▶ ザ ファインスタイン インスティテューツ フォー メディカル リサーチの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-12-01
(54)【発明の名称】神経保護のための方法及び組成物
(51)【国際特許分類】
A61K 45/06 20060101AFI20231124BHJP
A61P 25/28 20060101ALI20231124BHJP
A61K 31/155 20060101ALI20231124BHJP
A61K 31/198 20060101ALI20231124BHJP
A61K 31/375 20060101ALI20231124BHJP
A61K 31/4152 20060101ALI20231124BHJP
A61K 31/77 20060101ALI20231124BHJP
A61K 38/07 20060101ALI20231124BHJP
A61K 31/122 20060101ALI20231124BHJP
A61K 38/13 20060101ALI20231124BHJP
A61K 31/506 20060101ALI20231124BHJP
A61K 31/4709 20060101ALI20231124BHJP
A61K 9/08 20060101ALI20231124BHJP
A61K 47/04 20060101ALI20231124BHJP
A61K 47/10 20170101ALI20231124BHJP
A61K 47/34 20170101ALI20231124BHJP
A61K 47/42 20170101ALI20231124BHJP
【ＦＩ】
A61K45/06
A61P25/28
A61K31/155
A61K31/198
A61K31/375
A61K31/4152
A61K31/77
A61K38/07
A61K31/122
A61K38/13
A61K31/506
A61K31/4709
A61K9/08
A61K47/04
A61K47/10
A61K47/34
A61K47/42
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023530058
(86)(22)【出願日】2021-11-17
(85)【翻訳文提出日】2023-07-14
(86)【国際出願番号】 US2021059612
(87)【国際公開番号】W WO2022108963
(87)【国際公開日】2022-05-27
(31)【優先権主張番号】63/114,786
(32)【優先日】2020-11-17
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＲＩＴＯＮ
２．ＢＲＩＪ
(71)【出願人】
【識別番号】522339189
【氏名又は名称】ザ ファインスタイン インスティテューツ フォー メディカル リサーチ
【氏名又は名称原語表記】Ｔｈｅ Ｆｅｉｎｓｔｅｉｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｆｏｒ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ
【住所又は居所原語表記】３５０ Ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ Ｄｒｉｖｅ， Ｍａｎｈａｓｓｅｔ， ＮＹ １１０３０ （ＵＳ）
(74)【代理人】
【識別番号】100099759
【弁理士】
【氏名又は名称】青木 篤
(74)【代理人】
【識別番号】100123582
【弁理士】
【氏名又は名称】三橋 真二
(74)【代理人】
【識別番号】100117019
【弁理士】
【氏名又は名称】渡辺 陽一
(74)【代理人】
【識別番号】100141977
【弁理士】
【氏名又は名称】中島 勝
(74)【代理人】
【識別番号】100138210
【弁理士】
【氏名又は名称】池田 達則
(74)【代理人】
【識別番号】100170852
【弁理士】
【氏名又は名称】白樫 依子
(72)【発明者】
【氏名】ランス ベッカー
(72)【発明者】
【氏名】リシャブ チャラン チョーダリー
【テーマコード（参考）】
4C076
4C084
4C086
4C206
【Ｆターム（参考）】
4C076AA12
4C076DD23
4C076DD26Z
4C076DD37
4C076EE23
4C076EE41
4C084AA02
4C084AA03
4C084AA20
4C084BA01
4C084BA08
4C084BA16
4C084BA18
4C084BA23
4C084BA24
4C084CA59
4C084DA11
4C084MA02
4C084MA17
4C084MA52
4C084MA55
4C084MA59
4C084MA60
4C084MA65
4C084MA66
4C084NA14
4C084ZA15
4C086AA01
4C086AA02
4C086BA18
4C086BC36
4C086BC42
4C086FA02
4C086GA07
4C086MA02
4C086MA03
4C086MA04
4C086MA17
4C086MA52
4C086MA55
4C086MA59
4C086MA60
4C086MA65
4C086MA66
4C086NA14
4C086ZA15
4C206AA01
4C206AA02
4C206CB27
4C206HA31
4C206JA58
4C206MA03
4C206MA04
4C206MA37
4C206MA72
4C206MA75
4C206MA79
4C206MA80
4C206MA85
4C206MA86
4C206NA14
4C206ZA15
(57)【要約】
本開示は、脳虚血に関連する神経損傷の予防のための組成物、組成物の調製方法、及び該組成物の投与を含む方法に関する。
【選択図】図１
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
脳虚血に罹患しているか、罹患したことがあるか、又は罹患するリスクがある対象の脳に神経保護を提供する方法であって、ミトコンドリア複合体－１阻害剤、抗酸化剤、脂質二重層安定剤、ミトコンドリア膜透過性遷移孔阻害剤、ミトコンドリア膜保護剤、チアミン補充剤、及びＮＨＥ－１阻害剤からなる群から選択される少なくとも２つの治療剤の有効量を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項2】
以下の治療剤：メトホルミン、Ｎ－アセチルシステイン、ビタミンＣ、エダラボン、ポラキサマー１８８、ＳＳ－３１、ＣｏＱ１０、シクロスポリンＡ、スルブチアミン、及びゾニポリド、又はそれらのいずれかの薬学的に許容される塩のうちの１つ以上の有効量が、単一製剤として前記対象に併用投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記少なくとも２つの治療剤が、別個の組成物として前記対象に同時に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
以下の治療剤：メトホルミン、Ｎ－アセチルシステイン、ビタミンＣ、エダラボン、ポラキサマー１８８、ＳＳ－３１、ＣｏＱ１０、シクロスポリンＡ、スルブチアミン、及びゾニポリドの各々の有効量が、２つ以上の組成物として同時に前記対象に投与される、請求項３に記載の方法。
【請求項5】
以下の治療剤：メトホルミン、Ｎ－アセチルシステイン、ビタミンＣ、エダラボン、ポラキサマー１８８、ＳＳ－３１、ＣｏＱ１０、シクロスポリンＡ、スルブチアミン、及びゾニポリドの各々の有効量を１つの組成物中に一緒に混合することによって調製される製剤を前記対象に投与することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項6】
以下の治療剤：メトホルミン、Ｎ－アセチルシステイン、ビタミンＣ、エダラボン、ポラキサマー１８８、ＳＳ－３１、ＣｏＱ１０、シクロスポリンＡ、スルブチアミン、及びゾニポリドの有効量が、単一製剤として前記対象に併用投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項7】
前記治療剤が、前記製剤中に、メトホルミン：Ｎアセチルシステイン：ポロキサマー１８８：コエンザイムＱ１０（ＣｏＱ１０）：シクロスポリンＡ：エダラボン：エラミプレチド（ＳＳ－３１）：スルブチアミン：ビタミンＣ：ゾニポリドの質量比、約８０～約１２０：約１２０～約１８０：約１２０～約１８０：約２４～約３６：約８～約１２：約２．４～約３．６：約０．４～約０．６：約１０～約１５：約８０～約１２０：約２．４～約３．６で存在する、請求項５に記載の方法。
【請求項8】
前記治療剤が、前記製剤中に、メトホルミン：Ｎアセチルシステイン：ポロキサマー１８８：コエンザイムＱ１０（ＣｏＱ１０）：シクロスポリンＡ：エダラボン：エラミプレチド（ＳＳ－３１）：スルブチアミン：ビタミンＣ：ゾニポリドの質量比、約１００：約１５０：約１５０：約３０：約１０：約３：約０．５：約１２．５：約１００：約３で存在する、請求項５に記載の方法。
【請求項9】
各治療剤の前記有効量が、対象質量１ｋｇ当たりのミリグラムで、メトホルミン：約８０ｍｇ／ｋｇ～約１２０ｍｇ／ｋｇ；
Ｎ－アセチルシステイン：約１２０ｍｇ／ｋｇ～約１８０ｍｇ／ｋｇ；
ポロキサマー１８８：約１２０ｍｇ／ｋｇ～約１８０ｍｇ／ｋｇ；
ＣｏＱ１０：約２４ｍｇ／ｋｇ～約３６ｍｇ／ｋｇ；
シクロスポリンＡ：約８ｍｇ／ｋｇ～約１２ｍｇ／ｋｇ；
エダラボン：約２．４ｍｇ／ｋｇ～約３．６ｍｇ／ｋｇ；
ＳＳ－３１：約０．４ｍｇ／ｋｇ～約０．６ｍｇ／ｋｇ；
スルブチアミン：約１０ｍｇ／ｋｇ～約１５ｍｇ／ｋｇ；
ビタミンＣ：約８０ｍｇ／ｋｇ～約１２０ｍｇ／ｋｇ；及び
ゾニポリド：約２．４ｍｇ／ｋｇ～約３．６ｍｇ／ｋｇである、請求項１に記載の方法。
【請求項10】
対象質量１ｋｇ当たりのミリグラムでの各治療剤の前記有効量が、メトホルミン：約１００ｍｇ／ｋｇ；
Ｎ－アセチルシステイン：約１５０ｍｇ／ｋｇ；
ポロキサマー１８８：約１５０ｍｇ／ｋｇ；
ＣｏＱ１０：約３０ｍｇ／ｋｇ；
シクロスポリンＡ：約１０ｍｇ／ｋｇ；
エダラボン：約３ｍｇ／ｋｇ；
ＳＳ－３１：約０．５ｍｇ／ｋｇ；
スルブチアミン：約１２．５ｍｇ／ｋｇ；
ビタミンＣ：約１００ｍｇ／ｋｇ；及び
ゾニポリド：約３ｍｇ／ｋｇである、請求項１に記載の方法。
【請求項11】
前記製剤が、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、エタノール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、及びウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）に溶解したポリオキシエタニル－α－トコフェリルセバケート（ＰＴＳ）の担体を更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項12】
前記脳虚血が、びまん性低酸素性脳症（ＤＣＨ）、限局性脳虚血、脳梗塞、虚血再灌流、鎌状赤血球貧血症、アテローム性動脈硬化症、血管圧迫、心室頻脈、血餅、低血圧、心停止、先天性心疾患、心臓伝導障害、及び全脳虚血を含むか、又はそれらによって引き起こされる、請求項１に記載の方法。
【請求項13】
前記脳虚血が、心停止、ぜんそく、貧血症、溺水、窒息、脳卒中、一酸化炭素中毒、オピオイド過剰摂取、ＣＮＳ抑制薬過剰摂取、てんかん重積状態、窒素性環境への曝露、潜水からの上昇、シャローウォーターブラックアウト、無圧客室中の高高度飛行、及び高所での身体運動によって引き起こされる低酸素性脳症を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項14】
前記脳虚血が、心停止によって引き起こされる、請求項１に記載の方法。
【請求項15】
前記投与が、心停止の開始後、約３０分未満、約２５分未満、約２０分未満、約１５分未満、約１０分未満、約５分未満、又は約２分未満に開始される、請求項１４に記載の方法。
【請求項16】
前記投与が、心停止の開始の約１２分後に開始される、請求項１４に記載の方法。
【請求項17】
前記併用投与が、前記単一製剤の静脈内注射、筋肉内注射、皮下注射、直腸投与、膣投与、経鼻投与、及び経口投与のうちの１つ以上を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項18】
前記併用投与が、静脈内注射を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項19】
脳虚血に罹患しているか、罹患したことがあるか、又は罹患するリスクがある対象の脳に神経保護を提供するための薬学的組成物であって、前記組成物は、ミトコンドリア複合体－１阻害剤、抗酸化剤、脂質二重層安定剤、ミトコンドリア膜透過性遷移孔阻害剤、ミトコンドリア膜保護剤、チアミン補充剤、及びＮＨＥ－１阻害剤からなる群から選択される少なくとも２つの治療剤の有効量を含む、薬学的組成物。
【請求項20】
前記治療剤：メトホルミン、Ｎ－アセチルシステイン、ビタミンＣ、エダラボン、ポラキサマー１８８、ＳＳ－３１、ＣｏＱ１０、シクロスポリンＡ、スルブチアミン、及びゾニポリド、又はそれらのいずれかの薬学的に許容される塩のうちの１つ以上の有効量を含む、請求項１９に記載の薬学的組成物。
【請求項21】
前記治療剤：メトホルミン、Ｎ－アセチルシステイン、ビタミンＣ、エダラボン、ポラキサマー１８８、ＳＳ－３１、ＣｏＱ１０、シクロスポリンＡ、スルブチアミン、及びゾニポリド、又はそれらのいずれかの薬学的に許容される塩の有効量を含む、請求項１９に記載の薬学的組成物。
【請求項22】
単一の組成物中に以下の治療剤：メトホルミン、Ｎ－アセチルシステイン、ビタミンＣ、エダラボン、ポラキサマー１８８、ＳＳ－３１、ＣｏＱ１０、シクロスポリンＡ、スルブチアミン、及びゾニポリドの各々の有効量を混合することによって得られる、又は得ることができる、薬学的組成物。
【請求項23】
前記治療剤が、前記製剤中に、メトホルミン：Ｎアセチルシステイン：ポロキサマー１８８：コエンザイムＱ１０（ＣｏＱ１０）：シクロスポリンＡ：エダラボン：エラミプレチド（ＳＳ－３１）：スルブチアミン：ビタミンＣ：ゾニポリドの質量比、約８０～約１２０：約１２０～約１８０：約１２０～約１８０：約２４～約３６：約８～約１２：約２．４～約３．６：約０．４～約０．６：約１０～約１５：約８０～約１２０：約２．４～約３．６で存在する、請求項２０に記載の薬学的組成物。
【請求項24】
前記治療剤が、前記製剤中に、メトホルミン：Ｎアセチルシステイン：ポロキサマー１８８：コエンザイムＱ１０（ＣｏＱ１０）：シクロスポリンＡ：エダラボン：エラミプレチド（ＳＳ－３１）：スルブチアミン：ビタミンＣ：ゾニポリドの質量比、約１００：約１５０：約１５０：約３０：約１０：約３：約０．５：約１２．５：約１００：約３で存在する、請求項２０に記載の薬学的組成物。
【請求項25】
各治療剤の前記有効量が、対象質量１ｋｇ当たりの治療剤のｍｇで、メトホルミン：約８０ｍｇ／ｋｇ～約１２０ｍｇ／ｋｇ；
Ｎ－アセチルシステイン：約１２０ｍｇ／ｋｇ～約１８０ｍｇ／ｋｇ；
ポロキサマー１８８：約１２０ｍｇ／ｋｇ～約１８０ｍｇ／ｋｇ；
ＣｏＱ１０：約２４ｍｇ／ｋｇ～約３６ｍｇ／ｋｇ；
シクロスポリンＡ：約８ｍｇ／ｋｇ～約１２ｍｇ／ｋｇ；
エダラボン：約２．４ｍｇ／ｋｇ～約３．６ｍｇ／ｋｇ；
ＳＳ－３１：約０．４ｍｇ／ｋｇ～約０．６ｍｇ／ｋｇ；
スルブチアミン：約１０ｍｇ／ｋｇ～約１５ｍｇ／ｋｇ；
ビタミンＣ：約８０ｍｇ／ｋｇ～約１２０ｍｇ／ｋｇ；及び
ゾニポリド：約２．４ｍｇ／ｋｇ～約３．６ｍｇ／ｋｇを含む、請求項２０に記載の薬学的組成物。
【請求項26】
各治療剤の前記有効量が、対象質量１ｋｇ当たりの治療剤のｍｇで、メトホルミン：約１００ｍｇ／ｋｇ；
Ｎ－アセチルシステイン：約１５０ｍｇ／ｋｇ；
ポロキサマー１８８：約１５０ｍｇ／ｋｇ；
ＣｏＱ１０：約３０ｍｇ／ｋｇ；
シクロスポリンＡ：約１０ｍｇ／ｋｇ；
エダラボン：約３ｍｇ／ｋｇ；
ＳＳ－３１：約０．５ｍｇ／ｋｇ；
スルブチアミン：約１２．５ｍｇ／ｋｇ；
ビタミンＣ：約１００ｍｇ／ｋｇ；及び
ゾニポリド：約３ｍｇ／ｋｇである、請求項２０に記載の薬学的組成物。
【請求項27】
各治療剤：メトホルミン：約５．６ｇ～約８．４ｇ；
Ｎ－アセチルシステイン：約８．４ｇ～約１２．６ｇ；
ポロキサマー１８８：約８．４ｇ～約１２．６ｇ；
ＣｏＱ１０：約１．６８ｇ～約２．５２ｇ；
シクロスポリンＡ：約５６０ｍｇ～約８４０ｍｇ；
エダラボン：約１６８ｍｇ～約２５２ｍｇ；
ＳＳ－３１：約２８ｍｇ～約４２ｍｇ；
スルブチアミン：約７００ｍｇ～約１０５０ｍｇ；
ビタミンＣ：約５．６ｇ～約８．４ｇ；及び
ゾニポリド：約１６８ｍｇ～約２５２ｍｇを含む、請求項２０に記載の薬学的組成物。
【請求項28】
各治療剤：メトホルミン：約７ｇ；
Ｎ－アセチルシステイン：約１０．５ｇ；
ポロキサマー１８８：約１０．５ｇ；
ＣｏＱ１０：約２．１ｇ；
シクロスポリンＡ：約７００ｍｇ；
エダラボン：約２１０ｍｇ；
ＳＳ－３１：約３５ｍｇ；
スルブチアミン：約８７５ｍｇ；
ビタミンＣ：約７ｇ；及び
ゾニポリド：約２１０ｍｇを含む、請求項２０に記載の薬学的組成物。
【請求項29】
単一製剤が、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、エタノール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、及びＢＳＡに溶解したポリオキシエタニル－α－トコフェリルセバケート（ＰＴＳ）の担体を更に含む、請求項１９に記載の薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本出願は、２０２０年１１月１７日に出願された米国仮特許出願第６３／１１４，７８６号に対する優先権を主張し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0002】
本開示は、脳虚血に関連する神経損傷の予防のための組成物、組成物の調製方法、及び該組成物の投与を含む方法に関する。
【背景技術】
【0003】
心停止は、西洋諸国における全死亡の約１５％を占める（２５）。米国では、成人の間で年間３２６，０００症例の院外心停止及び２０９，０００症例の院内心停止が発生している（２６）、（２７）。米国では、妊娠中、１万２０００人の分娩に約１人、又は１０，０００人の生児出生当たり１．８人で心停止が発生している。
【0004】
心停止は、深刻な事象である。蘇生の方法の改善にもかかわらず、院外心停止（out-of-hospital cardiac arrest、ＯＨＣＡ）を患う人々の死亡率は、９０％超であり、多くの生存者が重度の神経障害を残している。一次傷害は、停止時に起こり、不可逆的であり、二次傷害は、自己心拍再開（return of spontaneous circulation、ＲＯＳＣ）及びその後の脳再灌流に続いて発生し、可逆的である可能性がある。脳は、低酸素症に非常に敏感に反応する。循環停止の２０秒以内に、ニューロンの酸素貯蔵が使い果たされ、意識消失をもたらす。５分後、グルコース及びアデノシン三リン酸（adenosine triphosphate、ＡＴＰ）貯蔵が枯渇する。これは、カルシウム恒常性の破壊、フリーラジカル形成、並びに有害なプロテアーゼカスケード及び細胞死シグナル伝達機構の活性化をもたらす。これが大脳の一次傷害を引き起こす（２８）。傷害は、心停止後の脳再灌流からも生じ得る。
【0005】
心停止及び脳への血流を減少させる他の状態によって引き起こされる脳虚血及び低酸素性脳症の深刻な影響に対する神経保護を提供する治療が必要とされている。本開示は、この必要性を満たすものである。
【発明の概要】
【0006】
一態様では、脳虚血に罹患しているか、罹患したことがあるか、又は罹患するリスクがある対象の脳に神経保護を提供する方法であって、ミトコンドリア複合体－１阻害剤、抗酸化剤、脂質二重層安定剤、ミトコンドリア膜透過性遷移孔阻害剤、ミトコンドリア膜保護剤、チアミン補充剤、及びＮＨＥ－１阻害剤からなる群から選択される少なくとも２つの治療剤の有効量を対象に併用投与することを含む。
【0007】
いくつかの実施形態では、以下の治療剤：メトホルミン、Ｎ－アセチルシステイン、ビタミンＣ、エダラボン、ポラキサマー１８８、ＳＳ－３１、ＣｏＱ１０、シクロスポリンＡ、スルブチアミン若しくはその誘導体、及びゾニポリド、又はそれらのいずれかの薬学的に許容される塩のうちの１つ以上の有効量が、対象に併用投与される。
【0008】
いくつかの実施形態では、脳虚血は、びまん性低酸素性脳症（diffuse cerebral hypoxia、ＤＣＨ）、限局性脳虚血、脳梗塞、虚血再灌流、鎌状赤血球貧血症、アテローム性動脈硬化症、血管圧迫、心室頻脈、血餅、低血圧、心停止、先天性心疾患、心臓伝導障害、及び全脳虚血を含むか、又はそれらによって引き起こされる。いくつかの実施形態では、脳虚血は、心停止、ぜんそく、貧血症、溺水、窒息、脳卒中、一酸化炭素中毒、オピオイド過剰摂取、ＣＮＳ抑制薬過剰摂取、てんかん重積状態、窒素性環境への曝露、潜水からの上昇、シャローウォーターブラックアウト、無圧客室中の高高度飛行、及び高所での身体運動によって引き起こされる低酸素性脳症を含む。
【0009】
別の態様では、脳虚血に罹患しているか、罹患したことがあるか、又は罹患するリスクがある対象の脳に神経保護を提供するための薬学的組成物であって、本明細書に開示される少なくとも２つの治療剤の有効量を含む組成物が提供される。
【0010】
別の態様では、脳虚血に罹患しているか、罹患したことがあるか、又は罹患するリスクがある対象の脳に神経保護を提供するための薬学的組成物を調製する方法であって、
ａ）ＣｏＱ１０及びシクロスポリンＡを含む第１の混合物と、
ｂ）メトホルミン、Ｎ－アセチルシステイン、ポラキサマー－１８８、エダラボン、ＳＳ－３１、ビタミンＣ、及びゾニポリドを含む第２の混合物と、
を混合して第３の混合物を形成することを含む方法が提供される。いくつかの実施形態では、本方法は、第３の混合物と、スルブチアミン又はその誘導体を含む第４の混合物とを混合することを更に含む。
ａ）ＣｏＱ１０及びシクロスポリンＡを含む第１の混合物と、
ｂ）メトホルミン、Ｎ－アセチルシステイン、ポラキサマー－１８８、エダラボン、ＳＳ－３１、ビタミンＣ、及びゾニポリドを含む第２の混合物と、
