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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-12-01
(54)【発明の名称】ＳＡＰ ＦＣ融合タンパク質及び使用方法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/62 20060101AFI20231124BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20231124BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20231124BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20231124BHJP
C12P 21/08 20060101ALI20231124BHJP
C12P 21/02 20060101ALI20231124BHJP
A61K 38/16 20060101ALI20231124BHJP
A61K 47/68 20170101ALI20231124BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20231124BHJP
A61P 3/10 20060101ALI20231124BHJP
A61P 25/28 20060101ALI20231124BHJP
A61P 25/14 20060101ALI20231124BHJP
C12N 15/13 20060101ALN20231124BHJP
C12N 15/12 20060101ALN20231124BHJP
C07K 16/00 20060101ALN20231124BHJP
C07K 14/435 20060101ALN20231124BHJP
【ＦＩ】
C12N15/62 Z
C12N15/63 Z
C07K19/00
C12N5/10
C12P21/08
C12P21/02 C
A61K38/16
A61K47/68
A61P43/00 111
A61P3/10
A61P25/28
A61P25/14
C12N15/13 ZNA
C12N15/12
C07K16/00
C07K14/435
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023526513
(86)(22)【出願日】2021-11-01
(85)【翻訳文提出日】2023-05-16
(86)【国際出願番号】 US2021072168
(87)【国際公開番号】W WO2022094630
(87)【国際公開日】2022-05-05
(31)【優先権主張番号】63/108,799
(32)【優先日】2020-11-02
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/153,777
(32)【優先日】2021-02-25
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】522189850
【氏名又は名称】アトララス・インコーポレイテッド
(71)【出願人】
【識別番号】504326686
【氏名又は名称】ユニバーシティ オブ テネシー リサーチ ファウンデーション
(74)【代理人】
【識別番号】100127926
【弁理士】
【氏名又は名称】結田 純次
(74)【代理人】
【識別番号】100140132
【弁理士】
【氏名又は名称】竹林 則幸
(74)【代理人】
【識別番号】100216105
【弁理士】
【氏名又は名称】守安 智
(72)【発明者】
【氏名】ジョーム・ポンズ
(72)【発明者】
【氏名】ジョナサン・エス・ウォール
【テーマコード（参考）】
4B064
4B065
4C076
4C084
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B064AG01
4B064AG26
4B064CA19
4B064CC24
4B064DA01
4B065AA90X
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA24
4B065CA25
4B065CA44
4C076AA95
4C076CC01
4C076CC21
4C076CC41
4C076EE41
4C076EE59
4C084AA02
4C084AA07
4C084BA44
4C084NA14
4C084ZA02
4C084ZA16
4C084ZC35
4C084ZC41
4H045AA11
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA41
4H045CA40
4H045DA76
4H045EA20
4H045FA74
(57)【要約】
本発明は、ＳＡＰ－Ｆｃ融合タンパク質、及びアミロイド関連疾患を治療する方法に関する。
【選択図】図１
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
Ｎ末端からＣ末端に向かって以下の式、ＳＡＰ－Ｆｃ１－Ｌ１－Ｆｃ２
〔式中、
Ｆｃ１は、ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３を含む第１Ｆｃドメイン配列であり、Ｌ１はリンカーであり、Ｆｃ２は、ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３を含む第２Ｆｃドメイン配列であり、
ＳＡＰはヒト血清アミロイドＰ（ＳＡＰ）成分タンパク質であり、
前記Ｆｃ１及び前記Ｆｃ２は、ＥＵ付番による位置Ｃ２２６及び／またはＣ２２９にアミノ酸置換を含む〕
で表される構造を含む融合タンパク質。
【請求項2】
前記Ｆｃ１及び前記Ｆｃ２が、ＥＵ付番による位置Ｃ２２６及びＣ２２９におけるアミノ酸置換、任意選択的にはＣ２２６Ｓ及びＣ２２９Ｓ
を含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項3】
前記融合タンパク質が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号２３または配列番号２４で示されるアミノ酸配列を含む、請求項１または請求項２に記載の融合タンパク質。
【請求項4】
前記融合タンパク質が、Ｃ末端側リジンを有さない配列番号１、Ｃ末端側リジンを有さない配列番号２、Ｃ末端側リジンを有さない配列番号３、Ｃ末端側リジンを有さない配列番号４、Ｃ末端側リジンを有さない配列番号２３、またはＣ末端側リジンを有さない配列番号２４
で示されるアミノ酸配列を含む、請求項３に記載の融合タンパク質。
【請求項5】
前記融合タンパク質が、ＴＮＴ１４６、ＴＮＴ１５１、ＴＮＴ１５５、ＴＮＴ１５６、ＴＮＴ１７０またはＴＮＴ１７１のポリペプチド配列を含む、請求項１または請求項２に記載の融合タンパク質。
【請求項6】
第１ポリペプチド及び第２ポリペプチドを含む融合タンパク質であって、前記第１ポリペプチドが、第１ヒトＦｃドメイン（Ｆｃ１）のＮ末端に連結されたヒト血清アミロイドＰ（ＳＡＰ）成分タンパク質を含み、前記第２ポリペプチドが、第２ヒトＦｃドメイン（Ｆｃ２）を含むがヒトＳＡＰ成分タンパク質を含まず、前記第１及び前記第２Ｆｃドメインが二量体を形成し、２つの前記Ｆｃドメインのうちの一方がノブ変異を含み、もう一方の前記Ｆｃドメインがホール変異を含む、前記融合タンパク質。
【請求項7】
前記第１ポリペプチドがノブ変異を含み、前記第２ポリペプチドがホール変異を含む、請求項６に記載の融合タンパク質。
【請求項8】
前記第１ポリペプチドが、配列番号５、配列番号７、配列番号８または配列番号１０で示されるアミノ酸配列を含み、前記第２ポリペプチドが、配列番号６または配列番号９で示されるアミノ酸配列を含む、請求項７に記載の融合タンパク質。
【請求項9】
前記第１ポリペプチドが、配列番号５で示されるアミノ酸配列を含み、前記第２ポリペプチドが、配列番号６で示されるアミノ酸配列を含む；前記第１ポリペプチドが、配列番号７で示されるアミノ酸配列を含み、前記第２ポリペプチドが、配列番号６で示されるアミノ酸配列を含む；
前記第１ポリペプチドが、配列番号８で示されるアミノ酸配列を含み、前記第２ポリペプチドが、配列番号９で示されるアミノ酸配列を含む；または
前記第１ポリペプチドが、配列番号１０で示されるアミノ酸配列を含み、前記第２ポリペプチドが、配列番号９で示されるアミノ酸配列を含む、
請求項８に記載の融合タンパク質。
【請求項10】
前記第１ポリペプチドが、Ｃ末端側リジンを有するもしくは有さない配列番号５で示されるアミノ酸配列を含み、前記第２ポリペプチドが、Ｃ末端側リジンを有するもしくは有さない配列番号６で示されるアミノ酸配列を含む；前記第１ポリペプチドが、Ｃ末端側リジンを有するもしくは有さない配列番号７で示されるアミノ酸配列を含み、前記第２ポリペプチドが、Ｃ末端側リジンを有するもしくは有さない配列番号６で示されるアミノ酸配列を含む；
前記第１ポリペプチドが、Ｃ末端側リジンを有するもしくは有さない配列番号８で示されるアミノ酸配列を含み、前記第２ポリペプチドが、Ｃ末端側リジンを有するもしくは有さない配列番号９で示されるアミノ酸配列を含む；または
前記第１ポリペプチドが、Ｃ末端側リジンを有するもしくは有さない配列番号１０で示されるアミノ酸配列を含み、前記第２ポリペプチドが、Ｃ末端側リジンを有するもしくは有さない配列番号６で示されるアミノ酸配列を含む、
請求項８に記載の融合タンパク質。
【請求項11】
前記融合タンパク質が、表２に記載のＴＮＴ１４８、ＴＮＴ１５２、ＴＮＴ１５７、ＴＮＴ１５８、ＴＮＴ１４７、ＴＮＴ１５９、ＴＮＴ１６０またはＴＮＴ１６１の第１ポリペプチド及び第２ポリペプチド配列を含む、請求項６に記載の融合タンパク質。
【請求項12】
前記第１ポリペプチドの前記Ｆｃドメインがホール変異を含み、前記第２ポリペプチドの前記Ｆｃドメインがノブ変異を含む、請求項６に記載の融合タンパク質。
【請求項13】
前記第１ポリペプチドが、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１４または配列番号１６で示されるアミノ酸配列を含み、前記第２ポリペプチドが、配列番号１２または配列番号１５で示されるアミノ酸配列を含む、請求項６に記載の融合タンパク質。
【請求項14】
前記第１ポリペプチドが、配列番号１１で示されるアミノ酸配列を含み、前記第２ポリペプチドが、配列番号１２で示されるアミノ酸配列を含む；前記第１ポリペプチドが、配列番号１３で示されるアミノ酸配列を含み、前記第２ポリペプチドが、配列番号１２で示されるアミノ酸配列を含む；
前記第１ポリペプチドが、配列番号１４で示されるアミノ酸配列を含み、前記第２ポリペプチドが、配列番号１５で示されるアミノ酸配列を含む；または
前記第１ポリペプチドが、配列番号１６で示されるアミノ酸配列を含み、前記第２ポリペプチドが、配列番号１５で示されるアミノ酸配列を含む、
請求項１３に記載の融合タンパク質。
【請求項15】
前記第１ポリペプチドが、Ｃ末端側リジンを有するもしくは有さない配列番号１１で示されるアミノ酸配列を含み、前記第２ポリペプチドが、Ｃ末端側リジンを有するもしくは有さない配列番号１２で示されるアミノ酸配列を含む；前記第１ポリペプチドが、Ｃ末端側リジンを有するもしくは有さない配列番号１３で示されるアミノ酸配列を含み、前記第２ポリペプチドが、Ｃ末端側リジンを有するもしくは有さない配列番号１２で示されるアミノ酸配列を含む；
前記第１ポリペプチドが、Ｃ末端側リジンを有するもしくは有さない配列番号１４で示されるアミノ酸配列を含み、前記第２ポリペプチドが、Ｃ末端側リジンを有するもしくは有さない配列番号１５で示されるアミノ酸配列を含む；または
前記第１ポリペプチドが、Ｃ末端側リジンを有するもしくは有さない配列番号１６で示されるアミノ酸配列を含み、前記第２ポリペプチドが、Ｃ末端側リジンを有するもしくは有さない配列番号１５で示されるアミノ酸配列を含む、
請求項１３に記載の融合タンパク質。
【請求項16】
前記ヒトＳＡＰが、配列番号１７で示されるアミノ酸配列を任意選択的に含む野生型ＳＡＰである、請求項１または請求項６に記載の融合タンパク質。
【請求項17】
前記ヒトＳＡＰが、配列番号１７に基づく位置Ｎ３２またはＮ１１０にアミノ酸置換を含む、請求項１または請求項６に記載の融合タンパク質。
【請求項18】
前記ヒトＳＡＰが、配列番号２０で示されるアミノ酸配列を含む、請求項１７に記載の融合タンパク質。
【請求項19】
前記Ｆｃ１及び前記Ｆｃ２が、ＥＵ付番による位置Ｃ２２６及び／またはＣ２２９にアミノ酸置換を含む、請求項６または１６～１８のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項20】
前記Ｆｃ１及び前記Ｆｃ２が、ＥＵ付番による位置Ｃ２２６及びＣ２２９にアミノ酸置換を含む、請求項１９に記載の融合タンパク質。
【請求項21】
前記Ｆｃ１及び前記Ｆｃ２が、ＥＵ付番によるアミノ酸置換Ｃ２２６Ｓ及び／またはＣ２２９Ｓを含む、請求項１、２、６または１６～２０のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項22】
前記Ｆｃ１及び前記Ｆｃ２が、ＥＵ付番によるアミノ酸置換Ｃ２２６Ｓ及びＣ２２９Ｓを含む、請求項２１に記載の融合タンパク質。
【請求項23】
前記Ｆｃ１及び／または前記Ｆｃ２が、配列番号１８のアミノ酸配列に基づいて付番してアミノ酸位置１１及び／または１４にアミノ酸置換を含む、請求項１、２、６または１５～１７のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項24】
前記Ｆｃ１及び／または前記Ｆｃ２が、配列番号１８のアミノ酸配列に基づいて付番してアミノ酸位置１１及び／または１４にセリン残基を含む、請求項２３に記載の融合タンパク質。
【請求項25】
前記Ｆｃ１及び／または前記Ｆｃ２が、配列番号１８で示されるアミノ酸配列を含む、請求項２３または請求項２４に記載の融合タンパク質。
【請求項26】
前記第１及び／または前記第２Ｆｃドメインが、ＦｃＲｎ結合性を低下させる変異を含む、請求項１、２、６または１６～１８に記載の融合タンパク質。
【請求項27】
Ｎ末端からＣ末端に向かって以下の式、Ｆｃ１－Ｌ１－Ｆｃ２
〔式中、
Ｆｃ１は、ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３を含む第１Ｆｃドメイン配列であり、Ｌ１はリンカーであり、Ｆｃ２は、ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３を含む第２Ｆｃドメイン配列であり、
前記Ｆｃ１及び前記Ｆｃ２は、ＥＵ付番によるアミノ酸置換Ｃ２２６Ｓ及び／またはＣ２２９Ｓを含む、ならびに／または前記Ｆｃ１及び前記Ｆｃ２は、配列番号１８のアミノ酸配列に基づいて付番してアミノ酸位置１１及び／または１４にセリン残基を含む〕
で表される構造を含む融合タンパク質。
【請求項28】
前記融合タンパク質が、前記融合タンパク質のＮ末端にヒト血清アミロイドＰ（ＳＡＰ）成分タンパク質をさらに含む、請求項２７に記載の融合タンパク質。
【請求項29】
前記ヒトＳＡＰが、野生型ＳＡＰ、任意選択的には配列番号１７で示されるアミノ酸配列
である、請求項２８に記載の融合タンパク質。
【請求項30】
前記ヒトＳＡＰが、配列番号１７に基づく位置Ｎ３２またはＮ１１０にアミノ酸置換を含む、請求項２８に記載の融合タンパク質。
【請求項31】
前記ヒトＳＡＰが、配列番号２０で示されるアミノ酸配列を含む、請求項３０に記載の融合タンパク質。
【請求項32】
前記融合タンパク質が五量体または十量体（ｄｅｃｃａｍｅｒ）を形成する、請求項１～３１のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項33】
前記Ｆｃ１及び前記Ｆｃ２がヒトＦｃドメインである、請求項１～３２のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項34】
前記Ｆｃ１及び前記Ｆｃ２がヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインである、請求項１～３３のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項35】
前記融合タンパク質が、１つ以上の前記アミノ酸置換を欠く融合タンパク質と比較して凝集が軽減されている、請求項１～３４のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項36】
請求項１～３５のいずれか１項に記載の融合タンパク質、及び薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
【請求項37】
前記融合タンパク質の少なくとも５０％が五量体及び／または十量体の状態にある、請求項３６に記載の医薬組成物。
【請求項38】
請求項１～３５のいずれか１項に記載の融合タンパク質をコードする核酸。
【請求項39】
請求項３８に記載の核酸を含むベクター。
【請求項40】
請求項３８に記載の核酸または請求項３９に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項41】
前記宿主細胞がＣＨＯ細胞または２９３細胞である、請求項４０に記載の宿主細胞。
【請求項42】
請求項１～３５のいずれか１項に記載の融合タンパク質を製造する方法であって、前記融合タンパク質をコードする核酸を含む宿主細胞を、前記融合タンパク質を発現させる条件の下で培養すること
を含む、前記方法。
【請求項43】
前記宿主細胞がＣＨＯ細胞または２９３細胞である、請求項４２に記載の方法。
【請求項44】
前記宿主細胞が前記ＳＡＰ成分タンパク質をグリコシル化しない、請求項４２または請求項４３に記載の方法。
【請求項45】
個体におけるアミロイド病を治療する方法であって、請求項１～３５のいずれか１項に記載の融合タンパク質を前記個体に投与すること
を含む、前記方法。
【請求項46】
個体におけるアミロイド病を治療する方法であって、請求項４２～４４のいずれか１項に記載の方法によって製造された前記融合タンパク質を前記個体に投与すること
を含む、前記方法。
【請求項47】
前記アミロイド病が、ＡＡアミロイドーシス、ＡＬアミロイドーシス、ＡＨアミロイドーシス、Ａβアミロイドーシス、ＡＴＴＲアミロイドーシス、ＡＬｅｃｔ２アミロイドーシス、ＩＩ型糖尿病のＩＡＰＰアミロイドーシス、及びアルツハイマー病
からなる群から選択される、請求項４５または請求項４６に記載の方法。
【請求項48】
請求項４２～４５のいずれか１項に記載の方法によって製造されたＳＡＰ－Ｆｃ融合タンパク質。
【請求項49】
前記個体がヒトである、請求項４５～４７のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年１１月２日に出願された米国仮出願第６３／１０８，７９９号及び２０２１年２月２５日に出願された米国仮出願第６３／１５３，７７７号に基づく優先権を主張するものであり、参照によりそれらの各々の内容の全体を本明細書に援用する。
本出願は、２０２０年１１月２日に出願された米国仮出願第６３／１０８，７９９号及び２０２１年２月２５日に出願された米国仮出願第６３／１５３，７７７号に基づく優先権を主張するものであり、参照によりそれらの各々の内容の全体を本明細書に援用する。
【0002】
ＡＳＣＩＩテキストファイルでの配列表の提出
参照により、ＡＳＣＩＩテキストファイルでの以下の提出物の内容の全体を本明細書に援用する：配列表のコンピュータ可読形態（ＣＲＦ）（ファイル名：１６５９９２０００２００ＳＥＱＬＩＳＴ．ＴＸＴ、記録日：２０２１年１０月２８日、サイズ：９１，３９９バイト）。
参照により、ＡＳＣＩＩテキストファイルでの以下の提出物の内容の全体を本明細書に援用する：配列表のコンピュータ可読形態（ＣＲＦ）（ファイル名：１６５９９２０００２００ＳＥＱＬＩＳＴ．ＴＸＴ、記録日：２０２１年１０月２８日、サイズ：９１，３９９バイト）。
【0003】
本発明は、ＳＡＰ－Ｆｃ融合タンパク質、及びＳＡＰ－Ｆｃ融合タンパク質を投与することによってアミロイド関連障害を治療する方法に関する。
【背景技術】
【0004】
アミロイドーシスは、他の疾患、例えば、アルツハイマー病、伝達性海綿状脳症、ハンチントン病またはＩＩ型真性糖尿病を含むタンパク質コンホメーション病の群に属する疾患の広い群である。
【0005】
アミロイドーシスは、組織における異常な線維状立体配座を有する不溶性タンパク質沈着物の存在を特徴とする希少疾患である。原因となっていることが最も多いのは、血清前駆体タンパク質の断片である。多くの器官は、「アミロイド物質」と呼ばれるこれらの細胞外沈着物によって侵され得る。アミロイド沈着物によって侵される主な器官は、腎臓、心臓、消化管、肝臓、皮膚、末梢神経及び眼である。この疾患によって侵された器官は、大抵、相当な体積を有する。最終的にアミロイドーシスは全器官及び中枢神経系を侵し得、このため、実に様々な多くの症候が存在する。
【0006】
アミロイドーシスを治療するための様々な手法が試みられてきた。例えば、グルココルチコイド（デキサメタゾン）及び抗有糸分裂薬の投与による化学療法治療である。新たな抗炎症薬（抗ＴＮＦ、抗ＩＬ１）の有効性は現在臨床評価中である。しかし、当面は、沈着物をより速やかに排除し得る特効治療法が存在していないがためにこのアミロイドーシスは不治かつ致命的であり続ける。ＤＭＳＯ及びコルヒチン、ならびにＩ－Ｄｏｘアントラサイクリンも、試されたことがある。
【0007】
抗ＳＡＰ抗体は、アミロイドーシスのために開発されつつあるもう１つの治療薬である。ＥＯＤ００１はモノクローナル抗体であるが、これは、特異的にアミロイドアミロイドＡＬまたはＡＡを標的とするものである。ＷＯ２０１５０６３７２８には、アミロイドーシスを治療するためのＳＡＰ－Ｆｃ抗体融合体が開示されている。
【0008】
したがって、アミロイドーシス及びアミロイド関連疾患のための効果的な治療法が必要とされている。
【発明の概要】
【0009】
一態様において、本明細書に提供されるのは、第１ポリペプチド及び第２ポリペプチドを含む融合タンパク質であって、第１ポリペプチドが、第１ヒトＦｃドメインのＮ末端に連結されたヒト血清アミロイドＰ（ＳＡＰ）成分タンパク質を含み、第２ポリペプチドが、第２ヒトＦｃドメインを含むがヒトＳＡＰ成分タンパク質を含まず、第１及び第２Ｆｃドメインが二量体を形成し、２つのＦｃドメインのうちの一方がノブ変異を含み、もう一方のＦｃドメインがホール変異を含む、当該融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、第１ポリペプチドはノブ変異を含み、第２ポリペプチドはホール変異を含む。いくつかの実施形態では、第１ポリペプチドは、配列番号５、配列番号７、配列番号８または配列番号１０で示されるアミノ酸配列を含み、第２ポリペプチドは、配列番号６または配列番号９で示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第１ポリペプチドはホール変異を含み、第２ポリペプチドはノブ変異を含む。いくつかの実施形態では、第１ポリペプチドは、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１４または配列番号１６で示されるアミノ酸配列を含み、第２ポリペプチドは、配列番号１２または配列番号１５で示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ヒト血清アミロイドＰ成分タンパク質は、配列番号１７に基づく位置Ｎ３２またはＮ１１０にアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、ヒト血清アミロイドＰ成分タンパク質は、配列番号２０で示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第１及び第２Ｆｃドメインは、ＥＵ付番による位置Ｃ２２６またはＣ２２９にアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、第１及び第２Ｆｃドメインは、ＥＵ付番によるアミノ酸置換Ｃ２２６ＳまたはＣ２２９Ｓを含む。いくつかの実施形態では、第１及び第２Ｆｃドメインは、配列番号１８のアミノ酸配列に基づいて付番してアミノ酸位置１１または１４にアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、第１及び第２Ｆｃドメインは、配列番号１８のアミノ酸配列に基づいて付番してアミノ酸位置１１または１４にセリン残基を含む。いくつかの実施形態では、第１及び第２Ｆｃドメインは、配列番号１８で示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第１または第２Ｆｃドメインは、ＦｃＲｎ結合性を低下させる変異を含む。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は五量体を形成する。
【0010】
