特表 2023-550969 イソプレノイド側鎖を有するサイトカイニンを産生することが可能な遺伝子組換え細菌

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-12-06

(54)【発明の名称】イソプレノイド側鎖を有するサイトカイニンを産生することが可能な遺伝子組換え細菌

(51)【国際特許分類】

   C12N 1/21 20060101AFI20231129BHJP

   C12P 1/04 20060101ALI20231129BHJP

   C12N 15/54 20060101ALN20231129BHJP

   C12N 9/10 20060101ALN20231129BHJP

   C12N 9/00 20060101ALN20231129BHJP

   C12N 15/52 20060101ALN20231129BHJP

【ＦＩ】

C12N1/21 ZNA

C12P1/04 Z

C12N15/54

C12N9/10

C12N9/00

C12N15/52 Z

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023532104

(86)(22)【出願日】2021-11-26

(85)【翻訳文提出日】2023-07-24

(86)【国際出願番号】 EP2021083188

(87)【国際公開番号】W WO2022112509

(87)【国際公開日】2022-06-02

(31)【優先権主張番号】20075015.6

(32)【優先日】2020-11-26

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】516334905

【氏名又は名称】アツィエス・ビオ・デ・オ・オ

【氏名又は名称原語表記】ＡＣＩＥＳ ＢＩＯ ｄ．ｏ．ｏ．

【住所又は居所原語表記】Ｔｅｈｎｏｌｏｓｋｉ ｐａｒｋ ２１， １０００ Ｌｊｕｂｌｊａｎａ， Ｓｌｏｖｅｎｉａ

(74)【代理人】

【識別番号】100114890

【弁理士】

【氏名又は名称】アインゼル・フェリックス＝ラインハルト

(74)【代理人】

【識別番号】100098501

【弁理士】

【氏名又は名称】森田 拓

(74)【代理人】

【識別番号】100116403

【弁理士】

【氏名又は名称】前川 純一

(74)【代理人】

【識別番号】100134315

【弁理士】

【氏名又は名称】永島 秀郎

(74)【代理人】

【識別番号】100162880

【弁理士】

【氏名又は名称】上島 類

(72)【発明者】

【氏名】ティナ コゲイ

(72)【発明者】

【氏名】グレゴール コセチ

(72)【発明者】

【氏名】シュテファン フイス

(72)【発明者】

【氏名】マルコ ブラジッチ

(72)【発明者】

【氏名】ヤカ ホルバット

【テーマコード（参考）】

4B064

4B065

【Ｆターム（参考）】

4B064AE43

4B064CA02

4B064CA19

4B064CC24

4B064DA01

4B065AA15X

4B065AA24X

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA27

4B065CA44

(57)【要約】

本発明は、概して、バイオテクノロジー工学に関し、具体的には、イソプレノイド側鎖を有するサイトカイニン（イソプレノイドサイトカイニン）を産生することが可能な遺伝子組換え細菌、ならびにその作製および適用に関する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

アデニル酸イソペンテニルトランスフェラーゼ活性を有する異種ポリペプチドを発現するグラム陽性細菌。

【請求項2】

前記細菌が、バチルスおよびコリネバクテリウムからなる群から選択される科である、請求項１記載の細菌。

【請求項3】

前記細菌がバチルス科である、請求項１または２記載の細菌。

【請求項4】

前記細菌がコリネバクテリウム科である、請求項１または２記載の細菌。

【請求項5】

前記細菌がバチルスまたはコリネバクテリウム属である、請求項１または２記載の細菌。

【請求項6】

前記細菌がバチルス属である、請求項１または２記載の細菌。

【請求項7】

前記細菌がコリネバクテリウム属である、請求項１または２記載の細菌。

【請求項8】

前記細菌がバチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）である、請求項１または２記載の細菌。

【請求項9】

前記細菌がコリネバクテリウム・スタティオニス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｔａｔｉｏｎｉｓ）である、請求項１または２記載の細菌。

【請求項10】

前記アデニル酸イソペンテニルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドが、ｉ）配列番号１～３３のいずれか１つのアミノ酸配列を含むポリペプチド；およびｉｉ）配列番号１～３３のいずれか１つのアミノ酸配列に対して少なくとも約５０％、例えば少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９３％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドからなる群から選択される、請求項１から９までのいずれか１項記載の細菌。

【請求項11】

前記アデニル酸イソペンテニルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドが、ｉ）配列番号１～１０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むポリペプチド；およびｉｉ）配列番号１～１０のいずれか１つのアミノ酸配列に対して少なくとも約５０％、例えば少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９３％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドからなる群から選択される、請求項１から９までのいずれか１項記載の細菌。

【請求項12】

前記アデニル酸イソペンテニルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドが、ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含むポリペプチド；およびｉｉ）配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも約５０％、例えば少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９３％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドからなる群から選択される、請求項１から９までのいずれか１項記載の細菌。

【請求項13】

サイトカイニンリボシド５’－一リン酸ホスホリボヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドのタンパク質発現が、改変を有しないが、それ以外は同一の細菌と比較して増加するように改変されている、請求項１から１２までのいずれか１項記載の細菌。

【請求項14】

前記サイトカイニンリボシド５’－一リン酸ホスホリボヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドが、ｉ）配列番号３４～６２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むポリペプチド、およびｉｉ）配列番号３４～６２のいずれか１つのアミノ酸配列に対して少なくとも約７０％、例えば少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９３％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドからなる群から選択される、請求項１３記載の細菌。

【請求項15】

前記サイトカイニンリボシド５’－一リン酸ホスホリボヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドが、ｉ）配列番号３４～４４のいずれか１つのアミノ酸配列を含むポリペプチド；およびｉｉ）配列番号３４～４４のいずれか１つのアミノ酸配列に対して少なくとも約７０％、例えば少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９３％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドからなる群から選択される、請求項１３記載の細菌。

【請求項16】

前記サイトカイニンリボシド５’－一リン酸ホスホリボヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドが、ｉ）配列番号３４のアミノ酸配列を含むポリペプチド；およびｉｉ）配列番号３４のアミノ酸配列に対して少なくとも約７０％、例えば少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９３％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドからなる群から選択される、請求項１３記載の細菌。

【請求項17】

前記細菌が、１－デオキシ－Ｄ－キシルロース－５－リン酸シンターゼ活性を有するポリペプチドのタンパク質発現が、改変を有しないが、それ以外は同一の細菌と比較して増加するようにさらに改変されている、請求項１から１６までのいずれか１項記載の細菌。

【請求項18】

前記１－デオキシ－Ｄ－キシルロース－５－リン酸シンターゼ活性を有するポリペプチドが、ｉ）配列番号６３～７０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むポリペプチド；およびｉｉ）配列番号６３～７０のいずれか１つのアミノ酸配列に対して少なくとも約７０％、例えば少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９３％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドからなる群から選択される、請求項１７記載の細菌。

【請求項19】

前記１－デオキシ－Ｄ－キシルロース－５－リン酸シンターゼ活性を有するポリペプチドが、ｉ）配列番号６３～６５のいずれか１つのアミノ酸配列を含むポリペプチド；およびｉｉ）配列番号６３～６５のいずれか１つのアミノ酸配列に対して少なくとも約７０％、例えば少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９３％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドからなる群から選択される、請求項１７記載の細菌。

【請求項20】

前記１－デオキシ－Ｄ－キシルロース－５－リン酸シンターゼ活性を有するポリペプチドが、ｉ）配列番号６３のアミノ酸配列を含むポリペプチド；およびｉｉ）配列番号６３のアミノ酸配列に対して少なくとも約７０％、例えば少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９３％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドからなる群から選択される、請求項１７記載の細菌。

【請求項21】

前記１－デオキシ－Ｄ－キシルロース－５－リン酸シンターゼ活性を有するポリペプチドが、ｉ）配列番号６４のアミノ酸配列を含むポリペプチド；およびｉｉ）配列番号６４のアミノ酸配列に対して少なくとも約７０％、例えば少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９３％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドからなる群から選択される、請求項１７記載の細菌。

【請求項22】

プリンヌクレオチド生合成経路に関与する少なくとも１つの酵素（例えば、アデノシン一リン酸生合成経路に関与する少なくとも１つの酵素）の発現および／または活性が、改変を有しないが、それ以外は同一の細菌と比較して増加するようにさらに改変されている、請求項１から２１までのいずれか１項記載の細菌。

【請求項23】

前記プリンヌクレオチド生合成経路に関与する少なくとも１つの酵素が、リボース－リン酸ジホスホキナーゼ活性を有する酵素、アミドホスホリボシルトランスフェラーゼ活性を有する酵素、ホルミルテトラヒドロ葉酸デホルミラーゼ活性を有する酵素、アデニロコハク酸リアーゼ活性を有する酵素、ホスホリボシルアミノイミダゾール－カルボキサミドホルミルトランスフェラーゼ活性を有する酵素、アデニロコハク酸シンターゼ活性を有する酵素およびアデノシンキナーゼ活性を有する酵素からなる群から選択される、請求項２２記載の細菌。

【請求項24】

プリンヌクレオチド分解経路に関与する少なくとも１つの内因性酵素の発現および／または活性が、改変を有しないが、それ以外は同一の細菌と比較して減少するようにさらに改変されている、請求項１から２３までのいずれか１項記載の細菌。

【請求項25】

前記プリンヌクレオチド分解経路に関与する少なくとも１つの内因性酵素が、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ活性を有する酵素およびアデノシン－ホスホリボシルトランスフェラーゼ活性を有する酵素からなる群から選択される、請求項２４記載の細菌。

【請求項26】

グアノシン一リン酸生合成経路に関与する少なくとも１つの内因性酵素の発現および／または活性が、改変を有しないが、それ以外は同一の細菌と比較して減少するようにさらに改変されている、請求項１から２５までのいずれか１項記載の細菌。

【請求項27】

前記グアノシン一リン酸生合成経路に関与する少なくとも１つの内因性酵素が、ＩＭＰデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素およびＧＭＰシンテターゼ活性を有する酵素からなる群から選択される、請求項２６記載の細菌。

【請求項28】

シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ（ＣＹＰ４５０）活性を有するポリペプチドのタンパク質発現が、改変を有しないが、それ以外は同一の細菌と比較して増加するようにさらに改変されている、請求項１から２７までのいずれか１項記載の細菌。

【請求項29】

前記シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ（ＣＹＰ４５０）活性を有するポリペプチドが、ｉ）配列番号９３～９５のいずれか１つのアミノ酸配列を含むポリペプチド、およびｉｉ）配列番号９３～９５のいずれか１つのアミノ酸配列に対して少なくとも約７０％、例えば少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９３％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドからなる群から選択される、請求項２８記載の細菌。

【請求項30】

イソプレノイドサイトカイニンまたはそのリボシド誘導体を生成する方法であって、請求項１から２９までのいずれか１項記載の細菌を好適な培養条件下にて好適な培養培地中で培養することを含む、方法。

【請求項31】

前記イソプレノイドサイトカイニンまたはそのリボシド誘導体が、ｔｒａｎｓ－ゼアチン（ｔＺ）、ｔｒａｎｓ－ゼアチンリボシド（ｔＺＲ）、Ｎ^６－（Ｄ２－イソペンテニル）アデニン（ｉＰ）、Ｎ（６）－（ジメチルアリル）アデノシン（ｉＰＲ）、ジヒドロゼアチン（ＤＺ）、リボシルジヒドロゼアチン（ＤＺＲ）およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項３０記載の方法。

【請求項32】

前記イソプレノイドサイトカイニンまたはそのリボシド誘導体が、それぞれｔｒａｎｓ－ゼアチン（ｔＺ）およびｔｒａｎｓ－ゼアチンリボシド（ｔＺＲ）である、請求項３０または３１記載の方法。

【請求項33】

前記方法がｔｒａｎｓ－ゼアチン（ｔＺ）を生成するためのものである、請求項３０記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、概して、バイオテクノロジー工学に関し、具体的には、イソプレノイド側鎖を有するサイトカイニン（イソプレノイドサイトカイニン）を産生することが可能な遺伝子組換え細菌、ならびにその作製および適用に関する。

【0002】

発明の背景
サイトカイニンは、種子の発芽から植物および葉の老化に至るまで、多くの植物の成長および発生プロセスを制御する必須の植物ホルモンであり、細胞分裂を誘導する能力を特徴とする（Mok, Martin, and Mok 2000）。天然に存在するサイトカイニンは、芳香族側鎖（芳香族サイトカイニン）またはアデニンのＮ^６末端のイソプレン由来の側鎖（イソプレノイドサイトカイニン）のいずれかを有するアデニン誘導体である。Ｎ^６側鎖の構造および配置により、サイトカイニンの種類およびその活性の両方が決まる。イソプレノイドサイトカイニンは広範にわたり、植物および藻類、さらには多くの種の細菌、真菌、線虫および寄生昆虫において天然に産生される（Stirk and van Staden 2010）。天然イソプレノイドサイトカイニンは、Ｎ^６－（Ｄ２－イソペンテニル）アデニン（ｉＰ）、ｔｒａｎｓ－ゼアチン（ｔＺ）、ｃｉｓ－ゼアチン（ｃＺ）およびジヒドロゼアチン（ＤＺ）である（図１）。

【0003】

イソプレノイドサイトカイニンは、アデニンまたはアデノシンの誘導体であり、６位の環外アミノ基がジメチルアリル側鎖の付加によって修飾され、親化合物Ｎ^６－（Ｄ２－イソペンテニル）アデニン（ｉＰ）およびそのリボシドであるＮ^６－（Ｄ２－イソペンテニル）アデノシン（ｉＰＲ）を生じる。ジメチルアリル側鎖を９’位でヒドロキシル化して、ｔｒａｎｓ－ゼアチン（ｔＺ）またはそのリボシドであるｔｒａｎｓ－リボシルゼアチン（ｔＺＲ）を得ることができる。また、環外二重結合を還元して、ジヒドロゼアチン（ＤＺ）またはそのリボシドであるリボシルジヒドロゼアチン（ＤＺＲ）を得ることができる（図１）。ｉＰ、ｉＰＲ、ｔＺ、ｔＺＲ、ＤＺおよびＤＺＲの６つ全ての化合物が生物学的に活性であり、天然に存在する。

【0004】

天然に存在するサイトカイニンの大半が、特徴的な構造誘導体または形態、例えば遊離塩基、リボシドおよびヌクレオチド、またはグルコース、キシロースもしくはアミノ酸残基とのコンジュゲートで存在する。植物では、サイトカイニン遊離塩基が最も生物学的に活性な形態であると考えられ、グルコースコンジュゲートは、グリコシル化の位置に応じて、永続的に不活性または可逆的な貯蔵形態であると考えられる。

【0005】

ゼアチンは、植物におけるサイトカイニンの主要な形態である。ゼアチンは、アデニンのＮ^６位にヒドロキシル化されたイソプレン由来の側鎖を有するアデニン誘導体であり、シスまたはトランス配置で存在し得る（図１）。ｔｒａｎｓ－ゼアチンは、最も有効な天然に存在するサイトカイニンの１つである。多くの先行研究では、分析法によりｃｉｓ－およびｔｒａｎｓ－ゼアチンを区別することができず、観察された生理学的プロセスにおける両化合物の存在および役割の理解が曖昧であった。

【0006】

構造類似性にもかかわらず、ｃｉｓ－ゼアチンがｔＲＮＡ経路によって合成される一方で、ｔｒａｎｓ－ゼアチンならびに生合成的に関連する化合物であるｉＰおよびＤＺは、植物細胞においてｄｅ ｎｏｖｏ（またはＡＭＰ）生合成経路で合成される。

【0007】

ｔＲＮＡ経路では、ｃｉｓ－ゼアチンは、イソペンテニル化ｔＲＮＡの分解の再循環産物である。ｃｉｓ－ゼアチンは、古細菌を除くほぼ全ての生物において（Schaefer et al. 2015）、特定の（ＵＮＮ－）ｔＲＮＡ上のアデニン３７のプレニル化を触媒し、イソペンテニルアデニン（ＩＰ）含有ｔＲＮＡの形成をもたらすｔＲＮＡ－イソペンテニルトランスフェラーゼ（ｔＲＮＡ－ＩＰＴ）によって極めて低い割合で合成される。ｄｅ ｎｏｖｏサイトカイニン生合成経路では、イソペンテニルアデニンヌクレオチド（ｉＰ）を生成するアデニル酸イソペンテニルトランスフェラーゼ（ＩＰＴ、ＥＣ ２．５．１．２７）によって触媒される、ジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）によるアデノシン５’－リン酸（ＡＭＰ、ＡＤＰまたはＡＴＰ）のＮ－プレニル化が第１段階である。植物においてＩＰＴにより生成するｉＰは、続いてプレニル側鎖でのヒドロキシル化を受け、ｔＺ－ヌクレオチドが生じる。シロイヌナズナでは、ＣＹＰ７３５Ａ１およびＣＹＰ７３５Ａ２の２つのシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼが、ヒドロキシル化反応を触媒する。ＣＹＰ７３５Ａは、ｉＰ－ヌクレオシドおよびｉＰよりもｉＰ－ヌクレオチドを選択的に利用する。この反応は立体特異的であるため、ＣＹＰ７３５ＡはｔＺ－ヌクレオチドを生成する（Takei, Yamaya, and Sakakibara 2004）。ｄｅ ｎｏｖｏおよびｔＲＮＡ経路の両方の経路の最終段階では、サイトカイニン活性化酵素であるサイトカイニンリボシド５’－一リン酸ホスホリボヒドロラーゼ「ロンリーガイ（Lonely guy）」（ＬＯＧ、ＥＣ ３．２．２．ｎ１）がリボシル部分を除去し、サイトカイニンヌクレオチドを活性核酸塩基に変換する（Kurakawa et al. 2007）。ｉＰＲＭＰ、ｔＺＲＭＰ、ＤＺＲＭＰおよびｃＺＲＭＰの４つ全てのサイトカイニンヌクレオシド一リン酸がＬＯＧによって利用される。

【0008】

アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）等の植物病原性細菌による植物感染の場合、ｔＺの生合成が開始して感染が促進される。感染プロセス中に、ｔＺまたはｉＰの生合成が細菌細胞内で起こるか、または細菌ＩＰＴ遺伝子ホモログが宿主の核ゲノムに組み込まれ、感染植物細胞で発現されることがある。

【0009】

重要なことには、細菌のＩＰＴと高等植物のＩＰＴとで基質特異性が異なる（Kakimoto 2001；Sakakibara 2005）。第１の側面では、Ａ．ツメファシエンス（Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）に由来するＴｍｒおよびＴｚｓ等の細菌ＩＰＴは、ＡＭＰのみをアクセプタとして用い（一方、植物のＩＰＴ酵素は、ＡＤＰおよびＡＴＰを選択的に用いる）、ｔｒａｎｓ－ゼアチンリボシド５’－一リン酸（ｔＺＲＭＰ）を形成する（Sakakibara 2006；Kamada-Nobusada and Sakakibara 2009）。さらに、アグロバクテリウムＩＰＴであるＴｚｓおよびＴｍｒは、ＤＭＡＰＰまたはメチルエリスリトールリン酸（ＭＥＰ）経路におけるＤＭＡＰＰのヒドロキシル化前駆体である１－ヒドロキシ－２－メチル－２－ブテニル４－二リン酸（ＨＭＢＤＰ）のいずれかを側鎖ドナーとして使用することが可能である。ＤＭＡＰＰが基質として使用される場合、主要産物はｉＰＲＭＰであるが、ＩＰＴがＨＭＢＤＰを利用する場合はｔＺＲＭＰが形成される。したがって、感染中に植物細胞の葉緑体においてアグロバクテリウムＩＰＴ Ｔｍｒが発現されることで、ｔＺＲＭＰの直接合成のための代謝バイパスが作られ、イソプレノイド前駆体ＨＭＢＤＰの効率的な基質供給量が植物細胞のプラスチドに隔離される。本来の経路と同様、ＬＯＧホスホリボヒドロラーゼは、ｉＰ－またはｔＺ－ヌクレオシド一リン酸（ｉＰＲＭＰ、ｔＺＲＭＰ）から最終的にリボース一リン酸部分を放出し、生物学的に活性な分子であるｉＰおよびｔＺを生じる。

【0010】

腫瘍を誘導する植物病原性細菌であるＡ．ツメファシエンス（Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）は、ＴｍｒおよびＴｚｓの２つのＩＰＴを有する。ＴｍｒおよびＴｚｓは相同タンパク質であり、どちらもＤＭＡＰＰ：ＡＭＰイソペンテニルトランスフェラーゼであるが、基質認識に不可欠なアミノ酸が植物のアデニル酸ＩＰＴとは異なる（Chu et al., 2010）。ｔｍｒ（ｉｐｔ）遺伝子は、Ｔｉ－プラスミドのＴ領域に位置し、宿主植物への感染を媒介する。ｔｍｒ遺伝子が細菌から植物ゲノムに導入され、宿主植物にサイトカイニンを産生させることで、腫瘍形成を引き起こす。ｉｎ ｖｉｔｒｏ実験では、ＴｍｒがＤＭＡＰＰおよびＨＭＢＤＰの両方を同様のＫｍ値でＡＭＰに転移することが実証された（Sakakibara et al. 2005）。Ａ．ツメファシエンス（Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）のノパリン産生株は、ＤＭＡＰＰ：ＡＭＰイソペンテニルトランスフェラーゼの別の遺伝子であるｔｚｓを有し、これはＴｉ－プラスミドのｖｉｒ領域に存在し、植物細胞へは移行しない。Ｔｚｓは、これらのＡ．ツメファシエンス（Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）株による高レベルのサイトカイニン産生および分泌を可能にし（Morris et al. 1993）、ｉＰＲＭＰおよびｔＺＲＭＰの産生にＨＭＢＤＰまたはＤＭＡＰＰを用いることもできる。Ｔｚｓは、Ｔｍｒと５１．３％のタンパク質配列同一性を有する。ｔｍｒ／ｔｚｓと相同なＤＭＡＰＰ：ＡＭＰイソペンテニルトランスフェラーゼをコードする遺伝子が、アグロバクテリウム属の他の細菌であるＡ．ビティス（Ａ．ｖｉｔｉｓ）およびＡ．リゾゲネス（Ａ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）、ならびに他の植物病原性細菌、例えばシュードモナス・シリンガエｐｖ．サバスタノイ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ ｐｖ． ｓａｖａｓｔａｎｏｉ）、シュードモナス・ソラナセアルム（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ）、パントエア・アグロメランス（Ｐａｎｔｏｅａ ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ）およびロドコッカス・ファシアンス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｓｃｉａｎｓ）に存在する（Kakimoto, 2003）。

【0011】

イソペンテニルドナーであるジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）およびその前駆体である１－ヒドロキシ－２－メチル－２－ブテニル４－二リン酸（ＨＭＢＤＰ）は、植物の葉緑体および細菌、さらにはバチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）におけるメチルエリスリトールリン酸（ＭＥＰ）経路によって生成する。ＭＥＰ経路では、ピルビン酸およびグリセルアルデヒド－３－リン酸が、酵素１－デオキシ－Ｄ－キシルロース－５－リン酸シンターゼ（Ｄｘｓ、ＥＣ ２．２．１．７）によって縮合し、最終的にＨＭＢＤＰ、ＤＭＡＰＰ、およびイソプレンまたはより大きなテルペノイド化合物を生成する代謝カスケードとなる。ＤＸＳによって媒介されるＭＥＰ経路の第１段階は、植物および細菌におけるイソプレノイド産生の律速段階である（Julsing et al. 2007）。

【0012】

発明の概要
植物病原性細菌における感染時のｄｅ ｎｏｖｏ経路を介したサイトカイニンの天然生合成率は非常に低い。これは、宿主細胞の代謝によって供給される細菌起源のＩＰＴ酵素、ＬＯＧ酵素およびビルディングブロックの発現に依存する。かかる感染ベースの系は、工業規模の生産には容易に移行することができない。農業用途におけるサイトカイニンホルモンの高い活性および使用可能性のために、遺伝的およびバイオテクノロジーに適した宿主株におけるｉＰ、ｔＺ、ならびにリボシドであるｔＺＲおよびｉＰＲ等のサイトカイニンの効率的かつ持続的な生産が必要とされている。

【0013】

本発明の目的は、イソプレノイド側鎖を有するサイトカイニン（イソプレノイドサイトカイニン）、例えばｔＺおよびｉＰ、ならびにそれらのリボシドであるｔＺＲおよびｉＰＲのより効率的な生産を可能にする手段を提供することである。より詳細には、本発明の目的は、イソプレノイド側鎖を有するサイトカイニン（イソプレノイドサイトカイニン）、例えばｔＺおよびｉＰ、ならびにそれらのリボシドであるｔＺＲおよびｉＰＲの生産をより高い公称収率で可能にする手段を提供することである。

【0014】

これは、ａ）アデニル酸イソペンテニルトランスフェラーゼ活性を有する異種ポリペプチドを発現し、任意にｂ）サイトカイニンリボシド５’－一リン酸ホスホリボヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドのタンパク質発現が増加するように改変された細菌株を操作した本発明者らによって達成される。実施例に示すように、このような操作された細菌株は、驚くべきことに、上清中で１０ｍｇ／Ｌを超えるイソプレノイドサイトカイニンの異常に高い力価を示す。結果として、これは、植物細胞感染の状況がもはや必要とされず、ｔＺおよびｉＰ、ならびにそれらのリボシドであるｔＺＲおよびｉＰＲ等のイソプレノイドサイトカイニンの効率的な生合成のための生合成基質および補助因子が、操作された細菌細胞によって効果的に供給されることを意味する。

【0015】

したがって、本発明は、第１の態様において、アデニル酸イソペンテニルトランスフェラーゼ活性を有する異種ポリペプチドを発現する細菌を提供する。より詳細には、本発明は、ａ）アデニル酸イソペンテニルトランスフェラーゼ活性を有する異種ポリペプチドを発現し、任意にｂ）サイトカイニンリボシド５’－一リン酸ホスホリボヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドのタンパク質発現が、改変を有しないが、それ以外は同一の細菌と比較して増加するように改変されている細菌を提供する。

【0016】

本発明は、第２の態様において、サイトカイニンまたはそのリボシド誘導体、特にイソプレノイドサイトカイニンまたはそのリボシド誘導体を生成する方法であって、本発明による細菌を好適な培養条件下にて好適な培養培地中で培養することを含む、方法をさらに提供する。

【0017】

本発明は、以下の項目によってまとめることができる：

【0018】

１． アデニル酸イソペンテニルトランスフェラーゼ活性を有する異種ポリペプチドを発現する細菌。

【0019】

２． アデニル酸イソペンテニルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドが、ｉ）配列番号１～３３のいずれか１つのアミノ酸配列を含むポリペプチド；およびｉｉ）配列番号１～３３のいずれか１つのアミノ酸配列に対して少なくとも約５０％、例えば少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９３％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドからなる群から選択される、項目１記載の細菌。

【0020】

３． アデニル酸イソペンテニルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドが、ｉ）配列番号１～１０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むポリペプチド；およびｉｉ）配列番号１～１０のいずれか１つのアミノ酸配列に対して少なくとも約５０％、例えば少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９３％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドからなる群から選択される、項目１記載の細菌。

【0021】

４． アデニル酸イソペンテニルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドが、ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含むポリペプチド；およびｉｉ）配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも約５０％、例えば少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９３％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドからなる群から選択される、項目１記載の細菌。

【0022】

５． 細菌が、上記異種ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む外因性核酸分子を含む、項目１から４までのいずれか１つ記載の細菌。

【0023】

６． 外因性核酸分子が、細菌においてｍＲＮＡ分子の産生を引き起こすように機能し、上記異種ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に操作可能に連結したプロモーターをさらに含む、項目５記載の細菌。

【0024】

７． 外因性核酸分子がベクターである、項目５または６記載の細菌。

【0025】

８． 外因性核酸分子が、細菌のゲノムに安定に組み込まれる、項目５または６記載の細菌。

【0026】

９． サイトカイニンリボシド５’－一リン酸ホスホリボヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドのタンパク質発現が、改変を有しないが、それ以外は同一の細菌と比較して増加するように改変されている、項目１から８までのいずれか１つ記載の細菌。

【0027】

１０． サイトカイニンリボシド５’－一リン酸ホスホリボヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドのタンパク質発現の増加が、上記ポリペプチドをコードする遺伝子のコピー数を増加させることによって達成される、項目９記載の細菌。

【0028】

１１． 遺伝子のコピー数の増加が、細菌においてｍＲＮＡ分子の産生を引き起こすように機能するプロモーターに操作可能に連結した遺伝子を含む１つ以上の外因性核酸分子（例えば１つ以上のベクター）を細菌に導入することによって達成される、項目１０記載の細菌。

【0029】

１２． 細菌が、サイトカイニンリボシド５’－一リン酸ホスホリボヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む外因性核酸分子（ベクター等）を含む、項目９から１１までのいずれか１つ記載の細菌。

【0030】

１３． 外因性核酸分子が、細菌においてｍＲＮＡ分子の産生を引き起こすように機能し、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に操作可能に連結したプロモーターをさらに含む、項目１２記載の細菌。

【0031】

１４． 外因性核酸分子がベクターである、項目１１から１３までのいずれか１つ記載の細菌。

【0032】

１５． 外因性核酸分子が、細菌のゲノムに安定に組み込まれる、項目１１から１３までのいずれか１つ記載の細菌。

【0033】

１６． サイトカイニンリボシド５’－一リン酸ホスホリボヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドのタンパク質発現の増加が、リボソーム結合部位を改変することによって達成される、項目９から１５までのいずれか１つ記載の細菌。

【0034】

１７． サイトカイニンリボシド５’－一リン酸ホスホリボヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドのタンパク質発現の増加が、ポリペプチドをコードする遺伝子に操作可能に連結したプロモーターの強度を増大させることによって達成される、項目９から１６までのいずれか１つ記載の細菌。

【0035】

１８． サイトカイニンリボシド５’－一リン酸ホスホリボヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドが、ｉ）配列番号３４～６２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むポリペプチド、およびｉｉ）配列番号３４～６２のいずれか１つのアミノ酸配列に対して少なくとも約７０％、例えば少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９３％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドからなる群から選択される、項目９から１７までのいずれか１つ記載の細菌。

【0036】

１９． サイトカイニンリボシド５’－一リン酸ホスホリボヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドが、ｉ）配列番号３４～４４のいずれか１つのアミノ酸配列を含むポリペプチド；およびｉｉ）配列番号３４～４４のいずれか１つのアミノ酸配列に対して少なくとも約７０％、例えば少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９３％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドからなる群から選択される、項目９から１８までのいずれか１つ記載の細菌。

【0037】

２０． サイトカイニンリボシド５’－一リン酸ホスホリボヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドが、ｉ）配列番号３４のアミノ酸配列を含むポリペプチド；およびｉｉ）配列番号３４のアミノ酸配列に対して少なくとも約７０％、例えば少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９３％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドからなる群から選択される、項目９から１８までのいずれか１つ記載の細菌。

【0038】

２１． サイトカイニンリボシド５’－一リン酸ホスホリボヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドが、サイトカイニンリボシド５’－一リン酸ホスホリボヒドロラーゼ活性を有する細菌ポリペプチドである、項目９から２０までのいずれか１つ記載の細菌。

【0039】

２２． １－デオキシ－Ｄ－キシルロース－５－リン酸シンターゼ活性を有するポリペプチドのタンパク質発現が、改変を有しないが、それ以外は同一の細菌と比較して増加するようにさらに改変されている、項目１から２１までのいずれか１つ記載の細菌。

【0040】

２３． １－デオキシ－Ｄ－キシルロース－５－リン酸シンターゼ活性を有するポリペプチドのタンパク質発現の増加が、上記ポリペプチドをコードする遺伝子のコピー数を増加させることによって達成される、項目２２記載の細菌。

【0041】

２４． 遺伝子のコピー数の増加が、細菌においてｍＲＮＡ分子の産生を引き起こすように機能するプロモーターに操作可能に連結した遺伝子を含む１つ以上の外因性核酸分子（例えば１つ以上のベクター）を細菌に導入することによって達成される、項目２３記載の細菌。

【0042】

２５． 細菌が、１－デオキシ－Ｄ－キシルロース－５－リン酸シンターゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む外因性核酸分子（ベクター等）を含む、項目２２から２４までのいずれか１つ記載の細菌。

【0043】

２６． 外因性核酸分子が、細菌においてｍＲＮＡ分子の産生を引き起こすように機能し、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に操作可能に連結したプロモーターをさらに含む、項目２５記載の細菌。

【0044】

２７． 外因性核酸分子がベクターである、項目２４から２６までのいずれか１つ記載の細菌。

【0045】

２８． 外因性核酸分子が、細菌のゲノムに安定に組み込まれる、項目２４から２６までのいずれか１つ記載の細菌。

【0046】

２９． １－デオキシ－Ｄ－キシルロース－５－リン酸シンターゼ活性を有するポリペプチドのタンパク質発現の増加が、リボソーム結合部位を改変することによって達成される、項目２２から２８までのいずれか１つ記載の細菌。

【0047】

３０． １－デオキシ－Ｄ－キシルロース－５－リン酸シンターゼ活性を有するポリペプチドのタンパク質発現の増加が、ポリペプチドをコードする遺伝子に操作可能に連結したプロモーターの強度を増大させることによって達成される、項目２２から２９までのいずれか１つ記載の細菌。