を混合して第３の混合物を形成することを含む方法が提供される。いくつかの実施形態では、本方法は、第３の混合物と、スルブチアミン又はその誘導体を含む第４の混合物とを混合することを更に含む。
【図面の簡単な説明】
【0011】
【図1】心停止（cardiac arrest、ＣＡ）がラットにおいて開始され、続いて本発明による製剤が投与された、実施例１の実験の実験時間の詳細を表す図を示す。
【0012】
【図2】実施例１の実験の全体概略図を示す。
【0013】
【図3】１２分間の心停止及び自己心拍再開後のカクテル注射ラット群とビヒクル注射ラット群との間の７２時間生存期間のカプラン－マイヤー分析。有意差：＊＊Ｐ＜０．００６対ビヒクル注射群。
【0014】
【図4A】１２分間の心停止及び蘇生後のビヒクル注射群とカクテル注射群との間の２４時間後（図４Ａ）、４８時間後（図４Ｂ）及び７２時間後（図４Ｃ）の神経学的欠損スコア（Neurological deficit score、ＮＤＳ）。死亡したラット（スコア＝０によって示される）は、統計分析から除外された。統計的有意性、群間で＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．００５。
【0015】
【図5A】ベースライン及び自己心拍再開（ＲＯＳＣ）後の心停止（ＣＡ）後ケア中の食道温度、平均動脈圧、及び心拍数の変化を示す。（図５Ａ）食道温度（℃）（図５Ｂ）平均動脈圧（mean arterial pressure、ＭＡＰ）（図５Ｃ）心拍数（heart rate、ＨＲ）。＊－ｐ＜０．０５対ビヒクル、＊＊－ｐ＜０．００５対ビヒクル、＃－ｐ＜０．０５対それぞれのベースライン、＃＃＃ｐ＜０．０００５対それぞれのベースライン、＃＃＃－ｐ＜０．０００１対それぞれのベースライン、バーは、平均値及びＳＥＭを表す。Ｔｅｓｏ、食道温度、ＢＬは、ベースラインを示す、ＣＰＲ、心肺蘇生（cardiopulmonary resuscitation）。＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．００５。
【図5B】ベースライン及び自己心拍再開（ＲＯＳＣ）後の心停止（ＣＡ）後ケア中の食道温度、平均動脈圧、及び心拍数の変化を示す。（図５Ａ）食道温度（℃）（図５Ｂ）平均動脈圧（mean arterial pressure、ＭＡＰ）（図５Ｃ）心拍数（heart rate、ＨＲ）。＊－ｐ＜０．０５対ビヒクル、＊＊－ｐ＜０．００５対ビヒクル、＃－ｐ＜０．０５対それぞれのベースライン、＃＃＃ｐ＜０．０００５対それぞれのベースライン、＃＃＃－ｐ＜０．０００１対それぞれのベースライン、バーは、平均値及びＳＥＭを表す。Ｔｅｓｏ、食道温度、ＢＬは、ベースラインを示す、ＣＰＲ、心肺蘇生（cardiopulmonary resuscitation）。＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．００５。
【図5C】ベースライン及び自己心拍再開（ＲＯＳＣ）後の心停止（ＣＡ）後ケア中の食道温度、平均動脈圧、及び心拍数の変化を示す。（図５Ａ）食道温度（℃）（図５Ｂ）平均動脈圧（mean arterial pressure、ＭＡＰ）（図５Ｃ）心拍数（heart rate、ＨＲ）。＊－ｐ＜０．０５対ビヒクル、＊＊－ｐ＜０．００５対ビヒクル、＃－ｐ＜０．０５対それぞれのベースライン、＃＃＃ｐ＜０．０００５対それぞれのベースライン、＃＃＃－ｐ＜０．０００１対それぞれのベースライン、バーは、平均値及びＳＥＭを表す。Ｔｅｓｏ、食道温度、ＢＬは、ベースラインを示す、ＣＰＲ、心肺蘇生（cardiopulmonary resuscitation）。＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．００５。
【0016】
【図6】１０種類の薬物のカクテルのエレクトロスプレーイオン化／質量分析（Electrospray ionization/mass spectrometry、ＥＳＩ／ＭＳ）分析。カクテルの酢酸エチル抽出後のポジティブイオンモード（上）及びネガティブイオンモード（下）。分析は、主要な成分（メトホルミン、エダラボン、ゾニポリド、シクロスポリンＡ、Ｎ－アセチルシステイン、及びビタミンＣ、並びに微量のポリエチレングリコール（polyethylene glycol、ＰＥＧ））についてのｍ／ｚ（質量／電荷）値を示す。残りの薬物は検出されず、より複雑な抽出及び分析方法を必要とする。
【0017】
【図7】盲検実験の手順及びタイムラインの概略図。上は、最大７２時間生存のラットＣＡ実験のタイムラインを示し、下は、盲検様式で生存試験を行うための方法を示す。ＣＰＲ、心肺蘇生、ＲＯＳＣ、自己心拍再開。
【0018】
【図8A】カクテルは、窒息性心停止及び蘇生後の生存及び神経機能を改善する。生存は、自己心拍再開（ＲＯＳＣ、Ｐ＝０．００６）の７２時間後で、ビヒクル処置ラット（２８．６％）とカクテル処置ラット（７８．６％）との間で実質的に異なっていた。
【図8B】カクテルは、窒息性心停止及び蘇生後の生存及び神経機能を改善する。ビヒクル処置ラット及びカクテル処置ラットにおける２４時間、４８時間、及び７２時間での修正神経学的欠損スコア（Modified neurological deficit score、ｍＮＤＳ、スケール１）。生存しなかったラット（スコア＝０）は、統計分析から除外された。
【図8C】カクテルは、窒息性心停止及び蘇生後の生存及び神経機能を改善する。ビヒクル処置ラット及びカクテル処置ラットにおけるＲＯＳＣの２４時間後、４８時間後、及び７２時間後での神経学的欠損スコア（ＮＤＳ、スケール２）。スコアは、ＲＯＳＣの２４時間後及び７２時間後では有意差はあったが、４８時間後では有意差はなかった（ただし、増加傾向を示した）。データは、平均値±ＳＥＭとして提示される。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．００５。
【0019】
【図9A】カクテルは、窒息性心停止及び蘇生後の脳組織構造を改善する。カクテル処置ラットの海馬におけるアポトーシス細胞の減少を示す代表的な（図９Ａ）Ｎｉｓｓｌ染色及び（図９Ｂ）ＴＵＮＥＬ染色。青色の枠は左大脳半球における海馬のＣＡ１領域を示し、赤色の枠はＣＡ３領域を示す。赤色の矢印は虚血ニューロンを示し、オレンジ色の矢印はアポトーシス細胞を示す。海馬のＣＡ１及びＣＡ３領域における虚血ニューロン及びアポトーシス細胞の平均数は、シャムラットよりもビヒクル処置ラットにおいて有意に多く、ビヒクル処置ラットに対してカクテル処置ラットにおいて有意に減少していた。データは、平均値±ＳＥＭとして提示される。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。
【図9B】カクテルは、窒息性心停止及び蘇生後の脳組織構造を改善する。カクテル処置ラットの海馬におけるアポトーシス細胞の減少を示す代表的な（図９Ａ）Ｎｉｓｓｌ染色及び（図９Ｂ）ＴＵＮＥＬ染色。青色の枠は左大脳半球における海馬のＣＡ１領域を示し、赤色の枠はＣＡ３領域を示す。赤色の矢印は虚血ニューロンを示し、オレンジ色の矢印はアポトーシス細胞を示す。海馬のＣＡ１及びＣＡ３領域における虚血ニューロン及びアポトーシス細胞の平均数は、シャムラットよりもビヒクル処置ラットにおいて有意に多く、ビヒクル処置ラットに対してカクテル処置ラットにおいて有意に減少していた。データは、平均値±ＳＥＭとして提示される。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。
【0020】
【図10A】カクテルは、窒息性心停止及び蘇生後の乳酸、グルコース、及び血行動態を改善する。乳酸濃度は、ビヒクル処置ラット及びカクテル処置ラットの両方において、自己心拍再開（ＲＯＳＣ）の２０分後及び４０分後で、ベースライン（ＢＬ）に対して有意に高かった。乳酸濃度は、ＲＯＳＣ後２０分及び４０分では、ビヒクル処置ラットに対してカクテル処置ラットにおいてより高かった。
【図10B】カクテルは、窒息性心停止及び蘇生後の乳酸、グルコース、及び血行動態を改善する。グルコース濃度は、カクテル処置ラットにおいてビヒクル処置ラットよりも高く、ＲＯＳＣ後２０分で最も有意な差があった（Ｐ＜０．０５）。グルコース濃度は、実験時間の経過にわたって両群とも減少傾向を示した。
【図10C】カクテルは、窒息性心停止及び蘇生後の乳酸、グルコース、及び血行動態を改善する。平均動脈圧（ＭＡＰ）は、ＲＯＳＣ後３０分においてのみ、カクテル処置ラットに対してビヒクル処置ラットにおいて有意に高かった。
【図10D】カクテルは、窒息性心停止及び蘇生後の乳酸、グルコース、及び血行動態を改善する。心拍数（ＨＲ）（拍／分（ｂｐｍ））は、ＲＯＳＣ後６０分においてのみ、カクテル処置ラットに対してビヒクル処置ラットにおいて有意に高かった（Ｄ）。データは、平均値±ＳＥＭとして提示され、群内の有意な比較は挿入図に示される。ビヒクルとカクテルとの間で＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。
【0021】
【図11A】心停止後のカクテル処置ラット及びビヒクル処置ラットにおける生存及び神経学的欠損の予備試験。予備試験における１２分間の心停止（ＣＡ）及び蘇生後のカクテル処置ラット及びビヒクル処置ラットの生存分析。生存は、ＲＯＳＣ後７２時間でカクテル処置ラットにおいて実質的により大きかった。
【図11B】心停止後のカクテル処置ラット及びビヒクル処置ラットにおける生存及び神経学的欠損の予備試験。予備試験における１２分間のＣＡ及び蘇生後のビヒクル処置ラット及びカクテル処置ラットの（図１１Ｂ）２４時間及び（図１１Ｃ）４８時間での修正神経学的欠損スコア（ｍＮＤＳ）。生存しなかったラット（スコア＝０）は、統計分析から除外された。カクテル処置ラットにおけるスコアは、自己心拍再開（ＲＯＳＣ）後の２４時間でビヒクル処置ラットよりも有意に高かった。ビヒクル処置ラットでは、１匹のみが、ＲＯＳＣの４８時間後に生存していた。データは、平均値±ＳＥＭとして提示される。ビヒクルとカクテルとの間で＊Ｐ＜０．０５。
【図11C】心停止後のカクテル処置ラット及びビヒクル処置ラットにおける生存及び神経学的欠損の予備試験。予備試験における１２分間のＣＡ及び蘇生後のビヒクル処置ラット及びカクテル処置ラットの（図１１Ｂ）２４時間及び（図１１Ｃ）４８時間での修正神経学的欠損スコア（ｍＮＤＳ）。生存しなかったラット（スコア＝０）は、統計分析から除外された。カクテル処置ラットにおけるスコアは、自己心拍再開（ＲＯＳＣ）後の２４時間でビヒクル処置ラットよりも有意に高かった。ビヒクル処置ラットでは、１匹のみが、ＲＯＳＣの４８時間後に生存していた。データは、平均値±ＳＥＭとして提示される。ビヒクルとカクテルとの間で＊Ｐ＜０．０５。
【0022】
【図12A】心停止後のカクテル処置ラット及びビヒクル処置ラットにおける食道温度及び血行動態変化の予備試験。Ａ～Ｃ、予備試験におけるベースライン（ＢＬ）及び自己心拍再開（ＲＯＳＣ）後での（図１２Ａ）食道温度、（図１２Ｂ）平均動脈圧（ＭＡＰ）、及び（図１２Ｃ）心拍数（ＨＲ）の変化。ビヒクル処置ラットとカクテル処置ラットとの間に大きな差は生じなかった。データは、平均値±ＳＥＭとして提示され、群内の有意性比較は挿入図に示される。Ｂｐｍは、拍／分を表す。
【0023】
【発明を実施するための形態】
【0024】
本開示の実施は、別段の指示がない限り、当該技術分野の範囲内である化学、生化学、及び薬理学の従来の方法を使用する。このような技術は、文献に十分に説明されている。例えば、Ａ．Ｌ．Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．，ｃｕｒｒｅｎｔ ａｄｄｉｔｉｏｎ）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ａｎｄ Ｂｏｙｄ，Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ａｌｌｙｎ ａｎｄ Ｂａｃｏｎ，Ｉｎｃ．，ｃｕｒｒｅｎｔ ａｄｄｉｔｉｏｎ）；Ｊ．Ｍａｒｃｈ，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ，ｃｕｒｒｅｎｔ ａｄｄｉｔｉｏｎ）；Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｅｄ．，２０ｔｈ Ｅｄ．；ＦＤＡ’ｓ Ｏｒａｎｇｅ Ｂｏｏｋ，Ｇｏｏｄｍａｎ ＆ Ｇｉｌｍａｎ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｊ．Ｇｒｉｆｆｉｔｈ Ｈａｒｄｍａｎ，Ｌ．Ｌ．Ｌｉｍｂｉｒｄ，Ａ．Ｇｉｌｍａｎ，１１ｔｈ Ｅｄ．，２００５，Ｔｈｅ Ｍｅｒｃｋ Ｍａｎｕａｌ，１８ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，２００７，ａｎｄ Ｔｈｅ Ｍｅｒｃｋ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ２００３を参照されたい。
【0025】
本明細書及び特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈が明確に別段の指示をしない限り、複数の言及を含む。本明細書全体を通して、別段の指示がない限り、「含む（comprise）」、「含む（comprises）」及び「含んでいる（comprising）」は、排他的ではなく包括的に使用される。「又は」という用語は、例えば、「いずれか」によって修飾されない限り、包括的である。したがって、文脈又は明示的な記述が別段の指示をしない限り、「又は」という語は、特定のリストの任意の１つのメンバーを意味し、そのリストのメンバーの任意の組み合わせも含む。実施例以外、又は別段の指示がある場合を除き、本明細書で使用される成分の量又は反応条件を表す全ての数字は、全ての場合において「約」という用語によって修飾されるものとして理解されるべきである。
【0026】
本明細書で使用される場合、「含んでいる（comprising）」又は「含む（comprises）」という用語は、組成物及び方法が列挙された要素を含むが、他のものを排除しないことを意味することが意図される。「から本質的になる」は、組成物及び方法を定義するために使用される場合、記載された目的のための組み合わせに対する任意の本質的に重要な他の要素を除外することを意味するものとする。したがって、本明細書で定義される要素から本質的になる組成物は、特許請求された発明の基本的かつ新規な特徴に実質的に影響を及ぼさない他の材料又は工程を除外しない。「からなる」は、微量を超える他の成分及び他の実質的な方法工程を除外することを意味するものとする。これらの移行語の各々によって定義される実施形態は、本発明の範囲内である。実施形態がこれらの用語のうちの１つ（例えば、「含んでいる（comprising）」）によって定義される場合、本開示は、該実施形態についての「から本質的になる（consisting essentially of）」及び「からなる（consisting of）」などの代替実施形態も含むことを理解されたい。
【0027】
「実質的に」又は「本質的に」は、ほぼ全て又はほぼ完全にを意味し、例えば、ある所与の量の９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上を意味する。
【0028】
「薬学的に許容される賦形剤又は担体」は、任意選択的に本開示の組成物中に含まれてもよく、患者に対して著しい有害な毒性学的影響を引き起こさない賦形剤を指す。
【0029】
「薬学的に許容される塩」とは、化合物の塩を指し、塩は、薬学的使用に好適であり、当該技術分野で周知の種々の有機対イオン及び無機対イオンから誘導される。薬学的に許容される塩としては、化合物が酸性官能基を含有する場合、ほんの一例として、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、アンモニウム、及びテトラアルキルアンモニウムが挙げられる。分子が塩基性官能基を含有する場合、塩酸塩、臭化水素酸塩、酒石酸塩、メシル酸塩、酢酸塩、マレイン酸塩、及びシュウ酸塩などの有機酸又は無機酸の塩である。Ｓｔａｈｌ ａｎｄ Ｗｅｒｍｕｔｈ，ｅｄｓ．，「Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｌｙ Ａｃｃｅｐｔａｂｌｅ Ｓａｌｔｓ，」（２００２），Ｖｅｒｌａｇ Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ，Ｚｕｒｉｃｈ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）は、薬学的に許容される塩に関するその教示について参照により本明細書に組み込まれるが、様々な薬学的塩、それらの選択、調製、及び使用について論じている。薬学的に許容される塩としてはまた、親化合物中に存在する酸性プロトンが、金属イオン（例えば、アルカリ金属イオン、アルカリ土類金属イオン、又はアルミニウムイオン）又はアンモニウムイオン（例えば、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、モルホリン、ピペリジン、ジメチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、及びアンモニアなどの有機塩基から誘導されるアンモニウムイオン）のいずれかによって置換される場合に形成される塩が挙げられる。
【0030】
「対象」、「個体」又は「患者」という用語は、本明細書において互換的に使用され、脊椎動物、好ましくは哺乳動物を指す。哺乳動物としては、マウス、げっ歯類、ラット、サル、ヒト、家畜、イヌ、ネコ、スポーツ動物、及びペットが挙げられるが、これらに限定されない。
【0031】
本明細書で提供される組成物又は薬剤の「薬理学的有効量」又は「治療有効量」又は「有効量」という用語は、非毒性であるが、進行性神経変性疾患の減少又は逆転などの所望の応答を提供するのに十分な組成物又は薬剤の量を指す。必要とされる正確な量は、対象の種、年齢、及び全身状態、治療される状態の重症度、使用される特定の薬物（単数又は複数）、投与様式等に応じて、対象ごとに異なる。任意の個々の場合における適切な「有効」量は、本明細書に提供される情報に基づいて、日常的な実験を使用して当業者によって決定され得る。
【0032】
「約」という用語は、当業者によって理解され、それが使用される文脈に応じてある程度異なる。それが使用される文脈を考慮して、当業者に明確でない用語の使用がある場合、「約」は、その特定の用語の最大プラス又はマイナス１０％を意味する。例えば、いくつかの実施形態では、それは特定の用語のプラス又はマイナス５％を意味する。特定の範囲は、「約」という用語が先行する数値で本明細書に提示される。本明細書では、「約」という用語は、それが先行する正確な数、並びにその用語が先行する数に近いか、又は近似する数に対する文字通りの支持を提供するために使用される。ある数が具体的に列挙された数に近いか又は近似するかどうかを決定する際に、その近いか又は近似する列挙されていない数は、それが提示される文脈において、具体的に列挙された数の実質的な均等物を提供する数であり得る。
【0033】
値の範囲が提供される場合、文脈が明確に別段の指示をしない限り、その範囲の上限と下限との間の下限の単位の１０分の１までの各介在値、及び記載された範囲内の任意の他の記載された値又は介在値が、本発明内に包含されることが理解される。これらのより小さい範囲の上限及び下限は、そのより小さい範囲に独立して含まれてよく、やはり本発明内に包含されるが、記載された範囲内で任意に具体的に限界が除外されることがある。記載された範囲が限界の一方又は両方を含む場合、それらの含まれる限界のいずれか又は両方を除外する範囲も本開示に含まれる。
【0034】
見出しは便宜上提供されるに過ぎず、本発明を限定するものと決して解釈されるべきではない。別段に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的としており、特許請求の範囲によってのみ定義される本発明の範囲を限定することは意図されていない。また、常に明示的に述べられているわけではないが、本明細書に記載されている試薬は単に例示的なものであり、そのようなものの均等物は当該技術分野において公知であり、詳細な記載全体を通して記載されていることも理解されたい。
【0035】
本明細書で使用される場合、「治療」又は「治療すること」という用語は、患者における疾患若しくは状態又は関連する障害の任意の治療を意味し、
・疾患若しくは状態を阻害若しくは予防すること、すなわち、脳虚血に起因する神経学的欠損などの臨床症状の発症を阻止若しくは抑制すること（神経保護の提供も「治療」に含まれる）、及び／又は
・疾患若しくは状態を緩和すること、すなわち、臨床症状の退行を引き起こすこと、例えば、神経学的能力を増加させるか、若しくは神経学的欠陥を減少させること、を含む。
いくつかの実施形態では、「治療」は、対象に「神経保護を提供すること」を包含する。「治療」及び「神経保護を提供すること」は、本明細書に開示される治療剤又は組成物の投与を含み得る。
・疾患若しくは状態を阻害若しくは予防すること、すなわち、脳虚血に起因する神経学的欠損などの臨床症状の発症を阻止若しくは抑制すること（神経保護の提供も「治療」に含まれる）、及び／又は
・疾患若しくは状態を緩和すること、すなわち、臨床症状の退行を引き起こすこと、例えば、神経学的能力を増加させるか、若しくは神経学的欠陥を減少させること、を含む。
いくつかの実施形態では、「治療」は、対象に「神経保護を提供すること」を包含する。「治療」及び「神経保護を提供すること」は、本明細書に開示される治療剤又は組成物の投与を含み得る。
【0036】
「神経保護」は、ニューロン構造及び／又は機能の相対的な保存を指す。進行中の損傷（低酸素性脳症などの神経変性損傷）の場合、ニューロンの健全性が相対的に保たれることは、経時的なニューロン損失速度の低下を意味する。
【0037】
「低酸素性脳症」は、低酸素症（酸素の供給の減少）の形態であり、特に脳に関与する。脳が完全に酸素を奪われる場合、脳無酸素症と呼ばれる。
【0038】
本明細書で使用される「脳虚血」は、健康な対象と比較して、脳への血流の減少又は不足を指す。
【0039】
「心停止」は、心臓が効果的に送り出すことができないことに起因する血流の突然の低下を指す。徴候としては、意識の喪失及び呼吸の異常又は消失が挙げられる。一部の個人は、心停止前の胸痛、息切れ、又は悪心を経験し得る。
【0040】
