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特表2023-551103新型コロナウイルスに対する抗体、新型コロナウイルスを検出する試薬及びキット

書誌要約請求の範囲詳細な説明課題実施例実施するための形態図面の説明

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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-12-07

(54)【発明の名称】新型コロナウイルスに対する抗体、新型コロナウイルスを検出する試薬及びキット

(51)【国際特許分類】

C12N 15/13 20060101AFI20231130BHJP

C07K 16/10 20060101ALI20231130BHJP

C12N 15/63 20060101ALI20231130BHJP

C12N 1/15 20060101ALI20231130BHJP

C12N 1/19 20060101ALI20231130BHJP

C12N 1/21 20060101ALI20231130BHJP

C12N 5/10 20060101ALI20231130BHJP

G01N 33/53 20060101ALI20231130BHJP

G01N 33/536 20060101ALI20231130BHJP

G01N 33/569 20060101ALI20231130BHJP

【ＦＩ】

C12N15/13

C07K16/10 ZNA

C12N15/63 Z

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

G01N33/53 D

G01N33/536 B

G01N33/536 C

G01N33/536 D

G01N33/536 E

G01N33/569 L

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023526469

(86)(22)【出願日】2021-09-10

(85)【翻訳文提出日】2023-05-05

(86)【国際出願番号】 CN2021117802

(87)【国際公開番号】W WO2022089044

(87)【国際公開日】2022-05-05

(31)【優先権主張番号】202011182628.X

(32)【優先日】2020-10-29

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】521131797

【氏名又は名称】菲鵬生物股▲ふん▼有限公司

【氏名又は名称原語表記】ＦａｐｏｎＢｉｏｔｅｃｈＩｎｃ．

【住所又は居所原語表記】Ｒｏｏｍ６０４，６０３，６０２，６０１，ＵｎｉｔＡＢＣＤ，６／Ｆ，ＢｕｉｌｄｉｎｇＤ２，ＴＣＬＳｃｉｅｎｃｅＰａｒｋ，Ｎｏ．１００１ＺｈｏｎｇｓｈａｎＹｕａｎＲｏａｄ，Ｌｉｕｘｉａｎｄｏｎｇ，Ｘｉｌｉ，ＮａｎｓｈａｎＤｉｓｔｒｉｃｔ，ＳｈｅｎｚｈｅｎＣｉｔｙ，ＧｕａｎｇｄｏｎｇＰｒｏｖｉｎｃｅ５１８０６３，Ｃｈｉｎａ

(74)【代理人】

【識別番号】100158920

【弁理士】

【氏名又は名称】上野英樹

(72)【発明者】

【氏名】サイ，ペン

(72)【発明者】

【氏名】カ，チーチャン

(72)【発明者】

【氏名】モウ，エン

(72)【発明者】

【氏名】ヂォン，トウバイ

(72)【発明者】

【氏名】ロウ，ウェンケン

(72)【発明者】

【氏名】ファン，リンユン

【テーマコード（参考）】

4B065

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B065AA90X

4B065AB01

4B065AC14

4B065AC15

4B065BA02

4B065BC01

4B065CA25

4B065CA46

4H045AA10

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA10

4H045CA40

4H045DA76

4H045EA53

4H045FA74

(57)【要約】

新型コロナウイルスに対する抗体、新型コロナウイルスを検出する試薬及びキットであって、抗体技術の分野に関する。新型コロナウイルスに対する抗体は、重鎖相補性決定領域及び軽鎖相補性決定領域を含む。当該抗体の新型コロナウイルスのＮタンパク質に対する親和性が比較的良く、当該抗体を使用した新型コロナウイルスの検出は、比較的良い感度及び特異性を有する。新型コロナウイルスの検出に、抗体選択肢を提供する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

新型コロナウイルス又はそのＮタンパク質に対する抗体又はその機能性断片であって、前記抗体又はその機能性断片は、下記の相補性決定領域を含み、
ＣＤＲ－ＶＨ１：Ｇ－Ｘ１－Ｔ－Ｆ－Ｓ－Ｘ２－Ｆ－Ｘ３－Ｍ－Ｈ、ここで、Ｘ１はＶ或いはＦであり、Ｘ２はＳ或いはＴであり、Ｘ３はＧ或いはＡであり、
ＣＤＲ－ＶＨ２：Ｙ－Ｘ１－Ｎ－Ｓ－Ｘ２－Ｓ－Ｎ－Ｘ３－Ｉ－Ｙ－Ｙ－Ａ－Ｄ－Ｔ－Ｘ４－Ｋ、ここで、Ｘ１はＬ或いはＩであり、Ｘ２はＧ或いはＡであり、Ｘ３はＩ、Ｖ或いはＬであり、Ｘ４はＩ、Ｖ或いはＬであり、
ＣＤＲ－ＶＨ３：Ｘ１－Ｒ－Ｈ－Ｘ２－Ｍ、ここで、Ｘ１はＡ或いはＴであり、Ｘ２はＡ或いはＶであり、
ＣＤＲ－ＶＬ１：Ｓ－Ｑ－Ｓ－Ｘ１－Ｄ－Ｙ－Ｘ２－Ｇ－Ｄ－Ｓ－Ｘ３－Ｍ、ここで、Ｘ１はＩ、Ｖ或いはＬであり、Ｘ２はＤ或いはＮであり、Ｘ３はＦ或いはＹであり、
ＣＤＲ－ＶＬ２：Ｘ１－Ａ－Ｓ－Ｎ－Ｘ２－Ｅ－Ｓ、ここで、Ｘ１はＡ或いはＤであり、Ｘ２はＩ、Ｖ或いはＬであり、
ＣＤＲ－ＶＬ３：Ｑ－Ｘ１－Ｓ－Ｎ－Ｅ－Ｘ２－Ｐ－Ｙ、ここで、Ｘ１はＮ、Ｈ或いはＱであり、Ｘ２はＤ或いはＥであることを特徴とする新型コロナウイルス又はそのＮタンパク質に対する抗体又はその機能性断片。

【請求項2】

ＣＤＲ－ＶＨ１において、Ｘ１はＦであり、
ＣＤＲ－ＶＨ２において、Ｘ１はＩであり、
ＣＤＲ－ＶＨ３において、Ｘ１はＡであり、
ＣＤＲ－ＶＬ１において、Ｘ３はＹであり、
好ましくは、ＣＤＲ－ＶＨ１において、Ｘ２はＳであり、
好ましくは、ＣＤＲ－ＶＨ１において、Ｘ２はＴであり、
好ましくは、ＣＤＲ－ＶＨ１において、Ｘ３はＧであり、
好ましくは、ＣＤＲ－ＶＨ１において、Ｘ３はＡであり、
好ましくは、ＣＤＲ－ＶＨ２において、Ｘ２はＧであり、
好ましくは、ＣＤＲ－ＶＨ２において、Ｘ２はＡであり、
好ましくは、ＣＤＲ－ＶＨ２において、Ｘ３はＩであり、
好ましくは、ＣＤＲ－ＶＨ２において、Ｘ３はＶであり、
好ましくは、ＣＤＲ－ＶＨ２において、Ｘ３はＬであり、
好ましくは、ＣＤＲ－ＶＨ２において、Ｘ４はＩであり、
好ましくは、ＣＤＲ－ＶＨ２において、Ｘ４はＶであり、
好ましくは、ＣＤＲ－ＶＨ２において、Ｘ４はＬであり、
好ましくは、ＣＤＲ－ＶＨ３において、Ｘ２はＡであり、
好ましくは、ＣＤＲ－ＶＨ３において、Ｘ２はＶであり、
好ましくは、ＣＤＲ－ＶＬ１において、Ｘ１はＩであり、
好ましくは、ＣＤＲ－ＶＬ１において、Ｘ１はＶであり、
好ましくは、ＣＤＲ－ＶＬ１において、Ｘ１はＬであり、
好ましくは、ＣＤＲ－ＶＬ１において、Ｘ２はＤであり、
好ましくは、ＣＤＲ－ＶＬ１において、Ｘ２はＮであり、
好ましくは、ＣＤＲ－ＶＬ２において、Ｘ１はＡであり、
好ましくは、ＣＤＲ－ＶＬ２において、Ｘ１はＤであり、
好ましくは、ＣＤＲ－ＶＬ２において、Ｘ２はＩであり、
好ましくは、ＣＤＲ－ＶＬ２において、Ｘ２はＶであり、
好ましくは、ＣＤＲ－ＶＬ２において、Ｘ２はＬであり、
好ましくは、ＣＤＲ－ＶＬ１において、Ｘ１はＮであり、
好ましくは、ＣＤＲ－ＶＬ１において、Ｘ１はＨであり、
好ましくは、ＣＤＲ－ＶＬ１において、Ｘ１はＱであり、
好ましくは、ＣＤＲ－ＶＬ２において、Ｘ２はＤであり、
好ましくは、ＣＤＲ－ＶＬ２において、Ｘ２はＥであり、
好ましくは、前記抗体又はその機能性断片の各相補性決定領域は、下記の突然変異組合せ１～６８から選択されるいずれか１つであることを特徴とする請求項１に記載の抗体又はその機能性断片。

【表1(1)】

【表1(2)】

【請求項3】

前記抗体又はその機能性断片が新型コロナウイルスのＮタンパク質とＫ_Ｄ≦８×１０^－９ｍｏｌ／Ｌの親和性で、好ましくは、Ｋ_Ｄ≦７×１０^－１０ｍｏｌ／Ｌの親和性で結合することを特徴とする請求項２に記載の抗体又はその機能性断片。

【請求項4】

ＣＤＲ－ＶＨ１において、Ｘ１はＶであり、
ＣＤＲ－ＶＨ２において、Ｘ１はＬであり、
ＣＤＲ－ＶＨ３において、Ｘ１はＴであり、
ＣＤＲ－ＶＬ１において、Ｘ３はＦであり、
好ましくは、前記抗体又はその機能性断片の各相補性決定領域は、下記の突然変異組合せ６９～７６中から選択されるいずれか１つであることを特徴とする請求項１に記載の抗体又はその機能性断片。