【0048】

３１． １－デオキシ－Ｄ－キシルロース－５－リン酸シンターゼ活性を有するポリペプチドが、ｉ）配列番号６３～７０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むポリペプチド；およびｉｉ）配列番号６３～７０のいずれか１つのアミノ酸配列に対して少なくとも約７０％、例えば少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９３％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドからなる群から選択される、項目２２から３０までのいずれか１つ記載の細菌。

【0049】

３２． １－デオキシ－Ｄ－キシルロース－５－リン酸シンターゼ活性を有するポリペプチドが、ｉ）配列番号６３～６５のいずれか１つのアミノ酸配列を含むポリペプチド；およびｉｉ）配列番号６３～６５のいずれか１つのアミノ酸配列に対して少なくとも約７０％、例えば少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９３％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドからなる群から選択される、項目２２から３１までのいずれか１つ記載の細菌。

【0050】

３３． １－デオキシ－Ｄ－キシルロース－５－リン酸シンターゼ活性を有するポリペプチドが、ｉ）配列番号６３のアミノ酸配列を含むポリペプチド；およびｉｉ）配列番号６３のアミノ酸配列に対して少なくとも約７０％、例えば少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９３％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドからなる群から選択される、項目２２から３２までのいずれか１つ記載の細菌。

【0051】

３４． １－デオキシ－Ｄ－キシルロース－５－リン酸シンターゼ活性を有するポリペプチドが、ｉ）配列番号６４のアミノ酸配列を含むポリペプチド；およびｉｉ）配列番号６４のアミノ酸配列に対して少なくとも約７０％、例えば少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９３％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドからなる群から選択される、項目２２から３２までのいずれか１つ記載の細菌。

【0052】

３５． １－デオキシ－Ｄ－キシルロース－５－リン酸シンターゼ活性を有するポリペプチドが、１－デオキシ－Ｄ－キシルロース－５－リン酸シンターゼ活性を有する細菌ポリペプチドである、項目２２から３４までのいずれか１つ記載の細菌。

【0053】

３６． プリンヌクレオチド生合成経路に関与する少なくとも１つの酵素（例えば、アデノシン一リン酸生合成経路に関与する少なくとも１つの酵素）の発現および／または活性が、改変を有しないが、それ以外は同一の細菌と比較して増加するようにさらに改変されている、項目１から３５までのいずれか１つ記載の細菌。

【0054】

３７． プリンヌクレオチド生合成経路に関与する少なくとも１つの酵素が、リボース－リン酸ジホスホキナーゼ活性を有する酵素、アミドホスホリボシルトランスフェラーゼ活性を有する酵素、ホルミルテトラヒドロ葉酸デホルミラーゼ活性を有する酵素、アデニロコハク酸リアーゼ活性を有する酵素、ホスホリボシルアミノイミダゾール－カルボキサミドホルミルトランスフェラーゼ活性を有する酵素、アデニロコハク酸シンターゼ活性を有する酵素およびアデノシンキナーゼ活性を有する酵素からなる群から選択される、項目３６記載の細菌。

【0055】

３８． プリンヌクレオチド分解経路に関与する少なくとも１つの内因性酵素の発現および／または活性が、改変を有しないが、それ以外は同一の細菌と比較して減少するようにさらに改変されている、項目１から３７までのいずれか１つ記載の細菌。

【0056】

３９． プリンヌクレオチド分解経路に関与する少なくとも１つの内因性酵素が、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ活性を有する酵素およびアデノシン－ホスホリボシルトランスフェラーゼ活性を有する酵素からなる群から選択される、項目３８記載の細菌。

【0057】

４０． プリンヌクレオチド分解経路に関与する少なくとも１つの内因性酵素が、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ活性を有する酵素である、項目３８または３９記載の細菌。

【0058】

４１． プリンヌクレオチド分解経路に関与する少なくとも１つの内因性酵素が、アデノシン－ホスホリボシルトランスフェラーゼ活性を有する酵素である、項目３８から４０までのいずれか１つ記載の細菌。

【0059】

４２． グアノシン一リン酸生合成経路に関与する少なくとも１つの内因性酵素の発現および／または活性が、改変を有しないが、それ以外は同一の細菌と比較して減少するようにさらに改変されている、項目１から４１までのいずれか１つ記載の細菌。

【0060】

４３． グアノシン一リン酸生合成経路に関与する少なくとも１つの内因性酵素が、ＩＭＰデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素およびＧＭＰシンテターゼ活性を有する酵素からなる群から選択される、項目４２記載の細菌。

【0061】

４４． グアノシン一リン酸生合成経路に関与する少なくとも１つの内因性酵素が、ＩＭＰデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素である、項目４２または４３記載の細菌。

【0062】

４５． グアノシン一リン酸生合成経路に関与する少なくとも１つの内因性酵素が、ＧＭＰシンテターゼ活性を有する酵素である、項目４２から４４までのいずれか１つ記載の細菌。

【0063】

４６． シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ（ＣＹＰ４５０）活性を有するポリペプチドのタンパク質発現が、改変を有しないが、それ以外は同一の細菌と比較して増加するようにさらに改変されている、項目１から４５までのいずれか１つ記載の細菌。

【0064】

４７． シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ（ＣＹＰ４５０）活性を有するポリペプチドのタンパク質発現の増加が、上記ポリペプチドをコードする遺伝子のコピー数を増加させることによって達成される、項目４６記載の細菌。

【0065】

４８． 遺伝子のコピー数の増加が、細菌においてｍＲＮＡ分子の産生を引き起こすように機能するプロモーターに操作可能に連結した遺伝子を含む１つ以上の外因性核酸分子（例えば１つ以上のベクター）を細菌に導入することによって達成される、項目４７記載の細菌。

【0066】

４９． 細菌が、シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ（ＣＹＰ４５０）活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む外因性核酸分子（ベクター等）を含む、項目１から４８までのいずれか１つ記載の細菌。

【0067】

５０． 外因性核酸分子が、細菌においてｍＲＮＡ分子の産生を引き起こすように機能し、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に操作可能に連結したプロモーターをさらに含む、項目４９記載の細菌。

【0068】

５１． 外因性核酸分子がベクターである、項目４８から５０までのいずれか１つ記載の細菌。

【0069】

５２． 外因性核酸分子が、細菌のゲノムに安定に組み込まれる、項目４８から５０までのいずれか１つ記載の細菌。

【0070】

５３． シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ（ＣＹＰ４５０）活性を有するポリペプチドが、ｉ）配列番号９３～９５のいずれか１つのアミノ酸配列を含むポリペプチド、およびｉｉ）配列番号９３～９５のいずれか１つのアミノ酸配列に対して少なくとも約７０％、例えば少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９３％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドからなる群から選択される、項目４６から５２までのいずれか１つ記載の細菌。

【0071】

５４． 細菌が、腸内細菌科、バチルス、ラクトバチルスおよびコリネバクテリウムからなる群から選択される科である、項目１から５３までのいずれか１つ記載の細菌。

【0072】

５５． 細菌が、バチルスおよびコリネバクテリウムからなる群から選択される科である、項目１から５３までのいずれか１つ記載の細菌。

【0073】

５６． 細菌がバチルス科である、項目１から５３までのいずれか１つ記載の細菌。

【0074】

５７． 細菌がコリネバクテリウム科である、項目１から５３までのいずれか１つ記載の細菌。

【0075】

５８． 細菌が、バチルス、ラクトコッカス、ラクトバチルス、クロストリジウム、コリネバクテリウム、ゲオバチルス、サーモアナエロバクテリウム、ストレプトコッカス、シュードモナス、ストレプトマイセス、エシェリキア、シゲラ、アシネトバクター、シトロバクター、サルモネラ、クレブシエラ、エンテロバクター、エルウィニア、クライベラ、セラチア、セデセア、モーガネラ、ハフニア、エドワージエラ、プロビデンシア、プロテウスまたはエルシニア属である、項目１から５３までのいずれか１つ記載の細菌。

【0076】

５９． 細菌がバチルスまたはコリネバクテリウム属である、項目１から５３までのいずれか１つ記載の細菌。

【0077】

６０． 細菌がバチルス属である、項目１から５３までのいずれか１つ記載の細菌。

【0078】

６１． 細菌がコリネバクテリウム属である、項目１から５３までのいずれか１つ記載の細菌。

【0079】

６２． 細菌がバチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）である、項目１から５３までのいずれか１つ記載の細菌。

【0080】

６３． 細菌がコリネバクテリウム・スタティオニス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｔａｔｉｏｎｉｓ）である、項目１から５３までのいずれか１つ記載の細菌。

【0081】

６４． イソプレノイドサイトカイニンまたはそのリボシド誘導体を生成する方法であって、項目１から６３までのいずれか１つ記載の細菌を好適な培養条件下にて好適な培養培地中で培養することを含む、方法。

【0082】

６５． イソプレノイドサイトカイニンまたはそのリボシド誘導体が、ｔｒａｎｓ－ゼアチン（ｔＺ）、ｔｒａｎｓ－ゼアチンリボシド（ｔＺＲ）、Ｎ^６－（Ｄ２－イソペンテニル）アデニン（ｉＰ）、Ｎ（６）－（ジメチルアリル）アデノシン（ｉＰＲ）、ジヒドロゼアチン（ＤＺ）、リボシルジヒドロゼアチン（ＤＺＲ）およびそれらの組合せからなる群から選択される、項目６４記載の方法。

【0083】

６６． イソプレノイドサイトカイニンまたはそのリボシド誘導体が、それぞれｔｒａｎｓ－ゼアチン（ｔＺ）およびｔｒａｎｓ－ゼアチンリボシド（ｔＺＲ）である、項目６５記載の方法。

【0084】

６７． 方法がｔｒａｎｓ－ゼアチン（ｔＺ）を生成するためのものである、項目６４記載の方法。

【図面の簡単な説明】

【0085】

【図1】イソプレノイドサイトカイニンを示す図である：Ａ）リボシド：Ｎ^６－（Ｄ２－イソペンテニル）アデニンリボシド（ｉＰＲ）、ｔｒａｎｓ－ゼアチンリボシド（ｔＺＲ）、ｃｉｓ－ゼアチンリボシド（ｃＺＲ）およびジヒドロゼアチンリボシド（ＤＺＲ）。Ｂ）遊離塩基：Ｎ^６－（Ｄ２－イソペンテニル）アデニン（ｉＰ）、ｔｒａｎｓ－ゼアチン（ｔＺ）、ｃｉｓ－ゼアチン（ｃＺ）およびジヒドロゼアチン（ＤＺ）。

【図2】ＭＥＰ代謝経路の概略図である。

【図3】ＩＰＴ（ＥＣ ２．５．１．２７）およびＬＯＧ（ＥＣ ３．２．２．ｎ１）の異種発現によるイソプレノイドサイトカイニン生合成経路を示す図である。

【図4】シェーカースケール実験での実験におけるバチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株のｔｒａｎｓ－ゼアチンおよび関連イソプレノイドサイトカイニンの産生を示す図である。ＶＫＰＭ Ｂ２１１６ － 親株、ＴＺＡＢ１４、ＴＺＡＢ１５ － ＩＰＴ－ＬＯＧ。

【図5】硫酸アデニンを用いたシェーカースケール実験での実験におけるバチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株のｔｒａｎｓ－ゼアチンおよび関連イソプレノイドサイトカイニンの産生を示す図である。ＶＫＰＭ Ｂ２１１６ － 親株、ＴＺＡＢ１４ － ＩＰＴ－ＬＯＧ。

【図6】シェーカースケール実験におけるＩＰＴおよびＬＯＧ遺伝子とＤＸＳ遺伝子とを有するバチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株によるｔｒａｎｓ－ゼアチンおよび関連イソプレノイドサイトカイニンの産生を示す図である。ＶＫＰＭ Ｂ２１１６ － 親株、ＴＺＡＢ１５ － ＩＰＴ－ＬＯＧ、ＴＺＡＢ４３ － ＩＰＴ－ＬＯＧ－ＤＸＳ。

【図7】シェーカースケール実験における２８時間後のＩＰＴ（配列番号１）およびＬＯＧ（配列番号３４）またはＩＰＴ（配列番号２）およびＬＯＧ（配列番号３４）を発現するバチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株によるｔｒａｎｓ－ゼアチンおよび関連イソプレノイドサイトカイニンの産生を示す図である。ＶＫＰＭ Ｂ２１１６ － 親株、ＴＺＡＢ１、ＴＺＡＢ２、ＴＺＡＢ３、ＴＺＡＢ４ － ＩＰＴ（配列番号２）およびＬＯＧ（配列番号３４）を有する株、ＴＺＡＢ１４、ＴＺＡＢ１５ － ＩＰＴ（配列番号１）およびＬＯＧ（配列番号３４）を有する株。

【図8】シェーカースケール実験における２４時間後のＩＰＴ（配列番号１）、ＬＯＧ（配列番号３４）と、ＤＸＳ（配列番号６３）の過剰発現とを有するバチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株１６８でのサイトカイニンの産生を示す図である。

【図9】シェーカースケール実験における１８時間後のＩＰＴ（配列番号１）、ＬＯＧ（配列番号３４）と、ＤＸＳ（配列番号６３）の過剰発現とを有するバチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株ＲＢ５０でのサイトカイニンの産生を示す図である。

【図10】シェーカースケール実験における２４時間後のＩＰＴ（配列番号１）、ＬＯＧ（配列番号３４）と、ＤＸＳ（配列番号６３）の過剰発現とを有するバチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株ＶＫＰＭ Ｂ２１１６でのサイトカイニンの産生を示す図である。

【図11】シェーカースケール実験における１０時間後のＩＰＴ（配列番号１）、ＬＯＧ（配列番号３４）と、ＤＸＳ（配列番号６３）の過剰発現とを有するエシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）株ＢＬ２１（ＤＥ３）でのサイトカイニンの産生を示す図である。

【図12】シェーカースケール実験における４８時間後のＩＰＴ（配列番号１）、ＬＯＧ（配列番号３４）と、ＤＸＳ（配列番号６３）の過剰発現とを有するコリネバクテリウム・スタティオニス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｔａｔｉｏｎｉｓ）でのサイトカイニンの産生を示す図である。

【図13】シェーカースケール実験における１８時間後の様々なＩＰＴ（配列番号１、配列番号６、配列番号７および配列番号９）と組み合わせてＬＯＧ８（配列番号４１）を発現するバチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株でのサイトカイニンの産生を示す図である。

【図14】シェーカースケール実験における１８時間後の様々なＬＯＧ（配列番号３４～４４）と組み合わせてＩＰＴ（配列番号１）を発現するバチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株でのサイトカイニンの産生を示す図である。

【0086】

ここで、本発明を以下により詳細に説明する。

【0087】

発明の詳細な説明
本明細書で特に定義されない限り、使用される全ての技術用語および科学用語は、生化学、遺伝学および微生物学の分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。

【0088】

本明細書に記載のものと同様または同等の全ての方法および材料を本発明の実施または試験において使用することができ、好適な方法および材料が本明細書に記載される。本明細書で言及される全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参照文献は、その全体が参照により援用される。矛盾する場合には、定義を含む本明細書が優先される。さらに、材料、方法および実施例は、特に指定のない限り、例示に過ぎず、限定を意図していない。

【0089】

本発明の実施には、特に記載のない限り、当業者の技能の範囲内の細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学および組換えＤＮＡの従来の手法が用いられる。かかる手法は、文献中で十分に説明される。例えば、Current Protocols in Molecular Biology (Frederick M. AUSUBEL, 2000, Wiley and son Inc, Library of Congress, USA)；Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition, (Sambrook et al, 2001, Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press)；Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed., 1984)；Mullis et al.の米国特許第４，６８３，１９５号明細書；Nucleic Acid Hybridization (B. D. Harries & S. J. Higgins eds. 1984)；Transcription And Translation (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984)；Culture Of Animal Cells (R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987)；Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986)；B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984)；Methods In ENZYMOLOGY (J. Abelson and M. Simon, eds.-in-chief, Academic Press, Inc., New York)のシリーズ、特にVols.154および155 (Wu et al. eds.)ならびにVol. 185, “Gene Expression Technology” (D. Goeddel, ed.)を参照されたい。

【0090】

本発明の細菌
上述のように、本発明者らは、ａ）アデニル酸イソペンテニルトランスフェラーゼ活性を有する異種ポリペプチドを発現し、任意にｂ）サイトカイニンリボシド５’－一リン酸ホスホリボヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドのタンパク質発現が増加するように改変された細菌株を操作した。実施例に示すように、このような操作された細菌株は、驚くべきことに、上清中で１０ｍｇ／Ｌを超えるイソプレノイドサイトカイニンの異常に高い力価を示す。結果として、これは、植物細胞感染の状況がもはや必要とされず、ｔＺおよびｉＰ、ならびにそれらのリボシドであるｔＺＲおよびｉＰＲ等のイソプレノイドサイトカイニンの効率的な生合成のための生合成基質および補助因子が、操作された細菌細胞によって効果的に供給されることを意味する。

【0091】

したがって、本発明は、第１の態様において、アデニル酸イソペンテニルトランスフェラーゼ活性を有する異種ポリペプチドを発現する細菌を提供する。より詳細には、本発明は、ａ）アデニル酸イソペンテニルトランスフェラーゼ活性を有する異種ポリペプチドを発現し、任意にｂ）サイトカイニンリボシド５’－一リン酸ホスホリボヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドのタンパク質発現が、改変を有しないが、それ以外は同一の細菌と比較して増加するように改変されている細菌を提供する。

【0092】

アデニル酸イソペンテニルトランスフェラーゼ（ＩＰＴ）は、ｄｅ ｎｏｖｏサイトカイニン生合成経路の第１段階である、ジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）または１－ヒドロキシ－２－メチル－２－ブテニル４－二リン酸（ＨＭＢＤＰ）のいずれかによるアデノシン５’－リン酸（ＡＭＰ、ＡＤＰまたはＡＴＰ）のＮ－プレニル化を触媒する、明確に定義されたクラスの酵素である。ＩＰＴには２種類ある（ＥＣ ２．５．１．２７およびＥＣ ２．５．１．１１２）。ＩＰＴ酵素は、細菌および植物に存在する。ＴｚｓおよびＴｍｒの２つのＩＰＴホモログを含むアグロバクテリウム等の細菌に由来するＩＰＴは、プレニルアクセプタとしてＡＭＰ、ドナーとしてＨＭＢＤＰまたはＤＭＡＰＰを用いる（ＥＣ ２．５．１．２７）。ＨＭＢＤＰとの反応の生成物は、ｔＺ－ヌクレオチドである。さらに、細菌由来のＩＰＴは、タンパク質ファミリーおよびドメインのＰｆａｍデータベース（https://pfam.xfam.org/family/ipt）のＰｆａｍファミリーＩＰＴ（ＰＦ０１７４５）に属している。ＩＰＴ Ｐｆａｍドメイン遺伝子は、系統的に分散しており、アクチノバクテリア、シアノバクテリア、α－プロテオバクテリア、β－プロテオバクテリアおよびγ－プロテオバクテリアの一部のメンバー、ならびに真核生物ディクチオステリウム・ディスコイデウム（Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ）にのみ見出される（Nishii et al., 2018）。高等植物由来のＩＰＴは、主にプレニルアクセプタとしてＡＴＰまたはＡＤＰ、ドナーとしてＤＭＡＰＰを用い（ＥＣ ２．５．１．１１２）、ＰｆａｍファミリーＩＰＰＴ（ＰＦ０１７１５）に属する（https://pfam.xfam.org/family/ippt）。反応の生成物はｉＰであり、これがプレニル側鎖でヒドロキシル化され、ｔＺ－ヌクレオチドを生じる。

【0093】

アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）のＴｚｓ（ＩＰＴ（ＰＦ０１７４５）；ＥＣ ２．５．１．２７；配列番号１）は、３つのα－ヘリックス（α１～α３）で囲まれた５本鎖平行β－シートを有するＮ末端ドメイン、および５つのαヘリックス（α４～α８）を有するＣ末端ドメインの２つのドメインからなる。Ｎ末端ドメインは、ヌクレオチド結合ｐループモチーフＧｌｙ－８－Ｐｒｏ－Ｔｈｒ－Ｃｙｓ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ－Ｔｈｒ－１５を含み、ｐループを含むヌクレオシド三リン酸ヒドロラーゼ（ｐＮＴＰアーゼ）スーパーファミリーと構造的に関連している。α８のＣ末端側は、Ｎ末端に伸び、それに付着する。ドメイン間の界面は、溶媒露出チャネルを形成し、ＡＭＰを結合する。ＡＭＰのプレニル化部位は、Ａｓｐ－３３およびＳｅｒ－４５に結合する。ＤＭＡＰＰは、Ａｓｐ－１７３、Ｔｙｒ－２１１およびＨｉｓ－２１４に結合する。Ｔｈｒ－１０、Ａｓｐ－３３およびＡｒｇ－１３８は、ＩＰＴ内で完全に保存されている。Ｔｚｓでは、側鎖によって形成される親水性領域は、プレニル－ドナー基質のヒドロキシル基の有無を区別する、基質結合ポケット内の２つの重要なアミノ酸残基であるＨｉｓ－２１４およびＡｓｐ－１７３を含み、これによりＨＭＢＤＰの使用が可能となる（Sugawara et al. 2008）。

【0094】

概して、本発明に従って用いられるアデニル酸イソペンテニルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドは、細菌に対して異種であり、すなわち、上記ポリペプチドは、通常は細菌に見られないか、または細菌によって作製（すなわち発現）されず、異なる種に由来する。さらに、アデニル酸イソペンテニルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドは、ＰｆａｍファミリーＩＰＴ（ＰＦ０１７４５）のメンバーに由来するか、またはそれに相当し、好ましくは、アデニル酸イソペンテニルトランスフェラーゼ活性を有する細菌ポリペプチドである。「アデニル酸イソペンテニルトランスフェラーゼ活性を有する細菌ポリペプチド」とは、アデニル酸イソペンテニルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドが、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）等の細菌に由来することを意味する。

【0095】

ｔＺ、ｉＰ、ｔＺＲおよびｉＰＲを含むイソプレノイドサイトカイニンの生合成に最も適したアデニル酸イソペンテニルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドは、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）のＴｚｓまたはＴｍｒ等のＨＭＢＤＰおよびＤＭＡＰＰの両方をプレニルドナーとして使用することができる酵素である。さらに、これらはＰｆａｍファミリーＩＰＴ（ＰＦ０１７４５）に属し、配列番号１の１７３位に相当する位置にＡｓｐ残基、配列番号１の２１１位に相当する位置にＴｙｒ残基、および／または配列番号１の２１４位に相当する位置にＨｉｓ残基を含む。

【0096】

本発明に従って使用されるアデニル酸イソペンテニルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドは例えば、ｉ）配列番号１～３３のいずれか１つのアミノ酸配列を含むポリペプチド；およびｉｉ）配列番号１～３３のいずれか１つのアミノ酸配列に対して少なくとも約５０％、例えば少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９３％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドからなる群から選択される、アデニル酸イソペンテニルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドであり得る。

【0097】

本発明に従って使用されるアデニル酸イソペンテニルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドは例えば、ｉ）配列番号１～３３のいずれか１つのアミノ酸配列を含むポリペプチド；およびｉｉ）配列番号１～３３のいずれか１つのアミノ酸配列に対して少なくとも約７０％、例えば少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９３％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドからなる群から選択される、アデニル酸イソペンテニルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドであり得る。

【0098】

本発明に従って使用されるアデニル酸イソペンテニルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドは例えば、ｉ）配列番号１～１０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むポリペプチド；およびｉｉ）配列番号１～１０のいずれか１つのアミノ酸配列に対して少なくとも約８５％、例えば少なくとも約９０％、少なくとも約９３％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドからなる群から選択される、アデニル酸イソペンテニルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドであり得る。

【0099】

本発明に従って使用されるアデニル酸イソペンテニルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドは例えば、ｉ）配列番号１～１０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むポリペプチド；およびｉｉ）配列番号１～１０のいずれか１つのアミノ酸配列に対して少なくとも約７０％、例えば少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９３％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドからなる群から選択される、アデニル酸イソペンテニルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドであり得る。

【0100】

本発明に従って使用されるアデニル酸イソペンテニルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドは例えば、ｉ）配列番号１～１０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むポリペプチド；およびｉｉ）配列番号１～１０のいずれか１つのアミノ酸配列に対して少なくとも約８５％、例えば少なくとも約９０％、少なくとも約９３％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドからなる群から選択される、アデニル酸イソペンテニルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドであり得る。

【0101】

幾つかの実施形態によると、アデニル酸イソペンテニルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドは、アミノ酸配列配列番号１と少なくとも５０％、例えば少なくとも５５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態によると、アデニル酸イソペンテニルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドは、アミノ酸配列配列番号１と少なくとも６０％、例えば少なくとも６５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態によると、アデニル酸イソペンテニルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドは、アミノ酸配列配列番号１と少なくとも７０％、例えば少なくとも７５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態によると、アデニル酸イソペンテニルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドは、アミノ酸配列配列番号１と少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態によると、アデニル酸イソペンテニルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドは、アミノ酸配列配列番号１と少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態によると、アデニル酸イソペンテニルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドは、アミノ酸配列配列番号１と少なくとも９５％、例えば少なくとも９７％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態によると、アデニル酸イソペンテニルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を含む。

【0102】

幾つかの実施形態によると、アデニル酸イソペンテニルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドは、アミノ酸配列配列番号２と少なくとも５０％、例えば少なくとも５５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態によると、アデニル酸イソペンテニルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドは、アミノ酸配列配列番号２と少なくとも６０％、例えば少なくとも６５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態によると、アデニル酸イソペンテニルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドは、アミノ酸配列配列番号２と少なくとも７０％、例えば少なくとも７５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態によると、アデニル酸イソペンテニルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドは、アミノ酸配列配列番号２と少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態によると、アデニル酸イソペンテニルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドは、アミノ酸配列配列番号２と少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態によると、アデニル酸イソペンテニルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドは、アミノ酸配列配列番号２と少なくとも９５％、例えば少なくとも９７％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態によると、アデニル酸イソペンテニルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列を含む。

【0103】

幾つかの実施形態によると、アデニル酸イソペンテニルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドは、アミノ酸配列配列番号３と少なくとも５０％、例えば少なくとも５５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態によると、アデニル酸イソペンテニルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドは、アミノ酸配列配列番号３と少なくとも６０％、例えば少なくとも６５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態によると、アデニル酸イソペンテニルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドは、アミノ酸配列配列番号３と少なくとも７０％、例えば少なくとも７５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態によると、アデニル酸イソペンテニルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドは、アミノ酸配列配列番号３と少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態によると、アデニル酸イソペンテニルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドは、アミノ酸配列配列番号３と少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態によると、アデニル酸イソペンテニルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドは、アミノ酸配列配列番号３と少なくとも９５％、例えば少なくとも９７％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態によると、アデニル酸イソペンテニルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号３のアミノ酸配列を含む。

【0104】

幾つかの実施形態によると、アデニル酸イソペンテニルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドは、アミノ酸配列配列番号４と少なくとも５０％、例えば少なくとも５５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態によると、アデニル酸イソペンテニルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドは、アミノ酸配列配列番号４と少なくとも６０％、例えば少なくとも６５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態によると、アデニル酸イソペンテニルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドは、アミノ酸配列配列番号４と少なくとも７０％、例えば少なくとも７５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態によると、アデニル酸イソペンテニルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドは、アミノ酸配列配列番号４と少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態によると、アデニル酸イソペンテニルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドは、アミノ酸配列配列番号４と少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態によると、アデニル酸イソペンテニルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドは、アミノ酸配列配列番号４と少なくとも９５％、例えば少なくとも９７％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態によると、アデニル酸イソペンテニルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号４のアミノ酸配列を含む。

【0105】

幾つかの実施形態によると、アデニル酸イソペンテニルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドは、アミノ酸配列配列番号５と少なくとも５０％、例えば少なくとも５５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態によると、アデニル酸イソペンテニルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドは、アミノ酸配列配列番号５と少なくとも６０％、例えば少なくとも６５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態によると、アデニル酸イソペンテニルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドは、アミノ酸配列配列番号５と少なくとも７０％、例えば少なくとも７５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態によると、アデニル酸イソペンテニルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドは、アミノ酸配列配列番号５と少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態によると、アデニル酸イソペンテニルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドは、アミノ酸配列配列番号５と少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態によると、アデニル酸イソペンテニルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドは、アミノ酸配列配列番号５と少なくとも９５％、例えば少なくとも９７％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態によると、アデニル酸イソペンテニルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号５のアミノ酸配列を含む。

【0106】

幾つかの実施形態によると、アデニル酸イソペンテニルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドは、アミノ酸配列配列番号６と少なくとも５０％、例えば少なくとも５５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態によると、アデニル酸イソペンテニルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドは、アミノ酸配列配列番号６と少なくとも６０％、例えば少なくとも６５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態によると、アデニル酸イソペンテニルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドは、アミノ酸配列配列番号６と少なくとも７０％、例えば少なくとも７５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態によると、アデニル酸イソペンテニルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドは、アミノ酸配列配列番号６と少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態によると、アデニル酸イソペンテニルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドは、アミノ酸配列配列番号６と少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態によると、アデニル酸イソペンテニルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドは、アミノ酸配列配列番号６と少なくとも９５％、例えば少なくとも９７％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態によると、アデニル酸イソペンテニルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号６のアミノ酸配列を含む。

【0107】

幾つかの実施形態によると、アデニル酸イソペンテニルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドは、アミノ酸配列配列番号７と少なくとも５０％、例えば少なくとも５５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態によると、アデニル酸イソペンテニルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドは、アミノ酸配列配列番号７と少なくとも６０％、例えば少なくとも６５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態によると、アデニル酸イソペンテニルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドは、アミノ酸配列配列番号７と少なくとも７０％、例えば少なくとも７５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態によると、アデニル酸イソペンテニルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドは、アミノ酸配列配列番号７と少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態によると、アデニル酸イソペンテニルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドは、アミノ酸配列配列番号７と少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態によると、アデニル酸イソペンテニルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドは、アミノ酸配列配列番号７と少なくとも９５％、例えば少なくとも９７％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態によると、アデニル酸イソペンテニルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号７のアミノ酸配列を含む。

【0108】

幾つかの実施形態によると、アデニル酸イソペンテニルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドは、アミノ酸配列配列番号８と少なくとも５０％、例えば少なくとも５５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態によると、アデニル酸イソペンテニルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドは、アミノ酸配列配列番号８と少なくとも６０％、例えば少なくとも６５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態によると、アデニル酸イソペンテニルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドは、アミノ酸配列配列番号８と少なくとも７０％、例えば少なくとも７５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態によると、アデニル酸イソペンテニルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドは、アミノ酸配列配列番号８と少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態によると、アデニル酸イソペンテニルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドは、アミノ酸配列配列番号８と少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態によると、アデニル酸イソペンテニルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドは、アミノ酸配列配列番号８と少なくとも９５％、例えば少なくとも９７％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態によると、アデニル酸イソペンテニルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号８のアミノ酸配列を含む。

【0109】

幾つかの実施形態によると、アデニル酸イソペンテニルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドは、アミノ酸配列配列番号９と少なくとも５０％、例えば少なくとも５５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態によると、アデニル酸イソペンテニルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドは、アミノ酸配列配列番号９と少なくとも６０％、例えば少なくとも６５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態によると、アデニル酸イソペンテニルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドは、アミノ酸配列配列番号９と少なくとも７０％、例えば少なくとも７５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態によると、アデニル酸イソペンテニルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドは、アミノ酸配列配列番号９と少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態によると、アデニル酸イソペンテニルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドは、アミノ酸配列配列番号９と少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態によると、アデニル酸イソペンテニルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドは、アミノ酸配列配列番号９と少なくとも９５％、例えば少なくとも９７％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態によると、アデニル酸イソペンテニルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号９のアミノ酸配列を含む。

【0110】

幾つかの実施形態によると、アデニル酸イソペンテニルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドは、アミノ酸配列配列番号１０と少なくとも５０％、例えば少なくとも５５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態によると、アデニル酸イソペンテニルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドは、アミノ酸配列配列番号１０と少なくとも６０％、例えば少なくとも６５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態によると、アデニル酸イソペンテニルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドは、アミノ酸配列配列番号１０と少なくとも７０％、例えば少なくとも７５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態によると、アデニル酸イソペンテニルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドは、アミノ酸配列配列番号１０と少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態によると、アデニル酸イソペンテニルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドは、アミノ酸配列配列番号１０と少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態によると、アデニル酸イソペンテニルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドは、アミノ酸配列配列番号１０と少なくとも９５％、例えば少なくとも９７％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態によると、アデニル酸イソペンテニルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号１０のアミノ酸配列を含む。

【0111】

アデニル酸イソペンテニルトランスフェラーゼ活性を決定する手法は、当業者に既知である。例示的な方法は、例えばTakei, Sakakibara, and Sugiyama (2001)およびFrebortova, Greplova et al, (2015)に記載されている。アデニル酸イソペンテニルトランスフェラーゼ活性は、例えば以下のアッセイのいずれかに従って決定することができる：

【0112】

（１）酵素を、１ｍＭ ＡＭＰおよび３４０μＭ ＤＭＡＰＰを含む反応混合物（１Ｍベタイン、２０ｍＭトリエタノールアミン、５０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１ｍＭジチオスレイトール、１ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン、ｐＨ８．０）中にて２５℃で２０分間インキュベートする。１／４量の１０％アセテートの添加によって反応を停止させ、１８，０００×ｇで２０分間遠心分離する。得られた上清をサイトカイニン分析に供する。１単位のＩＰＴ活性は、反応の条件下で１分当たり１μｍｏｌのｉＰＭＰを生成する酵素の量として定義される（Takei, Sakakibara, and Sugiyama 2001）。

