特表 2023-550644 安定な液状脂質ナノ粒子製剤

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-12-04

(54)【発明の名称】安定な液状脂質ナノ粒子製剤

(51)【国際特許分類】

   A61K 9/10 20060101AFI20231127BHJP

   A61K 31/7088 20060101ALI20231127BHJP

   A61K 47/26 20060101ALI20231127BHJP

   A61K 47/24 20060101ALI20231127BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20231127BHJP

   A61K 39/00 20060101ALI20231127BHJP

   A61K 47/22 20060101ALI20231127BHJP

   A61K 47/12 20060101ALI20231127BHJP

   A61K 47/02 20060101ALI20231127BHJP

   A61K 47/18 20170101ALI20231127BHJP

   A61K 47/28 20060101ALI20231127BHJP

   A61K 47/34 20170101ALI20231127BHJP

   A61P 37/04 20060101ALI20231127BHJP

   C12N 15/12 20060101ALI20231127BHJP

   C07K 14/00 20060101ALN20231127BHJP

【ＦＩ】

A61K9/10

A61K31/7088

A61K47/26

A61K47/24

A61K48/00

A61K39/00 E

A61K47/22

A61K47/12

A61K47/02

A61K47/18

A61K47/28

A61K47/34

A61P37/04

C12N15/12 ZNA

C07K14/00

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023531521

(86)(22)【出願日】2021-11-24

(85)【翻訳文提出日】2023-07-14

(86)【国際出願番号】 US2021060745

(87)【国際公開番号】W WO2022115547

(87)【国際公開日】2022-06-02

(31)【優先権主張番号】63/118,243

(32)【優先日】2020-11-25

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】517316797

【氏名又は名称】トランスレイト バイオ， インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100127926

【弁理士】

【氏名又は名称】結田 純次

(74)【代理人】

【識別番号】100140132

【弁理士】

【氏名又は名称】竹林 則幸

(74)【代理人】

【識別番号】100216105

【弁理士】

【氏名又は名称】守安 智

(72)【発明者】

【氏名】シュリーラン・カルヴィ

(72)【発明者】

【氏名】アシシュ・サロード

(72)【発明者】

【氏名】ナタリア・バルガス・モントジャ

(72)【発明者】

【氏名】プリヤール・パテル

(72)【発明者】

【氏名】フランク・デローザ

【テーマコード（参考）】

4C076

4C084

4C085

4C086

4H045

【Ｆターム（参考）】

4C076AA16

4C076BB15

4C076BB16

4C076CC06

4C076DD26Z

4C076DD38

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4C076DD50Z

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4C076EE23

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4C076FF36

4C076FF61

4C076FF63

4C084AA13

4C084MA21

4C084MA66

4C084NA03

4C084ZB091

4C084ZB092

4C085AA03

4C085BB23

4C085DD11

4C085EE05

4C085EE07

4C085GG03

4C085GG04

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4C086AA02

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4C086MA03

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4C086MA21

4C086MA66

4C086NA03

4C086ZB09

4H045AA10

4H045AA30

4H045BA10

4H045CA40

4H045DA13

4H045EA20

4H045FA74

(57)【要約】

本発明は、とりわけ、ペプチドまたはポリペプチドをコードするｍＲＮＡを封入する液状脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）製剤であって、－２０℃での複数回の凍結および再解凍の後の凝集およびｍＲＮＡ分解に抵抗性であるＬＮＰ製剤を提供する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

凝集およびｍＲＮＡ分解に抵抗性である、ペプチドまたはポリペプチドをコードするｍＲＮＡを封入する液状脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）製剤であって、
ａ．カチオン性脂質、非カチオン性脂質、ＰＥＧ修飾脂質、および場合によりコレステロールを含むかまたはそれからなる脂質成分を有する１つまたはそれ以上のＬＮＰ；
ｂ．１つまたはそれ以上の脂質ナノ粒子内に封入され、ペプチドまたはポリペプチドをコードするｍＲＮＡ；
ｃ．糖または糖アルコール；
ｄ．６．０～８．０であるＬＮＰ製剤のｐＨ；
ｅ．最小緩衝イオン強度でＬＮＰ製剤のｐＨを提供するｐＨ緩衝液；
ｆ．場合により、ＬＮＰ製剤にイオン強度を提供する１種またはそれ以上の追加の薬剤
を含み、（ｅ）からのｐＨ緩衝液の全濃度、および場合により（ｆ）からの１種またはそれ以上の追加の薬剤は、最小緩衝イオン強度よりも少なくとも２倍大きいＬＮＰ製剤のイオン強度を提供する、ＬＮＰ製剤。

【請求項2】

－２０℃での３回の凍結および再解凍後、最小緩衝イオン強度よりも少なくとも２倍大きいイオン強度の代わりに、ＬＮＰ製剤中の最小緩衝イオン強度のみを有する同一のＬＮＰ製剤と比較して、（ｉ）より少ない凝集、（ｉｉ）封入されたｍＲＮＡのより少ない分解、または（ｉｉｉ）（ｉ）と（ｉｉ）の両方を示す、請求項１に記載のＬＮＰ製剤。

【請求項3】

非カチオン性脂質が、１，２－ジエルコイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＥＰＥ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、パルミトイルオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、ジオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン４－（Ｎ－マレイミドメチル）－シクロヘキサン－１－カルボキシレート（ＤＯＰＥ－ｍａｌ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジミリストイルホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジステアロイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、１６－Ｏ－モノメチルＰＥ、１６－Ｏ－ジメチルＰＥ、１８－１－トランスＰＥ、または１－ステアロイル－２－オレオイル－ホスファチジエタノールアミン（ＳＯＰＥ）から選択される、請求項１に記載のＬＮＰ製剤。

【請求項4】

非カチオン性脂質がジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）である、請求項３に記載のＬＮＰ製剤。

【請求項5】

ＤＯＰＥが１０％またはそれ以上、例えば１０％～３０％の脂質モル比である、請求項４に記載のＬＮＰ製剤。

【請求項6】

カチオン性脂質がリピドイドであり、場合により、リピドイドが４０％～６０％、例えば４０％～５０％の脂質モル比である、請求項１～５のいずれか１項に記載のＬＮＰ製剤。

【請求項7】

ｍＲＮＡが対象において欠損しているタンパク質をコードする、請求項１～６のいずれか１項に記載のＬＮＰ製剤。

【請求項8】

ｍＲＮＡがワクチン抗原をコードする、請求項１～６のいずれか１項に記載のＬＮＰ製剤。

【請求項9】

糖または糖アルコールが、デキストロース、ソルビトール、トレハロース、スクロース、ラフィノース、デキストラン、およびイヌリンからなる群から選択される、請求項１～８のいずれか１項に記載のＬＮＰ製剤。

【請求項10】

糖が二糖である、請求項１～９のいずれか１項に記載のＬＮＰ製剤。

【請求項11】

二糖が約１％～２０％の濃度である、請求項１０に記載のＬＮＰ製剤。

【請求項12】

二糖が約２．５～３．０％の濃度である、請求項１１に記載のＬＮＰ製剤。

【請求項13】

二糖対緩衝液の比が０．２～０．５の間である、請求項１２に記載のＬＮＰ製剤。

【請求項14】

二糖がトレハロースである、請求項１０～１３のいずれか１項に記載のＬＮＰ製剤。

【請求項15】

ｐＨが約６．０～約８．０の間、例えば６．０～７．０、６．５～７．５または７．０～８．０である、請求項１～１４のいずれか１項に記載のＬＮＰ製剤。

【請求項16】

ｐＨが７．４である、請求項１に記載のＬＮＰ製剤。

【請求項17】

ｐＨ緩衝液が６．０～８．２の間のｐＫａを有する、請求項１～１６のいずれか１項に記載のＬＮＰ製剤。

【請求項18】

緩衝液が、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、イミダゾール緩衝液、ヒスチジン緩衝液、およびグッド緩衝液からなる群から選択される、請求項１７に記載のＬＮＰ製剤。

【請求項19】

グッド緩衝液がＴｒｉｓ緩衝液またはＨＥＰＥＳ緩衝液である、請求項１８に記載のＬＮＰ製剤。

【請求項20】

ｐＨ緩衝液が、リン酸緩衝液（例えば、クエン酸－リン酸緩衝液）、Ｔｒｉｓ緩衝液、またはイミダゾール緩衝液である、請求項１８または１９に記載のＬＮＰ製剤。

【請求項21】

最小緩衝イオン強度が、少なくとも７５ｍＭ、少なくとも１００ｍＭ、少なくとも１２５ｍＭ、少なくとも１５０ｍＭ、または少なくとも２００ｍＭである、請求項１～２０のいずれか１項に記載のＬＮＰ製剤。

【請求項22】

最小緩衝イオン強度が、約７５ｍＭ～２００ｍＭ、７５ｍＭ～１５０ｍＭ、７５ｍＭ～１００ｍＭ、または１００ｍＭ～２００ｍＭである、請求項２１に記載のＬＮＰ製剤。

【請求項23】

最小緩衝イオン強度が１００ｍＭ～２００ｍＭの間である、請求項２２に記載のＬＮＰ製剤。

【請求項24】

イオン強度を提供する１種またはそれ以上の薬剤が塩または糖を含む、請求項１～２３のいずれか１項に記載のＬＮＰ製剤。

【請求項25】

塩が、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、およびＣａＣｌ_２からなる群から選択され、糖がトレハロースである、請求項２４に記載のＬＮＰ製剤。

【請求項26】

イオン強度を提供する１種またはそれ以上の追加の薬剤の全濃度が、約５０～３００ｍＭ、５０～１５０ｍＭ、または７５～１２５ｍＭの間である、請求項１～２２のいずれか１項に記載のＬＮＰ製剤。

【請求項27】

ｐＨ緩衝液の全濃度が、約１５～２５０ｍＭ、３０～１５０ｍＭ、または４０～５０ｍＭの間である、請求項２６に記載のＬＮＰ製剤。

【請求項28】

イオン強度を提供するｐＨ緩衝液および１種またはそれ以上の追加の薬剤の全濃度が、約４０ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液および約５０～２００ｍＭのＮａＣｌ、約５０ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液および約５０ｍＭ～２００ｍＭのＮａＣｌ、約１００ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液および約５０ｍＭ～２００ｍＭのＮａＣｌ、約４０ｍＭイミダゾールおよび約５０ｍＭ～２００ｍＭのＮａＣｌ、約５０ｍＭイミダゾールおよび約５０ｍＭ～２００ｍＭのＮａＣｌ、約１００ｍＭイミダゾールおよび５０ｍＭ～２００ｍＭのＮａＣｌ、約４０ｍＭリン酸塩および５０ｍＭ～２００ｍＭのＮａＣｌ、約５０ｍＭリン酸塩および５０～２００ｍＭのＮａＣｌ、約１００ｍＭリン酸塩および５０～２００ｍＭのＮａＣｌから選択される、請求項２６に記載のＬＮＰ製剤。

【請求項29】

ＬＮＰ製剤のイオン強度が、最小緩衝イオン強度よりも少なくとも２．２５倍大きい、少なくとも２．５倍大きい、少なくとも２．７５倍大きい、少なくとも３倍大きい、少なくとも３．５倍大きい、少なくとも４倍大きい、少なくとも４．５倍大きい、少なくとも５倍大きい、請求項１～２８のいずれか１項に記載のＬＮＰ製剤。

【請求項30】

ＬＮＰ製剤のイオン強度が、最小緩衝イオン強度の２０倍未満、１９倍未満、１８倍未満、１７倍未満、１６倍未満、１５倍未満、１４倍未満、１３倍未満、１２倍未満、１１倍未満、１０倍未満、９倍未満、８倍未満、７倍未満、６倍未満、５倍未満、４倍未満である、請求項１～２８のいずれか１項に記載のＬＮＰ製剤。

【請求項31】

ＬＮＰ製剤のイオン強度が、最小緩衝イオン強度よりも少なくとも２倍大きく２０倍未満であり、ＬＮＰ製剤のイオン強度が、約１５０ｍＭ～７５０ｍＭ、１５０ｍＭ～５００ｍＭ、１５０ｍＭ～４００ｍＭ、１５０ｍＭ～３００ｍＭ、１５０ｍＭおよび２００ｍＭの間である、請求項１～３０のいずれか１項に記載のＬＮＰ製剤。

【請求項32】

ＬＮＰ製剤のイオン強度が、最小緩衝イオン強度よりも少なくとも２倍大きく２０倍未満であり、ＬＮＰ製剤のイオン強度が１５０ｍＭ以上である、請求項１～３１のいずれか１項に記載のＬＮＰ製剤。

【請求項33】

凝集がより少ないことが濁度分析によって決定される、請求項１～３２のいずれか１項に記載のＬＮＰ製剤。

【請求項34】

封入されたｍＲＮＡの分解が少ないことを濁度分析によって決定される、請求項１～３３のいずれか１項に記載のＬＮＰ製剤。

【請求項35】

－２０℃での３回を超える凍結および再解凍後、ＬＮＰ製剤は、最小緩衝イオン強度よりも少なくとも２倍大きいイオン強度の代わりに、ＬＮＰ製剤中の最小緩衝イオン強度のみを有する同一のＬＮＰ製剤と比較して、（ｉ）より少ない凝集、（ｉｉ）封入されたｍＲＮＡのより少ない分解、または（ｉｉｉ）（ｉ）と（ｉｉ）の両方を示す、請求項１～３４のいずれか１項に記載のＬＮＰ製剤。

【請求項36】

ＬＮＰが約１００ｎｍ未満の直径を有する、請求項１～３５のいずれか１項に記載のＬＮＰ製剤。

【請求項37】

ＬＮＰが約７０ｎｍ～９０ｎｍの間の直径を有する、請求項３２に記載のＬＮＰ製剤。

【請求項38】

脂質成分が、ＤＭＧ－ＰＥＧ－２０００、ｃＫＫ－Ｅ１０、コレステロール、およびＤＯＰＥを含むかまたはそれからなる、請求項１～３７のいずれか１項に記載のＬＮＰ製剤。

【請求項39】

Ｎ／Ｐ比が約３～５の間である、請求項１～３８のいずれか１項に記載のＬＮＰ製剤。

【請求項40】

Ｎ／Ｐ比が約４である、請求項３９に記載のＬＮＰ製剤。

【請求項41】

ｍＲＮＡが、約０．０５ｍｇ／ｍＬ～１．０ｍｇ／ｍＬの間の最終濃度である、請求項１～４０のいずれか１項に記載のＬＮＰ製剤。

【請求項42】

ｍＲＮＡが、約０．２ｍｇ／ｍＬ～０．５ｍｇ／ｍＬの間の濃度である、請求項４１に記載のＬＮＰ製剤。

【請求項43】

ＬＮＰが、少なくとも３カ月間、６カ月間、１２カ月間、または１２カ月間を超えて－２０℃で安定である、請求項１～４２のいずれか１項に記載のＬＮＰ製剤。

【請求項44】

希釈後に安定である、請求項１～４３のいずれか１項に記載のＬＮＰ製剤。

【請求項45】

製剤の皮下または筋肉内送達が、３００ｍＭまたはそれ未満の濃度、および約７．０～７．５の間のｐＨを有する緩衝液を含まない製剤と比較して、疼痛の減少を伴う、請求項１～４４のいずれか１項に記載のＬＮＰ製剤。

【請求項46】

疼痛減少が、１０ｃｍの視覚アナログスケール（ＶＡＳ）または６項目の言語評価スケール（ＶＲＳ）によって評価される、請求項４５に記載のＬＮＰ製剤。

【請求項47】

ＬＮＰの分解および／または凝集を減少する方法であって、請求項１～４６のいずれか１項に記載の製剤中にＬＮＰを貯蔵することを含む、方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年１１月２５日に出願された米国仮特許出願第６３／１１８，２４３号の優先権および利益を主張し、その内容は全体が参照により本明細書に組み入れられる。

【背景技術】

【0002】

核酸ベースの技術は、限定されないが、メッセンジャーＲＮＡ療法を含む種々の治療的応用にとってますます重要になっている。核酸を送達するための努力には、インビボで送達した場合の分解から核酸を保護するように調製された組成物の作製が含まれている。核酸用の送達ビヒクルの１つのタイプは、脂質ナノ粒子である。送達ビヒクルとしての脂質ナノ粒子の使用を成功させるために考慮すべき重要なパラメータには、脂質ナノ粒子形成、脂質成分の物理的性質、核酸封入効率、インビボ核酸放出ポテンシャル、および脂質ナノ粒子毒性が含まれる。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0003】

凍結／解凍サイクルに抵抗性である安定な脂質ナノ粒子の生成は、当技術分野では依然として課題である。

【課題を解決するための手段】

【0004】

本発明は、とりわけ、－２０℃での複数回の凍結および再解凍後の凝集および／またはｍＲＮＡ分解に抵抗性であるペプチドまたはポリペプチドをコードするｍＲＮＡを封入する液状脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）製剤を提供する。本発明者らは驚くべきことに、高いイオン強度を有するＬＮＰ製剤が、複数回の凍結および解凍後に、ＬＮＰの凝集および／またはｍＲＮＡ分解を防止することを発見した。本発明者らは驚くべきことに、安定で凝集および／またはｍＲＮＡ分解に抵抗性である高イオン強度ＬＮＰ製剤が、より高い緩衝強度またはＬＮＰ製剤中の高い塩濃度のいずれかを用いることによって達成され得ることを発見した。

【0005】

一部の態様では、液状脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）製剤は、凝集およびｍＲＮＡ分解に抵抗性であるペプチドまたはポリペプチドをコードするｍＲＮＡを封入するように提供され、ＬＮＰ製剤は、ａ．カチオン性脂質、非カチオン性脂質、ＰＥＧ修飾脂質、および場合によりコレステロールを含むかまたはそれからなる脂質成分を有する１つまたはそれ以上のＬＮＰ；ｂ．１つまたはそれ以上の脂質ナノ粒子内に封入され、ペプチドまたはポリペプチドをコードするｍＲＮＡ；ｃ．糖または糖アルコール；ｄ．６．０～８．０であるＬＮＰ製剤のｐＨ；ｅ．最小緩衝イオン強度でＬＮＰ製剤のｐＨを提供するｐＨ緩衝液；ｆ．場合により、ＬＮＰ製剤にイオン強度を提供する１種またはそれ以上の追加の薬剤を含み、（ｅ）からのｐＨ緩衝液の全濃度、および場合により（ｆ）からの１種またはそれ以上の追加の薬剤は、最小緩衝イオン強度よりも少なくとも２倍大きいＬＮＰ製剤のイオン強度を提供し、－２０℃での３回の凍結および再解凍後、ＬＮＰ製剤が、最小緩衝イオン強度よりも少なくとも２倍大きいイオン強度の代わりに、ＬＮＰ製剤中の最小緩衝イオン強度のみを有する同一のＬＮＰ製剤と比較して、（ｉ）より少ない凝集、（ｉｉ）封入されたｍＲＮＡのより少ない分解、または（ｉｉｉ）（ｉ）と（ｉｉ）の両方を示す。

【0006】

一部の実施形態では、ＬＮＰ製剤は、１つまたはそれ以上の凍結保護剤を含む。凍結保護剤は、浸透性であるかまたは非浸透性であり得る。例えば、一部の実施形態では、浸透性凍結保護剤は、グリセリン、エチレングリコール、トリエチレングリコール、プロピレングリコール、またはテトラエチレングリコールを含む。したがって、一部の実施形態では、浸透性凍結保護剤はグリセリンを含む。一部の実施形態では、浸透性凍結保護剤はエチレングリコールを含む。一部の実施形態では、浸透性凍結保護剤はトリエチレングリコールを含む。一部の実施形態では、浸透性凍結保護剤はプロピレングリコールを含む。一部の実施形態では、浸透性凍結保護剤はテトラエチレングリコールを含む。

【0007】

一部の実施形態では、非浸透性凍結保護剤は、糖および／またはポリマーから選択される。例えば、一部の実施形態では、非浸透性凍結保護剤は、以下の糖：デキストロース、ソルビトール、トレハロース、スクロース、ラフィノース、デキストラン、またはイヌリンのうちの１つまたはそれ以上から選択される。したがって、一部の実施形態では、非浸透性凍結保護剤はデキストロースを含む。一部の実施形態では、非浸透性凍結保護剤はソルビトールを含む。一部の実施形態では、非浸透性凍結保護剤はトレハロースを含む。一部の実施形態では、非浸透性凍結保護剤はスクロースを含む。一部の実施形態では、非浸透性凍結保護剤はラフィノースを含む。一部の実施形態では、非浸透性凍結保護剤はデキストランを含む。一部の実施形態では、非浸透性凍結保護剤はイヌリンを含む。

【0008】

一部の実施形態では、非浸透性凍結保護剤は、以下のポリマー：ＰＶＰ、ＰＶＡ、ポロキサマー、またはＰＥＧのうちの１つまたはそれ以上から選択される。したがって、一部の実施形態では、非浸透性凍結保護剤はＰＶＰから選択される。一部の実施形態では、非浸透性凍結保護剤はポロキサマーから選択される。一部の実施形態では、非浸透性凍結保護剤はＰＥＧから選択される。

【0009】

一部の実施形態では、ＬＮＰ中のｍＲＮＡの安定な液状溶液を作製する方法が提供される。例えば、一部の実施形態では、ＬＮＰに封入されたｍＲＮＡは、インビトロ転写（ＩＶＴ）によって産生される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼのような適切なＲＮＡポリメラーゼを用いて合成される。したがって、一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼを用いて合成される。ＬＮＰは、例えば、カチオン性脂質、非カチオン性脂質、ＰＥＧ修飾脂質、および場合によりコレステロールを含む。

【0010】

一部の実施形態では、非カチオン性脂質は、１，２－ジエルコイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＥＰＥ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、パルミトイルオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、ジオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン４－（Ｎ－マレイミドメチル）－シクロヘキサン－１－カルボキシレート（ＤＯＰＥ－ｍａｌ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジミリストイルホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジステアロイル－ホスファチジル－エタノールアミン（ＤＳＰＥ）、１６－Ｏ－モノメチルＰＥ、１６－Ｏ－ジメチルＰＥ、１８－１－トランスＰＥ、または１－ステアロイル－２－オレオイル－ホスファチジエタノールアミン（ＳＯＰＥ）から選択される。

【0011】

一部の実施形態では、非カチオン性脂質は、１０％より高いモル比である。例えば、一部の実施形態では、非カチオン性脂質は、脂質モル比が１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、または５０％である。一部の実施形態では、非カチオン性脂質は、脂質モル比が約１５％である。一部の実施形態では、非カチオン性脂質は、脂質モル比が約２０％である。一部の実施形態では、非カチオン性脂質は、脂質モル比が約２５％である。一部の実施形態では、非カチオン性脂質は、脂質モル比が約３０％である。一部の実施形態では、非カチオン性脂質は、脂質モル比が約３５％である。一部の実施形態では、非カチオン性脂質は、脂質モル比が約４０％である。一部の実施形態では、非カチオン性脂質は、脂質モル比が約４５％である。一部の実施形態では、非カチオン性脂質は脂質モル比が、約５０％である。

【0012】

一部の実施形態では、非カチオン性脂質は、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）である。

【0013】

一部の実施形態では、ＤＯＰＥは、１０％より高い脂質モル比である。例えば、一部の実施形態では、ＤＯＰＥは、脂質モル比が１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、または５０％である。一部の実施形態では、ＤＯＰＥは、脂質モル比が約１５％である。一部の実施形態では、ＤＯＰＥは、脂質モル比が約２０％である。一部の実施形態では、ＤＯＰＥは、脂質モル比が約２５％である。一部の実施形態では、ＤＯＰＥは、脂質モル比が約３０％である。一部の実施形態では、ＤＯＰＥは、脂質モル比が約３５％である。一部の実施形態では、ＤＯＰＥは、脂質モル比が約４０％である。一部の実施形態では、ＤＯＰＥは、脂質モル比が約４５％である。一部の実施形態では、ＤＯＰＥは、脂質モル比が約５０％である。一部の実施形態では、ＤＯＰＥは、脂質モル比が約１０％～３０％の間である。

【0014】

一部の実施形態では、カチオン性脂質はリピドイドである。一部の実施形態では、リピドイドは、モル比が、例えば、約４０％～６０％である。一部の実施形態では、リピドイドは、モル比が約５０％～６０％である。一部の実施形態では、リピドイドは、モル比が約４０％である。一部の実施形態では、リピドイドは、モル比が約５０％である。一部の実施形態では、リピドイドは、モル比が約６０％である。

【0015】

一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、対象において欠損しているタンパク質をコードする。例えば、一部の実施形態では、対象において欠損しているタンパク質はＣＦＴＲである。

【0016】

一部の実施形態では、ｍＲＮＡはワクチン抗原をコードする。例えば、一部の実施形態では、ワクチン抗原はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原である。

【0017】

一部の実施形態では、糖は二糖である。一部の実施形態では、二糖はトレハロースである。

【0018】

一部の実施形態では、糖または糖アルコールは、デキストロース、ソルビトール、トレハロース、スクロース、ラフィノース、デキストラン、およびイヌリンからなる群から選択される。したがって、一部の実施形態では、糖または糖アルコールはデキストロースである。一部の実施形態では、糖または糖アルコールはソルビトールである。一部の実施形態では、糖または糖アルコールはトレハロースである。一部の実施形態では、糖または糖アルコールはスクロースである。一部の実施形態では、糖または糖アルコールはラフィノースである。一部の実施形態では、糖または糖アルコールはデキストランである。一部の実施形態では、糖または糖アルコールはイヌリンである。