【表2】

【請求項5】

前記抗体は、配列が順番に配列番号１～４に示されるか、又は配列番号１～４と少なくとも８０％の相同性を有する軽鎖フレームワーク領域ＦＲ１－Ｌ、ＦＲ２－Ｌ、ＦＲ３－Ｌ及びＦＲ４－Ｌ、及び／又は、配列が順番に配列番号５～８に示されるか、又は配列番号５～８と少なくとも８０％の相同性を有する重鎖フレームワーク領域ＦＲ１－Ｈ、ＦＲ２－Ｈ、ＦＲ３－Ｈ及びＦＲ４－Ｈを含み、
好ましくは、前記ＦＲ１－Ｈのアミノ酸配は配列番号１５に示され、
好ましくは、前記抗体は、定常領域をさらに含み、
好ましくは、前記定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ及びＩｇＤから選択されるいずれか１つの定常領域であり、
好ましくは、前記定常領域の由来となる種属は、牛、馬、乳牛、豚、ヒツジ、ヤギ、ラット、マウス、イヌ、ネコ、ウサギ、ラクダ、ロバ、鹿、ミンク、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、七面鳥、闘鶏又はヒトであり、
好ましくは、前記定常領域はマウスに由来し、
好ましくは、前記定常領域の軽鎖定常領域の配列は、配列番号９に示されるか、又は配列番号９と少なくとも８０％の相同性を有し、前記定常領域の重鎖定常領域の配列は、配列番号１０に示されるか、又は配列番号１０と少なくとも８０％の相同性を有し、
好ましくは、前記重鎖定常領域の配列は、配列番号１６に示され、
好ましくは、前記機能性断片は、前記抗体のＶＨＨ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ及びｓｃＦｖから選択されるいずれか１つであることを特徴とする請求項１～４のいずれか１項に記載の抗体又はその機能性断片。

【請求項6】

前記抗体は、それぞれ順番に配列番号１、２、３、４と少なくとも８０％の相同性を有する軽鎖フレームワーク領域ＦＲ１－Ｌ、ＦＲ２－Ｌ、ＦＲ３－Ｌ及びＦＲ４－Ｌ、及び／又は、それぞれ順番に配列番号５、６、７、８と少なくとも８０％の相同性を有する重鎖フレームワーク領域ＦＲ１－Ｈ、ＦＲ２－Ｈ、ＦＲ３－Ｈ及びＦＲ４－Ｈを含むことを特徴とする請求項１～４のいずれか１項に記載の新型コロナウイルスに対する抗体又はその機能性断片。

【請求項7】

請求項１～６のいずれか１項に記載の抗体又はその機能性断片を含むことを特徴とする新型コロナウイルス又はそのＮタンパク質を検出する試薬又はキット。

【請求項8】

前記抗体又はその機能性断片には、検出可能なマーカーが標識され、
好ましくは、前記検出可能なマーカーは、蛍光染料、基質の発色を触媒する酵素、放射性同位元素、化学発光試薬及びナノ粒子類マーカーから選択され、
好ましくは、前記蛍光染料は、フルオレセイン類染料及びその誘導体、ローダミン類染料及びその誘導体、Ｃｙ系染料及びその誘導体、Ａｌｅｘａ系染料及びその誘導体、並びにタンパク質類染料及びその誘導体から選択され、
好ましくは、前記基質の発色を触媒する酵素は、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β－ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、炭酸脱水酵素、アセチルコリンエステラーゼ及びグルコース６リン酸脱水素酵素から選択され、
好ましくは、前記放射性同位元素は、^２１２Ｂｉ、^１３１Ｉ、^１１１Ｉｎ、^９０Ｙ、^１８６Ｒｅ、^２１１Ａｔ、^１２５Ｉ、^１８８Ｒｅ、^１５３Ｓｍ、^２１３Ｂｉ、^３２Ｐ、^９４ｍＴｃ、^９９ｍＴｃ、^２０３Ｐｂ、^６７Ｇａ、^６８Ｇａ、^４３Ｓｃ、^４７Ｓｃ、^１１０ｍＩｎ、^９７Ｒｕ、^６２Ｃｕ、^６４Ｃｕ、^６７Ｃｕ、^６８Ｃｕ、^８６Ｙ、^８８Ｙ、^１２１Ｓｎ、^１６１Ｔｂ、^１６６Ｈｏ、^１０５Ｒｈ、^１７７Ｌｕ、^１７２Ｌｕ及び^１８Ｆから選択され、
好ましくは、前記化学発光試薬は、ルミノール及びその誘導体、ルシゲニン、甲殻類動物のフルオレセイン及びその誘導体、ビピリジンルテニウム及びその誘導体、アクリジニウムエステル及びその誘導体、ジオキシシクロエタン及びその誘導体、ロフィン及びその誘導体、並びにペルオキシシュウ酸塩及びその誘導体から選択され、
好ましくは、前記ナノ粒子類マーカーは、ナノ粒子、コロイド、有機ナノ粒子、磁性ナノ粒子、量子ドットナノ粒子及び希土類錯体ナノ粒子から選択され、
好ましくは、前記コロイドは、コロイド金属、分散型染料、染料標識のミクロスフェア及びラテックスから選択され、
好ましくは、前記コロイド金属は、コロイド金、コロイド銀及びコロイドセレンから選択されることを特徴とする請求項７に記載の試薬又はキット。

【請求項9】

請求項１～６のいずれか１項に記載の抗体又はその機能性断片をコードすることを特徴とする核酸分子。

【請求項10】

請求項１～６のいずれか１項に記載の抗体又はその機能性断片をコードする核酸断片を含有することを特徴とするベクター。

【請求項11】

請求項１０に記載のベクターを含有することを特徴とする組換え細胞。

【請求項12】

請求項１～６のいずれか１項に記載の抗体又はその機能性断片又は請求項７又は８に記載の試薬又はキットの、新型コロナウイルスの検出における使用。

【請求項13】

新型コロナウイルスを検出するために使用される、請求項１～６のいずれか１項に記載の抗体又はその機能性断片又は請求項７又は８に記載の試薬又はキット。

【請求項14】

結合反応が発生するのに十分な条件下で、請求項１～６のいずれか１項に記載の抗体又はその機能性断片と試料とを接触させて、結合反応を行うステップＡ）と、
結合反応によって生成される免疫複合体を検出するステップＢ）とを含む新型コロナウイルスを検出する方法。

【請求項15】

被験者の新型コロナウイルス感染又は新型コロナウイルス感染に関連する疾患を診断する方法であって、
結合反応が発生するのに十分な条件下で、請求項１～６のいずれか１項に記載の抗体又はその機能性断片と前記被験者からの試料とを接触させて、結合反応を行うステップＡ）と、
結合反応によって生成される免疫複合体を検出するステップＢ）とを含む方法

【請求項16】

前記新型コロナウイルス感染に関連する疾患には、呼吸器症状、発熱、咳、息切れ、呼吸困難、肺炎、重症急性呼吸器症候群、腎不全が含まれる請求項１５に記載の方法。

【請求項17】

前記新型コロナウイルスに感染した被験者には、無症候性感染者、明らかな症状のない感染者、症状のある感染者が含まれる請求項１５に記載の方法。

【請求項18】

請求項１１に記載の組換え細胞を培養し、培養物から単離精製して前記抗体又はその機能性断片を得ることを特徴とする請求項１～６のいずれか１項に記載の抗体又はその機能性断片を調製する方法。

【発明の詳細な説明】

【関連出願の相互参照】

【0001】

本開示は、２０２０年１０月２９日に中国特許庁に提出された、出願番号が「２０２０１１１８２６２８．Ｘ」で、名称が「新型コロナウイルスに対する抗体、新型コロナウイルスを検出する試薬及びキット」である中国特許出願の優先権を主張しており、そのすべての内容は、引用により本開示に組み込まれている。

【技術分野】

【0002】

本開示は、抗体技術の分野に関し、具体的には、新型コロナウイルスに対する抗体、新型コロナウイルスを検出する試薬及びキットに関する。

【背景技術】

【0003】

新型コロナウイルス２０１９－ｎＣｏＶの構造タンパク質は、スパイク糖タンパク質（Ｓタンパク質）、エンベロープ糖タンパク質（Ｅタンパク質）、膜糖タンパク質（Ｍタンパク質）、及びヌクレオカプシドタンパク質（Ｎタンパク質）に分けられ、これらのタンパク質には複数の抗原エピトープが含まれている。Ｎタンパク質とウイルスゲノムＲＮＡとが互いに絡み合ってウイルスのヌクレオカプシドを形成し、ウイルスＲＮＡの合成過程において重要な役割を果たす。また、Ｎタンパク質は比較的に保存的なものであり、ウイルスの構造タンパク質中で占める割合が最も大きく、生体は感染早期にＮタンパク質に対する高いレベルの抗体を生成することができる。最後に、Ｎタンパク質は新型コロナウイルスの重要なマーカータンパク質であり、抗原と抗体との特異的な結合原理を利用して、Ｎタンパク質モノクローナル抗体で抗原の存在を検出でき、それにより、サンプルに新型コロナウイルスが含有されていることを直接証明し、新型コロナウイルスの検出が実現される。

【0004】

検出された抗体は、主に、ＩｇＭ及びＩｇＧの２つの種類に分けられる。現在のところ、新型コロナウイルスのこの２つの種類の抗体の生成と持続時間に関する体系的な研究がまだない。通常の場合、ＩｇＭ抗体は、その生成が早く、一度感染すると、迅速に生成し、維持時間が短く、急速に消失し、血液からの陽性の検出は生体が急性感染状態にあることを反映し、早期感染の指標とすることができる。核酸検出法に比べ、抗体検出サンプルは血清や血漿であるので、サンプルのサンプリングによる影響が少なく、早期診断及び疑わしい症例の排除に有利でありながら、検出が迅速で便利であり、大規模なスクリーニングに適している。

