特表 2023-550557 改良された小分子

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-12-01

(54)【発明の名称】改良された小分子

(51)【国際特許分類】

   C07D 519/00 20060101AFI20231124BHJP

   A61K 31/551 20060101ALI20231124BHJP

   A61K 47/55 20170101ALI20231124BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20231124BHJP

   C07K 5/062 20060101ALN20231124BHJP

【ＦＩ】

C07D519/00

A61K31/551

A61K47/55

A61P35/00

C07K5/062

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023552391

(86)(22)【出願日】2021-10-19

(85)【翻訳文提出日】2023-07-05

(86)【国際出願番号】 GB2021052698

(87)【国際公開番号】W WO2022101603

(87)【国際公開日】2022-05-19

(31)【優先権主張番号】2017717.6

(32)【優先日】2020-11-10

(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】518451183

【氏名又は名称】ユニバーシティ・オブ・ダンディー

(71)【出願人】

【識別番号】593089149

【氏名又は名称】プロメガ コーポレイション

【氏名又は名称原語表記】Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ

(74)【代理人】

【識別番号】100099759

【弁理士】

【氏名又は名称】青木 篤

(74)【代理人】

【識別番号】100123582

【弁理士】

【氏名又は名称】三橋 真二

(74)【代理人】

【識別番号】100117019

【弁理士】

【氏名又は名称】渡辺 陽一

(74)【代理人】

【識別番号】100141977

【弁理士】

【氏名又は名称】中島 勝

(74)【代理人】

【識別番号】100138210

【弁理士】

【氏名又は名称】池田 達則

(74)【代理人】

【識別番号】100182730

【弁理士】

【氏名又は名称】大島 浩明

(72)【発明者】

【氏名】アレッシオ チュッリ

(72)【発明者】

【氏名】アンドレア テスタ

(72)【発明者】

【氏名】キアーラ マニアチ

(72)【発明者】

【氏名】ニコライ マクキン

(72)【発明者】

【氏名】今出 慧海

(72)【発明者】

【氏名】ダネット ダニエルズ

(72)【発明者】

【氏名】クリスティン リッチング

【テーマコード（参考）】

4C072

4C076

4C086

4H045

【Ｆターム（参考）】

4C072MM10

4C072UU01

4C076AA95

4C076CC27

4C076EE59

4C086AA01

4C086AA02

4C086AA03

4C086CB30

4C086MA01

4C086MA04

4C086NA05

4C086NA14

4C086ZA33

4C086ZB07

4C086ZB11

4C086ZB26

4C086ZB33

4H045AA10

4H045AA30

4H045BA11

4H045BA50

4H045EA28

4H045FA10

(57)【要約】

本発明は、特に、タンパク質のブロモ反復配列および末端特異的配列（ＢＥＴ）ファミリー内のタンパク質に結合する、本明細書に記載の式Ｉの三官能性ＰＲＯＴＡＣに関し、特に、優先的結合を誘導する小分子Ｅ３ユビキチンリガーゼタンパク質結合リガンド化合物を含む、ＢＥＴファミリータンパク質のブロモドメイン内のＢＲＤ２タンパク質の分解を誘導するＰＲＯＴＡＣに関する。
【選択図】図５

【特許請求の範囲】

【請求項1】

式Ｉの化合物：

【化1】

（式中、ＢおよびＤは、それぞれ、ユビキチンリガーゼにより分解させようとしている標的タンパク質またはポリペプチドに結合するリガンドであり；
ＡはＥ３ユビキチンリガーゼタンパク質結合性リガンドであり；
ｍ、ｎおよびｏは、それぞれ独立に、０、１、２、３、４、５および６から選択される）
またはその薬学的に許容される塩、エナンチオマー、立体異性体、水和物、溶媒和物もしくは多形。

【請求項2】

ｍおよびｎが、それぞれ独立に、２、３、４、５および６から選択され、任意選択的にｍおよびｎが両方とも同じであって２、３、４、５および６から選択される、請求項１に記載の化合物。

【請求項3】

ｍおよびｎが、それぞれ独立に、２、３および４から選択され、任意選択的にｍおよびｎが両方とも同じであって２、３および４から選択される、請求項１または２に記載の化合物。

【請求項4】

ｍおよびｎが３である、請求項１～３のいずれか一項に記載の化合物。

【請求項5】

ｏが０および１から選択され、任意選択的にｏが０である、請求項１～４のいずれか一項に記載の化合物。

【請求項6】

以下：
ＢおよびＤが、それぞれ、タンパク質のブロモ反復配列および特異的末端配列（ＢＥＴ）ファミリー内のタンパク質に結合する化学部分である；
ＢおよびＤが、それぞれ、ブロモドメインの反復配列および特異的末端配列（ＢＥＴ）ファミリー内のタンパク質のＢＲＤ２、ＢＲＤ３および／またはＢＲＤ４ タンパク質の分解を誘導する化学部分であることができる；
ＢおよびＤが、それぞれ独立に、以下：

【化2】

から選択される
のうちの少なくとも１つである、請求項１～７のいずれか一項に記載の化合物。

【請求項7】

ＢおよびＤの少なくとも１つが

【化3】

である、請求項１～６のいずれか一項に記載の化合物。

【請求項8】

ＢおよびＤの両方が

【化4】

である、請求項１～７のいずれか一項に記載の化合物。

【請求項9】

Ａがフォン・ヒッペル－リンドゥ（ＶＨＬ）－Ｅ３ユビキチンリガーゼ結合リガンドまたはセレブロン（ＣＲＢＮ）－Ｅ３ユビキチンリガーゼリガンドから選択される、請求項１～９のいずれか一項に記載の化合物。

【請求項10】

以下：

【化5】

からなる群より選択される、請求項１～９のいずれか一項に記載の化合物。

【請求項11】

Ａが以下：

【化6】

から選択される、請求項１～１０のいずれか一項に記載の化合物。

【請求項12】

Ａが

【化7】

である、請求項１～１１のいずれか一項に記載の化合物。

【請求項13】

式Ｉの化合物が、式ＩＡ：

【化8】

（式中、ｐは２、３、４、５および６から選択され；そして
ｑは０、１、２から選択される）
を有する、請求項１～１２のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩、エナンチオマー、立体異性体、水和物、溶媒和物もしくは多形。

【請求項14】

ｐが２、３および４から選択され、任意選択的にｐが３である、請求項１３に記載の化合物。

【請求項15】

ｑが０および１から選択され、任意選択的にｑが０である、請求項１３または１４に記載の化合物。

【請求項16】

式Ｉの化合物が式ＩＢ：

【化9】

（式中、ｒは２、３、４、５および６から選択され；そして
ｓは０、１、２から選択される）
を有する、請求項１～１２のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩、エナンチオマー、立体異性体、水和物、溶媒和物もしくは多形。

【請求項17】

以下：
ｒが、２、３および４から選択され、任意選択的にｒが３である；
ｓが０および１から選択され、任意選択的にｓが０である
のうちの少なくとも１つである、請求項１６に記載の化合物。

【請求項18】

式Ｉの化合物が、式ＩＣ：

【化10】

（式中、ｔは２、３、４、５および６から選択され；そして
ｕは０、１および２から選択される）
を有する、請求項１～１２のいずれか一項に記載の化合物、
またはその薬学的に許容される塩、エナンチオマー、立体異性体、水和物、溶媒和物もしくは多形。

【請求項19】

以下：
ｔが２、３および４から選択され、任意選択的にｔが３である；
ｕが０および１から選択され、任意選択的にｕが０である
のうちの少なくとも１つである、請求項１８に記載の化合物。

【請求項20】

式Ｉの化合物が式ＩＤ：

【化11】

（式中、ｖは２、３、４、５および６から選択され；そして
ｗは０、１および２から選択される）
を有する、請求項１～１２のいずれか一項に記載の化合物、
またはその薬学的に許容される塩、エナンチオマー、立体異性体、水和物、溶媒和物もしくは多形。

【請求項21】

以下：
ｖが２、３および４から選択され、任意選択的にｖが３である；
ｗが０および１から選択され、任意選択的にｗが０である
のうちの少なくとも１つである、請求項２０に記載の化合物。。

【請求項22】

前記化合物が以下：
（ｉ）Ｎ，Ｎ′－（１１－（（２－（（（Ｓ）－１－（（２Ｓ，４Ｒ）－４－ヒドロキシ－２－（（４－（４－メチルチアゾール－５－イル）ベンジル））カルバモイル）ピロリジン－１－イル）－３，３－ジメチル－１－オキソブタン－２－イル）アミノ）－２－オキソエトキシ）メチル）－１１－メチル－３，６，９，１３，１６，１９－ヘキサオキサヘニコサン－１，２１－ジイル）ビス（２－（（Ｓ）－４－（４－クロロフェニル）－２，３，９－トリメチル－６Ｈ－チエノ［３，２－ｆ］［１，２，４］トリアゾロ［４，３－ａ］［１，４］ジアゼピン－６－イル）アセトアミド）；
（ｉｉ）Ｎ，Ｎ′－（１１－（（２－（２－（（（Ｓ）－１－（（２Ｓ，４Ｒ）－４－ヒドロキシ－２－（（４－（４－メチルチアゾール－５－イル）ベンジル）カルバモイル）ピロリジン－１－イル）－３，３－ジメチル－１－オキソブタン－２－イル）アミノ）－２－オキソエトキシ）エトキシ）メチル）－１１－メチル－３，６，９，１３，１６，１９－ヘキサオキサヘニコサン－１，２１－ジイル）ビス（２－（（Ｓ）－４－（４－クロロフェニル）－２，３，９－トリメチル－６Ｈ－チエノ［３，２－ｆ］［１，２，４］トリアゾロ［４，３－ａ］［１，４］ジアゼピン－６－イル）アセトアミド）；
（ｉｉｉ）Ｎ，Ｎ′－（１４－（（２－（（（Ｓ）－１－（（２Ｓ，４Ｒ）－４－ヒドロキシ－２－（（４－（４－メチルチアゾール－５－イル）ベンジル））カルバモイル）ピロリジン－１－イル）－３，３－ジメチル－１－オキソブタン－２－イル）アミノ）－２－オキソエトキシ）メチル）－１４－メチル－３，６，９，１２，１６，１９、２２，２５－オクタオキサヘプタコサン－１，２７－ジイル）ビス（２－（（Ｓ）－４－（４－クロロフェニル）－２，３，９－トリメチル－６Ｈ－チエノ［３，２－ｆ］［１，２，４］トリアゾロ［４，３－ａ］［１，４］ジアゼピン－６－イル）アセトアミド）；
（ｉｖ）Ｎ，Ｎ′－（１１－（（２－（（２－（（２－（２，６－ジオキソピペリジン－３－イル）－１，３－ジオキソイソインドリン－４－イル）アミノ）エチル）アミノ）－２－オキソエトキシ）メチル）－１１－メチル－３，６，９，１３，１６，１９－ヘキサオキサヘニコサン－１，２１－ジイル）ビス（２－（（Ｓ）－４－（４－クロロフェニル）－２，３，９－トリメチル－６Ｈ－チエノ［３，２－ｆ］［１，２，４］トリアゾロ［４，３－ａ］［１，４］ジアゼピン－６－イル）アセトアミド）；
（ｖ）Ｎ，Ｎ′－（１１－（（２－（２－（（２－（（２－（２，６－ジオキソピペリジン－３－イル）－１，３－ジオキソイソインドリン－４－イル）アミノ）エチル）アミノ）－２－オキソエトキシ）エトキシ）メチル）－１１－メチル－３，６，９，１３，１６，１９－ヘキサオキサヘニコサン－１，２１－ジイル）ビス（２－（（Ｓ）－４－（４－クロロフェニル）－２，３，９－トリメチル－６Ｈ－チエノ［３，２－ｆ］［１，２，４］トリアゾロ［４，３－ａ］［１，４］ジアゼピン－６－イル）アセトアミド）；
（ｖｉ）Ｎ，Ｎ′－（１４－（（２－（（２－（（２－（２，６－ジオキソピペリジン－３－イル）－１，３－ジオキソイソインドリン－４－イル）アミノ）エチル）アミノ）－２－オキソエトキシ）メチル）－１４－メチル－３，６，９，１２，１６，１９，２２，２５－オクタオキサヘプタコサン－１，２７－ジイル）ビス（２－（（Ｓ）－４－（４－クロロフェニル）－２，３，９－トリメチル－６Ｈ－チエノ［３，２－ｆ］［１，２，４］トリアゾロ［４，３－ａ］［１，４］ジアゼピン－６－イル）アセトアミド）；
（ｖｉｉ）Ｎ，Ｎ′－（１１－（（２－（（（Ｓ）－１－（（２Ｓ，４Ｓ）－４－ヒドロキシ－２－（（４－（４－メチルチアゾール－５－イル）ベンジル））カルバモイル）ピロリジン－１－イル）－３，３－ジメチル－１－オキソブタン－２－イル）アミノ）－２－オキソエトキシ）メチル）－１１－メチル－３，６，９，１３，１６，１９－ヘキサオキサヘニコサン－１，２１－ジイル）ビス（２－（（Ｓ）－４－（４－クロロフェニル）－２，３，９－トリメチル－６Ｈ－チエノ［３，２－ｆ］［１，２，４］トリアゾロ［４，３－ａ］［１，４］ジアゼピン－６－イル）アセトアミド）；
（ｖｉｉｉ）（２Ｓ，４Ｒ）－１－（（２０Ｓ）－２０－（ｔｅｒｔ－ブチル）－１－（（Ｒ）－４－（４－クロロフェニル）－２，３，９－トリメチル－６Ｈ－チエノ［３，２－ｆ］［１，２，４］トリアゾロ［４，３－ａ］［１，４］ジアゼピン－６－イル）－１４－（１３－（（Ｓ）－４－（４－クロロフェニル））－２，３，９－トリメチル－６Ｈ－チエノ［３，２－ｆ］［１，２，４］トリアゾロ［４，３－ａ］［１，４］ジアゼピン－６－イル）－１２－オキソ－２，５，８－トリオキサ－１１－アザトリデシル）－１４－メチル－２，１８－ジオキソ－６，９，１２，１６－テトラオキサ－３，１９－ジアザヘニコサン－２１－オイル）－４－ヒドロキシ－Ｎ－（４－（４－メチルチアゾール－５－イル）ベンジル）ピロリジン－２－カルボキサミド；
（ｉｘ）Ｎ，Ｎ′－（８－（（２－（（（Ｓ）－１－（（２Ｓ，４Ｒ）－４－ヒドロキシ－２－（（４－（４－メチルチアゾール－５－イル）ベンジル））カルバモイル）ピロリジン－１－イル）－３，３－ジメチル－１－オキソブタン－２－イル）アミノ）－２－オキソエトキシ）メチル）－８－メチル－３，６，１０，１３－テトラオキサペンタデカン－１，１５－ジイル）ビス（２－（（Ｓ）－４－（４－クロロフェニル）－２，３，９－トリメチル－６Ｈ－チエノ［３，２－ｆ］［１，２，４］トリアゾロ［４，３－ａ］［１，４］ジアゼピン－６－イル）アセトアミド）
から選択される、請求項１～１２のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩、エナンチオマー、立体異性体、水和物、溶媒和物もしくは多形。

【請求項23】

前記いずれかの請求項に記載された化合物と、その薬学的に許容されるビヒクルまたは希釈剤とを含む医薬組成物。

【請求項24】

薬剤として使用するための、請求項１～２２のいずれか一項に記載の化合物。

【請求項25】

良性の増殖性疾患、感染性または非感染性の炎症事象、自己免疫疾患；炎症性疾患；全身性炎症反応症候群；ウイルス感染症およびウイルス性疾患；眼科的疾患からなる群より独立に選択される、疾患または症状の予防または治療のための、請求項１～２２のいずれか一項に記載の化合物、または請求項２３に記載の医薬組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

発明の分野
本発明は、新規な小分子であるＥ３ユビキチンリガーゼタンパク質結合リガンド化合物、およびタンパク質分解標的キメラ（ＰＲＯＴＡＣ）におけるそれらの利用、並びにそれらの製造方法、および医学における使用に関する。本発明は、特に、ＢＥＴタンパク質（ブロモドメインの反復配列および特異的末端配列；Ｂｒｏｍｏ－ａｎｄ Ｅｔｒａ－ｔｅｒｍｉｎａｌ）ファミリー内のタンパク質に結合するＰＲＯＴＡＣに関し、特にＢＥＴファミリータンパク質のブロモドメイン内のＢＲＤ２タンパク質の優先的な分解を誘導する、小分子Ｅ３ユビキチンリガーゼタンパク質結合性リガンド化合物を含むＰＲＯＴＡＣに関する。

【背景技術】

【0002】

発明の背景
従来、標的分解性化合物は、結合が二価であるか一価であるかに応じてＰＲＯＴＡＣまたは分子接着剤（ｇｌｕｅ）のいずれかに分類されており、該化合物は、生物学および疾患治療のための療法を研究するうえでの新規クラスの化学的プローブとして大きな期待を集めている（参考文献（以下ｒｅｆ．とする）１－３）。

【0003】

分解剤（ｄｅｇｒａｄｅｒ）は三元複合体を形成し、標的タンパク質とＥ３ユビキチンリガーゼ成分を結び付け、ユビキチン化とその後のプロテアソームを介した標的タンパク質の分解を引き起こす。

【0004】

分子接着剤は、典型的には、Ｅ３リガーゼまたは標的のいずれかに一価で係合（ｅｎｇａｇｅｍｅｎｔ）し、三元複合体において非同族の結合パートナーの高度に協同的な動員（リクルート）を付随的に誘導する（ｒｅｆ．４－８）。

【0005】

対照的に、ＰＲＯＴＡＣは、伝統的に二官能性、すなわちリンカーによって連結された２つのリガンドから構成されており、その結果、標的またはＥ３成分を二元複合体として別々に係合するか、または標的とＥ３成分の両者を同時に係合して三元複合体を形成することができる（ｒｅｆ．９－１１）。この設計機能により、ＰＲＯＴＡＣは分子接着剤よりも広範な標的範囲を可能にするだけでなく、確立されたＥ３リガーゼバインダーを利用して、該設計を標準化することもできる。実際、強力なＰＲＯＴＡＣ分解剤は、核（ｒｅｆ．１２，１３，１４，１５，１６）、細胞質（ｒｅｆ．１１，１７，１８）、膜結合（ｒｅｆ．１９）、および多回通過膜貫通タンパク質（ｒｅｆ．２０）に対してフォン・ヒッペル・リンドウ（ｖｏｎ Ｈｉｐｐｅｒ－Ｌｉｎｄａｕ；ＶＨＬ）またはセレブロン（ｃｅｒｅｂｌｏｎ；ＣＲＢＮ）Ｅ３リガーゼのいずれかを最も多く動員するように開発されている。

【0006】

ＰＲＯＴＡＣは、三元複合体を介した複雑な作用機序により、それを構成している阻害剤と比較して予想外の利点を示す。例えば、ＰＲＯＴＡＣは、相同性の高い標的どうしを識別することができ（ｒｅｆ．２１－２４）、低い二成分結合親和性または低い細胞透過性を補完することができ、脆弱で機能的でない阻害剤であっても弾頭リガンドとして作用させることが可能である、触媒機構によって予想を上回る、かなり大きい能力を発揮することができる（ｒｅｆ．１５，２２，２５，２６）。

【0007】

さらに、ＰＲＯＴＡＣは、バイスタンダーのユビキチン化または不安定化のいずれかを介して、分解剤に直接係合していなくても、複合体中のタンパク質に作用することができる（ｒｅｆ．１５，２７，２８）。前述の利点と顕著な成功が実証されているにもかかわらず、ＰＲＯＴＡＣを効率的に設計することは困難であり、しばしば広範な化学的最適化を必要とする（ｒｅｆ．２９，３０）。

【0008】

阻害剤とは異なり、分解剤は、単純なバイナリー結合（ホモ二量体結合）の域を超えて機能しなければならない。むしろ、分解剤は一連の事象のカスケードを経由して機能し、本来は相互作用しない２つのタンパク質間の近接化を誘導することのみならず、Ｅ３リガーゼによる効率的なユビキチン化のために標的タンパク質を構造的に適切に配置させる、プロダクティブな（生産的な）三元複合体を創出することも必要でありうる（ｒｅｆ．３１，３２，３３）。

【0009】

ＰＲＯＴＡＣ三元複合体の最近のＸ線結晶構造学および関連する生物物理学的研究は、一部のＰＲＯＴＡＣ媒介三元複合体が、分子接着剤のように、協同的に結合できることを見事に実証しており、特にＶＨＬ－ＭＺ１－ＢＲＤ４^ＢＤ２三元複合体について顕著に示されている（ｒｅｆ．２１）。この研究とその後の研究は、生産的な標的ユビキチン化と、触媒的な低濃度での顕著な標的分解を促進するために、分解剤が、有利な複合体内相互作用によって強化された、十分な安定性、協同性、および滞留時間を備えた複合体を形成する必要があることを示しておる（ｒｅｆ．１５，２１，２２，３１，３２）。

【0010】

分子認識機能のこのような最適な「接着（ｇｌｕｉｎｇ）」は、着目の標的において定義上一価である従来のＰＲＯＴＡＣ分解剤では実現することが困難であるだろう。これは、三元複合体内の好ましいタンパク質間相互作用やその他の安定化相互作用を活用する能力を制限してしまう。

【0011】

実際、非協同的なＰＲＯＴＡＣ三元複合体、または負に協同的な同複合体もしばしば認められるが、これは下流のタンパク質ユビキチン化および分解に対して忍容性であるにもかかわらず、高濃度での顕著なフック効果などの好ましくない分解剤の薬理学的特性を引き起こし、多くの場合、緩慢で不完全な標的分解をもたらし得る（ｒｅｆ．１７，３４）。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0012】

本発明の目的は、これらの問題の少なくとも一部を軽減または対処することである。

【課題を解決するための手段】

【0013】

発明の概要
本発明者らは、ＢＥＴドメイン（ブロモドメインの反復配列および特異的末端配列）ファミリーメンバータンパク質であるＢＲＤ２、ＢＲＤ３およびＢＲＤ４の標的タンパク質分解を促進するために、三価（三官能価）のＰＲＯＴＡＣを利用する、新しい戦略を開発した。本発明者らは、二価の標的リガンドの効果とＥ３リガーゼ動員とを相乗させることにより、結合性、協同性および標的分解性が強化された三価ＰＲＯＴＡＣを創製する戦略を開発した。

【0014】

第一態様において、式Ｉの化合物：

【0015】

【化1】

【0016】

（式中、ＢおよびＤはそれぞれ、ユビキチンリガーゼにより分解させようとしている標的タンパク質またはポリペプチドに結合するリガンドであり；
ＡはＥ３ユビキチンリガーゼタンパク質結合性リガンドであり；
ｍ、ｎおよびｏはそれぞれ独立に、０、１、２、３、４、５および６から選択される）
またはその薬学的に許容される塩、エナンチオマー、立体異性体、水和物、溶媒和物もしくは多形が提供される。

【0017】

式Ｉの化合物において、ｍおよびｎは、それぞれ独立に、２、３、４、５および６から選択され得る。好ましい式Ｉの化合物では、ｍおよびｎはそれぞれ独立に２、３および４から選択され得る。

【0018】

式Ｉの化合物において、ｍおよびｎは両方とも同じであり、２、３、４、５および６から選択され得る。好ましい式Ｉの化合物では、ｍおよびｎは両方とも同じであり、２、３、および４から選択され得る。さらに好ましい式Ｉの化合物では、ｍおよびｎが両方とも３であってよい。

【0019】

式Ｉの化合物において、ｏは０および１から選択され得る。式Ｉの好ましい化合物において、ｏは０であってもよい。

【0020】

式Ｉの化合物において、ＢおよびＤはそれぞれ、タンパク質のＢＥＴ（ブロモドメインの反復配列および特異的末端配列）ファミリー内のタンパク質に結合する化学部分であり得る。式Ｉの化合物において、ＢおよびＤはそれぞれ、ＢＥＴファミリー内のＢＲＤ２、ＢＲＤ３、および／またはＢＲＤ４タンパク質の分解を誘導する化学部分であり得る。

【0021】

式Ｉの化合物において、ＢおよびＤは各々独立に、以下から選択され得る：

【0022】

【化2】

【0023】

好ましい実施形態では、ＢおよびＤの少なくとも１つが

【化3】

である。

【0024】

好ましい実施形態では、

【化4】

のキラル中心（不斉中心）はＳ配置を有する。

【0025】

いくつかの実施形態では、ＢまたはＤの一方が、

【化5】

であり、ＢまたはＤの他方が、

【化6】

である。

【0026】

すなわち、いくつかの実施形態では、ＢまたはＤの一方が、キラル中心にＳ配置を有する

【化7】

であり、そしてＢまたはＤの他方が、キラル中心にＲ配置を有する

【化8】

である。

【0027】

最も好ましい実施形態では、ＢおよびＤは両方とも、

【化9】

である。すなわち、ＢおよびＤはいずれもキラル中心にＳ配置を有する、

【0028】

【化10】

である。

【0029】

式Ｉの化合物において、Ａは、フォン・ヒッペル・リンドウ（ｖｏｎ Ｈｉｐｐｅｌ－Ｌｉｎｄａｕ；ＶＨＬ）－Ｅ３ユビキチンリガーゼ結合性リガンドまたはセレブロン（ｃｅｒｅｂｌｏｎ；ＣＲＢＮ）－Ｅ３ユビキチンリガーゼ結合性リガンドから選択することができる。

【0030】

式Ｉの化合物の好ましい実施形態では、Ａは以下から選択され得る：

【0031】

【化11】

【0032】

式Ｉの化合物のさらに好ましい実施形態では、Ａは以下から選択され得る：

【0033】

【化12】

【0034】

さらに好ましい実施形態では、Ａは

【化13】

であり得る。

【0035】

式Ｉの化合物は、式ＩＡ：

【化14】

【0036】

（式中、ｐは２、３、４、５および６から選択され；
ｑは０、１および２から選択される）を有するか、
またはその薬学的に許容される塩、エナンチオマー、水和物もしくは多形であることができる。

【0037】

式ＩＡの好ましい化合物において、ｐは２、３および４から選択され得る。さらに好ましい式ＩＡの化合物において、ｐは３であり得る。

【0038】

式ＩＡの好ましい化合物において、ｑは０および１から選択され得る。さらに好ましい式ＩＡの化合物において、ｑは０であり得る。

【0039】

式Ｉの化合物は、式ＩＢ：

【化15】

【0040】

（式中、ｒは２、３、４、５および６から選択され；
ｓは０、１および２から選択される）を有するか、
またはその薬学的に許容される塩、エナンチオマー、立体異性体、水和物、溶媒和物もしくは多形であり得る。

【0041】

式ＩＢの好ましい化合物において、ｒは２、３および４から選択され得る。さらに好ましい式ＩＢの化合物において、ｒは３であり得る。

【0042】

式ＩＢの好ましい化合物において、ｓは０および１から選択され得る。さらに好ましい式ＩＢの化合物において、ｓは０であり得る。

【0043】

式Ｉの化合物は、式ＩＣ：

【化16】

【0044】

（式中、ｔは２、３、４、５および６から選択され；
ｕは ０、１および２から選択される）
を有するか、またはその薬学的に許容される塩、エナンチオマー、立体異性体、水和物、溶媒和物もしくは多形であり得る。

【0045】

式ＩＣの好ましい化合物において、ｔは２、３および４から選択され得る。さらに好ましい式ＩＣの化合物において、ｔは３であり得る。

【0046】

式ＩＣの好ましい化合物において、ｕは０および１から選択され得る。さらに好ましい式ＩＣの化合物において、ｕは０であり得る。

【0047】

式Ｉの化合物は、式ＩＤ：

【化17】

【0048】

（式中、ｖは２、３、４、５、および６から選択され；
ｗは０、１および２から選択される）
を有するか、またはその薬学的に許容される塩、エナンチオマー、立体異性体、水和物、溶媒和物もしくは多形であり得る。

【0049】

好ましい式ＩＤの化合物において、ｖは２、３および４から選択され得る。さらに好ましい式ＩＤの化合物において、ｖは３であり得る。

【0050】

好ましい式ＩＤの化合物において、ｗは０および１から選択され得る。さらに好ましい式ＩＤの化合物において、ｗは０であり得る。

【0051】

式Ｉ、ＩＡ、ＩＢ、ＩＣ、およびＩＤの化合物は、以下：
（ｉ）Ｎ，Ｎ′－（１１－（（２－（（（Ｓ）－１－（（２Ｓ，４Ｒ）－４－ヒドロキシ－２－（（４－（４－メチルチアゾール－５－イル）ベンジル）カルバモイル）ピロリジン－１－イル）－３，３－ジメチル－１－オキソブタン－２－イル）アミノ）－２－オキソエトキシ）メチル）－１１－メチル－３，６，９，１３，１６，１９－ヘキサオキサヘニコサン－１，２１－ジイル）ビス（２－（（Ｓ）－４－（４－クロロフェニル）－２，３，９－トリメチル－６Ｈ－チエノ［３，２－ｆ］［１，２，４］トリアゾロ［４，３－ａ］［１，４］ジアゼピン－６－イル）アセトアミド）；
（ｉｉ）Ｎ，Ｎ′－（１１－（（２－（２－（（（Ｓ）－１－（（２Ｓ，４Ｒ）－４－ヒドロキシ－２－（（４－（４－メチルチアゾール－５－イル）ベンジル）カルバモイル）ピロリジン－１－イル）－３，３－ジメチル－１－オキソブタン－２－イル）アミノ）－２－オキソエトキシ）エトキシ）メチル）－１１－メチル－３，６，９，１３，１６，１９－ヘキサオキサヘニコサン－１，２１－ジイル）ビス（２－（（Ｓ）－４－（４－クロロフェニル）－２，３，９－トリメチル－６Ｈ－チエノ［３，２－ｆ］［１，２，４］トリアゾロ［４，３－ａ］［１，４］ジアゼピン－６－イル）アセトアミド）；
（ｉｉｉ）Ｎ，Ｎ′－（１４－（（２－（（（Ｓ）－１－（（２Ｓ，４Ｒ）－４－ヒドロキシ－２－（（４－（４－メチルチアゾール－５－イル）ベンジル）カルバモイル）ピロリジン－１－イル）－３，３－ジメチル－１－オキソブタン－２－イル）アミノ）－２－オキソエトキシ）メチル）－１４－メチル－３，６，９，１２，１６，１９，２２，２５－オクタオキサヘプタコサン－１，２７－ジイル）ビス（２－（（Ｓ）－４－（４－クロロフェニル）－２，３，９－トリメチル－６Ｈ－チエノ［３，２－ｆ］［１，２，４］トリアゾロ［４，３－ａ］［１，４］ジアゼピン－６－イル）アセトアミド）；
（ｉｖ）Ｎ，Ｎ′－（１１－（（２－（（２－（（２－（２，６－ジオキソピペリジン－３－イル）－１，３－ジオキソイソインドリン－４－イル）アミノ）エチル）アミノ）－２－オキソエトキシ）メチル）－１１－メチル－３，６，９，１３，１６，１９－ヘキサオキサヘニコサン－１，２１－ジイル）ビス（２－（（Ｓ）－４－（４－クロロフェニル）－２，３，９－トリメチル－６Ｈ－チエノ［３，２－ｆ］［１，２，４］トリアゾロ［４，３－ａ］［１，４］ジアゼピン－６－イル）アセトアミド）；
（ｖ）Ｎ，Ｎ′－（１１－（（２－（２－（（２－（（２－（２，６－ジオキソピペリジン－３－イル）－１，３－ジオキソイソインドリン－４－イル）アミノ）エチル）アミノ）－２－オキソエトキシ）エトキシ）メチル）－１１－メチル－３，６，９，１３，１６，１９－ヘキサオキサヘニコサン－１，２１－ジイル）ビス（２－（（Ｓ）－４－（４－クロロフェニル）－２，３，９－トリメチル－６Ｈ－チエノ［３，２－ｆ］［１，２，４］トリアゾロ［４，３－ａ］［１，４］ジアゼピン－６－イル）アセトアミド）；
（ｖｉ）Ｎ，Ｎ′－（１４－（（２－（（２－（（２－（２，６－ジオキソピペリジン－３－イル）－１，３－ジオキソイソインドリン－４－イル）アミノ）エチル）アミノ）－２－オキソエトキシ）メチル）－１４－メチル－３，６，９，１２，１６，１９，２２，２５－オクタオキサヘプタコサン－１，２７－ジイル）ビス（２－（（Ｓ）－４－（４－クロロフェニル）－２，３，９－トリメチル－６Ｈ－チエノ［３，２－ｆ］［１，２，４］トリアゾロ［４，３－ａ］［１，４］ジアゼピン－６－イル）アセトアミド）；
（ｖｉｉ）Ｎ，Ｎ′－（１１－（（２－（（（Ｓ）－１－（（２Ｓ，４Ｓ）－４－ヒドロキシ－２－（（４－（４－メチルチアゾール－５－イル）ベンジル））カルバモイル）ピロリジン－１－イル）－３，３－ジメチル－１－オキソブタン－２－イル）アミノ）－２－オキソエトキシ）メチル）－１１－メチル－３，６，９，１３，１６，１９－ヘキサオキサヘニコサン－１，２１－ジイル）ビス（２－（（Ｓ）－４－（４－クロロフェニル）－２，３，９－トリメチル－６Ｈ－チエノ［３，２－ｆ］［１，２，４］トリアゾロ［４，３－ａ］［１，４］ジアゼピン－６－イル）アセトアミド）；
（ｖｉｉｉ）（２Ｓ，４Ｒ）－１－（（２０Ｓ）－２０－（ｔｅｒｔ－ブチル）－１－（（Ｒ）－４－（４－クロロフェニル）－２，３，９－トリメチル－６Ｈ－チエノ［３，２－ｆ］［１，２，４］トリアゾロ［４，３－ａ］［１，４］ジアゼピン－６－イル）－１４－（１３－（（Ｓ）－４－（４－クロロフェニル））－２，３，９－トリメチル－６Ｈ－チエノ［３，２－ｆ］［１，２，４］トリアゾロ［４，３－ａ］［１，４］ジアゼピン－６－イル）－１２－オキソ－２，５，８－トリオキサ－１１－アザトリデシル）－１４－メチル－２，１８－ジオキソ－６，９，１２，１６－テトラオキサ－３，１９－ジアザヘニコサン－２１－オイル）－４－ヒドロキシ－Ｎ－（４－（４－メチルチアゾール－５－イル）ベンジル）ピロリジン－２－カルボキサミド；
（ｉｘ）Ｎ，Ｎ′－（８－（（２－（（（Ｓ）－１－（（２Ｓ，４Ｒ）－４－ヒドロキシ－２－（（４－（４－メチルチアゾール－５－イル）ベンジル）カルバモイル）ピロリジン－１－イル）－３，３－ジメチル－１－オキソブタン－２－イル）アミノ）－２－オキソエトキシ）メチル）－８－メチル－３，６，１０，１３－テトラオキサペンタデカン－１，１５－ジイル）ビス（２－（（Ｓ）－４－（４－クロロフェニル）－２，３，９－トリメチル－６Ｈ－チエノ［３，２－ｆ］［１，２，４］トリアゾロ［４，３－ａ］［１，４］ジアゼピン－６－イル）アセトアミド）；
またはその薬学的に許容される塩、エナンチオマー、立体異性体、水和物、溶媒和物もしくは多形から選択され得る。

【0052】

本明細書で使用する場合、「薬学的に許容される塩」という用語は、健全な医学的判断の範囲内で、ヒトおよび下等動物の組織と接触して使用するのに適した、過度の毒性、刺激、アレルギー反応などがなく、合理的なベネフィット／リスク比に見合った、本発明の方法によって形成される化合物の塩を指す。薬学的に許容される塩は当技術分野で周知である。例えば、Ｓ．Ｍ．Ｂｅｒｇｅらは、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、６６：１－１９（１９７７）において、薬学的に許容される塩を具体的に記載している。それらの塩は、本発明の化合物の最終的な単離および精製中にその場で調製することができ、または遊離塩基官能基を適切な有機酸と反応させることによって個別に調製することができる。本明細書での使用に適した薬学的に許容される塩の例としては、限定されないが、非毒性の酸付加塩が挙げられ、酸付加塩は、塩酸、臭化水素酸、リン酸、硫酸および過塩素酸などの無機酸と共に、または酢酸、マレイン酸、酒石酸、クエン酸、コハク酸もしくはマロン酸などの有機酸と共に形成される、またはイオン交換などの当技術分野で使用される他の方法を使用することにより形成される、アミノ基の塩である。

【0053】

他の薬学的に許容される塩には、限定されるものではないが、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスコルビン酸塩、アスパラギン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、重硫酸塩、ホウ酸塩、酪酸塩、カンファー酸塩、カンファースルホン酸塩、クエン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、ギ酸塩、フマル酸塩、グルコヘプトン酸塩、グリセロリン酸塩、グルコン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、ヨウ化水素酸塩、２－ヒドロキシエタンスルホン酸塩、ラクトビオン酸塩、乳酸塩、ラウリン酸塩、ラウリル硫酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メタンスルホン酸塩、２－ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、パモ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３－フェニルプロピオン酸塩、リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、ｐ－トルエンスルホン酸塩、ウンデカン酸塩、吉草酸塩等が挙げられる。代表的なアルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩としては、ナトリウム、リチウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム塩などが挙げられる。さらに薬学的に許容される塩としては、適切な場合、非毒性のアンモニウム塩、第四級アンモニウム塩、並びにハロゲン化物イオン、水酸化物イオン、カルボン酸イオン、硫酸イオン、リン酸イオン、硝酸イオン、炭素原子数１～６のアルキルスルホン酸イオンおよびアリールスルホン酸イオンなどの対イオンを使用して形成される、アミンカチオン塩が挙げられる。

【0054】

本発明のＰＲＯＴＡＣ化合物は、本発明の化合物をｉｎ ｖｉｖｏ（生体内）で遊離する、薬学的に許容されるプロドラッグとして投与することができる。本明細書で使用するときの「プロドラッグ」とは、代謝手段により（例えば、加水分解により）ｉｎ ｖｉｖｏで変換され、本発明の式によって表される任意の化合物を与える化合物を意味する。例えば“Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｄｒｕｇｓ， Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ”、第５章、１１３～１９１（１９９１）；Ｂｕｎｄｇａａｒｄ他、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒ Ｒｅｖｉｅｗｓ、８：１－３８（１９９２）；およびＢｅｒｎａｒｄ Ｔｅｓｔａ ＆ Ｊｏａｃｈｉｍ Ｍａｙｅｒ、“Ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｄｒｕｇ ａｎｄ Ｐｒｏｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ－Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｌｔｄ．（２００３）で論じられているように、プロドラッグの様々な形態が当技術分野で知られている。

【0055】

本発明によって想定される置換基および変数の組み合わせは、安定な化合物の形成をもたらすもののみである。本明細書で使用する「安定な」という用語は、製造を可能にするのに十分な安定性を有し、且つ本明細書で詳述する目的（例えば、対象への治療的または予防的投与）に有用であるのに十分な期間にわたって化合物の完全性を維持する化合物のことを指す。

【0056】

関連用語は、上記の定義および技術分野での一般的な使用法に従って適宜解釈されるものとする。

【0057】

本明細書で定義される式ＩのＰＲＯＴＡＣ化合物に使用される式Ｉの化合物は、特定された立体異性体として表される場合がある。このような化合物の絶対配置は、例えばＸ線回折またはＮＭＲなどの当業界で既知の方法および／または既知の立体化学の出発物質からの示唆を使用して決定することができる。

【0058】

本発明にかかる医薬組成物は、好ましくは、指定された立体異性体の実質上立体異性的に純粋な調製物を含むであろう。

【0059】

本明細書に記載の化合物および中間体の純粋な立体異性体は、前記化合物または中間体の同一基本分子構造の他のエナンチオマーまたはジアステレオマー形態を実質的に含まない異性体として定義される。特に、「立体異性的に純粋な」という用語は、立体異性体過剰が少なくとも８０％（すなわち、１異性体が最低９０％で、他の可能な異性体が最大１０％）から立体異性体過剰が最大１００％（すなわち、１異性体が１００％で、他の異性体は存在しない）までである化合物または中間体に関し、より具体的には、立体異性体過剰が９０％～１００％、さらにより特定的には、立体異性体過剰が９４％～１００％、最も特定的には立体異性体過剰が９７％～１００％である化合物または中間体に関する。「エナンチオマー的に純粋な」および「ジアステレオマー的に純粋な」という用語も同様に解釈されるべきであるが、問題の混合物のそれぞれのエナンチオマー過剰およびジアステレオマー過剰を考慮する必要がある。

【0060】

本明細書に詳述する化合物および中間体の純粋な立体異性体は、当該技術分野で知られている手順を適用することによって得ることができる。例えば、エナンチオマーは、光学活性酸または塩基を用いたジアステレオマー塩の選択的結晶化（分別結晶）によって互いに分割することができる。その例としては、酒石酸、ジベンゾイル酒石酸、ジトルオイル酒石酸、カンファースルホン酸などが挙げられる。あるいは、エナンチオマーは、キラル固定相を使用するクロマトグラフィー技術によって分離することもできる。前記立体化学的に純粋な異性体は、反応が立体特異的に起こる場合には、適切な出発物質の対応する純粋な立体化学的な異性体から誘導することもできる。好ましくは、特定の立体異性体が望ましい場合、前記化合物は立体特異的な製造方法によって合成される。これらの方法は、有利にはエナンチオマー的に純粋な出発物質を使用するであろう。

【0061】

本明細書で定義される式ＩのＰＲＯＴＡＣ化合物に使用するための式Ｉの化合物のジアステレオマーラセミ体は、従来の方法により個別に得ることができる。有利に使用できる適切な物理的分離方法は、例えば、選択的結晶化（分別結晶）およびクロマトグラフィー、例えば、カラムクロマトグラフィーである。

【0062】

本発明は、Ｂがタンパク質のＢＥＴ（ブロモドメインの反復配列および特異的末端配列）ファミリー内のタンパク質に結合する化学成分である、式ＩのＰＲＯＴＡＣ化合物、好ましくは、ＢがＢＲＤ２、ＢＲＤ３およびＢＲＤ４から独立に選択されたＢＥＴファミリータンパク質内のタンパク質に結合する化学成分である式ＩのＰＲＯＴＡＣ化合物、特にＢがＢＥＴファミリータンパク質内のＢＲＤ２タンパク質の分解を選択的に誘導する化学成分である、式ＩのＰＲＯＴＡＣ化合物を提供する。

【0063】

さらなる態様において、本発明は、薬剤として使用するための、本明細書に定義される式ＩのＰＲＯＴＡＣ化合物を提供する。

【0064】

本明細書で使用される「対象」という用語は、哺乳動物を指す。したがって、対象とは、例えば、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、モルモットなどを指す。好ましくは、対象はヒトである。対象がヒトである場合、対象は本明細書では患者（被験体）とも称され得る。