【0019】

一部の実施形態では、トレハロースは、濃度が約１％～２０％の間である。一部の実施形態では、トレハロースは、濃度が約２．５％～３．０％の間である。一部の実施形態では、トレハロースは、濃度が約５．０％～１５％の間である。一部の実施形態では、トレハロースは、濃度が約１０％～２０％の間である。

【0020】

一部の実施形態では、ｐＨは、約６．０～約８．０の間である。例えば、一部の実施形態では、ｐＨは、約６．０～７．０、６．５～７．５または７．０～８．０の間である。したがって、一部の実施形態では、ｐＨは約６．０～７．０の間である。一部の実施形態では、ｐＨは約６．５～７．５の間である。一部の実施形態では、ｐＨは約７．０～８．０の間である。一部の実施形態では、ｐＨは約７．４である。一部の実施形態では、ｐＨは、７．４である。

【0021】

一部の実施形態では、ｐＨ緩衝液は、６．０～８．２の間のｐＫａを有する。したがって、一部の実施形態では、ｐＨ緩衝液は、約６．２、６．４、６．６、６．８、７．０、７．２、７．４、７．６、７．８、８．０、または８．２のｐＫａを有する。一部の実施形態では、ｐＨ緩衝液は約６．２のｐＫａを有する。一部の実施形態では、ｐＨ緩衝液は約６．４のｐＫａを有する。一部の実施形態では、ｐＨ緩衝液は約６．６のｐＫａを有する。一部の実施形態では、ｐＨ緩衝液は約６．８のｐＫａを有する。一部の実施形態では、ｐＨ緩衝液は約７．０のｐＫａを有する。一部の実施形態では、ｐＨ緩衝液は約７．２のｐＫａを有する。一部の実施形態では、ｐＨ緩衝液は約７．４のｐＫａを有する。一部の実施形態では、ｐＨ緩衝液は約７．６のｐＫａを有する。一部の実施形態では、ｐＨ緩衝液は約７．８のｐＫａを有する。一部の実施形態では、ｐＨ緩衝液は約８．０のｐＫａを有する。一部の実施形態では、ｐＨ緩衝液は約８．２のｐＫａを有する。

【0022】

一部の実施形態では、緩衝液は、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、イミダゾール緩衝液、ヒスチジン緩衝液、およびグッド緩衝液からなる群から選択される。したがって、一部の実施形態では、緩衝液はリン酸緩衝液である。一部の実施形態では、緩衝液はクエン酸緩衝液である。一部の実施形態では、緩衝液はイミダゾール緩衝液である。一部の実施形態では、緩衝液はヒスチジン緩衝液である。一部の実施形態では、緩衝液はグッド緩衝液である。一部の実施形態では、グッド緩衝液は、Ｔｒｉｓ緩衝液またはＨＥＰＥＳ緩衝液である。

【0023】

一部の実施形態では、ｐＨ緩衝液は、リン酸緩衝液（例えば、クエン酸－リン酸緩衝液）、Ｔｒｉｓ緩衝液、またはイミダゾール緩衝液である。

【0024】

一部の実施形態では、最小緩衝イオン強度は、少なくとも７５ｍＭ、少なくとも１００ｍＭ、少なくとも１２５ｍＭ、少なくとも１５０ｍＭ、または少なくとも２００ｍＭである。したがって、一部の実施形態では、最小緩衝イオン強度は、少なくとも７５ｍＭである。一部の実施形態では、最小緩衝イオン強度は、少なくとも１００ｍＭである。一部の実施形態では、最小緩衝イオン強度は、少なくとも１２５ｍＭである。一部の実施形態では、最小緩衝イオン強度は、少なくとも１５０ｍＭである。一部の実施形態では、最小緩衝イオン強度は、少なくとも２００ｍＭである。

【0025】

一部の実施形態では、最小緩衝イオン強度は、約７５ｍＭ～２００ｍＭ、７５ｍＭ～１５０ｍＭ、７５ｍＭ～１００ｍＭ、または１００ｍＭ～２００ｍＭの間である。したがって、一部の実施形態では、最小緩衝イオン強度は、約７５ｍＭ～２００ｍＭの間である。一部の実施形態では、最小緩衝イオン強度は、約７５ｍＭ～１５０ｍＭの間である。一部の実施形態では、最小緩衝イオン強度は、約７５ｍＭ～１００ｍＭの間である。一部の実施形態では、最小緩衝イオン強度は、約１００ｍＭ～２００ｍＭの間である。

【0026】

一部の実施形態では、最小緩衝イオン強度は、製剤中の緩衝液濃度を増加させること、および／または製剤中の塩濃度を増加させることのいずれかによって得られる。したがって、一部の実施形態では、最小緩衝イオン強度は、緩衝液濃度を増加させることによって得られる。一部の実施形態では、最小緩衝イオン強度は、製剤の塩濃度を増加させることによって得られる。一部の実施形態では、最小緩衝イオン強度は、製剤中の緩衝液濃度を増加させることによって、および製剤中の塩濃度を増加させることによって得られる。

【0027】

一部の実施形態では、二糖対緩衝液の比は０．１～０．９の間である。一部の実施形態では、二糖対緩衝液の比は０．１～０．７の間である。一部の実施形態では、二糖対緩衝液の比は０．２～０．７の間である。一部の実施形態では、二糖対緩衝液の比は０．２～０．５の間である。

【0028】

一部の実施形態では、イオン強度を提供する１つまたはそれ以上の薬剤は塩を含む。一部の実施形態では、塩は、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、およびＣａＣｌ_２からなる群から選択される。したがって、一部の実施形態では、塩はＮａＣｌである。一部の実施形態では、塩はＫＣｌである。一部の実施形態では、塩はＣａＣｌ_２である。

【0029】

一部の実施形態では、イオン強度を提供する１種またはそれ以上の追加の薬剤の全濃度は、約５０～５００ｍＭ、１００～４００ｍＭ、または２００～３００ｍＭの間である。したがって、一部の実施形態では、１つまたはそれ以上の薬剤の全濃度は約５０～５００ｍＭの間である。一部の実施形態では、１つまたはそれ以上の薬剤の全濃度は約１００～４００ｍＭの間である。一部の実施形態では、１つまたはそれ以上の薬剤の全濃度は約２００～３００ｍＭの間である。一部の実施形態では、イオン強度を提供する１つまたはそれ以上の薬剤の全濃度は、約５０～３００ｍＭ、５０～１５０ｍＭ、または７５～１２５ｍＭの間である。一部の実施形態では、イオン強度を提供する１つまたはそれ以上の薬剤の全濃度は、約５０～３００ｍＭの間である。一部の実施形態では、イオン強度を提供する１つまたはそれ以上の薬剤の全濃度は、約５０～１５０ｍＭの間である。一部の実施形態では、イオン強度を提供する１つまたはそれ以上の薬剤の全濃度は、約７５～１２５ｍＭの間である。

【0030】

一部の実施形態では、ｐＨ緩衝液の全濃度は、約１００～３００ｍＭ、２００～３００ｍＭ、または２５０～３００ｍＭの間である。したがって、一部の実施形態では、ｐＨ緩衝液の全濃度は約１００～３００ｍＭの間である。一部の実施形態では、ｐＨ緩衝液の全濃度は２００～３００ｍＭの間である。一部の実施形態では、ｐＨ緩衝液の全濃度は２５０～３００ｍＭの間である。一部の実施形態では、ｐＨ緩衝液の全濃度は約１５～２５０ｍＭ、３０～１５０ｍＭ、または４０～５０ｍＭの間である。したがって、一部の実施形態では、ｐＨ緩衝液の全濃度は約１５～２５０ｍＭの間である。一部の実施形態では、ｐＨ緩衝液の全濃度は約３０～１５０ｍＭの間である。一部の実施形態では、ｐＨ緩衝液の全濃度は約４０～５０ｍＭの間である。

【0031】

一部の実施形態では、ｐＨ緩衝液およびイオン強度を提供する１種またはそれ以上の追加の薬剤の全濃度は、約４０ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液および約７５～２００ｍＭのＮａＣｌ、約５０ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液および約７５ｍＭ～２００ｍＭのＮａＣｌ、約１００ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液および約７５ｍＭ～２００ｍＭのＮａＣｌ、約４０ｍＭイミダゾールおよび約７５ｍＭ～２００ｍＭのＮａＣｌ、約５０ｍＭイミダゾールおよび７５ｍＭ～２００ｍＭのＮａＣｌ、約１００ｍＭイミダゾールおよび７５ｍＭ～２００ｍＭのＮａＣｌ、約４０ｍＭリン酸塩および約７５～２００ｍＭのＮａＣｌ、約５０ｍＭリン酸塩および約７５～２００ｍＭのＮａＣｌ、約１００ｍＭリン酸塩および７５～２００ｍＭのＮａＣｌから選択される。したがって、一部の実施形態では、ｐＨ緩衝液およびイオン強度を提供する１種またはそれ以上の追加の薬剤の全濃度は、約４０ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液および約７５～２００ｍＭのＮａＣｌである。一部の実施形態では、ｐＨ緩衝液およびイオン強度を提供する１種またはそれ以上の追加の薬剤の全濃度は、約５０ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液および約７５ｍＭ～２００ｍＭのＮａＣｌである。一部の実施形態では、ｐＨ緩衝液およびイオン強度を提供する１種またはそれ以上の追加の薬剤の全濃度は、約１００ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液および約７５ｍＭ～２００ｍＭのＮａＣｌである。一部の実施形態では、ｐＨ緩衝液およびイオン強度を提供する１種またはそれ以上の追加の薬剤の全濃度は、約４０ｍＭイミダゾールおよび約７５ｍＭ～２００ｍＭのＮａＣｌである。一部の実施形態では、ｐＨ緩衝液およびイオン強度を提供する１種またはそれ以上の追加の薬剤の全濃度は、５０ｍＭイミダゾールおよび７５ｍＭ～２００ｍＭのＮａＣｌである。一部の実施形態では、ｐＨ緩衝液およびイオン強度を提供する１種またはそれ以上の追加の薬剤の全濃度は、１００ｍＭイミダゾールおよび７５ｍＭ～２００ｍＭのＮａＣｌである。一部の実施形態では、ｐＨ緩衝液およびイオン強度を提供する１種またはそれ以上の追加の薬剤の全濃度は、約４０ｍＭイミダゾール、約７５ｍＭ～２００ｍＭのＮａＣｌ、および２．５～１０％トレハロースである。一部の実施形態では、ｐＨ緩衝液およびイオン強度を提供する１種またはそれ以上の追加の薬剤の全濃度は、５０ｍＭイミダゾール、約７５ｍＭ～２００ｍＭのＮａＣｌ、および２．５～１０％トレハロースである。一部の実施形態では、ｐＨ緩衝液およびイオン強度を提供する１種またはそれ以上の追加の薬剤の全濃度は、１００ｍＭイミダゾール、約７５ｍＭ～２００ｍＭのＮａＣｌ、および２．５～１０％トレハロースである。

【0032】

一部の実施形態では、ＬＮＰ製剤のイオン強度は、最小緩衝イオン強度よりも少なくとも２．２５倍大きい、少なくとも２．５倍大きい、少なくとも２．７５倍大きい、少なくとも３倍大きい、少なくとも３．５倍大きい、少なくとも４倍大きい、少なくとも４．５倍大きい、少なくとも５倍大きい。したがって、一部の実施形態では、ＬＮＰ製剤のイオン強度は、最小緩衝イオン強度の少なくとも２．２５倍大きい。一部の実施形態では、ＬＮＰ製剤のイオン強度は、最小緩衝イオン強度の少なくとも２．５倍大きい。一部の実施形態では、ＬＮＰ製剤のイオン強度は、最小緩衝イオン強度の少なくとも２．７５倍大きい。一部の実施形態では、ＬＮＰ製剤のイオン強度は、最小緩衝イオン強度の少なくとも３．０倍大きい。一部の実施形態では、ＬＮＰ製剤のイオン強度は、最小緩衝イオン強度の少なくとも３．５倍大きい。一部の実施形態では、ＬＮＰ製剤のイオン強度は、最小緩衝イオン強度の少なくとも４．０倍大きい。一部の実施形態では、ＬＮＰ製剤のイオン強度は、最小緩衝イオン強度の少なくとも４．５倍大きい。一部の実施形態では、ＬＮＰ製剤のイオン強度は、最小緩衝イオン強度の少なくとも５．０倍大きい。

【0033】

一部の実施形態では、ＬＮＰ製剤のイオン強度は、最小緩衝イオン強度の２０倍未満、１９倍未満、１８倍未満、１７倍未満、１６倍未満、１５倍未満、１４倍未満、１３倍未満、１２倍未満、１１倍未満、１０倍未満、９倍未満、８倍未満、７倍未満、６倍未満、５倍未満、４倍未満である。したがって、一部の実施形態では、ＬＮＰ製剤のイオン強度は、最小緩衝イオン強度の２０倍未満である。一部の実施形態では、ＬＮＰ製剤のイオン強度は、最小緩衝イオン強度の１９倍未満である。一部の実施形態では、ＬＮＰ製剤のイオン強度は、最小緩衝イオン強度の１８倍未満である。一部の実施形態では、ＬＮＰ製剤のイオン強度は、最小緩衝イオン強度の１７倍未満である。一部の実施形態では、ＬＮＰ製剤のイオン強度は、最小緩衝イオン強度の１６倍未満である。一部の実施形態では、ＬＮＰ製剤のイオン強度は、最小緩衝イオン強度の１５倍未満である。一部の実施形態では、ＬＮＰ製剤のイオン強度は、最小緩衝イオン強度の１４倍未満である。一部の実施形態では、ＬＮＰ製剤のイオン強度は、最小緩衝イオン強度の１３倍未満である。一部の実施形態では、ＬＮＰ製剤のイオン強度は、最小緩衝イオン強度の１２倍未満である。一部の実施形態では、ＬＮＰ製剤のイオン強度は、最小緩衝イオン強度の１１倍未満である。一部の実施形態では、ＬＮＰ製剤のイオン強度は、最小緩衝イオン強度の１０倍未満である。一部の実施形態では、ＬＮＰ製剤のイオン強度は、最小緩衝イオン強度の９倍未満である。一部の実施形態では、ＬＮＰ製剤のイオン強度は、最小緩衝イオン強度の８倍未満である。一部の実施形態では、ＬＮＰ製剤のイオン強度は、最小緩衝イオン強度の７倍未満である。一部の実施形態では、ＬＮＰ製剤のイオン強度は、最小緩衝イオン強度の６倍未満である。一部の実施形態では、ＬＮＰ製剤のイオン強度は、最小緩衝イオン強度の５倍未満である。一部の実施形態では、ＬＮＰ製剤のイオン強度は、最小緩衝イオン強度の４倍未満である。

【0034】

一部の実施形態では、ＬＮＰ製剤のイオン強度は、最小緩衝イオン強度よりも少なくとも２倍大きく２０倍未満であり、ＬＮＰ製剤のイオン強度は、約１５０ｍＭ～７５０ｍＭ、１５０ｍＭ～５００ｍＭ、１５０ｍＭ～４００ｍＭ、１５０ｍＭ～３００ｍＭ、１５０ｍＭおよび２００ｍＭの間である。したがって、一部の実施形態では、ＬＮＰ製剤のイオン強度は、最小緩衝イオン強度の少なくとも２倍大きく２０倍未満であり、ＬＮＰ製剤のイオン強度は約１５０ｍＭ～７５０ｍＭの間である。一部の実施形態では、ＬＮＰ製剤のイオン強度は、最小緩衝イオン強度の少なくとも２倍大きく２０倍未満であり、ＬＮＰ製剤のイオン強度は約１５０ｍＭ～５００ｍＭの間である。一部の実施形態では、ＬＮＰ製剤のイオン強度は、最小緩衝イオン強度よりも少なくとも２倍大きく２０倍未満であり、ＬＮＰ製剤のイオン強度は約１５０ｍＭ～４００ｍＭの間である。一部の実施形態では、ＬＮＰ製剤のイオン強度は、最小緩衝イオン強度よりも少なくとも２倍大きく２０倍未満であり、ＬＮＰ製剤のイオン強度は約１５０ｍＭ～３００ｍＭの間である。一部の実施形態では、ＬＮＰ製剤のイオン強度は、最小緩衝イオン強度よりも少なくとも２倍大きく２０倍未満であり、ＬＮＰ製剤のイオン強度は約１５０ｍＭ～２００ｍＭの間である。

【0035】

一部の実施形態では、ＬＮＰ製剤のイオン強度は、最小緩衝イオン強度よりも少なくとも２倍大きく２０倍未満であり、ＬＮＰ製剤のイオン強度は１５０ｍＭであるかまたは１５０ｍＭより大きい。

【0036】

一部の実施形態では、より少ない凝集を濁度分析によって決定する。一部の実施形態では、封入されたｍＲＮＡの分解が少ないことを濁度分析によって決定する。濁度を測定する様々な方法を使用することができ、例えば、視覚分析および／または分光分析の使用が含まれる。

【0037】

一部の実施形態では、－２０℃での３回を超える凍結および再解凍後、ＬＮＰ製剤は、（ｉ）最小緩衝イオン強度よりも少なくとも２倍大きいイオン強度の代わりに、ＬＮＰ製剤中の最小緩衝イオン強度のみを有する同一のＬＮＰ製剤と比較して、（ｉ）より少ない凝集、（ｉｉ）封入されたｍＲＮＡのより少ない分解、または（ｉｉｉ）（ｉ）と（ｉｉ）の両方を示す。

【0038】

一部の実施形態では、ＬＮＰは、約１００ｎｍ未満の直径を有する。一部の実施形態では、ＬＮＰは、約７０ｎｍ～９０ｎｍの間の直径を有する。例えば、一部の実施形態では、ＬＮＰは、約７０ｎｍ～８５ｎｍの間の直径を有する。一部の実施形態では、ＬＮＰは、約７０ｎｍ～８０ｎｍの間の直径を有する。一部の実施形態では、ＬＮＰは、約７０ｎｍ～７５ｎｍの間の直径を有する。一部の実施形態では、ＬＮＰは、約８０ｎｍ～９０ｎｍの間の直径を有する。一部の実施形態では、ＬＮＰは、約８５ｎｍ～９０ｎｍの間の直径を有する。一部の実施形態では、ＬＮＰは、約７５ｎｍ～９０ｎｍの間の直径を有する。一部の実施形態では、ＬＮＰは、約７５ｎｍ～８５ｎｍの間の直径を有する。一部の実施形態では、ＬＮＰは、約７５ｎｍ～８０ｎｍの間の直径を有する。一部の実施形態では、ＬＮＰは、約７０ｎｍ未満の直径を有する。

【0039】

一部の実施形態では、脂質成分は、ＤＭＧ－ＰＥＧ－２０００、ｃＫＫ－Ｅ１０、コレステロール、およびＤＯＰＥを含むかまたはそれからなる。したがって、一部の実施形態では、脂質成分は、ＤＭＧ－ＰＥＧ－２０００、ｃＫＫ－Ｅ１０、コレステロール、およびＤＯＰＥを含む。一部の実施形態では、脂質成分は、ＤＭＧ－ＰＥＧ－２０００、ｃＫＫ－Ｅ１０、コレステロール、およびＤＯＰＥからなる。

【0040】

一部の実施形態では、Ｎ／Ｐ比は約３～５の間である。例えば、一部の実施形態では、Ｎ／Ｐ比は約３である。一部の実施形態では、Ｎ／Ｐ比は約４である。一部の実施形態では、Ｎ／Ｐ比は約５である。

【0041】

一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、最終濃度が約０．０５ｍｇ／ｍＬ～１．０ｍｇ／ｍＬの間である。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、最終濃度が約０．０５ｍｇ／ｍＬである。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、最終濃度が約０．１ｍｇ／ｍＬである。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、最終濃度が約０．１ｍｇ／ｍＬである。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、最終濃度が約０．２ｍｇ／ｍＬである。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、最終濃度が約０．３ｍｇ／ｍＬである。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、最終濃度が約０．４ｍｇ／ｍＬである。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、最終濃度が約０．５ｍｇ／ｍＬである。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、最終濃度が約０．６ｍｇ／ｍＬである。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、最終濃度が約０．７ｍｇ／ｍＬである。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、最終濃度が約０．８ｍｇ／ｍＬである。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、最終濃度が約０．９ｍｇ／ｍＬである。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、最終濃度が約１．０ｍｇ／ｍＬである。

【0042】

一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、約０．２ｍｇ／ｍＬ～０．５ｍｇ／ｍＬの間の濃度である。

【0043】

一部の実施形態では、ＬＮＰは、少なくとも３カ月間、６カ月間、１２カ月間、または１２カ月間を超えて－２０℃で安定である。したがって、一部の実施形態では、ＬＮＰは、少なくとも３カ月間、－２０℃で安定である。一部の実施形態では、ＬＮＰは、少なくとも６カ月間、－２０℃で安定である。一部の実施形態では、ＬＮＰは、少なくとも１２カ月間、－２０℃で安定である。一部の実施形態では、ＬＮＰは、１２カ月間を超えて、－２０℃で安定である。

【0044】

一部の実施形態では、ＬＮＰ製剤は希釈後に安定である。

【0045】

一部の実施形態では、製剤の皮下または筋肉内送達は、３００ｍＭまたはそれ以下の濃度、および約７．０～７．５の間のｐＨを有する緩衝液を含まない製剤と比較して、疼痛の減少を伴う。

【0046】

一部の実施形態では、疼痛減少は、１０ｃｍの視覚アナログスケール（ＶＡＳ）または６項目の言語評価スケール（ＶＲＳ）によって評価される。したがって、一部の実施形態では、疼痛減少は、１０ｃｍの視覚アナログスケール（ＶＡＳ）によって評価される。一部の実施形態では、疼痛減少は、６項目の言語評価スケール（ＶＲＳ）によって評価される。

【0047】

一部の実施形態では、ＬＮＰの分解および／または凝集を減少する方法が提供され、この方法は、本明細書に記載されるように製剤中にＬＮＰを貯蔵することを含む。

【0048】

本出願において、「または」の使用は、特に断らない限り、「および／または」を意味する。本開示で使用される場合、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、ならびに「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」のような用語の変形は、他の添加剤、成分、整数または工程を除外することを意図しない。本出願で使用される場合、「約」および「およそ」という用語は、同等物として使用される。両方の用語は、関連技術分野の当業者によって認識される任意の正常な揺らぎをカバーすることを意味する。

【0049】

本発明の他の特徴、目的、および利点は、以下の詳細な説明、図面、および特許請求の範囲において明らかである。しかしながら、詳細な説明、図面、および特許請求の範囲は、本発明の実施形態を示しているが、限定ではなく、例示としてのみ示されていることを理解されたい。本発明の範囲内の種々の変更および修正は、当業者に明らかになる。

【0050】

図面は、限定するものではないが、例示な目的である。

【図面の簡単な説明】

【0051】

【図1A】ＬＮＰ製剤中のトレハロース濃度の増加の関数として、またｐＨ７．５でＬＮＰ安定性を維持するのに必要な最小緩衝強度の関数として、ｐＨ７．５でのＬＮＰの安定性を示すグラフである。

【図1B】ｐＨの揺らぎの関数として、およびＬＮＰ製剤の安定性を維持するのに必要な最小緩衝強度の関数として、ＬＮＰ製剤の一定のパーセンテージ（すなわち、２．７％）でトレハロースを有するＬＮＰ製剤の安定性を示すグラフである。

【図2】試験されたＬＮＰ製剤の脂質ｐＫａ依存性挙動を示すグラフである。これらの研究では、ＬＮＰ製剤は２．７％でトレハロースを含んだ。

【図3A】は、試験されたＬＮＰ製剤についての種々の条件を示す図である。表は、脂質のモル濃度およびｐＨ７．５でのＴｒｉｓ緩衝液の濃度を示す。表中のチェックマークは、安定したＬＮＰ製剤を表す。「Ｘ」は不安定なＬＮＰ製剤を表す。

【図3B】動物モデルにおける投与後の６時間または２４時間のいずれかでヒトＥＰＯ ｍＲＮＡを封入したＬＮＰに由来するヒトＥＰＯタンパク質の発現を示すグラフである。種々のＬＮＰ構成脂質を示す。

【図4A】試験されたＬＮＰ製剤の種々の組成を示す一連の表を示す。表は、試験した緩衝液（すなわち、Ｔｒｉｓまたはイミダゾール）のモル濃度、および評価した様々なＬＮＰ製剤中で試験した対応する塩濃度（すなわち、ＮａＣｌ）を示す。表中のチェックマークは、安定したＬＮＰ製剤を表す。「Ｘ」は不安定なＬＮＰ製剤を表す。

【図4B】種々のＬＮＰ製剤を評価した表を示す。ＬＮＰ製剤は、Ｔｒｉｓまたはリン酸緩衝液のいずれかの濃度に関して変化した。ＬＮＰの希釈後の安定性を評価した。安定なＬＮＰはチェックマークを付けて表示され、不安定なＬＮＰ製剤は「Ｘ」で表示される。

