特表 2023-550497 ヘモグロビン補正装置を用いた改良型ＥＬＩＳＡ、及びその方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-12-01

(54)【発明の名称】ヘモグロビン補正装置を用いた改良型ＥＬＩＳＡ、及びその方法

(51)【国際特許分類】

   G01N 33/543 20060101AFI20231124BHJP

   G01N 33/53 20060101ALI20231124BHJP

   G01N 35/02 20060101ALI20231124BHJP

【ＦＩ】

G01N33/543 545D

G01N33/53 D

G01N33/53 X

G01N35/02 A

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023530884

(86)(22)【出願日】2020-11-23

(85)【翻訳文提出日】2023-07-24

(86)【国際出願番号】 US2020061721

(87)【国際公開番号】W WO2022108600

(87)【国際公開日】2022-05-27

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】501464761

【氏名又は名称】ノヴァ バイオメディカル コーポレイション

【住所又は居所原語表記】２００ Ｐｒｏｓｐｅｃｔ Ｓｔｒｅｅｔ Ｗａｌｔｈａｍ ＭＡ ０２４５４（ＵＳ）

(74)【代理人】

【識別番号】110000578

【氏名又は名称】名古屋国際弁理士法人

(72)【発明者】

【氏名】メドコヴァ マルティナ

(72)【発明者】

【氏名】キング ダニエル

(72)【発明者】

【氏名】チェン ジェフ

【テーマコード（参考）】

2G058

【Ｆターム（参考）】

2G058AA09

2G058CC01

2G058CC12

(57)【要約】

１人の患者に対して全血及び血漿中の酵素結合免疫吸着アッセイを行うための、使い捨てバイオアッセイ診断カートリッジであって、カートリッジは複数のウェルを有する。カートリッジは、内部側壁を有し、複数のウェルのうちの１つのウェルに配置されたピペットチップであって、内部側壁は、抗体で前処理及びコーティングされているピペットチップと、複数のウェルのうちの別のウェルに配された試薬混合物であって、ｐＨ安定剤、イオン性触媒制御剤、イオン性細胞内抑制制御剤、洗剤、陰性対照剤、キレート剤、及び殺生物性防腐剤からなる群から選択される少なくとも１種の試薬、抗体、及び複合体安定化剤を備える試薬混合物とを備える。少なくとも発色基質及び可視化試薬が、複数のウェルの一体型キュベットに配されている。また、試料中の血漿量の補正が行えるように、血液試料中のヘモグロビン量を検出することも含まれる。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

１人の患者に対して酵素結合免疫吸着アッセイを行うための、使い捨てバイオアッセイ診断カートリッジであって、前記カートリッジは複数のウェルを有し、前記カートリッジは、
内部側壁を有し、前記複数のウェルのうちの１つのウェルに配置されたピペットチップであって、前記内部側壁は、抗体で前処理及びコーティングされている、ピペットチップと、
前記複数のウェルのうちの別のウェルに配された試薬混合物であって、前記試薬混合物は、ｐＨ安定剤、イオン性触媒制御剤、イオン性細胞内抑制制御剤、洗剤、陰性対照剤、キレート剤、及び殺生物性防腐剤からなる群から選択される少なくとも１種の試薬と、抗体と、複合体安定化剤とを備える、試薬混合物と、
前記複数のウェルの一体型キュベットに配された、少なくとも発色基質及び可視化試薬と、
を備える、使い捨てバイオアッセイ診断カートリッジ。

【請求項2】

請求項１に記載の使い捨てカートリッジであって、
前記内部側壁をコーティングしている前記抗体は、抗Ｃ反応性タンパク質抗体、抗シスタチンＣ抗体、抗ＩＧＦ－１抗体、抗アラニンアミノトランスフェラーゼ抗体、及び抗アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ抗体からなる群から選択されている、使い捨てカートリッジ。

【請求項3】

請求項１に記載の使い捨てカートリッジであって、
前記発色基質及び前記抗体は、約１：１の割合で存在している、使い捨てカートリッジ。

【請求項4】

請求項１に記載の使い捨てカートリッジであって、
前記発色基質は、３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジンである、使い捨てカートリッジ。

【請求項5】

請求項１に記載の使い捨てカートリッジであって、
前記少なくとも１種の試薬は、前記発色基質及び前記可視化試薬の量に対応する量で存在している、使い捨てカートリッジ。

【請求項6】

請求項１に記載の使い捨てカートリッジであって、
前記少なくとも１種の試薬は、０．００２％サポニンと、０．０１％低発泡界面活性剤と、０．０２％アジ化ナトリウムとを有するリシン溶液の少なくとも１５０μｌの試薬混合物からなる、使い捨てカートリッジ。

【請求項7】

請求項１に記載の使い捨てカートリッジであって、
前記第３ウェルは、ＰＢＳと、０．０５％ポリソルベート系非イオン性界面活性剤と、０．０３％殺生物性防腐剤とを有している、使い捨てカートリッジ。

【請求項8】

請求項１に記載の使い捨てカートリッジであって、さらに、
抗Ｃ反応性タンパク質抗体、抗シスタチンＣ抗体、抗ＩＧＦ－１抗体、抗アラニンアミノトランスフェラーゼ抗体、及び抗アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ抗体からなる群から選択される抗体と、複合体安定化剤と、０．５％抗発泡／消泡剤とを有する第４ウェルを備える、使い捨てカートリッジ。

【請求項9】

請求項１に記載の使い捨てカートリッジであって、
前記ピペットの前記側壁をコーティングしている前記抗体は、抗シスタチンＣ抗体であり、前記第２ウェル中の前記少なくとも１種の試薬は、０．００２％サポニンと、０．０１％低発泡界面活性剤と、０．０２％アジ化ナトリウムとを有する溶解溶液からなる、使い捨てカートリッジ。

【請求項10】

請求項１に記載の使い捨てカートリッジであって、さらに、
１０ｍＭ ＰＢＳ、０．０５％ポリソルベート系非イオン性界面活性剤、及び０．０３％殺生物性防腐剤を有する第４ウェルと、
抗Ｃ反応性タンパク質抗体、抗シスタチンＣ抗体、抗ＩＧＦ－１抗体、抗アラニンアミノトランスフェラーゼ抗体、及び抗アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ抗体からなる群から選択される抗体、複合体安定化剤、及び０．５％抗発泡／消泡剤を有する第５ウェルと
を備える、使い捨てカートリッジ。

【請求項11】

請求項２に記載の使い捨てカートリッジであって、
前記一体型キュベットは、５３０ｎｍにて第１のＬＥＤを用いて第１の光検出を読み取ること、及び６６０ｎｍにて第２のＬＥＤを用いて第２の光検出を読み取ることを容易にすることが可能な、第１の壁及び第２の壁を有している、使い捨てカートリッジ。

【請求項12】

酵素結合免疫吸着バイオアッセイ診断キットであって、
フィンガースティック装置と、
複数のウェル及び光学キュベットを有するカートリッジであって、前記カートリッジは、前記複数のウェルのうちの１つに配置されたピペットチップ及び前記複数のウェルのうちの１つまたは複数の残りのウェルに配された、バイオアッセイ成分を有し、前記複数のウェルのうちの１つは、光学キュベットである、カートリッジと
を備え、
前記ピペットチップは、抗体でコーティングされた側壁を有し、
前記バイオアッセイ成分は、ｐＨ安定剤、イオン性触媒制御剤、イオン性細胞内抑制制御剤、洗剤、陰性対照剤、キレート剤、及び殺生物性防腐剤からなる群から選択された少なくとも１種の試薬と、抗体と、複合体安定化剤と、発色基質と、可視化試薬とを備える、酵素結合免疫吸着バイオアッセイ診断キット。

【請求項13】

洗浄時間を短縮しつつ、酵素結合免疫吸着アッセイを行うのに用いるための使い捨てピペットを作製する方法であって、前記方法は、
ピペットチップを、前記ピペットチップの内面をコーティングすることによって前処理する工程であって、前記前処理する工程は、
親和剤を含有している第１のコーティングを、前記ピペットチップの前記内面に沿って配置することと、
ブロッキング溶液を含有している第２のコーティングを、前記第１のコーティングの上に前記ピペットチップの前記内面に沿って配置することと、
活性防腐剤を含有している第３のコーティングを、前記第２のコーティングの上に前記ピペットチップの前記内面に沿って配置して、酵素結合免疫吸着アッセイを行うのに用いるためのコーティングされたピペットチップを形成することであって、前記酵素結合免疫吸着アッセイは、ｐＨ安定剤、イオン性触媒制御剤、イオン性細胞内抑制制御剤、洗剤、陰性対照剤、キレート剤、及び殺生物性防腐剤からなる群から選択される少なくとも１種の試薬混合物、抗体、及び複合体安定化剤を用いた前記コーティングされたピペットチップへの直接的なピペッティングを容易にすることによって、洗浄時間を短縮する、第３のコーティングを、前記第２のコーティングの上に前記ピペットチップの前記内面に沿って配置することと、
を備える、前処理する工程と、
発色基質及び可視化試薬を前記コーティングされたピペットチップの中の前記親和剤と直接反応させるために、前記発色基質及び前記可視化試薬を含んでいる１つのウェルを前記カートリッジ内に設ける工程と
を備える、方法。

【請求項14】

請求項１３に記載の方法であって、さらに、
抗体、抗体断片、組み換えタンパク質、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＡ／Ｇ、ストレプトアビジン、組み換えタンパク質断片、核酸、多糖類、糖タンパク質、ペプチドグリカン、分子インプリントポリマー、及びアプタマー分子からなる群から前記親和剤を選択することを備える、方法。

【請求項15】

請求項１３に記載の方法であって、さらに、
炭酸塩／重炭酸塩緩衝剤、スクロース緩衝剤、リン酸緩衝生理食塩水、及びトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン生理食塩水からなる群からコーティング緩衝剤を選択することを備える、方法。

【請求項16】

請求項１３に記載の方法であって、
前記第１のコーティングを前記ピペットチップの前記内面に沿って前記親和剤を用いて配置する工程であって、前記第１のコーティング工程は、さらに、
前記親和剤を選択することと、
コーティング緩衝剤を選択することと、
選択された前記抗体及び選択された前記コーティング緩衝剤を混合することによって、抗体溶液を調製することと、
混合された前記抗体溶液を前記ピペットチップに充填することと、
前記ピペットチップを第１の温度で所定の時間インキュベーションすることと
を備える、方法。

【請求項17】

請求項１３に記載の方法であって、
前記第２のコーティングを前記第１のコーティングの上に前記ピペットチップの前記内面に沿って前記ブロッキング溶液を用いて配置する工程であって、第２のコーティング工程は、さらに、
前記ブロッキング溶液を選択することと、
前記ピペットチップに前記ブロッキング溶液を充填することと、
前記ピペットチップを第２の温度で所定の時間インキュベーションすることと
を備える、方法。

【請求項18】

請求項１３に記載の方法であって、
前記第３のコーティングを前記第２のコーティングの上に前記ピペットチップの前記内面に沿って前記活性防腐剤を用いて配置する工程であって、第３のコーティング工程は、さらに、
前記活性防腐剤を選択することと、
前記ピペットチップに前記活性防腐剤を充填することと、
前記ピペットチップを第３の温度で所定の時間インキュベーションすることと
を備える、方法。

