特表 2023-550419 二機能性分子

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-12-01

(54)【発明の名称】二機能性分子

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/62 20060101AFI20231124BHJP

   C07K 16/46 20060101ALI20231124BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20231124BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20231124BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20231124BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20231124BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20231124BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20231124BHJP

   C12P 21/08 20060101ALI20231124BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20231124BHJP

   A61K 51/10 20060101ALI20231124BHJP

   A61K 49/00 20060101ALI20231124BHJP

   A61K 38/16 20060101ALI20231124BHJP

   A61K 38/20 20060101ALI20231124BHJP

   A61K 38/19 20060101ALI20231124BHJP

   A61K 38/21 20060101ALI20231124BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20231124BHJP

   A61K 47/68 20170101ALI20231124BHJP

   A61K 47/55 20170101ALI20231124BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20231124BHJP

   A61P 37/02 20060101ALI20231124BHJP

   A61P 31/00 20060101ALI20231124BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20231124BHJP

   A61P 11/00 20060101ALI20231124BHJP

   A61P 1/16 20060101ALI20231124BHJP

   A61P 1/18 20060101ALI20231124BHJP

   A61P 15/00 20060101ALI20231124BHJP

   A61P 19/08 20060101ALI20231124BHJP

   A61P 13/12 20060101ALI20231124BHJP

   A61P 13/10 20060101ALI20231124BHJP

   A61P 13/08 20060101ALI20231124BHJP

   A61P 1/04 20060101ALI20231124BHJP

   A61P 1/02 20060101ALI20231124BHJP

   A61P 11/02 20060101ALI20231124BHJP

   A61P 11/04 20060101ALI20231124BHJP

   A61P 25/00 20060101ALI20231124BHJP

   A61P 21/00 20060101ALI20231124BHJP

   A61P 17/00 20060101ALI20231124BHJP

   A61P 37/04 20060101ALI20231124BHJP

   C12N 15/13 20060101ALN20231124BHJP

   C12N 15/12 20060101ALN20231124BHJP

   C07K 16/28 20060101ALN20231124BHJP

   C07K 16/24 20060101ALN20231124BHJP

   C07K 14/705 20060101ALN20231124BHJP

【ＦＩ】

C12N15/62 Z ZNA

C07K16/46

C07K19/00

C12N15/63 Z

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

C12P21/08

A61K39/395 N

A61K39/395 L

A61K51/10 200

A61K49/00

A61K51/10 100

A61K38/16

A61K38/20

A61K38/19

A61K38/21

A61K45/00

A61K47/68

A61K47/55

A61P35/00

A61P37/02

A61P31/00

A61P43/00 111

A61P43/00 105

A61P43/00 125

A61P11/00

A61P1/16

A61P1/18

A61P15/00

A61P19/08

A61P13/12

A61P13/10

A61P13/08

A61P1/04

A61P1/02

A61P11/02

A61P11/04

A61P25/00

A61P21/00

A61P17/00

A61P37/04

C12N15/13

C12N15/12

C07K16/28

C07K16/24

C07K14/705

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023530164

(86)(22)【出願日】2021-11-18

(85)【翻訳文提出日】2023-07-18

(86)【国際出願番号】 CN2021131389

(87)【国際公開番号】W WO2022105817

(87)【国際公開日】2022-05-27

(31)【優先権主張番号】PCT/CN2020/129918

(32)【優先日】2020-11-18

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(31)【優先権主張番号】PCT/CN2021/073341

(32)【優先日】2021-01-22

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】522458778

【氏名又は名称】スーチョウ・トランスセンタ・セラピューティクス・カンパニー・リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100118902

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 修

(74)【代理人】

【識別番号】100106208

【弁理士】

【氏名又は名称】宮前 徹

(74)【代理人】

【識別番号】100196508

【弁理士】

【氏名又は名称】松尾 淳一

(74)【代理人】

【識別番号】100188374

【弁理士】

【氏名又は名称】一宮 維幸

(72)【発明者】

【氏名】キアン，シュエミン

(72)【発明者】

【氏名】リー，ホンジュン

(72)【発明者】

【氏名】テン，フェイ

(72)【発明者】

【氏名】グオ，フアンフアン

(72)【発明者】

【氏名】グー，イー

【テーマコード（参考）】

4B064

4B065

4C076

4C084

4C085

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B064AG27

4B064CA19

4B064CC24

4B064DA01

4B065AA01X

4B065AA57X

4B065AA72X

4B065AA90X

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA24

4B065CA25

4B065CA44

4C076CC07

4C076CC27

4C076CC31

4C076EE41

4C076EE59

4C076FF34

4C084AA02

4C084AA12

4C084AA17

4C084AA19

4C084BA01

4C084BA08

4C084BA22

4C084BA23

4C084BA41

4C084DA01

4C084DA12

4C084DA14

4C084DA19

4C084DA22

4C084DA47

4C084DB63

4C084DC50

4C084NA05

4C084NA14

4C084ZA021

4C084ZA341

4C084ZA362

4C084ZA591

4C084ZA661

4C084ZA671

4C084ZA751

4C084ZA811

4C084ZA891

4C084ZA941

4C084ZA961

4C084ZB022

4C084ZB071

4C084ZB072

4C084ZB091

4C084ZB211

4C084ZB261

4C084ZB262

4C084ZB311

4C084ZC032

4C084ZC201

4C084ZC411

4C084ZC421

4C084ZC711

4C084ZC712

4C085AA14

4C085AA16

4C085AA23

4C085AA25

4C085AA26

4C085AA27

4C085BB36

4C085BB41

4C085BB42

4C085BB43

4C085CC23

4C085DD62

4C085EE01

4C085HH03

4C085HH11

4C085KA04

4C085KA05

4C085KA27

4C085KA29

4C085KB12

4C085LL18

4C085LL20

4H045AA11

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA10

4H045BA41

4H045CA40

4H045DA51

4H045DA76

4H045DA83

4H045EA20

4H045FA74

(57)【要約】

ＴＧＦβ結合性部分、ＩＬ－１結合性部分、免疫賦活性ポリペプチド（例えば、可溶性ＬＡＧ３もしくは可溶性ＣＤ４）またはＣＤ４７結合性部分に連結されたＰＤ－Ｌ１結合性部分を含むタンパク質、それをコードする単離されたポリヌクレオチド、それを含む医薬組成物およびこれらの使用が提供される。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

免疫チェックポイント分子に結合する第１の部分、およびインターロイキン－１（ＩＬ－１）の活性を遮断する第２の部分を含む、二機能性分子。

【請求項2】

第１の部分が、ＣＤ２７、ＣＤ７０、ＣＤ２８、ＣＤ８０（Ｂ７－１）、ＣＤ８６（Ｂ７－２）、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ（ＣＤ１５４）、ＣＤ１２２、ＣＤ１３７、ＣＤ１３７Ｌ、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、ＯＸ４０Ｌ（ＣＤ２５２）、ＧＩＴＲ、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）およびＩＣＯＳＬＧ（ＣＤ２７５）、ＣＤ２、ＩＣＡＭ－１、ＬＦＡ－１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、ＣＤ３０、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０、ＣＤ１６０およびＣＤ８３からなる群から任意選択で選択される、免疫賦活性チェックポイント分子のアゴニストを含む、請求項１に記載の二機能性分子。

【請求項3】

第１の部分が、Ａ２ＡＲ、Ｂ７－Ｈ３（ＣＤ２７６）、Ｂ７－Ｈ４（ＶＴＣＮ１）、ＢＴＬＡ（ＣＤ２７２）、ＣＴＬＡ－４（ＣＤ１５２）、ＩＤＯ１、ＩＤＯ２、ＴＤＯ、ＫＩＲ、ＬＡＧ３、ＮＯＸ２、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＴＩＭ－３、ＶＩＳＴＡ、ＳＩＧＬＥＣ７（ＣＤ３２８）、ＴＩＧＩＴ、ＰＶＲ（ＣＤ１５５）、ＳＩＧＬＥＣ９（ＣＤ３２９）、ＣＤ１６０、ＬＡＩＲ１、２Ｂ４（ＣＤ２４４）、ＣＤ４７、Ｂ７－Ｈ５からなる群から任意選択で選択される、免疫阻害性チェックポイント分子のアンタゴニストを含む、請求項１に記載の二機能性分子。

【請求項4】

免疫チェックポイント分子がＰＤ－Ｌ１である、請求項３に記載の二機能性分子。

【請求項5】

第１の部分がＰＤ－Ｌ１に対する抗体またはその抗原結合性断片を含み、第２の部分がＩＬ－１結合性部分またはＩＬ－１受容体（ＩＬ－１Ｒ）結合性部分を含む、請求項１～５のいずれかに記載の二機能性分子。

【請求項6】

ＩＬ－１結合性部分が、ＩＬ－１Ｒまたはその断片もしくはバリアント、あるいはＩＬ－１に対する抗体またはその抗原結合性断片を含む、請求項５に記載の二機能性分子。

【請求項7】

ＩＬ－１に対する抗体またはその抗原結合性断片が、ＸＢ２００１、ルチキズマブ、ＬＹ２１８９１０２およびベルメキマブからなる群から選択される抗ＩＬ－１α抗体由来、またはＳＳＧＪ－６１３、ＣＤＰ４８４、カナキヌマブおよびゲボキズマブからなる群から選択される抗ＩＬ－１β抗体由来の重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域を含む、請求項６に記載の二機能性分子。

【請求項8】

ＩＬ－１に対する抗体またはその抗原結合性断片が、配列番号１０４もしくは配列番号１１２の配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号１０５もしくは配列番号１１３の配列を含むＨＣＤＲ２、および配列番号１０６もしくは配列番号１１４の配列を含むＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、ならびに／または配列番号１０７もしくは配列番号１１５の配列を含むＬＣＤＲ１、配列番号１０８もしくは配列番号１１６の配列を含むＬＣＤＲ２、および配列番号１０９もしくは配列番号１１７の配列を含むＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む、請求項６に記載の二機能性分子。

【請求項9】

ＩＬ－１に対する抗体またはその抗原結合性断片が、配列番号１０４の配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号１０５の配列を含むＨＣＤＲ２、および配列番号１０６の配列を含むＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、ならびに／または配列番号１０７の配列を含むＬＣＤＲ１、配列番号１０８の配列を含むＬＣＤＲ２、および配列番号１０９の配列を含むＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む、請求項６に記載の二機能性分子。

【請求項10】

ＩＬ－１に対する抗体またはその抗原結合性断片が、配列番号１１２の配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号１１３の配列を含むＨＣＤＲ２、および配列番号１１４の配列を含むＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、ならびに／または配列番号１１５の配列を含むＬＣＤＲ１、配列番号１１６の配列を含むＬＣＤＲ２、および配列番号１１７の配列を含むＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む、請求項６に記載の二機能性分子。

【請求項11】

ＩＬ－１に対する抗体またはその抗原結合性断片が、配列番号１０２、配列番号１１０、およびこれらに少なくとも８０％の配列同一性を有するその相同性配列からなる群から選択される配列を含む重鎖可変領域、ならびに／または配列番号１０３、配列番号１１１、およびこれらに少なくとも８０％の配列同一性を有するその相同性配列からなる群から選択される配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項６に記載の二機能性分子。

【請求項12】

ＩＬ－１に対する抗体またはその抗原結合性断片が、配列番号１０２、およびこれに少なくとも８０％の配列同一性を有するその相同性配列からなる群から選択される配列を含む重鎖可変領域、ならびに／または配列番号１０３、およびこれに少なくとも８０％の配列同一性を有するその相同性配列からなる群から選択される配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項６に記載の二機能性分子。

【請求項13】

ＩＬ－１に対する抗体またはその抗原結合性断片が、配列番号１１０、およびこれに少なくとも８０％の配列同一性を有するその相同性配列からなる群から選択される配列を含む重鎖可変領域、ならびに／または配列番号１１１、およびこれに少なくとも８０％の配列同一性を有するその相同性配列からなる群から選択される配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項６に記載の二機能性分子。

【請求項14】

ＩＬ－１Ｒ結合性部分が、インターロイキン－１受容体アンタゴニストまたはその断片もしくはバリアント、あるいはＩＬ－１Ｒに対する抗体またはその抗原結合性断片を含む、請求項５に記載の二機能性分子。

【請求項15】

ＩＬ－１Ｒに対する抗体またはその抗原結合性断片が、スペソリマブ、アステゴリマブ、イムシドリマブ、ＡＭＧ１０８、メルリリマブ、ニダニリマブ、ＭＥＤＩ８９６８、ＲＥＧＮ６４９０、ＨＢ００３４およびＣＳＣ０１２からなる群から選択される抗体由来の重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域を含む、請求項１４に記載の二機能性分子。

【請求項16】

ＰＤ－Ｌ１に結合する第１の部分、およびａ）免疫抑制性サイトカインの活性を遮断する、またはｂ）免疫を刺激する第２の部分を含む二機能性分子であって、第１の部分が、重鎖可変（ＶＨ）領域および／または軽鎖可変（ＶＬ）領域を含む、ＰＤ－Ｌ１に対する抗体またはその抗原結合性断片を含み、重鎖可変領域が、
ａ）ＤＹＹＭＮ（配列番号１）もしくはこれに少なくとも８０％の配列同一性のある相同性配列を含むＨＣＤＲ１、
ｂ）ＤＩＮＰＮＮＸ_１Ｘ_２ＴＸ_３ＹＮＨＫＦＫＧ（配列番号１９）もしくはこれに少なくとも８０％の配列同一性のある相同性配列を含むＨＣＤＲ２、および
ｃ）ＷＧＤＧＰＦＡＹ（配列番号３）もしくはこれに少なくとも８０％の配列同一性のある相同性配列を含むＨＣＤＲ３
を含み、かつ／または
軽鎖可変領域が、
ｄ）ＫＡＳＱＮＶＸ_４Ｘ_５Ｘ_６ＶＡ（配列番号２０）もしくはこれに少なくとも８０％の配列同一性のある相同性配列からなる群から選択される配列を含むＬＣＤＲ１、
ｅ）ＳＸ_７ＳＸ_８ＲＹＴ（配列番号２１）もしくはこれに少なくとも８０％の配列同一性のある相同性配列からなる群から選択される配列を含むＬＣＤＲ２、および
ｆ）ＱＱＹＳＮＹＰＴ（配列番号６）もしくはこれに少なくとも８０％の配列同一性のある相同性配列からなる群から選択される配列を含むＬＣＤＲ３
を含み、
式中、Ｘ_１がＧまたはＡであり、Ｘ_２がＧまたはＤまたはＱまたはＥまたはＬであり、Ｘ_３がＳまたはＭまたはＱまたはＬまたはＶであり、Ｘ_４がＧまたはＰまたはＫであり、Ｘ_５がＡまたはＧであり、Ｘ_６がＡまたはＩであり、Ｘ_７がＡまたはＮまたはＲまたはＶであり、かつＸ_８がＮまたはＨまたはＶまたはＤである、二機能性分子。

【請求項17】

重鎖可変領域が、
ａ）配列番号１の配列を含むＨＣＤＲ１、
ｂ）配列番号２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１７および配列番号１８からなる群から選択される配列を含むＨＣＤＲ２、ならびに
ｃ）配列番号３の配列を含むＨＣＤＲ３、
を含み、かつ／または
軽鎖可変領域が、
ｄ）配列番号４、配列番号７、配列番号８および配列番号９からなる群から選択される配列を含むＬＣＤＲ１、
ｅ）配列番号５、配列番号１０、配列番号１１および配列番号１２からなる群から選択される配列を含むＬＣＤＲ２、ならびに
ｆ）配列番号６の配列を含むＬＣＤＲ３
を含む、請求項１６に記載の二機能性分子。

【請求項18】

重鎖可変領域が、
ａ）配列番号１の配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号２の配列を含むＨＣＤＲ２、および配列番号３の配列を含むＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；
ｂ）配列番号１の配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号１３の配列を含むＨＣＤＲ２、および配列番号３の配列を含むＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；
ｃ）配列番号１の配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号１４の配列を含むＨＣＤＲ２、および配列番号３の配列を含むＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；
ｄ）配列番号１の配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号１５の配列を含むＨＣＤＲ２、および配列番号３の配列を含むＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；ならびに
ｅ）配列番号１の配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号１７の配列を含むＨＣＤＲ２、および配列番号３の配列を含むＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域
からなる群から選択される、請求項１７に記載の二機能性分子。

【請求項19】

軽鎖可変領域が、
ａ）配列番号４の配列を含むＬＣＤＲ１、配列番号５の配列を含むＬＣＤＲ２、および配列番号６の配列を含むＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；
ｂ）配列番号９の配列を含むＬＣＤＲ１、配列番号５の配列を含むＬＣＤＲ２、および配列番号６の配列を含むＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；
ｃ）配列番号８の配列を含むＬＣＤＲ１、配列番号５の配列を含むＬＣＤＲ２、および配列番号６の配列を含むＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；
ｄ）配列番号４の配列を含むＬＣＤＲ１、配列番号１２の配列を含むＬＣＤＲ２、および配列番号６の配列を含むＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；ならびに
ｅ）配列番号４の配列を含むＬＣＤＲ１、配列番号１１の配列を含むＬＣＤＲ２、および配列番号６の配列を含むＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域
からなる群から選択される、請求項１７または１８に記載の二機能性分子。

【請求項20】

ＰＤ－Ｌ１に対する抗体もしくはその抗原結合性断片が、重鎖ＨＦＲ１、ＨＦＲ２、ＨＦＲ３およびＨＦＲ４の１つもしくは複数、ならびに／または軽鎖ＬＦＲ１、ＬＦＲ２、ＬＦＲ３およびＬＦＲ４の１つもしくは複数をさらに含み、
ａ）ＨＦＲ１が、ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＸ_９ＦＴ（配列番号４０）またはこれに少なくとも８０％の配列同一性のある相同性配列を含み、
ｂ）ＨＦＲ２が、ＷＶＲＱＡＰＧＱＸ_１０ＬＥＷＭＧ（配列番号４１）またはこれに少なくとも８０％の配列同一性のある相同性配列を含み、
ｃ）ＨＦＲ３配列が、ＲＶＴＸ_１６ＴＶＤＸ_１１ＳＩＳＴＡＹＭＥＬＳＲＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＸ_１２Ｘ_１３（配列番号４２）またはこれに少なくとも８０％の配列同一性のある相同性配列を含み、
ｄ）ＨＦＲ４が、ＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号２５）またはこれに少なくとも８０％の配列同一性のある相同性配列を含み、
ｅ）ＬＦＲ１が、ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣ（配列番号２６）またはこれに少なくとも８０％の配列同一性のある相同性配列を含み、
ｆ）ＬＦＲ２が、ＷＹＱＱＫＰＧＫＸ_１４ＰＫＬＬＩＹ（配列番号４３）またはこれに少なくとも８０％の配列同一性のある相同性配列を含み、
ｇ）ＬＦＲ３が、ＧＶＰＸ_１５ＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＸ_１７ＴＩＳＳＬＱＰＥＤＩＡＴＹＹＣ（配列番号４４）またはこれに少なくとも８０％の配列同一性のある相同性配列を含み、
ｈ）ＬＦＲ４が、ＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号２９）またはこれに少なくとも８０％の配列同一性のある相同性配列を含み、
式中、Ｘ_９がＴまたはＶであり、Ｘ_１０がＧまたはＳであり、Ｘ_１１がＴまたはＫであり、Ｘ_１２がＡまたはＶであり、Ｘ_１３がＲまたはＫであり、Ｘ_１４がＡまたはＳであり、Ｘ_１５がＳまたはＤであり、Ｘ_１６がＭまたはＶであり、かつＸ_１７がＦまたはＬである、請求項１６から１９のいずれかに記載の二機能性分子。

【請求項21】

ＨＦＲ１が、配列番号２２および３０からなる群から選択される配列を含み、
ＨＦＲ２が、配列番号２３および３１からなる群から選択される配列を含み、
ＨＦＲ３が、配列番号２４および３２～３５からなる群から選択される配列を含み、
ＨＦＲ４が、配列番号２５の配列を含み、
ＬＦＲ１が、配列番号２６からなる群からの配列を含み、
ＬＦＲ２が、配列番号２７および３６からなる群から選択される配列を含み、
ＬＦＲ３が、配列番号２８、および３７～３８、３９、４５からなる群から選択される配列を含み、
ＬＦＲ４が、配列番号２９の配列を含む、請求項２０に記載の二機能性分子。

【請求項22】

重鎖可変領域が、配列番号４６、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、およびこれらに少なくとも８０％の配列同一性を有するその相同性配列からなる群から選択される配列を含む、請求項１６から２１のいずれかに記載の二機能性分子。

【請求項23】

軽鎖可変領域が、配列番号４７、配列番号５４、配列番号５５、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、およびこれらに少なくとも８０％の配列同一性を有するその相同性配列からなる群から選択される配列を含む、請求項１６から２２のいずれかに記載の二機能性分子。

【請求項24】

ＰＤ－Ｌ１に対する抗体またはその抗原結合性断片が、配列番号４９／５４、５０／５４、５１／５４、５２／５４、４９／５５、５０／５５、５１／５５、５２／５５、５８／６２、５８／６３、５８／６４、５８／６５、５９／６２、５９／６３、５９／６４、５９／６５、６０／６２、６０／６３、６０／６４および６０／６５からなる群から選択される重鎖可変領域配列と軽鎖可変領域配列との対を含む、請求項１６に記載の二機能性分子。

【請求項25】

ＰＤ－Ｌ１に対する抗体またはその抗原結合性断片が、ＰＤ－Ｌ１への特異的結合特異性および／または親和性を依然として保持する１つまたは複数のアミノ酸残基置換または改変をさらに含む、請求項１６から２４のいずれかに記載の二機能性分子。

【請求項26】

置換または改変の少なくとも１つが、ＶＨまたはＶＬ配列のＣＤＲ配列の１つもしくは複数、および／または非ＣＤＲ領域の１つもしくは複数にある、請求項２５に記載の二機能性分子。

【請求項27】

ＰＤ－Ｌ１に対する抗体またはその抗原結合性断片が、免疫グロブリン定常領域、任意選択でヒトＩｇの定常領域、または任意選択でヒトＩｇＧの定常領域をさらに含む、請求項１６から２６のいずれかに記載の二機能性分子。

【請求項28】

定常領域が、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４のＦｃ領域を含む、請求項２７に記載の二機能性分子。

【請求項29】

定常領域が、対応する野生型Ｆｃ領域と比べて低下したエフェクター機能を有するＦｃバリアントを含む、請求項２８に記載の二機能性分子。

【請求項30】

Ｆｃバリアントが、２２０Ｓ、２２６Ｓ、２２８Ｐ、２２９Ｓ、２３３Ｐ、２３４Ｖ、２３４Ｇ、２３４Ａ、２３４Ｆ、２３４Ａ、２３５Ａ、２３５Ｇ、２３５Ｅ、２３６Ｅ、２３６Ｒ、２３７Ａ、２３７Ｋ、２３８Ｓ、２６７Ｒ、２６８Ａ、２６８Ｑ、２６９Ｒ、２９７Ａ、２９７Ｑ、２９７Ｇ、３０９Ｌ、３１８Ａ、３２２Ａ、３２５Ｌ、３２８Ｒ、３３０Ｓ、３３１Ｓおよびこれらの任意の組合せからなる群から選択される１つまたは複数のアミノ酸残基置換を含み、Ｆｃ領域中の残基の番号付けがＫａｂａｔにあるとおりのＥＵインデックスのものである、請求項２９に記載の二機能性分子。

【請求項31】

Ｆｃバリアントが、ａ）Ｋ３２２Ａ、Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａ；ｂ）Ｐ３３１Ｓ、Ｌ２３４ＦおよびＬ２３５Ｅ；ｃ）Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａ；ｃ）Ｎ２９７Ａ；ｄ）Ｎ２９７Ｑ；ｅ）Ｎ２９７Ｇ；ｆ）Ｌ２３５Ｅ；ｇ）Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａ（ＩｇＧ１）；ｈ）Ｆ２３４ＡおよびＬ２３５Ａ（ＩｇＧ４）；ｉ）Ｈ２６８Ｑ、Ｖ３０９Ｌ、Ａ３３０ＳおよびＰ３３１Ｓ（ＩｇＧ２）；ｊ）Ｖ２３４Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｐ２３８Ｓ、Ｈ２６８Ａ、Ｖ３０９Ｌ、Ａ３３０ＳおよびＰ３３１Ｓ（ＩｇＧ２）からなる群から選択される変異の組合せを含み、Ｆｃ領域中の残基の番号付けがＫａｂａｔにあるとおりのＥＵインデックスのものである、請求項２９から３０のいずれかに記載の二機能性分子。

【請求項32】

Ｆｃバリアントが、配列番号８１のアミノ酸配列を含む、請求項２９から３１のいずれかに記載の二機能性分子。

【請求項33】

ＰＤ－Ｌ１に対する抗体またはその抗原結合性断片がヒト化されている、請求項１６から３２のいずれかに記載の二機能性分子。

【請求項34】

抗原結合性断片が、ダイアボディ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｄ、Ｆｖ断片、ジスルフィド安定化Ｆｖ断片（ｄｓＦｖ）、（ｄｓＦｖ）_２、二特異性ｄｓＦｖ（ｄｓＦｖ－ｄｓＦｖ’）、ジスルフィド安定化ダイアボディ（ｄｓダイアボディ）、１本鎖抗体分子（ｓｃＦｖ）、ｓｃＦｖ二量体（二価ダイアボディ）、多特異性抗体、ラクダ化単一ドメイン抗体、ナノボディ、ドメイン抗体および二価ドメイン抗体である、請求項１６から３３のいずれかに記載の二機能性分子。

【請求項35】

抗体またはその抗原結合性断片が、ヒトＰＤ－Ｌ１およびカニクイザルＰＤ－Ｌ１の両方に結合することが可能である、請求項１６から３４のいずれかに記載の二機能性分子。

【請求項36】

第１の部分が、ＰＤ－Ｌ１への結合について、請求項１６から３５のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合性断片と競合する抗体またはその抗原結合性断片を含む、請求項１から１５のいずれかに記載の二機能性分子。

【請求項37】

免疫抑制性サイトカインが、トランスフォーミング増殖因子ベータ（ＴＧＦ－β）スーパーファミリー中のサイトカイン、ＩＬ－１、または血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）を含む、請求項１６から３６のいずれかに記載の二機能性分子。

【請求項38】

ＴＧＦ－βスーパーファミリー中の免疫抑制性サイトカインが、ＴＧＦ－β、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、アクチビン、ＮＯＤＡＬ、および増殖分化因子（ＧＤＦ）を含む、請求項３７に記載の二機能性分子。

【請求項39】

免疫抑制性サイトカインがＴＧＦ－βである、請求項１６から３８のいずれか一項に記載の二機能性分子。

【請求項40】

第２の部分がＴＧＦ－β結合性部分を含む、請求項１６から３９に記載の二機能性分子。

【請求項41】

ＴＧＦ－β結合性部分が、可溶性ＴＧＦβ受容体（ＴＧＦβＲ）またはそのＴＧＦ－β結合性断片もしくはバリアント、あるいはＴＧＦβに対する抗体およびその抗原結合性断片を含む、請求項４０に記載の二機能性分子。

【請求項42】

可溶性ＴＧＦβＲが、ＴＧＦβＲの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）またはそのＴＧＦ－β結合性断片もしくはバリアントを含む、請求項４１に記載の二機能性分子。

【請求項43】

ＴＧＦβＲが、ＴＧＦβ受容体Ｉ（ＴＧＦβＲＩ）、ＴＧＦβ受容体ＩＩ（ＴＧＦβＲＩＩ）、ＴＧＦβ受容体ＩＩＩ（ＴＧＦβＲＩＩＩ）、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される、請求項４２に記載の二機能性分子。

【請求項44】

ＴＧＦβＲがＴＧＦβＲＩＩである、請求項４２に記載の二機能性分子。

【請求項45】

ＴＧＦβＲＩＩが、ＴＧＦβ２およびＴＧＦβ３よりもＴＧＦβ１に選択的に結合する、請求項４４に記載の二機能性分子。

【請求項46】

ＴＧＦβ１が、ヒトＴＧＦβ１またはマウスＴＧＦβ１である、請求項４５に記載の二機能性分子。

【請求項47】

ＴＧＦβＲのＥＣＤが、配列番号６６、７９、７８、７７のアミノ酸配列、またはＴＧＦ－βへの特異的結合特異性および／または親和性を依然として保持する、これらに少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む、請求項４２から４６のいずれかに記載の二機能性分子。

【請求項48】

第２の部分が、ＩＬ－１結合性部分またはＩＬ－１受容体（ＩＬ－１Ｒ）結合性部分を含む、請求項３６に記載の二機能性分子。

【請求項49】

ＩＬ－１結合性部分が、可溶性ＩＬ－１Ｒ、ＩＬ－１ＲのＩＬ－１結合性断片もしくはバリアント、またはＩＬ－１に対する抗体もしくはその抗原結合性断片を含む、請求項４８に記載の二機能性分子。

【請求項50】

ＩＬ－１に対する抗体またはその抗原結合性断片が、ＸＢ２００１、ルチキズマブ、ＬＹ２１８９１０２およびベルメキマブからなる群から選択される抗ＩＬ－１α抗体由来、またはＳＳＧＪ－６１３、ＣＤＰ４８４、カナキヌマブおよびゲボキズマブからなる群から選択される抗ＩＬ－１β抗体由来の重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域を含む、請求項４９に記載の二機能性分子。

【請求項51】

ＩＬ－１に対する抗体またはその抗原結合性断片が、配列番号１０４もしくは配列番号１１２の配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号１０５もしくは配列番号１１３の配列を含むＨＣＤＲ２、および配列番号１０６もしくは配列番号１１４の配列を含むＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、ならびに／または配列番号１０７もしくは配列番号１１５の配列を含むＬＣＤＲ１、配列番号１０８もしくは配列番号１１６の配列を含むＬＣＤＲ２、および配列番号１０９もしくは配列番号１１７の配列を含むＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む、請求項４９に記載の二機能性分子。

【請求項52】

ＩＬ－１に対する抗体またはその抗原結合性断片が、配列番号１０４の配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号１０５の配列を含むＨＣＤＲ２、および配列番号１０６の配列を含むＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、ならびに／または配列番号１０７の配列を含むＬＣＤＲ１、配列番号１０８の配列を含むＬＣＤＲ２、および配列番号１０９の配列を含むＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む、請求項４９に記載の二機能性分子。

【請求項53】

ＩＬ－１に対する抗体またはその抗原結合性断片が、配列番号１１２の配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号１１３の配列を含むＨＣＤＲ２および配列番号１１４の配列を含むＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、ならびに／または配列番号１１５の配列を含むＬＣＤＲ１、配列番号１１６の配列を含むＬＣＤＲ２および配列番号１１７の配列を含むＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む、請求項４９に記載の二機能性分子。

【請求項54】

ＩＬ－１に対する抗体またはその抗原結合性断片が、配列番号１０２、配列番号１１０およびこれらに少なくとも８０％の配列同一性を有するその相同性配列からなる群から選択される配列を含む重鎖可変領域、ならびに／または配列番号１０３、配列番号１１１およびこれらに少なくとも８０％の配列同一性を有するその相同性配列からなる群から選択される配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項４９に記載の二機能性分子。

【請求項55】

ＩＬ－１に対する抗体またはその抗原結合性断片が、配列番号１０２およびこれに少なくとも８０％の配列同一性を有するその相同性配列からなる群から選択される配列を含む重鎖可変領域、ならびに／または配列番号１０３およびこれに少なくとも８０％の配列同一性を有するその相同性配列からなる群から選択される配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項４９に記載の二機能性分子。

【請求項56】

ＩＬ－１に対する抗体またはその抗原結合性断片が、配列番号１１０、およびこれに少なくとも８０％の配列同一性を有するその相同性配列からなる群から選択される配列を含む重鎖可変領域、ならびに／または配列番号１１１、およびこれに少なくとも８０％の配列同一性を有するその相同性配列からなる群から選択される配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項４９に記載の二機能性分子。

【請求項57】

配列番号１１８もしくは配列番号１２０のアミノ酸配列を含む重鎖、および／または配列番号１１９もしくは配列番号１２１のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、請求項４９に記載の二機能性分子。

【請求項58】

ＩＬ－１結合性部分が、ＩＬ－１ＲＩの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）、ＩＬ－１ＲＩ、ＩＬ－１ＲＩのＥＣＤ、ＩＬ－１ＲＩＩ、またはＩＬ－１ＲＩＩのＥＣＤ、またはＩＬ－１ＲＡＰ、またはＩＬ－１ＲＡＰのＥＣＤ、ＩＬ－１ｓＲＩまたはＩＬ－１ｓＲＩＩのいずれかのＩＬ－１結合性断片またはバリアントを含む、請求項４９に記載の二機能性分子。

【請求項59】

ＩＬ－１Ｒ結合性部分が、ＩＬ－１ＲａまたはそのＩＬ－１結合性断片もしくはバリアント、あるいはＩＬ－１Ｒに対する抗体またはその抗原結合性断片を含む、請求項４８に記載の二機能性分子。

【請求項60】

ＩＬ－１Ｒに対する抗体またはその抗原結合性断片が、スペソリマブ、アステゴリマブ、イムシドリマブ、ＡＭＧ１０８、メルリリマブ、ニダニリマブ、ＭＥＤＩ８９６８、ＲＥＧＮ６４９０、ＨＢ００３４およびＣＳＣ０１２からなる群から選択される抗体由来の重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域を含む、請求項５９に記載の二機能性分子。

【請求項61】

ＩＬ－１Ｒ結合性部分が、配列番号６７もしくは７６のアミノ酸配列、または配列番号６７もしくは７６に少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、またはそのＩＬ－１結合性断片もしくはバリアントを含む、請求項６０に記載の二機能性分子。

【請求項62】

ＩＬ－１が、ＩＬ－１αまたはＩＬ－１βである、請求項４８から４９のいずれかに記載の二機能性分子。

【請求項63】

ＩＬ－１βがヒトＩＬ－１βである、請求項６２に記載の二機能性分子。

【請求項64】

第２の部分が、抗腫瘍免疫を刺激し、かつ免疫賦活性ポリペプチドを含む、請求項１６から３６のいずれかに記載の二機能性分子。

【請求項65】

免疫賦活性ポリペプチドが、インターロイキン（ＩＬ）－２（ＩＬ－２）、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－２３、ＩＬ－２７、ＩＬ－３５、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、可溶性ＣＤ４、可溶性ＬＡＧ－３、ＩＦＮ－α、またはこれらの機能性等価物を含む、請求項６４に記載の二機能性分子。

【請求項66】

可溶性ＬＡＧ－３が、ＬＡＧ－３の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）またはそのＭＨＣＩＩ結合性バリアントを含む、請求項６５に記載の二機能性分子。

【請求項67】

第２の部分が、抗腫瘍免疫を刺激し、かつ免疫阻害性受容体シグナル伝達のアンタゴニストを含む、請求項１６から３６のいずれかに記載の二機能性分子。

【請求項68】

免疫阻害性受容体が、シグナル制御タンパク質アルファ（ＳＩＲＰα）である、請求項６７に記載の二機能性分子。

【請求項69】

第２の部分が、ＣＤ４７とＳＩＲＰαとの間の相互作用を遮断する、請求項６８に記載の二機能性分子。

【請求項70】

第２の部分が、ＣＤ４７結合性ドメインまたはＳＩＲＰα結合性ドメインを含む、請求項６９に記載の二機能性分子。

【請求項71】

ＣＤ４７結合性ドメインが、可溶性ＳＩＲＰαまたはそのＣＤ４７結合性断片もしくはバリアント、あるいは抗ＣＤ４７抗体またはその抗原結合性断片を含む、請求項７０に記載の二機能性分子。

【請求項72】

可溶性ＳＩＲＰαが、ＳＩＲＰαの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）またはそのＣＤ４７結合性バリアントを含む、請求項７１に記載の二機能性分子。

【請求項73】

ＣＤ４７結合性ドメインが、配列番号８４のアミノ酸配列、またはＣＤ４７に対する結合特異性を依然として保持する、これに少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項７０に記載の二機能性分子。

【請求項74】

ＳＩＲＰα結合性ドメインが、可溶性ＣＤ４７またはそのＳＩＲＰα結合性断片もしくはバリアント、あるいは抗ＳＩＲＰα抗体またはその抗原結合性断片を含む、請求項７０に記載の二機能性分子。

【請求項75】

可溶性ＣＤ４７が、ＣＤ４７の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）またはそのＳＩＲＰα結合性断片もしくはバリアント、抗ＳＩＲＰα抗体またはその抗原結合性断片を含む、請求項７４に記載の二機能性分子。

【請求項76】

第１の部分と第２の部分とを繋ぐリンカーをさらに含む、請求項１～７５のいずれかに記載の二機能性分子。

【請求項77】

リンカーが、切断性リンカー、非切断性リンカー、ペプチドリンカー、可動性リンカー、剛性リンカー、ヘリックスリンカー、および非ヘリックスリンカーからなる群から選択される、請求項７６に記載の二機能性分子。

【請求項78】

リンカーが（（Ｇ）ｎＳ）ｍのアミノ酸配列を含み、式中、ｍおよびｎが独立的に０から３０から選択される整数である、請求項７７に記載の二機能性分子。

【請求項79】

１つまたは複数の第２の部分を含む、請求項１６から７８のいずれかに記載の二機能性分子。

【請求項80】

第２の部分の少なくとも１つが、第１の部分のポリペプチド鎖のＮ末端またはＣ末端に連結されている、請求項７９に記載の二機能性分子。

【請求項81】

第２の部分の少なくとも１つが、ａ）第１の部分の重鎖のＮ末端もしくはＣ末端、またはｂ）第１の部分の軽鎖のＮ末端もしくはＣ末端に連結されている、請求項７９に記載の二機能性分子。

【請求項82】

第２の部分の少なくとも１つが、第１の部分の重鎖定常領域のＣ末端に連結されている、請求項７９に記載の二機能性分子。

【請求項83】

第２の部分のそれぞれが、第１の部分の各重鎖定常領域のＣ末端にそれぞれ連結されている、請求項７９に記載の二機能性分子。

【請求項84】

第１の部分の重鎖のＮ末端、第１の部分の重鎖のＣ末端、第１の部分の軽鎖のＮ末端、第１の部分の軽鎖のＣ末端、またはこれらの任意の組合せにそれぞれ連結された１つより多い第２の部分を含む、請求項７９に記載の二機能性分子。

【請求項85】

ホモ二量体重鎖またはヘテロ二量体重鎖を含む、請求項７９から８４のいずれか一項に記載の二機能性分子。

【請求項86】

重鎖が、第２の部分の存在または位置に関してヘテロ二量体性である、請求項７９から８４のいずれか一項に記載の二機能性分子。

【請求項87】

ヘテロ二量体重鎖が、第２の部分を有する一方の重鎖およびそれを有さない他方の重鎖を含む、請求項８６に記載の二機能性分子。

【請求項88】

ヘテロ二量体重鎖が、ホモ二量体化を防止する、および／またはヘテロ二量体化を支持するように関連するヘテロ二量体Ｆｃ領域をさらに含む、請求項８６に記載の二機能性分子。

【請求項89】

ヘテロ二量体Ｆｃ領域が、ノブイントゥーホール、疎水性相互作用、静電相互作用、親水性相互作用、または可動性の増加を介してヘテロ二量体に会合することが可能である、請求項８６に記載の二機能性分子。

【請求項90】

ヘテロ二量体Ｆｃ領域が、１つのＦｃポリペプチド鎖中にＹ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡもしくはＹ４０７Ｖまたはこれらの任意の組合せ、および別のＦｃポリペプチド鎖中にＳ３５４ＣもしくはＴ３６６Ｗまたはこれらの組合せを含み、Ｆｃポリペプチド鎖中の残基の番号付けがＫａｂａｔにあるとおりのＥＵインデックスのものである、請求項８８から８９のいずれかに記載の二機能性分子。

【請求項91】

１つまたは複数のコンジュゲート部分にさらに連結されている、請求項１～９０いずれかに記載の二機能性分子。

【請求項92】

コンジュゲート部分が、クリアランス改変剤、化学療法剤、毒素、放射性同位元素、ランタニド、発光標識、蛍光標識、酵素基質標識、ＤＮＡアルキル化剤、トポイソメラーゼ阻害剤、チューブリン結合剤、またはアンドロゲン受容体阻害剤などの他の抗がん薬物を含む、請求項９１に記載の二機能性分子。

【請求項93】

請求項１～９２のいずれかに記載の二機能性分子、および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物またはキット。

【請求項94】

請求項１６から９２のいずれか一項に記載の二機能性分子をコードする単離されたポリヌクレオチド。

【請求項95】

請求項９４に記載の単離されたポリヌクレオチドを含むベクター。

【請求項96】

請求項９５に記載のベクターを含む宿主細胞。

【請求項97】

請求項９５に記載のベクターが発現される条件下で請求項９６に記載の宿主細胞を培養するステップを含む、請求項１６から９２のいずれか一項に記載の二機能性分子を発現させる方法。

【請求項98】

請求項１６から９２のいずれか一項に記載の二機能性分子、および／または請求項９３に記載の医薬組成物もしくはキットの治療有効量を対象に投与するステップを含む、対象においてＰＤ－Ｌ１関連疾患を処置する、予防するまたは軽減する方法。

【請求項99】

疾患が、免疫関連疾患もしくは障害、がん、または感染性疾患である、請求項９８に記載の方法。

【請求項100】

がんが、肺がん（例えば、非小細胞肺がん）、肝臓がん、膵臓がん、乳がん、気管支がん、骨がん、肝臓および胆管がん、卵巣がん、精巣がん、腎臓がん、膀胱がん、頭頸部がん、脊椎がん、脳がん、子宮頸がん、子宮がん、子宮内膜がん、結腸がん、結腸直腸がん、前立腺がん、胃－食道がん、直腸がん、肛門がん、胃腸がん、皮膚がん、下垂体がん、胃がん、腟がん、甲状腺がん、神経膠芽腫、星状細胞腫、黒色腫、骨髄異形成症候群、肉腫、奇形腫、神経膠腫ならびに腺癌からなる群から選択される、請求項９９に記載の方法。

【請求項101】

対象が、ＰＤ－Ｌ１発現がん細胞を有すると同定されている、請求項９８から１００のいずれかに記載の方法。

【請求項102】

ＰＤ－Ｌ１関連疾患が、ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１単剤治療に抵抗性である、請求項９８から１０１のいずれかに記載の方法。

【請求項103】

対象がヒトである、請求項９８から１０２のいずれかに記載の方法。

【請求項104】

第２の治療剤の治療有効量を投与するステップをさらに含む、請求項９８から１０３のいずれかに記載の方法。

【請求項105】

第２の治療剤が、化学療法剤、抗がん薬物、放射線療法、免疫療法剤、血管新生抑制剤、標的療法剤、細胞療法剤、遺伝子療法剤、ホルモン療法剤、またはサイトカインから選択される、請求項１０４に記載の方法。

【請求項106】

対象におけるＰＤ－Ｌ１関連疾患または状態を処置するための医薬の製造における、請求項１６から９２のいずれかに記載の二機能性分子の使用。

【請求項107】

対象において、免疫抑制性サイトカインの抑制から、持続性免疫応答の誘導から、または抗腫瘍免疫の刺激から利益を受ける疾患または状態を処置する、予防する、または軽減する方法であって、請求項１６から９２のいずれかに記載の二機能性分子の有効量を投与するステップを含む方法。

【請求項108】

免疫抑制性サイトカインがＴＧＦβである、請求項１０７に記載の方法。

【請求項109】

疾患または状態が、ＴＧＦ－β関連疾患または状態である、請求項１０８に記載の方法。

【請求項110】

ＴＧＦ－β関連疾患が、がん、線維性疾患、または腎疾患である、請求項１０９に記載の方法。

【請求項111】

免疫抑制性サイトカインがＩＬ－１である、請求項１０７に記載の方法。

【請求項112】

疾患または状態が、ＩＬ－１関連疾患または状態である、請求項１１１に記載の方法。

【請求項113】

疾患または状態が、免疫賦活性ポリペプチドを用いてＭＨＣＩＩシグナル伝達を刺激することによる持続性免疫応答の誘導から利益を受ける、請求項１０７に記載の方法。

【請求項114】

免疫賦活性ポリペプチドが可溶性ＬＡＧ－３である、請求項１１３に記載の方法。

【請求項115】

疾患または状態が、免疫阻害性受容体シグナル伝達を阻害することによる抗腫瘍免疫の刺激から利益を受ける、請求項１０７に記載の方法。

【請求項116】

免疫阻害性受容体がＳＩＲＰαである、請求項１１５に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

[001]本開示は、一般に、免疫チェックポイント分子（例えば、ＰＤ－Ｌ１）を標的化し、抗腫瘍免疫抑制（ＡＴＩＳ）サイトカイン（例えば、ＩＬ－１またはＴＧＦβ）の活性を遮断するかまたは免疫を刺激する新規二機能性分子に関する。

【背景技術】

【0002】

[002]プログラム死１（ＰＤ－１）ならびにそのリガンドＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ２は、Ｔ細胞媒介性免疫応答の調節における重要な共抑制分子である。ＰＤ－１は、末梢組織の活性化Ｔ細胞の表面で発現される単一の細胞外免疫グロブリンスーパーファミリー（ＩｇＳＦ）Ｖ－セットドメインを含むＩ型膜タンパク質である（Ｚｈａｎｇ Ｘら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、２００４、２０（３）：３３７～３４７）。ＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ２は、樹状細胞およびマクロファージで一般に発現され、それらの外部ドメインは、膜遠位ＩｇＳＦ Ｖ－セットおよび膜近位ＩｇＳＦ Ｃ－セットドメインから構成される（Ｌａｔｃｈｍａｎ Ｙら、Ｎａｔｕｒｅ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、２００１、２（３）：２６１～２６８）。ＰＤ－１とその２つのリガンドとのライゲーションは、免疫受容体チロシンベース阻害モチーフおよび免疫受容体チロシンベーススイッチモチーフを含有するＰＤ－１の細胞質ドメインを通じて共抑制シグナル伝達を開始し、それにより、シグナル伝達に関与するエフェクター分子を脱リン酸化することによってＴＣＲシグナル伝達を下方制御するＳＨＰホスファターゼの活性化をもたらす（Ｃｈｅｍｎｉｔｚ Ｊ Ｍら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２００４、１７３（２）：９４５～９５４）。結果として、ＰＤ－１シグナル伝達は、過剰なまたは有害な炎症を予防し、正常な状態での自己抗原への免疫寛容を維持する（Ｃｏｌｌｉｎｓ Ａ Ｖら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、２００２、１７（２）：２０１～２１０）。

【0003】

[003]ＰＤ－Ｌ１は、別の受容体、Ｂ７．１（Ｂ７－１またはＣＤ８０としても知られる）との相互作用を通じてもＴ細胞機能を負に制御する。ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１およびＰＤ－Ｌ１／Ｂ７．１複合体の形成は、Ｔ細胞受容体シグナル伝達を負に制御し、続くＴ細胞活性化の下方制御および抗腫瘍免疫活性の抑制を生じる（Ｂｕｔｔｅ Ｍ Ｊら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、２００７、２７（１）：１１１～１２２）。

【0004】

[004]ＰＤ－Ｌ１は、さまざまな腫瘍においてしばしば過剰発現され、Ｔ細胞でのＰＤ－１とのその相互作用は、がん細胞がＴ細胞媒介免疫応答を回避できるようにする（Ｏｋａｚａｋｉ Ｔら、Ｎａｔｕｒｅ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、２０１３、１４（１２）：１２１２～１２１８）。これにより、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１相互作用を遮断することは、Ｔ細胞活性化および抗腫瘍応答を回復できる（Ｃａｌｌａｈａｎ Ｍ Ｋら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、２０１６、４４（５）：１０６９～１０７８）。アテゾリズマブ（Ｔｅｃｅｎｔｒｉｑ（登録商標））（Ｒｉｔｔｍｅｙｅｒ Ａら、Ｔｈｅ Ｌａｎｃｅｔ、２０１７、３８９（１００６６）：２５５～２６５）、アベルマブ（Ｂａｖｅｎｃｉｏ（登録商標））（Ｈａｍｉｌｔｏｎ Ｇら、Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｏｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｔｈｅｒａｐｙ、２０１７、１７（４）：５１５～５２３）およびデュルバルマブ（Ｉｍｆｉｎｚｉ（登録商標））（Ｂｒｏｗｅｒ Ｖ、Ｔｈｅ Ｌａｎｃｅｔ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、２０１６、１７（７）：ｅ２７５）などの抗体ベースのＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１遮断療法の成功は、ヒトのがん、特に、固形腫瘍との闘いに大きな進歩をもたらした。腫瘍細胞および／または浸潤性免疫細胞によるＰＤ－Ｌ１発現とＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１標的療法への臨床応答との間に関連が示されたが、この関連は完璧ではない（Ｈｅｒｂｓｔ，Ｒ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ５１５、５６３～５６７（２０１４）；Ｔａｕｂｅ Ｊ Ｍら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｃａｎｃｅｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ、２０１４、２０（１９）：５０６４～５０７４）。ＰＤ－Ｌ１陽性腫瘍のごく一部だけがこれらの処置に応答し、ある種のＰＤ－Ｌ１陰性腫瘍は、それにもかかわらず、処置に応答性である。このことは、追加的な因子がＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１標的療法への患者の応答を決定し、追加的な予測バイオマーカーがこれらの薬剤の臨床使用を改善するために同定されなければならない可能性を生じる。

【0005】

[005]Ｍａｒｉａｔｈａｓａｎ Ｓらは、応答の欠如が線維芽細胞におけるトランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ－β）シグナル伝達のシグネチャーと関連することを見出した（Ｍａｒｉａｔｈａｓａｎ Ｓら、Ｎａｔｕｒｅ、２０１８、５５４（７６９３）：５４４～５４８）。Ｄａｖｉｄ ＪＭらも上皮間葉転換（ＥＭＴ）を誘導し、抗腫瘍免疫を抑制するとして知られる多面的サイトカインとして、ＴＧＦ－βが、いくつかの上皮ＮＳＣＬＣ細胞系において腫瘍ＰＤ－Ｌ１発現を上方制御でき、上方制御は、ＴＧＦ－βシグナル伝達の重要な下流エフェクターであるＳｍａｄ２のリン酸化と関連することを見出した（Ｄａｖｉｄ Ｊ Ｍら、Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、２０１７、６（１０）：ｅ１３４９５８９）。マウスでは、抗ＰＤ－Ｌ１と合わせたＴＧＦ－β遮断抗体の治療用投与は、間質細胞においてＴＧＦ－βシグナル伝達を低減し、腫瘍の中心へのＴ細胞進入を促進し、活発な抗腫瘍免疫および腫瘍退縮を誘発した（Ｍａｒｉａｔｈａｓａｎ Ｓら、Ｎａｔｕｒｅ、２０１８、５５４（７６９３）：５４４～５４８）。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

[006]しかし、抗ＰＤ－Ｌ１抗体の低い親和性は、高い処置有効性および低い毒性の副作用を達成するための課題をいまだ提示している。

【0007】

[007]したがって、ＰＤ－Ｌ１への高い結合親和性を有し、治療有効性が改善され、毒性の副作用が低減された治療用分子が必要である。

【課題を解決するための手段】

【0008】

[008]本開示を通じて、冠詞「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、冠詞の文法上の目的語の１つまたは１つより多く（すなわち、少なくとも１つ）を指して本明細書において使用される。例として「抗体（ａｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ）」は、１つの抗体または１つより多い抗体を意味する。

【0009】

[009]一態様では、本開示は、免疫チェックポイント分子に結合する第１の部分、およびインターロイキン－１（ＩＬ－１）の活性を遮断する第２の部分を含む、二機能性分子を提供する。