【0005】

新型コロナウイルス２０１９－ｎＣｏＶ肺炎疫病が発生してから、全世界に拡散し、人間の生命安全と身体健康を深刻に脅かしている。呼吸器の飛沫及び密接な接触による伝播は、新型コロナウイルスによる肺炎の主な伝播経路であり、比較的閉鎖的な環境で高濃度のエアロゾルに長時間露出している場合に、エアロゾルにより伝播される可能性がある。２０１９－ｎＣｏＶは非常に強い伝染性を有し、多くの患者は感染した後に臨床症状が現れたが、一部の患者は無症候性感染者である。ヒトがコロナウイルスに感染した後によく見られる身体的徴候には、呼吸器症状、発熱、咳、息切れ、呼吸困難などがある。比較的深刻な症例では、感染により肺炎、重症急性呼吸器症候群、腎不全、さらには死亡に至る可能性がある。現在のところ、新型コロナウイルスによる疾患に対する特異的な治療法はないが、治療により軽症や無症状の患者の完治率を大幅に高め、治療期間を短縮することができる。そのため、患者の検出と鑑定は特に重要となる。

【0006】

現在のところ、主に、核酸検出とウイルス遺伝子シークエンシングを病原学確定診断の証拠とし、サンプリング、操作及び試薬などの多岐にわたる要素に影響されるため、核酸検出の結果が偽陰性になる場合がある。２０１９新型コロナウイルス（２０１９－ｎＣｏＶ）に感染されたと高度に疑われる患者のウイルス核酸検出の陽性率は３０％～５０％にすぎない。また、核酸検出は計器・設備、検出場所及び環境条件に対する要求が高く、検出時間が長く、スループットが低いなどの欠点があり、現在の疫病状況でのヒトの大規模な検出には不向きである。そのため、感染したヒトをできるだけ早く隔離してウイルスの伝播を遮断するために、臨床検出のための迅速で便利な検出キットを開発することが急務となっている。そのため、抗体検出キットがより重要となっている。

【0007】

現在、２０１９－ｎＣｏＶＮタンパク質モノクローナル抗体製品は少なく、性能に差がある。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0008】

本開示は、新型コロナウイルス又はそのＮタンパク質に対する抗体又はその機能性断片を提供し、前記抗体又はその機能性断片は、下記の相補性決定領域を含み、
ＣＤＲ－ＶＨ１：Ｇ－Ｘ１－Ｔ－Ｆ－Ｓ－Ｘ２－Ｆ－Ｘ３－Ｍ－Ｈ、ここで、Ｘ１はＶ或いはＦであり、Ｘ２はＳ或いはＴであり、Ｘ３はＧ或いはＡであり、
ＣＤＲ－ＶＨ２：Ｙ－Ｘ１－Ｎ－Ｓ－Ｘ２－Ｓ－Ｎ－Ｘ３－Ｉ－Ｙ－Ｙ－Ａ－Ｄ－Ｔ－Ｘ４－Ｋ、ここで、Ｘ１はＬ或いはＩであり、Ｘ２はＧ或いはＡであり、Ｘ３はＩ、Ｖ或いはＬであり、Ｘ４はＩ、Ｖ或いはＬであり、
ＣＤＲ－ＶＨ３：Ｘ１－Ｒ－Ｈ－Ｘ２－Ｍ、ここで、Ｘ１はＡ或いはＴであり、Ｘ２はＡ或いはＶであり、
ＣＤＲ－ＶＬ１：Ｓ－Ｑ－Ｓ－Ｘ１－Ｄ－Ｙ－Ｘ２－Ｇ－Ｄ－Ｓ－Ｘ３－Ｍ、ここで、Ｘ１はＩ、Ｖ或いはＬであり、Ｘ２はＤ或いはＮであり、Ｘ３はＦ或いはＹであり、
ＣＤＲ－ＶＬ２：Ｘ１－Ａ－Ｓ－Ｎ－Ｘ２－Ｅ－Ｓ、ここで、Ｘ１はＡ或いはＤであり、Ｘ２はＩ、Ｖ或いはＬであり、
ＣＤＲ－ＶＬ３：Ｑ－Ｘ１－Ｓ－Ｎ－Ｅ－Ｘ２－Ｐ－Ｙ、ここで、Ｘ１はＮ、Ｈ或いはＱであり、Ｘ２はＤ或いはＥである。

【0009】

いくつかの実施形態では、
ＣＤＲ－ＶＨ１において、Ｘ１はＦであり、
ＣＤＲ－ＶＨ２において、Ｘ１はＩであり、
ＣＤＲ－ＶＨ３において、Ｘ１はＡであり、
ＣＤＲ－ＶＬ１において、Ｘ３はＹである。

【0010】

いくつかの実施形態では、ＣＤＲ－ＶＨ１において、Ｘ２はＳである。
いくつかの実施形態では、ＣＤＲ－ＶＨ１において、Ｘ２はＴである。
いくつかの実施形態では、ＣＤＲ－ＶＨ１において、Ｘ３はＧである。
いくつかの実施形態では、ＣＤＲ－ＶＨ１において、Ｘ３はＡである。
いくつかの実施形態では、ＣＤＲ－ＶＨ２において、Ｘ２はＧである。
いくつかの実施形態では、ＣＤＲ－ＶＨ２において、Ｘ２はＡである。
いくつかの実施形態では、ＣＤＲ－ＶＨ２において、Ｘ３はＩである。
いくつかの実施形態では、ＣＤＲ－ＶＨ２において、Ｘ３はＶである。
いくつかの実施形態では、ＣＤＲ－ＶＨ２において、Ｘ３はＬである。
いくつかの実施形態では、ＣＤＲ－ＶＨ２において、Ｘ４はＩである。
いくつかの実施形態では、ＣＤＲ－ＶＨ２において、Ｘ４はＶである。
いくつかの実施形態では、ＣＤＲ－ＶＨ２において、Ｘ４はＬである。
いくつかの実施形態では、ＣＤＲ－ＶＨ３において、Ｘ２はＡである。
いくつかの実施形態では、ＣＤＲ－ＶＨ３において、Ｘ２はＶである。
いくつかの実施形態では、ＣＤＲ－ＶＬ１において、Ｘ１はＩである。
いくつかの実施形態では、ＣＤＲ－ＶＬ１において、Ｘ１はＶである。
いくつかの実施形態では、ＣＤＲ－ＶＬ１において、Ｘ１はＬである。
いくつかの実施形態では、ＣＤＲ－ＶＬ１において、Ｘ２はＤである。
いくつかの実施形態では、ＣＤＲ－ＶＬ１において、Ｘ２はＮである。
いくつかの実施形態では、ＣＤＲ－ＶＬ２において、Ｘ１はＡである。
いくつかの実施形態では、ＣＤＲ－ＶＬ２において、Ｘ１はＤである。
いくつかの実施形態では、ＣＤＲ－ＶＬ２において、Ｘ２はＩである。
いくつかの実施形態では、ＣＤＲ－ＶＬ２において、Ｘ２はＶである。
いくつかの実施形態では、ＣＤＲ－ＶＬ２において、Ｘ２はＬである。
いくつかの実施形態では、ＣＤＲ－ＶＬ１において、Ｘ１はＮである。
いくつかの実施形態では、ＣＤＲ－ＶＬ１において、Ｘ１はＨである。
いくつかの実施形態では、ＣＤＲ－ＶＬ１において、Ｘ１はＱである。
いくつかの実施形態では、ＣＤＲ－ＶＬ２において、Ｘ２はＤである。
いくつかの実施形態では、ＣＤＲ－ＶＬ２において、Ｘ２はＥである。

【0011】

いくつかの実施形態では、前記抗体又はその機能性断片の各相補性決定領域は、下記の突然変異組合せ１～６８から選択されるいずれか１つである。

【表1(1)】

【表1(2)】

【0012】

いくつかの実施形態では、前記抗体又はその機能性断片は、新型コロナウイルスのＮタンパク質とＫ_Ｄ≦８×１０^－９ｍｏｌ／Ｌの親和性で結合する。いくつかの実施形態では、Ｋ_Ｄ≦７×１０^－１０ｍｏｌ／Ｌである。

【0013】

いくつかの実施形態では、
ＣＤＲ－ＶＨ１において、Ｘ１はＶであり、
ＣＤＲ－ＶＨ２において、Ｘ１はＬであり、
ＣＤＲ－ＶＨ３において、Ｘ１はＴであり、
ＣＤＲ－ＶＬ１において、Ｘ３はＦである。

【0014】

いくつかの実施形態では、前記抗体又はその機能性断片の各相補性決定領域は、下記の突然変異組合せ６９～７６から選択されるいずれか１つである。

【表2】

【0015】

いくつかの実施形態では、前記抗体は、それぞれ順番に配列番号１、２、３、４と少なくとも８０％の相同性を有する軽鎖フレームワーク領域ＦＲ１－Ｌ、ＦＲ２－Ｌ、ＦＲ３－Ｌ及びＦＲ４－Ｌ、及び／又は、それぞれ順番に配列番号５、６、７、８と少なくとも８０％の相同性を有する重鎖フレームワーク領域ＦＲ１－Ｈ、ＦＲ２－Ｈ、ＦＲ３－Ｈ及びＦＲ４－Ｈを含む。

【0016】

いくつかの実施形態では、前記ＦＲ１－Ｈのアミノ酸配は、例えば配列番号１５に示される。

【0017】

いくつかの実施形態では、前記抗体は、定常領域をさらに含む。

【0018】

いくつかの実施形態では、前記定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ及びＩｇＤから選択されるいずれか１つの定常領域である。

【0019】

いくつかの実施形態では、前記定常領域の由来となる種属は、牛、馬、乳牛、豚、ヒツジ、ヤギ、ラット、マウス、イヌ、ネコ、ウサギ、ラクダ、ロバ、鹿、ミンク、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、七面鳥、闘鶏又はヒトである。