【発明の詳細な説明】

【発明の詳細な説明】

【0001】

［発明の背景］
１．発明の分野
本発明は、概して、酵素結合免疫吸着アッセイのための方法及び装置に関する。

【0002】

２．従来技術の説明
酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）は、試料中の抗体または抗原を検出及び／または定量化するのに用いられる、生化学的な技法である。古典的な２ステップサンドイッチＥＬＩＳＡは、最初に分析物を分析物に対する捕捉抗体に結合させることと、それに続く、標識化された検出抗体を捕捉された分析物に結合させることとに基づいている。１ステップサンドイッチＥＬＩＳＡでは、捕捉抗体及び検出抗体への分析物の結合が同時に行なわれる。検出抗体は、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）またはアルカリホスファターゼ（ＡＰ）等の、酵素に結合され得る。その後、捕捉された免疫複合体に酵素基質を導入することによって、光学的にまたは他の手段によって測定可能な発色が生じる。発色の速度及び程度は、抗原の濃度に比例する。

【0003】

ＥＬＩＳＡは通常、マイクロタイタープレート形式で行なわれ、複雑な機器及び／または高度な技術を持つ担当者を必要とする。ＥＬＩＳＡは通常、９６ウェルまたは３８４ウェルのポリスチレンプレート、及び溶液中の試料を用いても行なわれる。試料が加えられたときに捕捉抗体のみを含む従来のＥＬＩＳＡキットに加えて、他のインスタントＥＬＩＳＡキットは、捕捉抗体と、凍結乾燥された検出抗体とを保持している前処理済みのプレートと、ストレプトアビジンＨＲＰと、試料希釈液とを含んでいる。

【0004】

Ａｐｐａｒａｔｕｓ ｆｏｒ Ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ Ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓａｍｐｌｅｓと題された米国特許９，０１１，７７２は、試料の自動バイオプロセスを行なうためのバイオプロセス装置、バイオプロセスカード、及びフルイディクスカートリッジを開示している。バイオプロセスカードは、複数のピペットチップと、複数のピペットチップと流体連通している少なくとも１つのポンプとを備えていてもよい。いくつかの実施形態では、ポンプとピペットチップとが、微少の流路であり得る処理流路を介して流体連通している。また、同特許では、少なくとも１つのバイオプロセスカードと、少なくとも１つのフルイディックカートリッジと、試料の自動バイオプロセスを制御するように構成された自動制御システムとを備える、自動バイオプロセス装置も提供されている。さらに同特許では、当該装置、カード、及びカートリッジの使用方法が提供されている。

【0005】

Ｓｙｓｔｅｍｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｍｕｌｔｉ－Ａｎａｌｙｓｉｓと題された米国特許第９，８１０，７０４号は、試料処理のためのシステム及び方法を開示している。具体的には、試料の受け取りと、試料の調製、試料のアッセイ、及び検出工程のうちの１つ以上を行なうこととが可能な装置が提供されてもよいことを開示している。当該装置は、複数のアッセイを行なうことが可能であってもよい。当該装置は、試料の調製、試料のアッセイ、及び検出工程のうちの１つ以上を行なうことが可能であり得る、１つ以上のモジュールを備えていてもよい。当該装置は、少量の試料を用いてこれらの工程を行なうことが可能であってもよい。

【0006】

［発明の概要］
既知の先行技術に対する発明の利点及び相違点
先行技術の上述の部分は、当該産業のすべての要求を満たすのに十分に満足できることをこれまでに証明していない。

【0007】

向上した機能をもたらす改良型ＥＬＩＳＡ自己充足式キットを提供する本発明の方法の利点の一部を、以下で説明する。通常のＥＬＩＳＡ技法を改良する利点の１つには、関連するピペットチップの機能性が向上するということが含まれる。さらなる利点は、洗浄を増やすことで相互汚染が減少または排除される、ということに関連する。本発明の方法のさらなる利点は、検査前に酵素－基質反応を止める必要がないということである。本発明の改良型ＥＬＩＳＡのさらなる利点は、１５分未満、より好ましくは約１０～１４分、及び一部の実施形態では７～９分程度で結果を提供する、より迅速なイムノアッセイである。

【0008】

本発明の目的の達成
本発明は、捕捉親和性試薬が結合される可動要素を有する、酵素結合免疫吸着アッセイシステムを提供する。一実施形態では、捕捉親和性試薬は抗体である。一実施形態では、可動要素はピペットチップである。さらなる実施形態では、システムは、複数の異なる試薬を保持することが可能な複数のウェルを有する使い捨てカートリッジを用いる。この実施形態では、可動要素をウェルに挿入可能で、可動要素がカートリッジの周辺での液体の吸引、保持、分注、及び移動を可能なように、ウェルの大きさが上記の可動要素に対応している。

【0009】

当該システムは、所定の量の試料をカートリッジ内に供給可能な、試料収集装置を用いてもよい。好適なシステムは、可動要素を使って様々な生体材料の正確な吸引、分注、移動、混合、及び様々な分析物の存在の光学的検出が可能な機器も用いてもよい。

【0010】

好適な実施形態では、ピペットチップ等の可動要素及び試薬カートリッジは、ポリスチレン（ＰＳ）、またはポリプロピレン（ＰＰ）、またはポリエチレンＰＥ）、またはポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、またはポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、またはポリカーボネート（ＰＣ）、またはＴＯＰ ＡＳ（登録商標）等の環状オレフィン共重合体、またはＺｅｏｎｏｒ（登録商標）及びＺｅｏｎｅｘ（登録商標）等のシクロオレフィン重合体、またはセルロース及びその誘導体、またはシリコン及びその誘導体、またはガラス、または石英、または金属、等の様々な材料で構成され得る。

【0011】

好適な実施形態では、ピペットチップ等の可動要素は、抗体、抗体断片、組み換えタンパク質、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＡ／Ｇ、ストレプトアビジン、またはその組み換えタンパク質または断片、核酸、多糖、糖タンパク質、ペプチドグリカン、分子インプリントポリマーまたはアプタマー分子等の、タンパク質でコーティングされ得る。抗体は、好適な親和剤である。固定化は、非特異的吸着、または共有結合性の結合によって達成され得る。

【0012】

好適な実施形態では、カートリッジウェルは、試料溶解緩衝剤、洗浄緩衝剤、検出抗体複合体及び酵素基質、等の試薬で予め充填されている。好適な実施形態では、検出抗体は、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）またはアルカリホスファターゼ（ＡＰ）等の、酵素に結合され得る。

【0013】

もう１つの目的は、複数の種類のＥＬＩＳＡを行なうことができるシステム及び方法を提供することである。したがって、本発明の方法によれば、１ステップ及び２ステップＥＬＩＳＡの両方を行なうことができる。

【0014】

本発明は、酵素結合免疫吸着アッセイを行なうためのポイント・オブ・ケア使い捨てバイオアッセイ診断カートリッジを提供することによって、これら及びその他の目的を達成する。使い捨てカートリッジは複数のウェルを有していてもよく、第１ウェルは、特定の抗体で前処理及びコーティングされた内部側壁を有する、ピペットチップを保持していてもよい。カートリッジの第２ウェルは、ｐＨ安定剤、イオン性触媒制御剤、イオン性細胞内抑制制御剤、洗剤、陰性対照剤、キレート剤、及び殺生物性防腐剤の少なくとも１種の試薬、抗体、及び複合体安定化剤を有する少なくとも１つの試薬混合物を有していてもよい。抗体は、抗Ｃ反応性タンパク質抗体、抗シスタチンＣ抗体、抗ＩＧＦ－１抗体、抗アラニンアミノトランスフェラーゼ抗体、及び抗アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ抗体のうちの１つ以上であってもよい。第３ウェルは、発色基質及び可視化試薬のうちの少なくとも一方を有する試薬混合物を保持してもよい。

【0015】

本発明は、フィンガースティック装置と、単一の自己充足式使い捨て診断カートリッジとを有する、酵素結合免疫吸着バイオアッセイ診断キットを提供することによっても、これらの目的を果たす。カートリッジは、ピペットチップと、カートリッジ内に収容されたバイオアッセイ成分とを有していてもよい。カートリッジはまた、一体型の光学キュベットも有していてもよい。カートリッジは、ユーザの利便性のため、外面に沿って識別子も有していてもよい。

【0016】

カートリッジ内のピペットチップは、抗体でコーティングされた内部側壁を有し、ピペットチップの内部チャンバ内の少なくとも一部は、開放されたままになっており、内部側壁にアクセス可能である。すなわち、コーティングされたピペットチップは、完全に満たされているのではなく、充填可能なままである。

【0017】

カートリッジ内のバイオアッセイ成分は、ｐＨ安定剤、イオン性触媒制御剤、イオン性細胞内抑制制御剤、洗剤、陰性対照剤、キレート剤、及び殺生物性防腐剤のうちの少なくとも１種の反応性または非反応性の試薬と、抗体と、複合体安定化剤と、発色基質と、可視化試薬とを有する。

【0018】

本発明のピペットチップは、様々な量の抗体でコーティングされた内壁を有していてもよい。同様に、本発明のカートリッジウェルは、様々な量のバイオアッセイ成分を有していてもよい。本発明に従って行なわれる改良型ＥＬＩＳＡの例が、特定の量と共に本明細書中に提供されている。しかしながら、これらの量は、本発明の趣旨から逸脱することなく、カートリッジ及び用いられるチップのサイズにより異なる場合があると理解されるべきである。本発明では通常、同様の量の抗体及び発色基質が用いられる。

【0019】

例えば、大抵の実施形態では、約１：１の抗体と発色基質との相互関係が存在する。４０μｌ～６０μｌの抗体が使用される場合、通常、４０μｌ～６０μｌの範囲の発色基質も使用される。約９０μｌ～１１０μｌの抗体が使用される場合、通常、９０μｌ～１１０μｌの範囲の発色基質も使用される。３００μｌ～３２０μｌの範囲の量の抗体が使用される場合、通常、約３００μｌ～３２０μｌの発色基質も存在する。

【0020】

本発明の概念は、さらに、酵素結合免疫吸着アッセイを行なうためのカートリッジを作製する新規の方法を提供することによって現在の目標を達成する。当該方法は、（１）ピペットチップの内面をコーティングすることによって、ピペットチップを前処理する工程と、（２）第１コーティングをピペットチップの内面に沿って親和剤で施す工程と、（３）第２コーティングを第１コーティングの上にピペットチップの内面に沿ってブロッキング溶液で施す工程と、（４）第３コーティングを第２コーティングの上にピペットチップの内面に沿って活性防腐剤で施す工程と、（５）ｐＨ安定剤、イオン性触媒制御剤、イオン性細胞内抑制制御剤、洗剤、陰性対照剤、キレート剤、及び殺生物性防腐剤からなる群から選択される少なくとも１種の試薬混合物と、抗体と、複合体安定化剤とを用いた直接的なピペッティングを促進することによって洗浄時間を短縮する工程と、（６）発色基質及び可視化試薬と直接反応させるためにカートリッジ内に１つのウェルを設ける工程とを有する。

【0021】

この方法は、前記親和剤を、抗体、抗体断片、組み換えタンパク質、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＡ／Ｇ、ストレプトアビジン、組み換えタンパク質断片、核酸、多糖類、糖タンパク質、ペプチドグリカン、分子インプリントポリマー、及びアプタマー分子からなる群から選択することも備えていてもよい。