別の態様において、本明細書に提供されるのは、Ｎ末端からＣ末端に向かって以下の式、ＳＡＰ－ヒンジ１－Ｆｃ１－Ｌ１－ヒンジ２－Ｆｃ２〔式中、ＳＡＰはヒト血清アミロイドＰ（ＳＡＰ）成分タンパク質であり、ヒンジ１は第１ヒンジ配列であり、Ｆｃ１は第１Ｆｃドメイン配列であり、Ｌ１はリンカーであり、ヒンジ２は第２ヒンジ配列であり、Ｆｃ２は第２Ｆｃドメイン配列である〕で表される構造を含む融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１、配列番号２、配列番号３または配列番号４で示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ヒト血清アミロイドＰ成分タンパク質は、配列番号１７に基づく位置Ｎ３２またはＮ１１０にアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、ヒト血清アミロイドＰ成分タンパク質は、配列番号２０で示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第１及び第２Ｆｃドメインは、ＥＵ付番による位置Ｃ２２６またはＣ２２９にアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、第１及び第２Ｆｃドメインは、ＥＵ付番によるアミノ酸置換Ｃ２２６ＳまたはＣ２２９Ｓを含む。いくつかの実施形態では、第１及び第２Ｆｃドメインは、配列番号１８のアミノ酸配列に基づいて付番してアミノ酸位置１１または１４にアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、第１及び第２Ｆｃドメインは、配列番号１８のアミノ酸配列に基づいて付番してアミノ酸位置１１または１４にセリン残基を含む。いくつかの実施形態では、第１及び第２Ｆｃドメインは、配列番号１８で示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第１または第２Ｆｃドメインは、ＦｃＲｎ結合性を低下させる変異を含む。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は五量体を形成する。
【0011】
別の態様において、本明細書に提供されるのは、本明細書に記載の融合タンパク質を含む医薬組成物である。
【0012】
別の態様において、本明細書に提供されるのは、本明細書に記載の融合タンパク質をコードする核酸である。
【0013】
別の態様において、本明細書に提供されるのは、本明細書に記載の核酸を含む宿主細胞である。
【0014】
別の態様において、本明細書に提供されるのは、本明細書に記載の融合タンパク質を製造する方法であって、融合タンパク質をコードする核酸を含む宿主細胞を、融合タンパク質を発現させる条件の下で培養することを含む、当該方法である。いくつかの実施形態では、宿主細胞はＣＨＯ細胞または２９３細胞である。いくつかの実施形態では、宿主細胞はＳＡＰ成分タンパク質をグリコシル化しない。
【0015】
別の態様において、本明細書に提供されるのは、アミロイド病を治療する方法であって、本明細書に記載の融合タンパク質を、それを必要とする個体に投与することを含む、当該方法である。いくつかの実施形態では、アミロイド病は全身性アミロイドーシスを含む。
【0016】
別の態様において、本明細書に提供されるのは、Ｎ末端からＣ末端に向かって以下の式、ヒンジ１－Ｆｃ１－Ｌ１－ヒンジ２－Ｆｃ２〔式中、ヒンジ１は第１ヒンジ配列であり、Ｆｃ１は第１Ｆｃドメイン配列であり、Ｌ１はリンカーであり、ヒンジ２は第２ヒンジ配列であり、Ｆｃ２は第２Ｆｃドメイン配列であり、第１及び第２Ｆｃドメインは、ＥＵ付番によるアミノ酸置換Ｃ２２６ＳもしくはＣ２２９Ｓを含む、及び／または第１及び第２Ｆｃドメインは、配列番号１８のアミノ酸配列に基づいて付番してアミノ酸位置１１もしくは１４にセリン残基を含む〕で表される構造を含む融合タンパク質である。
【図面の簡単な説明】
【0017】
【図1】ＳＡＰ－ｓｃＦｃ構築物を示す。
【図2】Ａは、脱グリコシル化ＳＡＰ変異体を示す。Ｂは、ノブ及びホールＦｃ領域を示す。Ｃは、ＦｃＲＮ変異を有するＦｃを示す。
【図3】Ａは、ＳＡＰ－ｓｃＦｃ構築物ＴＮＴ１４６を示す。Ｂは、ＳＡＰ－ｓｃＦｃ構築物ＴＮＴ１５１を示す。Ｃは、ＳＡＰ－ｓｃＦｃ構築物ＴＮＴ１５５を示す。Ｄは、ＳＡＰ－ｓｃＦｃ構築物ＴＮＴ１５６を示す。
【図4】Ａは、ＳＡＰ－Ｆｃ構築物ＴＮＴ１４８を示す。Ｂは、ＳＡＰ－Ｆｃ構築物ＴＮＴ１５２を示す。Ｃは、ＳＡＰ－Ｆｃ構築物ＴＮＴ１５７を示す。Ｄは、ＳＡＰ－Ｆｃ構築物ＴＮＴ１５８を示す。
【図5】Ａは、ＳＡＰ－Ｆｃ構築物ＴＮＴ１４７を示す。Ｂは、ＳＡＰ－Ｆｃ構築物ＴＮＴ１５９を示す。Ｃは、ＳＡＰ－Ｆｃ構築物ＴＮＴ１６０を示す。Ｄは、ＳＡＰ－Ｆｃ構築物ＴＮＴ１６１を示す。
【図6】Ａ及びＢは、精製ステップ後の還元及び非還元ＳＡＰ－ＦｃのＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を示す。「１」と標示されたレーンは精製生成物の還元試料を示し、「２」と標示されたレーンは精製生成物の非還元試料を示し、「Ｍ」と標示されたレーンはタンパク質マーカー（ＡＬＬ ＢＬＵＥ ＰＲＥＣＩＳＩＯＮ ＰＬＵＳ，ＢＩＯ－ＲＡＤ（登録商標）、Ｃａｔ＃１６１－０３７３）を示す。矢印は、（「
【化1】
【化2】
【図7A】ＳＥＣクロマトグラムの主要な溶離ピークを示す。試料画分はｘ軸上に標示される。
【図7B】このＳＥＣ精製ステップからの試料画分の非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を示す。
【図7C】画分「２Ｂ１」の非還元マイクロ流体電気泳動分析を示す。
【図7D】画分「２Ｂ１」の還元マイクロ流体電気泳動分析を示す。
【図7E】画分「２Ａ９」のサイズ排除クロマトグラフィー多角度光散乱（ＳＥＣ－ＭＡＬＳ）分析を示す。
【図7F】画分「２Ａ９」のＳＥＣ－ＨＰＬＣ分析を示す。
【図7G】画分「２Ａ９」の脱グリコシル化質量分析を示す。
【図8】Ａは、合成ｒＶλ６Ｗｉｌフィブリルに結合しているｈＩｇＧ（対照）、ｃ１１－１Ｆ４、ＴＮＴ１４６（２９３）及びＴＮＴ１４７（２９３）のＥＬＩＳＡアッセイを示す。Ｂは、合成ｒＶλ６Ｗｉｌフィブリルに結合しているｈＩｇＧ（対照）、ＴＮＴ１４６（ＣＨＯ）、ＴＮＴ１４８（ＣＨＯ）、ＴＮＴ１５１（２９３）及びＴＮＴ１５２（２９３）のＥＬＩＳＡアッセイを示す。
【図9】Ａ及びＢは、ＳＨＩ ＡＬλ及びＰｅｒ１２５ ｗｔＡＴＴＲに結合しているｈＩｇＧ（対照）、ＴＮＴ１４６（２９３）及びＴＮＴ１４７（２９３）のＥＬＩＳＡアッセイを示す。
【図10A】ｒＶλ６Ｗｉｌフィブリル、Ｐｅｒ１２５ ｗｔＡＴＴＲ抽出物、Ｋｅｎ ＡＴＴＲ抽出物、ＳＨＩ ＡＬλ肝臓抽出物、及びＴＡＬ ＡＬκ肝臓抽出物に結合しているＩｇＧ１のＥＬＩＳＡアッセイを示す。
【図10B】ｒＶλ６Ｗｉｌフィブリル、Ｐｅｒ１２５ ｗｔＡＴＴＲ抽出物、Ｋｅｎ ＡＴＴＲ抽出物、ＳＨＩ ＡＬλ肝臓抽出物、及びＴＡＬ ＡＬκ肝臓抽出物に結合しているＴＮＴ１４６（２９３）のＥＬＩＳＡアッセイを示す。
【図10C】ｒＶλ６Ｗｉｌフィブリル、Ｐｅｒ１２５ ｗｔＡＴＴＲ抽出物、Ｋｅｎ ＡＴＴＲ抽出物、ＳＨＩ ＡＬλ肝臓抽出物、及びＴＡＬ ＡＬκ肝臓抽出物に結合しているＴＮＴ１４８（ＣＨＯ）のＥＬＩＳＡアッセイを示す。
【図10D】ｒＶλ６Ｗｉｌフィブリル、Ｐｅｒ１２５ ｗｔＡＴＴＲ抽出物、Ｋｅｎ ＡＴＴＲ抽出物、ＳＨＩ ＡＬλ肝臓抽出物、及びＴＡＬ ＡＬκ肝臓抽出物に結合しているＴＮＴ１５１（２９３）のＥＬＩＳＡアッセイを示す。
【図10E】ｒＶλ６Ｗｉｌフィブリル、Ｐｅｒ１２５ ｗｔＡＴＴＲ抽出物、Ｋｅｎ ＡＴＴＲ抽出物、ＳＨＩ ＡＬλ肝臓抽出物、及びＴＡＬ ＡＬκ肝臓抽出物に結合しているＴＮＴ１５２（２９３）のＥＬＩＳＡアッセイを示す。
【図11A】１０μｇのＳＡＰ－Ｆｃ １４６を注射したＡＡマウスにおいてコンゴーレッド（左列）及び１２５Ｉ標識ＴＮＴ１４６（２９３）のオートラジオグラフィー（右列）によって染色されたアミロイド沈着を示す。
【図11B】１０μｇのＳＡＰ－Ｆｃ １４７を注射したＡＡマウスにおいてコンゴーレッド（左列）及び１２５Ｉ標識ＴＮＴ１４７（２９３）のオートラジオグラフィー（右列）によって染色されたアミロイド沈着を示す。
【図11C】５００μｇのＳＡＰ－Ｆｃ １４７を注射したＡＡマウスについてコンゴーレッド（第１及び第３列）及び抗ヒトＦｃ免疫染色（第２及び第４列）によって染色されたアミロイド沈着を示す。
【図12】Ａ及びＢは、野生型（ＷＴ）マウスに対するＡＡマウスにおけるＳＡＰ－Ｆｃ生体内分布の比較を示す。Ａは、野生型（ＷＴ）マウスに対するＡＡマウスにおけるＳＡＰ－Ｆｃ １４６生体内分布の比較を示す。Ｂは、野生型（ＷＴ）マウスに対するＡＡマウスにおけるＳＡＰ－Ｆｃ １４７生体内分布の比較を示す。
【図13】ＴＮＴ１４６（２９３）、ＴＮＴ１４７（２９３）、ＴＮＴ１４６（ＣＨＯ）、ＴＮＴ１４８（ＨＥＫ）、ＴＮＴ１４８（ＣＨＯ）、ＴＮＴ１５１（２９３）、ＴＮＴ１５１（ＣＨＯ）、ＴＮＴ１５２（２９３）及びＴＮＴ１５２（ＣＨＯ）のＳＥＣクロマトグラムを示す。下側の矢印は、１５０ｋＤａ、２００ｋＤａ、４４３ｋＤａ及び６６９ｋＤａの分子量標準の溶離の時間を指し示している。
【図14A】ＡＡマウスにおけるＴＮＴ１５１（２９３）の生体内分布を示す。
【図14B】ＡＡマウスにおけるＴＮＴ１５２（２９３）の生体内分布を示す。
【図14C】ＡＡマウスにおけるＴＮＴ１４８（２９３）の生体内分布を示す。
【図15】処理しなかった場合（ＴＨＰ１対照）、ｈＩｇＧ１で処理した場合（ｈＩｇＧ１対照）、ｍｌｇｐ５で処理した場合（ネズミ抗体－ペプチド融合体）、ＳＡＰ－Ｆｃ ＴＮＴ１４６（ＣＨＯ）で処理した場合、ＴＮＴ１４７（２３９）で処理した場合（ＴＮＴ１４７と標示される）、ＴＮＴ１４８（ＣＨＯ）で処理した場合、ＴＮＴ１５１（ＣＨＯ）で処理した場合、及びＴＮＴ１５２（ＣＨＯ）で処理した場合のＴＨＰ１細胞によるｒＶλ６Ｗｉｌフィブリルの食作用を示す。
【図16】Ａ及びＢは、精製ＳＡＰ－Ｆｃ構築のＳＤＳ ＰＡＧＥゲルを示す。Ａのレーン１は非還元条件下のＴＮＴ１４６であり、レーン２は非還元条件下のＴＮＴ１５１であり、レーン３は非還元条件下のＴＮＴ１５５であり、レーン４は還元条件下のＴＮＴ１４６であり、レーン５は還元条件下のＴＮＴ１５１であり、レーン６は還元条件下のＴＮＴ１５５である。Ｂのレーンａは非還元条件下のＴＮＴ１４７であり、レーン２ｂｉｓは非還元条件下のＴＮＴ１４８であり、レーンｃは非還元条件下のＴＮＴ１６０であり、レーンｄは還元条件下のＴＮＴ１４７であり、レーンｅは還元条件下のＴＮＴ１４８であり、レーンｆは還元条件下のＴＮＴ１６０である。
【図17】Ａ及びＢは、皮下ヒトＡＬλアミロイドを有するマウスの光学撮像から得たｐＨｒｏｄｏレッド蛍光放射の定量を示す。Ａは、ＴＮＴ１４６アミロイドを有するマウス及び対照マウスにおけるｐＨｒｏｄｏレッド蛍光（平均±標準偏差）の変化を示す。Ｂは、ＴＮＴ１４６処理アミロイドにおける１日目のｐＨｒｏｄｏレッド発光の増加を示しているグラフである。
【図18】Ａ及びＢは、注射後１４日目のｐＨｒｏｄｏレッド標識ヒトＡＬλ皮下アミロイドを有するマウスの光学撮像を示す。矢印は、標識付きアミロイドの場所を指し示している。Ａは、対照マウスについての結果を示す。Ｂは、ＳＡＰ－Ｆｃ融合タンパク質で処置したマウスについての結果を示す。
【図19】モルモット補体（「Ｃ」と表される）の存在下でのｒＶλＷｉｌ ＡＬアミロイドフィブリルの食作用の定量を示す。
【図20】Ａ～Ｄは、３０μｇ／ｍＬの濃度のヒトＳＡＰとの前インキュベーションの後のアミロイド抽出物及び合成フィブリルに対するＳＡＰ－Ｆｃ融合体の結合性の比較を示す。
【図21】３０μｇ／ｍＬの濃度のヒトＳＡＰの存在下でのアミロイド抽出物に対するＳＡＰ－Ｆｃ融合体の結合性を示す。
【発明を実施するための形態】
【0018】
本明細書に提供されるのは、アミロイドに高い親和性で結合すること及び食作用を誘発することができるＳＡＰ－Ｆｃ融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、ＳＡＰ－Ｆｃ融合タンパク質は、二量体化を促進する１つまたは改変をＦｃ領域に有する。いくつかの実施形態では、ＳＡＰ－Ｆｃ融合タンパク質は、ＳＡＰ－Ｆｃ融合体に比べて向上した安定性を有する。いくつかの実施形態では、ＳＡＰ－Ｆｃ融合タンパク質は、安定した非共有結合性五量体を形成する。いくつかの実施形態では、ＳＡＰ－Ｆｃ融合タンパク質は、安定した非共有結合性十量体を形成する。いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるＳＡＰ－Ｆｃ融合タンパク質は、凝集が軽減されている。
【0019】
ＳＡＰ－Ｆｃ融合タンパク質
本明細書に提供されるのは、Ｎ末端からＣ末端に向かって、ＳＡＰ成分タンパク質、第１ヒンジ配列を含む第１Ｆｃドメイン、リンカーペプチド、及び第２ヒンジ配列を含む第２Ｆｃドメインを含む、ＳＡＰ－Ｆｃ融合タンパク質である。
【表1-1】
【表1-2】
【表2-1】
【表2-2】
【表2-3】
【表2-4】
【表2-5】
【表2-6】
【表2-7】
【表2-8】
【表3-1】
【表3-2】
【表3-3】
【0020】
いくつかの実施形態では、ヒンジ配列は抗体ヒンジ配列である。いくつかの実施形態では、ヒンジ配列はヒト抗体ヒンジ配列である。いくつかの実施形態では、ヒンジ配列は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４抗体ヒンジ配列である。いくつかの実施形態では、ヒンジ配列はヒトＩｇＧ１抗体ヒンジ配列である。いくつかの実施形態では、ヒンジ配列は、１つ以上のアミノ酸置換を有するヒトＩｇＧ１抗体ヒンジ配列である。いくつかの実施形態では、ヒンジ配列は、１つ以上のシステイン残基が置換されたヒトＩｇＧ１抗体ヒンジ配列である。いくつかの実施形態では、ヒンジ配列は、１つ以上のシステイン残基がセリンに置換されたヒトＩｇＧ１抗体ヒンジ配列である。
【0021】
いくつかの実施形態では、ＳＡＰ成分タンパク質はヒトＳＡＰタンパク質である。いくつかの実施形態では、ヒトＳＡＰタンパク質は配列番号１７のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ヒトＳＡＰタンパク質は、ＳＡＰタンパク質のグリコシル化を減少させる１つ以上の改変を含む。いくつかの実施形態では、ＳＡＰタンパク質のグリコシル化を減少させる１つ以上の改変は、ＳＡＰタンパク質のＮ末端から付番を開始してＮ３２Ｓ及びＮ１１０Ｓアミノ酸置換から選択される。いくつかの実施形態では、ヒトＳＡＰタンパク質は、ＳＡＰタンパク質のＮ末端から付番を開始してアミノ酸置換Ｎ３２Ｓ及びＮ１１０Ｓを含む。いくつかの実施形態では、ヒトＳＡＰタンパク質は配列番号２０のアミノ酸配列を含む。
【0022】
いくつかの実施形態では、第１ヒンジ配列を含む第１Ｆｃドメインは、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインを含む。いくつかの実施形態では、第１ヒンジ配列を含む第１Ｆｃドメインは、ヒンジ領域内のシステイン残基を除去する１つ以上の改変を含む。いくつかの実施形態では、ヒンジ領域内のシステイン残基を除去する改変は、ヘテロ二量体型ＳＡＰ－Ｆｃ融合タンパク質の安定性を向上させる。いくつかの実施形態では、改変は、高次な共有結合性多量体化を防止する。
【0023】
システイン残基、例えばＦｃドメインのヒンジ領域内のシステイン残基は、異なるＦｃ領域上にあるシステイン残基の間での分子間ジスルフィド結合の形成に起因するタンパク質凝集を引き起こし得る。それゆえ、いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるＳＡＰ－Ｆｃ融合タンパク質は、ヒンジ領域内のシステイン残基を除去する１つ以上の改変を含むＦｃドメインを含み、かくして、システイン残基の分子間対形成を原因とするＳＡＰ－Ｆｃ融合タンパク質の凝集が防止または軽減される。いくつかの実施形態では、ヒンジ領域内のシステイン残基を除去する１つ以上の改変は、ＥＵ付番による位置Ｃ２２６またはＣ２２９にある。いくつかの実施形態では、置換は、ＥＵ付番方式に基づいて付番してＣ２２６Ｓ及びＣ２２９Ｓアミノ酸置換から選択される。いくつかの実施形態では、第１ヒンジ配列を含むＦｃドメインは、ＥＵ付番方式に基づいて付番してＣ２２６Ｓ及びＣ２２９Ｓアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、第１及び第２Ｆｃドメインは両方とも、ヒンジ領域における置換を位置Ｃ２２６または位置Ｃ２２９に含む。いくつかの実施形態では、置換は、配列番号１８の付番によるアミノ酸位置１１のセリン残基、及び配列番号１８の付番によるアミノ酸位置１４のセリン残基から選択される。いくつかの実施形態では、第１ヒンジ配列を含むＦｃドメインは、配列番号１８の付番によるアミノ酸位置１１のセリン残基及びアミノ酸位置１４のセリン残基を含む。いくつかの実施形態では、第１及び第２Ｆｃドメインは両方とも、配列番号１８の付番によるアミノ酸位置１１のセリン残基及びアミノ酸位置１４のセリン残基を含む。いくつかの実施形態では、ヒンジ配列を含むＦｃドメインは配列番号１８のアミノ酸配列を含む。
【0024】
いくつかの実施形態では、ヒンジ配列を含むＦｃドメインは、ＦｃＲｎ結合性を低下させる１つ以上の改変を含む。いくつかの実施形態では、ＦｃＲｎ結合性を低下させる１つ以上の改変は、ＥＵ方式によって付番して位置Ｉ２５３、Ｈ３１０またはＨ４３５にある。いくつかの実施形態では、改変は、ＥＵ付番方式に基づいて付番してＩ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ及びＨ４３５Ａアミノ酸置換のうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、ヒンジ配列を含むＦｃドメインは、ＥＵ付番方式に基づいて付番してアミノ酸置換Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ及びＨ４３５Ａを含む。いくつかの実施形態では、ＦｃＲｎ結合性を低下させる１つ以上の改変は、配列番号９の付番によるアミノ酸位置３８、９５または２２０にある。いくつかの実施形態では、改変は、配列番号９の付番によるアミノ酸位置３８、９５及び２２０のうちの１つ以上のアラニン残基を含む。いくつかの実施形態では、ヒンジ配列を含むＦｃドメインは、配列番号９の付番によるアミノ酸位置３８、９５及び２２０にアラニン残基を含む。いくつかの実施形態では、第１及び第２Ｆｃドメインは各々、配列番号９の付番によるアミノ酸位置３８、９５または２２０に置換を含む。いくつかの実施形態では、第１ヒンジ配列を含むＦｃドメインは、配列番号９、１５または２１のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第１及び第２Ｆｃドメインは各々、ＥＵ付番方式に基づいて付番して位置Ｉ２５３、Ｈ３１０またはＨ４３５に置換を含む。
【0025】
いくつかの実施形態では、ＳＡＰ－Ｆｃ融合タンパク質はリンカーをさらに含む。いくつかの実施形態では、リンカーは、第１Ｆｃ領域のＣ末端を第２Ｆｃ領域のＮ末端に連結する。いくつかの実施形態では、リンカーは、第１Ｆｃ領域のＣ末端を第２Ｆｃのヒンジ領域に連結する。いくつかの実施形態では、リンカーペプチドは、グリシン－セリンリンカー配列を含む。いくつかの実施形態では、リンカーペプチドは、（Ｇ４Ｓ）ｎ配列を含む。いくつかの実施形態では、ｎ＝１～１０である。いくつかの実施形態では、リンカーペプチドは配列番号１９のアミノ酸配列を含む。
【0026】
いくつかの実施形態では、ヒンジ配列を含むＦｃドメインは、ヒンジ領域内のシステインを除去する１つ以上の改変、及びＦｃＲｎ結合性を低下させる１つ以上の改変を含む。いくつかの実施形態では、ヒンジ領域内のシステイン残基を除去する１つ以上の改変は、ＥＵ付番方式に基づいて付番してＣ２２６Ｓ及びＣ２２９Ｓアミノ酸置換から選択される。いくつかの実施形態では、ヒンジ領域内のシステイン残基を除去する１つ以上の改変は、配列番号１８の付番によるアミノ酸位置１１のセリン残基、及び配列番号１８の付番によるアミノ酸位置１４のセリン残基から選択される。いくつかの実施形態では、第２ヒンジ配列を含む第２Ｆｃドメインは、ＦｃＲｎ結合性を低下させる１つ以上の改変を含む。いくつかの実施形態では、ＦｃＲｎ結合性を低下させる１つ以上の改変は、ＥＵ付番方式に基づいて付番してＩ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ及びＨ４３５Ａアミノ酸置換から選択される。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインはヒンジ配列を含み、ＥＵ付番方式に基づいて付番してアミノ酸置換Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ及びＨ４３５Ａを含む。いくつかの実施形態では、ＦｃＲｎ結合性を低下させる１つ以上の改変は、配列番号９の付番による３８、９５及び２２０から選択されるアミノ酸位置のアラニン残基である。いくつかの実施形態では、ヒンジ配列を含むＦｃドメインは、配列番号９の付番によるアミノ酸位置３８、９５及び２２０にアラニン残基を含む。いくつかの実施形態では、ヒンジ配列を含むＦｃドメインは配列番号２１のアミノ酸配列を含む。
【0027】
いくつかの実施形態では、ＳＡＰ－Ｆｃ融合タンパク質は一本鎖ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、ＳＡＰ－Ｆｃ融合体は一本鎖Ｆｃを含む。いくつかの実施形態では、ＳＡＰ－Ｆｃ融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に向かって、ＳＡＰ成分タンパク質、第１ヒンジ配列を含む第１Ｆｃドメイン、リンカーペプチド、及び第２ヒンジ配列を含む第２Ｆｃドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＳＡＰ成分タンパク質は配列番号１７のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第１ヒンジ配列を含む第１Ｆｃドメインは配列番号１８のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、リンカーペプチドは配列番号１９のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第２ヒンジ配列を含む第２Ｆｃドメインは配列番号１８のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＳＡＰ－Ｆｃ融合タンパク質は配列番号１のアミノ酸配列を含む。
【0028】
いくつかの実施形態では、ＳＡＰ－Ｆｃ融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に向かって、ＳＡＰ成分タンパク質のグリコシル化を減少させる１つ以上の改変を含むＳＡＰ成分タンパク質、第１ヒンジ配列を含む第１Ｆｃドメイン、リンカーペプチド、及び第２ヒンジ配列を含む第２Ｆｃドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＳＡＰ成分タンパク質は配列番号２０のアミノ酸配列を含み、第１ヒンジ配列を含む第１Ｆｃドメインは配列番号１８のアミノ酸配列を含み、リンカーペプチドは配列番号１９のアミノ酸配列を含み、第２ヒンジ配列を含む第２Ｆｃドメインは配列番号１８のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＳＡＰ－Ｆｃ融合タンパク質は配列番号２のアミノ酸配列を含む。
【0029】
いくつかの実施形態では、ＳＡＰ－Ｆｃ融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に向かって、ＳＡＰ成分タンパク質、第１ヒンジ配列及びＦｃＲｎ結合性を低下させる１つ以上の改変を含む第１Ｆｃドメイン、リンカーペプチド、ならびに第２ヒンジ配列を含む第２Ｆｃドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＳＡＰ成分タンパク質は配列番号１７のアミノ酸配列を含み、第１ヒンジ配列及びＦｃＲｎ結合性を低下させる１つ以上の改変を含む第１Ｆｃドメインは配列番号２１のアミノ酸配列を含み、リンカーペプチドは配列番号１９のアミノ酸配列を含み、第２ヒンジ配列を含む第２Ｆｃドメインは配列番号１８のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＳＡＰ－Ｆｃ融合タンパク質は配列番号２３のアミノ酸配列を含む。
【0030】
いくつかの実施形態では、ＳＡＰ－Ｆｃ融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に向かって、ＳＡＰ成分タンパク質、第１ヒンジ配列を含む第１Ｆｃドメイン、リンカーペプチド、ならびに第２ヒンジ配列及びＦｃＲｎ結合性を低下させる１つ以上の改変を含む第２Ｆｃドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＳＡＰ成分タンパク質は配列番号１７のアミノ酸配列を含み、第１ヒンジ配列を含む第１Ｆｃドメインは配列番号１８のアミノ酸配列を含み、リンカーペプチドは配列番号１９のアミノ酸配列を含み、第２ヒンジ配列及びＦｃＲｎ結合性を低下させる１つ以上の改変を含む第２Ｆｃドメインは配列番号２１のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＳＡＰ－Ｆｃ融合タンパク質は配列番号２４のアミノ酸配列を含む。
【0031】