「組成物」及び「製剤」は、本明細書で互換的に使用される。これらの用語は、１つ以上の治療剤と、担体、賦形剤、又は他の不活性成分との混合物を指す。
【0041】
本明細書で使用される「ミトコンドリア複合体１」は、呼吸複合体Ｉ、ＮＡＤＨ：ユビキノンオキシドレダクターゼ（ubiquinone oxidoreductase）、又はＩ型ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼを指す。それは、細菌からヒトまでの多くの生物の呼吸鎖の最初の大きなタンパク質複合体である。それは、ＮＡＤＨから補酵素Ｑ１０（ＣｏＱ１０）への電子の移動を触媒し、真核生物においてミトコンドリア内膜を横切ってプロトンを移動させる。
【0042】
本明細書で使用される「抗酸化剤」は、酸化を阻害する化合物を指す。酸化は、フリーラジカルを生成し得る化学反応であり、それによって、生物の細胞に損傷を与え得る連鎖反応をもたらす。
【0043】
本明細書で使用される「脂質二重層安定剤」は、生物有機体の脂質二重層を安定化させる任意の薬剤を含む。脂質二重層安定剤は、血液脳関門損傷を減少させ、脳浮腫を低減させ、細胞死を減少させる働きをする。
【0044】
本明細書で使用される「ミトコンドリア膜透過性遷移孔」又は「ＭＴＰ」は、外傷性脳損傷及び脳卒中などの特定の病的状態下でミトコンドリアの内膜に形成されるタンパク質を指す。開口は、分子量が１５００ダルトン未満の分子に対するミトコンドリア膜の透過性の増加を可能にする。膜透過性遷移孔、ミトコンドリア膜透過性遷移（ｍＰＴ又はＭＰＴ）の誘導は、ミトコンドリア膨潤及びアポトーシス又は壊死を介する細胞死をもたらし得る。ＭＴＰの阻害剤は、ミトコンドリアからのシトクロムＣ放出を促進するミトコンドリア膜電位を増強し、スーパーオキシドジスムターゼ活性を増加させて神経保護を提供する。
【0045】
本明細書で使用される「ミトコンドリア膜保護剤」は、カルジオリピンと相互作用し、ミトコンドリア膜を保護し、ミトコンドリア損傷から保護する任意の薬剤を指す。
【0046】
本明細書で使用される「チアミン補充剤」は、チアミンを放出するか、チアミンに代謝するか、又はチアミンの関連する薬理活性を有する任意の薬剤を指す。
【0047】
本明細書で使用される「ＮＨＥ－１」は、ナトリウム／水素交換体１又はＳＬＣ９Ａ１（ＳｏＬｕＴｅ Ｃａｒｒｉｅｒファミリー９Ａ１）としても知られるナトリウム－水素アンチポーター１（sodium-hydrogen antiporter 1）（ＮＨＥ－１）を指す。ＮＨＥ－１は、ヒトにおいてＳＬＣ９Ａ１遺伝子によってコードされるナトリウム水素アンチポーターのアイソフォームである。これは、脊椎細胞の体積及びｐＨ調節に関与するユビキタスな膜結合酵素である。
【0048】
本明細書で使用される「メトホルミン」は、化合物：
及びその薬学的に許容される塩又は溶媒和物を指す。この化合物は、Ｇｌｕｃｏｐｈａｇｅ（登録商標）としても市販されている。
【化1】
【0049】
「Ｎ－アセチルシステイン」（ＮＡＣ）は、化合物：
又はその薬学的に許容される塩若しくは溶媒和物を指す。
【化2】
【0050】
本明細書で使用される「ビタミンＣ」は、化合物アスコルビン酸又はその薬学的に許容される塩若しくは溶媒和物を指す。
【0051】
本明細書で使用される「エダラボン」は、以下の構造の化合物：
又はその薬学的に許容される塩若しくは溶媒和物を指す。エダラボンは、Ｒａｄｉｃｕｔ（登録商標）、Ｒａｄｉｃａｖａ（登録商標）、Ｘａｖｒｏｎ（登録商標）、又はＥｄａｖｉｔ（登録商標）として市販されている。
【化3】
【0052】
本明細書で使用される「ポラキサマー１８８」は、以下の構造のブロックコポリマー：
（式中、ｘは２～１３０であってよく、ｙは１５～６７であってよく、ｚは２～１３０であってよく、総平均分子量は約８，４００Ｄａである）を指す。
【化4】
【0053】
エラミプレチドとしても知られる「ＳＳ－３１」は、以下の構造の化合物：
又はその薬学的に許容される塩若しくは溶媒和物を指す。
【化5】
【0054】
ユビキノン－１０としても知られる「補酵素Ｑ１０」又は「ＣｏＱ１０」は、動物及びほとんどの細菌に遍在するＣｏＱファミリーの補酵素メンバーである。ヒトにおいて、ＣｏＱの最も一般的な形態は、以下の構造：
を有するコエンザイムＱ１０である。
【化6】
【0055】
「シクロスポリンＡ」は、以下の式の免疫抑制化合物：
又はその薬学的に許容される塩若しくは溶媒和物を指す。
【化7】
【0056】
「スルブチアミン」（Ａｒｃａｌｉｏｎ（登録商標））は、以下の構造のチアミン（ビタミンＢ１）の合成誘導体：
又はその薬学的に許容される塩若しくは溶媒和物を指す。スルブチアミンの誘導体も使用することができる。例えば、以下の化合物がスルブタミンから合成され、本発明の組成物における使用に好適である。
【化8】
【化9】
【0057】
本明細書で使用される「ゾニポリド」は、化合物：
又はその薬学的に許容される塩若しくは溶媒和物を指す。
【化10】
【0058】
神経保護を提供する方法
一態様では、脳虚血に罹患しているか、罹患したことがあるか、又は罹患するリスクがある対象の脳に神経保護を提供する方法が提供され、該方法は、ミトコンドリア複合体－１阻害剤、抗酸化剤、脂質二重層安定剤、ミトコンドリア膜透過性遷移孔阻害剤、ミトコンドリア膜保護剤、チアミン補充剤、及びＮＨＥ－１阻害剤からなる群から選択される少なくとも２つの治療剤の有効量を対象に併用投与することを含む。
一態様では、脳虚血に罹患しているか、罹患したことがあるか、又は罹患するリスクがある対象の脳に神経保護を提供する方法が提供され、該方法は、ミトコンドリア複合体－１阻害剤、抗酸化剤、脂質二重層安定剤、ミトコンドリア膜透過性遷移孔阻害剤、ミトコンドリア膜保護剤、チアミン補充剤、及びＮＨＥ－１阻害剤からなる群から選択される少なくとも２つの治療剤の有効量を対象に併用投与することを含む。
【0059】
一実施形態では、神経保護は、ニューロンの構造及び／又は機能を保存することを含む。ニューロン構造の保存は、磁気共鳴画像法（magnetic resonance imaging、ＭＲＩ）、機能的ＭＲＩ（ｆＭＲＩ）、ポジトロン放出断層撮影（Positron Emission Tomography、ＰＥＴ）、及び脳波検査（Electroencephalography、ＥＥＧ）などの画像技術などのツールを用いて評価することができる。ニューロン機能の保存は、当該技術分野で公知の任意の臨床的に関連する試験、例えば、開耳及び開眼、表面立ち直り、空中立ち直り、前肢握り、聴覚驚愕、平面立ち直り、負の走地性、オープンフィールド横断、断崖回避、バーンズ迷路、高架式十字迷路、Ｊａｍａｒダイナモメータ、手持ち式ダイナモメータ、徒手筋力試験（manual muscle testing、ＭＭＴ）、等速性ダイナモメータ、体幹安定試験（trunk stability test、ＴＳＴ）、片側股関節耐久試験（unilateral hip bridge endurance test、ＵＨＢＥ）、回内筋徴候、バレー徴候、ロンベルグ試験、ランドウ反射、微粒子懸濁、感覚反射（ピン感覚（pinprick）、軽い触覚（light touch）、位置、振動、及びチャージャー（charger））、反射（二頭筋、三頭筋、上腕橈骨、膝蓋、及び足関節）、モロー反射、緊張性首反応、吸引反射、手掌及び足底把握反射、パラシュート反応、頸の立ち直り反応（neck on body righting reaction、ＮＯＢ）、体に働く体の立ち直り反応（body on body righting reaction、ＢＯＢ）、開耳音響反射、静的コンプライアンス、外耳道の物理的容積、対側下肢反射、同側性反射、ティンパノメトリー、Ｙ迷路、ノベルオブジェクト探索試験、ＳＴＰＩ（Ｓｔａｔｅ－Ｔｒａｉｔ Ｐｅｒｓｏｎａｌｉｔｙ Ｉｎｖｅｎｔｏｒｙ、状態－特性人格尺度）、五次元好奇心尺度、自己好奇心態度関心尺度、好奇心探究心尺度ＩＩ、状態－特性人格尺度（ＳＴＰＩ）、刺激希求尺度（Sensation Seeking Scale、ＳＳＳ）の下位尺度、ベイリー乳幼児発達検査（Bayley Scales of Infant Development、ＢＳＩＤ－ＩＩＩ）（１～４２ヵ月）、ミューレン早期学習尺度（１～６８ヵ月）、乳幼児知能のＦａｇａｎ試験（Fagan Test of Infant Intelligence、ＦＴＩＩ）（出生１２ヵ月）、Ｇｒｉｆｆｉｔｈの精神発達尺度Ｉ（０～２年）、Ｂａｔｔｅｌｌｅ発達尺度（Battelle Developmental Inventory、ＢＤＩ）（出生～８歳）、及びＶｉｎｅｌａｎｄ適応行動尺度（０～１８歳）、又はＡＤＡＳＣｏｇ、ミニ精神状態検査（Mini-Mental State Exam、ＭＭＳＥ）、ミニコグ試験、認識能力のＷｏｏｄｃｏｃｋ－Ｊｏｈｎｓｏｎ試験、Ｌｅｉｔｅｒ国際動作性尺度、ミラー類推試験、レーヴン漸進的マトリックス、Ｗｏｎｄｅｒｌｉｃ Ｐｅｒｓｏｎｎｅｌ試験、ＩＱ試験、及びＣａｎｔａｂ Ｍｏｂｉｌｅ、Ｃｏｇｎｉｇｒａｍ、Ｃｏｇｎｉｖｕｅ、Ｃｏｇｎｉｓｉｏｎ、若しくはＡｕｔｏｍａｔｅｄ Ｎｅｕｒｏｐｓｙｃｈｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ Ｍｅｔｒｉｃｓ Ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｔｅｓｔ（ＣＰＴ）から選択されるコンピュータ化試験を含む認知試験を用いて評価することができる。
【0060】
いくつかの実施形態では、方法又は組成物によって提供される神経保護の程度は、ニューロン構造及び／又は機能を評価するための上記の任意のツールを用いて対象を評価し、対象の結果を、脳虚血を経験していない同じ年齢、性別及び種の対照対象と比較することによって決定され得る。いくつかの実施形態では、脳虚血及び併用投与の後、対象は、ニューロン構造及び／又は機能の評価のために上に列挙した前述のツール又は試験のいずれかに対する対照対象のスコアの約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、又は約１００％のスコアを取る。
【0061】
いくつかの実施形態では、脳虚血は、脳への血流の減少を含む。いくつかの実施形態では、脳虚血は、虚血性低酸素性脳症（血流途絶による酸欠）を含む。脳への血流の減少及び／又は低酸素性脳症は、心停止、ぜんそく、貧血症、溺水、窒息、脳卒中、一酸化炭素中毒、オピオイド過剰摂取、ＣＮＳ抑制薬過剰摂取、てんかん重積状態、窒素性環境への曝露、血餅、アテローム性動脈硬化症、潜水からの上昇、シャローウォーターブラックアウト、無圧客室中の高高度飛行、及び高所での身体運動のうちの１つ以上によって引き起こされ得る。
【0062】
低酸素性脳症又は脳虚血は、動脈血液ガス又はＡＢＧ試験、脳のＭＲＩ検査、脳のコンピュータ断層撮影（ＣＴスキャン）、心エコー検査、心電図検査、脳電図、脳血管撮影、頸動脈デュプレックス、ドップラ超音波検査、磁気共鳴血管造影、皮膚色の検査（薄い皮膚）、唇色の検査（青い唇は低酸素症を示す）、対象における意識消失、対象における正常な呼吸速度（１２～２０呼吸／分）からの低下によって対象に存在すると決定され得る。
【0063】
いくつかの実施形態では、併用投与は、眩暈、悪心又は嘔吐、異常に重度の頭痛、混乱、見当識障害又は記憶喪失、四肢又は顔の麻痺又は衰弱、異常な又は不明瞭な発語、理解困難、視力喪失又は見づらさ、バランス、協調又は歩行能力の喪失、蒼白な皮膚、青い唇、意識消失、ピンポイント瞳孔、散大瞳孔、努力性呼吸、頻脈、徐脈、脈拍の停止、呼吸の停止、安静時心拍数に対する脈拍の低下、及び安静時呼吸数に対する呼吸数の低下からなる群から選択される１つ以上の症状を示すか又は示したことのある対象に対するものである。
【0064】
いくつかの実施形態では、少なくとも２つの治療剤の併用投与は、連続投与を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つの治療剤の併用投与は、同時投与を含む。３つ以上の治療剤の併用投与を含む実施形態では、任意の２つ以上の治療剤が同時に投与され得る一方で、残りの治療剤は、同時に投与される薬剤に対して連続的に投与される。同時投与される薬剤に対して連続的に投与される残りの治療薬のいずれも、それら自体が互いに対して連続的に又は同時に投与され得る。
【0065】
いくつかの実施形態では、併用投与される治療剤のうちの１つ以上の投与は、静脈内、筋肉内、心臓内、皮下、経口、舌下、頬側、鼻腔内、直腸、膣、及び経皮投与を含む。
【0066】
いくつかの実施形態では、併用投与される１つ以上の薬剤の投与は、対象に埋め込まれたポンプを介して行われる。埋め込まれたポンプは、心停止中又は心停止後に治療剤を投与するために、対象のペースメーカーと共に構成されてもよい。
【0067】
いくつかの実施形態では、併用投与は、対象への２つの治療剤の投与を含む。いくつかの実施形態では、併用投与は、対象への３つの治療剤の投与を含む。いくつかの実施形態では、併用投与は、対象への４つの治療剤の投与を含む。いくつかの実施形態では、併用投与は、対象への５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、又は２５個の治療剤の投与を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つの治療剤は、対象に同時に投与され得る。
【0068】
いくつかの実施形態では、ミトコンドリア複合体１阻害剤は、ロテノン、メトホルミン、ブホルミン、フェンホルミン、ガレジン、ｓｙｎｔｈａｌｉｎ Ａ、ピエリシジン、カプサイチン、ロリニアスタチン、スチグマテリン、ムシジン、補酵素Ｑ２、ＪＣＩ－２０６７９、セラストロール、ＡＧ３１１、カルキトキシン、ＢＡＹ８７－２２４３、キサントフモール、ベルコシジン、カナグリフロジン、フェノフィブラート、デグエリン、ＲＴＣ１、ＲＴＢ７０、シクログアニル、プログアニル、アミロライド類（ＥＩＰＡ、ＭＩＡ、及びベンザミル）、殺ダニ剤（フェナザキン、フェンピロキシメート、ピリダベン、及びテブフェンピラド）、ナフュレジン、Ａ－７６９６６２、サリチル酸ブラタシン、ピエリシジン、アセトゲニン、アデノシン二リン酸リボース、類似体１３、ウビシジン３（ubicidin3）、ヒドロキシピリジン類似体３、オチバリン、フェノキサン、チアガゾール、ミキサラミドＰＩ、フェナラミドＡ２、オーラチンＡ、ミキソチアゾール、ＴＤＳ、アウレオチン、コクリオキノンＢ、プテルロン、類似体３７、レイン、パパベリン、ユビキノン２、ユビキノン３、イデベノン、Ｓａｎｄｏｚ ５４７Ａ、ピリダベン、フェンピロキシメート、テブフェンピラド、フェナザキン、ベンズイミダゾール、シハロトリン、６－クロロ－ベンゾチアジアゾール、２Ｍ－ＴＩＯ、アミタール、メプデリン（Ｄｅｍｅｒｏｌ（登録商標））、メペリジン類似体４９、ＭＰＰ＋、デシル－ＭＰＰ＋、ＭＱ１８、２－メチルタルミン、ＴＩＱ、アミノエチルシステインケタミン、ハロペリドール、ＨＰＰ＋、デカリニウム塩化物、シンナリジン、ラノラジン、ｖａｃｏｒ、ノニルフェノール、カテコール、ジニトロフェノール、ＣＣＣＰ、４－ｓ－ブチル類似体、７－クロロ－４－オクチルオキシ類似体、２－ウンデシル－３－メチル類似体、４－ヒドロキシ類似体３７、４’－ヘパチル類似体、エリトロシン５’ヨードアセトアミド、サフラニン、ｄｉＯＣ５（３）（Ｄ－２７２）、ｄｉＯＣ６（３）、ＤＰＩ、ＤＣＣＤ、ｏ－フェナントロリン、及びＭｉｔｏＳＮＯのうちの１つ以上を含む。
【0069】
いくつかの実施形態では、抗酸化剤は、チオール、アスコルビン酸（ビタミンＣ）、グルタチオン、カタラーゼ酵素、スーパーオキシドジスムターゼ酵素、ビタミンＥ及びその誘導体、尿酸、ユビキノン、セレニウム、亜鉛、リポ酸、カロテン、トコフェロール、ユビキノール、ペルオキシレドキシン、没食子酸プロピル（ＰＧ、Ｅ３１０）、三級ブチルヒドロキノン（ＴＢＨＱ）、ブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ、Ｅ３２０）、ブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ、Ｅ３２１）、アリウム硫黄化合物、アントシアニン、β－カロテン、カテキン、銅、クリプトキサンチン、フラボノイド、インドール、イソフラボノイド、リグナン、ルテイン、リコペン、マンガン、ビタミンＡ、動物化学物質、ユビキノール－１０、Ｎ－アセチルシステイン、亜鉛、セレニウム、銅、ケルセチン、ミリセチン、アピゲニン、タキシフォリン、ルテオリン、エピガロカテキン、ヘスペレチン、ナリンゲニン、シニジン（cynidin）、デルフィジン（delphidin）、ゲニスタイン、ダイゼイン、フェルラ酸、コーヒー酸、シナピン酸、ｐ－クマル酸、テアフラビン、テアファビン－３－没食子酸塩（theafavin-3-gallate）、アリシン、ピペリン、クルクミン、アリウム硫黄化合物、ポリフェノール、デフェロキサミンコルチゾン、エストラジオール、エストリオール、メラトニン及びエストロゲンのうちの１つ以上を含む。
【0070】
いくつかの実施形態では、脂質二重層安定剤は、ポロキサマー１８８、ポロキサマー４０７、コリフォールＰ１８８、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ－１２７、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、Ｂｒｉｊ ９３、ポリ（エチレングリコール）－ブロック－ポリ（プロピレングリコール）－ブロック－ポリ（エチレングリコール）（５００～１００Ｄａ、１０００～２０００Ｄａ、２０００～３０００Ｄａ、３０００～４０００Ｄａ、４０００～５０００Ｄａ、５０００～６０００Ｄａ、６０００～７０００Ｄａ、７０００～８０００Ｄａ、８０００～９０００Ｄａ、９０００～１１０００Ｄａ、１１０００～１３０００Ｄａ又は１３０００Ｄａ超から選択される分子量を有する）、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８、Ｆｌｏｃｏｒ及びＲｈｅｏＴｈＲｘ、並びにＳＰＡＮ８０、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）のうちの１つ以上を含む。
【0071】
いくつかの実施形態は、ミトコンドリア膜透過性遷移孔阻害剤は、シクロスポリンＡ、サングリフェリンＡ、ＦＬＯＣＯＲ、ＮＩＭ－８１１、ｋｏｌｌｉｐｈｏｒ（登録商標）Ｐ１８８、ＥＲ－０００４４４７９３、ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８デシルユビキノン（５５４８６－００－５）、ＧＮＸ－４７２８、ＧＮＸ－４９７５、ＡｎｔｉＯｘＢＥＮ３、ＴＲＯ４０３０３及びＴＲＯ１９６２２のうちの１つ以上を含む。
【0072】
いくつかの実施形態では、ミトコンドリア膜保護剤は、ＳＳ－３１を含む。
【0073】
いくつかの実施形態では、チアミン補充剤は、スルブチアミン、チアミン、並びにモダフィニル（Ｐｒｏｖｉｇｉｌ（登録商標））、アンフェタミン（Ａｄｄｅｒａｌｌ（登録商標））、メタアンフェタミン（Ｄｅｓｏｘｙｎ（登録商標））、メチルフェニデート（Ｒｉｔａｌｉｎ（登録商標））、及びメマンチン（Ａｘｕｒａ（登録商標））などの他の向知性薬物を含む。
【0074】
いくつかの実施形態では、ＮＨＥ－１阻害剤は、ゾニポリド、カリポリド、アミロリド、エニポリド、カリポリド、リメポリド、Ｐｈｘ－３（２－アミノフェノキサジン－３－オン）、９ｔ（５－アリール－４－（４－（５－メチル－１Ｈ－イミダゾール－４－イル）ピペリジジン－１－イル（５－ａｒｙｌ－４－（４－（５－ｍｅｔｈｙｌ－１Ｈ－ｉｍｉｄａｚｏｌ－４－ｙｌ）ｐｉｐｅｒｉｄｉｄｎ－１－ｙｌ））、ＢＩＸ ＮＨＥ１阻害剤、ＫＲ－３２５６８、エンパグリフロジン（ＥＭＰＡ）、サビポリド、ダパグリフロジン（ＤＡＰＡ）、カナグリフロジン（ＣＡＮＡ）及びアミロリドのうちの１つ以上を含む。
【0075】
いくつかの実施形態では、以下の治療剤：メトホルミン、Ｎ－アセチルシステイン、ビタミンＣ、エダラボン、ポラキサマー１８８、ＳＳ－３１、ＣｏＱ１０、シクロスポリンＡ、スルブチアミン、及びゾニポリドのうちの１つ以上の有効量は、別個の組成物中で同時に対象に投与される。いくつかの実施形態では、以下の治療剤：メトホルミン、Ｎ－アセチルシステイン、ビタミンＣ、エダラボン、ポラキサマー１８８、ＳＳ－３１、ＣｏＱ１０、シクロスポリンＡ、スルブチアミン、及びゾニポリドのうちの少なくとも２つが、単一の組成物中で一緒に混合され、次いで、単一又は複数の組成物として投与される。
【0076】
いくつかの実施形態では、併用投与は、以下の治療剤：メトホルミン、Ｎ－アセチルシステイン、ビタミンＣ、エダラボン、ポラキサマー１８８、ＳＳ－３１、ＣｏＱ１０、シクロスポリンＡ、スルブチアミン、及びゾニポリドの各々の有効量を混合することによって調製される又は得られる薬学的組成物を対象に投与することを含み得る。
【0077】
いくつかの実施形態では、併用投与される任意の治療剤の有効量は、対象質量１ｋｇ当たりのミリグラムで、
メトホルミン： 約８０ｍｇ／ｋｇ～約１２０ｍｇ／ｋｇ；
Ｎ－アセチルシステイン： 約１２０ｍｇ／ｋｇ～約１８０ｍｇ／ｋｇ；
ポロキサマー１８８： 約１２０ｍｇ／ｋｇ～約１８０ｍｇ／ｋｇ；
ＣｏＱ１０： 約２４ｍｇ／ｋｇ～約３６ｍｇ／ｋｇ；
シクロスポリンＡ： 約８ｍｇ／ｋｇ～約１２ｍｇ／ｋｇ；
エダラボン： 約２．４ｍｇ／ｋｇ～約３．６ｍｇ／ｋｇ；
ＳＳ－３１： 約０．４ｍｇ／ｋｇ～約０．６ｍｇ／ｋｇ；
スルブチアミン： 約１０ｍｇ／ｋｇ～約１５ｍｇ／ｋｇ；
ビタミンＣ： 約８０ｍｇ／ｋｇ～約１２０ｍｇ／ｋｇ；及び
ゾニポリド： 約２．４ｍｇ／ｋｇ～約３．６ｍｇ／ｋｇ
から選択される。
メトホルミン： 約８０ｍｇ／ｋｇ～約１２０ｍｇ／ｋｇ；
Ｎ－アセチルシステイン： 約１２０ｍｇ／ｋｇ～約１８０ｍｇ／ｋｇ；
ポロキサマー１８８： 約１２０ｍｇ／ｋｇ～約１８０ｍｇ／ｋｇ；
ＣｏＱ１０： 約２４ｍｇ／ｋｇ～約３６ｍｇ／ｋｇ；
シクロスポリンＡ： 約８ｍｇ／ｋｇ～約１２ｍｇ／ｋｇ；
エダラボン： 約２．４ｍｇ／ｋｇ～約３．６ｍｇ／ｋｇ；
ＳＳ－３１： 約０．４ｍｇ／ｋｇ～約０．６ｍｇ／ｋｇ；
スルブチアミン： 約１０ｍｇ／ｋｇ～約１５ｍｇ／ｋｇ；
ビタミンＣ： 約８０ｍｇ／ｋｇ～約１２０ｍｇ／ｋｇ；及び
ゾニポリド： 約２．４ｍｇ／ｋｇ～約３．６ｍｇ／ｋｇ
から選択される。
【0078】
いくつかの実施形態では、併用投与される任意の治療剤の有効量は、対象質量１ｋｇ当たりのミリグラムで、
メトホルミン： 約１００ｍｇ／ｋｇ；
