(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-12-05
(54)【発明の名称】フローセル信号の変更
(51)【国際特許分類】
C12M 1/00 20060101AFI20231128BHJP
C12Q 1/6869 20180101ALI20231128BHJP
B82Y 20/00 20110101ALI20231128BHJP
B82Y 40/00 20110101ALI20231128BHJP
G01N 21/64 20060101ALI20231128BHJP
G01N 21/05 20060101ALI20231128BHJP
C12N 15/09 20060101ALN20231128BHJP
【ＦＩ】
C12M1/00 A
C12Q1/6869 Z
B82Y20/00
B82Y40/00
G01N21/64 F
G01N21/64 G
G01N21/64 C
G01N21/05
C12N15/09 Z
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022580758
(86)(22)【出願日】2021-11-12
(85)【翻訳文提出日】2023-01-31
(86)【国際出願番号】 EP2021081502
(87)【国際公開番号】W WO2022101401
(87)【国際公開日】2022-05-19
(31)【優先権主張番号】63/114,305
(32)【優先日】2020-11-16
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】502279294
【氏名又は名称】イルミナ ケンブリッジ リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100106518
【弁理士】
【氏名又は名称】松谷 道子
(74)【代理人】
【識別番号】100132263
【弁理士】
【氏名又は名称】江間 晴彦
(74)【代理人】
【識別番号】100221501
【弁理士】
【氏名又は名称】式見 真行
(72)【発明者】
【氏名】アルティオリ，ジャンルカ アンドレア
(72)【発明者】
【氏名】フォン ハッテン，ゼイビア
【テーマコード（参考）】
2G043
2G057
4B029
4B063
【Ｆターム（参考）】
2G043AA04
2G043BA16
2G043CA04
2G043DA05
2G043EA01
2G043FA01
2G043FA03
2G043KA02
2G043KA09
2G043LA03
2G057AA04
2G057AB01
2G057AB04
2G057AC01
2G057BA05
2G057BB06
2G057CB01
4B029AA07
4B029AA23
4B029FA15
4B029GA08
4B029GB09
4B029GB10
4B063QA13
4B063QR08
4B063QR62
4B063QS39
4B063QS40
4B063QX02
4B063QX04
(57)【要約】
例示的な方法では、ヒドロゲルを基材の表面に適用し、適用ヒドロゲルにプライマーをグラフトする。プライマーをグラフトする前又は後に、プラズモンナノ構造は、適用ヒドロゲルへと導入された。この基材はフローセルの一方の表面を構成することができる。フローセルが配列決定操作で使用される場合、プラズモンナノ構造は、生成される蛍光信号を増強することができる。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
方法であって、基材の表面にヒドロゲルを適用することと、
プライマーを前記適用ヒドロゲルにグラフトすることと、
前記プライマーをグラフトする前又は後に、前記適用ヒドロゲルにプラズモンナノ構造を導入することと、
を含む、方法。
【請求項2】
前記プラズモンナノ構造が、前記ヒドロゲルの遊離アジド基に共有結合するアルキンで官能化されている、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記プラズモンナノ構造が、前記ヒドロゲルのアルキンに共有結合するアジドで官能化されている、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
前記プラズモンナノ構造が、前記ヒドロゲルに付着している前記結合対の第２のメンバーと相互作用する結合対の第１のメンバーで官能化されている、請求項１に記載の方法。
【請求項5】
前記第１のメンバー及び前記第２のメンバーが、ＮｉＮＴＡリガンド及びヒスチジンタグ、又はストレプトアビジン及びビオチン、又はスパイタグ（spytag）及びスパイキャッチャー（spycatcher）、又はマレイミド及びシステイン、又はＮ－ヒドロキシスクシンイミドエステル及びアミン、又はアルデヒド及びヒドラジン、又はアミン及び活性化カルボキシレート、又はアミン及びＮ－ヒドロキシスクシンイミドエステル、又はチオール及びアルキル化試薬、又はホスホラミダイト及びチオエーテルを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項6】
前記基材の前記表面が、間隙領域によって分離されたくぼみを含み、前記方法が、前記プライマーをグラフトする前及び前記プラズモンナノ構造を導入する前に、前記ヒドロゲルを前記間隙領域から除去することを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項7】
前記基材の前記表面が、間隙領域によって取り囲まれたレーンを含み、前記方法が、前記プライマーをグラフトする前及び前記プラズモンナノ構造を導入する前に、前記ヒドロゲルを前記間隙領域から除去することを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項8】
前記プラズモンナノ構造が、金ナノ構造、銀ナノ構造、スズナノ構造、ロジウムナノ構造、ルテニウムナノ構造、パラジウムナノ構造、オスミウムナノ構造、イリジウムナノ構造、白金ナノ構造、クロムナノ構造、銅ナノ構造、ガリウムヒ素ナノ構造、ドープシリコンナノ構造、アルミニウムナノ構造、マグネシウムナノ構造、銀及び金複合ナノ構造、並びにそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項9】
前記プラズモンナノ構造が、各々、固体構造、中空構造、又はコアシェル構造を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項10】
フローセルであって、前記ベース支持体と、
前記ベース支持体上のパターン化材料であって、前記パターン化材料は、
樹脂マトリックス材料、及び
前記樹脂マトリックス材料の表面全体にわたって分散されている又は配置されている、消光ナノ構造
を含む、パターン化材料と、
活性領域のための領域を画定する前記パターン化材料であって、前記領域が間隙領域によって取り囲まれている、パターン化材料と、
前記領域内のヒドロゲルと、
前記ヒドロゲルに付着されたプライマーと、
を含む、フローセル。
【請求項11】
前記消光ナノ構造が、金ナノ構造、銀ナノ構造、スズナノ構造、ロジウムナノ構造、ルテニウムナノ構造、パラジウムナノ構造、オスミウムナノ構造、イリジウムナノ構造、白金ナノ構造、クロムナノ構造、銅ナノ構造、ガリウムヒ素ナノ構造、ドープシリコンナノ構造、アルミニウムナノ構造、マグネシウムナノ構造、銀及び金複合ナノ構造、並びにそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１０に記載のフローセル。
【請求項12】
前記消光ナノ構造が、固体構造、中空構造、又はコアシェル構造を有する、請求項１０に記載のフローセル。
【請求項13】
前記領域が、レーンを含み、前記間隙領域が、前記レーンを取り囲む、請求項１０に記載のフローセル。
【請求項14】
前記領域が、くぼみであり、前記パターン化材料が、複数の前記くぼみを画定し、
前記複数のくぼみの各々が、前記間隙領域によって分離されている、
請求項１０に記載のフローセル。
【請求項15】
フローセルにおける配列決定中にシグナル・ノイズ比を増加させるための方法であって、樹脂マトリックス材料をナノインプリントして、間隙領域によって分離されたくぼみを含むパターン化材料を形成することと、
前記パターン化材料の表面上に消光ナノ構造のフィルムを堆積させることであって、前記フィルムが約１ｎｍ～約２０ｎｍの範囲の厚さを有する、堆積させることと、
ヒドロゲルを前記くぼみへと導入することと、
プライマーを前記ヒドロゲルにグラフトすることと、
を含む、方法。
【請求項16】
前記消光ナノ構造が、金ナノ構造、銀ナノ構造、スズナノ構造、ロジウムナノ構造、ルテニウムナノ構造、パラジウムナノ構造、オスミウムナノ構造、イリジウムナノ構造、白金ナノ構造、クロムナノ構造、銅ナノ構造、ガリウムヒ素ナノ構造、ドープシリコンナノ構造、アルミニウムナノ構造、マグネシウムナノ構造、銀及び金複合ナノ構造、並びにそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項17】
フローセルにおける配列決定中にシグナル・ノイズ比を増加させるための方法であって、消光ナノ構造を樹脂マトリックス材料へと組み込むことと、
間隙領域によって取り囲まれた活性領域のための領域を画定するように前記樹脂マトリックス材料をパターン化することと、
ヒドロゲルを前記領域へと導入することと、
プライマーを前記ヒドロゲルにグラフトすることと、
を含む、方法。
【請求項18】
前記消光ナノ構造が、前記消光ナノ構造と前記樹脂マトリックス材料との混合物の総重量の約０．１重量％～約１０重量％の範囲にわたる量で前記樹脂マトリックス材料へと組み込まれる、請求項１７に記載の方法。
【請求項19】
前記消光ナノ構造が、金ナノ構造、銀ナノ構造、スズナノ構造、ロジウムナノ構造、ルテニウムナノ構造、パラジウムナノ構造、オスミウムナノ構造、イリジウムナノ構造、白金ナノ構造、クロムナノ構造、銅ナノ構造、ガリウムヒ素ナノ構造、ドープシリコンナノ構造、アルミニウムナノ構造、マグネシウムナノ構造、銀及び金複合ナノ構造、並びにそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項20】
前記領域が、レーンを含み、前記間隙領域が、前記レーンを取り囲む、請求項１７に記載の方法。
【請求項21】
前記領域が、くぼみであり、前記パターン化材料は、複数の前記くぼみを画定し、
前記複数のくぼみの各々が、前記間隙領域によって分離されている、
請求項１７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２０２０年１１月１６日に出願された米国仮特許出願第６３／１１４，３０５号の利益を主張するものであり、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０２０年１１月１６日に出願された米国仮特許出願第６３／１１４，３０５号の利益を主張するものであり、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【0002】
生物学的又は化学的研究における様々なプロトコルは、局所支持体表面上又は所定の反応チャンバ内で多数の制御された反応を実施することを含む。次いで、指定された反応を観察又は検出することができ、その後の分析は、反応に関与する化学物質の特性を識別又は明らかにするのに役立ち得る。いくつかの例では、制御された反応は、電荷、導電率、又は他の何らかの電気的特性を変化させ、したがって電子システムを検出に使用することができる。他の例では、制御された反応は蛍光を産生させ、したがって光学システムを検出に使用することができる。
【発明の概要】
【0003】
プラズモンナノ構造体はフローセル基材に組み込まれる。いくつかの例では、プラズモンナノ構造はフローセルのヒドロゲルに導入され、したがって光学標識の信号増強近接内に局在化される。蛍光を示す光学標識は、フローセル基材上の配列決定中に新生核酸鎖へと組み込まれた標識ヌクレオチドの構成要素である。したがって、プラズモンナノ構造は、光学信号として読み取られる光学標識の蛍光を増強することができる。
【0004】
他の例では、プラズモンナノ構造は、基材樹脂マトリックス材料によって産生された蛍光信号（複数可）の信号消光近接内に局在化される。これらの例では、プラズモンナノ構造は、樹脂マトリックス材料の自己蛍光を消光させることができる。これらの例では、プラズモンナノ構造は消光ナノ構造として機能し、したがって樹脂マトリックス材料からのバックグラウンドノイズを低減する。
【0005】
更に他の例では、プラズモン／消光ナノ構造は、光学標識の光信号を増強すること、及びまた樹脂マトリックス材料からの光信号を消光することの両方が可能である。
【0006】
導入
本明細書に開示される第１の態様は、ヒドロゲルを基材の表面に適用することと、適用ヒドロゲルにプライマーをグラフトすることと、プライマーをグラフトする前又は後に、適用されたヒドロゲルへとプラズモンナノ構造を導入することと、を含む方法である。
本明細書に開示される第１の態様は、ヒドロゲルを基材の表面に適用することと、適用ヒドロゲルにプライマーをグラフトすることと、プライマーをグラフトする前又は後に、適用されたヒドロゲルへとプラズモンナノ構造を導入することと、を含む方法である。
【0007】
第１の態様の一例では、プラズモンナノ構造は、ヒドロゲルの遊離アジド基に共有結合するアルキンで官能化されている。
【0008】
第１の態様の一例では、プラズモンナノ構造は、ヒドロゲルのアルキンへと共有結合するアジドで官能化されている。
【0009】
第１の態様の一例では、プラズモンナノ構造体は、ヒドロゲルに付着している結合対の第２のメンバーと相互作用する結合対の第１のメンバーで官能化されている。一例では、第１のメンバー及び第２のメンバーは、ＮｉＮＴＡリガンド及びヒスチジンタグ、又はストレプトアビジン及びビオチン、又はスパイタグ及びスパイキャッチャー、又はマレイミド及びシステイン、又はＮ－ヒドロキシスクシンイミドエステル及びアミン、又はアルデヒド及びヒドラジン、又はアミン及び活性化カルボキシレート、又はアミン及びＮ－ヒドロキシスクシンイミドエステル、又はチオール及びアルキル化試薬、又はホスホラミダイト及びチオエーテルを含む。
【0010】
第１の態様の一例では、基材の表面は、間隙領域によって分離されたくぼみを含み、本方法は、プライマーをグラフトする前及びプラズモンナノ構造を導入する前に、ヒドロゲルを間隙領域から除去することを更に含む。
【0011】
第１の態様の一例では、基材の表面は、間隙領域によって取り囲まれたレーンを含み、本方法は、プライマーをグラフトする前及びプラズモンナノ構造を導入する前に、ヒドロゲルを間隙領域から除去することを更に含む。
【0012】
第１の態様の一例では、プラズモンナノ構造は、金ナノ構造、銀ナノ構造、スズナノ構造、ロジウムナノ構造、ルテニウムナノ構造、パラジウムナノ構造、オスミウムナノ構造、イリジウムナノ構造、白金ナノ構造、クロムナノ構造、銅ナノ構造、ガリウムヒ素ナノ構造、ドープシリコンナノ構造、アルミニウムナノ構造、マグネシウムナノ構造、銀及び金複合ナノ構造、並びにそれらの組合せからなる群から選択される。
【0013】
第１の態様の一例では、プラズモンナノ構造は、各々、固体構造、中空構造、又はコアシェル構造を有する。
【0014】
第１の態様の任意の特徴を、任意の望ましい方法で一緒に組み合わせてもよく、及び／又は本明細書に開示される例のうちのいずれかと組み合わせて、例えば、配列決定プロトコルのイメージング中における蛍光を増強し、したがって信号を増強することを含む、本開示に記載される利益を達成してもよいことを理解されたい。
【0015】
本明細書に開示される第２の態様は、ベース支持体を含む、フローセルと、ベース支持体上のパターン化材料であって、樹脂マトリックス材料及び樹脂マトリックス材料の表面全体にわたって分散又は配置された消光ナノ構造を含む、パターン化材料と、活性領域のための領域を画定するパターン化材料であって、この領域が間隙領域によって取り囲まれている、パターン化材料と、領域内のヒドロゲルと、ヒドロゲルに付着したプライマーと、を含む。
【0016】
第２の態様の一例では、消光ナノ構造は、金ナノ構造、銀ナノ構造、スズナノ構造、ロジウムナノ構造、ルテニウムナノ構造、パラジウムナノ構造、オスミウムナノ構造、イリジウムナノ構造、白金ナノ構造、クロムナノ構造、銅ナノ構造、ガリウムヒ素ナノ構造、ドープシリコンナノ構造、アルミニウムナノ構造、マグネシウムナノ構造、銀及び金複合ナノ構造、並びにそれらの組合せからなる群から選択される。
【0017】
第２の態様の一例では、消光ナノ構造は、固体構造、中空構造、又はコアシェル構造を有する。
【0018】
第２の態様の一例では、領域はレーンを含み、間隙領域はレーンを取り囲む。
【0019】
第２の態様の一例では、領域はくぼみであり、パターン化材料は複数のくぼみを画定し、複数のくぼみの各々は間隙領域によって分離されている。
【0020】