【0022】

この方法は、コーティング緩衝剤を、炭酸塩／重炭酸塩緩衝剤、スクロース緩衝剤、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、及びトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン生理食塩水からなる群から選択することも備えていてもよい。

【0023】

第１コーティングをピペットチップの内面に沿って親和剤で施すことは、親和剤を選択することと、コーティング緩衝剤を選択することと、選択された抗体及び選択されたコーティング緩衝剤を混合することによって、抗体溶液を調製することと、混合された抗体溶液をピペットチップに充填することと、ピペットチップを第１温度で第１時間の間インキュベーションすることとによって、さらに定義されてもよい。

【0024】

第２コーティングを第１コーティングの上にピペットチップの内面に沿ってブロッキング溶液で施すことは、ブロッキング溶液を選択することと、ピペットチップにブロッキング溶液を充填することと、ピペットチップを第２温度で第２の時間の間インキュベーションすることとによって、さらに定義されてもよい。

【0025】

第３コーティングを第２コーティングの上にピペットチップの内面に沿って活性防腐剤で施すことは、活性防腐剤を選択することと、ピペットチップに活性防腐剤を充填することと、ピペットチップを第３温度で第３の時間の間インキュベーションすることとによって、さらに定義されてもよい。

【図面の簡単な説明】

【0026】

【図1】図示のようにスキャナと共に使用するための、本発明のバイオアッセイカートリッジキットの図である。

【図2】本発明の一実施形態に係るカートリッジの断面図である。

【図3】本発明のさらなる実施形態に係るカートリッジ、及びピペットチップの断面図である。

【図4】本発明のさらなる実施形態に係るカートリッジ、及びピペットチップの断面図である。

【図5】ユーザが、本発明のカートリッジの識別子をスキャンしている図である。

【図6】ユーザが、本発明の方法に従ってフィンガースティック装置を用いて血液試料を採取している図である。

【図7】ユーザが、本発明のカートリッジから採取装置を取り出している図である。

【図8】ユーザが、本発明のカートリッジの採取装置に血液試料を充填している図である。

【図9】ユーザが、血液試料が充填された採取装置を本発明のカートリッジに戻している図である。

【図10】ユーザが、充填された採取装置を有する本発明のカートリッジを分析装置に入れている図である。

【図11】本発明の方法の概要を図示している。

【図12】本発明のチップを作製する工程の概要を図示している。

【図13】図１２における工程のならなる続きを図示している。

【図14】図１２における工程の様子を図示している。

【図15】６６０ｎｍでＣＲＰ（ｍｇ／Ｌ）に対する光学密度を測定することによるＣＲＰの用量反応を用いた、第１実施形態の結果を図示しているグラフである。

【図16】６６０ｎｍでシスタチン（ｍｇ／Ｌ）に対する光学密度を測定することによるシスタチンの用量反応を用いた、さらなる実施形態の結果を図示しているグラフである。

【図17】６６０ｎｍでＡＬＴ濃度（Ｕ／Ｌ）に対する光学密度を測定することによるＡＬＴの用量反応を用いた、さらなる実施形態の結果を図示しているグラフである。

【図18】６６０ｎｍでＡＳＴ濃度（Ｕ／Ｌ）に対する光学密度を測定することによるＡＳＴ非処理の用量反応を用いた、さらなる実施形態の結果を図示しているグラフである。

【図19】６６０ｎｍでｈｓ－ＣＲＰ濃度（ｍｇ／Ｌ）に対する光学密度を測定することによるｈｓ－ＣＲＰの用量反応を用いた、さらなる実施形態の結果を図示しているグラフである。

【図20】６６０ｎｍでＩＧＦ－１濃度（ｎｇ／ｍＬ）に対する光学密度を測定することによるＩＧＦ－１の用量反応を用いた、さらなる実施形態の結果を図示しているグラフである。

【図21】通常のＣＲＰ光学密度測定値に及ぼすＨＧＢ効果の結果を図示しているグラフである。

【図22】ＨＧＢ効果を考慮するために、補正された通常のＣＲＰ光学密度測定値を図示しているグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0027】

［発明の詳細な説明］
本発明の好適な実施形態を、図１～２２を参照して説明する。上述のとおり、本発明は、ヘモグロビン補正を伴う改良型ＥＬＩＳＡのための方法及び装置に関する工程、技法、システム、及び装置を提供する。

【0028】

包括的なカートリッジキット
図１に示されているのは、想定される分析装置システム１の隣に示された、完全に包括的かつ総合的な本発明のカートリッジキット１０の図である。このカートリッジキット１０は、独立した分析装置システム１で単回使用するために予め梱包された、改良型ＥＬＩＳＡカートリッジ１２と、フィンガースティック装置１４とを備える。本発明の様々な実施形態によれば、キットが設計されている特定の検査に応じて、カートリッジキットは、図２～４を用いて以下でより詳細に説明される、少なくとも１本のピペットチップ２０、採取装置１８、及び一体型キュベット１６ｇも備えていてもよい。これらのコンポーネントを単一のパッケージ１９に１つにまとめたキットとして提供することにより、本発明は、全体の処理時間及びユーザエラーの両方を削減する。

【0029】

本明細書に記載のアッセイを行なうことができる例示的な分析装置システム１は、Ｎｏｖａ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製のＡＬＬＥＧＲＯ（商標）分析装置である。本明細書に記載のカートリッジ１２と共に使用できる例示的な採取装置及びカートリッジベースは、Ｎｏｖａ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎの米国特許１０，１１７，６１５により完全に記載されており、その全内容は本明細書に援用される。

【0030】

改良型ＥＬＩＳＡカートリッジ
本発明のシステム及び技法で使用できる例示的なカートリッジキットは、図２～４をさらに参照してここに説明するような、内蔵型で単回使用の、使い捨て一体型カートリッジ１２を備えていてもよい。

【0031】

カートリッジの第１実施形態が図２に図示されており、断面図では見えないものの、カートリッジは、分析装置１に対して特定のタイプのカートリッジ（ひいてはＥＬＩＳＡ）であることを識別することができる、バーコード等の識別子１３を有する。この識別子１３は、カートリッジ１２の目視できる外面に沿って視認できるようになっていてもよく、メインパッケージ１９の外面に沿って設けられていてもよい。上述のように、このパッケージ１９は、カートリッジ１２、及び少なくとも１つのフィンガースティックランセット１４、または皮膚を破って検査用の血液試料を採取することができる、他の同様の装置を含んでいてもよい。

【0032】

大抵の実施形態では、カートリッジ１２は、カートリッジ１２自体の取り外し可能なコンポーネントであるキャピラリ採取装置１８を有する。また、ほとんどのカートリッジ１２は、光学測定を促進可能な側壁を有する一体型キュベット１６ｇも有する。しかしながら、パッケージ１９には、カートリッジベースに加えて設けられた独立した異なるキュベット１６ｇを必要とするカートリッジ１２が含まれている場合がある、ということも予想される。いずれにせよ、これらのカートリッジは、少なくとも、本発明の方法によるアッセイの成分が予め充填された、一連のウェル１６を有している必要がある。

【0033】

図２で見られ得るように、採取装置１８は、使い捨て検査カートリッジ１２のカバー延長部の段差を設けた延長部分の延長部上面にある対応する毛細管受入開口から挿入されて段差を設けた延長部に着座する、キャピラリ要素（符号なし）を有する。挿入及びセッティング工程の間、採取装置１８の毛細管は、キャピラリワイパーの頂端に位置する下部開口から挿入される。下部開口の断面積は毛細管の断面積よりも小さいため、下部開口は、毛細管の外面に対してスキージのように機能し、不注意で毛細管の外面に配されたあらゆる試料がカートリッジ１２のチャンバ１６ｂに進入して堆積することを防止する。

【0034】

これらのカートリッジ１２のキャピラリワイパーは、毛細管の外面からいかなる試料７も除去する。これにより、検査カートリッジ１２内の適切なウェル１６ｂに試料７が「過剰充填」されることによる、誤った結果が防止される。同様に、毛細管がユーザによって拭かれることはないため、毛細管内のいかなる試料７が不注意に除去されて、検査カートリッジ１２内のウェル１６ｂが試料７の「充填不足」となることによって誤った結果をもたらすような可能性は、全くあるいはほとんどない。

【0035】

単一のカートリッジ１２の第１ウェル１６ａに備えられたピペットチップ２０は、図２に示すように外面に沿って測定の目盛りを有するピペットチップであってもよい。あるいは、これらのチップは、図３～４に示されるように、傾斜がつけられ、延長され、及び／または徐々に変化がつけられたものであってもよい。いずれにせよ、カートリッジ１２の第１ウェル１６内の少なくとも１つのピペットチップ２０は、内壁に沿ってコーティング３０を有することになる。様々なタイプのコーティング３０、及びこれらのコーティングを施す方法は、さらに以下で図１２～１４を参照してより詳細に説明される。

【0036】

ユーザの視点からの方法
ここで、ユーザの視点の概要について、図５～１１を参照してここで説明する。これらの図に示されるように、最初に、改良型ＥＬＩＳＡカートリッジまたはカートリッジキットが、ユーザによって選択される１０２。改良型ＥＬＩＳＡカートリッジが手動で選択された１０２後、カートリッジを分析装置でスキャンして、選択されたアッセイが識別されてもよい１０３。その後、血液試料の取得１０４には、単純な指先穿刺１０５を行なって、必要な量の血液試料を提供することが含まれてもよい。この工程で血液試料が得られ得るという容易さは、静脈穿刺または他の大量の血液試料の収集を必要とする他の従来技術のシステム及び方法に対する、本発明のシステムの利点の１つを示している。

【0037】

バイオアッセイが最初に識別された場合、キャピラリ採取装置をカートリッジから取り外し１０６、血液試料を充填し１０７、所定のカートリッジへ戻す１０８ことが、すべて指先穿刺１０５を行なってから３０秒以内に行なわれてもよい。充填済みの採取装置がカートリッジに戻された１０８後、識別子を分析装置でスキャンし１０３、カートリッジを分析装置に挿入１０９してもよい。カートリッジを分析装置に装填した後、自動処理１１０が開始される。自動処理には、選択されたバイオアッセイに応じて、バイオアッセイ成分の所定の順序に従った、添加１１２、混合１１４、測定１１６、インキュベーション１１７、補正１１８、及びユーザまたはその他の指定された個人への結果報告１１９、の自動化された工程が含まれることになる。

【0038】

ＣＲＰ抗体を用いたピペットチップのコーティング方法
ここで、本発明の方法に従ってピペットチップ２０を作製するための様々な方法を、特に図１２～１４を参照して説明する。一般的に、ピペットチップ２０の作製には、抗体溶液を用いたコーティング１６０、ブロッキング溶液を用いたコーティング１７０、活性防腐剤溶液を用いたコーティング１７５、及びチップの乾燥１８０を行なって使用に備える、という４つの主要な工程が含まれる。開示された量の範囲にかかわらず、使用される量が、キャピラリチップのサイズ及びカートリッジ１２内のウェルの大きさに依存することになることは理解されるべきである。