いくつかの実施形態では、ＳＡＰ－Ｆｃ融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に向かって、ＳＡＰ成分タンパク質、第１ヒンジ配列及びＦｃＲｎ結合性を低下させる１つ以上の改変を含む第１Ｆｃドメイン、リンカーペプチド、ならびに第２ヒンジ配列及びＦｃＲｎ結合性を低下させる１つ以上の改変を含む第２Ｆｃドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＳＡＰ成分タンパク質は配列番号１７のアミノ酸配列を含み、第１ヒンジ配列及びＦｃＲｎ結合性を低下させる１つ以上の改変を含む第１Ｆｃドメインは配列番号２１のアミノ酸配列を含み、リンカーペプチドは配列番号１９のアミノ酸配列を含み、第２ヒンジ配列及びＦｃＲｎ結合性を低下させる１つ以上の改変を含む第２Ｆｃドメインは配列番号２１のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＳＡＰ－Ｆｃ融合タンパク質は配列番号３のアミノ酸配列を含む。
【0032】
いくつかの実施形態では、ＳＡＰ－Ｆｃ融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に向かって、ＳＡＰ成分タンパク質のグリコシル化を減少させる１つ以上の改変を含むＳＡＰ成分タンパク質、第１ヒンジ配列及びＦｃＲｎ結合性を低下させる１つ以上の改変を含む第１Ｆｃドメイン、リンカーペプチド、ならびに第２ヒンジ配列及びＦｃＲｎ結合性を低下させる１つ以上の改変を含む第２Ｆｃドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＳＡＰ成分タンパク質のグリコシル化を減少させる１つ以上の改変を含むＳＡＰ成分タンパク質は配列番号２０のアミノ酸配列を含み、第１ヒンジ配列及びＦｃＲｎ結合性を低下させる１つ以上の改変を含む第１Ｆｃドメインは配列番号２１のアミノ酸配列を含み、リンカーペプチドは配列番号１９のアミノ酸配列を含み、第２ヒンジ配列及びＦｃＲｎ結合性を低下させる１つ以上の改変を含む第２Ｆｃドメインは配列番号２１のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＳＡＰ－Ｆｃ融合タンパク質は配列番号４のアミノ酸配列を含む。
【0033】
本明細書にさらに提供されるのは、第１ポリペプチド及び第２ポリペプチドを含むＳＡＰ－Ｆｃ融合タンパク質であって、第１ポリペプチドが、第１ヒトＦｃドメインのＮ末端に連結されたヒトＳＡＰ成分タンパク質を含み、第２ポリペプチドが、第２ヒトＦｃドメインを含むがヒトＳＡＰ成分タンパク質を含まず、第１及び第２Ｆｃドメインが二量体を形成し、２つのＦｃドメインのうちの一方が１つ以上のノブ変異を含み、もう一方のＦｃドメインが１つ以上のホール変異を含む、当該ＳＡＰ－Ｆｃ融合タンパク質である。
【0034】
いくつかの実施形態では、ヒトＳＡＰ成分タンパク質は配列番号１７のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ヒトＳＡＰ成分タンパク質は、ＳＡＰ成分タンパク質のグリコシル化を減少させる１つ以上の改変を含む。いくつかの実施形態では、ＳＡＰ成分タンパク質のグリコシル化を減少させる１つ以上の改変は、ＳＡＰ成分タンパク質のＮ末端から付番を開始してＮ３２Ｓ及びＮ１１０Ｓアミノ酸置換から選択される。いくつかの実施形態では、ヒトＳＡＰ成分タンパク質は、ＳＡＰ成分タンパク質のＮ末端から付番を開始してアミノ酸置換Ｎ３２Ｓ及びＮ１１０Ｓを含む。いくつかの実施形態では、ヒトＳＡＰ成分タンパク質は配列番号２０のアミノ酸配列を含む。
【0035】
いくつかの実施形態では、ＳＡＰ－Ｆｃ融合タンパク質は、Ｆｃドメインのヘテロ二量体化を促進する１つ以上の改変を含む。いくつかの実施形態では、２つのＦｃドメインのうちの一方は１つ以上のノブ変異を含み、もう一方のＦｃドメインは１つ以上のホール変異を含み、ノブ及びホール変異は、第１及び第２Ｆｃドメインの会合、例えば二量体となる会合を促進する。いくつかの実施形態では、１つ以上のノブ変異を含むＦｃドメインはＴ３６６Ｗアミノ酸置換を含み、１つ以上のホール変異を含むＦｃドメインはアミノ酸置換Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖを含み、付番はＥＵ付番方式に基づく。いくつかの実施形態では、１つ以上のノブ変異を含むＦｃドメインはＴ３６６Ｗ及びＹ３４９Ｃアミノ酸置換を含み、１つ以上のホール変異を含むＦｃドメインはアミノ酸置換Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖを含み、付番はＥＵ付番方式に基づく。いくつかの実施形態では、１つ以上のノブ変異を含むＦｃドメインはＴ３６６Ｗ及びＹ３４９Ｃアミノ酸置換を含み、１つ以上のホール変異を含むＦｃドメインはアミノ酸置換Ｅ３５６Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖを含み、付番はＥＵ付番方式に基づく。いくつかの実施形態では、１つ以上のノブ変異を含むＦｃドメインはＲ４０９Ｄ及びＫ３７０Ｅアミノ酸置換を含み、１つ以上のホール変異を含むＦｃドメインはアミノ酸置換Ｄ３９９Ｋ及びＥ３５７Ｋを含み、付番はＥＵ付番方式に基づく。いくつかの実施形態では、１つ以上のノブ変異を含むＦｃドメインはアミノ酸置換Ｔ３６６Ｗ、Ｒ４０９Ｄ及びＫ３７０Ｅを含み、１つ以上のホール変異を含むＦｃドメインはアミノ酸置換Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ、Ｄ３９９Ｋ及びＥ３５７Ｋを含み、付番はＥＵ付番方式に基づく。いくつかの実施形態では、２つのＦｃドメインのうちの一方はアミノ酸置換Ｙ３４９Ｃ及びＴ３６６Ｗを含み、もう一方のＦｃドメインはアミノ酸置換Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖを含み、付番はＥＵ付番方式に基づく。いくつかの実施形態では、２つのＦｃドメインのうちの一方はＴ３６６Ｗアミノ酸置換を含み、もう一方のＦｃドメインはアミノ酸置換Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖを含み、付番はＥＵ付番方式に基づく。いくつかの実施形態では、２つのＦｃドメインのうちの一方はアミノ酸置換Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｗ、Ｒ４０９Ｄ及びＫ３７０Ｅを含み、もう一方のＦｃドメインはアミノ酸置換Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ、Ｄ３９９Ｋ及びＥ３５７Ｋを含み、付番はＥＵ付番方式に基づく。当技術分野で知られているさらなる、または代替となる「ノブ－イン－ホール」技術、例えばＥＰ１８７０４５９Ａ１に記載されている技術を本開示のＳＡＰ－Ｆｃ融合タンパク質に用いてもよい。いくつかの実施形態では、１つ以上のノブ変異を含むＦｃドメインは、配列番号１２の付番によるアミノ酸位置１５１にトリプトファン残基を含み、１つ以上のホール変異を含むＦｃドメインは、アミノ酸位置１５１にセリン残基、アミノ酸位置１５３にアラニン残基、及びアミノ酸位置１９２にバリン残基を含み、付番は配列番号６に基づく。
【0036】
いくつかの実施形態では、ＳＡＰ－ｆｃ融合タンパク質は、第１ポリペプチド及び第２ポリペプチドを含み（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ ａ ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）、第１ポリペプチドは、第１ヒトＦｃドメインのＮ末端に連結されたヒト血清アミロイドＰ（ＳＡＰ）タンパク質を含み、第２ポリペプチドは、第２ヒトＦｃドメインを含むがヒトＳＡＰ成分タンパク質を含まず、第１及び第２Ｆｃドメインは二量体を形成し、２つのＦｃドメインのうちの一方はノブ変異を含み、もう一方のＦｃドメインはホール変異を含む。いくつかの実施形態では、第１ヒトＦｃドメインはノブ変異を含む。いくつかの実施形態では、ノブ変異は、ＥＵ付番方式に基づいて付番してＴ３６６Ｗアミノ酸置換である。いくつかの実施形態では、ノブ変異は、配列番号１２の付番によるアミノ酸位置１５１のトリプトファン残基である。いくつかの実施形態では、第１ヒトＦｃドメインは配列番号１２のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第１ヒトＦｃドメインは、ＦｃＲｎ結合性を低下させる１つ以上の改変をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＦｃＲｎ結合性を低下させる１つ以上の改変は、ＥＵ付番方式に基づいて付番してＩ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ及びＨ４３５Ａアミノ酸置換から選択される。いくつかの実施形態では、第１ヒトＦｃドメインは、ＥＵ付番方式に基づいて付番してアミノ酸置換Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ及びＨ４３５Ａを含む。いくつかの実施形態では、ＦｃＲｎ結合性を低下させる１つ以上の改変は、配列番号１５の付番による３８、９５及び２２０から選択されるアミノ酸位置のアラニン残基である。いくつかの実施形態では、第１ヒトＦｃドメインは、配列番号１５の付番によるアミノ酸位置３８、９５及び２２０にアラニン残基を含む。いくつかの実施形態では、第１ヒトＦｃドメインは配列番号１５のアミノ酸配列を含む。
【0037】
いくつかの実施形態では、第１Ｆｃドメインがノブ変異を含む場合、第２ヒトＦｃドメインは１つ以上のホール変異を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のホール変異は、ＥＵ付番方式に基づいて付番してＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のホール変異は、アミノ酸位置１５１のセリン残基、アミノ酸位置１５３のアラニン残基、及びアミノ酸位置１９２のバリン残基を含み、付番は配列番号６に基づく。いくつかの実施形態では、第２ヒトＦｃドメインは配列番号６のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第２ヒトＦｃドメインは、ＦｃＲｎ結合性を低下させる１つ以上の改変をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＦｃＲｎ結合性を低下させる１つ以上の改変は、ＥＵ付番方式に基づいて付番してＩ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ及びＨ４３５Ａアミノ酸置換から選択される。いくつかの実施形態では、第２ヒトＦｃドメインは、ＥＵ付番方式に基づいて付番してアミノ酸置換Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ及びＨ４３５Ａを含む。いくつかの実施形態では、ＦｃＲｎ結合性を低下させる１つ以上の改変は、配列番号９の付番による３８、９５及び２２０から選択されるアミノ酸位置のアラニン残基である。いくつかの実施形態では、第２ヒトＦｃドメインは、配列番号９の付番によるアミノ酸位置３８、９５及び２２０にアラニン残基を含む。いくつかの実施形態では、第２ヒトＦｃドメインは配列番号９のアミノ酸配列を含む。
【0038】
いくつかの実施形態では、第１ヒトＦｃドメインは１つ以上のホール変異を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のホール変異は、ＥＵ付番方式に基づいて付番してＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のホール変異は、アミノ酸位置１５１のセリン残基、アミノ酸位置１５３のアラニン残基、及びアミノ酸位置１９２のバリン残基を含み、付番は配列番号６に基づく。いくつかの実施形態では、第１ヒトＦｃドメインは配列番号６のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第１ヒトＦｃドメインは、ＦｃＲｎ結合性を低下させる１つ以上の改変をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＦｃＲｎ結合性を低下させる１つ以上の改変は、ＥＵ付番方式に基づいて付番してＩ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ及びＨ４３５Ａアミノ酸置換から選択される。いくつかの実施形態では、第１ヒトＦｃドメインは、ＥＵ付番方式に基づいて付番してアミノ酸置換Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ及びＨ４３５Ａを含む。いくつかの実施形態では、ＦｃＲｎ結合性を低下させる１つ以上の改変は、配列番号９の付番による３８、９５及び２２０から選択されるアミノ酸位置のアラニン残基である。いくつかの実施形態では、第１ヒトＦｃドメインは、配列番号９の付番によるアミノ酸位置３８、９５及び２２０にアラニン残基を含む。いくつかの実施形態では、第１ヒトＦｃドメインは配列番号９のアミノ酸配列を含む。
【0039】
いくつかの実施形態では、第１Ｆｃドメインがホール変異を含む場合、第２ヒトＦｃドメインはノブ変異を含む。いくつかの実施形態では、ノブ変異は、ＥＵ付番方式に基づいて付番してＴ３６６Ｗアミノ酸置換である。いくつかの実施形態では、ノブ変異は、配列番号１２の付番によるアミノ酸位置１５１のトリプトファン残基である。いくつかの実施形態では、第２ヒトＦｃドメインは配列番号１２のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第２ヒトＦｃドメインは、ＦｃＲｎ結合性を低下させる１つ以上の改変をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＦｃＲｎ結合性を低下させる１つ以上の改変は、ＥＵ付番方式に基づいて付番してＩ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ及びＨ４３５Ａアミノ酸置換から選択される。いくつかの実施形態では、第２ヒトＦｃドメインは、ＥＵ付番方式に基づいて付番してアミノ酸置換Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ及びＨ４３５Ａを含む。いくつかの実施形態では、ＦｃＲｎ結合性を低下させる１つ以上の改変は、配列番号１５の付番による３８、９５及び２２０から選択されるアミノ酸位置のアラニン残基である。いくつかの実施形態では、第２ヒトＦｃドメインは、配列番号１５の付番によるアミノ酸位置３８、９５及び２２０にアラニン残基を含む。いくつかの実施形態では、第２ヒトＦｃドメインは配列番号１５のアミノ酸配列を含む。
【0040】
いくつかの実施形態では、ＳＡＰ－Ｆｃ融合タンパク質は第１ポリペプチド及び第２ポリペプチドを含み、第１ポリペプチドは、第１ヒトＦｃドメインのＮ末端に連結されたＳＡＰ成分タンパク質を含み、第２ポリペプチドは、第２ヒトＦｃドメインを含むがヒトＳＡＰ成分タンパク質を含まず、第１及び第２Ｆｃドメインは二量体を形成し、第１Ｆｃドメインは１つ以上のノブ変異を含み、第２Ｆｃドメインは１つ以上のホール変異を含む。いくつかの実施形態では、ＳＡＰ成分タンパク質は配列番号１７のアミノ酸配列を含み、第１Ｆｃドメインは配列番号１２のアミノ酸配列を含み、第２Ｆｃドメインは配列番号６のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第１ポリペプチドは配列番号５のアミノ酸配列を含み、第２ポリペプチドは配列番号６のアミノ酸配列を含む。
【0041】
いくつかの実施形態では、ＳＡＰ－Ｆｃ融合タンパク質は第１ポリペプチド及び第２ポリペプチドを含み、第１ポリペプチドは、ＳＡＰ成分タンパク質のグリコシル化を減少させる１つ以上の改変を含むＳＡＰ成分タンパク質を含み、ＳＡＰ成分タンパク質は、第１ヒトＦｃドメインのＮ末端に連結されており、第２ポリペプチドは、第２ヒトＦｃドメインを含むがヒトＳＡＰ成分タンパク質は含まず、第１及び第２Ｆｃドメインは二量体を形成し、第１Ｆｃドメインは１つ以上のノブ変異を含み、第２Ｆｃドメインは１つ以上のホール変異を含む。いくつかの実施形態では、ＳＡＰ成分タンパク質は配列番号２０のアミノ酸配列を含み、第１Ｆｃドメインは配列番号１２のアミノ酸配列を含み、第２Ｆｃドメインは配列番号６のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第１ポリペプチドは配列番号７のアミノ酸配列を含み、第２ポリペプチドは配列番号６のアミノ酸配列を含む。
【0042】
いくつかの実施形態では、ＳＡＰ－Ｆｃ融合タンパク質は第１ポリペプチド及び第２ポリペプチドを含み、第１ポリペプチドは、ＦｃＲｎ結合性を低下させる１つ以上の改変を含む第１ヒトＦｃドメインのＮ末端に連結されたＳＡＰ成分タンパク質を含み、第２ポリペプチドは、ＦｃＲｎ結合性を低下させる１つ以上の改変を含む第２ヒトＦｃドメインを含がヒトＳＡＰ成分タンパク質を含まず、第１及び第２Ｆｃドメインは二量体を形成し、第１Ｆｃドメインは１つ以上のノブ変異を含み、第２Ｆｃドメインは１つ以上のホール変異を含む。いくつかの実施形態では、ＳＡＰ成分タンパク質は配列番号１７のアミノ酸配列を含み、第１Ｆｃドメインは配列番号１５のアミノ酸配列を含み、第２Ｆｃドメインは配列番号９のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第１ポリペプチドは配列番号８のアミノ酸配列を含み、及び第２ポリペプチドは配列番号９のアミノ酸配列を含む。
【0043】
いくつかの実施形態では、ＳＡＰ－Ｆｃ融合タンパク質は第１ポリペプチド及び第２ポリペプチドを含み、第１ポリペプチドは、ＳＡＰ成分タンパク質のグリコシル化を減少させる１つ以上の改変を含むＳＡＰ成分タンパク質を含み、ＳＡＰ成分タンパク質は、ＦｃＲｎ結合性を低下させる１つ以上の改変を含む第１ヒトＦｃドメインのＮ末端に連結されており、第２ポリペプチドは、ＦｃＲｎ結合性を低下させる１つ以上の改変を含む第２ヒトＦｃドメインを含むがヒトＳＡＰ成分タンパク質を含まず、第１及び第２Ｆｃドメインは二量体を形成し、第１Ｆｃドメインは１つ以上のノブ変異を含み、第２Ｆｃドメインは１つ以上のホール変異を含む。いくつかの実施形態では、ＳＡＰ成分タンパク質は、グリコシル化部位を除去する１つ以上の改変を含む。いくつかの実施形態では、ＳＡＰ成分タンパク質は配列番号２０のアミノ酸配列を含み、第１ヒトＦｃドメインは配列番号１５のアミノ酸配列を含み、第２ヒトＦｃドメインは配列番号９のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第１ポリペプチドは配列番号１０のアミノ酸配列を含み、第２ポリペプチドは配列番号９のアミノ酸配列を含む。
【0044】
いくつかの実施形態では、ＳＡＰ－Ｆｃ融合タンパク質は第１ポリペプチド及び第２ポリペプチドを含み、第１ポリペプチドは、第１ヒトＦｃドメインのＮ末端に連結されたＳＡＰ成分タンパク質を含み、第２ポリペプチドは、第２ヒトＦｃドメインを含むがヒトＳＡＰ成分タンパク質を含まず、第１及び第２Ｆｃドメインは二量体を形成し、第１Ｆｃドメインは１つ以上のホール変異を含み、第２Ｆｃドメインは１つ以上のノブ変異を含む。いくつかの実施形態では、ＳＡＰ成分タンパク質は配列番号１７のアミノ酸配列を含み、第１Ｆｃドメインは配列番号６のアミノ酸配列を含み、第２Ｆｃドメインは配列番号１２のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第１ポリペプチドは配列番号１１のアミノ酸配列を含み、第２ポリペプチドは配列番号１２のアミノ酸配列を含む。
【0045】
いくつかの実施形態では、ＳＡＰ－Ｆｃ融合タンパク質は第１ポリペプチド及び第２ポリペプチドを含み、第１ポリペプチドは、ＳＡＰ成分タンパク質のグリコシル化を減少させる１つ以上の改変を含むＳＡＰ成分タンパク質を含み、ＳＡＰ成分タンパク質は第１ヒトＦｃドメインのＮ末端に連結されており、第２ポリペプチドは、第２ヒトＦｃドメインを含むがヒトＳＡＰ成分タンパク質を含まず、第１及び第２Ｆｃドメインは二量体を形成し、第１Ｆｃドメインは１つ以上のホール変異を含み、第２Ｆｃドメインは１つ以上のノブ変異を含む。いくつかの実施形態では、ＳＡＰ成分タンパク質は配列番号２０のアミノ酸配列を含み、第１Ｆｃドメインは配列番号６のアミノ酸配列を含み、第２Ｆｃドメインは配列番号１２のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第１ポリペプチドは配列番号１３のアミノ酸配列を含み、第２ポリペプチドは配列番号１２のアミノ酸配列を含む。
【0046】
いくつかの実施形態では、ＳＡＰ－Ｆｃ融合タンパク質は第１ポリペプチド及び第２ポリペプチドを含み、第１ポリペプチドは、ＦｃＲｎ結合性を低下させる１つ以上の改変を含む第１ヒトＦｃドメインのＮ末端に連結されたＳＡＰ成分タンパク質を含み、第２ポリペプチドは、ＦｃＲｎ結合性を低下させる１つ以上の改変を含む第２ヒトＦｃドメインを含むがヒトＳＡＰ成分タンパク質を含まず、第１及び第２Ｆｃドメインは二量体を形成し、第１Ｆｃドメインは１つ以上のホール変異を含み、第２Ｆｃドメインは１つ以上のノブ変異を含む。いくつかの実施形態では、ＳＡＰ成分タンパク質は配列番号１７のアミノ酸配列を含み、第１Ｆｃドメインは配列番号９のアミノ酸配列を含み、第２Ｆｃドメインは配列番号１５のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第１ポリペプチドは配列番号１４のアミノ酸配列を含み、第２ポリペプチドは配列番号１５のアミノ酸配列を含む。
【0047】
いくつかの実施形態では、ＳＡＰ－Ｆｃ融合タンパク質は第１ポリペプチド及び第２ポリペプチドを含み、第１ポリペプチドは、ＳＡＰ成分タンパク質のグリコシル化を減少させる１つ以上の改変を含むＳＡＰ成分タンパク質を含み、ＳＡＰ成分タンパク質は、ＦｃＲｎ結合性を低下させる１つ以上の改変を含む第１ヒトＦｃドメインのＮ末端に連結されており、第２ポリペプチドは、ＦｃＲｎ結合性を低下させる１つ以上の改変を含む第２ヒトＦｃドメインを含むがヒトＳＡＰ成分タンパク質を含まず、第１及び第２Ｆｃドメインは二量体を形成し、第１Ｆｃドメインは１つ以上のホール変異を含み、第２Ｆｃドメインは１つ以上のノブ変異を含む。いくつかの実施形態では、ＳＡＰ成分タンパク質は配列番号２０のアミノ酸配列を含み、第１Ｆｃドメインは配列番号９のアミノ酸配列を含み、第２Ｆｃドメインは配列番号１５のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第１ポリペプチドは配列番号１６のアミノ酸配列を含み、第２ポリペプチドは配列番号１５のアミノ酸配列を含む。
【0048】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＳＡＰ－Ｆｃ融合タンパク質は、アミロイド沈着物またはフィブリルに結合する。いくつかの実施形態では、ＳＡＰ－Ｆｃ融合タンパク質は、アミロイド中の１つ以上のアミロイド原性ペプチドに結合する。いくつかの実施形態では、ＳＡＰ－Ｆｃ融合タンパク質に結合されるアミロイドは、アミロイド原性λ６可変ドメインタンパク質（Ｖλ６Ｗｉｌ）もしくはアミロイド原性（ａｍｙｌｏｉｄ ｇｅｎｉｃ）免疫グロブリン軽鎖（ＡＬ）、Ａβ（１－４０）アミロイド様フィブリルもしくはアミロイド原性Ａβ前駆体タンパク質、または血清アミロイドタンパク質Ａ（ＡＡ）を含む。他の実施形態では、ＳＡＰ－Ｆｃ融合タンパク質に結合されるアミロイドは、アミロイド原性形態の免疫グロブリン重鎖（ＡＨ）、β２－マイクログロブリン（Ａβ２Ｍ）、トランスサイレチン多様体（ＡＴＴＲ）、アポリポタンパク質ＡＩ（ＡＡｐｏＡＩ）、アポリポタンパク質ＡＩＩ（ＡＡｐｏＡＩＩ）、ゲルソリン（ＡＧｅｌ）、リゾチーム（ＡＬｙｓ）、白血球走化性因子（ＡＬｅｃｔ２）、フィブリノゲンａ多様体（ＡＦｉｂ）、シスタチン多様体（ＡＣｙｓ）、カルシトニン（ＡＣａｌ）、ラクトアドヘリン（ＡＭｅｄ）、膵島アミロイドポリペプチド（ＡＩＡＰＰ）、プロラクチン（ＡＰｒｏ）、インスリン（ＡＩｎｓ）、プリオンタンパク質（ｐｒｉｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ）（ＡＰｒＰ）、α－シヌクレイン（ＡαＳｙｎ）、タウ（ＡＴａｕ）、心房性ナトリウム利尿因子（ＡＡＮＦ）、ＩＡＡＰ、ＡＬκ４、Ａｌλ１、または他のアミロイド原性ペプチドを含む。ＳＡＰ－Ｆｃ融合タンパク質に結合されるアミロイド原性ペプチドは、タンパク質、タンパク質断片またはタンパク質ドメインであり得る。いくつかの実施形態では、アミロイド沈着物またはアミロイドフィブリルは組換えアミロイド原性タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、アミロイドは疾患の病理の一部である。
【0049】
いくつかの実施形態では、ＳＡＰ－Ｆｃ融合タンパク質はアミロイド沈着物の食作用を促進する。いくつかの実施形態では、ＳＡＰ－Ｆｃ融合タンパク質は、マクロファージ媒介食作用を促進する。
