔｏｉｄ培地を含むか又はそれからなる。

【0069】

任意の態様において、本発明の任意の方法のステップｃ）に定義される培養培地は、限定はされないが、表３ａにあるものを含めた、本明細書に定義されるとおりのヒトｉＢｌａｓｔｏｉｄ培地を含め、本発明の任意の培養培地であり得る。

【0070】

任意の態様において、体細胞は疾患遺伝子型を有し得る。例えば、体細胞は、遺伝性疾患、好ましくは初期発生疾患を有する個体に由来し得る。初期発生疾患の例は、異数性、胞状奇胎及びコルネリアデランゲ症候群である。

【0071】

好ましくは本発明の方法に従って作り出される、本発明の１つ又は複数の多層細胞構造体又は胚盤胞様構造体（ｉＢｌａｓｔｏｉｄ）は、ヒト初期発生の不安定な状態にある間の生体異物の副作用及び他の潜在的環境危険因子を理解するための代表的なモデルとして利用し得るが、それが存在する場合、妊娠の準備をしている患者に対する具体的な薬物レジメンの予測及び続く処方が容易となるであろうことも見込まれる。

【0072】

好ましくは本発明の方法に従って作り出される、本発明の１つ又は複数の多層細胞構造体又は胚盤胞様構造体は、ＣＲＩＳＰＲベースの技術の試験／開発における使用のため、インビトロ付着アッセイを開発／改良するため、胚発生及び胚体外組織（胎盤など）の発生の研究のためを含めた、種々の他の使用のためのプラットフォームとして使用することができる。

【0073】

別の態様において、本発明は、胚盤胞の発生（任意選択で体外受精技術に関連する手法を改良するため）及び／又は活性を調節する能力を有する薬剤を同定する方法であって、
－ 好ましくは本発明に従って作り出される、本発明の多層細胞構造体又は胚盤胞様構造体を候補薬剤と接触させること；
－ 薬剤との接触後の多層細胞構造体又は胚盤胞様構造体の発生及び／又は活性を、薬剤なしでの多層細胞構造体又は胚盤胞様構造体の発生及び／又は活性と比較すること
を含む方法も提供し、多層細胞構造体又は胚盤胞様構造体の発生及び／又は活性に対する薬剤の効果が、薬剤なしでの多層細胞構造体又は胚盤胞様構造体の発生に対して所定のレベルだけ上回ることは、その薬剤が栄養膜細胞の発生及び／又は活性を調節することを示す。

【0074】

別の態様において、本発明は、多層細胞構造体又は胚盤胞様構造体によって作製される化合物又は粒子を入手する方法であって、本発明に従う多層細胞構造体又は胚盤胞様構造体を培養することと、細胞によって分泌される化合物又は粒子を培養培地から単離することとを含み、それにより多層細胞構造体又は胚盤胞様構造体によって作製される化合物を入手する方法を提供する。化合物は、ホルモン又は成長因子であり得る。粒子は、エキソソームなどの細胞外小胞であり得る。

【0075】

本発明の、好ましくは本明細書に記載される方法に従って作製される１つ又は複数の多細胞構造体又は胚盤胞様構造体は、キメラ臓器又はオルガノイドの作成において有用であり得る。このように、本発明は、キメラ臓器又はオルガノイドの作成における、本発明の、好ましくは本明細書に記載される方法に従って作製される１つ又は複数の多細胞構造体又は胚盤胞様構造体の使用も提供する。かかるキメラオルガノイドは、様々な病態若しくは疾患の研究又は治療用薬剤のスクリーニングに有用であり得る。

【0076】

別の態様において、本発明は、本明細書に開示されるとおりの多層細胞構造体又は胚盤胞様構造体を作製するためのキットにも関する。一部の実施形態において、キットは、体細胞、再プログラム化因子及び本明細書に開示されるとおりの１つ以上の培養培地を含む。好ましくは、本キットは、多層細胞構造体又は胚盤胞様構造体の作製に使用することができる。好ましくは、本キットは、線維芽細胞である体細胞と共に使用することができる。一部の実施形態において、本キットは、本明細書に開示されるとおりの方法に従って体細胞を多層細胞構造体又は胚盤胞様構造体に再プログラム化するための説明書を更に含む。好ましくは、本発明は、本明細書に記載される本発明の方法で使用されるときのキットを提供する。

【0077】

更なる態様において、本発明は、本発明の、好ましくは本明細書に記載される方法に従って作製される１つ又は複数の多細胞構造体又は胚盤胞様構造体に由来するか、それから単離されるか又はそれから入手される細胞又は細胞の集団を提供する。この細胞又は細胞の集団は、ＥＰＩ系統の１つ以上の特徴、又はＰＥ系統の１つ以上の特徴、又はＴＥ系統の１つ以上の特徴を呈し得る。

【0078】

典型的には、本発明の、好ましくは本発明の方法に従って作製される多細胞構造体又は胚盤胞様構造体に由来するか、それから単離されるか又はそれから入手される細胞又は細胞の集団は、自己複製能を有する。換言すれば、本発明の、好ましくは本発明の方法に従って作製される多細胞構造体又は胚盤胞様構造体に由来するか、それから単離されるか又はそれから入手される細胞又は細胞の集団は、それを培養下に維持できることを特徴とする。

【0079】

更なる態様において、本発明は、本明細書に記載される細胞又は細胞の集団に由来するか又はそれから入手されるオルガノイドも提供する。オルガノイドは、本発明の、好ましくは本明細書に記載される方法に従って作製される多細胞構造体又は胚盤胞様構造体に由来するキメラオルガノイドも含み得る。

【0080】

本明細書で使用されるとき、文脈上特に必要な場合を除き、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」並びにこの用語の変化形、例えば「含んでいる」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」及び「含まれる」などは、更なる追加、成分、完全体又はステップを除外することを意図しない。

【0081】

本発明の更なる態様及び前出の段落に記載される態様の更なる実施形態は、例として提供され、且つ添付の図面を参照する以下の説明から明らかになるであろう。

【図面の簡単な説明】

【0082】

【図1】再プログラム化によるヒトｉＢｌａｓｔｏｉｄの作成。ａ、再プログラム化及びｉＢｌａｓｔｏｉｄ誘導の実験計画。ｂ、ｉＢｌａｓｔｏｉｄの位相差画像（ｎ＝５）。スケールバー、５０μｍ。ｃ、ｉＢｌａｓｔｏｉｄのＮＡＮＯＧに関する位相差画像及び免疫染色画像（ｎ＝５）。スケールバー、５０μｍ。ｄ～ｈ、ヒト胚盤胞と比較したｉＢｌａｓｔｏｉｄのｘ軸及びｙ軸直径、ｘ／ｙアスペクト比、投影面積の測定（ｎ＝１８）（Ｓｈａｈｂａｚｉ，Ｍ．Ｎ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１８，７００－７０８（２０１６）；Ｂｌａｋｅｌｅｙ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １４２，３６１３（２０１５）；Ｐｅｔｒｏｐｏｕｌｏｓ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ １６５，１０１２－１０２６（２０１６）；Ｘｉａｎｇ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ５７７，５３７－５４２（２０２０）；Ｑｉｎ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．１４，２３０１－２３１２（２０１６）；Ｌｉｕ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．１０，３６４（２０１９）；Ｄｕｒｒｕｔｈｙ－Ｄｕｒｒｕｔｈｙ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｄｅｖ．Ｃｅｌｌ ３８，１００－１１５（２０１６）；Ｆｏｇａｒｔｙ，Ｎ．Ｍ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ５５０，６７－７３（２０１７））（ｎ＝８）。ｉ、ｉＢｌａｓｔｏｉｄの総細胞数推定（ｎ＝１４）。ｊ、ＣＤＸ２及びＮＡＮＯＧに関して染色したｉＢｌａｓｔｏｉｄの３次元及び２次元表現（ｎ＝５）。スケールバー、２０μｍ。ｋ～ｌ、ｉＢｌａｓｔｏｉｄの代表的なＤＩＣ表現及びＣＤＸ２、ＮＡＮＯＧ免疫染色（ｎ＝５）、矢印で示したとおりの胞胚腔様の空洞を例証する。スケールバー、１０μｍ。ｍ、ＧＡＴＡ２、ＯＣＴ４及びＳＯＸ２に関するｉＢｌａｓｔｏｉｄの免疫染色（ｎ＝３）。スケールバー、２０μｍ。ｎ、ＩＣＭ様区画を有するＧＡＴＡ２、ＮＡＮＯＧ及びＳＯＸ１７に関して染色したｉＢｌａｓｔｏｉｄ－拡大表示はＳＯＸ１７陽性ＰＥ様細胞を示す（ｎ＝２）。ｏ、ＩＣＭ様区画を有するＣＤＸ２、ＯＣＴ４及びＧＡＴＡ６に関して染色したｉＢｌａｓｔｏｉｄ－拡大表示は低ＣＤＸ２及びＧＡＴＡ６陽性ＰＥ様細胞を示す（ｎ＝２）。ｎ～ｏのスケールバー＝１０μｍ。ｐ～ｑ、ＥＰＩ様及びＴＥ様細胞を有するＦ－アクチン及びＮＡＮＯＧに関して染色したｉＢｌａｓｔｏｉｄの代表的な画像、拡大表示（ｑ）その形態学的差異を強調する（ｎ＝２）。ｒ、（ｐ）のｉＢｌａｓｔｏｉｄのＦ－アクチン（明るい青色）及びＮＡＮＯＧ（オレンジ色）に基づく３次元セグメンテーション。ｐ～ｒのスケールバー＝ｉＢｌａｓｔｏｉｄ全体について１０μｍ、ＩＣＭ拡大表示について２μｍ。ｓ、Ｆ－アクチン、ＯＣＴ４及びＫＲＴ８共染色、ｎ＝２。

【図2】ｉＢｌａｓｔｏｉｄの作成及び特徴付け。ａ、２１日目再プログラム化中間体のｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ解析、ＥＰＩ、ＴＥ及びＰＥ様集団の存在を示している。ｂ、ｉＢｌａｓｔｏｉｄ形成の経時的位相差画像変化（ｎ＝５）。スケールバー、１００μｍ。ｃ、空洞形成のあるｉＢｌａｓｔｏｉｄの定量化（ｎ＝１００）。スケールバー、２０μｍ。ｄ、線維芽細胞培地で古典的線維芽細胞形態を伴い増殖したものである、ｉＢｌａｓｔｏｉｄの形成中にマイクロウェルの縁部に接着した不応性ＨＤＦａの代表的な位相差画像（ｎ＝２）。スケールバー、１００μｍ。ｅ、ＣＤＸ２及びＮＡＮＯＧに関して染色したｉＢｌａｓｔｏｉｄの３次元及び２次元表現（ｎ＝５）。スケールバー、２０μｍ。ｆ、ＧＡＴＡ２、ＮＡＮＯＧ及びＳＯＸ１７に関して染色したｉＢｌａｓｔｏｉｄ（ｎ＝２）。ｇ、ＣＤＸ２、ＯＣＴ４及びＧＡＴＡ６に関して染色したｉＢｌａｓｔｏｉｄ（ｎ＝２）。ｆ～ｇのスケールバー、２０μｍ。ｈ、２１日目再プログラム化細胞における種々の既存の細胞集団の定量化；ｎ＝３。ｉ、ｉＢｌａｓｔｏｉｄのスコア化に用いた判定基準。ｊ、スコア判定に含めたｉＢｌａｓｔｏｉｄの位相差画像、ｎ＝２４。スケールバー、１００μｍ。ｋ、（ｉ）における（ｈ）によるｉＢｌａｓｔｏｉｄについてのＩＣＭ及びＴＥの平均評点、ｎ＝２４。

【図3】ｉＢｌａｓｔｏｉｄの単一細胞トランスクリプトームプロファイリング。ａ、ｉＢｌａｓｔｏｉｄを使用したｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ実験の実験計画。ｂ、ｉＢｌａｓｔｏｉｄ ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑライブラリからの６８５８個の細胞についてのＥＰＩマーカー（ＰＯＵ５Ｆ１及びＮＡＮＯＧ）、ＴＥマーカー（ＣＤＸ２及びＧＡＴＡ２）及びＰＥマーカー（ＳＯＸ１７及びＧＡＴＡ６）の発現。ｃ、ｉＢｌａｓｔｏｉｄ ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑデータセットのＵＭＡＰでのＥＰＩ、ＴＥ及びＥＰＩシグネチャについての１細胞当たり発現スコア。ｄ、ｉＢｌａｓｔｏｉｄデータセットの教師なしクラスタリングと割り当てたクラスター名。ｅ、ｉＢｌａｓｔｏｉｄ ＥＰＩ、ＴＥ及びＰＥ細胞を胚盤胞からのＥＰＩ、ＴＥ及びＰＥ細胞（Ｂｌａｋｅｌｅｙ及びＰｅｔｒｏｐｏｕｌｏｓ）と共に示す統合データセットのＵＭＡＰ投影。ｆ、統合データセットのＥＰＩ、ＴＥ及びＰＥシグネチャの１細胞当たり発現スコア。ｇ、統合データセットの教師なしクラスタリングと割り当てたクラスター名。ｈ、統合解析前のそれぞれの元の細胞ＩＤによるｉＢｌａｓｔｏｉｄ及びヒト胚盤胞データセット（Ｂｌａｋｅｌｅｙ及びＰｅｔｒｏｐｏｕｌｏｓ）についての各統合クラスター内での細胞の比率。ｉ、ｉＢｌａｓｔｏｉｄ ＥＰＩ、ＴＥ及びＰＥクラスターと胚盤胞からのアノテーション付きＥＰＩ、ＴＥ及びＰＥクラスター（Ｂｌａｋｅｌｅｙ及びＰｅｔｒｏｐｏｕｌｏｓ）とのピアソン相関分析。ｊ、ｋ、ｉＢｌａｓｔｏｉｄ ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ ＴＥクラスターでの定義された壁ＴＥ及び極ＴＥシグネチャの１細胞当たり発現スコア。ｌ、ＵＭＡＰ成分１に沿った壁ＴＥ及び極ＴＥシグネチャのビニング後サブタイプスコア。ｍ、ＣＣＲ７に関するｉＢｌａｓｔｏｉｄの免疫染色、ｎ＝４。スケールバー、２０μｍ。ｎ、ｉＢｌａｓｔｏｉｄの極ＴＥ及び壁ＴＥのＣＣＲ７蛍光強度、ｎ＝４。各箱内の線は中央値を表し、髭は、それぞれ最大値及び最小値を表す。

【図4】ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑパイプライン及びクオリティコントロール。ａ、ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ解析戦略（詳細については「方法」を参照されたい）。ｂ、ｉＢｌａｓｔｏｉｄについてのドナー細胞分布のＵＭＡＰ表現。ｃ、ｉＢｌａｓｔｏｉｄ ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑライブラリについての細胞周期のＵＭＡＰ表現。ｄ、ｉＢｌａｓｔｏｉｄにおけるセンダイ－ＫＬＦ４、センダイ－ＫＯＳ及びセンダイ－ＭＹＣの発現。ｅ、Ｐｅｔｒｏｐｏｕｌｏｓ ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑライブラリ（Ｐｅｔｒｏｐｏｕｌｏｓ）についてのＥＰＩマーカー（ＰＯＵ５Ｆ１及びＮＡＮＯＧ）、ＴＥマーカー（ＣＤＸ２及びＧＡＴＡ２）及びＰＥマーカー（ＳＯＸ１７及びＧＡＴＡ６）の発現。ｆ、ｇ、ｉＢｌａｓｔｏｉｄデータセットのＵＭＡＰでの非再プログラム化シグネチャの発現及びＩＦＩ２７発現。

【図5】胚盤胞及びｉＢｌａｓｔｏｉｄに関する定義されたＥ５～７ ＥＰＩ、ＴＥ及びＰＥシグネチャのスコア化。ａ、Ｐｅｔｒｏｐｏｕｌｏｓ ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑデータセット（Ｐｅｔｒｏｐｏｕｌｏｓ）上での発生日齢Ｅ５、Ｅ６及びＥ７についての定義されたＥＰＩ、ＴＥ及びＰＥシグネチャ。ｂ、ｉＢｌａｓｔｏｉｄ ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑデータセット上での発生日齢Ｅ５、Ｅ６及びＥ７についての定義されたＥＰＩ、ＴＥ及びＰＥシグネチャ。

【図6】ｉＢｌａｓｔｏｉｄ及び胚盤胞データセットのｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ解析。ａ、割り当てた全てのクラスターで見た各ドナーの細胞比率。ｂ、ｉＢｌａｓｔｏｉｄ ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑデータセットにおける割り当てた各クラスターの遺伝子発現プロファイルを示すヒートマップ（それぞれ上位１０遺伝子）。ｃ、統合データセットにおけるｉＢｌａｓｔｏｉｄ及び胚盤胞（Ｂｌａｋｅｌｅｙ及びＰｅｔｒｏｐｏｕｌｏｓ）の細胞分布を示すＵＭＡＰ投影。ｄ、ｉＢｌａｓｔｏｉｄ及びＥ５～７胚盤胞（Ｂｌａｋｅｌｅｙ及びＰｅｔｒｏｐｏｕｌｏｓ）の統合データセットについてのＥＰＩマーカー（ＰＯＵ５Ｆ１及びＮＡＮＯＧ）、ＴＥマーカー（ＣＤＸ２及びＧＡＴＡ２）及びＰＥマーカー（ＳＯＸ１７及びＧＡＴＡ６）の発現。ｅ、ｉＢｌａｓｔｏｉｄ ＥＰＩ、ＴＥ及びＰＥクラスターと胚盤胞からのアノテーション付きＥＰＩ、ＴＥ及びＰＥクラスター（Ｂｌａｋｅｌｅｙ及びＰｅｔｒｏｐｏｕｌｏｓ）とのピアソン相関分析。

【図7】ｉＢｌａｓｔｏｉｄを使用したヒトインビトロ着床のモデル化。ａ、付着１、３及び４．５日目のｉＢｌａｓｔｏｉｄの代表的な位相差画像（ｎ＝５）。スケールバー、１００μｍ、ｂ、ＧＡＴＡ２、ＮＡＮＯＧ及びＳＯＸ１７共染色、ｎ＝２。ｃ、ＣＤＸ２、ＯＣＴ４及びＧＡＴＡ６共染色、ｎ＝２。ｄ、Ｆ－アクチン、ＯＣＴ４及びａＰＫＣ共染色、原始羊膜腔様の空洞を矢印で指示する、ｎ＝２。ｅ、ＫＲＴ７及びＮＡＮＯＧ共染色、ｎ＝４。ｆ、Ｆ－アクチン及びＮＡＮＯＧ共染色、胚盤葉上層様細胞及び推定ＳＴ及びＥＶＴを指示する、ｎ＝２。ｇ、ＭＭＰ２及びｈＣＧ共染色、ｎ＝２。スケールバー、５０μｍ；拡大表示については１０μｍ。ｈ、付着したｉＢｌａｓｔｏｉｄにおけるＳＴ及びＥＶＴマーカーのｑＲＴ－ＰＣＲ解析、平均値±ｓ．ｅ．ｍ、ｎ＝５。ｉ、付着したｉＢｌａｓｔｏｉｄから回収した馴化培地を使用してｈＣＧ ＥＬＩＳＡにより検出したｈＣＧタンパク質レベル、平均値±ｓ．ｅ．ｍ、ｎ＝４。

【図8】付着したｉＢｌａｓｔｏｉｄにおける胚盤葉上層発生の判定。ａ、ｉＢｌａｓｔｏｉｄインビトロ付着アッセイについての実験計画の概略図。ｂ、付着アッセイ５日目までのｉＢｌａｓｔｏｉｄにおける原始線条マーカー（ＴＢＸＴ、エオメス及びＭＩＸＬ１）の経時的ｑＲＴ－ＰＣＲ解析。ＴＢＸＴ、エオメス及びＭＩＸＬ１の陽性対照は、既発表の中胚葉分化プロトコル（Ｌａｍ ｅｔ ａｌ．，２０１４，Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｎｅｐｈｒｏｌ）を用いて作成した（ｎ＝６） ｃ、ＣＤＸ２及びＮＡＮＯＧに関して染色した付着したｉＢｌａｓｔｏｉｄ（ｎ＝５）。ｄ、ＧＡＴＡ２、ＯＣＴ４及びＳＯＸ２に関して染色した付着したｉＢｌａｓｔｏｉｄ（ｎ＝３）。ｅ、ＮＡＮＯＧ及びＳＯＸ１７に関して染色した付着したｉＢｌａｓｔｏｉｄの拡大表示像（ｎ＝２）。ｆ、ＯＣＴ４及びＧＡＴＡ６に関して染色した付着したｉＢｌａｓｔｏｉｄの拡大表示像（ｎ＝２）。ｃ～ｆのスケールバー、１００μｍ。ｇ、Ｆ－アクチン、ＯＣＴ４及びａＰＫＣで染色した付着したｉＢｌａｓｔｏｉｄのＺ－切片系列、拡大表示像は原始羊膜腔の空洞、ｎ＝２。スケールバー、２０μｍ。ｈ、Ｆ－アクチン、ＯＣＴ４及びａＰＫＣに関するｉＢｌａｓｔｏｉｄ、１日目の付着したｉＢｌａｓｔｏｉｄ及び３日目の付着したｉＢｌａｓｔｏｉｄの免疫染色、ｎ＝２。スケールバー、２０μｍ。原始羊膜腔様の空洞の外観に矢印で印を付ける。ｉ、ＫＲＴ７及びＮＡＮＯＧに関するｉＢｌａｓｔｏｉｄ及び付着したｉＢｌａｓｔｏｉｄの免疫染色、ｎ＝４。ｊ、Ｆ－アクチン及びＮＡＮＯＧに関して染色した付着したｉＢｌａｓｔｏｉｄ、ｎ＝２。ｋ、ＭＭＰ２及びｈＣＧに関するｉＢｌａｓｔｏｉｄ及び付着したｉＢｌａｓｔｏｉｄの免疫染色、ｎ＝２。

【図9】（ａ）ＧＦＰレポーターを含むナイーブ型ｉＰＳＣ。スケールバー：１００μｍ．（ｂ）：ｍＣｈｅｒｒｙレポーターを含むｉＴＳＣ。スケールバー：１００μｍ．（ｃ）：ナイーブ型ｉＰＳＣ及びｉＴＳＣの集合体。スケールバー：２０μｍ．（ｄ）：ナイーブ型ｉＰＳＣのみの集合体。スケールバー：２０μｍ。（ｅ）：ｉＴＳＣのみの集合体。スケールバー：２０μｍ。（ｆ）：多能性マーカーＯＣＴ４及びＴＳＣマーカーＫＲＴ７を使用したナイーブ型ｉＰＳＣ及びｉＴＳＣ、ナイーブ型ｉＰＳＣのみ及びｉＴＳＣのみの集合構造体の免疫染色。スケールバー：２０μｍ．（ｇ）：多能性マーカーＮＡＮＯＧ及びＴＳＣマーカーＣＤＸ２を使用したナイーブ型ｉＰＳＣのみの集合構造体の免疫染色。スケールバー：２０μｍ。

【図10】付着したｉＢｌａｓｔｏｉｄの特徴付け。付着したｉＢｌａｓｔｏｉｄにおけるＳＴマーカー（ＳＤＣ１、ＨＳＤ３Ｂ１）及びＥＶＴマーカー（ＩＴＧＡ５、ＦＮ１）のｑＲＴ－ＰＣＲ解析、平均値±ｓ．ｅ．ｍ、ｎ＝５。

【図11】他の培養条件での再プログラム化時のＥＰＩ、ＴＥ及びＰＥ様細胞の比率の判定。８日目再プログラム化中間体をａ）ＮＡＣＬ培地及びｂ）ＰＡ培地及びｃ）ｔ２ｉＬＧｏ培地に移し、再プログラム化２１日目のＥＰＩ、ＴＥ及びＰＥ様細胞の比率について判定した。マーカーとしてＴＥ様細胞にＧＡＴＡ３、ＰＥ様細胞にＧＡＴＡ６及びＥＰＩ様細胞にＫＬＦ１７を選定した。スケールバー、１００μｍ。