【0020】

いくつかの実施形態では、前記定常領域はマウスに由来する。

【0021】

いくつかの実施形態では、前記定常領域の軽鎖定常領域の配列は、配列番号９に示されるか、又は配列番号９と少なくとも８０％の相同性を有し、前記定常領域の重鎖定常領域の配列は、配列番号１０に示されるか、又は配列番号１０と少なくとも８０％の相同性を有する。

【0022】

いくつかの実施形態では、前記重鎖定常領域の配列は、配列番号１６に示される。

【0023】

いくつかの実施形態では、前記機能性断片は、前記抗体のＶＨＨ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ及びｓｃＦｖから選択されるいずれか１つである。

【0024】

本開示は、上記のいずれか１項に記載の抗体又はその機能性断片を含む新型コロナウイルス又はそのＮタンパク質を検出する試薬又はキットを提供する。

【0025】

いくつかの実施形態では、前記抗体又はその機能性断片には、検出可能なマーカーが標識されている。

【0026】

いくつかの実施形態では、前記検出可能なマーカーは、蛍光染料、基質の発色を触媒する酵素、放射性同位元素、化学発光試薬及びナノ粒子類マーカーから選択される。

【0027】

いくつかの実施形態では、前記蛍光染料は、フルオレセイン類染料及びその誘導体、ローダミン類染料及びその誘導体、Ｃｙ系染料及びその誘導体、Ａｌｅｘａ系染料及びその誘導体、並びにタンパク質類染料及びその誘導体から選択される。

【0028】

いくつかの実施形態では、前記基質の発色を触媒する酵素は、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β－ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、炭酸脱水酵素、アセチルコリンエステラーゼ及びグルコース６リン酸脱水素酵素から選択される。

【0029】

いくつかの実施形態では、前記放射性同位元素は、^２１２Ｂｉ、^１３１Ｉ、^１１１Ｉｎ、^９０Ｙ、^１８６Ｒｅ、^２１１Ａｔ、^１２５Ｉ、^１８８Ｒｅ、^１５３Ｓｍ、^２１３Ｂｉ、^３２Ｐ、^９４ｍＴｃ、^９９ｍＴｃ、^２０３Ｐｂ、^６７Ｇａ、^６８Ｇａ、^４３Ｓｃ、^４７Ｓｃ、^１１０ｍＩｎ、^９７Ｒｕ、^６２Ｃｕ、^６４Ｃｕ、^６７Ｃｕ、^６８Ｃｕ、^８６Ｙ、^８８Ｙ、^１２１Ｓｎ、^１６１Ｔｂ、^１６６Ｈｏ、^１０５Ｒｈ、^１７７Ｌｕ、^１７２Ｌｕ及び^１８Ｆから選択される。

【0030】

いくつかの実施形態では、前記化学発光試薬は、ルミノール及びその誘導体、ルシゲニン、甲殻類動物のフルオレセイン及びその誘導体、ビピリジンルテニウム及びその誘導体、アクリジニウムエステル及びその誘導体、ジオキシシクロエタン及びその誘導体、ロフィン（Ｌｏｐｈｉｎｅ）及びその誘導体、並びにペルオキシシュウ酸塩及びその誘導体から選択される。

【0031】

いくつかの実施形態では、前記ナノ粒子類マーカーは、ナノ粒子、コロイド、有機ナノ粒子、磁性ナノ粒子、量子ドットナノ粒子及び希土類錯体ナノ粒子から選択される。

【0032】

いくつかの実施形態では、前記コロイドは、コロイド金属、分散型染料、染料標識のミクロスフェア及びラテックスから選択される。

【0033】

いくつかの実施形態では、前記コロイド金属は、コロイド金、コロイド銀及びコロイドセレンから選択される。

【0034】

本開示は、上記のいずれか１項に記載の抗体又はその機能性断片をコードする核酸分子を提供する。

【0035】

本開示は、上記のいずれか１項に記載の抗体又はその機能性断片をコードする核酸断片を含有するベクターを提供する。

【0036】

本開示は、前記ベクターを含有する組換え細胞を提供する。

【0037】

本開示は、前記抗体又はその機能性断片、前記試薬又はキットの、新型コロナウイルスの検出における使用を提供する。

【0038】

本開示は、新型コロナウイルスを検出するために使用される前記抗体又はその機能性断片、前記試薬又はキットを提供する。

【0039】

本開示は、新型コロナウイルスを検出する方法を提供し、当該方法は、
結合反応が発生するのに十分な条件下で、上記のいずれか１項に記載の抗体又はその機能性断片と試料とを接触させて、結合反応を行うステップＡ）と、
結合反応によって生成される免疫複合体を検出するステップＢ）と、を含む。

【0040】

本開示は、被験者の新型コロナウイルス感染又は新型コロナウイルス感染に関連する疾患を診断する方法を提供し、当該方法は、
結合反応が発生するのに十分な条件下で、上記のいずれか１項に記載の抗体又はその機能性断片と前記被験者からの試料とを接触させて、結合反応を行うステップＡ）と、
結合反応によって生成される免疫複合体を検出するステップＢ）とを含む。
いくつかの実施形態では、前記新型コロナウイルス感染に関連する疾患には、呼吸器症状、発熱、咳、息切れ、呼吸困難、肺炎、重症急性呼吸器症候群、腎不全が含まれる。

【0041】

いくつかの実施形態では、前記新型コロナウイルスに感染した被験者には、無症候性感染者、明らかな症状のない感染者、症状のある感染者が含まれる。

【0042】

本開示は、前記組換え細胞を培養して、培養物から単離精製して前記抗体又はその機能性断片を得るステップを含む上記のいずれか１項に記載の抗体又はその機能性断片を調製する方法を提供する。

【図面の簡単な説明】

【0043】

本開示の実施例の技術的解決手段をより明確に説明するために、以下、実施例に使用する必要のある図面について簡単に説明したが、以下の図面は本開示の一部の実施例を示しただけであるため、範囲を限定するものとして見なすべきではなく、当業者であれば、創造的な努力なしに、これらの図面に基づいて他の関連する図面を得ることができることを理解されたい。

【図1】実施例１の新型コロナウイルスに対する抗体の還元性ＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果である。

【発明を実施するための形態】

【0044】

本開示の実施例の目的、技術的解決手段、及び利点をより明確にするために、以下、本開示の実施例における技術的解決手段について明確かつ完全に説明する。具体的な条件が以下の実施形態及び実施例に記載されていない場合、通常の条件又は製造者が提案した条件にしたがって行う。使用された試薬又は計器は、製造メーカが明記されていない場合、いずれも市販で購入することができる通常の製品である。

【0045】

別段の定義がない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、本開示の内容が属する分野の一般技術者が一般に理解する意味と同じ意味を有する。本明細書に記載されたそれらの方法及び材料と類似するか又は同等であるいずれの方法及び材料は、いずれも本明細書の製剤又は単位用量の実施又は試験に使用され得るが、本明細書にはいくつかの方法及び材料が記載されている。別段の説明がない限り、本明細書で採用又は検討されている技術は標準的な方法である。材料、方法及び例は、例示的なものにすぎず、限定的なものではない。

【0046】

特に明記されていない限り、本開示の実施には、細胞生物学、分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、生化学、及び免疫学の従来技術が使用されており、前記従来技術は当業者の能力の範囲内にある。このような技術は、『分子クローニング：実験室マニュアル（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ）』、第２版（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）、『オリゴヌクレオチド合成（ＯｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓ）』（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編集、１９８４）、『動物細胞培養（ＡｎｉｍａｌＣｅｌｌＣｕｌｔｕｒｅ）』（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編集、１９８７）、『酵素学的方法（ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）』（アカデミックプレス株式会社（ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）、『実験免疫学ハンドブック（ＨａｎｄｂｏｏｋｏｆＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）』（Ｄ．Ｍ．ＷｅｉｒとＣ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編集）、『哺乳動物細胞用遺伝子導入ベクター（ＧｅｎｅＴｒａｎｓｆｅｒＶｅｃｔｏｒｓｆｏｒＭａｍｍａｌｉａｎＣｅｌｌｓ）』（Ｊ．Ｍ．ＭｉｌｌｅｒとＭ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ編集、１９８７）、『現代分子生物学的方法（ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ）』（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編集、１９８７）、『ＰＣＲ：ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ：ＴｈｅＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＣｈａｉｎＲｅａｃｔｉｏｎ）』（Ｍｕｌｌｉｓら編集、１９９４）、及び『現代の免疫学的方法（ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）』（Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎら編集、１９９１）などの文献で十分に説明されており、これらの文献の各々は引用によって本明細書に明示的に組み込まれている。

【0047】

用語の定義
本明細書で使用されるように、「相補性決定領域」という用語は、無傷又は完全な抗体が２本の重鎖及び２本の軽鎖を含むことを意味し、各重鎖は可変領域（ＶＨ）及び定常領域（ＣＨ）を含有し、各軽鎖は一つの可変領域（ＶＬ）及び一つの定常領域（ＣＬ）を含有し、抗体は「Ｙ」字状であり、Ｙの茎部はジスルフィド結合により一体に結合された２本の重鎖の第２定常領域及び第３定常領域から構成されており、Ｙの各アーム部は、単一の軽鎖の可変領域及び定常領域に結合された単一の重鎖の可変領域及び第１定常領域を含み、当該軽鎖の可変領域及び重鎖の可変領域は抗原結合を担当し、２本の鎖中の可変領域は、通常、相補性決定領域と呼ばれる３つの超可変領域を含む。

【0048】

本明細書で使用されるように、抗体を表すために使用される場合、「機能性断片」という用語は、断片由来の抗体の一部又はすべての結合活性を保存する重鎖又は軽鎖ポリペプチドを含む抗体の一部を意味する。これらの機能性断片は、（例えば）Ｆｄ、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ）２、Ｆ（ａｂ’）２、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、二本鎖抗体（ｄｉａｂｏｄｙ）、三本鎖抗体（ｔｒｉａｂｏｄｙ）、四本鎖抗体（ｔｅｔｒａｂｏｄｙ）、及びマイクロ抗体（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）を含むことができる。他の機能性断片は、（例えば）重鎖又は軽鎖ポリペプチド、可変領域ポリペプチド、ＣＤＲポリペプチド又はその部分を含むことができ、これらの機能性断片が結合活性を保存していればよい。