【0050】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＳＡＰ－Ｆｃ融合タンパク質は、非グリコシル化されており、アミロイド沈着物またはフィブリルに結合する。いくつかの実施形態では、非グリコシル化ＳＡＰ－Ｆｃ融合タンパク質は、アミロイド中の１つ以上のアミロイド原性ペプチドに結合する。いくつかの実施形態では、非グリコシル化ＳＡＰ－Ｆｃ融合タンパク質に結合されるアミロイドは、アミロイド原性λ６可変ドメインタンパク質（Ｖλ６Ｗｉｌ）もしくはアミロイド原性免疫グロブリン軽鎖（ＡＬ）、Ａβ（１－４０）アミロイド様フィブリルもしくはアミロイド原性Ａβ前駆体タンパク質、または血清アミロイドタンパク質Ａ（ＡＡ）を含む。他の実施形態では、非グリコシル化ＳＡＰ－Ｆｃ融合タンパク質に結合されるアミロイドは、アミロイド原性形態の免疫グロブリン重鎖（ＡＨ）、β２－マイクログロブリン（Ａβ２Ｍ）、トランスサイレチン多様体（ＡＴＴＲ）、アポリポタンパク質ＡＩ（ＡＡｐｏＡＩ）、アポリポタンパク質ＡＩＩ（ＡＡｐｏＡＩＩ）、ゲルソリン（ＡＧｅｌ）、リゾチーム（ＡＬｙｓ）、白血球走化性因子（ＡＬｅｃｔ２）、フィブリノゲンａ多様体（ＡＦｉｂ）、シスタチン多様体（ＡＣｙｓ）、カルシトニン（ＡＣａｌ）、ラクトアドヘリン（ＡＭｅｄ）、膵島アミロイドポリペプチド（ＡＩＡＰＰ）、プロラクチン（ＡＰｒｏ）、インスリン（ＡＩｎｓ）、プリオンタンパク質（ｐｒｉｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ）（ＡＰｒＰ）、α－シヌクレイン（ＡαＳｙｎ）、タウ（ＡＴａｕ）、心房性ナトリウム利尿因子（ＡＡＮＦ）、ＩＡＡＰ、ＡＬκ４、Ａｌλ１、または他のアミロイド原性ペプチドを含む。非グリコシル化ＳＡＰ－Ｆｃ融合タンパク質に結合されるアミロイド原性ペプチドは、タンパク質、タンパク質断片またはタンパク質ドメインであり得る。いくつかの実施形態では、アミロイド沈着物またはアミロイドフィブリルは組換えアミロイド原性タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、アミロイドは疾患の病理の一部である。いくつかの実施形態では、非グリコシル化ＳＡＰ－Ｆｃ融合タンパク質は、アミロイド沈着物の食作用を促進する。いくつかの実施形態では、非グリコシル化ＳＡＰ－Ｆｃ融合タンパク質は、マクロファージ媒介食作用を促進する。
【0051】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＳＡＰ－Ｆｃ融合タンパク質は、グリコシル化されており、アミロイド沈着物またはフィブリルに結合する。いくつかの実施形態では、グリコシル化ＳＡＰ－Ｆｃ融合タンパク質は、アミロイド中の１つ以上のアミロイド原性ペプチドに結合する。いくつかの実施形態では、グリコシル化ＳＡＰ－Ｆｃ融合タンパク質に結合されるアミロイドは、アミロイド原性λ６可変ドメインタンパク質（Ｖλ６Ｗｉｌ）もしくはアミロイド原性免疫グロブリン軽鎖（ＡＬ）、Ａβ（１－４０）アミロイド様フィブリルもしくはアミロイド原性Ａβ前駆体タンパク質、または血清アミロイドタンパク質Ａ（ＡＡ）。他の実施形態では、グリコシル化ＳＡＰ－Ｆｃ融合タンパク質に結合されるアミロイドは、アミロイド原性形態の免疫グロブリン重鎖（ＡＨ）、β２－マイクログロブリン（Ａβ２Ｍ）、トランスサイレチン多様体（ＡＴＴＲ）、アポリポタンパク質ＡＩ（ＡＡｐｏＡＩ）、アポリポタンパク質ＡＩＩ（ＡＡｐｏＡＩＩ）、ゲルソリン（ＡＧｅｌ）、リゾチーム（ＡＬｙｓ）、白血球走化性因子（ＡＬｅｃｔ２）、フィブリノゲンａ多様体（ＡＦｉｂ）、シスタチン多様体（ＡＣｙｓ）、カルシトニン（ＡＣａｌ）、ラクトアドヘリン（ＡＭｅｄ）、膵島アミロイドポリペプチド（ＡＩＡＰＰ）、プロラクチン（ＡＰｒｏ）、インスリン（ＡＩｎｓ）、プリオンタンパク質（ｐｒｉｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ）（ＡＰｒＰ）、α－シヌクレイン（ＡαＳｙｎ）、タウ（ＡＴａｕ）、心房性ナトリウム利尿因子（ＡＡＮＦ）、ＩＡＡＰ、ＡＬκ４、Ａｌλ１、または他のアミロイド原性ペプチドを含む。グリコシル化ＳＡＰ－Ｆｃ融合タンパク質に結合されるアミロイド原性ペプチドは、タンパク質、タンパク質断片またはタンパク質ドメインであり得る。いくつかの実施形態では、アミロイド沈着物またはアミロイドフィブリルは組換えアミロイド原性タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、アミロイドは疾患の病理の一部である。いくつかの実施形態では、グリコシル化ＳＡＰ－Ｆｃ融合タンパク質は、アミロイド沈着物の食作用を促進する。いくつかの実施形態では、グリコシル化ＳＡＰ－Ｆｃ融合タンパク質は、マクロファージ媒介食作用を促進する。
【0052】
非ヒト細胞（例えばＣＨＯ細胞）で産生されたタンパク質とヒト細胞（例えばＨＥＫ２９３細胞）で産生されたタンパク質との間でグリコシル化パターンが異なることは知られている。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＳＡＰ－Ｆｃ融合タンパク質は、ヒト細胞、例えばＨＥＫ２９３細胞で産生され、アミロイド沈着物またはフィブリルに結合する。いくつかの実施形態では、ＳＡＰ－Ｆｃ融合タンパク質は、ヒト細胞、例えばＨＥＫ２９３細胞で産生され、アミロイド中の１つ以上のアミロイド原性ペプチドに結合する。いくつかの実施形態では、ヒト細胞、例えばＨＥＫ２９３細胞で産生されたＳＡＰ－Ｆｃ融合タンパク質に結合されるアミロイドは、アミロイド原性λ６可変ドメインタンパク質（Ｖλ６Ｗｉｌ）もしくはアミロイド原性免疫グロブリン軽鎖（ＡＬ）、Ａβ（１－４０）アミロイド様フィブリルもしくはアミロイド原性Ａβ前駆体タンパク質、または血清アミロイドタンパク質Ａ（ＡＡ）を含む。他の実施形態では、ヒト細胞、例えばＨＥＫ２９３細胞で産生されたＳＡＰ－Ｆｃ融合タンパク質に結合されるアミロイドは、アミロイド原性形態の免疫グロブリン重鎖（ＡＨ）、β２－マイクログロブリン（Ａβ２Ｍ）、トランスサイレチン多様体（ＡＴＴＲ）、アポリポタンパク質ＡＩ（ＡＡｐｏＡＩ）、アポリポタンパク質ＡＩＩ（ＡＡｐｏＡＩＩ）、ゲルソリン（ＡＧｅｌ）、リゾチーム（ＡＬｙｓ）、白血球走化性因子（ＡＬｅｃｔ２）、フィブリノゲンａ多様体（ＡＦｉｂ）、シスタチン多様体（ＡＣｙｓ）、カルシトニン（ＡＣａｌ）、ラクトアドヘリン（ＡＭｅｄ）、膵島アミロイドポリペプチド（ＡＩＡＰＰ）、プロラクチン（ＡＰｒｏ）、インスリン（ＡＩｎｓ）、プリオンタンパク質（ｐｒｉｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ）（ＡＰｒＰ）、α－シヌクレイン（ＡαＳｙｎ）、タウ（ＡＴａｕ）、心房性ナトリウム利尿因子（ＡＡＮＦ）、ＩＡＡＰ、ＡＬκ４、Ａｌλ１、または他のアミロイド原性ペプチドを含む。ヒト細胞、例えばＨＥＫ２９３細胞で産生されたＳＡＰ－Ｆｃ融合タンパク質に結合されるアミロイド原性ペプチドは、タンパク質、タンパク質断片またはタンパク質ドメインであり得る。いくつかの実施形態では、アミロイド沈着物またはアミロイドフィブリルは組換えアミロイド原性タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、アミロイドは疾患の病理の一部である。いくつかの実施形態では、ヒト細胞、例えばＨＥＫ２９３細胞で産生されたＳＡＰ－Ｆｃ融合タンパク質は、アミロイド沈着物の食作用を促進する。いくつかの実施形態では、ヒト細胞、例えばＨＥＫ２９３細胞で産生されたＳＡＰ－Ｆｃ融合タンパク質は、マクロファージ媒介食作用を促進する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＳＡＰ－Ｆｃ融合タンパク質は、非ヒト細胞、例えばＣＨＯ細胞で産生され、アミロイド沈着物またはフィブリルに結合する。いくつかの実施形態では、非ヒト細胞、例えばＣＨＯ細胞で産生されたＳＡＰ－Ｆｃ融合タンパク質は、アミロイド中の１つ以上のアミロイド原性ペプチドに結合する。いくつかの実施形態では、非ヒト細胞、例えばＣＨＯ細胞で産生されたＳＡＰ－Ｆｃ融合タンパク質に結合されるアミロイドは、アミロイド原性λ６可変ドメインタンパク質（Ｖλ６Ｗｉｌ）もしくはアミロイド原性免疫グロブリン軽鎖（ＡＬ）、Ａβ（１－４０）アミロイド様フィブリルもしくはアミロイド原性Ａβ前駆体タンパク質、または血清アミロイドタンパク質Ａ（ＡＡ）を含む。他の実施形態では、非ヒト細胞、例えばＣＨＯ細胞で産生されたＳＡＰ－Ｆｃ融合タンパク質に結合されるアミロイドは、アミロイド原性形態の免疫グロブリン重鎖（ＡＨ）、β２－マイクログロブリン（Ａβ２Ｍ）、トランスサイレチン多様体（ＡＴＴＲ）、アポリポタンパク質ＡＩ（ＡＡｐｏＡＩ）、アポリポタンパク質ＡＩＩ（ＡＡｐｏＡＩＩ）、ゲルソリン（ＡＧｅｌ）、リゾチーム（ＡＬｙｓ）、白血球走化性因子（ＡＬｅｃｔ２）、フィブリノゲンａ多様体（ＡＦｉｂ）、シスタチン多様体（ＡＣｙｓ）、カルシトニン（ＡＣａｌ）、ラクトアドヘリン（ＡＭｅｄ）、膵島アミロイドポリペプチド（ＡＩＡＰＰ）、プロラクチン（ＡＰｒｏ）、インスリン（ＡＩｎｓ）、プリオンタンパク質（ｐｒｉｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ）（ＡＰｒＰ）、α－シヌクレイン（ＡαＳｙｎ）、タウ（ＡＴａｕ）、心房性ナトリウム利尿因子（ＡＡＮＦ）、ＩＡＡＰ、ＡＬκ４、Ａｌλ１、または他のアミロイド原性ペプチドを含む。非ヒト細胞、例えばＣＨＯ細胞で産生されたＳＡＰ－Ｆｃ融合タンパク質に結合されるアミロイド原性ペプチドは、タンパク質、タンパク質断片またはタンパク質ドメインであり得る。いくつかの実施形態では、アミロイド沈着物またはアミロイドフィブリルは組換えアミロイド原性タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、アミロイドは疾患の病理の一部である。いくつかの実施形態では、非ヒト細胞、例えばＣＨＯ細胞で産生されたＳＡＰ－Ｆｃ融合タンパク質は、アミロイド沈着物の食作用を促進する。いくつかの実施形態では、非ヒト細胞、例えばＣＨＯ細胞で産生されたＳＡＰ－Ｆｃ融合タンパク質は、マクロファージ媒介食作用を促進する。
【0053】
いくつかの実施形態では、アミロイド沈着物またはフィブリルに対する本明細書に記載のＳＡＰ－Ｆｃ融合タンパク質の結合性は、ＳＡＰ－Ｆｃ融合タンパク質のグリコシル化状態に影響されない。いくつかの実施形態では、アミロイド中の１つ以上のアミロイド原性ペプチドに対するＳＡＰ－Ｆｃ融合タンパク質の結合性は、ＳＡＰ－Ｆｃ融合タンパク質のグリコシル化状態に影響されない。いくつかの実施形態では、ＳＡＰ－Ｆｃ融合タンパク質に結合されるアミロイドは、アミロイド原性λ６可変ドメインタンパク質（Ｖλ６Ｗｉｌ）もしくはアミロイド原性免疫グロブリン軽鎖（ＡＬ）、Ａβ（１－４０）アミロイド様フィブリルもしくはアミロイド原性Ａβ前駆体タンパク質、または血清アミロイドタンパク質Ａ（ＡＡ）を含む。他の実施形態では、ＳＡＰ－Ｆｃ融合タンパク質に結合されるアミロイドは、アミロイド原性形態の免疫グロブリン重鎖（ＡＨ）、β２－マイクログロブリン（Ａβ２Ｍ）、トランスサイレチン多様体（ＡＴＴＲ）、アポリポタンパク質ＡＩ（ＡＡｐｏＡＩ）、アポリポタンパク質ＡＩＩ（ＡＡｐｏＡＩＩ）、ゲルソリン（ＡＧｅｌ）、リゾチーム（ＡＬｙｓ）、白血球走化性因子（ＡＬｅｃｔ２）、フィブリノゲンａ多様体（ＡＦｉｂ）、シスタチン多様体（ＡＣｙｓ）、カルシトニン（ＡＣａｌ）、ラクトアドヘリン（ＡＭｅｄ）、膵島アミロイドポリペプチド（ＡＩＡＰＰ）、プロラクチン（ＡＰｒｏ）、インスリン（ＡＩｎｓ）、プリオンタンパク質（ｐｒｉｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ）（ＡＰｒＰ）、α－シヌクレイン（ＡαＳｙｎ）、タウ（ＡＴａｕ）、心房性ナトリウム利尿因子（ＡＡＮＦ）、ＩＡＡＰ、ＡＬκ４、Ａｌλ１、または他のアミロイド原性ペプチドを含む。ＳＡＰ－Ｆｃ融合タンパク質に結合されるアミロイド原性ペプチドは、タンパク質、タンパク質断片またはタンパク質ドメインであり得る。いくつかの実施形態では、アミロイド沈着物またはアミロイドフィブリルは組換えアミロイド原性タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、アミロイドは疾患の病理の一部である。いくつかの実施形態では、アミロイド沈着物の食作用を促進することにおける本明細書に記載のＳＡＰ－Ｆｃ融合タンパク質の活性は、ＳＡＰ－Ｆｃ融合タンパク質のグリコシル化状態に影響されない。いくつかの実施形態では、マクロファージ媒介食作用を促進することにおける本明細書に記載のＳＡＰ－Ｆｃ融合タンパク質の活性は、ＳＡＰ－Ｆｃ融合タンパク質のグリコシル化状態に影響されない。
【0054】
いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるＳＡＰ－Ｆｃ融合タンパク質は、２つのＦｃポリペプチド及び１つのＳＡＰポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ＳＡＰ－Ｆｃ融合タンパク質は、安定した非共有結合性ヘテロ二量体を形成する。いくつかの実施形態では、ＳＡＰ－Ｆｃ融合タンパク質は、Ｆｃヒンジ領域に位置する１つ以上のシステインを含まない。いくつかの実施形態では、ＳＡＰ－Ｆｃ融合タンパク質は、凝集が軽減されている。
【0055】
いくつかの実施形態では、本明細書に提供される二量体型ＳＡＰ－Ｆｃ融合タンパク質は、安定した非共有結合五量体を形成する。いくつかの実施形態では、五量体は、１、２、３、４、５、２４時間またはそれ以上にわたって安定している。いくつかの実施形態では、五量体（ｐｅｔａｍｅｒｓ）は、サイズ排除クロマトグラフィーカラムにおいて安定している。いくつかの実施形態では、五量体は、約３７５ｋＤａの分子量を有する。
【0056】
いくつかの実施形態では、本明細書に提供される二量体型ＳＡＰ－Ｆｃ融合タンパク質は、安定した非共有結合性十量体を形成する。いくつかの実施形態では、十量体は、１、２、３、４、５、２４時間またはそれ以上にわたって安定している。いくつかの実施形態では、十量体は、サイズ排除クロマトグラフィーカラムにおいて安定している。いくつかの実施形態では、十量体は、ＳＡＰ－Ｆｃ十量体についておおよそで約７５０ｋＤａの分子量を有する。
【0057】
本明細書にさらに提供されるのは、ＳＡＰ－Ｆｃ融合タンパク質及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物である。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、いかなる保存剤または他の担体、賦形剤もしくは安定化剤も本質的に含まないものであり得る。あるいは、医薬組成物は、１つ以上の保存剤、例えば、本明細書中の他のどこかに記載されている抗菌剤、薬学的に許容される担体、賦形剤または安定化剤を任意選択的に含み得、但し、それらがＳＡＰ－Ｆｃ融合体の物理化学的安定性に悪影響を及ぼさないことを条件とする。許容される担体、賦形剤及び安定化剤の例としては、付加的な緩衝剤、共溶媒、界面活性剤、アスコルビン酸及びメチオニンを含めた酸化防止剤、キレート剤、例えばＥＤＴＡ、金属錯体（例えば、Ｚｎ－タンパク質錯体）、及び生分解性ポリマー、例えばポリエステルが挙げられるが、これらに限定されない。薬学的に許容される担体、安定化剤及び浸透圧調節物質（ｉｓｏｍｏｌｙｔｅｓ）の配合及び選択についての詳細な論述は、参照により本明細書に援用されるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１８ｔｈ ｅｄ．；Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｔｏｎ，Ｐａ．，１９９０）の中に見つかり得る。
【0058】
ｉｎ ｖｉｖｏ投与のために使用される製剤は、無菌でなければならない。これは、無菌濾過膜による濾過によって容易に成し遂げられる。
【0059】
本発明の医薬組成物は、その意図した投与経路に適合するように製剤化される。投与経路の例としては、非経口、例えば、静脈内、皮内、皮下、経口（例えば吸入）、経皮（例えば局所）、経粘膜及び直腸投与が挙げられる。非経口、皮内または皮下適用のために使用される液剤または懸濁剤は、以下の成分を含み得る：無菌希釈剤、例えば、注射用水、生理食塩水、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒；抗菌剤、例えばベンジルアルコールまたはメチルパラベン；酸化防止剤、例えばアスコルビン酸または重亜硫酸ナトリウム；キレート剤、例えばエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）；緩衝剤、例えば、酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩、及び張度の調整のための薬剤、例えば塩化ナトリウムまたはデキストロース。ｐＨは、酸または塩基、例えば塩酸または水酸化ナトリウムを使用して調整され得る。非経口調製剤は、ガラス製またはプラスチック製のアンプル、使い捨てシリンジまたは複数回用量バイアルの中に封入され得る。
【0060】
注射剤用途に適する医薬組成物としては、無菌水性液剤（水溶性の場合）または分散体、及び無菌注射液剤または分散体の即席調製のための無菌散剤が挙げられる。静脈内投与の場合、好適な担体としては、生理食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬ（商標）（ＢＡＳＦ、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，Ｎ．Ｊ．）、またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。あらゆる場合において、組成物は無菌でなければならず、シリンジ易操作性が存在する程度に流動性を有するべきである。それは、製造及び貯蔵の条件の下で安定でなければならず、細菌及び真菌などの微生物の汚染作用から守られなければならない。担体は、例えば水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール及び液体ポリエチレングリコールなど）及びその好適な混合物を含有する、溶媒または分散媒体であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング剤の使用、分散体の場合における必要な粒径の維持、及び界面活性剤の使用によって維持され得る。微生物の作用の防止は、様々な抗菌及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどによって成し遂げられ得る。多くの場合、等張化剤、例えば、糖、ポリアルコール、例えばマンニトール、ソルビトール、塩化ナトリウムを組成物中に含むことが好ましいであろう。注射組成物の長期吸収は、吸収を遅らせる薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを組成物中に含むことによってもたらされ得る。
【0061】
無菌注射液剤は、適切な溶媒に所要量の活性化合物を、必要に応じて上に列挙される原料の１つまたは組合せと共に組み込み、その後に濾過滅菌することによって、調製され得る。一般に、分散体は、塩基性分散媒体及び上に列挙されるものからの必要な他の原料を含有する無菌ビヒクルに活性化合物を組み込むことによって調製される。無菌注射液剤の調製のための無菌散剤の場合、調製方法は、活性成分に任意の付加的な所望の原料が加わった、それらの前無菌濾過溶液からの粉末を生産する、真空乾燥及び凍結乾燥である。
【0062】
治療方法
本明細書にさらに提供されるのは、本明細書に開示されるＳＡＰ－Ｆｃ融合タンパク質を個体に投与することを含む、アミロイド関連障害を治療する方法である。
本明細書にさらに提供されるのは、本明細書に開示されるＳＡＰ－Ｆｃ融合タンパク質を個体に投与することを含む、アミロイド関連障害を治療する方法である。
【0063】
いくつかの実施形態では、ＳＡＰ－Ｆｃ融合タンパク質はアミロイド沈着物に結合する。いくつかの実施形態では、アミロイド沈着物は疾患の病理の一因であり得る。他の実施形態では、アミロイド沈着物は、個体におけるアミロイドーシスまたはアミロイド関連疾患を示唆するものであり得る。いくつかの実施形態では、ＳＡＰ－Ｆｃ融合タンパク質は、アミロイドーシスを有する個体においてアミロイドに結合する。いくつかの実施形態では、アミロイドーシスは、特定の組織または器官系、例えば、肝臓、心臓または中枢神経系に局在化している。
【0064】
他の実施形態では、アミロイドーシスは全身性アミロイドーシスである。いくつかの実施形態では、アミロイドーシスは家族性アミロイドーシスである。他の実施形態では、アミロイドーシスは孤発性アミロイドーシスである。いくつかの実施形態では、アミロイドーシスまたはアミロイド関連疾患は、ＡＡアミロイドーシス、ＡＬアミロイドーシス、ＡＨアミロイドーシス、Ａβアミロイドーシス、ＡＴＴＲアミロイドーシス、ＡＬｅｃｔ２アミロイドーシス、及びＩＩ型糖尿病のＩＡＰＰアミロイドーシス、アルツハイマー病、ダウン症候群、オランダ型アミロイドーシスを伴う遺伝性脳出血、脳ベータアミロイド血管症、海綿状脳症、甲状腺腫瘍、パーキンソン病、レビー小体型認知症、タウオパシー、ハンチントン病、老人性全身性アミロイドーシス、家族性血液透析、老人性全身性老化、老化性下垂体障害、医原性症候群、海綿状脳症、反応性慢性炎症、甲状腺腫瘍、骨髄腫、または他の形態のがんである。いくつかの実施形態では、ＳＡＰ－Ｆｃ融合タンパク質は、正常な老化に関連するアミロイドに結合する。他の実施形態では、ＳＡＰ－Ｆｃ融合タンパク質は、対象におけるアミロイドーシスまたはアミロイド関連疾患の診断、治療または予後に使用される。
【0065】
いくつかの実施形態では、治療される個体または対象は、動物、例えば哺乳動物である。いくつかの実施形態では、哺乳動物は、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、乳牛、ブタ、ヒツジ、仔羊、ヤギ、霊長類、マウス、ラットまたはヒトである。いくつかの実施形態では、個体または対象はヒトである。
【0066】
宿主細胞、ベクター、製造方法
いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるのは、ＳＡＰ－Ｆｃ融合タンパク質をコードする核酸である。いくつかの実施形態では、核酸はベクターの中にある。いくつかの実施形態では、ベクターは発現ベクターである。いくつかの実施形態では、ベクターは、原核生物発現のためのものである。いくつかの実施形態では、ベクターは、真核生物発現のためのものである。いくつかの実施形態では、ベクターは、哺乳動物発現ベクターである。いくつかの実施形態では、ベクターはウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、ベクターは、ＳＡＰ－Ｆｃ融合タンパク質の転写を促すプロモーターを含む。いくつかの実施形態では、プロモーターは、恒常または誘導性プロモーターである。
いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるのは、ＳＡＰ－Ｆｃ融合タンパク質をコードする核酸である。いくつかの実施形態では、核酸はベクターの中にある。いくつかの実施形態では、ベクターは発現ベクターである。いくつかの実施形態では、ベクターは、原核生物発現のためのものである。いくつかの実施形態では、ベクターは、真核生物発現のためのものである。いくつかの実施形態では、ベクターは、哺乳動物発現ベクターである。いくつかの実施形態では、ベクターはウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、ベクターは、ＳＡＰ－Ｆｃ融合タンパク質の転写を促すプロモーターを含む。いくつかの実施形態では、プロモーターは、恒常または誘導性プロモーターである。
【0067】
いくつかの実施形態では、ＳＡＰ－Ｆｃ融合タンパク質は、ポリペプチド構築物（例えば、Ｆｃ多様体、リンカー及び融合体パートナー）をコードする核酸を含有する核酸、好ましくは発現ベクターで形質転換された宿主細胞を、ポリペプチド構築物の発現を誘導するまたはもたらす適切な条件の下で培養することによって、製造される。いくつかの実施形態では、発現に適する条件は、選択される発現ベクター及び宿主細胞によって様々である。いくつかの実施形態では、哺乳動物細胞、細菌、昆虫細胞及び酵母を含むがこれらに限定されない様々な適切な宿主細胞が使用される。例えば、本開示において用途が見出される種々の細胞株は、アメリカンタイプカルチャーコレクションから入手できるＡＴＣＣ（登録商標）細胞株カタログに記載されている。いくつかの実施形態では、本開示のＳＡＰ－Ｆｃ融合タンパク質は、細胞株の遺伝子操作または細胞培養条件の改変、例えばキフネンシンの添加か、天然にグリコシル化しない宿主、例えば原核生物（Ｅ．ｃｏｌｉなど）の使用かのどちらかによって細胞に発現するタンパク質をグリコシル化しないように最適化された当該細胞において発現し、場合によっては、Ｆｃ中のグリコシル化配列の改変は不要となる。
【0068】
