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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-12-06
(54)【発明の名称】抗体様タンパク質およびその用途
(51)【国際特許分類】
C07K 19/00 20060101AFI20231129BHJP
C07K 16/18 20060101ALI20231129BHJP
C07K 14/46 20060101ALI20231129BHJP
C12N 15/62 20060101ALI20231129BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20231129BHJP
C12N 15/12 20060101ALI20231129BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20231129BHJP
A61P 35/02 20060101ALI20231129BHJP
A61P 31/00 20060101ALI20231129BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20231129BHJP
【ＦＩ】
C07K19/00
C07K16/18 ZNA
C07K14/46
C12N15/62 Z
C12N15/13
C12N15/12
A61P35/00
A61P35/02
A61P31/00
A61K39/395 E
A61K39/395 T
A61K39/395 R
A61K39/395 D
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023526090
(86)(22)【出願日】2021-11-01
(85)【翻訳文提出日】2023-04-27
(86)【国際出願番号】 KR2021015602
(87)【国際公開番号】W WO2022092974
(87)【国際公開日】2022-05-05
(31)【優先権主張番号】10-2020-0143660
(32)【優先日】2020-10-30
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(31)【優先権主張番号】10-2021-0148175
(32)【優先日】2021-11-01
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】519367980
【氏名又は名称】セレメディー カンパニー，リミテッド
【住所又は居所原語表記】Ｈ４３０１， ４ｔｈ Ｆｌｏｏｒ， Ｂｕｎｄａｎｇ Ｓｅｏｕｌ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｕｎｉｖ． Ｈｏｓｐｉｔａｌ ＨＩＰ， １７２ Ｄｏｌｍａ－ｒｏ， Ｂｕｎｄａｎｇ－ｇｕ， Ｓｅｏｎｇｎａｍ－ｓｉ， Ｇｙｅｏｎｇｇｉ－ｄｏ １３６０５ Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｋｏｒｅａ
(74)【代理人】
【識別番号】100137095
【弁理士】
【氏名又は名称】江部 武史
(74)【代理人】
【識別番号】100091627
【弁理士】
【氏名又は名称】朝比 一夫
(72)【発明者】
【氏名】リ， ジェ ウォン
(72)【発明者】
【氏名】リ， ボ ラム
(72)【発明者】
【氏名】ユン， チュル ジュ
【テーマコード（参考）】
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C085AA13
4C085BB11
4C085CC21
4C085DD62
4C085EE01
4H045AA10
4H045AA11
4H045AA30
4H045BA10
4H045BA41
4H045EA20
(57)【要約】
本発明は、抗体様タンパク質およびその用途に関し、より詳細には、抗体の相補性決定領域が融合したＣＤＲ－フェリチン単量体を少なくとも含む複数のフェリチン単量体の自己集合からなることにより、相補性決定領域がその表面または外部に高密度で存在し、ＨＣＤＲ３などの一部の相補性決定領域のみでも抗体と類似したレベルの結合力（affinity）で抗原に結合することができ、複数の抗原と同時に結合するのに有利な構造的特性を有しており、抗体に比べて結合活性（avidity）が顕著に改善された、抗体様タンパク質およびその用途に関する。本発明の抗体様タンパク質は、抗体ベースの用途および分野で広く利用できる抗体の代替材料である。
【選択図】図９
【選択図】図９
【特許請求の範囲】
【請求項1】
相補性決定領域（Complementarity Determining Region）が融合したＣＤＲ－フェリチン単量体を少なくとも含む複数のフェリチン単量体の自己集合からなる抗体様タンパク質。
【請求項2】
前記相補性決定領域は、前記抗体のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３およびそれらの保存的配列変異体からなる群より選択されるいずれか１つである、請求項１に記載の抗体様タンパク質。
【請求項3】
前記相補性決定領域は、抗原との結合のために前記タンパク質の表面または外部に露出している、請求項１に記載の抗体様タンパク質。
【請求項4】
前記相補性決定領域は、２５ａａ以下の長さを有する、請求項１に記載の抗体様タンパク質。
【請求項5】
前記ＣＤＲ－フェリチン単量体は、前記相補性決定領域がヒトフェリチン重鎖単量体に融合したものである、請求項１に記載の抗体様タンパク質。
【請求項6】
前記ＣＤＲ－フェリチン単量体における前記相補性決定領域は、フェリチン単量体のα－ヘリックスの内部、隣接するα－ヘリックスの間、Ｎ末端、Ｃ末端、ＡＢループ、ＢＣループ、ＣＤループ、ＤＥループ、Ｎ末端とＡヘリックスの間、およびＥヘリックスとＣ末端の間からなる群より選択されるいずれか１つに融合する、請求項１に記載の抗体様タンパク質。
【請求項7】
前記ＣＤＲ－フェリチン単量体は、１つのフェリチン単量体に前記抗体の複数の相補性決定領域が融合したものである、請求項１に記載の抗体様タンパク質。
【請求項8】
前記ＣＤＲ－フェリチン単量体は、１つのフェリチン単量体に前記抗体のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３およびそれらの保存的配列変異体からなる群より選択される少なくとも１つの重鎖相補性決定領域が融合したものである、請求項１に記載の抗体様タンパク質。
【請求項9】
前記ＣＤＲ－フェリチン単量体は、１つのフェリチン単量体に、前記抗体のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３およびそれらの保存的配列変異体からなる群より選択される少なくとも１つの軽鎖相補性決定領域が融合したものである、請求項１に記載の抗体様タンパク質。
【請求項10】
前記ＣＤＲ－フェリチン単量体は、前記抗体のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３およびそれらの保存的配列変異体からなる群より選択される少なくとも１つの重鎖相補性決定領域が融合した重鎖ＣＤＲ－フェリチン単量体と、前記抗体のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３およびそれらの保存的配列変異体からなる群より選択される少なくとも１つの軽鎖相補性決定領域が融合した軽鎖ＣＤＲ－フェリチン単量体とを含む、請求項１に記載の抗体様タンパク質。
【請求項11】
前記相補性決定領域は、前記ＣＤＲ－フェリチン単量体のＤＥループまたはＣ末端に融合して４重対称構造（four fold symmetry）を形成する、請求項１に記載の抗体様タンパク質。
【請求項12】
前記相補性決定領域は、前記ＣＤＲ－フェリチン単量体のＮ末端、ＡＢループまたはＢＣループに融合して２重対称構造（two fold symmetry）を形成する、請求項１に記載の抗体様タンパク質。
【請求項13】
前記相補性決定領域は、前記ＣＤＲ－フェリチン単量体のＣＤループに融合して３重対称構造（three fold symmetry）を形成する、請求項１に記載の抗体様タンパク質。
【請求項14】
前記相補性決定領域は、０．７～７ｎｍの距離で離隔して配置される、請求項１１～１３のいずれか一項に記載の抗体様タンパク質。
【請求項15】
前記ＣＤＲ－フェリチン単量体は、１つのフェリチン単量体に２種以上の抗体の各相補性決定領域が融合したものである、請求項１に記載の抗体様タンパク質。
【請求項16】
前記ＣＤＲ－フェリチン単量体は、第１の抗体の少なくとも１つの相補性決定領域が融合した第１のＣＤＲ－フェリチン単量体、および第２の抗体の少なくとも１つの相補性決定領域が融合した第２のＣＤＲ－フェリチン単量体を少なくとも含む、請求項１に記載の抗体様タンパク質。
【請求項17】
前記第１のＣＤＲ－フェリチン単量体は、前記第１の抗体のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３およびそれらの保存的配列変異体からなる群より選択される少なくとも１つの重鎖相補性決定領域が融合した第１の重鎖ＣＤＲ－フェリチン単量体と、前記第１の抗体のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３およびそれらの保存的配列変異体からなる群より選択される少なくとも１つの軽鎖相補性決定領域が融合した第１の軽鎖ＣＤＲ－フェリチン単量体とを含む、請求項１６に記載の抗体様タンパク質。
【請求項18】
前記第２のＣＤＲ－フェリチン単量体は、前記第２の抗体のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３およびそれらの保存的配列変異体からなる群より選択される少なくとも１つの重鎖相補性決定領域が融合した第２の重鎖ＣＤＲ－フェリチン単量体と、前記第２の抗体のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３およびそれらの保存的配列変異体からなる群より選択される少なくとも１つの軽鎖相補性決定領域が融合した第２の軽鎖ＣＤＲ－フェリチン単量体とを含む、請求項１６に記載の抗体様タンパク質。
【請求項19】
前記第１のＣＤＲ－フェリチン単量体および前記第２のＣＤＲ－フェリチン単量体は１：１～１：５で含まれる、請求項１６に記載の抗体様タンパク質。
【請求項20】
前記ＣＤＲ－フェリチン単量体は、複数の異なる抗体を含む第１の抗体群の複数の相補性決定領域が融合した第１のＣＤＲ－フェリチン単量体、および複数の異なる抗体を含む第２の抗体群の複数の相補性決定領域が融合した第２のＣＤＲ－フェリチン単量体を少なくとも含む、請求項１に記載の抗体様タンパク質。
【請求項21】
前記複数のフェリチン単量体は、前記相補性決定領域が融合していないフェリチン単量体を少なくとも含む、請求項１に記載の抗体様タンパク質。
【請求項22】
前記ＣＤＲ－フェリチン単量体の２４個が自己集合してなる、請求項１に記載の抗体様タンパク質。
【請求項23】
粒径８～５０ｎｍの球状である、請求項１に記載の抗体様タンパク質。
【請求項24】
前記相補性決定領域に結合する抗原に対する結合力（Ｋｄ）が１，０００ｎＭ以下である、請求項１に記載の抗体様タンパク質。
【請求項25】
前記抗体は、ＰＤ－１、Ｈｅｒ－２／ｎｅｕ、ＶＩＳＴＡ、４－１ＢＢＬ、ＣＤ４８、ガレクチン９（Galectin－9）、アデノシンＡ２ａ受容体（Adenosine A2a receptor）、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＩＣＯＳ、ＩＣＯＳＬ、ＢＴＬＡ、ＯＸ－４０Ｌ、ＣＤ１５５、ＢＣＬ２、ＭＹＣ、ＰＰ２Ａ、ＢＲＤ１、ＢＲＤ２、ＢＲＤ３、ＢＲＤ４、ＢＲＤＴ、ＣＢＰ、Ｅ２Ｆ１、ＭＤＭ２、ＭＤＭＸ、ＰＰＰ２ＣＡ、ＰＰＭ１Ｄ、ＳＴＡＴ３、ＩＤＨ１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＣＤ４０Ｌ、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＴＩＧＩＴ、ＢＴＬＡ、ＣＤ５２、ＳＬＡＭＦ７、４－１ＢＢ、ＯＸ－４０、ＩＣＯＳ、ＧＩＴＲ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１６、ＣＤ３、ＣＤ２０、ＥＧＦＲファミリー、ＡＸＬ、ＣＳＦ１Ｒ、ＤＤＲ１、ＤＤＲ２、ＥＰＨ受容体ファミリー、ＦＧＦＲファミリー、ＶＥＧＦＲファミリー、ＩＧＦ１Ｒ、ＬＴＫ、ＰＤＧＦＲファミリー、ＲＥＴ、ＫＩＴ、ＫＲＡＳ、ＮＴＲＫ１、ＮＴＲＫ２およびＳＡＲＳ－Ｃｏｖからなる群より選択されるいずれか１つに対する抗体である、請求項１に記載の抗体様タンパク質。
【請求項26】
