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特表2023-550832ＣＤ３９およびＴＧＦβを標的とする新規のコンジュゲート分子
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-12-05
(54)【発明の名称】ＣＤ３９およびＴＧＦβを標的とする新規のコンジュゲート分子
(51)【国際特許分類】
C12N 15/62 20060101AFI20231128BHJP
C12N 15/12 20060101ALI20231128BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20231128BHJP
C12N 15/113 20100101ALI20231128BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20231128BHJP
C07K 16/28 20060101ALI20231128BHJP
C07K 14/72 20060101ALI20231128BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20231128BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20231128BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20231128BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20231128BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20231128BHJP
C12P 21/02 20060101ALI20231128BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20231128BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20231128BHJP
A61K 39/44 20060101ALI20231128BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20231128BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20231128BHJP
A61P 1/18 20060101ALI20231128BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20231128BHJP
A61P 35/02 20060101ALI20231128BHJP
A61K 47/68 20170101ALI20231128BHJP
A61P 37/06 20060101ALI20231128BHJP
A61P 31/00 20060101ALI20231128BHJP
A61P 31/18 20060101ALI20231128BHJP
A61P 31/14 20060101ALI20231128BHJP
A61P 31/20 20060101ALI20231128BHJP
A61P 1/04 20060101ALI20231128BHJP
A61P 7/00 20060101ALI20231128BHJP
A61P 11/00 20060101ALI20231128BHJP
A61P 11/06 20060101ALI20231128BHJP
A61P 17/00 20060101ALI20231128BHJP
A61P 9/00 20060101ALI20231128BHJP
A61P 13/12 20060101ALI20231128BHJP
A61P 17/06 20060101ALI20231128BHJP
A61P 1/00 20060101ALI20231128BHJP
A61P 37/02 20060101ALI20231128BHJP
【ＦＩ】
C12N15/62 Z ZNA
C12N15/12
C12N15/13
C12N15/113 120Z
C12N15/113 140Z
C07K19/00
C07K16/28
C07K14/72
C12N15/63 Z
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
C12P21/02 C
A61K39/395 D
A61K39/395 C
A61K45/00
A61K39/395 Y
A61K39/44
A61P35/00
A61K48/00
A61P1/18
A61P43/00 105
A61P35/02
A61K47/68
A61P37/06
A61P31/00
A61P31/18
A61P31/14
A61P31/20
A61P1/04
A61P43/00 121
A61P7/00
A61P11/00
A61P11/06
A61P17/00
A61P9/00
A61P13/12
A61P17/06
A61P1/00
A61P37/02
A61K39/395 L
A61K39/395 N
A61K39/395 T
A61K39/395 S
A61K39/395 E
A61K39/395 Q
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023532306
(86)(22)【出願日】2021-11-25
(85)【翻訳文提出日】2023-07-26
(86)【国際出願番号】 CN2021133083
(87)【国際公開番号】W WO2022111576
(87)【国際公開日】2022-06-02
(31)【優先権主張番号】PCT/CN2020/132392
(32)【優先日】2020-11-27
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(31)【優先権主張番号】202111396829.4
(32)【優先日】2021-11-23
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】520502972
【氏名又は名称】エルピサイエンス（スーチョウ）・バイオファーマ，リミテッド
(71)【出願人】
【識別番号】520502983
【氏名又は名称】エルピサイエンス・バイオファーマ，リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100118902
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 修
(74)【代理人】
【識別番号】100106208
【弁理士】
【氏名又は名称】宮前 徹
(74)【代理人】
【識別番号】100196508
【弁理士】
【氏名又は名称】松尾 淳一
(74)【代理人】
【識別番号】100163784
【弁理士】
【氏名又は名称】武田 健志
(72)【発明者】
【氏名】スン，ダウェイ
(72)【発明者】
【氏名】ウー，チーハオ
(72)【発明者】
【氏名】スン，ジュン
(72)【発明者】
【氏名】ゲン，イェナン
(72)【発明者】
【氏名】ガオ，ルイ
(72)【発明者】
【氏名】タン，リリ
(72)【発明者】
【氏名】ドゥ，チンリン
(72)【発明者】
【氏名】チウ，ヤンシェン
(72)【発明者】
【氏名】アーチ，ロバート・エイチ
(72)【発明者】
【氏名】ルー，ホンタオ
【テーマコード（参考）】
4B064
4B065
4C076
4C084
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B064AG20
4B064AG27
4B064CA19
4B064CC24
4B064DA01
4B064DA05
4B065AA01X
4B065AA57X
4B065AA72X
4B065AA87X
4B065AA93Y
4B065AA94Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA24
4B065CA25
4B065CA44
4C076AA95
4C076BB01
4C076BB02
4C076BB13
4C076BB15
4C076BB16
4C076BB25
4C076CC07
4C076CC11
4C076CC14
4C076CC15
4C076CC16
4C076CC17
4C076CC18
4C076CC20
4C076CC27
4C076CC32
4C076CC35
4C076CC41
4C076EE41
4C076EE59
4C076FF31
4C076FF68
4C084AA13
4C084AA19
4C084MA02
4C084MA52
4C084MA57
4C084MA59
4C084MA65
4C084MA66
4C084NA05
4C084NA13
4C084NA14
4C084ZA511
4C084ZA512
4C084ZA601
4C084ZA602
4C084ZA661
4C084ZA662
4C084ZA681
4C084ZA682
4C084ZA811
4C084ZA812
4C084ZA891
4C084ZA892
4C084ZB051
4C084ZB052
4C084ZB081
4C084ZB082
4C084ZB211
4C084ZB212
4C084ZB261
4C084ZB262
4C084ZB271
4C084ZB272
4C084ZB321
4C084ZB322
4C084ZB331
4C084ZB332
4C084ZC751
4C085AA13
4C085AA14
4C085BB31
4C085BB33
4C085BB36
4C085BB37
4C085BB41
4C085BB43
4C085CC22
4C085CC23
4C085DD62
4C085EE01
4C085EE03
4C085GG02
4C085GG03
4C085GG04
4C085GG05
4C085GG08
4C085GG10
4H045AA10
4H045AA11
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045BA41
4H045CA42
4H045DA50
4H045DA76
4H045EA20
4H045EA28
4H045FA74
(57)【要約】
ＣＤ３９とその基質との間の相互作用を妨害することができるＣＤ３９阻害性部分、およびＴＧＦβとその受容体との間の相互作用を妨害することができるＴＧＦβ阻害性部分を含むコンジュゲート分子、これらをコードする単離されたポリヌクレオチド、これらを含む医薬組成物、ならびにそれらの使用が提供される。
【選択図】図２４
【選択図】図２４
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＣＤ３９とその基質との間の相互作用を妨害することができるＣＤ３９阻害性部分、およびＴＧＦβとその受容体との間の相互作用を妨害することができるＴＧＦβ阻害性部分を含む、コンジュゲート分子。
【請求項2】
ＣＤ３９阻害性部分がＣＤ３９とＡＴＰ／ＡＤＰとの間の相互作用を妨害することができ、かつ／またはＴＧＦβ阻害性部分がＴＧＦβとＴＧＦβ受容体との間の相互作用を妨害することができる、請求項１に記載のコンジュゲート分子。
【請求項3】
ＣＤ３９阻害性部分が、ＣＤ３９結合剤、ＣＤ３９のコード配列を標的とするＲＮＡｉ、ＣＤ３９のコード配列を標的とするアンチセンスヌクレオチド、およびＣＤ３９と競合してその基質に結合する薬剤からなる群から選択されるＣＤ３９のアンタゴニストである、請求項１又は２に記載のコンジュゲート分子。
【請求項4】
ＴＧＦβ阻害性部分が、ＴＧＦβ結合剤、ＴＧＦβのコード配列を標的とするＲＮＡｉ、ＴＧＦβのコード配列を標的とするアンチセンスヌクレオチド、およびＴＧＦβと競合してその受容体に結合する薬剤からなる群から選択されるＴＧＦβのアンタゴニストである、請求項１～３のいずれか一項に記載のコンジュゲート分子。
【請求項5】
ＣＤ３９結合剤が、ＣＤ３９を特異的に認識する抗体またはその抗原結合性断片、およびＣＤ３９に結合する低分子化合物からなる群から選択され、かつ／またはＴＧＦβ結合剤が、ＴＧＦβを特異的に認識する抗体またはその抗原結合性断片、およびＴＧＦβに結合する低分子化合物からなる群から選択される、請求項１～４のいずれか一項に記載のコンジュゲート分子。
【請求項6】
ＴＧＦβ結合ドメインに連結されたＣＤ３９結合ドメインを含む融合タンパク質である、請求項１～５のいずれか一項に記載のコンジュゲート分子。
【請求項7】
ＴＧＦβ結合ドメインが、ヒトおよび／またはマウスＴＧＦβに結合する、請求項６に記載のコンジュゲート分子。
【請求項8】
ＴＧＦβ結合ドメインが、ヒトＴＧＦβ１、ヒトＴＧＦβ２、および／またはヒトＴＧＦβ３に結合する、請求項６に記載のコンジュゲート分子。
【請求項9】
ＴＧＦβ結合ドメインが、ＴＧＦβ受容体の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を含む、請求項６～８のいずれか一項に記載のコンジュゲート分子。
【請求項10】
ＴＧＦβ受容体が、ＴＧＦβ受容体Ｉ（ＴＧＦβＲＩ）、ＴＧＦβ受容体ＩＩ（ＴＧＦβＲＩＩ）、またはＴＧＦβ受容体ＩＩＩ（ＴＧＦβＲＩＩＩ）である、請求項９に記載のコンジュゲート分子。
【請求項11】
ＥＣＤが、配列番号１６３、配列番号１６４、配列番号１６５のアミノ酸配列、またはその少なくとも８５％の配列同一性を有ししかもＴＧＦβに対する結合特異性を保持しているアミノ酸配列を含む、請求項９又は１０に記載のコンジュゲート分子。
【請求項12】
ＴＧＦβ結合ドメインが、ＴＧＦβ受容体の２つ以上のＥＣＤを含む、請求項６～１１のいずれか一項に記載のコンジュゲート分子。
【請求項13】
前記２つ以上のＥＣＤが、同じＴＧＦβ受容体に由来するか、または少なくとも２つの異なるＴＧＦβ受容体に由来する、請求項１２に記載のコンジュゲート分子。
【請求項14】
前記２つ以上のＥＣＤが、ＴＧＦβＲＩに由来する第１のＥＣＤおよびＴＧＦβＲＩＩに由来する第２のＥＣＤを含む、請求項１２に記載のコンジュゲート分子。
【請求項15】
前記２つ以上のＥＣＤが連続して作動可能に連結された、請求項１２～１４のいずれか一項に記載のコンジュゲート分子。
【請求項16】
前記２つ以上のＥＣＤが第１のリンカーを介して連結された、請求項１５に記載のコンジュゲート分子。
【請求項17】
ＴＧＦβ結合ドメインが、配列番号１６６、配列番号１６７、配列番号１６８、配列番号１６９、配列番号１７０、配列番号１７１、またはそれらの任意の組合せからなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１６に記載のコンジュゲート分子。
【請求項18】
ＣＤ３９結合ドメインがヒトＣＤ３９に結合する、請求項６～１７のいずれか一項に記載のコンジュゲート分子。
【請求項19】
ＴＧＦβ結合ドメインが、第２のリンカーを介してＣＤ３９結合ドメインに連結された、請求項６～１８のいずれか一項に記載のコンジュゲート分子。
【請求項20】
ＣＤ３９結合ドメインが抗ＣＤ３９抗体部分を含む、請求項６～１９のいずれか一項に記載のコンジュゲート分子。
【請求項21】
抗ＣＤ３９抗体部分が重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む、請求項２０に記載のコンジュゲート分子。
【請求項22】
抗ＣＤ３９抗体部分が、重鎖可変領域のカルボキシル末端に付加された重鎖定常ドメインをさらに含む、請求項２１に記載のコンジュゲート分子。
【請求項23】
抗ＣＤ３９抗体部分が、軽鎖可変領域のカルボキシル末端に付加された軽鎖定常ドメインをさらに含む、請求項２１又は２２に記載のコンジュゲート分子。
【請求項24】
ＴＧＦβ結合ドメインが、抗ＣＤ３９抗体部分の、１）重鎖可変領域のアミノ末端、２）軽鎖可変領域のアミノ末端、３）重鎖可変領域のカルボキシル末端、４）軽鎖可変領域のカルボキシル末端、５）重鎖定常領域のカルボキシル末端、および６）軽鎖定常領域のカルボキシル末端からなる群から選択される位置で抗ＣＤ３９抗体部分に連結された、請求項２１～２３のいずれか一項に記載のコンジュゲート分子。
【請求項25】
融合タンパク質が、（ｉ）抗ＣＤ３９抗体部分の重鎖可変領域に全て連結された、または（ｉｉ）抗ＣＤ３９抗体部分の軽鎖可変領域に全て連結された、２つ以上のＴＧＦβ結合ドメインを含む、請求項２１～２４のいずれか一項に記載のコンジュゲート分子。
【請求項26】
融合タンパク質が、抗ＣＤ３９抗体部分の重鎖および軽鎖可変領域にそれぞれ連結された２つ以上のＴＧＦβ結合ドメインを含む、請求項２１～２４のいずれか一項に記載のコンジュゲート分子。
【請求項27】
融合タンパク質が、抗ＣＤ３９抗体部分の重鎖定常領域に全て連結された２つ以上のＴＧＦβ結合ドメインを含む、請求項２１～２４のいずれか一項に記載のコンジュゲート分子。
【請求項28】
融合タンパク質が、抗ＣＤ３９抗体部分の軽鎖定常領域に全て連結された２つ以上のＴＧＦβ結合ドメインを含む、請求項２１～２４のいずれか一項に記載のコンジュゲート分子。
【請求項29】
融合タンパク質が、抗ＣＤ３９抗体部分の重鎖および軽鎖定常領域にそれぞれ連結された２つ以上のＴＧＦβ結合ドメインを含む、請求項２１～２４のいずれか一項に記載のコンジュゲート分子。
【請求項30】
融合タンパク質が、２、３、４、５、６つまたはそれ以上のＴＧＦβ結合ドメインを含む、請求項６～２９のいずれか一項に記載のコンジュゲート分子。
【請求項31】
第１および／または第２のリンカーが、切断可能リンカー、切断不能リンカー、ペプチドリンカー、可撓性リンカー、剛性リンカー、ヘリックスリンカー、および非ヘリックスリンカーからなる群から選択される、請求項１６～３０のいずれか一項に記載のコンジュゲート分子。
【請求項32】
第１および／または第２のリンカーがペプチドリンカーを含む、請求項３１に記載のコンジュゲート分子。
【請求項33】
ペプチドリンカーが、ＧＳリンカーを含む、請求項３２に記載のコンジュゲート分子。
【請求項34】
ＧＳリンカーが、配列番号１７７（ＧＧＧＳ）または配列番号１７３（ＧＧＧＧＳ）の１つもしくは複数の反復を含む、または配列番号１８２（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧ）のアミノ酸配列を含む、請求項３３に記載のコンジュゲート分子。
【請求項35】
抗ＣＤ３９抗体部分が、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、ならびに／またはＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含み、ａ）ＨＣＤＲ１が、ＮＹＧＭＮ（配列番号１）、ＫＹＷＭＮ（配列番号２）、ＮＹＷＭＮ（配列番号３）、ＤＴＦＬＨ（配列番号４）、ＤＹＮＭＹ（配列番号５）、およびＤＴＹＶＨ（配列番号６）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、
ｂ）ＨＣＤＲ２が、ＬＩＮＴＹＴＧＥＰＴＹＡＤＤＦＫＤ（配列番号７）、ＥＩＲＬＫＳＮＫＹＧＴＨＹＡＥＳＶＫＧ（配列番号８）、ＱＩＲＬＮＰＤＮＹＡＴＨＸ１ＡＥＳＶＫＧ（配列番号９）、Ｘ５８ＩＤＰＡＸ５９Ｘ６０ＮＩＫＹＤＰＫＦＱＧ（配列番号１５１）、ＦＩＤＰＹＮＧＹＴＳＹＮＱＫＦＫＧ（配列番号１１）、およびＲＩＤＰＡＩＤＮＳＫＹＤＰＫＦＱＧ（配列番号１２）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、
ｃ）ＨＣＤＲ３が、ＫＧＩＹＹＤＹＶＷＦＦＤＶ（配列番号１３）、ＱＬＤＬＹＷＦＦＤＶ（配列番号１４）、ＨＧＸ２ＲＧＦＡＹ（配列番号１５）、ＳＰＹＹＹＧＳＧＹＲＩＦＤＶ（配列番号１６）、ＩＹＧＹＤＤＡＹＹＦＤＹ（配列番号１７）、およびＹＹＣＡＬＹＤＧＹＮＶＹＡＭＤＹ（配列番号１８）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、
ｄ）ＬＣＤＲ１が、ＫＡＳＱＤＩＮＲＹＩＡ（配列番号１９）、ＲＡＳＱＳＩＳＤＹＬＨ（配列番号２０）、ＫＳＳＱＳＬＬＤＳＤＧＲＴＨＬＮ（配列番号２１）、ＳＡＦＳＳＶＮＹＭＨ（配列番号２２）、ＳＡＴＳＳＶＳＹＭＨ（配列番号２３）、およびＲＳＳＫＮＬＬＨＳＮＧＩＴＹＬＹ（配列番号２４）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、
ｅ）ＬＣＤＲ２が、ＹＴＳＴＬＬＰ（配列番号２５）、ＹＡＳＱＳＩＳ（配列番号２６）、ＬＶＳＫＬＤＳ（配列番号２７）、ＴＴＳＮＬＡＳ（配列番号２８）、ＳＴＳＮＬＡＳ（配列番号２９）、およびＲＡＳＴＬＡＳ（配列番号３０）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、
ｆ）ＬＣＤＲ３が、ＬＱＹＳＮＬＬＴ（配列番号３１）、ＱＮＧＨＳＬＰＬＴ（配列番号３２）、ＷＱＧＴＬＦＰＷＴ（配列番号３３）、ＱＱＲＳＴＹＰＦＴ（配列番号３４）、ＱＱＲＩＴＹＰＦＴ（配列番号３５）、およびＡＱＬＬＥＬＰＨＴ（配列番号３６）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、
Ｘ１がＹまたはＦであり、Ｘ２がＳまたはＴであり、Ｘ５８がＲまたはＫであり、Ｘ５９がＮ、Ｇ、Ｓ、またはＱであり、Ｘ６０がＧ、Ａ、またはＤである、請求項２０～３４のいずれか一項に記載のコンジュゲート分子。
【請求項36】
ａ）ＨＣＤＲ１が配列番号３のアミノ酸配列を含み、かつ／またはｂ）ＨＣＤＲ２が配列番号９のアミノ酸配列を含み、かつ／または
ｃ）ＨＣＤＲ３が配列番号１５のアミノ酸配列を含み、かつ／または
ｄ）ＬＣＤＲ１が配列番号２１のアミノ酸配列を含み、かつ／または
ｅ）ＬＣＤＲ２が配列番号２７のアミノ酸配列を含み、かつ／または
ｆ）ＬＣＤＲ３が配列番号３３のアミノ酸配列を含み、
Ｘ１およびＸ２が請求項３５に定義した通りである、請求項３５に記載のコンジュゲート分子。
【請求項37】
ＨＣＤＲ２が配列番号３７および配列番号３８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、かつ／またはＨＣＤＲ３が配列番号４０および配列番号４１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項３６に記載のコンジュゲート分子。
【請求項38】
ａ）ＨＣＤＲ１が配列番号４のアミノ酸配列を含み、かつ／またはｂ）ＨＣＤＲ２が配列番号１５１のアミノ酸配列を含み、かつ／または
ｃ）ＨＣＤＲ３が配列番号１６のアミノ酸配列を含み、かつ／または
ｄ）ＬＣＤＲ１が配列番号２２のアミノ酸配列を含み、かつ／または
ｅ）ＬＣＤＲ２が配列番号２８のアミノ酸配列を含み、かつ／または
ｆ）ＬＣＤＲ３が配列番号３４のアミノ酸配列を含み、
Ｘ５８、Ｘ５９およびＸ６０が請求項３５に定義した通りである、請求項３５に記載のコンジュゲート分子。
【請求項39】
重鎖可変領域がａ）配列番号１の配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号７の配列を含むＨＣＤＲ２、および配列番号１３の配列を含むＨＣＤＲ３、または
ｂ）配列番号２の配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号８の配列を含むＨＣＤＲ２、および配列番号１４の配列を含むＨＣＤＲ３、または
ｃ）配列番号３の配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号３７の配列を含むＨＣＤＲ２、および配列番号４０の配列を含むＨＣＤＲ３、または
ｄ）配列番号３の配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号３８の配列を含むＨＣＤＲ２、および配列番号４１の配列を含むＨＣＤＲ３、または
ｅ）配列番号４の配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号１０の配列を含むＨＣＤＲ２、および配列番号１６の配列を含むＨＣＤＲ３、または
ｆ）配列番号４の配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、および１３９からなる群から選択される配列を含むＨＣＤＲ２、ならびに配列番号１６の配列を含むＨＣＤＲ３、または
ｇ）配列番号５の配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号１１の配列を含むＨＣＤＲ２、および配列番号１７の配列を含むＨＣＤＲ３、または
ｈ）配列番号６の配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号１２の配列を含むＨＣＤＲ２、および配列番号１８の配列を含むＨＣＤＲ３
を含む、請求項３５～３８のいずれか一項に記載のコンジュゲート分子。
【請求項40】
軽鎖可変領域が、ａ）配列番号１９の配列を含むＬＣＤＲ１、配列番号２５の配列を含むＬＣＤＲ２、および配列番号３１の配列を含むＬＣＤＲ３、または
ｂ）配列番号２０の配列を含むＬＣＤＲ１、配列番号２６の配列を含むＬＣＤＲ２、および配列番号３２の配列を含むＬＣＤＲ３、または
ｃ）配列番号２１の配列を含むＬＣＤＲ１、配列番号２７の配列を含むＬＣＤＲ２、および配列番号３３の配列を含むＬＣＤＲ３、または
ｄ）配列番号２２の配列を含むＬＣＤＲ１、配列番号２８の配列を含むＬＣＤＲ２、および配列番号３４の配列を含むＬＣＤＲ３、または
ｅ）配列番号２３の配列を含むＬＣＤＲ１、配列番号２９の配列を含むＬＣＤＲ２、および配列番号３５の配列を含むＬＣＤＲ３、または
ｆ）配列番号２４の配列を含むＬＣＤＲ１、配列番号３０の配列を含むＬＣＤＲ２、および配列番号３６の配列を含むＬＣＤＲ３
を含む、請求項３５～３９のいずれか一項に記載のコンジュゲート分子。
【請求項41】
ａ）ＨＣＤＲ１が配列番号１の配列を含み、ＨＣＤＲ２が配列番号７の配列を含み、ＨＣＤＲ３が配列番号１３の配列を含み、ＬＣＤＲ１が配列番号１９の配列を含み、ＬＣＤＲ２が配列番号２５の配列を含み、ＬＣＤＲ３が配列番号３１の配列を含むか、またはｂ）ＨＣＤＲ１が配列番号２の配列を含み、ＨＣＤＲ２が配列番号８の配列を含み、ＨＣＤＲ３が配列番号１４の配列を含み、ＬＣＤＲ１が配列番号２０の配列を含み、ＬＣＤＲ２が配列番号２６の配列を含み、ＬＣＤＲ３が配列番号３２の配列を含むか、または
ｃ）ＨＣＤＲ１が配列番号３の配列を含み、ＨＣＤＲ２が配列番号３７の配列を含み、ＨＣＤＲ３が配列番号４０の配列を含み、ＬＣＤＲ１が配列番号２１の配列を含み、ＬＣＤＲ２が配列番号２７の配列を含み、ＬＣＤＲ３が配列番号３３の配列を含むか、または
ｄ）ＨＣＤＲ１が配列番号３の配列を含み、ＨＣＤＲ２が配列番号３８の配列を含み、ＨＣＤＲ３が配列番号４１の配列を含み、ＬＣＤＲ１が配列番号２１の配列を含み、ＬＣＤＲ２が配列番号２７の配列を含み、ＬＣＤＲ３が配列番号３３の配列を含むか、または
ｅ）ＨＣＤＲ１が配列番号４の配列を含み、ＨＣＤＲ２が配列番号１０の配列を含み、ＨＣＤＲ３が配列番号１６の配列を含み、ＬＣＤＲ１が配列番号２２の配列を含み、ＬＣＤＲ２が配列番号２８の配列を含み、ＬＣＤＲ３が配列番号３４の配列を含むか、または
ｆ）ＨＣＤＲ１が配列番号４の配列を含み、ＨＣＤＲ２が配列番号１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、および１３９からなる群から選択される配列を含み、ＨＣＤＲ３が配列番号１６の配列を含み、ＬＣＤＲ１が配列番号２２の配列を含み、ＬＣＤＲ２が配列番号２８の配列を含み、ＬＣＤＲ３が配列番号３４の配列を含むか、または
ｇ）ＨＣＤＲ１が配列番号５の配列を含み、ＨＣＤＲ２が配列番号１１の配列を含み、ＨＣＤＲ３が配列番号１７の配列を含み、ＬＣＤＲ１が配列番号２３の配列を含み、ＬＣＤＲ２が配列番号２９の配列を含み、ＬＣＤＲ３が配列番号３５の配列を含むか、または
ｈ）ＨＣＤＲ１が配列番号６の配列を含み、ＨＣＤＲ２が配列番号１２の配列を含み、ＨＣＤＲ３が配列番号１８の配列を含み、ＬＣＤＲ１が配列番号２４の配列を含み、ＬＣＤＲ２が配列番号３０の配列を含み、ＬＣＤＲ３が配列番号３６の配列を含む、請求項３５～４０のいずれか一項に記載のコンジュゲート分子。
【請求項42】
抗ＣＤ３９抗体部分が、１つまたは複数の重鎖フレームワーク領域ＨＦＲ１、ＨＦＲ２、ＨＦＲ３およびＨＦＲ４、ならびに／または軽鎖フレームワーク領域ＬＦＲ１、ＬＦＲ２、ＬＦＲ３およびＬＦＲ４をさらに含み、ＨＦＲ１が配列番号８４～８６、１１５、１１９～１２０、および１３１からなる群から選択される配列を含み、
ＨＦＲ２が配列番号８７～９０、および１２１～１２３からなる群から選択される配列を含み、
ＨＦＲ３が配列番号９１～９７、１１６～１１７、および１２４～１２５からなる群から選択される配列を含み、
ＨＦＲ４が配列番号７９および１１８からなる群から選択される配列を含み、
ＬＦＲ１が配列番号９８～１０３、および１２７～１２９からなる群から選択される配列を含み、
ＬＦＲ２が配列番号１０４、１０５、および１３０からなる群から選択される配列を含み、
ＬＦＲ３が配列番号１０６～１１０、および１３２～１３３からなる群から選択される配列を含み、
ＬＦＲ４が配列番号８３および１５３からなる群から選択される配列を含む、請求項３５～４１のいずれか一項に記載のコンジュゲート分子。
【請求項43】
抗ＣＤ３９抗体部分が、配列番号６０、６２、６４、６６、１４０、１４１、１４２、１４６、１４７、および３９からなる群から選択されるアミノ酸配列、またはその少なくとも８０％の配列同一性を有ししかもヒトＣＤ３９に対する特異的結合特異性を保持しているアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、ならびに配列番号６１、６３、６５、６７、１４３、１４４、１４５、１１１、１１２、および６３からなる群から選択されるアミノ酸配列、またはその少なくとも８０％の配列同一性を有ししかもヒトＣＤ３９に対する特異的結合特異性を保持しているアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含む、請求項３５～４２のいずれか一項に記載のコンジュゲート分子。
【請求項44】
抗ＣＤ３９抗体部分が、配列番号６８、７０、７２、および７４からなる群から選択されるアミノ酸配列、またはその少なくとも８０％の配列同一性を有ししかもヒトＣＤ３９に対する特異的結合特異性を保持しているアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、ならびに配列番号６９、７１、７３、および７５からなる群から選択されるアミノ酸配列、またはその少なくとも８０％の配列同一性を有ししかもヒトＣＤ３９に対する特異的結合特異性を保持しているアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含む、請求項３５～４３のいずれか一項に記載のコンジュゲート分子。
【請求項45】
抗ＣＤ３９抗体部分が、ａ）配列番号４２の配列を含む重鎖可変領域、および配列番号５１の配列を含む軽鎖可変領域、または
ｂ）配列番号４３の配列を含む重鎖可変領域、および配列番号５２の配列を含む軽鎖可変領域、または
ｃ）配列番号４４の配列を含む重鎖可変領域、および配列番号５３の配列を含む軽鎖可変領域、または
ｄ）配列番号４５の配列を含む重鎖可変領域、および配列番号５４の配列を含む軽鎖可変領域、または
ｅ）配列番号４７の配列を含む重鎖可変領域、および配列番号５６の配列を含む軽鎖可変領域、または
ｆ）配列番号４９の配列を含む重鎖可変領域、および配列番号５８の配列を含む軽鎖可変領域、または
ｇ）配列番号５０の配列を含む重鎖可変領域、および配列番号５９の配列を含む軽鎖可変領域、または
ｈ）配列番号６０の配列を含む重鎖可変領域、および配列番号６３の配列を含む軽鎖可変領域、または
ｉ）配列番号６２の配列を含む重鎖可変領域、および配列番号６３の配列を含む軽鎖可変領域、または
ｊ）配列番号６４の配列を含む重鎖可変領域、および配列番号６３の配列を含む軽鎖可変領域、または
ｋ）配列番号６６の配列を含む重鎖可変領域、および配列番号６３の配列を含む軽鎖可変領域、または
ｌ）配列番号６０の配列を含む重鎖可変領域、および配列番号６５の配列を含む軽鎖可変領域、または
ｍ）配列番号６２の配列を含む重鎖可変領域、および配列番号６５の配列を含む軽鎖可変領域、または
ｎ）配列番号６４の配列を含む重鎖可変領域、および配列番号６５の配列を含む軽鎖可変領域、または
ｏ）配列番号６６の配列を含む重鎖可変領域、および配列番号６５の配列を含む軽鎖可変領域、または
ｐ）配列番号６０の配列を含む重鎖可変領域、および配列番号６７の配列を含む軽鎖可変領域、または
ｑ）配列番号６２の配列を含む重鎖可変領域、および配列番号６７の配列を含む軽鎖可変領域、または
ｒ）配列番号６４の配列を含む重鎖可変領域、および配列番号６７の配列を含む軽鎖可変領域、または
ｓ）配列番号６６の配列を含む重鎖可変領域、および配列番号６７の配列を含む軽鎖可変領域、または
ｔ）配列番号１４０の配列を含む重鎖可変領域、および配列番号６１の配列を含む軽鎖可変領域、または
ｕ）配列番号１４１の配列を含む重鎖可変領域、および配列番号６１の配列を含む軽鎖可変領域、または
ｖ）配列番号１４２の配列を含む重鎖可変領域、および配列番号６１の配列を含む軽鎖可変領域、または
ｗ）配列番号１４０の配列を含む重鎖可変領域、および配列番号１４３の配列を含む軽鎖可変領域、または
ｘ）配列番号１４１の配列を含む重鎖可変領域、および配列番号１４３の配列を含む軽鎖可変領域、または
ｙ）配列番号１４２の配列を含む重鎖可変領域、および配列番号１４３の配列を含む軽鎖可変領域、または
ｚ）配列番号１４０の配列を含む重鎖可変領域、および配列番号１４４の配列を含む軽鎖可変領域、または
ａａ）配列番号１４１の配列を含む重鎖可変領域、および配列番号１４４の配列を含む軽鎖可変領域、または
ｂｂ）配列番号１４２の配列を含む重鎖可変領域、および配列番号１４４の配列を含む軽鎖可変領域、または
ｃｃ）配列番号１４０の配列を含む重鎖可変領域、および配列番号１４５の配列を含む軽鎖可変領域、または
ｄｄ）配列番号１４１の配列を含む重鎖可変領域、および配列番号１４５の配列を含む軽鎖可変領域、または
ｅｅ）配列番号１４２の配列を含む重鎖可変領域、および配列番号１４５の配列を含む軽鎖可変領域、または
ｆｆ）配列番号１４６の配列を含む重鎖可変領域、および配列番号１１１の配列を含む軽鎖可変領域、または
ｇｇ）配列番号１４６の配列を含む重鎖可変領域、および配列番号１１２の配列を含む軽鎖可変領域、または
ｈｈ）配列番号１４７の配列を含む重鎖可変領域、および配列番号１１１の配列を含む軽鎖可変領域、または
ｉｉ）配列番号３９の配列を含む重鎖可変領域、および配列番号６３の配列を含む軽鎖可変領域、または
ｊｊ）配列番号６８の配列を含む重鎖可変領域、および配列番号６９の配列を含む軽鎖可変領域、または
ｋｋ）配列番号７０の配列を含む重鎖可変領域、および配列番号６９の配列を含む軽鎖可変領域、または
ｌｌ）配列番号７２の配列を含む重鎖可変領域、および配列番号６９の配列を含む軽鎖可変領域、または
ｍｍ）配列番号７４の配列を含む重鎖可変領域、および配列番号６９の配列を含む軽鎖可変領域、または
ｎｎ）配列番号６８の配列を含む重鎖可変領域、および配列番号７１の配列を含む軽鎖可変領域、または
ｏｏ）配列番号７０の配列を含む重鎖可変領域、および配列番号７１の配列を含む軽鎖可変領域、または
ｐｐ）配列番号７２の配列を含む重鎖可変領域、および配列番号７１の配列を含む軽鎖可変領域、または
ｑｑ）配列番号７４の配列を含む重鎖可変領域、および配列番号７１の配列を含む軽鎖可変領域、または
ｒｒ）配列番号６８の配列を含む重鎖可変領域、および配列番号７３の配列を含む軽鎖可変領域、または
ｓｓ）配列番号７０の配列を含む重鎖可変領域、および配列番号７３の配列を含む軽鎖可変領域、または
ｔｔ）配列番号７２の配列を含む重鎖可変領域、および配列番号７３の配列を含む軽鎖可変領域、または
ｕｕ）配列番号７４の配列を含む重鎖可変領域、および配列番号７３の配列を含む軽鎖可変領域、または
ｖｖ）配列番号６８の配列を含む重鎖可変領域、および配列番号７５の配列を含む軽鎖可変領域、または
ｗｗ）配列番号７０の配列を含む重鎖可変領域、および配列番号７５の配列を含む軽鎖可変領域、または
ｘｘ）配列番号７２の配列を含む重鎖可変領域、および配列番号７５の配列を含む軽鎖可変領域、または
ｙｙ）配列番号７４の配列を含む重鎖可変領域、および配列番号７５の配列を含む軽鎖可変領域
を含む、請求項３５～４４のいずれか一項に記載のコンジュゲート分子。
【請求項46】
抗ＣＤ３９抗体部分が、１つまたは複数のアミノ酸残基の置換または修飾をさらに含み、しかもヒトＣＤ３９に対する特異的結合特異性を保持している、請求項３５～４５のいずれか一項に記載のコンジュゲート分子。
【請求項47】
前記置換または修飾のうち少なくとも１つが重鎖可変領域または軽鎖可変領域のＣＤＲ配列の１つもしくは複数の中、および／または非ＣＤＲ配列の１つもしくは複数の中にある、請求項４６に記載のコンジュゲート分子。
【請求項48】
定常領域がヒト免疫グロブリン（Ｉｇ）、または任意選択でヒトＩｇＧに由来する、請求項２１～４７のいずれか一項に記載のコンジュゲート分子。
【請求項49】
定常領域がヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、またはＩｇＭに由来する、請求項４８に記載のコンジュゲート分子。
【請求項50】
抗ＣＤ３９抗体部分がヒト化されている、請求項３５～４９のいずれか一項に記載のコンジュゲート分子。
【請求項51】
抗ＣＤ３９抗体部分が、ダイアボディ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖ断片、ジスルフィド安定化Ｆｖ断片（ｄｓＦｖ）、（ｄｓＦｖ）２、二重特異的ｄｓＦｖ（ｄｓＦｖ－ｄｓＦｖ’）、ジスルフィド安定化ダイアボディ（ｄｓダイアボディ）、単鎖抗体分子（ｓｃＦｖ）、ｓｃＦｖダイマー（二価ダイアボディ）、多重特異的抗体、ラクダ化単一ドメイン抗体、ナノボディ、ドメイン抗体、または二価ドメイン抗体である、請求項１９～５０のいずれか一項に記載のコンジュゲート分子。
【請求項52】
ＦＡＣＳアッセイによって測定して１０－８Ｍ以下のＥＣ５０でヒトＣＤ３９に特異的に結合することができる、請求項１～５１のいずれか一項に記載のコンジュゲート分子。
【請求項53】
ａ）ＦＡＣＳアッセイによって測定してヒトＣＤ３９に特異的に結合するが、マウスＣＤ３９に特異的に結合しない、ｂ）ＦＡＣＳアッセイによって測定して１０－８Ｍ以下のＥＣ５０でカニクイザルＣＤ３９に特異的に結合する、
ｃ）Ｂｉａｃｏｒｅアッセイによって測定して１０－７Ｍ以下（たとえば５×１０－８Ｍ以下、３×１０－８Ｍ以下、２×１０－８Ｍ以下、１×１０－８Ｍ以下、または８×１０－９Ｍ以下）のＫＤ値でヒトＣＤ３９に特異的に結合する、
ｄ）Ｏｃｔｅｔアッセイによって測定して１０－８Ｍ以下（たとえば８×１０－９Ｍ以下、５×１０－９Ｍ以下、４×１０－９Ｍ以下、３×１０－９Ｍ以下、１×１０－９Ｍ以下、または９×１０－１０Ｍ以下）のＫＤ値でヒトＣＤ３９に特異的に結合する、
ｅ）ＡＴＰアーゼ活性アッセイによって測定して５０ｎＭ以下（たとえば１ｎＭ以下、５ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、または３０ｎＭ以下）のＩＣ５０でＣＤ３９発現細胞中のＡＴＰアーゼ活性を阻害する、
ｆ）ＦＡＣＳアッセイによるＣＤ８０、ＣＤ８６、および／またはＣＤ４０の発現の解析によって測定して１０ｎＭ以下（たとえば５ｎＭ以下、３ｎＭ以下、２ｎＭ以下、１ｎＭ以下、０．５ｎＭ以下、または０．２ｎＭ以下）の濃度でＡＴＰ媒介単球活性化を増強することができる、
ｇ）ＩＬ－２の分泌、ＩＦＮ－γの分泌、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋のＴ細胞の増殖によって測定して２５ｎＭ以下の濃度でＰＢＭＣ中のＡＴＰ媒介Ｔ細胞活性化を増強することができる、
ｈ）ＦＡＣＳアッセイによるＣＤ８３の発現の解析によって、またはＴ細胞の増殖を促進する活性化樹状細胞（ＤＣ）の能力によって、または混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイにおけるＩＦＮ－γの産生を促進する活性化ＤＣの能力によって測定して、２５ｎＭ以下（または１０ｎＭ以下、または５ｎＭ以下、または１ｎＭ以下、または０．５ｎＭ以下）の濃度でＡＴＰ媒介ＤＣ活性化を増強することができる、
ｉ）ＦＡＣＳアッセイによって測定して１ｎＭ以下（たとえば０．１ｎＭ以下、０．０１ｎＭ以下）の濃度で（ＡＴＰから加水分解される）アデノシンによって誘導されるＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖の阻害をブロックすることができる、
ｊ）哺乳動物のＮＫ細胞またはマクロファージ細胞に依存する様式で腫瘍の成長を阻害することができる、
ｋ）Ｔ細胞の増殖、ＣＤ２５＋細胞、および生細胞集団によって測定して、ｅＡＴＰによって阻害されたヒトＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を反転させることができる、および
ｌ）ＥＬＩＳＡアッセイによって測定して５０ｎＭ以下（または１２．５ｎＭ以下、または３．１３ｎＭ以下、または０．７８ｎＭ以下、または０．２ｎＭ以下、または０．０４９ｎＭ以下、または０．０１２ｎＭ以下、または０．００３ｎＭ以下、または０．０００８ｎＭ以下）の濃度で、ＬＰＳ刺激によって誘導されたヒトマクロファージのＩＬ１βの放出を増強することができる、
からなる群から選択される１つまたは複数の特性を有する、請求項１～５２のいずれか一項に記載のコンジュゲート分子。
【請求項54】
ＣＤ３９結合ドメインが、ヒトＣＤ３９との結合について配列番号４３の配列を含む重鎖可変領域および配列番号５２の配列を含む軽鎖可変領域を含む抗体と競合する、請求項１～３４のいずれか一項に記載のコンジュゲート分子。
【請求項55】
ＣＤ３９結合ドメインが、ヒトＣＤ３９との結合について配列番号４４の配列を含む重鎖可変領域および配列番号５３の配列を含む軽鎖可変領域を含む抗体と競合するか、または配列番号４５の配列を含む重鎖可変領域および配列番号５４の配列を含む軽鎖可変領域を含む抗体と競合する、請求項１～３４のいずれか一項に記載のコンジュゲート分子。
【請求項56】
ＣＤ３９結合ドメインが、ヒトＣＤ３９との結合について配列番号４７の配列を含む重鎖可変領域および配列番号５６の配列を含む軽鎖可変領域を含む抗体と競合する、請求項１～３４のいずれか一項に記載のコンジュゲート分子。
【請求項57】
ＣＤ３９結合ドメインが、ＣＤ３９のエピトープと特異的に結合し、エピトープが、Ｑ９６、Ｎ９９、Ｅ１４３、Ｒ１４７、Ｒ１３８、Ｍ１３９、Ｅ１４２、Ｋ５、Ｅ１００、Ｄ１０７、Ｖ８１、Ｅ８２、Ｒ１１１、およびＶ１１５からなる群から選択される１つまたは複数の残基を含む、請求項１～５６のいずれか一項に記載のコンジュゲート分子。
【請求項58】
エピトープが、Ｑ９６、Ｎ９９、Ｅ１４３、およびＲ１４７からなる群から選択される１つまたは複数の残基を含む、請求項５７に記載のコンジュゲート分子。
【請求項59】
エピトープが、Ｒ１３８、Ｍ１３９、およびＥ１４２からなる群から選択される１つまたは複数の残基を含む、請求項５７に記載のコンジュゲート分子。
【請求項60】
エピトープが、Ｋ５、Ｅ１００、およびＤ１０７からなる群から選択される１つまたは複数の残基を含む、請求項５７に記載のコンジュゲート分子。
【請求項61】
エピトープが、Ｖ８１、Ｅ８２、Ｒ１１１、およびＶ１１５からなる群から選択される１つまたは複数の残基を含む、請求項５７に記載のコンジュゲート分子。
【請求項62】
ＣＤ３９結合ドメインが、配列番号１６２のアミノ酸配列を含むヒトＣＤ３９に特異的に結合する、請求項１～６１のいずれか一項に記載のコンジュゲート分子。
【請求項63】
ＣＤ３９結合ドメインが、抗体９－８Ｂ、抗体Ｔ８９５、および抗体Ｉ３９４のいずれにも由来せず、抗体９－８Ｂが配列番号４６の配列を含む重鎖可変領域および配列番号４８の配列を含む軽鎖可変領域を含み、
抗体Ｔ８９５が配列番号５５の配列を含む重鎖可変領域および配列番号５７の配列を含む軽鎖可変領域を含み、
抗体Ｉ３９４が配列番号１１３の配列を含む重鎖可変領域および配列番号１１４の配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項５６～６２のいずれか一項に記載のコンジュゲート分子。
【請求項64】
ａ）ヒトＴＧＦβ１、ヒトＴＧＦβ２、および／またはヒトＴＧＦβ３に特異的に結合する、ｂ）類似した親和性でヒトＴＧＦβ１およびマウスＴＧＦβ１に特異的に結合する、
ｃ）ＥＬＩＳＡアッセイによって測定して３×１０－１１Ｍ以下（たとえば２×１０－１１Ｍ以下、１×１０－１１Ｍ以下、０．９×１０－１１Ｍ以下、０．８×１０－１１Ｍ以下、０．７×１０－１１Ｍ以下、０．６×１０－１１Ｍ以下、０．５×１０－１１Ｍ以下）のＥＣ５０でヒトＴＧＦβ１に特異的に結合する、
ｄ）ブロッキングアッセイによって測定して４×１０－１０Ｍ以下（たとえば、３×１０－１０Ｍ以下、２×１０－１０Ｍ以下、１×１０－１０Ｍ以下、０．５×１０－１０Ｍ以下）のＩＣ５０でヒトＴＧＦβ１およびＴＧＦβＲＩＩ結合をブロックすることができる、
ｅ）ＦＡＣＳアッセイによって測定して用量依存的にヒトＣＤ３９に結合することができる、
ｆ）ＥＬＩＳＡアッセイまたはＦＡＣＳアッセイによって測定してＣＤ３９およびＴＧＦβに同時に結合することができる、
ｇ）ＴＧＦ－β ＳＭＡＤレポーターアッセイによって測定して４×１０－１１Ｍ以下のＩＣ５０でＴＧＦβシグナルを阻害することができる、
ｈ）ＡＴＰアーゼ活性アッセイによって測定して７×１０－１０Ｍ以下（たとえば６×１０－１０Ｍ以下、５×１０－１０Ｍ以下、４×１０－１０Ｍ以下、３×１０－１０Ｍ以下、２×１０－１０Ｍ以下、１×１０－１０Ｍ以下、０．５×１０－１０Ｍ以下）のＩＣ５０でＣＤ３９発現細胞におけるＡＴＰアーゼ活性を阻害することができる、
ｉ）Ｏｃｔｅｔアッセイによって測定して４×１０－１０Ｍ以下（たとえば３×１０－１０Ｍ以下、２×１０－１０Ｍ以下、１×１０－１０Ｍ以下、または０．５×１０－１０Ｍ以下）のＫＤ値でヒトＣＤ３９に特異的に結合する、
ｊ）Ｏｃｔｅｔアッセイによって測定して４×１０－１１Ｍ以下（たとえば３×１０－１１Ｍ以下、２×１０－１１Ｍ以下、１×１０－１１Ｍ以下、または０．５×１０－１１Ｍ以下）のＫＤ値でヒトＴＧＦβ１に特異的に結合する、
ｋ）Ｔｒｅｇ抑制アッセイによって測定してＴ細胞機能を回復させることができる、
ｌ）用量依存的にヒトＴ細胞のアポトーシスを阻害することができる、
ｍ）刺激によるヒトＴ細胞の生存および活性化を促進することができる、
ｎ）全Ｔ細胞におけるＴＧＦβ誘導Ｆｏｘｐ３発現をブロックすることができる、
ｏ）ヒトＴ細胞増殖に対するＡＴＰ誘導阻害を回復させることができる、
からなる群から選択される１つまたは複数の特性を有する、請求項１～６３のいずれか一項に記載のコンジュゲート分子。
【請求項65】
１つまたは複数のコンジュゲート部分をさらに含む、請求項１～６４のいずれか一項に記載のコンジュゲート分子。
【請求項66】
コンジュゲート部分がクリアランス修飾剤、化学療法剤、毒素、放射性同位体、ランタニド、発光標識、蛍光標識、酵素基質標識、ＤＮＡアルキル化剤、トポイソメラーゼ阻害剤、チューブリンバインダー、精製部分、またはその他の抗がん薬物を含む、請求項６５に記載のコンジュゲート分子。
【請求項67】
請求項１～６６のいずれか一項に記載のコンジュゲート分子および１つまたは複数の薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
【請求項68】
請求項１～６７のいずれか一項に記載のコンジュゲート分子をコードする、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項69】
請求項６８に記載の単離されたポリヌクレオチドを含む、ベクター。
【請求項70】
請求項６９に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項71】
請求項１～６６のいずれか一項に記載のコンジュゲート分子、および／または請求項６７に記載の医薬組成物、ならびに第２の治療剤を含む、キット。
【請求項72】
請求項６９に記載のベクターが発現される条件下で請求項７０に記載の宿主細胞を培養するステップを含む、請求項１～６６のいずれか一項に記載のコンジュゲート分子を発現する方法。
【請求項73】
治療有効量の請求項１～６６のいずれか一項に記載のコンジュゲート分子、および／または請求項６７に記載の医薬組成物を対象に投与するステップを含む、対象におけるＣＤ３９関連および／またはＴＧＦβ関連の疾患、障害、または状態を処置し、防止し、または軽減する方法。
【請求項74】
治療有効量の請求項１～６６のいずれか一項に記載のコンジュゲート分子、および／または請求項６７に記載の医薬組成物を対象に投与するステップを含む、対象におけるＣＤ３９のＡＴＰアーゼ活性を低減させることによって処置可能な疾患を処置し、防止し、または軽減する方法。
【請求項75】
治療有効量の請求項１～６６のいずれか一項に記載のコンジュゲート分子、および／または請求項６７に記載の医薬組成物を対象に投与するステップを含む、対象におけるＴ、単球、マクロファージ、ＤＣ、ＡＰＣ、ＮＫ、および／またはＢ細胞の活性のアデノシン媒介阻害に関連する疾患を処置し、防止し、または軽減する方法。
【請求項76】
治療有効量の請求項１～６６のいずれか一項に記載のコンジュゲート分子、および／または請求項６７に記載の医薬組成物を対象に投与するステップを含む、対象におけるＴＧＦβのレベルおよび／または活性の上昇に関連する疾患を処置し、防止し、または軽減する方法。
【請求項77】
前記疾患、障害、または状態が、がん、膵萎縮症、または線維症である、請求項７３～７６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項78】
がんが、肛門がん、虫垂がん、星状細胞腫、基底細胞癌、胆嚢がん、胃がん、肺がん、気管支がん、骨がん、肝胆管がん、膵がん、乳がん、肝がん、卵巣がん、精巣がん、腎がん、腎盂尿管がん、唾液腺がん、小腸がん、尿道がん、膀胱がん、頭頚部がん、脊椎がん、脳がん、頸がん、子宮がん、子宮内膜がん、結腸がん、結腸直腸がん、直腸がん、食道がん、胃腸管がん、皮膚がん、前立腺がん、下垂体がん、膣がん、甲状腺がん、咽喉がん、膠芽細胞腫、黒色腫、骨髄異形成症候群、肉腫、奇形腫、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、ＴもしくはＢ細胞リンパ腫、ＧＩ器官間質腫、軟組織腫瘍、肝細胞癌、腺癌である、請求項７７に記載の方法。
【請求項79】
がんが、白血病、リンパ腫、膀胱がん、神経膠腫、膠芽細胞腫、卵巣がん、黒色腫、前立腺がん、甲状腺がん、食道がん、または乳がんである、請求項７７に記載の方法。
【請求項80】
対象が、任意選択で非がん細胞または非免疫抑制細胞において通常見られるレベルより有意に高いレベルで、ＣＤ３９および／またはＴＧＦβを発現しているがん細胞または腫瘍浸潤性免疫細胞もしくは免疫抑制細胞を有すると同定されている、請求項７３～７６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項81】
免疫抑制細胞が制御性Ｔ細胞である、請求項８０に記載の方法。
【請求項82】
対象が、対照の対象に通常見られる制御性Ｔ細胞の活性と比較して、腫瘍微小環境において過剰活性な制御性Ｔ細胞を有すると同定されている、請求項８１に記載の方法。
【請求項83】
対象が、免疫抑制の反転、または機能不全の疲弊したＴ細胞の反転から利益を得ることが予想される、請求項８１又は８２に記載の方法。
【請求項84】
前記疾患、障害、または状態が自己免疫疾患または感染である、請求項７３～７６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項85】
自己免疫疾患が、免疫性血小板減少症、全身性強皮症、硬化症、成人呼吸窮迫症候群、湿疹、喘息、シェーグレン症候群、アジソン病、巨細胞性動脈炎、免疫複合体性腎炎、免疫性血小板減少性紫斑病、自己免疫性血小板減少症、セリアック病、乾癬、皮膚炎、結腸炎、または全身性エリテマトーデスである、請求項８４に記載の方法。
【請求項86】
感染がＨＩＶ感染、ＨＢＶ感染、ＨＣＶ感染、炎症性腸疾患、またはクローン病である、請求項８４に記載の方法。
【請求項87】
対象がヒトである、請求項７３～８６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項88】
前記投与が経口、経鼻、静脈内、皮下、舌下、または筋肉内投与を介する、請求項７３～８７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項89】
治療有効量の第２の治療剤を投与するステップをさらに含む、請求項７３～８８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項90】
第２の治療剤が、化学療法剤、抗がん薬、放射線療法剤、免疫療法剤、抗血管新生剤、標的療法剤、細胞療法剤、遺伝子療法剤、ホルモン療法剤、抗ウイルス剤、抗生剤、鎮痛剤、抗酸化剤、金属キレート剤、およびサイトカインからなる群から選択される、請求項８９に記載の方法。
【請求項91】
ＣＤ３９陽性細胞を請求項１～６６のいずれか一項に記載のコンジュゲート分子および／または請求項６７に記載の医薬組成物に曝露するステップを含む、ＣＤ３９陽性細胞におけるＣＤ３９の活性を調節する方法。
【請求項92】
ＣＤ３９陽性細胞が免疫細胞である、請求項９１に記載の方法。
【請求項93】
対象におけるＣＤ３９関連またはＴＧＦβ関連の疾患、障害、または状態を処置し、防止し、または軽減するための医薬の製造における、請求項１～６６のいずれか一項に記載のコンジュゲート分子および／または請求項６７に記載の医薬組成物の使用。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
[001]本開示は一般に、ＣＤ３９およびＴＧＦβを標的とする新規のコンジュゲート分子に関する。
【背景技術】
【0002】
[002]ＣＤ３９は、エクト－ヌクレオシドトリホスフェートジホスホヒドロラーゼ１（ＥＮＴＰＤアーゼ１）としても知られている、ＡＴＰまたはＡＤＰをＡＭＰに変換する内在性膜タンパク質であり、次いでＣＤ７３がＡＭＰを脱ホスホリル化してアデノシンに変換する。アデノシンは強力な免疫抑制剤であり、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋Ｔ細胞、およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の表面においてアデノシン受容体（たとえばＡ２Ａ受容体）に結合し、Ｔ細胞およびＮＫ細胞の応答を阻害して、それにより免疫系を抑制する。アデノシンはまた、マクロファージおよび樹状細胞の上のＡ２ＡおよびＡ２Ｂ受容体に結合し、ファゴサイトーシスおよび抗原提示を阻害し、ＶＥＧＦ、ＴＧＦβ、およびＩＬ－６等の腫瘍促進因子の分泌を増加させる。ＣＤ３９およびＣＤ７３の酵素活性は、ＡＤＰおよびＡＴＰのＡＭＰへの変換、ならびにＡＭＰのアデノシンへの変換のそれぞれを通して免疫細胞に送達されるプリン作動性シグナルの持続期間、規模、および化学的性質の調整に重要な役割を果たしている（Ｌｕｃａ Ａｎｔｏｎｉｏｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｍｏｌ Ｍｅｄ．２０１３ Ｊｕｎ；１９（６）：３５５－３６７）。ＣＤ３９およびＣＤ７３によって媒介されるアデノシンレベルの増加は免疫抑制性環境を生成し、それによりがんの発生および進行が促進される。
【0003】