【0039】

図１２で、第１主要工程、すなわち抗体溶液を用いたコーティング１６０、の工程を詳しく見ていく。一実施形態によれば、この第１主要工程は、抗体ストック、この場合は抗ＣＲＰ、を選択し１６１、コーティング緩衝剤、この場合はｐＨ９．６の２００ｍＭ炭酸塩、を選択する１６２ことで開始した。これは、抗体、抗体断片、組み換えタンパク質、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＡ／Ｇ、ストレプトアビジン、またはその組み換えタンパク質または断片、核酸、多糖、糖タンパク質、ペプチドグリカン、分子インプリントポリマーまたはアプタマー分子等の、いかなる同様のタンパク質でも機能するであろうということは理解されるべきである。抗体は、ＥＬＩＳＡシステムで一般的に使用されているため、好適な親和剤である。上述のように、固定化は、非特異的吸着、または共有結合性の結合によって達成され得る。

【0040】

同様に、この方法で使用されるコーティング緩衝剤には、炭酸塩／重炭酸塩緩衝系及びスクロースが含まれる一方で、リン酸緩衝生理食塩水等の同様のコーティング緩衝剤も使用されてもよく、トリス緩衝生理食塩水等の緩衝剤も許容されるであろうことが理解されるべきである。

【0041】

次に、選択された抗体ストックとコーティング緩衝剤とを混合１６３することで、抗体溶液（抗ＣＲＰ，５μｇ／ｍｌ）が調製された。その後、この溶液は９６ウェルプレートに分注１６４された。ピペットチップが取り付けられたマルチチャンネルピペットを使用して、選択されたピペットチップに抗体溶液が満杯まで吸引１６６された。具体的には、抗体溶液の量は、約１００ポーション～３００ポーションの間、好ましくは１５０μｌ～２００μｌの間、より好ましくは５０μｌ～３００μｌの間の約１６５ポーション、好ましくは７５μｌ～２００μｌの間、より好ましくは選択されたピペットチップに満杯まで充填１６６された抗体溶液約１００μｌである。その後、これらの充填済のピペットチップは、１０℃～５０℃の間、好ましくは２０℃～３０℃の間で、より好ましくは約２２℃～２５℃の室温で、２００～２分の間、好ましくは５０～１０分の間、より好ましくは約３０分である第１の時間、インキュベーション１６７された。ここで、抗体溶液の層がピペットチップの内壁に付着した。その後、余分な溶液はピペットチップから吐出されて、廃棄された。余分な溶液が排出された後、ピペットチップは、さらにブロッキング溶液を用いたコーティング１７０、その後、活性防腐剤溶液を用いたコーティング１７５、続いてチップの乾燥１８０を経る。ブロッキング溶液を用いたコーティング１７０の工程、及び活性防腐剤溶液を用いたコーティングの工程は、さらに図１３に図示されている。

【0042】

ここで図１３を参照して、図１３で次の工程を詳しく見ていくと、チップは次にブロッキング溶液でコーティング１７０されたことがわかる。具体的には、最初にブロッキング緩衝剤が選択１７１される。この工程に十分であると思われるブロッキング緩衝剤には、０．５％～５％の間の、より好ましくは１％のウシ血清アルブミン、ゼラチン、乾燥粉乳を含有する、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が含まれるであろう。

【0043】

次に、約５０μｌ～１，０００μｌの間、好ましくは１００μｌ～４００μｌの間、より好ましくは約２００μｌの選択されたブロッキング緩衝剤がチップに充填１７２されるように、選択されたブロッキング緩衝剤がチップに吸引される。その後、充填済みのチップは、約２～３０分の間、好ましくは５～２０分の間、より好ましくは約１０分である第２の時間の間、インキュベーション１７３される。このインキュベーション１７３は、大抵１０℃～５０℃の間、好ましくは２０℃～３０℃の間の温度で、より好ましくは約２２℃～２５℃の室温で行われる。ここでブロッキング緩衝剤の層が抗体溶液の第１の層の上の適切な場所にあり、余分なブロッキング緩衝剤はここで排出され、ピペットチップから吐出１７４される。

【0044】

次に、活性防腐剤のコーティングが施される１７５。具体的には、最初に、活性防腐剤が選択１７６される。この工程に十分と思われる活性防腐剤には、０．５％～５％の間、より好ましくは２％のスクロース、トレハロース、ゼラチン、及び他の同様の活性防腐剤が含まれるであろう。

【0045】

次に、選択された活性防腐剤は、すでに第１の層及び第２の層（すなわち、それぞれ抗体溶液のコーティング、及びブロッキング溶液のコーティング）を有するチップに分注１７７される。しかしながら、この層は、チップにまだ５０μｌ～１，０００μｌの間、好ましくは１００μｌ～４００μｌの間、より好ましくは約１１０μｌの選択された活性防腐剤が充填１７６されるように、上下に沿った部分も含めて前の層を完全に覆うことになる。その後、充填済みのチップ１７７は第３の時間、約１分、１０℃～５０℃の間、好ましくは２０℃～３０℃の間の温度で、より好ましくは約２２℃～２５℃のほぼ室温で、インキュベーション１７８される。ここで活性防腐剤の第３の層は、ブロッキング緩衝剤及び抗体溶液の第１の層及び第２の層の上の適切な位置にあり、これらの層を完全に覆っている。インキュベーション後、ここで過剰量の活性防腐剤は排出され、ピペットチップから吐出１７９される。その後、チップを２～２０時間の間、好ましくは４～１０時間の間、より好ましくは約８時間、真空チャンバ内で乾燥１８０させた。

【0046】

この処理は、図１４において視覚的に概略的に示されている。具体的には、上記の方法に従ってチップ２０を作製する処理における、ピペットチップ２０の断面図が示されている。最初、ピペットチップ２０は、ピペットチップ２０の第１端の開口２２から主要部分２６を通ってピペットチップ２０の第２端の第２開口２８まで延在する、空の内部空洞２４を有するように示されている。その後、ピペットチップ２０には、内部空洞２４が実質的に満たされるように、抗体溶液３１が充填される。

【0047】

余分な材料が排出されると、抗体溶液３１の第１の層３４は、内部空洞２４の内部の表面に沿って乾燥した状態で残る。内部空洞の空の体積は、残存する抗体溶液３１の第１の層３４の体積によって減少する。しかしながら、コーティング緩衝剤３７は、通常、抗体溶液３１の垂直方向の高さよりも高いところまで加えられる。したがって、その後コーティング緩衝剤３７がピペットチップ２０に加えられるときに、ピペットチップ２０を満たすには、まだ同程度の量のコーティング緩衝剤溶液３７の追加量が必要とされる。余分な緩衝材料が排出された後、コーティング緩衝剤の層３６は、内部空洞２４内の抗体溶液の第１の層３４の内部に向かい合う面に沿って付着した状態で残る。活性防腐剤溶液３８は、通常、コーティング緩衝剤３６の垂直方向の高さよりも高いところまで加えられる。したがって、その後に活性防腐剤溶液３８がピペットチップ２０に加えられるときに、ピペットチップ２０を満たすには、まだ同程度の量の活性防腐剤溶液３８の追加量が必要とされる。余分な活性防腐剤溶液３８が排出された後、活性防腐材料の層３９は、内部空洞２４内のコーティング緩衝剤の第２の層３６の内部に向かい合う面に沿って付着した状態で残る。コーティング緩衝剤３６及び／または活性防腐剤３９のさらなる層が、上記の方法に従って同様に施されてもよい。図示されている層は予想されるものよりも厚く、単に説明の目的で示されており、各層のピペットチップの壁厚に対する、または各層の互いに対する実際の相対的な厚さを表すものではないということは理解されるべきである。

【0048】

上記のピペットチップを作製するために、試薬の特定の量が挙げられていることに留意されたい。体積に対する表面積の割合が（単位は別として）１／６より大きい限り、任意の対応する量で十分であることに注意すべきである。チップの表面積＝πｒｈ＋πｒ^２、及びチップの体積＝１／３πｒ^２ｌにおいて、ｒ＝チップの大径、ｌ＝チップの長さ、及びｈ＝チップの斜辺である。例えば、３ｍｍの半径及び１０．６ｍｍの長さを有するチップの場合、ピペットチップの内側に沿った表面積は、少なくとも１３２．１ｍｍ^２、体積は１００ｍｍ^３、表面積対体積の割合は１３２：１００または１．３２：１となる。

【0049】

あるいは、７．８７ｍｍの底部の半径及び５８．４２ｍｍの長さを有するチップの場合、ピペットチップの内側に沿った表面積は、１６５２ｍｍ^２となり、チップは、３７８９ｍｍ^３の体積を有し得り、表面積対体積の割合は１６５２：３７８９または０．４３：１になる。試薬に対するチップの露出表面積が大きいほど全体的な反応速度の増加が大きくなり、所要反応時間を短縮することができる。しかしながら、表面積対体積の割合は、１より大きい必要はない。研究によると、表面対体積の割合は、５～１／５の間、より好ましくは１～１／４の間、より好ましくは約０．４３であれば十分であることが示されている。

【0050】

一般的なアッセイ試薬、及び追加成分
一実施形態に係る第１試薬混合物は、ｐＨ安定剤、イオン性触媒制御剤、イオン性細胞内抑制制御剤、洗剤、陰性対照剤、キレート剤、及び殺生物性防腐剤を有する。

【0051】

一実施形態に係る第２試薬混合物は、ｐＨ安定剤、イオン性触媒制御剤、イオン性細胞内抑制制御剤、キレート剤、及び殺生物性防腐剤を有する。
一実施形態に係る第３試薬混合物は、抗体、複合体安定化剤、及び陰性対照を有する。

【0052】

一実施形態に係る第４試薬混合物は、発色基質または可視化試薬のうちの少なくとも一方を有する。
一実施形態に係る第１試薬混合物は、ｐＨ安定剤、イオン性触媒制御剤、イオン性細胞内抑制制御剤、洗剤、陰性対照剤、キレート剤、及び殺生物性防腐剤を有する。

【0053】

一実施形態に係る第２試薬混合物は、ｐＨ安定剤、イオン性触媒制御剤、イオン性細胞内抑制制御剤、キレート剤、及び殺生物性防腐剤を有する。
一実施形態に係る第３試薬混合物は、抗体、複合体安定化剤、及び陰性対照を有する。

【0054】

一実施形態に係る第４試薬混合物は、発色基質または可視化試薬のうちの少なくとも一方を有する。
本発明の方法で使用され得る例示的なｐＨ安定剤は、１０ｍＭリン酸緩衝剤であり、これによりｐＨ７．４の保持が容易になる。

【0055】

本発明の方法で使用され得る例示的なイオン性触媒制御剤は、１３８ｍＭ ＮａＣｌ溶液である。
本発明の方法で使用され得る例示的なイオン性細胞内抑制制御剤は、２．７ｍＭ ＫＣｌ溶液である。

【0056】

本発明の方法で使用され得る例示的な殺生物性防腐剤は、ＰｒｏＣｌｉｎ（商標）３００の商標で販売されている０．０３％の殺生物性防腐剤であり、これは、水溶性で、アルキカルボキシレート安定剤を含有する塩を含まない独自のグリコール中の３％のＣＭＩＴ／ＭＩＴからなる。

【0057】

本発明の方法で使用され得る例示的なキレート剤は、５ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）である。
本発明の方法で使用され得る例示的な洗剤は、Ｔｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ－１００（ＴＸ１００）の商標で販売されている０．１％洗剤であり、これは、細胞を溶解して、タンパク質及び他の細胞小器官を抽出するか、またはトランスフェクションのために生細胞膜を透過処理するのに、最も広く使用されている非イオン性界面活性剤の１つである。