【図12】ｍＲＮＡ媒介性の再プログラム化でヒト線維芽細胞から作成された２１日目再プログラム化細胞。ａ、ヒト線維芽細胞の４×ＯＫＳＭＮＬ ｍＲＮＡトランスフェクションから作成された２１日目再プログラム化細胞に関するＯＣＴ４、ＧＡＴＡ６及びＣＤＸ２の免疫染色分析。ｂ、ヒト線維芽細胞の４×ＯＫＳＭＮＬ ｍＲＮＡトランスフェクションから作成された２１日目再プログラム化細胞に関するＧＡＴＡ２、ＮＡＮＯＧ及びＳＯＸ１７の免疫染色分析。ｃ、ヒト線維芽細胞の６×ＯＫＳＭＮＬ ｍＲＮＡトランスフェクションから作成された２１日目再プログラム化細胞に関するＯＣＴ４、ＧＡＴＡ６及びＣＤＸ２の免疫染色分析。ｄ、ヒト線維芽細胞の６×ＯＫＳＭＮＬ ｍＲＮＡトランスフェクションから作成された２１日目再プログラム化細胞に関するＧＡＴＡ２、ＮＡＮＯＧ及びＳＯＸ１７の免疫染色分析。

【図13】センダイウイルス媒介性の再プログラム化でヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）から作成された２１日目再プログラム化細胞。ａ、ｈＭＳＣから作成された２１日目再プログラム化細胞に関するＯＣＴ４、ＧＡＴＡ６及びＣＤＸ２の免疫染色分析。ｂ、ｈＭＳＣから作成された２１日目再プログラム化細胞に関するＧＡＴＡ２、ＮＡＮＯＧ及びＳＯＸ１７の免疫染色分析。

【図14】センダイウイルス媒介性の再プログラム化でヒト末梢血単核球（ｈＰＢＭＣ）から作成された１８日目及び２１日目再プログラム化細胞。ａ、ＳｔｅｍＰｒｏ３４培地でｈＰＢＭＣから作成された１８日目再プログラム化細胞に関するＯＣＴ４、ＧＡＴＡ６及びＣＤＸ２の免疫染色分析。ｂ、ＳｔｅｍＰｒｏ３４培地でｈＰＢＭＣから作成された２１日目再プログラム化細胞に関するＯＣＴ４、ＧＡＴＡ６及びＣＤＸ２の免疫染色分析。ｃ、１０％ＦＢＳを補足したＳｔｅｍＰｒｏ３４培地でｈＰＢＭＣから作成された１８日目再プログラム化細胞に関するＯＣＴ４、ＧＡＴＡ６及びＣＤＸ２の免疫染色分析。ｄ、１０％ＦＢＳを補足したＳｔｅｍＰｒｏ３４培地でｈＰＢＭＣから作成された１８日目再プログラム化細胞に関するＧＡＴＡ２、ＮＡＮＯＧ及びＳＯＸ１７の免疫染色分析。ｅ、１０％ＦＢＳを補足したＳｔｅｍＰｒｏ３４培地でｈＰＢＭＣから作成された２１日目再プログラム化細胞に関するＯＣＴ４、ＧＡＴＡ６及びＣＤＸ２の免疫染色分析。ｆ、１０％ＦＢＳを補足したＳｔｅｍＰｒｏ３４培地でｈＰＢＭＣから作成された２１日目再プログラム化細胞に関するＧＡＴＡ２、ＮＡＮＯＧ及びＳＯＸ１７の免疫染色分析。

【発明を実施するための形態】

【0083】

ここで、本発明の特定の実施形態が詳細に参照される。本発明は、実施形態と併せて説明されるが、その意図は、本発明をそれらの実施形態に限定することではないと理解されるであろう。むしろ逆に、本発明は、特許請求の範囲により定義されるとおりの本発明の範囲内に含まれ得る全ての代替形態、変形形態及び均等物を網羅することが意図される。

【0084】

当業者は、本発明の実施に使用し得るような、本明細書に記載されるものと同様の又は均等な多くの方法及び材料を認識するであろう。本発明は、記載されるそれらの方法及び材料に決して限定されない。本明細書に開示及び定義される本発明が、言及されているか又は本明細書若しくは図面から明らかな個別の特徴の２つ以上のあらゆる代替的な組み合わせに及ぶことが理解されるであろう。それらの異なる組み合わせは、全て本発明の様々な代替的態様を成す。

【0085】

本明細書を解釈する目的上、単数形で使用される用語には複数形も含まれ、逆も同様であるものとする。

【0086】

本発明者らは、ヒト胚盤胞の形態、空間的相互作用及び分子組成を忠実に再現するヒト多層細胞構造体又は胚盤胞様構造体（以下ではｉＢｌａｓｔｏｉｄとも称する）にヒト体細胞（例えば、線維芽細胞）を直接再プログラム化することができるという予期せぬ発見から導き出される新規培養方法を開発した。更に、ｉＢｌａｓｔｏｉｄは、ヒト胚付着培養を用いたインビトロ付着アッセイにより検証されるとおり、初期ヒト胚発生の多くの側面を模倣することができる。従って、本発明者らが初めてヒトｉＢｌａｓｔｏｉｄの作成を報告し、これは、初期ヒト胚発生中に起こる複雑な細胞及び分子の相互作用をモデル化して調べるための、ユニークな、実験的に扱い易いシステムに相当する。

【0087】

細胞
本発明の方法は、再プログラム化された体細胞の使用を含み、細胞は、胚盤葉上層（ＥＰＩ）、栄養外胚葉（ＴＥ）及び原始内胚葉（ＰＥ）転写シグネチャを呈するため、胚盤胞に似た多層細胞構造体を作成する。本明細書に更に記載するとおり、特定の態様において、本発明の方法には、再プログラム化する前且つ胚盤葉上層（ＥＰＩ）、栄養外胚葉（ＴＥ）及び原始内胚葉（ＰＥ）転写シグネチャを呈する再プログラム化された体細胞を入手する前に体細胞から開始する手法が含まれ得ることが理解されるであろう。そのような場合、本方法には、本明細書に更に記載される方法に従い、体細胞の再プログラム化を開始する最初のステップが必要となり得る。代替的な態様において、本発明の方法は、再プログラム化中間体（例えば、多能性状態に向けた再プログラム化を促進する条件で培養されたが、完全な多能性状態に向けた再プログラム化は、完了していても又は完了していなくてもよく、そのため、再プログラム化中間体と称される）から始めることを含み得る。

【0088】

体細胞は、健常体細胞又は罹患細胞であり得るか、又は健常な個体又は１つ以上の医学的病態若しくは疾患を有する若しくは有する疑いがある個体に由来し得る。体細胞は、死亡した個体からのものでもあり得る。体細胞は、成熟細胞又は成熟若しくは非胚性細胞の１つ以上の検出可能な特徴を示す成体由来の細胞であり得る。罹患体細胞は、疾患又は病態の１つ以上の検出可能な特徴を示す細胞であり得る。

【0089】

本発明における使用のための体細胞は、ｉＰＳＣ又は他の胚性若しくは成体幹細胞に由来し得るか、又は対象からの組織外植片に由来し得る。詳細な例では、本発明における使用のための体細胞は、脱分化状態又は多能性状態に向けて再プログラム化するための因子をコードする誘導性発現カセットを含み、ｉＰＳＣ又は他の胚性若しくは成体幹細胞から分化させて、次に発現カセットの発現の誘導を通じて脱分化させる。

【0090】

体細胞の集団は、好ましくは、均一な細胞集団を含むことになる（即ち線維芽細胞の均一集団又はケラチノサイトの均一集団等、同じ種類の体細胞の集団、ここで、この細胞集団は、別の細胞型の体細胞を含まない）。かかる均一細胞集団を入手するためには、均一細胞集団が入手されるように、細胞の集団（例えば、個体から入手されるもの）を培養及びその他の、細胞の異種集団から目的の体細胞を単離するために必要なステップに供する必要があり得ることが理解されるであろう。

【0091】

特定の実施形態において、胚盤葉上層（ＥＰＩ）、栄養外胚葉（ＴＥ）及び原始内胚葉（ＰＥ）転写シグネチャを呈する細胞に再プログラム化するために使用される体細胞の集団は、胚性幹細胞を含まず、好ましくは増量した（又は増大した）多能性幹細胞を含まない。

【0092】

好ましい実施形態において、体細胞は、線維芽細胞（好ましくは皮膚線維芽細胞）、ケラチノサイト（好ましくは表皮角化細胞）、単球又は内皮細胞又は間葉系幹細胞である。好ましくは、本発明の方法における使用のための体細胞は、線維芽細胞のみを含む。代わりに、本発明の方法における使用のための体細胞は、好ましくはヒトの、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）であり得る。代わりに、本発明の方法における使用のための体細胞は、好ましくはヒトの、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）であり得る。体細胞に特徴的な形態学的及び遺伝子発現マーカーは、当業者に公知であろう。結果的に、本発明の方法の経過中に体細胞に特徴的なマーカーの減少に関して試験し、且つそれを観察することは、当業者の範囲内にあることになる。特定の例では、体細胞が皮膚線維芽細胞である場合、形態学的特徴としては、扁平な間葉形態が挙げられ、マーカーとしては、ＣＤ１３（ＡＮＰＥＰ）、ＣＤ４４、ＴＷＩＳＴ１及びＺＥＢ１が挙げられる。

【0093】

ケラチノサイトマーカーとしては、ケラチン１、ケラチン１４及びインボルクリンが挙げられ、細胞形態は敷石状外観である。内皮細胞マーカーとしては、ＣＤ３１（Ｐｅ－ＣＡＭ）、ＶＥ－カドヘリン及びＶＥＧＦＲ２が挙げられ、細胞形態は毛細血管様構造体であり得る。上皮細胞のマーカーとしては、サイトケラチン１５（ＣＫ１５）、サイトケラチン３（ＣＫ３）、インボルクリン及びコネキシン４が挙げられる。好ましくは、観察される形態は敷石状外観である。造血幹細胞のマーカーは、ＣＤ４５（汎造血マーカー）、ＣＤ１９／２０（Ｂ細胞マーカー）、ＣＤ１４／１５（骨髄）、ＣＤ３４（前駆体／ＳＣマーカー）、ＣＤ９０（ＳＣ）を含み得る。間葉系幹細胞のマーカーは、ＣＤ１３、ＣＤ２９、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１０、ＣＤ４５を含む。

【0094】

本明細書で使用されるとき、用語「幹細胞」は、最終分化していない細胞を指し、即ち、これは、より詳細化した特殊な機能を有する他の細胞型への分化能を有する。この用語は、胚性幹細胞、胎生幹細胞、成体幹細胞又は委任細胞／前駆細胞を包含する。

【0095】

本明細書で使用されるとき、「体細胞」は、最終分化した細胞を指す。本明細書で使用されるとき、用語「体細胞」は、生殖系列細胞とは対照的に、生物の体を形成する任意の細胞を指す。哺乳類では、生殖系列細胞（「配偶子」としても知られる）とは、受精時に融合して、接合子と呼ばれる、哺乳類胚全体が発生する元となる細胞を生み出す精子及び卵子のことである。哺乳類の体にある他の全ての細胞型は、－ 精子及び卵子、それらが作り出される元となる細胞（ガメトサイト）及び未分化の幹細胞を別として －、体細胞である：内臓器官、皮膚、骨、血液及び結合組織は、全て体細胞でできている。一部の実施形態において、体細胞は「非胚性体細胞」であり、これは、胚に存在しないか又は胚から入手されるのでない体細胞であって、且つかかる細胞のインビトロ増殖によって得られるのでない体細胞を意味する。一部の実施形態において、体細胞は「成体体細胞」であり、これは、胚若しくは胎児以外の生物に存在するか若しくはそうした生物から入手される細胞又はかかる細胞のインビトロ増殖により得られる細胞を意味する。体細胞は、例えば、テロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）のレベルを増加させることにより、細胞の無限の供給を提供するように不死化され得る。例えば、ＴＥＲＴレベルは、内因性遺伝子からのＴＥＲＴの転写を増加させることによるか、又は任意の遺伝子デリバリー方法若しくはシステムを通じてトランス遺伝子を導入することにより増加させることができる。

【0096】

分化した体細胞は、胎児、新生児、若齢又は成体の、ヒトを含めた霊長類個体からの細胞を含め、本発明の方法における使用に好適な体細胞である。好適な体細胞としては、限定はされないが、骨髄細胞、上皮細胞、内皮細胞、線維芽細胞、末梢血単核球、造血細胞、ケラチノサイト、肝細胞、腸細胞、間葉細胞、骨髄前駆細胞及び脾臓細胞が挙げられる。代わりに、体細胞は、血液幹細胞、筋肉／骨幹細胞、脳幹細胞及び肝幹細胞を含め、それ自体が増殖し、他の細胞型に分化することのできる細胞であり得る。好適な体細胞は、転写因子をコードする遺伝子材料を含め、転写因子を取り込むだけの受容性があるか、又は科学文献中で概して公知の方法を用いて受容性にすることができる。取込みを増強させる方法は、細胞の種類及び発現システムに応じて異なり得る。好適な形質導入効率を有する受容性のある体細胞を調製するために用いられる例示的条件は、当業者に周知である。出発体細胞は、約２４時間の倍加時間を有し得る。

【0097】

用語「単離された細胞」は、本明細書で使用されるとき、それが当初見られた生物から取り出されている細胞又はかかる細胞の子孫を指す。任意選択で、細胞は、例えば他の細胞の存在下でインビトロ培養されている。任意選択で、細胞は、後に第２の生物に導入されるか、又はそれ（又はそれからの子孫となった細胞）が単離された元の生物に再び導入される。

【0098】

多層細胞構造体又は胚盤胞様構造体
本発明は、多層細胞構造体又は胚盤胞様構造体又はそれを含む組成物を提供する。好ましくは、多層細胞構造体は、本明細書に記載されるとおりの任意の方法によって入手されるか又は入手可能である。かかる多層細胞構造体又は胚盤胞様構造体は、インビトロ由来の又はインビトロで作成されたブラストイド若しくは胚盤胞様構造体又は「ｉＢｌａｓｔｏｉｄ」とも称され得る。

【0099】

本発明の多層細胞構造体又は胚盤胞様構造体は、以下に更に記載するものなど、幾つもの構造的及び機能的特質によって特徴付け得ることが理解されるであろう。重要なことに且つ以下に詳述するとおり、本発明の構造体は、Ｅ５～７のヒト胚盤胞の主要な形態学的特質を呈するが、本構造体は、自然発生の胚盤胞に存在するが、本発明の構造体には存在しない透明帯の欠如など、自然発生のヒト胚盤胞とは異なる特質によっても特徴付けられる。このように、本発明のインビトロ由来の又はインビトロで作成された胚盤胞構造体は、自然発生の胚盤胞とは明確に区別され得る。

【0100】

任意の態様において、多層細胞構造体又は胚盤胞様構造体は、内細胞層と外細胞層とを含み、内細胞層は、胚盤葉上層及び／又は原始内胚葉系統の細胞の１つ以上の特徴を呈する細胞を含み、及び外細胞層は、栄養外胚葉の細胞の１つ以上の特徴を呈する細胞を含む。好ましくは、特徴は、細胞形態、遺伝子発現プロファイル、活性アッセイ、タンパク質発現プロファイル、表面マーカープロファイル、分化能力又はこれらの組み合わせの分析によって決定し得る。特徴又はマーカーの例には、本明細書に記載されるもの及び当業者に公知のものが含まれる。多層細胞構造体又は胚盤胞様構造体は、空洞／胞胚腔を有しても又は有しなくてもよい。

【0101】

任意の態様において、内細胞層は、ＰＥの１つ以上の特徴を呈する細胞塊を更に含む。好ましくは、ＰＥの１つ以上の特徴を呈する細胞は、胚盤葉上層の細胞の１つ以上の特徴を呈する細胞の周辺にあるか又は主にその周辺にある。

【0102】

任意の態様において、内細胞層は、本質的に天然に形成された内部細胞塊のように挙動する内部細胞塊様組織である。

【0103】

任意の態様において、外細胞層は、本質的に天然に形成された栄養外胚葉のように挙動する栄養外胚葉様組織である。

【0104】

多層細胞構造体又は胚盤胞様構造体は、胞胚腔及び内部細胞塊様組織を取り囲む栄養外胚葉様組織を含む人工胚盤胞とも称され得る。

【0105】

任意の態様において、胚盤葉上層（ＥＰＩ）、栄養外胚葉（ＴＥ）及び／又は原始内胚葉（ＰＥ）系統の転写シグネチャを呈する細胞の集団は、好ましくは、胚盤葉上層（ＥＰＩ）、栄養外胚葉（ＴＥ）及び原始内胚葉（ＰＥ）系統の各々の転写シグネチャを呈する。

【0106】

任意の態様において、ＥＰＩ細胞の特徴は、マーカーＮＡＮＯＧ、ＯＣＴ４（別名ＰＯＵ５Ｆ１）又はＳＯＸ２のいずれか１つ以上の存在である。一実施形態において、多層細胞構造体又は胚盤胞様構造体のより多くの細胞は、ＮＡＮＯＧよりもＯＣＴ４を発現する。

【0107】

任意の態様において、ＥＰＩ細胞の特徴は、円柱状外観の形態である。

【0108】

任意の態様において、ＴＥ細胞の特徴は、マーカーＣＤＸ２及びＧＡＴＡ２の１つ以上の存在である。

【0109】

任意の態様において、ＴＥ細胞の特徴は、扁平な又は細長い上皮形態である。

【0110】

任意の態様において、ＰＥ細胞の特徴は、マーカーＳＯＸ１７又はＧＡＴＡ６の存在である。

【0111】

【表1】

【0112】

任意の態様において、多層細胞構造体又は胚盤胞様構造体は、ＯＣＴ４陽性細胞に隣接するＧＡＴＡ６陽性細胞（任意選択でＣＤＸ２低染色又は弱染色を伴う）を更に含み得る。

【0113】

任意の態様において、多層細胞構造体又は胚盤胞様構造体は、Ｅ５～７、好ましくはＥ６～７のヒト胚盤胞の主要な形態学的特質を呈する。Ｅ５～７及びＥ６～７のヒト胚盤胞の主要な形態学的特質は、当業者に公知である。かかる特質には、半径方向に位置する少なくとも２層を含み、且つ内細胞層（本明細書に定義されるとおり）及び外細胞層（本明細書に定義されるとおり）を透明帯及び胞胚腔と呼ばれる液体で満たされた空洞と共に含む、球形又はほぼ球形の層状細胞凝集体又は構造体が含まれ得る。胚盤胞は直径が約０．１～０．２ｍｍであり、典型的には約２００～３００細胞を含む。概して胚盤葉上層及び／又は原始内胚葉系統の細胞の１つ以上の特徴を呈する細胞は、凝集体又は構造体の内側に位置する単一の塊状で存在する一方、栄養外胚葉の細胞の１つ以上の特徴を呈する細胞は、外側に存在する。

【0114】

ヒト胚盤胞の更なる特徴及び特質については、例えば、Ｂｌａｋｅｌｅｙ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １４２，３６１３；Ｐｅｔｒｏｐｏｕｌｏｓ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｃｅｌｌ １６５，１０１２－１０２６；Ｓｈａｈｂａｚｉ，Ｍ．Ｎ．ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１８，７００－７０８；Ｘｉａｎｇ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．（２０２０）Ｎａｔｕｒｅ ５７７，５３７－５４２；Ｑｉｎ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．１４，２３０１－２３１２；Ｌｉｕ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．（２０１９）Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．１０，３６４；Ｄｕｒｒｕｔｈｙ－Ｄｕｒｒｕｔｈｙ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｄｅｖ．Ｃｅｌｌ ３８，１００－１１５；Ｆｏｇａｒｔｙ，Ｎ．Ｍ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｎａｔｕｒｅ ５５０，６７－７３に記載されている。

【0115】

更に、多層細胞構造体又は胚盤胞様構造体は、胚盤葉上層、原始内胚葉及び栄養外胚葉の細胞の１つ以上の特徴を呈する細胞も含み得、これらの細胞は、Ｅ５～７、好ましくはＥ６～７のヒト胚盤胞におけるそれぞれ胚盤葉上層、原始内胚葉及び栄養外胚葉細胞と同じ又は類似した相対的空間配置をとる。本明細書で使用されるとき、ヒト胚盤胞と比べて「同じ又は類似した相対的空間配置」とは、半径方向に位置する少なくとも２層を有し、且つ内細胞層（本明細書に定義されるとおり）と外細胞層（本明細書に定義されるとおり）とを含むことを意味すると解釈されるものとする。２層より多い細胞層があり得るが、概してその本質は、胚盤葉上層及び／又は原始内胚葉系統の細胞の１つ以上の特徴を呈する細胞が、凝集体又は構造体の内側に位置する単一の塊状で存在する一方、栄養外胚葉の細胞の１つ以上の特徴を呈するものは、外側に存在するというところにある。換言すれば、構造体における細胞の外層は、典型的にはＴＥの細胞である（また、ＣＤＸ２及びＧＡＴＡ２などのＴＥマーカーを発現する）一方、胚盤葉上層を指示するものである細胞（また、これは、ＮＡＮＯＧ及び４及びＳＯＸ２などのマーカーを発現する）は、構造体内のＩＣＭ様区画に見られる。

【0116】

任意の態様において、多層細胞構造体又は胚盤胞様構造体は、無細胞の空洞又は胞胚腔様の空洞も含む。多層細胞構造体又は胚盤胞様構造体は空洞化を起こし、それにより胞胚腔の形成を可能にし得る。胞胚腔様の空洞の形成後、内部細胞塊様組織が内部空洞の１つの位置に位置取り得る一方、空洞の残りの部分は液体で満たされる。

【0117】

本発明の方法によって作製される多層細胞構造体又は胚盤胞様構造体は、概して、本発明の構造体が透明帯を形成しないか又はそれを含まない点において、自然発生するヒト胚盤胞と異なる。

【0118】

本明細書で使用されるとき、用語「透明帯」は、哺乳類卵母細胞の細胞膜を取り囲む糖タンパク質層を指す。卵母細胞の受精後も透明帯はインタクトなまま残り、従って天然に存在する胚盤胞は透明帯を受精後約５日まで含み、その際、胚盤胞は、着床の一環として透明帯が退化及び分解するいわゆる「透明帯孵化」を果たす。

【0119】

本発明の構造体は、ＰＥ及びＴＥの両方、ＰＥ及びＥＰＩの両方、ＴＥ及びＥＰＩの両方又はＰＥ、ＴＥ及びＥＰＩの組み合わせに特徴的な遺伝子を細胞が発現するなど、典型的には混合型遺伝子発現プロファイルである、胚盤胞の細胞に見られない遺伝子シグネチャ全般を有する細胞が構造体に含まれ得る点において、天然に存在する胚盤胞から分化させることもできる。換言すれば、本発明の構造体中の一部の細胞は、２つ以上の系統に特徴的な混合型転写シグネチャを有し得る。換言すれば、１つ以上の個別の細胞が、２つ以上の系統に特徴的な混合型転写シグネチャを有し得る。各系統に関連する転写シグネチャは、更に本明細書に、例えば上記の［１１７］～［１２２］及び表１に記載されている。

