特表 2023-551135 構成可能なヒドロゲル材料、及び生物活性物質の隔離及び／又は放出のためのヒドロゲル材料を構成するための方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-12-07

(54)【発明の名称】構成可能なヒドロゲル材料、及び生物活性物質の隔離及び／又は放出のためのヒドロゲル材料を構成するための方法

(51)【国際特許分類】

   C08G 81/00 20060101AFI20231130BHJP

   A61P 37/02 20060101ALI20231130BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20231130BHJP

   A61P 3/10 20060101ALI20231130BHJP

   A61P 25/00 20060101ALI20231130BHJP

   A61P 1/04 20060101ALI20231130BHJP

   A61P 11/06 20060101ALI20231130BHJP

   A61P 19/02 20060101ALI20231130BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20231130BHJP

   A61P 17/02 20060101ALI20231130BHJP

   A61P 19/08 20060101ALI20231130BHJP

   A61K 9/06 20060101ALI20231130BHJP

   A61K 47/32 20060101ALI20231130BHJP

   A61K 47/34 20170101ALI20231130BHJP

   A61K 47/42 20170101ALI20231130BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20231130BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20231130BHJP

   C08F 220/06 20060101ALI20231130BHJP

【ＦＩ】

C08G81/00

A61P37/02

A61P35/00

A61P3/10

A61P25/00

A61P1/04

A61P11/06

A61P19/02

A61P29/00 101

A61P17/02

A61P19/08

A61K9/06

A61K47/32

A61K47/34

A61K47/42

A61K45/00

C12N5/10

C08F220/06

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023528579

(86)(22)【出願日】2021-11-11

(85)【翻訳文提出日】2023-07-13

(86)【国際出願番号】 DE2021100903

(87)【国際公開番号】W WO2022111756

(87)【国際公開日】2022-06-02

(31)【優先権主張番号】102020131536.8

(32)【優先日】2020-11-27

(33)【優先権主張国・地域又は機関】DE

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．テフロン

２．ＴＲＩＴＯＮ

(71)【出願人】

【識別番号】500525405

【氏名又は名称】ライプニッツ－インスティチュート フュア ポリマーフォルシュング ドレスデン エーファウ

【氏名又は名称原語表記】Ｌｅｉｂｎｉｚ－Ｉｎｓｔｉｔｕｔ ｆｕｅｒ Ｐｏｌｙｍｅｒｆｏｒｓｃｈｕｎｇ Ｄｒｅｓｄｅｎ ｅ．Ｖ．

【住所又は居所原語表記】Ｈｏｈｅ Ｓｔｒａｓｓｅ ６，Ｄ－０１０６９ Ｄｒｅｓｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ

(74)【代理人】

【識別番号】100079108

【弁理士】

【氏名又は名称】稲葉 良幸

(74)【代理人】

【識別番号】100109346

【弁理士】

【氏名又は名称】大貫 敏史

(74)【代理人】

【識別番号】100117189

【弁理士】

【氏名又は名称】江口 昭彦

(74)【代理人】

【識別番号】100134120

【弁理士】

【氏名又は名称】内藤 和彦

(72)【発明者】

【氏名】アッタラーフ，パッサント

(72)【発明者】

【氏名】フロイデンベルク，ウーベ

(72)【発明者】

【氏名】ウェルナー，カルステン

(72)【発明者】

【氏名】シーデル，アナ

(72)【発明者】

【氏名】デニソン，ニコラス

【テーマコード（参考）】

4B065

4C076

4C084

4J031

4J100

【Ｆターム（参考）】

4B065AA90X

4B065AB01

4B065BA02

4B065CA44

4B065CA60

4C076AA09

4C076BB31

4C076BB32

4C076CC01

4C076CC04

4C076CC07

4C076CC15

4C076CC16

4C076CC19

4C076CC27

4C076EE06A

4C076EE08A

4C076EE13A

4C076EE16A

4C076EE23A

4C076EE26A

4C076EE41A

4C076EE43

4C084AA17

4C084MA63

4C084MA67

4C084NA03

4C084NA05

4C084ZA01

4C084ZA59

4C084ZA68

4C084ZA89

4C084ZA96

4C084ZB07

4C084ZB15

4C084ZB26

4C084ZC35

4J031AA04

4J031AA19

4J031AA53

4J031AB01

4J031AC11

4J031AD01

4J031AF03

4J031AF09

4J100AJ02P

4J100AM21Q

4J100AM21R

4J100BA56R

4J100BC43R

4J100BC66H

4J100BC66Q

4J100CA04

4J100CA05

4J100CA31

4J100HC63

4J100JA51

(57)【要約】

本発明は、ヒドロゲル材料への生物活性物質の隔離及び／又はヒドロゲル材料からの生物活性物質の放出のための構成可能なヒドロゲル材料に関する。本発明は更に、生物活性物質の隔離及び／又は放出のためのヒドロゲル材料の構成を決定し利用可能にする方法に関する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

構成可能なヒドロゲル材料であって、前記ヒドロゲル材料への物質の隔離及び生体液中の前記物質の枯渇、及び／又は前記ヒドロゲル材料から前記生体液への物質の放出及び前記ヒドロゲル材料中の前記物質の枯渇のための構成可能なヒドロゲル材料であり、前記ヒドロゲル材料は、求核基を有し、生理的条件下にてアニオン性で荷電された少なくとも３つのユニットに基づき、非荷電ユニットは、前記求核基と反応することができる少なくとも２つの求電子基を有し、前記荷電ユニットと前記非荷電ユニットは架橋されて、前記求核基と前記求電子基の反応によって得られることができる、ポリマーネットワークを形成し、前記ヒドロゲル材料の組成は、前記アニオン性ユニットを規定するパラメーターＰ０、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３の群から選択された３つのパラメーターを使用して構成可能であり、パラメーターＰ０は、生理的条件下で膨潤した前記ヒドロゲル材料のユニット体積当たり全てのアニオン性基が３０％イオン化すると仮定して、イオン化されたアニオン性基の数から計算された値に対応し、パラメーターＰ１は、生理的条件下で膨潤した前記ヒドロゲル材料のユニット体積当たり２．５未満の固有ｐＫ_Ａを有する強アニオン性基の数から計算された値に対応し、パラメーターＰ２は、繰り返しユニット当たり２．５未満の固有ｐＫ_Ａを有する強アニオン性基の数を前記繰り返しユニットのモル質量で割ることから計算される値に対応し、パラメーターＰ３は、前記アニオン性荷電ユニットの両親媒性を説明するための値に対応する、構成可能なヒドロゲル材料。

【請求項2】

構成可能なヒドロゲル材料であって、前記ヒドロゲル材料への物質の隔離及び生体液中の前記物質の枯渇、及び／又は前記ヒドロゲル材料から前記生体液への物質の放出及び前記ヒドロゲル材料中の前記物質の枯渇のための構成可能なヒドロゲル材料であり、前記ヒドロゲル材料は、ポリ（アクリル酸－コ－４－アクリルアミドメチルベンゼンスルホン酸）及び／又はポリ（アクリル酸－コ－アクリルアミドエタンスルホン酸）及び／又はポリ（アクリル酸－コ－アクリルアミドエタンヒドロゲンスルフェート）の形態の荷電ユニット、並びにアミノ基又はチオール基を含むポリマーの、又は少なくとも２つのアミノ基又はチオール基を有する架橋剤分子の形態の非荷電ユニットに基づき、前記荷電ユニットと前記非荷電ユニットは架橋されて、ポリマーネットワークを形成し、これは、前記ポリ（アクリル酸－コ－４－アクリルアミドメチルベンゼンスルホン酸）及び／又は前記ポリ（アクリル酸－コ－アクリルアミドエタンスルホン酸）及び／又はＥＤＣ／スルホ－ＮＨＳを有する前記ポリ（アクリル酸－コ－アクリルアミドエタンヒドロゲンスルフェート）のカルボキシル基の活性化、並びにそれぞれの場合においてアミドを形成する、アミノ基を含む前記ポリマー若しくは前記少なくとも２つのアミノ基を有する前記架橋剤分子への直接架橋、又はアミノ基及びマイケル型付加が可能な基をそれぞれ含む二官能性架橋剤分子による活性化されたカルボキシル基の官能基化のいずれか、並びにそれぞれの場合においてマイケル型付加を介する、チオール基を含む前記ポリマーとの、又は前記少なくとも２つのチオール基を有する前記架橋剤分子との引き続く架橋によって得られることができ、前記ヒドロゲル材料の組成は、パラメーターＰ０、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３の群から選択された、荷電基保持ユニットを規定する３つのパラメーターに基づいて構成可能であり、パラメーターＰ０は、生理的条件下で膨潤した前記ヒドロゲル材料のユニット体積当たり全てのアニオン性基が３０％イオン化すると仮定して、イオン化されたアニオン性基の数から計算された値に対応し、
パラメーターＰ１は、生理的条件下で膨潤した前記ヒドロゲル材料のユニット体積当たり２．５未満の固有ｐＫ_Ａを有する強アニオン性基の数から計算された値に対応し、
パラメーターＰ２は、繰り返しユニット当たり２．５未満の固有ｐＫ_Ａを有する強アニオン性基の数を前記繰り返しユニットのモル質量で割ることから計算される値に対応し、
パラメーターＰ３は、前記アニオン性荷電ユニットの両親媒性を説明するための値に対応する、構成可能なヒドロゲル材料。

【請求項3】

マイケル型付加が可能な前記基は、マレイミド基、ビニルスルホン基、又はアクリレート基から選択されることを特徴とする、請求項２に記載の構成可能なヒドロゲル材料。

【請求項4】

非荷電単位として、アミン基及びチオール基を含む前記ポリマーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリ（２－オキサゾリン）（ＰＯＸ）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）及び／又はポリアリールアミド（ＰＡＭ）の部類から選択され、アミン基又はチオール基を含む前記架橋剤分子は、非ポリマーの二官能性架橋剤分子であることを特徴とする、請求項２又は３に記載の構成可能なヒドロゲル材料。

【請求項5】

選択される前記荷電ユニットは、９：１から１：９の範囲内のアクリル酸の４－アクリルアミドメチルベンゼンスルホン酸に対する変動モル比、及び５０００～１０００００ｇ／モルの範囲内のモル質量を有するポリ（アクリル酸－コ－４－アクリルアミドメチルベンゼンスルホン酸）、及び／又は荷電ユニットとして、９：１から１：９の範囲内のアクリル酸のアクリルアミドエタンスルホン酸に対する変動モル比、及び５０００～１０００００ｇ／モルの範囲内のモル質量を有するポリ（アクリル酸－コ－アクリルアミドエタンスルホン酸）、及び／又は荷電ユニットとして、９：１から１：９の範囲内のアクリル酸のアクリルアミドエタンヒドロゲンスルフェートに対する変動モル比、及び５０００～１０００００ｇ／モルの範囲内のモル質量を有するポリ（アクリル酸－コ－アクリルアミドエタンヒドロゲンスルフェート）であることを特徴とする、請求項１～４のいずれか一項に記載の構成可能なヒドロゲル材料。

【請求項6】

利用される前記非荷電ユニットは、ペプチド配列中の反応性アミノ酸としてリシン又はシステインを含む、酵素的に切断可能な共役ペプチドを有するポリマーであることを特徴とする、請求項１～５のいずれか一項に記載の構成可能なヒドロゲル材料。

【請求項7】

前記酵素的に切断可能なペプチドは、ヒト又は細菌のプロテアーゼ、特にＭＭＰ、カテプシン、エラスターゼ、オーレオリシン及び／又は血液凝固酵素によって切断可能であることを特徴とする、請求項６に記載の構成可能なヒドロゲル材料。

【請求項8】

前記荷電ユニットポリ（アクリル酸－コ－４－アクリルアミドメチルベンゼンスルホン酸）及び／又はポリ（アクリル酸－コ－アクリルアミドエタンスルホン酸）及び／又はポリ（アクリル酸－コ－アクリルアミドエタンハイドロジェンスルフェート）に、又はヒドロゲルネットワークへの共有結合を形成するマイケル型付加が可能な基を有するそれらの誘導体に、アミノ基又はカルボキシル基及び／又は細胞指示ペプチドを有する生物活性分子及び／又は接着防止分子は、前記配列においてリシン又はシステインを介して結合されることを特徴とする、請求項２～７のいずれか一項に記載の構成可能なヒドロゲル材料。