【0113】

（２）活性アッセイを、基質としての１００μＭ ＡＭＰおよび１００μＭ ＤＭＡＰＰ（Echelon BioSciences，Salt Lake City，UT，USA）、ならびに１００μｌの精製酵素を含む２００μｌの反応混合物（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌバッファー、ｐＨ７．５、１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２含有）中にて２５℃で一晩行う。ＩＰＴの基質選好性を評価するために、ＡＤＰまたはＡＴＰをイソプレン鎖受容基質として使用し、イソペンテニル二リン酸またはＨＭＢＰＰ（Echelon Biosciences）をイソプレン鎖供与基質として使用する。反応をイソプレノイド基質の添加によって開始し、９５℃に５分間加熱して酵素を不活性化することによって停止させる。ＩＰＴ活性アッセイは、ＨＰＬＣまたはキャピラリー電気泳動による反応生成物の決定と２６８ｎｍでのＵＶ検出とに基づく。サイトカイニンリボシドおよび対応する一リン酸を、Ａｌｌｉａｎｃｅ ２６９５高速液体クロマトグラフ（Waters）に接続したＳｙｍｍｅｔｒｙ Ｃ１８カラム（２．１×１５０ｍｍ、５μｍ；Waters，Milford，MA，USA）で決定する。カラムは、以下の溶媒混合物を用いる１５ｍＭギ酸アンモニウム、ｐＨ４．０（Ａ）およびメタノール（Ｂ）の線形勾配によって溶出させた：０～２５分、５～６０％のＢ、２５～２６分、６０～１００％のＢ、２６～２７分、１００％のＢ。１５ｍＭギ酸アンモニウム、ｐＨ４．０（Ａ）およびアセトニトリル（Ｂ）の線形勾配をオリゴリボヌクレオチド加水分解物の分析に用いた（０～３０分、５～２４％のＢ、３０～３１分、２４～１００％のＢ）。流量は０．２５ｍｌ／分であり、カラム温度は３０℃である。生成物の濃度を、真正標準化合物（Olchemim，Olomouc，Czech Republic）を用いた検量線法により決定する。キャピラリー電気泳動をサイトカイニン二リン酸および三リン酸の決定に用いる（Frebortova, Greplova et al, 2015）。

【0114】

アデニル酸イソペンテニルトランスフェラーゼ活性を有する異種ポリペプチドを発現する以外に、本発明の細菌は任意に、サイトカイニンリボシド５’－一リン酸ホスホリボヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドのタンパク質発現が、改変を有しないが、それ以外は同一の細菌と比較して増加するように（さらに）改変されてもよい。

【0115】

したがって、幾つかの実施形態によると、本発明の細菌は、アデニル酸イソペンテニルトランスフェラーゼ活性を有する異種ポリペプチドを発現し、サイトカイニンリボシド５’－一リン酸ホスホリボヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドのタンパク質発現が、改変を有しないが、それ以外は同一の細菌と比較して増加するように改変されている。

【0116】

「タンパク質発現の増加」とは、このように改変された細菌が産生するサイトカイニンリボシド５’－一リン酸ホスホリボヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドの量が、改変を有しないが、それ以外は同一の細菌と比較して増加することを意味する。より詳細には、「発現の増加」とは、このように改変された細菌が産生するサイトカイニンリボシド５’－一リン酸ホスホリボヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドの量が、改変を有しないが、それ以外は同一の細菌と比較して少なくとも１０％、例えば少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも１５０％、少なくとも２００％、少なくとも３００％、少なくとも４００％、少なくとも５００％、少なくとも６００％、少なくとも７００％、少なくとも８００％、少なくとも約９００％、少なくとも約１０００％、少なくとも約２０００％、少なくとも約３０００％、少なくとも約４０００％、少なくとも約５０００％、少なくとも約６０００％、少なくとも約７０００％、少なくとも約８０００％、少なくとも約９０００％または少なくとも約１００００％増加することを意味する。所与の細胞におけるタンパク質の量は、当該技術分野で既知の任意の好適な定量化技術、例えばＥＬＩＳＡ、免疫組織化学またはウエスタンブロッティングによって決定することができる。

【0117】

タンパク質発現の増加は、当業者に既知の任意の好適な手段によって達成することができる。例えば、タンパク質発現の増加は、例えば細菌においてｍＲＮＡ分子の産生を引き起こすように機能するプロモーターに操作可能に連結した、サイトカイニンリボシド５’－一リン酸ホスホリボヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を含むベクター等の外因性核酸を細菌に導入することにより、細菌におけるサイトカイニンリボシド５’－一リン酸ホスホリボヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子のコピー数を増加させることによって達成することができる。

【0118】

タンパク質発現の増加は、サイトカイニンリボシド５’－一リン酸ホスホリボヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子の少なくとも第２のコピーを細菌のゲノムに組み込むことによっても達成することができる。

【0119】

タンパク質発現の増加は、例えばネイティブプロモーターを、ネイティブプロモーターと比較してポリペプチドのより高い発現および過剰産生を可能にするプロモーターに置き換えることにより、サイトカイニンリボシド５’－一リン酸ホスホリボヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子に操作可能に連結したプロモーターの強度を増大させることによっても達成することができる。使用され得るプロモーターとしては、バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・アミロリクエファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）等に由来する天然プロモーター、例えばＰ４３、Ｐ１５、Ｐｖｅｇ、Ｐｙｌｂ、ＰｇｒｏＥＳ、ＰｓｉｇＸ、ＰｔｒｎＱ、Ｐｐｓｔ、ＰｓｏｄＡ、ＰｒｐｓＦ、ＰｌｅｐＡ、ＰｌｉａＧ、ＰｒｐｓＦ、Ｐｐｓｔ、ＰｆｕｓＡ、ＰｓｏｄＡ、Ｐｈａｇ、ならびにバチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）で活性な人工プロモーター、または誘導性バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）プロモーター、例えばＰｍｔｌＡ、Ｐｓｐａｃ、ＰｘｙｌＡ、ＰｓａｃＢ等が挙げられる。更なる例としては、コリネバクテリウム由来の天然プロモーター、例えばＰ ＣＰ＿２４５４、ＰｔｕｆおよびＰｓｏｄ、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来の天然プロモーター、例えばＴ７、ＰａｒａＢＡＤ、Ｐｌａｃ、ＰｔａｃおよびＰｔｒｃ、ならびにコリネファージＢＦＫ２０に由来するプロモーターＰ Ｆ１が挙げられる。

【0120】

タンパク質発現の増加は、サイトカイニンリボシド５’－一リン酸ホスホリボヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするｍＲＮＡ分子上のリボソーム結合部位を改変することによっても達成することができる。リボソーム結合部位の配列を改変することで、翻訳開始速度を高め、それにより翻訳効率を向上させることができる。

【0121】

幾つかの実施形態によると、遺伝子のコピー数の増加は、宿主細胞においてｍＲＮＡ分子の産生を引き起こすように機能するプロモーターに操作可能に連結した遺伝子を含む１つ以上の（例えば２つまたは３つの）外因性核酸分子（例えば１つ以上のベクター）を細菌に導入することによって達成される。

【0122】

幾つかの実施形態によると、本発明の細菌は、サイトカイニンリボシド５’－一リン酸ホスホリボヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする１つ以上の（例えば２つ、３つまたは４つの）ヌクレオチド配列を含む外因性核酸分子（ベクター等）を含む。好適には、外因性核酸分子は、細菌においてｍＲＮＡ分子の産生を引き起こすように機能し、上記サイトカイニンリボシド５’－一リン酸ホスホリボヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に操作可能に連結したプロモーターをさらに含む。幾つかの実施形態によると、外因性核酸分子は、細菌のゲノムに安定に組み込まれる。

【0123】

サイトカイニンリボシド５’－一リン酸ホスホリボヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドは、サイトカイニンリボシド５’－一リン酸ホスホリボヒドロラーゼとして酵素機能を有するサイトカイニン活性化酵素である。かかるポリペプチドは、ロンリーガイ（ＬＯＧ）タンパク質とも称され、広範な生物のゲノムにコードされ、ＬＯＧタンパク質の大部分が原核生物のものである。オリザ・サティバ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）、アラビドプシス・サリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）、クラビセプス・プルプレア（Ｃｌａｖｉｃｅｐｓ ｐｕｒｐｕｒｅａ）、マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）およびコリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）等の幾つかの生物に由来する酵素が、生化学的および機能的研究によってＬＯＧとして特徴付けられている。ＬＯＧタンパク質は当初、植物ホルモン活性化植物酵素として特徴付けられ、細菌ＬＯＧホモログは、実験的証拠なしに誤って推定リジンデカルボキシラーゼ（ＬＤＣ）に指定された。それらの真の酵素活性は近年、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ホモログの機能分析によって確認された（Seo et al. 2016）。細菌では、二量体のＩ型ＬＯＧおよび六量体のＩＩ型ＬＯＧの２種類のＬＯＧタンパク質が同定された。ＩＩ型ＬＯＧタンパク質は、オリゴマー状態およびプレニル結合部位の残基が異なる。Ｉ型ＬＯＧは、Ｉａ型およびＩｂ型の２つのサブグループにさらに分類することができる。Ｉａ型は殆どの生物に由来する二量体ＬＯＧを含み、Ｉｂ型は放線菌目に由来する二量体ＬＯＧを含む。ＩＩ型ＬＯＧは、殆どの生物に由来する六量体ＬＯＧを含むＩＩａ型と、高等植物に由来するＬＯＧを含むＩＩｂ型とに分類される（Seo and Kim 2017）。

【0124】

ＬＯＧタンパク質は、ｉＰＲＭＰまたはｔｒａｎｓ－ゼアチンリボシド５’－一リン酸（ｔＺＲＭＰ）等のサイトカイニン前駆体におけるＮ^６置換塩基とリボース５’－一リン酸との間の結合の加水分解である脱ホスホリボシル化によって活性サイトカイニンを生成する。Ｃ．グルタミカム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ＬＯＧは、２つの同一の単量体から構成され、中央のβ－シートが７本の平行β－ストランドによって形成され、これが８つのα－ヘリックスで囲まれる。ＬＯＧタンパク質は、活性部位の形成に寄与する「ＰＧＧＸＧＴＸＸＥ」モチーフを含む。活性部位は二量体のポケットに形成され、保存された「ＰＧＧＸＧＴＸＸＥ」モチーフがポケットの表面に存在する。「ＰＧＧＸＧＴＸＸＥ」モチーフはヌクレオチド結合部位であり、保存された残基が、結合したＡＭＰを安定させる（Seo et al. 2016）。このモチーフは、全てのＬＯＧ酵素で高度に保存されている（Seo and Kim 2017）。

【0125】

サイトカイニンリボシド５’－一リン酸ホスホリボヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドは、それが発現される細菌と同じ種に由来していても、またはそれが発現される細菌とは異なる種に由来していてもよい（すなわち異種である）。幾つかの実施形態によると、サイトカイニンリボシド５’－一リン酸ホスホリボヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドは、それが発現される細菌と同じ種に由来する。幾つかの実施形態によると、サイトカイニンリボシド５’－一リン酸ホスホリボヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドは、それが発現される細菌とは異なる種に由来する（すなわち異種である）。

【0126】

幾つかの実施形態によると、サイトカイニンリボシド５’－一リン酸ホスホリボヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドは、サイトカイニンリボシド５’－一リン酸ホスホリボヒドロラーゼ活性を有する細菌ポリペプチドである。「サイトカイニンリボシド５’－一リン酸ホスホリボヒドロラーゼ活性を有する細菌ポリペプチド」とは、サイトカイニンリボシド５’－一リン酸ホスホリボヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドが、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）等の細菌に自然由来することを意味する。

【0127】

本発明に従って使用されるサイトカイニンリボシド５’－一リン酸ホスホリボヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドは例えば、ｉ）配列番号３４～６２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むポリペプチド；およびｉｉ）配列番号３４～６２のいずれか１つのアミノ酸配列に対して少なくとも約７０％、例えば少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９３％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドからなる群から選択される、サイトカイニンリボシド５’－一リン酸ホスホリボヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドであり得る。

【0128】

本発明に従って使用されるサイトカイニンリボシド５’－一リン酸ホスホリボヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドは例えば、ｉ）配列番号３４～４４のいずれか１つのアミノ酸配列を含むポリペプチド；およびｉｉ）配列番号３４～４４のいずれか１つのアミノ酸配列に対して少なくとも約７０％、例えば少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９３％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドからなる群から選択される、サイトカイニンリボシド５’－一リン酸ホスホリボヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドであり得る。

【0129】

幾つかの実施形態によると、サイトカイニンリボシド５’－一リン酸ホスホリボヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号３４のアミノ酸配列または配列番号３４と少なくとも７０％、例えば少なくとも７５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態によると、サイトカイニンリボシド５’－一リン酸ホスホリボヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号３４のアミノ酸配列または配列番号３４と少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態によると、サイトカイニンリボシド５’－一リン酸ホスホリボヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号３４のアミノ酸配列または配列番号３４と少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態によると、サイトカイニンリボシド５’－一リン酸ホスホリボヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号３４のアミノ酸配列を含む。

【0130】

幾つかの実施形態によると、サイトカイニンリボシド５’－一リン酸ホスホリボヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号３５のアミノ酸配列または配列番号３５と少なくとも７０％、例えば少なくとも７５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態によると、サイトカイニンリボシド５’－一リン酸ホスホリボヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号３５のアミノ酸配列または配列番号３５と少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態によると、サイトカイニンリボシド５’－一リン酸ホスホリボヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号３５のアミノ酸配列または配列番号３５と少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態によると、サイトカイニンリボシド５’－一リン酸ホスホリボヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号３５のアミノ酸配列を含む。

【0131】

幾つかの実施形態によると、サイトカイニンリボシド５’－一リン酸ホスホリボヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号３６のアミノ酸配列または配列番号３６と少なくとも７０％、例えば少なくとも７５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態によると、サイトカイニンリボシド５’－一リン酸ホスホリボヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号３６のアミノ酸配列または配列番号３６と少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態によると、サイトカイニンリボシド５’－一リン酸ホスホリボヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号３６のアミノ酸配列または配列番号３６と少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態によると、サイトカイニンリボシド５’－一リン酸ホスホリボヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号３６のアミノ酸配列を含む。

【0132】

幾つかの実施形態によると、サイトカイニンリボシド５’－一リン酸ホスホリボヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号３７のアミノ酸配列または配列番号３７と少なくとも７０％、例えば少なくとも７５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態によると、サイトカイニンリボシド５’－一リン酸ホスホリボヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号３７のアミノ酸配列または配列番号３７と少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態によると、サイトカイニンリボシド５’－一リン酸ホスホリボヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号３７のアミノ酸配列または配列番号３７と少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態によると、サイトカイニンリボシド５’－一リン酸ホスホリボヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号３７のアミノ酸配列を含む。

【0133】

幾つかの実施形態によると、サイトカイニンリボシド５’－一リン酸ホスホリボヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号３８のアミノ酸配列または配列番号３８と少なくとも７０％、例えば少なくとも７５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態によると、サイトカイニンリボシド５’－一リン酸ホスホリボヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号３８のアミノ酸配列または配列番号３８と少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態によると、サイトカイニンリボシド５’－一リン酸ホスホリボヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号３８のアミノ酸配列または配列番号３８と少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態によると、サイトカイニンリボシド５’－一リン酸ホスホリボヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号３８のアミノ酸配列を含む。

【0134】

幾つかの実施形態によると、サイトカイニンリボシド５’－一リン酸ホスホリボヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号３９のアミノ酸配列または配列番号３９と少なくとも７０％、例えば少なくとも７５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態によると、サイトカイニンリボシド５’－一リン酸ホスホリボヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号３９のアミノ酸配列または配列番号３９と少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態によると、サイトカイニンリボシド５’－一リン酸ホスホリボヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号３９のアミノ酸配列または配列番号３９と少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態によると、サイトカイニンリボシド５’－一リン酸ホスホリボヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号３９のアミノ酸配列を含む。

【0135】

幾つかの実施形態によると、サイトカイニンリボシド５’－一リン酸ホスホリボヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号４０のアミノ酸配列または配列番号４０と少なくとも７０％、例えば少なくとも７５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態によると、サイトカイニンリボシド５’－一リン酸ホスホリボヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号４０のアミノ酸配列または配列番号４０と少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態によると、サイトカイニンリボシド５’－一リン酸ホスホリボヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号４０のアミノ酸配列または配列番号４０と少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態によると、サイトカイニンリボシド５’－一リン酸ホスホリボヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号４０のアミノ酸配列を含む。

【0136】

幾つかの実施形態によると、サイトカイニンリボシド５’－一リン酸ホスホリボヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号４１のアミノ酸配列または配列番号４１と少なくとも７０％、例えば少なくとも７５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態によると、サイトカイニンリボシド５’－一リン酸ホスホリボヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号４１のアミノ酸配列または配列番号４１と少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態によると、サイトカイニンリボシド５’－一リン酸ホスホリボヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号４１のアミノ酸配列または配列番号４１と少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態によると、サイトカイニンリボシド５’－一リン酸ホスホリボヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号４１のアミノ酸配列を含む。

【0137】

幾つかの実施形態によると、サイトカイニンリボシド５’－一リン酸ホスホリボヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号４２のアミノ酸配列または配列番号４２と少なくとも７０％、例えば少なくとも７５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態によると、サイトカイニンリボシド５’－一リン酸ホスホリボヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号４２のアミノ酸配列または配列番号４２と少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態によると、サイトカイニンリボシド５’－一リン酸ホスホリボヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号４２のアミノ酸配列または配列番号４２と少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態によると、サイトカイニンリボシド５’－一リン酸ホスホリボヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号４２のアミノ酸配列を含む。

【0138】

幾つかの実施形態によると、サイトカイニンリボシド５’－一リン酸ホスホリボヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号４３のアミノ酸配列または配列番号４３と少なくとも７０％、例えば少なくとも７５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態によると、サイトカイニンリボシド５’－一リン酸ホスホリボヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号４３のアミノ酸配列または配列番号４３と少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態によると、サイトカイニンリボシド５’－一リン酸ホスホリボヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号４３のアミノ酸配列または配列番号４３と少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態によると、サイトカイニンリボシド５’－一リン酸ホスホリボヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号４３のアミノ酸配列を含む。

【0139】

幾つかの実施形態によると、サイトカイニンリボシド５’－一リン酸ホスホリボヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号４４のアミノ酸配列または配列番号４４と少なくとも７０％、例えば少なくとも７５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態によると、サイトカイニンリボシド５’－一リン酸ホスホリボヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号４４のアミノ酸配列または配列番号４４と少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態によると、サイトカイニンリボシド５’－一リン酸ホスホリボヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号４４のアミノ酸配列または配列番号４４と少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態によると、サイトカイニンリボシド５’－一リン酸ホスホリボヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号４４のアミノ酸配列を含む。

【0140】

サイトカイニンリボシド５’－一リン酸ホスホリボヒドロラーゼ活性を決定する手法は、当業者に既知である。例示的な方法は、例えばSeo et al. (2016)に記載されている。サイトカイニンリボシド５’－一リン酸ホスホリボヒドロラーゼ活性は、例えば以下の方法に従って決定することができる：

【0141】

ホスホリボヒドロラーゼ活性は、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）法によって分離されたアデニン環化合物を検出することによって決定される。酵素反応を２０ｍＭ ＡＭＰ、３６ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．０および２３μＭ精製酵素の混合物中にて３０℃で行った後、混合物を９５℃で１．５分間加熱することによって反応を停止させる。次いで、反応混合物をＰＥＩ－セルロース－ＦプラスチックＴＬＣシート（Merck Millipore）上に点着する。移動相は１Ｍ塩化ナトリウムである。ＴＬＣチャンバーにおいて展開した後、シートを完全に乾燥させる。アデニン環を含む化合物をＵＶランプ（２９０ｎｍ）によって検出する（Seo et al. 2016）。

【0142】

イソプレノイドサイトカイニンのイソペンテニル側鎖前駆体の供給量を増加させるために、メチルエリスリトール４－リン酸（ＭＥＰ）経路を経る代謝フラックスを増加させてもよい。これは、主に１－デオキシ－Ｄ－キシルロース５－リン酸（ＤＸＰ）シンターゼ（ＤＸＳ）の過剰発現によって達成される。

【0143】

したがって、幾つかの実施形態によると、本発明の細菌は、１－デオキシ－Ｄ－キシルロース－５－リン酸シンターゼ活性を有するポリペプチドのタンパク質発現が、改変を有しないが、それ以外は同一の細菌と比較して増加するように（さらに）改変されていることを特徴とする。

【0144】

「タンパク質発現の増加」とは、このように改変された細菌が産生する１－デオキシ－Ｄ－キシルロース－５－リン酸シンターゼ活性を有するポリペプチドの量が、改変を有しないが、それ以外は同一の細菌と比較して増加することを意味する。より詳細には、「発現の増加」とは、改変された細菌が産生する１－デオキシ－Ｄ－キシルロース－５－リン酸シンターゼ活性を有するポリペプチドの量が、改変を有しないが、それ以外は同一の細菌と比較して少なくとも１０％、例えば少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも１５０％、少なくとも２００％、少なくとも３００％、少なくとも４００％、少なくとも５００％、少なくとも６００％、少なくとも７００％、少なくとも８００％、少なくとも約９００％、少なくとも約１０００％、少なくとも約２０００％、少なくとも約３０００％、少なくとも約４０００％、少なくとも約５０００％、少なくとも約６０００％、少なくとも約７０００％、少なくとも約８０００％、少なくとも約９０００％または少なくとも約１００００％増加することを意味する。所与の細胞におけるタンパク質の量は、当該技術分野で既知の任意の好適な定量化技術、例えばＥＬＩＳＡ、免疫組織化学またはウエスタンブロッティングによって決定することができる。

【0145】

タンパク質発現の増加は、当業者に既知の任意の好適な手段によって達成することができる。例えば、タンパク質発現の増加は、例えば細菌においてｍＲＮＡ分子の産生を引き起こすように機能するプロモーターに操作可能に連結した、１－デオキシ－Ｄ－キシルロース－５－リン酸シンターゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を含むベクター等の外因性核酸を細菌に導入することにより、細菌における１－デオキシ－Ｄ－キシルロース－５－リン酸シンターゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子のコピー数を増加させることによって達成することができる。

【0146】

タンパク質発現の増加は、１－デオキシ－Ｄ－キシルロース－５－リン酸シンターゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子の少なくとも第２のコピーを細菌のゲノムに組み込むことによっても達成することができる。

【0147】

タンパク質発現の増加は、例えばネイティブプロモーターを、ネイティブプロモーターと比較してポリペプチドのより高い発現および過剰産生を可能にするプロモーターに置き換えることにより、１－デオキシ－Ｄ－キシルロース－５－リン酸シンターゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子に操作可能に連結したプロモーターの強度を増大させることによっても達成することができる。使用され得るプロモーターとしては、バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・アミロリクエファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）等に由来する天然プロモーター、例えばＰ４３、Ｐ１５、Ｐｖｅｇ、Ｐｙｌｂ、ＰｇｒｏＥＳ、ＰｓｉｇＸ、ＰｔｒｎＱ、Ｐｐｓｔ、ＰｓｏｄＡ、ＰｒｐｓＦ、ＰｌｅｐＡ、ＰｌｉａＧ、ＰｒｐｓＦ、Ｐｐｓｔ、ＰｆｕｓＡ、ＰｓｏｄＡ、Ｐｈａｇ、ならびにバチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）で活性な人工プロモーター、または誘導性バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）プロモーター、例えばＰｍｔｌＡ、Ｐｓｐａｃ、ＰｘｙｌＡ、ＰｓａｃＢ等が挙げられる。更なる例としては、コリネバクテリウム由来の天然プロモーター、例えばＰ ＣＰ＿２４５４、ＰｔｕｆおよびＰｓｏｄ、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来の天然プロモーター、例えばＴ７、ＰａｒａＢＡＤ、Ｐｌａｃ、ＰｔａｃおよびＰｔｒｃ、ならびにコリネファージＢＦＫ２０に由来するプロモーターＰ Ｆ１が挙げられる。

【0148】

タンパク質発現の増加は、１－デオキシ－Ｄ－キシルロース－５－リン酸シンターゼ活性を有するポリペプチドをコードするｍＲＮＡ分子上のリボソーム結合部位を改変することによっても達成することができる。リボソーム結合部位の配列を改変することで、翻訳開始速度を高め、それにより翻訳効率を向上させることができる。

【0149】

幾つかの実施形態によると、遺伝子のコピー数の増加は、細菌においてｍＲＮＡ分子の産生を引き起こすように機能するプロモーターに操作可能に連結した遺伝子を含む１つ以上の（例えば２つまたは３つの）外因性核酸分子（例えば１つ以上のベクター）を細菌に導入することによって達成される。

【0150】

幾つかの実施形態によると、本発明の細菌は、１－デオキシ－Ｄ－キシルロース－５－リン酸シンターゼ活性を有するポリペプチドをコードする１つ以上の（例えば２つ、３つまたは４つの）ヌクレオチド配列を含む外因性核酸分子（ベクター等）を含む。好適には、外因性核酸分子は、細菌においてｍＲＮＡ分子の産生を引き起こすように機能し、上記１－デオキシ－Ｄ－キシルロース－５－リン酸シンターゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に操作可能に連結したプロモーターをさらに含む。幾つかの実施形態によると、外因性核酸分子は、細菌のゲノムに安定に組み込まれる。

【0151】

１－デオキシ－Ｄ－キシルロース－５－リン酸シンターゼ活性を有するポリペプチドは、Ｄ－グリセルアルデヒド３－リン酸とピルビン酸との間の縮合を触媒して、１－デオキシ－Ｄ－キシルロース５－リン酸（ＤＸＰ）を生成する酵素である（ＤＸＳ；Ｅ．Ｃ．２．２．１．７）。ＤＸＳは、メチルエリスリトールリン酸（ＭＥＰ）経路におけるＨＭＢＤＰおよびＤＭＡＰＰのイソプレノイド生合成の最初の酵素段階を触媒し、そのｋｃａｔ／Ｋｍ値は、この経路の他の酵素よりも大幅に低い（Kuzuyama et al. 2000）。ＤＸＳは、真正細菌において単一コピーで存在するが、緑藻および高等植物は、ＤＸＳをコードする２つ以上の遺伝子を有し、これが３つの区別可能な群を形成する。高等植物では、異なるＤＸＳイソ酵素の発現は、組織の種類および発生段階によって決まる。

【0152】

ＤＸＳは、細菌および植物において高度に保存されている。そのタンパク質配列は、トランスケトラーゼおよびピルビン酸デヒドロゲナーゼＥ１サブユニットと約２０％の同一性を有する。３つ全ての酵素が同様の反応を触媒し、補酵素チアミンピロリン酸（ＴＰＰ）を必要とする。Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するＤＸＳは、３つのドメイン（Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩ）を含み、これらはトランスケトラーゼおよびピルビン酸デヒドロゲナーゼのＥ１サブユニット中の同等ドメインと相同である。２つのＤＸＳ単量体が二量体に並んで配置される。ドメインＩ（残基１～３１９）は、同じ単量体のドメインＩＩ（残基３２０～４９５）およびＩＩＩ（残基４９６～６２９）の上にある。３つ全てのドメインがα／βフォールドを有し、中央のほぼ平行なβ－シートがαヘリックス間にある。ドメインＩは５本鎖平行β－シートを含み、ドメインＩＩは６本鎖平行β－シートを含み、ドメインＩＩＩは５本鎖β－シートを含み、第１鎖が他の４本の鎖に対して逆平行である。ドメインＩは、Ｎ末端（残基１～４９）、第１鎖の後（残基８１～１２２）、および第４鎖と第５鎖との間の接続部（残基１８４～２５０）に幾つかの拡張表面セグメントを有する。

【0153】

ＤＸＳの活性部位は、同じ単量体中のドメインＩおよびＩＩの界面に位置する。２つのドメインの中央の平行β－シートのＣ末端は、互いに向かい合い、ＴＰＰ補酵素は、この界面のポケットの底に位置する。ＴＰＰのアミノピリミジン環は、ドメインＩＩと相互作用し、ピロリン酸基はドメインＩと相互作用する。チアゾリウム環のＣ２原子は、基質結合部位に露出する。Ｃ２原子は反応に関与する。ＴＰＰのピロリン酸基は、酵素と多数の極性相互作用を有する。活性部位は、２つのリン酸基の間に結合したマグネシウムイオンと、Ａｓｐ１５４、Ａｓｎ１８３およびＭｅｔ１８５の側鎖とから構成される。ＤＸＳのＧｌｙ１５３－Ａｓｐ－Ｇｌｙ１５５－Ａｓｎ１８３配列は、ＴＰＰ結合モチーフ≫ＧＤＧ－Ｘ（２５－３０）－Ｎ≪と一致する。Ｃ２はピルビン酸結合部位を構成する。ＧＡＰはポケット内に位置する（Xiang et al., 2007）。

【0154】

ＤＸＰの形成がＭＥＰ経路の律速段階であることが幾つかの研究により示されていることから、ＤＸＳ活性の増大は、多くの種と同様にＢ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）においてもテルペノイド生合成を増加させる最も効果的な戦略として認識されている（Yang et al. 2019）。Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）およびデイノコッカス・ラディオデュランス（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ）のＤｘｓにおける単一アミノ酸突然変異が、それらの触媒活性を増大させる。Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｄｘｓの突然変異Ｙ３９２Ｆは、野生型と比較して相対触媒活性を２．５倍増大させた（Xiang et al. 2012）。ＤＸＳは、ＭＥＰ経路の最終生成物であるＩＰＰおよびＤＭＡＰＰによるネガティブフィードバック機構によって調節される（Banerjee et al. 2013）。ＤＸＳは、ＩＰＰおよびＤＭＡＰＰのネガティブフィードバック阻害を緩和するために部位特異的突然変異誘発の対象となる。ポプルス・トリコカルパ（Ｐｏｐｕｌｕｓ ｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ）ＤＸＳのＡ１４７Ｇ／Ａ３５２Ｇでの突然変異は、そのＩＰＰ結合親和性を僅かに低下させたが、ＴＰＰおよびピルビン酸に対するＫｍを増加させ、酵素の触媒効率を約１５倍低下させた（Banerjee et al., 2016）。ＤＸＳ以外の経路の幾つかの他の酵素の過剰発現も試験され、種々の細菌において様々な結果が得られている。また、人工オペロン（オペロンｄｘｓ－ｉｓｐＤ－ｉｓｐＦ－ｉｓｐＨおよびｉｓｐＣ／ｄｘｒ－ｉｓｐＥ－ｉｓｐＧ－ｉｓｐＡ）としてのＭＥＰ経路全体の過剰発現が、Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）において試験されている（Xue et al. 2015）。

【0155】

１－デオキシ－Ｄ－キシルロース－５－リン酸シンターゼ活性を有するポリペプチドは、それが発現される細菌と同じ種に由来していても、またはそれが発現される細菌とは異なる種に由来していてもよい（すなわち異種である）。幾つかの実施形態によると、１－デオキシ－Ｄ－キシルロース－５－リン酸シンターゼ活性を有するポリペプチドは、それが発現される細菌と同じ種に由来する。幾つかの実施形態によると、１－デオキシ－Ｄ－キシルロース－５－リン酸シンターゼ活性を有するポリペプチドは、それが発現される細菌とは異なる種に由来する（すなわち異種である）。

【0156】

好ましくは、１－デオキシ－Ｄ－キシルロース－５－リン酸シンターゼ活性を有するポリペプチドは、１－デオキシ－Ｄ－キシルロース－５－リン酸シンターゼ活性を有する細菌ポリペプチドである。「１－デオキシ－Ｄ－キシルロース－５－リン酸シンターゼ活性を有する細菌ポリペプチド」とは、１－デオキシ－Ｄ－キシルロース－５－リン酸シンターゼ活性を有するポリペプチドが、バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）等の細菌に自然由来することを意味する。

【0157】

本発明に従って使用される１－デオキシ－Ｄ－キシルロース－５－リン酸シンターゼ活性を有するポリペプチドは例えば、ｉ）配列番号６３～７０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むポリペプチド；およびｉｉ）配列番号６３～７０のいずれか１つのアミノ酸配列に対して少なくとも約７０％、例えば少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９３％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドからなる群から選択される、１－デオキシ－Ｄ－キシルロース－５－リン酸シンターゼ活性を有するポリペプチドであり得る。

【0158】

幾つかの実施形態によると、１－デオキシ－Ｄ－キシルロース－５－リン酸シンターゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号６３のアミノ酸配列または配列番号６３と少なくとも７０％、例えば少なくとも７５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態によると、１－デオキシ－Ｄ－キシルロース－５－リン酸シンターゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号６３のアミノ酸配列または配列番号６３と少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態によると、１－デオキシ－Ｄ－キシルロース－５－リン酸シンターゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号６３のアミノ酸配列または配列番号６３と少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態によると、１－デオキシ－Ｄ－キシルロース－５－リン酸シンターゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号６３のアミノ酸配列を含む。