【0120】

任意の態様において、多層細胞構造体又は胚盤胞様構造体は、受精後胚齢５～７日目（Ｅ５～７）のヒト胚盤胞の既発表の測定値と同等のサイズのｘ軸及びｙ軸直径、ｘ：ｙアスペクト比並びに／又は投影面積を有する。例えば、多層細胞構造体又は胚盤胞様構造体のｘ軸及び／又はｙ軸直径は、約１００～約３００μｍである。好ましくは、ｘ／ｙ軸比は、約１である。多層細胞構造体又は胚盤胞様構造体の投影面積は、約５，０００～約１０，０００μｍ^２、約１０，０００～約４０，０００μｍ^２、約４０，０００～約６０，０００μｍ^２、好ましくは約２０，０００～約４０，０００μｍ^２である。

【0121】

本明細書で使用されるとき、Ｅ５～７のヒト胚盤胞の既発表の測定値と「同等の」ｘ軸及びｙ軸直径又はｘ：ｙアスペクト比は、既発表の測定値の約５０％～２００％、好ましくは、既発表の測定値の少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約１００％、少なくとも約１１０％、少なくとも約１２００％、少なくとも約１２０％、少なくとも約１３０％、少なくとも約１４０％、少なくとも約１５０％、少なくとも約１６０％、少なくとも約１７０％、少なくとも約１８０％、少なくとも約１９０％又は少なくとも約２００％のｘ軸及びｙ軸直径又はｘ：ｙアスペクト比を含み得る。

【0122】

本明細書で使用されるとき、Ｅ５～７のヒト胚盤胞の既発表の測定値と「同等の」投影面積は、ヒト胚盤胞についての既発表の測定値の約５０％～２００％の投影面積を含み得る。好ましくは、同等の投影面積は、５，０００～約４０，０００μｍ^２の範囲にある値の少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約１００％、少なくとも約１１０％、少なくとも約１２００％、少なくとも約１２０％、少なくとも約１３０％、少なくとも約１４０％、少なくとも約１５０％、少なくとも約１６０％、少なくとも約１７０％、少なくとも約１８０％、少なくとも約１９０％又は少なくとも約２００％である面積を含む。換言すれば、同等の投影面積は、約５，０００～約１０，０００μｍ^２、約１０，０００～約４０，０００μｍ^２、約４０，０００μｍ^２～約６０，０００μｍ^２、好ましくは約２０，０００～約４０，０００μｍ^２の面積であり得る。

【0123】

本発明との関連において、多層細胞構造体又は胚盤胞様構造体は、半径方向に位置する少なくとも２層を含む層状細胞凝集体又は構造体である。好ましくは、これは、内細胞層（本明細書に定義されるとおり）と外細胞層（本明細書に定義されるとおり）とを含む球形又はほぼ球形の細胞凝集体又は構造体である。２層より多い細胞層があり得るが、概してその本質は、胚盤葉上層及び／又は原始内胚葉系統の細胞の１つ以上の特徴を呈する細胞が、凝集体又は構造体の内側に位置する単一の塊状で存在する一方、栄養外胚葉の細胞の１つ以上の特徴を呈する細胞は、外側に存在するというところにある。

【0124】

任意の態様において、多層細胞構造体又は胚盤胞様構造体は、約１００～４００個の総細胞を含む。

【0125】

好ましい実施形態において、本発明は、以下の特徴の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２又は１３個を有する、インビトロ由来の又はインビトロ作成した胚盤胞又はブラストイド構造体（即ち多層細胞構造体又は胚盤胞様構造体）を提供する：
・半径方向に位置する少なくとも２層を含み、且つ内細胞層と外層とを含んで透明帯がない球形又はほぼ球形の層状細胞凝集体又は構造体；
・胚盤葉上層（ＥＰＩ）の細胞の特徴の１つ以上を呈する細胞を含む内細胞層、ＥＰＩ細胞の特徴は、マーカーＮＡＮＯＧ、ＯＣＴ４（別名ＰＯＵ５Ｆ１）又はＳＯＸ２のいずれか１つ以上の存在及び円柱状の外観である；
・原始内胚葉（ＰＥ）系統の１つ以上の特徴を呈する細胞塊も含む内細胞層、ここで、ＰＥの１つ以上の特徴を呈する細胞は、胚盤葉上層の細胞の１つ以上の特徴を呈する細胞の周囲にあるか又は主にその周囲にある；ＰＥ細胞の特徴は、マーカーＳＯＸ１７又はＧＡＴＡ６の存在である。
・栄養外胚葉（ＴＥ）の細胞の１つ以上の特徴を呈する細胞を含む外細胞層、ＴＥ細胞の特徴は、マーカーＣＤＸ２及びＧＡＴＡ２の１つ以上の存在並びに扁平な又は細長い上皮形態である；
・約０．１～０．２ｍｍの直径；
・約１００～４００細胞；
・多層細胞構造体又は胚盤胞様構造体のより多くの細胞は、ＮＡＮＯＧよりもＯＣＴ４を発現する；
・ＯＣＴ４陽性細胞に隣接するＧＡＴＡ６陽性細胞（任意選択でＣＤＸ２低染色又は弱染色を伴う）；
・多層細胞構造体又は胚盤胞様構造体のｘ軸及び／又はｙ軸直径が、約１００～約３００μｍである；
・約１のｘ／ｙ軸比；
・約５，０００～約１０，０００μｍ^２、約１０，０００～約４０，０００μｍ^２、約４０，０００μｍ^２～約６０，０００μｍ^２、好ましくは約２０，０００～約４０，０００μｍ^２の投影面積；
・任意選択で、胞胚腔と呼ばれる液体で満たされた空洞；及び
・任意選択で、胚盤葉上層及び／又は原始内胚葉系統の細胞の１つ以上の特徴を呈する細胞は、凝集体又は構造体の内側に位置する単一の塊状で存在する一方、栄養外胚葉の細胞の１つ以上の特徴を呈する細胞は、外側に存在する。

【0126】

本発明の及び／又は本発明の方法に従い入手される多層細胞構造体又は胚盤胞様構造体は、典型的には、初期ヒト胚発生の多くの側面を模倣する特徴を呈する。特定の実施形態において、この構造体は、胚着床の研究に利用され得るインビトロ付着アッセイにおいて、ヒト胚の特徴を模倣する。例えば、ＩＶＣ１培地（本明細書に定義されるとおり）で１日間培養し、続いてＩＶＣ２培地（本明細書に定義されるとおり）で２日目から４．５日目まで培養したとき、多層細胞構造体又は胚盤胞様構造体は、
ｉ）サイズの増加、扁平化及び増殖体の形成に至るまでの進行；
ｊ）ＮＡＮＯＧ及びＯＣＴ４／ＳＯＸ２陽性細胞数の増加；
ｋ）ＣＤＸ２及びＧＡＴＡ２陽性細胞の広がり；
ｌ）ＮＡＮＯＧ又はＯＣＴ４陽性細胞の周囲にＳＯＸ１７及びＧＡＴＡ６陽性細胞が局在すること；
ｍ）外細胞層又はＴＥ細胞の少なくとも１つの特徴を呈する細胞におけるケラチンＫＲＴ７又は他の栄養膜細胞マーカーの発現；
ｎ）合胞体栄養膜細胞（ＳＴ）及び絨毛外栄養膜細胞（ＥＶＴ）に形態学的に似た細胞（例えば、それぞれＳＴ及びＥＶＴ様細胞）の存在、例えば多核性表現型及び紡錘様形態；
ｏ）ｈＣＧ（例示的ＳＴマーカー）及びＭＭＰ２（例示的ＥＶＴマーカー）を発現する細胞の存在；及び
ｐ）ＳＴマーカーＣＳＨ１及びＥＶＴマーカーＩＴＧＡ１の上方制御を呈する細胞の存在
の１つ以上を呈し得る。

【0127】

「増加させる」は、本明細書で使用されるとき、特定のマーカーに関して陽性の細胞のサイズの増加に関してであろうと、数の増加に関してであろうと、約５％より大きい変化を指すことが認識されるであろう。このように「増加」には、多層細胞又は胚盤胞様構造体のサイズの文脈では、（本明細書に記載されるなどのインビトロ付着アッセイにおいて培養される前の構造体のサイズと比較して、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも１５０％、少なくとも２００％、少なくとも２５０％、少なくとも３００％又はそれを超えるサイズの増加が含まれることが理解されるであろう。同様に、特定のマーカー（ＮＡＮＯＧ及びＯＣＴ４／ＳＯＸ２など）に関して陽性の細胞の数の「増加」とは、インビトロ付着アッセイで培養される前の構造体中のマーカー陽性細胞の数と比較して、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも１５０％、少なくとも２００％、少なくとも２５０％、少なくとも３００％又はそれを超える細胞の数の増加であり得る

【0128】

本発明の第１の態様において、多層細胞構造体又は胚盤胞様構造体は、胚盤葉上層（ＥＰＩ）、栄養外胚葉（ＴＥ）及び原始内胚葉（ＰＥ）転写シグネチャを呈する再プログラム化された体細胞（好ましくは再プログラム化されたヒト体細胞）の集団から入手されることが理解されるであろう。多層細胞構造体又は胚盤胞様構造体は、代わりに、ｉＰＳＣ及びｉＴＳＣ又はｉＰＳＣ及びｉＴＳＣの集団の集合によって作成され得る。例えば、多層細胞構造体を作製する方法は、
－ 凝集を可能にする条件下でｉＰＳＣ及びｉＴＳＣ細胞を培養して、多層細胞構造体を入手すること
を含み、それにより多層細胞構造体を作製する。

【0129】

代わりに、インビトロ由来の胚盤胞様構造体を作製する方法があり、この方法は、
－ 凝集を可能にする条件下でｉＰＳＣ及びｉＴＳＣ細胞を培養して胚盤胞様構造体を入手すること
を含み、それにより胚盤胞様構造体を作製する。

【0130】

ｉＰＳＣ及びｉＴＳＣの作成方法は、当技術分野で公知である。ｉＰＳＣの例示的作成方法については、例えば、Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，（２００７）Ｃｅｌｌ，１３１：８６１－８７２、国際公開第２０１７／２１９２３２号パンフレット、国際公開第２０１４／２００１１４号パンフレット、国際公開第２０１４／０６５４３５号パンフレット、国際公開第２０１９／０７３０５５号パンフレット、Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，（２０１７）Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１４：１０５５－１０６２（これらの内容は、全て全体として参照により本明細書に援用される）に記載されている。ｉＴＳＣの例示的作成方法については、Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，（２０２０）Ｎａｔｕｒｅ，５８６：１０１－１０７（この内容も参照により本明細書に援用される）に記載されている。

【0131】

一実施形態において、ｉＰＳＣ及びｉＴＳＣは、本明細書に記載される任意の培養ベッセル、例えば、２４ウェルＡｇｇｒｅＷｅｌｌ（商標）４００プレートにおいて共培養され得る。好ましくは、細胞は、細胞が、本明細書に記載されるとおりの胚盤胞様構造体の少なくとも１つの特徴を呈することを促進するための任意の培養培地（例えば、胚盤胞促進培地又はｉＢｌａｓｔｏｉｄ培地）で培養される。好ましくは、培養培地は、表３ａに示されるとおりのｉＢｌａｓｔｏｉｄ培地である。

【0132】

好ましくは、ｉＰＳＣ及びｉＴＳＣは、同じウェル内において、それぞれ１：２．５の比で、１ウェル当たり１．２×１０^５個の総細胞数として共培養される。

【0133】

別の態様において、本発明は、本明細書に記載されるとおりの任意の方法によって作製される多層細胞構造体又は胚盤胞様構造体も提供する。

【0134】

再プログラム化
当技術分野では、体細胞を脱分化状態又は多能性状態に向けて再プログラム化する様々な方法が公知である。体細胞の再プログラム化には、典型的には、再プログラム化因子（転写因子を含む）の発現と、続く分化マーカーの喪失及び多能性／可塑性マーカーの獲得を促進するための特定の条件での培養が関わる。

【0135】

本発明の方法によれば、体細胞は、ＥＰＩ、ＴＥ又はＰＥ系統の転写シグネチャを呈する細胞の集団を入手するため、多層細胞構造体又は胚盤胞様構造体の形成を促進するための培養条件に供される前に脱分化状態又は多能性状態に向けて再プログラム化される。このように、細胞の集団は、多層細胞構造体又は胚盤胞様構造体の形成を促進するための培養条件に供される時点で再プログラム化中間体を含むことが認識されるであろう。再プログラム化中間体は、ＥＰＩ、ＴＥ及び／又はＰＥ系統の転写シグネチャを呈する。好ましくは、中間体の集団は、ＥＰＩ、ＴＥ及びＰＥ系統の３つ全てについての転写シグネチャを呈する。

【0136】

本発明に従って作り出される再プログラム化中間体の集団は、本明細書の図２ｈに示されるとおり、マーカーＯＣＴ４、ＧＡＴＡ６及びＣＤＸ２に関して陽性又は陰性染色される異なる細胞集団の比率を参照することによっても特徴付けられ得る。

【0137】

任意の態様において、ＥＰＩ、ＴＥ又はＰＥ系統の転写シグネチャを呈する細胞の集団は、本明細書の表１に掲載されるマーカーの少なくとも１つを発現する細胞の集団を含む。

【0138】

好ましくは、ＥＰＩ系統の転写シグネチャは、本明細書の表１に掲載されるとおりのＥＰＩ系統のマーカーの少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０個若しくはそれを超えるもの又は全ての発現を含む。より好ましくは、ＴＥ系統の転写シグネチャは、本明細書の表１に掲載されるとおりのＴＥ系統のマーカーの少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０個若しくはそれを超えるもの又は全ての発現を含む。より好ましくは、ＰＥ系統の転写シグネチャは、本明細書の表１に掲載されるとおりのＰＥ系統のマーカーの少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０個若しくはそれを超えるもの又は全ての発現を含む。

【0139】

特に好ましい実施形態において、ＥＰＩ系統の転写シグネチャは、マーカー：ＡＲＧＦＸ、ＮＡＮＯＧ、ＧＤＦ３、ＳＵＳＤ２、ＤＰＰＡ５、ＰＯＵ５Ｆ１、ＵＴＦ１、ＴＤＧＦ１、ＰＤＬＩＭ１及びＵＳＰ２８のいずれか１、２、３、４、５、６、７、８又は９個又はその全ての発現を含む；ＴＥ系統の転写シグネチャは、マーカー：ＫＲＴ１８、ＫＲＴ８、ＮＯＤＡＬ、ＵＰＰ１、ＴＡＧＬＮ２、ＫＲＴ１９、ＳＬＣ７Ａ５、ＦＡＭ１０１Ｂ、ＣＤＸ２及びＧＡＴＡ２のいずれか１、２、３、４、５、６、７、８又は９個又はその全ての発現を含む；及びＰＥ系統の転写シグネチャは、マーカー：ＰＡＬＬＤ、ＦＳＴ、ＮＯＧ、ＣＬＤＮ１０、ＳＥＲＰＩＮＢ６、ＭＩＡＴ、ＣＨＳＴ２、ＶＳＮＬ１、ＭＴ１Ｘ、ＰＤＰＮ、ＳＯＸ１７及びＧＡＴＡ６のいずれか１、２、３、４、５、６、７、８又は９個又はその全ての発現である。

【0140】

体細胞の再プログラム化に好適な方法の例は、当技術分野に豊富にあり、国際公開第２００９／１０１４０７号パンフレット、国際公開第２０１４／２０００３０号パンフレット、国際公開第２０１５／０５６８０４号パンフレット、国際公開第２０１４／２００１１４号パンフレット、国際公開第２０１４／０６５４３５号パンフレット、国際公開第２０１３／１７６２３３号パンフレット、国際公開第２０１２／０６０４７３号パンフレット、国際公開第２０１２／０３６２９９号パンフレット、国際公開第２０１１／１５８９６７号パンフレット、国際公開第２０１１／０５５８５１号パンフレット、国際公開第２０１１／０３７２７０号パンフレット、国際公開第２０１１／０９０２２１号パンフレット（これらの内容は、参照により本明細書に援用される）に例示されている。典型的には、かかる方法は、細胞を多能性状態に向けて再プログラム化する能力を有する（又はそれを目的とする）１つ以上の因子又は薬剤の量を出発細胞型（又は供給源細胞）において増加させることを含む。

【0141】

特定の実施形態において、体細胞を再プログラム化するための又は体細胞を再プログラム化する能力を有する因子又は薬剤は、転写因子である。代わりに、その因子又は薬剤は、本明細書に更に記載するとおり、細胞中の１つ以上の転写因子のレベルを間接的に増加させる。本発明の方法に従う体細胞（例えば、線維芽細胞）の再プログラム化に使用し得る特に好ましい転写因子及びその核酸配列を表２に示す。本発明において、体細胞を再プログラム化するため、表２に掲載される転写因子の１つ以上、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上又は６つ全てが使用され得ることが理解されるであろう。しかしながら、本発明は、体細胞を再プログラム化するため表２に記載される転写因子を使用することに限定されない点が理解されるであろう。

【0142】

本明細書において言及される転写因子及び他のタンパク質因子は、ＨＵＧＯ遺伝子命名法委員会（ＨＧＮＣ）記号で言及される。表２は、本明細書に記載される転写因子の例示的Ｅｎｓｅｍｂｌｅ遺伝子ＩＤ及びＵｎｉｐｒｏｔ ＩＤを提供する。ヌクレオチド配列は、Ｅｎｓｅｍｂｌデータベース（Ｆｌｉｃｅｋ ｅｔ ａｌ．（２０１４）．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｖｏｌｕｍｅ ４２，Ｉｓｓｕｅ Ｄ１．Ｐｐ．Ｄ７４９－Ｄ７５５）バージョン８３に由来する。本明細書において言及される転写因子の任意の変異体、ホモログ、オルソログ又はパラログも本発明における使用が企図される。

【0143】

特定の実施形態では、単一の細胞型のみが、本発明の方法に従う再プログラム化に供される。換言すれば、好ましくは再プログラム化に供される細胞の集団は、均一な又は実質的に均一な細胞集団である。例えば好ましくは、細胞の集団は、線維芽細胞若しくはケラチノサイト又は本明細書に記載されるとおりの任意の他の体細胞型のみを含むか又は主に含む。このように、体細胞を多能性状態に向けて再プログラム化するのに好適な関連性のある因子を決定する際に考慮する必要があるのは、１つの出発細胞型のみであることが理解されるであろう。

【0144】

他の実施形態において、均一な細胞（ＰＢＭＣなど）の集団は、本明細書に記載される方法に従い再プログラム化し得る。

【0145】

当業者は、本発明の方法を実施するにおいて、例えば、体細胞における転写因子の量の増加をもたらす目的又は体細胞における転写因子の組換え発現のための核酸などを提供する目的のため、この情報を使用し得ることを認識するであろう。

【0146】

【表2】

【0147】

完全長ポリペプチドと少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％又は９９％同一のポリペプチドを指すことにおける用語「変異体」である。本発明は、本明細書に記載される転写因子の変異体の使用を企図する。変異体は、完全長ポリペプチドの断片又は天然に存在するスプライス変異体である可能性がある。変異体は、ポリペプチドの断片と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％又は９９％同一のポリペプチドである可能性があり、断片は、ある体細胞型から標的細胞型への変換を促進する能力など、目的の機能的活性を完全長野生型ポリペプチド又はそのドメインが有する限り、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％又は９９％である。一部の実施形態において、ドメインは、配列中の任意のアミノ酸位置から始まってＣ末端に向けて延びる、少なくとも１００、２００、３００又は４００アミノ酸長である。タンパク質の活性を消失させるか又は実質的に減少させるような当技術分野で公知の変異は、好ましくは回避される。一部の実施形態において、変異体は、完全長ポリペプチドのＮ末端及び／又はＣ末端部分を欠き、例えば、いずれかの末端から最大１０、２０又は５０アミノ酸を欠いている。一部の実施形態において、ポリペプチドは、成熟（完全長）ポリペプチドの配列を有し、成熟ポリペプチドとは、通常の細胞内タンパク質分解プロセシングの間に（例えば、同時翻訳又は翻訳後プロセシングの間に）シグナルペプチドなどの１つ以上の部分が取り除かれたポリペプチドを意味する。タンパク質が、それを天然に発現する細胞からそれを精製すること以外によって作製される一部の実施形態において、タンパク質はキメラポリペプチドであり、キメラポリペプチドとは、それが２つ以上の異なる種からの部分を持つことを意味する。タンパク質が、それを天然に発現する細胞からそれを精製すること以外によって作製される一部の実施形態において、タンパク質は誘導体であり、誘導体とは、タンパク質が、タンパク質に関係しない追加的な配列を、それらの配列がタンパク質の生物学的活性を実質的に低減しない限りにおいて含むことを意味する。当業者は、特定のポリペプチド変異体、断片又は誘導体が機能性かどうかについて把握しているか、又は当技術分野で公知のアッセイを用いて容易に確認することができるであろう。例えば、転写因子の変異体が体細胞を標的細胞型に変換する能力は、本明細書の実施例に開示されるとおりのアッセイを用いて判定することができる。他の好都合なアッセイとしては、ルシフェラーゼなどの検出可能なマーカーをコードする核酸配列に作動可能に連結された転写因子結合部位を含有するレポーターコンストラクトの転写を活性化させる能力を測定することが挙げられる。本発明の特定の実施形態において、機能変異体又は断片は、完全長野生型ポリペプチドの活性の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％又はそれを超えるものを有する。

【0148】

細胞を多能性状態に向けて再プログラム化するための因子の量を増加させることに関して、用語「～の量を増加させること」は、目的の細胞（例えば、線維芽細胞などの体細胞）における因子（例えば、転写因子）の分量を増加させることを指す。一部の実施形態において、因子の量は、目的の細胞（例えば、１つ以上の因子をコードするポリヌクレオチドの発現を導く発現カセットが導入されている細胞）において因子の分量が対照（例えば、前記発現カセットのいずれも導入されていない線維芽細胞）と比べて少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又はそれを超えるとき、「増加している」。しかしながら、因子の量を増加させる任意の方法が、因子（又はそれをコードするプレｍＲＮＡ又はｍＲＮＡ）の転写、翻訳、安定性又は活性の量、速度又は効率を増加させる任意の方法を含め、企図される。加えて、転写発現の負の制御因子の下方制御又は干渉、既存の翻訳の効率増加（例えばＳＩＮＥＵＰ）も考えられる。

【0149】

用語「薬剤」は、本明細書で使用されるとき、限定はされないが、小分子、核酸、ポリペプチド、ペプチド、薬物、イオン等、任意の化合物又は物質を意味する。薬剤は、本明細書に記載されるとおりの転写因子を含めた因子の量を増加させる任意の化合物又は物質であり得る。「薬剤」は、限定なしに、合成及び天然に存在するタンパク質性及び非タンパク質性実体を含め、任意の化学物質、実体又は部分であり得る。一部の実施形態において、薬剤は、限定なしに、タンパク質、オリゴヌクレオチド、リボザイム、ＤＮＡザイム、糖タンパク質、ｓｉＲＮＡ、リポタンパク質、アプタマー並びにこれらの修飾及び組み合わせ等を含めた、核酸、核酸類似体、タンパク質、抗体、ペプチド、アプタマー、核酸オリゴマー、アミノ酸又は炭水化物である。特定の実施形態において、薬剤は、化学的部分を有する小分子である。例えば、化学的部分には、マクロライド系薬、レプトマイシン系薬及びその関連する天然産物又は類似体を含め、非置換又は置換アルキル、芳香族又はヘテロ環式部分が含まれた。化合物は、所望の活性及び／又は特性を有することが公知であり得るか、又は多様な化合物のライブラリから選択され得る。

【0150】

用語「外因性」は、細胞又は生物のタンパク質、遺伝子、核酸又はポリヌクレオチドに関して使用されるとき、人工又は天然の手段によって細胞又は生物に導入されたタンパク質、遺伝子、核酸又はポリヌクレオチドを指す；又は細胞に関して使用されるとき、単離され、続いて人工又は天然の手段によって他の細胞又は生物に導入された細胞を指す。外因性核酸は、異なる生物又は細胞からのものであり得るか、又はそれは、生物内又は細胞内に天然で存在する核酸の１つ以上の追加的なコピーであり得る。外因性細胞は、異なる生物からのものであり得るか、又はそれは、同じ生物からのものであり得る。非限定的な例として、外因性核酸は、天然の細胞と異なる染色体位置にあるものであるか、又は他の場合には天然に見られるものと異なる核酸配列が隣接しているものである。外因性核酸は、エピソームベクターなど、染色体外にもあり得る。