【図5A】４℃で様々なトレハロース対ＰＢＳ比（例えば、約０．２～０．５）を含むＬＮＰ製剤の封入効率％のグラフを示す。

【図5B】２５℃で様々なトレハロース対ＰＢＳ比（例えば、約０．２～０．５）を含むＬＮＰ製剤の封入効率％のグラフを示す。

【図6A】４℃で様々なトレハロース対ＰＢＳ比（例えば、約０．２～０．５）を含むＬＮＰ製剤のＬＮＰサイズ（ナノメートル）のグラフを示す。

【図6B】２５℃で様々なトレハロース対ＰＢＳ比（例えば、約０．２～０．５）を含むＬＮＰ製剤のＬＮＰサイズ（ナノメートル）のグラフを示す。

【発明を実施するための形態】

【0052】

定義
本発明がより容易に理解されるようにするために、ある特定の用語をまず以下に定義する。以下の用語および他の用語についての追加の定義は本明細書を通して示される。本発明の背景を説明し、その実施に関する追加の詳細を提供するために本明細書で参照される刊行物および他の参考資料は参照によって本明細書に組み入れられる。

【0053】

およそまたは約：本明細書で使用される場合、「およそ」または「約」という用語は、目的の１つまたはそれ以上の値に適用される場合、言及される参照値に類似の値を指す。ある特定の実施形態では、「およそ」または「約」という用語は、別段の記載がない限り、または文脈から明らかでない限り（このような数が可能な値の１００％を超える場合を除き）、上述の参照値の２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％以内の、いずれかの方向での（より大きいかまたはより小さい）、該当する値の範囲を指す。

【0054】

本明細書で使用される場合、「バッチ」という用語は、例えば、同じ製造サイクル中に単一製造順序に従って製造される、一度に合成されるｍＲＮＡの含量または量を指す。バッチとは、１セットの条件下で連続的に合成するために、酵素の単一アリコートおよび／またはＤＮＡ鋳型の単一アリコートを介して起こる１つの反応において合成されるｍＲＮＡの量を指すことができる。一部の実施形態では、バッチは、反応が進行するにつれて全ての試薬および／または成分が補充および／または補給されるわけではない反応から産生されるｍＲＮＡを含む。「単一バッチではない」という用語は、所望の量を達成するために組み合わされる異なる時間に合成されたｍＲＮＡを意味しない。

【0055】

送達：本明細書で使用される場合、「送達」という用語は、局所送達と全身送達の両方を包含する。例えば、ｍＲＮＡの送達は、ｍＲＮＡが標的組織に送達され、コードされるタンパク質が発現されて標的組織内に保持される状況（「局所分配」または「局所送達」とも呼ばれる）、およびｍＲＮＡが標的組織に送達され、コードされるタンパク質が発現されて患者の循環系（例えば、血清）内に分泌され、全身に分配され、他の組織によって取り込まれる状況（「全身分配」または「全身送達」とも呼ばれる）を包含する。一部の実施形態では、送達は、例えば噴霧を含む、肺送達である。

【0056】

封入：本明細書で使用される場合、「封入」という用語、または文法上同等物は、ｍＲＮＡ分子をナノ粒子内に閉じ込めるプロセスを指す。

【0057】

操作されたまたは突然変異体：本明細書で使用される場合、「操作された」もしくは「突然変異体」という用語、または文法的同等物は、その天然に存在する配列と比較して１つまたはそれ以上の修飾を含むヌクレオチド配列またはタンパク質配列を指し、限定されないが、欠失、異種核酸もしくはアミノ酸の挿入、逆位、置換、またはそれらの組合せが含まれる。

【0058】

発現：本明細書で使用される場合、核酸配列の「発現」は、ｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳、複数のポリペプチド（例えば、抗体の重鎖または軽鎖）のインタクトタンパク質（例えば、抗体）への組み立て、および／またはポリペプチドもしくは完全に組み立てられたタンパク質（例えば、抗体）の翻訳後修飾を指す。本出願において、「発現」および「産生」という用語、ならびに文法的同等物は、互換的に使用される。

【0059】

機能的：本明細書で使用される場合、「機能的」生物学的分子は、それによって特徴付けられる特性および／または活性を示す形態の生物学的分子である。

【0060】

半減期：本明細書で使用される場合、「半減期」という用語は、ある期間の開始時に測定した場合、核酸もしくはタンパク質濃度または活性のような含量がその値の半分に低下するのに必要とされる時間である。

【0061】

改善する、増加させる、または減少させる：本明細書で使用される場合、「改善する」、「増加させる」もしくは「減少させる」という用語、または文法上同等物は、本明細書に記載される処置の開始前の同じ個体における測定値、または本明細書に記載される処置の非存在下の対照となる対象（または複数の対照となる対象）における測定値などの、ベースライン測定値に対する値を示す。「対照となる対象」は、処置される対象とほぼ同じ年齢の、処置される対象と同じ形態の疾患に罹患している対象である。

【0062】

不純物：本明細書で使用される場合、「不純物」という用語は、標的材料または化合物の化学組成とは異なる、限られた量の液体、気体、または固体内部の物質を指す。不純物は、汚染物質とも呼ばれる。

【0063】

インビトロ：本明細書で使用される場合、「インビトロ」という用語は、多細胞生物内ではなく、人工的な環境、例えば、試験管または反応容器、細胞培養物等で起こるイベントを指す。

【0064】

インビボ：本明細書で使用される場合、「インビボ」という用語は、ヒトおよび非ヒト動物などの多細胞生物内で起こるイベントを指す。細胞系の文脈においては、この用語は、生細胞内で起こるイベントを指すために使用される（例えば、インビトロ系と対照的に）。

【0065】

単離された：本明細書で使用される場合、「単離された」という用語は、（１）（天然および／または実験設定のいずれにせよ）最初に産生された際に会合していた成分の少なくとも一部から分離された、ならびに／または（２）人の手によって産生、製造、および／もしくは製作された、物質および／または実体を指す。単離された物質および／または実体は、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約９９％超のこれらが最初に会合していた他の成分から分離される。一部の実施形態では、単離された薬剤が、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約９９％超純粋である。本明細書で使用される場合、物質は、他の成分を実質的に含まない場合に、「純粋」である。本明細書で使用される場合、単離された物質および／または実体のパーセント純度の計算は賦形剤（例えば、緩衝剤、溶媒、水等）を含むべきでない。

【0066】

メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）：本明細書で使用される場合、「メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）」という用語は、少なくとも１つのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを指す。ｍＲＮＡは、本明細書で使用される場合、修飾ＲＮＡと未修飾ＲＮＡの両方を包含する。ｍＲＮＡは、１つまたはそれ以上のコード領域および非コード領域を含有する。ｍＲＮＡは、天然供給源から精製する、組換え発現系を使用して産生し、場合により精製する、化学的に合成すること等が可能である。適切な場合、例えば化学的に合成した分子の場合には、ｍＲＮＡは、化学修飾塩基または糖、骨格修飾等を有する類似体などのヌクレオシド類似体を含むことができる。特に断らない限り、ｍＲＮＡ配列は５’から３’方向に提示される。

【0067】

核酸：本明細書で使用される場合、「核酸」という用語は、最も広義の意味で、ポリヌクレオチド鎖に組み込まれるか、または組み込むことができる任意の化合物および／または物質を指す。一部の実施形態では、核酸は、ホスホジエステル結合を介してポリヌクレオチド鎖に組み込まれるか、または組み込むことができる化合物および／または物質である。一部の実施形態では、「核酸」は、個々の核酸残基（例えば、ヌクレオチドおよび／またはヌクレオシド）を指す。一部の実施形態では、「核酸」は、個々の核酸残基を含むポリヌクレオチド鎖を指す。一部の実施形態では、「核酸」は、ＲＮＡならびに一本鎖および／または二本鎖ＤＮＡおよび／またはｃＤＮＡを包含する。さらに、「核酸」、「ＤＮＡ」、「ＲＮＡ」という用語、および／または同様の用語は、核酸類似体、すなわち、ホスホジエステル骨格以外を有する類似体を含む。例えば、当技術分野で公知であり、骨格中にホスホジエステル結合の代わりにペプチド結合を有する、いわゆる「ペプチド核酸」は本発明の範囲内にあると考えられる。「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列」という用語は、互いの縮重バージョンである、および／または同じアミノ酸配列をコードする全てのヌクレオチド配列を含む。タンパク質をコードするヌクレオチド配列および／またはＲＮＡはイントロンを含む。核酸は、天然供給源から精製する、組換え発現系を使用して産生し、場合により精製する、化学合成すること等が可能である。適切な場合、例えば化学的に合成した分子の場合には、核酸は、化学修飾塩基または糖、骨格修飾等を有する類似体などのヌクレオシド類似体を含むことができる。核酸配列は、特に指示しない限り、５’から３’方向に提示される。一部の実施形態では、核酸は、天然ヌクレオシド（例えば、アデノシン、チミジン、グアノシン、シチジン、ウリジン、デオキシアデノシン、デオキシチミジン、デオキシグアノシン、およびデオキシシチジン）；ヌクレオシド類似体（例えば、２－アミノアデノシン、２－チオチミジン、イノシン、ピロロ－ピリミジン、３－メチルアデノシン、５－メチルシチジン、Ｃ－５プロピニル－シチジン、Ｃ－５プロピニル－ウリジン、２－アミノアデノシン、Ｃ５－ブロモウリジン、Ｃ５－フルオロウリジン、Ｃ５－ヨードウリジン、Ｃ５－プロピニル－ウリジン、Ｃ５－プロピニル－シチジン、Ｃ５－メチルシチジン、２－アミノアデノシン、７－デアザアデノシン、７－デアザグアノシン、８－オキソアデノシン、８－オキソグアノシン、Ｏ（６）－メチルグアニン、および２－チオシチジン）；化学修飾塩基；生物修飾塩基（例えば、メチル化塩基）；挿入塩基；修飾糖（例えば、２’－フルオロリボース、リボース、２’－デオキシリボース、アラビノース、およびヘキソース）；および／または修飾リン酸基（例えば、ホスホロチオエートおよび５’－Ｎ－ホスホロアミダイト結合）であるか、またはこれらを含む。一部の実施形態では、本発明は、具体的には、送達を容易にするまたは達成するために化学的に修飾されていない核酸（例えば、ヌクレオチドおよび／またはヌクレオシドを含む、ポリヌクレオチドおよび残基）を意味する「未修飾核酸」に関する。一部の実施形態では、ヌクレオチドＴおよびＵは、配列記載において互換的に使用される。

【0068】

患者：本明細書で使用される場合、「患者」または「対象」という用語は、提供される組成物を、例えば、実験、診断、予防、化粧、および／または治療目的で投与することができる任意の生物を指す。典型的な患者には、動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、非ヒト霊長類、および／またはヒトなどの哺乳動物）が含まれる。一部の実施形態では、患者がヒトである。ヒトには、出生前および出生後形態が含まれる。

【0069】

薬学的に許容される：「薬学的に許容される」という用語は、本明細書で使用される場合、信頼できる医学的判断の範囲内で、合理的なベネフィット／リスク比と釣り合って、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、または他の問題もしくは合併症なしに、ヒトおよび動物の組織と接触して使用するのに適した物質を指す。

【0070】

安定な：本明細書で使用される場合、用語「安定な」タンパク質またはその文法的同等物は、その物理的安定性および／または生物学的活性を保持するタンパク質を指す。一実施形態では、タンパク質の安定性は、溶液中のモノマータンパク質のパーセンテージに基づいて、分解された（例えば、フラグメント化された）および／または凝集されたタンパク質の低いパーセンテージで決定される。一実施形態では、安定な操作されたタンパク質は、野生型タンパク質と比較して、増大した半減期を保持するかまたはそれを示す。一実施形態では、安定な操作されたタンパク質は、野生型タンパク質と比較して、タンパク質分解をもたらすユビキチン化を受けにくい。

【0071】

対象：本明細書で使用される場合、「対象」という用語は、ヒトまたは任意の非ヒト動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマまたは霊長類）を指す。ヒトには、出生前および出生後形態が含まれる。多くの実施形態では、対象はヒトである。対象は、疾患の診断または処置のために医療提供者にかかっているヒトを指す患者であることができる。「対象」という用語は、本明細書において、「個体」または「患者」と互換的に使用される。対象は、疾患または障害に罹患することができるか、またはかかりやすいが、疾患または障害の症状を示していても、示していなくてもよい。

【0072】

実質的に：本明細書で使用される場合、「実質的に」という用語は、目的の特徴または特性の全部または全部に近い程度または度合いを示す定量的状態を指す。生物分野の当業者であれば、生物および化学現象が、完了するおよび／または完了まで進行するまたは絶対的な結果を達成するもしくは回避することがあったとしても稀であることを理解するだろう。したがって、「実質的に」という用語は、多くの生物および化学現象に固有の完全性の潜在的な欠如をとらえるために本明細書で使用される。

【0073】

処置すること：本明細書で使用される場合、「処置する」、「処置」、または「処置すること」という用語は、特定の疾患、障害、および／または状態の１つまたは複数の症状または機能を部分的または完全に軽減する、改善する、緩和する、阻害する、予防する、その発症を遅延させる、その重症度を減少させる、および／またはその発生を減少させるために使用される任意の方法を指す。処置は、疾患に関連する病態を発症するリスクを減らす目的で、疾患の徴候を示していない、および／または疾患の早期徴候のみを示す対象に投与することができる。

【0074】

詳細な説明
本発明は、とりわけ、多数の凍結／解凍サイクルに抵抗性であるｍＲＮＡを封入する安定なＬＮＰ製剤の生成をもたらす改善された方法および組成物を提供する。複数の凍結／解凍サイクルに対するこのような抵抗性は、少なくとも１）１回またはそれ以上の凍結／解凍サイクル後のＬＮＰの低凝集；および２）封入されたｍＲＮＡの低分解によって明らかにされる。

【0075】

安定な脂質ナノ粒子製剤
本明細書では、ペプチドまたはポリペプチドをコードするｍＲＮＡを封入する安定な液状脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）用の製剤が提供される。このような安定なＬＮＰは、１回またはそれ以上の凍結解凍サイクル後の凝集およびｍＲＮＡ分解に抵抗性である。例えば、安定なＬＮＰは、１回、２回、３回、４回、５回、または５回を超える凍結解凍サイクルに対して抵抗性であり、ｍＲＮＡを封入するＬＮＰは－２０℃で保存される。一部の実施形態では、安定なＬＮＰは、１回、２回、３回、４回、５回、または５回を超える凍結解凍サイクルに対して抵抗性であり、ｍＲＮＡを封入するＬＮＰは－８０℃またはそれ未満で保存される。

【0076】

さらに、本明細書に記載されるｍＲＮＡを封入する安定なＬＮＰ製剤は、それを必要とする対象に投与された場合、疼痛の減少を伴う。例えば、記載されるＬＮＰ製剤は、本明細書に記載されるようなある特定のイオン強度を有さないＬＮＰ製剤と比較して、筋肉内または皮下投与によるような投与時の疼痛を減少させる。

【0077】

一部の実施形態では、このような安定なＬＮＰ製剤は、ａ）カチオン性脂質、非カチオン性脂質、ＰＥＧ修飾脂質、および場合によりコレステロールを含む脂質成分を有する１つまたはそれ以上のＬＮＰ；ｂ）１つまたはそれ以上の脂質ナノ粒子内に封入され、ペプチドまたはポリペプチドをコードするｍＲＮＡ；ｃ）糖または糖アルコール；ｄ）６．０～８．０のＬＮＰ製剤のｐＨ；ｅ）最小緩衝イオン強度でＬＮＰ製剤のｐＨを提供するｐＨ緩衝液；および場合によりｆ）ＬＮＰ製剤にイオン強度を提供する１種またはそれ以上の追加の薬剤を含む。安定なＬＮＰ製剤は、（ｅ）からのｐＨ緩衝液の全濃度、および場合により（ｆ）からの１種またはそれ以上の追加の薬剤を有し、最小緩衝イオン強度よりも少なくとも２倍大きいＬＮＰ製剤のイオン強度を提供する。１回、２回、３回または３回以上の凍結および解凍後、記載されるＬＮＰ製剤は、最小緩衝イオン強度よりも少なくとも２倍大きいイオン強度の代わりに、ＬＮＰ製剤中の最小緩衝イオン強度のみを有する同一のＬＮＰ製剤と比較して、（ｉ）凝集が少なく、（ｉｉ）封入されたｍＲＮＡの分解が少なく、または（ｉｉｉ）（ｉ）と（ｉｉ）の両方を有する。

【0078】

上記（ｆ）における１種またはそれ以上の追加の薬剤は、塩、緩衝液、または塩と緩衝液の組合せであり得る。例えば、（ｆ）における１種またはそれ以上の追加の薬剤は、例えば、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、およびＣａＣｌ_２を含むことができる。緩衝液は、例えば、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、イミダゾール緩衝液、ヒスチジン緩衝液、またはグッド緩衝液を含む。様々な種類のグッド緩衝液が当技術分野において公知であり、例えば、ＭＥＳ、ビス－トリスメタン、ＡＤＡ、ビス－トリスプロパン、ＰＩＰＥＳ、ＡＣＥＳ、ＰＯＰＳＯ、塩化コールアミン、ＭＯＰＳ、ＢＥＳ、ＡＭＰＢ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＤＩＰＳＯ、ＭＯＢＳ、アセトアミドグリシン、ＴＡＰＳＯ、ＴＥＡ、ＰＯＰＳＯ、ＨＥＰＰＳＯ、ＥＰＳ、ＨＥＰＰＳ、トリシン、Ｔｒｉｓ、グリシンアミド、グリシルグリシン、ＨＥＰＢＳ、ビシン、ＴＡＰＳ、ＡＭＰＢ、ＣＨＥＳ、ＣＡＰＳＯ、ＡＭＰ、ＣＡＰＳ、およびＣＡＢＳが含まれる。一部の実施形態では、グッド緩衝液は、Ｔｒｉｓ緩衝液またはＨＥＰＥＳ緩衝液のいずれかである。

【0079】

一部の実施形態では、１種またはそれ以上の追加の薬剤は、約５０～５００ｍＭ、１００～４００ｍＭ、または２００～３００ｍＭの間の濃度を有する。本明細書に記載されるＬＮＰ製剤の緩衝液ｐＨは、約１００～３００ｍＭ、２００～３００ｍＭ、または２５０～３００ｍＭの間の濃度を有する。

【0080】

本明細書に記載されるｍＲＮＡを封入する安定なＬＮＰ製剤の最小緩衝イオン強度は、例えば、少なくとも１５ｍＭ、少なくとも２５ｍＭ、少なくとも５０ｍＭ、少なくとも７５ｍＭ、少なくとも１００ｍＭ、少なくとも１２５ｍＭ、少なくとも１５０ｍＭ、または少なくとも２００ｍＭである。実施形態では、本明細書に記載されるｍＲＮＡを封入する安定なＬＮＰ製剤は、例えば、約１５ｍＭ～２００ｍＭ、５０ｍＭ～２００ｍＭ、７５ｍＭ～２００ｍＭ、１５ｍＭ～１５０ｍＭ、５０ｍＭ～１５０ｍＭ、７５ｍＭ～１５０ｍＭ、１５ｍＭ～１００ｍＭ、５０ｍＭ～１００ｍＭ、７５ｍＭ～１００ｍＭ、または１００ｍＭ～２００ｍＭの間である。最小緩衝イオン強度は、種々の方法で得ることができる。例えば、一部の実施形態では、最小緩衝イオン強度は、緩衝液濃度を増加させることによって得られる。あるいは、最小緩衝イオン強度は、塩濃度を増加させることによって得られる。一部の実施形態では、最小緩衝イオン強度は、緩衝液濃度および塩濃度の両方を増加させることによって得られる。例えば、一部の実施形態では、ｐＨ緩衝液およびイオン強度を提供する１種またはそれ以上の追加の薬剤の全濃度は、約４０ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液および約７５～２００ｍＭのＮａＣｌ、約５０ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液および約７５ｍＭ～２００ｍＭのＮａＣｌ、約１００ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液および約７５ｍＭ～２００ｍＭのＮａＣｌ、約４０ｍＭイミダゾールおよび約７５ｍＭ～２００ｍＭのＮａＣｌ、約５０ｍＭイミダゾールおよび７５ｍＭ～２００ｍＭのＮａＣｌ、約１００ｍＭイミダゾールおよび７５ｍＭ～２００ｍＭのＮａＣｌ、約４０ｍＭリン酸塩および約７５～２００ｍＭのＮａＣｌ、約５０ｍＭリン酸塩および７５～２００ｍＭのＮａＣｌ、約１００ｍＭリン酸塩および７５～２００ｍＭのＮａＣｌから選択される。一部の実施形態では、ｐＨ緩衝液およびイオン強度を提供する１種またはそれ以上の追加の薬剤の全濃度は、４０ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液、約７５～２００ｍＭのＮａＣｌ、および約２．５～１０％トレハロース、約５０ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液、約７５ｍＭ～２００ｍＭのＮａＣｌおよび約２．５～１０％トレハロース、約１００ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液、約７５ｍＭ～２００ｍＭのＮａＣｌおよび約２．５～１０％トレハロース、約４０ｍＭイミダゾール、約７５ｍＭ～２００ｍＭのＮａＣｌおよび約２．５～１０％トレハロース、約５０ｍＭイミダゾール、７５ｍＭ～２００ｍＭのＮａＣｌおよび約２．５～１０％トレハロース、約１００ｍＭイミダゾール、７５ｍＭ～２００ｍＭのＮａＣｌおよび約２．５～１０％トレハロース、約４０ｍＭリン酸塩、約７５ｍＭ～２００ｍＭのＮａＣｌおよび約２．５～１０％トレハロース、約５０ｍＭリン酸塩、７５ｍＭ～２００ｍＭのＮａＣｌおよび約２．５～１０％トレハロース、約１００ｍＭリン酸塩、７５ｍＭ～２００ｍＭのＮａＣｌおよび約２．５～１０％トレハロースから選択される。

【0081】

一部の実施形態では、緩衝液は、互換的に使用される。一部の実施形態では、Ｔｒｉｓ緩衝液は、イミダゾール緩衝液またはリン酸緩衝液で置換される。一部の実施形態では、Ｔｒｉｓ緩衝液は、イミダゾール緩衝液で置換される。一部の実施形態では、Ｔｒｉｓ緩衝液は、リン酸緩衝液で置換される。一部の実施形態では、イミダゾール緩衝液は、リン酸緩衝液またはＴｒｉｓ緩衝液で置換される。一部の実施形態では、イミダゾール緩衝液は、リン酸緩衝液で置換される。一部の実施形態では、イミダゾール緩衝液は、Ｔｒｉｓ緩衝液で置換される。一部の実施形態では、リン酸緩衝液は、Ｔｒｉｓ緩衝液またはイミダゾール緩衝液で置換される。一部の実施形態では、リン酸緩衝液は、Ｔｒｉｓ緩衝液で置換される。一部の実施形態では、リン酸緩衝液は、イミダゾール緩衝液で置換される。

【0082】

一部の実施形態では、Ｔｒｉｓ緩衝液、イミダゾール緩衝液またはリン酸緩衝液は、高緩衝強度（例えば、１００ｍＭまたはそれ以上）を有する。一部の実施形態では、低緩衝強度（例えば、１５～２０ｍＭ）でのＴｒｉｓ緩衝液、リン酸緩衝液またはイミダゾール緩衝液は、高塩濃度（例えば、２００ｍＭまたはそれ以上のＮａＣｌ）とともに使用される。一部の実施形態では、中程度の緩衝強度（例えば、４０～５０ｍＭ）でのＴｒｉｓ緩衝液、リン酸緩衝液またはイミダゾール緩衝液は、中程度の塩濃度（例えば、５０～１００ｍＭのＮａＣｌ）とともに使用される。

【0083】

一部の実施形態では、Ｔｒｉｓ緩衝液、リン酸緩衝液またはイミダゾール緩衝液は、低トレハロース濃度（例えば、５０～１００ｍＭのＮａＣｌ）で使用される。一部の実施形態では、ＬＮＰ製剤の安定性は、低い糖／緩衝液比でより大きかった。一部の実施形態では、ＬＮＰ製剤のより低いトレハロース対緩衝比は、封入の低下を防止するのに有益であった。一部の実施形態では、より低いトレハロース対緩衝比は、ＬＮＰサイズの増加を防止した。

【0084】

一部の実施形態では、ＬＮＰ製剤は、最小緩衝イオン強度よりも少なくとも２．２５倍大きい、少なくとも２．５倍大きい、少なくとも２．７５倍大きい、少なくとも３倍大きい、少なくとも３．５倍大きい、少なくとも４倍大きい、少なくとも４．５倍大きい、少なくとも５倍大きいイオン強度を有する。一部の実施形態では、ＬＮＰ製剤は、最小緩衝イオン強度の２０倍未満、１９倍未満、１８倍未満、１７倍未満、１６倍未満、１５倍未満、１４倍未満、１３倍未満、１２倍未満、１１倍未満、１０倍未満、９倍未満、８倍未満、７倍未満、６倍未満、５倍未満、４倍未満であるイオン強度を有する。一部の実施形態では、ＬＮＰ製剤のイオン強度は、最小緩衝イオン強度よりも少なくとも２倍大きく２０倍未満であり、ＬＮＰ製剤のイオン強度は、約１５０ｍＭ～７５０ｍＭ、１５０ｍＭ～５００ｍＭ、１５０ｍＭ～４００ｍＭ、１５０ｍＭ～３００ｍＭ、１５０ｍＭおよび２００ｍＭの間である。一部の実施形態では、ＬＮＰ製剤のイオン強度は、最小緩衝イオン強度よりも少なくとも２倍大きく２０倍未満であり、ＬＮＰ製剤のイオン強度は、１５０ｍＭであるかまたは１５０ｍＭより大きい。全体にわたって参照される最小緩衝イオン強度は、少なくとも７５ｍＭ、少なくとも１００ｍＭ、少なくとも１２５ｍＭ、少なくとも１５０ｍＭ、または少なくとも２００ｍＭである。