【0049】

本明細書で使用されるように、「定常領域」という用語は、抗体分子の軽鎖及び重鎖中のＣ末端に近いアミノ酸配列が相対的安定した領域を意味する。

【0050】

本明細書で使用されるように、「可変領域」という用語は、抗体分子の軽鎖及び重鎖中のＮ末端に近いアミノ酸配列の変化が比較的大きい領域を意味する。

【0051】

本明細書で使用されるように、「裸抗体安定性」という用語は、標識されていない抗体又はその機能性断片、例えば検出可能なマーカーが標識されていない抗体又はその機能性断片を意味する。

【0052】

本開示のいくつかの実施形態は、新型コロナウイルスに対する抗体、新型コロナウイルス検出用の試料及びキットを提供し、当該抗体は、新型コロナウイルスのＮタンパク質に特異的に結合することができ、このＮタンパク質に対して比較的高い親和性を有し、当該抗体を用いた新型コロナウイルスの検出は、比較的良い感度及び特異性を有する。本開示は、新型コロナウイルスの検出に、より豊富な抗体選択肢を提供する。

【0053】

本開示の一実施形態は、新型コロナウイルス又はそのＮタンパク質に対する抗体又はその機能性断片を提供し、前記抗体又はその機能性断片は、下記の相補性決定領域を有し、
ＣＤＲ－ＶＨ１：Ｇ－Ｘ１－Ｔ－Ｆ－Ｓ－Ｘ２－Ｆ－Ｘ３－Ｍ－Ｈ、ここで、Ｘ１はＶ或いはＦであり、Ｘ２はＳ或いはＴであり、Ｘ３はＧ或いはＡであり、
ＣＤＲ－ＶＨ２：Ｙ－Ｘ１－Ｎ－Ｓ－Ｘ２－Ｓ－Ｎ－Ｘ３－Ｉ－Ｙ－Ｙ－Ａ－Ｄ－Ｔ－Ｘ４－Ｋ、ここで、Ｘ１はＬ或いはＩであり、Ｘ２はＧ或いはＡであり、Ｘ３はＩ、Ｖ或いはＬであり、Ｘ４はＩ、Ｖ或いはＬであり、
ＣＤＲ－ＶＨ３：Ｘ１－Ｒ－Ｈ－Ｘ２－Ｍ、ここで、Ｘ１はＡ或いはＴであり、Ｘ２はＡ或いはＶであり、
ＣＤＲ－ＶＬ１：Ｓ－Ｑ－Ｓ－Ｘ１－Ｄ－Ｙ－Ｘ２－Ｇ－Ｄ－Ｓ－Ｘ３－Ｍ、ここで、Ｘ１はＩ、Ｖ或いはＬであり、Ｘ２はＤ或いはＮであり、Ｘ３はＦ或いはＹであり、
ＣＤＲ－ＶＬ２：Ｘ１－Ａ－Ｓ－Ｎ－Ｘ２－Ｅ－Ｓ、ここで、Ｘ１はＡ或いはＤであり、Ｘ２はＩ、Ｖ或いはＬであり、
ＣＤＲ－ＶＬ３：Ｑ－Ｘ１－Ｓ－Ｎ－Ｅ－Ｘ２－Ｐ－Ｙ、ここで、Ｘ１はＮ、Ｈ或いはＱであり、Ｘ２はＤ或いはＥである。

【0054】

本開示にて提供される新型コロナウイルスに対する抗体又はその機能性断片は、上記の相補性決定領域構造を有し、上記の相補性決定領域構造により、抗体又はその機能性断片は新型コロナウイルスのＮタンパク質に特異的に結合することができ、このＮタンパク質に対して比較的良い親和性を有し、当該抗体又はその機能性断片を用いた新型コロナウイルスの検出は、比較的良い特異性及び感度を有する。本開示は、新型コロナウイルスの検出に、より豊富な抗体選択肢を提供する。

【0055】

選択可能な実施形態では、ＣＤＲ－ＶＨ１において、Ｘ１はＦであり、ＣＤＲ－ＶＨ２において、Ｘ１はＩであり、ＣＤＲ－ＶＨ３において、Ｘ１はＡであり、ＣＤＲ－ＶＬ１において、Ｘ３はＹである。

【0056】

本実施例の実験結果から分かるように、各相補性決定領域における上記の突然変異部位が上記のアミノ酸残基である場合、当該抗体は新型コロナウイルスのＮタンパク質に対して、より高い親和性を示す。

【0057】

選択可能な実施形態では、ＣＤＲ－ＶＨ１において、Ｘ２はＳである。
選択可能な実施形態では、ＣＤＲ－ＶＨ１において、Ｘ２はＴである。
選択可能な実施形態では、ＣＤＲ－ＶＨ１において、Ｘ３はＧである。
選択可能な実施形態では、ＣＤＲ－ＶＨ１において、Ｘ３はＡである。
選択可能な実施形態では、ＣＤＲ－ＶＨ２において、Ｘ２はＧである。
選択可能な実施形態では、ＣＤＲ－ＶＨ２において、Ｘ２はＡである。
選択可能な実施形態では、ＣＤＲ－ＶＨ２において、Ｘ３はＩである。
選択可能な実施形態では、ＣＤＲ－ＶＨ２において、Ｘ３はＶである。
選択可能な実施形態では、ＣＤＲ－ＶＨ２において、Ｘ３はＬである。
選択可能な実施形態では、ＣＤＲ－ＶＨ２において、Ｘ４はＩである。
選択可能な実施形態では、ＣＤＲ－ＶＨ２において、Ｘ４はＶである。
選択可能な実施形態では、ＣＤＲ－ＶＨ２において、Ｘ４はＬである。
選択可能な実施形態では、ＣＤＲ－ＶＨ３において、Ｘ２はＡである。
選択可能な実施形態では、ＣＤＲ－ＶＨ３において、Ｘ２はＶである。
選択可能な実施形態では、ＣＤＲ－ＶＬ１において、Ｘ１はＩである。
選択可能な実施形態では、ＣＤＲ－ＶＬ１において、Ｘ１はＶである。
選択可能な実施形態では、ＣＤＲ－ＶＬ１において、Ｘ１はＬである。
選択可能な実施形態では、ＣＤＲ－ＶＬ１において、Ｘ２はＤである。
選択可能な実施形態では、ＣＤＲ－ＶＬ１において、Ｘ２はＮである。
選択可能な実施形態では、ＣＤＲ－ＶＬ２において、Ｘ１はＡである。
選択可能な実施形態では、ＣＤＲ－ＶＬ２において、Ｘ１はＤである。
選択可能な実施形態では、ＣＤＲ－ＶＬ２において、Ｘ２はＩである。
選択可能な実施形態では、ＣＤＲ－ＶＬ２において、Ｘ２はＶである。
選択可能な実施形態では、ＣＤＲ－ＶＬ２において、Ｘ２はＬである。
選択可能な実施形態では、ＣＤＲ－ＶＬ１において、Ｘ１はＮである。
選択可能な実施形態では、ＣＤＲ－ＶＬ１において、Ｘ１はＨである。
選択可能な実施形態では、ＣＤＲ－ＶＬ１において、Ｘ１はＱである。
選択可能な実施形態では、ＣＤＲ－ＶＬ２において、Ｘ２はＤである。
選択可能な実施形態では、ＣＤＲ－ＶＬ２において、Ｘ２はＥである。
選択可能な実施形態では、前記抗体又はその機能性断片の各相補性決定領域は、下記の突然変異組合せ１～６８から選択されるいずれか１つである。

【0058】

【表3(1)】

【表3(2)】

【0059】

選択可能な実施形態では、前記抗体又はその機能性断片は、新型コロナウイルスのＮタンパク質とＫ_Ｄ≦８×１０^－９ｍｏｌ／Ｌの親和性で結合する。

【0060】

選択可能な実施形態では、Ｋ_Ｄ≦７×１０^－１０ｍｏｌ／Ｌである。

【0061】

選択可能な実施形態では、Ｋ_Ｄ≦８×１０^－９ｍｏｌ／Ｌ、Ｋ_Ｄ≦７×１０^－９ｍｏｌ／Ｌ、Ｋ_Ｄ≦６×１０^－９ｍｏｌ／Ｌ、Ｋ_Ｄ≦５×１０^－９ｍｏｌ／Ｌ、Ｋ_Ｄ≦４×１０^－９ｍｏｌ／Ｌ、Ｋ_Ｄ≦３×１０^－９ｍｏｌ／Ｌ、Ｋ_Ｄ≦２×１０^－９ｍｏｌ／Ｌ、Ｋ_Ｄ≦１×１０^－９ｍｏｌ／Ｌ、Ｋ_Ｄ≦９×１０^－１０ｍｏｌ／Ｌ、Ｋ_Ｄ≦８×１０^－１０ｍｏｌ／Ｌ、Ｋ_Ｄ≦７×１０^－１０ｍｏｌ／Ｌ、Ｋ_Ｄ≦６×１０^－１０ｍｏｌ／Ｌ、Ｋ_Ｄ≦５×１０^－１０ｍｏｌ／Ｌ、Ｋ_Ｄ≦４×１０^－１０ｍｏｌ／Ｌ、Ｋ_Ｄ≦３×１０^－１０ｍｏｌ／Ｌ、Ｋ_Ｄ≦２×１０^－１０ｍｏｌ／Ｌ、Ｋ_Ｄ≦１×１０^－１０ｍｏｌ／Ｌ、Ｋ_Ｄ≦９×１０^－１１ｍｏｌ／Ｌ又はＫ_Ｄ≦８×１０^－１１ｍｏｌ／Ｌである。