【0151】

好適な検出手段としては、ラジオヌクレオチド、酵素、補酵素、蛍光剤、化学発光剤、色原体、酵素基質又は補因子、酵素阻害薬、補欠分子族複合体、フリーラジカル、粒子、色素など、標識の使用が挙げられる。かかる標識された試薬は、ラジオイムノアッセイ、酵素イムノアッセイ、例えば、ＥＬＩＳＡ、蛍光イムノアッセイなど、種々の周知のアッセイにおいて使用し得る。例えば、米国特許第３，７６６，１６２号明細書；同第３，７９１，９３２号明細書；同第３，８１７，８３７号明細書；及び同第４，２３３，４０２号明細書を参照されたい。

【0152】

本開示の方法は、アッセイシステムにおいて、限定はされないが、１プレート当たり２４、４８、９６又は３８４ウェルなど、マルチウェルプレート、マイクロチップ又はスライドを含め、任意の許容できる小型化方法を通じて「小型化」され得る。このアッセイは、有利には関わる試薬及び他の材料の量がより少ない、マイクロチップ支持体上で行えるようにサイズを減少させ得る。

【0153】

培養ベッセル
多層細胞構造体又は胚盤胞様構造体の形成は、細胞の凝集又は自己組織化を可能にする任意の好適な容器、プレート、システム又はベッセルにおいて行う。典型的には、培養は、細胞の三次元凝集を可能にする任意の培養プレート、培養ベッセル、マイクロ流体システム又は培養システムで行う。

【0154】

好適な容器、プレート、システム又はベッセルは、好ましくは、非接着性表面を有する。非接着性表面とは、細胞を上に置く表面であって、細胞との接着傾向がほとんど又は全くない表面である。従って、細胞は本質的にこの表面に接着しない。理論によって拘束されることを望むものではないが、非接着性表面を使用すると、細胞が表面に接着するのでなく、代わりに互いに接着し合って、従って本発明における使用のための細胞構造体を形成するような駆動力が付与される。

【0155】

非接着性表面は、非接着性の生物学的又は人工的材料で材料をコーティングすることによって形成され得るか、又は非接着性表面は、非接着性材料に好適な形状を付与することによるか若しくは当技術分野で公知の他の手段によって入手され得る。その中又はその上で細胞凝集体が形成し得る容器は、以下では足場と呼ぶこととする。

【0156】

非接着性表面を備える足場は、例えば、エチレンオキシド、酸化プロピレン、ポリエチレングリコール、（ＰＥＧ）－（コ）ポリマー（例えばＰＬＬ－ｇ－（ＰＥＧ））、ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ）（コ）ポリマー、アガロースヒドロゲル、その下限臨界共溶温度（ＬＣＳＴ）を下回る感温性材料（例えばポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド））、疎水性材料（例えばオレフィンポリマー）、細胞剥離性マイクロ及びナノトポグラフィーでできているか又はそれでコーティングされる。

【0157】

従って、本発明に従う細胞凝集体の形成は、好ましくは非接着性足場で実現される。非接着性足場は、本質的に細胞の接着を許容しない少なくとも１つの表面を有する。好ましくは、これは、凝集体を形成させる細胞がその上又はその中に置かれる側面である。非接着性足場は、非接着性材料で形成され得るか、又は非接着性材料でコーティングされた別の材料で形成され得る。非接着性ペトリ皿又はチューブを例えば足場として使用し得るが、好ましくは、足場は、例えば、おおよそ六角形、五角形、正方形、矩形、三角形、楕円形又は円形の形状など、プレート様の形状を有する。

【0158】

より好ましくは、足場は、少なくとも１つの好適なキャビティ又はチャネルを含む。好ましくは、足場には複数のキャビティ又はチャネルが存在する。それらのキャビティ又はチャネルが、形成させようとする細胞凝集体のサイズよりも幾らか大きいならば、好ましい。好適なキャビティ及びチャネルは小さく、例えば、直径２０～５０００μｍ、より好ましくは１００～１０００μｍなどであり、最も好ましくは直径１００～５００μｍ、特に約２００μｍのキャビティである。好適なキャビティ又はチャネルは、当技術分野で公知の任意の手段により入手され得る。直径は、キャビティ又はチャネルの開口の周囲上にある任意の対向する２点間の可能な限りで最も長い直線距離として定義される。チャネル又はキャビティは、閉鎖された底を有し、少なくともキャビティ又はチャネルの内側の表面は非接着性材料を含む。

【0159】

好ましくは、キャビティは、長さ及び幅がほぼ同じような大きさの形状を有する。深さもほぼ同じ大きさである。かかるキャビティは、マイクロウェルと呼ばれる。本発明について、非接着性足場がマイクロウェルを含むならば、好ましい。マイクロウェルは、好ましくは、長さがその幅の最大でも約５倍、好ましくは３倍及びより好ましくはほぼ等しく、且つ深さがその幅の１０倍を超えない、好ましくは５倍を超えない、より好ましくは最大でも３倍のキャビティである。

【0160】

マイクロウェルの長さは、マイクロウェルの開口の周囲上にある任意の対向する２点間の可能な限りで最も長い直線距離として定義される。従って、マイクロウェルの長さはその直径と見なされ、それは、好ましくは、例えば２０～５０００μｍ、より好ましくは１００～１０００μｍ及び最も好ましくは１００～５００μｍ、特に約２００μｍである。マイクロウェルの幅は、その長さと垂直なマイクロウェルの開口の周囲上にある任意の対向する２点間の最も長い直線距離として定義される。

【0161】

マイクロウェルの様々な断面積、中でも特に、足場の表面と垂直及び平行な断面積は、不規則な形状を含め、任意の形状であり得るが、好ましくは、マイクロウェルの可能性のある断面積は、独立に、正方形又はほぼ正方形、矩形又はほぼ矩形、三角形又はほぼ三角形、楕円形又はほぼ楕円形又は円形又はほぼ円形である。しかしながら、マイクロウェルが円筒形で、ほぼ足場の表面が円形の開口を有するならば、好ましい。好適なマイクロウェルは、例えば、当技術分野で一般的に使用されるなどのマイクロウェルプレート上に存在する。

【0162】

非接着性足場がマイクロウェルを含む場合、単一の足場に配置された複数のマイクロウェルを有することが有利である。好ましくは、これらのマイクロウェルは、規則的なパターンで配置される。これにより、多数のブラストイドのハイスループット調製が可能になる。

【0163】

一態様において、培養ベッセルは、４００μｍ若しくは８００μｍ又は約４００μｍ～８００μｍ若しくはほぼその程度の逆ピラミッド形のマイクロウェルがアレイ状に並んだ培養プレートである。例示的培養プレートは、ＡｇｇｒｅＷｅｌｌ（商標）プレート、例えばＡｇｇｒｅＷｅｌｌ（商標）４００又は８００である。ＡｇｇｒｅＷｅｌｌプレートの各ウェル内に、幾つものマイクロウェルがある（例えば、２４ウェルＡｇｇｒｅｗｅｌｌの各ウェルには、１２００個のマイクロウェルがある）。

【0164】

細胞は、既知の密度の単一細胞の良く分散した懸濁液をプレートウェルに加え、プレートを穏やかに遠心して細胞を一様にマイクロウェルに押し込むことによってマイクロウェルに播種又は添加し得る。

【0165】

細胞の三次元凝集を可能にする条件には、１ウェル当たり０．５～２×１０^５若しくは約０．５～２×１０^５細胞、１ウェル当たり０．６～２×１０^５若しくは約０．６～２×１０^５細胞、１ウェル当たり０．８～２×１０^５若しくは約０．８～２×１０^５細胞、１ウェル当たり１～２×１０^５若しくは約１～２×１０^５細胞、１ウェル当たり０．６×１０^５若しくは約０．６×１０^５細胞、１ウェル当たり０．８×１０^５若しくは約０．８×１０^５細胞、１ウェル当たり１×１０^５若しくは約１×１０^５細胞、１ウェル当たり１．２×１０^５若しくは約１．２×１０^５細胞、１ウェル当たり１．４×１０^５若しくは約１．４×１０^５細胞、１ウェル当たり１．６×１０^５若しくは約１．６×１０^５細胞、１ウェル当たり１．８×１０^５若しくは約１．８×１０^５細胞又は１ウェル当たり２×１０^５若しくは約２×１０^５細胞の密度（例えば、本明細書に記載されるとおりのＡｇｇｒｅＷｅｌｌプレートに細胞を播種するとき；播種は、１マイクロウェル当たり１～１０００細胞であり得る）で細胞を播種することが含まれる。好ましくは、細胞は、播種前は単一細胞懸濁液である。好ましくは、細胞は、胚盤葉上層（ＥＰＩ）、栄養外胚葉（ＴＥ）及び原始内胚葉（ＰＥ）転写シグネチャを呈する再プログラム化された体細胞又は本明細書に記載される方法のステップｃ）及び／又はステップｄ）の細胞の細胞集団である。

【0166】

培養培地及び条件
用語「細胞培養培地」（本明細書では「培養培地」又は「培地」とも称される）は、本明細書において参照されるとき、栄養素を含有した、細胞生存を維持し、且つ増殖を支持する細胞の培養用培地である。細胞培養培地は、以下のいずれかを適切な組み合わせで含有し得る：１つ又は複数の塩、１つ又は複数の緩衝液、アミノ酸、グルコース又は他の１つ又は複数の糖、抗生物質、血清又は血清代替物等、ペプチド成長因子などの成分等。特定の細胞型に通常使用される細胞培養培地は、当業者に公知である。本発明の方法で使用するための例示的細胞培養培地は、表３に示されるものを含め、本明細書に記載される。

【0167】

本発明の方法における使用のための体細胞は、本明細書に記載されるとおりの、ステップｃ）で培養培地と接触させるステップ前に多能性状態への再プログラム化が完了している必要はない。換言すれば、細胞は、好ましくは、中間状態にあり、胚盤胞様構造体又は多細胞構造体を入手するための凝集を実現可能にする培養培地と接触させる時点で、分化した状態から多能性状態に移行中である。従って、本明細書に記載されるとおりの、ステップｂ）の終了時、ステップｃ）で培養する前の細胞は、再プログラム化中間体と称され得る。

【0168】

特定の実施形態において、多能性状態に向けた再プログラム化を開始させるための細胞の培養期間は、１つ以上の因子のタンパク質発現若しくは量の増加後又は１つ以上の因子のタンパク質発現若しくは量を増加させるために細胞を薬剤と接触させたときから始まって少なくとも１日である。この期間は、１つ以上の因子のタンパク質発現又は量が増加した後の２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０又は２１日又はそれを超えるものであり得る。任意の実施形態において、脱分化した多能性状態に向けた再プログラム化を開始させるための細胞の培養期間は、任意の期間であり得るが、但し、それは、体細胞に関連するマーカーの減少を実現可能であるものとする。

【0169】

本発明の更なる実施形態において、上記の方法は、ＥＰＩ、ＴＥ及びＰＥ系統転写シグネチャの上方制御を誘導する培地で細胞を脱分化状態又は多能性状態に向けて培養することを含む。好ましくは、培地は、体細胞（又は再プログラム化の供給源細胞）を培養下に維持するのに好適なものであり、多能性の促進に使用される培地ではないか、又は多能性のみの促進に使用される培地ではない。再プログラム化される体細胞が線維芽細胞である場合、培地は、線維芽細胞培地、例えば表３ａ及び／又は表３ｂにおけるものを含む、本明細書に定義される線維芽細胞培地である。表３ａにあるものなど、及び図１１に示されるとおり又は再プログラム化の供給源細胞が線維芽細胞でないとき（例えば、供給源細胞が上皮細胞、内皮細胞、ケラチノサイト等である場合）、他の培地が好適であり得ることが理解されるであろう；かかる培地の例は、表３ｂにも掲載される。

【0170】

本明細書で使用されるとき、ステップｃ）の培養培地は、胚盤胞促進培地又はｉＢｌａｓｔｏｉｄ培地とも称され得る。好ましくは、胚盤胞促進培地又はｉＢｌａｓｔｏｉｄ培地は、本明細書に定義されるとおりのいずれかである。任意の実施形態において、細胞は、ステップｃ）において、少なくとも約１、少なくとも約２、少なくとも約３、少なくとも約４、少なくとも約５、少なくとも約６、少なくとも約８、少なくとも約１０、少なくとも約１２、少なくとも約１４、少なくとも約１６，少なくとも約２０、少なくとも約２４日間又はそれを超える期間にわたって培養培地で培養される。

【0171】

任意の実施形態において、体細胞を多能性状態に向けて再プログラム化するための因子のタンパク質発現又は量を増加させることと、ステップｃ）で細胞を培養培地と接触させることとの間の期間は、任意の期間であり得るが、但し、それは、体細胞に関連するマーカーの減少を実現可能であるものとする。更なる例において、因子のタンパク質発現又は量を増加させることと、ステップｃ）で細胞を培養培地と接触させることとの間の期間は、任意の期間であり得るが、但し、それは、細胞が間葉上皮移行状態を進行することを実現可能であるものとする。更なる又は代替的な実施形態において、この期間は、任意の期間であり得るが、但し、それは、胚盤葉上層（ＥＰＩ）、栄養外胚葉（ＴＥ）及び原始内胚葉（ＰＥ）転写シグネチャの発現を実現可能であるものとする。

【0172】

別の態様において、本発明は、細胞が胚盤胞様構造体の少なくとも１つの特徴を呈することを促進するための培養培地であって、
－ ＷＮＴ経路のシグナル伝達を活性化させる薬剤（任意選択でＧＳＫ－３阻害薬）；
－ 少なくとも１つ、好ましくは２つのＴＧＦ－β阻害薬、
－ ＨＤＡＣ阻害薬、
－ 成長因子（好ましくはＥＧＦ）、及び
－ ＢＭＰ（好ましくはＢＭＰ４）
を含む培養培地を提供する。

【0173】

この態様において、ＷＮＴ経路シグナル伝達を活性化させる薬剤（任意選択でＧＳＫ－３阻害薬）、１つ又は複数のＴＧＦ－β阻害薬、ＨＤＡＣ阻害薬は、本明細書に記載されるいずれか１つを含め、当技術分野において公知のいずれか１つであり得る。

【0174】

好ましくは、培養培地は、
－ ＩＴＳ－Ｘ；
－ Ｌ－グルタミン；
－ Ｎ－アセチル－Ｌ－システイン；
－ β－エストラジオール；
－ プロゲステロン；
－ ２－メルカプトエタノール；
－ Ｌ－アスコルビン酸；
－ トランスフェリン（例えば、ヒト）、
－ インスリン（例えば、ヒト）、
－ Ｎ２サプリメント；及び
－ Ｂ２７サプリメント
を更に含む。

【0175】

好ましくは、プロゲステロン、トランスフェリン及びインスリンは、本明細書に記載されるとおりの、プトレシン及び亜セレン酸塩を更に含むＮ２サプリメントで提供される。

【0176】

好ましくは、Ｂ２７サプリメントは、ビオチン、ＤＬα酢酸トコフェロール、ＤＬαトコフェロール、ビタミンＡ（酢酸塩）、ＢＳＡ、カタラーゼ、インスリン（ヒト）、スーパーオキシドジスムターゼ、コルチコステロン、Ｄ－ガラクトース、エタノールアミンＨＣＬ、グルタチオン、Ｌ－カルニチンＨＣＬ、リノール酸、リノレン酸、プロゲステロン、プトレシン２ＨＣｌ、亜セレン酸ナトリウム、Ｔ３（トリヨード－ｌ－チロニン）を含む。

【0177】

任意の実施形態において、培養培地は、抗生物質、例えばペニシリン－ストレプトマイシンを更に含む。

【0178】

一実施形態において、培養培地は、
－ それぞれ２：１：１の比の、本明細書に定義されるとおりのＩＶＣ１培地、Ｎ２Ｂ２７基本培地及びＴＳＣ基本培地、
－ ＷＮＴ経路のシグナル伝達を活性化するための薬剤（任意選択でＧＳＫ－３阻害薬）、
－ 少なくとも１つ、好ましくは２つのＴＧＦ－β阻害薬、
－ ＨＤＡＣ阻害薬、
－ 成長因子（好ましくはＥＧＦ）、及び
－ ＢＭＰ（好ましくはＢＭＰ４）
を含む。

【0179】

好ましくはＴＧＦ－β経路阻害薬は、ＳＢ４３１５４２及びＡ８３－０１から選択され、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）１阻害薬は、ＶＰＡ（バルプロ酸）であり、ＧＳＫ－３阻害薬は、ＣＨＩＲ９９０２１である。

【0180】

好ましくは、ＧＳＫ－３阻害薬は、２μＭ又は約２μＭの濃度であり、ＴＧＦ－β経路阻害薬は、０．５μＭ若しくは１μＭ又は約０．５μＭ若しくは１μＭの濃度であり、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）１阻害薬は、０．８ｍＭ又は約０．８ｍＭの濃度であり、ＥＧＦは、５０ｎｇ／ｍｌ又は約５０ｎｇ／ｍｌの濃度であり、及びＢＭＰ４は、１０ｎｇ／ｍｌ又は約１０ｎｇ／ｍｌの濃度である。

【0181】

本明細書で使用されるとき、成長因子とは、任意の成長因子であり得るが、好ましくは上皮成長因子（ＥＧＦ）、インスリン、形質転換成長因子（ＴＧＦ）から選択されるものである。成長因子の量は、任意の量、例えば、０．１～１０００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは１０～１００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは５０ｎｇ／ｍｌであり得る。

【0182】

本明細書で使用されるとき、ＲＯＣＫ阻害薬とは、Ｒｈｏ結合キナーゼの阻害薬を指す。かかる阻害薬の例としては、（（１Ｒ，４ｒ）－４－（（Ｒ）－１－アミノエチル）－Ｎ－（ピリジン－４－イル）シクロヘキサンカルボキサミド、Ａｂｃａｍ）、別名ｔｒａｎｓ－Ｎ－（４－（１－アミノエチル）－シクロヘキサンカルボキサミド、１－（５－イソキノリニル）（スルホニル）ホモピペラジン （１－（５－イソキノリニルスルホニル）ホモピペラジンが挙げられる。典型的にはＲＯＣＫ阻害薬の量は、約０．１～５０μＭ、好ましくは約１～１０μＭである。

【0183】

好ましくは、ＲＯＣＫ阻害薬は、Ｙ－２７６３２である。好ましくは、ＲＯＣＫ阻害薬は、１０μＭ又は約１０μＭの濃度である。

【0184】

別の態様において、培養培地は、表３ａに定義されるとおりの線維芽細胞培地、Ｎ２Ｂ２７基本培地、ＴＳＣ基本培地、ＩＶＣ１培地、ＩＶＣ２培地又はヒトｉＢｌａｓｔｏｉｄ培地を含むか又はそれからなる。

【0185】

任意の態様において、本発明の任意の方法のステップｃ）に定義される培養培地は、限定はされないが、表３ａにあるものを含め、本明細書に定義されるとおりのヒトｉＢｌａｓｔｏｉｄ培地を含め、本発明の任意の培養培地であり得る。

【0186】

【表3a-1】

【0187】

【表3a-2】

【0188】

【表3a-3】

【0189】

【表3b】

【0190】

核酸及びベクター
本明細書に記載されるとおりの核酸又は核酸を含むベクターには、上記の表２に言及される配列の１つ以上が含まれ得る。核酸又はベクターは、体細胞を多能性状態に向けて再プログラム化するための因子の１つ以上をコードする配列を含み得る。

【0191】

用語「発現」は、適用可能な場合、限定はされないが、例えば転写、翻訳、折り畳み、修飾及びプロセシングを含めた、ＲＮＡ及びタンパク質の産生並びに適宜タンパク質の分泌が関わる細胞過程を指す。

【0192】

用語「単離されている」又は「部分的に精製されている」は、本明細書で使用されるとき、核酸又はポリペプチドの場合、その天然の供給源に見られるとおりのその核酸又はポリペプチドと共に存在し、且つ／又は細胞が発現したとき若しくは分泌型のポリペプチドの場合には分泌されたときにその核酸又はポリペプチドと共に存在するであろう少なくとも１つの他の成分（例えば、核酸又はポリペプチド）から分離されている核酸又はポリペプチドを指す。化学的に合成された核酸又はポリペプチド又はインビトロ転写／翻訳を用いて合成されるものは、「単離されている」と見なされる。

【0193】

用語「ベクター」は、宿主又は体細胞への導入のためＤＮＡ配列を挿入することができる担体ＤＮＡ分子を指す。好ましいベクターは、自己複製能を有するもの及び／又はそれが連結されている核酸の発現能を有するものである。それが作動可能に連結されている遺伝子の発現を導く能力を有するベクターは、本明細書では「発現ベクター」と称される。従って、「発現ベクター」は、宿主細胞における目的の遺伝子の発現に必要な必須調節領域を持つ特殊化したベクターである。一部の実施形態において、目的の遺伝子は、ベクター内で別の配列に作動可能に連結されている。ベクターは、ウイルスベクター又は非ウイルスベクターであり得る。ウイルスベクターが使用される場合、そのウイルスベクターは複製欠損であることが好ましく、複製欠損は、例えば、複製をコードする全てのウイルス核酸を除去することによって実現し得る。複製欠損ウイルスベクターは、その感染特性はなおも保持しており、複製性アデノウイルスベクターと同じような方法で細胞に侵入するが、しかしながら、細胞に入った後、複製欠損ウイルスベクターは、複製又は増殖しない。ベクターは、リポソーム及びナノ粒子並びにＤＮＡ分子を細胞に送達する他の手段も含む。

【0194】

用語「作動可能に連結された」は、コード配列の発現に必要な調節配列がＤＮＡ分子内でコード配列に対し、コード配列の発現を行うような適切な位置に置かれていることを意味する。これと同じ定義が、時に発現ベクター内でのコード配列及び転写制御エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー及び終結エレメント）の配置に適用される。用語「作動可能に連結された」には、発現させようとするポリヌクレオチド配列の前に適切な開始シグナル（例えばＡＴＧ）を有すること並びに発現制御配列の制御下でのポリヌクレオチド配列の発現及びポリヌクレオチド配列によってコードされる所望のポリペプチドの産生を許容するような正しいリーディングフレームを維持していることが含まれる。

【0195】

用語「ウイルスベクター」は、細胞内への核酸コンストラクトの担体としてのウイルス又はウイルス関連ベクターの使用を指す。コンストラクトは、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）又は単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）又は他のレトロウイルス及びレンチウイルスベクター、センダイウイルスベクターを含めた、細胞への感染又は形質導入のためのもののような非複製性の欠損ウイルスゲノムに組み込まれ、パッケージされ得る。ベクターは細胞のゲノムに取り込まれても又は取り込まれなくてもよい。コンストラクトには、必要に応じて、トランスフェクションのためのウイルス配列が含まれ得る。代わりに、コンストラクトは、エピソーム複製能を有するベクター、例えばＥＰＶ及びＥＢＶベクターに取り込まれ得る。

【0196】

本明細書で使用されるとき、用語「アデノウイルス」は、アデノウイルス科（Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａ）のウイルスを指す。アデノウイルスは、ヌクレオカプシドと二本鎖線状ＤＮＡゲノムとで構成される中型（９０～１００ｎｍ）のエンベロープを持たない（ネイキッドの）正二十面体ウイルスである。