第２の態様の任意の特徴は、任意の望ましい方法で一緒に組み合わされてもよいことを理解すべきである。更に、第１の態様及び／若しくは第２の態様の特徴の任意の組合せを一緒に使用してもよいこと、並びに／又は本明細書に開示される例のうちのいずれかと組み合わせて、例えば、配列決定プロトコルのイメージング中のバックグラウンド信号を消光することを含む、本開示に記載される利益を達成してもよいことを理解されたい。
【0021】
本明細書に開示される第３の態様は、フローセルにおける配列決定中にシグナル・ノイズ比を増加させるための方法であって、樹脂マトリックス材料をナノインプリントして、間隙領域によって分離されたくぼみを含むパターン化材料を形成することと、パターン化材料の表面上に消光ナノ構造のフィルムを堆積させることであって、当該フィルムが約１ｎｍ～約２０ｎｍの範囲の厚さを有する、堆積させることと、ヒドロゲルをくぼみへと導入する工程と、ヒドロゲルにプライマーをグラフトすることと、を含む方法である。
【0022】
第３の態様の一例では、消光ナノ構造は、金ナノ構造、銀ナノ構造、スズナノ構造、ロジウムナノ構造、ルテニウムナノ構造、パラジウムナノ構造、オスミウムナノ構造、イリジウムナノ構造、白金ナノ構造、クロムナノ構造、銅ナノ構造、ガリウムヒ素ナノ構造、ドープシリコンナノ構造、アルミニウムナノ構造、マグネシウムナノ構造、銀及び金複合ナノ構造、並びにそれらの組合せからなる群から選択される。
【0023】
第３の態様の任意の特徴は、任意の望ましい方法で一緒に組み合わされてもよいことを理解すべきである。更に、第１の態様及び／若しくは第２の態様及び／若しくは第３の態様の特徴の任意の組合せを一緒に使用してもよいこと、並びに／又は本明細書に開示される例のうちのいずれかと組み合わせて、例えば、配列決定プロトコルのイメージング中のバックグラウンド信号を消光することを含む、本開示に記載される利益を達成してもよいことを理解されたい。
【0024】
本明細書に開示される第４の態様は、フローセルにおける配列決定中にシグナル・ノイズ比を増加させるための方法であって、消光ナノ構造を樹脂マトリックス材料に組み込むことと、間隙領域によって取り囲まれた活性領域のための領域を画定するように当該樹脂マトリックス材料をパターン化することと、ヒドロゲルを領域へと導入する工程と、ヒドロゲルにプライマーをグラフトすることと、を含む方法である。
【0025】
第４の態様の一例では、消光ナノ構造は、消光ナノ構造と樹脂マトリックス材料との混合物の総重量の約０．１重量％～約１０重量％の範囲にわたる量で樹脂マトリックス材料へと組み込まれる。
【0026】
第４の態様の一例では、消光ナノ構造は、金ナノ構造、銀ナノ構造、スズナノ構造、ロジウムナノ構造、ルテニウムナノ構造、パラジウムナノ構造、オスミウムナノ構造、イリジウムナノ構造、白金ナノ構造、クロムナノ構造、銅ナノ構造、ガリウムヒ素ナノ構造、ドープシリコンナノ構造、アルミニウムナノ構造、マグネシウムナノ構造、銀及び金複合ナノ構造、並びにそれらの組合せからなる群から選択される。
【0027】
第４の態様の一例では、領域はレーンを含み、間隙領域はレーンを取り囲む。
【0028】
第４の態様の一例では、領域はくぼみであり、パターン化材料は複数のくぼみを画定し、複数のくぼみの各々は間隙領域によって分離されている。
【0029】
第４の態様の任意の特徴は、任意の望ましい方法で一緒に組み合わされてもよいことを理解すべきである。更に、第１の態様及び／若しくは第２の態様及び／若しくは第３の態様及び／若しくは第４の態様の特徴の任意の組合せを一緒に使用してもよいこと、並びに／又は本明細書に開示される例のうちのいずれかと組み合わせて、例えば、配列決定プロトコルのイメージング中のバックグラウンド信号を消光することを含む、本開示に記載される利益を達成してもよいことを理解されたい。
【図面の簡単な説明】
【0030】
本開示の例の特徴は、以下の詳細な説明及び図面を参照することにより明らかになろう。図面において、同様の参照番号は、類似なものではあるが、おそらく同一ではない構成要素に対応している。簡潔にするために、前述の機能を有する参照番号又は特徴は、それらが現れる他の図面と関連させて記載してもよく、記載しなくてもよい。
【図1A】本明細書に開示される方法の２つの例を示す。
【図1B】本明細書に開示される方法の２つの例を示す。
【図1C】本明細書に開示される方法の２つの例を示す。
【図1D】本明細書に開示される方法の２つの例を示す。
【図1E】本明細書に開示される方法の２つの例を示す。
【図2A】フローセルのある例の上面図である。
【図3A】本明細書に開示される別の例示的方法を示す。
【図3B】本明細書に開示される別の例示的方法を示す。
【図3C】本明細書に開示される別の例示的方法を示す。
【図3D】本明細書に開示される別の例示的方法を示す。
【図4A】本明細書に開示される更に別の例示的方法を示す。
【図4B】本明細書に開示される更に別の例示的方法を示す。
【図4C】本明細書に開示される更に別の例示的方法を示す。
【図5A】本明細書に開示される更に別の例示的方法を示す。
【図5B】本明細書に開示される更に別の例示的方法を示す。
【図5C】本明細書に開示される更に別の例示的方法を示す。
【図6A】フローセルの最初に着色された写真の白黒再現であり、色はフローセルのレーンのいくつかに導入されたプラズモンナノ粒子溶液の存在を示し、レーン１は蛍光ヒドロゲル（ＡＬＥＸＡ ＦＬＵＯＲ（登録商標）５４５色素が付着したヒドロゲル）なし及びプラズモンナノ粒子溶液なしの対照レーンであり、レーン２はプラズモンナノ粒子溶液でコーティングされたが蛍光ヒドロゲルなしの対照レーンであり、レーン３～レーン７は蛍光ヒドロゲル及び異なる濃度のプラズモンナノ粒子溶液の両方でコーティングされた例示的なレーンであり、レーン８は蛍光ヒドロゲルでコーティングされたがプラズモンナノ粒子溶液なしの対照レーンであった。
【図6B】請求項２～請求項７からナノ粒子溶液を洗い流した後、及び緩衝液を導入した後に、５３２ｎｍ緑色レーザ（励起用）及びＴＡＭＲＡフィルタを用いて収集された、図６Ａのフローセルの蛍光スキャナ画像であって、レーン３～レーン８における蛍光信号滴定及びレーン１又はレーン２における信号なしを示す。
【図6D】（ｉ）蛍光ヒドロゲルを含む図６Ａのフローセルの一方のレーンであるが、ナノ粒子溶液での処理前であり、かつ緩衝液が導入された後である、一方のレーン（レーン８）と、（ｉｉ）ナノ粒子溶液がそこに導入され、そこから洗い流された後であり、かつ緩衝液が導入された後である、図６Ａのフローセルのレーン３～レーン７とについて、５３２ｎｍ緑色レーザを用いて収集された蛍光強度を示すグラフである
【図7】（ｉ）ナノ粒子溶液処理なしで、かつ緩衝液が導入された後に、別の蛍光ヒドロゲル（ＡＬＥＸＡ ＦＬＵＯＲ（登録商標）４８８色素を含む）でコーティングされたフローセルの一方のレーンと、（ｉｉ）ナノ粒子溶液がそこに導入され、そこから洗い流された後、かつ緩衝液が導入された後である、このフローセルの他の５つのレーンとについて、４８８ｎｍ青色レーザを用いて収集された蛍光強度を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【0031】
本明細書に開示される例では、配列決定中のヌクレオチド塩基呼び出しは、光学標識からの蛍光の検出を介して行われる。
【0032】
いくつかの例では、プラズモン共鳴による蛍光増強は、配列決定に使用されるフローセルのヒドロゲル全体に分散されたプラズモンナノ構造を介して達成される。ヒドロゲルは、プラズモンナノ構造の少なくともいくつかを、光学標識の信号増強近接内に局在化する。蛍光を示す光学標識は、配列決定中に新生核酸鎖へと組み込まれた標識ヌクレオチドの構成要素である。「信号増強近接（signal enhancing proximity）」とは、プラズモンナノ構造及び光学標識が、（ｉ）プラズモンナノ構造及び光学標識が互いに近すぎる位置にある場合に起こり得る消光を防止し、（ｉｉ）より長い距離で著しく低下し得るプラズモン増強を増加させる距離によって、分離されることを意味する。信号増強近接に対応する距離は０ｎｍ超～約１００ｎｍの範囲であり得るが、プラズモンナノ構造（例えば、組成、形状、サイズ）と、光源で励起する際に蛍光を示す光学標識とに依存する。いくつかの例では、信号増強近接に対応する距離は、約０．１ｎｍ～約２５ｎｍ、例えば約１ｎｍ～約２０ｎｍなどの範囲である。一具体例では、信号増強近接に対応する距離は、約３ｎｍ～約１２ｎｍの範囲である。
【0033】
他の例では、自己蛍光消光は、プラズモン又は消光ナノ構造によって達成される。フローセル基材に使用されるいくつかの樹脂マトリックス材料は、イメージング中に自己蛍光を示す。いくつかの例では、自己蛍光は、加熱中に表面に向かって移動する樹脂マトリックス材料中の光学活性成分（複数可）の結果であり得る。樹脂マトリックス材料からの自己蛍光は、配列決定中に個々の新生鎖に組み込まれ、光源で励起する際に蛍光を示すヌクレオチドの光学標識をイメージングする場合、バックグラウンドノイズを増加させ得る。バックグラウンドノイズが増加すると、シグナル・ノイズ比（signal to noise ratio：ＳＮＲ）が低下する可能性があるため、光源で励起した際の個々の光学標識からの蛍光及び対応する信号は、配列決定中に解明することがより困難になる。これらの例では、プラズモンナノ構造は、樹脂マトリックス材料内に分散されるか、又は樹脂マトリックス材料上に層として適用され、したがって、樹脂マトリックス材料内の光学活性成分（複数可）の「信号消光近接（signal quenching proximity）」内か、樹脂マトリックス材料の表面に吸着されるか、又は樹脂マトリックス材料の表面に近い溶液中にある。「信号消光近接」とは、プラズモンナノ構造及び樹脂マトリックス材料が、樹脂マトリックス材料からのバックグラウンド信号が消光されるには充分に互いに近い（例えば、いくつかのナノ構造及び光学活性成分（複数可）については４ｎｍ以下以内）ことを意味する。バックグラウンド信号を消光するとＳＮＲが増加し、したがって配列決定一次及び二次メトリックが改善される。一例として、バックグラウンドノイズが低いほど塩基をより正確に呼び出すことができ、これにより、より長い配列決定実行が可能になる。
【0034】
定義
本明細書に使用される用語は、別段の指定がない限り、関連する技術分野における通常の意味をとるものと理解されたい。本明細書で使用されるいくつかの用語及びそれらの意味は、以下に記載される。
本明細書に使用される用語は、別段の指定がない限り、関連する技術分野における通常の意味をとるものと理解されたい。本明細書で使用されるいくつかの用語及びそれらの意味は、以下に記載される。
【0035】
単数形「１つの（a）」、「１つの（an）」、及び「その（the）」は、文脈上明確に別段の指示がない限り、複数の指示対象を含む。
【0036】
含む（comprising）、含む（including）、含有する（containing）という用語、及びこれらの用語の様々な形態は、互いに同義であり、等しく広義であることを意味する。
【0037】
フローセル及び／又はフローセルの様々な構成要素を説明するために、本明細書では、上（top）、下（bottom）、下方（lower）、上方（upper）、隣接（adjacent）、上（on）などの用語が使用される。これらの方向を示す用語は、特定の配向を示すことを意味するものではなく、構成要素間の相対的な配向を指定するために使用されることを理解されたい。方向を示す用語の使用は、本明細書に開示される例を任意の特定の配向に制限すると解釈されるものではない。
【0038】
第１、第２などの用語はまた、特定の配向又は順序を示すことを意味するものではなく、むしろ１つの構成要素を別の構成要素から区別するために使用される。
【0039】
「アクリルアミドモノマー」は、構造
【0040】
【化1】
【0041】
【化2】
【0042】
【化3】
【0043】
「活性領域」という用語は、反応を行うことができる基材の領域を指す。フローセルの作製中、活性領域は、核酸鋳型増幅に関与し得るプライマーを付着させることができるヒドロゲルを含み得る。最終フローセルでは、活性領域は、プライマーが付着したヒドロゲルを含み得る。いくつかの例では、活性領域はまた、ヒドロゲル全体に分散したプラズモンナノ構造も含む。活性領域内のプライマーを使用して、配列決定される核酸鋳型を産生することができ、配列決定中、核酸鋳型は光学標識で標識されたヌクレオチドの取り込みを可能にする。光学標識は（光源による励起の際に）蛍光を示し、この蛍光は、ヒドロゲル全体に分散したプラズモンナノ構造によって増強され得る。
【0044】
「活性化」という用語は、本明細書に使用されるとき、ベース支持体の表面、又は多層構造の最外層、又は消光ナノ構造のフィルムに反応性基を産生するプロセスを指す。活性化はシラン化又はプラズマアッシングを用いて達成され得る。活性化は本明細書に開示される方法のいずれかで実行され得ることを理解されたい。活性化が行われる場合、ヒドロゲルを下にある支持体又は層若しくはフィルムに共有結合的に付着させるように、シラン化層又は－ＯＨ基（プラズマアッシングから）が存在する。
【0045】
本明細書に使用されるとき、「アルデヒド」とは、構造－ＣＨＯを含む官能基を含有する有機化合物であり、これは、水素、及び、アルキル又は他の側鎖などのＲ基にも結合した炭素原子を有するカルボニル中心（すなわち、酸素に二重結合した炭素）を含む。アルデヒドの一般構造は、
【0046】
【化4】
【0047】
本明細書に使用されるとき、「アルキル」は、完全に飽和している（すなわち、二重結合又は三重結合を含有しない）直鎖又は分岐鎖炭化水素鎖を指す。アルキル基は、１～２０個の炭素原子を有し得る。例示的なアルキル基としては、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、三級ブチル、ペンチル、ヘキシルなどが挙げられる。ある例として、表記「Ｃ１～４アルキル」は、アルキル鎖中に１～４個の炭素原子が存在すること、すなわち、アルキル鎖が、メチル、エチル、プロピル、イソ－プロピル、ｎ－ブチル、イソブチル、ｓｅｃ－ブチル、及びｔ－ブチルからなる群から選択されることを示す。
【0048】
本明細書に使用されるとき、「アルケニル」は、１つ以上の二重結合を含有する直鎖又は分岐鎖炭化水素鎖を指す。アルケニル基は、２～２０個の炭素原子を有し得る。例示的なアルケニル基としては、エテニル、プロペニル、ブテニル、ペンテニル、ヘキセニルなどが挙げられる。
【0049】
本明細書に使用されるとき、「アルキン」又は「アルキニル」は、１つ以上の三重結合を含有する直鎖又は分岐鎖炭化水素鎖を指す。アルキニル基は、２～２０個の炭素原子を有し得る。
【0050】
本明細書で使用するとき、「アリール」は、環骨格中に炭素のみを含有する芳香環又は環系（すなわち、２個の隣接する炭素原子を共有する２つ以上の縮合環）を指す。アリールが環系である場合、系内の全ての環は芳香環である。アリール基は、６～１８個の炭素原子を有し得る。アリール基の例としては、フェニル、ナフチル、アズレニル、及びアントラセニルが挙げられる。
【0051】
「アミノ」官能基は、－ＮＲａＲｂ基を指し、式中、Ｒａ及びＲｂは各々、本明細書で定義されるように、水素（例えば、
【0052】
【化5】
【0053】
本明細書に使用されるとき、「付着した（attached）」という用語は、２つのものが、直接的又は間接的のいずれかで、互いに、接合、締結、接着、接続、又は結合されている状態を指す。例えば、核酸は、共有結合又は非共有結合によってポリマーヒドロゲルに付着され得る。共有結合は、原子間の電子対の共有によって特徴付けられる。非共有結合は、電子対の共有を伴わない物理結合であり、例えば、水素結合、イオン結合、ファンデルワールス力、親水性相互作用、及び疎水性相互作用を挙げることができる。
【0054】
「アジド（azide）」又は「アジド（azido）」官能基は、－Ｎ３を指す。
【0055】
本明細書に使用されるとき、「炭素環」は、環系骨格に炭素原子のみを含有する非芳香族環式環又は環系を意味する。炭素環が環系である場合、２つ以上の環が、縮合、架橋、又はスピロ結合方式で一緒に接合され得る。炭素環は、環系内の少なくとも１つの環が芳香族ではないことを条件として、任意の飽和度を有し得る。したがって、炭素環には、シクロアルキル、シクロアルケニル、及びシクロアルキニルが含まれる。炭素環基は、３～２０個の炭素原子を有し得る。炭素環式環の例としては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘキセニル、２，３－ジヒドロ－インデン、ビシクロ［２．２．２］オクタニル、アダマンチル、及びスピロ［４．４］ノナニルが挙げられる。
【0056】
本明細書で使用される場合、本明細書で使用される「カルボン酸」又は「カルボキシル」という用語は、－ＣＯＯＨを指す。
【0057】
本明細書で使用される場合、「シクロアルキレン」は、２つの結合点を介して分子の残りに結合した完全飽和炭素環式環又は環系を意味する。
【0058】