[003]トランスフォーミング成長因子ベータ（ＴＧＦβ）は、多面的なサイトカインであり、末期の原発性および転移性腫瘍において高レベルで発現し、抗増殖および腫瘍促進の両方のシグナル伝達カスケードを活性化する。腫瘍間質細胞および、乳房、大腸、肺、膵臓、前立腺、血液悪性腫瘍等多くの種類の腫瘍で、ＴＧＦβが高レベルに産生されている。ＴＧＦβは、腫瘍細胞の上皮間葉転換（ＥＭＴ）、浸潤、転移を促進するほか、インターフェロンγ（ＩＦＮ－γ）の発現抑制、Ｔｈ１細胞の分化抑制、ＣＤ８＋エフェクター細胞の機能減退等のメカニズムにより、腫瘍が免疫監視から逃れられるようにする。最も重要なことは、ＴＧＦβが制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の分化を誘導することである。Ｔｒｅｇは、免疫抑制性サイトカイン（ＩＬ－１０、ＴＧＦβ、ＩＬ－３５）の産生、阻害性分子（ＣＴＬＡ－４）の発現、ＣＤ３９を介してＡＴＰをアデノシンに加水分解することにより、さらに炎症を抑制する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0004】
[004]ＣＤ３９とＴＧＦβが腫瘍に対する免疫応答を調節する役割を果たすことを考えると、たとえばがん等の疾患の処置のために、ＣＤ３９活性、あるいはＣＤ３９とＴＧＦβの両方の活性に拮抗する治療剤へのニーズが依然としてある。
【課題を解決するための手段】
【0005】
[005]本開示を通して、冠詞「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、本明細書において、その冠詞の文法的目的物の１つまたはそれ超（即ち、少なくとも１つ）を意味するために用いられる。例として、「抗体」は１つの抗体または２つ以上の抗体を意味する。
【0006】
[006]１つの観点では、本開示は、ＣＤ３９とその基質との間の相互作用を妨害することができるＣＤ３９阻害性部分、およびＴＧＦβとその受容体との間の相互作用を妨害することができるＴＧＦβ阻害性部分を含むコンジュゲート分子を提供する。
【0007】
[007]ある特定の実施形態では、ＣＤ３９阻害性部分はＣＤ３９とＡＴＰ／ＡＤＰとの間の相互作用を妨害することができ、かつ／またはＴＧＦβ阻害性部分がＴＧＦβとＴＧＦβ受容体との間の相互作用を妨害することができる。ある特定の実施形態では、ＣＤ３９阻害性部分は、ＣＤ３９結合剤、ＣＤ３９のコード配列を標的とするＲＮＡｉ、ＣＤ３９のコード配列を標的とするアンチセンスヌクレオチド、およびＣＤ３９と競合してその基質に結合する薬剤からなる群から選択されるＣＤ３９のアンタゴニストである。ある特定の実施形態では、ＴＧＦβ阻害性部分が、ＴＧＦβ結合剤、ＴＧＦβのコード配列を標的とするＲＮＡｉ、ＴＧＦβのコード配列を標的とするアンチセンスヌクレオチド、およびＴＧＦβと競合してその受容体に結合する薬剤からなる群から選択されるＴＧＦβのアンタゴニストである。ある特定の実施形態では、ＣＤ３９結合剤は、ＣＤ３９を特異的に認識する抗体もしくはその抗原結合性断片、およびＣＤ３９に結合する低分子化合物からなる群から選択され、かつ／またはＴＧＦβ結合剤は、ＴＧＦβを特異的に認識する抗体もしくはその抗原結合性断片、およびＴＧＦβに結合する低分子化合物からなる群から選択される。
【0008】
[008]ある特定の実施形態では、コンジュゲート分子は、ＴＧＦβ結合ドメインに連結されたＣＤ３９結合ドメインを含む融合タンパク質である。ある特定の実施形態では、ＴＧＦβ結合ドメインは、ヒトおよび／またはマウスＴＧＦβに結合する。ある特定の実施形態では、ＴＧＦβ結合ドメインは、ヒトＴＧＦβ１、ヒトＴＧＦβ２、および／またはヒトＴＧＦβ３に結合する。ある特定の実施形態では、ＴＧＦβ結合ドメインは、ＴＧＦβ受容体の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を含む。ある特定の実施形態では、ＴＧＦβ受容体は、ＴＧＦβ受容体Ｉ（ＴＧＦβＲＩ）、ＴＧＦβ受容体ＩＩ（ＴＧＦβＲＩＩ）、またはＴＧＦβ受容体ＩＩＩ（ＴＧＦβＲＩＩＩ）である。ある特定の実施形態では、ＥＣＤは、配列番号１６３、配列番号１６４、配列番号１６５のアミノ酸配列、またはその少なくとも８５％の配列同一性を有ししかもＴＧＦβに対する結合特異性を保持しているアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、ＴＧＦβ結合ドメインは、ＴＧＦβ受容体の２つ以上のＥＣＤを含む。ある特定の実施形態では、２つ以上のＥＣＤは、同じＴＧＦβ受容体に由来するか、または少なくとも２つの異なるＴＧＦβ受容体に由来する。ある特定の実施形態では、２つ以上のＥＣＤは、ＴＧＦβＲＩに由来する第１のＥＣＤおよびＴＧＦβＲＩＩに由来する第２のＥＣＤを含む。ある特定の実施形態では、２つ以上のＥＣＤは連続して作動可能に連結される。ある特定の実施形態では、２つ以上のＥＣＤは第１のリンカーを介して連結される。ある特定の実施形態では、ＴＧＦβ結合ドメインは、配列番号１６６、配列番号１６７、配列番号１６８、配列番号１６９、配列番号１７０、配列番号１７１、またはそれらの任意の組合せからなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【0009】
[009]ある特定の実施形態では、ＣＤ３９結合ドメインは、ヒトＣＤ３９に結合する。ある特定の実施形態では、ＴＧＦβ結合ドメインは、第２のリンカーを介してＣＤ３９結合ドメインに連結される。ある特定の実施形態では、ＣＤ３９結合ドメインは、抗ＣＤ３９抗体部分を含む。ある特定の実施形態では、抗ＣＤ３９抗体部分は重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む。ある特定の実施形態では、抗ＣＤ３９抗体部分は、重鎖可変領域のカルボキシル末端に付加された重鎖定常ドメインをさらに含む。ある特定の実施形態では、抗ＣＤ３９抗体部分は、軽鎖可変領域のカルボキシル末端に付加された軽鎖定常ドメインをさらに含む。ある特定の実施形態では、ＴＧＦβ結合ドメインは、抗ＣＤ３９抗体部分の、１）重鎖可変領域のアミノ末端、２）軽鎖可変領域のアミノ末端、３）重鎖可変領域のカルボキシル末端、４）軽鎖可変領域のカルボキシル末端、５）重鎖定常領域のカルボキシル末端、および６）軽鎖定常領域のカルボキシル末端からなる群から選択される位置で抗ＣＤ３９抗体部分に連結される。
【0010】
[0010]ある特定の実施形態では、融合タンパク質は、（ｉ）抗ＣＤ３９抗体部分の重鎖可変領域に全て連結された、または（ｉｉ）抗ＣＤ３９抗体部分の軽鎖可変領域に全て連結された、２つ以上のＴＧＦβ結合ドメインを含む。ある特定の実施形態では、融合タンパク質は、抗ＣＤ３９抗体部分の重鎖および軽鎖可変領域にそれぞれ連結された２つ以上のＴＧＦβ結合ドメインを含む。ある特定の実施形態では、融合タンパク質は、抗ＣＤ３９抗体部分の重鎖定常領域に全て連結された２つ以上のＴＧＦβ結合ドメインを含む。ある特定の実施形態では、融合タンパク質は、抗ＣＤ３９抗体部分の軽鎖定常領域に全て連結された２つ以上のＴＧＦβ結合ドメインを含む。融合タンパク質は、抗ＣＤ３９抗体部分の重鎖および軽鎖定領域にそれぞれ連結された２つ以上のＴＧＦβ結合ドメインを含む。
【0011】
[0011]ある特定の実施形態では、融合タンパク質は、２、３、４、５、６つまたはそれ以上のＴＧＦβ結合ドメインを含む。ある特定の実施形態では、第１および／または第２のリンカーは、切断可能リンカー、切断不能リンカー、ペプチドリンカー、可撓性リンカー、剛性リンカー、ヘリックスリンカー、および非ヘリックスリンカーからなる群から選択される。ある特定の実施形態では、第１および／または第２のリンカーはペプチドリンカーを含む。ある特定の実施形態では、ペプチドリンカーは、ＧＳリンカーを含む。ある特定の実施形態では、ＧＳリンカーは、配列番号１７７（ＧＧＧＳ）または配列番号１７３（ＧＧＧＧＳ）の１つもしくは複数の反復を含む。ある特定の実施形態では、ペプチドリンカーは、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧ（配列番号１８２）のアミノ酸配列を含む。
【0012】
[0012]別の態様では、本開示は、本開示のコンジュゲート分子、および１つまたは複数の薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。別の態様では、本開示は、本開示のコンジュゲート分子をコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。別の態様では、本開示は、本開示の単離されたポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。別の態様では、本開示は、本開示のベクターを含む宿主細胞を提供する。別の態様では、本開示は、本開示のコンジュゲート分子および／または本開示の医薬組成物、ならびに第２の治療剤を含むキットを提供する。
【0013】
[0013]別の態様では、本開示は、本開示のベクターが発現される条件下で本開示の宿主細胞を培養するステップを含む、本開示のコンジュゲート分子を発現する方法を提供する。別の態様では、本開示は、治療有効量の本開示のコンジュゲート分子、および／または本開示の医薬組成物を対象に投与するステップを含む、対象におけるＣＤ３９関連および／またはＴＧＦβ関連の疾患、障害、または状態を処置し、防止し、または軽減する方法を提供する。別の態様では、本開示は、治療有効量の本開示のコンジュゲート分子、および／または本開示の医薬組成物を対象に投与するステップを含む、対象におけるＣＤ３９のＡＴＰアーゼ活性を低減させることによって処置可能な疾患を処置し、防止し、または軽減する方法を提供する。別の態様では、本開示は、治療有効量の本開示のコンジュゲート分子、および／または本開示の医薬組成物を対象に投与するステップを含む、対象におけるＴ、単球、マクロファージ、ＤＣ、ＡＰＣ、ＮＫおよび／またはＢ細胞の活性のアデノシン媒介阻害に関連する疾患を処置し、防止し、または軽減する方法を提供する。別の態様では、本開示は、ＣＤ３９陽性細胞を本開示のコンジュゲート分子および／または本開示の医薬組成物に曝露するステップを含む、ＣＤ３９陽性細胞におけるＣＤ３９の活性を調節する方法を提供する。
【0014】
[0014]別の態様では、本開示は、治療有効量の本開示のコンジュゲート分子、および／または本開示の医薬組成物を対象に投与するステップを含む、対象におけるＴＧＦβのレベルおよび／または活性の上昇に関連する疾患を処置し、防止し、または軽減する方法を提供する。別の態様では、本開示は、対象におけるＣＤ３９関連またはＴＧＦβ関連の疾患、障害、または状態を処置し、防止し、または軽減するための医薬の製造における、本開示のコンジュゲート分子および／または本開示の医薬組成物の使用を提供する。
【図面の簡単な説明】
【0015】
【図4-1】[0018]図４Ａ～４Ｃは、ＦＡＣＳを用いたＣＤ８６（図４Ａ）、ＣＤ８３（図４Ｂ）、及びＨＬＡ－ＤＲ（図４Ｃ）の発現によって測定した抗ＣＤ３９キメラ抗体ｃ１４、ｃ１９、ｃ２１、およびｃ２３によるＡＴＰ媒介ＤＣ活性化を示す。
【図4-2】同上。
【図6】[0020]図６Ａは、ヒト化抗体ｈｕ２３．Ｈ５Ｌ５のＥＮＴＰＤ１（即ちＣＤ３９）、ＥＮＴＰＤ２（即ちＣＤ３９Ｌ１）、ＥＮＴＰＤ３（即ちＣＤ３９Ｌ３）、ＥＮＴＰＤ５（即ちＣＤ３９Ｌ４）、およびＥＮＴＰＤ６（即ちＣＤ３９Ｌ２）タンパク質それぞれに対する結合特性を示す。図６Ｂは、陰性対照ｈＩｇＧ４のＥＮＴＰＤ１（即ちＣＤ３９）、ＥＮＴＰＤ２（即ちＣＤ３９Ｌ１）、ＥＮＴＰＤ３（即ちＣＤ３９Ｌ３）、ＥＮＴＰＤ５（即ちＣＤ３９Ｌ４）、およびＥＮＴＰＤ６（即ちＣＤ３９Ｌ２）タンパク質それぞれに対する結合を示す。
【図10-2】同上。
【図11-1】[0025]図１１Ａ～１１Ｄは、ＩＬ－２（図１１Ａ）、ＩＦＮ－γ（図１１Ｂ）、ＣＤ４＋Ｔ細胞増殖（図１１Ｃ）、及びＣＤ８＋Ｔ細胞増殖（図１１Ｄ）によって測定したヒト化抗体ｈｕ２３．Ｈ５Ｌ５によるＰＭＢＣ中のＡＴＰ媒介Ｔ細胞活性化を示す。
【図11-2】同上。
【図12-1】[0026]図１２Ａ～１２Ｅは、ＦＡＣＳによるヒト化抗体ｈｕ２３．Ｈ５Ｌ５およびｈｕ１４．Ｈ１Ｌ１の、ＳＫ－ＭＥＬ－５細胞（図１２Ａ）、ＳＫ－ＭＥＬ－２８細胞（図１２Ｂ）、ＭＯＬＰ－８細胞（図１２Ｃ）、ＣＨＯＫ１－ｃｙｎｏＣＤ３９細胞（図１２Ｄ）、及びＣＨＯＫ１－ｍＣＤ３９細胞（図１２Ｅ）との結合活性を示す。
【図12-2】同上。
【図12-3】同上。
【図13】[0027]図１３Ａは、ＳＫ－ＭＥＬ－５細胞におけるヒト化抗体ｈｕ２３．Ｈ５Ｌ５およびｈｕ１４．Ｈ１Ｌ１によるＡＴＰアーゼ阻害活性を示す。図１３Ｂは、ＭＯＬＰ－８細胞におけるヒト化抗体ｈｕ２３．Ｈ５Ｌ５およびｈｕ１４．Ｈ１Ｌ１によるＡＴＰアーゼ阻害活性を示す。
【図14-1】[0028]図１４Ａ～１４Ｃは、ＣＤ８０（図１４Ａ）、ＣＤ８６（図１４Ｂ）、及びＣＤ４０（図１４Ｃ）の発現によって測定した抗ＣＤ３９ヒト化抗体ｈｕ２３．Ｈ５Ｌ５によるＡＴＰ媒介単球活性化を示す。
【図14-2】同上。
【図15-1】[0029]図１５は、ＣＤ８３の発現（図１５Ａ）、増強されたＴ細胞の増殖（図１５Ｂ）、及びＴ細胞の活性化（図１５Ｃ）によって測定してヒト化抗体ｈｕ２３．Ｈ５Ｌ５がＡＴＰ媒介ＤＣ活性化を増加させることを示す。
【図15-2】同上。
【図15-3】同上。
【図19-2】同上。
【図21】[0035]図２１は、ＰＢＭＣ養子マウスにおける異なる用量（０．０３ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ）のヒト化抗体ｈｕ２３．Ｈ５Ｌ５の腫瘍成長阻害を示す。
【図23-1】[0037]図２３Ａ～２３Ｃは、Ｔ細胞の増殖（図２３Ａ）、ＣＤ２５＋細胞（図２３Ｂ）、及び生細胞集団（図２３Ｃ）によって測定したヒト化抗体ｈｕ２３．Ｈ５Ｌ５によって反転された細胞外ＡＴＰ阻害ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を示す。
【図23-2】同上。
【図24-2】同上。
【図24-3】同上。
【図24-4】同上。
【図24-5】同上。
【図24-6】同上。
【図24-7】同上。
【図25-1】[0039]図２５Ａ～２５Ｄは、ヒトＴＧＦβ１（図２５Ａ）、ヒトＴＧＦβ２（図２５Ｂ）、ヒトＴＧＦβ３（図２５Ｃ）およびマウスＴＧＦβ１（図２５Ｄ）への例示的な抗ＣＤ３９／ＴＧＦβ Ｔｒａｐ分子の結合特性をそれぞれ示す。
【図25-2】同上。
【図27】[0041]図２７Ａおよび２７Ｂは、ＦＡＣＳによる、ヒトＣＤ３９に対する例示的な抗ＣＤ３９／ＴＧＦβ Ｔｒａｐ分子の結合活性をＭＯＬＰ－８細胞（図２７Ａ）およびＣＨＯＫ１細胞（図２７Ｂ）を用いてそれぞれ示す。
【図28】[0042]図２８Ａおよび２８Ｂは、ＥＬＩＳＡ（図２８Ａ）およびＦＡＣＳ（図２８Ｂ）による、ヒトＣＤ３９およびＴＧＦβ１に対する例示的な抗ＣＤ３９／ＴＧＦβトラップ分子の同時結合活性をそれぞれ示す。
【図29】[0043]図２９Ａは、トランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞における例示的な抗ＣＤ３９／ＴＧＦβ Ｔｒａｐ分子のＴＧＦβレポーターアッセイの結果を示す。図２９Ｂは、異なるＣＤ３９タンパク質：抗ＣＤ３９／ＴＧＦβ Ｔｒａｐ分子比でプレインキュベートした場合の、例示的な抗ＣＤ３９／ＴＧＦβ Ｔｒａｐ分子のＴＧＦβ中和活性を示す。
【図30-1】[0044]図３０Ａ～３０Ｃは、ＭＯＬＰ－８細胞（図３０Ａおよび３０Ｂ）およびＣＨＯ細胞（図３０Ｃ）における例示的な抗ＣＤ３９／ＴＧＦβ Ｔｒａｐ分子によるＡＴＰアーゼ阻害活性をそれぞれ示す。
【図30-2】同上。
【図31-1】[0045]図３１Ａは、同種ＤＣによってプライミングされた自己Ｔ細胞へのＴｒｅｇの添加が、Ｔ細胞のＩＦＮ－γ分泌を抑制することを示す。図３１Ｂ～３１Ｄは、ＣＤ４＋Ｔ細胞増殖％（図３１Ｂ）、ＣＤ８＋Ｔ細胞増殖％（図３１Ｃ）およびＩＦＮ－γ分泌の変化（図３１Ｄ）によって測定した、ヒトＴ細胞のＴｒｅｇ媒介抑制に対する例示的な抗ＣＤ３９／ＴＧＦβ Ｔｒａｐ分子の効果を示す。
【図31-2】同上。
【図32】[0046]図３２は、示されたように、同モルの抗ＣＤ３９／ＴＧＦβ Ｔｒａｐ分子ＥＳ０１４－１およびＥＳ０１４－２、抗ＣＤ３９抗体ＥＳ０１４＿ｖ２、ＴＧＦ－ベータ Ｔｒａｐ ＥＳ０１４＿ｖ１、ならびに対照抗体ＥＳ０１４＿ｖ３で処理したヒトＴ細胞に対するアポトーシスの阻害パーセントを描写するグラフを提供する。図３２Ａは、全Ｔ細胞における初期アポトーシスの割合を示し、Ｘ軸は抗体および濃度を示し、Ｙ軸は初期Ｔ細胞アポトーシスの割合（％）を示す（Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ＋ＰＩ－）。図３２Ｂは、全Ｔ細胞における後期アポトーシスの割合を示し、Ｘ軸は抗体および濃度を示し、Ｙ軸は後期Ｔ細胞アポトーシスの割合（％）を示す（Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ＋ＰＩ＋）。
【図33】[0047]図３３は、示されたように、同モルの抗ＣＤ３９／ＴＧＦβ Ｔｒａｐ分子ＥＳ０１４－１およびＥＳ０１４－２、抗ＣＤ３９抗体ＥＳ０１４＿ｖ２、ＴＧＦ－ベータ Ｔｒａｐ ＥＳ０１４＿ｖ１、ならびに対照抗体ＥＳ０１４＿ｖ３で処理したＴ細胞の機能を描写するグラフを提供する。図３３Ａは、細胞生存率および細胞活性化に関するＦＡＣＳプロットを示し、図３３Ｂは、上清におけるＩＬ－２およびＩＦＮ－γの産生を示した。
【発明を実施するための形態】
【0016】
[0050]以下の本開示の記述は、本開示の種々の実施形態を説明することを意図しているのみである。したがって、議論する特定の改変は本開示の範囲を限定するものと解釈すべきではない。本開示の範囲から逸脱することなしに種々の等価物、変更、および改変ができることは、当業者には明らかであり、そのような等価の実施形態が本明細書に含まれるべきことが理解される。出版物、特許、および特許出願を含む本明細書で引用した全ての参照文献は、参照により全体として本明細書に組み込まれる。
【0017】
定義
[0051]本明細書で用いる用語「抗体」は、特定の抗原に結合する任意の免疫グロブリン、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多価抗体、二価抗体、一価抗体、多重特異的抗体、または二重特異的抗体を含む。天然のインタクトな抗体は２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖を含む。哺乳動物の重鎖はアルファ、デルタ、イプシロン、ガンマ、およびミューに分類され、それぞれの重鎖は可変領域（ＶＨ）ならびに第１、第２、第３、および任意選択で第４の定常領域（それぞれＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、ＣＨ４）からなる。哺乳動物の軽鎖はλまたはκと分類され、それぞれの軽鎖は可変領域（ＶＬ）および定常領域からなる。抗体は「Ｙ」の形状を有し、Ｙの軸はジスルフィド結合を介して互いに結合した２つの重鎖の第２および第３の定常領域からなる。Ｙのそれぞれのアームは、１本の軽鎖の可変および定常領域に結合した１本の重鎖の可変領域および第１の定常領域を含む。軽鎖および重鎖の可変領域は抗原の結合に関与している。両方の鎖の可変領域は一般に、相補性決定領域（ＣＤＲ）（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む軽鎖ＣＤＲ、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含む重鎖ＣＤＲ）と呼ばれる３つの高度に可変性のループを含む。本明細書で開示する抗体および抗原結合性断片のＣＤＲの境界は、Ｋａｂａｔ、ＩＭＧＴ、Ｃｈｏｔｈｉａ、またはＡｌ－Ｌａｚｉｋａｎｉの規則によって定義され、または同定されてよい（Ａｌ－Ｌａｚｉｋａｎｉ，Ｂ．，Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｃ．，Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２７３（４），９２７（１９９７）；Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．Ｄｅｃ ５；１８６（３）：６５１－６３（１９８５）；Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｃ．ａｎｄ Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６，９０１（１９８７）；Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．Ｄｅｃ ２１－２８；３４２（６２５２）：８７７－８３（１９８９）；Ｋａｂａｔ Ｅ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）；Ｍａｒｉｅ－Ｐａｕｌｅ Ｌｅｆｒａｎｃ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２７：５５－７７（２００３）；Ｍａｒｉｅ－Ｐａｕｌｅ Ｌｅｆｒａｎｃ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１（３），（２００５）；Ｍａｒｉｅ－Ｐａｕｌｅ Ｌｅｆｒａｎｃ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｂ ｃｅｌｌｓ（ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ），ｃｈａｐｔｅｒ ２６，４８１－５１４，（２０１５））。３つのＣＤＲは、ＣＤＲよりも高度に保存され、高度に可変性のループを支持するスキャフォールドを形成するフレームワーク領域（ＦＲ）（ＬＦＲ１、ＬＦＲ２、ＬＦＲ３、およびＬＦＲ４を含む軽鎖ＦＲ、ならびにＨＦＲ１、ＨＦＲ２、ＨＦＲ３、およびＨＦＲ４を含む重鎖ＦＲ）として知られる隣接する区間の間に挿入されている。重鎖および軽鎖の定常領域は抗原結合には関与しないが、種々のエフェクター機能を呈する。抗体は、その重鎖の定常領域のアミノ酸配列に基づいてクラスに割り付けられる。抗体の５つの主なクラスまたはアイソタイプはＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭであり、これらはそれぞれアルファ、デルタ、イプシロン、ガンマ、およびミュー重鎖の存在によって特徴付けられる。主な抗体クラスのいくつかは、ＩｇＧ１（ガンマ１重鎖）、ＩｇＧ２（ガンマ２重鎖）、ＩｇＧ３（ガンマ３重鎖）、ＩｇＧ４（ガンマ４重鎖）、ＩｇＡ１（アルファ１重鎖）、またはＩｇＡ２（アルファ２重鎖）等のサブクラスに分割される。
[0051]本明細書で用いる用語「抗体」は、特定の抗原に結合する任意の免疫グロブリン、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多価抗体、二価抗体、一価抗体、多重特異的抗体、または二重特異的抗体を含む。天然のインタクトな抗体は２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖を含む。哺乳動物の重鎖はアルファ、デルタ、イプシロン、ガンマ、およびミューに分類され、それぞれの重鎖は可変領域（ＶＨ）ならびに第１、第２、第３、および任意選択で第４の定常領域（それぞれＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、ＣＨ４）からなる。哺乳動物の軽鎖はλまたはκと分類され、それぞれの軽鎖は可変領域（ＶＬ）および定常領域からなる。抗体は「Ｙ」の形状を有し、Ｙの軸はジスルフィド結合を介して互いに結合した２つの重鎖の第２および第３の定常領域からなる。Ｙのそれぞれのアームは、１本の軽鎖の可変および定常領域に結合した１本の重鎖の可変領域および第１の定常領域を含む。軽鎖および重鎖の可変領域は抗原の結合に関与している。両方の鎖の可変領域は一般に、相補性決定領域（ＣＤＲ）（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む軽鎖ＣＤＲ、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含む重鎖ＣＤＲ）と呼ばれる３つの高度に可変性のループを含む。本明細書で開示する抗体および抗原結合性断片のＣＤＲの境界は、Ｋａｂａｔ、ＩＭＧＴ、Ｃｈｏｔｈｉａ、またはＡｌ－Ｌａｚｉｋａｎｉの規則によって定義され、または同定されてよい（Ａｌ－Ｌａｚｉｋａｎｉ，Ｂ．，Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｃ．，Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２７３（４），９２７（１９９７）；Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．Ｄｅｃ ５；１８６（３）：６５１－６３（１９８５）；Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｃ．ａｎｄ Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６，９０１（１９８７）；Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．Ｄｅｃ ２１－２８；３４２（６２５２）：８７７－８３（１９８９）；Ｋａｂａｔ Ｅ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）；Ｍａｒｉｅ－Ｐａｕｌｅ Ｌｅｆｒａｎｃ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２７：５５－７７（２００３）；Ｍａｒｉｅ－Ｐａｕｌｅ Ｌｅｆｒａｎｃ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１（３），（２００５）；Ｍａｒｉｅ－Ｐａｕｌｅ Ｌｅｆｒａｎｃ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｂ ｃｅｌｌｓ（ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ），ｃｈａｐｔｅｒ ２６，４８１－５１４，（２０１５））。３つのＣＤＲは、ＣＤＲよりも高度に保存され、高度に可変性のループを支持するスキャフォールドを形成するフレームワーク領域（ＦＲ）（ＬＦＲ１、ＬＦＲ２、ＬＦＲ３、およびＬＦＲ４を含む軽鎖ＦＲ、ならびにＨＦＲ１、ＨＦＲ２、ＨＦＲ３、およびＨＦＲ４を含む重鎖ＦＲ）として知られる隣接する区間の間に挿入されている。重鎖および軽鎖の定常領域は抗原結合には関与しないが、種々のエフェクター機能を呈する。抗体は、その重鎖の定常領域のアミノ酸配列に基づいてクラスに割り付けられる。抗体の５つの主なクラスまたはアイソタイプはＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭであり、これらはそれぞれアルファ、デルタ、イプシロン、ガンマ、およびミュー重鎖の存在によって特徴付けられる。主な抗体クラスのいくつかは、ＩｇＧ１（ガンマ１重鎖）、ＩｇＧ２（ガンマ２重鎖）、ＩｇＧ３（ガンマ３重鎖）、ＩｇＧ４（ガンマ４重鎖）、ＩｇＡ１（アルファ１重鎖）、またはＩｇＡ２（アルファ２重鎖）等のサブクラスに分割される。
【0018】
[0052]ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗体はその任意の抗原結合性断片を包含する。本明細書で用いる用語「抗原結合性断片」は、１つまたは複数のＣＤＲを含む抗体の一部から形成された抗体断片、または抗原に結合するが、インタクトな天然の抗体構造を含まない任意の他の抗体断片を意味する。抗原結合性断片の例には、限定なく、ダイアボディ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ断片、ジスルフィド安定化Ｆｖ断片（ｄｓＦｖ）、（ｄｓＦｖ）２、二重特異的ｄｓＦｖ（ｄｓＦｖ－ｄｓＦｖ’）、ジスルフィド安定化ダイアボディ（ｄｓダイアボディ）、単鎖抗体分子（ｓｃＦｖ）、ｓｃＦｖダイマー（二価ダイアボディ）、二重特異的抗体、多重特異的抗体、ラクダ化単鎖ドメイン抗体、ナノボディ、ドメイン抗体、または二価ドメイン抗体が含まれる。抗原結合性断片は、親抗体が結合する同じ抗原に結合することができる。
【0019】
[0053]「Ｆａｂ」は、抗体に関して、ジスルフィド結合によって単一の重鎖の可変領域および第１の定常領域に結合した単一の軽鎖（可変領域と定常領域の両方）からなる抗体の部分を意味する。
【0020】
[0054]「Ｆａｂ’」は、ヒンジ領域の一部を含むＦａｂ断片を意味する。
[0055]「Ｆ（ａｂ’）２」は、Ｆａｂ’のダイマーを意味する。
[0056]「Ｆｃ」は、抗体（たとえばＩｇＧ、ＩｇＡ、またはＩｇＤアイソタイプ）に関して、ジスルフィド結合を介して第２の重鎖の第２および第３の定常ドメインに結合した第１の重鎖の第２および第３の定常ドメインからなる抗体の部分を意味する。ＩｇＭおよびＩｇＥアイソタイプの抗体に関するＦｃは、第４の定常ドメインをさらに含む。抗体のＦｃ部分は、抗体依存性細胞媒介細胞毒性（ＡＤＣＣ）および補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）等の種々のエフェクター機能に関与しているが、抗原結合には機能しない。
[0055]「Ｆ（ａｂ’）２」は、Ｆａｂ’のダイマーを意味する。
[0056]「Ｆｃ」は、抗体（たとえばＩｇＧ、ＩｇＡ、またはＩｇＤアイソタイプ）に関して、ジスルフィド結合を介して第２の重鎖の第２および第３の定常ドメインに結合した第１の重鎖の第２および第３の定常ドメインからなる抗体の部分を意味する。ＩｇＭおよびＩｇＥアイソタイプの抗体に関するＦｃは、第４の定常ドメインをさらに含む。抗体のＦｃ部分は、抗体依存性細胞媒介細胞毒性（ＡＤＣＣ）および補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）等の種々のエフェクター機能に関与しているが、抗原結合には機能しない。
【0021】
[0057]「Ｆｖ」は、抗体に関して、完全な抗原結合部位を担う抗体の最小断片を意味する。Ｆｖ断片は、単一の重鎖の可変領域に結合した単一の軽鎖の可変領域からなる。
[0058]「単鎖Ｆｖ抗体」または「ｓｃＦｖ」は、直接またはペプチドリンカー配列を介して相互に連結された軽鎖可変領域および重鎖可変領域からなる操作された抗体を意味する（Ｈｕｓｔｏｎ ＪＳ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，８５：５８７９（１９８８））。
[0058]「単鎖Ｆｖ抗体」または「ｓｃＦｖ」は、直接またはペプチドリンカー配列を介して相互に連結された軽鎖可変領域および重鎖可変領域からなる操作された抗体を意味する（Ｈｕｓｔｏｎ ＪＳ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，８５：５８７９（１９８８））。
【0022】
[0059]「単鎖Ｆｖ－Ｆｃ抗体」または「ｓｃＦｖ－Ｆｃ」は、抗体のＦｃ領域に連結されたｓｃＦｖからなる操作された抗体を意味する。
[0060]「ラクダ化単鎖ドメイン抗体」、「重鎖抗体」、または「ＨＣＡｂ」は、２つのＶＨドメインを含み、軽鎖を含まない抗体を意味する（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ Ｌ．ａｎｄ Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ Ｓ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｄｅｃ １０；２３１（１－２）：２５－３８（１９９９）；Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ Ｓ．，Ｊ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｊｕｎ；７４（４）：２７７－３０２（２００１）；ＷＯ９４／０４６７８；ＷＯ９４／２５５９１；米国特許第６，００５，０７９号）。重鎖抗体はもともとラクダ科（ラクダ、ヒトコブラクダ、およびリャマ）に由来する。ラクダ化抗体は軽鎖を有しないが、真正の抗原結合能力を有する（Ｈａｍｅｒｓ－Ｃａｓｔｅｒｍａｎ Ｃ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．Ｊｕｎ ３；３６３（６４２８）：４４６－８（１９９３）；Ｎｇｕｙｅｎ ＶＫ．ｅｔ ａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ．Ａｐｒ；５４（１）：３９－４７（２００２）；Ｎｇｕｙｅｎ ＶＫ．ｅｔ ａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．Ｍａｙ；１０９（１）：９３－１０１（２００３））。重鎖抗体の可変ドメイン（ＶＨＨドメイン）は、適応免疫応答によって生成される既知の最小の抗原結合単位を表す（Ｋｏｃｈ－Ｎｏｌｔｅ Ｆ．ｅｔ ａｌ．，ＦＡＳＥＢ Ｊ．Ｎｏｖ；２１（１３）：３４９０－８．Ｅｐｕｂ ２００７ Ｊｕｎ １５（２００７））。
[0060]「ラクダ化単鎖ドメイン抗体」、「重鎖抗体」、または「ＨＣＡｂ」は、２つのＶＨドメインを含み、軽鎖を含まない抗体を意味する（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ Ｌ．ａｎｄ Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ Ｓ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｄｅｃ １０；２３１（１－２）：２５－３８（１９９９）；Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ Ｓ．，Ｊ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｊｕｎ；７４（４）：２７７－３０２（２００１）；ＷＯ９４／０４６７８；ＷＯ９４／２５５９１；米国特許第６，００５，０７９号）。重鎖抗体はもともとラクダ科（ラクダ、ヒトコブラクダ、およびリャマ）に由来する。ラクダ化抗体は軽鎖を有しないが、真正の抗原結合能力を有する（Ｈａｍｅｒｓ－Ｃａｓｔｅｒｍａｎ Ｃ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．Ｊｕｎ ３；３６３（６４２８）：４４６－８（１９９３）；Ｎｇｕｙｅｎ ＶＫ．ｅｔ ａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ．Ａｐｒ；５４（１）：３９－４７（２００２）；Ｎｇｕｙｅｎ ＶＫ．ｅｔ ａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．Ｍａｙ；１０９（１）：９３－１０１（２００３））。重鎖抗体の可変ドメイン（ＶＨＨドメイン）は、適応免疫応答によって生成される既知の最小の抗原結合単位を表す（Ｋｏｃｈ－Ｎｏｌｔｅ Ｆ．ｅｔ ａｌ．，ＦＡＳＥＢ Ｊ．Ｎｏｖ；２１（１３）：３４９０－８．Ｅｐｕｂ ２００７ Ｊｕｎ １５（２００７））。
【0023】
[0061]「ナノボディ」は、重鎖抗体のＶＨＨドメインおよび２つの定常ドメイン、ＣＨ２およびＣＨ３からなる抗体断片を意味する。
[0062]「ダイアボディ」または「ｄＡｂ」には、２つの抗原結合部位を有する小さな抗体断片が含まれ、断片は同じポリペプチド鎖の中でＶＬドメインに連結されたＶＨドメインを含む（ＶＨ－ＶＬまたはＶＬ－ＶＨ）（たとえばＨｏｌｌｉｇｅｒ Ｐ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．Ｊｕｌ １５；９０（１４）：６４４４－８（１９９３）；ＥＰ４０４０９７；ＷＯ９３／１１１６１を参照）。同じ鎖の中の２つのドメインの間での対形成を可能にするには短すぎるリンカーを用いることによって、ドメインは別の鎖の相補的なドメインと対を形成することを強制され、それにより２つの抗原結合部位が創出される。抗原結合部位は同じまたは異なる抗原（またはエピトープ）を標的とし得る。ある特定の実施形態では、「二重特異的ｄｓダイアボディ」は、２つの異なる抗原（またはエピトープ）を標的とするダイアボディである。
[0062]「ダイアボディ」または「ｄＡｂ」には、２つの抗原結合部位を有する小さな抗体断片が含まれ、断片は同じポリペプチド鎖の中でＶＬドメインに連結されたＶＨドメインを含む（ＶＨ－ＶＬまたはＶＬ－ＶＨ）（たとえばＨｏｌｌｉｇｅｒ Ｐ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．Ｊｕｌ １５；９０（１４）：６４４４－８（１９９３）；ＥＰ４０４０９７；ＷＯ９３／１１１６１を参照）。同じ鎖の中の２つのドメインの間での対形成を可能にするには短すぎるリンカーを用いることによって、ドメインは別の鎖の相補的なドメインと対を形成することを強制され、それにより２つの抗原結合部位が創出される。抗原結合部位は同じまたは異なる抗原（またはエピトープ）を標的とし得る。ある特定の実施形態では、「二重特異的ｄｓダイアボディ」は、２つの異なる抗原（またはエピトープ）を標的とするダイアボディである。
【0024】
[0063]「ドメイン抗体」は、重鎖の可変領域または軽鎖の可変領域のみを含む抗体断片を意味する。ある例では、２つ以上のＶＨドメインがペプチドリンカーと共有結合的に接合されて、二価または多価のドメイン抗体が創出される。二価ドメイン抗体の２つのＶＨドメインは、同じまたは異なる抗原を標的とし得る。
【0025】
[0064]本明細書で用いる用語「価」は、所与の分子の中の特定した数の抗原結合部位の存在を意味する。用語「一価」は、ただ一つの単一の抗原結合部位を有する抗体または抗原結合性断片を意味し、用語「多価」は、複数の抗原結合部位を有する抗体または抗原結合性断片を意味する。したがって、用語「二価」、「四価」、および「六価」は、抗原結合性分子の中のそれぞれ２つの結合部位、４つの結合部位、および６つの結合部位の存在を示す。一部の実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は二価である。一部の実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は四価である。
【0026】
[0065]本明細書で用いる場合、「二重特異的」抗体は、２つの異なるモノクローナル抗体に由来する断片、または１つの抗体と別のタンパク質（たとえば、ＴＧＦβ受容体）に由来する断片を有し、２つの異なるエピトープに結合することができる人工の抗体を意味する。２つのエピトープは同じ抗原の上に存在してもよく、または２つの異なる抗原の上に存在してもよい。
【0027】
[0066]ある特定の実施形態では、「ｓｃＦｖダイマー」は、別のＶＨ－ＶＬ部分と二量化した（ペプチドリンカーによって二量化された）ＶＨ－ＶＬを含む二価ダイアボディまたは二重特異的ｓｃＦｖ（ＢｓＦｖ）であり、それにより１つの部分のＶＨが他の部分のＶＬと協調して、同じ抗原（またはエピトープ）または異なる抗原（またはエピトープ）を標的とすることができる２つの結合部位を形成する。他の実施形態では、「ｓｃＦｖダイマー」は、（ペプチドリンカーによって連結された）ＶＬ１－ＶＨ２と会合した（これもペプチドリンカーによって連結した）ＶＨ１－ＶＬ２を含む二重特異的ダイアボディであり、それによりＶＨ１とＶＬ１が協調し、ＶＨ２とＶＬ２が協調して、それぞれの協調した対が異なる抗原特異性を有する。
【0028】
[0067]「ｄｓＦｖ」は、単一の軽鎖の可変領域と単一の重鎖の可変領域との間の連結がジスルフィド結合であるジスルフィド安定化Ｆｖ断片を意味する。一部の実施形態では、「（ｄｓＦｖ）２」または「（ｄｓＦｖ－ｄｓＦｖ’）」は、３つのペプチド鎖、即ちペプチドリンカー（たとえば長い可撓性リンカー）によって連結され、ジスルフィド架橋を介してそれぞれ２つのＶＬ部分に結合した２つのＶＨ部分を含む。一部の実施形態では、ｄｓＦｖ－ｄｓＦｖ’は、ジスルフィドで対を形成したそれぞれの重鎖および軽鎖が異なる抗原特異性を有する二重特異的である。
【0029】
[0068]本明細書で用いる用語「キメラ」は、１つの種に由来する重鎖および／または軽鎖の一部と、異なる種に由来する重鎖および／または軽鎖の残りとを有する抗体または抗原結合性断片を意味する。説明的な例では、キメラ抗体はヒトに由来する定常領域と、マウス等の非ヒト動物に由来する可変領域とを含んでよい。一部の実施形態では、非ヒト動物は哺乳動物、たとえばマウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、モルモット、またはハムスターである。
【0030】
[0069]本明細書で用いる用語「ヒト化」は、抗体または抗原結合性断片が非ヒト動物に由来するＣＤＲ、ヒトに由来するＦＲ領域、および適用される場合にはヒトに由来する定常領域を含むことを意味する。
【0031】
[0070]本明細書で用いる用語「親和性」は、免疫グロブリン分子（即ち抗体）またはその断片と抗原との間の非共有結合相互作用の強さを意味する。
[0071]本明細書で用いる用語「特異的結合」または「特異的に結合する」は、たとえば抗体と抗原のような２つの分子の間の非ランダム結合反応を意味する。特異的結合は、たとえば抗原と抗原結合性分子との間の結合が平衡に達したときのＫＤ値、即ち解離速度と会合速度との比（ｋｏｆｆ／ｋｏｎ）によって表される結合親和性において特徴付けることができる。ＫＤは、それだけに限らないが、表面プラスモン共鳴法、Ｏｃｔｅｔ法、ミクロスケールサーモフォレーシス法、ＨＰＬＣ－ＭＳ法、およびＦＡＣＳアッセイ法を含む当技術分野で既知の任意の従来法を用いて決定してよい。１０－６Ｍ以下（たとえば５×１０－７Ｍ以下、２×１０－７Ｍ以下、１０－７Ｍ以下、５×１０－８Ｍ以下、２×１０－８Ｍ以下、１０－８Ｍ以下、５×１０－９Ｍ以下、４×１０－９Ｍ以下、３×１０－９Ｍ以下、２×１０－９Ｍ以下、または１０－９Ｍ以下）のＫＤ値は、抗体またはその抗原結合性断片とＣＤ３９（たとえばヒトＣＤ３９）との間の特異的結合を示し得る。
[0071]本明細書で用いる用語「特異的結合」または「特異的に結合する」は、たとえば抗体と抗原のような２つの分子の間の非ランダム結合反応を意味する。特異的結合は、たとえば抗原と抗原結合性分子との間の結合が平衡に達したときのＫＤ値、即ち解離速度と会合速度との比（ｋｏｆｆ／ｋｏｎ）によって表される結合親和性において特徴付けることができる。ＫＤは、それだけに限らないが、表面プラスモン共鳴法、Ｏｃｔｅｔ法、ミクロスケールサーモフォレーシス法、ＨＰＬＣ－ＭＳ法、およびＦＡＣＳアッセイ法を含む当技術分野で既知の任意の従来法を用いて決定してよい。１０－６Ｍ以下（たとえば５×１０－７Ｍ以下、２×１０－７Ｍ以下、１０－７Ｍ以下、５×１０－８Ｍ以下、２×１０－８Ｍ以下、１０－８Ｍ以下、５×１０－９Ｍ以下、４×１０－９Ｍ以下、３×１０－９Ｍ以下、２×１０－９Ｍ以下、または１０－９Ｍ以下）のＫＤ値は、抗体またはその抗原結合性断片とＣＤ３９（たとえばヒトＣＤ３９）との間の特異的結合を示し得る。
【0032】
[0072]本明細書で用いる「ヒトＣＤ３９との結合について競合する」能力は、第１の抗体または抗原結合性断片の、ヒトＣＤ３９と第２の抗ＣＤ３９抗体との間の結合相互作用を何らかの検出可能な程度で阻害する能力を意味する。ある特定の実施形態では、ヒトＣＤ３９との結合について競合する抗体または抗原結合性断片は、ヒトＣＤ３９と第２の抗ヒトＣＤ３９抗体との間の結合相互作用を少なくとも８５％、または少なくとも９０％阻害する。ある特定の実施形態では、この阻害は９５％より大きく、または９９％より大きくてよい。
【0033】
[0073]本明細書で用いる用語「エピトープ」は、それに抗体が結合する抗原の上の特定の原子またはアミノ酸の群を意味する。２つの抗体が抗原に対して競合的結合を示せば、それらは抗原の中の同じまたは密接に関連したエピトープに結合し得る。エピトープは線状またはコンフォメーション状（即ち、隔たれたアミノ酸残基を含む）であってよい。たとえば、抗体または抗原結合性断片が参照抗体の抗原への結合を少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％ブロックすれば、その抗体または抗原結合性断片は、参照抗体と同じ／密接に関連したエピトープと結合するとみなしてよい。
【0034】
[0074]本明細書で用いる用語「アミノ酸」は、それぞれのアミノ酸に特有の側鎖とともにアミン（－ＮＨ２）およびカルボキシル（－ＣＯＯＨ）官能基を含む有機化合物を意味する。本開示においてアミノ酸の名称は標準的な１文字または３文字のコードとして表すこともでき、それらを以下に要約する。
【0035】
【表1】
【0036】
[0075]用語「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、本明細書では相互交換可能に用いられ、アミノ酸残基のポリマーを意味する。この用語は、１つまたは複数のアミノ酸残基が対応する天然に存在するアミノ酸の人工的な化学的模倣物であるアミノ酸ポリマー、ならびに天然に存在するアミノ酸ポリマーおよび非天然に存在するアミノ酸ポリマーにも適用される。
【0037】
[0076]アミノ酸配列に関する「保存的置換」は、アミノ酸残基を、同様の物理化学的特性を有する側鎖を有する異なるアミノ酸残基で置き換えることを意味する。たとえば、保存的置換は、疎水性側鎖を有するアミノ酸残基（たとえばＭｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、およびＩｌｅ）の間で、中性親水性側鎖を有するアミノ酸残基（たとえばＣｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、およびＧｌｎ）の間で、酸性側鎖を有するアミノ酸残基（たとえばＡｓｐ、Ｇｌｕ）の間で、塩基性側鎖を有するアミノ酸残基（たとえばＨｉｓ、Ｌｙｓ、およびＡｒｇ）の間で、または芳香族側鎖を有するアミノ酸残基（たとえばＴｒｐ、Ｔｙｒ、およびＰｈｅ）の間で行うことができる。当技術分野で既知のように、保存的置換は通常、タンパク質のコンフォメーション構造において顕著な変化を生じず、したがってタンパク質の生物学的活性を保持することができる。
【0038】
[0077]本明細書で用いる用語「相同」は、最適に整列させたときに別の配列と少なくとも６０％（たとえば少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％）の配列同一性を有する核酸配列（またはその相補的ストランド）またはアミノ酸配列を意味する。
【0039】
[0078]アミノ酸配列（または核酸配列）に関する「配列同一性パーセント（％）」は、配列を整列させ、必要な場合には同一のアミノ酸（または核酸）の数が最大になるようにギャップを導入した後の、参照配列におけるアミノ酸（または核酸）残基と同一である候補配列におけるアミノ酸（または核酸）残基のパーセンテージとして定義される。換言すれば、アミノ酸配列（または核酸配列）の配列同一性パーセント（％）は、比較する参照配列に関して同一であるアミノ酸残基（または塩基）の数を、候補配列または参照配列のどちらか短い方におけるアミノ酸残基（または塩基）の全数で除することによって計算することができる。アミノ酸残基の保存的置換は、同一の残基とみなしてもよく、みなさなくてもよい。アミノ酸（または核酸）の配列同一性パーセントを計算するための整列は、たとえばＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴｐ（Ｕ．Ｓ．Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）のウェブサイトから入手可能、Ａｌｔｓｃｈｕｌ Ｓ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３－４１０（１９９０）；Ｓｔｅｐｈｅｎ Ｆ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２５：３３８９－３４０２（１９９７）も参照されたい）、ＣｌｕｓｔａｌＷ２（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅのウェブサイトから入手可能、Ｈｉｇｇｉｎｓ Ｄ．Ｇ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２６６：３８３－４０２（１９９６）；Ｌａｒｋｉｎ Ｍ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ（Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ），２３（２１）：２９４７－８（２００７）も参照されたい）、およびＡＬＩＧＮまたはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェア等の公衆利用可能なツールを用いて達成することができる。当業者であれば、ツールによって提供されるデフォルトパラメーターを用いてもよく、またはたとえば好適なアルゴリズムを選択することによって整列のために適切なパラメーターをカスタマイズしてもよい。
【0040】
[0079]本明細書で用いる「エフェクター機能」は、抗体のＦｃ領域の、Ｃ１複合体およびＦｃ受容体等のそのエフェクターへの結合に帰せられる生物学的活性を意味する。例示的なエフェクター機能には、抗体とＣ１複合体上のＣ１ｑとの相互作用によって媒介される補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）、抗体のＦｃ領域のエフェクター細胞上のＦｃ受容体への結合によって媒介される抗体依存性細胞媒介細胞毒性（ＡＤＣＣ）、およびファゴサイトーシスが含まれる。エフェクター機能は、Ｆｃ受容体結合アッセイ、Ｃ１ｑ結合アッセイ、および細胞溶解アッセイ等の種々のアッセイを用いて評価することができる。
【0041】
[0080]「単離された」物質は、天然の状態から人の手によって改変されている。「単離された」組成物または物質が天然に生じるならば、それはその元の環境から変化しもしくは除去されているか、またはその両方である。たとえば、生きている動物の中に天然に存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは「単離されて」いないが、同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、その天然の状態において共存する物質から十分に分離されて実質的に純粋な状態で存在するならば、「単離されて」いる。「単離された核酸配列」は、単離された核酸分子の配列を意味する。ある特定の実施形態では、「単離された抗体またはその抗原結合性断片」は、電気泳動法（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、等電点電気泳動、キャピラリ電気泳動等）またはクロマトグラフィー法（イオン交換クロマトグラフィーまたは逆相ＨＰＬＣ）によって決定して少なくとも６０％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の純度を有する抗体またはその抗原結合性断片を意味する。
【0042】
[0081]本明細書で用いる用語「ベクター」は、その中に遺伝要素が作動可能に挿入され、その遺伝要素の発現が生じて、それにより、その遺伝要素によってコードされるタンパク質、ＲＮＡ、またはＤＮＡが産生され、またはその遺伝要素が複製されるビヒクルを意味する。ベクターは、宿主細胞をトランスフォーム、トランスデュース、またはトランスフェクトして、それが宿主細胞の中に運搬する遺伝要素の発現を生じさせるために用い得る。ベクターの例には、プラスミド、ファージミド、コスミド、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、またはＰ１由来人工染色体（ＰＡＣ）等の人工染色体、ラムダファージまたはＭ１３ファージ等のバクテリオファージ、および動物ウイルスが含まれる。ベクターは、プロモーター配列、転写開始配列、エンハンサー配列、選択可能な要素、およびレポーター遺伝子等の発現を制御するための種々の要素を含んでよい。さらに、ベクターは複製の起点を含んでよい。ベクターは、ウイルス粒子、リポソーム、またはタンパク質コーティングを含むがこれらに限定されない、ベクターの細胞内への進入を補助する物質を含んでもよい。ベクターは発現ベクターまたはクローニングベクターであってよい。本開示は、抗体またはその抗原結合性断片をコードする本明細書で提供される核酸配列、核酸配列に作動可能に連結された少なくとも１つのプロモーター（たとえばＳＶ４０、ＣＭＶ、ＥＦ－１α）、および少なくとも１つの選択マーカーを含むベクター（たとえば発現ベクター）を提供する。
【0043】
[0082]本明細書で用いる語句「宿主細胞」は、その中に外来のポリヌクレオチドおよび／またはベクターを導入することができ、またはこれらが導入された細胞を意味する。
[0083]用語「対象」は、ヒトおよび非ヒト動物を含む。非ヒト動物は、全ての脊椎動物、たとえば哺乳動物および非ヒト霊長類、マウス、ラット、ネコ、ウサギ、ヒツジ、イヌ、雌ウシ、ニワトリ、両生類、および爬虫類等の非哺乳動物を含む。注記した場合を除いて、用語「患者」または「対象」は、本明細書では相互交換可能に用いられる。
[0083]用語「対象」は、ヒトおよび非ヒト動物を含む。非ヒト動物は、全ての脊椎動物、たとえば哺乳動物および非ヒト霊長類、マウス、ラット、ネコ、ウサギ、ヒツジ、イヌ、雌ウシ、ニワトリ、両生類、および爬虫類等の非哺乳動物を含む。注記した場合を除いて、用語「患者」または「対象」は、本明細書では相互交換可能に用いられる。
【0044】
[0084]用語「抗腫瘍活性」は、腫瘍細胞の増殖、生存性、または転移活性の低減を意味する。たとえば、抗腫瘍活性は、治療のない対照と比較して、治療中に生じる異常な細胞の増殖速度の低下、または腫瘍のサイズの安定性もしくは低減、あるいは治療による長期生存によって示すことができる。そのような活性は、異種移植モデル、同種移植モデル、マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）モデル、および抗腫瘍活性を検討するための当技術分野で既知のその他のモデルを含むがこれらに限らない許容されたｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏの腫瘍モデルを用いて評価することができる。
【0045】
[0085]本明細書で用いる疾患、障害、もしくは状態を「処置すること」またはそれらの「処置」は、疾患、障害、もしくは状態を防止しまたは軽減すること、疾患、障害、もしくは状態の発症または発生速度を遅くすること、疾患、障害、もしくは状態を発生させるリスクを低減すること、疾患、障害、もしくは状態に関連する症状の発生を防止しまたは遅延させること、疾患、障害、もしくは状態に関連する症状を低減しまたは終止させること、疾患、障害、もしくは状態を完全にまたは部分的に寛解させること、疾患、障害、もしくは状態を治癒させること、またはそれらのいくつかの組合せを含む。
【0046】
[0086]用語「診断」、「診断する」、または「診断すること」は、ＣＤ３９関連疾患の同定のような、病的な状態、疾患、または状態の同定を意味し、または特定の処置レジメンによって恩恵を受ける可能性のあるＣＤ３９関連疾患を有する対象の同定を意味する。一部の実施形態では、診断はＣＤ３９の異常な量または活性の同定を含む。一部の実施形態では、診断は対象におけるがんまたは自己免疫疾患の同定を意味する。
【0047】