【0062】

選択可能な実施形態では、８．７５×１０^－１１ｍｏｌ／Ｌ≦Ｋ_Ｄ≦７．０８×１０^－１０ｍｏｌ／Ｌである。

【0063】

Ｋ_Ｄの検出は、本開示の実施例における方法を参照して行われる。

【0064】

選択可能な実施形態では、ＣＤＲ－ＶＨ１において、Ｘ１はＶであり、ＣＤＲ－ＶＨ２において、Ｘ１はＬであり、ＣＤＲ－ＶＨ３において、Ｘ１はＴであり、ＣＤＲ－ＶＬ１において、Ｘ３はＦである。

【0065】

選択可能な実施形態では、前記抗体又はその機能性断片の各相補性決定領域は、下記の突然変異組合せ６９～７６中から選択されるいずれか１つである。

【表4】

【0066】

選択可能な実施形態では、前記抗体は、配列が順番に配列番号１～４に示される如き軽鎖フレームワーク領域ＦＲ１－Ｌ、ＦＲ２－Ｌ、ＦＲ３－Ｌ及びＦＲ４－Ｌ、及び／又は、配列が順番に配列番号５～８に示される如き重鎖フレームワーク領域ＦＲ１－Ｈ、ＦＲ２－Ｈ、ＦＲ３－Ｈ及びＦＲ４－Ｈを含む。

【0067】

通常の場合、重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）は、以下の番号のＣＤＲとＦＲとを、ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４のような組合せで並ばれて連結することにより得ることができる。

【0068】

いくつかの実施形態では、抗体は、それぞれ順番に配列番号１、２、３、４と少なくとも８０％の相同性を有する軽鎖フレームワーク領域ＦＲ１－Ｌ、ＦＲ２－Ｌ、ＦＲ３－Ｌ及びＦＲ４－Ｌ、及び／又は、それぞれ順番に配列番号５、６、７、８と少なくとも８０％の相同性を有する重鎖フレームワーク領域ＦＲ１－Ｈ、ＦＲ２－Ｈ、ＦＲ３－Ｈ及びＦＲ４－Ｈを含む。

【0069】

いくつかの実施形態では、抗体は、それぞれ順番に配列番号１、２、３、４と少なくとも８０％の同一性を有する軽鎖フレームワーク領域ＦＲ１－Ｌ、ＦＲ２－Ｌ、ＦＲ３－Ｌ及びＦＲ４－Ｌ、及び／又は、それぞれ順番に配列番号５、６、７、８と少なくとも８０％の同一性を有する重鎖フレームワーク領域ＦＲ１－Ｈ、ＦＲ２－Ｈ、ＦＲ３－Ｈ及びＦＲ４－Ｈを含む。

【0070】

なお、他の実施形態及び実施例では、本開示にて提供される抗体又はその機能性断片の各フレームワーク領域のアミノ酸配列は、上記の対応するフレームワーク領域（配列番号１、２、３、４、５、６、７又は８）と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の相同性を有してもよい。例えば、ＦＲ１－Ｈのアミノ酸配列は、さらに、配列番号１５であってもよい。

【0071】

選択可能な実施形態では、前記抗体は、定常領域をさらに含む。

【0072】

選択可能な実施形態では、前記定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ及びＩｇＤから選択されるいずれか１つの定常領域である。

【0073】

選択可能な実施形態では、前記定常領域の由来となる種属は哺乳類動物又は家禽類動物である。選択可能な実施形態では、哺乳類動物には、牛、馬、乳牛、豚、ヒツジ、ヤギ、ラット、マウス、イヌ、ネコ、ウサギ、ラクダ、ロバ、鹿、ミンク又はヒトが含まれる。選択可能な実施形態では、家禽類動物には、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、七面鳥又は闘鶏が含まれる。

【0074】

選択可能な実施形態では、前記定常領域の由来となる種属は、牛、馬、乳牛、豚、ヒツジ、ヤギ、ラット、マウス、イヌ、ネコ、ウサギ、ラクダ、ロバ、鹿、ミンク、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、七面鳥、闘鶏又はヒトである。

【0075】

選択可能な実施形態では、前記定常領域はマウスに由来する。

【0076】

選択可能な実施形態では、前記定常領域の軽鎖定常領域（ＣＬ）配列は、配列番号９に示され、前記定常領域の重鎖定常領域（ＣＨ）配列は、配列番号１０に示される。

【0077】

なお、他の実施例では、本開示にて提供される抗体の定常領域配列は、上記の定常領域（配列番号９又は１０）と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％或９９％の相同性を有してもよい。例えば、重鎖定常領域は、さらに、配列番号１６であってもよい。

【0078】

選択可能な実施形態では、前記機能性断片は、前記抗体のＶＨＨ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ及びｓｃＦｖから選択されるいずれか１つである。

【0079】

上記の抗体の機能性断片は、通常、その由来となる抗体と同じ結合特異性を有する。当業者が本開示に記載の内容に基づいて容易に理解できるように、上記抗体の機能性断片は、酵素消化方法（ペプシン又はパパインを含むが、これらに限定されない）及び／又は化学的還元によりジスルフィド結合を開裂する方法を含むが、これらに限定されない方法により得ることができる。当業者は本開示にて提供される無傷抗体の構造を基に、上記の機能性断片を容易に取得することができる。

【0080】

上記の抗体の機能性断片は、さらに、当業者に知られている組換え遺伝学技術により、又は、例えばＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ社などにより販売されている自動ペプチド合成装置を含むがこれに限定されない自動ペプチド合成機の合成により取得することができる。本開示の一実施形態では、上記のいずれか１項に記載の抗体又はその機能性断片を含む新型コロナウイルス又はそのＮタンパク質を検出する試薬又はキットを提供する。

【0081】

選択可能な実施形態では、上記の試薬又はキットにおいて、前記抗体又はその機能性断片には検出可能なマーカーが標識されている。

【0082】

本明細書で使用されるように、「検出可能なマーカー」とは、肉眼で直接観察できるか、又は計器により検出又は探知できる特性、例えば発光、発色、放射性等の特性を有する一種類の物質をいい、当該特性により対応する目標物の定性的又は定量的検出を実現することができる。

【0083】

選択可能な実施形態では、前記検出可能なマーカーは、蛍光染料、基質の発色を触媒する酵素、放射性同位元素、化学発光試薬、及びナノ粒子類マーカーを含むが、これらに限定されない。

【0084】

実際の使用中に、当業者は、検出条件又は実際のニーズに応じて適切なマーカーを選択することができ、どのようなマーカーが使用されても、いずれも本開示の保護範囲に属する。

【0085】

選択可能な実施形態では、前記蛍光染料は、フルオレセイン類染料及びその誘導体（例えば、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ヒドロキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、テトラクロロフルオレセイン（ＴＥＴ）など又はその類似体を含むが、これらに限定されない）、ローダミン類染料及びその誘導体（例えば、赤色ローダミン（ＲＢＩＴＣ）、テトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）、ローダミンＢ（ＴＲＩＴＣ）など又はその類似体を含むが、これらに限定されない）、Ｃｙ系染料及びその誘導体（例えば、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ３Ｂ、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ３など又はその類似体を含むが、これらに限定されない）、Ａｌｅｘａ系染料及びその誘導体（例えば、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ３５０、４０５、４３０、４８８、５３２、５４６、５５５、５６８、５９４、６１０、３３、６４７、６８０、７００、７５０など又はその類似体を含むが、これらに限定されない）、並びに、タンパク質類染料及びその誘導体（例えば、フィコエリトリン（ＰＥ）、フィコシアニン（ＰＣ）、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）、ペリジニン－クロロフィルタンパク質（ｐｒｅＣＰ）などを含むが、これらに限定されない）を含むが、これらに限定されない。

【0086】

選択可能な実施形態では、前記基質の発色を触媒する酵素は、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β－ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、炭酸脱水酵素、アセチルコリンエステラーゼ及びグルコース６リン酸脱水素酵素を含むが、これらに限定されない。

【0087】

選択可能な実施形態では、前記放射性同位元素は、^２１２Ｂｉ、^１３１Ｉ、^１１１Ｉｎ、^９０Ｙ、^１８６Ｒｅ、^２１１Ａｔ、^１２５Ｉ、^１８８Ｒｅ、^１５３Ｓｍ、^２１３Ｂｉ、^３２Ｐ、^９４ｍＴｃ、^９９ｍＴｃ、^２０３Ｐｂ、^６７Ｇａ、^６８Ｇａ、^４３Ｓｃ、^４７Ｓｃ、^１１０ｍＩｎ、^９７Ｒｕ、^６２Ｃｕ、^６４Ｃｕ、^６７Ｃｕ、^６８Ｃｕ、^８６Ｙ、^８８Ｙ、^１２１Ｓｎ、^１６１Ｔｂ、^１６６Ｈｏ、^１０５Ｒｈ、^１７７Ｌｕ、^１７２Ｌｕ及び^１８Ｆを含むが、これらに限定されない。

【0088】

選択可能な実施形態では、前記化学発光試薬は、ルミノール及びその誘導体、ルシゲニン、甲殻類動物のフルオレセイン及びその誘導体、ビピリジンルテニウム及びその誘導体、アクリジニウムエステル及びその誘導体、ジオキシシクロエタン及びその誘導体、ロフィン及びその誘導体、並びにペルオキシシュウ酸塩及びその誘導体を含むが、これらに限定されない。

【0089】

選択可能な実施形態では、前記ナノ粒子類マーカーは、ナノ粒子、コロイド、有機ナノ粒子、磁性ナノ粒子、量子ドットナノ粒子及び希土類錯体ナノ粒子を含むが、これらに限定されない。

【0090】

選択可能な実施形態では、前記コロイドは、コロイド金属、分散型染料、染料標識のミクロスフェア及びラテックスを含むが、これらに限定されない。

【0091】

選択可能な実施形態では、前記コロイド金属は、コロイド金、コロイド銀及びコロイドセレンを含むが、これらに限定されない。
本開示の一実施形態は、上記の抗体又はその機能性断片をコードする核酸分子を提供する。本開示の一実施形態は、上記の核酸分子を含有するベクターを提供する。本開示の一実施形態は、上記のベクターを含有する組換え細胞を提供する。本開示の一実施形態は、上記のような組換え細胞を培養して、培養物から単離精製して前記抗体又はその機能性断片を得るステップを含む抗体又はその機能性断片を調製する方法を提供する。