本明細書に使用されるとき、「シクロアルケニル」又は「シクロアルケン」は、少なくとも１つの二重結合を有する炭素環式環又は環系を意味し、環系内の環は、いずれも芳香族ではない。例としては、シクロヘキセニル又はシクロヘキセン及びノルボルネニル又はノルボルネンが挙げられる。また、本明細書に使用されるとき、「ヘテロシクロアルケニル」又は「ヘテロシクロアルケン」とは、少なくとも１つの二重結合を有する、環骨格内に少なくとも１つのへテロ原子を有する炭素環又は環系を意味し、環系の中のいずれも環も、芳香族ではない。
【0059】
本明細書に使用されるとき、「シクロアルキニル」又は「シクロアルキン」は、少なくとも１つの三重結合を有する炭素環式環又は環系を意味し、環系内の環は、いずれも芳香族ではない。例は、シクロオクチンである。別の例は、ビクロノニンである。本明細書に使用されるとき、「ヘテロシクロアルキニル」又は「ヘテロシクロアルキン」は、少なくとも１つの三重結合を有する、環骨格内に少なくとも１つのへテロ原子を有する炭素環式環又は環系を意味し、環系内の環は、いずれも芳香族ではない。
【0060】
本明細書に使用されるとき、「くぼみ」という用語は、基材で定義された別個の凹状特徴を指し、基材の間隙領域（複数可）によって少なくとも部分的に取り囲まれた表面の開口部を有する。くぼみは、表面の開口部において、例として、円形、楕円形、正方形、多角形、星形（任意の数の頂点を持つ）などの、様々な形状をとることができる。表面と直交するように取られたくぼみの断面は、湾曲形状、正方形、多角形、双曲線、円錐、角のある形状などであることができる。例として、くぼみは、ウェル又は２つの相互接続されたウェルであり得る。
【0061】
「各」という用語は、項目の集合を参照して使用されるとき、集合内の個々の項目を識別することを意図しているが、必ずしも集合内の全ての項目を指すものではない。明示的な開示又は文脈がそうでないことを明確に指示する場合、例外が生じ得る。
【0062】
「エポキシ」という用語（グリシジル又はオキシラン基とも称される）は、本明細書で使用するとき、
【0063】
【化6】
【0064】
本明細書で使用される場合、「フローセル」という用語は、反応を行うことができるフローチャネル、試薬（複数可）をフローチャネルに送達するための入口、及びフローチャネルから試薬（試薬）を除去するための出口を有する容器を意味することを意図する。いくつかの例では、フローセルは、フローセル内で起こる反応の検出に対応する。例えば、フローセルは、アレイ、光学的標識分子などの光学的検出を可能にする１つ又は複数の透明な表面を含み得る。
【0065】
本明細書に使用されるとき、「フローチャネル」又は「チャネル」とは、液体サンプル、試薬などを選択的に受け取ることができる２つの結合された構成要素間に画定された領域であり得る。いくつかの例では、フローチャネルは２つの基材間に画定されてもよく、したがって、各基材の活性領域と流体連通してもよい。他の例では、フローチャネルは基材と蓋との間に画定されてもよく、したがって、１つの基材の活性領域と流体連通してもよい。
【0066】
本明細書で使用される場合、「ヘテロアリール」は、環骨格中に窒素、酸素、及び硫黄を含むがこれらに限定されない、１個以上のヘテロ原子、すなわち炭素以外の元素を含有する芳香環又は環系（すなわち、２個の隣接する原子を共有する２つ以上の縮合環）を指す。ヘテロアリールが環系である場合、系内の全ての環は芳香環である。ヘテロアリール基は、５～１８環員を有し得る。
【0067】
本明細書で使用するとき、「複素環」は、環骨格中に少なくとも１つのヘテロ原子を含有する非芳香族環又は環系を意味する。複素環どうしは、縮合、架橋、又はスピロ結合式に、一体に接合されてもよい。複素環は、環系中の少なくとも１つの環が芳香族ではないことを条件として、任意の飽和度を有してもよい。環系の中で、ヘテロ原子は、非芳香環又は芳香環のいずれかに存在してよい。複素環基は、３～２０環員（すなわち、炭素原子及びヘテロ原子を含む、環骨格を形成する原子の数）を有してよい。いくつかの例では、ヘテロ原子は、Ｏ、Ｎ、又はＳである。
【0068】
本明細書に使用されるとき、用語「ヒドラジン」又は「ヒドラジニル」とは、－ＮＨＮＨ２基を意味する。
【0069】
本明細書で使用される場合、本明細書で使用される「ヒドラゾン」又は「ヒドラゾニル」という用語は、
【0070】
【化7】
【0071】
本明細書に使用されるとき、「ヒドロキシ」又は「ヒドロキシル」は、－ＯＨ基を指す。
【0072】
本明細書に使用されるとき、「間隙領域」という用語は、例えば、くぼみを分離するか又はレーンを取り囲む基材の領域を指す。ある例として、間隙領域は、アレイの１つのくぼみを、アレイの別のくぼみから分離することができる。別の例として、間隙領域は、フローセルの一方のレーンをフローセルの別のレーンから分離することができる。互いに分離されたくぼみ及びレーンは、別個であってもよい、すなわち、互いとの物理的な接触が欠如していてもよい。多くの例では、間隙領域は、連続的であるが、くぼみ又はレーンは、例えば、それ以外が連続的である表面中に又は表面上に画定される複数のくぼみ又はレーンの場合のように、別個である。間隙領域によって提供される分離は、部分的又は完全な分離であり得る。間隙領域は、くぼみ又はレーンの表面材料とは異なる表面材料を有してもよい。例えば、くぼみ及びレーンは、その中にポリマーヒドロゲル及びプライマーを有することができ、間隙領域は、ポリマーヒドロゲル及びプライマーの両方を含まなくともよい。
【0073】
「ニトリルオキシド」は、本明細書で使用される場合、「ＲａＣ≡Ｎ＋Ｏ－」基を意味し、式中、Ｒａは本明細書で定義される。ニトリルオキシドの調製例としては、クロラミド－Ｔでの処理による、又は、イミドイルクロリド［ＲＣ（Ｃｌ）＝ＮＯＨ］上での塩基作用による、又は、ヒドロキシルアミンとアルデヒドとの反応によるアルドキシムからのｉｎ ｓｉｔｕ生成が挙げられる。
【0074】
「ニトロン」は、本明細書に使用されるとき、
【0075】
【化8】
【0076】
本明細書に使用されるとき、「ヌクレオチド」は、窒素含有複素環式塩基、糖、及び１つ以上のリン酸基を含む。ヌクレオチドは、核酸配列のモノマー単位である。ＲＮＡでは、糖はリボースであり、ＤＮＡでは、糖は、デオキシリボース、すなわち、リボースの２’位に存在するヒドロキシル基が欠如している糖である。窒素含有複素環式塩基（すなわち、核酸塩基）は、プリン塩基であってもピリミジン塩基であってもよい。プリン塩基としては、アデニン（Ａ）及びグアニン（Ｇ）、並びにそれらの修飾された誘導体又は類似体が挙げられる。ピリミジン塩基としては、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）、及びウラシル（Ｕ）、並びにそれらの修飾された誘導体又は類似体が挙げられる。デオキシリボースのＣ－１原子は、ピリミジンのＮ－１又はプリンのＮ－９に結合される。核酸類似体は、リン酸骨格、糖、又は核酸塩基のいずれかが変化していてもよい。核酸類似体の例としては、例えば、ペプチド核酸（peptide nucleic acid、ＰＮＡ）などのユニバーサル塩基又はリン酸－糖骨格類似体が挙げられる。「標識ヌクレオチド」は、少なくとも光学標識が付着したヌクレオチドである。光学標識の例としては、励起波長に応答して蛍光を発することができる任意の色素が挙げられる。
【0077】
「プラズモンナノ構造」は、プラズモン共鳴を示すことができる任意の独立した構造を含む。
【0078】
「ポリマーヒドロゲル」という用語は、液体及び気体に対して透過性である半硬質ポリマーを指す。ポリマーヒドロゲルは、液体（例えば、水）が吸収される場合に膨潤し、例えば乾燥によって液体が除去される場合に収縮することができる。ヒドロゲルは水を吸収し得るが、水溶性ではない。
【0079】
本明細書に使用されるとき、「プライマー」という用語は、一本鎖核酸配列（例えば、一本鎖ＤＮＡ）として定義される。本明細書において増幅プライマーと称されるいくつかのプライマーは、鋳型増幅及びクラスタ生成の開始点として機能する。本明細書において配列決定プライマーと称される他のプライマーは、ＤＮＡ合成の開始点として機能する。プライマーの５’末端は、ポリマーヒドロゲルの官能基でカップリング反応を可能にするように修飾されてもよい。プライマーの長さは、任意の数の塩基の長さであることができ、様々な非天然ヌクレオチドを含むことができる。一例では、配列決定プライマーは、１０～６０塩基、又は２０～４０塩基の範囲の短鎖である。
【0080】
「消光ナノ構造」とは、エネルギー伝達に起因して、光学活性成分の近接を消光する場合に光学活性成分によって放出される波長を最小にする、プラズモンナノ構造である。例えば、光学活性成分が、光学活性成分によって放出される波長でエネルギーを伝達する消光ナノ構造と直接接触している場合、蛍光は消光される。
【0081】
「チオール」官能基とは、－ＳＨを意味する。
【0082】
本明細書に使用されるとき、用語「テトラジン」及び「テトラジニル」とは、４つの窒素原子を含む６員のヘテロアリール基を意味する。テトラジンは、任意に置換され得る。
【0083】
本明細書に使用されるとき、「テトラゾール」とは、４つの窒素原子を含む５員の複素環基を意味する。テトラゾールは、任意に置換され得る。
【0084】
プラズモン又は消光ナノ構造
本明細書に記載されるように、プラズモンナノ構造は、プラズモン共鳴を示すことができる任意の独立した構造を含む。プラズモン共鳴とは、材料表面層中の電子が、ある入射角の入射光の光子によって励起され、材料表面に平行に伝播する現象である。プラズモンナノ構造の表面は、伝搬又は局在化表面プラズモンとのカップリングを通じて電磁界を強く閉じ込めることができる。この相互作用は局所電界の大きな増強に関連し、これは、励起及び発光速度を高め、蛍光エミッタの励起状態の寿命を減少させ得る。これは増幅された蛍光信号をもたらし、光退色に対する耐性もまた改善し得る。
本明細書に記載されるように、プラズモンナノ構造は、プラズモン共鳴を示すことができる任意の独立した構造を含む。プラズモン共鳴とは、材料表面層中の電子が、ある入射角の入射光の光子によって励起され、材料表面に平行に伝播する現象である。プラズモンナノ構造の表面は、伝搬又は局在化表面プラズモンとのカップリングを通じて電磁界を強く閉じ込めることができる。この相互作用は局所電界の大きな増強に関連し、これは、励起及び発光速度を高め、蛍光エミッタの励起状態の寿命を減少させ得る。これは増幅された蛍光信号をもたらし、光退色に対する耐性もまた改善し得る。
【0085】
本明細書に記載されるように、消光ナノ構造とは、エネルギー伝達に起因して、光学活性成分の近接を消光する場合に光学活性成分によって放出される波長を最小にする、ナノ構造である。このように、消光ナノ構造は、光学活性成分の近接を消光する場合、光学活性成分からのノイズの自己蛍光強度を減少させる。
【0086】
「プラズモン材料」と本明細書では称される、プラズモン共鳴が可能な任意の材料をプラズモンナノ構造として使用することができる。プラズモン共鳴が可能な特定のナノ構造体はまた、自己蛍光消光も可能である。いくつかの金属（例えば、金、銀、スズ、ロジウム、ルテニウム、パラジウム、オスミウム、イリジウム、白金、銅、アルミニウムなど）、ドープされた半金属（例えば、ドープシリコン）、直接バンドギャップ半導体（例えば、ガリウムヒ素）、及び金属複合材料は、プラズモン共鳴が可能である。金属複合材は上記の金属の２つ以上を含んでもよい。例として、２金属複合材は銀及び金を含み、３金属複合材は銀、金、及び白金を含む。本明細書に記載の例のいずれかでは、プラズモンナノ構造又は消光ナノ構造は、金ナノ構造、銀ナノ構造、スズナノ構造、ロジウムナノ構造、ルテニウムナノ構造、パラジウムナノ構造、オスミウムナノ構造、イリジウムナノ構造、白金ナノ構造、クロムナノ構造、銅ナノ構造、ガリウムヒ素ナノ構造、ドープシリコンナノ構造、アルミニウムナノ構造、マグネシウムナノ構造、銀及び金複合ナノ構造、並びにそれらの組合せからなる群から選択されてもよい。
【0087】
一例では、プラズモンナノ構造又は消光ナノ構造は、球形ナノ粒子である。別の例では、プラズモンナノ構造又は消光ナノ構造は、立方体、三角柱、棒状形状、小平板、ケージ状（例えば、多孔質シェルを有する非球形中空粒子）、チューブなどの非球形ナノ粒子である。更に別の例では、プラズモンナノ構造又は消光ナノ構造は不規則な形状のナノ粒子である。プラズモンナノ構造の形態は、本明細書に開示される例のいくつかにおける蛍光増強の大きさに影響を及ぼし得る。例えば、球形ナノ粒子、ナノプレートレット、及びナノチューブは、ナノチューブよりも蛍光増強を拡大し得る。
【0088】
プラズモンナノ構造又は消光ナノ構造は、各々、固体構造、中空構造、又はコアシェル構造を有し得る。コアシェル構造は、コアとして１つの材料を有し、コアを少なくとも部分的に封入するシェルとして別の材料を有する。いくつかの例では、２つの異なるプラズモン材料がコア及びシェルとして使用される。他の例では、コアはプラズモン材料であり、シェルは非プラズモン材料である。好適なシェル材料のいくつかの例としては、シリカ、アルミナ、チタニア、及び酸化タンタルなどの金属酸化物、ウシ血清アルブミンなどのタンパク質、並びにポリ（メチルメタクリレート）（ＰＭＭＡ）、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）、及びポリ（メチルアクリレート）（ＰＭＡ）などの配列決定中に使用される波長に対して透明な有機ポリマーが挙げられる。非プラズモン材料はコアのプラズモン共鳴を妨害しない。コアシェル構造の１つの具体例は、シリカコアによって少なくとも部分的にカプセル化された銀及び金複合コアを含む。
【0089】
プラズモンナノ構造又は消光ナノ構造の寸法は、その形状に応じて変化し得る。本明細書に開示される例では、プラズモンナノ構造又は消光ナノ構造の最大寸法（例えば、直径、長さ、中央値など）は、ナノスケールであり、したがって約１ｎｍ～１０００ｎｍ未満の範囲である。いくつかの例では、ナノ構造体は、１ｎｍ以上、２ｎｍ、３ｎｍ、４ｎｍ、５ｎｍ、６ｎｍ、７ｎｍ、８ｎｍ、９ｎｍ、１０ｎｍ、２０ｎｍ、３０ｎｍ、４０ｎｍ、５０ｎｍ、６０ｎｍ、７０ｎｍ、８０ｎｍ、９０ｎｍ以上、又は１００ｎｍ以上の直径を有するナノ粒子である。プラズモンナノ構造のサイズは、本明細書に開示される例のいくつかにおける蛍光増強の大きさに影響を及ぼし得る。より具体的には、異なるサイズを有するプラズモンナノ構造（複数可）は、異なる波長で共鳴する。蛍光増強を最大化するために、ナノ構造共鳴波長が考慮され得る。例えば、モデリングを使用して、所望の波長で共鳴するナノ構造を標的とするために、所与のサイズ及び形状のナノ構造の光学特性を予測することができる。一例では、球形ナノ粒子のモデリングは、マクスウェル方程式の方程式を用いて、ミー理論によって実行することができる。その蛍光が増強されたフルオロフォアの化学構造はまた、本明細書に開示される例のいくつかにおける増強の大きさに影響を及ぼし得る。
【0090】
いくつかの例では、プラズモンナノ構造は、それらがヒドロゲルに付着することができるように官能化される。
【0091】
一例では、プラズモンナノ構造は、ヒドロゲルの官能基に共有結合することができる官能基を含む。例として、プラズモンナノ構造は、ヒドロゲルの遊離アジド基に共有結合するアルキン（例えば、ジベンゾシクロオクチン）で官能化されているか、又は、プラズモンナノ構造は、ヒドロゲルのアルキン（例えば、ジアルキン）へと共有結合するアジドで官能化されているか、又は、プラズモンナノ構造は、ヒドロゲルの遊離アミン基へと共有結合するエポキシで官能化されている。プラズモンナノ構造とヒドロゲルとの間の他の共有結合もまた可能であって、求核置換反応によって得られるものを含む（例えば、求核基と脱離基との間）。いくつかの具体例としては、アルデヒド及びヒドラジン、又はアミン及び活性化カルボキシレート（例えば、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル）、又はチオール及びアルキル化試薬、又はホスホラミダイト及びチオエーテルを含むものが挙げられる。
【0092】
他の例では、プラズモンナノ構造は、ヒドロゲルに非共有結合することができる。例えば、プラズモンナノ構造体は、ヒドロゲルに付着している結合対の第２のメンバーと相互作用する結合対の第１のメンバーで官能化されている。結合対の例では、第１のメンバー及び第２のメンバーは、それぞれ、ＮｉＮＴＡ（ニッケル－ニトリロ三酢酸）リガンド及びヒスチジンタグ、又はストレプトアビジン若しくはアビジン及びビオチン、又はスパイタグ及びスパイキャッチャーを含む。
【0093】
プラズモン増強のための方法及びフローセル
図１Ａ～図１Ｅは、配列決定中に光学信号として読み取られる蛍光を増強することができるフローセル基材を作製するための方法の２つの異なる例を示す。一例では、図１Ａ～図１Ｃ及び図１Ｅが挙げられる。別の例では、図１Ａ、図１Ｂ、図１Ｄ、及び図１Ｅが挙げられる。これらの例の各々では、プラズモンナノ構造は、フローセル基材のヒドロゲルに組み込まれる。この方法は、概して、ヒドロゲルを基材の表面に適用することと、適用ヒドロゲルにプライマーをグラフトすることと、プライマーをグラフトする前又は後に、適用されたヒドロゲルへとプラズモンナノ構造を導入することと、を含む。