[0087]本明細書で用いる場合、用語「生物学的試料」または「試料」は、目的の対象から得られまたは由来し、たとえば物理的、生化学的、化学的、および／または生理学的特徴に基づいて特徴付けおよび／または同定される、細胞および／またはその他の分子実体を含む生物学的組成物を意味する。生物学的試料は、当業者には既知の任意の方法によって得られる対象の細胞、組織、臓器、および／または生物学的流体を含むが、これらに限定されない。一部の実施形態では、生物学的試料は流体試料である。一部の実施形態では、流体試料は全血、血漿、血清、粘液（鼻漏および痰を含む）、腹水、胸膜液、胸水、唾液、尿、滑液、脳脊髄液（ＣＳＦ）、胸腔穿刺液、腹部の液、腹水、または心嚢液である。一部の実施形態では、生物学的試料は対象の心臓、肝臓、脾臓、肺、腎臓、皮膚、または血管から得られる組織または細胞である。
【0048】
[0088]用語「作動可能に連結する」または「作動可能に連結された」は、スペーサーまたはリンカーの有無にかかわらず、目的の２つ以上の生物学的配列が、それらが意図した方法で機能することを可能にする関係にあるように並置されていることを意味する。ポリペプチドに関して用いる場合、ポリペプチド配列が、連結された生成物が意図された生物学的機能を有することを可能にするような方法で連結されていることを意味することが意図される。たとえば、抗体可変領域は、抗原結合活性を有する安定な生成物を提供するように、定常領域に作動可能に連結されてよい。この用語は、ポリヌクレオチドに関しても用いられてよい。一例として、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが調節配列（たとえば、プロモーター、エンハンサー、サイレンサー配列等）に作動可能に連結されている場合、ポリヌクレオチドからのポリペプチドの調節された発現を可能にするような方法で、ポリヌクレオチド配列が連結されていることを意味することが意図される。
【0049】
[0089]アミノ酸配列（たとえば、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質）に関して用いる場合、用語「融合」または「融合した」は、たとえば化学結合または組換え手段によって、天然には存在しない単一のアミノ酸配列に２つ以上のアミノ酸配列を結合することを意味する。融合アミノ酸配列は、２つのコードポリヌクレオチド配列の遺伝子組換えにより産生してよく、組換えポリヌクレオチドを含む構築物を宿主細胞に導入する方法によって発現させることができる。
【0050】
[0090]本明細書で用いる「ＣＤ３９」は、ＥＮＴＰＤ１またはＥＮＴＰＤアーゼ１としても知られている、ＡＴＰをＡＭＰに変換する内在性膜タンパク質を意味する。構造的には、これは２つの膜貫通ドメイン、小さな細胞質ドメイン、および大きな細胞外疎水性ドメインによって特徴付けられる。ある特定の実施形態では、ＣＤ３９はヒトＣＤ３９である。本明細書で用いるＣＤ３９は、マウスおよびとりわけカニクイザル等のその他の動物種からであってよい。ヒトＣＤ３９タンパク質の例示的な配列は、ＮＣＢＩ Ｒｅｆ Ｓｅｑ Ｎｏ．ＮＰ＿００１７６７．３に開示されている。Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ（マウス）ＣＤ３９タンパク質の例示的な配列はＮＣＢＩ Ｒｅｆ Ｓｅｑ Ｎｏ．ＮＰ＿０３３９７８．１に開示されている。カニクイザル（サル）ＣＤ３９タンパク質の例示的な配列はＮＣＢＩ Ｒｅｆ Ｓｅｑ Ｎｏ．ＸＰ＿０１５３１１９４５．１に開示されている。
【0051】
[0091]ＣＤ３９に加えて、ＥＮＴＰＤアーゼファミリーは、ＥＮＴＰＤアーゼ２、３、４、５、６、７、および８（ＥＮＴＰＤ２、３、４、５、６、７、および８としても知られており、本開示では相互交換可能に用いる）を含む他のいくつかのメンバーをも含む。ＥＮＴＰＤアーゼのうち４つは、細胞外に面する触媒部位を有する典型的な細胞表面局在酵素（ＥＮＴＰＤアーゼ１、２、３、８）である。ＥＮＴＰＤアーゼ５および６は細胞内局在化を呈し、非相同発現の後で分泌を受ける。ＥＮＴＰＤアーゼ４および７は完全に細胞内局在化しており、細胞質オルガネラの管腔に面している。一部の実施形態では、本明細書で提供される抗体またはその抗原結合性断片はＣＤ３９（即ちＥＮＴＰＤアーゼ１）に特異的に結合するが、他のファミリーメンバー、たとえばＥＮＴＰＤアーゼ２、３、５、または６には結合しない。
【0052】
[0092]用語「抗ＣＤ３９抗体部分」は、ＣＤ３９（たとえば、ヒトまたはサルＣＤ３９）に特異的に結合できる抗体（その抗原結合性断片を含む）を意味し、ＣＤ３９とＴＧＦβの両方を標的とするコンジュゲート分子の一部を形成する。用語「抗ヒトＣＤ３９抗体部分」は、ヒトＣＤ３９に特異的に結合できる抗体（その抗原結合性断片を含む）を意味し、ヒトＣＤ３９とＴＧＦβの両方を標的とするコンジュゲート分子の一部を形成する。
【0053】
[0093]本明細書で用いる「ＣＤ３９関連」の疾患、障害、または状態は、ＣＤ３９の増加したまたは減少した発現または活性によって惹起され、悪化され、またはその他に関連する任意の疾患または状態を意味する。一部の実施形態では、ＣＤ３９関連の疾患、障害、または状態は、たとえば自己免疫疾患等の免疫関連障害である。一部の実施形態では、ＣＤ３９関連の疾患、障害、または状態は、たとえばがん等の過剰な細胞の増殖に関連する障害である。ある特定の実施形態では、ＣＤ３９関連の疾患または状態は、ＣＤ３９および／またはＥＮＴＰＤ１、２、３、４、５、６、７、または８遺伝子等のＣＤ３９関連遺伝子の発現または過発現において特徴付けられる。
【0054】
[0094]本明細書で用いる用語「トランスフォーミング成長因子ベータ」および「ＴＧＦβ」は、対象（たとえばヒト）由来のいずれかのＴＧＦベータの完全長、天然のアミノ酸配列を有するいずれかのＴＧＦβファミリータンパク質を意味し、潜在型、および前駆体と成熟ＴＧＦβとの関連または非関連複合体（「潜在性ＴＧＦβ」）も含まれる。本明細書におけるこのようなＴＧＦβへの言及は、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３アイソフォームおよびそれらの潜在型を含む現在同定されている形態のいずれか１つ、ならびに将来同定されるヒトＴＧＦβ種への言及であり、任意の公知のＴＧＦβの配列に由来し、配列と少なくとも約７５％、好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約８５％、さらにより好ましくは少なくとも約９０％、およびさらにより好ましくは少なくとも約９５％相同なポリペプチドが含まれると理解される。特定の用語「ＴＧＦβ１」、「ＴＧＦβ２」、および「ＴＧＦβ３」は、たとえば、Ｄｅｒｙｎｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，４７：７０７（１９８７）；Ｓｅｙｅｄｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６１：５６９３－５６９５（１９８６）；ｄｅＭａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．，６：３６７３（１９８７）；Ｋｕｐｐｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，４２：５６２（１９８８）の文献で定義されているＴＧＦ－ベータを意味する。用語「トランスフォーミング成長因子ベータ」、「ＴＧＦβ」、「ＴＧＦｂｅｔａ」、「ＴＧＦ－β」、「ＴＧＦ－ｂｅｔａ」、「ＴＧＦｂ」、「ＴＧＦ－ｂ」、「ＴＧＦＢ」、および「ＴＧＦ－Ｂ」は、本開示では相互交換可能に用いられる。
【0055】
[0095]本明細書で用いる場合、用語「ヒトＴＧＦβ１」は、ヒトＴＧＦＢ１遺伝子（たとえば、野生型ヒトＴＧＦＢ１遺伝子）によりコードされるＴＧＦβ１タンパク質を意味する。例示的な野生型ヒトＴＧＦβ１タンパク質は、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＰ＿０００６５１．３によって提供される。本明細書で用いる場合、用語「ヒトＴＧＦβ２」は、ヒトＴＧＦＢ２遺伝子（たとえば、野生型ヒトＴＧＦＢ２遺伝子）によりコードされるＴＧＦβ２タンパク質を意味する。例示的な野生型ヒトＴＧＦβ２タンパク質は、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＰ＿００１１２９０７１．１およびＮＰ＿００３２２９．１によって提供される。本明細書で用いる場合、用語「ヒトＴＧＦβ３」は、ヒトＴＧＦＢ３遺伝子（たとえば、野生型ヒトＴＧＦＢ３遺伝子）によりコードされるＴＧＦβ３タンパク質を意味する。例示的な野生型ヒトＴＧＦβ３タンパク質は、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＰ＿００３２３０．１、ＮＰ＿００１３１６８６８．１、およびＮＰ＿００１３１６８６７．１によって提供される。
【0056】
[0096]本明細書で用いる場合、用語「マウスＴＧＦβ１」、「マウスＴＧＦβ２」、および「マウスＴＧＦβ３」は、マウスＴＧＦＢ１遺伝子（たとえば、野生型マウスＴＧＦＢ１遺伝子）、マウスＴＧＦＢ２遺伝子（たとえば、野生型マウスＴＧＦＢ２遺伝子）、およびマウスＴＧＦＢ３遺伝子（たとえば、野生型マウスＴＧＦＢ３遺伝子）によってそれぞれコードされるＴＧＦβ１タンパク質、ＴＧＦβ２タンパク質およびＴＧＦβ３タンパク質を意味する。例示的な野生型マウス（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）ＴＧＦβ１タンパク質は、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＰ＿０３５７０７．１およびＣＡＡ０８９００．１によって提供される。例示的な野生型マウスＴＧＦβ２タンパク質は、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＰ＿０３３３９３．２によって提供される。例示的な野生型マウスＴＧＦβ３タンパク質は、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＡＡ４０４２２．１によって提供される。
【0057】
[0097]本明細書で用いる用語「ＴＧＦβ受容体」は、少なくとも１つのＴＧＦβアイソフォームを結合する任意の受容体を意味する。一般に、ＴＧＦβ受容体は、ＴＧＦβ受容体Ｉ（ＴＧＦβＲＩ）、ＴＧＦβ受容体ＩＩ（ＴＧＦβＲＩＩ）、またはＴＧＦβ受容体ＩＩＩ（ＴＧＦβＲＩＩＩ）である。
【0058】
[0098]ヒトに関して、用語「ＴＧＦβ受容体Ｉ」または「ＴＧＦβＲＩ」は、野生型ヒトＴＧＦβ受容体１型配列（たとえば、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＢＤ４６７５３．１のアミノ酸配列）を有する、またはＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＢＤ４６７５３．１のアミノ酸配列と実質的に同一の配列を有するポリペプチドを意味する。ＴＧＦβＲＩは、野生型配列のＴＧＦβ結合活性の少なくとも０．１％、少なくとも０．５％、少なくとも１％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２５％、少なくとも３５％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％を保持してもよい。発現されたＴＧＦβＲＩのポリペプチドは、シグナル配列を欠く。
【0059】
[0099]ヒトに関して、用語「ＴＧＦβ受容体ＩＩ」または「ＴＧＦβＲＩＩ」は、野生型ヒトＴＧＦβ受容体２型アイソフォームＡ配列（たとえば、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＰ＿００１０２００１８．１のアミノ酸配列）を有するポリペプチド、あるいは野生型ヒトＴＧＦβ受容体２型アイソフォームＢ配列（たとえば、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＰ＿００３２３３．４のアミノ酸配列）を有する、またはＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＰ＿００１０２００１８．１もしくはＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＰ＿００３２３３．４のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の配列同一性の配列を有するポリペプチドを意味する。ＴＧＦβＲＩＩは、野生型配列のＴＧＦβ結合活性の少なくとも０．１％、少なくとも０．５％、少なくとも１％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２５％、少なくとも３５％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％を保持してもよい。発現されたＴＧＦβＲＩＩのポリペプチドは、シグナル配列を欠く。
【0060】
[00100]ヒトに関して、用語「ＴＧＦβ受容体ＩＩＩ」または「ＴＧＦβＲＩＩＩ」は、野生型ヒトＴＧＦβ受容体３型アイソフォームＡ配列（たとえば、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＰ＿００３２３４．２のアミノ酸配列）を有するポリペプチド、または野生型ヒトＴＧＦβ受容体３型アイソフォームＢ配列（たとえば、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＰ＿００１１８２６１２．１のアミノ酸配列）を有する、もしくはＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＰ＿００３２３４．２およびＮＰ＿００１１８２６１２．１のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の配列同一性の配列を有するポリペプチドを意味する。ＴＧＦβＲＩＩＩは、野生型配列のＴＧＦβ結合活性の少なくとも０．１％、少なくとも０．５％、少なくとも１％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２５％、少なくとも３５％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％を保持してもよい。発現されたＴＧＦβＲＩＩＩのポリペプチドは、シグナル配列を欠く。
【0061】
[00101]本明細書で用いる「ＴＧＦβ関連」の疾患、障害、または状態は、ＴＧＦβの増加したまたは減少した発現または活性によって惹起され、悪化され、またはその他に関連する任意の疾患または状態を意味する。一部の実施形態では、ＴＧＦβ関連の疾患、障害、または状態は、たとえば自己免疫疾患等の免疫関連障害である。一部の実施形態では、ＴＧＦβ関連の疾患、障害、または状態は、たとえばがん等の過剰な細胞の増殖に関連する障害である。ある特定の実施形態では、ＴＧＦβ関連の疾患または状態は、ＴＧＦβおよび／またはＴＧＦＢ１、ＴＧＦＢ２、ＴＧＦＢ３遺伝子等のＴＧＦβ関連遺伝子の発現または過発現において特徴付けられる。
【0062】
[00102]用語「抗ＴＧＦβ抗体部分」は、ＴＧＦβ（たとえば、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３）に特異的に結合できる抗体を意味し、ＣＤ３９とＴＧＦβの両方を標的とするタンパク質の一部を形成する。用語「抗ヒトＴＧＦβ抗体部分」は、ヒトＴＧＦβに特異的に結合できる抗体を意味し、ＣＤ３９とヒトＴＧＦβの両方を標的とするタンパク質の一部を形成する。
【0063】
[00103]用語「薬学的に許容される」は、指定した担体、ビヒクル、希釈剤、賦形剤、および／または塩が一般に、その製剤を構成する他の成分と化学的におよび／または物理的に適合性があり、その受容者に生理学的に適合性があることを示す。
【0064】
[00104]本明細書で用いる用語「ＣＤ３９陽性細胞」は、細胞の表面にＣＤ３９を発現する細胞（たとえば食細胞）を意味する。
[00105]本明細書で用いる用語「経路」は、ある化合物を別の化合物に段階的なプロセスで連続して変換することができる生化学反応群を意味する。経路の第１のステップの生成物は第２のステップの基質であってよく、第２のステップの生成物は第３のステップの基質であってよい、等である。経路の構成要素は、経路の全ての基質、補因子、副産物、中間体、最終産物、任意の酵素を含む。したがって、本明細書で用いる用語「アデノシン経路」は、生化学的経路のコレクションを意味し、そのうちのいずれか１つはアデノシン、たとえばアデノシンの産生またはアデノシンの他の物質への変換を含む。本明細書で用いる用語「ＴＧＦβシグナル伝達経路」は、生化学的経路のコレクションを意味し、そのうちのいずれか１つはＴＧＦβ、たとえばＴＧＦβの産生またはＴＧＦβの他の物質への変換を含む。
[00105]本明細書で用いる用語「経路」は、ある化合物を別の化合物に段階的なプロセスで連続して変換することができる生化学反応群を意味する。経路の第１のステップの生成物は第２のステップの基質であってよく、第２のステップの生成物は第３のステップの基質であってよい、等である。経路の構成要素は、経路の全ての基質、補因子、副産物、中間体、最終産物、任意の酵素を含む。したがって、本明細書で用いる用語「アデノシン経路」は、生化学的経路のコレクションを意味し、そのうちのいずれか１つはアデノシン、たとえばアデノシンの産生またはアデノシンの他の物質への変換を含む。本明細書で用いる用語「ＴＧＦβシグナル伝達経路」は、生化学的経路のコレクションを意味し、そのうちのいずれか１つはＴＧＦβ、たとえばＴＧＦβの産生またはＴＧＦβの他の物質への変換を含む。
【0065】
[00106]本明細書で用いる用語「アンタゴニスト」は、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドの発現レベルまたは活性を阻害し、それによってタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドの量、形成、機能、および／または下流のシグナル伝達を減少させる分子を意味する。たとえば、本開示の「ＣＤ３９のアンタゴニスト」は、ＣＤ３９の発現レベルまたは活性を阻害し、それによってＣＤ３９の量、形成、機能、および／または下流のシグナル伝達を減少させる分子を意味する。別の例として、本開示の「ＴＧＦβのアンタゴニスト」は、ＴＧＦβの発現レベルまたは活性を阻害し、それによってＴＧＦβの量、形成、機能、および／または下流のシグナル伝達を減少させる分子を意味する。
【0066】
[00107]本明細書で用いる用語「コードされる」または「コードする」は、ｍＲＮＡへの転写および／またはペプチドもしくはタンパク質への翻訳が可能であることを意味する。用語「コード配列」または「遺伝子」は、ペプチドまたはタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を意味する。これらの２つの用語は、本開示では相互交換可能に用いられ得る。一部の実施形態では、コード配列は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）から逆転写される相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）配列である。一部の実施形態では、コード配列はｍＲＮＡである。
【0067】
[00108]本明細書で用いる用語「アンチセンスヌクレオチド」は、水素結合によって標的核酸にハイブリダイゼーションすることができるオリゴマー化合物を意味する。たとえば、「ＣＤ３９のコード配列を標的とするアンチセンスヌクレオチド」は、ＣＤ３９のコード配列またはその一部にハイブリダイゼーションすることができるヌクレオチドを意味する。
【0068】
ＣＤ３９およびＴＧＦβを標的とするコンジュゲート分子
[00109]現在の免疫チェックポイント阻害剤（たとえば、ＰＤ１およびＣＴＬＡ－４）の潜在的な限界は、アデノシンおよびＴＧＦβに富む腫瘍微小環境（「ＴＭＥ」）である。腫瘍浸潤性Ｔ細胞の局在微小環境におけるアデノシンおよびＴＧＦβシグナル伝達は、それらをＴｒｅｇに偏らせ、免疫エフェクター細胞の活性化を減衰させることができた。本発明者らは、新規のコンジュゲート分子によってＣＤ３９とＴＧＦβを同時に標的とすることにより、アデノシン経路（ＣＤ３９の阻害による）およびＴＧＦβシグナル伝達経路（ＴＧＦβ Ｔｒａｐを介して）の同時封鎖により、より免疫正常化したＴＭＥと相乗的な抗腫瘍効果を達成できることを予想外に見出した。実際、本発明者らは、本開示のＣＤ３９およびＴＧＦβを同時に標的とするコンジュゲート分子が、特にＴ細胞の生存、サイトカイン産生およびＴｒｅｇ抑制の点で、ＴＧＦβ受容体または抗ＣＤ３９抗体による単剤療法で観察されたものを超える相乗的抗腫瘍効果を示すことを証明した。
[00109]現在の免疫チェックポイント阻害剤（たとえば、ＰＤ１およびＣＴＬＡ－４）の潜在的な限界は、アデノシンおよびＴＧＦβに富む腫瘍微小環境（「ＴＭＥ」）である。腫瘍浸潤性Ｔ細胞の局在微小環境におけるアデノシンおよびＴＧＦβシグナル伝達は、それらをＴｒｅｇに偏らせ、免疫エフェクター細胞の活性化を減衰させることができた。本発明者らは、新規のコンジュゲート分子によってＣＤ３９とＴＧＦβを同時に標的とすることにより、アデノシン経路（ＣＤ３９の阻害による）およびＴＧＦβシグナル伝達経路（ＴＧＦβ Ｔｒａｐを介して）の同時封鎖により、より免疫正常化したＴＭＥと相乗的な抗腫瘍効果を達成できることを予想外に見出した。実際、本発明者らは、本開示のＣＤ３９およびＴＧＦβを同時に標的とするコンジュゲート分子が、特にＴ細胞の生存、サイトカイン産生およびＴｒｅｇ抑制の点で、ＴＧＦβ受容体または抗ＣＤ３９抗体による単剤療法で観察されたものを超える相乗的抗腫瘍効果を示すことを証明した。
【0069】
[00110]１つの態様では、本開示は、ＣＤ３９とその基質との間の相互作用を妨害することができるＣＤ３９阻害性部分、およびＴＧＦβとその受容体との間の相互作用を妨害することができるＴＧＦβ阻害性部分を含むコンジュゲート分子を提供する。コンジュゲート分子は、低分子、化合物（天然または合成）、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、干渉性ＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ等であってよい。ある特定の実施形態では、コンジュゲート分子は、２つ以上の異なる物質の混合物ではない（すなわち、２つ以上の異なる物質は、一緒に置かれているだけで、化学的に結合されていない）。ある特定の実施形態では、コンジュゲート分子は二機能性分子であり、ＣＤ３９とその基質との間の相互作用を妨害することができ、ＴＧＦβとその受容体との間の相互作用を妨害することができる。
【0070】
[00111]アデノシン経路は、マクロファージ、樹状細胞、骨髄由来抑制細胞、Ｔ細胞、およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞のような免疫細胞および炎症細胞の機能を制御することにより、免疫寛容な腫瘍微小環境の形成に関与している。また、アデノシン経路は、がん細胞と内皮細胞にそれぞれ発現するアデノシン受容体を介して、がん細胞の増殖、アポトーシス、血管新生を妨害することにより、がんの増殖と転移を制御する。固形腫瘍は、高レベルのＣＤ３９およびＣＤ７３、ならびに低レベルのヌクレオシドトランスポーター（ＮＴ）、エクトアデノシンデアミナーゼおよびその補因子ＣＤ２６を発現する。これは、がん環境におけるアデノシンシグナル伝達の増加をもたらす。ある特定の実施形態では、本開示のＣＤ３９阻害性部分は、ＣＤ３９とＡＴＰ／ＡＤＰとの間の相互作用を妨害することができる。ある特定の実施形態では、コンジュゲート分子のＣＤ３９阻害性部分は、がんの処置、防止または軽減に特に有用である。
【0071】
[00112]ある特定の実施形態では、コンジュゲート分子のＣＤ３９阻害性部分は、ＣＤ３９結合剤、ＣＤ３９のコード配列を標的とするＲＮＡｉ、ＣＤ３９のコード配列を標的とするアンチセンスヌクレオチド、およびＣＤ３９と競合してその基質に結合する薬剤からなる群から選択されるＣＤ３９のアンタゴニストである。
【0072】
[00113]分子がＣＤ３９の発現レベルまたは活性を阻害すると考えられるのは、分子がＣＤ３９の発現（転写または翻訳のいずれかのレベル）レベルまたは活性を有意に低下させる場合である。同様に、分子がＣＤ３９とその基質（たとえばＡＴＰまたはＡＤＰ）の間の結合を阻害すると考えられるのは、分子がＣＤ３９とその基質の間の結合を著しく低下させる場合である。これによりＣＤ３９によって媒介される下流のシグナル伝達および機能を著しく低下させる。低下は、たとえば、低下が少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％であれば、有意と考えられる。
【0073】
[00114]ＣＤ３９結合剤（アンタゴニスト）は、２つの方法で作用することができる。一部の実施形態では、本開示のＣＤ３９結合剤は、ＣＤ３９と競合してその基質に結合し、それによってＣＤ３９のその基質への結合を妨害、ブロックまたは他の方法で防止することができる。基質を結合するが、予想されるシグナル伝達を誘発しないこのタイプのアンタゴニストは、「競合アンタゴニスト」としても公知である。他の実施形態では、本開示のＣＤ３９結合剤は、ＣＤ３９のその基質への結合を実質的に妨害、ブロックまたは他の方法で防止するために、十分な親和性および特異性でＣＤ３９に結合して隔離することができる。このタイプのアンタゴニストは、「中和アンタゴニスト」としても公知であり、たとえば、ＣＤ３９に特異的に結合するＣＤ３９に向けられた抗体またはアプタマーを含むことができる。
【0074】
[00115]ある特定の実施形態では、ＣＤ３９結合剤は、ＣＤ３９を特異的に認識する抗体またはその抗原結合性断片、およびＣＤ３９に結合する低分子化合物からなる群から選択される。
【0075】
[00116]本明細書で用いる用語「低分子化合物」は、酵素基質または生物学的プロセスの調節因子として機能することができる低分子量化合物を意味する。一般に、「低分子化合物」は、サイズが約５キロダルトン（ｋＤ）未満である分子である。一部の実施形態では、低分子は、約４ｋＤ未満、３ｋＤ未満、約２ｋＤ未満、または約１ｋＤ未満である。一部の実施形態では、低分子は、約８００ダルトン（Ｄ）未満、約６００Ｄ未満、約５００Ｄ未満、約４００Ｄ未満、約３００Ｄ未満、約２００Ｄ未満、または約１００Ｄ未満である。一部の実施形態では、低分子は、約２０００ｇ／モル未満、約１５００ｇ／モル未満、約１０００ｇ／モル未満、約８００ｇ／モル未満、または約５００ｇ／モル未満である。一部の実施形態では、低分子は非ポリマーである。一部の実施形態では、本開示に従って、低分子は、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、ペプチド、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、多糖類、糖タンパク質、プロテオグリカン等ではない。一部の実施形態では、低分子は治療薬である。一部の実施形態では、低分子はアジュバントである。一部の実施形態では、低分子は薬物である。
【0076】
[00117]ある特定の実施形態では、コンジュゲート分子のＴＧＦβ阻害性部分は、ＴＧＦβとＴＧＦβ受容体との間の相互作用を妨害することができる。ある特定の実施形態では、ＴＧＦβとＴＧＦβ受容体との間の相互作用は、ＴＧＦβシグナル伝達経路内のシグナル伝達カスケードを破壊し、ＴＧＦβまたはＴＧＦβスーパーファミリーリガンドがその内因性受容体に結合することを破壊または防止し得る薬剤によってブロックされる。ＴＧＦβシグナル伝達経路阻害剤の阻害活性を決定するために使用できる例示的なアッセイには、特に限定されないが、電気泳動移動度シフトアッセイ、抗体スーパーシフトアッセイ、ならびにＷＯ２００６／０１２９５４に記載のＴＧＦβ誘導性遺伝子レポーターアッセイ等がある。
【0077】
[00118]ある特定の実施形態では、コンジュゲート分子のＴＧＦβ阻害性部分は、ＴＧＦβ結合剤、ＴＧＦβのコード配列を標的とするＲＮＡｉ、ＴＧＦβのコード配列を標的とするアンチセンスヌクレオチド、およびＴＧＦβと競合してその受容体（たとえば、ＴＧＦβＲＩ、ＴＧＦβＲＩＩ、またはＴＧＦβＲＩＩＩ）に結合する薬剤からなる群から選択されるＴＧＦβのアンタゴニストである。
【0078】
[00119]分子がＴＧＦβの発現レベルまたは活性を阻害すると考えられるのは、分子がＴＧＦβの発現（転写または翻訳のいずれかのレベル）レベルまたは活性を有意に低下させる場合である。同様に、分子がＴＧＦβとその受容体（たとえば、ＴＧＦβＲＩ、ＴＧＦβＲＩＩ、またはＴＧＦβＲＩＩＩ）の間の結合を阻害すると考えられるのは、分子がＴＧＦβとその受容体の間の結合を著しく低下させる場合である。これによりＴＧＦβによって媒介される下流のシグナル伝達および機能を著しく低下させる。低下は、たとえば、低下が少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％であれば、有意と考えられる。
【0079】
[00120]ＴＧＦβ結合剤（アンタゴニスト）は、２つの方法で作用することができる。一部の実施形態では、本開示のＴＧＦβ結合剤は、ＴＧＦβと競合してその受容体に結合し、それによってＴＧＦβはその受容体への結合を妨害、ブロックまたは他の方法で防止することができる。受容体を結合するが、予想されるシグナル伝達を誘発しないこのタイプのアンタゴニストは、「競合アンタゴニスト」としても公知である。他の実施形態では、本開示のＴＧＦβ結合剤は、ＴＧＦβのその受容体への結合を実質的に妨害、ブロックまたは他の方法で防止するために、十分な親和性および特異性でＴＧＦβに結合して隔離することができる。このタイプのアンタゴニストは、「中和アンタゴニスト」としても公知であり、たとえば、ＴＧＦβに特異的に結合するＴＧＦβに向けられた抗体またはアプタマーを含むことができる。
【0080】
[00121]ある特定の実施形態では、ＴＧＦβ結合剤は、ＴＧＦβを特異的に認識する抗体またはその抗原結合性断片、およびＴＧＦβに結合する低分子化合物からなる群から選択される。
【0081】
[00122]ある特定の実施形態では、本開示のコンジュゲート分子は、ＴＧＦβ結合ドメインに連結されたＣＤ３９結合ドメインを含む融合タンパク質である。
[00123]本明細書で用いる場合、用語「結合ドメイン」は、標的分子または複合体に特異的に結合する能力を有する部分を意味する。結合ドメインは、低分子、ペプチド、修飾ペプチド（たとえば、非天然アミノ酸残基を有するペプチド）、ポリペプチド、タンパク質、抗体またはその抗原結合性断片、リガンド、核酸、またはそれらの任意の組合せを含んでよい。たとえば、用語「ＣＤ３９結合ドメイン」は、ＣＤ３９（たとえば、ヒトおよび／またはマウスＣＤ３９）に特異的に結合する能力を有する部分を意味する。用語「ＴＧＦβ結合ドメイン」は、ＴＧＦβファミリーの１つもしくは複数のファミリーメンバーまたはアイソフォーム（たとえば、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、もしくはＴＧＦβ３）に特異的に結合する能力を有する部分を意味する。「ＴＧＦβ結合ドメイン」は、本開示において「ＴＧＦβ Ｔｒａｐ」とも称されてよい。したがって、本開示のＴＧＦβ結合ドメインに連結されたＣＤ３９結合ドメインを含むタンパク質は、本開示において「抗ＣＤ３９／ＴＧＦβ Ｔｒａｐ」とも称されてよい。
[00123]本明細書で用いる場合、用語「結合ドメイン」は、標的分子または複合体に特異的に結合する能力を有する部分を意味する。結合ドメインは、低分子、ペプチド、修飾ペプチド（たとえば、非天然アミノ酸残基を有するペプチド）、ポリペプチド、タンパク質、抗体またはその抗原結合性断片、リガンド、核酸、またはそれらの任意の組合せを含んでよい。たとえば、用語「ＣＤ３９結合ドメイン」は、ＣＤ３９（たとえば、ヒトおよび／またはマウスＣＤ３９）に特異的に結合する能力を有する部分を意味する。用語「ＴＧＦβ結合ドメイン」は、ＴＧＦβファミリーの１つもしくは複数のファミリーメンバーまたはアイソフォーム（たとえば、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、もしくはＴＧＦβ３）に特異的に結合する能力を有する部分を意味する。「ＴＧＦβ結合ドメイン」は、本開示において「ＴＧＦβ Ｔｒａｐ」とも称されてよい。したがって、本開示のＴＧＦβ結合ドメインに連結されたＣＤ３９結合ドメインを含むタンパク質は、本開示において「抗ＣＤ３９／ＴＧＦβ Ｔｒａｐ」とも称されてよい。
【0082】
[00124]ある特定の実施形態では、本開示のコンジュゲート分子は、ヒトＴＧＦβ１、ヒトＴＧＦβ２、および／またはヒトＴＧＦβ３に特異的に結合する。ある特定の実施形態では、本開示のコンジュゲート分子は、類似した親和性でヒトＴＧＦβ１およびマウスＴＧＦβ１に特異的に結合する。ある特定の実施形態では、本開示のコンジュゲート分子は、ＥＬＩＳＡアッセイによって測定して３×１０－１１Ｍ以下（たとえば２×１０－１１Ｍ以下、１×１０－１１Ｍ以下、０．９×１０－１１Ｍ以下、０．８×１０－１１Ｍ以下、０．７×１０－１１Ｍ以下、０．６×１０－１１Ｍ以下、０．５×１０－１１Ｍ以下）のＥＣ５０でヒトＴＧＦβ１に特異的に結合する。ある特定の実施形態では、本開示のコンジュゲート分子は、ブロッキングアッセイによって測定して４×１０－１０Ｍ以下（たとえば、３×１０－１０Ｍ以下、２×１０－１０Ｍ以下、１×１０－１０Ｍ以下、０．５×１０－１０Ｍ以下）のＩＣ５０でヒトＴＧＦβ１およびＴＧＦβＲＩＩ結合をブロックすることができる。ある特定の実施形態では、本開示のコンジュゲート分子は、ＦＡＣＳアッセイによって測定して用量依存的にヒトＣＤ３９に結合することができる。ある特定の実施形態では、本開示のコンジュゲート分子は、ＥＬＩＳＡアッセイまたはＦＡＣＳアッセイによって測定してＣＤ３９およびＴＧＦβに同時に結合することができる。ある特定の実施形態では、本開示のコンジュゲート分子は、ＴＧＦ－β ＳＭＡＤレポーターアッセイによって測定して４×１０－１１Ｍ以下のＩＣ５０でＴＧＦβシグナルを阻害することができる。ある特定の実施形態では、本開示のコンジュゲート分子は、ＡＴＰアーゼ活性アッセイによって測定して７×１０－１０Ｍ以下（たとえば６×１０－１０Ｍ以下、５×１０－１０Ｍ以下、４×１０－１０Ｍ以下、３×１０－１０Ｍ以下、２×１０－１０Ｍ以下、１×１０－１０Ｍ以下、０．５×１０－１０Ｍ以下）のＩＣ５０でＣＤ３９発現細胞におけるＡＴＰアーゼ活性を阻害することができる。ある特定の実施形態では、本開示のコンジュゲート分子は、Ｏｃｔｅｔアッセイによって測定して４×１０－１０Ｍ以下（たとえば３×１０－１０Ｍ以下、２×１０－１０Ｍ以下、１×１０－１０Ｍ以下、または０．５×１０－１０Ｍ以下）のＫＤ値でヒトＣＤ３９に特異的に結合することができる。ある特定の実施形態では、本開示のコンジュゲート分子は、Ｏｃｔｅｔアッセイによって測定して４×１０－１１Ｍ以下（たとえば３×１０－１１Ｍ以下、２×１０－１１Ｍ以下、１×１０－１１Ｍ以下、０．５×１０－１１Ｍ以下）のＫＤ値でヒトＴＧＦβ１に特異的に結合することができる。ある特定の実施形態では、本開示のコンジュゲート分子は、Ｔｒｅｇ抑制アッセイによって測定してＴ細胞機能を回復させることができる。ある特定の実施形態では、本開示のコンジュゲート分子は、用量依存的にヒトＴ細胞のアポトーシスを阻害することができる。ある特定の実施形態では、本開示のコンジュゲート分子は、刺激によるヒトＴ細胞の生存および活性化を促進することができる。ある特定の実施形態では、本開示のコンジュゲート分子は、全Ｔ細胞におけるＴＧＦβ誘導Ｆｏｘｐ３発現をブロックすることができる。ある特定の実施形態では、本開示のコンジュゲート分子は、ヒトＴ細胞増殖に対するＡＴＰ誘導阻害を回復させることができる。
【0083】
ＴＧＦβ結合ドメイン
[00125]ある特定の実施形態では、ＴＧＦβ結合ドメインは、ヒトおよび／またはマウスＴＧＦβに結合する。ある特定の実施形態では、ＴＧＦβ結合ドメインは、ＴＧＦβシグナル伝達経路に拮抗し、かつ／またはそれを阻害することができる。ある特定の実施形態では、ＴＧＦβ結合ドメインは、ＴＧＦβに拮抗し、かつ／またはそれを阻害することができる。本開示では、ＴＧＦβ結合ドメインは、ＴＧＦβファミリーの１つもしくは複数のファミリーメンバーまたはアイソフォームに特異的に結合する任意の部分であり得る。ある特定の実施形態では、ＴＧＦβ結合ドメインは、ＴＧＦβ１（たとえばヒトＴＧＦβ１）、ＴＧＦβ２（たとえばヒトＴＧＦβ２）、および／もしくはＴＧＦβ３（たとえばヒトＴＧＦβ３）に結合するタンパク質、または類似もしくは改善されたＴＧＦβ結合親和性を有するそのバリアントを含む。ある特定の実施形態では、ＴＧＦβ結合ドメインは、ＴＧＦβ１（たとえば、ヒトＴＧＦβ１）に結合する。ある特定の実施形態では、ＴＧＦβ結合ドメインは、ＴＧＦβ２（たとえば、ヒトＴＧＦβ２）に結合する。ある特定の実施形態では、ＴＧＦβ結合ドメインは、ＴＧＦβ３（たとえば、ヒトＴＧＦβ３）に結合する。ある特定の実施形態では、ＴＧＦβ結合ドメインは、ＴＧＦβ１（たとえばヒトＴＧＦβ１）およびＴＧＦβ２（たとえばヒトＴＧＦβ２）に特異的に結合する。ある特定の実施形態では、ＴＧＦβ結合ドメインは、ＴＧＦβ１（たとえばヒトＴＧＦβ１）およびＴＧＦβ３（たとえばヒトＴＧＦβ３）に特異的に結合する。ある特定の実施形態では、ＴＧＦβ結合ドメインは、ＴＧＦβ２（たとえばヒトＴＧＦβ２）およびＴＧＦβ３（たとえばヒトＴＧＦβ３）に特異的に結合する。ある特定の実施形態では、ＴＧＦβ結合ドメインは、ＴＧＦβ１（たとえばヒトＴＧＦβ１）、ＴＧＦβ２（たとえばヒトＴＧＦβ２）およびＴＧＦβ３（たとえばヒトＴＧＦβ３）に特異的に結合する。当業者であれば、ＴＧＦβファミリーの１つのファミリーメンバーまたはアイソフォームに結合するＴＧＦβ結合ドメインが、ＴＧＦβファミリーの１つまたは複数の他のファミリーメンバーまたはアイソフォームに類似またはより高い親和性で結合することができることを理解するであろう。
[00125]ある特定の実施形態では、ＴＧＦβ結合ドメインは、ヒトおよび／またはマウスＴＧＦβに結合する。ある特定の実施形態では、ＴＧＦβ結合ドメインは、ＴＧＦβシグナル伝達経路に拮抗し、かつ／またはそれを阻害することができる。ある特定の実施形態では、ＴＧＦβ結合ドメインは、ＴＧＦβに拮抗し、かつ／またはそれを阻害することができる。本開示では、ＴＧＦβ結合ドメインは、ＴＧＦβファミリーの１つもしくは複数のファミリーメンバーまたはアイソフォームに特異的に結合する任意の部分であり得る。ある特定の実施形態では、ＴＧＦβ結合ドメインは、ＴＧＦβ１（たとえばヒトＴＧＦβ１）、ＴＧＦβ２（たとえばヒトＴＧＦβ２）、および／もしくはＴＧＦβ３（たとえばヒトＴＧＦβ３）に結合するタンパク質、または類似もしくは改善されたＴＧＦβ結合親和性を有するそのバリアントを含む。ある特定の実施形態では、ＴＧＦβ結合ドメインは、ＴＧＦβ１（たとえば、ヒトＴＧＦβ１）に結合する。ある特定の実施形態では、ＴＧＦβ結合ドメインは、ＴＧＦβ２（たとえば、ヒトＴＧＦβ２）に結合する。ある特定の実施形態では、ＴＧＦβ結合ドメインは、ＴＧＦβ３（たとえば、ヒトＴＧＦβ３）に結合する。ある特定の実施形態では、ＴＧＦβ結合ドメインは、ＴＧＦβ１（たとえばヒトＴＧＦβ１）およびＴＧＦβ２（たとえばヒトＴＧＦβ２）に特異的に結合する。ある特定の実施形態では、ＴＧＦβ結合ドメインは、ＴＧＦβ１（たとえばヒトＴＧＦβ１）およびＴＧＦβ３（たとえばヒトＴＧＦβ３）に特異的に結合する。ある特定の実施形態では、ＴＧＦβ結合ドメインは、ＴＧＦβ２（たとえばヒトＴＧＦβ２）およびＴＧＦβ３（たとえばヒトＴＧＦβ３）に特異的に結合する。ある特定の実施形態では、ＴＧＦβ結合ドメインは、ＴＧＦβ１（たとえばヒトＴＧＦβ１）、ＴＧＦβ２（たとえばヒトＴＧＦβ２）およびＴＧＦβ３（たとえばヒトＴＧＦβ３）に特異的に結合する。当業者であれば、ＴＧＦβファミリーの１つのファミリーメンバーまたはアイソフォームに結合するＴＧＦβ結合ドメインが、ＴＧＦβファミリーの１つまたは複数の他のファミリーメンバーまたはアイソフォームに類似またはより高い親和性で結合することができることを理解するであろう。
【0084】
[00126]本開示のＴＧＦβ結合ドメインは、抗ＴＧＦβ抗体部分またはその抗原結合性断片であってよい。例示的な抗ＴＧＦβ抗体部分には、フレソリムマブおよびメテリムマブ、ならびに、たとえば、それぞれが参照によりその全体が本明細書に組み入れられる、ＵＳ７４９４６５１Ｂ２、ＵＳ８３８３７８０Ｂ２、ＵＳ８０１２４８２Ｂ２、ＷＯ２０１７１４１２０８Ａ１に記載の抗ＴＧＦβ抗体部分またはその抗原結合性断片が含まれる。
【0085】
[00127]本開示のＴＧＦβ結合ドメインはまた、ＴＧＦβ受容体（たとえば、ＴＧＦβＲＩ、ＴＧＦβＲＩＩ、ＴＧＦβＲＩＩＩ）またはその断片であってよい。ある特定の実施形態では、ＴＧＦβ結合ドメインは、可溶性ＴＧＦβ受容体（たとえば、可溶性ヒトＴＧＦβ受容体）、またはその断片を含む。ある特定の実施形態では、ＴＧＦβ結合ドメインは、ＴＧＦβ受容体（たとえば、ヒトＴＧＦβ受容体）の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を含む。ある特定の実施形態では、ＴＧＦβ受容体は、ＴＧＦβ受容体Ｉ（ＴＧＦβＲＩ）、ＴＧＦβ受容体ＩＩ（ＴＧＦβＲＩＩ）、またはＴＧＦβ受容体ＩＩＩ（ＴＧＦβＲＩＩＩ）、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される。ある特定の実施形態では、ＴＧＦβ受容体は、ＴＧＦβＲＩ（たとえば、ヒトＴＧＦβＲＩ）である。ある特定の実施形態では、ＴＧＦβ受容体は、ＴＧＦβＲＩＩ（たとえば、ヒトＴＧＦβＲＩＩ）である。ある特定の実施形態では、ＴＧＦβ受容体は、ＴＧＦβＲＩＩＩ（たとえば、ヒトＴＧＦβＲＩＩＩ）である。
【0086】
[00128]ある特定の実施形態では、ＴＧＦβ結合ドメインは、ＴＧＦβＲＩ（たとえば、ヒトＴＧＦβＲＩ）のＥＣＤ、ＴＧＦβＲＩＩ（たとえば、ヒトＴＧＦβＲＩＩ）のＥＣＤ、ＴＧＦβＲＩＩＩ（たとえば、ヒトＴＧＦβＲＩＩＩ）のＥＣＤ、またはそれらの任意の組合せを含む。ある特定の実施形態では、ＴＧＦβ結合ドメインは、ＴＧＦβＲＩ（たとえば、ヒトＴＧＦβＲＩ）のＥＣＤを含む。ある特定の実施形態では、ＴＧＦβ結合ドメインは、ＴＧＦβＲＩＩ（たとえば、ヒトＴＧＦβＲＩＩ）のＥＣＤを含む。ある特定の実施形態では、ＴＧＦβ結合ドメインは、ＴＧＦβＲＩＩＩ（たとえば、ヒトＴＧＦβＲＩＩＩ）のＥＣＤを含む。ある特定の実施形態では、ＴＧＦβ結合ドメインは、ＴＧＦβＲＩ（たとえば、ヒトＴＧＦβＲＩ）のＥＣＤ、およびＴＧＦβＲＩＩ（たとえば、ヒトＴＧＦβＲＩＩ）のＥＣＤを含む。ある特定の実施形態では、ＴＧＦβ結合ドメインは、ＴＧＦβＲＩ（たとえば、ヒトＴＧＦβＲＩ）のＥＣＤ、およびＴＧＦβＲＩＩＩ（たとえば、ヒトＴＧＦβＲＩＩＩ）のＥＣＤを含む。ある特定の実施形態では、ＴＧＦβ結合ドメインは、ＴＧＦβＲＩＩ（たとえば、ヒトＴＧＦβＲＩＩ）のＥＣＤ、ＴＧＦβＲＩＩＩ（たとえば、ヒトＴＧＦβＲＩＩＩ）のＥＣＤを含む。
【0087】
[00129]ある特定の実施形態では、ＴＧＦβ受容体のＥＣＤは、配列番号１６３、配列番号１６４、もしくは配列番号１６５のアミノ酸配列、またはその少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の配列同一性を有ししかもＴＧＦβに対する結合特異性を保持しているアミノ酸配列を含むかまたはそれらからなる。
【0088】
[00130]ある特定の実施形態では、ＴＧＦβ結合ドメインは、ＴＧＦβ受容体の２つ以上の（たとえば、３、４、５、６、７、８、９、１０等）ＥＣＤを含む。ある特定の実施形態では、２つ以上のＥＣＤは同一のＴＧＦβ受容体に由来する。たとえば、２つ以上のＥＣＤは、ＴＧＦβＲＩ（たとえば、ヒトＴＧＦβＲＩ）に由来し、本開示において「ＴＧＦβＲＩ ＥＣＤ」または「ＴＧＦβＲＩ ＥＣＤｓ」とも称される。別の例では、２つ以上のＥＣＤは、ＴＧＦβＲＩＩ（たとえば、ヒトＴＧＦβＲＩＩ）に由来し、本開示において「ＴＧＦβＲＩＩ ＥＣＤ」または「ＴＧＦβＲＩＩ ＥＣＤｓ」とも称される。さらに別の例では、２つ以上のＥＣＤは、ＴＧＦβＲＩＩＩ（たとえば、ヒトＴＧＦβＲＩＩＩ）に由来し、本開示において「ＴＧＦβＲＩＩＩ ＥＣＤ」または「ＴＧＦβＲＩＩＩ ＥＣＤｓ」とも称される。ある特定の実施形態では、２つ以上のＥＣＤのアミノ酸配列は、同一である。ある特定の実施形態では、２つ以上のＥＣＤのアミノ酸配列は、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１アミノ酸以下だけ異なっている。ある特定の実施形態では、２つ以上のＥＣＤのアミノ酸配列は異なるが、互いに少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の配列同一性を有する。ある特定の実施形態では、２つ以上のＥＣＤのアミノ酸配列は異なるが、それぞれが、配列番号１６３から１６５のいずれか１つと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の配列同一性を有ししかもＴＧＦβに対する結合特異性を保持している。
【0089】
[00131]ある特定の実施形態では、２つ以上のＥＣＤは、少なくとも２つの異なるＴＧＦβ受容体に由来する。たとえば、２つ以上の（たとえば、３、４、５、６、７、８、９、１０等）ＥＣＤは、ＴＧＦβＲＩ（たとえば、ヒトＴＧＦβＲＩ）、ＴＧＦβＲＩＩ（たとえば、ヒトＴＧＦβＲＩＩ）、およびＴＧＦβＲＩＩＩ（たとえば、ヒトＴＧＦβＲＩＩＩ）から選択される少なくとも２つ（たとえば、２、３）の異なるＴＧＦβ受容体に由来する。ある特定の実施形態では、２つ以上のＥＣＤは、ＴＧＦβＲＩ（たとえば、ヒトＴＧＦβＲＩ）に由来する第１のＥＣＤ、およびＴＧＦβＲＩＩ（たとえば、ヒトＴＧＦβＲＩＩ）に由来する第２のＥＣＤを含む。ある特定の実施形態では、２つ以上のＥＣＤは、ＴＧＦβＲＩ（たとえば、ヒトＴＧＦβＲＩ）に由来する第１のＥＣＤ、およびＴＧＦβＲＩＩＩ（たとえば、ヒトＴＧＦβＲＩＩＩ）に由来する第２のＥＣＤを含む。ある特定の実施形態では、２つ以上のＥＣＤは、ＴＧＦβＲＩＩ（たとえば、ヒトＴＧＦβＲＩＩ）に由来する第１のＥＣＤ、およびＴＧＦβＲＩＩＩ（たとえば、ヒトＴＧＦβＲＩＩＩ）に由来する第２のＥＣＤを含む。
【0090】
[00132]ある特定の実施形態では、ＴＧＦβとＴＧＦβ受容体の相互作用をブロックする際の抗ＣＤ３９／ＴＧＦβ Ｔｒａｐの能力は、ＴＧＦβ受容体ＥＣＤの増加とともに増加する。たとえば、４つのＴＧＦβＲＩＩ ＥＣＤを有する抗ＣＤ３９／ＴＧＦβ Ｔｒａｐは、ＴＧＦβとＴＧＦβＲＩＩとの相互作用をブロックすることにおいて、２つのＴＧＦβＲＩＩ ＥＣＤを有する抗ＣＤ３９／ＴＧＦβ Ｔｒａｐより強力である。
【0091】
[00133]ある特定の実施形態では、２つ以上のＥＣＤは連続して作動可能に連結されている。ある特定の実施形態では、２つ以上のＥＣＤは互いに共有結合的にまたは非共有結合的に連結されている。ある特定の実施形態では、２つ以上のＥＣＤは互いに直接的に連結されるか、リンカーを介して互いに連結されている。ある特定の実施形態では、２つ以上のＥＣＤは第１のリンカーを介して連結されている。
【0092】
[00134]本明細書で用いる用語「リンカー」は、ペプチド結合によって連結された、１、２、３、４、５個のアミノ酸残基、または５から１５、２０、３０、５０以上の間の長さのアミノ酸残基を有する人工アミノ酸配列を意味し、１つまたは複数のポリペプチドの連結に使用される。リンカーは、二次構造を有していても、有していなくてもよい。リンカー配列は当技術分野で公知であり、たとえばＨｏｌｌｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：６４４４－６４４８（１９９３）；Ｐｏｌｊａｋ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ２：１１２１－１１２３（１９９４）を参照されたい。
【0093】
[00135]ある特定の実施形態では、第１のリンカーは、切断可能リンカー、切断不能リンカー、ペプチドリンカー、可撓性リンカー、剛性リンカー、ヘリックスリンカー、および非ヘリックスリンカーからなる群から選択される。当技術分野で公知の任意の適切なリンカーが使用され得る。ある特定の実施形態では、第１のリンカーは、ペプチドリンカーを含む。たとえば、本開示における有用なリンカーは、グリシンおよびセリン残基が豊富であってよい。例としては、ＴＧＧＧＧ（配列番号１７２）、ＧＧＧＧＳ（配列番号１７３）またはＳＧＧＧＧ（配列番号１７４）またはそのタンデム反復（たとえば２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上の反復）のようなスレオニン／セリンおよびグリシンを含む単一または反復配列を有するリンカーが挙げられる。ある特定の実施形態では、本開示で用いられる第１のリンカーは、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１７５）を含む。あるいは、リンカーは、ＧＡＰＧＧＧＧＧＡＡＡＡＡＧＧＧＧＧ（配列番号１７６）のアミノ酸配列の１つまたは複数の連続反復またはタンデム反復を含む長いペプチド鎖であってよい。ある特定の実施形態では、第１のリンカーは、配列番号１７６の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上の連続反復またはタンデム反復を含む。ある特定の実施形態では、ペプチドリンカーは、ＧＳリンカーを含む。ある特定の実施形態では、ＧＳリンカーは、ＧＧＧＳ（配列番号１７７）または配列番号１７３の１つもしくは複数の反復を含む。ある特定の実施形態では、ペプチドリンカーは、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧ（配列番号１８２）のアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、第１のリンカーは、配列番号１７２～１７７、１８２のいずれか１つと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むかまたはそれらからなる。上記の第１のリンカーの説明は、以下の第１のリンカーにも適用可能である。
【0094】
[00136]ある特定の実施形態では、ＴＧＦβ結合ドメインは、配列番号１６６、配列番号１６７、配列番号１６８、配列番号１６９、配列番号１７０、配列番号１７１、またはそれらの任意の組合せからなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【0095】
[00137]ＴＧＦβ受容体のいくつかの例示的なＥＣＤのアミノ酸配列を、以下の表３０に示す。第１のリンカーは下線が引かれている。
【0096】
【表2-1】
【0097】
【表2-2】
【0098】
【表2-3】
【0099】
ＣＤ３９結合ドメイン
[00138]ある特定の実施形態では、本開示のＣＤ３９結合ドメインは、ＣＤ３９（たとえば、ヒトＣＤ３９、カニクイザルＣＤ３９、またはマウスＣＤ３９）に結合する。ある特定の実施形態では、本開示のＣＤ３９結合ドメインは、ヒトＣＤ３９に結合する。
[00138]ある特定の実施形態では、本開示のＣＤ３９結合ドメインは、ＣＤ３９（たとえば、ヒトＣＤ３９、カニクイザルＣＤ３９、またはマウスＣＤ３９）に結合する。ある特定の実施形態では、本開示のＣＤ３９結合ドメインは、ヒトＣＤ３９に結合する。
【0100】
[00139]ある特定の実施形態では、本開示のＣＤ３９結合ドメインは、抗ＣＤ３９抗体部分を含む。例示的な抗ＣＤ３９抗体部分には、たとえば、それぞれが参照によりその全体が本明細書に組み入れられる、ＵＳ１０５５６９５９Ｂ２、ＵＳ２０２００２７７３９４Ａ１、ＥＰ３４２９６９２Ａ１、ＷＯ２０１８０６５５５２Ａ１に記載の抗ＣＤ３９抗体またはその抗原結合性断片が含まれる。ある特定の実施形態では、例示的な抗ＣＤ３９抗体部分は、本開示の抗ＣＤ３９抗体部分の節および実例となる抗ＣＤ３９抗体部分の節に開示される。
【0101】
[00140]ある特定の実施形態では、抗ＣＤ３９抗体部分は、１つまたは複数のＣＤＲを含む。ある特定の実施形態では、抗ＣＤ３９抗体部分は、本開示の実例となる抗ＣＤ３９抗体部分の節に記載の１つまたは複数のＣＤＲを含む。ある特定の実施形態では、抗ＣＤ３９抗体部分は重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。ある特定の実施形態では、抗ＣＤ３９抗体部分は、本開示の実例となる抗ＣＤ３９抗体部分の節に開示される抗ＣＤ３９抗体のＶＨおよびＶＬを含む。
【0102】
[00141]ある特定の実施形態では、抗ＣＤ３９抗体部分は、重鎖可変領域のカルボキシル末端に付加された重鎖定常ドメインをさらに含む。ある特定の実施形態では、重鎖定常領域は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭからなる群に由来する。ある特定の実施形態では、重鎖定常領域はヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、またはＩｇＭに由来する。ある特定の実施形態では、重鎖定常領域は、ヒトＩｇＧ１（配列番号１７８）またはＩｇＧ４（配列番号１７９）に由来する。ある特定の実施形態では、抗ＣＤ３９抗体部分は、軽鎖可変領域のカルボキシル末端に付加された軽鎖定常ドメインをさらに含む。ある特定の実施形態では、軽鎖定常領域は、カッパ軽鎖またはラムダ軽鎖に由来する。カッパ軽鎖定常領域およびラムダ軽鎖定常領域のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１８０および配列番号１８１に示される。いくつかの例示的な定常領域のアミノ酸配列を、以下の表３１に示す。
【0103】
【表3】
【0104】
ＴＧＦβ結合ドメインとＣＤ３９結合ドメインとの間の連結
[00142]本開示では、ＴＧＦβ結合ドメインは、ＣＤ３９結合ドメイン（たとえば、抗ＣＤ３９抗体部分）の任意の部分に連結され得る。ある特定の実施形態では、ＴＧＦβ結合ドメインは、抗ＣＤ３９抗体部分の、１）重鎖可変領域のアミノ末端、２）軽鎖可変領域のアミノ末端、３）重鎖可変領域のカルボキシル末端、４）軽鎖可変領域のカルボキシル末端、５）重鎖定常領域のカルボキシル末端、および６）軽鎖定常領域のカルボキシル末端からなる群から選択される位置で抗ＣＤ３９抗体部分に連結される。
[00142]本開示では、ＴＧＦβ結合ドメインは、ＣＤ３９結合ドメイン（たとえば、抗ＣＤ３９抗体部分）の任意の部分に連結され得る。ある特定の実施形態では、ＴＧＦβ結合ドメインは、抗ＣＤ３９抗体部分の、１）重鎖可変領域のアミノ末端、２）軽鎖可変領域のアミノ末端、３）重鎖可変領域のカルボキシル末端、４）軽鎖可変領域のカルボキシル末端、５）重鎖定常領域のカルボキシル末端、および６）軽鎖定常領域のカルボキシル末端からなる群から選択される位置で抗ＣＤ３９抗体部分に連結される。
【0105】