【0159】

幾つかの実施形態によると、１－デオキシ－Ｄ－キシルロース－５－リン酸シンターゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号６４のアミノ酸配列または配列番号６４と少なくとも７０％、例えば少なくとも７５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態によると、１－デオキシ－Ｄ－キシルロース－５－リン酸シンターゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号６４のアミノ酸配列または配列番号６４と少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態によると、１－デオキシ－Ｄ－キシルロース－５－リン酸シンターゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号６４のアミノ酸配列または配列番号６４と少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態によると、１－デオキシ－Ｄ－キシルロース－５－リン酸シンターゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号６４のアミノ酸配列を含む。

【0160】

幾つかの実施形態によると、１－デオキシ－Ｄ－キシルロース－５－リン酸シンターゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号６５のアミノ酸配列または配列番号６５と少なくとも７０％、例えば少なくとも７５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態によると、１－デオキシ－Ｄ－キシルロース－５－リン酸シンターゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号６５のアミノ酸配列または配列番号６５と少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態によると、１－デオキシ－Ｄ－キシルロース－５－リン酸シンターゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号６５のアミノ酸配列または配列番号６５と少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態によると、１－デオキシ－Ｄ－キシルロース－５－リン酸シンターゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号６５のアミノ酸配列を含む。

【0161】

幾つかの実施形態によると、１－デオキシ－Ｄ－キシルロース－５－リン酸シンターゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号６６のアミノ酸配列または配列番号６６と少なくとも７０％、例えば少なくとも７５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態によると、１－デオキシ－Ｄ－キシルロース－５－リン酸シンターゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号６６のアミノ酸配列または配列番号６６と少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態によると、１－デオキシ－Ｄ－キシルロース－５－リン酸シンターゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号６６のアミノ酸配列または配列番号６６と少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態によると、１－デオキシ－Ｄ－キシルロース－５－リン酸シンターゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号６６のアミノ酸配列を含む。

【0162】

幾つかの実施形態によると、１－デオキシ－Ｄ－キシルロース－５－リン酸シンターゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号６７のアミノ酸配列または配列番号６７と少なくとも７０％、例えば少なくとも７５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態によると、１－デオキシ－Ｄ－キシルロース－５－リン酸シンターゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号６７のアミノ酸配列または配列番号６７と少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態によると、１－デオキシ－Ｄ－キシルロース－５－リン酸シンターゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号６７のアミノ酸配列または配列番号６７と少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態によると、１－デオキシ－Ｄ－キシルロース－５－リン酸シンターゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号６７のアミノ酸配列を含む。

【0163】

幾つかの実施形態によると、１－デオキシ－Ｄ－キシルロース－５－リン酸シンターゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号６８のアミノ酸配列または配列番号６８と少なくとも７０％、例えば少なくとも７５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態によると、１－デオキシ－Ｄ－キシルロース－５－リン酸シンターゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号６８のアミノ酸配列または配列番号６８と少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態によると、１－デオキシ－Ｄ－キシルロース－５－リン酸シンターゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号６８のアミノ酸配列または配列番号６８と少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態によると、１－デオキシ－Ｄ－キシルロース－５－リン酸シンターゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号６８のアミノ酸配列を含む。

【0164】

上述のように、野生型ＤＸＳ配列の改変は、触媒活性を増大させ得る。したがって、本発明は、それが由来する野生型ＤＸＳ酵素と比較して増大した活性または不活性化したネガティブフィードバック機構を有する突然変異体ＤＸＳの使用を特に企図する。かかる突然変異体ＤＸＳ酵素の非限定的な例は、配列番号６９および７０に記載されている。

【0165】

幾つかの実施形態によると、１－デオキシ－Ｄ－キシルロース－５－リン酸シンターゼ活性を有するポリペプチドは、３９２位のアミノ酸がＹではなく、好ましくは３９２位のアミノ酸がＦであるという条件で、配列番号６９のアミノ酸配列または配列番号６９と少なくとも７０％、例えば少なくとも７５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態によると、１－デオキシ－Ｄ－キシルロース－５－リン酸シンターゼ活性を有するポリペプチドは、３９２位のアミノ酸がＹではなく、好ましくは３９２位のアミノ酸がＦであるという条件で、配列番号６９のアミノ酸配列または配列番号６９と少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態によると、１－デオキシ－Ｄ－キシルロース－５－リン酸シンターゼ活性を有するポリペプチドは、３９２位のアミノ酸がＹではなく、好ましくは３９２位のアミノ酸がＦであるという条件で、配列番号６９のアミノ酸配列または配列番号６９と少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態によると、１－デオキシ－Ｄ－キシルロース－５－リン酸シンターゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号６９のアミノ酸配列を含む。

【0166】

幾つかの実施形態によると、１－デオキシ－Ｄ－キシルロース－５－リン酸シンターゼ活性を有するポリペプチドは、３８９位のアミノ酸がＹではなく、好ましくは３８９位のアミノ酸がＦであるという条件で、配列番号７０のアミノ酸配列または配列番号７０と少なくとも７０％、例えば少なくとも７５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態によると、１－デオキシ－Ｄ－キシルロース－５－リン酸シンターゼ活性を有するポリペプチドは、３８９位のアミノ酸がＹではなく、好ましくは３８９位のアミノ酸がＦであるという条件で、配列番号７０のアミノ酸配列または配列番号７０と少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。幾つかの実施形態によると、１－デオキシ－Ｄ－キシルロース－５－リン酸シンターゼ活性を有するポリペプチドは、３８９位のアミノ酸がＹではなく、好ましくは３８９位のアミノ酸がＦであるという条件で、配列番号７０のアミノ酸配列または配列番号７０と少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態によると、１－デオキシ－Ｄ－キシルロース－５－リン酸シンターゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号７０のアミノ酸配列を含む。

【0167】

１－デオキシ－Ｄ－キシルロース－５－リン酸シンターゼ活性を決定する手法は、当業者に既知である。例示的な方法は、例えばKuzuyama et al (2000)およびKudoh et al (2017)に記載されている。１－デオキシ－Ｄ－キシルロース－５－リン酸シンターゼ活性は、例えば以下の方法に従って決定することができる：

【0168】

（１）１－デオキシ－Ｄ－キシルロース－５－リン酸シンターゼ活性をＤＸＳアッセイによって決定する（Kuzuyama et al., 2000）：標準アッセイ系は、０．５ｍｌの最終容量の１ｍＭ ＭｇＣｌ_２、２ｍＭ ｄｌ－ジチオスレイトール、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、２ｍＭ ｄｌ－グリセルアルデヒド３－リン酸および１５０μＭチアミン二リン酸を含有する１００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）からなる。酵素溶液を完全なアッセイ混合物に３７℃で添加することによって反応を開始し、１０分間のインキュベーション後に、１００℃で１分間のインキュベーションにより反応を停止させる。次に、反応混合物を５６℃で６０分間、アルカリホスファターゼで処理し、反応生成物であるＤＸＰを完全に脱リン酸化する。得られる脱リン酸化化合物である１－デオキシキシルロース（ＤＸ）の生成を、８０℃、１ｍｌ／分の流量にてＨ_２Ｏで溶出させるＳｈｏｄｅｘ ＫＳ－８０１（８ｍｍ×３００ｍｍ）カラム（昭和電工）を用いた屈折率分光計（モデルＲＩ－７１；昭和電工、東京、日本）によってモニタリングする。この条件下では８．６分でＤＸが溶出する。ＤＸ生成の量は、化学合成されたＤＸを標準として用いて正確に推定される。１単位のＤＸＳ活性は、３７℃で１分当たり１μｍｏｌのＤＸＰを生成した酵素の量として定義される。ＤＸＳによるＤＸＰの生成は、１ｍｌ／分の流量にて１００ｍＭ ＫＨ_２ＰＯ_４（ｐＨ３．５）で溶出させるＳｅｎｓｈｕ Ｐａｋ ＮＨ２－１２５１－Ｎ（４．６ｍｍ×２５０ｍｍ）カラム（株式会社センシュー科学、東京、日本）を用いた高速液体クロマトグラフィーによって１９５ｎｍでモニタリングする。この条件下では８．１分でＤＸＰが溶出する。

【0169】

（２）ＤＸＳの共役酵素アッセイ（Kudoh et al., 2017）：ＤＸＳ活性を、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来のＤＸＲを共役酵素とする共役酵素アッセイを用いて測定する。このアッセイでは、ＤＸＳ活性によって生成したＤＸＰをさらにＭＥＰに変換する。この段階ではＮＡＤＰＨが消費され、反応全体を３４０ｎｍで分光光度的に測定することができる。アッセイ混合物は、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．８）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、０．３ｍＭチアミンピロリン酸（ＴＰＰ）、１ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）、０．３ｍＭニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）、様々な濃度のピルビン酸ナトリウム（０．０５～５ｍＭ）およびＤ，Ｌ－ＧＡＰ（０．２～２．０ｍＭ）、ならびにＤＸＲ（１００または５０ｍｇ／ｍｌ）を含有する。混合物を温度制御分光光度計（モデルＵＶ－１８００、株式会社島津製作所、京都、日本）内にて３０℃で２分間インキュベートし、ＤＸＳサンプルに添加し（最終濃度５０または２５ｍｇ／ｍｌ）、反応を開始する。３４０ｎｍでの吸収を３０℃でモニタリングすることによって反応を追跡する。

【0170】

プリンヌクレオチドは、ＤＮＡおよびＲＮＡの構造成分、エネルギー担体（すなわちＡＴＰおよびＧＴＰ）、酵素の補助因子（すなわちＮＡＤ^＋およびＮＡＤＰ^＋）であるため、細胞生理に不可欠な代謝産物である。プリンヌクレオチドの合成は、Ｄ－リボース５－リン酸およびＡＴＰからの５’－ホスホリボシル－ピロリン酸（ＰＲＰＰ）の合成によって始まる。酵素ＰＲＰＰシンターゼ（リボース－リン酸ジホスホキナーゼ；ＥＣ ２．７．６．１）は、Ｄ－リボース５－リン酸へのＡＴＰのジホスホリル基の移行を触媒し、ＡＭＰが同時に形成される。ＰＲＰＰシンターゼは、自由生活生物に普遍的である。殆どの細菌は、ＰＲＰＰシンターゼをコードする遺伝子を１つ有するが、真核生物には２つ以上の遺伝子が存在する。次の段階は、ＰＲＰＰおよびグルタミンからの５－ホスホ－β－Ｄ－リボシルアミンの合成であり、Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ではｐｕｒＦにコードされるグルタミン５－ホスホリボシル－１－ピロリン酸（ＰＲＰＰ）アミドトランスフェラーゼ（アミドホスホリボシルトランスフェラーゼ；ＥＣ ２．４．２．１４）によって触媒される。これはプリンｄｅ ｎｏｖｏ合成の律速反応である。５－ホスホ－β－Ｄ－リボシルアミンからイノシン－５－リン酸（ＩＭＰ）の合成をもたらす更なる１０段階は、ｐｕｒオペロンにコードされる酵素によって触媒される。ｐｕｒオペロンは、ｐｕｒＲにコードされるＰｕｒＲリプレッサーによって転写レベルで負に調節され、また影響を受ける遺伝子の上流の制御領域にある特定のＤＮＡ配列であるＰｕｒＢｏｘによって調節される。ＩＭＰは、ＡＭＰとＧＭＰとの合成の分岐点である。ＡＭＰは、ＰｕｒＡおよびＰｕｒＢによって触媒される２つの酵素段階でＩＭＰから合成されるが、ＧＭＰは、ＧｕａＢおよびＧｕａＡによってＩＭＰから合成される。プリン合成の酵素をコードする遺伝子またはオペロンの発現は、成長培地中のプリン塩基およびヌクレオシドによって調節される。酵素ＰＲＰＰシンテターゼ、ＰＲＰＰアミドトランスフェラーゼ、アデニロコハク酸シンテターゼおよびＩＭＰデヒドロゲナーゼは、経路の最終生成物のフィードバック阻害によって調節される。ＰｕｒＲリプレッサーは、転写の開始を阻害する。サルベージ経路は、ヒポキサンチン、グアニンおよびアデニンを用いて対応するモノヌクレオチドＡＭＰおよびＧＭＰを生成することにも関与する。

【0171】

プリンヌクレオチド生合成経路は、一次代謝におけるプリンヌクレオチドの役割のためによく研究されている。これにはｄｅ ｎｏｖｏ合成経路およびサルベージ経路の両方が含まれる。転写および代謝レベルでのプリンヌクレオチド生合成経路の脱調節により、プリンヌクレオチド生合成経路を経る代謝の流れが促進され、その結果、プリンヌクレオチド生合成経路から直接生じる生成物：イノシン、グアノシン、アデノシンおよびリボフラビンの収率が高まる。プリンヌクレオチド生合成経路の生成物の収率を高めるために遺伝子過剰発現、遺伝子欠失、および突然変異による酵素脱調節を含む様々な改変が首尾よく用いられている。プリンフラックスの増加に好影響を与えるＢ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）酵素における例示的な改変を下記表１に挙げる。

【0172】

【表1-1】

【表1-2】

【表1-3】

【0173】

したがって、幾つかの実施形態によると、本発明の細菌は、プリンヌクレオチド生合成経路に関与する少なくとも１つの酵素の発現および／または活性が、改変を有しないが、それ以外は同一の細菌と比較して増加するように（さらに）改変されていることを特徴とする。

【0174】

幾つかの実施形態によると、本発明の細菌は、アデノシン一リン酸生合成経路に関与する少なくとも１つの酵素の発現および／または活性が、改変を有しないが、それ以外は同一の細菌と比較して増加するように（さらに）改変されていることを特徴とする。

【0175】

プリンヌクレオチド生合成経路に関与する少なくとも１つの酵素（例えば、アデノシン一リン酸生合成経路に関与する少なくとも１つの酵素）は、それが発現される細菌と同じ種に由来していても、またはそれが発現される細菌とは異なる種に由来していてもよい（すなわち異種である）。幾つかの実施形態によると、プリンヌクレオチド生合成経路に関与する少なくとも１つの酵素（例えば、アデノシン一リン酸生合成経路に関与する少なくとも１つの酵素）は、それが発現される細菌と同じ種に由来する。幾つかの実施形態によると、プリンヌクレオチド生合成経路に関与する少なくとも１つの酵素（例えば、アデノシン一リン酸生合成経路に関与する少なくとも１つの酵素）は、それが発現される細菌とは異なる種に由来する（すなわち異種である）。

【0176】

「タンパク質発現の増加」とは、このように改変された細菌が産生するプリンヌクレオチド生合成経路に関与する酵素（例えば、アデノシン一リン酸生合成経路に関与する酵素）の量が、改変を有しないが、それ以外は同一の細菌と比較して増加することを意味する。より詳細には、「発現の増加」とは、このように改変された細菌が産生するプリンヌクレオチド生合成経路に関与する酵素（例えば、アデノシン一リン酸生合成経路に関与する酵素）の量が、改変を有しないが、それ以外は同一の細菌と比較して少なくとも１０％、例えば少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも１５０％、少なくとも２００％、少なくとも３００％、少なくとも４００％、少なくとも５００％、少なくとも６００％、少なくとも７００％、少なくとも８００％、少なくとも約９００％、少なくとも約１０００％、少なくとも約２０００％、少なくとも約３０００％、少なくとも約４０００％、少なくとも約５０００％、少なくとも約６０００％、少なくとも約７０００％、少なくとも約８０００％、少なくとも約９０００％または少なくとも約１００００％増加することを意味する。所与の細胞におけるタンパク質の量は、当該技術分野で既知の任意の好適な定量化技術、例えばＥＬＩＳＡ、免疫組織化学またはウエスタンブロッティングによって決定することができる。

【0177】

タンパク質発現の増加は、当業者に既知の任意の好適な手段によって達成することができる。例えば、タンパク質発現の増加は、例えば細菌においてｍＲＮＡ分子の産生を引き起こすように機能するプロモーターに操作可能に連結した、プリンヌクレオチド生合成経路に関与する酵素（例えば、アデノシン生合成経路に関与する酵素）をコードする遺伝子を含むベクター等の外因性核酸を細菌に導入することにより、細菌におけるプリンヌクレオチド生合成経路に関与する酵素（例えば、アデノシン一リン酸生合成経路に関与する酵素）をコードする遺伝子のコピー数を増加させることによって達成することができる。

【0178】

タンパク質発現の増加は、プリンヌクレオチド生合成経路に関与する酵素（例えば、アデノシン一リン酸生合成経路に関与する酵素）をコードする遺伝子の少なくとも第２のコピーを細菌のゲノムに組み込むことによっても達成することができる。

【0179】

タンパク質発現の増加は、例えばネイティブプロモーターを、ネイティブプロモーターと比較して酵素のより高い発現および過剰産生を可能にするプロモーターに置き換えることにより、プリンヌクレオチド生合成経路に関与する酵素（例えば、アデノシン一リン酸生合成経路に関与する酵素）をコードする遺伝子に操作可能に連結したプロモーターの強度を増大させることによっても達成することができる。使用され得るプロモーターとしては、バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・アミロリクエファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）等に由来する天然プロモーター、例えばＰ４３、Ｐ１５、Ｐｖｅｇ、Ｐｙｌｂ、ＰｇｒｏＥＳ、ＰｓｉｇＸ、ＰｔｒｎＱ、Ｐｐｓｔ、ＰｓｏｄＡ、ＰｒｐｓＦ、ＰｌｅｐＡ、ＰｌｉａＧ、ＰｒｐｓＦ、Ｐｐｓｔ、ＰｆｕｓＡ、ＰｓｏｄＡ、Ｐｈａｇ、ならびにバチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）で活性な人工プロモーター、または誘導性バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）プロモーター、例えばＰｍｔｌＡ、Ｐｓｐａｃ、ＰｘｙｌＡ、ＰｓａｃＢ等が挙げられる。更なる例としては、コリネバクテリウム由来の天然プロモーター、例えばＰ ＣＰ＿２４５４、ＰｔｕｆおよびＰｓｏｄ、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来の天然プロモーター、例えばＴ７、ＰａｒａＢＡＤ、Ｐｌａｃ、ＰｔａｃおよびＰｔｒｃ、ならびにコリネファージＢＦＫ２０に由来するプロモーターＰ Ｆ１が挙げられる。

【0180】

タンパク質発現の増加は、プリンヌクレオチド生合成経路に関与する酵素をコードするｍＲＮＡ分子上のリボソーム結合部位を改変することによっても達成することができる。リボソーム結合部位の配列を改変することで、翻訳開始速度を高め、それにより翻訳効率を向上させることができる。

【0181】

幾つかの実施形態によると、遺伝子のコピー数の増加は、宿主細胞においてｍＲＮＡ分子の産生を引き起こすように機能するプロモーターに操作可能に連結した遺伝子を含む１つ以上の（例えば２つまたは３つの）外因性核酸分子（例えば１つ以上のベクター）を細菌に導入することによって達成される。

【0182】

幾つかの実施形態によると、本発明の細菌は、プリンヌクレオチド生合成経路に関与する酵素（例えば、アデノシン一リン酸生合成経路に関与する酵素）をコードする１つ以上の（例えば２つ、３つまたは４つの）ヌクレオチド配列を含む外因性核酸分子（ベクター等）を含む。好適には、外因性核酸分子は、細菌においてｍＲＮＡ分子の産生を引き起こすように機能し、上記プリンヌクレオチド生合成経路に関与する酵素（例えば、上記アデノシン一リン酸生合成経路に関与する酵素）をコードするヌクレオチド配列に操作可能に連結したプロモーターをさらに含む。幾つかの実施形態によると、外因性核酸分子は、細菌のゲノムに安定に組み込まれる。

【0183】

プリンヌクレオチド生合成経路に関与する少なくとも１つの酵素は、リボース－リン酸ジホスホキナーゼ活性を有する酵素、アミドホスホリボシルトランスフェラーゼ活性を有する酵素、ホルミルテトラヒドロ葉酸デホルミラーゼ活性を有する酵素、ホスホリボシルアミン－グリシンリガーゼ活性を有する酵素、ホスホリボシルグリシンアミドホルミルトランスフェラーゼ活性を有する酵素、ホスホリボシルホルミルグリシンアミジンシンターゼ活性を有する酵素、ホスホリボシルホルミルグリシンアミジンシクロリガーゼ活性を有する酵素、Ｎ５－カルボキシアミノイミダゾールリボヌクレオチドシンテターゼ活性を有する酵素、Ｎ５－カルボキシアミノイミダゾールリボヌクレオチドムターゼ活性を有する酵素、ホスホリボシルアミノイミダゾールスクシノカルボキサミドシンターゼ活性を有する酵素、アデニロコハク酸リアーゼ活性を有する酵素、ホスホリボシルアミノイミダゾール－カルボキサミドホルミルトランスフェラーゼ活性を有する酵素、ＩＭＰシクロヒドロラーゼ活性を有する酵素、アデニロコハク酸シンターゼ活性を有する酵素、アデニル酸キナーゼ活性を有する酵素、ＡＴＰシンターゼ活性を有する酵素、アデノシンキナーゼ活性を有する酵素、ＩＭＰデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素およびＧＭＰシンターゼ活性を有する酵素からなる群から選択される酵素であり得る。

【0184】

アデノシン一リン酸生合成経路に関与する少なくとも１つの酵素は、リボース－リン酸ジホスホキナーゼ活性を有する酵素、アミドホスホリボシルトランスフェラーゼ活性を有する酵素、ホルミルテトラヒドロ葉酸デホルミラーゼ活性を有する酵素、ホスホリボシルアミン－グリシンリガーゼ活性を有する酵素、ホスホリボシルグリシンアミドホルミルトランスフェラーゼ活性を有する酵素、ホスホリボシルホルミルグリシンアミジンシンターゼ活性を有する酵素、ホスホリボシルホルミルグリシンアミジンシクロリガーゼ活性を有する酵素、Ｎ５－カルボキシアミノイミダゾールリボヌクレオチドシンテターゼ活性を有する酵素、Ｎ５－カルボキシアミノイミダゾールリボヌクレオチドムターゼ活性を有する酵素、ホスホリボシルアミノイミダゾールスクシノカルボキサミドシンターゼ活性を有する酵素、アデニロコハク酸リアーゼ活性を有する酵素、ホスホリボシルアミノイミダゾール－カルボキサミドホルミルトランスフェラーゼ活性を有する酵素、ＩＭＰシクロヒドロラーゼ活性を有する酵素、アデニロコハク酸シンターゼ活性を有する酵素、アデニル酸キナーゼ活性を有する酵素、ＡＴＰシンターゼ活性を有する酵素およびアデノシンキナーゼ活性を有する酵素からなる群から選択される酵素であり得る。

【0185】

幾つかの実施形態によると、プリンヌクレオチド生合成経路（アデノシン一リン酸生合成経路等）に関与する少なくとも１つの酵素は、リボース－リン酸ジホスホキナーゼ活性を有する酵素、アミドホスホリボシルトランスフェラーゼ活性を有する酵素、ホルミルテトラヒドロ葉酸デホルミラーゼ活性を有する酵素、アデニロコハク酸リアーゼ活性を有する酵素、ホスホリボシルアミノイミダゾール－カルボキサミドホルミルトランスフェラーゼ活性を有する酵素、アデニロコハク酸シンターゼ活性を有する酵素およびアデノシンキナーゼ活性を有する酵素からなる群から選択される。

【0186】

幾つかの実施形態によると、本発明の細菌は、プリンヌクレオチド生合成経路に関与するその内因性酵素の１つ以上に関して表１に開示されるような改変のいずれか１つを有するように（さらに）改変されている。特に、細菌は、問題の酵素の阻害剤に耐性を示すようにするランダム突然変異誘発の結果であってもよい。

【0187】

幾つかの実施形態によると、本発明の細菌は、プリンヌクレオチド分解経路に関与する少なくとも１つの内因性酵素の発現および／または活性が、改変を有しないが、それ以外は同一の細菌と比較して減少するように（さらに）改変されていることを特徴とする。

【0188】

幾つかの実施形態によると、本発明の細菌は、プリンヌクレオチド分解経路に関与する少なくとも１つの内因性酵素の発現が、改変を有しないが、それ以外は同一の細菌と比較して減少するように改変されていてもよい。

【0189】

幾つかの実施形態によると、本発明の細菌は、上記プリンヌクレオチド分解経路に関与する少なくとも１つの内因性酵素をコードする内在性遺伝子の発現レベルが、改変を有しないが、それ以外は同一の細菌と比較して減少するように改変されていてもよい。内在性遺伝子の発現レベルは例えば、それ以外は同一の細菌と比較して少なくとも５０％、例えば少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも１００％減少し得る。

【0190】

幾つかの実施形態によると、上記酵素をコードする内在性遺伝子は、例えば遺伝子配列の一部または全体の欠失によって不活性化されている。

【0191】

幾つかの実施形態によると、上記酵素をコードする内在性遺伝子は、上記酵素をコードする内在性遺伝子をＤＮＡ切断、好ましくは二本鎖切断により選択的に不活性化することが可能なレアカットエンドヌクレアーゼを微生物に導入または発現させることによって不活性化されている。内在性遺伝子を不活性化するために本発明に従って使用されるレアカットエンドヌクレアーゼは、例えば転写アクチベーター様エフェクター（ＴＡＬＥ）ヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）またはＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼであり得る。

【0192】

上記酵素をコードする内在性遺伝子を不活性化する方法の１つは、ＣＲＩＳＰＲｉシステムを使用することである。ＣＲＩＳＰＲｉシステムは、遺伝子発現の標的抑制またはゲノム上の標的位置のブロックのためのツールとして開発された。ＣＲＩＳＰＲｉシステムは、触媒的に不活性な「死んだ」Ｃａｓ９タンパク質（ｄＣａｓ９）と、ＤＮＡに対するｄＣａｓ９の結合部位を画定するガイドＲＮＡとからなる。

【0193】

このため、幾つかの実施形態によると、上記酵素をコードする内在性遺伝子は、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ、例えば触媒的に不活性なＣａｓ９タンパク質と、上記酵素をコードするゲノムＤＮＡと細胞条件下で特異的にハイブリダイズする（例えば結合する）シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）とを細菌に導入または発現させることによって不活性化される。

【0194】

幾つかの実施形態によると、上記プリンヌクレオチド分解経路に関与する少なくとも１つの内因性酵素の発現は、阻害によって減少する。

【0195】

上記内因性酵素の発現の阻害は、当該技術分野で既知の任意の好適な手段によって達成することができる。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイムまたは干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）分子、例えばマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）または短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）等の阻害性核酸分子の使用を伴う遺伝子サイレンシング技術によって発現を阻害することができる。

【0196】

幾つかの実施形態によると、上記プリンヌクレオチド分解経路に関与する少なくとも１つの内因性酵素の発現は、上記ポリペプチドをコードする内在性遺伝子の転写抑制および／または翻訳抑制によって減少する（例えば阻害される）。

【0197】

幾つかの実施形態によると、上記プリンヌクレオチド分解経路に関与する少なくとも１つの内因性酵素の発現は、阻害性核酸分子を細菌に導入または発現させることによって阻害される。例えば、阻害性核酸分子は、細菌において上記阻害性核酸分子の産生を引き起こすように機能するプロモーター、例えば誘導性プロモーターに操作可能に連結した、上記阻害性核酸分子をコードするヌクレオチド配列を含む外因性核酸分子によって導入することができる。好適には、阻害性核酸分子は、内因性酵素をコードする細胞ｍＲＮＡおよび／またはゲノムＤＮＡと細胞条件下で特異的にハイブリダイズする（例えば結合する）ものである。標的に応じて、コードゲノムＤＮＡの転写および／またはコードｍＲＮＡの翻訳を阻害する。

【0198】

幾つかの実施形態によると、阻害性核酸分子は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイムまたは干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）分子である。好ましくは、かかる核酸分子は、対象のポリペプチドまたは酵素をコードする細胞ｍＲＮＡおよび／またはゲノムＤＮＡ（例えば、ポリペプチドをコードする細胞ｍＲＮＡおよび／またはゲノムＤＮＡ）の相補体の少なくとも１０個の連続ヌクレオチドを含む。

【0199】

幾つかの実施形態によると、阻害性核酸はアンチセンスオリゴヌクレオチドである。かかるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ポリペプチドをコードする細胞ｍＲＮＡおよび／またはゲノムＤＮＡと細胞条件下で特異的にハイブリダイズする（例えば結合する）核酸分子（ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれか）である。

【0200】

幾つかの実施形態によると、阻害性核酸分子は、ハンマーヘッド型リボザイム等のリボザイムである。リボザイム分子は、ポリペプチドの翻訳を防ぐためにｍＲＮＡ転写産物を触媒的に切断するように設計されている。

【0201】

幾つかの実施形態によると、阻害性核酸分子は干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）分子である。ＲＮＡ干渉は、ＲＮＡ分子が発現を阻害する生物学的プロセスであり、通例、特定のｍＲＮＡの破壊を引き起こす。ＲＮＡｉ分子の例示的なタイプとしては、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）および短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）が挙げられる。幾つかの実施形態によると、ＲＮＡｉ分子はｍｉＲＮＡである。幾つかの実施形態によると、ＲＮＡｉ分子はｓｉＲＮＡである。幾つかの実施形態によると、ＲＮＡｉ分子はｓｈＲＮＡである。

【0202】

幾つかの実施形態によると、本発明の細菌は、プリンヌクレオチド分解経路に関与する少なくとも１つの内因性酵素の活性が、改変を有しないが、それ以外は同一の細菌と比較して減少するように改変されている。

【0203】

プリンヌクレオチド分解経路に関与する内因性酵素の活性の減少は、当該技術分野で既知の任意の好適な手段によって達成することができる。例えば、活性の低下または喪失をもたらす１つ以上の突然変異を酵素の活性部位に導入することによって活性を減少させることができる。このように、幾つかの実施形態によると、プリンヌクレオチド分解経路に関与する内因性酵素の活性が、活性の低下または喪失をもたらす少なくとも１つの活性部位突然変異によって減少する。少なくとも１つの活性部位突然変異は、例えば少なくとも１つの非保存的アミノ酸置換であり得る。

【0204】

幾つかの実施形態によると、プリンヌクレオチド分解経路に関与する少なくとも１つの酵素は、プリンヌクレオシドホスホリラーゼおよびアデノシン－ホスホリボシルトランスフェラーゼからなる群から選択される。幾つかの実施形態によると、プリンヌクレオチド分解経路に関与する少なくとも１つの内因性酵素は、プリンヌクレオシドホスホリラーゼである。幾つかの実施形態によると、プリンヌクレオチド分解経路に関与する少なくとも１つの内因性酵素は、アデノシン－ホスホリボシルトランスフェラーゼである。

【0205】

幾つかの実施形態によると、本発明の細菌は、グアノシン一リン酸生合成経路に関与する少なくとも１つの内因性酵素の発現および／または活性が、改変を有しないが、それ以外は同一の細菌と比較して減少するように（さらに）改変されている。

【0206】

幾つかの実施形態によると、本発明の細菌は、上記グアノシン一リン酸生合成経路に関与する少なくとも１つの内因性酵素をコードする内在性遺伝子の発現レベルが、改変を有しないが、それ以外は同一の細菌と比較して減少するように改変されていてもよい。内在性遺伝子の発現レベルは例えば、それ以外は同一の細菌と比較して少なくとも５０％、例えば少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも１００％減少し得る。

【0207】

幾つかの実施形態によると、上記酵素をコードする内在性遺伝子は、例えば遺伝子配列の一部または全体の欠失によって不活性化されている。

【0208】

幾つかの実施形態によると、上記酵素をコードする内在性遺伝子は、上記酵素をコードする内在性遺伝子をＤＮＡ切断、好ましくは二本鎖切断により選択的に不活性化することが可能なレアカットエンドヌクレアーゼを微生物に導入または発現させることによって不活性化されている。内在性遺伝子を不活性化するために本発明に従って使用されるレアカットエンドヌクレアーゼは、例えば転写アクチベーター様エフェクター（ＴＡＬＥ）ヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）またはＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼであり得る。

【0209】

上記酵素をコードする内在性遺伝子を不活性化する方法の１つは、ＣＲＩＳＰＲｉシステムを使用することである。ＣＲＩＳＰＲｉシステムは、遺伝子発現の標的抑制またはゲノム上の標的位置のブロックのためのツールとして開発された。ＣＲＩＳＰＲｉシステムは、触媒的に不活性な「死んだ」Ｃａｓ９タンパク質（ｄＣａｓ９）と、ＤＮＡに対するｄＣａｓ９の結合部位を画定するガイドＲＮＡとからなる。

【0210】

このため、幾つかの実施形態によると、上記酵素をコードする内在性遺伝子は、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ、例えば触媒的に不活性なＣａｓ９タンパク質と、上記酵素をコードするゲノムＤＮＡと細胞条件下で特異的にハイブリダイズする（例えば結合する）シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）とを細菌に導入または発現させることによって不活性化される。

【0211】

幾つかの実施形態によると、上記グアノシン一リン酸生合成経路に関与する少なくとも１つの内因性酵素の発現は、阻害によって減少する。

【0212】

上記内因性酵素の発現の阻害は、当該技術分野で既知の任意の好適な手段によって達成することができる。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイムまたは干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）分子、例えばマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）または短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）等の阻害性核酸分子の使用を伴う遺伝子サイレンシング技術によって発現を阻害することができる。

【0213】

幾つかの実施形態によると、上記グアノシン一リン酸生合成経路に関与する少なくとも１つの内因性酵素の発現は、上記ポリペプチドをコードする内在性遺伝子の転写抑制および／または翻訳抑制によって減少する（例えば阻害される）。