【0197】

本明細書で使用されるとき、用語「非組込み型ウイルスベクター」は、宿主ゲノムに組み込まれないウイルスベクターを指す；このウイルスベクターによって送達される遺伝子の発現は、一時的である。宿主ゲノムへの組込みがほとんど乃至全くないため、非組込み型ウイルスベクターには、ゲノム中のランダムな点における挿入によってＤＮＡ突然変異を生じさせることがないという利点がある。例えば、非組込み型ウイルスベクターは染色体外に留まり、その遺伝子を宿主ゲノムに挿入しないため、内因性遺伝子の発現を破綻させる可能性がない。非組込み型ウイルスベクターとしては、限定はされないが、以下を挙げることができる：アデノウイルス、アルファウイルス、ピコルナウイルス及びワクシニアウイルス。何らかのまれな状況では、これらのいずれかがウイルス核酸を宿主細胞のゲノムに組み込み得る可能性があるにせよ、これらのウイルスベクターは、この用語が本明細書において使用されるとおりの「非組込み型」ウイルスベクターである。決定的に重要なことは、本明細書に記載される方法において用いられるウイルスベクターが、原則として又は用いられる条件下でのそのライフサイクルの主要な部分として、その核酸を宿主細胞のゲノムに組み込まない点である。

【0198】

本明細書に記載されるベクターは、治療法で使用する際のその安全性を増加させること、必要に応じて選択及び濃縮マーカーを包含すること及びそこに含まれるヌクレオチド配列の発現を最適化することが科学文献において概して公知の方法を用いて構築及び操作することができる。ベクターは、ベクターがその体細胞型において自己複製することを許容する構造成分を含まなければならない。例えば、公知のエプスタイン・バーｏｒｉＰ／核抗原－１（ＥＢＮＡ－Ｉ）の組み合わせ（例えば、Ｌｉｎｄｎｅｒ，Ｓ．Ｅ．ａｎｄ Ｂ．Ｓｕｇｄｅｎ，Ｔｈｅ ｐｌａｓｍｉｄ ｒｅｐｌｉｃｏｎ ｏｆ Ｅｐｓｔｅｉｎ－Ｂａｒｒ ｖｉｒｕｓ：ｍｅｃｈａｎｉｓｔｉｃ ｉｎｓｉｇｈｔｓ ｉｎｔｏ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ，ｌｉｃｅｎｓｅｄ，ｅｘｔｒａｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌｓ，Ｐｌａｓｍｉｄ ５８：１（２００７）（その全体が本明細書に示されたものとして参照によって援用される）を参照されたい）は、ベクターの自己複製を支持するのに十分であり、哺乳類、特に霊長類の細胞で機能することが公知の他の組み合わせも用いることができる。本発明での使用に好適な発現ベクターを構築する標準的な技法は当業者に周知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ，ｅｔ ａｌ．，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，”（３ｒｄ ｅｄ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．２００１）（その全体が示されたものとして参照により本明細書に援用される）などの刊行物を参照することができる。

【0199】

本発明の方法では、変換に必要な関連性のある転写因子をコードする遺伝子材料は、１つ以上の再プログラム化ベクターによって体細胞に送達される。各転写因子は、体細胞でのポリヌクレオチドの発現をドライブすることのできる異種プロモーターに作動可能に連結された転写因子をコードするポリヌクレオチドトランス遺伝子として体細胞に導入することができる。

【0200】

好適な再プログラム化ベクターは、プラスミドなどのエピソームベクターを含め、感染性又は複製コンピテントのウイルスを生じさせるのに十分なウイルスゲノムの全て又は一部をコードしない本明細書に記載される任意のものであるが、こうしたベクターは、１つ以上のウイルスから入手される構造エレメントを含有することができる。単一の体細胞に１つ又は複数の再プログラム化ベクターを導入することができる。単一の再プログラム化ベクターに１つ以上のトランス遺伝子を提供することができる。１つの強力な構成的転写プロモーターが複数のトランス遺伝子の転写制御を提供することができ、これらは発現カセットとして提供され得る。ベクター上の別個の発現カセットが別個の強力な構成的プロモーターの転写制御下にあり得、これらは、同じプロモーターのコピーであり得るか、又は異なるプロモーターであり得る。様々な異種プロモーターが当技術分野で公知であり、転写因子の所望の発現レベルなどの要因に応じて使用することができる。以下に例証するとおり、細胞において別個の発現カセットの転写を異なる強度の異なるプロモーターを使用して制御することが有利であり得る。転写プロモーターの選択において考慮すべき別の点は、１つ又は複数のプロモーターがサイレンシングされる速度である。当業者は、１つ又は複数の遺伝子の産生が完了した後又は再プログラム化方法におけるその役割を実質的に完了した後、１つ以上のトランス遺伝子又はトランス遺伝子発現カセットの発現を減少させることが有利であり得ることを認識するであろう。例示的プロモーターは、ヒトＥＦ１α伸長因子プロモーター、ＣＭＶサイトメガロウイルス前初期プロモーター及びＣＡＧニワトリアルブミンプロモーター及び他の種由来の対応する相同プロモーターである。ヒト体細胞では、ＥＦ１α及びＣＭＶの両方が強力なプロモーターであるが、ＣＭＶプロモーターはＥＦ１αプロモーターよりも効率的にサイレンシングされるため、前者の制御下にあるトランス遺伝子の発現は、後者の制御下にあるトランス遺伝子と比べてより早くオフになる。これらの転写因子を体細胞において様々に異なり得る相対比率で発現させることにより、再プログラム化効率を調節することができる。好ましくは、複数のトランス遺伝子が単一の転写物上にコードされる場合、転写プロモーターの遠位にある１つ又は複数のトランス遺伝子の上流に配列内リボソーム進入部位が提供される。因子の相対比率は、送達される因子に依存して変わり得るが、本開示を把握している当業者は、因子の最適な比率を決定することができる。

【0201】

当業者は、全ての因子を導入する効率は、複数のベクターによるよりむしろ、単一のベクターによる方が有利であるが、全体的なベクターサイズが増加するにつれ、ベクターの導入が次第に困難になることを認識するであろう。当業者は、ベクター上における転写因子の位置がその時間的発現及び結果として生じる再プログラム化効率に影響し得ることも認識するであろう。このように、本発明の方法は、ベクターの組み合わせに対して様々な組み合わせの因子を使用して実施することができる。幾つかのかかる組み合わせは、再プログラム化を支持することが公知である。

【0202】

１つ又は複数の再プログラム化ベクターを導入した後、体細胞が再プログラム化されている間、ベクターは標的細胞に残り続け得る一方、導入されたトランス遺伝子は転写され、翻訳される。トランス遺伝子発現は有利には、標的細胞型に再プログラム化され終えた細胞では下方制御されるか又はオフになり得る。１つ又は複数の再プログラム化ベクターは染色体外に留まる。効率が極めて低いとき、１つ又は複数のベクターは細胞のゲノムに組み込まれ得る。以下の例は、本発明を例示することを意図しており、本発明を限定する意図は一切ない。

【0203】

本発明で使用する細胞、組織又は生物の形質転換に好適な核酸送達方法には、本明細書に記載されるとおりの又は当業者に公知であろうとおりの、核酸（例えば、ＤＮＡ）を細胞、組織又は生物に導入することのできる事実上任意の方法が含まれると考えられる（例えば、Ｓｔａｄｔｆｅｌｄ ａｎｄ Ｈｏｃｈｅｄｌｉｎｇｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ６（５）：３２９－３３０（２００９）；Ｙｕｓａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ６：３６３－３６９（２００９）；Ｗｏｌｔｊｅｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４５８，７６６－７７０（９ Ａｐｒ．２００９））。かかる方法としては、限定はされないが、ＤＮＡの直接送達、例えば、エキソビボトランスフェクション（Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１３４４－１３４６，１９８９、Ｎａｂｅｌ ａｎｄ Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｎａｔｕｒｅ ３２６：７１１－７１３，１９８７）であって、任意選択でＦｕｇｅｎｅ６（Ｒｏｃｈｅ）又はＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）などの脂質ベースのトランスフェクション試薬を伴うものによるもの、注入（米国特許第５，９９４，６２４号明細書、同第５，９８１，２７４号明細書、同第５，９４５，１００号明細書、同第５，７８０，４４８号明細書、同第５，７３６，５２４号明細書、同第５，７０２，９３２号明細書、同第５，６５６，６１０号明細書、同第５，５８９，４６６号明細書及び同第５，５８０，８５９号明細書、それぞれ参照により本明細書に援用される）であって、マイクロインジェクション（Ｈａｒｌａｎｄ ａｎｄ Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１０１：１０９４－１０９９，１９８５；米国特許第５，７８９，２１５号明細書、参照により本明細書に援用される）を含めたもの；電気穿孔によるもの（米国特許第５，３８４，２５３号明細書、参照により本明細書に援用される；Ｔｕｒ－Ｋａｓｐａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，６：７１６－７１８，１９８６；Ｐｏｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：７１６１－７１６５，１９８４）；リン酸カルシウム沈殿によるもの（Ｇｒａｈａｍ ａｎｄ Ｖａｎ Ｄｅｒ Ｅｂ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２：４５６－４６７，１９７３；Ｃｈｅｎ ａｎｄ Ｏｋａｙａｍａ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，７（８）：２７４５－２７５２，１９８７；Ｒｉｐｐｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１０：６８９－６９５，１９９０）；ＤＥＡＥ－デキストランと、続くポリエチレングリコールを使用することによるもの（Ｇｏｐａｌ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，５：１１８８－１１９０，１９８５）；直接の音波負荷によるもの（Ｆｅｃｈｈｅｉｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４：８４６３－８４６７，１９８７）；リポソーム媒介性トランスフェクションによるもの（Ｎｉｃｏｌａｕ ａｎｄ Ｓｅｎｅ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，７２１：１８５－１９０，１９８２；Ｆｒａｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７６：３３４８－３３５２，１９７９；Ｎｉｃｏｌａｕ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１４９：１５７－１７６，１９８７；Ｗｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ，１０：８７－９４，１９８０；Ｋａｎｅｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４３：３７５－３７８，１９８９；Ｋａｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６６：３３６１－３３６４，１９９１）及び受容体媒介性トランスフェクション（Ｗｕ ａｎｄ Ｗｕ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７：８８７－８９２，１９８８；Ｗｕ ａｎｄ Ｗｕ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６２：４４２９－４４３２，１９８７）；及びかかる方法の任意の組み合わせ（これらの各々が参照により本明細書に援用される）が挙げられる。

【0204】

これまで、細胞への関連する分子の導入を媒介する能力を有する幾つものポリペプチドが記載されており、本発明に応用することができる。例えば、Ｌａｎｇｅｌ（２００２）Ｃｅｌｌ Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ Ｓｅｒｉｅｓを参照されたい。膜を越えた輸送を増強するポリペプチド配列の例としては、限定はされないが、ショウジョウバエ属（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）ホメオタンパク質アンテナペディア転写タンパク質（ＡｎｔＨＤ）（Ｊｏｌｉｏｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｗ Ｂｉｏｌ．３：１１２１－３４，１９９１；Ｊｏｌｉｏｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：１８６４－８，１９９１；Ｌｅ Ｒｏｕｘ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：９１２０－４，１９９３）、単純ヘルペスウイルス構造タンパク質ＶＰ２２（Ｅｌｌｉｏｔｔ ａｎｄ Ｏ’Ｈａｒｅ，Ｃｅｌｌ ８８：２２３－３３，１９９７）；ＨＩＶ－１転写活性化因子ＴＡＴタンパク質（Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ Ｌｏｅｗｅｎｓｔｅｉｎ，Ｃｅｌｌ ５５：１１７９－１１８８，１９８８；Ｆｒａｎｋｅｌ ａｎｄ Ｐａｂｏ，Ｃｅｌｌ ５５：１ ２８９－１１９３，１９８８）；カポジＦＧＦシグナル配列（ｋＦＧＦ）；タンパク質形質導入ドメイン－４（ＰＴＤ４）；ペネトラチン、Ｍ９１８、トランスポータン－１０；核局在化配列、ＰＥＰ－Ｉペプチド；両親媒性ペプチド（例えば、ＭＰＧペプチド）；米国特許第６，７３０，２９３号明細書に記載されるなどの送達増強輸送体（限定はされないが、少なくとも５～２５個以上の連続するアルギニン又は連続する一組の３０、４０又は５０アミノ酸中の５～２５個以上のアルギニンを含むペプチド配列を含む；限定はされないが、十分な、例えば、少なくとも５個のグアニジノ又はアミジノ部分を有するペプチドを含む）；及び市販のＰｅｎｅｔｒａｔｉｎ（商標）１ペプチド及び仏国パリのＤａｉｔｏｓ Ｓ．Ａ．から入手可能なＶｅｃｔｏｃｅｌｌ（登録商標）プラットフォームのＤｉａｔｏｓペプチドベクター（「ＤＰＶ」）が挙げられる。国際公開第２００５／０８４１５８号パンフレット及び国際公開第２００７／１２３６６７号パンフレット並びにそれに記載される更なる輸送体も参照されたい。これらのタンパク質が細胞膜を通過できるのみならず、本明細書に記載される転写因子などの他のタンパク質の付着が、これらの複合体の細胞取込みを刺激するには十分である。

【0205】

使用及び適用
本発明に従って作り出されるとおりの、多層細胞構造体又は胚盤胞様構造体は、胚盤胞又はそこにある細胞の発生及び／又は活性に関連する障害のモデルシステムの調製にも使用し得る。このシステムは、胚盤胞に発現するか又は胚盤胞の分化及び／又は活性に不可欠な遺伝子のスクリーニングにおいて、発生に影響を及ぼす薬剤及び条件（培養条件及び操作など）をスクリーニングするため、特定の成長因子及びホルモンを産生するか、又は発生に関連する障害に対する細胞療法として有用性が見出される。

【0206】

従って、本発明のある態様によれば、胚盤胞の発生及び／又は活性を調節する能力を有する薬剤を同定する方法であって、
（ｉ）好ましくは本発明の方法に従って作り出される、多層細胞構造体又は胚盤胞様構造体を候補薬剤と接触させること；及び
（ｉｉ）前記薬剤との前記接触後の多層細胞構造体又は胚盤胞様構造体の発生及び／又は活性を薬剤なしでの多層細胞構造体又は胚盤胞様構造体の発生及び／又は活性と比較すること
を含む方法が提供され、多層細胞構造体又は胚盤胞様構造体の前記発生及び／又は活性に対する前記薬剤の効果が、薬剤なしでの多層細胞構造体又は胚盤胞様構造体の前記発生及び／又は活性に対して所定のレベルだけ上回ることは、前記薬物が胚盤胞の発生及び／又は活性を調節することを示す。

【0207】

本明細書で使用されるとき、用語「調節すること」は、阻害するか又は促進するかのいずれかによって胚盤胞の発生及び／又は活性を変化させることを指す。

【0208】

具体的な実施形態によれば、調節することは、発生及び／又は活性を阻害することである。

【0209】

具体的な実施形態によれば、調節することは、発生及び／又は活性を促進することである。

【0210】

同じ培養条件について、多層細胞構造体又は胚盤胞様構造体の発生及び／又は活性に対する候補薬剤の効果は、概して、同じ種の、但し候補薬剤と接触していないか、又は対照とも称される、媒体対照と接触した多層細胞構造体又は胚盤胞様構造体における発生及び／又は活性との比較で表現される。

【0211】

本明細書で使用されるとき、語句「所定のレベルを上回る効果」は、薬剤と接触させた後の多層細胞構造体又は胚盤胞様構造体の発生及び／又は活性の変化が、候補薬剤と接触させる前の本明細書に記載される任意のマーカーの存在又はレベルと比べて、約１０％など、所定のレベルより高い、例えば、約２０％より高い、例えば、約３０％高い、例えば、約４０％高い、例えば、約５０％高い、例えば、約６０％高い、約７０％高い、約８０％高い、約９０％高い、約２倍高い、約３倍高い、約４倍高い、約５倍高い、約６倍高い、約７倍高い、約８倍高い、約９倍高い、約２０倍高い、約５０倍高い、約１００倍高い、約２００倍高い、約３５０より高い、約５００倍高い、約１０００倍高い又はそれを超えて高いことを指す。

【0212】

具体的な実施形態によれば、候補薬剤は、限定はされないが、化学物質、小分子、ポリペプチド及びポリヌクレオチドを含め、任意の化合物であり得る。

【0213】

具体的な実施形態によれば、選択される薬剤は、本明細書に記載される病態など、胚盤胞の発生又は活性の調節が必要な様々な病態の治療に更に使用され得る。

【0214】

本発明の別の態様によれば、胚盤胞は、幾つかの分泌型成長因子及びホルモン並びにエキソソームなどの粒子を産生するため、多層細胞構造体又は胚盤胞様構造体によって作製された化合物又は粒子を入手する方法であって、本発明の多層細胞構造体又は胚盤胞様構造体を培養することと、細胞によって分泌される化合物又は粒子を培養培地から単離することとを含み、それにより多層細胞構造体又は胚盤胞様構造体によって作製された化合物又は粒子を入手する方法が提供される。

【0215】

本明細書に概説されるとおり、本発明は、ヒトブラストイドに直接再プログラム化される体細胞を提供し、且つ自然発生のヒト胚盤胞の使用を伴わない手法を提供する。完全を期するならば、本発明の方法は、
－ 胚の破壊を伴わない；
－ 受精を伴わない；
－ 卵母細胞の活性化を伴わない；
－ ヒトになるまで発生することができない；及び
－ ヒトを作成する過程の一ステップでない；及び
－ 妊婦から採取した初代天然媒体を伴わない。

【0216】

更に、多層細胞構造体又は胚盤胞様構造体の培養は必要最小限の時間、例えば最大でも５日の追加日数（約Ｅ１１に相当する）、好ましくは４．５日間であり、原始線条の形態学的エビデンスの前に実験を終了する。

【実施例】

【0217】

実施例１－倫理声明
本研究は、モナッシュ大学施設内ヒト研究倫理委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ｍｏｎａｓｈ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｕｍａｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｅｔｈｉｃｓ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）の承認（ＭＵＨＲＥＣ ２０２０－２２９０９－３９９３５により、ＭＵＨＲＥＣ ２０２０－２７１４７－５１９９５による）を得て行われた。ＭＵＨＲＥＣ ２０２０－２２９０９－３９９３５は、再プログラム化を受けるヒト線維芽細胞の機能的及び分子的特徴付けが関わる、３次元オルガノイドベースの培養システム（ブラストイド）を使用してそれらの細胞を特徴付けるための作業を適用範囲とした。ＭＵＨＲＥＣ ２０２０－２７１４７－５１９９５は、ｉＢｌａｓｔｏｉｄの作成、分子的及び機能的特徴付けを適用範囲とした。

【0218】

更に、現在のところ、ヒトブラストイドモデルで作業する先例がないため、本発明者らの施設内ヒト研究倫理委員会の承認を求める傍ら、本発明者らは、全ての実験を既発表の推奨（Ｈｙｕｎ ｅｔ ａｌ．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ １４，１６９－１７４（２０２０））に従うと共に、ヒト胚の培養を受精後１４日及び／又は原始線条（ＰＳ）の形成のいずれか早い方までとする国際合意（Ｗａｒｎｏｃｋ，Ｉｒ．Ｎｕｒｓ．Ｎｅｗｓ ５，７－８（１９８５））を順守して実施した。

【0219】

（出発材料が胚起源でないため）ｉＢｌａｓｔｏｉｄに関する「１４日ルール」の適用可能性が不明確であることを所与として、ＨＤＦは、成人組織に由来し、本発明者らは、国際的ガイドライン（Ｈｙｕｎ ａｎｄ Ｗａｒｎｏｃｋ、前掲）の範囲内に十分に留まるように、ｉＢｌａｓｔｏｉｄの培養を必要最小限の時間、この場合、最大でも５日の追加日数（約Ｅ１１に相当）とすることと、ＰＳの形態学的エビデンスの前に実験を終了することとに焦点を置いた。

【0220】

ＰＳ形成の分子的エビデンスを除外するため、本発明者らは、５日間胚付着培養の間に幾つかの鍵となる原始線条マーカーのｑＲＴ－ＰＣＲ ２４時間経時解析を実施し（Ｘｉａｎｇ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ５７７，５３７－５４２（２０２０）；Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．．Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．５，３６７８（２０１４）；Ｔｙｓｅｒ，ｅｔ ａｌ．ｂｉｏＲｘｉｖ（２０２０））、ＴＢＸＴ、エオメス若しくはＭＩＸＬ１の上方制御又は原腸形成を指示するいかなる形態学的変化も認めなかった（Ｔｙｓｅｒ、前掲；Ｏ’Ｒａｈｉｌｌｙ，Ｒ．＆Ｍｕｅｌｌｅｒ，Ｆ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｓｔａｇｅｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｓ：ｒｅｖｉｓｅｄ ａｎｄ ｎｅｗ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ．Ｃｅｌｌｓ Ｔｉｓｓｕｅｓ Ｏｒｇａｎｓ １９２，７３－８４（２０１０）；Ｙａｍａｇｕｃｈｉ，Ｙ．＆Ｙａｍａｄａ，Ｓ．Ｃｅｌｌｓ Ｔｉｓｓｕｅｓ Ｏｒｇａｎｓ ２０５，３１４－３１９（２０１８））（図８ｂ、図８ａ）。従って、５日間のｉＢｌａｓｔｏｉｄ付着培養では、ＥＰＩ区画はＰＳの形成まで進まなかった。それにも関わらず、上記のパラメータを厳密に順守することにより、以降のヒトｉＢｌａｓｔｏｉｄ付着培養実験は、全てｉＢｌａｓｔｏｉｄ形成後合計４．５日間実施した（図８ａ）。

【0221】

実施例２－細胞培養培地
線維芽細胞培地：ＤＭＥＭ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、１％非必須アミノ酸（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、１ｍＭ ＧｌｕｔａＭＡＸ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、１％ペニシリン－ストレプトマイシン（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、５５μＭ ２－メルカプトエタノール（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）及び１ｍＭピルビン酸ナトリウム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）。

【0222】

Ｎ２Ｂ２７基本培地：２ｍＭ Ｌ－グルタミン（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、０．１ｍＭ ２－メルカプトエタノール（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、０．５％Ｎ２サプリメント（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、１％Ｂ２７サプリメント（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、１％ペニシリン－ストレプトマイシン（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を補足した、ＤＭＥＭ／Ｆ－１２（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）とＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）との５０：５０混合物。

【0223】

ＴＳＣ基本培地：０．３％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）、０．２％ＦＢＳ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、１％ＩＴＳ－Ｘサプリメント（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、０．１ｍＭ ２－メルカプトエタノール（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、０．５％ペニシリン－ストレプトマイシン（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、１．５μｇ／ｍｌ Ｌ－アスコルビン酸（Ｓｉｇｍａ）を補足した、ＤＭＥＭ／Ｆ－１２、ＧｌｕｔａＭＡＸ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）。

【0224】

ＩＶＣ１培地：Ａｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ／Ｆ－１２（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、１％ＩＴＳ－Ｘサプリメント（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、２ｍＭ Ｌ－グルタミン（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、０．５％ペニシリン－ストレプトマイシン（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、２０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、２５μＭ Ｎ－アセチル－Ｌ－システイン（Ｓｉｇｍａ）、８ｎＭ β－エストラジオール（Ｓｉｇｍａ）及び２００ｎｇ／ｍｌプロゲステロン（Ｓｉｇｍａ）。ＩＶＣ２培地：Ａｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ／Ｆ－１２（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、１％ＩＴＳ－Ｘサプリメント（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、２ｍＭ Ｌ－グルタミン（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、０．５％ペニシリン－ストレプトマイシン（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、３０％ノックアウト血清代替物（ＫＳＲ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、２５μＭ Ｎ－アセチル－Ｌ－システイン（Ｓｉｇｍａ）、８ｎＭ β－エストラジオール（Ｓｉｇｍａ）及び２００ｎｇ／ｍｌプロゲステロン（Ｓｉｇｍａ）。