【0092】

当業者は、本開示にて提供される抗体又はその機能性断片のアミノ酸配列を基に、遺伝子工学技術又は他の技術（化学合成、ハイブリドーマ細胞）を用いて当該抗体又はその機能性断片を調製することを容易に想到することができ、例えば、上記のいずれか１項に記載の抗体又はその機能性断片を組み換えて発現する組換え細胞の培養物から単離精製して、当該抗体又はその機能性断片を得ることができ、これは、当業者にとって容易に達成できることであり、それに基づいて、本開示の抗体又はその機能性断片は、どのような技術を用いて調製するかにかかわらず、いずれも本開示の特許範囲に属する。

【実施例】

【0093】

以下、実施例を参照して本開示の特徴及び性能について、さらに詳細に説明する。

【0094】

（実施例１）
本実施例では、制限エンドヌクレアーゼ、ＰｒｉｍｅＳｔａｒＤＮＡポリメラーゼはＴａｋａｒａ社から購入したものである。ＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ－ＲＮＡ抽出キットはＴＯＹＯＢＯ社から購入したものである。ＢＤＳＭＡＲＴ^ＴＭＲＡＣＥｃＤＮＡＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎＫｉｔキットはＴａｋａｒａ社から購入したものである。ｐＭＤ－１８ＴベクターはＴａｋａｒａ社から購入したものである。プラスミド抽出キットは天根公司から購入したものである。プライマー合成と遺伝子シークエンシングはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社によって行われた。

【0095】

１組換えプラスミドの構築
（１）抗体遺伝子の調製
新型コロナウイルスのＮタンパク質に対する抗体を分泌するハイブリドーマ細胞株からｍＲＮＡを抽出し、ＲＴ－ＰＣＲ方法によりＤＮＡ産物を取得し、当該産物に対してｒＴａｑＤＮＡポリメラーゼでＡ添加反応を行った後、ｐＭＤ－１８Ｔベクターに挿入し、ＤＨ５αコンピテント細胞に形質転換し、コロニーが成長した後、重鎖（ＨｅａｖｙＣｈａｉｎ）及び軽鎖（ＬｉｇｈｔＣｈａｉｎ）遺伝子クローンをそれぞれ採集し、シークエンシングのために、それぞれの４つのクローンを遺伝子シークエンシング会社に送った。

【0096】

（２）抗体の可変領域遺伝子の配列分析
上記のシークエンシングによって得られた遺伝子配列をＩＭＧＴ抗体データベース（ＩＭＧＴ抗体データベースの出所：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ）に入れて分析し、ＶＮＴＩ１１．５ソフトウェアで分析して、重鎖と軽鎖プライマーペアから増幅された遺伝子がいずれも正しいことを決定し、ここで、軽鎖から増幅された遺伝子断片のうち、ＶＬ遺伝子配列は３４２ｂｐで、ＶｋＩＩ遺伝子ファミリーに属し、その前方に５７ｂｐのプリアンブルペプチド配列があり、重鎖プライマーペアから増幅された遺伝子断片のうち、ＶＨ遺伝子配列は３３６ｂｐで、ＶＨ１遺伝子ファミリーに属し、その前方に５７ｂｐのプリアンブルペプチド配列がある。

【0097】

（３）組換え抗体発現プラスミドの構築
ｐｃＤＮＡ^ＴＭ３．４ＴＯＰＯ（登録商標）ｖｅｃｔｏｒは、構築された組換え抗体真核発現ベクターであり、当該発現ベクターは、すでにＨｉｎｄＩＩＩ、ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩなどの多重クローニング酵素切断部位が導入され、ｐｃＤＮＡ３．４Ａ発現ベクターと命名し、その後、３．４Ａ発現ベクターと略称した。上記のｐＭＤ－１８Ｔ中の抗体可変領域の遺伝子シークエンシング結果に基づいて、当該抗体のＶＬ及びＶＨ遺伝子特異性プライマーを設計し、プライマーの両端のそれぞれにＨｉｎｄＩＩＩ、ＥｃｏＲＩ酵素切断部位と保護塩基があり、ＰＣＲ増幅方法により０．７２ｋｂの軽鎖遺伝子断片及び１．４１ｋｂの重鎖遺伝子断片を増幅した。

【0098】

重鎖及び軽鎖の遺伝子断片に対してそれぞれＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＩで二重酵素切断を行い、３．４Ａベクターに対してＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＩで二重酵素切断を行い、断片とベクターを精製して回収した後、重鎖遺伝子及び軽鎖遺伝子を３．４Ａ発現ベクターに連結して、重鎖及び軽鎖の組換え発現プラスミドを得た。

【0099】

２安定した細胞株のスクリーニング
（１）組換え抗体発現プラスミドをＣＨＯ細胞に一過性トランスフェクションし、発現プラスミド活性を決定する
ステップ１－（３）で得られたプラスミドを超純水で４００ｎｇ／ｍｌに希釈し、ＣＨＯ細胞を遠心分離管で１．４３×１０^７個の細胞／ｍｌに調整して、１００μＬのプラスミドと７００μＬの細胞を混合してエレクトロポレーションカップに入れ、エレクトロポレーションを行い、３、５、７日目に試料を採取してカウントし、７日目に試料を採取して検出した。

【0100】

コーティング液（主成分ＮａＨＣＯ_３）で２０１９－ｎＣｏＶＮタンパク質抗原を１μｇ／ｍｌに希釈し、１ウェル当たり１００μＬとし、４℃で一晩放置し、翌日、洗浄液で２回洗浄し、叩いて乾かし、ブロッキング液（２０％のＢＳＡ＋８０％のＰＢＳ）を１ウェル当たり１２０μＬ加え、３７℃で１ｈ叩いて乾かし、希釈されたＣＨＯ細胞の上清を１００μＬ／ウェルになるように加え、３７℃で３０ｍｉｎ（一部の上清は１ｈ）であり、洗浄液で５回洗浄し、叩いて乾かし、ヤギ抗マウスＩｇＧ－ＨＲＰ（ここで、ＨＲＰは西洋ワサビペルオキシダーゼマーカーである）を加え、１ウェル当たり１００μＬとし、３７℃で３０ｍｉｎであり、洗浄液で５回洗浄し、叩いて乾かし、発色液Ａ液（５０μＬ／ウェル、クエン酸＋酢酸ナトリウム＋アセトアニリド＋過酸化尿素を含む）を加え、発色液Ｂ液（５０μＬ／ウェル、クエン酸＋ＥＤＴＡ・２Ｎａ＋ＴＭＢ＋濃ＨＣＬを含む）を加え、１０ｍｉｎであり、停止液（５０μＬ／ウェル、ＥＤＴＡ・２Ｎａ＋濃Ｈ_２ＳＯ_４を含む）を加え、マイクロプレートリーダの４５０ｎｍ（６３０ｎｍを参照）でＯＤ値を読み取った。その結果、細胞の上清で１０００倍希釈した後の反応のＯＤは依然として１．０より大きく、細胞の上清を加えなかった反応のＯＤは０．１より小さいことを示し、これは、プラスミドの一過性トランスフェクション後に生成された抗体は、２０１９－ｎＣｏＶＮタンパク質抗原に対して活性があることを示す。

【0101】

（２）組換え抗体発現プラスミドの直線化
５０μＬのＢｕｆｆｅｒ、１００μｇ／管のＤＮＡ、１０μＬのＰｕｖＩ酵素、及び５００μＬになるまでの残量の無菌水の試薬を用意して、３７℃の水浴にて一晩酵素切断し、先に等体積のフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（下層）２５：２４：１を用いて、続いてクロロホルム（水相）を用いて順次抽出し、０．１倍体積（水相）の３Ｍ酢酸ナトリウムと２倍体積のエタノールを氷上に沈殿させ、７０％のエタノールで沈殿物をリンスして、有機溶媒を除去し、エタノールが完全に揮発すると、適量の殺菌水で再溶解し、最後に濃度を測定した。

【0102】

（３）組換え抗体発現プラスミドの安定的なトランスフェクション、安定した細胞株の加圧スクリーニング
ステップ２－（２）で得られたプラスミドを超純水で４００ｎｇ／ｍｌに希釈し、ＣＨＯ細胞を遠心分離管で１．４３×１０^７個の細胞／ｍｌに調整し、１００μＬのプラスミドと７００μＬの細胞とを混合してエレクトロポレーションカップに入れ、エレクトロポレーションを行い、翌日カウントし、２５ｕｍｏｌ／ＬのＭＳＸ９６ウェルにて加圧培養を約２５日間行った。

【0103】

細胞が成長したクローンウェルを顕微鏡で観察しマークして、そのコンフルエンシーを記録し、培養上清を採取して、サンプルを検出のために送り、抗体濃度、相対濃度の高い細胞株を選んで２４ウェルに転移し、３日ほどで６ウェルに転移し、３日間後に種ものを保存した後にバッチ培養を行い、細胞の密度を０．５×１０^６個の細胞／ｍｌに調整して、２．２ｍｌでバッチ培養を行い、細胞の密度を０．３×１０^６個の細胞／ｍｌとして、２ｍｌで種ものを保存し、７日間後に、６ウェルのバッチ培養の上清サンプルを検出のために送り、抗体濃度及び細胞直径が比較的小さい細胞株を選んで、ＴＰＰで種ものを保存して継代した。

【0104】

３組換え抗体の生産
（１）細胞拡大培養
ステップ２－（３）で得られた継代による細胞を蘇生させた後、１２５ｍｌ規格の振とうフラスコにて培養し、接種体積は３０ｍｌであり、培地は１００％のＤｙｎａｍｉｓ培地であり、回転数が１２０ｒ／ｍｉｎで、温度が３７℃で、二酸化炭素が８％であるシェーカーに置いた。７２ｈ培養し、５０万個の細胞／ｍｌの接種密度で接種して拡大培養し、拡大培養体積は、生産のニーズに応じて計算し、培地は１００％のＤｙｎａｍｉｓ培地である。その後、７２ｈごとに一回拡大培養した。細胞量が生産のニーズを満たす場合には、接種密度を５０万個の細胞／ｍｌ程度に厳格に制御して生産した。