【0065】

「治療（処置）する」、「治療（処置）すること」および「治療（処置）」とは、疾患および／またはそれに付随する症状を緩和または軽減する方法を指す。

【0066】

「治療上有効な量」という用語は、疾病、疾患または病気の状態を治療、治癒または改善するのに有効な量を意味する。

【0067】

本発明のさらなる態様は、ＢＥＴ（Ｂｒｏｍｏ－ａｎｄ Ｅｘｔｒａ－ｔｅｒｍｉｎａｌ）ファミリー内のタンパク質ＢＲＤ２、ＢＲＤ３、およびＢＲＤ４のうちの１つまたは複数のタンパク質のタンパク質活性の調節解除（ｄｅｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）に関連する疾患または症状の予防または治療方法であって、前記疾患または状態に罹患している、またはそれにさらされる可能性がある対象への式ＩのＰＲＯＴＡＣ化合物の投与を含む治療方法を提供する。本発明の関連する態様は、ＢＥＴタンパク質活性の調節解除に関連する疾患または症状の治療または予防における式ＩのＰＲＯＴＡＣ化合物の使用を提供する。さらに関連する態様は、ＢＥＴタンパク質活性の調節解除に関連する疾患または症状の治療または予防のための、本明細書に定義される式ＩのＰＲＯＴＡＣ化合物の使用を提供する。

【0068】

本発明のさらなる態様は、タンパク質ＢＲＤ２、ＢＲＤ３、およびＢＲＤ４のＢＥＴ（ブロモドメインの反復配列および特異的末端配列）ファミリー内の１つ以上のタンパク質のタンパク質活性の調節解除に関連する疾患または症状の予防または治療方法を提供する。前記疾患または状態に罹患しているか、またはそれにさらされる可能性が高い対象に、治療有効量の式ＩのＰＲＯＴＡＣ化合物を投与することを含む。本発明の関連する態様は、ＢＥＴタンパク質活性の調節解除に関連する疾患または症状の治療または予防における、治療有効量の式ＩのＰＲＯＴＡＣ化合物の使用を提供する。さらに関連する態様は、ＢＥＴタンパク質活性の調節解除に関連する疾患または状態の治療または予防のための、本明細書に定義される式ＩのＰＲＯＴＡＣ化合物の治療有効量の使用を提供する。

【0069】

本発明のさらなる態様は、前記疾患または状態に罹患している、またはそれにさらされる可能性がある対象に、本明細書に定義される式ＩのＰＲＯＴＡＣ化合物を投与することを含む、ＢＥＴファミリータンパク質のブロモドメイン内のＢＲＤ２タンパク質の選択的分解に関連する疾患または状態の予防または治療方法を提供する。本発明の関連する態様は、ＢＥＴファミリータンパク質のブロモドメイン内でのＢＲＤ２タンパク質の選択的分解に関連する疾患または症状の治療または予防における、式ＩのＰＲＯＴＡＣ化合物の使用を提供する。さらに関連する態様は、ＢＥＴファミリータンパク質のブロモドメイン内のＢＲＤ２タンパク質の選択的分解に関連する疾患または症状の治療または予防のための、式ＩのＰＲＯＴＡＣ化合物の使用を提供する。

【0070】

本明細書に定義される式ＩのＰＲＯＴＡＣ化合物の投与を介して治療することができる、タンパク質ＢＲＤ２、ＢＲＤ３、およびＢＲＤ４のＢＥＴ（ブロモドメインの反復配列および特異的末端配列）ファミリー内の１つ以上のタンパク質のタンパク質活性の調節解除に関連する疾患または状態には、次のものが含まれる：癌、良性の増殖性疾患、感染性または非感染性の炎症状態；自己免疫疾患；炎症性疾患；全身性炎症反応症候群；ウイルス感染症およびウイルス性疾患；および眼科疾患。

【0071】

本発明はまた、医学における使用、特にＢＥＴ（ブロモドメインの反復配列および特異的末端配列）ファミリー内のタンパク質に結合する状態または疾患における使用のための、本明細書に詳述される任意の態様または好ましい態様による、式ＩのＰＲＯＴＡＣ化合物を提供する。本発明は、ＢＲＤ２、ＢＲＤ３、およびＢＲＤ４から独立して選択されるタンパク質の使用に関連しており、特に以下から独立して選択される１つ以上の状態または疾患の治療における使用に関連している：良性の増殖性疾患；感染性または非感染性の炎症事象；自己免疫疾患；炎症性疾患；全身性炎症反応症候群；ウイルス感染症およびウイルス性疾患；並びに眼科疾患。

【0072】

また、本明細書では、哺乳動物、特にそのような治療を必要とするヒトに対して、癌（がん）の治療に使用するための、本明細書のいずれかの態様による式ＩのＰＲＯＴＡＣ化合物、および本明細書のいずれかの態様による式ＩのＰＲＯＴＡＣ化合物の有効量の投与による癌の治療方法も提供される。本明細書で定義される式ＩのＰＲＯＴＡＣ化合物の投与を介して治療することができる癌の種類には、上皮細胞傷害に関連する癌腫型の癌、例えば、乳癌、前立腺癌、肺癌、膵臓癌および結腸癌；間葉系細胞障害に関連する肉腫型の癌；リンパ腫；白血病、例えば急性骨髄性白血病など；精巣癌や卵巣癌などの多能性細胞に関連する癌および／または癌性腫瘍が含まれる。

【0073】

本発明の化合物を治療に使用することができる癌の例としては、副腎癌、腺房細胞癌、聴神経腫、末端性黒子性黒色腫、先端汗腺腫、急性好酸球性白血病、急性赤血球性白血病、急性リンパ芽球性白血病、急性巨核芽球性白血病、急性単球性白血病、急性前骨髄球性白血病、腺癌、腺様嚢胞癌、腺腫、腺腫様歯原性腫瘍、腺扁平上皮癌、脂肪組織腫瘍、副腎皮質癌、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫、進行性ＮＫ細胞白血病、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、肺胞横紋筋肉腫、肺胞軟部肉腫、エナメル上皮線維腫、未分化大細胞型リンパ腫、未分化甲状腺癌、血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫、血管筋脂肪腫、血管肉腫、星状細胞腫、非定型奇形性ラブドイド腫瘍、Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、Ｂ細胞リンパ腫、基底細胞癌、胆道癌、膀胱癌、芽腫、骨肉腫、ブレンナー腫瘍、褐色腫瘍、バーキットリンパ腫、乳癌、脳腫瘍、癌腫、上皮内癌、癌肉腫、軟骨腫瘍、セメント腫、骨髄性肉腫、軟骨腫、脊索腫、絨毛癌、脈絡叢乳頭腫、腎臓明細胞肉腫、頭蓋咽頭腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、子宮頸癌、結腸直腸癌、デゴス病、線維形成性小円形細胞腫瘍、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、胚形成不全神経上皮腫瘍、胚芽細胞腫、胎児性癌、内分泌腺腫瘍、内皮洞腫瘍、腸疾患関連Ｔ細胞リンパ腫、食道癌、胎児線維腫、線維肉腫、濾胞性リンパ腫、濾胞性甲状腺癌、神経節神経腫、消化管癌、生殖細胞腫瘍、妊娠絨毛癌、巨細胞線維芽腫、骨巨細胞腫、グリア腫瘍、多形神経膠芽腫、神経膠腫、脳神経膠腫症、グルカゴノーマ、性腺芽腫、顆粒膜細胞腫瘍、婦人科芽腫、胆嚢癌、胃癌、有毛細胞白血病、血管芽腫、頭頸部がん、血管周皮腫、血液悪性腫瘍、肝芽腫、肝脾Ｔ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、浸潤性小葉癌、腸癌、腎臓癌、喉頭癌、悪性黒子、致死性正中癌、白血病、ライディッヒ細胞腫瘍、脂肪肉腫、肺癌、リンパ管腫、リンパ管肉腫、リンパ上皮腫、リンパ腫、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、肝癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、ＭＡＬＴリンパ腫、悪性線維性組織球腫、末梢悪性末梢神経鞘腫瘍、悪性トリトン腫瘍、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、マスト細胞白血病、縦隔胚細胞腫瘍、乳房髄様癌、甲状腺髄様癌、髄芽腫、黒色腫、髄膜腫、メルケル細胞癌、中皮腫、転移性尿路上皮癌、混合ミュラー管腫瘍、粘液性腫瘍、多発性骨髄腫、筋組織新生物、菌状息肉腫、粘液性脂肪肉腫、粘液腫、粘液肉腫、上咽頭癌、神経鞘腫、神経芽腫、神経線維腫、神経腫、結節性黒色腫、眼癌、乏突起星状細胞腫、乏突起膠腫、腫瘍細胞腫、視神経鞘髄膜腫、視神経腫瘍、口腔癌、骨肉腫、卵巣癌、パンコースト腫瘍、甲状腺乳頭癌、傍神経節腫、松果体芽腫、松果細胞腫、下垂体細胞腫、下垂体腺腫、下垂体腫瘍、形質細胞腫、多胚腫、前駆体Ｔリンパ芽球性リンパ腫、原発性中枢神経系リンパ腫、原発性滲出性リンパ腫、原発性腹膜癌、前立腺癌、膵臓癌、咽頭癌、腹膜偽粘液腫、腎細胞癌、腎髄質癌、網膜芽細胞腫、横紋筋腫、横紋筋肉腫、リヒター形質転換、直腸癌、肉腫、神経鞘腫症、セミノーマ、セルトリ細胞腫瘍、性索生殖腺間質腫瘍、印環細胞癌、皮膚癌、小型青色円形細胞腫瘍、小細胞癌、軟部組織肉腫、ソマトスタチノーマ、すすいぼ、脊髄腫瘍、脾臓辺縁帯リンパ腫、扁平上皮癌、滑膜肉腫、セザリー病、小腸癌、扁平上皮癌、胃癌、Ｔ細胞リンパ腫、精巣癌、鞘腫、甲状腺癌、移行上皮癌、咽頭癌、尿膜管癌、泌尿生殖器癌、尿路上皮癌、ブドウ膜黒色腫、子宮癌、疣状癌、視覚経路神経膠腫、外陰癌、膣癌、ワルデンシュトローム・マクログロブリン血症、ワルシン腫瘍、ウィルムス腫瘍、血液癌（白血病など）、肺癌、乳癌、結腸癌を含む上皮癌、正中線癌、間葉癌、肝臓癌、腎臓および神経腫瘍が挙げられる。

【0074】

したがって、本発明の化合物を治療に使用することができる良性増殖性障害の例としては、良性軟部組織腫瘍、骨腫瘍、脳および脊椎腫瘍、眼瞼および眼窩腫瘍、肉芽腫、脂肪腫、髄膜腫、多発性内分泌腫瘍、鼻ポリープ、下垂体腫瘍、プロラクチノーマ、脳偽性腫瘍、脂漏性角化症、胃ポリープ、甲状腺結節、膵臓の嚢胞性新生物、血管腫、声帯結節、ポリープおよび嚢胞、キャッスルマン病、慢性毛嚢炎、皮膚線維腫、柱状嚢胞、化膿性肉芽腫、および若年性ポリポーシス症候群が挙げられるが、これらに限定されない。

【0075】

また、本明細書では、感染性および非感染性の炎症事象、並びに自己免疫および他の炎症性の疾患、障害および症候群の治療に使用するための、本明細書のいずれかの態様による式ＩのＰＲＯＴＡＣ化合物、並びに感染性および非感染性の炎症事象並びに自己免疫性および他の炎症性疾患、障害および症候群の治療方法であって、本明細書のいずれかの態様に従って式ＩのＰＲＯＴＡＣ化合物の有効量を、哺乳動物に、特にそのような治療が必要なヒトに投与することによる治療方法も提供される。本発明の化合物を治療に使用することができる感染性および非感染性の炎症事象並びに自己免疫性および他の炎症性の疾患、障害および症候群の例には、限定されるものではないが、炎症性骨盤疾患（ＰＩＤ）、痛風、胸膜炎、湿疹、脾炎、喉頭炎、甲状腺炎、前立腺炎、咽頭炎、サルコイドーシス、脂漏性皮膚炎、過敏性腸症候群（ＩＢＳ）、憩室炎、尿道炎、皮膚の日焼け、副鼻腔炎、肺炎、脳炎、髄膜炎、心筋炎、腎炎、骨髄炎、筋炎、肝炎、胃炎、腸炎、皮膚炎、歯肉炎、虫垂炎、膵炎、胆嚢炎、無ガンマグロブリン血症、乾癬、アレルギー反応、クローン病、過敏性腸症候群、潰瘍性大腸炎、シェーグレン病、組織移植片拒絶反応、移植臓器の超急性拒絶反応、喘息、アレルギー性鼻炎、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、自己免疫性多腺症（自己免疫性多腺症候群としても知られる）、自己免疫性脱毛症、悪性貧血、糸球体腎炎、皮膚筋炎、多発性硬化症、一部のミオパチー、強皮症、血管炎、自己免疫性溶血性および血小板減少性状態、グッドパスチャー症候群、アテローム性動脈硬化症、アジソン病、パーキンソン病、アルツハイマー病、Ｉ型糖尿病、敗血症性ショック、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、関節リウマチ、乾癬性関節炎、若年性関節炎、変形性関節症、慢性特発性血小板減少性紫斑病、ワルデンストロームマクログロブリン血症、重症筋無力症、橋本甲状腺炎、アトピー皮膚炎、変性関節疾患、白斑、自己免疫性下垂体機能低下症、ギラン・バレー症候群、ベーチェット病、強皮症、菌状息肉症、急性炎症反応（急性呼吸窮迫症候群、虚血／再灌流傷害など）、グレーヴス（バセドウ病）が挙げられる。

【0076】

他の実施形態では、本発明は、全身性炎症反応症候群の治療に使用するための、本明細書のいずれかの態様による式ＩのＰＲＯＴＡＣ化合物、および、本明細書のいずれかの態様による式Ｉの化合物を、哺乳動物、特にそのような治療を必要とするヒトに投与することを含む、有効量のＰＲＯＴＡＣの投与による全身性炎症反応症候群の治療方法を提供する。本発明の化合物を治療に使用することができる全身性炎症反応症候群の例としては、ＬＰＳ誘発性内毒素ショックおよび／または細菌誘発性敗血症が挙げられる。

【0077】

本明細書で定義される構造式ＩのＰＲＯＴＡＣ化合物の投与によって治療することができる自己免疫疾患および自己免疫関連疾患には、次のものが含まれる：急性壊死性出血性白質脳炎；急性壊死性出血性脊髄炎；急性散在性脳脊髄炎（ＡＤＥＭ）；アジソン病；無ガンマグロブリン血症；円形脱毛症；アミロイドーシス；強直性脊椎炎；抗ＧＢＭ／抗ＴＢＭ腎炎；抗リン脂質症候群（ＡＰＳ）；自己免疫性血管浮腫；自己免疫性再生不良性貧血；自己免疫性自律神経失調症；自己免疫性肝炎；自己免疫性高脂血症；自己免疫性免疫不全症；自己免疫性内耳疾患（ＡＩＥＤ）；自己免疫性心筋炎；自己免疫性卵巣炎；自己免疫性膵炎；自己免疫性網膜症；自己免疫性血小板減少性紫斑病（ＡＴＰ）；自己免疫性甲状腺疾患；自己免疫性蕁麻疹；軸索および神経性神経障害；バロ病；ベーチェット病；膨隆性類天疱瘡；心筋症；キャッスルマン病；セリアック病；シャーガス病；慢性疲労症候群；慢性炎症性脱髄性多発神経障害（ＣＩＤＰ）；慢性再発性多巣性口骨炎（ＣＲＭＯ）；チャーグ・シュトラウス症候群；重症類天疱瘡／良性粘膜類天疱瘡；クローン病；コーガン症候群；寒冷凝集素病；先天性心ブロック；コクサッキー心筋炎；ＣＲＥＳＴ病；本態性混合型クリオグロブリン血症；髄鞘形成性神経障害；疱疹状皮膚炎；皮膚筋炎；デビック病（視神経脊髄炎）；椎間板性狼瘡；ドレスラー症候群；子宮内膜症；好酸球性食道炎；好酸球性筋膜炎；結節性紅斑；実験的アレルギー性脳脊髄炎；エヴァンス症候群；線維筋痛症；線維形成性肺胞炎；巨細胞性動脈炎（側頭動脈炎）；巨大細胞性心筋炎；糸球体腎炎；グッドパスチャー症候群；多発血管炎を伴う肉芽腫症（ＧＰＡ）（かつてはウェゲナー肉芽腫症と呼ばれていた）；グレーブス病（バセドウ病）；ギラン・バレー症候群；橋本脳炎；橋本甲状腺炎；溶血性貧血；ヘノッホ・シェーンライン紫斑病；妊娠ヘルペス；低ガンマグロブリン血症；特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）；ＩｇＡ腎症；ＩｇＧ４関連の硬化性疾患；免疫調節リポタンパク質；封入体筋炎；間質性膀胱炎；若年性関節炎；若年性糖尿病（Ｉ型糖尿病）；若年性筋炎；川崎症候群；ランバート・イートン症候群；白血球破壊性血管炎；扁平苔癬；硬化性苔癬；木質結膜炎；線状ＩｇＡ疾患（ＬＡＤ）；ループス（ＳＬＥ）；ライム病；メニエール病；顕微鏡的多発血管炎；混合結合組織病（ＭＣＴＤ）；ムーレン潰瘍；ミュシャ・ハーベルマン病；多発性硬化症；重症筋無力症；筋炎；ナルコレプシー；視神経脊髄炎（デビック病）；好中球減少症；眼瘢痕性類天疱瘡；視神経炎；パリンドローム性リウマチ；ＰＡＮＤＡＳ（連鎖球菌に関連する小児自己免疫性精神神経疾患）；腫瘍随伴性小脳変性症；発作性夜間ヘモグロビン尿症（ＰＮＨ）；パリー・ロンバーグ症候群；パーソナージ・ターナー症候群；扁平部炎（末梢ブドウ膜炎）；天疱瘡；末梢神経障害；周囲静脈性脳脊髄炎；悪性貧血；ＰＯＥＭＳ症候群；結節性多発性動脈炎；Ｉ型、ＩＩ型およびＩＩＩ型自己免疫性多腺症候群；リウマチ性多発筋痛症；多発性筋炎；後心筋梗塞症候群；後心膜切開症候群；プロゲステロン皮膚炎；原発性胆汁性肝硬変；原発性硬化性胆管炎；乾癬；乾癬性関節炎；特発性肺線維症；壊疽性膿皮症；赤芽球癆（ろう）；レイノー現象；反応性関節炎；反射性交感神経性ジストロフィー；ライター症候群；再発性多発性軟骨炎；レストレスレッグス（むずむず脚）症候群；後腹膜線維症；リューマチ熱；関節リウマチ；サルコイドーシス；シュミット症候群；強膜炎；強皮症；シェーグレン症候群；精子・精巣自己免疫；全身硬直（スティッフパーソン）症候群；亜急性細菌性心内膜炎（ＳＢＥ）；スザック症候群；交感神経性眼炎；高安動脈炎；側頭動脈炎／巨細胞性動脈炎；血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）；トロサ・ハント症候群；横断性脊髄炎；１型糖尿病；潰瘍性大腸炎；未分化結合組織病（ＵＣＴＤ）；ブドウ膜炎；血管炎；小水疱水疱性皮膚病；白斑；ウェゲナー肉芽腫症（現在は多発血管炎性肉芽腫症（ＧＰＡ）と呼ばれる）。

【0078】

当業者には容易に理解されるように、本明細書において炎症性および自己免疫性の障害または状態として定義される状態および疾患の間には、ある程度の重複があり、これは、そのような状態の複雑な性質および炎症の発現並びに各個体による提示を考慮すると予想されることである。

【0079】

さらに、ウイルス感染症および疾患の治療に使用するための、本明細書のいずれかの態様に係る式ＩのＰＲＯＴＡＣ化合物、および、本明細書のいずれかの態様に係る、哺乳動物、特にそのような治療が必要なヒトに対する式ＩのＰＲＯＴＡＣ化合物の有効量の投与による、ウイルス感染症および疾患の治療方法が本明細書で提供される。本発明の化合物を治療に使用することができるウイルス感染症および疾患の例としては、以下が挙げられる：ヒトパピローマウイルス、ヘルペスウイルス、エプスタイン・バーウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、およびＣ型肝炎ウイルスなど。

【0080】

本明細書では、ウイルス感染症の治療に使用するための、本明細書のいずれかの態様に係る式ＩのＰＲＯＴＡＣ化合物、および有効量の本明細書のいずれかの態様に係る式ＩのＰＲＯＴＡＣ化合物の投与によるウイルス感染症の治療方法も提供される。本明細書における側面は、哺乳動物、特にそのような治療を必要とするヒトに対するものである。本発明の化合物を治療に使用することができるウイルス感染症の例には、ヘルペスウイルス、ヒトパピローマウイルス、アデノウイルス、ポックスウイルスおよび他のＤＮＡウイルスが含まれる。

【0081】

また、本明細書では、眼科的適応症の治療に使用するための、本明細書のいずれかの態様に係る式ＩのＰＲＯＴＡＣ化合物、および、哺乳動物、特にそのような治療が必要なヒトに対する、本明細書のいずれかの態様に係る式ＩのＰＲＯＴＡＣ化合物の有効量の投与による、眼科的適応症の治療方法も提供される。本発明の化合物を治療に使用できる眼科適応症の例には、ドライアイが含まれる。

【0082】

本発明のさらなる態様は、ＢＥＴタンパク質活性の調節解除（ｄｅｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）に関連する疾患または状態の予防または治療方法であって、本明細書で定義される構造ＩのＰＲＯＴＡＣ化合物を、前記疾患もしくは状態に罹患しているか、またはそれにさらされやすい対象に投与することを含む方法を提供する。前記疾患または状態は、以下から独立に選択される：癌；良性の増殖性疾患；感染性または非感染性の炎症事象；自己免疫疾患；炎症性疾患；全身性炎症反応症候群；ウイルス感染症とウイルス性疾患；および眼科的状態。本発明の関連する態様は、ＢＥＴタンパク質活性の調節解除に関連する疾患または状態の治療または予防における、本明細書で定義される式ＩのＰＲＯＴＡＣ化合物の使用を提供し、前記疾患または状態が、癌（がん）；良性増殖性疾患；感染性または非感染性の炎症事象；自己免疫疾患；炎症性疾患；全身性炎症反応症候群；ウイルス感染症とウイルス性疾患；および眼科的状態から独立に選択される。さらに関連する態様は、ＢＥＴタンパク質活性の調節解除に関連する疾患または状態の治療または予防のための、本明細書に定義される式ＩのＰＲＯＴＡＣ化合物の使用を提供し、前記疾患または状態が、癌；良性増殖性疾患；感染性または非感染性の炎症事象；自己免疫疾患；炎症性疾患；全身性炎症反応症候群；ウイルス感染症とウイルス性疾患；および眼科的状態から独立に選択される。

【0083】

また、ブロモドメイン阻害剤が適応となる疾患または状態の治療に使用するための、本明細書のいずれかの態様に係る式ＩのＰＲＯＴＡＣ化合物、および、ブロモドメイン阻害剤が適応となる疾患または状態の治療方法であって本明細書のいずれかの態様に係る式ＩのＰＲＯＴＡＣ化合物の有効量を、そのような治療を必要とする哺乳動物、特にヒトに投与することによる治療方法が提供される。ブロモドメイン阻害剤が適応となる疾患または症状の例には、敗血症、火傷、膵炎、重大な外傷、出血および虚血などの全身性炎症反応症候群に関連する疾患が含まれる。

【0084】

そのような使用または方法において、式ＩのＰＲＯＴＡＣ化合物は、好ましくは、ＳＩＲＳの発病、ショックの発症、多臓器不全症候群（急性肺損傷、ＡＲＤＳ、急性腎損傷、肝臓損傷、心臓損傷、胃腸損傷および死亡の発生を含む）の発症を低減するために、診断の時点でそのような治療が必要な対象に投与されるだろう。

【0085】

あるいは、敗血症、出血、広範な組織損傷、ＳＩＲＳまたはＭＯＤＳの高リスクが認識されている他の状況では、式ＩのＰＲＯＴＡＣ化合物は、好ましくは、かかるリスクからの保護を必要とする対象に、例えば敗血症、出血、広範な組織損傷、ＳＩＲＳまたはＭＯＤＳの高リスクに関連した外科手術またはその他の処置の前に、投与されるだろう。

【0086】

特定の実施形態によれば、敗血症、敗血症症候群、敗血症性ショックおよび／または内毒素血症の治療における使用のための式ＩのＰＲＯＴＡＣ化合物の使用が本明細書において提供される。

【0087】

別の実施形態によれば、本明細書では、急性もしくは慢性膵炎、または火傷の治療における使用のための、式ＩのＰＲＯＴＡＣ化合物の使用が提供される。

【0088】

ブロモドメイン阻害剤が適応となりかつ式ＩのＰＲＯＴＡＣ化合物がその治療に使用され得る疾患または状態のさらなる例としては、単純ヘルペス感染および再活性化、ヘルペス、帯状疱疹感染および再活性化、水痘、帯状疱疹、ヒトパピローマウイルス、子宮頸部腫瘍、急性呼吸器疾患を含むアデノウイルス感染症、牛痘や天然痘などのポックスウイルス感染症、アフリカ豚コレラウイルスなどが挙げられる。

【0089】

さらなる実施形態によれば、皮膚または頸部上皮のヒトパピローマウイルス感染症の治療に使用するための、式ＩのＰＲＯＴＡＣ化合物の使用が本明細書で提供される。

【0090】

さらなる態様では、癌、炎症性疾患および／またはウイルス疾患の治療における、上記の疾患または状態のいずれかの治療に使用するための式ＩのＰＲＯＴＡＣ化合物であって、前記治療が、タンパク質メチル化、遺伝子発現、細胞増殖、細胞分化および／またはアポトーシスのうちの１つ以上をｉｎ ｖｉｖｏ（生体内）で調節するために使用される式ＩのＰＲＯＴＡＣ化合物が提供される。

【0091】

別の態様によれば、癌、炎症性疾患、および／またはウイルス性疾患から独立に選択された疾患または状態の治療における、タンパク質メチル化、遺伝子発現、細胞増殖、細胞分化および／またはアポトーシスのうちの１つ以上をｉｎ ｖｉｖｏ（生体内）調節に使するために使用される、式ＩのＰＲＯＴＡＣ化合物が提供される。

【0092】

別の態様によれば、癌、炎症性疾患、および／またはウイルス性疾患の治療において、タンパク質メチル化、遺伝子発現、細胞増殖、細胞分化、および／またはアポトーシスのうちの１つ以上をｉｎ ｖｉｖｏで調節する治療方法であって、式Ｉの１つ以上のＰＲＯＴＡＣ化合物の治療有効量を、そのような治療が必要な対象に投与することによる治療方法が提供される。

【0093】

また、本明細書で実証されるように、例えば化合物ＳＩＭ１などの式ＩのＰＲＯＴＡＣ化合物は、強力にかつ迅速に、ＢＲＤ３やＢＲＤ４を上回る、可逆的で長期持続性でかつ予想外のＢＲＤ２の選択的除去を誘導する。

【0094】

したがって、本発明は、タンパク質のブロモドメインの反復配列および特異的末端配列（Ｂｒｏｍｏ－ａｎｄ Ｅｔｒａ－ｔｅｒｍｉｎａｌ；ＢＥＴ）ファミリー内のタンパク質に結合する式ＩのＰＲＯＴＡＣ化合物を提供する。

【0095】

一態様によれば、本発明は、式ＩのＰＲＯＴＡＣ化合物であって、式中、ＢおよびＤが、ユビキチンリガーゼにより分解させようとしている標的タンパク質またはポリペプチドに結合するリガンドであり、そして前記標的タンパク質が、構造タンパク質、受容体、酵素、細胞表面タンパク質；細胞の統合機能、例えば触媒活性、アロマターゼ活性、運動活性、ヘリカーゼ活性、代謝過程（同化および異化）、抗酸化活性、タンパク質分解、生合成、キナーゼ活性、オキシドレダクターゼ活性、トランスフェラーゼ活性、加水分解酵素活性、リアーゼ活性、イソメラーゼ活性、リガーゼ活性、酵素調節活性、シグナル伝達活性、構造分子活性、結合活性（タンパク質、脂質、炭水化物）、受容体活性、細胞運動、膜融合、細胞間コミュニケーション、生物学的過程の調節、発生、細胞分化、刺激への応答に関与するタンパク質を含む、統合機能に関連するタンパク質；行動タンパク質、細胞接着タンパク質、細胞死に関与するタンパク質、輸送に関与するタンパク質（タンパク質トランスポーター活性、核輸送、イオントランスポーター活性、チャネルトランスポーター活性、キャリア活性、パーミアーゼ活性、分泌活性、電子トランスポーター活性を含む）、病因学、シャペロン調節活性、核酸結合活性、転写調節活性、細胞外組織化および生合成活性、並びに翻訳調節活性に関与するタンパク質からなる群より選択される、式ＩのＰＲＯＴＡＣ化合物を提供する。

【0096】

一態様によれば、本発明は、上で定義した式Ｉを有するＰＲＯＴＡＣ化合物であって、式中、ＢおよびＤが、ユビキチンリガーゼによって分解させようとしている標的タンパク質またはポリペプチドに結合するリガンドであり、前記標的タンパク質が、以下：Ｂ７．１およびＢ７、ＴＩ ＦＲｌｍ、ＴＮＦＲ２、ＮＡＤＰＨオキシダーゼ、ＢｃｌＩ Ｂａｘおよびアポトーシス経路の他のパートナー、Ｃ５ａ受容体、ＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼ、ＰＤＥ（ホスホジエステラーゼ）Ｖ型、ＰＤＥ（ホスホジエステラーゼ）ＩＶ型、ＰＤＥ Ｉ型、ＰＤＥ ＩＩ型、ＰＤＥ ＩＩＩ型、スクアレンシクラーゼ阻害剤ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、一酸化窒素（ＮＯ）シンターゼ、シクロオキシゲナーゼ１、シクロオキシゲナーゼ２、５ＨＴ受容体、ドーパミン受容体、Ｇタンパク質、すなわちＧｑ、ヒスタミン受容体、５－リポキシゲナーゼ、トリプターゼセリンプロテアーゼ、チミジル酸シンターゼ、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、ＧＡＤＰＤトリパノソーマ、グリコーゲンホスホリラーゼ、炭酸脱水酵素、ケモカイン受容体、ＪＡＷ ＳＴＡＴ、ＲＸＲおよび類似体、ＨＩＶ １プロテアーゼ、ＨＩＶ １インテグラーゼ、インフルエンザ・ノイラミニダーゼ、Ｂ型肝炎逆転写酵素、ナトリウムチャネル、多剤耐性（ＭＤＲ）タンパク質、プロテインＰ糖タンパク質（およびＭＲＰ）、チロシンキナーゼ、ＣＤ２３、ＣＤ１２４、チロシンキナーゼｐ５６ ｌｃｋ、ＣＤ４、ＣＤ５、ＩＬ－２受容体、ＩＬ－１受容体、ＴＮＦ－αＲ、ＩＣＡＭ１、Ｃａｔ^＋チャネル、ＶＣＡＭ、ＶＬＡ－４インテグリン、セレクチン、ＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌ、ニューロキニンおよび受容体、イノシン一リン酸デヒドロゲナーゼ、ｐ３８ ＭＡＰキナーゼ、ＲａｓＩ／ＲａｆＩ／ＭＥＫ／ＥＲＫ（ＭＡＲＫ）経路、インターロイキン－１変換酵素、カスパーゼ、ＨＣＶ ＮＳ３プロテアーゼ、ＨＣＶ ＮＳ３ ＲＮＡヘリカーゼ、グリシンアミドリボヌクレオチド・ホルミルトランスフェラーゼ、ライノウイルス３Ｃプロテアーゼ、単純ヘルペスウイルス－１（ＨＳＶ－１）プロテアーゼ、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロテアーゼ、ポリ（ＡＤＰ－リボース）ポリメラーゼ、サイクリン依存性キナーゼ、血管内皮増殖因子、オキシトシン受容体、ミクロソーム転移タンパク質阻害剤、胆汁酸輸送阻害剤、５αレダクターゼ阻害剤、アンジオテンシンＩＩ、グリシン受容体、ノルアドレナリン再取込み受容体、エンドセリン受容体、神経ペプチドＹおよび受容体、アデノシン受容体、アデノシンキナーゼおよびＡＭＰデアミナーゼ、プリン作動性受容体（Ｐ２Ｙ１、Ｐ２Ｙ２、Ｐ２Ｙ４、Ｐ２Ｙ６、Ｐ２Ｘ１－７）、ファルネシルトランスフェラーゼ、ゲラニルゲラニルトランスフェラーゼ、ＮＧＦのＴｒｋＡ受容体、βアミロイド、チロシンキナーゼＦｌｋ－ＩＩ ＫＤＲ、ビトロネクチン受容体、インテグリン受容体、Ｈｅｒ－２１ ｎｅｕ、テロメラーゼ阻害剤、サイトゾルホスホリパーゼＡ２およびＥＧＦ受容体チロシンキナーゼ、エクジソン２０－モノオキシゲナーゼ、ＧＡＢＡ依存性クロライドチャネルのイオンチャネル、アセチルコリンエステラーゼ、電圧感受性ナトリウムチャネルタンパク質、カルシウム放出チャネル、およびクロライドチャネル、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ、アデニルコハク酸シンセターゼ、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ、並びにエノールピルビルシキミ酸ホスフェートシンターゼから選択されるＰＲＯＴＡＣ化合物を提供する。

【0097】

一態様によれば、本発明は、式Ｉを有するＰＲＯＴＡＣ化合物であって、式中、ＢおよびＤが、ユビキチンリガーゼにより分解させようとしている標的タンパク質またはポリペプチドに結合するリガンドであり、そしてＢおよびＤが、Ｈｓｐ９０阻害剤、キナーゼ阻害剤、ホスファターゼ阻害剤、ＭＤＭ２阻害剤、ヒトＢＥＴブロモドメイン含有タンパク質を標的とする化合物、ＨＤＡＣ阻害剤、ヒトリジンメチルトランスフェラーゼ阻害剤、ＲＡＦ受容体を標的とする化合物、ＦＫＢＰを標的とする化合物、血管新生阻害剤、免疫抑制性化合物、アリール炭化水素受容体を標的とする化合物、アンドロゲン受容体を標的とする化合物、エストロゲン受容体を標的とする化合物、甲状腺ホルモン受容体を標的とする化合物、ＨＩＶプロテアーゼを標的とする化合物、ＨＩＶインテグラーゼを標的とする化合物、ＨＣＶプロテアーゼを標的とする化合物、またはアシルプロテインチオエステラーゼ１および／または２を標的とする化合物である、式ＩのＰＲＯＴＡＣ化合物を提供する。

【0098】

一態様によれば、本発明は、必要な対象（患者）において標的タンパク質を分解する方法であって、本明細書に定義される式ＩのＰＲＯＴＡＣ化合物の有効量を前記対象（患者）に投与することを含む方法、またはＰＲＯＴＡＣ化合物の有効量の投与による、対象（患者）において標的タンパク質を分解するための前記ＰＲＯＴＡＣの使用を提供する。

【0099】

一態様によれば、本発明は、本明細書に定義される式ＩのＰＲＯＴＡＣ化合物の有効量に前記細胞を曝露することを含む、細胞内のタンパク質をターゲティング（標的指向）する方法、または前記細胞をＰＲＯＴＡＣ化合物の有効量に暴露することを含む、細胞内のタンパク質をターゲティングするための前記ＰＲＯＴＡＣの使用を提供する。

【0100】

本発明のＰＲＯＴＡＣ化合物は、医薬組成物として、任意の従来の経路により、特に経腸的に、例えば経口的に、例えば錠剤もしくはカプセル剤の形態で、または非経口的に、例えば注射用液剤もしくは懸濁液剤の形態で、局所的に、例えば、ローション剤、ゲル剤、軟膏もしくはクリームの形態で、または経鼻用もしくは座剤の形態で投与することができる。本発明のＰＲＯＴＡＣ化合物は、遊離形態でまたは薬学的に許容される塩の形態で、少なくとも１つの薬学的に許容される担体または希釈剤と組み合わせて含有する医薬組成物は、混合、造粒またはコーティング法による従来の方式で製造することができる。例えば、経口組成物は、有効成分と共に、ａ）希釈剤、例えばラクトース、デキストロース、スクロース、マンニトール、ソルビトール、セルロースおよび／またはグリシン；ｂ）滑沢剤、例えば、シリカ、タルク、ステアリン酸、そのマグネシウム塩もしくはカルシウム塩、および／またはポリエチレングリコール；錠剤の場合にはさらに、ｃ）結合剤、例えば、ケイ酸アルミニウムマグネシウム、デンプンペースト、ゼラチン、トラガカント、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、および／またはポリビニルピロリドン；所望であれば、ｄ）崩壊剤、例えば、デンプン、寒天、アルギン酸もしくはそのナトリウム塩、または発泡性混合物；および／またはｅ）吸収剤、着色剤、香料および甘味料を含有する、錠剤またはゼラチンカプセル剤でありうる。注射用組成物は等張水溶液剤または懸濁液剤であり得、坐剤は脂肪乳剤または懸濁液剤から調製され得る。該組成物は滅菌することができ、そして／または防腐剤、安定化剤、湿潤剤または乳化剤、溶液促進剤、浸透圧を調節するための塩および／または緩衝剤などの補助剤を含有することができる。さらに、他の治療上価値のある物質も含有してよい。経皮適用に適した製剤には、有効量の本発明のＰＲＯＴＡＣ化合物と担体が含まれる。担体は、宿主の皮膚の通過を助けるために吸収性の薬理学的に許容される溶媒を含むことができる。例えば、経皮デバイスは、裏打ち部材、場合により担体を含む化合物を収容するリザーバ、場合により長期間にわたって制御された所定の速度で宿主の皮膚に化合物を送達するための速度制御バリアを含む包帯の形態である。デバイスを皮膚に固定するための手段、マトリックス経皮製剤も使用できる。例えば皮膚および眼などの局所適用に適した製剤は、当技術分野で周知の水溶液、軟膏、クリームまたはゲルであることが好ましい。これらには、可溶化剤、安定剤、等張化剤、緩衝剤、および保存剤が含まれる場合がある。

【0101】

本発明の医薬組成物は、１つ以上の薬学的に許容される担体とともに製剤化された、本発明のＰＲＯＴＡＣ化合物の治療有効量を含む。本明細書で使用する場合、「薬学的に許容される担体」という用語は、非毒性の、不活性固体の、半固体のまたは液体の充填剤、希釈剤、封入剤または任意の種類の製剤補助剤を意味する。

【0102】

本発明の医薬組成物は、ヒトおよび他の動物に、経口、直腸、非経口、槽内、膣内、腹腔内、局所（粉末、軟膏、点滴剤によるなど）、口腔、または経口もしくは経鼻スプレーとして投与することができる。

【0103】

経口投与用の液体剤形には、薬学的に許容される乳剤、マイクロ乳剤、液剤、懸濁液剤、シロップ剤およびエリキシル剤が含まれる。活性化合物に加えて、液体剤形は、当技術分野で一般に使用される不活性希釈剤、例えば水または他の溶媒、可溶化剤および乳化剤、例えばエチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３－ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、油脂（特に綿実油、落花生油、トウモロコシ油、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油、およびゴマ油）、グリセリン、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコール、ソルビタンの脂肪酸エステル、並びにそれらの混合物を含有することができる。不活性希釈剤に加えて、経口組成物はまた、湿潤剤、乳化剤および懸濁化剤、甘味剤、香料、および芳香剤などの補助剤も含んでよい。

【0104】

注射用製剤、例えば、無菌注射用水性または油性懸濁液剤は、好適な分散剤または湿潤剤および懸濁化剤を使用して、公知技術に従って製剤化され得る。無菌注射用製剤はまた、例えば１，３－ブタンジオール中の溶液として、非経口的に許容される非毒性の希釈剤または溶媒中の無菌注射用液剤、懸濁液剤または乳剤であってもよい。使用できる許容可能なビヒクルおよび溶媒の中には、水、リンゲル液、ＵＳＰ（米国薬局方）準拠および等張性の塩化ナトリウム溶液がある。さらに、無菌の固定油が溶媒または懸濁化媒体として従来から使用されている。この目的には、合成モノグリセリドまたはジグリセリドを含む、刺激の少ない任意の固定油（不揮発性油）を使用することができる。加えて、オレイン酸などの脂肪酸が注射剤の調製に使用される。薬物の奏効を持続させるために、皮下または筋肉内注射による薬物の吸収を遅らせることが望ましい場合がしばしばある。これは、水への溶解度が低い結晶質または非晶質材料の液体懸濁液を使用することにより達成することができる。次に、薬物の吸収速度はその溶解速度に依存し、さらに溶解速度は結晶のサイズと結晶形に依存しうる。あるいは、非経口投与された薬物形態の遅延吸収は、薬物を油性ビヒクルに溶解または懸濁させることによって達成される。

【0105】

直腸または膣内投与用の組成物は、好ましくは、本発明のＰＲＯＴＡＣ化合物を、周囲温度では固体であるが体内では液体であり、直腸もしくは膣内で溶解して活性化合物を放出する、カカオバター、ポリエチレングリコールまたは座剤ワックスなどの適切な非刺激性賦形剤または担体と混合することによって調製できる、座剤である。同様のタイプの固体組成物は、ラクトースまたは乳糖、並びに高分子量ポリエチレングリコールなどのような賦形剤を使用して、軟質および硬質ゼラチンカプセル中の充填剤として使用することもできる。

【0106】

ＰＲＯＴＡＣ化合物は、上述の１種以上の賦形剤とともに、マイクロカプセル化形態で提供することもできる。錠剤、糖衣錠、カプセル剤、丸剤、および粒剤という固体剤形は、腸溶性コーティング、制御放出コーティングおよび医薬製剤業界で周知の他のコーティングなどのコーティング（被膜）およびシェル（外殻）を用いて調製することができる。このような固体剤形では、活性化合物を、スクロース、ラクトースまたはデンプンなどの少なくとも１種の不活性希釈剤と混合することができる。このような剤形は、通常の慣例のように、不活性希釈剤以外の追加の物質、例えば錠剤化のための滑沢剤および他の助剤、例えばステアリン酸マグネシウムおよび微結晶セルロースを含んでもよい。カプセル、錠剤および丸薬の場合、剤形は緩衝剤も含んでよい。

【0107】

本発明の化合物の局所または経皮投与用の剤形には、軟膏、ペースト、クリーム、ローション剤、ゲル剤、散剤、液剤、スプレー剤、吸入剤またはパッチが含まれる。有効成分は、必要に応じて、無菌条件下で、薬学的に許容される担体および任意の必要な保存剤または緩衝剤と共に混合される。眼科用製剤、点耳薬、眼軟膏、散剤および液剤も本発明の範囲内であると考えられる。軟膏、ペースト、クリームおよびゲル剤は、本発明の活性化合物に加えて、動物性および植物性脂肪、油脂、ワックス、パラフィン、デンプン、トラガカント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコーン、ベントナイト、ケイ酸、タルク、酸化亜鉛、またはそれらの混合物などの賦形剤を含有することができる。

【0108】

散剤およびスプレー剤は、本発明のＰＲＯＴＡＣ化合物に加えて、ラクトース、タルク、ケイ酸、水酸化アルミニウム、ケイ酸カルシウムおよびポリアミド粉末、またはこれらの物質の混合物などの賦形剤を含有することができる。スプレー剤には、クロロフルオロ炭化水素などの通常の噴射剤がさらに含まれる場合がある。経皮パッチは、身体への化合物の制御送達を提供するという追加の利点がある。このような剤形は、化合物を適切な媒質に溶解または分配することによって作製することができる。吸収促進剤を使用して、皮膚を通過する化合物の流量を増加させることもできる。その速度は、速度制御膜を設けるか、またはポリマーマトリックスもしくはゲル中に化合物を分散させるかによって、制御することができる。