前記抗体は、ｇｐ１００、ＭＡＲＴ－１、Ｍｅｌｎａ－Ａ、ＭＡＧＥ－Ａ３、ＭＡＧＥ－Ｃ２、マンマグロビンＡ（Mammaglobin－A）、プロテイナーゼ３（proteinsase－3）、ムチン１（mucin－1）、ＨＰＶ Ｅ６、ＬＭＰ２、ＰＳＭＡ、ＧＤ２、ｈＴＥＲＴ、ＰＡＰ、ＥＲＧ、ＮＡ１７、ＡＬＫ、ＧＭ３、ＥＰｈＡ２、ＮＡ１７－Ａ、ＴＲＰ－１、ＴＲＰ－２、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＣＥＡ、ＣＡ １２５、ＡＦＰ、サバイビン (Survivin)、ＡＨ１、ｒａｓ、Ｇ１７ＤＴ、ＭＵＣ１、Ｈｅｒ－２／ｎｅｕ、Ｅ７５、ｐ５３、ＰＳＡ、ＨＣＧ、ＰＲＡＭＥ、ＷＴ１、ＵＲＬＣ１０、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、Ｅ７、チロシナーゼ（Tyrosinase）ペプチド、Ｂ１６Ｆ１０、ＥＬ４およびネオアンチゲン（neoantigen）からなる群より選択されるものに対する抗体である、請求項１に記載の抗体様タンパク質。
【請求項27】
前記抗体は、脳癌、頭頸部癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌、食道癌、白血病、肺癌、肝癌、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、直腸癌、腎臓癌、胃癌、精巣癌、子宮癌、血管腫瘍、扁平細胞癌種、腺癌種、小細胞癌種、黒色腫、神経膠腫、神経芽細胞腫、肉腫、喉頭癌、耳下腺癌、胆道癌、甲状腺癌、日光角化症、急性リンパ球性白血病、急性骨髄性白血病、腺様嚢胞癌、腺腫、腺扁平上皮癌腫、肛門管癌、肛門癌、肛門直腸癌、星細胞腫、バルトリン腺癌、基底細胞癌腫、胆汁癌、骨癌、骨髄癌、気管支癌、気管支腺癌腫、カルチノイド、胆管癌腫、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、淡明細胞癌腫、結合組織癌、嚢腺腫、消化器系癌、十二指腸癌、内分泌系癌、内胚葉洞腫瘍、子宮内膜増殖症、子宮内膜様腺癌、内皮細胞癌、上衣腫、上皮細胞癌、眼窩癌、局所性結節性過形成、胆嚢癌、幽門洞癌、胃基底部癌、ガストリノーマ、膠芽腫、グルカゴノーマ、心臓癌、血管芽細胞腫、血管内皮腫、血管腫、肝腺腫、肝腺腫症、肝胆道癌、肝細胞癌腫、ホジキン病、回腸癌、インスリノーマ、上皮内新生物、上皮内扁平細胞新生物、肝内胆道癌、浸潤性扁平細胞癌腫、空腸癌、関節癌、骨盤癌、巨細胞癌腫、大腸癌、リンパ腫、悪性中皮腫、髄芽腫、髄質上皮腫、脳膜癌、中皮癌、転移性癌腫、口腔癌、粘表皮癌、多発性骨髄腫、筋肉癌、鼻腔癌、神経系癌、非上皮皮膚癌、非ホジキンリンパ腫、燕麦細胞癌、乏突起膠腫、口腔癌、骨肉腫、漿液性乳頭状腺癌、陰茎癌、咽頭癌、下垂体腫瘍、形質細胞性腫瘍、偽肉腫、肺芽腫、直腸癌、腎細胞癌腫、呼吸器系癌、網膜芽細胞腫、漿液性癌、副鼻腔癌、皮膚癌、小細胞癌、小腸癌、平滑筋肉腫、軟部組織癌、ソマトスタチノーマ、脊椎癌、扁平細胞癌、線条筋肉癌、中皮細胞下層癌、Ｔ細胞白血病、舌癌、尿管癌、尿道癌、子宮頸癌、子宮体癌、膣癌、ＶＩＰｏｍａ、外陰部癌、高分化癌、およびウィルムス腫瘍からなる群より選択される癌の抗原に対する抗体である、請求項１に記載の抗体様タンパク質。
【請求項28】
前記抗体は、感染性疾患抗原に対する抗体である、請求項１に記載の抗体様タンパク質。
【請求項29】
前記感染性疾患は、バクテリア、真菌、ウイルス、寄生虫またはプリオン誘発疾患である、請求項２８に記載の抗体様タンパク質。
【請求項30】
請求項１に記載の抗体様タンパク質を含む、疾患の治療または予防用薬学組成物。
【請求項31】
請求項１に記載の抗体様タンパク質を含む、疾患の診断用組成物。
【請求項32】
請求項１に記載の抗体様タンパク質を処理するステップを含む、抗原の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、新規な構造および特性を有するタンパク質並びにその用途に関する。
【背景技術】
【0002】
標的指向型薬物送達システムとは、薬物を治療部位に選択的に送達することにより、健康な組織を薬物に暴露させないとともに、少量の薬物でも優れた治療効果を発揮できるように設計された技術を指す。標的指向型薬物送達システムを利用すれば、特定の疾患部位に薬物を集中させることで薬物治療効果を最大化し、抗癌剤などの毒性の強い薬物による副作用を最小限に抑えることができる。
【0003】
ほとんどの場合、標的指向性を付与する代表的な物質はシグナルペプチドと抗体である。抗体とは、脊椎動物の免疫応答によって産生されるタンパク質であって、抗原の特定の部位を特異的に認識して結合し、抗原の作用を不活性化または除去する免疫タンパク質である。抗体は２つの重鎖（heavy chain）と２つの軽鎖（light chain）を有し、最も一般的に利用されているＧクラスの抗体（immunoglobulin G）の場合は、基本的にＹ字型をしている。軽鎖と重鎖の可変領域が一緒になって抗原結合部位（antigen binding site）が形成される。このような抗体は２つの抗原結合部位を有するため、１つの抗体は２つの抗原エピトープしか結合することができない。また、抗原結合部位が占める部分は、抗体全体の大きさに比べて一部であり、抗体の使用時には抗原－抗体反応を誘発できる抗原結合部位以外に他の外来配列が投与体に共に導入される限界がある。
【0004】
フェリチンは鉄を貯蔵するタンパク質であり、原核生物と真核生物に広く存在している。フェリチンの分子量は約５００，０００Ｄａで、重鎖（Heavy chain）と軽鎖（Light chain）で構成されており、自己集合能力があって球状粒子を形成する独特の特性を示す。フェリチンは２４個の単量体（重鎖または軽鎖のいずれかで構成される単一単量体または異種単量体）が集まって巨大な球状の三次構造を形成したタンパク質であり、ヒトフェリチンの場合、外径が約１２ｎｍ、内径が約８ｎｍである。
【0005】
フェリチン構造体は、選択的方法により適切な機能団を用いて修飾（modification）することができ、必要な様々な物理化学的性質を付与できる利点を有する。一例として、抗原エピトープと融合したフェリチン単量体が自己集合してフェリチンタンパク質を形成し、そのフェリチンタンパク質は樹状細胞に抗原を提示する役割を果たすことができる。しかし、フェリチン単量体に抗体の相補性決定領域を融合させた事例は未だ報告されていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
本発明は、抗原への結合活性に優れた抗体様タンパク質を提供することを目的とする。
【0007】
本発明は、抗体全体を用いることによる不要な免疫応答を誘発しない抗体様タンパク質を提供することを目的とする。
【0008】
本発明は、生産および保存が容易な抗体様タンパク質を提供することを目的とする。
【0009】
本発明は、前記抗体様タンパク質を用いる疾患の治療または予防用薬学組成物、疾患の診断用組成物および抗原の検出方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0010】
本発明は、相補性決定領域（Complementarity Determining Region）が融合したＣＤＲ－フェリチン単量体を少なくとも含む複数のフェリチン単量体の自己集合からなる抗体様タンパク質を提供する。
【0011】
本発明の抗体様タンパク質における前記相補性決定領域は、前記抗体のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３およびそれらの保存的配列変異体からなる群より選択されるいずれか１つであってもよい。
【0012】
本発明の抗体様タンパク質における前記相補性決定領域は、抗原との結合のために前記タンパク質の表面または外部に露出していてもよい。
【0013】
本発明の抗体様タンパク質における前記相補性決定領域は、２５ａａ以下の長さを有することができる。
【0014】
本発明の抗体様タンパク質における前記ＣＤＲ－フェリチン単量体は、前記相補性決定領域がヒトフェリチン重鎖単量体に融合したものであってもよい。
【0015】
本発明の抗体様タンパク質における前記相補性決定領域は、α－ヘリックスの内部、隣接するα－ヘリックスの間、Ｎ末端、Ｃ末端、ＡＢループ、ＢＣループ、ＣＤループ、ＤＥループ、Ｎ末端とＡヘリックスの間、およびＥヘリックスとＣ末端の間からなる群より選択されるいずれか１つに融合するものであってもよい。
【0016】
本発明の抗体様タンパク質における前記ＣＤＲ－フェリチン単量体は、１つのフェリチン単量体に前記抗体の複数の相補性決定領域が融合したものであってもよい。
【0017】
本発明の抗体様タンパク質における前記ＣＤＲ－フェリチン単量体は、１つのフェリチン単量体に前記抗体のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３およびそれらの保存的配列変異体からなる群より選択される少なくとも１つの重鎖相補性決定領域が融合したものであってもよい。
【0018】
本発明の抗体様タンパク質における前記ＣＤＲ－フェリチン単量体は、１つのフェリチン単量体に、前記抗体のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３およびそれらの保存的配列変異体からなる群より選択される少なくとも１つの軽鎖相補性決定領域が融合したものであってもよい。
【0019】
本発明の抗体様タンパク質における前記ＣＤＲ－フェリチン単量体は、前記抗体のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３およびそれらの保存的配列変異体からなる群より選択される少なくとも１つの重鎖相補性決定領域が融合した重鎖ＣＤＲ－フェリチン単量体と、前記抗体のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３およびそれらの保存的配列変異体からなる群より選択される少なくとも１つの軽鎖相補性決定領域が融合した軽鎖ＣＤＲ－フェリチン単量体とを含むことができる。
【0020】
本発明の抗体様タンパク質における前記相補性決定領域は、前記ＣＤＲ－フェリチン単量体のＤＥループまたはＣ末端に融合して４重対称構造（four fold symmetry）を形成することができる。
【0021】
本発明の抗体様タンパク質における前記相補性決定領域は、前記ＣＤＲ－フェリチン単量体のＮ末端、ＡＢループまたはＢＣループに融合して２重対称構造（two fold symmetry）を形成することができる。
【0022】
本発明の抗体様タンパク質における前記相補性決定領域は、前記ＣＤＲ－フェリチン単量体のＣＤループに融合して３重対称構造（three fold symmetry）を形成することができる。
【0023】
本発明の抗体様タンパク質における前記相補性決定領域は、０．７～７ｎｍの距離で離隔して配置することができる。
【0024】
本発明の抗体様タンパク質における前記ＣＤＲ－フェリチン単量体は、１つのフェリチン単量体に２種以上の抗体の各相補性決定領域が融合したものであってもよい。
【0025】
本発明の抗体様タンパク質における前記ＣＤＲ－フェリチン単量体は、第１の抗体の少なくとも１つの相補性決定領域が融合した第１のＣＤＲ－フェリチン単量体、および第２の抗体の少なくとも１つの相補性決定領域が融合した第２のＣＤＲ－フェリチン単量体を少なくとも含むことができる。
【0026】
本発明の抗体様タンパク質における前記第１のＣＤＲ－フェリチン単量体は、前記第１の抗体のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３およびそれらの保存的配列変異体からなる群より選択される少なくとも１つの重鎖相補性決定領域が融合した第１の重鎖ＣＤＲ－フェリチン単量体と、前記第１の抗体のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３およびそれらの保存的配列変異体からなる群より選択される少なくとも１つの軽鎖相補性決定領域が融合した第１の軽鎖ＣＤＲ－フェリチン単量体とを含むことができる。
【0027】
本発明の抗体様タンパク質における前記第２のＣＤＲ－フェリチン単量体は、前記第２の抗体のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３およびそれらの保存的配列変異体からなる群より選択される少なくとも１つの重鎖相補性決定領域が融合した第２の重鎖ＣＤＲ－フェリチン単量体と、前記第２の抗体のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３およびそれらの保存的配列変異体からなる群より選択される少なくとも１つの軽鎖相補性決定領域が融合した第２の軽鎖ＣＤＲ－フェリチン単量体とを含むことができる。
【0028】
本発明の抗体様タンパク質において、前記第１のＣＤＲ－フェリチン単量体および前記第２のＣＤＲ－フェリチン単量体は１：１～１：５で含むことができる。
【0029】
本発明の抗体様タンパク質における前記ＣＤＲ－フェリチン単量体は、複数の異なる抗体を含む第１の抗体群の複数の相補性決定領域が融合した第１のＣＤＲ－フェリチン単量体、および複数の異なる抗体を含む第２の抗体群の複数の相補性決定領域が融合した第２のＣＤＲ－フェリチン単量体を少なくとも含むことができる。
【0030】
本発明の抗体様タンパク質における前記複数のフェリチン単量体は、前記相補性決定領域が融合していないフェリチン単量体を少なくとも含むことができる。
【0031】
本発明の抗体様タンパク質は、前記ＣＤＲ－フェリチン単量体の２４個が自己集合してなるものであってもよい。