【0085】

一部の実施形態では、本明細書に記載される安定なＬＮＰ製剤は、１つまたはそれ以上の凍結保護剤をさらに含む。凍結保護剤は、「浸透性」凍結保護剤または「非浸透性」凍結保護剤のいずれかとして特徴付けることができる。本明細書に記載されるＬＮＰ製剤のための適切な凍結保護剤は、浸透性凍結保護剤および／または非浸透性凍結保護剤から選択することができる。例示的な非浸透性凍結保護剤は、例えば、デキストロース、ソルビトール、トレハロース、スクロース、ラフィノース、デキストラン、およびイヌリンのような糖を含む。非浸透性凍結保護剤の別のカテゴリーは、例えば、ＰＶＰ、ＰＶＡ、ポロキサマー、およびＰＥＧのようなポリマーを含む。浸透性凍結保護剤の例としては、例えば、グリセロール、エチレングリコール、トリエチレングリコール、プロピレングリコール、テトラエチレングリコールが挙げられる。記載される凍結保護剤のいずれか１つまたはそれ以上は、本明細書に記載される安定なＬＮＰ製剤に包含するのに適している。一部の実施形態では、ＬＮＰ製剤中の凍結保護剤は、１％～２０％の間の濃度でトレハロースを含む。一部の実施形態では、ＬＮＰ製剤中の凍結保護剤は、約２．５％～３．０％の間の濃度でトレハロースを含む。一部の実施形態では、ＬＮＰ製剤中の凍結保護剤は、約２．５％の濃度でトレハロースを含む。一部の実施形態では、ＬＮＰ製剤中の凍結保護剤は、約２．６％の濃度でトレハロースを含む。一部の実施形態では、ＬＮＰ製剤中の凍結保護剤は、約２．７％の濃度でトレハロースを含む。一部の実施形態では、ＬＮＰ製剤中の凍結保護剤は、約２．８％の濃度でトレハロースを含む。一部の実施形態では、ＬＮＰ製剤中の凍結保護剤は、約２．９％の濃度でトレハロースを含む。一部の実施形態では、ＬＮＰ製剤中の凍結保護剤は、約３．０％の濃度でトレハロースを含む。

【0086】

種々の非カチオン性脂質は、本明細書に記載されるＬＮＰ製剤において使用することができる。例えば、本明細書に記載されるＬＮＰ製剤のための適切なカチオン性脂質は、１，２－ジエルコイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＥＰＥ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、パルミトイルオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、ジオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン４－（Ｎ－マレイミドメチル）－シクロヘキサン－１－カルボキシレート（ＤＯＰＥ－ｍａｌ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジミリストイルホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジステアロイル－ホスファチジル－エタノールアミン（ＤＳＰＥ）、１６－Ｏ－モノメチルＰＥ、１６－Ｏ－ジメチルＰＥ、１８－１－トランスＰＥ、または１－ステアロイル－２－オレオイル－ホスファチジエタノールアミン（ＳＯＰＥ）から選択することができる。一部の実施形態では、非カチオン性脂質はＤＯＰＥである。

【0087】

ＬＮＰ製剤中の非カチオン性脂質は、１０％を超える脂質モル比であり得る。例えば、一部の実施形態では、非カチオン性脂質は、脂質モル比が１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、または５０％である。

【0088】

一部の実施形態では、カチオン性脂質は、リピドイドから選択される。種々のリピドイドが当技術分野において公知である。例えば、リピドイドは、Ｇｏｌｄｂｅｒｇ Ｍ．（２０１３）Ｌｉｐｉｄｏｉｄｓ：Ａ Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ｓｉＲＮＡ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ．Ｉｎ：Ｈｏｗａｒｄ Ｋ．（編集）ＲＮＡ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ ｆｒｏｍ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｔｏ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ．に記載され、その内容は参照により本明細書に組み入れられる。一部の実施形態では、リピドイドは、カチオン性である。一部の実施形態では、リピドイドは、最大７つの尾部を含む。７つの尾部は、例えばアミン骨格から伸長することができる。一部の実施形態では、リピドイドは、トリグリセリドのような天然脂質と比較した場合、脂肪族鎖に関してそのエステル結合の逆転を有する。一部の実施形態では、リピドイドは、トリグリセリドのような天然脂質と比較した場合、脂肪族鎖に関してそのエステル結合の逆転を有さない。

【0089】

一部の実施形態では、リピドイドは、例えば、アミノアルコールリピドイドを含む。一部の実施形態では、リピドイドは、ｃＫＫ－Ｅ１０、ＯＦ－０２、またはＣ１２－２００から選択される。したがって、一部の実施形態では、リピドイドはｃＫＫ－Ｅ－１０である。一部の実施形態では、リピドイドはＯＦ－０２である。一部の実施形態では、リピドイドはＣ１２－２００である。

【0090】

本発明のＬＮＰ製剤は、約６．０～８．０の間のｐＨを有することができる。例えば、一部の実施形態では、ＬＮＰ製剤は、約６．０～７．０の間のｐＨを有することができる。一部の実施形態では、ＬＮＰ製剤は、約６．５～７．５の間のｐＨを有することができる。一部の実施形態では、ＬＮＰ製剤は、約７．０～８．０の間のｐＨを有することができる。一部の実施形態では、ＬＮＰ製剤は、約７．４のｐＨを有する。一部の実施形態では、ＬＮＰ製剤は、生理学的ｐＨと同等であるｐＨを有する。

【0091】

ＬＮＰ製剤のｐＨ緩衝液は、約６．０～８．２の間のｐＫａを有することができる。例えば、ＬＮＰ製剤のｐＨ緩衝液は、約６．２、６．４、６．６、６．８、７．０、７．２、７．４、７．６、７．８、８．０、または８．２のｐＫａを有する。一部の実施形態では、ｐＨ緩衝液は約６．２のｐＫａを有する。一部の実施形態では、ｐＨ緩衝液は約６．４のｐＫａを有する。一部の実施形態では、ｐＨ緩衝液は約６．６のｐＫａを有する。一部の実施形態では、ｐＨ緩衝液は約６．８のｐＫａを有する。一部の実施形態では、ｐＨ緩衝液は約７．０のｐＫａを有する。一部の実施形態では、ｐＨ緩衝液は約７．２のｐＫａを有する。一部の実施形態では、ｐＨ緩衝液は約７．４のｐＫａを有する。一部の実施形態では、ｐＨ緩衝液は約７．６のｐＫａを有する。一部の実施形態では、ｐＨ緩衝液は約７．８のｐＫａを有する。一部の実施形態では、ｐＨ緩衝液は約８．０のｐＫａを有する。一部の実施形態では、ｐＨ緩衝液は約８．２のｐＫａを有する。

【0092】

上記のように、本明細書に記載されるＬＮＰ製剤は、１回またはそれ以上の凍結解凍サイクルの後で凝集がより少ない。ＬＮＰ凝集を決定するための種々の方法が当技術分野に存在し、例えば、動的光散乱（ＤＬＳ）、ナノ粒子追跡分析（ＮＴＡ）、濁度分析、フロー顕微鏡分析、フローサイトメトリー、ＦＴＩＲ顕微鏡法、共鳴質量測定（ＲＭＭ）、ラマン顕微鏡法、濾過、レーザー回折、電子顕微鏡法、原子間力顕微鏡法（ＡＦＭ）、静的光散乱（ＳＬＳ）、多角形静的光散乱（ＭＡＬＳ）、フィールドフロー分画（ＦＦＦ）、および分析的超遠心分離法（ＡＵＣ）のいずれか１つによって決定される。これらの方法のいずれか１つまたはそれ以上を用いて、ＬＮＰ凝集を評価することができる。

【0093】

本明細書に記載されるＬＮＰ製剤はまた、１回またはそれ以上の凍結解凍サイクルの後に、より少ないｍＲＮＡ分解を有する。ｍＲＮＡ分解を決定するために、例えば、動的光散乱（ＤＬＳ）、ナノ粒子追跡分析（ＮＴＡ）、濁度分析、フロー顕微鏡分析、フローサイトメトリー、ＦＴＩＲ顕微鏡法、共鳴質量測定（ＲＭＭ）、ラマン顕微鏡法、濾過、レーザー回折、電子顕微鏡法、原子間力顕微鏡法（ＡＦＭ）、静的光散乱（ＳＬＳ）、多角形静的光散乱（ＭＡＬＳ）、フィールドフロー分画（ＦＦＦ）、および分析的超遠心分離法（ＡＵＣ）のような当技術分野において種々の方法がある。これらの方法のいずれか１つまたはそれ以上を用いて、ｍＲＮＡ分解を評価することができる。

【0094】

本明細書に記載されるＬＮＰ製剤は１００ｎｍ未満の直径を有する。例えば、一部の実施形態では、ＬＮＰは７０ｎｍ～９０ｎｍの間の直径を有する。一部の実施形態では、ＬＮＰは７０ｎｍ未満の直径を有する。

【0095】

全体を通して記載されるように、種々の種類の脂質成分が、本明細書に記載されるＬＮＰに適している。一部の実施形態では、ＬＮＰ製剤は、ＤＭＧ－ＰＥＧ－２０００、ｃＫＫ－Ｅ１０、コレステロール、およびＤＯＰＥを含む脂質成分を有する。一部の実施形態では、ＬＮＰ製剤は、ＤＭＧ－ＰＥＧ－２０００、ｃＫＫ－Ｅ１０、コレステロール、およびＤＯＰＥからなる脂質成分を有する。

【0096】

ＬＮＰ製剤は、約３～５のＮ／Ｐ比の範囲を有することができる。一部の実施形態では、Ｎ／Ｐ比は約３である。一部の実施形態では、Ｎ／Ｐ比は約４である。一部の実施形態では、Ｎ／Ｐ比は約５である。

【0097】

ＬＮＰ製剤はｍＲＮＡを封入する。任意のｍＲＮＡは、本明細書に記載されるＬＮＰ製剤によって封入することができる。ＬＮＰ内に封入されたｍＲＮＡの最終濃度は、約０．０５ｍｇ／ｍＬ～１．０ｍｇ／ｍＬの間の範囲であり得る。一部の実施形態では、ＬＮＰ内に封入されたｍＲＮＡは、約０．２ｍｇ／ｍＬ～約０．５ｍｇ／ｍＬの範囲である。

【0098】

本明細書に記載されるＬＮＰ製剤は、－２０℃、－８０℃、または－８０℃未満で保存した場合に安定である。したがって、一部の実施形態では、本明細書に記載されるＬＮＰ製剤は、－２０℃で保存した場合に安定である。一部の実施形態では、本明細書に記載されるＬＮＰ製剤は、－８０℃未満で保存した場合に安定である。一部の実施形態では、本明細書に記載されるＬＮＰ製剤は、－８０℃未満で保存した場合に安定である。例えば、ＬＮＰ製剤は、－２０℃で保存した場合に、少なくとも３カ月間、６カ月間、１２カ月間、または１２カ月間を超えて安定である。さらに、ＬＮＰ製剤は希釈後に安定である。

【0099】

ｍＲＮＡの合成
本発明によるｍＲＮＡは、種々の公知である方法のいずれかに従って合成することができる。例えば、本発明によるｍＲＮＡはインビトロ転写（ＩＶＴ）を介して合成することができる。手短に言えば、ＩＶＴは、典型的にはプロモーターを含有する直鎖または環状ＤＮＡ鋳型、リボヌクレオチド三リン酸のプール、ＤＴＴおよびマグネシウムイオンを含むことができる緩衝系、ならびに適切なＲＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔ３、Ｔ７、またはＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ）、ＤＮＡｓｅ Ｉ、ピロホスファターゼ、および／またはＲＮＡｓｅ阻害剤を用いて実施される。正確な条件は具体的な用途によって変化する。

【0100】

一部の実施形態では、本発明によるｍＲＮＡを調製するために、ＤＮＡ鋳型をインビトロで転写する。適切なＤＮＡ鋳型は、典型的には、インビトロ転写のためのプロモーター、例えば、Ｔ３、Ｔ７またはＳＰ６プロモーターを有し、続いて所望のｍＲＮＡおよび終止シグナルのための所望のヌクレオチド配列を有する。

【0101】

ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼを用いたｍＲＮＡの合成
一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼを用いて産生される。ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼは、ＳＰ６プロモーター配列に対して高い配列特異性を有するＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼである。ＳＰ６ポリメラーゼは、プロモーターから下流の一本鎖ＤＮＡまたは二本鎖ＤＮＡ上のＲＮＡの５’→３’インビトロ合成を触媒し、天然リボヌクレオチドおよび／または修飾リボヌクレオチドおよび／または標識リボヌクレオチドを重合転写産物に取り込む。このような標識されたリボヌクレオチドの例としては、ビオチン－、フルオレセイン－、ジゴキシゲニン－、アミノアリル－、および同位体標識ヌクレオチドが挙げられる。

【0102】

バクテリオファージＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼの配列は、初期には、以下のアミノ酸配列：
ＭＱＤＬＨＡＩＱＬＱＬＥＥＥＭＦＮＧＧＩＲＲＦＥＡＤＱＱＲＱＩＡＡＧＳＥＳＤＴＡＷＮＲＲＬＬＳＥＬＩＡＰＭＡＥＧＩＱＡＹＫＥＥＹＥＧＫＫＧＲＡＰＲＡＬＡＦＬＱＣＶＥＮＥＶＡＡＹＩＴＭＫＶＶＭＤＭＬＮＴＤＡＴＬＱＡＩＡＭＳＶＡＥＲＩＥＤＱＶＲＦＳＫＬＥＧＨＡＡＫＹＦＥＫＶＫＫＳＬＫＡＳＲＴＫＳＹＲＨＡＨＮＶＡＶＶＡＥＫＳＶＡＥＫＤＡＤＦＤＲＷＥＡＷＰＫＥＴＱＬＱＩＧＴＴＬＬＥＩＬＥＧＳＶＦＹＮＧＥＰＶＦＭＲＡＭＲＴＹＧＧＫＴＩＹＹＬＱＴＳＥＳＶＧＱＷＩＳＡＦＫＥＨＶＡＱＬＳＰＡＹＡＰＣＶＩＰＰＲＰＷＲＴＰＦＮＧＧＦＨＴＥＫＶＡＳＲＩＲＬＶＫＧＮＲＥＨＶＲＫＬＴＱＫＱＭＰＫＶＹＫＡＩＮＡＬＱＮＴＱＷＱＩＮＫＤＶＬＡＶＩＥＥＶＩＲＬＤＬＧＹＧＶＰＳＦＫＰＬＩＤＫＥＮＫＰＡＮＰＶＰＶＥＦＱＨＬＲＧＲＥＬＫＥＭＬＳＰＥＱＷＱＱＦＩＮＷＫＧＥＣＡＲＬＹＴＡＥＴＫＲＧＳＫＳＡＡＶＶＲＭＶＧＱＡＲＫＹＳＡＦＥＳＩＹＦＶＹＡＭＤＳＲＳＲＶＹＶＱＳＳＴＬＳＰＱＳＮＤＬＧＫＡＬＬＲＦＴＥＧＲＰＶＮＧＶＥＡＬＫＷＦＣＩＮＧＡＮＬＷＧＷＤＫＫＴＦＤＶＲＶＳＮＶＬＤＥＥＦＱＤＭＣＲＤＩＡＡＤＰＬＴＦＴＱＷＡＫＡＤＡＰＹＥＦＬＡＷＣＦＥＹＡＱＹＬＤＬＶＤＥＧＲＡＤＥＦＲＴＨＬＰＶＨＱＤＧＳＣＳＧＩＱＨＹＳＡＭＬＲＤＥＶＧＡＫＡＶＮＬＫＰＳＤＡＰＱＤＩＹＧＡＶＡＱＶＶＩＫＫＮＡＬＹＭＤＡＤＤＡＴＴＦＴＳＧＳＶＴＬＳＧＴＥＬＲＡＭＡＳＡＷＤＳＩＧＩＴＲＳＬＴＫＫＰＶＭＴＬＰＹＧＳＴＲＬＴＣＲＥＳＶＩＤＹＩＶＤＬＥＥＫＥＡＱＫＡＶＡＥＧＲＴＡＮＫＶＨＰＦＥＤＤＲＱＤＹＬＴＰＧＡＡＹＮＹＭＴＡＬＩＷＰＳＩＳＥＶＶＫＡＰＩＶＡＭＫＭＩＲＱＬＡＲＦＡＡＫＲＮＥＧＬＭＹＴＬＰＴＧＦＩＬＥＱＫＩＭＡＴＥＭＬＲＶＲＴＣＬＭＧＤＩＫＭＳＬＱＶＥＴＤＩＶＤＥＡＡＭＭＧＡＡＡＰＮＦＶＨＧＨＤＡＳＨＬＩＬＴＶＣＥＬＶＤＫＧＶＴＳＩＡＶＩＨＤＳＦＧＴＨＡＤＮＴＬＴＬＲＶＡＬＫＧＱＭＶＡＭＹＩＤＧＮＡＬＱＫＬＬＥＥＨＥＶＲＷＭＶＤＴＧＩＥＶＰＥＱＧＥＦＤＬＮＥＩＭＤＳＥＹＶＦＡ
を有するものとして記載された（ＧｅｎＢａｎｋ：Ｙ００１０５．１）。

【0103】

本発明に適したＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼは、バクテリオファージＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼと実質的に同じポリメラーゼ活性を有する任意の酵素である。したがって、一部の実施形態では、本発明に適したＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼは、配列番号１６から修飾される。例えば、適切なＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼは、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換、欠失、または付加を含み得る。一部の実施形態では、適切なＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼは、配列番号１６と約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、８０％、７５％、７０％、６５％、もしくは６０％同一または相同であるアミノ酸配列を有する。一部の実施形態では、適切なＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼは、（Ｎ末端、Ｃ末端、または内部から）切断されたタンパク質であり得るが、ポリメラーゼ活性を保持する。一部の実施形態では、適切なＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼは融合タンパク質である。

【0104】

本発明に適したＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼは、例えば、Ａｌｄｅｖｒｏｎ、Ａｍｂｉｏｎ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（ＮＥＢ）、ＰｒｏｍｅｇａおよびＲｏｃｈｅから市販されている製品であり得る。ＳＰ６は、配列番号１６のアミノ酸配列または本明細書に記載される配列番号１６のバリアントに従って、商業的供給源または非商業的供給源から注文および／またはカスタム設計することができる。ＳＰ６は、標準忠実度ポリメラーゼであり得るか、またはＲＮＡポリメラーゼ活性、例えば、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子における突然変異またはＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ自体の翻訳後修飾を促進するように修飾された高忠実度／高効率／高容量であり得る。このような修飾されたＳＰ６の例としては、ＡｍｂｉｏｎのＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ－Ｐｌｕｓ（商標）、ＮＥＢのＨｉＳｃｒｉｂｅ ＳＰ６、ならびにＰｒｏｍｅｇａのＲｉｂｏＭＡＸ（商標）およびＲｉｂｏｐｒｏｂｅ（登録商標）システムが挙げられる。

【0105】

一部の実施形態では、適切なＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼは融合タンパク質である。例えば、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼは、酵素の単離、精製、または溶解性を促進するために、１つまたはそれ以上のタグを含み得る。適切なタグは、Ｎ末端、Ｃ末端、および／または内部に位置することができる。適切なタグの非限定的な例としては、カルモジュリン結合タンパク質（ＣＢＰ）；ファシオラ肝臓８－ｋＤａ抗原（Ｆｈ８）；ＦＬＡＧタグペプチド；グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）；ヒスチジンタグ（例えば、ヘキサヒスチジンタグ（Ｈｉｓ６））；マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）；Ｎ－利用物質（ＮｕｓＡ）；小ユビキチン関連修飾因子（ＳＵＭＯ）融合タグ；ストレプトアビジン結合ペプチド（ＳＴＲＥＰ）；タンデム親和性精製（ＴＡＰ）；およびチオレドキシン（ＴｒｘＡ）が挙げられる。本発明では、他のタグを使用することができる。これらおよび他の融合タグは、例えば、Ｃｏｓｔａら、Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ５巻（２０１４）：６３頁およびＰＣＴ／ＵＳ１６／５７０４４号に記載され、その内容は、それらの全体が参照により本明細書に組み入れられる。ある特定の実施形態では、Ｈｉｓタグは、ＳＰ６のＮ末端に位置する。

【0106】

ＤＮＡ鋳型
典型的には、ＤＮＡ鋳型は、完全に二本鎖であるかまたは二本鎖ＳＰ６プロモーター配列を有するほとんどの一本鎖のいずれかである。

【0107】

線状化プラスミドＤＮＡ（１つまたはそれ以上の制限酵素を介して線状化される）、線状化ゲノムＤＮＡフラグメント（制限酵素および／または物理的手段を介する）、ＰＣＲ産物、および／または合成ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、それらが転写されるＤＮＡ配列の上流（および正方向）に二本鎖ＳＰ６プロモーターを含むことを条件として、ＳＰ６を用いたインビトロ転写のための鋳型として用いることができる。

【0108】

一部の実施形態では、線状化ＤＮＡ鋳型は、平滑末端を有する。

【0109】

一部の実施形態では、転写されるＤＮＡ配列は、より効率的な転写および／または翻訳を促進するために最適化される。例えば、ＤＮＡ配列は、シス調節エレメント（例えば、ＴＡＴＡボックス、終止シグナルおよびタンパク質結合部位）、人工組換え部位、カイ部位、ＣｐＧジヌクレオチド含有量、ネガティブＣｐＧアイランド、ＧＣ含有量、ポリメラーゼスリップ部位、および／または転写に関連する他のエレメントに関して最適化される；ＤＮＡ配列は、潜在的スプライス部位、ｍＲＮＡ二次構造、ｍＲＮＡの安定な自由エネルギー、反復配列、ＲＮＡ不安定モチーフ、および／またはｍＲＮＡプロセシングおよび安定性に関連する他のエレメントに関して最適化される；ＤＮＡ配列は、コドン使用バイアス、コドン適合性、内部カイ部位、リボソーム結合部位（例えば、ＩＲＥＳ）、未成熟ポリＡ部位、シャイン－ダルガーノ（ＳＤ）配列、および／または翻訳に関連する他のエレメントに関して最適化される；および／またはＤＮＡ配列は、コドンコンテキスト、コドン－アンチコドン相互作用、翻訳休止部位、および／またはタンパク質折り畳みに関連する他のエレメントに関して最適化される。当技術分野において公知である最適化方法、例えば、その全体が参照により本明細書に組み入れられる米国特許出願公開第２０１１／００８１７０８号に記載されるＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒおよびＯｐｔｉｍｕｍＧｅｎｅ（商標）によるＧｅｎｅＯｐｔｉｍｉｚｅｒを本発明で使用することができる。

【0110】

一部の実施形態では、ＤＮＡ鋳型は、５’および／または３’非翻訳領域を含む。一部の実施形態では、５’非翻訳領域は、ｍＲＮＡの安定性または翻訳に影響する１つまたはそれ以上のエレメント、例えば、鉄応答性エレメントを含む。一部の実施形態では、５’非翻訳領域は、長さが約５０～５００ヌクレオチドの間であり得る。

【0111】

一部の実施形態では、３’非翻訳領域は、ポリアデニル化シグナルのうちの１つもしくはそれ以上、細胞内での位置のｍＲＮＡの安定性に影響するタンパク質の結合部位、またはｍｉＲＮＡの１つもしくはそれ以上の結合部位を含む。一部の実施形態では、３’非翻訳領域は、長さが５０～５００ヌクレオチドの間またはそれ以上であり得る。

【0112】

例示的な３’および／または５’ＵＴＲ配列は、センスｍＲＮＡ分子の安定性を増加させるために、安定であるｍＲＮＡ分子（例えば、グロビン、アクチン、ＧＡＰＤＨ、チューブリン、ヒストン、またはクエン酸サイクル酵素）から誘導することができる。例えば、５’ＵＴＲ配列は、ヌクレアーゼ耐性を改善し、および／またはポリヌクレオチドの半減期を改善するために、ＣＭＶ前初期１（ＩＥ１）遺伝子の部分配列またはそのフラグメントを含み得る。また、ポリヌクレオチドをさらに安定化するために、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）をコードする配列またはそのフラグメントをポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）の３’末端または非翻訳領域に含めることが考えられる。一般に、これらの修飾は、修飾されていない対応物と比較して、ポリヌクレオチドの安定性および／または薬物動態特性（例えば、半減期）を改善し、例えば、インビボヌクレアーゼ消化に対するこのようなポリヌクレオチドの抵抗性を改善するためになされる修飾を含む。

【0113】

大規模ｍＲＮＡ合成
一部の実施形態では、本発明は、安定なＬＮＰに封入されたｍＲＮＡの大規模産生に用いることができる。一部の実施形態では、本発明に従う方法は、少なくとも１００ｍｇ、１５０ｍｇ、２００ｍｇ、３００ｍｇ、４００ｍｇ、５００ｍｇ、６００ｍｇ、７００ｍｇ、８００ｍｇ、９００ｍｇ、１ｇ、５ｇ、１０ｇ、２５ｇ、５０ｇ、７５ｇ、１００ｇ、２５０ｇ、５００ｇ、７５０ｇ、１ｋｇ、５ｋｇ、１０ｋｇ、５０ｋｇ、１００ｋｇ、１０００ｋｇまたはそれ以上のｍＲＮＡを単一バッチで合成する。本明細書で使用される場合、「バッチ」という用語は、一度に合成されたｍＲＮＡの含量または量、例えば、単一の製造設定に従って製造されたｍＲＮＡの含量または量を指す。バッチとは、１セットの条件下で連続的に合成するために、酵素の単一アリコートおよび／またはＤＮＡ鋳型の単一アリコートを介して起こる１つの反応において合成されるｍＲＮＡの量を指すことができる。単一のバッチで合成されたｍＲＮＡは、所望の量を達成するために組み合わされる異なる時間に合成されたｍＲＮＡを含まない。一般に、反応混合物は、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ、直鎖ＤＮＡ鋳型、およびＲＮＡポリメラーゼ反応緩衝液（リボヌクレオチドを含む場合があるかまたはリボヌクレオチドの添加を必要とする場合がある）を含む。