【0109】

本発明の治療方法によれば、疾患、状態、または障害は、治療有効量の本発明のＰＲＯＴＡＣ化合物を対象に投与することによって、望ましい結果を達成するために必要な量と時間で、ヒトまたは他の動物などの対象において治療または予防される。本明細書で使用される本発明の化合物の「治療有効量」という用語は、対象における障害の症状を軽減するのに十分な化合物の量を意味する。医学領域で十分理解されているように、本発明のＰＲＯＴＡＣ化合物の治療有効量は、あらゆる医療に適用できる妥当なベネフィット／リスク比となるであろう。

【0110】

本発明の化合物の投与量は、疾患の種類、患者の年齢および全身状態、投与される特定の化合物、および薬物で経験毒性または副作用の存在またはレベルを含む多くの要因に従って変化し得る。適切な用量範囲の代表的な例は、約０．０２５ｍｇ程度から約１０００ｍｇまでである。ただし、投与量は一般に医師の裁量に任されている。

【0111】

哺乳動物患者用の多種多様な医薬剤形を使用することができる。固体剤形が経口投与に使用される場合、製剤は錠剤、硬ゼラチンカプセル剤、トローチ剤またはロゼンジ錠の形態であり得る。固形担体の量は広範囲に異なるが、一般にＰＲＯＴＡＣ化合物の量は約０．０２５ｍｇ～約１ｇであり、所望の錠剤、硬ゼラチンカプセル剤、トローチ剤またはロゼンジ錠のサイズによって固形担体の量が異なる。したがって、便利には、錠剤、硬ゼラチンカプセル剤、トローチ剤またはロゼンジ錠は、例えば、０．０２５ｍｇ、０．０５ｍｇ、０．１ｍｇ、０．５ｍｇ、１ｍｇ、５ｍｇ、１０ｍｇ、２５ｍｇ、１００ｍｇ、２５０ｍｇ、５００ｍｇ、または１０００ｍｇの本発明化合物を有するだろう。錠剤、硬ゼラチンカプセル剤、トローチ剤またはロゼンジ錠は、１日１回、２回または３回投与するのが便利である。

【0112】

一般に、本発明のＰＲＯＴＡＣ化合物は、単独で、または１つ以上の治療薬と組み合わせて、当技術分野で公知の通常の許容される様式のいずれかを介して治療有効量で投与される。治療有効量は、疾患の重症度、対象の年齢および相対的な健康状態、使用される化合物の効力および他の要因に応じて大きく変動し得る。

【0113】

特定の実施形態において、本発明の化合物の治療量または用量は、約０．１ｍｇ／Ｋｇ～約５００ｍｇ／Ｋｇ、あるいは約１～約５０ｍｇ／ｋｇの範囲であり得る。一般に、本発明による治療計画は、そのような治療を必要とする患者に、１日当たり約１０ｍｇ～約１０００ｍｇの本発明の化合物を単回または複数回投与することを含む。治療量または用量は、投与経路以外にも他の薬剤との併用の可能性によって異なるだろう。対象の状態が改善したら、必要に応じて本発明の化合物、組成物または組み合わせの維持用量を投与してもよい。その後、症状の関数として、投与量もしくは投与頻度、またはその両方を、改善された状態が維持されるレベルにまで減らすことができ、症状が所望のレベルに軽減されたときには、治療を中止すべきである。しかしながら、疾患のいずれかの症状が再発した場合には、対象は長期にわたる断続的な治療を必要とする場合がある。本発明の化合物および組成物の一日の総使用量は、健全な医学的判断の範囲内で、主治医によって決定されることが理解されるだろう。特定の患者に対する具体的な抑制量は、治療すべき疾患、および該疾患の重症度、使用した特定化合物の活性、使用した特定の組成物；患者の年齢、体重、一般的な健康状態、性別および食事；使用した特定の化合物の投与時間、投与経路および排泄速度；治療の存続期間；使用した特定化合物と併用または同時使用される薬剤；および医療分野で周知の同様の要因に依存するだろう。

【0114】

本発明はまた、医薬の組み合わせ、例えば、ａ）遊離形または薬学的に許容される塩の形の、本明細書に開示される本発明のＰＲＯＴＡＣ化合物である第１の薬剤と、およびｂ）少なくとも１つの補助薬剤（ｃｏ－ａｇｅｎｔ）とを含む医薬の組み合わせ、例えばキットを提供する。キットは、その投与のための説明書を含むことができる。本明細書で使用される「同時投与」または「併用投与」などの用語は、選択された治療薬を単一の患者へ投与することを含む意味であり、薬剤が必ずしも同じ投与経路でまたは同時に投与されるわけではない治療計画を含むことを意図する。本明細書で使用される「医薬組み合わせ」という用語は、複数の有効成分の混合または組み合わせから生じる製品を意味し、有効成分の固定組み合わせと非固定組み合わせの両方を含む。「固定組み合わせ」という用語は、有効成分、例えば本発明のＰＲＯＴＡＣ化合物と補助薬剤とが両方とも単一の存在または１回量の形で同時に患者に投与されることを意味する。「非固定の組み合わせ」という用語は、有効成分、例えば本発明のＰＲＯＴＡＣ化合物と補助薬剤とが両方とも別個の存在として患者に同時に、一緒に、または特定の時間制限なしで連続的に、投与されることを意味する。ここで、そのような投与は、患者の体内に２つの化合物の治療有効量を提供する。後者は、カクテル療法、例えば３つ以上の有効成分の投与にも適用される。薬学的に許容される担体として機能し得る材料のいくつかの例としては、限定されないが、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、ヒト血清アルブミンなどの血清タンパク質、緩衝物質、例えばリン酸塩、グリシン、ソルビン酸またはソルビン酸カリウム、飽和植物脂肪酸の部分グリセリド混合物、水、塩類または電解質、例えば硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイド状シリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、ポリアクリレート、ワックス、ポリエチレン－ポリオキシプロピレン－ブロックポリマー、羊毛脂、乳糖、ブドウ糖、ショ糖などの糖類；コーンスターチおよびポテトスターチなどのデンプン類；セルロースおよびその誘導体、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、酢酸セルロース；粉末トラガカント；麦芽；ゼラチン；タルク；カカオバターおよび座薬ワックスなどの賦形剤、落花生油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、コーン油および大豆油などの油；グリコール、例えばプロピレングリコールやポリエチレングリコール；オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチルなどのエステル；寒天；水酸化マグネシウムや水酸化アルミニウムなどの緩衝剤；アルギン酸；発熱物質不含有の水、等張食塩水；リンガー液；エチルアルコール、リン酸緩衝液、並びに他の非毒性の相溶性滑沢剤、例えばラウリル硫酸ナトリウムおよびステアリン酸マグネシウム；並びに着色剤、離脱剤、コーティング剤、甘味料、香料、芳香剤、防腐剤、酸化防止剤が、処方者の判断に従って、組成物中に存在することもできる。

【図面の簡単な説明】

【0115】

【図1】図１ａ）および１ｂ）は、三価ＰＲＯＴＡＣ設計においてリンカーの化学的分岐用化合物の溶媒暴露領域を同定するための、ＶＨＬ：ＭＺ１：ＢＲＤ４^ＢＤ２（ａ、ＰＤＢ ５Ｔ３５）およびＢＲＤ４^ＢＤ２：ＭＴ１：ＢＲＤ４^ＢＤ２（ｂ、ＰＤＢ ５ＪＷＭ）の三元複合体の結晶構造を示す。親の二官能性分子ＭＺ１とＭＴ１の化学構造も示す。図１ｃ）は、ＶＨＬおよびＣＲＢＮ Ｅ３リガーゼリガンドに基づいて設計された三価ＰＲＯＴＡＣの化学構造を示す。図１ｄ）は、ＨＥＫ２９３細胞を１μＭ ＰＲＯＴＡＣ（ＳＩＭ１～６）またはＤＭＳＯで４時間処理した後のＢＲＤ２、ＢＲＤ３、ＢＲＤ４の免疫ブロット分析を示す。図１ｅ）は、１μＭのＰＲＯＴＡＣ化合物またはＤＭＳＯにより４連で（四重複製で）処理した後のＣＲＩＳＰＲ ＨｉＢｉＴ－ＢＲＤ４ ＨＥＫ２９３細胞の定量的生細胞分解のカイネティクス（動態）を示す。発光（ＲＬＵ）を２４時間にわたって５分間隔で継続的にモニターした。図１ｆ）は、各濃度点について３連で（三重複製で）ＰＲＯＴＡＣまたはＤＭＳＯにより４８時間処理した後のＭＶ４；１１ ＡＭＬ細胞株の細胞生存率を表すグラフである。

【0116】

【図2】図２ａ）は、段階希釈したＰＲＯＴＡＣ化合物ＳＩＭ１、ＳＩＭ２およびＳＩＭ３で４時間処理したＨＥＫ２９３細胞における、ＢＲＤ２、ＢＲＤ３、ＢＲＤ４レベルの免疫ブロットを示す。図６ｄに示すように、ＢＥＴタンパク質レベルの定量化をＤＭＳＯ対照と比較して行い、プロットを使用してＤＣ_５０値を測定した。図示されたブロットは、２つの独立した実験を表す。図２ｂ）は、４連で段階希釈したＳＩＭ１で処理した後のＣＲＩＳＰＲ ＨｉＢｉＴ－ＢＲＤ２、ＢＲＤ３およびＢＲＤ４ ＨＥＫ２９３細胞の定量的生細胞分解のカイネティクス（動態）を示す。発光（ＲＬＵ）を２４時間にわたって継続的にモニターした。図２ｃ）は、パネルｂに示されたＢＲＤ２、ＢＲＤ３およびＢＲＤ４カイネティクス解析プロファイルからの分解速度、分解最大値（Ｄｍａｘ）、およびＤｍａｘ_５０値の計算を示す。図２ｄ）は、１０ｎＭの化合物で４時間処理したＭＶ４；１１細胞のプロテオームに対するＳＩＭ１（青）およびｃｉｓ－ＳＩＭ１（赤）の効果を示す。データは、３つの独立した実験からのタンパク質あたりのＰ値の－ｌｏｇ_１０（ｙ軸）に対して、ＤＭＳＯ対照に対比した倍率変化のｌｏｇ_２値（ｘ軸）をプロットしたものである。代表的なタンパク質の定量化は図７ｄに見ることができる。図２ｅ）は、１０ｎＭの化合物ＳＩＭ１で処理した後のＨｉＢｉＴ－ＢＥＴタンパク質のＮａｎｏＢＲＥＴ^（商標）ユビキチン化のカイネティクス（動態）を示す。

【0117】

【図3】図３ａ）は、ＨｉＢｉＴ－ＢＲＤ２カイネティクスの用量応答プロファイルから計算された分解速度、Ｄｍａｘ、Ｄｍａｘ_５０値と、ＳＩＭ１（カイネティクス解析プロファイルは図２ｂに示される）、ＡＲＶ－７７１（カイネティクス解析プロファイルは図８ａに示される）およびＭＺ１（ｒｅｆ．３１）との比較を示す。図３ｂ）は、指示化合物で４時間処理した２２Ｒｖ１前立腺癌細胞株における内因性ＢＲＤ２およびＭｙｃの定量化した発現レベルを示すグラフを示す。曲線は、生物学的に独立した２つの実験の平均値のベストフィット（±ＳＥＭ）である。図３ｃ）１ｎＭ濃度の指示化合物で４連で（４重複製で）処理したＭＶ４；１１細胞における、ＣＲＩＳＰＲ ｃＭｙｃ－ＨｉＢｉＴタンパク質レベルの減少および相関する細胞生存率を表すグラフを示す。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）により、２４時間にわたる様々な時点で発光と細胞生存率を測定した。図３ｄ）は、カスパーゼ阻害剤（ＱＶＤ－ＯＰｈ；２０μＭ）またはネクロプトーシス（制御されたネクローシス）阻害剤（ネクロスタチン－１；２０μＭ）の添加有り／無しで、１０ｎＭの指示化合物で２４時間処理した２２Ｒｖ１細胞におけるＰＡＲＰ開裂のイムノブロットを示す。４８時間処理および１ｍＭのＭＺ１およびＭＴ１処理の場合のブロットは図１０に示される。図３ｅ）は、２２Ｒｖ１細胞において化合物またはＤＭＳＯで２４時間処理したカスパーゼ－Ｇｌｏ３／７^（商標）アッセイを示す。曲線は３つの生物学的に独立した実験の平均値のベストフィット（±ＳＥＭ）である。図３ｆ）は、クローン形成アッセイにおける、２２Ｒｖ１細胞の生存実験の画像を示す。細胞を１０ｎＭの化合物で２４時間処理した。５００個の細胞を再播種し、スキャン前に３７℃で２０日間増殖させた。生存率は、処理細胞のコロニー形成率を未処理細胞のコロニー形成率で割ることによって決定した。エラーバーは二重反復試験からの平均値±Ｓ．Ｄ．を示す。

【0118】

【図4】図４ａ）は、ＳＩＭ１（赤）、ＭＺ１またはｃｉｓ－ＳＩＭ１（オレンジ色）、ＭＴ１（緑色）またはＤＭＳＯ（シアン色）と、ＢＲＤ４由来のＢＤ１－ＢＤ２タンデムドメインとのインキュベーション後の複合体形成のサイズ排除クロマトグラフィーの結果を示す（左パネル：野生型、中央のパネル：Ｎ１４０Ｆ変異体、右のパネル：ＶＣＢタンパク質を有する野生型）。ピークの強度は２８０ｎｍでの吸光度である。図４ｂ）は、ＢＲＤ４野生型（ＷＴ）のＢＤ１－ＢＤ２タンデムドメインから成るか、またはＮａｎｏＬｕｃ^（商標）ドナーおよびＨａｌｏＴａｇ^（商標）受容体融合タグにより隣接されたＢＤ２のＮ４３３Ｆ変異を含む、ＮａｎｏＢＲＥＴ^（商標）のコンフォメーションバイオセンサーアッセイを示す。ＨＥＫ２９３細胞をＷＴまたはＮ４３３Ｆ変異体バイオセンサーのいずれかで一時的にトランスフェクトし、次いで化合物ＳＩＭ１、ｃｉｓ－ＳＩＭ１、またはＭＴ１化合物の段階希釈液で４連（４重複製）にて処理した。どの処理がコンホメーション変化を示したかを決定するためにＮａｎｏＢＲＥＴを測定し、ＥＣ_５０値を計算して示した。図４ｃ）は、ＳＩＭ１（１６μＭ）とＶＣＢ（３２μＭ）の１：１混合物中にＢＲＤ４のＢＤ１－ＢＤ２タンデムタンパク質（シリンジ中に投入、ＷＴ２００μＭ、Ｎ４３３Ｆ変異体３００μＭ）のＩＴＣ力価測定を示す。図４ｄ）は、４連にてＳＩＭ１、ｃｉｓ－ＳＩＭ１、ＭＴ１、またはＤＭＳＯ対照で処理した全長ＢＲＤ４のＷＴ（野生型）、Ｎ１４０Ｆ変異体またはＮ４３３Ｆ変異体のいずれかと組み合わせた、ＨａｌｏＴａｇ－ＶＨＬを一過性発現するＨＥＫ２９３細胞における、ＮａｎｏＢＲＥＴ^（商標）カイネティクス三元複合体形成を表示するグラフを示す。ＮａｎｏＢＲＥＴは化合物添加後２時間にわたり継続的にモニターし、ＢＲＤ４変異体ごとに異なるレベルの三元複合体形成を示した。図４ｅ）は、ＶＣＢタンパク質の非存在下（赤色）または存在下（青色）における、ビオチン－ＪＱ１：ＢＲＤ４^ＢＤ２に対する２連（二重複製）でのＳＩＭ１のＡｌｐｈａＬＩＳＡ^（商標）滴定を示す。図４ｆ）は、ＢＲＤ４タンデムＢＤ１－ＢＤ２の存在下または非存在下で、３連（三重複製）で滴定されたＳＩＭ１によるＶＣＢからのＦＡＭ標識ＨＩＦ－１αペプチドの置換を測定する蛍光偏光競合アッセイからの近似曲線を示す。図４ｇ）は、プレインキュベートしたＳＩＭ１－ＢＲＤ４タンデムタンパク質と固定化ビオチン－ＶＣＢタンパク質との相互作用を、リアルタイムでモニタリングするためのＳＰＲセンサーグラムを示す。示されているセンサーグラムは、三元複合体の解離定数Ｋ_ｄと解離半減期ｔ_１／２を測定するための、３つの独立した実験の代表としての三元単回カイネティクス（ＳＣＫ）実験のものである。図４ｈ）は、ＮａｎｏＢＲＥＴ^（商標）ターゲットエンゲージメントによって測定された、ＢＲＤ４を用いた生細胞での化合物滞留時間実験を示す。ＣＲＩＳＰＲ ＨｉＢｉＴ－ＢＲＤ４細胞を、指示化合物と共に４連（４重複製）でインキュベートし、続いて競合的に蛍光標識されたＢＥＴ阻害剤を添加した。ＮａｎｏＢＲＥＴを生細胞中でカイネティクス測定した。

【0119】

【図5】図５ａ）は、ＶＨＬおよびＢＥＴタンパク質と共にＳＩＭ１が１：１：１の三元複合体を形成するというメカニズムの提唱を示す。ＢＲＤ４のＢＤ２へのＳＩＭ１の優先的な初期結合に続いて、コンホメーション変化とＢＤ１への分子内同時結合が起こる。結合力と協同性は、ごく低濃度のＳＩＭ１で存続時間が長くなり、安定性の高い三元複合体の形成に寄与する。図５ｂ）は、様々なタイプのＰＲＯＴＡＣと、Ｅ３リガーゼ部分を有する分子接着剤により誘導される三元複合体を示し、そしてＰＲＯＴＡＣまたは分解濃度の１因子としてそれらの変動する範囲で描写されている。結合力と協同性を併せ持つ三価複合体は、フック効果が最小限に抑えられた、最大でかつ最も持続的なレベルの三元複合体形成を示す。協同的な二価ＰＲＯＴＡＣ複合体が次のレベルであり、非協同的な二価複合体がその後に続く。最後に、分子接着剤化合物により誘導された三元複合体が示されるが、これはプラトーに達し、ＰＲＯＴＡＣとは異なり高濃度で競合的フック効果を受けない。

【0120】

【図6】図６（図１に関連）図６ａ）は、三元複合体結晶構造の探索を示す。ＢＲＤ４ＢＤ１：Ｂｉ－ＢＥＴ：ＢＲＤ４^ＢＤ１（ＰＤＢ：５ａｄ３）は、タンパク質界面の内側に埋没した二価の阻害剤を示し、誘導体化が結合様式を破壊することを示唆している。図６ｂ）は、４連で段階希釈したＳＩＭ１～ＳＩＭ３で処理した後の、ＬｇＢｉＴを安定発現するＣＲＩＳＰＲ ＨｉＢｉＴ－ＢＲＤ４ ＨＥＫ２９３細胞の定量的生細胞分解動態を示す。発光（ＲＬＵ）を２４時間にわたって５～１５分間隔で連続的にモニターし、ＤＭＳＯ対照に対する正規化によってフラクションＲＬＵを決定した。図６ｃ）は、各濃度点につき３連（三重複製）にてＰＲＯＴＡＣまたはＤＭＳＯで４８時間処理した後のＡ５４９肺癌細胞株またはＨＬ－６０ ＡＭＬ細胞株の細胞生存率を示す。図６ｄ）は、図２ａのＨＥＫ２９３細胞からのＩＢデータのＤＭＳＯ対照と比較した各ＢＥＴタンパク質レベルの定量化を示す。

【0121】

【図7】図７（図２に関連）図７ａ）、ｂ）は、４連で段階希釈したＳＩＭ２またはＳＩＭ３処理した後の、ＬｇＢｉＴを安定発現するＣＲＩＳＰＲ ＨｉＢｉＴ－ＢＲＤ２、ＢＲＤ３およびＢＲＤ４ ＨＥＫ２９３細胞の定量的生存細胞分解の動態を示す。発光（ＲＬＵ）を２４時間にわたって５～１５分間隔で連続的にモニターし、ＤＭＳＯ対照に対する正規化によりフラクションＲＬＵを決定した。図７ｃ）は、図７ａまたは２ｂにそれぞれ示されているＳＩＭ２およびＳＩＭ３の動態プロファイルからのＳＩＭ２（上のセット）およびＳＩＭ３（下のセット）についての分解速度、分解最大値（Ｄｍａｘ）、およびＤｍａｘ_５０値の計算を示す。図７ｄ）は、図２ｄの質量分析プロテオミクスの代表的タンパク質の定量化を示す。図７ｅ）は、４連での１００ｎＭ ＳＩＭ１もしくはＭＺ１またはＤＭＳＯ処理後の、ＬｇＢｉＴおよびＨａｌｏＴａｇ－ユビキチンを発現しているＨｉＢｉＴ－ＢＥＴ ＨＥＫ２９３細胞のＮａｎｏＢＲＥＴユビキチン化動態を示す。値は、ＤＭＳＯ対照に対する倍率増加分として表される。

【0122】

【図8】図８（図３に関連）図８ａ）は、４連で段階希釈したＡＲＶ－７７１での処理後の、ＣＲＩＳＰＲ ＨｉＢｉＴ－ＢＲＤ２、ＢＲＤ３、およびＢＲＤ４ ＨＥＫ２９３細胞の定量的生細胞分解のカイネティクスを示す。発光（ＲＬＵ）を２４時間にわたって５～１５分間隔で連続的にモニターし、ＤＭＳＯ対照に対する正規化によってフラクションのＲＬＵを決定した。図８ｂ）ＳＩＭ１（図２ｂ）、ＡＲＶ－７７１（図８ａ）、および以前に決定されたＭＺ１（Ｒｉｃｈｉｎｇ他、ＡＣＳ Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２０１８）の動態プロファイルからのＢＲＤ３およびＢＲＤ４分解速度、分解最大値（Ｄｍａｘ）およびＤｍａｘ_５０値の比較。図８ｃ）（上のグラフ）は、化合物で４時間処理した２２Ｒｖ１前立腺癌細胞株における内在性ＢＲＤ３およびＢＲＤ４の定量化発現レベルを示す。曲線は、２つの生物学的に独立した実験からの平均値のベストフィット（最も適合）±ＳＥＭである。（下の画像）図３ｂおよび上のグラフ（８ｃ）についてのウェスタンブロットの代表的な画像。図８ｄ）は、プロテアソーム阻害剤（ＭＧ１３２）またはＶＨＬリガンド（ＶＨ２９８）の有り／無しでの、ＢＲＤ分解剤または阻害剤の存在下で４時間処理したＭＶ４；１１細胞における内在性ＢＲＤ２、ＢＲＤ３およびＢＲＤ４のイムノブロットを示す。エラーバーは、２つの生物学的に独立した実験からの平均値±ＳＤを示す。ＳＩＭ１およびｃｉｓ－ＳＩＭ１は１００ｎＭで使用した。ＭＧ１３２は３μＭで使用した。ＶＨ２９８は１０μＭで使用した。

【0123】

【図9】図９（図３ｃに関連）図９ａ）およびｂ）は、３ｎＭ、１０ｎＭ、５０ｎＭおよび１００ｎＭ濃度の指示化合物で４連で処理したＭＶ４；１１細胞におけるＣＲＩＳＰＲ ｃＭｙｃ－ＨｉＢｉＴタンパク質レベルの劣化（ａ）および相関細胞生存率（ｂ）を示すグラフを示す。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）による発光および細胞生存率を２４時間にわたる様々な時点で測定し、ＤＭＳＯ対照に対して正規化した。

【0124】

【図10】図１０（図３ｄ、ｅに関連）図１０ａ）は、カスパーゼ阻害剤（ＱＶＤ－ＯＰｈ；２０μＭ）またはネクロプトーシス阻害剤（ネクロスタチン－１；２０μＭ）の添加有り／無しでの、指示時点における１０ｎＭのＳＩＭ１またはｃｉｓ－ＳＩＭ１を用いた２２Ｒｖ１細胞中でのＰＡＲＰ開裂のイムノブロットを示す。図１０ｂ）は、カスパーゼ阻害剤（ＱＶＤ－ＯＰｈ；２０μＭ）またはネクロプトーシス阻害剤（ネクロスタチン－１；２０μＭ）の添加有り／無しでの、指示時点における１０ｎＭまたは１μＭのＭＴ１を用いた２２Ｒｖ１細胞中でのＰＡＲＰ開裂のイムノブロットを示す。図１０ｃ）は、カスパーゼ阻害剤（ＱＶＤ－ＯＰｈ；２０μＭ）または壊死阻害剤（ネクロスタチン－１；２０μＭ）の添加有り／無しでの、指示時点における１０ｎＭまたは１μＭのＭＺ１を用いた２２Ｒｖ１細胞中でのＰＡＲＰ開裂のイムノブロットを示す。図１０ｄ）は、２２Ｒｖ１細胞中でカスパーゼ阻害剤（ＱＶＤ－ＯＰｈ）またはＶＨＬリガンド（ＶＨ２９８）の有り／無しでの、ＢＥＴ分解剤または阻害剤の存在下で２４時間処理したカスパーゼ－Ｇｌｏ３／７（商標）アッセイを示す。エラーバーは、３つの生物学的に独立した実験からの平均値±ＳＤを示す。ＳＩＭ１、ｃｉｓ－ＳＩＭ１およびＭＴ１は１００ｎＭで使用した。ＭＺ１およびＡＲＶ－７７１は１μＭで使用した。ＶＨ２９８は１０ｍＭで使用した。ＱｖＤ－ＯＰｈは２０μＭで使用した。

【0125】

【図11】図１１（図４に関連）図１１ａ）は、２５μＭのＢＲＤ４のＢＤ１－ＢＤ２タンデムタンパク質（左パネル：Ｎ４３３Ｆ変異体、右パネル：ＶＣＢタンパク質を含むＮ１４０Ｆ変異体）と共にＳＩＭ１（赤色、２５μＭ）、ＭＺ１（橙色、２５μＭ）、ＭＴ１（緑色、２５μＭ）またはＤＭＳＯ（シアン色、２５μＭ）をインキュベートした後の複合体形成のサイズ排除クロマトグラフィーを示す。ピークの強度は２８０ｎｍでの吸光度である。図１１ｂ）は、透過処理された生細胞形態で行われた、ＬｇＢｉＴを安定発現するＣＲＩＳＰＲ ＨｉＢｉＴ－ＢＲＤ４ ＨＥＫ２９３細胞を用いた４連のＮａｎｏＢＲＥＴ標的結合アッセイを示す。細胞を蛍光ＢＥＴトレーサーで処理し、その後、さまざまな濃度の指定化合物とともにインキュベートして、競合的置換を測定した。各化合物のＩＣ_５０値は、透過処理された細胞と生細胞の両方について示される。図１１ｃ）は、４連での１００ｎＭのＳＩＭ１もしくはＭＺ１でまたはＤＭＳＯでの処理後の、ＬｇＢｉＴおよびＨａｌｏＴａｇ－ＶＨＬを発現するＨｉＢｉＴ－ＢＥＴ ＨＥＫ２９３細胞のＮａｎｏＢＲＥＴ^（商標）三元複合体のカイネティクスを示す。値は、ＤＭＳＯ対照に対する倍率増加分として表される。

【0126】

【図12】図１２は、固定化ＶＣＢに結合するＳＩＭ１二元複合体および三元複合体についての実験およびフィッティングＳＰＲデータを示している表１を示す。

【0127】

【図13】図１３は、ＳＩＭ１と、それの命名されたネガティブコントロール（Ｒ，Ｓ）－ＳＩＭ１およびｃｉｓ－ＳＩＭ１の化学構造を示す。反対の立体中心はアスタリスク（＊）で示されている。

【0128】

【図14】図１４は、ＢＲＤ４（１，２）からのＳＩＭ１および（Ｒ，Ｓ）－ＳＩＭ１による、ブロモスキャン置換力価測定を示す。ｑＰＣＲによって測定されたブロモドメインタンパク質の量（シグナル；ｙ軸）が、対応する化合物濃度に対してｌｏｇ_１０スケール（ｎＭ；ｘ軸）でプロットされている。曲線フィッティングからの解離定数Ｋ_ｄが表にまとめられる。誤差値はＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（商標）プログラムによって生成され、それは非線形最小二乗曲線と実験データとの間のフィッティングの質を反映する。

【0129】

【図15】図１５は、１μＭの指示化合物またはＤＭＳＯで４時間処理した後の、ＨＥＫ２９３細胞におけるＢＥＴタンパク質分解の免疫ブロットを示す。

【0130】

【図16】図１６は、ＣＲＩＳＰＲ ＨｉＢｉＴ－ＢＲＤ２、ＢＲＤ３およびＢＲＤ４ ＨＥＫ２９３細胞を、ウォッシュアウト実験のために複製プレート中で、１００ｎＭのＤＭＳＯ、ＭＺ１、（Ｒ，Ｓ）－ＳＩＭ１、並びに１０ｎＭと１００ｎＭの両方のＳＩＭ１で処理した結果を示す。１０ｎＭおよび／または１００ｎＭの化合物を含む培地を、グラフ上に示すように３．５時間目に取り出し、そして実験の残りのものについては、化合物を含まない培地と交換した。発光（ＲＬＵ）を５０時間の期間にわたって継続的にモニターし、ＤＭＳＯ対照に対して正規化してフラクションＲＬＵとしてプロットした。

【0131】

【図17】図１７は、Ａｐｏトラッカーグリーン（Ａｐｏｔｒａｃｋｅｒ Ｇｒｅｅｎ）とＤＡＰＩ染色によりそれぞれ生存率とホスファチジルセリンの細胞表面提示について分析し、そしてフローサイトメトリー分析により分析した、指示濃度の試験化合物で２４時間処理した後の、初期（ＦＩＴＣ：Ａｐｏｔｒａｃｋｅｒ Ｇｒｅｅｎ）および後期（ＦＩＴＣ：Ａｐｏｔｒａｃｋｅｒ ＧｒｅｅｎおよびＤＡＰＩ）アポトーシス性ＭＶ４；１１細胞と健全ＭＶ４；１１細胞の割合を表す棒グラフを示す。データは積み重ね棒としてプロットされるため、単一点は表示されない。エラーバーは、３つの生物学的複製物の平均±Ｓ．Ｄ．を反映する。

【0132】

【図18】図１８は、雄Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝３）への単回静脈内（ＩＶ）または皮下（ＳＣ）投与（５ｍｇ／ｋｇ）後のＳＩＭ１の平均血漿濃度－時間プロファイルを示す。このグラフは、ＳＩＭ１が生体内で優れた利用可能性（アバイラビリティ）と薬物動態暴露を提示することを示す。詳細については、関連する表２を参照のこと。

【0133】

【図19】図１９は、ＳＩＭ１の静脈内（ｉ．ｖ．）および皮下（ｓ．ｃ．）投与（本試験）について、ＭＺ１（ｈｔｔｐｓ：／／ｏｐｎｍｅ．ｃｏｍ／ｍｏｌｅｃｕｌｅｄ／ｂｅｔ－ｍｚ－１）およびＪＱ１（Ｆｉｌｉｐｐａｋｏｐｏｕｌｏｓ他、Ｎａｔｕｒｅ４６８、１０６７－１０７３（２０１０））のものに対する、算出された薬物動態パラメータを記載した表２を示す。

【0134】

【図20】図２０は、ＢＲＤ２およびＢＲＤ４イソ型を分解するときのＳＩＭ１およびその類似体ＭＮ６７４の効力を定量化するための、ＢＲＤ２、ＢＲＤ４＿ｌｏｎｇおよびＢＲＤ４＿ｓｈｏｒｔのＤＣ_５０値（ｎＭで）を要約する表３を示す。ＤＣ_５０値はｎＭ単位であり、図２２で作成された用量依存曲線から得られる。

【0135】

【図21】図２１は、ＲＣＣ４－ＨＡ－ＶＨＬにおいてヘテロ三価ＰＲＯＴＡＣのＳＩＭ１およびＭＮ６７４を使用した、ＢＲＤ２およびＢＲＤ４の用量依存的タンパク質分解を表すイムノブロットを示す。

【0136】

【図22】図２２は、分解剤ＰＲＯＴＡＣの濃度（ｎＭで）に対してプロットした、０．１％ＤＭＳＯのみの対照（コントロール）に対して比率にし、％バンド強度に変換した、図２１に示されるＭｎ６７４およびＳＩＭ１による、ＢＲＤ２（図２２ａ）およびＢＲＤ４（図２２ｂ）の用量依存性タンパク質分解の免疫ブロットのバンド強度を表すグラフである。

【実施例】

【0137】

三価ＰＲＯＴＡＣの構造に基づく設計と合成
ＭＺ１（欧州特許ＥＰ３２６８３６３に開示）を含むいくつかのＢＥＴファミリーＰＲＯＴＡＣは、親の一価ＢＥＴ阻害剤から開発されている（ｒｅｆ．９，１１，３７，３８）。本発明者らは、ｐａｎ－ＢＥＴ ＢＤ阻害剤である（＋）－ＪＱ１にコンジュゲートされたＶＨＬリガンドＶＨ０３２（ｒｅｆ．３９）から構成される、有力なＢＥＴ ＰＲＯＴＡＣ化合物ＭＺ１（ｒｅｆ．９）を以前に合成した。ＢＲＤ４の第二ブロモドメイン（ＢＤ）であるＢＲＤ４^ＢＤ２とＶＨＬとを有する三元複合体（ｒｅｆ．２１）に結合されたＭＺ１の結晶構造は、ＭＺ１のＰＥＧ３リンカーの中央部分が溶媒の方に露出していることを示し、ＰＥＧ３リンカーが２番目のＢＥＴリガンドに結合する潜在的な分岐点であることを示唆している（図１ａ）。同様に、ＢＲＤ４^ＢＤ２の２つのモノマーに結合した、ＰＥＧ７リンカーを有する（＋）－ＪＱ１のホモ二量体である二価ＢＥＴ阻害剤ＭＴ１（ｒｅｆ．４０）の共結晶構造の解析により、リンカーの中央領域内の１つの部位が、Ｅ３リガーゼリガンドに向かう潜在的な化学的分岐点であることを明らかにした（図１ｂ）。対照的に、二価阻害剤Ｂｉ－ＢＥＴは、その共結晶構造中の２つのブロモドメインの界面に完全に埋没しており、誘導体化によってその結合様式を破壊しうることを示唆している（図６ａ）（ｒｅｆ．４１）。

【0138】

本発明者らは、設計戦略において前駆体二官能性分子としてＭＺ１およびＭＴ１を選出した。次に、可変リンカーを介して３つのリガンドを集成し、三官能性ＰＲＯＴＡＣを創製可能にする、適切な「コア・スキャフォールド（足場）」を考案した（図１ｃ）。本発明者らは、トリメチロールエタン（ＴＭＥ）としても知られる１，１，１－トリス（ヒドロキシメチル）エタンを選択した。その理由は、該化合物がネオペンチルコア構造内の３つの第一級アルコール基を特徴としており、従ってＰＥＧ単位の分岐型近接バイオアイソステリック置換（生物学的等価体置換）として機能するからである。いくつかの実施形態では、各ＢＥＴリガンド部分への化学リンカーは同一に保持され、その結果、ＴＭＥの中心の第四級炭素のアキラリティー（ａｃｈｉｒａｌｉｔｙ；不斉がないこと）をもたらした。全体の化学構造を可能な限りＭＺ１およびＭＴ１の化学構造に近似させながら、同時に、異なる単量体リガンド間の相対的拘束を探索する際に柔軟性をもたせるために、ＢＥＴリガンドへ向かう各リンカーの位置にＰＥＧ３またはＰＥＧ４を有する（ｎ＝３または４）、およびＶＨ０３２に向かうリンカーにＰＥＧ０またはＰＥＧ１を有する（ｍ＝０または１）、３種の分岐型ＰＲＯＴＡＣ（ＳＩＭ１～ＳＩＭ３）を設計した（図１ｃ）。本発明者らはまた、ＶＨ０３２（ＳＩＭ４～ＳＩＭ６）の代わりにＣＲＢＮターゲティングリガンドであるポマリドミド（ｐｏｍａｌｉｄｏｍｉｄｅ）から構成される類似化合物も設計した（図１ｃ）。

【0139】

一般構造（１２）を有するＶＨＬベースの三価ＰＲＯＴＡＣを合成するために、本発明者らは、三価リンカーコアへの重要な前駆体として、ＴＭＥから合成されたアセトニド（１）から出発した（スキーム１）。アセトニド（１）のアリル化とその後の脱保護によりジオール（２）を提供し、これをメシレートリンカー（３）でアルキル化して、Ｅ３リガーゼリガンドへのｍ＝０のＰＲＯＴＡＣ前駆体としてのアリルエーテル（４）を得た。追加のＰＥＧ１単位（ｍ＝１）を導入するために、水素化ナトリウムの存在下でアルコール（１）をヨウ化物（５）と反応させた。６のアセトニド基の脱保護と、その後のリンカー（３）による露出した第一級アルコールのアルキル化により、ジアジド（７）を得た。ジアジド７のｐ－メトキシベンジル（ＰＭＢ）基を２，３－ジクロロ－５，６－ジシアノ－１，４－ベンゾキノン（ＤＤＱ）で脱保護し、続いてアリル化して、アリルエーテル（８）を得た。アリルエーテル（４または８）中の二重結合を酸化的に開裂させ、その後得られたアルデヒド（９）をピニック酸化してカルボン酸（１０）を得、これをＶＨ０３２－アミン（ｒｅｆ． ２７，３７）とカップリングさせた。（１１）中の２つのアジド基をアミンに還元し、さらに（＋）－ＪＱ１カルボン酸とアミドカップリングすることで、ＶＨＬベースの三価ＰＲＯＴＡＣの調製を完成させた。ＣＲＢＮベースの三価ＰＲＯＴＡＣは、ＶＨ０３２－アミンの代わりにポマリドミド（ｒｅｆ．２９）のアミン含有類似体をカップリングすることによって同様に達成された。

【0140】

ｃｉｓ－ＳＩＭ１の合成はそのｔｒａｎｓ型ジアステレオマーと同様に容易であったけれども、最終カップリング工程で半当量のＢＥＴリガンドを使用することによる（Ｒ，Ｓ）－ＳＩＭ１化合物を合成する最初の試み（図１３を参照）は、許容できる収率で所望の１：１カップリングを果たすことはできなかった。したがって、本発明者らは、まず（＋）－ＪＱ１（Ｆｉｌｉｐｐａｋｏｐｏｕｌｏｓ他、Ｎａｔｕｒｅ ４６８，１０６７－１０７３（２０１０））とカップリングし、次に（－）－ＪＱ１（Ｆｉｌｉｐｐａｋｏｐｏｕｌｏｓ他、Ｎａｔｕｒｅ ４６８，１０６７－１０７３（２０１０））とカップリングするという、後続の独立したカップリング工程を可能にするように合成経路を修正した（本文「化学－材料と方法」の箇所を参照）。

【0141】

ＳＩＭ１は、ＢＲＤ２分解に好ましい有力なＶＨＬベースの三価ＰＲＯＴＡＣである。
ＢＥＴタンパク質の細胞内分解を誘導する三価化合物の能力を評価するために、本発明者らはまず、ヒトＨＥＫ２９３細胞を１μＭ濃度で４時間処理し、ウエスタンブロットによってＢＲＤ２、ＢＲＤ３およびＢＲＤ４のレベルを評価した。ＶＨＬベースのＳＩＭ１～ＳＩＭ３では、ＢＥＴタンパク質全体にわたって顕著な分解が観察されたが、ＣＲＢＮベースのＳＩＭ４～ＳＩＭ６では、最小限から完全無までの分解が観察された（図１ｄ）。ＣＲＢＮベースのＰＲＯＴＡＣと比較して、ＶＨＬベースの化合物の活性がより高いことを確認するために、次に、ＨＥＫ２９３細胞においてＣＲＩＳＰＥＲ／Ｃａｓ９で内因的にタグ付けされたＨｉＢｉＴ－ＢＲＤ４の生細胞連続発光モニタリングを２４時間にわたって実施した（ｒｅｆ．２９，３１）ＳＩＭ１～ＳＩＭ３では、ＳＩＭ４～ＳＩＭ６と比較して、より大きな最大分解レベルを伴う、より迅速なＢＲＤ４分解の初期速度が認められた（図１ｅ）。ＳＩＭ１～３を含むＨｉＢｉＴ－ＢＲＤ４の用量応答性カイネティクス解析では、どの化合物にもフック効果は観察されず、４ｎＭ～１μＭで急速かつ完全に分解することが示された（図６ｂ）。ＶＨＬベースの化合物のより大きな効力を確認するため、本発明者らは、化合物処理によるＢＥＴ感受性癌細胞株ＭＶ４；１１（図１ｆ）、Ａ５４９およびＨＬ－６０（図６ｃ）の増殖阻害プロファイルを評価した。化合物ＳＩＭ１～ＳＩＭ３は、ＳＩＭ４～ＳＩＭ６と比較して、更に親の二官能性分子ＭＺ１およびＭＴ１と比較して、より強力な活性を一貫して示した（図１ｆおよび図６ｃ）。まとめると、初期スクリーニングは、構造に基づいて誘導設計したＶＨＬ分解剤が、相同のＣＲＢＮ分子を上回る、より大きな活性を持つことを支持している。

【0142】

これらの初期結果に励まされて、本発明者らは次に、ＢＥＴタンパク質ファミリー全体にわたってＶＨＬベースの分解剤の分解活性を、より深く特徴づけようと努めた。イムノブロットを使用した４時間の処理での濃度依存プロファイリングでは、すべてのＢＥＴタンパク質において、ＭＺ１（ＤＣ_５０値が２５～９２０ｎＭ）と比較して、化合物ＳＩＭ１～ＳＩＭ３のＤＣ_５０値が０．７～９．５ｎＭとはるかに低いことが証明され、ＳＩＭ１が３つの分解剤の中で最も強力であった（図２ａおよび図６ｄ）。本発明者らはまた、ＭＺ１の顕著に優先的なＢＲＤ４分解と比較して、すべての化合物でＢＲＤ３およびＢＲＤ４よりもＢＲＤ２の分解を優先することも観察した（図６ｄ）（ｒｅｆ．９，２１，２５）。化合物ＳＩＭ１～ＳＩＭ３を用いた定量的生細胞分解速度アッセイは、ＢＥＴファミリーメンバーＢＲＤ２、ＢＲＤ３およびＢＲＤ４のＣＲＩＳＰＥＲ ＨｉＢｉＴ細胞株を用いて実行され、化合物ＳＩＭ１～ＳＩＭ３を最大１０ｎＭ濃度まで滴定した（図２ｂおよび図７ａ、ｂ）。これらの分析により、化合物ＳＩＭ１がすべてのＢＥＴファミリーメンバーの中で最も強力な分解剤である（Ｄｍａｘ_５０が６０～４００ｐＭ）（図２ｂ、ｃおよび図７ａ～ｃ）としてさらに見なされ、全ての化合物でＢＲＤ２が最速の分解速度と最低のＤｍａｘ_５０値を示した（図２ｃおよび図７ｃ）。