【請求項9】

前記生物活性分子は、抗菌物質、例えば、抗生物質又は防腐剤、又は医薬品有効成分であることを特徴とする、請求項８に記載の構成可能なヒドロゲル材料。

【請求項10】

前記接着防止分子は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）又はポリ（２－オキサゾリン）（ＰＯＸ）であることを特徴とする、請求項８又は９に記載の構成可能なヒドロゲル材料。

【請求項11】

前記細胞指示ペプチドは、細胞外マトリックスの構造タンパク質及び機能タンパク質、例えば、コラーゲン、ラミニン、テネイシン、フィブロネクチン及びビトロネクチンに由来するペプチドであることを特徴とする、請求項８～１０のいずれか一項に記載の構成可能なヒドロゲル材料。

【請求項12】

前記生物活性分子及び／又は接着防止分子及び／又は細胞指示ペプチドは、酵素的に切断可能なペプチド配列を介して前記ヒドロゲルネットワークに共有結合されることを特徴とする、請求項８～１１のいずれか一項に記載の構成可能なヒドロゲル材料。

【請求項13】

前記ヒドロゲル材料は、０．２ｋＰａ～２２ｋＰａの貯蔵弾性率を有することを特徴とする、請求項１～１２のいずれか一項に記載の構成可能なヒドロゲル材料。

【請求項14】

ポリ（アクリル酸－コ－４－アクリルアミドメチルベンゼンスルホン酸）及び／又はポリ（アクリル酸－コ－アクリルアミドエタンスルホン酸）及び／又はポリ（アクリル酸－コ－アクリルアミドエタンヒドロゲンスルフェート）の形態の荷電ユニットと、ポリマーの形態の非荷電ユニットとの間の物理的相互作用に基づく構成可能な物理的に架橋されたヒドロゲル材料であって、強く正に荷電したペプチド配列は、前記ポリマーに共役されており、前記ヒドロゲル材料の組成は、パラメーターＰ０、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３の群から選択された、荷電基保持ユニットを規定する３つのパラメーターに基づいて構成可能であり、パラメーターＰ０は、生理的条件下で膨潤した前記ヒドロゲル材料のユニット体積当たり全てのアニオン性基が３０％イオン化すると仮定して、イオン化されたアニオン性基の数から計算された値に対応し、
パラメーターＰ１は、生理的条件下で膨潤した前記ヒドロゲル材料のユニット体積当たり２．５未満の固有ｐＫ_Ａを有する強アニオン性基の数から計算された値に対応し、
パラメーターＰ２は、繰り返しユニット当たり２．５未満の固有ｐＫ_Ａを有する強アニオン性基の数を前記繰り返しユニットのモル質量で割ることから計算される値に対応し、
パラメーターＰ３は、前記アニオン性基の周囲の分子構造の両親媒性を説明するための値に対応する、構成可能な物理的に架橋されたヒドロゲル材料。

【請求項15】

前記強く正に荷電したペプチド配列は、リシン又はアルギニンの少なくとも１０回の繰り返し、又はリシン及びアラニン又はアルギニン及びアラニンを有するジペプチドモチーフの少なくとも５回の繰り返しを含むことを特徴とする、請求項１４に記載の構成可能な物理的に架橋されたヒドロゲル材料。

【請求項16】

請求項１～１５のいずれか一項に記載のヒドロゲル材料を使用する、ヒドロゲル材料への生物活性物質の隔離及び生体液中の前記物質の枯渇、及び／又は前記ヒドロゲル材料から前記生体液への物質の放出及び前記ヒドロゲル材料中の前記物質の枯渇のための前記ヒドロゲル材料のための構成を決定及び提供する方法であって、
－物質は、物質の正味電荷と水が接触可能な前記物質の表面積の比から計算されるＰＰ値に従って少なくとも２つのカテゴリーに分類され、
－各カテゴリーにおいて、規定のヒドロゲル構成のパラメーターの少なくとも２つの異なる値について、物質摂取値は、前記ヒドロゲル材料への前記カテゴリーに割り当てられた試験物質の物質摂取のパーセントから、それぞれの場合に実験的に確認され、及び／又は物質放出値は、前記ヒドロゲル材料から前記生体液への前記試験物質の物質放出のパーセントから、それぞれの場合に実験的に確認され、並びに少なくとも２つの実験的に確認された物質摂取値及び／又は少なくとも２つの実験的に確認された物質放出値は、それぞれ、カテゴリー固有の関数を形成するために使用され、これに基づいて、規定のパラメーターを用いて更に規定されたヒドロゲル構成の更なる物質摂取値及び／又は物質放出値が決定され、前記生体液中のカテゴリーに割り当てることができる任意の物質の濃度は、前記実験的に確認された物質摂取値及び前記決定された物質放出値、及び／又は前記実験的に確認された物質放出値及び前記計算された物質放出値から形成されるカテゴリー固有の回帰関数は、少なくとも０．６、好ましくは少なくとも０．７の決定係数Ｒ^２を有する、前記パラメーターの規定の値を用いて前記ヒドロゲル材料の適切なヒドロゲル構成を選択することによって影響を受ける方法。

【請求項17】

前記規定のヒドロゲル構成は、パラメーターＰ０、Ｐ２、Ｐ３又はＰ１、Ｐ２、Ｐ３を用いて形成されることを特徴とする、請求項１６に記載の方法。

【請求項18】

それらのＰＰ値を使用して物質を４つのカテゴリーＡ、Ｂ、Ｃ、及びＤに分類し、カテゴリーＡに割り当てられる物質は、ＰＰ値が９４０を超え、カテゴリーＢに割り当てられる物質は、ＰＰ値が９４０から１２８の範囲内にあり、カテゴリーＣに割り当てられる物質は、ＰＰ値が１２８から－１２８の範囲内にあり、カテゴリーＤに割り当てられる物質は、ＰＰ値が－１２８未満であることを特徴とする、請求項１６又は１７に記載の方法。

【請求項19】

前記物質摂取値及び／又は物質放出値は、
０～８０マイクロモル／ｍｌの範囲内の値をパラメーターＰ０として、
０～１５０マイクロモル／ｍｌの範囲内の値をパラメーターＰ１として、
０～１０ミリモル／（ｇ／モル）の範囲内の値をパラメーターＰ２として、及び
－７×１０^３から７×１０^３Ａ^－２の範囲内の値をパラメーターＰ３として規定することによって、実験的に決定されることを特徴とする、請求項１６～１８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項20】

理論的に確認された物質摂取値及び／又は物質放出値に対する前記カテゴリー固有の回帰関数は、ヒドロゲル構成の少なくとも１つのパラメーターＰ０、Ｐ１、Ｐ２又はＰ３の値の範囲を確認するために使用されることを特徴とする、請求項１６～１９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項21】

ヒドロゲル構成Ｐ０Ｐ１Ｐ２及び／又はヒドロゲル構成Ｐ１Ｐ２Ｐ３の前記パラメーターの値は、得られるヒドロゲルにおいて、１つのカテゴリーの少なくとも１つの物質が前記ヒドロゲル材料中で結合されている、又は初期濃度の５０％までのみ前記ヒドロゲル材料から放出されるように選択されることを特徴とする、請求項１６～２０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項22】

免疫障害、癌、糖尿病、神経変性障害、クローン病、潰瘍性大腸炎、多発性硬化症、喘息、関節リウマチ又は皮膚創傷、及び骨再生の場合の、血管新生の制御のための生体内での因子管理における、請求項１～１６のいずれか一項に記載のヒドロゲル材料の使用。

【請求項23】

微生物又は真核生物起源の細胞溶解物からのタンパク質の制御された精製における、請求項１～１６のいずれか一項に記載のヒドロゲル材料の使用。

【請求項24】

生体外細胞培養、並びに人工多能性幹細胞（ｉＰＳ）及びｉＰＳのカテゴリーに当てはまらない他の幹細胞及び前駆細胞、患者から得られた初代細胞、固定された細胞株、並びに、心臓組織、筋肉組織、腎臓組織、肝臓組織、及び神経組織の器官培養における、請求項１～１６のいずれか一項に記載のヒドロゲル材料の使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ヒドロゲル材料への生物活性物質の隔離及び／又はヒドロゲル材料からの生物活性物質の放出のための構成可能な（configurable）ヒドロゲル材料に関する。本発明は更に、生物活性物質の隔離及び／又は放出のためのヒドロゲル材料のための構成を確認及び提供する方法に関する。

【背景技術】

【0002】

多くの用途に対するその生体適合性と組織のような機械的特性のため、ヒドロゲルは、医学とバイオテクノロジーの両方にて多方面で使用されており、物質摂取システム又は物質放出システムとしても使用されている。ヒドロゲルは、規定上、高度に水和され、共有結合又は物理的に架橋されたポリマーである。剛性、含水量、及び構造再構成性などの様々な生物学的に関連するシグナルの制御、並びに共有結合した細胞接着タンパク質又はペプチドの提示（presentation）と同様に、ヒドロゲルは、非共有結合相互作用を介して生物活性物質を可逆的に結合することを可能にし、従って、物質を結合し、生体液又は生体組織から、例えば、それらをヒドロゲル内に隔離する又はヒドロゲルから環境に物質を放出することができる。このような生物活性物質は、タンパク質系のシグナル伝達分子、例えば、サイトカイン、ケモカイン、ホルモン、神経伝達物質、成長因子又は酵素であり得、これらは、１つ以上の生物学的機能を果たすとともに、電荷相互作用及び／又は更なる相互作用、例えば、疎水性相互作用又は水素結合のために、親和性を与えるヒドロゲルの成分に可逆的に結合できる。加えて、同様にサイトカイン、ケモカイン、ホルモン、神経伝達物質、又は成長因子の上記の細胞指示シグナル伝達特性を担い、更なる生物学的効果を引き起こすことができ、ヒドロゲルによって可逆的に結合及び放出される、非タンパク質系の生理活性化学物質、有効成分又は小分子も知られている。加えて、生物活性物質は、医薬品有効成分であり得る。前述の生物活性物質は全て、重要な特徴として、７０ｋＤａ以上の分子量を有し、従って、それらの分子サイズのために、電荷に依存して本発明のヒドロゲルネットワークのメッシュに浸透することができ、従って、そこから隔離される又は放出されることができる。このような生物活性物質は、便宜上、以下物質と称される。従来技術、例えば、国際公開第２０１８／１６２００９Ａ２号は、物質の隔離又は放出の制御、及び従って物質に対するその親和性が、ヒドロゲルネットワークの全体的及び局所的な電荷密度を介して説明されるヒドロゲルシステムを開示している。公知の解決策の欠点は、特定の生物活性物質の結合又は放出に対するヒドロゲルネットワークの特異性が低く、結果、そのような物質の制御された放出又は結合を所望の度合いまで達成できないことである。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0003】

物質特異的な方法でヒドロゲルネットワークの組成を適応又は構成することは可能であるが、既存の又は考えられる物質構造の数とそれに関連して必要な実験試行の数を考慮すると、物質特異的なヒドロゲルの開発は、容認できないレベルの経済支出と関連する。従って、必要とされるのは、生体液又は生体組織からの物質の分化した摂取及び／又は生体液又は生体組織への物質の分化した放出のための特定の物理化学的特性を有するヒドロゲルを提供する方法である。

【課題を解決するための手段】

【0004】

従って、本発明の目的は、特定の生物活性物質における所望の親和性に関して構成されることができる構成可能なヒドロゲル材料を提案することである。また、本発明の目的は、特定の生物活性物質の隔離及び／又は放出に適したヒドロゲル材料の構成の容易な確認を可能にする方法を提供することである。

【0005】

この目的は、請求項１に記載の特徴を有する構成可能なヒドロゲル材料及び請求項１６に記載の方法によって達成される。本発明の展開（development）は、それぞれの従属請求項に特定されている。

【0006】

本発明は、求核基を有し、生理的条件下にてアニオン性で荷電された少なくとも３つのユニット（unit）に基づく第１のヒドロゲル材料を包含し、好ましくは硫酸基、スルホン酸基、リン酸基又はカルボキシル基を有するユニット、求核基と反応することができる少なくとも２つの求電子基を有する非荷電ユニットを包含し、この場合、荷電ユニットと非荷電ユニットは架橋されて、求核基と求電子基の反応によって得られることができる、ポリマーネットワークが形成される。ヒドロゲル材料の組成は、アニオン性ユニットを規定するパラメーターＰ０、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３の群から選択された３つのパラメーターを使用して構成可能であり、この場合、パラメーターＰ０は、生理的条件下で膨潤したヒドロゲル材料のユニット体積当たり全てのアニオン性基が３０％イオン化すると仮定して、イオン化されたアニオン性基の数から計算された値に対応し、パラメーターＰ１は、生理的条件下で膨潤したヒドロゲル材料のユニット体積当たり２．５未満の固有ｐＫ_Ａを有する強アニオン性基の数から計算された値に対応し、パラメーターＰ２は、繰り返しユニット当たり２．５未満の固有ｐＫ_Ａを有する強アニオン性基の数を繰り返しユニットのモル質量で割ることから計算される値に対応し、パラメーターＰ３は、アニオン性ユニットの両親媒性を説明するための値に対応する。