図１Ａ～図１Ｅは、配列決定中に光学信号として読み取られる蛍光を増強することができるフローセル基材を作製するための方法の２つの異なる例を示す。一例では、図１Ａ～図１Ｃ及び図１Ｅが挙げられる。別の例では、図１Ａ、図１Ｂ、図１Ｄ、及び図１Ｅが挙げられる。これらの例の各々では、プラズモンナノ構造は、フローセル基材のヒドロゲルに組み込まれる。この方法は、概して、ヒドロゲルを基材の表面に適用することと、適用ヒドロゲルにプライマーをグラフトすることと、プライマーをグラフトする前又は後に、適用されたヒドロゲルへとプラズモンナノ構造を導入することと、を含む。
【0094】
フローセル基材は、１つ以上の活性領域を支持する単層構造又は多層構造である。図１Ａにおいて、基材は単層構造１２である。好適な単層構造１２の例としては、エポキシシロキサン、ガラス、改質又は官能化ガラス、プラスチック（アクリル、ポリスチレン、及びスチレンと他の材料とのコポリマー、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリブチレン、ポリウレタン、ポリテトラフルオロエチレン（例えば、Ｃｈｅｍｏｕｒｓ製のＴＥＦＬＯＮ（登録商標））、環状オレフィン／シクロオレフィンポリマー（cyclo-olefin polymer：ＣＯＰ）（例えば、Ｚｅｏｎ製ＺＥＯＮＯＲ（登録商標））、ポリイミドなど）、ナイロン（ポリアミド）、セラミック／セラミック酸化物、シリカ、溶融シリカ、又はシリカ系材料、ケイ酸アルミニウム、ケイ素及び改質ケイ素（例えば、ホウ素ドープｐ＋ケイ素）、窒化ケイ素（Ｓｉ３Ｎ４）、酸化ケイ素（ＳｉＯ２）、五酸化タンタル（Ｔａ２Ｏ５）、又は他の酸化タンタル（ＴａＯｘ）、酸化ハフニウム（ＨｆＯ２）、炭素、金属、無機ガラスなどが挙げられる。
【0095】
他の例では、図１Ａ～図１Ｅに示す方法は、多層構造１２’（多層基材１２’とも称される）を利用することができる。多層構造体１２’の一例を図２Ｃに示す。多層構造１２’のいくつかの例は、光学イメージングに使用される光に対して透明である、五酸化タンタル又は別の酸化物のコーティング層を有するガラス又はケイ素を含む。多層基材１２’の他の例としては、シリコン・オン・インシュレータ（silicon-on-insulator：ＳＯＩ）基材を挙げることができる。図２Ｃを特に参照すると、多層構造１２’の他の例は、その上にパターン化材料１６を有する下部ベース支持体１４を含む。
【0096】
一例では、パターン化材料１６は、蒸着、エアロゾル印刷、又はインクジェット印刷を介して支持体１４に選択的に適用される無機酸化物であり得る。適切な無機酸化物の例としては、酸化タンタル（例えば、Ｔａ２Ｏ５）、酸化アルミニウム（例えば、Ａｌ２Ｏ３）、酸化ケイ素（例えば、ＳｉＯ２）、酸化ハフニウム（例えば、ＨｆＯ２）などが挙げられる。
【0097】
別の例として、パターン化材料１６は、支持体１４に適用され、次いでパターン化される樹脂マトリックス材料であり得る。好適な堆積技術としては、化学蒸着、ディップコーティング、ダンクコーティング、スピンコーティング、スプレーコーティング、液滴分配、超音波スプレーコーティング、ドクターブレードコーティング、エアロゾル印刷、スクリーン印刷、マイクロコンタクト印刷などを含む。好適なパターニング技術としては、フォトリソグラフィ、ナノインプリントリソグラフィ（nanoimprint lithography：ＮＩＬ）、スタンピング技術、エンボス技術、成形技術、マイクロエッチング技術、印刷技術などが挙げられる。好適な樹脂のいくつかの例としては、多面体オリゴマーシルセスキオキサンベースの樹脂、非多面体オリゴマーシルセスキオキサンエポキシ樹脂、ポリ（エチレングリコール）樹脂、ポリエーテル樹脂（例えば、開環エポキシ）、アクリル樹脂、アクリレート樹脂、メタクリレート樹脂、アモルファスフルオロポリマー樹脂（例えば、ＢｅｌｌｅｘからのＣＹＴＯＰ（登録商標））、及びそれらの組合せが挙げられる。
【0098】
本明細書に使用されるとき、「多面体オリゴマーシルセスキオキサン」（Ｈｙｂｒｉｄ Ｐｌａｓｔｉｃｓから商標名「ＰＯＳＳ」（登録商標）として市販）という用語は、シリカ（ＳｉＯ２）とシリコーン（Ｒ２ＳｉＯ）とのハイブリッド中間体（例えば、ＲＳｉＯ１．５）である化学組成物を指す。多面体オリゴマーシルセスキオキサンの例は、Ｋｅｈａｇｉａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ８６（２００９），ｐｐ．７７６－７７８に記載されているものであり得、これは、参照によりその全体が組み込まれる。一例では、組成物は、化学式［ＲＳｉＯ３／２］ｎを有する有機ケイ素化合物であり、Ｒ基は同じであっても異なってもよい。ＰＯＳＳの例示的なＲ基としては、エポキシ、アジド（azide）／アジド（azido）、チオール、ポリ（エチレングリコール）、ノルボルネン、テトラジン、アクリレート、及び／若しくはメタクリレート、又は更には、例えば、アルキル基、アリール基、アルコキシ基、及び／若しくはハロアルキル基が挙げられる。本明細書に開示される樹脂組成物は、モノマーユニットとして１つ以上の異なるケージ又はコア構造を含み得る。平均ケージ含有量は、合成期間に調整され得、及び／又は精製方法によって制御され得、モノマーユニットのケージサイズの分布は本明細書に開示される実施例で使用され得る。
【0099】
一例では、基材１２、１２’（単層であるか、多層である）は、円形かつ約２ｍｍ～約３００ｍｍの範囲にわたる直径を有してもよく、又は最大約１０フィート（～３メートル）の最大寸法を有する長方形のシート若しくはパネルを有し得る。一例では、基材１２、１２’は、約２００ｍｍ～約３００ｍｍの範囲にわたる直径を有するウェ－ハである。その後、ウェーハを角切りして個々のフローセル基材を形成することができる。別の例では、基材１２、１２’は、約０．１ｍｍ～約１０ｍｍの範囲の幅を有するダイである。例示的な寸法を示しているが、任意の好適な寸法を有する基材１２、１２’を使用してもよいことを理解すべきである。別の例として、３００ｍｍの丸いウェーハよりも大きな表面積を有する長方形の支持体であるパネルが使用され得る。その後、パネルを角切りして個々のフローセルを形成することができる。
【0100】
図１Ａでは、基材は、平坦な表面を有し、任意の特定の構造を有しない単層構造１２として示されている。しかしながら、基材１２又は１２’は、活性領域（複数可）が形成されるいくつかの構造を含むことを理解されたい。いくつかの例では、基材１２又は１２’の構造は、活性領域が形成される単一レーン１８（図２Ｂ参照）を含む。これらの例では、単一レーン１８は、間隙領域２２によって取り囲まれている。他の例では、基材１２、１２’の構造は、活性領域が形成されるくぼみ２０を含む（図２Ｃを参照されたい）。これらの例では、くぼみ２０は間隙領域２２によって分離されている。単一レーン１８又はくぼみ２０は、単層基材１２内に形成されてもよく、又は多層構造１２’の最外層に形成されてもよい。単一レーン１８又はくぼみ２０は、基材１２、１２’の材料（複数可）に応じて、エッチング、インプリント、ナノインプリントリソグラフィ、又は別の好適な技術によって画定することができる。基材１２、１２’の構造は、図２Ａ、図２Ｂ、及び図２Ｃを参照してより詳細に説明される。
【0101】
図１Ｂに示すように、本方法の各例は、ヒドロゲル２４を基材１２、１２’の表面２６に適用することを含む。基材１２、１２’の表面２６は、単一レーン１８又はくぼみ２０、及び間隙領域２２を含んでもよい。
【0102】
ヒドロゲル２４は、液体が吸収される場合に膨潤し、例えば乾燥によって液体が除去される場合に収縮することができる任意のゲル材料であり得る。一例では、ヒドロゲル２４には、アクリルアミドコポリマー、例えば、ポリ（Ｎ－（５－アジドアセトアミジルペンチル）アクリルアミド－コ－アクリルアミド、ＰＡＺＡＭが含まれる。ＰＡＺＡＭ及び他のいくつかの形態のアクリルアミドコポリマーは、次の構造（Ｉ）で表され、
【0103】
【化9】
ＲＡは、アジド、任意選択で置換アミノ、任意選択で置換アルケニル、任意選択で置換アルキン、ハロゲン、任意選択で置換ヒドラゾン、任意選択で置換ヒドラジン、カルボキシル、ヒドロキシ、任意選択で置換テトラゾール、任意選択で置換テトラジン、ニトリルオキシド、ニトロン、硫酸塩、及びチオールからなる群から選択され、
ＲＢはＨ又は任意選択で置換アルキルであり、
ＲＣ、ＲＤ、及びＲＥはそれぞれ、Ｈ及び任意選択で置換アルキルからなる群から独立して選択され、
－（ＣＨ２）ｐ－のそれぞれは、任意選択で置き換えられ得、
ｐは１から５０の範囲の整数であり、
ｎは１から５０，０００の範囲の整数であり、及び
ｍは、１から１００，０００の範囲の整数である）。
【0104】
当業者は、構造（Ｉ）において繰り返される特徴「ｎ」及び「ｍ」の配置が代表的なものであり、モノマーサブユニットがポリマー構造（例えば、ランダム、ブロック、パターン化、又はそれらの組合せ）中に任意の順序で存在し得ることを認識する。
【0105】
ＰＡＺＡＭ及び他の形態のアクリルアミドコポリマーの分子量は、約５ｋＤａから約１５００ｋＤａ又は約１０ｋＤａから約１０００ｋＤａの範囲であり得るか、あるいは特定の例では、約３１２ｋＤａであり得る。
【0106】
いくつかの例では、ＰＡＺＡＭ及び他の形態のアクリルアミドコポリマーは線状ポリマーである。他のいくつかの例では、ＰＡＺＡＭ及び他の形態のアクリルアミドコポリマーは、軽度に架橋されたポリマーである。
【0107】
他の例では、ヒドロゲル２４は、構造（Ｉ）の変形であってもよい。一例では、アクリルアミドユニットは、Ｎ，Ｎジメチルアクリルアミド（
【0108】
【化10】
【0109】
【化11】
【0110】
【化12】
【0111】
ヒドロゲル２４の別の例として、構造（Ｉ）における繰り返す特徴「ｎ」は、構造（ＩＩ）を有する複素環式アジド基を含むモノマーで置き換えられ得、
【0112】
【化13】
【0113】
本明細書で前述したヒドロゲル２４の例では、ＲＡ、ＮＨ２、及び／又はＮ３のいずれかは、プラズモンナノ構造１０の表面での官能化に応じて、プラズモンナノ構造１０（図１Ｄを参照）に付着し得る。ＲＡ及び／又はＮ３基のいくつかは、代替的にオリゴヌクレオチドプライマー２８Ａ、２８Ｂ（図１Ｃを参照）へと付着し得る。加えて、プラズモンナノ構造１０を付着させるための結合対メンバー又は別の官能基は、例えば、重合において、又はヒドロゲル２４形成後のグラフトプロセスにおいて、又は化学修飾反応において使用されるモノマーの一部として、ヒドロゲル２４に導入されてもよい。
【0114】
オリゴヌクレオチドプライマー２８Ａ、２８Ｂをグラフトし、プラズモンナノ構造１０を付着させるように官能化されている限り、他のヒドロゲル２４を使用してもよいことを理解されたい。好適なヒドロゲル２４のいくつかの例としては、官能化ポリシラン、例えばノルボルネンシラン、アジドシラン、アルキン官能化シラン、アミン官能化シラン、マレイミドシラン、又は所望のプラズモンナノ構造１０及びオリゴヌクレオチドプライマー２８Ａ、２８Ｂを付着することができる官能基を有する任意の他のポリシランが挙げられる。好適なヒドロゲル２４の他の例としては、アガロースなどのコロイド構造、又はゼラチンなどのポリマーメッシュ構造、又はポリアクリルアミドポリマー及びコポリマー、シランフリーアクリルアミド（ＳＦＡ）、又はアジド分解バージョンのＳＦＡなどの架橋ポリマー構造を有するものが挙げられる。適切なポリアクリルアミドポリマーの例は、アクリルアミドとアクリル酸若しくはビニル基を含むアクリル酸とから、又は［２＋２］光付加環化反応を形成するモノマーから合成され得る。好適なポリマーヒドロゲルの更に他の例としては、アクリルアミドとアクリレートとの混合コポリマーが挙げられる。本明細書に開示される実施例では、星状ポリマー、星型又は星型ブロックポリマー、デンドリマーなどを含む分岐ポリマーなど、アクリルモノマー（例えば、アクリルアミド、アクリレートなど）を含む様々なポリマー構造は利用され得る。例えば、モノマー（例えば、アクリルアミド、触媒を含有するアクリルアミドなど）は、ランダムに又はブロックで、星型状ポリマーの分岐（アーム）に組み込まれてもよい。
【0115】
ヒドロゲル２４は任意の好適な共重合プロセスを用いて形成することができる。ヒドロゲル２４を表面２６に導入するために、ヒドロゲル２４の混合物を産生し、次いで基材１２又は１２’に適用することができる。一例では、ヒドロゲル２４は、混合物（例えば、水との混合物、又はエタノールと水との混合物）中に存在し得る。次いで、混合物は、スピンコーティング、又は浸漬若しくはディップコーティング、又は陽圧若しくは陰圧下での材料の流れ、又は別の好適な技術を使用して、基材表面２６に適用することができる。これらの種類の技術は、基材１２又は１２’上に（例えば、レーン１８内に、くぼみ２０内に、及び間隙領域２２上に）全面を覆うようにヒドロゲル２４を堆積させる。他の選択的堆積技術（例えば、マスク、制御された印刷技術などを伴う）は、レーン１８又はくぼみ２０内でヒドロゲル２４を特異的に堆積させ、間隙領域２２上では堆積させないように使用されてもよい。
【0116】
ポリマーヒドロゲル２４の化学的性質に応じて、適用された混合物を硬化プロセスに曝露してもよい。一例では、硬化は、室温（例えば、約２５℃）～約９５℃の範囲の温度で、約１ミリ秒～約数日の範囲の時間にわたって行うことができる。
【0117】
ヒドロゲル２４の基材１２又は１２’への付着は、共有結合によるものであり得る。いくつかの例では、下にある基材１２又は１２’は、例えばシラン化又はプラズマアッシングによって最初に活性化されてもよい。一例では、シラン化は、ノルボルネンシランを基材１２又は１２’表面に導入することを含む。ヒドロゲル２４の基材１２又は１２’への共有結合は、様々な使用中にフローセルの寿命を通して活性領域内のプライマー２８Ａ、２８Ｂ及びプラズモンナノ粒子１０を維持するのに役立つ。
【0118】
ヒドロゲル２４が、レーン１８内、又はくぼみ２０内、及び間隙領域２２上に堆積される場合、本方法は、プライマー２８Ａ、２８Ｂをグラフトする前、及びプラズモンナノ粒子１０を導入する前に、間隙領域２２からヒドロゲル２４を除去することを更に含み得る。ヒドロゲル２４の除去は研磨プロセスを含み得る。研磨プロセスは化学スラリーを用いて実行してもよく、この化学スラリーは、間隙領域２２からポリマーヒドロゲル２４を、それらの領域２２の下にある基材に有害な影響を与えることなく除去することができる一方で、レーン１８内又はくぼみ２０内のポリマーヒドロゲル２４を少なくとも実質的に無傷のままにすることができる。化学スラリーとしては、例えば、研磨粒子、緩衝剤、キレート剤、界面活性剤、及び／又は分散剤を挙げることができる。あるいは、研磨は、研磨剤粒子を含まない溶液により行ってよい。化学的スラリー又は溶液は、化学機械研磨システムで使用されて、間隙領域２２の表面を研磨することができる。一例として、研磨ヘッドは、Ｓｔｒａｓｂａｕｇｈ ＶｉＰＲＲ ＩＩ研磨ヘッドであってよい。
【0119】
本方法の一例は図１Ｃに進み、ここで、プラズモンナノ粒子１０の導入前にプライマー２８Ａ、２８Ｂがヒドロゲル２４にグラフトされる。グラフトは、フロースルー堆積（例えば、一時的に結合された蓋を使用する）、ダンクコーティング、スプレーコーティング、液滴分配、又はプライマー２８Ａ、２８Ｂをポリマーヒドロゲル２４に付着させる別の好適な方法を含み得る。これらの例示的な技術の各々は、プライマー２８Ａ、２８Ｂ、水、緩衝液、及び触媒を含み得る、プライマー溶液又は混合物を利用し得る。グラフト法のいずれかを用いると、プライマー２８Ａ、２８Ｂは、ポリマーヒドロゲル２４の反応性基と反応し、周囲の基材１２、１２’（例えば、間隙領域２２）に対する親和性を有しない。したがって、プライマー２８Ａ、２８Ｂは、ポリマーヒドロゲル２４へと選択的にグラフトする。
【0120】
一例では、プライマー２８Ａ、２８Ｂは、プライマー２８Ａ、２８Ｂの５’末端又はその近傍における一点共有結合性付着によって、ポリマーヒドロゲル２４に固定化され得る。この付着により、（ｉ）プライマー２８Ａ、２８Ｂのアダプター特異的部分は、その同族の配列決定可能な核酸断片に自由にアニールすることができ、（ｉｉ）３’ヒドロキシル基は、自由にプライマーを伸長することができる。この目的のために、任意の好適な共有結合を使用することができる。使用できる末端プライマーの例としては、アルキン末端プライマー（例えば、ポリマーヒドロゲル２４のアジド表面部分に付着し得る）、又はアジド末端プライマー（例えば、ポリマーヒドロゲル２４のアルキン表面部分に付着し得る）が挙げられる。
【0121】
好適なプライマー２８Ａ、２８Ｂの具体例としては、ＨＩＳＥＱ（商標）、ＨＩＳＥＱＸ（商標）、ＭＩＳＥＱ（商標）、ＭＩＳＥＱＤＸ（商標）、ＭＩＮＩＳＥＱ（商標）、ＮＥＸＴＳＥＱ（商標）、ＮＥＸＴＳＥＱＤＸ（商標）、ＮＯＶＡＳＥＱ（商標）、ＧＥＮＯＭＥ ＡＮＡＬＹＺＥＲ（商標）、ＩＳＥＱ（商標）、及び他の機器プラットフォームでの配列決定のためにＩｌｌｕｍｉｎａ Ｉｎｃ．により販売されている市販のフローセルの表面上で使用されるＰ５及びＰ７プライマーが挙げられる。
【0122】
【0123】