【0143】

（Ｒ，Ｓ）－ＳＩＭ１も分解活性について試験したところ、ＭＺ１と同様に挙動するが、すべてのＢＥＴファミリーメンバーの分解についてＳＩＭ１よりも活性が弱いことが判明した（図１５を参照、この図は１μＭの指示化合物またはＤＭＳＯで４時間処理した後のＨＥＫ２９３細胞におけるＢＥＴタンパク質の分解のイムノブロットを示す）。

【0144】

三価のＰＲＯＴＡＣが、ＭＺ１または（Ｒ，Ｓ）－ＳＩＭ１と比較して細胞内のＢＥＴタンパク質のより持続的な分解も誘導するかどうかを評価するために、分解ウォッシュアウト試験を実施した。ＣＲＩＳＰＥＲ標識ＨｉＢｉＴ－ＢＥＴ ＨＥＫ２９３細胞を、等濃度（１００ｎＭ）のＳＩＭ１、（Ｒ，Ｓ）－ＳＩＭ１、およびＭＺ１化合物で３．５時間処理し、その後、培地を除去して、化合物を含まない培地で置換した。本発明者らはまた、ＢＥＴタンパク質全体にわたるそのより高い分解能力を説明するために、１０倍低い（１０分の１の）濃度（１０ｎＭ）でＳＩＭ１を試験した。ＨｉＢｉＴ－ＢＥＴタンパク質レベルを、化合物の最初の添加から洗浄直後まで合計５０時間にわたって継続的にモニタリングした。１００ｎＭ処理では、ＳＩＭ１によるすべてのＢＥＴファミリーメンバーの分解は、ウォッシュアウト後に、時間経過しても一定の低レベルに留まったのに対し、１０ ｎＭのＳＩＭ１処理では、ウォッシュアウト後に、ＢＲＤ２、ＢＲＤ３およびＢＲＤ４について部分的な回復が観察された（図１６）。１００ｎＭの（Ｒ，Ｓ）－ＳＩＭ１または１００ｎＭのＭＺ１で処理した細胞のウォッシュアウト後のすべてのＢＥＴファミリーメンバーの回復は、ＳＩＭ１で観察されたものよりも大きく、より迅速に起こった（図１６）。

【0145】

ＢＥＴタンパク質に対する化合物ＳＩＭ１の細胞選択性を評価するために、多重化ＴＭＴ（Ｔａｎｄｅｍ Ｍａｓｓ Ｔａｇ^（商標））標識質量分析プロテオミクス実験を実施し、定量的でかつ公正な（客観的な）方法でタンパク質レベルをモニタリングした。これらの実験において適切な非分解性ネガティブコントロール（陰性対照）異性体を提供するために、発明者らは、ＶＨＬリガンドのヒドロキシプロリン中心に逆の立体化学を有しており、そのためＶＨＬへの結合の損失を引き起こす、化合物ｃｉｓ－ＳＩＭ１を合成した（本文の「化学－材料および方法」の箇所を参照のこと）（ｒｅｆ．９，１０）。

【0146】

急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）ＭＶ４；１１細胞を、ＤＭＳＯ、１０ｎＭの化合物ＳＩＭ１、または１０ｎＭの化合物ｃｉｓ－ＳＩＭ１で４時間、３連（三重複製）において処理した。定量化された５，２３２種のタンパク質群の中で、ＢＲＤ２は、化合物ｃｉｓ－ＳＩＭ１と比較して化合物ＳＩＭ１により最も顕著に分解されることが判明し、次にＢＲＤ３およびＢＲＤ４が続いた（図２ｄおよび図７ｄ）。

【0147】

本発明者らはまた、ＢＥＴ誘導分解の既知の下流効果である、ＭＹＣのタンパク質レベルのわずかな減少、およびアポトーシスの早期開始を示唆するＨＭＯＸ１（ヘムオキシゲナーゼ１）タンパク質レベルのわずかな減少を観察した（ｒｅｆ．４２）。

【0148】

分解速度および／または分解レベルの増加は、ユビキチン化の増加と相関することが判明しているため、ＨｉＢｉＴ－ＢＥＴ ＣＲＩＳＰＲ細胞株からなる生物発光共鳴エネルギー移動（ＮａｎｏＢＲＥＴ^（商標））アッセイを使用して、蛍光標識されたＨａｌｏＴａｇ－ユビキチンを発現するＢＥＴファミリーメンバーのユビキチン化のカイネティクス（動態）をモニタリングする細胞研究を行った（３１）。図２ｅに示すように、１０ｎＭの化合物ＳＩＭ１で処理した後の細胞ユビキチン化の動的増加は、ＢＲＤ３およびＢＲＤ４と比較してＢＲＤ２の方がより強かった。

【0149】

これらと同じ傾向が、１００ｎＭ濃度の化合物ＳＩＭ１でも観察された。ＭＺ１との比較により、化合物ＳＩＭ１が、すべてのＢＥＴファミリーメンバーのより高レベルのユビキチン化を引き起こし、ＢＲＤ２で最も大きな差異が観察されたことが明らかになった（図７ｅ）。これらの細胞分解データを総合すると、研究した三価ＰＲＯＴＡＣの中で、ＳＩＭ１化合物が最も強力なＢＥＴ分解剤であり、ＢＲＤ２が優先的に分解されることが強調された。

【0150】

化合物ＳＩＭ１は、二価ＢＥＴ ＰＲＯＴＡＣおよび親の二官能性阻害剤よりも機能的に強力である

【0151】

化合物ＳＩＭ１の標的結合価数の増加が、他のＶＨＬベースの二価ＰＲＯＴＡＣと比較して、分解と有効性の両方を改善したかどうかを判断するために、まず、二価ＢＥＴ ＰＲＯＴＡＣ ＡＲＶ－７７１について各ＢＥＴファミリーメンバーの動的分解プロファイルを決定した（ｒｅｆ．３７）（図８ａ）。これらおよび以前に公開されたＭＺ１解析（ｒｅｆ．３１）から計算し、化合物ＳＩＭ１と比較した、分解速度およびＤｍａｘ_５０値をＢＲＤ２（図３ａ）、並びにＢＲＤ３およびＢＲＤ４（図８ｂ）についてプロットした。これらの定量的比較により、化合物ＳＩＭ１は、大幅に向上した分解速度を有し、また、ＢＲＤ２については８０～３００倍（図３ａ）、ＢＲＤ３については２～３５倍、ＢＲＤ４については１０～２０倍の分解能の増加に及ぶＤｍａｘ_５０値を有することが明らかになった（図８ｂ）。

【0152】

二価のＢＥＴ ＰＲＯＴＡＣと比較して、三価ＰＲＯＴＡＣの分解の改善が機能的結果の向上につながるのかどうかを解明するために、本発明者らは次に、ＢＥＴ感受性細胞株である前立腺癌株２２Ｒｖ１における化合物ＳＩＭ１の応答を研究することに移った。４時間という早い時点で様々な濃度の化合物で２２Ｒｖ１細胞を処理すると、関連する二官能性ＢＥＴ分解剤であるＭＺ１およびＡＲＶ－７７１並びに非分解性対照であるＭＴ１およびｃｉｓ－ＳＩＭ１と比較して、化合物ＳＩＭ１のＢＥＴ分解力およびｃＭｙｃレベルの抑制活性の増強が確認された（図３ｂおよび図８ｃ）（ｒｅｆ．３９）。

【0153】

ＶＨＬ阻害剤ＶＨ２９８（ｒｅｆ．３９）とプロテアソーム阻害剤ＭＧ１３２での同時処理により、機能的ＶＨＬリガーゼおよびプロテアソーム活性に対する化合物ＳＩＭ１誘導性分解の予想される力学的依存関係が確証された（図８ｄ）。

【0154】

ＢＥＴ阻害剤および分解剤は、ＭＶ４；１１のＢＥＴ関連ＡＭＬ系における非バイアスプロテオミクス・プロファイリングにおいて、ｃＭｙｃを含む多数の標的の下方制御（ダウンレギュレーション）をもたらした（１０ｎＭの化合物ＳＩＭ１で４時間処理した後に減少を示した）（図２ｄ）。この癌細胞系におけるｃＭｙｃの時間依存性減少を定量するために、ｃＭｙｃにＨｉＢｉＴで内因的にタグ付けし、様々な濃度の化合物ＳＩＭ１、ｃｉｓ－ＳＩＭ１、およびＭＴ１を使用して細胞溶解物中のタンパク質レベルを様々な時点でモニタリングした（図３ｃ、左および図９ａ）。１ｎＭのＳＩＭ１濃度でｃＭｙｃの急速かつ完全な減少が観察されたが（図３ｃ、左）、親のＭＴ１またはｃｉｓ－ＳＩＭ１では、同様のレベルのｃＭｙｃの減少は５０～１００ｎＭの処理濃度まで達成されなかった（図９ａ）。各化合物が細胞死にどのような影響を与えるかを解明するために、細胞生存率相関アッセイを実施した。該アッセイにより、１ｎＭのＳＩＭ１での処理の場合のみ（ｃｉｓ－ＳＩＭ１またはＭＴ１の場合では起こらない）６時間後に測定可能な細胞死が生じることが明らかになった（図３ｃ、右）。同様の傾向が、より高い化合物濃度でも観察され、６時間後にＳＩＭ１は、どの濃度でも対照化合物よりも細胞毒性が顕著に高いことが判明した（図９ｂ）。

【0155】

次に、本発明者らは、２２Ｒｖ１癌細胞の生存力に対するＳＩＭ１の機能的効果を評価した。ＰＡＲＰ開裂アッセイによって示されるように、１０ｎＭのＳＩＭ１での２４時間処理後に実質的な細胞死が観察された（図３ｄおよび図１０ａ）。対照的に、ＭＴ１またはＭＺ１は、ＳＩＭ１と同じ濃度で４８時間処理しても、検出可能なＰＡＲＰ開裂を引き起こさなかった（図１０ｂ～ｃ）。同レベルのＰＡＲＰ切断が、濃度１μＭでのみＭＴ１およびＭＺ１で観察された（図１０ｂ～ｃ）。汎カスパーゼ阻害剤（ｐａｎ－ｃａｓｐａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）であるＱＶＤ－ＯＰｈでの同時処理によるＰＡＲＰの開裂の抑制によって示されるように、細胞はアポトーシスが原因で死滅したのであり、ネクロスタチン－１との同時処理によって示されるように、ネクロプトーシスによるものではなかった（図３ｄおよび図１０ａ）。

【0156】

化合物処理の間の初期および後期アポトーシス誘導を比較したところ、顕著には、１０倍高い濃度の（Ｒ，Ｓ）－ＳＩＭ１、ＭＺ１またはＭＴ１と比較した場合でも、ＳＩＭ１は、試験した全ての二価相当物と比較して、１ｎＭで初期と後期のアポトーシスの両方をはるかに大きい程度誘導した（図１７参照、これは、生存率およびホスファチジルセリンの表面存在についてそれぞれＡｐｏｔｒａｃｋｅｒ Ｇｒｅｅｎ染色とＤＡＰＩ染色によりおよびフローサイトメトリー分析により解析したとき、指示濃度の試験化合物での２４時間処理後の、初期（ＦＩＴＣ：Ａｐｏｔｒａｃｋｅｒ Ｇｒｅｅｎ）および後期（ＦＩＴＣ：Ａｐｏｔｒａｃｋｅｒ ＧｒｅｅｎおよびＤＡＰＩ）アポトーシス性細胞と健全なＭＶ４；１１細胞との割合を示す。データは、積み重ねバーとしてプロットされ、単一のドットは示されない。エラーバーは、３つの生物学的複製物の平均±Ｓ．Ｄ．を反映する）。まとめると、生物学的データは、（Ｒ，Ｓ）－ＳＩＭ１および親の二価分解剤または阻害剤と比較して、三価分解剤ＳＩＭ１の、より強力な分解と、より実質的な下流機能活性とを裏付けている。

【0157】

二官能性分解剤であるＭＺ１およびＡＲＶ－７７１（それぞれＥＣ_５０が１５０ｎＭおよび９０ｎＭ）と比較して、化合物ＳＩＭ１（ＥＣ_５０が２ｎＭ）の活性が著しく強力であることが確認され、非分解剤ｃｉｓ－ＳＩＭ１およびＭＴ１（図３ｅ）よりもはるかに大きい最大シグナルを有した。化合物ＳＩＭ１、ＭＺ１、およびＡＲＶ－７７１のカスパーゼ－Ｇｌｏ活性は、ＶＨ２９８およびＱＶＤ－ＯＰｈでの同時処理によってブロックされたが、一方でＱＶＤ－ＯＰｈのみがｃｉｓ－ＳＩＭ１およびＡＲＶ－７７１の活性をブロックし、ＶＨ２９８との同時処理はブロックせず、この結果は、それらが異なる作用機序であることと一致している（図１０ｄ）。

【0158】

化合物ＳＩＭ１の優れた活性は、２２Ｒｖ１細胞を１０ｎＭ濃度の試験化合物で２４時間処理し、処理細胞を再播種して２０日間増殖させるというコロニー形成アッセイにおいて証明された。このアッセイでは、化合物ＳＩＭ１での処理のみが、ビヒクル対照と比較して有意な細胞毒性をもたらした（図３ｆ）。総合すると、生物学的データは、基準となる親の二価分解剤または阻害剤と比較して、三価分解剤化合物ＳＩＭ１の、より強力な分解とより実質的な下流機能活性を裏付けている。

【0159】

最後に、本発明者らは、マウスにおける静脈内および皮下投与後のＳＩＭ１の薬物動態（ＰＫ）を評価した（図１８を参照）。ＳＩＭ１は、高いＡＵＣ、低いクリアランス、長い半減期など、非常に好ましいバイオアベイラビリティと安定性を示し、標準的な小分子成分、いわゆる一価のＪＱ１（ｒｅｆ．３６）や二価のＭＺ１と比べて優れている（データはＯｐｎＭｅ．ｃｏｍにて入手可能）（図１８および表２）。このような好ましいＰＫプロファイルは、その大きなサイズ（分子量１，６１９Ｄａ）を考慮すると注目に値し、ＳＩＭ１を生体内での使用に適した化学プローブとして認定する。

【0160】

化合物ＳＩＭ１はＢＤ１およびＢＤ２と分子内で係合し、ＶＨＬおよびＢＲＤ４と１：１：１の三元複合体を形成する。

【0161】

化合物ＳＩＭ１の顕著な細胞活性および効力のため、本発明者らは、代表的なＢＥＴタンパク質としてＶＨＬおよびＢＲＤ４との三価ＰＲＯＴＡＣ複合体の分子認識および化学量論を調べるように促された。これまでの研究により、二価のＢＥＴ阻害剤がＢＥＴタンパク質内のＢＤ１およびＢＤ２ブロモドメインに分子内で同時に係合することは確立されていた（ｒｅｆ．４０，４１）。

【0162】

したがって、本発明者らは、三価のＢＥＴ ＰＲＯＴＡＣ ＳＩＭ１が、その作用機序を支えるシス分子内結合を示す可能性があるという仮説を立てた。これに対処するために、本発明者らはまず、組換えタンパク質を用いた生物物理学的結合アッセイを採用した。野生型（ＷＴ）であってそのためシス分子内結合に適格性がある（ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）ＢＲＤ４からのタンデムＢＤ１－ＢＤ２構成物か、またはリガンド結合ポケット中の保存的アスパラギン残基のところにＢＤ１もしくはＢＤ２中に点変異を含み（ＢＲＤ４^ＢＤ１中のＮ１４０ＦまたはＢＲＤ４^ＢＤ２中のＮ４３３Ｆ）２つのブロモドメインのうちの１つへの結合を無効にし、それによって変異体タンデムがシス二価様式で係合できなくなったＢＲＤ４からのＢＲＤ１－ＢＤＲ２タンデム構成物を使用して、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）（ｒｅｆ．２７）実験を行った。

【0163】

化合物ＳＩＭ１は、遊離型またはＭＺ１結合型ＢＲＤ４と比較して、ＢＲＤ４野生型ＢＤ１－ＢＤ２タンデム構築物のＳＥＣプロファイルを、より高い溶出容量にシフトすることができた。この結果は、ＭＴ１で観察されたように（図４ａ）、化合物ＳＩＭ１とのよりコンパクトな分子内１：１複合体の形成と一致する。対照的に、Ｎ１４０ＦまたはＮ４３３Ｆ変異体タンデムを使用した場合、化合物ＳＩＭ１およびＭＴ１の両方で、溶出容量が大幅に減少することが観察された。この知見は、溶液中での高分子量二量体種の形成と一致しており、比較参照の遊離型のものまたはＭＺ１結合型ＢＲＤ４と比較して、溶液中でのより高分子量の２：１種の形成と一致している（図４ａおよび図１１ａ）。

【0164】

化合物ＳＩＭ１がその二価ＢＥＴリガンド部分を利用して、シス分子内様式でＢＤ１とＢＤ２を係合することを確立したので、本発明者らは次に、ＶＨＬリガンド部分からの残余の結合原子価を利用することにより、化合物ＳＩＭ１がＢＤ１－ＢＤ２タンデムドメインとＥ３リガーゼＶＨＬとの間で所望の１：１：１複合体を形成できるかどうかを問題にした。実際、化合物ＳＩＭ１、ＢＤ１－ＢＤ２、およびＶＨＬ－ＥｌｏｎｇｉｎＢ－ＥｌｏｎｇｉｎＣ複合体（ＶＣＢ）を１：１：１当量で含むサンプルは、単一種としてカラムを流れ、ｃｉｓ－ＳＩＭ１、ＢＤ１－ＢＤ２タンデムおよびＶＣＢを同じ当量比で含むサンプルから観察された２本のピーク（この場合は１：１のｃｉｓ－ＳＩＭ１：ＢＤ１－ＢＤ２複合体、および未結合ＶＣＢサンプルのみが形成されうる）のいずれと比較しても低い溶出容量で溶出した（図４ａ）。

【0165】

二価ＢＥＴ阻害剤を用いたこれまでの生物物理学および細胞研究において、ＢＤ１とＢＤ２の分子内結合がＢＲＤ４の構造的コンホメーション変化を引き起こすことが示された（ｒｅｆ．４１）。化合物ＳＩＭ１のＢＲＤ４への細胞結合も構造変化を誘導する可能性があるかどうかを決定するために、本発明者らは、ＮａｎｏＬｕｃドナーとＨａｌｏＴａｇアクセプターがそれぞれ隣接した、野生型ＢＲＤ４または変異体Ｎ４３３Ｆの同一ＢＤ１－ＢＤ２タンデムドメインを含有する、ＮａｎｏＢＲＥＴバイオセンサーを利用した（図４ｂ）。ＢＤ１－ＢＤ２タンデムＷＴセンサーでは、すべての化合物がＢＲＤ４コンホメーションの変化を示した。これは、分子内係合で予想されるように、プラトーに達した後に維持される、ＮａｎｏＢＲＥＴシグナルの増加により明らかである（図４ｂ）。ｃｉｓ－ＳＩＭ１とＳＩＭ１が類似パターンを示すことを考慮すると、ＶＨＬを係合する能力は、ＢＲＤ４の構造変化に有意な影響を与えないように見えた（図４ｂ）。対照的に、ＢＤ１－ＢＤ２のＮ４３３Ｆ変異体センサーは全く応答を示さなかったが、これはコンホメーション変化にＢＤ１とＢＤ２の同時結合が必要であることを示している（図４ｂ）。興味深いことに、ｃｉｓ－ＳＩＭ１およびＳＩＭ１は、ＢＲＤ４係合のＥＣ_５０値がＭＴ１よりも高いこと示した（図４ｂ）。

【0166】

これが分子量の増加によるＢＲＤ４の結合親和性の低下および／またはそれらの透過性の減少によるものであるかどうかを判断するために、ＨｉＢｉＴ－ＢＲＤ４に結合した蛍光ＢＥＴトレーサー分子の置換（ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ）を測定するＮａｎｏＢＲＥＴターゲットエンゲージメントアッセイ（ｒｅｆ．４１）を実施した。透過性が要因とはならない透過処理（透徹）細胞において、本発明者らは、ＳＩＭ１、ｃｉｓ－ＳＩＭ１およびＭＴ１が、ほぼ同一の結合親和性およびＩＣ_５０値で、内因性ＨｉＢｉＴ－ＢＲＤ４に結合することを観察した（図１１ｂ）。しかしながら、生細胞では、ＳＩＭ１とｃｉｓ－ＳＩＭ１の両方とも、ＭＴ１と比較してＢＲＤ４に対する結合親和性の低下を示し、コンホメーションセンサーアッセイにおいても同じ１０倍のシフトが観察された。この結果は、それが親の二価阻害剤と比較して、三価分子の透過性の減少を反映するものであることを示唆している（図１１ｂ）。

【0167】

このような細胞透過性の減少にもかかわらず、化合物ＳＩＭ１が高度に有力な分解剤であり、それらの生化学および細胞研究は、三元複合体形成の様式に関して、化合物ＳＩＭ１が所定のＢＥＴタンパク質内でＢＤ１とＢＤ２を同時に係合し、ＶＨＬをリクルートして１：１：１複合体を形成させるという洞察を与える。

【0168】

（Ｒ，Ｓ）－ＳＩＭ１を単座ＢＥＴバインダー対照として使用し、二座ＢＥＴバインダーＳＩＭ１がどの程度の結合力を示すか、つまり分子内ＢＤ１およびＢＤ２結合によるＢＥＴタンパク質に対する結合親和性をどの程度強化するかを調べた。本発明者らは、確立されたファージベースのブロモドメイン置換（ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ）アッセイを使用して、タンデムブロモドメイン構築物との化合物の結合を定量測定した。二座ＳＩＭ１は、タンデムブロモドメイン構築物ＢＲＤ２（１，２）、ＢＲＤ３（１，２）、ＢＲＤ４（１，２）および全長ＢＲＤ４に対してピコモルの親和性を示し、単座（Ｒ，Ｓ）－ＳＩＭ１と比較して親和性が５０～９０倍増加しており、二座（二価）ＳＩＭ１の親和性を証明している（図１４を参照）。

【0169】

化合物ＭＮ６７４は、ＳＩＭ１の別の類似体として設計され合成された。ＭＮ６７４の構造はＳＩＭ１と同じであるが、ＪＱ１バインダーへのリンカー中に含まれるＰＥＧ単位が１つ少ない。ＭＮ６７４は、用量応答性分解アッセイにおいて哺乳動物細胞株ＲＣＣ４－ＨＡ－ＶＨＬでテストした。このアッセイは、各化合物について５００ｎＭから６．４ｐＭまでの８段階の５倍段階希釈での６時間処理を示すイムノブロット（ウエスタンブロットの生データについては図２１を、用量応答曲線については図２２を参照）を含んだ。ＢＲＤ２およびＢＲＤ４のタンパク質レベルの定量を行ってＤＣ_５０値を測定し、それを表３にまとめた（図２０）。図２１は、ＲＣＣ－ＨＡ－ＶＨＬ細胞においてヘテロ三価ＰＲＯＴＡＣ ＳＩＭ１およびＭＮ６７４を使用して、ＢＲＤ２およびＢＲＤ４の用量依存性タンパク質分解を実証するイムノブロットの結果を示す。ＲＣＣ－ＨＡ－ＶＨＬ細胞を、ヘテロ三価ＢＥＴ－ＢＥＴ－ＶＨＬ ＰＲＯＴＡＣ ＳＩＭ１およびＭＮ６７４の８段階の５倍ずつの段階希釈液（５００ｎＭ～６．４ｐＭ）に６時間曝露し、その後、溶解物を回収してイムノブロット分析した（図２１）。ＢＲＤ２（ＩＲＤｙｅ ８００ＣＷ）、ＢＲＤ４＿ｌｏｎｇ（ＩＲＤｙｅ ８００ＣＷ）、ＢＲＤ４＿ｓｈｏｒｔ（ＩＲＤｙｅ ８００ＣＷ）およびハウスキーピング遺伝子チューブリン（ローダミン）の蛍光検出には、Ｂｉｏ－Ｒａｄ社ＭＰイメージングシステムを使用した。バンドの強度は、ＩｍａｇｅＬａｂ（商標）ソフトウェアを使用して決定し、すべてのＢＥＴタンパク質強度を、０．１％ＤＭＳＯのみの対照に対して有理化された％バンド強度に変換するために、チューブリンに対して正規化した。次に、これらの強度を用量応答［阻害］変数勾配（４パラメーター）分析用のＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（商標）にプロットして、ＢＲＤ２（図２２ａ）およびＢＲＤ４（図２２ｂ）に関する曲線を作成し、表３に示すＤＣ_５０値を決定した（図２０）。この実験は、ｎ＝２、つまり生物学的複製試験を表す。

【0170】

全体として、ＭＮ６７４は、異なる細胞株に応じて結果がわずかに異なるにもかかわらず、分解能力に関してはＳＩＭ１に匹敵することが示された。

【0171】

化合物ＳＩＭ１は、細胞の滞留時間を延長して協同的で安定な三元複合体を形成する
三元複合体の化学量論を検証し、結合熱力学と三元複合体形成と解離の反応速度をさらに特徴付けるために、本発明者らは、次に逆滴定を行うことによる等温滴定熱量測定（ＩＴＣ）を使用した（ｒｅｆ．２１，３２）。まず、予め形成されたＳＩＭ１：ＶＣＢ複合体に対するＢＲＤ４のＮ１４０ＦまたはＮ４３３Ｆタンデムの滴定では、２：１の化学量論、モル結合エンタルピーΔＨ＝－９．１および－１１．６ｋｃａｌ／モル、およびＫ_ｄ＝０．１２および１．２μＭがそれぞれ観察された。対照的に、同一条件下でのＢＲＤ４のＷＴ（野生型）ＢＤ１－ＢＤ２の滴定では、１：１の結合化学量論、大きな負の結合エンタルピー（ΔＨ＝－２０ｋｃａｌ／モル）、および、はるかに低い解離定数（Ｋ_ｄ＜２０ｎＭ）が観察された（図４ｃ）。総合すると、ＩＴＣデータは、ＳＥＣで観察された化学量論を確証し、ＶＣＢ：ＳＩＭ１によるＢＲＤ４^ＢＤ２の優先的結合が、分子内１：１係合より前の最初のステップである可能性が高いことを示している。

【0172】

細胞の全長ＢＲＤ４に関連して、ＢＤ１とＢＤ２の両方をＶＨＬと共に三元複合体に係合する（ｅｎｇａｇｅｍｅｎｔ）ことの有利性を研究するために、本発明者らは、カイネティクス（速度論的）ＮａｎｏＢＲＥＴ三元複合体アッセイ（ｒｅｆ．３１）を使用して、全長ＢＲＤ４のＷＴ（野生型）、Ｎ１４０Ｆ変異体、またはＮ４３３Ｆ変異体に対するＶＨＬの結合を調査した。ＨａｌｏＴａｇ－ＶＨＬとのさまざまなＮａｎｏＬｕｃ－ＢＲＤ４融合体を発現するＨＥＫ２９３細胞では、ＶＨＬとＷＴのＢＲＤ４を有する三元複合体が、ＳＩＭ１の存在下で急速に形成されたのに対し、対照のｃｉｓ－ＳＩＭ１またはＭＴ１では該複合体が形成されなかった（図４ｄ）。しかしながら、三元複合体形成はＢＲＤ４のＮ１４０Ｆ変異により著しく減少し、Ｎ４３３Ｆ変異によりほぼ消失した（図４ｄ）。これらの結果は、化合物ＳＩＭ１が三元複合体形成にＢＤ１とＢＤ２の両方を利用することを確証し、ＩＴＣの結果およびＭＺ１で以前に観察されたものと一致して、化合物ＳＩＭ１がＢＤ１よりもＢＤ２に優先的に結合することを示唆している（ｒｅｆ．２１，３２）。

【0173】

ＭＺ１と比較した化合物ＳＩＭ１による細胞内のＮａｎｏＢＲＥＴ三元複合体形成も、内因的にタグ付けされたＨｉＢｉＴ ＢＥＴファミリーメンバーのパネルを用いて評価した。ＭＺ１と比較して、化合物ＳＩＭ１によって誘導されるＶＨＬを含むＢＲＤ２およびＢＲＤ４では、より強力で持続的な三元複合体が観察された。ＢＲＤ３を用いた場合のそれは、それほど長期にわたり安定していないようであり（図１１ｃ）、やはりＭＺ１で以前に認められた結果と同様であった（ｒｅｆ．３１，３２）。

【0174】

本発明者らは次に、三元複合体の協同性を調査し、ＢＲＤ４^ＢＤ２からのビオチン化ＪＱ１の置換（ｒｅｆ．４３）を介した、単独での化合物ＳＩＭ１の結合（ＩＣ_５０＝２０５ｎＭ）またはＳＩＭ１：ＶＣＢ二元複合体（ＩＣ_５０＝５８ｎＭ）を測定する、競合ＡｌｐｈａＬＩＳＡアッセイ（図４ｅ）に示される通り、三元複合体形成に関して正の協同性を意味する、３．５のアルファ値を示すことを実証した。クロスバリデーション（相互検証）として、本発明者らは、蛍光ＨＩＦ－１αペプチドプローブの置換を介した、ＰＲＯＴＡＣ分子のＶＨＬ末端での結合を測定する、競合ＦＰアッセイ（ｒｅｆ．１５，３２）において協同性を評価した。再び、この実験において、化合物ＳＩＭ１は、ＳＩＭ１単独（Ｋｄ＝１８６ｎＭ）と比較して、二元ＳＩＭ１：ＢＤ１－ＢＤ２タンデム（Ｋｄ＝３３ｎＭ）としての化合物ＳＩＭ１の競合的置換の親和性を増強したことから、正の協同性（α＝５．２）を示した（図４ｆ）。

【0175】

最後に、本発明者らは、以前記載された通り（ｒｅｆ．３２）、ＳＰＲ結合アッセイにおいて化合物ＳＩＭ１の三元複合体の形成を評価した。本発明者らは、ビオチン化ＶＣＢを表面チップ上に固定化し、シングルサイクル（単回）カイネティクス形式の実験で、ＢＤ１－ＢＤ２タンパク質過剰量の存在下でプレインキュベートした化合物ＳＩＭ１の段階希釈溶液をチップに注入した（図４ｇ）（ｒｅｆ．３２）。ＳＩＭ１：ＢＤ１－ＢＤ２は、予測１：１結合モデルについての％Ｒｍａｘ実測値（６４．７±２．３％）が、単独のＳＩＭ１の滴定から観察された値（７７％）と同等でありかつそれを超えていなかったことにより証明されるように、１：１化学量論でＶＣＢに結合した（図１２－表１）。化合物ＳＩＭ１は、野生型ＢＤ１－ＢＤ２およびＶＣＢと共に、高親和性で、安定で、かつ長寿命の１：１：１複合体を形成した（ｔ_１／２＝１１９±２１秒；Ｋ_ｄ＝５３±４ｎＭ）（図４ｇと図１２－表１）。

【0176】

かかる化合物ＳＩＭ１の正の協同性と、更に二価阻害剤が一価阻害剤と比較して効力が向上するメカニズムとして長い標的滞留時間を提示することを示した以前の研究から、本発明者らは、生細胞において標的へのまたは三元複合体内のいずれかの、化合物ＳＩＭ１のシス結合様式が、滞留時間の何らかの変化に寄与するかどうかを調べるべく促された。

【0177】

滞留時間をモニタリングするために、ＨｉＢｉＴ－ＢＲＤ４－ＣＲＩＳＰＲ細胞をまず飽和濃度のＰＲＯＴＡＣまたは阻害剤化合物と共にインキュベートし、続いて競合ＢＥＴ蛍光トレーサーとインキュベートした。この競合的置換（ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ）から生成されるＮａｎｏＢＲＥＴシグナルは、生細胞内でカイネティクス（動態）的に監視でき、その速度と強度は、初期化合物が結合した複合体の滞留時間と正の相関関係を示す（ｒｅｆ．４１）。以前の研究と一致して、ＪＱ１は短い滞留時間を有したが、一方でＭＴ１は、二価阻害剤に予想されるように、長い滞留時間を示した（図４ｈ）。興味深いことに、ＭＺ１は、一価ＢＥＴ阻害剤と二価ＢＥＴ阻害剤の間の滞留時間を示し、一価ＢＥＴ標的結合であっても、ＰＲＯＴＡＣを用いて滞留時間の改善が可能であることを示した（図４ｈ）。本発明者らは、これがその協同的な結合によるものであると考えている（ｒｅｆ．２１）。驚くべきことに、化合物ｃｉｓ－ＳＩＭ１とＳＩＭ１との間に差が観察され、ＳＩＭ１はＢＲＤ４に関して最長の滞留時間を示したが、ｃｉｓ－ＳＩＭ１はＭＴ１と同じ置換動態を示した（図４ｈ）。

【0178】

いずれも二価のターゲットエンゲージメント（標的係合）からの結合活性を示しｃｉｓ－ＳＩＭ１、（Ｒ，Ｓ）－ＳＩＭ１、およびＳＩＭ１の間の差異的な挙動は、、ＳＩＭ１によるＶＨＬのリクルートが、細胞の内側での高度に安定でかつ協同的な三元複合体の形成により、ＢＲＤ４に対する滞留時間を有意に増加させることを示している。まとめると、それらの生物物理学的結合アッセイとｉｎ ｖｉｔｒｏ（試験管内）での細胞研究の結果を総合すると、化合物ＳＩＭ１が、ＶＨＬおよびＢＥＴタンパク質と共に、協同的でかつ安定した長寿命の１：１：１三元複合体を形成することが実証された。さらに、本発明者らの知見は、これが構造変化に加えて長期にわたる標的と化合物との相互作用の両方をもたらす、分子内結合によって促進されることを示唆し、かかる分子内結合は、三元複合体にＶＨＬを係合させる能力によってさらに強化されることを示唆している。

【0179】

結果についての考察
本発明者らは、本発明の新規三価ＰＲＯＴＡＣ化合物ＳＩＭ１～ＳＩＭ６、特にＳＩＭ１が、極めて強力で著しく活性なＢＥＴタンパク質の分解剤であることを実証した。本発明者らによる化合物ＳＩＭ１の生物学および機序の研究は、三元複合体にプラス効果（付加効果）を与えることによってその作用機序を促進するための実行可能な戦略として、ＰＲＯＴＡＣ分解剤の原子価を増加させるという概念実証（ｐｒｏｏｆ－ｏｆ－ｃｏｎｃｅｐｔ）を提供する。化合物ＳＩＭ１の作用機序を理解するために、一連の生物物理学的、生化学的、細胞的研究を実施した。最も重要なことに、それらが１：１：１のＢＲＤ４：ＳＩＭ１：ＶＨＬ複合体化学量論を示し、ＳＩＭ１がＢＲＤ４のＢＤ１とＢＤ２の両方にシス様式で分子内結合し、構造変化を誘導したことを示した（図５ａ）。ＢＲＤ４のＢＤ１またはＢＤ２変異体を用いた更なる研究により、親のＰＲＯＴＡＣ ＭＺ１のＢＤ２特異性と一致して、より重要な最初の段階がＢＤ２であり、ＢＲＤ４へのＳＩＭ１の連続的または優先的なＢＤ結合が起こることが示唆された（図５ａ）。したがって、本明細書に提示される広範なデータおよびすべてのＢＥＴファミリーメンバーの分解パターンに基づいて、本発明者らは、すべてのＢＥＴファミリーがこれと同じ様式で化合物ＳＩＭ１と連関することを提唱する。

【0180】

興味深いことに、ＢＲＤ２は、一連の直交解析において、ファミリーメンバーの中で最も堅牢な分解レベルを示し、更にそれに対応して最も堅牢なユビキチン化レベルを示すことが判明した。これは、このクラスのＢＥＴ ＰＲＯＴＡＣ分解剤の中から、ＢＲＤ２に対して前例のない優先性（選好性）があることを意味する。なぜこのような優先性があるのかは不明であるが、ＢＲＤ２とＶＨＬとのより高い結合力と三元複合体の安定性、または、誘導される構造変化が、ＢＲＤ３またはＢＲＤ４と比較してＢＲＤ２をより生産的なユビキチン化に好ましい状態に配置させる可能性を反映していると思われる。

【0181】

ＰＲＯＴＡＣを介して分解が成功するには、標的タンパク質とＥ３リガーゼとの間で誘導される三元複合体が形成されなければならないことのみならず、複合体内で標的が効率的なユビキチン化のために適切な位置に配置されることも必要である。この構造上の有利性を達成するために、Ｅ２／Ｅ３で触媒される新基質のユビキチン化にとって生産的な位置および形状において、標的を最適にリクルートする化合物を発見するために、ＰＲＯＴＡＣの開発に向けて多数のリンカーがテストされている（ｒｅｆ．２１，３４，４４）。おそらく最適でない構造配置までも克服できる、成功への鍵となる要因となり得る追加の要素は、三元複合体形成のカイネティクス（動態）的および熱力学的有利性である。これらの場合、ＰＲＯＴＡＣは、一価分子接着剤の作用機序と同様に、Ｅ３リガーゼと標的との間のポジティブな（正の）新相互作用を促進し、その結果、触媒の様にユビキチン化を促進する、安定で、協同的で、かつ長寿命の三元複合体を創製する（ｒｅｆ．２１，３１，３２，４５）。この後者の三元複合体の有利性を持たない化合物の場合、二元複合体が三元複合体よりも形成の優先性は高いはずであるから、分解効率の領域（ｗｉｎｄｏｗ）はフック効果によって制限されることになる（図５ｂ）（ｒｅｆ．１７，４６）。一方、協同的な三元複合体を促進するＰＲＯＴＡＣは、標的またはＥ３リガーゼと化合物との非生産的な二元相互作用と比較して、より広範囲の分解活性領域を有する三元複合体の方に複合体平衡がシフトされるので、それらの分解効率の領域は、フック効果によって制限されるだろう（図５ｂ）。下流のユビキチン化と分解の結果は三元複合体に依存するため、合理的な化学的設計を通じて最適化できる可能性がある（ｒｅｆ．１５）。

【0182】

本明細書に開示される三価ＰＲＯＴＡＣを用いた研究は、その過程での結合力増加の結果としての、構造的、エネルギー的およびカイネティクス的な三元複合体優先性パラメータの最適化を支持する証拠を提供する（図５ｂ）。これは、ＶＨＬが係合すると三元複合体を形成する場合にのみ、ＢＲＤ４に結合する化合物ＳＩＭ１の細胞滞留時間が延長されることで最も顕著に観察される。三元ＰＲＯＴＡＣによるパラメータの全ての改善が、分解域（ｗｉｎｄｏｗ）の大幅な拡大をもたらし、ごく低濃度でのＢＥＴファミリーの損失速度から、全くフック効果が観察されないＤｍａｘ_５０値より１０，０００倍高い濃度を有する最大分解まで、分解域の大幅な拡大をもたらした。それらの特性の一部は、ＭＺ１との協同複合体（ｒｅｆ．９）やｄＢＥＴ－６（ｒｅｆ．３８）およびＡＲＶ－７７１（ｒｅｆ．３７）による強力な分解など、二価ＢＥＴファミリーＰＲＯＴＡＣで以前に観察されているが、三元複合体で最大の結合活性を達成するためにこれらを組み合わせることで、顕著な分解を駆動することができることは、まだ示されていない。

【0183】

ヘテロ二官能性分解剤から三価分解剤への移行は、特に化学合成の難しさという課題と、分解剤の分子量の増加により細胞透過性の低下または完全に不透性の化合物のいずれかが伴うという前提を鑑みると、三価分解剤への移行は分解結果を改善するための自明のアプローチではない。驚くべきことに、本明細書に開示され特徴づけられる式Ｉの化合物は、そうではないことを実証した。実際、三価化合物ＳＩＭ１およびｃｉｓ－ＳＩＭ１は、親の二価阻害剤と比較して透過性が低下するけれども、それでもまだ十分な細胞透過性を示す。

【0184】

さらに、二価ＢＥＴ ＰＲＯＴＡＣから三価ＢＥＴ ＰＲＯＴＡＣへの移行により、いくつかの非常に強力で有効な化合物が生まれ、すべてのＢＥＴファミリーメンバーの分解が改善されるだけでなく、ＢＥＴ化合物の治療用途の可能性を評価するために使用される、関連の細胞疾患アッセイの性能も向上した。三価分解剤の化学設計と合成は、二価ＰＲＯＴＡＣよりも複雑化するが、労力の増加によって大きな利益が生まれ、標的とＥ３バインダーの両方がコンジュゲートすることのできる分岐型三官能性のスキャフォールド（足場）を構築するための新しいリンカー設計戦略のアウトラインが提示される。これらの認識されている課題点を克服する上で、三価ＰＲＯＴＡＣは、標的結合価数の増加によって改善された分解剤をもたらすことが明らかになった。

【0185】

生物学的方法
細胞株と培養物。ＨＥＫ２９３、２２Ｒｖ１およびＭＶ４；１１細胞（ＡＴＣＣ）を、それぞれＤＭＥＭおよびＲＰＭＩ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）中で増殖させ、１０％ｖ／ｖウシ胎児血清（ＦＢＳ）（南米起源、Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ社）を補足し、加湿雰囲気中、５％ＣＯ_２、３７℃および５℃で培養した。ＬｇＢｉＴを安定発現するＣＲＩＳＰＲ ＨｉＢｉＴ－ＢＲＤ２、ＨｉＢｉＴ－ＢＲＤ３、およびＨｉＢｉＴ－ＢＲＤ４ ＨＥＫ２９３細胞を、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ中で増殖させ、ＣＲＩＳＰＲ ｃＭｙｃ－ＨｉＢｉＴ ＭＶ４；１１細胞を、１０％ｖ／ｖ ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ中で増殖させた。９０％コンフルエントになった時点で全ての細胞を週に１～２回分割し、３０継代以降は使用しなかった。Ｍｙｃｏａｌｅｒｔ^（商標）検出キット（Ｌｏｎｚａ社）を使用して細胞のマイコプラズマ汚染を定期的にチェックした。