【0105】

（２）振とうフラスコによる生産及び精製
振とうフラスコパラメータ：回転速度が１２０ｒ／ｍｉｎで、温度が３７℃で、二酸化炭素が８％である。流加補充：振とうフラスコで７２ｈ培養した後から始まって材料を毎日補充し、初期培養体積の３％のＨｙＣｌｏｎｅＣｅｌｌＢｏｏｓｔＦｅｅｄ７ａを毎日流加し、初期培養体積の１０００分の１の流加量で、Ｆｅｅｄ７ｂを毎日流加し、１２日目（１２日目も補充）までに補充した。６日目にブドウ糖を３ｇ／Ｌ補充した。１３日目に試料を採取した。プロテインＡ（ｐｒｏｔｅｉｎＡ）アフィニティークロマトグラフィーカラムを用いてアフィニティー精製を行った。精製された抗体を４μｇ取って還元性ＳＤＳ－ＰＡＧＥを行い、４μｇの外因性対照抗体を対照とし、電気泳動図は図１に示すように、還元性ＳＤＳ－ＰＡＧＥの後に２本のバンドを示し、１本のＭｒは５０ＫＤ（重鎖、配列番号１４）で、もう１つのＭｒは２８ＫＤ（軽鎖、配列番号１３）である。

【0106】

（実施例２）
抗体の性能検出
（１）実施例１の抗体及びその突然変異体の活性検出
実施例１の抗体（ＷＴ）配列を分析すると、その重鎖可変領域は配列番号１２に示され、ここで、重鎖可変領域上の各相補性決定領域のアミノ酸配列は以下のとおりであり、
ＣＤＲ－ＶＨ１：Ｇ－Ｖ（Ｘ１）－Ｔ－Ｆ－Ｓ－Ｔ（Ｘ２）－Ｆ－Ａ（Ｘ３）－Ｍ－Ｈ、
ＣＤＲ－ＶＨ２：Ｙ－Ｌ（Ｘ１）－Ｎ－Ｓ－Ａ（Ｘ２）－Ｓ－Ｎ－Ｌ（Ｘ３）－Ｉ－Ｙ－Ｙ－Ａ－Ｄ－Ｔ－Ｌ（Ｘ４）－Ｋ、
ＣＤＲ－ＶＨ３：Ｔ（Ｘ１）－Ｒ－Ｈ－Ａ（Ｘ２）－Ｍ、
その軽鎖可変領域は配列番号１１に示され、ここで、軽鎖可変領域上の各相補性決定領域のアミノ酸配列は以下のとおりである。
ＣＤＲ１－ＶＬ：Ｓ－Ｑ－Ｓ－Ｉ（Ｘ１）－Ｄ－Ｙ－Ｄ（Ｘ２）－Ｇ－Ｄ－Ｓ－Ｆ（Ｘ３）－Ｍ、
ＣＤＲ－ＶＬ２：Ｄ（Ｘ１）－Ａ－Ｓ－Ｎ－Ｖ（Ｘ２）－Ｅ－Ｓ、
ＣＤＲ－ＶＬ３：Ｑ－Ｈ（Ｘ１）－Ｓ－Ｎ－Ｅ－Ｄ（Ｘ２）－Ｐ－Ｙ。

【0107】

実施例１の新型コロナウイルスに対する抗体（ＷＴ）を基に、相補性決定領域中で抗体の活性に関連する部位を突然変異させ、ここで、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４はいずれも突然変異部位である。次の表１を参照する。

【表5】

【0108】

表１の抗体の結合活性の検出
コーティング液（主成分ＮａＨＣＯ_３）で２０１９－ｎＣｏＶＮタンパク質抗原を１μｇ／ｍｌに希釈し、１ウェル当たり１００μｌでマイクロプレートコーティングを行い、４℃で一晩放置し、翌日、洗浄液で２回洗浄し、叩いて乾かし、ブロッキング液（２０％ＢＳＡ＋８０％ＰＢＳ）を１ウェル当たり１２０μｌになるように加え、３７℃で１ｈ叩いて乾かし、希釈された表１のモノクローナル抗体を１００μｌ／ウェルで加え、３７℃で３０ｍｉｎ～６０ｍｉｎであり、洗浄液で５回洗浄し、叩いて乾かし、ヤギ抗マウスＩｇＧ－ＨＲＰを１ウェル当たり１００μｌになるように加え、３７℃で３０ｍｉｎであり、洗浄液（ＰＢＳ）で５回洗浄し、叩いて乾かし、発色液Ａ（５０μｌ／ウェル、２．１ｇ／Ｌのクエン酸、１２．２５ｇ／Ｌのクエン酸、０．０７ｇ／Ｌのアセトアニリド、及び０．５ｇ／Ｌの過酸化尿素を含む）を加え、発色液Ｂ液（５０μｌ／ウェル、１．０５ｇ／Ｌのクエン酸、０．１８６ｇ／ＬのＥＤＴＡ・２Ｎａ、０．４５ｇ／ＬのＴＭＢ、０．２ｍｌ／Ｌの濃ＨＣｌを含む）を加え、１０ｍｉｎであり、停止液（５０μｌ／ウェル、０．７５ｇ／ＬのＥＤＴＡ・２Ｎａ及び１０．２ｍｌ／Ｌの濃Ｈ_２ＳＯ_４を含む）を加え、マイクロプレートリーダの４５０ｎｍ（６３０ｎｍ参照）でＯＤ値を読み取った。結果を次の表２に示した。

【表6】

【0109】

表２の結果から分かるように、ＷＴ及び突然変異体は、両方とも良好な結合活性を有し、ここで、突然変異１の活性が最適である。

【0110】

（２）抗体及びその突然変異体の親和性の検出
（ａ）突然変異１を基に、各ＣＤＲ領域の他の部位を突然変異させ、各突然変異の配列を次の表３に示した。

【表7(1)】

【表7(2)】

【表7(3)】

【0111】

親和性分析
ＡＭＣセンサーを利用して、精製した抗体をＰＢＳＴ（リン酸塩ツイーン緩衝液、主成分はＮａ_２ＨＰＯ_４＋ＮａＣｌ＋ＴＷ－２０である）で１０μｇ／ｍＬに希釈し、２０１９－ｎＣｏＶＮタンパク質抗原をＰＢＳＴで１．４１μｇ／ｍＬ、０．７０μｇ／ｍＬ、０．３５μｇ／ｍＬ、０．１８μｇ／ｍＬ、０．０９μｇ／ｍＬ、０．０４μｇ／ｍＬに段階的に希釈した。

【0112】

実行プロセス：緩衝液１（ＰＢＳＴ）中で６０ｓ平衡化し、抗体溶液中で抗体を３００ｓ固化し、緩衝液２（ＰＢＳＴ）中で１８０ｓインキュベートし、抗原溶液中で４２０ｓ結合し、緩衝液２中で１２００ｓ解離し、１０ｍＭのｐＨ１．６９ＧＬＹ溶液及び緩衝液３でセンサー再生を行って、データを出力した。Ｋ_Ｄは、親和性である平衡解離定数を表し、ｋｏｎは、結合速度を表し、ｋｄｉｓは、解離速度を表す。結果を次の表４に示した。

【表8(1)】

【表8(2)】

【0113】

表４のデータは、突然変異１及びそのシリーズ突然変異体は、両方とも良好な親和性を有することを示し、これは、突然変異１を基に表３の突然変異方式で突然変異させて得られた抗体は、いずれも比較的良い親和性を有することを明らかに示す。

【0114】

（ｂ）ＷＴを基に、他の部位を突然変異させ、且つ上記の２（ａ）の親和性測定方法を利用して各突然変異体の親和性を検出し、各突然変異の配列を次の表５に示し、対応する親和性データを次の表６に示した。

【表9】

【表10】

【0115】

表６のデータは、ＷＴ及びそのシリーズ突然変異体は、抗原に対しても良い親和性を有することを示し、これは、ＷＴを基に、表５の突然変異方式で突然変異させて得られた抗体は、いずれも良い親和性を有することを明らかに示す。

【0116】

（３）裸抗体の安定性評価
上記の抗体を４℃（冷蔵庫）、－８０℃（冷蔵庫）、３７℃（恒温槽）にて２１日間放置し、７日目、１４日目、２１日目に試料を取って状態を観察し、２１日目の試料に対して活性検出を行った結果は、抗体を３種類の評価条件で２１日間放置し、いずれにもタンパク質状態の明らかな変化が見られず、活性も評価温度の上昇に伴って低下する傾向が見られないことを示し、これは、上記の抗体が安定していることを明らかに示す。表７の突然変異１抗体は、２１日間評価した酵素結合免疫活性検出のＯＤ結果である。

【表11】

【0117】

以上は、本開示の好ましい実施例にすぎず、本開示を限定するものではなく、当業者にとって、本開示の様々な変更及び変化が可能である。本開示の精神及び原則内で行われる修正、等価置換、改良などは、いずれも本開示の保護範囲内に含まれるべきである。

【産業上の利用可能性】

【0118】

本開示は、新型コロナウイルスに対する抗体、新型コロナウイルスを検出する試薬及びキットを提供し、当該抗体は、新型コロナウイルスのＮタンパク質に特異的に結合することができ、Ｎタンパク質に対して高親和性を有し、当該抗体を用いた新型コロナウイルスの検出は、優れた感度及び特異性を有する。本開示は、新型コロナウイルスの検出のために、より豊富な抗体選択を提供する。また、本開示にて提供される検出キットも、同様に、当該抗体と同じ技術的効果を有し、広い応用の見込みと高い市場価値を有する。

【図1】