いくつかの実施形態では、哺乳動物細胞を宿主細胞として使用して本開示のポリペプチドを製造する。哺乳動物細胞種の例としては、ヒト胚性腎臓（ＨＥＫ）（例えば、ＨＥＫ２９３、ＨＥＫ２９３Ｆ）、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、ＨｅＬａ、ＣＯＳ、ＰＣ３、Ｖｅｒｏ、ＭＣ３Ｔ３、ＮＳ０、Ｓｐ２／０、ＶＥＲＹ、ＢＨＫ、ＭＤＣＫ、Ｗ１３８、ＢＴ４８３、Ｈｓ５７８Ｔ、ＨＴＢ２、ＢＴ２０、Ｔ４７Ｄ、ＮＳ０（いかなる免疫グロブリン鎖も内因的に産生しないネズミ骨髄腫細胞株）、ＣＲＬ７Ｏ３Ｏ及びＨｓＳ７８Ｂｓｔ細胞が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞を宿主細胞として使用して本開示のポリペプチドを製造する。Ｅ．ｃｏｌｉ系統の例としては、Ｅ．ｃｏｌｉ ２９４（ＡＴＣＣ（登録商標）３１，４４６）、Ｅ．ｃｏｌｉ λ１７７６（ＡＴＣＣ（登録商標）３１，５３７、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）（ＡＴＣＣ（登録商標）ＢＡＡ－１０２５）及びＥ．ｃｏｌｉ ＲＶ３０８（ＡＴＣＣ（登録商標）３１，６０８）が挙げられるが、これらに限定されない。
【0069】
異なる宿主細胞は、タンパク質生成物の翻訳後プロセシング及び修飾（例えばグリコシル化）に関して特徴的かつ特異な機序を有する。いくつかの実施形態では、発現するポリペプチドの正しい修飾及びプロセシングを確保すべく適切な細胞株または宿主システムを選択する。いくつかの実施形態では、α２，３結合シアル酸ＳＡＰ部分を産生しない宿主細胞が選択される。いくつかの実施形態では、α２，６結合シアル酸ＳＡＰ部分を野生型ヒトＳＡＰと同等のレベルで産生する宿主細胞が選択される。
【0070】
ベクターがタンパク質産生のための宿主細胞に導入され次第、プロモーターの誘導、形質転換体の選択、または所望の配列をコードする遺伝子の増幅のために適宜改変された従来の栄養培地で宿主細胞を培養する。
【0071】
いくつかの実施形態では、レトロウイルスまたはアデノウイルスなどのウイルスを使用して哺乳動物細胞に発現構築物を導入するシステムを含めた哺乳動物発現システムにおいて、ポリペプチド構築物、例えば、ＳＡＰ－Ｆｃ融合タンパク質を含むポリペプチドを発現させる。いくつかの実施形態では、ヒト、マウス、ラット、ハムスターまたは霊長類細胞を利用する。好適な細胞にはまた、Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３、ＣＨＯ、ＣＯＳ及び２９３細胞を含むがこれらに限定されない既知の研究細胞も、含まれる。あるいは、いくつかの実施形態では、細菌細胞においてタンパク質を発現させる。細菌発現システムは当技術分野でよく知られており、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｃｒｅｍｏｒｉｓ、及びＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｖｉｄａｎｓが挙げられる。場合によっては、昆虫細胞、例えば、限定されないがＳｆ９及びＳｆ２１細胞、または酵母細胞、例えば、限定されないが、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ及びＹａｒｒｏｗｉａ属からの生物において、Ｆｃ多様体を含むポリペプチド構築物を産生させる。場合によっては、無細胞翻訳システムを用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで、Ｆｃ多様体を含むポリペプチド構築物を産生させる。原核（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）及び真核（例えば、小麦胚芽、ウサギ網状赤血球）細胞に由来するｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳システムは、入手可能であり、いくつかの実施形態では関心対象のタンパク質の発現レベル及び機能特性に基づいて選択される。例えば、当業者には認識されるであろうが、ｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳は、いくつかのディスプレイ技術、例えばリボソームディスプレイのために必要とされる。加えて、いくつかの実施形態では、ＳＡＰ－Ｆｃ融合タンパク質（ｐｒｅｏｔｓｉｎｓ）多様体は、化学合成法、例えば、限定されないが、液相ペプチド合成及び固相ペプチド合成によって製造される。細菌抽出物などの非グリコシル化システムを使用するｉｎ ｖｉｔｒｏ転写の場合、Ｆｃは、天然のグリコシル化部位が存在していてもグリコシル化されることがなく、それゆえ、等しくＦｃの不活性化が得られることになる。
【0072】
いくつかの実施形態では、ポリペプチド構築物には、天然に存在するアミノ酸と同様に機能する非天然アミノ酸、アミノ酸類縁体、アミノ酸模倣体またはその任意の組合せが含まれる。天然にコードされるアミノ酸は、一般に、２０種のありふれたアミノ酸（アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン及びバリン）及びピロリジン及びセレノシステインを指す。アミノ酸類縁体は、天然に存在するアミノ酸と同じ基本化学構造、例えば、水素に結合した炭素（ａｎ ａ ｃａｒｂｏｎ）、カルボキシル基、アミノ基及びＲ基を有する化合物、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムを指す。いくつかの実施形態では、そのような類縁体は修飾Ｒ基（例えばノルロイシン）または修飾ペプチド主鎖を有するが、概して、天然に存在するアミノ酸と同じ基本化学構造を保持している。
【0073】
タンパク質製造、回収及び精製
いくつかの実施形態では、本開示のポリペプチドを製造するために使用される宿主細胞を、選択された宿主細胞の培養に適した培地で成長させる。哺乳動物宿主細胞に適する培地の例としては、最小必須培地（ＭＥＭ）、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、Ｅｘｐｉ２９３（商標）発現培地、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）が補充されたＤＭＥＭ、及びＲＰＭＩ－１６４０が挙げられる。細菌宿主細胞に適する培地の例としては、ルリアブロス（ＬＢ）に必要な栄養補助剤、例えば選択剤、例えばアンピシリンを加えたものが挙げられる。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、好適な温度、例えば約２０℃～約３９℃、例えば約２５℃～約３７℃、好ましくは３７℃で、例えば約５％～１０％のＣＯ２レベルで培養される。いくつかの実施形態では、培地のｐＨは、主に宿主生物に応じて、ｐＨ約６．８～ｐＨ７．４、例えばｐＨ７．０である。発現ベクターに誘導性プロモーターを使用する場合、タンパク質発現は、プロモーターの活性化に適した条件の下で誘導され得る。
いくつかの実施形態では、本開示のポリペプチドを製造するために使用される宿主細胞を、選択された宿主細胞の培養に適した培地で成長させる。哺乳動物宿主細胞に適する培地の例としては、最小必須培地（ＭＥＭ）、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、Ｅｘｐｉ２９３（商標）発現培地、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）が補充されたＤＭＥＭ、及びＲＰＭＩ－１６４０が挙げられる。細菌宿主細胞に適する培地の例としては、ルリアブロス（ＬＢ）に必要な栄養補助剤、例えば選択剤、例えばアンピシリンを加えたものが挙げられる。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、好適な温度、例えば約２０℃～約３９℃、例えば約２５℃～約３７℃、好ましくは３７℃で、例えば約５％～１０％のＣＯ２レベルで培養される。いくつかの実施形態では、培地のｐＨは、主に宿主生物に応じて、ｐＨ約６．８～ｐＨ７．４、例えばｐＨ７．０である。発現ベクターに誘導性プロモーターを使用する場合、タンパク質発現は、プロモーターの活性化に適した条件の下で誘導され得る。
【0074】
いくつかの実施形態では、タンパク質回収は、宿主細胞を、例えば、浸透圧ショック、超音波処理または溶解によって破壊することを伴う。細胞が破壊され次第、細胞残屑を遠心分離または濾過によって除去する。タンパク質はその後さらに精製され得る。いくつかの実施形態では、本開示のポリペプチドは、タンパク質精製の様々な方法、例えば、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー及びサイズ排除カラムクロマトグラフィー）、遠心分離、溶解度差、またはタンパク質の精製のための他の任意の標準的技術によって精製される。例えば、いくつかの実施形態では、タンパク質は、親和性カラム、例えばプロテインＡカラム（例えば、ＰＯＲＯＳプロテインＡクロマトグラフィー）と、クロマトグラフィーカラム（例えば、ＰＯＲＯＳ ＨＳ－５０カチオン交換クロマトグラフィー）、濾過、限外濾過、脱塩及び透析手順とを適切に選択及び併用することによって単離及び精製される。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、精製を容易にするためにマーカー配列、例えばペプチドに結合体化される。マーカーアミノ酸配列の一例はヘキサヒスチジンペプチド（Ｈｉｓ６－ｔａｇ）であるが、これは、ニッケル官能化アガロース親和性カラムにマイクロモーラーの親和性で結合し得るものである。あるいは、インフルエンザヘマグルチニンタンパク質に由来するエピトープに相当するものであるヘマグルチニン「ＨＡ」タグが使用され得る。
【0075】
いくつかの実施形態では、本開示のポリペプチド、例えば、ＳＡＰ－Ｆｃ融合タンパク質を含むポリペプチド構築物は、例えば遺伝子療法の文脈において、本開示のポリペプチドをコードする核酸分子を含有するベクター、例えばウイルスベクター（例えば、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ポックスウイルスベクター（例えばワクチニアウイルスベクター、例えば改変ワクチニアアンカラ（ＭＶＡ））、アデノ随伴ウイルスベクター、及びアルファウイルスベクター）を投与することによって対象（例えばヒト）の細胞によって産生される。ベクターは、（例えば、形質転換、トランスフェクション、電気穿孔、リン酸カルシウム沈殿、直接マイクロインジェクション、感染などによって）対象の細胞の中に入り次第、本明細書に開示されるポリペプチドの発現のために使用され得る。場合によっては、ポリペプチドは細胞から分泌される。いくつかの実施形態では、疾患または障害の治療が所望の転帰である場合、さらなる行為は必要でない。いくつかの実施形態では、タンパク質の回収が望まれる場合、対象から血液を採取し、様々な方法によって血液からタンパク質を精製する。
【0076】
キット
本明細書にさらに提供されるのは、ＳＡＰ－Ｆｃ融合タンパク質及び使用説明書を含むキットである。いくつかの実施形態では、キットは、本明細書に記載の方法のいずれかに従う説明書を含む。いくつかの実施形態では、キットは、アミロイド障害を治療するための説明書を含む。いくつかの実施形態では、は、全身性アミロイド障害を治療するための説明書を含む。いくつかの実施形態では、キットは、ＡＡアミロイドーシス、ＡＬアミロイドーシス、ＡＨアミロイドーシス、Ａβアミロイドーシス、ＡＴＴＲアミロイドーシス、ＡＬｅｃｔ２アミロイドーシス、及びＩＩ型糖尿病のＩＡＰＰアミロイドーシス、アルツハイマー病、ダウン症候群、オランダ型アミロイドーシスを伴う遺伝性脳出血、脳ベータアミロイド血管症、海綿状脳症、甲状腺腫瘍、パーキンソン病、レビー小体型認知症、タウオパシー、ハンチントン病、老人性全身性アミロイドーシス、家族性血液透析、老人性全身性老化、老化性下垂体障害、医原性症候群、海綿状脳症、反応性慢性炎症、甲状腺腫瘍、骨髄腫、または他の形態のがんを治療するための説明書を含む。
本明細書にさらに提供されるのは、ＳＡＰ－Ｆｃ融合タンパク質及び使用説明書を含むキットである。いくつかの実施形態では、キットは、本明細書に記載の方法のいずれかに従う説明書を含む。いくつかの実施形態では、キットは、アミロイド障害を治療するための説明書を含む。いくつかの実施形態では、は、全身性アミロイド障害を治療するための説明書を含む。いくつかの実施形態では、キットは、ＡＡアミロイドーシス、ＡＬアミロイドーシス、ＡＨアミロイドーシス、Ａβアミロイドーシス、ＡＴＴＲアミロイドーシス、ＡＬｅｃｔ２アミロイドーシス、及びＩＩ型糖尿病のＩＡＰＰアミロイドーシス、アルツハイマー病、ダウン症候群、オランダ型アミロイドーシスを伴う遺伝性脳出血、脳ベータアミロイド血管症、海綿状脳症、甲状腺腫瘍、パーキンソン病、レビー小体型認知症、タウオパシー、ハンチントン病、老人性全身性アミロイドーシス、家族性血液透析、老人性全身性老化、老化性下垂体障害、医原性症候群、海綿状脳症、反応性慢性炎症、甲状腺腫瘍、骨髄腫、または他の形態のがんを治療するための説明書を含む。
【0077】
キットはまた、バイアル、バッグ、ポンプまたはシリンジなどの容器に入ったＳＡＰ－Ｆｃ融合タンパク質も含み得る。いくつかの実施形態では、ＳＡＰ－Ｆｃ融合タンパク質は医薬組成物中に含まれている。
実施形態
１．第１ポリペプチド及び第２ポリペプチドを含む融合タンパク質であって、前記第１ポリペプチドが、第１ヒトＦｃドメインのＮ末端に連結されたヒト血清アミロイドＰ（ＳＡＰ）成分タンパク質を含み、前記第２ポリペプチドが、第２ヒトＦｃドメインを含むがヒトＳＡＰ成分タンパク質を含まず、前記第１及び前記第２Ｆｃドメインが二量体を形成し、２つの前記Ｆｃドメインのうちの一方がノブ変異を含み、もう一方の前記Ｆｃドメインがホール変異を含む、前記融合タンパク質。
２．前記第１ポリペプチドがノブ変異を含み、前記第２ポリペプチドがホール変異を含む、実施形態１に記載の融合タンパク質。
３．前記第１ポリペプチドが、配列番号５、配列番号７、配列番号８または配列番号１０で示されるアミノ酸配列を含み、前記第２ポリペプチドが、配列番号６または配列番号９で示されるアミノ酸配列を含む、実施形態２に記載の融合タンパク質。
４．前記融合タンパク質が、表２に記載のＴＮＴ１４８、ＴＮＴ１５２、ＴＮＴ１５７、ＴＮＴ１５８、ＴＮＴ１４７、ＴＮＴ１５９、ＴＮＴ１６０またはＴＮＴ１６１の第１ポリペプチド及び第２ポリペプチド配列を含む、実施形態１に記載の融合タンパク質。
５．前記第１ポリペプチドの前記Ｆｃドメインがホール変異を含み、前記第２ポリペプチドの前記Ｆｃドメインがノブ変異を含む、実施形態１に記載の融合タンパク質。
６．前記第１ポリペプチドが、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１４または配列番号１６で示されるアミノ酸配列を含み、前記第２ポリペプチドが、配列番号１２または配列番号１５で示されるアミノ酸配列を含む、実施形態５に記載の融合タンパク質。
７．Ｎ末端からＣ末端に向かって以下の式、ＳＡＰ－ヒンジ１－Ｆｃ１－Ｌ１－ヒンジ２－Ｆｃ２〔式中、ＳＡＰはヒト血清アミロイドＰ（ＳＡＰ）成分タンパク質であり、ヒンジ１は第１ヒンジ配列であり、Ｆｃ１は第１Ｆｃドメイン配列であり、Ｌ１はリンカーであり、ヒンジ２は第２ヒンジ配列であり、Ｆｃ２は第２Ｆｃドメイン配列である〕で表される構造を含む融合タンパク質。
８．前記融合タンパク質が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号２３または配列番号２４で示されるアミノ酸配列を含む、実施形態７に記載の融合タンパク質。
９．前記融合タンパク質が、ＴＮＴ１４６、ＴＮＴ１５１、ＴＮＴ１５５、ＴＮＴ１５６、ＴＮＴ１７０またはＴＮＴ１７１のポリペプチド配列を含む、実施形態７に記載の融合タンパク質。
１０．前記ヒト血清アミロイドＰ成分タンパク質が、配列番号１７に基づく位置Ｎ３２またはＮ１１０にアミノ酸置換を含む、実施形態１または実施形態７に記載の融合タンパク質。
１１．前記ヒト血清アミロイドＰ成分タンパク質が、配列番号２０で示されるアミノ酸配列を含む、実施形態１０に記載の融合タンパク質。
１２．前記第１及び第２Ｆｃドメインが、ＥＵ付番による位置Ｃ２２６またはＣ２２９にアミノ酸置換を含む、実施形態１または実施形態７に記載の融合タンパク質。
１３．前記第１及び第２Ｆｃドメインが、ＥＵ付番によるアミノ酸置換Ｃ２２６ＳまたはＣ２２９Ｓを含む、実施形態１２に記載の融合タンパク質。
１４．前記第１及び第２Ｆｃドメインが、配列番号１８のアミノ酸配列に基づいて付番してアミノ酸位置１１または１４にアミノ酸置換を含む、実施形態１または実施形態７に記載の融合タンパク質。
１５．前記第１及び第２Ｆｃドメインが、配列番号１８のアミノ酸配列に基づいて付番してアミノ酸位置１１または１４にセリン残基を含む、実施形態１４に記載の融合タンパク質。
１６．前記第１または第２Ｆｃドメインが、配列番号１８で示されるアミノ酸配列を含む、実施形態１２～１５のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
１７．前記第１及び／または第２Ｆｃドメインが、ＦｃＲｎ結合性を低下させる変異を含む、実施形態１または実施形態７に記載の融合タンパク質。
１８．前記融合タンパク質が五量体を形成する、実施形態１～１７のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
１９．実施形態１～１８のいずれか１項に記載の融合タンパク質を含む、医薬組成物。
２０．実施形態１～１８のいずれか１項に記載の融合タンパク質をコードする核酸。
２１．実施形態２０に記載の核酸を含む宿主細胞。
２２．実施形態１～１８のいずれか１項に記載の融合タンパク質を製造する方法であって、前記融合タンパク質をコードする核酸を含む宿主細胞を、前記融合タンパク質を発現させる条件の下で培養することを含む、前記方法。
２３．前記宿主細胞がＣＨＯ細胞または２９３細胞である、実施形態２２に記載の方法。
２４．前記宿主細胞が前記ＳＡＰ成分タンパク質をグリコシル化しない、実施形態２２または実施形態２３に記載の方法。
２５．アミロイド病を治療する方法であって、実施形態１～１８のいずれか１項に記載の融合タンパク質を、それを必要とする個体に投与することを含む、前記方法。
２６．前記アミロイド病が全身性アミロイドーシスを含む、実施形態２５に記載の方法。
２７．Ｎ末端からＣ末端に向かって以下の式、ヒンジ１－Ｆｃ１－Ｌ１－ヒンジ２－Ｆｃ２〔式中、ヒンジ１は第１ヒンジ配列であり、Ｆｃ１は第１Ｆｃドメイン配列であり、Ｌ１はリンカーであり、ヒンジ２は第２ヒンジ配列であり、Ｆｃ２は第２Ｆｃドメイン配列であり、前記第１及び第２Ｆｃドメインは、ＥＵ付番によるアミノ酸置換Ｃ２２６ＳもしくはＣ２２９Ｓを含む、及び／または前記第１及び第２Ｆｃドメインは、配列番号１８のアミノ酸配列に基づいて付番してアミノ酸位置１１もしくは１４にセリン残基を含む〕で表される構造を含む融合タンパク質。
２８．前記融合タンパク質が、前記融合タンパク質のＮ末端にヒト血清アミロイドＰ（ＳＡＰ）成分タンパク質をさらに含む、実施形態２７に記載の融合タンパク質。
１Ａ．Ｎ末端からＣ末端に向かって以下の式、ＳＡＰ－Ｆｃ１－Ｌ１－Ｆｃ２〔式中、Ｆｃ１は、ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３を含む第１Ｆｃドメイン配列であり、Ｌ１はリンカーであり、Ｆｃ２は、ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３を含む第２Ｆｃドメイン配列であり、ＳＡＰはヒト血清アミロイドＰ（ＳＡＰ）成分タンパク質であり、前記Ｆｃ１及び前記Ｆｃ２は、ＥＵ付番による位置Ｃ２２６及び／またはＣ２２９にアミノ酸置換を含む〕で表される構造を含む融合タンパク質。
２Ａ．前記Ｆｃ１及び前記Ｆｃ２が、ＥＵ付番による位置Ｃ２２６及びＣ２２９にアミノ酸置換を含む、実施形態１Ａに記載の融合タンパク質。
３Ａ．前記融合タンパク質が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号２３または配列番号２４で示されるアミノ酸配列を含む、実施形態１Ａまたは実施形態２Ａに記載の融合タンパク質。
４Ａ．前記融合タンパク質が、Ｃ末端側リジンを有さない配列番号１、Ｃ末端側リジンを有さない配列番号２、Ｃ末端側リジンを有さない配列番号３、Ｃ末端側リジンを有さない配列番号４、Ｃ末端側リジンを有さない配列番号２３、またはＣ末端側リジンを有さない配列番号２４で示されるアミノ酸配列を含む、実施形態３Ａに記載の融合タンパク質。
５Ａ．前記融合タンパク質が、ＴＮＴ１４６、ＴＮＴ１５１、ＴＮＴ１５５、ＴＮＴ１５６、ＴＮＴ１７０またはＴＮＴ１７１のポリペプチド配列を含む、実施形態１Ａまたは実施形態２Ａに記載の融合タンパク質。
６Ａ．第１ポリペプチド及び第２ポリペプチドを含む融合タンパク質であって、前記第１ポリペプチドが、第１ヒトＦｃドメイン（Ｆｃ１）のＮ末端に連結されたヒト血清アミロイドＰ（ＳＡＰ）成分タンパク質を含み、前記第２ポリペプチドが、第２ヒトＦｃドメイン（Ｆｃ２）を含むがヒトＳＡＰ成分タンパク質を含まず、前記第１及び前記第２Ｆｃドメインが二量体を形成し、２つの前記Ｆｃドメインのうちの一方がノブ変異を含み、もう一方の前記Ｆｃドメインがホール変異を含む、前記融合タンパク質。
７Ａ．前記第１ポリペプチドがノブ変異を含み、前記第２ポリペプチドがホール変異を含む、実施形態６Ａに記載の融合タンパク質。
８Ａ．前記第１ポリペプチドが、配列番号５、配列番号７、配列番号８または配列番号１０で示されるアミノ酸配列を含み、前記第２ポリペプチドが、配列番号６または配列番号９で示されるアミノ酸配列を含む、実施形態７Ａに記載の融合タンパク質。
９Ａ．前記第１ポリペプチドが、配列番号５で示されるアミノ酸配列を含み、前記第２ポリペプチドが、配列番号６で示されるアミノ酸配列を含む；
前記第１ポリペプチドが、配列番号７で示されるアミノ酸配列を含み、前記第２ポリペプチドが、配列番号６で示されるアミノ酸配列を含む；
前記第１ポリペプチドが、配列番号８で示されるアミノ酸配列を含み、前記第２ポリペプチドが、配列番号９で示されるアミノ酸配列を含む；または
前記第１ポリペプチドが、配列番号１０で示されるアミノ酸配列を含み、前記第２ポリペプチドが、配列番号６で示されるアミノ酸配列を含む、
実施形態８Ａに記載の融合タンパク質。
１０Ａ．前記第１ポリペプチドが、Ｃ末端側リジンを有するもしくは有さない配列番号５で示されるアミノ酸配列を含み、前記第２ポリペプチドが、Ｃ末端側リジンを有するもしくは有さない配列番号６で示されるアミノ酸配列を含む；
前記第１ポリペプチドが、Ｃ末端側リジンを有するもしくは有さない配列番号７で示されるアミノ酸配列を含み、前記第２ポリペプチドが、Ｃ末端側リジンを有するもしくは有さない配列番号６で示されるアミノ酸配列を含む；
前記第１ポリペプチドが、Ｃ末端側リジンを有するもしくは有さない配列番号８で示されるアミノ酸配列を含み、前記第２ポリペプチドが、Ｃ末端側リジンを有するもしくは有さない配列番号９で示されるアミノ酸配列を含む；または
前記第１ポリペプチドが、Ｃ末端側リジンを有するもしくは有さない配列番号１０で示されるアミノ酸配列を含み、前記第２ポリペプチドが、Ｃ末端側リジンを有するもしくは有さない配列番号６で示されるアミノ酸配列を含む、
実施形態８Ａに記載の融合タンパク質。
１１Ａ．前記融合タンパク質が、表２に記載のＴＮＴ１４８、ＴＮＴ１５２、ＴＮＴ１５７、ＴＮＴ１５８、ＴＮＴ１４７、ＴＮＴ１５９、ＴＮＴ１６０またはＴＮＴ１６１の第１ポリペプチド及び第２ポリペプチド配列を含む、実施形態６Ａに記載の融合タンパク質。
１２Ａ．前記第１ポリペプチドの前記Ｆｃドメインがホール変異を含み、前記第２ポリペプチドの前記Ｆｃドメインがノブ変異を含む、実施形態６Ａに記載の融合タンパク質。
１３Ａ．前記第１ポリペプチドが、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１４または配列番号１６で示されるアミノ酸配列を含み、前記第２ポリペプチドが、配列番号１２または配列番号１５で示されるアミノ酸配列を含む、実施形態６Ａに記載の融合タンパク質。
１４Ａ．前記第１ポリペプチドが、配列番号１１で示されるアミノ酸配列を含み、前記第２ポリペプチドが、配列番号１２で示されるアミノ酸配列を含む；
前記第１ポリペプチドが、配列番号１３で示されるアミノ酸配列を含み、前記第２ポリペプチドが、配列番号１２で示されるアミノ酸配列を含む；
前記第１ポリペプチドが、配列番号１４で示されるアミノ酸配列を含み、前記第２ポリペプチドが、配列番号１５で示されるアミノ酸配列を含む；または
前記第１ポリペプチドが、配列番号１６で示されるアミノ酸配列を含み、前記第２ポリペプチドが、配列番号１５で示されるアミノ酸配列を含む、
実施形態１３Ａに記載の融合タンパク質。
１５Ａ．前記第１ポリペプチドが、Ｃ末端側リジンを有するもしくは有さない配列番号１１で示されるアミノ酸配列を含み、前記第２ポリペプチドが、Ｃ末端側リジンを有するもしくは有さない配列番号１２で示されるアミノ酸配列を含む；
前記第１ポリペプチドが、Ｃ末端側リジンを有するもしくは有さない配列番号１３で示されるアミノ酸配列を含み、前記第２ポリペプチドが、Ｃ末端側リジンを有するもしくは有さない配列番号１２で示されるアミノ酸配列を含む；
前記第１ポリペプチドが、Ｃ末端側リジンを有するもしくは有さない配列番号１４で示されるアミノ酸配列を含み、前記第２ポリペプチドが、Ｃ末端側リジンを有するもしくは有さない配列番号１５で示されるアミノ酸配列を含む；または
前記第１ポリペプチドが、Ｃ末端側リジンを有するもしくは有さない配列番号１６で示されるアミノ酸配列を含み、前記第２ポリペプチドが、Ｃ末端側リジンを有するもしくは有さない配列番号１５で示されるアミノ酸配列を含む、
実施形態１３Ａに記載の融合タンパク質。
１６Ａ．前記ヒトＳＡＰが、配列番号１７で示されるアミノ酸配列を任意選択的に含む野生型ＳＡＰである、実施形態１Ａまたは実施形態６Ａに記載の融合タンパク質。