【0032】
本発明の抗体様タンパク質は、粒径８～５０ｎｍの球状であってもよい。
【0033】
本発明の抗体様タンパク質において、前記相補性決定領域に結合する抗原への結合力（Ｋｄ）は１，０００ｎＭ以下であってもよい。
【0034】
本発明の抗体様タンパク質における前記抗体は、ＰＤ－１、Ｈｅｒ－２／ｎｅｕ、ＶＩＳＴＡ、４－１ＢＢＬ、ＣＤ４８、ガレクチン９（Galectin－9）、アデノシンＡ２ａ受容体（Adenosine A2a receptor）、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＩＣＯＳ、ＩＣＯＳＬ、ＢＴＬＡ、ＯＸ－４０Ｌ、ＣＤ１５５、ＢＣＬ２、ＭＹＣ、ＰＰ２Ａ、ＢＲＤ１、ＢＲＤ２、ＢＲＤ３、ＢＲＤ４、ＢＲＤＴ、ＣＢＰ、Ｅ２Ｆ１、ＭＤＭ２、ＭＤＭＸ、ＰＰＰ２ＣＡ、ＰＰＭ１Ｄ、ＳＴＡＴ３、ＩＤＨ１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＣＤ４０Ｌ、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＴＩＧＩＴ、ＢＴＬＡ、ＣＤ５２、ＳＬＡＭＦ７、４－１ＢＢ、ＯＸ－４０、ＩＣＯＳ、ＧＩＴＲ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１６、ＣＤ３、ＣＤ２０、ＥＧＦＲファミリー、ＡＸＬ、ＣＳＦ１Ｒ、ＤＤＲ１、ＤＤＲ２、ＥＰＨ受容体ファミリー、ＦＧＦＲファミリー、ＶＥＧＦＲファミリー、ＩＧＦ１Ｒ、ＬＴＫ、ＰＤＧＦＲファミリー、ＲＥＴ、ＫＩＴ、ＫＲＡＳ、ＮＴＲＫ１、ＮＴＲＫ２およびＳＡＲＳ－Ｃｏｖからなる群より選択されるいずれか１つに対する抗体であってもよい。
【0035】
本発明の抗体様タンパク質における前記抗体は、ｇｐ１００、ＭＡＲＴ－１、Ｍｅｌｎａ－Ａ、ＭＡＧＥ－Ａ３、ＭＡＧＥ－Ｃ２、マンマグロビンＡ（Mammaglobin－A）、プロテイナーゼ３（proteinsase－3）、ムチン１（mucin－1）、ＨＰＶ Ｅ６、ＬＭＰ２、ＰＳＭＡ、ＧＤ２、ｈＴＥＲＴ、ＰＡＰ、ＥＲＧ、ＮＡ１７、ＡＬＫ、ＧＭ３、ＥＰｈＡ２、ＮＡ１７－Ａ、ＴＲＰ－１、ＴＲＰ－２、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＣＥＡ、ＣＡ １２５、ＡＦＰ、サバイビン (Survivin)、ＡＨ１、ｒａｓ、Ｇ１７ＤＴ、ＭＵＣ１、Ｈｅｒ－２／ｎｅｕ、Ｅ７５、ｐ５３、ＰＳＡ、ＨＣＧ、ＰＲＡＭＥ、ＷＴ１、ＵＲＬＣ１０、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、Ｅ７、チロシナーゼ（Tyrosinase）ペプチド、Ｂ１６Ｆ１０、ＥＬ４およびネオアンチゲン（neoantigen）からなる群より選択されるものに対する抗体であってもよい。
【0036】
本発明の抗体様タンパク質における前記抗体は、脳癌、頭頸部癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌、食道癌、白血病、肺癌、肝癌、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、直腸癌、腎臓癌、胃癌、精巣癌、子宮癌、血管腫瘍、扁平細胞癌種、腺癌種、小細胞癌種、黒色腫、神経膠腫、神経芽細胞腫、肉腫、喉頭癌、耳下腺癌、胆道癌、甲状腺癌、日光角化症、急性リンパ球性白血病、急性骨髄性白血病、腺様嚢胞癌、腺腫、腺扁平上皮癌腫、肛門管癌、肛門癌、肛門直腸癌、星細胞腫、バルトリン腺癌、基底細胞癌腫、胆汁癌、骨癌、骨髄癌、気管支癌、気管支腺癌腫、カルチノイド、胆管癌腫、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、淡明細胞癌腫、結合組織癌、嚢腺腫、消化器系癌、十二指腸癌、内分泌系癌、内胚葉洞腫瘍、子宮内膜増殖症、子宮内膜様腺癌、内皮細胞癌、上衣腫、上皮細胞癌、眼窩癌、局所性結節性過形成、胆嚢癌、幽門洞癌、胃基底部癌、ガストリノーマ、膠芽腫、グルカゴノーマ、心臓癌、血管芽細胞腫、血管内皮腫、血管腫、肝腺腫、肝腺腫症、肝胆道癌、肝細胞癌腫、ホジキン病、回腸癌、インスリノーマ、上皮内新生物、上皮内扁平細胞新生物、肝内胆道癌、浸潤性扁平細胞癌腫、空腸癌、関節癌、骨盤癌、巨細胞癌腫、大腸癌、リンパ腫、悪性中皮腫、髄芽腫、髄質上皮腫、脳膜癌、中皮癌、転移性癌腫、口腔癌、粘表皮癌、多発性骨髄腫、筋肉癌、鼻腔癌、神経系癌、非上皮皮膚癌、非ホジキンリンパ腫、燕麦細胞癌、乏突起膠腫、口腔癌、骨肉腫、漿液性乳頭状腺癌、陰茎癌、咽頭癌、下垂体腫瘍、形質細胞性腫瘍、偽肉腫、肺芽腫、直腸癌、腎細胞癌腫、呼吸器系癌、網膜芽細胞腫、漿液性癌、副鼻腔癌、皮膚癌、小細胞癌、小腸癌、平滑筋肉腫、軟部組織癌、ソマトスタチノーマ、脊椎癌、扁平細胞癌、線条筋肉癌、中皮細胞下層癌、Ｔ細胞白血病、舌癌、尿管癌、尿道癌、子宮頸癌、子宮体癌、膣癌、ＶＩＰｏｍａ、外陰部癌、高分化癌、およびウィルムス腫瘍からなる群より選択される癌の抗原に対する抗体であってもよい。
【0037】
本発明の抗体様タンパク質における前記抗体は、感染性疾患抗原に対する抗体であってもよい。
【0038】
本発明の抗体様タンパク質における前記感染性疾患は、バクテリア、真菌、ウイルス、寄生虫またはプリオン誘発疾患であってもよい。
【0039】
また、本発明は、前記抗体様タンパク質を含む、疾患の治療または予防用薬学組成物を提供する。
【0040】
また、本発明は、前記抗体様タンパク質を含む、疾患の診断用組成物を提供する。
【0041】
また、本発明は、前記抗体様タンパク質を含む抗体様タンパク質を処理するステップを含む、抗原の検出方法を提供する。
【発明の効果】
【0042】
本発明の抗体様タンパク質は、抗体またはその断片（ｓｃＦｖ）とは全く異なる構造を有する。
【0043】
本発明の抗体様タンパク質は、相補性決定領域がその表面または外部に高密度で存在し、一部の相補性決定領域だけでも抗体と類似したレベルの結合力（affinity）で抗原に結合することができる。
【0044】
本発明の抗体様タンパク質は、抗体の相補性決定領域間の距離を考慮して、フェリチンタンパク質の表面または外部に相補性決定領域が配置されるように設計することができる。
【0045】
本発明の抗体様タンパク質は、２重抗体などの多重抗体と類似した役割を果たすことができる。
【0046】
本発明の抗体様タンパク質は、複数の抗原と同時に結合するのに有利な構造的特性を有しており、抗体に比べて結合活性（avidity）が顕著に改善されている。
【0047】
本発明の抗体様タンパク質は、抗体のＣＤＲまたはその保存的配列変異体のみを含み、ＣＤＲ以外の抗体全配列を用いることによる不要な免疫応答を誘発しない。
【0048】
本発明の抗体様タンパク質は、微生物において容易に産生することができる。
【0049】
本発明の抗体様タンパク質は保存が容易である。
【図面の簡単な説明】
【0050】
【図4】図４は、αＰＤ－Ｌ１ ＨＣＤＲ３が融合した重鎖ＣＤＲ－フェリチン単量体（ｈｕＨＦ－αＰＤ－Ｌ１ ＨＣＤＲ３）の製造のためのベクター模式図およびその単量体の製造並びに自己集合の有無を確認したものである。
【図5】図５は、αＰＤ１ ＨＣＤＲ３が融合した重鎖ＣＤＲ－フェリチン単量体（ｈｕＨＦ－αＰＤ１ ＨＣＤＲ３）の製造のためのベクター模式図およびその単量体の製造並びに自己集合の有無を確認したものである。
【図6】図６は、αＣＴＬＡ４ ＨＣＤＲ３が融合した重鎖ＣＤＲ－フェリチン単量体（ｈｕＨＦ－αＣＴＬＡ４ ＨＣＤＲ３）の製造のためのベクター模式図およびその単量体の製造並びに自己集合の有無を確認したものである。
【図7】図７は、αＴＩＧＩＴ ＨＣＤＲ３が融合した重鎖ＣＤＲ－フェリチン単量体（ｈｕＨＦ－αＴＩＧＩＴ ＨＣＤＲ３）の製造のためのベクター模式図およびその単量体の製造並びに自己集合の有無を確認したものである。
【図8】図８は、αＬＡＧ３ ＨＣＤＲ３が融合した重鎖ＣＤＲ－フェリチン単量体（ｈｕＨＦ－αＬＡＧ３ ＨＣＤＲ３）の製造のためのベクター模式図およびその単量体の製造並びに自己集合の有無を確認したものである。
【図9】図９は、αＴＩＭ３ ＨＣＤＲ３が融合した重鎖ＣＤＲ－フェリチン単量体（ｈｕＨＦ－αＴＩＭ３ ＨＣＤＲ３）の製造のためのベクター模式図およびその単量体の製造並びに自己集合の有無を確認したものである。
【図10】図１０は、αＰＤ－Ｌ１ ＨＣＤＲ３とαＴＩＧＩＴ ＨＣＤＲ３が融合した重鎖ＣＤＲ－フェリチン単量体（ｈｕＨＦ－αＰＤ－Ｌ１－αＴＩＧＩＴ）の製造のためのベクター模式図およびその単量体の製造並びに自己集合の有無を確認したものである。
【図12】図１２は、ＰＤ１（Tecentriq）ＨＣＤＲ３が融合した重鎖ＣＤＲ－フェリチン単量体（ｈｕＨＦ－ＰＤ１（Tecentriq）ＨＣＤＲ３）の製造のためのベクター模式図およびその単量体の製造並びに自己集合の有無を確認したものである。
【発明を実施するための形態】
【0051】
本発明の一実施形態は、抗体の相補性決定領域が融合したＣＤＲ－フェリチン単量体を少なくとも含む複数のフェリチン単量体の自己集合からなることにより、相補性決定領域がその表面または外部に高密度で存在し、ＨＣＤＲ３などの一部の相補性決定領域だけでも抗体と類似したレベルの結合力（affinity）で抗原に結合でき、複数の抗原と同時に結合するのに有利な構造的特性を有していることから、抗体に比べて結合活性（avidity）が顕著に改善された抗体様タンパク質を提供する。
【0052】
本発明の抗体様タンパク質は、フェリチン単量体が自己集合してなる。真核細胞フェリチンは、２４個の単量体が集まって球状の立体構造を形成する。
【0053】
本発明で使用できるフェリチン単量体は、由来および配列に制限がない。本発明のフェリチン単量体は、ヒトフェリチン単量体を含む。ヒトフェリチン単量体としては、ヒト重鎖フェリチン単量体またはヒト軽鎖フェリチン単量体を使用することができる。ヒト重鎖フェリチン単量体とヒト軽鎖フェリチン単量体を共に使用することもできる。
【0054】
ヒトフェリチンは、重鎖（heavy chain、21kDa）と軽鎖（light chain、19kDa）で構成され、２４個の単量体が自己集合体を形成する。
【0055】
ヒトフェリチンの場合は、外径が約１２ｎｍ、内径が約８ｎｍである。フェリチン単量体の構造は、５つのαヘリックス構造、すなわちＡヘリックス、Ｂヘリックス、Ｃヘリックス、ＤヘリックスおよびＥヘリックスが順次連結された形態であり、ループ（loop）と呼ばれる各々のαヘリックス構造のポリペプチドを連結する非定型のポリペプチド部分を含む。
【0056】
ループとは、フェリチン単量体に相補性決定領域が挿入されても構造的に壊れない領域（region）を意味する。本発明では、ＡヘリックスとＢヘリックスを連結するループをＡＢループ、ＢヘリックスとＣヘリックスを連結するループをＢＣループ、ＣヘリックスとＤヘリックスを連結するループをＣＤループ、ＤヘリックスとＥヘリックスを連結するループをＤＥループという。
【0057】
フェリチン単量体の情報はＮＣＢＩに公知されている（GenBank Accession No．NM_000146、NM_002032など）。
【0058】
フェリチン単量体はフェリチン重鎖単量体であってもよく、具体的には、ヒトフェリチン重鎖単量体であってもよい。前記ヒトフェリチン重鎖単量体（ｈｕＨＦ）は、ヒト由来の配列番号１のアミノ酸配列で表されるタンパク質であってもよい。
【0059】
フェリチン重鎖単量体は、トランスフェリン受容体への結合力が低下するように一部の配列が突然変異したものであってもよい。例えば、ヒトフェリチン重鎖単量体の場合、配列番号１の配列における１５番、１６番、２３番、８２番または８４番のアミノ酸がアラニン、グリシン、バリンまたはロイシンで置換されたものであってもよい。
【0060】
ＣＤＲ－フェリチン単量体は、相補性決定領域（Complementarity Determining Region）が融合したフェリチン単量体である。本発明の抗体様タンパク質は、複数のフェリチン単量体が自己集合してなるが、複数のフェリチン単量体の中には、少なくとも１つのＣＤＲ－フェリチン単量体が含まれる。ＣＤＲ－フェリチン単量体は２４個以下で含まれ得る。
【0061】
相補性決定領域は、抗体のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３からなる群より選択されるいずれか１つを指す。相補性決定領域はまた、それらの保存的配列変異体を含む。
【0062】
保存的配列変異体は、特定のアミノ酸配列を有する相補性決定領域の結合特性に深刻な影響を及ぼさないか、または変化させないか、または結合特性が改善されたアミノ酸配列の変異体を意味する。この保存的配列変異体には、アミノ酸の置換、付加および欠失が含まれる。保存的アミノ酸置換には、アミノ酸残基を、類似した側鎖を有するアミノ酸残基で置換することが含まれる。類似した側鎖を有するアミノ酸残基の群が当業界で定義されている。この群には、塩基性側鎖（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、帯電していない極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、β－分岐型側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸が含まれる。