[00143]ＴＧＦβ結合ドメインは、抗ＣＤ３９抗体部分の任意の部分（たとえば、免疫グロブリン鎖のアミノ末端またはカルボキシル末端）に（たとえば、直接または第２のリンカーを介して）（共有結合的または非共有結合的に）連結され得る。共有結合連結は、化学的連結または遺伝的連結であり得る。ある特定の実施形態では、第２のリンカーは、切断可能リンカー、切断不能リンカー、ペプチドリンカー、可撓性リンカー、剛性リンカー、ヘリックスリンカー、および非ヘリックスリンカーからなる群から選択される。当技術分野で公知の任意の適切なリンカーが使用され得る。ある特定の実施形態では、第２のリンカーは、ペプチドリンカーを含む。たとえば、本開示における有用なリンカーは、グリシンおよびセリン残基が豊富であってよい。例としては、ＴＧＧＧＧ（配列番号１７２）、ＧＧＧＧＳ（配列番号１７３）またはＳＧＧＧＧ（配列番号１７４）またはそのタンデム反復（たとえば２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上の反復）のようなスレオニン／セリンおよびグリシンからなる単一または反復配列を有するリンカーが挙げられる。ある特定の実施形態では、本開示で用いられる第２のリンカーは、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１７５）を含む。あるいは、リンカーは、ＧＡＰＧＧＧＧＧＡＡＡＡＡＧＧＧＧＧ（配列番号１７６）のアミノ酸配列の１つまたは複数の連続反復またはタンデム反復を含む長いペプチド鎖であってよい。ある特定の実施形態では、第２のリンカーは、配列番号１７６の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上の連続反復またはタンデム反復を含む。ある特定の実施形態では、ペプチドリンカーは、ＧＳリンカーを含む。ある特定の実施形態では、ＧＳリンカーは、ＧＧＧＳ（配列番号１７７）または配列番号１７３の１つもしくは複数の反復を含む。ある特定の実施形態では、ペプチドリンカーは、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧ（配列番号１８２）のアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、第２のリンカーは、配列番号１７２～１７７、１８２のいずれか１つと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むかまたはそれらからなる。上記の第２のリンカーの説明は、以下の第２のリンカーにも適用可能である。
【0106】
[00144]ある特定の実施形態では、ＴＧＦβ結合ドメインは、抗ＣＤ３９抗体部分の重鎖可変領域に連結される。ＴＧＦβ結合ドメインは、抗ＣＤ３９抗体部分の重鎖可変領域のアミノ末端（Ｎ末端）またはカルボキシル末端（Ｃ末端）アミノ酸残基を含む、重鎖可変領域の任意の部分に連結され得る。ある特定の実施形態では、ＴＧＦβ結合ドメインは、抗ＣＤ３９抗体部分の重鎖可変領域のアミノ末端に（たとえば、直接または第２のリンカーを介して）連結される。ある特定の実施形態では、ＴＧＦβ結合ドメインは、抗ＣＤ３９抗体部分の重鎖可変領域のカルボキシル末端に（たとえば、直接または第２のリンカーを介して）連結される。
【0107】
[00145]抗ＣＤ３９抗体部分のそれぞれの重鎖可変領域のアミノ末端に連結された２つのＴＧＦβＲＩＩ ＥＣＤを含む、例示的な抗ＣＤ３９／ＴＧＦβ Ｔｒａｐ分子の概略図を本開示の図２４Ｃに示す。
【0108】
[00146]ある特定の実施形態では、ＴＧＦβ結合ドメインは、抗ＣＤ３９抗体部分の軽鎖可変領域に連結される。ＴＧＦβ結合ドメインは、抗ＣＤ３９抗体部分の軽鎖可変領域のアミノ末端またはカルボキシル末端アミノ酸残基を含む、軽鎖可変領域の任意の部分に連結され得る。ある特定の実施形態では、ＴＧＦβ結合ドメインは、抗ＣＤ３９抗体部分の軽鎖可変領域のアミノ末端に（たとえば、直接または第２のリンカーを介して）連結される。ある特定の実施形態では、ＴＧＦβ結合ドメインは、抗ＣＤ３９抗体部分の軽鎖可変領域のカルボキシル末端に（たとえば、直接または第２のリンカーを介して）連結される。
【0109】
[00147]抗ＣＤ３９抗体部分のそれぞれの軽鎖可変領域のアミノ末端に連結された２つのＴＧＦβＲＩＩ ＥＣＤを含む、例示的な抗ＣＤ３９／ＴＧＦβ Ｔｒａｐ分子の概略図を本開示の図２４Ｄに示す。
【0110】
[00148]ある特定の実施形態では、ＴＧＦβ結合ドメインは、抗ＣＤ３９抗体部分の重鎖定常領域に連結される。ＴＧＦβ結合ドメインは、抗ＣＤ３９抗体部分の重鎖定常領域のアミノ末端またはカルボキシル末端アミノ酸残基を含む、重鎖定常領域の任意の部分に連結され得る。ある特定の実施形態では、ＴＧＦβ結合ドメインは、抗ＣＤ３９抗体部分の重鎖定常領域のアミノ末端に（たとえば、直接または第２のリンカーを介して）連結される。ある特定の実施形態では、ＴＧＦβ結合ドメインは、抗ＣＤ３９抗体部分の重鎖定常領域のカルボキシル末端に（たとえば、直接または第２のリンカーを介して）連結される。
【0111】
[00149]抗ＣＤ３９抗体部分のそれぞれの重鎖定常領域のカルボキシル末端に連結された１つのＴＧＦβＲＩＩ ＥＣＤを含む、例示的な抗ＣＤ３９／ＴＧＦβ Ｔｒａｐ分子の概略図を本開示の図２４Ａに示す。抗ＣＤ３９抗体部分のそれぞれの重鎖定常領域のカルボキシル末端に連結された２つのＴＧＦβＲＩＩ ＥＣＤを含む、例示的な抗ＣＤ３９／ＴＧＦβ Ｔｒａｐ分子の概略図を本開示の図２４Ｂに示す。
【0112】
[00150]ある特定の実施形態では、ＴＧＦβ結合ドメインは、抗ＣＤ３９抗体部分の軽鎖定常領域に連結される。ＴＧＦβ結合ドメインは、抗ＣＤ３９抗体部分の軽鎖定常領域のアミノ末端またはカルボキシル末端アミノ酸残基を含む、軽鎖定常領域の任意の部分に連結され得る。ある特定の実施形態では、ＴＧＦβ結合ドメインは、抗ＣＤ３９抗体部分の軽鎖定常領域のアミノ末端に（たとえば、直接または第２のリンカーを介して）連結される。ある特定の実施形態では、ＴＧＦβ結合ドメインは、抗ＣＤ３９抗体部分の軽鎖定常領域のカルボキシル末端に（たとえば、直接または第２のリンカーを介して）連結される。
【0113】
[00151]抗ＣＤ３９抗体部分のそれぞれの軽鎖定常領域のカルボキシル末端に連結された２つのＴＧＦβＲＩＩ ＥＣＤを含む、例示的な抗ＣＤ３９／ＴＧＦβ Ｔｒａｐ分子の概略図を本開示の図２４Ｆに示す。
【0114】
[00152]ある特定の実施形態では、本開示のタンパク質は、全てが抗ＣＤ３９抗体部分の重鎖可変領域に（たとえば、直接または第２のリンカーを介して）連結された２つ以上（たとえば、３、４、５、６、７、８、９、１０以上）のＴＧＦβ結合ドメインを含む。ある特定の実施形態では、本開示のタンパク質は、全てが抗ＣＤ３９抗体部分の重鎖可変領域のアミノ末端に（たとえば、直接または第２のリンカーを介して）連結された２つ以上（たとえば、３、４、５、６、７、８、９、１０以上）のＴＧＦβ結合ドメインを含む。ある特定の実施形態では、本開示のタンパク質は、全てが抗ＣＤ３９抗体部分の重鎖可変領域のカルボキシル末端に（たとえば、直接または第２のリンカーを介して）連結された２つ以上（たとえば、３、４、５、６、７、８、９、１０以上）のＴＧＦβ結合ドメインを含む。ある特定の実施形態では、本開示のタンパク質は、抗ＣＤ３９抗体部分の重鎖可変領域のアミノ末端およびカルボキシル末端にそれぞれ（たとえば、直接または第２のリンカーを介して）連結された２つ以上（たとえば、３、４、５、６、７、８、９、１０以上）のＴＧＦβ結合ドメインを含む。ある特定の実施形態では、２つ以上のＴＧＦβ結合ドメインは、互いに直接または第１のリンカーを介して連結される。
【0115】
[00153]ある特定の実施形態では、本開示のタンパク質は、全てが抗ＣＤ３９抗体部分の軽鎖可変領域に（たとえば、直接または第２のリンカーを介して）連結された２つ以上（たとえば、３、４、５、６、７、８、９、１０以上）のＴＧＦβ結合ドメインを含む。ある特定の実施形態では、本開示のタンパク質は、全てが抗ＣＤ３９抗体部分の軽鎖可変領域のアミノ末端に（たとえば、直接または第２のリンカーを介して）連結された２つ以上（たとえば、３、４、５、６、７、８、９、１０以上）のＴＧＦβ結合ドメインを含む。ある特定の実施形態では、本開示のＣＤ３９とＴＧＦβの両方を標的とするタンパク質は、全てが抗ＣＤ３９抗体部分の軽鎖可変領域のカルボキシル末端に（たとえば、直接または第２のリンカーを介して）連結された２つ以上（たとえば、３、４、５、６、７、８、９、１０以上）のＴＧＦβ結合ドメインを含む。ある特定の実施形態では、本開示のタンパク質は、抗ＣＤ３９抗体部分の軽鎖可変領域のアミノ末端およびカルボキシル末端にそれぞれ（たとえば、直接または第２のリンカーを介して）連結された２つ以上（たとえば、３、４、５、６、７、８、９、１０以上）のＴＧＦβ結合ドメインを含む。ある特定の実施形態では、２つ以上のＴＧＦβ結合ドメインは、互いに直接または第１のリンカーを介して連結される。
【0116】
[00154]ある特定の実施形態では、本開示のＣＤ３９とＴＧＦβの両方を標的とするタンパク質は、抗ＣＤ３９抗体部分の重鎖および軽鎖可変領域にそれぞれ連結された２つ以上（たとえば、３、４、５、６、７、８、９、１０以上）のＴＧＦβ結合ドメインを含む。ある特定の実施形態では、本開示のタンパク質は、抗ＣＤ３９抗体部分の重鎖可変領域のアミノ末端に連結された少なくとも１つ（たとえば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上）のＴＧＦβ結合ドメイン、および抗ＣＤ３９抗体部分の軽鎖可変領域のアミノ末端に連結された少なくとも１つ（たとえば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上）のＴＧＦβ結合ドメインを含む。ある特定の実施形態では、本開示のタンパク質は、抗ＣＤ３９抗体部分の重鎖可変領域のカルボキシル末端に連結された少なくとも１つ（たとえば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上）のＴＧＦβ結合ドメイン、および抗ＣＤ３９抗体部分の軽鎖可変領域のカルボキシル末端に連結された少なくとも１つ（たとえば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上）のＴＧＦβ結合ドメインを含む。ある特定の実施形態では、本開示のタンパク質は、抗ＣＤ３９抗体部分の重鎖可変領域のアミノ末端に連結された少なくとも１つ（たとえば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上）のＴＧＦβ結合ドメイン、および抗ＣＤ３９抗体部分の軽鎖可変領域のカルボキシル末端に連結された少なくとも１つ（たとえば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上）のＴＧＦβ結合ドメインを含む。ある特定の実施形態では、本開示のタンパク質は、抗ＣＤ３９抗体部分の重鎖可変領域のカルボキシル末端に連結された少なくとも１つ（たとえば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上）のＴＧＦβ結合ドメイン、および抗ＣＤ３９抗体部分の軽鎖可変領域のアミノ末端に連結された少なくとも１つ（たとえば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上）のＴＧＦβ結合ドメインを含む。
【0117】
[00155]抗ＣＤ３９抗体部分のそれぞれの重鎖可変領域のアミノ末端に連結された１つのＴＧＦβＲＩＩ ＥＣＤ、および抗ＣＤ３９抗体部分のそれぞれの軽鎖可変領域のアミノ末端に連結された１つのＴＧＦβＲＩＩ ＥＣＤを含む、例示的な抗ＣＤ３９／ＴＧＦβ Ｔｒａｐ分子の概略図を本開示の図２４Ｅに示す。
【0118】
[00156]ある特定の実施形態では、本開示のＣＤ３９とＴＧＦβの両方を標的とするタンパク質は、全てが抗ＣＤ３９抗体部分の重鎖定常領域に（たとえば、直接または第２のリンカーを介して）連結された２つ以上（たとえば、３、４、５、６、７、８、９、１０以上）のＴＧＦβ結合ドメインを含む。ある特定の実施形態では、本開示のタンパク質は、全てが抗ＣＤ３９抗体部分の重鎖定常領域のアミノ末端に（たとえば、直接または第２のリンカーを介して）連結された２つ以上（たとえば、３、４、５、６、７、８、９、１０以上）のＴＧＦβ結合ドメインを含む。ある特定の実施形態では、本開示のタンパク質は、全てが抗ＣＤ３９抗体部分の重鎖定常領域のカルボキシル末端に（たとえば、直接または第２のリンカーを介して）連結された２つ以上（たとえば、３、４、５、６、７、８、９、１０以上）のＴＧＦβ結合ドメインを含む。ある特定の実施形態では、本開示のタンパク質は、抗ＣＤ３９抗体部分の重鎖定常領域のアミノ末端およびカルボキシル末端にそれぞれ（たとえば、直接または第２のリンカーを介して）連結された２つ以上（たとえば、３、４、５、６、７、８、９、１０以上）のＴＧＦβ結合ドメインを含む。ある特定の実施形態では、２つ以上のＴＧＦβ結合ドメインは、互いに直接または第１のリンカーを介して連結される。
【0119】
[00157]ある特定の実施形態では、本開示のＣＤ３９とＴＧＦβの両方を標的とするタンパク質は、全てが抗ＣＤ３９抗体部分の軽鎖定常領域に（たとえば、直接または第２のリンカーを介して）連結された２つ以上（たとえば、３、４、５、６、７、８、９、１０以上）のＴＧＦβ結合ドメインを含む。ある特定の実施形態では、本開示のＣＤ３９とＴＧＦβの両方を標的とするタンパク質は、全てが抗ＣＤ３９抗体部分の軽鎖定常領域のアミノ末端に（たとえば、直接または第２のリンカーを介して）連結された２つ以上（たとえば、３、４、５、６、７、８、９、１０以上）のＴＧＦβ結合ドメインを含む。ある特定の実施形態では、本開示のタンパク質は、全てが抗ＣＤ３９抗体部分の軽鎖定常領域のカルボキシル末端に（たとえば、直接または第２のリンカーを介して）連結された２つ以上（たとえば、３、４、５、６、７、８、９、１０以上）のＴＧＦβ結合ドメインを含む。ある特定の実施形態では、本開示のタンパク質は、抗ＣＤ３９抗体部分の軽鎖定常領域のアミノ末端およびカルボキシル末端にそれぞれ（たとえば、直接または第２のリンカーを介して）連結された２つ以上（たとえば、３、４、５、６、７、８、９、１０以上）のＴＧＦβ結合ドメインを含む。ある特定の実施形態では、２つ以上のＴＧＦβ結合ドメインは、互いに直接または第１のリンカーを介して連結される。
【0120】
[00158]ある特定の実施形態では、本開示のタンパク質は、抗ＣＤ３９抗体部分の重鎖および軽鎖定常領域にそれぞれ（たとえば、直接または第２のリンカーを介して）連結された２つ以上のＴＧＦβ結合ドメインを含む。ある特定の実施形態では、本開示のタンパク質は、抗ＣＤ３９抗体部分の重鎖定常領域のアミノ末端に連結された少なくとも１つ（たとえば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上）のＴＧＦβ結合ドメイン、および抗ＣＤ３９抗体部分の軽鎖定常領域のアミノ末端に連結された少なくとも１つ（たとえば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上）のＴＧＦβ結合ドメインを含む。ある特定の実施形態では、本開示のタンパク質は、抗ＣＤ３９抗体部分の重鎖定常領域のカルボキシル末端に連結された少なくとも１つ（たとえば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上）のＴＧＦβ結合ドメイン、および抗ＣＤ３９抗体部分の軽鎖定常領域のカルボキシル末端に連結された少なくとも１つ（たとえば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上）のＴＧＦβ結合ドメインを含む。ある特定の実施形態では、本開示のタンパク質は、抗ＣＤ３９抗体部分の重鎖定常領域のアミノ末端に連結された少なくとも１つ（たとえば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上）のＴＧＦβ結合ドメイン、および抗ＣＤ３９抗体部分の軽鎖定常領域のカルボキシル末端に連結された少なくとも１つ（たとえば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上）のＴＧＦβ結合ドメインを含む。ある特定の実施形態では、本開示のタンパク質は、抗ＣＤ３９抗体部分の重鎖定常領域のカルボキシル末端に連結された少なくとも１つ（たとえば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上）のＴＧＦβ結合ドメイン、および抗ＣＤ３９抗体部分の軽鎖定常領域のアミノ末端に連結された少なくとも１つ（たとえば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上）のＴＧＦβ結合ドメインを含む。
【0121】
[00159]抗ＣＤ３９抗体部分のそれぞれの重鎖定常領域のカルボキシル末端に連結された１つのＴＧＦβＲＩＩ ＥＣＤ、および抗ＣＤ３９抗体部分のそれぞれの軽鎖定常領域のカルボキシル末端に連結された２つのＴＧＦβＲＩＩ ＥＣＤを含む、例示的な抗ＣＤ３９／ＴＧＦβ Ｔｒａｐ分子の概略図を本開示の図２４Ｇに示す。
【0122】
[00160]ある特定の実施形態では、抗ＣＤ３９抗体部分の重鎖（たとえば、重鎖可変領域、重鎖定常領域）または軽鎖（たとえば、軽鎖可変領域、軽鎖定常領域）のＣ末端に連結されたＴＧＦβ結合ドメインを含む抗ＣＤ３９／ＴＧＦβ Ｔｒａｐ分子は、抗ＣＤ３９抗体部分の重鎖（たとえば、重鎖可変領域、重鎖定常領域）または軽鎖（たとえば、軽鎖可変領域、軽鎖定常領域）のＮ末端に連結されたＴＧＦβ結合ドメインを含む抗ＣＤ３９／ＴＧＦβ Ｔｒａｐ分子よりも、ＣＤ３９および／またはＴＧＦβに結合する効果が高い。ある特定の実施形態では、抗ＣＤ３９抗体部分の重鎖（たとえば、重鎖可変領域、重鎖定常領域）または軽鎖（たとえば、軽鎖可変領域、軽鎖定常領域）のＮ末端に連結されたＴＧＦβ結合ドメインを含む抗ＣＤ３９／ＴＧＦβ Ｔｒａｐ分子は、抗ＣＤ３９抗体部分の重鎖（たとえば、重鎖可変領域、重鎖定常領域）または軽鎖（たとえば、軽鎖可変領域、軽鎖定常領域）のＣ末端に連結されたＴＧＦβ結合ドメインを含む抗ＣＤ３９／ＴＧＦβ Ｔｒａｐ分子よりも、ＣＤ３９および／またはＴＧＦβに結合する効果が高い。
【0123】
抗ＣＤ３９抗体部分
[00161]ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるコンジュゲート分子のＣＤ３９結合ドメインは、抗ＣＤ３９抗体部分またはその抗原結合性断片を含む。ある特定の実施形態では、抗ＣＤ３９抗体部分およびその抗原結合性断片は、ＣＤ３９に特異的に結合することができる。
[00161]ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるコンジュゲート分子のＣＤ３９結合ドメインは、抗ＣＤ３９抗体部分またはその抗原結合性断片を含む。ある特定の実施形態では、抗ＣＤ３９抗体部分およびその抗原結合性断片は、ＣＤ３９に特異的に結合することができる。
【0124】
[00162]ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗ＣＤ３９抗体部分およびその抗原結合性断片は、Ｂｉａｃｏｒｅアッセイによって１０－７Ｍ以下、８×１０－８Ｍ以下、５×１０－８Ｍ以下、２×１０－８Ｍ以下、８×１０－９Ｍ以下、５×１０－９Ｍ以下、２×１０－９Ｍ以下、１０－９Ｍ以下、８×１０－１０Ｍ以下、７×１０－１０Ｍ以下、または６×１０－１０Ｍ以下のＫＤ値で、ヒトＣＤ３９に特異的に結合する。Ｂｉａｃｏｒｅアッセイは表面プラスモン共鳴技術に基づいている。たとえばＭｕｒｐｈｙ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｃｈａｐｔｅｒ １９，ｕｎｉｔ １９．１４，２００６を参照されたい。ある特定の実施形態では、ＫＤ値は本開示の実施例５．１に記載した方法によって測定される。ある特定の実施形態では、ＫＤ値は約２５℃、または約３７℃で測定される。ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗体およびその抗原結合性断片は、２５℃で測定して、３７℃で測定したＫＤ値と同程度の、たとえば３７℃で測定したＫＤ値の約８０％～約１５０％、約９０％～約１３０％、または約９０％～約１２０％、約９０％～約１１０％のＫＤ値を有する。
【0125】
[00163]ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗ＣＤ３９抗体部分およびその抗原結合性断片は、Ｏｃｔｅｔアッセイによって１０－８Ｍ以下、８×１０－９Ｍ以下、５×１０－９Ｍ以下、４×１０－９Ｍ以下、３×１０－９Ｍ以下、２×１０－９Ｍ以下、１×１０－９Ｍ以下、９×１０－１０Ｍ以下、８×１０－１０Ｍ以下、７×１０－１０Ｍ以下、または６×１０－１０Ｍ以下のＫＤ値で、ヒトＣＤ３９に特異的に結合する。Ｏｃｔｅｔアッセイは、生物層干渉分光技術に基づいている。たとえばＡｂｄｉｃｈｅ，Ｙａｓｍｉｎａ Ｎ．，ｅｔ ａｌ．Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３８６．２（２００９）：１７２－１８０およびＳｕｎ Ｙ Ｓ．，Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ＆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１４，４２（２）：１０９－１２７を参照されたい。ある特定の実施形態では、ＫＤ値は本開示の実施例５．１に記載した方法によって測定される。
【0126】
[00164]本明細書で提供される抗体部分またはその抗原結合性断片のヒトＣＤ３９への結合は、「５０％効果濃度」（ＥＣ５０）値によっても表すことができる。ＥＣ５０値は、その最大の結合の５０％が観察される抗体部分の濃度を意味する。ＥＣ５０値は当技術分野で既知の結合アッセイ、たとえば酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）等の直接または間接結合アッセイ、ＦＡＣＳアッセイ、およびその他の結合アッセイによって測定することができる。ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗体部分およびその抗原結合性断片は、ＦＡＣＳ（蛍光活性化細胞ソーティング）アッセイによって測定して、１０－７Ｍ以下、８×１０－８Ｍ以下、５×１０－８Ｍ以下、２×１０－８Ｍ以下、１０－８Ｍ以下、８×１０－９Ｍ以下、５×１０－９Ｍ以下、２×１０－９Ｍ以下、１０－９Ｍ以下、８×１０－１０Ｍ以下、７×１０－１０Ｍ以下、または６×１０－１０Ｍ以下のＥＣ５０（即ち５０％結合濃度）で、ヒトＣＤ３９に特異的に結合する。ある特定の実施形態では、結合はＥＬＩＳＡまたはＦＡＣＳアッセイによって測定される。
【0127】
[00165]一部の実施形態では、本明細書で提供される抗ＣＤ３９抗体部分またはその抗原結合性断片は、ヒトＣＤ３９（即ちＥＮＴＰＤアーゼ１）に特異的に結合する。一部の実施形態では、本明細書で提供される抗ＣＤ３９抗体部分またはその抗原結合性断片は、ＥＮＴＰＤアーゼファミリーの他のメンバーには結合しない。一部の実施形態では、本明細書で提供される抗ＣＤ３９抗体部分またはその抗原結合性断片は、たとえばＥＬＩＳＡアッセイによって測定して、ヒトＣＤ３９に特異的に結合するが、ＥＮＴＰＤアーゼ２、３、５、６には特異的に結合しない。
【0128】
[00166]ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗ＣＤ３９抗体部分およびその抗原結合性断片は、たとえばＦＡＣＳアッセイによって測定して、ヒトＣＤ３９に特異的に結合するが、マウスＣＤ３９には特異的に結合しない。
【0129】
[00167]ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗ＣＤ３９抗体部分およびその抗原結合性断片は、ＦＡＣＳアッセイによって１０－７Ｍ以下、８×１０－８Ｍ以下、５×１０－８Ｍ以下、２×１０－８Ｍ以下、１０－８Ｍ以下、８×１０－９Ｍ以下、５×１０－９Ｍ以下、２×１０－９Ｍ以下、１０－９Ｍ以下、８×１０－１０Ｍ以下、７×１０－１０Ｍ以下、または６×１０－１０Ｍ以下のＥＣ５０で、カニクイザルＣＤ３９に特異的に結合する。
【0130】
[00168]ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗ＣＤ３９抗体部分およびその抗原結合性断片は、ＡＴＰアーゼ活性アッセイによって測定して５０ｎＭ以下、４０ｎＭ以下、３０ｎＭ以下、２０ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、８ｎＭ以下、５ｎＭ以下、３ｎＭ以下、１ｎＭ以下、０．９ｎＭ以下、０．８ｎＭ以下、０．７ｎＭ以下、０．６ｎＭ以下、０．５ｎＭ以下、０．４ｎＭ以下、０．３ｎＭ以下、０．２ｎＭ以下、０．１ｎＭ以下、０．０９ｎＭ以下、０．０８ｎＭ以下、０．０７ｎＭ以下、０．０６ｎＭ以下、または０．０５ｎＭ以下のＩＣ５０で、ＣＤ３９発現細胞中のＡＴＰアーゼ活性を阻害する。ＡＴＰアーゼ活性アッセイは当技術分野で既知の任意の方法を用いて、たとえばＡＴＰアーゼ活性の結果として放出されるリン酸塩の比色検出によって決定することができる。ある特定の実施形態では、ＡＴＰアーゼ活性は、本開示の実施例３．３に記載した方法によって決定される。
【0131】
[00169]ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗ＣＤ３９抗体部分およびその抗原結合性断片は、ＣＤ８０、ＣＤ８６、および／またはＣＤ４０の上方制御が単球の活性化を示すＦＡＣＳアッセイによるＣＤ８０、ＣＤ８６、および／またはＣＤ４０の発現の解析によって測定して、５０ｎＭ以下（たとえば４０ｎＭ以下、３０ｎＭ以下、２０ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、５ｎＭ以下、３ｎＭ以下、２ｎＭ以下、１ｎＭ以下、０．５ｎＭ以下、または０．２ｎＭ以下）の濃度で、ＡＴＰ媒介単球活性化を増強することができる。ＡＴＰ媒介単球の活性は当技術分野で既知の方法を用いて、たとえば本開示の実施例５．５に記載の方法によって決定することができる。
【0132】
[00170]ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗ＣＤ３９抗体部分およびその抗原結合性断片は、ＩＬ－２の分泌、またはＩＦＮ－γの分泌、またはＣＤ４＋もしくはＣＤ８＋のＴ細胞の増殖によって測定して、たとえば本開示の実施例５．５に記載の方法によって、２５ｎＭ以下、２０ｎＭ以下、１５ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、９ｎＭ以下、８ｎＭ以下、７ｎＭ以下、６ｎＭ以下、５ｎＭ以下、４ｎＭ以下、３ｎＭ以下、２ｎＭ以下、または１ｎＭ以下の濃度で、ＰＢＭＣ中のＡＴＰ媒介Ｔ細胞活性化を増強することができる。
【0133】
[00171]ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗ＣＤ３９抗体部分およびその抗原結合性断片は、ＦＡＣＳアッセイによるＣＤ８３の発現の解析によって測定して、２５ｎＭ以下（または１０ｎＭ以下、または５ｎＭ以下、または１ｎＭ以下、または０．５ｎＭ以下）の濃度で、ＡＴＰ媒介樹状細胞（ＤＣ）活性化を増強することができる。
【0134】
[00172]ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗ＣＤ３９抗体部分およびその抗原結合性断片は、Ｔ細胞の増殖を促進する活性化ＤＣの能力によって測定して、２５ｎＭ以下（または１０ｎＭ以下、または５ｎＭ以下、または１ｎＭ以下、または０．５ｎＭ以下）の濃度で、ＡＴＰ媒介ＤＣ活性化を増強することができる。
【0135】
[00173]本明細書で提供される抗ＣＤ３９抗体部分およびその抗原結合性断片は、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイにおけるＩＦＮ－γの産生を促進する活性化ＤＣの能力によって測定して、２５ｎＭ以下（または１０ｎＭ以下、または５ｎＭ以下、または１ｎＭ以下、または０．５ｎＭ以下）の濃度で、ＡＴＰ媒介ＤＣ活性化を増強することができる。
【0136】
[00174]ＡＴＰ媒介ＤＣ成熟の活性は、当技術分野で既知の方法、たとえば本開示の実施例５．５に記載の方法を用いて決定することができる。
[00175]ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗ＣＤ３９抗体部分およびその抗原結合性断片は、ＦＡＣＳアッセイによって測定して１ｎＭ以下（たとえば０．１ｎＭ以下、０．０１ｎＭ以下）の濃度で、（ＡＴＰから加水分解される）アデノシンによって誘導されるＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖の阻害をブロックすることができる。Ｔ細胞の増殖は、当技術分野で既知の方法、たとえば本開示の実施例３．４に記載の方法を用いて決定することができる。
[00175]ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗ＣＤ３９抗体部分およびその抗原結合性断片は、ＦＡＣＳアッセイによって測定して１ｎＭ以下（たとえば０．１ｎＭ以下、０．０１ｎＭ以下）の濃度で、（ＡＴＰから加水分解される）アデノシンによって誘導されるＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖の阻害をブロックすることができる。Ｔ細胞の増殖は、当技術分野で既知の方法、たとえば本開示の実施例３．４に記載の方法を用いて決定することができる。
【0137】
[00176]ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗ＣＤ３９抗体部分およびその抗原結合性断片は、ＮＫ細胞またはマクロファージ細胞に依存する様式で哺乳動物における腫瘍の成長を阻害することができる。
【0138】
[00177]ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗ＣＤ３９抗体部分およびその抗原結合性断片は、Ｔ細胞の増殖、ＣＤ２５＋細胞、および生細胞集団によって測定して、ｅＡＴＰによって阻害されたヒトＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を反転させることができる。Ｔ細胞の増殖の％、ＣＤ２５＋細胞の％、および生細胞の％は、当技術分野で既知の方法、たとえば本開示の実施例３．４に記載の方法を用いて決定することができる。
【0139】
[00178]ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗ＣＤ３９抗体部分およびその抗原結合性断片は、ＥＬＩＳＡアッセイによって測定して、５０ｎＭ以下（または１２．５ｎＭ以下、または３．１３ｎＭ以下、または０．７８ｎＭ以下、または０．２ｎＭ以下、または０．０４９ｎＭ以下、または０．０１２ｎＭ以下、または０．００３ｎＭ以下、または０．０００８ｎＭ以下）の濃度で、ＬＰＳ刺激によって誘導されたヒトマクロファージのＩＬ１βの放出を増強することができる。マクロファージのＩＬ１β放出は、当技術分野で既知の方法、たとえば本開示の実施例５．５．４に記載の方法を用いて決定することができる。
【0140】
実例となる抗ＣＤ３９抗体部分
[00179]ある特定の実施形態では、本開示の抗ＣＤ３９抗体部分（たとえば抗ヒトＣＤ３９抗体部分）およびその抗原結合性断片は、ＮＹＧＭＮ（配列番号１）、ＫＹＷＭＮ（配列番号２）、ＮＹＷＭＮ（配列番号３）、ＤＴＦＬＨ（配列番号４）、ＤＹＮＭＹ（配列番号５）、ＤＴＹＶＨ（配列番号６）、ＬＩＮＴＹＴＧＥＰＴＹＡＤＤＦＫＤ（配列番号７）、ＥＩＲＬＫＳＮＫＹＧＴＨＹＡＥＳＶＫＧ（配列番号８）、ＱＩＲＬＮＰＤＮＹＡＴＨＸ１ＡＥＳＶＫＧ（配列番号９）、Ｘ５８ＩＤＰＡＸ５９Ｘ６０ＮＩＫＹＤＰＫＦＱＧ（配列番号１５１）、ＦＩＤＰＹＮＧＹＴＳＹＮＱＫＦＫＧ（配列番号１１）、ＲＩＤＰＡＩＤＮＳＫＹＤＰＫＦＱＧ（配列番号１２）、ＫＧＩＹＹＤＹＶＷＦＦＤＶ（配列番号１３）、ＱＬＤＬＹＷＦＦＤＶ（配列番号１４）、ＨＧＸ２ＲＧＦＡＹ（配列番号１５）、ＳＰＹＹＹＧＳＧＹＲＩＦＤＶ（配列番号１６）、ＩＹＧＹＤＤＡＹＹＦＤＹ（配列番号１７）、ＹＹＣＡＬＹＤＧＹＮＶＹＡＭＤＹ（配列番号１８）、ＫＡＳＱＤＩＮＲＹＩＡ（配列番号１９）、ＲＡＳＱＳＩＳＤＹＬＨ（配列番号２０）、ＫＳＳＱＳＬＬＤＳＤＧＲＴＨＬＮ（配列番号２１）、ＳＡＦＳＳＶＮＹＭＨ（配列番号２２）、ＳＡＴＳＳＶＳＹＭＨ（配列番号２３）、ＲＳＳＫＮＬＬＨＳＮＧＩＴＹＬＹ（配列番号２４）、ＹＴＳＴＬＬＰ（配列番号２５）、ＹＡＳＱＳＩＳ（配列番号２６）、ＬＶＳＫＬＤＳ（配列番号２７）、ＴＴＳＮＬＡＳ（配列番号２８）、ＳＴＳＮＬＡＳ（配列番号２９）、ＲＡＳＴＬＡＳ（配列番号３０）、ＬＱＹＳＮＬＬＴ（配列番号３１）、ＱＮＧＨＳＬＰＬＴ（配列番号３２）、ＷＱＧＴＬＦＰＷＴ（配列番号３３）、ＱＱＲＳＴＹＰＦＴ（配列番号３４）、ＱＱＲＩＴＹＰＦＴ（配列番号３５）、およびＡＱＬＬＥＬＰＨＴ（配列番号３６）からなる群から選択される配列を含む１つまたは複数の（たとえば１、２、３、４、５、または６つの）ＣＤＲを含み、ここでＸ１はＹまたはＦであり、Ｘ２はＳまたはＴであり、Ｘ５８はＲまたはＫであり、Ｘ５９はＮ、Ｇ、Ｓ、またはＱであり、Ｘ６０はＧ、Ａ、またはＤである。ある特定の実施形態では、本開示の抗ＣＤ３９抗体部分およびその抗原結合性断片は、配列番号１～９、１１～３６、および１５１のいずれかの１つ、２つ、もしくは３つ以下のアミノ酸残基の置換を有する。
[00179]ある特定の実施形態では、本開示の抗ＣＤ３９抗体部分（たとえば抗ヒトＣＤ３９抗体部分）およびその抗原結合性断片は、ＮＹＧＭＮ（配列番号１）、ＫＹＷＭＮ（配列番号２）、ＮＹＷＭＮ（配列番号３）、ＤＴＦＬＨ（配列番号４）、ＤＹＮＭＹ（配列番号５）、ＤＴＹＶＨ（配列番号６）、ＬＩＮＴＹＴＧＥＰＴＹＡＤＤＦＫＤ（配列番号７）、ＥＩＲＬＫＳＮＫＹＧＴＨＹＡＥＳＶＫＧ（配列番号８）、ＱＩＲＬＮＰＤＮＹＡＴＨＸ１ＡＥＳＶＫＧ（配列番号９）、Ｘ５８ＩＤＰＡＸ５９Ｘ６０ＮＩＫＹＤＰＫＦＱＧ（配列番号１５１）、ＦＩＤＰＹＮＧＹＴＳＹＮＱＫＦＫＧ（配列番号１１）、ＲＩＤＰＡＩＤＮＳＫＹＤＰＫＦＱＧ（配列番号１２）、ＫＧＩＹＹＤＹＶＷＦＦＤＶ（配列番号１３）、ＱＬＤＬＹＷＦＦＤＶ（配列番号１４）、ＨＧＸ２ＲＧＦＡＹ（配列番号１５）、ＳＰＹＹＹＧＳＧＹＲＩＦＤＶ（配列番号１６）、ＩＹＧＹＤＤＡＹＹＦＤＹ（配列番号１７）、ＹＹＣＡＬＹＤＧＹＮＶＹＡＭＤＹ（配列番号１８）、ＫＡＳＱＤＩＮＲＹＩＡ（配列番号１９）、ＲＡＳＱＳＩＳＤＹＬＨ（配列番号２０）、ＫＳＳＱＳＬＬＤＳＤＧＲＴＨＬＮ（配列番号２１）、ＳＡＦＳＳＶＮＹＭＨ（配列番号２２）、ＳＡＴＳＳＶＳＹＭＨ（配列番号２３）、ＲＳＳＫＮＬＬＨＳＮＧＩＴＹＬＹ（配列番号２４）、ＹＴＳＴＬＬＰ（配列番号２５）、ＹＡＳＱＳＩＳ（配列番号２６）、ＬＶＳＫＬＤＳ（配列番号２７）、ＴＴＳＮＬＡＳ（配列番号２８）、ＳＴＳＮＬＡＳ（配列番号２９）、ＲＡＳＴＬＡＳ（配列番号３０）、ＬＱＹＳＮＬＬＴ（配列番号３１）、ＱＮＧＨＳＬＰＬＴ（配列番号３２）、ＷＱＧＴＬＦＰＷＴ（配列番号３３）、ＱＱＲＳＴＹＰＦＴ（配列番号３４）、ＱＱＲＩＴＹＰＦＴ（配列番号３５）、およびＡＱＬＬＥＬＰＨＴ（配列番号３６）からなる群から選択される配列を含む１つまたは複数の（たとえば１、２、３、４、５、または６つの）ＣＤＲを含み、ここでＸ１はＹまたはＦであり、Ｘ２はＳまたはＴであり、Ｘ５８はＲまたはＫであり、Ｘ５９はＮ、Ｇ、Ｓ、またはＱであり、Ｘ６０はＧ、Ａ、またはＤである。ある特定の実施形態では、本開示の抗ＣＤ３９抗体部分およびその抗原結合性断片は、配列番号１～９、１１～３６、および１５１のいずれかの１つ、２つ、もしくは３つ以下のアミノ酸残基の置換を有する。
【0141】
[00180]本明細書で用いる抗体「ｍＡｂ１３」は、配列番号４２の配列を有する重鎖可変領域および配列番号５１の配列を有する軽鎖可変領域を含むモノクローナル抗体を意味する。
【0142】
[00181]本明細書で用いる抗体「ｍＡｂ１４」は、配列番号４３の配列を有する重鎖可変領域および配列番号５２の配列を有する軽鎖可変領域を含むモノクローナル抗体を意味する。
【0143】
[00182]本明細書で用いる抗体「ｍＡｂ１９」は、配列番号４４の配列を有する重鎖可変領域および配列番号５３の配列を有する軽鎖可変領域を含むモノクローナル抗体を意味する。
【0144】
[00183]本明細書で用いる抗体「ｍＡｂ２１」は、配列番号４５の配列を有する重鎖可変領域および配列番号５４の配列を有する軽鎖可変領域を含むモノクローナル抗体を意味する。
【0145】
[00184]本明細書で用いる抗体「ｍＡｂ２３」は、配列番号４７の配列を有する重鎖可変領域および配列番号５６の配列を有する軽鎖可変領域を含むモノクローナル抗体を意味する。
【0146】
[00185]本明細書で用いる抗体「ｍＡｂ３４」は、配列番号４９の配列を有する重鎖可変領域および配列番号５８の配列を有する軽鎖可変領域を含むモノクローナル抗体を意味する。
【0147】
[00186]本明細書で用いる抗体「ｍＡｂ３５」は、配列番号５０の配列を有する重鎖可変領域および配列番号５９の配列を有する軽鎖可変領域を含むモノクローナル抗体を意味する。
【0148】
[00187]ある特定の実施形態では、本開示の抗ＣＤ３９抗体部分およびその抗原結合性断片は、抗体ｍＡｂ１３、ｍＡｂ１４、ｍＡｂ１９、ｍＡｂ２１、ｍＡｂ２３、ｍＡｂ３４、またはｍＡｂ３５の１つまたは複数の（たとえば１、２、３、４、５、または６つの）ＣＤＲ配列を含む。
【0149】
[00188]ある特定の実施形態では、本開示の抗ＣＤ３９抗体部分およびその抗原結合性断片は、配列番号１～６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号７～９、１１～１２、および１５１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２、および配列番号１３～１８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３、ならびに／または配列番号１９～２４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、配列番号２５～３０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２、および配列番号３１～３６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３を含む。
【0150】
[00189]ある特定の実施形態では、本開示の抗ＣＤ３９抗体部分およびその抗原結合性断片は、配列番号１の配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号７の配列を含むＨＣＤＲ２、配列番号１３の配列を含むＨＣＤＲ３、ならびに／または配列番号１９の配列を含むＬＣＤＲ１、配列番号２５の配列を含むＬＣＤＲ２、および配列番号３１の配列を含むＬＣＤＲ３を含む。
【0151】
[00190]ある特定の実施形態では、本開示の抗ＣＤ３９抗体部分およびその抗原結合性断片は、配列番号２の配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号８の配列を含むＨＣＤＲ２、配列番号１４の配列を含むＨＣＤＲ３、ならびに／または配列番号２０の配列を含むＬＣＤＲ１、配列番号２６の配列を含むＬＣＤＲ２、および配列番号３２の配列を含むＬＣＤＲ３を含む。
【0152】
[00191]ある特定の実施形態では、本開示の抗ＣＤ３９抗体部分およびその抗原結合性断片は、配列番号３の配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号３７の配列を含むＨＣＤＲ２、配列番号４０の配列を含むＨＣＤＲ３、ならびに／または配列番号２１の配列を含むＬＣＤＲ１、配列番号２７の配列を含むＬＣＤＲ２、および配列番号３３の配列を含むＬＣＤＲ３を含む。
【0153】
[00192]ある特定の実施形態では、本開示の抗ＣＤ３９抗体部分およびその抗原結合性断片は、配列番号３の配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号３８の配列を含むＨＣＤＲ２、配列番号４１の配列を含むＨＣＤＲ３、ならびに／または配列番号２１の配列を含むＬＣＤＲ１、配列番号２７の配列を含むＬＣＤＲ２、および配列番号３３の配列を含むＬＣＤＲ３を含む。
【0154】
[00193]ある特定の実施形態では、本開示の抗ＣＤ３９抗体部分およびその抗原結合性断片は、配列番号４の配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号１０の配列を含むＨＣＤＲ２、配列番号１６の配列を含むＨＣＤＲ３、ならびに／または配列番号２２の配列を含むＬＣＤＲ１、配列番号２８の配列を含むＬＣＤＲ２、および配列番号３４の配列を含むＬＣＤＲ３を含む。
【0155】
[00194]ある特定の実施形態では、本開示の抗ＣＤ３９抗体部分およびその抗原結合性断片は、配列番号５の配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号１１の配列を含むＨＣＤＲ２、配列番号１７の配列を含むＨＣＤＲ３、ならびに／または配列番号２３の配列を含むＬＣＤＲ１、配列番号２９の配列を含むＬＣＤＲ２、および配列番号３５の配列を含むＬＣＤＲ３を含む。
【0156】
[00195]ある特定の実施形態では、本開示の抗ＣＤ３９抗体およびその抗原結合性断片は、配列番号６の配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号１２の配列を含むＨＣＤＲ２、配列番号１８の配列を含むＨＣＤＲ３、ならびに／または配列番号２４の配列を含むＬＣＤＲ１、配列番号３０の配列を含むＬＣＤＲ２、および配列番号３６の配列を含むＬＣＤＲ３を含む。
【0157】
[00196]下の表１は、抗体部分ｍＡｂ１３、ｍＡｂ１４、ｍＡｂ１９、ｍＡｂ２１、ｍＡｂ２３、ｍＡｂ３４、およびｍＡｂ３５のＣＤＲアミノ酸配列を示す。ＣＤＲの境界はＫａｂａｔの規則によって定義し、または同定した。下の表２は、抗体部分ｍＡｂ１３、ｍＡｂ１４、ｍＡｂ１９、ｍＡｂ２１、ｍＡｂ２３、ｍＡｂ３４、およびｍＡｂ３５の重鎖および軽鎖の可変領域のアミノ酸配列を示す。
【0158】
【表4】
【0159】
【表5-1】
【0160】
【表5-2】
【0161】
[00197]抗体部分ｍＡｂ１３、ｍＡｂ１４、ｍＡｂ１９、ｍＡｂ２１、ｍＡｂ２３、ｍＡｂ３４、およびｍＡｂ３５のそれぞれがＣＤ３９に結合することができ、抗原結合特異性が一次的にＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域によって提供されることを考えれば、抗体部分ｍＡｂ１３、ｍＡｂ１４、ｍＡｂ１９、ｍＡｂ２１、ｍＡｂ２３、ｍＡｂ３４、およびｍＡｂ３５のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３の配列、ならびにＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３の配列は「混合および整合されて」（即ち異なる抗体部分のＣＤＲは混合および整合されるが、それぞれの抗体部分はＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３、ならびにＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含まなくてはならない）、本開示の抗ＣＤ３９結合分子を創出することができる。そのような「混合および整合された」抗体のＣＤ３９結合は、上記および実施例に記載した結合アッセイを用いて試験することができる。好ましくは、ＶＨ ＣＤＲ配列が混合および整合される場合には、特定のＶＨ配列からのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、および／またはＨＣＤＲ３配列は、構造的に同様のＣＤＲ配列で置き換えられる。同様に、ＶＬ ＣＤＲ配列が混合および整合される場合には、特定のＶＬ配列からのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、および／またはＬＣＤＲ３配列は、好ましくは構造的に同様のＣＤＲ配列で置き換えられる。たとえば、抗体部分ｍＡｂ１３およびｍＡｂ１９のＨＣＤＲ１はいくつかの構造的同様性を共有しており、したがって混合および整合させやすい。モノクローナル抗体部分ｍＡｂ１３、ｍＡｂ１４、ｍＡｂ１９、ｍＡｂ２１、ｍＡｂ２３、ｍＡｂ３４、およびｍＡｂ３５について１つまたは複数のＶＨおよび／またはＶＬ ＣＤＲ配列を本明細書で開示したＣＤＲ配列からの構造的に同様の配列で置換することによって新規のＶＨおよびＶＬ配列が創出され得ることは、当業者には容易に明白になる。
【0162】
[00198]ＣＤＲは抗原結合に関与していることが知られている。しかし、６つのＣＤＲの全てが不可欠または不変ではないことが見出されている。換言すれば、ＣＤ３９への特異的な結合親和性を実質的に保持しながら抗ＣＤ３９抗体部分ｍＡｂ１３、ｍＡｂ１４、ｍＡｂ１９、ｍＡｂ２１、ｍＡｂ２３、ｍＡｂ３４、およびｍＡｂ３５における１つまたは複数のＣＤＲを置き換え、変更、または修飾することが可能である。
【0163】
[00199]ある特定の実施形態では、本開示の抗ＣＤ３９抗体部分およびその抗原結合性断片は、その抗体部分およびその抗原結合性断片がＣＤ３９に特異的に結合することができる限り、好適なフレームワーク領域（ＦＲ）配列を含む。上の表１で提供したＣＤＲ配列はマウス抗体から得られるが、これらは組換え手法等の当技術分野で既知の好適な方法を用いてとりわけマウス、ヒト、ラット、ウサギ等の任意の好適な種の任意の好適なＦＲ配列にグラフトすることができる。
【0164】
[00200]ある特定の実施形態では、本開示の抗ＣＤ３９抗体部分およびその抗原結合性断片は、ヒト化される。ヒト化抗体部分またはその抗原結合性断片は、ヒトにおけるその低減した免疫原性において望ましい。ヒト化抗体部分は、非ヒトＣＤＲ配列がヒトまたは実質的にヒトのＦＲ配列にグラフトされているので、その可変領域においてキメラである。抗体部分または抗原結合性断片のヒト化は本質的に、非ヒト（マウス等）ＣＤＲ遺伝子をヒト免疫グロブリン遺伝子中の対応するヒトＣＤＲ遺伝子で置換することによって実施することができる（たとえばＪｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２－５２５；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３－３２７；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４－１５３６）を参照されたい）。
【0165】
[00201]この目的を達成するために、当技術分野で既知の方法を用いて好適なヒト重鎖および軽鎖の可変ドメインを選択することができる。説明的な例では、「ベストフィット」アプローチを用いることができ、ここでは非ヒト（たとえばげっ歯類）抗体の可変ドメイン配列が既知のヒト可変ドメイン配列に対してスクリーニングまたはＢＬＡＳＴ処理され、非ヒトクエリー配列に最も近いヒト配列が同定され、非ヒトＣＤＲ配列をグラフトするためのヒトスキャフォールドとして用いられる（たとえばＳｉｍｓ ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２２９６；Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｊ．Ｍｏｔ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１を参照されたい）。あるいは、非ヒトＣＤＲのグラフト化のために、全てのヒト抗体のコンセンサス配列に由来するフレームワークを用いてもよい（たとえばＣａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：４２８５；Ｐｒｅｓｔａ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５１：２６２３を参照されたい）。
【0166】
[00202]一部の実施形態では、本開示はそれぞれｈｕ１４．Ｈ１Ｌ１、ｈｕ１４．Ｈ２Ｌ１、ｈｕ１４．Ｈ３Ｌ１、ｈｕ１４．Ｈ４Ｌ１、ｈｕ１４．Ｈ１Ｌ２、ｈｕ１４．Ｈ２Ｌ２、ｈｕ１４．Ｈ３Ｌ２、ｈｕ１４．Ｈ４Ｌ２、ｈｕ１４．Ｈ１Ｌ３、ｈｕ１４．Ｈ２Ｌ３、ｈｕ１４．Ｈ３Ｌ３、ｈｕ１４．Ｈ４Ｌ３、ｈｕ１４．Ｈ１Ｌ４、ｈｕ１４．Ｈ２Ｌ４、ｈｕ１４．Ｈ３Ｌ４、およびｈｕ１４．Ｈ４Ｌ４と表記されるｃ１４の１６種のヒト化抗体部分を提供する。ｃ１４のそれぞれのヒト化抗体部分の重鎖および軽鎖の可変領域の配列番号を実施例５．１の表１６に示す。ｃ１４の１６種のヒト化抗体部分のそれぞれは、配列番号２の配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号８の配列を含むＨＣＤＲ２、配列番号１４の配列を含むＨＣＤＲ３、配列番号２０の配列を含むＬＣＤＲ１、配列番号２６の配列を含むＬＣＤＲ２、および配列番号３２の配列を含むＬＣＤＲ３を含む。ＣＤＲの境界はＫａｂａｔの規則によって定義し、または同定した。
【0167】
[00203]一部の実施形態では、本開示はそれぞれｈｕ２３．Ｈ１Ｌ１、ｈｕ２３．Ｈ２Ｌ１、ｈｕ２３．Ｈ３Ｌ１、ｈｕ２３．Ｈ４Ｌ１、ｈｕ２３．Ｈ１Ｌ２、ｈｕ２３．Ｈ２Ｌ２、ｈｕ２３．Ｈ３Ｌ２、ｈｕ２３．Ｈ４Ｌ２、ｈｕ２３．Ｈ１Ｌ３、ｈｕ２３．Ｈ２Ｌ３、ｈｕ２３．Ｈ３Ｌ３、ｈｕ２３．Ｈ４Ｌ３、ｈｕ２３．Ｈ１Ｌ４、ｈｕ２３．Ｈ２Ｌ４、ｈｕ２３．Ｈ３Ｌ４、ｈｕ２３．Ｈ４Ｌ４、ｈｕ２３．Ｈ５Ｌ１、ｈｕ２３．Ｈ６Ｌ１、ｈｕ２３．Ｈ７Ｌ１、ｈｕ２３．Ｈ１Ｌ５、ｈｕ２３．Ｈ５Ｌ５、ｈｕ２３．Ｈ６Ｌ５、ｈｕ２３．Ｈ７Ｌ５、ｈｕ２３．Ｈ１Ｌ６、ｈｕ２３．Ｈ５Ｌ６、ｈｕ２３．Ｈ６Ｌ６、ｈｕ２３．Ｈ７Ｌ６、ｈｕ２３．Ｈ１Ｌ７、ｈｕ２３．Ｈ５Ｌ７、ｈｕ２３．Ｈ６Ｌ７、およびｈｕ２３．Ｈ７Ｌ７と表記されるｃ２３の３１種のヒト化抗体部分を提供する。ｃ２３のそれぞれのヒト化抗体部分の重鎖および軽鎖の可変領域の配列番号を実施例５．１の表１３および表１４に示す。上の抗体部分ｃ２３についての３１種のヒト化抗体部分のそれぞれは、配列番号４の配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号１０の配列を含むＨＣＤＲ２、配列番号１６の配列を含むＨＣＤＲ３、配列番号２２の配列を含むＬＣＤＲ１、配列番号２８の配列を含むＬＣＤＲ２、および配列番号３４の配列を含むＬＣＤＲ３を含む。ＣＤＲの境界はＫａｂａｔの規則によって定義し、または同定した。
【0168】
[00204]一部の実施形態では、本開示は、ＨＣＤＲ２のアミノ酸配列が異なることを除いてｃ２３と同じＣＤＲを有する６種のヒト化抗体部分をも提供する。一部の実施形態では、これらのｃ２３のバリアント（ｃ２３’）のヒト化抗体部分のＨＣＤＲ２のアミノ酸配列は、Ｘ５８ＩＤＰＡＸ５９Ｘ６０ＮＩＫＹＤＰＫＦＱＧ（配列番号１５１）のアミノ酸配列を含み、ここでＸ５８はＲまたはＫであり、Ｘ５９はＮ、Ｇ、Ｓ、またはＱであり、Ｘ６０はＧ、Ａ、またはＤである。一部の実施形態では、これらのｃ２３のバリアント（ｃ２３’）のヒト化抗体部分のＨＣＤＲ２のアミノ酸配列は、ＲＩＤＰＡＧＧＮＩＫＹＤＰＫＦＱＧ（配列番号１３４）、ＲＩＤＰＡＳＧＮＩＫＹＤＰＫＦＱＧ（配列番号１３５）、ＲＩＤＰＡＱＧＮＩＫＹＤＰＫＦＱＧ（配列番号１３６）、ＲＩＤＰＡＮＡＮＩＫＹＤＰＫＦＱＧ（配列番号１３７）、ＲＩＤＰＡＮＤＮＩＫＹＤＰＫＦＱＧ（配列番号１３８）、およびＫＩＤＰＡＮＧＮＩＫＹＤＰＫＦＱＧ（配列番号１３９）からなる群から選択される配列を含む。ＣＤＲの境界はＫａｂａｔの規則によって定義し、または同定した。
【0169】
[00205]一部の実施形態では、本開示は、ｈｕ２３．２０１、ｈｕ２３．２０３、ｈｕ２３．２０７、およびｈｕ２３．２１１と表記される、酵母ディスプレイによるｃ２３バリアントに対する４種のヒト化抗体をも提供する。ヒト化抗体部分ｈｕ２３．２０１、ｈｕ２３．２０３、ｈｕ２３．２０７、およびｈｕ２３．２１１の重鎖可変領域および軽鎖可変領域を実施例５．１の表１５に示す。４種のヒト化抗体部分ｈｕ２３．２０１、ｈｕ２３．２０３、ｈｕ２３．２０７、およびｈｕ２３．２１１のそれぞれは、配列番号４の配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号１０の配列を含むＨＣＤＲ２、配列番号１６の配列を含むＨＣＤＲ３、配列番号２２の配列を含むＬＣＤＲ１、配列番号２８の配列を含むＬＣＤＲ２、および配列番号３４の配列を含むＬＣＤＲ３を含む。ＣＤＲの境界はＫａｂａｔの規則によって定義し、または同定した。
【0170】
[00206]下の表３は、ヒト化ｃ１４重鎖可変領域の４つのバリアント（即ちｈｕ１４．ＶＨ＿１、ｈｕ１４．ＶＨ＿２、ｈｕ１４．ＶＨ＿３、およびｈｕ１４．ＶＨ＿４）およびヒト化ｃ１４軽鎖可変領域の４つのバリアント（即ちｈｕ１４．ＶＬ＿１、ｈｕ１４．ＶＬ＿２、ｈｕ１４．ＶＬ＿３、およびｈｕ１４．ＶＬ＿４）を示す。下の表４は、ヒト化ｃ１４の重鎖および軽鎖の可変領域についてのＦＲのアミノ酸配列を示す。下の表５は、それぞれｈｕ１４．Ｈ１Ｌ１、ｈｕ１４．Ｈ２Ｌ１、ｈｕ１４．Ｈ３Ｌ１、ｈｕ１４．Ｈ４Ｌ１、ｈｕ１４．Ｈ１Ｌ２、ｈｕ１４．Ｈ２Ｌ２、ｈｕ１４．Ｈ３Ｌ２、ｈｕ１４．Ｈ４Ｌ２、ｈｕ１４．Ｈ１Ｌ３、ｈｕ１４．Ｈ２Ｌ３、ｈｕ１４．Ｈ３Ｌ３、ｈｕ１４．Ｈ４Ｌ３、ｈｕ１４．Ｈ１Ｌ４、ｈｕ１４．Ｈ２Ｌ４、ｈｕ１４．Ｈ３Ｌ４、ｈｕ１４．Ｈ４Ｌ４と表記されるキメラ抗体部分ｃ１４についての１６種のヒト化抗体部分のそれぞれの重鎖および軽鎖のＦＲアミノ酸配列を示す。これら１６種のヒト化抗体部分の重鎖可変領域および軽鎖可変領域を実施例５．１の表１６に示す。
【0171】
【表6】
【0172】
【表7】
【0173】
【表8】
【0174】
[00207]下の表６は、ヒト化ｃ２３重鎖可変領域の７つのバリアント（即ちｈｕ２３．ＶＨ＿１、ｈｕ２３．ＶＨ＿２、ｈｕ２３．ＶＨ＿３、ｈｕ２３．ＶＨ＿４、ｈｕ２３．ＶＨ＿５、ｈｕ２３．ＶＨ＿６、およびｈｕ２３．ＶＨ＿７）およびヒト化ｃ２３軽鎖可変領域の７つのバリアント（即ちｈｕ２３．ＶＬ＿１、ｈｕ２３．ＶＬ＿２、ｈｕ２３．ＶＬ＿３、ｈｕ２３．ＶＬ＿４、ｈｕ２３．ＶＬ＿５、ｈｕ２３．ＶＬ＿６、およびｈｕ２３．ＶＬ＿７）を示す。下の表７に、酵母ディスプレイによって得られたキメラ抗体部分ｃ２３についての４種のヒト化抗体部分の重鎖および軽鎖の可変領域のアミノ酸配列を示す。下の表８に、ｃ２３の３５種のヒト化抗体部分のＦＲアミノ酸配列を示す。下の表９に、ｃ２３の３５種のヒト化抗体部分のそれぞれの重鎖および軽鎖についてのＦＲアミノ酸配列を示す。
【0175】
【表9-1】
【0176】
【表9-2】
【0177】
【表10】
【0178】
【表11-1】
【0179】
【表11-2】
【0180】
【表12】
【0181】
[00208]ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるヒト化抗ＣＤ３９抗体部分またはその抗原結合性断片は、非ヒトであるＣＤＲ配列を除いて、実質的に全てのヒト配列からなっている。一部の実施形態では、可変領域ＦＲおよび存在する場合には定常領域は、完全にまたは実質的にヒト免疫グロブリン配列からのものである。ヒトＦＲ配列およびヒト定常領域配列は異なるヒト免疫グロブリン遺伝子由来でよく、たとえばＦＲ配列は１つのヒト抗体由来であり、定常領域は別のヒト抗体に由来する。一部の実施形態では、ヒト化抗体部分またはその抗原結合性断片は、ヒト重鎖ＨＦＲ１～４、および／または軽鎖ＬＦＲ１～４を含む。