【0007】

アニオン性荷電ユニットと非荷電ユニットから形成されるポリマーネットワークは、アニオン性荷電ポリマーネットワークである。アニオン性荷電ユニットポリマーネットワークは、アニオン性荷電ユニットを規定するパラメーターを使用して構成できる。

【0008】

加えて、本発明は、ポリ（アクリル酸－コ－４－アクリルアミドメチルベンゼンスルホン酸）及び／又はポリ（アクリル酸－コ－アクリルアミドエタンスルホン酸）及び／又はポリ（アクリル酸－コ－アクリルアミドエタンヒドロゲンスルフェート）の形態の荷電ユニット、並びにアミノ基又はチオール基を含むポリマーの、又は少なくとも２つのアミノ基又はチオール基を有する架橋剤分子の形態の非荷電ユニットに基づく第２のヒドロゲル材料を包含し、この場合、荷電ユニットと非荷電ユニットが、架橋して、ポリマーネットワークを形成し、これは、ポリ（アクリル酸－コ－４－アクリルアミドメチルベンゼンスルホン酸）及び／又はポリ（アクリル酸－コ－アクリルアミドエタンスルホン酸）及び／又はＥＤＣ／スルホ－ＮＨＳを有するポリ（アクリル酸－コ－アクリルアミドエタンヒドロゲンスルフェート）のカルボキシル基の活性化、並びにそれぞれの場合においてアミドを形成する、アミノ基を含むポリマー若しくは少なくとも２つのアミノ基を有する架橋剤分子への直接架橋、又はアミノ基及びマイケル型付加が可能な基をそれぞれ含む二官能性架橋剤分子による活性化されたカルボキシル基の官能基化のいずれか、並びに、それぞれの場合においてマイケル型付加を介する、チオール基を含むポリマーとの、又は少なくとも２つのチオール基を有する架橋剤分子との引き続く架橋によって得られることができる。ヒドロゲル材料の組成は、パラメーターＰ０、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３の群から選択される、荷電基保持ユニットを規定する３つのパラメーターに基づいて構成可能である。パラメーターＰ０は、生理的条件下で膨潤したヒドロゲル材料のユニット体積当たり全てのアニオン性基が３０％イオン化すると仮定して、イオン化されたアニオン性基の数から計算された値に対応し、パラメーターＰ１は、生理的条件下で膨潤したヒドロゲル材料のユニット体積当たり２．５未満の固有ｐＫ_Ａを有する強アニオン性基の数から計算された値に対応し、パラメーターＰ２は、繰り返しユニット当たり２．５未満の固有ｐＫ_Ａを有する強アニオン性基の数を繰り返しユニットのモル質量で割ることから計算される値に対応し、パラメーターＰ３は、アニオン性基の周囲の分子構造の両親媒性を説明するための値に対応する。

【0009】

本発明の文脈において、生体液又は組織は、生物活性物質が放出される、又は生物活性物質が隔離される生物学的に関連する区分の同義語であると理解される。

【0010】

本発明の文脈における生物活性物質は、サイトカイン、ケモカイン、ホルモン、神経伝達物質又は成長因子のシグナル伝達特性を有し、更なる生物学的効果を引き起こす、タンパク質系及び非タンパク質系の生物活性物質、活性成分及び小分子を意味すると理解される。生物活性物質は、特に医薬品有効成分であり得る。上記の全ての生物活性物質において、重要な特徴は、分子量が７０ｋＤａ以下であることである。

【0011】

本発明の構成可能なヒドロゲル材料は、ヒドロゲル材料への物質の隔離及び生体液又は組織中の物質の枯渇、及び／又はヒドロゲル材料から生体液又は組織への物質の放出及びヒドロゲル材料中の物質の枯渇を目的とする。

【0012】

アニオン性ユニットは、複数のアニオン性基及び少なくとも３つの求核性基を有するポリマー又はオリゴマーのヒドロゲルユニットを意味すると理解される。

【0013】

パラメーターＰ０～Ｐ３は、より具体的には次の仕様と形成方法によって規定される：
パラメーターＰ０：Ｐ０の値は、マイクロモル／ｍｌの単位で報告することができ、生理的条件下（０．１５４ミリモル／ｌＮａＣｌ、ｐＨ７．４に緩衝）で膨潤したヒドロゲルの体積に基づいてアニオン性基の総数の３０％に対応する。この計算は、例えば、生理的溶液中で膨潤したヒドロゲルユニットのポリマー濃度から計算することができる。

【0014】

パラメーターＰ１：Ｐ１の値は、マイクロモル／ｍｌの単位で報告することができ、
生理的条件下（０．１５４ミリモル／ｌＮａＣｌ、ｐＨ７．４に緩衝）で膨潤したヒドロゲル体積に基づいて２．５未満のｐＫａを有する強アニオン性基の数に対応する。

【0015】

パラメーターＰ２：Ｐ２の値は、ミリモル／（ｇ／モル）の単位で報告することができ、アニオン性荷電ユニット当たり２．５未満のｐＫａを有する強アニオン性基の数を、アニオン性ユニットのそれぞれの分子量で割ったものに対応する。

【0016】

パラメーターＰ３：パラメーターＰ３は、アニオン性ユニットの両親媒性を表し、アニオン性ユニットのオクタノール／水分配係数（ｌｏｇＰ値）を、水溶媒が接触可能な（accessible to）アニオン性ユニットの表面積で割ることにより計算される。これは、ChemDraw19.0及びChemAxon MarvinSketch 19.21ソフトウェアを利用して次の通り行うことができる：ChemDraw19.0ソフトウェアを使用して、２２個の炭素原子のポリマー骨格の長さを有する各アニオン性ユニット、又は糖系の構造体の場合は、合計２つの二糖ユニットを有する各アニオン性ユニットが、完全な化学構造体として表される。続いて、ChemAxon MarvinSketch 19.21ソフトウェアアプリケーションを使用して、ChemDraw 19.0で表される構造式をインポートし、溶媒半径１．４Åで水溶媒が接触可能な表面積を計算することにより、オクタノール／水分配係数（ｌｏｇＰ値）が計算される。１０^－３×［１／Ａ^２又はＡ^－２］のユニットを得るために、得られた値に１０００の係数を掛ける。本発明の第２のヒドロゲル材料において、マイケル型付加が可能な基は、マレイミド基、ビニルスルホン基、又はアクリレート基から選択することができる。

【0017】

加えて、本発明の第２のヒドロゲル材料の場合、非荷電単位として、アミン基及びチオール基を含むポリマーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリ（２－オキサゾリン）（ＰＯＸ）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）及び／又はポリアリールアミド（ＰＡＭ）の部類から選択され、アミン基又はチオール基を含む架橋剤分子は、非ポリマーの（nonpolymeric）二官能性架橋剤分子である場合があり得る。

【0018】

本発明の第１のヒドロゲル材料及び本発明の第２のヒドロゲル材料については、選択される荷電ユニットは、９：１から１：９の範囲内のアクリル酸の４－アクリルアミドメチルベンゼンスルホン酸に対する変動モル比、及び５０００～１０００００ｇ／モルの範囲内のモル質量を有するポリ（アクリル酸－コ－４－アクリルアミドメチルベンゼンスルホン酸）、及び／又は荷電ユニットとして、９：１から１：９の範囲内のアクリル酸のアクリルアミドエタンスルホン酸に対する変動モル比、及び５０００～１０００００ｇ／モルの範囲内のモル質量を有するポリ（アクリル酸－コ－アクリルアミドエタンスルホン酸）、及び／又は、荷電ユニットとして、９：１から１：９の範囲内のアクリル酸のアクリルアミドエタンヒドロゲンスルフェートに対する変動モル比、及び５０００～１０００００ｇ／モルの範囲内のモル質量を有するポリ（アクリル酸－コ－アクリルアミドエタンヒドロゲンスルフェート）である場合があり得る。

【0019】

ポリマーネットワーク形成に利用される非荷電ユニットは、ペプチド配列中の反応性アミノ酸としてリシン又はシステインを含む、酵素的に切断可能な共役ペプチドを有するポリマーであり得る。これに関連して、酵素的に切断可能なペプチドは、ヒト又は細菌のプロテアーゼ、特にＭＭＰ、カテプシン、エラスターゼ、オーレオリシン及び／又は血液凝固酵素によって切断可能である場合も更にあり得る。

【0020】

本発明の第２のヒドロゲルの開発では、荷電ユニットポリ（アクリル酸－コ－４－アクリルアミドメチルベンゼンスルホン酸）及び／又はポリ（アクリル酸－コ－アクリルアミドエタンスルホン酸）及び／又はポリ（アクリル酸－コ－アクリルアミドエタンヒドロゲンスルフェート）に、又はヒドロゲルネットワークへの共有結合を形成するマイケル型付加が可能な基を有するその誘導体に、アミノ基又はカルボキシル基を有する生物活性分子及び／又は接着防止分子及び／又は細胞指示ペプチド（cell-instructive peptide）を、配列においてリシン又はシステインを介して結合させることができる。この開発において、生物活性分子は、抗菌物質、例えば、抗生物質又は防腐剤、又は医薬品有効成分であり得る。加えて、接着防止分子は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）又はポリ（２－オキサゾリン）（ＰＯＸ）であり得る。

【0021】

本発明の第２のヒドロゲルの上記の開発に関連して、細胞指示ペプチドが、細胞外マトリックスの構造タンパク質及び機能タンパク質に、例えば、コラーゲン、ラミニン、テネイシン、フィブロネクチン及びビトロネクチンに由来するペプチドである場合も更にあり得る。生物活性分子及び／又は接着防止分子及び／又は細胞指示ペプチドは、酵素的に切断可能なペプチド配列を介してヒドロゲルネットワークに共有結合することができる。本発明の両方のヒドロゲル材料は、好ましくは０．２ｋＰａ～２２ｋＰａの貯蔵弾性率を有し得る。

【0022】

本発明は、ポリ（アクリル酸－コ－４－アクリルアミドメチルベンゼンスルホン酸）及び／又はポリ（アクリル酸－コ－アクリルアミドエタンスルホン酸）及び／又はポリ（アクリル酸－コ－アクリルアミドエタンヒドロゲンスルフェート）の形態の荷電ユニット、並びにポリマーの形態の非荷電ユニットの間の物理的相互作用に基づく構成可能な物理的に架橋されたヒドロゲル材料を更に包含し、強く正に荷電したペプチド配列がポリマーに共役されており、この場合、ヒドロゲル材料の組成は、パラメーターＰ０、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３の群から選択される、荷電基保持ユニットを規定する３つのパラメーターによって構成可能である。パラメーターＰ０は、生理的条件下で膨潤したヒドロゲル材料のユニット体積当たり全てのアニオン性基が３０％イオン化すると仮定して、イオン化されたアニオン性基の数から計算された値に対応し、パラメーターＰ１は、生理的条件下で膨潤したヒドロゲル材料のユニット体積当たり２．５未満の固有ｐＫ_Ａを有する強アニオン性基の数から計算された値に対応し、パラメーターＰ２は、繰り返しユニット当たり２．５未満の固有ｐＫ_Ａを有する強アニオン性基の数を繰り返しユニットのモル質量で割ることから計算される値に対応し、パラメーターＰ３は、アニオン性基の周囲の分子構造の両親媒性を説明するための値に対応する。

【0023】

物理的に架橋されたヒドロゲル材料では、強く正に荷電したペプチド配列が、リシン又はアルギニンの少なくとも１０回の繰り返し、又はリシン及びアラニン又はアルギニン及びアラニンを有するジペプチドモチーフの少なくとも５回の繰り返しを含む場合があり得る。

【0024】

本発明は更に、本発明のヒドロゲル材料の１つを使用する、ヒドロゲル材料への生物活性物質の隔離及び生体液中の生物活性物質の枯渇、及び／又はヒドロゲル材料から生体液への生物活性物質の放出及びヒドロゲル材料中の生物活性物質の枯渇のためのヒドロゲル材料のための構成を決定及び提供する方法に関する。