【0114】

本発明によれば、１～１００ｍｇのＳＰ６ポリメラーゼが、典型的には、生成されたｍＲＮＡの１グラム（ｇ）あたり使用される。一部の実施形態では、生成されたｍＲＮＡの１ｇあたり約１～９０ｍｇ、１～８０ｍｇ、１～６０ｍｇ、１～５０ｍｇ、１～４０ｍｇ、１０～１００ｍｇ、１０～８０ｍｇ、１０～６０ｍｇ、１０～５０ｍｇのＳＰ６ポリメラーゼが使用される。一部の実施形態では、約５～２０ｍｇのＳＰ６ポリメラーゼを使用して、約１グラムのｍＲＮＡを生成する。一部の実施形態では、約０．５～２グラムのＳＰ６ポリメラーゼを使用して、約１００グラムのｍＲＮＡを生成する。一部の実施形態では、約５～２０グラムのＳＰ６ポリメラーゼを使用して、約１キログラムのｍＲＮＡを生成する。一部の実施形態では、少なくとも５ｍｇのＳＰ６ポリメラーゼを使用して、少なくとも１グラムのｍＲＮＡを生成する。一部の実施形態では、少なくとも５００ｍｇのＳＰ６ポリメラーゼを使用して、少なくとも１００グラムのｍＲＮＡを生成する。一部の実施形態では、少なくとも５グラムのＳＰ６ポリメラーゼを使用して、少なくとも１キログラムのｍＲＮＡを生成する。一部の実施形態では、生成されたｍＲＮＡ１ｇあたり約１０ｍｇ、２０ｍｇ、３０ｍｇ、４０ｍｇ、５０ｍｇ、６０ｍｇ、７０ｍｇ、８０ｍｇ、９０ｍｇ、または１００ｍｇのプラスミドＤＮＡが使用される。一部の実施形態では、約１０～３０ｍｇのプラスミドＤＮＡを使用して、約１グラムのｍＲＮＡを生成する。一部の実施形態では、約１～３グラムのプラスミドＤＮＡを使用して、約１００グラムのｍＲＮＡを生成する。一部の実施形態では、約１０～３０グラムのプラスミドＤＮＡを使用して、約１キログラムのｍＲＮＡを生成する。一部の実施形態では、少なくとも１０ｍｇのプラスミドＤＮＡを使用して、少なくとも１グラムのｍＲＮＡを生成する。一部の実施形態では、少なくとも１グラムのプラスミドＤＮＡを使用して、少なくとも１００グラムのｍＲＮＡを生成する。一部の実施形態では、少なくとも１０グラムのプラスミドＤＮＡを使用して、少なくとも１キログラムのｍＲＮＡを生成する。

【0115】

一部の実施形態では、反応混合物中のＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼの濃度は、約１～１００ｎＭ、１～９０ｎＭ、１～８０ｎＭ、１～７０ｎＭ、１～６０ｎＭ、１～５０ｎＭ、１～４０ｎＭ、１～３０ｎＭ、１～２０ｎＭ、または約１～１０ｎＭであり得る。ある特定の実施形態では、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼの濃度は、約１０～５０ｎＭ、２０～５０ｎＭ、または３０～５０ｎＭである。ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼの１００～１００００単位／ｍｌの濃度、例として、１００～９０００単位／ｍｌ、１００～８０００単位／ｍｌ、１００～７０００単位／ｍｌ、１００～６０００単位／ｍｌ、１００～５０００単位／ｍｌ、１００～１０００単位／ｍｌ、２００～２０００単位／ｍｌ、５００～１０００単位／ｍｌ、５００～２０００単位／ｍｌ、５００～３０００単位／ｍｌ、５００～４０００単位／ｍｌ、５００～５０００単位／ｍｌ、５００～６０００単位／ｍｌ、１０００～７５００単位／ｍｌ、および２５００～５０００単位／ｍｌの濃度を用いることができる。

【0116】

反応混合物中の各リボヌクレオチド（例えば、ＡＴＰ、ＵＴＰ、ＧＴＰ、およびＣＴＰ）の濃度は、約０．１ｍＭ～約１０ｍＭ、例えば、約１ｍＭ～約１０ｍＭの間、約２ｍＭ～約１０ｍＭの間、約３ｍＭ～約１０ｍＭの間、約１ｍＭ～約８ｍＭの間、約１ｍＭ～約６ｍＭの間、約３ｍＭ～約１０ｍＭの間、約３ｍＭ～約８ｍＭの間、約３ｍＭ～約６ｍＭの間、約４ｍＭ～約５ｍＭの間である。一部の実施形態では、各リボヌクレオチドは、反応混合物中で約５ｍＭである。一部の実施形態では、反応において使用されるｒＮＴＰ（例えば、ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰおよびＵＴＰの組合せ）の全濃度は、１ｍＭ～４０ｍＭの間の範囲である。一部の実施形態では、反応において使用されるｒＮＴＰ（例えば、ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰおよびＵＴＰの組合せ）の全濃度は、１ｍＭ～３０ｍＭの間、または１ｍＭ～２８ｍＭの間、または１ｍＭ～２５ｍＭの間、または１ｍＭ～２０ｍＭの間の範囲である。一部の実施形態では、全ｒＮＴＰ濃度は３０ｍＭ未満である。一部の実施形態では、全ｒＮＴＰ濃度は２５ｍＭ未満である。一部の実施形態では、全ｒＮＴＰ濃度は２０ｍＭ未満である。一部の実施形態では、全ｒＮＴＰ濃度は１５ｍＭ未満である。一部の実施形態では、全ｒＮＴＰ濃度は１０ｍＭ未満である。

【0117】

ＲＮＡポリメラーゼ反応緩衝液には、典型的には、塩／緩衝剤、例えば、Ｔｒｉｓ、ＨＥＰＥＳ、硫酸アンモニウム、重炭酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、リン酸カリウム、リン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、および塩化マグネシウムが含まれる。

【0118】

反応混合物のｐＨは、約６～８．５、約６．５～８．０、約７．０～７．５であり得、一部の実施形態では、ｐＨは７．５である。

【0119】

直鎖または線状化のＤＮＡ鋳型（例えば、上記されるように、所望の量のＲＮＡを提供するのに十分な量／濃度で）、ＲＮＡポリメラーゼ反応緩衝液、およびＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼを組み合わせて、反応混合物を形成する。反応混合物を約３７℃～約４２℃で３０分～６時間、例えば約６０～約９０分間インキュベートする。

【0120】

一部の実施形態では、適切なＲＮＡポリメラーゼ反応緩衝液（最終反応混合物のｐＨは約７．５である）中の約５ｍＭ ＮＴＰ、約０．０５ｍｇ／ｍＬ ＳＰ６ポリメラーゼ、および約０．１ｍｇ／ｍｌ ＤＮＡ鋳型を約３７℃～約４２℃で６０～９０分間インキュベートする。

【0121】

一部の実施形態では、反応混合物は、ＳＰ６ポリメラーゼ特異的プロモーター、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ、ＲＮａｓｅ阻害剤、ピロホスファターゼ、２９ｍＭ ＮＴＰ、１０ｍＭ ＤＴＴおよび反応緩衝液（１０×の場合は８００ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２０ｍＭスペルミジン、２５０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、ｐＨ７．７）および所望の反応体積に十分な含量（ＱＳ）をＲＮａｓｅフリー水とともに有する線状化二本鎖ＤＮＡ鋳型を含有する。次に、この反応混合物を３７℃で６０分間インキュベートする。次に、ポリメラーゼ反応を、ＤＮａｓｅ ＩおよびＤＮａｓｅ Ｉ緩衝液（１０×の場合は１００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ_２および２５ｍＭ ＣａＣｌ_２、ｐＨ７．６）の添加によってクエンチさせ、精製のための調製における二本鎖ＤＮＡ鋳型の消化を促進する。この実施形態は、１００グラムのｍＲＮＡを生成するのに十分であることが示されている。

【0122】

一部の実施形態では、反応混合物は、１～１０ｍＭの範囲の濃度のＮＴＰ、０．０１～０．５ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度のＤＮＡ鋳型、および０．０１～０．１ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度のＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼを含み、例えば、反応混合物は、５ｍＭの濃度のＮＴＰ、０．１ｍｇ／ｍｌの濃度のＤＮＡ鋳型、および０．０５ｍｇ／ｍｌの濃度のＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼを含む。

【0123】

ヌクレオチド
種々の天然に存在するかまたは修飾されたヌクレオシドを用いて、本発明によるｍＲＮＡを生成することができる。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、天然ヌクレオシド（例えば、アデノシン、グアノシン、シチジン、ウリジン）；ヌクレオシド類似体（例えば、２－アミノアデノシン、２－チオチミジン、イノシン、ピロロ－ピリミジン、３－メチルアデノシン、５－メチルシチジン、Ｃ－５プロピニル－シチジン、Ｃ－５プロピニル－ウリジン、２－アミノアデノシン、Ｃ５－ブロモウリジン、Ｃ５－フルオロウリジン、Ｃ５－ヨードウリジン、Ｃ５－プロピニル－ウリジン、Ｃ５－プロピニル－シチジン、Ｃ５－メチルシチジン、２－アミノアデノシン、７－デアザアデノシン、７－デアザグアノシン、８－オキソアデノシン、８－オキソグアノシン、Ｏ（６）－メチルグアニン、シュードウリジン、（例えば、Ｎ－１－メチル－シュードウリジン）、２－チオウリジン、および２－チオシチジン）；化学的に修飾された塩基；生物学的に修飾された塩基（例えば、メチル化塩基）；インターカレートされた塩基；修飾糖（例えば、２’－フルオロリボース、リボース、２’－デオキシリボース、アラビノース、およびヘキソース）；および／または修飾されたリン酸基（例えば、ホスホロチオエートおよび５’－Ｎ－ホスホルアミダイト結合）であるかまたはそれを含む。

【0124】

一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、１つまたはそれ以上の非標準ヌクレオチド残基を含む。非標準ヌクレオチド残基は、例えば、５－メチル－シチジン（「５ｍＣ」）、シュードウリジン（「ψＵ」）、および／または２－チオ－ウリジン（「２ｓＵ」）を含み得る。このような残基の検討およびそれらのｍＲＮＡへの取り込みについては、例えば、米国特許第８，２７８，０３６号または国際公開第２０１１／０１２３１６号を参照されたい。ｍＲＮＡはＲＮＡであり得、Ｕ残基の２５％が２－チオ－ウリジンであり、Ｃ残基の２５％が５－メチルシチジンであるＲＮＡとして定義される。ＲＮＡの使用のための教示は、米国特許出願公開第２０１２／０１９５９３６号および国際公開第２０１１／０１２３１６号に開示され、いずれも参照によりそれらの全体が本明細書に組み入れられる。非標準ヌクレオチド残基の存在は、ｍＲＮＡを、同じ配列を有するが、標準残基のみを含有する対照ｍＲＮＡよりも安定におよび／またはあまり免疫原性ではなくすることができる。さらなる実施形態では、ｍＲＮＡは、イソシトシン、シュードイソシトシン、５－ブロモウラシル、５－プロピニルウラシル、６－アミノプリン、２－アミノプリン、イノシン、ジアミノプリンおよび２－クロロ－６－アミノプリンシトシン、ならびにこれらの修飾および他の核酸塩基修飾の組合せから選択される１つまたはそれ以上の非標準ヌクレオチド残基を含むことができる。一部の実施形態は、フラノース環または核酸塩基に対する追加の修飾をさらに含むことができる。追加の修飾には、例えば、糖修飾または置換（例えば、２’－Ｏ－アルキル修飾、ロック核酸（ＬＮＡ）の１つまたはそれ以上）が含まれる。一部の実施形態では、ＲＮＡは追加のポリヌクレオチドおよび／またはペプチドポリヌクレオチド（ＰＮＡ）と複合体化またはハイブリダイズされる。糖修飾が２’－Ｏ－アルキル修飾である一部の実施形態では、このような修飾には、それだけに限らないが、２’－デオキシ－２’－フルオロ修飾、２’－Ｏ－メチル修飾、２’－Ｏ－メトキシエチル修飾および２’－デオキシ修飾が含まれる。一部の実施形態では、これらの修飾のいずれもヌクレオチドの０～１００％－例えば、個別にまたは組み合わせて構成ヌクレオチドの０％、１％、１０％、２５％、５０％、７５％、８５％、９０％、９５％超または１００％で存在することができる。

【0125】

合成後プロセシング
典型的には、５’キャップおよび／または３’テールを合成後に付加することができる。キャップの存在は、ほとんどの真核細胞に見られるヌクレアーゼに対する耐性を提供するのに重要である。「テール」の存在は、ｍＲＮＡをエキソヌクレアーゼ分解から保護するのに役立つ。

【0126】

５’キャップは、典型的には、以下のように付加される：第１に、ＲＮＡ末端ホスファターゼが５’ヌクレオチドから末端リン酸基のうちの１つを除去し、２つの末端リン酸を残す；次に、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）がグアニル基転移酵素を介して末端リン酸に付加され、５’５’５三リン酸結合を生成し；次に、グアニンの７－窒素がメチル基転移酵素によってメチル化される。キャップ構造の例としては、限定されないが、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’（Ａ，Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）ＡおよびＧ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇが挙げられる。さらなるキャップ構造は、参照により本明細書に組み入れられる、２０１７年２月２７日に出願された米国特許出願公開第２０１６／００３２３５６号および米国仮特許出願第６２／４６４，３２７号に記載される。

【0127】

典型的には、テール構造は、ポリ（Ａ）および／またはポリ（Ｃ）テールを含む。ｍＲＮＡの３’末端上のポリＡまたはポリＣテールは、典型的には、それぞれ少なくとも５０個のアデノシンもしくはシトシンヌクレオチド、少なくとも１５０個のアデノシンもしくはシトシンヌクレオチド、少なくとも２００個のアデノシンもしくはシトシンヌクレオチド、少なくとも２５０個のアデノシンもしくはシトシンヌクレオチド、少なくとも３００個のアデノシンもしくはシトシンヌクレオチド、少なくとも３５０個のアデノシンもしくはシトシンヌクレオチド、少なくとも４００個のアデノシンもしくはシトシンヌクレオチド、少なくとも４５０個のアデノシンもしくはシトシンヌクレオチド、少なくとも５００個のアデノシンもしくはシトシンヌクレオチド、少なくとも５５０個のアデノシンもしくはシトシンヌクレオチド、少なくとも６００個のアデノシンもしくはシトシンヌクレオチド、少なくとも６５０個のアデノシンもしくはシトシンヌクレオチド、少なくとも７００個のアデノシンもしくはシトシンヌクレオチド、少なくとも７５０個のアデノシンもしくはシトシンヌクレオチド、少なくとも８００個のアデノシンもしくはシトシンヌクレオチド、少なくとも８５０個のアデノシンもしくはシトシンヌクレオチド、少なくとも９００個のアデノシンもしくはシトシンヌクレオチド、少なくとも９５０個のアデノシンもしくはシトシンヌクレオチド、または少なくとも１ｋｂのアデノシンもしくはシトシンヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ポリＡまたはポリＣテールは、それぞれ約１０～８００個のアデノシンまたはシトシンヌクレオチド（例えば、約１０～２００個のアデノシンもしくはシトシンヌクレオチド、約１０～３００個のアデノシンもしくはシトシンヌクレオチド、約１０～４００個のアデノシンもしくはシトシンヌクレオチド、約１０～５００個のアデノシンもしくはシトシンヌクレオチド、約１０～５５０個のアデノシンもしくはシトシンヌクレオチド、約１０～６００個のアデノシンもしくはシトシンヌクレオチド、約５０～６００個のアデノシンもしくはシトシンヌクレオチド、約１００～６００個のアデノシンもしくはシトシンヌクレオチド、約１５０～６００個のアデノシンもしくはシトシンヌクレオチド、約２００～６００個のアデノシンもしくはシトシンヌクレオチド、約２５０～６００個のアデノシンもしくはシトシンヌクレオチド、約３００～６００個のアデノシンもしくはシトシンヌクレオチド、約３５０～６００個のアデノシンもしくはシトシンヌクレオチド、約４００～６００個のアデノシンもしくはシトシンヌクレオチド、約４５０～６００個のアデノシンもしくはシトシンヌクレオチド、約５００～６００個のアデノシンもしくはシトシンヌクレオチド、約１０～１５０個のアデノシンもしくはシトシンヌクレオチド、約１０～１００個のアデノシンもしくはシトシンヌクレオチド、約２０～７０個のアデノシンもしくはシトシンヌクレオチド、または約２０～６０個のアデノシンもしくはシトシンヌクレオチド）であることができる。一部の実施形態では、テール構造は、本明細書に記載される様々な長さのポリ（Ａ）テールとポリ（Ｃ）テールの組合せである。一部の実施形態では、テール構造は、少なくとも５０％、５５％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のアデノシンヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、テール構造は、少なくとも５０％、５５％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のシトシンヌクレオチドを含む。

【0128】

本明細書に記載されるように、キャッピングおよび／またはテーリングがないと、早期中断ｍＲＮＡ転写産物のサイズがあまりに小さすぎて検出することができないために、５’キャップおよび／または３’テールの付加によって、インビトロ合成中に産生される中断転写産物の検出が容易になる。よって、一部の実施形態では、ｍＲＮＡを純度（ｍＲＮＡ中に存在する中断転写産物のレベル）について試験する前に、５’キャップおよび／または３’テールを合成されたｍＲＮＡに付加する。一部の実施形態では、ｍＲＮＡを本明細書に記載されるように精製する前に、５’キャップおよび／または３’テールを合成されたｍＲＮＡに付加する。他の実施形態では、ｍＲＮＡを本明細書に記載されるように精製した後に、５’キャップおよび／または３’テールを合成されたｍＲＮＡに付加する。

【0129】

本発明に従って合成されたｍＲＮＡは、さらなる精製なしに使用することができる。特に、本発明に従って合成されたｍＲＮＡは、ショートマーを除去する工程なしで使用することができる。一部の実施形態では、本発明に従って合成されたｍＲＮＡをさらに精製することができる。種々の方法を用いて、本発明に従って合成されたｍＲＮＡを精製することができる。例えば、遠心分離、濾過および／またはクロマトグラフィー法を使用して、ｍＲＮＡの精製を実施することができる。一部の実施形態では、合成されたｍＲＮＡは、エタノール沈殿もしくは濾過もしくはクロマトグラフィー、もしくはゲル精製または任意の他の適切な手段によって精製される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡはＨＰＬＣによって精製される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、当業者に周知の、標準フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール溶液中で抽出される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡはタンジェンシャルフローフィルトレーションを使用して精製される。適切な精製方法には、２０１８年２月２７日に出願された「ＭＥＴＨＯＤＳ ＦＯＲ ＰＵＲＩＦＩＣＡＴＩＯＮ ＯＦ ＭＥＳＳＥＮＧＥＲ ＲＮＡ」と題する米国特許出願公開第２０１６／００４０１５４号、米国特許出願公開第２０１５／０３７６２２０号、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ１８／１９９５４号、および２０１８年２月２７日に出願された「ＭＥＴＨＯＤＳ ＦＯＲ ＰＵＲＩＦＩＣＡＴＩＯＮ ＯＦ ＭＥＳＳＥＮＧＥＲ ＲＮＡ」と題する国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ１８／１９９７８号に記載されたものが含まれ、全て参照により本明細書に組み入れられ、本発明を実施するために使用することができる。

【0130】

一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、キャッピングおよびテーリング前に精製される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、キャッピングおよびテーリング後に精製される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、キャッピングおよびテーリングの前と後の両方で精製される。

【0131】

一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、遠心分離によってキャッピングおよびテーリングの前もしくは後のいずれかまたは前と後の両方で精製される。

【0132】

一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、濾過によってキャッピングおよびテーリングの前もしくは後のいずれかまたは前と後の両方で精製される。

【0133】

一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、タンジェンシャルフローフィルトレーション（ＴＦＦ）によってキャッピングおよびテーリングの前もしくは後のいずれかまたは前と後の両方で精製される。

【0134】

一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、クロマトグラフィーによってキャッピングおよびテーリングの前もしくは後のいずれかまたは前と後の両方で精製される。

【0135】

ｍＲＮＡの特徴付け
ｍＲＮＡの完全長または中断転写産物は、当技術分野において利用可能な任意の方法を用いて検出および定量することができる。一部の実施形態では、合成されたｍＲＮＡ分子は、ブロット法、キャピラリー電気泳動、クロマトグラフィー、蛍光、ゲル電気泳動、ＨＰＬＣ、銀染色、分光法、紫外線（ＵＶ）、もしくはＵＰＬＣ、またはそれらの組合せを用いて検出される。当技術分野において公知である他の検出方法が、本発明に含まれる。一部の実施形態では、合成されたｍＲＮＡ分子は、キャピラリー電気泳動による分離を伴うＵＶ吸収分光法を用いて検出される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡを、ゲル電気泳動（「グリオキサールゲル電気泳動」）の前にまずグリオキサール色素によって変性させる。一部の実施形態では、合成されたｍＲＮＡをキャッピングまたはテーリング前に特性評価する。一部の実施形態では、合成されたｍＲＮＡをキャッピングおよびテーリング後に特性評価する。

【0136】

一部の実施形態では、本明細書に開示される方法によって生成されたｍＲＮＡは、完全長ｍＲＮＡ以外の不純物を１０％未満、９％未満、８％未満、７％未満、６％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、１％未満、０．５％未満、０．１％未満で含む。不純物には、ＩＶＴ汚染物質、例えば、タンパク質、酵素、遊離ヌクレオチドおよび／またはショートマーが含まれる。

【0137】

一部の実施形態では、本発明に従って生成されたｍＲＮＡは、ショートマーおよび中断転写産物を実質的に含まない。特に、本発明に従って生成されたｍＲＮＡは、キャピラリー電気泳動またはグリオキサールゲル電気泳動により検出不能なレベルのショートマーまたは中断転写産物を含有する。本明細書で使用される場合、「ショートマー」または「中断転写産物」という用語は、完全長未満である任意の転写産物を指す。一部の実施形態では、「ショートマー」または「中断転写産物」は、長さが１００ヌクレオチド未満、９０未満、８０未満、７０未満、６０未満、５０未満、４０未満、３０未満、２０未満、または１０未満のヌクレオチドである。一部の実施形態では、ショートマーは、５’－キャップおよび／または３’－ポリＡテールを付加した後に検出または定量される。

【0138】

ｍＲＮＡ溶液
一部の実施形態では、ｍＲＮＡを脂質ナノ粒子に封入することができるように、ｍＲＮＡは脂質溶液と混合する溶液中に提供することができる。適切なｍＲＮＡ溶液は、種々の濃度で封入されるｍＲＮＡを含有する任意の水溶液であり得る。例えば、適切なｍＲＮＡ溶液は、約０．０１ｍｇ／ｍｌ、０．０５ｍｇ／ｍｌ、０．０６ｍｇ／ｍｌ、０．０７ｍｇ／ｍｌ、０．０８ｍｇ／ｍｌ、０．０９ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌ、０．１５ｍｇ／ｍｌ、０．２ｍｇ／ｍｌ、０．３ｍｇ／ｍｌ、０．４ｍｇ／ｍｌ、０．５ｍｇ／ｍｌ、０．６ｍｇ／ｍｌ、０．７ｍｇ／ｍｌ、０．８ｍｇ／ｍｌ、０．９ｍｇ／ｍｌ、または１．０ｍｇ／ｍｌの濃度またはそれよりも大きい濃度でｍＲＮＡを含有し得る。一部の実施形態では、適切なｍＲＮＡ溶液は、約０．０１～１．０ｍｇ／ｍｌ、０．０１～０．９ｍｇ／ｍｌ、０．０１～０．８ｍｇ／ｍｌ、０．０１～０．７ｍｇ／ｍｌ、０．０１～０．６ｍｇ／ｍｌ、０．０１～０．５ｍｇ／ｍｌ、０．０１～０．４ｍｇ／ｍｌ、０．０１～０．３ｍｇ／ｍｌ、０．０１～０．２ｍｇ／ｍｌ、０．０１～０．１ｍｇ／ｍｌ、０．０５～１．０ｍｇ／ｍｌ、０．０５～０．９ｍｇ／ｍｌ、０．０５～０．８ｍｇ／ｍｌ、０．０５～０．７ｍｇ／ｍｌ、０．０５～０．６ｍｇ／ｍｌ、０．０５～０．５ｍｇ／ｍｌ、０．０５～０．４ｍｇ／ｍｌ、０．０５～０．３ｍｇ／ｍｌ、０．０５～０．２ｍｇ／ｍｌ、０．０５～０．１ｍｇ／ｍｌ、０．１～１．０ｍｇ／ｍｌ、０．２～０．９ｍｇ／ｍｌ、０．３～０．８ｍｇ／ｍｌ、０．４～０．７ｍｇ／ｍｌ、または０．５～０．６ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度でｍＲＮＡを含有し得る。一部の実施形態では、適切なｍＲＮＡ溶液は、最大約５．０ｍｇ／ｍｌ、４．０ｍｇ／ｍｌ、３．０ｍｇ／ｍｌ、２．０ｍｇ／ｍｌ、１．０ｍｇ／ｍｌ、０．０９ｍｇ／ｍｌ、０．０８ｍｇ／ｍｌ、０．０７ｍｇ／ｍｌ、０．０６ｍｇ／ｍｌ、または０．０５ｍｇ／ｍｌの濃度でｍＲＮＡを含有し得る。