【0063】
相補性決定領域は、抗原との結合のために、抗体様タンパク質の表面または外部に露出している。
【0064】
相補性決定領域は、フェリチン単量体に融合できる長さを有する。例えば、その長さは２５ａａ以下であってもよい。長さが２５ａａ以下であると、フェリチン単量体の自己集合に支障がなく、自己集合によって抗体様タンパク質が形成された後、相補性決定領域が表面または外部に露出するのに適している。
【0065】
相補性決定領域の長さは、例えば、２５ａａ以下、２０ａａ以下、１９ａａ以下、１８ａａ以下、１７ａａ以下、１６ａａ以下、１５ａａ以下、１４ａａ以下、１３ａａ以下、１２ａａ以下、１１ａａ以下、１０ａａ以下、９ａａ以下などであってもよい。また、例えば、３ａａ以上、４ａａ以上、５ａａ以上、６ａａ以上であってもよい。
【0066】
相補性決定領域は、フェリチン単量体のαヘリックスの内部、隣接するαヘリックスの間、Ｎ末端、Ｃ末端、ＡＢループ、ＢＣループ、ＣＤループ、ＤＥループ、Ｎ末端とＡヘリックスの間、およびＥヘリックスとＣ末端の間からなる群より選択されるいずれか１つに融合する。抗体中の相補性決定領域の３次元配置、相互間の距離、抗原との特異的結合に及ぼす影響の程度などを考慮して、フェリチン単量体の前述した部位の中で相補性決定領域が融合する位置を決定することができる。
【0067】
ＣＤＲ－フェリチン単量体は、１つまたは複数の相補性決定領域が融合したものである。ＣＤＲ－フェリチン単量体は、抗体のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３およびそれらの保存的配列変異体からなる群より選択される少なくとも１つの重鎖相補性決定領域が融合したものであってもよい。ＣＤＲ－フェリチン単量体は、抗体のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３およびそれらの保存的配列変異体からなる群より選択される少なくとも１つの軽鎖相補性決定領域が融合したものであってもよい。
【0068】
１つの抗体に対する相補性決定領域は、１つのＣＤＲ－フェリチン単量体に融合してもよく、複数のＣＤＲ－フェリチン単量体に融合してもよい。
【0069】
１つのＣＤＲ－フェリチン単量体には、１つの抗体に対する相補性決定領域が融合してもよく、複数の抗体に対する相補性決定領域が融合してもよい。
【0070】
ＣＤＲ－フェリチン単量体は、１個～２４個が自己集合に関与することができる。相補性決定領域が融合していないフェリチン単量体の場合は、０個～２３個が自己集合に関与することができる。
【0071】
例えば、ＣＤＲ－フェリチン単量体の２４個が自己集合して抗体様タンパク質を形成することができる。例えば、ＣＤＲ－フェリチン単量体の１２個と、相補性決定領域が融合していないフェリチン単量体の１２個とが自己集合し、抗体様タンパク質を形成することができる。例えば、第１の抗体に対する第１のＣＤＲ－フェリチン単量体の１２個と、第２の抗体に対する第２のＣＤＲ－フェリチン単量体の１２個とが自己集合して、抗体様タンパク質を形成することができる。例えば、ある抗体に対する重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３またはその保存的配列変異体）が融合した重鎖ＣＤＲ－フェリチン単量体の１２個と、同一抗体に対する軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３またはその保存的配列変異体）が融合した軽鎖ＣＤＲ－フェリチン単量体の１２個とが自己集合し、抗体様タンパク質を形成することができる。また、例えば、複数の異なる抗体を含む第１の抗体群の複数の相補性決定領域が融合した第１のＣＤＲ－フェリチン単量体の１２個と、複数の異なる抗体を含む第２の抗体群の複数の相補性決定領域が融合した第２のＣＤＲ－フェリチン単量体の１２個とが自己集合し、抗体様タンパク質を形成することができる。
【0072】
相補性決定領域の全部または一部をフェリチン単量体のどの位置に融合させるかは、抗体の相補性決定領域の距離、必要とされる結合力および結合活性、各相補性決定領域の結合に対する寄与度などを考慮して決定することができる。
【0073】
自己集合するＣＤＲ－フェリチン単量体の数、その単量体に含まれる相補性決定領域の数、相補性決定領域の融合位置、自己集合後の相補性決定領域の密度などによって、抗体様タンパク質の結合力および結合活性を調節することができる。
【0074】
抗体の相補性決定領域のうち、抗原との結合に主要な影響を及ぼす一部のみを選択してフェリチン単量体に融合させることもできる。抗体の種類によって、６つの相補性決定領域の中で１個、２個、３個、４個または５個が抗原との結合に主要な影響を及ぼす場合には、その主要な影響を有する一部の相補性決定領域のみをフェリチン単量体に融合させ、ＣＤＲ－フェリチン単量体を製造することができる。例えば、抗体のＨＣＤＲ３のみをフェリチン単量体に融合させ、ＣＤＲ－フェリチン単量体を製造することができる。例えば、抗体のＨＣＤＲ３およびＬＣＤＲ３のみを選択してフェリチン単量体に融合させ、ＣＤＲ－フェリチン単量体を製造することができる。
【0075】
相補性決定領域がＣＤＲ－フェリチン単量体のＤＥループまたはＣ末端に融合する場合には、４重対称構造（four fold symmetry）を形成することができる。この４重対称構造を利用して、抗体様タンパク質の表面の相補性決定領域間の配置および距離を、抗体の相補性決定領域間の配置および距離と類似するようにすることができる。例えば、フェリチン単量体のＣ末端に重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３およびそれらの保存的配列変異体の少なくとも１つ）を融合させた重鎖ＣＤＲ－フェリチン単量体の１２個と、フェリチン単量体のＣ末端に軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３およびそれらの保存的配列変異体の少なくとも１つ）が融合した軽鎖ＣＤＲ－フェリチン単量体を同じ比率で自己集合させる場合、抗体様タンパク質の表面に重鎖相補性決定領域と軽鎖相補性決定領域が抗体と類似した距離だけ離隔した状態でディスプレイされ得る。
【0076】
相補性決定領域がＣＤＲ－フェリチン単量体のＮ末端、ＡＢループまたはＢＣループに融合する場合には、２重対称構造（two fold symmetry）を形成することができる。この４重対称構造を利用して、抗体様タンパク質の表面の相補性決定領域間の配置および距離を、抗体の相補性決定領域間の配置および距離と類似にすることができる。特に、ＢＣループは相対的に長さが長いことから、相補性決定領域間の配置および距離を考慮して適切な位置に相補性決定領域を融合するのに適している。例えば、フェリチン単量体のＢＣループに重鎖相補性決定領域に相当するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３（または、それらの保存的配列変異体）を抗体と類似した間隔だけ離隔して融合させた重鎖ＣＤＲ－フェリチン単量体の１２個と、他のフェリチン単量体のＢＣループに軽鎖相補性決定領域に相当するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３（または、それらの保存的配列変異体）を抗体と類似した間隔だけ離隔して融合させた軽鎖ＣＤＲ－フェリチン単量体を同じ比率で自己集合させる場合、抗体様タンパク質の表面に重鎖相補性決定領域と軽鎖相補性決定領域が抗体と類似した距離だけ離隔している状態でディスプレイされ得る。
【0077】
相補性決定領域がＣＤＲ－フェリチン単量体のＣＤループに融合する場合には、３重対称構造（three fold symmetry）を形成することができる。例えば、ＣＤＲ－フェリチン単量体のＣＤループに抗原との結合に重要な役割を果たすことが知られている一部の相補性決定領域（例えば、ＨＣＤＲ３）を融合させる場合には、ＨＣＤＲ３の密度が抗体に比べて３倍高い抗体様タンパク質を製造することができる。
【0078】
相補性決定領域は、フェリチン単量体のどのループ、末端またはヘリックスに融合するか、また、そのループ、末端またはヘリックスの中で特にどの位置に融合するかによって、ＣＤＲ－フェリチン単量体が融合して抗体様タンパク質を形成したとき、隣接する相補性決定領域との距離が異なり得る。
【0079】
例えば、相補性決定領域の距離は、０．７ｎｍ、０．７５ｎｍ、０．８ｎｍ、０．８５ｎｍ、０．９ｎｍ、０．９５ｎｍ、１．０ｎｍ、１．０５ｎｍ、１．１ｎｍ、１．１５ｎｍ、１．２ｎｍ、１．２５ｎｍ、１．３ｎｍ、１．３５ｎｍ、１．４ｎｍ、１．４５ｎｍ、１．５ｎｍ、１．５５ｎｍ、１．６ｎｍ、１．６５ｎｍ、１．７ｎｍ、１．７５ｎｍ、１．８ｎｍ、１．８５ｎｍ、１．９ｎｍ、１．９５ｎｍ、２．０ｎｍ、２．０５ｎｍ、２．１ｎｍ、２．１５ｎｍ、２．２ｎｍ、２．２５ｎｍ、２．３ｎｍ、２．３５ｎｍ、２．４ｎｍ、２．４５ｎｍ、２．５ｎｍ、２．５５ｎｍ、２．６ｎｍ、２．６５ｎｍ、２．７ｎｍ、２．７５ｎｍ、２．８ｎｍ、２．８５ｎｍ、２．９ｎｍ、２．９５ｎｍ、３．０ｎｍ、３．０５ｎｍ、３．１ｎｍ、３．１５ｎｍ、３．２ｎｍ、３．２５ｎｍ、３．３ｎｍ、３．３５ｎｍ、３．４ｎｍ、３．４５ｎｍ、３．５ｎｍ、３．５５ｎｍ、３．６ｎｍ、３．６５ｎｍ、３．７ｎｍ、３．７５ｎｍ、３．８ｎｍ、３．８５ｎｍ、３．９ｎｍ、３．９５ｎｍ、４．０ｎｍ、４．０５ｎｍ、４．１ｎｍ、４．１５ｎｍ、４．２ｎｍ、４．２５ｎｍ、４．３ｎｍ、４．３５ｎｍ、４．４ｎｍ、４．４５ｎｍ、４．５ｎｍ、４．５５ｎｍ、４．６ｎｍ、４．６５ｎｍ、４．７ｎｍ、４．７５ｎｍ、４．８ｎｍ、４．８５ｎｍ、４．９ｎｍ、４．９５ｎｍ、５．０ｎｍ、５．０５ｎｍ、５．１ｎｍ、５．１５ｎｍ、５．２ｎｍ、５．２５ｎｍ、５．３ｎｍ、５．３５ｎｍ、５．４ｎｍ、５．４５ｎｍ、５．５ｎｍ、５．５５ｎｍ、５．６ｎｍ、５．６５ｎｍ、５．７ｎｍ、５．７５ｎｍ、５．８ｎｍ、５．８５ｎｍ、５．９ｎｍ、５．９５ｎｍ、６．０ｎｍ、６．０５ｎｍ、６．１ｎｍ、６．１５ｎｍ、６．２ｎｍ、６．２５ｎｍ、６．３ｎｍ、６．３５ｎｍ、６．４ｎｍ、６．４５ｎｍ、６．５ｎｍ、６．５５ｎｍ、６．６ｎｍ、６．６５ｎｍ、６．７ｎｍ、６．７５ｎｍ、６．８ｎｍ、６．８５ｎｍ、６．９ｎｍ、６．９５ｎｍ、７．０ｎｍであってもよい。
【0080】
抗体は相補性決定領域を有するタンパク質である。例えば、ＩｇＡ、ＩＧＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＹ、ＩｇＷクラス等に属する抗体、その抗原結合断片などを含む。
【0081】
また、抗体は、疾患抗原の抗体、免疫チェックポイント分子に対する抗体、診断、予測、評価などの目的で検出しようとする抗原に対する抗体、疾患の治療ターゲットとなる抗原の抗体などであってもよい。
【0082】
疾患抗原は、疾患を引き起こす抗原、疾患細胞の表面または内部抗原などであってもよい。疾患細胞は、病原体細胞、病原体に感染した細胞などであってもよい。
【0083】
疾患とは、抗体によって治療され得る全ての疾患を意味する。例えば、感染性疾患、癌、炎症性疾患などである。
【0084】
感染性疾患は、例えば、ウイルス、細菌、真菌、寄生虫またはプリオンによる疾患であってもよい。
【0085】
炎症性疾患は、例えば、アテローム性動脈硬化症、動脈硬化症、自己免疫疾患、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、リウマチ性多発筋痛症、痛風性関節炎、変形性関節症、腱炎、滑液包炎、乾癬、嚢胞性線維症、骨関節炎、関節リウマチ、炎症性関節炎、シェーグレン症候群、巨細胞性動脈炎、進行性全身性強皮症（皮膚硬化症）、強直性脊椎炎、多発性筋炎、皮膚筋炎、類天疱瘡、糖尿病（例えば、１型）、重症筋無力症、橋本甲状腺炎、グレーブス病、グッドパスチャー病、混合性結合組織病、硬化性胆管炎、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、悪性貧血、炎症性皮膚疾患、通常型間質性肺炎、石綿肺症、珪肺症、気管支拡張症、ベリリウム肺症、滑石症、塵肺症、サルコイドーシス、剥離性間質性肺炎、リンパ球性間質性肺炎、巨細胞性間質性肺炎、細胞性間質性肺炎、外因性アレルギー性肺胞炎、ウェゲナー肉芽腫症および関連形態の血管炎（側頭動脈炎および結節性多発動脈炎）、炎症性皮膚病、肝炎、遅延型過敏反応（例えば、ツタウルシ過敏症）、肺炎、気道の炎症、成人呼吸窮迫症候群、脳炎、即時型過敏反応、喘息、花粉症、アレルギー、急性アナフィラキシー、リウマチ熱、糸球体腎炎、腎盂腎炎、蜂巣炎、膀胱炎、慢性胆嚢炎、虚血（虚血性傷害）、再灌流障害、同種移植片拒絶、宿主対移植片拒絶、虫垂炎、動脈炎、眼瞼炎、細気管支炎、気管支炎、子宮頸管炎、胆管炎、絨毛羊膜炎、結膜炎、涙腺炎、皮膚筋炎、心内膜炎、子宮内膜炎、腸炎、全腸炎、上顆炎、精巣上体炎、筋膜炎、結合組織炎、胃炎、胃腸炎、歯肉炎、回腸炎、虹彩炎、喉頭炎、脊髄炎、心筋炎、腎炎、臍炎、卵巣炎、精巣炎、骨炎、中耳炎、膵炎、耳下腺炎、心膜炎、咽頭炎、胸膜炎、静脈炎、肺炎、直腸炎、前立腺炎、鼻炎、卵管炎、副鼻腔炎、口内炎、滑膜炎、睾丸炎、扁桃炎、尿道炎、膀胱炎、ブドウ膜炎、膣炎、血管炎、外陰炎、外陰膣炎、血管炎、慢性気管支炎、骨髄炎、視神経炎、側頭動脈炎、横断性脊髄炎、壊死性筋膜炎、および壊死性腸炎を含む。