【0186】

分解アッセイ。処理の１２～２４時間前に、ＭＶ４；１１細胞を、１０ｃｍ培養皿に１ｍＬ当たり１×１０^－６細胞の密度で播種した。２２Ｒｖ１およびＨＥＫ２９３細胞を、処理の１２～２４時間前に、６ウェルプレートに２．５～６×１０^５細胞／ウェルの密度で播種した。それらの細胞を、指示阻害剤の有無のもと、試験化合物または等量のＤＭＳＯで処理し、記載の時点で溶解させた。溶解のために、細胞を氷冷ＰＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で２回洗浄し、その後、５０ｍＭトリス塩酸塩、ｐＨ７．４、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４、１％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ^（商標）Ｘ－１００、１×Ｈａｌｔ^（商標）プロテアーゼ阻害剤カクテル（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社）を含有する氷冷溶解緩衝液を用いて、ＭＶ４；１１細胞については２５０μＬ／プレート、または２２Ｒｖ１細胞とＨＥＫ２９３細胞については８０μＬ／ウェル中で溶解した。ライセートを超音波処理し、４℃、１５８００×ｇで１０分間遠心分離して清澄にし、上清を－８０℃で保存した。タンパク質濃度をＢＣＡアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ社）によって決定し、５６２ｎｍでの吸光度を分光測光法（ＮａｎｏＤｒｏｐ^（商標） ＮＤ１０００）によって測定した。Ｎｏｖｅｘ（登録商標）ＮｕＰＡＧＥ^（商標）４－１２％Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を使用し、総タンパク質量４０μｇ／ウェルで、サンプルをＳＤＳ－ＰＡＧＥで泳動し、湿式転写によって孔径０．２μｍのニトロセルロース膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ社）に転写し、３％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ社）－０．１％ＴＢＳＴ溶液でブロックした。ブロットは、抗ＢＲＤ２（１：２０００、Ａｂｃａｍ社＃ａｂ５０８１８）、抗ＰＡＲＰ（１：１０００、ＣＳＴ社＃９５４２Ｓ）、抗開裂形ＰＡＲＰ（１：１０００、ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社、＃５１－９００００１７）、抗カスパーゼ－３（１：１００００、ＣＳＴ社、＃９６６２Ｓ）、抗チューブリン（１：３０００、Ｂｉｏ－Ｒａｄ社＃１２００４１６５）または抗β－アクチン（１：２５００、ＣＴＳ社＃４９７０Ｓ）抗体中で４℃にて一晩、回転させながらブロットをインキュベートした。次いで、ヤギ抗マウスまたはロバ抗ウサギＩＲＤｙｅ８００ＣＷ二次抗体（１：１００００、ＬＩＣＯＲ社＃９２５－３２２１０および＃９２６－３２２１３）中で、回転させながらブロットを室温で１時間インキュベートした。ＣｈｅｍｉＤｏｃ^（商標）ＭＰイメージングシステム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社）を使ってバンドを検出し、そしてβ－アクチンおよびＤＭＳＯ対照に対する正規化を用いて、各時点についてバンドを定量した（Ｉｍａｇｅ Ｓｔｕｄｉｏ Ｌｉｔｅ、バージョン５．２）。特に示さない限り、データは２つの生物学的複製の平均である。分解データは、Ｐｒｉｓｍ^（商標）（ＧｒａｐｈＰａｄ、バージョン７．０３）中の単相指数関数減衰モデルを使用して、非線形回帰によってプロットし、フィッティングした。

【0187】

細胞生死アッセイ。ＭＶ４；１１細胞を、透明底の３８４ウェルプレート上で、所望の濃度の化合物とともに４８時間インキュベートした。ＭＶ４；１１細胞は、１０％ＦＢＳ、Ｌ－グルタミンを補足したＲＰＭＩ培地中に維持した。初期細胞密度は３×１０^５／ｍＬであった。細胞を、様々な濃度の化合物または０．０５％ＤＭＳＯで各濃度点について３回ずつ処理した。処理後、製造業者の指示に従って、Ｐｒｏｍｅｇａ製ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）発光細胞生存率アッセイキットを用いて、細胞生存率を測定した。シグナルは、ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ製Ｐｈｅｒａｓｔａｒ（登録商標）発光プレートリーダー上で、推奨設定のもとで記録した。データをＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（登録商標）ソフトウェアで解析して、各試験化合物のＥＣ_５０を取得した。

【0188】

カイネティクス的分解と定量。ＬｇＢｉＴ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を安定発現するＨＥＫ２９３細胞（ＡＴＣＣより）を、ＣＲＩＳＰＥＲ／Ｃａｓ９を使用してゲノム編集し、ＢＲＤ２、ＢＲＤ３またはＢＲＤ４のＮ末端ゲノム遺伝子座に、ＨｉＢｉＴタグを内在的に取り付けた（ｒｅｆ．３１）。カイネティクス分解アッセイでは、細胞を白色の９６ウェル組織培養プレートに、１００μＬの増殖培地中１ウェルあたり２×１０^４個の細胞密度で播種し、３７℃、５％ＣＯ_２にて一晩インキュベートした。翌日、培地を１：１００希釈のエンデュラジン（Ｅｎｄｕｒａｚｉｎｅ；Ｐｒｏｍｅｇａ製）を含有するＣＯ_２非依存性培地（Ｇｉｂｃｏ社製）と交換し、５％ＣＯ_２中３７℃で２．５時間インキュベートした後、化合物の最終濃度１μＭ（ＳＩＭ１、ＳＩＭ２、およびＳＩＭ３とＢＲＤ４）または１０ｎＭ（ＳＩＭ１とＢＲＤ２、ＢＲＤ３およびＢＲＤ４）の３倍段階希釈液を添加した。プレートを、３７℃に設定したＧｌｏＭａｘ（登録商標）Ｄｉｓｃｏｖｅｒマイクロプレートリーダー（Ｐｒｏｍｅｇａ製）に蓋をして置き、化合物処理後２４時間にわたって５～１５分ごとの読み取りによる連続発光測定を実施した。

【0189】

分解カイネティクスの定量化。分解速度および分解プラトー値は、上記で決定されたカイネティクス（動的）分解プロファイルから算出した（ｒｅｆ．３１）。簡単に言うと、各カイネティクス濃度曲線の初期劣化部分を、次の方程式にフィッティング（適合）させた：

【0190】

ｙ＝（ｙ_０－プラトー）ｅ^－λｔ＋プラトー

【0191】

ここでパラメータλ＝ｈ^－１単位での分解速度定数。最大分解分画量（ｄｅｇｒａｄｅｄ ｆｒａｃｔｉｏｎ）Ｄｍａｘは、１マイナス（－）プラトーとして計算された。各曲線について、分解の開始前のデータ点は、フィッティング（ｆｉｔｔｉｎｇ）から除外された。次いで、Ｄｍａｘを濃度に対してプロットし、Ｄｍａｘ_５０値を決定した。

【0192】

質量分析プロテオミクス。サンプル調製。ＲＰＭＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）中のＭＶ４；１１細胞を、処理２４時間前に、１００ｍｍプレート上に５×１０^６細胞数にて播種した。試験化合物の添加により細胞を３播種数（３重複製）にて処理した。４時間後、細胞を２５０×ｇで５分間遠心分離し、１２ｍＬの冷ＰＢＳで２回洗浄した。細胞を、プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ社）を添加した１００ｍＭ ＴＲＩＳ ｐＨ８．０、４％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ ５００μＬ中で溶解させた。ライセートを短時間パルス超音波処理し、その後４℃、１５，０００×ｇで１０分間遠心分離した。マイクロＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を使用してサンプルを定量し、フィルター支援サンプル調製法を使用して各サンプル２００μｇを処理および消化し、その後、以前記載されたとおりに（ｒｅｆ．２１）ヨードアセトアミドでのアルキル化とトリプシンによる消化を実施した。次に、製造業者の指示に従って、７ｍｍ径の３ｍＬ Ｃ１８ ＳＰＥカートリッジカラム（Ｅｍｐｏｒｅ^（商標）；３Ｍ社製）を使ってサンプルを脱塩し、ＴＭＴ１０ｐｌｅｘ^（商標）アイソバリック質量タグ標識試薬セット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）で標識した。標識後、９つのサンプルからのペプチドを、同じ割合で一緒にプールした。プールしたサンプルを、Ｕｌｔｉｍａｔｅ^（商標）３０００ＨＰＬＣシステム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ／Ｄｉｏｎｅｘ社製）上でＸＢｒｉｄｇｅ^ＴＭペプチドＢＥＨカラム（１３０Å、３．５μｍ、２．１×１５０ｍｍ、Ｗａｔｅｒｓ社製）での高ｐＨ逆相クロマトグラフィーを使用して分画した。緩衝液Ａ（水中１０ｍＭギ酸アンモニウム、ｐＨ９）および緩衝液Ｂ（９０％アセトニトリル中１０ｍＭギ酸アンモニウム、ｐＨ９）を、流速２００μＬ／分で６０分間にわたり、５％→６０％緩衝液Ｂの直線勾配で使用した。次に、８０本のフラクション（画分）を収集した後、各フラクションの紫外線シグナルに基づいて、それを２０本のフラクションにまとめた。すべてのフラクションをＧｅｎｅｖａｃ^（商標）ＥＺ－２濃縮器中で乾燥し、質量分析のために１％ギ酸に再懸濁した。

【0193】

ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析。フラクションをＵｌｔｉＭａｔｅ^（商標）３０００ ＲＳＬＣｎａｎｏ Ｕｌｔｒａ ＨＰＬＣシステム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃｓ社）およびＥａｓｙＳｐｒａｙ^（商標）カラム（７５μｍ×５０ｃｍ、ＰｅｐＭａｐ ＲＳＬＣ Ｃ１８カラム、２μｍ、１００Å、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）に接続されたＱ Ｅｘａｃｔｉｖｅ^（商標）ＨＦハイブリッド四重極Ｏｒｂｉｔｒａｐ^（商標）質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）上で連続的に分析した。緩衝液Ａ（水中０．１％ギ酸）および緩衝液Ｂ（８０％アセトニトリル中０．０８％ギ酸）を、３００ｎＬ／分で１２５分間にわたって５％→３５％緩衝液Ｂの直線勾配で使用した。カラム温度は５０℃であった。質量分析計は、３３５～１，６００ｍ／ｚのシングル質量分析サーベイスキャンと、それに続く１５回の連続したｍ／ｚ依存ＭＳ２スキャンを行う、データ依存モードで操作した。最も強度の高い１５本の前駆体イオンが、より高エネルギーの衝突解離によって順番に断片化された。ＭＳ１分離ウィンドウは０．７ｍ／ｚに設定され、分解能は１２０，０００に設定された。ＭＳ２分解能は６０，０００に設定された。ＭＳ１とＭＳ２の自動利得制御（オートゲインコントロール；ＡＧＣ）ターゲットは、それぞれ３×１０^６イオンと１×１０^５イオンに設定された。正規化された衝突エネルギーは３２％に設定された。ＭＳ１とＭＳ２の最大イオン導入時間は、それぞれ５０ｍｓと２００ｍｓに設定された。

【0194】

ペプチドとタンパク質の同定。２０フラクションすべての質量分析生データファイルをマージし、タンパク質の同定とＴＭＴレポーターイオンの定量のために、ＭａｘＱｕａｎｔ^（商標）ソフトウェアのバージョン１．６．０．１６によりＵｎｉｐｒｏｔ－ｓｐｒｏｔ（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ）ヒト正準データベースに対して検索を行った。ＭａｘＱｕａｎｔ^（商標）パラメータは次のように設定された：酵素はトリプシン／Ｐを使用、誤開裂の最大数は２に等しく；前駆体の質量許容誤差は１０ｐｐｍに等しく；フラグメント質量許容誤差は２０ｐｐｍに等しく；可変的修飾：酸化（Ｍ）、アセチル化（Ｎ末端）、脱アミド化（ＮＱ）、Ｇｌｎ（グルタミン）→ｐｙｒｏ－Ｇｌｕ（ピログルタミン酸）（Ｎ末端のＱ）；固定修飾：カルバミドメチル（Ｃ）。データは、１％の誤検出率を適用し、続いて２未満のユニークペプチドを含むタンパク質を除外することによってフィルタリングした。３つのＤＭＳＯ複製物間の絶対的倍率変化の差が１．５以上である場合、定量したタンパク質を除外した。

【0195】

ＭＶ４；１１細胞におけるｃＭｙｃ損失と細胞生存率のモニタリング。ＣＲＩＳＰＥＲ／ｃＭｙｃ－ＨｉＢｉＴ／ＭＶ４；１１細胞（Ｐｒｏｍｅｇａ製）を、不透明の白色９６ウェル組織培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｏｓｔａｒ^（商標） ＃３９１７）に１ウェルあたり５×１０^４細胞数の密度で塗抹した。一晩インキュベートした後、それらを１～１００ｎＭ濃度の指定化合物で処理し、プロットした時点で、ＮａｎｏＧｌｏ^（商標）ＨｉＢｉＴ溶解試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ製）による発光測定を使用して、ｃＭｙｃレベルを測定した。すべての化合物処理の複製プレートを調製し、タンパク質濃度測定と同じ時点で、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ製）を使用して細胞生存率を測定した。プレートをオービタルシェーカー上で１０～２０分間振盪し、その後、ＧｌｏＭａｘ^（商標）Ｄｉｓｃｏｖｅｒマイクロプレートリーダー（Ｐｒｏｍｅｇａ製）上で発光を読み取った。

【0196】

Ｃａｓｐａｓｅ－Ｇｌｏ（登録商標）３／７アッセイ。２２Ｒｖ１細胞を白色９６ウェルプレート（Ｃｌｏｎｉｎｇ社製、＃３９１７）中に１０，０００個細胞／ウェルで播種してから１２～２４時間後に、阻害剤の存在下もしくは非存在下で試験化合物によりまたは等量のＤＭＳＯにより２４時間処理した。１００μＬ／ウェルのＣａｓｐａｓｅ－Ｇｌｏ（登録商標）３／７試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ製）を加え、プレートを５００ｒｐｍで３０秒間振盪した。該プレートを２時間インキュベートし、ＰＨＥＲＳｔａｒ（登録商標）ＦＳプレートリーダー（ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ社）を使用して発光を測定した。

【0197】

クローン形成アッセイ。２２Ｒｖ１細胞を１０ｎＭ ＳＩＭ１、ｃｉｓ－ＳＩＭ１、ＭＴ１、ＭＺ１、およびＡＲＶ７１１で２４時間処理した。翌日、細胞をトリプシン処理して計数した。５００個の細胞を再播種し、３７℃、５％ＣＯ_２にて２０日間増殖させた。２０日間インキュベーション後、氷冷１００％（ｖ／ｖ）メタノールを用いて４℃で３０分間、細胞を固定した。その後、メタノールを除去し、細胞を５００μＬの０．１％クリスタルバイオレット色素（ＭｅＯＨ中）により、室温で３０分間、細胞を染色した。インキュベーション後、細胞をｄＨ_２Ｏで洗浄し、一晩放置して乾燥させた。プレートをエプソン社製Ｐｅｒｆｅｃｔｉｏｎ^（商標）Ｖ８００フォトスキャナーでスキャンした。画像解析はＩｍａｇｅＪ（登録商標）ソフトウェアを使って実行した。コロニー形成率（ｐｌａｔｉｎｇ ｅｆｆｅｃｔ；ＰＥ）は、各処理条件でコロニーを計数し、平均値をコロニー形成細胞数で割ることによって算出した。生存率は、処理細胞のＰＥを未処理細胞のＰＥで割り、１００を乗じることによって求めた。棒グラフは、ＧｒａｐｈＰａｄ ＰＲＩＳＭ（登録商標）ソフトウェアを使用して作成した。エラーバーは、平均値±ＳＤを示す。２つの独立した実験を行った。

【0198】

構築物、タンパク質の発現および精製。ヒトタンパク質ＢＲＤ２（Ｐ２５４４０）、ＢＲＤ３（Ｑ１５０５９）およびＢＲＤ４（Ｏ６０８８５）ＶＨＬ（ＵｉＰｒｏｔアクセッション番号：Ｐ４０３３７）、ＥｌｏｎｇｉｎＣ（Ｑ１５３６９）、ＥｌｏｎｇｉｎＢ（Ｑ１５３７０）の野生型および変異型バージョンをすべてのタンパク質発現に使用した。

【0199】

ｐＥＴ－Ｈｉｓ－ＳＵＭＯ ＴＥＶ－ＢＲＤ４タンデム構築物は、リガーゼ非依存性クローニングを使用して、２つのブロモドメイン（残基１～４６３）を含む短縮型ＢＲＤ４を、親のｐＥＴ－Ｈｉｓ６－ＳＵＭＯ ＴＥＶ ＬＩＣクローニングベクター（１Ｓ）中にクローニングすることによって作製した。ｐＥＴ Ｈｉｓ６ ＳＵＭＯ ＴＥＶ ＬＩＣクローニングベクター（１Ｓ）は、Ｓｃｏｔｔ Ｇｒａｄｉａ社から贈呈された（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド＃２９６５９）。標準的な手順に従って、突然変異誘発性プライマーを使用してｐＥＴ－Ｈｉｓ－ＳＵＭＯ ＢＲＤ４タンデムに対してＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）突然変異誘発を実行し、アセチル－リジン結合ポケット中に位置する保存的アスパラギン残基がフェニルアラニン残基で置換された突然変異体、すなわち、ＢＲＤ４ Ｎ１４０ＦおよびＢＲＤ４ Ｎ４３３Ｆを作出した。

【0200】

ＢＲＤ４タンデム構築物の発現には、Ｎ末端にＨｉｓ６タグが付けられたＢＲＤ４（残基１～４６３）または同様の変異体を、０．４ｍＭイソプロピルβ－Ｄ－１－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を使用して、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）中で１８℃にて１６時間発現させた。大腸菌細胞を高圧セルホモジナイザー（Ｓｔａｎｓｔｅｄ Ｆｌｕｉｄ Ｐｏｗｅｒ社）を使用して溶解し、溶解物を遠心分離によって清澄化した。Ｈｉｓ６タグ付きＶＣＢを、ＨｉｓＴｒａｐ^（商標）ＨＰアフィニティーカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）上で、イミダゾール勾配を用いた溶出により精製した。ＴＥＶプロテアーゼを使用してＨｉｓ６タグを除去し、タグを外した複合体を低濃度のイミダゾール緩衝液中に透析した。次に、ＢＲＤ４をもう一度ＨｉｓＴｒａｐ^（商標）ＨＰカラムに流し（複合体は結合せずに溶出されるので）、不純物を結合させた。次いで、ＢＲＤ４を、それぞれＭｏｎｏ Ｓ^（商標）およびＳｕｐｅｒｄｅｘ^（商標）－２００カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を使用する、陰イオン交換クロマトグラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィーによってさらに精製した。最終的に精製した複合体を、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、１００ｍＭ塩化ナトリウムおよび１ｍＭ ＴＣＥＰ中に保存した。

【0201】

ＶＣＢ複合体は、前述のように発現させて精製した。簡単に言えば、Ｎ末端にＨｉｓ６タグが付いたＶＨＬ（残基５４～２１３）、ＥｌｏｎｇｉｎＣ（残基１７～１１２）、およびＥｌｏｎｇｉｎＢ（残基１～１０４）を同時発現させ、複合体をＮｉ－アフィニティークロマトグラフィーによって単離し、ＴＥＶプロテアーゼを使用してＨｉｓ６タグを外し、複合体を陰イオン交換およびサイズ排除クロマトグラフィーでさらに精製した。

【0202】

ＢＥＴタンパク質ＢＤは、以前に記載されているように（ｒｅｆ．２１）発現および精製した。簡単に説明すると、Ｎ末端にＨｉｓ６タグが付いたＢＲＤ２－ＢＤ１（残基７１～１９４）、ＢＲＤ２－ＢＤ２（残基３４４～４５５）、ＢＲＤ３－ＢＤ１（残基２４～１４６）、ＢＲＤ３－ＢＤ２（残基３０６～４１６）、ＢＲＤ４－ＢＤ１（残基４４～１７８）およびＢＲＤ４－ＢＤ２（残基３３３～４６０）を発現させ、Ｎｉ－アフィニティークロマトグラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィーによって単離した。

【0203】

サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）
ＳＥＣ実験は、ＡＫＴＡ Ｐｕｒｅ Ｓｙｓｔｅｍ （ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）にて室温で行った。溶液中のオリゴマー状態のＢＲＤ４ ＢＤ１－ＢＤ２タンデムタンパク質は、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ^（商標）２００ Ｉｎｃｒｅａｓｅ １０／３００ ＧＬカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を使用し、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ ＮａＣｌおよび１ｍＭ ＴＣＥＰを含む緩衝液中でのゲル濾過によって分析し、分子量が既知の球状タンパク質（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、２８－４０３８－４１／４２）で較正した。ＢＲＤ４タンデム（２５μＭ）は、注入前にＳＩＭ１（２５μＭ）、ＭＺ１（２５μＭ）、ＭＴ１（２５μＭ）またはＤＭＳＯ（０．５％）と共に室温で３０分間インキュベートした。各注入サンプル量は２００μＬ、流速は０．８ｍＬ／分であった。溶出ピークは、２８０ｎｍでの紫外吸光度を使用してモニターした。

【0204】

ＩＴＣ。
滴定はＩＴＣ２００マイクロ熱量計（Ｍａｌｖｅｒｎ社）で実施した。滴定は、２０ｍＭビス－トリス（Ｔｒｉｓ）プロパン、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＴＣＥＰ、１．６％ＤＭＳＯ、ｐＨ７．５中の２μＬのタンデムＢＲＤ４ ＢＤ１－ＢＤ２構成物（ＷＴまたはＮ１４０ＦまたはＮ４３３Ｆ変異体）溶液を、１２０秒の時間間隔で０．５μＬ／秒を１９回注入することで構成された。タンパク質の最初の注入（０．４μＬ）を行い、その結果はデータ解析中に廃棄した。すべての実験は、７５０ｒｐｍで撹拌しながら、１０ｍＭ ＤＭＳＯ原液からのＳＩＭ１を２５℃で実施し、ＶＣＢを２０ｍＭビス－トリスプロパン、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＴＣＥＰ、ｐＨ７．５を含む緩衝液で希釈した。最終ＤＭＳＯ濃度は１．６％（ｖ／ｖ）であった。ＢＲＤタンパク質（２００μＭ、シリンジ中）をＳＩＭ１－ＶＣＢ複合体（ＳＩＭ１ １６μＭ；ＶＣＢ ３２μＭ、セル中）に滴定した。製造業者により提供されたＭｉｃｒｏｃａｌ ＬＬＣ製ＩＴＣ２００ Ｏｒｉｇｉｎ^（商標）ソフトウェアを使用して、各ＢＲＤ４変異体の単一結合部位モデルまたはＢＲＤ４ ＷＴの２結合部位モデルにデータを当てはめて、化学量論（ｎ）、解離定数（Ｋ_ｄ）、および結合エンタルピー（ΔＨ）を取得した。

【0205】

ＡｌｐｈａＬＩＳＡアッセイ
リガンドは、４ｎＭ Ｈｉｓタグ付きＢＲＤ４^ＢＤ２および１０ｎＭビオチン化ＪＱ１に対して滴定した。すべての試薬は、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ＢＳＡ、０．０２％ＣＨＡＰＳ、ｐＨ７．５（最終濃度）に希釈した。ＶＣＢプレミックス条件では、緩衝液に１２．５ｍＭ ＶＣＢも含まれていた。リガンドは、ＶＣＢ無しで１００μＭから開始するか、または２０ｍＭ ＶＣＢ含有で１０ｍＭから開始して、最終ＤＭＳＯ濃度が１％となる１１点の３倍ずつの段階希釈において試験した。結合は、抗Ｈｉｓ６抗体がコンジュゲートされたＡｌｐｈａＬＩＳＡアクセプタービーズおよびストレプトアビジンがコーティングされたドナービーズ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製）を使用して、各ビーズの最終濃度１０μｇ／ｍＬで検出した。滴定は、白色の３８４ウェルのＡｌｐｈａｐｌａｔｅｓ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製）で調製され、ＡｌｐｈａＬＩＳＡ励起／発光モジュールを備えたＰｈｅｒａｓｔａｒ^（商標）ＦＳプレートリーダー（ＢＭＧ社製）上で読み取った。データを解析し、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（登録商標）７を使用して用量反応曲線を作成した。各アッセイウェルの最終容量は２５μＬであった。まず、２．５×リガンドまたはＶＣＢを含む２．５×リガンド１０μＬを、ブロモドメインとビオチン化ＪＱ１との５×混合物５μＬと混合し、室温で１時間インキュベートした。次いでアッセイプレートを暗室に移動し、５μＬの５×アクセプタービーズを添加し、１時間インキュベートした。次に、（まだ遮光下で）５μＬの５×ドナービーズを添加し、プレートを１時間インキュベートした後に読み取った。

【0206】

蛍光偏光アッセイ
ＦＰ競合結合アッセイは、以前に記載されたとおりに（ｒｅｆ．３２）、１５μＬの最終容量で実施し、各ウェル溶液は、１５ｎＭ ＶＣＢタンパク質、１０ｎＭ ＦＡＭ標識ＨＦ－１αペプチド（ＦＡＭ－ＤＥＡＬＡＨｙｐＹＩＰＭＤＤＤＦＱＬＲＳＦ、「ＪＣ９」と称する）、および漸減濃度のＰＲＯＴＡＣ（５０μＭから出発する１４点の２倍段階希釈液）またはＰＲＯＴＡＣ：ＢＲＤ４タンデムタンパク質（１０μＭ ＰＲＯＴＡＣ：４０μＭ個々のブロモドメインまたは１０μＭ ＰＲＯＴＡＣ：２０μＭタンデムブロモドメインから出発する１４点の２倍段階希釈液）を含有する。アッセイは、３８４ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ ３５７５）上で三重複製に調製し、全ての測定値は、ＰＨＥＲＡｓｔａｒ ＦＳ（登録商標）（ＢＭＧ ＬＡＢＴＥＣＨ）を使用して、それぞれ４８５ｎｍと５２０ｎｍの励起波長と発光波長（λ）で取得した。１００ ｍＭ Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓプロパン、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＴＣＥＰ、ｐＨ７．５を使って各成分を原液から溶解し、そしてＤＭＳＯを適宜添加して１％の最終濃度になるようにした。正規化を可能にするために、化合物を含まないＶＣＢとＪＣ９を含有する対照ウェル（ゼロ置換）、またはタンパク質が存在しないＪＣ９を含む対照ウェル（最大置換）も含めた。正規化された（％）変位値をｌｏｇ［ＰＲＯＴＡＣ］に対してプロットし、そしてＰｒｉｓｍ（商標）（ｖ．８．０．１、ＧｒａｐｈＰａｄ）を使って非線形回帰により曲線をフィットさせ、各滴定についてのＩＣ_５０値を決定した。Ｋ_ｉ値は、前に記載の通り、ＪＣ９のＫ_ｄ（～２ｎＭ、直接結合から求めた）から逆算して、ＩＣ_５０値を当てはめた。協同性（α）値は、ＳＩＭ１単独またはＳＩＭ１＋ＢＲＤ４によりそれぞれＪＣ９置換について決定された二元Ｋ_ｉ値と三元Ｋ_ｉ値との比から計算された。

【0207】

ＳＰＲ結合研究
ＳＰＲ実験は、以前に記載されたとおり（ｒｅｆ．３２）、Ｂｉａｃｏｒｅ^（商標）Ｔ２００装置（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）上で実施した。ビオチン化ＶＣＢの固定化は、２０ｍＭ ＴＲＩＳ、１５０ｍＭ塩化カリウム、２ｍＭ塩化マグネシウム、２ｍＭ ＴＣＥＰ、０．００５％ＴＷＥＥＮ（商標）２０、１％ＤＭＳＯを含むランニング緩衝液（ｐＨ８．３）中で、予めカップリングされたＳｅｒｉｅｓ Ｓ ＳＡチップ上で、２５℃にて実施した。ビオチン化ＶＨＬの多重表面密度（４０、８０および１２０ ＲＵ）を使用した。ビオチン化ＶＣＢは以前に記載されているように調製した（ｒｅｆ．３２）。すべての相互作用実験は、２０ｍＭ ＴＲＩＳ、１５０ ｍＭ塩化カリウム、２ｍＭ塩化マグネシウム、２ ｍＭ ＴＣＥＰ、０．００５％ＴＷＥＥＮ（商標）２０、１％ＤＭＳＯを含むランニング緩衝液（ｐＨ８．３）中で、９℃で実施した。ＳＩＭ１（１００％ＤＭＳＯ中１０ ｍＭ）は、最初に２％ＤＭＳＯの濃度のランニング緩衝液中１μＭで調製した。この溶液を、ＤＭＳＯを含まないランニング緩衝液中５０μＭのＢＲＤ４タンデムタンパク質の溶液と１：１混合し、１％ＤＭＳＯを含むランニング緩衝液中５００ ｎＭのＳＩＭ１および２５μＭのＢＲＤ４タンデムタンパク質の最終溶液を調製した。次に、この複合体を、２μＭブロモドメインおよび１％ＤＭＳＯを含むランニング緩衝液で段階希釈した（５点の５倍ずつの段階希釈）。溶液は、注入の間に３０秒の安定化期間とシリンジ洗浄（５０％ＤＭＳＯ）を使用し、チップ表面の再生なしのシングルサイクルカイネティクス解析方式（実験繰り返しごとに三連の複製シリーズ、接触時間１００秒、流速１００μＬ／分、解離時間８００秒）で連続的に注入した。物質移動の影響を最小限に抑えるために、高速の流速と高い表面密度（固定化量が多い）を使用した。すべてのシングルサイクル実験について、２シリーズのブランク注入を実行した。Ｂｉａｃｏｒｅ Ｉｎｓｉｇｈｔ^（商標）評価ソフトウェアを使用したデータ解析の前に、基準表面とブランク注入からのセンサーグラムを生データから差し引いた。会合速度（ｋ_ｏｎ）、解離速度（ｋ_ｏｆｆ）、および解離定数（Ｋ_Ｄ）を算出するために、物質移動の項を含めた１：１ラングミュア（Ｌａｎｇｍｕｉｒ）相互作用モデルを使用して、実験を該モデルにフィッティングさせた。

【0208】

ＮａｎｏＢＲＥＴユビキチン化、三元複合体、およびバイオセンサー実験。
内因性生細胞ＢＥＴ：ユビキチンおよびＢＥＴ：ＶＨＬアッセイにおいて、ＬｇＢｉＴを安定発現するＣＲＩＳＰＲ ＨｉＢｉＴ－ＢＲＤ２、ＨｉＢｉＴ－ＢＲＤ３、およびＨｉＢｉＴ－ＢＲＤ４ ＨＥＫ２９３細胞を、ＦｕＧＥＮＥ ＨＤ（商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使って、６ウェルプレート中２μｇのＨａｌｏＴａｇ－ＵＢＢまたはＨａｌｏＴａｇ－ＶＨＬベクターによりトランスフェクトした。ＮａｎｏＬｕｃ－ＢＲＤ４ ＷＴ、Ｎ４３３Ｆ変異体、またはＮ１４０Ｆ変異体を使用した完全一過性ＮａｎｏＢＲＥＴ実験では、ＨＥＫ２９３細胞（８×１０^５個）を、０．０２μｇのＮａｎｏＬｕｃ－ＢＲＤ４および２μｇのＨａｌｏＴａｇ－ＶＨＬベクターにより同時トランスフェクトした。ＷＴタンデムＢＤ１－ＢＤ２ドメイン（ＡＡ ４４～４６０）またはＮ４３３Ｆ変異を含むＢＲＤ４ ＮＬ－ＢＤ１－ＢＤ２－ＨＴバイオセンサーを使用した一過性ＮａｎｏＢＲＥＴ実験では、ＨＥＫ２９３細胞（８×１０^５）を０．０２μｇバイオセンサープラスミドと２μｇのキャリアＤＮＡによりトランスフェクトした。翌日、トランスフェクトされた細胞（２×１０^４個）を、ＨａｌｏＴａｇ ＮａｎｏＢＲＥＴ６１８リガンド（Ｐｒｏｍｅｇａ製）の存在下または非存在下で、白色９６ウェル組織培養プレートに再播種し、３７℃、５％ＣＯ_２にてインキュベートした。カイネティクス実験では、培地をビバジン（Ｖｉｖａｚｉｎｅ；Ｐｒｏｍｅｇａ製）の１：１００希釈液を含有するＯｐｔｉ－ＭＥＭ（商標）（Ｇｉｂｃｏ社）に置き換え、プレートを３７℃、５％ＣＯ_２にて１時間インキュベートした後、ＤＭＳＯまたは最終濃度１０ｎＭ～１μＭの指示化合物を添加した。次いで、３７℃、５％ＣＯ_２に設定された雰囲気制御ユニット（ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ社）を装備したＣＬＡＲＩＯｓｔａｒ（商標）上で、３分ごとに最大５時間まで、継続的なＢＲＥＴ測定を実施した。バイオセンサー実験では、細胞を１０μＭの指定化合物の３倍ずつの段階的滴定で処理した。ＮａｎｏＢＲＥＴ ＮａｎｏＧｌｏ（商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ製）基質を添加し、化合物処理の２時間後に、ＧｌｏＭａｘ（登録商標）Ｄｉｓｃｏｖｅｒマイクロプレートリーダー（Ｐｒｏｍｅｇａ製）を使用してＢＲＥＴ測定を行った。二元フィルターを通過した発光は、４６０ｎｍ／８０ｎｍバンドパスフィルターと６１０ｎｍロングパスフィルター（アクセプター、ＨａｌｏＴａｇ ＮａｎｏＢＲＥＴ^（商標）リガンド）を使用し、０．５秒の積分時間で集光した。すべてのＮａｎｏＢＲＥＴ実験について、ミリＢＲＥＴ単位で表されるバックグラウンドを差し引いたＮａｎｏＢＲＥＴ比は、次の方程式から計算された。

【0209】

【数1】

【0210】

ＢＲＥＴの倍率増加は、ｍＢＲＥＴ比をＤＭＳＯ対照の平均ｍＢＲＥＴ比に対して正規化することによって算出した。

【0211】

ＮａｎｏＢＲＥＴ ^（商標） ターゲットエンゲージメントおよび滞留時間
生細胞と透過処理した細胞におけるターゲットエンゲージメント（候補化合物が目的の標的に結合し、疾患に対して期待通りの作用を示すかどうかを判断指標をもって評価すること）実験のために、ＬｇＢｉＴを安定発現するＣＲＩＳＰＲ ＨｉＢｉＴ－ＢＲＤ４ ＨＥＫ２９３細胞を、２×１０^４細胞／ウェルの密度で白色９６ウェル組織培養プレートに播種した。ＮａｎｏＢＲＥＴ測定の前に、細胞をエネルギー移動プローブおよび指定の試験化合物によって１時間平衡化した。ＮａｎｏＢＲＥＴトレーサーは、トレーサー希釈緩衝液（１２．５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、３１．２５％ＰＥＧ－４００、ｐＨ７．５）中２０×の使用濃度に調製した。ＮａｎｏＢＲＥＴ^（商標） ＢＲＤ Ｔｒａｃｅｒ－０２を、０．５μＭの最終濃度で細胞に添加した。生細胞中でＮａｎｏＢＲＥＴを測定するために、ＮａｎｏＢＲＥＴ ＮａｎｏＧｌｏ^（商標）基質および細胞外ＮａｎｏＬｕｃ^（商標）阻害剤（Ｐｒｏｍｅｇａ）を、製造業者の推奨プロトコルに従って添加し、そして４５０ｎｍ ＢＰフィルター（ドナー）および６００ｎｍ ＬＰフィルター（アクセプター）を備えたＧｌｏＭａｘ（登録商標）Ｄｉｓｃｏｖｅｒルミノメーター上で、フィルターを通過した発光を測定した。０．３秒の積分時間を使用した。透過処理された細胞でＮａｎｏＢＲＥＴを測定するために、最終濃度５０μｇ／ｍＬになるようにジギトニンを細胞に添加し、検出工程では細胞外ＮＬｕｃ阻害剤を省略した。滞留時間実験では、ＬｇＢｉＴを安定発現するＣＲＩＳＰＲ ＨｉＢｉＴ－ＢＲＤ４ ＨＥＫ２９３細胞をトリプシン処理し、洗浄し、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ（登録商標）で２×１０^５細胞／ｍＬの密度に再懸濁し、１μＭ ＪＱ１、１μＭ ＳＩＭ１、１００ｎＭのｃｉｓ－ＳＩＭ１、１００ｎＭ ＭＴ１のいずれかとともに、または生細胞フォーマットでのトレーサー置換の代表的なＩＣ８０値を表す１０μＭ ＭＺ１とともにインキュベートした。細胞は、組織培養インキュベータ内で、キャップを緩めた１５ ｍＬコニカルチューブ中で１時間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を３００×ｇで５分間遠心し、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ^（商標）で１回洗浄し、２回目に３００×ｇで５分間遠心し、新鮮なＯｐｔｉ－ＭＥＭで再懸濁した後、２×１０^４細胞／ウェルで塗抹した。ＮａｎｏＢＲＥＴ^（商標）Ｔｒａｃｅｒ－０２を最終濃度０．５μＭ細胞で添加し、カイネティクスＮａｎｏＢＲＥＴ^（商標）測定値をＧｌｏＭａｘ（登録商標）Ｄｉｓｃｏｖｅｒで収集した。ＮａｎｏＢＲＥＴ^（商標）比はミリＢＲＥＴ単位で表され、「ＮａｎｏＢＲＥＴユビキチン化、三元複合体、およびバイオセンサー実験」という上記の項目に記載の式に従って計算した。

【0212】

化学－材料と方法
特に断らない限り、全ての化学物質は市販品であり、少なくとも純度９０％であり、更に精製することなく使用した。市販の乾燥溶媒を使用した。順相ＴＬＣは、プレコーティング済シリカプレート（Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ^（商標）６０ Ｆ２５４、ＢＤＨ社）上でＵＶ光（ＵＶ ２５４ｎｍおよび／または３６５ｎｍ）および／または塩基性過マンガン酸カリウム溶液を介した可視化によって実行した。フラッシュカラムクロマトグラフィーは、充填済Ｒｅｄｉｓｅｐ（商標）ＲＦ順相使い捨てカラムを用いるテラダイン社のＩｓｃｏ Ｃｏｍｉｆｌａｓｈ（商標）Ｒｆを使って実施した。ＮＭＲスペクトルは、指定どおりブルカー社Ａｓｃｅｎｄ^（商標）４００ＭＨｚまたは５００ＭＨｚ上に記録した。化学シフトはｐｐｍで記録し、残留溶媒シグナルを基準とする：^１Ｈ－ＮＭＲδ（ｐｐｍ）＝７．２６（ＣＤＣｌ_３）、^１３Ｃ－ＮＭＲδ（ｐｐｍ）＝７７．１６（ＣＤＣｌ_３）；^１Ｈ－ＮＭＲδ（ｐｐｍ）＝５．３２（ＣＤ_２Ｃｌ_２）、^１３Ｃ－ＮＭＲδ（ｐｐｍ）＝５３．８４（ＣＤ_２Ｃｌ_２）、^１Ｈ－ＮＭＲδ（ｐｐｍ）＝２．５０（ＤＭＳＯ－ｄ６）；^１Ｈ－ＮＭＲδ（ｐｐｍ）＝３．３１（ＣＤ_３ＯＤ）、^１３Ｃ－ＮＭＲδ（ｐｐｍ）＝４９．００（ＣＤ_３ＯＤ）。シグナル分割パターンは、一重線（ｓ）、二重線（ｄ）、三重線（ｔ）、四重線（ｑ）、多重線（ｍ）、幅広（ｂｒ）、またはそれらの組み合わせとして記述される。カップリング定数（Ｊ）はヘルツ（Ｈｚ）単位で測定される。高分解能質量スペクトル（ＨＲＭＳ）は、ブルカー社のｍｉｃｒｏＴＯＦ^（商標）上で記録された。他の分解用ＭＳおよび分析用ＨＰＬＣトレースは、Ａｇｉｌｅｎｔ社のダイオードアレイ検出器に接続されたＡｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製６１３０四重極ＬＣ／ＭＳ搭載のＡｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製１２００ＨＰＬＣ上で記録された。使用したカラムはＷａｔｅｒｓ社製ＸＢｒｉｄｇｅ^（商標）カラム（５０ｍｍ×２．１ｍｍ、粒径３．５μｍ）であり、化合物は５～９５％アセトニトリル／水＋０．１％ギ酸の勾配（「酸性法」）で溶出させた。ＨＰＬＣ精製は、Ｗａｔｅｒｓ社製ＸＢｒｉｄｇｅ^（商標）Ｃ１８カラム（１００ｍｍ×１９ｍｍ；粒径５μｍ）を装備したＧｉｌｓｏｎ社製分取用ＨＰＬＣシステム上で、１０分間にわたる水中５％～９５％アセトニトリルの勾配により、流量２５ｍＬ／分にて、水相に０．１％アンモニアを使用して実施した。

【0213】

使用する略語：ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）、ＰＭＢ（ｐ－メトキシベンジル）、Ｍｓ（メシル）、ｔＢｕ（ｔｅｒｔ－ブチル）、ｐＴｓＯＨ（ｐ－トルエンスルホン酸）、ＴＢＡＢ（臭化テトラブチルアンモニウム）、ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）、ＭｅＯＨ（メタノール）、ＤＣＭ（ジクロロメタン）、ＤＤＱ（２，３－ジクロロ－５，６－ジシアノ－１，４－ベンゾキノン）、ＴＨＦ（テトラヒドロフラン）、ＨＡＴＵ（１－［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］－１Ｈ－１，２，３－トリアゾロ［４，５－ｂ］ピリジニウム３－オキシドヘキサフルオロリン酸塩）、ＨＯＡｔ（１－ヒドロキシ－７－アザベンゾトリアゾール）、ＤＩＰＥＡ（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン）、ＤＭＦ（Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド）、ＭＴＢＥ（メチルｔｅｒｔ－ブチルエーテル）、ＣＯＭＵ（（１－シアノ－２－エトキシ）－２－オキソエチリデンアミノオキシ）ジメチルアミノ－モルホリノ－カルベニウムヘキサフルオロリン酸塩）。

【0214】

化合物ＳＩＭ１、ＳＩＭ２およびＳＩＭ３の合成

【0215】

【化18】

【0216】

【化19】

【0217】

（２，２，５－トリメチル－１，３－ジオキサン－５－イル）メタノール（１）

【0218】

【化20】

【0219】

２－（ヒドロキシメチル）－２－メチルプロパン－１，３－ジオール（５０．０ｇ、０．４２モル）およびｐ－トルエンスルホン酸（５０ｍｇ）を乾燥アセトン（５００ｍＬ）に溶解した。－混合物を室温で２日間撹拌した。固体の炭酸カリウムを添加することによって溶液を中和し、濾過し、真空下で蒸発させて、所望の生成物（６４ｇ、９６％、濃厚な無色油）を得、これをさらに精製することなく使用した。分析データは文献で報告されているデータと一致した（Ｏｕｃｈｉ Ｍ．他、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９８７、５２、２４２０）。

【0220】

２－（（アリルオキシ）メチル）－２－メチルプロパン－１，３－ジオール（２）

【0221】

【化21】

【0222】

Ｈ_２Ｏ（１．０５ｍＬ）中の水酸化カリウム（１．０５ｇ、１６．７５ミリモル）、臭化アリル（１．５４ｍＬ、１８．７５ミリモル）およびＴＢＡＢ（２０２ｍｇ、０．６２５ミリモル）を、トルエン（６．２５ｍＬ）中の（２，２，５－トリメチル－１，３－ジオキサン－５－イル）メタノール（１）（１．０ｇ、６．２５ミリモル）の溶液に添加した。得られた混合物を室温で２４時間撹拌した。反応混合物をジクロロメタンで希釈した。有機相を分離し、蒸発乾固した。粗製物質をカラムクロマトグラフィーにより精製した。得られたアリルエーテルをメタノール（１６ｍＬ）およびＨ_２Ｏ（３．２ｍＬ）に溶解した。トリフルオロ酢酸（２８７μＬ）を加えた後、混合物を室温で４時間撹拌した。反応混合物を蒸発乾固した。粗製物質をカラムクロマトグラフィーにより精製して、表題化合物を得た。収量：８６０ｍｇ（８６％）。

【0223】

^１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）δ（ｐｐｍ）＝５．９８－５．８３（１Ｈ，ｍ），５．２８（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１．４，１７．３Ｈｚ），５．２１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１．２，１０．５Ｈｚ），４．０３－３．９８（２Ｈ，ｍ），３．７３（２Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝４．８，１１．０Ｈｚ），３．６２（２Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝５．５，１０．９Ｈｚ），３．４７（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．０Ｈｚ），２．７０（２Ｈ，ｓ），０．８６（３Ｈ，ｓ）。
^１３Ｃ－ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）δ（ｐｐｍ）＝１３４．３，１１７．２，７５．８，７２．５，６８．０，４０．８，１７．２。