【0139】

典型的には、適切なｍＲＮＡ溶液は、緩衝剤および／または塩を含有することもできる。一般的に、緩衝剤は、ＨＥＰＥＳ、硫酸アンモニウム、重炭酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、リン酸カリウムおよびリン酸ナトリウムを含むことができる。一部の実施形態では、緩衝剤の適切な濃度は、約０．１ｍＭ～１００ｍＭ、０．５ｍＭ～９０ｍＭ、１．０ｍＭ～８０ｍＭ、２ｍＭ～７０ｍＭ、３ｍＭ～６０ｍＭ、４ｍＭ～５０ｍＭ、５ｍＭ～４０ｍＭ、６ｍＭ～３０ｍＭ、７ｍＭ～２０ｍＭ、８ｍＭ～１５ｍＭ、または９～１２ｍＭの範囲であることができる。一部の実施形態では、緩衝剤の適切な濃度は、約０．１ｍＭ、０．５ｍＭ、１ｍＭ、２ｍＭ、４ｍＭ、６ｍＭ、８ｍＭ、１０ｍＭ、１５ｍＭ、２０ｍＭ、２５ｍＭ、３０ｍＭ、３５ｍＭ、４０ｍＭ、４５ｍＭ、もしくは５０ｍＭであるかまたはそれより大きい。

【0140】

例示的な塩には、塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、および塩化カリウムが含まれる。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液中の塩の適切な濃度は、約１ｍＭ～５００ｍＭ、５ｍＭ～４００ｍＭ、１０ｍＭ～３５０ｍＭ、１５ｍＭ～３００ｍＭ、２０ｍＭ～２５０ｍＭ、３０ｍＭ～２００ｍＭ、４０ｍＭ～１９０ｍＭ、５０ｍＭ～１８０ｍＭ、５０ｍＭ～１７０ｍＭ、５０ｍＭ～１６０ｍＭ、５０ｍＭ～１５０ｍＭ、または５０ｍＭ～１００ｍＭの範囲であることができる。適切なｍＲＮＡ溶液中の塩濃度は、約１ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭ、３０ｍＭ、４０ｍＭ、５０ｍＭ、６０ｍＭ、７０ｍＭ、８０ｍＭ、９０ｍＭ、もしくは１００ｍＭである、またはそれを超える。

【0141】

一部の実施形態では、適切なｍＲＮＡ溶液は、約３．５～６．５、３．５～６．０、３．５～５．５、３．５～５．０、３．５～４．５、４．０～５．５、４．０～５．０、４．０～４．９、４．０～４．８、４．０～４．７、４．０～４．６、または４．０～４．５の範囲のｐＨを有することができる。一部の実施形態では、適切なｍＲＮＡ溶液は、約３．５、４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５．０、５．２、５．４、５．６、５．８、６．０、６．１、６．３、および６．５のｐＨまたはそれ以下を有することができる。

【0142】

様々な方法を使用して本発明に適したｍＲＮＡ溶液を製造することができる。一部の実施形態では、ｍＲＮＡを本明細書に記載される緩衝液に直接溶解することができる。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は、ｍＲＮＡストック溶液を封入用の脂質溶液と混合する前に緩衝液と混合することによって作製することができる。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は、ｍＲＮＡストック溶液を封入用の脂質溶液と混合する直前に緩衝液と混合することによって作製することができる。一部の実施形態では、適切なｍＲＮＡストック溶液は、約０．２ｍｇ／ｍｌ、０．４ｍｇ／ｍｌ、０．５ｍｇ／ｍｌ、０．６ｍｇ／ｍｌ、０．８ｍｇ／ｍｌ、１．０ｍｇ／ｍｌ、１．２ｍｇ／ｍｌ、１．４ｍｇ／ｍｌ、１．５ｍｇ／ｍｌ、もしくは１．６ｍｇ／ｍｌ、２．０ｍｇ／ｍｌ、２．５ｍｇ／ｍｌ、３．０ｍｇ／ｍｌ、３．５ｍｇ／ｍｌ、４．０ｍｇ／ｍｌ、４．５ｍｇ／ｍｌ、もしくは５．０ｍｇ／ｍｌまたはそれを超える濃度で水中にｍＲＮＡを含有することができる。

【0143】

一部の実施形態では、ｍＲＮＡストック溶液はポンプを使用して緩衝液と混合される。例示的なポンプには、それだけに限らないが、ギアポンプ、蠕動ポンプおよび遠心ポンプが含まれる。

【0144】

典型的には、緩衝液は、ｍＲＮＡストック溶液の流量を超える流量で混合される。例えば、緩衝液は、ｍＲＮＡストック溶液の流量より少なくとも１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、または２０倍大きい流量で混合される。一部の実施形態では、緩衝液は、約１００～６０００ｍｌ／分（例えば、約１００～３００ｍｌ／分、３００～６００ｍｌ／分、６００～１２００ｍｌ／分、１２００～２４００ｍｌ／分、２４００～３６００ｍｌ／分、３６００～４８００ｍｌ／分、４８００～６０００ｍｌ／分、または６０～４２０ｍｌ／分）の間の範囲の流量で混合される。一部の実施形態では、緩衝液は、約６０ｍｌ／分、１００ｍｌ／分、１４０ｍｌ／分、１８０ｍｌ／分、２２０ｍｌ／分、２６０ｍｌ／分、３００ｍｌ／分、３４０ｍｌ／分、３８０ｍｌ／分、４２０ｍｌ／分、４８０ｍｌ／分、５４０ｍｌ／分、６００ｍｌ／分、１２００ｍｌ／分、２４００ｍｌ／分、３６００ｍｌ／分、４８００ｍｌ／分、もしくは６０００ｍｌ／分またはそれを超える流量で混合される。

【0145】

一部の実施形態では、ｍＲＮＡストック溶液は、約１０～６００ｍｌ／分（例えば、約５～５０ｍｌ／分、約１０～３０ｍｌ／分、約３０～６０ｍｌ／分、約６０～１２０ｍｌ／分、約１２０～２４０ｍｌ／分、約２４０～３６０ｍｌ／分、約３６０～４８０ｍｌ／分、または約４８０～６００ｍｌ／分）の間の範囲の流量で混合される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡストック溶液は、約５ｍｌ／分、１０ｍｌ／分、１５ｍｌ／分、２０ｍｌ／分、２５ｍｌ／分、３０ｍｌ／分、３５ｍｌ／分、４０ｍｌ／分、４５ｍｌ／分、５０ｍｌ／分、６０ｍｌ／分、８０ｍｌ／分、１００ｍｌ／分、２００ｍｌ／分、３００ｍｌ／分、４００ｍｌ／分、５００ｍｌ／分、もしくは６００ｍｌ／分またはそれを超える流量で混合される。

【0146】

送達ビヒクル
本明細書に記載される安定な脂質ナノ粒子製剤は、ｍＲＮＡ用の送達ビヒクルとして適している。

【0147】

本明細書で使用される場合、「送達ビヒクル」、「導入ビヒクル」、「ナノ粒子」という用語または文法上同等物は互換的に使用される。

【0148】

送達ビヒクルは、１つもしくはそれ以上の追加の核酸、担体、標的化リガンドもしくは安定化試薬と組み合わせて、または適切な賦形剤と混合される薬理学的組成物に製剤化される。薬物を製剤化および投与するための技術は、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、ペンシルバニア州イーストン、最新版に見られる。特定の送達ビヒクルは、標的細胞への核酸のトランスフェクションを容易にする能力に基づいて選択される。

【0149】

リポソーム送達ビヒクル
一部の実施形態では、適切な送達ビヒクルはリポソーム送達ビヒクル、例えば脂質ナノ粒子である。本明細書で使用される場合、リポソーム送達ビヒクル、例えば脂質ナノ粒子は、通常、１つまたはそれ以上の二重層の膜によって外側媒体から隔離された内部水空間を有する顕微鏡的小胞として特徴付けられる。リポソームの二重層膜は、典型的には空間的に分離された親水性ドメインおよび疎水性ドメインを含む合成または天然起源の脂質などの両親媒性分子によって形成される（Ｌａｓｉｃ、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１６：３０７～３２１、１９９８）。リポソームの二重層膜はまた、両親媒性ポリマーおよび界面活性剤によっても形成される（例えば、ポリマーソーム、ニオソーム等）。本発明の文脈において、リポソーム送達ビヒクルは、典型的には所望のｍＲＮＡを標的細胞または組織に輸送するのに役立つ。一部の実施形態では、ナノ粒子送達ビヒクルはリポソームである。一部の実施形態では、リポソームは、１つまたはそれ以上のカチオン性脂質、１つまたはそれ以上の非カチオン性脂質、１つまたはそれ以上のコレステロール系脂質、および１つまたはそれ以上のＰＥＧ修飾脂質を含む。一部の実施形態では、リポソームは３つ以下の別個の脂質成分を含む。一部の実施形態では、１つの別個の脂質成分はステロール系カチオン性脂質である。

【0150】

カチオン性脂質
本明細書で使用される場合、「カチオン性脂質」という句は、生理学的ｐＨなどの選択されたｐＨで正味の正の電荷を有するいくつかの脂質種のいずれかを指す。

【0151】

本発明の組成物および方法に使用するのに適したカチオン性脂質には、参照によって本明細書に組み入れられる、国際公開第２０１０／１４４７４０号に記載されるカチオン性脂質が含まれる。ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、

【化1】

の化合物構造を有する、カチオン性脂質、（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）－ヘプタトリアコンタ－６，９，２８，３１－テトラエン－１９－イル４－（ジメチルアミノ）ブタノエート、およびその薬学的に許容される塩を含む。

【0152】

本発明の組成物および方法に使用するのに適した他のカチオン性脂質には、参照によって本明細書に組み入れられる、国際公開第２０１３／１４９１４０号に記載されるイオン化可能なカチオン性脂質が含まれる。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の式：

【化2】

の１つのカチオン性脂質またはその薬学的に許容される塩（式中、Ｒ_１およびＲ_２は、水素、場合により置換された、可変的に飽和または不飽和のＣ_１～Ｃ_２０アルキルおよび場合により置換された、可変的に飽和または不飽和のＣ_６～Ｃ_２０アシルからなる群からそれぞれ独立に選択され；Ｌ_１およびＬ_２は、水素、場合により置換されたＣ_１～Ｃ_３０アルキル、場合により置換された、可変的に不飽和のＣ_１～Ｃ_３０アルケニル、および場合により置換されたＣ_１～Ｃ_３０アルキニルからなる群からそれぞれ独立に選択され；ｍおよびｏは０および任意の正の整数からなる群からそれぞれ独立に選択され（例えば、ｍは３である）；ｎは０または任意の正の整数である（例えば、ｎは１である））を含む。ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、

【化3】

の化合物構造を有する、カチオン性脂質（１５Ｚ，１８Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－６－（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イル）テトラコサ－１５，１８－ジエン－１－アミン（「ＨＧＴ５０００」）およびその薬学的に許容される塩を含む。ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、

【化4】

の化合物構造を有する、カチオン性脂質（１５Ｚ，１８Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－６－（（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イル）テトラコサ－４，１５，１８－トリエン－１－アミン（「ＨＧＴ５００１」）およびその薬学的に許容される塩を含む。ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、

【化5】

の化合物構造を有する、カチオン性脂質および（１５Ｚ，１８Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－６－（（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イル）テトラコサ－５，１５，１８－トリエン－１－アミン（「ＨＧＴ５００２」）およびその薬学的に許容される塩を含む。

【0153】

本発明の組成物および方法に使用するのに適した他のカチオン性脂質には、参照によって本明細書に組み入れられる、国際公開第２０１０／０５３５７２号にアミノアルコールリピドイドとして記載されるカチオン性脂質が含まれる。ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、

【化6】

の化合物構造を有するカチオン性脂質およびその薬学的に許容される塩を含む。

【0154】

本発明の組成物および方法に使用するのに適した他のカチオン性脂質には、参照によって本明細書に組み入れられる、国際公開第２０１６／１１８７２５号に記載されるカチオン性脂質が含まれる。ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、

【化7】

の化合物構造を有するカチオン性脂質およびその薬学的に許容される塩を含む。

【0155】

本発明の組成物および方法に使用するのに適した他のカチオン性脂質には、参照によって本明細書に組み入れられる、国際公開第２０１６／１１８７２４号に記載されるカチオン性脂質が含まれる。ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、

【化8】

の化合物構造を有するカチオン性脂質およびその薬学的に許容される塩を含む。

【0156】

本発明の組成物および方法に使用するのに適した他のカチオン性脂質には、１４，２５－ジトリデシル１５，１８，２１，２４－テトラアザ－オクタトリアコンタンの式を有するカチオン性脂質、およびその薬学的に許容される塩が含まれる。

【0157】

本発明の組成物および方法に使用するのに適した他のカチオン性脂質には、その各々を参照によって本明細書に組み入れられる、国際公開第２０１３／０６３４６８号および国際公開第２０１６／２０５６９１号に記載されるカチオン性脂質が含まれる。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の式：

【化9】

のカチオン性脂質またはその薬学的に許容される塩（式中、Ｒ^Ｌの各例は独立に、場合により置換されたＣ_６～Ｃ_４０アルケニルである）を含む。ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、

【化10】

の化合物構造を有するカチオン性脂質およびその薬学的に許容される塩を含む。ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、

【化11】

の化合物構造を有するカチオン性脂質およびその薬学的に許容される塩を含む。ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、

【化12】

の化合物構造を有するカチオン性脂質およびその薬学的に許容される塩を含む。ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、

【化13】

の化合物構造を有するカチオン性脂質およびその薬学的に許容される塩を含む。

【0158】

本発明の組成物および方法に使用するのに適した他のカチオン性脂質には、参照によって本明細書に組み入れられる、国際公開第２０１５／１８４２５６号に記載されるカチオン性脂質が含まれる。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の式：

【化14】

のカチオン性脂質またはその薬学的に許容される塩（式中、各Ｘは独立に、ＯまたはＳであり；各Ｙは独立に、ＯまたはＳであり；各ｍは独立に、０～２０であり；各ｎは独立に、１～６であり；各Ｒ_Ａは独立に、水素、場合により置換されたＣ１～５０アルキル、場合により置換されたＣ２～５０アルケニル、場合により置換されたＣ２～５０アルキニル、場合により置換されたＣ３～１０カルボシクリル、場合により置換された３～１４員ヘテロシクリル、場合により置換されたＣ６～１４アリール、場合により置換された５～１４員ヘテロアリールまたはハロゲンであり；各Ｒ_Ｂは独立に、水素、場合により置換されたＣ１～５０アルキル、場合により置換されたＣ２～５０アルケニル、場合により置換されたＣ２～５０アルキニル、場合により置換されたＣ３～１０カルボシクリル、場合により置換された３～１４員ヘテロシクリル、場合により置換されたＣ６～１４アリール、場合により置換された５～１４員ヘテロアリールまたはハロゲンである）を含む。ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、

【化15】

の化合物構造を有する、カチオン性脂質、「標的２３」およびその薬学的に許容される塩を含む。

【0159】

本発明の組成物および方法に使用するのに適した他のカチオン性脂質には、参照によって本明細書に組み入れられる、国際公開第２０１６／００４２０２号に記載されるカチオン性脂質が含まれる。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、化合物構造：

【化16】

を有するカチオン性脂質またはその薬学的に許容される塩を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、化合物構造：

【化17】

を有するカチオン性脂質またはその薬学的に許容される塩を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、化合物構造：

【化18】

を有するカチオン性脂質またはその薬学的に許容される塩を含む。

【0160】

本発明の組成物および方法に使用するのに適した他のカチオン性脂質には、参照によって本明細書に組み入れられる、米国仮特許出願第６２／７５８，１７９号に記載されるカチオン性脂質が含まれる。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の式：

【化19】

のカチオン性脂質またはその薬学的に許容される塩（式中、各Ｒ^１およびＲ^２は独立に、ＨまたはＣ_１～Ｃ_６脂肪族であり；各ｍは独立に、１～４の値を有する整数であり；各Ａは独立に、共有結合またはアリーレンであり；各Ｌ^１は独立に、エステル、チオエステル、ジスルフィド、または無水物基であり；各Ｌ^２は独立に、Ｃ_２～Ｃ_１０脂肪族であり；各Ｘ^１は独立に、ＨまたはＯＨであり；各Ｒ^３は独立に、Ｃ_６～Ｃ_２０脂肪族である）を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の式：

【化20】

のカチオン性脂質またはその薬学的に許容される塩を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の式：

【化21】

のカチオン性脂質またはその薬学的に許容される塩を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の式：

【化22】

のカチオン性脂質またはその薬学的に許容される塩を含む。

【0161】

本発明の組成物および方法に使用するのに適した他のカチオン性脂質には、参照によって本明細書に組み入れられる、Ｊ．ＭｃＣｌｅｌｌａｎ、Ｍ．Ｃ．Ｋｉｎｇ、Ｃｅｌｌ ２０１０、１４１、２１０～２１７およびＷｈｉｔｅｈｅａｄら、Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ（２０１４）５：４２７７に記載されるカチオン性脂質が含まれる。ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法のカチオン性脂質は、

【化23】

の化合物構造を有するカチオン性脂質およびその薬学的に許容される塩を含む。

【0162】

本発明の組成物および方法に使用するのに適した他のカチオン性脂質には、参照によって本明細書に組み入れられる、国際公開第２０１５／１９９９５２号に記載されるカチオン性脂質が含まれる。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、化合物構造：

【化24】

を有するカチオン性脂質およびその薬学的に許容される塩を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、化合物構造：

【化25】

を有するカチオン性脂質およびその薬学的に許容される塩を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、化合物構造：

【化26】

を有するカチオン性脂質およびその薬学的に許容される塩を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、化合物構造：

【化27】

を有するカチオン性脂質およびその薬学的に許容される塩を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、化合物構造：

【化28】

を有するカチオン性脂質およびその薬学的に許容される塩を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、化合物構造：

【化29】

を有するカチオン性脂質およびその薬学的に許容される塩を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、化合物構造：

【化30】

を有するカチオン性脂質およびその薬学的に許容される塩を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、化合物構造：

【化31】

を有するカチオン性脂質およびその薬学的に許容される塩を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、化合物構造：

【化32】

を有するカチオン性脂質およびその薬学的に許容される塩を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、化合物構造：

【化33】

を有するカチオン性脂質およびその薬学的に許容される塩を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、化合物構造：

【化34】

を有するカチオン性脂質およびその薬学的に許容される塩を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、化合物構造：

【化35】

を有するカチオン性脂質およびその薬学的に許容される塩を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、化合物構造：

【化36】

を有するカチオン性脂質およびその薬学的に許容される塩を含む。

【0163】

本発明の組成物および方法に使用するのに適した他のカチオン性脂質には、参照によって本明細書に組み入れられる、国際公開第２０１７／００４１４３号に記載されるカチオン性脂質が含まれる。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、化合物構造：

【化37】

を有するカチオン性脂質およびその薬学的に許容される塩を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、化合物構造：

【化38】

を有するカチオン性脂質およびその薬学的に許容される塩を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、化合物構造：

【化39】

を有するカチオン性脂質およびその薬学的に許容される塩を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、化合物構造：

【化40】

を有するカチオン性脂質およびその薬学的に許容される塩を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、化合物構造：

【化41】

を有するカチオン性脂質およびその薬学的に許容される塩を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、化合物構造：

【化42】

を有するカチオン性脂質およびその薬学的に許容される塩を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、化合物構造：

【化43】

を有するカチオン性脂質およびその薬学的に許容される塩を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、化合物構造：

【化44】

を有するカチオン性脂質およびその薬学的に許容される塩を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、化合物構造：

【化45】

を有するカチオン性脂質およびその薬学的に許容される塩を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、化合物構造：

【化46】

を有するカチオン性脂質およびその薬学的に許容される塩を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、化合物構造：

【化47】

を有するカチオン性脂質およびその薬学的に許容される塩を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、化合物構造：

【化48】

を有するカチオン性脂質およびその薬学的に許容される塩を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、化合物構造：

【化49】

を有するカチオン性脂質およびその薬学的に許容される塩を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、化合物構造：

【化50】

を有するカチオン性脂質およびその薬学的に許容される塩を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、化合物構造：

【化51】

を有するカチオン性脂質およびその薬学的に許容される塩を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、化合物構造：

【化52】

を有するカチオン性脂質およびその薬学的に許容される塩を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、化合物構造：

【化53】

を有するカチオン性脂質およびその薬学的に許容される塩を含む。

【0164】

本発明の組成物および方法に使用するのに適した他のカチオン性脂質には、参照によって本明細書に組み入れられる、国際公開第２０１７／０７５５３１号に記載されるカチオン性脂質が含まれる。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の式：

【化54】

のカチオン性脂質またはその薬学的に許容される塩（式中、Ｌ^１またはＬ^２の一方は－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－、－（Ｃ＝Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）_ｘ、－Ｓ－Ｓ－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｓ－、－ＳＣ（＝Ｏ）－、－ＮＲ^ａＣ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ^ａ－、ＮＲ^ａＣ（＝Ｏ）ＮＲ^ａ－、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲ^ａ－、または－ＮＲ^ａＣ（＝Ｏ）Ｏ－であり；Ｌ^１またはＬ^２の他方は－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－、－（Ｃ＝Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）_ｘ、－Ｓ－Ｓ－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｓ－、ＳＣ（＝Ｏ）－、－ＮＲ^ａＣ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ^ａ－、ＮＲ^ａＣ（＝Ｏ）ＮＲ^ａ－、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲ^ａ－または－ＮＲ^ａＣ（＝Ｏ）Ｏ－または直接結合であり；Ｇ^１およびＧ^２はそれぞれ独立に、非置換Ｃ_１～Ｃ_１２アルキレンまたはＣ_１～Ｃ_１２アルケニレンであり；Ｇ^３はＣ_１～Ｃ_２４アルキレン、Ｃ_１～Ｃ_２４アルケニレン、Ｃ_３～Ｃ_８シクロアルキレン、Ｃ_３～Ｃ_８シクロアルケニレンであり；Ｒ^ａはＨまたはＣ_１～Ｃ_１２アルキルであり；Ｒ^１およびＲ^２はそれぞれ独立に、Ｃ_６～Ｃ_２４アルキルまたはＣ_６～Ｃ_２４アルケニルであり；Ｒ^３はＨ、ＯＲ^５、ＣＮ、－Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ^４、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ^４または－ＮＲ^５Ｃ（＝Ｏ）Ｒ^４であり；Ｒ^４はＣ_１～Ｃ_１２アルキルであり；Ｒ^５はＨまたはＣ_１～Ｃ_６アルキルであり；ｘは０、１または２である）を含む。

【0165】

本発明の組成物および方法に使用するのに適した他のカチオン性脂質には、参照によって本明細書に組み入れられる、国際公開第２０１７／１１７５２８号に記載されるカチオン性脂質が含まれる。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、化合物構造：

【化55】

を有するカチオン性脂質およびその薬学的に許容される塩を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、化合物構造：

【化56】

を有するカチオン性脂質およびその薬学的に許容される塩を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、化合物構造：

【化57】

を有するカチオン性脂質およびその薬学的に許容される塩を含む。

【0166】

本発明の組成物および方法に使用するのに適した他のカチオン性脂質には、参照によって本明細書に組み入れられる、国際公開第２０１７／０４９２４５号に記載されるカチオン性脂質が含まれる。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法のカチオン性脂質は、以下の式：

【化58】

の１つの化合物およびその薬学的に許容される塩を含む。これらの４つの式のいずれか１つについて、Ｒ_４は－（ＣＨ_２）_ｎＱおよび－（ＣＨ_２）_ｎＣＨＱＲから独立に選択され；Ｑは－ＯＲ、－ＯＨ、－Ｏ（ＣＨ_２）_ｎＮ（Ｒ）_２、－ＯＣ（Ｏ）Ｒ、－ＣＸ_３、－ＣＮ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）_２Ｒ、－Ｎ（Ｈ）Ｓ（Ｏ）_２Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）_２、－Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）_２、－Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｈ）（Ｒ）、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）_２、－Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）_２、－Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｈ）（Ｒ）、および複素環からなる群から選択され；ｎは１、２、または３である。ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、

【化59】

の化合物構造を有するカチオン性脂質およびその薬学的に許容される塩を含む。ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、

【化60】

の化合物構造を有するカチオン性脂質およびその薬学的に許容される塩を含む。ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、

【化61】

の化合物構造を有するカチオン性脂質およびその薬学的に許容される塩を含む。ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、

【化62】

の化合物構造を有するカチオン性脂質およびその薬学的に許容される塩を含む。

【0167】

本発明の組成物および方法に使用するのに適した他のカチオン性脂質には、その各々を参照によって本明細書に組み入れられる、国際公開第２０１７／１７３０５４号および国際公開第２０１５／０９５３４０号に記載されるカチオン性脂質が含まれる。ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、

【化63】

の化合物構造を有するカチオン性脂質およびその薬学的に許容される塩を含む。ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、

【化64】

の化合物構造を有するカチオン性脂質およびその薬学的に許容される塩を含む。ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、