【0025】

この方法では、物質は、物質の正味電荷と水が接触可能な物質の表面積の比から計算されるＰＰ値に従って少なくとも２つのカテゴリーに分類され、各カテゴリーにおいて、規定のヒドロゲル構成のパラメーターの少なくとも２つの異なる値について、物質摂取値は、ヒドロゲル材料へのカテゴリーに割り当てられた試験物質の物質摂取のパーセントから、それぞれの場合に実験的に確認され、及び／又は物質放出値は、ヒドロゲル材料から生体液への試験物質の物質放出のパーセントから、それぞれの場合に実験的に確認される。少なくとも２つの実験的に確認された物質摂取値及び／又は少なくとも２つの実験的に確認された物質放出値は、それぞれ、カテゴリー固有の関数を形成するために使用され、これに基づいて、規定のパラメーターを用いて更に規定されたヒドロゲル構成の更なる物質摂取値及び／又は物質放出値が決定され、生体液中のカテゴリーに割り当てることができる任意の物質の濃度は、実験的に確認された物質摂取値及び決定された物質放出値、及び／又は実験的に確認された物質放出値及び計算された物質放出値から形成されるカテゴリー固有の回帰関数は、少なくとも０．６、好ましくは少なくとも０．７の決定係数Ｒ^２を有するパラメーターの規定の値を用いてヒドロゲル材料の適切なヒドロゲル構成を選択することによって影響を受ける。

【0026】

本発明の方法により、物質放出値又は物質摂取値を実験的に決定する必要はなく、規定の物質摂取値又は規定の物質放出値におけるそのＰＰ値に従ってカテゴリーに割り当てられることができる任意の物質の規定のパラメーター値を使用して、パラメーターＰ０、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３に従って適切なヒドロゲル構成を指定することができる。従って、本発明のヒドロゲル材料を使用すると、用途固有のヒドロゲル構成を確認し、確認された構成に従ってそれらを用途に提供することが可能である。

【0027】

生物活性物質のＰＰ値の計算／決定は、物質の正味電荷を水溶媒が接触可能な物質の表面積で割った値から計算される。

【0028】

タンパク質系の物質の場合、全てのタンパク質構造は、Protein Data Bank(ＰＤＢ、http://www.rcsb.org/)で入手できる。選択したタンパク質構造の正味電荷は、ｐＨ７の標準設定でDelphi Web Server(http://compbio.clemson.edu/sapp/delphi_webserver/)を使用して計算される。水溶媒が接触可能なタンパク質の表面積は、１．４Åの水の溶媒半径を使用して、ＰｙＭｏｌソフトウェア(www.pymol.org)によって計算される。次いで、ユニット１０^－６×［１／Ａ^２又はＡ^－２］を得るために、正味電荷を水溶媒が接触可能なタンパク質表面積で割り、１００００００の係数を掛けることにより、ＰＰが計算される。非タンパク質系の物質の場合、過剰なアニオン性又はカチオン性基に対応する化学構造から導出される正味電荷と、ChemDraw 19.0及びChemAxon MarvinSketch 19.21ソフトウェアを利用してパラメーターＰ３を形成する方法と同様に導出された水溶媒が接触可能な分子表面積が計算される。ユニット１０^－６×［１／Ａ^２又はＡ^－２］を得るために、得られた値に１００００００の係数を掛ける。

【0029】

本発明の文脈における物質摂取値は、物質を含む溶液からの生体液からヒドロゲル材料に取り込まれる物質の割合のパーセントを表す。物質放出値は、生体液に放出されるヒドロゲル材料内に結合した物質の割合を表す。規定の物質摂取値範囲及び規定の物質放出値範囲は、それぞれ、固定される最小物質摂取値及び固定される最大物質摂取値、又は固定される最小パーセント物質放出値及び固定される最大パーセント物質放出値を有する値の範囲を規定する。

【0030】

本発明は、物質の正味電荷と水が接触可能な表面積との比（ＰＰ値）を介して、本発明に従って計算される特定の物質特性に基づいて、物質を分類できるという驚くべき発見に基づいており、この場合、カテゴリー内の物質には、生体液中の物質の濃度に影響を与えるための、規定のパーセントの物質摂取値又は規定のパーセントの物質放出値に関して適切な様々なヒドロゲル構成を割り当てることができる。正しいヒドロゲル構成の割り当ては、カテゴリー内の各物質に適用されるため、それぞれの場合に試験物質に対して適切なヒドロゲル構成が決定される場合に十分である。従って、本発明の方法により、カテゴリー内の任意の物質について、問題の物質について特定の試験を行う必要がなく、規定のパーセントの物質摂取値又はパーセントの物質放出値について少なくとも１つのヒドロゲル構成を指定することが可能である。

【0031】

Ｐ０、Ｐ２、Ｐ３ヒドロゲル構成として、パラメーターＰ０、Ｐ２、Ｐ３を用いて、又はＰ１、Ｐ２、Ｐ３ヒドロゲル構成として、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３を用いて、規定のヒドロゲル構成を形成することが可能であることが好ましい。

【0032】

本発明の方法の一実行変形実施形態では、物質は、そのＰＰ値を使用して４つのカテゴリーＡ、Ｂ、Ｃ、及びＤに分類されることができ、この場合、カテゴリーＡに割り当てられた物質は、＞９４０のＰＰ値を有し、カテゴリーＢに割り当てられた物質は、９４０～１２８の範囲内のＰＰ値を有し、カテゴリーＣに割り当てられた物質は、１２８～－１２８の範囲内のＰＰ値を有し、カテゴリーＤに割り当てられた物質は、＜－１２８のＰＰ値を有する。

【0033】

物質摂取値を実験的に決定するために、及び／又は物質放出値を実験的に決定するために、０～５０マイクロモル／ｍｌの範囲内の値をパラメーターＰ０として、０～１００マイクロモル／ｍｌの範囲内の値をパラメーターＰ１として、０～１０ミリモル／（ｇ／モル）の範囲内の値をパラメーターＰ２として、－７から７Ａ^－２の範囲内の値をパラメーターＰ３として規定することができる。

【0034】

使用される試験物質は、例えば、エオタキシン、ＩＰ１０、ＳＤＦ１、ＭＣＰ１、ＳＧＦ２、ランテス、ｂＮＧＦ、ＩＬ－４、ＩＬ８、ＰＧＧＦｂ、ＧＲＯ－Ａ、ＩＬ６、ＩＬ１０、ＴＮＦα、ＩＦＮｇ、ＶＥＧＦ１ ６５ＭＰ、ＩＬ１ｂ、ＧＭＣＳＦ、ＩＧＦのタンパク質であり得る。

【0035】

本発明の方法では、実験的に確認されていない、即ち割り当てられた物質摂取値及び／又は物質放出値のカテゴリー固有の回帰関数を使用して、ヒドロゲル構成の少なくとも１つのパラメーターＰ０、Ｐ１、Ｐ２又はＰ３における値の範囲を確認する場合があり得る。パラメーターの値は、数学的モデルを使用して確認される。

【0036】

ヒドロゲル構成Ｐ０Ｐ１Ｐ２及び／又はヒドロゲル構成Ｐ１Ｐ２Ｐ３のパラメーターの値は、得られるヒドロゲルにおいて、１つのカテゴリーの少なくとも１つの物質がヒドロゲル材料中に結合される、又は初期濃度の５０％までのみヒドロゲル材料から放出されるように選択される場合も更にあり得る。

【0037】

本発明のヒドロゲル材料は、免疫障害、癌、糖尿病、神経変性障害、クローン病、潰瘍性大腸炎、多発性硬化症、喘息、関節リウマチ又は皮膚創傷、及び骨再生の場合の、血管新生の制御のための生体内での因子管理での使用を意図している。

【0038】

加えて、本発明のヒドロゲル材料は、微生物又は真核生物起源の細胞溶解物からのタンパク質の制御された精製に使用できる。

【0039】

生体外細胞培養、並びに人工多能性幹細胞（ｉＰＳ）及びｉＰＳのカテゴリーに当てはまらない他の幹細胞及び前駆細胞、患者から得られた初代細胞、固定された細胞株、並びに、心臓組織、筋肉組織、腎臓組織、肝臓組織、及び神経組織の器官培養における本発明のヒドロゲル材料の使用は、この場合、それぞれの細胞／器官が、ヒドロゲルに重合される、又はヒドロゲルの表面で培養される。

【0040】

細胞は、本発明のヒドロゲル材料において固定化されることができる。

【0041】

本発明の構成の更なる詳細、特徴及び利点は、対応する図面及び表を参照して、以下の実施例の説明から明らかになるであろう。図は、以下を示す：

【図面の簡単な説明】

【0042】

【図1】ヒドロゲルの形成に使用されるアニオン性ユニットの化学構造、左側：様々なラジカルを有するポリアクリレート（ＰＡＡ）の誘導体：Ｒ：マレイミド基及びＲ’＝アミノメチルベンゼン－１－スルホン酸（ＡＭＢＳ、ＧＢ１及びＧＢ２）又はアミノエタンスルホン酸（ＡＥＳ、ＧＢ３及びＧＢ４）又は２－アミノエチルヒドロゲンスルフェート（ＡＥＨＳ、ＧＢ５及びＧＢ６）、中央：Ｒラジカルを有するスチレンスルホネート－マレイン酸コポリマー：マレイミド基（ＧＢ７及びＧＢ８）、右側：ヘパリン（ＧＢ９）、

【図2A】本発明の方法を説明するための図、

【図2B】本発明の方法を説明するための図、

【図2C】本発明の方法を説明するための図、

【0043】

表１－１～１－２：
使用されたヒドロゲルユニット：表の列は左から右へ：（１）化学名、（２）略語、（３）モル質量、（４）１分子当たりのマレイミド基の数、（５）１分子当たりのアニオン性基の数、（６）１分子当たりのｐＫａ＜２．５の強アニオン性基の数、（７）ヒドロゲルユニットのパラメーターＰ２及び（８）ヒドロゲルユニットのパラメーターＰ３、

【表1-1】

【表1-2】

【0044】

表２：ＤＭＴＭＭによる硫酸化（スルホン化）アミンを用いたポリアクリル酸ナトリウムの硫酸化（スルホン化）におけるバッチサイズ、列（１）アニオン性荷電ユニットの名称、（２）反応物の名称：それぞれのポリマーとカルボン酸基のモル量、モル量、溶媒としてのミリポア水の体積、及び固形分に基づいて、使用される当量（ｅｑ）に関して、

【表2】

【0045】

表３：アニオン性荷電ユニットＧＢ１とＧＢ２、ＧＢ３とＧＢ４、ＧＢ５とＧＢ６、及びＧＢ９の１Ｈ ＮＭＲスペクトル（重水中で５００．１３ＭＨｚ）のシグナルと、それらが基づくプロトンの対応する化学シフト及び帰属、

【表3】

【0046】

表４：アニオン性荷電ユニットＧＢ１～ＧＢ９のマレイミド化の合成条件、ＧＢ＊は、それぞれの非マレイミド化アニオン性荷電ユニットを示す、

【表4】

【0047】

表５－１～５－５：
タイプ１～７６のヒドロゲル材料の形成方法、及び生理的条件下で膨潤したヒドロゲル材料の得られる物理化学的特性、（列１）：ヒドロゲル材料タイプの名称：１～７６、（列２～４）：ポリマーネットワーク形成のためのヒドロゲルユニット（ＧＢ１、２、３、４、５、６、７、８又は９、ＵＧＢ１、ＵＧＢ２、ＵＧＢ３）の濃度、（列５及び６）：生理的条件下でのヒドロゲル材料の膨潤の場合の相対膨潤度及び標準偏差、（列７及び８）：生理的条件下で膨潤したヒドロゲル材料の貯蔵弾性率と標準偏差、（列１０）：生理的条件下で膨潤した後のアニオン性荷電ユニットの濃度、（列１１）：生理的条件下で膨潤したヒドロゲル材料のパラメーターＰ０、（列１２）：生理的条件下で膨潤したヒドロゲル材料のパラメーターＰ１、