プラズモンナノ粒子１０を水中に分散させ、次いで、基材１２、１２’（この例では、ヒドロゲル２４及びその上のプライマー２８Ａ、２８Ｂ）を分散液で洗い流してもよい。フラッシングは、フロースルー堆積（例えば、一時的に結合された蓋を使用する）、ダンクコーティング、液滴分配、又はプラズモンナノ粒子１０をポリマーヒドロゲル２４へと導入する別の好適な方法を含み得る。プラズモンナノ粒子１０がヒドロゲル２４に付着することができるように、ナノ粒子分散液を、基材１２、１２’上でインキュベートしてもよい。インキュベーション時間及び付着機構は、プラズモンナノ粒子１０及びヒドロゲル２４の官能化、プラズモンナノ粒子１０及びヒドロゲル２４の濃度などに依存する。一例では、インキュベーション時間は２分間～１２時間の範囲であり得る。いくつかの例では、室温（例えば、約２５℃）でのインキュベーションは、約５分間～約１時間、例えば約５分間～約３０分間、又は約１分間～約１０分間などの範囲である。
【0124】
【0125】
図１Ｂに戻って参照すると、ヒドロゲル２４が適用された後、本方法の別の例は図１Ｄに進み、ここで、プラズモンナノ粒子１０は、プライマー２８Ａ、２８Ｂがグラフトされる前にヒドロゲル２４へと導入される。プラズモンナノ粒子１０を水中に分散させ、次いで、基材１２、１２’（この例では、その上のヒドロゲル２４）を本明細書に記載のように分散液で洗い流してもよい。
【0126】
プラズモンナノ粒子１０が（図１Ｄに示すように）導入された後、本方法のこの例は、そこに付着したプラズモンナノ粒子１０を有するヒドロゲル２４へのプライマー２８Ａ、２８Ｂのグラフトに進む。これを図１Ｅに示す。プライマー２８Ａ、２８Ｂは、図１Ｃを参照して説明したようにグラフトされ得る。
【0127】
【0128】
図１Ｅに示す構造はフローセルの活性領域の一例を示す。活性領域のこの例は、プライマー２８Ａ、２８Ｂ、及びそれらに付着したプラズモンナノ粒子１０を伴うヒドロゲル２４を含む。上述のように、活性領域は、フローセルの単一レーン１８内に位置してもよく（図２Ｂを参照）、又はフローセルのくぼみ２０内に位置してもよい（図２Ｃを参照）。これらフローセルの各例について説明する。
【0129】
フローセル３０の例の上面図が図２Ａに示される。図２Ｂを参照して説明するように、フローセル３０Ａのいくつかの例は２つの対向する基材１２及び１２Ａを含み、その各々は、配列決定が行われ得る活性領域３２及び３２Ａを支持するレーン１８、１８Ａを含む。これらの例の各々では、フローチャネル３４は、基材１２と基材１２Ａとの間に画定される。図２Ｃを参照して説明するように、フローセル３０Ｂの他の例は２つの対向する基材１２’及び１２’’を含み、その各々は、配列決定が行われ得る活性領域３２’及び３２’’を支持するくぼみ２０、２０’を含む。これらの例の各々では、フローチャネル３４は、基材１２’と基材１２’’との間に画定される。他の例では、フローセル３０は、一方の基材１２又は１２’（活性領域（複数可）３２又は３２’を支持）と、基材１２又は１２’に取り付けられた蓋とを含む。これらの例では、フローチャネル３４は、基材１２又は１２’と蓋との間に画定される。
【0130】
図２Ａに示す例では、フローセル３０は、複数のフローチャネル３４を含む。８つのチャネル３４が示されるが、任意の数のチャネル３４がフローセル３０（例えば、単一のチャネル３４、４つのチャネル３４など）に含まれ得ることを理解すべきである。各フローチャネル３４は、任意の特定のフローチャネル３４に導入された流体（複数可）が任意の隣接するフローチャネル３４に流れ込まないように、フローセル３０内でフローチャネル３４ごとに単離されていてもよい。増幅、クラスタリング、配列決定、デブロッキングなどのための試薬は、それぞれ、入力ポート及び出力ポートを介してフローチャネル（複数可）３４に導入及びそこから除去することができる。
【0131】
フローチャネル３４の一部分は、基材１２及び１２Ａ又は１２’及び１２’’の材料（複数可）に部分的に依存する任意の好適な技術を用いて、基材１２及び１２Ａ又は１２’及び１２’’内に画定され得る。一例では、フローチャネル３４の一部分が各ガラス基材（例えば、１２及び１２Ａ）へとエッチングされる。別の例では、フローチャネル３４の一部分は、フォトリソグラフィ、ナノインプリントリソグラフィなどを用いて、多層基材１２’の材料１６へとパターン化され得る。別個の材料３６は基材１２又は１２’に適用されることで、別個の材料３６がフローチャネル３４の壁の少なくとも一部分を画定してもよい。
【0132】
一例では、フローチャネル３４は、丸みを帯びた端部を有する実質的に長方形の構成を有する。フローチャネル３４の長さ及び幅は、それぞれ、基材１２又は１２’の長さ及び幅よりも小さくてもよく、その結果、フローチャネル３４を取り囲む基材表面の一部分は別の基材１２Ａ若しくは１２’’又は蓋への付着に利用可能である。いくつかの例では、各フローチャネル３４の幅は、少なくとも約１ｍｍ、少なくとも約２．５ｍｍ、少なくとも約５ｍｍ、少なくとも約７ｍｍ、少なくとも約１０ｍｍ、又はそれ超であり得る。いくつかの例では、各フローチャネル３４の長さは、少なくとも約１０ｍｍ、少なくとも約２５ｍｍ、少なくとも約５０ｍｍ、少なくとも約１００ｍｍ、又はそれ超であり得る。各フローチャネル３４の幅及び／又は長さは、上で指定した値よりも大きくてもよく、それよりも小さくてもよく、又はそれらの間であってもよい。別の例では、フローチャネル３４は正方形（例えば、１０ｍｍ×１０ｍｍ）である。
【0133】
各フローチャネル３４の深さは、例えば、マイクロコンタクト、エアロゾル、又はインクジェット印刷を使用して、流路壁を少なくとも部分的に画定する別個の材料３６を堆積する場合、複数の単層の厚さまで小さくすることができる。他の例では、各フローチャネル３４の深さは、約１μｍ、約１０μｍ、約５０μｍ、約１００μｍ、又はそれ以上であってもよい。一例では、深さは、約１０μｍから約１００μｍの範囲であり得る。別の例では、深さは約５μｍ以下である。各フローチャネル３４の深さはまた、上で指定された値よりも大きいか、小さいか、又はそれらの間であり得ることを理解すべきである。フローチャネル３４の深さはまた、例えば、くぼみ２０が含まれる場合、フローセル３０Ｂの長さ及び幅に沿って変化してもよい。
【0134】
図２Ｂは、レーン１８、１８Ａを含むフローセル３０Ａの断面図を示す。この例では、フローチャネル３４の一部は、単層基材１２、１２Ａの各々に画定される。例えば、活性領域３２、３２Ａの構成要素によって占有されていないレーン１８、１８Ａ内の空間は、フローチャネル３４の一部であると見なされ得る。
【0135】
それぞれの基材１２、１２Ａのレーン１８、１８Ａ内の活性領域３２、３２Ａは、表面２６又は２６Ａ上のヒドロゲル２４又は２４Ａ、ヒドロゲル２４又は２４Ａに付着したプライマー２８Ａ、２８Ｂ、及びヒドロゲル２４又は２４Ａに付着したプラズモンナノ粒子１０、１０Ａを含む。これらの活性領域３２，３２Ａの各々は、図１Ａ～図１Ｅを参照して説明した方法のいずれかに従って基材１２、１２Ａ上に調製されてもよく、その後、基材１２、１２Ａが互いに取り付けられて、フローセル３０Ａの一例を形成し得る。接着剤、結合を助ける放射線吸収材料などの任意の好適な別個の材料３６を使用して、基材１２、１２Ａを一緒に結合してもよい。
【0136】
図２Ｃは、多層基材１２’、１２’’のパターン化材料１６、１６’に画定されたくぼみ２０、２０’を含むフローセル３０Ｂの断面図を示す。図２Ｃに示すように、パターン化材料１６、１６’は、それぞれそこに画定されたくぼみ２０、２０’、及び隣接するくぼみ２０、２０’を分離する間隙領域２２、２２’を含む。
【0137】
規則的、繰り返し、及び非規則的なパターンを含む、くぼみ２０、２０’の多くの異なるレイアウトが想定され得る。一例では、くぼみ２０、２０’は、密なパッキング及び改善された密度のために六角形グリッドに配置される。他のレイアウトは、例えば、直線的な（長方形）レイアウト、三角形のレイアウトなどを含み得る。いくつかの例では、レイアウト又はパターンは、行及び列をなしているくぼみ２０、２０’のｘ－ｙ形式であり得る。他のいくつかの例では、レイアウト又はパターンは、くぼみ２０、２０’及び／又は間隙領域２２、２２’の繰り返し配置であり得る。更に他の例では、レイアウト又はパターンは、くぼみ２０、２０’及び／又は間隙領域２２、２２’のランダムな配置であり得る。パターンは、ストライプ、渦巻き、線、三角形、長方形、円、円弧、格子柄、対角線、矢印、及び／又は正方形を含んでもよい。
【0138】
くぼみ２０、２０’のレイアウト又はパターンは、画定された領域におけるくぼみ２０、２０’の密度（例えば、くぼみ２０、２０’の数）により特徴付けられ得る。例えば、くぼみ２０、２０’は、およそ２００万／ｍｍ２の密度で存在し得る。例えば、１ｍｍ２あたり約１００、１ｍｍ２あたり約１，０００、１ｍｍ２あたり約１０万、１ｍｍ２あたり約１００万、１ｍｍ２あたり約２００万、１ｍｍ２あたり約５００万、１ｍｍ２あたり約１０００万、１ｍｍ２あたり約５０００万、又はそれ以下の密度を含む、異なる密度に調整され得る。パターン化材料１６、１６’のくぼみ２０、２０’の密度は、上記の範囲から選択された低い値の１つと高い値の１つとの間にあり得ることを更に理解すべきである。例として、高密度アレイは、約１００ｎｍ未満で分離されたくぼみ２０、２０’を有するものとして特徴付けられ得、中密度アレイは、約４００ｎｍ～約１μｍで分離されたくぼみ２０、２０’を有するものとして特徴付けられ得、低密度アレイは、約１μｍを超えて分離されたくぼみ２０、２０’を有するものとして特徴付けられ得る。密度の例が提供されるが、任意の適切な密度を使用できることを理解すべきである。くぼみ２０、２０’の密度は、くぼみ２０、２０’の深さに部分的に依存し得る。いくつかの例では、くぼみ２０、２０’間の間隔が、本明細書に記載された例よりも更に大きいことが望ましい場合がある。
【0139】
くぼみ２０、２０’のレイアウト又はパターンはまた、又は代替的に、平均ピッチ、又はくぼみ２０、２０’の中心から隣接するくぼみ２０、２０’の中心までの間隔（中心間の間隔）、又は１つのくぼみ２０、２０’の左端から隣接するくぼみ２０、２０’の右端までの間隔（エッジ間の間隔）に関して特徴付けられ得る。パターンは、平均ピッチ周辺の変動係数が小さくなるように規則的である場合もあれば、パターンが不規則である場合もあり、その場合、変動係数は比較的大きくなる可能性がある。いずれの場合も、平均ピッチは、例えば、おおよそ約５０ｎｍ、約０．１μｍ、約０．５μｍ、約１μｍ、約５μｍ、約１０μｍ、又は約１００μｍであってもよい。くぼみ２０、２０’の特定のパターンの平均ピッチは、上記の範囲から選択された低い値の１つと高い値の１つとの間であり得る。一例では、くぼみ２０、２０’は、約１．５μｍのピッチ（中心間の間隔）を有する。平均ピッチ値の例が提供されるが、他の平均ピッチ値も使用され得ることを理解すべきである。
【0140】
くぼみ２０、２０’の各々のサイズは、その体積、開口面積、深さ、及び／又は直径によって特徴付けられ得る。
【0141】
くぼみ２０、２０’の各々は、フローセル３０Ｂに導入される少なくともいくらかの流体を隔離する（confining）ことができる任意の体積を有し得る。最小又は最大の体積は、例えば、フローセル３０Ｂの下流での使用に期待されるスループット（例えば、多重度）、解像度、ヌクレオチド、又は分析物の反応性に対応するように選択され得る。例えば、体積は、少なくとも約１×１０－３μｍ３、少なくとも約１×１０－２μｍ３、少なくとも約０．１μｍ３、少なくとも約１μｍ３、少なくとも約１０μｍ３、少なくとも約１００μｍ３、又はそれ以上であり得る。代替的又は更に、体積は、最大で約１×１０４μｍ３、最大で約１×１０３μｍ３、最大で約１００μｍ３、最大で約１０μｍ３、最大で約１μｍ３、最大で約０．１μｍ３、又はそれ以下であり得る。
【0142】
各くぼみの開口部が占有する面積は、上記の体積と同様の基準に基づいて選択され得る。例えば、各くぼみ開口部の面積は、少なくとも約１×１０－３μｍ２、少なくとも約１×１０－２μｍ２、少なくとも約０．１μｍ２、少なくとも約１μｍ２、少なくとも約１０μｍ２、少なくとも約１００μｍ２、又はそれ以上であり得る。代替的又は更に、面積は、最大で約１×１０３μｍ２、最大で約１００μｍ２、最大で約１０μｍ２、最大で約１μｍ２、最大で約０．１μｍ２、最大で約１×１０－２μｍ２、又はそれ以下であり得る。各くぼみの開口部が占有する面積は、上記の値よりも大きい、小さい、又はそれらの間であり得る。
【0143】
くぼみ２０、２０’の各々の深さは、ポリマーヒドロゲル２４、２４Ａの一部を収容するのに充分な大きさであり得る。一例では、深さは、少なくとも約０．１μｍ、少なくとも約０．５μｍ、少なくとも約１μｍ、少なくとも約１０μｍ、少なくとも約１００μｍ、又はそれ以上であり得る。代替的又は更に、深さは、最大で約１×１０３μｍ、最大で約１００μｍ、最大で約１０μｍ、又はそれ以下であり得る。いくつかの例では、深さは約０．４μｍである。各くぼみ２０、２０’の深さは、上記の値よりも大きい、小さい、又はそれらの間であり得る。
【0144】
いくつかの例では、各くぼみ２０、２０’の直径又は長さ及び幅は、少なくとも約５０ｎｍ、少なくとも約０．１μｍ、少なくとも約０．５μｍ、少なくとも約１μｍ、少なくとも約１０μｍ、少なくとも約１００μｍ、又はそれ以上であり得る。代替的又は更に、直径又は長さ及び幅は、最大で約１×１０３μｍ、最大で約１００μｍ、最大で約１０μｍ、最大で約１μｍ、最大で約０．５μｍ、最大で約０．１μｍ、又はそれ以下（例えば、約５０ｎｍ）であり得る。いくつかの例では、直径又は長さ及び幅は約０．４μｍである。各くぼみ２０、２０’の直径又は長さ及び幅は、上記の値よりも大きい、小さい、又はそれらの間であり得る。
【0145】
図２Ｃに示す例では、フローチャネル３４の一部は、多層基材１２’、１２’’の各々に画定される。例えば、活性領域３２’、３２’’の構成要素によって占有されていないくぼみ２０、２０’内の空間は、フローチャネル３４の一部であると見なされ得る。
【0146】
それぞれの基材１２’、１２’’の活性領域３２’、３２’’は、各くぼみ２０、２０’の表面上のヒドロゲル２４又は２４’、ヒドロゲル２４又は２４’に付着したプライマー２８Ａ、２８Ｂ、及びヒドロゲル２４又は２４’に付着したプラズモンナノ粒子１０、１０’を含む。これらの活性領域３２’、３２’’の各々は、図１Ａ～図１Ｅを参照して説明した方法のいずれかに従って基材１２’、１２’’上に調製することができ、次いで、基材１２’、１２’’を互いに取り付けてフローセル３０Ｂの別の例を形成してもよい。接着剤、結合を助ける放射線吸収材料などの任意の好適な別個の材料３６を使用して、基材１２’、１２’’を一緒に結合してもよい。
【0147】
フローセル３０Ａ又は３０Ｂの例が配列決定に使用される場合、配列決定される鋳型鎖（図示せず）は、ヒドロゲル２４、２４Ａに付着したプライマー２８Ａ、２８Ｂを用いて活性領域３２、３２Ａ又は３２’、３２’’に形成され得る。鋳型鎖の形成の最初に、ライブラリ鋳型を、任意の核酸サンプル（例えば、ＤＮＡサンプル又はＲＮＡサンプル）から調製することができる。ＤＮＡ核酸サンプルは、同様にサイズ決定された（例えば、１０００ｂｐ未満の）一本鎖ＤＮＡ断片に断片化されてもよい。ＲＮＡ核酸サンプルは、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を合成するために使用することができ、ｃＤＮＡは、同様にサイズ決定された（例えば、１０００ｂｐ未満の）一本鎖ｃＤＮＡ断片に断片化されてもよい。調製中に、アダプターは断片のいずれかの末端に追加され得る。低減サイクル増幅を通して、活性領域３２、３２Ａ又は３２’、３２’’におけるプライマー２８Ａ、２８Ｂに相補的である配列決定プライマー結合部位、インデックス、及び領域などの様々なモチーフが、アダプターに導入され得る。いくつかの例では、単一の核酸サンプルからの断片は、断片に追加された同じアダプターを有する。最終的なライブラリ鋳型は、ＤＮＡ又はｃＤＮＡ断片と、両端にアダプターとを含む。ＤＮＡ又はｃＤＮＡ断片は、シーケンシングしようとする最終ライブラリ鋳型の一部分を表す。
【0148】
複数のライブラリ鋳型がフローセル３０Ａ、３０Ｂに導入されてもよい。複数のライブラリ鋳型は、例えば、活性領域３２、３２Ａ又は３２’、３２’’内に固定化された２種類のプライマー２８Ａ、２８Ｂのうち１つにハイブリダイズする。
【0149】
次に、クラスタ生成が実行され得る。クラスタ生成の１つの例では、ライブラリ鋳型は、高忠実度ＤＮＡポリメラーゼ（high-fidelity DNA polymerase）を使用して３’伸長によって、ハイブリダイズされたプライマーからコピーされる。元のライブラリ鋳型は変性され、活性領域３２、３２Ａ又は３２’、３２’’に固定化されたコピーが残る。固定化されたコピーを増幅するために、等温ブリッジ増幅又は他の何らかの形態の増幅が使用され得る。例えば、コピーされた鋳型はループオーバーして隣接する相補的なプライマーにハイブリダイズし、ポリメラーゼはコピーされた鋳型をコピーして二本鎖ブリッジ構造を形成し、当該構造は変性して２本の一本鎖を形成する。これらの２本の鎖は、ループオーバーして隣接する相補的なプライマーにハイブリダイズし、再度伸長して、２つの新しい二本鎖ループを形成する。このプロセスを、等温変性及び増幅のサイクルによって各鋳型コピーに対して繰り返して、密集したクローンクラスタを作り出す。二本鎖ブリッジ構造の各クラスタが変性される。一例では、逆鎖は、特異的塩基切断によって除去され、順方向鋳型鎖を残す。クラスタリングは、活性領域３２、３２Ａ又は３２’、３２’’に固定化されたいくつかの鋳型鎖の形成をもたらす（例えば、図２Ｂに示すようにレーン１８、１８Ａを横切るか、又は図２Ｃに示すようにくぼみ２０、２０’にある）。このクラスタ化の例はブリッジ増幅と称され、この増幅は実行できる増幅の１つの例である。排除増幅（Ｅｘａｍｐ）ワークフロー（Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｉｎｃ．）などの他の増幅技術が使用され得ることを理解すべきである。