【0086】
癌は、例えば、脳癌、頭頸部癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌、食道癌、白血病、肺癌、肝癌、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、直腸癌、腎臓癌、胃癌、精巣癌、子宮癌、血管腫瘍、扁平細胞癌種、腺癌種、小細胞癌種、黒色腫、神経膠腫、神経芽細胞腫、肉腫、喉頭癌、耳下腺癌、胆道癌、甲状腺癌、日光角化症、急性リンパ球性白血病、急性骨髄性白血病、腺様嚢胞癌、腺腫、腺扁平上皮癌腫、肛門管癌、肛門癌、肛門直腸癌、星細胞腫、バルトリン腺癌、基底細胞癌腫、胆汁癌、骨癌、骨髄癌、気管支癌、気管支腺癌腫、カルチノイド、胆管癌腫、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、淡明細胞癌腫、結合組織癌、嚢腺腫、消化器系癌、十二指腸癌、内分泌系癌、内胚葉洞腫瘍、子宮内膜増殖症、子宮内膜様腺癌、内皮細胞癌、上衣腫、上皮細胞癌、眼窩癌、局所性結節性過形成、胆嚢癌、幽門洞癌、胃基底部癌、ガストリノーマ、膠芽腫、グルカゴノーマ、心臓癌、血管芽細胞腫、血管内皮腫、血管腫、肝腺腫、肝腺腫症、肝胆道癌、肝細胞癌腫、ホジキン病、回腸癌、インスリノーマ、上皮内新生物、上皮内扁平細胞新生物、肝内胆道癌、浸潤性扁平細胞癌腫、空腸癌、関節癌、骨盤癌、巨細胞癌腫、大腸癌、リンパ腫、悪性中皮腫、髄芽腫、髄質上皮腫、脳膜癌、中皮癌、転移性癌腫、口腔癌、粘表皮癌、多発性骨髄腫、筋肉癌、鼻腔癌、神経系癌、非上皮皮膚癌、非ホジキンリンパ腫、燕麦細胞癌、乏突起膠腫、口腔癌、骨肉腫、漿液性乳頭状腺癌、陰茎癌、咽頭癌、下垂体腫瘍、形質細胞性腫瘍、偽肉腫、肺芽腫、直腸癌、腎細胞癌腫、呼吸器系癌、網膜芽細胞腫、漿液性癌、副鼻腔癌、皮膚癌、小細胞癌、小腸癌、平滑筋肉腫、軟部組織癌、ソマトスタチノーマ、脊椎癌、扁平細胞癌、線条筋肉癌、中皮細胞下層癌、Ｔ細胞白血病、舌癌、尿管癌、尿道癌、子宮頸癌、子宮体癌、膣癌、ＶＩＰｏｍａ、外陰部癌、高分化癌、およびウィルムス腫瘍からなる群より選択される癌であってもよい。
【0087】
炎症性疾患抗原は、例えば、炎症性サイトカインであってもよい。例えば、ヒト成長ホルモン（human growth hormone）、Ｎ－メチオニルヒト成長ホルモン（N-methionyl human growth hormone）およびウシ成長ホルモン（bovine growth hormone）などの成長ホルモン；副甲状腺ホルモン（parathyroid hormone）；チロキシン（thyroxine）；インシュリン（insulin）；プロインシュリン（proinsulin）；リラキシン（relaxin）；プロリラキシン（prorelaxin）；卵胞刺激ホルモン（follicle stimulating hormone、FSH）、甲状腺刺激ホルモン（thyroid stimulating hormone、TSH）および黄体形成ホルモン（luteinizing hormone、LH）などの糖タンパク質ホルモン；肝臓増殖因子（hepatic growth factor）；線維芽細胞増殖因子（fibroblast growth factor）；プロラクチン（prolactin）；胎盤性ラクトゲン（placental lactogen）；腫瘍壊死因子－α（tumor necrosis factor such as tumor necrosis factor-alpha、TNF-α）および腫瘍壊死因子－β（tumor necrosis factor-beta、TNF-β）などの腫瘍壊死因子；ミュラー管（mullerian）抑制因子；マウスゴナドトロピン関連ペプチド（mouse gonadotropin-associated peptide）；インヒビン（inhibin）；アクチビン（activin）；血管内皮増殖因子（vascular endothelial growth factor）；インテグリン（integrin）；トロンボポエチン（thrombopoietin、TPO）；ＮＧＦ－α（NGF-α）などの神経成長因子（nerve growth factors）；血小板成長因子（platelet-growth factor）；胎盤増殖因子（placental growth factor）；ＴＧＦ－αおよびＴＧＦ－βなどのトランスフォーミング増殖因子（transforming growth factors、TGF）；インスリン様増殖因子－１および－１１（insulin-like growth factor-1 and -11）；エリスロポエチン（erythropoietin、EPO）；骨誘導因子（osteoinductive factors）；インターフェロン－α (IFN-α)、インターフェロン－β（IFN－β）およびインターフェロン－γ（IFN－γ）などのインターフェロン；マクロファージ－ＣＳＦ（macrophage-CSF、M-CSF）などのコロニー刺激因子（colony stimulating factors、CSF）；顆粒球マクロファージ－ＣＳＦ（granulocyte macrophage-CSF、GM-CSF）；顆粒球－ＣＳＦ（granulocyte-CSF、G-CSF）；ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１１、ＩＬ－１２、ＩＬ－１３、ＩＬ－１５、ＩＬ－１７、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、ＩＬ－２２、ＩＬ－２３、ＩＬ－３３などのインターロイキン；並びにＬＩＦおよびキットリガンド（kit ligand、KL）を含むその他のポリペプチド因子を含む。
【0088】
癌抗原は、例えば、ｇｐ１００、ＭＡＲＴ－１、Ｍｅｌｎａ－Ａ、ＭＡＧＥ－Ａ３、ＭＡＧＥ－Ｃ２、マンマグロビンＡ（Mammaglobin－A）、プロテイナーゼ３（proteinsase－3）、ムチン１（mucin－1）、ＨＰＶ Ｅ６、ＬＭＰ２、ＰＳＭＡ、ＧＤ２、ｈＴＥＲＴ、ＰＡＰ、ＥＲＧ、ＮＡ１７、ＡＬＫ、ＧＭ３、ＥＰｈＡ２、ＮＡ１７－Ａ、ＴＲＰ－１、ＴＲＰ－２、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＣＥＡ、ＣＡ １２５、ＡＦＰ、サバイビン (Survivin)、ＡＨ１、ｒａｓ、Ｇ１７ＤＴ、ＭＵＣ１、Ｈｅｒ－２／ｎｅｕ、Ｅ７５、ｐ５３、ＰＳＡ、ＨＣＧ、ＰＲＡＭＥ、ＷＴ１、ＵＲＬＣ１０、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、Ｅ７、チロシナーゼ（Tyrosinase）ペプチド、Ｂ１６Ｆ１０、ＥＬ４およびネオアンチゲン（neoantigen）であってもよい。前記ネオアンチゲンとは、腫瘍細胞内の体性突然変異によって誘導されて形成される免疫原性ペプチドを意味する。前記ネオアンチゲンは、ＭＨＣ Ｉと複合体を形成し、腫瘍細胞の表面に移動して抗原エピトープとして表示され得るが、Ｔ細胞の受容体（T－cell receptor、TCR）がこのネオアンチゲン－ＭＨＣ Ｉ複合体を認識することによって免疫応答を誘導することができる。
【0089】
免疫チェックポイント分子は、例えば、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ１、ＣＴＬＡ４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３またはＴＩＧＩＴであってもよい。
【0090】
抗体は、例えば、癌細胞またはＴ細胞の表面の免疫チェックポイント分子に対する抗体であってもよい。例えば、ＰＤ－１、Ｈｅｒ－２／ｎｅｕ、ＶＩＳＴＡ、４－１ＢＢＬ、ＣＤ４８、ガレクチン９（Galectin－9）、アデノシンＡ２ａ受容体（Adenosine A2a receptor）、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＩＣＯＳ、ＩＣＯＳＬ、ＢＴＬＡ、ＯＸ－４０Ｌ、ＣＤ１５５、ＢＣＬ２、ＭＹＣ、ＰＰ２Ａ、ＢＲＤ１、ＢＲＤ２、ＢＲＤ３、ＢＲＤ４、ＢＲＤＴ、ＣＢＰ、Ｅ２Ｆ１、ＭＤＭ２、ＭＤＭＸ、ＰＰＰ２ＣＡ、ＰＰＭ１Ｄ、ＳＴＡＴ３、ＩＤＨ１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＣＤ４０Ｌ、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＴＩＧＩＴ、ＢＴＬＡ、ＣＤ５２、ＳＬＡＭＦ７、４－１ＢＢ、ＯＸ－４０、ＩＣＯＳ、ＧＩＴＲ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１６、ＣＤ３、ＣＤ２０、ＥＧＦＲファミリー、ＡＸＬ、ＣＳＦ１Ｒ、ＤＤＲ１、ＤＤＲ２、ＥＰＨ受容体ファミリー、ＦＧＦＲファミリー、ＶＥＧＦＲファミリー、ＩＧＦ１Ｒ、ＬＴＫ、ＰＤＧＦＲファミリー、ＲＥＴ、ＫＩＴ、ＫＲＡＳ、ＮＴＲＫ１またはＮＴＲＫ２であってもよい。
【0091】
検出しようとする抗原は、例えばバイオマーカーであってもよく、例えば、疾患診断用バイオマーカー、発症リスク予測用バイオマーカー、特定の医薬の予後診断用バイオマーカーなどであってもよいが、これらに限定されるものではない。
【0092】
以下、図１に基づいて本発明の抗体様タンパク質を説明する。
【0093】
図１は、２４個のフェリチン単量体の自己集合からなるタンパク質の構造を例示したものであり、フェリチンは、４重、３重、２重の対称構造（4－fold、3－fold、2－fold symetry）を有する複数の対称構造となっており、Ｎ末端、ＡＢループ、ＢＣループは２重対称構造、ＣＤループは３重対称構造、ＤＥループおよびＣ末端は４重対称構造を形成することができる。前記対称構造は、その柔軟な末端が集まる個数を意味するものであり、当該部位に相補性決定領域が融合する場合、自己集合体において相補性決定領域が２個、３個、４個ずつ集まり得る。図１における各色で表示される部分は、各部位に相補性決定領域を融合させる際のその融合部位を示したものであり、各部位に融合されるタンパク質の配置、密度等が異なることを確認できる。
【0094】
例えば、図１に示す部位に相補性決定領域が融合したＣＤＲ－フェリチン単量体の２４個を自己集合し、相補性決定領域が４個ずつ６個の部位に集まった抗体様タンパク質を得るか、またはＣＤＲ－フェリチン単量体の数を減らすことにより、前記６個の部位に集まった相補性決定領域の数を調節することもできる。また、長さの長いループ（例えば、ＢＣループ）における相補性決定領域の融合位置を調節することにより、複数ずつ集まった相補性決定領域間の距離を多様に調節することができる。これは、ＣＤＲ－フェリチン単量体に複数の相補性決定領域が融合した場合にも同様に適用されるものであり、１つの抗体に対して複数の同種の相補性決定領域が融合した場合にそれらを特定の位置に融合させてさらに密集させるか、または異種の相補性決定領域が融合した場合に、実際の抗体における相補性決定領域構造を模倣するように、３重対称構造を有する部位に相補性決定領域を融合させて、３つの異種のＣＤＲ（例えば、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、またはＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３）が近距離に集まるように（例えば、ＣＤループに融合）するなどにより調節することができる。
【0095】
前記調節は、複数の抗体に対して複数の相補性決定領域が融合した場合にも同様に適用することができる。例えば、互いに異なる抗体の相補性決定領域が密集している場合には、立体障害によって抗原の結合が阻害される可能性があるため、互いに異なる抗体の相補性決定領域が密集することがないように調節できる。これは、例えば、互いに異なる抗体の相補性決定領域がそれぞれ融合した第１のＣＤＲ－フェリチン単量体と第２のＣＤＲ－フェリチン単量体において、各ＣＤＲ－フェリチン単量体の互いに異なる部位に相補性決定領域を融合させて調節することができる。
【0096】
また、例えば、同一抗体の相補性決定領域が融合した第１のＣＤＲ－フェリチン単量体と第２のＣＤＲ－フェリチン単量体における抗体の構造を模擬するように、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３が密集するか、またはＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３が集まるか、またはこれらのすべてが集まるように調節できる。これは、例えば、第１及び第２のＣＤＲ－フェリチン単量体における同一部位に相補性決定領域を融合させて調節することができ、例えば、３重対称構造が形成される部位にＣＤＲを融合させて調節することができる。これは、例えばＣＤループであってもよい。例えば、第１のＣＤＲ－フェリチン単量体のＣＤループに特定抗体のＨＣＤＲ１を融合させ、第２のＣＤＲ－フェリチン単量体のＣＤループにそれと同じ抗体のＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３を融合させて、それらが自己集合すると、３重対称性構造にＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３が密集している抗体様タンパク質が得られる。