【表5-1】

【表5-2】

【表5-3】

【表5-4】

【表5-5】

【0048】

表６－１～６－３：
生物活性物質の隔離：上の４行：（１）それぞれのヒドロゲル材料と接触させた溶液２００μｌ中に使用される生物活性物質（ここではタンパク質）のモル量、（２）Protein Data Bank（ＰＤＢ）からのファイル、３）生物活性物質の名称、（４）カテゴリーＡ～Ｄ、（５）生物活性物質のパラメーターＰＰ、（６～２５）ヒドロゲル材料による生物活性物質の得られる隔離、下１８行：アニオン性ヒドロゲル材料の名称（ヒドロゲル材料タイプ２８～５２）とパラメーターＰ０、Ｐ１、Ｐ２、及びＰ３を使用したアニオン性ヒドロゲル材料の説明、及び物質摂取値（％）、平均±標準偏差、ｎ＝６、

【表6-1】

【表6-2】

【表6-3】

【0049】

表７：隔離値の線形回帰分析、（１）式の数、（２）考慮されるヒドロゲルのパラメーター、（３）考慮されるＰＰ値（物質）、（４）物質放出値に関する関数の決定係数Ｒ^２、

【表7】

【0050】

表８－１～８－２：
タイプ５３～６２のヒドロゲル材料からの生物活性物質としてのＶＥＧＦ１６５の累積放出量（平均±標準偏差、ｎ＝６）、上段：ヒドロゲル材料タイプ、行２～５：パラメーターＰ０、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、行７～１２：３、２４、４８、９６、１６８、及び２４０時間での物質放出値（％）、

【表8-1】

【表8-2】

【0051】

表９：ＩＬ－８を含まないＵＧＢ１／ＵＧＢ３ネガティブコントロールヒドロゲル材料に移行した細胞の数に応じて様々なアニオン性荷電ユニットを有するインキュベートされたＩＬ－８溶液に対するヒト全血からの免疫細胞の移動及び血液顆粒球の反応
（平均±標準偏差、ｎ＝５）、

【表9】

【0052】

表１０：ＨＵＶＥＣの細胞培養、行１：ヒドロゲルの種類、行２～４：パラメーターＰ０～Ｐ３、行６：所望の細胞形態としての管状構造の表面（平均±標準偏差、ｎ＝５）、並びに

【表10】

【0053】

表１１：ＨＫ－２細胞の細胞培養、行１：ヒドロゲルの種類、行２～４：パラメーターＰ０～Ｐ３、行６：丸い回転楕円体（％）、行７：尖った回転楕円体（％）、行８：管状構造（％）（平均±標準偏差、ｎ＝５）。

【表11】

【発明を実施するための形態】

【0054】

アニオン性荷電ヒドロゲルユニットは、以下ではＧＢと略記され、異なるアニオン性荷電ユニットは、更に番号によって識別される。ヒドロゲル材料の非荷電ユニットは、ＵＧＢと略記され、様々な非荷電ユニットは、番号で識別される。簡易にするために及びスペースの都合上、表ではヒドロゲル材料はヒドロゲルと称される。ヒドロゲル材料のタイプは、表ではヒドロゲルのタイプと称される。

【0055】

図１は、ヒドロゲル材料の形成に使用されるアニオン性ユニットの化学構造を示している。左側に示されているのは、様々なラジカルを有するポリアクリレート（ＰＡＡ）の誘導体である：Ｒ：マレイミド基、及びＲ’＝アミノメチルベンゼン－１－スルホン酸（ＡＭＢＳ、ＧＢ１及びＧＢ２）又はアミノエタンスルホン酸（ＡＥＳ、ＧＢ３及びＧＢ４）又は２－アミノエチルヒドロゲンスルフェート（ＡＥＨＳ、ＧＢ５及びＧＢ６）。中央に示されているのは、Ｒラジカル：マレイミド基を有するスチレンスルホネート－マレイン酸コポリマー（ＧＢ７及びＧＢ８）である。右側に示されているのは、ヘパリン（ＧＢ９）である。ヒドロゲル材料の生成に使用されるアニオン性ユニットは、ポリアクリレート（ＰＡＡ、図１を参照）、ＧＢ１～ＧＢ６、スチレンスルホネート－マレイン酸コポリマーＧＢ７及びＧＢ８、又はヘパリン（ＧＢ９）に基づく硫酸化又はスルホン化ポリマーである。

【0056】

表１－１～１－２は、本発明のヒドロゲル材料を生成するためのヒドロゲルユニットの例を示す。表１－１から１－２の列１から８は、左から右に以下を示す：列１：ヒドロゲルユニットの化学名、列２：本明細書で使用される略語、列３：モル質量、列４：分子当たりのマレイミド基の数、列５：分子当たりのアニオン性基の数、列６：分子当たりのｐＫａ＜２．５を有する強アニオン性基の数、列７：パラメーターＰ２、及び列８：ヒドロゲルユニットのパラメーターＰ３。

【0057】

アニオン性荷電ユニットＧＢ１～ＧＢ６の合成
ＰＡＡに基づくアニオン性荷電ヒドロゲルユニット（ＧＢ１～ＧＢ６）は、Thompson,K.et al.J.Polym.Sci.Part A Polym.Chem.44,126-136(2006)のプロトコールにより、４－（４，６－ジメトキシ－１，３，５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴＭＭ）を介したアミド形成によって合成される。３つの異なる硫酸化（スルホン化）アミン、４－アミノメチルベンゼン－１－スルホン酸（ＡＭＢＳ、ＧＢ１及びＧＢ２の形成用）、アミノエタンスルホン酸（ＡＥＳ、ＧＢ３及びＧＢ４の形成用）、及び２－アミノエチルヒドロゲンスルフェート（ＡＥＨＳ、ＧＢ５及びＧＢ６の形成用）は、ポリマー主鎖に沿った荷電基の局所的な電荷分布を変動させるために、カルボキシル基の数に基づいてそれぞれ１０％又は５０％の量でＰＡＡ＊に共役される。ＧＢ３～ＧＢ６のアミンは、非常に類似した分子構造を有するが、ＧＢ５とＧＢ６の場合の末端硫酸基とは対照的に、ＧＢ３とＧＢ４の場合の末端スルホン酸基が唯一の違いである。４－アミノメチルベンゼン－１－スルホン酸の場合のスルホン酸基は、フェニル基に結合しており、これにより、アニオン性ユニットＧＢ１及びＧＢ２の疎水性が増加する（パラメーターＰ３、表１－１～１－２を参照）。

【0058】

合成のために、ポリアクリル酸ナトリウム（１５ｋＤａ、水中で３４．７重量％、Sigma-Aldrich、Germany）を凍結乾燥し、官能化のために、８００ｍｇの初期仕込みをミリポア水に溶解した（表２）。続いて、最初に、デシケーター内で解凍したＤＭＴＭＭ（TCI Chemicals、Japan）、次いで、アミン、４－アミノメチルベンゼン－１－スルホン酸（ＡＭＢＳ、Sigma-Aldrich)、アミノエタンスルホン酸（ＡＥＳ、Sigma-Aldrich、Germany）又は２－アミノエチルヒドロゲンスルフェート（ＡＥＨＳ、Sigma-Aldrich、Germany）を乾燥状態で添加し、それぞれの場合において、指定された量で容器をすすぐ。反応混合物を室温（ＲＴ）で一晩撹拌する。部分的に沈殿した固体をミリポア水で溶解し、溶液を、２ｋＤａのサイズ排除（ＭＷＣＯ）の透析膜（ZelluTrans、Roth、Germany)にて、媒体を２回交換して１Ｍ ＮａＣｌ溶液（ＮａＣｌ、Fluka、Germany）に対して６時間透析し、次いで３回交換してミリポア水に対して１８時間透析し、次いで凍結乾燥する。官能化の度合いを決定するために、精製した生成物を重水中で１Ｈ ＮＭＲにより分析し（BrukerのＤＲＸ５００、５００．１３ＭＨｚで、溶媒シグナルは化学シフトの基準として機能する）、この場合、エチルプロトンは、ポリマーＥ及びＨの内部基準とみなされ、環プロトンは、Ｂの内部基準とみなされる（表３を参照）。ポリマー主鎖内の３つのプロトンに対する比を使用して、官能化の度合いを計算できる。

【0059】

表２は、ＤＭＴＭＭによる硫酸化（スルホン化）アミンを用いたポリアクリル酸ナトリウムの硫酸化（スルホン化）のバッチサイズを示しており、列１は、アニオン性荷電ユニットの名称、列２は、反応物の名称であり、使用される当量（ｅｑ）に関しては、それぞれのポリマーとカルボン酸基のモル量、モル量、溶媒としてのミリポア水の体積、及び固形分に基づいている。

【0060】

硫酸化（スルホン化）反応の変換を分析するために、各ポリマーのプロトン核スピン共鳴分光分析（１Ｈ ＮＭＲ）を行った（表３を参照）。硫酸化（スルホン化）共役体の１Ｈ ＮＭＲスペクトルは、ＧＢ３＊／ＧＢ４＊では２．９ｐｐｍ～３．７０ｐｐｍの特徴的なシグナルを示し、ＧＢ５＊／ＧＢ６＊では３．２５ｐｐｍ～４．１５ｐｐｍのシグナルを示し、これは、エチル連結基の４つのプロトンに対応し、ＧＢ１＊／ＧＢ２＊の計算には、フェニルプロトンに基づく７．００～８．００ｐｐｍのシグナルを使用した。０．８０～２．９０ｐｐｍでのＰＡＡ主鎖の３つのプロトンのシグナル領域に関連する特徴的なシグナルの統合により、様々な硫酸化（スルホン化）アミンによるＰＡＡの官能基化の度合いを決定することができた。

【0061】

表３は、アニオン性荷電ユニットＧＢ１とＧＢ２、ＧＢ３とＧＢ４、ＧＢ５とＧＢ６、及びＧＢ９の１Ｈ ＮＭＲスペクトル（重水中で５００．１３ＭＨｚ）のシグナルを、対応する化学シフト及びそれらに基づくプロトンの帰属とともに示している。

【0062】

アニオン性荷電ユニットＧＢ１～ＧＢ９のマレイミド化
チオール官能化４アームポリエチレングリコール（ＵＧＢ２、ｓｔａｒＰＥＧ－ＳＨ）を使用した例でのネットワーク形成を可能にするために、それぞれのアニオン性荷電ユニット（ＧＢ１～ＧＢ９）は、１－エチル－３－（ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド／Ｎ－ヒドロキシスルホスクシンイミド（ＥＤＣ／スルホＮＨＳ）を介して、１－エチル－３－（ジメチルアミノプロピル）－で活性化されたカルボキシル基にＮ－２－アミノエチルマレイミドトリフルオロ酢酸塩（マレイミド）と結合させられ、ＧＢ１～ＧＢ６の場合は約１２．５個のマレイミド基、ＧＢ７及びＧＢ８当たり９個、及びＧＢ９当たり７個を得る（表１－１～１－２、列：マレイミド基の数を参照）。

【0063】

この目的のために、３００ｍｇのポリマーを適切な量の溶媒に溶解し、次いでスルホ－ＮＨＳ（Sigma-Aldrich、Germany）を加え、次いで溶液中のＥＤＣ（Iris Biotech、Germany）を加え、混合物を氷浴にて、２０分間（ＧＢ７では１０分間）撹拌した後、溶解したＮ－（２－アミノエチル）マレイミドトリフルオロ酢酸（マレイミド、Sigma-Aldrich、Germany）をゆっくり滴下する。それぞれの場合に使用される溶媒は、氷冷したミリポア水である。反応混合物を氷浴中で更に１０分間撹拌し、撹拌を室温で一晩継続する。この溶液を、２ｋＤａのＭＷＣＯ透析膜にて、媒体を２回交換して１Ｍ ＮａＣｌ溶液に対して６時間透析し、次いで媒体を３回交換してミリポア水に対して１８時間透析し、次いで凍結乾燥する。使用した反応混合物に関する更なる情報は、表４に見られることができる。マレイミド基の数は、重水中で１Ｈ ＮＭＲによって決定され、結果は、ポリマー主鎖のプロトン数の硫酸化（スルホン化）ポリマーのマレイミドプロトン数に対する比として、及びアセチルプロトン数のヘパリンのマレイミドプロトン数に対する比として表される（表３を参照）。官能化の度合いは、それぞれの場合において１Ｈ ＮＭＲによって決定される（表３を参照）。ＧＢ７及びＧＢ８についてのみ、マレイミド共役の度合いがペプチド滴定法によって評価される（Atallah et al.,2018 doi:10.1016/j.biomaterials.2018.07.056を参照）。マレイミド共役は、異なるモル当量のシステイン含有ペプチドと反応し、サイズ排除クロマトグラフィーによって分析される。