Ｎ－アセチルシステイン： 約１５０ｍｇ／ｋｇ；
ポロキサマー１８８： 約１５０ｍｇ／ｋｇ；
ＣｏＱ１０： 約３０ｍｇ／ｋｇ；
シクロスポリンＡ： 約１０ｍｇ／ｋｇ；
エダラボン： 約３ｍｇ／ｋｇ；
ＳＳ－３１： 約０．５ｍｇ／ｋｇ；
スルブチアミン： 約１２．５ｍｇ／ｋｇ；
ビタミンＣ： 約１００ｍｇ／ｋｇ；及び
ゾニポリド： 約３ｍｇ／ｋｇ
から選択される。
メトホルミン： 約１００ｍｇ／ｋｇ；
Ｎ－アセチルシステイン： 約１５０ｍｇ／ｋｇ；
ポロキサマー１８８： 約１５０ｍｇ／ｋｇ；
ＣｏＱ１０： 約３０ｍｇ／ｋｇ；
シクロスポリンＡ： 約１０ｍｇ／ｋｇ；
エダラボン： 約３ｍｇ／ｋｇ；
ＳＳ－３１： 約０．５ｍｇ／ｋｇ；
スルブチアミン： 約１２．５ｍｇ／ｋｇ；
ビタミンＣ： 約１００ｍｇ／ｋｇ；及び
ゾニポリド： 約３ｍｇ／ｋｇ
から選択される。
【0079】
脳虚血は、びまん性低酸素性脳症（ＤＣＨ）、限局性脳虚血、脳梗塞、虚血再灌流、鎌状赤血球貧血症、アテローム性動脈硬化症、血管圧迫、心室頻脈、血餅、低血圧、心停止、先天性心疾患、心臓伝導障害、全脳虚血、ぜんそく、貧血症、溺水、窒息、脳卒中、一酸化炭素中毒、オピオイド過剰摂取、ＣＮＳ抑制薬過剰摂取、てんかん重積状態、窒素性環境への曝露、潜水からの上昇、シャローウォーターブラックアウト、無圧客室中の高高度飛行、及び高所での身体運動から選択される状態によって引き起こされ得るか、それらを含み得るか、又はそれらをもたらし得る。
【0080】
いくつかの実施形態では、脳虚血は、対象における心停止、脳卒中、オピオイド過剰摂取、ＣＮＳ抑制薬過剰摂取、喘息発作、又は意識喪失によって引き起こされる。対象への治療剤の併用投与は、心停止、脳卒中、オピオイド過剰摂取、ＣＮＳ抑制薬過剰摂取、喘息発作、又は意識消失の開始後、約３０秒間、約１分間、約２分間、約３分間、約４分間、約５分間、約１０分間、約１５分間、約２０分間、約２５分間、約３０分間、約３５分間、約４０分間、約４５分間、約５０分間、約５５分間、約６０分間、約６５分間、約７０分間、約７５分間、約８０分間、約８５分間、又は約９０分間であり得る。
【0081】
治療剤の併用投与は、脳虚血の存在に先行してもよい。いくつかの実施形態では、対象は、脳虚血のリスクがあり、併用投与は、１日４回、１日３回、１日２回、毎日、１日おき、週３回、週１回、又はこれらの組み合わせで行われる。併用投与は、１日～約１週間、約１週間～約２週間、約２週間～約４週間、約４週間～約２ヵ月、約２ヵ月～約６ヵ月、約６ヵ月～約１年、又は約１年超継続してもよい。
【0082】
薬学的組成物
別の態様では、脳虚血に罹患しているか、罹患したことがあるか、又は罹患するリスクがある対象の脳に神経保護を提供するための医薬製剤が提供される。組成物は、ミトコンドリア複合体－１阻害剤、抗酸化剤、脂質二重層安定剤、ミトコンドリア膜透過性遷移孔阻害剤、ミトコンドリア膜保護剤、チアミン補充剤、及びＮＨＥ－１阻害剤からなる群から選択される少なくとも２つの治療剤の有効量を含み得る。組成物は、以下の治療剤：メトホルミン、Ｎ－アセチルシステイン、ビタミンＣ、エダラボン、ポラキサマー１８８、ＳＳ－３１、ＣｏＱ１０、シクロスポリンＡ、スルブチアミン、及びゾニポリド、又はそれらのいずれかの薬学的に許容される塩のうちの１つ以上を含み得る。
別の態様では、脳虚血に罹患しているか、罹患したことがあるか、又は罹患するリスクがある対象の脳に神経保護を提供するための医薬製剤が提供される。組成物は、ミトコンドリア複合体－１阻害剤、抗酸化剤、脂質二重層安定剤、ミトコンドリア膜透過性遷移孔阻害剤、ミトコンドリア膜保護剤、チアミン補充剤、及びＮＨＥ－１阻害剤からなる群から選択される少なくとも２つの治療剤の有効量を含み得る。組成物は、以下の治療剤：メトホルミン、Ｎ－アセチルシステイン、ビタミンＣ、エダラボン、ポラキサマー１８８、ＳＳ－３１、ＣｏＱ１０、シクロスポリンＡ、スルブチアミン、及びゾニポリド、又はそれらのいずれかの薬学的に許容される塩のうちの１つ以上を含み得る。
【0083】
いくつかの実施形態では、治療剤は、製剤中に
メトホルミン：Ｎアセチルシステイン：ポロキサマー１８８：コエンザイムＱ１０（ＣｏＱ１０）：シクロスポリンＡ：エダラボン：エラミプレチド（ＳＳ－３１）：スルブチアミン：ビタミンＣ：ゾニポリド
の質量比、
約８０～約１２０（メトホルミン）：約１２０～約１８０（ＮＡＣ）：約１２０～約１８０（ポロキサマー１８８）：約２４～約３６（ＣｏＱ１０）：約８～約１２（サイクロスポリンＡ）：約２．４～約３．６（エダラボン）：約０．４～約０．６（ＳＳ－３１）：約１０～約１５（スルブチアミン）：約８０～約１２０（ビタミンＣ）：約２．４～約３．６（ゾニポリド）で存在し、
任意の１つ以上の薬剤が存在しなくてもよい。例えば、メトホルミンが存在しない組成物は、
Ｎ－アセチルシステイン：ポロキサマー１８８：コエンザイムＱ１０（ＣｏＱ１０）：シクロスポリンＡ：エダラボン：エラミプレチド（ＳＳ－３１）：スルブチアミン：ビタミンＣ：ゾニポリド
の質量比、
約１２０～約１８０：約１２０～約１８０：約２４～約３６：約８～約１２：約２．４～約３．６：約０．４～約０．６：約１０～約１５：約８０～約１２０：約２．４～約３．６を含む。
メトホルミン：Ｎアセチルシステイン：ポロキサマー１８８：コエンザイムＱ１０（ＣｏＱ１０）：シクロスポリンＡ：エダラボン：エラミプレチド（ＳＳ－３１）：スルブチアミン：ビタミンＣ：ゾニポリド
の質量比、
約８０～約１２０（メトホルミン）：約１２０～約１８０（ＮＡＣ）：約１２０～約１８０（ポロキサマー１８８）：約２４～約３６（ＣｏＱ１０）：約８～約１２（サイクロスポリンＡ）：約２．４～約３．６（エダラボン）：約０．４～約０．６（ＳＳ－３１）：約１０～約１５（スルブチアミン）：約８０～約１２０（ビタミンＣ）：約２．４～約３．６（ゾニポリド）で存在し、
任意の１つ以上の薬剤が存在しなくてもよい。例えば、メトホルミンが存在しない組成物は、
Ｎ－アセチルシステイン：ポロキサマー１８８：コエンザイムＱ１０（ＣｏＱ１０）：シクロスポリンＡ：エダラボン：エラミプレチド（ＳＳ－３１）：スルブチアミン：ビタミンＣ：ゾニポリド
の質量比、
約１２０～約１８０：約１２０～約１８０：約２４～約３６：約８～約１２：約２．４～約３．６：約０．４～約０．６：約１０～約１５：約８０～約１２０：約２．４～約３．６を含む。
【0084】
いくつかの実施形態では、治療剤は、製剤中に
メトホルミン：Ｎアセチルシステイン：ポロキサマー１８８：コエンザイムＱ１０（ＣｏＱ１０）：シクロスポリンＡ：エダラボン：エラミプレチド（ＳＳ－３１）：スルブチアミン：ビタミンＣ：ゾニポリド
の質量比、
約１００：約１５０：約１５０：約３０：約１０：約３：約０．５：約１２．５：約１００：約３で存在し、
任意の１つ以上の薬剤が存在しなくてもよい。
メトホルミン：Ｎアセチルシステイン：ポロキサマー１８８：コエンザイムＱ１０（ＣｏＱ１０）：シクロスポリンＡ：エダラボン：エラミプレチド（ＳＳ－３１）：スルブチアミン：ビタミンＣ：ゾニポリド
の質量比、
約１００：約１５０：約１５０：約３０：約１０：約３：約０．５：約１２．５：約１００：約３で存在し、
任意の１つ以上の薬剤が存在しなくてもよい。
【0085】
いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、治療剤のいずれか１つ以上について、以下の量：
メトホルミン： 約５．６ｇ～約８．４ｇ；
Ｎ－アセチルシステイン： 約８．４ｇ～約１２．６ｇ；
ポロキサマー１８８： 約８．４ｇ～約１２．６ｇ；
ＣｏＱ１０： 約１．６８ｇ～約２．５２ｇ；
シクロスポリンＡ： 約５６０ｍｇ～約８４０ｍｇ；
エダラボン： 約１６８ｍｇ～約２５２ｍｇ；
ＳＳ－３１： 約２８ｍｇ～約４２ｍｇ；
スルブチアミン： 約７００ｍｇ～約１０５０ｍｇ；
ビタミンＣ： 約５．６ｇ～約８．４ｇ；及び
ゾニポリド： 約１６８ｍｇ～約２５２ｍｇ
のいずれかを含む。
メトホルミン： 約５．６ｇ～約８．４ｇ；
Ｎ－アセチルシステイン： 約８．４ｇ～約１２．６ｇ；
ポロキサマー１８８： 約８．４ｇ～約１２．６ｇ；
ＣｏＱ１０： 約１．６８ｇ～約２．５２ｇ；
シクロスポリンＡ： 約５６０ｍｇ～約８４０ｍｇ；
エダラボン： 約１６８ｍｇ～約２５２ｍｇ；
ＳＳ－３１： 約２８ｍｇ～約４２ｍｇ；
スルブチアミン： 約７００ｍｇ～約１０５０ｍｇ；
ビタミンＣ： 約５．６ｇ～約８．４ｇ；及び
ゾニポリド： 約１６８ｍｇ～約２５２ｍｇ
のいずれかを含む。
【0086】
いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、治療剤のいずれか１つ以上について、以下の量：
メトホルミン： 約７ｇ；
Ｎ－アセチルシステイン： 約１０．５ｇ；
ポロキサマー１８８： 約１０．５ｇ；
ＣｏＱ１０： 約２．１ｇ；
シクロスポリンＡ： 約７００ｍｇ；
エダラボン： 約２１０ｍｇ；
ＳＳ－３１： 約３５ｍｇ；
スルブチアミン： 約８７５ｍｇ；
ビタミンＣ： 約７ｇ；及び
ゾニポリド： 約２１０ｍｇ
のいずれかを含む。
メトホルミン： 約７ｇ；
Ｎ－アセチルシステイン： 約１０．５ｇ；
ポロキサマー１８８： 約１０．５ｇ；
ＣｏＱ１０： 約２．１ｇ；
シクロスポリンＡ： 約７００ｍｇ；
エダラボン： 約２１０ｍｇ；
ＳＳ－３１： 約３５ｍｇ；
スルブチアミン： 約８７５ｍｇ；
ビタミンＣ： 約７ｇ；及び
ゾニポリド： 約２１０ｍｇ
のいずれかを含む。
【0087】
治療剤は、任意の順序で、又は更には同時に併用投与されてもよい。複数の治療剤は、単一の統一された形態で、又は複数の形態で（ほんの一例として、単一の丸剤又は２つの別個の丸剤のいずれかとして）提供され得る。治療剤の一方を複数回投与で与えてもよく、又は両方を複数回投与として与えてもよい。同時でない場合、複数回投与間のタイミングは、０週超から４週未満まで変動し得る。加えて、組成物及び製剤は、２つの薬剤のみの使用に限定されない。
【0088】
本技術の薬学的組成物は、希釈剤、崩壊剤、甘味剤、流動促進剤、又は香味剤などの薬学的に許容される担体を含んでもよく、錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、懸濁剤、乳剤、若しくはシロップ剤などの経口剤形、又は外用液剤、外用懸濁剤、外用乳剤、ゲル剤（軟膏剤など）、吸入剤、噴霧剤、注射剤などの非経口剤形に製剤化されてもよい。該剤形は、様々な形態、例えば、単回投与用又は複数回投与用の剤形に製剤化されてもよい。
【0089】
いくつかの実施形態では、担体は、ポリオキシエタニル－α－トコフェリルセバケート（polyoxyethanyl-α-tocopheryl sebacate、ＰＴＳ）、リン酸緩衝生理食塩水（phosphate buffered saline、ＰＢＳ）、エタノール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、及び（ウシ血清アルブミン、ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ）ＢＳＡのうちの１つ以上を含む。
【0090】
本技術の薬学的組成物は、ラクトース、コーンスターチなどの賦形剤、ステアリン酸マグネシウムなどの流動促進剤、乳化剤、懸濁化剤、安定化剤、等張化剤などを含んでもよい。所望であれば、甘味剤及び／又は香味剤を添加してもよい。例示的な賦形剤としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、硬化ヒマシ油（hydrogenated castor oil、ＨＣＯ）、クレモホール、炭水化物、デンプン（例えば、トウモロコシデンプン）、無機塩、抗菌剤、抗酸化剤、結合剤／充填剤、界面活性剤、滑沢剤（例えば、ステアリン酸カルシウム又はステアリン酸マグネシウム）、タルクなどの流動促進剤、崩壊剤、希釈剤、緩衝剤、酸、塩基、フィルムコート、これらの組み合わせなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【0091】
具体的な炭水化物賦形剤としては、例えば、フルクトース、マルトース、ガラクトース、グルコース、Ｄ－マンノース、ソルボースなどの単糖類；ラクトース、スクロース、トレハロース、セロビオースなどの二糖類；ラフィノース、メレジトース、マルトデキストリン、デキストラン、デンプンなどの多糖類；及びマンニトール、キシリトール、マルチトール、ラクチトール、キシリトール、ソルビトール（グルシトール）、ピラノシルソルビトール、ミオイノシトールなどのアルジトールが挙げられる。
【0092】
無機塩又は緩衝剤としては、クエン酸、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸ナトリウム、硝酸カリウム、リン酸一ナトリウム、リン酸二ナトリウム、及びこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【0093】
本開示における使用に好適な抗酸化剤としては、例えば、パルミチン酸アスコルビル、ブチルヒドロキシアニソール、ブチルヒドロキシトルエン、次亜リン酸、モノチオグリセロール、没食子酸プロピル、亜硫酸水素ナトリウム、ホルムアルデヒドスルホキシル酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、及びこれらの組み合わせが挙げられる。
【0094】
更なる例示的な賦形剤としては、ポリソルベート、例えば、「Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０」及び「Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０」などの界面活性剤、並びにＦ６８及びＦ８８などのｐｌｕｒｏｎｉｃ（これらは両方ともＢＡＳＦ，Ｍｏｕｎｔ Ｏｌｉｖｅ，Ｎ．Ｊ．から入手可能である）、ソルビタンエステル、脂質（例えば、レシチン及び他のホスファチジルコリンなどのリン脂質、並びにホスファチジルエタノールアミン）、脂肪酸及び脂肪エステル、コレステロールなどのステロイド、並びにＥＤＴＡなどのキレート剤、亜鉛及び他のそのような好適なカチオンが挙げられる。
【0095】
更に、本明細書に開示される組成物は、１つ以上の酸又は塩基を任意選択的に含んでもよい。使用することができる酸の非限定的な例としては、塩酸、酢酸、リン酸、クエン酸、リンゴ酸、乳酸、ギ酸、トリクロロ酢酸、硝酸、過塩素酸、リン酸、硫酸、フマル酸、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される酸が挙げられる。好適な塩基の非限定的な例としては、水酸化ナトリウム、酢酸ナトリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カリウム、酢酸アンモニウム、酢酸カリウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、クエン酸ナトリウム、ギ酸ナトリウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、フマル酸カリウム、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される塩基が挙げられる。
【0096】
組成物中の任意の個々の賦形剤の量は、賦形剤の役割、活性薬剤成分の用量要件、及び組成物の特定の必要性に応じて変化する。
【0097】
しかしながら、一般的に、賦形剤は、約１重量％～約９９重量％、好ましくは約５重量％～約９８重量％、より好ましくは約１５重量％～約９５重量％の賦形剤の量で組成物中に存在する。一般に、本開示の組成物に存在する賦形剤の量は、以下の、少なくとも約２重量％、５重量％、１０重量％、１５重量％、２０重量％、２５重量％、３０重量％、３５重量％、４０重量％、４５重量％、５０重量％、５５重量％、６０重量％、６５重量％、７０重量％、７５重量％、８０重量％、８５重量％、９０重量％、又は更には９５重量％から選択される。
【0098】
本技術の組成物は、経口的に、又は吸入、静脈内、腹腔内、皮下、直腸及び局所投与経路を含む非経口的に投与することができる。したがって、本技術の組成物は、錠剤、カプセル、水溶液、懸濁液などの様々な形態に製剤化することができる。経口投与のための錠剤の場合、ラクトース、コーンスターチ、及びステアリン酸マグネシウムを例とする滑沢剤、などの担体を、従来通りにそれに添加することができる。経口投与用カプセルの場合、ラクトース及び／又は乾燥コーンスターチを希釈剤として使用することができる。経口投与のために水性懸濁液が必要とされる場合、活性成分を乳化剤及び／又は懸濁化剤と組み合わせることができる。所望であれば、特定の甘味剤及び／又は香味剤をそれに添加することができる。筋肉内、腹腔内、皮下及び静脈内投与のために、活性成分の滅菌溶液が通常調製され、溶液のｐＨは適切に調整され、緩衝化されるべきである。静脈内投与の場合、溶質の総濃度は、調製物を等張性にするために制御されるべきである。本技術の組成物は、薬学的に許容される担体を含有する水溶液、例えば、７．４のｐＨレベルを有する生理食塩水の形態であってもよい。溶液は、局所急速注射によって患者の筋肉内血流に導入することができる。
【0099】
製造方法
別の態様では、脳虚血に罹患しているか、罹患したことがあるか、又は罹患するリスクがある対象の脳に神経保護を提供するための薬学的組成物を調製する方法が提供される。治療剤は、本発明の組成物を製剤化する目的のために、疎水性又は親水性として分類され得る。当業者は、極性及び水又は有機溶媒との混和性などの特性に基づいて、化合物の疎水性及び親水性を容易に決定することができる。
別の態様では、脳虚血に罹患しているか、罹患したことがあるか、又は罹患するリスクがある対象の脳に神経保護を提供するための薬学的組成物を調製する方法が提供される。治療剤は、本発明の組成物を製剤化する目的のために、疎水性又は親水性として分類され得る。当業者は、極性及び水又は有機溶媒との混和性などの特性に基づいて、化合物の疎水性及び親水性を容易に決定することができる。
【0100】
いくつかの実施形態では、本方法は、
ａ）１つ以上の疎水性治療剤を含む第１の混合物と、
ｂ）１つ以上の親水性治療剤を含む第２の混合物と、
を混合して第３の混合物を形成することを含む。
ａ）１つ以上の疎水性治療剤を含む第１の混合物と、
ｂ）１つ以上の親水性治療剤を含む第２の混合物と、
を混合して第３の混合物を形成することを含む。
【0101】
第１の混合物は、本明細書に記載される１つ以上の疎水性担体、及び任意選択的に緩衝剤を更に含んでもよい。第２の混合物は、本明細書に記載される１つ以上の親水性担体、並びに任意選択的に緩衝剤及び／又は有機溶媒を更に含んでもよい。
【0102】
いくつかの実施形態では、本方法は、第３の混合物と、１つ以上の治療剤を含む第４の混合物とを混合して、最終組成物に更に加工され得る組成物を形成することを更に含む。
【0103】
別の実施形態では、本方法は
ａ）ＣｏＱ１０及びシクロスポリンＡを含む第１の混合物と、
ｂ）メトホルミン、Ｎ－アセチルシステイン、ポラキサマー－１８８、エダラボン、ＳＳ－３１、ビタミンＣ、及びゾニポリドを含む第２の混合物と、
を混合して第３の混合物を形成することを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、第３の混合物と、スルブチアミンを含む第４の混合物とを混合することを更に含む。いくつかの実施形態では、第１の混合物は、ポリオキシエタニル－α－トコフェリルセバケート（ＰＴＳ）及びウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を更に含む。いくつかの実施形態では、第１の混合物は、緩衝液、例えば、ＰＢＳを更に含む。
ａ）ＣｏＱ１０及びシクロスポリンＡを含む第１の混合物と、
ｂ）メトホルミン、Ｎ－アセチルシステイン、ポラキサマー－１８８、エダラボン、ＳＳ－３１、ビタミンＣ、及びゾニポリドを含む第２の混合物と、
を混合して第３の混合物を形成することを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、第３の混合物と、スルブチアミンを含む第４の混合物とを混合することを更に含む。いくつかの実施形態では、第１の混合物は、ポリオキシエタニル－α－トコフェリルセバケート（ＰＴＳ）及びウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を更に含む。いくつかの実施形態では、第１の混合物は、緩衝液、例えば、ＰＢＳを更に含む。
【0104】
いくつかの実施形態では、第１の混合物は、
ｉ）ＣｏＱ１０及びＰＴＳを含む混合物と、
ｉｉ）シクロスポリンＡ及びＢＳＡを含む混合物と、
を混合することによって、形成される。
いくつかの実施形態では、ｉ）の混合物及びｉｉ）の混合物は、各々、緩衝液、例えば、ＰＢＳを更に含む。いくつかの実施形態では、第４の混合物は、Ｃ１～Ｃ６アルコール及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を更に含む。
ｉ）ＣｏＱ１０及びＰＴＳを含む混合物と、
ｉｉ）シクロスポリンＡ及びＢＳＡを含む混合物と、
を混合することによって、形成される。
いくつかの実施形態では、ｉ）の混合物及びｉｉ）の混合物は、各々、緩衝液、例えば、ＰＢＳを更に含む。いくつかの実施形態では、第４の混合物は、Ｃ１～Ｃ６アルコール及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を更に含む。
【0105】
本明細書に記載される実施形態は、決して限定されるものではないが、以下の実施例によって更に例示される。
【実施例】
【0106】
実施例１：ラットにおける心停止後の改善された神経学的回復
概要：本出願人は、１２分間の心停止を受けたＳｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙラット（４００～５００ｇｍ）において、本発明による医薬製剤（「カクテル」とも呼ばれる）の二重盲検無作為化比較試験を行った。ラットを、自己心拍再開（ＲＯＳＣ）直後にカクテル又は対照薬物を受けるように無作為に割り当てた。薬物注入は、注入ポンプを用いて２０分間にわたって行った。動物を人工呼吸器で２時間維持し、この間、平均動脈圧（ＭＡＰ）、心拍数（ＨＲ）、動脈血ガス分析（ＡＢＧ）及びグルコース測定を行った。ラットの体温は、実験を通して３７±０．５℃の間に維持した。ＲＯＳＣの２時間後、動物を抜管し、カニューレを除去し、縫合し、動物施設に戻した。評価した結果には、ＲＯＳＣの７２時間後の生存、並びにＲＯＳＣの２４時間後、４８時間後及び７２時間後の神経学的結果が含まれた。