【0214】

幾つかの実施形態によると、上記グアノシン一リン酸生合成経路に関与する少なくとも１つの内因性酵素の発現は、阻害性核酸分子を細菌に導入または発現させることによって阻害される。例えば、阻害性核酸分子は、細菌において上記阻害性核酸分子の産生を引き起こすように機能するプロモーター、例えば誘導性プロモーターに操作可能に連結した、上記阻害性核酸分子をコードするヌクレオチド配列を含む外因性核酸分子によって導入することができる。好適には、阻害性核酸分子は、内因性酵素をコードする細胞ｍＲＮＡおよび／またはゲノムＤＮＡと細胞条件下で特異的にハイブリダイズする（例えば結合する）ものである。標的に応じて、コードゲノムＤＮＡの転写および／またはコードｍＲＮＡの翻訳を阻害する。

【0215】

幾つかの実施形態によると、阻害性核酸分子は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイムまたは干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）分子である。好ましくは、かかる核酸分子は、対象のポリペプチドまたは酵素をコードする細胞ｍＲＮＡおよび／またはゲノムＤＮＡ（例えば、ポリペプチドをコードする細胞ｍＲＮＡおよび／またはゲノムＤＮＡ）の相補体の少なくとも１０個の連続ヌクレオチドを含む。

【0216】

幾つかの実施形態によると、阻害性核酸はアンチセンスオリゴヌクレオチドである。かかるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ポリペプチドをコードする細胞ｍＲＮＡおよび／またはゲノムＤＮＡと細胞条件下で特異的にハイブリダイズする（例えば結合する）核酸分子（ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれか）である。

【0217】

幾つかの実施形態によると、阻害性核酸分子は、ハンマーヘッド型リボザイム等のリボザイムである。リボザイム分子は、ポリペプチドの翻訳を防ぐためにｍＲＮＡ転写産物を触媒的に切断するように設計されている。

【0218】

幾つかの実施形態によると、阻害性核酸分子は干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）分子である。ＲＮＡ干渉は、ＲＮＡ分子が発現を阻害する生物学的プロセスであり、通例、特定のｍＲＮＡの破壊を引き起こす。ＲＮＡｉ分子の例示的なタイプとしては、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）および短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）が挙げられる。幾つかの実施形態によると、ＲＮＡｉ分子はｍｉＲＮＡである。幾つかの実施形態によると、ＲＮＡｉ分子はｓｉＲＮＡである。幾つかの実施形態によると、ＲＮＡｉ分子はｓｈＲＮＡである。

【0219】

幾つかの実施形態によると、本発明の細菌は、グアノシン一リン酸生合成経路に関与する少なくとも１つの内因性酵素の活性が、改変を有しないが、それ以外は同一の細菌と比較して減少するように改変されている。

【0220】

グアノシン一リン酸生合成経路に関与する内因性酵素の活性の減少は、当該技術分野で既知の任意の好適な手段によって達成することができる。例えば、活性の低下または喪失をもたらす１つ以上の突然変異を酵素の活性部位に導入することによって活性を減少させることができる。このように、幾つかの実施形態によると、グアノシン一リン酸生合成経路に関与する内因性酵素の活性が、活性の低下または喪失をもたらす少なくとも１つの活性部位突然変異によって減少する。少なくとも１つの活性部位突然変異は、例えば少なくとも１つの非保存的アミノ酸置換であり得る。

【0221】

幾つかの実施形態によると、グアノシン一リン酸生合成経路に関与する少なくとも１つの酵素は、ＩＭＰデヒドロゲナーゼおよびＧＭＰシンテターゼからなる群から選択される。

【0222】

幾つかの実施形態によると、グアノシン一リン酸生合成経路に関与する少なくとも１つの酵素は、ＩＭＰデヒドロゲナーゼである。

【0223】

幾つかの実施形態によると、グアノシン一リン酸生合成経路に関与する少なくとも１つの酵素は、ＧＭＰシンテターゼである。

【0224】

ＣＹＰ４５０は、ヘム含有酵素の多様な群であり、広範な酸化反応を触媒する。シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ（ＣＹＰ４５０）もイソペンテニルアデニン型サイトカイニンのヒドロキシル化を触媒する。シロイヌナズナでは、イソペンテニルアデニン型サイトカイニンをヒドロキシル化する、ＣＹＰ７３５Ａ１およびＣＹＰ７３５Ａ２の２つのシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼが存在する。ＣＹＰ７３５Ａは、ｉＰ－ヌクレオチドのヒドロキシル化の立体特異的反応を触媒し、より低い親和性でｉＰ－ヌクレオシドまたはｉＰのヒドロキシル化を触媒して、ｔＺを合成する（Takei et al., 2004b）。植物起源の殆どのＣＹＰ４５０は、小胞体（ＥＲ）の膜に固定される。シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼは、ロドコッカス・ファシアンス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｓｃｉａｎｓ）等の細菌にも存在する。シトクロムＰ４５０は一般に、補助タンパク質の性質に応じて大きく２つのクラスに分類される。クラスＩ Ｐ４５０は、ミトコンドリアの膜上および細菌に見られ、クラスＩＩシトクロムＰ４５０は、哺乳動物細胞の肝ミクロゾーム酵素に代表される。クラスＩ Ｐ４５０は、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）含有レダクターゼ、鉄硫黄タンパク質（フェレドキシン）およびＰ４５０を含む３成分系である。クラスＩＩシトクロムＰ４５０は、ＦＡＤ含有、フラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）含有のＮＡＤＰＨ依存性シトクロムＰ４５０レダクターゼおよびＰ４５０から構成される。クラスＩＩＩおよびクラスＩＶ ＣＹＰ４５０も細菌で報告されているが、クラスＩが細菌において最も一般的なＣＹＰ４５０である。シュードモナス・プチダＰ４５０ｃａｍの最もよく特徴付けられている細菌シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ系は、プチダレドキシンレダクターゼ；中間鉄硫黄タンパク質であるプチダレドキシン；およびシトクロムＰ４５０ｃａｍの３つの可溶性タンパク質からなる。ＣＹＰ４５０ Ｆａｓ１は、線状プラスミドのｆａｓ領域にコードされ、Ｒ．ファシアンス（Ｒ．ｆａｓｃｉａｎｓ）が産生するサイトカイニンをヒドロキシル化すると考えられる（Frebort et al., 2011）。

【0225】

シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ（ＣＹＰ４５０）は、ｉＰ－ヌクレオチドをヒドロキシル化し、ＡＭＰおよびＤＭＡＰＰから３つの酵素段階でｔｒａｎｓ－ゼアチンを生成することができる。この酵素は、ｉＰＲＭＰのプレニル側鎖を立体特異的にヒドロキシル化することで、ｔＺＲＭＰへのバイパスを作ることができ、これをさらに活性化してｔｒａｎｓ－ゼアチンを生成することができる。

【0226】

したがって、幾つかの実施形態によると、本発明の細菌は、シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ（ＣＹＰ４５０）活性を有するポリペプチドのタンパク質発現が、改変を有しないが、それ以外は同一の細菌と比較して増加するように（さらに）改変されていることを特徴とする。

【0227】

「タンパク質発現の増加」とは、このように改変された細菌が産生するシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ（ＣＹＰ４５０）活性を有するポリペプチドの量が、改変を有しないが、それ以外は同一の細菌と比較して増加することを意味する。より詳細には、「発現の増加」とは、このように改変された細菌が産生するシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ（ＣＹＰ４５０）活性を有するポリペプチドの量が、改変を有しないが、それ以外は同一の細菌と比較して少なくとも１０％、例えば少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも１５０％、少なくとも２００％、少なくとも３００％、少なくとも４００％、少なくとも５００％、少なくとも６００％、少なくとも７００％、少なくとも８００％、少なくとも約９００％、少なくとも約１０００％、少なくとも約２０００％、少なくとも約３０００％、少なくとも約４０００％、少なくとも約５０００％、少なくとも約６０００％、少なくとも約７０００％、少なくとも約８０００％、少なくとも約９０００％または少なくとも約１００００％増加することを意味する。所与の細胞におけるタンパク質の量は、当該技術分野で既知の任意の好適な定量化技術、例えばＥＬＩＳＡ、免疫組織化学またはウエスタンブロッティングによって決定することができる。

【0228】

タンパク質発現の増加は、当業者に既知の任意の好適な手段によって達成することができる。例えば、タンパク質発現の増加は、例えば細菌においてｍＲＮＡ分子の産生を引き起こすように機能するプロモーターに操作可能に連結した、シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ（ＣＹＰ４５０）活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を含むベクター等の外因性核酸を細菌に導入することにより、細菌におけるシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ（ＣＹＰ４５０）活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子のコピー数を増加させることによって達成することができる。

【0229】

タンパク質発現の増加は、シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ（ＣＹＰ４５０）活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子の少なくとも第２のコピーを細菌のゲノムに組み込むことによっても達成することができる。

【0230】

タンパク質発現の増加は、シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ（ＣＹＰ４５０）活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子に操作可能に連結したプロモーターの強度を増大させることによっても達成することができる。使用され得るプロモーターとしては、バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・アミロリクエファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）等に由来する天然プロモーター、例えばＰ４３、Ｐ１５、Ｐｖｅｇ、Ｐｙｌｂ、ＰｇｒｏＥＳ、ＰｓｉｇＸ、ＰｔｒｎＱ、Ｐｐｓｔ、ＰｓｏｄＡ、ＰｒｐｓＦ、ＰｌｅｐＡ、ＰｌｉａＧ、ＰｒｐｓＦ、Ｐｐｓｔ、ＰｆｕｓＡ、ＰｓｏｄＡ、Ｐｈａｇ、ならびにバチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）で活性な人工プロモーター、または誘導性バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）プロモーター、例えばＰｍｔｌＡ、Ｐｓｐａｃ、ＰｘｙｌＡ、ＰｓａｃＢ等が挙げられる。更なる例としては、コリネバクテリウム由来の天然プロモーター、例えばＰ ＣＰ＿２４５４、ＰｔｕｆおよびＰｓｏｄ、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来の天然プロモーター、例えばＴ７、ＰａｒａＢＡＤ、Ｐｌａｃ、ＰｔａｃおよびＰｔｒｃ、ならびにコリネファージＢＦＫ２０に由来するプロモーターＰ Ｆ１が挙げられる。

【0231】

タンパク質発現の増加は、シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ（ＣＹＰ４５０）活性を有するポリペプチドをコードするｍＲＮＡ分子上のリボソーム結合部位を改変することによっても達成することができる。リボソーム結合部位の配列を改変することで、翻訳開始速度を高め、それにより翻訳効率を向上させることができる。

【0232】

幾つかの実施形態によると、遺伝子のコピー数の増加は、宿主細胞においてｍＲＮＡ分子の産生を引き起こすように機能するプロモーターに操作可能に連結した遺伝子を含む１つ以上の（例えば２つまたは３つの）外因性核酸分子（例えば１つ以上のベクター）を細菌に導入することによって達成される。

【0233】

幾つかの実施形態によると、本発明の細菌は、シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ（ＣＹＰ４５０）活性を有するポリペプチドをコードする１つ以上の（例えば２つ、３つまたは４つの）ヌクレオチド配列を含む外因性核酸分子（ベクター等）を含む。好適には、外因性核酸分子は、細菌においてｍＲＮＡ分子の産生を引き起こすように機能し、上記シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ（ＣＹＰ４５）活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に操作可能に連結したプロモーターをさらに含む。幾つかの実施形態によると、外因性核酸分子は、細菌のゲノムに安定に組み込まれる。

【0234】

シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ（ＣＹＰ４５０）活性を有するポリペプチドは、それが発現される細菌と同じ種に由来していても、またはそれが発現される細菌とは異なる種に由来していてもよい（すなわち異種である）。幾つかの実施形態によると、シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ（ＣＹＰ４５０）活性を有するポリペプチドは、それが発現される細菌と同じ種に由来する。幾つかの実施形態によると、シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ（ＣＹＰ４５０）活性を有するポリペプチドは、それが発現される細菌とは異なる種に由来する（すなわち異種である）。例としては、細菌がシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ（ＣＹＰ４５０）活性を有するポリペプチドをコードする内在性遺伝子を有しない場合、上記細菌で発現されるシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ（ＣＹＰ４５０）活性を有するポリペプチドは、上記細菌に対して異種である。

【0235】

幾つかの実施形態によると、シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ（ＣＹＰ４５０）活性を有するポリペプチドは、シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ（ＣＹＰ４５０）活性を有する細菌ポリペプチドである。「シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ（ＣＹＰ４５０）活性を有する細菌ポリペプチド」とは、シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ（ＣＹＰ４５０）活性を有するポリペプチドが、ロドコッカス・ファシアンス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｓｃｉａｎｓ）等の細菌に自然由来することを意味する。シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ（ＣＹＰ４５０）活性を有する細菌ポリペプチドの非限定的な例を配列番号９３に記載する。

【0236】

幾つかの実施形態によると、シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ（ＣＹＰ４５０）活性を有するポリペプチドは、シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ（ＣＹＰ４５０）活性を有する植物ポリペプチドである。「シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ（ＣＹＰ４５０）活性を有する植物ポリペプチド」とは、シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ（ＣＹＰ４５０）活性を有するポリペプチドが、アラビドプシス・サリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）等の植物に自然由来することを意味する。シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ（ＣＹＰ４５０）活性を有する植物ポリペプチドの非限定的な例を配列番号９４および９５に記載する。

【0237】

本発明に従って使用されるシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ（ＣＹＰ４５０）活性を有するポリペプチドは例えば、ｉ）配列番号９３～９５のいずれか１つのアミノ酸配列を含むポリペプチド；およびｉｉ）配列番号９３～９５のいずれか１つのアミノ酸配列に対して少なくとも約７０％、例えば少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９３％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドからなる群から選択される、シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ（ＣＹＰ４５０）活性を有するポリペプチドであり得る。

【0238】

幾つかの実施形態によると、シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ（ＣＹＰ４５０）活性を有するポリペプチドは、配列番号９３のアミノ酸配列または配列番号９３と少なくとも７０％、例えば少なくとも７５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態によると、シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ（ＣＹＰ４５０）活性を有するポリペプチドは、配列番号９３のアミノ酸配列または配列番号９３と少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態によると、シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ（ＣＹＰ４５０）活性を有するポリペプチドは、配列番号９３のアミノ酸配列または配列番号９３と少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態によると、シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ（ＣＹＰ４５０）活性を有するポリペプチドは、配列番号９３のアミノ酸配列を含む。

【0239】

幾つかの実施形態によると、シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ（ＣＹＰ４５０）活性を有するポリペプチドは、配列番号９４のアミノ酸配列または配列番号９４と少なくとも７０％、例えば少なくとも７５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態によると、シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ（ＣＹＰ４５０）活性を有するポリペプチドは、配列番号９４のアミノ酸配列または配列番号９４と少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態によると、シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ（ＣＹＰ４５０）活性を有するポリペプチドは、配列番号９４のアミノ酸配列または配列番号９４と少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態によると、シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ（ＣＹＰ４５０）活性を有するポリペプチドは、配列番号９４のアミノ酸配列を含む。

【0240】

幾つかの実施形態によると、シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ（ＣＹＰ４５０）活性を有するポリペプチドは、配列番号９５のアミノ酸配列または配列番号９５と少なくとも７０％、例えば少なくとも７５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態によると、シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ（ＣＹＰ４５０）活性を有するポリペプチドは、配列番号９５のアミノ酸配列または配列番号９５と少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態によると、シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ（ＣＹＰ４５０）活性を有するポリペプチドは、配列番号９５のアミノ酸配列または配列番号９５と少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態によると、シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ（ＣＹＰ４５０）活性を有するポリペプチドは、配列番号９５のアミノ酸配列を含む。

【0241】

本発明による細菌は、任意の好適な細菌から作製することができる。細菌はグラム陽性またはグラム陰性であり得る。グラム陰性細菌宿主細胞の非限定的な例としては、エシェリキア、エルウィニア、クレブシエラおよびシトロバクター属からの種が挙げられる。グラム陽性細菌宿主細胞の非限定的な例としては、バチルス、ラクトコッカス、ラクトバチルス、クロストリジウム、コリネバクテリウム、ストレプトマイセス、ストレプトコッカスおよびセルロモナス属からの種が挙げられる。幾つかの実施形態によると、本発明の細菌はグラム陽性である。幾つかの実施形態によると、本発明の細菌はグラム陰性である。

【0242】

幾つかの実施形態によると、本発明の細菌は、腸内細菌科、バチルス、ラクトバチルスおよびコリネバクテリウムからなる群から選択される科の細菌である。幾つかの実施形態によると、組換え宿主細胞は、腸内細菌科の細菌である。幾つかの実施形態によると、組換え宿主細胞は、バチルス科の細菌である。幾つかの実施形態によると、組換え宿主細胞は、コリネバクテリウム科の細菌である。

【0243】

幾つかの実施形態によると、本発明の細菌は、バチルス、ラクトコッカス、ラクトバチルス、クロストリジウム、コリネバクテリウム、ゲオバチルス、サーモアナエロバクテリウム、ストレプトコッカス、シュードモナス、ストレプトマイセス、エシェリキア、シゲラ、アシネトバクター、シトロバクター、サルモネラ、クレブシエラ、エンテロバクター、エルウィニア、クライベラ、セラチア、セデセア、モーガネラ、ハフニア、エドワージエラ、プロビデンシア、プロテウスまたはエルシニア属の細菌であり得る細菌である。

【0244】

幾つかの実施形態によると、本発明の細菌は、バチルス属の細菌である。バチルス属の細菌の非限定的な例は、バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・アミロリクエファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）およびバチルス・モジャベンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｏｊａｖｅｎｓｉｓ）である。幾つかの実施形態によると、本発明の細菌は、バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）である。

【0245】

幾つかの実施形態によると、本発明の細菌は、コリネバクテリウム属の細菌である。コリネバクテリウム属の細菌の非限定的な例は、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）およびコリネバクテリウム・スタティオニス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｔａｔｉｏｎｉｓ）である。一部によると、本発明の細菌は、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）である。一部によると、本発明の細菌は、コリネバクテリウム・スタティオニス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｔａｔｉｏｎｉｓ）である。本発明の文脈において、コリネバクテリウム・スタティオニス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｔａｔｉｏｎｉｓ）およびコリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）は同じ種を指し、区別なく使用され得る。

【0246】

幾つかの実施形態によると、本発明の細菌は、エシェリキア属の細菌である。エシェリキア属の細菌の非限定的な例は、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）である。一部によると、本発明の細菌は、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）である。

【0247】

上述のように、本発明の細菌は、本明細書に詳述するように１つ以上のポリペプチドを発現するように改変され、これは、上記ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む外因性核酸分子、例えばＤＮＡ分子が細菌に導入されていることを意味し得る。このため、本発明の細菌は、問題のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子等の外因性核酸分子を含むことがある。ＤＮＡ分子等の外因性核酸分子を細菌細胞に導入する手法は、当業者に既知であり、特に形質転換（例えば、熱ショックまたは自然形質転換）が挙げられる。

【0248】

細菌におけるポリペプチドの（過剰）発現を促進するために、外因性核酸分子は、細菌細胞においてｍＲＮＡ分子の産生を引き起こすように機能し、上記ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に操作可能に連結したプロモーター等の好適な調節要素を含んでいてもよい。

【0249】

本発明に従って有用なプロモーターは、所与の宿主細胞においてｍＲＮＡ分子の産生を引き起こすように機能する任意の既知のプロモーターである。多くのかかるプロモーターが当業者に既知である。かかるプロモーターとしては、通常は他の遺伝子と関連するプロモーター、および／または任意の細菌から単離されたプロモーターが挙げられる。タンパク質発現のためのプロモーターの使用は、一般に分子生物学の当業者に既知であり、例えば、Sambrook et al., Molecular cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. , 1989を参照されたい。用いられるプロモーターは誘導性、例えば温度誘導性プロモーター（例えば、それぞれ温度感受性λリプレッサーｃ１８５７によって制御され得るｐＬまたはｐＲファージλプロモーター）であってもよい。プロモーターの文脈において使用される「誘導性」という用語は、温度の変化または化学物質（「化学誘導物質」）の存在等の刺激が存在する場合にのみ、プロモーターが操作可能に連結したヌクレオチド配列の転写を誘導することを意味する。本明細書で使用される場合、本発明による「化学的誘導」は、外因性または内因性物質（高分子、例えばタンパク質または核酸を含む）を宿主細胞に物理的に適用することを指す。これは、宿主細胞に存在する標的プロモーターの転写速度を高める効果を有する。代替的には、用いられるプロモーターは構成的であってもよい。プロモーターの文脈において使用される「構成的」という用語は、プロモーターが刺激（熱ショック、化学物質等）の非存在下で、操作可能に連結したヌクレオチド配列の転写を誘導することができることを意味する。

【0250】

温度誘導系は、例えば熱不安定性リプレッサーによって抑制されるプロモーターを用いることで作用する。これらのリプレッサーは、例えば３０℃のより低い温度で活性を有するが、３７℃では正確にフォールディングすることができないため、不活性である。したがって、かかる回路を用いることで、遺伝子をリプレッサーとともにゲノムに組み込むことによっても対象の遺伝子を直接調節することができる。かかる温度誘導性発現系の例は、熱不安定性ｃＩ８５７リプレッサーによって調節されるｐＬおよび／またはｐＲ λファージプロモーターに基づく。ゲノム組込みＤＥ３系と同様、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子の発現も温度制御プロモーター系を用いて制御することができ、Ｔ７プロモーターを用いて対象の遺伝子の発現を制御することができる。

【0251】

細菌において機能するプロモーターの非限定的な例としては、構成的および誘導性の両方のプロモーター、例えばＴ７プロモーター、β－ラクタマーゼおよびラクトースプロモーター系；アルカリホスファターゼ（ｐｈｏＡ）プロモーター、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系、テトラサイクリンプロモーター、λ－ファージプロモーター、リボソームタンパク質プロモーター；ならびにｔａｃプロモーター等のハイブリッドプロモーターが挙げられる。他の細菌プロモーターおよび合成プロモーターも好適である。

【0252】

外因性核酸分子は、プロモーターに加えて５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）および３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）から選択される少なくとも１つの調節要素をさらに含んでいてもよい。原核生物および真核生物に由来する多くのかかる５’ＵＴＲおよび３’ＵＴＲが当業者に既知である。かかる調節要素としては、通常は他の遺伝子と関連する５’ＵＴＲおよび３’ＵＴＲ、ならびに／または任意の細菌から単離された５’ＵＴＲおよび３’ＵＴＲが挙げられる。

【0253】

通常、５’ＵＴＲは、通常は開始コドンの３～１０塩基対上流にあるシャイン－ダルガノ配列としても知られるリボソーム結合部位（ＲＢＳ）を含む。

【0254】

外因性核酸分子は、ベクターまたはベクターの一部、例えば発現ベクターであり得る。通常、かかるベクターは、細菌細胞において染色体外に留まり、すなわち細菌の核または核様体領域の外に見られる。

【0255】

外因性核酸分子が細菌のゲノムに安定に組み込まれることも本発明により企図される。例えば相同組換えにより宿主細胞のゲノムに安定に組み込むための手段が当業者に既知である。

【0256】

本発明の方法
本発明は、イソプレノイドサイトカイニンまたはそのリボシド誘導体を生成する方法であって、本発明による細菌を好適な培養条件下にて好適な培養培地中で培養することを含む、方法も提供する。

【0257】

方法は、イソプレノイドサイトカイニンまたはそのリボシド誘導体を培養培地から回収することをさらに含み得る。

【0258】

幾つかの実施形態によると、イソプレノイドサイトカイニンまたはそのリボシド誘導体は、ｔｒａｎｓ－ゼアチン（ｔＺ）、ｔｒａｎｓ－ゼアチンリボシド（ｔＺＲ）、Ｎ^６－（Ｄ２－イソペンテニル）アデニン（ｉＰ）、Ｎ^６－（ジメチルアリル）アデノシン（ｉＰＲ）、ジヒドロゼアチン（ＤＺ）、リボシルジヒドロゼアチン（ＤＺＲ）およびそれらの組合せからなる群から選択される。

【0259】

幾つかの実施形態によると、イソプレノイドサイトカイニンまたはそのリボシド誘導体は、それぞれｔｒａｎｓ－ゼアチン（ｔＺ）およびｔｒａｎｓ－ゼアチンリボシド（ｔＺＲ）である。

【0260】

用いられる培養培地は、問題の細菌細胞の培養に適した任意の従来の培地とすることができ、従来技術の原理に従って構成され得る。培地は通常、それぞれの細菌の成長および生存に必要とされる全ての栄養素、例えば炭素源および窒素源、ならびに他の無機塩を含有する。好適な培地、例えば最少培地または複合培地は、商業的供給業者から入手可能であるか、または公表されているレセプト、例えばアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）の菌株カタログに従って調製することができる。当業者に既知の非限定的な標準培地としては、ルリアベルターニ（ＬＢ）ブロス、サブローデキストロース（ＳＤ）ブロス、ＭＳブロス、酵母ペプトンデキストロース、ＢＭＭＹ、ＧＭＭＹまたは酵母麦芽エキス（ＹＭ）ブロスが挙げられ、全て市販されている。Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、Ｌ．ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）またはＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞等の細菌細胞の培養に適した培地の非限定的な例としては、最少培地および富栄養培地、例えばルリアブロス（ＬＢ）、Ｍ９培地、Ｍ１７培地、ＳＡ培地、ＭＯＰＳ培地、テリフィックブロス、ＹＴ等が挙げられる。

【0261】

炭素源は、当該技術分野で既知の任意の好適な炭素基質、特に微生物の培養および／または発酵に一般に使用されている任意の炭素基質とすることができる。好適な発酵性炭素基質の非限定的な例としては、炭水化物（例えば、アラビノースもしくはキシロース等のＣ５糖、またはグルコース等のＣ６糖）、グリセロール、グリセリン、アセテート、ジヒドロキシアセトン、１炭素原子源、メタノール、メタン、油、動物性脂肪、動物油、植物油、脂肪酸、脂質、リン脂質、グリセロ脂質、モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド、再生可能炭素源、ポリペプチド（例えば、微生物または植物のタンパク質またはペプチド）、酵母エキス、酵母エキスからの成分、ペプトン、カザミノ酸、または上述の２つ以上の任意の組合せが挙げられる。

【0262】

窒素源として、アンモニアおよび硫酸アンモニウム等の様々なアンモニウム塩、アミン等の他の窒素化合物、ペプトン、大豆加水分解物および発酵微生物の消化物等の天然窒素源を使用することができる。ミネラルとして、一リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、塩化カルシウム等を使用することができる。

【0263】

それぞれｔｒａｎｓ－ゼアチン（ｔＺ）およびｔｒａｎｓ－ゼアチンリボシド（ｔＺＲ）であるようなイソプレノイドサイトカイニンまたはそのリボシド誘導体の生成をさらに改善するために、培養培地にアデニンまたはアデノシンの供給源、例えば硫酸アデニンを添加してもよい。このため、幾つかの実施形態によると、培養培地は硫酸アデニンを含む。培養培地中の硫酸アデニンの濃度は、一般に約０．１ｇ／Ｌ～約４ｇ／Ｌ、例えば約１ｇ／Ｌ～約３．５ｇ／Ｌの範囲であり得る。幾つかの実施形態によると、培養培地中の硫酸アデニンの濃度は、約２．５ｇ／Ｌ～約３．５ｇ／Ｌの範囲である。しかしながら、酵母エキス等の他のアデニンまたはアデノシンの供給源も、本発明に従って使用が企図される。

【0264】

培養は、好ましくは好気条件下で、例えば振盪培養、および通気を伴う撹拌培養により、約２０～約４５℃、例えば約３０～３８℃、例えば約３７℃の温度で行うことができる。幾つかの実施形態によると、培養は約３０～３８℃、例えば約３７℃の温度で行われる。培養物のｐＨは、通常は５超、例えば約６～約８、好ましくは約６．５～約７．５、より好ましくは約６．８～約７．２の範囲である。幾つかの実施形態によると、培養は約６～約８のｐＨで行われる。培養物のｐＨはアンモニア、炭酸カルシウム、様々な酸、様々な塩基および緩衝剤で調整することができる。培養は、１０～７０時間の範囲、例えば１０～２４時間または１０～４８時間の範囲の期間にわたって行うことができる。

【0265】

培養後に、細胞等の固形物を遠心分離または膜濾過によって培養培地から除去することができる。イソプレノイドサイトカイニンまたはそのリボシド誘導体は、化学化合物を培地から単離および精製する従来の方法によって回収することができる。よく知られた精製手順としては、遠心分離または濾過、沈殿、イオン交換、クロマトグラフィー法、例えばイオン交換クロマトグラフィーまたはゲル濾過クロマトグラフィー、および結晶化法が挙げられるが、これらに限定されない。

【0266】

このため、本発明は、本明細書に詳述する方法によって得ることができるイソプレノイドサイトカイニンまたはそのリボシド誘導体を提供する。

【0267】

略語
ｉＰ － Ｎ^６－（Ｄ２－イソペンテニル）アデニン
ｉＰＲ － Ｎ^６－（Ｄ２－イソペンテニル）アデニンリボシド、別名Ｎ^６－（Ｄ２－イソペンテニル）アデノシン
ｔＺ － ｔｒａｎｓ－ゼアチン
ｔＺＲ － ｔｒａｎｓ－リボシルゼアチン、別名ｔｒａｎｓ－ゼアチンリボシド
ＤＺ － ジヒドロゼアチン
ＤＺＲ － リボシルジヒドロゼアチン、別名ジヒドロゼアチンリボシド
ｃＺ － ｃｉｓ－ゼアチン
ＭＶＡ経路 － メバロン酸生合成経路
ＭＥＰ経路 － メチルエリスリトールリン酸生合成経路
ＤＭＡＰＰ － ジメチルアリル二リン酸
ＨＭＢＤＰ － １－ヒドロキシ－２－メチル－２－ブテニル４－二リン酸
ＤＸＰ － １－デオキシ－Ｄ－キシルロース－５－リン酸
ＤＸＳ － １－デオキシ－Ｄ－キシルロース－５－リン酸シンターゼ；ＤＸＰ－シンターゼ（ＥＣ ２．２．１．７）
ｔＺＲＭＰ － ｔｒａｎｓ－ゼアチンリボシド５’－一リン酸
ｉＰＲＭＰ － Ｎ^６－（Ｄ２－イソペンテニル）アデニンリボシド５’－一リン酸
ＤＺＲＭＰ － ジヒドロゼアチンリボシド５’－一リン酸
ｃＺＲＭＰ － ｃｉｓ－ゼアチンリボシド５’－一リン酸
ＩＰＴ － アデニル酸イソペンテニルトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．５．１．２７）
ＬＯＧ － サイトカイニンリボシド５’－一リン酸ホスホリボヒドロラーゼ「ロンリーガイ」（ＥＣ ３．２．２．ｎ１）
ＣＹＰ４５０ － シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ

【0268】

或る特定の他の定義
本明細書で使用される場合、「アデニル酸イソペンテニルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチド」（“polypeptide having adenylate isopentenyltransferase activity” or a “polypeptide, which has adenylate isopentenyltransferase activity”）は、以下の反応を触媒するポリペプチドを意味する：ジメチルアリル二リン酸＋ＡＭＰ＜＝＞二リン酸＋Ｎ（６）－（ジメチルアリル）アデノシン５’－リン酸（ＥＣ ２．５．１．２７）および任意に１－ヒドロキシ－２－メチル－２－ブテニル４－二リン酸＋ＡＭＰ＜＝＞二リン酸＋ｔｒａｎｓ－ゼアチンリボシド５’－リン酸。かかるポリペプチドの非限定的な例を配列番号１～３３に示す。

【0269】

本明細書で使用される場合、「サイトカイニンリボシド５’－一リン酸ホスホリボヒドロラーゼ活性を有するポリペプチド」（“polypeptide having cytokinin riboside 5’-monophosphate phosphoribohydrolase activity” or a “polypeptide which has cytokinin riboside 5’-monophosphate phosphoribohydrolase activity”）は、以下の反応を触媒するポリペプチドを意味する：Ｎ（６）－（Δ（２）－イソペンテニル）－アデノシン５’－リン酸＋Ｈ（２）Ｏ＜＝＞Ｎ（６）－（ジメチルアリル）アデニン＋Ｄ－リボース５’－リン酸（ＥＣ ３．２．２．ｎ１）。かかるポリペプチドの非限定的な例を配列番号３４～６２に示す。

【0270】

本明細書で使用される場合、「１－デオキシ－Ｄ－キシルロース－５－リン酸シンターゼ活性を有するポリペプチド」（“polypeptide having 1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate synthase activity” or a “polypeptide, which has 1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate synthase activity”）は、以下の反応を触媒するポリペプチドを意味する：ピルビン酸＋Ｄ－グリセルアルデヒド３－リン酸＜＝＞１－デオキシ－Ｄ－キシルロース５－リン酸＋ＣＯ（２）（ＥＣ ２．２．１．７）。かかるポリペプチドの非限定的な例を配列番号６３～７０に示す。

【0271】

本明細書で使用される場合、「リボース－リン酸ジホスホキナーゼ活性を有する酵素」（“enzyme having ribose-phosphate diphosphokinase activity” or an “enzyme, which has ribose-phosphate diphosphokinase activity”）は、以下の反応を触媒する酵素を意味する：ＡＴＰ＋Ｄ－リボース５－リン酸＜＝＞ＡＭＰ＋５－ホスホ－α－Ｄ－リボース１－二リン酸（ＥＣ ２．７．６．１）。リボース－リン酸ジホスホキナーゼ活性を有する酵素は、細菌遺伝子ｐｒｓまたはそのオーソログにコードされる。