【0064】

表４は、アニオン性荷電ユニットＧＢ１～ＧＢ９のマレイミド化の合成条件を示し、この場合、ＧＢ＊は、それぞれの非マレイミド化アニオン性荷電ユニットを示す。

【0065】

タイプ１～７６のヒドロゲル材料の形成と架橋
本発明のヒドロゲル材料を形成するために、ＵＧＢ１とともに、それぞれのマレイミド官能化されたアニオン性荷電ユニットＧＢ１、ＧＢ２、ＧＢ３、ＧＢ４、ＧＢ５、ＧＢ６、ＧＢ７、ＧＢ８又はＧＢ９、又はＧＢ１、ＧＢ２、ＧＢ３、ＧＢ４、ＧＢ５、ＧＢ６、ＧＢ７、ＧＢ８、又はＧＢ９の混合物が、マイケル型付加反応を介してチオール基とマレイミド基とを混合及び反応させることによって、チオール官能化ＵＧＢ２（４アームポリエチレングリコール、チオール末端）で又はチオール官能化ＵＧＢ３（４アームポリエチレングリコール、酵素的に切断可能なシステインを含むペプチド配列で末端化）で架橋される。ＵＧＢ１とＵＧＢ２から形成された非荷電の基準ヒドロゲルは、タイプ５２のヒドロゲル材料である。ヒドロゲルユニットの水溶液からそれぞれのヒドロゲル材料を形成するために利用されるヒドロゲルユニットの濃度は、表５－１から５－５に見られることができる。反応と共有結合ネットワークの形成は、数秒から最大１分以内に進行する。形成方法は、生理的条件（０．１５４ミリモルのＮａＣｌ、リン酸緩衝液でｐＨ７．４に緩衝）下で膨潤させると、パラメーターＰ０及びＰ１の全範囲の異なるパラメーター値が得られ、同時にまた、それぞれのアニオン性荷電ユニットによって規定されるパラメーターＰ２及びＰ３の異なる変数値が得られるように選択された（パラメーターＰ２及びＰ３の値に関しては、表５－１～５－５、ヒドロゲルタイプ１～７６、及び表１－１～１－２を参照）。加えて、膨潤したヒドロゲル材料の物理的特性、ヒドロゲル材料の相対膨潤度、及びヒドロゲル材料の貯蔵弾性率が、レオメトリーによって検査される。ヒドロゲル形成におけるアニオン性荷電ユニットの相対膨潤度及び濃度は、膨潤後のアニオン性荷電ユニットの濃度を確認するために使用され、これは、パラメーターの規定に従ってヒドロゲル材料のパラメーターＰ０及びＰ１を計算するために使用される。ヒドロゲル材料の剛性及び膨潤の物理化学的特性、及びパラメーターＰ０、Ｐ１、Ｐ２、及びＰ３の値は、広範囲にわたって変動させることができるため、生物活性物質の所望の隔離特性又は摂取特性及び／又は放出特性に合わせて段階的に変化させることができる（表５－１～５－５及び表１－１～１－２を参照）。

【0066】

報告されているヒドロゲル材料の貯蔵弾性率は、ゴム弾性モデル（Rubinstein et al.、2003 ISBN:9780198520597）に従って、次の式に従う６．５～２３ｎｍのメッシュサイズを与える：

【数1】

（式中、Ｇ’は貯蔵弾性率（Ｐａ）、ＮＡはアボガドロ定数、Ｒは普遍気体定数、Ｔは温度（ケルビン）である）。ここで論じている７０ｋＤａ未満の分子サイズを有する生物活性物質は、これらのメッシュサイズを考慮すると、本発明のヒドロゲル材料の浸透に関して立体的な制限を受けるべきではない。

【0067】

ヒドロゲル材料の形成のために、ヒドロゲルユニット及び荷電ユニット及び非荷電ユニットを、リン酸緩衝生理食塩水（０．１５４ミリモルのＮａＣｌ、リン酸緩衝液でｐＨ７．４に緩衝）中に表５－１から５－５に指定された濃度で溶解し、次いでピペッティング（pipetting）により激しく混合する。ヒドロゲル材料は数秒から最大１分以内に形成される。

【0068】

ヒドロゲルの物理的特性を決定するために、丸い９ｍｍのカバースリップに疎水性コーティングが施される。コーティングにおいて、カバースリップをSigmacote（登録商標）溶液（Sigma-Aldrich、Germany）に２秒間浸漬し、濾紙上で乾燥させ、ミリポア水で濯ぎ、再度乾燥させた。アニオン性荷電ユニットと非荷電ユニットを含む溶液を、ｐＨ７．４のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に溶解し、ＧＢ溶液とＵＧＢ溶液のそれぞれ３３．５μｌを混合し、カバースリップにピペットで移し、高さ約１ｍｍのゲルを形成するために、更にカバースリップで覆う。１時間後、カバースリップを取り外し、リン酸緩衝生理食塩水中で（更にＰＢＳ中で）一晩膨潤させる。貯蔵弾性率を決定するためのレオロジー検討（Ares LN2、TA Instruments、United Kingdom）は、室温で平行プレート間測定配列（parallel plate-plate measuring arrangement）を使用し、周波数を１から１００ラジアン／秒に増加させ（わずかな変形あり（２％）、膨潤ヒドロゲルの８ｍｍの打ち抜き試料を使用して実施した。三重の判定が行われ、それぞれの場合において周波数範囲全体にわたって貯蔵弾性率の平均が求められる。損失弾性率は、それぞれの場合で数桁小さくなる（データは示されず）。相対的な体積の膨潤を決定するために、膨潤したゲルディスクをレーザースキャナー（Fujifilm FLA-5100）を利用して画像化し、直径を決定する。次の式

【数2】

を使用して相対膨潤度を決定し（表３を参照）、この場合、ｄ０は、膨潤していないゲルディスクの初期直径に対応し、ｄは、ＰＢＳ中で２４時間膨潤させた後の直径に対応する。

【0069】

表５－１から５－５は、タイプ１から７６のヒドロゲル材料の形成方法、及び生理的条件下で膨潤したヒドロゲル材料の得られる物理化学的特性を示している、列１：ヒドロゲル材料のタイプの名称：１～７６、列２～４：ポリマーネットワーク形成における反応混合物中のヒドロゲルユニットの濃度（ＧＢ１、２、３、４、５、６、７、８又は９、ＵＧＢ１、ＵＧＢ２、ＵＧＢ３）、列５及び６：生理的条件下でのヒドロゲル材料の膨潤の場合の相対膨潤度及び標準偏差、列７及び８：生理的条件下で膨潤したヒドロゲル材料の貯蔵弾性率及び標準偏差、列１０：生理的条件下で膨潤した後のアニオン性荷電ユニットの濃度、列１１：生理的条件下で膨潤したヒドロゲル材料のパラメーターＰ０、列１２：生理的条件下で膨潤したヒドロゲル材料のパラメーターＰ１。

【0070】

マルチプレックスイムノアッセイによるタイプ２８～５２のアニオン性荷電ヒドロゲルにおける生物活性物質の隔離の特性評価
生物活性物質の規定の混合物、即ち、異なる荷電特性を有する生物医学的に重要なタンパク質系のシグナル伝達分子の混合物は、タイプ２８～５１の一連の異なるアニオン性荷電ヒドロゲル材料と、タイプ５２の非荷電基準ゲルを用いた対応する結合の検討で使用される（表５－１～５－５を参照）。組換えタンパク質（複数のProcartaPlex Simplex protein standards,cat.no.:EPX01A-xxxx-901 Thermo Fisher Scientific,USAで再構成された）を、０．４４～１２．２５ｎｇ／ｍｌの範囲内の生物学的関連性の様々な濃度で１％ＢＳＡ及び０．１％Proclin（Sigma-Aldrich、Germany）を含むＰＢＳに溶解する。１０μｌの各ゲルタイプ（ｎ＝３）を２５０μｌのタンパク質混合物を用いて２４時間インキュベートし、次いで、Bioplex 200（Biorad,USA）を使用して、ProcartaPlex Simplex Multiplex kits（ThermoFischer,USA）を用いて、上清中のサイトカイン濃度を分析する。対照実験として、ヒドロゲル材料を含まない溶液が使用され、ヒドロゲル材料によって隔離された、即ち取り込まれたタンパク質のパーセントを決定するために、インキュベーション後、検出されたタンパク質の量が、ヒドロゲル材料を含む溶液中のタンパク質の量と比較される。隔離検討の結果を、表６－１～６－３に示す。

【0071】

表６－１～６－３は、生物活性物質の隔離を示している：上の４行：（１）それぞれのヒドロゲル材料と接触させた溶液２００μｌ中の使用された生物活性物質（ここではタンパク質）のモル量、（２）Protein Data Bank（ＰＤＢ）からのファイル、（３）生物活性物質の名称、（４）カテゴリーＡ～Ｄ、（５）生物活性物質のパラメーターＰＰ、（６～２５）ヒドロゲル材料による生物活性物質の得られた隔離、下の１８行：アニオン性ヒドロゲル材料の名称（ヒドロゲル材料タイプ２８～５２）及びパラメーターＰ０、Ｐ１、Ｐ２、及びＰ３を使用したアニオン性ヒドロゲル材料の記載、並びに物質摂取値（％単位、平均±標準偏差、ｎ＝６）。

【0072】

表６－１～６－３の結果を使用して、そのＰＰ値に応じて物質を４つのカテゴリーＡ、Ｂ、Ｃ、及びＤに分類し、この場合、カテゴリーＡに割り当てられる物質は、ＰＰ値が９４０を超え、カテゴリーＢに割り当てられる物質は、ＰＰ値が９４０から１２８の範囲内にあり、カテゴリーＣに割り当てられる物質は、ＰＰ値が１２８から－１２８の範囲内にあり、カテゴリーＤに割り当てられる物質は、ＰＰ値が－１２８未満である。

【0073】

続いて、統計解析ソフトウェアＪＭＰ（SAS Institute）によって、物質摂取のそれぞれのパーセント（ｙ値として）と、ヒドロゲルのパラメーターＰ０又はＰ１及びＰ２及びＰ３と物質のＰＰの値の間の線形回帰分析を最小二乗法によって実行する。

【0074】

線形回帰分析の目的は、次の式１に示されるように、物質摂取におけるＰ０又はＰ１及びＰ２及びＰ３の影響を数学関数で記述することである：

【数3】

ｙ＝物質摂取、
α＝軸切片、
Ｃ＝係数。

【0075】

実験的隔離試験の結果（例えば、全ての物質、又は１つのカテゴリーＡ又はＢ又はＣ又はＤの物質のみ）は、それぞれの物質摂取値（％）と、Ｐ０又はＰ１、Ｐ２、Ｐ３、及びＰＰの対応するパラメーター値（表６－１～６－３を参照）からなる値の対として回帰分析に導入され、式１で上記に示されるように数学的相関（関数）が形成される。軸切片の数値（定数として）とパラメーター項の係数は、関数式に基づいて確認された物質摂取値と、値の対でインポートされた実験結果を繰り返し比較することによって確認される（表６－１から６－３）。予測値と測定値の差は、残差と称される。最小二乗法の使用は、繰り返し法において、関数式に基づいて確認された物質摂取値と実験的に決定された物質摂取値とを比較し、実験的物質摂取値と関数によって計算された物質摂取値との差を二乗し、これらの二乗差の和を最小化することにおいて、軸切片及び係数の値を決定する。

【0076】

図２Ａは、最小二乗法がJMPソフトウェアでどのように表示及び評価されるかを示している。測定された値（ｙ軸）は、関数によって予測された値（ｘ軸）に対してプロットされる。各点は、モデルが基づく詳細な実験の１つを表しており、理想的には全ての点が、赤い線（ｙ＝ｘ）上にある必要がある。各点が赤い線から離れるほど、この特定の実験点の残存量が高くなる。Ｒｓｑ（Ｒ^２）は、モデルの品質を評価するために使用される。モデルが正確であればあるほど、残差は低くなり、決定係数は高くなる、Ｒｓｑ値（０～１）。

【0077】

合計１０回の回帰分析が実行され、表７に示されている選択されたパラメーター及び物質に従って、それに示されている決定係数Ｒ^２が得られる。

【0078】

関数の重み付けには、対応するパラメーターＰ０又はＰ１並びにＰ２及びＰ３、及びＰＰがある。各関数について、個々のパラメーターの線形寄与及び又パラメーター間の二次効果が考慮される。示されている式では、有意な寄与のみが考慮される（ｐ＜０．０１）。