【0058】

本発明の方法で使用され得る例示的な乳化剤は、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０（商標）（ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート）の商標で販売されている０．０５％乳化剤である。

【0059】

本発明の方法で使用され得る例示的な陰性対照は、テネシー州のＭｅｒｉｄｉａｎ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｉｎｃから入手可能なマウスＩｇＧであり、これは一般的に血清免疫グロブリンの７５％を構成し、プラズマＢ細胞によって合成及び分泌される。

【0060】

本発明の方法で使用され得る抗体は、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）に結合したＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）一次抗体である、抗ＣＲＰ抗体ＨＲＰ（２５０ｎｇ／ｍＬ）である。

【0061】

ＣＲＰは、環状五量体構造を特徴とするタンパク質である、ペントラキシンファミリーの一員である。ヒトＣＲＰ遺伝子は、２２４のアミノ酸前駆体をコード化する。成熟したヒトＣＲＰタンパク質は、非共有結合性の結合をして五量体を形成する２０６のアミノ酸を有する。ヒトＣＲＰは、７１％のアミノ酸配列相同性をマウスと共有し、６４％のアミノ酸配列相同性をラットと共有する。

【0062】

肝細胞によって合成されたＣＲＰは、ヒトの主要な急性期血清タンパク質である。ＩＬ－６、ＩＬ－１、及びグルココルチコイドは、ＣＲＰ遺伝子の主要な誘導物質である。感染、炎症、または組織の損傷に反応して、ヒト血清中のＣＲＰレベルは、２４～４８時間以内に１，０００倍に増加し得る。ヒト血清中のＣＲＰレベルは、１μｇ／ｍＬ未満の基準レベルに非常に速く戻る。ヒトＣＲＰは、宿主の先天的宿主防御の第一線で作用する、急性期の血清タンパク質である。他のペントラキシンと同様に、ＣＲＰはＣａ^＋＋依存のリガンドへの結合を示す。多くの細菌壁及び真菌壁の構成物であるホスホコリン（ＰＣｈ）は、ＣＲＰの主要なリガンドである。

【0063】

ＣＲＰは、損傷した細胞の膜、壊死細胞の膜及び核成分、アポトーシス細胞の膜及び核成分にも結合する。リガンドと結合すると、ＣＲＰはＣ１ｑによって認識され、補体カスケードの活性化を開始する。リガンド結合ＣＲＰは、食細胞上のＦｃガンマＲＩ及びＦｃガンマＲＩＩａにも結合して、食作用反応を活性化する。食作用に加えて、ＣＲＰは、過酸化水素、及びＩＬ－１、ＩＬ－６及びＴＮＦアルファ等の炎症性サイトカインの産生を単球によって誘発することもできる。これらの機能を有することから、ヒトＣＲＰは、抗菌性病原体に対して、また損傷した細胞やアポトーシス細胞の除去のために、重要な血清タンパク質である。しかしながら、マウスでは、ＣＲＰは非常に低いレベルで発現しており、急性期の反応物質ではない。別のペントラキシンである血清アミロイドＰ成分（ＳＡＰ）は、マウスでの主要な急性期血清タンパク質である。ヒトにおいてＣＲＰレベルが高いことは、心血管疾患のリスクの増加と関連していることがこれまでに示されている。

【0064】

本発明の方法で使用され得る複合体安定化剤は、ＳｔａｂｉｌＺｙｍｅ（商標）の商標で販売されている複合体安定化剤であり、これは、イムノアッセイで一般的に使用される抗体／抗原複合体、抗体被覆粒子、及び未修飾タンパク質の構造を維持するために作られた、多目的ＨＲＰ複合体安定化剤溶液である。

【0065】

本発明の方法で使用され得る発色基質または可視化試薬は、３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）である。
本発明の方法では、抗発泡／消泡剤が使用され得る。そのような薬剤の例は、Ｆｏａｍ Ａｗａｙ（商標）の商標で販売され、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから入手可能である。

【0066】

例－図１５に図示されたＣＲＰの結果
アッセイカートリッジ及びキュベットの作製には、抗ＣＲＰ捕捉抗体を用いた上記の方法によるピペットチップの作製が含まれた。具体的には、ピペットチップ２０の作製１５０中に、抗ＣＲＰ捕捉抗体をピペットチップ２０の内側に結合させた。当該ピペットチップは、抗ＣＲＰ捕捉抗体の結合がなければ３００μｌの量の溶液を保持できるものである。

【0067】

上記の方法に従って、示されたウェルに以下の量を分注することによって、カートリッジを作製した。

【0068】

【表1】

【0069】

カートリッジの作製後、上述の方法に従って血液試料をキャピラリ採取装置１８で採取１０４した。分析装置が選択されたバイオアッセイを識別した後、カートリッジが分析装置に装填され、自動処理１１０が開始される。具体的には、分析装置は、ピペットアームを用いて重力を発生させて、所定の自動処理１１０に従って試薬または血液試料を移す１１２。

【0070】

このバイオアッセイにおいて、自動工程には、添加１１２、混合１１４、測定１１６、インキュベーション１１７、補正１１８、及びユーザまたは他の指定された個人への結果報告１１９が含まれる。アッセイは、２９０μｌの第１試薬量を、第３ウェル１６ｃから第２ウェル１６ｂに移すことで開始された。

【0071】

次に、５μｌの血液試料がキャピラリ採取装置１８から第２ウェル１６ｂに絞り出された１１２。その後、第１ウェル１６ａからの抗体付きピペットチップを使って、第２ウェルから１００μＬの試料が吸引された。その後、この試料はピペットチップ内で６０秒間保持１１７され、その後、溶解した血液試料は第２ウェル１６ｂに戻され廃棄された。

【0072】

その後、１回目の洗浄が行なわれた。１回目の洗浄では、第６ウェル１６ｆから１３０μＬの第４試薬が吸引され、その後再び戻され廃棄された。その後、２回目の洗浄が、第４ウェル１６ｄからの５５μＬの第２試薬、続いて７５μＬのエアギャップを用いて行なわれた。その後、これは第３ウェル１６ｃに廃棄された。これが、３回目の洗浄として繰り返された。

【0073】

次に、抗ＣＲＰ－ＨＲＰを用いた分析物の標識化が、混合１１４と、第５ウェル１６ｅからの１００μＬの第３試薬の吸引と、４分間の保持１１７とによって行なわれた。その後、これは第５ウェル１６ｅに戻され廃棄された。

【0074】

その後、ピペットチップの追加洗浄が４回行なわれた。４回目の洗浄では、１３０μＬの第１試薬が吸引１１４され、その後、第３ウェル１６ｃに戻され廃棄された。５回目の洗浄では、６５μＬの第２試薬、続いて６５μＬのエアギャップが第４ウェル１６ｄから吸引１１４された。その後、これも第３ウェル１６ｃに廃棄された。６回目の洗浄では、第４ウェル１６ｄから６５μＬの第２試薬、続いて６５μＬのエアギャップが吸引１１４された。その後、これも第３ウェル１６ｃに廃棄された。７回目の洗浄では、１３０μＬの第３試薬が第４ウェル１６ｄから吸引１１４された。その後、これは第４ウェル１６ｄに廃棄された。次に、１００μｌの第５試薬がその後キュベット１６ｇから吸引１１４されて２分間保持１１７され、その後、キュベット１６ｇに戻されて廃棄され、混合１１４された。その後、本明細書の他の箇所に記載のように、試料は６６０ｎｍにおいて読み取られた１１６。

【0075】

この手順が、６つの異なる濃度のＣＲＰに対して繰り返された。データを下の表に示す。

【0076】

【表2】

【0077】

前述のとおり、このデータは、図１５において視覚的にも図示されている。
例－図１６に図示されたシスタチンの結果
アッセイカートリッジ及びキュベットの作製には、抗シスタチンＣ捕捉抗体を用いた上記の方法によるピペットチップの作製が含まれた。具体的には、ピペットチップ２０の作製１５０中に、抗シスタチンＣ捕捉抗体をピペットチップ２０の内側に結合させた。当該ピペットチップは、抗シスタチンＣ捕捉抗体の結合がなければ３００μｌの量の溶液を保持することができる。

【0078】

上記の方法に従って、示されたウェルに以下の量を分注することによって、カートリッジを作製した。

【0079】

【表3】

【0080】

カートリッジの作製後、異なる濃度のシスタチンを有する試料を、キャピラリ採取装置１８で採取１０４した。分析装置が選択されたバイオアッセイを識別した後、カートリッジを分析装置に装填し、自動処理１１０が開始される。具体的には、分析装置は、ピペットアームを用いて重力を発生させて、所定の自動処理１１０に従って試薬または血液試料を移す１１２。

【0081】

このバイオアッセイにおいて、自動工程には、添加１１２、混合１１４、測定１１６、インキュベーション１１７、補正１１８、及びユーザまたは他の指定された個人への結果報告１１９が含まれる。アッセイは、２９０μｌの第１試薬量を第３ウェル１６ｃから第２ウェル１６ｂに移すことで開始された。

【0082】

次に、５μｌの試料がキャピラリ採取装置１８から第２ウェル１６ｂに絞り出された１１２。その後、第１ウェル１６ａからの抗体付きピペットチップを使って、７５μＬの希釈された血液試料が第２ウェル１６ｂから第６ウェル１６ｆに吸引された。次に、第５ウェル１６ｅからの７５μＬの第３試薬も第５ウェル１６ｅから第６ウェル１６ｆに移された１１２。

【0083】

その後、分析物の標識化が、第６ウェル１６ｆ内の試薬混合物及び希釈された試料を３回上下にピペッティングして混合１１４することによって行なわれた。その後、１００μＬのこの試料混合物がピペットチップに吸引され、６０秒間インキュベーション１１７された後、溶解した血液試料混合物が第６ウェル１６ｆに戻され廃棄された。

【0084】

その後、ピペットチップの洗浄が４回行なわれた。１回目の洗浄では、５０μＬの第１試薬が吸引１１４され、その後、第３ウェル１６ｃに戻され廃棄された。２回目の洗浄では、第４ウェル１６ｄから１１０μＬの第２試薬、続いて２０μＬのエアギャップが吸引１１４された。その後、これも第３ウェル１６ｃに廃棄された。３回目の洗浄では、第４ウェル１６ｄから１１０μＬの第２試薬、続いて２０μＬのエアギャップが吸引１１４された。その後、これも第３ウェル１６ｃに廃棄された。４回目の洗浄では、１１０μＬの第３試薬が第４ウェル１６ｄから吸引１１４された。その後、これは第２ウェル１６ｂに廃棄された。

【0085】

次に、１００μｌの第４試薬がキュベット１６ｇから吸引１１４されて２分間保持１１７され、その後、キュベット１６ｇに戻されて廃棄され、混合１１４された。その後、本明細書の他の箇所に記載のように、試料が６６０ｎｍにおいて読み取られた１１６。