１７Ａ．前記ヒトＳＡＰが、配列番号１７に基づく位置Ｎ３２またはＮ１１０にアミノ酸置換を含む、実施形態１Ａまたは実施形態６Ａに記載の融合タンパク質。
１８Ａ．前記ヒトＳＡＰが、配列番号２０で示されるアミノ酸配列を含む、実施形態１７Ａに記載の融合タンパク質。
１９Ａ．前記Ｆｃ１及び前記Ｆｃ２が、ＥＵ付番による位置Ｃ２２６及び／またはＣ２２９にアミノ酸置換を含む、実施形態６Ａまたは１６Ａ～１８Ａのいずれか１項に記載の融合タンパク質。
２０Ａ．前記Ｆｃ１及び前記Ｆｃ２が、ＥＵ付番による位置Ｃ２２６及びＣ２２９にアミノ酸置換を含む、実施形態１９Ａに記載の融合タンパク質。
２１Ａ．前記Ｆｃ１及び前記Ｆｃ２が、ＥＵ付番によるアミノ酸置換Ｃ２２６Ｓ及び／またはＣ２２９Ｓを含む、実施形態１Ａ、２Ａ、６Ａまたは１６Ａ～２０Ａのいずれか１項に記載の融合タンパク質。
２２Ａ．前記Ｆｃ１及び前記Ｆｃ２が、ＥＵ付番によるアミノ酸置換Ｃ２２６Ｓ及びＣ２２９Ｓを含む、実施形態２１Ａに記載の融合タンパク質。
２３Ａ．前記Ｆｃ１及び／または前記Ｆｃ２が、配列番号１８のアミノ酸配列に基づいて付番してアミノ酸位置１１及び／または１４にアミノ酸置換を含む、実施形態１Ａ、２Ａ、６Ａまたは１５Ａ～１７Ａのいずれか１項に記載の融合タンパク質。
２４Ａ．前記Ｆｃ１及び／または前記Ｆｃ２が、配列番号１８のアミノ酸配列に基づいて付番してアミノ酸位置１１及び／または１４にセリン残基を含む、実施形態２３Ａに記載の融合タンパク質。
２５Ａ．前記Ｆｃ１及び／または前記Ｆｃ２が、配列番号１８で示されるアミノ酸配列を含む、実施形態２３Ａまたは実施形態２４Ａに記載の融合タンパク質。
２６Ａ．前記第１及び／または第２Ｆｃドメインが、ＦｃＲｎ結合性を低下させる変異を含む、実施形態１Ａ、２Ａ、６Ａまたは１６Ａ～１８Ａに記載の融合タンパク質。
２７Ａ．Ｎ末端からＣ末端に向かって以下の式、Ｆｃ１－Ｌ１－Ｆｃ２〔式中、Ｆｃ１は、ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３を含む第１Ｆｃドメイン配列であり、Ｌ１はリンカーであり、Ｆｃ２は、ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３を含む第２Ｆｃドメイン配列であり、前記Ｆｃ１及び前記Ｆｃ２は、ＥＵ付番によるアミノ酸置換Ｃ２２６Ｓ及び／またはＣ２２９Ｓを含む、及び／または前記Ｆｃ１及び前記Ｆｃ２は、配列番号１８のアミノ酸配列に基づいて付番してアミノ酸位置１１及び／または１４にセリン残基を含む〕で表される構造を含む融合タンパク質。
２８Ａ．前記融合タンパク質が、前記融合タンパク質のＮ末端にヒト血清アミロイドＰ（ＳＡＰ）成分タンパク質をさらに含む、実施形態２７Ａに記載の融合タンパク質。
２９Ａ．前記ヒトＳＡＰが、配列番号１７で示されるアミノ酸配列を任意選択的に含む野生型ＳＡＰである、実施形態２８Ａに記載の融合タンパク質。
３０Ａ．前記ヒトＳＡＰが、配列番号１７に基づく位置Ｎ３２またはＮ１１０にアミノ酸置換を含む、実施形態２８Ａに記載の融合タンパク質。
３１Ａ．前記ヒトＳＡＰが、配列番号２０で示されるアミノ酸配列を含む、実施形態３０Ａに記載の融合タンパク質。
３２Ａ．前記融合タンパク質が五量体または十量体（ｄｅｃｃａｍｅｒ）を形成する、実施形態１Ａ～３１Ａのいずれか１項に記載の融合タンパク質。
３３Ａ．前記融合タンパク質がヒトＦｃ領域を含む、実施形態１Ａ～３２Ａのいずれか１項に記載の融合タンパク質。
３４Ａ．前記融合タンパク質がヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む、実施形態１Ａ～３３Ａのいずれか１項に記載の融合タンパク質。
３５Ａ．前記融合タンパク質が、１つ以上の前記アミノ酸置換を欠く融合タンパク質と比較して凝集が軽減されている、実施形態１Ａ～３４Ａのいずれか１項に記載の融合タンパク質。
３６Ａ．実施形態１Ａ～３５Ａのいずれか１項に記載の融合タンパク質、及び薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
３７Ａ．前記融合タンパク質の少なくとも５０％が五量体及び／または十量体の状態にある、実施形態３６Ａに記載の医薬組成物。
３８Ａ．実施形態１Ａ～３５Ａのいずれか１項に記載の融合タンパク質をコードする核酸。
３９Ａ．実施形態３８Ａに記載の核酸を含むベクター。
４０Ａ．請求項３８に記載の核酸または実施形態３９Ａに記載のベクターを含む、宿主細胞。
４１Ａ．前記宿主細胞がＣＨＯ細胞または２９３細胞である、実施形態４０Ａに記載の宿主細胞。
４２Ａ．実施形態１Ａ～３５Ａのいずれか１項に記載の融合タンパク質を製造する方法であって、前記融合タンパク質をコードする核酸を含む宿主細胞を、前記融合タンパク質を発現させる条件の下で培養することを含む、前記方法。
４３Ａ．前記宿主細胞がＣＨＯ細胞または２９３細胞である、実施形態４２Ａに記載の方法。
４４Ａ．前記宿主細胞が前記ＳＡＰ成分タンパク質をグリコシル化しない、実施形態４２または実施形態４３に記載の方法。
４５Ａ．個体におけるアミロイド病を治療する方法であって、実施形態１Ａ～３５Ａのいずれか１項に記載の融合タンパク質を前記個体に投与することを含む、前記方法。
４６Ａ．個体におけるアミロイド病を治療する方法であって、実施形態４２Ａ～４４Ａのいずれか１項に記載の方法によって製造された前記融合タンパク質を前記個体に投与することを含む、前記方法。
４７Ａ．前記アミロイド病が、ＡＡアミロイドーシス、ＡＬアミロイドーシス、ＡＨアミロイドーシス、Ａβアミロイドーシス、ＡＴＴＲアミロイドーシス、ＡＬｅｃｔ２アミロイドーシス、ＩＩ型糖尿病のＩＡＰＰアミロイドーシス、及びアルツハイマー病からなる群から選択される、実施形態４５Ａまたは請求項４６Ａに記載の方法。
４８Ａ．実施形態４２Ａ～４５Ａのいずれか１項に記載の方法によって製造されたＳＡＰ－Ｆｃ融合タンパク質。
４９Ａ．前記個体がヒトである、実施形態４５Ａ～４７Ａのいずれか１項に記載の方法。
実施形態
１．第１ポリペプチド及び第２ポリペプチドを含む融合タンパク質であって、前記第１ポリペプチドが、第１ヒトＦｃドメインのＮ末端に連結されたヒト血清アミロイドＰ（ＳＡＰ）成分タンパク質を含み、前記第２ポリペプチドが、第２ヒトＦｃドメインを含むがヒトＳＡＰ成分タンパク質を含まず、前記第１及び前記第２Ｆｃドメインが二量体を形成し、２つの前記Ｆｃドメインのうちの一方がノブ変異を含み、もう一方の前記Ｆｃドメインがホール変異を含む、前記融合タンパク質。
２．前記第１ポリペプチドがノブ変異を含み、前記第２ポリペプチドがホール変異を含む、実施形態１に記載の融合タンパク質。
３．前記第１ポリペプチドが、配列番号５、配列番号７、配列番号８または配列番号１０で示されるアミノ酸配列を含み、前記第２ポリペプチドが、配列番号６または配列番号９で示されるアミノ酸配列を含む、実施形態２に記載の融合タンパク質。
４．前記融合タンパク質が、表２に記載のＴＮＴ１４８、ＴＮＴ１５２、ＴＮＴ１５７、ＴＮＴ１５８、ＴＮＴ１４７、ＴＮＴ１５９、ＴＮＴ１６０またはＴＮＴ１６１の第１ポリペプチド及び第２ポリペプチド配列を含む、実施形態１に記載の融合タンパク質。
５．前記第１ポリペプチドの前記Ｆｃドメインがホール変異を含み、前記第２ポリペプチドの前記Ｆｃドメインがノブ変異を含む、実施形態１に記載の融合タンパク質。
６．前記第１ポリペプチドが、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１４または配列番号１６で示されるアミノ酸配列を含み、前記第２ポリペプチドが、配列番号１２または配列番号１５で示されるアミノ酸配列を含む、実施形態５に記載の融合タンパク質。
７．Ｎ末端からＣ末端に向かって以下の式、ＳＡＰ－ヒンジ１－Ｆｃ１－Ｌ１－ヒンジ２－Ｆｃ２〔式中、ＳＡＰはヒト血清アミロイドＰ（ＳＡＰ）成分タンパク質であり、ヒンジ１は第１ヒンジ配列であり、Ｆｃ１は第１Ｆｃドメイン配列であり、Ｌ１はリンカーであり、ヒンジ２は第２ヒンジ配列であり、Ｆｃ２は第２Ｆｃドメイン配列である〕で表される構造を含む融合タンパク質。
８．前記融合タンパク質が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号２３または配列番号２４で示されるアミノ酸配列を含む、実施形態７に記載の融合タンパク質。
９．前記融合タンパク質が、ＴＮＴ１４６、ＴＮＴ１５１、ＴＮＴ１５５、ＴＮＴ１５６、ＴＮＴ１７０またはＴＮＴ１７１のポリペプチド配列を含む、実施形態７に記載の融合タンパク質。
１０．前記ヒト血清アミロイドＰ成分タンパク質が、配列番号１７に基づく位置Ｎ３２またはＮ１１０にアミノ酸置換を含む、実施形態１または実施形態７に記載の融合タンパク質。
１１．前記ヒト血清アミロイドＰ成分タンパク質が、配列番号２０で示されるアミノ酸配列を含む、実施形態１０に記載の融合タンパク質。
１２．前記第１及び第２Ｆｃドメインが、ＥＵ付番による位置Ｃ２２６またはＣ２２９にアミノ酸置換を含む、実施形態１または実施形態７に記載の融合タンパク質。
１３．前記第１及び第２Ｆｃドメインが、ＥＵ付番によるアミノ酸置換Ｃ２２６ＳまたはＣ２２９Ｓを含む、実施形態１２に記載の融合タンパク質。
１４．前記第１及び第２Ｆｃドメインが、配列番号１８のアミノ酸配列に基づいて付番してアミノ酸位置１１または１４にアミノ酸置換を含む、実施形態１または実施形態７に記載の融合タンパク質。
１５．前記第１及び第２Ｆｃドメインが、配列番号１８のアミノ酸配列に基づいて付番してアミノ酸位置１１または１４にセリン残基を含む、実施形態１４に記載の融合タンパク質。
１６．前記第１または第２Ｆｃドメインが、配列番号１８で示されるアミノ酸配列を含む、実施形態１２～１５のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
１７．前記第１及び／または第２Ｆｃドメインが、ＦｃＲｎ結合性を低下させる変異を含む、実施形態１または実施形態７に記載の融合タンパク質。
１８．前記融合タンパク質が五量体を形成する、実施形態１～１７のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
１９．実施形態１～１８のいずれか１項に記載の融合タンパク質を含む、医薬組成物。
２０．実施形態１～１８のいずれか１項に記載の融合タンパク質をコードする核酸。
２１．実施形態２０に記載の核酸を含む宿主細胞。
２２．実施形態１～１８のいずれか１項に記載の融合タンパク質を製造する方法であって、前記融合タンパク質をコードする核酸を含む宿主細胞を、前記融合タンパク質を発現させる条件の下で培養することを含む、前記方法。
２３．前記宿主細胞がＣＨＯ細胞または２９３細胞である、実施形態２２に記載の方法。
２４．前記宿主細胞が前記ＳＡＰ成分タンパク質をグリコシル化しない、実施形態２２または実施形態２３に記載の方法。
２５．アミロイド病を治療する方法であって、実施形態１～１８のいずれか１項に記載の融合タンパク質を、それを必要とする個体に投与することを含む、前記方法。
２６．前記アミロイド病が全身性アミロイドーシスを含む、実施形態２５に記載の方法。
２７．Ｎ末端からＣ末端に向かって以下の式、ヒンジ１－Ｆｃ１－Ｌ１－ヒンジ２－Ｆｃ２〔式中、ヒンジ１は第１ヒンジ配列であり、Ｆｃ１は第１Ｆｃドメイン配列であり、Ｌ１はリンカーであり、ヒンジ２は第２ヒンジ配列であり、Ｆｃ２は第２Ｆｃドメイン配列であり、前記第１及び第２Ｆｃドメインは、ＥＵ付番によるアミノ酸置換Ｃ２２６ＳもしくはＣ２２９Ｓを含む、及び／または前記第１及び第２Ｆｃドメインは、配列番号１８のアミノ酸配列に基づいて付番してアミノ酸位置１１もしくは１４にセリン残基を含む〕で表される構造を含む融合タンパク質。
２８．前記融合タンパク質が、前記融合タンパク質のＮ末端にヒト血清アミロイドＰ（ＳＡＰ）成分タンパク質をさらに含む、実施形態２７に記載の融合タンパク質。
１Ａ．Ｎ末端からＣ末端に向かって以下の式、ＳＡＰ－Ｆｃ１－Ｌ１－Ｆｃ２〔式中、Ｆｃ１は、ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３を含む第１Ｆｃドメイン配列であり、Ｌ１はリンカーであり、Ｆｃ２は、ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３を含む第２Ｆｃドメイン配列であり、ＳＡＰはヒト血清アミロイドＰ（ＳＡＰ）成分タンパク質であり、前記Ｆｃ１及び前記Ｆｃ２は、ＥＵ付番による位置Ｃ２２６及び／またはＣ２２９にアミノ酸置換を含む〕で表される構造を含む融合タンパク質。
２Ａ．前記Ｆｃ１及び前記Ｆｃ２が、ＥＵ付番による位置Ｃ２２６及びＣ２２９にアミノ酸置換を含む、実施形態１Ａに記載の融合タンパク質。
３Ａ．前記融合タンパク質が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号２３または配列番号２４で示されるアミノ酸配列を含む、実施形態１Ａまたは実施形態２Ａに記載の融合タンパク質。
４Ａ．前記融合タンパク質が、Ｃ末端側リジンを有さない配列番号１、Ｃ末端側リジンを有さない配列番号２、Ｃ末端側リジンを有さない配列番号３、Ｃ末端側リジンを有さない配列番号４、Ｃ末端側リジンを有さない配列番号２３、またはＣ末端側リジンを有さない配列番号２４で示されるアミノ酸配列を含む、実施形態３Ａに記載の融合タンパク質。
５Ａ．前記融合タンパク質が、ＴＮＴ１４６、ＴＮＴ１５１、ＴＮＴ１５５、ＴＮＴ１５６、ＴＮＴ１７０またはＴＮＴ１７１のポリペプチド配列を含む、実施形態１Ａまたは実施形態２Ａに記載の融合タンパク質。
６Ａ．第１ポリペプチド及び第２ポリペプチドを含む融合タンパク質であって、前記第１ポリペプチドが、第１ヒトＦｃドメイン（Ｆｃ１）のＮ末端に連結されたヒト血清アミロイドＰ（ＳＡＰ）成分タンパク質を含み、前記第２ポリペプチドが、第２ヒトＦｃドメイン（Ｆｃ２）を含むがヒトＳＡＰ成分タンパク質を含まず、前記第１及び前記第２Ｆｃドメインが二量体を形成し、２つの前記Ｆｃドメインのうちの一方がノブ変異を含み、もう一方の前記Ｆｃドメインがホール変異を含む、前記融合タンパク質。
７Ａ．前記第１ポリペプチドがノブ変異を含み、前記第２ポリペプチドがホール変異を含む、実施形態６Ａに記載の融合タンパク質。
８Ａ．前記第１ポリペプチドが、配列番号５、配列番号７、配列番号８または配列番号１０で示されるアミノ酸配列を含み、前記第２ポリペプチドが、配列番号６または配列番号９で示されるアミノ酸配列を含む、実施形態７Ａに記載の融合タンパク質。
９Ａ．前記第１ポリペプチドが、配列番号５で示されるアミノ酸配列を含み、前記第２ポリペプチドが、配列番号６で示されるアミノ酸配列を含む；
前記第１ポリペプチドが、配列番号７で示されるアミノ酸配列を含み、前記第２ポリペプチドが、配列番号６で示されるアミノ酸配列を含む；
前記第１ポリペプチドが、配列番号８で示されるアミノ酸配列を含み、前記第２ポリペプチドが、配列番号９で示されるアミノ酸配列を含む；または
前記第１ポリペプチドが、配列番号１０で示されるアミノ酸配列を含み、前記第２ポリペプチドが、配列番号６で示されるアミノ酸配列を含む、
実施形態８Ａに記載の融合タンパク質。
１０Ａ．前記第１ポリペプチドが、Ｃ末端側リジンを有するもしくは有さない配列番号５で示されるアミノ酸配列を含み、前記第２ポリペプチドが、Ｃ末端側リジンを有するもしくは有さない配列番号６で示されるアミノ酸配列を含む；
前記第１ポリペプチドが、Ｃ末端側リジンを有するもしくは有さない配列番号７で示されるアミノ酸配列を含み、前記第２ポリペプチドが、Ｃ末端側リジンを有するもしくは有さない配列番号６で示されるアミノ酸配列を含む；
前記第１ポリペプチドが、Ｃ末端側リジンを有するもしくは有さない配列番号８で示されるアミノ酸配列を含み、前記第２ポリペプチドが、Ｃ末端側リジンを有するもしくは有さない配列番号９で示されるアミノ酸配列を含む；または
前記第１ポリペプチドが、Ｃ末端側リジンを有するもしくは有さない配列番号１０で示されるアミノ酸配列を含み、前記第２ポリペプチドが、Ｃ末端側リジンを有するもしくは有さない配列番号６で示されるアミノ酸配列を含む、
実施形態８Ａに記載の融合タンパク質。
１１Ａ．前記融合タンパク質が、表２に記載のＴＮＴ１４８、ＴＮＴ１５２、ＴＮＴ１５７、ＴＮＴ１５８、ＴＮＴ１４７、ＴＮＴ１５９、ＴＮＴ１６０またはＴＮＴ１６１の第１ポリペプチド及び第２ポリペプチド配列を含む、実施形態６Ａに記載の融合タンパク質。
１２Ａ．前記第１ポリペプチドの前記Ｆｃドメインがホール変異を含み、前記第２ポリペプチドの前記Ｆｃドメインがノブ変異を含む、実施形態６Ａに記載の融合タンパク質。
１３Ａ．前記第１ポリペプチドが、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１４または配列番号１６で示されるアミノ酸配列を含み、前記第２ポリペプチドが、配列番号１２または配列番号１５で示されるアミノ酸配列を含む、実施形態６Ａに記載の融合タンパク質。
１４Ａ．前記第１ポリペプチドが、配列番号１１で示されるアミノ酸配列を含み、前記第２ポリペプチドが、配列番号１２で示されるアミノ酸配列を含む；
前記第１ポリペプチドが、配列番号１３で示されるアミノ酸配列を含み、前記第２ポリペプチドが、配列番号１２で示されるアミノ酸配列を含む；
前記第１ポリペプチドが、配列番号１４で示されるアミノ酸配列を含み、前記第２ポリペプチドが、配列番号１５で示されるアミノ酸配列を含む；または
前記第１ポリペプチドが、配列番号１６で示されるアミノ酸配列を含み、前記第２ポリペプチドが、配列番号１５で示されるアミノ酸配列を含む、
実施形態１３Ａに記載の融合タンパク質。
１５Ａ．前記第１ポリペプチドが、Ｃ末端側リジンを有するもしくは有さない配列番号１１で示されるアミノ酸配列を含み、前記第２ポリペプチドが、Ｃ末端側リジンを有するもしくは有さない配列番号１２で示されるアミノ酸配列を含む；
前記第１ポリペプチドが、Ｃ末端側リジンを有するもしくは有さない配列番号１３で示されるアミノ酸配列を含み、前記第２ポリペプチドが、Ｃ末端側リジンを有するもしくは有さない配列番号１２で示されるアミノ酸配列を含む；
前記第１ポリペプチドが、Ｃ末端側リジンを有するもしくは有さない配列番号１４で示されるアミノ酸配列を含み、前記第２ポリペプチドが、Ｃ末端側リジンを有するもしくは有さない配列番号１５で示されるアミノ酸配列を含む；または
前記第１ポリペプチドが、Ｃ末端側リジンを有するもしくは有さない配列番号１６で示されるアミノ酸配列を含み、前記第２ポリペプチドが、Ｃ末端側リジンを有するもしくは有さない配列番号１５で示されるアミノ酸配列を含む、
実施形態１３Ａに記載の融合タンパク質。
１６Ａ．前記ヒトＳＡＰが、配列番号１７で示されるアミノ酸配列を任意選択的に含む野生型ＳＡＰである、実施形態１Ａまたは実施形態６Ａに記載の融合タンパク質。
１７Ａ．前記ヒトＳＡＰが、配列番号１７に基づく位置Ｎ３２またはＮ１１０にアミノ酸置換を含む、実施形態１Ａまたは実施形態６Ａに記載の融合タンパク質。
１８Ａ．前記ヒトＳＡＰが、配列番号２０で示されるアミノ酸配列を含む、実施形態１７Ａに記載の融合タンパク質。
１９Ａ．前記Ｆｃ１及び前記Ｆｃ２が、ＥＵ付番による位置Ｃ２２６及び／またはＣ２２９にアミノ酸置換を含む、実施形態６Ａまたは１６Ａ～１８Ａのいずれか１項に記載の融合タンパク質。
２０Ａ．前記Ｆｃ１及び前記Ｆｃ２が、ＥＵ付番による位置Ｃ２２６及びＣ２２９にアミノ酸置換を含む、実施形態１９Ａに記載の融合タンパク質。
２１Ａ．前記Ｆｃ１及び前記Ｆｃ２が、ＥＵ付番によるアミノ酸置換Ｃ２２６Ｓ及び／またはＣ２２９Ｓを含む、実施形態１Ａ、２Ａ、６Ａまたは１６Ａ～２０Ａのいずれか１項に記載の融合タンパク質。
２２Ａ．前記Ｆｃ１及び前記Ｆｃ２が、ＥＵ付番によるアミノ酸置換Ｃ２２６Ｓ及びＣ２２９Ｓを含む、実施形態２１Ａに記載の融合タンパク質。
２３Ａ．前記Ｆｃ１及び／または前記Ｆｃ２が、配列番号１８のアミノ酸配列に基づいて付番してアミノ酸位置１１及び／または１４にアミノ酸置換を含む、実施形態１Ａ、２Ａ、６Ａまたは１５Ａ～１７Ａのいずれか１項に記載の融合タンパク質。
２４Ａ．前記Ｆｃ１及び／または前記Ｆｃ２が、配列番号１８のアミノ酸配列に基づいて付番してアミノ酸位置１１及び／または１４にセリン残基を含む、実施形態２３Ａに記載の融合タンパク質。
２５Ａ．前記Ｆｃ１及び／または前記Ｆｃ２が、配列番号１８で示されるアミノ酸配列を含む、実施形態２３Ａまたは実施形態２４Ａに記載の融合タンパク質。
２６Ａ．前記第１及び／または第２Ｆｃドメインが、ＦｃＲｎ結合性を低下させる変異を含む、実施形態１Ａ、２Ａ、６Ａまたは１６Ａ～１８Ａに記載の融合タンパク質。
２７Ａ．Ｎ末端からＣ末端に向かって以下の式、Ｆｃ１－Ｌ１－Ｆｃ２〔式中、Ｆｃ１は、ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３を含む第１Ｆｃドメイン配列であり、Ｌ１はリンカーであり、Ｆｃ２は、ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３を含む第２Ｆｃドメイン配列であり、前記Ｆｃ１及び前記Ｆｃ２は、ＥＵ付番によるアミノ酸置換Ｃ２２６Ｓ及び／またはＣ２２９Ｓを含む、及び／または前記Ｆｃ１及び前記Ｆｃ２は、配列番号１８のアミノ酸配列に基づいて付番してアミノ酸位置１１及び／または１４にセリン残基を含む〕で表される構造を含む融合タンパク質。
２８Ａ．前記融合タンパク質が、前記融合タンパク質のＮ末端にヒト血清アミロイドＰ（ＳＡＰ）成分タンパク質をさらに含む、実施形態２７Ａに記載の融合タンパク質。
２９Ａ．前記ヒトＳＡＰが、配列番号１７で示されるアミノ酸配列を任意選択的に含む野生型ＳＡＰである、実施形態２８Ａに記載の融合タンパク質。
３０Ａ．前記ヒトＳＡＰが、配列番号１７に基づく位置Ｎ３２またはＮ１１０にアミノ酸置換を含む、実施形態２８Ａに記載の融合タンパク質。
３１Ａ．前記ヒトＳＡＰが、配列番号２０で示されるアミノ酸配列を含む、実施形態３０Ａに記載の融合タンパク質。
３２Ａ．前記融合タンパク質が五量体または十量体（ｄｅｃｃａｍｅｒ）を形成する、実施形態１Ａ～３１Ａのいずれか１項に記載の融合タンパク質。
３３Ａ．前記融合タンパク質がヒトＦｃ領域を含む、実施形態１Ａ～３２Ａのいずれか１項に記載の融合タンパク質。
３４Ａ．前記融合タンパク質がヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む、実施形態１Ａ～３３Ａのいずれか１項に記載の融合タンパク質。
３５Ａ．前記融合タンパク質が、１つ以上の前記アミノ酸置換を欠く融合タンパク質と比較して凝集が軽減されている、実施形態１Ａ～３４Ａのいずれか１項に記載の融合タンパク質。
３６Ａ．実施形態１Ａ～３５Ａのいずれか１項に記載の融合タンパク質、及び薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
３７Ａ．前記融合タンパク質の少なくとも５０％が五量体及び／または十量体の状態にある、実施形態３６Ａに記載の医薬組成物。
３８Ａ．実施形態１Ａ～３５Ａのいずれか１項に記載の融合タンパク質をコードする核酸。
３９Ａ．実施形態３８Ａに記載の核酸を含むベクター。
４０Ａ．請求項３８に記載の核酸または実施形態３９Ａに記載のベクターを含む、宿主細胞。
４１Ａ．前記宿主細胞がＣＨＯ細胞または２９３細胞である、実施形態４０Ａに記載の宿主細胞。
４２Ａ．実施形態１Ａ～３５Ａのいずれか１項に記載の融合タンパク質を製造する方法であって、前記融合タンパク質をコードする核酸を含む宿主細胞を、前記融合タンパク質を発現させる条件の下で培養することを含む、前記方法。
４３Ａ．前記宿主細胞がＣＨＯ細胞または２９３細胞である、実施形態４２Ａに記載の方法。
４４Ａ．前記宿主細胞が前記ＳＡＰ成分タンパク質をグリコシル化しない、実施形態４２または実施形態４３に記載の方法。
４５Ａ．個体におけるアミロイド病を治療する方法であって、実施形態１Ａ～３５Ａのいずれか１項に記載の融合タンパク質を前記個体に投与することを含む、前記方法。
４６Ａ．個体におけるアミロイド病を治療する方法であって、実施形態４２Ａ～４４Ａのいずれか１項に記載の方法によって製造された前記融合タンパク質を前記個体に投与することを含む、前記方法。
４７Ａ．前記アミロイド病が、ＡＡアミロイドーシス、ＡＬアミロイドーシス、ＡＨアミロイドーシス、Ａβアミロイドーシス、ＡＴＴＲアミロイドーシス、ＡＬｅｃｔ２アミロイドーシス、ＩＩ型糖尿病のＩＡＰＰアミロイドーシス、及びアルツハイマー病からなる群から選択される、実施形態４５Ａまたは請求項４６Ａに記載の方法。
４８Ａ．実施形態４２Ａ～４５Ａのいずれか１項に記載の方法によって製造されたＳＡＰ－Ｆｃ融合タンパク質。
４９Ａ．前記個体がヒトである、実施形態４５Ａ～４７Ａのいずれか１項に記載の方法。
【実施例】
【0078】
実施例１．ＳＡＰ－ｓｃＦｃ構築物の製造