概要：本出願人は、１２分間の心停止を受けたＳｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙラット（４００～５００ｇｍ）において、本発明による医薬製剤（「カクテル」とも呼ばれる）の二重盲検無作為化比較試験を行った。ラットを、自己心拍再開（ＲＯＳＣ）直後にカクテル又は対照薬物を受けるように無作為に割り当てた。薬物注入は、注入ポンプを用いて２０分間にわたって行った。動物を人工呼吸器で２時間維持し、この間、平均動脈圧（ＭＡＰ）、心拍数（ＨＲ）、動脈血ガス分析（ＡＢＧ）及びグルコース測定を行った。ラットの体温は、実験を通して３７±０．５℃の間に維持した。ＲＯＳＣの２時間後、動物を抜管し、カニューレを除去し、縫合し、動物施設に戻した。評価した結果には、ＲＯＳＣの７２時間後の生存、並びにＲＯＳＣの２４時間後、４８時間後及び７２時間後の神経学的結果が含まれた。
【0107】
材料及び方法：全ての実験は、動物実験委員会（Institutional Animal Care and Use Committee、ＩＡＣＵＣ）ガイドラインの承認に従って実施した。成体雄Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙラット（４００～５００ｇｍ）をＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）から入手し、水及び食物に自由にアクセスできる１２時間の明／暗サイクルで動物センターに収容した。１４匹のラットを対照（ビヒクル注射）に使用し、１４匹のラットをカクテル注射（実験）群に使用し、合計２８匹のラットとした。カクテルをラットに投与し、カクテル中の各化合物（薬物とも呼ばれる）の投与量は、以下の表１に記載される通りである。
【表1】
【0108】
以下のようにラットに心停止を誘導した。ラットに麻酔をかけ、２％イソフルラン下で人工呼吸器にかけた。左大腿動脈及び左大腿静脈にポリエチレンカテーテルをカニューレ挿入して、それぞれ動脈圧及び薬物注入を測定し、創傷を縫合した。外科的準備及びヘパリン（３００ＩＵ）注射の後、ＭＡＰを正常化するために動物を飼育した。ＣＡの手順は、ベクロニウム臭化物（２ｍｇ／ｋｇ体重）を左大腿静脈から４分かけてゆっくりと注射することから開始した。窒息性ＣＡは、人工呼吸器のスイッチを切り、続いてイソフルランを中止することによって誘導した。２０ｍｍＨｇ未満の平均動脈圧をＣＡと定義し、これは通常、窒息の開始後約３分以内に観察された。１２分間の窒息後、１００％酸素下で換気及び胸部圧迫を再開して蘇生を開始した。ＣＰＲの開始から２０秒後に、エピネフリンの２０μｇ／ｋｇ急速注射を静脈カテーテルを介して投与した。動物が６０ｍｍＨｇを超える収縮期血圧として定義されるＲＯＳＣに達するまで、胸骨圧迫を継続した。ＲＯＳＣがＣＰＲの開始から５分以内に起こらなかった場合、動物は試験に含めなかった。
【0109】
１２分間の心停止（ＣＡ）を誘導した後、動物を胸部圧迫によって蘇生させ、一度、自己心拍再開（ＲＯＳＣ）が達成されたら、対照（ビヒクル）又はカクテルのいずれかを、注入ポンプを用いて２０分間にわたって静脈内（ｉ．ｖ．）投与した。各動物の体温は、実験を通して１２０分間（３６．５～３７．５）の間に維持した。動物の血行動態（平均動脈圧、心拍数、気管内ＣＯ２）を実験全体を通してモニターした。平均動脈圧、心拍数、ＥＴＣＯ２の外科的準備ベースライン記録を行った後に血行動態を記録し、これをＣＡ中並びにＲＯＳＣ後の２時間にわたって継続した。ＡＤＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，ＵＳＡを用いて血行動態パラメータを記録した。動脈血ガス分析（Arterial blood gas analysis、ＡＢＧ）を行って、ｐＨ、ｐＯ２、ｐＣＯ２、ＨＣＯ３、ＴｃＯ２、乳酸及び酸素の飽和度を調べて、動物の正常な生理状態を維持及びモニターした。血液採取は、ベースライン時、ＲＯＳＣ時、ＲＯＳＣの２０分後、ＲＯＳＣの４０分後、及びＲＯＳＣの２時間後で行った。次いで、血液試料を１６００ｒｃｆで１０分間遠心分離して血漿を分離し、収集した血漿を更なる生化学分析に使用した。動脈血ガス（ＡＢＧ）分析のために、ｐＨ、ｐＣＯ２、ｐＯ２、ＨＣＯ３、乳酸及び酸素飽和度を、ベースライン時、ＲＯＳＣの２０分後及びＲＯＳＣの４０分後で測定した。ｐＨ、ｐＣＯ２及びｐＯ２レベルが、ＲＯＳＣの４０分後経過しても正常範囲内にない場合、ＲＯＳＣの６０分後のＡＢＧを測定した。
【0110】
グルコース測定は、ベースライン時、ＲＯＳＣ時、ＲＯＳＣの２０分後、４０分後及び１２０分後で行った。ＲＯＳＣの２時間後、動物を抜管し、カニューレを除去し、縫合し、次いで生理食塩水注入及びｂｕｒｐｏｎｅｘ皮下注射を含む術後ケアを提供した後、動物を動物収容施設に戻した。全ての実験動物に、手作業での給餌（自力で食べることができない場合）、有意なレベルの生理食塩水及びデキストロース注入（飲むことができない場合）、温度維持（加熱パッド及びランプを提供することによる）、並びに疼痛緩和薬物注射を含む毎日のケアを提供した。動物の長期（７２時間）生存をモニターした。Ｎｅｕｍａｒ ｅｔ ａｌ．，１９９５に従って、対照処置群及びカクテル処置群における神経学的回復を観察するために、実験的に盲検化されたヒトによって、蘇生の２４時間後、４８時間後及び７２時間後にｍＮＤＳ値を記録した（１５）。７２時間の生存及びｍＮＤＳ記録の後、動物を安楽死させ、神経変性の組織学的分析のために全脳切片を取り出した。実験中に行った血液採取を生化学分析に使用した。
【0111】
二重盲検試験のための動物無作為化：合計４回の実験を１日で実施した。動物を試験のために無作為化し、実験条件を盲検化されているヒトが動物のためのコードを作成した。実験当日、カクテル薬物をビヒクルと共に別々に調製した。カクテル及びビヒクルにコードを割り当て（動物のコード生成に関与するヒトによって）、手術を行う外科医に転送した。外科医は、薬物に対して盲検化され、どの動物がカクテル又はビヒクルを受けるかについての知識に対しても盲検化された。手術及び１２分間の窒息の誘導後、カクテル及びビヒクルを調製したヒトによって蘇生を行った。生成されたコードに応じて、自己心拍再開（ＲＯＳＣ）後にカクテル又は対照薬物を注射した。ＲＯＳＣ後２時間の換気に続いて、動物は術後ケアを受け、動物収容室に移された。カクテル二重盲検試験の詳細な図式表示を図２に示し、図１は実験の時間経過を詳述する。
【0112】
試験の盲検解除：各外科医は、ラットに注射された薬物コードを用いて実施した実験の記録を追跡した。全ての実験が完了した後、外科医は、実施した実験のリストを示すように求められ、これを生成された薬物コードと一致させて試験を盲検解除した。
【0113】
神経学的欠損分析：神経学的欠損スコア（ＮＤＳ）の記録を、蘇生の２４時間後、４８時間後及び７２時間後に行った。神経学的転帰をチェックするために、本出願人は、Ｎｅｕｍａｒ ｅｔ ａｌ．，１９９５（１５）によって述べられた行動試験に従って記録されたＮＤＳを、以下の表２に集計されるように修正した。前述のＮＤＳスコアリングシステムでは、呼吸のスコアリングは、０又は１００のいずれかであり、したがって、本出願人は、正常な呼吸（１分当たり６０～１２０回の呼吸）については１００に、１２０～１４０回の呼吸については５０に、これらの２つのカテゴリに該当しない呼吸パターンについては０に変更した。蘇生の２４時間後、４８時間後及び７２時間後にＮＤＳ値をモニターした（ＮＤＳ、０－５００；０、脳死；５００、正常）。
【表2】
【0114】
生化学的分析：Ｓ１００Ｂ、ＮＳＥ及び８－ヒドロキシ－２’－デオキシグアノシン（８－ＯＨｄＧ）のような生化学的アッセイのために、異なる時間間隔で採取した血液試料を使用した。本出願人はまた、抗炎症マーカーを測定して、異なる間隔でそれらの変化をチェックした。
【0115】
組織像及び染色：７２時間の生存期間の完了後、動物をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、１×、ｐＨ＝７．４）で心臓を灌流した。全脳組織を取り出し、４％ＰＦＡに移した。スクロース溶液で更に処理した後、Ｎｉｓｓｌ染色及びＴＵＮＥＬ染色のために、冠状脳切片をガラススライド上に採取した。ＴＵＮＥＬ染色は、ＡＢＣＡＭ－ＴＵＮＥＬ染色キットを使用して行った。
【0116】
統計：連続変数についてのデータは、平均値の標準誤差（standard error of the mean、ＳＥＭ）を伴う平均値として提示される。カテゴリデータは、頻度と共にカウントとして提示される。対応のない両側スチューデントｔ検定又はマン－ホイットニーＵ検定を使用して、連続変数について、適宜、２つの独立した群を比較した。正規分布データ及び非正規分布データの事後比較のそれぞれのために、一元配置又は二元配置分散分析（analysis of variance、ＡＮＯＶＡ）、続いて事後比較のためのＳｉｄａｋ補正、及びクラスカル・ウォリス検定、続いてＤｕｎｎ多重比較を使用した。カプラン－マイヤー法を用いて生存率を推定し、ログランク検定を用いて群間の生存曲線を比較した。予備データに基づいて、ＣＡ後７２時間での平均生存率は、ビヒクル処置ラットで２５％、カクテル処置ラットで８５％と予想されたので、本発明者らは、各生存試験において群当たり１４匹のラットが必要であると予想した（α＝０．０５、β＝０．２［検出力＝８０％］、両側）。有意性は、Ｐ＜０．０５のレベルで考慮した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ７．０（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ，ＵＳＡ）及びＳＰＳＳ ２３．０（ＳＰＳＳ Ｉｎｃ．，Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ，ＵＳＡ）を統計分析に使用した。
【0117】
結果：カクテル薬は、１２分のＣＡ及び蘇生の７２時間後に生存率を改善した。ＲＯＳＣは２８匹のラット全てにおいて達成された。実験薬物を受けた全てのラットを、この試験において分析した。ビヒクル又はカクテル薬で処置したラットの間で、ベースラインにおける体重、血行動態又は血液ガスに有意差はなかった（表３及び４）。ＣＡは窒息の開始後２００秒未満で起こり、群間で有意差はなく、群間でＲＯＳＣまでのＣＰＲ時間の有意差は観察されなかった（表３）。ＲＯＳＣ後の最初の４０分間、両方の群は、ｐＨ、二酸化炭素の分圧（ｐＣＯ２）、及びＨＣＯ３において有意差を示さなかった。予期せぬことに、ＲＯＳＣの２０分後の動脈血試料の動脈血酸素分圧（ｐＯ２）及び４０分後の動脈血試料の酸素飽和度（ＳａＯ２）は、ビヒクル群と比較してカクテル群において低かった。ＲＯＳＣの２０分後の動脈乳酸及びグルコースレベルは、ビヒクル群よりもカクテル群において著しく高かった。ビヒクル群における生存率は、ＣＡ後７２時間で２８．６％（１４例中５例）であった。カクテル薬は、生存率を７８．６％（１４例中１２例）に有意に改善した（ビヒクルに対してログランクＰ＝０．００６、図３）。
ＭＡＰ平均動脈血圧；ＨＲ、心拍数；ＢＰＭ、拍／分；ＣＡ、心停止；ＣＰＲ、心肺蘇生；ＲＯＳＣ、自己心拍再開；ｓｅｃ、秒。値は平均値±ＳＥＭとして表した。
値は平均値±ＳＥＭとして表した。反復測定分析の混合効果モデルによる群間でベースライン時に有意差はなかった。それぞれの時点で、＊＝Ｐ＜０．０５対ビヒクル、＊＊＝Ｐ＜０．００５対ビヒクル。ＲＯＳＣ自己心拍再開、ＳａＯ２、酸素飽和度。
【表3】
【表4】
【0118】
カクテルは、ＣＡ及び蘇生の７２時間後に神経機能障害を予防する。生存動物は、ＲＯＳＣの２４、４８、及び７２時間後に、ＮＤＳ（０＝死亡又は脳死、５００＝正常）に基づいて神経機能について評価した。ＮＤＳは、ＲＯＳＣの２４時間後にビヒクル群（２１２．５±２５．７６）よりもカクテル群（２９７．３±１７．７０）の生存ラットにおいて有意に高かった（マン－ホイットニー検定によりＰ＝０．０１４）。ＮＤＳは、ＲＯＳＣの４８時間後に群間で有意差はなかったが（Ｐ＝０．０８２）、ＲＯＳＣの７２時間後のＮＤＳは、ビヒクル（２６５．０±１４．４３）処置群と比較して、カクテル薬物（３４１．４±１５．１２）で処置された生存ラットにおいて有意に改善された（Ｐ＝０．００４、図４）。これらの結果は、カクテル薬物が、ラットにおいてＲＯＳＣ後の初期段階及び後の段階の両方で神経機能障害の発症を予防したことを示唆する。
【0119】
カクテル薬物は、ＣＡ及び蘇生後早期に体温及び血行動態パラメータを改変した。食道温度は、実験薬物の内容を盲検化されている治験責任医師によって３６．５～３７．５℃の間に留まることが意図されたが、食道温度は、ＲＯＳＣの３０分後、６０分後、及び１２０分後に、ビヒクル群よりもカクテル群において意図せずに低かった（図５Ａ）。両群とも、ＭＡＰは、ベースラインと比較して、ＲＯＳＣの３０分後に増加した（ビヒクル、１２１．６４±２．９４対ベースライン、８８．４１±３．９４、ｐ＜０．０００１、カクテル１０４．３８±３．７６、対ベースライン、８９．０７±３．６３、ｐ＜０．０５、）。その後、ＭＡＰは、ＲＯＳＣの９０分後までベースラインの約８０％に減少し、その後、ＲＯＳＣの１２０分後にベースライン値に戻った。ＲＯＳＣの３０分後のＭＡＰは、ビヒクル処置群（１２１．６４±２．９４）と比較して、カクテル処置群（１０４．３８±３．７６）において著しく低かった（ｐ＜０．０５、図５Ｂ）。ＲＯＳＣの３０分後、両群ともベースラインと比較して、ＨＲは増加した（ビヒクル、３５８．５４±８．１５対ベースライン、３１３．７９±１３．４７、ｐ＜０．０５、カクテル３４７．７４±８．０５、対ベースライン、２９５．９４±１２．０８）（ｐ＜０．００５、図５Ｃ）。ビヒクル処置群では、増加したＨＲはＲＯＳＣ後６０分まで継続し、その後ベースライン値に戻ったが、心拍数は６０分でベースラインに戻り、カクテル処置群では残りの経過観察期間も維持された。これらの観察は、カクテル薬物が、ＣＡ後のより高い生存率に関連する可能性が高い蘇生後の初期血行動態変化に影響を及ぼすことを示唆する。
【0120】
このカクテルは、ＣＡ及び蘇生後早期に動脈血ガス分析を改変した。ＲＯＳＣの２０分後に、ビヒクル処置群（３８４．１±３５．９３）と比較してカクテル処置群（２２７．９±３０．２２）においてｐＯ２に有意な減少があり（ｐ＜０．００５（表４））、ＲＯＳＣの４０分後に、カクテル（９４．８６±１．２７）及びビヒクル（９８．５０±０．３６）処置群間の酸素飽和度（ＳａＯ２）にも有意な減少（ｐ＜０．０５（表４））があった。乳酸レベルの有意な増加が、ビヒクル注射群（３．２８±０．２５）と比較して、カクテル注射群（４．１３±０．１５）においてＲＯＳＣの２０分後で観察され、これは、ＲＯＳＣの４０分後で基底レベルに戻る傾向を示す（ｐ＜０．０５（表４））。血中グルコースレベルは、ビヒクル群（２８７．７７±１８．２９）と比較して、ＲＯＳＣの２０分後でカクテル処置群（３７７．５±２１．３７）において増加した（ｐ＜０．０５（表４））が、これは両群ともＲＯＳＣ後更に１２０分まで減少し続けた。これらの観察は、カクテル薬物が、蘇生後の初期ｐＯ２、ＳａＯ２血中乳酸及び血糖の変化に影響を及ぼすことを示唆しており、これは、ＣＡ後のより高い生存率に関連している可能性が高い。
【0121】
結果：本試験の全体的な目標は、複数の経路を標的化することによって、重度のＣＡモデルにおいて良好な神経学的転帰を伴う長期生存利益を有する多剤カクテルを開発することであった。本出願人は、ビヒクル注射群（約２８％）と比較して、カクテル注射群において非常に良好な生存（約７８％）を観察し、カクテル処置群において神経学的転帰が増強され、これは薬物カクテルの有益な効果を示す。低体温の影響を除外するために、両群とも食道温度（esophageal temperature）（Ｔｅｓｏ）を３７±０．５℃の間に維持し、両群間でＴｅｓｏに有意差が観察されたが、観察された温度は、範囲（３７±０．５℃）内であり、したがって低体温の影響は有意ではない。更に、ＲＯＳＣの２０分後にビヒクル群と比較してカクテル注射群においてｐＯ２に有意な減少があり、ＲＯＳＣの４０分後に酸素飽和度（ＳａＯ２）に有意な減少があった。ｐＯ２に関する観察は、ＲＯＳＣ後のより低い酸素濃度が生存及び好ましい神経学的転帰に関連することを示唆する。蘇生後の過酸素症は、軽度の低体温療法を伴う患者において死亡率を増加させることが示されている（１７～１９）。本試験は、初期段階におけるより低い酸素レベルがＣＡ後の神経保護に有益であることを示唆する。
【0122】
本試験における最も重要な知見の１つは、カクテル処置群におけるＲＯＳＣ後の初期段階（３０分未満）での乳酸及び血中グルコースレベルの増加である。カクテル群における乳酸の増加率は、ＲＯＳＣの２０分後でビヒクル注射群よりも高く、ＲＯＳＣの２０分後のカクテル注射群における乳酸塩クリアランス率は、ビヒクル注射群よりも遅かった。カクテルは、ミトコンドリア複合体Ｉ（ＣＯＸ１）阻害剤（例えば、メトホルミン）及び他の酸化的リン酸化（ＯＸＰＨＯＳ）阻害剤（例えば、Ｎ－アセチルシステイン）を含むので、増加した乳酸及びグルコースは、初期再灌流（３０分未満）におけるＲＯＳ生成の主要な源であるＣＯＸ１阻害（２１）に関連し得る。高い乳酸クリアランスは、敗血症及びＣＡ後の転帰の改善と関連付けられており、一方、低い乳酸クリアランスは、死亡率の増加と関連付けられている（２２）。更に、Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，２０１３は、最初の乳酸レベルではなく乳酸クリアランス速度が、低体温療法後のＯＨＣＡ患者における神経学的転帰と関連付けられることを示した（２３）。乳酸クリアランスは、死亡率を予測しないが、神経学的転帰の改善の１つの予測因子である（２４）。この研究は、初期段階におけるより高い乳酸及びグルコースレベルが、生存及び好ましい神経学的転帰と関連付けられる場合も又は関連付けられない場合もあることを示唆する。
【0123】
実施例２：製剤（カクテル）の調製
本発明の製剤に使用される化合物は、表５に示されるように、最初に薬物を親水性及び疎水性化学物質に分類した。
本発明の製剤に使用される化合物は、表５に示されるように、最初に薬物を親水性及び疎水性化学物質に分類した。
【表5】
【0124】
全ての親水性薬物を別々に秤量し、最初に７５０μＬのポロキサマー１８８に溶解した。のＣｏＱ１０、シクロスポリン－Ａ、及びスルブタミンの別個の混合物を、以下に記載されるように作製した。
【0125】
ＣｏＱ１０：１５ｍｇのＣｏＱ１０を、最初に３００μＬのポリオキシエタニル－α－トコフェリルセバケート（ＰＴＳ）（既に少なくとも２４時間凍結乾燥されている）と混合し、次いで水浴中６０℃で１５分間インキュベートした。次いで、１ｍｌの１×リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を添加し、十分に混合し、再び水浴中６０℃で１５分間インキュベートした。超音波処理を１０～１５分間行った。
【0126】
シクロスポリンＡ：５ｍｇのシクロスポリン－Ａを、ＰＢＳ中で調製した１．５ｍｌの４％ＢＳＡに溶解した。次いで、それを５分間超音波処理した。
【0127】
スルブチアミン：６．２５ｍｇのスルブチアミンを、最初に１００μＬのエタノールと十分に混合し、次いでその後４００μＬのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を添加した。次いで、それを５分間超音波処理した。
【0128】
製剤化及び超音波処理を別々に行った後、ＣｏＱ１０（ＰＴＳ及びＰＢＳ中）混合物をシクロスポリン－Ａ（ＢＳＡ及びＰＢＳ中）混合物と混合し、得られた混合物を１０分間超音波処理した。次いで、ポラキサマー－１８８中の親水性薬物混合物をＣｏＱ１０／シクロスポリン－Ａ混合物と混合し、得られた混合物を再び１０分間超音波処理した。最後に、スルブチアミン（エタノール及びＰＥＧを含む）混合物をＣｏＱ１０／シクロスポリン－Ａ／親水性薬物混合物と混合し、得られたカクテル混合物を半透明の色が観察されるまで超音波処理した。次いで、カクテルを０．４５ミクロンフィルターで濾過し、溶液のｐＨを重炭酸ナトリウムで７．３５～７．４５に調整した。
【0129】
実施例１で使用した対照ビヒクル製剤は、表１の活性化合物を含まず、ポラキサマー－１８８の代わりにＰＢＳを使用したことを除いて、同様に調製した。具体的には、３００ｕＬのポリオキシエタニル－α－トコフェリルセバケート（ＰＴＳ）（既に少なくとも２４時間凍結乾燥されている）を水浴中６０℃で１５分間インキュベートし、次いで１ｍｌの１×リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を添加して、ヌルＣｏＱ１０混合物（ＣｏＱ１０を欠く混合物）を形成した。次いで、ヌル－ＣｏＱ１０混合物を撹拌し、水浴中６０℃で１５分間インキュベートし、続いて５分間超音波処理した。ヌル－シクロスポリン－Ａ（シクロスポリン－Ａを欠く）を、ＰＢＳ混合物中４％ＢＳＡの１．５ｍｌに達する割合でＢＳＡをＰＢＳと混合することによって調製した。１００μｌのエタノールを４００μｌのＰＥＧに添加することによって、ヌル－スルブチアミン（スルブチアミンを欠く）混合物を調製した。次いで、ヌル－ＣｏＱ１０混合物、ヌル－シクロスポリン－Ａ混合物、及びヌル－スルブチアミン混合物を７５０μｌのＰＢＳと混合し、２～３分間超音波処理してビヒクルを生成した。次いで、ビヒクルを０．４５ミクロンフィルターで濾過し、ｐＨを重炭酸ナトリウムで７．３５～７．４５に調整した。
参考文献
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１６．Ｈａｎ，Ｆ．，ｅｔ ａｌ．Ｒｅｓｕｓｃｉｔａｔｉｏｎ ８１，９３－９９
１７．Ｊａｎｚ，Ｄ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．Ｃｒｉｔ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ ４０，３１３５－３１３９
１８．Ｋｉｌｇａｎｎｏｎ，Ｊ．Ｈ．，ｅｔ ａｌ ＪＡＭＡ ３０３，２１６５－２１７１
１９．Ｅｌｍｅｒ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔｅｎｓｉｖｅ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ ４１，４９－５７