【0086】

この手順が、７つの異なる濃度の既知のシスタチン濃度に対して繰り返された。データを下の表に示す。

【0087】

【表4】

【0088】

前述のとおり、このデータは、図１６において視覚的にも図示されている。
例－図１７に図示されたＡＬＴの結果
アッセイカートリッジ及びキュベットの作製には、今回はコーティングが抗アラニンアミノトランスフェラーゼ（抗ＡＬＴ）抗体を用いて行われた点を除いて、上記の方法によるピペットチップの作製が含まれた。具体的には、ピペットチップ２０の作製１５０中に、抗ＡＬＴ捕捉抗体をピペットチップ２０の内側に結合させた。当該ピペットチップは、抗ＡＬＴ捕捉抗体の結合がなければ３００μｌの量の溶液を保持することができる。

【0089】

上記の方法に従って、示されたウェルに以下の量を分注することによって、カートリッジを作製した。

【0090】

【表5】

【0091】

カートリッジの作製後、異なる濃度のＡＬＴを有する試料を、キャピラリ採取装置１８で採取１０４した。分析装置が選択されたバイオアッセイを識別した後、カートリッジを分析装置に装填し、自動処理１１０が開始される。具体的には、分析装置は、ピペットアームを用いて重力を発生させて、所定の自動処理１１０に従って試薬または血液試料を移す１１２。

【0092】

この例示的なバイオアッセイにおいて、自動工程には、添加１１２、混合１１４、測定１１６、インキュベーション１１７、補正１１８、及びその後のユーザまたは他の指定された個人への結果報告１１９が含まれる。アッセイは、２９０μｌの第１試薬量を第３ウェル１６ｃから第２ウェル１６ｂに移すことで開始された。

【0093】

次に、５μｌの試料がその後キャピラリ採取装置１８から第２ウェル１６ｂに絞り出された１１２。その後、第１ウェル１６ａからの抗体付きピペットチップを使って、第２ウェル１６ｂから１００μＬの溶解した血液試料が吸引された。その後、この試料はピペットチップ内で１０分間保持１１７され、その後、溶解した血液試料は第２ウェル１６ｂに戻され廃棄された。

【0094】

その後、１回目の洗浄が行なわれ、１回目の洗浄では、第３ウェル１６ｃから１３０μＬの第４試薬が吸引され、その後再び戻され廃棄された。その後、２回目の洗浄が、第４ウェル１６ｄからの５５μＬの第２試薬、続いて７５μＬのエアギャップを用いて行なわれた。その後、これは第３ウェル１６ｃに廃棄された。これが、３回目の洗浄として繰り返された。

【0095】

次に、分析物の標識化が、混合１１４と、第５ウェル１６ｅからの１００μＬの第３試薬の吸引と、４分間の保持１１７とによって行なわれた。その後、これは第５ウェル１６ｅに戻され廃棄された。

【0096】

その後、ピペットチップの追加洗浄が４回行なわれた。４回目の洗浄では、１３０μＬの第１試薬が第３ウェル１６ｃから吸引１１４され、その後、第３ウェル１６ｃに戻され廃棄された。５回目の洗浄では、第４ウェル１６ｄから６５μＬの第２試薬、続いて６５μＬのエアギャップが吸引１１４された。その後、これも第３ウェル１６ｃに廃棄された。６回目の洗浄では、第４ウェル１６ｄから６５μＬの第２試薬、続いて６５μＬのエアギャップが吸引１１４された。その後、これも第３ウェル１６ｃに廃棄された。７回目の洗浄では、第４ウェル１６ｄから１３０μＬの第２試薬が再び吸引１１４された。その後、これは第４ウェル１６ｄに再び廃棄された。次に、１００μｌの第５試薬がその後、キュベット１６ｇから吸引１１４されて、１０分間保持１１７され、その後、キュベット１６ｇに戻されて廃棄され、混合１１４された。その後、本明細書の他の箇所に記載のように、試料は６６０ｎｍにおいて読み取られた１１６。

【0097】

この手順が、３つの異なる濃度のアラニンアミノトランスフェラーゼ濃度に対して繰り返された。データを下の表に示す。

【0098】

【表6】

【0099】

例－図１８に図示された、前処理及び追加の二次的な任意の前処理に対してのＡＳＴの結果
図１８では、本方法と比較した、二次的な任意の前処理が与えるさらなる利点を、追加のプラズマ処理が施されたチップと本方法で処理されたチップとのアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）抗体に関する分析を比較することによって説明する結果が示されている。本明細書で説明される通常の発明の方法による抗体コーティング前に、プラズマチャンバにおいてピペットチップに追加の前処理を行なうことによって、製造業者に提供されたままで使用されるピペットチップと比較して、前処理されたピペットチップに対するより良好な抗体の結合をもたらすことができる。この抗体結合の向上は、ひいてはアッセイ信号の向上に反映される。アッセイカートリッジ及びキュベットの作製には、上述の改良された方法によるピペットチップの作製が含まれていた。このコーティング手順は、追加の手順に（プラズマ処理と称される）任意の追加の前処理が含まれることを除いて、上述のコーティング手順と実質的に同様であった。以下に説明されるコーティング処理及び追加のプラズマコーティング処理は、両方とも抗アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（抗ＡＳＴ）捕捉抗体を用いて行なわれた。

【0100】

具体的には、ピペットチップ２０の作製１５０中に、抗ＡＳＴ捕捉抗体をピペットチップ２０の内側に結合させた。当該ピペットチップは、抗ＡＳＴ捕捉抗体の結合がなければ３００μｌの量の溶液を保持することができる。最初に、ＫＰＬ緩衝剤中に５μｇ／ｍＬの捕捉ＡＢを有する１００μＬの抗体溶液が吸引され、２時間保持された。側壁に結合しなかった分は、その後廃棄された。次に、２００μＬの１０ｍＭ ＰＢＳ及び０．０５％のＴｗ－２０がピペットチップに吸引され、この一部がピペットチップの側壁に結合した。側壁に結合しなかった分は、その後廃棄された。最後に、２００μＬの１０ｍＭ ＰＢＳ、０．０５％のＴｗ－２０、０．１％のＢＳＡがピペットチップに吸引され、５分間インキュベーションされて、ピペットチップの側壁に沿って第３の層を形成した。側壁に結合しなかった分は、その後廃棄された。

【0101】

上記の方法に従って、示されたウェルに以下の量を分注することによって、カートリッジを作製した。

【0102】

【表7】

【0103】

カートリッジの作製後、検査試料を採取１０４して、キャピラリ採取装置１８に入れた。分析装置が選択されたバイオアッセイを識別した後、カートリッジを分析装置に装填して、自動処理１１０が開始される。具体的には、分析装置は、ピペットアームを用いて重力を発生させて、所定の自動処理１１０に従って試薬または血液試料を移す１１２。

【0104】

この例示的なバイオアッセイにおいて、自動工程には、添加１１２、混合１１４、測定１１６、インキュベーション１１７、補正１１８、及びその後のユーザまたは他の指定された個人への結果報告１１９が含まれる。アッセイは、２９０μｌの第１試薬量を第３ウェル１６ｃから第２ウェル１６ｂに移すことで開始された。

【0105】

次に、８μｌのＡＳＴキャリブレータがキャピラリ採取装置１８から第２ウェル１６ａに絞り出された１１２。その後、第１ウェル１６ａからの抗体付きピペットチップを使って、第２ウェルからの１００μＬの試料が吸引された。その後、この試料はピペットチップ内で１０分間保持１１７され、その後、試料は第２ウェル１６ｂに戻され廃棄された。

【0106】

その後、１回目の洗浄が行なわれ、１回目の洗浄では、第６ウェル１６ｆからの１３０μＬの第４試薬が吸引され、その後再び戻され廃棄された。その後、２回目の洗浄が、第４ウェル１６ｄからの５５μＬの第２試薬、続いて７５μＬのエアギャップを用いて行なわれた。その後、これは第３ウェル１６ｃに廃棄された。これが、３回目の洗浄として繰り返された。

【0107】

次に、分析物の標識化が、第５ウェル１６ｅからの１００μＬの第３試薬の吸引、及び１０分間の保持１１７によって行なわれた。その後、これは第５ウェル１６ｅに戻され廃棄された。

【0108】

その後、ピペットチップの追加洗浄が４回行なわれた。４回目の洗浄では、１３０μＬの第１試薬が第３ウェル１６ｃから吸引１１４され、その後、第３ウェル１６ｃに戻され廃棄された。５回目の洗浄では、第４ウェル１６ｄから６５μＬの第２試薬、続いて６５μＬのエアギャップが吸引１１４された。その後、これも第３ウェル１６ｃに廃棄された。６回目の洗浄では、第４ウェル１６ｄから６５μＬの第２試薬、続いて６５μＬのエアギャップが吸引１１４された。その後、これも第３ウェル１６ｃに廃棄された。７回目の洗浄では、第４ウェル１６ｄから１３０μＬの第２試薬が再び吸引１１４された。その後、これは第４ウェル１６ｄに再び廃棄された。次に、１００μｌの第５試薬がキュベット１６ｇから吸引１１４されて、１０分間保持１１７され、その後、キュベット１６ｇに戻されて廃棄され、混合１１４された。その後、本明細書の他の箇所に記載のように、試料は６６０ｎｍにおいて読み取られた１１６。

【0109】

この手順が、プラズマ処理されたチップ及び処理されたチップの各々の、８つの異なる濃度のＡＳＴに対して繰り返された。データを下の表に示す。

【0110】

【表8】

【0111】

例－図１９に図示されたｈｓ－ＣＲＰの結果
アッセイカートリッジ及びキュベットの作製には、抗ＣＲＰ捕捉抗体を用いた上記の方法によるピペットチップの作製が含まれた。具体的には、ピペットチップ２０の作製１５０中に、抗ＣＲＰ捕捉抗体をピペットチップ２０の内側に結合させた。当該ピペットチップは、抗ＣＲＰ捕捉抗体の結合がなければ３００μｌの量の溶液を保持することができる。

【0112】

上記の方法に従って、示されたウェルに以下の量を分注することによって、カートリッジを作製した。

【0113】

【表9】

【0114】

カートリッジの作製後、検査試料を採取１０４して、キャピラリ採取装置１８に入れた。分析装置が選択されたバイオアッセイを識別した後、カートリッジを分析装置に装填し、自動処理１１０が開始される。具体的には、分析装置は、ピペットアームを用いて重力を発生させて、所定の自動処理１１０に従って試薬または血液試料を移す１１２。

【0115】

この例示的なバイオアッセイにおいて、自動工程には、添加１１２、混合１１４、測定１１６、インキュベーション１１７、補正１１８、及びその後のユーザまたは他の指定された個人への結果報告１１９が含まれる。アッセイは、２９０μｌの第１試薬量を第３ウェル１６ｃから第２ウェル１６ｂに移すことで開始された。

【0116】

次に、高感度Ｃ反応性タンパク質（ｈｓ－ＣＲＰ）を有する５μｌの試料が、その後、キャピラリ採取装置１８から第２ウェル１６ｂに絞り出された１１２。その後、第１ウェル１６ａからの抗体付きピペットチップを使って、第２ウェル１６ｂから１００μＬの試料が吸引された。その後、この試料はピペットチップ内で保持１１７され、その後、第２ウェル１６ｂに戻され廃棄された。

【0117】

その後、１回目の洗浄が行なわれ、１回目の洗浄では、第６ウェル１６ｆからの１３０μＬの第４試薬が吸引され、その後再び戻され廃棄された。その後、２回目の洗浄が、第４ウェル１６ｄからの５５μＬの第２試薬、続いて７５μＬのエアギャップを用いて行なわれた。その後、これは第３ウェル１６ｃに廃棄された。これが、３回目の洗浄として繰り返された。