【0182】
[00209]一部の実施形態では、ヒトに由来するＦＲ領域は、それが由来する元のヒト免疫グロブリンと同じアミノ酸配列を含んでよい。一部の実施形態では、ヒトＦＲの１つまたは複数のアミノ酸残基は、親の非ヒト抗体からの対応する残基で置換される。これは、ある特定の実施形態ではヒト化抗体またはその断片を非ヒト親抗体の構造に密接に近似させ、それによって結合特性を最適化（たとえば結合親和性を増大）させるために望ましい。ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるヒト化抗体部分またはその抗原結合性断片は、ヒトＦＲ配列のそれぞれにおいて１０、９、８、７、６、５、４、３、２、もしくは１個以下のアミノ酸残基の置換、または重鎖もしくは軽鎖の可変ドメインの全てのＦＲ配列において１０、９、８、７、６、５、４、３、２、もしくは１個以下のアミノ酸残基の置換を含む。一部の実施形態では、アミノ酸残基におけるそのような変化は、重鎖ＦＲ領域にのみ、軽鎖ＦＲ領域にのみ、または両方の鎖に存在し得る。ある特定の実施形態では、ヒトＦＲ配列の１つまたは複数のアミノ酸はランダムに変異して結合親和性を増大させる。ある特定の実施形態では、ヒトＦＲ配列の１つまたは複数のアミノ酸は親の非ヒト抗体の対応するアミノ酸に復帰変異して結合親和性を増大させる。
【0183】
[00210]ある特定の実施形態では、本開示のヒト化抗ＣＤ３９抗体部分およびその抗原結合性断片は、Ｘ１９ＶＱＬＶＸ２０ＳＧＸ２１Ｘ２２Ｘ２３Ｘ２４ＫＰＧＸ２５ＳＸ２６Ｘ２７Ｘ２８ＳＣＸ２９ＡＳＧＸ３０Ｘ３１Ｘ３２Ｘ３３（配列番号７６）の配列またはその少なくとも８０％の配列同一性のある相同配列を含む重鎖ＨＦＲ１、ＷＶＸ３４ＱＸ３５ＰＧＸ３６Ｘ３７ＬＥＷＸ３８Ｘ３９（配列番号７７）の配列またはその少なくとも８０％の配列同一性のある相同配列を含む重鎖ＨＦＲ２、Ｘ４０Ｘ４１ＴＸ４２Ｘ４３Ｘ４４ＤＸ４５ＳＸ４６Ｘ４７ＴＸ４８ＹＸ４９Ｘ５０Ｘ５１Ｘ５２ＳＬＸ５３Ｘ５４ＥＤＴＡＶＹＹＣＸ５５Ｘ５６（配列番号７８）の配列またはその少なくとも８０％の配列同一性のある相同配列を含む重鎖ＨＦＲ３、およびＷＧＱＧＴＸ５７ＶＴＶＳＳ（配列番号１２６）の配列またはその少なくとも８０％の配列同一性のある相同配列を含む重鎖ＨＦＲ４を含み、ここでＸ１９はＱまたはＥであり、Ｘ２０はＥまたはＱであり、Ｘ２１はＧまたはＡであり、Ｘ２２はＧまたはＥであり、Ｘ２３はＬまたはＶであり、Ｘ２４はＶまたはＫであり、Ｘ２５はＧまたはＡであり、Ｘ２６はＬ、Ｍ、またはＶであり、Ｘ２７はＲまたはＫであり、Ｘ２８はＶまたはＬであり、Ｘ２９はＡまたはＫであり、Ｘ３０はＦまたはＹであり、Ｘ３１はＮまたはＴであり、Ｘ３２はＦまたはＬであり、Ｘ３３はＳまたはＫであり、Ｘ３４はＲまたはＫであり、Ｘ３５はＡまたはＳであり、Ｘ３６はＫまたはＱであり、Ｘ３７はＲまたはＧであり、Ｘ３８はＭ、Ｉ、またはＶであり、Ｘ３９はＧまたはＡであり、Ｘ４０はＲまたはＫであり、Ｘ４１はＶ、Ａ、またはＦであり、Ｘ４２はＩまたはＬであり、Ｘ４３はＳまたはＴであり、Ｘ４４はＲまたはＡであり、Ｘ４５はＤまたはＴであり、Ｘ４６はＫ、Ａ、またはＳであり、Ｘ４７はＳまたはＮであり、Ｘ４８はＬ、Ｖ、またはＡであり、Ｘ４９はＭまたはＬであり、Ｘ５０はＱまたはＥであり、Ｘ５１はＭまたはＬであり、Ｘ５２はＳ、Ｉ、またはＮであり、Ｘ５３はＲまたはＫであり、Ｘ５４はＳまたはＴであり、Ｘ５５はＡまたはＴであり、Ｘ５６はＲ、Ｎ、またはＴであり、Ｘ５７はＴまたはＬである。
【0184】
[00211]ある特定の実施形態では、本開示のヒト化抗ＣＤ３９抗体部分およびその抗原結合性断片は、Ｘ３ＩＶＸ４ＴＱＳＰＡＴＬＸ５Ｘ６ＳＰＧＥＲＸ７ＴＸ８Ｘ９Ｃ（配列番号８０）の配列またはその少なくとも８０％の配列同一性のある相同配列を含む軽鎖ＬＦＲ１、ＷＹＱＱＫＰＧＱＸ１０ＰＸ１１ＬＬＩＹ（配列番号８１）の配列またはその少なくとも８０％の配列同一性のある相同配列を含む軽鎖ＬＦＲ２、ＧＸ１２ＰＸ１３ＲＦＳＧＳＧＳＧＴＸ１４Ｘ１５ＴＬＴＩＳＳＸ１６ＥＰＥＤＦＡＶＹＸ１７Ｃ（配列番号８２）の配列またはその少なくとも８０％の配列同一性のある相同配列を含む軽鎖ＬＦＲ３、およびＦＧＸ１８ＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号１５２）の配列またはその少なくとも８０％の相同配列を含む軽鎖ＬＦＲ４を含み、ここでＸ３はＥまたはＱであり、Ｘ４はＬまたはＭであり、Ｘ５はＳまたはＴであり、Ｘ６はＬ、Ｖ、またはＡであり、Ｘ７はＡまたはＶであり、Ｘ８はＬまたはＩであり、Ｘ９はＳまたはＴであり、Ｘ１０はＡまたはＳであり、Ｘ１１はＲまたはＫであり、Ｘ１２はＩまたはＶであり、Ｘ１３はＡまたはＴであり、Ｘ１４はＤまたはＳであり、Ｘ１５はＦまたはＹであり、Ｘ１６はＬ、Ｍ、またはＶであり、Ｘ１７はＹまたはＦであり、Ｘ１８はＧまたはＱである。
【0185】
[00212]ある特定の実施形態では、本開示のヒト化抗ＣＤ３９抗体部分およびその抗原結合性断片は、ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＳＸ６１ＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳ（配列番号１５４）の配列またはその少なくとも８０％の配列同一性のある相同配列を含む重鎖ＨＦＲ１、ＷＶＲＱＸ６２ＰＧＫＧＬＥＷＶＸ６３（配列番号１５５）の配列またはその少なくとも８０％の配列同一性のある相同配列を含む重鎖ＨＦＲ２、ＲＦＴＩＳＲＤＤＳＫＮＴＸ６４ＹＬＱＭＮＳＬＫＴＥＤＴＡＶＹＹＣＴＴ（配列番号１５６）の配列またはその少なくとも８０％の配列同一性のある相同配列を含む重鎖ＨＦＲ３、ＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ（配列番号７９）の配列またはその少なくとも８０％の配列同一性のある相同配列を含む重鎖ＨＦＲ４を含み、ここでＸ６１はＬまたはＭであり、Ｘ６２はＡまたはＳであり、Ｘ６３はＧまたはＡであり、Ｘ６４はＬまたはＶである。
【0186】
[00213]ある特定の実施形態では、本開示のヒト化抗ＣＤ３９抗体部分およびその抗原結合性断片は、ＥＩＶＸ６５ＴＱＳＰＡＴＬＳＸ６６ＳＰＧＥＲＸ６７ＴＬＳＣ（配列番号１５７）またはその少なくとも８０％の配列同一性のある相同配列を含む軽鎖ＬＦＲ１、ＷＹＱＱＫＰＧＱＸ６８ＰＲＬＬＩＹ（配列番号１５８）の配列またはその少なくとも８０％の配列同一性のある相同配列を含む軽鎖ＬＦＲ２、ＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＸ６９ＥＰＥＤＦＡＶＹＸ７０Ｃ（配列番号１５９）の配列またはその少なくとも８０％の配列同一性のある相同配列を含む軽鎖ＬＦＲ３、およびＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号１５３）またはその少なくとも８０％の配列同一性のある相同配列を含む軽鎖ＬＦＲ４を含み、ここでＸ６５はＬまたはＭであり、Ｘ６６はＬまたはＶであり、Ｘ６７はＡまたはＶであり、Ｘ６８はＡまたはＳであり、Ｘ６９はＬまたはＶであり、Ｘ７０はＹまたはＦである。
【0187】
[00214]ある特定の実施形態では、本開示のヒト化抗ＣＤ３９抗体部分およびその抗原結合性断片は、Ｘ７１ＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＸ７２ＳＣＫＡＳＧＹＸ７３ＬＫ（配列番号１６０）の配列またはその少なくとも８０％の配列同一性のある相同配列を含む重鎖ＨＦＲ１、ＷＶＸ７４ＱＡＰＧＱＸ７５ＬＥＷＸ７６Ｇ（配列番号１６１）の配列またはその少なくとも８０％の配列同一性のある相同配列を含む重鎖ＨＦＲ２、Ｘ７７Ｘ７８ＴＸ７９ＴＸ８０ＤＴＳＸ８１Ｘ８２ＴＡＹＸ８３ＥＬＸ８４ＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＸ８５（配列番号１４９）の配列またはその少なくとも８０％の配列同一性のある相同配列を含む重鎖ＨＦＲ３、ＷＧＱＧＴＸ５７ＶＴＶＳＳ（配列番号１２６）またはその少なくとも８０％の配列同一性のある相同配列を含む重鎖ＨＦＲ４を含み、ここでＸ５７は上で定義した通りであり、Ｘ７１はＱまたはＥであり、Ｘ７２はＶまたはＬであり、Ｘ７３はＮまたはＴであり、Ｘ７４はＲまたはＫであり、Ｘ７５はＲまたはＧであり、Ｘ７６はＭまたはＩであり、Ｘ７７はＲまたはＫであり、Ｘ７８はＶまたはＡであり、Ｘ７９はＩまたはＬであり、Ｘ８０はＲまたはＡであり、Ｘ８１はＡまたはＳであり、Ｘ８２はＳまたはＮであり、Ｘ８３はＭまたはＬであり、Ｘ８４はＳまたはＩであり、Ｘ８５はＲまたはＮである。
【0188】
[00215]ある特定の実施形態では、本開示のヒト化抗ＣＤ３９抗体部分およびその抗原結合性断片は、Ｘ８６ＩＶＬＴＱＳＰＡＴＬＸ８７Ｘ８８ＳＰＧＥＲＸ８９ＴＸ９０Ｘ９１Ｃ（配列番号１５０）の配列またはその少なくとも８０％の配列同一性のある相同配列を含む軽鎖ＬＦＲ１、ＷＹＱＱＫＰＧＱＸ１０ＰＸ１１ＬＬＩＹ（配列番号８１）の配列またはその少なくとも８０％の配列同一性のある相同配列を含む軽鎖ＬＦＲ２、ＧＸ９２ＰＸ９３ＲＦＳＧＳＧＳＧＴＸ９４Ｘ９５ＴＬＴＩＳＳＸ９６ＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣ（配列番号１４８）の配列またはその少なくとも８０％の配列同一性のある相同配列を含む軽鎖ＬＦＲ３、およびＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号８３）の配列またはその少なくとも８０％の配列同一性のある相同配列を含む軽鎖ＬＦＲ４を含み、ここでＸ１０およびＸ１１は上で定義した通りであり、Ｘ８６はＥまたはＱであり、Ｘ８７はＳまたはＴであり、Ｘ８８はＬまたはＡであり、Ｘ８９はＡまたはＶであり、Ｘ９０はＬまたはＩであり、Ｘ９１はＳまたはＴであり、Ｘ９２はＩまたはＶであり、Ｘ９３はＡまたはＴであり、Ｘ９４はＤまたはＳであり、Ｘ９５はＦまたはＹであり、Ｘ９６はＬまたはＭである。
【0189】
[00216]ある特定の実施形態では、本開示のヒト化抗ＣＤ３９抗体部分およびその抗原結合性断片は、配列番号８４～８６、１１５、１１９～１２０、および１３１からなる群から選択される配列を含む重鎖ＨＦＲ１、配列番号８７～９０および１２１～１２３の配列を含む重鎖ＨＦＲ２、配列番号９１～９７、１１６～１１７、および１２４～１２５からなる群から選択される配列を含む重鎖ＨＦＲ３、および配列番号７９および１１８からなる群から選択される配列を含む重鎖ＨＦＲ４、ならびに／または配列番号９８～１０３および１２７～１２９からなる群からの配列を含む軽鎖ＬＦＲ１、配列番号１０４、１０５、および１３０からなる群から選択される配列を含む軽鎖ＬＦＲ２、配列番号１０６～１１０および１３２～１３３からなる群から選択される配列を含む軽鎖ＬＦＲ３、および配列番号８３および１５３からなる群から選択される配列を含む軽鎖ＬＦＲ４を含む。
【0190】
[00217]ある特定の実施形態では、本開示のヒト化抗ＣＤ３９抗体部分およびその抗原結合性断片は、ｈｕ１４．ＶＨ＿１（配列番号６８）、ｈｕ１４．ＶＨ＿２（配列番号７０）、ｈｕ１４．ＶＨ＿３（配列番号７２）、ｈｕ１４．ＶＨ＿４（配列番号７４）、ｈｕ２３．ＶＨ＿１（配列番号６０）、ｈｕ２３．ＶＨ＿２（配列番号６２）、ｈｕ２３．ＶＨ＿３（配列番号６４）、ｈｕ２３．ＶＨ＿４（配列番号６６）、ｈｕ２３．ＶＨ＿５（配列番号１４０）、ｈｕ２３．ＶＨ＿６（配列番号１４１）、ｈｕ２３．ＶＨ＿７（配列番号１４２）、ｈｕ２３．２０１Ｈ（配列番号１４６）、ｈｕ２３．２０７Ｈ（配列番号１４７）、およびｈｕ２３．２１１Ｈ（配列番号３９）からなる群から選択される重鎖可変領域に含まれるＨＦＲ１、ＨＦＲ２、ＨＦＲ３、および／またはＨＦＲ４配列を含む。
【0191】
[00218]ある特定の実施形態では、本開示のヒト化抗ＣＤ３９抗体部分およびその抗原結合性断片は、ｈｕ１４．ＶＬ＿１（配列番号６９）、ｈｕ１４．ＶＬ＿２（配列番号７１）、ｈｕ１４．ＶＬ＿３（配列番号７３）、ｈｕ１４．ＶＬ＿４（配列番号７５）、ｈｕ２３．ＶＬ＿１（配列番号６１）、ｈｕ２３．ＶＬ＿２（配列番号６３）、ｈｕ２３．ＶＬ＿３（配列番号６５）、ｈｕ２３．ＶＬ＿４（配列番号６７）、ｈｕ２３．ＶＬ＿５（配列番号１４３）、ｈｕ２３．ＶＬ＿６（配列番号１４４）、ｈｕ２３．ＶＬ＿７（配列番号１４５）、ｈｕ２３．２０１Ｌ（配列番号１１１）、ｈｕ２３．２０３Ｌ（配列番号１１２）、およびｈｕ２３．２１１Ｌ（配列番号６３）からなる群から選択される軽鎖可変領域に含まれるＬＦＲ１、ＬＦＲ２、ＬＦＲ３、および／またはＬＦＲ４配列を含む。
【0192】
[00219]ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるヒト化抗ＣＤ３９抗体部分およびその抗原結合性断片は、配列番号３９、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、１４０、１４１、１４２、１４６、１４７からなる群から選択される重鎖可変ドメイン配列、ならびに／または配列番号６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、１１１、１１２、１４３、１４４、および１４５からなる群から選択される軽鎖可変ドメイン配列を含む。
【0193】
[00220]本開示のキメラ抗体部分ｃ１４の例示的なヒト化抗体部分は、
１）ｈｕ１４．ＶＨ＿１（配列番号６８）の重鎖可変領域およびｈｕ１４．ＶＬ＿１（配列番号６９）の軽鎖可変領域を含む「ｈｕ１４．Ｈ１Ｌ１」、
２）ｈｕ１４．ＶＨ＿２（配列番号７０）の重鎖可変領域およびｈｕ１４．ＶＬ＿１（配列番号６９）の軽鎖可変領域を含む「ｈｕ１４．Ｈ２Ｌ１」、
３）ｈｕ１４．ＶＨ＿３（配列番号７２）の重鎖可変領域およびｈｕ１４．ＶＬ＿１（配列番号６９）の軽鎖可変領域を含む「ｈｕ１４．Ｈ３Ｌ１」、
４）ｈｕ１４．ＶＨ＿４（配列番号７４）の重鎖可変領域およびｈｕ１４．ＶＬ＿１（配列番号６９）の軽鎖可変領域を含む「ｈｕ１４．Ｈ４Ｌ１」、
５）ｈｕ１４．ＶＨ＿１（配列番号６８）の重鎖可変領域およびｈｕ１４．ＶＬ＿２（配列番号７１）の軽鎖可変領域を含む「ｈｕ１４．Ｈ１Ｌ２」、
６）ｈｕ１４．ＶＨ＿２（配列番号７０）の重鎖可変領域およびｈｕ１４．ＶＬ＿２（配列番号７１）の軽鎖可変領域を含む「ｈｕ１４．Ｈ２Ｌ２」、
７）ｈｕ１４．ＶＨ＿３（配列番号７２）の重鎖可変領域およびｈｕ１４．ＶＬ＿２（配列番号７１）の軽鎖可変領域を含む「ｈｕ１４．Ｈ３Ｌ２」、
８）ｈｕ１４．ＶＨ＿４（配列番号７４）の重鎖可変領域、およびｈｕ１４．ＶＬ＿２（配列番号７１）の軽鎖可変領域を含む「ｈｕ１４．Ｈ４Ｌ２」、
９）ｈｕ１４．ＶＨ＿１（配列番号６８）の重鎖可変領域およびｈｕ１４．ＶＬ＿３（配列番号７３）の軽鎖可変領域を含む「ｈｕ１４．Ｈ１Ｌ３」、
１０）ｈｕ１４．ＶＨ＿２（配列番号７０）の重鎖可変領域およびｈｕ１４．ＶＬ＿３（配列番号７３）の軽鎖可変領域を含む「ｈｕ１４．Ｈ２Ｌ３」、
１１）ｈｕ１４．ＶＨ＿３（配列番号７２）の重鎖可変領域およびｈｕ１４．ＶＬ＿３（配列番号７３）の軽鎖可変領域を含む「ｈｕ１４．Ｈ３Ｌ３」、
１２）ｈｕ１４．ＶＨ＿４（配列番号７４）の重鎖可変領域、およびｈｕ１４．ＶＬ＿３（配列番号７３）の軽鎖可変領域を含む「ｈｕ１４．Ｈ４Ｌ３」、
１３）ｈｕ１４．ＶＨ＿１（配列番号６８）の重鎖可変領域およびｈｕ１４．ＶＬ＿４（配列番号７５）の軽鎖可変領域を含む「ｈｕ１４．Ｈ１Ｌ４」、
１４）ｈｕ１４．ＶＨ＿２（配列番号７０）の重鎖可変領域およびｈｕ１４．ＶＬ＿４（配列番号７５）の軽鎖可変領域を含む「ｈｕ１４．Ｈ２Ｌ４」、
１５）ｈｕ１４．ＶＨ＿３（配列番号７２）の重鎖可変領域およびｈｕ１４．ＶＬ＿４（配列番号７５）の軽鎖可変領域を含む「ｈｕ１４．Ｈ３Ｌ４」、
１６）ｈｕ１４．ＶＨ＿４（配列番号７４）の重鎖可変領域、およびｈｕ１４．ＶＬ＿４（配列番号７５）の軽鎖可変領域を含む「ｈｕ１４．Ｈ４Ｌ４」、
を含む。
１）ｈｕ１４．ＶＨ＿１（配列番号６８）の重鎖可変領域およびｈｕ１４．ＶＬ＿１（配列番号６９）の軽鎖可変領域を含む「ｈｕ１４．Ｈ１Ｌ１」、
２）ｈｕ１４．ＶＨ＿２（配列番号７０）の重鎖可変領域およびｈｕ１４．ＶＬ＿１（配列番号６９）の軽鎖可変領域を含む「ｈｕ１４．Ｈ２Ｌ１」、
３）ｈｕ１４．ＶＨ＿３（配列番号７２）の重鎖可変領域およびｈｕ１４．ＶＬ＿１（配列番号６９）の軽鎖可変領域を含む「ｈｕ１４．Ｈ３Ｌ１」、
４）ｈｕ１４．ＶＨ＿４（配列番号７４）の重鎖可変領域およびｈｕ１４．ＶＬ＿１（配列番号６９）の軽鎖可変領域を含む「ｈｕ１４．Ｈ４Ｌ１」、
５）ｈｕ１４．ＶＨ＿１（配列番号６８）の重鎖可変領域およびｈｕ１４．ＶＬ＿２（配列番号７１）の軽鎖可変領域を含む「ｈｕ１４．Ｈ１Ｌ２」、
６）ｈｕ１４．ＶＨ＿２（配列番号７０）の重鎖可変領域およびｈｕ１４．ＶＬ＿２（配列番号７１）の軽鎖可変領域を含む「ｈｕ１４．Ｈ２Ｌ２」、
７）ｈｕ１４．ＶＨ＿３（配列番号７２）の重鎖可変領域およびｈｕ１４．ＶＬ＿２（配列番号７１）の軽鎖可変領域を含む「ｈｕ１４．Ｈ３Ｌ２」、
８）ｈｕ１４．ＶＨ＿４（配列番号７４）の重鎖可変領域、およびｈｕ１４．ＶＬ＿２（配列番号７１）の軽鎖可変領域を含む「ｈｕ１４．Ｈ４Ｌ２」、
９）ｈｕ１４．ＶＨ＿１（配列番号６８）の重鎖可変領域およびｈｕ１４．ＶＬ＿３（配列番号７３）の軽鎖可変領域を含む「ｈｕ１４．Ｈ１Ｌ３」、
１０）ｈｕ１４．ＶＨ＿２（配列番号７０）の重鎖可変領域およびｈｕ１４．ＶＬ＿３（配列番号７３）の軽鎖可変領域を含む「ｈｕ１４．Ｈ２Ｌ３」、
１１）ｈｕ１４．ＶＨ＿３（配列番号７２）の重鎖可変領域およびｈｕ１４．ＶＬ＿３（配列番号７３）の軽鎖可変領域を含む「ｈｕ１４．Ｈ３Ｌ３」、
１２）ｈｕ１４．ＶＨ＿４（配列番号７４）の重鎖可変領域、およびｈｕ１４．ＶＬ＿３（配列番号７３）の軽鎖可変領域を含む「ｈｕ１４．Ｈ４Ｌ３」、
１３）ｈｕ１４．ＶＨ＿１（配列番号６８）の重鎖可変領域およびｈｕ１４．ＶＬ＿４（配列番号７５）の軽鎖可変領域を含む「ｈｕ１４．Ｈ１Ｌ４」、
１４）ｈｕ１４．ＶＨ＿２（配列番号７０）の重鎖可変領域およびｈｕ１４．ＶＬ＿４（配列番号７５）の軽鎖可変領域を含む「ｈｕ１４．Ｈ２Ｌ４」、
１５）ｈｕ１４．ＶＨ＿３（配列番号７２）の重鎖可変領域およびｈｕ１４．ＶＬ＿４（配列番号７５）の軽鎖可変領域を含む「ｈｕ１４．Ｈ３Ｌ４」、
１６）ｈｕ１４．ＶＨ＿４（配列番号７４）の重鎖可変領域、およびｈｕ１４．ＶＬ＿４（配列番号７５）の軽鎖可変領域を含む「ｈｕ１４．Ｈ４Ｌ４」、
を含む。
【0194】
[00221]本開示のキメラ抗体部分ｃ２３の例示的なヒト化抗体部分は、
１）ｈｕ２３．ＶＨ＿１（配列番号６０）の重鎖可変領域およびｈｕ２３．ＶＬ＿１（配列番号６１）の軽鎖可変領域を含む「ｈｕ２３．Ｈ１Ｌ１」、
２）ｈｕ２３．ＶＨ＿２（配列番号６２）の重鎖可変領域およびｈｕ２３．ＶＬ＿１（配列番号６１）の軽鎖可変領域を含む「ｈｕ２３．Ｈ２Ｌ１」、
３）ｈｕ２３．ＶＨ＿３（配列番号６４）の重鎖可変領域およびｈｕ２３．ＶＬ＿１（配列番号６１）の軽鎖可変領域を含む「ｈｕ２３．Ｈ３Ｌ１」、
４）ｈｕ２３．ＶＨ＿４（配列番号６６）の重鎖可変領域およびｈｕ２３．ＶＬ＿１（配列番号６１）の軽鎖可変領域を含む「ｈｕ２３．Ｈ４Ｌ１」、
５）ｈｕ２３．ＶＨ＿１（配列番号６０）の重鎖可変領域およびｈｕ２３．ＶＬ＿２（配列番号６３）の軽鎖可変領域を含む「ｈｕ２３．Ｈ１Ｌ２」、
６）ｈｕ２３．ＶＨ＿２（配列番号６２）の重鎖可変領域およびｈｕ２３．ＶＬ＿２（配列番号６３）の軽鎖可変領域を含む「ｈｕ２３．Ｈ２Ｌ２」、
７）ｈｕ２３．ＶＨ＿３（配列番号６４）の重鎖可変領域およびｈｕ２３．ＶＬ＿２（配列番号６３）の軽鎖可変領域を含む「ｈｕ２３．Ｈ３Ｌ２」、
８）ｈｕ２３．ＶＨ＿４（配列番号６６）の重鎖可変領域およびｈｕ２３．ＶＬ＿２（配列番号６３）の軽鎖可変領域を含む「ｈｕ２３．Ｈ４Ｌ２」、
９）ｈｕ２３．ＶＨ＿１（配列番号６０）の重鎖可変領域およびｈｕ２３．ＶＬ＿３（配列番号６５）の軽鎖可変領域を含む「ｈｕ２３．Ｈ１Ｌ３」、
１０）ｈｕ２３．ＶＨ＿２（配列番号６２）の重鎖可変領域およびｈｕ２３．ＶＬ＿３（配列番号６５）の軽鎖可変領域を含む「ｈｕ２３．Ｈ２Ｌ３」、
１１）ｈｕ２３．ＶＨ＿３（配列番号６４）の重鎖可変領域およびｈｕ２３．ＶＬ＿３（配列番号６５）の軽鎖可変領域を含む「ｈｕ２３．Ｈ３Ｌ３」、
１２）ｈｕ２３．ＶＨ＿４（配列番号６６）の重鎖可変領域およびｈｕ２３．ＶＬ＿３（配列番号６５）の軽鎖可変領域を含む「ｈｕ２３．Ｈ４Ｌ３」、
１３）ｈｕ２３．ＶＨ＿１（配列番号６０）の重鎖可変領域およびｈｕ２３．ＶＬ＿４（配列番号６７）の軽鎖可変領域を含む「ｈｕ２３．Ｈ１Ｌ４」、
１４）ｈｕ２３．ＶＨ＿２（配列番号６２）の重鎖可変領域およびｈｕ２３．ＶＬ＿４（配列番号６７）の軽鎖可変領域を含む「ｈｕ２３．Ｈ２Ｌ４」、
１５）ｈｕ２３．ＶＨ＿３（配列番号６４）の重鎖可変領域およびｈｕ２３．ＶＬ＿４（配列番号６７）の軽鎖可変領域を含む「ｈｕ２３．Ｈ３Ｌ４」、
１６）ｈｕ２３．ＶＨ＿４（配列番号６６）の重鎖可変領域およびｈｕ２３．ＶＬ＿４（配列番号６７）の軽鎖可変領域を含む「ｈｕ２３．Ｈ４Ｌ４」、
１７）ｈｕ２３．ＶＨ＿５（配列番号１４０）の重鎖可変領域およびｈｕ２３．ＶＬ＿１（配列番号６１）の軽鎖可変領域を含む「ｈｕ２３．Ｈ５Ｌ１」、
１８）ｈｕ２３．ＶＨ＿６（配列番号１４１）の重鎖可変領域およびｈｕ２３．ＶＬ＿１（配列番号６１）の軽鎖可変領域を含む「ｈｕ２３．Ｈ６Ｌ１」、
１９）ｈｕ２３．ＶＨ＿７（配列番号１４２）の重鎖可変領域およびｈｕ２３．ＶＬ＿１（配列番号６１）の軽鎖可変領域を含む「ｈｕ２３．Ｈ７Ｌ１」、
２０）ｈｕ２３．ＶＨ＿１（配列番号６０）の重鎖可変領域およびｈｕ２３．ＶＬ＿５（配列番号１４３）の軽鎖可変領域を含む「ｈｕ２３．Ｈ１Ｌ５」、
２１）ｈｕ２３．ＶＨ＿５（配列番号１４０）の重鎖可変領域およびｈｕ２３．ＶＬ＿５（配列番号１４３）の軽鎖可変領域を含む「ｈｕ２３．Ｈ５Ｌ５」、
２２）ｈｕ２３．ＶＨ＿６（配列番号１４１）の重鎖可変領域およびｈｕ２３．ＶＬ＿５（配列番号１４３）の軽鎖可変領域を含む「ｈｕ２３．Ｈ６Ｌ５」、
２３）ｈｕ２３．ＶＨ＿７（配列番号１４２）の重鎖可変領域およびｈｕ２３．ＶＬ＿５（配列番号１４３）の軽鎖可変領域を含む「ｈｕ２３．Ｈ７Ｌ５」、
２４）ｈｕ２３．ＶＨ＿１（配列番号６０）の重鎖可変領域およびｈｕ２３．ＶＬ＿６（配列番号１４４）の軽鎖可変領域を含む「ｈｕ２３．Ｈ１Ｌ６」、
２５）ｈｕ２３．ＶＨ＿５（配列番号１４０）の重鎖可変領域およびｈｕ２３．ＶＬ＿６（配列番号１４４）の軽鎖可変領域を含む「ｈｕ２３．Ｈ５Ｌ６」、
２６）ｈｕ２３．ＶＨ＿６（配列番号１４１）の重鎖可変領域およびｈｕ２３．ＶＬ＿６（配列番号１４４）の軽鎖可変領域を含む「ｈｕ２３．Ｈ６Ｌ６」、
２７）ｈｕ２３．ＶＨ＿７（配列番号１４２）の重鎖可変領域およびｈｕ２３．ＶＬ＿６（配列番号１４４）の軽鎖可変領域を含む「ｈｕ２３．Ｈ７Ｌ６」、
２８）ｈｕ２３．ＶＨ＿１（配列番号６０）の重鎖可変領域およびｈｕ２３．ＶＬ＿７（配列番号１４５）の軽鎖可変領域を含む「ｈｕ２３．Ｈ１Ｌ７」、
２９）ｈｕ２３．ＶＨ＿５（配列番号１４０）の重鎖可変領域およびｈｕ２３．ＶＬ＿７（配列番号１４５）の軽鎖可変領域を含む「ｈｕ２３．Ｈ５Ｌ７」、
３０）ｈｕ２３．ＶＨ＿６（配列番号１４１）の重鎖可変領域およびｈｕ２３．ＶＬ＿７（配列番号１４５）の軽鎖可変領域を含む「ｈｕ２３．Ｈ６Ｌ７」、
３１）ｈｕ２３．ＶＨ＿７（配列番号１４２）の重鎖可変領域およびｈｕ２３．ＶＬ＿７（配列番号１４５）の軽鎖可変領域を含む「ｈｕ２３．Ｈ７Ｌ７」、
３２）ｈｕ２３．２０１Ｈ（配列番号１４６）の重鎖可変領域およびｈｕ２３．２０１Ｌ（配列番号１１１）の軽鎖可変領域を含む「ｈｕ２３．２０１」、
３３）ｈｕ２３．２０１Ｈ（配列番号１４６）の重鎖可変領域およびｈｕ２３．２０３Ｌ（配列番号１１２）の軽鎖可変領域を含む「ｈｕ２３．２０３」、
３４）ｈｕ２３．２０７Ｈ（配列番号１４７）の重鎖可変領域およびｈｕ２３．２０１Ｌ（配列番号１１１）の軽鎖可変領域を含む「ｈｕ２３．２０７」、
３５）ｈｕ２３．２１１Ｈ（配列番号３９）の重鎖可変領域およびｈｕ２３．２１１Ｌ（配列番号６３）の軽鎖可変領域を含む「ｈｕ２３．２１１」
を含む。
１）ｈｕ２３．ＶＨ＿１（配列番号６０）の重鎖可変領域およびｈｕ２３．ＶＬ＿１（配列番号６１）の軽鎖可変領域を含む「ｈｕ２３．Ｈ１Ｌ１」、
２）ｈｕ２３．ＶＨ＿２（配列番号６２）の重鎖可変領域およびｈｕ２３．ＶＬ＿１（配列番号６１）の軽鎖可変領域を含む「ｈｕ２３．Ｈ２Ｌ１」、
３）ｈｕ２３．ＶＨ＿３（配列番号６４）の重鎖可変領域およびｈｕ２３．ＶＬ＿１（配列番号６１）の軽鎖可変領域を含む「ｈｕ２３．Ｈ３Ｌ１」、
４）ｈｕ２３．ＶＨ＿４（配列番号６６）の重鎖可変領域およびｈｕ２３．ＶＬ＿１（配列番号６１）の軽鎖可変領域を含む「ｈｕ２３．Ｈ４Ｌ１」、
５）ｈｕ２３．ＶＨ＿１（配列番号６０）の重鎖可変領域およびｈｕ２３．ＶＬ＿２（配列番号６３）の軽鎖可変領域を含む「ｈｕ２３．Ｈ１Ｌ２」、
６）ｈｕ２３．ＶＨ＿２（配列番号６２）の重鎖可変領域およびｈｕ２３．ＶＬ＿２（配列番号６３）の軽鎖可変領域を含む「ｈｕ２３．Ｈ２Ｌ２」、
７）ｈｕ２３．ＶＨ＿３（配列番号６４）の重鎖可変領域およびｈｕ２３．ＶＬ＿２（配列番号６３）の軽鎖可変領域を含む「ｈｕ２３．Ｈ３Ｌ２」、
８）ｈｕ２３．ＶＨ＿４（配列番号６６）の重鎖可変領域およびｈｕ２３．ＶＬ＿２（配列番号６３）の軽鎖可変領域を含む「ｈｕ２３．Ｈ４Ｌ２」、
９）ｈｕ２３．ＶＨ＿１（配列番号６０）の重鎖可変領域およびｈｕ２３．ＶＬ＿３（配列番号６５）の軽鎖可変領域を含む「ｈｕ２３．Ｈ１Ｌ３」、
１０）ｈｕ２３．ＶＨ＿２（配列番号６２）の重鎖可変領域およびｈｕ２３．ＶＬ＿３（配列番号６５）の軽鎖可変領域を含む「ｈｕ２３．Ｈ２Ｌ３」、
１１）ｈｕ２３．ＶＨ＿３（配列番号６４）の重鎖可変領域およびｈｕ２３．ＶＬ＿３（配列番号６５）の軽鎖可変領域を含む「ｈｕ２３．Ｈ３Ｌ３」、
１２）ｈｕ２３．ＶＨ＿４（配列番号６６）の重鎖可変領域およびｈｕ２３．ＶＬ＿３（配列番号６５）の軽鎖可変領域を含む「ｈｕ２３．Ｈ４Ｌ３」、
１３）ｈｕ２３．ＶＨ＿１（配列番号６０）の重鎖可変領域およびｈｕ２３．ＶＬ＿４（配列番号６７）の軽鎖可変領域を含む「ｈｕ２３．Ｈ１Ｌ４」、
１４）ｈｕ２３．ＶＨ＿２（配列番号６２）の重鎖可変領域およびｈｕ２３．ＶＬ＿４（配列番号６７）の軽鎖可変領域を含む「ｈｕ２３．Ｈ２Ｌ４」、
１５）ｈｕ２３．ＶＨ＿３（配列番号６４）の重鎖可変領域およびｈｕ２３．ＶＬ＿４（配列番号６７）の軽鎖可変領域を含む「ｈｕ２３．Ｈ３Ｌ４」、
１６）ｈｕ２３．ＶＨ＿４（配列番号６６）の重鎖可変領域およびｈｕ２３．ＶＬ＿４（配列番号６７）の軽鎖可変領域を含む「ｈｕ２３．Ｈ４Ｌ４」、
１７）ｈｕ２３．ＶＨ＿５（配列番号１４０）の重鎖可変領域およびｈｕ２３．ＶＬ＿１（配列番号６１）の軽鎖可変領域を含む「ｈｕ２３．Ｈ５Ｌ１」、
１８）ｈｕ２３．ＶＨ＿６（配列番号１４１）の重鎖可変領域およびｈｕ２３．ＶＬ＿１（配列番号６１）の軽鎖可変領域を含む「ｈｕ２３．Ｈ６Ｌ１」、
１９）ｈｕ２３．ＶＨ＿７（配列番号１４２）の重鎖可変領域およびｈｕ２３．ＶＬ＿１（配列番号６１）の軽鎖可変領域を含む「ｈｕ２３．Ｈ７Ｌ１」、
２０）ｈｕ２３．ＶＨ＿１（配列番号６０）の重鎖可変領域およびｈｕ２３．ＶＬ＿５（配列番号１４３）の軽鎖可変領域を含む「ｈｕ２３．Ｈ１Ｌ５」、
２１）ｈｕ２３．ＶＨ＿５（配列番号１４０）の重鎖可変領域およびｈｕ２３．ＶＬ＿５（配列番号１４３）の軽鎖可変領域を含む「ｈｕ２３．Ｈ５Ｌ５」、
２２）ｈｕ２３．ＶＨ＿６（配列番号１４１）の重鎖可変領域およびｈｕ２３．ＶＬ＿５（配列番号１４３）の軽鎖可変領域を含む「ｈｕ２３．Ｈ６Ｌ５」、
２３）ｈｕ２３．ＶＨ＿７（配列番号１４２）の重鎖可変領域およびｈｕ２３．ＶＬ＿５（配列番号１４３）の軽鎖可変領域を含む「ｈｕ２３．Ｈ７Ｌ５」、
２４）ｈｕ２３．ＶＨ＿１（配列番号６０）の重鎖可変領域およびｈｕ２３．ＶＬ＿６（配列番号１４４）の軽鎖可変領域を含む「ｈｕ２３．Ｈ１Ｌ６」、
２５）ｈｕ２３．ＶＨ＿５（配列番号１４０）の重鎖可変領域およびｈｕ２３．ＶＬ＿６（配列番号１４４）の軽鎖可変領域を含む「ｈｕ２３．Ｈ５Ｌ６」、
２６）ｈｕ２３．ＶＨ＿６（配列番号１４１）の重鎖可変領域およびｈｕ２３．ＶＬ＿６（配列番号１４４）の軽鎖可変領域を含む「ｈｕ２３．Ｈ６Ｌ６」、
２７）ｈｕ２３．ＶＨ＿７（配列番号１４２）の重鎖可変領域およびｈｕ２３．ＶＬ＿６（配列番号１４４）の軽鎖可変領域を含む「ｈｕ２３．Ｈ７Ｌ６」、
２８）ｈｕ２３．ＶＨ＿１（配列番号６０）の重鎖可変領域およびｈｕ２３．ＶＬ＿７（配列番号１４５）の軽鎖可変領域を含む「ｈｕ２３．Ｈ１Ｌ７」、
２９）ｈｕ２３．ＶＨ＿５（配列番号１４０）の重鎖可変領域およびｈｕ２３．ＶＬ＿７（配列番号１４５）の軽鎖可変領域を含む「ｈｕ２３．Ｈ５Ｌ７」、
３０）ｈｕ２３．ＶＨ＿６（配列番号１４１）の重鎖可変領域およびｈｕ２３．ＶＬ＿７（配列番号１４５）の軽鎖可変領域を含む「ｈｕ２３．Ｈ６Ｌ７」、
３１）ｈｕ２３．ＶＨ＿７（配列番号１４２）の重鎖可変領域およびｈｕ２３．ＶＬ＿７（配列番号１４５）の軽鎖可変領域を含む「ｈｕ２３．Ｈ７Ｌ７」、
３２）ｈｕ２３．２０１Ｈ（配列番号１４６）の重鎖可変領域およびｈｕ２３．２０１Ｌ（配列番号１１１）の軽鎖可変領域を含む「ｈｕ２３．２０１」、
３３）ｈｕ２３．２０１Ｈ（配列番号１４６）の重鎖可変領域およびｈｕ２３．２０３Ｌ（配列番号１１２）の軽鎖可変領域を含む「ｈｕ２３．２０３」、
３４）ｈｕ２３．２０７Ｈ（配列番号１４７）の重鎖可変領域およびｈｕ２３．２０１Ｌ（配列番号１１１）の軽鎖可変領域を含む「ｈｕ２３．２０７」、
３５）ｈｕ２３．２１１Ｈ（配列番号３９）の重鎖可変領域およびｈｕ２３．２１１Ｌ（配列番号６３）の軽鎖可変領域を含む「ｈｕ２３．２１１」
を含む。
【0195】
[00222]これらの例示的なヒト化抗ＣＤ３９抗体部分はＣＤ３９に対する特異的な結合能力または親和性を保持しており、その観点において親のマウス抗体部分ｍＡｂ１４またはｍＡｂ２３と少なくとも同程度またはそれより優れていた。
【0196】
[00223]一部の実施形態では、本明細書で提供される抗ＣＤ３９抗体部分および抗原結合性断片は、重鎖可変ドメインの全てもしくは一部、および／または軽鎖可変ドメインの全てもしくは一部を含む。一実施形態では、本明細書で提供される抗ＣＤ３９抗体部分またはその抗原結合性断片は、本明細書で提供される重鎖可変ドメインの全てまたは一部からなる単鎖ドメイン抗体である。そのような単鎖ドメイン抗体のさらなる情報は当技術分野で利用可能である（たとえば米国特許第６，２４８，５１６号を参照されたい）。
【0197】
[00224]ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗ＣＤ３９抗体部分またはその抗原結合性断片は、免疫グロブリン（Ｉｇ）の定常領域をさらに含み、これは任意選択で重鎖および／または軽鎖の定常領域をさらに含む。ある特定の実施形態では、重鎖定常領域はＣＨ１、ヒンジ、および／またはＣＨ２－ＣＨ３領域（または任意選択でＣＨ２－ＣＨ３－ＣＨ４領域）を含む。ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗ＣＤ３９抗体またはその抗原結合性断片は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、またはＩｇＭの重鎖定常領域を含む。ある特定の実施形態では、軽鎖定常領域はＣκまたはＣλを含む。本明細書で提供される抗ＣＤ３９抗体部分またはその抗原結合性断片の定常領域は、野生型の定常領域の配列と同一であってもよく、１つまたは複数の変異において異なってもよい。
【0198】
[00225]ある特定の実施形態では、重鎖定常領域はＦｃ領域を含む。Ｆｃ領域は、抗体依存性細胞性細胞毒性（ＡＤＣＣ）および抗体の補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）等のエフェクター機能を媒介することが知られている。異なるＩｇアイソタイプのＦｃ領域はエフェクター機能を誘導する異なる能力を有する。たとえば、ＩｇＧ１およびＩｇＧ３のＦｃ領域は、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４のＦｃ領域より効果的にＡＤＣＣとＣＤＣの両方を誘導することが認識されている。ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗ＣＤ３９抗体部分およびその抗原結合性断片は、ＡＤＣＣまたはＣＤＣを誘導することができるＩｇＧ１またはＩｇＧ３アイソタイプのＦｃ領域を含み、あるいはエフェクター機能が低減しまたは枯渇したＩｇＧ４もしくはＩｇＧ２アイソタイプの定常領域を含む。一部の実施形態では、ヒトＩｇＧ１に由来するＦｃ領域は低減したエフェクター機能を有する。一部の実施形態では、ヒトＩｇＧ１に由来するＦｃ領域はＬ２３４Ａおよび／またはＬ２３５Ａの変異を含む。ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗ＣＤ３９抗体部分またはその抗原結合性断片は、野生型のヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域またはその他の野生型のヒトＩｇＧ４の対立遺伝子を含む。ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗ＣＤ３９抗体部分またはその抗原結合性断片は、Ｓ２２８Ｐの変異および／もしくはＬ２３５Ｅの変異、ならびに／またはＦ２３４ＡおよびＬ２３５Ａの変異を含むヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域を含む。一部の実施形態では、ヒトＩｇＧ４に由来するＦｃ領域はＳ２２８Ｐの変異ならびに／またはＦ２３４ＡおよびＬ２３５Ａの変異を含む。
【0199】
[00226]ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗ＣＤ３９抗体部分またはその抗原結合性断片は、診断用および／または治療用に提供するために十分なヒトＣＤ３９に対する特異的結合親和性を有する。
【0200】
[00227]本明細書で提供される抗ＣＤ３９抗体部分またはその抗原結合性断片は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、組換え抗体、二重特異的抗体、多重特異的抗体、標識抗体、二価抗体、抗イディオタイプ抗体、または融合タンパク質であってよい。組換え抗体は、動物体内でなくｉｎ ｖｉｔｒｏで組換え法を用いて調製された抗体である。
【0201】
[00228]ある特定の実施形態では、本開示は、ＣＤ３９との結合について本明細書で提供される抗体部分またはその抗原結合性断片と競合する、抗ＣＤ３９抗体部分またはその抗原結合性断片を提供する。ある特定の実施形態では、本開示は、ヒトＣＤ３９との結合について配列番号４３の配列を含む重鎖可変領域および配列番号５２の配列を含む軽鎖可変領域を含む抗体部分と競合する、抗ＣＤ３９抗体部分またはその抗原結合性断片を提供する。ある特定の実施形態では、本開示は、ヒトＣＤ３９との結合について配列番号４４の配列を含む重鎖可変領域および配列番号５３の配列を含む軽鎖可変領域を含む抗体部分と競合する、抗ＣＤ３９抗体部分またはその抗原結合性断片を提供する。ある特定の実施形態では、本開示は、ヒトＣＤ３９との結合について配列番号４５の配列を含む重鎖可変領域および配列番号５４の配列を含む軽鎖可変領域を含む抗体部分と競合するか、またはヒトＣＤ３９との結合について配列番号４７の配列を含む重鎖可変領域および配列番号５６の配列を含む軽鎖可変領域を含む抗体部分と競合する、抗ＣＤ３９抗体部分またはその抗原結合性断片を提供する。
【0202】
[00229]一部の実施形態では、本開示は、ＣＤ３９のエピトープと特異的に結合する抗ＣＤ３９抗体部分またはその抗原結合性断片を提供し、ここでエピトープはＱ９６、Ｎ９９、Ｅ１４３、Ｒ１４７、Ｒ１３８、Ｍ１３９、Ｅ１４２、Ｋ５、Ｅ１００、Ｄ１０７、Ｖ８１、Ｅ８２、Ｒ１１１、およびＶ１１５からなる群から選択される１つまたは複数の残基を含む。
【0203】
[00230]一部の実施形態では、エピトープはＱ９６、Ｎ９９、Ｅ１４３、およびＲ１４７からなる群から選択される１つまたは複数の残基を含む。一部の実施形態では、エピトープは残基Ｑ９６、Ｎ９９、Ｅ１４３、およびＲ１４７の全てを含む。
【0204】
[00231]一部の実施形態では、エピトープはＲ１３８、Ｍ１３９、およびＥ１４２からなる群から選択される１つまたは複数の残基を含む。一部の実施形態では、エピトープは残基Ｒ１３８、Ｍ１３９、およびＥ１４２の全てを含む。
【0205】
[00232]一部の実施形態では、エピトープはＫ５、Ｅ１００、およびＤ１０７からなる群から選択される１つまたは複数の残基を含む。一部の実施形態では、エピトープは残基Ｋ５、Ｅ１００、およびＤ１０７の全てを含む。
【0206】
[00233]一部の実施形態では、エピトープはＶ８１、Ｅ８２、Ｒ１１１、およびＶ１１５からなる群から選択される１つまたは複数の残基を含む。一部の実施形態では、エピトープは残基Ｖ８１、Ｅ８２、Ｒ１１１、およびＶ１１５の全てを含む。
【0207】
[00234]一部の実施形態では、ＣＤ３９はヒトＣＤ３９である。一部の実施形態では、ＣＤ３９は配列番号１６２のアミノ酸配列を含むヒトＣＤ３９である。
[00235]一部の実施形態では、本明細書で提供される抗ＣＤ３９抗体部分またはその抗原結合性断片は、抗体９－８Ｂ、抗体Ｔ８９５、および抗体Ｉ３９４のいずれでもない。
[00235]一部の実施形態では、本明細書で提供される抗ＣＤ３９抗体部分またはその抗原結合性断片は、抗体９－８Ｂ、抗体Ｔ８９５、および抗体Ｉ３９４のいずれでもない。
【0208】
[00236]本明細書で用いる「９－８Ｂ」は、配列番号４６のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および配列番号４８のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む抗体またはその抗原結合性断片を意味する。
【0209】
[00237]本明細書で用いる「Ｔ８９５」は、配列番号５５のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および配列番号５７のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む抗体またはその抗原結合性断片を意味する。
【0210】
[00238]本明細書で用いる「Ｉ３９４」は、配列番号１１３のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および配列番号１１４のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む抗体またはその抗原結合性断片を意味する。
【0211】
抗体バリアント
[00239]本明細書で提供される抗ＣＤ３９抗体部分およびその抗原結合性断片は、本明細書で提供される抗体配列の種々のバリアントをも包含する。
[00239]本明細書で提供される抗ＣＤ３９抗体部分およびその抗原結合性断片は、本明細書で提供される抗体配列の種々のバリアントをも包含する。
【0212】
[00240]ある特定の実施形態では、抗体バリアントは、上の表１で提供したＣＤＲ配列の１つもしくは複数、上の表４、表５、表８、および表９で提供した重鎖可変領域もしくは軽鎖可変領域の非ＣＤＲ配列の１つもしくは複数、ならびに／または定常領域（たとえばＦｃ領域）における１つまたは複数の修飾または置換を含む。そのようなバリアントはＣＤ３９に対するそれらの親抗体の結合特異性を保持しているが、修飾または置換によって与えられる１つまたは複数の望ましい特性を有する。たとえば、抗体バリアントは、改善された抗原結合親和性、改善されたグリコシル化パターン、低減されたグリコシル化のリスク、低減された脱アミノ化、低減されまたは枯渇したエフェクター機能、改善されたＦｃＲｎ受容体結合、増大した薬物動態学的半減期、ｐＨ感受性、および／またはコンジュゲート化に対する適合性（たとえば導入された１つまたは複数のシステイン残基）を有し得る。
【0213】
[00241]当技術分野で既知の方法、たとえば「アラニンスキャニング変異生成」を用いて親抗体配列をスクリーニングして、修飾しまたは置換するために好適なまたは好ましい残基を同定してよい（たとえばＣｕｎｎｉｎｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｅｌｌｓ（１９８９） Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１０８１－１０８５を参照されたい）。簡単には、標的の残基（たとえばＡｒｇ、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、およびＧｌｕ等の荷電残基）を同定し、中性または陰荷電のアミノ酸（たとえばアラニンまたはポリアラニン）で置き換えることができ、修飾された抗体を産生して目的の特性についてスクリーニングする。特定のアミノ酸の位置における置換によって目的の機能の変化が実証されれば、その位置を修飾または置換のための可能性のある残基として同定することができる。可能性のある残基は、異なる種類の残基（たとえばシステイン残基、陽荷電残基等）で置換することによってさらに評価してよい。
【0214】
親和性バリアント
[00242]抗体の親和性バリアントは、上の表１で提供した１つもしくは複数のＣＤＲ配列、上の表４、表５、表８、および表９で提供した１つもしくは複数のＦＲ配列、または上の表２、表３、表６、および表７で提供した重鎖または軽鎖の可変領域配列における修飾または置換を含んでよい。ＣＤＲ領域は可変領域において２つのＦＲ領域に隣接していることが当技術分野で公知であるので、ＦＲ配列は、上の表１におけるＣＤＲ配列および上の表２、表３、表６、および表７における可変領域配列に基づいて当業者によって容易に同定することができる。親和性バリアントはＣＤ３９に対する親抗体の特異的結合親和性を保持し、または親抗体よりも改善されたＣＤ３９特異的結合親和性さえも有する。ある特定の実施形態では、ＣＤＲ配列、ＦＲ配列、または可変領域配列における置換の少なくとも１つ（または全て）は、保存的置換を含む。
[00242]抗体の親和性バリアントは、上の表１で提供した１つもしくは複数のＣＤＲ配列、上の表４、表５、表８、および表９で提供した１つもしくは複数のＦＲ配列、または上の表２、表３、表６、および表７で提供した重鎖または軽鎖の可変領域配列における修飾または置換を含んでよい。ＣＤＲ領域は可変領域において２つのＦＲ領域に隣接していることが当技術分野で公知であるので、ＦＲ配列は、上の表１におけるＣＤＲ配列および上の表２、表３、表６、および表７における可変領域配列に基づいて当業者によって容易に同定することができる。親和性バリアントはＣＤ３９に対する親抗体の特異的結合親和性を保持し、または親抗体よりも改善されたＣＤ３９特異的結合親和性さえも有する。ある特定の実施形態では、ＣＤＲ配列、ＦＲ配列、または可変領域配列における置換の少なくとも１つ（または全て）は、保存的置換を含む。
【0215】
[00243]当業者であれば、上の表１で提供したＣＤＲ配列、ならびに上の表２、表３、表６、および表７で提供した可変領域配列において、１つまたは複数のアミノ酸残基が置換され、しかも得られる抗体もしくは抗原結合性断片がまだＣＤ３９に対する結合親和性もしくは結合容量を保持し、または改善された結合親和性もしくは容量さえも有することが理解される。この目的を達成するために、当技術分野で既知の種々の方法を用いることができる。たとえば、ファージディスプレイ技術を用いて抗体バリアント（ＦａｂまたはｓｃＦｖバリアント等）のライブラリーを生成して発現させ、次いでヒトＣＤ３９への結合親和性についてスクリーニングすることができる。別の例として、コンピューターソフトウェアを用いて抗体のヒトＣＤ３９への結合を仮想的に模擬し、結合界面を形成する抗体上のアミノ酸残基を同定することができる。そのような残基は、結合親和性の低減を防止するために置換において避けるか、またはより強い結合を提供するために置換の標的としてもよい。
【0216】
[00244]ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるヒト化抗ＣＤ３９抗体部分またはその抗原結合性断片は、ＣＤＲ配列の１つもしくは複数において、および／またはＦＲ配列の１つもしくは複数において、１つまたは複数のアミノ酸残基の置換を含む。ある特定の実施形態では、親和性バリアントは、ＣＤＲ配列中および／またはＦＲ配列中、合計で２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１以下の置換を含む。
【0217】
[00245]ある特定の実施形態では、抗ＣＤ３９抗体部分またはその抗原結合性断片は、上の表１に列挙したＣＤＲと少なくとも８０％（たとえば少なくとも８５％、８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％）の配列同一性を有する１つ、２つ、または３つのＣＤＲ配列を含み、しかもその親抗体と同様またはそれより高いレベルでさえＣＤ３９に対する特異的結合親和性を保持している。
【0218】
[00246]ある特定の実施形態では、抗ＣＤ３９抗体部分またはその抗原結合性断片は、上の表２、表３、表６、および表７に列挙した可変領域配列と少なくとも８０％（たとえば少なくとも８５％、８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％）の配列同一性を有する１つまたは複数の可変領域配列を含み、しかもその親抗体と同様またはそれより高いレベルでさえＣＤ３９に対する特異的結合親和性を保持している。一部の実施形態では、上の表２、表３、表６、および表７に列挙した可変領域配列において全部で１～１０個のアミノ酸が置換され、挿入され、または欠失している。一部の実施形態では、置換、挿入、または欠失は、ＣＤＲの外（たとえばＦＲの中）の領域で起こる。
【0219】
グリコシル化バリアント
[00247]本明細書で提供される抗ＣＤ３９抗体部分またはその抗原結合性断片は、抗体またはその抗原結合性断片のグリコシル化の程度を増加しまたは減少することによって得られるグリコシル化バリアントをも包含する。
[00247]本明細書で提供される抗ＣＤ３９抗体部分またはその抗原結合性断片は、抗体またはその抗原結合性断片のグリコシル化の程度を増加しまたは減少することによって得られるグリコシル化バリアントをも包含する。
【0220】
[00248]抗ＣＤ３９抗体部分またはその抗原結合性断片は、グリコシル化部位を導入しまたは除去する１つまたは複数の修飾を含んでよい。グリコシル化部位は、炭水化物部分（たとえばオリゴ糖構造）を結合することができる側鎖を有するアミノ酸残基である。抗体のグリコシル化は、典型的にはＮ連結またはＯ連結である。Ｎ連結は、アスパラギン残基、たとえばアスパラギン－Ｘ－セリンおよびアスパラギン－Ｘ－スレオニン等のトリペプチド配列においてＸがプロリンを除く任意のアミノ酸である、アスパラギン残基の側鎖への炭水化物部分の結合を意味する。Ｏ連結グリコシル化は、糖、Ｎ－アセチルガラクトサミン、ガラクトース、またはキシロースのうちの１つの、ヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセリンまたはスレオニンへの結合を意味する。天然のグリコシル化部位の除去は、たとえば配列中に存在する上記のトリペプチド配列（Ｎ連結グリコシル化部位について）またはセリンもしくはスレオニン残基（Ｏ連結グリコシル化部位について）の１つが置換されるようにアミノ酸配列を改変することによって、便利に達成することができる。そのようなトリペプチド配列またはセリンもしくはスレオニン残基を導入することによって、新たなグリコシル化部位を同様に創出することができる。
【0221】
[00249]ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗ＣＤ３９抗体部分および抗原結合性断片は、１つまたは複数の脱アミド化部位を除去するために、Ｎ５５、Ｇ５６、およびＮ２３９からなる群から選択される位置に１つまたは複数の変異を含む。ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗ＣＤ３９抗体部分および抗原結合性断片は、Ｎ５５の変異（たとえばＮ５５Ｇ、Ｎ５５Ｓ、またはＮ５５Ｑ）、および／またはＧ５６の変異（たとえばＧ５６Ａ、Ｇ５６Ｄ）、および／またはＮ２９７の変異（たとえばＮ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｑ、またはＮ２９７Ｇ）を含む。これらの変異を試験し、本明細書で提供される抗体部分の結合親和性に悪影響を与えないと考えられる。
【0222】
システイン操作されたバリアント
[00250]本明細書で提供される抗ＣＤ３９抗体部分またはその抗原結合性断片は、導入された１つまたは複数の遊離のシステインアミノ酸残基を含む、システイン操作されたバリアントをも包含する。
[00250]本明細書で提供される抗ＣＤ３９抗体部分またはその抗原結合性断片は、導入された１つまたは複数の遊離のシステインアミノ酸残基を含む、システイン操作されたバリアントをも包含する。
【0223】
[00251]遊離のシステイン残基は、ジスルフィド架橋の部分ではない残基である。システイン操作されたバリアントは、操作されたシステインの部位で、たとえばマレイミドまたはハロアセチルによって、たとえば細胞毒性および／またはイメージング化合物、標識、またはとりわけ放射性同位体とコンジュゲートするために有用である。抗体またはその抗原結合性断片を操作して遊離のシステイン残基を導入する方法は当技術分野で既知であり、たとえばＷＯ２００６／０３４４８８を参照されたい。
【0224】
Ｆｃバリアント
[00252]本明細書で提供される抗ＣＤ３９抗体部分またはその抗原結合性断片は、たとえばＡＤＣＣおよびＣＤＣ等の改変されたエフェクター機能を提供するために、Ｆｃ領域および／またはヒンジ領域に１つまたは複数のアミノ酸残基の修飾または置換を含むＦｃバリアントをも包含する。抗体操作によってＡＤＣＣ活性を改変する方法は当技術分野において記載されており、たとえばＳｈｉｅｌｄｓ ＲＬ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２００１．２７６（９）：６５９１－６０４；Ｉｄｕｓｏｇｉｅ ＥＥ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０００．１６４（８）：４１７８－８４；Ｓｔｅｕｒｅｒ Ｗ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９５，１５５（３）：１１６５－７４；Ｉｄｕｓｏｇｉｅ ＥＥ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００１，１６６（４）：２５７１－５；Ｌａｚａｒ ＧＡ．ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ，２００６，１０３（１１）：４００５－４０１０；Ｒｙａｎ ＭＣ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ．，２００７，６：３００９－３０１８；Ｒｉｃｈａｒｄｓ ＪＯ，．ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ．２００８，７（８）：２５１７－２７；Ｓｈｉｅｌｄｓ Ｒ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，２００２，２７７：２６７３３－２６７４０；Ｓｈｉｎｋａｗａ Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，２００３，２７８：３４６６－３４７３を参照されたい。
[00252]本明細書で提供される抗ＣＤ３９抗体部分またはその抗原結合性断片は、たとえばＡＤＣＣおよびＣＤＣ等の改変されたエフェクター機能を提供するために、Ｆｃ領域および／またはヒンジ領域に１つまたは複数のアミノ酸残基の修飾または置換を含むＦｃバリアントをも包含する。抗体操作によってＡＤＣＣ活性を改変する方法は当技術分野において記載されており、たとえばＳｈｉｅｌｄｓ ＲＬ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２００１．２７６（９）：６５９１－６０４；Ｉｄｕｓｏｇｉｅ ＥＥ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０００．１６４（８）：４１７８－８４；Ｓｔｅｕｒｅｒ Ｗ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９５，１５５（３）：１１６５－７４；Ｉｄｕｓｏｇｉｅ ＥＥ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００１，１６６（４）：２５７１－５；Ｌａｚａｒ ＧＡ．ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ，２００６，１０３（１１）：４００５－４０１０；Ｒｙａｎ ＭＣ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ．，２００７，６：３００９－３０１８；Ｒｉｃｈａｒｄｓ ＪＯ，．ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ．２００８，７（８）：２５１７－２７；Ｓｈｉｅｌｄｓ Ｒ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，２００２，２７７：２６７３３－２６７４０；Ｓｈｉｎｋａｗａ Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，２００３，２７８：３４６６－３４７３を参照されたい。
【0225】
[00253]本明細書で提供される抗体部分または抗原結合性断片のＣＤＣ活性は、たとえばＣ１ｑ結合および／またはＣＤＣを改善しまたは減退させることによって改変することもできる（たとえばＷＯ９９／５１６４２；Ｄｕｎｃａｎ ＆ Ｗｉｎｔｅｒ Ｎａｔｕｒｅ ３２２：７３８－４０（１９８８）；米国特許第５，６４８，２６０号；米国特許第５，６２４，８２１号；ならびにＦｅ領域バリアントの他の例に関してはＷＯ９４／２９３５１を参照されたい）。Ｆｃ領域のアミノ酸残基３２９、３３１、および３２２から選択される１つまたは複数のアミノ酸を異なるアミノ酸残基で置き換えて、Ｃ１ｑの結合および／または低減されもしくは消失された補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）を改変することができる（たとえばＩｄｕｓｏｇｉｅらによる米国特許第６，１９４，５５１号を参照されたい）。１つまたは複数のアミノ酸置換を導入して、抗体の補体を固定する能力を改変することもできる（ＢｏｄｍｅｒらによるＰＣＴ公開ＷＯ ９４／２９３５１を参照されたい）。
【0226】