【0224】

１１－（（アリルオキシ）メチル）－１，２１－ジアジド－１１－メチル－３，６，９，１３，１６，１９－ヘキサオキサヘニコサン（５）

【0225】

【化22】

【0226】

２－（（アリルオキシ）メチル）－２－メチルプロパン－１，３－ジオール（２）（１３６ｍｇ、０．８５ミリモル）、２－（２－（２－アジドエトキシ）エトキシ）エチルメタンスルホネート（４）（６４６ｍｇ、２．５５ミリモル）を、１，４－ジオキサン（０．８５ｍＬ）に溶解した。ＴＢＡＢ（５５ｍｇ、０．１８ミリモル）、ヨウ化カリウム（７．１ｍｇ、０．０４ミリモル）および水酸化カリウム粉末（１４３ｍｇ、２．５５ミリモル）を加え、反応液を１００℃で２時間撹拌した。反応混合物をジクロロメタンで希釈し、濾過した。有機相を蒸発乾固させた。粗製物質を酸性条件下でＨＰＬＣ（０．１％ＨＣＯ_２Ｈ水溶液中５％～９５％ＣＨ_３ＣＮ勾配）により精製して、表題化合物を得た。収量：５０ｍｇ（１２％）。

【0227】

^１Ｈ－ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）δ（ｐｐｍ）＝５．９６－５．８４（１Ｈ，ｍ），５．２６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１．７，１７．２Ｈｚ），５．１５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１．５，１０．４Ｈｚ），４．０１－３．９３（２Ｈ，ｍ），３．７６－３．６１（１６Ｈ，ｍ），３．６２－３．５５（４Ｈ，ｍ），３．４４－３．３７（４Ｈ，ｍ），３．３７－３．３３（４Ｈ，ｍ），３．３３－３．２９（２Ｈ，ｍ），０．９６（３Ｈ，ｓ）。
^１３Ｃ－ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）＝１３５．３，１１６．０，７４．０，７３．０，７２．３，７１．１，７０．８，７０．７，７０．５，７０．０，５０．７，４１．０，１７．４。

【0228】

１４－（（アリルオキシ）メチル）－１，２７－ジアジド－１４－メチル－３，６，９，１２，１６，１９，２２，２５－オクタオキサヘプタコサン（６）

【0229】

【化23】

【0230】

２－（（アリルオキシ）メチル）－２－メチルプロパン－１，３－ジオール（２）（５０ｍｇ、０．３１ミリモル）、２－（２－（２－（２－アジドエトキシ）エトキシ）エトキシ）エチルメタンスルホネート（４）（２７８ｍｇ、０．９４ミリモル）を１，４－ジオキサン（０．３１ｍＬ）に溶解した。ＴＢＡＢ（５５ｍｇ、０．１８ミリモル）、ヨウ化カリウム（２．６ｍｇ、０．０１６ミリモル）および水酸化カリウム粉末（５２．５ｍｇ、０．９４ミリモル）を加え、反応液を１００℃で２時間撹拌した。反応混合物をジクロロメタンで希釈し、濾過した。有機相を蒸発乾固させた。粗製物質を酸性条件下でＨＰＬＣ（０．１％ＨＣＯ_２Ｈ水溶液中５％～９５％ＣＨ_３ＣＮ勾配）により精製して、表題化合物を得た。収量：１５ｍｇ（９％）。

【0231】

^１Ｈ－ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）δ（ｐｐｍ）＝５．９３－５．８３（１Ｈ，ｍ），５．２５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１．３，１７．２Ｈｚ），５．１６－５．１１（１Ｈ，ｍ），３．９６－３．９２（２Ｈ，ｍ），３．７１－３．５４（２８Ｈ，ｍ），３．４２－３．２７（１０Ｈ，ｍ），０．９４（３Ｈ，ｓ）。
^１３Ｃ－ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）δ（ｐｐｍ）＝１３５．５，１１６．２，７４．２，７３．２，７２．４，７１．２，７０．９，７０．８，７０．６，７０．２，５０．９，４１．２，１７．６。

【0232】

１－（（２－ヨードエトキシ）メチル）－４－メトキシベンゼン（８）

【0233】

【化24】

【0234】

ヨウ素（１８０ｍｇ、０．７１ミリモル）を０℃で、トリフェニルホスフィン（１８７ｍｇ、０．７１ミリモル）およびイミダゾール（４８．６ｍｇ、０．７１ミリモル）のジクロロメタン（３．８ｍＬ）溶液に加えた。得られた混合物を室温で５分間撹拌した。反応混合物に、ジクロロメタン（１．３ｍＬ）中の２－（（４－メトキシベンジル）オキシ）エタン－１－オール（７）（１００ｍｇ、０．５５ミリモル）を０℃で加えた。混合物を室温で３時間撹拌した。反応をＮａ_２ＳＯ_４（水性）およびＮａＨＣＯ_３でクエンチし、次いで酢酸エチルで抽出した。有機相を合わせ、蒸発乾固した。粗製物質をフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製して、表題化合物を得た。収量：１３１ｍｇ（８２％）。

【0235】

^１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）δ（ｐｐｍ）＝７．２８（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ），６．８９（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ），４．５１（２Ｈ，ｓ），３．８１（３Ｈ，ｓ），３．７１（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ），３．２６（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．７Ｈｚ）
^１３Ｃ－ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）δ（ｐｐｍ）＝１５９．４，１２９．９，１２９．４，１１３．９，７２．６，７０．５，５５．３，３．０。

【0236】

５－（（２－（（４－メトキシベンジル）オキシ）エトキシ）メチル）－２，２，５－トリメチル－１，３－ジオキサン（９）

【0237】

【化25】

【0238】

水素化ナトリウム６０％鉱油分散液（３８４ｍｇ、９．６０ミリモル）を、０℃にてＤＭＦ（３．０ｍＬ）中の（２，２，５－トリメチル－１，３－ジオキサン－５－イル）メタノール（１）（１．５４ｇ、９．６０ミリモル）の溶液に加えた。得られた混合物を室温で３０分間撹拌した。混合物に、ＤＭＦ（０．５ｍＬ）中の１－（（２－ヨードエトキシ）メチル）－４－メトキシベンゼン（８）（７００ｍｇ、２．４０ミリモル）を０℃で滴下した。反応混合物を１３０℃で４５分間撹拌した。混合物をＨ_２Ｏでクエンチし、酢酸エチルで抽出した。有機相を蒸発乾固させた。粗製物質をフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製して、表題化合物を得た。収量：１１０ｍｇ（１４％）。

【0239】

^１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）δ（ｐｐｍ）＝７．２９（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．３Ｈｚ），６．９０（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ），４．５３（２Ｈ，ｓ），３．８３（３Ｈ，ｓ），３．７４（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝１１．９Ｈｚ），３．６８－３．６０（４Ｈ，ｍ），３．５６（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝１１．７Ｈｚ），３．４９（２Ｈ，ｓ），１．４５（３Ｈ，ｓ），１．４２（３Ｈ，ｓ），０．９２（３Ｈ，ｓ）．
^１３ＣＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）δ（ｐｐｍ）＝１５９．３，１３０．７，１２９．４，１１３．９，９８．０，７４．３，７３．０，７１．３，６９．２，６６．７，５５．４，３４．６，２６．４，２１．５，１８．５。

【0240】

２－（（２－（（４－メトキシベンジル）オキシ）エトキシ）メチル）－２－メチルプロパン－１，３－ジオール（１０）

【0241】

【化26】

【0242】

トリフルオロ酢酸（１１μＬ、０．１４ミリモル）を、メタノール（０．６ｍＬ）と水（０．０２ｍＬ）中の５－（（２－（（４－メトキシベンジル）オキシ）エトキシ）メチル）－２，２，５－トリメチル－１，３－ジオキサン（９）（７７ｍｇ、０．２４ミリモル）に添加した。得られた混合物を室温で１６時間撹拌し、次いで蒸発乾固した。粗物質をフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製して、表題化合物を得た。収量６０ｍｇ（８９％）。

【0243】

^１Ｈ－ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）δ（ｐｐｍ）＝７．２６（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ），６．８８（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ），４．４９（２Ｈ，ｓ），３．８０（３Ｈ，ｓ），３．５１（２Ｈ，ｓ），２．６６（２Ｈ，ｓ），０．８０（３Ｈ，ｓ）。
^１３Ｃ－ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）δ（ｐｐｍ）＝１５９．５，１３０．１，１２９．６，１１４．０，７３．１，７０．９，６９．０，６８．３，５５．４，４１．０，１７．４。

【0244】

１，２１－ジアジド－１１－（（２－（（４－メトキシベンジル）オキシ）エトキシ）メチル）－１１－メチル－３，６，９，１３，１６，１９－ヘキサオキサヘニコサン（１１）

【0245】

【化27】

【0246】

１，４－ジオキサン（０．５１ｍＬ）中の２－（（２－（（４－メトキシベンジル）オキシ）エトキシ）メチル）－２－メチルプロパン－１，３－ジオール（１０）（７３ｍｇ、０．２６ミリモル）と２－（２－（２－アジドエトキシ）エトキシ）エチルメタンスルホネート（３）（３９０ｍｇ、１．５４ミリモル）の混合物に、ＴＢＡＢ（２５ｍｇ、０．０７７ミリモル）、ヨウ化カリウム（２．１ｍｇ、０．０１３ミリモル）および水酸化カリウム粉末（８６ｍｇ、１．５４ミリモル）を添加した。得られた反応混合物を１００℃で４０時間撹拌した。反応混合物をフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製して、表題化合物を得た。収量：８５ｍｇ（５５％）。

【0247】

^１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）δ（ｐｐｍ）＝７．２６（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ），６．８７（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ），４．４９（２Ｈ，ｓ），３．８０（３Ｈ，ｓ），３．７０－３．５３（２４Ｈ，ｍ），３．４１－３．３５（４Ｈ，ｍ），３．３５－３．３０（６Ｈ，ｍ），０．９４（３Ｈ，ｓ）。
^１３Ｃ－ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）δ（ｐｐｍ）＝１５９．３，１３０．８，１２９．３，１１３．９，７４．１，７２．９，７１．２，７０．９，７０．８，７０．７，７０．２，６９．３，５５．４，５０．９，４１．２，１７．５。

【0248】

１－アジド－１１－（（２－（２－（２－アジドエトキシ）エトキシ）エトキシ）メチル）－１１－メチル－３，６，９，１３－テトラオキサペンタデカン－１５－オール（１２）

【0249】

【化28】

【0250】

Ｈ_２Ｏ（０．２０ｍＬ）とジクロロメタン（２．０ｍＬ）中の１，２１－ジアジド－１１－（（２－（（４－メトキシベンジル）オキシ）エトキシ）メチル）－１１－メチル－３，６，９，１３，１６，１９－ヘキサオキサヘニコサン（１１）（１１８ｍｇ、０．２０ミリモル）の混合物に、２，３－ジクロロ－５，６－ジシアノ－１，４－ベンゾキノン（４９．２ｍｇ、０．２２ミリモル）を０℃で加えた。得られた反応混合物を４℃で１６時間撹拌した。反応混合物をＮａＨＣＯ_３（水性）でクエンチし、濾過して沈殿物を除去した。濾液を蒸発させ、残った残渣を酸性条件下でＨＰＬＣ（０．１％ＨＣＯ_２Ｈ水溶液中５％～９５％ＣＨ_３ＣＮ勾配）で精製して表題化合物を得た。収量：８６ｍｇ（９１％）。

【0251】

^１Ｈ－ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）δ（ｐｐｍ）＝３．７１－３．６１（１８Ｈ，ｍ），３．６０－３．５５（４Ｈ，ｍ），３．５５－３．５１（２Ｈ，ｍ），３．４２－３．３０（１０Ｈ，ｍ），２．４８（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．２Ｈｚ），０．９４（３Ｈ，ｓ）。
^１３Ｃ－ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）δ（ｐｐｍ）＝７４．２，７３．５，７２．３，７１．２，７０．９，７０．８，７０．７，７０．２，６１．７，５０．９，４１．１，１７．７。

【0252】

１１－（（２－（アリルオキシ）エトキシ）メチル）－１，２１－ジアジド－１１－メチル－３，６，９，１３，１６，１９－ヘキサオキサヘニコサン（１３）

【0253】

【化29】

【0254】

１，４－ジオキサン（０．２１ｍＬ）中の１－アジド－１１－（（２－（２－（２－アジドエトキシ）エトキシ）エトキシ）メチル）－１１－メチル－３，６，９，１３－テトラオキサペンタデカン－１５－オール（１２）（５０ｍｇ、０．１０ミリモル）の混合物に、臭化アリル（２６ｍｇ、０．３１ミリモル）および水酸化カリウム粉末（１８ｍｇ、０．３１ミリモル）を加えた。得られた反応混合物を８０℃で６時間撹拌した。反応混合物をジクロロメタンで希釈し、蒸発させた。残った残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製して、表題化合物を得た。収量：３９ｍｇ（７２％）。

【0255】

^１Ｈ－ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）δ（ｐｐｍ）＝５．９５－５．８５（１Ｈ，ｍ），５．２６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１．７，１７．２Ｈｚ），５．１６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１．４，１０．５Ｈｚ），４．０１（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．０Ｈｚ），３．７３－３．５９（１６Ｈ，ｍ），３．５８－３．５２（８Ｈ，ｍ），３．４０－３．３５（４Ｈ，ｍ），３．３５－３．２８（６Ｈ，ｍ），０．９３（３Ｈ，ｓ）。
^１３Ｃ－ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）δ（ｐｐｍ）＝１３５．１，１１６．８，７４．１，７２．２，７１．２，７０．９，７０．８，７０．７，７０．２，６９．５，５０．８，４１．２，１７．５。

【0256】

１－アジド－１１－（（２－（２－（２－アジドエトキシ）エトキシ）エトキシ）メチル）－１１－メチル－３，６，９，１３－テトラオキサペンタデカン－１５－アール（１４）

【0257】

【化30】

【0258】

Ｈ_２Ｏ（０．３ｍＬ）および１，４－ジオキサン（１．０ｍＬ）中の１１－（（アリルオキシ）メチル）－１，２１－ジアジド－１１－メチル－３，６，９，１３，１６，１９－ヘキサオキサヘニコサン（５）（２５ｍｇ、０．０５３ミリモル）の混合物に、２，６－ルチジン（１２．２μＬ、０．１１ミリモル）、Ｈ_２Ｏ中４％四酸化オスミウム（６．７μＬ、０．００１１ミリモル）、過ヨウ素酸ナトリウム（４５ｍｇ、０．２１ミリモル）を添加した。得られた反応混合物を室温で１６時間撹拌した。反応混合物をＮａ_２ＳＯ_３（水溶液）でクエンチし、ジクロロメタンで抽出した。有機層を濃縮し、残った残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィーで精製して、表題化合物を得た。収量：１６ｍｇ（６４％）。

【0259】

^１Ｈ－ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）δ（ｐｐｍ）＝９．７３（１Ｈ，ｓ），４．０２（２Ｈ，ｓ），３．７４－３．５２（２０Ｈ，ｍ），３．４６－３．２６（１０Ｈ，ｍ），０．９８（３Ｈ，ｓ）。
^１３Ｃ－ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）δ（ｐｐｍ）＝２０２．２，７７．０，７４．７，７３．９，７１．２，７０．９，７０．８，７０．７，７０．２，５０．９，４１．３，１７．５。

【0260】

１－アジド－１１－（（２－（２－（２－アジドエトキシ）エトキシ）エトキシ）メチル）－１１－メチル－３，６，９，１３，１６－ペンタオキサオクタデカン－１８－アール（１５）

【0261】

【化31】

【0262】

Ｈ_２Ｏ（０．６ｍＬ）および１，４－ジオキサン（１．７ｍＬ）中の１１－（（２－（アリルオキシ）エトキシ）メチル）－１，２１－ジアジド－１１－メチル－３，６，９，１３，１６，１９－ヘキサオキサヘニコサン（１３）（５０ｍｇ、０．０９６ミリモル）の混合物に、２，６－ルチジン（２２．４μＬ、０．１９ミリモル）、四酸化オスミウム４％水溶液（１２．２μＬ、０．００１９ミリモル）および過ヨウ素酸ナトリウム（８２．５ｍｇ、０．３９ミリモル）を加えた。得られた反応混合物を室温で１６時間撹拌した。反応混合物をＮａ_２ＳＯ_３（水溶液）でクエンチし、ジクロロメタンで抽出した。有機層を濃縮し、残った残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィーで精製して、表題化合物を得た。収量：３８ｍｇ（７６％）。

【0263】

^１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）δ（ｐｐｍ）＝９．７１（１Ｈ，ｓ），４．１４（２Ｈ，ｓ），３．７１－３．５０（２４Ｈ，ｍ），３．４４－３．２５（１０Ｈ，ｍ），０．９２（３Ｈ，ｓ）。
^１３Ｃ－ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）δ（ｐｐｍ）＝２０１．３，７７．０，７３．９，７３．４，７１．１，７０．８，７０．６，７０．１，５５．１，５０．８，４１．０，１７．５。

【0264】

１－アジド－１４－（１３－アジド－２，５，８，１１－テトラオキサトリデシル）－１４－メチル－３，６，９，１２，１６－ペンタオキサオクタデカン－１８－アール（１６）

【0265】

【化32】

【0266】

Ｈ_２Ｏ（０．４ｍＬ）および１，４－ジオキサン（１．７ｍＬ）中の１４－（（アリルオキシ）メチル）－１，２７－ジアジド－１４－メチル－３，６，９，１２，１６，１９，２２，２５－オクタオキサヘプタコサン（６）（３５ｍｇ、０．０６２ミリモル）の混合物に、２，６－ルチジン（１４．５μＬ、０．１２ミリモル）、四酸化オスミウム４％水溶液（１２．２μＬ、０．００１２ミリモル）、過ヨウ素酸ナトリウム（５３ｍｇ、０．２５ミリモル）を加えた。得られた反応混合物を室温で１６時間撹拌した。反応混合物をＮａ_２ＳＯ_３（水溶液）でクエンチし、ジクロロメタンで抽出した。有機層を濃縮し、残った残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製して、表題化合物を得た。収量：２３ｍｇ（６５％）。

【0267】

^１Ｈ－ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）δ（ｐｐｍ）＝９．７５（１Ｈ，ｓ），４．１０－３．９９（２Ｈ，ｍ），３．７７－３．２９（３８Ｈ，ｍ），１．００（３Ｈ，ｓ）。
^１３Ｃ－ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）δ（ｐｐｍ）＝２０２．２，７４．７，７３．９，７１．２，７０．９，７０．８，７０．６，７０．２，５０．９，４１．３，１７．５。

【0268】

１－アジド－１１－（（２－（２－（２－アジドエトキシ）エトキシ）エトキシ）メチル）－１１－メチル－３，６，９，１３－テトラオキサペンタデカン－１５－酸（１７）

【0269】

【化33】

【0270】

ｔ－ＢｕＯＨ（０．６ｍＬ）中の１－アジド－１１－（（２－（２－（２－アジドエトキシ）エトキシ）エトキシ）メチル）－１１－メチル－３，６，９，１３－テトラオキサペンタデカン－１５－アール（１４）（１６ｍｇ、０．０３４ミリモル）の混合物に、ＴＨＦ中２Ｍの２－メチル－２－ブテン（８４μＬ、０．１６８ミリモル）、ＮａＨ_２ＰＯ_４（４．０ｍｇ、０．０３４ミリモル）、Ｈ_２Ｏ（０．２ｍＬ）中塩化ナトリウム（１２．１ｍｇ、０．１３４ミリモル）を添加した。生じた反応混合物を室温で１６時間撹拌した。反応混合物を濃縮し、次いでＮａＯＨ（水性）で希釈した。混合物をＭＴＢＥで洗浄し、２Ｍ ＨＣｌで中和した。ジクロロメタンで抽出し、有機層をＮａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、濃縮した。残った粗生成物をさらに精製することなく次のステップで使用した。収量：１６ｍｇ（９７％）。

【0271】

^１Ｈ－ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）δ（ｐｐｍ）＝４．０５（２Ｈ，ｓ），３．７０－３．５８（２０Ｈ，ｍ），３．４５－３．３３（１０Ｈ，ｍ），０．９５（３Ｈ，ｓ）。
^１３Ｃ－ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）δ（ｐｐｍ）＝１７２．１，７５．４，７４．７，７１．３，７０．９，７０．７，７０．４，７０．２，６８．８，５０．８，４０．８，１８．０。

【0272】

１－アジド－１１－（（２－（２－（２－アジドエトキシ）エトキシ）エトキシ）メチル）－１１－メチル－３，６，９，１３，１６－ペンタオキサオクタデカン－１８－酸（１８）

【0273】

【化34】

【0274】

ｔ－ブタノール（１．２ｍＬ）中の１－アジド－１１－（（２－（２－（２－アジドエトキシ）エトキシ）エトキシ）メチル）－１１－メチル－３，６，９，１３，１６－ペンタオキサオクタデカン－１８－アール（１５）（３５ｍｇ、０．０６７ミリモル）の溶液に、ＴＨＦ中２Ｍの２－メチル－２－ブテン溶液（１６８μＬ、０．３３６ミリモル）、ＮａＨ_２ＰＯ_４（８．１ｍｇ、０．０６７ミリモル）、Ｈ_２Ｏ（０．２ｍＬ）中の塩化ナトリウム（２４ｍｇ、０．２６５ミリモル）を加えた。得られた反応混合物を室温で１６時間撹拌した。反応混合物を濃縮し、次いでＮａＯＨ（水溶液）で希釈した。混合物をＭＴＢＥで洗浄し、２Ｍ ＨＣｌで中和した。ジクロロメタンで抽出し、有機層をＮａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、濃縮した。残った粗生成物をさらに精製することなく次のステップで使用した。収量：３６ｍｇ（定量的）。

【0275】

^１Ｈ－ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）δ（ｐｐｍ）＝４．０９（２Ｈ，ｓ），３．７１－３．４７（２４Ｈ，ｍ），３．３７－３．２１（１０Ｈ，ｍ），０．８７（３Ｈ，ｓ）。
^１３Ｃ－ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）δ（ｐｐｍ）＝１７２．２，７４．０，７３．９，７１．５，７１．１，７０．８，７０．７，７０．１，６８．９，５０．８，４１．０，１７．５。

【0276】

１－アジド－１４－（１３－アジド－２，５，８，１１－テトラオキサトリデシル）－１４－メチル－３，６，９，１２，１６－ペンタオキサオクタデカン－１８－酸（１９）

【0277】

【化35】

【0278】

ｔ－ブタノール（０．４５ｍＬ）中の１－アジド－１４－（１３－アジド－２，５，８，１１－テトラオキサトリデシル）－１４－メチル－３，６，９，１２，１６－ペンタオキサオクタデカン－１８－アール（１６）（１４ｍｇ、０．０２５ミリモル）の混合物に、ＴＨＦ中２Ｍの２－メチル－２－ブテン溶液（６２μＬ、０．１２４ミリモル）、ＮａＨ_２ＰＯ_４（３．０ｍｇ、０．０２５ミリモル）、Ｈ_２Ｏ（０．１５ｍＬ）中の塩化ナトリウム（８．９ｍｇ、０．０９９ミリモル）を加えた。得られた反応混合物を室温で１６時間撹拌した。反応混合物を濃縮し、次いでＮａＯＨ（水溶液）で希釈した。混合物をＭＴＢＥで洗浄し、２Ｍ ＨＣｌで中和した。ジクロロメタンで抽出し、有機層をＮａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、濃縮した。残った粗生成物をさらに精製することなく次のステップで使用した。収量：８ｍｇ（５６％）。

【0279】

^１Ｈ－ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）δ（ｐｐｍ）＝４．０４（２Ｈ，ｓ），３．７１－３．５５（２８Ｈ，ｍ），３．４５－３．３２（１０Ｈ，ｍ），０．９５（３Ｈ，ｓ）。
^１３Ｃ－ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）δ（ｐｐｍ）＝１７１．９，７５．３，７４．７，７１．４，７０．９，７０．８，７０．７，７０．４，７０．２，６８．９，５０．９，４０．８，１８．０。

【0280】

（２Ｓ，４Ｒ）－１－（（Ｓ）－１－アジド－１１－（（２－（２－（２－アジドエトキシ）エトキシ）エトキシ）メチル）－１７－（ｔｅｒｔ－ブチル）－１１－メチル－１５－オキソ－３，６，９，１３－テトラオキサ－１６－アザオクタデカン－１８－オイル）－４－ヒドロキシ－Ｎ－（４－（４－メチルチアゾール－５－イル）ベンジル）ピロリジン－２－カルボキサミド（２０）

【0281】

【化36】

【0282】

ＣＯＭＵ（１０．４ｍｇ、０．０２４ミリモル）、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（１４．１μＬ、０．０８１ミリモル）を、ＤＭＦ（０．２０ｍＬ）中の１－アジド－１１－（（２－（２－（２－アジドエトキシ）エトキシ）エトキシ）メチル）－１１－メチル－３，６，９，１３－テトラオキサペンタデカン－１５－酸（１７）（１０ｍｇ、０．０２０ミリモル）の溶液に添加した。得られた反応混合物を室温で２分間撹拌した。ＶＨ０３２アミン塩酸塩（ｒｅｆ．５３）（１４．２ｍｇ、０．０３１ミリモル）を混合物に加えた。次いで、混合物を室温で１６時間撹拌し、酸性条件下でＨＰＬＣ（０．１％ＨＣＯ_２Ｈ水溶液中５％～９５％ＣＨ_３ＣＮ勾配）により精製して、表題化合物を得た。収量：１０ｍｇ（５４％）。

【0283】

^１Ｈ－ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）δ（ｐｐｍ）＝８．６８（１Ｈ，ｓ），７．３９－７．３０（５Ｈ，ｍ），７．１０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ），４．７３（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），４．５９－４．５１（２Ｈ，ｍ），４．４８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ），４．３５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝５．５，１５．０Ｈｚ），４．０９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１２．０Ｈｚ），３．９４（２Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１５．４，１７．７Ｈｚ），３．７１－３．５３（２１Ｈ，ｍ），３．４６－３．３０（１０Ｈ，ｍ），２．６０－２．４９（１Ｈ，ｍ），２．５１（３Ｈ，ｓ），２．１６－２．０８（１Ｈ，ｍ），０．９６（３Ｈ，ｓ），０．９５（９Ｈ，ｓ）。
^１３Ｃ－ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）δ（ｐｐｍ）＝１７１．５，１７０．８，１７０．７，１５０．５，１４８．６，１３８．３，１３１．８，１３１．１，１２９．７，１２８．３，７４．８，７４．２，７４．１，７１．２，７０．９，７０．８，７０．７，７０．６，７０．３，７０．２，５８．５，５７．２，５６．７，５０．８，４３．４，４１．１，３５．９，３５．０，２６．５，１７．７，１６．２。
ＭＳ（ＥＳＩ）：Ｃ_４１Ｈ_６５Ｎ_１０Ｏ_１１Ｓ［Ｍ＋Ｈ^＋］についての計算値９０５．５、実測値９０５．３。

【0284】

（２Ｓ，４Ｒ）－１－（（Ｓ）－２１－アジド－１１－（（２－（２－（２－アジドエトキシ）エトキシ）エトキシ）メチル）－２－（ｔｅｒｔ－ブチル）－１１－メチル－４－オキソ－６，９，１３，１６，１９－ペンタオキサ－３－アザヘニコサノイル）－４－ヒドロキシ－Ｎ－（４－（４－メチルチアゾール－５－イル）ベンジル）ピロリジン－２－カルボキサミド（２１）

【0285】

【化37】

【0286】

ＤＭＦ（０．３２ｍＬ）中の１－アジド－１１－（（２－（２－（２－アジドエトキシ）エトキシ）エトキシ）メチル）－１１－メチル－３，６，９，１３，１６－ペンタオキサオクタデカン－１８－酸（１８）（１７ｍｇ、０．０３２ミリモル）の溶液に、ＨＡＴＵ（１８ｍｇ、０．０４８ミリモル）、ＨＯＡｔ（６．５ｍｇ、０．０４８ミリモル）、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（２２μＬ、０．１２７ミリモル）を加えた。得られた反応混合物を室温で５分間撹拌した。ＶＨ０３２アミン塩酸塩（ｒｅｆ．５３）（２２．１ｍｇ、０．０３２ミリモル）を混合物に加えた。次いで、混合物を室温で６時間撹拌し、酸性条件下でＨＰＬＣ（０．１％ＨＣＯ_２Ｈ水溶液中５％～９５％ＣＨ_３ＣＮ勾配）により精製して、表題化合物を得た。収量：１３ｍｇ（４３％）。

【0287】

^１Ｈ－ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）δ（ｐｐｍ）＝８．７５（１Ｈ，ｓ），７．４４－７．３４（５Ｈ，ｍ），７．２１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），４．７６（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），４．６１－４．５０（３Ｈ，ｍ），４．３８（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝５．４，１４．８Ｈｚ），４．１２－３．９７（３Ｈ，ｍ），３．７４－３．５５（２５Ｈ，ｍ），３．４３－３．２９（１０Ｈ，ｍ），２．６１－２．５１（１Ｈ，ｍ），２．５４（３Ｈ，ｓ），２．１７－２．１０（１Ｈ，ｍ），０．９７（９Ｈ，ｓ），０．９４（３Ｈ，ｓ）。

【0288】

^１３Ｃ－ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）δ（ｐｐｍ）＝１７１．６，１７０．８，１７０．５，１５０．６，１４８．３，１３８．４，１３１．９，１３０．９，１２９．７，１２８．３，７４．２，７４．１，７１．２，７１．１，７０．９，７０．８，７０．６，７０．３，７０．２，５８．６，５７．２，５６．８，５０．９，４３．４，４１．１，３６．０，３５．１，２６．６，１７．５，１６．０。
ＭＳ（ＥＳＩ）：Ｃ_４３Ｈ_６９Ｎ_１０Ｏ_１２Ｓ［Ｍ＋Ｈ^＋］についての計算値９４９．５、実測値９４９．４。

【0289】

（２Ｓ，４Ｒ）－１－（（Ｓ）－１－アジド－１４－（１３－アジド－２，５，８，１１－テトラオキサトリデシル）－２０－（ｔｅｒｔ－ブチル）－１４－メチル－１８－オキソ－３，６，９，１２，１６－ペンタオキサ－１９－アザヘニコサン－２１－オイル）－４－ヒドロキシ－Ｎ－（４－（４－メチルチアゾール－５－イル）ベンジル）ピロリジン－２－カルボキサミド（２２）

【0290】

【化38】

【0291】

ＤＭＦ（０．２０ｍＬ）中の１－アジド－１４－（１３－アジド－２，５，８，１１－テトラオキサトリデシル）－１４－メチル－３，６，９，１２，１６－ペンタオキサオクタデカン－１８－酸（１９）（７．１ｍｇ、０．０１２ミリモル）の溶液に、ＨＡＴＵ（７．０ｍｇ、０．０１８ミリモル）、ＨＯＡｔ（２．５ｍｇ、０．０１８ミリモル）、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（８．５μＬ、０．１２７ミリモル）を加えた。得られた反応混合物を室温で５分間撹拌した。ＶＨ０３２アミン塩酸塩（ｒｅｆ．５３）（２２．１ｍｇ、０．０４９ミリモル）を混合物に加えた。次いで、混合物を室温で６時間撹拌し、酸性条件下でＨＰＬＣ（０．１％ＨＣＯ_２Ｈ水溶液中５％～９５％ＣＨ_３ＣＮ勾配）により精製して、表題化合物を得た。収量：６．２ｍｇ（５１％）。

【0292】

^１Ｈ－ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤ_３ＯＤ）δ（ｐｐｍ）＝８．９０（１Ｈ，ｓ），７．５４－７．３６（５Ｈ，ｍ），４．６９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．７Ｈｚ），４．６１－４．４８（３Ｈ，ｍ），４．３６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝５．１，１５．６Ｈｚ），４．００（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１４．８Ｈｚ），３．９６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１５．４Ｈｚ），３．８７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１１．５Ｈｚ），３．８０（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝３．７，１０．８Ｈｚ），３．６９－３．５５（２８Ｈ，ｍ），３．４８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．３Ｈｚ），３．４４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ），３．４１－３．３４（８Ｈ，ｍ），２．４９（３Ｈ，ｓ），２．２７－２．１９（１Ｈ，ｍ），２．１４－２．０６（１Ｈ，ｍ），１．０５（９Ｈ，ｓ），１．０１（３Ｈ，ｓ）。

【0293】

^１３Ｃ－ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）δ（ｐｐｍ）＝１７４．４，１７１．９，１７１．６，１５２．９，１４９．０，１４０．３，１３３．５，１３１．５，１３０．４，１２９．０，７５．５，７４．８，７４．８，７２．２，７１．７，７１．６，７１．５，７１．１，６０．８，５８．１，５１．８，４３．７，４２．１，３８．９，３７．３，２７．０，１８．０，１５．８。
ＭＳ（ＥＳＩ）：Ｃ_４５Ｈ_７３Ｎ_１０Ｏ_１３Ｓ［Ｍ＋Ｈ^＋］についての計算値９９３．５、実測値９９３．４。

【0294】

Ｎ，Ｎ′－（１１－（（２－（（（Ｓ）－１－（（２Ｓ，４Ｒ）－４－ヒドロキシ－２－（（４－（４－メチルチアゾール－５－イル）ベンジル）カルバモイル）ピロリジン－１－イル）－３，３－ジメチル－１－オキソブタン－２－イル）アミノ）－２－オキソエトキシ）メチル）－１１－メチル－３，６，９，１３，１６，１９－ヘキサオキサヘニコサン－１，２１－ジイル）ビス（２－（（Ｓ）－４－（４－クロロフェニル）－２，３，９－トリメチル－６Ｈ－チエノ［３，２－ｆ］［１，２，４］トリアゾロ［４，３－ａ］［１，４］ジアゼピン－６－イル）アセトアミド）（ＳＩＭ１）

【0295】

【化39】

【0296】

ＭｅＯＨ（０．６０ｍＬ）中の（２Ｓ，４Ｒ）－１－（（Ｓ）－１－アジド－１１－（（２－（２－（２－アジドエトキシ）エトキシ）エトキシ）メチル）－１７－（ｔｅｒｔ－ブチル）－１１－メチル－１５－オキソ－３，６，９，１３－テトラオキサ－１６－アザオクタデカン－１８－オイル）－４－ヒドロキシ－Ｎ－（４－（４－メチルチアゾール－５－イル）ベンジル）ピロリジン－２－カルボキサミド（２０）（１０ｍｇ、０．０１１ミリモル）の混合物に、１０重量％パラジウム／炭素（２．０ｍｇ）を加えた。得られた反応混合物を水素雰囲気下、室温で２時間撹拌した。次いで、混合物をセライトパッドで濾過し、蒸発させた。ＤＭＦ（０．２０ｍＬ）中の（＋）－ＪＱ１カルボン酸（１２．５ｍｇ、０．０３１ミリモル）、ＣＯＭＵ（１３．４ｍｇ、０．０３１ミリモル）、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（１３．６μＬ、０．０７８ミリモル）の事前攪拌混合物を、濃縮粗製物に添加した。次いで、その混合物を室温で３時間撹拌し、酸性条件下でＨＰＬＣ（０．１％ＨＣＯ_２Ｈ水溶液中５％～９５％ＣＨ_３ＣＮ勾配）により精製して、表題化合物を得た。収量：１０ｍｇ（５４％）。

【0297】

^１Ｈ－ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）δ（ｐｐｍ）＝８．６７（１Ｈ，ｓ），７．４７－７．２８（１４Ｈ，ｍ），７．１７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．７Ｈｚ），４．８６（１Ｈ，ｍ），４．８３（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝７．９Ｈｚ），４．７０－４．６１（３Ｈ，ｍ），４．５３（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝５．７，１５．２Ｈｚ），４．４８－４．４２（１Ｈ，ｍ），４．３４（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝６．０，１４．９Ｈｚ），４．１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１１．１Ｈｚ），４．０６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１５．３Ｈｚ），３．９６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１５．３Ｈｚ），３．７０－３．２４（３１Ｈ，ｍ），３．２１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．９Ｈｚ），２．６３（６Ｈ，ｓ），２．５０（３Ｈ，ｓ），２．４４（１Ｈ，ｍ），２．３９（６Ｈ，ｓ），２．１５（１Ｈ，ｍ），１．９４－１．８４（４Ｈ，ｍ），１．６５（６Ｈ，ｓ），０．９７（９Ｈ，ｓ），０．９３（３Ｈ，ｓ）。

【0298】

^１３Ｃ－ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）δ（ｐｐｍ）＝１７１．５，１７１．２，１７０．８，１７０．７，１６４．０，１５５．９，１５０．４，１４９．９，１４８．６，１３８．５，１３６．９，１３２．３，１３１．１，１３０．９，１３０．７，１３０．１，１２９．６，１２８．８，１２８．２，７３．７，７３．６，７３．５，７１．２，７０．８，７０．７，７０．６，７０．４，７０．３，７０．１，５９．０，５７．３，５６．７，５４．５，４３．３，４１．１，３９．６，３８．８，３６．５，３５．６，２６．６，１７．７，１６．２，１４．５。
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）：Ｃ_７９Ｈ_９９Ｃ_ｌ２Ｎ_１４Ｏ_１３Ｓ_３［Ｍ＋Ｈ^＋］についての計算値１６１７．６０５０、実測値１６１７．６３９０。

【0299】

Ｎ，Ｎ′－（１１－（（２－（２－（（（Ｓ）－１－（（２Ｓ，４Ｒ）－４－ヒドロキシ－２－（（４－（４－メチルチアゾール－５－イル））ベンジル）カルバモイル）ピロリジン－１－イル）－３，３－ジメチル－１－オキソブタン－２－イル）アミノ）－２－オキソエトキシ）エトキシ）メチル）－１１－メチル－３，６，９，１３，１６，１９－ヘキサオキサヘニコサン－１，２１－ジイル）ビス（２－（（Ｓ）－４－（４－クロロフェニル）－２，３，９－トリメチル－６Ｈ－チエノ［３，２－ｆ］［１，２，４］トリアゾロ［４，３－ａ］［１，４］ジアゼピン－６－イル）アセトアミド）（ＳＩＭ２）

【0300】

【化40】

【0301】

ＭｅＯＨ（０．８０ｍＬ）中の（２Ｓ，４Ｒ）－１－（（Ｓ）－２１－アジド－１１－（（２－（２－（２－アジドエトキシ）エトキシ）エトキシ）メチル）－２－（ｔｅｒｔ－ブチル））－１１－メチル－４－オキソ－６，９，１３，１６，１９－ペンタオキサ－３－アザヘニコサノイル）－４－ヒドロキシ－Ｎ－（４－（４－メチルチアゾール－５－イル）ベンジル）ピロリジン－２－カルボキサミド（２１）（１３ｍｇ、０．０１４ミリモル）の溶液に、１０重量％パラジウム／炭素（２．５ｍｇ）を加えた。得られた反応混合物を水素雰囲気下、室温で２時間撹拌した。次いで、混合物をセライトパッドで濾過し、蒸発させた。ＤＭＦ（０．２０ｍＬ）中の（＋）－ＪＱ１カルボン酸（２２．２ｍｇ、０．０５５ミリモル）、ＣＯＭＵ（２３．７ｍｇ、０．０５５ミリモル）、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（１６μＬ、０．０９２ミリモル）の溶液の事前撹拌混合物を、濃縮粗製物に添加した。次いで、混合物を室温で１６時間撹拌し、酸性条件下でＨＰＬＣ（０．１％ＨＣＯ_２Ｈ水溶液中の５～９５％ＣＨ_３ＣＮ）により精製して、表題化合物を得た。収量：１２ｍｇ（５３％）。

【0302】

^１Ｈ－ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）δ（ｐｐｍ）＝８．６７（１Ｈ，ｓ），７．５７（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝４．９Ｈｚ），７．４２－７．２８（１２Ｈ，ｍ），７．２５－７．１５（２Ｈ，ｍ），４．８１（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．７Ｈｚ），４．６９－４．６０（３Ｈ，ｍ），４．５４－４．４７（２Ｈ，ｍ），４．４６－４．４２（１Ｈ，ｍ），４．３６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝５．８，１５．３Ｈｚ），４．０７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１５．４Ｈｚ），４．０５（１Ｈ，ｂｒｄ，Ｊ＝１１．１Ｈｚ），３．９８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１５．４Ｈｚ），３．７３－３．２３（３６Ｈ，ｍ），２．６３（３Ｈ，ｓ），２．６２（３Ｈ，ｓ），２．５０（３Ｈ，ｓ），２．４７－２．４０（１Ｈ，ｍ），２．３９（６Ｈ，ｓ），２．２３－２．１６（１Ｈ，ｍ），２．０１－１．９１（４Ｈ，ｍ），１．６６（６Ｈ，ｓ），０．９７（９Ｈ，ｓ），０．９２（３Ｈ，ｓ）。

【0303】

^１３Ｃ－ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）δ（ｐｐｍ）＝１７１．４，１７１．２，１７０．７，１７０．２，１６３．９，１５５．９，１５０．３，１４９．９，１４８．６，１３８．５，１３６．９，１３６．８，１３２．３，１３１．８，１３１．１，１３０．９，１３０．７，１３０．０，１２９．６，１２８．８，１２８．２，７４．０，７３．８，７１．２，７１．１，７１．０，７０．７，７０．６，７０．１，５９．０，５７．２，５６．８，５４．５，４３．３，４１．２，３９．６，３９．０，３６．５，３５．８，２６．６，１７．６，１６．２，１４．５，１３．２，１１．９。
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）：Ｃ_８１Ｈ_１０３Ｃｌ_２Ｎ_１４Ｏ_１４Ｓ_３［Ｍ＋Ｈ^＋］についての計算値１６６１．６３１２、実測値１６６１．８２００。

【0304】

Ｎ，Ｎ′－（１４－（（２－（（（Ｓ）－１－（（２Ｓ，４Ｒ）－４－ヒドロキシ－２－（（４－（４－メチルチアゾール－５－イル）ベンジル）カルバモイル）ピロリジン－１－イル）－３，３－ジメチル－１－オキソブタン－２－イル）アミノ）－２－オキソエトキシ）メチル）－１４－メチル－３，６，９，１２，１６，１９，２２，２５－オクタオキサヘプタコサン－１，２７－ジイル）ビス（２－（（Ｓ）－４－（４－クロロフェニル）－２，３，９－トリメチル－６Ｈ－チエノ［３，２－ｆ］［１，２，４］トリアゾロ［４，３－ａ］［１，４］ジアゼピン－６－イル）アセトアミド）（ＳＩＭ３）