ＳＡＰ－ｓｃＦｃをプロテインＡ親和性（ＭＡＢＳＥＬＥＣＴ ＳＵＲＥＴＭ ＬＸ、ＣＹＴＩＶＡ（登録商標））精製ステップ及び１７００ｍｌサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）精製ステップによって精製した。しかしながら、これらの精製ステップは単量体及び二量体を他のオリゴマーから分離することができなかった（図６のＡ及びＢ）。単量体及び二量体を他のオリゴマーからよりよく分離するために、１７００ｍｌＳＥＣの精製生成物を４９６ｍｌＳＥＣ精製ステップによってさらに精製した（図７Ａ）。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析は、このステップで得られた画分が単量体、二量体及び他のオリゴマーの混合物を含有していることを示している（図７Ｂ）。４９６ｍｌＳＥＣからの画分「２Ｂ１」を、還元及び非還元マイクロ流体電気泳動（ＬＡＢＣＨＩＰ（登録商標）ＧＸＩＩ、ＰＥＲＫＩＮＥＬＭＥＲ（登録商標））による分析のために選択した。画分「２Ｂ１」の非還元マイクロ流体電気泳動が複数のオリゴマーピークを示した一方、還元マイクロ流体電気泳動は主要な単量体ピークを示した（図７Ｃ～７Ｄ）。４９６ｍｌＳＥＣからの画分「２Ａ９」をサイズ排除クロマトグラフィー多角度光散乱（ＳＥＣ－ＭＡＬＳ）による分析のために選択した。ＳＥＣ－ＭＡＬＳ結果は、ＳＡＰ－ｓｃＦｃタンパク質が高分子量複合体として存在することを示している（図７Ｅ）。これらの分析は、４９６ｍｌＳＥＣ精製ステップが、単量体及び二量体と他のオリゴマーとの分離を改善しなかったことを示している。４９６ｍｌＳＥＣ精製ステップの後の「２Ａ９」画分のＳＥＣ－ＨＰＬＣ分析が単一のピーク（図７Ｆ）を示した一方、変性グリコシル化質量分析は、単量体、二量体及び三量体信号を示した（図７Ｇ）。したがって、ＳＡＰ－ｓｃＦｃが、非共有結合的相互作用によって組み合わさった単量体と二量体と三量体との複合体として存在している可能性があるという仮説が立てられる。
ＳＡＰ－ｓｃＦｃをプロテインＡ親和性（ＭＡＢＳＥＬＥＣＴ ＳＵＲＥＴＭ ＬＸ、ＣＹＴＩＶＡ（登録商標））精製ステップ及び１７００ｍｌサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）精製ステップによって精製した。しかしながら、これらの精製ステップは単量体及び二量体を他のオリゴマーから分離することができなかった（図６のＡ及びＢ）。単量体及び二量体を他のオリゴマーからよりよく分離するために、１７００ｍｌＳＥＣの精製生成物を４９６ｍｌＳＥＣ精製ステップによってさらに精製した（図７Ａ）。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析は、このステップで得られた画分が単量体、二量体及び他のオリゴマーの混合物を含有していることを示している（図７Ｂ）。４９６ｍｌＳＥＣからの画分「２Ｂ１」を、還元及び非還元マイクロ流体電気泳動（ＬＡＢＣＨＩＰ（登録商標）ＧＸＩＩ、ＰＥＲＫＩＮＥＬＭＥＲ（登録商標））による分析のために選択した。画分「２Ｂ１」の非還元マイクロ流体電気泳動が複数のオリゴマーピークを示した一方、還元マイクロ流体電気泳動は主要な単量体ピークを示した（図７Ｃ～７Ｄ）。４９６ｍｌＳＥＣからの画分「２Ａ９」をサイズ排除クロマトグラフィー多角度光散乱（ＳＥＣ－ＭＡＬＳ）による分析のために選択した。ＳＥＣ－ＭＡＬＳ結果は、ＳＡＰ－ｓｃＦｃタンパク質が高分子量複合体として存在することを示している（図７Ｅ）。これらの分析は、４９６ｍｌＳＥＣ精製ステップが、単量体及び二量体と他のオリゴマーとの分離を改善しなかったことを示している。４９６ｍｌＳＥＣ精製ステップの後の「２Ａ９」画分のＳＥＣ－ＨＰＬＣ分析が単一のピーク（図７Ｆ）を示した一方、変性グリコシル化質量分析は、単量体、二量体及び三量体信号を示した（図７Ｇ）。したがって、ＳＡＰ－ｓｃＦｃが、非共有結合的相互作用によって組み合わさった単量体と二量体と三量体との複合体として存在している可能性があるという仮説が立てられる。
【0079】
また、１７００ｍｌＳＥＣの精製生成物を、ＳＰ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ 高性能強力カチオン交換クロマトグラフィー（ＨＩＴＲＡＰＴＭ ＳＰ ＨＰ、ＣＹＴＩＶＡ（登録商標））、ＰＯＲＯＳ（商標）ＸＳ 強力カチオン交換クロマトグラフィー（ＴＨＥＲＭＯ ＦＩＳＨＥＲ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ（登録商標））、ＰＨＥＮＹＬ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ ６ 高速流疎水的相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＴＲＡＰＴＭ ＰＨＥＮＹＬ ＦＦ、ＣＹＴＩＶＡ（登録商標））、ＢＵＴＹＬ－Ｓ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ ６ 高速流疎水的相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＴＲＡＰＴＭ ＢＵＴＹＬ－Ｓ ＦＦ、ＣＹＴＩＶＡ（登録商標））、ＢＩＯＰＲＯＣＥＳＳ ＣＡＰＴＯ ＰＨＥＮＹＬ ＩＭＰＲＥＳ 疎水的相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＴＲＡＰＴＭ ＣＡＰＴＯ ＰＨＥＮＹＬ ＩＭＰＲＥＳ、ＣＹＴＩＶＡ（登録商標））、及びＣＨＴ（商標）セラミックヒドロキシアパタイトカルシウム親和性カチオン交換クロマトグラフィー（ＢＩＯ－ＲＡＤ（登録商標））を用いるさらなる小スケール精製ステップにも供した。しかしながら、どの小スケール精製方法も、単量体及び二量体と他のオリゴマーとの分離を改善しなかった。
【0080】
実施例２．改変型ＳＡＰ－Ｆｃ融合タンパク質
実施例１に記載されるように、ＳＡＰ－Ｆｃの構造は精製プロセスにおける難題を招いた。発現及び精製プロファイルを改善するために、ＳＡＰ－Ｆｃ構造の改変を探索した。
実施例１に記載されるように、ＳＡＰ－Ｆｃの構造は精製プロセスにおける難題を招いた。発現及び精製プロファイルを改善するために、ＳＡＰ－Ｆｃ構造の改変を探索した。
【0081】
ヒンジ領域内のシステイン残基を除去するためのＳＡＰ－Ｆｃの改変
位置２２６のシステイン残基からセリンへ、及び位置２２９のシステイン残基からセリンへ点変異させ（Ｃ２２６Ｓ／Ｃ２２９Ｓ、ＥＵ付番体系）、かくしてＳＡＰ－Ｆｃヒンジ領域内のシステイン残基を除去することによって、ＴＮＴ１４６（２９３）及びＴＮＴ１４６（ＣＨＯ）を製造した（表１）。
位置２２６のシステイン残基からセリンへ、及び位置２２９のシステイン残基からセリンへ点変異させ（Ｃ２２６Ｓ／Ｃ２２９Ｓ、ＥＵ付番体系）、かくしてＳＡＰ－Ｆｃヒンジ領域内のシステイン残基を除去することによって、ＴＮＴ１４６（２９３）及びＴＮＴ１４６（ＣＨＯ）を製造した（表１）。
【0082】
Ｆｃ領域を生成するために「ノブ－ホール」法を用いるＳＡＰ－Ｆｃの改変
Ｆｃ領域を生成するために「ノブ－ホール」法を用いてＳＡＰ－Ｆｃを改変することによって、ＴＮＴ１４７（２９３）、ＴＮＴ１４８（２９３）及びＴＮＴ１４８（ＣＨＯ）を製造した（表１）。ノブ変異体は、位置３３６のスレオニンからトリプトファンへの点変異（Ｔ３６６Ｗ、ＥＵ付番体系）によって生成した。ホール変異体は、位置３６６のスレオニンからセリンへ、位置３６８のロイシンからアラニンへ、及び位置４０７のチロシンからバリンへの点変異（Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ、ＥＵ付番体系）によって生成した。
Ｆｃ領域を生成するために「ノブ－ホール」法を用いてＳＡＰ－Ｆｃを改変することによって、ＴＮＴ１４７（２９３）、ＴＮＴ１４８（２９３）及びＴＮＴ１４８（ＣＨＯ）を製造した（表１）。ノブ変異体は、位置３３６のスレオニンからトリプトファンへの点変異（Ｔ３６６Ｗ、ＥＵ付番体系）によって生成した。ホール変異体は、位置３６６のスレオニンからセリンへ、位置３６８のロイシンからアラニンへ、及び位置４０７のチロシンからバリンへの点変異（Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ、ＥＵ付番体系）によって生成した。
【0083】
ＳＡＰ内のグリコシル化部位を除去するためのＳＡＰ－Ｆｃの改変
ＳＡＰ－Ｆｃを改変してＳＡＰ内のグリコシル化部位を除去することによって、ＴＮＴ１５１（２９３）及びＴＮＴ１５１（ＣＨＯ）を製造した（表１）。非グリコシル化ＳＡＰは、位置３２のアスパラギンからセリンへ、及び位置１１０のアスパラギンからセリンへの点変異（Ｎ３２Ｓ／Ｎ１１０Ｓ、ＳＡＰの第１アミノ酸からの付番）によって生成した。
ＳＡＰ－Ｆｃを改変してＳＡＰ内のグリコシル化部位を除去することによって、ＴＮＴ１５１（２９３）及びＴＮＴ１５１（ＣＨＯ）を製造した（表１）。非グリコシル化ＳＡＰは、位置３２のアスパラギンからセリンへ、及び位置１１０のアスパラギンからセリンへの点変異（Ｎ３２Ｓ／Ｎ１１０Ｓ、ＳＡＰの第１アミノ酸からの付番）によって生成した。
【0084】
Ｆｃ領域を生成するために「ノブ－ホール」法を用いる、及びＳＡＰ内のグリコシル化部位を除去するための、ＳＡＰ－Ｆｃの改変
ＳＡＰ－Ｆｃを改変してＳＡＰ内のグリコシル化部位を除去すること及び「ノブ－ホール」法を用いてＦｃ領域を生成することによって、ＴＮＴ１５２（２９３）及びＴＮＴ１５２（ＣＨＯ）を製造した（表１）。非グリコシル化ＳＡＰ及び「ノブ－ホール」Ｆｃ領域は、上記のとおりに生成した。
ＳＡＰ－Ｆｃを改変してＳＡＰ内のグリコシル化部位を除去すること及び「ノブ－ホール」法を用いてＦｃ領域を生成することによって、ＴＮＴ１５２（２９３）及びＴＮＴ１５２（ＣＨＯ）を製造した（表１）。非グリコシル化ＳＡＰ及び「ノブ－ホール」Ｆｃ領域は、上記のとおりに生成した。
【0085】
実施例３．ＳＡＰ－Ｆｃ及びその改変型タンパク質の製造。
ＳＡＰ－Ｆｃ構築物の製造
組換えＳＡＰ－Ｆｃタンパク質の生成レベルをＥＬＩＳＡによって評価した。まず、ＭａｘｉＳｏｒｐ（商標）プレート（ＮＵＮＣ）を４℃で一晩、抗ヒトＩｇＧ一次抗体（１μｇ／ｍｌ、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）で被覆した。ＰＢＳ／０．０５％のｔｗｅｅｎ－２０で３回洗浄した後、完全培地で希釈された試料５０μｌを３７℃で２時間にわたってインキュベートした。同時に、完全培地で希釈された標準範囲のヒトＩｇＧをインキュベートした。３回洗浄した後、アルカリホスファターゼに連結された抗ＩｇＧ抗体（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）（１μｇ／ｍｌ）を添加し、３７℃で１時間３０分にわたってインキュベートした。一連の最終洗浄の後、１００μｌの体積のアルカリホスファターゼ基質を添加し、次いで、数分後に３ＭのＮａＯＨを使用して反応を停止した。プレートを４０５ｎｍでの分光法によって読み取った。
ＳＡＰ－Ｆｃ構築物の製造
組換えＳＡＰ－Ｆｃタンパク質の生成レベルをＥＬＩＳＡによって評価した。まず、ＭａｘｉＳｏｒｐ（商標）プレート（ＮＵＮＣ）を４℃で一晩、抗ヒトＩｇＧ一次抗体（１μｇ／ｍｌ、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）で被覆した。ＰＢＳ／０．０５％のｔｗｅｅｎ－２０で３回洗浄した後、完全培地で希釈された試料５０μｌを３７℃で２時間にわたってインキュベートした。同時に、完全培地で希釈された標準範囲のヒトＩｇＧをインキュベートした。３回洗浄した後、アルカリホスファターゼに連結された抗ＩｇＧ抗体（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）（１μｇ／ｍｌ）を添加し、３７℃で１時間３０分にわたってインキュベートした。一連の最終洗浄の後、１００μｌの体積のアルカリホスファターゼ基質を添加し、次いで、数分後に３ＭのＮａＯＨを使用して反応を停止した。プレートを４０５ｎｍでの分光法によって読み取った。
【0086】
次いで、得られたＳＡＰ－Ｆｃ融合タンパク質をＡＫＴＡＦＰＬＣシステム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で親和性クロマトグラフィーによって、Ｆｃセグメントに対するプロテインＡの強い親和性及び本発明に係るキメラタンパク質におけるＦｃ領域断片の存在ゆえにプロテインＡ親和性カラム（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して精製した。カラムの下流に配置されたＵＶ検出器は進行の追跡を可能にするものであり；非保持相の吸収が閾値まで降下した時にｐＨ２．６の０．１Ｍのグリシンでタンパク質を溶離させた。クロマトグラムピークに基づいて種々の画分を回収した。次いで、得られた溶離液をｐＨ８．８のトリスで中和した。
【0087】
精製タンパク質を、３０ｋＤａ未満のサイズの分子の排除を可能にするものであるＡｍｉｃｏｎ（登録商標）Ｕｌｔｒａ４ ３０ｋフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）によって濃縮した。溶液をフィルターの中に入れ、所望の体積及び所望の濃度を得るために要する時間にわたって４０００ｇで遠心分離した。
【0088】
変性ゲルを使用するウェスタンブロッティングによって、精製タンパク質（または培養上清）を検出した。タンパク質を、β－メルカプトエタノールを含有する一定体積の装填用緩衝液（Ｂｉｏ Ｒａｄ）と混合し、５分間にわたって煮沸した。次いで、それらを、７．５％の積重相及び１０％の分離相から成り立っているポリアクリルアミドゲル（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）で電気泳動によって移動させた。その後、タンパク質をＰＶＤＦ膜上に転写し、５％乳で飽和させた。次いで、それらを周囲温度で１時間にわたって、ＨＲＰ（ＢＥＣＫＭＡＮ ＣＯＵＬＴＥＲ（登録商標））に連結されたマウス抗ＳＡＰ（Ａｂｅａｍ）または抗ＩｇＧ抗体（１μｇ／ｍｌ）の存在下でインキュベートした。抗ＳＡＰ抗体を、ＨＲＰ（ＳＡＮＴＡ ＣＲＵＺ（登録商標））に連結されたヤギ抗マウスＩｇＧ二次抗体（０．２μｇ／ｍｌ）によって明らかにした。化学発光は、ＥＣＬ基質（ＰＩＥＲＣＥ（登録商標））を添加することによって誘発され、オートラジオグラフィー膜（ＫＯＤＡＫ（登録商標））上で明らかにされた。
【0089】
半天然ゲルを使用するウェスタンブロッティングによっても精製タンパク質（または培養上清）を検出した。タンパク質を、β－メルカプトエタノールを含まない一定体積の装填用緩衝液と混合し、その後、ＳＤＳ－１２％ＰＡＧＥゲルにおいて移動させた。残りのプロトコールは変性ゲルの場合と同じである。
【0090】
図１６のＡ及びＢは、精製融合タンパク質のＳＤＳ ＰＡＧＥゲルを示す。これらの実験では、ＴＮＴ１４６、ＴＮＴ１４７、ＴＮＴ１４８、ＴＮＴ１５５及びＴＮＴ１６０を２ステップの精製によって精製した。ＴＮＴ１５１については単回のプロテインＡ精製ステップによって精製した。
【0091】
実施例４．フィブリルに対する改変ＳＡＰ－Ｆｃの結合性
フィブリル及び抽出物に対するＳＡＰ－Ｆｃ及びＳＡＰ－ｓｃＦｃ結合性を、ＥＬＩＳＡによって調べた。
フィブリル及び抽出物に対するＳＡＰ－Ｆｃ及びＳＡＰ－ｓｃＦｃ結合性を、ＥＬＩＳＡによって調べた。
【0092】
ヒト化ＩｇＧに対するユーロピウム結合免疫吸着アッセイ（ＥｕＬＩＳＡ）法を用いて、０．８３□ＭのｒＶ□６Ｗｉｌフィブリルの（超音波処理された）懸濁液をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で調製した。９６ウェルマイクロプレートのウェルを、各ウェルへの５０□Ｌの添加によってフィブリルで被覆した。プレートを３７□Ｃで一晩乾燥させた。Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋが入った、２ｍＭの塩化カルシウム（Ｃａ）を含むトリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）（ＳＢＴ）を、２００□Ｌ／ウェルを用いて添加することによって、マイクロプレートのウェルをブロッキングし、３７□Ｃで１時間にわたって放置した。一次（試験）ＳＡＰ－Ｆｃ融合タンパク質、ヒト化免疫グロブリン、ｈＩｇＧ１またはｃ１１－１Ｆ４を添加した。プレートを３７□Ｃで１時間にわたってインキュベートした。洗浄ステップ（ＴＢＳ／Ｃａ＋０．０５％のｔｗｅｅｎ ２０を使用してプレートを３回洗浄した）の後、二次抗体を添加した－１００□Ｌ／ウェルで、ビオチン化ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ）のＳＢＴＴによる１：３０００希釈液。プレートを３７□Ｃで１時間にわたってインキュベートした。もう１回の洗浄ステップの後、１００□Ｌ／ウェルのユーロピウム／ストレプトアビジンの１：１０００希釈液（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を添加した。プレートを３７□Ｃで１時間にわたってインキュベートした。最終洗浄ステップの後、１００□Ｌ／ウェルのユーロピウム増強溶液（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を添加した。マイクロプレートリーダー（Ｗａｌｌａｃ）を使用して時間分解蛍光放射を読み取った。
【0093】
図８のＡに示される結果は、元より提供されていたＴＮＴ１４６（２９３）及びＴＮＴ１４７（２９３）がＥＬＩＳＡアッセイにおいてｈＩｇＧ１対照及びｃ１１－１Ｆ４よりも大きな親和性（ＥＣ５０）で合成ｒＶλ６Ｗｉｌフィブリルに結合することを示している。図８のＢは、ＴＮＴ１５２（２９３）を除いてＴＮＴ１４６（ＣＨＯ）、ＴＮＴ１４８（ＣＨＯ）、ＴＮＴ１５１（２９３）が等しく良好にｒＶλ６Ｗｉｌフィブリルに結合することを示している。図９のＡ～Ｂに示される結果は、ノブ－ホール及びｃｙｓ変異形態のＳＡＰ－Ｆｃがｉｎ ｖｉｔｒｏでのアミロイド反応性を保持していることを示している。
【0094】
図１０Ａ～１０Ｅ及び表４に示される結果は、ＴＮＴ１５２（２９３）及びＴＮＴ１４８（ＣＨＯ）を除くすべての構築物が１～１０ｎＭの範囲のＥＣ５０値を呈することを示している。ｗｔＡＴＴＲ抽出物に対する最も高い結合性は、ＳＡＰ－ｓｃＦｃ試薬ＴＮＴ１４６（２９３）、ＴＮＴ１４６（ＣＨＯ）、ＴＮＴ１５１（２９３）についてみられた（表４）。ＳＡＰ－ｓｃＦｃの文脈において、ＳＡＰの非グリコシル化は、アミロイド抽出物に対するＥＣ５０がｈＩｇＧ１－ペプチド融合体よりも高いものであるＴＮＴ１５２（２９３）を除いて、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのアミロイド反応性を同程度のＥＣ５０で保持する（図８のＢ及び表４）。
【表4】
【0095】
プルダウンアッセイにおいてもフィブリル及び抽出物に対するＳＡＰ－Ｆｃ融合体の結合性を試験した。ｒＶλ６Ｗｉｌからの合成アミロイドフィブリルを以下のとおりに調製した：ＮａＮ３が０．０１％ｗ／ｖでありｐＨ７．５であるリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）の中に１ｍｇ／ｍＬの単量体を含有する体積１ｍＬを、０．２ｍｍ孔径のフィルターで濾過し、１５ｍｌ容の円錐形ポリプロピレン製チューブ（ＢＤ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）に加え、反応混合物が不透明になるまで３７℃で３～５日間にわたって角度４５°で２２５ｒｐｍで振盪した。
【0096】
Ｐｒａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ（１９６９）１３０（４）：７７７－７９５に記載されているような水上浮遊法を改変せずに用いて、軽鎖（ＡＬ）またはトランスサイレチン関連（ＡＴＴＲ）アミロイドーシスの患者からの剖検由来組織を使用して精製ヒトアミロイド組織抽出物を調製した。水洗浄液中に精製アミロイド材料が単離され、アミロイドに富むペレットを回収し、使用時まで室温で凍結乾燥保存した。
【0097】
プルダウンアッセイのために、１ｍｇ／ｍＬのＡＬ抽出物または合成ｒＶλ６Ｗｉｌ可変ドメインフィブリル（ＲＥＦ）２５マイクロリットルを０．５ｍｌ容の微量遠心管に入れて５分間にわたって２１，０００×ｇで遠心分離した。上清を捨て、ペレットを、０．０５％のｔｗｅｅｎ－２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳＴ）２００μＬの中に再懸濁させた。１２５Ｉ－ｐ５＋１４（約１００，０００計数毎分（ＣＰＭ）；約５ｎｇのペプチド）または１２５Ｉ標識ＳＡＰ－Ｆｃ融合タンパク質を懸濁液に添加した。混合物を室温で１時間にわたって回転させた。その後、試料を２回、１０分間にわたって１５，０００×ｇで遠心分離した。各ステップの後に上清とペレットとを分離し、各々における放射能を、Ｃｏｂｒａ ＩＩ ガンマ計数器（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用して１分間の取得で測定した。ペレットに結合している１２５Ｉ－ｐ５＋１４または１２５Ｉ標識ＳＡＰ－Ｆｃ融合タンパク質の百分率を以下のとおりに決定した：
ペレットＣＰＭ／（ペレットＣＰＭ＋上清ＣＰＭ）×１００
ペレットＣＰＭ／（ペレットＣＰＭ＋上清ＣＰＭ）×１００
【0098】
プルダウンアッセイにおいて１２５Ｉ標識ＴＮＴ１４６及びＴＮＴ１４７は基質に対して弱い結合性を示してＥＣ５０がナノモーラー範囲内に入り（表５）、酸化的放射性ヨウ素化が生成物に悪影響を及ぼして活性の喪失を招き得ること；可溶性材料として提供されるアミロイド抽出物が、異なる結合部位を呈し得ること；及びより高い濃度の試薬がＥＬＩＳＡ形式での結合を促し得ることが示唆された。
【表5】
【0099】
実施例５．マウスにおけるＳＡＰ－Ｆｃの生体内分布
ＡＡアミロイドーシスマウスモデル
ＡＡアミロイドーシスマウスは、安定的に挿入された導入遺伝子からヒトＩＬ６（ｈｕＩＬ６）タンパク質を発現するマウスの系統である。米国国立衛生研究所にて、Ｂａｌｂ／ｃバックグラウンドに対する原型Ｈ２－Ｌｄ－ＩＬ－６ Ｔｇ Ｃ５７ＢＬ／６遺伝子導入マウスの戻し交配による遺伝子導入を２０世代を超えて行うこと（Ｋｏｖａｌｃｈｕｋ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ（２００２）９９：１５０９－１５１４）によって、Ｂ６（Ｃ）－Ｔｇ（Ｈ２－Ｌｄ－ＩＬ－６）Ｋｉｓｈ（Ｈ２／ｈｕＩＬ－６）系統が得られた。これらのマウスは、マウス主要組織適合性複合体クラス１（Ｈ２－Ｌｄ）プロモーターの制御の下でｈｕＩＬ６導入遺伝子を恒常的に発現する。導入遺伝子はメンデル遺伝の常染色体様式で分離する（Ｓｕｅｍａｔｓｕ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ（１９９２）８９：２３２－２３５）。炎症応答の維持及び免疫応答中のリンパ球増殖におけるＩＬ６の役割ゆえに、これらの遺伝子導入動物の初期世代は、１８月齢のマウスの５６％において、高いｓＡＡレベル、及びポリクローン性形質細胞増殖の進展を伴う著しいリンパ球増多症を有していた（Ｋｏｖａｌｃｈｕｋ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ（２００２）９９：１５０９－１５１４）。この遺伝子導入系統の初期世代におけるヒトＩＬ６血清レベルは０．５～１ｎｇ／ｍＬであったが、本発明者らの施設でおよそ２年間にわたって繁殖させた戻し交配Ｂａｌｂ／ｃマウスは、８週齢でおよそ３００倍高いレベル（０．３～１μｇ／ｍＬ）の循環ｈｕＩＬ６レベルを有していた（Ｓｏｌｏｍｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ（１９９９）１５４：１２６７－１２７２４）。炎症促進性ｈｕＩＬ６サイトカインに応答して、マウスは、循環ｓＡＡ結合体化高比重リポタンパク質の濃度の上昇をきたす慢性炎症状態を被る。これらのマウスにおけるＡＡアミロイドーシスの自発的発症は典型的には５月齢で起こり、生検によって組織学的に検出できる脾臓のみにおける毛胞周囲の沈着物として最初に顕在化した（Ｓｏｌｏｍｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ（１９９９）１５４：１２６７－１２７２４）。次の３～４ヶ月の間にアミロイドは肝臓内の門脈周囲の脈管構造及び類洞、舌、心臓及び腸絨毛、ならびに腎臓間質、糸球体及び乳頭において検出された。加えて、ＩＬ６濃度の上昇に起因するアミロイドーシスまたはリンパ組織過形成（またはその両方）のために、髄外造血巣及び脾腫と同様に円柱腎症が共通して認められた。
ＡＡアミロイドーシスマウスモデル
ＡＡアミロイドーシスマウスは、安定的に挿入された導入遺伝子からヒトＩＬ６（ｈｕＩＬ６）タンパク質を発現するマウスの系統である。米国国立衛生研究所にて、Ｂａｌｂ／ｃバックグラウンドに対する原型Ｈ２－Ｌｄ－ＩＬ－６ Ｔｇ Ｃ５７ＢＬ／６遺伝子導入マウスの戻し交配による遺伝子導入を２０世代を超えて行うこと（Ｋｏｖａｌｃｈｕｋ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ（２００２）９９：１５０９－１５１４）によって、Ｂ６（Ｃ）－Ｔｇ（Ｈ２－Ｌｄ－ＩＬ－６）Ｋｉｓｈ（Ｈ２／ｈｕＩＬ－６）系統が得られた。これらのマウスは、マウス主要組織適合性複合体クラス１（Ｈ２－Ｌｄ）プロモーターの制御の下でｈｕＩＬ６導入遺伝子を恒常的に発現する。導入遺伝子はメンデル遺伝の常染色体様式で分離する（Ｓｕｅｍａｔｓｕ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ（１９９２）８９：２３２－２３５）。炎症応答の維持及び免疫応答中のリンパ球増殖におけるＩＬ６の役割ゆえに、これらの遺伝子導入動物の初期世代は、１８月齢のマウスの５６％において、高いｓＡＡレベル、及びポリクローン性形質細胞増殖の進展を伴う著しいリンパ球増多症を有していた（Ｋｏｖａｌｃｈｕｋ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ（２００２）９９：１５０９－１５１４）。この遺伝子導入系統の初期世代におけるヒトＩＬ６血清レベルは０．５～１ｎｇ／ｍＬであったが、本発明者らの施設でおよそ２年間にわたって繁殖させた戻し交配Ｂａｌｂ／ｃマウスは、８週齢でおよそ３００倍高いレベル（０．３～１μｇ／ｍＬ）の循環ｈｕＩＬ６レベルを有していた（Ｓｏｌｏｍｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ（１９９９）１５４：１２６７－１２７２４）。炎症促進性ｈｕＩＬ６サイトカインに応答して、マウスは、循環ｓＡＡ結合体化高比重リポタンパク質の濃度の上昇をきたす慢性炎症状態を被る。これらのマウスにおけるＡＡアミロイドーシスの自発的発症は典型的には５月齢で起こり、生検によって組織学的に検出できる脾臓のみにおける毛胞周囲の沈着物として最初に顕在化した（Ｓｏｌｏｍｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ（１９９９）１５４：１２６７－１２７２４）。次の３～４ヶ月の間にアミロイドは肝臓内の門脈周囲の脈管構造及び類洞、舌、心臓及び腸絨毛、ならびに腎臓間質、糸球体及び乳頭において検出された。加えて、ＩＬ６濃度の上昇に起因するアミロイドーシスまたはリンパ組織過形成（またはその両方）のために、髄外造血巣及び脾腫と同様に円柱腎症が共通して認められた。