【0010】

[0010]ある特定の実施形態では、第１の部分は、ＣＤ２７、ＣＤ７０、ＣＤ２８、ＣＤ８０（Ｂ７－１）、ＣＤ８６（Ｂ７－２）、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ（ＣＤ１５４）、ＣＤ１２２、ＣＤ１３７、ＣＤ１３７Ｌ、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、ＯＸ４０Ｌ（ＣＤ２５２）、ＧＩＴＲ、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、およびＩＣＯＳＬＧ（ＣＤ２７５）、ＣＤ２、ＩＣＡＭ－１、ＬＦＡ－１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、ＣＤ３０、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０、ＣＤ１６０およびＣＤ８３からなる群から任意選択で選択される、免疫賦活性チェックポイント分子のアゴニストを含む。

【0011】

[0011]ある特定の実施形態では、第１の部分は、Ａ２ＡＲ、Ｂ７－Ｈ３（ＣＤ２７６）、Ｂ７－Ｈ４（ＶＴＣＮ１）、ＢＴＬＡ（ＣＤ２７２）、ＣＴＬＡ－４（ＣＤ１５２）、ＩＤＯ１、ＩＤＯ２、ＴＤＯ、ＫＩＲ、ＬＡＧ３、ＮＯＸ２、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＴＩＭ－３、ＶＩＳＴＡ、ＳＩＧＬＥＣ７（ＣＤ３２８）、ＴＩＧＩＴ、ＰＶＲ（ＣＤ１５５）、ＳＩＧＬＥＣ９（ＣＤ３２９）、ＣＤ１６０、ＬＡＩＲ１、２Ｂ４（ＣＤ２４４）、ＣＤ４７およびＢ７－Ｈ５からなる群から任意選択で選択される、免疫阻害性チェックポイント分子のアンタゴニストを含む。

【0012】

[0012]ある特定の実施形態では、免疫チェックポイント分子はＰＤ－Ｌ１である。

【0013】

[0013]ある特定の実施形態では、第１の部分はＰＤ－Ｌ１に対する抗体またはその抗原結合性断片を含み、第２の部分はＩＬ－１結合性部分またはＩＬ－１受容体（ＩＬ－１Ｒ）結合性部分を含む。

【0014】

[0014]ある特定の実施形態では、ＩＬ－１結合性部分は、ＩＬ－１ＲまたはそのＩＬ－１結合性断片もしくはバリアント、あるいはＩＬ－１に対する抗体またはその抗原結合性断片を含む。

【0015】

[0015]ある特定の実施形態では、ＩＬ－１に対する抗体またはその抗原結合性断片は、ＸＢ２００１、ルチキズマブ、ＬＹ２１８９１０２およびベルメキマブからなる群から選択される抗ＩＬ－１α抗体由来、またはＳＳＧＪ－６１３、ＣＤＰ４８４、カナキヌマブおよびゲボキズマブからなる群から選択される抗ＩＬ－１β抗体由来の重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域を含む。

【0016】

[0016]ある特定の実施形態では、ＩＬ－１に対する抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号１０４もしくは配列番号１１２の配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号１０５もしくは配列番号１１３の配列を含むＨＣＤＲ２、および配列番号１０６もしくは配列番号１１４の配列を含むＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、ならびに／または配列番号１０７もしくは配列番号１１５の配列を含むＬＣＤＲ１、配列番号１０８もしくは配列番号１１６の配列を含むＬＣＤＲ２、および配列番号１０９もしくは配列番号１１７の配列を含むＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む。

【0017】

[0017]ある特定の実施形態では、ＩＬ－１に対する抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号１０４の配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号１０５の配列を含むＨＣＤＲ２、および配列番号１０６の配列を含むＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、ならびに／または配列番号１０７の配列を含むＬＣＤＲ１、配列番号１０８の配列を含むＬＣＤＲ２、および配列番号１０９の配列を含むＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む。

【0018】

[0018]ある特定の実施形態では、ＩＬ－１に対する抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号１１２の配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号１１３の配列を含むＨＣＤＲ２、および配列番号１１４の配列を含むＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、ならびに／または配列番号１１５の配列を含むＬＣＤＲ１、配列番号１１６の配列を含むＬＣＤＲ２、および配列番号１１７の配列を含むＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む。

【0019】

[0019]ある特定の実施形態では、ＩＬ－１に対する抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号１０２、配列番号１１０、およびこれらに少なくとも８０％の配列同一性を有するその相同性配列からなる群から選択される配列を含む重鎖可変領域、ならびに／または配列番号１０３、配列番号１１１、およびこれらに少なくとも８０％の配列同一性を有するその相同性配列からなる群から選択される配列を含む軽鎖可変領域を含む。

【0020】

[0020]ある特定の実施形態では、ＩＬ－１に対する抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号１０２、およびこれに少なくとも８０％の配列同一性を有するその相同性配列からなる群から選択される配列を含む重鎖可変領域、ならびに／または配列番号１０３、およびこれに少なくとも８０％の配列同一性を有するその相同性配列からなる群から選択される配列を含む軽鎖可変領域を含む。

【0021】

[0021]ある特定の実施形態では、ＩＬ－１に対する抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号１１０、およびこれに少なくとも８０％の配列同一性を有するその相同性配列からなる群から選択される配列を含む重鎖可変領域、ならびに／または配列番号１１１、およびこれに少なくとも８０％の配列同一性を有するその相同性配列からなる群から選択される配列を含む軽鎖可変領域を含む。

【0022】

[0022]ある特定の実施形態では、ＩＬ－１Ｒ結合性部分は、インターロイキン－１受容体アンタゴニストまたはその断片もしくはバリアント、あるいはＩＬ－１Ｒに対する抗体またはその抗原結合性断片を含む。

【0023】

[0023]ある特定の実施形態では、ＩＬ－１Ｒに対する抗体またはその抗原結合性断片は、スペソリマブ、アステゴリマブ、イムシドリマブ、ＡＭＧ１０８、メルリリマブ（ｍｅｌｒｉｌｉｍａｂ）、ニダニリマブ（ｎｉｄａｎｉｌｉｍａｂ）、ＭＥＤＩ８９６８、ＲＥＧＮ６４９０、ＨＢ００３４およびＣＳＣ０１２からなる群から選択される抗体由来の重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域を含む。

【0024】

[0024]別の態様では、二機能性分子は、ＰＤ－Ｌ１に結合する第１の部分、およびａ）免疫抑制性サイトカインの活性を遮断する、またはｂ）免疫を刺激する第２の部分を含み、第１の部分は、重鎖可変（ＶＨ）領域および／または軽鎖可変（ＶＬ）領域を含む、ＰＤ－Ｌ１に対する抗体またはその抗原結合性断片を含み、重鎖可変領域は、
ａ）ＤＹＹＭＮ（配列番号１）もしくはこれに少なくとも８０％の配列同一性のある相同性配列を含むＨＣＤＲ１、
ｂ）ＤＩＮＰＮＮＸ_１Ｘ_２ＴＸ_３ＹＮＨＫＦＫＧ（配列番号１９）もしくはこれに少なくとも８０％の配列同一性のある相同性配列を含むＨＣＤＲ２、および
ｃ）ＷＧＤＧＰＦＡＹ（配列番号３）もしくはこれに少なくとも８０％の配列同一性のある相同性配列を含むＨＣＤＲ３
を含み、かつ／または
軽鎖可変領域は、
ｄ）ＫＡＳＱＮＶＸ_４Ｘ_５Ｘ_６ＶＡ（配列番号２０）もしくはこれに少なくとも８０％の配列同一性のある相同性配列からなる群から選択される配列を含むＬＣＤＲ１、
ｅ）ＳＸ_７ＳＸ_８ＲＹＴ（配列番号２１）もしくはこれに少なくとも８０％の配列同一性のある相同性配列からなる群から選択される配列を含むＬＣＤＲ２、および
ｆ）ＱＱＹＳＮＹＰＴ（配列番号６）もしくはこれに少なくとも８０％の配列同一性のある相同性配列からなる群から選択される配列を含むＬＣＤＲ３
を含み、
式中、Ｘ_１はＧまたはＡであり、Ｘ_２はＧまたはＤまたはＱまたはＥまたはＬであり、Ｘ_３はＳまたはＭまたはＱまたはＬまたはＶであり、Ｘ_４はＧまたはＰまたはＫであり、Ｘ_５はＡまたはＧであり、Ｘ_６はＡまたはＩであり、Ｘ_７はＡまたはＮまたはＲまたはＶであり、かつＸ_８はＮまたはＨまたはＶまたはＤである。

【0025】

[0025]ある特定の実施形態では、重鎖可変領域は、
ａ）配列番号１の配列を含むＨＣＤＲ１、
ｂ）配列番号２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１７および配列番号１８からなる群から選択される配列を含むＨＣＤＲ２、ならびに
ｃ）配列番号３の配列を含むＨＣＤＲ３、
を含み、かつ／または
軽鎖可変領域は、
ｄ）配列番号４、配列番号７、配列番号８および配列番号９からなる群から選択される配列を含むＬＣＤＲ１、
ｅ）配列番号５、配列番号１０、配列番号１１および配列番号１２からなる群から選択される配列を含むＬＣＤＲ２、ならびに
ｆ）配列番号６の配列を含むＬＣＤＲ３
を含む。

【0026】

[0026]ある特定の実施形態では、重鎖可変領域は、
ａ）配列番号１の配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号２の配列を含むＨＣＤＲ２、および配列番号３の配列を含むＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；
ｂ）配列番号１の配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号１３の配列を含むＨＣＤＲ２、および配列番号３の配列を含むＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；
ｃ）配列番号１の配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号１４の配列を含むＨＣＤＲ２、および配列番号３の配列を含むＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；
ｄ）配列番号１の配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号１５の配列を含むＨＣＤＲ２、および配列番号３の配列を含むＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；
ｅ）配列番号１の配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号１７の配列を含むＨＣＤＲ２、および配列番号３の配列を含むＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；ならびに
ｆ）配列番号１の配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号１８の配列を含むＨＣＤＲ２、および配列番号３の配列を含むＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域
からなる群から選択される。

【0027】

[0027]ある特定の実施形態では、軽鎖可変領域は、
ａ）配列番号４の配列を含むＬＣＤＲ１、配列番号５の配列を含むＬＣＤＲ２、および配列番号６の配列を含むＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；
ｂ）配列番号９の配列を含むＬＣＤＲ１、配列番号５の配列を含むＬＣＤＲ２、および配列番号６の配列を含むＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；
ｃ）配列番号８の配列を含むＬＣＤＲ１、配列番号５の配列を含むＬＣＤＲ２、および配列番号６の配列を含むＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；
ｄ）配列番号４の配列を含むＬＣＤＲ１、配列番号１２の配列を含むＬＣＤＲ２、および配列番号６の配列を含むＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；ならびに
ｅ）配列番号４の配列を含むＬＣＤＲ１、配列番号１１の配列を含むＬＣＤＲ２、および配列番号６の配列を含むＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域
からなる群から選択される。

【0028】

[0028]ある特定の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１に対する抗体もしくはその抗原結合性断片は、重鎖ＨＦＲ１、ＨＦＲ２、ＨＦＲ３およびＨＦＲ４の１つもしくは複数、ならびに／または軽鎖ＬＦＲ１、ＬＦＲ２、ＬＦＲ３およびＬＦＲ４の１つもしくは複数をさらに含み、
ａ）ＨＦＲ１は、ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＸ_９ＦＴ（配列番号４０）のアミノ酸配列またはこれに少なくとも８０％の配列同一性のある相同性配列を含み、
ｂ）ＨＦＲ２は、ＷＶＲＱＡＰＧＱＸ_１０ＬＥＷＭＧ（配列番号４１）のアミノ酸配列またはこれに少なくとも８０％の配列同一性のある相同性配列を含み、
ｃ）ＨＦＲ３配列は、ＲＶＴＸ_１６ＴＶＤＸ_１１ＳＩＳＴＡＹＭＥＬＳＲＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＸ_１２Ｘ_１３（配列番号４２）のアミノ酸配列またはこれに少なくとも８０％の配列同一性のある相同性配列を含み、
ｄ）ＨＦＲ４は、ＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号２５）のアミノ酸配列またはこれに少なくとも８０％の配列同一性のある相同性配列を含み、
ｅ）ＬＦＲ１は、ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣ（配列番号２６）のアミノ酸配列またはこれに少なくとも８０％の配列同一性のある相同性配列を含み、
ｆ）ＬＦＲ２は、ＷＹＱＱＫＰＧＫＸ_１４ＰＫＬＬＩＹ（配列番号４３）のアミノ酸配列またはこれに少なくとも８０％の配列同一性のある相同性配列を含み、
ｇ）ＬＦＲ３は、ＧＶＰＸ_１５ＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＸ_１７ＴＩＳＳＬＱＰＥＤＩＡＴＹＹＣ（配列番号４４）のアミノ酸配列またはこれに少なくとも８０％の配列同一性のある相同性配列を含み、
ｈ）ＬＦＲ４は、ＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号２９）のアミノ酸配列またはこれに少なくとも８０％の配列同一性のある相同性配列を含み、
式中、Ｘ_９はＴまたはＶであり、Ｘ_１０はＧまたはＳであり、Ｘ_１１はＴまたはＫであり、Ｘ_１２はＡまたはＶであり、Ｘ_１３はＲまたはＫであり、Ｘ_１４はＡまたはＳであり、Ｘ_１５はＳまたはＤであり、Ｘ_１６はＭまたはＶであり、Ｘ_１７はＦまたはＬである。

【0029】

[0029]ある特定の実施形態では、
ＨＦＲ１は、配列番号２２および３０からなる群から選択される配列を含み、
ＨＦＲ２は、配列番号２３および３１からなる群から選択される配列を含み、
ＨＦＲ３は、配列番号２４および３２～３５からなる群から選択される配列を含み、
ＨＦＲ４は、配列番号２５の配列を含み、
ＬＦＲ１は、配列番号２６からなる群からの配列を含み、
ＬＦＲ２は、配列番号２７および３６からなる群から選択される配列を含み、
ＬＦＲ３は、配列番号２８、および３７～３８、３９、４５からなる群から選択される配列を含み、
ＬＦＲ４は、配列番号２９の配列を含む。

【0030】

[0030]ある特定の実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号４６、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、およびこれらに少なくとも８０％の配列同一性を有するその相同性配列からなる群から選択される配列を含む。

【0031】

[0031]ある特定の実施形態では、軽鎖可変領域は、配列番号４７、配列番号５４、配列番号５５、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、およびこれらに少なくとも８０％の配列同一性を有するその相同性配列からなる群から選択される配列を含む。

【0032】

[0032]ある特定の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１に対する抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号４９／５４、５０／５４、５１／５４、５２／５４、４９／５５、５０／５５、５１／５５、５２／５５、５８／６２、５８／６３、５８／６４、５８／６５、５９／６２、５９／６３、５９／６４、５９／６５、６０／６２、６０／６３、６０／６４および６０／６５からなる群から選択される重鎖可変領域配列と軽鎖可変領域配列との対を含む。

【0033】

[0033]ある特定の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１に対する抗体またはその抗原結合性断片は、ＰＤ－Ｌ１への特異的結合特異性および／または親和性を依然として保持する、１つまたは複数のアミノ酸残基置換または改変をさらに含む。

【0034】

[0034]ある特定の実施形態では、置換または改変の少なくとも１つは、ＶＨまたはＶＬ配列のＣＤＲ配列の１つもしくは複数、および／または非ＣＤＲ領域の１つもしくは複数にある。

【0035】

[0035]ある特定の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１に対する抗体またはその抗原結合性断片は、免疫グロブリン定常領域、任意選択でヒトＩｇの定常領域、または任意選択でヒトＩｇＧの定常領域をさらに含む。

【0036】

[0036]ある特定の実施形態では、定常領域は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４のＦｃ領域を含む。

【0037】

[0037]ある特定の実施形態では、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域は、配列番号８０、またはこれに少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％）の配列同一性を有するそのバリアントを含む。

【0038】

[0038]ある特定の実施形態では、定常領域は、対応する野生型Ｆｃ領域と比べて低下したエフェクター機能を有するＦｃバリアントを含む。ある特定の実施形態では、Ｆｃ領域は、配列番号８０と比べて低下したエフェクター機能を生じる１つまたは複数のアミノ酸残基改変または置換を含む。

【0039】

[0039]ある特定の実施形態では、Ｆｃ領域は、２２０Ｓ、２２６Ｓ、２２８Ｐ、２２９Ｓ、２３３Ｐ、２３４Ｖ、２３４Ｇ、２３４Ａ、２３４Ｆ、２３４Ａ、２３５Ａ、２３５Ｇ、２３５Ｅ、２３６Ｅ、２３６Ｒ、２３７Ａ、２３７Ｋ、２３８Ｓ、２６７Ｒ、２６８Ａ、２６８Ｑ、２６９Ｒ、２９７Ａ、２９７Ｑ、２９７Ｇ、３０９Ｌ、３１８Ａ、３２２Ａ、３２５Ｌ、３２８Ｒ、３３０Ｓ、３３１Ｓおよびこれらの任意の組合せからなる群から選択される１つまたは複数のアミノ酸残基置換を含み、Ｆｃ領域中の残基の番号付けはＫａｂａｔにあるとおりのＥＵインデックスのものである。

【0040】

[0040]ある特定の実施形態では、Ｆｃ領域は、ａ）Ｋ３２２Ａ、Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａ；ｂ）Ｐ３３１Ｓ、Ｌ２３４ＦおよびＬ２３５Ｅ；ｃ）Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａ；ｃ）Ｎ２９７Ａ；ｄ）Ｎ２９７Ｑ；ｅ）Ｎ２９７Ｇ；ｆ）Ｌ２３５Ｅ；ｇ）Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａ（ＩｇＧ１）；ｈ）Ｆ２３４ＡおよびＬ２３５Ａ（ＩｇＧ４）；ｉ）Ｈ２６８Ｑ、Ｖ３０９Ｌ、Ａ３３０ＳおよびＰ３３１Ｓ（ＩｇＧ２）；ｊ）Ｖ２３４Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｐ２３８Ｓ、Ｈ２６８Ａ、Ｖ３０９Ｌ、Ａ３３０ＳおよびＰ３３１Ｓ（ＩｇＧ２）からなる群から選択される変異の組合せを含み、Ｆｃ領域中の残基の番号付けはＫａｂａｔにあるとおりのＥＵインデックスのものである。

【0041】

[0041]ある特定の実施形態では、Ｆｃバリアントは、配列番号８１のアミノ酸配列を含む。

【0042】

[0042]ある特定の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１に対する抗体またはその抗原結合性断片はヒト化されている。

【0043】

[0043]ある特定の実施形態では、抗原結合性断片は、ダイアボディ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｄ、Ｆｖ断片、ジスルフィド安定化Ｆｖ断片（ｄｓＦｖ）、（ｄｓＦｖ）_２、二特異性ｄｓＦｖ（ｄｓＦｖ－ｄｓＦｖ’）、ジスルフィド安定化ダイアボディ（ｄｓダイアボディ）、１本鎖抗体分子（ｓｃＦｖ）、ｓｃＦｖ二量体（二価ダイアボディ）、多特異性抗体、ラクダ化単一ドメイン抗体、ナノボディ、ドメイン抗体および二価ドメイン抗体である。

【0044】

[0044]ある特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、ヒトＰＤ－Ｌ１およびカニクイザルＰＤ－Ｌ１の両方に結合することが可能である。

【0045】

[0045]ある特定の実施形態では、第１の部分は、ＰＤ－Ｌ１への結合について、本明細書において提供される抗体またはその抗原結合性断片と競合する抗体またはその抗原結合性断片を含む。

【0046】

[0046]ある特定の実施形態では、免疫抑制性サイトカインは、トランスフォーミング増殖因子ベータ（ＴＧＦ－β）スーパーファミリー中のサイトカイン、ＩＬ－１、または血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）を含む。

【0047】

[0047]ある特定の実施形態では、ＴＧＦ－βスーパーファミリー中の免疫抑制性サイトカインは、ＴＧＦ－β、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、アクチビン、ＮＯＤＡＬ、および増殖分化因子（ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ）（ＧＤＦ）を含む。

【0048】

[0048]ある特定の実施形態では、免疫抑制性サイトカインはＴＧＦ－βである。

【0049】

[0049]ある特定の実施形態では、第２の部分はＴＧＦ－β結合性部分を含む。

【0050】

[0050]ある特定の実施形態では、ＴＧＦ－β結合性部分は、可溶性ＴＧＦβ受容体（ＴＧＦβＲ）またはそのＴＧＦ－β結合性断片もしくはバリアント、あるいはＴＧＦβに対する抗体およびその抗原結合性断片を含む。

【0051】

[0051]ある特定の実施形態では、可溶性ＴＧＦβＲは、ＴＧＦβＲの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）またはそのＴＧＦ－β結合性断片もしくはバリアントを含む。

【0052】

[0052]ある特定の実施形態では、ＴＧＦβＲは、ＴＧＦβ受容体Ｉ（ＴＧＦβＲＩ）、ＴＧＦβ受容体ＩＩ（ＴＧＦβＲＩＩ）、ＴＧＦβ受容体ＩＩＩ（ＴＧＦβＲＩＩＩ）、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される。

【0053】

[0053]ある特定の実施形態では、ＴＧＦβＲはＴＧＦβＲＩＩである。

【0054】

[0054]ある特定の実施形態では、ＴＧＦβＲＩＩは、ＴＧＦβ２およびＴＧＦβ３よりもＴＧＦβ１に選択的に結合する。

【0055】

[0055]ある特定の実施形態では、ＴＧＦβ１は、ヒトＴＧＦβ１またはマウスＴＧＦβ１である。

【0056】

[0056]ある特定の実施形態では、ＴＧＦβＲのＥＣＤは、配列番号６６、７９、７８、７７のアミノ酸配列、またはＴＧＦ－βへの特異的結合特異性および／または親和性を依然として保持する、これらに少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む。

【0057】

[0057]ある特定の実施形態では、第２の部分は、ＩＬ－１結合性部分またはＩＬ－１受容体（ＩＬ－１Ｒ）結合性部分を含む。

【0058】

[0058]ある特定の実施形態では、ＩＬ－１結合性部分は、可溶性ＩＬ－１Ｒ、ＩＬ－１ＲのＩＬ－１結合性断片もしくはバリアント、またはＩＬ－１に対する抗体もしくはその抗原結合性断片を含む。

【0059】

[0059]ある特定の実施形態では、ＩＬ－１結合性部分は、ＩＬ－１ＲＩの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）、ＩＬ－１ＲＩ、ＩＬ－１ＲＩのＥＣＤ、ＩＬ－１ＲＩＩ、またはＩＬ－１ＲＩＩのＥＣＤ、またはＩＬ－１ＲＡＰ、またはＩＬ－１ＲＡＰのＥＣＤ、ＩＬ－１ｓＲＩまたはＩＬ－１ｓＲＩＩのいずれかのＩＬ－１結合性断片またはバリアントを含む。

【0060】

[0060]ある特定の実施形態では、ＩＬ－１Ｒ結合性部分が、ＩＬ－１ＲａまたはそのＩＬ－１結合性断片もしくはバリアント、あるいはＩＬ－１Ｒに対する抗体またはその抗原結合性断片を含む。

【0061】

[0061]ある特定の実施形態では、ＩＬ－１Ｒに対する抗体またはその抗原結合性断片は、スペソリマブ、アステゴリマブ、イムシドリマブ、ＡＭＧ１０８、メルリリマブ、ニダニリマブ、ＭＥＤＩ８９６８、ＲＥＧＮ６４９０、ＨＢ００３４およびＣＳＣ０１２からなる群から選択される抗体由来の重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域を含む。

【0062】

[0062]ある特定の実施形態では、ＩＬ－１Ｒ結合性部分は、配列番号６７もしくは７６のアミノ酸配列、または配列番号６７もしくは７６に少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、またはそのＩＬ－１結合性断片もしくはバリアントを含む。

【0063】

[0063]ある特定の実施形態では、ＩＬ－１は、ＩＬ－１αまたはＩＬ－１βである。

【0064】

[0064]ある特定の実施形態では、ＩＬ－１βはヒトＩＬ－１βである。

【0065】

[0065]ある特定の実施形態では、ＩＬ－１に対する抗体またはその抗原結合性断片は、ＸＢ２００１、ルチキズマブ、ＬＹ２１８９１０２およびベルメキマブからなる群から選択される抗ＩＬ－１α抗体由来、またはＳＳＧＪ－６１３、ＣＤＰ４８４、カナキヌマブおよびゲボキズマブからなる群から選択される抗ＩＬ－１β抗体由来の重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域を含む。

【0066】

[0066]ある特定の実施形態では、ＩＬ－１に対する抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号１０４もしくは配列番号１１２の配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号１０５もしくは配列番号１１３の配列を含むＨＣＤＲ２、および配列番号１０６もしくは配列番号１１４の配列を含むＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、ならびに／または配列番号１０７もしくは配列番号１１５の配列を含むＬＣＤＲ１、配列番号１０８もしくは配列番号１１６の配列を含むＬＣＤＲ２、および配列番号１０９もしくは配列番号１１７の配列を含むＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む。

【0067】

[0067]ある特定の実施形態では、ＩＬ－１に対する抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号１０４の配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号１０５の配列を含むＨＣＤＲ２、および配列番号１０６の配列を含むＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、ならびに／または配列番号１０７の配列を含むＬＣＤＲ１、配列番号１０８の配列を含むＬＣＤＲ２、および配列番号１０９の配列を含むＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む。

【0068】

[0068]ある特定の実施形態では、ＩＬ－１に対する抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号１１２の配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号１１３の配列を含むＨＣＤＲ２、および配列番号１１４の配列を含むＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、ならびに／または配列番号１１５の配列を含むＬＣＤＲ１、配列番号１１６の配列を含むＬＣＤＲ２、および配列番号１１７の配列を含むＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む。

【0069】

[0069]ある特定の実施形態では、ＩＬ－１に対する抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号１０２、配列番号１１０、およびこれらに少なくとも８０％の配列同一性を有するその相同性配列からなる群から選択される配列を含む重鎖可変領域、ならびに／または配列番号１０３、配列番号１１１、およびこれらに少なくとも８０％の配列同一性を有するその相同性配列からなる群から選択される配列を含む軽鎖可変領域を含む。

【0070】

[0070]ある特定の実施形態では、ＩＬ－１に対する抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号１０２、およびこれに少なくとも８０％の配列同一性を有するその相同性配列からなる群から選択される配列を含む重鎖可変領域、ならびに／または配列番号１０３、およびこれに少なくとも８０％の配列同一性を有するその相同性配列からなる群から選択される配列を含む軽鎖可変領域を含む。

【0071】

[0071]ある特定の実施形態では、ＩＬ－１に対する抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号１１０、およびこれに少なくとも８０％の配列同一性を有するその相同性配列からなる群から選択される配列を含む重鎖可変領域、ならびに／または配列番号１１１、およびこれに少なくとも８０％の配列同一性を有するその相同性配列からなる群から選択される配列を含む軽鎖可変領域を含む。

【0072】

[0072]ある特定の実施形態では、二機能性分子は、配列番号１１８もしくは配列番号１２０のアミノ酸配列を含む重鎖、および／または配列番号１１９もしくは配列番号１２１のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。

【0073】

[0073]ある特定の実施形態では、第２の部分は、抗腫瘍免疫を刺激し、かつ免疫賦活性ポリペプチドを含む。

【0074】

[0074]ある特定の実施形態では、免疫賦活性ポリペプチドは、インターロイキン（ＩＬ）－２（ＩＬ－２）、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－２３、ＩＬ－２７、ＩＬ－３５、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、可溶性ＣＤ４、可溶性ＬＡＧ－３、もしくはＩＦＮ－α、またはこれらの機能性等価物を含む。

【0075】

[0075]ある特定の実施形態では、可溶性ＬＡＧ－３は、ＬＡＧ－３の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）またはそのＭＨＣＩＩ結合性断片もしくはバリアントを含む。

【0076】

[0076]ある特定の実施形態では、第２の部分は、抗腫瘍免疫を刺激し、かつ免疫阻害性受容体シグナル伝達のアンタゴニストを含む。

【0077】

[0077]ある特定の実施形態では、免疫阻害性受容体は、シグナル制御タンパク質アルファ（ＳＩＲＰα）である。

【0078】

[0078]ある特定の実施形態では、第２の部分は、ＣＤ４７とＳＩＲＰαとの間の相互作用を遮断する。

【0079】

[0079]ある特定の実施形態では、第２の部分は、ＣＤ４７結合性ドメインまたはＳＩＲＰα結合性ドメインを含む。

【0080】

[0080]ある特定の実施形態では、ＣＤ４７結合性ドメインは、可溶性ＳＩＲＰαまたはそのＣＤ４７結合性断片もしくはバリアント、あるいは抗ＣＤ４７抗体またはその抗原結合性断片を含む。

【0081】

[0081]ある特定の実施形態では、可溶性ＳＩＲＰαは、ＳＩＲＰαの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）またはそのＣＤ４７結合性断片もしくはバリアントを含む。

【0082】

[0082]ある特定の実施形態では、可溶性ＳＩＲＰαは、配列番号８４のアミノ酸配列、またはＣＤ４７に対する結合特異性を依然として保持する、これに少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0083】

[0083]ある特定の実施形態では、ＳＩＲＰα結合性ドメインは、可溶性ＣＤ４７またはそのＳＩＲＰα結合性断片もしくはバリアント、あるいは抗ＳＩＲＰα抗体またはその抗原結合性断片を含む。

【0084】

[0084]ある特定の実施形態では、可溶性ＣＤ４７は、ＣＤ４７の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）またはそのＳＩＲＰα結合性断片もしくはバリアント、抗ＳＩＲＰα抗体またはその抗原結合性断片を含む。

【0085】

[0085]ある特定の実施形態では、二機能性分子は、第１の部分と第２の部分とを繋ぐリンカーをさらに含む。

【0086】

[0086]ある特定の実施形態では、リンカーは、切断性リンカー、非切断性リンカー、ペプチドリンカー、可動性リンカー、剛性リンカー、ヘリックスリンカー、および非ヘリックスリンカーからなる群から選択される。

【0087】

[0087]ある特定の実施形態では、リンカーは、（（Ｇ）ｎＳ）ｍのアミノ酸配列を含み、式中、ｍおよびｎは、独立的に０から３０から選択される整数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０）である。ある特定の実施形態では、ｎは、２、３、４または５であり、ｍは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０である。ある特定の実施形態では、リンカーは、配列番号６８のアミノ酸配列を含む。

【0088】

[0088]ある特定の実施形態では、二機能性分子は、１つまたは複数の第２の部分を含む。

【0089】

[0089]ある特定の実施形態では、第２の部分の少なくとも１つは、第１の部分のポリペプチド鎖のＮ末端またはＣ末端に連結されている。

【0090】

[0090]ある特定の実施形態では、第２の部分の少なくとも１つは、ａ）第１の部分の重鎖のＮ末端もしくはＣ末端、またはｂ）第１の部分の軽鎖のＮ末端もしくはＣ末端に連結されている。

【0091】

[0091]ある特定の実施形態では、第２の部分の少なくとも１つは、第１の部分の重鎖定常領域のＣ末端に連結されている。

【0092】

[0092]ある特定の実施形態では、第２の部分のそれぞれは、第１の部分の各重鎖定常領域のＣ末端にそれぞれ連結されている。

【0093】

[0093]ある特定の実施形態では、二機能性分子は、第１の部分の重鎖のＮ末端、第１の部分の重鎖のＣ末端、第１の部分の軽鎖のＮ末端、第１の部分の軽鎖のＣ末端、またはこれらの任意の組合せにそれぞれ連結された１つより多い第２の部分を含む。

【0094】

[0094]ある特定の実施形態では、二機能性分子は、ホモ二量体重鎖またはヘテロ二量体重鎖を含む。

【0095】

[0095]ある特定の実施形態では、重鎖は、第２の部分の存在または位置に関してヘテロ二量体性である。

【0096】

[0096]ある特定の実施形態では、ヘテロ二量体重鎖は、第２の部分を有する一方の重鎖およびそれを有さない他方の重鎖を含む。

【0097】

[0097]ある特定の実施形態では、ヘテロ二量体重鎖は、ホモ二量体化を防止する、および／またはヘテロ二量体化を支持するように関連するヘテロ二量体Ｆｃ領域をさらに含む。

【0098】

[0098]ある特定の実施形態では、第１のおよびヘテロ二量体Ｆｃ領域は、ノブイントゥーホール、疎水性相互作用、静電相互作用、親水性相互作用、または可動性の増加を介してヘテロ二量体に会合することが可能である。

【0099】

[0099]ある特定の実施形態では、ヘテロ二量体Ｆｃ領域は、１つのＦｃ領域中にＹ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡもしくはＹ４０７Ｖまたはこれらの任意の組合せ、および別のＦｃ領域中にＳ３５４ＣもしくはＴ３６６Ｗまたはこれらの組合せを含み、Ｆｃ領域中の残基の番号付けはＫａｂａｔにあるとおりのＥＵインデックスのものである。

【0100】

[00100]ある特定の実施形態では、二機能性分子は、１つまたは複数のコンジュゲート部分にさらに連結されている。

【0101】

[00101]ある特定の実施形態では、コンジュゲート部分は、クリアランス改変剤（ｃｌｅａｒａｎｃｅ－ｍｏｄｉｆｙｉｎｇ ａｇｅｎｔ）、化学療法剤、毒素、放射性同位元素、ランタニド、発光標識、蛍光標識、酵素基質標識、ＤＮＡアルキル化剤、トポイソメラーゼ阻害剤、チューブリン結合剤、またはアンドロゲン受容体阻害剤などの他の抗がん薬物を含む。

【0102】

[00102]別の態様では、本開示は、本明細書において提供される二機能性分子および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物またはキットをさらに提供する。

【0103】

[00103]別の態様では、本開示は、本明細書において提供される二機能性分子をコードする単離されたポリヌクレオチドをさらに提供する。

【0104】

[00104]別の態様では、本開示は、本明細書において提供される単離されたポリヌクレオチドを含むベクターをさらに提供する。

【0105】

[00105]別の態様では、本開示は、本明細書において提供されるベクターを含む宿主細胞をさらに提供する。

【0106】

[00106]別の態様では、本開示は、ベクターが発現される条件下で本明細書において提供される宿主細胞を培養するステップを含む、本明細書において提供される二機能性分子を発現させる方法をさらに提供する。

【0107】

[00107]別の態様では、本開示は、本明細書において提供される二機能性分子、および／または本明細書において提供される医薬組成物もしくはキットの治療有効量を対象に投与するステップを含む、対象においてＰＤ－Ｌ１関連疾患を処置する、予防するまたは軽減する方法をさらに提供する。

【0108】

[00108]ある特定の実施形態では、疾患は、免疫関連疾患もしくは障害、がん、自己免疫疾患、または感染性疾患である。

【0109】

[00109]ある特定の実施形態では、がんは、肺がん（例えば、非小細胞肺がん）、肝臓がん、膵臓がん、乳がん、気管支がん、骨がん、肝臓および胆管がん、卵巣がん、精巣がん、腎臓がん、膀胱がん、頭頸部がん、脊椎がん、脳がん、子宮頸がん、子宮がん、子宮内膜がん、結腸がん、結腸直腸がん、前立腺がん、胃－食道がん、直腸がん、肛門がん、胃腸がん、皮膚がん、下垂体がん、胃がん、腟がん、甲状腺がん、神経膠芽腫、星状細胞腫、黒色腫、骨髄異形成症候群、肉腫、奇形腫、神経膠腫ならびに腺癌からなる群から選択される。

【0110】

[00110]ある特定の実施形態では、対象は、ＰＤ－Ｌ１発現がん細胞を有すると同定されている。

【0111】

[00111]ある特定の実施形態では、対象はヒトである。

【0112】

[00112]ある特定の実施形態では、方法は、第２の治療剤の治療有効量を投与するステップをさらに含む。

【0113】

[00113]ある特定の実施形態では、第２の治療剤は、化学療法剤、抗がん薬物、放射線療法、免疫療法剤、血管新生抑制剤、標的療法剤、細胞療法剤、遺伝子療法剤、ホルモン療法剤、またはサイトカインから選択される。

【0114】

[00114]別の態様では、本開示は、対象におけるＰＤ－Ｌ１関連疾患または状態を処置するための医薬の製造における本明細書において提供される二機能性分子の使用を提供する。

【0115】

[00115]別の態様では、本開示は、対象において、免疫抑制性サイトカインの抑制から、持続性免疫応答の誘導から、または抗腫瘍免疫の刺激から利益を受ける疾患または状態を処置する、予防する、または軽減する方法であって、本明細書において提供される二機能性分子の有効量を投与するステップを含む方法を提供する。

【0116】

[00116]ある特定の実施形態では、免疫抑制性サイトカインはＴＧＦβである。

【0117】

[00117]ある特定の実施形態では、疾患または状態は、ＴＧＦ－β関連疾患または状態である。

【0118】

[00118]ある特定の実施形態では、ＴＧＦ－β関連疾患は、がん、線維性疾患、または腎疾患である。

【0119】

[00119]ある特定の実施形態では、免疫抑制性サイトカインはＩＬ－１である。

【0120】

[00120]ある特定の実施形態では、疾患または状態は、ＩＬ－１関連疾患または状態である。

【0121】

[00121]ある特定の実施形態では、疾患または状態は、免疫阻害性受容体シグナル伝達、例えば、ＳＩＲＰαシグナル伝達を阻害することによる抗腫瘍免疫の刺激から利益を受ける。

【図面の簡単な説明】

【0122】

【図1】[00122]図１は、ＥＬＩＳＡによるヒトＰＤ－Ｌ１へのヒト化４Ｂ６抗体の結合を示す。

【図2】[00123]図２は、ＥＬＩＳＡによるヒトＰＤ－Ｌ１へのＨｕ４Ｂ６＿ＨｇＬａの結合を示す。

【図3】[00124]図３Ａ～図３Ｃは、ＥＬＩＳＡによるＰＤ－Ｌ１へのＡＭ－４Ｂ６－ＩｇＧ１－ＴＧＦβＲＩＩバリアントの結合を示す。

【図4】[00125]図４は、フローサイトメトリーを使用するＡＭ－４Ｂ６－ＩｇＧ１－ＴＧＦβＩＩバリアントの親和性ランキングを示す。

【図5】[00126]図５Ａおよび図５Ｂは、ＡＭ－４Ｂ６－ＩｇＧ１－ＴＧＦβＩＩバリアントによるＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１またはＰＤ－Ｌ１／Ｂ７－１の遮断を示す。

【図6】[00127]図６は、細胞ベースのアッセイを使用するＡＭ－４Ｂ６－ＩｇＧ１－ＴＧＦβＩＩバリアントによるＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１の遮断を示す。

【図7】[00128]図７は、安定な細胞系を用いて発現されたＡＭ４Ｂ６＿ｈＩｇＧ１＿ＴＢＲＩＩ（２０－１３６）のＳＤＳ－ＰＡＧＥを示す。

【図8】[00129]図８Ａおよび図８Ｂは、ＥＬＩＳＡ分析によるヒトＰＤ－Ｌ１またはカニクイザルＰＤ－Ｌ１への結合を示す。

【図9-1】[00130]図９Ａ～図９Ｃは、ＥＬＩＳＡ分析によるヒトＰＤ－Ｌ１およびＢ７ファミリーの他のメンバーならびにＴＧＦβスーパーファミリーの他のメンバーへの結合を示す。

【図9-2】[00130]図９Ａ～図９Ｃは、ＥＬＩＳＡ分析によるヒトＰＤ－Ｌ１およびＢ７ファミリーの他のメンバーならびにＴＧＦβスーパーファミリーの他のメンバーへの結合を示す。

【図10-1】[00131]図１０Ａ～図１０Ｆは、ＦＡＣＳ解析によるＰＤ－Ｌ１発現細胞への結合を示す。

【図10-2】[00131]図１０Ａ～図１０Ｆは、ＦＡＣＳ解析によるＰＤ－Ｌ１発現細胞への結合を示す。

【図10-3】[00131]図１０Ａ～図１０Ｆは、ＦＡＣＳ解析によるＰＤ－Ｌ１発現細胞への結合を示す。

【図11】[00132]図１１は、ＦＡＣＳ解析による活性化ヒトＴ細胞上のヒトＰＤ－Ｌ１への結合を示す。

【図12】[00133]図１２Ａ～図１２Ｂは、ＥＬＩＳＡ分析によるヒトＰＤ－１へのヒトＰＤ－Ｌ１の結合またはカニクイザルＰＤ－１へのカニクイザルＰＤ－Ｌ１の結合の遮断を示す。

【図13】[00134]図１３は、ＥＬＩＳＡ分析によるｈＰＤ－Ｌ１およびＴＧＦｂ１への同時的結合を示す。

【図14】[00135]図１４は、レポーターアッセイを使用するｈＰＤ－Ｌ１／ｈＰＤ－１の遮断を示す。

【図15】[00136]図１５は、ＴＧＦ－βレポーターＨＥＫ－２９３細胞系を使用するＴＧＦβ１シグナル伝達の遮断を示す。

【図16】[00137]図１６は、ツベルクリン（ＴＢ）により刺激されたＰＢＭＣのＩＦＮγ放出に対するＡＭ４Ｂ６－ｈＩｇＧ１－ＴＧＦβＲＩＩ’の効果を示す。

【図17】[00138]図１７Ａ～図１７Ｂは、ＭＣ３８－ｈＰＤ－Ｌ１腫瘍モデルにおける抗腫瘍活性を示す。

【図18】[00139]図１８Ａ～図１８Ｂは、Ｈ４６０腫瘍モデルにおける抗腫瘍活性を示す。

【図19】[00140]図１９Ａ～図１９Ｂは、ＥＭＴ６－ｈＰＤ－Ｌ１腫瘍モデルにおける抗腫瘍活性を示す。

【図20】[00141]図２０Ａ～図２０Ｃは、ｉｎ ｖｉｖｏでのＡＭ４Ｂ６－ｈＩｇＧ１－ＴＧＦβＩＩの薬物動態および薬力学試験を示す。

【図21】[00142]図２１は、ＥＬＩＳＡによるヒトＰＤ－Ｌ１に対するＡＭ４Ｂ６－ｈＩｇＧ１－ＩＬ－１ＲＡの結合活性を示す。

【図22】[00143]図２２は、ＦＡＣＳ解析によるヒトＰＤ－Ｌ１に対するＡＭ４Ｂ６－ｈＩｇＧ１－ＩＬ－１ＲＡの結合活性を示す。

【図23】[00144]図２３は、細胞ベースのアッセイを使用するＡＭ４Ｂ６－ｈＩｇＧ１－ＩＬ－１ＲＡによるＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１の遮断を示す。

【図24】[00145]図２４は、ＥＬＩＳＡによるヒトＩＬ－１βに対するＡＭ４Ｂ６－ＩｇＧ１－ＩＬ－１ＲＡの遮断活性を示す。

【図25】[00146]図２５は、レポーター細胞上でのヒトＩＬ－１βに対するＡＭ４Ｂ６－ｈＩｇＧ１－ＩＬ－１ＲＡの遮断活性を示す。

【図26】[00147]図２６は、非対称性二機能性抗体のＳＥＣ－ＨＰＬＣ純度を示す。

【図27】[00148]図２７は、ＥＬＩＳＡによって測定されたヒトＰＤ－Ｌ１への二機能性分子の結合を示す。

【図28】[00149]図２８は、ＥＬＩＳＡによって測定されたヒトＣＤ４７への二機能性分子の結合を示す。

【図29】[00150]図２９は、ｈＩＬ－１βタンパク質へのＩｇＧ－ｓｃＦｖ－ＡＣＺ８８５－ＡＭ４Ｂ６およびＩｇＧ－ｓｃＦｖ－ＸＯＭＡ０５２－ＡＭ４Ｂ６ ｂｓＡｂのＥＬＩＳＡでの結合活性を示す。

【図30】[00151]図３０は、ｈＰＤ－Ｌ１タンパク質へのＩｇＧ－ｓｃＦｖ－ＡＣＺ８８５－ＡＭ４Ｂ６およびＩｇＧ－ｓｃＦｖ－ＸＯＭＡ０５２－ＡＭ４Ｂ６ ｂｓＡｂのＥＬＩＳＡでの結合活性を示す。

【図31】[00152]図３１は、ＦＡＣＳ法による、ＰＤ－Ｌ１を発現する２９３Ｔ細胞へのＩｇＧ－ｓｃＦｖ－ＡＣＺ８８５－ＡＭ４Ｂ６およびＩｇＧ－ｓｃＦｖ－ＸＯＭＡ０５２－ＡＭ４Ｂ６の結合を示す。

【図32】[00153]図３２は、ＩｇＧ－ｓｃＦｖ－ＡＣＺ８８５－ＡＭ４Ｂ６およびＩｇＧ－ｓｃＦｖ－ＸＯＭＡ０５２－ＡＭ４Ｂ６の細胞ベースのＰＤ１／ＰＤ－Ｌ１遮断活性を示す。

【図33】[00154]図３３は、ＨＤＦ細胞上でのヒトＩＬ－１βに対するＩｇＧ－ｓｃＦｖ－ＸＯＭＡ０５２－ＡＭ４Ｂ６の遮断活性を示す。

【図34】[00155]図３４は、レポーター細胞上でのｈＩＬ－１βに対するＩｇＧ－ｓｃＦｖ－ＡＣＺ８８５－ＡＭ４Ｂ６の遮断活性を示す。

【発明を実施するための形態】

【0123】

[00156]本開示の以下の記載は、本開示の種々の実施形態を例示することを単に目的とする。このように、考察される具体的な改変は、本開示の範囲の限定として解釈されない。種々の等価物、変更および改変が、本開示の範囲から逸脱することなく行われ得ることは当業者に明らかであり、そのような等価の実施形態が本明細書に含まれることは理解される。刊行物、特許および特許出願を含む、本明細書に引用されるすべての参考文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0124】

定義
[00157]本明細書で使用される場合、用語「抗体」は、特定の抗原に結合する任意の免疫グロブリン、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多価抗体、二価抗体、一価抗体、多特異性抗体または二特異性抗体を含む。天然の無傷抗体は、２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖を含む。哺乳動物の重鎖は、アルファ、デルタ、イプシロン、ガンマおよびミューとして分類され、各重鎖は、可変領域（ＶＨ）ならびに第１の、第２の、第３のおよび任意選択で第４の定常領域（それぞれＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、ＣＨ４）からなり；哺乳動物の軽鎖は、各軽鎖が、可変領域（ＶＬ）および定常領域からなり、λまたはκとして分類される。抗体は、ジスルフィド結合を介して共に結合された２本の重鎖の第２のおよび第３の定常領域からなるＹのステムを含んで「Ｙ」形を有する。Ｙの各アームは、単一の軽鎖の可変および定常領域に結合した単一の重鎖の可変領域および第１の定常領域を含む。軽鎖および重鎖の可変領域は、抗原結合に関与する。両方の鎖の可変領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる３つの高度に可変性のループを一般に含有する（軽鎖ＣＤＲはＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含み、重鎖ＣＤＲはＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３を含む）。本明細書において開示される抗体および抗原結合性断片についてのＣＤＲ境界は、Ｋａｂａｔ、ＩＭＧＴ、Ｃｈｏｔｈｉａ、またはＡｌ－Ｌａｚｉｋａｎｉの慣例によって定義されるか、または同定され得る（Ａｌ－Ｌａｚｉｋａｎｉ，Ｂ．、Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｃ．、Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２７３（４）、９２７（１９９７）；Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｃ．ら、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．Ｄｅｃ ５；１８６（３）：６５１～６３（１９８５）；Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｃ．およびＬｅｓｋ，Ａ．Ｍ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９６，９０１（１９８７）；Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｃ．ら、Ｎａｔｕｒｅ．Ｄｅｃ ２１～２８；３４２（６２５２）：８７７～８３（１９８９）；Ｋａｂａｔ Ｅ．Ａ．ら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．（１９９１）；Ｍａｒｉｅ－Ｐａｕｌｅ Ｌｅｆｒａｎｃら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、２７：５５～７７（２００３）；Ｍａｒｉｅ－Ｐａｕｌｅ Ｌｅｆｒａｎｃら、Ｉｍｍｕｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１（３）、（２００５）；Ｍａｒｉｅ－Ｐａｕｌｅ Ｌｅｆｒａｎｃ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｂ ｃｅｌｌｓ（第２版）、ｃｈａｐｔｅｒ ２６、４８１～５１４、（２０１５））。３つのＣＤＲは、ＣＤＲよりも高く保存され、高度に可変性のループを支えるスキャホールドを形成するフレームワーク領域（ＦＲ）（ＬＦＲ１、ＬＦＲ２、ＬＦＲ３およびＬＦＲ４を含む軽鎖ＦＲ、ＨＦＲ１、ＨＦＲ２、ＨＦＲ３およびＨＦＲ４を含む重鎖ＦＲ）として知られる隣接するストレッチの間に挿入される。重鎖および軽鎖の定常領域は、抗原結合には関与しないが、種々のエフェクター機能を示す。本明細書で使用される場合、用語「エフェクター機能」は、抗体のＦｃ領域と免疫細胞上のＣ１ｑ補体タンパク質またはＦｃ受容体（ＦｃＲ）との間の相互作用によってもたらされる細胞媒介または補体媒介細胞障害性作用を指す。例示的なエフェクター機能として、限定することなく、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞媒介ファゴサイトーシス（ＡＤＣＰ）および補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）効果が挙げられる。抗体は、それらの重鎖の定常領域のアミノ酸配列に基づいてクラスに割り当てられる。抗体の５つの主なクラスまたはアイソタイプは、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭであり、アルファ、デルタ、イプシロン、ガンマおよびミュー重鎖の存在によってそれぞれ特徴付けられる。いくつかの主な抗体のクラスは、ＩｇＧ１（ガンマ１重鎖）、ＩｇＧ２（ガンマ２重鎖）、ＩｇＧ３（ガンマ３重鎖）、ＩｇＧ４（ガンマ４重鎖）、ＩｇＡ１（アルファ１重鎖）またはＩｇＡ２（アルファ２重鎖）などのサブクラスに分けられる。

【0125】

[00158]ある特定の実施形態では、本明細書において提供される抗体は、その任意の抗原結合性断片を包含する。本明細書で使用される場合、用語「抗原結合性断片」は、１つもしくは複数のＣＤＲを含む抗体の一部分から形成される抗体断片、または抗原に結合するが無傷の天然抗体構造を含まない任意の他の抗体断片を指す。抗原結合性断片の例として、限定することなく、ダイアボディ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｖ断片、ジスルフィド安定化Ｆｖ断片（ｄｓＦｖ）、（ｄｓＦｖ）_２、二特異性ｄｓＦｖ（ｄｓＦｖ－ｄｓＦｖ’）、ジスルフィド安定化ダイアボディ（ｄｓダイアボディ）、１本鎖抗体分子（ｓｃＦｖ）、ｓｃＦｖ二量体（二価ダイアボディ）、二特異性抗体、多特異性抗体、ラクダ化単一ドメイン抗体、ナノボディ、ドメイン抗体および二価ドメイン抗体が挙げられる。抗原結合性断片は、親抗体が結合する同じ抗原に結合することが可能である。

【0126】

[00159]抗体に関して、「Ｆａｂ」は、ジスルフィド結合によって単一の重鎖の可変領域および第１の定常領域に結合された単一の軽鎖（可変性および定常領域の両方）からなる抗体の一部分を指す。