[00254]ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗ＣＤ３９抗体部分またはその抗原結合性断片は低減したエフェクター機能を有し、ＩｇＧ１において２３４、２３５、２３７、２３８、２６８、２９７、３０９、３３０、および３３１からなる群から選択される位置に１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗ＣＤ３９抗体部分またはその抗原結合性断片はＩｇＧ１アイソタイプのものであり、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｑ、Ｎ２９７Ｇ、Ｌ２３５Ｅ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３４Ｆ、Ｌ２３５Ｅ、Ｐ３３１Ｓからなる群から選択される１つもしくは複数のアミノ酸の置換、またはそれらの任意の組合せを含む。ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗ＣＤ３９抗体部分またはその抗原結合性断片はＩｇＧ１アイソタイプのものであり、Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａの変異を含む。ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗ＣＤ３９抗体部分またはその抗原結合性断片はＩｇＧ２アイソタイプのものであり、Ｈ２６８Ｑ、Ｖ３０９Ｌ、Ａ３３０Ｓ、Ｐ３３１Ｓ、Ｖ２３４Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｐ２３８Ｓ、Ｈ２６８Ａからなる群から選択される１つまたは複数のアミノ酸の置換、またはそれらの任意の組合せ（たとえばＨ２６８Ｑ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ、Ｖ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ）を含む。ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗ＣＤ３９抗体部分またはその抗原結合性断片はＩｇＧ４アイソタイプのものであり、Ｓ２２８Ｐ、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｑ、Ｎ２９７Ｇ、Ｌ２３５Ｅ、Ｆ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａからなる群から選択される１つまたは複数のアミノ酸の置換、またはそれらの任意の組合せを含む。ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗ＣＤ３９抗体部分またはその抗原結合性断片はＩｇＧ２／ＩｇＧ４交差アイソタイプのものである。ＩｇＧ２／ＩｇＧ４交差アイソタイプの例はＲｏｔｈｅｒ ＲＰ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２５：１２５６－１２６４（２００７）に記載されている。
【0227】
[00255]ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗ＣＤ３９抗体部分およびその抗原結合性断片はＩｇＧ４アイソタイプのものであり、２２８、２３４、および２３５の１つまたは複数の点に１つまたは複数のアミノ酸の置換を含む。ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗ＣＤ３９抗体部分および抗原結合性断片はＩｇＧ４アイソタイプのものであり、Ｆｃ領域にＳ２２８Ｐの変異ならびに／またはＬ２３５Ｅの変異ならびに／またはＦ２３４ＡおよびＬ２３５Ａの変異を含む。
【0228】
[00256]ある特定の実施形態では、抗ＣＤ３９抗体部分またはその抗原結合性断片は、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）へのｐＨ依存性結合を改善する１つまたは複数のアミノ酸の置換を含む。そのようなバリアントは酸性ｐＨでＦｃＲｎに結合してこれをリソソーム内での分解から逃れさせ、次いで転座して細胞外に放出されることを可能にするので、延長された薬物動態学的半減期を有することができる。抗体またはその抗原結合性断片を操作してＦｃＲｎとの結合親和性を改善する方法は当技術分野で公知であり、たとえばＶａｕｇｈｎ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，６（１）：６３－７３，１９９８；Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｖｏｌｕｍｅ １，Ｃｈａｐｔｅｒ ２７：Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ｆｃ ｒｅｇｉｏｎ ｆｏｒ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ＰＫ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，２０１０；Ｙｅｕｎｇ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，７０：３２６９－３２７７（２０１０）；ａｎｄ Ｈｉｎｔｏｎ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１７６：３４６－３５６（２００６）を参照されたい。
【0229】
[00257]ある特定の実施形態では、抗ＣＤ３９抗体部分またはその抗原結合性断片は、Ｆｃ領域の界面においてヘテロ二量化を容易にしおよび／または促進する１つまたは複数のアミノ酸の置換を含む。これらの修飾は、第１のＦｃポリペプチドへの突出部の導入および第２のＦｃポリペプチドへの空洞の導入を含み、突出部が空洞の中に位置して第１および第２のＦｃポリペプチドの相互作用が促進され、ヘテロ二量体または複合体が形成される。これらの修飾を有する抗体を生成する方法は、たとえば米国特許第５，７３１，１６８号に記載されているように当技術分野で既知である。
【0230】
抗原結合性断片
[00258]抗ＣＤ３９抗原結合性断片も、本明細書で提供される。種々の型の抗原結合性断片が当技術分野で既知であり、たとえばそのＣＤＲが上の表１に示され、可変配列が表２、表３、表６、および表７に示される、例示的な抗体部分ならびにその種々のバリアント（親和性バリアント、グリコシル化バリアント、Ｆｃバリアント、システイン操作されたバリアント、その他）を含む本明細書で提供される抗ＣＤ３９抗体部分に基づいて開発することができる。
[00258]抗ＣＤ３９抗原結合性断片も、本明細書で提供される。種々の型の抗原結合性断片が当技術分野で既知であり、たとえばそのＣＤＲが上の表１に示され、可変配列が表２、表３、表６、および表７に示される、例示的な抗体部分ならびにその種々のバリアント（親和性バリアント、グリコシル化バリアント、Ｆｃバリアント、システイン操作されたバリアント、その他）を含む本明細書で提供される抗ＣＤ３９抗体部分に基づいて開発することができる。
【0231】
[00259]ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗ＣＤ３９抗原結合性断片は、ダイアボディ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖ断片、ジスルフィド安定化Ｆｖ断片（ｄｓＦｖ）、（ｄｓＦｖ）２、二重特異的ｄｓＦｖ（ｄｓＦｖ－ｄｓＦｖ’）、ジスルフィド安定化ダイアボディ（ｄｓダイアボディ）、単鎖抗体分子（ｓｃＦｖ）、ｓｃＦｖダイマー（二価ダイアボディ）、多重特異的抗体、ラクダ化単鎖ドメイン抗体、ナノボディ、ドメイン抗体、および二価ドメイン抗体である。
【0232】
[00260]そのような抗原結合性断片の産生のために種々の手法を用いることができる。実例的な方法には、インタクトな抗体の酵素消化（たとえばＭｏｒｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４：１０７－１１７（１９９２）；およびＢｒｅｎｎａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：８１（１９８５）を参照されたい）、Ｅ．ｃｏｌｉ等の宿主細胞による組換え発現（たとえばＦａｂ、Ｆｖ、およびＳｃＦｖ抗体断片のため）、上で論じたファージディスプレイライブラリーからのスクリーニング（たとえばＳｃＦｖのため）、およびＦ（ａｂ’）２断片を形成するための２つのＦａｂ’－ＳＨ断片の化学的カップリング（Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：１６３－１６７（１９９２））が含まれる。抗体断片の産生のためのその他の手法は、当業者には明らかになる。
【0233】
[00261]ある特定の実施形態では、抗原結合性断片はｓｃＦｖである。ｓｃＦｖの生成は、たとえばＷＯ ９３／１６１８５；米国特許第５，５７１，８９４号および第５，５８７，４５８号に記載されている。ＳｃＦｖはアミノまたはカルボキシル末端でエフェクタータンパク質と融合して、融合タンパク質を提供することができる（たとえばＡｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ編を参照されたい）。
【0234】
[00262]ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗ＣＤ３９抗体部分またはその抗原結合性断片は、二価、四価、六価、または多価である。二価を超えるいずれの分子も多価と考えられ、たとえば三価、四価、六価等を包含する。
【0235】
[00263]二価分子は、２つの結合部位がいずれも同じ抗原または同じエピトープへの結合について特異的であれば、単一特異的である。これは、ある特定の実施形態では、抗原またはエピトープに対して一価の対応物よりも強い結合を提供する。同様に、多価分子も単一特異的であり得る。ある特定の実施形態では、二価または多価の抗原結合性部分において、結合部位の第１の価および結合部位の第２の価は構造的に同一である（即ち、同じ配列を有する）か、または構造的に異なる（即ち、同じ特異性であるが異なる配列を有する）。
【0236】
[00264]二価も、２つの結合部位が異なる抗原またはエピトープに特異的であれば、二重特異的であり得る。これは多価分子にもあてはまる。たとえば、三価分子は、２つの結合部位が第１の抗原（またはエピトープ）に対して単一特異的で、第３の結合部位が第２の抗原（またはエピトープ）に対して特異的であれば、二重特異的であり得る。
【0237】
二重特異的抗体
[00265]ある特定の実施形態では、抗ＣＤ抗体部分またはその抗原結合性断片は、二重特異的である。ある特定の実施形態では、抗ＣＤ３９抗体部分またはその抗原結合性断片は、前記抗ＣＤ３９抗体部分またはその抗原結合性断片とは異なる結合特異性を有する第２の機能性部分にさらに連結されている。
[00265]ある特定の実施形態では、抗ＣＤ抗体部分またはその抗原結合性断片は、二重特異的である。ある特定の実施形態では、抗ＣＤ３９抗体部分またはその抗原結合性断片は、前記抗ＣＤ３９抗体部分またはその抗原結合性断片とは異なる結合特異性を有する第２の機能性部分にさらに連結されている。
【0238】
[00266]ある特定の実施形態では、本明細書で提供される二重特異的抗体またはその抗原結合性断片は、ＣＤ３９以外の第２の抗原、またはＣＤ３９の上の第２のエピトープに特異的に結合することができる。ある特定の実施形態では、第２の抗原は、ＴＧＦベータ、ＣＤ７３、ＰＤ１、ＰＤＬ１、４－１ＢＢ、ＣＴＬＡ４、ＴＩＧＩＴ、ＧＩＴＡ、ＶＩＳＴＡ、ＴＩＧＩＴ、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、Ｂ７－Ｈ５、ＣＤ１１２Ｒ、Ｓｉｇｌｅｃ－１５、ＬＡＧ３、ＳＩＲＰα、ＣＤ４７およびＴＩＭ－３からなる群から選択される。
【0239】
コンジュゲート
[00267]一部の実施形態では、抗ＣＤ３９抗体部分またはその抗原結合性断片は、１つまたは複数のコンジュゲート部分をさらに含む。コンジュゲート部分は、抗体部分またはその抗原結合性断片に連結することができる。コンジュゲート部分は、抗体部分またはその抗原結合性断片に結合することができる部分である。種々のコンジュゲート部分が本明細書で提供される抗体部分またはその抗原結合性断片に連結され得ることが意図されている（たとえば「Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｖａｃｃｉｎｅｓ」，Ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎｓ ｔｏ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊ．Ｍ．Ｃｒｕｓｅ ａｎｄ Ｒ．Ｅ．Ｌｅｗｉｓ，Ｊｒ．（ｅｄｓ．），Ｃａｒｇｅｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，（１９８９）を参照されたい）。これらのコンジュゲート部分は、とりわけ共有結合、親和性結合、インターカレーション、配位結合、複合体化、会合、ブレンド、または付加によって、抗体部分またはその抗原結合性断片に連結され得る。一部の実施形態では、抗ＣＤ３９抗体部分またはその抗原結合性断片は、リンカーを介して１つまたは複数のコンジュゲートに連結することができる。
[00267]一部の実施形態では、抗ＣＤ３９抗体部分またはその抗原結合性断片は、１つまたは複数のコンジュゲート部分をさらに含む。コンジュゲート部分は、抗体部分またはその抗原結合性断片に連結することができる。コンジュゲート部分は、抗体部分またはその抗原結合性断片に結合することができる部分である。種々のコンジュゲート部分が本明細書で提供される抗体部分またはその抗原結合性断片に連結され得ることが意図されている（たとえば「Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｖａｃｃｉｎｅｓ」，Ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎｓ ｔｏ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊ．Ｍ．Ｃｒｕｓｅ ａｎｄ Ｒ．Ｅ．Ｌｅｗｉｓ，Ｊｒ．（ｅｄｓ．），Ｃａｒｇｅｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，（１９８９）を参照されたい）。これらのコンジュゲート部分は、とりわけ共有結合、親和性結合、インターカレーション、配位結合、複合体化、会合、ブレンド、または付加によって、抗体部分またはその抗原結合性断片に連結され得る。一部の実施形態では、抗ＣＤ３９抗体部分またはその抗原結合性断片は、リンカーを介して１つまたは複数のコンジュゲートに連結することができる。
【0240】
[00268]ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗ＣＤ３９抗体部分またはその抗原結合性断片は、エピトープ結合部分の外に、１つまたは複数のコンジュゲート部分への結合に利用できる特定の部位を含むように操作してよい。たとえば、そのような部位は、コンジュゲート部分への共有結合リンケージを容易にする１つまたは複数の反応性アミノ酸残基、たとえばシステインまたはヒスチジン残基を含んでよい。
【0241】
[00269]ある特定の実施形態では、抗ＣＤ３９抗体部分またはその抗原結合性断片は、コンジュゲート部分に間接的に、または別のコンジュゲート部分を通して連結されてもよい。たとえば、本明細書で提供される抗ＣＤ３９抗体部分またはその抗原結合性断片をビオチンにコンジュゲートさせ、次いでアビジンにコンジュゲートした第２のコンジュゲートに間接的にコンジュゲートしてよい。一部の実施形態では、コンジュゲート部分は、クリアランス修飾剤（たとえば半減期を延長させるＰＥＧ等のポリマー）、化学療法剤、毒素、放射性同位体、ランタニド、検出可能な標識（たとえば発光標識、蛍光標識、酵素基質標識）、ＤＮＡアルキル化剤、トポイソメラーゼ阻害剤、チューブリンバインダー、精製部分、またはその他の抗がん薬物を含む。
【0242】
[00270]「毒素」は、細胞に有害なまたは細胞に損傷を与えもしくはこれを殺す任意の薬剤であり得る。毒素の例には、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、エチジウムブロミド、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ＭＭＡＥ、ＭＭＡＦ、ＤＭ１、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアンスラシンジオン、ミトキサントロン、ミスラマイシン、アクチノマイシンＤ、１－デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、プロマイシンおよびそのアナログ、抗代謝物（たとえばメトトレキサート、６－メルカプトプリン、６－チオグアニン、シタラビン、５－フルオロウラシルデカルバジン）、アルキル化剤（たとえばメクロレタミン、チオエパクロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）およびロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド、ブスルファン、ジブロモマニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、およびｃｉｓ－ジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン、アンスラサイクリン類（たとえばダウノルビシン（以前はダウノマイシン）およびドキソルビシン）、抗生剤（たとえばダクチノマイシン（以前はアクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミスラマイシンおよびアンスラマイシン（ＡＭＣ））、抗有糸分裂剤（たとえばビンクリスチンおよびビンブラスチン）、トポイソメラーゼ阻害剤、ならびにチューブリンバインダーが限定なく含まれる。
【0243】
[00271]検出可能な標識の例には、蛍光標識（たとえばフルオレセイン、ローダミン、ダンシル、フィコエリスリン、またはテキサスレッド）、酵素基質標識（たとえばセイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ルセリフェラーゼ類、グルコアミラーゼ、リゾチーム、サッカライドオキシダーゼ類、またはβ－Ｄ－ガラクトシダーゼ）、放射性同位体（たとえば１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓ、３Ｈ、１１１Ｉｎ、１１２Ｉｎ、１４Ｃ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、８６Ｙ、８８Ｙ、９０Ｙ、１７７Ｌｕ、２１１Ａｔ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１５３Ｓｍ、２１２Ｂｉ、および３２Ｐ、その他のランタニド）、発光標識、色素体部分、ジゴキシゲニン、ビオチン／アビジン、ＤＮＡ分子、または検出用の金が含まれてよい。
【0244】
[00272]ある特定の実施形態では、コンジュゲート部分は、抗体の半減期を延長することを補助するクリアランス修飾剤であり得る。説明的な例には、水溶性ポリマー、たとえばＰＥＧ、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、その他が含まれる。ポリマーは任意の分子量のものであってよく、分枝しても分枝しなくてもよい。抗体に結合されるポリマーの数は変動し、２つ以上のポリマーが結合される場合にはこれらは同じ分子または異なる分子であり得る。
【0245】
[00273]ある特定の実施形態では、コンジュゲート部分は磁気ビーズ等の精製部分であり得る。
[00274]ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗ＣＤ３９抗体部分またはその抗原結合性断片は、コンジュゲートのための基礎として用いられる。
[00274]ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗ＣＤ３９抗体部分またはその抗原結合性断片は、コンジュゲートのための基礎として用いられる。
【0246】
ポリヌクレオチドおよび組換え方法
[00275]本開示は、本明細書で提供される抗ＣＤ３９／ＴＧＦβ Ｔｒａｐをコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。本明細書で用いる用語「核酸」または「ポリヌクレオチド」は、一本鎖または二本鎖の形態のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）およびそのポリマーを意味する。他に指示しなければ、特定のポリヌクレオチド配列は、その保存的に修飾されたバリアント（たとえば縮重コドン置換）、対立遺伝子、オルソログ、ＳＮＰ、および相補的配列をも黙示的に包含し、ならびに明白に示された配列を包含する。具体的には、縮重コドン置換は、その中の１つまたは複数の選択された（または全ての）コドンの第３の位置が混合された塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換された配列を生成することによって達成され得る（Ｂａｔｚｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１９：５０８１（１９９１）；Ｏｈｔｓｕｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５－２６０８（１９８５）；およびＲｏｓｓｏｌｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ ８：９１－９８（１９９４）を参照されたい）。
[00275]本開示は、本明細書で提供される抗ＣＤ３９／ＴＧＦβ Ｔｒａｐをコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。本明細書で用いる用語「核酸」または「ポリヌクレオチド」は、一本鎖または二本鎖の形態のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）およびそのポリマーを意味する。他に指示しなければ、特定のポリヌクレオチド配列は、その保存的に修飾されたバリアント（たとえば縮重コドン置換）、対立遺伝子、オルソログ、ＳＮＰ、および相補的配列をも黙示的に包含し、ならびに明白に示された配列を包含する。具体的には、縮重コドン置換は、その中の１つまたは複数の選択された（または全ての）コドンの第３の位置が混合された塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換された配列を生成することによって達成され得る（Ｂａｔｚｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１９：５０８１（１９９１）；Ｏｈｔｓｕｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５－２６０８（１９８５）；およびＲｏｓｓｏｌｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ ８：９１－９８（１９９４）を参照されたい）。
【0247】
[00276]モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、従来の手順を用いて（たとえば抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを用いることによって）容易に単離され、シーケンシングされる。コードするＤＮＡは、合成法によって得てもよい。
【0248】
[00277]本明細書で提供される抗ＣＤ３９／ＴＧＦβ Ｔｒａｐをコードする単離されたポリヌクレオチドは、当技術分野で公知の組換え手法を用いて、さらなるクローニング（ＤＮＡの増幅）または発現のためにベクターに挿入することができる。多くのベクターが利用可能である。ベクター成分には一般に、それだけに限らないが、以下の１つまたは複数が含まれる。シグナル配列、複製の起源、１つまたは複数のマーカー遺伝子、エンハンサー要素、プロモーター（たとえばＳＶ４０、ＣＭＶ、ＥＦ－１α）、および転写終止配列。
【0249】
[00278]本開示は、本明細書で提供される単離されたポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるポリヌクレオチドは、本明細書で提供される抗ＣＤ３９／ＴＧＦβ Ｔｒａｐ、核酸配列に作動可能に連結された少なくとも１つのプロモーター（たとえばＳＶ４０、ＣＭＶ、ＥＦ－１α）、および少なくとも１つの選択マーカーをコードする。ベクターの例には、それだけに限らないが、レトロウイルス（レンチウイルスを含む）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス（たとえばヘルペスシンプレックスウイルス）、ポックスウイルス、バキュロウイルス、パピローマウイルス、パポバウイルス（たとえばＳＶ４０）、ラムダファージ、およびＭ１３ファージ、プラスミドｐｃＤＮＡ３．３、ｐＭＤ１８－Ｔ、ｐＯｐｔｉｖｅｃ、ｐＣＭＶ、ｐＥＧＦＰ、ｐＩＲＥＳ、ｐＱＤ－Ｈｙｇ－ＧＳｅｕ、ｐＡＬＴＥＲ、ｐＢＡＤ、ｐｃＤＮＡ、ｐＣａｌ、ｐＬ、ｐＥＴ、ｐＧＥＭＥＸ、ｐＧＥＸ、ｐＣＩ、ｐＥＧＦＴ、ｐＳＶ２、ｐＦＵＳＥ、ｐＶＩＴＲＯ、ｐＶＩＶＯ、ｐＭＡＬ、ｐＭＯＮＯ、ｐＳＥＬＥＣＴ、ｐＵＮＯ、ｐＤＵＯ、Ｐｓｇ５Ｌ、ｐＢＡＢＥ、ｐＷＰＸＬ、ｐＢＩ、ｐ１５ＴＶ－Ｌ、ｐＰｒｏ１８、ｐＴＤ、ｐＲＳ１０、ｐＬｅｘＡ、ｐＡＣＴ２．２、ｐＣＭＶ－ＳＣＲＩＰＴ．ＲＴＭ．、ｐＣＤＭ８、ｐＣＤＮＡ１．１／ａｍｐ、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ＰＣＲ２．１、ｐＥＦ－１、ｐＦＢ、ｐＳＧ５、ｐＸＴ１、ｐＣＤＥＦ３、ｐＳＶＳＰＯＲＴ、ｐＥＦ－Ｂｏｓ等が含まれる。
【0250】
[00279]本明細書で提供される抗ＣＤ３９／ＴＧＦβ Ｔｒａｐをコードするポリヌクレオチド配列を含むベクターを、クローニングまたは遺伝子発現のために宿主細胞に導入することができる。本明細書におけるベクター中でのクローニングまたはＤＮＡ発現に適した宿主細胞は、原核細胞、酵母、または上述の高等な真核細胞である。この目的に適した原核細胞には、グラム陰性またはグラム陽性の生命体等の真正細菌、たとえばエシェリキア属、たとえば大腸菌等の腸内細菌科、エンテロバクター属、エルウィニア属、クレブシエラ属、プロテウス属、サルモネラ属、たとえばＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、セラチア属、たとえばＳｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃａｎｓ、およびシゲラ属、ならびにＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓおよびＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ等のバチルス属、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ等のシュードモナス属、ならびにストレプトミセス属が含まれる。
【0251】
[00280]原核細胞に加えて、糸状菌または酵母等の真核微生物は、抗ＣＤ３９／ＴＧＦβ Ｔｒａｐをコードするベクターのための好適なクローニングまたは発現用の宿主である。低級真核宿主微生物の中で、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅまたは一般的な製パン用酵母が最も一般に使用されている。しかし、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ、たとえばＫ．ｌａｃｔｉｓ、Ｋ．ｆｒａｇｉｌｉｓ（ＡＴＣＣ １２，４２４）、Ｋ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ（ＡＴＣＣ １６，０４５）、Ｋ．ｗｉｃｋｅｒａｍｉｉ（ＡＴＣＣ ２４，１７８）、Ｋ．ｗａｌｔｉｉ（ＡＴＣＣ ５６，５００）、Ｋ．ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｒｕｍ（ＡＴＣＣ ３６，９０６）、Ｋ．ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ、およびＫ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ等のクルイベロミセス宿主、ヤロウィア（ＥＰ ４０２，２２６）、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ（ＥＰ １８３，０７０）、カンジダ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｉａ（ＥＰ ２４４，２３４）、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ等のシュワニオミセス、およびたとえばＮｅｕｒｏｓｐｏｒａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ等の糸状菌、ならびにＡ．ｎｉｄｕｌａｎｓおよびＡ．ｎｉｇｅｒ等のアスペルギルス属の宿主等の他の多数の属、種、および株が一般に利用可能であり、本明細書で有用である。
【0252】
[00281]本明細書で提供されるグリコシル化抗体またはその抗原結合性断片の発現のために好適な宿主細胞は、多細胞生命体に由来する。無脊椎動物の細胞の例には、植物および昆虫の細胞が含まれる。多数のバキュロウイルス株およびバリアント、ならびにＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（毛虫）、Ａｅｄｅｓ ａｅｇｙｐｔｉ（蚊）、Ａｅｄｅｓ ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ（蚊）、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ（ミバエ）、およびＢｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ等の宿主からの対応する許容される昆虫宿主細胞が同定されている。トランスフェクションのための種々のウイルス株、たとえばＡｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ ＮＰＶのＬ－１バリアントおよびＢｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ ＮＰＶのＢｍ－５株は公に利用可能であり、そのようなウイルスは本発明に従って本明細書のウイルスとして、特にＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞のトランスフェクションのために用いてよい。木綿、トウモロコシ、ジャガイモ、大豆、ペチュニア、トマト、およびタバコの植物細胞培養も宿主として利用することができる。
【0253】
[00282]しかし、関心は脊椎動物細胞において最大であり、培養における脊椎動物細胞の増殖（組織培養）が通常の手順になっている。有用な哺乳動物宿主細胞株の例には、ＳＶ４０でトランスフォームされたサル腎ＣＶ１株（ＣＯＳ－７、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）、ヒト胚腎株（懸濁培養における増殖のためにサブクローニングした２９３または２９３細胞、Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．３６：５９（１９７７））、ベビーハムスター腎細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ １０）、チャイニーズハムスター卵巣細胞／－ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、Ｕｒｌａｕｂ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：４２１６（１９８０））、マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３－２５１（１９８０））、サル腎細胞（ＣＶ１ ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）、アフリカミドリザル腎細胞（ＶＥＲＯ－７６、ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１５８７）、ヒト子宮頚癌細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２）、イヌ腎細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ３４）、バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ ３Ａ、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １４４２）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７５）、ヒト肝細胞（Ｈｅｐ Ｇ２、ＨＢ ８０６５）、マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ ０６０５６２、ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１）、ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３：４４－６８（１９８２））、ＭＲＣ５細胞、ＦＳ４細胞、ならびにヒト肝細胞がん株（Ｈｅｐ Ｇ２）がある。一部の実施形態では、宿主細胞は、ＣＨＯ、ＢＨＫ、ＮＳ０、２９３等の哺乳動物培養細胞株、およびそれらの誘導体である。
【0254】
[00283]宿主細胞は、抗ＣＤ３９／ＴＧＦβ Ｔｒａｐの産生のための上記の発現またはクローニング用のベクターによってトランスフォームされ、プロモーターの誘導、トランスフォーマントの選択、または所望の配列をコードする遺伝子の増幅のために適するように修飾された従来の栄養培地中で培養される。別の実施形態では、抗ＣＤ３９／ＴＧＦβ Ｔｒａｐは当技術分野で既知の相同組換えによって産生してよい。ある特定の実施形態では、宿主細胞は、本明細書で提供される抗ＣＤ３９／ＴＧＦβ Ｔｒａｐを産生することができる。
【0255】
[00284]本開示はまた、本開示のベクターが発現される条件下で、本開示で提供される宿主細胞を培養するステップを含む、本明細書で提供される抗ＣＤ３９／ＴＧＦβ Ｔｒａｐを発現する方法を提供する。本明細書で提供される抗ＣＤ３９／ＴＧＦβ Ｔｒａｐを産生するために用いる宿主細胞は、種々の培地中で培養してよい。ＨａｍのＦ１０（Ｓｉｇｍａ）、Ｍｉｎｉｍａｌ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（ＭＥＭ）（Ｓｉｇｍａ）、ＲＰＭＩ－１６４０（Ｓｉｇｍａ）、およびＤｕｌｂｅｃｃｏのＭｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）（Ｓｉｇｍａ）等の市販の培地は、宿主細胞を培養するために好適である。さらに、Ｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．５８：４４（１９７９）、Ｂａｒｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０２：２５５（１９８０）、米国特許第４，７６７，７０４号、第４，６５７，８６６号、第４，９２７，７６２号、第４，５６０，６５５号、もしくは第５，１２２，４６９号、ＷＯ ９０／０３４３０、ＷＯ ８７／００１９５、または米国特許Ｒｅ．３０，９８５に記載された培地のいずれも、宿主細胞の培養培地として用いてよい。これらの培地のいずれにも、ホルモンおよび／またはその他の成長因子（インスリン、トランスフェリン、または上皮細胞成長殖因子等）、塩（塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、およびリン酸塩）、緩衝剤（ＨＥＰＥＳ等）、ヌクレオチド（アデノシンおよびチミジン等）、抗生剤（ＧＥＮＴＡＭＹＣＩＮ（商標）薬物等）、微量元素（通常マイクロモル範囲の最終濃度で存在する無機化合物として定義される）、およびグルコースもしくは当量のエネルギー源を必要に応じて補ってよい。当業者に既知の他の任意の必要な補助物も、適切な濃度で含んでよい。温度、ｐＨ、その他の培養条件は、発現のために選択した宿主細胞とともに既に用いられたものであり、当業者には明白になる。
【0256】
[00285]組換え手法を用いる場合には、抗ＣＤ３９／ＴＧＦβ Ｔｒａｐは細胞内で、細胞膜周辺腔で、産生され、または培地中に直接分泌することができる。抗ＣＤ３９／ＴＧＦβ Ｔｒａｐが細胞内で産生される場合には、第１のステップとして、宿主細胞または溶解した断片の粒子状のデブリは、たとえば遠心分離または限外濾過によって除去される。Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：１６３－１６７（１９９２）は、大腸菌の細胞膜周辺腔に分泌される抗体を単離する手順を記載している。簡単には、酢酸ナトリウム（ｐＨ３．５）、ＥＤＴＡ、およびフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）の存在下に約３０分かけて細胞ペーストを解凍する。細胞デブリは遠心分離によって除去することができる。抗体が培地中に分泌される場合には、そのような発現システムからの上清を、一般に市販のタンパク質濃縮フィルター、たとえばＡｍｉｃｏｎまたはＭｉｌｌｉｐｏｒｅのＰｅｌｌｉｃｏｎ限外濾過ユニットを用いてまず濃縮する。タンパク質分解を阻害するためにＰＭＳＦ等のプロテアーゼ阻害剤を前記ステップのいずれにも含ませ、外来の夾雑物の増殖を防止するために抗生剤を含ませてよい。
【0257】
[00286]細胞から調製した抗ＣＤ３９／ＴＧＦβ Ｔｒａｐは、たとえばヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、ＤＥＡＥセルロースイオン交換クロマトグラフィー、硫酸アンモニウム沈降、塩析、およびアフィニティクロマトグラフィーを用いて精製することができ、アフィニティクロマトグラフィーが好ましい精製手法である。
【0258】
[00287]ある特定の実施形態では、固相に固定化されたプロテインＡが、抗ＣＤ３９／ＴＧＦβ Ｔｒａｐの免疫アフィニティ精製のために用いられる。アフィニティリガンドとしてのプロテインＡの好適性は、抗体中に存在する任意の免疫グロブリンのＦｃドメインの種およびアイソタイプによる。プロテインＡは、ヒトガンマ１、ガンマ２、またはガンマ４の重鎖に基づく抗体を精製するために用いることができる（Ｌｉｎｄｍａｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．６２：１－１３（１９８３））。全てのマウスアイソタイプおよびヒトガンマ３についてはプロテインＧが推奨される（Ｇｕｓｓ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．５：１５６７ １５７５（１９８６））。アフィニティリガンドが結合するマトリックスはアガロースであることが最も多いが、他のマトリックスも利用可能である。制御された細孔ガラスまたはポリ（スチレンジビニル）ベンゼン等の機械的に安定なマトリックスは、アガロースによって達成されるよりも速い流量および短い処理時間を可能にする。抗体がＣＨ３ドメインを含む場合には、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ ＡＢＸ（商標）樹脂（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ，Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ，Ｎ．Ｊ．）が精製に有用である。イオン交換カラム上の分別、エタノール沈降、逆相ＨＰＬＣ、シリカ上のクロマトグラフィー、ヘパリンＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）上のクロマトグラフィー、アニオンまたはカチオン交換樹脂（ポリアスパラギン酸カラム等）上のクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、および硫酸アンモニウム沈降等のタンパク質精製のための他の手法も、回収すべき抗体に応じて利用可能である。
【0259】
[00288]任意の予備的な精製ステップに続いて、目的の抗体および夾雑物を含む混合物を、約２．５～４．５のｐＨで溶出緩衝液を用い、好ましくは低い塩濃度（たとえば約０～０．２５Ｍの塩）で実施する低ｐＨ疎水性相互作用クロマトグラフィーに供してよい。
【0260】
医薬組成物
[00289]本開示は、抗ＣＤ３９／ＴＧＦβ Ｔｒａｐおよび１つもしくは複数の薬学的に許容される担体を含む医薬組成物をさらに提供する。
[00289]本開示は、抗ＣＤ３９／ＴＧＦβ Ｔｒａｐおよび１つもしくは複数の薬学的に許容される担体を含む医薬組成物をさらに提供する。
【0261】
[00290]本明細書で開示する医薬組成物における使用のための薬学的に許容される担体には、たとえば薬学的に許容される液体、ゲル、もしくは固体の担体、水性ビヒクル、非水性ビヒクル、抗微生物剤、等張剤、緩衝剤、抗酸化剤、麻酔剤、懸濁／分散剤、隔離剤もしくはキレート化剤、希釈剤、アジュバント、賦形剤、または非毒性補助物質、当技術分野で既知の他の成分、またはそれらの種々の組合せが含まれ得る。
【0262】
[00291]好適な成分には、たとえば抗酸化剤、充填材、結合剤、崩壊剤、緩衝剤、保存剤、滑剤、香味剤、増粘剤、着色剤、乳化剤、または糖およびシクロデキストリン等の安定剤が含まれ得る。好適な抗酸化剤には、たとえばメチオニン、アスコルビン酸、ＥＤＴＡ、チオ硫酸ナトリウム、白金、カタラーゼ、クエン酸、システイン、チオグリセロール、チオグリコール酸、チオソルビトール、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、および／またはプロピルガレートが含まれ得る。本明細書で開示したように、本明細書で提供される抗ＣＤ３９／ＴＧＦβ Ｔｒａｐおよびコンジュゲートを含む組成物におけるメチオニン等の１つもしくは複数の抗酸化剤の含有により、抗ＣＤ３９／ＴＧＦβ Ｔｒａｐの酸化が低減される。この酸化の低減によって結合親和性の喪失が防止されまたは低減され、それにより抗体の安定性が改善され、保存期間が最大化される。したがって、ある特定の実施形態では、本明細書で開示した１つもしくは複数の抗ＣＤ３９／ＴＧＦβ Ｔｒａｐおよびメチオニン等の１つもしくは複数の抗酸化剤を含む医薬組成物が提供される。抗ＣＤ３９／ＴＧＦβ Ｔｒａｐをメチオニン等の１つもしくは複数の抗酸化剤と混合することによって、本明細書で提供される抗ＣＤ３９／ＴＧＦβ Ｔｒａｐの酸化を防止し、保存期間を延長し、および／または効率を改善する方法がさらに提供される。
【0263】
[00292]さらに説明すると、薬学的に許容される担体には、たとえば注射用塩化ナトリウム、リンゲル注射液、等張デキストロース注射液、注射用滅菌水、もしくはデキストロースおよびラクテート化リンゲル注射液等の水性ビヒクル、植物由来の固定化油、綿実油、コーン油、ゴマ油、またはピーナツ油等の非水性ビヒクル、静細菌性または静真菌性の濃度の抗微生物剤、塩化ナトリウムもしくはデキストロース等の等張剤、リン酸塩もしくはクエン酸塩等の緩衝剤、重硫酸ナトリウム等の抗酸化剤、プロカイン塩酸塩等の局所麻酔剤、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、もしくはポリビニルピロリドン等の懸濁分散剤、Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ８０（ＴＷＥＥＮ（登録商標）－８０）等の乳化剤、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）もしくはＥＧＴＡ（エチレングリコール四酢酸）等の隔離剤もしくはキレート化剤、エチルアルコール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、水酸化ナトリウム、塩酸、クエン酸、または乳酸が含まれ得る。多数回投与用容器中の医薬組成物には、フェノール類もしくはクレゾール類、水銀化合物、ベンジルアルコール、クロロブタノール、メチルおよびプロピルｐ－ヒドロキシ安息香酸エステル、チメロサール、塩化ベンザルコニウム、および塩化ベンゼトニウムを含む、担体として利用される抗微生物剤を添加してよい。好適な賦形剤には、たとえば水、食塩液、デキストロース、グリセロール、またはエタノールが含まれ得る。好適な非毒性補助物質には、たとえば湿潤もしくは乳化剤、ｐＨ緩衝剤、安定剤、溶解促進剤、または酢酸ナトリウム、ソルビタンモノラウレート、トリエタノールアミンオレエート、もしくはシクロデキストリン等の薬剤が含まれ得る。
【0264】
[00293]医薬組成物は、液体溶液、懸濁液、エマルジョン、ピル、カプセル、錠剤、持続放出製剤、または粉末であり得る。経口製剤には、医薬グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム等の標準的な担体が含まれ得る。
【0265】
[00294]ある特定の実施形態では、医薬組成物は注射可能な組成物に製剤化される。注射可能な医薬組成物は、たとえば液体溶液、懸濁液、エマルジョン、を生成するために好適な液体溶液、懸濁液、エマルジョン、または固体形態等の任意の従来の形態で調製してよい。注射用の調製物には、即時注射可能な無菌かつ／または非発熱性の溶液、皮下注射用錠剤を含む使用直前に溶媒と即時混合できる凍結乾燥粉末等の無菌の乾燥した可溶性製品、即時注射可能な無菌の懸濁液、使用直前にビヒクルと即時混合できる無菌の乾燥した不溶性製品、ならびに無菌かつ／または非発熱性のエマルジョンが含まれ得る。溶液は水性または非水性であってよい。
【0266】
[00295]ある特定の実施形態では、単位用量の調製物がアンプル、バイアル、または針付きシリンジの中に包装される。非経口投与のための全ての調製物は、当技術分野で知られており実践されているように、無菌かつ非発熱性であるべきである。
【0267】
[00296]ある特定の実施形態では、無菌の凍結乾燥された粉末は、本明細書で開示した抗体または抗原結合性断片を好適な溶媒に溶解することによって調製される。溶媒は、粉末または粉末から調製される再構成された溶液の安定性またはその他の薬理学的要素を改善する賦形剤を含んでよい。用い得る賦形剤には、それだけに限らないが、水、デキストロース、ソルビタール、フルクトース、コーンシラップ、キシリトール、グリセリン、グルコース、スクロース、またはその他の好適な薬剤が含まれる。溶媒は、一実施形態ではほぼ中性のｐＨで、クエン酸塩、リン酸ナトリウムもしくはカリウム、またはその他の当業者には既知のそのような緩衝剤等の緩衝剤を含んでよい。引き続く溶液の無菌濾過およびそれに続く当業者には既知の標準的条件下における凍結乾燥によって、望ましい製剤が提供される。一実施形態では、得られる溶液は凍結乾燥のためのバイアルに分注される。各バイアルは、抗ＣＤ３９／ＴＧＦβ Ｔｒａｐ、またはその組成物の単一用量または多回用量を含み得る。用量または用量の組に必要な量より少量（たとえば約１０％）多くバイアルを過剰充填することは、正確な試料取り出しおよび正確な投与を容易にするために許容される。凍結乾燥された粉末は、約４℃～室温等の適切な条件下で保存することができる。
【0268】
[00297]凍結乾燥された粉末を注射用水で再構成することによって、非経口投与における使用のための製剤が提供される。一実施形態では、再構成のために、無菌かつ／もしくは非発熱性の水またはその他の好適な液体担体を、凍結乾燥された粉末に添加する。正確な量は与えられる選択した療法に依存し、実験的に決定することができる。
【0269】
キット
[00298]ある特定の実施形態では、本開示は、本明細書で提供される抗ＣＤ３９／ＴＧＦβ Ｔｒａｐ、ならびに／または本明細書で提供される医薬組成物を含むキットを提供する。ある特定の実施形態では、本開示は、本明細書で提供される抗ＣＤ３９／ＴＧＦβ Ｔｒａｐ、ならびに第２の治療剤を含むキットを提供する。ある特定の実施形態では、第２の治療剤は、化学療法剤、抗がん薬物、放射線療法、免疫療法剤、抗血管形成剤、標的療法、細胞療法、遺伝子療法、ホルモン療法、抗ウイルス剤、抗生剤、鎮痛剤、抗酸化剤、金属キレート化剤、およびサイトカインからなる群から選択される。
[00298]ある特定の実施形態では、本開示は、本明細書で提供される抗ＣＤ３９／ＴＧＦβ Ｔｒａｐ、ならびに／または本明細書で提供される医薬組成物を含むキットを提供する。ある特定の実施形態では、本開示は、本明細書で提供される抗ＣＤ３９／ＴＧＦβ Ｔｒａｐ、ならびに第２の治療剤を含むキットを提供する。ある特定の実施形態では、第２の治療剤は、化学療法剤、抗がん薬物、放射線療法、免疫療法剤、抗血管形成剤、標的療法、細胞療法、遺伝子療法、ホルモン療法、抗ウイルス剤、抗生剤、鎮痛剤、抗酸化剤、金属キレート化剤、およびサイトカインからなる群から選択される。
【0270】
[00299]そのようなキットは、当業者には容易に明白になるように、所望であればたとえば１つもしくは複数の薬学的に許容される担体を含む容器、追加の容器、その他の種々の従来の医薬キット成分の１つまた複数をさらに含み得る。投与すべき成分の量を示す、挿入物またはラベルとしての説明書、投与のためのガイドライン、および／または成分を混合するためのガイドラインも、キットに含ませることができる。
【0271】
使用の方法
[00300]本開示は、治療有効量の本明細書で提供される抗ＣＤ３９／ＴＧＦβ Ｔｒａｐ、および／または本明細書で提供される医薬組成物を対象に投与するステップを含む、対象におけるＣＤ３９関連および／またはＴＧＦβ関連の疾患、障害、または状態を処置し、防止し、または軽減する方法をも提供する。ある特定の実施形態では、対象はヒトである。本発明者らは、アデノシン経路のブロック（ＣＤ３９の阻害による）およびＴＧＦβシグナル伝達経路のブロック（ＴＧＦβ Ｔｒａｐを介して）を同時に行うことにより、対象におけるＣＤ３９関連および／またはＴＧＦβ関連の疾患、障害または状態の処置、防止または軽減において相乗効果が得られることを予想外に発見した。
[00300]本開示は、治療有効量の本明細書で提供される抗ＣＤ３９／ＴＧＦβ Ｔｒａｐ、および／または本明細書で提供される医薬組成物を対象に投与するステップを含む、対象におけるＣＤ３９関連および／またはＴＧＦβ関連の疾患、障害、または状態を処置し、防止し、または軽減する方法をも提供する。ある特定の実施形態では、対象はヒトである。本発明者らは、アデノシン経路のブロック（ＣＤ３９の阻害による）およびＴＧＦβシグナル伝達経路のブロック（ＴＧＦβ Ｔｒａｐを介して）を同時に行うことにより、対象におけるＣＤ３９関連および／またはＴＧＦβ関連の疾患、障害または状態の処置、防止または軽減において相乗効果が得られることを予想外に発見した。
【0272】
[00301]一部の実施形態では、ＣＤ３９関連の疾患、障害、または状態は、ＣＤ３９の発現または過発現によって特徴付けられる。一部の実施形態では、ＴＧＦβ関連の疾患、障害、または状態は、ＴＧＦβの発現または過発現によって特徴付けられる。
【0273】
[00302]ある特定の実施形態では、ＣＤ３９関連の疾患、障害、または状態は、がんである。ある特定の実施形態では、がんはＣＤ３９を発現しているがんである。本明細書で用いる「ＣＤ３９を発現している」がんは、がん細胞、腫瘍浸潤性免疫細胞もしくは免疫抑制細胞の中でＣＤ３９タンパク質を発現していること、またはがん細胞、腫瘍浸潤性免疫細胞もしくは免疫抑制細胞の中で正常細胞において予想されるよりも有意に高いレベルでＣＤ３９を発現していることにおいて特徴付けられるがんを意味する。対象からの試験生物学的試料の中のＣＤ３９の存在および／または量を決定するために、種々の方法を用いることができる。たとえば、試験生物学的試料を、発現されたＣＤ３９タンパク質に結合し、これを検出する抗ＣＤ３９抗体またはその抗原結合性断片に曝露することができる。あるいは、ｑＰＣＲ、逆転写酵素ＰＣＲ、マイクロアレイ、ＳＡＧＥ、ＦＩＳＨ、その他の方法を用いて、核酸発現レベルでＣＤ３９を検出することもできる。一部の実施形態では、試験試料はがん細胞もしくは組織、または腫瘍浸潤性免疫細胞に由来する。参照試料は、健常もしくは非疾患個体から得られた対照試料、または試験試料を得た同じ個体からの健常もしくは非疾患試料であり得る。たとえば、参照試料は、試験試料（たとえば腫瘍）に隣接したまたはその付近の非疾患試料であり得る。
【0274】
[00303]ある特定の実施形態では、ＴＧＦβ関連の疾患、障害、または状態は、がんである。ある特定の実施形態では、がんはＴＧＦβを発現しているがんである。本明細書で用いる「ＴＧＦβを発現している」がんは、がん細胞、腫瘍浸潤性免疫細胞もしくは免疫抑制細胞の中でＴＧＦβタンパク質を発現していること、またはがん細胞、腫瘍浸潤性免疫細胞もしくは免疫抑制細胞の中で正常細胞において予想されるよりも有意に高いレベルでＴＧＦβを発現していることにおいて特徴付けられるがんを意味する。
【0275】
[00304]本開示は、治療有効量の本明細書で提供される抗ＣＤ３９／ＴＧＦβ Ｔｒａｐ、および／または本明細書で提供される医薬組成物を対象に投与するステップを含む、対象におけるＴＧＦβのレベルおよび／または活性の上昇に関連する疾患を処置し、防止し、または軽減する方法をも提供する。
【0276】
[00305]対象からの試験生物学的試料の中のＴＧＦβの存在および／または量を決定するために、種々の方法を用いることができる。たとえば、試験生物学的試料を、発現されたＴＧＦβタンパク質に結合し、これを検出する抗ＴＧＦβ抗体またはその抗原結合性断片に曝露することができる。あるいは、ｑＰＣＲ、逆転写酵素ＰＣＲ、マイクロアレイ、ＳＡＧＥ、ＦＩＳＨ、その他の方法を用いて、核酸発現レベルでＴＧＦβを検出することもできる。一部の実施形態では、試験試料はがん細胞もしくは組織、または腫瘍浸潤性免疫細胞に由来する。参照試料は、健常もしくは非疾患個体から得られた対照試料、または試験試料を得た同じ個体からの健常もしくは非疾患試料であり得る。たとえば、参照試料は、試験試料（たとえば腫瘍）に隣接したまたはその付近の非疾患試料であり得る。
【0277】
[00306]ある特定の実施形態では、疾患、障害、または状態は、がん、膵萎縮症、または線維症である。
[00307]ある特定の実施形態では、がんは肛門がん、虫垂がん、星状細胞腫、基底細胞癌、胆嚢がん、胃がん、肺がん、気管支がん、骨がん、肝胆管がん、膵がん、乳がん、肝がん、卵巣がん、精巣がん、腎がん、腎盂尿管がん、唾液腺がん、小腸がん、尿道がん、膀胱がん、頭頚部がん、脊椎がん、脳がん、頸がん、子宮がん、子宮内膜がん、結腸がん、結腸直腸がん、直腸がん、肛門がん、食道がん、胃腸管がん、皮膚がん、前立腺がん、下垂体がん、膣がん、甲状腺がん、咽喉がん、膠芽細胞腫、黒色腫、骨髄異形成症候群、肉腫、奇形腫、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、ＴまたはＢ細胞リンパ腫、ＧＩ器官間質腫、軟組織腫瘍、肝細胞癌、および腺癌からなる群から選択される。ある特定の実施形態では、がんは白血病、リンパ腫、膀胱がん、神経膠腫、膠芽細胞腫、卵巣がん、黒色腫、前立腺がん、甲状腺がん、食道がん、または乳がんである。