【0272】

本明細書で使用される場合、「アミドホスホリボシルトランスフェラーゼ活性を有する酵素」（“enzyme having amidophosphoribosyltransferase activity” or an “enzyme, which has amidophosphoribosyltransferase activity”）は、以下の反応を触媒する酵素を意味する：５－ホスホ－β－Ｄ－リボシルアミン＋二リン酸＋Ｌ－グルタミン酸＜＝＞Ｌ－グルタミン＋５－ホスホ－α－Ｄ－リボース１－二リン酸＋Ｈ_２Ｏ（ＥＣ ２．４．２．１４）。アミドホスホリボシルトランスフェラーゼ活性を有する酵素は、細菌遺伝子ｐｕｒＦまたはそのオーソログにコードされる。

【0273】

本明細書で使用される場合、「ホルミルテトラヒドロ葉酸デホルミラーゼ活性を有する酵素」（“enzyme having formyltetrahydrofolate deformylase activity” or an “enzyme, which has formyltetrahydrofolate deformylase activity”）は、以下の反応を触媒する酵素を意味する：１０－ホルミルテトラヒドロ葉酸＋Ｈ_２Ｏ＜＝＞ギ酸＋テトラヒドロ葉酸（ＥＣ ３．５．１．１０）。アミドホスホリボシルトランスフェラーゼ活性を有する酵素は、細菌遺伝子ｐｕｒＵまたはそのオーソログにコードされる。

【0274】

本明細書で使用される場合、「ホスホリボシルアミン－グリシンリガーゼ活性を有する酵素」（“enzyme having phosphoribosylamine-glycine ligase activity” or an “enzyme, which has phosphoribosylamine-glycine ligase activity”）は、以下の反応を触媒する酵素を意味する：ＡＴＰ＋５－ホスホ－β－Ｄ－リボシルアミン＋グリシン＜＝＞ＡＤＰ＋リン酸＋Ｎ^１－（５－ホスホ－β－Ｄ－リボシル）グリシンアミド（ＥＣ ６．３．４．１３）。ホスホリボシルアミン－グリシンリガーゼ活性を有する酵素は、細菌遺伝子ｐｕｒＤまたはそのオーソログにコードされる。

【0275】

本明細書で使用される場合、「ホスホリボシルグリシンアミドホルミルトランスフェラーゼ活性を有する酵素」（“enzyme having phosphoribosylglycineamide formyltransferase activity” or an “enzyme, which has phosphoribosylglycineamide formyltransferase activity”）は、以下の反応を触媒する酵素を意味する：１０－ホルミルテトラヒドロ葉酸＋Ｎ^１－（５－ホスホ－β－Ｄ－リボシル）グリシンアミド＜＝＞テトラヒドロ葉酸＋Ｎ^２－ホルミル－Ｎ^１－（５－ホスホ－β－Ｄ－リボシル）グリシンアミド（ＥＣ ２．１．２．２）。ホスホリボシルグリシンアミドホルミルトランスフェラーゼ活性を有する酵素は、細菌遺伝子ｐｕｒＴまたはそのオーソログにコードされる。

【0276】

本明細書で使用される場合、「ホスホリボシルホルミルグリシンアミジンシンターゼ活性を有する酵素」（“enzyme having phosphoribosylformylglycinamidine synthase activity” or an “enzyme, which has phosphoribosylformylglycinamidine synthase activity”）は、以下の反応を触媒する酵素を意味する：ＡＴＰ＋Ｎ^２－ホルミル－Ｎ^１－（５－ホスホ－β－Ｄ－リボシル）グリシンアミド＋Ｌ－グルタミン＋Ｈ_２Ｏ＜＝＞ＡＤＰ＋リン酸＋２－（ホルムアミド）－Ｎ^１－（５－ホスホ－β－Ｄ－リボシル）アセトアミジン＋Ｌ－グルタミン酸（ＥＣ ６．３．５．３）。ホスホリボシルホルミルグリシンアミジンシンターゼ活性を有する酵素は、細菌遺伝子ｐｕｒＬまたはそのオーソログにコードされる。

【0277】

本明細書で使用される場合、「ホスホリボシルホルミルグリシンアミジンシクロリガーゼ活性を有する酵素」（“enzyme having phosphoribosylformylglycineamidine cyclo-ligase activity” or an “enzyme, which has phosphoribosylformylglycineamidine cyclo-ligase activity”）は、以下の反応を触媒する酵素を意味する：ＡＴＰ＋２－（ホルムアミド）－Ｎ^１－（５－ホスホ－β－Ｄ－リボシル）アセトアミジン＜＝＞ＡＤＰ＋リン酸＋５－アミノ－１－（５－ホスホ－β－Ｄ－リボシル）イミダゾール（ＥＣ ６．３．３．１）。ホスホリボシルホルミルグリシンアミジンシクロリガーゼ活性を有する酵素は、細菌遺伝子ｐｕｒＭまたはそのオーソログにコードされる。

【0278】

本明細書で使用される場合、「Ｎ５－カルボキシアミノイミダゾールリボヌクレオチドシンテターゼ活性を有する酵素」（“enzyme having N5-carboxyaminoimidazole ribonucleotide synthetase activity” or an “enzyme, which has N5-carboxyaminoimidazole ribonucleotide synthetase activity”）は、以下の反応を触媒する酵素を意味する：ＡＴＰ＋５－アミノ－１－（５－ホスホ－Ｄ－リボシル）イミダゾール＋ＨＣＯ_３ ^－＜＝＞ＡＤＰ＋リン酸＋５－カルボキシアミノ－１－（５－ホスホ－Ｄ－リボシル）イミダゾール（ＥＣ ６．３．４．１８）。Ｎ５－カルボキシアミノイミダゾールリボヌクレオチドシンテターゼ活性を有する酵素は、細菌遺伝子ｐｕｒＫまたはそのオーソログにコードされる。

【0279】

本明細書で使用される場合、「Ｎ５－カルボキシアミノイミダゾールリボヌクレオチドムターゼ活性を有する酵素」（“enzyme having N5-carboxyaminoimidazole ribonucleotide mutase activity” or an “enzyme, which has N5-carboxyaminoimidazole ribonucleotide mutase activity”）は、以下の反応を触媒する酵素を意味する：５－カルボキシアミノ－１－（５－ホスホ－Ｄ－リボシル）イミダゾール＜＝＞５－アミノ－１－（５－ホスホ－Ｄ－リボシル）イミダゾール－４－カルボン酸（ＥＣ ５．４．９９．１８）。Ｎ５－カルボキシアミノイミダゾールリボヌクレオチドムターゼ活性を有する酵素は、細菌遺伝子ｐｕｒＥまたはそのオーソログにコードされる。

【0280】

本明細書で使用される場合、「ホスホリボシルアミノイミダゾールスクシノカルボキサミドシンターゼ活性を有する酵素」（“enzyme having phosphoribosylaminoimidazolesuccinocarboxamide synthase activity” or an “enzyme, which has phosphoribosylaminoimidazolesuccinocarboxamide synthase activity”）は、以下の反応を触媒する酵素を意味する：ＡＴＰ＋５－アミノ－１－（５－ホスホ－Ｄ－リボシル）イミダゾール－４－カルボン酸＋Ｌ－アスパラギン酸＜＝＞ＡＤＰ＋リン酸＋（Ｓ）－２－（５－アミノ－１－（５－ホスホ－Ｄ－リボシル）イミダゾール－４－カルボキサミド）コハク酸（ＥＣ ６．３．２．６）。ホスホリボシルアミノイミダゾールスクシノカルボキサミドシンターゼ活性を有する酵素は、細菌遺伝子ｐｕｒＣまたはそのオーソログにコードされる。

【0281】

本明細書で使用される場合、「アデニロコハク酸リアーゼ活性を有する酵素」（“enzyme having adenylosuccinate lyase activity” or an “enzyme, which has adenylosuccinate lyase activity”）は、以下の反応を触媒する酵素を意味する：（Ｓ）－２－（５－アミノ－１－（５－ホスホ－Ｄ－リボシル）イミダゾール－４－カルボキサミド）コハク酸＜＝＞フマル酸＋５－アミノ－１－（５－ホスホ－Ｄ－リボシル）イミダゾール－４－カルボキサミド（ＥＣ ４．３．２．２）。アデニロコハク酸リアーゼ活性を有する酵素は、細菌遺伝子ｐｕｒＢまたはそのオーソログにコードされる。

【0282】

本明細書で使用される場合、「ホスホリボシルアミノイミダゾール－カルボキサミドホルミルトランスフェラーゼ活性を有する酵素」（“enzyme having phosphoribosylaminoimidazole-carboxamide formyltransferase activity” or an “enzyme, which has phosphoribosylaminoimidazole-carboxamide formyltransferase activity”）は、以下の反応を触媒する酵素を意味する：１０－ホルミルテトラヒドロ葉酸＋５－アミノ－１－（５－ホスホ－Ｄ－リボシル）イミダゾール－４－カルボキサミド＜＝＞テトラヒドロ葉酸＋５－ホルムアミド－１－（５－ホスホ－Ｄ－リボシル）イミダゾール－４－カルボキサミド（ＥＣ ２．１．２．３）。ホスホリボシルアミノイミダゾール－カルボキサミドホルミルトランスフェラーゼ活性を有する酵素は、細菌遺伝子ｐｕｒＨまたはそのオーソログにコードされる。

【0283】

本明細書で使用される場合、「ＩＭＰシクロヒドロラーゼ活性を有する酵素」（“enzyme having IMP cyclohydrolase activity” or an “enzyme, which has IMP cyclohydrolase activity”）は、以下の反応を触媒する酵素を意味する：ＩＭＰ＋Ｈ_２Ｏ＜＝＞５－ホルムアミド－１－（５－ホスホ－Ｄ－リボシル）イミダゾール－４－カルボキサミド（ＥＣ ３．５．４．１０）。ＩＭＰシクロヒドロラーゼ活性を有する酵素は、例えば細菌遺伝子ｐｕｒＨまたはそのオーソログにコードされる。

【0284】

本明細書で使用される場合、「アデニロコハク酸シンターゼ活性を有する酵素」（“enzyme having adenylosuccinate synthase activity” or an “enzyme, which has adenylosuccinate synthase activity”）は、以下の反応を触媒する酵素を意味する：ＧＴＰ＋ＩＭＰ＋Ｌ－アスパラギン酸＜＝＞ＧＤＰ＋リン酸＋Ｎ^６－（１，２－ジカルボキシエチル）－ＡＭＰ（ＥＣ ６．３．４．４）。アデニロコハク酸シンターゼ活性を有する酵素は、細菌遺伝子ｐｕｒＡまたはそのオーソログにコードされる。

【0285】

本明細書で使用される場合、「アデニル酸キナーゼ活性を有する酵素」（“enzyme having adenylate kinase activity” or an “enzyme, which has adenylate kinase activity”）は、以下の反応を触媒する酵素を意味する：ＡＴＰ＋ＡＭＰ＜＝＞２ＡＤＰ（ＥＣ ２．７．４．３）。アデニル酸キナーゼ活性を有する酵素は、細菌遺伝子ａｄｋまたはそのオーソログにコードされる。

【0286】

本明細書で使用される場合、「ＡＴＰシンターゼ活性を有する酵素」（“enzyme having ATP synthase activity” or an “enzyme, which has ATP synthase activity”）は、以下の反応を触媒する酵素を意味する：ＡＴＰ＋Ｈ_２Ｏ＋Ｈ^＋（サイトゾル）＜＝＞ＡＤＰ＋リン酸＋Ｈ^＋（ペリプラズム）（ＥＣ ３．６．３．１４）。ＡＴＰシンターゼ活性を有する酵素は、例えば細菌ａｔｐオペロン（遺伝子ａｔｐＢ、ａｔｐＦ、ａｔｐＥ、ａｔｐＤ、ａｔｐＧ、ａｔｐＡ、ａｔｐＨおよびａｔｐＣを含む）またはそのオーソログにコードされるＡＴＰシンターゼＦ_０またはＦ_１複合体である。

【0287】

本明細書で使用される場合、「アデノシンキナーゼ活性を有する酵素」（“enzyme having adenosine kinase activity” or an “enzyme, which has adenosine kinase activity”）は、以下の反応を触媒する酵素を意味する：ＡＴＰ＋アデノシン＜＝＞ＡＤＰ＋ＡＭＰ（ＥＣ ２．７．１．２０）。アデノシンキナーゼ活性を有する酵素は、細菌遺伝子ａｄｋまたそのオーソログにコードされる。

【0288】

本明細書で使用される場合、「ＩＭＰデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素」（“enzyme having IMP dehydrogenase activity” or an “enzyme, which has IMP dehydrogenase activity”）は、以下の反応を触媒する酵素を意味する：イノシン５’－リン酸＋ＮＡＤ^＋＋Ｈ_２Ｏ＜＝＞キサントシン５’－リン酸＋ＮＡＤＨ（ＥＣ １．１．１．２０５）。ＩＭＰデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素は、細菌遺伝子ｇｕａＢまたはそのオーソログにコードされる。

【0289】

本明細書で使用される場合、「ＧＭＰシンターゼ活性を有する酵素」（“enzyme having GMP synthase activity” or an “enzyme, which has GMP synthase activity”）は、以下の反応を触媒する酵素を意味する：ＡＴＰ＋ＸＭＰ＋Ｌ－グルタミン＋Ｈ_２Ｏ＜＝＞ＡＭＰ＋二リン酸＋ＧＭＰ＋Ｌ－グルタミン酸（ＥＣ ６．３．５．２）。ＧＭＰシンターゼ活性を有する酵素は、細菌遺伝子ｇｕａＡまたはそのオーソログにコードされる。

【0290】

本明細書で使用される場合、「プリンヌクレオシドホスホリラーゼ活性を有する酵素」（“enzyme having purine nucleoside phosphorylase activity” or an “enzyme, which has purine nucleoside phosphorylase activity”）は、以下の反応を触媒する酵素を意味する：プリンヌクレオシド＋リン酸＜＝＞プリン＋α－Ｄ－リボース１－リン酸（ＥＣ ２．４．２．１）。プリンヌクレオシドホスホリラーゼ活性を有する酵素は、例えば細菌遺伝子ｄｅｏＤまたはそのオーソログにコードされる。

【0291】

本明細書で使用される場合、「アデノシンホスホリボシルトランスフェラーゼ活性を有する酵素」（“enzyme having adenosine phosphoribosyltransferase activity” or an “enzyme, which has adenosine phosphoribosyltransferase activity”）は、以下の反応を触媒する酵素を意味する：ＡＭＰ＋二リン酸＜＝＞アデニン＋５－ホスホ－α－Ｄ－リボース１－二リン酸（ＥＣ ２．４．２．７）。アデノシンホスホリボシルトランスフェラーゼ活性を有する酵素は、例えば細菌遺伝子ａｐｔまたはそのオーソログにコードされる。

【0292】

本明細書で使用される場合、「プリンヌクレオチド生合成経路」は、ヌクレオチドが合成されるｄｅ ｎｏｖｏ生合成経路およびサルベージ経路の両方を含むと理解される。

【0293】

本明細書で使用される場合、「アデノシン一リン酸生合成経路」は、アデノシン一リン酸が合成されるｄｅ ｎｏｖｏ生合成経路およびサルベージ経路の両方を含むと理解される。

【0294】

本明細書で使用される場合、「グアノシン一リン酸生合成経路」は、グアノシン一リン酸が合成されるｄｅ ｎｏｖｏ生合成経路およびサルベージ経路の両方を含むと理解される。

【0295】

本明細書で使用される場合、「シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ（ＣＹＰ４５０）活性を有するポリペプチド」（“polypeptide having cytochrome P450 monooxygenase (CYP450) activity” or a “polypeptide, which has cytochrome P450 monooxygenase (CYP450) activity”）は、以下のトランスヒドロキシル化反応を触媒するポリペプチドを意味する：１）Ｎ６－（Δ２－イソペンテニル）－アデノシン５’－一リン酸＋還元型［ＮＡＤＰＨ－ヘムタンパク質レダクターゼ］＋酸素→ｔｒａｎｓ－ゼアチンリボシド一リン酸＋酸化型［ＮＡＤＰＨ－ヘムタンパク質レダクターゼ］＋Ｈ_２Ｏ；２）Ｎ６－（Δ２－イソペンテニル）－アデノシン５’－三リン酸＋還元型［ＮＡＤＰＨ－ヘムタンパク質レダクターゼ］＋酸素→ｔｒａｎｓ－ゼアチンリボシド三リン酸＋酸化型［ＮＡＤＰＨ－ヘムタンパク質レダクターゼ］＋Ｈ_２Ｏ；３）Ｎ６－（Δ２－イソペンテニル）－アデノシン５’－二リン酸＋還元型［ＮＡＤＰＨ－ヘムタンパク質レダクターゼ］＋酸素→ｔｒａｎｓ－ゼアチンリボシド二リン酸＋酸化型［ＮＡＤＰＨ－ヘムタンパク質レダクターゼ］＋Ｈ_２Ｏ（ＥＣ １．１４．１４．－）。シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ（ＣＹＰ４５０）活性を有するポリペプチドは、例えば細菌遺伝子ＦＡＳ１、またはアラビドプシス・サリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）（植物）遺伝子ＣＹＰ７３５Ａ１およびＣＹＰ７３５Ａ２、またはそのオーソログにコードされる。非限定的な例としては、配列番号９３～９５が挙げられる。

【0296】

「ポリペプチド」および「タンパク質」は、長さまたは翻訳後修飾（例えばグリコシル化、リン酸化、脂質化、ミリストイル化、ユビキチン化等）にかかわらず、アミド結合によって共有結合した少なくとも２つのアミノ酸のポリマーを表すために本明細書で区別なく使用される。Ｄ－およびＬ－アミノ酸、ならびにＤ－およびＬ－アミノ酸の混合物がこの定義に含まれる。

【0297】

「核酸」または「ポリヌクレオチド」は、長さまたは塩基修飾にかかわらず、ホスホジエステル結合によって共有結合した少なくとも２つの核酸モノマー単位または塩基（例えばアデニン、シトシン、グアニン、チミン）のポリマーを表すために本明細書で区別なく使用される。

【0298】

例えば細菌、核酸またはポリペプチドに関して使用される「組換え」または「非自然発生」は、そうでなければ自然界には存在しない様式で修飾された、またはそれと同一であるが、合成物質から、かつ／もしくは組換え技術を用いた操作によって生成もしくは誘導された、物質またはその物質の自然もしくは天然形態に対応する物質を指す。非限定的な例としては、特に、細胞の天然（非組換え）形態に見られない遺伝子を発現するか、またはそうでなければ異なるレベルで発現される天然遺伝子を発現する組換え細菌細胞が挙げられる。

【0299】

本明細書で遺伝子または核酸分子の文脈において使用される「異種」または「外因性」は、それが存在する細菌のゲノムの一部として天然に存在しない、または天然に存在する場合とは異なるゲノム内の位置に見られる遺伝子または核酸分子（すなわちＤＮＡまたはＲＮＡ分子）を指す。このように、「異種」または「外因性」の遺伝子または核酸分子は、細菌に対して内因性ではなく、微生物に外因的に導入されたものである。「異種」遺伝子または核酸分子のＤＮＡ分子は、宿主ＤＮＡとして異なる生物、異なる種、異なる属または異なる界に由来し得る。

【0300】

本明細書でポリペプチドの文脈において使用される「異種」は、ポリペプチドが通常は宿主微生物に見られず、または宿主微生物によって作製（すなわち発現）されず、異なる生物、異なる種、異なる属または異なる界に由来することを意味する。

【0301】

本明細書で使用される場合、「オーソログ」（“ortholog” or “orthologs”）という用語は、共通の祖先遺伝子に由来するが、異なる種に存在する遺伝子、それによりコードされる核酸分子、すなわちｍＲＮＡ、またはそれによりコードされるタンパク質を指す。

【0302】

遺伝子の「発現レベルの低下」とは、改変された細菌が産生する転写産物の量、それぞれ上記遺伝子によってコードされるポリペプチドの量が、改変を有しないが、それ以外は同一の細菌と比較して減少することを意味する。より詳細には、遺伝子の「発現レベルの低下」とは、改変された細菌が産生する転写産物の量、それぞれ上記遺伝子によってコードされるポリペプチドの量が、改変を有しないが、それ以外は同一の細菌と比較して少なくとも１０％、例えば少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも１００％減少することを意味する。遺伝子発現のレベルは、ＰＣＲ、サザンブロッティング等を含む既知の方法によって決定することができる。加えて、遺伝子発現のレベルは、ノーザンブロッティング、定量ＲＴ－ＰＣＲ等を含む様々な既知の方法を用いて、遺伝子から転写されるｍＲＮＡの量を測定することで推定することができる。遺伝子によってコードされるポリペプチドの量は、ＥＬＩＳＡ、免疫組織化学またはウエスタンブロッティング等を含む既知の方法によって測定することができる。

【0303】

遺伝子の発現は、遺伝子によってコードされるポリペプチドの細胞内活性が、突然変異を有しないが、それ以外は同一の細菌と比較して減少するように、改変された細菌のゲノム内の遺伝子に突然変異を導入することによって減少させることができる。遺伝子の発現の減少をもたらす突然変異としては、遺伝子によってコードされるポリペプチドにおいてアミノ酸置換を引き起こす１ヌクレオチド以上の置換（ミスセンス突然変異）、終止コドンの導入（ナンセンス突然変異）、フレームシフトを引き起こすヌクレオチドの欠失もしくは挿入、薬剤耐性遺伝子の挿入、または遺伝子の一部もしくは遺伝子全体の欠失が挙げられる（Qiu and Goodman, 1997；Kwon et al., 2000）。プロモーター、シャイン－ダルガノ（ＳＤ）配列等の発現調節配列の改変等によっても発現を減少させることができる。遺伝子の発現は、「λ－レッド媒介遺伝子置換」等の遺伝子置換によって減少させることもできる（Datsenko and Wanner, 2000）。λ－レッド媒介遺伝子置換は、本明細書に記載される１つ以上の遺伝子を不活性化する特に好適な方法である。

【0304】

「不活性化する」、「不活性化」および「不活性化した」は、遺伝子の文脈において使用される場合、問題の遺伝子がもはや機能性タンパク質を発現しないことを意味する。遺伝子配列の一部もしくは全体の欠失、遺伝子のリーディングフレームの移動、ミスセンス／ナンセンス突然変異の導入、または遺伝子発現を制御する配列、例えばプロモーター、エンハンサー、アテニュエーター、リボソーム結合部位等を含む遺伝子の調節領域の改変のために改変ＤＮＡ領域が遺伝子を天然に発現することができない可能性がある。好ましくは、対象の遺伝子は、遺伝子置換等による遺伝子配列の一部または全体の欠失によって不活性化される。不活性化は、対象の遺伝子をＤＮＡ切断、好ましくは二本鎖切断により選択的に不活性化することが可能なレアカットエンドヌクレアーゼを導入または発現させることによっても達成され得る。本発明の文脈における「レアカットエンドヌクレアーゼ」としては、転写アクチベーター様エフェクター（ＴＡＬＥ）ヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）およびＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼが挙げられる。

【0305】

細菌のゲノム内の遺伝子の有無は、ＰＣＲ、サザンブロッティング等を含む既知の方法によって検出することができる。加えて、遺伝子発現のレベルは、ノーザンブロッティング、定量ＲＴ－ＰＣＲ等を含む様々な既知の方法を用いて、遺伝子から転写されるｍＲＮＡの量を測定することで推定することができる。遺伝子によってコードされるタンパク質の量は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥに続くイムノブロッティングアッセイ（ウエスタンブロッティング分析）等を含む既知の方法によって測定することができる。

【0306】

遺伝子の「発現レベルの増加」とは、改変された細菌が産生する転写産物の量、それぞれ上記遺伝子によってコードされるポリペプチドの量が、改変を有しないが、それ以外は同一の細菌と比較して増加することを意味する。より詳細には、遺伝子の「発現レベルの増加」とは、改変された細菌が産生する転写産物の量、それぞれ上記遺伝子によってコードされるポリペプチドの量が、改変を有しないが、それ以外は同一の細菌と比較して少なくとも１０％、例えば少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも１５０％、少なくとも２００％、少なくとも３００％、少なくとも４００％、少なくとも５００％、少なくとも６００％、少なくとも７００％、少なくとも８００％、少なくとも約９００％、少なくとも約１０００％、少なくとも約２０００％、少なくとも約３０００％、少なくとも約４０００％、少なくとも約５０００％、少なくとも約６０００％、少なくとも約７０００％、少なくとも約８０００％、少なくとも約９０００％または少なくとも約１００００％増加することを意味する。遺伝子発現のレベルは、ＰＣＲ、サザンブロッティング等を含む既知の方法によって決定することができる。加えて、遺伝子発現のレベルは、ノーザンブロッティング、定量ＲＴ－ＰＣＲ等を含む様々な既知の方法を用いて、遺伝子から転写されるｍＲＮＡの量を測定することで推定することができる。遺伝子によってコードされるポリペプチドの量は、ＥＬＩＳＡ、免疫組織化学またはウエスタンブロッティング等を含む既知の方法によって測定することができる。

【0307】

ポリペプチドの「発現レベルの増加」とは、改変された微生物が産生する問題のポリペプチドの量が、改変を有しないが、それ以外は同一の細菌と比較して増加することを意味する。より詳細には、ポリペプチドの「発現レベルの増加」とは、改変された細菌が産生する問題のポリペプチドの量が、改変を有しないが、それ以外は同一の細菌と比較して少なくとも１０％、例えば少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも１５０％、少なくとも２００％、少なくとも３００％、少なくとも４００％、少なくとも５００％、少なくとも６００％、少なくとも７００％、少なくとも８００％、少なくとも約９００％、少なくとも約１０００％、少なくとも約２０００％、少なくとも約３０００％、少なくとも約４０００％、少なくとも約５０００％、少なくとも約６０００％、少なくとも約７０００％、少なくとも約８０００％、少なくとも約９０００％または少なくとも約１００００％増加することを意味する。所与の細胞において産生されるポリペプチドの量は、当該技術分野で既知の任意の好適な定量化技術、例えばＥＬＩＳＡ、免疫組織化学またはウエスタンブロッティングによって決定することができる。

【0308】

ポリペプチド発現の増加は、当業者に既知の任意の好適な手段によって達成することができる。例えば、ポリペプチド発現の増加は、微生物においてポリペプチドをコードする遺伝子のコピー数を増加させること、例えば微生物においてｍＲＮＡ分子の産生を引き起こすように機能するプロモーターに操作可能に連結した、ポリペプチドをコードする遺伝子を含む外因性核酸、例えばベクターを微生物に導入することによって達成され得る。ポリペプチド発現の増加は、ポリペプチドをコードする遺伝子の少なくとも第２のコピーを微生物のゲノムに組み込むことによっても達成することができる。ポリペプチド発現の増加は、ポリペプチドをコードする遺伝子に操作可能に連結したプロモーターの強度を増大させることによっても達成することができる。ポリペプチド発現の増加は、ポリペプチドをコードするｍＲＮＡ分子上のリボソーム結合部位を改変することによっても達成することができる。リボソーム結合部位の配列を改変することで、翻訳開始速度を高め、それにより翻訳効率を向上させることができる。

【0309】

本明細書で使用される場合、ポリペプチド（例えばプリンヌクレオチド分解経路に関与する酵素）の発現が「減少した」、「減少する」またはその「減少」とは、改変された細菌における上記ポリペプチドの発現が、改変を有しないが、それ以外は同一の細菌（対照）における上記ポリペプチドの発現と比較して低下することを意味する。改変された細菌におけるポリペプチドの発現は、改変を有しないが、それ以外は同一の細菌（対照）における上記ポリペプチドの発現と比較して少なくとも約１０％、好ましくは少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％もしくは１００％、または１０％～１００％の整数（例えば６％、７％、８％等）の任意のパーセンテージで低下し得る。より詳細には、ポリペプチドの発現が「減少した」、「減少する」またはその「減少」とは、改変された細菌におけるポリペプチドの量が、改変を有しないが、それ以外は同一の細菌（対照）における上記ポリペプチドの量と比較して少なくとも約１０％、好ましくは少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％もしくは１００％、または１０％～１００％の整数（例えば６％、７％、８％等）の任意のパーセンテージで低下することを意味する。微生物におけるポリペプチドの発現または量は、ＥＬＩＳＡ、免疫組織化学、ウエスタンブロッティングまたはフローサイトメトリー等の手法を含む当該技術分野で既知の任意の好適な手段によって決定することができる。

【0310】

本明細書で使用される場合、ポリペプチド（例えばプリンヌクレオチド分解経路に関与する酵素）の活性が「減少した」、「減少する」またはその「減少」とは、改変された細菌における上記ポリペプチドの触媒活性が、改変を有しないが、それ以外は同一の細菌（対照）における上記ポリペプチドの触媒活性と比較して低下することを意味する。改変された細菌におけるポリペプチドの活性は、改変を有しないが、それ以外は同一の細菌（対照）における上記ポリペプチドの発現と比較して少なくとも約１０％、好ましくは少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％もしくは１００％、または１０％～１００％の整数（例えば６％、７％、８％等）の任意のパーセンテージで低下し得る。微生物におけるポリペプチドの活性は、任意の好適なタンパク質および酵素活性アッセイによって決定することができる。

【0311】

本明細書で使用される場合、「酵素の阻害剤」は、酵素の触媒活性を阻害する天然または合成の任意の化学化合物を指す。酵素の阻害剤は、必ずしも１００％または完全な阻害を達成する必要はない。この点で、酵素の阻害剤は、任意のレベルの阻害を誘導することができる。

【0312】

「置換」または「置換された」は、或るアミノ酸残基を別のアミノ酸残基に置き換えることによるポリペプチドの改変を指し、例えばポリペプチド配列中のセリン残基をグリシンまたはアラニン残基で置き換えることは、アミノ酸置換である。ポリヌクレオチドに関して使用される場合、「置換」または「置換された」は、或るヌクレオチドを別のヌクレオチドで置き換えることによるポリヌクレオチドの改変を指し、例えばポリヌクレオチド配列中のシトシンをチミンで置き換えることは、ヌクレオチド置換である。

【0313】

「保存的置換」は、ポリペプチドに関して使用される場合、アミノ酸残基を同様の側鎖を有する異なる残基で置換することを指し、したがって、通例、ポリペプチド中のアミノ酸を同じまたは同様のクラス内のアミノ酸で置換することを含む。例としては、限定されるものではないが、脂肪族側鎖を有するアミノ酸は、別の脂肪族アミノ酸、例えばアラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシンで置換されてもよく、ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸は、ヒドロキシル側鎖を有する別のアミノ酸、例えばセリンおよびトレオニンで置換され、芳香族側鎖を有するアミノ酸は、芳香族側鎖を有する別のアミノ酸、例えばフェニルアラニン、チロシン、トリプトファンおよびヒスチジンで置換され、塩基性側鎖を有するアミノ酸は、塩基性側鎖を有する別のアミノ酸、例えばリジンおよびアルギニンで置換され、酸性側鎖を有するアミノ酸は、酸性側鎖を有する別のアミノ酸、例えばアスパラギン酸またはグルタミン酸で置換され、疎水性または親水性アミノ酸は、それぞれ別の疎水性または親水性アミノ酸で置き換えられる。

【0314】

「非保存的置換」は、ポリペプチドに関して使用される場合、ポリペプチド中のアミノ酸を側鎖の特性が顕著に異なるアミノ酸で置換することを指す。非保存的置換では、定義された基の中ではなく、その間のアミノ酸を使用することができ、（ａ）置換（例えば、グリシンの代わりにセリン）の領域におけるペプチド骨格の構造、（ｂ）電荷もしくは疎水性、または（ｃ）側鎖の嵩高さに影響を与える。例として、限定されるものではないが、例示的な非保存的置換は、塩基性または脂肪族アミノ酸で置換された酸性アミノ酸；小型のアミノ酸で置換された芳香族アミノ酸；および疎水性アミノ酸で置換された親水性アミノ酸であり得る。

【0315】

「発現」は、転写、転写後修飾、翻訳、翻訳後修飾および分泌を含むが、これらに限定されない、ポリペプチド（例えば、コードされる酵素）の産生に関与する任意の工程を含む。

【0316】

本明細書で使用される場合、遺伝子の「調節領域」は、コード配列の発現に影響を与える核酸配列を指す。調節領域は、当該技術分野で既知であり、プロモーター、エンハンサー、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位、マトリックス付着領域、および／またはコード配列の発現を調節する他の要素が挙げられるが、これらに限定されない。

【0317】

本明細書で使用される場合、「ベクター」は、それが連結した別の核酸分子を輸送することができる核酸分子を指す。ベクターの一種は、付加的な核酸セグメントがライゲートし得る環状二本鎖核酸ループを指す「プラスミド」である。或る特定のベクターは、それが操作可能に連結した遺伝子の発現を誘導することができる。かかるベクターは、本明細書で「発現ベクター」と称される。或る特定の他のベクターは、細菌のゲノムへの外因性核酸分子の挿入を促進することができる。かかるベクターは、本明細書で「形質転換ベクター」と称される。概して、組換え核酸技術に有用なベクターは、プラスミドの形態であることが多い。プラスミドがベクターの最も一般的に使用される形態であることから、本明細書では、「プラスミド」および「ベクター」は区別なく使用され得る。多数の好適なベクターが当業者に既知であり、市販されている。