【0127】

[00160]「Ｆａｂ’」は、ヒンジ領域の一部分を含むＦａｂ断片を指す。

【0128】

[00161]「Ｆ（ａｂ’）_２」は、Ｆａｂ’の二量体を指す。

【0129】

[00162]抗体（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡまたはＩｇＤアイソタイプの）に関して、「Ｆｃ」は、ジスルフィド結合を介して第２の重鎖の第２のおよび第３の定常ドメインに結合した第１の重鎖の第２のおよび第３の定常ドメインからなる抗体の一部分を指す。ＩｇＭおよびＩｇＥアイソタイプの抗体に関するＦｃは、第４の定常ドメインをさらに含む。抗体のＦｃの一部分は、抗体依存性細胞媒介細胞傷害（ＡＤＣＣ）、および補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）などの種々のエフェクター機能に関与するが、抗原結合には機能しない。

【0130】

[00163]抗体に関して、「Ｆｖ」は完全な抗原結合部位を保有する抗体の最小の断片を指す。Ｆｖ断片は、単一の重鎖の可変領域に結合された単一の軽鎖の可変領域からなる。

【0131】

[00164]「１本鎖Ｆｖ抗体」または「ｓｃＦｖ」は、直接またはペプチドリンカー配列を介して互いに繋がれた軽鎖可変領域および重鎖可変領域からなる操作された抗体を指す（Ｈｕｓｔｏｎ ＪＳら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、８５：５８７９（１９８８））。

【0132】

[00165]「１本鎖Ｆｖ－Ｆｃ抗体」または「ｓｃＦｖ－Ｆｃ」は、抗体のＦｃ領域に繋がれたｓｃＦｖからなる操作された抗体を指す。

【0133】

[00166]「ラクダ化単一ドメイン抗体」、「重鎖抗体」または「ＨＣＡｂ」は、２つのＶ_Ｈドメインを含有するが軽鎖を含有しない抗体を指す（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ Ｌ．およびＭｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ Ｓ．、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｄｅｃ １０；２３１（１－２）：２５～３８（１９９９）；Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ Ｓ．、Ｊ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｊｕｎ；７４（４）：２７７～３０２（２００１）；ＷＯ９４／０４６７８；ＷＯ９４／２５５９１；米国特許第６，００５，０７９号）。重鎖抗体は、元はラクダ科（ラクダ、ヒトコブラクダおよびラマ）に由来した。軽鎖を欠いているが、ラクダ化抗体は、標準の抗原結合レパートリーを有する（Ｈａｍｅｒｓ－Ｃａｓｔｅｒｍａｎ Ｃ．ら、Ｎａｔｕｒｅ．Ｊｕｎ ３；３６３（６４２８）：４４６～８（１９９３）；Ｎｇｕｙｅｎ ＶＫ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ．Ａｐｒ；５４（１）：３９～４７（２００２）；Ｎｇｕｙｅｎ ＶＫ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．Ｍａｙ；１０９（１）：９３～１０１（２００３））。重鎖抗体の可変ドメイン（ＶＨＨドメイン）は、適応免疫応答によって生じる最小の公知の抗原結合単位を表す（Ｋｏｃｈ－Ｎｏｌｔｅ Ｆ．ら、ＦＡＳＥＢ Ｊ．Ｎｏｖ；２１（１３）：３４９０～８．Ｅｐｕｂ ２００７ Ｊｕｎ １５（２００７））。

【0134】

[00167]「ナノボディ」は、重鎖抗体由来のＶＨＨドメインならびに２つの定常ドメイン、ＣＨ２およびＣＨ３からなる抗体断片を指す。

【0135】

[00168]「ダイアボディ」または「ｄＡｂ」は、２つの抗原結合部位を有する小さな抗体断片を含み、断片は同じペプチド鎖中でＶＬドメインに繋がれたＶＨドメインを含む（ＶＨ－ＶＬまたはＶＬ－ＶＨ）（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ Ｐ．ら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．Ｊｕｌ １５；９０（１４）：６４４４～８（１９９３）；ＥＰ４０４０９７；ＷＯ９３／１１１６１を参照されたい）。同じ鎖上の２つのドメイン間での対合を可能にするには短すぎるリンカーを使用することによって、ドメインは、別の鎖の相補性ドメインと対合するように仕向けられ、それにより２つの抗原結合部位を創出する。抗原結合部位は、同じまたは異なる抗原（またはエピトープ）を標的にし得る。ある特定の実施形態では、「二特異性ｄｓダイアボディ」は、２つの異なる抗原（またはエピトープ）を標的にするダイアボディである。

【0136】

[00169]「ドメイン抗体」は、重鎖の可変領域または軽鎖の可変領域だけを含有する抗体断片を指す。ある特定の場合では、２つ以上のＶＨドメインは、二価または多価ドメイン抗体を創出するようにペプチドリンカーを用いて共有結合される。二価のドメイン抗体２つのＶＨドメインは、同じまたは異なる抗原を標的にし得る。

【0137】

[00170]本明細書で使用される場合、用語「価」は、所与の分子中の指定の数の抗原結合部位の存在を指す。用語「一価」はただ１つの抗原結合部位を有する抗体または抗原結合性断片を指し；用語「多価」は複数の抗原結合部位を有する抗体または抗原結合性断片を指す。このように用語「二価」、「四価」および「六価」は、抗原結合分子中の２つの結合部位、４つの結合部位および６つの結合部位の存在をそれぞれ記す。一部の実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は二価である。

【0138】

[00171]本明細書で使用される場合、「二特異性」抗体は、２つの異なるモノクローナル抗体由来の断片を有し、２つの異なるエピトープに結合することが可能である人工抗体を指す。２つのエピソードは同じ抗原上に存在していてよく、またはそれらは２つの異なる抗原上に存在してもよい。

【0139】

[00172]ある特定の実施形態では、「ｓｃＦｖ二量体」は、一方の部分のＶＨ’が他方の部分のＶＬ’と合わせられ、同じ抗原（もしくはエピトープ）または異なる抗原（もしくはエピトープ）を標的にできる２つの結合部位を形成するように別のＶＨ－ＶＬ部分と二量体化されたＶＨ－ＶＬ（ペプチドリンカーによって連結されている）を含む二価ダイアボディまたは二特異性ｓｃＦｖ（ＢｓＦｖ）である。他の実施形態では、「ｓｃＦｖ二量体」は、ＶＨ１とＶＬ１とが合わせられ、ＶＨ２とＶＬ２とが合わせられ、合わせられた各対が異なる抗原特異性を有するように、ＶＬ１－ＶＨ２（ペプチドリンカーによって連結されている）と合わせられたＶＨ１－ＶＬ２（同様に、ペプチドリンカーによって連結されている）を含む二特異性ダイアボディである。

【0140】

[00173]「ｄｓＦｖ」は、単一の軽鎖の可変領域と単一の重鎖の可変領域との間の連結がジスルフィド結合であるジスルフィド安定化Ｆｖ断片を指す。一部の実施形態では、「（ｄｓＦｖ）２」または「（ｄｓＦｖ－ｄｓＦｖ’）」は、３つのペプチド鎖を含む：ペプチドリンカー（例えば、長い可動性リンカー）によって連結され、２つのＶＬ部分にそれぞれジスルフィド架橋を介して結合された２つのＶＨ部分。一部の実施形態では、ｄｓＦｖ－ｄｓＦｖ’は、それぞれジスルフィド結合で対合した重鎖および軽鎖が異なる抗原特異性を有して二特異性である。

【0141】

[00174]本明細書で使用される場合、用語「キメラ」は、ある種由来の重鎖および／または軽鎖の一部分ならびに別の種由来の重鎖および／または軽鎖の残りの部分を有する抗体または抗原結合性断片を意味する。例示的な例では、キメラ抗体は、ヒト由来の定常領域およびマウス由来などの非ヒト動物由来の可変領域を含み得る。一部の実施形態では、非ヒト動物は、哺乳動物、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、モルモットまたはハムスターである。

【0142】

[00175]本明細書で使用される場合、用語「ヒト化」は、抗体または抗原結合性断片が非ヒト動物由来のＣＤＲ、ヒト由来のＦＲ領域および適用可能な場合はヒト由来の定常領域を含むことを意味する。

【0143】

[00176]本明細書で使用される場合、用語「親和性」は、免疫グロブリン分子（すなわち、抗体）またはその断片と抗原との間の非共有結合相互作用の強さを指す。

【0144】

[00177]本明細書で使用される場合、用語「特異的結合」または「特異的に結合する」は、２つの分子、例えば、抗体と抗原の間の非無作為結合反応を指す。特異的結合は、例えば、抗原と抗原結合分子との間の結合が平衡に達したときのＫ_Ｄ値、すなわち、解離速度の会合速度に対する比（ｋ_ｏｆｆ／ｋ_ｏｎ）によって表される結合親和性において特徴付けられ得る。Ｋ_Ｄは、これだけに限らないが、表面プラズモン共鳴法、オクテット法、マイクロスケール熱泳動法、ＨＰＬＣ－ＭＳ法およびＦＡＣＳアッセイ法が挙げられる当技術分野において公知の任意の従来の方法を使用することによって決定され得る。≦１０^－６Ｍ（例えば、≦５ｘ１０^－７Ｍ、≦２ｘ１０^－７Ｍ、≦１０^－７Ｍ、≦５ｘ１０^－８Ｍ、≦２ｘ１０^－８Ｍ、≦１０^－８Ｍ、≦５ｘ１０^－９Ｍ、≦４ｘ１０^－９Ｍ、≦３ｘ１０^－９Ｍ、≦２ｘ１０^－９Ｍまたは≦１０^－９Ｍ）のＫ_Ｄ値は、抗体またはその抗原結合性断片とＰＤ－Ｌ１（例えば、ヒトＰＤ－Ｌ１またはカニクイザルＰＤ－Ｌ１）との間の特異的結合を示すことができる。

【0145】

[00178]本明細書で使用される場合、「ＰＤ－Ｌ１への結合について競合」する能力は、ＰＤ－Ｌ１と第２の抗ＰＤ－Ｌ１抗体との結合相互作用を任意の検出可能な程度に阻害する第１の抗体または抗原結合性断片の能力を指す。ある特定の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１への結合について競合する抗体または抗原結合性断片は、ＰＤ－Ｌ１と第２の抗ＰＤ－Ｌ１抗体との結合相互作用を少なくとも８５％、または少なくとも９０％阻害する。ある特定の実施形態では、この阻害は、９５％より大きい、または９９％より大きい場合がある。

【0146】

[00179]本明細書で使用される場合、用語「アミノ酸」は、各アミノ酸に特異的な側鎖と共にアミン（－ＮＨ_２）およびカルボキシル（－ＣＯＯＨ）官能基を含有する有機化合物を指す。本開示においてアミノ酸の名称は、以下にまとめられている標準的な１文字または３文字コードとしても表される。

【0147】

【表1】

【0148】

[00180]用語「ポリペプチド」、「ぺプチド」および「タンパク質」は、アミノ酸残基のポリマーを指して本明細書において互換的に使用される。用語は、１つまたは複数のアミノ酸残基が対応する天然に存在するアミノ酸の人工的な化学的模倣物であるアミノ酸ポリマー、ならびに天然に存在するアミノ酸ポリマーおよび天然に存在しないアミノ酸ポリマーにも適用される。

【0149】

[00181]アミノ酸配列に関連する「保存的置換」は、同様の生理化学的特性を有する側鎖を有する異なるアミノ酸残基を用いてアミノ酸残基を置き換えることを指す。例えば、保存的置換は、疎水性側鎖を有するアミノ酸残基の中（例えば、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、ＬｅｕおよびＩｌｅ）、中性親水性側鎖を有するアミノ酸残基の中（例えば、Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、ＡｓｎおよびＧｌｎ）、酸性側鎖を有するアミノ酸残基の中（例えば、Ａｓｐ、Ｇｌｕ）、塩基性側鎖を有するアミノ酸残基の中（例えば、Ｈｉｓ、ＬｙｓおよびＡｒｇ）、または芳香族側鎖を有するアミノ酸残基の中（例えば、Ｔｒｐ、ＴｙｒおよびＰｈｅ）で行われ得る。当技術分野において公知のとおり、保存的置換は、タンパク質の立体配置的構造に顕著な変化を通常生じず、それによりタンパク質の生物活性を保持できる。

【0150】

[00182]アミノ酸配列（または核酸配列）に関して、「パーセント（％）配列同一性」は、最大の一致を達成するように任意選択でギャップを導入して配列をアラインした後に、参照配列中のアミノ酸（または核酸）残基と同一である候補配列中のアミノ酸（または核酸）残基のパーセンテージとして定義される。アミノ酸（または核酸）配列同一性のパーセントを決定する目的のためのアライメントは、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴｐ（Ｕ．Ｓ．Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）のウェブサイトで利用可能、Ａｌｔｓｃｈｕｌ Ｓ．Ｆ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２１５：４０３～４１０（１９９０）；Ｓｔｅｐｈｅｎ Ｆ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２５：３３８９～３４０２（１９９７）も参照されたい）、ＣｌｕｓｔａｌＷ２（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅのウェブサイトで利用可能、Ｈｉｇｇｉｎｓ Ｄ．Ｇ．ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、２６６：３８３～４０２（１９９６）；Ｌａｒｋｉｎ Ｍ．Ａ．ら、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ（Ｏｘｆｏｒｄ、Ｅｎｇｌａｎｄ）、２３（２１）：２９４７～８（２００７）も参照されたい）およびＡＬＩＧＮまたはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウエアなどの公的に入手可能なツールを使用して達成され得る。当業者は、ツールによって提供される初期パラメーターを使用できる、または例えば、好適なアルゴリズムを選択することによってなどアライメントの任意選択でパラメーターをカスタマイズできる。ある特定の実施形態では、同一でない残基位置は保存的アミノ酸置換によって異なっている場合がある。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が類似の化学的特性（例えば、電荷または疎水性）を有する側鎖（Ｒ基）を有する別のアミノ酸によって置換されているものである。一般に、保存的アミノ酸置換は、タンパク質の機能的特性を実質的に変更しない。保存的置換によって２つ以上のアミノ酸配列が互いに異なっている場合、類似性のパーセントまたは程度は、置換の保存的性質を補正するように上方に調整される場合がある。この調整を行うための手段は、当業者に周知である。例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｐｅａｒｓｏｎ（１９９４）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４：３０７～３３１を参照されたい。

【0151】

[00183]本明細書で使用される場合、「相同性配列」は、任意選択でアラインされた場合に別の配列に少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％）の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列（もしくはその相補鎖）またはアミノ酸配列を指す。

【0152】

[00184]「単離された」物質は、天然の状態から人工的に変更されている。「単離された」組成物または物質が天然に存在する場合、それは、その元の環境から変更されているか、もしくは除去されているか、または両方である。例えば、生きている動物において天然に存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは「単離されて」いないが、実質的に純粋な状態で存在するように、それが天然状態で共存する材料から十分に分離された場合は、同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは「単離されて」いる。単離された「核酸」または「ポリヌクレオチド」は、互換的に使用され、単離された核酸分子の配列を指す。ある特定の実施形態では、「単離された抗体またはその抗原結合性断片」は、電気泳動的方法（例えば、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、等電点電気泳動、キャピラリー電気泳動）またはクロマトグラフィー法（例えば、イオン交換クロマトグラフィーもしくは逆相ＨＰＬＣ）によって決定されて、少なくとも６０％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の純度を有する抗体または抗原結合性断片を指す。

【0153】

[00185]用語「対象」は、ヒトおよび非ヒト動物を含む。非ヒト動物は、すべての脊椎動物、例えば哺乳動物および非哺乳動物、例えば非ヒト霊長類、マウス、ラット、ネコ、ウサギ、ヒツジ、イヌ、ウシ、ニワトリ、両生類および爬虫類を含む。記した場合を除いて、用語「患者」または「対象」は、本明細書において互換的に使用される。

【0154】

[00186]本明細書で使用される場合、状態を「処置すること」またはその「処置」は、状態を予防するもしくは軽減すること、状態の開始もしくは発達の速度を遅らせること、状態を発症するリスクを低減すること、状態に関連する症状の発症を予防するもしくは遅らせること、状態に関連する症状を低減するもしくは終わらせること、状態の完全なもしくは部分的な退縮を生じさせること、状態を治癒すること、またはこれらの何らかの組合せを含む。

【0155】

[00187]本明細書で使用される場合、用語「ベクター」は、遺伝的エレメントによってコードされたタンパク質、ＲＮＡもしくはＤＮＡを産生するように、または遺伝的エレメントを複製するように、遺伝的エレメントの発現をもたらすように遺伝的エレメントが作動可能に挿入され得るビヒクルを指す。ベクターは、宿主細胞内にそれが保有する遺伝的エレメントの発現をもたらすように宿主細胞を形質転換、形質導入またはトランスフェクトするために使用され得る。ベクターの例として、プラスミド、ファージミド、コスミド、人工染色体、例えば、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌バクテリア人工染色体（ＢＡＣ）、またはＰ１由来人工染色体（ＰＡＣ）、バクテリオファージ、例えば、ラムダファージまたはＭ１３ファージ、および動物ウイルスが挙げられる。ベクターは、プロモーター配列、転写開始配列、エンハンサー配列、選択可能エレメントおよびレポーター遺伝子が挙げられる、発現を調節するための種々のエレメントを含有し得る。加えて、ベクターは、複製開始点を含有し得る。ベクターは、これだけに限らないが、ウイルス粒子、リポソームまたはタンパク質コーティングが挙げられる細胞へのその進入を補助する材料も含み得る。ベクターは、発現ベクターまたはクローニングベクターであり得る。本開示は、抗体またはその抗原結合性断片、核酸配列に作動可能に連結した少なくとも１つのプロモーター（例えば、ＳＶ４０、ＣＭＶ、ＥＦ－１α）、および少なくとも１つの選択マーカーをコードする本明細書において提供される核酸配列を含有するベクター（例えば、発現ベクター）を提供する。

【0156】

[00188]本明細書で使用される場合、「宿主細胞」は、外因性ポリヌクレオチドおよび／またはベクターが導入された細胞を指す。

【0157】

[00189]本明細書で使用される場合、用語「可溶性」は、液体および水性の環境などの溶媒に溶解される分子（例えば、タンパク質）の能力を指す。

【0158】

[00190]本明細書で使用される場合、用語「トランスフォーミング増殖因子ベータ」および「ＴＧＦβ」は、前駆体および成熟ＴＧＦβ（「潜在型ＴＧＦβ」）の潜在型形態および会合または非会合複合体を含んで、対象（例えば、ヒト）由来のＴＧＦ－ベータのいずれかの全長、天然アミノ酸配列のいずれかを有する任意のＴＧＦβファミリータンパク質を指す。本明細書においてそのようなＴＧＦβを参照することは、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３アイソフォームおよびこれらの潜在型バージョンが挙げられる現在同定されている形態、ならびに、任意の公知のＴＧＦβの配列に由来し、配列に少なくとも約７５％、好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約８５％、さらにより好ましくは少なくとも約９０％、またさらに好ましくは少なくとも約９５％相同性であるポリペプチドを含む今後同定されるヒトＴＧＦβ種のいずれか１つを参照すると理解される。具体的な用語「ＴＧＦβ１」、「ＴＧＦβ２」および「ＴＧＦβ３」は、文献、例えば、Ｄｅｒｙｎｃｋら、Ｎａｔｕｒｅ、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、４７：７０７（１９８７）；Ｓｅｙｅｄｉｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６１：５６９３～５６９５（１９８６）；ｄｅＭａｒｔｉｎら、ＥＭＢＯ Ｊ．、６：３６７３（１９８７）；Ｋｕｐｐｎｅｒら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、４２：５６２（１９８８）において定義されるＴＧＦ－ベータを指す。用語「トランスフォーミング増殖因子ベータ」、「ＴＧＦβ」、「ＴＧＦベータ」、「ＴＧＦ－β」および「ＴＧＦ－ベータ」は、本開示において互換的に使用される。

【0159】

[00191]本明細書で使用される場合、用語「ヒトＴＧＦβ１」は、ヒトＴＧＦＢ１遺伝子（例えば、野生型ヒトＴＧＦＢ１遺伝子）によってコードされるＴＧＦβ１タンパク質を指す。例示的な野生型ヒトＴＧＦβ１タンパク質は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿０００６５１．３によって提供される。本明細書で使用される場合、用語「ヒトＴＧＦβ２」は、ヒトＴＧＦＢ２遺伝子（例えば、野生型ヒトＴＧＦＢ２遺伝子）によってコードされるＴＧＦβ２タンパク質を指す。例示的な野生型ヒトＴＧＦβ２タンパク質は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００１１２９０７１．１およびＮＰ＿００３２２９．１によって提供される。本明細書で使用される場合、用語「ヒトＴＧＦβ３」は、ヒトＴＧＦＢ３遺伝子（例えば、野生型ヒトＴＧＦＢ３遺伝子）によってコードされるＴＧＦβ３タンパク質を指す。例示的な野生型ヒトＴＧＦβ３タンパク質は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００３２３０．１、ＮＰ＿００１３１６８６８．１およびＮＰ＿００１３１６８６７．１によって提供される。

【0160】

[00192]本明細書で使用される場合、用語「マウスＴＧＦβ１」、「マウスＴＧＦβ２」および「マウスＴＧＦβ３」は、マウスＴＧＦＢ１遺伝子（例えば、野生型マウスＴＧＦＢ１遺伝子）、マウスＴＧＦＢ２遺伝子（例えば、野生型マウスＴＧＦＢ２遺伝子）およびマウスＴＧＦＢ３遺伝子（例えば、野生型マウスＴＧＦＢ３遺伝子）によってそれぞれコードされるＴＧＦβ１タンパク質、ＴＧＦβ２タンパク質およびＴＧＦβ３タンパク質を指す。例示的な野生型マウス（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）ＴＧＦβ１タンパク質は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿０３５７０７．１およびＣＡＡ０８９００．１によって提供される。例示的な野生型マウスＴＧＦβ２タンパク質は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿０３３３９３．２によって提供される。例示的な野生型マウスＴＧＦβ３タンパク質は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＡ４０４２２．１によって提供される。

【0161】

[00193]本明細書で使用される場合、用語「ＴＧＦβ受容体」は、少なくとも１つのＴＧＦβアイソフォームに結合する任意の受容体を指す。一般に、ＴＧＦβ受容体として、ＴＧＦβ受容体Ｉ（ＴＧＦβＲＩ）、ＴＧＦβ受容体ＩＩ（ＴＧＦβＲＩＩ）またはＴＧＦβ受容体ＩＩＩ（ＴＧＦβＲＩＩＩ）が挙げられる。

【0162】

[00194]ヒトに関して、用語「ＴＧＦβ受容体Ｉ」または「ＴＧＦβＲＩ」は、野生型ＴＧＦβＲＩ、ならびに、少なくとも１つのＴＧＦβアイソフォームに結合することが可能であることが公知であるそのすべてのアイソフォームおよびバリアントが挙げられるヒトＴＧＦβ受容体１型配列を指す。野生型ＴＧＦβＲＩの例示的なアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＢＤ４６７５３．１の下で、またはＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ３６８９７の下で入手可能であり、本明細書にも配列番号６９として含まれる。バリアントＴＧＦβＲＩは、配列番号６９のアミノ酸配列に少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性のある配列を有し、野生型配列（例えば、配列番号６９）の少なくとも２５％、３５％、５０％、７５％、９０％、９５％または９９％のＴＧＦβ結合活性を保持し得る。

【0163】

[00195]ヒトに関して、用語「ＴＧＦβ受容体ＩＩ」または「ＴＧＦβＲＩＩ」は、野生型ＴＧＦβＲＩＩ、ならびに、少なくとも１つのＴＧＦβアイソフォームに結合することが可能であることが公知であるそのすべてのアイソフォームおよびバリアントを含んでヒトＴＧＦβ受容体２型アイソフォームＡ配列を指す。野生型ＴＧＦβＲＩＩアイソフォームＡまたはアイソフォーム１の例示的なアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００１０２００１８．１の下またはＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ３７１７３－１の下で入手可能であり、本明細書にも配列番号７０として含まれ、野生型ＴＧＦβＲＩＩアイソフォームＢは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００３２３３．４またはＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ３７１７３－２の下で入手可能であり、本明細書にも配列番号７１として含まれる。バリアントＴＧＦβＲＩＩは、配列番号７０または７１に少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性のある配列を有し、野生型配列（例えば、配列番号７０または７１）の少なくとも２５％、３５％、５０％、７５％、９０％、９５％または９９％のＴＧＦβ結合活性を保持し得る。

【0164】

[00196]ヒトに関して、用語「ＴＧＦβ受容体ＩＩＩ」または「ＴＧＦβＲＩＩＩ」は、野生型ＴＧＦβＲＩＩならびにすべてのアイソフォームおよびバリアントを含んでヒトＴＧＦβ受容体３型配列を指す。野生型ＴＧＦβＲＩＩＩの例示的なアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００３２３４．２の下またはＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｑ０３１６７の下で入手可能であり、本明細書にも配列番号７２として含まれる。

【0165】

[00197]本明細書で使用される場合、ある特定の参照タンパク質またはペプチドに関して、用語「バリアント」は、参照配列に少なくとも７０％（例えば、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％）の配列同一性のあるアミノ酸配列を有し、参照配列（例えば、野生型配列）の少なくとも２５％（例えば、３５％、５０％、７５％、９０％、９５％または９９％）の生物活性または結合活性を保持する参照タンパク質またはペプチドの改変バージョン、例えば機能性等価物、断片、融合物、誘導体、模倣物、またはこれらの任意の組合せを意味する。バリアントは、参照タンパク質またはペプチドの断片、変異体、融合物、短縮物またはこれらの任意の組合せであり得る。

【0166】

[00198]本明細書で使用される場合、用語「インターロイキン－１」または「ＩＬ－１」は、ＩＬ－１αおよびＩＬ－１β、それらの前駆体（例えば、プロＩＬ－１αおよびプロＩＬ－１β）、アイソフォームならびにバリアントを含む。

【0167】

[00199]本明細書で使用される場合、用語「ヒトＩＬ－１α」は、ヒトＩＬ１Ａ遺伝子（例えば、野生型ヒトＩＬ１Ａ遺伝子）によってコードされるＩＬ－１αタンパク質、およびアイソフォームおよびバリアントを指す。例示的な野生型ヒトＩＬ１αタンパク質は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ０１５８３によって提供される。

【0168】

[00200]本明細書で使用される場合、用語「ヒトＩＬ－１β」は、ヒトＩＬ１Ｂ遺伝子（例えば、野生型ヒトＩＬ１Ｂ遺伝子）によってコードされるＩＬ－１βタンパク質を指す。例示的な野生型ヒトＩＬ１βタンパク質は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿０００５６７．１によって、またはＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｃ９ＪＶＫ０の下で提供される。

【0169】

[00201]本明細書で使用される場合、用語「ＩＬ－１受容体」または「ＩＬ－１Ｒ」は、ＩＬ－１に結合することができるそのすべての野生型受容体、アイソフォームおよびバリアントを含む、ＩＬ－１に結合することが可能である受容体を指す。一般に、２つの種類のＩＬ－１受容体、すなわち、ＩＬ－１受容体Ｉ（ＩＬ－１ＲＩ）、およびＩＬ－１受容体ＩＩ（ＩＬ－１ＲＩＩ）がある。ＩＬ－１ＲＩＩは、シグナルを伝達することなくリガンドに結合するデコイ受容体として作用する。ＩＬ－１ＲＩＩのタンパク分解性切断は、シグナルを伝達することなくリガンドに結合する可溶性受容体、例えば、ＩＬ－１ｓＲＩおよびＩＬ－１ｓＲＩＩの形成を生じる（詳細には、Ｔｈｏｍａｓ Ｇ．Ｋｅｎｎｅｄｙ、Ｃｈａｐｔｅｒ Ｖ．Ｂ．２．、Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｈｏｒｍｏｎｅｓ、２００３を参照されたい）。ＩＬ－１ｓＲＩおよびＩＬ－１ｓＲＩＩは、ＩＬ－１ＲＩＩのタンパク分解性切断生成物であり、ＩＬ－１ＲＩＩの細胞外ドメイン断片の群であり得る。用語、ＩＬ－１Ｒは、ＮＦ－カッパ－Ｂおよび他の経路のインターロイキン－１－依存性活性化を媒介する高親和性インターロイキン－１受容体複合体を形成するようにＩＬ－１βに結合したＩＬ－１ＲＩと会合できる共受容体ＩＬ－１ＲＡＰを包含することも意図する。

【0170】

[00202]本明細書で使用される場合、用語「ＩＬ－１ＲＩ」は、野生型ＩＬ－１ＲＩならびにＩＬ－１αおよび／またはＩＬ－１βに結合することが可能であるそのすべてのアイソフォームおよびバリアントを含む。野生型ＩＬ－１ＲＩの例示的なアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ１４７７８の下で入手可能であり、本明細書にも配列番号７３として含まれる。

【0171】

[00203]本明細書で使用される場合、用語「ＩＬ－１ＲＩＩ」は、野生型ＩＬ－１ＲＩＩ、ならびに、ＩＬ－１αおよび／またはＩＬ－１βに結合することが可能であるそのすべてのアイソフォームおよびバリアントを含む。野生型ＩＬ－１ＲＩＩの例示的なアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ２７９３０の下で入手可能であり、本明細書にも配列番号７５として含まれる。

【0172】

[00204]本明細書で使用される場合、用語「ＩＬ－１ＲＡＰ」は、野生型ＩＬ－１ＲＡＰ、ならびに、ＩＬ－１βに結合したＩＬ－１Ｒに結合することが可能であるそのすべてのアイソフォームおよびバリアントを含む。野生型ＩＬ－１ＲＡＰの例示的なアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｑ９ＮＰＨ３の下で入手可能であり、本明細書にも配列番号７４として含まれる。

【0173】

[00205]本明細書で使用される場合、用語「ＩＬ－１ｓＲＩ」は、メタロプロテイナーゼが関与するタンパク分解性切断によって産生され得るＩＬ－１ＲＩのすべての可溶性形態を含む。天然に存在するＩＬ－１ｓＲＩは、約４５ｋＤａから６０Ｋｄａの範囲の分子量を有し得る。この用語は、ＩＬ－１αおよび／またはＩＬ－１βに結合することが可能であるＩＬ－１ｓＲＩのすべてのアイソフォームおよびバリアントも包含し得る。

【0174】

[00206]本明細書で使用される場合、用語「ＩＬ－１ｓＲＩＩ」は、メタロプロテイナーゼが関与するタンパク分解性切断によって産生され得るＩＬ－１ＲＩＩのすべての可溶性形態を含む。天然に存在するＩＬ－１ｓＲＩＩは、約４５ｋＤａから６０Ｋｄａの範囲の分子量を有し得る。この用語は、ＩＬ－１αおよび／またはＩＬ－１βに結合することが可能であるＩＬ－１ｓＲＩＩのすべてのアイソフォームおよびバリアントも包含し得る。

【0175】

[00207]本明細書で使用される場合、用語「ＩＬ－１受容体アンタゴニスト」は、ＩＬ－１受容体への結合についてＩＬ－１αまたはＩＬ－１βと競合でき、ＩＬ－１αまたはＩＬ－１βの活性を阻害する任意のタンパク質を一般に含む。ＩＬ－１受容体アンタゴニストは、ＩＬ－１Ｒａ、ＩＬ－１ｓＲＩおよびＩＬ－１ｓＲＩＩなどの天然に存在するアンタゴニスト、ならびに、ＩＬ－１受容体、特にＩＬ－１ＲＩへの結合についてＩＬ－１αまたはＩＬ－１βの結合を遮断できる他の人工アンタゴニストを含み得る。

【0176】

[00208]本明細書で使用される場合、用語「ＩＬ－１Ｒａ」は、野生型ＩＬ－１Ｒａ、ならびに、ＩＬ－１αおよび／またはＩＬ－１βに結合することが可能であるそのすべてのアイソフォームおよびバリアントを含む。野生型ＩＬ－１Ｒａの例示的なアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ１８５１０の下で入手可能であり、本明細書にも配列番号７６として含まれる。

【0177】

[00209]本明細書で使用される場合、「がん」は、悪性の細胞増殖または新生物、異常な増殖、浸潤または転移によって特徴付けられる任意の医学的状態を指し、良性または悪性である場合があり、固形腫瘍および、白血病などの非固形がん（例えば、血液悪性腫瘍）の両方を含む。本明細書で使用される場合、「固形腫瘍」は、新生物、および／または悪性細胞の固形塊を指す。

【0178】

[00210]用語「薬学的に許容される」は、指定の担体、ビヒクル、希釈剤、賦形剤（複数可）および／または塩が、製剤中に含まれる他の成分と一般に化学的におよび／または物理的に適合性であり、そのレシピエントと生理学的に適合性であることを示す。

【0179】

[00211]本明細書において「約」の値またはパラメーターを参照することは、その値またはパラメーターそれ自体に方向付けられる実施形態を含む（および記載する）。例えば、「約Ｘ」を参照する記載は、「Ｘ」の記載を含む。数値範囲は、範囲を定義する数について包括的である。一般に述べると、用語「約」は、変数の指定の値、および指定の値の実験誤差の内（例えば、平均について９５％信頼区間内）または指定の値の１０パーセント内のいずれか大きい方での変数のすべての値を指す。

【0180】

[00212]アミノ酸配列（例えば、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質）に関して使用される場合、用語「融合」または「融合された」は、例えば、化学結合または組換え手段による２つ以上のアミノ酸配列の天然では存在しない単一のアミノ酸配列への組合せを指す。融合アミノ酸配列は、２つのコードポリヌクレオチド配列の遺伝的組換えによって産生され得、組換えポリヌクレオチドを含有する構築物を宿主細胞に導入する方法によって発現され得る。

【0181】

[00213]用語「薬学的に許容される」は、指定の担体、ビヒクル、希釈剤、賦形剤（複数可）および／または塩が、製剤中に含まれる他の成分と一般に化学的におよび／または物理的に適合性であり、そのレシピエントと生理学的に適合性であることを示す。

【0182】

Ｉ．免疫チェックポイント分子を標的化し、ＩＬ－１活性を遮断する二機能性分子
[00214]本開示は、免疫チェックポイント分子に結合する第１の部分、およびインターロイキン－１（ＩＬ－１）の活性を遮断する第２の部分を含む二機能性分子を提供する。本明細書において提供される二機能性分子は、ＩＬ－１と、ＩＬ－１結合性部分またはＩＬ－１受容体（ＩＬ－１Ｒ）結合性部分（すなわち、二機能性分子の第２の部分）のいずれかを含むＩＬ－１受容体との間の相互作用を遮断することによって腫瘍微小環境でのＩＬ－１活性の遮断および／または低減を可能にする。ＩＬ－１結合性部分および／またはＩＬ－１Ｒ結合性部分は、ある特定の腫瘍細胞または免疫細胞の表面に見出され得る免疫チェックポイント分子を標的化する部分（すなわち、二機能性分子の第１の部分）に連結され得る。

【0183】

[00215]ＩＬ－１は、炎症性サイトカインである。炎症は、腫瘍微小環境の重要な構成要素であり、ＩＬ－１は、発癌および腫瘍進行において重要な役割を果たす（Ａ．Ｍａｎｔｏｖａｎｉら、Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ．２０１８ Ｊａｎ；２８１（１）：５７～６１．）。ＩＬ－１は、慢性の治療抵抗性炎症の駆動、腫瘍血管新生、ＩＬ－１７経路の活性化、骨髄系由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）およびマクロファージリクルートメントの誘導、侵入および転移を含む、腫瘍開始および進行のさまざまなレベルで作用する（同上）。

【0184】

[00216]免疫チェックポイント分子は、Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞などのある特定の免疫細胞上で発現される。一部のがん細胞はまた、免疫チェックポイントの活性化を遮断でき、それにより、がん細胞が免疫系のサーベイランスを回避できるようにするある特定の免疫チェックポイント分子を発現する。

【0185】

[00217]腫瘍微小環境中のＩＬ－１を低減し、チェックポイント遮断を低減することによって、本開示は、がん、自己免疫疾患、感染性疾患などの免疫チェックポイント関連疾患を処置するために有用であり得る新規二機能性分子を提供する。

【0186】

[00218]ある特定の実施形態では、第１の部分は、免疫賦活または同時刺激活性を有する免疫チェックポイント分子のアゴニストを含む。そのような免疫賦活性チェックポイント分子として、限定することなく、ＣＤ２７、ＣＤ７０、ＣＤ２８、ＣＤ８０（Ｂ７－１）、ＣＤ８６（Ｂ７－２）、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ（ＣＤ１５４）、ＣＤ１２２、ＣＤ１３７、ＣＤ１３７Ｌ、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、ＯＸ４０Ｌ（ＣＤ２５２）、ＧＩＴＲ、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）およびＩＣＯＳＬＧ（ＣＤ２７５）、ＣＤ２、ＩＣＡＭ－１、ＬＦＡ－１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、ＣＤ３０、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０、ＣＤ１６０およびＣＤ８３を挙げることができる。

【0187】

[00219]ある特定の実施形態では、第１の部分は、免疫阻害性または共抑制活性を有するチェックポイント分子の阻害剤を含む。そのような免疫阻害チェックポイント分子として、限定することなく、Ａ２ＡＲ、Ｂ７－Ｈ３（ＣＤ２７６）、Ｂ７－Ｈ４（ＶＴＣＮ１）、ＢＴＬＡ（ＣＤ２７２）、ＣＴＬＡ－４（ＣＤ１５２）、ＩＤＯ１、ＩＤＯ２、ＴＤＯ、ＫＩＲ、ＬＡＧ３、ＮＯＸ２、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＴＩＭ－３、ＶＩＳＴＡ、ＳＩＧＬＥＣ７（ＣＤ３２８）、ＴＩＧＩＴ、ＰＶＲ（ＣＤ１５５）、ＳＩＧＬＥＣ９（ＣＤ３２９）、ＣＤ１６０、ＬＡＩＲ１、２Ｂ４（ＣＤ２４４）、ＣＤ４７およびＢ７－Ｈ５を挙げることができる。

【0188】

[00220]ある特定の実施形態では、免疫チェックポイント分子は、ＰＤ－Ｌ１である。ある特定の実施形態では、第１の部分は、ＰＤ－Ｌ１に対する抗体部分またはその抗原結合性断片を含む。ある特定の実施形態では、第１の部分は、ＰＤ－Ｌ１に対するアンタゴニスト抗体部分またはその抗原結合性断片を含む。

【0189】

[00221]ある特定の実施形態では、第２の部分は、ＩＬ－１結合性部分またはＩＬ－１受容体（ＩＬ－１Ｒ）結合性部分を含む。

【0190】

[00222]ＩＬ－１αおよびＩＬ－１βの両方は、炎症誘発性であり、ＩＬ－１Ｒに結合する。ＩＬ－１αまたはＩＬ－１βへの結合で、ＩＬ－１Ｒは、ＩＬ－１Ｒアクセサリータンパク質およびアダプタータンパク質ＭｙＤ８８の両方を受容体複合体にリクルートでき、下流シグナル伝達カスケードの活性化および、最終的には多種多様な免疫および炎症遺伝子の活性化を生じる。ＩＬ－１の活性またはＩＬ－１Ｒへのその結合を遮断することは、免疫チェックポイント分子の調節との組合せで有用であることが本発明者らによって見出された。

【0191】

[00223]ある特定の実施形態では、ＩＬ－１は、ＩＬ－１αまたはＩＬ－１βである。ある特定の実施形態では、ＩＬ－１βはヒトＩＬ－１βである。

【0192】

[00224]ある特定の実施形態では、第２の部分は、ＩＬ－１結合性部分を含む。ある特定の実施形態では、ＩＬ－１結合性部分は、ＩＬ－１αまたはＩＬ－１βに特異的に結合する。ある特定の実施形態では、ＩＬ－１結合性部分は、可溶性ＩＬ－１Ｒ、ＩＬ－１ＲのＩＬ－１結合性断片もしくはバリアント、またはＩＬ－１に対する抗体もしくはその抗原結合性断片を含む。

【0193】

[00225]可溶性ＩＬ－１Ｒは、ＩＬ－１Ｒのドメインまたは断片、例えば、ＩＬ－１Ｒの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）であり得る。代替的に、可溶性ＩＬ－１Ｒはまた、天然で可溶性であり、ＩＬ－１に結合することが可能であるアイソフォームであるＩＬ－１ｓＲＩまたはＩＬ－１ｓＲＩＩであり得る。

【0194】

[00226]当業者は、ＩＬ－１ＲＩの短縮化断片、またはＩＬ－１ＲＩのＥＣＤ、またはＩＬ－１ＲＩＩ、またはＩＬ－１ＲＩＩのＥＣＤ、またはＩＬ－１ＲＡＰ、またはＩＬ－１ＲＡＰのＥＣＤ、またはＩＬ－１ｓＲＩまたはＩＬ－１ｓＲＩＩは、そのような断片がＩＬ－１結合性ドメインを含有する限り、ＩＬ－１（例えば、ＩＬ－１αまたはＩＬ－１β）に結合するために十分であり得ることを理解するだろう。したがって、本開示はまた、ＩＬ－１ＲＩ、ＩＬ－１ＲＩのＥＣＤ、またはＩＬ－１ＲＩＩ、またはＩＬ－１ＲＩＩのＥＣＤ、またはＩＬ－１ＲＡＰ、またはＩＬ－１ＲＡＰのＥＣＤ、ＩＬ－１ｓＲＩおよびＩＬ－１ｓＲＩＩのいずれかのすべてのＩＬ－１結合性断片またはバリアントを包含する。ある特定の実施形態では、ＩＬ－１結合性部分は、配列番号７３、７４もしくは７５のアミノ酸配列またはそのＩＬ－１結合性断片もしくはバリアントを含む。ある特定の実施形態では、ＩＬ－１結合性部分は、配列番号７３、７４および７５のいずれかに少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、またはそのＩＬ－１結合性断片もしくはバリアントを含む。

【0195】

[00227]ある特定の実施形態では、ＩＬ－１結合性部分は、ＩＬ－１に対する抗体またはその抗原結合性断片を含む。ＩＬ－１に対する抗体またはその抗原結合性断片も、そのような抗体または抗原結合性断片が、ＩＬ－１（例えば、ＩＬ－１αまたはＩＬ－１β）のＩＬ－１Ｒへの結合に干渉できる限り、使用され得る。

【0196】

[00228]ある特定の実施形態では、ＩＬ－１に対する抗体またはその抗原結合性断片は、ＸＢ２００１、ルチキズマブ、ＬＹ２１８９１０２およびベルメキマブからなる群から選択される抗ＩＬ－１α抗体由来、またはＳＳＧＪ－６１３、ＣＤＰ４８４、カナキヌマブおよびゲボキズマブからなる群から選択される抗ＩＬ－１β抗体由来の重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域を含む。

【0197】

[00229]ある特定の実施形態では、ＩＬ－１に対する抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号１０４もしくは配列番号１１２の配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号１０５もしくは配列番号１１３の配列を含むＨＣＤＲ２、および配列番号１０６もしくは配列番号１１４の配列を含むＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、ならびに／または配列番号１０７もしくは配列番号１１５の配列を含むＬＣＤＲ１、配列番号１０８もしくは配列番号１１６の配列を含むＬＣＤＲ２、および配列番号１０９もしくは配列番号１１７の配列を含むＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む。

【0198】

[00230]ある特定の実施形態では、ＩＬ－１に対する抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号１０４の配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号１０５の配列を含むＨＣＤＲ２、および配列番号１０６の配列を含むＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、ならびに／または配列番号１０７の配列を含むＬＣＤＲ１、配列番号１０８の配列を含むＬＣＤＲ２、および配列番号１０９の配列を含むＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む。

【0199】

[00231]ある特定の実施形態では、ＩＬ－１に対する抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号１１２の配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号１１３の配列を含むＨＣＤＲ２、および配列番号１１４の配列を含むＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、ならびに／または配列番号１１５の配列を含むＬＣＤＲ１、配列番号１１６の配列を含むＬＣＤＲ２、および配列番号１１７の配列を含むＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む。

【0200】

[00232]ある特定の実施形態では、ＩＬ－１に対する抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号１０２、配列番号１１０、およびこれらに少なくとも８０％の配列同一性を有するその相同性配列からなる群から選択される配列を含む重鎖可変領域、ならびに／または配列番号１０３、配列番号１１１、およびこれらに少なくとも８０％の配列同一性を有するその相同性配列からなる群から選択される配列を含む軽鎖可変領域を含む。

【0201】

[00233]ある特定の実施形態では、ＩＬ－１に対する抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号１０２、およびこれに少なくとも８０％の配列同一性を有するその相同性配列からなる群から選択される配列を含む重鎖可変領域、ならびに／または配列番号１０３、およびこれに少なくとも８０％の配列同一性を有するその相同性配列からなる群から選択される配列を含む軽鎖可変領域を含む。

【0202】

[00234]ある特定の実施形態では、ＩＬ－１に対する抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号１１０、およびこれに少なくとも８０％の配列同一性を有するその相同性配列からなる群から選択される配列を含む重鎖可変領域、ならびに／または配列番号１１１、およびこれに少なくとも８０％の配列同一性を有するその相同性配列からなる群から選択される配列を含む軽鎖可変領域を含む。ある特定の実施形態では、第２の部分はＩＬ－１Ｒ結合性部分を含む。

【0203】

[00235]ある特定の実施形態では、ＩＬ－１Ｒ結合性部分は、ＩＬ－１ＲａまたはそのＩＬ－１Ｒ結合性断片もしくはバリアントを含む。ＩＬ－１Ｒａは、ＩＬ－１Ｒのアンタゴニストであり、ＩＬ－１Ｒへの結合についてＩＬ－１αまたはＩＬ－１βと競合できる。同様に当業者は、ＩＬ－１Ｒへの結合において、および／またはＩＬ－１αもしくはＩＬ－１βとの競合において有用であることにＩＬ－１Ｒａの短縮化断片が十分であり得ることを理解するだろう。ある特定の実施形態では、ＩＬ－１Ｒ結合性部分は、ＩＬ－１Ｒａの短縮形態を含む。ある特定の実施形態では、ＩＬ－１Ｒ結合性部分は、配列番号６７もしくは７６のアミノ酸配列、またはこれらの任意のＩＬ－１結合性断片もしくはバリアントを含む。ある特定の実施形態では、ＩＬ－１Ｒ結合性部分は、配列番号６７もしくは７６に少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、またはこれらの任意のＩＬ－１結合性断片もしくはバリアントを含む。当業者は、野生型ＩＬ－１Ｒａのバリアントも、そのようなバリアントがＩＬ－１Ｒとの結合についてＩＬ－１αまたはＩＬ－１βと競合することができる限り、本開示において有用であり得ることを理解するだろう。

【0204】

[00236]ある特定の実施形態では、ＩＬ－１Ｒ結合性部分は、ＩＬ－１Ｒに対する抗体またはその抗原結合性断片を含む。ＩＬ－１Ｒに対する抗体またはその抗原結合性断片も、そのような抗体または抗原結合性断片がＩＬ－１Ｒとの結合についてＩＬ－１αまたはＩＬ－１βと競合することが可能である限り使用され得る。

【0205】

[00237]ある特定の実施形態では、ＩＬ－１Ｒに対する抗体またはその抗原結合性断片は、スペソリマブ、アステゴリマブ、イムシドリマブ、ＡＭＧ１０８、メルリリマブ、ニダニリマブ、ＭＥＤＩ８９６８、ＲＥＧＮ６４９０、ＨＢ００３４およびＣＳＣ０１２からなる群から選択される抗体由来の重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域を含む。

【0206】

ＩＩ．ＰＤ－Ｌ１を標的化する二機能性分子および第２の部分
[00238]ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１軸チェックポイント阻害剤（例えば、ＰＤ－Ｌ１抗体）の治療有効性は、腫瘍微小環境（「ＴＭＥ」）が免疫抑制性サイトカインに富む場合に限定され得る。局在化された微小環境でのそのような免疫抑制性サイトカインのシグナル伝達は、腫瘍浸潤Ｔ細胞を低減しそれらをＴｒｅｇに傾け、免疫エフェクター細胞の活性化を減弱する場合がある。

【0207】

[00239]一態様では、本開示は、ＰＤ－Ｌ１に結合する第１の部分、およびａ）免疫抑制性サイトカインの活性を遮断する、またはｂ）抗腫瘍免疫を刺激する第２の部分を含む新規二機能性分子を提供する。分子は、化合物、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質またはこれらの任意の組合せであり得る。第２の部分は、免疫抑制性活性もしくはサイトカインを遮断することによって、または免疫を増加させるもしくは刺激することのいずれかによって腫瘍微小環境において免疫応答を回復させ得る。

【0208】

[00240]ある特定の実施形態では、本明細書において提供される二機能性分子は、ＰＤ－Ｌ１に結合する第１の部分（すなわち、ＰＤ－Ｌ１結合性部分）、および免疫抑制性サイトカインの活性を遮断する第２の部分を含む。

【0209】

[00241]ある特定の実施形態では、免疫抑制性サイトカインは、トランスフォーミング増殖因子ベータ（ＴＧＦ－β）スーパーファミリー中のサイトカイン、ＩＬ－１、または血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）を含む。ある特定の実施形態では、ＴＧＦ－βスーパーファミリー中の免疫抑制性サイトカインは、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、アクチビン、ＮＯＤＡＬ、および増殖分化因子（ＧＤＦ）を含む。

【0210】

[00242]ある特定の実施形態では、免疫抑制性サイトカインはＴＧＦ－βである。ある特定の実施形態では、免疫抑制性サイトカインはＩＬ－１である。

【0211】

[00243]ある特定の実施形態では、第２の部分はＴＧＦβ結合性部分を含む。ある特定の実施形態では、第２の部分はＩＬ－１結合性部分を含む。本明細書で使用される場合、用語「結合性部分」、「結合性断片」は、標的分子または複合体に特異的に結合する能力を有する部分または断片を指す。用語「ＴＧＦβ結合性部分」は、ＴＧＦβファミリー（例えば、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２もしくはＴＧＦβ３）の１つまたは複数のファミリーメンバーまたはアイソフォームに特異的に結合する能力を有する部分を指す。同様に、用語「ＩＬ－１結合性部分」は、ＩＬ－１ファミリー（例えば、ＩＬ－１α、ＩＬ－１β）の１つまたは複数のファミリーメンバーに特異的に結合する能力を有する部分を指す。

【0212】

[00244]ある特定の実施形態では、本明細書において提供される二機能性分子は、ＰＤ－Ｌ１に結合する第１の部分（すなわち、ＰＤ－Ｌ１結合性部分）、および抗腫瘍免疫を刺激する第２の部分を含む。ある特定の実施形態では、第２の部分は、免疫賦活性ポリペプチドまたはその機能性等価物またはそのバリアントを含む。ある特定の実施形態では、免疫賦活性ポリペプチドは、インターロイキン（ＩＬ）－２（ＩＬ－２）、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－２３、ＩＬ－２７、ＩＬ－３５、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、可溶性ＣＤ４、可溶性ＬＡＧ－３もしくはＩＦＮ－α、またはこれらの機能性等価物である。

【0213】

[00245]ある特定の実施形態では、第２の部分は、免疫阻害性受容体シグナル伝達のアンタゴニストを含む。ある特定の実施形態では、免疫阻害性受容体はＳＩＲＰαである。

【0214】

[00246]ある特定の実施形態では、二機能性分子は１つまたは複数の第２の部分を含む。ある特定の実施形態では、第２の部分の１つまたは複数は同じ種類のものであり得る、例えばそれらそれぞれは、免疫抑制性サイトカインの活性を遮断できる、またはそれらそれぞれは抗腫瘍免疫を刺激できる。ある特定の実施形態では、第２の部分の１つまたは複数は、異なる種類のものであり得る。ある特定の実施形態では、第２の部分のそれぞれは同じ配列を有し得る、またはアミノ酸配列中に差異を有し得る。

【0215】

ｉ．ＴＧＦβ結合性部分
[00247]ある特定の実施形態では、ＴＧＦβ結合性部分は、可溶性ＴＧＦβ受容体（ＴＧＦβＲ）またはそのＴＧＦβ結合性断片もしくはバリアント、あるいはＴＧＦβに対する抗体およびその抗原結合性断片を含む。