２０．Ｓｔｏｒｍ，Ｃ．，ｅｔ ａｌ．Ｓｃａｎｄ Ｊ Ｔｒａｕｍａ Ｒｅｓｕｓｃ Ｅｍｅｒｇ Ｍｅｄ ２４，４３
２１．Ｐｉｅｌ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．Ａｃｔａ Ｐｈｙｓｉｏｌ（Ｏｘｆ）２１３，１７１－１８０
２２．Ｎｇｕｙｅｎ，Ｈ．Ｂ．，ｅｔ ａｌ．Ｃｒｉｔ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ ３２，１６３７－１６４２
２３．Ｌｅｅ，Ｔ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．Ｃｒｉｔ Ｃａｒｅ １７，Ｒ２６０
２４．Ｄｏｎｎｉｎｏ，Ｍ．Ｗ．，ｅｔ ａｌ．Ｒｅｓｕｓｃｉｔａｔｉｏｎ ７５，２２９－２３４
２５．Ｚｈｅｎｇ ＺＪ，ｅｔ ａｌ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．１０４（１８）：２１５８－６３．ｄｏｉ：１０．１１６１／ｈｃ４３０１．０９８２５４．ＰＭＩＤ １１６８４６２４。
２６．Ｋｒｏｎｉｃｋ ＳＬ，ｅｔ ａｌ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．１３２（１８ Ｓｕｐｐｌ ２）：Ｓ３９７－４１３．ｄｏｉ：１０．１１６１／ｃｉｒ．０００００００００００００２５８．ＰＭＩＤ ２６４７２９９２。
２７．Ｃｙｄｕｌｋａ，Ｒｉｔａ Ｋ．，ｅｄｉｔｏｒ．（２０１７－０８－２８）．Ｔｉｎｔｉｎａｌｌｉ’ｓ ｅｍｅｒｇｅｎｃｙ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ｍａｎｕａｌ．ＩＳＢＮ ９７８００７１８３７０２６．ＯＣＬＣ ９５７５０５６４２。
２８．Ｃｏｎｔｉｎｕｉｎｇ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ ｉｎ Ａｎａｅｓｔｈｅｓｉａ Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｃａｒｅ ＆ Ｐａｉｎ，Ｖｏｌｕｍｅ １２，Ｉｓｓｕｅ ６，Ｄｅｃｅｍｂｅｒ ２０１２，Ｐａｇｅｓ ２８３－２８７
参考文献
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２５．Ｚｈｅｎｇ ＺＪ，ｅｔ ａｌ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．１０４（１８）：２１５８－６３．ｄｏｉ：１０．１１６１／ｈｃ４３０１．０９８２５４．ＰＭＩＤ １１６８４６２４。
２６．Ｋｒｏｎｉｃｋ ＳＬ，ｅｔ ａｌ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．１３２（１８ Ｓｕｐｐｌ ２）：Ｓ３９７－４１３．ｄｏｉ：１０．１１６１／ｃｉｒ．０００００００００００００２５８．ＰＭＩＤ ２６４７２９９２。
２７．Ｃｙｄｕｌｋａ，Ｒｉｔａ Ｋ．，ｅｄｉｔｏｒ．（２０１７－０８－２８）．Ｔｉｎｔｉｎａｌｌｉ’ｓ ｅｍｅｒｇｅｎｃｙ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ｍａｎｕａｌ．ＩＳＢＮ ９７８００７１８３７０２６．ＯＣＬＣ ９５７５０５６４２。
２８．Ｃｏｎｔｉｎｕｉｎｇ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ ｉｎ Ａｎａｅｓｔｈｅｓｉａ Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｃａｒｅ ＆ Ｐａｉｎ，Ｖｏｌｕｍｅ １２，Ｉｓｓｕｅ ６，Ｄｅｃｅｍｂｅｒ ２０１２，Ｐａｇｅｓ ２８３－２８７
【0130】
実施例３：多剤カクテル療法は、げっ歯類における心停止後の生存及び神経機能を改善する
心停止（ＣＡ）は、米国における主要な死因である。しかしながら、生存及び神経学的転帰を実質的に改善する療法の開発においては、ほとんど進歩していない。ＣＡは、酸化、炎症、及び代謝性ストレスなどの複数の経路を介して、全体的な虚血及びニューロン変性を引き起こす。ＣＡ後の神経保護のための現在の治療は、主に、多数の他の損傷に対処することなく、いくつかの損傷を引き起こす経路を標的とする。本試験において、本発明者らは、虚血再灌流傷害に関与する複数の罹患経路を同時に標的とすることができる多剤カクテル療法を開発しようとした。本発明者らはまた、重度損傷ラットモデルＣＡにおける心肺蘇生後の神経学的無傷生存を改善するカクテルの有効性を評価した。
心停止（ＣＡ）は、米国における主要な死因である。しかしながら、生存及び神経学的転帰を実質的に改善する療法の開発においては、ほとんど進歩していない。ＣＡは、酸化、炎症、及び代謝性ストレスなどの複数の経路を介して、全体的な虚血及びニューロン変性を引き起こす。ＣＡ後の神経保護のための現在の治療は、主に、多数の他の損傷に対処することなく、いくつかの損傷を引き起こす経路を標的とする。本試験において、本発明者らは、虚血再灌流傷害に関与する複数の罹患経路を同時に標的とすることができる多剤カクテル療法を開発しようとした。本発明者らはまた、重度損傷ラットモデルＣＡにおける心肺蘇生後の神経学的無傷生存を改善するカクテルの有効性を評価した。
【0131】
方法：本発明者らは、生存及び神経保護に重点を置いて、虚血再灌流傷害の異なる態様を標的とする１０種の薬物を含む多剤カクテルを開発した。本発明者らは、１２分間の窒息性ＣＡを受けた雄のＳｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙラットにおいて、プロスペクティブ無作為化盲検プラセボ対照試験を行った。ラットを蘇生させ、自己心拍再開（ＲＯＳＣ）の直後に、ラットをカクテル（ｎ＝１４）又はビヒクル（ｎ＝１４）のいずれかを静脈内投与するように無作為に割り当てた。血行動態をモニターし、動脈血液ガス及びグルコースを分析するために、ラットを２時間、人工呼吸で維持した。評価した結果は、ＲＯＳＣ後の７２時間生存、及び２４、４８、及び７２時間後で神経機能が含まれる。カクテルを投与した後の細胞における形態学的変化を分析するために、組織学的染色を用いて脳も評価した。
【0132】
結果：本発明者らは、カクテルが７２時間の生存を有意に改善したことを見出し、ビヒクル処置ラットの２８．６％に対して、カクテル処置ラットの７８．６％が生存した（ログランク検定、Ｐ＝０．００６）。２つの神経学的欠損スコアは、ビヒクル処置ラットに対してカクテル処置ラットにおいて７２時間で実質的に改善された神経機能を示した（スケール１の場合Ｐ＝０．００４及びスケール２の場合Ｐ＝０．０１３）。
【0133】
結論：１２分窒息性ＣＡの致死性げっ歯類モデルを使用する無作為化対照試験において、本発明者らの多剤カクテルは、７２時間生存及び神経学的転帰を有意に改善し、現在の療法が失敗した時点で多剤カクテルが有効であり得ることを示唆した。
略語
ＡＮＯＶＡ 一元配置分散分析
ＡＴＰ アデノシン三リン酸
ＡＴＰ－ＭｇＣｌ２ アデノシン三リン酸－塩化マグネシウム
ＢＢＢ 血液脳関門
ＢＰＭ 呼吸／分
ｂｐｍ 拍／分
ＣＡ 心停止
ＣＰＲ 心肺蘇生
ＥＳＩ－ＭＳ エレクトロスプレーイオン化質量分析
ＥＴＣＯ２ 呼気終末ＣＯ２
ＨＲ 心拍数
ＭＡＰ 平均動脈圧
ｍＮＤＳ 修正神経学的欠損スコア
ｍＰＴＰ ミトコンドリア膜透過性遷移孔
ＮＤＳ 神経欠損スコア
ＮＨＥ－１ ナトリウム－水素交換アイソフォーム－１
ＰＢＳ リン酸緩衝生理食塩水
ＰＦＡ パラホルムアルデヒド
ｐＯ２ 酸素分圧
ＰＴＳ ポリオキシエタニル－α－トコフェリルセバケート
ＲＯＳ 活性酸素種
ＲＯＳＣ 自己心拍再開
ＳａＯ２ 酸素飽和度
ＳＥＭ 平均値の標準誤差
ＳＳ－３１ Ｓｚｅｔｏ－Ｓｃｈｉｌｌｅｒペプチド－３１
ＴＵＮＥＬ 末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ
ｄＵＴＰ ニック末端標識
略語
ＡＮＯＶＡ 一元配置分散分析
ＡＴＰ アデノシン三リン酸
ＡＴＰ－ＭｇＣｌ２ アデノシン三リン酸－塩化マグネシウム
ＢＢＢ 血液脳関門
ＢＰＭ 呼吸／分
ｂｐｍ 拍／分
ＣＡ 心停止
ＣＰＲ 心肺蘇生
ＥＳＩ－ＭＳ エレクトロスプレーイオン化質量分析
ＥＴＣＯ２ 呼気終末ＣＯ２
ＨＲ 心拍数
ＭＡＰ 平均動脈圧
ｍＮＤＳ 修正神経学的欠損スコア
ｍＰＴＰ ミトコンドリア膜透過性遷移孔
ＮＤＳ 神経欠損スコア
ＮＨＥ－１ ナトリウム－水素交換アイソフォーム－１
ＰＢＳ リン酸緩衝生理食塩水
ＰＦＡ パラホルムアルデヒド
ｐＯ２ 酸素分圧
ＰＴＳ ポリオキシエタニル－α－トコフェリルセバケート
ＲＯＳ 活性酸素種
ＲＯＳＣ 自己心拍再開
ＳａＯ２ 酸素飽和度
ＳＥＭ 平均値の標準誤差
ＳＳ－３１ Ｓｚｅｔｏ－Ｓｃｈｉｌｌｅｒペプチド－３１
ＴＵＮＥＬ 末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ
ｄＵＴＰ ニック末端標識
【0134】
臨床的観点
本発明者らは、１０種の神経保護薬を含む多剤カクテル療法を開発した。本発明者らは、盲検無作為化プラセボ対照研究において、１２分間の心停止とそれに続く心肺蘇生のげっ歯類モデルにおける多剤カクテルの有効性を評価した。本発明者らの多剤カクテル療法は、心停止後の神経機能及び生存の改善に関連していた。
本発明者らは、１０種の神経保護薬を含む多剤カクテル療法を開発した。本発明者らは、盲検無作為化プラセボ対照研究において、１２分間の心停止とそれに続く心肺蘇生のげっ歯類モデルにおける多剤カクテルの有効性を評価した。本発明者らの多剤カクテル療法は、心停止後の神経機能及び生存の改善に関連していた。
【0135】
心停止後の全体的な虚血－再灌流傷害は、特に脳において重篤な多臓器損傷を引き起こし、心停止後を保護するための新規な多面的治療を必要とする。心停止後の多剤カクテルによる治療は、ヒト患者に変換され得る好ましい神経学的転帰を伴って、生存を改善することに成功した。
【0136】
序論
心停止（ＣＡ）は、米国において３６００００人を超える死亡の原因であり、死亡率はほぼ９０％である１。このような高い死亡率にもかかわらず、生存及び神経学的転帰を実質的に改善する薬理学的介入の開発はほとんど進展がない。
心停止（ＣＡ）は、米国において３６００００人を超える死亡の原因であり、死亡率はほぼ９０％である１。このような高い死亡率にもかかわらず、生存及び神経学的転帰を実質的に改善する薬理学的介入の開発はほとんど進展がない。
【0137】
ＣＡは、体内の全ての臓器への血流を突然減少させ、全体的な虚血をもたらす複雑な状態である２。蘇生中に、酸素が再導入され、以前の虚血性傷害を増大させる再灌流傷害をもたらす。ＣＡ後、ミトコンドリア機能不全３、小胞体ストレス４、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）などの高エネルギー代謝産物の枯渇５、酸化的損傷６、及び炎症反応７を含む事象の複雑なカスケードにより、脳損傷及び生存率の低下が起こる。これらの事象は細胞死をもたらし、神経機能を損なう。ＣＡは、他の臓器にも影響を及ぼす。例えば、長期ＣＡ後の臓器メタボロミックプロファイリングは、蘇生媒介代謝機能不全を示した８。更に、蘇生後の代謝調節不全がげっ歯類及びヒトにおいて同様に観察され９、全身損傷を示し、その改善は、併用療法などの多次元アプローチを必要とする。
【0138】
全身的な疾患として、多数の代謝、エネルギー及び炎症経路の変化が存在する。虚血性傷害後に有益性をもたらす神経保護薬物の発見を目指したいくつかの研究は１０、ほとんどは、単一の薬物しか使用していない。このアプローチは、ＣＡ病理についてより多く理解し、改善された治療を設計するために有用である。しかしながら、ＣＡ損傷の重症度及び複雑性のために、単剤療法は、ヒトにおいて保護を与えるには十分ではない。多臓器に対するＣＡの影響は、治療に対するより複雑なアプローチを必要とする。いくつかの研究は、個々の薬理学的介入として、又は低体温療法と組み合わせて、薬物を組み合わせている１１－１３。これらの研究は、２つの重大な制限事項：大多数の損傷経路を標的化することができない最小数の治療剤を使用すること、及び処置に対して包括的なアプローチを必要とする、より重度のＣＡモデルにおいて試験されていないこと、を有する。多剤カクテルはまた、ＨＩＶ／ＡＩＤＳ１４、がん１５、及びコロナウイルス疾患２０１９などの他の疾患を治療するためにも使用されてきた１６。この広範な適用性は、虚血再灌流傷害などの複雑な疾患を治療するために多剤カクテルを使用することへの現実的な強みを示す。しかしながら、この多剤アプローチは、ＣＡにおいて検討されてこなかった。
【0139】
この盲検無作為化プラセボ対照試験において、本発明者らの目的は、多剤カクテルを開発し、窒息性ＣＡ及び蘇生のげっ歯類モデルにおける７２時間の生存及び神経転帰の改善におけるカクテルの効力を特定することであった。
【0140】
方法
多剤カクテルの選択及び製剤化
本発明者らは、異なる物理的及び化学的特性を有する薬物の複合混合物を含有する多剤カクテルを開発することを目的とした。本発明者らの目標は、単一調合物中の最小数の薬剤で最大の利益を提供することであった。有効なカクテルを作製するために、臨床又は前臨床現場において、含まれる薬物は、ＣＡ後に生存及び／又は神経保護のいずれかをもたらす能力について評価されなければならない。この情報は、適切かつ実際的に組み合わせることができる薬剤を選択する際の一助となる。本発明者らは、文献を徹底的に検索し、多剤カクテルに含めるために１０種の神経保護薬：メトホルミン、Ｎ－アセチルシステイン、ポロキサマー１８８、エダラボン、Ｓｚｅｔｏ－Ｓｃｈｉｌｌｅｒペプチド－３１（ＳＳ－３１）、ビタミンＣ、ゾニポリド、ＣｏＱ１０、シクロスポリンＡ、及びスルブチアミン（公開された用量及び経路を表６に列挙する）を選択した。各薬物を、個々に及び各種組み合わせで、正常ラット（ｎ＝３）に投与して、即死などの任意の潜在的な副作用を特定した。本発明者らは、カクテル開発及び予備試験の逐次反復を行い（データ補足の表９を参照）、最終製剤に到達した（データ補足の表１０及び方法を参照）。
多剤カクテルの選択及び製剤化
本発明者らは、異なる物理的及び化学的特性を有する薬物の複合混合物を含有する多剤カクテルを開発することを目的とした。本発明者らの目標は、単一調合物中の最小数の薬剤で最大の利益を提供することであった。有効なカクテルを作製するために、臨床又は前臨床現場において、含まれる薬物は、ＣＡ後に生存及び／又は神経保護のいずれかをもたらす能力について評価されなければならない。この情報は、適切かつ実際的に組み合わせることができる薬剤を選択する際の一助となる。本発明者らは、文献を徹底的に検索し、多剤カクテルに含めるために１０種の神経保護薬：メトホルミン、Ｎ－アセチルシステイン、ポロキサマー１８８、エダラボン、Ｓｚｅｔｏ－Ｓｃｈｉｌｌｅｒペプチド－３１（ＳＳ－３１）、ビタミンＣ、ゾニポリド、ＣｏＱ１０、シクロスポリンＡ、及びスルブチアミン（公開された用量及び経路を表６に列挙する）を選択した。各薬物を、個々に及び各種組み合わせで、正常ラット（ｎ＝３）に投与して、即死などの任意の潜在的な副作用を特定した。本発明者らは、カクテル開発及び予備試験の逐次反復を行い（データ補足の表９を参照）、最終製剤に到達した（データ補足の表１０及び方法を参照）。
【0141】
本発明者らの試験で使用したビヒクルは、１０種の薬物を除く多剤カクテルの全ての要素を含有していた。
略語：ＢＢＢは血液脳関門を示し、ｍＰＴＰは、ミトコンドリア膜透過性遷移孔を示し、ＮＨＥ－１は、ナトリウム－水素交換体アイソフォーム－１を示し、ＲＯＳは、活性酸素種を示す。
【表6】
【0142】
多剤カクテル及びビヒクルを製剤化するための詳細なプロトコル
全ての親水性薬物を別々に秤量し、７５０μＬのポロキサマー１８８に溶解した。疎水性薬物を最初に別々に製剤化し、次いで組み合わせて完全なカクテルを形成した。ＣｏＱ１０（１５ｍｇ）を最初に、予め２４時間凍結乾燥させた３００μＬのポリオキシエタニル－α－トコフェリルセバケート（ＰＴＳ、１５％ｗ／ｖ水溶液）に溶解した。この合わせた混合物を６０℃の水浴中で１５分間インキュベートした。次いで、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ １×、１ｍＬ）を混合物に添加し、次いでこれをボルテックスし、６０℃の水浴中で１５分間インキュベートし、１０～１５分間超音波処理した。シクロスポリンＡ（５ｍｇ）を、１×ＰＢＳ中で調製した１．５ｍＬの４％ＢＳＡに溶解し、５分間超音波処理した。スルブチアミン（６．２５ｍｇ）を１００μＬの無水エタノールに完全に溶解した。次いで、４００μＬのポリエチレングリコール３００（ＰＥＧ－３００）を混合物に添加した後、５分間超音波処理した。各疎水性薬物の個々の製剤を完成させた後、ＣｏＱ１０及びシクロスポリンＡの製剤を合わせ、１０分間超音波処理した。この混合物を全ての親水性薬物の溶液と混合し、再び１０分間超音波処理した。最後に、スルブチアミン製剤を混合物に添加し、溶液が半透明になるまで溶液全体を超音波処理した。カクテルを０．４５μｍシリンジフィルターで濾過し、重炭酸ナトリウム（５０ｍＥｑ）（０．８～１．０ｍＬ）を使用してｐＨを７．３５～７．４５に調整した。カクテルの最終体積は、約４．５ｍＬであった。
全ての親水性薬物を別々に秤量し、７５０μＬのポロキサマー１８８に溶解した。疎水性薬物を最初に別々に製剤化し、次いで組み合わせて完全なカクテルを形成した。ＣｏＱ１０（１５ｍｇ）を最初に、予め２４時間凍結乾燥させた３００μＬのポリオキシエタニル－α－トコフェリルセバケート（ＰＴＳ、１５％ｗ／ｖ水溶液）に溶解した。この合わせた混合物を６０℃の水浴中で１５分間インキュベートした。次いで、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ １×、１ｍＬ）を混合物に添加し、次いでこれをボルテックスし、６０℃の水浴中で１５分間インキュベートし、１０～１５分間超音波処理した。シクロスポリンＡ（５ｍｇ）を、１×ＰＢＳ中で調製した１．５ｍＬの４％ＢＳＡに溶解し、５分間超音波処理した。スルブチアミン（６．２５ｍｇ）を１００μＬの無水エタノールに完全に溶解した。次いで、４００μＬのポリエチレングリコール３００（ＰＥＧ－３００）を混合物に添加した後、５分間超音波処理した。各疎水性薬物の個々の製剤を完成させた後、ＣｏＱ１０及びシクロスポリンＡの製剤を合わせ、１０分間超音波処理した。この混合物を全ての親水性薬物の溶液と混合し、再び１０分間超音波処理した。最後に、スルブチアミン製剤を混合物に添加し、溶液が半透明になるまで溶液全体を超音波処理した。カクテルを０．４５μｍシリンジフィルターで濾過し、重炭酸ナトリウム（５０ｍＥｑ）（０．８～１．０ｍＬ）を使用してｐＨを７．３５～７．４５に調整した。カクテルの最終体積は、約４．５ｍＬであった。
【0143】
ビヒクルをカクテルと同様に製剤化した。ポロキサマー１８８の代わりに、ＰＢＳ（１×、７５０μＬ）を可溶化剤として使用した。予め２４時間凍結乾燥したＰＴＳ（３００μＬ）を６０℃の水浴中で１５分間インキュベートし、これに１ｍＬの１×ＰＢＳを添加した。溶液を６０℃の水浴中で１５分間インキュベートし、次いで５分間超音波処理した。この混合物を、１×ＰＢＳ中で調製した１．５ｍＬの４％ＢＳＡと合わせ、１００μＬの無水エタノールを４００μＬのＰＥＧに添加した。次いで、全ての溶液を合わせ、２～３分間超音波処理した。ビヒクルも０．４５μｍシリンジフィルターを通して濾過し、重炭酸ナトリウムを使用してｐＨを７．３５～７．４５に調整した。
【0144】
質量分析を使用した活性カクテル成分の評価
カクテルの最終製剤を開発した後、本発明者らは、質量分析（ＭＳ）を用いて本発明者らの製剤中の薬物の安定性及び／又は分子相互作用を確認した。カクテル製剤から個々の薬物を分離するために、本発明者らは、酢酸エチルを使用する液／液抽出法１７を適用した。次いで、抽出された成分の分子量をエレクトロスプレーイオン化質量分析（electrospray ionization mass spectrometry、ＥＳＩ－ＭＳ）によって分析した（図６）。抽出のために、５００μＬのカクテル製剤を１０００μＬの酢酸エチルと混合し、次いで３０秒間ボルテックスした。次いで、調製物を室温で２分間、１００００ｇで遠心分離した。次いで、上層（酢酸エチル）を分離し、新しいバイアルに移した。更に１０００μＬの酢酸エチルを下層に添加し、抽出を繰り返した。合わせた有機相を窒素ガスで乾燥させた。残渣を５００μＬのメタノール中で再構成し、１０秒間ボルテックスし、１３０００ｇで２分間遠心分離した。最終抽出物をポリプロピレンバイアルに移した。次いで、３０μＬの最終抽出物を注入し、ＬＴＱ ＸＬ（商標）Ｌｉｎｅａｒ Ｉｏｎ Ｔｒａｐ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）で分析し、Ｘｃａｌｉｂｕｒ ３．１（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を用いてデータを分析した。
カクテルの最終製剤を開発した後、本発明者らは、質量分析（ＭＳ）を用いて本発明者らの製剤中の薬物の安定性及び／又は分子相互作用を確認した。カクテル製剤から個々の薬物を分離するために、本発明者らは、酢酸エチルを使用する液／液抽出法１７を適用した。次いで、抽出された成分の分子量をエレクトロスプレーイオン化質量分析（electrospray ionization mass spectrometry、ＥＳＩ－ＭＳ）によって分析した（図６）。抽出のために、５００μＬのカクテル製剤を１０００μＬの酢酸エチルと混合し、次いで３０秒間ボルテックスした。次いで、調製物を室温で２分間、１００００ｇで遠心分離した。次いで、上層（酢酸エチル）を分離し、新しいバイアルに移した。更に１０００μＬの酢酸エチルを下層に添加し、抽出を繰り返した。合わせた有機相を窒素ガスで乾燥させた。残渣を５００μＬのメタノール中で再構成し、１０秒間ボルテックスし、１３０００ｇで２分間遠心分離した。最終抽出物をポリプロピレンバイアルに移した。次いで、３０μＬの最終抽出物を注入し、ＬＴＱ ＸＬ（商標）Ｌｉｎｅａｒ Ｉｏｎ Ｔｒａｐ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）で分析し、Ｘｃａｌｉｂｕｒ ３．１（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を用いてデータを分析した。