【0097】
図２は、市販の抗体のテセントリク（Tecentriq、アテゾリズマブ）のＣＤＲ間の距離（上）、およびヒトフェリチン重鎖単量体の２４個が自己集合したタンパク質における各部位間の距離（下）を示す。これは、蛋白質構造データバンク（www.rcsb.org）の３Ｄビュー上で各アミノ酸の位置を指定してそれらの間の距離を測定したものである。図２の下は配列番号１の配列を基準としてＮ末端、ＡＢループ；４６Ｄ／４７Ｖの間、ＢＣループ；８１Ｆ／８２Ｌの間、８７Ｋ／８８Ｋの間、９３Ｄ／９４Ｗ、ＣＤループ；１２７Ｄ／１２８Ｐの間、ＤＥループ；１６２Ｅ／１６３Ｓの間、Ｃ末端に相補性決定領域が融合した場合、そのＣＤＲ－フェリチン単量体が自己集合したときの各相補性決定領域間の距離を示す。それを参照して、公知の抗体における相補性決定領域間の距離を測定し、その相補性決定領域間の距離、密集度などを模倣するように、ＣＤＲ－フェリチン単量体の前記抗体に対するＣＤＲを、各抗体における距離を満足できる位置に融合することにより、前記抗体を模倣することができる。
【0098】
本発明の抗体様タンパク質は、抗原に対する優れた結合力を示すことができる。その結合力は、先に例示したような相補性決定領域の融合位置、複数の相補性決定領域の適用程度等によって多様に調節できるが、例えば、ＣＤＲ－フェリチン単量体のその相補性決定領域に対応する抗原に対する結合力（affinity、Kd）は１，０００ｎＭ以下であってもよい。前記範囲内では、１，０００ｎＭ以下、９００ｎＭ以下、８００ｎＭ以下、７００ｎＭ以下、６００ｎＭ以下、５００ｎＭ以下、４００ｎＭ以下、３００ｎＭ以下、２００ｎＭ以下、１５０ｎＭ以下、１００ｎＭ以下などであってもよい。その下限は限定されず、例えば、１ｎＭ、５ｎＭ、１０ｎＭ、２０ｎＭ、３０ｎＭ、４０ｎＭ、５０ｎＭなどであってもよい。前記結合力は、例えばＥＬＩＳＡ法によって測定したものであってもよい。
【0099】
本発明の抗体様タンパク質が粒子をなす場合、その粒径は例えば８～５０ｎｍであってもよい。具体的には、８ｎｍ～５０ｎｍ、８ｎｍ～４５ｎｍ、８ｎｍ～４０ｎｍ、８ｎｍ～３５ｎｍ、８ｎｍ～３０ｎｍ、８ｎｍ～２５ｎｍ、８ｎｍ～２０ｎｍ、８ｎｍ～１５ｎｍなどであってもよいが、これらに制限されるものではない。
【0100】
本発明の抗体様タンパク質は、前記のように抗体構成の中でＣＤＲのみを使用するので、抗体全配列の使用による不要な免疫応答を誘発しない。
【0101】
また、フェリチンタンパク質は常温保存が可能であるので、本発明の抗体様タンパク質は冷蔵保存が不要である。
【0102】
また、本発明は、前記抗体様タンパク質を含む、疾患の治療または予防用薬学組成物に関するものである。
【0103】
その対象疾患に合った抗体のＣＤＲを使用すればよいので、本発明の疾患治療用薬学組成物は特定疾患の治療用途のみに使用可能なものではなく、抗体の使用によって緩和、治療、改善できる全ての疾患に適用可能である。治療対象となる疾患には、抗体の適用によって治療できることが知られている全ての疾患を制限なく適用することができ、例えば、感染性疾患、炎症性疾患、癌などであってもよい。その具体例は前述の通りである。
【0104】
本発明の抗体様タンパク質に融合したＣＤＲは、疾患抗原に対する抗体、または疾患における治療標的物質に対する抗体のＣＤＲであってもよい。
【0105】
本発明の薬学組成物は、標的疾患に対して当該分野で公知の有効物質、治療剤などをさらに含むことができる。
【0106】
さらに含むことができる有効物質、治療剤などは、自己集合された構造の内部に含まれてもよいが、これに限定されるものではない。
【0107】
本発明の薬学組成物は、薬学的に許容可能な担体を含むことができる。本発明で用語「薬学的に許容可能な担体」とは、生物体を非常に刺激せず、投与成分の生物学的活性および特性を阻害しない担体または希釈剤を指す。本発明における「薬学的に許容可能な担体」としては、生理食塩水、滅菌水、リンガー液、緩衝生理食塩水、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エタノール及びこれらの成分のうちの１成分又は１成分以上を混合して使用することができる。必要に応じて、抗酸化剤、緩衝液および静菌剤などの他の通常の添加剤を添加して、組織または臓器に注入するのに適した注射剤の形で製剤化することができる。また、等張性滅菌溶液、または場合によって滅菌水や生理食塩水を添加して注射可能な溶液となり得る乾燥剤（特に、凍結乾燥剤）に製剤化することもできる。さらに、標的器官に特異的に作用できるように、標的器官特異的な抗体または他のリガンドを前記担体と結合して使用することができる。
【0108】
また、本発明の組成物は、充填剤、賦形剤、崩壊剤、結合剤または滑沢剤をさらに含むことができる。さらに、本発明の組成物は、哺乳動物に投与された後に活性成分の迅速、持続または遅延放出を提供できるように、当業界で公知の方法を使用して製剤化することができる。
【0109】
一実施形態では、前記薬学組成物は注射製剤であってもよく、静脈内投与されるものであってもよいが、これに限定されるものではない。
【0110】
本発明の用語「有効量」は、目的とする治療すべき特定の疾患の発症または進行を遅らせるか、または完全に増進するのに必要な量を意味する。
【0111】
本発明において、組成物は薬学的有効量で投与することができる。前記薬学組成物の適切な１日の総使用量を、適切な医学的判断の範囲内で治療医によって決定され得ることは当業者にとって自明なことである。
【0112】
本発明の目的のために、特定の患者に対する具体的な薬学的有効量は、達成しようとする反応の種類および程度、場合によっては他の製剤が使用されるかどうかを含む具体的な組成物、患者の年齢、体重、一般的な健康状態、性別、食物、投与時間、投与経路、組成物の分泌率、治療期間、具体的な組成物と併用または同時使用される薬物を含む様々な因子および医薬分野でよく知られている類似因子によって異なるように適用することが好ましい。
【0113】
本発明において、前記薬学組成物は、必要に応じて薬物の製造、使用および販売を管轄する行政機関によって指定された方式での、容器に付帯する注意書きを添付してもよい。前記注意書きは、組成物の形またはヒトもしくは獣医的な投与に関する私益機関による認可を示し、例えば処方薬に関する米国食品医薬品局により認可された表示でもよい。
【0114】
また、本発明は、前記抗体様タンパク質を含む標的物質検出用組成物に関するものである。
【0115】
本発明の組成物は、前記タンパク質を含み、その標的物質との結合の有無で標的物質の存否を確認・検出することができる。
【0116】
標的物質は、例えばバイオマーカーであってもよく、例えば、疾患診断用バイオマーカー、発症リスク予測用バイオマーカー、特定の医薬の敏感度予測用バイオマーカーなどであってもよいが、これらに限定されるものではない。
【0117】
標的物質が疾患診断用バイオマーカーである場合、本発明の組成物は疾患の診断用組成物として使用することができる。
【0118】
抗体ＣＤＲは、標的物質に対する抗体のＣＤＲであってもよい。
【0119】
標的物質の容易な検出・確認のために、抗体ＣＤＲ、フェリチン単量体またはタンパク質は、蛍光染料、放射性同位元素などで標識されたものであってもよいが、これらに限定されるものではない。
【0120】
本発明の組成物は、標的物質の存否を確認しようとするサンプルに処理するか、または動物に処理することができる。
【0121】
動物は、例えばヒトを含む哺乳類であってもよく、具体的にはヒトであってもよい。
【0122】
本発明の組成物は、公知の様々な方法で製剤化することができ、例えば、前述の薬学組成物について例示した製剤に製剤化することができるが、これに限定されるものではない。
【0123】
また、本発明は、個体に前記抗体様タンパク質を投与するステップを含む、疾患の治療方法に関するものである。
【0124】
個体は疾患に罹患した個体であり、これはヒトを含む哺乳類であってもよく、具体的にはヒトであってもよい。
【0125】
疾患は、抗体の使用によって処理できる疾患であり、先に例示した疾患であってもよいが、これらに限定されるものではない。
【0126】
本発明のタンパク質に融合した抗体ＣＤＲは、疾患抗原に対する抗体、または疾患における治療標的物質に対する抗体のＣＤＲであってもよい。
【0127】
タンパク質は治療上有効量で投与することができる。
【0128】
本発明で用語「投与」とは、いかなる適切な方法で患者に本発明の組成物を導入することを意味する。本発明の組成物の投与経路は、目的の組織に到達できる限り、経口または非経口の様々な経路であってもよい。腹腔内投与、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与、経口投与、局所投与、鼻腔内投与、肺内投与、または直腸内投与することができるが、これらに限定されるものではない。
【0129】
また、本発明は、前記抗体様タンパク質を処理するステップを含む抗原の検出方法に関するものである。
【0130】
抗体ＣＤＲは、標的抗原に対する抗体のＣＤＲであってもよい。
【0131】
標的抗原の容易な検出・確認のために、抗体ＣＤＲ、フェリチン単量体またはタンパク質は、蛍光染料、放射性同位元素などで標識されたものであってもよいが、これらに限定されるものではない。
【0132】
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明することとする。
【0133】
実施例
１．タンパク質製造用発現ベクターの構成
（１）ｈｕＨＦは２４個の単量体から構成された球状タンパク質ナノ粒子（１２ｎｍ）であり、各単量体は合計５個のα－ヘリックス（helix）から構成されている。本発明の発明者らは、ｈｕＨＦ単量体の各α－ヘリックスの間のループ（ＰＤＢ ３ＡＪＯ ｓｅｑｕｅｎｃｅ基準にｈｕＨＦ ５Ｔ～１７６Ｇ中のＡＢループ；４６Ｄ／４７Ｖの間、ＢＣループ；９３Ｄ／９４Ｗ、ＣＤループ；１２７Ｄ／１２８Ｐの間、ＤＥループ；１６３Ｅ／１６４Ｓの間）とＮ末端およびＣ末端中の選択される位置に、抗体ＣＤＲ３ペプチドを遺伝子クローニングにより挿入することにより、ｈｕＨＦの様々な位置に抗体ＣＤＲ３ペプチドが挿入された送達体を確保した。
１．タンパク質製造用発現ベクターの構成
（１）ｈｕＨＦは２４個の単量体から構成された球状タンパク質ナノ粒子（１２ｎｍ）であり、各単量体は合計５個のα－ヘリックス（helix）から構成されている。本発明の発明者らは、ｈｕＨＦ単量体の各α－ヘリックスの間のループ（ＰＤＢ ３ＡＪＯ ｓｅｑｕｅｎｃｅ基準にｈｕＨＦ ５Ｔ～１７６Ｇ中のＡＢループ；４６Ｄ／４７Ｖの間、ＢＣループ；９３Ｄ／９４Ｗ、ＣＤループ；１２７Ｄ／１２８Ｐの間、ＤＥループ；１６３Ｅ／１６４Ｓの間）とＮ末端およびＣ末端中の選択される位置に、抗体ＣＤＲ３ペプチドを遺伝子クローニングにより挿入することにより、ｈｕＨＦの様々な位置に抗体ＣＤＲ３ペプチドが挿入された送達体を確保した。
【0134】
下記表１の配列を使用し、図４～１０、表２の製造のためのベクター模式図に従ってＰＣＲを行い、ｈｕＨＦ－αＰＤ－Ｌ１ ＨＣＤＲ３（ＣＤループ、Ｃ末端）、ｈｕＨＦ－αＰＤ１ ＨＣＤＲ３（Ｃ末端）、ｈｕＨＦ－αＣＴＬＡ４ ＨＣＤＲ３（Ｃ末端）、ｈｕＨＦ αＴＩＧＩＴ ＨＣＤＲ３（Ｃ末端）、ｈｕＨＦ－αＬＡＧ３ ＨＣＤＲ３（Ｃ末端）、ｈｕＨＦ－αＴＩＭ３ ＨＣＤＲ３（Ｃ末端）、ｈｕＨＦ－αＰＤ－Ｌ１ ＨＣＤＲ３（ＡＢループ）－αＴＩＧＩＴ ＨＣＤＲ３（Ｃ末端）（デュアルブロッカー（dual blocker））を製造した。製造した全てのプラスミド発現ベクターをアガロースゲルで精製し、完全なＤＮＡシーケンシングによって配列を確認した。
【0135】
具体的には、表３のプライマーセットを用いて、各々の発現ベクターの製造に必要なＰＣＲ産物を順次にプラスミドｐＴ７－７ベクターに挿入し、各々のタンパク質ナノ粒子を発現できる発現ベクターを構成した。このとき、さらに下記表３のリンカー（ｌｉｎｋｅｒ）ペプチドを含むことができる。
【0136】
【表1】
【0137】
【表2】
【0138】
【表3】
【0139】
【表4】
【0140】
（２）ｈｕＨＦ単量体の各α－ヘリックスの間のループ（ＰＤＢ ３ＡＪＯ ｓｅｑｕｅｎｃｅ基準にｈｕＨＦ ５Ｔ～１７６Ｇ中のＡＢループ；４６Ｄ／４７Ｖの間、ＢＣループ；８１Ｆ／８２Ｌの間、８７Ｋ／８８Ｋの間、９３Ｄ／９４Ｗ、ＣＤループ；１２７Ｄ／１２８Ｐの間、ＤＥループ；１６２Ｅ／１６３Ｓの間）とＮ末端およびＣ末端中の選択される位置に、抗体ＣＤＲ３ペプチドを遺伝子クローニングにより挿入することにより、ｈｕＨＦの様々な位置に抗体ＣＤＲ３ペプチドが挿入された送達体を確保した。
【0141】
ｈｕＨＦとしては、配列番号２５のミュータント（ｍｕｔａｎｔ） ｈｕＨＦを用いた。
【0142】