【0216】

[00248]「ＴＧＦβ結合性部分」は、本開示において「ＴＧＦβ Ｔｒａｐ」として参照される場合もある。したがって、ＰＤ－Ｌ１およびＴＧＦβの両方を標的化するタンパク質は、本開示において「抗ＰＤ－Ｌ１／ＴＧＦβ Ｔｒａｐ」として参照される場合もある。

【0217】

[00249]ある特定の実施形態では、ＴＧＦβ結合性部分は、ヒトおよび／またはマウスＴＧＦβに結合する。ある特定の実施形態では、ＴＧＦβ結合性部分は、ＴＧＦβシグナル伝達経路をアンタゴナイズおよび／または阻害することが可能である。ある特定の実施形態では、ＴＧＦβ結合性部分はＴＧＦβをアンタゴナイズおよび／または阻害することが可能である。

【0218】

[00250]本開示では、ＴＧＦβ結合性部分は、ＴＧＦβファミリーの１つまたは複数のファミリーメンバーまたはアイソフォームに特異的に結合する任意の部分を含み得る。ある特定の実施形態では、ＴＧＦβ結合性部分は、ＴＧＦβ１（例えば、ヒトＴＧＦβ１）、ＴＧＦβ２（例えば、ヒトＴＧＦβ２）、および／もしくはＴＧＦβ３（例えば、ヒトＴＧＦβ３）に結合する部分、または同様のもしくは改善されたＴＧＦβ結合親和性を有するそのバリアントを含む。ある特定の実施形態では、ＴＧＦβ結合性部分は、ＴＧＦβ１（例えば、ヒトＴＧＦβ１）に結合する部分を含む。ある特定の実施形態では、ＴＧＦβ結合性部分は、ＴＧＦβ２（例えば、ヒトＴＧＦβ２）に結合する部分を含む。ある特定の実施形態では、ＴＧＦβ結合性部分は、ＴＧＦβ３（例えば、ヒトＴＧＦβ３）に結合する部分を含む。ある特定の実施形態では、ＴＧＦβ結合性部分は、ＴＧＦβ１（例えば、ヒトＴＧＦβ１）およびＴＧＦβ２（例えば、ヒトＴＧＦβ２）の両方に特異的に結合する部分を含む。ある特定の実施形態では、ＴＧＦβ結合性部分は、ＴＧＦβ１（例えば、ヒトＴＧＦβ１）およびＴＧＦβ３（例えば、ヒトＴＧＦβ３）の両方に特異的に結合する部分を含む。ある特定の実施形態では、ＴＧＦβ結合性部分は、ＴＧＦβ２（例えば、ヒトＴＧＦβ２）およびＴＧＦβ３（例えば、ヒトＴＧＦβ３）の両方に特異的に結合する部分を含む。ある特定の実施形態では、ＴＧＦβ結合性部分は、ＴＧＦβ１（例えば、ヒトＴＧＦβ１）、ＴＧＦβ２（例えば、ヒトＴＧＦβ２）およびＴＧＦβ３（例えば、ヒトＴＧＦβ３）のそれぞれに特異的に結合する部分を含む。当業者は、ＴＧＦβファミリーの１つのファミリーメンバーまたはアイソフォームに結合するＴＧＦβ結合性部分が、ＴＧＦβファミリーの１つまたは複数の他のファミリーメンバーまたはアイソフォームに同様のまたはより高い親和性で結合することが可能であり得ることを理解するだろう。

【0219】

[00251]ある特定の実施形態では、ＴＧＦβ結合性部分は、ＴＧＦβ２よりも、および／またはＴＧＦβ３よりもＴＧＦβ１に選択的に結合する部分を含む。

【0220】

[00252]ある特定の実施形態では、ＴＧＦβ結合性部分は、同様の親和性でヒトＴＧＦβ１およびマウスＴＧＦβ１に特異的に結合する部分を含む。

【0221】

[00253]ある特定の実施形態では、本開示のＴＧＦβ結合性部分は、可溶性ＴＧＦβ受容体（ＴＧＦβＲ）またはそのＴＧＦβ結合性断片もしくはバリアントを含む。

【0222】

[00254]例示的なＴＧＦβ受容体として、ＴＧＦβＲＩ、ＴＧＦβＲＩＩおよびＴＧＦβＲＩＩＩが挙げられる。ある特定の実施形態では、ＴＧＦβ受容体は、ＴＧＦβ受容体Ｉ（ＴＧＦβＲＩ）、ＴＧＦβ受容体ＩＩ（ＴＧＦβＲＩＩ）、ＴＧＦβ受容体ＩＩＩ（ＴＧＦβＲＩＩＩ）およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される。ある特定の実施形態では、ＴＧＦβ受容体はＴＧＦβＲＩ（例えば、ヒトＴＧＦβＲＩ）である。ある特定の実施形態では、ＴＧＦβ受容体はＴＧＦβＲＩＩ（例えば、ヒトＴＧＦβＲＩＩ）である。ある特定の実施形態では、ＴＧＦβ受容体はＴＧＦβＲＩＩＩ（例えば、ヒトＴＧＦβＲＩＩＩ）である。

【0223】

[00255]ある特定の実施形態では、ＴＧＦβ結合性部分は、ＴＧＦβ受容体（例えば、ヒトＴＧＦβ受容体）の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）またはそのＴＧＦβ結合性断片もしくはバリアントを含む。ある特定の実施形態では、ＴＧＦβ受容体のＥＣＤは、ＴＧＦβＲＩ（例えば、ヒトＴＧＦβＲＩ）のＥＣＤ、ＴＧＦβＲＩＩ（例えば、ヒトＴＧＦβＲＩＩ）のＥＣＤ、ＴＧＦβＲＩＩＩ（例えば、ヒトＴＧＦβＲＩＩＩ）のＥＣＤまたはこれらの任意の組合せを含む。ある特定の実施形態では、ＴＧＦβＲＩＩのＥＣＤは、配列番号６６、７９のアミノ酸配列、またはＴＧＦβへの結合特異性を依然として保持する、これらに少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、ＴＧＦβＲＩのＥＣＤは、配列番号７７のアミノ酸配列、またはＴＧＦβへの結合特異性を依然として保持する、これに少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、ＴＧＦβＲＩＩＩのＥＣＤは、配列番号７８のアミノ酸配列、またはＴＧＦβへの結合特異性を依然として保持する、これに少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0224】

[00256]ある特定の実施形態では、ＴＧＦβ結合性部分は、ＴＧＦβに対する抗体およびその抗原結合性断片を含む。例示的な抗ＴＧＦβ抗体として、フレソリムマブおよびメテリムマブ、ならびに、例えば、それぞれその全体が本明細書に参照により組み込まれるＵＳ７４９４６５１Ｂ２、ＵＳ８３８３７８０Ｂ２、ＵＳ８０１２４８２Ｂ２、ＷＯ２０１７１４１２０８Ａ１に記載されている抗ＴＧＦβ抗体またはその抗原結合性断片を含む。

【0225】

[00257]ある特定の実施形態では、ＴＧＦβ結合性部分は、１つもしくは複数のＴＧＦβ受容体の１つもしくは複数のＥＣＤ、および／または１つまたは複数の抗ＴＧＦβ抗体もしくはその抗原結合性断片の組合せを含む。

【0226】

[00258]１つまたは複数のＥＣＤは、同じでも異なっていてもよい。例えば、ＴＧＦβ結合性部分は、ＴＧＦβ受容体のＥＣＤの同一のリピートを含み得る、または代替的に同じＴＧＦβ受容体の異なるＥＣＤ配列の組合せを含み得る、または代替的に異なるＴＧＦβ受容体由来の異なるＥＣＤの組合せを含み得る。同様に、１つまたは複数の抗ＴＧＦβ抗体は、同じでも異なっていてもよい。

【0227】

[00259]ある特定の実施形態では、ＴＧＦβ結合性部分は、ＴＧＦβＲＩ（例えば、ヒトＴＧＦβＲＩ）のＥＣＤ、ＴＧＦβＲＩＩ（例えば、ヒトＴＧＦβＲＩＩ）のＥＣＤ、ＴＧＦβＲＩＩＩ（例えば、ヒトＴＧＦβＲＩＩＩ）のＥＣＤまたはこれらの任意の組合せからなる群から選択されるＥＣＤの組合せ（または融合物）を含む。

【0228】

[00260]ある特定の実施形態では、ＴＧＦβ結合性部分は、１つまたは複数の抗ＴＧＦβ抗体またはその抗原結合性断片の組合せ（または融合物）を含む。

【0229】

[00261]ある特定の実施形態では、ＴＧＦβ結合性部分は、ＴＧＦβＲＩ（例えば、ヒトＴＧＦβＲＩ）のＥＣＤ、ＴＧＦβＲＩＩ（例えば、ヒトＴＧＦβＲＩＩ）のＥＣＤ、ＴＧＦβＲＩＩＩ（例えば、ヒトＴＧＦβＲＩＩＩ）のＥＣＤ、１つもしくは複数の抗ＴＧＦβ抗体もしくはその抗原結合性断片、またはこれらの任意の組合せからなる群から選択されるＥＣＤの組合せ（または融合物）を含む。

【0230】

ｉｉ．ＩＬ結合性部分
[00262]ある特定の実施形態では、第２の部分はＩＬ－１結合性部分を含む。ある特定の実施形態では、ＩＬ－１はＩＬ－１αまたはＩＬ－１βである。ある特定の実施形態では、ＩＬ－１βはヒトＩＬ－１βである。

【0231】

[00263]ある特定の実施形態では、ＩＬ－１結合性部分は、ＩＬ－１αまたはＩＬ－１βに特異的に結合する。ある特定の実施形態では、ＩＬ－１結合性部分は、ＩＬ－１αよりもＩＬ－１βに選択的に結合する、またはＩＬ－１βよりもＩＬ－１αに選択的に結合する部分を含む。

【0232】

[00264]ある特定の実施形態では、ＩＬ－１結合性部分は、可溶性ＩＬ－１Ｒ、ＩＬ－１ＲのＩＬ－１結合性断片もしくはバリアント、またはＩＬ－１に対する抗体もしくはその抗原結合性断片を含む。

【0233】

[00265]可溶性ＩＬ－１Ｒは、ＩＬ－１Ｒのドメインまたは断片またはバリアント、例えば、ＩＬ－１Ｒの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を含み得る。代替的に、可溶性ＩＬ－１Ｒは、天然で可溶性であり、ＩＬ－１に結合することが可能であるアイソフォームであるＩＬ－１ｓＲＩまたはＩＬ－１ｓＲＩＩも含み得る。

【0234】

[00266]当業者は、ＩＬ－１Ｒの短縮化断片、またはＩＬ－１ＲのＥＣＤ、またはＩＬ－１ｓＲＩまたはＩＬ－１ｓＲＩＩは、そのような断片がＩＬ－１結合性ドメインを含有する限り、ＩＬ－１（例えば、ＩＬ－１αまたはＩＬ－１β）に結合するために十分であり得ることを理解するだろう。したがって、本明細書において提供されるＩＬ－１結合性部分は、ＩＬ－１Ｒ、ＩＬ－１ＲのＥＣＤ、ＩＬ－１ｓＲＩおよびＩＬ－１ｓＲＩＩのいずれかのＩＬ－１結合性断片も含み得る。ある特定の実施形態では、ＩＬ－１結合性部分は、配列番号７３、７４もしくは７５のアミノ酸配列またはそのＩＬ－１結合性断片もしくはバリアントを含む。ある特定の実施形態では、ＩＬ－１結合性部分は、配列番号７３、７４および７５のいずれかに少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列またはそのＩＬ－１結合性断片もしくはバリアントを含む。

【0235】

[00267]ある特定の実施形態では、ＩＬ－１結合性部分は、ＩＬ－１に対する抗体またはその抗原結合性断片を含む。ＩＬ－１に対する抗体またはその抗原結合性断片も、そのような抗体または抗原結合性断片がＩＬ－１（例えば、ＩＬ－１αまたはＩＬ－１β）のＩＬ－１Ｒへの結合に干渉できる限り使用され得る。

【0236】

[00268]ある特定の実施形態では、ＩＬ－１に対する抗体またはその抗原結合性断片は、ＸＢ２００１、ルチキズマブ、ＬＹ２１８９１０２およびベルメキマブからなる群から選択される抗ＩＬ－１α抗体由来、またはＳＳＧＪ－６１３、ＣＤＰ４８４、カナキヌマブおよびゲボキズマブからなる群から選択される抗ＩＬ－１β抗体由来の重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域を含む。

【0237】

[00269]ある特定の実施形態では、ＩＬ－１に対する抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号１０４もしくは配列番号１１２の配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号１０５もしくは配列番号１１３の配列を含むＨＣＤＲ２、および配列番号１０６もしくは配列番号１１４の配列を含むＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、ならびに／または配列番号１０７もしくは配列番号１１５の配列を含むＬＣＤＲ１、配列番号１０８もしくは配列番号１１６の配列を含むＬＣＤＲ２、および配列番号１０９もしくは配列番号１１７の配列を含むＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む。

【0238】

[00270]ある特定の実施形態では、ＩＬ－１に対する抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号１０４の配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号１０５の配列を含むＨＣＤＲ２、および配列番号１０６の配列を含むＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、ならびに／または配列番号１０７の配列を含むＬＣＤＲ１、配列番号１０８の配列を含むＬＣＤＲ２、および配列番号１０９の配列を含むＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む。

【0239】

[00271]ある特定の実施形態では、ＩＬ－１に対する抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号１１２の配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号１１３の配列を含むＨＣＤＲ２、および配列番号１１４の配列を含むＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、ならびに／または配列番号１１５の配列を含むＬＣＤＲ１、配列番号１１６の配列を含むＬＣＤＲ２、および配列番号１１７の配列を含むＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む。

【0240】

[00272]ある特定の実施形態では、ＩＬ－１に対する抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号１０２、配列番号１１０、およびこれらに少なくとも８０％の配列同一性を有するその相同性配列からなる群から選択される配列を含む重鎖可変領域、ならびに／または配列番号１０３、配列番号１１１、およびこれらに少なくとも８０％の配列同一性を有するその相同性配列からなる群から選択される配列を含む軽鎖可変領域を含む。

【0241】

[00273]ある特定の実施形態では、ＩＬ－１に対する抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号１０２、およびこれに少なくとも８０％の配列同一性を有するその相同性配列からなる群から選択される配列を含む重鎖可変領域、ならびに／または配列番号１０３、およびこれに少なくとも８０％の配列同一性を有するその相同性配列からなる群から選択される配列を含む軽鎖可変領域を含む。

【0242】

[00274]ある特定の実施形態では、ＩＬ－１に対する抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号１１０、およびこれに少なくとも８０％の配列同一性を有するその相同性配列からなる群から選択される配列を含む重鎖可変領域、ならびに／または配列番号１１１、およびこれに少なくとも８０％の配列同一性を有するその相同性配列からなる群から選択される配列を含む軽鎖可変領域を含む。

【0243】

[00275]ある特定の実施形態では、ＩＬ－１結合性部分は、ＩＬ－１Ｒ、ＩＬ－１ＲのＥＣＤ、ＩＬ－１ｓＲＩ、ＩＬ－１ｓＲＩＩ、ＩＬ－１に対する抗体、これらの任意のＩＬ－１結合性断片およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される１つまたは複数の部分の組合せを含む。そのような１つまたは複数の部分は、直接結合によって連結され得る、または適切なリンカーによって連結され得る。

【0244】

[00276]ある特定の実施形態では、ＩＬ－１Ｒ結合性部分は、ＩＬ－１ＲａまたはそのＩＬ－１Ｒ結合性断片もしくはバリアントを含む。ＩＬ－１Ｒａは、ＩＬ－１Ｒのアンタゴニストであり、ＩＬ－１Ｒへの結合についてＩＬ－１αまたはＩＬ－１βと競合できる。同様に、当業者は、ＩＬ－１Ｒへの結合において、および／またはＩＬ－１αもしくはＩＬ－１βとの競合において有用であることにＩＬ－１Ｒａの短縮化断片が十分であり得ることを理解するだろう。ある特定の実施形態では、ＩＬ－１Ｒ結合性部分は、ＩＬ－１Ｒａの短縮形態を含む。ある特定の実施形態では、ＩＬ－１Ｒ結合性部分は、配列番号６７のアミノ酸配列、またはその任意のＩＬ－１結合性断片もしくはバリアントを含む。ある特定の実施形態では、ＩＬ－１Ｒ結合性部分は、配列番号６７に少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、またはその任意のＩＬ－１結合性断片もしくはバリアントを含む。当業者は、野生型ＩＬ－１Ｒａのバリアントも、そのようなバリアントがＩＬ－１Ｒとの結合についてＩＬ－１αまたはＩＬ－１βと競合することが可能である限り、本開示において有用であり得ることを理解するだろう。

【0245】

[00277]ある特定の実施形態では、ＩＬ－１Ｒ結合性部分は、ＩＬ－１Ｒに対する抗体またはその抗原結合性断片を含む。ＩＬ－１Ｒに対する抗体またはその抗原結合性断片も、そのような抗体または抗原結合性断片がＩＬ－１Ｒとの結合についてＩＬ－１αまたはＩＬ－１βと競合できる限り使用され得る。

【0246】

[00278]ある特定の実施形態では、ＩＬ－１Ｒ結合性部分は、ＩＬ－１Ｒａ、ＩＬ－１Ｒに対する抗体、その任意のＩＬ－１Ｒ結合性断片またはバリアントおよびこれらの任意の組合せからなる群から選択される１つまたは複数の部分の組合せを含む。そのような１つまたは複数の部分は、直接結合によって連結され得る、または適切なリンカーによって連結され得る。

【0247】

[00279]ある特定の実施形態では、ＩＬ－１Ｒに対する抗体またはその抗原結合性断片は、スペソリマブ、アステゴリマブ、イムシドリマブ、ＡＭＧ１０８、メルリリマブ、ニダニリマブ、ＭＥＤＩ８９６８、ＲＥＧＮ６４９０、ＨＢ００３４およびＣＳＣ０１２からなる群から選択される抗体由来の重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域を含む。

【0248】

ｉｉｉ．免疫賦活性ポリペプチド
[00280]ある特定の実施形態では、第２の部分は、免疫賦活性ポリペプチドまたはその機能性等価物またはそのバリアントを含む。ある特定の実施形態では、免疫賦活性ポリペプチドは、可溶性ＣＤ４、可溶性ＬＡＧ－３またはこれらの機能性等価物である。

【0249】

[00281]ある特定の実施形態では、可溶性ＬＡＧ－３は、ＬＡＧ－３の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）もしくはＭＨＣクラスＩＩ（ＭＨＣＩＩ）結合性断片またはそのバリアントを含む。

【0250】

[00282]ＬＡＧ－３（Ｕｎｉｐｒｏｔ番号：Ｑ６１７９０）は、免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリーに属し、５０３アミノ酸を含むＩ型膜貫通タンパク質である。Ｌａｇ－３は、細胞内ドメイン（ＩＣＤ）、膜貫通ドメイン（ＴＭＤ）および細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を含む。ＥＣＤは、４つのＩｇ様ドメイン、すなわち、Ｄ１からＤ４を含み、ここで、Ｄ１は、９個のβ鎖、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｃ’、Ｃ’’、Ｄ、Ｅ、ＦおよびＧ鎖を含む。Ｃ鎖とＣ’鎖との間には、「エクストラループ」を形成する約３０アミノ酸を有する追加的配列がある。そのような「エクストラループ」は、ＬＡＧ－３とＭＨＣＩＩとの間の相互作用に関与すると報告されている。ある特定の実施形態では、可溶性ＬＡＧ－３は、エクストラループ、Ｄ１ドメイン、Ｄ１プラスＤ２ドメイン、またはこれらの任意のＭＨＣ ＩＩ結合性断片もしくはバリアントのアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、可溶性ＬＡＧ－３は、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１またはこれらの任意のＭＨＣ ＩＩ結合性断片もしくはバリアントのアミノ酸配列を含む。

【0251】

[00283]ＬＡＧ－３は、活性化Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞、Ｂ細胞および形質細胞様樹状細胞で発現される。その主要なリガンドは、ＭＨＣクラスＩＩであり、ＣＤ４よりも高い親和性を有してそれに結合する。接続ペプチド（ＣＰ）は、ＬＡＧ－３のＤ４とＴＭＤとの間に存在し、ここでメタロプロテイナーゼＡＤＡＭ１０および／またはＡＤＡＭ１７の存在で切断が生じ、切断された可溶性ＬＡＧ－３を産生する。例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｈｕａｒｄら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １９９７；９４：５７４４～９．；Ｗｏｒｋｍａｎら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００２；１６９：５３９２～５．ｄｏｉ：１０．４０４９／ｊｉｍｍｕｎｏｌ．１６９．１０．５３９２；およびＬａｗｒｅｎｃｅら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ Ｃａｎｃｅｒ．２０１５；３（Ｓｕｐｐｌ ２）：Ｐ２１６を参照されたい。

【0252】

[00284]ＬＡＧ－３は、ＬＡＧ－３の可溶性形態に翻訳される代替的スプライスバリアントもコードする。可溶性ＬＡＧ－３は、ＭＨＣＩＩシグナル伝達を通じて抗原提示細胞（ＡＰＣ）を活性化し、ｉｎ ｖｉｖｏで抗原特異的Ｔ細胞応答の増加をもたらす。例えば、可溶性ＬＡＧ－３は、樹状細胞（ＤＣ）を活性化し、サイトカイン活性化（例えば、ＴＮＦ－αおよび／またはＩＬ－１２活性化）バイスタンダーＴ細胞の炎症誘発活性に関与することが報告されており、ＤＣを直接活性化し得る。例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｔｒｉｅｂｅｌ、Ｔｒｅｎｄｓ Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２００３、２４：６１９～６２２を参照されたい。

【0253】

[00285]ある特定の実施形態では、可溶性ＬＡＧ－３は、エフチラギモドアルファ（ＩＭＰ３２１）またはそのＭＨＣ ＩＩ結合性断片もしくはバリアントを含む。ＩＭＰ３２１は、ＬＡＧ－３の可溶性二量体組換え形態である。ＩＭＰ３２１は、ＭＨＣＩＩ分子を通じて樹状細胞を刺激することによって持続性の免疫応答を誘導する。ＭＰ３２１と抗ＰＤ－１抗体または抗ＰＤ－Ｌ１抗体との組合せ療法は、Ｔ細胞を相乗的に活性化することが示されている（特に、ＣＤ８＋Ｔ細胞）。例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｌｕｃら、Ｆｕｔｕｒｅ Ｏｎｃｏｌ Ａｃｔｉｏｎｓ Ｓｅａｒｃｈ ｉｎ ＰｕｂＭｅｄ Ｓｅａｒｃｈ ｉｎ ＮＬＭ Ｃａｔａｌｏｇ Ａｄｄ ｔｏ Ｓｅａｒｃｈ．２０１９ Ｊｕｎ；１５（１７）：１９６３～１９７３．ｄｏｉ：１０．２２１７／ｆｏｎ－２０１８－０８０７．Ｅｐｕｂ ２０１９ Ａｐｒ １２．；Ｊｕｌｉｏら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌｕｍｅ ３７、Ｉｓｓｕｅ １５；およびＵＳ１０８７４７１３Ｂを参照されたい。

【0254】

ｉｖ．免疫阻害性受容体シグナル伝達のアンタゴニスト
[00286]ある特定の実施形態では、第２の部分は、免疫阻害性受容体シグナル伝達のアンタゴニストを含む。ある特定の実施形態では、免疫阻害性受容体は、ＳＩＲＰαである。

【0255】

[00287]本明細書で使用される場合、用語「ＳＩＲＰα」は、用語「シグナル制御タンパク質アルファ」と互換的に、主に骨髄性細胞および樹状細胞上で発現される阻害性受容体を指す。ＳＩＲＰαは、ＳＩＲＰβおよびＳＩＲＰγが挙げられるいくつかの他の膜貫通糖タンパク質も含むＳＩＲＰファミリーに属する。ＳＩＲＰファミリーの各メンバーは、３つの同様の細胞外Ｉｇ様ドメインと共に別個の膜貫通および細胞質ドメインを含有する。

【0256】

[00288]ＳＩＲＰαは、ファゴサイトーシスを抑制するように「私を食べないで（ｄｏｎ’ｔ ｅａｔ ｍｅ）」シグナルを送達するＣＤ４７に結合でき、貪食細胞上のＳＩＲＰαのＣＤ４７媒介係合を遮断することは「私を食べて（ｅａｔ ｍｅ）」シグナルを保有する生細胞の除去を生じ得る。ＣＤ４７は、細胞外Ｎ末端ＩｇＶドメイン、５つの膜貫通ドメインおよび短いＣ末端細胞内テールを有する広範に発現される膜貫通糖タンパク質である。ＣＤ４７は、ＳＩＲＰαについての細胞性リガンドとして機能する。腫瘍細胞は、マクロファージ媒介破壊を回避するためにＣＤ４７をしばしば過剰発現する。ＣＤ４７とＳＩＲＰαとの相互作用は、マクロファージ媒介ファゴサイトーシスの制御に関与することが示されている（Ｔａｋｅｎａｋａら、Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ．、８（１２）：１３１３～１３２３、２００７）。

【0257】

[00289]ある特定の実施形態では、第２の部分は、ＣＤ４７とＳＩＲＰαとの間の相互作用を遮断する。さまざまな前臨床モデルにおいて、ＣＤ４７とＳＩＲＰαとの相互作用を遮断する治療は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでがん細胞のファゴサイトーシスおよびｉｎ ｖｉｖｏで抗腫瘍免疫応答を刺激する。

【0258】

[00290]第２の部分は、ＣＤ４７結合性ドメインまたはＳＩＲＰα結合性ドメインを含み得る。ある特定の実施形態では、免疫阻害性受容体は、シグナル制御タンパク質アルファ（ＳＩＲＰα）である。ある特定の実施形態では、第２の部分は、ＣＤ４７とＳＩＲＰαとの間の相互作用を遮断する。ある特定の実施形態では、第２の部分は、ＣＤ４７結合性ドメインまたはＳＩＲＰα結合性ドメインを含む。ある特定の実施形態では、ＣＤ４７結合性ドメインは、可溶性ＳＩＲＰαもしくはそのＣＤ４７結合性断片、または抗ＣＤ４７抗体もしくはその抗原結合性断片を含む。

【0259】

[00291]ある特定の実施形態では、可溶性ＳＩＲＰα は、ＳＩＲＰαの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）またはそのＣＤ４７結合性断片もしくはバリアントを含む。ある特定の実施形態では、可溶性ＳＩＲＰ は、配列番号８４のアミノ酸配列、またはＣＤ４７に対する結合特異性を依然として保持する、少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。任意選択で、可溶性ＳＩＲＰ は、操作された高親和性ＳＩＲＰ バリアントであり、がん細胞でＣＤ４７を強くアンタゴナイズしたが、それ自体はマクロファージファゴサイトーシスを誘導しない。ある特定の実施形態では、ＳＩＲＰ バリアントは、配列番号９８と比較して、Ｌ４Ｖ、Ｌ４Ｉ、Ｖ６Ｉ、Ｖ６Ｌ、Ａ２１Ｖ、Ｖ２７Ｉ、Ｖ２７Ｌ、Ｉ３１Ｔ、Ｉ３１Ｓ、Ｉ３１Ｆ、Ｅ４７Ｖ、Ｅ４７Ｌ、Ｋ５３Ｒ、Ｅ５４Ｑ、Ｈ５６Ｐ、Ｈ５６Ｒ、Ｖ６３Ｉ、Ｓ６６Ｔ、Ｓ６６Ｇ、Ｋ６８Ｒ、Ｖ９２Ｉ、Ｆ９４Ｌ、Ｆ９４ＶおよびＦ１０３Ｖからなる群から選択される１つまたは複数の変異を含む。ある特定の実施形態では、ＳＩＲＰαバリアントは、１）Ｖ２７Ｉ、Ｋ５３Ｒ、Ｓ６６Ｔ、Ｋ６８Ｒ、Ｆ１０３Ｖ；２）Ｌ４Ｖ、Ｖ２７Ｌ、Ｅ４７Ｖ、Ｋ５３Ｒ、Ｅ５４Ｑ、Ｓ６６Ｇ、Ｋ６８Ｒ、Ｖ９２Ｉ；３）Ｌ４Ｖ、Ｖ６Ｉ、Ａ２１Ｖ、Ｖ２７Ｉ、Ｉ３１Ｔ、Ｅ４７Ｌ、Ｋ５３Ｒ、Ｈ５６Ｐ、Ｓ６６Ｔ、Ｋ６８Ｒ、Ｆ９４Ｌ；４）Ｖ６Ｉ、Ｖ２７Ｉ、Ｉ３１Ｓ、Ｅ４７Ｖ、Ｋ５３Ｒ、Ｅ５４Ｑ、Ｈ５６Ｐ、Ｓ６６Ｇ、Ｖ９２Ｉ、Ｆ９４Ｌ；５）Ｌ４Ｉ、Ａ２１Ｖ、Ｖ２７Ｉ、Ｉ３１Ｆ、Ｅ４７Ｖ、Ｋ５３Ｒ、Ｅ５４Ｑ、Ｈ５６Ｒ、Ｓ６６Ｇ、Ｆ９４Ｖ、Ｆ１０３Ｖ；６）Ｌ４Ｖ、Ｖ６Ｉ、Ｖ２７Ｉ、Ｉ３１Ｆ、Ｅ４７Ｖ、Ｋ５３Ｒ、Ｈ５６Ｒ、Ｓ６６Ｇ、Ｋ６８Ｒ、Ｖ９２Ｉ、Ｆ９４Ｌ；７）Ｌ４Ｖ、Ｖ６Ｌ、Ｉ３１Ｆ、Ｅ４７Ｖ、Ｋ５３Ｒ、Ｈ５６Ｐ、Ｓ６６Ｇ、Ｖ９２Ｉ、Ｆ１０３Ｖ；８）Ｖ６Ｉ、Ｖ２７Ｉ、Ｉ３１Ｆ、Ｅ４７Ｌ、Ｋ５３Ｒ、Ｅ５４Ｑ、Ｈ５６Ｐ、Ｓ６６Ｔ；９）Ｌ４Ｖ、Ｖ６Ｉ、Ｖ２７Ｉ、Ｉ３１Ｆ、Ｅ４７Ｖ、Ｋ５３Ｒ、Ｅ５４Ｑ、Ｈ５６Ｐ、Ｖ６３、Ｓ６６Ｔ、Ｋ６８Ｒ、Ｖ９２Ｉ；１０）Ｖ６Ｉ、Ｖ２７Ｉ、Ｉ３１Ｔ、Ｅ４７Ｖ、Ｋ５３Ｒ、Ｅ５４Ｑ、Ｈ５６Ｐ、Ｓ６６Ｇ、Ｋ６８Ｒ、Ｖ９２Ｉ、Ｆ１０３Ｖ；および１１）Ｖ６Ｉ、Ｖ２７Ｉ、Ｉ３１Ｆ、Ｅ４７Ｖ、Ｋ５３Ｒ、Ｅ５４Ｑ、Ｈ５６Ｐ、Ｓ６６Ｔ、Ｖ９２Ｉからなる群から選択される変異の組合せを含む。例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｋｉｐｐ Ｗｅｉｓｋｏｐｆら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３４１、８８（２０１３）を参照されたい。

【0260】

[00292]ある特定の実施形態では、ＳＩＲＰα結合性ドメインは、可溶性ＣＤ４７もしくはそのＳＩＲＰα結合性断片、または抗ＳＩＲＰα抗体もしくはその抗原結合性断片を含む。ある特定の実施形態では、可溶性ＣＤ４７は、ＣＤ４７の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）またはそのＳＩＲＰα結合性断片、抗ＳＩＲＰα抗体またはその抗原結合性断片を含む。

【0261】

[00293]ある特定の実施形態では、ＣＤ４７結合性ドメインは、抗ＣＤ４７抗体およびその抗原結合性断片を含む。例示的な抗ＣＤ４７抗体として、限定することなく、ヒト化５Ｆ９抗体、Ｂ６Ｈ１２抗体およびＺＦ１抗体が挙げられる。参照により本明細書に組み込まれる、Ｌｕら、ＯｎｃｏＴａｒｇｅｔｓ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ、Ｖｏｌｕｍｅ １３、ＤＯＩ ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．２１４７／ＯＴＴ．Ｓ２４９８２２を参照されたい。ある特定の実施形態では、ＳＩＲＰα結合性ドメインは、抗ＳＩＲＰα抗体またはその抗原結合性断片を含む。例示的な抗ＳＩＲＰα抗体として、限定することなくＢＩ７６５０６４およびＡＬ００８が挙げられる。例えば、参照により本明細書に組み込まれる、ＷＯ２０１９０７３０８０Ａ１、ＷＯ２０１９１７５２１８Ａ１およびＷＯ２０１８１０７０５８Ａ１を参照されたい。

【0262】

[00294]ある特定の実施形態では、ＣＤ４７結合性ドメインは、１つもしくは複数のＳＩＲＰα、ＳＩＲＰβもしくはＳＩＲＰγおよび／または１つもしくは複数の抗ＣＤ４７抗体もしくはその抗原結合性断片の１つまたは複数のＥＣＤの組合せを含む。

【0263】

[00295]１つまたは複数のＥＣＤは、同じでも異なっていてもよい。例えば、ＣＤ４７結合性ドメインは、ＳＩＲＰα、ＳＩＲＰβもしくはＳＩＲＰγのＥＣＤの同一の反復を含み得る、または代替的に、同じＳＩＲＰα、ＳＩＲＰβもしくはＳＩＲＰγの異なるＥＣＤ配列の組合せを含み得る、または代替的に異なるＳＩＲＰα、ＳＩＲＰβもしくはＳＩＲＰγ由来の異なるＥＣＤの組合せを含み得る。同様に、１つまたは複数の抗ＣＤ４７抗体は、同じでも異なっていてもよい。

【0264】

[00296]ある特定の実施形態では、ＣＤ４７結合性ドメインは、ＳＩＲＰαのＥＣＤ、ＳＩＲＰβのＥＣＤ、ＳＩＲＰγのＥＣＤ、またはこれらの任意の組合せからなる群から選択されるＥＣＤの組合せ（または融合物）を含む。

【0265】

[00297]ある特定の実施形態では、ＣＤ４７結合性ドメインは、１つまたは複数の抗ＣＤ４７抗体またはその抗原結合性断片の組合せ（または融合物）を含む。

【0266】

[00298]ある特定の実施形態では、ＣＤ４７結合性ドメインは、ＳＩＲＰαのＥＣＤ、ＳＩＲＰβのＥＣＤ、ＳＩＲＰγのＥＣＤ、１つもしくは複数の抗ＣＤ４７抗体もしくはその抗原結合性断片、またはこれらの任意の組合せからなる群から選択されるＥＣＤの組合せ（または融合物）を含む。

【0267】

ｖ．ＰＤ－Ｌ１結合性部分
[00299]ある特定の実施形態では、本明細書において提供される二機能性分子は、ＰＤ－Ｌ１結合性部分である第１の部分を含む。

【0268】

[00300]ある特定の実施形態では、本開示のＰＤ－Ｌ１結合性部分は、ＰＤ－Ｌ１（例えば、ヒトＰＤ－Ｌ１またはカニクイザルＰＤ－Ｌ１）に結合する。ある特定の実施形態では、本開示のＰＤ－Ｌ１結合性部分は、ヒトＰＤ－Ｌ１に結合する。ある特定の実施形態では、本開示のＰＤ－Ｌ１結合性部分は、カニクイザルＰＤ－Ｌ１に結合する。

【0269】

[00301]ある特定の実施形態では、本開示のＰＤ－Ｌ１結合性部分は、抗ＰＤ－Ｌ１抗体部分を含む。ある特定の実施形態では、例示的な抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、本開示の抗ＰＤ－Ｌ１抗体の章および例示的な抗ＰＤ－Ｌ１抗体の章に開示される。

【0270】

[00302]ある特定の実施形態では、抗ＰＤ－Ｌ１抗体部分は、１つまたは複数のＣＤＲを含む。ある特定の実施形態では、抗ＰＤ－Ｌ１抗体部分は、本開示の例示的な抗ＰＤ－Ｌ１抗体の章に開示される１つまたは複数のＣＤＲを含む。ある特定の実施形態では、抗ＰＤ－Ｌ１抗体部分は、重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。ある特定の実施形態では、抗ＰＤ－Ｌ１抗体部分は、本開示の例示的な抗ＰＤ－Ｌ１抗体の章に開示される抗ＰＤ－Ｌ１抗体のＶＨおよびＶＬを含む。

【0271】

[00303]ある特定の実施形態では、抗ＰＤ－Ｌ１抗体部分は、重鎖可変領域のカルボキシル末端に付加された重鎖定常ドメインをさらに含む。ある特定の実施形態では、重鎖定常領域は、ＩｇＡ、ＩｇＧおよびＩｇＭからなる群由来である。ある特定の実施形態では、重鎖定常領域は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２またはＩｇＭ由来である。ある特定の実施形態では、抗ＰＤ－Ｌ１抗体部分は、軽鎖可変領域のカルボキシル末端に付加された軽鎖定常ドメインをさらに含む。ある特定の実施形態では、軽鎖定常領域は、カッパ軽鎖またはラムダ軽鎖由来である。ある特定の実施形態では、重鎖定常領域は、配列番号８０または８１のアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、軽鎖定常領域は、配列番号８２のアミノ酸配列を含む。

【0272】

ｖｉ．第１の部分と第２の部分との間の連結
[00304]本開示では、第２の部分は、第１の部分の任意の一部分に連結され得る。例えば、ＴＧＦβ結合性部分またはＩＬ－１結合性部分などの第２の部分は、ＰＤ－Ｌ１結合性部分（例えば、抗ＰＤ－Ｌ１抗体部分）などの第１の部分の任意の好適な一部分に連結され得る。

【0273】

[00305]ある特定の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１結合性部分は、抗体重鎖および軽鎖などの１つまたは複数のポリペプチド鎖を含む。

【0274】

[00306]ある特定の実施形態では、二機能性分子は、１つまたは複数の第２の部分を含む。ある特定の実施形態では、第２の部分の少なくとも１つは第１の部分のポリペプチド鎖のアミノ末端（Ｎ末端）またはカルボキシル（Ｃ末端）に連結される。ある特定の実施形態では、第２の部分の少なくとも１つは第１の部分の重鎖のＮ末端もしくはＣ末端に連結される、または第１の部分の軽鎖のＮ末端もしくはＣ末端に連結される。

【0275】

[00307]ある特定の実施形態では、第２の部分の少なくとも１つは第１の部分の重鎖定常領域のＣ末端に連結される。ある特定の実施形態では、第２の部分のそれぞれは、第１の部分の各重鎖定常領域のＣ末端にそれぞれ連結される。

【0276】

[00308]ある特定の実施形態では、二機能性分子は、第２の部分の少なくとも２つを含み、そのそれぞれは、第１の部分の各重鎖のＣ末端にそれぞれ連結されるか、または第１の部分の各軽鎖のＣ末端にそれぞれ連結される。ある特定の実施形態では、二機能性分子は、第２の部分の少なくとも２つを含み、そのそれぞれは、第１の部分の各重鎖のＮ末端にそれぞれ連結されるか、または第１の部分の各軽鎖のＮ末端にそれぞれ連結される。

【0277】

[00309]ある特定の実施形態では、二機能性分子は、第１の部分の重鎖のＮ末端、第１の部分の重鎖のＣ末端、第１の部分の軽鎖のＮ末端、第１の部分の軽鎖のＣ末端、またはこれらの任意の組合せにそれぞれ連結された第２の部分の１つより多くを含む。例えば、二機能性分子は、第２の部分の少なくとも２つを含んでよく、その一方は第１の部分の重鎖のＣ末端に連結され、他方は第１の部分の軽鎖のＣ末端に連結される。例えば、二機能性分子は、第２の部分の少なくとも２つを含んでよく、その一方は第１の部分の重鎖のＮ末端に連結され、他方は第１の部分の軽鎖のＮ末端に連結される。

【0278】

[00310]ある特定の実施形態では、１つまたは複数のＴＧＦβ結合性部分、１つもしくは複数のＩＬ－１結合性部分、１つもしくは複数の免疫賦活性ポリペプチド（例えば、可溶性ＬＡＧ３もしくは可溶性ＣＤ４）または１つもしくは複数のＣＤ４７結合性部分は、抗ＰＤ－Ｌ１抗体部分に、抗ＰＤ－Ｌ１抗体部分の１）重鎖可変領域のＮ末端、２）軽鎖可変領域のＮ末端、３）重鎖可変領域のＣ末端；４）軽鎖可変領域のＣ末端；５）重鎖定常領域のＣ末端；６）軽鎖定常領域のＣ末端、および７）これらの任意の組合せからなる群から選択される１つまたは複数の位置で連結される。

【0279】

[00311]ある特定の実施形態では、二機能性分子はホモ二量体重鎖を含む。ある特定の実施形態では、二機能性分子はヘテロ二量体重鎖を含む。重鎖は、第２の部分の存在または位置に関してヘテロ二量体性である。ある特定の実施形態では、ヘテロ二量体重鎖は、第２の部分を有する一方の重鎖およびそれを有さない他方の重鎖を含む。

【0280】

ｖｉｉ．リンカー
[00312]第２の部分は、第１の部分に直接またはリンカーを介して連結され得る。直接の連結は、化学的連結（共有結合など）であり得る。

【0281】

[00313]ある特定の実施形態では、二機能性分子は、第１の部分と第２の部分とを繋ぐリンカーをさらに含む。本明細書で使用される場合、用語「リンカー」は、連結される少なくとも２つの実体と反応し、それにより１つの分子を形成するように実体を結合する、または十分に近い近接で実体の会合を維持することが可能である任意の好適な二機能性部分であり得る。リンカーは、反応したその官能基と共にまたはこれを伴わずに、生じた連結された分子または構造中に組み込まれ得る。

【0282】

[00314]ある特定の実施形態では、リンカーは、切断性リンカー、非切断性リンカー、ペプチドリンカー、可動性リンカー、剛性リンカー、ヘリックスリンカー、および非ヘリックスリンカーからなる群から選択される。

【0283】

[00315]ある特定の実施形態では、リンカーはペプチドリンカーを含む。ペプチドリンカーは、ペプチド結合によって互いに連結されたアミノ酸残基から作られていてよい。ある特定の実施形態では、ペプチドリンカーは、１つまたは複数の非天然アミノ酸をさらに含み得る。ある特定の実施形態では、ペプチドリンカーは、ペプチド結合によって繋がれ、２つ以上のポリペプチドを連結することが可能である少なくとも１、２、３、４、５、８、１０、１５、２０、３０、５０またはこれを超えるアミノ酸残基を有するアミノ酸配列を含む。ペプチドリンカーは、二次構造を有する場合と有さない場合がある。

【0284】

[00316]任意の好適なペプチドリンカーは使用され得る。多数のペプチドリンカー配列が当技術分野において公知である、例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：６４４４～６４４８（１９９３）；Ｐｏｌｊａｋら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ２：１１２１～１１２３（１９９４）を参照されたい。ある特定の実施形態では、ペプチドリンカーは、アミノ酸グリシン、セリン、アラニン、メチオニン、アスパラギンおよびグルタミンから選択されるアミノ酸残基を含み得るか、またはこれからなり得る。一部の実施形態では、ペプチドリンカーは、グリシンおよびアラニンなどの立体障害のないアミノ酸が大部分で作製され得る。一部の実施形態では、リンカーは、ポリグリシン、ポリアラニン、グリシンとアラニンとの組合せ（例えば、ポリ（Ｇｌｙ－Ａｌａ））またはグリシンとセリンとの組合せ（例えば、ポリ（Ｇｌｙ－Ｓｅｒ））である。

【0285】

[00317]ある特定の実施形態では、リンカーは、（（Ｇ）ｎＳ）ｍのアミノ酸配列を含み、式中、ｍおよびｎは、独立的に０から３０、１から２９、２から２８、３から２７、４から２６、５から２５、６から２４、７から２３、８から２２、９から２１、１０から２０、１１から１９、１２から１８、１３から１７、１４から１６または５から選択される整数である。ある特定の実施形態では、ｍは４であり、ｎは４である。

【0286】

[00318]ある特定の実施形態では、リンカーは、配列番号６８のアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、リンカーは、配列番号６８に少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0287】

ｖｉｉｉ．抗ＰＤ－Ｌ１抗体およびその抗原結合性断片
[00319]ある特定の実施形態では、本明細書において提供される二機能性分子のＰＤ－Ｌ１結合性部分は、抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその抗原結合性断片を含む部分を含む。ある特定の実施形態では、抗ＰＤ－Ｌ１抗体およびその抗原結合性断片は、ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合することが可能である。

【0288】

[00320]ある特定の実施形態では、本明細書において提供される抗ＰＤ－Ｌ１抗体およびその抗原結合性断片は、Ｂｉａｃｏｒｅアッセイによる測定で、ヒトＰＤ－Ｌ１に０．８ｎＭ以下、０．７ｎＭ以下、０．６ｎＭ以下、０．５ｎＭ以下、または０．４ｎＭ以下のＫ_Ｄ値で特異的に結合する。Ｂｉａｃｏｒｅアッセイは、表面プラズモン共鳴技術に基づく、例えば、Ｍｕｒｐｈｙ，Ｍ．ら、Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｃｈａｐｔｅｒ １９、ｕｎｉｔ １９．１４、２００６を参照されたい。ある特定の実施形態では、Ｋ_Ｄ値は、本開示の実施例６に記載の方法によって測定される。

【0289】

[00321]本明細書において提供される抗体またはその抗原結合性断片のヒトＰＤ－Ｌ１への結合は、その最大結合の５０％が観察される抗体の濃度を指す「最大半量有効濃度」（ＥＣ_５０）値によっても表され得る。ＥＣ_５０値は、当技術分野において公知の結合アッセイ、例えば、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、蛍光励起細胞選別（ＦＡＣＳ）アッセイおよび他の結合アッセイなどの直接的または間接的結合アッセイによって測定され得る。ある特定の実施形態では、本明細書において提供される抗体およびその抗原結合性断片は、ＥＬＩＳＡによる測定で０．３ｎＭ以下、０．２ｎＭ以下、０．１ｎＭ以下または０．０９ｎＭ以下のＥＣ_５０（すなわち、５０％結合濃度）でＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する。ある特定の実施形態では、本明細書において提供される抗体またはその抗原結合性断片は、ＦＡＣＳアッセイによる測定で１．４ｎＭ以下、１．３ｎＭ以下、１．２ｎＭ以下、１．１ｎＭ以下、１．０ｎＭ以下、０．３ｎＭ以下、０．２５ｎＭ以下または０．２１ｎＭ以下のＥＣ_５０（すなわち、５０％結合濃度）でＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する。

【0290】

[00322]一部の実施形態では、本明細書において提供される抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその抗原結合性断片は、ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する。一部の実施形態では、本明細書において提供される抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその抗原結合性断片は、Ｂ７ファミリーの他のメンバーに結合しない。

【0291】

[00323]ある特定の実施形態では、本明細書において提供される抗ＰＤ－Ｌ１抗体およびその抗原結合性断片は、ＰＤ－Ｌ１とその結合パートナー（例えば、ＰＤ－１およびＢ７－１）との間の相互作用を、ＥＬＩＳＡによる測定で２．２、２．１、２．０、１．９、１．８または１．２ｕｇ／ｍｌ以下のＩＣ５０を有して遮断することが可能である。

【0292】

[00324]ある特定の実施形態では、本明細書において提供される抗ＰＤ－Ｌ１抗体およびその抗原結合性断片は、ＰＤ－Ｌ１とその結合パートナー（例えば、ＰＤ－１、）との間の相互作用を、細胞ベースのアッセイによる測定で１．３、１．２、１．１、１．０、０．９または０．８ｎＭ以下のＥＣ５０を有して遮断することが可能である。

【0293】

ｉｘ．例示的な抗ＰＤ－Ｌ１抗体およびその抗原結合性断片
[00325]ある特定の実施形態では、本開示の抗ＰＤ－Ｌ１抗体（すなわち、ＰＤ－Ｌ１に対する抗体）およびその抗原結合性断片は、ＤＹＹＭＮ（配列番号１）、ＤＩＮＰＮＮＸ_１Ｘ_２ＴＸ_３ＹＮＨＫＦＫＧ（配列番号１９）、ＷＧＤＧＰＦＡＹ（配列番号３）、ＫＡＳＱＮＶＸ_４Ｘ_５Ｘ_６ＶＡ（配列番号２０）、ＳＸ_７ＳＸ_８ＲＹＴ（配列番号２１）、ＱＱＹＳＮＹＰＴ（配列番号６）からなる群から選択される配列を含む１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５または６つ）のＣＤＲを含み、式中、Ｘ_１はＧまたはＡであり、Ｘ_２はＧまたはＤまたはＱまたはＥまたはＬであり、Ｘ_３はＳまたはＭまたはＱまたはＬまたはＶであり、Ｘ_４はＧまたはＰまたはＫであり、Ｘ_５はＡまたはＧであり、Ｘ_６はＡまたはＩであり、Ｘ_７はＡまたはＮまたはＲまたはＶであり、Ｘ_８はＮまたはＨまたはＶまたはＤである。

【0294】

[00326]ある特定の実施形態では、重鎖可変領域は、
ａ）配列番号１の配列を含むＨＣＤＲ１、
ｂ）配列番号２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１７および配列番号１８からなる群から選択される配列を含むＨＣＤＲ２、ならびに
ｃ）配列番号３の配列を含むＨＣＤＲ３、
を含み、かつ／または
軽鎖可変領域は、
ｄ）配列番号４、配列番号７、配列番号８および配列番号９からなる群から選択される配列を含むＬＣＤＲ１、
ｅ）配列番号５、配列番号１０、配列番号１１および配列番号１２からなる群から選択される配列を含むＬＣＤＲ２、ならびに
ｆ）配列番号６の配列を含むＬＣＤＲ３
を含む。

【0295】

[00327]ある特定の実施形態では、重鎖可変領域は、
ｇ）配列番号１の配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号２の配列を含むＨＣＤＲ２、および配列番号３の配列を含むＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；
ｈ）配列番号１の配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号１３の配列を含むＨＣＤＲ２、および配列番号３の配列を含むＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；
ｉ）配列番号１の配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号１４の配列を含むＨＣＤＲ２、および配列番号３の配列を含むＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；
ｊ）配列番号１の配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号１５の配列を含むＨＣＤＲ２、および配列番号３の配列を含むＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；ならびに
ｋ）配列番号１の配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号１７の配列を含むＨＣＤＲ２、および配列番号３の配列を含むＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；ならびに
ｌ）配列番号１の配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号１８の配列を含むＨＣＤＲ２、および配列番号３の配列を含むＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域
からなる群から選択される。

【0296】

[00328]ある特定の実施形態では、軽鎖可変領域は、
ａ）配列番号４の配列を含むＬＣＤＲ１、配列番号５の配列を含むＬＣＤＲ２、および配列番号６の配列を含むＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；
ｂ）配列番号９の配列を含むＬＣＤＲ１、配列番号５の配列を含むＬＣＤＲ２、および配列番号６の配列を含むＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；
ｃ）配列番号８の配列を含むＬＣＤＲ１、配列番号５の配列を含むＬＣＤＲ２、および配列番号６の配列を含むＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；
ｄ）配列番号４の配列を含むＬＣＤＲ１、配列番号１２の配列を含むＬＣＤＲ２、および配列番号６の配列を含むＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；ならびに
ｅ）配列番号４の配列を含むＬＣＤＲ１、配列番号１１の配列を含むＬＣＤＲ２、および配列番号６の配列を含むＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域
からなる群から選択される。

【0297】

[00329]本明細書で使用される場合、抗体「４Ｂ６」は、配列番号４６の配列を有する重鎖可変領域、および配列番号４７の配列を有する軽鎖可変領域を含むモノクローナル抗体を指す。