【0305】

【化41】

【0306】

ＭｅＯＨ（０．２０ｍＬ）中の（２Ｓ，４Ｒ）－１－（（Ｓ）－１－アジド－１４－（１３－アジド－２，５，８，１１－テトラオキサトリデシル）－２０－（ｔｅｒｔ－ブチル）－１４－メチル－１８－オキソ－３，６，９，１２，１６－ペンタオキサ－１９－アザヘニコサン－２１－オイル）－４－ヒドロキシ－Ｎ－（４－（４－メチルチアゾール－５－イル）ベンジル）ピロリジン－２－カルボキサミド（２２）（１０ｍｇ、０．０２０ミリモル）の溶液に、１０重量％のパラジウム炭素（１０．４ｍｇ）を加えた。得られた反応混合物を水素雰囲気下、室温で２時間撹拌した。次いで、混合物をセライトパッド上で濾過し、蒸発させた。次いでその濃縮組成物に、ＤＭＦ（０．１２ｍＬ）中の（＋）－ＪＱ１カルボン酸（１４．８ｍｇ、０．０３７ミリモル）、ＨＡＴＵ（１４ｍｇ、０．０３７ミリモル）、ＨＯＡｔ（５．０ｍｇ、０．０３７ミリモル）、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（１２．８μＬ、０．０７４ミリモル）の事前撹拌混合物を加えた。次いで、混合物を室温で１６時間撹拌し、酸性条件下でＨＰＬＣ（０．１％ＨＣＯ_２Ｈ水溶液中の５％～９５％ＣＨ_３ＣＮ勾配）により精製して、表題化合物を得た。収量：１３ｍｇ（４３％）。

【0307】

^１Ｈ－ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤ_３ＯＤ）δ（ｐｐｍ）＝８．８６（１Ｈ，ｓ），７．５２－７．３６（１２Ｈ，ｍ），４．７１－４．４０（６Ｈ，ｍ），４．３９－４．２９（１Ｈ，ｍ），３．９７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１４．４Ｈｚ），３．９３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１５．６Ｈｚ），３．８５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１０．８Ｈｚ），３．７９（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝３．９，１１．１Ｈｚ），３．６８－３．３３（４１Ｈ，ｍ），３．２８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝５．１Ｈｚ），２．６８（６Ｈ，ｓ），２．４６（３Ｈ，ｓ），２．４４（６Ｈ，ｓ），２．２６－２．１８（１Ｈ，ｍ），２．１２－２．０５（１Ｈ，ｍ），１．６９（６Ｈ，ｓ），１．０３（９Ｈ，ｓ），０．９７（３Ｈ，ｓ）。

【0308】

^１３Ｃ－ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，ＣＤ_３ＯＤ）δ（ｐｐｍ）＝１７４．４，１７２．９，１７１．８，１７１．６，１６６．１，１５７．１，１５２．８，１４９．１，１４０．３，１３８．２，１３７．９，１３３．５，１３３．２，１３２．０，１３１．５，１３１．４，１３０．５，１３０．４，１２９．８，１２９．０，７５．５，７４．８，７２．２，７１．７，７１．６，７１．５，７１．４，７１．１，７０．７，６０．９，５８．１，５８．０，５５．２，４３．７，４２．１，４０．６，３８．９，３８．８，３７．３，２７．０，１８．０，１５．９，１４．４，１２．９，１１．６。
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）：Ｃ_８３Ｈ_１０７Ｃｌ_２Ｎ_１４Ｏ_１５Ｓ_３［Ｍ＋Ｈ^＋］についての計算値１７０５．６５７４、実測値１７０５．６４３０。

【0309】

化合物ＳＩＭ４、ＳＩＭ５の合成

【化42】

【0310】

１－アジド－１１－（（２－（２－（２－アジドエトキシ）エトキシ）エトキシ）メチル）－Ｎ－（２－（（２－（２，６－ジオキソピペリジン－３－イル）－１，３－ジオキソイソインドリン－４－イル）アミノ）エチル）－１１－メチル－３，６，９，１３－テトラオキサペンタデカン－１５－アミド（２３）

【0311】

【化43】

【0312】

ＤＭＦ（０．２ｍＬ）中の１－アジド－１１－（（２－（２－（２－アジドエトキシ）エトキシ）エトキシ）メチル）－１１－メチル－３，６，９，１３－テトラオキサペンタデカン－１５－酸（１７）（１４ｍｇ、０．０２８４ミリモル）の溶液に、ＣＯＭＵ（１３．４ｍｇ、０．０３１ミリモル）、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（１４．８μＬ、０．０８５ミリモル）を加えた。得られた反応混合物を室温で２分間撹拌した。その混合物に４－［（２－アミノエチル）アミノ］－２－（２，６－ジオキソ－３－ピペリジニル）－１Ｈ－イソインドール－１，３（２Ｈ）－ジオン（ｒｅｆ．５４）（１０．８ｍｇ、０．０３４ミリモル）を加えた。次いで、混合物を室温で１時間撹拌し、酸性条件下でＨＰＬＣ（０．１％ＨＣＯ_２Ｈ水溶液中５％～９５％ＣＨ_３ＣＮ勾配）により精製して、表題化合物を得た。収量：１２．５ｍｇ（５６％）。

【0313】

^１Ｈ－ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）δ（ｐｐｍ）＝８．２７（１Ｈ，ｓ），７．５４（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），７．１４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．１Ｈｚ），７．０７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ），６．５０（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．７Ｈｚ），４．９４（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝５．３，１２．３Ｈｚ），４．００－３．９５（２Ｈ，ｍ），３．７３－３．４９（２４Ｈ，ｍ），３．４５－３．３２（１０Ｈ，ｍ），２．９４－２．７０（３Ｈ，ｍ），２．２１－２．１１（１Ｈ，ｍ），０．９２（３Ｈ，ｓ）。

【0314】

^１３Ｃ－ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）δ（ｐｐｍ）＝１７１．４，１７１．１，１６９．５，１６８．４，１６７．７，１４７．０，１３６．４，１３２．７，１１７．０，１１２．０，１１０．５，７５．０，７４．４，７１．２，７０．８，７０．７，７０．５，７０．１，５０．９，４９．１，４２．３，４０．９，３８．７，３１．６，２２．９。
ＭＳ（ＥＳＩ）：Ｃ_３４Ｈ_５１Ｎ_１０Ｏ_１２［Ｍ＋Ｈ^＋］計算値７９１．４、実測値７９１．３。

【0315】

１－アジド－１１－（（２－（２－（２－アジドエトキシ）エトキシ）エトキシ）メチル）－Ｎ－（２－（（２－（２，６－ジオキソピペリジン－３－イル）－１，３－ジオキソイソインドリン－４－イル）アミノ）エチル）－１１－メチル－３，６，９，１３，１６－ペンタオキサオクタデカン－１８－アミド（２４）

【0316】

【化44】

【0317】

ＤＭＦ（０．４２ｍＬ）中の１－アジド－１１－（（２－（２－（２－アジドエトキシ）エトキシ）エトキシ）メチル）－１１－メチル－３，６，９，１３，１６－ペンタオキサオクタデカン－１８－酸（１８）（１４ｍｇ、０．０２６ミリモル）の混合物に、ＣＯＭＵ（１２ｍｇ、０．０２９ミリモル）、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（１４μＬ、０．０７８ミリモル）を加えた。得られた反応混合物を室温で２分間撹拌した。その混合物に４－［（２－アミノエチル）アミノ］－２－（２，６－ジオキソ－３－ピペリジニル）－１Ｈ－イソインドール－１，３（２Ｈ）－ジオン（ｒｅｆ．５４）（２２．１ｍｇ、０．０３２ミリモル）を加えた。次いで、混合物を室温で１時間撹拌し、酸性条件下でＨＰＬＣ（０．１％ＨＣＯ_２Ｈ水溶液中５％～９５％ＣＨ_３ＣＮ勾配）により精製して、表題化合物を得た。収量：１２ｍｇ（５５％）。

【0318】

^１Ｈ－ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）δ（ｐｐｍ）＝８．３６（１Ｈ，ｓ），７．５３（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），７．２２（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），７．１４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），７．０５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ），６．４９（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．７Ｈｚ），４．９４（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝５．２，１２．２Ｈｚ），４．０７－４．０１（２Ｈ，ｍ），３．７２－３．４７（２８Ｈ，ｍ），３．４４－３．２９（１０Ｈ，ｍ），２．９５－２．６９（３Ｈ，ｍ），２．１８－２．１０（１Ｈ，ｍ），０．９５（３Ｈ，ｓ）。

【0319】

^１３Ｃ－ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）δ（ｐｐｍ）＝１７１．２，１６９．４，１６８．４，１６７．７，１４６．９，１３６．４，１３２．７，１１６．９，１１２．１，１１０．６，７４．２，７４．１，７１．２，７１．１，７０．９，７０．８，７０．７，７０．６，７０．１，５０．９，４９．１，４２．３，４１．２，３８．６，３１．６，２２．９，１７．６。
ＭＳ（ＥＳＩ）：Ｃ_３６Ｈ_５５Ｎ_１０Ｏ_１３［Ｍ＋Ｈ^＋］計算値８３５．４、実測値８３５．３。

【0320】

Ｎ，Ｎ′－（１１－（（２－（（２－（（２－（２，６－ジオキソピペリジン－３－イル）－１，３－ジオキソイソインドリン－４－イル）アミノ）エチル）アミノ）－２－オキソエトキシ）メチル）－１１－メチル－３，６，９，１３，１６，１９－ヘキサオキサヘニコサン－１，２１－ジイル）ビス（２－（（Ｓ）－４－（４－クロロフェニル）－２，３，９－トリメチル－６Ｈ－チエノ［３，２－ｆ］［１，２，４］トリアゾロ［４，３－ａ］［１，４］ジアゼピン－６－イル）アセトアミド）（ＳＩＭ４）

【0321】

【化45】

【0322】

ＭｅＯＨ（０．８ｍＬ）中の１－アジド－１１－（（２－（２－（２－アジドエトキシ）エトキシ）エトキシ）メチル）－Ｎ－（２－（（２－（２，６－ジオキソピペリジン－３－イル）－１，３－ジオキソイソインドリン－４－イル）アミノ）エチル）－１１－メチル－３，６，９，１３－テトラオキサペンタデカン－１５－アミド（２３）（１２．５ｍｇ、０．０１５８ミリモル）に、１０重量％パラジウム／炭素（２．５ｍｇ）を加えた。得られた反応混合物を水素雰囲気下、室温で２時間撹拌した。次いで、その混合物をセライトパッド上で濾過し、溶媒を蒸発させた。その濃縮組成物に、ＤＭＦ（０．２０ｍＬ）中の（＋）－ＪＱ１カルボン酸（１２．５ｍｇ、０．０３１ミリモル）、ＣＯＭＵ（１３．４ｍｇ、０．０３１ミリモル）、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（１３．６μＬ、０．０７８ミリモル）の事前撹拌混合物を加えた。次いで、その混合物を室温で４時間撹拌し、酸性条件下でＨＰＬＣ（０．１％ＨＣＯ_２Ｈ水溶液中５％～９５％ＣＨ_３ＣＮ勾配）で精製して、表題化合物を得た。収量：１．３ｍｇ（５％）。

【0323】

^１Ｈ－ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤ_３ＯＤ）δ（ｐｐｍ）＝８．５３（１Ｈ，ｓ），７．５１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝７．３，８．５Ｈｚ），７．４４（４Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ），７．３９（４Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２．２，８．８Ｈｚ），７．０８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ），７．０２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ），４．９９（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝２．０，５．５，１２．６Ｈｚ），４．６５－４．５９（２Ｈ，ｍ），３．９２－３．８６（２Ｈ，ｍ），３．６９－３．３８（３２Ｈ，ｍ），３．３１－３．２５（６Ｈ，ｍ），２．８９－２．７８（１Ｈ，ｍ），２．７５－２．６２（８Ｈ，ｍ），２．４３（６Ｈ，ｓ），２．１２－２．０３（１Ｈ，ｍ），１．６８（６Ｈ，ｓ），０．８７（３Ｈ，ｓ）。

【0324】

^１３Ｃ－ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，ＣＤ_３ＯＤ）δ（ｐｐｍ）＝１７４．７，１７３．５，１７２．９，１７１．４，１７０．３，１６９．２，１６６．１，１５７．０，１５２．２，１４８．１，１３８．１，１３７．９，１３７．３，１３３．５，１３３．２，１３２．０，１３１．４，１３０．４，１２９．８，１２９．５，１１８．０，１１２．１，１１１．３，７５．４，７４．７，７２．１，７１．６，７１．４，７０．７，５５．２，４２．６，４１．８，４０．６，３９．６，３８．７，３２．２，３０．８，２３．８，１８．０，１４．５。
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）：Ｃ_７２Ｈ_８５Ｃ_ｌ２Ｎ_１４Ｏ_１４Ｓ_２［Ｍ＋２Ｈ^＋］／２計算値７５２．２６３３、実測値７５２．２７３２。

【0325】

Ｎ，Ｎ′－（１１－（（２－（２－（（２－（（２－（２，６－ジオキソピペリジン－３－イル）－１，３－ジオキソイソインドリン－４－イル）アミノ）エチル）アミノ）－２－オキソエトキシ）エトキシ）メチル）－１１－メチル－３，６，９，１３，１６，１９－ヘキサオキサヘニコサン－１，２１－ジイル）ビス（２－（（Ｓ）－４－（４－クロロフェニル））－２，３，９－トリメチル－６Ｈ－チエノ［３，２－ｆ］［１，２，４］トリアゾロ［４，３－ａ］［１，４］ジアゼピン－６－イル）アセトアミド）（ＳＩＭ５）

【0326】

【化46】

【0327】

ＭｅＯＨ（０．８０ｍＬ）中の１－アジド－１１－（（２－（２－（２－アジドエトキシ）エトキシ）エトキシ）メチル）－Ｎ－（２－（（２－（２，６－ジオキソピペリジン－３－イル）－１，３－ジオキソイソインドリン－４－イル）アミノ）エチル）－１１－メチル－３，６，９，１３，１６－ペンタオキサオクタデカン－１８－アミド（２４）（１２ｍｇ、０．０１４４ミリモル）の混合物に、１０重量％のパラジウム／炭素（２．５ｍｇ）を添加した。得られた反応混合物を水素雰囲気下、室温で２時間撹拌した。次いで、その混合物をセライトパッド上で濾過し、溶媒を蒸発させた。その濃縮粗製物に、ＤＭＦ（０．２０ｍＬ）中の（＋）－ＪＱ１カルボン酸（１３．８ｍｇ、０．０３５ミリモル）、ＣＯＭＵ（１４．８ｍｇ、０．０３５ミリモル）、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（１５μＬ、０．０８６ミリモル）の事前攪拌混合物を添加した。次いで、混合物を室温で１６時間撹拌し、酸性条件下でＨＰＬＣ（０．１％ＨＣＯ_２Ｈ水溶液中の５％～９５％ＣＨ_３ＣＮ勾配）により精製して、表題化合物を得た。収量：１．８ｍｇ（８％）。

【0328】

^１Ｈ－ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤ_３ＯＤ）δ（ｐｐｍ）＝７．５２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝７．４，８．２Ｈｚ），７．４４（４Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ），７．３９（４Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１．４，８．７Ｈｚ），７．１０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ），７．０２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．１Ｈｚ），５．００（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝５．３，１３．０Ｈｚ），４．６２（２Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝５．２，８．９Ｈｚ），３．９９－３．９４（２Ｈ，ｍ），３．６７－３．３８（３６Ｈ，ｍ），３．３６－３．２３（７Ｈ，ｍ），２．８８－２．７８（１Ｈ，ｍ），２．７６－２．６１（２Ｈ，ｍ），２．６８（６Ｈ，ｓ），２．４３（６Ｈ，ｓ），２．１２－２．０４（１Ｈ，ｍ），１．６９（６Ｈ，ｓ），０．８８（３Ｈ，ｓ）。

【0329】

^１３Ｃ－ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，ＣＤ_３ＯＤ）δ（ｐｐｍ）＝１７４．６，１７３．５，１７２．９，１７１．４，１７０．５，１６９．２，１６６．１，１５７．０，１５２．２，１４８．０，１３８．１，１３７．９，１３７．３，１３３．５，１３３．２，１３２．０，１３１．４，１２９．８，１１８．１，１１２．１，１１１．４，７４．８，７２．１，７１．９，７１．７，７１．６，７１．４，７１．３，７０．７，５５．２，４２．６，４２．０，４０．６，３９．４，３８．７，３２．２，３０．８，２３．７，１８．０，１４．５，１２．９，１１．６。
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）：Ｃ_７４Ｈ_８９Ｃｌ_２Ｎ_１４Ｏ_１５Ｓ_２［Ｍ＋Ｈ^＋］計算値１５４７．５４４５、実測値１５４７．５９８９。

【0330】

化合物ＳＩＭ６、ｃｉｓ－ＳＩＭ１の合成

【0331】

【化47】

【0332】

Ｎ，Ｎ′－（１１－（（アリルオキシ）メチル）－１１－メチル－３，６，９，１３，１６，１９－ヘキサオキサヘニコサン－１，２１－ジイル）ビス（２－（（Ｓ）－４－（４－クロロフェニル）－２，３，９－トリメチル－６Ｈ－チエノ［３，２－ｆ］［１，２，４］トリアゾロ［４，３－ａ］［１，４］ジアゼピン－６－イル）アセトアミド）（２５）

【0333】

【化48】

【0334】

１１－（（アリルオキシ）メチル）－１，２１－ジアジド－１１－メチル－３，６，９，１３，１６，１９－ヘキサオキサヘニコサン（５）（２５ｍｇ、０．０５３ミリモル）のＴＨＦ（０．５３ｍＬ）混合物に、ＰＰｈ_３（４１．７ｍｇ、０．１６６ミリモル）を添加した。得られた混合物を５０℃で１時間撹拌した。Ｈ_２Ｏ（０．０５ｍＬ）を反応混合物に加えた。次に、混合物を５０℃で１時間撹拌し、濃縮した。ＤＭＦ（０．４２ｍＬ）中の（＋）－ＪＱ１カルボン酸（６４ｍｇ、０．１６ミリモル）、ＣＯＭＵ（２０．５ｍｇ、０．１６ミリモル）、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（５５．４μＬ、０．３２ミリモル）のＤＭＦ（０．４２ｍＬ）の事前攪拌混合物を、濃縮粗製物に添加した。次いで、得られた混合物を室温で１時間撹拌し、酸性条件下でＨＰＬＣ（０．１％ＨＣＯ_２Ｈ水溶液中５％～９５％ＣＨ_３ＣＮ勾配）により精製して、表題化合物を得た。収量：１７ｍｇ（２７％）。

【0335】

^１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）δ（ｐｐｍ）＝７．４０（４Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ），７．３１（４Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ），６．９８－６．８９（２Ｈ，ｍ），５．９３－５．８０（１Ｈ，ｍ），５．２３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１７．２Ｈｚ），５．１２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１１．０Ｈｚ），４．６５（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），３．９３（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝５．２Ｈｚ），３．７２－３．２４（３２Ｈ，ｍ），２．６６（６Ｈ，ｓ），２．３９（６Ｈ，ｓ），１．６６（６Ｈ，ｓ），０．９４（３Ｈ，ｓ）。

【0336】

^１３Ｃ－ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）δ（ｐｐｍ）＝１７０．７，１６４．０，１５５．８，１５０．０，１３６．９，１３６．８，１３５．４，１３２．３，１３１．０，１３０．９，１３０．６，１３０．０，１１６．３，７４．１，７３．１，７２．４，７１．２，７０．７，７０．６，７０．５，７０．０，５４．５，４１．１，３９．６，３９．２，１７．６，１４．５，１３．２，１１．９。
ＭＳ（ＥＳＩ）：Ｃ_５８Ｈ_７３Ｃｌ_２Ｎ_１０Ｏ_９Ｓ_２［Ｍ＋Ｈ^＋］計算値１１８７．４、実測値１１８７．４。

【0337】

Ｎ，Ｎ′－（１４－（（アリルオキシ）メチル）－１４－メチル－３，６，９，１２，１６，１９，２２，２５－オクタオキサヘプタコサン－１，２７－ジイル）ビス（２－（（Ｓ）－４－（４－クロロフェニル）－２，３，９－トリメチル－６Ｈ－チエノ［３，２－ｆ］［１，２，４］トリアゾロ［４，３－ａ］［１，４］ジアゼピン－６－イル）アセトアミド）（２６）

【0338】

【化49】

【0339】

ＴＨＦ（１．２ｍＬ）中の１４－（（アリルオキシ）メチル）－１，２７－ジアジド－１４－メチル－３，６，９，１２，１６，１９，２２，２５－オクタオキサヘプタコサン（６）（６７ｍｇ、０．１１９ミリモル）の混合物に、ＰＰｈ_３（９３．５ｍｇ、０．３６ミリモル）を加えた。得られた混合物を５０℃で１時間撹拌した。Ｈ_２Ｏ（０．１２ｍＬ）を反応混合物に加えた。次に、その混合物を５０℃で１時間撹拌し、濃縮した。その濃縮粗製物質にＤＭＦ（０．９５ｍＬ）中の（＋）－ＪＱ１カルボン酸（１４３ｍｇ、０．３６ミリモル）、ＣＯＭＵ（１５３ｍｇ、０．３６ミリモル）、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（１２４μＬ、０．７２ミリモル）の事前撹拌混合物を加えた。次いで、得られた混合物を室温で１時間撹拌し、酸性条件下でＨＰＬＣ（０．１％ＨＣＯ_２Ｈ水溶液中５％～９５％ＣＨ_３ＣＮ勾配）により精製して、表題化合物を得た。収量：８７ｍｇ（５７％）。

【0340】

^１Ｈ－ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）δ（ｐｐｍ）＝７．３８（４Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ），７．２８（４Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），７．０９－６．９３（２Ｈ，ｍ），５．８９－５．７６（１Ｈ，ｍ），５．２０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１８．０Ｈｚ），５．０８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１０．２Ｈｚ），４．６２（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ），３．８９（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．８Ｈｚ），３．８２－３．１８（４０Ｈ，ｍ），２．６２（６Ｈ，ｓ），２．３６（６Ｈ，ｓ），１．６４（６Ｈ，ｓ），０．９０（３Ｈ，ｓ）。

【0341】

^１３Ｃ－ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）δ（ｐｐｍ）＝１７０．５，１６３．７，１５５．６，１４９．７，１３６．６，１３５．２，１３２．０，１３０．８，１３０．４，１２９．８，１２８．６，１１６．０，７３．９，７２．９，７２．１，７１．０，７０．６，７０．５，７０．３，６９．７，５４．３，４０．９，３９．４，３８．９，１７．４，１４．３，１３．０，１１．７。
ＭＳ（ＥＳＩ）：Ｃ_６２Ｈ_８１Ｃｌ_２Ｎ_１０Ｏ_１１Ｓ_２［Ｍ＋Ｈ^＋］計算値１２７５．５、実測値１２７５．５。

【0342】

Ｎ，Ｎ′－（１１－メチル－１１－（（２－オキソエトキシ）メチル）－３，６，９，１３，１６，１９－ヘキサオキサヘニコサン－１，２１－ジイル）ビス（２－（（Ｓ）－４－（４－クロロフェニル）－２，３，９－トリメチル－６Ｈ－チエノ［３，２－ｆ］［１，２，４］トリアゾロ［４，３－ａ］［１，４］ジアゼピン－６－イル）アセトアミド）（２７）

【0343】

【化50】

【0344】

Ｈ_２Ｏ（０．０９ｍＬ）および１，４－ジオキサン（０．２６ｍＬ）中のＮ，Ｎ′－（１１－（（アリルオキシ）メチル）－１１－メチル－３，６，９，１３，１６，１９－ヘキサオキサヘニコサン－１，２１－ジイル）ビス（２－（（Ｓ）－４－（４－クロロフェニル）－２，３，９－トリメチル－６Ｈ－チエノ［３，２－ｆ］［１，２，４］トリアゾロ［４，３－ａ］［１，４］ジアゼピン－６－イル）アセトアミド）（２５）（１７ｍｇ、０．０１４ミリモル）の混合物に、２，６－ルチジン（３．３μＬ、０．０２９ミリモル）、四酸化オスミウム４％水溶液（１．８μＬ、０．０００３ミリモル）、過ヨウ素酸ナトリウム（１２．２ｍｇ、０．０５８ミリモル）を加えた。得られた反応混合物を室温で８時間撹拌した。反応混合物をＮａ_２ＳＯ_３（水溶液）でクエンチし、ジクロロメタンで抽出した。有機層を濃縮し、残った残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィーで精製して、表題化合物を得た。収量：１４ｍｇ（８２％）。

【0345】

^１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）δ（ｐｐｍ）＝９．６９（１Ｈ，ｓ），７．４０（４Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ），７．３１（４Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），７．００－６．９０（２Ｈ，ｍ），４．６６（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．７Ｈｚ），４．０４－３．９８（２Ｈ，ｍ），３．７４－３．２７（３２Ｈ，ｍ），２．６５（６Ｈ，ｓ），２．３９（６Ｈ，ｓ），１．６６（６Ｈ，ｓ），０．９７（３Ｈ，ｓ）。

【0346】

^１３Ｃ－ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）δ（ｐｐｍ）＝２０２．４，１７０．７，１６３．９，１５５．８，１５０．０，１３６．８，１３２．３，１３１．０，１３０．８，１３０．６，１３０．０，１２８．８，７４．７，７３．９，７１．２，７０．７，７０．６，７０．０，５４．５，４１．２，３９．５，３９．２，２９．８，１７．５，１４．５，１３．２，１２．０。
ＭＳ（ＥＳＩ）：Ｃ_５７Ｈ_７１Ｃｌ_２Ｎ_１０Ｏ_１０Ｓ_２［Ｍ＋Ｈ^＋］計算値１１８９．４、実測値１１８９．４。

【0347】

Ｎ，Ｎ′－（１４－メチル－１４－（（２－オキソエトキシ）メチル）－３，６，９，１２，１６，１９，２２，２５－オクタオキサヘプタコサン－１，２７－ジイル）ビス（２－（（Ｓ）－４－（４－クロロフェニル）－２，３，９－トリメチル－６Ｈ－チエノ［３，２－ｆ］［１，２，４］トリアゾロ［４，３－ａ］［１，４］ジアゼピン－６－イル）アセトアミド）（２８）

【0348】

【化51】

【0349】

Ｈ_２Ｏ（０．４１ｍＬ）と１，４－ジオキサン（１．２ｍＬ）中のＮ，Ｎ′－（１４－（（アリルオキシ）メチル）－１４－メチル－３，６，９，１２，１６，１９，２２，２５－オクタオキサヘプタコサン－１，２７－ジイル）ビス（２－（（Ｓ）－４－（４－クロロフェニル）－２，３，９－トリメチル－６Ｈ－チエノ［３，２－ｆ］［１，２，４］トリアゾロ［４，３－ａ］［１，４］ジアゼピン－６－イル）アセトアミド）（２６）（８７ｍｇ、０．０６８ミリモル）の混合物に、２，６－ルチジン（１５．９μＬ、０．１３６ミリモル）、四酸化オスミウム４％水溶液（１．８μＬ、０．００１４ミリモル）、過ヨウ素酸ナトリウム（５８ｍｇ、０．２７ミリモル）を加えた。得られた反応混合物を室温で８時間撹拌した。反応混合物をＮａ_２ＳＯ_３（水性）でクエンチし、ジクロロメタンで抽出した。有機層を濃縮し、残った残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィーで精製して、表題化合物を得た。収量：７４ｍｇ（８５％）。

【0350】

^１Ｈ－ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）δ（ｐｐｍ）＝９．７０（１Ｈ，ｓ），７．４１（４Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ），７．３２（４Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ），６．９３－６．８５（２Ｈ，ｍ），４．６５（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．９Ｈｚ），４．０７－４．０１（２Ｈ，ｍ），３．７３－３．４５（３６Ｈ，ｍ），３．４４－３．２９（６Ｈ，ｍ），２．６６（６Ｈ，ｓ），２．３９（６Ｈ，ｓ），１．６７（６Ｈ，ｓ），０．９４（３Ｈ，ｓ）。

【0351】

^１３Ｃ－ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）δ（ｐｐｍ）＝２０２．０，１７０．６，１６３．７，１５５．７，１４９．８，１３６．７，１３６．７，１３２．２，１３０．９，１３０．７，１３０．４，１２９．９，１２８．６，７６．９，７４．６，７３．８，７１．０，７０．６，７０．５，７０．４，７０．３，６９．８，５４．４，４１．０，３９．４，３９．０，１７．４，１４．３，１３．０，１１．８。
ＭＳ（ＥＳＩ）：Ｃ_６１Ｈ_７９Ｃｌ_２Ｎ_１０Ｏ_１２Ｓ_２［Ｍ＋Ｈ^＋］計算値１２７７．５、実測値１２７７．５。

【0352】

１－（（Ｓ）－４－（４－クロロフェニル）－２，３，９－トリメチル－６Ｈ－チエノ［３，２－ｆ］［１，２，４］トリアゾロ［４，３－ａ］［１，４］ジアゼピン－６－イル）－１４－（１３－（（Ｓ）－４－（４－クロロフェニル）－２，３，９－トリメチル－６Ｈ－チエノ［３，２－ｆ］［１，２，４］トリアゾロ［４，３－ａ］［１，４］ジアゼピン－６－イル）－１２－オキソ－２，５，８－トリオキサ－１１－アザトリデシル）－１４－メチル－２－オキソ－６，９，１２，１６－テトラオキサ－３－アザオクタデカン－１８－酸（２９）

【0353】

【化52】

【0354】

ｔ－ＢｕＯＨ（０．２１ｍＬ）中のＮ，Ｎ′－（１１－メチル－１１－（（２－オキソエトキシ）メチル）－３，６，９，１３，１６，１９－ヘキサオキサヘニコサン－１，２１－ジイル）ビス（２－（（Ｓ）－４－（４－クロロフェニル）－２，３，９－トリメチル－６Ｈ－チエノ［３，２－ｆ］［１，２，４］トリアゾロ［４，３－ａ］［１，４］ジアゼピン－６－イル）アセトアミド）（２７）（１４ｍｇ、０．０１２ミリモル）の溶液に、ＴＨＦ中２Ｍの２－メチル－２－ブテン溶液（５９μＬ、０．１２ミリモル）、ＮａＨ_２ＰＯ_４（１．４ｍｇ、０．０１２ミリモル）、Ｈ_２Ｏ（０．０７ｍＬ）中の塩化ナトリウム（４．６ｍｇ、０．０４７ミリモル）を加えた。得られた反応混合物を室温で４時間撹拌した。反応混合物を蒸発させ、酸性条件下でＨＰＬＣ（０．１％ＨＣＯ_２Ｈ水溶液中５％～９５％ＣＨ_３ＣＮ勾配）により精製して、表題化合物を得た。収量：６．２ｍｇ（４４％）。

【0355】

^１Ｈ－ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）δ（ｐｐｍ）＝７．４１（４Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ），７．３２（４Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ），４．６８（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ），４．１１－４．０５（２Ｈ，ｍ），３．７２－３．３１（３４Ｈ，ｍ），２．６６（６Ｈ，ｓ），２．４０（６Ｈ，ｓ），１．６８（６Ｈ，ｓ），０．９４（３Ｈ，ｓ）。

【0356】

^１３Ｃ－ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）δ（ｐｐｍ）＝１７０．７，１６４．０，１５５．８，１５０．０，１３７．０，１３６．７，１３２．１，１３１．１，１３０．９，１３０．０，１２８．９，７４．４，７１．４，７０．８，７０．６，７０．１，５４．６，４１．０，３９．６，３９．１，１７．８，１４．５，１３．２，１１．９。
ＭＳ（ＥＳＩ）：Ｃ_５７Ｈ_７１Ｃｌ_２Ｎ_１０Ｏ_１１Ｓ_２［Ｍ＋Ｈ^＋］計算値１２０５．４、実測値１２０５．４。

【0357】

１－（（Ｓ）－４－（４－クロロフェニル）－２，３，９－トリメチル－６Ｈ－チエノ［３，２－ｆ］［１，２，４］トリアゾロ［４，３－ａ］［１，４］ジアゼピン－６－イル）－１７－（１６－（（Ｓ）－４－（４－クロロフェニル）－２，３，９－トリメチル－６Ｈ－チエノ［３，２－ｆ］［１，２，４］トリアゾロ［４，３－ａ］［１，４］ジアゼピン－６－イル）－１５－オキソ－２，５，８，１１－テトラオキサ－１４－アザヘキサデシル）－１７－メチル－２－オキソ－６，９，１２，１５，１９－ペンタオキサ－３－アザヘニコサン－２１－酸（３０）

【0358】

【化53】

【0359】

ｔ－ブタノール（１．０ｍＬ）中のＮ，Ｎ′－（１４－メチル－１４－（（２－オキソエトキシ）メチル）－３，６，９，１２，１６，１９，２２，２５－オクタオキサヘプタコサン－１，２７－ジイル）ビス（２－（（Ｓ）－４－（４－クロロフェニル）－２，３，９－トリメチル－６Ｈ－チエノ［３，２－ｆ］［１，２，４］トリアゾロ［４，３－ａ］［１，４］ジアゼピン－６－イル）アセトアミド）（２８）（７４ｍｇ、０．０５８ミリモル）の混合物に、ＴＨＦ中２Ｍの２－メチル－２－ブテン（２９０μＬ、０．５８ミリモル）、ＮａＨ_２ＰＯ_４（７．０ｍｇ、０．０５８ミリモル）、Ｈ_２Ｏ（０．３５ｍＬ）中塩化ナトリウム（２２．４ｍｇ、０．２３ミリモル）溶液を添加した。得られた反応混合物を室温で４時間撹拌した。反応混合物を蒸発させ、酸性条件下でＨＰＬＣ（０．１％ＨＣＯ_２Ｈ水溶液中５％～９５％ＣＨ_３ＣＮ勾配）により精製して、表題化合物を得た。収量：６３ｍｇ（８４％）。

【0360】

^１Ｈ－ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）δ（ｐｐｍ）＝７．４１（４Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ），７．３３（４Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ），７．０４－６．９４（２Ｈ，ｍ），４．６６（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ），４．０９－４．０５（２Ｈ，ｍ），３．７４－３．４３（３６Ｈ，ｍ），３．４１－３．３０（６Ｈ，ｍ），２．６７（６Ｈ，ｓ），２．４０（６Ｈ，ｓ），１．６８（７Ｈ，ｓ），０．９４（３Ｈ，ｓ）。

【0361】

^１３Ｃ－ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）δ（ｐｐｍ）＝１７２．７，１７０．６，１６３．９，１５５．６，１４９．９，１３６．８，１３６．６，１３２．０，１３１．０，１３０．７，１２９．９，１２８．７，７４．７，７４．２，７１．１，７０．７，７０．５，７０．３，６９．７，６９．１，５４．４，４０．９，３９．５，３８．９，１７．５，１４．４，１３．１，１１．７。
ＭＳ（ＥＳＩ）：Ｃ_６１Ｈ_７９Ｃｌ_２Ｎ_１０Ｏ_１２Ｓ_２［Ｍ＋Ｈ^＋］計算値１２９３．５、実測値１２９３．４。

【0362】

Ｎ，Ｎ′－（１４－（（２－（（２－（（２－（２，６－ジオキソピペリジン－３－イル）－１，３－ジオキソイソインドリン－４－イル）アミノ）エチル）アミノ）－２－オキソエトキシ）メチル）－１４－メチル－３，６，９，１２，１６，１９，２２，２５－オクタオキサヘプタコサン－１，２７－ジイル）ビス（２－（（Ｓ）－４－（４－クロロフェニル）－２，３，９－トリメチル－６Ｈ－チエノ［３，２－ｆ］［１，２，４］トリアゾロ［４，３－ａ］［１，４］ジアゼピン－６－イル）アセトアミド）（ＳＩＭ６）

【0363】

【化54】

【0364】

ＤＭＦ（０．１２ｍＬ）中の１－（（Ｓ）－４－（４－クロロフェニル）－２，３，９－トリメチル－６Ｈ－チエノ［３，２－ｆ］［１，２，４］トリアゾロ［４，３－ａ］［１，４］ジアゼピン－６－イル）－１７－（１６－（（Ｓ）－４－（４－クロロフェニル）－２，３，９－トリメチル－６Ｈ－チエノ［３，２－ｆ］［１，２，４］トリアゾロ［４，３－ａ］［１，４］ジアゼピン－６－イル）－１５－オキソ－２，５，８，１１－テトラオキサ－１４－アザヘキサデシル）－１７－メチル－２－オキソ－６，９，１２，１５，１９－ペンタオキサ－３－アザヘニコサン－２１－酸（３０）（１０ｍｇ、０．００７８ミリモル）の混合物に、ＣＯＭＵ（３．７ｍｇ、０．００８６ミリモル）、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（４．１μＬ、０．０２３ミリモル）を加えた。得られた反応混合物を室温で５分間撹拌した。混合物を４－［（２－アミノエチル）アミノ］－２－（２，６－ジオキソ－３－ピペリジニル）－１Ｈ－イソインドール－１，３（２Ｈ）－ジオン（ｒｅｆ．５４）（３．７ｍｇ、０．０１２ミリモル）に加えた。次いで、混合物を室温で１時間撹拌し、酸性条件下でＨＰＬＣ（０．１％ＨＣＯ_２Ｈ水溶液中５％～９５％ＣＨ_３ＣＮ勾配）により精製して、表題化合物を得た。収量：５．０ｍｇ（４１％）。

【0365】

^１Ｈ－ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤ_３ＯＤ）δ（ｐｐｍ）＝７．５１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝７．３，８．５Ｈｚ），７．４４（４Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ），７．３９（４Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１．３，８．５Ｈｚ），７．０９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ），７．０１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．９Ｈｚ），５．００（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝２．３，５．３，１２．８Ｈｚ），４．６５－４．５９（２Ｈ，ｍ），３．９１－３．８６（２Ｈ，ｍ），３．６６－３．３８（４０Ｈ，ｍ），３．３０－３．２３（６Ｈ，ｍ），２．８９－２．７８（１Ｈ，ｍ），２．７６－２．６１（２Ｈ，ｍ），２．６９（６Ｈ，ｓ），２．４３（６Ｈ，ｓ），２．１１－２．０４（１Ｈ，ｍ），１．６９（６Ｈ，ｓ），０．８５（３Ｈ，ｓ）。

【0366】

^１３Ｃ－ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，ＣＤ_３ＯＤ）δ（ｐｐｍ）＝１７４．６，１７３．５，１７２．９，１７１．３，１７０．６，１６９．２，１６６．１，１５７．１，１５２．１，１４８．２，１３８．２，１３７．９，１３７．３，１３３．９，１３３．５，１３３．２，１３２．０，１３１．４，１２９．８，１１８．１，１１２．２，１１１．４，７５．６，７４．８，７２．１，７１．７，７１．６，７１．４，７０．７，５５．２，５０．２，４２．６，４１．９，４０．６，３９．６，３８．８，３２．２，２３．８，１８．０，１４．４，１２．９，１１．６。
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）：Ｃ_７６Ｈ_９３Ｃｌ_２Ｎ_１４Ｏ_１６Ｓ_２［Ｍ＋Ｈ＋］計算値１５９１．５７０７、実測値１５９１．５３４３。

【0367】

Ｎ，Ｎ′－（１１－（（２－（（（Ｓ）－１－（（２Ｓ，４Ｓ）－４－ヒドロキシ－２－（（４－（４－メチルチアゾール－５－イル）ベンジル）カルバモイル））ピロリジン－１－イル）－３，３－ジメチル－１－オキソブタン－２－イル）アミノ）－２－オキソエトキシ）メチル）－１１－メチル－３，６，９，１３，１６，１９－ヘキサオキサヘニコサン－１，２１－ジイル）ビス（２－（（Ｓ）－４－（４－クロロフェニル）－２，３，９－トリメチル－６Ｈ－チエノ［３，２－ｆ］［１，２，４］トリアゾロ［４，３－ａ］［１，４］ジアゼピン－６－イル）アセトアミド）（ｃｉｓ－ＳＩＭ１）

【0368】

【化55】

【0369】

ＤＭＦ（０．０７ｍＬ）中の１－（（Ｓ）－４－（４－クロロフェニル）－２，３，９－トリメチル－６Ｈ－チエノ［３，２－ｆ］［１，２，４］トリアゾロ［４，３－ａ］［１，４］ジアゼピン－６－イル）－１４－（１３－（（Ｓ）－４－（４－クロロフェニル）－２，３，９－トリメチル－６Ｈ－チエノ［３，２－ｆ］［１，２，４］トリアゾロ［４，３－ａ］［１，４］ジアゼピン－６－イル）－１２－オキソ－２，５，８－トリオキサ－１１－アザトリデシル）－１４－メチル－２－オキソ－６，９，１２，１６－テトラオキサ－３－アザオクタデカン－１８－酸（２９）（５．２ｍｇ、０．００４３ミリモル）の混合物に、ＣＯＭＵ（２．０ｍｇ、０．００４７ミリモル）、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（２．３μＬ、０．０１３ミリモル）を加えた。得られた反応混合物を室温で５分間撹拌した。混合物をｃｉｓ－ＶＨ０３２アミン塩酸塩（ｒｅｆ．９）（３．０ｍｇ、０．００６５ミリモル）に加えた。次いで、混合物を室温で１時間撹拌し、酸性条件下でＨＰＬＣ（０．１％ＨＣＯ_２Ｈ水溶液中５％～９５％ＣＨ_３ＣＮ勾配）により精製して、表題化合物を得た。収量：４．４ｍｇ（６３％）。

【0370】

^１Ｈ－ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤ_３ＯＤ）δ（ｐｐｍ）＝８．８５（１Ｈ，ｓ），７．４８－７．３６（１２Ｈ，ｍ），４．６５－４．５９（３Ｈ，ｍ），４．５８－４．５０（２Ｈ，ｍ），４．４０－４．３２（２Ｈ，ｍ），４．０１－３．８９（３Ｈ，ｍ），３．７３－３．３４（３５Ｈ，ｍ），３．２７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝５．１Ｈｚ），２．６８（６Ｈ，ｓ），２．４６（３Ｈ，ｓ），２．４４－２．３６（１Ｈ，ｍ），２．４３（６Ｈ，ｓ），１．９６（１Ｈ，ｄｔ，Ｊ＝４．４，１３．３Ｈｚ），１．６９（６Ｈ，ｓ），１．０２（９Ｈ，ｓ），０．９７（３Ｈ，ｓ）。

【0371】

^１３Ｃ－ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，ＣＤ_３ＯＤ）δ（ｐｐｍ）＝１７４．８，１７２．９，１７２．０，１７１．８，１６６．１，１５７．１，１５２．８，１５２．１，１４９．１，１４０．０，１３８．２，１３７．９，１３３．５，１３３．２，１３２．０，１３１．４，１３０．４，１２９．８，１２９．１，７５．４，７４．８，７４．７，７２．２，７１．７，７１．５，７１．４，７０．７，６１．０，５７．９，５７．６，５５．２，４３．９，４２．１，４０．６，３８．８，３７．８，３６．８，２７．０，１８．０，１５．９。
ＭＳ（ＥＳＩ）：Ｃ_７９Ｈ_９９Ｃｌ_２Ｎ_１４Ｏ_１３Ｓ_３［Ｍ＋Ｈ^＋］計算値１６１７．６０５０、実測値１６１７．５７１６。

【0372】

（Ｒ，Ｓ）－ＳＩＭ１の合成

【0373】

【化56】

【0374】

（２Ｓ，４Ｒ）－１－（（１７Ｓ）－１－アミノ－１１－（（２－（２－（２－アジドエトキシ）エトキシ）エトキシ）メチル）－１７－（ｔｅｒｔ－ブチル）－１１－メチル－１５－オキソ－３，６，９，１３－テトラオキサ－１６－アザオクタデカン－１８－オイル）－４－ヒドロキシ－Ｎ－（４－（４－メチルチアゾール－５－イル）ベンジル）ピロリジン－２－カルボキサミド（３１）