【化65】

の化合物構造を有するカチオン性脂質およびその薬学的に許容される塩を含む。ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、

【化66】

の化合物構造を有するカチオン性脂質およびその薬学的に許容される塩を含む。

【0168】

本発明の組成物および方法に使用するのに適した他のカチオン性脂質には、参照によって本明細書に組み入れられる、国際公開第２０１２／１７０８８９号に記載される切断可能なカチオン性脂質が含まれる。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の式：

【化67】

のカチオン性脂質
（式中、Ｒ_１はイミダゾール、グアニジニウム、アミノ、イミン、エナミン、場合により置換されたアルキルアミノ（例えば、ジメチルアミノなどのアルキルアミノ）およびピリジルからなる群から選択され；Ｒ_２は以下の２つの式：

【化68】

の１つからなる群から選択され、Ｒ_３およびＲ_４は、場合により置換された、可変的に飽和または不飽和のＣ_６～Ｃ_２０アルキルおよび場合により置換された、可変的に飽和または不飽和のＣ_６～Ｃ_２０アシルからなる群からそれぞれ独立に選択され；ｎは０または任意の正の整数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０またはそれ以上）である）を含む。ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、

【化69】

の化合物構造を有する、カチオン性脂質、「ＨＧＴ４００１」およびその薬学的に許容される塩を含む。ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、

【化70】

の化合物構造を有するカチオン性脂質「ＨＧＴ４００２」（本明細書では「Ｇｕａｎ－ＳＳ－Ｃｈｏｌ」とも称する）およびその薬学的に許容される塩を含む。ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、

【化71】

の化合物構造を有する、カチオン性脂質、「ＨＧＴ４００３」およびその薬学的に許容される塩を含む。ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、

【化72】

の化合物構造を有する、カチオン性脂質、「ＨＧＴ４００４」およびその薬学的に許容される塩を含む。ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、

【化73】

の化合物構造を有する、カチオン性脂質「ＨＧＴ４００５」およびその薬学的に許容される塩を含む。

【0169】

本発明の組成物および方法に使用するのに適した他のカチオン性脂質には、２０１８年５月１６日に出願された米国仮特許出願第６２／６７２，１９４号に記載され、参照によって本明細書に組み入れられる、切断可能なカチオン性脂質が含まれる。ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、米国仮特許出願第６２／６７２，１９４号に記載される一般式のいずれかまたは構造（１ａ）～（２１ａ）および（１ｂ）～（２１ｂ）および（２２）～（２３７）のいずれかであるカチオン性脂質を含む。ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、式（Ｉ’）による構造を有するカチオン性脂質

【化74】

（式中、
Ｒ^Ｘは独立に、－Ｈ、－Ｌ^１－Ｒ^１、または－Ｌ^５Ａ－Ｌ^５Ｂ－Ｂ’であり；
Ｌ^１、Ｌ^２、およびＬ^３の各々は独立に、共有結合、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）Ｓ－、または－Ｃ（Ｏ）ＮＲ^Ｌ－であり；
各Ｌ^４ＡおよびＬ^５Ａは独立に、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、または－Ｃ（Ｏ）ＮＲ^Ｌ－であり；
各Ｌ^４ＢおよびＬ^５Ｂは独立に、Ｃ_１～Ｃ_２０アルキレン；Ｃ_２～Ｃ_２０アルケニレン；またはＣ_２～Ｃ_２０アルキニレンであり；
各ＢおよびＢ’はＮＲ^４Ｒ^５または５～１０員窒素含有ヘテロアリールであり；
各Ｒ^１、Ｒ^２、およびＲ^３は独立に、Ｃ_６～Ｃ_３０アルキル、Ｃ_６～Ｃ_３０アルケニル、またはＣ_６～Ｃ_３０アルキニルであり；
各Ｒ^４およびＲ^５は独立に、水素、Ｃ_１～Ｃ_１０アルキル；Ｃ_２～Ｃ_１０アルケニル；またはＣ_２～Ｃ_１０アルキニルであり；
各Ｒ^Ｌは独立に、水素、Ｃ_１～Ｃ_２０アルキル、Ｃ_２～Ｃ_２０アルケニル、またはＣ_２～Ｃ_２０アルキニルである）
を含む。

【0170】

ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、

【化75】

の化合物構造を有する、６２／６７２，１９４の化合物（１３９）であるカチオン性脂質を含む。

【0171】

一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、カチオン性脂質、Ｎ－［１－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピル］－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（「ＤＯＴＭＡ」）を含む（参照によって本明細書に組み入れられる、Ｆｅｉｇｎｅｒら、（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８４、７４１３（１９８７）；米国特許第４，８９７，３５５号）。本発明の組成物および方法に適した他のカチオン性脂質には、例えば、５－カルボキシスペルミルグリシンジオクタデシルアミド（「ＤＯＧＳ」）；２，３－ジオレイルオキシ－Ｎ－［２－（スペルミン－カルボキサミド）エチル］－Ｎ，Ｎ－ジメチル－１－プロパンアミニウム（「ＤＯＳＰＡ」）（Ｂｅｈｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８６、６９８２（１９８９）、米国特許第５，１７１，６７８号；米国特許第５，３３４，７６１号）；１，２－ジオレオイル－３－ジメチルアンモニウム－プロパン（「ＤＯＤＡＰ」）；１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（「ＤＯＴＡＰ」）が含まれる。

【0172】

本発明の組成物および方法に適した追加の例示的なカチオン性脂質には、１，２－ジステアリルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－アミノプロパン（「ＤＳＤＭＡ」）；１，２－ジオレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－アミノプロパン（「ＤＯＤＭＡ」）；１，２－ジリノレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－アミノプロパン（「ＤＬｉｎＤＭＡ」）；１，２－ジリノレニルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－アミノプロパン（「ＤＬｅｎＤＭＡ」）；Ｎ－ジオレイル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムクロリド（「ＤＯＤＡＣ」）；Ｎ，Ｎ－ジステアリル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムブロミド（「ＤＤＡＢ」）；Ｎ－（１，２－ジミリスチルオキシプロパ－３－イル）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｎ－ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（「ＤＭＲＩＥ」）；３－ジメチルアミノ－２－（コレスタ－５－エン－３－ベータ－オキシブタン－４－オキシ）－１－（シス，シス－９，１２－オクタデカジエノキシ）プロパン（「ＣＬｉｎＤＭＡ」）；２－［５’－（コレスタ－５－エン－３－ベータ－オキシ）－３’－オキサペントキシ）－３－ジメチル－１－（シス，シス－９’，１－２’－オクタデカジエノキシ）プロパン（「ＣｐＬｉｎＤＭＡ」）；Ｎ，Ｎ－ジメチル－３，４－ジオレイルオキシベンジルアミン（「ＤＭＯＢＡ」）；１，２－Ｎ，Ｎ’－ジオレイルカルバミル－３－ジメチルアミノプロパン（「ＤＯｃａｒｂＤＡＰ」）；２，３－ジリノレオイルオキシ－Ν，Ν－ジメチルプロピルアミン（「ＤＬｉｎＤＡＰ」）；１，２－Ｎ，Ｎ’－ジリノレイルカルバミル－３－ジメチルアミノプロパン（「ＤＬｉｎｃａｒｂＤＡＰ」）；１，２－ジリノレオイルカルバミル－３－ジメチルアミノプロパン（「ＤＬｉｎＣＤＡＰ」）；２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノメチル－［１，３］－ジオキソラン（「ＤＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡ」）；２－（（８－［（３Ｐ）－コレスタ－５－エン－３－イルオキシ］オクチル）オキシ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］プロパン－１－アミン（「オクチル－ＣＬｉｎＤＭＡ」）；（２Ｒ）－２－（（８－［（３ベータ）－コレスタ－５－エン－３－イルオキシ］オクチル）オキシ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］プロパン－１－アミン（「オクチル－ＣＬｉｎＤＭＡ（２Ｒ）」）；（２Ｓ）－２－（（８－［（３Ｐ）－コレスタ－５－エン－３－イルオキシ］オクチル）オキシ）－Ｎ，ｆｓｌ－ｄｉｍｅｔｈｙｈ３－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］プロパン－１－アミン（「オクチル－ＣＬｉｎＤＭＡ（２Ｓ）」）；２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノエチル－［１，３］－ジオキソラン（「ＤＬｉｎ－Ｋ－ＸＴＣ２－ＤＭＡ」）；および２－（２，２－ジ（（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イル）－１，３－ジオキソラン－４－イル）－Ｎ，Ｎ－ジメチルエタンアミン（「ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ」）（参照によって本明細書に組み入れられる、国際公開第２０１０／０４２８７７号；Ｓｅｍｐｌｅら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２８：１７２～１７６（２０１０）参照）が含まれる（Ｈｅｙｅｓ，Ｊ．ら、Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ １０７：２７６～２８７（２００５）；Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ，ＤＶ．ら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３（８）：１００３～１００７（２００５）；国際公開第２００５／１２１３４８号）。一部の実施形態では、カチオン性脂質の１つまたはそれ以上は、イミダゾール、ジアルキルアミノ、またはグアニジニウム部分の少なくとも１つを含む。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法に適した１つまたはそれ以上のカチオン性脂質には、２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノエチル－［１，３］－ジオキソラン（「ＸＴＣ」）；（３ａＲ，５ｓ，６ａＳ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－２，２－ジ（（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエニル）テトラヒドロ－３ａＨ－シクロペンタ［ｄ］［１，３］ジオキソール－５－アミン（「ＡＬＮＹ－１００」）および／または４，７，１３－トリス（３－オキソ－３－（ウンデシルアミノ）プロピル）－Ｎ１，Ｎ１６－ジウンデシル－４，７，１０，１３－テトラアザヘキサデカン－１，１６－ジアミド（「ＮＣ９８－５」）が含まれる。

【0173】

一部の実施形態では、本発明の組成物および方法に適した１つまたはそれ以上のカチオン性脂質は、

【化76】

の化合物構造を有するＴＬ１－０４Ｄ－ＤＭＡであるカチオン性脂質を含む。

【0174】

一部の実施形態では、本発明の組成物および方法に適した１つまたはそれ以上のカチオン性脂質は、

【化77】

の化合物構造を有するＧＬ－ＴＥＳ－ＳＡ－ＤＭＥ－Ｅ１８－２であるカチオン性脂質を含む。

【0175】

一部の実施形態では、本発明の組成物および方法に適した１つまたはそれ以上のカチオン性脂質は、

【化78】

の化合物構造を有するＳＹ－３－Ｅ１４－ＤＭＡＰｒであるカチオン性脂質を含む。

【0176】

一部の実施形態では、本発明の組成物および方法に適した１つまたはそれ以上のカチオン性脂質は、

【化79】

の化合物構造を有するＴＬ１－０１Ｄ－ＤＭＡであるカチオン性脂質を含む。

【0177】

一部の実施形態では、本発明の組成物および方法に適した１つまたはそれ以上のカチオン性脂質は、

【化80】

の化合物構造を有するＴＬ１－１０Ｄ－ＤＭＡであるカチオン性脂質を含む。

【0178】

一部の実施形態では、本発明の組成物および方法に適した１つまたはそれ以上のカチオン性脂質は、

【化81】

の化合物構造を有するＧＬ－ＴＥＳ－ＳＡ－ＤＭＰ－Ｅ１８－２であるカチオン性脂質を含む。

【0179】

一部の実施形態では、本発明の組成物および方法に適した１つまたはそれ以上のカチオン性脂質は、

【化82】

の化合物構造を有するＨＥＰ－Ｅ４－Ｅ１０であるカチオン性脂質を含む。

【0180】

一部の実施形態では、本発明の組成物および方法に適した１つまたはそれ以上のカチオン性脂質は、

【化83】

の化合物構造を有するＨＥＰ－Ｅ３－Ｅ１０であるカチオン性脂質を含む。

【0181】

一部の実施形態では、本発明の組成物は、組成物、例えば脂質ナノ粒子中の総脂質含有量の、重量によって測定される、少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、または７０％を構成する１つまたはそれ以上のカチオン性脂質を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物は、組成物、例えば脂質ナノ粒子中の総脂質含有量の、ｍｏｌ％として測定される、少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、または７０％を構成する１つまたはそれ以上のカチオン性脂質を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物は、組成物、例えば脂質ナノ粒子中の総脂質含有量の、重量によって測定される、約３０～７０％（例えば、約３０～６５％、約３０～６０％、約３０～５５％、約３０～５０％、約３０～４５％、約３０～４０％、約３５～５０％、約３５～４５％、または約３５～４０％）を構成する１つまたはそれ以上のカチオン性脂質を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物は、組成物、例えば脂質ナノ粒子中の総脂質含有量の、ｍｏｌ％として測定される、約３０～７０％（例えば、約３０～６５％、約３０～６０％、約３０～５５％、約３０～５０％、約３０～４５％、約３０～４０％、約３５～５０％、約３５～４５％、または約３５～４０％）を構成する１つまたはそれ以上のカチオン性脂質を含む。

【0182】

非カチオン性／ヘルパー脂質
一部の実施形態では、提供されるリポソームは１つまたはそれ以上の非カチオン性（「ヘルパー」）脂質を含有する。本明細書で使用される場合、「非カチオン性脂質」という句は、任意の中性、双性イオン性またはアニオン性脂質を指す。本明細書で使用される場合、「アニオン性脂質」という句は、生理学的ｐＨなどの選択されたｐＨで正味の負の電荷を有するいくつかの脂質種のいずれかを指す。非カチオン性脂質には、それだけに限らないが、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、パルミトイルオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、ジオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン４－（Ｎ－マレイミドメチル）－シクロヘキサン－ｌ－カルボキシレート（ＤＯＰＥ－ｍａｌ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジミリストイルホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジステアロイル－ホスファチジル－エタノールアミン（ＤＳＰＥ）、ホスファチジルセリン、スフィンゴ脂質、セレブロシド、ガングリオシド、１６－Ｏ－モノメチルＰＥ、１６－Ｏ－ジメチルＰＥ、１８－１－トランスＰＥ、ｌ－ステアロイル－２－オレオイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＳＯＰＥ）、またはこれらの混合物が含まれる。

【0183】

一部の実施形態では、このような非カチオン性脂質は単独で使用されるが、好ましくは他の脂質、例えばカチオン性脂質と組み合わせて使用される。一部の実施形態では、非カチオン性脂質は、リポソーム中に存在する総脂質の約５％～約９０％、または約１０％～約７０％のモル比を含み得る。一部の実施形態では、非カチオン性脂質は中性脂質、すなわち、組成物が製剤化および／または投与される条件で正味の電荷を有さない脂質である。一部の実施形態では、リポソーム中の非カチオン性脂質のパーセンテージは、５％超、１０％超、２０％超、３０％超、または４０％超であることができる。

【0184】

コレステロール系脂質
一部の実施形態では、提供されるリポソームは、１つまたはそれ以上のコレステロール系脂質を含む。例えば、適切なコレステロール系カチオン性脂質は、例えば、ＤＣ－Ｃｈｏｉ（Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｎ－エチルカルボキサミドコレステロール）、１，４－ビス（３－Ｎ－オレイルアミノ－プロピル）ピペラジン（Ｇａｏら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１７９、２８０頁（１９９１）；Ｗｏｌｆら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２３巻、１３９頁（１９９７）；米国特許第５，７４４，３３５号）、またはＩＣＥを含む。一部の実施形態では、コレステロール系脂質は、リポソーム中に存在する総脂質の約２％～約３０％、または約５％～約２０％のモル比を含み得る。一部の実施形態では、脂質ナノ粒子中のコレステロール系脂質のパーセンテージは、５％超、１０％超、２０％超、３０％超、または４０％超であることができる。

【0185】

ＰＥＧ修飾脂質
例えば、Ｎ－オクタノイル－スフィンゴシン－１－［スクシニル（メトキシポリエチレングリコール）－２０００］（Ｃ８ ＰＥＧ－２０００セラミド）を含む、誘導体化セラミド（ＰＥＧ－ＣＥＲ）などの、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）修飾リン脂質および誘導体化脂質の使用も、単独でまたは好ましくは導入ビヒクルを含む他の脂質製剤と組み合わせて（例えば、脂質ナノ粒子）、本発明によって企図される。企図されるＰＥＧ修飾脂質には、それだけに限らないが、Ｃ_６～Ｃ_２０長のアルキル鎖を有する脂質に共有結合した最大ＳｋＤａ長のポリエチレングリコール鎖が含まれる。このような成分の添加は複雑な凝集を防ぎ、循環寿命を増加させ、脂質－核酸組成物の標的組織への送達を増加させる手段を提供することもできる（Ｋｌｉｂａｎｏｖら（１９９０）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ、２６８（１）：２３５～２３７）、またはこれらはインビボで製剤から迅速に交換するよう選択される（米国特許第５，８８５，６１３号参照）。特に有用な交換可能な脂質は、より短いアシル鎖（例えば、Ｃ_１４またはＣ_１８）を有するＰＥＧ－セラミドである。本発明のＰＥＧ修飾リン脂質および誘導体化脂質は、リポソーム導入ビヒクル中に存在する全脂質の約０％～約２０％、約０．５％～約２０％、約１％～約１５％、約４％～約１０％、または約２％のモル比を構成することができる。

【0186】

様々な実施形態によると、脂質ナノ粒子を構成するカチオン性脂質、非カチオン性脂質、および／またはＰＥＧ修飾脂質の選択、ならびにこのような脂質の互いに対する相対モル比は、選択される脂質の特徴、意図した標的細胞の性質、送達されるＭＣＮＡの特徴に基づく。追加の考慮事項には、例えば、アルキル鎖の飽和、ならびに選択される脂質のサイズ、電荷、ｐＨ、ｐＫａ、膜融合性および毒性が含まれる。よって、それに応じてモル比を調整することができる。

【0187】

ポリマー
一部の実施形態では、適切な送達ビヒクルは、担体としてのポリマーを単独で、または本明細書に記載される様々な脂質を含む他の担体と組み合わせて使用して製剤化される。よって、一部の実施形態では、リポソーム送達ビヒクルは、本明細書で使用される場合、ポリマーを含むナノ粒子も包含する。適切なポリマーには、例えば、ポリアクリレート、ポリアルキルシアノアクリレート、ポリラクチド、ポリラクチド－ポリグリコリドコポリマー、ポリカプロラクトン、デキストラン、アルブミン、ゼラチン、アルギネート、コラーゲン、キトサン、シクロデキストリン、プロタミン、ＰＥＧ化プロタミン、ＰＬＬ、ＰＥＧ化ＰＬＬおよびポリエチレンイミン（ＰＥＩ）が含まれる。ＰＥＩが存在する場合、これは１０～４０ｋＤａの範囲の分子量の分枝ＰＥＩ、例えば２５ｋＤａ分枝ＰＥＩ（Ｓｉｇｍａ 番号４０８７２７）であることができる。

【0188】

本発明による使用に適したリポソーム
本発明に適したリポソームは、本明細書に記載されるカチオン性脂質、非カチオン性脂質、コレステロール脂質、ＰＥＧ修飾脂質および／またはポリマーのいずれか１つまたはそれ以上を種々の比率で含むことができる。非限定的な例として、適切なリポソーム製剤は、ｃＫＫ－Ｅ１２、ＤＯＰＥ、コレステロールおよびＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋ；Ｃ１２－２００、ＤＯＰＥ、コレステロールおよびＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋ；ＨＧＴ４００３、ＤＯＰＥ、コレステロールおよびＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋ；ＩＣＥ、ＤＯＰＥ、コレステロールおよびＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋ；またはＩＣＥ、ＤＯＰＥ、およびＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋから選択される組合せを含むことができる。

【0189】

様々な実施形態では、カチオン性脂質（例えば、ｃＫＫ－Ｅ１２、Ｃ１２－２００、ＩＣＥ、および／またはＨＧＴ４００３）は、モル比でリポソームの約３０～６０％（例えば、約３０～５５％、約３０～５０％、約３０～４５％、約３０～４０％、約３５～５０％、約３５～４５％、または約３５～４０％）を構成する。一部の実施形態では、カチオン性脂質（例えば、ｃＫＫ－Ｅ１２、Ｃ１２－２００、ＩＣＥ、および／またはＨＧＴ４００３）のパーセンテージは、モル比でリポソームの約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、もしくは約６０％であるかまたはこれらを超える。

【0190】

一部の実施形態では、カチオン性脂質と非カチオン性脂質とコレステロール系脂質とＰＥＧ修飾脂質の比はそれぞれ約３０～６０：２５～３５：２０～３０：１～１５の間である。一部の実施形態では、カチオン性脂質と非カチオン性脂質とコレステロール系脂質とＰＥＧ修飾脂質の比はそれぞれおよそ４０：３０：２０：１０である。一部の実施形態では、カチオン性脂質と非カチオン性脂質とコレステロール系脂質とＰＥＧ修飾脂質の比はそれぞれおよそ４０：３０：２５：５である。一部の実施形態では、カチオン性脂質と非カチオン性脂質とコレステロール系脂質とＰＥＧ修飾脂質の比はそれぞれおよそ４０：３２：２５：３である。一部の実施形態では、カチオン性脂質と非カチオン性脂質とコレステロール系脂質とＰＥＧ修飾脂質の比はおよそ５０：２５：２０：５である。

【0191】

特定の実施形態では、本発明により使用するためのリポソームは、カチオン性脂質、非カチオン性脂質（例えば、ＤＯＰＥまたはＤＥＰＥ）、ＰＥＧ修飾脂質（例えば、ＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋ）、および場合によりコレステロールからなる脂質成分を含む。このようなリポソームに包含するのに特に適したカチオン性脂質には、ＧＬ－ＴＥＳ－ＳＡ－ＤＭＥ－Ｅ１８－２、ＴＬ１－０１Ｄ－ＤＭＡ、ＳＹ－３－Ｅ１４－ＤＭＡＰｒ、ＴＬ１－１０Ｄ－ＤＭＡ、ＨＧＴ４００２（本明細書ではＧｕａｎ－ＳＳ－Ｃｈｏｌとも称される）、ＧＬ－ＴＥＳ－ＳＡ－ＤＭＰ－Ｅ１８－２、ＨＥＰ－Ｅ４－Ｅ１０、ＨＥＰ－Ｅ３－Ｅ１０、およびＴＬ１－０４Ｄ－ＤＭＡが含まれる。これらのカチオン性脂質は、噴霧を介して肺送達を通じて投与されるリポソームにおける使用に特に適していることが見出されている。これらの中で、ＨＥＰ－Ｅ４－Ｅ１０、ＨＥＰ－Ｅ３－Ｅ１０、ＧＬ－ＴＥＳ－ＳＡ－ＤＭＥ－Ｅ１８－２、ＧＬ－ＴＥＳ－ＳＡ－ＤＭＰ－Ｅ１８－２、ＴＬ１－０１Ｄ－ＤＭＡおよびＴＬ１－０４Ｄ－ＤＭＡは特に良好に機能した。

【0192】

リポソームの例には、カチオン性脂質成分としてのＧＬ－ＴＥＳ－ＳＡ－ＤＭＥ－Ｅ１８－２、ＴＬ１－０１Ｄ－ＤＭＡ、ＳＹ－３－Ｅ１４－ＤＭＡＰｒ、ＴＬ１－１０Ｄ－ＤＭＡ、ＧＬ－ＴＥＳ－ＳＡ－ＤＭＰ－Ｅ１８－２、ＨＥＰ－Ｅ４－Ｅ１０、ＨＥＰ－Ｅ３－Ｅ１０およびＴＬ１－０４Ｄ－ＤＭＡ、非カチオン性脂質成分としてのＤＯＰＥ、ヘルパー脂質成分としてのコレステロール、ならびにＰＥＧ修飾脂質成分としてのＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋのうちの１つが含まれる。一部の実施形態では、カチオン性脂質と非カチオン性脂質とコレステロールとＰＥＧ修飾脂質のモル比は、それぞれ約３０～６０：２５～３５：２０～３０：１～１５の間であり得る。一部の実施形態では、カチオン性脂質と非カチオン性脂質とコレステロールとＰＥＧ修飾脂質のモル比は、それぞれ、およそ４０：３０：２０：１０である。一部の実施形態では、カチオン性脂質と非カチオン性脂質とコレステロールとＰＥＧ修飾脂質のモル比は、それぞれ、およそ４０：３０：２５：５である。一部の実施形態では、カチオン性脂質と非カチオン性脂質とコレステロールとＰＥＧ修飾脂質のモル比は、それぞれ、およそ４０：３２：２５：３である。一部の実施形態では、カチオン性脂質と非カチオン性脂質とコレステロールとＰＥＧ修飾脂質のモル比は、およそ５０：２５：２０：５である。

【0193】

一部の実施形態では、肺送達に特に適したリポソームの脂質成分は、ＨＧＴ４００２（本明細書ではＧｕａｎ－ＳＳ－Ｃｈｏｌとも称される）、ＤＯＰＥおよびＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋからなる。一部の実施形態では、カチオン性脂質と非カチオン性脂質とＰＥＧ修飾脂質のモル比は、およそ６０：３５：５である。

【0194】

別個の脂質成分の比
脂質ナノ粒子が３つまたは３つ以下の別個の脂質の成分を含む実施形態では、全脂質含有量の比（すなわち、脂質成分（１）：脂質成分（２）：脂質成分（３）の比）をｘ：ｙ：ｚとして表すことができ、ここでは、
（ｙ＋ｚ）＝１００－ｘ
である。