【0225】

ヒトｉＢｌａｓｔｏｉｄ培地：２μＭ ＣＨＩＲ９９０２１（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）、０．５μＭ Ａ８３－０１（Ｓｉｇｍａ）、１μＭ ＳＢ４３１５４２、０．８ｍＭバルプロ酸（ＶＰＡ、Ｓｉｇｍａ）、５０ｎｇ／ｍｌ ＥＧＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）及び１０ｎｇ／ｍｌ ＢＭＰ４（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を補足した、それぞれ２：１：１の比のＩＶＣ１培地、Ｎ２Ｂ２７基本培地及びＴＳＣ基本培地。

【0226】

【0227】

実施例３－再プログラム化によるｉＢｌａｓｔｏｉｄ作成
この研究で使用した細胞系は、全て研究報告要約（Ｒｅｐｏｒｔｉｎｇ Ｓｕｍｍａｒｙ）に記載されるとおり認証され、マイコプラズマ検査を受けた。３例の異なる女性ドナーからの初代ヒト成人皮膚線維芽細胞（ＨＤＦａ）をＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒから入手し（カタログ番号Ｃ－０１３－５Ｃ並びに３８Ｆはロット番号１０２９０００、５５Ｆはロット番号１５２８５２６及び３２Ｆはロット番号１５６９３９０）、細胞を回復させ、低血清成長サプリメント（ＬＳＧＳ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を補足した培地１０６（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）に播いて増大させた。

【0228】

ヒト体細胞再プログラム化を以前に記載されたとおり実施して（Ｌｉｕ，Ｘ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １４，１０５５－１０６２（２０１７））、２１日目再プログラム化中間体を入手した。簡潔に言えば、ヒト線維芽細胞の再プログラム化は、ＣｙｔｏＴｕｎｅ－ｉＰＳ ２．０ Ｓｅｎｄａｉ再プログラム化キットを製造者の指示に従って使用して（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、ロット番号２１７００５２）行った。初代ＨＤＦａを線維芽細胞培地に約５～１０×１０^４細胞の密度で播種した。図１ａに示されるとおり、細胞をＦＭ中にてセンダイウイルスによって以下のとおりの感染多重度（ＭＯＩ）、ＫＯＳ（ＫＬＦ４－ＯＣＴ４－ＳＯＸ２）ＭＯＩ＝５、ｃ－ＭＹＣ ＭＯＩ＝５、ＫＬＦ４ ＭＯＩ＝６で形質導入した。培地交換を形質導入後１日目から開始して隔日で行い、８日目以降は毎日行った。再プログラム化の２１日目、細胞を解離し、２４ウェルＡｇｇｒｅｗｅｌｌプレート（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）において、製造者の指示に従って１０μＭ Ｙ－２７６３２（ＲＯＣＫ阻害薬、Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ）を補足したヒトｉＢｌａｓｔｏｉｄ培地に１ウェル当たり１．２×１０^５細胞の密度で播種した。細胞をインキュベーターにおいて３７℃、５％Ｏ２及び５％ＣＯ２で培養した。２４時間後、細胞にＲＯＣＫ阻害薬のない新鮮なヒトｉＢｌａｓｔｏｉｄ培地を補充した。ＡｇｇｒｅｗｅｌｌでのｉＢｌａｓｔｏｉｄ形成の６日目、続く分析又はインビトロ付着アッセイのためｉＢｌａｓｔｏｉｄを回収した。ｉＢｌａｓｔｏｉｄの作成に使用した培養培地の詳細は、上記の実施例２にまとめている。

【0229】

本発明者らは、体細胞再プログラム化を以前に記載されたとおり実施して（Ｌｉｕ，Ｘ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １４，１０５５－１０６２（２０１７））、組込みのないセンダイウイルスを使用することによりＯＣＴ４／ＰＯＵ５Ｆ１、ＫＬＦ４、ＳＯＸ２及びｃ－ＭＹＣ（ＯＫＳＭ）転写因子（ＴＦ）を送達して、２１日目再プログラム化中間体を入手した。代わりに、本発明者らは体細胞再プログラム化を、本明細書の実施例１１に更に記載するとおり、転写因子のｍＲＮＡトランスフェクションによって実施した。本発明者ら、実施例１２及び１３に記載するとおり、同様の手法を用いて別の体細胞を再プログラム化し得ることも実証し、従って再プログラム化中間体を本発明の方法における使用のために様々な体細胞から入手し得ることを確立した。

【0230】

中間体をＡｇｇｒｅＷｅｌｌシステムへと、ＷＮＴ活性化薬、ＴＧＦ－β阻害薬、ＨＤＡＣ阻害薬、ＥＧＦ及びＢＭＰ４を含有する培地に切り替えたとき（「方法」を参照されたい）（図１ａ）、中間体は凝集体を形成し始め、３日目から空洞を形成し、徐々に拡大した（図２ｂ）。５～６日目までに胚盤胞様構造体が明確になり（図１ｂ）、この構造体のＮＡＮＯＧに関する免疫蛍光染色により、ＮＡＮＯＧ陽性細胞を有する内部細胞塊（ＩＣＭ）様細胞内区画が胞胚腔様の空洞と共にＮＡＮＯＧ陰性細胞の外層に取り囲まれていることが明らかになった（図１ｃ）。この構造体は体細胞の再プログラム化によって直接得られたため、これを「ヒト誘導ブラストイド」（ｉＢｌａｓｔｏｉｄ）と称した。更に、ｉＢｌａｓｔｏｉｄのｘ軸及びｙ軸直径、ｘ：ｙアスペクト比並びに投影面積の測定値から、それが受精後胚齢５～７日目（Ｅ５～７）のヒト胚盤胞の既発表の測定値と同等のサイズを有することが明らかになった（図１ｄ～図１ｈ）。加えて、ｉＢｌａｓｔｏｉｄの細胞数は１００～４００の範囲であり、中央値は約２８０細胞であった。細胞数中央値はＥ５～７のヒト胚盤胞についての報告値（近似平均値２４０細胞）よりもやや大きいが、それでもなお、これまでＥ５～７胚盤胞について報告されている範囲内である（図１ｉ）。ｉＢｌａｓｔｏｉｄ形成効率を定量化するため１００個のランダムな構造体をカウントし、１４％が、胞胚腔の空洞を含む典型的な胚盤胞様形態を呈することが分かった（図２ｃ）。ＡｇｇｒｅＷｅｌｌシステムにおけるｉＢｌａｓｔｏｉｄ形成の間、ｉＢｌａｓｔｏｉｄの一部でない接着性の細胞クラスターがマイクロウェルの縁部に沿って一貫して観察された。これらは、再プログラム化培養物からの不応性線維芽細胞であると仮定された（図２ｄ）。これを確かめるため、この細胞クラスターを単離し、線維芽細胞培地で培養したところ、古典的線維芽細胞形態を持つ細胞の増殖が起こった（図２ｄ）。これは、この再プログラム化不応性線維芽細胞がｉＢｌａｓｔｏｉｄ形成に寄与しなかったことを示唆した。ＩＶＦ胚盤胞品質基準（良い＝１、普通＝２又は悪い＝３）を用いた（Ｔｈｅ Ｉｓｔａｎｂｕｌ ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ ｗｏｒｋｓｈｏｐ ｏｎ ｅｍｂｒｙｏ ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ：ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ａｎ ｅｘｐｅｒｔ ｍｅｅｔｉｎｇ．Ｈｕｍ．Ｒｅｐｒｏｄ．２６，１２７０－１２８３（２０１１）に記載される手法に従うｉＢｌａｓｔｏｉｄのスコア化によれば、ｉＢｌａｓｔｏｉｄには良い又は普通の評点が付き、平均スコアはＩＣＭについて１．７５及びＴＥについて１．６７であることが示された（図２ｉ～図２ｋ）。

【0231】

要約すれば、これらのデータは、再プログラム化中間体を使用して、構造的に胚盤胞と類似した「ｉＢｌａｓｔｏｉｄ」と名付けられるヒト胚盤胞様構造体を直接作成できることを実証している。

【0232】

実施例４－ｉＢｌａｓｔｏｉｄ特徴付けの材料及び方法
免疫蛍光染色
ｉＢｌａｓｔｏｉｄ／細胞を４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ、Ｓｉｇｍａ）に固定し、ＤＰＢＳ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）中０．５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（Ｓｉｇｍａ）で透過処理して、ブロッキング緩衝液（ＤＰＢＳ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）中３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（Ｓｉｇｍａ）＋０．１％Ｔｗｅｅｎ－２０（Ｓｉｇｍａ））でブロックした。この研究で使用した全ての抗体を以下の表に掲載する。

【0233】

【0234】

【0235】

例えば、使用した一次抗体：ブロッキング緩衝液中に調製したウサギ抗ＮＡＮＯＧポリクローナル（１：１００、Ａｂｃａｍ）、マウス抗ＣＤＸ２ ＩｇＧ１（１：５０、Ａｂｃａｍ）。一次抗体インキュベーションは振盪機上４℃で一晩行い、続いてｒｔｐインキュベーションを二次抗体（ブロッキング緩衝液中１：５００）と共に３時間行った。この研究で使用した二次抗体は、ＮＡＮＯＧについてヤギ抗ウサギＩｇＧ ＡＦ５５５（１：５００、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）又はヤギ抗ウサギＩｇＧ ＡＦ６４７（１：５００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＣＤＸ２についてヤギ抗マウスＩｇＧ ＡＦ４８８（１：４００、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）又はヤギ抗マウスＩｇＧ ＡＦ４８８（１：５００、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）であった。標識後、ｉＢｌａｓｔｏｉｄ／細胞をブロッキング緩衝液中５μｇ／ｍｌの濃度の４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール、二塩酸塩（ＤＡＰＩ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）で１時間染色した。ＳＰ８倒立共焦点顕微鏡（Ｌｅｉｃａ）又はＬＳＭ７８０多光子共焦点顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ）を使用して画像を取得した。

【0236】

共焦点イメージング及び解析
ＳＰ８倒立共焦点顕微鏡（Ｌｅｉｃａ）又はレーザー走査型共焦点（ＬＳＭ ７８０顕微鏡、Ｚｅｉｓｓ）をＣｏｎｆｏｃｏｒ ３モジュール（Ｚｅｉｓｓ）の水浸紫外可視赤外アポクロマート４０倍１．２ＮＡ対物レンズ及び高感度アバランシュフォトダイオード光検出器と共に使用して、免疫染色したｉＢｌａｓｔｏｉｄを画像化した。ｉＢｌａｓｔｏｉｄの３次元視覚化は、Ｉｍａｒｉｓ ９．５ソフトウェア（Ｂｉｔｐｌａｎｅ ＡＧ）を使用して実施した。細胞及びｉＢｌａｓｔｏｉｄのセグメンテーションには手動表面レンダリングモジュールを使用した。最終的な画像は、Ａｄｏｂｅ Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ又はＩｍａｇｅＪを使用して処理し、アセンブルした。

【0237】

蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）
ｉＢｌａｓｔｏｉｄをＴｒｙｐＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）で解離し、２％ＦＢＳ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）及び１０μＭ Ｙ－２７６３２（Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ）を補足したＤＰＢＳ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して試料を最終的に再懸濁した。解離された細胞を４００×ｇで５分間ペレット化し、次にヨウ化プロピジウム（ＰＩ）（Ｓｉｇｍａ）を２μｇ／ｍｌの濃度となるように加えて５００μｌの最終容積に再懸濁した。Ｉｎｆｌｕｘ機器（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）において１００μｍノズルで細胞選別を実行した。

【0238】

定量的ＲＴ－ＰＣＲ
ＲＮｅａｓｙマイクロキット（Ｑｉａｇｅｎ）又はＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）及びＱＩＡｃｕｂｅ（Ｑｉａｇｅｎ）を製造者の指示に従って使用して、細胞からＲＮＡを抽出した。次に、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ ｃＤＮＡ合成キット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）又はＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ逆転写キット（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号２０５３１１）を使用して逆転写を実施し、ＱｕａｎｔｉＦａｓｔ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してリアルタイムＰＣＲ反応をトリプリケートでセットアップし、次に７５００リアルタイムＰＣＲシステム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）で実行した。この研究で使用したｑＲＴ－ＰＣＲプライマーを以下の表に示す。

【0239】

【0240】

中胚葉分化
原始線条マーカーのｑＲＴ－ＰＣＲの陽性対照は、既発表の中胚葉分化プロトコル（Ｌａｍ，Ａ．Ｑ．ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．２５，１２１１－１２２５（２０１４））を修正することにより入手した。簡潔に言えば、Ｅ８培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）で５０％コンフルエンシーに成長させたヒトｉＰＳＣについて、ＲＰＭＩ、ＧｌｕｔａＭＡＸ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、１％Ｂ２７サプリメント（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、１％ペニシリン－ストレプトマイシン（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）及び５μＭ ＣＨＩＲ９９０２１（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）からなる培養培地に交換した。４８時間後、ｑＲＴ－ＰＣＲ解析のために分化細胞を回収したところ、原始線条マーカーＴＢＸＴ、エオメス及びＭＩＸＬ１が高発現していた（図８ｂ）。

【0241】

ｈＣＧ ＥＬＩＳＡ
ｉＢｌａｓｔｏｉｄの作成及びインビトロ付着アッセイを、以下の「インビトロ付着アッセイ」の実施例に記載するとおり実施した。ｉＢｌａｓｔｏｉｄ（６日目）及び付着したｉＢｌａｓｔｏｉｄ（６＋４．５日目）の両方について培地を回収し、－８０℃で保存した。ｈＣＧ ＥＬＩＳＡキット（Ａｂｎｏｖａ、ＡＢＮＯＫＡ４００５）を製造者の指示に従って使用して、培地中のｈＣＧレベルを測定した。

【0242】

ｉＢｌａｓｔｏｉｄのシングルセルＲＮＡシーケンシング（ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ）
ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ実験のため、上記の節に記載したとおりｉＢｌａｓｔｏｉｄを解離してＦＡＣＳのための単一細胞懸濁液を入手した。ＦＡＣＳに供する細胞は、ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑのためにＰＩ陰性のデブリのない単一生細胞を選別した。Ｃｈｒｏｍｉｕｍコントローラー（１０ｘ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）を製造者の指示「Ｃｈｒｏｍｉｕｍ Ｎｅｘｔ ＧＥＭ Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｅｌｌ ３’ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ Ｖ３．３ Ｕｓｅｒ Ｇｕｉｄｅ」に従って使用して、回収した細胞を単離、封入及び構築した。Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＮｏｖａＳｅｑ ６０００で、ペアエンド（Ｒ１ ２８ｂｐ及びＲ２ ８７ｂｐ）シーケンシング戦略を用いて、１細胞当たり２０，０００リードペアを目標にシーケンシングを行った。Ｃｈｒｏｍｉｕｍバーコードを使用してデマルチプレックス化し、Ｃｅｌｌｒａｎｇｅｒプログラム（ｖ３．１．０、ｈｔｔｐ：／／ｓｏｆｔｗａｒｅ．１０ｘｇｅｎｏｍｉｃｓ．ｃｏｍ／ｓｉｎｇｌｅ－ｃｅｌｌ／ｏｖｅｒｖｉｅｗ／ｗｅｌｃｏｍｅ）を使用してｍｋｆａｓｔｑパイプラインからＦＡＳＴＱファイルを作成した。アラインメント及びＵＭＩカウントはＣｅｌｌｒａｎｇｅｒを用いて実施したが、これはＳＴＡＲアライナー（Ｄｏｂｉｎ，Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２９，１５－２１（２０１３））を利用してシーケンシングリードをカスタムバージョンのＥｎｓｅｍｂｌ ＧＲＣｈ３７．８７参照ゲノムにマッピングするものであり、この参照ゲノムは、本発明者らがカスタムのセンダイＫＬＦ４、ＭＹＣ及びＳＥＶ（ＫＯＳ）ベクターの配列によって拡大したものであった。このステップの結果、９０６０個のユニークな細胞バーコードが得られる。

【0243】

ｉＢｌａｓｔｏｉｄ ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ細胞ドナー同定
細胞毎に個々のドナーのアイデンティティを決定するため、ベイズのデマルチプレックス化ツールＶｉｒｅｏ（ｖ０．３．２）を利用した（Ｈｕａｎｇ，Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ．２０，２７３（２０１９））。簡潔に言えば、本発明者らは、ｃｅｌｌＳＮＰ（ｖ０．３．０）を使用してシングルセルデータ中の発現したアレルをコンパイルし、アレル頻度最小値（引数ｍｉｎＭＡＦを使用）を０．１及び一意の分子識別子最小値（引数ｍｉｎＣＯＵＮＴを使用）を２０とした一塩基変異多型（ＳＮＰ）のリストを作成した。更に、ｃｅｌｌＳＮＰではＳＮＰをコールするためヒト変異体の参照リストが要求され、本発明者らは、Ｖｉｒｅｏの著者らが提供する１０００ゲノムプロジェクトからのプレコンパイルされたＳＮＰリスト（ｈｔｔｐｓ：／／ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔ／ｐｒｏｊｅｃｔｓ／ｃｅｌｌｓｎｐ／ｆｉｌｅｓ／ＳＮＰｌｉｓｔ／からダウンロード）を使用した。詳細には、７４０万個のＳＮＰを含む、マイナーアレル頻度＞０．０５のｈｇ１９ゲノムベースの変異体のリストを使用した。続いて、Ｖｉｒｅｏを実施して、細胞を２つのドナー集団に分けることによりシングルセルライブラリをデマルチプレックス化した。Ｖｉｒｅｏができるのは細胞をこれらの２ドナーに関して区別することのみであり、各細胞にドナーアイデンティティそのもの（３２Ｆ又は３８Ｆ）を割り付けることはできない点に留意されたい。

【0244】

ｉＢｌａｓｔｏｉｄ ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑセルコーリング、クオリティコントロール
初めに細胞レベルのクオリティコントロールを実施した。（ｉ）細胞系ドナーのエビデンスが両方あるか又はいずれもない細胞、（ｉｉ）発現した遺伝子の数［ｎＧｅｎｅ］が少ない細胞、又は（ｉｉｉ）ミトコンドリア遺伝子の割合［ｐｃｔＭＴ］が高い細胞は破棄した。破棄する細胞には、ｎＧｅｎｅ＜１，３００ ｐｃｔＭＴ＞１５のカットオフを適用した。次に、遺伝子レベルのクオリティコントロールを実施した。それぞれ少なくとも１リードの少なくとも５０細胞に存在しない場合に遺伝子をフィルタリングした。カットオフは、全て各変数の分布を調べた後に決定した。クオリティコントロール後、ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑに６８５８個の細胞及び１４２２４個の遺伝子が残る。

【0245】

ｉＢｌａｓｔｏｉｄ ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ解析
本節の残りの部分における解析は、Ｒ（ｖ３．６）５５をＳｅｕｒａｔ（ｖ３．１．５）と共に使用して行った（Ｂｕｔｌｅｒ，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３６，４１１－４２０（２０１８）；Ｓｔｕａｒｔ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ １７７，１８８８－１９０２．ｅ２１（２０１９））。バイオインフォマティクスプロットはｇｇｐｌｏｔ２（ｖ３．３．１）５８を使用して作成し、ヒートマップはｐｈｅａｔｍａｐ（ｖ１．０．１２）で作成した（Ｋｏｌｄｅ，Ｒ．＆Ｖｉｌｏ，Ｊ．Ｆ１０００Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｖｏｌ．４ ５７４（２０１５））。ＳｅｕｒａｔのＳＣＴｒａｎｓｆｏｒｍ関数（Ｈａｆｅｍｅｉｓｔｅｒ，Ｃ．＆Ｓａｔｉｊａ，Ｒ．Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ．２０，２９６（２０１９））を使用してデータのスケーリング及び正規化を行った。主成分分析（ＰＣＡ）後、２０次元を用いて均一マニホルド近似（ｕｎｉｆｏｒｍ ｍａｎｉｆｏｌｄ ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｉｏｎ：ＵＭＡＰ）を作成した。ＦｉｎｄＣｌｕｓｔｅｒｓ関数を０．２の分解能で使用して教師なしクラスタリングを実施したところ、７個の個別のクラスターが得られた。ＦｉｎｄＡｌｌＭａｒｋｅｒｓ関数により、ウィルコクソン順位和検定及び０．２５対数倍の最小アップレギュレーションを用いて、クラスター間で発現差異のある遺伝子（クラスターマーカー）を同定した。細胞型シグネチャ（ＥＰＩ、ＴＥ、ＰＥ、非再プログラム化（ＮＲ）の平均過剰発現を、ＡｄｄＭｏｄｕｌｅＳｃｏｒｅ関数及びＰｅｔｒｏｐｏｕｌｏｓ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ １６５，１０１２－１０２６（２０１６）及びＬｉｕ ｅｔ ａｌ（Ｎａｔｕｒｅ ２０２０ Ｓｅｐ １６．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓ４１５８６－０２０－２７３４－６）がそれぞれ発表した遺伝子シグネチャで計算した。カノニカルマーカー、Ｐｅｔｒｏｐｏｕｌｏｓ及びＬｉｕシグネチャをエビデンスとして使用して、細胞型を手動でクラスターに割り付けた。残りの細胞集団は「中間体」（ＩＭ）に分類して数え上げた（Ｒｏｓｓａｎｔ，Ｊ．＆Ｔａｍ，Ｐ．Ｐ．Ｌ．Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ｖｏｌ．２０ １８－２８（２０１７）；Ｈａｒｒｉｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５６，（２０１７）；Ｓｏｚｅｎ，Ｂ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２０，９７９－９８９（２０１８））。最後に、ｓｃｒａｎパッケージからのｃｙｃｌｏｎｅ関数（Ｓｃｉａｌｄｏｎｅ，Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ８５，５４－６１（２０１５））を使用して細胞周期スコアを計算し、最も高い確率に基づき細胞相を割り付けた。

【0246】

統合ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ解析
Ｐｅｔｒｏｐｏｕｌｏｓ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ １６５，１０１２－１０２６（２０１６）（Ｐｅｔｒｏｐｏｕｌｏｓ）及びＢｌａｋｅｌｅｙ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １４２，３６１３（２０１５）（Ｂｌａｋｅｌｅｙ）からの既発表のシングルセルデータセットを、ここで発表したｉＢｌａｓｔｏｉｄデータと統合した。初めに、ＮＲクラスターからの細胞をこの統合に無関係としてｉＢｌａｓｔｏｉｄデータから除去する。Ｐｅｔｒｏｐｏｕｌｏｓの合計１５２９細胞を胚盤胞細胞に関してフィルタリングして胚盤胞期前のものを除去すると、１０９６個のＥ５～Ｅ７ ＥＰＩ、ＴＥ及びＰＥ細胞が残った。Ｐｅｔｒｏｐｏｕｌｏｓのデータ及びＢｌａｋｅｌｅｙの３０個の細胞を、ＳＣＴｒａｎｓｆｏｒｍを用いて処理した。ＳＣＴアッセイに由来する４０００個のアンカー遺伝子を使用して統合遺伝子を同定した後（ＦｉｎｄＩｎｔｅｇｒａｔｉｏｎＡｎｃｈｏｒｓ及びＩｎｔｅｇｒａｔｅＤａｔａ）、両方のデータセットをｉＢｌａｓｔｏｉｄデータに統合した。この統合データセットは、７８６１個の細胞、２３３０８個の遺伝子及び４０００個の統合遺伝子を有する。ＰＣＡ及びＵＭＡＰ（２０次元）を用いて次元削減し、ＦｉｎｄＣｌｕｓｔｅｒｓを用いてクラスターを同定する（分解能０．２）。エビデンスとしての３つ全てのデータセットからの細胞アイデンティティの共局在性並びにマーカー及びシグネチャ発現を用いて５個の個別のクラスターについてのクラスターアイデンティティを手動で割り付けた。統合遺伝子発現値及びピアソン相関を用いて、ａ）同じ元の細胞アイデンティティ（ＢｌａｋｅｌｅｙについてはｉＢｌａｓｔｏｉｄ、ＥＰＩ、ＴＥ、ＰＥのクラスターｉｄ、ＰｅｔｒｏｐｏｕｌｏｓについてはＥ５～７ ＥＰＩ、ＴＥ、ＰＥ）、又はｂ）同じ細胞型（全てのＥＰＩ、ＴＥ、ＰＥ細胞の凝集体及び加えてｉＢｌａｓｔｏｉｄについてはＩＭ）の全ての細胞の平均遺伝子発現値でトランスクリプトーム相関を計算した。