【0150】
鋳型鎖上の配列の相補的な部分にハイブリダイズする配列決定プライマー（図示せず）を導入してもよい。この配列決定プライマーは、鋳型鎖を配列決定可能な状態にする。
【0151】
次いで、標識ヌクレオチドを含む組み込み混合物を、例えば入力ポートを介してフローセル３０Ａ、３０Ｂへと導入してもよい。標識ヌクレオチドに加えて、組み込み混合物は、水、緩衝液、及びポリメラーゼを含み得る。組み込みミックスがフローセル３０Ａ、３０Ｂへと導入された場合、ミックスがフローチャネル３４に入り、活性領域３２、３２Ａ又は３２’、３２’’（鋳型鎖が存在する）と接触する。
【0152】
組み込み混合物をフローセル３０Ａ、３０Ｂ内でインキュベートし、標識ヌクレオチドを、鋳型鎖に沿ってそれぞれのポリメラーゼによって新生鎖へと組み込む。組み込み中、標識ヌクレオチドの１つは、それぞれのポリメラーゼにより、１つの配列決定プライマーを伸長し鋳型鎖の１つに相補的である１つの新生鎖に組み込まれる。組み込みは鋳型鎖依存的方式で行われ、したがって、新生鎖に付加された標識ヌクレオチドの種類の蛍光検出を使用して鋳型鎖の配列を決定することができる。組み込みは、単一の配列決定サイクル中に活性領域（複数可）３２、３２Ａ又は３２’、３２’’にわたって鋳型鎖の少なくともいくつかで起こる。
【0153】
組み込まれた標識ヌクレオチドは、標識ヌクレオチドが付加されると更なる配列決定プライマー伸長を終結させる３’ＯＨブロッキング基の存在に起因する、可逆的終結特性を含み得る。インキュベーション及び組み込みのための所望の時間の後、組み込まれていない標識ヌクレオチドを含む組み込み混合物は、洗浄サイクル中にフローセル３０Ａ、３０Ｂから除去され得る。洗浄サイクルは、例えばポンプ又は他の好適な機構によって、洗浄溶液（例えば、緩衝液）がフローチャネル内に導かれ、フローチャネルを通り、次いでフローチャネルから出るフロースルー技術を含み得る。
【0154】
プラズモンナノ粒子１０、１０Ａは、鋳型鎖が固定化されている活性領域３２、３２Ａ又は３２’、３２’’に存在し、ここには最後に組み込まれた標識ヌクレオチドが位置する。したがって、プラズモンナノ構造１０、１０Ａの少なくともいくつかは、ヌクレオチド組み込み後に光学標識の信号増強近接内に保持される。
【0155】
更なる組み込みが行われることなく、直近で組み込まれた光学標識ヌクレオチドを、イメージング事象を通して検出することができる。イメージング事象中、照明システム（図示せず）は、活性領域３２、３２Ａ又は３２’、３２’に励起光を提供してもよい。組み込まれた標識ヌクレオチドの光学（例えば、色素）標識は、励起光に応答して蛍光を発する。加えて、プラズモンナノ構造１０、１０Ａの少なくともいくつかは、それぞれの色素標識の信号増強近接内にあるので、色素標識からの信号はプラズモン共鳴によって増強することができる。
【0156】
イメージングを行った後、切断ミックスを次いでフローセル３０Ａ、３０Ｂへと導入してもよい。一例では、切断ミックスは、（ｉ）組み込まれたヌクレオチドから３’ＯＨブロッキング基を除去することができ、（ｉｉ）組み込まれたヌクレオチドから色素標識を切断することができる。切断ミックス中の３’ＯＨブロッキング基及び好適な脱ブロッキング剤／成分の例は、以下を含み得る。塩基加水分解によって除去することができるエステル部分；Ｎａｌ、クロロトリメチルシラン及びＮａ２Ｓ２Ｏ３で又はアセトン／水中のＨｇ（ＩＩ）で除去することができるアリル部分；トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）又はトリス（ヒドロキシプロピル）ホスフィン（ＴＨＰ）などのホスフィンで切断することができるアジドメチル；酸性条件で切断することができるｔｅｒｔ－ブトキシ－エトキシなどのアセタール；ＬｉＢＦ４及びＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏで切断することができるＭＯＭ（－ＣＨ２ＯＣＨ３）部分；チオフェノール及びチオサルフェートなどの求核剤で切断することができる２，４－ジニトロベンゼンスルフェニル；Ａｇ（Ｉ）又はＨｇ（ＩＩ）で切断することができるテトラヒドロフラニルエーテル；並びにホスファターゼ酵素（例えば、ポリヌクレオチドキナーゼ）によって切断され得る３’ホスフェート。切断混合物中の好適な色素標識切断剤／構成要素の例としては、隣接ジオールを切断することができる過ヨウ素酸ナトリウム；アジドメチル結合を切断することができる、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）又はトリ（ヒドロキシプロピル）ホスフィン（ＴＨＰ）などのホスフィン；アリルを切断することができるパラジウム及びＴＨＰ；エステル部分を切断することができる塩基；又は任意の他の好適な切断剤を含み得る。
【0157】
次いで、鋳型鎖が配列決定されるまで、更なる配列決定サイクルが行われ得る。
【0158】
消光のための方法及びフローセル
本明細書に開示されるフローセル３０の他の例は、消光ナノ構造４０を含む。これらのフローセルの各一部を、それぞれ、図３Ｄの符号３０Ｃ、図４Ｃの符号３０Ｄ）、及び図５Ｃの符号３０Ｅに示す。これらの例では、消光ナノ構造４０は、フローセル３０Ｃに示されるようにパターン化材料１６の表面にわたって配置されるか、又はフローセル３０Ｄ及び３０Ｅに示されるようにパターン化材料１６全体にわたって分散される。これらの例示的なフローセル３０Ｃ、３０Ｄ、３０Ｅでは、プラズモンナノ構造１０、１０Ａはヒドロゲル２４に付着していない。
本明細書に開示されるフローセル３０の他の例は、消光ナノ構造４０を含む。これらのフローセルの各一部を、それぞれ、図３Ｄの符号３０Ｃ、図４Ｃの符号３０Ｄ）、及び図５Ｃの符号３０Ｅに示す。これらの例では、消光ナノ構造４０は、フローセル３０Ｃに示されるようにパターン化材料１６の表面にわたって配置されるか、又はフローセル３０Ｄ及び３０Ｅに示されるようにパターン化材料１６全体にわたって分散される。これらの例示的なフローセル３０Ｃ、３０Ｄ、３０Ｅでは、プラズモンナノ構造１０、１０Ａはヒドロゲル２４に付着していない。
【0159】
図３Ｄ、図４Ｃ、及び図５Ｃに示すように、フローセル３０Ｃ、３０Ｄ、３０Ｅの各部分は、ベース支持体１４と、ベース支持体１４上のパターン化材料１６と、樹脂マトリックス材料４２、４２’及び樹脂マトリックス材料４２、４２’の表面全体にわたって分散又は配置された消光ナノ構造４０を含む、パターン化材料１６と、活性領域（例えば、３２Ｂ、３２Ｃ、３２Ｄ）のための領域（例えば、レーン１８又はくぼみ２０）を画定するパターン化材料１６と、間隙領域２２によって取り囲まれている領域と、領域内のヒドロゲル２４と、ヒドロゲル２４に付着したプライマー２８Ａ、２８Ｂと、を含む。したがって、図３Ｄ、図４Ｃ、及び図５Ｃの各々は、その上に形成された活性領域（複数可）３２Ｂ、３２Ｃ、３２Ｄを有する多層基材１２’、１２’－１、１２’－２の一例を示す。最終フローセル３０Ｃ、３０Ｄ、３０Ｅは、第２の多層基材１２’、１２’－１、１２’－２、又は多層基材１２’、１２’－１、１２’－２に結合された蓋、及び基材１２’、１２’－１、１２’－２又は基材１２’、１２’－１、１２’－２と蓋との間に画定されたフローチャネル３４を含むことを理解されたい。
【0160】
いくつかのパターン化材料１６は、対象となる励起波長において、望ましくないレベルの自己蛍光（例えば、約３８０ｎｍ～約４５０ｎｍの範囲の紫色励起波長、又は、約４５０ｎｍ～約４９５ｎｍの範囲の青色励起波長、又は、約４９５ｎｍ～約５７０ｎｍの範囲の緑色励起波長）を示す。パターン化材料１６からの自己蛍光は、配列決定中にくぼみ２０内に形成された個別の新生鎖に組み込まれるヌクレオチドの光学標識をイメージングするときに、バックグラウンドノイズを増加させる可能性がある。フローセル３０Ｃ、３０Ｄ、３０Ｅ内の消光ナノ構造４０は、パターン化材料１６からの自己蛍光を消光するように配置される。これらのナノ構造４０は、例えば、赤色、緑色、青色、紫色、又はそれらの組合せの標的波長を消光するように選択され得る。このように、消光ナノ構造４０はバックグラウンドノイズを減少させ、したがってシグナル・ノイズ比（ＳＮＲ）を増加させることで、結果として、個々のくぼみ２０内の個々のクラスタからの蛍光は配列決定中に容易に分解可能である。
【0161】
ここで図３Ａ～図３Ｄを参照すると、フローセル３０Ｃを作製するための例示的な方法が図示されている。この方法は、概して、樹脂マトリックス材料４２をナノインプリントして、間隙領域２２によって分離されたくぼみ２０を含むパターン化材料１６を形成することと、パターン化材料１６の表面上に消光ナノ構造４０のフィルム４６を堆積させることであって、フィルム４６が約１ｎｍ～約２０ｎｍの範囲の厚さを有する、堆積させることと、ヒドロゲル２４をくぼみ２０へと導入する工程と、ヒドロゲル２４にプライマーをグラフト２８Ａ、２８Ｂすることと、を含む方法である。
【0162】
図３Ａに示すように、この例示的な方法は、ベース支持体１４の上に配置された樹脂マトリックス材料４２を含む材料のスタックを利用する。樹脂マトリックス材料４２及びベース支持体１４は、本明細書に記載の例のうちのいずれかであってもよい。樹脂マトリックス材料４２をパターン化して、パターン化材料１６（図３Ｂ）と、多層基材１２’の一例（図２Ｃに示すものと同様）とを形成する。
【0163】
図３Ａに示す例では、樹脂マトリックス材料４２がベース支持体１４に適用されている。樹脂マトリックス材料４２は、適用に好適な粘度に希釈されてもよい。好適な液体担体の例としては、プロピレングリコールモノメチルエーテルアセテート（ＰＧＭＥＡ）、トルエン、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）などが挙げられる。次いで、希釈樹脂マトリックス材料４２は、手動又は自動であり得る任意の好適な適用技術を用いてベース支持体１４上に適用され得る。例として、樹脂マトリックス材料４２の適用は、蒸着技術又はコーティング技術などを用いて行うことができる。いくつかの特定の例としては、化学蒸着（ＣＶＤ）、スプレーコーティング（例えば、超音波スプレーコーティング）、スピンコーティング、ダンク又はディップコーティング、ドクターブレードコーティング、液滴分配、エアロゾル印刷、スクリーン印刷、マイクロコンタクト印刷、インクジェット印刷などが挙げられる。一例では、スピンコーティングが使用される。
【0164】
樹脂マトリックス材料４２を適用するために使用される技術は、液体担体の少なくとも一部を蒸発させることができる。樹脂マトリックス材料４２をベース支持体１４の表面に適用した後、これをソフトベークして、余分な液体担体を除去してもよい。実施されるとき、ソフトベークは、樹脂マトリックス材料４２が堆積された後、作業スタンプ３８がその中に配置される前に行われてもよい。ソフトベークは、硬化に使用されるよりも低い温度（例えば、約５０℃～約１５０℃の範囲）で、０秒間超～約３分間の範囲にわたる時間行われてもよい。一例では、ソフトベークの時間は、約３０秒～約２．５分の範囲である。
【0165】
次いで、樹脂マトリックス材料４２は、任意の好適なパターン化技術を用いてパターン化する。図３Ａ及び図３Ｂに示す例では、ナノインプリントリソグラフィを使用して、樹脂マトリックス材料４２をパターン化する。ナノインプリントリソグラフィモールド又は作業スタンプ３８は、樹脂マトリックス材料４２の層に押しつけられ、樹脂マトリックス材料４２上にインプリントを形成する。言い換えれば、樹脂マトリックス材料４２は、作業スタンプ３８の突出部（ナノフィーチャ４４）によってインデントされる、又は穿孔される。樹脂マトリックス材料４２を、次に、作業スタンプ３８が定位置にある状態で硬化することができる。
【0166】
硬化は、適用されナノインプリントされた樹脂マトリックス材料４２を紫外線（ＵＶ）照射などの化学線に曝露することによって達成することができる。一例では、放出されるＵＶ放射線の大部分は、約３６５ｎｍの波長を有し得る。硬化プロセスは、単一のＵＶ露光段階又は複数のＵＶ硬化段階を含み得る。硬化後、作業スタンプ３８が取り外される。得られた硬化樹脂マトリックス材料４２’及び多層基材１２’を図３Ｂに示す。硬化樹脂マトリックス材料４２’は、内部に画定された地形を有し、したがってパターン化材料１６と称される。図３Ｂに示すように、パターン化材料１６はその中に画定されたくぼみ２０を有し、各くぼみ２０は、間隙領域２２によって分離されている。
【0167】
図３Ｃに示すように、本方法は、次いで、パターン化材料１６の表面上に消光ナノ構造４０のフィルム４６を堆積させることを含む。消光ナノ構造４０は、本明細書に記載の例のいずれかであってもよく、任意の好適な技術を用いて堆積されてもよい。例として、消光ナノ構造４０は、電着、スプレーコーティング、又は化学蒸着を用いて堆積されてもよい。
【0168】
消光ナノ構造４０は、約１ｎｍ～約２０ｎｍの範囲にわたる厚さを有するフィルム４６を形成するように堆積されてもよい。この厚さにより、硬化樹脂マトリックス材料４２’内のフルオロフォアの信号消光近接内に消光ナノ構造４０が配置される。
【0169】
図３Ｄに示すように、本方法は、次いで、ヒドロゲル２４をくぼみ２０に導入することと、グラフトプライマー２８Ａ、２８Ｂをヒドロゲル２４にグラフトすることと、を含む。ヒドロゲル２４の適用は図１Ｂを参照して記載されるように行われてもよく、プライマー２８Ａ、２８Ｂのグラフトは、図１Ｅを参照して記載されるように行われてもよい。他の例では、ヒドロゲル２４はプライマー２８Ａ、２８Ｂで予めグラフトされてもよく、したがって、追加のグラフトプロセスは実行されなくてもよい。
【0170】
ヒドロゲル２４の適用の前に、フィルム４６は、例えば、スルフィドノルボルネン誘導体、又は消光ナノ構造４０に付着することができる別のノルボルネン誘導体で活性化されてもよい。スルフィドノルボルネン誘導体では、スルフィドはフィルム４６の消光ナノ構造４０に付着することができ、続いて、ノルボルネンは堆積されるヒドロゲル２４に付着することができる。
【0171】
研磨が（予めグラフトされた）ヒドロゲル２４の適用中に行われる場合、フィルム４６中の消光ナノ構造４０は、間隙領域２２から除去されなくてもよいことを理解されたい。
【0172】
この例示的な方法は、くぼみ２０の各々に活性領域３２Ｂの別の例を産生する。この活性領域３２Ｂは、各くぼみ２０の表面上のヒドロゲル２４と、ヒドロゲル２４に付着したプライマー２８Ａ、２８Ｂとを含む。消光ナノ構造４０は、活性領域３２Ｂの一部と見なされても、又は見なされなくてもよい。本明細書に記載されるように、消光ナノ構造４０は、硬化樹脂マトリックス材料４２’からの信号を消光するように配置される。フィルム４６中の消光ナノ構造４０のいくつかはまた、配列決定中にくぼみ（複数可）２０に導入された光学標識の信号増強近接内に配置されてもよい。これらの消光ナノ構造４０は、硬化樹脂バックグラウンド信号を消光し、光学標識信号を増強する二重機能を有し得る。
【0173】
図３Ｄに示すフィルム４６及び活性領域３２Ｂを有する多層基材１２’は、フローセル３０Ｃの一部を形成し、別の多層基材１２’（フィルム４６及び活性領域３２Ｂを有する）又は蓋に取り付けられ（例えば、別個の材料３６を介して）、最終フローセル３０Ｃを形成してもよい。最終フローセル３０Ｃの構造は図２Ｃに示すものと同様であり得る。
【0174】
図４Ａ～図４Ｃ及び図５Ａ～図５Ｃは、フローセル３０Ｄ及び３０Ｅを作製するための他の例示的な方法を示す。この例示的な方法は、概して、消光ナノ構造体４０を樹脂マトリックス材料４２に組み込むことと、間隙領域２２によって取り囲まれた活性領域のための領域４８を画定するように樹脂マトリックス材料４２をパターン化することと、ヒドロゲル２４を領域４８へと導入する工程と、ヒドロゲル２４にプライマーをグラフト２８Ａ、２８Ｂすることと、を含む。
【0175】
ここで図４Ａ～図４Ｃを参照すると、フローセル３０Ｄを作製するための例示的な方法が図示されている。図４Ａに示すように、この例示的な方法は、ベース支持体１４及びベース支持体１４上の樹脂マトリックス材料４２を含む材料のスタックを利用し、樹脂マトリックス材料４２は、その中に分散された消光ナノ構造４０を含む。
【0176】
ベース支持体１４は、本明細書に記載の例のうちのいずれかであってもよい。
【0177】