【0195】

一部の実施形態では、「ｘ」、「ｙ」、および「ｚ」の各々は脂質の３つの別個の成分のモルパーセンテージを表し、比はモル比である。

【0196】

一部の実施形態では、「ｘ」、「ｙ」、および「ｚ」の各々は脂質の３つの別個の成分の重量パーセンテージを表し、比は重量比である。

【0197】

一部の実施形態では、変数「ｘ」によって表される、脂質成分（１）はステロール系カチオン性脂質である。

【0198】

一部の実施形態では、変数「ｙ」によって表される、脂質成分（２）はヘルパー脂質である。

【0199】

一部の実施形態では、変数「ｚ」によって表される、脂質成分（３）はＰＥＧ脂質である。

【0200】

一部の実施形態では、脂質成分（１）（例えば、ステロール系カチオン性脂質）のモルパーセンテージを表す変数「ｘ」は、少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、または約９５％である。

【0201】

一部の実施形態では、脂質成分（１）（例えば、ステロール系カチオン性脂質）のモルパーセンテージを表す変数「ｘ」は、約９５％、約９０％、約８５％、約８０％、約７５％、約７０％、約６５％、約６０％、約５５％、約５０％、約４０％、約３０％、約２０％、または約１０％以下である。実施形態では、変数「ｘ」は約６５％、約６０％、約５５％、約５０％、約４０％以下である。

【0202】

一部の実施形態では、脂質成分（１）（例えば、ステロール系カチオン性脂質）のモルパーセンテージを表す変数「ｘ」は、少なくとも約５０％であるが約９５％未満；少なくとも約５０％であるが約９０％未満；少なくとも約５０％であるが約８５％未満；少なくとも約５０％であるが約８０％未満；少なくとも約５０％であるが約７５％未満；少なくとも約５０％であるが約７０％未満；少なくとも約５０％であるが約６５％未満；または少なくとも約５０％であるが約６０％未満である。実施形態では、変数「ｘ」は少なくとも約５０％であるが約７０％未満；少なくとも約５０％であるが約６５％未満；または少なくとも約５０％であるが約６０％未満である。

【0203】

一部の実施形態では、脂質成分（１）（例えば、ステロール系カチオン性脂質）の重量パーセンテージを表す変数「ｘ」は、少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、または約９５％である。

【0204】

一部の実施形態では、脂質成分（１）（例えば、ステロール系カチオン性脂質）の重量パーセンテージを表す変数「ｘ」は、約９５％、約９０％、約８５％、約８０％、約７５％、約７０％、約６５％、約６０％、約５５％、約５０％、約４０％、約３０％、約２０％、または約１０％以下である。実施形態では、変数「ｘ」は約６５％、約６０％、約５５％、約５０％、約４０％以下である。

【0205】

一部の実施形態では、脂質成分（１）（例えば、ステロール系カチオン性脂質）の重量パーセンテージを表す変数「ｘ」は：少なくとも約５０％であるが約９５％未満；少なくとも約５０％であるが約９０％未満；少なくとも約５０％であるが約８５％未満；少なくとも約５０％であるが約８０％未満；少なくとも約５０％であるが約７５％未満；少なくとも約５０％であるが約７０％未満；少なくとも約５０％であるが約６５％未満；または少なくとも約５０％であるが約６０％未満である。実施形態では、変数「ｘ」は少なくとも約５０％であるが約７０％未満；少なくとも約５０％であるが約６５％未満；または少なくとも約５０％であるが約６０％未満である。

【0206】

一部の実施形態では、脂質成分（３）（例えば、ＰＥＧ脂質）のモルパーセンテージを表す変数「ｚ」は、約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、または２５％以下である。実施形態では、脂質成分（３）（例えば、ＰＥＧ脂質）のモルパーセンテージを表す変数「ｚ」は、約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％である。実施形態では、脂質成分（３）（例えば、ＰＥＧ脂質）のモルパーセンテージを表す変数「ｚ」は、約１％～約１０％、約２％～約１０％、約３％～約１０％、約４％～約１０％、約１％～約７．５％、約２．５％～約１０％、約２．５％～約７．５％、約２．５％～約５％、約５％～約７．５％、または約５％～約１０％である。

【0207】

一部の実施形態では、脂質成分（３）（例えば、ＰＥＧ脂質）の重量パーセンテージを表す変数「ｚ」は、約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、または２５％以下である。実施形態では、脂質成分（３）（例えば、ＰＥＧ脂質）の重量パーセンテージを表す変数「ｚ」は、約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％である。実施形態では、脂質成分（３）（例えば、ＰＥＧ脂質）の重量パーセンテージを表す変数「ｚ」は、約１％～約１０％、約２％～約１０％、約３％～約１０％、約４％～約１０％、約１％～約７．５％、約２．５％～約１０％、約２．５％～約７．５％、約２．５％～約５％、約５％～約７．５％、または約５％～約１０％である。

【0208】

３つおよび３つのみの別個の脂質の成分を有する組成物について、変数「ｘ」、「ｙ」、および「ｚ」は、３つの変数の和が合計して総脂質含有量の１００％になる限り、任意の組合せであることができる。

【0209】

ｍＲＮＡを封入するリポソームの形成
本発明の組成物に使用するためのリポソーム導入ビヒクルは、当技術分野において現在公知である種々の技術によって調製することができる。提供される組成物に使用するためのリポソームは、当技術分野において現在公知である種々の技術によって調製することができる。例えば、適切な容器（ｃｏｎｔａｉｎｅｒ）または容器（ｖｅｓｓｅｌ）の内壁に選択された脂質を、適切な溶媒に溶解することによって、沈着させ、次に、溶媒を蒸発させて容器内に薄膜を残すかまたは噴霧乾燥させるような従来技術に従って、多層小胞（ＭＬＶ）を調製することができる。次に、水相を、ＭＬＶの形成をもたらす渦運動で容器に添加することができる。次に、単層小胞（ＵＬＶ）は、多層小胞の均質化、超音波処理または押し出しによって形成される。さらに、界面活性剤除去技術によって単層小胞を形成することができる。

【0210】

ある特定の実施形態では、提供される組成物は、ｍＲＮＡがリポソームの両表面上に会合されており、同リポソーム内に封入されているリポソームを含む。例えば、本発明の組成物の製造中、カチオン性リポソームは、静電的相互作用を通してｍＲＮＡと会合することができる。例えば、本発明の組成物の調製中に、カチオン性リポソームは、静電的相互作用を介してｍＲＮＡと会合し得る。

【0211】

一部の実施形態では、本発明の組成物および方法はリポソームに封入されたｍＲＮＡを含む。一部の実施形態では、１つまたはそれ以上のｍＲＮＡ種は同じリポソームに封入される。一部の実施形態では、１つまたはそれ以上のｍＲＮＡ種は異なるリポソームに封入される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、その脂質組成、脂質成分のモル比、径、電荷（ゼータ電位）、標的化リガンドおよび／またはこれらの組合せが異なる１つまたはそれ以上のリポソームに封入される。一部の実施形態では、１つまたはそれ以上のリポソームは、ステロール系カチオン性脂質、中性脂質、ＰＥＧ修飾脂質および／またはこれらの組合せの異なる組成を有することができる。一部の実施形態では、１つまたはそれ以上のリポソームは、リポソームを作製するために使用されるコレステロール系カチオン性脂質、中性脂質、およびＰＥＧ修飾脂質の異なるモル比を有することができる。

【0212】

所望のｍＲＮＡをリポソームに取り込む方法は、しばしば「搭載」と称される。例示的な方法は、参照により本明細書に組み入れられるＬａｓｉｃら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．、３１２巻：２５５～２５８頁、１９９２に記載されている。リポソームを取り込んだ核酸は、リポソームの内部空間内、リポソームの二重層膜内に完全にもしくは部分的に位置されるか、またはリポソーム膜の外表面に完全にもしくは部分的に会合することができる。核酸のリポソームへの取り込みはまた、本明細書において「封入」とも称され、核酸はリポソームの内部空間内に完全に含有される。リポソームのような導入ビヒクルにｍＲＮＡを取り込む目的は、しばしば、核酸の迅速な排出を引き起こす、核酸および／またはシステムもしくは受容体を分解する酵素または化学物質を含有し得る環境から核酸を保護することである。したがって、一部の実施形態では、適切な送達ビヒクルは、その中に含有されるｍＲＮＡの安定性を増強することができ、および／または標的細胞もしくは組織へのｍＲＮＡの送達を促進することができる。

【0213】

本発明による適切なリポソームは、種々のサイズで作製することができる。一部の実施形態では、提供されたリポソームは、公知のｍＲＮＡを封入するリポソームよりも小さくすることができる。一部の実施形態では、リポソームのサイズの減少は、ｍＲＮＡのより効率的な送達と関連する。適切なリポソームサイズの選択は、標的細胞または組織の部位、およびある程度、リポソームが作製されている用途を考慮に入れることができる。

【0214】

一部の実施形態では、ｍＲＮＡによりコードされる抗体の全身的分布を促進するために、適切なサイズのリポソームが選択される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡのトランスフェクションをある特定の細胞または組織に制限することが望ましい場合がある。例えば、肝細胞を標的とするために、リポソームは、その寸法が、肝臓内の肝類洞を裏打ちする内皮層の有窓部よりも小さくなるようなサイズであり得る。このような場合に、リポソームは、標的肝細胞に到達するために、このような内皮有窓部を容易に貫通することができる。

【0215】

あるいはまたはさらに、リポソームは、リポソームの寸法が、ある特定の細胞または組織への分布を制限または明示的に回避するのに十分な直径を有するようなサイズであり得る。

【0216】

当技術分野において公知である種々の代替方法が、リポソーム集団のサイズ決定に利用可能である。このようなサイズ決定方法の１つは、参照により本明細書に組み入れられる米国特許第４，７３７，３２３号に記載されている。浴またはプローブ超音波処理のいずれかによりリポソーム懸濁液を超音波処理することによって、直径約０．０５ミクロン未満の小さなＵＬＶまで漸進的なサイズ減少が生じる。均質化は、大きなリポソームをより小さなリポソームにフラグメント化するためのせん断エネルギーに依存する別の方法である。典型的な均質化手順では、典型的には約０．１～０．５ミクロンの間の選択されたリポソームサイズが観察されるまで、ＭＬＶを標準エマルジョンホモジナイザーを介して再循環させる。リポソームのサイズは、参照により本明細書に組み入れられるＢｌｏｏｍｆｉｅｌｄ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｅｎｇ．、１０巻：４２１～１５０頁（１９８１）に記載されているように、準電光散乱（ＱＥＬＳ）によって決定することができる。形成されたリポソームの超音波処理によって、平均リポソーム直径を減少させることができる。効率的なリポソーム合成を導くために、間欠的超音波処理サイクルをＱＥＬＳ評価と交互に行うことができる。

【0217】

組成物の治療的使用
一態様では、本発明は、とりわけ、治療目的に有用であるｍＲＮＡを封入するＬＮＰ製剤を提供する。例えば、一部の実施形態では、ＬＮＰに封入されたｍＲＮＡは、対象において欠損しているタンパク質をコードする。例えば、ｍＲＮＡは、膀胱炎線維症を処置するためのＣＦＴＲをコードし得る。ＣＦＴＲをコードする適切なｍＲＮＡは、例えば、国際公開第２０２０／１０６９４６号および国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０／４４１５８号に記載され、各々は、それらの全体が参照により本明細書に組み入れられる。別の例として、ｍＲＮＡは、例えば、国際公開第２０１７／２１８５２４号に記載される、オルニチントランスカルバミラーゼ欠損症を処置するためのＯＴＣをコードすることができ、その内容はその全体が本明細書に組み入れられる。

【0218】

一部の実施形態では、ＬＮＰに封入されたｍＲＮＡは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原のようなワクチン抗原をコードするタンパク質をコードする。このようなＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原は、米国特許出願第６３／０２１，３１９号に記載され、その内容は参照により本明細書に組み入れられる。

【0219】

一部の実施形態では、ｍＲＮＡはコドン最適化される。種々のコドン最適化方法が当技術分野において公知である。

【0220】

遺伝子治療
一部の実施形態では、本明細書に記載されるＬＮＰ製剤は、それを必要とする対象を処置するために使用されるタンパク質をコードするコドン最適化された核酸を含む医薬組成物に適している。一部の実施形態では、本明細書に記載されるｒＡＡＶベクターを含む医薬組成物は、それを必要とする対象を処置するために使用される。本発明のｒＡＡＶベクターまたは粒子を含有する医薬組成物は、薬学的に許容される賦形剤、希釈剤または担体を含有する。適切な薬学的担体の例は、当技術分野において周知であり、リン酸緩衝生理食塩水溶液、水、油／水エマルジョンのようなエマルジョン、種々のタイプの湿潤剤、滅菌溶液などを含む。医薬組成物は、凍結乾燥形態であり得る。このような担体は、従来の方法によって製剤化することができ、治療的に有効な量で対象に投与される。

【0221】

ｒＡＡＶベクターは、それを必要とする対象に、適切な経路を介して投与される。一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、静脈内、腹腔内、皮下、または皮内経路によって投与される。一実施形態では、ｒＡＡＶベクターは静脈内投与される。実施形態では、皮内投与は、「遺伝子銃」またはバイオリスティック粒子送達システムの使用による投与を含む。一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、非ウイルス性脂質ナノ粒子を介して投与される。例えば、ｒＡＡＶベクターを含む組成物は、１つまたはそれ以上の希釈剤、緩衝剤、リポソーム、脂質、脂質複合体を含み得る。一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、マイクロスフェアまたはナノ粒子、例えば、脂質ナノ粒子または無機ナノ粒子内に含まれる。

【0222】

一部の実施形態では、ｒＡＡＶはシュードタイプ化される。シュードタイプ化されたｒＡＡＶは、ＡＡＶカプシドタンパク質とｒＡＡＶゲノムの任意の組合せを含む感染性ウイルスである。シュードタイプ化されたｒＡＡＶは、ｒＡＡＶの組織または細胞特異性を変化させるのに有用であり、単独でまたはシュードタイプ化されていないｒＡＡＶと組み合わせて使用して、１つまたはそれ以上の遺伝子を細胞、例えば哺乳動物細胞に移入することができる。例えば、シュードタイプ化されていないｒＡＡＶに対する免疫応答を発生した哺乳動物において、シュードタイプ化されていないｒＡＡＶとの投与後に、シュードタイプ化されたｒＡＡＶを使用することができる。任意のＡＡＶ血清型由来のカプシドタンパク質は、異なる血清型の野生型ＡＡＶゲノムに由来するかもしくは得られるｒＡＡＶゲノム、またはキメラゲノムであるｒＡＡＶゲノム、すなわち、２つ以上の異なる血清型、例えば、２つのＩＴＲを有するキメラゲノム、異なる血清型もしくはキメラＩＴＲ由来の各ＩＴＲから形成されるＡＡＶ ＤＮＡとともに用いることができる。２つのＡＡＶ血清型由来のＩＴＲまたはキメラＩＴＲを含むもののようなキメラゲノムの使用は、指向性組換えを生じ得、転写活性分子間コンカテマーの産生をさらに増強し得る。したがって、本発明のｒＡＡＶベクター内の５’および３’ＩＴＲは、相同性、すなわち、同一の血清型、異種性、すなわち、異なる血清型、またはキメラ、すなわち、１を超えるＡＡＶ血清型由来のＩＴＲ配列を有するＩＴＲであり得る。

【0223】

一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、またはＡＡＶ１１ベクターである。一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターはＡＡＶ１である。一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターはＡＡＶ２である。一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターはＡＡＶ３である。一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターはＡＡＶ４である。一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターはＡＡＶ５である。一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターはＡＡＶ６である。一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターはＡＡＶ７である。一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターはＡＡＶ８である。一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターはＡＡＶ９である。一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターはＡＡＶ１０である。一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターはＡＡＶ１１である。一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターは配列最適化される。一部の実施形態では、ｒＡＡＶカプシドは修飾される。例えば、一部の実施形態では、ｒＡＡＶ８カプシドは修飾される。

【実施例】

【0224】

本発明のある特定の化合物、組成物および方法は、ある特定の実施形態に従って特異性をもって記載されてきたが、以下の実施例は、本発明の化合物を例示するためにのみ役立ち、本発明の化合物を限定することを意図するものではない。

【実施例1】

【0225】

ＬＮＰ安定性における糖、緩衝率およびｐＨの効果
様々な量の糖、ここではトレハロース、様々な緩衝強度、および／または様々なｐＨレベルの存在下でのＬＮＰの安定性を評価するために分析を行った。まとめると、これらの研究からのデータは、より低いｐＨレベルでは、安定性を維持するためにより高い最小緩衝強度が必要であることを示す。さらに、結果は、糖、トレハロースが製剤内で一定のパーセンテージに維持される場合、製剤のｐＨが上昇するにつれて、ＬＮＰ安定性を維持するために必要な最小緩衝強度が低下することを示した。

【0226】

図１Ａは、ｐＨ７．５において、ＬＮＰ製剤中の糖、トレハロースのパーセンテージを増加させると、ＬＮＰ製剤中に必要とされる最小緩衝強度が同時に増加することを示すグラフである。図１Ｂは、トレハロースが一定のパーセンテージ（すなわち、２．７％）に維持される場合、ｐＨレベルが増加すると、最小緩衝強度が減少することを示すグラフである。

【0227】

これらのデータが示したのは、ある特定のｐＨではより低い糖／緩衝液比が必要であるということである。さらに、データは、ＬＮＰ製剤中のｐＨが低いほど、ある特定の糖濃度でＬＮＰを安定化するために、より高い緩衝強度が必要であることも示す。例えば、糖濃度を一定に維持する場合、ｐＨレベルが低ければ低いほど、ＬＮＰ安定性を維持するのに必要な緩衝強度は高くなる。

【実施例2】

【0228】

緩衝強度を下げると、脂質のｐＫａ未満で高い安定性が得られる
脂質ｐＫａ依存性挙動を評価するために研究を行った。これらの研究では、ＬＮＰ製剤を分析し、２．７％トレハロースを含み、クエン酸緩衝液を用いてｐＨ４．５にするように製剤化した。これらの分析が示したのは、緩衝強度を低下させると、脂質のｐＫａ未満でＬＮＰのより高い安定性がもたらされることであった。具体的には、ＬＮＰ安定性は、試験された緩衝強度の増加、すなわち、１、１０、２０、５０、７５、から１００ｍＭに伴って低下することが観察された。これは、図２のグラフ形式で例示される。

【0229】

これらのデータは、緩衝強度が、サンプルの希釈後にＬＮＰ製剤を安定化するのにより良好であることを示す。例えば、安定は、以下のシナリオ：１）２．７％トレハロース＋１００ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ７．５（溶液の観察－透明）；２）２．７％トレハロース＋２０ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ７．５＋１００ｍＭのＮａＣｌ（溶液の観察－クラッシュ／曇り）；３）２．７％トレハロース＋１６ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ７．５＋２２０ｍＭのＮａＣｌ（溶液の観察－透明）で視覚的に観察された。

【0230】

まとめると、これらのデータから、より高いイオン強度を維持することは、ＬＮＰ凝集の防止、および結果としてのｍＲＮＡ安定性に望ましいと結論付けられた。これは、例えば、１）高い緩衝強度（例えば、１００ｍＭまたはそれ以上）を有すること；２）低い緩衝強度（例えば、１５～２０ｍＭ）と高い塩濃度（例えば、２００ｍＭまたはそれ以上）を組み合わせること；または中程度の緩衝強度（例えば、４０～５０ｍＭ）と中程度の塩濃度（例えば、５０～１００ｍＭ）を組み合わせることによって、様々な方法において達成され得ると推定された。

【実施例3】

【0231】

力価対安定性
非常に強力なＬＮＰは、より高量のＬＮＰ凝集とそれに続くｍＲＮＡ分解と関連することが以前に観察されている。本明細書に記載されるＬＮＰ製剤は、これらの製剤が、凝集に抵抗性であり、その後のｍＲＮＡ分解に抵抗性であるＬＮＰに封入されたｍＲＮＡを得る能力に何らかの影響を及ぼすかどうかを決定するために調査された。

【0232】

ヒトエリスロポエチン（ＥＰＯ）ｍＲＮＡを封入する種々のＬＮＰ製剤を６時間および２５時間で安定性について試験した。試験したＬＮＰ製剤は、凝集しやすいことが以前に見出されていた。図３Ａおよび３Ｂに示されるように、本明細書に記載されるＬＮＰ製剤の使用は、凝集に抵抗性である所望の、非常に強力なＬＮＰの成功した製剤化を可能にした。

【0233】

試験された異なるＬＮＰ製剤は、図３Ａおよび図３Ｂに記載される。図３Ｂからのデータは、記載されたＬＮＰ製剤をマウスに投与後６時間または２４時間のいずれかで分析したインビボ試験からのものであった。データは、例えば、高濃度のＤＯＰＥを有するリピドイドを含む、非常に強力な脂質を使用する場合の、６時間と２４時間の両方でのヒトＥＰＯタンパク質の発現を示す。

【0234】

図４Ａは、ＬＮＰ製剤で試験された緩衝液および塩濃度の種々の組合せ、ならびに種々のＬＮＰ製剤に関連する得られた希釈後の安定性を示す。データは、実施例２に提示された結果、すなわち、ＬＮＰ凝集の防止、および結果としてのｍＲＮＡ安定性に、より高いイオン強度が望ましいことと一致する。特に、これらのデータは、中程度の緩衝強度（例えば、４０～５０ｍＭ）と中程度の塩濃度（例えば、５０～１２５ｍＭ）とを組み合わせると、希釈後に安定なＬＮＰ製剤が得られることを確認した。

【0235】

図４Ｂは、希釈後のＬＮＰ製剤の安定性を要約する表を示す。これらのアッセイでは、ＬＮＰは、Ｔｒｉｓまたはリン酸緩衝液濃度に関してのみ変化した。本研究におけるＬＮＰは全て、Ｔｒｉｓまたはリン酸緩衝液および２．７％トレハロース中に製剤化された。データが示すように、製剤ｐＨは２０ｍＭ緩衝強度で達成されたが、これらのＬＮＰ製剤は安定ではなかった。緩衝強度が１００ｍＭまたはそれ以上に達した場合、ＬＮＰ製剤は安定であった。これらのデータは、実施例２に提示された結果、すなわち、ＬＮＰ凝集の防止、および結果としてのｍＲＮＡ安定性に、より高いイオン強度が望ましいことと一致する。

【実施例4】

【0236】

脂質ナノ粒子の封入効率およびサイズにおける糖対緩衝液の比の影響
－２０℃での製剤の安定性における糖対緩衝液の比の効果を評価するために研究を行った。これらの研究では、０．９ｍｇ／ｍｌ～１．６ｍｇ／ｍｌの間の開始ｍＲＮＡ濃度で、０．１９～０．４７の間の例示的なトレハロース対ＰＢＳ比を含むＬＮＰ製剤を分析した（表１）。封入効率（図５Ａおよび図５Ｂ）および脂質ナノ粒子のサイズ（図６Ａおよび図６Ｂ）を、ＬＮＰ製剤のトレハロース対ＰＢＳ比を変えて４℃および２５℃で評価した。これらの分析が示したものは、ＬＮＰ製剤のより低いトレハロース対ＰＢＳ比が、封入の低下およびＬＮＰサイズの増加を防止するのに有益であり、それによってＬＮＰ製剤のより高い安定性をもたらしたことであった。全体として、ＬＮＰ製剤の安定性は低糖対緩衝液比でより大きかった。これは、封入効率（図５Ａおよび図５Ｂ）およびＬＮＰサイズ（図６Ａおよび６Ｂ）における糖対緩衝液の比の効果を示すグラフ形式で示されている。

【0237】

【表1】

【0238】

封入効率を種々の例示的な時間点（０時間、１時間、３時間、６時間および２４時間）で評価し、観察された封入効率パーセントを４℃（図５Ａ）および２５℃（図５Ｂ）でグラフ表示した。結果は、トレハロース対ＰＢＳ比が増加するＬＮＰ製剤では、封入低下が観察され、安定性の低下が示された。結果は４℃で顕著であったが、２５℃でも同様の傾向が観察された。

【0239】

ＬＮＰサイズを種々の例示的な時間点（０時間、１時間、３時間、６時間および２４時間）で測定し、観察されたＬＮＰサイズ（ナノメートル）を４℃（図６Ａ）および２５℃（図６Ｂ）でグラフ表示した。結果は、トレハロース対ＰＢＳ比が増加するＬＮＰ製剤では、封入低下が観察され、安定性の低下が示された。結果は２５℃で顕著であったが、４℃でも同様の傾向が観察された。

【0240】

全体として、これらの研究の結果は、低トレハロース対ＰＢＳ比がＬＮＰのより高い安定性に対応して、封入の増加とＬＮＰサイズの低下に有利であることを示した。

【0241】

本明細書に記載される全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、それらの全体が参照により本明細書に組み入れられる。加えて、材料、方法、および実施例は、単に例示的であり、限定することを意図しない。別段の定義がない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されたものと類似または同等の方法および材料が、本発明の実施または試験において使用され得るが、適切な方法および材料が本明細書に記載される。

【0242】

等価物
当業者であれば、日常的な実験でしかないものを使用して、本明細書に記載される本発明の具体的な実施形態の多くの等価物を認識するか、または確認することができるだろう。本発明の範囲は、上記の明細書に限定されることを意図するものではなく、むしろ以下の特許請求の範囲に示される通りである。

【図1A】

【図1B】

【図2】

【図3A】

【図3B】

【図4A】

【図4B】

【図5A】

【図5B】

【図6A】

【図6B】

【国際調査報告】