【0247】

インビトロ付着アッセイ
ｉＢｌａｓｔｏｉｄの作成を上記の実施例３に記載されるとおり実施した。インビトロ付着アッセイ（これは胚着床モデルとして使用されることが多い）を、既発表のプロトコル（Ｓｈａｈｂａｚｉ，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１８，７００－７０８（２０１６）；Ｄｅｇｌｉｎｃｅｒｔｉ，Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ５３３，２５１－２５４（２０１６））に適合させることにより実施した。簡潔に言えば、得られたｉＢｌａｓｔｏｉｄを光学グレードの組織培養プレート（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）に移し、３７℃、５％Ｏ_２及び５％ＣＯ_２インキュベーターにおいてＩＶＣ１培地で培養した。付着アッセイの２日目、培養培地をＩＶＣ２培地に切り替えた。ｉＢｌａｓｔｏｉｄは付着アッセイで４．５日目まで培養し、分析のため回収した。このインビトロ付着アッセイに使用した培養培地の詳細は、実施例２にまとめる。

【0248】

統計及び再現性
図２ａについて、４，７６１細胞で、先行研究（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ（Ｎａｔｕｒｅ ２０２０ Ｓｅｐ １６．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓ４１５８６－０２０－２７３４－６）から入手される２１日目線維芽細胞再プログラム化中間体ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑデータを再分析した。ｉＢｌａｓｔｏｉｄ ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑデータについては、この研究で使用した全ての分析に、ｎ＝２バイオロジカルレプリケートから入手される合計６８５８細胞を組み入れた。この研究で使用したヒト胚盤胞のｓｃＲＮＡ－ｓｅｑデータセットについては、Ｐｅｔｒｏｐｏｕｌｏｓデータセットから合計１０９６細胞を採用し、Ｂｌａｋｅｌｅｙデータセットから合計３０細胞を分析に採用した。ｉＢｌａｓｔｏｉｄ及びヒト胚盤胞統合データセットについては、合計７８６１細胞を分析に使用した。図１ｂについては、ｉＢｌａｓｔｏｉｄは２つの独立した再プログラム化実験の３つの異なるドナー線維芽細胞から作成し（ｎ＝５バイオロジカルレプリケート）、この図には代表的な画像を示した。図１ｃについては、２つの独立した再プログラム化実験の３例の異なるドナーからのｉＢｌａｓｔｏｉｄで免疫染色を実施し（ｎ＝５バイオロジカルレプリケート）、同様の結果が得られ、この図には代表的な画像を示した。図１ｅ～図１ｈについては、ヒト胚盤胞のデータは、８文献を参照する（ｎ＝８）一方、ｉＢｌａｓｔｏｉｄに関する様々なパラメータの定量化は、それぞれ３例の異なるドナーから入手した１８個の独立したｉＢｌａｓｔｏｉｄで行った（ｎ＝１８バイオロジカルレプリケート）。図１ｉについては、３例の異なるドナーから入手した１４個の独立したｉＢｌａｓｔｏｉｄで細胞数定量化を実施した（ｎ＝１４バイオロジカルレプリケート）。図１ｊ～図１ｌについては、２つの独立した再プログラム化実験の３例の異なるドナーからのｉＢｌａｓｔｏｉｄで免疫染色を実施し（ｎ＝５バイオロジカルレプリケート）、同様の結果が得られ、この図には代表的な画像を示した。図１ｍについては、３例の異なるドナーからのｉＢｌａｓｔｏｉｄで免疫染色を実施し（ｎ＝３バイオロジカルレプリケート）、同様の結果が得られ、この図には代表的な画像を示した。図１ｎ～図１ｒについては、２例の異なるドナーからのｉＢｌａｓｔｏｉｄで免疫染色を実施し（ｎ＝２バイオロジカルレプリケート）、同様の結果が得られ、この図には代表的な画像を示した。ｉＢｌａｓｔｏｉｄには、外側ＴＥ様細胞を有する緻密なケラチン８（ＫＲＴ８）線維組織も観察され、これは、胚盤胞で典型的に観察されるものと一致した（図１ｓ）。

【0249】

図７ａについては、２つの独立した再プログラム化実験の３個の異なるドナー線維芽細胞に由来するｉＢｌａｓｔｏｉｄを使用してインビトロ付着アッセイを実施し（ｎ＝５バイオロジカルレプリケート）、この図には代表的な画像を示した。図７ｂ～図７ｃについては、２例の異なるドナーからのｉＢｌａｓｔｏｉｄで免疫染色を実施し（ｎ＝２バイオロジカルレプリケート）、同様の結果が得られ、この図には代表的な画像を示した。図７ｅについては、２つの独立した再プログラム化実験の２例の異なるドナーからのｉＢｌａｓｔｏｉｄで免疫染色を実施し（ｎ＝４バイオロジカルレプリケート）、同様の結果が得られ、この図には代表的な画像を示した。図７ｆ～図７ｇについては、２例の異なるドナーからのｉＢｌａｓｔｏｉｄで免疫染色を実施し（ｎ＝２バイオロジカルレプリケート）、同様の結果が得られ、この図には代表的な画像を示した。図７ｈについては、ｎ＝５の独立した実験においてテクニカルレプリケートでＣＳＨ１及びＩＴＧＡ１の発現変化倍数を測定した。データは平均値±ｓ．ｅ．ｍとして表す。図７ｉについては、ｎ＝４の独立した実験においてテクニカルレプリケートでｈＣＧ ＥＬＩＳＡを行った。データは平均値±ｓ．ｅ．ｍとして表す。図２ｂについては、２つの独立した再プログラム化実験の３個の異なるドナー線維芽細胞からｉＢｌａｓｔｏｉｄを作成し（ｎ＝５バイオロジカルレプリケート）、この図には代表的な画像を示した。図２ｃについては、入手した１００個の独立した３次元構造体をカウントすることにより、ｉＢｌａｓｔｏｉｄ効率の定量化を行った（ｎ＝１００バイオロジカルレプリケート）。図２ｄについては、３例の異なるドナーからのｎ＝３バイオロジカルレプリケートで実験を実施し、同様の結果が得られ、この図には代表的な画像を示した。図２ｅについては、２つの独立した再プログラム化実験の３例の異なるドナーからのｉＢｌａｓｔｏｉｄで免疫染色を実施し（ｎ＝５バイオロジカルレプリケート）、同様の結果が得られ、この図には代表的な画像を示した。図２ｆ～図２ｇについては、２例の異なるドナーからのｉＢｌａｓｔｏｉｄで免疫染色を実施し（ｎ＝２バイオロジカルレプリケート）、同様の結果が得られ、この図には代表的な画像を示した。図８ｂについては、２例のドナーからのｎ＝６の独立した実験においてテクニカルレプリケートでＴＢＸＴ、エオメス、ＭＩＸＬ１の発現変化倍数を測定した。データは平均値±ｓ．ｅ．ｍとして表す。図８ｃについては、２つの独立した再プログラム化実験の３例の異なるドナーからのｉＢｌａｓｔｏｉｄで免疫染色を実施し（ｎ＝５バイオロジカルレプリケート）、同様の結果が得られ、この図には代表的な画像を示した。図８ｄについては、３例の異なるドナーからのｉＢｌａｓｔｏｉｄで免疫染色を実施し（ｎ＝３バイオロジカルレプリケート）、同様の結果が得られ、この図には代表的な画像を示した。図８ｅ～図８ｆについては、２例の異なるドナーからのｉＢｌａｓｔｏｉｄで免疫染色を実施し（ｎ＝２バイオロジカルレプリケート）、同様の結果が得られ、この図には代表的な画像を示した。

【0250】

実施例５－ｉＢｌａｓｔｏｉｄの特徴付けの結果
ｉＢｌａｓｔｏｉｄ内の細胞のアイデンティティ及び空間的局在性を更に確認するため、本発明者らは、ＥＰＩマーカーＮＡＮＯＧ及びＴＥマーカーＣＤＸ２の共免疫染色を実施した。次に本発明者らは共焦点イメージングを適用及び解析することにより、ｉＢｌａｓｔｏｉｄの三次元（３Ｄ）表現を入手した。結果は、ＮＡＮＯＧ陽性細胞がもっぱらＩＣＭ様区画に局在する一方、ＣＤＸ２陽性細胞はＴＥに似た外層に見られることを示している（図１ｊ）。

【0251】

微分干渉コントラスト（ＤＩＣ）像及び蛍光像の３次元再構成及びオーバーレイにより、ＮＡＮＯＧ陽性及びＣＤＸ２陽性細胞の空間的局在性が確認され、且つ胚盤胞と類似したｉＢｌａｓｔｏｉｄ構造体に形成された胞胚腔様の空洞の存在が確認された（Ｓｈａｈｂａｚｉ，Ｍ．Ｎ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１８，７００－７０８（２０１６）、Ｄｅｇｌｉｎｃｅｒｔｉ，Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ５３３，２５１－２５４（２０１６）；Ｘｉａｎｇ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ５７７，５３７－５４２（２０２０）（図１ｋ、図１ｌ）。ｉＢｌａｓｔｏｉｄ構造体の起源（即ち再プログラム化された線維芽細胞に由来すること）と一致して、透明帯は観察されなかった。重要なことに、本発明者らは、２つの追加的な線維芽細胞ドナーから作成されたｉＢｌａｓｔｏｉｄのこれらの結果を複数回のｉＢｌａｓｔｏｉｄ作成ラウンドで確認することができた（図２ｅ）。

【0252】

ｉＢｌａｓｔｏｉｄのＥＰＩ及びＴＥ様細胞を更に特徴付けるため、本発明者らは、ｉＢｌａｓｔｏｉｄにおいて２つの追加的なＥＰＩマーカー（ＯＣＴ４、別名ＰＯＵ５Ｆ１及びＳＯＸ２）及びＴＥマーカー（ＧＡＴＡ２）の組み合わせを試験した。ヒト胚盤胞について記載されるとおり（Ｆｏｇａｒｔｙ，Ｎ．Ｍ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ５５０，６７－７３（２０１７）；Ｂｏｒｏｖｉａｋ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １４５，（２０１８））、外側ＴＥ様細胞はＧＡＴＡ２陽性であった一方、ＩＣＭ様区画にＯＣＴ４及びＳＯＸ２の顕著な共局在が見られた（図１ｍ）。ｉＢｌａｓｔｏｉｄにおけるＰＥ様細胞の存在を評価するため、本発明者らは、初めにＰＥマーカーであるＳＯＸ１７の免疫染色を、ＧＡＴＡ２（ＴＥマーカー）及びＮＡＮＯＧ（ＥＰＩマーカー）と並行して実施した。本発明者らは、ＩＣＭ様区画内において、ＮＡＮＯＧ陽性細胞の周囲にあるＳＯＸ１７陽性細胞を同定し（図１ｎ、図２ｆ）、これはＥ６～７胚盤胞について既報告のものと類似していた（Ｘｉａｎｇ 前掲；Ｗａｍａｉｔｈａ，Ｓ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．１１，７６４（２０２０））。

【0253】

更なる検証のため、本発明者らは、別のＰＥマーカー、ＧＡＴＡ６を使用して、ＣＤＸ２（ＴＥマーカー）及びＯＣＴ４（ＥＰＩマーカー）と組み合わせた追加的な免疫染色を実施した。本発明者らは、ＴＥ様区画に、ＧＡＴＡ６染色とＣＤＸ２染色の共局在によって指示されるとおりの「ごま塩状」のパターンを認めた（図１ｏ、図２ｇ）。当初は不可解であったものの、このパターンは以前にも報告されており、そこではＥ６～７ヒト胚盤胞においてもＧＡＴＡ６が遍在的に検出されている（Ｄｅｇｌｉｎｃｅｒｔｉ、前掲；Ｒｏｏｄｅ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍａｎ ｈｙｐｏｂｌａｓｔ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｓ ｎｏｔ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｏｎ ＦＧＦ ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．３６１，３５８－３６３（２０１２）；Ｋｕｉｊｋ，Ｅ．Ｗ．ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ｒｏｌｅｓ ｏｆ ＦＧＦ ａｎｄ ＭＡＰ ｋｉｎａｓｅ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｉｎ ｔｈｅ ｓｅｇｒｅｇａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｅｐｉｂｌａｓｔ ａｎｄ ｈｙｐｏｂｌａｓｔ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅａｇｅｓ ｉｎ ｂｏｖｉｎｅ ａｎｄ ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｓ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １３９，８７１－８８２（２０１２））。重要なことに、調べを進めると、本発明者らはＩＣＭ様区画にＯＣＴ４陽性細胞に隣接するＧＡＴＡ６陽性細胞（ＣＤＸ２低染色又は弱染色を伴う）を観察したことから、ｉＢｌａｓｔｏｉｄにＧＡＴＡ６陽性ＰＥ様細胞が存在する可能性が示唆される（図１ｏ）。

【0254】

ヒト胚盤胞では、ＴＥ系統とＥＰＩ系統との細胞には細胞形態学的に明確な差異があり、ＴＥ細胞は、「古典的な」細長い上皮形態を示す一方、ＥＰＩ細胞は、ＩＣＭの制約に起因して、より小型で密集している（Ｋｏｖａｃｉｃ，Ｂ．，Ｖｌａｉｓａｖｌｊｅｖｉｃ，Ｖ．，Ｒｅｌｊｉｃ，Ｍ．＆Ｃｉｚｅｋ－Ｓａｊｋｏ，Ｍ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｏｎｌｉｎｅ ８，６８７－６９４（２００４））。ｉＢｌａｓｔｏｉｄにおいてＥＰＩ様細胞とＴＥ様細胞との細胞形態に何らかの差異があるかどうかを調べるため、本発明者らは、ｉＢｌａｓｔｏｉｄに対して細胞膜マーカーＦ－アクチン（別名ファロイジン）を利用して細胞構成を可視化した（図１ｐ～図１ｒ）。結果は、コンパクトなＮＡＮＯＧ陽性ＥＰＩ様細胞がより円柱状の外観を有した一方、胞胚腔の空洞を取り囲むＴＥ様細胞が扁平であったことを示しており、このモデルがＥＰＩ細胞とＴＥ細胞との細胞構成の差異を再現可能であることが強調される（図１ｑ）。まとめると、これらの結果は、ｉＢｌａｓｔｏｉｄがＥ６～７のヒト胚盤胞の主要な形態学的特徴を呈し、ＥＰＩ、ＴＥ及びＰＥ細胞の鍵となる分子的及び空間的側面をモデル化もできることを実証している。

【0255】

実施例６－ｉＢｌａｓｔｏｉｄの単一細胞トランスクリプトームプロファイリング
ｉＢｌａｓｔｏｉｄにおける細胞の転写構成を更に特徴付けるため、本発明者らは、２例のドナーから作成したｉＢｌａｓｔｏｉｄを使用してシングルセルＲＮＡシーケンシング（ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ）を実施した（図３ａ）。クオリティコントロール及びストリンジェントなフィルタリング後、下流分析のために６８５８個の細胞が確保され（ドナー１から３２４９個及びドナー２から３６０９個の細胞）、合計１４２２４個の遺伝子が検出された（図４ａ）。このｓｃＲＮＡ－ｓｅｑデータの均一マニホルド近似投影（ＵＭＡＰ）解析により、ドナー又は細胞周期の差異に基づくクラスタリングなしに細胞が均等に分布していることが示された（図４ｂ、図４ｃ）。センダイ－ＫＬＦ４転写物を検出することができたが、ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑデータにセンダイ－ＫＯＳ及びセンダイ－ＭＹＣ発現が最小限にのみあり（図４ｄ）、外因性ＯＣＴ４及びＳＯＸ２が発現しなかったか又は極めて低い発現レベルであったことが示された。

【0256】

ＵＭＡＰで推定ＥＰＩ、ＴＥ及びＰＥ細胞クラスターを同定するため、本発明者らは、本発明者らのｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ ｉＢｌａｓｔｏｉｄデータセットでＥＰＩマーカー（ＮＡＮＯＧ及びＯＣＴ４／ＰＯＵ５Ｆ１）、ＴＥマーカー（ＣＤＸ２及びＧＡＴＡ２）及びＰＥマーカー（ＳＯＸ１７及びＧＡＴＡ６）の発現を調べた。図３ｂに示されるとおり、ＯＣＴ４及びＮＡＮＯＧ発現細胞は、ＵＭＡＰ空間内で個別的な領域を占める。これについて、より多くの細胞は、ＮＡＮＯＧよりも内因性ＯＣＴ４を発現し、これは、ヒト胚盤胞で観察される特質である（「方法」を参照されたい）（図４ｅ）。ＳＯＸ１７及びＧＡＴＡ６発現細胞は、ＵＭＡＰ上の限定された領域にも見られた一方、本発明者らは、ＣＤＸ２及びＧＡＴＡ２の発現がより不均一であることを認め、これは、Ｅ５～７ヒト胚盤胞から作成されるｓｃＲＮＡ－ｓｅｑデータセットにおいても同様に観察される（図３ｂ、図４ｅ）。

【0257】

ｉＢｌａｓｔｏｉｄにおける細胞アイデンティティ並びにＥＰＩ、ＴＥ及びＰＥ系統の存在を更に確認するため、本発明者らは、Ｅ５～７ヒト胚盤胞のそのｓｃＲＮＡ－ｓｅｑを使用した、Ｐｅｔｒｏｐｏｕｌｏｓ 前掲に定義されている一組のＥＰＩ、ＴＥ及びＰＥ特異的遺伝子シグネチャに基づくスコアリングシステムを適用した（図３ｃ）。これらの定義されたシグネチャを使用して、本発明者らは、ｉＢｌａｓｔｏｉｄデータセットのＵＭＡＰで個別的なＥＰＩ、ＴＥ及びＰＥ細胞集団を解いた。ｉＢｌａｓｔｏｉｄ及び胚盤胞ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑデータセットでＥ５、Ｅ６及びＥ７別に分けたＥＰＩ、ＴＥ及びＰＥシグネチャを更に調べると、無視できる程度の差異のみが示される（図５ａ～図５ｂ）。まとめると、これらの結果により、ｉＢｌａｓｔｏｉｄにおけるＥＰＩ、ＴＥ及びＰＥ様細胞の存在が確認される。

【0258】

実施例７－ｉＢｌａｓｔｏｉｄは胚盤胞と転写的に類似している
ｉＢｌａｓｔｏｉｄ内の細胞のアイデンティティを更に解くため、本発明者らは、教師なしクラスタリング分析を実施して、７つの細胞クラスターを同定した（図３ｄ）。ＥＰＩ、ＴＥ及びＰＥ遺伝子シグネチャに基づいて、これらのクラスターを、ＥＰＩクラスター、ＴＥクラスター又はＰＥクラスターとして割り付けた。残りの３つのクラスターは、先験的に明確なアイデンティティを有しなかったものであり、中間体シグネチャ（クラスターＩＭ１～３）を有するように見える（図６ａ～図６ｂ、図３ｄ）。これらの残りのクラスターは、混合型転写シグネチャを有する細胞の例である。興味深いことに、クラスターＩＭ１は、ＣＤＸ２並びに外因性ＫＬＦ４を高度に発現し（図３ｂ、図４ｄ）、これは、それらの細胞がＴＥ様細胞になる途中であることを示唆し得る。同様に、ＥＰＳＣから作成されるマウスブラストイドは、ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑトランスクリプトームプロファイリングによって明らかになるとおり、中間体の又は定義付けられていないシグネチャの細胞クラスターを有する。本発明者らは、再プログラム化されてない不応性線維芽細胞に相当する細胞塊も観察した（図４ｆ、図４ｇ）。これについて、この小型の線維芽細胞クラスターは下流分析から除外した。

【0259】

ヒト胚盤胞のＴＥ細胞は、胚発生中に極ＴＥと壁ＴＥとに指定される。ｉＢｌａｓｔｏｉｄにおいて、Ｐｅｔｒｏｐｏｕｌｏｓ ｅｔ ａｌが定義する極ＴＥ及び壁ＴＥシグネチャを調べたところ、ｉＢｌａｓｔｏｉｄは２つの個別的なＴＥ細胞集団を有し、一方がより高い極ＴＥ関連シグネチャを発現し、もう一方が壁ＴＥシグネチャを発現することが示された（図３ｊ、図３ｋ、図３ｌ）。極マーカー、ＣＣＲ７１３の免疫染色分析によっても、ｉＢｌａｓｔｏｉｄの極側でより高発現であることが示唆された（図３ｍ、図３ｎ）。

【0260】

ＩＶＦ後に作成される胚盤胞の細胞にｉＢｌａｓｔｏｉｄの細胞がどの程度類似しているかを決定するため、本発明者らは、ｉＢｌａｓｔｏｉｄ ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑを、Ｌａｎｎｅｒ ａｎｄ Ｎｉａｋａｎのグループによって以前に報告されたヒト胚盤胞から入手される２つの追加的なｓｃＲＮＡ－ｓｅｑデータセットと統合した。Ｌａｎｎｅｒのグループのデータセットは、トリチュレートした細胞にＳｍａｒｔ－ｓｅｑ２を用いて作成されたものであり、Ｅ５～７の試料のサブセットが免疫手術でＩＣＭ細胞に関して濃縮されている。Ｎｉａｋａｎグループのデータセットについては、レーザー生検によるマイクロマニピュレーションを用いて胚盤胞からＩＣＭ及び極ＴＥが分離され、単離した単一細胞からｃＤＮＡが作成され、シーケンシングされた。ＵＭＡＰ分析により、胚盤胞とｉＢｌａｓｔｏｉｄとの細胞間での高い一致が明らかになった（図３ｅ、図３ｆ、図６ｃ、図６ｄ）。重要なことに、ＥＰＩ－ｉＢｌａｓｔｏｉｄクラスター、ＴＥ－ｉＢｌａｓｔｏｉｄクラスター及びＰＥ－ｉＢｌａｓｔｏｉｄクラスターからの細胞は、胚盤胞からのそのＥＰＩ、ＰＥ及びＴＥ対応物と重複している（図３ｅ）。これらの細胞集団を更に特徴付けるため、教師なしクラスタリングを実施したところ（図３ｇ、図３ｈ）、ｉＢｌａｓｔｏｉｄからのＰＥ、ＥＰＩ及びＴＥ様細胞が胚盤胞からのＰＥ、ＥＰＩ及びＴＥ細胞と同じクラスターを共有することが確認された。これについて、本発明者らは、一部の胚盤胞ＴＥ細胞がＩＭ１－ｉＢｌａｓｔｏｉｄクラスターの細胞と共にクラスタリングされたことも観察した（図３ｅ）。更には、ｉＢｌａｓｔｏｉｄ ＥＰＩ、ＴＥ及びＰＥクラスターとＥ５～７胚盤胞からのアノテーション付きＥＰＩ、ＴＥ及びＰＥ細胞との相関分析により、ｉＢｌａｓｔｏｉｄクラスターとそれらの胚盤胞対応物との間の高い相関（約０．９）が明らかになった（図３ｉ）。本発明者らは、ｉＢｌａｓｔｏｉｄ細胞クラスターをＰｅｔｒｏｐｏｕｌｏｓデータセット中の異なる発生日齢（Ｅ５、Ｅ６及びＥ７）の胚盤胞からのＥＰＩ、ＴＥ及びＰＥ細胞と相関付け、ｉＢｌａｓｔｏｉｄクラスターとＥ５～７胚盤胞期のそれぞれのＥＰＩ／ＴＥ／ＰＥ系統との相関を観察した（図６ｅ）。階層クラスタリング分析では、ｉＢｌａｓｔｏｉｄ ＥＰＩクラスターと初期胚盤胞ＥＰＩ（Ｅ５及びＥ６）との相関がより良好であることが示唆される。まとめると、このデータは、ｉＢｌａｓｔｏｉｄの細胞が、Ｅ５～６のヒト胚盤胞に存在するこれら３つの細胞系統の転写構成を忠実に再現することを実証している。