ＣＤＲとしては、下記表５の配列を用い、図３の製造のためのベクター模式図に従い、ｈｕＨＦ－Ｈｅｒ２／ｎｅｕ（ハーセプチン（herceptin））ＨＣＤＲ３（Ｃ末端）、ｈｕＨＦ－ＰＤ１（キイトルーダ（keytruda））ＨＣＤＲ３（Ｃ末端）、ｈｕＨＦ－ＰＤ－Ｌ１（テセントリク（tecentriq））ＨＣＤＲ３（Ｃ末端）、ｈｕＨＦ－ＰＤ－Ｌ１ ＨＣＤＲ３（Ｎ末端、ＡＢループ、ＢＣループ（８１／８２）、ＢＣループ（８７／８８）、ＢＣループ（９３／９４）、ＤＥループまたはＣ末端）、ｈｕＨＦ－ＴＩＭ３ ＨＣＤＲ３（Ｃ末端）、ｈｕＨＦ－ＬＡＧ３ ＨＣＤＲ３（Ｃ末端）、ｈｕＨＦ－ＴＩＧＩＴ ＨＣＤＲ３（Ｃ末端）、ｈｕＨＦ－ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ ＨＣＤＲ３（Ｃ末端）、ｈｕＨＦ－ＰＤ－Ｌ１ ＨＣＤＲ３（ＡＢループ）－αＴＩＧＩＴ ＨＣＤＲ３（Ｃ末端）を製造した。
【0143】
製造したすべてのプラスミド発現ベクターをアガロースゲルで精製し、完全なＤＮＡシークエンシングによって配列を確認した。プラスミドベクターとしては、ｐＴ７－７ベクターを用いた。
【0144】
【表5】
【0145】
（３）図１１の製造のためのベクター模式図に従い、ｈｕＨＦ－Ｈｅｒ２／ｎｅｕ（herceptin）ＨＣＤＲ３（Ｃ末端）、ｈｕＨＦ－ＰＤ１（keytruda）ＨＣＤＲ３（Ｃ末端）、ｈｕＨＦ－ＣＴＬＡ４（ヤーボイ（yervoy））ＨＣＤＲ３（Ｃ末端）、ｈｕＨＦ－ＰＤ－Ｌ１（tecentriq）ＨＣＤＲ３（Ｃ末端）、ｈｕＨＦ－ＰＤ－Ｌ１ ＨＣＤＲ３（Ｃ末端）、ｈｕＨＦ－ＬＡＧ３ ＨＣＤＲ３（Ｃ末端）、ｈｕＨＦ－ＴＩＭ３ ＨＣＤＲ３（Ｃ末端）、ｈｕＨＦ－ＴＩＧＩＴ ＨＣＤＲ３を製造した。
【0146】
製造したすべてのプラスミド発現ベクターをアガロースゲルで精製し、完全なＤＮＡシークエンシングによって配列を確認した。プラスミドベクターとしては、ｐＴ７－７ベクターを用いた。
【0147】
２．タンパク質の生合成
大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）［Ｆ－ｏｍｐＴｈｓｄＳＢ（ｒＢ－ｍＢ－）］を前記で製造した発現ベクターでそれぞれ形質転換し、アンピシリン－抵抗性形質転換体を選択した。形質転換された大腸菌は、５０ｍＬのＬＢ（Luria－Bertani）培地（１００ｍｇのＬ－１アンピシリンを含有）を含有するフラスコ（２５０ｍＬ三角フラスコ、３７℃、１５０ｒｐｍ）で培養した。培地の濁度（Ｏ．Ｄ６００）が約０．５～０．７に達したとき、ＩＰＴＧ（イソプロピル‐β－Ｄチオガラクトピラノシド（Isopropyl－β－Dthiogalactopyranosid））（１．０ｍＭ）を注入して組換え遺伝子の発現を誘導した。
大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）［Ｆ－ｏｍｐＴｈｓｄＳＢ（ｒＢ－ｍＢ－）］を前記で製造した発現ベクターでそれぞれ形質転換し、アンピシリン－抵抗性形質転換体を選択した。形質転換された大腸菌は、５０ｍＬのＬＢ（Luria－Bertani）培地（１００ｍｇのＬ－１アンピシリンを含有）を含有するフラスコ（２５０ｍＬ三角フラスコ、３７℃、１５０ｒｐｍ）で培養した。培地の濁度（Ｏ．Ｄ６００）が約０．５～０．７に達したとき、ＩＰＴＧ（イソプロピル‐β－Ｄチオガラクトピラノシド（Isopropyl－β－Dthiogalactopyranosid））（１．０ｍＭ）を注入して組換え遺伝子の発現を誘導した。
【0148】
ｈｕＨＦ－（９３－ＡｂＰＤ－Ｌ１＋Ｃ－ＡｂＴＩＧＩＴ）を除いて、個々の発現ベクターを用いて１つのベクターに形質転換した。ｈｕＨＦ－（９３－ＡｂＰＤ－Ｌ１＋Ｃ－ＡｂＴＩＧＩＴ）の場合は、ｈｕＨＦ－ＰＤ－Ｌ１ ＨＣＤＲ３（ＢＣループ（９２／９３））およびｈｕＨＦ－ＴＩＧＩＴ ＨＣＤＲ３を製造するための２つのベクターに形質転換したものである。
【0149】
２０℃で１６～１８時間培養した後、培養した大腸菌を４，５００ｒｐｍで１０分間遠心分離して菌体沈殿物を回収し、５ｍｌの破砕溶液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７．５、１０ｍＭ ＥＤＴＡ）に懸濁し、超音波破砕機（Branson Ultrasonics Corp.、Danbury、CT、USA）を用いて破砕した。破砕後、１３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上澄み液と不溶性凝集体を分離した。分離した上澄み液は、その後の実験に使用した。
【0150】
３．タンパク質の精製および蛍光物質の付着
前記実施例２で得られた上澄み液を３段階の過程を経て精製した。まず、１）組換えタンパク質に融合したヒスチジンとニッケルの結合を用いたＮｉ２＋－ＮＴＡアフィニティークロマトグラフィーを行った後、２）組換えタンパク質を濃縮し、バッファー交換によって蛍光物質を付着し、３）最後に、蛍光物質が付着した自己集合したタンパク質ナノ粒子のみを分離するために、スクロース勾配超遠心分離（ultracentifugation）を行った。各段階の詳細は以下の通りである。
前記実施例２で得られた上澄み液を３段階の過程を経て精製した。まず、１）組換えタンパク質に融合したヒスチジンとニッケルの結合を用いたＮｉ２＋－ＮＴＡアフィニティークロマトグラフィーを行った後、２）組換えタンパク質を濃縮し、バッファー交換によって蛍光物質を付着し、３）最後に、蛍光物質が付着した自己集合したタンパク質ナノ粒子のみを分離するために、スクロース勾配超遠心分離（ultracentifugation）を行った。各段階の詳細は以下の通りである。
【0151】
１）Ｎｉ２＋－ＮＴＡアフィニティークロマトグラフィー
組換えタンパク質を精製するために、前記と同様の方法で培養された大腸菌を回収し、その細胞ペレットを５ｍＬのライシスバッファー（ｐＨ８．０、５０ｍＭ リン酸ナトリウム、３００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ イミダゾール）に再浮遊し、超音波破砕機を用いて細胞を破砕した。破砕した細胞液を１３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離してその上澄み液のみを分離した後、各組換えタンパク質をＮｉ２＋－ＮＴＡカラム（Qiagen, Hilden, Germany）を用いてそれぞれ分離した（洗浄バッファー：ｐＨ８．０、５０ｍＭ リン酸ナトリウム、３００ｍＭ ＮａＣｌ、８０ｍＭ イミダゾール／溶出バッファー：ｐＨ８．０、５０ｍＭ リン酸ナトリウム、３００ｍＭ ＮａＣｌ、２００ｍＭ イミダゾール）。
組換えタンパク質を精製するために、前記と同様の方法で培養された大腸菌を回収し、その細胞ペレットを５ｍＬのライシスバッファー（ｐＨ８．０、５０ｍＭ リン酸ナトリウム、３００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ イミダゾール）に再浮遊し、超音波破砕機を用いて細胞を破砕した。破砕した細胞液を１３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離してその上澄み液のみを分離した後、各組換えタンパク質をＮｉ２＋－ＮＴＡカラム（Qiagen, Hilden, Germany）を用いてそれぞれ分離した（洗浄バッファー：ｐＨ８．０、５０ｍＭ リン酸ナトリウム、３００ｍＭ ＮａＣｌ、８０ｍＭ イミダゾール／溶出バッファー：ｐＨ８．０、５０ｍＭ リン酸ナトリウム、３００ｍＭ ＮａＣｌ、２００ｍＭ イミダゾール）。
【0152】
２）濃縮とバッファー交換および蛍光物質の付着過程
イメージングのために、ｈｕＨＦ－ｇｐ１００粒子とｈｕＨＦ－ＰＤ１粒子は、Ｎｉ２＋－ＮＴＡアフィニティークロマトグラフィーを経て溶出された３ｍｌの組換えタンパク質を、超遠心ろ過器（Ultracentrifugal filter、Amicon Ultra 100K、Millipore、Billerica、MA）に入れて、カラムの上に１ｍｌの溶液が残るまで５，０００ｇで遠心分離を行った。その後、ＮＩＲ蛍光物質であるｃｙ５．５およびＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアン酸塩）を付着するために、タンパク質粒子を重炭酸ナトリウム（sodium bicarbonate）（０．１Ｍ、ｐＨ８．５）バッファーでバッファー交換を行い、常温で１２時間蛍光物質を付着した。
イメージングのために、ｈｕＨＦ－ｇｐ１００粒子とｈｕＨＦ－ＰＤ１粒子は、Ｎｉ２＋－ＮＴＡアフィニティークロマトグラフィーを経て溶出された３ｍｌの組換えタンパク質を、超遠心ろ過器（Ultracentrifugal filter、Amicon Ultra 100K、Millipore、Billerica、MA）に入れて、カラムの上に１ｍｌの溶液が残るまで５，０００ｇで遠心分離を行った。その後、ＮＩＲ蛍光物質であるｃｙ５．５およびＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアン酸塩）を付着するために、タンパク質粒子を重炭酸ナトリウム（sodium bicarbonate）（０．１Ｍ、ｐＨ８．５）バッファーでバッファー交換を行い、常温で１２時間蛍光物質を付着した。
【0153】
３）スクロース勾配超高速遠心分離
ＰＢＳ（２．７ｍＭ ＫＣｌ、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、１０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、ｐＨ７．４）バッファーにスクロースを濃度別にそれぞれ添加し、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％のスクロースを含む溶液をそれぞれ準備した。その後、超高速遠心分離用チューブ（ultraclear 13.2ml tube、Beckman）に各濃度別（４５～２０％）のスクロース溶液を濃度の高い溶液から２ｍｌずつ入れた後、準備した自己集合用バッファーに存在する組換えタンパク質溶液を１ｍｌ充填した後、３５，０００ｒｐｍにおいて４℃で１６時間超高速遠心分離を行った（Ultracentrifuge L－90k、Beckman）。遠心分離後、慎重にパイペットを用いて上層（２０－２５％スクロース溶液部分）を、前記２）に記載されているように超遠心ろ過器（Ultracentrifugal filter）とＰＢＳバッファーを用いて組換えタンパク質のバッファーを交換した。
ＰＢＳ（２．７ｍＭ ＫＣｌ、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、１０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、ｐＨ７．４）バッファーにスクロースを濃度別にそれぞれ添加し、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％のスクロースを含む溶液をそれぞれ準備した。その後、超高速遠心分離用チューブ（ultraclear 13.2ml tube、Beckman）に各濃度別（４５～２０％）のスクロース溶液を濃度の高い溶液から２ｍｌずつ入れた後、準備した自己集合用バッファーに存在する組換えタンパク質溶液を１ｍｌ充填した後、３５，０００ｒｐｍにおいて４℃で１６時間超高速遠心分離を行った（Ultracentrifuge L－90k、Beckman）。遠心分離後、慎重にパイペットを用いて上層（２０－２５％スクロース溶液部分）を、前記２）に記載されているように超遠心ろ過器（Ultracentrifugal filter）とＰＢＳバッファーを用いて組換えタンパク質のバッファーを交換した。
【0154】
４．タンパク質の水溶性画分の確認
ｐＴ７－７ベースの様々な発現ベクターでＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテントセル（competent cell）を形質転換（transformation）した。単一コロニーをアンピシリン１００ｍｇ／Ｌが添加されたＬＢ液体培地（５０ｍＬ）に接種し、振とう培養器（shaking incubator）で３７℃、１３０ｒｐｍの条件で培養した。濁度（turbidity／optical density at 600nm）が０．５に達すると、ＩＰＴＧの１ｍＭを投与して標的タンパク質の発現を誘導した。その後、２０℃で１２～１６時間培養した後、培養液中の細胞を遠心分離（１３，０００ｒｐｍ、１０分）によってスピンダウン（spun-down）し、細胞ペレットを回収して１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－Ｈｃｌ（ｐＨ７．４）バッファーに再浮遊させた。再浮遊された細胞は、ブランソンのソニファイアー（Branson Sonifier、Branson Ultrasonics Corp.、Danbury、CT）を用いて破裂した。音波処理後、溶解性タンパク質を含む上澄み液と不溶性タンパク質を含む凝集体は、遠心分離（１３，０００ｒｐｍ、１０分）で分離した。分離された溶解性、不溶性タンパク質画分をＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析によって確認した。