【0298】

[00330]ある特定の実施形態では、本開示は、抗体４Ｂ６または抗体４Ｂ６のバリアントの１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５または６つ）のＣＤＲ配列を含む抗ＰＤ－Ｌ１抗体およびその抗原結合性断片を提供する。ＣＤＲ境界は、Ｋａｂａｔの慣例によって定義されたか、または同定された。

【0299】

[00331]ある特定の実施形態では、本開示は、配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号２、１３、１４、１５、１７および１８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２、ならびに配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３、ならびに／または配列番号４、７、８～９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、配列番号５、１０、１１～１２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２、ならびに配列番号６のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３を含む抗ＰＤ－Ｌ１抗体およびその抗原結合性断片を提供する。

【0300】

[00332]

【0301】

【表2】

【0302】

[00333]

【0303】

【表3】

【0304】

[00334]ＣＤＲは、抗原結合に関与することが公知である。しかし、６つのＣＤＲのすべてが不可欠または変更不能であるのではないことが見出された。言い換えると、抗ＰＤ－Ｌ１抗体４Ｂ６中の１つまたは複数のＣＤＲは、ＰＤ－Ｌ１への特異的結合親和性を実質的に依然として保持して置き換えるか、変更するか、または改変することが可能である。

【0305】

[00335]ある特定の実施形態では、本明細書において提供される抗体およびその抗原結合性断片は、抗体およびその抗原結合性断片がＰＤ－Ｌ１に特異的に結合できる限り、好適なフレームワーク領域（ＦＲ）配列を含む。上の表１に提供されるＣＤＲ配列は、マウス抗体から得られるが、それらは、組換え技術などの当技術分野において公知の好適な方法を使用して、特にマウス、ヒト、ラット、ウサギなどの任意の好適な種の任意の好適なＦＲ配列に移植され得る。

【0306】

[00336]ある特定の実施形態では、本明細書において提供される抗体およびその抗原結合性断片は、ヒト化されている。ヒト化抗体またはその抗原結合性断片は、ヒトでのその免疫原性の低減において望ましい。ヒト化抗体は、非ヒトＣＤＲ配列がヒトまたは実質的にヒトのＦＲ配列に移植されていることから、その可変領域においてキメラである。抗体または抗原結合性断片のヒト化は、非ヒト（例えば、マウス）ＣＤＲ遺伝子でヒト免疫グロブリン遺伝子中の対応するヒトＣＤＲ遺伝子を置換することによって基本的に実施され得る（例えば、Ｊｏｎｅｓら、（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２～５２５；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３～３２７；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４～１５３６を参照されたい）。

【0307】

[00337]好適なヒト重鎖および軽鎖可変ドメインは、当技術分野において公知の方法を使用してこの目的を達成するために選択され得る。例示的な例では、「ベストフィット」アプローチは、使用されてよく、ここで、非ヒト（例えば、げっ歯類）抗体可変ドメイン配列は、公知のヒト可変ドメイン配列のデータベースに対してスクリーニングされるかまたはＢＬＡＳＴされ、非ヒトクエリー配列に最も近いヒト配列が非ヒトＣＤＲ配列を移植するためのヒトスキャホールドとして同定され、使用される（例えば、Ｓｉｍｓら、（１９９３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２２９６；Ｃｈｏｔｈｉａら、（１９８７）Ｊ．Ｍｏｔ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１を参照されたい）。代替的に、すべてのヒト抗体のコンセンサス配列由来のフレームワークは、非ヒトＣＤＲの移植のために使用され得る（例えば、Ｃａｒｔｅｒら、（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９：４２８５；Ｐｒｅｓｔａら、（１９９３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５１：２６２３を参照されたい）。

【0308】

[00338]一部の実施形態では、本開示は、４Ｂ６の１２個のヒト化抗体を提供し、それらはそれぞれ、Ｈｕ４Ｂ６＿Ｈｇ．２Ｌａ．１、Ｈｕ４Ｂ６＿Ｈｇ．２Ｌａ．２、Ｈｕ４Ｂ６＿Ｈｇ．２Ｌａ．４、Ｈｕ４Ｂ６＿Ｈｇ．２Ｌａ．６、Ｈｕ４Ｂ６＿Ｈｇ．３Ｌａ．１、Ｈｕ４Ｂ６＿Ｈｇ．３Ｌａ．２、Ｈｕ４Ｂ６＿Ｈｇ．３Ｌａ．４、Ｈｕ４Ｂ６＿Ｈｇ．３Ｌａ．６、Ｈｕ４Ｂ６＿Ｈｇ．５Ｌａ．１、Ｈｕ４Ｂ６＿Ｈｇ．５Ｌａ．２、Ｈｕ４Ｂ６＿Ｈｇ．５Ｌａ．４およびＨｕ４Ｂ６＿Ｈｇ．５Ｌａ．６と名付けられる。４Ｂ６の各ヒト化抗体の重鎖および軽鎖可変領域の配列番号は、表５に示される。４Ｂ６の１２個のヒト化抗体それぞれのＣＤＲは、表５（下線付き配列）に示される。ＣＤＲ境界は、Ｋａｂａｔの慣例によって定義されたか、または同定された。

【0309】

[00339]下の表３ａは、ヒト化４Ｂ６についてのバリアントＣＤＲのアミノ酸配列を示し、下の表３ｂは、ヒト化４Ｂ６重鎖および軽鎖可変領域についてのＦＲを示す。下の表４は、キメラ抗体４Ｂ６についての１２個のヒト化抗体の各重鎖および軽鎖についてのＦＲアミノ酸配列を示し、それらはそれぞれ、Ｈｕ４Ｂ６＿Ｈｇ．２Ｌａ．１、Ｈｕ４Ｂ６＿Ｈｇ．２Ｌａ．２、Ｈｕ４Ｂ６＿Ｈｇ．２Ｌａ．４、Ｈｕ４Ｂ６＿Ｈｇ．２Ｌａ．６、Ｈｕ４Ｂ６＿Ｈｇ．３Ｌａ．１、Ｈｕ４Ｂ６＿Ｈｇ．３Ｌａ．２、Ｈｕ４Ｂ６＿Ｈｇ．３Ｌａ．４、Ｈｕ４Ｂ６＿Ｈｇ．３Ｌａ．６、Ｈｕ４Ｂ６＿Ｈｇ．５Ｌａ．１、Ｈｕ４Ｂ６＿Ｈｇ．５Ｌａ．２、Ｈｕ４Ｂ６＿Ｈｇ．５Ｌａ．４およびＨｕ４Ｂ６＿Ｈｇ．５Ｌａ．６と名付けられる。これら１２個のヒト化抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域は表５に示される。

【0310】

[00340]

【0311】

【表4】

【0312】

[00341]

【0313】

【表5】

【0314】

[00342]

【0315】

【表6】

【0316】

[00343]下の表５は、ヒト化４Ｂ６重鎖可変領域の３個のバリアント（すなわち、Ｈｕ４Ｂ６＿Ｈｇ．２、Ｈｕ４Ｂ６＿Ｈｇ．３およびＨｕ４Ｂ６＿Ｈｇ．５）ならびにヒト化４Ｂ６軽鎖可変領域の４個のバリアント（すなわち、ＡＭ４Ｂ６＿Ｌａ．１、ＡＭ４Ｂ６＿Ｌａ．２、ＡＭ４Ｂ６＿Ｌａ．４、ＡＭ４Ｂ６＿Ｌａ．６）を示す。

【0317】

【表7-1】

【0318】

【表7-2】

【0319】

[00344]ある特定の実施形態では、本明細書において提供されるヒト化抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその抗原結合性断片は、非ヒトであるＣＤＲ配列を除いて実質的にすべてのヒト配列から構成される。一部の実施形態では、可変領域ＦＲおよび、存在する場合、定常領域は、完全にまたは実質的にヒト免疫グロブリン配列由来である。ヒトＦＲ配列およびヒト定常領域配列は、異なるヒト免疫グロブリン遺伝子由来、例えば、１つのヒト抗体由来のＦＲ配列および別のヒト抗体由来の定常領域であってよい。一部の実施形態では、ヒト化抗体またはその抗原結合性断片は、ヒト重鎖ＨＦＲ１－４、および／または軽鎖ＬＦＲ１－４を含む。

【0320】

[00345]一部の実施形態では、ヒト由来のＦＲ領域は、それが由来するヒト免疫グロブリンと同じアミノ酸配列を含み得る。一部の実施形態では、ヒトＦＲの１つまたは複数のアミノ酸残基は、親非ヒト抗体由来の対応する残基で置換される。これは、非ヒト親抗体構造に非常に近いヒト化抗体またはその断片を作るため、それにより結合特徴を最適化する（例えば、結合親和性を増加させる）ためにある特定の実施形態では望ましい場合がある。ある特定の実施形態では、本明細書において提供されるヒト化抗体またはその抗原結合性断片は、ヒトＦＲ配列のそれぞれにおいて１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個、２個もしくは１個以下のアミノ酸残基置換、または重鎖もしくは軽鎖可変ドメインのすべてのＦＲ配列中に１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個、２個もしくは１個以下のアミノ酸残基置換を含む。一部の実施形態では、アミノ酸残基におけるそのような変更は、重鎖ＦＲ領域にだけ、軽鎖ＦＲ領域にだけ、または両方の鎖に存在し得る。ある特定の実施形態では、ヒトＦＲ配列の１つまたは複数のアミノ酸は、結合親和性を増加させるために無作為に変異される。ある特定の実施形態では、ヒトＦＲ配列の１つまたは複数のアミノ酸は、結合親和性を増加させるように親非ヒト抗体の対応するアミノ酸（複数可）に復帰変異される。

【0321】

[00346]ある特定の実施形態では、本開示のヒト化抗ＰＤ－Ｌ１抗体およびその抗原結合性断片は、ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＸ_９ＦＴ（配列番号４０）の配列またはこれに少なくとも８０％の配列同一性のある相同性配列を含む重鎖ＨＦＲ１、ＷＶＲＱＡＰＧＱＸ_１０ＬＥＷＭＧ（配列番号４１）の配列またはこれに少なくとも８０％の配列同一性のある相同性配列を含む重鎖ＨＦＲ２、ＲＶＴＸ_１６ＴＶＤＸ_１１ＳＩＳＴＡＹＭＥＬＳＲＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＸ_１２Ｘ_１３（配列番号４２）の配列またはこれに少なくとも８０％の配列同一性のある相同性配列を含む重鎖ＨＦＲ３、およびＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号２５）の配列またはこれに少なくとも８０％の配列同一性のある相同性配列を含む重鎖ＨＦＲ４を含み、式中、Ｘ_９はＴまたはＶであり、Ｘ_１０はＧまたはＳであり、Ｘ_１１はＴまたはＫであり、Ｘ_１２はＡまたはＶであり、Ｘ_１３はＲまたはＫである。

【0322】

[00347]ある特定の実施形態では、本開示のヒト化抗ＰＤ－Ｌ１抗体およびその抗原結合性断片は、ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣ（配列番号２６）の配列またはこれに少なくとも８０％の配列同一性のある相同性配列を含む軽鎖ＬＦＲ１、ＷＹＱＱＫＰＧＫＸ_１４ＰＫＬＬＩＹ（配列番号４３）の配列またはこれに少なくとも８０％の配列同一性のある相同性配列を含む軽鎖ＬＦＲ２、ＧＶＰＸ_１５ＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＸ_１７ＴＩＳＳＬＱＰＥＤＩＡＴＹＹＣ（配列番号４４）の配列またはこれに少なくとも８０％の配列同一性のある相同性配列を含む軽鎖ＬＦＲ３、およびＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号２９）の配列またはこれに少なくとも８０％の配列同一性のある相同性配列を含む軽鎖ＬＦＲ４を含み、式中、Ｘ_１４はＡまたはＳであり、Ｘ_１５はＳまたはＤであり、Ｘ_１６はＭまたはＶであり、Ｘ_１７はＦまたはＬである。

【0323】

[00348]ある特定の実施形態では、ＨＦＲ１は配列番号２２および３０からなる群から選択される配列を含み、ＨＦＲ２は配列番号２３および３１からなる群から選択される配列を含み、ＨＦＲ３は配列番号２４および３２～３５からなる群から選択される配列を含み、ＨＦＲ４は配列番号２５の配列を含み、ＬＦＲ１は配列番号２６からなる群からの配列を含み、ＬＦＲ２は配列番号２７および３６からなる群から選択される配列を含み、ＬＦＲ３は配列番号２８、および３７～３８、３９、４５からなる群から選択される配列を含み、ＬＦＲ４は配列番号２９の配列を含む。

【0324】

[00349]ある特定の実施形態では、本開示のヒト化抗ＰＤ－Ｌ１抗体およびその抗原結合性断片は、Ｈｕ４Ｂ６＿Ｈｇ．２（配列番号５８）、ＡＭ４Ｂ６＿Ｈｇ．３（配列番号５９）、ＡＭ４Ｂ６＿Ｈｇ．５（配列番号６０）からなる群から選択される重鎖可変領域中に含有されるＨＦＲ１、ＨＦＲ２、ＨＦＲ３、および／またはＨＦＲ４配列を含む。

【0325】

[00350]ある特定の実施形態では、本開示のヒト化抗ＰＤ－Ｌ１抗体およびその抗原結合性断片は、ＡＭ４Ｂ６＿Ｌａ．１（配列番号６２）、ＡＭ４Ｂ６＿Ｌａ．２（配列番号６３）、ＡＭ４Ｂ６＿Ｌａ．４（配列番号６４）、およびＡＭ４Ｂ６＿Ｌａ．６（配列番号６５）からなる群から選択される軽鎖可変領域に含有されるＬＦＲ１、ＬＦＲ２、ＬＦＲ３、および／またはＬＦＲ４配列を含む。

【0326】

[00351]ある特定の実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号４６、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、およびこれらに少なくとも８０％の配列同一性を有するその相同性配列からなる群から選択される配列を含む。ある特定の実施形態では、軽鎖可変領域は、配列番号４７、配列番号５４、配列番号５５、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、およびこれらに少なくとも８０％の配列同一性を有するその相同性配列からなる群から選択される配列を含む。ある特定の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１に対する抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号４９／５４、５０／５４、５１／５４、５２／５４、４９／５５、５０／５５、５１／５５、５２／５５、５８／６２、５８／６３、５８／６４、５８／６５、５９／６２、５９／６３、５９／６４、５９／６５、６０／６２、６０／６３、６０／６４および６０／６５からなる群から選択される重鎖可変領域配列と軽鎖可変領域配列との対を含む。

【0327】

[00352]これらの例示的なヒト化抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、ＰＤ－Ｌ１への特異的結合能力または親和性を保持し、その態様においては親マウス抗体４Ｂ６より良好である。

【0328】

[00353]一部の実施形態では、本明細書において提供される抗ＰＤ－Ｌ１抗体または抗原結合性断片は、重鎖可変ドメインのすべてもしくは一部分および／または軽鎖可変ドメインのすべてもしくは一部分を含む。一実施形態では、本明細書において提供される抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその抗原結合性断片は、本明細書において提供される重鎖可変ドメインのすべてまたは一部分からなる単一ドメイン抗体である。そのような単一ドメイン抗体についてのさらなる情報は、当技術分野において入手可能である（例えば、米国特許第６，２４８，５１６号を参照されたい）。

【0329】

[00354]ある特定の実施形態では、本明細書において提供される抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその抗原結合性断片は、重鎖および／または軽鎖定常領域を任意選択でさらに含む免疫グロブリン（Ｉｇ）定常領域をさらに含む。ある特定の実施形態では、重鎖定常領域は、ＣＨ１、ヒンジおよび／またはＣＨ２－ＣＨ３領域（または、任意選択でＣＨ２－ＣＨ３－ＣＨ４領域）を含む。ある特定の実施形態では、本明細書において提供される抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその抗原結合性断片は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２またはＩｇＭの重鎖定常領域を含む。ある特定の実施形態では、軽鎖定常領域は、ＣκまたはＣλを含む。本明細書において提供される抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその抗原結合性断片の定常領域は、野生型定常領域配列と同一であってよい、または１つまたは複数の変異において異なっていてよい。

【0330】

[00355]ある特定の実施形態では、本明細書において提供される抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその抗原結合性断片は、診断および／または治療的使用を提供するために十分である、ヒトＰＤ－Ｌ１への特異的結合親和性を有する。

【0331】

[00356]本明細書において提供される抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその抗原結合性断片は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、組換え抗体、二特異性抗体、多特異性抗体、標識抗体、二価抗体、抗イディオタイプ抗体または融合タンパク質であり得る。組換え抗体は、動物においてよりも組換え法を使用してｉｎ ｖｉｔｒｏで調製された抗体である。

【0332】

[00357]ある特定の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１結合性部分は、配列番号４９／５４、５０／５４、５１／５４、５２／５４、４９／５５、５０／５５、５１／５５、５２／５５、５８／６２、５８／６３、５８／６４、５８／６５、５９／６２、５９／６３、５９／６４、５９／６５、６０／６２、６０／６３、６０／６４および６０／６５からなる群から選択される重鎖可変領域配列と軽鎖可変領域配列との対を含む抗体またはその抗原結合性断片と、ＰＤ－Ｌ１への結合について競合する抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその抗原結合性断片を含む。

【0333】

ｘ．抗体バリアント
[00358]本明細書において提供される抗ＰＤ－Ｌ１抗体およびその抗原結合性断片は、本明細書において提供される抗体配列の種々のバリアントも包含する。

【0334】

[00359]ある特定の実施形態では、抗体バリアントは、上の表１に提供されるＣＤＲ配列の１つまたは複数に、上の表３ａ、３ｂおよび５に提供される重鎖可変領域もしくは軽鎖可変領域の非ＣＤＲ配列の１つまたは複数に、ならびに／または定常領域（例えば、Ｆｃ領域）に１つまたは複数の改変または置換を含む。そのようなバリアントは、それらの親抗体のＰＤ－Ｌ１への結合特異性を保持しているが、改変（複数可）または置換（複数可）によって付与される１つまたは複数の望ましい特性を有する。例えば、抗体バリアントは、改善された抗原結合親和性、改善されたグリコシル化パターン、グリコシル化のリスクの低減、脱アミノ化の低減、エフェクター機能（複数可）の低減もしくは枯渇、ＦｃＲｎ受容体結合の改善、薬物動態学的半減期、ｐＨ感度、および／またはコンジュゲーションへの適合性（例えば、１つまたは複数のシステイン残基の導入）の増加を有し得る。

【0335】

[00360]親抗体配列は、当技術分野において公知の方法、例えば「アラニンスキャニング変異誘発法」（例えば、ＣｕｎｎｉｎｇｈａｍおよびＷｅｌｌｓ（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４４：１０８１～１０８５を参照されたい）を使用して、改変または置換されるのに好適または好ましい残基を同定するためにスクリーニングされ得る。簡潔には、標的残基（例えば、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、ＬｙｓおよびＧｌｕなどの荷電残基）は、同定され、中性または負に荷電したアミノ酸（例えば、アラニンまたはポリアラニン）によって置き換えられ得、改変された抗体は産生され、目的の特性についてスクリーニングされる。特定のアミノ酸位置での置換が目的の機能的変化を実証する場合、次に位置は、改変または置換のための有望な残基として同定され得る。有望な残基は、異なる種類の残基（例えば、システイン残基、正に荷電した残基など）を用いて置換することによってさらに評価され得る。

【0336】

ｘｉ．親和性バリアント
[00361]抗体の親和性バリアントは、上の表１に提供される１つもしくは複数のＣＤＲ配列に、上の表３ｂおよび４に提供される１つもしくは複数のＦＲ配列に、または上の表５に提供される重鎖もしくは軽鎖可変領域配列に改変または置換を含有し得る。ＦＲ配列は、ＣＤＲ領域が可変領域中で２つのＦＲ領域によって隣接されていることが当技術分野において周知であることから、上の表１のＣＤＲ配列および上の表５の可変領域配列に基づいて当業者によって容易に同定され得る。親和性バリアントは、親抗体のＰＤ－Ｌ１への特異的結合親和性を保持しているか、またはさらに親抗体を超える改善されたＰＤ－Ｌ１特異的結合親和性を有する。ある特定の実施形態では、ＣＤＲ配列、ＦＲ配列または可変領域配列中の少なくとも１つ（またはすべて）の置換（複数可）は、保存的置換を含む。

【0337】

[00362]当業者は、上の表１および３ａで提供されるＣＤＲ配列および上の表５で提供される可変領域配列において、１つまたは複数のアミノ酸残基は生じた抗体または抗原結合性断片が、ＰＤ－Ｌ１への結合親和性もしくは結合能力を依然として保持するか、またはさらに改善された結合親和性もしくは能力を有して置換され得ることを理解する。当技術分野において公知の種々の方法がこの目的を達成するために使用され得る。例えば、抗体バリアント（ＦａｂまたはｓｃＦｖバリアントなど）のライブラリーは、ファージディスプレイ技術を用いて作製および発現され得、次に、ＰＤ－Ｌ１への結合親和性についてスクリーニングされ得る。別の例として、コンピューターソフトウェアは、ＰＤ－Ｌ１への抗体の結合を実質的にシミュレートし、結合境界面を形成する抗体上のアミノ酸残基を同定するために使用され得る。そのような残基は、結合親和性の低下を予防するために置換を回避されるか、またはより強力な結合を提供するために置換の標的にされるかのいずれかであり得る。

【0338】

[00363]ある特定の実施形態では、本明細書において提供されるヒト化抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその抗原結合性断片は、１つもしくは複数のＣＤＲ配列および／または１つもしくは複数のＦＲ配列に、１つまたは複数のアミノ酸残基置換を含む。ある特定の実施形態では、親和性バリアントは、ＣＤＲ配列および／またはＦＲ配列に合計で２０個、１５個、１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個、２個または１個以下の置換を含む。

【0339】

[00364]ある特定の実施形態では、抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその抗原結合性断片は、ＰＤ－Ｌ１への特異的結合親和性をその親抗体と同様のまたはそれよりも高くさえあるレベルで依然として保持する、上の表１および３ａに列挙されたもの（複数可）に少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％）の配列同一性を有する１個、２個、または３個のＣＤＲ配列を含む。

【0340】

[00365]ある特定の実施形態では、抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその抗原結合性断片は、ＰＤ－Ｌ１への特異的結合親和性をその親抗体と同様のまたはそれよりも高くさえあるレベルで依然として保持する、上の表５に列挙されたもの（複数可）に少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％）の配列同一性を有する１つまたは複数の可変領域配列を含む。一部の実施形態では、上の表５に列挙された可変領域配列で合計１から１０個のアミノ酸が置換されるか、挿入されるかまたは欠失されている。一部の実施形態では、置換、挿入または欠失はＣＤＲの外の領域で（例えば、ＦＲにおいて）生じる。

【0341】

ｘｉｉ．グリコシル化バリアント
[00366]本明細書において提供される抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその抗原結合性断片は、抗体またはその結合性断片のグリコシル化の程度を増加させるか、または減少させるかのいずれかのために得られ得るグリコシル化バリアントも包含する。

【0342】

[00367]抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその抗原結合性断片は、グリコシル化部位を導入するか、または除去する１つまたは複数の改変を含み得る。グリコシル化部位は、炭水化物部分（例えば、オリゴ糖構造）が結合され得る側鎖を有するアミノ酸残基である。抗体のグリコシル化は、典型的にはＮ結合またはＯ結合のいずれかである。Ｎ結合は、アスパラギン残基、例えば、アスパラギン－Ｘ－セリンおよびアスパラギン－Ｘ－スレオニンなどのトリペプチド配列中のアスパラギン残基の側鎖への炭水化物部分の結合を指し、ここでＸは、プロリンを除く任意のアミノ酸である。Ｏ結合グリコシル化は、糖Ｎ－アセチルガラクトサミン、ガラクトースまたはキシロースの内の１つのヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセリンまたはスレオニンへの結合を指す。天然グリコシル化部位の除去は、例えば、配列中に存在する上に記載されたトリペプチド配列（Ｎ結合グリコシル化部位について）またはセリンもしくはスレオニン残基（Ｏ結合グリコシル化部位について）の１つが置換されるようにアミノ酸配列を変更することによって好都合に達成され得る。新規グリコシル化部位は、そのようなトリペプチド配列またはセリンもしくはスレオニン残基を導入することによって同様の方法において創出され得る。

【0343】

[00368]ある特定の実施形態では、本明細書において提供される抗ＰＤ－Ｌ１抗体または抗原結合性断片は、１つまたは複数の脱アミド化部位を除去するような１つまたは複数の変異を含む。ある特定の実施形態では、本明細書において提供される抗ＰＤ－Ｌ１抗体または抗原結合性断片は、重鎖中のＧ５５に変異（例えば、Ｇ５５Ａ）を含む。これらの変異は、検査され、本明細書において提供される抗体の結合親和性に悪影響を与えないと考えられる。

【0344】

ｘｉｉｉ．システインが操作されたバリアント
[00369]本明細書において提供される抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその抗原結合性断片は、１つまたは複数の導入された遊離システインアミノ酸残基を含む、システインが操作されたバリアントも包含する。

【0345】

[00370]遊離システイン残基は、ジスルフィド結合の一部ではないものである。システインが操作されたバリアントは、例えば、特に細胞傷害性および／またはイメージング化合物、標識、または放射性同位元素（ｒａｄｉｏｉｓｏｐｔｙｐｅ）などとの、操作されたシステインの部位での、例えば、マレイミドまたはハロアセチルを通じたコンジュゲーションのために有用である。遊離システイン残基を導入するために抗体またはその抗原結合性断片を操作するための方法は、当技術分野において公知である、例えば、ＷＯ２００６／０３４４８８を参照されたい。

【0346】

ｘｉｖ．Ｆｃバリアント
[00371]本明細書において提供される抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその抗原結合性断片は、例えば、ＡＤＣＣおよびＣＤＣなどエフェクター機能の変化を提供するように、Ｆｃ領域および／またはヒンジ領域に１つまたは複数のアミノ酸残基改変または置換を含むＦｃバリアントも包含する。抗体を操作することによってＡＤＣＣ活性を変化させる方法は、当技術分野において記載されている、例えば、Ｓｈｉｅｌｄｓ ＲＬ．ら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２００１．２７６（９）：６５９１～６０４；Ｉｄｕｓｏｇｉｅ ＥＥ．ら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０００．１６４（８）：４１７８～８４；Ｓｔｅｕｒｅｒ Ｗ．ら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９５、１５５（３）：１１６５～７４；Ｉｄｕｓｏｇｉｅ ＥＥ．ら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００１、１６６（４）：２５７１～５；Ｌａｚａｒ ＧＡ．ら、ＰＮＡＳ、２００６、１０３（１１）：４００５～４０１０；Ｒｙａｎ ＭＣ．ら、Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ．、２００７、６：３００９～３０１８；Ｒｉｃｈａｒｄｓ ＪＯら、Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ．２００８、７（８）：２５１７～２７；Ｓｈｉｅｌｄｓ Ｒ．Ｌ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ、２００２、２７７：２６７３３～２６７４０；Ｓｈｉｎｋａｗａ Ｔ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ、２００３、２７８：３４６６～３４７３を参照されたい。

【0347】

[00372]本明細書において提供される抗体または抗原結合性断片のＣＤＣ活性は、例えば、Ｃ１ｑ結合および／またはＣＤＣを改善するか、または弱めることによって変更され得る（例えば、ＷＯ９９／５１６４２；Ｄｕｎｃａｎ ＆ Ｗｉｎｔｅｒ Ｎａｔｕｒｅ ３２２：７３８～４０（１９８８）；米国特許第５，６４８，２６０号；米国特許第５，６２４，８２１号を参照されたい）；およびＦｃ領域バリアントの他の例に関してＷＯ９４／２９３５１。Ｆｃ領域のアミノ酸残基３２９、３３１および３２２から選択される１つまたは複数のアミノ酸は、Ｃ１ｑ結合を変更させる、および／または補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を低減もしくは消失させるように異なるアミノ酸残基で置き換えられ得る（Ｉｄｕｓｏｇｉｅらによる、米国特許第６，１９４，５５１号を参照されたい）。１つまたは複数のアミノ酸置換（複数可）も、補体を固定する抗体の能力を変化させるために導入され得る（ＢｏｄｍｅｒらによるＰＣＴ公開ＷＯ９４／２９３５１を参照されたい）。

【0348】

[00373]ある特定の実施形態では、本明細書において提供されるＦｃバリアントは、野生型Ｆｃ（例えば、ＩｇＧ１のＦｃ）と比較して低減したエフェクター機能を有し、Ｆｃ領域の２２０、２２６、２２８、２２９、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２６７、２６８、２６９、２７０、２９７、３０９、３１８、３２０、３２２、３２５、３２８、３２９、３３０、３３１および３３２からなる群から選択される位置に１つまたは複数のアミノ酸置換（複数可）を含む（ＷＯ２０１６／１９６２２８；Ｒｉｃｈａｒｄｓら、（２００８）Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐ．７：２５１７；Ｍｏｏｒｅら、（２０１０）ｍＡｂｓ ２：１８１；およびＳｔｒｏｈｌ（２００９）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２０：６８５～６９１を参照されたい）、ここで、Ｆｃ領域中の残基の番号付けはＫａｂａｔにあるとおりのＥＵインデックスのものである。低減したエフェクター機能についての例示的な置換として、限定することなく、２２０Ｓ、２２６Ｓ、２２８Ｐ、２２９Ｓ、２３３Ｐ、２３４Ｖ、２３４Ｇ、２３４Ａ、２３４Ｆ、２３４Ａ、２３５Ａ、２３５Ｇ、２３５Ｅ、２３６Ｅ、２３６Ｒ、２３７Ａ、２３７Ｋ、２３８Ｓ、２６７Ｒ、２６８Ａ、２６８Ｑ、２６９Ｒ、２９７Ａ、２９７Ｑ、２９７Ｇ、３０９Ｌ、３１８Ａ、３２２Ａ、３２５Ｌ、３２８Ｒ、３３０Ｓ、３３１Ｓまたはこれらの任意の組合せが挙げられる（ＷＯ２０１６／１９６２２８；およびＳｔｒｏｈｌ（２００９）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２０：６８５～６９１を参照されたい）。

【0349】

[00374]ある特定の実施形態では、本明細書において提供される抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその抗原結合性断片は、エフェクター機能が低減しており、２３４、２３５、２３７、２３８、２６８、２９７、３０９、３３０および３３１からなる群から選択される位置でＩｇＧ１中に１つまたは複数のアミノ酸置換（複数可）を含む。ある特定の実施形態では、本明細書において提供される抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその抗原結合性断片は、ＩｇＧ１アイソタイプのものであり、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｑ、Ｎ２９７Ｇ、Ｌ２３５Ｅ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３４Ｆ、Ｌ２３５Ｅ、Ｐ３３１Ｓおよびこれらの任意の組合せからなる群から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換（複数可）を含む。

【0350】

[00375]ある特定の実施形態では、本明細書において提供される抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその抗原結合性断片は、ＩｇＧ１アイソタイプのものであり、Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａ変異を含む。ある特定の実施形態では、本明細書において提供される抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその抗原結合性断片は、ＩｇＧ１アイソタイプのものであり、Ｌ２３４Ｆ、Ｌ２３５ＥおよびＰ３３１Ｓを含む。ＦｃドメインのＣＨ２領域に位置する、置換のＬ２３４Ｆ、Ｌ２３５ＥおよびＰ３３１Ｓのセット（ＦＥＳ三重変異とも称される）は、ＦＣγＲおよびＣ１ｑ結合を抑止し、ＡＤＣＣまたはＣＤＣを誘発できない抗体を生じる（Ｏｇａｎｅｓｙａｎら、Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｄ ６４：７００～７０４（２００８））。ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／３６８７２は、バリアントＦｃドメイン、例えば、抗体のバリアントＦｃドメインにおいてこれらの変異を組み合わせることが、野生型親分子、例えば、野生型ＩｇＧ１ Ｆｃと比べて低下した熱安定性を有するＦｃドメインを生じることを示した。ある特定の実施形態では、Ｆｃバリアントは、配列番号８１のアミノ酸配列を含む。

【0351】

[00376]ある特定の実施形態では、本明細書において提供される抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその抗原結合性断片は、ＩｇＧ２アイソタイプのものであり、Ｈ２６８Ｑ、Ｖ３０９Ｌ、Ａ３３０Ｓ、Ｐ３３１Ｓ、Ｖ２３４Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｐ２３８Ｓ、Ｈ２６８Ａおよびこれらの任意の組合せ（例えば、Ｈ２６８Ｑ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ、Ｖ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ）からなる群から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換（複数可）を含む。ある特定の実施形態では、本明細書において提供される抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその抗原結合性断片は、ＩｇＧ４アイソタイプのものであり、Ｓ２２８Ｐ、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｑ、Ｎ２９７Ｇ、Ｌ２３５Ｅ、Ｆ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａおよびこれらの任意の組合せからなる群から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換（複数可）を含む。ある特定の実施形態では、本明細書において提供される抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその抗原結合性断片は、ＩｇＧ２／ＩｇＧ４クロスアイソタイプのものである。ＩｇＧ２／ＩｇＧ４クロスアイソタイプの例は、Ｒｏｔｈｅｒ ＲＰら、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２５：１２５６～１２６４（２００７）に記載されている。

【0352】

[00377]ある特定の実施形態では、抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその抗原結合性断片は、新生児期Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）へのｐＨ依存性結合を改善する１つまたは複数のアミノ酸置換（複数可）を含む。そのようなバリアントは、それが酸性ｐＨでＦｃＲｎに結合し、そのことがリソソームでの分解から逃れ、次いで細胞外に移動および放出されるようすることから、薬物動態学的半減期の延長を有し得る。ＦｃＲｎとの結合親和性を改善するように抗体またはその抗原結合性断片を操作する方法は、当技術分野において周知である、例えば、Ｖａｕｇｈｎ，Ｄ．ら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、６（１）：６３～７３、１９９８；Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ，Ｒ．ら、Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｖｏｌｕｍｅ １、Ｃｈａｐｔｅｒ ２７：Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ｆｃ ｒｅｇｉｏｎ ｆｏｒ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ＰＫ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒにより公開、２０１０；Ｙｅｕｎｇ，Ｙ．ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、７０：３２６９～３２７７（２０１０）；およびＨｉｎｔｏｎ，Ｐ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１７６：３４６～３５６（２００６）を参照されたい。

【0353】

[00378]ある特定の実施形態では、抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその抗原結合性断片は、ヘテロ二量体化を促進するおよび／またはプロモートするためにＦｃ領域の境界面に１つまたは複数のアミノ酸置換（複数可）を含む。これらの改変は、第１のＦｃポリペプチドへの隆起、および第２のＦｃポリペプチドへの空洞の導入を含み、ここで隆起は、ヘテロ二量体または複合体を形成するための第１のおよび第２のＦｃポリペプチドの相互作用をプロモートするように空洞中に位置付けられ得る。これらの改変を有する抗体を生成する方法は、例えば米国特許第５，７３１，１６８号に記載されているとおり当技術分野において公知である。

【0354】

ｘｖ．抗原結合性断片
[00379]本明細書において提供される二機能性分子中のＰＤ－Ｌ１結合性部分は、抗ＰＤ－Ｌ１抗原結合性断片も包含する。さまざまな種類の抗原結合性断片が当技術分野において公知であり、例えば、そのＣＤＲが上の表１および３ａに示されており、可変配列が表２および５に示されている例示的な抗体およびそれらのさまざまなバリアント（例えば、親和性バリアント、グリコシル化バリアント、Ｆｃバリアント、システインが操作されたバリアントなど）を含んで、本明細書において提供される抗ＰＤ－Ｌ１抗体に基づいて開発され得る。

【0355】

[00380]ある特定の実施形態では、本明細書において提供される抗ＰＤ－Ｌ１抗原結合性断片は、ダイアボディ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖ断片、ジスルフィド安定化Ｆｖ断片（ｄｓＦｖ）、（ｄｓＦｖ）_２、二特異性ｄｓＦｖ（ｄｓＦｖ－ｄｓＦｖ’）、ジスルフィド安定化ダイアボディ（ｄｓダイアボディ）、１本鎖抗体分子（ｓｃＦｖ）、ｓｃＦｖ二量体（二価ダイアボディ）、多特異性抗体、ラクダ化単一ドメイン抗体、ナノボディ、ドメイン抗体および二価ドメイン抗体である。

【0356】

[00381]種々の技術が、そのような抗原結合性断片の産生のために使用され得る。例示的な方法として、無傷抗体の酵素消化（例えば、Ｍｏｒｉｍｏｔｏら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４：１０７～１１７（１９９２）；およびＢｒｅｎｎａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２９：８１（１９８５）を参照されたい）、Ｅ．Ｃｏｌｉなどの宿主細胞による組換え発現（例えば、Ｆａｂ、ＦｖおよびＳｃＦｖ抗体断片について）、上に考察されたファージディスプレイライブラリーからのスクリーニング（例えば、ＳｃＦｖについて）およびＦ（ａｂ’）_２断片を形成するような２つのＦａｂ’－ＳＨ断片の化学的カップリング（Ｃａｒｔｅｒら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：１６３～１６７（１９９２））が挙げられる。抗体断片の産生のための他の技術は、当業者に明らかである。

【0357】

[00382]ある特定の実施形態では、抗原結合性断片はｓｃＦｖである。ｓｃＦｖの生成は、例えば、ＷＯ９３／１６１８５；米国特許第５，５７１，８９４号；および第５，５８７，４５８号に記載されている。ＳｃＦｖは、融合タンパク質を提供するようにアミノまたはカルボキシル末端のいずれかでエフェクタータンパク質に融合され得る（例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ編を参照されたい）。

【0358】

[00383]ある特定の実施形態では、本明細書において提供される抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその抗原結合性断片は、二価、四価、六価または多価である。二価より多い任意の分子は、例えば、三価、四価、六価などを包含して多価とみなされる。

【0359】

[00384]二価分子は、２つの結合部位が同じ抗原または同じエピトープへの結合に対して両方とも特異的である場合は、単一特異性であり得る。ある特定の実施形態では、これは、一価のカウンターパートよりも抗原またはエピトープに対するより強力な結合を提供する。同様に、多価分子も単一特異性であり得る。ある特定の実施形態では、二価または多価抗原結合性部分において、結合部位の第１の価および結合部位の第２の価は、構造的に同一である（すなわち、同じ配列を有する）または構造的に異なっている（すなわち、同じ特異性を有するが異なる配列を有する）。

【0360】

[00385]二価は、２つの結合部位が異なる抗原またはエピトープに対して特異的である場合に、二特異性でもあり得る。これは、多価分子にも適用される。例えば、三価分子は、２つの結合部位が第１の抗原（またはエピトープ）に単一特異性であり、第３の結合部位が第２の抗原（またはエピトープ）に特異的である場合に、二特異性であり得る。

【0361】

ｘｖｉ．二特異性抗体
[00386]ある特定の実施形態では、抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその抗原結合性断片は二特異性である。ある特定の実施形態では、本明細書において提供される第２の部分とは別に、ＰＤ－Ｌ１結合抗体またはその抗原結合性断片は、前記抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその抗原結合性断片由来の異なる結合特異性を有する追加的な機能的ドメインにさらに連結される。

【0362】

[00387]ある特定の実施形態では、本明細書において提供される二特異性抗体またはその抗原結合性断片は、ＰＤ－Ｌ１以外（および、第２の部分によって結合される標的以外）の第２の抗原、またはＰＤ－Ｌ１上の第２のエピトープ（もしくは、第２の部分によって結合される標的上の第２のエピトープ）に特異的に結合することが可能である。

【0363】

ｘｖｉｉ．二機能性分子
[00388]ある特定の実施形態では、本明細書において提供される二機能性分子は、第２の部分によって結合されたＰＤ－Ｌ１および標的の両方に結合することが可能である。ある特定の実施形態では、本明細書において提供される二機能性分子は、ＰＤ－Ｌ１およびＴＧＦβの両方に結合する、またはＰＤ－Ｌ１およびＩＬ－１の両方に結合する、またはＰＤ－Ｌ１およびＩＬ－１Ｒの両方に結合する、またはＰＤ－Ｌ１およびＭＨＣＩＩの両方に結合する、またはＰＤ－Ｌ１およびＣＤ４７の両方に結合する、またはＰＤ－Ｌ１およびＳＩＲＰαの両方に結合することが可能である。

【0364】

[00389]ある特定の実施形態では、本開示のＰＤ－Ｌ１およびＴＧＦβを標的化する二機能性分子は、ＥＬＩＳＡアッセイによる測定で２．０ｎＭ以下（例えば、２．０ｎＭ以下、１．２ｎＭ以下、１．１ｎＭ以下、１．０ｎＭ以下、０．９ｎＭ以下、０．８ｎＭ以下）のＥＣ_５０でヒトＴＧＦβ１に特異的に結合する。ある特定の実施形態では、本開示のＰＤ－Ｌ１およびＴＧＦβを標的化するタンパク質は、ＥＬＩＳＡアッセイによる測定でＰＤ－Ｌ１およびＴＧＦβに同時に結合することが可能である。ある特定の実施形態では、本開示のＰＤ－Ｌ１およびＴＧＦβを標的化する二機能性分子は、Ｂｉａｃｏｒｅアッセイによる測定で０．８ｎＭ以下、０．７ｎＭ以下、０．６ｎＭ以下、０．５ｎＭ以下または０．４ｎＭ以下のＫ_Ｄ値でヒトＰＤ－Ｌ１に特異的に結合することが可能である。ある特定の実施形態では、本開示のＰＤ－Ｌ１およびＴＧＦβを標的化する二機能性分子は、ＥＬＩＳＡアッセイによる測定で２．０ｎＭ以下（例えば、２．０ｎＭ以下、１．２ｎＭ以下、１．１ｎＭ以下、１．０ｎＭ以下、０．９ｎＭ以下、０．８ｎＭ以下）のＫ_Ｄ値でヒトＴＧＦβ１に特異的に結合することが可能である。

【0365】

[00390]ある特定の実施形態では、本開示のＰＤ－Ｌ１およびＴＧＦβを標的化する二機能性分子は、用量依存的様式で腫瘍成長阻害に相乗効果を示すことが可能である。

【0366】

[00391]ある特定の実施形態では、本開示のＰＤ－Ｌ１およびＴＧＦβを標的化する二機能性分子は、免疫チェックポイント分子のみを含む分子と比較して、腫瘍微小環境への抗腫瘍免疫細胞の浸潤の増強を示すことが可能である。

【0367】

[00392]ある特定の実施形態では、本開示のＰＤ－Ｌ１およびＴＧＦβを標的化する二機能性分子は、血漿中のＴＧＦβ１を少なくとも９０％（例えば、少なくとも８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％または２０％）選択的に低減することが可能であり、そのような低減は、少なくとも１０、１４または２１日間維持され得る。

【0368】

[00393]ある特定の実施形態では、二機能性分子は、ヘテロ二量体重鎖を含む。重鎖は、第２の部分の存在または位置に関してヘテロ二量体性である。ある特定の実施形態では、ヘテロ二量体重鎖は、第２の部分を有する１つの重鎖と有さない他の重鎖とを含み、ここで第２の部分は、ＣＤ４７結合性ドメイン（例えば、可溶性ＳＩＲＰα）またはＳＩＲＰα結合性ドメインを含む。

【0369】

[00394]二機能性分子では、ヘテロ二量体重鎖は、第２の部分を有する１つの重鎖と有さない他の重鎖とを含む。ヘテロ二量体重鎖は、ホモ二量体化を防止する、および／またはヘテロ二量体化を支持するように関連するヘテロ二量体Ｆｃ領域をさらに含み得る。例えば、ヘテロ二量体Ｆｃ領域は、それらが同一ではなく、それらの中でホモ二量体を形成するよりも互いの間で優先的にヘテロ二量体を形成するように選択され得る。ある特定の実施形態では、ヘテロ二量体Ｆｃ領域は、ノブイントゥーホールの形成、疎水性相互作用、静電相互作用、親水性相互作用、または可動性の増加を介してヘテロ二量体に会合することが可能である。ある特定の実施形態では、ヘテロ二量体Ｆｃ領域は、ノブイントゥーホールを形成することが可能であるようにそれぞれ変異されているＣＨ２および／またはＣＨ３ドメインを含む。ノブは、第１のＣＨ２／ＣＨ３ポリペプチド中の小さなアミノ酸残基の大きなものでの置き換えによって得ることができ、ホールは、大きな残基の小さなものでの置き換えによって得ることができる。ある特定の実施形態では、ヘテロ二量体Ｆｃ領域は、Ｓ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗ置換を含有するＩｇＧ１アイソタイプの第１のＣＨ３ドメイン（配列番号９６、ノブ）ならびにＹ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡおよびＹ４０７Ｖ置換を含有するＩｇＧ１アイソタイプの第２のＣＨ３ドメイン（配列番号９７、ホール）を含む。

【0370】

[00395]ある特定の実施形態では、二機能性分子は、配列番号１１８もしくは配列番号１２０のアミノ酸配列を含む重鎖、および／または配列番号１１９もしくは配列番号１２１のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。

【0371】

ｘｖｉｉｉ．コンジュゲート
[00396]一部の実施形態では、二機能性分子は、１つまたは複数のコンジュゲート部分をさらに含む。コンジュゲート部分は、二機能性分子に連結され得る。コンジュゲート部分は、二機能性分子に結合され得る部分である。種々のコンジュゲート部分が、本明細書において提供される二機能性分子に連結され得ることは検討されている（例えば、「Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｖａｃｃｉｎｅｓ」、Ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎｓ ｔｏ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｊ．Ｍ．ＣｒｕｓｅおよびＲ．Ｅ．Ｌｅｗｉｓ，Ｊｒ．（編）、Ｃａｒｇｅｒ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、（１９８９）を参照されたい）。これらのコンジュゲート部分は、他にも方法はあるが、共有結合、親和性結合、インターカレーション、配位結合、複合体化、会合、混合または付加によって二機能性分子に連結され得る。一部の実施形態では、二機能性分子は、リンカーを介して１つまたは複数のコンジュゲートに連結され得る。

【0372】

[00397]ある特定の実施形態では、本明細書において提供される二機能性分子は、エピトープ結合性部分の外に、１つまたは複数のコンジュゲート部分への結合のために利用され得る特異的部位を含有するように操作され得る。例えば、そのような部位は、コンジュゲート部分への共有結合を促進するための１つまたは複数の反応性アミノ酸残基、例えば、システインまたはヒスチジン残基などを含み得る。

【0373】

[00398]ある特定の実施形態では、二機能性分子は、コンジュゲート部分に間接的にまたは別のコンジュゲート部分を通じて連結され得る。例えば、本明細書において提供される二機能性分子は、ビオチンにコンジュゲートされてよく、次いで、アビジンにコンジュゲートされる第２のコンジュゲートに間接的にコンジュゲートされてよい。一部の実施形態では、コンジュゲート部分は、クリアランス改変剤（例えば、半減期を延長するＰＥＧなどのポリマー）、化学療法剤、毒素、放射性同位元素、ランタニド、検出可能な標識（例えば、発光標識、蛍光標識、酵素基質標識）、ＤＮＡアルキル化剤、トポイソメラーゼ阻害剤、チューブリン結合剤、精製のための部分または他の抗がん薬物を含む。

【0374】

[00399]「毒素」は、細胞に有害である、または細胞を損傷もしくは死滅させることができる任意の薬剤であり得る。毒素の例として、限定することなく、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、エチジウムブロマイド、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ＭＭＡＥ、ＭＭＡＦ、ＤＭ１、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミスラマイシン、アクチノマイシンＤ、１－デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、ピューロマイシンおよびそのアナログ、代謝拮抗薬（例えば、メトトレキサート、６－メルカプトプリン、６－チオグアニン、シタラビン、５－フルオロウラシルダカルバジン（ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ ｄｅｃａｒｂａｚｉｎｅ）、アルキル化剤（例えば、メクロレタミン、チオテパクロラムブシル（ｔｈｉｏｅｐａ ｃｈｌｏｒａｍｂｕｃｉｌ）、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）およびロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｔｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣおよびｃｉｓ－ジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシン（以前は、ダウノマイシン）およびドキソルビシン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（以前は、アクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミスラマイシンおよびアントラマイシン（ＡＭＣ））、有糸分裂阻害薬（例えば、ビンクリスチンおよびビンブラスチン）、トポイソメラーゼ阻害薬ならびにチューブリン結合剤が挙げられる。

【0375】

[00400]検出可能な標識の例として、蛍光標識（例えば、フルオレセイン、ローダミン、ダンシル、フィコエリトリンまたはテキサスレッド）、酵素基質標識（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ルシフェラーゼ（ｌｕｃｅｒｉｆｅｒａｓｅ）、グルコアミラーゼ、リゾチーム、糖質酸化酵素またはβ－Ｄ－ガラクトシダーゼ）、放射性同位元素（例えば、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓ、３Ｈ、１１１Ｉｎ、１１２Ｉｎ、１４Ｃ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、８６Ｙ、８８Ｙ、９０Ｙ、１７７Ｌｕ、２１１Ａｔ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１５３Ｓｍ、２１２Ｂｉおよび３２Ｐ、他のランタニド）、発光標識、発色部分、ジゴキシゲニン、ビオチン／アビジン、検出用ＤＮＡ分子または金を挙げることができる。

【0376】

[00401]ある特定の実施形態では、コンジュゲート部分は、二機能性分子の半減期の増加を助けるクリアランス改変剤であってもよい。例示的な例として、水溶性ポリマー、例えばＰＥＧ、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマーなどが挙げられる。ポリマーは、任意の分子量のものであってよく、分岐または未分岐であってよい。抗体に結合しているポリマーの数は変動する場合があり、１つより多いポリマーが結合している場合、それらは同じまたは異なる分子であってよい。

【0377】

[00402]ある特定の実施形態では、コンジュゲート部分は、磁気ビーズなどの精製のための部分であり得る。

【0378】

[00403]ある特定の実施形態では、本明細書において提供される二機能性分子は、コンジュゲートのためのベースとして使用される。

【0379】

ＩＩＩ．ポリヌクレオチドおよび組換え法
[00404]本開示は、本明細書において提供される二機能性分子をコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。本明細書で使用される場合、用語「核酸」または「ポリヌクレオチド」は、１本鎖形態または２本鎖形態のいずれかでのデオシキリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）およびこれらのポリマーを指す。他に示さない限り、具体的なポリヌクレオチド配列は、その保存的に改変されたバリアント（例えば、縮重コドン置換）、対立遺伝子、オルソログ、ＳＮＰおよび相補配列も、明確に示された配列と同様に非明示的に包含する。具体的には、縮重コドン置換は、１つまたは複数の選択された（または、すべての）コドンの３番目の位置が、混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換されている配列を生成することによって達成され得る（Ｂａｔｚｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１９：５０８１（１９９１）；Ｏｈｔｓｕｋａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５～２６０８（１９８５）；およびＲｏｓｓｏｌｉｎｉら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ ８：９１～９８（１９９４）を参照されたい）。

【0380】

[00405]モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、従来の手順を使用して（例えば、抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することが可能であるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）容易に単離および配列決定される。コードＤＮＡは、合成法によっても得られ得る。

【0381】

[00406]二機能性分子をコードする単離されたポリヌクレオチドは、当技術分野において公知の組換え技術を使用して、さらなるクローニング（ＤＮＡの増幅）のために、または発現のためにベクターに挿入され得る。多数のベクターが入手可能である。ベクター構成要素として、これだけに限らないが、次の、単一配列、複製開始点、１つまたは複数のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター（例えば、ＳＶ４０、ＣＭＶ、ＥＦ－１α）および転写終結配列の１つまたは複数が一般に挙げられる。