【0318】

本明細書で使用される場合、「プロモーター」は、ＲＮＡポリメラーゼおよび転写の開始に必要とされ得る他の因子の認識および結合部位を与えることによってコード領域の発現を制御する、通常は構造遺伝子のコード領域の上流（５’）にあるＤＮＡの配列を指す。プロモーターの選択は、関心の核酸配列によって決まる。好適な「プロモーター」は一般に、本発明の細菌における転写の開始を支持し、ｍＲＮＡ分子の産生を引き起こすことができるものである。「強力な」プロモーターとしては例えば、タンパク質の効率的な発現および過剰産生を可能にする、バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・アミロリクエファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）等に由来する天然プロモーター、例えばＰ４３、Ｐ１５、Ｐｖｅｇ、Ｐｙｌｂ、ＰｇｒｏＥＳ、ＰｓｉｇＸ、ＰｔｒｎＱ、Ｐｐｓｔ、ＰｓｏｄＡ、ＰｒｐｓＦ、ＰｌｅｐＡ、ＰｌｉａＧ、ＰｒｐｓＦ、Ｐｐｓｔ、ＰｆｕｓＡ、ＰｓｏｄＡ、Ｐｈａｇ、ならびにバチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）で活性な人工プロモーター、または誘導性バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）プロモーター、例えばＰｍｔｌＡ、Ｐｓｐａｃ、ＰｘｙｌＡ、ＰｓａｃＢ等が挙げられる。「強力な」プロモーターの更なる例としては、コリネバクテリウム由来の天然プロモーター、例えばＰ ＣＰ＿２４５４、ＰｔｕｆおよびＰｓｏｄ、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来の天然プロモーター、例えばＴ７、ならびにコリネファージＢＦＫ２０に由来するプロモーターＰ Ｆ１が挙げられる。

【0319】

本明細書で使用される場合、「操作可能に連結した」とは、記載の構成要素が意図されるように機能することを可能にする関係にある並置を指す。コード配列に「操作可能に連結した」制御配列は、制御配列に適合する条件下でコード配列の発現が達成されるようにライゲートする。プロモーター配列は、遺伝子の転写開始部位に、遺伝子の転写を調節するのに十分に近接している場合に、遺伝子に「操作可能に連結している」。

【0320】

「配列同一性のパーセンテージ」、「％配列同一性」および「パーセント同一性」は、本明細書においてアミノ酸配列と参照アミノ酸配列との間の比較を指すために使用される。本明細書で使用される「％配列同一性」は、２つのアミノ酸配列から以下のように算出される：Genetic Computing GroupのＧＡＰ（グローバルアラインメントプログラム）バージョン９を用い、デフォルトのＢＬＯＳＵＭ６２行列を－１２のギャップオープンペナルティ（ギャップの最初のヌルに対する）および－４のギャップ伸長ペナルティ（ギャップ内の追加の各ヌルに対する）で用いて配列をアラインメントする。アラインメント後に、参照アミノ酸配列中のアミノ酸の数に対するパーセンテージとしてマッチの数を表すことによって、パーセンテージ同一性を算出する。

【0321】

「参照配列」または「参照アミノ酸配列」は、別の配列と比較される規定の配列を指す。本発明の文脈において、参照アミノ酸配列は、例えば配列番号１に記載のアミノ酸配列であり得る。

【0322】

本明細書で使用される場合、「約」という用語は、それが用いられる数の数値のプラスまたはマイナス１０％を意味する。

【0323】

数値の限界または範囲が本明細書において定められる場合、端点が含まれる。また、数値の限界または範囲内の全ての値および部分範囲は、明示的に書き出されるかのように具体的に含まれる。

【0324】

本明細書で使用される場合、不定冠詞「a」および「an」は、文脈上そうでないことが明らかに指示されない限り、「少なくとも１つ」または「１つ以上」を意味する。

【0325】

本明細書で使用される場合、「含む（comprising）」、「含む（including）」、「有する（having）」およびその文法的変形語は、記載される特徴、工程または構成要素を指定するとみなされるが、その１つ以上の付加的な特徴、工程、構成要素または群を加えることを排除するものではない。

【0326】

本発明を一般的に説明したが、例示のみを目的として本明細書に提示され、特に指定のない限り、限定を意図するものではない或る特定の具体例を参照することによって更なる理解を得ることができる。

【0327】

実施例
実施例１：出発株の選択
イソプレノイドサイトカイニン産生工学のための出発株として種々のバチルス株を使用することができる（表２）。バチルス属種株は自然界から単離するか、またはカルチャーコレクションから得ることができる。中でも、イソプレノイドサイトカイニン産生のための出発株は、プリンヌクレオチド生合成経路に関連する代謝産物を過剰産生するために、既に突然変異誘発および選択の古典的方法に供したバチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株の中から選択され得る。例えば、リボフラビン、イノシン、グアノシンまたはアデノシンを過剰産生する株を選択することができる。ランダム突然変異誘発ならびにプリンヌクレオチドおよびリボフラビン経路からの毒性代謝阻害剤に供した株が好ましく、表３に挙げられる。

【0328】

【表2】

【0329】

【表3】

【0330】

バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＶＫＰＭ Ｂ２１１６は、Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）１６８（およそ４Ｍｂｐのゲノムを有する最も一般的なＢ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）宿主株）と株Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）Ｗ２３に由来するＤＮＡの６．４ｋｂｐのアイランドとのハイブリッド株である。かかる構造は、殆どのＢ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）工業株に共通しており、Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）１６８（トリプトファン栄養要求株ｔｒｐＣ）をＷ２３（原栄養性ＴｒｐＣ＋）ＤＮＡで形質転換することで得られた。ＶＫＰＭ Ｂ２１２１６のゲノム中の６．４ｋｂｐのＷ２３アイランドは、ゲノムが公開されているＢ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）レガシー株の１つであるＢ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＳＭＹと同じである（Zeigler et al. 2008）。Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＶＫＰＭ Ｂ２１１６は、古典的な突然変異誘発および選択によって得られたＢ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＳＭＹの直系の子孫株である。この株の別名は、Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＶＮＩＩ Ｇｅｎｅｔｉｋａ ３０４である。株の構築の説明は、１９８０年に出願されたソ連国特許発明第９０８０９２号明細書に記載されている。この突然変異は、その後の突然変異誘発および代謝阻害剤の選択によって得られた。株ＶＫＰＭ Ｂ２１１６は、フラビンキナーゼをコードするｒｉｂＣ遺伝子の突然変異により、ビタミンＢ２の毒性類似体であるロゼオフラビンに耐性を示す。この株は、毒性のプリン類似体である８－アザグアニンにも耐性を示す。

【0331】

実施例２：バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）に最適化されたイソプレノイドサイトカイニン生合成のための合成遺伝子ＩＰＴ配列番号１およびＬＯＧ配列番号３４の合成
アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）（シノニム アグロバクテリウム・ファブルム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆａｂｒｕｍ）（株Ｃ５８／ＡＴＣＣ ３３９７０）に由来するアデニル酸ジメチルアリルトランスフェラーゼ（ＩＰＴ）Ｔｚｓのアミノ酸配列（遺伝子ｔｚｓ、Ｅ．Ｃ．２．５．１．２７、ＵｎｉＰｒｏｔ：Ｐ５８７５８）（配列番号１）およびコリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）に由来するサイトカイニンリボシド５’－一リン酸ホスホリボヒドロラーゼ（ＬＯＧ）のアミノ酸配列（株ＡＴＣＣ １３０３２／ＤＳＭ ２０３００／ＮＣＩＭＢ １００２５、遺伝子Ｃｇｌ２３７９、Ｅ．Ｃ．３．２．２．ｎ１、ＵｎｉＰｒｏｔ：Ｑ８ＮＮ３４）（配列番号３４）を使用し、ＧＥＮＥｉｕｓ（Eurofins）を用いることで、Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）における遺伝子発現のためのコドン最適化ヌクレオチド配列を生成した。合成ＤＮＡフラグメントＩＰＴ－ＬＯＧ（配列番号７１）は、ＲＢＳ配列を付加し、合成イソプレノイドサイトカイニンオペロン発現カセットの更なるアセンブリのために合成フラグメントの両末端に短いアダプター配列を用いて設計した。

【0332】

実施例３：バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）に最適化されたイソプレノイドサイトカイニン生合成のための合成遺伝子ＩＰＴ配列番号２およびＬＯＧ配列番号３４の合成
アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）（シノニム アグロバクテリウム・ファブルム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆａｂｒｕｍ）（株Ｃ５８／ＡＴＣＣ ３３９７０）に由来するアデニル酸ジメチルアリルトランスフェラーゼ（ＩＰＴ）Ｔｍｒのアミノ酸配列（遺伝子ｉｚｔ、Ｅ．Ｃ．２．５．１．２７、Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ０Ａ３Ｌ５）（配列番号２）およびコリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）に由来するサイトカイニンリボシド５’－一リン酸ホスホリボヒドロラーゼ（ＬＯＧ）のアミノ酸配列（遺伝子Ｃｇｌ２３７９、Ｅ．Ｃ．３．２．２．ｎ１、ＵｎｉＰｒｏｔ：Ｑ８ＮＮ３４）（配列番号３４）を使用し、ＧＥＮＥｉｕｓ（Eurofins）を用いることで、Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）における遺伝子発現のためのコドン最適化ヌクレオチド配列を生成した。合成ＤＮＡフラグメントＩＰＴ－ＬＯＧ（配列番号７２）は、ＲＢＳ配列を付加し、合成イソプレノイドサイトカイニンオペロン発現カセットの更なるアセンブリのために合成フラグメントの両末端に短いアダプター配列を用いて設計した。

【0333】

実施例４：ＩＰＴおよびＬＯＧを含む合成イソプレノイドサイトカイニンオペロンのアセンブリ、ならびにＢ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）への形質転換
イソプレノイドサイトカイニン生合成のための合成遺伝子ＩＰＴ－ＬＯＧを含む合成フラグメント（配列番号７１および配列番号７２）を人工イソプレノイドサイトカイニンオペロンにアセンブリした。遺伝子組込み相同性、プロモーター配列およびエリスロマイシン選択可能マーカー（配列番号７３）を含む先頭および最終フラグメントを、Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のゲノム中のａｍｙＥ遺伝子座への安定したゲノム組込みのために設計し、合成した。

【0334】

人工オペロンアセンブリの最初の工程は、配列番号７５の先頭フラグメント、ならびにイソプレノイド－サイトカイニン生合成のための遺伝子を含む配列番号７１および配列番号７２の合成フラグメントＩＰＴ－ＬＯＧに対して配列番号７４および配列番号７５のプライマー対を用いて行われる別個のＤＮＡフラグメントのＰＣＲ増幅であった。配列番号７７および配列番号７８のプライマーセットを配列番号７９の最終フラグメントの増幅に使用した。

【0335】

フラグメントは、EppendorfのサイクラーおよびＰｈｕｓｉｏｎポリメラーゼ（Thermo Fisher）を使用し、製造業者により提供されるバッファー中にて２００μＭ ｄＮＴＰ、０．５μＭの各プライマーおよびおよそ１０ｎｇの鋳型を添加し、５０μｌの最終容量で以下のＰＣＲサイクル条件を用いて３０サイクル増幅した：９８℃で３０秒、（９８℃で３０秒、６８．５℃で２５秒、７２℃で２３／２５秒）の３０サイクル、７２℃で５分、１０℃でホールド。

【0336】

各フラグメントのＰＣＲ反応生成物を０．８％アガロースゲルで泳動し、ゲルから切り出し、ＧｅｎｅＪＥＴ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Thermo Fisher）により、製造業者によって提供されるプロトコルに従ってゲルから抽出した。制限およびライゲーションの繰り返し工程により、フラグメントを人工オペロンにアセンブリした。ＳｐｅＩ（ＢｃｕＩ）およびＸｂａＩ制限部位の組合せを用いることで、ライゲーションの成功に適合した制限末端を得た。ライゲーションの各工程の後に、組み合わせたフラグメントを次のＰＣＲ増幅に新たな鋳型として使用した。５μｌのＦＤ ｇｒｅｅｎバッファー（Thermo Fisher Scientific）、２～３μｌの選択酵素（ＳｐｅＩ（ＢｃｕＩ）およびＸｂａＩ、Thermo Fisher）および最大およそ１５００ｎｇのＰＣＲフラグメントを添加して５０μｌ容量で制限を行った。制限消化後に、消化されたＤＮＡフラグメントを、Ｗｉｚａｒｄ ＳＶ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－ｕｐ ｓｙｓｔｅｍを用い、製造業者によって提供されるプロトコルに従ってクリーニングした。最初の２つのフラグメントを、製造業者により提供されるバッファー中にて５％ＰＥＧ ４０００を添加し、両方のフラグメントを１：１のモル比で最終容量１５μｌとして、２．５ＵのＴ４ ＤＮＡリガーゼ（Thermo Fisher）によるライゲーション反応に使用した。次の工程では、１μｌの不活性化ライゲーションを鋳型として、配列番号８０および配列番号８１のプライマーセットを用い、先と同じＰＣＲミックスおよびＰＣＲサイクル条件であるが、伸長時間を長くして新たな５０μＬのＰＣＲに使用した。制限消化、クリーニングおよびライゲーション工程を最終フラグメントのライゲーションのために繰り返した。ＰＣＲを０．８％アガロースゲルで行い、フラグメントをゲルから切り出し、先と同様に消化およびクリーニングし、先と同様にライゲートした。ａｍｙ Ｅ相同性、ＲＢＳ配列を伴うプロモーター、ＩＰＴおよびＬＯＧ遺伝子、ならびにエリスロマイシン耐性カセットを含む最終オペロンを、配列番号７６および配列番号７７のプライマー対を用いて増幅し、上述のようにクリーニングおよびライゲートした。配列番号８２および配列番号８３のＩＰＴ－ＬＯＧを含む構築した合成ｔｒａｎｓ－ゼアチンオペロンをバチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＶＫＰＭ Ｂ２１１６の形質転換に使用した。配列番号８３のＩＰＴ－ＬＯＧオペロンを用いた形質転換により、形質転換株ＴＺＡＢ１、ＴＺＡＢ２、ＴＺＡＢ３およびＴＺＡＢ４が得られた。配列番号８２のＩＰＴ－ＬＯＧオペロンを用いた形質転換により、形質転換株ＴＺＡＢ１４およびＴＺＡＢ１５が得られた。ａｍｙＥ組込み部位での人工オペロンの正確な組込みをｃＰＣＲによって確認した。

【0337】

【表4】

【0338】

実施例５：ｄｘｓの過剰発現を用いたイソプレノイド前駆体供給量の増加によるイソプレノイドサイトカイニン生合成の増加
イソプレノイドサイトカイニンの生合成のためのイソプレノイド側鎖は、Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のＭＥＰ経路によって合成される。Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）に由来する１－デオキシキシルロース－５－リン酸シンターゼ（ＤＸＳ、Ｅ．Ｃ．２．２．１．７）のタンパク質配列を用い、Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）での遺伝子発現のためのコドン最適化特徴ＧＥＮＥｉｕｓ（Eurofins）を用いることで、ｄｘｓの合成ヌクレオチド配列を生成した。配列番号８４および配列番号８５のｄｘｓの合成ＤＮＡフラグメントを重複する２つの部分で設計し、オーバーラップＰＣＲによって結合した。結合した配列番号８６の合成遺伝子ｄｘｓ全体を人工オペロンにアセンブリした。ｌａｃＡ相同性、プロモーター配列、および配列番号８７のスペクチノマイシン選択可能マーカーを含む先頭および最終フラグメントを、Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のゲノムへの安定したゲノム組込みのために設計し、合成した。フラグメントは、実施例４に記載のようにアセンブリした。

【0339】

人工オペロンアセンブリの最初の工程は、配列番号８８の先頭フラグメント、配列番号８９の最終フラグメント、および配列番号８６の結合した合成遺伝子ｄｘｓに対して配列番号７４および配列番号７５のプライマーのセットを用いて行われる別個のＤＮＡフラグメントのＰＣＲ増幅であった。

【0340】

フラグメントは、EppendorfのサイクラーおよびＰｈｕｓｉｏｎポリメラーゼ（Thermo Fisher）を使用し、製造業者により提供されるバッファー中にて２００μＭ ｄＮＴＰ、０．５μＭの各プライマーおよびおよそ１０ｎｇの鋳型を添加し、５０μｌの最終容量で３０サイクル増幅した。使用したＰＣＲサイクル条件は、９８℃で３０秒、（９８℃で３０秒、７１℃で２５秒、７２℃で２３／２５秒）の３０サイクル、７２℃で５分、１０℃でホールドであった。

【0341】

各フラグメントのＰＣＲ反応生成物を０．８％アガロースゲルで泳動し、ゲルから切り出し、ＧｅｎｅＪＥＴ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Thermo Fisher）により、製造業者によって提供されるプロトコルに従ってゲルから抽出した。制限およびライゲーションの繰り返し工程により、フラグメントを人工オペロンにアセンブリした。ＳｐｅＩ（ＢｃｕＩ）およびＸｂａＩ制限部位の組合せを用いることで、ライゲーションの成功に適合した制限末端を得た。ライゲーションの各工程の後に、組み合わせたフラグメントを新たな鋳型として次のＰＣＲ増幅に使用した。５μｌのＦＤ ｇｒｅｅｎバッファー（Thermo Fisher Scientific）、２～３μｌの選択酵素（ＳｐｅＩ（ＢｃｕＩ）およびＸｂａＩ、Thermo Fisher）および最大およそ１５００ｎｇのＰＣＲフラグメントを添加して５０μｌ容量で制限を行った。制限消化後に、消化されたＤＮＡフラグメントを、Ｗｉｚａｒｄ ＳＶ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－ｕｐ ｓｙｓｔｅｍを用い、製造業者によって提供されるプロトコルに従ってクリーニングした。最初の２つのフラグメントを、製造業者により提供されるバッファー中にて両方のフラグメントを１：１のモル比で最終容量１５μｌとして、２．５ＵのＴ４ ＤＮＡリガーゼ（Thermo Fisher）によるライゲーション反応に使用した。次の工程では、１μｌの不活性化ライゲーションを鋳型として、配列番号７４および配列番号７５のプライマーセットを用い、先と同じＰＣＲミックスおよびＰＣＲサイクル条件であるが、伸長時間を長くして新たな５０μＬのＰＣＲに使用した。制限消化、クリーニングおよびライゲーション工程を最終フラグメントのライゲーションのために繰り返した。最終工程では、１μｌの不活性化ライゲーションを、配列番号９０の完全な合成ｄｘｓオペロンの鋳型として、配列番号９１および配列番号９２のプライマーを用い、先と同じＰＣＲミックスおよびＰＣＲサイクル条件であるが、伸長時間を長くして新たな５０μＬのＰＣＲに使用した。ＰＣＲを０．８％アガロースゲルで行い、フラグメントをゲルから切り出し、先と同様にクリーニングし、先と同様にライゲートした。構築した合成ｄｘｓオペロンを、ａｍｙＥにＩＰＴ－ＬＯＧオペロンを有するバチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＴＺＡＢ１５の形質転換に使用した（配列番号８０）。人工ＤＸＳオペロン（配列番号９０）を用いた形質転換により、形質転換株ＴＺＡＢ４３が得られた。ｌａｃＡ組込み部位での人工オペロンの正確な組込みをｃＰＣＲによって確認した。

【0342】

【表5】

【0343】

実施例６：イソプレノイドサイトカイニンの産生のためのバチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株の培養
構築した株および対照株は全て、この手順に従って培養した。２０％グリセロール中にて－８０℃で保存した株ＶＫＰＭ Ｂ２１１６、ＴＺＡＢ１、ＴＺＡＢ２、ＴＺＡＢ３、ＴＺＡＢ４、ＴＺＡＢ１４、ＴＺＡＢ１５およびＴＺＡＢ４３の凍結ストックを、適切な濃度のエリスロマイシンおよびリンコマイシンを含有する固体シード培地に塗抹し、３７℃でおよそ１日インキュベートした。更なる試験のために、栄養段階培地に、２５ｍＬの栄養培地および適切な量の抗生物質が入ったバッフル付き２５０ｍＬエルレンマイヤーフラスコ１本当たり、固体シードプレート上の培養物を１～５プラグ接種した。培養物を３７℃にて１８～２０時間、２２０ＲＰＭでインキュベートした。栄養培地中の培養物をシード培養物として使用し、これを産生培地に接種した。１０％接種材料を用いた（２５０ｍＬエルレンマイヤーフラスコ内の産生培地２５ｍＬ当たり２．５ｍＬ）。産生培地を前述のように使用するか、または硫酸アデニン（最終濃度３ｇ／Ｌ）で改良した。培養物を３０℃または３７℃にて最大４８時間、２２０ＲＰＭでインキュベートした。発酵した培養物をサンプリングし、実施例７に記載のように分析した。ｔｒａｎｓ－ゼアチン、ｔｒａｎｓ－ゼアチンリボシドおよびイソペンテニルアデニンの力価は、実施例７に記載のようにＬＣ／ＭＳを用いて測定した。

【0344】

【表6】

【0345】

【表7】

【0346】

栄養培地（表７）の成分を混合し、ｐＨを７．２～７．４とした。次いで、ＫＨ_２ＰＯ_４－Ｋ_２ＨＰＯ_４溶液をＫＨ_２ＰＯ_４ １．５ｇ／ＬおよびＫ_２ＨＰＯ_４ ３．５ｇ／Ｌの最終濃度で添加した。培地をエルレンマイヤーフラスコ（２５ｍｌ／２５０ｍｌ－バッフル付きエルレンマイヤーフラスコ）に分配し、１２１℃で３０分間オートクレーブ処理した。滅菌グルコースをオートクレーブ処理後に最終濃度７．５ｇ／Ｌで添加した。抗生物質を接種前に添加した。

【0347】

【表8】

【0348】

産生培地（表８）の成分を混合し、ｐＨを７．２～７．４とした。次いで、ＫＨ_２ＰＯ_４－Ｋ_２ＨＰＯ_４溶液をＫＨ_２ＰＯ_４ １．５ｇ／ＬおよびＫ_２ＨＰＯ_４ ３．５ｇ／Ｌの濃度で添加した。培地を１２１℃で３０分間オートクレーブ処理した。滅菌尿素溶液（２０ｍｌのストック溶液、最終濃度は６ｇ／Ｌである）、滅菌グルコース溶液（５００ｍｌのストック溶液、最終濃度は１００ｇ／Ｌグルコースである）をオートクレーブ処理後に添加し、１Ｌの産生培地を得た。適切な抗生物質を接種前に添加した。次いで、培地を滅菌エルレンマイヤーフラスコ（２５ｍｌ／２５０ｍｌ－バッフル付きエルレンマイヤーフラスコ）に分配した。

【0349】

実施例７：イソプレノイドサイトカイニンの分析
実施例６に記載の手順に従って培養した株は全て、この手順に従って分析した。発酵した産生培地をサンプリングし、即座に－２０℃で凍結した。代謝産物の抽出のために、発酵した産生培地を、メタノールおよび１００ｍＭ酢酸アンモニウムｐＨ４の１：１混合物から構成される抽出バッファーで１：１に希釈した。サンプルを常に撹拌しながら室温で１時間抽出し、４０００～４５００ＲＰＭで１５分間遠心分離し、濾過した（０．２２ｕｍ）。サンプルを即座にＬＣ／ＭＳによって分析するか、または分析まで－２０℃で保管した。

【0350】

サンプルを、ＭＳ／ＭＳ可能質量分析計Ｔｈｅｒｍｏ ＴＳＱ Ｑｕａｎｔｕｍ Ａｃｃｅｓｓ ＭＡＸと組み合わせたＴｈｅｒｍｏ Ａｃｃｅｌａ １２５０ ＨＰＬＣ機器で分析した。方法は、Ｔｈｅｒｍｏ Ａｃｃｕｃｏｒｅ Ｃ３０、１５０×４．６ｍｍ、２．６ｕｍ粒径カラムに基づき、６０℃に維持し、移動相Ａ－水中の０．１％ギ酸および移動相Ｂ－メタノールを開始条件：９５％のＡ、１０分でＢの％を５０％まで線形勾配で増加、および初期条件に５分間安定化の勾配プログラムにて、１ｍｌ／分の流量で用いる。質量分析計はｈＥＳＩイオン源を備え、ポジティブ（＋）モードで動作し、スプレー電圧を４６００Ｖ、気化器温度を３５０℃、衝突圧を１．０トル、衝突エネルギーを１０Ｖに設定した。ｔｒａｎｓ－ゼアチンは、親の２１９．９ｍ／ｚから娘イオン：１８５．２、１４８．０および１３６．０への遷移でＭＲＭモードにて観察された。

【0351】

ｔｒａｎｓ－ゼアチンリボシド（ｔＺＲ）は、親の３５２．５ｍ／ｚから娘イオン：２２０．１、２０２．１、１４８．０および１３６．１への遷移でＭＲＭモードにて観察された。イソペンテニルアデニン（ｉＰ）は、親の２０４．４ｍ／ｚから娘イオン：１４８．４、１３６．３および１１９．２への遷移でＭＲＭモードにて観察された。イソペンテニルアデニンリボシド（ｉＰＲ）は、親の３３６．５ｍ／ｚから娘イオン：２０４．１、１４８．０および１１３．１への遷移でＭＲＭモードにて観察された。

【0352】

実施例８：ＩＰＴおよびＬＯＧの異種発現を有するバチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株によるｔｒａｎｓ－ゼアチンおよび関連イソプレノイドサイトカイニンの産生
培養は実施例６に記載のように行った。抽出および分析は、実施例７に記載のように行った。検出されたイソプレノイドサイトカイニンの収率を図４に示す。配列番号８２のＩＰＴ－ＬＯＧを発現する株は、イソプレノイドサイトカイニンを最大１０ｍｇ／Ｌの量で産生する（図４を参照されたい）。

【0353】

実施例９：ＩＰＴおよびＬＯＧを異種発現させ、硫酸アデニンを成長培地に用いたバチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株によるｔｒａｎｓ－ゼアチンおよび関連イソプレノイドサイトカイニンの産生
培養は実施例６に記載のように行った。産生培地を実施例６に記載のように構成するか、または最終濃度３ｇ／Ｌの硫酸アデニンで改良した。発酵ブロスを抽出し、実施例７に記載のように分析した。結果を図５に示す。配列番号８２のＩＰＴ－ＬＯＧを有する株ＴＺＡＢ１４におけるイソプレノイドサイトカイニンの産生は、硫酸アデニンを含まない培地と比較して、硫酸アデニンを含有する培地で増加する。

【0354】

実施例１０：配列番号８２のＩＰＴ－ＬＯＧの異種発現およびＤＸＳの過剰発現を有するバチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株によるｔｒａｎｓ－ゼアチンおよび関連イソプレノイドサイトカイニンの産生
培養は実施例６に記載のように行った。抽出および分析は、実施例７に記載のように行った。収率を図６に示す。イソプレノイドサイトカイニンの産生は、配列番号８２のＩＰＴ－ＬＯＧオペロンおよび配列番号９０のＤＸＳオペロンを有する株で増加する。

【0355】

実施例１１：ＩＰＴ－ＬＯＧ（配列番号８３）を有するバチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株によるｔｒａｎｓ－ゼアチンおよび関連イソプレノイドサイトカイニン産生の分析
培養は実施例６に記載のように行った。抽出および分析は、実施例７に記載のように行った。配列番号８３のＩＰＴ－ＬＯＧを有する株ＴＺＡＢ１、ＴＺＡＢ２、ＴＺＡＢ３およびＴＺＡＢ４ならびに配列番号８２のＩＰＴ－ＬＯＧを有する株ＴＺＡＢ１４およびＴＺＡＢ１５は、イソプレノイドサイトカイニンを産生した。結果を図７に示す。

【0356】

実施例１２：バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株におけるＩＰＴ－ＬＯＧオペロン、ＩＰＴおよびＤＸＳの異種発現によるｔｒａｎｓ－ゼアチンおよび関連イソプレノイドサイトカイニンの産生
イソプレノイドサイトカイニン生合成のための遺伝子ＩＰＴ１－ＬＯＧ１（配列番号７１）を含む合成ＤＮＡフラグメントを、実施例４に記載のように人工イソプレノイドサイトカイニンオペロンにアセンブリした。

【0357】

ＩＰＴ１（配列番号１）のみを含むＩＰＴ１発現カセットを、配列番号１２３および配列番号１８３のプライマーを用いるフラグメントＩＰＴ１－ＬＯＧ１（配列番号８２）の最初の部分、ならびに別個に配列番号１２３および配列番号１２８のプライマーを用いるＩＰＴ１－ＬＯＧ１（配列番号８２）の最後の部分を、EppendorfのサイクラーおよびＰｈｕｓｉｏｎポリメラーゼ（Thermo Fisher）を用い、製造業者により提供されるバッファー中にて２００μＭ ｄＮＴＰ、０．５μＭの各プライマーおよびおよそ１０ｎｇの鋳型を添加し、５０μｌの最終容量で以下のＰＣＲサイクル条件を用いて３０サイクルＰＣＲ増幅することによってアセンブリした：９８℃で３０秒、（９８℃で３０秒、６８．５℃で２５秒、７２℃で２５秒）の３０サイクル、７２℃で５分、１０℃でホールド。ＰＣＲ反応生成物を０．８％アガロースゲルで泳動し、ゲルから切り出し、ＧｅｎｅＪＥＴ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Thermo Fisher）により、製造業者によって提供されるプロトコルに従ってゲルから抽出した。制限およびライゲーションによってフラグメントを人工ＩＰＴ１発現カセットにアセンブリした。ＸｂａＩ制限部位を用いて、ライゲーションの成功に適合した制限末端を得た。ライゲーション後に、組み合わせたフラグメントを次のＰＣＲ増幅に新たな鋳型として使用した。５μｌのＦＤ ｇｒｅｅｎバッファー（Thermo Fisher Scientific）、２～３μｌの選択ＸｂａＩ（Thermo Fisher）制限酵素および最大およそ１５００ｎｇのＰＣＲフラグメントを添加して５０μｌ容量で制限を行った。制限消化後に、消化されたＤＮＡフラグメントを、Ｗｉｚａｒｄ ＳＶ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－ｕｐ ｓｙｓｔｅｍを用い、製造業者によって提供されるプロトコルに従ってクリーニングした。最初の２つのフラグメントを、製造業者により提供されるバッファー中にて５％ＰＥＧ ４０００を添加し、両方のフラグメントを１：１のモル比で最終容量１５μｌとして、２．５ＵのＴ４ ＤＮＡリガーゼ（Thermo Fisher）によるライゲーション反応に使用した。次の工程では、１μｌの不活性化ライゲーションを鋳型として、配列番号１２３および配列番号１２８のプライマーセットを用い、先と同じＰＣＲミックスおよびＰＣＲサイクル条件であるが、伸長時間を長くして新たな５０μＬのＰＣＲに使用した。ＩＰＴフラグメント（配列番号１８４）を有する最終発現カセットが生成する。

【0358】

次いで、ＩＰＴ１－ＬＯＧ１（配列番号８２）またはＩＰＴフラグメント（配列番号１８４）を含むｔｒａｎｓ－ゼアチンオペロンのために構築した最終発現カセットをバチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＶＫＰＭ Ｂ２１１６、バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）１６８およびバチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＲＢ５０株の形質転換に使用することで、表９に示す新たな形質転換株が開発された。ａｍｙＥ組込み部位での人工オペロンの正確な組込みをｃＰＣＲによって確認した。

【0359】

ｄｘｓ遺伝子（配列番号８６）を含む合成フラグメントを実施例５に記載のように発現カセットにアセンブリした。構築したＤＸＳ発現カセット（配列番号９０）をバチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＶＫＰＭ Ｂ２１１６、バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）１６８およびバチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＲＢ５０由来株の形質転換に使用することで、表９に示す新たな形質転換株が開発された。ｌａｃＡ組込み部位での人工オペロンの正確な組込みをｃＰＣＲによって確認した。

【0360】

【表9】

【0361】

構築した株および対照株は全て、実施例６に記載の手順に従って培養した。２０％グリセロール中にて－８０℃で保存した株の凍結ストックを、適切な濃度のエリスロマイシンおよびリンコマイシンを含有する固体シード培地に塗抹し、３７℃でおよそ１日インキュベートした。更なる試験のために、栄養段階培地に、２５ｍＬの栄養培地および適切な量の抗生物質が入ったバッフル付き２５０ｍＬエルレンマイヤーフラスコ１本当たり、固体シードプレート上の培養物を１～５プラグ接種した。培養物を３７℃にて８～２０時間、２２０ＲＰＭでインキュベートした。栄養培地中の培養物をシード培養物として使用し、これを産生培地に接種した。１０％接種材料を用いた（２５０ｍＬエルレンマイヤーフラスコ内の産生培地２５ｍＬ当たり２．５ｍＬ）。バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）１６８由来株の評価のために産生培地をトリプトファン（最終濃度５０ｍｇ／Ｌ）で改良した。培養物を３０℃、３４℃または３７℃にて最大４８時間、２２０ＲＰＭでインキュベートした。発酵した培養物をサンプリングし、実施例７に記載のように分析した。ｔｒａｎｓ－ゼアチン（ｔＺ）、ｔｒａｎｓ－ゼアチンリボシド（ｔＺＲ）、イソペンテニルアデニンリボシド（ｉＰＲ）およびイソペンテニルアデニン（ｉＰ）の力価は、実施例７に記載のようにＬＣ／ＭＳを用いて測定した。