[00307]ある特定の実施形態では、がんは肛門がん、虫垂がん、星状細胞腫、基底細胞癌、胆嚢がん、胃がん、肺がん、気管支がん、骨がん、肝胆管がん、膵がん、乳がん、肝がん、卵巣がん、精巣がん、腎がん、腎盂尿管がん、唾液腺がん、小腸がん、尿道がん、膀胱がん、頭頚部がん、脊椎がん、脳がん、頸がん、子宮がん、子宮内膜がん、結腸がん、結腸直腸がん、直腸がん、肛門がん、食道がん、胃腸管がん、皮膚がん、前立腺がん、下垂体がん、膣がん、甲状腺がん、咽喉がん、膠芽細胞腫、黒色腫、骨髄異形成症候群、肉腫、奇形腫、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、ＴまたはＢ細胞リンパ腫、ＧＩ器官間質腫、軟組織腫瘍、肝細胞癌、および腺癌からなる群から選択される。ある特定の実施形態では、がんは白血病、リンパ腫、膀胱がん、神経膠腫、膠芽細胞腫、卵巣がん、黒色腫、前立腺がん、甲状腺がん、食道がん、または乳がんである。
【0278】
[00308]ＴＧＦβは、慢性腎臓病（ＣＫＤ）の全てではないにしても、そのほとんどの形態において線維症を促進する主要な因子である。ＴＧＦ－βのアイソフォームであるＴＧＦ－β１やその下流のシグナル伝達経路を阻害すると、様々な疾患モデルにおいて腎線維症が大幅に制限されるが、ＴＧＦ－β１の過発現は腎線維症を誘発する。ＴＧＦ－β１は、正準シグナル伝達経路（Ｓｍａｄベース）と非正準シグナル伝達経路（非Ｓｍａｄベース）の両方の活性化を介して線維症を誘導し、筋線維芽細胞の活性化、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の過剰生産、ＥＣＭ分解の阻害をもたらす。線維症の制御におけるＳｍａｄタンパク質の役割は複雑で、線維化促進作用と抗線維化作用（間葉系移行制御を含む）が競合し、ＴＧＦ－β／Ｓｍａｄと他のシグナル伝達経路との間の複雑な相互作用がある。研究により、線維症におけるＴＧＦ－β１／Ｓｍａｄシグナル伝達の作用を制御する追加のメカニズムが特定され、これには短いノンコーディングＲＮＡ分子および長いノンコーディングＲＮＡ分子、ＤＮＡやヒストンタンパク質のエピジェネティック修飾が含まれている。ＴＧＦ－β１が他のプロセスに関与しているため、ＴＧＦ－β１を直接標的とした抗線維化療法は実現しそうにないが、ＴＧＦ－β１が線維症を制御する様々な経路の理解を深めることにより、ＣＫＤにおける最も有害なプロセスを阻止する新規治療薬を開発する代替の標的が特定された。
【0279】
[00309]アデノシンは炎症や組織リモデリングに重要な役割を持ち、アデノシン受容体（Ａ２ＡＲ）の活性化により皮膚線維症を促進する。細胞外アデノシンは、エクト酵素ＣＤ３９とＣＤ７３によって連動して生成され、線維化を促進する。アデノシン軸は腎虚血再灌流障害（ＩＲＩ）に関与し、ＣＤ３９とＣＤ７３の作用によるアデノシンの生成は保護的である。しかし、アデノシンの慢性的な上昇は、腎線維症の発症に関連している。エビデンスは、ＣＤ３９および／またはＣＤ７３の欠失が、コラーゲン含有量を減少させ、ブレオマイシン負荷後の皮膚肥厚および引張強度上昇を防止することを示した。皮膚線維症の特徴の減少は、ＣＤ３９および／またはＣＤ７３欠損マウスにおいて、線維化促進のメディエーターであるトランスフォーミング成長因子－β１および結合組織成長因子の発現の減少、ならびに筋線維芽細胞集団の減少に関連していた。
【0280】
[00310]ＣＤ３９およびＴＧＦ－βの阻害は、強皮症、肝線維症および腎線維症等の疾患における線維症の処置に有望であると仮説を立てた。
[00311]ある特定の実施形態では、線維症は、強皮症、腎線維症、肺線維症（たとえば、嚢胞性線維症、特発性肺線維症）、肝線維症（たとえば、架橋線維症、肝硬変）、脳線維症、関節線維症、縦隔線維症、骨髄線維症、腎性全身性線維症、後腹膜線維症、および心筋線維症（たとえば、間質性線維症、置換性線維症）からなる群から選択される。一部の実施形態では、対象は、任意選択で非がん細胞または非免疫抑制細胞において通常見られるレベルより有意に高いレベルで、ＣＤ３９および／またはＴＧＦβを発現しているがん細胞または腫瘍浸潤性免疫細胞もしくは免疫抑制細胞を有すると同定されている。
[00311]ある特定の実施形態では、線維症は、強皮症、腎線維症、肺線維症（たとえば、嚢胞性線維症、特発性肺線維症）、肝線維症（たとえば、架橋線維症、肝硬変）、脳線維症、関節線維症、縦隔線維症、骨髄線維症、腎性全身性線維症、後腹膜線維症、および心筋線維症（たとえば、間質性線維症、置換性線維症）からなる群から選択される。一部の実施形態では、対象は、任意選択で非がん細胞または非免疫抑制細胞において通常見られるレベルより有意に高いレベルで、ＣＤ３９および／またはＴＧＦβを発現しているがん細胞または腫瘍浸潤性免疫細胞もしくは免疫抑制細胞を有すると同定されている。
【0281】
[00312]一部の実施形態では、免疫抑制細胞は、制御性Ｔ細胞である。制御性Ｔ細胞（「Ｔｒｅｇ」）は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでレスポンダーＴ細胞の増殖を優位に抑制し、ｉｎ ｖｉｖｏで自己免疫疾患を阻害する能力を有する、Ｔリンパ球の別個の集団である。本開示のＴｒｅｇは、抑制特性を有するＣＤ４＋ ＣＤ２５＋ ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞であり得る。ある特定の実施形態では、本開示のＴｒｅｇは、ＣＤ４＋ Ｔｒｅｇ、特に、ＣＤ３９を過発現するＣＤ４＋ Ｔｒｅｇである。
【0282】
[00313]一部の実施形態では、対象は、対照の対象に通常見られる制御性Ｔ細胞の活性と比較して、腫瘍微小環境において過剰活性な制御性Ｔ細胞を有すると同定されている。腫瘍微小環境における制御性Ｔ細胞の活性は、当技術分野における従来の方法、たとえば、Ｔ細胞上のＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋の上方調節、ＴＧＦβおよびＩＬ－１０の分泌、ＣＴＬ細胞傷害性の阻害等によって決定することができる。
【0283】
[00314]一部の実施形態では、対象は、免疫抑制の反転、または機能不全の疲弊したＴ細胞の反転から利益を得ることが予想される。
[00315]一部の実施形態では、疾患、障害、または状態は、自己免疫疾患または感染である。一部の実施形態では、自己免疫疾患は免疫性血小板減少症、全身性強皮症、硬化症、成人呼吸窮迫症候群、湿疹、喘息、シェーグレン症候群、アジソン病、巨細胞性動脈炎、免疫複合体性腎炎、免疫性血小板減少性紫斑病、自己免疫性血小板減少症、セリアック病、乾癬、皮膚炎、結腸炎、または全身性エリテマトーデスである。一部の実施形態では、感染はウイルス感染または細菌感染である。一部の実施形態では、感染はＨＩＶ感染、ＨＢＶ感染、ＨＣＶ感染、炎症性腸疾患、またはクローン病である。
[00315]一部の実施形態では、疾患、障害、または状態は、自己免疫疾患または感染である。一部の実施形態では、自己免疫疾患は免疫性血小板減少症、全身性強皮症、硬化症、成人呼吸窮迫症候群、湿疹、喘息、シェーグレン症候群、アジソン病、巨細胞性動脈炎、免疫複合体性腎炎、免疫性血小板減少性紫斑病、自己免疫性血小板減少症、セリアック病、乾癬、皮膚炎、結腸炎、または全身性エリテマトーデスである。一部の実施形態では、感染はウイルス感染または細菌感染である。一部の実施形態では、感染はＨＩＶ感染、ＨＢＶ感染、ＨＣＶ感染、炎症性腸疾患、またはクローン病である。
【0284】
[00316]別の態様では、治療有効量の本明細書で提供される抗ＣＤ３９／ＴＧＦβ Ｔｒａｐ、および／または本明細書で提供される医薬組成物を、疾患、障害、または状態の処置、防止、または軽減を必要とする対象に投与するステップを含む、ＣＤ３９の活性および／またはＴＧＦβの活性を調節することによる恩恵を受ける対象における疾患、障害、または状態を処置、防止、または軽減する方法が提供される。ある特定の実施形態では、疾患、障害、または状態は、上で定義したＣＤ３９関連および／またはＴＧＦβ関連の疾患、障害、または状態である。
【0285】
[00317]本明細書で提供される抗ＣＤ３９／ＴＧＦβ Ｔｒａｐの治療有効量は、たとえば体重、年齢、過去の病歴、現在の投薬、対象の健康状態および交差反応の可能性、アレルギー、感受性、および有害な副反応、ならびに投与経路および疾患発生の程度等の当技術分野で既知の種々の因子に依存する。用量は、これらのおよびその他の状況または要求によって指示されるように、当事者（たとえば医師または獣医師）によって比例的に低減されまたは増加されてよい。
【0286】
[00318]一部の実施形態では、本明細書で提供される抗ＣＤ３９／ＴＧＦβ Ｔｒａｐは、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約１００ｍｇ／ｋｇの治療有効用量で投与してよい。ある特定の実施形態では、投与用量は処置の経過にわたって変化してよい。たとえばある特定の実施形態では、初期の投与用量は引き続く投与用量より高くてよい。ある特定の実施形態では、投与用量は対象の反応に応じて処置の経過にわたって変動してよい。
【0287】
[00319]投薬レジメンは、最適の所望の応答（たとえば治療応答）が提供されるように調整してよい。たとえば、単一用量を投与してもよく、いくつかに分割した用量を経時的に投与してもよい。
【0288】
[00320]本明細書で提供される抗ＣＤ３９／ＴＧＦβ Ｔｒａｐは、当技術分野で公知の任意の経路、たとえば非経口（たとえば皮下、腹腔内、静脈内注入を含む静脈内、筋肉内、または皮内注射）または非－非経口（たとえば経口、鼻内、眼内、舌下腺、直腸、または局所）経路によって投与してよい。
【0289】
[00321]一部の実施形態では、本明細書で提供される抗ＣＤ３９／ＴＧＦβ Ｔｒａｐは、単独で、または治療有効量の第２の治療剤と組み合わせて、投与してよい。たとえば、本明細書で開示する抗ＣＤ３９／ＴＧＦβ Ｔｒａｐは、第２の治療剤、たとえば化学療法剤、抗がん薬、放射線療法剤、免疫療法剤、抗血管新生剤、標的療法剤、細胞療法剤、遺伝子療法剤、ホルモン療法剤、抗ウイルス剤、抗生剤、鎮痛剤、抗酸化剤、金属キレート剤、およびサイトカインと組み合わせて投与してよい。
【0290】
[00322]本明細書で用いる用語「免疫療法」は、免疫系を刺激してがん等の疾患と闘わせるか、一般的な方法で免疫系を強化する療法の型を意味する。免疫療法の例には、チェックポイント調節剤、養子細胞移植、サイトカイン、腫瘍溶解性ウイルス、および治療用ワクチンが限定なく含まれる。
【0291】
[00323]「標的療法」は、がんに関連する特定の分子、たとえばがん細胞には存在するが正常な細胞には存在しない、もしくはがん細胞でより豊富に存在する特定のタンパク質、またはがんの成長および生存に寄与するがん微小環境における標的分子に作用する療法の型である。標的療法は治療剤を腫瘍に標的させ、それにより正常組織を治療剤の影響から救う。
【0292】
[00324]これらの実施形態のあるものでは、１つもしくは複数の追加の治療剤と組み合わせて投与される本明細書で提供される抗ＣＤ３９／ＴＧＦβ Ｔｒａｐは、その１つもしくは複数の追加の治療剤と同時に投与してよく、またこれらの実施形態のあるものでは、抗ＣＤ３９／ＴＧＦβ Ｔｒａｐおよび追加の治療剤は、同じ医薬組成物の部分として投与してよい。しかし、別の治療剤と「組み合わせて」投与される抗ＣＤ３９／ＴＧＦβ Ｔｒａｐは、その薬剤と同時にもしくは同じ組成物中で投与されなくてもよい。別の薬剤の前にもしくはその後に投与される抗ＣＤ３９／ＴＧＦβ Ｔｒａｐは、その抗ＣＤ３９／ＴＧＦβ Ｔｒａｐおよび第２の薬剤が異なる経路を介して投与されたとしても、その語句が本明細書で使用されれば、その薬剤と「組み合わせて」投与されたと考えられる。可能な場合には、本明細書で開示した抗ＣＤ３９／ＴＧＦβ Ｔｒａｐと組み合わせて投与された追加の治療剤は、その追加の治療剤の製品情報シートに列挙されたスケジュールに従って、またはＰｈｙｓｉｃｉａｎｓ’ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ２００３（Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ’ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，５７版；Ｍｅｄｉｃａｌ Ｅｃｏｎｏｍｉｃｓ Ｃｏｍｐａｎｙ；ＩＳＢＮ：１５６３６３４４５７；５７版（２００２年１１月）もしくは当技術分野で公知のプロトコルに従って、投与される。
【0293】
[00325]本開示は、ＣＤ３９陽性細胞を本明細書で提供される抗ＣＤ３９／ＴＧＦβ Ｔｒａｐに曝露するステップを含む、ＣＤ３９陽性細胞におけるＣＤ３９の活性を調節する方法をさらに提供する。一部の実施形態では、ＣＤ３９陽性細胞は免疫細胞である。
【0294】
[00326]本開示は、ＴＧＦβ陽性細胞を本明細書で提供される抗ＣＤ３９／ＴＧＦβ Ｔｒａｐに曝露するステップを含む、ＴＧＦβ陽性細胞におけるＴＧＦβの活性を調節する方法をさらに提供する。
【0295】
[00327]別の態様では、本開示は、試料を本明細書で提供される抗ＣＤ３９／ＴＧＦβ Ｔｒａｐ、および／または本明細書で提供される医薬組成物と接触させるステップ、ならびに試料中のＣＤ３９の存在または量を決定するステップを含む、試料中のＣＤ３９および／またはＴＧＦβの存在または量を検出する方法を提供する。
【0296】
[00328]別の態様では、本開示は、ａ）対象から得た試料を本明細書で提供される抗ＣＤ３９／ＴＧＦβ Ｔｒａｐおよび／または本明細書で提供される医薬組成物と接触させるステップ、ｂ）試料中のＣＤ３９および／またはＴＧＦβの存在または量を決定するステップ、ならびにｃ）ＣＤ３９および／またはＴＧＦβの存在または量を対象におけるＣＤ３９関連および／またはＴＧＦβ関連の疾患、障害、またはステータスの存在または状態と相関させるステップを含む、対象におけるＣＤ３９関連および／またはＴＧＦβ関連の疾患、障害、または状態を診断する方法を提供する。
【0297】
[00329]別の態様では、本開示は、ＣＤ３９関連および／またはＴＧＦβ関連の疾患、障害、または状態の検出に有用な、任意選択で検出可能な部分とコンジュゲートした、本明細書で提供される抗ＣＤ３９／ＴＧＦβ Ｔｒａｐ、および／または本明細書で提供される医薬組成物を含むキットを提供する。キットは、使用説明書をさらに含んでよい。
【0298】
[00330]別の態様では、本開示は、対象におけるＣＤ３９関連および／またはＴＧＦβ関連の疾患、障害、または状態を処置し、防止し、または軽減するための医薬の製造における、ならびにＣＤ３９関連および／またはＴＧＦβ関連の疾患、障害、または状態を診断するための診断試薬の製造における、本明細書で提供される抗ＣＤ３９／ＴＧＦβ Ｔｒａｐおよび／または本明細書で提供される医薬組成物の使用をも提供する。
【0299】
[00331]別の態様では、本開示は、治療有効量の本明細書で提供される抗ＣＤ３９／ＴＧＦβ Ｔｒａｐ、および／または本明細書で提供される医薬組成物を対象に投与するステップを含む、対象におけるＣＤ３９のＡＴＰアーゼ活性を低減させることによって処置可能な疾患を処置し、防止し、または軽減する方法を提供する。たとえば、ＣＤ３９を発現しているがん細胞、腫瘍浸潤性免疫細胞、免疫抑制細胞のＡＴＰアーゼ活性を低減させるために、本明細書で提供される抗ＣＤ３９／ＴＧＦβ Ｔｒａｐを投与してよい。一部の実施形態では、対象はヒトである。一部の実施形態では、対象はがん、膵萎縮症、線維症、自己免疫疾患、および感染症からなる群から選択される疾患、障害、または状態を有する。
【0300】
[00332]別の態様では、本開示は、治療有効量の本明細書で提供される抗ＣＤ３９／ＴＧＦβ Ｔｒａｐ、および／または本明細書で提供される医薬組成物を対象に投与するステップを含む、対象におけるＴ細胞、単球、マクロファージ、ＤＣ、ＡＰＣ、ＮＫおよび／またはＢ細胞の活性のアデノシン媒介阻害に関連する疾患を処置し、防止し、または軽減する方法を提供する。
【0301】
[00333]以下の実施例は、特許請求する発明をより良く説明するために提供され、本発明の範囲を限定するものと解釈すべきではない。以下に記載する全ての特定の組成物、材料、および方法は全体としてまたは部分的に、本発明の範囲に含まれる。これらの特定の組成物、材料、および方法は本発明を限定することを意図しておらず、本発明の範囲に含まれる特定の実施形態を説明するのみである。当業者であれば、発明の能力を行使することなく、また本発明の範囲から逸脱せずに、等価の組成物、材料、および方法を開発することができる。本発明の境界内に留まりつつ、本明細書に記載した手順の中で多くの変形を行うことができることが理解されよう。そのような変形が本発明の範囲に含まれることは、本発明者らの意図である。
【実施例】
【0302】
実施例１．材料の生成
[00334]１．１．参照抗体の生成
[00335]抗ＣＤ３９参照抗体は、公開された配列に基づいて生成した。抗体９－８Ｂは特許出願ＷＯ ２０１６／０７３８４５Ａ１に開示されており、その重鎖および軽鎖の可変領域の配列はそれぞれ配列番号４６および４８として本明細書に含まれている。抗体Ｔ８９５は抗体３１８９５として特許出願ＷＯ ２０１９／０２７９３５Ａ１に開示されており、その重鎖および軽鎖の可変領域の配列はそれぞれ配列番号５５および５７として本明細書に含まれている。抗体Ｉ３９４は特許出願ＷＯ ２０１８／１６７２６７Ａ１に開示されており、その重鎖および軽鎖の可変領域の配列はそれぞれ配列番号１１３および１１４として本明細書に含まれている。抗体９－８Ｂ、Ｔ８９５、およびＩ３９４の重鎖および軽鎖の可変領域を下の表１０に示す。参照抗体をコードするＤＮＡをＥｘｐｉ２９３細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中でクローニングし、発現させた。細胞培養培地を収集して遠心分離し、細胞ペレットを除去した。回収した上清をプロテインＡアフィニティクロマトグラフィー（ＭａｂｓｅｌｅｃｔＳｕｒｅ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で精製して、参照抗体調製物を得た。
[00334]１．１．参照抗体の生成
[00335]抗ＣＤ３９参照抗体は、公開された配列に基づいて生成した。抗体９－８Ｂは特許出願ＷＯ ２０１６／０７３８４５Ａ１に開示されており、その重鎖および軽鎖の可変領域の配列はそれぞれ配列番号４６および４８として本明細書に含まれている。抗体Ｔ８９５は抗体３１８９５として特許出願ＷＯ ２０１９／０２７９３５Ａ１に開示されており、その重鎖および軽鎖の可変領域の配列はそれぞれ配列番号５５および５７として本明細書に含まれている。抗体Ｉ３９４は特許出願ＷＯ ２０１８／１６７２６７Ａ１に開示されており、その重鎖および軽鎖の可変領域の配列はそれぞれ配列番号１１３および１１４として本明細書に含まれている。抗体９－８Ｂ、Ｔ８９５、およびＩ３９４の重鎖および軽鎖の可変領域を下の表１０に示す。参照抗体をコードするＤＮＡをＥｘｐｉ２９３細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中でクローニングし、発現させた。細胞培養培地を収集して遠心分離し、細胞ペレットを除去した。回収した上清をプロテインＡアフィニティクロマトグラフィー（ＭａｂｓｅｌｅｃｔＳｕｒｅ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で精製して、参照抗体調製物を得た。
【0303】
【表13】
【0304】
[00336]１．２．ヒト、カニクイザル、およびマウスのＣＤ３９安定発現細胞株の生成
[00337]それぞれ全長のヒトＣＤ３９（ＮＰ＿００１７６７．３）、カニクイザルＣＤ３９（ＸＰ＿０１５３１１９４４．１）、およびマウスＣＤ３９（ＮＰ＿０３３９７８．１）をコードするＤＮＡ配列を発現ベクター中にクローニングし、続いてＨＥＫ２９３細胞中でトランスフェクトし発現させた。それぞれヒトＣＤ３９、カニクイザルＣＤ３９、およびマウスＣＤ３９を発現しているトランスフェクトされた細胞を選択培地中で培養した。ヒトＣＤ３９、カニクイザルＣＤ３９、またはマウスＣＤ３９を安定的に発現している単一細胞クローンを限界希釈法によって単離した。続いて細胞を、抗ヒトＣＤ３９抗体（ＢＤ、Ｃａｔ＃５５５４６４）、抗カニクイザルＣＤ３９（９－８Ｂ）、抗マウスＣＤ３９（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、Ｃａｔ＃１４３８１０）を用いるＦＡＣＳによってスクリーニングした。
[00337]それぞれ全長のヒトＣＤ３９（ＮＰ＿００１７６７．３）、カニクイザルＣＤ３９（ＸＰ＿０１５３１１９４４．１）、およびマウスＣＤ３９（ＮＰ＿０３３９７８．１）をコードするＤＮＡ配列を発現ベクター中にクローニングし、続いてＨＥＫ２９３細胞中でトランスフェクトし発現させた。それぞれヒトＣＤ３９、カニクイザルＣＤ３９、およびマウスＣＤ３９を発現しているトランスフェクトされた細胞を選択培地中で培養した。ヒトＣＤ３９、カニクイザルＣＤ３９、またはマウスＣＤ３９を安定的に発現している単一細胞クローンを限界希釈法によって単離した。続いて細胞を、抗ヒトＣＤ３９抗体（ＢＤ、Ｃａｔ＃５５５４６４）、抗カニクイザルＣＤ３９（９－８Ｂ）、抗マウスＣＤ３９（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、Ｃａｔ＃１４３８１０）を用いるＦＡＣＳによってスクリーニングした。
【0305】
[00338]同様にして、ヒトＣＤ３９、カニクイザルＣＤ３９、およびマウスＣＤ３９発現プラスミドでトランスフェクトしたＣＨＯＫ１細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を選択培地中で培養した。ヒトＣＤ３９、カニクイザルＣＤ３９、またはマウスＣＤ３９を安定的に発現している単一細胞クローンを限界希釈法によって単離し、続いて抗ヒトＣＤ３９抗体、抗カニクイザルＣＤ３９抗体、または抗マウスＣＤ３９抗体を用いるＦＡＣＳによってスクリーニングした。
【0306】
[00339]安定な細胞株をそれぞれＨＥＫ２９３－ｈＣＤ３９、ＨＥＫ２９３－ｃｙｎｏＣＤ３９、ＨＥＫ２９３－ｍＣＤ３９、ＣＨＯＫ１－ｈＣＤ３９、ＣＨＯＫ１－ｃｙｎｏＣＤ３９、およびＣＨＯＫ１－ｍＣＤ３９と表記した。これらの全ては高い発現およびＡＴＰアーゼ活性を示した。
【0307】
[00340]１．３．組換えタンパク質の生成
[00341]ヒトＣＤ３９の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）をコードするＤＮＡ配列を発現ベクター中にクローニングし、ＨＥＫ２９３細胞中にトランスフェクトして、組換えＥＣＤタンパク質を発現させた。
[00341]ヒトＣＤ３９の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）をコードするＤＮＡ配列を発現ベクター中にクローニングし、ＨＥＫ２９３細胞中にトランスフェクトして、組換えＥＣＤタンパク質を発現させた。
【0308】
実施例２．抗体の生成
[00342]２．１．免疫ならびにハイブリドーマの生成およびスクリーニング
[00343]ＣＤ３９に対する抗体を生成するため、Ｂａｌｂ／ｃおよびＳＪＬ／Ｊマウス（ＳＬＡＣ）を、組換え発現させたヒトＣＤ３９抗原もしくはその断片、または全長のヒトＣＤ３９をコードするＤＮＡ、および／またはヒトＣＤ３９を発現する細胞で免疫した。免疫プロトコルの経過にわたって、尾静脈または後眼窩での採血によって得られた血漿または血清試料によって免疫応答をモニターした。抗ＣＤ３９抗体の十分なタイターを有するマウスを融合に用いた。免疫したマウスの脾細胞および／またはリンパ節細胞を単離し、マウスミエローマ細胞株（ＳＰ２／０）に融合させた。得られたハイブリドーマを、ヒトＣＤ３９ ＥＣＤ組換えタンパク質を用いるＥＬＩＳＡアッセイによって、またはヒトＣＤ３９を安定的に発現しているＣＨＯＫ１－ｈＣＤ３９細胞を用いるＡｃｕｍｅｎアッセイ（ＴＴＰ Ｌａｂｔｅｃｈ）によって、ＣＤ３９特異的抗体の産生についてスクリーニングした。ｈＣＤ３９に特異的なハイブリドーマクローンをＦＡＣＳおよび酵素活性ブロッキングアッセイによって確認し、サブクローニングして安定なハイブリドーマクローンを得た。１～２回のサブクローニングの後、抗体の産生のためにハイブリドーマモノクローンを増殖させ、ストックとして凍結した。
[00342]２．１．免疫ならびにハイブリドーマの生成およびスクリーニング
[00343]ＣＤ３９に対する抗体を生成するため、Ｂａｌｂ／ｃおよびＳＪＬ／Ｊマウス（ＳＬＡＣ）を、組換え発現させたヒトＣＤ３９抗原もしくはその断片、または全長のヒトＣＤ３９をコードするＤＮＡ、および／またはヒトＣＤ３９を発現する細胞で免疫した。免疫プロトコルの経過にわたって、尾静脈または後眼窩での採血によって得られた血漿または血清試料によって免疫応答をモニターした。抗ＣＤ３９抗体の十分なタイターを有するマウスを融合に用いた。免疫したマウスの脾細胞および／またはリンパ節細胞を単離し、マウスミエローマ細胞株（ＳＰ２／０）に融合させた。得られたハイブリドーマを、ヒトＣＤ３９ ＥＣＤ組換えタンパク質を用いるＥＬＩＳＡアッセイによって、またはヒトＣＤ３９を安定的に発現しているＣＨＯＫ１－ｈＣＤ３９細胞を用いるＡｃｕｍｅｎアッセイ（ＴＴＰ Ｌａｂｔｅｃｈ）によって、ＣＤ３９特異的抗体の産生についてスクリーニングした。ｈＣＤ３９に特異的なハイブリドーマクローンをＦＡＣＳおよび酵素活性ブロッキングアッセイによって確認し、サブクローニングして安定なハイブリドーマクローンを得た。１～２回のサブクローニングの後、抗体の産生のためにハイブリドーマモノクローンを増殖させ、ストックとして凍結した。
【0309】
[00344]抗体を分泌するハイブリドーマを限界希釈法によってサブクローニングした。安定なサブクローンをｉｎ ｖｉｔｒｏで培養し、特徴付けのために組織培養培地中で抗体を生成させた。１～２回のサブクローニングの後、抗体の産生のためにハイブリドーマモノクローンを増殖させた。
【0310】
[00345]約１４日間の培養の後、ハイブリドーマ細胞培養培地を収集してプロテインＡアフィニティクロマトグラフィー（ＧＥ）によって精製した。ハイブリドーマ抗体クローンをそれぞれｍＡｂ１３、ｍＡｂ１４、Ａｂ１９、ｍＡｂ２１、ｍＡｂ２３、ｍＡｂ３４、およびｍＡｂ３５と表記した。
【0311】
実施例３．抗体の特徴付け
[00346]３．１．抗体
[00347]ハイブリドーマ抗体クローンｍＡｂ１３、ｍＡｂ１４、Ａｂ１９、ｍＡｂ２１、ｍＡｂ２３、ｍＡｂ３４、およびｍＡｂ３５を、以下に記載するように一連の結合および機能性アッセイにおいて特徴付けた。
[00346]３．１．抗体
[00347]ハイブリドーマ抗体クローンｍＡｂ１３、ｍＡｂ１４、Ａｂ１９、ｍＡｂ２１、ｍＡｂ２３、ｍＡｂ３４、およびｍＡｂ３５を、以下に記載するように一連の結合および機能性アッセイにおいて特徴付けた。
【0312】
[00348]３．２．ヒトＣＤ３９、カニクイザルＣＤ３９、およびマウスＣＤ３９に対する結合親和性
[00349]ＦＡＣＳを用いて、天然に（ＳＫ－ＭＥＬ－２８）もしくは組換えによって（ＣＨＯＫ１－ｈＣＤ３９、ＣＨＯＫ１－ｃｙｎｏＣＤ３９、およびＣＨＯＫ１－ｍＣＤ３９）ＣＤ３９を発現している細胞株、または陰性対照としてＣＤ３９発現を欠く細胞（ＣＨＯＫ１－ｂｌａｎｋ）への抗体の結合を決定した。
[00349]ＦＡＣＳを用いて、天然に（ＳＫ－ＭＥＬ－２８）もしくは組換えによって（ＣＨＯＫ１－ｈＣＤ３９、ＣＨＯＫ１－ｃｙｎｏＣＤ３９、およびＣＨＯＫ１－ｍＣＤ３９）ＣＤ３９を発現している細胞株、または陰性対照としてＣＤ３９発現を欠く細胞（ＣＨＯＫ１－ｂｌａｎｋ）への抗体の結合を決定した。
【0313】
[00350]ＣＨＯＫ１－ｈＣＤ３９、ＣＨＯＫ１－ｃＣＤ３９、ＣＨＯＫ１－ｍＣＤ３９、およびＣＨＯＫ１－ｂｌａｎｋ細胞を、ＡＴＣＣの手順に従って培養培地中で維持した。細胞を収集し、細胞密度３×１０６個／ｍｌでブロッキング緩衝液中に再懸濁した。細胞を１００μｌ／ウェル（３×１０５個／ウェル）で９６ウェルのＦＡＣＳプレートに移し、プレートを遠心分離し、ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ、１％ ＦＢＳ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－２０）で２回洗浄した。抗ＣＤ３９抗体の４倍段階希釈をＦＡＣＳ緩衝液中で３０μｇ／ｍｌから始めて調製した。参照抗体９－８Ｂおよびマウス／ヒト対照ＩｇＧを、それぞれ陽性および陰性の対照として用いた。細胞を１００μＬ／ウェル希釈抗体中で再懸濁し、プレートを４℃で６０分インキュベートした。プレートをＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、Ａｌｅｘａ－Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８ラベル二次抗体（ＦＡＣＳ緩衝液中１：１０００）を各ウェルに加えて、４℃で３０分インキュベートした。プレートをＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、細胞を１００μＬ／ウェルのＰＢＳで再懸濁した。次いで細胞をＦＡＣＳＶｅｒｓｅ（商標）で解析し、平均蛍光強度を決定した。抗体濃度の範囲を試験することによって、ＣＤ３９発現細胞について完全結合曲線を生成した。Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて、各抗体について見かけの親和性を決定した。
【0314】
[00351]同様に、ヒトＣＤ３９発現細胞ＳＫ－ＭＥＬ－５、ＳＫ－ＭＥＬ－２８、またはＭＯＬＰ－８を勾配濃度の抗ＣＤ３９抗体とともに４℃で３０分インキュベートした。ＦＡＣＳ緩衝液を用いて細胞を３回洗浄し、次いで蛍光標識二次抗体（ヤギ抗マウスＩｇＧまたはヤギ抗ヒトＩｇＧ）と４℃で３０分インキュベートした。細胞を３回洗浄し、次いでＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁して、ＢＤ Ｃｅｌｅｓｔａでフローサイトメトリー解析によって解析した。データはＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ８．０２を用いてプロットし、解析した。
【0315】
[00352]精製された７種のハイブリドーマ抗体の結合親和性を、既知の抗ＣＤ３９抗体９－８Ｂと比較して表１１に要約する。全てのハイブリドーマ抗体は用量依存的にヒトおよびカニクイザルのＣＤ３９に結合したが、ＦＡＣＳ研究においていずれもマウスＣＤ３９を認識しなかった。
【0316】
【表14】
【0317】
[00353]３．３．ＡＴＰアーゼ阻害の検出
[00354]ＣＤ３９発現細胞、ＳＫ－ＭＥＬ－５およびＭＯＬＰ－８をＰＢＳ緩衝液で洗浄し、抗体の勾配とともに３７℃で３０分インキュベートした。５０ｍＭのＡＴＰを各ウェルに加え、細胞とともに１６時間インキュベートした。上清を収集し、ＡＴＰの分解によるオルソリン酸塩産物をＭａｌａｃｈｉｔｅ Ｇｒｅｅｎ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ＃ＤＹ９９６）により、製造者のマニュアルに従って測定した。アイソタイプおよび／または９－８Ｂを対照として用いた。データはＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ８．０２を用いてプロットし、解析した。ＥＣ５０はこのアッセイにおいてシグナルの５０％に達する表示した抗体の濃度である。
[00354]ＣＤ３９発現細胞、ＳＫ－ＭＥＬ－５およびＭＯＬＰ－８をＰＢＳ緩衝液で洗浄し、抗体の勾配とともに３７℃で３０分インキュベートした。５０ｍＭのＡＴＰを各ウェルに加え、細胞とともに１６時間インキュベートした。上清を収集し、ＡＴＰの分解によるオルソリン酸塩産物をＭａｌａｃｈｉｔｅ Ｇｒｅｅｎ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ＃ＤＹ９９６）により、製造者のマニュアルに従って測定した。アイソタイプおよび／または９－８Ｂを対照として用いた。データはＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ８．０２を用いてプロットし、解析した。ＥＣ５０はこのアッセイにおいてシグナルの５０％に達する表示した抗体の濃度である。
【0318】
[00355]表１１に要約したように、精製した７種のハイブリドーマ抗体の全てが、参照抗体９－８Ｂと比較して良好なＡＴＰアーゼ阻害活性を有していた。
[00356]３．４．ＡＴＰ媒介Ｔ細胞増殖抑制アッセイ
[00357]ＣＳＦＥで標識し、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８で刺激したヒトＴ細胞を、ＡＴＰの存在下で抗ＣＤ３９抗体またはアイソタイプ対照とともにインキュベートした。Ｔ細胞の増殖はＣＳＦＥ希釈によるＦＡＣＳで解析した。ｍＩｇＧ２ａをアイソタイプ対照として用いた。
[00356]３．４．ＡＴＰ媒介Ｔ細胞増殖抑制アッセイ
[00357]ＣＳＦＥで標識し、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８で刺激したヒトＴ細胞を、ＡＴＰの存在下で抗ＣＤ３９抗体またはアイソタイプ対照とともにインキュベートした。Ｔ細胞の増殖はＣＳＦＥ希釈によるＦＡＣＳで解析した。ｍＩｇＧ２ａをアイソタイプ対照として用いた。
【0319】
[00358]選択した抗ＣＤ３９抗体ｍＡｂ２１およびｍＡｂ２３のＴ細胞増殖活性を図１に示し、表１１に要約した。ＥＣ５０はこのアッセイにおいてシグナルの５０％に達する表示した抗体の濃度である。両方の抗体が用量依存的にＴ細胞の増殖を増強した。即ち、両方の抗体がＴ細胞の増殖に対するＡＴＰ媒介阻害をブロックした。
【0320】
[00359]３．５．エピトープビニング
[00360]Ａｌｅｘ４８８標識キットを用いて抗ＣＤ３９抗体を標識し、一連の濃度で希釈して、ＣＨＯＫ１－ｈＣＤ３９細胞と混合し、ＦＡＣＳを用いて結合のＥＣ５０を試験した。非標識抗体の標識抗体に対するブロッキング効率を試験した。簡単には、単核ＣＨＯＫ１－ｈＣＤ３９細胞を２×１０６個／ｍｌに調製して５０μｌ／ウェルで９６ウェルプレートに播種し、最終体積１００μｌまで抗体勾配と混合し、等量のＡｌｅｘ４８８標識抗体をＥＣ８０の２倍の濃度で加えた。９６ウェルプレートを４℃で１時間インキュベートし、遠心沈殿して、２００μｌのＦＡＣＳ緩衝液で３回洗浄した。ＦＡＣＳｃｅｌｅｓｔａマシンでＦＡＣＳ解析を実施し、データをＦｌｏｗｊｏソフトウェアで解析した。ブロッキング率を計算し、非競合ウェル（Ａｌｅｘ４８８標識抗体のみ）と比較して８０％を超える競合率を有する抗体を１つのエピトープ群に割り付けた。
[00360]Ａｌｅｘ４８８標識キットを用いて抗ＣＤ３９抗体を標識し、一連の濃度で希釈して、ＣＨＯＫ１－ｈＣＤ３９細胞と混合し、ＦＡＣＳを用いて結合のＥＣ５０を試験した。非標識抗体の標識抗体に対するブロッキング効率を試験した。簡単には、単核ＣＨＯＫ１－ｈＣＤ３９細胞を２×１０６個／ｍｌに調製して５０μｌ／ウェルで９６ウェルプレートに播種し、最終体積１００μｌまで抗体勾配と混合し、等量のＡｌｅｘ４８８標識抗体をＥＣ８０の２倍の濃度で加えた。９６ウェルプレートを４℃で１時間インキュベートし、遠心沈殿して、２００μｌのＦＡＣＳ緩衝液で３回洗浄した。ＦＡＣＳｃｅｌｅｓｔａマシンでＦＡＣＳ解析を実施し、データをＦｌｏｗｊｏソフトウェアで解析した。ブロッキング率を計算し、非競合ウェル（Ａｌｅｘ４８８標識抗体のみ）と比較して８０％を超える競合率を有する抗体を１つのエピトープ群に割り付けた。
【0321】
[00361]競合の結果を表１２に示す。競合の結果に基づいて、表１１に示すように、４種の抗ＣＤ３９ハイブリドーマ抗体（ｍＡｂ１４、ｍＡｂ１９、ｍＡｂ２１、ｍＡｂ２３）を４つの異なるエピトープ群に分類することができる。具体的には、抗ＣＤ３９抗体ｍＡｂ１９とｍＡｂ２１は高度に類似したエピトープについて競合し、表１１に示すようにエピトープ群Ｉに分類される。ｍＡｂ１４は試験した他のいずれの抗体とも競合せず、表１１に示すようにエピトープ群ＩＶに分類された。ｍＡｂ２３はｍＡｂ１９およびｍＡｂ２１と交差競合を示し、表１１のエピトープ群ＩＩに分類された。
【0322】
【表15】
【0323】
[00362]３．６．ハイブリドーマのシーケンシング
[00363]モノクローナルハイブリドーマ細胞からＲＮＡを単離し、市販のキットを用いてｃＤＮＡに逆転写した。次いでｃＤＮＡを鋳型として用い、Ｍｏｕｓｅ Ｉｇ－Ｐｒｉｍｅｒ Ｓｅｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ）のプライマーで重鎖および軽鎖の可変領域を増幅した。正しいサイズのＰＣＲ産物を収集して精製し、好適なプラスミドベクターでライゲートした。ライゲーション産物をＤＨ５αコンピテント細胞にトランスフォームした。クローンを選択し、挿入された断片をＤＮＡシーケンシングによって解析した。
[00363]モノクローナルハイブリドーマ細胞からＲＮＡを単離し、市販のキットを用いてｃＤＮＡに逆転写した。次いでｃＤＮＡを鋳型として用い、Ｍｏｕｓｅ Ｉｇ－Ｐｒｉｍｅｒ Ｓｅｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ）のプライマーで重鎖および軽鎖の可変領域を増幅した。正しいサイズのＰＣＲ産物を収集して精製し、好適なプラスミドベクターでライゲートした。ライゲーション産物をＤＨ５αコンピテント細胞にトランスフォームした。クローンを選択し、挿入された断片をＤＮＡシーケンシングによって解析した。
【0324】
[00364]ハイブリドーマ抗体の可変領域配列を本明細書の表２に提供する。
実施例４．キメラ抗体の生成および特徴付け
[00365]４．１．キメラ抗体の生成および産生
[00366]選択した４種のハイブリドーマ抗体（ｍＡｂ１４、ｍＡｂ１９、ｍＡｂ２１、およびｍＡｂ２３）の可変領域をコードするＤＮＡを合成し、前もってヒトＩｇＧ定常遺伝子を含ませた発現ベクターにサブクローニングした。組換えタンパク質の発現のためにベクターを哺乳動物細胞にトランスフェクトし、発現させた抗体をプロテインＡアフィニティカラムで精製した。得られたキメラ抗体を本明細書ではｃ１４、ｃ１９、ｃ２１、およびｃ２３と称し、ここで接頭辞「ｃ」は「キメラ」を示し、数字はハイブリドーマ抗体のクローンを示す。たとえば数「１４」はハイブリドーマ抗体ｍＡｂ１４からであることを示す。
実施例４．キメラ抗体の生成および特徴付け
[00365]４．１．キメラ抗体の生成および産生
[00366]選択した４種のハイブリドーマ抗体（ｍＡｂ１４、ｍＡｂ１９、ｍＡｂ２１、およびｍＡｂ２３）の可変領域をコードするＤＮＡを合成し、前もってヒトＩｇＧ定常遺伝子を含ませた発現ベクターにサブクローニングした。組換えタンパク質の発現のためにベクターを哺乳動物細胞にトランスフェクトし、発現させた抗体をプロテインＡアフィニティカラムで精製した。得られたキメラ抗体を本明細書ではｃ１４、ｃ１９、ｃ２１、およびｃ２３と称し、ここで接頭辞「ｃ」は「キメラ」を示し、数字はハイブリドーマ抗体のクローンを示す。たとえば数「１４」はハイブリドーマ抗体ｍＡｂ１４からであることを示す。
【0325】
[00367]４．２．キメラ抗体の特徴付け
[00368]精製された４種のキメラ抗体を、Ｔ細胞の増殖に対するＡＴＰ媒介抑制をブロックする活性について試験した（実施例３．４に記載した方法と同様）。図２に示すように、抗ＣＤ３９キメラ抗体ｃ１４、ｃ１９、ｃ２１、およびｃ２３は用量依存的に（１００ｎＭ、１０ｎＭ、１ｎＭ、０．１ｎＭ、０．０１ｎＭ、および０．００１ｎＭの範囲の濃度で）ＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖に対する抑制をブロックした。ＣＦＳＥ－ＣＤ４＋ＴおよびｈＩｇＧ４をそれぞれＡＴＰ媒介Ｔ細胞増殖の陽性および陰性の対照として用いた。
[00368]精製された４種のキメラ抗体を、Ｔ細胞の増殖に対するＡＴＰ媒介抑制をブロックする活性について試験した（実施例３．４に記載した方法と同様）。図２に示すように、抗ＣＤ３９キメラ抗体ｃ１４、ｃ１９、ｃ２１、およびｃ２３は用量依存的に（１００ｎＭ、１０ｎＭ、１ｎＭ、０．１ｎＭ、０．０１ｎＭ、および０．００１ｎＭの範囲の濃度で）ＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖に対する抑制をブロックした。ＣＦＳＥ－ＣＤ４＋ＴおよびｈＩｇＧ４をそれぞれＡＴＰ媒介Ｔ細胞増殖の陽性および陰性の対照として用いた。
【0326】
[00369]精製された４種のキメラ抗体を、ＡＴＰ誘導樹状細胞（ＤＣ）活性化およびＡＴＰの存在下の成熟を増強する能力についてさらに試験した。ＡＴＰは、単球に由来する樹状細胞の上のＰ２Ｙ１１受容体の刺激を通してＤＣの成熟を誘導する。
【0327】
[00370]簡単には、健常ヒト血液からヒト単球を単離し、ＧＭ－ＣＳＦおよびＩＬ－４の存在下で６日間、ＭｏＤＣに分化させた。次いで分化したＭｏＤＣを異なる用量の４種の抗ＣＤ３９キメラ抗体と、ＡＴＰの存在下でさらに２４時間、処置した。次いでＤＣの成熟をＦＡＣＳアッセイでＣＤ８６、ＣＤ８３、およびＨＬＡ－ＤＲの発現を解析することによって評価した。
【0328】
[00371]図３に、ＦＡＣＳによるＤＣ表面上のＣＤ３９のレベルを示した。図４Ａ～図４Ｃには、それぞれ抗体処置後のＣＤ８６（図４Ａ）、ＣＤ８３（図４Ｂ）、およびＨＬＡ－ＤＲ（図４Ｃ）の発現を示した。ＡＴＰ誘導ＤＣ成熟は、ビヒクル処置と比較して増加したＣＤ８６、ＣＤ８３、およびＨＬＡ－ＤＲの発現によって示された。４種の抗ＣＤ３９抗体ｃ１４、ｃ１９、ｃ２１、およびｃ２３の全ては、ＡＴＰ誘導ＤＣ成熟の増強に対して顕著な効果を示した。
【0329】
[00372]キメラ抗体を、抗腫瘍活性についてｉｎ ｖｉｖｏでも試験した。ＮＯＤ－ＳＣＩＤマウスの右後側腹領域に、腫瘍発生のためのマトリゲル（１：１）と混合した０．１ｍｌのＰＢＳ中の腫瘍細胞（１０×１０６個）を皮下接種した。平均腫瘍サイズがほぼ８０ｍｍ３に達した時にマウスをランダムに群別した。処置はランダム化と同じ日に３０ｍｇ／ｋｇで開始し、毎週２回投与した。腫瘍体積はランダム化の後、週２回、キャリパーを用いて二次元で測定し、式：Ｖ＝（Ｌ×Ｗ×Ｗ）／２を用いて体積をｍｍ３で表した。ここでＶは腫瘍体積、Ｌは腫瘍の長さ（最長の腫瘍寸法）、Ｗは腫瘍の幅（Ｌに直角な最長の腫瘍寸法）である。投薬ならびに腫瘍および体重の測定は層流キャビネット内で行った。データはＧｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍによる双方向ＡＮＯＶＡを用いて解析した。
【0330】
[00373]キメラ抗ＣＤ３９抗体ｃ２３の腫瘍成長結果を図５に示した。ｃ２３のヒトＩｇＧ１アイソタイプとＩｇＧ４アイソタイプの両方が得られ、試験した。ｃ２３－ｈＩｇＧ４とｃ２３－ｈＩｇＧ１の両方のキメラ抗体はビヒクル群と比較して抗腫瘍効率を示し、ｃ２３－ｈＩｇＧ４とｃ２３－ｈＩｇＧ１の間に有意差は同定されなかった。
【0331】
実施例５．抗体のヒト化および親和性成熟
[00374]５．１．ヒト化
[00375]キメラ抗体ｃ２３およびｃ１４をヒト化のためのクローンとして選択した。抗体配列をヒト生殖細胞配列と整列させて最適フィットモデルを同定した。元のマウス抗体配列との相同性に基づき、ヒト化のための鋳型として最良整合したヒト生殖細胞配列を選択した。次いでマウス抗体配列からのＣＤＲを、抗体の上部および中央のコア構造を維持するための残基とともに鋳型にグラフトした。最適化された変異をフレームワーク領域に導入して、ヒト化重鎖可変領域のバリアントおよびヒト化軽鎖可変領域のバリアントを生成し、これらを混合して整合させ、多重ヒト化抗体クローンを提供した。グラフトおよび変異の後、ヒト化抗体はヒトＣＤ３９発現細胞に同様の結合親和性を保持していた。ヒト化抗体を、ＣＤ３９ ＡＴＰアーゼ阻害アッセイおよびｉｎ ｖｉｔｒｏの免疫細胞活性化アッセイによってさらに評価した。ヒト化抗体のいくつかについてはｉｎ ｖｉｖｏ研究も行った。
[00374]５．１．ヒト化
[00375]キメラ抗体ｃ２３およびｃ１４をヒト化のためのクローンとして選択した。抗体配列をヒト生殖細胞配列と整列させて最適フィットモデルを同定した。元のマウス抗体配列との相同性に基づき、ヒト化のための鋳型として最良整合したヒト生殖細胞配列を選択した。次いでマウス抗体配列からのＣＤＲを、抗体の上部および中央のコア構造を維持するための残基とともに鋳型にグラフトした。最適化された変異をフレームワーク領域に導入して、ヒト化重鎖可変領域のバリアントおよびヒト化軽鎖可変領域のバリアントを生成し、これらを混合して整合させ、多重ヒト化抗体クローンを提供した。グラフトおよび変異の後、ヒト化抗体はヒトＣＤ３９発現細胞に同様の結合親和性を保持していた。ヒト化抗体を、ＣＤ３９ ＡＴＰアーゼ阻害アッセイおよびｉｎ ｖｉｔｒｏの免疫細胞活性化アッセイによってさらに評価した。ヒト化抗体のいくつかについてはｉｎ ｖｉｖｏ研究も行った。
【0332】
[00376]ｃ２３について全部で３１種のヒト化抗体クローンが得られ、ヒト化ｃ２３重鎖可変領域の７種のバリアント（即ちｈｕ２３．ＶＨ＿１、ｈｕ２３．ＶＨ＿２、ｈｕ２３．ＶＨ＿３、ｈｕ２３．ＶＨ＿４、ｈｕ２３．ＶＨ＿５、ｈｕ２３．ＶＨ＿６、およびｈｕ２３．ＶＨ＿７）ならびにヒト化ｃ２３軽鎖可変領域の７種のバリアント（即ちｈｕ２３．ＶＬ＿１、ｈｕ２３．ＶＬ＿２、ｈｕ２３．ＶＬ＿３、ｈｕ２３．ＶＬ＿４、ｈｕ２３．ＶＬ＿５、ｈｕ２３．ＶＬ＿６、およびｈｕ２３．ＶＬ＿７）を混合し、整合させた。３１種のヒト化抗体クローンを上の表９ならびに下の表１３、表１４、および表１５に示すようにｈｕ２３．Ｈ１Ｌ１、ｈｕ２３．Ｈ１Ｌ２等と表記した。ここで接頭辞「ｈｕ」は「ヒト化」を示し、接尾辞、たとえば「Ｈ１Ｌ１」はｈｕ２３．ＶＨ＿１バリアントおよびｈｕ２３．ＶＬ＿１バリアントの可変領域を有するｃ２３ヒト化抗体クローンの一連番号を表す。
【0333】
【表16】
【0334】
【表17】
【0335】
【表18】
【0336】
[00377]同様に、ｃ１４について全部で１６種のヒト化抗体が得られ、ヒト化ｃ１４重鎖可変領域の４つのバリアント（即ちｈｕ１４．ＶＨ＿１、ｈｕ１４．ＶＨ＿２、ｈｕ１４．ＶＨ＿３、およびｈｕ１４．ＶＨ＿４）ならびにヒト化ｃ１４軽鎖可変領域の４つのバリアント（即ちｈｕ１４．ＶＬ＿１、ｈｕ１４．ＶＬ＿２、ｈｕ１４．ＶＬ＿３、およびｈｕ１４．ＶＬ＿４）を混合し、整合させた。１６種のヒト化抗体クローンを同じ表象によって下の表１６に示すようにｈｕ１４．Ｈ１Ｌ１、ｈｕ１４．Ｈ１Ｌ２等と表記した。
【0337】
【表19】
【0338】
[00378]ｃ２３について酵母ディスプレイによっていくつかのヒト化抗体クローンも得た。簡単には、マウス重鎖および軽鎖の配列をヒト抗体配列の社内のデータベースと整列させた。重鎖および軽鎖のＣＤＲグラフト化のため、それぞれ最大の相同性を有する鋳型であるＩＧＨＶ１－３＊０１およびＩＧＫＶ３－１１＊０１を選択した。復帰変異は酵母ディスプレイを用いる高スループット法によって同定した。具体的には、ＣＤＲのコンフォメーションに寄与する位置（Ｖｅｒｎｉｅｒゾーン残基）を同定し、ＤＮＡ合成の間に鋳型およびマウス残基の両方をそれぞれの位置に組み込むことによって復帰変異のライブラリーを創出した。ヒトＣＤ３９タンパク質へのトップバインダーのシーケンシングによって最終の候補を同定した。酵母ディスプレイを介して得られたｃ２３についてのヒト化抗体をｈｕ２３．２０１（配列番号１４６／１１１のＶＨ／ＶＬを有する）、ｈｕ２３．２０３（配列番号１４６／１１２のＶＨ／ＶＬを有する）、ｈｕ２３．２０７（配列番号１４７／１１１のＶＨ／ＶＬを有する）、およびｈｕ２３．２１１（配列番号３９／６３のＶＨ／ＶＬを有する）と表記する。
【0339】
[00379]表１３、表１４、表１５、および表１６のヒト化抗体を組換えで産生して結合親和性について試験し、これらがヒトＣＤ３９への特異的結合を保持できることが示された。比較的高い親和性を有するヒト化抗体を、ＣＤ３９ブロッキングアッセイおよびｉｎ ｖｉｔｒｏ免疫細胞活性化アッセイを含む機能性アッセイにおいてさらに評価した。
【0340】
[00380]特に、ヒト化抗体ｈｕ２３．Ｈ５Ｌ５、ｈｕ２３．２０１、ｈｕ１４．Ｈ１Ｌ１、ならびに参照抗体Ｉ３９４およびＴ８９５を、Ｂｉａｃｏｒｅ（ＧＥ）を用いてヒトＣＤ３９に対する結合親和性について特徴付けた。簡単には、Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃａｐｕｔｕｒｅ Ｋｉｔ（ＧＥ）を用いて試験すべき抗体をＣＭ５チップ（ＧＥ）に捕捉した。６×Ｈｉｓタグ付けしたヒトＣＤ３９の抗原を多重用量のため段階希釈し、３０μｌ／分で１８０秒、注入した。解離のため緩衝液流量を４００秒、保った。チップの再生のため３ＭのＭｇＣｌ２を用いた。会合および解離の曲線は１：１結合モデルに合致し、それぞれの抗体についてＫａ／Ｋｄ／ＫＤ値を計算した。試験した抗体の親和性データを下の表１７に要約する。
【0341】
【表20】
【0342】
[00381]さらに、Ｏｃｔｅｔアッセイ（Ｃｒｅａｔｉｖｅ Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いて製造者のマニュアルに従い、ヒト化抗体ｈｕ２３．Ｈ５Ｌ５およびｈｕ１４．Ｈ１Ｌ２、ならびに参照抗体Ｉ３９４、Ｔ８９５、および９－８Ｂを、ヒトＣＤ３９に対する結合親和性について特徴付けた。簡単には、抗体をセンサーにカプリングし、次いでセンサーをＣＤ３９の勾配に浸漬した（開始時２００ｎＭ、２倍希釈により全体で８用量）。これらの結合応答をリアルタイムで測定した。結果は全体的に合致した。試験した抗体の親和性データを下の表１８に要約する。
【0343】
【表21】
【0344】
[00382]さらに、ｃ２３抗体のヒト化抗体クローン（たとえばｈｕ２３．Ｈ５Ｌ５）のＨＣＤＲ２において、脱アミド化を受けやすい１つのＮＧモチーフ（Ｎ５５Ｇ５６）が同定された。脱アミド化部位を除去するため、Ｎ５５またはＧ５６に様々な変異を導入し、Ｎ５５およびＧ５６はそれぞれ種々の残基に変異させることができ、しかもヒトＣＤ３９への特異的結合を保持することが見出された。たとえば、Ｎ５５をＧ、Ｓ、またはＱによって一点のみ置き換えると、抗体結合親和性は保持され、かつヒトＣＤ３９への結合には不利な影響がないことが見出された。同様に、Ｇ５６をＡまたはＤで置き換えると、変異抗体もヒトＣＤ３９への特異的結合および結合親和性を保持していた。その他の変異も同様に効果があると予想された。
【0345】
[00383]５．２．結合特異性の検出
[00384]精製されたヒト化抗体ｈｕ２３．Ｈ５Ｌ５のＥＮＴＰＤアーゼファミリーメンバーに対する結合特異性をＥＬＩＳＡアッセイによって検出した。簡単には、ＥＮＴＰＤ１（即ちＣＤ３９）およびＥＮＴＰＤ２／３／５／６タンパク質を９６ウェルのＥＬＩＳＡプレートに４℃で一夜コートした。翌日ＥＬＩＳＡプレートを洗浄し、ブロッキング緩衝液（ＰＢＳ中１％ＢＳＡおよび０．０５％ Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０）２００μｌ／ウェルで２時間ブロッキングした。次いでｈｕ２３．Ｈ５Ｌ５の勾配を２連にしてウェルに入れ、抗ｈＩｇＧ－ＨＲＰで染色した。プレートの洗浄後、プレートをＴＭＢ基質で発色させ、２Ｎ ＨＣｌで停止した。プレートリーダーを用いてＯＤ４５０を記録し、Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍによってプロットした。ｈｕ２３．Ｈ５Ｌ５の結合特異特性を図６に示す。図６Ａより、ヒト化抗体ｈｕ２３．Ｈ５Ｌ５はヒトＣＤ３９に特異的に結合するが、ＥＮＴＰＤ２／３／５／６タンパク質のいずれにも結合しないことが分かる。図６Ｂは、陰性対照ｈＩｇＧ４がＥＮＴＰＤ１／２／３／５／６タンパク質のいずれにも結合しないことを示している。
[00384]精製されたヒト化抗体ｈｕ２３．Ｈ５Ｌ５のＥＮＴＰＤアーゼファミリーメンバーに対する結合特異性をＥＬＩＳＡアッセイによって検出した。簡単には、ＥＮＴＰＤ１（即ちＣＤ３９）およびＥＮＴＰＤ２／３／５／６タンパク質を９６ウェルのＥＬＩＳＡプレートに４℃で一夜コートした。翌日ＥＬＩＳＡプレートを洗浄し、ブロッキング緩衝液（ＰＢＳ中１％ＢＳＡおよび０．０５％ Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０）２００μｌ／ウェルで２時間ブロッキングした。次いでｈｕ２３．Ｈ５Ｌ５の勾配を２連にしてウェルに入れ、抗ｈＩｇＧ－ＨＲＰで染色した。プレートの洗浄後、プレートをＴＭＢ基質で発色させ、２Ｎ ＨＣｌで停止した。プレートリーダーを用いてＯＤ４５０を記録し、Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍによってプロットした。ｈｕ２３．Ｈ５Ｌ５の結合特異特性を図６に示す。図６Ａより、ヒト化抗体ｈｕ２３．Ｈ５Ｌ５はヒトＣＤ３９に特異的に結合するが、ＥＮＴＰＤ２／３／５／６タンパク質のいずれにも結合しないことが分かる。図６Ｂは、陰性対照ｈＩｇＧ４がＥＮＴＰＤ１／２／３／５／６タンパク質のいずれにも結合しないことを示している。
【0346】
[00385]５．３．ヒト化抗体の特徴付け
[00386]ｃ２３のヒト化抗体の結合親和性をＦＡＣＳにより、実施例３．２に記載したものと同様の方法を用いて決定した。良好な結合親和性を示すｃ２３ヒト化抗体クローンを下の表１９および表２０に列挙し、また図７Ａ、図７Ｂ、および図８にも示す。ＥＣ５０はこのアッセイにおいてシグナルの５０％に達する表示した抗体の濃度である。
[00386]ｃ２３のヒト化抗体の結合親和性をＦＡＣＳにより、実施例３．２に記載したものと同様の方法を用いて決定した。良好な結合親和性を示すｃ２３ヒト化抗体クローンを下の表１９および表２０に列挙し、また図７Ａ、図７Ｂ、および図８にも示す。ＥＣ５０はこのアッセイにおいてシグナルの５０％に達する表示した抗体の濃度である。
【0347】
【表22】
【0348】
【表23】
【0349】
[00387]選択したｃ２３のヒト化抗体を、ＡＴＰアーゼ阻害アッセイで（実施例３．３に記載したように）ＳＫ－ＭＥＬ－２８細胞について試験した。表示した抗体の阻害プロットを図９Ａおよび図９Ｂに示し、表２１に要約する。さらなるバリデーションのためにｈｕ２３．Ｈ５Ｌ５およびｈｕ２３．２０１を選択した。
【0350】
【表24】
【0351】
[00388]ｃ１４のヒト化抗体の結合親和性をＦＡＣＳにより、ヒトＣＤ３９を発現するＭＯＬＰ－８細胞を用い、実施例３．２に記載したものと同様の方法を用いて決定した。
[00389]良好な結合親和性を示すｃ１４のヒト化抗体クローンを図１０Ａ、図１０Ｂ、および図１０Ｃに示した。ＥＣ５０は表２２に要約した。
[00389]良好な結合親和性を示すｃ１４のヒト化抗体クローンを図１０Ａ、図１０Ｂ、および図１０Ｃに示した。ＥＣ５０は表２２に要約した。
【0352】
【表25】
【0353】
[00390]５．４．エピトープビニング
[00391]選択したヒト化抗体を競合結合について試験した（実施例３．５に記載した方法）。ヒト化抗体ｈｕ２３．Ｈ５Ｌ５およびｈｕ１４．Ｈ１Ｌ１と参照抗体のエピトープビニングの結果を図１９Ａに示した。
[00391]選択したヒト化抗体を競合結合について試験した（実施例３．５に記載した方法）。ヒト化抗体ｈｕ２３．Ｈ５Ｌ５およびｈｕ１４．Ｈ１Ｌ１と参照抗体のエピトープビニングの結果を図１９Ａに示した。
【0354】
[00392]競合の結果（図１９Ａに示す）に基づいて、２種のヒト化抗ＣＤ３９抗体ｈｕ２３．Ｈ５Ｌ５およびｈｕ１４．Ｈ１Ｌ１が２つの異なるエピトープ群に分類できた（図１９Ｂを参照）。具体的には、抗ＣＤ３９抗体ｈｕ２３．Ｈ５Ｌ５は高度に類似したエピトープについて参照抗体Ｉ３９４、Ｔ８９５、および９－８Ｂと競合し、エピトープ群Ｉに分類された。ｈｕ１４．Ｈ１Ｌ１、ｃ３４、およびｃ３５はＴ８９５と部分的に競合する他には試験した他のいずれの抗体とも競合せず、エピトープ群ＩＩに分類された。