【0145】
１２分間の窒息性心停止のための動物実験手順
全ての実験は、動物実験委員会（ＩＡＣＵＣ）ガイドラインの承認に従って実施した。体重４００～５００ｇの雄Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙラット（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）において仮死を誘導するための手順は、以前に公開された通りであった１８（データ補足の方法を参照）。性差によって引き起こされる効果修飾の調査は、本発明者らの試験の現在の態様をはるかに超えており、したがって、本発明者らは、性差によって影響され得る潜在的な転帰変動性を低減するために、本試験において雄動物のみを使用した。簡潔に述べると、ラットを２つの群：カクテル処置及びビヒクル処置に割り当てた。外科的準備及び１２分間の窒息性ＣＡの後、１００％酸素で人工呼吸を再開し、胸骨圧迫を開始することによって蘇生を開始した１８。ラットに、ＲＯＳＣ直後にカクテル又はビヒクルのいずれかを与え、人工呼吸をＲＯＳＣの後２時間にわたって継続した。次いで、ラットを動物収容施設に戻し、承認されたプロトコルに従って毎日のケアを提供した。ラットをＲＯＳＣの最大７２時間後の生存についてモニターし、神経学的評価をＲＯＳＣの２４、４８、及び７２時間後に盲検研究者によって２つのスコアリングスケールを用いて行った１９，２０。７２時間で、ラットを安楽死させ、ニューロン変性の組織学的分析のために全脳を採取した（図７）。
全ての実験は、動物実験委員会（ＩＡＣＵＣ）ガイドラインの承認に従って実施した。体重４００～５００ｇの雄Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙラット（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）において仮死を誘導するための手順は、以前に公開された通りであった１８（データ補足の方法を参照）。性差によって引き起こされる効果修飾の調査は、本発明者らの試験の現在の態様をはるかに超えており、したがって、本発明者らは、性差によって影響され得る潜在的な転帰変動性を低減するために、本試験において雄動物のみを使用した。簡潔に述べると、ラットを２つの群：カクテル処置及びビヒクル処置に割り当てた。外科的準備及び１２分間の窒息性ＣＡの後、１００％酸素で人工呼吸を再開し、胸骨圧迫を開始することによって蘇生を開始した１８。ラットに、ＲＯＳＣ直後にカクテル又はビヒクルのいずれかを与え、人工呼吸をＲＯＳＣの後２時間にわたって継続した。次いで、ラットを動物収容施設に戻し、承認されたプロトコルに従って毎日のケアを提供した。ラットをＲＯＳＣの最大７２時間後の生存についてモニターし、神経学的評価をＲＯＳＣの２４、４８、及び７２時間後に盲検研究者によって２つのスコアリングスケールを用いて行った１９，２０。７２時間で、ラットを安楽死させ、ニューロン変性の組織学的分析のために全脳を採取した（図７）。
【0146】
盲検、無作為化、プラセボ対照試験
ラット実験を無作為化及び盲検様式で実施した。カクテル及びビヒクルは、研究者Ａが、過剰かつ同定不可能な様式で新たに調製した。研究者Ｂは、カクテル又はビヒクルを無作為に割り当て、全ての実験条件に対して盲検化した。２人の外科医、研究者Ｃ及びＤは、動物手術を実施し、ＲＯＳＣの成功後に盲検様式で処置を施した。１２分間の窒息性ＣＡ後、蘇生プロセス中の一貫性を維持するために、研究者Ａが胸骨圧迫による心肺蘇生（ＣＰＲ）を実施した。ＲＯＳＣの２時間後、動物は術後ケアを受け、動物収容施設に移された。神経学的評価は、研究者Ｅが実施した。
ラット実験を無作為化及び盲検様式で実施した。カクテル及びビヒクルは、研究者Ａが、過剰かつ同定不可能な様式で新たに調製した。研究者Ｂは、カクテル又はビヒクルを無作為に割り当て、全ての実験条件に対して盲検化した。２人の外科医、研究者Ｃ及びＤは、動物手術を実施し、ＲＯＳＣの成功後に盲検様式で処置を施した。１２分間の窒息性ＣＡ後、蘇生プロセス中の一貫性を維持するために、研究者Ａが胸骨圧迫による心肺蘇生（ＣＰＲ）を実施した。ＲＯＳＣの２時間後、動物は術後ケアを受け、動物収容施設に移された。神経学的評価は、研究者Ｅが実施した。
【0147】
蘇生の２４、４８及び７２時間後での神経学的欠損スコア
神経学的転帰を評価するために、本発明者らは２つのスケール（スケール１１９及びスケール２２０）を使用した。神経学的欠損スケール（ＮＤＳ）は、意識、脳神経機能、運動及び感覚能力、並びに全体的な協調性技能などの全体的な一般的外観を含むラットの全体的な機能を捉えようとするものである。本発明者らは、スケール１におけるバイナリ呼吸スコアの０又は１００から、５０を含むように変更し、１００は６０～１２０呼吸／分（ＢＰＭ）の正常呼吸を示し、５０は１２０～１４０ＢＰＭの呼吸を示し、０はその範囲外の呼吸パターンを示す（データ補足の表１０を参照）。神経機能を、ＲＯＳＣの２４、４８、及び７２時間後に評価した（ｍＮＤＳは０～５００の範囲であり、０は死亡を示し、５００は正常動物を示す）。０が脳死を表し、８０が正常を表すように、０～８０の範囲のスケールによる二次神経学的評価（スケール２）を使用した（データ補足の表１１を参照）。
神経学的転帰を評価するために、本発明者らは２つのスケール（スケール１１９及びスケール２２０）を使用した。神経学的欠損スケール（ＮＤＳ）は、意識、脳神経機能、運動及び感覚能力、並びに全体的な協調性技能などの全体的な一般的外観を含むラットの全体的な機能を捉えようとするものである。本発明者らは、スケール１におけるバイナリ呼吸スコアの０又は１００から、５０を含むように変更し、１００は６０～１２０呼吸／分（ＢＰＭ）の正常呼吸を示し、５０は１２０～１４０ＢＰＭの呼吸を示し、０はその範囲外の呼吸パターンを示す（データ補足の表１０を参照）。神経機能を、ＲＯＳＣの２４、４８、及び７２時間後に評価した（ｍＮＤＳは０～５００の範囲であり、０は死亡を示し、５００は正常動物を示す）。０が脳死を表し、８０が正常を表すように、０～８０の範囲のスケールによる二次神経学的評価（スケール２）を使用した（データ補足の表１１を参照）。
【0148】
組織像及び染色
ＲＯＳＣの７２時間後に、生存しているラットを麻酔下に置き、冷リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、１Ｘ、ｐＨ＝７．４）で経心腔的に灌流した。全脳を採取し、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）中、４℃で固定した。ＰＢＳ中の３０％スクロース溶液中で凍結保存した後、連続冠状切片（１４μｍ）をクリオスタット（ＣＭ１９００、Ｌｅｉｃａ）上で切断し、スライドガラス上に収集した。Ｎｉｓｓｌ染色（Ｃｒｅｓｙｌ Ｖｉｏｌｅｔ，Ａｃｒｏｓ Ｏｒｇａｎｉｃｓ，ＵＳＡ）及びＴＵＮＥＬ（ｔｅｒｍｉｎａｌ ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｄＵＴＰ ｎｉｃｋ ｅｎｄ ｌａｂｅｌｉｎｇ）（Ａｂｃａｍ，ＵＫ）染色を、製造業者の説明書に従って、以前に発表されたように実施した２０。海馬ＣＡ１／ＣＡ３錐体ニューロンを、ＢＸ－Ｘ８００明視野顕微鏡（Ｋｅｙｅｎｃｅ，ＵＳＡ）を用いて画像化した。ＢＸ－Ｘ８００アナライザー（Ｋｅｙｅｎｃｅ，ＵＳＡ）を使用して、虚血細胞（Ｎｉｓｓｌ染色）及びアポトーシス細胞（ＴＵＮＥＬ染色）を半定量した。シャムラットを、実験ラットと同じ脳組織像のための灌流及び固定法の前に深く麻酔した。生存しているラット（シャム、ビヒクル処置、及びカクテル処置、各々ｎ＝４）の間で脳組織像を比較するために、本発明者らは、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を使用し、その後、事後比較のためにＴｕｋｅｙ補正を使用した。
ＲＯＳＣの７２時間後に、生存しているラットを麻酔下に置き、冷リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、１Ｘ、ｐＨ＝７．４）で経心腔的に灌流した。全脳を採取し、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）中、４℃で固定した。ＰＢＳ中の３０％スクロース溶液中で凍結保存した後、連続冠状切片（１４μｍ）をクリオスタット（ＣＭ１９００、Ｌｅｉｃａ）上で切断し、スライドガラス上に収集した。Ｎｉｓｓｌ染色（Ｃｒｅｓｙｌ Ｖｉｏｌｅｔ，Ａｃｒｏｓ Ｏｒｇａｎｉｃｓ，ＵＳＡ）及びＴＵＮＥＬ（ｔｅｒｍｉｎａｌ ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｄＵＴＰ ｎｉｃｋ ｅｎｄ ｌａｂｅｌｉｎｇ）（Ａｂｃａｍ，ＵＫ）染色を、製造業者の説明書に従って、以前に発表されたように実施した２０。海馬ＣＡ１／ＣＡ３錐体ニューロンを、ＢＸ－Ｘ８００明視野顕微鏡（Ｋｅｙｅｎｃｅ，ＵＳＡ）を用いて画像化した。ＢＸ－Ｘ８００アナライザー（Ｋｅｙｅｎｃｅ，ＵＳＡ）を使用して、虚血細胞（Ｎｉｓｓｌ染色）及びアポトーシス細胞（ＴＵＮＥＬ染色）を半定量した。シャムラットを、実験ラットと同じ脳組織像のための灌流及び固定法の前に深く麻酔した。生存しているラット（シャム、ビヒクル処置、及びカクテル処置、各々ｎ＝４）の間で脳組織像を比較するために、本発明者らは、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を使用し、その後、事後比較のためにＴｕｋｅｙ補正を使用した。
【0149】
統計分析
連続変数についてのデータは、平均値±平均値の標準誤差（ＳＥＭ）として提示される。カテゴリデータは、割合と共に頻度として提示される。血行動態パラメータ測定（ビヒクル処置及びカクテル処置、各々ｎ＝１４）について、差異を、反復測定二元配置ＡＮＯＶＡ、続いて同じ群内の事後比較のためのＴｕｋｅｙ補正、及び群間の事後比較のためのＳｉｄａｋ補正によって比較した。本発明者らは、反復測定混合効果分析を用いて、全てのラットについて乳酸及びグルコース測定値を比較し、その後、同じ群内での事後比較のためのＴｕｋｅｙ補正、又は群間の事後比較のためのＳｉｄａｋ補正を用いて比較した。機器がいくつかの時点で誤動作し、欠測値をもたらしたため、混合効果分析を使用した。他の分析については、対応のない両側スチューデントｔ検定又はマン－ホイットニーＵ検定のいずれかを使用して、適宜、連続変数について２つの独立群を比較した。最大７２時間生存するラットの割合を、ログランク検定を用いて評価して、２群間の生存曲線を比較した。生存の予備分析（データ補足の図１１を参照）は、ＣＡの７２時間後での平均生存率が、ビヒクル処置ラットにおいて２５％であり、カクテル処置ラットにおいて８５％であることを示した。したがって、本発明者らは、２群間の生存における６０％の差を検出するために、各生存試験について１群当たり１４匹のラットが適切であると予想した（α＝０．０５、β＝０．２［検出力＝８０％］、両側）。統計的有意性はＰ＜０．０５に設定した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍバージョン８．４（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ，ＵＳＡ）及びＳＰＳＳバージョン２３．０（ＳＰＳＳ Ｉｎｃ．，Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ，ＵＳＡ）を統計分析に使用した。
連続変数についてのデータは、平均値±平均値の標準誤差（ＳＥＭ）として提示される。カテゴリデータは、割合と共に頻度として提示される。血行動態パラメータ測定（ビヒクル処置及びカクテル処置、各々ｎ＝１４）について、差異を、反復測定二元配置ＡＮＯＶＡ、続いて同じ群内の事後比較のためのＴｕｋｅｙ補正、及び群間の事後比較のためのＳｉｄａｋ補正によって比較した。本発明者らは、反復測定混合効果分析を用いて、全てのラットについて乳酸及びグルコース測定値を比較し、その後、同じ群内での事後比較のためのＴｕｋｅｙ補正、又は群間の事後比較のためのＳｉｄａｋ補正を用いて比較した。機器がいくつかの時点で誤動作し、欠測値をもたらしたため、混合効果分析を使用した。他の分析については、対応のない両側スチューデントｔ検定又はマン－ホイットニーＵ検定のいずれかを使用して、適宜、連続変数について２つの独立群を比較した。最大７２時間生存するラットの割合を、ログランク検定を用いて評価して、２群間の生存曲線を比較した。生存の予備分析（データ補足の図１１を参照）は、ＣＡの７２時間後での平均生存率が、ビヒクル処置ラットにおいて２５％であり、カクテル処置ラットにおいて８５％であることを示した。したがって、本発明者らは、２群間の生存における６０％の差を検出するために、各生存試験について１群当たり１４匹のラットが適切であると予想した（α＝０．０５、β＝０．２［検出力＝８０％］、両側）。統計的有意性はＰ＜０．０５に設定した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍバージョン８．４（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ，ＵＳＡ）及びＳＰＳＳバージョン２３．０（ＳＰＳＳ Ｉｎｃ．，Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ，ＵＳＡ）を統計分析に使用した。
【0150】
結果
多剤カクテルの予備分析
カクテル製剤は、開発中に複数回の繰り返しを必要とした。本発明者らは、最終カクテルを作製する前に、様々な製剤及び組み合わせを用いて８回の予備試験を行った（データ補足の表９を参照）。各試験は、対照及びＣＡラットにおけるカクテルの機能性及び潜在的な副作用に関する情報を提供した。各予備試験で、（１）注入速度が血行動態変動を最小限に抑えるべきであること、（２）ｐＨが重炭酸ナトリウムで調整されるべきであること、及び（３）ＡＴＰ－塩化マグネシウムがその降圧作用のために除去されるべきであることなどの修正点が判明した。数回の試行の後、最終薬物カクテルを製剤化した。
多剤カクテルの予備分析
カクテル製剤は、開発中に複数回の繰り返しを必要とした。本発明者らは、最終カクテルを作製する前に、様々な製剤及び組み合わせを用いて８回の予備試験を行った（データ補足の表９を参照）。各試験は、対照及びＣＡラットにおけるカクテルの機能性及び潜在的な副作用に関する情報を提供した。各予備試験で、（１）注入速度が血行動態変動を最小限に抑えるべきであること、（２）ｐＨが重炭酸ナトリウムで調整されるべきであること、及び（３）ＡＴＰ－塩化マグネシウムがその降圧作用のために除去されるべきであることなどの修正点が判明した。数回の試行の後、最終薬物カクテルを製剤化した。
【0151】
図６は、カクテル薬物の質量スペクトルを示し、メトホルミン、エダラボン、ゾニポリド、シクロスポリンＡ、Ｎ－アセチルシステイン、及びビタミンＣが無傷で安定であることを示す。
【0152】
この結果は、カクテルの有効性を評価するための盲検実験の基礎となった。最初に、非盲検予備試験により、ビヒクル処置ラット（ｎ＝５）とカクテル処置ラット（ｎ＝６）との間の生存及び神経保護の差を決定した（合計１１匹のラットについて）。ラットに１２分間の窒息性ＣＡを行い、ＲＯＳＣに達した直後に、それらにビヒクル又はカクテルのいずれかを注射した。次いで、本発明者らは、これらのラットにおける生存、神経機能、血行動態、グルコース、及び乳酸の差を評価した（図１１～図１３）。これらの予備実験は、改善された生存及び神経機能を実証した。
【0153】
カクテルは生存を改善し、窒息性心停止後の神経機能障害及び脳損傷を軽減する
窒息性ＣＡの７２時間後、生存率は、ビヒクル処置ラットにおいて２８．６％（５／１４）であり、カクテル処置ラットにおいて７８．６％（１２／１４）であり、カクテル療法が生存率を有意に改善したことを示した（Ｐ＝０．００６）（図８Ａ）。生存動物を、ＲＯＳＣの２４時間後、４８時間後、及び７２時間後に、２つの神経学的スケール（スケール１及びスケール２、データ補足の表ＩＩ及びＩＩＩを参照）で神経機能について評価した。ＲＯＳＣの２４時間後、スケール１からのスコアは、ビヒクルで処置した生存ラット（２１２．５±２５．８）に対してカクテルで処置した生存ラット（２９７．３±１７．７）において有意に高かった（Ｐ＝０．０１４）（図８Ｂ）。ＲＯＳＣの４８時間後に、本発明者らは、統計的に有意ではないが、群間で改善傾向が認められ、カクテル群では、神経機能の保持が潜在的に大きいことを示した（Ｐ＝０．０８２）（図８Ｂ）。ＲＯＳＣの７２時間後、神経機能は、ビヒクルで処置したラット（２６５．０±１４．４）に対してカクテルで処置した生存ラット（３４１．４±１５．１）において有意に高かった（Ｐ＝０．００４）（図３Ｂ）。スケール２でも、ＲＯＳＣの２４時間後（Ｐ＝０．１９０）、４８時間後（Ｐ＝０．０３７）、及び７２時間後（Ｐ＝０．０１３）に、ビヒクル処置ラットに対してカクテル処置ラットにおいて、神経機能が有意に改善された（図８Ｃ）。これらの結果は、カクテル療法が、ＣＡ損傷の重度モデルのラットにおける神経機能障害を軽減したことを支持するものである。
窒息性ＣＡの７２時間後、生存率は、ビヒクル処置ラットにおいて２８．６％（５／１４）であり、カクテル処置ラットにおいて７８．６％（１２／１４）であり、カクテル療法が生存率を有意に改善したことを示した（Ｐ＝０．００６）（図８Ａ）。生存動物を、ＲＯＳＣの２４時間後、４８時間後、及び７２時間後に、２つの神経学的スケール（スケール１及びスケール２、データ補足の表ＩＩ及びＩＩＩを参照）で神経機能について評価した。ＲＯＳＣの２４時間後、スケール１からのスコアは、ビヒクルで処置した生存ラット（２１２．５±２５．８）に対してカクテルで処置した生存ラット（２９７．３±１７．７）において有意に高かった（Ｐ＝０．０１４）（図８Ｂ）。ＲＯＳＣの４８時間後に、本発明者らは、統計的に有意ではないが、群間で改善傾向が認められ、カクテル群では、神経機能の保持が潜在的に大きいことを示した（Ｐ＝０．０８２）（図８Ｂ）。ＲＯＳＣの７２時間後、神経機能は、ビヒクルで処置したラット（２６５．０±１４．４）に対してカクテルで処置した生存ラット（３４１．４±１５．１）において有意に高かった（Ｐ＝０．００４）（図３Ｂ）。スケール２でも、ＲＯＳＣの２４時間後（Ｐ＝０．１９０）、４８時間後（Ｐ＝０．０３７）、及び７２時間後（Ｐ＝０．０１３）に、ビヒクル処置ラットに対してカクテル処置ラットにおいて、神経機能が有意に改善された（図８Ｃ）。これらの結果は、カクテル療法が、ＣＡ損傷の重度モデルのラットにおける神経機能障害を軽減したことを支持するものである。
【0154】
本発明者らは、Ｎｉｓｓｌ染色及びＴＵＮＥＬ染色を用いた組織学的分析によって、ビヒクル処置ラット及びカクテル処置ラットにおける脳形態を評価した。左大脳半球の海馬ＣＡ１及びＣＡ３領域において、本発明者らは、Ｎｉｓｓｌ染色で虚血細胞を検出し、ＴＵＮＥＬ染色でアポトーシス細胞を検出した。海馬の両方の領域において、虚血ニューロンの平均数は、シャムラットよりもビヒクル処置ラットにおいて有意に高く、ビヒクル処置ラットに対してカクテル処置ラットにおいて有意に低かった（図９Ａ）。同様に、ＴＵＮＥＬ陽性細胞の平均数は、シャムラットに対してビヒクル処置ラットの海馬の両方の領域において有意に高く、ビヒクル処置ラットに対してカクテル処置ラットにおいて有意に低かった（図９Ｂ）。これらのデータから、カクテルが、ラットにおける重度のＣＡ損傷の７２時間後に脳の形態学的変化を有意に軽減したことが裏付けられる。
【0155】
カクテルは、窒息性心停止後の生理学的特性、血行動態、及び動脈血化学を向上させる
本発明者らは、ビヒクル処置ラット及びカクテル処置ラットの一般的な生理学的特性を評価した（表７～表８）。ベースライン特性、ＣＡに達する時間、又はＲＯＳＣに達する時間は、ビヒクル処置ラットとカクテル処置ラットとの間で有意差を示さなかった（表７）。動脈血化学分析は、ビヒクル処置ラットとカクテル処置ラットとの間に最小の差を示した。酸素の分圧（ｐＯ２）は、ＲＯＳＣの２０分後で、ビヒクル処置（３８４．０８±３５．９３ｍｍＨｇ）ラットに対してカクテル処置（２２７．９３±３０．２２ｍｍＨｇ）ラットにおいて有意に低かった（Ｐ＜０．００５）。酸素飽和度（ＳａＯ２）は、ＲＯＳＣの４０分後で、ビヒクル処置（９８．５０±０．３６％）ラットに対してカクテル処置（９４．８６±１．２７％）ラットで有意に低かった（Ｐ＜０．０５）（表８）。乳酸レベルは、ＲＯＳＣの２０分後で、ビヒクル処置（３．２８±０．２５ｍｍｏｌ／ｌ）ラットに対して、カクテル処置（４．１３±０．１５ｍｍｏｌ／ｌ）ラットにおいて有意に高く、ＲＯＳＣの４０分後で維持されていた（カクテル処置、２．８７±０．４０ｍｍｏｌ／ｌ；ビヒクル処置、１．６１±０．２１ｍｍｏｌ／ｌ、Ｐ＜０．０５）（図１０Ａ）。血中グルコースレベルは、ＲＯＳＣの２０分後でビヒクル処置（２８７．７７±１８．２９ｍｇ／ｄＬ）ラットに対してカクテル処置（３７７．５０±２１．３７ｍｇ／ｄＬ）ラットにおいてより高く（Ｐ＜０．０５）、レベルは、両群ともＲＯＳＣの１２０分後まで低下し続けた（図１０Ｂ）。乳酸及びグルコースレベルは最初にＲＯＳＣ後に増加したが、両群ともベースラインに向かって時間依存的な減少傾向があった。
略語：ＣＰＲは心肺蘇生を示し、ＨＣＯ３－は重炭酸塩を示し、ｐＣＯ２は二酸化炭素の分圧を示し、ｐＯ２は酸素分圧を示し、ＲＯＳＣは自己心拍再開を示し、ＳａＯ２は酸素飽和度を示す。
＊Ｐ＜０．０５及び＊＊Ｐ＜０．００５対ビヒクル。
†データは平均値±ＳＥＭとして表した。
略語：ＣＰＲは心肺蘇生を示し、ＨＣＯ３－は重炭酸塩を示し、ｐＣＯ２は二酸化炭素の分圧を示し、ｐＯ２は酸素分圧を示し、ＲＯＳＣは自己心拍再開を示し、ＳａＯ２は酸素飽和度を示す。
＊Ｐ＜０．０５及び＊＊Ｐ＜０．００５対ビヒクル。
†データは平均値±ＳＥＭとして表した。