【0118】

次に、分析物の標識化が、第５ウェル１６ｅからの１００μＬの第３試薬の吸引、及び３分間の保持１１７によって行なわれた。その後、これは第５ウェル１６ｅに戻され廃棄された。

【0119】

その後、ピペットチップの追加洗浄が４回行なわれた。４回目の洗浄では、１３０μＬの第１試薬が第３ウェル１６ｃから吸引１１４され、その後、第３ウェル１６ｃに戻され廃棄された。５回目の洗浄では、第４ウェル１６ｄから６５μＬの第２試薬、続いて６５μＬのエアギャップが吸引１１４された。その後、これも第３ウェル１６ｃに廃棄された。６回目の洗浄では、第４ウェル１６ｄから６５μＬの第２試薬、続いて６５μＬのエアギャップが吸引１１４された。その後、これも第３ウェル１６ｃに廃棄された。７回目の洗浄では、第４ウェル１６ｄから１３０μＬの第２試薬が再び吸引１１４された。その後、これは第４ウェル１６ｄに再び廃棄された。次に、１００μｌの第５試薬がその後、キュベット１６ｇから吸引１１４されて、２分間保持１１７され、その後、キュベット１６ｇに移し戻されて、混合１１４された。その後、本明細書の他の箇所に記載のように、試料は６６０ｎｍにおいて読み取られた１１６。

【0120】

この手順が、６つの異なる濃度のｈｓ－ＣＲＰに対して繰り返された。データを下の表に示す。

【0121】

【表10】

【0122】

このデータは、図１９において視覚的に図示されている。
例－図２０に図示されたＩＧＦ－１の結果
アッセイカートリッジ及びキュベットの作製には、上述の改良された方法によるピペットチップの作製が含まれた。このコーティング手順は、当該手順が抗インスリン様成長因子１（抗ＩＧＦ－１）捕捉抗体を用いて行なわれたことを除いて、上述のコーティング手順と実質的に同様であった。

【0123】

具体的には、ピペットチップ２０の作製１５０中に、抗ＩＧＦ－１捕捉抗体をピペットチップ２０の内側に結合させた。当該ピペットチップは、抗ＩＧＦ－１捕捉抗体の結合がなければ３００μｌの量の溶液を保持することができる。最初に、ＫＰＬ緩衝剤中に５μｇ／ｍＬの捕捉抗体を有する１００μＬの抗体溶液が吸引され、３０分間保持された。側壁に結合しなかった分は、その後廃棄された。次に、２００μＬの１０ｍＭ ＰＢＳ及び０．０５％のＴｗ－２０がピペットチップに吸引され、この一部がピペットチップの側壁に結合した。側壁に結合しなかった分は、その後廃棄された。最後に、２００μＬの１０ｍＭ ＰＢＳ、０．０５％のＴｗ－２０、０．１％のＢＳＡがピペットチップに吸引され、１０分間インキュベーションされて、ピペットチップの側壁に沿って第３の層を形成した。側壁に結合しなかった分は、その後廃棄された。

【0124】

上記の方法に従って、示されたウェルに以下の量を分注することによって、カートリッジを作製した。

【0125】

【表11】

【0126】

カートリッジの作製後、検査試料を採取１０４して、キャピラリ採取装置１８に入れた。分析装置が選択されたバイオアッセイを識別した後、カートリッジを分析装置に装填し、自動処理１１０が開始される。具体的には、分析装置は、ピペットアームを用いて重力を発生させて、所定の自動処理１１０に従って試薬または血液試料を移す１１２。

【0127】

この例示的なバイオアッセイにおいて、自動工程には、添加１１２、混合１１４、測定１１６、インキュベーション１１７、補正１１８、及びその後のユーザまたは他の指定された個人への結果報告１１９が含まれる。この一連のアッセイは、１５０μｌの第１試薬量を第３ウェル１６ｃから第２ウェル１６ｂに移すことで開始された。

【0128】

次に、ＩＧＦ－１を有する８μｌの試料がその後、キャピラリ採取装置１８から第２ウェル１６ｂに絞り出された１１２。その後、第１ウェル１６ａからの抗体付きピペットチップを使って、第２ウェル１６ｂからの１００μＬの試料が吸引された。その後、この試料はピペットチップ内で５分間保持１１７され、その後、第２ウェル１６ｂに戻され廃棄された。

【0129】

その後、１回目の洗浄が行なわれ、１回目の洗浄では、その後、第６ウェル１６ｆからの１３０μＬの第４試薬が吸引され、その後再び戻され廃棄された。その後、２回目の洗浄が、第４ウェル１６ｄからの５５μＬの第２試薬、続いて７５μＬのエアギャップを用いて行なわれた。その後、これは第３ウェル１６ｃに廃棄された。これが、３回目の洗浄として繰り返された。

【0130】

次に、分析物の標識化が、第５ウェル１６ｅからの１００μＬの第３試薬の吸引、及び５分間の保持１１７によって行なわれた。その後、これは第５ウェル１６ｅに戻され廃棄された。

【0131】

その後、ピペットチップの追加洗浄が４回行なわれた。４回目の洗浄では、１３０μＬの第１試薬が第３ウェル１６ｃから吸引１１４され、その後、第３ウェル１６ｃに戻され廃棄された。５回目の洗浄では、第４ウェル１６ｄから６５μＬの第２試薬、続いて６５μＬのエアギャップが吸引１１４された。その後、これも第３ウェル１６ｃに廃棄された。６回目の洗浄では、第４ウェル１６ｄから６５μＬの第２試薬、続いて６５μＬのエアギャップが吸引１１４された。その後、これも第３ウェル１６ｃに廃棄された。７回目の洗浄では、第４ウェル１６ｄから１３０μＬの第２試薬が再び吸引１１４された。その後、これは第４ウェル１６ｄに再び廃棄された。次に、１００μｌの第５試薬がキュベット１６ｇから吸引１１４されて、５分間保持１１７され、その後、キュベット１６ｇに移し戻されて、混合１１４された。その後、本明細書の他の箇所に記載のように、試料は６６０ｎｍにおいて読み取られた１１６。

【0132】

この手順が、６つの異なる濃度のＩＧＦ－１に対して繰り返された。データを下の表に示す。

【0133】

【表12】

【0134】

このデータは、図２０において視覚的に図示されている。
ヘモグロビンレベルの補正方法－図２１及び２２
本発明は、ＥＬＩＳＡ法に関連する光検出の検査室誤差のいくつかの原因に対処しようとするものである。試料中に塊が形成されると光吸収の測定値に影響を与える可能性があり、また塊の形成は時間の経過に依存することから、ＥＬＩＳＡ法に関連する光検出の検査室誤差の最大の原因の１つは、試料採取から測定の間の時間の経過に起因する。

【0135】

本発明の基本方針の１つは、試料採取から検出（測定）の間の時間の経過に起因して発生し得る誤差数の増加に対処できない、という従来技術の失敗に対処することである。本発明は、アッセイ成分を包括的なカートリッジに予め梱包し、アッセイ技法のために予め選択された成分を提供することによって、検出前段階の迅速化を図る。

【0136】

本発明がこの目標を達成する別の方法は、全血試料を使用することによって、検査前に赤血球を血漿から分離する必要なしに、正確な結果を得ることが可能なバイオアッセイを提供することである。現在利用可能なポイント・オブ・ケア分析装置では、試料として血漿を使用する必要がある。これには、検査結果を得る前に、血液試料中の血漿から赤血球を分離する必要があり、試料採取から検査の間の時間がさらに長くなってしまう。

【0137】

現在の分析装置が血漿を必要とする理由の１つは、先行技術の自動システム及びアッセイが自己補正分析を提供できないことに起因する、ということがわかった。血液試料中のヘモグロビンのレベルは、試料の光学密度に影響を与えることになる。本発明者らは、個人のヘモグロビン量の変動を考慮するために光学密度の信号出力を調節しないと、ＣＲＰレベルを正しく識別するのに誤差が生じ得る、ということを見い出している。

【0138】

この潜在的な誤差の原因に関して、先行技術の誤差に対処するため、本発明は、ヘモグロビンの自動補正を伴う改良型ＥＬＩＳＡバイオアッセイ方法を提供する。全血を使用する上述のアッセイの実施形態では、試料の光学密度は可視波長で測定される。続いて、ヘモグロビンレベルは、別の可視波長で試料の光学密度を測定することによって割り出される。その後、ＣＲＰレベルは、試料の調整された真の血漿値についてのヘモグロビン測定を用いて補正される。

【0139】

このようにして、本発明は、個人の患者の血漿量の変動を考慮しなかったという先行技術の方法の失敗に対処する、という別の目的を達成する。統計的に、患者の血液試料中の血漿量と検出されたヘモグロビン量との間には、直接的な相関関係がある。健康で典型的なヒト血液は、１２～１７ｇ／ｄＬの間のヘモグロビンを含み得る。世界保健機関は、貧血でない個人の検出されたヘモグロビンレベルは、年齢、標高、及び性別によって異なり得ると報告している。

【0140】

６か月～４歳：１１ｇ／ｄＬ以上
５～１２歳：１１．５ｇ／ｄＬ以上
１２～１５歳：１２ｇ／ｄＬ以上
成人男性：１３．０ｇ／ｄＬ以上～１７．２ｇ／ｄＬ
成人女性：１２．１以上～１５．１ｇ／ｄＬ
妊娠中：１１ｇ／ｄＬ以上
ただし、特定の患者のヘモグロビン量の変動は、例えば貧血患者では８～１２ｇ／ｄＬの間、または、例えば喫煙、高地在住、または赤血球の生成を刺激するエリスロポエチン等の薬またはホルモン剤服用の患者では、１５．０ｇ／ｄＬ～１９ｇ／ｄＬの間であることが記録されている。ＨＧＢレベルが高いほど、全血試料の体積のうち赤血球が占める割合が大きいことを示す。ＨＧＢレベルが低いほど、全血試料の体積のうち赤血球が占める割合が小さいことを示している。

【0141】

前述のように、検出される分析物は患者の血漿内で運ばれる。事実上、分析物の濃度割り出しのために光学検出を用いる場合、ＨＧＢレベルが（試料の量に対して）高いということは、分析に利用可能な血漿量が（試料の量に対して）少ないことを意味する。これにより、血漿レベルの変動を考慮しなかった従来技術の方法では、報告された値が患者の体内に実際に存在した値よりも低かったという結果になった。

【0142】

あるいは、ＨＧＢレベルが（試料の量に対して）通常よりも低かったということは、分析に利用可能であった血漿量が（試料の量に対して）多かったことを示す。これにより、血漿レベルの変動を考慮しなかった従来技術の方法では、報告された分析物の値が患者の体内に実際に存在した値よりも高かったという結果になった。

【0143】

本発明の方法によって、例えば、ただしこれに限定されないが、複数の波長の発光ダイオード（ＬＥＤ）等の複数の信号測定装置を備えるよう、機器の機能を拡張することが容易になる。混合物の光学密度を測定してアッセイを読み取るには、好ましくは６２０ｎｍ～７００ｎｍの範囲、より好ましくは６５０～６８０ｎｍの間、さらにより好ましくは６５８ｎｍ～６６８ｎｍの間、最も好ましくは６６０ｎｍの可視波長で行われる。試料の光学密度を測定してヘモグロビンレベルを読み取るには、好ましくは５００ｎｍ～５５０ｎｍの範囲、より好ましくは５１０ｎｍ～５４５ｎｍの間、さらにより好ましくは５２０ｎｍ～５４０ｎｍの間、最も好ましくは５３０ｎｍの可視波長で行われる。