【0261】

実施例８－ｉＢｌａｓｔｏｉｄはインビトロ着床をモデル化することができる
ヒト胚発生の着床前後及び着床後初期ウィンドウの間に起こる形態学的及び分子的変化を子宮の非存在下でモデル化するためにｉＢｌａｓｔｏｉｄを使用することができるかどうかを評価するため、本発明者らは、ヒト胚盤胞を使用した既発表のヒト胚付着培養を修正することにより、インビトロ付着アッセイを実施した。現在のところ、ヒトブラストイドモデルで作業する先例はないが、実験は、全て施設内ヒト研究倫理委員会によって承認され、既発表の推奨に従って、且つヒト胚の培養を受精後１４日及び／又は原始線条（ＰＳ）の形成のいずれか早い方までとする国際合意を順守した。出発線維芽細胞が成人ドナーに由来したことを考えると、ｉＢｌａｓｔｏｉｄには「１４日ルール」を適用できないことを所与として、本発明者らは、国際的ガイドラインの範囲内に十分に留まるように、ｉＢｌａｓｔｏｉｄの培養を可能な最小限の時間、この場合、最大でも５日の追加日数（約Ｅ１１に相当）とすることと、ＰＳの形態学的エビデンスの前に実験を終了することとに焦点を置いた。ＰＳ形成の分子的エビデンスを除外するため、本発明者らは、５日間胚付着培養の間に幾つかの鍵となる原始線条マーカーのｑＲＴ－ＰＣＲ ２４時間経時解析を実施し、ＴＢＸＴ、エオメス若しくはＭＩＸＬ１の上方制御又は原腸形成を指示するいかなる形態学的変化も認めなかった（図８ｂ）。従って、５日間のｉＢｌａｓｔｏｉｄ付着培養では、ＥＰＩ区画はＰＳの形成まで進まなかった。それにも関わらず、上記のパラメータを厳密に順守することにより、本発明者らは以降の全てのヒトｉＢｌａｓｔｏｉｄ付着培養実験をｉＢｌａｓｔｏｉｄ形成後合計４．５日間実施した。

【0262】

付着培養モデルを使用すると、ヒト胚盤胞において報告されているものと同様に、ほとんどのｉＢｌａｓｔｏｉｄ（＞９０％）が２４時間以内に付着し、サイズが増加し、扁平化し、増殖体の形成まで進んだ（図７ａ）。付着後、ＮＡＮＯＧ及びＯＣＴ４／ＳＯＸ２陽性細胞の数が増加したことから、ヒト胚盤胞を使用したときに観察されているものと同様に、ｉＢｌａｓｔｏｉｄ ＥＰＩの拡大が示される（図８ｃ、図８ｄ）。更に、付着時にＣＤＸ２及びＧＡＴＡ２陽性細胞も広がり（図８ｃ、図８ｄ）、このことから、付着したｉＢｌａｓｔｏｉｄのＴＥ増殖体が示された。同様の結果は、２例の追加的なドナーから作成したｉＢｌａｓｔｏｉｄを使用しても得られた（図示せず）。次に、本発明者らは、付着後のＰＥ様細胞の分布を調べた。その多くはなおもＴＥマーカー（ＧＡＴＡ２又はＣＤＸ２）と共染色されたが、本発明者らは、一部のＳＯＸ１７及びＧＡＴＡ６陽性細胞がＮＡＮＯＧ又はＯＣＴ４陽性ＥＰＩの周囲に局在することを認めた（図７ｂ、図７ｃ、図８ｅ、図８ｆ）。

【0263】

以前、インビトロ付着時にヒト胚盤胞のＥＰＩ細胞が分極し、原始羊膜腔として公知の管腔を形成することが報告されている。Ｆ－アクチン、ＯＣＴ４及びａＰＫＣ免疫染色により、組織化したＯＣＴ４陽性細胞によって半径方向に取り囲まれる約２０～３０％の付着したｉＢｌａｓｔｏｉｄのＥＰＩ区画内に中心管腔（Ｆ－アクチン及びａＰＫＣでマーキングされる）があることが示された（図７ｄ）。本発明者らは、付着３日目にＥＰＩ様細胞の分極及び原始羊膜腔様の空洞の発生を観察した。

【0264】

次に本発明者らは、付着時におけるＴＥ系統の可能な細胞運命移行を調査した。顕著なことに、本発明者らは、付着したｉＢｌａｓｔｏｉｄにＴＥ細胞の高強度線維状ケラチンＫＲＴ７（汎栄養膜細胞マーカー）染色を見出し、これは付着培養前のｉＢｌａｓｔｏｉｄにおける暗染の限定的なＫＲＴ７染色とは対照的であった（図７ｅ）。これらの結果は、ヒト胚盤胞を培養したときにも報告された、ＴＥ細胞状態が栄養膜細胞系統に移行することを示唆している。重要なことに、本発明者らは、付着したｉＢｌａｓｔｏｉｄにおいてＥＰＩ様区画を取り囲む細胞が、ＥＰＩの細胞と比較して大きい核体積を有することを観察したが、これは栄養膜細胞を指示するものである（図７ｆ）。注目すべきことに、本発明者らは、付着したｉＢｌａｓｔｏｉｄの周囲にあるそれぞれの多核性表現型及び紡錘様形態によって実証されるとおり、一部の細胞が形態学的に合胞体栄養膜細胞（ＳＴ）及び絨毛外栄養膜細胞（ＥＶＴ）に似ていることを見出した（図７ｆ）。

【0265】

ＳＴ及びＥＶＴ様細胞の存在を更に検証するため、本発明者らは、ＳＴマーカーとしてｈＣＧを使用し、ＥＶＴマーカーとしてＭＭＰ２を使用して、免疫染色を実施した（図７ｇ）。本発明者らは、ＳＴの初期発生を反映した、ｈＣＧに関する強力で広範な染色を検出した；一方、ＥＶＴが着床期において遅れて発生することと一致して、ＭＭＰ２は少ない細胞数で検出された（図７ｇ）。加えて、ｑＲＴ－ＰＣＲ解析によっても、付着に伴うＳＴマーカーＣＳＨ１及びＥＶＴマーカーＩＴＧＡ１１７の上方制御が明らかになったことから、ｉＢｌａｓｔｏｉｄ ＴＥ細胞がＳＴ及びＥＶＴ様状態に分化し得ることが示される（図７ｈ、図１０）。

【0266】

最後に、本発明者らは、付着したｉＢｌａｓｔｏｉｄから回収した馴化培地でｈＣＧ ＥＬＩＳＡを実施し、付着後４．５日でｈＣＧ量の１０倍の増加を検出した（図７ｉ）。まとめると、これらの結果は、ｉＢｌａｓｔｏｉｄを使用して胚盤胞に類似したインビトロ着床をモデル化できることを示しており、それが、ヒトにおける胚発生の着床前後及び着床後初期段階の分析を実現可能にする価値あるモデルシステムであるという事実が強調される。

【0267】

ここで、本発明者らは、インビトロヒト胚盤胞モデルシステムを提示する。マウスブラストイドの作成に用いられる手法と異なり、本発明者らは、線維芽細胞をｉＢｌａｓｔｏｉｄに直接再プログラム化することに基づくヒトｉＢｌａｓｔｏｉｄの作成戦略を開発した。従って、この手法によれば、ヒト胚盤胞に存在する３つの幹細胞型を集合前に誘導し及び増大させる必要はない。ｉＢｌａｓｔｏｉｄは、胚性供給源からの幹細胞から作成されるのでなく、体細胞から作成されるため、本発明者らは、このことにより、過去にｉＰＳＣが受け入れられたように、ｉＢｌａｓｔｏｉｄがモデルとして広く受け入れられることが容易になるであろうと予想する。本明細書に示されるとおり、ｉＢｌａｓｔｏｉｄは、空洞形成を伴うＴＥ及びＥＰＩ様層を含め、ヒト胚盤胞発生の統合モデルを忠実に再現することができると共に、ヒト胚盤胞内での細胞型の空間的配置も再現することができる（図１）。更には、ｉＢｌａｓｔｏｉｄ細胞はヒト胚盤胞の細胞と転写的に類似しており（図３～図６）、それを、ヒト胚盤胞の着床過程における鍵となる機能的特性の一部をインビトロでモデル化するために使用することもできる（図７）。

【0268】

転写解析に基づくと、ｉＢｌａｓｔｏｉｄのＥＰＩ様細胞は、胚盤胞からのＥ５／Ｅ６ ＥＰＩ細胞に対応する一方、ＰＥ及びＴＥ様細胞は、Ｅ７段階との相関がより良好である。これは、ｉＢｌａｓｔｏｉｄ間での一部の細胞の不均一性を反映している可能性があるか、又はｉＢｌａｓｔｏｉｄモデルにおいてこれらの３系統が完全に同期しているわけではない可能性を提起する。ｉＢｌａｓｔｏｉｄからのＴＥ、ＥＰＩ及びＰＥ様細胞は、再プログラム化因子を発現しなかったが、本発明者らは、ｉＢｌａｓｔｏｉｄの細胞のクラスター（ＩＭ－１、２クラスター）がなおも外因性ＫＬＦ４遺伝子を発現することを見出した。これらの細胞はＣＤＸ２及びＧＡＴＡ６も発現したが、強力なＴＥ又はＰＥシグネチャ全般は見られず、恐らく外因性ＫＬＦ４の共発現に起因したものと思われる。しかしながら、ＩＭ－１クラスターは、Ｅ６－ＴＥと良好な相関（約０．６）を示しており、従って、当然のことながら、胚盤胞からの幾つかのＴＥ細胞が同じＵＭＡＰ空間を占める。このデータは、ｉＢｌａｓｔｏｉｄが、基礎研究及びトランスレーショナル研究において多くの適用がある、利用し易く、拡張性のある、且つ扱い易い重要なモデルシステムに相当することを示している。例えば、ｉＢｌａｓｔｏｉｄは、胚発生中の初期細胞運命移行を模倣するインビトロプラットフォームを提供する。更には、これまでＴＥ及びＰＥとの協調的な相互作用についてはほぼ無視されてきたため、本発明者らは、正常な初期胚発生におけるそれほど多くの重要なイベントを制御する決定的な胚体－胚体外界面をインビトロで再樹立することにより、ヒト多能性についての既存の知識及び理解を再解釈し、洗練させる場にｉＢｌａｓｔｏｉｄであれば挑戦できる可能性があると期待する。特異的遺伝子負荷を備えるｉＢｌａｓｔｏｉｄを作成できるという事実を所与とすれば、これにより、異数性、胞状奇胎、コルネリアデランゲ症候群及び治療のためのスクリーニングなど、初期発生疾患の研究が可能となるであろう。ｉＢｌａｓｔｏｉｄは、遺伝的操作及び遺伝子編集技法を開発するための優れたプラットフォームとしての役割を果たす可能性もある。要約すれば、ｉＢｌａｓｔｏｉｄは、ヒト胚発生の着床前胚盤胞期及び着床前後をインビトロでモデル化する新しい機会となり、そのため、不妊症及び早期妊娠損失の理解に向けた途方もない可能性を持つ。

【0269】

実施例９－３次元培養システムにおけるｉＰＳＣ及びｉＴＳＣの共培養
ｉＰＳＣとｉＴＳＣとの間での集合を観察し易くするため、初めに、ＧＦＰレポーターを有するｉＰＳＣ系（ｉＰＳＣ－ＧＦＰ）及びｍＣｈｅｒｒｙレポーターを有するｉＴＳＣ系（ｉＴＳＣ－ｍＣｈｅｒｒｙ）を、それぞれＧＦＰ及びｍＣｈｅｒｒｙエンプティベクターコンストラクトのレンチウイルス形質導入によって作成した（図９ａ、図９ｂ）。共培養実験のため、解離された細胞は、２４ウェルＡｇｇｒｅＷｅｌｌ（商標）４００プレート上においてｉＢｌａｓｔｏｉｄ培地中、異なる条件とした：（１）ｉＰＳＣ及びｉＴＳＣをそれぞれ１：２．５の比で１ウェル当たり１．２×１０^５個の総細胞数（図９ｃ）；（２）ｉＰＳＣのみで１ウェル当たり１．２×１０^５個の総細胞数（図９ｄ）；（３）ｉＴＳＣのみで１ウェル当たり１．２×１０^５個の総細胞数（図９ｅ）。共培養の初日にＲＯＣＫｉを補足して細胞生存を増強し、細胞をＡｇｇｒｅＷｅｌｌシステムで６日間培養した。下流分析のため、形成６日目に入手される３次元構造体を回収した（図９ｃ～図９ｅ）。

【0270】

実施例１０－異なる培地を使用した再プログラム化中間体の作成
再プログラム化２１日目のＥＰＩ、ＴＥ及びＰＥ様細胞の比率の改善を探るため、初期胚及び胚体外系統細胞運命を調節することが公知の種々のシグナル伝達経路／培養条件を判定した。本発明者らは、本明細書の表３ａに掲載されるものなど、様々な培養培地で再プログラム化を探った。具体的には、ＮＡＣＬ培地はＰＥ様細胞運命を促進し；ＰＡ培地はＴＥ様細胞運命を促進し；及びｔ２ｉＬＧｏ培地は着床前ＥＰＩ様細胞運命を促進することが報告された。２１日目再プログラム化細胞の免疫蛍光分析に基づけば（図１１）、ＮＡＣＬ培地はＧＡＴＡ６（ＰＥ）及びＫＬＦ１７（ＥＰＩ）の発現を促進し；ＰＡ培地はＧＡＴＡ３（ＴＥ）、ＧＡＴＡ６（ＰＥ）及びＫＬＦ１７（ＥＰＩ）の上方制御を促進する一方、ｔ２ｉＬＧｏ培地はＫＬＦ１７（ＥＰＩ）の上方制御を促進する。試験した条件の中でも特に、ＰＡ培地は、判定したこれら３つのマーカーに基づけば、再プログラム化２１日目に最も多量のＴＥ、ＰＥ及びＥＰＩ様細胞を生じさせた。

【0271】

実施例１１－ＯＫＳＭＮＬ－ｍＲＮＡトランスフェクションによるヒト線維芽細胞の再プログラム化
この手法におけるヒト線維芽細胞の再プログラム化は、まとめてＯＫＳＭＮＬとして公知の、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ｃ－ＭＹＣ、ＮＡＮＯＧ及びＬＩＮ２８によって媒介される。ｍＲＮＡ手法による体細胞再プログラム化について、ＳｔｅｍＲＮＡ第３世代再プログラム化キット（ＳｔｅｍＧｅｎｔ、カタログ番号００－００７６）の製造者の指示に修正を加えたものに従って実験を実施した。再プログラム化を実施するため、１２ウェルプレートの１ウェル当たり１～２×１０^４個のヒト線維芽細胞を線維芽細胞培地に播種した。２４時間後（０日目）、細胞に、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）及びＲＮＡｉＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で製造者の指示に従って作成した、ＯＳＫＭＮＬ ＮＭ－ＲＮＡ、ＥＫＢ ＮＭ－ＲＮＡ及びＮＭ－マイクロＲＮＡを含有するＮＭ－ＲＮＡ再プログラム化トランスフェクション複合体をトランスフェクトした。１８時間後、培地を新鮮な線維芽細胞培地で再生したと共に、６時間後に次のトランスフェクションを実施する。このトランスフェクションプロセスを更に３日間（４×トランスフェクションレジームにわたって）又は５日間（６×トランスフェクションレジームにわたって）繰り返した。細胞を線維芽細胞培地で再プログラム化２１日目まで培養し、更なる分析のため回収した。これらの実験で使用した培地の更なる詳細は、実施例２に提供する。

【0272】

２１日目、細胞を免疫染色して、４×ＯＫＳＭＮＬ及び６×ＯＫＳＭＮＬ ｍＲＮＡトランスフェクションから作成したＯＣＴ４、ＧＡＴＡ６及びＣＤＸ２（図１２ａ及び図１２ｃ）、ＧＡＴＡ２、ＮＡＮＯＧ及びＳＯＸ１７（図１２ｂ及び図１２ｄ）の発現を決定した。

【0273】

これらの結果は、別の再プログラム化方法論を用いたとき、ヒト線維芽細胞から再プログラム化中間体を入手することができ、実施例３に記載されるとおり入手されるものと類似したマーカーＯＣＴ４、ＧＡＴＡ６、ＣＤＸ２、ＧＡＴＡ２、ＮＡＮＯＧ及びＳＯＸ１７の遺伝子発現プロファイルを有することを実証している。これらの結果は、別の方法論を用いて作成した再プログラム化中間体も、胚盤葉上層（ＥＰＩ）、栄養外胚葉（ＴＥ）及び／又は原始内胚葉（ＰＥ）転写シグネチャを呈することを示している。これらの結果は、ｉＢｌａｓｔｏｉｄが、異なる再プログラム化方法、特に、異なる方法により再プログラム化転写因子の発現をドライブすることによって入手される再プログラム化中間体に由来し得る可能性があることを示している。

【0274】

実施例１２－センダイウイルス媒介性の再プログラム化によるヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）の再プログラム化
ＣｙｔｏＴｕｎｅ－ｉＰＳ ２．０ Ｓｅｎｄａｉ再プログラム化キットを製造者の指示に従って使用して（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、ロット番号２１７００５２）、ｈＭＳＣの再プログラム化を行った。ｈＭＳＣをＭＳＣ培地に約５～１０×１０^４細胞の密度で播種した。約３６時間後、細胞をＦＭ中のセンダイウイルスにより、以下のとおりの感染多重度（ＭＯＩ）、ＫＯＳ ＭＯＩ＝５、ｃ－ＭＹＣ ＭＯＩ＝５、ＫＬＦ４ ＭＯＩ＝６で形質導入した。培地交換を形質導入後１日目から開始して隔日で行い、８日目以降は毎日行った。再プログラム化２１日目に、更なる分析のため再プログラム化された細胞を回収した。これらの実験で使用した培地の更なる詳細は、実施例２に提供する。

【0275】

２１日目、細胞を免疫染色して、ＯＣＴ４、ＧＡＴＡ６及びＣＤＸ２（図１３ａ）又はＧＡＴＡ２、ＮＡＮＯＧ及びＳＯＸ１７（図１３ｂ）の発現を決定した。

【0276】

これらの結果は、別の体細胞、この場合ｈＭＳＣから再プログラム化中間体を入手することができ、実施例３に記載されるとおり入手されるものと類似したマーカーＰＣＴ４、ＧＡＴＡ６、ＣＤＸ２、ＧＡＴＡ２、ＮＡＮＯＧ及びＳＯＸ１７の遺伝子発現プロファイルを有することを実証している。これらの結果は、別の体細胞から作成される再プログラム化中間体も胚盤葉上層（ＥＰＩ）、栄養外胚葉（ＴＥ）及び／又は原始内胚葉（ＰＥ）転写シグネチャを呈することを示している。これらの結果は、ｉＢｌａｓｔｏｉｄが、異なる再プログラム化方法、特に、異なる体細胞型によって入手される再プログラム化中間体に由来すると見込める可能性がある可能性があることも示している。

【0277】

実施例１３－センダイウイルス媒介性の再プログラム化によるヒト末梢血単核球（ｈＰＢＭＣ）の再プログラム化。
ＣｙｔｏＴｕｎｅ－ｉＰＳ ２．０センダイ再プログラム化キットを製造者の指示に従って使用して（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、ロット番号２１７００５２）、ｈＰＢＭＣの再プログラム化を行った。この再プログラム化を実施するため、２．５～５×１０^５個のｈＰＢＭＣをカウントし、１２ｍＬ丸底チューブに移した。再プログラム化混合物は、計算した容積のセンダイウイルスを以下のとおりの感染多重度（ＭＯＩ）、ＫＯＳ ＭＯＩ＝５、ｃ－ＭＹＣ ＭＯＩ＝５、ＫＬＦ４ ＭＯＩ＝６で１ｍＬのＰＢＭＣ培地中に加えることにより調製した。

【0278】

ｈＰＢＭＣが入った丸底チューブに再プログラム化混合物を移した後、細胞を室温にて１０００×ｇで３０分間遠心した。遠心した細胞に更に１ｍＬのＰＢＭＣ培地を加え、内容物を再懸濁し、１２ウェルプレートの１つのウェルに移して３７℃で一晩インキュベートした（０日目）。翌日（１日目）、培地を新鮮なＰＢＭＣ培地に交換した。３日目に、マトリゲルコートプレート上の新鮮なＰＢＭＣ培地中に細胞を１：３の比で播いた。４日目及び６日目、使用済みの培地の半分を取り除いて新鮮なＳｔｅｍＰｒｏ３４培地（サイトカイン不含のＰＢＭＣ培地）に交換することにより、培地交換を実施した。再プログラム化の８日目、ＳｔｅｍＰｒｏ３４培地又は１０％ＦＢＳを補足したＳｔｅｍＰｒｏ３４培地のいずれかに細胞を切り替え、この時点以降は隔日で培地交換を実施した。１８日目及び２１日目に更なる分析のために細胞を回収した。これらの実験で使用した培地の更なる詳細は、実施例２に提供する。

【0279】

１８日目及び２１日目、細胞を免疫染色して、ＯＣＴ４、ＧＡＴＡ６及びＣＤＸ２（図１４ａ～図１４ｃ）又はＧＡＴＡ２、ＮＡＮＯＧ及びＳＯＸ１７（図１４ｄ～図１４ｆ）の発現を決定した。

【0280】

これらの結果は、別の体細胞、この場合ヒト末梢血単核球から再プログラム化中間体を入手することができ、実施例３に記載されるとおり入手されるものと類似したマーカーＯＣＴ４、ＧＡＴＡ６、ＣＤＸ２、ＧＡＴＡ２、ＮＡＮＯＧ及びＳＯＸ１７の遺伝子発現プロファイルを有することを実証している。これらの結果は、別の体細胞から作成される再プログラム化中間体も胚盤葉上層（ＥＰＩ）、栄養外胚葉（ＴＥ）及び／又は原始内胚葉（ＰＥ）転写シグネチャを呈することを示している。これらの結果は、ｉＢｌａｓｔｏｉｄが、異なる再プログラム化方法、特に、異なる体細胞型によって入手される再プログラム化中間体に由来すると見込み得ることも示している。

【0281】

本明細書に開示及び定義される本発明は、言及されているか又は本明細書若しくは図面から明らかな個別の特徴の２つ以上のあらゆる代替的な組み合わせに及ぶことが理解されるであろう。それらの異なる組み合わせは、全て本発明の様々な代替的態様を成す。

【図1-1】

【図1-2】

【図1-3】

【図1-4】

【図1-5】

【図2-1】

【図2-2】

【図2-3】

【図2-4】

【図2-5】

【図3-1】

【図3-2】

【図3-3】

【図3-4】

【図3-5】

【図3-6】

【図3-7】

【図3-8】

【図4-1】

【図4-2】

【図4-3】

【図5-1】

【図5-2】

【図6-1】

【図6-2】

【図6-3】

【図7-1】

【図7-2】

【図7-3】

【図8-1】

【図8-2】

【図8-3】

【図8-4】

【図8-5】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【配列表】

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【国際調査報告】