【0382】

[00407]本開示は、本明細書において提供される単離されたポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。ある特定の実施形態では、本明細書において提供されるポリヌクレオチドは、二機能性分子、核酸配列に作動可能に連結された少なくとも１つのプロモーター（例えば、ＳＶ４０、ＣＭＶ、ＥＦ－１α）および少なくとも１つの選択マーカーをコードする。ベクターの例として、これだけに限らないが、レトロウイルス（レンチウイルスを含む）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス）、ポックスウイルス、バキュロウイルス、パピローマウイルス、パポバウイルス（例えば、ＳＶ４０）、ラムダファージおよびＭ１３ファージ、プラスミドｐｃＤＮＡ３．３、ｐＭＤ１８－Ｔ、ｐＯｐｔｉｖｅｃ、ｐＣＭＶ、ｐＥＧＦＰ、ｐＩＲＥＳ、ｐＱＤ－Ｈｙｇ－ＧＳｅｕ、ｐＡＬＴＥＲ、ｐＢＡＤ、ｐｃＤＮＡ、ｐＣａｌ、ｐＬ、ｐＥＴ、ｐＧＥＭＥＸ、ｐＧＥＸ、ｐＣＩ、ｐＥＧＦＴ、ｐＳＶ２、ｐＦＵＳＥ、ｐＶＩＴＲＯ、ｐＶＩＶＯ、ｐＭＡＬ、ｐＭＯＮＯ、ｐＳＥＬＥＣＴ、ｐＵＮＯ、ｐＤＵＯ、Ｐｓｇ５Ｌ、ｐＢＡＢＥ、ｐＷＰＸＬ、ｐＢＩ、ｐ１５ＴＶ－Ｌ、ｐＰｒｏ１８、ｐＴＤ、ｐＲＳ１０、ｐＬｅｘＡ、ｐＡＣＴ２．２、ｐＣＭＶ－ＳＣＲＩＰＴ．ＲＴＭ．、ｐＣＤＭ８、ｐＣＤＮＡ１．１／ａｍｐ、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ＰＣＲ２．１、ｐＥＦ－１、ｐＦＢ、ｐＳＧ５、ｐＸＴ１、ｐＣＤＥＦ３、ｐＳＶＳＰＯＲＴ、ｐＥＦ－Ｂｏｓなどが挙げられる。

【0383】

[00408]二機能性分子をコードするポリヌクレオチド配列を含むベクターは、クローニングおよび遺伝子発現のために宿主細胞に導入され得る。本明細書におけるベクター中のＤＮＡをクローニングまたは発現するために好適な宿主細胞は、上に記載される原核生物、酵母または高等真核生物細胞である。この目的のために好適な原核生物として、例えばグラム陰性またはグラム陽性生物などの真正細菌、例えば、大腸菌属などの腸内細菌科、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、エンテロバクター属、エルウィニア属、クレブシエラ属、プロテウス属、サルモネラ属、例えば、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、セラチア属、例えば、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃａｎｓおよび赤痢菌属ならびに、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓおよびＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓなどの杆菌、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａなどのシュードモナス属ならびにストレプトマイセス属が挙げられる。

【0384】

[00409]原核生物に加えて、糸状菌類または酵母などの真核性微生物は、二機能性分子をコードするベクターのための好適なクローニングまたは発現宿主である。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅまたは一般的なパン酵母は、下等真核性宿主微生物では最も一般的に使用される。しかし、多数の他の属、種および株は、本明細書において一般に入手可能であり、有用である、例えば、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ；クリベロミセス属宿主、例えば、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ、Ｋ．ｆｒａｇｉｌｉｓ（ＡＴＣＣ１２，４２４）、Ｋ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ（ＡＴＣＣ１６，０４５）、Ｋ．ｗｉｃｋｅｒａｍｉｉ（ＡＴＣＣ２４，１７８）、Ｋ．ｗａｌｔｉｉ（ＡＴＣＣ５６，５００）、Ｋ．ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｒｕｍ（ＡＴＣＣ３６，９０６）、Ｋ．ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓおよびＫ．ｍａｒｘｉａｎｕｓなど；ヤロウイア属（ＥＰ４０２，２２６）；Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ（ＥＰ１８３，０７０）；カンジダ属；Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｉａ（ＥＰ２４４，２３４）；Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ；シュワンニオミセス属、例えば、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ；ならびに糸状菌類、例えば、ニューロスポラ属、ペニシリウム属、トリポクラジウム属など、およびアスペルギルス属宿主、例えば、Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓおよびＡ．ｎｉｇｅｒなど。

【0385】

[00410]本明細書において提供されるグリコシル化された二機能性分子の発現のために好適な宿主細胞は、多細胞生物由来である。無脊椎動物細胞の例として、植物および昆虫細胞が挙げられる。多数のバキュロウイルス株およびバリアントならびに、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（イモムシ）、Ａｅｄｅｓ ａｅｇｙｐｔｉ（カ）、Ａｅｄｅｓ ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ（カ）、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ（ショウジョウバエ（ｆｒｕｉｆｆｌｙ））、およびＢｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉなどの宿主由来の対応する許容的昆虫宿主細胞が同定されている。トランスフェクションのための種々のウイルス株、例えば、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ ＮＰＶのＬ－１バリアントおよびＢｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ ＮＰＶのＢｍ－５株は公的に入手可能であり、そのようなウイルスは、本発明による本明細書のウイルスとして、特にＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞のトランスフェクションのために使用され得る。ワタ、トウモロコシ、ジャガイモ、ダイズ、ペチュニア、トマトおよびタバコの植物細胞培養物も宿主として利用され得る。

【0386】

[00411]しかし、関心は脊椎動物細胞において最も大きく、培養（組織培養）での脊椎動物細胞の増殖は、日常的手順である。有用な哺乳動物宿主細胞系の例は、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１系（ＣＯＳ－７、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）；ヒト胚性腎臓系（２９３または懸濁培養での増殖のためにサブクローニングされた２９３細胞、Ｇｒａｈａｍら、Ｊ．Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．３６：５９（１９７７））；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ １０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞／－ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、Ｕｒｌａｕｂら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：４２１６（１９８０））；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ、Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３～２５１（１９８０））；サル腎臓細胞（ＣＶ１ ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ－７６、ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１５８７）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ３４）；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ ３Ａ、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７５）；ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ Ｇ２、ＨＢ ８０６５）；マウス乳房腫瘍（ＭＭＴ ０６０５６２、ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒら、Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３：４４～６８（１９８２））；ＭＲＣ５細胞；ＦＳ４細胞；およびヒト肝細胞腫系（Ｈｅｐ Ｇ２）である。一部の実施形態では、宿主細胞は、ＣＨＯ、ＢＨＫ、ＮＳ０、２９３およびそれらの派生物などの哺乳動物培養細胞系である。

【0387】

[00412]宿主細胞は、二機能性分子の産生のための上に記載された発現またはクローニングベクターを用いて形質転換され、プロモーターを誘導する、形質転換体を選択する、または所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために適宜改変された従来の栄養培地で培養される。別の実施形態では、二機能性分子は、当技術分野において公知の相同組換えによって産生され得る。ある特定の実施形態では、宿主細胞は、本明細書において提供される二機能性分子を産生することが可能である。

【0388】

[00413]本開示は、本明細書において提供される宿主細胞を本開示のベクターが発現される条件下で培養することを含む、本明細書において提供される二機能性分子を発現する方法も提供する。本明細書において提供される二機能性分子を産生するために使用される宿主細胞は、種々の培地において培養され得る。Ｈａｍ’ｓ Ｆ１０（Ｓｉｇｍａ）、Ｍｉｎｉｍａｌ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（ＭＥＭ）、（Ｓｉｇｍａ）、ＲＰＭＩ－１６４０（Ｓｉｇｍａ）およびＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）、Ｓｉｇｍａ）などの市販で入手可能である培地は、宿主細胞を培養するために好適である。加えて、Ｈａｍら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．５８：４４（１９７９）、Ｂａｒｎｅｓら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０２：２５５（１９８０）、米国特許第４，７６７，７０４号；第４，６５７，８６６号；第４，９２７，７６２号；第４，５６０，６５５号；または第５，１２２，４６９号；ＷＯ９０／０３４３０；ＷＯ８７／００１９５または米国特許再発行第３０，９８５号に記載されている任意の培地も宿主細胞のための培養培地として使用され得る。これらの培地のいずれも必要に応じて、ホルモン、および／または他の増殖因子（インスリン、トランスフェリンもしくは上皮増殖因子など）、塩（塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウムおよびリン酸塩など）、緩衝剤（ＨＥＰＥＳなど）、ヌクレオチド（アデノシンおよびチミジンなど）、抗生物質（ＧＥＮＴＡＭＹＣＩＮＴＭ薬など）、微量元素（マイクロモル範囲の最終濃度で通常存在する無機化合物として定義される）、およびグルコースまたは等価のエネルギー源を補充され得る。任意の他の必要な補充物は、当業者に公知と思われる適切な濃度で含まれてもよい。温度、ｐＨなどの培養条件は、発現のために選択された宿主細胞を用いて以前使用されたものであり、当業者に明らかである。

【0389】

[00414]組換え技術を使用する場合、二機能性分子は、細胞内で、細胞膜周辺腔において、または培地に直接分泌されて産生され得る。二機能性分子が細胞内で産生される場合、第１のステップとして、宿主細胞または溶解された断片のいずれかの粒子性のデブリが、例えば、遠心分離または限外濾過によって除去される。Ｃａｒｔｅｒら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：１６３～１６７（１９９２）は、Ｅ．ｃｏｌｉの細胞膜周辺腔に分泌される抗体を単離するための手順を記載している。簡潔には細胞ペーストは、酢酸ナトリウム（ｐＨ３．５）、ＥＤＴＡおよびフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）の存在下で約３０分間かけて解凍される。細胞デブリは、遠心分離によって除去され得る。二機能性分子が培地に分泌される場合、そのような発現系由来の上清は、市販で入手可能なタンパク質濃縮フィルター、例えば、ＡｍｉｃｏｎまたはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｅｌｌｉｃｏｎ限外濾過装置を使用して、一般に最初に濃縮される。ＰＭＳＦなどのプロテアーゼ阻害剤は、タンパク質分解を阻害するために上記のステップのいずれにも含まれてよく、抗生物質は、外来性の夾雑物の増殖を予防するために含まれてよい。

【0390】

[00415]細胞から調製された二機能性分子は、例えば、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、ＤＥＡＥセルロースイオン交換クロマトグラフィー、硫酸アンモニウム沈殿、塩析および親和性クロマトグラフィーを使用して精製され得るが、親和性クロマトグラフィーが好ましい精製技術である。

【0391】

[00416]ある特定の実施形態では、固相に固定されたプロテインＡは、抗体およびその抗原結合性断片の免疫親和性精製のために使用される。親和性リガンドとしてのプロテインＡの適合性は、二機能性分子中に存在する任意の免疫グロブリンＦｃドメインの種およびアイソタイプに依存する。プロテインＡは、ヒトガンマ１、ガンマ２またはガンマ４重鎖に基づく抗体を精製するために使用され得る（Ｌｉｎｄｍａｒｋら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．６２：１～１３（１９８３））。プロテインＧは、すべてのマウスアイソタイプについて、およびヒトガンマ３について推奨される（Ｇｕｓｓら、ＥＭＢＯ Ｊ．５：１５６７ １５７５（１９８６））。親和性リガンドが結合するマトリックスは、ほとんどの場合アガロースであるが、他のマトリックスも利用可能である。制御された多孔性ガラスまたはポリ（スチレンジビニル）ベンゼンなどの機械的に安定なマトリックスは、速い流速およびアガロースを用いて達成され得るよりも短い処理時間を可能にする。抗体がＣＨ３ドメインを含む場合、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ ＡＢＸＴＭ樹脂（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ、Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ、Ｎ．Ｊ．）は、精製のために有用である。タンパク質精製のための他の技術、例えば、イオン交換カラム、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカ上でのクロマトグラフィー、ヘパリンＳＥＰＨＡＲＯＳＥＴＭ上でのクロマトグラフィー、アニオンまたはカチオン交換樹脂（ポリアスパラギン酸カラムなど）でのクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、および硫酸アンモニウム沈殿などでの分画も回収される抗体に応じて利用可能である。

【0392】

[00417]任意の予備精製ステップ（複数可）に続いて、目的の抗体および夾雑物を含む混合物は、約２．５～４．５の間のｐＨの溶出緩衝液を使用して、好ましくは低塩濃度（例えば、約０～０．２５Ｍの塩）で実施される低ｐＨ疎水性相互作用クロマトグラフィーに供され得る。

【0393】

ＩＶ．医薬組成物
[00418]本開示は、二機能性分子および１つまたは複数の薬学的に許容される担体を含む医薬組成物をさらに提供する。

【0394】

[00419]本明細書において開示される医薬組成物における使用のための薬学的に許容される担体として、例えば、薬学的に許容される液体、ゲルまたは固形担体、水性ビヒクル、非水性ビヒクル、抗菌剤、等張剤、緩衝剤、抗酸化剤、麻酔薬、懸濁化／ディスペンディング（ｄｉｓｐｅｎｄｉｎｇ）剤、捕捉もしくはキレート剤、希釈剤、アジュバント、賦形剤、または非毒性補助物質、当技術分野において公知の他の構成要素、またはこれらの種々の組合せを挙げることができる。

【0395】

[00420]好適な構成要素として、例えば、抗酸化剤、注入剤、結合剤、崩壊剤、緩衝剤、保存剤、潤滑剤、香味剤、増粘剤、着色剤、乳化剤、または糖類およびシクロデキストリンなどの安定化剤を挙げることができる。好適な抗酸化剤として、例えば、メチオニン、アスコルビン酸、ＥＤＴＡ、チオ硫酸ナトリウム、白金、カタラーゼ、クエン酸、システイン、チオグリセロール、チオグリコール酸、チオソルビトール、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエンおよび／または没食子酸プロピルを挙げることができる。本明細書に開示されるとおり、本明細書において提供される二機能性分子およびコンジュゲートを含む組成物中でのメチオニンなどの１つまたは複数の抗酸化剤の含有は、二機能性分子の酸化を減少させる。酸化のこの低減は、結合親和性の減少を防止または低減し、それにより抗体安定性を改善し、有効期間を最大化する。したがってある特定の実施形態では、医薬組成物は、本明細書において開示される１つまたは複数の二機能性分子およびメチオニンなどの１つまたは複数の抗酸化剤を含んで提供される。さらに提供されるのは、二機能性分子をメチオニンなどの１つまたは複数の抗酸化剤と混合することによって、本明細書において提供される二機能性分子の酸化を防止する、有効期間を延長するおよび／または有効性を改善するための方法である。

【0396】

[00421]さらに例示するために、薬学的に許容される担体として、例えば、水性ビヒクル、例えば、塩化ナトリウム注射剤、リンゲル注射剤、等張デキストロース注射剤、無菌水注射剤、またはデキストロースおよび乳糖リンゲル注射剤、非水性ビヒクル、例えば、植物由来の固定油、綿実油、トウモロコシ油、ゴマ油またはピーナッツ油、静菌性または静真菌性濃度の抗菌薬、等張剤、例えば、塩化ナトリウムまたはデキストロース、緩衝剤、例えばリン酸またはクエン酸緩衝剤、抗酸化剤、例えば重硫酸ナトリウム、局所麻酔薬、例えば、プロカイン塩酸塩、懸濁化剤および分散剤、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルメチルセルロースもしくはポリビニルピロリドン、乳化剤、例えば、ポリソルベート８０（ＴＷＥＥＮ（登録商標）－８０）、捕捉もしくはキレート剤、例えば、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）もしくはＥＧＴＡ（エチレングリコール四酢酸）、エチルアルコール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、水酸化ナトリウム、塩酸、クエン酸または乳酸を挙げることができる。担体として利用される抗菌薬は、フェノールまたはクレゾール、水銀、ベンジルアルコール、クロロブタノール、メチルおよびプロピルｐ－ヒドロキシ安息香酸エステル、チメロサール、塩化ベンザルコニウムならびにベンゼトニウム塩化物が挙げられて、複数用量容器中の医薬組成物に添加され得る。好適な賦形剤として、例えば、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロールまたはエタノールを挙げることができる。好適な非毒性補助物質として、例えば、湿潤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤、安定化剤、溶解性促進剤、または酢酸ナトリウム、ソルビタンモノラウレート、トリエタノールアミンオレエートもしくはシクロデキストリンなどの薬剤を挙げることができる。

【0397】

[00422]医薬組成物は、液体溶液剤、懸濁剤、乳剤、丸剤、カプセル剤、錠剤、徐放製剤または粉末剤でありうる。経口製剤として、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌ ｐｙｒｏｌｌｉｄｏｎｅ）、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどの標準的担体を挙げることができる。

【0398】

[00423]ある特定の実施形態では、医薬組成物は、注射可能組成物に製剤化され得る。注射可能医薬組成物は、任意の従来の形態、例えば、液体溶液剤、懸濁剤、乳剤または液体溶液剤、懸濁剤、乳剤を生成するために好適な固形形態に調製され得る。注射のための調製物として、注射のために準備された無菌および／または非発熱性溶液、無菌乾燥可溶性生成物、例えば、皮下組織用錠剤を含む使用直前に溶媒と合わせられるように準備された凍結乾燥粉末剤、注射のために準備された無菌懸濁剤、使用直前にビヒクルと合わせられるように準備された無菌乾燥不溶性生成物、ならびに無菌および／または非発熱性乳剤を挙げることができる。溶液は、水性または非水性のいずれであってもよい。

【0399】

[00424]ある特定の実施形態では、単位用量非経口調製物は、アンプル、バイアルまたは針付きシリンジに包装される。非経口投与のためのすべての調製物は、当技術分野において公知であり、実行されるとおり無菌および非発熱性である必要がある。

【0400】

[00425]ある特定の実施形態では、無菌凍結乾燥粉末剤は、本明細書において開示される二機能性分子を好適な溶媒に溶解することによって調製される。溶媒は、粉末から調製された粉末剤または再構成溶液の安定性または他の薬理学的構成要素を改善する賦形剤を含有し得る。使用され得る賦形剤として、これだけに限らないが、水、デキストロース、ソルビトール（ｓｏｒｂｉｔａｌ）、果糖、コーンシロップ、キシリトール、グリセリン、グルコース、ショ糖または他の好適な薬剤が挙げられる。溶媒は、緩衝剤、例えば、クエン酸塩、リン酸ナトリウムもしくはリン酸カリウムまたは当業者に公知であり、一実施形態ではほぼ中性のｐＨであるそのような他の緩衝剤を含んでよい。溶液の続く無菌濾過後の、当業者に公知の標準条件下での凍結乾燥は、所望の製剤を提供する。一実施形態では、生じた溶液は、凍結乾燥のためにバイアルに分配される。各バイアルは、二機能性分子またはその組成物の単一投薬量または複数の投薬量を含有し得る。１用量または用量セットのために必要なものを少量（例えば、約１０％）超えて含む過剰充填バイアルは、正確な試料退薬および正確な投薬を容易にするために許容される。凍結乾燥粉末剤は、約４℃から室温などの適切な条件下で保存され得る。

【0401】

[00426]注射用水を用いた凍結乾燥粉末剤の再構成は、非経口投与における使用のための製剤を提供する。一実施形態では、再構成のために、無菌および／または非発熱性水または他の液体の好適な担体が凍結乾燥粉末剤に添加される。正確な量は、与えられる選択された治療に応じて、経験的に決定され得る。

【0402】

Ｖ．キット
[00427]ある特定の実施形態では、本開示は、本明細書において提供される二機能性分子および／または本明細書において提供される医薬組成物を含むキットを提供する。ある特定の実施形態では、本開示は、本明細書において提供される二機能性分子および第２の治療剤を含むキットを提供する。ある特定の実施形態では、第２の治療剤は、化学療法剤、抗がん薬物、放射線療法、免疫療法剤、血管新生抑制剤、標的療法、細胞療法、遺伝子療法、ホルモン療法、抗ウイルス剤、抗菌薬、鎮痛薬、抗酸化剤、金属キレーターおよびサイトカインからなる群から選択される。

【0403】

[00428]そのようなキットは、当業者に容易に明らかであるとおり、所望により、１つまたは複数の種々の従来の医薬品キット構成要素、例えば、１つまたは複数の薬学的に許容される担体を含む容器、追加的容器などをさらに含む場合がある。投与される構成要素の量、投与の指針および／または構成要素を混合するための指針を示す使用説明書も、挿入物またはラベルとしてのいずれかでキットに含まれてよい。

【0404】

ＶＩ．使用方法
[00429]別の態様では、本開示は、対象におけるＰＤ－Ｌ１関連疾患を処置する、防止する、または軽減する方法であって、対象に、治療有効量の本明細書において提供される二機能性分子、または本明細書において提供される医薬組成物もしくはキットを投与することを含む、方法を提供する。

【0405】

[00430]ある特定の実施形態では、対象は、ヒトである。

【0406】

[00431]ＰＤ－１関連状態および障害は、免疫関連疾患もしくは障害、がん、自己免疫疾患、または感染症であってもよい。

【0407】

[00432]ある特定の実施形態では、ＰＤ－１関連状態および障害としては、がん、例えば、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、腎細胞がん、結腸直腸がん、卵巣がん、乳がん、膵臓がん、胃癌、膀胱がん、食道がん、中皮腫、黒色腫、頭頸部がん、甲状腺がん、肉腫、前立腺がん、神経膠芽腫、子宮頸がん、胸腺癌、白血病、リンパ腫、骨髄腫、菌状息肉症、メルケル細胞がん、ならびに他の血液悪性腫瘍、例えば、古典的ホジキンリンパ腫（ＣＨＬ）、縦隔原発大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞／組織球豊富型Ｂ細胞リンパ腫、ＥＢＶ陽性および陰性ＰＴＬＤ、ならびにＥＢＶ関連びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、形質芽球性リンパ腫、節外性ＮＫ／Ｔ細胞リンパ腫、上咽頭癌、およびＨＨＶ８関連原発性滲出液リンパ腫、ホジキンリンパ腫、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、例えば、原発性ＣＮＳリンパ腫、脊髄軸腫瘍、脳幹グリオーマが挙げられる。ある特定の実施形態では、腫瘍およびがんは、転移性、特に、ＰＤ－Ｌ１を発現する転移性腫瘍である。

【0408】

[00433]ある特定の実施形態では、ＰＤ－１関連状態および障害としては、自己免疫疾患が挙げられる。自己免疫疾患としては、限定されるものではないが、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ、自己免疫成分を含むウイルス疾患である）、円形脱毛症、強直性脊椎炎、抗リン脂質症候群、自己免疫性アジソン病、自己免疫性糖尿病、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、自己免疫性内耳疾患（ＡＩＥＤ）、自己免疫性リンパ増殖症候群（ＡＬＰＳ）、自己免疫性血小板減少性紫斑病（ＡＴＰ）、ベーチェット病、心筋症、セリアック病－疱疹状皮膚炎（ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ ｈｅｐｅｔｉｆｏｒｍｉｓ）；慢性疲労免疫機能障害症候群（ＣＦＩＤＳ）、慢性炎症性脱髄性多発性神経障害（ＣＩＰＤ）、瘢痕性類天疱瘡（ｃｉｃａｔｒｉｃｉａｌ ｐｅｍｐｈｉｇｏｌｄ）、寒冷凝集素症、クレスト症候群、クローン病、デゴス病、若年性皮膚筋炎、円板状ループス、本態性混合型クリオグロブリン血症、線維筋痛－線維筋炎、グレーブス病、ギラン・バレー症候群、橋本甲状腺炎、特発性肺線維症、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、ＩｇＡ腎症、インスリン依存性糖尿病、若年性慢性関節炎（スティル病）、若年性関節リウマチ、メニエール病、混合性結合組織疾患、多発性硬化症、重症筋無力症、悪性貧血（ｐｅｍａｃｉｏｕｓ ａｎｅｍｉａ）、結節性多発動脈炎、多発性軟骨炎、多腺性症候群、リウマチ性多発筋痛、多発筋炎および皮膚筋炎、原発性無ガンマグロブリン血症、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、乾癬性関節炎、レイノー現象、ライター症候群、リウマチ熱、リウマチ性関節炎、サルコイドーシス、強皮症（全身性進行性硬化症（ＰＳＳ）、全身性硬化症（ＳＳ）としても知られる）、シェーグレン症候群、スティフマン症候群、全身性エリテマトーデス、高安動脈炎、側頭動脈炎／巨細胞動脈炎、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、白斑およびウェゲナー肉芽腫症が挙げられる。

【0409】

[00434]ある特定の実施形態では、ＰＤ－１関連状態および障害としては、感染症が挙げられる。感染症としては、例えば、慢性ウイルス感染、例えば、真菌感染、寄生虫／原虫感染または慢性ウイルス感染、例えば、マラリア、コクシジオイデス症（ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｏｄｍｙｃｏｓｉｓ ｉｍｍｉｔｉｓ）、ヒストプラスマ症、爪甲真菌症、アスペルギルス症（ａｓｐｅｒｇｉｌｏｓｉｓ）、ブラストミセス症、カンジダ症（ｃａｎｄｉｄｉａｓｉｓ ａｌｂｉｃａｎｓ）、パラコクシジオイデス症（ｐａｒａｃｏｃｃｉｄｉｏｉｏｍｙｃｏｓｉｓ）、微胞子虫症、アカントアメーバ角膜炎、アメーバ症、回虫症、バベシア症、バランチジウム症、アライグマ回虫症、シャーガス病、肝吸虫症、ラセンウジバエ症（Ｃｏｃｈｌｉｏｍｙｉａ）、クリプトスポリジウム症、裂頭条虫症、メジナ虫症、エキノコックス症、象皮病、蟯虫症、肝蛭症、肥大吸虫症、フィラリア症、ランブル鞭毛虫症、顎口虫症、膜様条虫症、イソスポーラ症、片山熱、リーシュマニア症、ライム病、メタゴニムス症、ハエウジ症、オンコセルカ症、シラミ寄生症、疥癬、住血吸虫症、睡眠病、ふん線虫症、条虫症、トキソカラ症、トキソプラズマ症、旋毛虫病、鞭虫症、トリパノソーマ症、蠕虫感染、Ｂ型肝炎（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎（ＨＣＶ）、ヘルペスウイルス、エプスタイン・バーウイルス、ＨＩＶ－１、ＨＩＶ－２、サイトメガロウイルス、単純ヘルペスウイルスＩ型、単純ヘルペスウイルスＩＩ型、ヒトパピローマウイルス、アデノウイルス、カポジ西肉腫関連ヘルペスウイルス伝染病、シンリングウイルス（トルクテノウイルス）、ヒトＴリンパ向性ウイルスＩ、ヒトＴリンパ向性ウイルスＩＩ、水痘帯状疱疹ウイルス、ＪＣウイルスまたはＢＫウイルスの感染が挙げられる。

【0410】

[00435]ある特定の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１関連疾患は、ＰＤ－Ｌ１を発現するがん、またはＰＤ－Ｌ１を過剰発現するがんである。「ＰＤ－Ｌ１を発現するがん」は、細胞表面上にＰＤ－Ｌ１タンパク質が存在するがん細胞または腫瘍細胞を含むものである。「ＰＤ－Ｌ１を過剰発現するがん」は、同じ組織型の非がん性細胞と比較して、がんまたは腫瘍細胞の細胞表面に、有意に高いレベルのＰＤ－Ｌ１を有するものである。

【0411】

[00436]ＰＤ－Ｌ１の発現または過剰発現を、細胞の表面上に存在するＰＤ－Ｌ１のレベルの上昇を評価することによる（例えば、免疫組織化学アッセイ；ＩＨＣによる）、診断または予後診断アッセイにおいて決定することができる。あるいは、またはさらに、当業者であれば、例えば、蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ；１９９８年１０月に公開されたＷＯ９８／４５４７９を参照されたい）、サザンブロッティング、またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術、例えば、リアルタイム定量的ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）などによって、細胞中のＰＤ－Ｌ１をコードする核酸のレベルを測定することができる。また、当業者であれば、血清などの生体液中の脱落抗原（例えば、ＰＤ－Ｌ１細胞外ドメインまたは可溶性ＰＤ－Ｌ１）を測定することによって、ＰＤ－Ｌ１の過剰発現を試験することもできる。上記アッセイの他に、種々のｉｎ ｖｉｖｏアッセイが当業者には利用可能である。例えば、当業者であれば、患者の体内の細胞を、任意選択で検出可能標識、例えば、放射性同位体で標識された抗ＰＤ－Ｌ１抗体に曝露し、患者内の細胞への抗体の結合を、例えば、放射活性に関する外部走査によって、または抗体に予め曝露した患者から採取した生検を分析することによって評価することができる。

【0412】

[00437]一部の実施形態では、対象は、ＰＤ－１アンタゴニストに応答する可能性が高いと同定されている。目的の生体試料上のＰＤ－Ｌ１の存在またはレベルは、生体試料が誘導される対象がＰＤ－１アンタゴニストに応答する可能性があるかどうかを示し得る。一部の実施形態では、試験試料は、がん細胞もしくは組織、または腫瘍浸潤性免疫細胞に由来する。ある特定の実施形態では、試験生体試料中のＰＤ－Ｌ１の存在または上方調節されたレベルは、応答性の尤度を示す。本明細書で使用される場合、用語「上方調節された」とは、同じ抗体を使用して検出された参照試料中のＰＤ－Ｌ１タンパク質レベルと比較して、試験試料中のＰＤ－Ｌ１のタンパク質レベルにおける、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％以上の、またはそれより高い全体的な増加を指す。参照試料は、健康な、もしくは非疾患の個体から得られた対照試料、または試験試料が得られるのと同じ個体から得られた健康な、もしくは非疾患の試料であってもよい。例えば、参照試料は、試験試料（例えば、腫瘍）に隣接する、またはその近隣にある非疾患の試料であってもよい。

【0413】

[00438]ある特定の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１関連疾患は、ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１単剤療法に耐性である。本明細書で使用される場合、「ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１単剤療法」とは、ＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－１相互作用またはシグナル伝達を阻害するか、または低減させることによって作用する単剤療法を指す。例示的なＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１単剤療法は、抗ＰＤ－Ｌ１抗体療法、抗ＰＤ－１抗体療法、またはＰＤ－１もしくはＰＤ－Ｌ１に対する低分子阻害剤を含む単剤療法を含んでもよい。「耐性」とは、疾患がＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１単剤療法に対する応答性または感受性がないか、または低減していることを意味する。低減した応答性は、例えば、所与の有効性を達成するための用量の増加の要求によって示され得る。ある特定の実施形態では、疾患は、ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１単剤療法に対して非応答性であり得る。例えば、がん細胞または腫瘍サイズは、ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１単剤療法を用いた処置にも拘わらず増加するか、または疾患は、その以前の状態に戻る退縮、例えば、部分的回復後の以前の症状の復帰を示した。ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１単剤療法に対する耐性は、ｄｅ ｎｏｖｏであるか、または後天性であってもよい。

【0414】

[00439]別の態様では、本開示は、免疫抑制性サイトカインの抑制、持続的免疫応答の誘導、または抗腫瘍免疫の刺激から利益を受ける疾患または状態を対象において処置する、防止する、または軽減する方法であって、有効量の本明細書において提供される二機能性分子、または本明細書において提供される医薬組成物を投与することを含む、方法を提供する。

【0415】

[00440]一部の実施形態では、免疫抑制性サイトカインは、ＴＧＦβまたはＩＬ－１である。一部の実施形態では、免疫抑制性サイトカインは、ＴＧＦβ１またはＩＬ－１βである。

【0416】

[00441]一部の実施形態では、疾患または状態は、ＴＧＦβ関連疾患または状態である。一部の実施形態では、ＴＧＦβ関連疾患は、がん、線維性疾患、または腎臓病である。

【0417】

[00442]ある特定の実施形態では、ＴＧＦβ関連疾患は、がんである。ある特定の実施形態では、がんは、結腸直腸がん、乳がん、卵巣がん、膵がん、胃がん、前立腺がん、腎がん、子宮頸がん、骨髄腫、リンパ腫、白血病、甲状腺がん、子宮内膜がん、子宮がん、膀胱がん、神経内分泌がん、頭頸部がん、肝臓がん、上咽頭がん、精巣がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、黒色腫、基底細胞がん、皮膚がん、皮膚扁平上皮がん、隆起性皮膚線維肉腫、メルケル細胞癌、神経膠芽腫、神経膠腫、肉腫、中皮腫、および骨髄異形成症候群からなる群から選択される。

【0418】

[00443]ある特定の実施形態では、ＴＧＦβ関連疾患は、線維性疾患である。線維性疾患は、線維症を含む疾患または状態である。線維症は、例えば、肺、肝臓、腎臓、皮膚、心臓、腸または筋肉における、慢性臓器傷害の一般的な特徴である瘢痕化プロセスである。線維症は、トランスフォーミング増殖因子－ベータ（ＴＧＦ－β）の活性の上昇を特徴とし、細胞外マトリックスおよび他の線維症関連タンパク質の沈着の増加または変化をもたらす。

【0419】

[00444]線維性疾患は、肺、肝臓、腎臓、眼、皮膚、心臓、腸または筋肉における線維性疾患を含んでもよい。肺における線維性疾患の例としては、肺線維症、嚢胞性線維症、肺高血圧、進行性塊状線維症、閉塞性細気管支炎、慢性喘息と関連する気道再モデリングまたは特発性肺線維症（ｉｄｉｏｐａｔｈｉｃ ｐｕｌｍｏｎａｒｙ）が挙げられる。肝臓における線維性疾患の例としては、肝硬変または非アルコール性脂肪性肝炎が挙げられる。腎臓における線維性疾患の例としては、腎線維症、虚血性腎傷害、尿細管間質性線維症、糖尿病性ネフロパシー、腎硬化症、または腎臓毒性などが挙げられる。眼における線維性疾患の例としては、角膜線維症、網膜下線維症などが挙げられる。皮膚における線維性疾患の例としては、腎性全身性線維症、ケロイドまたは強皮症などが挙げられる。心臓における線維性疾患の例としては、心内膜心筋線維症または陳旧性心筋梗塞が挙げられる。

【0420】

[00445]一部の実施形態では、疾患または状態は、ＩＬ－１関連疾患または状態である。一部の実施形態では、ＩＬ－１関連疾患は、自己炎症疾患、代謝症候群、急性炎症、慢性炎症または悪性腫瘍である。

【0421】

[00446]一部の実施形態では、疾患または状態は、免疫賦活性ポリペプチド、例えば、可溶性ＬＡＧ－３を用いてＭＨＣＩＩシグナル伝達を刺激することによる持続的免疫応答の誘導から利益を受ける。一部の実施形態では、疾患または状態は、がん、ウイルス感染、寄生虫感染、またはその組合せである。

【0422】

[00447]一部の実施形態では、疾患または状態は、免疫阻害性受容体シグナル伝達を阻害することによる抗腫瘍免疫の刺激から利益を受ける。一部の実施形態では、免疫阻害性受容体は、ＳＩＲＰαである。ある特定の実施形態では、疾患、障害または状態は、がん、固形腫瘍、慢性感染、炎症疾患、多発性硬化症、自己免疫疾患、神経疾患、脳傷害、神経傷害、多血症、ヘモクロマトーシス、外傷、敗血性ショック、線維症、アテローム性動脈硬化症、肥満、ＩＩ型糖尿病、移植片機能障害、または関節炎などの、ＳＩＲＰα関連である。一部の実施形態では、がんは、肛門がん、虫垂がん、星状細胞腫、基底細胞癌、胆嚢がん、胃がん、肺がん、気管支がん、骨がん、肝臓および胆管がん、膵がん、乳がん、肝臓がん、卵巣がん、精巣がん、腎臓がん、腎盂および尿管がん、唾液腺がん、小腸がん、尿道がん、膀胱がん、頭頸部がん、脊椎がん、脳がん、子宮頸がん、子宮がん、子宮内膜がん、結腸がん、結腸直腸がん、直腸がん、肛門がん、食道がん、胃腸がん、皮膚がん、前立腺がん、下垂体がん、膣がん、甲状腺がん、咽頭がん、神経膠芽腫、黒色腫、骨髄異形成症候群、肉腫、奇形腫、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、ＴまたはＢ細胞リンパ腫、ＧＩ臓器間質腫瘍、軟部組織腫瘍、肝細胞癌、および腺癌である。一部の実施形態では、がんは、ＣＤ４７を発現するがん、またはＣＤ４７を過剰発現するがんである。

【0423】

[00448]本明細書において提供される二機能性分子の治療有効量は、例えば、対象の体重、年齢、過去の病歴、現在の薬剤、健康状態および交差反応の可能性、アレルギー、感度および有害な副作用、ならびに投与経路および疾患発生の程度などの、当技術分野で公知の種々の因子に依存するであろう。これらの、および他の環境または要件によって示されるように、当業者（例えば、医師または獣医師）であれば、投薬量を比例的に減少または増加させることができる。

【0424】

[00449]ある特定の実施形態では、本明細書において提供される二機能性分子を、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約１００ｍｇ／ｋｇの治療有効投薬量で投与することができる。ある特定の実施形態では、投与量は、処置の経過にわたって変化してもよい。例えば、ある特定の実施形態では、初期投与量は、その後の投与量よりも高くてもよい。ある特定の実施形態では、投与量は、対象の反応に応じて処置の経過にわたって変化してもよい。

【0425】

[00450]投薬量レジメンを、最適な望ましい応答（例えば、治療応答）を提供するために調整することができる。例えば、単回用量を投与するか、またはいくつかの分割された用量を経時的に投与することができる。

【0426】

[00451]本明細書において提供される二機能性分子を、例えば、非経口（例えば、皮下、腹腔内、静脈内輸注を含む静脈内、筋肉内、もしくは皮内注射）または非－非経口（例えば、経口、鼻内、眼内、舌下、直腸、もしくは局所）経路などの、当技術分野で公知の任意の経路によって投与することができる。

【0427】

[00452]一部の実施形態では、本明細書において提供される二機能性分子を、単独で、または治療有効量の第２の治療剤と組み合わせて投与することができる。例えば、本明細書において開示される二機能性分子を、第２の治療剤、例えば、化学療法剤、抗がん薬物、放射線療法、免疫療法剤、抗血管新生剤、標的療法、細胞療法、遺伝子療法、ホルモン療法、抗ウイルス剤、抗生物質、鎮痛剤、酸化防止剤、金属キレート剤、またはサイトカインと組み合わせて投与することができる。

【0428】

[00453]本明細書で使用される場合、用語「免疫療法」とは、がんなどの疾患に対して戦うために免疫系を刺激するか、または一般的な方法で免疫系を促進する療法の型を指す。免疫療法の例としては、限定されるものではないが、チェックポイントモジュレーター、養子細胞移入、サイトカイン、腫瘍溶解性ウイルスおよび治療ワクチンが挙げられる。

【0429】

[00454]「標的療法」は、正常細胞ではなく、がん細胞中に存在する、もしくはがん細胞中により豊富に存在する特定のタンパク質などの、がんと関連する特定の分子、またはがんの成長および生存に寄与するがん微小環境中の標的分子に対して作用する療法の型である。標的療法は、治療剤を腫瘍に標的化することによって、正常組織に治療剤の効果が及ばないようにする。

【0430】

[00455]ある特定のこれらの実施形態では、１つまたは複数のさらなる治療剤と組み合わせて投与される本明細書において提供される二機能性分子を、１つまたは複数のさらなる治療剤と同時に投与することができ、ある特定のこれらの実施形態では、二機能性分子およびさらなる治療剤を、同じ医薬組成物の一部として投与することができる。しかしながら、別の治療剤と「組み合わせて」投与される二機能性分子は、その薬剤と同時に、またはその薬剤と同じ組成物中で投与する必要はない。別の薬剤の前に、またはその後に投与される二機能性分子は、抗体または抗原結合性断片と第２の薬剤とが異なる経路によって投与される場合であっても、その語句が本明細書で使用される場合、その薬剤と「組み合わせて」投与されると考えられる。可能な場合、本明細書において開示される抗体またはその抗原結合性断片と組み合わせて投与されるさらなる治療剤は、さらなる治療剤の製品情報シートに列挙されたスケジュールに従って、またはＰｈｙｓｉｃｉａｎｓ’ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ２００３（Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ’ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ、第５７版、Ｍｅｄｉｃａｌ Ｅｃｏｎｏｍｉｃｓ Ｃｏｍｐａｎｙ；ＩＳＢＮ：１５６３６３４４５７；第５７版（２００２年１１月））もしくは当技術分野で周知のプロトコールに従って投与される。

【0431】

[00456]別の態様では、本開示はまた、対象におけるＰＤ－Ｌ１関連疾患および／またはＴＧＦ－β関連疾患および／またはＩＬ－１関連疾患および／またはＣＤ４７関連疾患を処置するために医薬の製造における、本明細書において提供される二機能性分子および／または本明細書において提供される医薬組成物の使用も提供する。

【0432】

[00457]以下の実施例は、特許請求される発明をより良好に例示するために提供され、本発明の範囲を限定すると解釈されるべきではない。以下に記載される全ての特定の組成物、材料、および方法は、全体として、または部分的に、本発明の範囲内にある。これらの特定の組成物、材料、および方法は、本発明を限定することを意図するものではなく、単に本発明の範囲内にある特定の実施形態を例示することを意図するものである。当業者であれば、発明能力を行使することなく、また、本発明の範囲から逸脱することなく、等価な組成物、材料、および方法を開発することができる。本発明の範囲内に依然としてありながら、記載される本明細書の手順に多くの変更を加えることができることが理解されるであろう。そのような変更が本発明の範囲内に含まれることは、本発明者らの意図するところである。

【実施例】

【0433】

実施例１
ヒト化４Ｂ６抗体の生成、発現および精製
[00458]以下に示される配列番号４６のＶＨ配列および配列番号４７のＶＬ配列を含む、特許ＷＯ２０１７１６１９７６Ａ１に由来する抗ＰＤ－Ｌ１ ｍＡｂ ４Ｂ６は、強力なＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１遮断剤であった。この抗体は、マウスハイブリドーマ抗体から生成され、したがって、それは適切なヒト化を必要とした。マウス抗体４Ｂ６の可変ドメインの配列を使用して、その対応するマウスフレームワークと最も高い相同性を有する生殖系列配列を同定した。相補性決定領域（ＣＤＲ）移植および復帰変異を有するヒト化バリアントを設計するために、コンピューターモデリングを使用した。

【0434】

[00459]マウス／キメラ重鎖可変領域（配列番号４６）：
ＥＶＱＬＱＱＳＧＰＥＬＶＫＰＧＡＳＶＫＩＳＣＫＡＳＧＹＶＦＴＤＹＹＭＮＷＶＫＱＳＨＧＫＳＬＥＷＩＧＤＩＮＰＮＮＧＧＴＳＹＮＨＫＦＫＧＫＡＴＶＴＶＤＫＳＳＲＴＡＹＭＥＬＬＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＶＫＷＧＤＧＰＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡ
[00460]マウス／キメラ軽鎖可変領域（配列番号４７）：
ＤＩＶＭＴＱＳＱＫＦＭＳＴＳＶＧＤＲＶＳＩＴＣＫＡＳＱＮＶＧＡＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＱＳＰＫＬＬＩＹＳＡＳＮＲＹＴＧＶＰＤＲＦＴＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＮＭＱＳＥＤＬＡＤＹＦＣＱＱＹＳＮＹＰＴＦＧＳＧＴＫＬＧＩＫ
[00461]注記：斜体部分はフレームワーク（ＦＲ）を表し、下線付き部分はＣＤＲ配列を表す。順序は、ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４である。

【0435】

[00462]軽鎖についてはＶＫ／１－３３および重鎖についてはＶＨ／１－２のヒト生殖系列フレームワーク配列を、それぞれ、ＣＤＲ移植のために使用した。

【0436】

[00463]重鎖バリアント１、２、３および４（すなわち、ＶＨバリアント１、２、３および４）を、３個のＣＤＲをＶＨ生殖系列配列（配列番号４８）に直接移植することによって、さらに、それぞれ、ＶＨバリアント１（配列番号４９）についてはＭ６９Ｖ、Ｒ７１Ｖの、ＶＨバリアント２（配列番号５０）についてはＭ６９Ｖ、Ｒ７１Ｖ、Ａ９３Ｖ、Ｒ９４の、ＶＨバリアント３（配列番号５１）についてはＭ６９Ｖ、Ｒ７１Ｖ、Ｔ７３Ｋ、Ｔ２８Ｖの、およびＶＨバリアント４（配列番号５２）についてはＭ６９Ｖ、Ｒ７１Ｖ、Ａ９３Ｖ、Ｒ９４Ｋ、Ｔ７３Ｋ、Ｔ２８Ｖ、Ｇ４４Ｓの復帰変異によって得た。

【0437】

[00464]４Ｂ６ ＶＨの生殖系列配列：
[00465]ＶＨ／１－２（４Ｂ６－ＶＨ生殖系列、配列番号４８）：
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＧＹＹＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＮＰＮＳＧＧＴＮＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＭＴＲＤＴＳＩＳＴＡＹＭＥＬＳＲＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＡＲ
[00466]ＶＨ／１－２バリアント１（４Ｂ６＿Ｈａ、配列番号４９）：
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＤＹＹＭＮＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＤＩＮＰＮＮＧＧＴＳＹＮＨＫＦＫＧＲＶＴＶＴＶＤＴＳＩＳＴＡＹＭＥＬＳＲＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＡＲＷＧＤＧＰＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
[00467]ＶＨ／１－２バリアント２（４Ｂ６＿Ｈｂ、配列番号５０）：
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＤＹＹＭＮＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＤＩＮＰＮＮＧＧＴＳＹＮＨＫＦＫＧＲＶＴＶＴＶＤＴＳＩＳＴＡＹＭＥＬＳＲＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＶＫＷＧＤＧＰＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
[00468]ＶＨ／１－２バリアント３（Ｈｕ４Ｂ６＿Ｈｃ、配列番号５１）：
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＶＦＴＤＹＹＭＮＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＤＩＮＰＮＮＧＧＴＳＹＮＨＫＦＫＧＲＶＴＶＴＶＤＫＳＩＳＴＡＹＭＥＬＳＲＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＡＲＷＧＤＧＰＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
[00469]ＶＨ／１－２バリアント４（Ｈｕ４Ｂ６＿Ｈｄ、配列番号５２）：
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＶＦＴＤＹＹＭＮＷＶＲＱＡＰＧＱＳＬＥＷＭＧＤＩＮＰＮＮＧＧＴＳＹＮＨＫＦＫＧＲＶＴＶＴＶＤＫＳＩＳＴＡＹＭＥＬＳＲＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＶＫＷＧＤＧＰＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
[00470]軽鎖バリアント１および２（ＶＬバリアント１および２）を、３個のＣＤＲを生殖系列配列（配列番号５３）に直接移植することによって、さらに、それぞれ、ＶＬバリアント１（配列番号５４）についてはＦ７３Ｌ変異の、およびＶＬバリアント２（配列番号５５）についてはＦ７３Ｌ、Ａ４３Ｓ、Ｓ６０Ｄ変異の復帰変異によって得た。

【0438】

[00471]４Ｂ６ ＶＬの生殖系列配列：
[00472]ＶＫ／１－３３（４Ｂ６－ＶＬ－生殖系列、配列番号５３）：
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＱＡＳＱＤＩＳＮＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＤＡＳＮＬＥＴＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＦＴＩＳＳＬＱＰＥＤＩＡＴＹＹＣＱＱＹＤＮＬＰ
[00473]ＶＫ／１－３３バリアント１（Ｈｕ４Ｂ６＿Ｌａ、配列番号５４）：
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＫＡＳＱＮＶＧＡＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＳＡＳＮＲＹＴＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＩＡＴＹＹＣＱＱＹＳＮＹＰＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ
[00474]ＶＫ／１－３３バリアント２（Ｈｕ４Ｂ６＿Ｌｂ、配列番号５５）：
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＫＡＳＱＮＶＧＡＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＳＰＫＬＬＩＹＳＡＳＮＲＹＴＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＩＡＴＹＹＣＱＱＹＳＮＹＰＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ
[00475]上の重鎖および軽鎖の可変領域のｃＤＮＡを合成した後、ヒトＩｇＧ１およびヒトカッパの定常領域の配列を融合した。得られた抗体遺伝子配列を、発現ベクター中にクローニングした。表６に示されるように、ヒト化４Ｂ６バリアント発現のためにＱｉａｇｅｎからのＰｌａｓｍｉｄ Ｍａｘｉｐｒｅｐ Ｓｙｓｔｅｍを使用することによって大規模ＤＮＡを調製し、製造業者のプロトコールに従ってＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎからのＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＣＨＯ Ｒｅａｇｅｎｔを使用して細胞トランスフェクションを実行した。細胞生存能力が６０％を超えた場合、上清を採取し、０．２２μｍの濾過カプセルを通して濾過して、細胞デブリを除去した。次いで、濾過された上清を、予め平衡化させたプロテインＡ親和性カラム上にロードした。プロテインＡ樹脂を、平衡化緩衝液（ＰＢＳ）で洗浄した後、２５ｍＭクエン酸（ｐＨ３．５）を使用して抗体を溶出させた。精製された抗体溶液を、１Ｍ Ｔｒｉｓ塩基（ｐＨ９．０）を使用することによってｐＨ６．０～７．０に調整した。内毒素を１ＥＵ／ｍｇより下に制御した。最後に、精製された抗体を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって特徴付けた。

【0439】

[00476]

【0440】

【表8】

【0441】

[00477]注記：この表は、異なる変異の種々の配列組合せを示す。例えば、Ｈｕ４Ｂ６＿ＨａＬａは、２種類の変異（重鎖Ｈｕ４Ｂ６＿Ｈａおよび軽鎖Ｈｕ４Ｂ６＿Ｌａ）がヒト化マウス抗体Ｈｕ４Ｂ６＿ＨａＬａ上に存在することなどを示す。Ｈｕ４Ｂ６＿Ｌ０およびＨｕ４Ｂ６＿Ｈ０は、ＣＤＲ移植によって得られ、これらは重要な復帰変異を欠き、したがって、それらは発現のために使用されない。

【0442】

実施例２
ＥＬＩＳＡアッセイによるヒトＰＤ－Ｌ１への結合
[00478]ヒト化抗体の結合を、ＥＬＩＳＡ法によって評価した。簡単に述べると、ヒトＰＤ－Ｌ１－Ｈｉｓを、プレート上に固定した。表６に記載のヒト化４Ｂ６抗体を、ＰＢＳ中で連続希釈し、１ｈのインキュベーションのために添加した。次に、ヒトＩｇＧ－ＨＲＰに対するヤギｐＡｂおよびＴＭＢを、ＯＤ４５０ｎｍでの結合の検出のために添加した。

【0443】

[00479]図１に示されるように、全てのヒト化バリアントを、最良のものをスクリーニングするために試験した。全てのバリアントがその結合活性を保持しＨｕ４Ｂ６＿ＨｄＬａは他のものよりも良好な結合活性を示した。

【0444】

[00480]本発明者らは、この抗体のＣＤＲ配列を分析し、重鎖のＣＤＲ２中にＮＧモチーフが存在することを見出した。発現および精製においては、脱アミノ化（deamination）のリスクがあり得る。脱アミド化ホットスポットを除去するために、本発明者らは、Ｈｕ４Ｂ６＿Ｈｄ中にＧ５５Ａ（以下で太字で拡大される）の変異を導入した。次いで、Ｈｕ４Ｂ６＿Ｈｇ（配列番号５６）を得て、図２に示されるように、ヒトＰＤ－Ｌ１に対する親和性は影響されなかった。