本発明者らは、ビヒクル処置ラット及びカクテル処置ラットの一般的な生理学的特性を評価した（表７～表８）。ベースライン特性、ＣＡに達する時間、又はＲＯＳＣに達する時間は、ビヒクル処置ラットとカクテル処置ラットとの間で有意差を示さなかった（表７）。動脈血化学分析は、ビヒクル処置ラットとカクテル処置ラットとの間に最小の差を示した。酸素の分圧（ｐＯ２）は、ＲＯＳＣの２０分後で、ビヒクル処置（３８４．０８±３５．９３ｍｍＨｇ）ラットに対してカクテル処置（２２７．９３±３０．２２ｍｍＨｇ）ラットにおいて有意に低かった（Ｐ＜０．００５）。酸素飽和度（ＳａＯ２）は、ＲＯＳＣの４０分後で、ビヒクル処置（９８．５０±０．３６％）ラットに対してカクテル処置（９４．８６±１．２７％）ラットで有意に低かった（Ｐ＜０．０５）（表８）。乳酸レベルは、ＲＯＳＣの２０分後で、ビヒクル処置（３．２８±０．２５ｍｍｏｌ／ｌ）ラットに対して、カクテル処置（４．１３±０．１５ｍｍｏｌ／ｌ）ラットにおいて有意に高く、ＲＯＳＣの４０分後で維持されていた（カクテル処置、２．８７±０．４０ｍｍｏｌ／ｌ；ビヒクル処置、１．６１±０．２１ｍｍｏｌ／ｌ、Ｐ＜０．０５）（図１０Ａ）。血中グルコースレベルは、ＲＯＳＣの２０分後でビヒクル処置（２８７．７７±１８．２９ｍｇ／ｄＬ）ラットに対してカクテル処置（３７７．５０±２１．３７ｍｇ／ｄＬ）ラットにおいてより高く（Ｐ＜０．０５）、レベルは、両群ともＲＯＳＣの１２０分後まで低下し続けた（図１０Ｂ）。乳酸及びグルコースレベルは最初にＲＯＳＣ後に増加したが、両群ともベースラインに向かって時間依存的な減少傾向があった。
【表7】
＊Ｐ＜０．０５及び＊＊Ｐ＜０．００５対ビヒクル。
†データは平均値±ＳＥＭとして表した。
【表8】
＊Ｐ＜０．０５及び＊＊Ｐ＜０．００５対ビヒクル。
†データは平均値±ＳＥＭとして表した。
【0156】
ベースラインと比較して、平均動脈圧（ＭＡＰ）は、ＲＯＳＣの３０分後で両群とも増加した（ビヒクル処置、ベースライン時の８８．４１±３．９４ｍｍＨｇに対して３０分で１２１．６４±２．９４ｍｍＨｇ、Ｐ＜０．０００１、カクテル処置：ベースライン時の８９．０７±３．６３ｍｍＨｇに対して３０分で１０４．３８±３．７６ｍｍＨｇ Ｐ＜０．０５）（図１０Ｃ）。ＲＯＳＣの３０分後に、ＭＡＰは、ビヒクル処置ラット（１２１．６４±２．９４ｍｍＨｇ、Ｐ＜０．０５）に対してカクテル処置ラット（１０４．３８±３．７６ｍｍＨｇ）において著しく低かった。両群とも、ＭＡＰは、ＲＯＳＣの１２０分後までにベースライン値に戻った。ベースライン値と比較して、心拍数（ＨＲ）は、ＲＯＳＣの１２０分後に両群ともより高かった（ビヒクル処置、ベースライン時の３１３．７９±１３．４７ｂｐｍに対して１２０分で３５８．５４±８．１５ｂｐｍ、Ｐ＜０．０５、カクテル処置、ベースライン時の２９５．９４±１２．０８ｂｐｍに対して１２０分で３４７．７４±８．０５ｂｐｍ、Ｐ＜０．００５）（図１０Ｄ）。ＨＲは、ＲＯＳＣの６０分後においてのみ２群間で有意差があった（Ｐ＜０．０１）。ビヒクル処置ラットでは、ＨＲはＲＯＳＣの６０分後で最も高く、次いでベースラインに戻ったが、カクテル処置ラットでは、ＨＲは全時間経過中、ベースライン値に近いままであった（図１０Ｄ）。
【0157】
考察
この試験において、本発明者らは、ＣＡを処置するための新規なカクテル療法を開発した。盲検無作為化対照試験において、本発明者らは、窒息性ＣＡの重度損傷モデルにおける新たに製剤化されたカクテル療法の効力を試験した。本発明者らの結果は、カクテルがこれらのラットにおいて７２時間生存並びに神経学的機能及び脳形態を実質的に改善したことを示し、カクテル介入がＣＡ後の神経学的に無傷な生存を改善することを支持するものである。１２分のＣＡモデルを使用することは、（１）高い死亡率を有し、生存ラットの大部分が重度の神経機能障害を示すと予想され、及び（２）従来のＣＰＲを使用して蘇生させることができる、重度の損傷を誘導することを支援し、これらの２つの因子は、本発明者らのカクテル療法の有効性の検証にこのモデルを使用することを支持するものである。カクテル介入と共にこの重度のＣＡモデルを実施することは、１つの変化を標的とする１つの療法でＣＡを治療するパラダイムを、複数の変化を同時に標的とするカクテル療法を使用することにシフトすることを支持するものである。
この試験において、本発明者らは、ＣＡを処置するための新規なカクテル療法を開発した。盲検無作為化対照試験において、本発明者らは、窒息性ＣＡの重度損傷モデルにおける新たに製剤化されたカクテル療法の効力を試験した。本発明者らの結果は、カクテルがこれらのラットにおいて７２時間生存並びに神経学的機能及び脳形態を実質的に改善したことを示し、カクテル介入がＣＡ後の神経学的に無傷な生存を改善することを支持するものである。１２分のＣＡモデルを使用することは、（１）高い死亡率を有し、生存ラットの大部分が重度の神経機能障害を示すと予想され、及び（２）従来のＣＰＲを使用して蘇生させることができる、重度の損傷を誘導することを支援し、これらの２つの因子は、本発明者らのカクテル療法の有効性の検証にこのモデルを使用することを支持するものである。カクテル介入と共にこの重度のＣＡモデルを実施することは、１つの変化を標的とする１つの療法でＣＡを治療するパラダイムを、複数の変化を同時に標的とするカクテル療法を使用することにシフトすることを支持するものである。
【0158】
多剤カクテルを開発するために、本発明者らは、虚血再灌流傷害に対する適度な神経保護を提供することが個々に示されている異なる薬物を製剤化した１２， ２１－２４。複数の薬物を１つのカクテルに製剤化する作業は、治療有効性の最大化と潜在的な副作用の最小化との間のバランスのために複雑である。これは、候補製剤を試験するための多くの試験において観察された。
【0159】
最終製剤について、本発明者らは、製剤中の薬物の保存を確認するためにＭＳを使用した。ＭＳ分析により、カクテル中のメトホルミン、エダバロン、ゾニポリド、シクロスポリンＡ、Ｎ－アセチルシステイン、及びビタミンＣの存在が確認された。
【0160】
更に、ＭＳ分析は、微量の製剤溶媒ＰＥＧを除いて、いかなる新しいピークも検出しなかった２５。この所見から、検出可能な薬物相互作用がシステムに存在しないと考えられる。生存転帰と共に、カクテル投与後の血行動態及び血液化学の変化をモニターした。開発中に、いくつかの製剤は、転帰不良をもたらす様々な治療効果及び副作用を示した。様々な試験の後、本発明者らは、ＭＡＰ及びＨＲなどの血行動態、並びにｐＨ、ｐＣＯ２、及びｐＯ２などの血液化学パラメータをベースラインに近いレベルに維持する製剤を開発した。これは、ＣＡが極めて異常な生理機能を生み出し、生存は、この重症度を最小限に抑えることに基づくことから、重要である。本発明者らのデータは、カクテルがこの目標を達成することができるが、乳酸レベルにいくらかの変化があったことを示しており、更なる改善の余地がまだあることを示唆している。
【0161】
併用薬物療法は、複数の成分を標的とすることにより、よりロバストな転帰応答をもたらすことができるという概念を用いて、感染症、糖尿病、がん、脂質異常、リウマチ性疾患を含む広範囲の疾患について議論されている２６，２７。ＣＡに対する機械的、技術的、及び薬学的介入の進歩にもかかわらず、生存率は低いままである２８。この低い生存率は、脳がミトコンドリア機能不全３，８、活性酸素種の生成の増加３、代謝破壊８，９、及び神経炎症の増加２９などの因子によって重度に影響を受けるため、神経学的保護の欠如に起因し得る。いくつかの研究が、ＳＳ－３１、サルブリナール、若しくはシクロスポリンＡなどの単一薬剤療法、又はＡＴＰ－塩化マグネシウム、エタノール－エピネフリン－バソプレッシン（ＨＢＮ－１）、若しくはアルゴン－キセノンなどのいくつかの薬剤のいくつかの組み合わせのいずれかのＣＡ後の神経保護を評価してきた３０，３１。多剤療法アプローチは、ＣＡ後にいくらかの良好な生存及び神経学的転帰をもたらすようであるが、これらの療法の多くは、全体的な損傷を軽減する複雑さを克服することができず、最小限の治療的利益しか提供せず、したがって、ヒト患者には適用されてこなかった。ブタ心室細動ＣＡのモデルにおける１つの研究は、エピネフリン、バソプレシン、アミオダロン、重炭酸ナトリウム、及びメトプロロールを含有する「カクテル」の迅速投与が、エピネフリン、バソプレシン、アミオダロン、及び重炭酸ナトリウムの連続投与よりも、より多くの副作用及びより悪い短期的な転帰を生じるようであることを示唆した３２。これは、薬物の数を増加させた初期の試験であったが、それらのカクテル設計は、単一療法での組み合わせではなく、ＣＡ後に薬剤を迅速に投与するものであった。
【0162】
創薬のために平均１２年の時間及びかなりの量の資源が必要であることから３３、本発明者らは、十分に研究された薬剤を１つのカクテル製剤に再利用することは、魅力的かつ実現可能なアプローチであると考える。本発明者らの研究は、ＣＡ後の転帰を改善するための単一療法としての多剤カクテルの可能性を示すことによって、ＣＡ後神経保護におけるこれらの以前の試みを基礎にして前に進むものである。生存及び神経保護の良好な結果にもかかわらず、本発明者らの研究は、いくつかの制限に関連して解釈されるべきである。第１に、個々の薬物を使用した転帰を比較することなく、カクテルとビヒクルとの間でＣＡ後の好ましい転帰を比較した。本発明者らの目的は、複数の経路を同時に標的化することであり、以前の研究は、本発明者らのカクテル中の全ての薬物を単回投与で既に使用していたため、個々の薬物試験を控えることを選択した。第２に、カクテル中の各成分の提案された機構を更に調査する必要がある。これらの薬物は、意図された作用を行って治療効力を付与するが、この製剤で投与された場合に、未知の又は新たに確立されたもののいずれかである他の作用機構を有する可能性がある。第３に、本発明者らのＭＳ分析は、スルブチアミン、ＳＳ－３１、ＣｏＱ１０、又はポロキサマー１８８を検出しなかったが、それは、これらの薬物が構造的に複雑であり、非常に不均一であるためである。現在、カクテル中のこれらの化合物を同定するためのより厳密な方法論を開発している。
【0163】
ＣＡ後の生存は、脳以外の他の臓器がどの程度保護されるかに依存するため、本発明者らの将来の目標は、カクテルが他の器官における損傷に対してどのように保護し得るかを決定すること、及び個々の薬物の連続注射と比較したカクテルの治療効力を評価することである。本発明者らの制限のいくつかに関して、これは、げっ歯類ＣＡの重症モデルにおいて神経学的に無傷な生存を実質的に改善するために、ＣＡ後の様々な傷害媒介性変化を標的化するための証拠に基づく１０種の別個の薬学的薬剤を単一の治療に組み合わせた新規な多剤カクテルの最初の報告である。
【0164】
結論
本発明者らの試験は、ＣＡ後の虚血－再灌流傷害に関与する様々な個々の経路を標的とすることが証明された１０種の薬物を組み合わせた多剤カクテルの開発及び製剤を記載する。このカクテルは、致死性の高い心停止のげっ歯類モデルにおいて７２時間で神経学的無傷生存率を改善した。本発明者らの結果は、アプローチを、現在の単剤療法から、多剤カクテルを用いてＣＡによって影響を受ける複数の経路を同時に治療して、神経保護及び生存率の改善を図るアプローチへ変更することを支持するものである。
本発明者らの試験は、ＣＡ後の虚血－再灌流傷害に関与する様々な個々の経路を標的とすることが証明された１０種の薬物を組み合わせた多剤カクテルの開発及び製剤を記載する。このカクテルは、致死性の高い心停止のげっ歯類モデルにおいて７２時間で神経学的無傷生存率を改善した。本発明者らの結果は、アプローチを、現在の単剤療法から、多剤カクテルを用いてＣＡによって影響を受ける複数の経路を同時に治療して、神経保護及び生存率の改善を図るアプローチへ変更することを支持するものである。
【0165】
補足的方法
化学薬品及び試薬
薬物：メトホルミン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，ＵＳＡ）、ＡＴＰ－塩化マグネシウム（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，ＵＳＡ）、Ｎ－アセチルシステイン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，ＵＳＡ）、ポロキサマー１８８（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，ＵＳＡ）、ＣｏＱ１０（Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ，ＵＳＡ）、シクロスポリンＡ（Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ，ＵＳＡ）、エダラボン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，ＵＳＡ）、ＳＳ－３１（Ｇｅｎｅｍｅｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ＵＳＡ）、スルブチアミン（Ｔｏｒｏｎｔｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｃａｎａｄａ）、ビタミンＣ（Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ，ＵＳＡ）、及びゾニポリド（Ｔｏｒｏｎｔｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｃａｎａｄａ）。
化学薬品及び試薬
薬物：メトホルミン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，ＵＳＡ）、ＡＴＰ－塩化マグネシウム（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，ＵＳＡ）、Ｎ－アセチルシステイン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，ＵＳＡ）、ポロキサマー１８８（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，ＵＳＡ）、ＣｏＱ１０（Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ，ＵＳＡ）、シクロスポリンＡ（Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ，ＵＳＡ）、エダラボン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，ＵＳＡ）、ＳＳ－３１（Ｇｅｎｅｍｅｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ＵＳＡ）、スルブチアミン（Ｔｏｒｏｎｔｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｃａｎａｄａ）、ビタミンＣ（Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ，ＵＳＡ）、及びゾニポリド（Ｔｏｒｏｎｔｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｃａｎａｄａ）。
【0166】
１２分間の窒息性ＣＡについての詳細な動物実験手順
成体雄Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙラット（４００～５００ ｇ）をＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ，ＵＳＡ）から入手し、水及び食物に自由にアクセスできる１２時間の明／暗サイクルでＦｅｉｎｓｔｅｉｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｆｏｒ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈの動物センターに収容した。ラットを４％イソフルレン（Ｉｓｏｔｈｅｓｉａ，Ｂｕｔｌｅｒ－Ｓｃｈｅｉｎ ＡＨＳ）で麻酔し、１４ゲージプラスチックカテーテル（Ｓｕｒｆｌｏ，Ｔｅｒｕｍｏ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ＮＪ，ＵＳＡ）を挿管し、２％イソフルレン下で人工呼吸を行った。左大腿動脈及び静脈にポリエチレンカテーテル（ＰＥ５０，ＢＤ Ｉｎｔｒａｍｅｄｉｃ，ＵＳＡ）をカニューレ挿入して、平均動脈圧をモニターし、薬物注入を補助した。外科的準備及びヘパリン（３００ＩＵ）の注射の後、ＰｏｗｅｒＬａｂ及びＬａｂＣｈａｒｔ（ＡＤＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，ＵＳＡ）を使用して、ＭＡＰ、ＨＲ、及び呼気終末ＣＯ２（ＥＴＣＯ２）などのベースラインの生理学的パラメータを記録した。ＣＡの手順は、ベクロニウム臭化物（２ｍｇ／ｋｇ体重、Ｈｏｓｐｉｒａ，ＵＳＡ）を静脈カテーテルを通して４分間かけてゆっくり注射することから開始した。窒息性ＣＡは、人工呼吸器を停止し、次いでイソフルランを中止することによって誘導した。窒息性ＣＡの１２分後、蘇生を開始し、人工呼吸を１００％酸素で再開し、胸骨圧迫を開始した。ＣＰＲの開始時に、エピネフリン（２０μｇ／ｋｇ、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ，Ｌｉｍｉｔｅｄ，ＵＳＡ）を静脈カテーテルを通して急速注射した。６０ｍｍＨｇを超えるＭＡＰとして定義されるＲＯＳＣに動物が達するまで、ＣＰＲを継続した。ＲＯＳＣがＣＰＲ開始後５分以内に起こらなかった場合、ラットを試験から除外した。血行動態記録をＲＯＳＣの２時間後まで継続した。
成体雄Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙラット（４００～５００ ｇ）をＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ，ＵＳＡ）から入手し、水及び食物に自由にアクセスできる１２時間の明／暗サイクルでＦｅｉｎｓｔｅｉｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｆｏｒ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈの動物センターに収容した。ラットを４％イソフルレン（Ｉｓｏｔｈｅｓｉａ，Ｂｕｔｌｅｒ－Ｓｃｈｅｉｎ ＡＨＳ）で麻酔し、１４ゲージプラスチックカテーテル（Ｓｕｒｆｌｏ，Ｔｅｒｕｍｏ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ＮＪ，ＵＳＡ）を挿管し、２％イソフルレン下で人工呼吸を行った。左大腿動脈及び静脈にポリエチレンカテーテル（ＰＥ５０，ＢＤ Ｉｎｔｒａｍｅｄｉｃ，ＵＳＡ）をカニューレ挿入して、平均動脈圧をモニターし、薬物注入を補助した。外科的準備及びヘパリン（３００ＩＵ）の注射の後、ＰｏｗｅｒＬａｂ及びＬａｂＣｈａｒｔ（ＡＤＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，ＵＳＡ）を使用して、ＭＡＰ、ＨＲ、及び呼気終末ＣＯ２（ＥＴＣＯ２）などのベースラインの生理学的パラメータを記録した。ＣＡの手順は、ベクロニウム臭化物（２ｍｇ／ｋｇ体重、Ｈｏｓｐｉｒａ，ＵＳＡ）を静脈カテーテルを通して４分間かけてゆっくり注射することから開始した。窒息性ＣＡは、人工呼吸器を停止し、次いでイソフルランを中止することによって誘導した。窒息性ＣＡの１２分後、蘇生を開始し、人工呼吸を１００％酸素で再開し、胸骨圧迫を開始した。ＣＰＲの開始時に、エピネフリン（２０μｇ／ｋｇ、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ，Ｌｉｍｉｔｅｄ，ＵＳＡ）を静脈カテーテルを通して急速注射した。６０ｍｍＨｇを超えるＭＡＰとして定義されるＲＯＳＣに動物が達するまで、ＣＰＲを継続した。ＲＯＳＣがＣＰＲ開始後５分以内に起こらなかった場合、ラットを試験から除外した。血行動態記録をＲＯＳＣの２時間後まで継続した。
【0167】
血液試料を、ベースライン時、ＲＯＳＣ時、並びにＲＯＳＣの２０分後、４０分後及び１２０分後に大腿動脈から得た。動脈血ガスを分析するために、ベースライン時、並びにＲＯＳＣの２０分後及び４０分後に、ｐＨ、ｐＣＯ２、ｐＯ２、重炭酸塩、乳酸塩、及びＳａＯ２飽和を測定した。ベースライン時、ＲＯＳＣ時、並びにＲＯＳＣの２０分後、４０分後、及び１２０分後に血中グルコースを測定した。次いで、ＲＯＳＣの１２０分後に、動物を抜管し、カニューレを除去し、縫合し、皮下生理食塩水及びＢｕｐｒｅｎｅｘ（ブプレノルフィン、０．０３ｍｇ／ｋｇ体重、Ｐａｒ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ，ＵＳＡ）を含む術後ケアを実施した。動物を動物収容施設に戻し、承認されたプロトコルに従って毎日のケアを提供した。動物を７２時間生存についてモニターし、ＲＯＳＣの２４、４８、及び７２時間後に、盲検化された研究者によって２つのスコアリングスケールを用いて神経機能を評価した。次いで、ラットを安楽死させ、ニューロン変性の組織学的分析のために全脳を採取した。
データ補足
略語：ＡＴＰ－ＭｇＣｌ２はアデノシン三リン酸－塩化マグネシウムを示し、ＰＢＳはリン酸緩衝生理食塩水を示す。
＊Ｎｅｕｍａｒ ｅｔ ａｌ．，１９９５から採用。
＊Ｊｉａ ｅｔ ａｌ．２００８に記載。
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データ補足
【表9】
【表10】
【表11】
参考文献
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４０．Ｔｓａｉ ＭＳ，ｅｔ ａｌ．Ａｃａｄ Ｅｍｅｒｇ Ｍｅｄ．２０１４；２１：２５７－６５。
４１．Ｌａｍｏｕｒｅｕｘ Ｌ，ｅｔ ａｌ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．２０１４；１３０：Ａ１４８－Ａ１４８。
【0168】
上記は特定の好ましい実施形態に言及しているが、本発明はそのように限定されないことが理解されるであろう。当業者であれば、開示された実施形態に対して様々な改変を行うことができ、そのような改変は本発明の範囲内にあることが意図されていることに気付くであろう。
【0169】
本明細書に引用される全ての刊行物、特許出願及び特許は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。更なる実施形態は、以下の特許請求の範囲に記載される。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図6】
【図7】
【図8A】
【図8B】
【図8C】
【図9A】
【図9B】
【図10A】
【図10B】
【図10C】
【図10D】
【図11A】
【図11B】
【図11C】
【図12A】
【図12B】
【図12C】
【図13A】
【図13B】
【国際調査報告】