樹脂マトリックス材料４２及び消光ナノ構造４０はまた、本明細書に記載の例のうちのいずれかであってもよい。この例では、消光ナノ構造体４０は樹脂マトリックス材料４２全体に分散されている。樹脂マトリックス材料４２をベース支持体１４上に適用する前に、本方法は、消光ナノ構造体４０を樹脂マトリックス材料４２に組み込むことを含んでもよい。一例では、消光ナノ構造４０は、消光ナノ構造４０と樹脂マトリックス材料４２との混合物の総重量の約０．１重量％～約１０重量％の範囲にわたる量で樹脂マトリックス材料４２へと組み込まれる。消光ナノ構造体４０を樹脂マトリックス材料４２に添加して混合物を形成してもよく、混合物を撹拌又は他の方法で撹拌して消光ナノ構造体４０を分散させてもよい。
【0178】
図４Ａに示す例では、そこに分散された樹脂マトリックス材料４２を有する消光ナノ構造４０を、ベース支持体１４に適用する。そこに分散された消光ナノ構造４０を有する樹脂マトリックス材料４２は、任意の例の液体担体で、適用に好適な粘度に希釈されてもよい。次いで、そこに分散した消光ナノ構造４０を有する希釈樹脂マトリックス材料４２を、任意の好適な適用技術を用いてベース支持体１４上に好適してもよい。適用後、図３Ａ及び図３Ｂを参照して説明したように、そこに分散した消光ナノ構造４０を有する樹脂マトリックス材料４２をソフトベークして、余分な液体担体を除去してもよい。
【0179】
次いで、例えばナノインプリントリソグラフィを用いて、そこに分散した消光ナノ構造４０を有する樹脂マトリックス材料４２をパターン化して、図４Ｂに示すように、間隙領域２２によって取り囲まれた領域４８を画定する。この例では、領域４８はレーン１８であり、間隙領域２２はレーン１８を取り囲む。図４Ａに示すように、この例示的な方法における作業スタンプ３８は、形成されるレーン（複数可）１８のネガティブレプリカであるナノフィーチャ（複数可）４４を含む。そこに分散した消光ナノ構造４０を有する樹脂マトリックス材料４２に作業スタンプ３８を押しつける場合、図３Ａ及び図３Ｂを参照して説明したように、樹脂が硬化し得る。得られた硬化樹脂マトリックス材料４２’（パターン化材料１６）及び多層基材１２’－１を図４Ｂに示す。図４Ｂに示すように、パターン化材料１６はその中に画定されたレーン１８を有し、レーン１８は間隙領域２２によって取り囲まれている。
【0180】
図４Ｃに示すように、本方法は、次いで、ヒドロゲル２４を領域４８（この例ではレーン１８）に導入することと、プライマー２８Ａ、２８Ｂをヒドロゲル２４にグラフトすることとを含む。ヒドロゲル２４の適用は図１Ｂを参照して記載されるように行われてもよく、プライマー２８Ａ、２８Ｂのグラフトは、図１Ｅを参照して記載されるように行われてもよい。他の例では、ヒドロゲル２４はプライマー２８Ａ、２８Ｂで予めグラフトされてもよく、したがって、追加のグラフトプロセスは実行されなくてもよい。
【0181】
この例示的な方法は、レーン１８内の活性領域３２Ｃの別の例を産生する。この活性領域３２Ｃは、レーン１８の表面上のヒドロゲル２４と、ヒドロゲル２４に付着したプライマー２８Ａ、２８Ｂとを含む。この例では、消光ナノ構造４０は活性領域３２Ｃの一部とは見なされない。
【0182】
図４Ｃに示す活性領域３２Ｃを有する多層基材１２’－１は、フローセル３０Ｄの一部を形成し、別の多層基材１２’－１又は蓋に取り付けられて（例えば、別個の材料３６を介して）、最終フローセル３０Ｄを形成し得る。最終フローセル３０Ｄの構造は図２Ｂに示すものと同様であり得る。
【0183】
ここで図５Ａ～図５Ｃを参照すると、フローセル３０Ｅを作製するための例示的な方法が図示されている。図５Ａに示すように、この例示的な方法は、ベース支持体１４及びベース支持体１４上の樹脂マトリックス材料４２を含む材料のスタックを利用し、樹脂マトリックス材料４２は、その中に分散された消光ナノ構造４０を含む。
【0184】
ベース支持体１４は、本明細書に記載の例のうちのいずれかであってもよい。
【0185】
樹脂マトリックス材料４２及び消光ナノ構造４０はまた、本明細書に記載の例のうちのいずれかであってもよい。この例では、消光ナノ構造４０は、図４Ａ～図４Ｃを参照して説明したように、樹脂マトリックス材料４２全体に分散されている。
【0186】
次いで、例えばナノインプリントリソグラフィを用いて、そこに分散した消光ナノ構造４０を有する樹脂マトリックス材料４２をパターン化して、図５Ｂに示すように、間隙領域２２によって取り囲まれた領域４８を画定する。この例では、各領域４８はくぼみ２０であり、間隙領域２２はくぼみ２０を取り囲む。図４Ａに示すように、この例示的な方法における作業スタンプ３８は、形成されるくぼみ（複数可）２０のネガティブレプリカであるナノフィーチャ（複数可）４４を含む。そこに分散した消光ナノ構造４０を有する樹脂マトリックス材料４２に作業スタンプ３８を押しつける場合、図３Ａ及び図３Ｂを参照して説明したように、樹脂が硬化し得る。得られた硬化樹脂マトリックス材料４２’（パターン化材料１６）及び多層基材１２’－２を図５Ｂに示す。図５Ｂに示すように、パターン化材料１６はその中に画定された複数のくぼみ２０を有し、各くぼみ２０は、間隙領域２２によって分離されている。
【0187】
図５Ｃに示すように、本方法は、次いで、ヒドロゲル２４を領域４８（この例ではくぼみ２０）に導入することと、プライマー２８Ａ、２８Ｂをヒドロゲル２４にグラフトすることとを含む。ヒドロゲル２４の適用は図１Ｂを参照して記載されるように行われてもよく、プライマー２８Ａ、２８Ｂのグラフトは、図１Ｅを参照して記載されるように行われてもよい。他の例では、ヒドロゲル２４はプライマー２８Ａ、２８Ｂで予めグラフトされてもよく、したがって、追加のグラフトプロセスは実行されなくてもよい。
【0188】
この例示的な方法は、各くぼみ２０の活性領域３２Ｄの別の例を産生する。この活性領域３２Ｄは、各くぼみ２０の表面上のヒドロゲル２４と、ヒドロゲル２４に付着したプライマー２８Ａ、２８Ｂとを含む。この例では、消光ナノ構造４０は活性領域３２Ｄの一部とは見なされない。
【0189】
図５Ｃに示す活性領域３２Ｄを有する多層基材１２’－２は、フローセル３０Ｅの一部を形成し、別の多層基材１２’－２又は蓋に取り付けられて（例えば、別個の材料３６を介して）、最終フローセル３０Ｅを形成し得る。最終フローセル３０Ｅの構造は図２Ｃに示すものと同様であり得る。
【0190】
フローセル３０Ｃ、３０Ｄ、及び３０Ｅの例は、フローセル３０Ａ及び３０Ｂについて本明細書に記載の配列決定方法で使用してもよい。消光ナノ構造４０の存在に起因して、配列決定中にシグナル・ノイズ比が増加し得る。フローセル３０Ａ及び３０Ｂを参照して記載されたプラズモン増強は、フローセル３０Ｃ、３０Ｄ、及び３０Ｅで発生しても、又は発生しなくてもよく、イメージング中に組み込まれた各標識ヌクレオチドの光学標識からの消光ナノ構造４０の距離に部分的に依存する。
【0191】
プラズモン増強及び消光のためのフローセル
本明細書に開示されるフローセル３０の更に他の例は、ハイブリッドである。一例は、図２Ｃに示すフローセル３０Ｂと、図３Ｄに示すフローセル３０Ｃとのハイブリッドである。この例は、ヒドロゲル２４内のプラズモンナノ構造１０と、パターン化材料１６上に形成されたフィルム４６内の消光ナノ構造４０とを含む。別の例は、図２Ｂに示すフローセル３０Ａと、図４Ｃに示すフローセル３０Ｄとのハイブリッドである。更に別の例は、図２Ｃに示すフローセル３０Ｂと、図５Ｃに示すフローセル３０Ｅとのハイブリッドである。これらの例は、ヒドロゲル２４中のプラズモンナノ構造１０と、パターン化材料１６中の消光ナノ構造４０とを含む。
本明細書に開示されるフローセル３０の更に他の例は、ハイブリッドである。一例は、図２Ｃに示すフローセル３０Ｂと、図３Ｄに示すフローセル３０Ｃとのハイブリッドである。この例は、ヒドロゲル２４内のプラズモンナノ構造１０と、パターン化材料１６上に形成されたフィルム４６内の消光ナノ構造４０とを含む。別の例は、図２Ｂに示すフローセル３０Ａと、図４Ｃに示すフローセル３０Ｄとのハイブリッドである。更に別の例は、図２Ｃに示すフローセル３０Ｂと、図５Ｃに示すフローセル３０Ｅとのハイブリッドである。これらの例は、ヒドロゲル２４中のプラズモンナノ構造１０と、パターン化材料１６中の消光ナノ構造４０とを含む。
【0192】
ハイブリッド例は、フローセル３０Ａ及び３０Ｂについて本明細書に記載の配列決定方法で使用してもよい。プラズモンナノ構造１０及び消光ナノ構造４０の両方の存在に起因して、組み込まれた各標識ヌクレオチドの光学標識からの信号は増強されてもよく、硬化樹脂マトリックス材料４２’からの信号は消光されてもよい。このようにして、シグナル・ノイズ比は配列決定中に増加し得る。
【0193】
本開示を更に説明するために、本明細書に例を示す。これらの例は、例示の目的で提供され、本開示の範囲を限定するものとして解釈されるべきではないことを理解すべきである。
【0194】
非限定的な作業例
実施例１
この実施例は、フローセルのヒドロゲルに組み込まれたプラズモンナノ粒子からの蛍光増強を実証するために行われた。
実施例１
この実施例は、フローセルのヒドロゲルに組み込まれたプラズモンナノ粒子からの蛍光増強を実証するために行われた。
【0195】
この例では、８つのフローチャネル（長さ８ｃｍ）を有するパターン化フローセルを使用した。この例では、フローチャネルをレーン１～レーン８と称する。各フローチャネルはパターン化された樹脂材料に形成されたくぼみを含んだ。
【0196】
第１のフローチャネル及び第２のフローチャネル（レーン１及びレーン２）は、対照フローチャネルであり、任意のヒドロゲルでコーティングされていなかった。第３～第８のフローチャネル（レーン３～レーン８）を蛍光ＰＡＺＡＭ（すなわち、そこにＡＬＥＸＡ ＦＬＵＯＲ（登録商標）５４５色素がグラフトされたＰＡＺＡＭ）でコーティングした。
【0197】
水中の銀ナノチューブ（約７５ｎｍ）を用いて、異なるナノ粒子濃度を有する５つの異なるプラズモンナノ粒子溶液を調製した。溶液の濃度を表１に示す。
【0198】
【表1】
【0199】
１００μＬの各溶液（ＮＰＳ１～ＮＰＳ５）を、レーン３～レーン７（蛍光ＰＡＺＡＭでコーティング）内でそれぞれ洗い流した。１００μＬのＮＰＳ１（１ｍｇ／ｍＬ）もまた、対照レーン２（蛍光ＰＡＺＡＭによりコーティングされず）内で洗い流した。ナノ粒子溶液のいずれも、対照レーン１（蛍光ＰＡＺＡＭでコーティングされていない）又は対照レーン８（蛍光ＰＡＺＡＭでコーティングされている）に導入しなかった。ナノ粒子溶液導入後のフローセルの写真を撮影し、図６Ａで本明細書に再現する。元のカラー写真では、ナノ粒子溶液でコーティングされたレーンは緑色であり、ナノ粒子濃度が増加するにつれて色が明るくなった。したがって、対照レーン２及びレーン３（各々ＮＰＳ１でコーティングされ、したがって、ナノ粒子の最高濃度）は、最も明るい緑色を呈した。色により、異なるナノ粒子溶液（ＮＰＳ１～ＮＰＳ５）の存在が確認された。
【0200】
レーン２～レーン７のナノ粒子溶液を用いて、フローセルのＴＹＰＨＯＯＮ（登録商標）スキャナ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）で蛍光スキャン（５３２ｎｍ励起）を行った。結果は本明細書で再現されないが、蛍光信号が、レーン３～レーン７（それぞれ、そこにＮＰＳ１～ＮＰＳ５を含む）において、及び対照レーン８（蛍光ＰＡＺＡＭであるが、ナノ粒子溶液はなし）において観察されたが、対照レーン１又は対照レーン２のいずれにおいても観察されなかった。対照レーン２の結果は、ナノ粒子自体から蛍光信号が放射されないことを確認した。
【0201】
次いで、ナノ粒子溶液ＮＰＳ１～ＮＰＳ５をレーン２～レーン７から流し出した。クエン酸ナトリウム緩衝液をレーン１～レーン８の各々に導入し、ＴＹＰＨＯＯＮ（登録商標）スキャナ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）でフローセルの別の蛍光スキャン（５３２ｎｍ励起）を行った。このスキャンからの画像は、図６Ｂにおいて、左側にレーン８、及び右側にレーン１を用いて再生される。図６Ｂの画像に対応する相対強度を図６Ｃのグラフに示す。図６Ｂ及び図６Ｃの両方に示すように、蛍光ＰＡＺＡＭなしの対照レーン１及び対照レーン２では蛍光信号は観察されなかった。これらの結果により、対照レーン２に導入されていたナノ粒子が、ＮＰＳ１がそこから洗い流された場合に除去されたことが確認された。対照的に、蛍光ＰＡＺＡＭを含むがナノ粒子溶液を含まないレーン８と、蛍光ＰＡＺＡＭを含みＮＰＳ１～ＮＰＳ５でコーティングされたレーン３～７の各々において、蛍光信号が観察された。これらの結果は、濃度が増加するにつれてレーン３～レーン７の蛍光信号が増加したので、プラズモンナノ粒子が、それぞれのナノ粒子溶液がそこから洗い流される前にレーン３～レーン７のヒドロゲルに捕捉されたことを実証している（すなわち、レーン３が最も強い信号を有し、レーン７が最も弱い信号を有した）。これらの結果は、ナノ粒子が蛍光信号を増強し、濃度が増強の大きさに影響を及ぼし得ることを実証した。
【0202】
蛍光ＰＡＺＡＭをレーン３～レーン８に導入した後、及びナノ粒子溶液の導入前に、フローセルのＴＹＰＨＯＯＮ（登録商標）スキャナで蛍光スキャン（５３２ｎｍ励起）を行った。レーン８のスキャンは、ＮＳＰ１～ＮＳＰ５のうち１つで処理する前に、コーティングされたレーンのベースライン蛍光強度測定を提供した。このベースライン測定値を図６Ｄのグラフに示す。
【0203】
ナノ粒子溶液の導入、インキュベーション、及び除去の後、並びにクエン酸ナトリウム緩衝液の導入の後、ＴＹＰＨＯＯＮ（登録商標）スキャナ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）上のフローセルの別の蛍光スキャン（５３２ｎｍ励起）を行った。ナノ粒子溶液の導入、インキュベーション、及び除去後、並びにクエン酸ナトリウム緩衝液の導入後に行われた蛍光スキャン（５３２ｎｍ励起）からのレーン３～レーン７の蛍光強度もまた、図６Ｄに示す。
【0204】
図６Ｄの結果は、ヒドロゲルに導入された溶液中のプラズモンナノ構造の濃度が大きいほど、蛍光増強が大きいことを示している。例えば、最高濃度のナノ粒子（１ｍｇ／ｍＬ）に曝露されたレーン３は、ベースライン測定と比較して、緑色（５３２ｎｍ）信号の４．５倍の増強に達した。
【0205】
実施例２
ナノ粒子濃度がプラズモンナノ粒子増強の大きさに及ぼし得る影響を更に調べるために、異なる蛍光ヒドロゲルを有する別のフローセルを調製し、試験した。
ナノ粒子濃度がプラズモンナノ粒子増強の大きさに及ぼし得る影響を更に調べるために、異なる蛍光ヒドロゲルを有する別のフローセルを調製し、試験した。
【0206】
この例では、８つのフローチャネル（長さ８ｃｍ）を有するパターン化フローセルを使用した。各フローチャネルはパターン化された樹脂材料に形成されたくぼみを含んだ。全てのレーンを第２の蛍光ＰＡＺＡＭでコーティングし、この実施例では、ＡＬＥＸＡ ＦＬＵＯＲ（登録商標）４８８色素がそこにグラフトされたＰＡＺＡＭであった。
【0207】
第２の蛍光ＰＡＺＡＭをレーンに導入した後、フローセルのＴＹＰＨＯＯＮ（登録商標）スキャナで蛍光スキャン（４８８ｎｍ励起）を行った。レーン８のスキャンは、実施例１のＮＳＰ１～ＮＳＰ５のうち１つで処理する前に、コーティングされたレーンのベースライン蛍光強度測定を提供した。このベースライン測定値を図７のグラフに示す。
【0208】
実施例１、ＮＰＳ１～ＮＰＳ５からの各ナノ粒子溶液１００μＬを、それぞれ、レーン３～レーン７（第２の蛍光ＰＡＺＡＭでコーティング）に洗い流した。溶液を、５分間にわたり室温でインキュベートした後、フローセルから洗い流させた。クエン酸ナトリウム緩衝液をレーン１～レーン８の各々に導入し、ＴＹＰＨＯＯＮ（登録商標）スキャナ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）でフローセルの別の蛍光スキャン（４８８ｎｍ励起）を行った。レーン３～レーン７の蛍光強度もまた図７に示す。
【0209】
図７の結果は、ヒドロゲルに導入された溶液中のプラズモンナノ構造の濃度が大きいほど、蛍光増強が大きいことを示している。例えば、最高濃度のナノ粒子（１ｍｇ／ｍＬ）に曝露されたレーン３は、ナノ粒子処理前にスキャンされた同じフローセルで得られた標準強度と比較して、青色（４８８ｎｍ）信号の両方で４．５倍の増強に達した。これらの結果は図６Ｄに示す緑色（５３２ｎｍ）の結果と一致する。
【0210】
実施例３
実施例１と同じ種類のフローセルを使用した。この例では、３つのレーンを以下のように処理した：レーン１をＰＡＺＡＭでコーティングし、Ｐ５及びＰ７プライマーをグラフトした。レーン２をＰＡＺＡＭでコーティングし、室温で５分間にわたり実施例１からのＮＰＳ１（１ｍｇ／ｍＬ）で処理した後、ＮＰＳ１を除去し、次いで、Ｐ５プライマー及びＰ７プライマーをグラフトした。レーン３をＰＡＺＡＭによりコーティングし、Ｐ５プライマー及びＰ７プライマーによりグラフトし、次いで、実施例１からのＮＰＳ１（１ｍｇ／ｍＬ）により室温で５分間処理した後、ＮＰＳ１を除去した。