【0445】

[00481]Ｈｕ４Ｂ６＿Ｈｇ（配列番号５６）：
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＶＦＴＤＹＹＭＮＷＶＲＱＡＰＧＱＳＬＥＷＭＧＤＩＮＰＮＮＡＧＴＳＹＮＨＫＦＫＧＲＶＴＶＴＶＤＫＳＩＳＴＡＹＭＥＬＳＲＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＶＫＷＧＤＧＰＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
実施例３
モノクローナルファージＥＬＩＳＡおよび配列分析
[00482]Ｈｕ４Ｂ６－ＨｇＬａは、アンタゴニスト薬物としてのキメラ４Ｂ６に由来する活性を保持したが、より高い親和性が好ましかった。Ｈｕ４Ｂ６－ＨｇＬａ配列に基づいて、ＣＤＲ中の部位特異的変異誘発およびｉｎ ｖｉｔｒｏでの解離速度依存的選択のための数サイクルのパンニングを親和性成熟のためにさらに使用した。まず第１に、４Ｂ６－ＨｇＬａのＶＬおよびＶＨドメインを増幅し、ペプチドリンカー（Ｇ_４Ｓ）３によって結合させて、重複ＰＣＲによりｓｃＦｖを形成させた後、ＳｆｉＩ切断部位を介して親和性成熟のための野生型配列としてのファージミドベクターｐＣｏｍｂ３ｘ（Ｗｕｈａｎ ＭｉａｏＬｉｎｇＢｉｏ、Ｐ０８６２）中にサブクローニングした。

【0446】

[00483]重鎖と軽鎖との両方の抗体ＣＤＲ３は通常、抗原結合において重要な役割を果たすため、両鎖のＣＤＲ１およびＣＤＲ２の４Ｂ６親和性成熟への個々の寄与を調査するために、上記のそれぞれのＣＤＲについて１つのＳＰＭ（小摂動変異誘発）ファージライブラリーを構築する。両鎖のＣＤＲ１およびＣＤＲ２配列を生殖系列配列と整列させ、重鎖および軽鎖の可変領域の生殖系列は、それぞれ、ＩＧＨＶ１－２およびＩＧＫＶ１－３３であった。生殖系列ＣＤＲ配列のバイオインフォマティクス分析結果を使用して、ライブラリーの設計を指導する。

【0447】

[00484]アミノ酸変異部位および置換配列を決定した後、変異ライブラリーの多様性を増大させるために縮重プライマーを設計した。多様化されたＣＤＲ断片を増幅して、４Ｂ６ ｓｃＦｖ遺伝子変異体ライブラリーを構築した。ｓｃＦｖ遺伝子を、ｐＣｏｍｂ３ＸＳＳファージディスプレイベクターとライゲーションして、ｓｃＦｖライブラリーを生成した。それぞれのＣＤＲ（表２に列挙された、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＬＣＤＲ１およびＬＣＤＲ２を含む）のコドンに基づくプライマーを、独立したライブラリーとして確立し、４Ｂ６親和性成熟ライブラリーを４つのライブラリーに分割した。その能力は、ＨＣＤＲ１については１．７６ｘ１０^８ＣＦＭ、ＨＣＤＲ２については１．８１ｘ１０^８ＣＦＭ、ＬＣＤＲ１については２．３４ｘ１０^８ＣＦＭおよびＬＣＤＲ２については２．００ｘ１０^８ＣＦＭであった。それぞれのライブラリーの５または６個のクローンを、コロニーの配列決定のために無作為に拾った。その結果、構築されたライブラリーの挿入率は１００％であることが示された。

【0448】

[00485]１０μｇ／ｍｌのｈＰＤ－Ｌ１（Ａｃｒｏ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＰＤ１－Ｈ５２２９）抗原を、ＥＬＩＳＡプレートにコーティングし、３７℃で１ｈ、２００μＬのファージ（１ｘ１０^１０ｐｆｕ／ｍｌのファージディスプレイライブラリー）と反応させた。洗浄後、約０．５のＯＤ６００を有するＴＧ１（Ｌｕｃｉｇｅｎ、６０５０２－２）を、感染のために直接ウェルに添加し、ファージと共に１５ｍｉｎインキュベートした。ライブラリーファージミドレスキューのための対数中期培養物に対する十分な体積のＭ１３ＫＯ７ヘルパーファージ（ＮＥＢ、Ｎ０３１５Ｓ）、およびファージを生成し、次のラウンドのスクリーニングのために精製した。スクリーニングプロセスを３ラウンドにわたって繰り返し、抗原の濃度を、２回目のラウンドについては２．５μｇ／ｍｌに、３回目のラウンドについては１μｇ／ｍｌに減少させた。

【0449】

[00486]これらのポリクローナルファージバリアントの力価を検出するために、ＥＬＩＳＡ結合アッセイを実行した。３ラウンドのパンニングの後、４Ｂ６－Ｈ－ＣＤＲ２、４Ｂ６－Ｌ－ＣＤＲ１および４Ｂ６－Ｌ－ＣＤＲ２を含む３つのライブラリーが明らかに富化されている。

【0450】

[00487]これらの３つのライブラリーについて、各ライブラリーの９６個のクローンを拾い、ファージＥＬＩＳＡにかけて、その結合活性を検出した。簡単に述べると、１μｇ／ｍｌのｈＰＤ－Ｌ１（Ａｃｒｏ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＰＤ１－Ｈ５２２９）抗原をＥＬＩＳＡプレートにコーティングし、４℃で一晩静置した。次いで、３００μＬの３％（ｗ／ｖ）スキムミルクを、室温で１ｈ、ブロッキングのために添加した。１ｈ後、モノクローナル抗体断片ファージを含有する１００μｌの上清を、陰性対照としてＰＢＳと共に添加し、３７℃で１ｈインキュベートした。３回洗浄するために０．５％ＰＢＳ＋Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－２０を使用し、１００μｌのＨＲＰ結合抗Ｍ１３ ｍＡｂ（１：２００００、Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、１１９７３－ＭＭ０５Ｔ－Ｈ）を添加した。室温で１ｈインキュベートした後、混合ＴＭＢ（ＩｎｎｏＲｅａｇｅｎｔｓ、ＴＭＢ－Ｓ－００３）基質試薬を添加し、プレートを室温で５ｍｉｎインキュベートした。反応を停止させるために０．１ＭのＨ_２ＳＯ_４を添加した後、ＯＤ４５０ｎｍを記録した。Ｇｅｎｅｗｉｚ（Ｓｕｚｈｏｕ、Ｃｈｉｎａ）によるＤＮＡ配列決定のために陽性クローンを拾った。配列を表７に示した。

【0451】

[00488]

【0452】

【表9】

【0453】

実施例４
結合親和性の検出のためのバイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）
[00489]ヒトＰＤ－Ｌ１－Ｆｃ（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、７０１１０－Ｄ０２Ｈ）抗原に対する４Ｂ６ ｓｃＦｖバリアントの結合親和性を試験するために、バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）を使用した。材料および手順を、それぞれ、表８および表９に示した。その結果を、表１０～１２に示した。結合親和性の結果に従って、４つの軽鎖バリアント（Ｌ－ＣＤＲ１－２、Ｌ－ＣＤＲ１－３、Ｌ－ＣＤＲ２－２、Ｌ－ＣＤＲ２－３）および３つの重鎖バリアント（Ｈ－ＣＤＲ２－２、Ｈ－ＣＤＲ２－３、Ｈ－ＣＤＲ２－５）を、将来の構築のために選択した。

【0454】

[00490]

【0455】

【表10】

【0456】

[00491]

【0457】

【表11】

【0458】

[00492]

【0459】

【表12】

【0460】

[00493]

【0461】

【表13】

【0462】

[00494]

【0463】

【表14】

【0464】

実施例５
ＡＭ－４Ｂ６－ｈＩｇＧ１－ＴＧＦβＲＩＩ（１－１３６）融合タンパク質の構築および発現
[00495]選択された重鎖および軽鎖バリアントを交差混合し、ｈＩｇＧ１－ＴＧＦβＲＩＩ（１－１３６）融合タンパク質と共に発現させた。ＴＧＦβＲＩＩ（１－１３６）は、配列番号７９に記載されるアミノ酸配列を有する：
ＴＩＰＰＨＶＱＫＳＶＮＮＤＭＩＶＴＤＮＮＧＡＶＫＦＰＱＬＣＫＦＣＤＶＲＦＳＴＣＤＮＱＫＳＣＭＳＮＣＳＩＴＳＩＣＥＫＰＱＥＶＣＶＡＶＷＲＫＮＤＥＮＩＴＬＥＴＶＣＨＤＰＫＬＰＹＨＤＦＩＬＥＤＡＡＳＰＫＣＩＭＫＥＫＫＫＰＧＥＴＦＦＭＣＳＣＳＳＤＥＣＮＤＮＩＩＦＳＥＥＹＮＴＳＮＰＤ
ｈＩｇＧ１のアミノ酸配列は、以下の通りである（配列番号８０）：
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
ＴＧＦβＲＩＩ（１－１３６）を、ペプチドリンカー（Ｇ４Ｓ）_４Ｇ（配列番号６８）を介してｈＩｇＧ１のカルボキシル末端に連結した。

【0465】

ｈＫａｐｐａのアミノ酸配列は、以下の通りである（配列番号８２）：
ＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
[00496]無傷抗体バリアントの前にＡＭ（親和性成熟した）を付した。重鎖および軽鎖の配列構築物を表１３に示し、無傷抗体の設計を表１４に示した。例えば、表１３および表１４に示されるように、二機能性分子「ＡＭ－４Ｂ６－ｈＩｇＧ１－ＴＧＦβＲＩＩバリアント１」は、重鎖および軽鎖を有し、重鎖は、Ｎ末端からＣ末端に向かって、Ｈｕ４Ｂ６＿Ｈｇ．２－＿ｈＩｇＧ１－（Ｇ４Ｓ）４Ｇ－ＴＧＦβＲＩＩ（１－１３６）を含み、軽鎖は、Ｎ末端からＣ末端に向かって、Ｈｕ４Ｂ６＿Ｌａ．１－ｈＫａｐｐａを含む。同じ命名法が表１４中の他のバリアントにも適用される。

【0466】

[00497]重鎖および軽鎖の同時トランスフェクションを、製造業者のプロトコールに従ってＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎからのＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＣＨＯ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ、Ａ２９１２９）を使用して実行した。上清を１０日目に採取し、親和性クロマトグラフィーによって精製した。

【0467】

[00498]

【0468】

【表15】

【0469】

[00499]

【0470】

【表16】

【0471】

実施例６
ｈＰＤ－Ｌ１に対するＡＭ－４Ｂ６－ｈＩｇＧ１－ＴＧＦβＲＩＩバリアントの結合親和性
[00500]ＥＬＩＳＡアッセイによるｈＰＤ－Ｌ１への結合
[00501]１μｇ／ｍｌのｈＰＤ－Ｌ１（Ａｃｒｏ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＰＤ１－Ｈ５２２９）抗原をＥＬＩＳＡプレートにコーティングし、４℃で一晩静置した。次いで、３００μｌの３％（ｗ／ｖ）スキムミルクを、室温で１ｈ、ブロッキングのために添加した。１ｈ後、１００ｎＭ～０．００６ｎＭ（４倍連続希釈）の範囲の濃度のＡＭ－４Ｂ６－ｈＩｇＧ１－ＴＧＦβＲＩＩバリアントまたは元の４Ｂ６－ｈＩｇＧ１－ＴＧＦβＲＩＩの１００μｌを、陰性対照としてＰＢＳと共に添加し、室温で１ｈインキュベートした。０．５％ＰＢＳ＋Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－２０を、３回の洗浄のために使用し、１００μｌのＨＲＰコンジュゲート化抗ヒトＦｃ抗体（１：２００００、Ａｂｃａｍ、ａｂ９８６２４）を添加した。室温で１ｈインキュベートした後、混合ＴＭＢ基質試薬（ＩｎｎｏＲｅａｇｅｎｔｓ、ＴＭＢ－Ｓ－００３）を添加し、室温で５ｍｉｎインキュベートした後、０．１Ｍ Ｈ_２ＳＯ_４を添加することによって停止させた。ＯＤ４５０ｎｍを、マイクロプレートリーダーによって記録した。

【0472】

[00502]図３Ａ～図３Ｃに示されるように、元の４Ｂ６－ｈＩｇＧ１－ＴＧＦβＲＩＩと比較した場合、全てのバリアントが、増強された結合シグナルおよび親和性を有していた。これらのバリアント間の限られた差異を考慮して、その結合親和性のさらなる評価のために表面プラズモン共鳴技術を使用した。

【0473】

[00503]ＢｉａｃｏｒｅによるｈＰＤ－Ｌ１への結合
[00504]４μｇ／ｍｌのＡＭ－４Ｂ６－ｈＩｇＧ１－ＴＧＦβＲＩＩバリアントまたは元の４Ｂ６－ｈＩｇＧ１－ＴＧＦβＲＩＩを、ＳシリーズのプロテインＡチップの表面上に固定した。ヒトＰＤ－Ｌ１を適切な濃度勾配（０ｎＭ、１．８７５ｎＭ、３．７５ｎＭ、７．５ｎＭ、１５ｎＭ、３０ｎＭ、６０ｎＭ）に希釈し、Ｂｉａｃｏｒｅ ２０００の試料チャネルに注入した。その結果を、表１５に示す。ヒトＰＤ－Ｌ１に対するＡＭ－４Ｂ６－ｈＩｇＧ１－ＴＧＦβＲＩＩバリアント７の結合親和性は、元の４Ｂ６－ｈＩｇＧ１－ＴＧＦβＲＩＩのものよりも約１５倍改善された。

【0474】

[00505]

【0475】

【表17】

【0476】

[00506]ＦＡＣＳアッセイによる細胞表面上に発現するＰＤ－Ｌ１への結合
[00507]２９３Ｔ－ＰＤ－Ｌ１－ＣＤ３Ｌ細胞を、ＰＤ－Ｌ１抗体の特性評価のためにＭａｂＳｐａｃｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅによって生成した。細胞に、ヒトＰＤ－Ｌ１と抗ＣＤ３ ｓｃＦｖとの両方をトランスフェクトした。ＡＭ－４Ｂ６－ｈＩｇＧ１－ＴＧＦβＲＩＩバリアントまたは元の４Ｂ６－ｈＩｇＧ１－ＴＧＦβＲＩＩを連続希釈（５倍希釈）して、希釈緩衝液（２％ＢＳＡを含むＰＢＳ）中で８つの濃度を得た。２９３Ｔ－ＰＤ－Ｌ１－ＣＤ３Ｌ細胞を採取し、遠心分離した。それらを、２ｘ１０^６細胞／ｍｌの密度でＰＢＳ中に再懸濁した後、ウェルあたり１００μｌでプレートに添加した。遠心分離および上清の除去後、希釈した抗体をプレートに添加し、４℃で３０ｍｉｎインキュベートした。希釈緩衝液で２回洗浄した後、ＰＥコンジュゲート化ロバ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｊａｃｋｓｏｎｉｍｍｕｎｏ、７０９－１１６－１４９）をプレートに添加し、４℃で３０ｍｉｎインキュベートした。洗浄後、細胞を２００μｌのＰＢＳ中に再懸濁し、フローサイトメトリーによって分析した。

【0477】

[00508]図４に示されるように、これらの５つのバリアントは、類似するＥＣ５０で２９３Ｔ－ＰＤ－Ｌ１－ＣＤ３Ｌ細胞の表面上に発現されたＰＤ－Ｌ１に結合した。バリアント７は、他のものよりもわずかに低いＥＣ５０を有し、これはＢｉａｃｏｒｅによって測定された結合親和性の結果と一致していた。

【0478】

実施例７
ＡＭ－４Ｂ６－ｈＩｇＧ１－ＴＧＦβＲＩＩバリアントのＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１遮断活性
[00509]ＥＬＩＳＡアッセイによるＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１およびＢ７－１／ＰＤ－Ｌ１遮断
リガンド／受容体遮断活性を試験するために、０．５μｇ／ｍｌのｈＰＤ－Ｌ１－Ｆｃ抗原をＥＬＩＳＡプレートにコーティングし、４℃で一晩静置した。３００μＬのブロッキング緩衝液を、室温で１ｈ、ブロッキングのために添加した。１ｈ後、１００ｎＭ～０．０２４ｎＭ（４倍連続希釈）の範囲の濃度のＡＭ－４Ｂ６－ｈＩｇＧ１－ＴＧＦβＲＩＩバリアント７または元の４Ｂ６－ｈＩｇＧ１－ＴＧＦβＲＩＩの５０μｌを、１μｇ／ｍｌの濃度のＰＤ－Ｌ１－ｈｉｓの５０μｌと共に添加し、室温で１ｈインキュベートした。０．５％ＰＢＳ＋Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－２０を３回洗浄するために使用し、１００μｌのＨＲＰコンジュゲート化ストレプトアビジン（１：５０００、Ａｂｃａｍ、カタログ番号ａｂ７４０３）を添加した。室温で１．５ｈインキュベートした後、混合ＴＭＢ基質試薬を添加し、室温で５ｍｉｎインキュベートした後、０．１Ｍ Ｈ_２ＳＯ_４を添加することによって停止させた。ＯＤ４５０ｎｍを、マイクロプレートリーダーによって記録した。図５Ａ～図５Ｂに示されるように、両試料はＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１またはＰＤ－Ｌ１／Ｂ７－１を遮断することができたが、ＡＭ－４Ｂ６－ｈＩｇＧ１－ＴＧＦβＲＩＩバリアント７はより低いＩＣ５０を有し、これはバリアント７が改善された活性を有することを示している。

【0479】

[00510]細胞ベースのアッセイによるＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１遮断
[00511]このアッセイでは、２９３Ｔ－ＰＤ－Ｌ１－ＣＤ３Ｌ細胞はＰＤ－Ｌ１および抗ＣＤ３ ｓｃＦｖを発現し、Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴ－Ｌｕｃ－ＰＤ１細胞はＰＤ－１を発現し、ＣＤ３刺激によって活性化することができるＮＦＡＴシグナルを担持する。ＮＦＡＴ活性化は、下流のルシフェラーゼ遺伝子の転写および発現をもたらし、その基質によって検出することができる。２つの細胞を、ＭａｂＳｐａｃｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅによって生成した。

【0480】

[00512]簡単に述べると、２９３Ｔ－ＰＤ－Ｌ１－ＣＤ３Ｌ細胞を採取し、２ｘ１０^６細胞／ｍｌの密度で再懸濁した。ウェルあたり２０μｌの細胞を、ハーフウェルプレートに添加した。ＡＭ－４Ｂ６－ｈＩｇＧ１－ＴＧＦβＲＩＩバリアントまたは元の４Ｂ６－ｈＩｇＧ１－ＴＧＦβＲＩＩを連続希釈（３倍希釈）して、２％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ培地中で８つの濃度を得た。ウェルあたり２０μｌの抗体をハーフウェルプレートに添加し、プレートを３７℃、５％ＣＯ_２で３０ｍｉｎインキュベートした。Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴ－Ｌｕｃ－ＰＤ１細胞を採取し、２％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ培地中に４ｘ１０^６細胞／ｍｌの密度で再懸濁した。最後に、ウェルあたり２０μｌの細胞を、５ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ－ベータ（Ｒ＆Ｄ、２４０－Ｂ－０１０）と共にハーフウェルプレートに添加し、３７℃、５％ＣＯ_２で５ｈインキュベートした。６０μｌのＯｎｅＧｌｏ検出試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｅ６１２０）を各ウェルに添加し、室温で５分間インキュベートした。発光シグナルをマイクロプレートリーダーによって読み取った。データをＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍによって分析した。

【0481】

[00513]図６に示されるように、以前のＥＬＩＳＡの結果と一致して、バリアント７が、他のバリアントと比較してこの細胞ベースのアッセイにおいて最も強力な遮断活性を有していた。したがって、ＡＭ－４Ｂ６－ｈＩｇＧ１－ＴＧＦβＲＩＩバリアント７の４Ｂ６ Ｆａｂ部分をＡＭ４Ｂ６と省略し、ＡＭ－４Ｂ６－ｈＩｇＧ１－ＴＧＦβＲＩＩ融合タンパク質を以下の実験においてさらに評価した。

【0482】

実施例８
ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＡＭ４Ｂ６－ｈＩｇＧ１－ＴＧＦβＲＩＩ’の生成および特性評価
[00514]ＡＭ４Ｂ６－ｈＩｇＧ１－ＴＧＦβＲＩＩのクローニングおよび発現
[00515]短縮型ＴＧＦβＲＩＩ ＥＣＤ＿２０－１３６は可溶性であり、ＴＧＦβ１に結合する能力を保持することが報告された（Ｋｉｍ－Ｍｉｎｇ Ｌｏら、ＵＳ９６７６８６３Ｂ２、２０１７；Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ Ｃ．ら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ、２０００、２０：９８～１０４）。次に、本発明者らは、ＴＧＦβＲＩＩ＿１－１３６の細胞外ドメインの完全長を、短縮型のものと置き換え、開発可能性および安定性を評価した。安定な細胞系からのＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果により、タンパク質発現が短縮型と完全長との両方のＴＧＦβＲＩＩ ＥＣＤについて良好であるが、タンパク質安定性は完全長ＴＧＦβＲＩＩ ＥＣＤよりも短縮型ＴＧＦβＲＩＩ ＥＣＤ＿２０－１３６の方がはるかに良好であることが示された（図７）。短縮型ＴＧＦβＲＩＩ ＥＣＤ＿２０－１３６の配列は、以下の通りである：
[00516]安定なＴＧＦ－βトラップ、ＴＧＦ－βＲＩＩ細胞外ドメイン（２０－１３６）の配列
ＧＡＶＫＦＰＱＬＣＫＦＣＤＶＲＦＳＴＣＤＮＱＫＳＣＭＳＮＣＳＩＴＳＩＣＥＫＰＱＥＶＣＶＡＶＷＲＫＮＤＥＮＩＴＬＥＴＶＣＨＤＰＫＬＰＹＨＤＦＩＬＥＤＡＡＳＰＫＣＩＭＫＥＫＫＫＰＧＥＴＦＦＭＣＳＣＳＳＤＥＣＮＤＮＩＩＦＳＥＥＹＮＴＳＮＰＤ
（配列番号６６）
[00517]短縮型ＴＧＦ－βＲＩＩ（すなわち、ＴＧＦ－βＲＩＩ（２０－１３６）、配列番号６６）を含む二機能性分子を、本実施例において、また、実施例９～１１においても使用した。そのような二機能性分子の名称を、ＴＧＦ－βＲＩＩ（１－１３６）と区別するために、ＴＧＦβＲＩＩ’で示した。例えば、ＡＭ４Ｂ６－ｈＩｇＧ１－ＴＧＦβＲＩＩ’は、ＴＧＦ－βＲＩＩ（２０－１３６）を有する分子を示す。

【0483】

[00518]ＥＬＩＳＡアッセイによる様々な種に由来するＰＤ－Ｌ１への結合
[00519]１μｇ／ｍｌのヒトＰＤ－Ｌ１（Ａｃｒｏ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＰＤ１－Ｈ５２２９）またはカニクイザルＰＤ－Ｌ１抗原をＥＬＩＳＡプレートにコーティングし、４℃で一晩静置した。次いで、３００μＬの３％（ｗ／ｖ）スキムミルクを、室温で１ｈ、ブロッキングのために添加した。１ｈ後、１００ｎＭ～０．０２ｎＭ（４倍連続希釈）の範囲の濃度のＡＭ４Ｂ６－ｈＩｇＧ１－ＴＧＦβＲＩＩ’または対照ｈＩｇＧ１－ＴＧＦβＲＩＩ’の１００μｌを添加し、室温で１ｈインキュベートした。０．５％ＰＢＳ＋Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－２０を、３回の洗浄のために使用し、１００μｌのＨＲＰコンジュゲート化抗ヒトＦｃ抗体（１：２００００、Ａｂｃａｍ、ａｂ９８６２４）を添加した。室温で１ｈインキュベートした後、混合ＴＭＢ基質試薬（ＩｎｎｏＲｅａｇｅｎｔｓ、ＴＭＢ－Ｓ－００３）を添加し、室温で５ｍｉｎインキュベートした後、０．１Ｍ Ｈ_２ＳＯ_４を添加することによって停止させた。ＯＤ４５０ｎｍを、マイクロプレートリーダーによって記録した。

【0484】

[00520]図８Ａおよび図８Ｂに示されるように、ＡＭ４Ｂ６－ｈＩｇＧ１－ＴＧＦβＲＩＩ’は、ヒトＰＤ－Ｌ１と類似するＥＣ５０でカニクイザルＰＤ－Ｌ１と交差反応した。

【0485】

[00521]ＥＬＩＳＡによる様々な種に由来するＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２およびＴＧＦβ３への結合
[00522]Ｕｎｉｐｏｒｔのウェブサイト（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／）上に公開された、４つの一般的な種：ヒト、カニクイザル、マウスおよびラットに由来するＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２およびＴＧＦβ３の配列によれば、ＴＧＦβメンバーは非常に保存的である。ヒトＴＧＦβ１およびカニクイザルＴＧＦβ１の配列は同一である；マウスＴＧＦβ１およびラットＴＧＦβ１は同一である；ヒトＴＧＦβ２およびカニクイザルＴＧＦβ２は同一である；マウスＴＧＦβ２およびラットＴＧＦβ２は同一である；ヒトＴＧＦβ３、カニクイザルＴＧＦβ３およびマウスＴＧＦβ３は同一である。

【0486】

[00523]ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ３について、手順は以下の通りである：０．５μｇ／ｍｌのヒトＴＧＦβ１（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、１０８０４－ＨＮＡＣ）またはマウスＴＧＦβ１（Ｎｏｖｏｐｒｏｔｅｉｎ、ＣＫ３３）またはヒトＴＧＦβ３（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ、Ｚ０３４３０）またはラットＴＧＦβ３（Ｎｏｖｏｐｒｏｔｅｉｎ、ＣＪ４４）抗原をＥＬＩＳＡプレートにコーティングし、４℃で一晩静置した。次いで、３００μＬの３％（ｗ／ｖ）スキムミルクを、室温で１ｈ、ブロッキングのために添加した。１ｈ後、１００ｎＭ～０．００６ｎＭ（４倍連続希釈）の範囲の濃度のＡＭ４Ｂ６－ｈＩｇＧ１－ＴＧＦβＲＩＩ’または対照ｈＩｇＧ１－ＴＧＦβＲＩＩ’の１００μｌを添加し、室温で１ｈインキュベートした。０．５％ＰＢＳ＋Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－２０を、３回の洗浄のために使用し、１００μｌのＨＲＰコンジュゲート化抗ヒトＦｃ抗体（１：２００００、Ａｂｃａｍ、ａｂ９８６２４）を添加した。室温で１ｈインキュベートした後、混合ＴＭＢ基質試薬（ＩｎｎｏＲｅａｇｅｎｔｓ、ＴＭＢ－Ｓ－００３）を添加し、室温で５ｍｉｎインキュベートした後、０．１Ｍ Ｈ_２ＳＯ_４を添加することによって停止させた。ＯＤ４５０ｎｍを、マイクロプレートリーダーによって記録した。

【0487】

[00524]ＴＧＦβ２については、試験手順が異なる：２μｇ／ｍｌのＡＭ４Ｂ６－ｈＩｇＧ１－ＴＧＦβＲＩＩ’または対照ｈＩｇＧ１－ＴＧＦβＲＩＩ’をＥＬＩＳＡプレートにコーティングし、４℃で一晩静置した。次いで、３００μＬの３％（ｗ／ｖ）スキムミルクを、室温で１ｈ、ブロッキングのために添加した。１ｈ後、３９．４ｎＭ～０．３ｎＭ（２倍連続希釈）の範囲の濃度のヒトＴＧＦβ２またはマウスＴＧＦβ２の１００μｌを添加し、室温で１ｈインキュベートした。０．５％ＰＢＳ＋Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－２０を３回の洗浄のために使用し、１００μｌのＴＧＦβ２ビオチン化抗体（１：１００００、Ｒ＆Ｄ、ＢＡＦ３０２）を添加した。室温で１ｈインキュベートし、洗浄した後、１００μｌのＨＲＰ－ストレプトアビジン（１：５０００、Ａｂｃａｍ、ａｂ７４０３）を添加し、プレートを室温で１ｈインキュベートした。洗浄後、混合ＴＭＢ基質試薬（ＩｎｎｏＲｅａｇｅｎｔｓ、ＴＭＢ－Ｓ－００３）を添加し、室温で５ｍｉｎインキュベートし、０．１Ｍ Ｈ_２ＳＯ_４を添加することによって停止させた。ＯＤ４５０ｎｍを、マイクロプレートリーダーによって記録した。

【0488】

[00525]結果を、表１６にまとめた。ＴＧＦβ１に対する結合親和性について、ＥＣ５０値は、異なる種の間で非常に類似していた。さらに、ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ３に対する結合親和性はＴＧＦβ２よりも有意に高かったが、これは、ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ３に対する遮断活性がＴＧＦβ２よりも強力であり得ることを示している。

【0489】

[00526]

【0490】

【表18】

【0491】

[00527]ＥＬＩＳＡアッセイによるＢ７ファミリーまたはＴＧＦβスーパーファミリー内の他のメンバーへの結合
[00528]Ｂ７ファミリーについては、０．５μｇ／ｍｌのｈＰＤ－Ｌ１（Ａｃｒｏ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＰＤ１－Ｈ５２２９）またはｈＰＤ－Ｌ２またはＢ７－２またはＢ７－１またはＢ７－Ｈ２またはＢ７－Ｈ３またはＢ７－Ｈ４またはＶＩＳＴＡをＥＬＩＳＡプレートにコーティングし、４℃で一晩静置した。ＴＧＦβスーパーファミリーについては、０．５μｇ／ｍｌのヒトアクチビンＡ、ＢＭＰ－２、ＬＡＰまたはＴＧＦβ１を４℃で一晩コーティングした。次いで、３００μＬの３％（ｗ／ｖ）スキムミルクを、室温で１ｈ、ブロッキングのために添加した。１ｈ後、１００ｎＭ～０．００６ｎＭ（連続希釈）の範囲の濃度のＡＭ４Ｂ６－ｈＩｇＧ１－ＴＧＦβＲＩＩ’の１００μｌを添加し、室温で１ｈインキュベートした。０．５％ＰＢＳ＋Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－２０を、３回の洗浄のために使用し、１００μｌのＨＲＰコンジュゲート化抗ヒトＦｃ抗体（１：２００００、Ａｂｃａｍ、ａｂ９８６２４）を添加した。室温で１ｈインキュベートした後、混合ＴＭＢ基質試薬（ＩｎｎｏＲｅａｇｅｎｔｓ、ＴＭＢ－Ｓ－００３）を添加し、室温で５ｍｉｎインキュベートした後、０．１Ｍ Ｈ_２ＳＯ_４を添加することによって停止させた。ＯＤ４５０ｎｍを、マイクロプレートリーダーによって記録した。

【0492】

[00529]図９Ａ～図９Ｂに示されるように、ＡＭ４Ｂ６－ｈＩｇＧ１－ＴＧＦβＲＩＩ’は、Ｂ７ファミリーにも属する他の抗原よりもむしろ、ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合した。図９Ｃに示されるように、ＡＭ４Ｂ６－ｈＩｇＧ１－ＴＧＦβＲＩＩ’は、ＴＧＦβスーパーファミリーにも属する他の抗原よりもむしろＴＧＦβ１に特異的に結合した。

【0493】

[00530]ＡＭ４Ｂ６－ｈＩｇＧ１－ＴＧＦβＲＩＩ’のＰＤ－Ｌ１発現細胞への結合
[00531]ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９系によるｍＰＤ－Ｌ１の欠失、次いで、レンチウイルスを使用したｈＰＤ－Ｌ１の形質導入によって、ＭＣ３８／ｈＰＤ－Ｌ１を生成した。この細胞系は、Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｓｕｚｈｏｕ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍｓ ＭｅｄｉｃｉｎｅのＰｒｏｆｅｓｓｏｒ Ｑｉｎ Ｘｉａｏｆｅｎｇの研究室の厚意によるものであった（Ｈｕａｎｇ、Ａｎｆｅｉら、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ ７（２０１７）：４２６８７）。ＭＣ－３８／ｈＰＤ－Ｌ１細胞を、ＲＰＭＩ１６４０＋１０％ＦＢＳ中で培養した。ＥＭＴ－６／ｈＰＤ－Ｌ１は、トランスフェクトされたヒトＰＤ－Ｌ１遺伝子を安定に発現するマウス乳がん細胞系である。ＥＭＴ－６／ｈＰＤ－Ｌ１細胞を、Ｗａｙｍｏｕｔｈ’ｓ（１ｘ）ＭＢ７５２／１＋１５％ＦＢＳ中で培養した。ＮＣＩ－Ｈ４６０細胞を、ＣＯＢＩＯＥＲ Ｌｔｄ．から購入した。それは、ＰＤ－Ｌ１発現を示すヒト肺上皮腫瘍細胞系である。ＮＣＩ－Ｈ４６０細胞を、ＲＰＭＩ１６４０＋１０％ＦＢＳ中で培養した。ＮＣＩ－Ｈ２９２細胞を、ＣＯＢＩＯＥＲ Ｌｔｄ．から購入した。それは、ＰＤ－Ｌ１発現を示すヒト肺上皮腫瘍細胞系である。ＮＣＩ－Ｈ２９２細胞をＲＰＭＩ１６４０＋１０％ＦＢＳ＋１ｎＭピルビン酸ナトリウム溶液中で培養した。ＦＡＣＳ解析のプロトコールは、実施例６のセクション３と同じであった。

【0494】

[00532]ヒトまたはカニクイザルＰＢＭＣ（ＴＰＣＳ、カタログ番号ＰＢ０２５Ｃ）を、液体窒素から回収し、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０中に再懸濁した。５μｇ／ｍｌのＰＨＡ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｌ８９０２）を添加して、ＰＢＭＣ活性化を刺激し、細胞を３日間培養した。活性化されたＰＢＭＣを採取し、遠心分離し、２ｘ１０^６細胞／ｍｌの密度でＰＢＳ中に再懸濁し、ウェルあたり１００μｌでプレートに添加した。ＡＭ４Ｂ６－ｈＩｇＧ１－ＴＧＦβＲＩＩ’またはＡＭ４Ｂ６または対照ｈＩｇＧ１－ＴＧＦβＲＩＩ’を連続希釈（５倍希釈）して、希釈緩衝液（２％ＢＳＡを含むＰＢＳ）中で１０種の濃度を得た。遠心分離し、プレート中の上清を除去した後、希釈した抗体を、活性化されたＰＢＭＣと共にプレートに添加し、４℃で１時間インキュベートした。希釈緩衝液で２回洗浄した後、Ａｌｅｘａ４８８標識されたマウス抗ヒトＣＤ３（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号３００３２０）およびＡＰＣ標識された抗ヒトＩｇＧ二次抗体（ＢＤ、カタログ番号５５０９３１）を添加し、４℃で３０ｍｉｎインキュベートした。洗浄後、細胞を１５０μｌのＰＢＳ中に再懸濁し、フローサイトメトリーによって分析した。

【0495】

[00533]図１０Ａ～図１０Ｆに示されるように、ＡＭ４Ｂ６－ｈＩｇＧ１－ＴＧＦβＲＩＩ’は、ＡＭ４Ｂ６ ｍＡｂ単独と類似する親和性で、これらのがん細胞系および活性化されたヒトまたはカニクイザルＴ細胞上に発現されるＰＤ－Ｌ１に結合することができた。

【0496】

[00534]活性化されたヒトＴ細胞への結合
[00535]ヒトＰＢＭＣ（ＴＰＣＳ、カタログ番号ＰＢ０２５Ｃ）を、液体窒素から回収し、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０中に再懸濁した。５μｇ／ｍｌのＰＨＡ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｌ８９０２）を添加して、ＰＢＭＣ活性化を刺激し、細胞を３日間培養した。活性化されたＰＢＭＣを採取し、遠心分離し、２ｘ１０^６細胞／ｍｌの密度でＰＢＳ中に再懸濁し、ウェルあたり１００μｌでプレートに添加した。ＡＭ４Ｂ６－ｈＩｇＧ１－ＴＧＦβＲＩＩ’またはＡＭ４Ｂ６または対照ｈＩｇＧ１－ＴＧＦβＲＩＩ’を連続希釈（５倍希釈）して、希釈緩衝液（２％ＢＳＡを含むＰＢＳ）中で１０種の濃度を得た。遠心分離し、プレート中の上清を除去した後、希釈した抗体を、活性化されたＰＢＭＣと共にプレートに添加し、４℃で１時間インキュベートした。希釈緩衝液で２回洗浄した後、Ａｌｅｘａ４８８標識されたマウス抗ヒトＣＤ３（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号３００３２０）およびＡＰＣ標識された抗ヒトＩｇＧ二次抗体（ＢＤ、カタログ番号５５０９３１）を添加し、４℃で３０ｍｉｎインキュベートした。洗浄後、細胞を１５０μｌのＰＢＳ中に再懸濁し、フローサイトメトリーによって分析した。

【0497】

[00536]図１１に示されるように、ＡＭ４Ｂ６－ｈＩｇＧ１－ＴＧＦβＲＩＩ’は、活性化されたヒトＴ細胞上に発現されるＰＤ－Ｌ１に結合することができた。

【0498】

[00537]ＥＬＩＳＡアッセイによるｈＰＤ－Ｌ１／ｈＰＤ－１およびカニクイザルＰＤ－Ｌ１／カニクイザルＰＤ－１の遮断
[00538]０．５μｇ／ｍｌのｈＰＤ－Ｌ１－Ｆｃまたは０．５μｇ／ｍｌのカニクイザルＰＤ－Ｌ１－ＦｃをＥＬＩＳＡプレートにコーティングし、４℃で一晩静置した。３００μＬの３％（ｗ／ｖ）スキムミルクを、室温で１ｈ、ブロッキングのために添加した。１ｈ後、１００ｎＭ～０．０２ｎＭ（４倍連続希釈）の範囲の濃度のＡＭ４Ｂ６－ｈＩｇＧ１－ＴＧＦβＲＩＩ’またはＡＭ４Ｂ６の１００μｌを、０．５μｇ／ｍｌのｈＰＤ－１－Ｆｃ－ビオチンまたはカニクイザルＰＤ－１－Ｆｃ－ビオチンと共に添加し、室温で１ｈインキュベートした。０．５％ＰＢＳ＋Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－２０を３回洗浄するために使用し、１００μｌのＨＲＰコンジュゲート化ストレプトアビジン（１：５０００）を添加した。室温で１ｈインキュベートした後、混合ＴＭＢ基質試薬を添加し、室温で５ｍｉｎインキュベートした後、０．１Ｍ Ｈ_２ＳＯ_４を添加することによって停止させた。ＯＤ４５０ｎｍを、マイクロプレートリーダーによって記録した。

【0499】

[00539]図１２Ａ～図１２Ｂに示されるように、ＡＭ４Ｂ６－ｈＩｇＧ１－ＴＧＦβＲＩＩ’は、ヒトＰＤ－Ｌ１／ヒトＰＤ－１の遮断のものと類似するＩＣ５０でカニクイザルＰＤ－Ｌ１／カニクイザルＰＤ－１を完全に遮断することもできた。

【0500】

[00540]ｈＰＤ－Ｌ１およびｈＴＧＦβ１への同時的結合
[00541]０．５μｇ／ｍｌのｈＴＧＦβ－１をＥＬＩＳＡプレートにコーティングし、４℃で一晩静置した。次いで、３００μＬのブロッキング緩衝液を、室温で１ｈ、ブロッキングのために添加した。１ｈ後、１００ｎＭ～０．０２ｎＭ（４倍連続希釈）の範囲の濃度のＡＭ４Ｂ６－ｈＩｇＧ１－ＴＧＦβＲＩＩ’またはＡＭ４Ｂ６または対照ｈＩｇＧ１－ＴＧＦβＲＩＩ’の１００μｌを添加し、室温で１ｈインキュベートした。０．５％ＰＢＳ＋Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－２０を３回洗浄するために使用し、次いで、０．５μｇ／ｍｌのｈＰＤ－Ｌ１－ビオチンを各ウェルに添加した。１ｈ後、１００μｌのＨＲＰコンジュゲート化ストレプトアビジン（１：５０００）を添加した。室温で１ｈインキュベートした後、混合ＴＭＢ基質試薬（ＩｎｎｏＲｅａｇｅｎｔｓ、ＴＭＢ－Ｓ－００３）を添加し、室温で５ｍｉｎインキュベートした後、０．１Ｍ Ｈ_２ＳＯ_４を添加することによって停止させた。ＯＤ４５０ｎｍを、マイクロプレートリーダーによって記録した。

【0501】

[00542]図１３に示されるように、抗ＰＤ－Ｌ１抗体ＡＭ４Ｂ６およびＴＧＦβＲＩＩ’から構成されるＡＭ４Ｂ６－ｈＩｇＧ１－ＴＧＦβＲＩＩ’は、同時に２つの標的に結合することができたが、これは、その二特異性または二機能性特性を示している。

【0502】

[00543]レポーター細胞アッセイによるｈＰＤ－Ｌ１／ｈＰＤ－１の遮断
[00544]プロトコールは、実施例１５のセクション２と同じであった。図１４に示されるように、ＡＭ４Ｂ６－ｈＩｇＧ１－ＴＧＦβＲＩＩは、ＡＭ４Ｂ６ ｍＡｂ単独と同じく、ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１の阻害効果を遮断し、続いて、シグナル伝達活性化を逆転させることができた。

【0503】

[00545]レポーター細胞アッセイによるＴＧＦβ１シグナル伝達の遮断
[00546]ＴＧＦβレポーターＨＥＫ－２９３細胞系を、Ｇｅｎｏｍｅｄｉｔｅｃｈ（カタログ番号ＧＭ－Ｃ０５３４６）から購入し、５％二酸化炭素を含む３７℃インキュベーター中、１０％ＦＢＳ、４μｇ／ｍｌブラスチシジン、４００μｇ／ｍｌネオマイシン、１２５μｇ／ｍｌハイグロマイシン、０．７５μｇ／ｍｌピューロマイシン、および１％Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐを含有するＤＭＥＭ培地中で培養した。

【0504】

[00547]細胞を、対数増殖期で収集し、ＤＭＥＭ培地中に再懸濁し、ウェルあたり２ｘ１０^４細胞／１００μｌの密度で９６ウェルプレート中に播種した。細胞を一晩培養した後、培地を、１０ｎｇ／ｍｌのヒトＴＧＦβ１を含有する７５μｌの培養培地と置き換えた。１００ｎＭ～０．０２ｎＭ（３倍連続希釈）の範囲の最終濃度で、７５μｌのＡＭ４Ｂ６－ｈＩｇＧ１－ＴＧＦβＲＩＩ’またはＡＭ４Ｂ６を添加した。プレートを３７℃インキュベーターで１６時間インキュベートした。ＯＮＥ－Ｇｌｏ（商標）ルシフェラーゼアッセイシステムを１５０μｌ／ウェルで添加し、室温で１０分間インキュベートした後、プレートを、マイクロプレートリーダーを用いて読み取った。

【0505】

[00548]図１５に示されるように、ＡＭ４Ｂ６－ｈＩｇＧ１－ＴＧＦβＲＩＩ’は、０．３５ｎＭのＩＣ５０でＴＧＦβ１シグナル伝達に対する強力な遮断活性を示したが、ＡＭ４Ｂ６ ｍＡｂ単独では遮断活性を有しなかった。これは、遮断活性がＴＧＦβ１特異的であることを示している。

【0506】

[00549]ツベルクリン（ＴＢ）により刺激されたＰＢＭＣのＩＦＮ－γ放出に対するＡＭ４Ｂ６－ｈＩｇＧ１－ＴＧＦβＲＩＩ’の効果
[00550]ヒトＰＢＭＣを、液体窒素から回収し、２ｘ１０^６個／ｍＬの密度で細胞を再懸濁した。ＴＢを１．３３μｇ／ｍＬの最終濃度で添加し、３７℃で５日間培養する。６日目に、誘導されたＰＢＭＣを収集し、遠心分離し、ＰＢＳで１回洗浄し、新鮮な培地中に再懸濁し、１ｘ１０^６／ｍｌの密度に調整し、１８０μＬ／ウェルで９６ウェル細胞プレート中に播種した。２０μＬ／ウェルの希釈した抗体を９６ウェル細胞培養プレートに添加する。対照群およびブランク群を２０μＬのＰＢＳと共に添加した。細胞培養プレートを、５％ＣＯ_２インキュベーター中、３７℃で３日間インキュベートした。インキュベーションの終わりに、細胞上清を１０倍希釈し、ＩＦＮγの分泌レベルを、ＩＦＮ－γＥＬＩＳＡ検出キット（Ｒ＆Ｄ、ＤＹ２８５Ｂ）で検出した。

【0507】

[00551]図１６に示されるように、ＡＭ４Ｂ６－ｈＩｇＧ１－ＴＧＦβＲＩＩ’は、ＡＭ４Ｂ６ ｍＡｂ単独よりも有意に高いレベルのＩＦＮ－γ放出を誘導したが、これは、その活性化活性がその二特異的結合および遮断活性に起因してより強力であることを示している。

【0508】

[00552]ＡＭ４Ｂ６－ｈＩｇＧ１－ＴＧＦβＲＩＩ’のＡＤＣＣ／ＣＤＣ活性
[00553]ＡＤＣＣアッセイについて、エフェクター細胞：Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴ Ｌｕｃ－ＦｃγＲＩＩＩａ－１５８Ｖ細胞系を、Ｍａｂｓｐａｃｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｓｕｚｈｏｕ）Ｃｏ．，Ｌｉｍｉｔｅｄによって構築した。標的細胞：ＨＥＫ－２９３Ｔ－ｈＰＤ－Ｌ１細胞（Ｃｒｏｗｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ．、カタログ番号２００５から購入）。

【0509】

[00554]ＨＥＫ－２９３Ｔ－ｈＰＤ－Ｌ１細胞を、ウェルあたり１０，０００個の細胞／１２．５μｌで細胞培養プレートに添加した。次いで、２００ｎＭ～０．００３ｎＭの範囲の最終濃度のＡＭ４Ｂ６－ｈＩｇＧ１－ＴＧＦβＲＩＩ’希釈液を、１２．５μｌ／ウェルで添加した。次いで、プレートを３７℃でインキュベーターに入れて、抗体および細胞を３０分間インキュベートした。次いで、Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴ Ｌｕｃ－ＦｃγＲＩＩＩａ－１５８Ｖ細胞を、ウェルあたり６０，０００個の細胞／２５μｌでウェルに添加した。次いで、プレートを３７℃で６時間、インキュベーターに入れた。ＯＮＥ－Ｇｌｏ（商標）ルシフェラーゼアッセイシステムを５０μｌ／ウェルで添加し、室温で１０分間インキュベートした後、プレートを、マイクロプレートリーダーを用いて読み取った。

【0510】

[00555]ＣＤＣアッセイについても、標的細胞はＨＥＫ－２９３Ｔ－ｈＰＤ－Ｌ１細胞である。ＨＥＫ－２９３Ｔ－ｈＰＤ－Ｌ１細胞を、ウェルあたり１０，０００個の細胞／２５で細胞培養プレートに添加した。次いで、２００ｎＭ～０．３ｎＭの範囲の最終濃度のＡＭ４Ｂ６－ｈＩｇＧ１－ＴＧＦβＲＩＩ’希釈液を、１２．５μｌ／ウェルで添加した。次いで、プレートを３７℃でインキュベーターに入れて、抗体および細胞を３０分間インキュベートした。ＨＥＫ－２９３Ｔ－ｈＰＤ－Ｌ１細胞を、５０μｌ／ウェルで、４０％補体で処理した後（最終濃度は２０％）、３７℃で８０ｍｉｎインキュベートした。ＯＮＥ－Ｇｌｏ（商標）ルシフェラーゼアッセイシステムを１００μｌ／ウェルで添加し、室温で１０分間インキュベートした後、プレートを、マイクロプレートリーダーを用いて読み取った。

【0511】

[00556]その結果、ＡＭ４Ｂ６－ｈＩｇＧ１－ＴＧＦβＲＩＩ’はＨＥＫ－２９３Ｔ－ｈＰＤ－Ｌ１細胞に対するＡＤＣＣ活性もＣＤＣ活性も有しないことが示唆された（データは示さない）。

【0512】

実施例９
ｉｎ ｖｉｖｏでのＡＭ４Ｂ６－ｈＩｇＧ１－ＴＧＦβＲＩＩ’の有効性
[00557]Ｃ５７ＢＬ／６マウス上でのＭＣ３８－ｈＰＤ－Ｌ１腫瘍モデル
[00558]マウス腫瘍細胞系ＭＣ３８（ＡＴＣＣ）における内因性マウスＰＤ－Ｌ１を、本発明者らが最近開発した非常に効率的なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を使用してノックアウトした。簡単に述べると、マウスＰＤ－Ｌ１遺伝子の第１のコードエクソンを標的とするｓｇＲＮＡを設計し、ヒットエンドランＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９＋ｓｇＲＮＡ構築物によって細胞をトランスフェクトし、ノックアウト細胞について選択した。内因性マウスＰＤ－Ｌ１が完全にノックアウトされた細胞を、定常状態でのＰＤ－Ｌ１の細胞表面発現についてＦＡＣＳ解析によって同定したか、またはインターフェロンガンマによって刺激した後、標的としたゲノム領域のＴＡクローニングおよび配列決定によって検証した。ヒトＰＤ－Ｌ１置き換え細胞系を生成するために、ヒトＰＤ－Ｌ１ ｃＤＮＡのコード配列を、ＦＧ１２由来レンチウイルスベクター中にクローニングした。次いで、マウスＰＤ－Ｌ１ノックアウト細胞に、ヒトＰＤ－Ｌ１を発現するレンチウイルスを感染させ、確立された細胞系におけるヒトＰＤ－Ｌ１の高レベルかつ安定な発現をＦＡＣＳ解析によって確認した。ＭＣ３８のこの操作された細胞を、ＭＣ３８－ｈＰＤ－Ｌ１と命名した。

【0513】

[00559]ＭＣ３８－ｈＰＤ－Ｌ１細胞を、１０％熱不活化ウシ胎仔血清を補充したＲＰＭＩ１６４０培地中、空気中に５％ＣＯ_２を含む雰囲気で３７℃にて、単層培養物としてｉｎ ｖｉｔｒｏで維持した。指数増殖期で増殖している腫瘍細胞を採取し、腫瘍接種のために計数した。それぞれのメスＳＰＦ等級Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、５０％マトリゲルを含む混合した２ｘ１０^６個のＭＣ３８－ｈＰＤ－Ｌ１細胞を接種した。腫瘍サイズが約９０ｍｍ^３になった時、腫瘍を担持するマウスを選択し、５つの群に無作為化した（ｎ＝８）。動物を、２．５ｍｇ／ｋｇのアイソタイプ対照、３ｍｇ／ｋｇのアイソタイプ対照－ＴＧＦβＲＩＩ’、２．５ｍｇ／ｋｇのＡＭ４Ｂ６、０．３ｍｇ／ｋｇのＡＭ４Ｂ６－ｈＩｇＧ１－ＴＧＦβＲＩＩ’、１ｍｇ／ｋｇのＡＭ４Ｂ６－ｈＩｇＧ１－ＴＧＦβＲＩＩ’および３ｍｇ／ｋｇのＡＭ４Ｂ６－ｈＩｇＧ１－ＴＧＦβＲＩＩ’で処置した。全ての抗体を、ｉ．ｐ．注射によって４週間にわたって週２回投与した。腫瘍サイズを、ノギス（ＩＮＳＩＺＥ）を使用して２次元で週２回または３回測定し、式：Ｖ＝０．５ａｘｂ^２（式中、ａおよびｂは、それぞれ、腫瘍の長い直径および短い直径である）を使用してｍｍ^３で体積を表した。結果を、Ｐｒｉｓｍ ＧｒａｐｈＰａｄを使用して分析し、平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．として表した。２群間の比較を、Ｔ検定によって行ったが、ｐが^＊＜０．０５かつ^＊＊＜０．０１である場合、差異が有意であると考えられる。