【0079】

式２は、例として、カテゴリーＡの物質摂取に対するＰ０、Ｐ２、及びＰ３の顕著な寄与を示している。これにより確認された関数は、物質摂取とパラメーターの間の相関関係を説明しており、従って規定のパラメーター値Ｐ０又はＰ１、Ｐ２、Ｐ３、及びＰＰに応じた新しい物質摂取値の予測にも利用できる。特定の生物活性物質、及びそれに対応して離散値ＰＰを考慮すると、任意の物質隔離値又は物質摂取値について、特定のアニオン性荷電ヒドロゲル材料の構成における異なるパラメーターの組み合わせＰ０又はＰ１及びＰ２及びＰ３を導出することも可能である。従って、全体として、あらゆる隔離特性を予測し、材料の特性の新しい組み合わせを開発及び予測することが可能である。

【0080】

式２：カテゴリーＡの物質のＰ０、Ｐ２、及びＰ３：

【数4】

【0081】

これらの予測は、JMP（登録商標）ソフトウェアを使用して以下の通り可能である：式（ここでは式２の例で示される）について、Ｘ軸上の変数として１つのパラメーターのみを考慮し、他のパラメーターにおいて一定値が固定された４つの場合が示される（図２Ｂ参照）。従って、１つのパラメーターに応じて、他の３つのパラメーターの所定の値を使用して、最小から最大までの全ての物質摂取値を確認することが可能である。例えば、値Ｐ０については、左側の図２Ｂを参照されたい。

【0082】

加えて、２つの変数パラメーターの相互の依存性を考慮することもできる。これは、図２Ｃに示されるように、それに対応して２つのパラメーターに応じた物質摂取値の２次元図である。一定の物質摂取値の線（等値線と称される）が得られ、領域には２つの一定のパラメーターが含まれる。３つのパラメーターの場合、２つの可変パラメーターの積み重ねられた領域から形成される立方体（いずれの場合も、立方体の軸に沿った１つの可変パラメーターと１つの定数パラメーター）が結果である。離散ＰＰを有する物質の場合、結果は、それに対応して可変パラメーターＰ０又はＰ１並びにＰ２及びＰ３を有する立方体である。

【0083】

式１：カテゴリーＡの物質のＰ０、Ｐ２、及びＰ３：

【数5】

【0084】

式２：カテゴリーＢの物質のＰ０、Ｐ２及びＰ３：

【数6】

【0085】

式３：カテゴリーＣの物質のＰ０、Ｐ２及びＰ３：

【数7】

【0086】

式４：カテゴリーＤの物質のＰ０、Ｐ２及びＰ３：

【数8】

【0087】

式５：カテゴリーＡ～Ｄの物質のＰ０、Ｐ２及びＰ３：

【数9】

【0088】

式６：カテゴリーＡの物質のＰ１、Ｐ２及びＰ３：

【数10】

【0089】

式７：カテゴリーＢの物質のＰ１、Ｐ２及びＰ３：

【数11】

【0090】

式８：カテゴリーＣの物質のＰ１、Ｐ２及びＰ３：

【数12】

【0091】

式９：カテゴリーＤの物質のＰ１、Ｐ２及びＰ３：

【数13】

【0092】

式１０：カテゴリーＡ～Ｄの物質のＰ１、Ｐ２及びＰ３：

【数14】

【0093】

ヒドロゲルからの成長因子ＶＥＧＦ１６５の放出
ヒドロゲル材料は、表５－１～５－５に規定されている混合物に従って生成される。１０μｌの前駆体溶液を混合し、同時にチューブ内でタンパク質結合が低い１００ｎｇの組換えヒトＶＥＧＦ１６５（３８．２ｋＤａ、Peprotech、Germany）と架橋させた。ヒドロゲル材料を室温で、０．１％ＢＳＡ及び０．０５％ＰｒｏＣｌｉｎ３００とともに無血清のダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、Gibco Life Technologies、US）３００μｌ中に置き、３、６、２４、９６、１６８及び２４０時間後、培地を除去、収集し、－８０℃で保存し、新しい培地と交換する。放出されたタンパク質ＶＥＧＦの量は、製造業者のプロトコールに従って、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ、DuoSet kit,R&D Systems,USA）によって除去時間ごとに定量される。

【0094】

それぞれのヒドロゲル材料からの成長因子ＶＥＧＦ１６５の長期放出に対するアニオン性荷電ヒドロゲル材料のパラメーターＰ０、Ｐ１、Ｐ２、及びＰ３の影響を、２４０時間（１０日間）の期間にわたって分析した（表７を参照）。

【0095】

結合実験で使用されたヒドロゲル材料と同様に、ＶＥＧＦ１６５は、同様の機械的特性（２～４ｋＰａの範囲内の貯蔵弾性率）を有するヒドロゲル材料から放出されたため、メッシュサイズは、自由なタンパク質輸送を可能にするのに十分な大きさであった。選択されたヒドロゲル材料の特性は、３５～６３マイクロモル／ｍｌの範囲内のパラメーターＰ０で表される、比較的高い濃度のアニオン性荷電基（ユニットではない）と、非常に可変性の積分硫酸濃度（Ｐ１）、局所硫酸（スルホネート）密度（Ｐ２）、及びアニオン性ユニットの両親媒性（Ｐ３）を有するように設計された。全てのヒドロゲル材料は、最初の２４時間以内にＶＥＧＦ１６５の初期の急速な放出を示し、その後２４０時間にわたって実質的に一定で段階的な直線的な放出プロファイルが続いた。ＰＥＧ／ＰＥＧヒドロゲル材料は、アニオン性荷電ユニットがないため、１０日間の検討の終わりに５５％の放出という最も高いＶＥＧＦ１６５放出を示した。

【0096】

表８－１～８－２は、タイプ５３～６２のヒドロゲル材料からの生物活性物質としてのＶＥＧＦ１６５の累積放出を示している（平均±標準偏差、ｎ＝６）、上段：ヒドロゲル材料のタイプ、行２～５：パラメーターＰ０、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、行７～１２：３、２４、４８、９６、１６８、及び２４０時間での物質放出値（％）。

【0097】

アニオン性ヒドロゲル材料の最も高いＶＥＧＦ１６５放出は、ＧＢ２－ＵＧＢ３タイプ５４で３２．８％のタンパク質放出で達成され、続いてＧＢ４－ＵＧＢ３タイプ５６ Ｅ５０で２４０時間後に２６．９％の放出が達成された（表７を参照）。この結果は、結合とは逆に、低いパラメーターＰ２（特定の電荷相互作用に重要な局所電荷密度）と低いパラメーターＰ３（従って親水性アニオン性ユニット）がＶＥＧＦ１６５の放出を促進することを示している。

【0098】

物質ＩＬ－８の段階的隔離に応じた免疫細胞の移動
前駆体溶液の１：１混合物（表５－１～５－５、ＧＢ２－ＵＧＢ３ ６３～ＵＧＢ１－ＵＧＢ３ ６６を参照）を２４ウェルプレートの底面にピペットで移し、テフロンフィルムで平らにしてウェルの底を覆う薄いゲル層を生成する。ヒドロゲル層をクリーンベンチ下で２０分間ＵＶ照射して滅菌し、滅菌した１％ＢＳＡで１時間インキュベートし、次いでＰＢＳで洗浄する。次いで、ヒドロゲルを８５０μｌのＩＬ－８溶液（０．１％ＢＳＡを含むＲＰＭＩ １６４０培地（Gibco,Life Technologies,USA）中０、１０又は１００ｎｇ／ｍｌＩＬ－８）中で２４時間インキュベートする。健康なヒト被験者から新鮮な全血を採取し、血液をヒルジン（Ｒｅｆｌｕｄａｎ １μＭ（Celgene Munich、Germany）で抗凝固処理する。次いで、２００μｌの血液を、基部においてヒドロゲル層及びＩＬ－８溶液を含む懸濁されたトランズウェルインサート（８μｍ、ＰＥＴ、Merck Millipore）に導入し、３７℃で２時間インキュベートする。移動した細胞をウェルから取り出し、ＲＰＭＩで洗浄する。フローサイトメトリーでは、細胞を、室温、暗所でＰＥ標識された抗ヒトＣＤ１５抗体（BioLegend、ＵＳＡ）で３０分間染色する。各ヒドロゲル条件について、ＣＤ１５＋移動顆粒球の量を、ＲＰＭＩにてインキュベートされたＰＥＧヒドロゲルに対して標準化する（－ｖｅコントロール）。

【0099】

多層プロセスによって生じる過剰な炎症の治療戦略は、ケモカインなどのエフェクター分子を破壊することである。炎症中に、ケモカインは、病原体及び損傷を認識して制御するために、免疫細胞を選択的に補充して活性化する。しかしながら、ケモカインの過剰発現は、免疫細胞の制御不能な流入につながる可能性があり、これにより更に多くのケモカインを含む更なる炎症メディエーターの生成が促進され、最終的には長期にわたる又は慢性的な炎症につながる。インターロイキン８（ＩＬ－８）は、感染部位での免疫細胞の補充を担い、免疫細胞の経内皮移動に関与し、多くの炎症疾患に関与し（Gerard et al.,2001,doi:10.1038/84209）、慢性的な傷に関与している（Kroeze et al.,2012 doi:10.1111/j.1524-475X.2012.00789.x）。

【0100】

アニオン性荷電ヒドロゲル材料によるパラメーター依存性のケモカインの隔離の生物学的に適切な使用を評価するために、ＩＬ－８の化学誘引機能を、生体液としてヒト全血を使用する現実的な遊出アッセイで検査し、この場合、顆粒球と称される特定の免疫細胞は、炎症時に走化性によりＩＬ－８の活性化に反応することが知られている（ＲＥＦ）。ＵＧＢ２及びＧＢ２又はＧＢ７（タイプ６３及び６４）の薄いヒドロゲルフィルムにてプレインキュベートされた培地にＩＬ－８を添加すると、ＩＬ－８の隔離に対するこれらのヒドロゲルの有効性が示され、これは、顆粒球の遊出が最小限に抑えられることで実証された（表８－１～８－２を参照）。生物学的に適切な２つの濃度のＩＬ－８（１０及び１００ｎｇ／ｍｌ）で、これらのヒドロゲルは、ＵＧＢ１／ＵＧＢ３ポジティブコントロールのヒドロゲル（タイプ６６）と比較して、顆粒球移動活性の有意な阻害を示した（有意値ｐ＜０．０００１）、表８－１～８－２を参照されたい。実際、これら２つのヒドロゲル材料の場合、移動する顆粒球の数は、ＩＬ－８に曝露されていないＵＧＢ１／ＵＧＢ２ヒドロゲル（ネガティブコントロール）の場合と同じくらい少なく、これは、高いＩＬ－８濃度範囲にわたって、ヒドロゲル内でＩＬ－８を消去及び保持する比類のない能力を示唆している。

【0101】

対照的に、ＧＢ９ヒドロゲル材料は、１０ｎｇ／ｍｌで顆粒球の移動をわずかに減少させるだけであり（ただし有意ではない）、１００ｎｇ／ｍｌでは移動の阻害は示されなかった。更に、アニオン性荷電ユニットに基づく他のヒドロゲル材料はいずれも、顆粒球の移動特性に有意な影響を示さなかった。立体的に接触可能なヒドロゲルネットワーク内のケモカイン消去成分ＧＢ７及びＧＢ２は、優れたＩＬ－８結合と顆粒球抑制作用を示したが、その理由は、ネットワーク内のアニオン性荷電密度（全体的にはＰ１、局所的にはＰ２）が高いからというだけではなく、また、静電的な相互作用だけでなく、疎水的な相互作用によってタンパク質の相互作用を安定させることができるからであり、ＩＬ－８とその受容体（ＩＬ－８ｒ１）との相互作用と同様である（Clubb et al.,1994 doi:10.1016/0014-5793(94)80123-1）。これらの結果は、回帰分析からの予測値と一致している。

【0102】

表８－１～８－２は、ＩＬ－８を含まないＵＧＢ１／ＵＧＢ３ネガティブコントロールヒドロゲル材料に移動した細胞数に対する、ヒト全血からの免疫細胞の移動、及び様々なアニオン性荷電ユニットとインキュベートされたＩＬ－８溶液に対する血液顆粒球の反応を示している（平均±標準偏差、ｎ＝５）。