【0362】

抽出および分析は、実施例７に記載のように行った。検出されたイソプレノイドサイトカイニンの収率を表１７、図８、図９および図１０に示す。配列番号８２のＩＰＴ－ＬＯＧを発現する株は、イソプレノイドサイトカイニンを最大６０ｍｇ／Ｌの総量で産生し（図１０を参照されたい）、イソプレノイドサイトカイニンの産生は、ＩＰＴ－ＬＯＧオペロン（配列番号８２）およびＤＸＳオペロン（配列番号９０）を有する株においてさらに全体的に増加する。

【0363】

実施例１３：エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）株におけるＩＰＴ、ＩＰＴ１－ＬＯＧ１オペロンおよびＤＸＳの異種発現によるｔｒａｎｓ－ゼアチンおよび関連イソプレノイドサイトカイニンの産生
可能性のあるイソプレノイドサイトカイニン産生株としてエシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）を評価するために２セットの発現プラスミドを構築した。

【0364】

第１のセットは、合成遺伝子ＩＰＴ（配列番号１７９）およびＩＰＴ－ＬＯＧオペロン（配列番号８２）の異種サイトカイニン遺伝子／オペロン発現のためのプラスミドであった。ＩＰＴ遺伝子またはＩＰＴ－ＬＯＧオペロンをｐＢＢＲ１プラスミドベクターにアセンブリした。ｐＢＢＲ１ベクターは、イソプロピル－β－Ｄ－１－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）で誘導可能なプロモーターに基づく異種発現系：ＬａｃＩ^Ｑ／Ｐ_{ｌａｃＵＶ５}－Ｔ７を有し、選択マーカーとしてクロラムフェニコール耐性カセットを含む。

【0365】

第２のプラスミドを、イソプレノイド前駆体供給量を増加させるＤＸＳ（配列番号９０）の異種発現のためにクローニングした。ＤＸＳ遺伝子をｐ１５Ａプラスミドベクターにアセンブリした。ｐ１５ＡベクターはＸｙｌＳ／Ｐｍに基づく発現系を有し、ここで、ＸｙｌＳはｍ－トルイル酸誘導性Ｐｍプロモーターの正の調節因子であり、選択マーカーとしてカナマイシン耐性カセットを含む。

【0366】

発現プラスミドアセンブリの最初の工程は、挿入フラグメント：ＩＰＴ－ＬＯＧ、ＤＸＳならびにベクター骨格：ｐＢＢＲ１およびｐ１５ＡのＰＣＲ増幅であった。ＩＰＴ ＤＮＡフラグメントは、配列番号１６３および配列番号１８２のプライマーセットで増幅したが、ＩＰＴ－ＬＯＧ ＤＮＡフラグメントは、ＩＰＴについては配列番号１６３および配列番号１６４、ＬＯＧ増幅については配列番号１６５および配列番号１６６のプライマーセットを用いて増幅した。配列番号１６７および配列番号１６８のプライマーセットをｐＢＢＲ１ベクター骨格の増幅に使用した。ＤＸＳフラグメントをプライマーセット：配列番号１６９および配列番号１７０で増幅し、配列番号１７１および配列番号１７２のプライマーセットをｐ１５Ａベクター骨格の増幅に使用した。フラグメントは、EppendorfのサイクラーおよびＰｈｕｓｉｏｎポリメラーゼ（Thermo Fisher）を使用し、製造業者により提供されるバッファー中にて２００μＭ ｄＮＴＰ、０．５μＭの各プライマーおよびおよそ１０ｎｇの鋳型を添加し、５０μｌの最終容量で３０サイクル増幅した。各フラグメントのＰＣＲ反応生成物を０．８％アガロースゲルで泳動し、ゲルから切り出し、ＧｅｎｅＪＥＴ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Thermo Fisher）により、製造業者によって提供されるプロトコルに従ってゲルから抽出した。各フラグメントの質量をＮａｎｏＤｒｏｐ機器、２６０ｎｍの吸光度を用いて測定した。１０μｌのＨＩＦＩアセンブリ反応（ＮＥＢｕｉｌｄｅｒ ＨｉＦｉ ＤＮＡ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ）によってフラグメントを最終発現構築物にアセンブリした。反応は氷上で行った：５μｌのＨｉＦｉ ＤＮＡ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘに、フラグメントをベクター：インサート＝１：２のＤＮＡモル比で添加した（フラグメントの総量は最大０．２ｐｍｏｌとした）。反応物をヌクレアーゼフリー水で１０μｌの最終容量まで満たした。サンプルをサーモサイクラーにて５０℃で６０分間インキュベートした。次の工程では、１μｌの冷却したアセンブリ産物をコンピテントＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞の形質転換に用いた。得られた株からプラスミドＤＮＡを単離し、シークエンシングによって正確なアセンブリを確認した。

【0367】

ＤＸＳ遺伝子の発現のためのｐ１５Ａプラスミドの形質転換により、形質転換株ＴＺ３０７７が得られた。ＩＰＴ遺伝子の発現のためのｐＢＢＲ１プラスミドの形質転換により、形質転換株ＴＺＡＢ３０７９が得られた。ＩＰＴ－ＬＯＧオペロンの発現のためのｐＢＢＲ１プラスミドの形質転換により、形質転換株ＴＺ３０８２が得られた。さらに、ＩＰＴ遺伝子およびＩＰＴ－ＬＯＧオペロン発現プラスミドをＴＺ３０７７（ＤＸＳ発現プラスミドを有するＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）株）に形質転換した。一方はＤＸＳ遺伝子、もう一方はＩＰＴ遺伝子の発現のための２つのプラスミドを有する得られた株をＴＺＡＢ３０８７として保存した。一方はＤＸＳ遺伝子、もう一方はＩＰＴ－ＬＯＧオペロンの発現のための２つのプラスミドを有する得られた株をＴＺ３０９１として保存した。全ての形質転換体をｃＰＣＲによって確認し、下記表１０に挙げる。

【0368】

【表10】

【0369】

構築した株（ＴＺ３０７７～ＴＺ３０９１）および対照株エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）を２０％グリセロール中にて－８０℃で保存した。株は常に適切な濃度の選択抗生物質（カナマイシン／クロラムフェニコール）の存在下で培養した。初めに、これらを固体シード培地－２ＹＴ寒天プレート（表１１）に塗抹し、３７℃でおよそ１７時間インキュベートした。更なる試験のために、栄養段階培地－２ＹＴに、５０ｍＬの栄養培地および適切な量の抗生物質が入った２５０ｍＬエルレンマイヤーフラスコ１本当たり、固体シードプレート上の培養物の単一のコロニーを接種した。培養物を３７℃にて１７時間、２２０ＲＰＭでインキュベートした。栄養培地（表１２）中の培養物をシード培養物として使用した：２．５％接種材料を用いて２５０ｍＬエルレンマイヤーフラスコ内の５０ｍＬの産生培地に接種した。産生培地（表１３）として、グルコースを添加した２ＹＴを使用した（滅菌グルコースをオートクレーブ処理後に最終濃度２５ｇ／Ｌで添加した）。培養物を３７℃にて１０時間、２２０ＲＰＭでインキュベートした。２時間の発酵後に、発現プラスミドを有する株を誘導した。ＩＰＴ／ＩＰＴ－ＬＯＧ発現プラスミドを有する株は、最終濃度１５０μＭのＩＰＴＧで誘導した。ＤＸＳ発現プラスミドを有する株は、最終濃度１ｍＭのｍ－トルイル酸で誘導した。両方の発現系（ＤＸＳおよびＩＰＴ／ＩＰＴ－ＬＯＧ）を有する株は、両方の誘導物質（１５０μＭ ＩＰＴＧおよび１ｍＭ ｍ－トルイル酸）で誘導した。１０時間の発酵後に、ｔｒａｎｓ－ゼアチンおよび関連イソプレノイドサイトカイニンの分析のために培養物をサンプリングした。用いた抽出プロトコルは、実施例７に記載の通りであった。ｔｒａｎｓ－ゼアチン、ｔｒａｎｓ－ゼアチンリボシド、イソペンテニルアデニンおよびイソペンテニルアデニンリボシドの力価は、実施例７に記載のようにＬＣ／ＭＳを用いて測定した。

【0370】

【表11】

【0371】

【表12】

【0372】

【表13】

【0373】

検出されたイソプレノイドサイトカイニンの収率を図１１に示す。株の成長は、１または２種の選択抗生物質および使用する異なる誘導物質の存在下で異なるため、サイトカイニン測定値を各培養物の６００ｎｍでの光学密度（ＯＤ６００）で除算することによって正規化した。

【0374】

ＩＰＴを発現する株は、イソプレノイドサイトカイニンを最大２．８ｍｇ／Ｌの量で産生する（図１１および表１７を参照されたい）。ＩＰＴ－ＬＯＧを発現する株は、イソプレノイドサイトカイニンを最大３．４ｍｇ／Ｌの量で産生する。イソプレノイドサイトカイニンの産生は、ＩＰＴ－ＬＯＧの発現およびイソプレノイド前駆体供給量のためのＤＸＳの付加的な発現を有する株において３．４ｍｇ／Ｌまで増加する。

【0375】

実施例１４：クローニングベクターへのＩＰＴ１－ＬＯＧ１オペロン、ＩＰＴ１およびＤＸＳ遺伝子のアセンブリ、ならびに細菌コリネバクテリウム・スタティオニス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｔａｔｉｏｎｉｓ）へのプラスミドの形質転換
イソプレノイドサイトカイニン生合成のための遺伝子ＩＰＴ１－ＬＯＧ１（配列番号１７８）を含む合成フラグメントを、先に構築した配列番号８２の合成ｔｒａｎｓ－ゼアチンオペロンから、配列番号１７８のフラグメントについては配列番号１７３および配列番号１７４のプライマーセットを用いて増幅し、遺伝子ＩＰＴ１（配列番号１８０）の発現については、配列番号１７３および配列番号１７７のプライマーセットを配列番号１８０のフラグメントの構築に使用した。フラグメントは、EppendorfのサイクラーおよびＰｈｕｓｉｏｎポリメラーゼ（Thermo Fisher）を使用し、製造業者により提供されるバッファー中にて２００μＭ ｄＮＴＰ、０．５μＭの各プライマーおよびおよそ１０ｎｇの鋳型を添加し、５０μｌの最終容量で以下のＰＣＲサイクル条件を用いて３０サイクル増幅した：９８℃で３０秒、（９８℃で３０秒、６３．３℃で２５秒、７２℃で４５秒）の３０サイクル、７２℃で５分、１０℃でホールド。

【0376】

合成ｄｘｓ遺伝子（配列番号１８１）を、先に構築した配列番号９０の合成ｄｘｓオペロンから、配列番号１７５および配列番号１７６のプライマーセットを用い、EppendorfのサイクラーおよびＰｈｕｓｉｏｎポリメラーゼ（Thermo Fisher）を使用し、製造業者により提供されるバッファー中にて２００μＭ ｄＮＴＰ、０．５μＭの各プライマーおよびおよそ１０ｎｇの鋳型を添加し、５０μｌの最終容量で以下のＰＣＲサイクル条件を用いて３０サイクル増幅した：９８℃で３０秒、（９８℃で３０秒、６７．６℃で２５秒、７２℃で６０秒）の３０サイクル、７２℃で５分、１０℃でホールド。各フラグメントのＰＣＲ反応生成物を０．８％アガロースゲルで泳動し、ゲルから切り出し、ＧｅｎｅＪＥＴ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Thermo Fisher）により、製造業者によって提供されるプロトコルに従ってゲルから抽出した。

【0377】

ＩＰＴ１遺伝子およびＩＰＴ１－ＬＯＧ１イソプレノイドサイトカイニンオペロンをｐＶＷＥｘ６プラスミド（Henke et al. 2021）、ｄｘｓ遺伝子発現カセットをｐＥＣＸＴ９９ＡＰｓｙｎプラスミドに、ＮＥＢｕｉｌｄｅｒ ＨｉＦｉ ＤＮＡ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘを用いるＨｉＦｉアセンブリ反応により、製造業者によって提供されるプロトコルに従ってさらにクローニングした。両方のプラスミドをＢａｍＨＩ ＦＤ制限酵素での消化によって予め線状化した。ＨｉＦｉ反応混合物を、エレクトロコンピテントＤＨ１０β Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞のエレクトロポレーションにさらに使用した。カナマイシン選択マーカーにより、ｐＶＷＥｘ６＋ＩＰＴ１－ＬＯＧ１およびｐＶＷＥｘ６＋ＩＰＴ１形質転換体の選択が可能となり、ｐＥＣＸＴ９９ＡＰｓｙｎ＋ｄｘｓ形質転換体の選択にはテトラサイクリンを使用した。形質転換体をコロニーＰＣＲによって確認した。プラスミド単離のために、適切な抗生物質を含む２ＴＹ培地にコロニーを接種し、３７℃で一晩インキュベートした。ＧｅｎｅＪＥＴ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Thermo Fisher）プラスミド抽出キットにより、製造業者によって提供されるプロトコルに従ってプラスミドを一晩培養物から単離した。単離されたプラスミドをＫｐｎＩおよびＸｂａＩ ＦＤ制限酵素での消化によってさらに分析した。

【0378】

生成したプラスミドをコリネバクテリウム・スタティオニス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｔａｔｉｏｎｉｓ）ＤＳＭ ２０３０５に形質転換するために、Yili et al. 2015に従ってエレクトロコンピテント細胞を作製した。単離プラスミドによる形質転換は、BioRadのエレクトロポレーターにより、２ｍｍキュベットを用いて行った。およそ２５０ｎｇのプラスミドを、先に作製したエレクトロコンピテント細胞の５０μＬアリコートに導入し、２ｍｍキュベットに移し、電気パルスに曝露した。細胞を即座に１ｍＬの再生培地が入った２ｍＬエッペンドルフチューブに移した。３０℃および２００ｒｐｍに設定したシェーカーでの３時間のインキュベーション後に、適切な濃度の選択マーカーを含む回復寒天プレートＬＢＨＩＳ上に形質転換体をプレーティングした。得られた形質転換体（表１４に示す）をコロニーＰＣＲによって検証した。

【0379】

ｐＶＷＥｘ６＋ｉｐｔ１－ｌｏｇ１およびｐＥＣＸＴ９９ＡＰｓｙｎ＋ｄｘｓならびにｐＶＷＥｘ６＋ｉｐｔ１およびｐＥＣＸＴ９９ＡＰｓｙｎ＋ｄｘｓ構築物の両方を有する形質転換体について、確認された形質転換体を、第２世代の株のための新たなエレクトロコンピテント細胞の作製に使用した。エレクトロコンピテント細胞を付加的なプラスミドで形質転換し、カナマイシンおよびテトラサイクリンの両方を含むプレート上で選択した。形質転換体のコロニーＰＣＲ検証を両方のプラスミドについて行った。

【0380】

【表14】

【0381】

実施例１５：コリネバクテリウム・スタティオニス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｔａｔｉｏｎｉｓ）異種発現によるｔｒａｎｓ－ゼアチンおよび関連イソプレノイドサイトカイニンの産生
構築した株および対照株は全て、この手順に従って培養した。２０％グリセロール中で保存し、－８０℃で保管した株コリネバクテリウム・スタティオニス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｔａｔｉｏｎｉｓ）ＤＳＭ ２０３０５、ＴＺ３１３６、ＴＺ３１３８、ＴＺ３１３９、ＴＺ３１４２およびＴＺ３１４６の凍結ストックを、適切な濃度のテトラサイクリンまたは／およびカナマイシンを含有する固体シード培地に塗抹し、３０℃でおよそ１日インキュベートした。更なる試験のために、栄養段階培地に、２５ｍＬの栄養培地および適切な量の抗生物質が入ったバッフル付き２５０ｍＬエルレンマイヤーフラスコ１本当たり、固体シードプレート上の培養物を５プラグ接種した。培養物を３０℃にて１８時間、２００ＲＰＭでインキュベートした。栄養培地中の培養物をシード培養物として使用し、これを産生培地に接種した。１０％接種材料を用いた（バッフル付き２５０ｍＬエルレンマイヤーフラスコ内の産生培地２５ｍＬ当たり２．５ｍＬ）。培養物を３０℃にて最大４８時間、２００ＲＰＭでインキュベートした。発酵した培養物をサンプリングし、実施例７に記載のように分析した。ｔｒａｎｓ－ゼアチン、ｔｒａｎｓ－ゼアチンリボシド、イソペンテニルアデニンおよびイソペンテニルアデニンリボシドの力価は、実施例７に記載のようにＬＣ／ＭＳを用いて測定した。

【0382】

【表15】

【0383】

【表16】

【0384】

実施例１６：コリネバクテリウム・スタティオニス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｔａｔｉｏｎｉｓ）異種発現によるイソプレノイドサイトカイニンの分析
コリネバクテリウム・スタティオニス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｔａｔｉｏｎｉｓ）形質転換体のイソプレノイドサイトカイニン産生を、発酵プロセスにおいて試験した。培養は実施例１５に記載のように行った。抽出および分析は、実施例７に記載の手順に従って行った。結果を図１２および表１７に示す。

【0385】

【表17】

【0386】

実施例１７：ｐｕｒＡ遺伝子の過剰発現によるバチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）におけるプリンヌクレオチド生合成経路の増強
プリンヌクレオチド生合成経路の増強に用いたｐｕｒＡ遺伝子（配列番号９８）を含む合成フラグメントを人工遺伝子発現カセットにアセンブリした。遺伝組込み相同性、プロモーター配列およびゼオシン選択可能マーカーを含む先頭（配列番号９６）および末端フラグメント（配列番号９７）を、Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のゲノム中のｙｙｂＮ遺伝子座への安定したゲノム組込みのために設計し、合成した。

【0387】

人工オペロンアセンブリの最初の工程は、配列番号９６の先頭フラグメントについては配列番号９９および配列番号１００のプライマー対、配列番号９７の末端フラグメントについては配列番号１０１および配列番号１０２のプライマーセットを用いて行われる別個のＤＮＡフラグメントのＰＣＲ増幅であった。配列番号１０３および配列番号１０４のプライマーセットを、配列番号９８のｐｕｒＡ過剰発現の遺伝子を含むフラグメントの増幅に使用した。フラグメントは、EppendorfのサイクラーおよびＰｈｕｓｉｏｎポリメラーゼ（Thermo Fisher）を使用し、製造業者により提供されるバッファー中にて２００μＭ ｄＮＴＰ、０．５μＭの各プライマーおよびおよそ１０ｎｇの鋳型を添加し、５０μｌの最終容量で以下のＰＣＲサイクル条件を用いて３０サイクル増幅した：９８℃で３０秒、（９８℃で３０秒、６５℃で２５秒、７２℃で２３／２５秒）の３０サイクル、７２℃で５分、１０℃でホールド。各フラグメントのＰＣＲ反応生成物を０．８％アガロースゲルで泳動し、ゲルから切り出し、ＧｅｎｅＪＥＴ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Thermo Fisher）により、製造業者によって提供されるプロトコルに従ってゲルから抽出した。制限およびライゲーションの繰り返し工程により、フラグメントを人工オペロンにアセンブリした。ＳｐｅＩ（ＢｃｕＩ）およびＸｂａＩ制限部位の組合せを用いることで、ライゲーションの成功に適合した制限末端を得た。ライゲーションの各工程の後に、組み合わせたフラグメントを次のＰＣＲ増幅に新たな鋳型として使用した。５μｌのＦＤ ｇｒｅｅｎバッファー（Thermo Fisher Scientific）、２～３μｌの選択酵素（ＳｐｅＩ（ＢｃｕＩ）およびＸｂａＩ、Thermo Fisher）および最大およそ１５００ｎｇのＰＣＲフラグメントを添加して５０μｌ容量で制限を行った。制限消化後に、消化されたＤＮＡフラグメントを、Ｗｉｚａｒｄ ＳＶ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－ｕｐ ｓｙｓｔｅｍを用い、製造業者によって提供されるプロトコルに従ってクリーニングした。最初の２つのフラグメントを、製造業者により提供されるバッファー中にて５％ＰＥＧ ４０００を添加し、両方のフラグメントを１：１のモル比で最終容量１５μｌとして、２．５ＵのＴ４ ＤＮＡリガーゼ（Thermo Fisher）によるライゲーション反応に使用した。次の工程では、１μｌの不活性化ライゲーションを鋳型として、配列番号１０２および配列番号１０５のプライマーセットを用い、先と同じＰＣＲミックスおよびＰＣＲサイクル条件であるが、伸長時間を長くして新たな５０μＬのＰＣＲに使用した。制限消化、クリーニングおよびライゲーション工程を末端フラグメントのライゲーションのために繰り返した。ＰＣＲを０．８％アガロースゲルで行い、フラグメントをゲルから切り出し、先と同様に消化およびクリーニングし、先と同様にライゲートした。ｙｙｂＮ相同性、ＲＢＳ配列を伴うプロモーター、ｐｕｒＡ遺伝子およびゼオシン耐性カセットを含む最終オペロンを、配列番号１０６および配列番号１０７のプライマー対を用いて増幅し、上述のようにクリーニングおよびライゲートした。構築した合成オペロンをバチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＶＫＰＭ Ｂ２１１６の形質転換に使用した。配列番号１０８のｐｕｒＡオペロンを用いた形質転換により、形質転換株ＢＳ１９が得られた。ｙｙｂＮ組込み部位での人工オペロンの正確な組込みをｃＰＣＲによって確認した。

【0388】

実施例１８：ＬＯＧ８遺伝子と組み合わせたＩＰＴ遺伝子の様々なホモログを含む合成イソプレノイドサイトカイニンオペロンのアセンブリ、およびＢ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）への形質転換
イソプレノイドサイトカイニン生合成のための合成ＬＯＧ遺伝子（ＬＯＧ８－配列番号１１６）および様々なＩＰＴ遺伝子（配列番号１２９、１５４～１５６）を含む合成フラグメントを人工イソプレノイドサイトカイニンオペロンにアセンブリした。遺伝子組込み相同性、プロモーター配列およびエリスロマイシン選択可能マーカー（配列番号７３）を含む先頭および末端フラグメントを、Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のゲノム中のａｍｙＥ遺伝子座への安定したゲノム組込みのために設計し、合成した。

【0389】

人工オペロンアセンブリの最初の工程は、配列番号７６の先頭フラグメント、ならびにイソプレノイド－サイトカイニン生合成のための遺伝子を含む合成フラグメントＬＯＧ８（配列番号１１６）ならびにフラグメントＩＰＴ１、ＩＰＴ６、ＩＰＴ７およびＩＰＴ９（それぞれ配列番号１７９、１５１、１５２および１５３）に対して配列番号７４および配列番号７５のプライマー対を用いて行われる別個のＤＮＡフラグメントのＰＣＲ増幅であった。配列番号７７および配列番号７８のプライマーセットを配列番号７９の末端フラグメントの増幅に使用した。フラグメントは、EppendorfのサイクラーおよびＰｈｕｓｉｏｎポリメラーゼ（Thermo Fisher）を使用し、製造業者により提供されるバッファー中にて２００μＭ ｄＮＴＰ、０．５μＭの各プライマーおよびおよそ１０ｎｇの鋳型を添加し、５０μｌの最終容量で以下のＰＣＲサイクル条件を用いて３０サイクル増幅した：９８℃で３０秒、（９８℃で３０秒、６５℃で２５秒、７２℃で３０秒）の３０サイクル、７２℃で５分、１０℃でホールド。各フラグメントのＰＣＲ反応生成物を０．８％アガロースゲルで泳動し、ゲルから切り出し、ＧｅｎｅＪＥＴ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Thermo Fisher）により、製造業者によって提供されるプロトコルに従ってゲルから抽出した。制限およびライゲーションの繰り返し工程により、フラグメントを人工オペロンにアセンブリした。ＳｐｅＩ（ＢｃｕＩ）、ＶｓｐＩ、ＮｄｅＩおよびＳｎａＢＩ制限部位の組合せを用いることで、ライゲーションの成功に適合した制限末端を得た。ライゲーションの各工程の後に、組み合わせたフラグメントを次のＰＣＲ増幅に新たな鋳型として使用した。５μｌのＦＤ ｇｒｅｅｎバッファー（Thermo Fisher Scientific）、２～３μｌの選択酵素（ＳｐｅＩ（ＢｃｕＩ）、ＶｓｐＩ、ＮｄｅＩおよびＳｎａＢＩ、Thermo Fisher）、ならびに最大およそ１５００ｎｇのＰＣＲフラグメントを添加して５０μｌ容量で制限を行った。制限消化後に、消化されたＤＮＡフラグメントを、Ｗｉｚａｒｄ ＳＶ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－ｕｐ ｓｙｓｔｅｍを用い、製造業者によって提供されるプロトコルに従ってクリーニングした。先頭フラグメントおよび様々なＩＰＴフラグメント（配列番号１７９、１５１、１５２および１５３）を、製造業者により提供されるバッファー中にて５％ＰＥＧ ４０００を添加し、両方のフラグメントを１：１のモル比で最終容量１５μｌとして、２．５ＵのＴ４ ＤＮＡリガーゼ（Thermo Fisher）によるライゲーション反応に使用した。次の工程では、１μｌの各不活性化ライゲーションを鋳型として、配列番号１２０および配列番号１２１のプライマーセットを用い、先と同じＰＣＲミックスおよびＰＣＲサイクル条件であるが、伸長時間を長くして新たな５０μＬのＰＣＲに使用した。ＤＮＡフラグメントを上述のようにアガロースゲルから抽出した。制限消化（ＶｓｐＩおよびＮｄｅＩ）、クリーニングおよびライゲーション工程をＡｍｙＥ＋ＩＰＴ１オペロン、ＡｍｙＥ＋ＩＰＴ６オペロン、ＡｍｙＥ＋ＩＰＴ７オペロンおよびＡｍｙＥ＋ＩＰＴ９オペロン（それぞれ配列番号１２９、１５４、１５５および１５６）、ならびにＬＯＧ８遺伝子（配列番号１１６）を含むフラグメントのライゲーションのために繰り返した。１μｌの不活性化ライゲーションを鋳型として、配列番号１２２および配列番号１２３のプライマーセットを用い、先と同じＰＣＲミックスおよびＰＣＲサイクル条件であるが、伸長時間を長くして新たな５０μＬのＰＣＲにさらに使用した。ＤＮＡフラグメントを上述のようにアガロースゲルから抽出した。ＸｂａＩ酵素消化を行い、先にＳｎａＢＩ制限部位によってライゲートし、配列番号１２６および配列番号１２７のプライマーセットを用いてＰＣＲ増幅したオペロンＡｍｙＥ ０＋ＩＰＴ１／６／７／９＋ＬＯＧ８（それぞれ配列番号１３６、１５７、１５８および１５９）およびオペロンＥｒｙＲ＋ＡｍｙＥ ＥＮＤ（配列番号１４０）をライゲートした。

【0390】

ａｍｙ Ｅ相同性、ＲＢＳ配列を伴うプロモーター、様々なＩＰＴ遺伝子および遺伝子ＬＯＧ８、ならびにエリスロマイシン耐性カセットを含む最終オペロンを、配列番号１２８および配列番号１２３のプライマー対を用いて増幅し、上述のようにクリーニングおよびライゲートした。ＩＰＴ１－ＬＯＧ８、ＩＰＴ６－ＬＯＧ８、ＩＰＴ７－ＬＯＧ８およびＩＰＴ９－ＬＯＧ８（それぞれ配列番号１４７、１６０、１６１および１６２）を含む構築した合成ｔｒａｎｓ－ゼアチンオペロンを、バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＢＳ１９（実施例１７に記載）の形質転換に使用した。全ての形質転換体をｃＰＣＲによって確認し、下記表１８に挙げる。構築した株は全て、実施例６に記載のように培養した。抽出および分析は、実施例７に記載のように行い、サイトカイニンの収率を図１３に示す。

【0391】

【表18】

【0392】

実施例１９：ＩＰＴ１および様々なＬＯＧを含む合成イソプレノイドサイトカイニンオペロンのアセンブリ、ならびにＢ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）への形質転換
イソプレノイドサイトカイニン生合成のための合成遺伝子ＩＰＴ１（配列番号７１）および様々なＬＯＧ遺伝子（配列番号１１０～１１９）を含む合成フラグメントを人工イソプレノイドサイトカイニンオペロンにアセンブリした。遺伝子組込み相同性、プロモーター配列およびエリスロマイシン選択可能マーカーを含む先頭および末端フラグメントを、Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のゲノム中のａｍｙＥ遺伝子座への安定したゲノム組込みのために設計し、合成した。

【0393】

人工オペロンアセンブリの最初の工程は、配列番号７６の先頭フラグメント、ならびにイソプレノイド－サイトカイニン生合成のための遺伝子を含む配列番号７１の合成フラグメントＩＰＴ１およびフラグメントＬＯＧ２～ＬＯＧ１１（配列番号１１０～１１９）に対して配列番号７４および配列番号７５のプライマー対を用いて行われる別個のＤＮＡフラグメントのＰＣＲ増幅であった。配列番号１２６および配列番号１２７のプライマーセットを、エリスロマイシン選択可能マーカー（配列番号１４０）を含む末端フラグメントの増幅に使用した。フラグメントは、EppendorfのサイクラーおよびＰｈｕｓｉｏｎポリメラーゼ（Thermo Fisher）を使用し、製造業者により提供されるバッファー中にて２００μＭ ｄＮＴＰ、０．５μＭの各プライマーおよびおよそ１０ｎｇの鋳型を添加し、５０μｌの最終容量で以下のＰＣＲサイクル条件を用いて３０サイクル増幅した：９８℃で３０秒、（９８℃で３０秒、６５℃で２５秒、７２℃で３０秒）の３０サイクル、７２℃で５分、１０℃でホールド。各フラグメントのＰＣＲ反応生成物を０．８％アガロースゲルで泳動し、ゲルから切り出し、ＧｅｎｅＪＥＴ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Thermo Fisher）により、製造業者によって提供されるプロトコルに従ってゲルから抽出した。制限およびライゲーションの繰り返し工程により、フラグメントを人工オペロンにアセンブリした。ＳｐｅＩ（ＢｃｕＩ）、ＶｓｐＩ、ＮｄｅＩ ＸｂａＩおよびＳｎａＢＩ制限部位の組合せを用いることで、ライゲーションの成功に適合した制限末端を得た。ライゲーションの各工程の後に、組み合わせたフラグメントを次のＰＣＲ増幅に新たな鋳型として使用した。５μｌのＦＤ ｇｒｅｅｎバッファー（Thermo Fisher Scientific）、２～３μｌの選択酵素（ＳｐｅＩ（ＢｃｕＩ）、ＶｓｐＩ、ＮｄｅＩ、ＸｂａＩおよびＳｎａＢＩ、Thermo Fisher）および最大およそ１５００ｎｇのＰＣＲフラグメントを添加して５０μｌ容量で制限を行った。制限消化後に、消化されたＤＮＡフラグメントを、Ｗｉｚａｒｄ ＳＶ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－ｕｐ ｓｙｓｔｅｍを用い、製造業者によって提供されるプロトコルに従ってクリーニングした。

【0394】

最初の２つのフラグメントを、製造業者により提供されるバッファー中にて５％ＰＥＧ ４０００を添加し、両方のフラグメントを１：１のモル比で最終容量１５μｌとして、２．５ＵのＴ４ ＤＮＡリガーゼ（Thermo Fisher）によるライゲーション反応に使用した。次の工程では、１μｌの不活性化ライゲーションを鋳型として、配列番号１２０および配列番号１２１のプライマーセットを用い、先と同じＰＣＲミックスおよびＰＣＲサイクル条件であるが、伸長時間を長くして新たな５０μＬのＰＣＲに使用した。ＤＮＡフラグメントを上述のようにアガロースゲルから抽出した。制限消化（ＶｓｐＩおよびＮｄｅＩ）、クリーニングおよびライゲーション工程を、様々なＬＯＧ遺伝子（配列番号１１０～１１９）を含むフラグメントのライゲーションのために繰り返した。１μｌの不活性化ライゲーションを鋳型として、配列番号１２２および配列番号１２３のプライマーセットを用い、先と同じＰＣＲミックスおよびＰＣＲサイクル条件であるが、伸長時間を長くして新たな５０μＬのＰＣＲにさらに使用した。ＤＮＡフラグメントを上述のようにアガロースゲルから抽出した。ＸｂａＩ酵素消化を行い、先にＳｎａＢＩ制限部位によってライゲートし、配列番号１２６および配列番号１２７のプライマーセットを用いてＰＣＲ増幅したオペロンＡｍｙＥ ０＋ＩＰＴ１＋ＬＯＧ２～１１（配列番号１３０～１３９）およびオペロンＥｒｙＲ＋ＡｍｙＥ ＥＮＤ（配列番号１４０）をライゲートした。

【0395】

ａｍｙＥ相同性、ＲＢＳ配列を伴うプロモーター、ＩＰＴ１および様々なＬＯＧ遺伝子およびエリスロマイシン耐性カセットを含む最終オペロンを、配列番号１２８および配列番号１２３のプライマー対を用いて増幅し、上述のようにクリーニングおよびライゲートした。ＩＰＴ１－ＬＯＧ ２～１１（配列番号１４１～１５０）を含む構築した合成ｔｒａｎｓ－ゼアチンオペロンをバチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＢＳ１９（実施例１７に記載）の形質転換に使用した。全ての形質転換体をｃＰＣＲによって確認し、下記表１９に挙げる。構築した株は全て、実施例６に記載のように培養した。抽出および分析は、実施例７に記載のように行い、サイトカイニンの収率を図１４に示す。

【0396】

【表19】

【0397】

本明細書に引用した参照文献のリスト
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【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【配列表】

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【国際調査報告】