ｐＴ７－７ベースの様々な発現ベクターでＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテントセル（competent cell）を形質転換（transformation）した。単一コロニーをアンピシリン１００ｍｇ／Ｌが添加されたＬＢ液体培地（５０ｍＬ）に接種し、振とう培養器（shaking incubator）で３７℃、１３０ｒｐｍの条件で培養した。濁度（turbidity／optical density at 600nm）が０．５に達すると、ＩＰＴＧの１ｍＭを投与して標的タンパク質の発現を誘導した。その後、２０℃で１２～１６時間培養した後、培養液中の細胞を遠心分離（１３，０００ｒｐｍ、１０分）によってスピンダウン（spun-down）し、細胞ペレットを回収して１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－Ｈｃｌ（ｐＨ７．４）バッファーに再浮遊させた。再浮遊された細胞は、ブランソンのソニファイアー（Branson Sonifier、Branson Ultrasonics Corp.、Danbury、CT）を用いて破裂した。音波処理後、溶解性タンパク質を含む上澄み液と不溶性タンパク質を含む凝集体は、遠心分離（１３，０００ｒｐｍ、１０分）で分離した。分離された溶解性、不溶性タンパク質画分をＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析によって確認した。
【0155】
【0156】
５．タンパク質の集合の検証
実施例３で製造した各タンパク質の精製組換えタンパク質ナノ粒子の構造を分析するために、透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）を用いて組換えタンパク質を撮影した。まず、染色していない精製タンパク質のサンプルを炭素コーティングされた銅電子顕微鏡グリッド（grids）に乗せた後、自然乾燥した。タンパク質の染色された画像を得るために、自然乾燥したサンプルを含む電子顕微鏡グリッドを２％（ｗ／ｖ）水性酢酸ウラニル溶液と共に１０分間室温でインキュベートし、蒸留水で３～４回洗浄した。タンパク質の画像をＰｈｉｌｉｐｓ Ｔｅｃｈｎａｉ １２０ｋＶ電子顕微鏡を用いて観察した結果、各粒子が球状のナノ粒子を形成することを確認した（図４～１０、１２及び１３）。
実施例３で製造した各タンパク質の精製組換えタンパク質ナノ粒子の構造を分析するために、透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）を用いて組換えタンパク質を撮影した。まず、染色していない精製タンパク質のサンプルを炭素コーティングされた銅電子顕微鏡グリッド（grids）に乗せた後、自然乾燥した。タンパク質の染色された画像を得るために、自然乾燥したサンプルを含む電子顕微鏡グリッドを２％（ｗ／ｖ）水性酢酸ウラニル溶液と共に１０分間室温でインキュベートし、蒸留水で３～４回洗浄した。タンパク質の画像をＰｈｉｌｉｐｓ Ｔｅｃｈｎａｉ １２０ｋＶ電子顕微鏡を用いて観察した結果、各粒子が球状のナノ粒子を形成することを確認した（図４～１０、１２及び１３）。
【0157】
６．タンパク質の抗原への結合力の測定
前記実施例で製造したタンパク質の抗原への結合力を、抗体の抗原への結合力と比較した。製造したタンパク質の抗原への結合力Ａを以下の方法によって測定した。
前記実施例で製造したタンパク質の抗原への結合力を、抗体の抗原への結合力と比較した。製造したタンパク質の抗原への結合力Ａを以下の方法によって測定した。
【0158】
Ｎｕｎｃ ＭａｘｉＳｏｒｐＴＭフラットボトム（cat．44－2404－21）９６ウェルを使用した。
【0159】
各ウェルに２μｇ／ｍｌ濃度のタンパク質を１００μｌずつ分注し、４℃、オーバーナイト（over-night）でプレート（plate）をシェーキング（shaking）してタンパク質を付着した。
【0160】
その後、プレートウェル（plate well）の溶液を除去した後、ＰＢＳＴ（Tween20、0.05％）を２００μｌずつ分注した後、それを除去した（washing）。
【0161】
ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋＴＭ（PBS）ブロッキングバッファー（cat．37515）を２００μｌずつ分注してマスキング（masking）し、プレートウェルの溶液を除去した後、ＰＢＳＴ（Tween20、0.05％）を２００μｌずつ分注した後、それを除去した（washing）。
【0162】
その後、Ｋｄを確認しようとするサンプルを、濃度によって１００μｌずつ各ウェルに分注し、プレートウェルの溶液を除去した後、ＰＢＳＴ（Tween20、0.05％）を２００μｌずつ分注した後、それを除去した（washing）。
【0163】
二次抗体（2nd antibody）－ＨＲＰを１／１００でＰＢＳに希釈した後、それを１００μｌずつ各ウェルに分注した。その後、プレートウェルの溶液を除去した後、ＰＢＳＴ（Tween20、0.05％）で２００μｌずつ分注した後、それを除去した（washing）。
【0164】
その後、ＴＭＢ溶液を１００μｌずつ各ウェルに分注し、停止液（１Ｍ Ｈ２ＳＯ４）を１００μｌずつ各ウェルに分注した後、波長４５０ｎｍにおける吸光度（absorbance）を測定した。
【0165】
各濃度による吸光度（ａｂｓ）のグラフを作成して飽和（saturation）点の蛍光値（ａｂｓ（ｓａｔ））を求め、ｘ軸が濃度／ａｂｓ、ｙ軸が濃度／ａｂｓ（ｓａｔ）であるグラフを作成して、それを線形フィット（linear fitting）して式を求めた。
【0166】
式のｙ切片にａｂｓ（ｓａｔ）を掛けると、Ｋｄが得られる。
【0167】
各結合力は、対象抗体の対象抗原への結合力を示す。図中、ｍＰＤ－Ｌ１のような「ｍ」はマウス抗原への結合力を示し、ｈＰＤ－Ｌ１のような「ｈ」はヒト抗原への結合力を示す。
【0168】
実施例の全ての抗体様タンパク質は、ＣＤＲ－フェリチン単量体の２４個が自己集合して形成されたものである。ｈｕＨＦ－ｄｕａｌはＰＤ－Ｌ１ ＨＣＤＲ３とＴＩＧＩＴ ＨＣＤＲ３が融合した重鎖ＣＤＲ－フェリチン単量体の２４個の自己集合体であり、ｈｕＨＦ－（９３－ＡｂＰＤ－Ｌ１＋Ｃ－ＡｂＴＩＧＩＴ）は９３番の位置（ＢＣループ）にＰＤ－Ｌ１ ＨＣＤＲ３が融合した第１の重鎖ＣＤＲ－フェリチン単量体と、Ｃ末端にＴＩＧＩＴ ＨＣＤＲ３が融合した第２の重鎖ＣＤＲ－フェリチン単量体との自己集合体であり、第１及び第２の重鎖ＣＤＲ－フェリチン単量体の数の合計は２４個である。
【0169】
測定の結果を下記表６～９および図１４～３５に示す。
【0170】
表６は、各抗体ＨＣＤＲ３がＣ末端に融合した重鎖ＣＤＲ－フェリチン単量体の２４個の自己集合体の抗原への結合力を測定した結果である。表７は、ＰＤ－Ｌ１ ＨＣＤＲ３が様々な位置にそれぞれ融合した重鎖ＣＤＲ－フェリチン単量体の２４個の自己集合体の抗原への結合力を測定した結果である。
【0171】
表８は、ｈｕＨＦ－ｄｕａｌ、ＰＤ－Ｌ１ ＨＣＤＲ３がＢＣループに融合した重鎖ＣＤＲ－フェリチン単量体の自己集合体、ＴＩＧＩＴ ＨＣＤＲ３がＣ末端に融合した重鎖ＣＤＲ－フェリチン単量体の自己集合体、およびｈｕＨＦ－（９３－ＡｂＰＤ－Ｌ１＋Ｃ－ＡｂＴＩＧＩＴ）の各抗原への結合力を測定した結果である。
【0172】
表９は、ｈｕＨＦ－ｄｕａｌのマウス抗原への結合力を測定した結果である。
【0173】
【表6】
【0174】
【表7】
【0175】
【表8】
【0176】
【表9】
【0177】
７．免疫チェックポイント分子に結合する分子が融合したタンパク質の使用
（１）腫瘍抑制能の評価
タンパク質の腫瘍抑制能は、大腸癌細胞株（ＣＴ２６）をＢＡＬＢ／ｃマウスに皮下接種し、図３６のスケジュールに従ってタンパク質を注射して評価した（図３７）。
（１）腫瘍抑制能の評価
タンパク質の腫瘍抑制能は、大腸癌細胞株（ＣＴ２６）をＢＡＬＢ／ｃマウスに皮下接種し、図３６のスケジュールに従ってタンパク質を注射して評価した（図３７）。
【0178】
具体的には、一定のサイズの大腸癌腫瘍（ＣＴ２６）が形成されたマウスＢａｌｂ／ｃに対して、３日間隔でＰＢＳ、ＰＤ－Ｌ１抗体とＴＩＧＩＴ抗体、ｈｕＨＦ－ＰＤ－Ｌ１－ＴＩＧＩＴデュアルブロッカー（dual blocker）タンパク質を静脈注射で注入した。観察の結果、ｈｕＨＦ－ＰＤ－Ｌ１－ＴＩＧＩＴデュアルブロッカータンパク質が抗体治療剤と類似した腫瘍治療効果を示すことを確認した。実験では実験群当たり４匹を使用し、癌細胞のサイズは下記式で計算した。
【0179】
［数学式１］
【0180】
ここで、実験群としては１）ＰＢＳ群、２）抗体治療剤併用処理群（α－ＰＤ－Ｌ１、α－ＴＩＧＩＴ）、３）タンパク質処理群（ｈｕＨＦ－ＰＤ－Ｌ１－ＴＩＧＩＴデュアルブロッカー）を使用した。
【0181】
また、各処理群ごとに腫瘍組織を摘出して重量を測定し、その結果を図３８に示す。その結果から、ＰＤ－Ｌ１とＴＩＧＩＴに結合する分子が融合したタンパク質の優れた抗癌効果を確認することができる。
【0182】
（２）フェリチン単量体への融合位置による効率の分析
α－ＰＤ－Ｌ１ ＨＣＤＲ３がフェリチン単量体の互いに異なる位置に融合したタンパク質を製造し、腫瘍抑制能を確認した。
α－ＰＤ－Ｌ１ ＨＣＤＲ３がフェリチン単量体の互いに異なる位置に融合したタンパク質を製造し、腫瘍抑制能を確認した。
【0183】
具体的には、ＦＩＴＣ蛍光物質が付着したｈｕＨＦ－αＰＤ－Ｌ１ ＨＣＤＲ３（ＡＢ、ＢＣ、ＣＤ、ＤＥループ、Ｃ末端）タンパク質のＣＴ２６大腸癌に対するターゲティング効率を比較するために、ＣＴ２６大腸癌細胞に３００ｎＭの濃度でタンパク質ナノ粒子を反応させた後、蛍光シグナルを比較して細胞取込（cell uptake）効率を確認した。対照群であるｈｕＨＦタンパク質よりも、ｈｕＨＦ－αＰＤ－Ｌ１ ＨＣＤＲ３（ＡＢ、ＢＣ、ＣＤ、ＤＥループ、Ｃ末端）タンパク質の方が、癌細胞と結合して蛍光シグナルを示すことを確認した。
【0184】
【0185】
確認の結果、融合部位に関係なく、抗体様タンパク質に比べて強いターゲティング能を示すことを確認した。
【0186】
８．抗体様タンパク質の細胞内での結合力の確認
ターゲットセル（Target cell）（immune cell、cancer cell）を培養して分注した（１×１０５個／１０ｕｌ、１ ＦＡＣＳ ｃｏｌｕｍｎ（5ml polystyrene round－bottom tube、Falcon（352052）））。
ターゲットセル（Target cell）（immune cell、cancer cell）を培養して分注した（１×１０５個／１０ｕｌ、１ ＦＡＣＳ ｃｏｌｕｍｎ（5ml polystyrene round－bottom tube、Falcon（352052）））。
【0187】
その後、サンプル（drug、antibody（anti－mouse PD－L1 antibody（BE0101）、anti－mouse TIGIT antibody（BE0274）、anti－human PD－L1（BE0285）））を１００μｌ／ＦＡＣＳカラム処理し、対照群ではＦＡＣＳバッファー（0.1％BSA＋0.01％ sodium azide in PBS）の１００μｌを処理した（３時間、室温）。
【0188】
ＦＡＣＳバッファーを各１ｍｌずつ前記ＦＡＣＳカラムに入れた後、１，７００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上澄み液を除去する工程を３回繰り返した。
【0189】
その後、蛍光抗体（Fluorescence antibody）（anti his tag antibody－PE（SC－8036 PE）、anti－IgG antibody－PE（PE goat F（ab’）2 anti－rat（IgG）secondary antibody（ab7010）， PE F（ab’）2－goat anti-mouse IgG（H＋L）secondary antibody（12－4010－82）））を処理した（２時間、室温）。
【0190】
ＦＡＣＳバッファーを各１ｍｌずつ前記ＦＡＣＳカラムに入れた後、１，７００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上澄み液を除去する工程を３回繰り返した。
【0191】
その後、各サンプルＦＡＣＳカラムにＦＡＣＳバッファーの１００ｕｌを入れた後、７－ＡＡＤ（BD Pharmigen（559925））の２μｌを５分間処理した。
【0192】
ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＦＡＣＳ装置を各ＦＡＣＳカラムにおけるライブセル（live cell）中のＰＥ蛍光を示すターゲットセルの割合を用いて分析した。
【0193】
測定の結果を図４１及び４２に示す。
【0194】
それを参照すると、本発明の抗体様タンパク質は、モノクローナル抗体に比べてＫｄの値が顕著に低いことから、非常に高い結合活性を示すことを確認することができる。これは、本発明の抗体様タンパク質が複数のＣＤＲを有し、多数の抗原に結合できることによる。
【図1】
【図2A】
【図2B】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
【図28】
【図29】
【図30】
【図31】
【図32】
【図33】
【図34】
【図35】
【図36】
【図37】
【図38】
【図39】
【図40】
【図41】
【図42】
【配列表】
【国際調査報告】