【0103】

細胞培養：ＨＵＶＥＣ形態形成
ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）は、以前に記載されているように（Weis et al.、1991 doi:10.1016/0049-3848(91)90245-r）、単離され、５％ＣＯ２、３７℃で湿らせたインキュベーター内で、フィブロネクチンで被覆された７５ｃｍ^２培養フラスコにて、サプリメントミックス（supplement mix）（Promocell、Germany）と１％ペンストレプトマイシン溶液（pen-strep）（Sigma-Aldrich、Germany）を含む内皮細胞増殖培地（ＥＣＧＭ、Promocell、Germany）において培養される。８０％のコンフルエントに達した後、細胞を０．５％トリプシン－ＥＤＴＡ溶液（Sigma-Aldrich,Germany）で剥離し、回収し、１０００ｒｐｍで遠心分離し、更に使用するまで適切な密度で再度播種する。全ての実験のために、通路２－６からの細胞が使用される。ＨＵＶＥＣ細胞培養実験は、Limasale et al.2020(Limasale,et al.,2020doi:10.1002/adfm.202000068)に従って実行される。実験的評価のために、ＨＵＶＥＣは、ヒドロゲルに埋め込まれる前に、製造業者のプロトコールに従って、細胞質トレーサーカルボキシフルオレセインジアセテート、スクシンイミジルエステル（ＣＦＤＡ－ＳＥ）（Vybrant（登録商標）CFDASE Cell Tracer Kit、Thermo Fischer Scientific、USA）で染色される。

【0104】

架橋剤分子ＵＧＢ３及びマレイミド化荷電ユニットＧＢ１～ＧＢ９を、ＨＵＶＥＣ培地（表５－１～５－５、ＧＢ７－ＵＧＢ３ ６７～ＵＧＢ１－ＵＧＢ３ ６９）に溶解し、次いで接着ペプチドＣＷＧＧＲＧＤＳＰ（ｃＲＧＤ、９９０ｇ／モル）を２：１のモル比で荷電ユニットに添加した。その後、ポリマー－ＲＧＤ混合物を最終濃度２０μｇ／ｍｌにてＶＥＧＦ１６５（PeproTech、USA）で官能化し、同量のＨＵＶＥＣ懸濁液を添加した。この溶液とＵＧＢ３を体積比１：１で、２０μｌのヒドロゲル材料滴を８ウェルチャンバー（Ibidi、Germany）としての疎水性μスライドにピペットで移す。その場での（in situ）架橋後、ゲルを直ちに細胞培養培地に置き、３日目に共焦点DragonFly Spinning Disc顕微鏡（Andor、Oxford Instruments、United Kingdom）を用いて検査する。３Ｄにおける管状構造の形成の度合いを定量化するために、フィラメントトレーサーモジュールを使用してImarisソフトウェア（バージョン９．２．１、Bitplane AG、Switzerland）を用いて厚さ１００μｍのｚ層を分析した。閾値アルゴリズムを使用して、ＣＦＤＡ－ＳＥ細胞染色から管状構造の３Ｄ画像を作成する。これらの画像は、血管の総面積を計算するために使用される。

【0105】

ＨＵＶＥＣ細胞培養実験の結果を表９に示す。アニオン性荷電ユニットを有さないヒドロゲル材料（ＵＧＢ１～ＵＧＢ３ ６９）は、最小限のセル拡張を示した。管状構造の総面積は、ＧＢ７（ＧＢ７－ＵＧＢ３ ６７）及びＧＢ９（ＧＢ９－ＵＧＢ３ ６８）を有するヒドロゲルの場合の方が大きかった。正しいヒドロゲル材料パラメーターの選択の相乗効果により、ＨＵＶＥＣの形態形成及び管の形成を刺激するためにＶＥＧＦ１６５の制御された放出が可能になった。

【0106】

表１０は、ＨＵＶＥＣの細胞培養を示す、行１：ヒドロゲルのタイプ、行２～４：パラメーターＰ０～Ｐ３、行６：所望の細胞形態としての管状構造の表面（平均±標準偏差、ｎ＝５）。

【0107】

細胞培養：ＨＫ－２細管形成
ＨＫ－２（ヒト腎臓細胞－２）を用いた細胞培養実験は、Weber et al.,2017 doi:10.1016/j.actbio.2017.05.035に基づいて実行される。ＨＫ－２細胞（American Type Culture Collection、ATCC、#CRL-2190）は、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Biochrom、Germany）及び１％ペンストレプトマイシン溶液（Sigma-Aldrich、Germany）を含むＤＭＥＭ／Ｆ－１２培地（Gibco、Life Technology、USA）において培養される。２Ｄ及び３Ｄ培養の培地は２日おきに交換する。継代１１～２０の細胞を使用し、３Ｄ培養物を３週間培養する。

【0108】

ヒドロゲル成分を、１％ペンストレプトマイシン溶液を含むＰＢＳに溶解し、ＨＫ－２細胞（総体積の４分の１に懸濁）と総体積の４分の１に溶解したマレイミド化ポリマーを混合する（ＧＢ３－ＵＧＢ３ ７０からＵＧＢ１－ＵＧＢ３ ７６）。細胞濃度は、２．５×１０６細胞／ｍｌであり、５００００細胞／２０μｌのゲルに対応する。架橋剤分子ＵＧＢ３を総量の半分に溶解し、２つの前駆体溶液に混合し、２０μｌのヒドロゲル液滴を、SigmaCote（登録商標）を備えた６ｍｍガラスプレートにピペットで移す。

【0109】

免疫組織化学では、試料をまず４％パラホルムアルデヒドで２０分間固定し、ＰＢＳで２回洗浄し、次いで免疫染色する。試料を、０．５％Triton X-100を含むＰＢＳ中で０．１％ＢＳＡで１時間ブロックし、一次抗体（マウス抗β－カテニン、１：１００、BD Transduction Laboratories、USA）を用いて４℃で一晩インキュベートする。ＰＢＳ／０．１％Triton X-100／０．１％ＢＳＡで３回洗浄した後、二次抗体（Alexa Fluor 488ヤギ抗マウス（goat anti-mouse）、１：２００、Invitrogen、USA）を添加し、室温で１時間インキュベートする。アクチン及びロータステトラゴノボラスレクチン（ＬＴＬ）染色の場合、二次抗体とのインキュベーション中に、Atto 550ファロイジン（１：５０、Sigma-Aldrich、Germany）又はフルオレセイン標識ＬＴＬ（１：５００、Vector Laboratories、USA）が添加される。続いて、試料を洗浄し、色素ＤＲＡＱ５（Thermo Fisher Scientific、USA）を用いて２０～３０分間インキュベートする。蛍光画像は、共焦点DragonFly Spinning Disc顕微鏡で記録される。

【0110】

形成されたチューブ構造の数と長さを定量化するために、細胞を固定した後、各ヒドロゲルの単相４×ＥＤＦコントラスト画像が撮影される。記録された画像における全ての細胞集合体は、Image Jソフトウェアでカウントされる。コロニーは、丸い回転楕円体、尖った回転楕円体、又は管状構造体に分類される。長さと直径の比が５より大きい場合、それらは管状と称される。コロニーに複数の突起／管状突出物がある場合、各コロニーについて最長のものを評価し、残りは無視する。直径は細管に沿って異なるため、２～３つの領域を測定して平均する。形成された管状構造の数は、細管を形成するコロニーのパーセントとして決定される。全ての細管コロニーの絶対的な細管長は、Image Jソフトウェアで評価される。

【0111】

三次元生体外組織モデルにおけるアニオン性イオン化ユニットに基づくヒドロゲルの可能な応用を実証するために、ＨＫ－２細胞をヒト腎細管形成モデルとして３Ｄで培養した。ＨＫ－２細胞は、有利なマトリックス条件下で極性管を形成できるヒト腎近位細管細胞株である。我々はすでに、近位腎細管形成を刺激し、生体内でヒト細管と同等の方法で同じ形態及び構造を有する管状構造を形成する、堅牢で調整可能なマトリックスとしてのｓｔａｒＰＥＧ－ｈｅｐヒドロゲルについて報告している（Weber et al.,2017 doi:10.1016/j.actbio.2017.05.035）。

【0112】

腎細管形成のためのアニオン性荷電ユニットに基づいてヒドロゲル材料の特性を検査し最適化するために、３つのポリマーＧＢ７、ＧＢ３、及びＧＢ４が選択された。ヒドロゲル材料のマレイミド化ユニット内のポリマーの異なる濃度（２％、２０％、及び１００％）の影響も同様に試験した。マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）と称される細胞分泌酵素によるマトリックスの細胞応答性再構築を可能にするために、様々なアニオン性荷電ユニットがＵＧＢ３で架橋された。分解性ヒドロゲル材料は、同様の剛性５００Ｐａを有するように調整された。すでに報告されているように（Weber et al.,2017 doi:10.1016/j.actbio.2017.05.035）、使用したポジティブコントロールは、ＧＢ９－ＵＧＢ３ヒドロゲルであり、一方、ＵＧＢ３ヒドロゲルを有する非硫酸化ＵＧＢ１を、ネガティブコントロールとして使用した。コロニーを数え、細管形成の段階（丸い回転楕円体、付属物を備えた回転楕円体（「尖った回転楕円体」）又は管状構造）に従って分類することにより、細管形成の度合い及び平均管長に関して評価した。コロニーは、長さと直径の比が５：１以上である場合、管状構造として分類された。

【0113】

ＧＢ９ヒドロゲル材料は、平均１３±７％の細管コロニーを示したが、ＵＧＢ１～ＵＧＢ３ヒドロゲルは、予想どおり細管形成を促進せず、細管コロニーは観察されなかった。ＧＢ９ヒドロゲルと同様の方法で、ＧＢ７（マレイミド化荷電ユニット２％を含む、ＧＢ７－ＵＧＢ１－ＵＧＢ３ ７４）及びＧＢ３（１００％を含む、ＧＢ３－ＵＧＢ３ ７０）は、それぞれ、１９±８％及び１４±１１％で管状コロニーを示した。興味深いことに、ヒドロゲル材料中のＧＢ７濃度が２％よりも高いと、ＨＫ－２細胞のアポトーシスが引き起こされ、これは、ＧＢ７が、高濃度で、タンパク質を消去し従って重要な栄養素の細胞を奪う培地中の必須タンパク質に対して高い親和性を有することを示している。ＧＢ３の高度にスルホン化された類似体はＧＢ４であり、そのヒドロゲル材料は、濃度１００％（ＧＢ４－ＵＧＢ３ ７２）及び２０％（ＧＢ４－ＵＧＢ１－ＵＧＢ３７３）の両方で尿細管形成が低いだけであり（それぞれ、４±７％及び２±３％）、これは、腎細管形成を制御するためにマトリックスの電荷を一致させることがいかに重要であるかを示している。更に、一部の疾患では、生体内での近位細管の形態に類似した構造があり、ＨＫ－２細胞は、側底膜に沿ってβ－カテニンを発現する内腔を有する球状体を形成した。最も有望なマトリックス条件、ＧＢ９（ＧＢ９－ＵＧＢ３ ７５）、ＧＢ７ ２％（ＧＢ７－ＵＧＢ１－ＵＧＢ３ ７４）、及びＧＢ３ １００％（ＧＢ３－ＵＧＢ３ ７０）ヒドロゲル材料では、平均管長は、それぞれ１４０μｍ、１７６μｍ及び１７３μｍで同等であった。アニオン性でイオン化可能なヒドロゲル材料の管状構造は、頂端マーカーとして近位細管に特異的なロータステトラゴノロバスレクチン（ＬＴＬ）と側底マーカーとしてβ－カテニンの両方に結合したため、ヒドロゲル中の管状構造体が、報告された３次元培養においても分化した表現型とその極性を維持したことが確認された。要約すると、アニオン性荷電ヒドロゲルは、ヘパリンに基づく十分に確立されたヒドロゲルモデルに匹敵する腎細管形成にとって有利なマトリックスを提供し、同様の形態及び構造を有する分極した細管構造を作成したと言うことができる。

【0114】

表１１は、ＨＫ－２細胞の細胞培養から得られた結果を示している、行１：ヒドロゲル材料のタイプ、行２～４：パラメーターＰ０～Ｐ３、行６：丸い回転楕円体（％）、行７：尖った回転楕円体（％）、行８：管状構造（％）（平均±標準偏差、ｎ＝５）。

【0115】

統計分析
全ての統計は、GraphPad Prism 5（GraphPad Software Inc.）を使用して実行された。全ての値は、少なくとも３つの独立した試料の平均±標準偏差として報告される。記載されている場合、統計分析は、一要因分散分析（ＡＮＯＶＡ）を使用して実行され、その後、信頼区間９５％のTukey事後検定（Tukey post-hoc test）が行われた。

【図1】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【国際調査報告】