【0144】

検出されたＣＲＰに及ぼす様々なレベルのヘモグロビンの効果（ヘマトクリット効果）を説明するために検査を行なった。結果を図２１及び２２に図示する。ここに示されるように、ヘモグロビンは０～２３ｇ／ｄＬの範囲であった。ヘモグロビンが増加するにつれて、先行技術の方法の算出ＣＲＰは減少した。可視範囲内の追加のＬＥＤを用いると、本発明の方法によって割り出されたＣＲＰレベルを、検出されたヘモグロビンに対して補正することができる。具体的には、図２２は、ヘモグロビンに対して補正されたＣＲＰを示す。

【0145】

下の表は、図２１に図示されたデータを示しており、試料ＩＤと、ヘモグロビンレベルと、補正前のＣＲＰ値とを関連付けている。

【0146】

【表13】

【0147】

続いて下において、この表は図２２に図示されたデータを示しており、試料ＩＤと、ヘモグロビンレベルと、補正後のＣＲＰ値とを関連付けている。

【0148】

【表14】

【0149】

このようにして、本発明者らは、個人のヘモグロビン量の変動を考慮するために光学密度の信号出力を調節して、ＣＲＰ値を正確に割り出す際の誤差を取り除いた。具体的には、本発明の方法は、補正されたＣＲＰレベルをユーザに提供する前に、すべての結果をＨＧＢ濃度１４ｇ／ｄＬに正規化する。

【0150】

結論
本明細書において本発明の好適な実施形態を説明したが、上記の説明は単なる例示に過ぎない。本明細書に開示された本発明のさらなる改良は、それぞれの技術分野の当業者によって想起されることになり、そのような改良はすべて、添付の請求項によって定められるような本発明の範囲内であるとみなされる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【手続補正書】

【提出日】2023-11-21

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【請求項1】

１人の患者に対して酵素結合免疫吸着アッセイを行うための、使い捨てバイオアッセイ診断カートリッジであって、前記使い捨てバイオアッセイ診断カートリッジは複数のウェルを有し、前記使い捨てバイオアッセイ診断カートリッジは、
内部側壁を有し、前記複数のウェルのうちの第１ウェルに配置されたピペットチップであって、前記内部側壁は、抗体で前処理及びコーティングされている、ピペットチップと、
前記複数のウェルのうちの第２ウェルに配された試薬混合物であって、前記試薬混合物は、ｐＨ安定剤、イオン性触媒制御剤、イオン性細胞内抑制制御剤、洗剤、陰性対照剤、キレート剤、及び殺生物性防腐剤からなる群から選択される少なくとも１種の試薬と、抗体と、複合体安定化剤とを備える、試薬混合物と、
前記複数のウェルの一体型キュベットに配された、少なくとも発色基質及び可視化試薬と、
を備える、使い捨てバイオアッセイ診断カートリッジ。

【請求項2】

請求項１に記載の使い捨てバイオアッセイ診断カートリッジであって、
前記内部側壁をコーティングしている前記抗体は、抗Ｃ反応性タンパク質抗体、抗シスタチンＣ抗体、抗ＩＧＦ－１抗体、抗アラニンアミノトランスフェラーゼ抗体、及び抗アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ抗体からなる群から選択されている、使い捨てバイオアッセイ診断カートリッジ。

【請求項3】

請求項１に記載の使い捨てバイオアッセイ診断カートリッジであって、
前記発色基質及び前記抗体は、１：１の割合で存在している、使い捨てバイオアッセイ診断カートリッジ。

【請求項4】

請求項１に記載の使い捨てバイオアッセイ診断カートリッジであって、
前記発色基質は、３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジンである、使い捨てバイオアッセイ診断カートリッジ。

【請求項5】

請求項１に記載の使い捨てバイオアッセイ診断カートリッジであって、
前記少なくとも１種の試薬は、前記発色基質及び前記可視化試薬の量に対応する量で存在している、使い捨てバイオアッセイ診断カートリッジ。

【請求項6】

請求項１に記載の使い捨てバイオアッセイ診断カートリッジであって、
前記少なくとも１種の試薬は、０．００２％サポニンと、０．０１％低発泡界面活性剤と、０．０２％アジ化ナトリウムとを有するリシン溶液の少なくとも１５０μｌの試薬混合物からなる、使い捨てバイオアッセイ診断カートリッジ。

【請求項7】

請求項１に記載の使い捨てバイオアッセイ診断カートリッジであって、
前記複数のウェルのうちの第３ウェルは、ＰＢＳと、０．０５％ポリソルベート系非イオン性界面活性剤と、０．０３％殺生物性防腐剤とを有している、使い捨てバイオアッセイ診断カートリッジ。

【請求項8】

請求項１に記載の使い捨てバイオアッセイ診断カートリッジであって、さらに、
抗Ｃ反応性タンパク質抗体、抗シスタチンＣ抗体、抗ＩＧＦ－１抗体、抗アラニンアミノトランスフェラーゼ抗体、及び抗アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ抗体からなる群から選択される抗体と、複合体安定化剤と、０．５％抗発泡／消泡剤とを有する第４ウェルを備える、使い捨てバイオアッセイ診断カートリッジ。

【請求項9】

請求項１に記載の使い捨てバイオアッセイ診断カートリッジであって、
前記ピペットチップの前記内部側壁をコーティングしている前記抗体は、抗シスタチンＣ抗体であり、前記第２ウェル中の前記少なくとも１種の試薬は、０．００２％サポニンと、０．０１％低発泡界面活性剤と、０．０２％アジ化ナトリウムとを有する溶解溶液からなる、使い捨てバイオアッセイ診断カートリッジ。

【請求項10】

請求項１に記載の使い捨てバイオアッセイ診断カートリッジであって、さらに、
１０ｍＭ ＰＢＳ、０．０５％ポリソルベート系非イオン性界面活性剤、及び０．０３％殺生物性防腐剤を有する第４ウェルと、
抗Ｃ反応性タンパク質抗体、抗シスタチンＣ抗体、抗ＩＧＦ－１抗体、抗アラニンアミノトランスフェラーゼ抗体、及び抗アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ抗体からなる群から選択される抗体、複合体安定化剤、及び０．５％抗発泡／消泡剤を有する第５ウェルと
を備える、使い捨てバイオアッセイ診断カートリッジ。

【請求項11】

請求項２に記載の使い捨てバイオアッセイ診断カートリッジであって、
前記一体型キュベットは、５３０ｎｍにて第１のＬＥＤを用いて第１の光検出を読み取ること、及び６６０ｎｍにて第２のＬＥＤを用いて第２の光検出を読み取ることを促進することが可能な、第１の壁及び第２の壁を有している、使い捨てバイオアッセイ診断カートリッジ。

【請求項12】

酵素結合免疫吸着バイオアッセイ診断キットであって、
フィンガースティック装置と、
複数のウェル及び光学キュベットを有するカートリッジであって、前記カートリッジは、前記複数のウェルのうちの１つに配置されたピペットチップ及び前記複数のウェルのうちの１つまたは複数の残りのウェルに配された、バイオアッセイ成分を有し、前記複数のウェルのうちの１つは、光学キュベットである、カートリッジと
を備え、
前記ピペットチップは、抗体でコーティングされた側壁を有し、
前記バイオアッセイ成分は、ｐＨ安定剤、イオン性触媒制御剤、イオン性細胞内抑制制御剤、洗剤、陰性対照剤、キレート剤、及び殺生物性防腐剤からなる群から選択された少なくとも１種の試薬と、抗体と、複合体安定化剤と、発色基質と、可視化試薬とを備える、酵素結合免疫吸着バイオアッセイ診断キット。

【請求項13】

洗浄時間を短縮しつつ、酵素結合免疫吸着アッセイを行うのに用いるための使い捨てピペットを作製する方法であって、前記方法は、
ピペットチップを、前記ピペットチップの内面をコーティングすることによって前処理する工程であって、前記前処理する工程は、
親和剤を含有している第１のコーティングを、前記ピペットチップの前記内面に沿って配置することと、
ブロッキング溶液を含有している第２のコーティングを、前記第１のコーティングの上に前記ピペットチップの前記内面に沿って配置することと、
活性防腐剤を含有している第３のコーティングを、前記第２のコーティングの上に前記ピペットチップの前記内面に沿って配置して、酵素結合免疫吸着アッセイを行うのに用いるためのコーティングされたピペットチップを形成することであって、前記酵素結合免疫吸着アッセイは、ｐＨ安定剤、イオン性触媒制御剤、イオン性細胞内抑制制御剤、洗剤、陰性対照剤、キレート剤、及び殺生物性防腐剤からなる群から選択される少なくとも１種の試薬混合物、抗体、及び複合体安定化剤を用いた前記コーティングされたピペットチップへの直接的なピペッティングを促進することによって、洗浄時間を短縮する、第３のコーティングを、前記第２のコーティングの上に前記ピペットチップの前記内面に沿って配置することと、
を備える、前処理する工程と、
発色基質及び可視化試薬を前記コーティングされたピペットチップの中の前記親和剤と直接反応させるために、前記発色基質及び前記可視化試薬を含んでいる１つのウェルをカートリッジ内に設ける工程と
を備える、方法。

【請求項14】

請求項１３に記載の方法であって、さらに、
抗体、抗体断片、組み換えタンパク質、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＡ／Ｇ、ストレプトアビジン、組み換えタンパク質断片、核酸、多糖類、糖タンパク質、ペプチドグリカン、分子インプリントポリマー、及びアプタマー分子からなる群から前記親和剤を選択することを備える、方法。

【請求項15】

請求項１３に記載の方法であって、さらに、
炭酸塩／重炭酸塩緩衝剤、スクロース緩衝剤、リン酸緩衝生理食塩水、及びトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン生理食塩水からなる群からコーティング緩衝剤を選択することを備える、方法。

【請求項16】

請求項１３に記載の方法であって、
前記第１のコーティングを前記ピペットチップの前記内面に沿って配置することは、
前記親和剤を選択することと、
コーティング緩衝剤を選択することと、
選択された前記抗体及び選択された前記コーティング緩衝剤を混合することによって、抗体溶液を調製することと、
混合された前記抗体溶液を前記ピペットチップに充填することと、
前記ピペットチップを第１の温度で所定の時間インキュベーションすることと
を備える、方法。

【請求項17】

請求項１３に記載の方法であって、
前記第２のコーティングを前記第１のコーティングの上に前記ピペットチップの前記内面に沿って配置することは、
前記ブロッキング溶液を選択することと、
前記ピペットチップに前記ブロッキング溶液を充填することと、
前記ピペットチップを第２の温度で所定の時間インキュベーションすることと
を備える、方法。

【請求項18】

請求項１３に記載の方法であって、
前記第３のコーティングを前記第２のコーティングの上に前記ピペットチップの前記内面に沿って配置することは、
前記活性防腐剤を選択することと、
前記ピペットチップに前記活性防腐剤を充填することと、
前記ピペットチップを第３の温度で所定の時間インキュベーションすることと
を備える、方法。

【国際調査報告】