【0355】
[00393]５．５．最適化されたヒト化抗体の特徴付け
[00394]５．５．１ ｈｕ２３．Ｈ５Ｌ５によるＣＤ３９の封鎖は、細胞外ＡＴＰ（ｅＡＴＰ）の存在下でヒトＴ細胞の増殖を改善した。
[00394]５．５．１ ｈｕ２３．Ｈ５Ｌ５によるＣＤ３９の封鎖は、細胞外ＡＴＰ（ｅＡＴＰ）の存在下でヒトＴ細胞の増殖を改善した。
【0356】
[00395]抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体で刺激したヒトＰＢＭＣを、ＡＴＰの存在下で、それぞれ２５ｎＭのヒト化抗ＣＤ３９抗体ｈｕ２３．Ｈ５Ｌ５およびビヒクルとともにインキュベートした。それぞれＩＬ－２およびＩＦＮ－γの分泌の検出のために細胞培養上清を回収した。ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を５日目にＦＡＣＳによりＣｅｌｌ Ｔｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ染料希釈によって解析した。
【0357】
[00396]図１１Ａ～図１１Ｄに示すように、ｈｕ２３．Ｈ５Ｌ５は濃度２５ｎＭでＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を有意に増強し、それらのＩＬ－２およびＩＦＮ－γの産生を活性化させた。図１１Ａ、図１１Ｂ、および図１１Ｄに示すように、ＰＢＭＣでのＴ細胞の活性化の増強において、ｈｕ２３．Ｈ５Ｌ５はＩ３９４よりも有意に高い活性を示した。
【0358】
[00397]ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞も健常ドナーのＰＢＭＣから単離し、次いで細胞増殖染料で標識し、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体で活性化し、異なる用量のヒト化抗ＣＤ３９抗体ｈｕ２３．Ｈ５Ｌ５または参照抗体Ｉ３９４で全処置期間を５日として処置し、ＣＤ３９封鎖処置の開始後３日目に２００μＭのＡＴＰを細胞に加えた。５日目にフローサイトメトリーを用いてＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖％、ＣＤ２５＋細胞の％、および生細胞の％を解析した。
【0359】
[00398]図２３Ａ～図２３Ｃに示すように、ｈｕ２３．Ｈ５Ｌ５は、ｅＡＴＰによって阻害されたヒトＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を顕著に反転させた。
[00399]ヒト化抗体ｈｕ２３．Ｈ５Ｌ５およびｈｕ１４．Ｈ１Ｌ１の結合親和性を、様々な細胞についてＦＡＣＳにより、実施例３．２に記載したものと同様の方法に従って試験した。
[00399]ヒト化抗体ｈｕ２３．Ｈ５Ｌ５およびｈｕ１４．Ｈ１Ｌ１の結合親和性を、様々な細胞についてＦＡＣＳにより、実施例３．２に記載したものと同様の方法に従って試験した。
【0360】
[00400]図１２Ａ～図１２Ｅに、ＳＫ－ＭＥＬ－５（図１２Ａ）、ＳＫ－ＭＥＬ－２８（図１２Ｂ）、ＭＯＬＰ－８（図１２Ｃ）、ＣＨＯＫ１－ｃｙｎｏＣＤ３９（図１２Ｄ）、およびＣＨＯＫ１－ｍＣＤ３９（図１２Ｅ）に対する抗体ｈｕ２３．Ｈ５Ｌ５およびｈｕ１４．Ｈ１Ｌ１の結合親和性をそれぞれ示す。参照抗体Ｔ８９５およびＩ３９４を対照抗体として並行して試験した。図１２に示し、表２３に要約するように、抗体ｈｕ２３．Ｈ５Ｌ５およびｈｕ１４．Ｈ１Ｌ１の両方は用量依存的にかつナノモル未満もしくはナノモルのレベルのＥＣ５０による類似した親和性で、ヒトおよびカニクイザルのＣＤ３９発現細胞に結合した。これらの抗体のいずれもＦＡＣＳ研究でマウスＣＤ３９を認識しなかった。それぞれの抗体について細胞の間で異なる最大シグナル（平均蛍光強度、ＭＦＩ）は、それらの発現レベルの相違によると考えられる。
【0361】
【表26】
【0362】
[00401]図１３に、ｈｕ２３．Ｈ５Ｌ５が参照抗体Ｔ８９５およびＩ３９４と同様にＳＫ－ＭＥＬ－５細胞（図１３Ａ）またはＭＯＬＰ－８細胞（図１３Ｂ）におけるＣＤ３９ ＡＴＰアーゼ活性をブロックしたことを示す（実施例３．３に記載した方法）。結果は表２４に要約した。
【0363】
[00402]ｈｕ２３．Ｈ５Ｌ５はＳＫ－ＭＥＬ－５細胞で７０ｐＭ、ＭＯＬＰ－８細胞で３３０ｐＭの酵素ブロッキングＩＣ５０を示し、参照抗体Ｔ８９５およびＩ３９４と同様またはこれらよりやや良好であった。９－８Ｂはこのアッセイでは非ブロッカーとして同定された。
【0364】
【表27】
【0365】
[00403]５．５．２ ｈｕ２３．Ｈ５Ｌ５によるＣＤ３９の封鎖は、ＡＴＰ媒介単球活性化を増強した。
[00404]ヒト化抗体ｈｕ２３．Ｈ５Ｌ５を、ＡＴＰ媒介単球活性化アッセイでも試験した。ＡＴＰ媒介炎症促進活性は、単球を含む多種の免疫細胞型の機能の制御において重要な役割を有する。ＣＤ３９の封鎖がＡＴＰ媒介単球活性化を増強できるか否かを評価するため、健常ヒト血液からヒト単球を精製し、次いでＡＴＰの存在下で、０．２ｎＭ～１００ｎＭの範囲の種々の濃度で抗ＣＤ３９抗体とインキュベートした。ｈｕ２３．Ｈ５Ｌ５は０．２ｎＭ、即ち試験した最低の濃度で、単球活性化の誘導に効果的であることが示された。単球活性化はＦＡＣＳアッセイにより、ＣＤ８０（図１４Ａ）、ＣＤ８６（図１４Ｂ）、およびＣＤ４０（図１４Ｃ）の発現を解析することによって評価した（ｈｕ２３．Ｈ５Ｌ５の濃度は５０ｎＭである）。参照の抗ＣＤ３９抗体Ｉ３９４およびＴ８９５を対照として用い、ｈＩｇＧ４をアイソタイプ対照として用いた。
[00404]ヒト化抗体ｈｕ２３．Ｈ５Ｌ５を、ＡＴＰ媒介単球活性化アッセイでも試験した。ＡＴＰ媒介炎症促進活性は、単球を含む多種の免疫細胞型の機能の制御において重要な役割を有する。ＣＤ３９の封鎖がＡＴＰ媒介単球活性化を増強できるか否かを評価するため、健常ヒト血液からヒト単球を精製し、次いでＡＴＰの存在下で、０．２ｎＭ～１００ｎＭの範囲の種々の濃度で抗ＣＤ３９抗体とインキュベートした。ｈｕ２３．Ｈ５Ｌ５は０．２ｎＭ、即ち試験した最低の濃度で、単球活性化の誘導に効果的であることが示された。単球活性化はＦＡＣＳアッセイにより、ＣＤ８０（図１４Ａ）、ＣＤ８６（図１４Ｂ）、およびＣＤ４０（図１４Ｃ）の発現を解析することによって評価した（ｈｕ２３．Ｈ５Ｌ５の濃度は５０ｎＭである）。参照の抗ＣＤ３９抗体Ｉ３９４およびＴ８９５を対照として用い、ｈＩｇＧ４をアイソタイプ対照として用いた。
【0366】
[00405]結果を図１４に示す。ＡＴＰ単独による刺激はＣＤ８０およびＣＤ８６の上方制御された発現を示し、単球の活性化が示された。抗ＣＤ３９ヒト化抗体ｈｕ２３．Ｈ５Ｌ５は、参照抗体Ｉ３９４による増強と同程度のレベルでのＣＤ８０、ＣＤ８６、およびＣＤ４０の上方制御によって実証されるように、ＡＴＰ媒介単球活性化をさらに増強した。参照抗体Ｔ８９５はＡＴＰ誘導活性化単球に対して顕著な効果を示さなかった。
【0367】
[00406]５．５．３ ｈｕ２３．Ｈ５Ｌ５によるＣＤ３９の封鎖は、ＡＴＰ媒介ＤＣ活性化を増強した。
[00407]選択したヒト化抗体ｈｕ２３．Ｈ５Ｌ５を、ＡＴＰ媒介ＤＣ活性化アッセイにおいても試験した（実施例４．２に記載した同様の方法に従って）。簡単には、ＦＡＣＳアッセイによってＣＤ８３の発現を解析することによってＤＣの成熟を評価した。ＡＴＰは、ＣＤ８３の増加した発現を示すことによって、ＤＣの成熟を誘導した（図１５Ａ）。ｈｕ２３．Ｈ５Ｌ５は０．２ｎＭという低いレベルから開始して用量依存的にＣＤ８３の発現を増加させ、０．６ｎＭの抗体レベルでＣＤ８３の発現を顕著に増加させた。これは参照抗体Ｔ８９５およびＩ３９４のいずれよりも強力である。
[00407]選択したヒト化抗体ｈｕ２３．Ｈ５Ｌ５を、ＡＴＰ媒介ＤＣ活性化アッセイにおいても試験した（実施例４．２に記載した同様の方法に従って）。簡単には、ＦＡＣＳアッセイによってＣＤ８３の発現を解析することによってＤＣの成熟を評価した。ＡＴＰは、ＣＤ８３の増加した発現を示すことによって、ＤＣの成熟を誘導した（図１５Ａ）。ｈｕ２３．Ｈ５Ｌ５は０．２ｎＭという低いレベルから開始して用量依存的にＣＤ８３の発現を増加させ、０．６ｎＭの抗体レベルでＣＤ８３の発現を顕著に増加させた。これは参照抗体Ｔ８９５およびＩ３９４のいずれよりも強力である。
【0368】
[00408]Ｔ細胞の活性化に対するＡＴＰ媒介ＤＣ活性化の結果的な効果をさらに評価するために、ＡＴＰ活性化ＤＣを洗浄し、次いで混合リンパ球反応（ＭＬＲ）のために同種Ｔ細胞とインキュベートした。Ｔ細胞の増殖（図１５Ｂ）および活性化Ｔ細胞からのＩＦＮ－γの産生を解析した（図１５Ｃ）。
【0369】
[00409]参照抗体Ｉ３９４およびＴ８９５比較して、抗ＣＤ３９抗体ｈｕ２３．Ｈ５Ｌ５はＡＴＰ誘導ＤＣ成熟の増強に対して用量依存的かつ顕著な効果を示した。参照Ｉ３９４は同様であったがやや弱い活性を示した。一方Ｔ８９５の効果は極めて軽度であった。一貫して、図１５Ｂおよび図１５Ｃに示すように、抗ＣＤ３９ブロッキング抗体ｈｕ２３．Ｈ５Ｌ５によって増強されたＡＴＰ媒介ＭｏＤＣ成熟により、より高いＴ細胞の増殖およびＭＬＲアッセイにおけるＩＦＮ－γの産生がもたらされた。
【0370】
[00410]５．５．４ ｈｕ２３．Ｈ５Ｌ５によるＣＤ３９の封鎖は、ＬＰＳ刺激によって誘導されたヒトマクロファージのＩＬ１βの放出を促進した。
[00411]健常ヒトＰＢＭＣからヒトＣＤ１４＋Ｔ細胞を単離し、次いで富化したＣＤ１４＋単球を２×１０６個／ウェルの密度で６ウェルのプレートに播種し、１００ｎｇ／ｍＬのヒトＧＭ－ＣＳＦと６日間培養して、Ｍ１様マクロファージを生成した。ｉｎ ｖｉｔｒｏで分化させたマクロファージを、増加する用量のｈｕ２３．Ｈ５Ｌ５または参照抗体Ｉ３９４と１時間処置し、続いて１０ｎｇ／ｍＬのＬＰＳで３時間刺激し、８００μＭのＡＴＰを２時間加えた。細胞培養上清中のＩＬ－１βをＥＬＩＳＡによって定量した。
[00411]健常ヒトＰＢＭＣからヒトＣＤ１４＋Ｔ細胞を単離し、次いで富化したＣＤ１４＋単球を２×１０６個／ウェルの密度で６ウェルのプレートに播種し、１００ｎｇ／ｍＬのヒトＧＭ－ＣＳＦと６日間培養して、Ｍ１様マクロファージを生成した。ｉｎ ｖｉｔｒｏで分化させたマクロファージを、増加する用量のｈｕ２３．Ｈ５Ｌ５または参照抗体Ｉ３９４と１時間処置し、続いて１０ｎｇ／ｍＬのＬＰＳで３時間刺激し、８００μＭのＡＴＰを２時間加えた。細胞培養上清中のＩＬ－１βをＥＬＩＳＡによって定量した。
【0371】
[00412]結果を図２０に示す。アステリスクはそれぞれの条件の間の有意差を示す。図２０に示すように、ｈｕ２３．Ｈ５Ｌ５はＬＰＳ刺激によって誘導されたヒトマクロファージのＩＬ１βの放出を顕著に促進し、ｈｕ２３．Ｈ５Ｌ５はＬＰＳ刺激によって誘導されたヒトマクロファージのＩＬ１βの放出の促進において参照抗体Ｉ３９４より有意に高い活性を示した。
【0372】
[00413]５．６．ｉｎ ｖｉｖｏ研究
[00414]ヒト化抗体ｈｕ２３．Ｈ５Ｌ５およびｈｕ１４．Ｈ１Ｌ１の効果をＭＯＬＰ－８異種移植マウスについて実施例４．２に記載した方法に従って決定した。
[00414]ヒト化抗体ｈｕ２３．Ｈ５Ｌ５およびｈｕ１４．Ｈ１Ｌ１の効果をＭＯＬＰ－８異種移植マウスについて実施例４．２に記載した方法に従って決定した。
【0373】
[00415]結果を図１６に示す。抗ＣＤ３９抗体の全ては、ビヒクル群と比較して腫瘍の成長を阻害した。Ｉ３９４について観察された効率は、ｈｕ２３．Ｈ５Ｌ５およびｈｕ１４．Ｈ１Ｌ１を含む他の抗体よりもやや弱かった。
【0374】
[00416]ヒト化抗体ｈｕ２３．Ｈ５Ｌ５の抗腫瘍効率も、ｉｎ ｖｉｖｏでＰＢＭＣ養子動物モデル（ＮＣＧマウス、ＭＯＬＰ－８細胞を５Ｍ／マウスで接種）において実施例４．２に記載した方法に従って異なる用量（０．０３ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．、ＢＩＷ×６用量）の範囲で試験することによって試験した。
【0375】
[00417]結果を図２１に示す。図２１に示すように、ヒト化抗体ｈｕ２３．Ｈ５Ｌ５は試験した全ての用量で強力に腫瘍の成長を阻害した。
[00418]抗ＣＤ３９抗体の抗腫瘍効率がＮＫ細胞またはマクロファージ細胞のいずれに依存しているかも判定した。抗アシアロ－ＧＭ１のＮＫ枯渇処置を腹腔内２０μｌ／マウスで７日目に開始し、５日ごとに１回行った。クロドロネートリポソームのマクロファージ枯渇処置も静脈内２００μｌ／マウスで７日目および９日目に開始し、毎週１回行った。血液試料解析データにより、単核食細胞またはＮＫが試薬によって顕著に除去されたことが実証された。
[00418]抗ＣＤ３９抗体の抗腫瘍効率がＮＫ細胞またはマクロファージ細胞のいずれに依存しているかも判定した。抗アシアロ－ＧＭ１のＮＫ枯渇処置を腹腔内２０μｌ／マウスで７日目に開始し、５日ごとに１回行った。クロドロネートリポソームのマクロファージ枯渇処置も静脈内２００μｌ／マウスで７日目および９日目に開始し、毎週１回行った。血液試料解析データにより、単核食細胞またはＮＫが試薬によって顕著に除去されたことが実証された。
【0376】
[00419]ＮＫ（図１７）またはマクロファージ（図１８）細胞が枯渇したモデルにおいてｈｕ２３．Ｈ５Ｌ５の腫瘍成長阻害効果は消失され、抗ＣＤ３９抗体の抗腫瘍効果がＮＫ細胞およびマクロファージに依存していることが示唆された。
【0377】
[00420]具体的には、図１７に示すように、抗アシアロ－ＧＭ１はビヒクルと比較して遅い段階で腫瘍成長をやや増強した。ｈｕ２３．Ｈ５Ｌ５で処置した群と比較して、これを抗アシアロ－ＧＭ１と組み合わせることによって、ｈｕ２３．Ｈ５Ｌ５の腫瘍成長阻害効率は完全に消失された。図１８に示すように、クロドロネートリポソームはビヒクルと比較して腫瘍成長に影響がなかった。しかし、クロドロネートリポソーム処置によってｈｕ２３．Ｈ５Ｌ５の腫瘍成長阻害効率は完全に消失された。
【0378】
実施例６．エピトープマッピング
[00421]抗ＣＤ３９抗体のエピトープを定義するため、ＣＤ３９変異体を設計し、ヒトＣＤ３９の表面上で分子表面に露出したアミノ酸の置換によって定義した。下の表２５に示すように、変異体をＣ末端ＥＧＦＰ配列と融合した発現ベクター中にクローニングし、ＨＥＫ－２９３Ｆ細胞にトランスフェクトした。標的したアミノ酸変異を、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ４９９６１（ＥＮＴＰ１＿ＨＵＭＡＮ）の番号付けを用いて示す。これはヒトＣＤ３９の野生型アミノ酸配列であり、本明細書で配列番号１６２として示す。たとえば、Ｖ７７Ｇは配列番号１６２の７７位のバリンがグリシンによって置き換えられていることを意味する。
[00421]抗ＣＤ３９抗体のエピトープを定義するため、ＣＤ３９変異体を設計し、ヒトＣＤ３９の表面上で分子表面に露出したアミノ酸の置換によって定義した。下の表２５に示すように、変異体をＣ末端ＥＧＦＰ配列と融合した発現ベクター中にクローニングし、ＨＥＫ－２９３Ｆ細胞にトランスフェクトした。標的したアミノ酸変異を、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ４９９６１（ＥＮＴＰ１＿ＨＵＭＡＮ）の番号付けを用いて示す。これはヒトＣＤ３９の野生型アミノ酸配列であり、本明細書で配列番号１６２として示す。たとえば、Ｖ７７Ｇは配列番号１６２の７７位のバリンがグリシンによって置き換えられていることを意味する。
【0379】
【表28】
【0380】
[00422]簡単には、ヒトＣＤ３９変異体を遺伝子合成によって生成し、次いで発現ベクターｐＣＭＶ３－ＧＦＰＳｐａｒｋの中にクローニングした。バリデートした変異配列を含むベクターを調製し、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの３日後、トランスジーンの発現についてＥＧＦＰを試験するため、細胞を収集した。生成した２０種の変異体について用量範囲の抗体（１００ｎＭから開始、３倍希釈、１１点）を試験し、ＦＡＣＳにより、ＡｌｅｘＦｌｕｏｒ６４７標識抗ｈＩｇＧによって染色した。抗体結合は、ＡｌｅｘＦｌｕｏｒ６４７の強度をＧＦＰの強度で除して導き出される相対結合として記述した。結果を図２２に示す。
【0381】
[00423]図２２に示すように、ヒト化抗体ｈｕ２３．Ｈ５Ｌ５は変異体ＫＷ２７－６およびＫＷ２７－２０への結合性を失っていたが、他の変異体には結合性を失っていなかった。変異体ＫＷ２７－６は残基Ｑ９６、Ｎ９９、Ｅ１４３、およびＲ１４７にアミノ酸置換を含み、変異体の残基の１つもしくは複数、または全てがｈｕ２３．Ｈ５Ｌ５のコアエピトープに重要であることを示している。変異体ＫＷ２７－２０は残基Ｒ１３８、Ｍ１３９、およびＥ１４２にアミノ酸置換を含み、変異体の残基の１つもしくは複数、または全てがまたｈｕ２３．Ｈ５Ｌ５のコアエピトープに重要であることを示している。
【0382】
[00424]図２２に示すように、キメラ抗体ｃ３４は変異体ＫＷ２７－１６への結合性を失っていたが、他のいずれの変異体にも結合性を失っていなかった。変異体ＫＷ２７－１６は残基Ｋ５、Ｅ１００、およびＤ１０７にアミノ酸置換を含み、変異体の残基の１つもしくは複数、または全てがｃ３４のコアエピトープに重要であることを示している。
【0383】
[00425]図２２に示すように、キメラ抗体ｃ３５は変異体ＫＷ２７－２への結合性を失っていたが、他のいずれの変異体にも結合性を失っていなかった。変異体ＫＷ２７－２は残基Ｖ８１、Ｅ８２、Ｒ１１１、およびＶ１１５にアミノ酸置換を含み、変異体の残基の１つもしくは複数、または全てがｃ３５のコアエピトープに重要であることを示している。
【0384】
[00426]図２２に示すように、参照抗体Ｔ８９５は変異体ＫＷ２７－２０への結合性を失っていたが、他のいずれの変異体にも結合性を失っていなかった。変異体ＫＷ２７－２０は残基Ｒ１３８、Ｍ１３９、およびＥ１４２にアミノ酸置換を含み、変異体の残基の１つもしくは複数、または全てがＴ８９５のコアエピトープに重要であることを示している。
【0385】
[00427]図２２に示すように、参照抗体Ｉ３９４は変異体ＫＷ２７－６およびＫＷ２７－２０への結合性を失っていたが、他の変異体には結合性を失っていなかった。変異体ＫＷ２７－６は残基Ｑ９６、Ｎ９９、Ｅ１４３、およびＲ１４７にアミノ酸置換を含み、変異体の残基の１つもしくは複数、または全てがＩ３９４のコアエピトープに重要であることを示している。変異体ＫＷ２７－２０は残基Ｒ１３８、Ｍ１３９、およびＥ１４２にアミノ酸置換を含み、変異体の残基の１つもしくは複数、または全てがＩ３９４のコアエピトープに重要であることを示している。
【0386】
[00428]図２２に示すように、参照抗体９－８Ｂは変異体ＫＷ２７－６への結合性を失っていたが、他のいずれの変異体にも結合性を失っていなかった。変異体ＫＷ２７－６は残基Ｑ９６、Ｎ９９、Ｅ１４３、およびＲ１４７にアミノ酸置換を含み、変異体の残基の１つもしくは複数、または全てが９－８Ｂのコアエピトープに重要であることを示している。
【0387】
実施例７．抗ＣＤ３９／ＴＧＦβ Ｔｒａｐ構築および発現
[00429]抗ＣＤ３９／ＴＧＦβ Ｔｒａｐ分子は、抗ＣＤ３９抗体部分の重鎖および／または軽鎖のＮ末端またはＣ末端で、ＴＧＦβ受容体ＩＩ ＥＣＤ（ＴＧＦβＲＩＩ ＥＣＤ）に連結された抗ＣＤ３９抗体部分として構築された。可撓性（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３リンカーは、ＴＧＦβＲＩＩ ＥＣＤのＮ末端に遺伝的に連結されていた。ＴＧＦβＲＩＩ ＥＣＤのモル比および抗ＣＤ３９抗体部分の位置を変更して、いくつかの抗ＣＤ３９／ＴＧＦβ Ｔｒａｐ分子を構築し、それらの概略図をそれぞれ図２４Ａ～Ｇに示した。ＴＧＦβ受容体Ｉ ＥＣＤ（ＴＧＦβＲＩ ＥＣＤ）またはＴＧＦβ受容体ＩＩＩ ＥＣＤ（ＴＧＦβＲＩＩＩ ＥＣＤ）に連結された抗ＣＤ３９抗体部分を含む抗ＣＤ３９／ＴＧＦβ Ｔｒａｐ分子は、同様の方法で構築してよいが、本明細書では示さなかった。
[00429]抗ＣＤ３９／ＴＧＦβ Ｔｒａｐ分子は、抗ＣＤ３９抗体部分の重鎖および／または軽鎖のＮ末端またはＣ末端で、ＴＧＦβ受容体ＩＩ ＥＣＤ（ＴＧＦβＲＩＩ ＥＣＤ）に連結された抗ＣＤ３９抗体部分として構築された。可撓性（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３リンカーは、ＴＧＦβＲＩＩ ＥＣＤのＮ末端に遺伝的に連結されていた。ＴＧＦβＲＩＩ ＥＣＤのモル比および抗ＣＤ３９抗体部分の位置を変更して、いくつかの抗ＣＤ３９／ＴＧＦβ Ｔｒａｐ分子を構築し、それらの概略図をそれぞれ図２４Ａ～Ｇに示した。ＴＧＦβ受容体Ｉ ＥＣＤ（ＴＧＦβＲＩ ＥＣＤ）またはＴＧＦβ受容体ＩＩＩ ＥＣＤ（ＴＧＦβＲＩＩＩ ＥＣＤ）に連結された抗ＣＤ３９抗体部分を含む抗ＣＤ３９／ＴＧＦβ Ｔｒａｐ分子は、同様の方法で構築してよいが、本明細書では示さなかった。
【0388】
[00430]１つの抗ＣＤ３９抗体部分（すなわちｈｕ２３．Ｈ５Ｌ５）および２つのＴＧＦβＲＩＩ ＥＣＤ（すなわち配列番号１６４）を含む抗ＣＤ３９／ＴＧＦβ Ｔｒａｐ分子ＥＳ０１４－１であって、１つのＴＧＦβＲＩＩ ＥＣＤはそれぞれの重鎖定常領域のＣ末端で抗ＣＤ３９抗体部分に連結される（図２４Ａ）。
【0389】
[00431]１つの抗ＣＤ３９抗体部分（すなわちｈｕ２３．Ｈ５Ｌ５）および４つのＴＧＦβＲＩＩ ＥＣＤ（すなわち配列番号１６４）を含む抗ＣＤ３９／ＴＧＦβ Ｔｒａｐ分子ＥＳ０１４－２であって、２つのＴＧＦβＲＩＩ ＥＣＤはそれぞれの重鎖定常領域のＣ末端で抗ＣＤ３９抗体部分に連結される（図２４Ｂ）。
【0390】
[00432]１つの抗ＣＤ３９抗体部分（すなわちｈｕ２３．Ｈ５Ｌ５）および４つのＴＧＦβＩＩ ＥＣＤ（すなわち配列番号１６４）を含む抗ＣＤ３９／ＴＧＦβ Ｔｒａｐ分子ＥＳ０１４－３であって、２つのＴＧＦβＲＩＩ ＥＣＤはそれぞれの重鎖可変領域のＮ末端で抗ＣＤ３９抗体部分に連結される（図２４Ｃ）。
【0391】
[00433]１つの抗ＣＤ３９抗体部分（すなわちｈｕ２３．Ｈ５Ｌ５）および４つのＴＧＦβＩＩ ＥＣＤ（すなわち配列番号１６４）を含む抗ＣＤ３９／ＴＧＦβ Ｔｒａｐ分子ＥＳ０１４－４であって、２つのＴＧＦβＲＩＩ ＥＣＤはそれぞれの軽鎖可変領域のＮ末端で抗ＣＤ３９抗体部分に連結される（図２４Ｄ）。
【0392】
[00434]１つの抗ＣＤ３９抗体部分（すなわちｈｕ２３．Ｈ５Ｌ５）および４つのＴＧＦβＩＩ ＥＣＤ（すなわち配列番号１６４）を含む抗ＣＤ３９／ＴＧＦβ Ｔｒａｐ分子ＥＳ０１４－５であって、１つのＴＧＦβＩＩ ＥＣＤはそれぞれの重鎖可変領域のＮ末端で抗ＣＤ３９抗体部分に連結され、１つのＴＧＦβＩＩ ＥＣＤはそれぞれの軽鎖可変領域のＮ末端で抗ＣＤ３９抗体部分に連結される（図２４Ｅ）。
【0393】
[00435]１つの抗ＣＤ３９抗体部分（すなわちｈｕ２３．Ｈ５Ｌ５）および４つのＴＧＦβＩＩ ＥＣＤ（すなわち配列番号１６４）を含む抗ＣＤ３９／ＴＧＦβ Ｔｒａｐ分子ＥＳ０１４－６であって、２つのＴＧＦβＲＩＩ ＥＣＤはそれぞれの軽鎖定常領域のＣ末端で抗ＣＤ３９抗体部分に連結される（図２４Ｆ）。
【0394】
[00436]１つの抗ＣＤ３９抗体部分（すなわちｈｕ２３．Ｈ５Ｌ５）および６つのＴＧＦβＩＩ ＥＣＤ（すなわち配列番号１６４）を含む抗ＣＤ３９／ＴＧＦβ Ｔｒａｐ分子ＥＳ０１４－７であって、１つのＴＧＦβＲＩＩ ＥＣＤはそれぞれの重鎖定常領域のＣ末端で抗ＣＤ３９抗体部分に連結され、２つのＴＧＦβＲＩＩ ＥＣＤはそれぞれの軽鎖定常領域のＣ末端で抗ＣＤ３９抗体部分に連結される（図２４Ｇ）。
【0395】
[00437]発現のために、同じ発現ベクターまたは別々の発現ベクターにある軽鎖および重鎖をコードするＤＮＡを使用して、トランスフェクションのためのＣＨＯ細胞にトランスフェクトした。培養液を採取し、プロテインＡ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムで融合タンパク質を精製した。
【0396】
実施例８．ＥＬＩＳＡによる抗ＣＤ３９／ＴＧＦβ Ｔｒａｐ分子のＴＧＦβへの結合
[00438]抗ＣＤ３９／ＴＧＦβ Ｔｒａｐ分子の結合能と特異性を決定するために、ヒトＴＧＦβ１、ヒトＴＧＦβ２、ヒトＴＧＦβ３およびマウスＴＧＦβ１を用いたＥＬＩＳＡアッセイを行った。試験した抗原は、１μｇ／ｍｌの濃度でＮＵＮＣ９６ウェル免疫プレートにコートした。抗ＣＤ３９／ＴＧＦβ Ｔｒａｐ分子の濃度上昇に伴う結合は、ＰＢＴ緩衝液で希釈した抗ヒトＦｃ抗体西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲートを用い、次いでＴＭＢ基質で発色させて測定した。可溶性ＴＧＦβ ｔｒａｐは対照として使用した。図２５Ａ～２５Ｃに示すように、抗ＣＤ３９／ＴＧＦβ Ｔｒａｐ分子ＥＳ０１４－１およびＥＳ０１４－２は、３つのＴＧＦβホモログ：ヒトＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２およびＴＧＦβ３全てと結合する。他の試験した抗ＣＤ３９／ＴＧＦβ Ｔｒａｐ分子（ＥＳ０１４－３、ＥＳ０１４－４、ＥＳ０１４－５、ＥＳ０１４－６、ＥＳ０１４－７を含む）の結合アッセイの結果は同様であり、本明細書では示さなかった。ヒトＴＧＦβ１に対するＥＣ５０を、以下の表２６に列挙した。さらに、抗ＣＤ３９／ＴＧＦβ Ｔｒａｐ分子ＥＳ０１４－１は、ヒトＴＧＦβ１と類似した親和性でマウスＴＧＦβ１に結合する（図２５Ｄ）。
[00438]抗ＣＤ３９／ＴＧＦβ Ｔｒａｐ分子の結合能と特異性を決定するために、ヒトＴＧＦβ１、ヒトＴＧＦβ２、ヒトＴＧＦβ３およびマウスＴＧＦβ１を用いたＥＬＩＳＡアッセイを行った。試験した抗原は、１μｇ／ｍｌの濃度でＮＵＮＣ９６ウェル免疫プレートにコートした。抗ＣＤ３９／ＴＧＦβ Ｔｒａｐ分子の濃度上昇に伴う結合は、ＰＢＴ緩衝液で希釈した抗ヒトＦｃ抗体西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲートを用い、次いでＴＭＢ基質で発色させて測定した。可溶性ＴＧＦβ ｔｒａｐは対照として使用した。図２５Ａ～２５Ｃに示すように、抗ＣＤ３９／ＴＧＦβ Ｔｒａｐ分子ＥＳ０１４－１およびＥＳ０１４－２は、３つのＴＧＦβホモログ：ヒトＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２およびＴＧＦβ３全てと結合する。他の試験した抗ＣＤ３９／ＴＧＦβ Ｔｒａｐ分子（ＥＳ０１４－３、ＥＳ０１４－４、ＥＳ０１４－５、ＥＳ０１４－６、ＥＳ０１４－７を含む）の結合アッセイの結果は同様であり、本明細書では示さなかった。ヒトＴＧＦβ１に対するＥＣ５０を、以下の表２６に列挙した。さらに、抗ＣＤ３９／ＴＧＦβ Ｔｒａｐ分子ＥＳ０１４－１は、ヒトＴＧＦβ１と類似した親和性でマウスＴＧＦβ１に結合する（図２５Ｄ）。
【0397】
【表29】
【0398】
実施例９．ＴＧＦβおよびＴＧＦβＲのブロッキングアッセイ
[00439]ブロッキングアッセイのために、ＴＧＦβペプチド（ＴＧＦβ１）をマイクロプレートにコートした。精製抗体の連続希釈液を、ＴＧＦβ１がコートされたプレートで、組換えＴＧＦβＲＩＩ－Ｈｉｓタンパク質（ＳｉｎｏＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ）と共に１時間インキュベートした。洗浄後、残存するＴＧＦβＲＩＩ－Ｈｉｓを抗Ｈｉｓ－ＨＲＰがコンジュゲートした二次抗体で検出した。ＴＧＦβ１へのＴＧＦβＲＩＩ－Ｈｉｓ結合の定量化のために、４５０ｎｍにおける吸光度の値をマイクロタイタープレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ Ｃｏｒｐ）で読み取った。試験した全ての抗ＣＤ３９／ＴＧＦβ Ｔｒａｐ分子（すなわち、ＥＳ０１４－１、ＥＳ０１４－２、ＥＳ０１４－３、ＥＳ０１４－６）は、ＴＧＦβ受容体ＴＧＦβＲＩＩへのヒトＴＧＦβ１の結合を効果的にブロックできた（図２６、対照として、可溶性ＴＧＦβ ｔｒａｐ（すなわちＴＧＦβＲＩＩ）を使用した）。抗ＣＤ３９／ＴＧＦβ Ｔｒａｐ分子のＩＣ５０値を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを用いて分析した。ＥＳ０１４－２、ＥＳ０１４－３およびＥＳ０１４－６のようなＴＧＦβＲＩＩ ＥＣＤを４コピー有する抗ＣＤ３９／ＴＧＦβ Ｔｒａｐ分子は、ＥＳ０１４－１のようなＴＧＦβＲＩＩ ＥＣＤを２コピー有する抗ＣＤ３９／ＴＧＦβ Ｔｒａｐ分子より強力である（表２７）。
[00439]ブロッキングアッセイのために、ＴＧＦβペプチド（ＴＧＦβ１）をマイクロプレートにコートした。精製抗体の連続希釈液を、ＴＧＦβ１がコートされたプレートで、組換えＴＧＦβＲＩＩ－Ｈｉｓタンパク質（ＳｉｎｏＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ）と共に１時間インキュベートした。洗浄後、残存するＴＧＦβＲＩＩ－Ｈｉｓを抗Ｈｉｓ－ＨＲＰがコンジュゲートした二次抗体で検出した。ＴＧＦβ１へのＴＧＦβＲＩＩ－Ｈｉｓ結合の定量化のために、４５０ｎｍにおける吸光度の値をマイクロタイタープレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ Ｃｏｒｐ）で読み取った。試験した全ての抗ＣＤ３９／ＴＧＦβ Ｔｒａｐ分子（すなわち、ＥＳ０１４－１、ＥＳ０１４－２、ＥＳ０１４－３、ＥＳ０１４－６）は、ＴＧＦβ受容体ＴＧＦβＲＩＩへのヒトＴＧＦβ１の結合を効果的にブロックできた（図２６、対照として、可溶性ＴＧＦβ ｔｒａｐ（すなわちＴＧＦβＲＩＩ）を使用した）。抗ＣＤ３９／ＴＧＦβ Ｔｒａｐ分子のＩＣ５０値を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを用いて分析した。ＥＳ０１４－２、ＥＳ０１４－３およびＥＳ０１４－６のようなＴＧＦβＲＩＩ ＥＣＤを４コピー有する抗ＣＤ３９／ＴＧＦβ Ｔｒａｐ分子は、ＥＳ０１４－１のようなＴＧＦβＲＩＩ ＥＣＤを２コピー有する抗ＣＤ３９／ＴＧＦβ Ｔｒａｐ分子より強力である（表２７）。
【0399】
【表30】
【0400】
実施例１０．ＦＡＣＳによる抗ＣＤ３９／ＴＧＦβ Ｔｒａｐ分子のＣＤ３９への結合
[00440]ＣＤ３９を過発現している約１００，０００個のＭＯＬＰ－８骨髄腫細胞を洗浄緩衝液で洗浄し、１００μｌの抗ＣＤ３９／ＴＧＦβ Ｔｒａｐ分子の連続希釈液と共に３０分間氷上でインキュベートした。細胞を次いで洗浄緩衝液で２回洗浄し、１００μｌの抗ヒトＦｃ－ＰＥと共に３０分間氷上でインキュベートした。細胞を次いで洗浄緩衝液で２回洗浄し、ＦＡＣＳ ＣａｎｔｏＩＩアナライザー（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で分析した。図２７Ａに示すように、試験した抗ＣＤ３９／ＴＧＦβ Ｔｒａｐ分子（たとえば、ＥＳ０１４－１、ＥＳ０１４－２、ＥＳ０１４－３、ＥＳ０１４－４、ＥＳ０１４－５、ＥＳ０１４－６、ＥＳ０１４－７）は全て、用量依存的にＭＯＬＰ－８細胞に結合した。図２７Ｂに示すように、ＥＳ０１４－１は、用量依存的にＣＨＯＫ１／ｈＣＤ３９細胞に結合した。他の試験した抗ＣＤ３９／ＴＧＦβ Ｔｒａｐ分子（たとえば、ＥＳ０１４－２、ＥＳ０１４－３、ＥＳ０１４－４、ＥＳ０１４－５、ＥＳ０１４－６、ＥＳ０１４－７）のＣＨＯＫ１／ｈＣＤ３９細胞との結合の特徴は同様であり、本明細書では示さなかった。
[00440]ＣＤ３９を過発現している約１００，０００個のＭＯＬＰ－８骨髄腫細胞を洗浄緩衝液で洗浄し、１００μｌの抗ＣＤ３９／ＴＧＦβ Ｔｒａｐ分子の連続希釈液と共に３０分間氷上でインキュベートした。細胞を次いで洗浄緩衝液で２回洗浄し、１００μｌの抗ヒトＦｃ－ＰＥと共に３０分間氷上でインキュベートした。細胞を次いで洗浄緩衝液で２回洗浄し、ＦＡＣＳ ＣａｎｔｏＩＩアナライザー（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で分析した。図２７Ａに示すように、試験した抗ＣＤ３９／ＴＧＦβ Ｔｒａｐ分子（たとえば、ＥＳ０１４－１、ＥＳ０１４－２、ＥＳ０１４－３、ＥＳ０１４－４、ＥＳ０１４－５、ＥＳ０１４－６、ＥＳ０１４－７）は全て、用量依存的にＭＯＬＰ－８細胞に結合した。図２７Ｂに示すように、ＥＳ０１４－１は、用量依存的にＣＨＯＫ１／ｈＣＤ３９細胞に結合した。他の試験した抗ＣＤ３９／ＴＧＦβ Ｔｒａｐ分子（たとえば、ＥＳ０１４－２、ＥＳ０１４－３、ＥＳ０１４－４、ＥＳ０１４－５、ＥＳ０１４－６、ＥＳ０１４－７）のＣＨＯＫ１／ｈＣＤ３９細胞との結合の特徴は同様であり、本明細書では示さなかった。
【0401】
実施例１１．抗ＣＤ３９／ＴＧＦβ Ｔｒａｐ分子のＣＤ３９およびＴＧＦβ１への同時結合。
[00441]ＣＤ３９／Ｈｉｓタンパク質（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）をコートしたプレートまたはＣＨＯ－Ｋ１／ｈＣＤ３９細胞を、ＥＳ０１４－１、抗ＣＤ３９ＡｂまたはＴＧＦβ ｔｒａｐ対照の連続希釈液、次いでビオチン化ＴＧＦβ１と共にインキュベートした。結合は、ストレプトアビジン－西洋ワサビペルオキシダーゼまたはストレプトアビジン－フルオレセインイソチオシアネートを用いて評価した。光学濃度（ＯＤ）は４５０ｎｍで読み取った。データは平均値±ＳＤであり、非線形ベストフィットを示す（ｎ＝２技術的反復）。結果を図２８に示す。図２８に示すように、代表的な抗ＣＤ３９／ＴＧＦβ Ｔｒａｐ分子（ＥＳ０１４－１）は、ＥＬＩＳＡ検出（図２８Ａ）およびＦＡＣＳ検出（図２８Ｂ）により、それぞれＣＤ３９およびＴＧＦβに同時に結合することができた。他の試験した抗ＣＤ３９／ＴＧＦβ Ｔｒａｐ分子（たとえば、ＥＳ０１４－２、ＥＳ０１４－３、ＥＳ０１４－４、ＥＳ０１４－５、ＥＳ０１４－６、ＥＳ０１４－７）の結果は同様であり、本明細書では示さなかった。
[00441]ＣＤ３９／Ｈｉｓタンパク質（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）をコートしたプレートまたはＣＨＯ－Ｋ１／ｈＣＤ３９細胞を、ＥＳ０１４－１、抗ＣＤ３９ＡｂまたはＴＧＦβ ｔｒａｐ対照の連続希釈液、次いでビオチン化ＴＧＦβ１と共にインキュベートした。結合は、ストレプトアビジン－西洋ワサビペルオキシダーゼまたはストレプトアビジン－フルオレセインイソチオシアネートを用いて評価した。光学濃度（ＯＤ）は４５０ｎｍで読み取った。データは平均値±ＳＤであり、非線形ベストフィットを示す（ｎ＝２技術的反復）。結果を図２８に示す。図２８に示すように、代表的な抗ＣＤ３９／ＴＧＦβ Ｔｒａｐ分子（ＥＳ０１４－１）は、ＥＬＩＳＡ検出（図２８Ａ）およびＦＡＣＳ検出（図２８Ｂ）により、それぞれＣＤ３９およびＴＧＦβに同時に結合することができた。他の試験した抗ＣＤ３９／ＴＧＦβ Ｔｒａｐ分子（たとえば、ＥＳ０１４－２、ＥＳ０１４－３、ＥＳ０１４－４、ＥＳ０１４－５、ＥＳ０１４－６、ＥＳ０１４－７）の結果は同様であり、本明細書では示さなかった。
【0402】
実施例１２．抗ＣＤ３９／ＴＧＦβ Ｔｒａｐ分子はＴＧＦβシグナルを阻害する
[00442]ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）ＴＧＦ－βレポーター細胞アッセイ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）を用いて、正準ＴＧＦβシグナル伝達に及ぼす抗ＣＤ３９／ＴＧＦβ Ｔｒａｐ分子の効果を評価した。抗ＣＤ３９／ＴＧＦβ Ｔｒａｐ分子または抗ＣＤ３９の連続希釈液を、組換えヒトＴＧＦ－β１（５ｎｇ／ｍｌ）の存在下でＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）ＴＧＦ－βレポーター細胞と共に２４時間インキュベートした。抗ＣＤ３９／ＴＧＦβ Ｔｒａｐ分子は、トランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞におけるＴＧＦ－β ＳＭＡＤレポーターアッセイにおいて、ＴＧＦ－β正準シグナル伝達［半最大阻害濃度（ＩＣ５０）＝３２ｐＭ］をブロックしたが、抗ＣＤ３９はブロックしなかった（図２９Ａ）。さらにＣＤ３９タンパク質で抗ＣＤ３９／ＴＧＦβ Ｔｒａｐ分子をプレインキュベートしても、抗ＣＤ３９／ＴＧＦβ Ｔｒａｐ分子のＴＧＦ－β中和活性に影響を与えなかった（図２９Ｂ）。図２９Ａおよび図２９Ｂは、代表的な抗ＣＤ３９／ＴＧＦβ Ｔｒａｐ分子ＥＳ０１４－１の結果を示している。他の試験した抗ＣＤ３９／ＴＧＦβ Ｔｒａｐ分子（たとえば、ＥＳ０１４－２、ＥＳ０１４－３、ＥＳ０１４－４、ＥＳ０１４－５、ＥＳ０１４－６、ＥＳ０１４－７）の結果は同様であり、本明細書では示さなかった。
[00442]ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）ＴＧＦ－βレポーター細胞アッセイ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）を用いて、正準ＴＧＦβシグナル伝達に及ぼす抗ＣＤ３９／ＴＧＦβ Ｔｒａｐ分子の効果を評価した。抗ＣＤ３９／ＴＧＦβ Ｔｒａｐ分子または抗ＣＤ３９の連続希釈液を、組換えヒトＴＧＦ－β１（５ｎｇ／ｍｌ）の存在下でＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）ＴＧＦ－βレポーター細胞と共に２４時間インキュベートした。抗ＣＤ３９／ＴＧＦβ Ｔｒａｐ分子は、トランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞におけるＴＧＦ－β ＳＭＡＤレポーターアッセイにおいて、ＴＧＦ－β正準シグナル伝達［半最大阻害濃度（ＩＣ５０）＝３２ｐＭ］をブロックしたが、抗ＣＤ３９はブロックしなかった（図２９Ａ）。さらにＣＤ３９タンパク質で抗ＣＤ３９／ＴＧＦβ Ｔｒａｐ分子をプレインキュベートしても、抗ＣＤ３９／ＴＧＦβ Ｔｒａｐ分子のＴＧＦ－β中和活性に影響を与えなかった（図２９Ｂ）。図２９Ａおよび図２９Ｂは、代表的な抗ＣＤ３９／ＴＧＦβ Ｔｒａｐ分子ＥＳ０１４－１の結果を示している。他の試験した抗ＣＤ３９／ＴＧＦβ Ｔｒａｐ分子（たとえば、ＥＳ０１４－２、ＥＳ０１４－３、ＥＳ０１４－４、ＥＳ０１４－５、ＥＳ０１４－６、ＥＳ０１４－７）の結果は同様であり、本明細書では示さなかった。
【0403】
実施例１３．悪性細胞のＣＤ３９活性に及ぼす抗ＣＤ３９／ＴＧＦβ Ｔｒａｐ分子の効果
[00443]悪性細胞株のＣＤ３９の酵素活性を阻害する抗ＣＤ３９／ＴＧＦβ Ｔｒａｐ分子の能力を、ｃｅｌｌ－ｔｉｔｅｒ ｇｌｏ（ＣＴＧ）アッセイを用いて測定した。簡単には、細胞を抗ＣＤ３９／ＴＧＦβ Ｔｒａｐ分子、抗ＣＤ３９抗体または対照抗体および１００μＭ ＡＴＰで６０分間処理した。残りのＡＴＰレベルは、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔアッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて測定した。このアッセイには、ＭＯＬＰ－８（ヒト多発性骨髄腫細胞株）またはＣＨＯ／ｈＣＤ３９細胞を使用した。図３０Ａ～Ｂに示すように、ＡＴＰの存在下で、抗ＣＤ３９／ＴＧＦβ Ｔｒａｐ分子または対照抗体の示した濃度の範囲でＭＯＬＰ－８細胞を処理すると、試験した分子ＥＳ０１４－１、ＥＳ０１４－２およびＥＳ０１４－６によるＣＤ３９活性の用量依存的阻害を生じた。ＣＤ３９活性の阻害は、残存するＡＴＰの程度によって決定し、阻害％として表した。下記表２８に記載したＩＣ５０の通り、ＥＳ０１４－１、ＥＳ０１４－２、ＥＳ０１４－６は、ナノモルのＩＣ５０で強い阻害活性を示した。図３０Ｃに示すように、ＡＴＰの存在下で、例示的な抗ＣＤ３９／ＴＧＦβ Ｔｒａｐ分子ＥＳ０１４－１または対照抗体の示した濃度の範囲でＣＨＯ／ｈＣＤ３９細胞を処理すると、試験した全ての抗体によるＣＤ３９活性の用量依存的阻害を生じた。他の試験した抗ＣＤ３９／ＴＧＦβ Ｔｒａｐ分子（たとえば、ＥＳ０１４－２、ＥＳ０１４－３、ＥＳ０１４－４、ＥＳ０１４－５、ＥＳ０１４－６、ＥＳ０１４－７）の濃度の範囲でＣＨＯ／ｈＣＤ３９細胞を処理した結果は同様で、本明細書では示さない。
[00443]悪性細胞株のＣＤ３９の酵素活性を阻害する抗ＣＤ３９／ＴＧＦβ Ｔｒａｐ分子の能力を、ｃｅｌｌ－ｔｉｔｅｒ ｇｌｏ（ＣＴＧ）アッセイを用いて測定した。簡単には、細胞を抗ＣＤ３９／ＴＧＦβ Ｔｒａｐ分子、抗ＣＤ３９抗体または対照抗体および１００μＭ ＡＴＰで６０分間処理した。残りのＡＴＰレベルは、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔアッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて測定した。このアッセイには、ＭＯＬＰ－８（ヒト多発性骨髄腫細胞株）またはＣＨＯ／ｈＣＤ３９細胞を使用した。図３０Ａ～Ｂに示すように、ＡＴＰの存在下で、抗ＣＤ３９／ＴＧＦβ Ｔｒａｐ分子または対照抗体の示した濃度の範囲でＭＯＬＰ－８細胞を処理すると、試験した分子ＥＳ０１４－１、ＥＳ０１４－２およびＥＳ０１４－６によるＣＤ３９活性の用量依存的阻害を生じた。ＣＤ３９活性の阻害は、残存するＡＴＰの程度によって決定し、阻害％として表した。下記表２８に記載したＩＣ５０の通り、ＥＳ０１４－１、ＥＳ０１４－２、ＥＳ０１４－６は、ナノモルのＩＣ５０で強い阻害活性を示した。図３０Ｃに示すように、ＡＴＰの存在下で、例示的な抗ＣＤ３９／ＴＧＦβ Ｔｒａｐ分子ＥＳ０１４－１または対照抗体の示した濃度の範囲でＣＨＯ／ｈＣＤ３９細胞を処理すると、試験した全ての抗体によるＣＤ３９活性の用量依存的阻害を生じた。他の試験した抗ＣＤ３９／ＴＧＦβ Ｔｒａｐ分子（たとえば、ＥＳ０１４－２、ＥＳ０１４－３、ＥＳ０１４－４、ＥＳ０１４－５、ＥＳ０１４－６、ＥＳ０１４－７）の濃度の範囲でＣＨＯ／ｈＣＤ３９細胞を処理した結果は同様で、本明細書では示さない。
【0404】
【表31】
【0405】
実施例１４．抗ＣＤ３９／ＴＧＦβ Ｔｒａｐ結合親和性
[00444]代表的な抗ＣＤ３９／ＴＧＦβ Ｔｒａｐ分子ＥＳ０１４－１は、製造者のマニュアルに従ってＯｃｔｅｔアッセイ（ＦｏｒｅＢｉｏ）を用いて、ヒトＴＧＦβ１またはＣＤ３９に対する結合親和性について別々に特徴付けられた。簡単には、抗体をセンサーにカプリングし、次いでセンサーをＴＧＦβまたはＣＤ３９のタンパク質勾配に浸漬した（開始時２００ｎＭ、２倍希釈により全体で８用量）。これらの結合応答をリアルタイムで測定した。結果は全体的に合致した。試験した分子ＥＳ０１４－１の親和性データを下の表２９に要約する。他の試験した分子（たとえば、ＥＳ０１４－２、ＥＳ０１４－３、ＥＳ０１４－４、ＥＳ０１４－５、ＥＳ０１４－６、ＥＳ０１４－７）の親和性データは同様であり、本明細書では示さなかった。
[00444]代表的な抗ＣＤ３９／ＴＧＦβ Ｔｒａｐ分子ＥＳ０１４－１は、製造者のマニュアルに従ってＯｃｔｅｔアッセイ（ＦｏｒｅＢｉｏ）を用いて、ヒトＴＧＦβ１またはＣＤ３９に対する結合親和性について別々に特徴付けられた。簡単には、抗体をセンサーにカプリングし、次いでセンサーをＴＧＦβまたはＣＤ３９のタンパク質勾配に浸漬した（開始時２００ｎＭ、２倍希釈により全体で８用量）。これらの結合応答をリアルタイムで測定した。結果は全体的に合致した。試験した分子ＥＳ０１４－１の親和性データを下の表２９に要約する。他の試験した分子（たとえば、ＥＳ０１４－２、ＥＳ０１４－３、ＥＳ０１４－４、ＥＳ０１４－５、ＥＳ０１４－６、ＥＳ０１４－７）の親和性データは同様であり、本明細書では示さなかった。
【0406】
【表32】
【0407】
実施例１５．Ｔｒｅｇ抑制アッセイ
[00445]ＴｒｅｇはＴＧＦβの主要な分泌源であり、ＣＤ３９はＴｒｅｇおよびＤＣに発現していることから、Ｔｒｅｇが媒介するＴ細胞の抑制を打ち消す抗ＣＤ３９／ＴＧＦβ Ｔｒａｐ分子の相対能力を、Ｔｒｅｇ抑制アッセイを用いて調べた。簡単には、ヒトＰＢＭＣから単離したＣＤ３＋全Ｔ細胞を、ＰＢＭＣから単離した自己ＣＤ４＋／ＣＤ２５＋天然Ｔｒｅｇ（ｎＴｒｅｇ）の存在下でＩＬ－４とＧＭ－ＣＳＦでパルスした同種ＤＣに加えて、ＩＬ２、抗ＣＤ３／ＣＤ２８およびラパマイシンの１：１：１０の比の存在下でＸ－ｖｉｖｏ培地で増殖させた。
[00445]ＴｒｅｇはＴＧＦβの主要な分泌源であり、ＣＤ３９はＴｒｅｇおよびＤＣに発現していることから、Ｔｒｅｇが媒介するＴ細胞の抑制を打ち消す抗ＣＤ３９／ＴＧＦβ Ｔｒａｐ分子の相対能力を、Ｔｒｅｇ抑制アッセイを用いて調べた。簡単には、ヒトＰＢＭＣから単離したＣＤ３＋全Ｔ細胞を、ＰＢＭＣから単離した自己ＣＤ４＋／ＣＤ２５＋天然Ｔｒｅｇ（ｎＴｒｅｇ）の存在下でＩＬ－４とＧＭ－ＣＳＦでパルスした同種ＤＣに加えて、ＩＬ２、抗ＣＤ３／ＣＤ２８およびラパマイシンの１：１：１０の比の存在下でＸ－ｖｉｖｏ培地で増殖させた。
【0408】
[00446]これらの混合リンパ球を、抗ＣＤ３９／ＴＧＦβ Ｔｒａｐ分子、抗ＣＤ３９抗体、可溶性ＴＧＦβ ｔｒａｐ、または抗ＣＤ３９抗体とＴＧＦβ ｔｒａｐの組合せで３日間培養した後、ＣＦＳＥ細胞トレーサーによるＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞増殖、ＨＴＲＦ（Ｃｉｓｂｏ）によるＩＦＮγ分泌を測定してＴ細胞機能を評価した。予想通り、自己Ｔｒｅｇの添加は、同種ＤＣによって誘発されるＴ細胞の活性化を抑制した（図３１Ａ）。代表的な抗ＣＤ３９／ＴＧＦβ Ｔｒａｐ分子ＥＳ０１４－１は、自己Ｔｒｅｇの存在下でＴｒｅｇが媒介する抑制を打ち消し、Ｔ細胞の活性化を回復させる上で、抗ＣＤ３９抗体、可溶性ＴＧＦβ ｔｒａｐまたはその組合せよりも効果が高かった（図３１Ｂ～Ｄ）。これらのデータは、抗ＣＤ３９／ＴＧＦβ Ｔｒａｐ分子ＥＳ０１４－１が、Ｔ細胞機能の回復において、抗ＣＤ３９抗体、可溶性ＴＧＦβ ｔｒａｐまたはそれらの組合せよりも効果が高いことを示す。他の試験した分子（たとえば、ＥＳ０１４－２、ＥＳ０１４－３、ＥＳ０１４－４、ＥＳ０１４－５、ＥＳ０１４－６、ＥＳ０１４－７）も同様の効果を示した（データは示さない）。
【0409】
実施例１６．抗ＣＤ３９／ＴＧＦβ Ｔｒａｐ分子は刺激なしでヒトＴ細胞のアポトーシスを阻害する
[00447]２×１０４のヒトＰＢＭＣからの精製全ＣＤ３＋Ｔ細胞を一晩培養し、抗ＣＤ３９／ＴＧＦβ Ｔｒａｐ分子ＥＳ０１４－１およびＥＳ０１４－２、ＴＧＦβＲ失活型変異体ＥＳ０１４＿ｖ２、抗ＣＤ３９失活型変異体ＥＳ０１４＿ｖ１およびダブルネガティブ変異体ＥＳ０１４＿ｖ３と等モル濃度で一晩インキュベートした。ヒトＴ細胞のアポトーシスは、製造者の使用説明書に従って、ＡＰＣ標識アネキシンＶとＰＩによりフローサイトメトリーで測定した。
[00447]２×１０４のヒトＰＢＭＣからの精製全ＣＤ３＋Ｔ細胞を一晩培養し、抗ＣＤ３９／ＴＧＦβ Ｔｒａｐ分子ＥＳ０１４－１およびＥＳ０１４－２、ＴＧＦβＲ失活型変異体ＥＳ０１４＿ｖ２、抗ＣＤ３９失活型変異体ＥＳ０１４＿ｖ１およびダブルネガティブ変異体ＥＳ０１４＿ｖ３と等モル濃度で一晩インキュベートした。ヒトＴ細胞のアポトーシスは、製造者の使用説明書に従って、ＡＰＣ標識アネキシンＶとＰＩによりフローサイトメトリーで測定した。
【0410】
[00448]図３２Ａおよび図３２Ｂに示すように、抗ＣＤ３９／ＴＧＦβ Ｔｒａｐ分子ＥＳ０１４－１およびＥＳ０１４－２は、ＴＧＦβＲ失活型変異体ＥＳ０１４＿ｖ２、抗ＣＤ３９失活型変異体ＥＳ０１４＿ｖ１およびダブルネガティブ変異体ＥＳ０１４＿ｖ３と比較して用量依存的にヒトＴ細胞のアポトーシスを阻害した。
【0411】
実施例１７．抗ＣＤ３９／ＴＧＦβ Ｔｒａｐ分子は刺激によるヒトＴ細胞の生存と活性化を促進する
[00449]５×１０３の精製全ＣＤ３＋Ｔ細胞を、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８ビーズ刺激の存在下、同モルの抗ＣＤ３９／ＴＧＦβ Ｔｒａｐ分子ＥＳ０１４－１およびＥＳ０１４－２、抗ＣＤ３９抗体ＥＳ０１４＿ｖ２、ＴＧＦ－ベータ ｔｒａｐ ＥＳ０１４＿ｖ１、コンボ（ＥＳ０１４＿ｖ２およびＥＳ０１４＿ｖ１）ならびに対照としてダブル変異体抗体ＥＳ０１４＿ｖ３を４日間共培養した。Ｔ細胞の機能は、生死染色によるＴ細胞の生存率、ｃｅｌｌｔｒａｃｅ標識によるＴ細胞の増殖、ＣＤ２５発現によるＴ細胞の活性化、サイトカイン産生を測定して定量化した。
[00449]５×１０３の精製全ＣＤ３＋Ｔ細胞を、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８ビーズ刺激の存在下、同モルの抗ＣＤ３９／ＴＧＦβ Ｔｒａｐ分子ＥＳ０１４－１およびＥＳ０１４－２、抗ＣＤ３９抗体ＥＳ０１４＿ｖ２、ＴＧＦ－ベータ ｔｒａｐ ＥＳ０１４＿ｖ１、コンボ（ＥＳ０１４＿ｖ２およびＥＳ０１４＿ｖ１）ならびに対照としてダブル変異体抗体ＥＳ０１４＿ｖ３を４日間共培養した。Ｔ細胞の機能は、生死染色によるＴ細胞の生存率、ｃｅｌｌｔｒａｃｅ標識によるＴ細胞の増殖、ＣＤ２５発現によるＴ細胞の活性化、サイトカイン産生を測定して定量化した。
【0412】
[00450]図３３Ａに示すように、抗ＣＤ３／ＣＤ２８刺激では、抗ＣＤ３９／ＴＧＦβ Ｔｒａｐ分子群を除く全ての群で死細胞がほとんどであった。さらに、抗ＣＤ３９／ＴＧＦβ Ｔｒａｐ分子群の生細胞は、より高い細胞増殖および活性化（図３３Ａ）、ならびにＩＬ－２およびＩＦＮ－γ産生（図３３Ｂ）を維持していた。これらのデータは、抗ＣＤ３９／ＴＧＦβ Ｔｒａｐ分子が、Ｔ細胞の過剰活性化において、抗ＣＤ３９抗体、ＴＧＦβ ｔｒａｐまたはそれらの組合せよりも効果が高いことを示す。
【0413】
実施例１８．抗ＣＤ３９／ＴＧＦβ Ｔｒａｐ分子は、全Ｔ細胞上のＴＧＦ－ベータ誘導Ｆｏｘｐ３発現をブロックする
[00451]５×１０４の精製Ｔ細胞を、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８ビーズ刺激の存在下、同モルの抗ＣＤ３９／ＴＧＦβ Ｔｒａｐ分子（ＥＳ０１４－１およびＥＳ０１４－２）、抗ＣＤ３９抗体（ＥＳ０１４＿ｖ２）、ＴＧＦ－ベータ ｔｒａｐ（ＥＳ０１４＿ｖ１）、コンボ（ＥＳ０１４＿ｖ２＋ＥＳ０１４＿ｖ１）ならびに対照抗体（ＥＳ０１４＿ｖ３）で前処理を３０分間行い、１０ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ－ベータを添加した。ＴＧＦ－ベータで４日間処理した後、Ｔｒｅｇ分化を測定した。
[00451]５×１０４の精製Ｔ細胞を、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８ビーズ刺激の存在下、同モルの抗ＣＤ３９／ＴＧＦβ Ｔｒａｐ分子（ＥＳ０１４－１およびＥＳ０１４－２）、抗ＣＤ３９抗体（ＥＳ０１４＿ｖ２）、ＴＧＦ－ベータ ｔｒａｐ（ＥＳ０１４＿ｖ１）、コンボ（ＥＳ０１４＿ｖ２＋ＥＳ０１４＿ｖ１）ならびに対照抗体（ＥＳ０１４＿ｖ３）で前処理を３０分間行い、１０ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ－ベータを添加した。ＴＧＦ－ベータで４日間処理した後、Ｔｒｅｇ分化を測定した。
【0414】
[00452]図３４Ａおよび３４Ｂに示すように、抗ＣＤ３９／ＴＧＦβ Ｔｒａｐ分子（ＥＳ０１４－１およびＥＳ０１４－２）、ＴＧＦ－ベータ ｔｒａｐ（ＥＳ０１４＿ｖ１）およびコンボ（ＥＳ０１４＿ｖ２＋ＥＳ０１４＿ｖ１）による処理は、培地、抗ＣＤ３９（ＥＳ０１４＿ｖ２）および対照抗体（ＥＳ０１４＿ｖ３）で処理されるものに比べ、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞のＴＧＦベータ誘導Ｆｏｘｐ３発現をブロックすることができた。特に、抗ＣＤ３９／ＴＧＦβ Ｔｒａｐ分子処理群におけるブロッキング効果は、ＴＧＦ－ベータ ｔｒａｐ（ＥＳ０１４＿ｖ１）およびコンボ（ＥＳ０１４＿ｖ２＋ＥＳ０１４＿ｖ１）処理群よりもより優れた活性を示し、特に抗ＣＤ３９／ＴＧＦβ Ｔｒａｐ分子ＥＳ０１４－１は優れた活性を示した。
【0415】
実施例１９．抗ＣＤ３９／ＴＧＦβ Ｔｒａｐ分子は、ヒトＴ細胞増殖に対するＡＴＰ誘導阻害を回復させる
[00453]５×１０４の精製Ｔ細胞を、ｃｅｌｌｔｒａｃｅ ｖｉｏｌｅｔで標識し、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８ビーズ刺激の存在下、抗ＣＤ３９／ＴＧＦβ Ｔｒａｐ分子（ＥＳ０１４－１およびＥＳ０１４－２）、抗ＣＤ３９抗体（ＥＳ０１４＿ｖ２）、ＴＧＦ－ベータ ｔｒａｐ（ＥＳ０１４＿ｖ１）、コンボ（ＥＳ０１４＿ｖ２＋ＥＳ０１４＿ｖ１）と対照抗体（ＥＳ０１４＿ｖ３）で一晩前処理を行った。１日目に２００μＭ ＡＴＰを添加し、３日間ＡＴＰで処理した後、Ｔ細胞増殖を測定した。図３５Ａおよび３５Ｂに示すように、抗ＣＤ３９／ＴＧＦβ Ｔｒａｐ分子（ＥＳ０１４－１およびＥＳ０１４－２）、抗ＣＤ３９抗体（ＥＳ０１４＿ｖ２）およびコンボ（ＥＳ０１４＿ｖ２＋ＥＳ０１４＿ｖ１）による処理は、培地、ＴＧＦベータ ｔｒａｐ（ＥＳ０１４＿ｖ１）および対照抗体（ＥＳ０１４＿ｖ３）で処理されるものに比べ、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞増殖に対するＡＴＰ誘導阻害を反転することができた。回復したＴ細胞増殖の結果は、ＣＤ３９活性のブロッキングに対する抗ＣＤ３９／ＴＧＦβ Ｔｒａｐ分子の効果を示し、ＡＴＰアーゼ阻害活性の結果と一致した。
[00453]５×１０４の精製Ｔ細胞を、ｃｅｌｌｔｒａｃｅ ｖｉｏｌｅｔで標識し、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８ビーズ刺激の存在下、抗ＣＤ３９／ＴＧＦβ Ｔｒａｐ分子（ＥＳ０１４－１およびＥＳ０１４－２）、抗ＣＤ３９抗体（ＥＳ０１４＿ｖ２）、ＴＧＦ－ベータ ｔｒａｐ（ＥＳ０１４＿ｖ１）、コンボ（ＥＳ０１４＿ｖ２＋ＥＳ０１４＿ｖ１）と対照抗体（ＥＳ０１４＿ｖ３）で一晩前処理を行った。１日目に２００μＭ ＡＴＰを添加し、３日間ＡＴＰで処理した後、Ｔ細胞増殖を測定した。図３５Ａおよび３５Ｂに示すように、抗ＣＤ３９／ＴＧＦβ Ｔｒａｐ分子（ＥＳ０１４－１およびＥＳ０１４－２）、抗ＣＤ３９抗体（ＥＳ０１４＿ｖ２）およびコンボ（ＥＳ０１４＿ｖ２＋ＥＳ０１４＿ｖ１）による処理は、培地、ＴＧＦベータ ｔｒａｐ（ＥＳ０１４＿ｖ１）および対照抗体（ＥＳ０１４＿ｖ３）で処理されるものに比べ、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞増殖に対するＡＴＰ誘導阻害を反転することができた。回復したＴ細胞増殖の結果は、ＣＤ３９活性のブロッキングに対する抗ＣＤ３９／ＴＧＦβ Ｔｒａｐ分子の効果を示し、ＡＴＰアーゼ阻害活性の結果と一致した。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4-1】
【図4-2】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10-1】
【図10-2】
【図11-1】
【図11-2】
【図12-1】
【図12-2】
【図12-3】
【図13】
【図14-1】
【図14-2】
【図15-1】
【図15-2】
【図15-3】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19-1】
【図19-2】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23-1】
【図23-2】
【図24-1】
【図24-2】
【図24-3】
【図24-4】
【図24-5】
【図24-6】
【図24-7】
【図25-1】
【図25-2】
【図26】
【図27】
【図28】
【図29】
【図30-1】
【図30-2】
【図31-1】
【図31-2】
【図32】
【図33】
【図34】
【図35】
【配列表】
【国際調査報告】