実施例１と同じ種類のフローセルを使用した。この例では、３つのレーンを以下のように処理した：レーン１をＰＡＺＡＭでコーティングし、Ｐ５及びＰ７プライマーをグラフトした。レーン２をＰＡＺＡＭでコーティングし、室温で５分間にわたり実施例１からのＮＰＳ１（１ｍｇ／ｍＬ）で処理した後、ＮＰＳ１を除去し、次いで、Ｐ５プライマー及びＰ７プライマーをグラフトした。レーン３をＰＡＺＡＭによりコーティングし、Ｐ５プライマー及びＰ７プライマーによりグラフトし、次いで、実施例１からのＮＰＳ１（１ｍｇ／ｍＬ）により室温で５分間処理した後、ＮＰＳ１を除去した。
【0211】
次いで、レーン１～レーン３の各々を、レーン内のＰ５プライマーにハイブリダイズし、したがって標識されたＡＬＥＸＡ ＦＬＵＯＲ（商標）５４５－Ｐ５補体に曝露した。ＴＹＰＨＯＯＮ（登録商標）スキャナ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）でフローセルの蛍光スキャン（５３２ｎｍ励起）を行った。結果は本明細書で再現されないが、蛍光増強はレーン１では観察されなかった一方で、レーン２及びレーン３で観察され、両方ともプラズモンナノ粒子で処理された。これらの結果は、プラズモンナノ粒子が、プライマーグラフトの前又は後のいずれかでヒドロゲルに導入され得ることを示した。
【0212】
追記事項
以下により詳細に考察される、前述の概念及び更なる概念の全ての組合せが、（かかる概念が相互に矛盾しなければ）本明細書に開示される発明の主題の一部であると企図されることを理解されたい。具体的には、本開示の終わりに現れる特許請求される主題の全ての組合せは、本明細書に開示される発明の主題の一部であると企図される。本明細書で明示的に用いられ、また参照により組み込まれる任意の開示においても出現し得る用語は、本明細書で開示される特定の概念と最も一致する意味が与えられるべきであることも理解すべきである。
以下により詳細に考察される、前述の概念及び更なる概念の全ての組合せが、（かかる概念が相互に矛盾しなければ）本明細書に開示される発明の主題の一部であると企図されることを理解されたい。具体的には、本開示の終わりに現れる特許請求される主題の全ての組合せは、本明細書に開示される発明の主題の一部であると企図される。本明細書で明示的に用いられ、また参照により組み込まれる任意の開示においても出現し得る用語は、本明細書で開示される特定の概念と最も一致する意味が与えられるべきであることも理解すべきである。
【0213】
「一例」、「別の例」、「ある例」などへの本明細書全体を通じての言及は、例に関連して記載されている特定の要素（例えば、特徴、構造、及び／又は特性）が、本明細書に記載されている少なくとも１つの例に含まれており、他の例に存在していても、存在していなくともよいことを意味している。更に、文脈上明確に別段の指示がない限り、任意の例に関する記載の要素は、様々な例において任意の好適な様式で組み合わせ得ることを理解すべきである。
【0214】
本明細書に提供される範囲は、そのような値又は部分範囲が明示的に列挙されているかのように、示される範囲及びその示される範囲内の任意の値又は部分範囲を含むことを理解されたい。例えば、約２ｍｍ～約３００ｍｍにわたる範囲は、約２ｍｍ～約３００ｍｍの明示的に記載された限界だけでなく、約４０ｍｍ、約２５０．５ｍｍなどの個々の値、及び約２５ｍｍ～約１７５ｍｍなどの部分範囲も含むと解釈するべきである。
【0215】
更に、「約」及び／又は「実質的に」が値を説明するために利用される場合、それらは、示された値からのわずかな変動（最大で±１０％）を包含することを意味する。
【0216】
いくつかの実施例を詳細に説明してきたが、開示された例は修正され得ることを理解すべきである。したがって、これまでの説明は非限定的なものであると考えるべきである。
【0217】
代表的な特徴。
代表的な特徴は、以下の番号を付けた条項に記載されており、単独であってもよく、又は任意の組合せで、本明細書の本文及び／又は図面に開示される１つ以上の特徴と組み合わされてもよい。
１．方法であって、
基材の表面にヒドロゲルを適用することと、
プライマーを当該適用ヒドロゲルにグラフトすることと、
当該プライマーをグラフトする前又は後に、当該適用ヒドロゲルにプラズモンナノ構造を導入することと、
を含む、方法。
２．当該プラズモンナノ構造が、当該ヒドロゲルの遊離アジド基に共有結合するアルキンで官能化されている、条項１に記載の方法。
３．当該プラズモンナノ構造が、当該ヒドロゲルのアルキンに共有結合するアジドで官能化されている、条項１又は条項２に記載の方法。
４．当該プラズモンナノ構造が、当該ヒドロゲルに付着している当該結合対の第２のメンバーと相互作用する結合対の第１のメンバーで官能化されている、条項１～３のいずれか一項に記載の方法。
５．当該第１のメンバー及び当該第２のメンバーが、ＮｉＮＴＡリガンド及びヒスチジンタグ、又はストレプトアビジン及びビオチン、又はスパイタグ（spytag）及びスパイキャッチャー（spycatcher）、又はマレイミド及びシステイン、又はＮ－ヒドロキシスクシンイミドエステル及びアミン、又はアルデヒド及びヒドラジン、又はアミン及び活性化カルボキシレート、又はアミン及びＮ－ヒドロキシスクシンイミドエステル、又はチオール及びアルキル化試薬、又はホスホラミダイト及びチオエーテルを含む、条項４に記載の方法。
６．当該基材の当該表面が、間隙領域によって分離されたくぼみを含み、当該方法が、当該プライマーをグラフトする前及び当該プラズモンナノ構造を導入する前に、当該ヒドロゲルを当該間隙領域から除去することを更に含む、条項１～５のいずれか一項に記載の方法。
７．当該基材の当該表面が、間隙領域によって取り囲まれたレーンを含み、当該方法が、当該プライマーをグラフトする前及び当該プラズモンナノ構造を導入する前に、当該ヒドロゲルを当該間隙領域から除去することを更に含む、条項１～６のいずれか一項に記載の方法。
８．当該プラズモンナノ構造が、金ナノ構造、銀ナノ構造、スズナノ構造、ロジウムナノ構造、ルテニウムナノ構造、パラジウムナノ構造、オスミウムナノ構造、イリジウムナノ構造、白金ナノ構造、クロムナノ構造、銅ナノ構造、ガリウムヒ素ナノ構造、ドープシリコンナノ構造、アルミニウムナノ構造、マグネシウムナノ構造、銀及び金複合ナノ構造、並びにそれらの組合せからなる群から選択される、条項１～７のいずれか一項に記載の方法。
９．当該プラズモンナノ構造が、各々、固体構造、中空構造、又はコアシェル構造を有する、条項１～８のいずれか一項に記載の方法。
１０．フローセルであって、
ベース支持体と、
当該ベース支持体上のパターン化材料であって、当該パターン化材料は、
樹脂マトリックス材料、及び
当該樹脂マトリックス材料の表面全体にわたって分散されている又は配置されている、消光ナノ構造
を含む、パターン化材料と、
活性領域のための領域を画定する当該パターン化材料であって、当該領域が間隙領域によって取り囲まれている、パターン化材料と、
当該領域内のヒドロゲルと、
当該ヒドロゲルに付着されたプライマーと、
を含む、フローセル。
１１．当該消光ナノ構造が、金ナノ構造、銀ナノ構造、スズナノ構造、ロジウムナノ構造、ルテニウムナノ構造、パラジウムナノ構造、オスミウムナノ構造、イリジウムナノ構造、白金ナノ構造、クロムナノ構造、銅ナノ構造、ガリウムヒ素ナノ構造、ドープシリコンナノ構造、アルミニウムナノ構造、マグネシウムナノ構造、銀及び金複合ナノ構造、並びにそれらの組合せからなる群から選択される、条項１０に記載のフローセル。
１２．当該消光ナノ構造が、固体構造、中空構造、又はコアシェル構造を有する、条項１０又は条項１１に記載のフローセル。
１３．当該領域が、レーンを含み、当該間隙領域が、当該レーンを取り囲む、条項１０～１２のいずれか一項に記載のフローセル。
１４．
当該領域が、くぼみであり、
当該パターン化材料が、複数の当該くぼみを画定し、
当該複数のくぼみの各々が、当該間隙領域によって分離されている、
条項１０～１３のいずれか一項に記載のフローセル。
１５．フローセルにおける配列決定中にシグナル・ノイズ比を増加させるための方法であって、
樹脂マトリックス材料をナノインプリントして、間隙領域によって分離されたくぼみを含むパターン化材料を形成することと、
パターン化材料の表面上に消光ナノ構造のフィルムを堆積させることであって、当該フィルムが約１ｎｍ～約２０ｎｍの範囲の厚さを有する、堆積させることと、
ヒドロゲルを当該くぼみへと導入することと、
プライマーを当該ヒドロゲルにグラフトすることと、
を含む、方法。
１６．当該消光ナノ構造が、金ナノ構造、銀ナノ構造、スズナノ構造、ロジウムナノ構造、ルテニウムナノ構造、パラジウムナノ構造、オスミウムナノ構造、イリジウムナノ構造、白金ナノ構造、クロムナノ構造、銅ナノ構造、ガリウムヒ素ナノ構造、ドープシリコンナノ構造、アルミニウムナノ構造、マグネシウムナノ構造、銀及び金複合ナノ構造、並びにそれらの組合せからなる群から選択される、条項１５に記載の方法。
１７．フローセルにおける配列決定中にシグナル・ノイズ比を増加させるための方法であって、
消光ナノ構造を樹脂マトリックス材料へと組み込むことと、
間隙領域によって取り囲まれた活性領域のための領域を画定するように当該樹脂マトリックス材料をパターン化することと、
ヒドロゲルを当該領域へと導入することと、
プライマーを当該ヒドロゲルにグラフトすることと、
を含む、方法。
１８．当該消光ナノ構造が、当該消光ナノ構造と当該樹脂マトリックス材料との混合物の総重量の約０．１重量％～約１０重量％の範囲にわたる量で当該樹脂マトリックス材料へと組み込まれる、条項１７に記載の方法。
１９．当該消光ナノ構造が、金ナノ構造、銀ナノ構造、スズナノ構造、ロジウムナノ構造、ルテニウムナノ構造、パラジウムナノ構造、オスミウムナノ構造、イリジウムナノ構造、白金ナノ構造、クロムナノ構造、銅ナノ構造、ガリウムヒ素ナノ構造、ドープシリコンナノ構造、アルミニウムナノ構造、マグネシウムナノ構造、銀及び金複合ナノ構造、並びにそれらの組合せからなる群から選択される、条項１７又は条項１８に記載の方法。
２０．当該領域が、レーンを含み、当該間隙領域が、当該レーンを取り囲む、条項１７～１９のいずれか一項に記載の方法。
２１．
当該領域が、くぼみであり、
当該パターン化材料が、複数の当該くぼみを画定し、
当該複数のくぼみの各々が、当該間隙領域によって分離されている、
条項１７～２０のいずれか一項に記載の方法。
代表的な特徴は、以下の番号を付けた条項に記載されており、単独であってもよく、又は任意の組合せで、本明細書の本文及び／又は図面に開示される１つ以上の特徴と組み合わされてもよい。
１．方法であって、
基材の表面にヒドロゲルを適用することと、
プライマーを当該適用ヒドロゲルにグラフトすることと、
当該プライマーをグラフトする前又は後に、当該適用ヒドロゲルにプラズモンナノ構造を導入することと、
を含む、方法。
２．当該プラズモンナノ構造が、当該ヒドロゲルの遊離アジド基に共有結合するアルキンで官能化されている、条項１に記載の方法。
３．当該プラズモンナノ構造が、当該ヒドロゲルのアルキンに共有結合するアジドで官能化されている、条項１又は条項２に記載の方法。
４．当該プラズモンナノ構造が、当該ヒドロゲルに付着している当該結合対の第２のメンバーと相互作用する結合対の第１のメンバーで官能化されている、条項１～３のいずれか一項に記載の方法。
５．当該第１のメンバー及び当該第２のメンバーが、ＮｉＮＴＡリガンド及びヒスチジンタグ、又はストレプトアビジン及びビオチン、又はスパイタグ（spytag）及びスパイキャッチャー（spycatcher）、又はマレイミド及びシステイン、又はＮ－ヒドロキシスクシンイミドエステル及びアミン、又はアルデヒド及びヒドラジン、又はアミン及び活性化カルボキシレート、又はアミン及びＮ－ヒドロキシスクシンイミドエステル、又はチオール及びアルキル化試薬、又はホスホラミダイト及びチオエーテルを含む、条項４に記載の方法。
６．当該基材の当該表面が、間隙領域によって分離されたくぼみを含み、当該方法が、当該プライマーをグラフトする前及び当該プラズモンナノ構造を導入する前に、当該ヒドロゲルを当該間隙領域から除去することを更に含む、条項１～５のいずれか一項に記載の方法。
７．当該基材の当該表面が、間隙領域によって取り囲まれたレーンを含み、当該方法が、当該プライマーをグラフトする前及び当該プラズモンナノ構造を導入する前に、当該ヒドロゲルを当該間隙領域から除去することを更に含む、条項１～６のいずれか一項に記載の方法。
８．当該プラズモンナノ構造が、金ナノ構造、銀ナノ構造、スズナノ構造、ロジウムナノ構造、ルテニウムナノ構造、パラジウムナノ構造、オスミウムナノ構造、イリジウムナノ構造、白金ナノ構造、クロムナノ構造、銅ナノ構造、ガリウムヒ素ナノ構造、ドープシリコンナノ構造、アルミニウムナノ構造、マグネシウムナノ構造、銀及び金複合ナノ構造、並びにそれらの組合せからなる群から選択される、条項１～７のいずれか一項に記載の方法。
９．当該プラズモンナノ構造が、各々、固体構造、中空構造、又はコアシェル構造を有する、条項１～８のいずれか一項に記載の方法。
１０．フローセルであって、
ベース支持体と、
当該ベース支持体上のパターン化材料であって、当該パターン化材料は、
樹脂マトリックス材料、及び
当該樹脂マトリックス材料の表面全体にわたって分散されている又は配置されている、消光ナノ構造
を含む、パターン化材料と、
活性領域のための領域を画定する当該パターン化材料であって、当該領域が間隙領域によって取り囲まれている、パターン化材料と、
当該領域内のヒドロゲルと、
当該ヒドロゲルに付着されたプライマーと、
を含む、フローセル。
１１．当該消光ナノ構造が、金ナノ構造、銀ナノ構造、スズナノ構造、ロジウムナノ構造、ルテニウムナノ構造、パラジウムナノ構造、オスミウムナノ構造、イリジウムナノ構造、白金ナノ構造、クロムナノ構造、銅ナノ構造、ガリウムヒ素ナノ構造、ドープシリコンナノ構造、アルミニウムナノ構造、マグネシウムナノ構造、銀及び金複合ナノ構造、並びにそれらの組合せからなる群から選択される、条項１０に記載のフローセル。
１２．当該消光ナノ構造が、固体構造、中空構造、又はコアシェル構造を有する、条項１０又は条項１１に記載のフローセル。
１３．当該領域が、レーンを含み、当該間隙領域が、当該レーンを取り囲む、条項１０～１２のいずれか一項に記載のフローセル。
１４．
当該領域が、くぼみであり、
当該パターン化材料が、複数の当該くぼみを画定し、
当該複数のくぼみの各々が、当該間隙領域によって分離されている、
条項１０～１３のいずれか一項に記載のフローセル。
１５．フローセルにおける配列決定中にシグナル・ノイズ比を増加させるための方法であって、
樹脂マトリックス材料をナノインプリントして、間隙領域によって分離されたくぼみを含むパターン化材料を形成することと、
パターン化材料の表面上に消光ナノ構造のフィルムを堆積させることであって、当該フィルムが約１ｎｍ～約２０ｎｍの範囲の厚さを有する、堆積させることと、
ヒドロゲルを当該くぼみへと導入することと、
プライマーを当該ヒドロゲルにグラフトすることと、
を含む、方法。
１６．当該消光ナノ構造が、金ナノ構造、銀ナノ構造、スズナノ構造、ロジウムナノ構造、ルテニウムナノ構造、パラジウムナノ構造、オスミウムナノ構造、イリジウムナノ構造、白金ナノ構造、クロムナノ構造、銅ナノ構造、ガリウムヒ素ナノ構造、ドープシリコンナノ構造、アルミニウムナノ構造、マグネシウムナノ構造、銀及び金複合ナノ構造、並びにそれらの組合せからなる群から選択される、条項１５に記載の方法。
１７．フローセルにおける配列決定中にシグナル・ノイズ比を増加させるための方法であって、
消光ナノ構造を樹脂マトリックス材料へと組み込むことと、
間隙領域によって取り囲まれた活性領域のための領域を画定するように当該樹脂マトリックス材料をパターン化することと、
ヒドロゲルを当該領域へと導入することと、
プライマーを当該ヒドロゲルにグラフトすることと、
を含む、方法。
１８．当該消光ナノ構造が、当該消光ナノ構造と当該樹脂マトリックス材料との混合物の総重量の約０．１重量％～約１０重量％の範囲にわたる量で当該樹脂マトリックス材料へと組み込まれる、条項１７に記載の方法。
１９．当該消光ナノ構造が、金ナノ構造、銀ナノ構造、スズナノ構造、ロジウムナノ構造、ルテニウムナノ構造、パラジウムナノ構造、オスミウムナノ構造、イリジウムナノ構造、白金ナノ構造、クロムナノ構造、銅ナノ構造、ガリウムヒ素ナノ構造、ドープシリコンナノ構造、アルミニウムナノ構造、マグネシウムナノ構造、銀及び金複合ナノ構造、並びにそれらの組合せからなる群から選択される、条項１７又は条項１８に記載の方法。
２０．当該領域が、レーンを含み、当該間隙領域が、当該レーンを取り囲む、条項１７～１９のいずれか一項に記載の方法。
２１．
当該領域が、くぼみであり、
当該パターン化材料が、複数の当該くぼみを画定し、
当該複数のくぼみの各々が、当該間隙領域によって分離されている、
条項１７～２０のいずれか一項に記載の方法。
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図1D】
【図1E】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図3D】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図6A】
【図6B】
【図6C】
【図6D】
【図7】
【国際調査報告】