【0375】

【化57】

【0376】

酢酸エチル（１．５ｍＬ）中のトリフェニルホスフィン（１５ｍｇ、０．０５７ミリモル）を、ＥｔＯＡｃ／ＴＨＦ／１ＭＨＣｌ（４ｍＬ、４：１：５）中の化合物２０（５３ｍｇ、０．０５８ミリモル）に室温で３時間かけて滴下添加した。反応混合物を室温で一晩激しく撹拌した後、４Ｍ ＨＣｌ（２ｍＬ）を加え、酢酸エチル層を除去した。水層をＥｔＯＡｃで洗浄し、濃縮した。粗生成物をＨＰＬＣ（０．１％アンモニアを含む水中５％～９５％ＣＨ_３ＣＮ勾配）によって精製して、１１ｍｇの出発物質２０および１０ｍｇ（回収された出発物質に基づいて２４％）の所望のモノアミン３１を得た。

【0377】

^１Ｈ－ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）δ（ｐｐｍ）＝８．６７（１Ｈ，ｓ），８．５２（１Ｈ，ｂｒ），７．３８－７．３３（４Ｈ，ｍ），７．１７（１Ｈ，ｍ），４．６７（１Ｈ，ｍ），４．５５－４．４７（３Ｈ，ｍ），４．３８（１Ｈ，ｍ），４．０７－３．９４（４Ｈ，ｍ），３．７０－３．２１（３１Ｈ，ｍ），２．９８（２Ｈ，ｍ），２．５１（３Ｈ，ｓ），２．３１（１Ｈ，ｓ），２．２３（１Ｈ，ｓ），１．０２－０．９３（１２Ｈ，ｍ）。

【0378】

^１３Ｃ－ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）δ（ｐｐｍ）＝１７１．４，１７１．０３，１７０．９８，１７０．７２，１７０．６５，１６９．４，１５０．２，１４８．４，１３８．５１，１３８．４７，１３１．６，１３０．６７，１３０．６６，１２９．３６，１２９．３５，１２７．９７，７４．２，７４．１，７４．０，７３．９，７３．１，７１．１，７０．８７，７０．８４，７０．８０，７１．７２，７０．７０，７０．６２，７０．４５，７０．４２，７０．３８，７０．３４，７０．３，７０．２，７０．２，７０．０，６９．９，６８．６，６８．５，５９．０，５７．３，５７．０，５０．６，４３．０，４２．９９，４１．０３，４１．０１，３９．８，３７．０７，３６．９８，３５．１７，３５．１０，２６．４，１７．５，１６．０。
ＭＳ（ＥＳＩ）：Ｃ_４１Ｈ_６７Ｎ_８Ｏ_１１Ｓ_１［Ｍ＋Ｈ^＋］^＋計算値８７９．５、実測値８７９．５。

【0379】

（２Ｓ，４Ｒ）－１－（（２０Ｓ）－１４－（（２－（２－（２－アジドエトキシ）エトキシ）エトキシ）メチル）－２０－（ｔｅｒｔ－ブチル）－１－（（Ｓ）－４－（４－クロロフェニル）－２，３，９－トリメチル－６Ｈ－チエノ［３，２－ｆ］［１，２，４］トリアゾロ［４，３－ａ］［１，４］ジアゼピン－６－イル）－１４－メチル－２，１８－ジオキソ－６，９，１２，１６－テトラオキサ－３，１９－ジアザヘニコサン－２１－オイル）－４－ヒドロキシ－Ｎ－（４－（４－メチルチアゾール－５－イル）ベンジル）ピロリジン－２－カルボキサミド（３２）

【0380】

【化58】

【0381】

ＤＭＦ（０．２ｍＬ）中の（＋）－ＪＱ１カルボン酸（４．５ｍｇ、０．０１１ミリモル）、ＨＡＴＵ（４．２ｍｇ、０．０１１ミリモル）、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（５μＬ、０．０３ミリモル）の事前撹拌混合物を、化合物３１（１０ｍｇ、０．０１１ミリモル）に加えた。得られた混合物を室温で１時間撹拌し、ＨＰＬＣ（０．１％ＨＣＯ_２Ｈ水溶液中の５～９５％ＣＨ_３ＣＮ）によって精製して、表題化合物３２を得た。収量：１２ｍｇ（８６％）。

【0382】

^１Ｈ－ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）δ（ｐｐｍ）＝８．６７（１Ｈ，ｓ），７．６９（１Ｈ，ｍ），７．４３－７．２８（１０Ｈ，ｍ），７．１５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ），４．８２（１Ｈ，ｍ），４．６４（２Ｈ，ｍ），４．５４（１Ｈ，ｍ），４．４７（１Ｈ，ｍ），４．３５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝５．４，１６．０Ｈｚ），４．１０（１Ｈ，ｍ），４．０４（１Ｈ，ｍ），３．９５（１Ｈ，ｍ），３．７０－３．１８（３８Ｈ，ｍ），２．６２（３Ｈ，ｓ），２．５１（３Ｈ，ｓ），２．４８（１Ｈ，ｍ），２．３９（３Ｈ，ｓ），２．１４（１Ｈ，ｍ），１．６５（３Ｈ，ｓ），０．９７（９Ｈ，ｓ），０．９５（１．５Ｈ，ｓ），０．９３（１．５Ｈ，ｓ）。

【0383】

^１３Ｃ－ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）δ（ｐｐｍ）＝１７１．２，１７１．１，１７０．８，１７０．５５，１７０．５２，１６３．９，１６２．３，１５５．８，１５０．２，１４９．８，１４８．４，１３８．３，１３６．７，１３２．０，１３１．７，１３１．０，１３０．８，１３０．７，１２９．９，１２９．５，１２８．７，１２８．１，７４．５，７３．９，７３．８，７３．５，７３．０，７２．７，７１．１，７０．９５，７０．９２，７０．８，７０．７，７０．５１，７０．４７，７０．３，７０．２４，７０．２１，７０．０，５８．７，５７．０，５６．６，５４．３，５０．７，４３．２，４０．９，３９．５，３８．４，３８．３，３６．２，３５．３，３５．２，２６．４，１７．５４，１７．４８，１６．０，１４．４，１３．１，１１．８。
ＭＳ（ＥＳＩ）：Ｃ_６０Ｈ_８３ＣｌＮ_１２Ｏ_１２Ｓ_２［Ｍ＋２Ｈ^＋］^２＋計算値６３１．３、実測値６３１．８。

【0384】

（２Ｓ，４Ｒ）－１－（（２０Ｓ）－２０－（ｔｅｒｔ－ブチル）－１－（（Ｒ）－４－（４－クロロフェニル）－２，３，９－トリメチル－６Ｈ－チエノ［３，２－ｆ］［１，２，４］トリアゾロ［４，３－ａ］［１，４］ジアゼピン－６－イル）－１４－（１３－（（Ｓ）－４－（４－クロロフェニル））－２，３，９－トリメチル－６Ｈ－チエノ［３，２－ｆ］［１，２，４］トリアゾロ［４，３－ａ］［１，４］ジアゼピン－６－イル）－１２－オキソ－２，５，８－トリオキサ－１１－アザトリデシル）－１４－メチル－２，１８－ジオキソ－６，９，１２，１６－テトラオキサ－３，１９－ジアザヘニコサン－２１－オイル）－４－ヒドロキシ－Ｎ－（４－（４－メチルチアゾール－５－イル）ベンジル）ピロリジン－２－カルボキサミド（（Ｒ，Ｓ）－ＳＩＭ１）

【0385】

【化59】

【0386】

ＭｅＯＨ（１ｍＬ）中の３２（１２ｍｇ、０．０１ミリモル）の混合物に、１０重量％のパラジウム／炭素（０．５ｍｇ）を加えた。得られた反応混合物を水素雰囲気下、室温で一晩撹拌した。次いで、混合物をセライトパッド上で濾過し、蒸発させた。濃縮粗製物に、ＤＭＦ（０．２０ｍＬ）中の（－）－ＪＱ１カルボン酸（４ｍｇ、０．０１ミリモル）、ＨＡＴＵ（４ｍｇ、０．０１ミリモル）、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（５μＬ、０．０３ミリモル）の事前撹拌混合物を加えた。混合物を室温で１時間撹拌し、ＨＰＬＣ（０．１％ＨＣＯ_２Ｈ水溶液中５％～９５％ＣＨ_３Ｎ勾配）によって精製して、表題化合物を得た。収量：４．７ｍｇ（３１％）。

【0387】

^１Ｈ－ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３、ジアステレオマー混合物）δ（ｐｐｍ）＝８．７０（１Ｈ，ｓ），７．５７－７．２８（１４Ｈ，ｍ），７．２０（１Ｈ，ｍ），４．７６（１Ｈ，ｍ），４．７２－４．６０（３Ｈ，ｍ），４．５８－４．４４（２Ｈ，ｍ），４．４３－４．３３（１Ｈ，ｍ），４．１４－３．９５（３Ｈ，３Ｈ），３．６９－３．２５（３８Ｈ，ｍ），２．６８－２．６０（６Ｈ，ｍ），２．５０（３Ｈ，ｓ），２．３９（６Ｈ，ｓ），２．３６－２．２９（１Ｈ，ｍ），２．２２－２．１２（１Ｈ，ｍ），１．６８－１．６１（６Ｈ，ｍ），１．００－０．９５（９Ｈ，ｍ），０．９２（３Ｈ，ｓ）。

【0388】

^１３Ｃ－ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３、ジアステレオマー混合物）δ（ｐｐｍ）＝１７１．４６，１７１．４１，１７０．８９，１７０．８６，１７０．７（ｂｒ），１７０．６，１６４．４（ｂｒ），１５５．５，１５０．４，１５０．０，１４８．１，１３８．５９，１３８．５５，１３７．０（ｂｒ），１３６．２（ｂｒ），１３２．１（ｂｒ），１３１．９，１３１．２（ｂｒ），１３１．１１，１３１．０９，１３０．４７，１３０．４２，１３０．１（ｂｒ），１２９．３３，１２９．３０，１２８．７，１２８．０，７３．８（ｂｒ），７０．９２，７０．８６，７０．６１，７０．５８，７０．４，７０．２（ｂｒ），７０．１，６９．９，５９．２，５９．１，５７．３，５６．８（ｂｒ），５３．９，４３．０，４１．０，４０．８，３９．３（ｂｒ），３８．０（ｂｒ），３６．７（ｂｒ），３５．５９，３５．５５，２９．７，２６．４，１７．７５，１７．７１，１５．９５，１４．４２，１４．３９，１４．３７，１３．１，１１．７。
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）：Ｃ_７９Ｈ_９９Ｃｌ_２Ｎ_１４Ｏ_１３Ｓ_３［Ｍ＋Ｈ^＋］計算値１６１７．６０５０、実測値１６１７．６０２５。

【0389】

化合物ＭＮ６７４の合成

【0390】

【化60】

【0391】

８－（（アリルオキシ）メチル）－１，１５－ジアジド－８－メチル－３，６，１０，１３－テトラオキサペンタデカン（３３）

【0392】

【化61】

【0393】

２－（（アリルオキシ）メチル）－２－メチルプロパン－１，３－ジオール（２）（３５０ ｍｇ、２．１９ミリモル）をＤＭＦ（５ｍＬ）に溶解し、０℃に冷却した。ＮａＨ（３５０ｍｇ、油中６０％、８．７５ミリモル）を加え、反応物を０℃で１５分間撹拌した。その後、２－（２－アジドエトキシ）エチルメタンスルホネート（１．４ｇ、６．５ミリモル）を加え、反応物を６０℃で一晩撹拌した。次いで、混合物をセライトパッド上で濾過し、濃縮した。粗製物質を酸性条件下でＨＰＬＣ（０．１％ＨＣＯ_２Ｈ水溶液中５～９５％ＣＨ_３ＣＮ）により精製して、表題化合物を得た。収量：５０７ｍｇ（６０％）。

【0394】

^１Ｈ－ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）δ（ｐｐｍ）＝５．９６－５．８４（１Ｈ，ｍ），５．２９（１Ｈ，ｍ），５．１６（１Ｈ，ｍ），４．００－３．９５（２Ｈ，ｍ），３．７３－３．６８（４Ｈ，ｍ），３．６８－３．６３（４Ｈ，ｍ），３．６３－３．５８（４Ｈ，ｍ），３．４２－３．３６（８Ｈ，ｍ），３．３３（２Ｈ，ｍ），０．９８（３Ｈ，ｓ）。

【0395】

２－（３－（２－（２－アジドエトキシ）エトキシ）－２－（（２－（２－アジドエトキシ）エトキシ）メチル）－２－メチルプロポキシ）アセトアルデヒド（３４）

【0396】

【化62】

【0397】

Ｈ_２Ｏ（４ｍＬ）と１，４－ジオキサン（１４ｍＬ）中の８－（（アリルオキシ）メチル）－１，１５－ジアジド－８－メチル－３，６，１０，１３－テトラオキサペンタデカン（３３）（５０７ｍｇ、１．３１ミリモル）の混合物に、２，６－ルチジン（３３０μＬ、２．６ミリモル）、四酸化オスミウム４％水溶液（１８０μＬ、０．０１ミリモル）、過ヨウ素酸ナトリウム（１．２ｇ、０．２１ミリモル）を加えた。得られた反応混合物を室温で１６時間撹拌した。反応混合物をＮａ_２ＳＯ_３（水性）でクエンチし、ジクロロメタンで抽出した。有機層を濃縮し、残った残渣をカラムクロマトグラフィーで精製して、表題化合物を得た。収量：４２５ｍｇ（８５％）。

【0398】

^１Ｈ－ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）δ（ｐｐｍ）＝９．７５（１Ｈ，ｓ），４．０２（２Ｈ，ｓ），３．７３－３．５８（１４Ｈ，ｍ），３．４６（２Ｈ，ｍ），３．４２－３．３５（１０Ｈ，ｍ），１．０１（３Ｈ，ｓ）。

【0399】

２－（３－（２－（２－アジドエトキシ）エトキシ）－２－（（２－（２－アジドエトキシ）エトキシ）メチル）－２－メチルプロポキシ）酢酸（３５）

【0400】

【化63】

【0401】

ｔ－ＢｕＯＨ（１５ｍＬ）中の２－（３－（２－（２－アジドエトキシ）エトキシ）－２－（（２－（２－アジドエトキシ）エトキシ）メチル）－２－メチルプロポキシ）アセトアルデヒド（３４）（４２５ｍｇ、１．１ミリモル）の混合物に、ＴＨＦ中２Ｍの２－メチル－２－ブテン（２．７５ｍＬ、５．５ミリモル）、ＮａＨ_２ＰＯ_４（１３２ｍｇ、１．１ミリモル）、Ｈ_２Ｏ（３ｍＬ）中の塩化ナトリウム（５００ｍｇ、４．４ミリモル）を加えた。得られた反応混合物を室温で１６時間撹拌した。反応混合物を濃縮し、次いでＮａＯＨ（水溶液）で希釈した。混合物をＭＴＢＥで洗浄し、２Ｍ ＨＣｌで中和した。ジクロロメタンで抽出し、有機層をＮａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、濃縮した。残った粗生成物をさらに精製することなく次のステップで使用した。収量：４２２ｍｇ（９５％）。

【0402】

（２Ｓ，４Ｒ）－１－（（Ｓ）－１５－アジド－８－（（２－（２－アジドエトキシ）エトキシ）メチル）－２－（ｔｅｒｔ－ブチル）－８－メチル－４－オキソ－６，１０，１３－トリオキサ－３－アザペンタデカノイル）－４－ヒドロキシ－Ｎ－（４－（４－メチルチアゾール－５－イル）ベンジル）ピロリジン－２－カルボキサミド（３６）

【0403】

【化64】

【0404】

ＨＡＴＵ（１９４ｍｇ、０．５１ミリモル）およびＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（２７０μＬ）を２－（３－（２－（２－アジドエトキシ）エトキシ）－２－（（２－（２－アジドエトキシ）エトキシ）メチル）－２－メチルプロポキシ）酢酸（３５）（２００ｍｇ、０．５１ミリモル）のＤＭＦ（２ｍＬ）溶液に加えた。得られた反応混合物を室温で２分間撹拌した。ＶＨ０３２アミン塩酸塩（２４０ｍｇ、０．５１ミリモル）を混合物に加えた。混合物を室温で１時間撹拌し、酸性条件下でＨＰＬＣ（０．１％ＨＣＯ_２Ｈ水溶液中５％～９５％ＣＨ_３ＣＮ勾配）で精製して、表題化合物を得た。収量：３１２ｍｇ（７５％）。

【0405】

^１Ｈ－ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）δ（ｐｐｍ）＝８．７０（１Ｈ，ｓ），７．４３－７．３３（５Ｈ，ｍ），７．１３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ），４．７７（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），４．６３－４．５４（２Ｈ，ｍ），４．４７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ），４．３７（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝５．５，１５．０Ｈｚ），４．１９－４．１３（１Ｈ，ｍ），３．９６（２Ｈ，ｍ），３．７１－３．５３（１４Ｈ，ｍ），３．４６－３．３４（１０Ｈ，ｍ），２．６３（１Ｈ，ｍ），２．５４（３Ｈ，ｓ），２．１４（１Ｈ，ｍ），１．０１（３Ｈ，ｓ），０．９７（９Ｈ，ｓ）。
ＭＳ（ＥＳＩ）：Ｃ_３７Ｈ_５７Ｎ_１０Ｏ_９Ｓ［Ｍ＋Ｈ^＋］計算値８１７．４、実測値８１７．９。

【0406】

Ｎ，Ｎ′－（８－（（２－（（（Ｓ）－１－（（２Ｓ，４Ｒ）－４－ヒドロキシ－２－（（４－（４－メチルチアゾール－５－イル）ベンジル）カルバモイル）ピロリジン－１－イル）－３，３－ジメチル－１－オキソブタン－２－イル）アミノ）－２－オキソエトキシ）メチル）－８－メチル－３，６，１０，１３－テトラオキサペンタデカン－１，１５－ジイル）ビス（２－（（Ｓ）－４－（４－クロロフェニル）－２，３，９－トリメチル－６Ｈ－チエノ［３，２－ｆ］［１，２，４］トリアゾロ［４，３－ａ］［１，４］ジアゼピン－６－イル）アセトアミド）（ＭＮ６７４）

【0407】

【化65】

【0408】

ＭｅＯＨ（１ｍＬ）中の（２Ｓ，４Ｒ）－１－（（Ｓ）－１５－アジド－８－（（２－（２－アジドエトキシ）エトキシ）メチル）－２－（ｔｅｒｔ－ブチル）－８－メチル－４－オキソ－６，１０，１３－トリオキサ－３－アザペンタデカノイル）－４－ヒドロキシ－Ｎ－（４－（４－メチルチアゾール－５－イル）ベンジル）ピロリジン－２－カルボキサミド（３６）（２０ｍｇ、０．０２４ミリモル）の溶液に、１０重量％パラジウム／炭素（０．５ｍｇ）を加えた。得られた反応混合物を水素雰囲気下、室温で一晩撹拌した。次いで、混合物をセライトパッドで濾過し、蒸発させた。得られた濃縮粗生成物に、ＤＭＦ（０．５ｍＬ）中の（＋）－ＪＱ１カルボン酸（２０ｍｇ、０．０５ミリモル）、ＨＡＴＵ（１９ｍｇ、０．０５ミリモル）、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（２０μＬ）の事前攪拌混合物を加えた。その混合物を室温で１時間撹拌し、ＨＰＬＣ（０．１％ＨＣＯ_２Ｈ水溶液中５％～９５％ＣＨ_３ＣＮ勾配）によって精製して、表題化合物を得た。収量：１３．５ｍｇ（３７％）。

【0409】

^１Ｈ－ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）δ（ｐｐｍ）＝８．７０（１Ｈ，ｓ），７．６７－７．６１（２Ｈ，ｍ），７．５７（１Ｈ，ｍ），７．４４－７．３０（１２Ｈ，ｍ），７．２４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．４Ｈｚ），４．８９（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），４．７５－４．６３（３Ｈ，ｍ），４．５３（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝６．４，１５．２Ｈｚ），４．４６（１Ｈ，ｍ），４．３４（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝５．５，１５．１Ｈｚ），４．２８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１５．７Ｈｚ），４．１４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１１．０Ｈｚ），４．０７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１５．７Ｈｚ），３．７６－３．２２（３１Ｈ，ｍ），２．６４（６Ｈ，ｓ），２．５１（３Ｈ，ｓ），２．４０（６Ｈ，ｓ），２．３９（１Ｈ，ｍ），２．１８（１Ｈ，ｍ），１．６７（６Ｈ，ｓ），１．０２（９Ｈ，ｓ），０．９３（３Ｈ，ｓ）。

【0410】

^１３Ｃ－ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）δ（ｐｐｍ）＝１７１．５，１７１．２，１７０．９，１７０．７，１６４．０，１６３．９，１５５．７，１５０．３，１４９．９，１４８．３，１３８．４，１３６．８，１３６．７５，１３６．５，１３２．０４，１３２．０２，１３１．８，１３１．０４，１３０．９７，１２９．９９，１２９．９７，１２９．４，１２８．７５，１２８．７３，１２８．０，７３．８，７３．６，７３．４，７１．３，７０．９，７０．３，７０．２，７０．０，５８．９，５７．３，５６．５，５４．１，５３．５，４３．１，４１．１，３９．６，３８．３，３６．６，３５．４，２６．６，２６．４，１７．７，１６．０，１４．４，１３．４，１３．１，１１．８。
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）：Ｃ_７５Ｈ_９１Ｃｌ_２Ｎ_１４Ｏ_１１Ｓ_３［Ｍ＋Ｈ^＋］計算値１５２９．５５３１、実測値１５２９．５５１６。

【0411】

参考文献
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５． Ｍａｔｙｓｋｉｅｌａ， Ｍ． Ｅ． ｅｔ ａｌ． Ａ ｎｏｖｅｌ ｃｅｒｅｂｌｏｎ ｍｏｄｕｌａｔｏｒ ｒｅｃｒｕｉｔｓ ＧＳＰＴ１ ｔｏ ｔｈｅ ＣＲＬ４（ＣＲＢＮ） ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ ｌｉｇａｓｅ． Ｎａｔｕｒｅ ５３５， ２５２-２５７ （２０１６）．

６． Ｂｕｓｓｉｅｒｅ， Ｄ． Ｅ． ｅｔ ａｌ． Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｂａｓｉｓ ｏｆ ｉｎｄｉｓｕｌａｍ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ＲＢＭ３９ ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ ｔｏ ＤＣＡＦ１５ Ｅ３ ｌｉｇａｓｅ ｃｏｍｐｌｅｘ． Ｎａｔ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ １６， １５-２３ （２０２０）．

７． Ｓlａｂｉｃｋｉ， Ｍ． ｅｔ ａｌ． Ｔｈｅ ＣＤＫ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ＣＲ８ ａｃｔｓ ａｓ ａ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｇｌｕｅ ｄｅｇｒａｄｅｒ ｔｈａｔ ｄｅｐｌｅｔｅｓ ｃｙｃｌｉｎ Ｋ． Ｎａｔｕｒｅ ３５９， ｅａａｏ５９０２-５ （２０２０）．

８． Ｍａｙｏｒ－Ｒｕｉｚ， Ｃ． ｅｔ ａｌ． Ｒａｔｉｏｎａｌ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｇｌｕｅ ｄｅｇｒａｄｅｒｓ ｖｉａ ｓｃａｌａｂｌｅ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ． Ｎａｔ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ ３４８， １３７６ （２０２０）．

９． Ｚｅｎｇｅｒｌｅ， Ｍ．， Ｃｈａｎ， Ｋ．－Ｈ． ＆ Ｃｉｕｌｌｉ， Ａ． Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ Ｓｍａｌｌ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＢＥＴ Ｂｒｏｍｏｄｏｍａｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ ＢＲＤ４． ＡＣＳ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ １０， １７７０-１７７７ （２０１５）．
１０． Ｂｏｎｄｅｓｏｎ， Ｄ． Ｐ． ｅｔ ａｌ． Ｃａｔａｌｙｔｉｃ ｉｎ ｖｉｖｏ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｎｏｃｋｄｏｗｎ ｂｙ ｓｍａｌｌ－ｍｏｌｅｃｕｌｅ ＰＲＯＴＡＣｓ． Ｎａｔ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ １１， ６１１-６１７ （２０１５）．

１１． Ｗｉｎｔｅｒ， Ｇ． Ｅ． ｅｔ ａｌ． Ｐｈｔｈａｌｉｍｉｄｅ ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ａｓ ａ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｆｏｒ ｉｎ ｖｉｖｏ ｔａｒｇｅｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ３４８， １３７６-１３８１ （２０１５）．

１２． Ｓａｌａｍｉ， Ｊ． ｅｔ ａｌ． Ａｎｄｒｏｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｂｙ ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ－ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｃｈｉｍｅｒａ ＡＲＣＣ－４ ｏｕｔｐｅｒｆｏｒｍｓ ｅｎｚａｌｕｔａｍｉｄｅ ｉｎ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ ｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ． Ｃｏｍｍｕｎ Ｂｉｏｌ １， １００ （２０１８）．

１３． Ｈｕ， Ｊ． ｅｔ ａｌ． Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ＥＲＤ－３０８ ａｓ ａ Ｈｉｇｈｌｙ Ｐｏｔｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｃｈｉｍｅｒａ （ＰＲＯＴＡＣ） Ｄｅｇｒａｄｅｒ ｏｆ Ｅｓｔｒｏｇｅｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ （ＥＲ）． Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ６２， １４２０-１４４２ （２０１９）．

１４． Ｑｉｎ， Ｃ． ｅｔ ａｌ． Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ＱＣＡ５７０ ａｓ ａｎ Ｅｘｃｅｐｔｉｏｎａｌｌｙ Ｐｏｔｅｎｔ ａｎｄ Ｅｆｆｉｃａｃｉｏｕｓ Ｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｃｈｉｍｅｒａ （ＰＲＯＴＡＣ） Ｄｅｇｒａｄｅｒ ｏｆ ｔｈｅ Ｂｒｏｍｏｄｏｍａｉｎ ａｎｄ Ｅｘｔｒａ－Ｔｅｒｍｉｎａｌ （ＢＥＴ） Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ｃａｐａｂｌｅ ｏｆ Ｉｎｄｕｃｉｎｇ Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ａｎｄ Ｄｕｒａｂｌｅ Ｔｕｍｏｒ Ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ． Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ６１， ６６８５-６７０４ （２０１８）．

１５． Ｆａｒｎａｂｙ， Ｗ． ｅｔ ａｌ． ＢＡＦ ｃｏｍｐｌｅｘ ｖｕｌｎｅｒａｂｉｌｉｔｉｅｓ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄ ｖｉａ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ－ｂａｓｅｄ ＰＲＯＴＡＣ ｄｅｓｉｇｎ． Ｎａｔ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ １５， ６７２-６８０ （２０１９）．

１６． Ｗａｎｇ， Ｓ． ｅｔ ａｌ． Ｕｎｃｏｕｐｌｉｎｇ ｏｆ ＰＡＲＰ１ ｔｒａｐｐｉｎｇ ａｎｄ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ＰＡＲＰ１ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ． Ｎａｔ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ １５， １２２３-１２３１ （２０１９）．

１７． Ｚｏｒｂａ， Ａ． ｅｔ ａｌ． Ｄｅｌｉｎｅａｔｉｎｇ ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ｔｈｅ ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ｐｏｔｅｎｔ ＰＲＯＴＡＣｓ ｆｏｒ ＢＴＫ． Ｐ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕｓａ １１５， Ｅ７２８５-Ｅ７２９２ （２０１８）．

１８． Ｐｏｐｏｗ， Ｊ． ｅｔ ａｌ． Ｈｉｇｈｌｙ Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ＰＴＫ２ Ｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｃｈｉｍｅｒａｓ （ＰＲＯＴＡＣｓ） ｔｏ Ｐｒｏｂｅ Ｆｏｃａｌ Ａｄｈｅｓｉｏｎ Ｋｉｎａｓｅ Ｓｃａｆｆｏｌｄｉｎｇ Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ． Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ６２， ａｃｓ．ｊｍｅｄｃｈｅｍ．８ｂ０１８２６-２５２０ （２０１９）．

１９． Ｂｕｒｓｌｅｍ， Ｇ． Ｍ． ｅｔ ａｌ． Ｔｈｅ Ａｄｖａｎｔａｇｅｓ ｏｆ Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ Ｏｖｅｒ Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ： Ａｎ ＲＴＫ Ｃａｓｅ Ｓｔｕｄｙ． Ｃｅｌｌ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ ２５， ６７-７７．ｅ３ （２０１８）．

２０． Ｂｅｎｓｉｍｏｎ， Ａ． ｅｔ ａｌ． Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｏｆ ＳＬＣ Ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒｓ Ｒｅｖｅａｌｓ Ａｍｅｎａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ Ｍｕｌｔｉ－Ｐａｓｓ Ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｔｏ Ｌｉｇａｎｄ－Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ． Ｃｅｌｌ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ （２０２０）． ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｈｅｍｂｉｏｌ．２０２０．０４．００３

２１． Ｇａｄｄ， Ｍ． Ｓ． ｅｔ ａｌ． Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｂａｓｉｓ ｏｆ ＰＲＯＴＡＣ ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｆｏｒ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ． Ｎａｔ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ １３， ５１４-５２１ （２０１７）．

２２． Ｂｏｎｄｅｓｏｎ， Ｄ． Ｐ． ｅｔ ａｌ． Ｌｅｓｓｏｎｓ ｉｎ ＰＲＯＴＡＣ Ｄｅｓｉｇｎ ｆｒｏｍ Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ａ Ｐｒｏｍｉｓｃｕｏｕｓ Ｗａｒｈｅａｄ． Ｃｅｌｌ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ ２５， ７８-８７．ｅ５ （２０１８）．

２３． Ｏｌｓｏｎ， Ｃ． Ｍ． ｅｔ ａｌ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ ｐｅｒｔｕｒｂａｔｉｏｎ ｏｆ ＣＤＫ９ ｕｓｉｎｇ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ＣＤＫ９ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｒ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ． Ｎａｔ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ １４， １６３-１７０ （２０１８）．

２４． Ｔｏｖｅｌｌ， Ｈ． ｅｔ ａｌ． Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ＳＧＫ３－ＰＲＯＴＡＣ１， ａｎ Ｉｓｏｆｏｒｍ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＳＧＫ３ Ｋｉｎａｓｅ ＰＲＯＴＡＣ Ｄｅｇｒａｄｅｒ． ＡＣＳ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ １４， ２０２４-２０３４ （２０１９）．

２５． Ｔｅｓｔａ， Ａ． ｅｔ ａｌ． ３－Ｆｌｕｏｒｏ－４－ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｌｉｎｅｓ： Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ， ａｎｄ Ｓｔｅｒｅｏｓｅｌｅｃｔｉｖｅ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｂｙ ｔｈｅ ＶＨＬ Ｅ３ Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ Ｌｉｇａｓｅ ｆｏｒ Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ． Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ １４０， ９２９９-９３１３ （２０１８）．

２６． Ｈａｎ， Ｘ． ｅｔ ａｌ． Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ＡＲＤ－６９ ａｓ ａ Ｈｉｇｈｌｙ Ｐｏｔｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｃｈｉｍｅｒａ （ＰＲＯＴＡＣ） Ｄｅｇｒａｄｅｒ ｏｆ Ａｎｄｒｏｇｅｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ （ＡＲ） ｆｏｒ ｔｈｅ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｐｒｏｓｔａｔｅ Ｃａｎｃｅｒ． Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ６２， ９４１-９６４ （２０１９）．

２７． Ｍａｎｉａｃｉ， Ｃ． ｅｔ ａｌ． Ｈｏｍｏ－ＰＲＯＴＡＣｓ： ｂｉｖａｌｅｎｔ ｓｍａｌｌ－ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｄｉｍｅｒｉｚｅｒｓ ｏｆ ｔｈｅ ＶＨＬ Ｅ３ ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ ｌｉｇａｓｅ ｔｏ ｉｎｄｕｃｅ ｓｅｌｆ－ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ． Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ ８， ８３０ （２０１７）．

２８． Ｐｏｔｊｅｗｙｄ， Ｆ． ｅｔ ａｌ． Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｏｌｙｃｏｍｂ Ｒｅｐｒｅｓｓｉｖｅ Ｃｏｍｐｌｅｘ ２ ｗｉｔｈ ａｎ ＥＥＤ－Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｂｉｖａｌｅｎｔ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｄｅｇｒａｄｅｒ． Ｃｅｌｌ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ ２７， ４７-５６．ｅ１５ （２０２０）．

２９． Ｚｏｐｐｉ， Ｖ． ｅｔ ａｌ． Ｉｔｅｒａｔｉｖｅ Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｎｉｔｉａｌｌｙ Ｉｎａｃｔｉｖｅ Ｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｃｈｉｍｅｒａｓ （ＰＲＯＴＡＣｓ） Ｉｄｅｎｔｉｆｙ ＶＺ１８５ ａｓ ａ Ｐｏｔｅｎｔ， Ｆａｓｔ， ａｎｄ Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｖｏｎ Ｈｉｐｐｅｌ－Ｌｉｎｄａｕ （ＶＨＬ） Ｂａｓｅｄ Ｄｕａｌ Ｄｅｇｒａｄｅｒ Ｐｒｏｂｅ ｏｆ ＢＲＤ９ ａｎｄ ＢＲＤ７． Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ６２， ６９９-７２６ （２０１９）．

３０． Ｃｒｅｗ， Ａ． Ｐ． ｅｔ ａｌ． Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｖｏｎ Ｈｉｐｐｅｌ－Ｌｉｎｄａｕ－Ｒｅｃｒｕｉｔｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｃｈｉｍｅｒａｓ （ＰＲＯＴＡＣｓ） ｏｆ ＴＡＮＫ－Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｋｉｎａｓｅ １． Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ６１， ５８３-５９８ （２０１８）．

３１． Ｒｉｃｈｉｎｇ， Ｋ． Ｍ． ｅｔ ａｌ． Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｌｉｖｅ－Ｃｅｌｌ Ｋｉｎｅｔｉｃ Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｍｅｃｈａｎｉｓｔｉｃ Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｏｆ ＰＲＯＴＡＣ Ｍｏｄｅ ｏｆ Ａｃｔｉｏｎ． ＡＣＳ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ １３， ２７５８-２７７０ （２０１８）．

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３３． Ｄａｎｉｅｌｓ， Ｄ． Ｌ．， Ｒｉｃｈｉｎｇ， Ｋ． Ｍ． ＆ Ｕｒｈ， Ｍ． Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ａｎｄ ｄｅｃｉｐｈｅｒｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｐａｔｈｗａｙｓ ｉｎｓｉｄｅ ｃｅｌｌｓ． Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｔｏｄａｙ： Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ３１， ６１-６８ （２０１９）．

３４． Ｎｏｗａｋ， Ｒ． Ｐ． ｅｔ ａｌ． Ｐｌａｓｔｉｃｉｔｙ ｉｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ｃｏｎｆｅｒｓ ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ｌｉｇａｎｄ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ａｒｔｉｃｌｅ． Ｎａｔ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ １４， ７０６-７１４ （２０１８）．

３５． Ｍａｍｍｅｎ， Ｍ．， Ｃｈｏｉ， Ｓ．－Ｋ． ＆ Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅｓ， Ｇ． Ｍ． Ｐｏｌｙｖａｌｅｎｔ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ： Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ Ｌｉｇａｎｄｓ ａｎｄ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ． Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ Ｉｎｔ Ｅｄ Ｅｎｇｌ ３７， ２７５４-２７９４ （１９９８）．

３６． Ｆｕｊｉｓａｗａ， Ｔ． ＆ Ｆｉｌｉｐｐａｋｏｐｏｕｌｏｓ， Ｐ． Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ｂｒｏｍｏｄｏｍａｉｎ－ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｒｏｌｅｓ ｉｎ ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ ａｎｄ ｃａｎｃｅｒ． Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １８， ２４６-２６２ （２０１７）．

３７． Ｒａｉｎａ， Ｋ． ｅｔ ａｌ． ＰＲＯＴＡＣ－ｉｎｄｕｃｅｄ ＢＥＴ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ａｓ ａ ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ｃａｓｔｒａｔｉｏｎ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ． Ｐ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕｓａ １１３， ７１２４-７１２９ （２０１６）．

３８． Ｗｉｎｔｅｒ， Ｇ． Ｅ． ｅｔ ａｌ． ＢＥＴ Ｂｒｏｍｏｄｏｍａｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｓ Ｍａｓｔｅｒ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒｓ Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｏｆ ＣＤＫ９ Ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ． Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ ６７， ５-１８．ｅ１９ （２０１７）．

３９． Ｆｒｏｓｔ， Ｊ． ｅｔ ａｌ． Ｐｏｔｅｎｔ ａｎｄ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｐｒｏｂｅ ｏｆ ｈｙｐｏｘｉｃ ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ ｏｆ ＨＩＦ－α ｈｙｄｒｏｘｙｌａｔｉｏｎ ｖｉａ ＶＨＬ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ． Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ ７， １３３１２ （２０１６）．
４０． Ｔａｎａｋａ， Ｍ． ｅｔ ａｌ． Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｉｖａｌｅｎｔ ＢＥＴ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ． Ｎａｔ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ １２， １０８９-１０９６ （２０１６）．
４１． Ｗａｒｉｎｇ， Ｍ． Ｊ． ｅｔ ａｌ． Ｐｏｔｅｎｔ ａｎｄ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｂｉｖａｌｅｎｔ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ ＢＥＴ ｂｒｏｍｏｄｏｍａｉｎｓ． Ｎａｔ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ １２， １０９７-１１０４ （２０１６）．

４２． Ｚｈｕ， Ｘ． Ｆ． ｅｔ ａｌ． Ｋｎｏｃｋｄｏｗｎ ｏｆ ｈｅｍｅ ｏｘｙｇｅｎａｓｅ－１ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ａｎｄ ａｕｔｏｐｈａｇｙ ａｎｄ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｔｈｅ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｏｆ ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ ｉｎ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ． Ｏｎｃｏｌ Ｌｅｔｔ １０， ２９７４-２９８０ （２０１５）．

４３． Ｒｕｎｃｉｅ， Ａ． Ｃ． ｅｔ ａｌ． Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ‘ｂｕｍｐ－ａｎｄ－ｈｏｌｅ’ ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ａｌｌｅｌｅ－ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ＢＥＴ ｂｒｏｍｏｄｏｍａｉｎ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ． Ｃｈｅｍ Ｓｃｉ ９， ２４５２-２４６８ （２０１８）．

４４． Ｓｍｉｔｈ， Ｂ． Ｅ． ｅｔ ａｌ． Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ＰＲＯＴＡＣ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｄｉｃｔａｔｅｄ ｂｙ ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｒｕｉｔｅｄ Ｅ３ ｌｉｇａｓｅ． Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ １０， １３１ （２０１９）．

４５． Ｈｕｇｈｅｓ， Ｓ． Ｊ． ＆ Ｃｉｕｌｌｉ， Ａ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｅｒｎａｒｙ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ： ａ ｎｅｗ ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ－ｇｕｉｄｅｄ ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｄｅｇｒａｄｅｒｓ． Ｅｓｓａｙｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ ６１， ５０５-５１６ （２０１７）．

４６． Ｆｉｓｈｅｒ， Ｓ． Ｌ． ＆ Ｐｈｉｌｌｉｐｓ， Ａ． Ｊ． Ｔａｒｇｅｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ｏｆ ｄｅｇｒａｄｅｒｓ． Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ ４４， ４７-５５ （２０１８）．

４７． Ｌｕｃａｓ， Ｘ．， Ｖａｎ Ｍｏｌｌｅ， Ｉ． ＆ Ｃｉｕｌｌｉ， Ａ． Ｓｕｒｆａｃｅ Ｐｒｏｂｉｎｇ ｂｙ Ｆｒａｇｍｅｎｔ－Ｂａｓｅｄ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ａｎｄ Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ Ｌｉｇａｎｄａｂｌｅ Ｐｏｃｋｅｔｓ ｏｎ ｔｈｅ ｖｏｎ Ｈｉｐｐｅｌ－Ｌｉｎｄａｕ （ＶＨＬ） Ｅ３ Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ Ｌｉｇａｓｅ． Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ６１， ７３８７-７３９３ （２０１８）．

４８． Ｓｕｎ， Ｑ． ｅｔ ａｌ． Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ｓｍａｌｌ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｔｈａｔ ｂｉｎｄ ｔｏ Ｋ－Ｒａｓ ａｎｄ ｉｎｈｉｂｉｔ Ｓｏｓ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ． Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ Ｉｎｔ Ｅｄ Ｅｎｇｌ ５１， ６１４０-６１４３ （２０１２）．
４９． Ｔａｋａｈａｓｈｉ， Ｄ． ｅｔ ａｌ． ＡＵＴＡＣｓ： Ｃａｒｇｏ－Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｄｅｇｒａｄｅｒｓ Ｕｓｉｎｇ Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ Ａｕｔｏｐｈａｇｙ． Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ ７６， ７９７-８１０．ｅ１０ （２０１９）．

５０． Ｙａｍａｚｏｅ， Ｓ． ｅｔ ａｌ． Ｈｅｔｅｒｏｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ Ｉｎｄｕｃｅ Ｄｅｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｋｉｎａｓｅｓ－Ａ Ｐｒｏｏｆ ｏｆ Ｃｏｎｃｅｐｔ Ｓｔｕｄｙ． Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ６３， ２８０７-２８１３ （２０２０）．
５１． Ｂａｎｉｋ， Ｓ． Ｍ． ｅｔ ａｌ． Ｌｙｓｏｓｏｍｅ－ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｃｈｉｍａｅｒａｓ ｆｏｒ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｐｒｏｔｅｉｎｓ． Ｎａｔｕｒｅ ５８４， ２９１-２９７ （２０２０）．
５２． Ｓｉｒｉｗａｒｄｅｎａ， Ｓ． Ｕ． ｅｔ ａｌ． Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ－Ｉｎｄｕｃｉｎｇ Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ｓｍａｌｌ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ． Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ １４２， １４０５２-１４０５７ （２０２０）．

５３． Ｇａｌｄｅａｎｏ， Ｃ． ｅｔ ａｌ． Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ－ｇｕｉｄｅｄ ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｍａｌｌ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｉｎ－ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ｖｏｎ Ｈｉｐｐｅｌ－Ｌｉｎｄａｕ （ＶＨＬ） Ｅ３ ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ ｌｉｇａｓｅ ａｎｄ ｔｈｅ ｈｙｐｏｘｉａ ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｆａｃｔｏｒ （ＨＩＦ） ａｌｐｈａ ｓｕｂｕｎｉｔ ｗｉｔｈ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｎａｎｏｍｏｌａｒ ａｆｆｉｎｉｔｉｅｓ． Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ５７， ８６５７-８６６３ （２０１４）．

５４． Ｇｉｒａｒｄｉｎｉ， Ｍ． ｅｔ ａｌ． Ｃｅｒｅｂｌｏｎ ｖｅｒｓｕｓ ＶＨＬ： Ｈｉｊａｃｋｉｎｇ Ｅ３ Ｌｉｇａｓｅｓ ａｇａｉｎｓｔ Ｅａｃｈ Ｏｔｈｅｒ Ｕｓｉｎｇ ＰＲＯＴＡＣｓ． Ｂｉｏｏｒｇ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ２７， ２４６６-２４７９ （２０１９）．

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【国際調査報告】