【0514】

[00560]図１７Ａ～図１７Ｂに示されるように、３ｍｇ／ｋｇのアイソタイプ対照－ＴＧＦβＲＩＩ’は、腫瘍成長を全く阻害しなかったが、これは、ＴＧＦβＲＩＩ’単独では有効性が低かったことを示している。２．５ｍｇ／ｋｇのＡＭ４Ｂ６は、０．３ｍｇ／ｋｇのＡＭ４Ｂ６－ｈＩｇＧ１－ＴＧＦβＲＩＩ’のものと同様、部分的な阻害効果のみ有していたが、これは腫瘍成長を制御するには不十分であると考えられた。投薬量の増加と共に、腫瘍体積は徐々に小さくなっていった。３ｍｇ／ｋｇのＡＭ４Ｂ６－ｈＩｇＧ１－ＴＧＦβＲＩＩ’は、腫瘍成長をほぼ完全に停止させ、そのＴＧＩは８４％であった（表１７）。

【0515】

[00561]

【0516】

【表19】

【0517】

[00562]ＮＯＤ－ＳＣＩＤマウス上でのＨ４６０腫瘍およびヒトＰＢＭＣ同時接種モデル
[00563]Ｈ４６０細胞を、ＣＯＢＩＯＥＲ Ｌｔｄ．から購入した。Ｈ４６０細胞を、１０％熱不活化ウシ胎仔血清を補充したＲＰＭＩ１６４０培地中、空気中に５％ＣＯ_２を含む雰囲気で３７℃にて、単層培養物としてｉｎ ｖｉｔｒｏで維持した。指数増殖期で増殖している腫瘍細胞を採取し、腫瘍接種のために計数した。それぞれのメスＳＰＦ等級ＮＯＤ－ＳＣＩＤマウスに、混合した３ｘ１０^６個のＨ４６０細胞（モデル群）または１．５ｘ１０^６個のヒトＰＢＭＣと混合した３ｘ１０^６個のＨ４６０細胞を接種した。全ての細胞懸濁液を、接種前に１：１比としてマトリゲルとよく混合した。接種の約４時間後、動物を７群に分け（ｎ＝１０）、示差的に投与した。動物を、１６．７ｍｇ／ｋｇの対照ｈＩｇＧ１、または２０ｍｇ／ｋｇの対照ｈＩｇＧ１－ＴＧＦβＲＩＩ’、または１６．７ｍｇ／ｋｇのＡＭ４Ｂ６、または５ｍｇ／ｋｇのＡＭ４Ｂ６－ｈＩｇＧ１－ＴＧＦβＲＩＩ’、または１０ｍｇ／ｋｇのＡＭ４Ｂ６－ｈＩｇＧ１－ＴＧＦβＲＩＩ’、または２０ｍｇ／ｋｇのＡＭ４Ｂ６－ｈＩｇＧ１－ＴＧＦβＲＩＩ’のいずれかで処置した。モデル群は何も処置しなかった。全ての抗体を、ｉ．ｐ．注射によって５週間にわたって週２回投与した。腫瘍サイズを、ノギス（ＩＮＳＩＺＥ）を使用して２次元で週２回または３回測定し、式：Ｖ＝０．５ａｘｂ^２（式中、ａおよびｂは、それぞれ、腫瘍の長い直径および短い直径である）を使用してｍｍ^３で体積を表した。結果を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを使用して分析し、平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．として表した。２群間の比較を、Ｔ検定によって行ったが、ｐが^＊＜０．０５かつ^＊＊＜０．０１である場合、差異が有意であると考えられる。

【0518】

[00564]図１８Ａ～図１８Ｂに示されるように、２０ｍｇ／ｋｇのアイソタイプ対照－ＴＧＦβＲＩＩ’は腫瘍成長を全く阻害しなかった。５ｍｇ／ｋｇのＡＭ４Ｂ６－ｈＩｇＧ１－ＴＧＦβＲＩＩ’が既に有意により良好な腫瘍阻害を有していた一方、１６．７ｍｇ／ｋｇのＡＭ４Ｂ６は部分的な阻害効果のみ有していたが、これは、ＴＧＦβＲＩＩ融合物がＡＭ４Ｂ６ ｍＡｂ単独の抗腫瘍有効性を増加させたことを示している。さらに、ＡＭ４Ｂ６－ｈＩｇＧ１－ＴＧＦβＲＩＩ’の明らかな用量応答がこのモデルにおいて観察されたが、これは再度、有効性がＡＭ４Ｂ６－ｈＩｇＧ１－ＴＧＦβＲＩＩ’に依存していることを示唆している。

【0519】

[00565]Ｃ５７ＢＬ／６マウス上でのＥＭＴ６－ｈＰＤ－Ｌ１腫瘍モデル
[00566]マウス腫瘍細胞系ＥＭＴ６（ＡＴＣＣ）中の内因性マウスＰＤ－Ｌ１をノックアウトし、ヒトＰＤ－Ｌ１を細胞中にノックインし、ＥＭＴ６の操作された細胞をＥＭＴ６－ｈＰＤ－Ｌ１と命名した。

【0520】

[00567]マウスに、ＥＭＴ６／ｈＰＤ－Ｌ１腫瘍細胞を皮下接種し、７つの群に無作為に分割した後、腫瘍体積に応じて１群あたり１０匹のマウスにした。グループ分けの後、第１群～第７群の動物に、それぞれ、２４．９ｍｇ／ｋｇの対照ｈＩｇＧ１、３０ｍｇ／ｋｇの対照ｈＩｇＧ１－ＴＧＦβＲＩＩ’、２４．９ｍｇ／ｋｇのＡＭ４Ｂ６、３ｍｇ／ｋｇのＡＭ４Ｂ６－ｈＩｇＧ１－ＴＧＦβＲＩＩ’、１０ｍｇ／ｋｇのＡＭ４Ｂ６－ｈＩｇＧ１－ＴＧＦβＲＩＩ’または３０ｍｇ／ｋｇのＡＭ４Ｂ６－ｈＩｇＧ１－ＴＧＦβＲＩＩ’を、４週間にわたって週２回、腹腔内注射によって投与した。腫瘍担持マウスの腫瘍体積および体重を週２回観察した。図１９Ａ～図１９Ｂに示されるように、ＡＭ４Ｂ６－ｈＩｇＧ１－ＴＧＦβＲＩＩ’は、投与後２９日目で、３、１０および３０ｍｇ／ｋｇでそれぞれ２１．４３％、４６．８３％および７９．３９％のＴＧＩで腫瘍成長を用量依存的に阻害した。等モル量で、３０ｍｇ／ｋｇでのＡＭ４Ｂ６－ｈＩｇＧ１－ＴＧＦβＲＩＩ’の抗腫瘍活性は、２４．９ｍｇ／ｋｇでＡＭ４Ｂ６よりも顕著であり、その群において、ＴＧＩは２９日目で２９．６７％であった。

【0521】

実施例１０
ＭＣ３８－ｈＰＤ－Ｌ１腫瘍モデルにおける腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）に対するＡＭ４Ｂ６－ｈＩｇＧ１－ＴＧＦβＲＩＩ’処置の影響
[00568]ＭＣ３８－ｈＰＤ－Ｌ１腫瘍細胞を培養し、実施例９の同じプロセスに従って接種した。腫瘍サイズが２５０～３００ｍｍ^３になった時、腫瘍担持マウスを選択し、４つの群（ｎ＝６）に無作為化した。動物を、ＰＢＳ、または３ｍｇ／ｋｇのアイソタイプ対照－ＴＧＦβＲＩＩ’、または２．５ｍｇ／ｋｇのＡＭ４Ｂ６、または３ｍｇ／ｋｇのＡＭ４Ｂ６－ｈＩｇＧ１－ＴＧＦβＲＩＩ’で処置した。全ての抗体を、ｉ．ｖ．注射によって１または２週間にわたって週２回投与した。腫瘍を、それぞれ、２回目の投薬の２４時間後および４回目の投薬の２４時間後に採取した後、穏やかなＭＡＣＳ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｏｒ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、１３０－０９３－２３５）を用いて解離し、３７℃で４０ｍｉｎ、マウス腫瘍解離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、１３０－０９６－７３０）で消化した。各群の単離された単一腫瘍細胞懸濁液を、表１８および表１９に示されるように、ＰＥ抗マウスＣＤ４５（ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号５５３０８１）、ＡＰＣ抗マウスＣＤ８ａ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号１００７１２）、ＡＰＣ抗マウスＮＫ１．１（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号１０８７１０）、ＦＩＴＣ抗マウスグランザイムＢ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号５１５４０３）およびＦＩＴＣ抗マウスＩＦＮガンマ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１１－７３１１－８２）によって染色した後、ＦＡＣＳを使用してＴＩＬサブ集団のパーセンテージについて分析した。

【0522】

[00569]

【0523】

【表20】

【0524】

[00570]

【0525】

【表21】

【0526】

[00571]２回目の投薬の後、異なる処置群間でＴＩＬのサブ集団のパーセンテージに有意な変化はなかった（表１８）。しかし、４回目の投薬の後、ＡＭ４Ｂ６群およびＡＭ４Ｂ６－ｈＩｇＧ１－ＴＧＦβＲＩＩ’群のＣＤ８＋／ＣＤ４５＋％は、アイソタイプ対照－ＴＧＦβＲＩＩ’群のものと比較して有意に増加した（表１９）。ＣＤ８＋ＧＺＭＢ＋％およびＮＫ１．１＋％もまた、アイソタイプ対照－ＴＧＦβＲＩＩ’群のものと比較して、多く増加した。これらの知見は、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ１．１ Ｔ細胞を、ＡＭ４Ｂ６またはＡＭ４Ｂ６－ｈＩｇＧ１－ＴＧＦβＲＩＩ’によって刺激して、活性化および増殖させ、また、腫瘍微小環境中で富化させて、腫瘍細胞死滅を容易にすることができることを示している。ＡＭ４Ｂ６と比較した場合、ＡＭ４Ｂ６－ｈＩｇＧ１－ＴＧＦβＲＩＩ’は、さらにより高いＣＤ８＋ＧＺＭＢ＋％およびＮＫ１．１＋％を有し、これは上記のＴＧＩによって測定した場合、そのより強力な抗腫瘍活性と相関していた。

【0527】

実施例１１
ｉｎ ｖｉｖｏでのＡＭ４Ｂ６－ｈＩｇＧ１－ＴＧＦβＲＩＩ’の薬物動態および薬力学試験
[00572]Ｃ５７ＢＬ／６メスマウスを、６群（ｎ＝３）に無作為化した。動物を、３ｍｇ／ｋｇのアイソタイプ対照－ＴＧＦβＲＩＩ’、または２．５ｍｇ／ｋｇのＡＭ４Ｂ６、または０．３ｍｇ／ｋｇのＡＭ４Ｂ６－ｈＩｇＧ１－ＴＧＦβＲＩＩ’、または１ｍｇ／ｋｇのＡＭ４Ｂ６－ｈＩｇＧ１－ＴＧＦβＲＩＩ’、または３ｍｇ／ｋｇのＡＭ４Ｂ６－ｈＩｇＧ１－ＴＧＦβＲＩＩ’、または３ｍｇ／ｋｇのＭ７８２４－アナログで処置した。Ｍ７８２４－アナログを、ＵＳ９６７６８６３に開示された配列に従ってＭａｂＳｐａｃｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓによって生成した。全ての抗体を、ｉ．ｖ．単回注射によって投与した。注射後、それぞれのマウスの血液２００μｌを、異なる時点で収集した：投薬前、注射後３０ｍｉｎ、２ｈ、８ｈ、２４ｈ、４８ｈ、Ｄ４、Ｄ７、Ｄ１０、Ｄ１４、Ｄ２１。それぞれのマウスの血漿８０μｌを収集し、抗体濃度を試験した。

【0528】

[00573]血漿中の抗体濃度を測定するために、２つの方法を使用した。第１のものは、ＡＭ４Ｂ６アームとＴＧＦβＲＩＩ’アームとの両方を含む全二機能性分子を検出することである。一般的には、１μｇ／ｍｌのヒトＰＤ－Ｌ１－ｈｉｓを、室温で２時間、９６ウェルＥＬＩＳＡプレート上にコーティングした。ブロッキング後、連続希釈した標準および血漿試料を添加し、１．５時間インキュベートした。洗浄後、０．１μｇ／ｍｌのビオチン化抗ヒトＴＧＦβＲＩＩ’を添加し、次いで、洗浄後、ストレプトアビジン－ＨＲＰを添加した。最後に、ＴＭＢを添加して発色させ、希硫酸によって停止させた。プレートを、マイクロプレートリーダーによってＯＤ４５０ｎｍおよびＯＤ６２０ｎｍについて読み取った。データをＯＤ４５０ｎｍ－ＯＤ６２０ｎｍによって分析した。

【0529】

[00574]第２のものは、ＡＭ４Ｂ６抗体アームのみを検出することである。上記手順と同様、１μｇ／ｍｌのヒトＰＤ－Ｌ１－ｈｉｓをコーティングし、連続希釈した標準および血漿試料を添加し、１．５時間インキュベートした。洗浄後、希釈したヤギＨＲＰコンジュゲート化抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ抗体を添加した。最後に、ＴＭＢを添加して発色させ、希硫酸によって停止させた。プレートを、マイクロプレートリーダーによってＯＤ４５０ｎｍおよびＯＤ６２０ｎｍについて読み取った。データをＯＤ４５０ｎｍ－ＯＤ６２０ｎｍによって分析した。

【0530】

[00575]血漿中の抗体濃度と、ＴＧＦβの変化との相関を評価するために、血漿中のＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２の濃度変化を試験した。簡単に述べると、４μｇ／ｍｌのマウスＴＧＦ－β１捕捉抗体または２μｇ／ｍｌのマウスＴＧＦ－β２捕捉抗体を、室温で２時間、９６ウェルＥＬＩＳＡプレート上にコーティングした。１０μｌの１Ｎ ＨＣｌを、５０μｌのそれぞれの血漿試料に添加し、室温で１０分間インキュベートした。１０μｌの１．２Ｎ ＮａＯＨ／０．５Ｍ ＨＥＰＥＳを添加して、最終ｐＨを７．２～７．６以内に確保することによって、酸化した試料を中和した。ブロッキング後、連続希釈した標準および血漿試料を添加し、１．５時間インキュベートした。洗浄後、ＴＧＦ－β１またはＴＧＦ－β２検出抗体を添加し、次いで、洗浄後、ストレプトアビジン－ＨＲＰを添加した。最後に、ＴＭＢを添加して発色させ、希硫酸によって停止させた。プレートを、マイクロプレートリーダーによってＯＤ４５０ｎｍおよびＯＤ６２０ｎｍについて読み取った。データをＯＤ４５０ｎｍ－ＯＤ６２０ｎｍによって分析した。

【0531】

[00576]図２０Ａは、血漿中の抗体濃度変化を示した。２つの方法を使用したＰＫプロファイルには有意な差異はなかったが、これは、全二機能性分子ＡＭ４Ｂ６－ｈＩｇＧ１－ＴＧＦβＲＩＩ’が、ＡＭ４Ｂ６ ｍＡｂのものと同様、ｉｎ ｖｉｖｏで異常な切断およびクリアランスを示すことなく非常に安定であったことを示している。そして同時に、ＡＭ４Ｂ６－ｈＩｇＧ１－ＴＧＦβＲＩＩ’は、図２０Ｂに示されるように、０．３ｍｇ／ｋｇの最も低い用量でも、ｉ．ｖ．注射後３０ｍｉｎ以内にＴＧＦ－β１を枯渇させた。Ｍ７８２４－アナログおよびアイソタイプ対照－ＴＧＦβＲＩＩ’もまたＴＧＦ－β１を枯渇させたが、Ｍ７８２４－アナログは２日目からその効果を維持することができなかった一方、ＡＭ４Ｂ６－ｈＩｇＧ１－ＴＧＦβＲＩＩ’は２１日目まで低レベルのＴＧＦ－β１を維持することができた。この結果は、そのＰＫ曝露（図２０Ｃ）とも一致していたが、これは、ＴＧＦ－β１が血漿中のＡＭ４Ｂ６－ｈＩｇＧ１－ＴＧＦβＲＩＩ’標的係合のための良好な薬力学的マーカーとして役立ち得ることを示している。マウス血漿中でＴＧＦ－β２の明らかな枯渇が検出された（ここではデータは示さない）。

【0532】

実施例１２
ＡＭ４Ｂ６－ｈＩｇＧ１－ＩＬ－１ＲＡ融合タンパク質の構築および発現
[00577]選択された重鎖および軽鎖バリアントを交差混合し、ｈＩｇＧ１－ＩＬ－１ＲＡ（３４－１７７）（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ、Ｐ１８５１０）融合タンパク質と共に発現させた。重鎖および軽鎖の配列を、表２０に示した。

【0533】

[00578]

【0534】

【表22】

【0535】

[00579]ＡＭ４Ｂ６－ｈＩｇＧ１－ＴＧＦβＲＩＩ’二機能性分子と同様、短縮型ヒトＩＬ－１ＲＡ＿３４－１７７をＡＭ４Ｂ６と融合させて、より良好な活性および安定性を得た。ＡＭ４Ｂ６－ｈＩｇＧ１－ＩＬ－１ＲＡは、ＡＭ４Ｂ６－ｈＩｇＧ１－ＩＬ－１ＲＡ（３４－１７７）の省略形であった。短縮型ヒトＩＬ－１ＲＡ＿３４－１７７の配列は、以下の通りである：（配列番号６７）
ＫＭＱＡＦＲＩＷＤＶＮＱＫＴＦＹＬＲＮＮＱＬＶＡＧＹＬＱＧＰＮＶＮＬＥＥＫＩＤＶＶＰＩＥＰＨＡＬＦＬＧＩＨＧＧＫＭＣＬＳＣＶＫＳＧＤＥＴＲＬＱＬＥＡＶＮＩＴＤＬＳＥＮＲＫＱＤＫＲＦＡＦＩＲＳＤＳＧＰＴＴＳＦＥＳＡＡＣＰＧＷＦＬＣＴＡＭＥＡＤＱＰＶＳＬＴＮＭＰＤＥＧＶＭＶＴＫＦＹＦＱＥＤＥ
[00580]重鎖および軽鎖の同時トランスフェクションを、製造業者のプロトコールに従ってＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎからのＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＣＨＯ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ、Ａ２９１２９）を使用して実行した。上清を１０日目に採取し、親和性クロマトグラフィーによって精製した。

【0536】

実施例１３
ＡＭ４Ｂ６－ｈＩｇＧ１－ＩＬ－１ＲＡ二機能性分子のｈＰＤ－Ｌ１に対する親和性
[00581]ＥＬＩＳＡアッセイに基づくヒトＰＤ－Ｌ１への結合
[00582]１μｇ／ｍｌのｈＰＤ－Ｌ１（Ａｃｒｏ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＰＤ１－Ｈ５２２９）抗原をＥＬＩＳＡプレートにコーティングし、４℃で一晩コーティングした。次いで、３００μＬの２％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを、室温で１ｈ、ブロッキングのために添加した。１ｈのインキュベーション後、１０ｎＭ～０．０００１７ｎＭ（３倍連続希釈）の範囲の濃度のＡＭ４Ｂ６－ｈＩｇＧ１－ＩＬ－１ＲＡ二機能性分子またはＡＭ４Ｂ６－ｈＩｇＧ１モノクローナル抗体の１００μｌを、陰性対照としてのＰＢＳＴと共に添加し、室温で１ｈインキュベートした。０．５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－２０を含むＰＢＳを、３回の洗浄のために使用し、１００μｌのＨＲＰコンジュゲート化抗ヒトＦｃ抗体（１：２００００、Ａｂｃａｍ、ａｂ９８６２４）を添加した。室温で１ｈインキュベートした後、混合ＴＭＢ基質試薬（ＩｎｎｏＲｅａｇｅｎｔｓ、ＴＭＢ－Ｓ－００３）を添加し、室温で５ｍｉｎインキュベートした後、０．１Ｍ Ｈ_２ＳＯ_４を添加することによって停止させた。ＯＤ４５０ｎｍを、マイクロプレートリーダーによって記録した。データをＧｒａｐｈＰａｄ ｐｒｉｓｍによって分析した。

【0537】

[00583]図２１に示されるように、ＡＭ４Ｂ６モノクローナル抗体と比較して、ＡＭ４Ｂ６－ｈＩｇＧ１－ＩＬ－１ＲＡ二機能性分子は、類似する結合シグナルおよび親和性を有する。

【0538】

[00584]ＦＡＣＳアッセイによるＡＭ４Ｂ６－ｈＩｇＧ１－ＩＬ－１ＲＡの細胞表面上に発現するＰＤ－Ｌ１への結合
[00585]２９３Ｔ－ＰＤ－Ｌ１－ＣＤ３Ｌ細胞を、ＰＤ－Ｌ１抗体の特性評価のためにＭａｂＳｐａｃｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓによって生成した。細胞に、ヒトＰＤ－Ｌ１と抗ＣＤ３ ｓｃＦｖとの両方をトランスフェクトした。ＡＭ４Ｂ６－ｈＩｇＧ１－ＩＬ－１ＲＡ二機能性分子またはＡＭ４Ｂ６モノクローナル抗体を、３倍希釈によって連続希釈して、希釈緩衝液（２％ＢＳＡを含むＰＢＳ）中に１１種の濃度を得た。２９３Ｔ－ＰＤ－Ｌ１－ＣＤ３Ｌ細胞を採取し、遠心分離した。次いで、それらを、２ｘ１０^６細胞／ｍｌの密度でＰＢＳ中に再懸濁し、ウェルあたり１００μｌでプレートに添加した。遠心分離および上清の除去後、希釈した抗体をプレートに添加し、４℃で３０ｍｉｎインキュベートした。希釈緩衝液で２回洗浄した後、ＰＥコンジュゲート化ロバ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｊａｃｋｓｏｎｉｍｍｕｎｏ、７０９－１１６－１４９）をプレートに添加し、４℃で３０ｍｉｎインキュベートした。洗浄後、細胞を２００μｌのＰＢＳ中に再懸濁し、フローサイトメトリーによって分析した。データをＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍによって分析した。

【0539】

[00586]図２２に示されるように、ＡＭ４Ｂ６－ｈＩｇＧ１－ＩＬ－１ＲＡ二機能性分子およびＡＭ４Ｂ６－ｈＩｇＧ１は、類似するＥＣ５０で細胞の表面上に発現されたＰＤ－Ｌ１に結合することができ、これはＥＬＩＳＡによって測定された親和性の結果と一致していた。

【0540】

実施例１４
ＡＭ４Ｂ６－ｈＩｇＧ１－ＩＬ－１ＲＡのＰＤ１／ＰＤ－Ｌ１遮断活性
[00587]このアッセイでは、２９３Ｔ－ＰＤ－Ｌ１－ＣＤ３Ｌ細胞はＰＤ－Ｌ１および抗ＣＤ３ ｓｃＦｖを発現し、Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴ－Ｌｕｃ－ＰＤ１細胞はＰＤ－１を発現し、ＣＤ３刺激によって活性化することができるＮＦＡＴシグナルを担持していた。ＮＦＡＴ活性化は、ルシフェラーゼ遺伝子の転写および発現をもたらし、その基質によって検出することができる。２つの細胞を両方とも、ＭａｂＳｐａｃｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓによって生成した。

【0541】

[00588]簡単に述べると、２９３Ｔ－ＰＤ－Ｌ１－ＣＤ３Ｌ細胞を採取し、２ｘ１０^６細胞／ｍｌの密度で再懸濁した。ウェルあたり２０μｌの細胞を、ハーフウェルプレートに添加した。ＡＭ４Ｂ６－ｈＩｇＧ１－ＩＬ－１ＲＡ二機能性分子およびＡＭ４Ｂ６－ｈＩｇＧ１を連続希釈（３倍希釈）して、２％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ培地中で８種の濃度を得た。ウェルあたり２０μｌの抗体をハーフウェルプレートに添加し、プレートを３７℃、５％ＣＯ_２で３０ｍｉｎインキュベートした。Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴ－Ｌｕｃ－ＰＤ１細胞を採取し、２％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ培地中に４ｘ１０^６細胞／ｍｌの密度で再懸濁した。最後に、ウェルあたり２０μｌの細胞をハーフウェルプレートに添加し、３７℃、５％ＣＯ_２で５ｈインキュベートした。６０μｌのＯｎｅＧｌｏ検出試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｅ６１２０）を各ウェルに添加し、室温で５分間インキュベートした。発光シグナルをマイクロプレートリーダーによって読み取った。データをＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍによって分析した。

【0542】

[00589]図２３に示されるように、ＡＭ４Ｂ６－ｈＩｇＧ１－ＩＬ－１ＲＡ二機能性分子およびＡＭ４Ｂ６－ｈＩｇＧ１は、この細胞ベースのアッセイにおいてＰＤ－Ｌ１に対する類似する遮断活性を有していた。

【0543】

実施例１５
ヒトＩＬ－１βに対するＡＭ４Ｂ６－ｈＩｇＧ１－ＩＬ－１ＲＡの遮断活性
[00590]ＥＬＩＳＡに基づくｈＩＬ－１βに対するＡＭ４Ｂ６－ｈＩｇＧ１－ＩＬ－１ＲＡ ＢｓＡｂの遮断活性
[00591]リガンド／受容体遮断活性を試験するために、５μｇ／ｍｌのヒトＩＬ－１βタンパク質（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、カタログ番号１０１３９）をＥＬＩＳＡプレートにコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。３００μＬのブロッキング緩衝液を、室温で１ｈ、ブロッキングのために添加した。１ｈ後、２００ｎＭ～０．０３ｎＭ（３倍連続希釈）の範囲の連続濃度のＡＭ４Ｂ６－ｈＩｇＧ１－ＩＬ－１ＲＡ ＢｓＡｂまたはＩＬ－１ＲＡタンパク質（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、カタログ番号１０１２３－ＨＮＡＥ）の５０μｌを、５０μｌの１０ｎＭヒトＩＬ－１ＲＩ－ｈｉｓ（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、カタログ番号１０１２６－Ｈ０８Ｈ）と共にウェルに添加し、室温で１ｈインキュベートした。０．５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－２０を含むＰＢＳを３回の洗浄のために使用し、１００μｌのＨＲＰコンジュゲート化ｈｉｓタグ抗体（１：２００００希釈、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ、カタログ番号Ａ００６１２）を添加し、室温で１ｈインキュベートした。次いで、混合ＴＭＢ基質試薬（ＩｎｎｏＲｅａｇｅｎｔｓ、カタログ番号ＴＭＢ－Ｓ－００３）を添加し、室温で５ｍｉｎインキュベートした後、０．１Ｍ Ｈ_２ＳＯ_４を添加することによって停止させた。ＯＤ４５０ｎｍを、マイクロプレートリーダーによって記録した。データをＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍによって分析した。

【0544】

[00592]図２４に示されるように、ＡＭ４Ｂ６－ｈＩｇＧ１－ＩＬ－１ＲＡは、用量依存的にＩＬ－１βを遮断することができ、ＩＬ－１ＲＩに対するＡＭ４Ｂ６－ｈＩｇＧ１－ＩＬ－１ＲＡの遮断活性は、ＩＬ－１ＲＡタンパク質のものよりも良好であった。

【0545】

[00593]レポーター細胞上でのｈＩＬ－１βに対するＡＭ４Ｂ６－ｈＩｇＧ１－ＩＬ－１ＲＡ二機能性分子の遮断活性
[00594]このアッセイでは、ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）ＣＤ４０Ｌ細胞を、Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ（カタログ番号ｈｋｂ－ｃｄ４０）から購入した。これらの細胞は、ヒトＣＤ４０遺伝子およびＮＦ－κＢ誘導性ＳＥＡＰ構築物のＨＥＫ２９３細胞への安定なトランスフェクションによって生成された。ＣＤ４０Ｌの、その受容体ＣＤ４０への結合は、ＮＦ－κＢの活性化およびＳＥＡＰのその後の産生をもたらすカスケードを誘発し、ＱＵＡＮＴＩ－Ｂｌｕｅによってモニタリングすることができる。ＨＥＫ２９３細胞は、ＣＤ４０Ｌと共通のシグナル伝達経路を共有するサイトカインＩＬ－１βのための受容体を内因性に発現する。したがって、ＩＬ－１ｂ媒介性ＳＥＡＰ産生を、中和抗体を使用して遮断することができる。

【0546】

[00595]簡単に述べると、対数期細胞でＨＥＫ２９３－ＣＤ４０Ｌ細胞を収集し、５ｘ１０^４／ウェル（１００μｌ／ウェル）の密度で細胞を９６ウェルプレート中に播種して、一晩接着させる。ＡＭ４Ｂ６－ｈＩｇＧ１－ＩＬ－１ＲＡ二特異性抗体およびＩＬ－１ＲＡタンパク質を連続希釈（５倍希釈）して、完全培養培地中で１０種の濃度を得た。５０μｌ／ウェルの希釈した抗体（またはＩＬ－１ＲＡタンパク質）および５０μｌ／ウェルのヒトＩＬ－１βを細胞に添加し、３７℃で２４ｈインキュベートする。次の日、１６０μｌのＱＵＡＮＴＩ－Ｂｌｕｅ（商標）溶液（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ、カタログ番号ｒｅｐ－ｑｂｓ）を新しいプレートに添加し、４０μｌの細胞培養上清をプレートに添加した。プレートを３７℃で２ｈインキュベートする。６２０ｎｍで分光光度計を使用してＳＥＡＰレベルを決定する。データをＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍによって分析した。

【0547】

[00596]図２５に示されるように、ＡＭ４Ｂ６－ｈＩｇＧ１－ＩＬ－１ＲＡは、用量依存的様式でＩＬ－１βを遮断することができ、ＩＬ－１βに対するＡＭ４Ｂ６－ｈＩｇＧ１－ＩＬ－１ＲＡの遮断活性は、ＩＬ－１ＲＡタンパク質よりも強力であったが、これはＥＬＩＳＡによって測定された遮断の結果と一致していた。

【0548】

実施例１６
ＡＭ４Ｂ６－ＳＩＲＰα二機能性抗体の構築、発現、精製
[00597]ＳＩＲＰα＿ＣＶ１は、操作された高親和性ＳＩＲＰαバリアントであり、がん細胞上のＣＤ４７と強力に拮抗したが、それ自身ではマクロファージファゴサイトーシスを誘導しなかった（Ｋｉｐｐ Ｗｅｉｓｋｏｐｆら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３４１、８８（２０１３））。本発明者らは、対称性抗体（ＡＭ４Ｂ６－ｈＩｇＧ１－ＳＩＲＰαおよび３２８０Ａ－ｈＩｇＧ１－ＳＩＲＰα）および非対称性抗体（ＡＭ４Ｂ６－ｈＩｇＧ１－ＳＩＲＰα（ＫＩＨ）および３２８０Ａ－ｈＩｇＧ１－ＳＩＲＰα（ＫＩＨ））（ここで、ＫＩＨはノブイントゥーホールの省略形である）を含む、ＰＤ－Ｌ１とＣＤ４７との両方を標的とする二機能性抗体を発明した。これらの分子の構築は、表２１に記載されており、配列決定されたＳＩＲＰα＿ＣＶ１は以下にも列挙される。

【0549】

[00598]ＳＩＲＰα＿ＣＶ１配列（配列番号８４）：
[00599]ＥＥＥＬＱＩＩＱＰＤＫＳＶＬＶＡＡＧＥＴＡＴＬＲＣＴＩＴＳＬＦＰＶＧＰＩＱＷＦＲＧＡＧＰＧＲＶＬＩＹＮＱＲＱＧＰＦＰＲＶＴＴＶＳＤＴＴＫＲＮＮＭＤＦＳＩＲＩＧＮＩＴＰＡＤＡＧＴＹＹＣＩＫＦＲＫＧＳＰＤＤＶＥＦＫＳＧＡＧＴＥＬＳＶＲＡＫＰＳ
[00600]

【0550】

【表23】

【0551】

[00601]４つ全部の二機能性抗体を、製造業者のプロトコールに従ってＥｘｐｉ－ＣＨＯ細胞を用いて発現させた。２つの対称性二機能性抗体について、１ステップのＭａｂｓｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ精製を用いて高純度の抗体が得られたが、非対称性二機能性抗体については、従来の１ステップのＭａｂｓｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ精製によって高純度抗体を得ることができない。高純度非対称性抗体を得るために、本発明者らが、ＨｉＴｒａｐ ＰｒｉｓｍＡ樹脂を使用して、抗体を研磨精製したところ、非対称性抗体の純度は９５％よりも良好であった。研磨精製手順は、以下のように記載される。

【0552】

[00602]使用した緩衝液：
[00603]平衡化緩衝液：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＡｃ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４。

【0553】

[00604]洗浄緩衝液：５０ｍＭ ＮａＡｃ／ＨＡｃ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、５％ＰＥＧ、ｐＨ５．５。

【0554】

[00605]溶出緩衝液：５０ｍＭ ＨＡｃ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、５％ＰＥＧ、ｐＨ３．０。

【0555】

[00606]ＵＶベースライン、溶離液のｐＨ、および伝導度が変化しなくなるまで、少なくとも５倍カラム体積（ＣＶ）にわたって平衡化緩衝液でＨｉＴｒａｐ ＰｒｉｓｍＡカラムを平衡化させる。

【0556】

[00607]予め平衡化させたＨｉＴｒａｐ ＰｒｉｓｍＡカラム上に試料をロードする。

【0557】

[00608]ＵＶトレースがベースラインに戻るまで、５～１０ＣＶの洗浄緩衝液を用いて洗浄する。

【0558】

[00609]１０～２０ＣＶ中、０～１００％の溶出緩衝液で溶出し、いくつかのチューブを用いて５～１０の画分を別々に収集する。１Ｍ Ｔｒｉｓ塩基（ｐＨ９．０）を用いて、ｐＨを約６．０～７．０に調整した。

【0559】

[00610]次いで、画分をＳＥＣ－ＨＰＬＣによって特徴付けた。図２６は、３２８０Ａ－ｈＩｇＧ１－ＳＩＲＰα（ＫＩＨ）およびＡＭ４Ｂ６－ｈＩｇＧ１－ＳＩＲＰα（ＫＩＨ）の純度が、それぞれ、９５．３３％および９６．５％であることを示す。

【0560】

[00611]ヒトＰＤ－Ｌ１またはヒトＣＤ４７に対する親和性を、ＥＬＩＳＡを用いて試験した。図２７および図２８は、二機能性抗体の抗原に対する親和性が、親モノクローナル抗体（４Ｂ６ ｍＡｂ対照）または融合タンパク質（ＳＩＲＰα－Ｆｃ（ＦＥＳ））のものと同等であることを示す。

【0561】

[00612]
実施例１７
ＩｇＧ－ｓｃＦｖ－ＡＣＺ８８５－ＡＭ４Ｂ６およびＩｇＧ－ｓｃＦｖ－ＸＯＭＡ０５２－ＡＭ４Ｂ６二特異性抗体（ｂｓＡｂ）の構築および発現
[00613]単鎖断片（ｓｃＦｖ）ＡＭ４Ｂ６の配列を、以下の表に示す。抗ＩＬ－１β抗体であるゲボキズマブ（ＸＯＭＡ０５２）およびカナキヌマブ（ＡＣＺ８８５）は、Ｎｏｖａｒｔｉｓからのものであった。ＡＭ４Ｂ６のｓｃＦｖを、抗ＩＬ－１β抗体重鎖Ｃ末端に接続して、より良好な活性および安定性を得た。ｓｃＦｖは、ＶＨをＶＬに接続したＧＳリンカー（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ）を有し、残基Ｈ４４ＣとＬ１００Ｃ（Ｋａｂａｔの番号付け）との間にドメイン間ジスルフィド結合を含有する。抗ＩＬ－１β抗体（ＸＯＭＡ０５２およびＡＣＺ８８５）の配列を、表２２に示す。構築された二特異性抗体を、それぞれ、ＩｇＧ－ｓｃＦｖ－ＡＣＺ８８５－ＡＭ４Ｂ６およびＩｇＧ－ｓｃＦｖ－ＸＯＭＡ０５２－ＡＭ４Ｂ６と命名した。

【0562】

[00614]ｂｓＡｂの重鎖および軽鎖の同時トランスフェクションを、製造業者のプロトコールに従ってＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎからのＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＣＨＯ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ、Ａ２９１２９）を使用して実行した。上清を１０日目に採取し、親和性クロマトグラフィーによって精製した。

【0563】

[00615]
実施例１８
ＩｇＧ－ｓｃＦｖ－ＡＣＺ８８５－ＡＭ４Ｂ６およびＩｇＧ－ｓｃＦｖ－ＸＯＭＡ０５２－ＡＭ４Ｂ６ ｂｓＡｂのｈＩＬ－１βに対する結合活性
[00616]ＥＬＩＳＡアッセイに基づくヒトＩＬ－１βタンパク質への結合
[00617]１００μＬの１μｇ／ｍｌのｈＩＬ－１βタンパク質（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、カタログ番号１０１３９－ＨＮＡＥ）をＥＬＩＳＡプレートにコーティングし、４℃で一晩コーティングした。次いで、２００μＬの２％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを、室温で２ｈ、ブロッキングのために添加した。インキュベーション後、２０ｎＭ～０．０００３３９ｎＭ（３倍連続希釈）の範囲の濃度のＩｇＧ－ｓｃＦｖ－ＡＣＺ８８５－ＡＭ４Ｂ６、ＩｇＧ－ｓｃＦｖ－ＸＯＭＡ０５２－ＡＭ４Ｂ６ ｂｓＡｂ、ＡＣＺ８８５、およびＸＯＭＡ０５２の１００μｌを、陰性対照としてのＰＢＳＴと共に添加し、室温で１ｈインキュベートした。０．５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－２０を含むＰＢＳを、３回の洗浄のために使用し、１００μｌのＨＲＰコンジュゲート化抗ヒトＦｃ抗体（１：２００００、Ａｂｃａｍ、ａｂ９８６２４）を添加した。室温で１ｈインキュベートした後、混合ＴＭＢ基質試薬（ＩｎｎｏＲｅａｇｅｎｔｓ、ＴＭＢ－Ｓ－００３）を添加し、室温で５ｍｉｎインキュベートした後、０．１Ｍ Ｈ_２ＳＯ_４を添加することによって停止させた。ＯＤ４５０ｎｍを、マイクロプレートリーダーによって記録した。データをＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍによって分析した。

【0564】

[00618]図２９に示されるように、ＡＣＺ８８５およびＸＯＭＡ０５２モノクローナル抗体と比較して、ＩｇＧ－ｓｃＦｖ－ＡＣＺ８８５－ＡＭ４Ｂ６およびＩｇＧ－ｓｃＦｖ－ＸＯＭＡ０５２－ＡＭ４Ｂ６ ｂｓＡｂは、それぞれ、ｈＩＬ－１βタンパク質に対する類似する結合活性を有する。

【0565】

[00619]
実施例１９
ＩｇＧ－ｓｃＦｖ－ＡＣＺ８８５－ＡＭ４Ｂ６およびＩｇＧ－ｓｃＦｖ－ＸＯＭＡ０５２－ＡＭ４Ｂ６ ｂｓＡｂのｈＰＤ－Ｌ１に対する結合活性
[00620]ＥＬＩＳＡアッセイに基づくヒトＰＤ－Ｌ１への結合
[00621]１μｇ／ｍｌのｈＰＤ－Ｌ１（Ａｃｒｏ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＰＤ１－Ｈ５２２９）抗原１００μＬをＥＬＩＳＡプレートにコーティングし、４℃で一晩コーティングした。次いで、３００μＬの２％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを、室温で１ｈ、ブロッキングのために添加した。１ｈのインキュベーション後、２０ｎＭ～０．０００３３９ｎＭ（３倍連続希釈）の範囲の濃度のＩｇＧ－ｓｃＦｖ－ＡＣＺ８８５－ＡＭ４Ｂ６、ＩｇＧ－ｓｃＦｖ－ＸＯＭＡ０５２－ＡＭ４Ｂ６ ｂｓＡｂまたはＡＭ４Ｂ６－ｈＩｇＧ１モノクローナル抗体（ＡＭ４Ｂ６ ｍＡｂ）の１００μｌを、陰性対照としてのＰＢＳＴと共に添加し、室温で１ｈインキュベートした。０．５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－２０を含むＰＢＳを、３回の洗浄のために使用し、１００μｌのＨＲＰコンジュゲート化抗ヒトＦｃ抗体（１：２００００、Ａｂｃａｍ、ａｂ９８６２４）を添加した。室温で１ｈインキュベートした後、混合ＴＭＢ基質試薬（ＩｎｎｏＲｅａｇｅｎｔｓ、ＴＭＢ－Ｓ－００３）を添加し、室温で５ｍｉｎインキュベートした後、０．１Ｍ Ｈ_２ＳＯ_４を添加することによって停止させた。ＯＤ４５０ｎｍを、マイクロプレートリーダーによって記録した。データをＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍによって分析した。

【0566】

[00622]図３０に示されるように、ＡＭ４Ｂ６モノクローナル抗体と比較して、ＩｇＧ－ｓｃＦｖ－ＡＣＺ８８５－ＡＭ４Ｂ６、ＩｇＧ－ｓｃＦｖ－ＸＯＭＡ０５２－ＡＭ４Ｂ６ ｂｓＡｂは、ｈＰＤ－Ｌ１タンパク質に対する類似する結合活性を有する。

【0567】

[00623]ＦＡＣＳ法による、ＰＤ－Ｌ１を発現する２９３Ｔ細胞へのＩｇＧ－ｓｃＦｖ－ＡＣＺ８８５－ＡＭ４Ｂ６およびＩｇＧ－ｓｃＦｖ－ＸＯＭＡ０５２－ＡＭ４Ｂ６の結合
[00624]２９３Ｔ－ＰＤ－Ｌ１－ＣＤ３Ｌ細胞を、ＰＤ－Ｌ１抗体の特性評価のためにＭａｂＳｐａｃｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓによって生成した。細胞に、ヒトＰＤ－Ｌ１と抗ＣＤ３ ｓｃＦｖとの両方をトランスフェクトした。ＩｇＧ－ｓｃＦｖ－ＡＣＺ８８５－ＡＭ４Ｂ６、ＩｇＧ－ｓｃＦｖ－ＸＯＭＡ０５２－ＡＭ４Ｂ６またはＡＭ４Ｂ６ ｍＡｂを、４倍希釈によって連続希釈して、希釈緩衝液（２％ＢＳＡを含むＰＢＳ）中で９種の濃度を得た。２９３Ｔ－ＰＤ－Ｌ１－ＣＤ３Ｌ細胞を採取し、遠心分離した。次いで、それらを、２ｘ１０^６細胞／ｍｌの密度でＰＢＳ中に再懸濁し、ウェルあたり１００μｌでプレートに添加した。遠心分離および上清の除去後、希釈した抗体をプレートに添加し、４℃で３０ｍｉｎインキュベートした。希釈緩衝液で２回洗浄した後、ＰＥコンジュゲート化ロバ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｊａｃｋｓｏｎｉｍｍｕｎｏ、７０９－１１６－１４９）をプレートに添加し、４℃で３０ｍｉｎインキュベートした。洗浄後、細胞を２００μｌのＰＢＳ中に再懸濁し、フローサイトメトリーによって分析した。データをＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍによって分析した。

【0568】

[00625]図３１に示されるように、ＩｇＧ－ｓｃＦｖ－ＡＣＺ８８５－ＡＭ４Ｂ６およびＩｇＧ－ｓｃＦｖ－ＸＯＭＡ０５２－ＡＭ４Ｂ６は、類似するＥＣ_５０で細胞の表面上に発現されたＰＤ－Ｌ１に結合することができ、これはＥＬＩＳＡによって測定された親和性の結果と一致していた。

【0569】

実施例２０
ＩｇＧ－ｓｃＦｖ－ＡＣＺ８８５－ＡＭ４Ｂ６およびＩｇＧ－ｓｃＦｖ－ＸＯＭＡ０５２－ＡＭ４Ｂ６のＰＤ１／ＰＤ－Ｌ１遮断活性
[00626]このアッセイでは、２９３Ｔ－ＰＤ－Ｌ１－ＣＤ３Ｌ細胞はＰＤ－Ｌ１および抗ＣＤ３ ｓｃＦｖを発現し、Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴ－Ｌｕｃ－ＰＤ１細胞はＰＤ－１を発現し、ＣＤ３刺激によって活性化することができるＮＦＡＴシグナルを担持していた。ＮＦＡＴ活性化は、ルシフェラーゼ遺伝子の転写および発現をもたらし、その基質によって検出することができる。２つの細胞系を、ＭａｂＳｐａｃｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓによって生成した。

【0570】

[00627]簡単に述べると、２９３Ｔ－ＰＤ－Ｌ１－ＣＤ３Ｌ細胞を採取し、２ｘ１０^６細胞／ｍｌの密度で再懸濁した。ウェルあたり２０μｌの細胞を、ハーフウェルプレートに添加した。ＩｇＧ－ｓｃＦｖ－ＡＣＺ８８５－ＡＭ４Ｂ６、ＩｇＧ－ｓｃＦｖ－ＸＯＭＡ０５２－ＡＭ４Ｂ６およびＡＭ４Ｂ６－ｈＩｇＧ１を連続希釈（３倍希釈）して、２％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ培地中で９種の濃度を得た。ウェルあたり２０μｌの抗体をハーフウェルプレートに添加し、プレートを３７℃、５％ＣＯ_２で３０ｍｉｎインキュベートした。Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴ－Ｌｕｃ－ＰＤ１細胞を採取し、２％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ培地中に４ｘ１０^６細胞／ｍｌの密度で再懸濁した。最後に、ウェルあたり２０μｌの細胞をハーフウェルプレートに添加し、３７℃、５％ＣＯ_２で５ｈインキュベートした。６０μｌのＯｎｅＧｌｏ検出試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｅ６１２０）を各ウェルに添加し、室温で５分間インキュベートした。発光シグナルをマイクロプレートリーダーによって読み取った。データをＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍによって分析した。

【0571】

[00628]図３２に示されるように、ＩｇＧ－ｓｃＦｖ－ＡＣＺ８８５－ＡＭ４Ｂ６、ＩｇＧ－ｓｃＦｖ－ＸＯＭＡ０５２－ＡＭ４Ｂ６およびＡＭ４Ｂ６－ｈＩｇＧ１は、この細胞ベースのアッセイにおいてＰＤ－Ｌ１に対する類似する遮断活性を有していた。

【0572】

実施例２１
ヒト皮膚線維芽（ＨＤＦ）細胞上でのヒトＩＬ－１βに対するＩｇＧ－ｓｃＦｖ－ＸＯＭＡ０５２－ＡＭ４Ｂ６の遮断活性
[00629]ＨＤＦ細胞上でのヒトＩＬ－１βに対するＩｇＧ－ｓｃＦｖ－ＸＯＭＡ０５２－ＡＭ４Ｂ６の遮断活性。

【0573】

[00630]リガンド／受容体遮断活性を試験するために、４ｘ１０^４個／ｍＬのＨＤＦ細胞を、１００μＬ／ウェルで、５０ｐｇ／ｍＬの組換えヒトＩＬ－１β（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、カタログ番号１０１３９）で刺激したが、陰性対照として細胞をＩＬ－１βで刺激しなかった。次いで、１００ｎＭ～０．０００３８ｎＭ（４倍連続希釈）の範囲の連続濃度で１００μＬ／ウェルのＩｇＧ－ｓｃＦｖ－ＸＯＭＡ０５２－ＡＭ４Ｂ６およびＸＯＭＡ０５２を培養物に添加し、室温で一晩（１６～１７ｈ）インキュベートした。刺激後、細胞培養上清中のＩＬ－６放出を、キットの使用説明書によって指導されるＩＬ－６ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄ、ＤＹ２０６、Ｐ２０９０２６）を使用して検出した。

【0574】

[00631]図３３に示されるように、ＩｇＧ－ｓｃＦｖ－ＸＯＭＡ０５２－ＡＭ４Ｂ６およびＸＯＭＡ０５２は、ＩＬ－１βを用量依存的に遮断することができ、ＩＬ－１βに対するＩｇＧ－ｓｃＦｖ－ＸＯＭＡ０５２－ＡＭ４Ｂ６の遮断活性は、ＨＤＦ細胞上でのＸＯＭＡ０５２のものと類似していた。

【0575】

[00632]レポーター細胞上でのｈＩＬ－１βに対するＩｇＧ－ｓｃＦｖ－ＡＣＺ８８５－ＡＭ４Ｂ６の遮断活性
[00633]このアッセイでは、ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）ＣＤ４０Ｌ細胞を、Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ（カタログ番号ｈｋｂ－ｃｄ４０）から購入した。これらの細胞は、ヒトＣＤ４０遺伝子およびＮＦ－κＢ誘導性ＳＥＡＰ構築物のＨＥＫ２９３細胞への安定なトランスフェクションによって生成された。ＣＤ４０Ｌの、その受容体ＣＤ４０への結合は、ＮＦ－κＢの活性化およびＳＥＡＰのその後の産生をもたらすカスケードを誘発し、ＱＵＡＮＴＩ－Ｂｌｕｅによってモニタリングすることができる。ＨＥＫ２９３細胞は、ＣＤ４０Ｌと共通のシグナル伝達経路を共有するサイトカインＩＬ－１βのための受容体を内因性に発現する。したがって、ＩＬ－１β媒介性ＳＥＡＰ産生を、中和抗体を使用して遮断することができる。

【0576】

[00634]簡単に述べると、対数期細胞でＨＥＫ２９３－ＣＤ４０Ｌ細胞を収集し、５ｘ１０^４／ウェル（１００μｌ／ウェル）の密度で細胞を９６ウェルプレート中に播種して、一晩接着させる。ＩｇＧ－ｓｃＦｖ－ＡＣＺ８８５－ＡＭ４Ｂ６およびＡＣＺ８８５を、１００ｎＭから連続希釈（４倍希釈）して、完全培養培地中で９種の濃度を得た。５０μｌ／ウェルの希釈した抗体および５０μｌ／ウェルのヒトＩＬ－１β（１ｎｇ／ｍＬ）を細胞に添加し、３７℃で２４ｈインキュベートする。次の日、１６０μｌのＱＵＡＮＴＩ－Ｂｌｕｅ（商標）溶液（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ、カタログ番号ｒｅｐ－ｑｂｓ）を新しいプレートに添加し、４０μｌの細胞培養上清をプレートに添加した。３７℃で２ｈ、プレートをインキュベートする。６２０ｎｍで分光光度計を使用してＳＥＡＰレベルを決定する。データをＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍによって分析した。

【0577】

[00635]図３４に示されるように、ＩｇＧ－ｓｃＦｖ－ＡＣＺ８８５－ＡＭ４Ｂ６およびＡＣＺ８８５（カナキヌマブ）は、用量依存的様式でＩＬ－１βを遮断することができるが、ＩｇＧ－ｓｃＦｖ－ＡＣＺ８８５－ＡＭ４Ｂ６の遮断活性は、ＨＥＫ２９３－ＣＤ４０Ｌレポーター細胞上でＡＣＺ８８５（カナキヌマブ）と類似していた。

【0578】

[00636]

【0579】

【表24-1】

【0580】

【表24-2】

【0581】

【表24-3】

【0582】

【表24-4】

【0583】

【表24-5】

【0584】

【表24-6】

【0585】

【表24-7】

【0586】

【表24-8】

【0587】

【表24-9】

【0588】

【表24-10】

【0589】

【表24-11】

【0590】

【表24-12】

【0591】

【表24-13】

【0592】

【表24-14】

【0593】

【表24-15】

【0594】

【表24-16】

【0595】

【表24-17】

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9-1】

【図9-2】

【図10-1】

【図10-2】

【図10-3】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26】

【図27】

【図28】

【図29】

【図30】

【図31】

【図32】

【図33】

【図34】

【配列表】

2023550419000001.app

【国際調査報告】