【0100】
Ｈ２／ｈｕＩＬ－６マウスにおけるアミロイドの性質は、ＡＡ特異的モノクローナル抗体を使用することによって免疫組織化学的に文書に記載された（Ｓｏｌｏｍｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ（１９９９）１５４：１２６７－１２７２４）。加えて、液体クロマトグラフィー結合型質量分析は、単離された組織由来ＡＡフィブリルが、最初の７７個のＮ末端側アミノ酸（残基１～７７）を含有する切断形態のｓＡＡで構成されていることを示した（Ｓｏｌｏｍｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ（１９９９）１５４：１２６７－１２７２４）。これらのマウスから抽出されたアミロイドの免疫組織化学的試験及び液体クロマトグラフィー結合型質量分析の間、アポリポタンパク質ＡＩ及びＡＩＩ、または免疫グロブリン軽鎖の証拠は見つからなかった。
【0101】
野生型（ＷＴ）マウス及びＡＡアミロイドーシスマウスモデルにおいてＳＡＰ－Ｆｃの生体内分布を調べた。
【0102】
野生型（ＷＴ）マウス及びＡＡアミロイドーシスマウスモデルにおいてＳＡＰ－Ｆｃの生体内分布を組織マイクロオートラジオグラフィーによって調べた。ＡＡアミロイドーシスマウスモデルは、ヒトインターロイキン６導入遺伝子を恒常的に発現するＨ２－Ｌｄ－ｈｕＩＬ－６ Ｔｇ Ｂａｌｂ／ｃ遺伝子導入マウスに、１０ｍｇの単離アミロイド増強因子（ＡＥＦ、Ａｘｅｌｒａｄ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｂ Ｉｎｖｅｓｔ（１９８２）４７：１３９－１４６．）を含む１００ｍｌの無菌リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）をＩＶ投与することによって作出された。これらの試験に使用されたマウスは、誘導後４～６週齢であった。ＡＡマウスモデルは、間質性心臓アミロイド沈着、肝臓における著しい類洞アミロイド沈着物、脾臓における初期の塊状の毛包周囲アミロイド沈着物、ならびに膵臓、腎臓、副腎及び腸における後期のアミロイド沈着物を特徴とする。
【0103】
ＡＡまたはＷＴマウスに１０μｇの１２５Ｉ標識ＴＮＴ１４６（２９３）及びＴＮＴ１４７（２９３）を注射し、次いで、注射後４８時間目に安楽死させた。安楽死後のＷＴ及びＡＡマウスから、脾臓、膵臓、左及び右腎、肝臓、心臓、筋肉、胃、腸上部及び下部、ならびに肺組織の試料を採取した。風袋の重さを量ったプラスチック製バイアルに各試料を入れ、重さを量り、自動化Ｗｉｚａｒｄ ３ ガンマカウンター（１４８０ Ｗａｌｌａｃ Ｇａｍｍａ Ｃｏｕｎｔｅｒ、ＰＥＲＫＩＮ ＥＬＭＥＲ（登録商標））を使用して１２５Ｉ放射能を測定した。生体内分布データを、組織１グラムあたりの注射用量の百分率（％ＩＤ／ｇ）として表した。加えて、組織学及びオートラジオグラフィーのために、各組織の試料を１０％の緩衝ホルマリンで２４時間にわたって固定し、パラフィンに包埋した。オートラジオグラフィーのために、ホルマリンで固定され、パラフィンに包埋された塊から厚さ４～６μｍの切片をＰｌｕｓ顕微鏡プレパラート（ＦＩＳＨＥＲ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ（登録商標））上に切り出し、ＮＴＢ２エマルジョン（ＥＡＳＴＭＡＮ ＫＯＤＡＫ（登録商標））に浸し、暗所で保存し、９６時間にわたる露光の後に現像した。各切片をヘマトキシリンで対比染色した。あるいは、ＡＡまたはＷＴマウスに５００μｇの無標識ＴＮＴ１４７（２９３）を注射し、次いで、注射後４８時間目に安楽死させた。各組織の試料を１０％の緩衝ホルマリンで２４時間にわたって固定し、パラフィンに包埋した。ホルマリンで固定され、パラフィンに包埋された塊から厚さ４～６μｍの切片をＰｌｕｓ顕微鏡プレパラート（ＦＩＳＨＥＲ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ（登録商標））上に切り出し、その後、抗ヒトＦｃを使用して切片を染色した。アルカリ性コンゴーレッドによる染色の後に交差偏光照射下で観察される連続組織切片において顕微鏡法によって組織アミロイド沈着物を同定した。すべての組織切片を、（コンゴーレッド複屈折の検出のための）交差偏光フィルターが装着された光学顕微鏡（ＤＭ５００、ＬＥＩＣＡ（登録商標））によって調べた。冷却電荷結合素子カメラ（ＳＰＯＴ、ＤＩＡＧＮＯＳＴＩＣ ＩＮＳＴＲＵＭＥＮＴＳ（登録商標））を使用することによってデジタル顕微鏡画像を取得した。
【0104】
図１１Ａ～１１Ｃに示される結果は、全身性疾患を有するマウスにおいてＴＮＴ１４６（２９３）及びＴＮＴ１４７（２９３）が、それらが１２５Ｉの放射性標識を有する場合及び無標識である場合の両方においてＡＡアミロイドに特異的に結合することを示している。ＴＮＴ１４６（２９３）及びＴＮＴ１４７（２９３）がどちらもアミロイド沈着物に特異的に結合することは、オートラジオグラフィーによって心臓にＡＡ沈着物が乏しいことで証明された。
【0105】
図１２のＡ～Ｂに示される結果は、１２５Ｉ標識ＴＮＴ１４６（２９３）及びＴＮＴ１４７（２９３）が、ＡＡマウスの肝臓及び脾臓には蓄積したがＷＴマウスのアミロイド不含組織には蓄積していないことを示している。
【0106】
実施例６．ＳＡＰ－Ｆｃ構築物の多量体化分析
アミロイドに対するＳＡＰの高アビディティー結合は、五量体または十量体としてのタンパク質の適切な多量体化によって得られる。他方、ＳＡＰ－Ｆｃの大きな及び／または不適切な凝集体は循環流から速やかに除去され得、かくして、そのＰＫ及び機能に悪影響を及ぼし得る。結果として、ＳＡＰ－Ｆｃ構築物の高次凝集体の分析は、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるそれらの機能を理解する上で重要である。
アミロイドに対するＳＡＰの高アビディティー結合は、五量体または十量体としてのタンパク質の適切な多量体化によって得られる。他方、ＳＡＰ－Ｆｃの大きな及び／または不適切な凝集体は循環流から速やかに除去され得、かくして、そのＰＫ及び機能に悪影響を及ぼし得る。結果として、ＳＡＰ－Ｆｃ構築物の高次凝集体の分析は、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるそれらの機能を理解する上で重要である。
【0107】
ＳＡＰ－Ｆｃ構築物の多量体化及び凝集を、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって分析した。１０～１３００ｋＤａの分子量を有するタンパク質に適するマトリックスをこの分析で使用した。市販のタンパク質調製物を分子量標準として使用した。ＳＡＰ－Ｆｃ単量体の推定分子量は約７５ｋＤａであり、ＳＡＰ－Ｆｃ五量体の推定分子量は約３７５ｋＤａであり、ＳＡＰ－Ｆｃ十量体の推定分子量は約７５０ｋＤａである。
【0108】
図１３に示される結果は、ＳＡＰ－Ｆｃ構築物がどれも異なる多量体化構造を有していた一方、ＴＮＴ１４６（２９３）及びＴＮＴ１４７（２９３）は最も均一であったことを示している。ＨＥＫ－２９３細胞と対比されるＣＨＯ細胞における産生はＴＮＴ１５１及びＴＮＴ１５２構築物の多量体化構造に大きく影響した（図１３）。
【0109】
マウスにおけるこれらの構築物の取込み及び生体内分布も比較した。脾臓においてＴＮＴ１４６（２９３）及びＴＮＴ１４７（２９３）はどちらも約１０％の分布を示した（図１２のＡ～Ｂ）。他の構築物は、脾臓においてより少ない分布を示した：ＴＮＴ１５１（２９３）は脾臓において約２．５％の分布を示したが、これはＴＮＴ１４６（２９３）及びＴＮＴ１４７（２９３）に比べて４分の１の低さであり（図１４Ａ）；ＴＮＴ１５２（２９３）は脾臓において約２％の分布を示したが、これはＴＮＴ１４６（２９３）及びＴＮＴ１４７（２９３）に比べて５分の１の低さであり（図１４Ｂ）；ＴＮＴ１４８（２９３）は脾臓において約３％の分布を示したが、これはＴＮＴ１４６（２９３）及びＴＮＴ１４７（２９３）に比べて３．３分の１の低さであった（図１４Ｃ）。多量体化分析のＳＥＣクロマトグラムと考え合わせると、これらの結果は、４５０～６６９ｋＤａの二量体ピークがＡＡマウスにおける最適なＳＡＰ－Ｆｃ取込みと相関することを示している（図１２のＡ～Ｂ、図１４Ａ～１４Ｃ、及び図１３）。
【0110】
実施例７．ＴＨＰ１細胞によるｒＶλ６Ｗｉｌフィブリルの食作用
ｐＨｒｏｄｏレッド標識ｒＶλ６Ｗｉｌフィブリルシステムを使用して食作用を調べた。
ｐＨｒｏｄｏレッド標識ｒＶλ６Ｗｉｌフィブリルシステムを使用して食作用を調べた。
【0111】
固相Ｗｉｌ ｆｉｂｒｉｌ取込みのために、２４ウェル組織培養プレートをＩ型ラットコラーゲン（２０ｍＭの酢酸の中に７５μｇ／ｍｌ、０．４ｍｌ）で２時間にわたって室温で被覆し、０．５ｍｌのＰＢＳで洗浄し、４℃の０．５ｍｌのＰＢＳの中で２０μｇ／ウェルのｐＨｒｏｄｏレッド標識ｒＶλ６フィブリル（３０％の標識率）で一晩被覆する。ウェルを０．５ｍｌのＰＢＳで洗浄し、０．５ｍｌの無血清フェノールレッド不含ＲＰＭＩ１６４０を添加する。抗体オプソニンまたはＳＡＰ－Ｆｃタンパク質を添加し、その後すぐに、ＲＡＷ２６４．７または非誘導ＴＨＰ－１細胞を含む無血清フェノールレッド不含ＲＰＭＩ１６４０（０．５ｍｌ中１．２×１０６個）を、３７℃で４時間にわたるインキュベーションのために添加する。取込み測定では、ＢｉｏＴｅｋ ＳｙｎｅｒｇｙＨＴ－１ マイクロプレートリーダーにおいてウェルスキャンモードで５３０／２５ｎｍ励起及び６４５／４０ｎｍ発光で蛍光測定するために、各ウェルからの細胞を黒色プラスチック製／透明底９６ウェルマイクロプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）の３反復ウェルに移す。１ｍｌの培地単独の中でインキュベートしたウェルからのバックグラウンド読み値を差し引いて、相対蛍光単位を得る。
【0112】
図１５に示される結果は、ＳＡＰ－Ｆｃ ＴＮＴ１４６（ＣＨＯ）、ＴＮＴ１４７（２３９）、ＴＮＴ１４８（ＣＨＯ）及びＴＮＴ１５１（ＣＨＯ）が優れたオプソニン化剤としての役割を果たす一方、ＴＮＴ１５２（ＣＨＯ）は最も効果の少ない試薬であったことを示しており、このことはｒＶλ６Ｗｉｌフィブリルに対するそのより弱い結合性と整合している。
【0113】
実施例８．第０相生体内分布試験
ＡＵＲ０３は、この試験においてヨードゲンチューブ法を用いて１２４Ｉで放射性標識が付けられたＳＡＰ－Ｆｃである。第０相試験の目的は：１）全身性アミロイドーシスを有するオフターゲット結合及び標的係合を含めて生体内分布を判定すること；２）標的アミロイドを含む器官、例えば心臓及び心臓にＡＵＲ０３が係合するか否かを判定すること；３）ＡＴＴＲ及びＡＬ患者の両方において、アミロイドを含む器官にＡＵＲ０３が結合するか否かを判定すること；４）開発計画立案のためにアミロイド種または器官によってＡＵＲ０３を他の薬物から差別化することである。
ＡＵＲ０３は、この試験においてヨードゲンチューブ法を用いて１２４Ｉで放射性標識が付けられたＳＡＰ－Ｆｃである。第０相試験の目的は：１）全身性アミロイドーシスを有するオフターゲット結合及び標的係合を含めて生体内分布を判定すること；２）標的アミロイドを含む器官、例えば心臓及び心臓にＡＵＲ０３が係合するか否かを判定すること；３）ＡＴＴＲ及びＡＬ患者の両方において、アミロイドを含む器官にＡＵＲ０３が結合するか否かを判定すること；４）開発計画立案のためにアミロイド種または器官によってＡＵＲ０３を他の薬物から差別化することである。
【0114】
３０名の患者を２つのコホートに採用する。心臓が関与している証拠を有する１５名のＡＴＴＲ患者をコホート１ａに採用し、胸腹部器官が関与している１５名のＡＬ患者をコホート１ｂに採用する。両コホートの患者に１回用量の１００μｇのＡＵＲ０３を与え、その後、１～２箇所の臨床会場にて、注射後２日目及び５日目に撮像を行う。
【0115】
ＣＢＣ、ＣｌｉｎＣｈｅｍ、ＮＴ－ｐｒｏＢＮＰ、及びＬＤＨ試験のために注射前後の血液を採取する。ＰＫ決定のために血液試料を採取し、血液試料における放射能を７２時間にわたって測定する。
【0116】
実施例９：ｉｎ ｖｉｖｏでの食作用
１０％のｐＨｒｏｄｏレッド標識材料を含有する１２ｍｇのヒトＡＬλ（ＳＨＩ）アミロイドのバッチを、２ｍＭのＣａＣｌ２を含むトリス緩衝生理食塩水の中に含まれた６００μｇのＴＮＴ１４６と共に、３０分間にわたって室温（ＲＴ）で混合しながら前インキュベートした。蛍光団ｐＨｒｏｄｏレッドの蛍光放射は、マクロファージによる、及び潜在的には好中球による食作用の最中におけるアミロイドの酸性化に関連付いている。免疫低下ＮＵ／ＮＵ（ヌード）マウス（ｎ＝５）に２ｍｇのヒトＡＬλ（ＳＨＩ）を、マウスの左腹側部における皮下注射として与えた。対照群のＮＵ／ＮＵマウス（ｎ＝５）にはＴＮＴ１４６による前処置を行わずに２ｍｇのヒトＡＬλ（ＳＨＩ）の同様の皮下用量を与えた。２％イソフルラン麻酔下のマウスを使用して、ｐＨｒｏｄｏレッド蛍光団によって放射される蛍光を光学撮像によって連続的に追跡した。アミロイド注射後１、３、８、１０、１２及び１４日目に画像を収集した。１５日目にマウスを安楽死させた。
１０％のｐＨｒｏｄｏレッド標識材料を含有する１２ｍｇのヒトＡＬλ（ＳＨＩ）アミロイドのバッチを、２ｍＭのＣａＣｌ２を含むトリス緩衝生理食塩水の中に含まれた６００μｇのＴＮＴ１４６と共に、３０分間にわたって室温（ＲＴ）で混合しながら前インキュベートした。蛍光団ｐＨｒｏｄｏレッドの蛍光放射は、マクロファージによる、及び潜在的には好中球による食作用の最中におけるアミロイドの酸性化に関連付いている。免疫低下ＮＵ／ＮＵ（ヌード）マウス（ｎ＝５）に２ｍｇのヒトＡＬλ（ＳＨＩ）を、マウスの左腹側部における皮下注射として与えた。対照群のＮＵ／ＮＵマウス（ｎ＝５）にはＴＮＴ１４６による前処置を行わずに２ｍｇのヒトＡＬλ（ＳＨＩ）の同様の皮下用量を与えた。２％イソフルラン麻酔下のマウスを使用して、ｐＨｒｏｄｏレッド蛍光団によって放射される蛍光を光学撮像によって連続的に追跡した。アミロイド注射後１、３、８、１０、１２及び１４日目に画像を収集した。１５日目にマウスを安楽死させた。
【0117】
光学撮像によるｐＨｒｏｄｏレッドの定量によってＴＮＴ１４６処置マウスにおける放射の初期増加が明らかとなったが、これは、試験の過程全体にわたって持続するものであった（図１７Ａ）。１日目（アミロイド注射後２４時間目）には、ＴＮＴ１４６処置アミロイドによる蛍光放射は対照動物よりも著しく強かった（図１７Ｂ）。１４日目には、ＴＮＴ１４６処置アミロイドは対照動物と比較して目に見えてより強い蛍光放射を呈した（図１８）。これらのデータは、マウスに皮下注射された場合にＴＮＴ１４６のアミロイドに対する結合がヒトアミロイドの食作用を増強することを示している。
【0118】
実施例１０ アミロイドフィブリルの補体増強食作用
ステップ１：ＴＨＰ－１細胞のＭ０マクロファージへの分化
１０％のＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ、ＳＨ ３００７１．０３）、１％のＰｅｎ－Ｓｔｒｅｐ（Ｇｉｂｃｏ、１５１４０－１２２）及び１％のゲンタマイシン（Ｇｉｂｃｏ、１５７１０－０６４）が補充された完全ＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｈｙｃｌｏｎｅ、ＳＨ ３００２３．０１）の中に含まれた１０６細胞／ウェルを、２４ウェル組織培養プレート（Ｃｏｓｔａｒ ３５２６）の中央ウェルの中に計数及び播種する。
ステップ１：ＴＨＰ－１細胞のＭ０マクロファージへの分化
１０％のＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ、ＳＨ ３００７１．０３）、１％のＰｅｎ－Ｓｔｒｅｐ（Ｇｉｂｃｏ、１５１４０－１２２）及び１％のゲンタマイシン（Ｇｉｂｃｏ、１５７１０－０６４）が補充された完全ＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｈｙｃｌｏｎｅ、ＳＨ ３００２３．０１）の中に含まれた１０６細胞／ウェルを、２４ウェル組織培養プレート（Ｃｏｓｔａｒ ３５２６）の中央ウェルの中に計数及び播種する。
【0119】
５０ｎｇ／ｍＬのＰＭＡ（Ｓｉｇｍａ、Ｐ８１３９）を添加し、細胞を５％ＣＯ２のインキュベータ内で２４時間にわたって３７℃で分化させる。
【0120】
２４時間後、ＰＭＡを含有する培地を手作業での吸引によって慎重に除去する。
【0121】
ウェルに１ｍｌの完全ＤＭＥＭ－Ｆ１２培地を補給し、最低でも４８時間にわたって細胞を休ませる。
【0122】
ステップ２：試料調製
ウェルを１ｍｌのＤＰＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ、ＳＨ ３００２８．０２）で１回すすぐ。
ウェルを１ｍｌのＤＰＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ、ＳＨ ３００２８．０２）で１回すすぐ。
【0123】
フェノールレッドを含まない５００μＬの無血清ＲＰＭＩ－１６４０（Ｈｙｃｌｏｎｅ、ＳＨ３０６０５．０１）を各ウェルに加え入れ、アッセイ開始時まで３７℃でプレートをインキュベートする。
【0124】
５００μＬのＲＰＭＩ－１６４０を微量遠心管に加え入れ、その後に３μｇのＴＮＴ１４６または対照Ｆｃを添加することによって、反応の準備をする。十分に混合する。
【0125】
微量遠心管にｐＨｒｏｄｏレッド標識（ｐＨｒｏｄｏ（商標）レッド ＳＥ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、Ｐ３６６００）ｒＶλ６Ｗｉｌフィブリル（２０μｇ）を添加する。
【0126】
次に、２０μｇのモルモット補体をウェルの半分まで加える。十分に混合し、室温で５分間にわたってインキュベートする。
【0127】
各微量遠心管の内容物を２４ウェルプレートのそのそれぞれのウェルに移し入れる（この時点で各ウェル内の全体積は１ｍＬとなる）。
【0128】
プレートを（回転運動ではなく）垂直運動で動かすことによって手で穏やかに混合する。
【0129】
食作用を容易にするために、組織培養プレートを５％ＣＯ２のインキュベータ内で１時間にわたって３７℃でインキュベートする。
【0130】
ステップ３：画像取得及び定量
１時間インキュベートした後、ｐＨｒｏｄｏレッドに関連する蛍光を蛍光顕微鏡法（Ｋｅｙｅｎｃｅ ＢＺ Ｘ８００ Ｖ １．３．１）によって記録する。
１時間インキュベートした後、ｐＨｒｏｄｏレッドに関連する蛍光を蛍光顕微鏡法（Ｋｅｙｅｎｃｅ ＢＺ Ｘ８００ Ｖ １．３．１）によって記録する。
【0131】
ウェルの全領域が文書に掲載されることを保証するためにウェル１つあたり４つの画像をキャプチャする。
【0132】
各画像において蛍光の量を、画像分割及び（Ｉｍａｇｅ Ｐｒｏ Ｐｒｅｍｉｅｒ Ｖ ９．０）を用いて定量する。
【0133】
４つの観察結果の平均及び標準偏差を算出することによってデータを解析する。Ｐｒｉｓｍ（ｖ．９．０、ＧｒａｐｈＰａｄ）を使用して、対応のない両側ｔ検定を用いてα＝０．０５（データが標準的に分布している場合）で統計解析を実施した。
【0134】
活性化ヒトＴＨＰ－１細胞は、ＴＮＴ１４６の添加によってオプソニン化された場合に合成ｒＶλ６Ｗｉｌ ＡＬ アミロイド様フィブリルを効果的に取り込む（貪食する）。２０μｇの高活性モルモット補体の存在下ではｐＨｒｏｄｏレッドの蛍光強度に著しい増加があり、ＴＮＴ１４６及び補体の存在下におけるフィブリルの食作用の増強が示唆される（図１９）。
【0135】
実施例１１ ｈｕＳＡＰの存在下でのアミロイドフィブリルに対するＳＡＰ－Ｆｃ融合体の結合性
９６ウェルマイクロプレートにおいて、２ｍＭのＣａＣＬ２を含むＴＢＳで作ったヒト血清アミロイドＰ成分（ＳＡＰ）溶液の中でヒトアミロイド抽出物（ＡＬκ ＴＡＬ及びＡＬλ ＳＨＩ）、ＡＴＴＲｗｔ及び合成ＡＬアミロイド様フィブリル（ｒＶλ６Ｗｉｌ）を３７℃で３０分間にわたるインキュベーションによって前処理した。ｒＶλ６Ｗｉｌ及びアミロイド抽出物のそれぞれ０．８３μＭ及び０．０６ｍｇ／ｍＬの原液を使用した。ヒトＳＡＰ中でインキュベートされていない試料は対照としての役割を果たした。インキュベート後に試料を洗浄し、ＴＢＳ／ＣａＣＬ２で１００ｎＭから段階希釈されたＴＮＴ１４６（ＭＷ＝４１０ｋＤ）をマイクロプレートウェルに加えた。洗浄ステップの後、ビオチン化抗ヒトＦｃ試薬の添加によって結合ＴＮＴ１４６を検出した。ストレプトアビジン－ユーロピウム結合体及び現像液の添加後に時間分解蛍光を測定することによって結合ＴＮＴ１４６を定量した。
９６ウェルマイクロプレートにおいて、２ｍＭのＣａＣＬ２を含むＴＢＳで作ったヒト血清アミロイドＰ成分（ＳＡＰ）溶液の中でヒトアミロイド抽出物（ＡＬκ ＴＡＬ及びＡＬλ ＳＨＩ）、ＡＴＴＲｗｔ及び合成ＡＬアミロイド様フィブリル（ｒＶλ６Ｗｉｌ）を３７℃で３０分間にわたるインキュベーションによって前処理した。ｒＶλ６Ｗｉｌ及びアミロイド抽出物のそれぞれ０．８３μＭ及び０．０６ｍｇ／ｍＬの原液を使用した。ヒトＳＡＰ中でインキュベートされていない試料は対照としての役割を果たした。インキュベート後に試料を洗浄し、ＴＢＳ／ＣａＣＬ２で１００ｎＭから段階希釈されたＴＮＴ１４６（ＭＷ＝４１０ｋＤ）をマイクロプレートウェルに加えた。洗浄ステップの後、ビオチン化抗ヒトＦｃ試薬の添加によって結合ＴＮＴ１４６を検出した。ストレプトアビジン－ユーロピウム結合体及び現像液の添加後に時間分解蛍光を測定することによって結合ＴＮＴ１４６を定量した。
【0136】
反復ウェルの平均及び標準偏差をプロットし、可変勾配を有するシグモイドアルゴリズム（Ｐｒｉｓｍ ｖ９．１、Ｇｒａｐｈｐａｄ）に対してデータを近似した。
【0137】
ＡＬもしくはＡＴＴＲアミロイド抽出物、またはアミロイド様フィブリルにヒトＳＡＰを予め結合させることは、ＴＮＴ１４６が基質に結合する能力に悪影響を及ぼさなかった（図２０のＡ～Ｄ）。
【0138】
実施例１２ ｈｕＳＡＰの存在下でのアミロイドフィブリルに対するＳＡＰ－Ｆｃ融合体の結合性
ＰＢＳ中に含まれる合成Ａβ（１－４０）アミロイド様フィブリルで９６ウェルマイクロプレートのウェルを被覆した。ウェルをブロッキングし、その後、洗浄ステップを行い、ＴＢＳ／ＣａＣＬ２で段階希釈されたＴＮＴ１４６（ＭＷ＝４１０ｋＤ）をマイクロプレートウェルに加えた。結合ＴＮＴ１４６をビオチン化抗ヒトＦｃ試薬の添加によって検出した。ストレプトアビジン－ユーロピウム結合体及び現像液の添加後に時間分解蛍光を測定することによって結合ＴＮＴ１４６を定量した。ヒトＦｃを対照試薬として使用した。
ＰＢＳ中に含まれる合成Ａβ（１－４０）アミロイド様フィブリルで９６ウェルマイクロプレートのウェルを被覆した。ウェルをブロッキングし、その後、洗浄ステップを行い、ＴＢＳ／ＣａＣＬ２で段階希釈されたＴＮＴ１４６（ＭＷ＝４１０ｋＤ）をマイクロプレートウェルに加えた。結合ＴＮＴ１４６をビオチン化抗ヒトＦｃ試薬の添加によって検出した。ストレプトアビジン－ユーロピウム結合体及び現像液の添加後に時間分解蛍光を測定することによって結合ＴＮＴ１４６を定量した。ヒトＦｃを対照試薬として使用した。
【0139】
反復ウェルの平均及び標準偏差をプロットし、可変勾配を有するシグモイドアルゴリズム（Ｐｒｉｓｍ ｖ９．１、Ｇｒａｐｈｐａｄ）に対してデータを近似した。
【0140】
Ａβ（１－４０）アミロイド様フィブリルに対するＴＮＴ１４６の結合は、０．４ｎＭの推定ＥＣ５０（５０％半数結合のときの濃度）を有する飽和性結合となった（図２１）。Ｆｃの結合性は弱く、Ｅｃ５０は正確には決定できなかったが約０．２ｍＭと推定された。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7A】
【図7B】
【図7C】
【図7D】
【図7E】
【図7F】
【図7G】
【図8】
【図9】
【図10A】
【図10B】
【図10C】
【図10D】
【図10E】
【図11A】
【図11B】
【図11C】
【図12】
【図13】
【図14A】
【図14B】
【図14C】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【配列表】
【国際調査報告】