特表 2023-551251 脳卒中を治療するための金クラスター、組成物、および方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-12-07

(54)【発明の名称】脳卒中を治療するための金クラスター、組成物、および方法

(51)【国際特許分類】

   A61K 33/242 20190101AFI20231130BHJP

   A61P 9/10 20060101ALI20231130BHJP

   A61K 47/20 20060101ALI20231130BHJP

   A61K 47/42 20170101ALI20231130BHJP

   A61K 47/54 20170101ALI20231130BHJP

   A61K 47/22 20060101ALI20231130BHJP

【ＦＩ】

A61K33/242

A61P9/10

A61K47/20

A61K47/42

A61K47/54

A61K47/22

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023531705

(86)(22)【出願日】2021-08-16

(85)【翻訳文提出日】2023-07-24

(86)【国際出願番号】 CN2021112729

(87)【国際公開番号】W WO2022110911

(87)【国際公開日】2022-06-02

(31)【優先権主張番号】PCT/CN2020/132280

(32)【優先日】2020-11-27

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】519000526

【氏名又は名称】深▲セン▼深見医薬科技有限公司

【氏名又は名称原語表記】ＳＨＥＮＺＨＥＮ ＰＲＯＦＯＵＮＤ ＶＩＥＷ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ＣＯ．， ＬＴＤ．

【住所又は居所原語表記】Ｒｏｏｍ ３３１１， Ｂｕｉｌｄｉｎｇ ９Ａ，Ｄｉｓｔｒｉｃｔ ＩＩ，Ｓｈｅｎｚｈｅｎ Ｂａｙ Ｅｃｏ－Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｐａｒｋ， Ｎｏ． ３６０９， Ｂａｉｓｈｉ Ｒｏａｄ， Ｈｉｇｈ－ｔｅｃｈ Ｚｏｎｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ， Ｙｕｅｈａｉ Ｓｔｒｅｅｔ， Ｎａｎｓｈａｎ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ， Ｓｈｅｎｚｈｅｎ， Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ ５１８０００ （ＣＮ）

(74)【代理人】

【識別番号】110001139

【氏名又は名称】ＳＫ弁理士法人

(74)【代理人】

【識別番号】100130328

【弁理士】

【氏名又は名称】奥野 彰彦

(74)【代理人】

【識別番号】100130672

【弁理士】

【氏名又は名称】伊藤 寛之

(72)【発明者】

【氏名】スゥン、タオレイ

【テーマコード（参考）】

4C076

4C086

【Ｆターム（参考）】

4C076CC01

4C076DD55

4C076DD60

4C076EE41

4C076FF68

4C086AA01

4C086AA02

4C086HA01

4C086MA02

4C086MA05

4C086NA10

4C086NA14

4C086ZA36

(57)【要約】

【要約】
本発明は、リガンド結合金クラスターおよび前記リガンド結合金クラスターを含む組成物の脳卒中の治療および脳卒中を治療するための医薬の製造における使用、及び脳卒中の治療方法を提供する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

対象の脳卒中を治療するためのリガンド結合金クラスターであって、前記リガンド結合金クラスターが、
金コアと、
前記金コアに結合したリガンドとを含み、
前記脳卒中が、出血性脳卒中、虚血性脳卒中、および一過性虚血発作（ＴＩＡ）からなる群より選ばれる、リガンド結合金クラスター。

【請求項2】

請求項１記載の脳卒中を治療するためのリガンド結合金クラスターであって、前記金コアの直径が、０．５～３ｎｍである、リガンド結合金クラスター。

【請求項3】

請求項１記載の脳卒中を治療するためのリガンド結合金クラスターであって、前記金コアの直径が、０．５～２．６ｎｍである、リガンド結合金クラスター。

【請求項4】

請求項１記載の脳卒中を治療するためのリガンド結合金クラスターであって、前記リガンドが、Ｌ－システインとその誘導体、Ｄ－システインとその誘導体、システイン含有オリゴペプチドとそれらの誘導体、およびその他のチオール含有化合物からなる群より選ばれる一つである、リガンド結合金クラスター。

【請求項5】

請求項４記載の前記脳卒中を治療するためのリガンド結合金クラスターであって、前記Ｌ－システインとその誘導体が、Ｌ－システイン、Ｎ－イソブチリル－Ｌ－システイン（Ｌ－ＮＩＢＣ）、およびＮ－アセチル－Ｌ－システイン（Ｌ－ＮＡＣ）からなる群より選ばれ、前記Ｄ－システインとその誘導体が、Ｄ－システイン、Ｎ－イソブチリル－Ｄ－システイン（Ｄ－ＮＩＢＣ）、およびＮ－アセチル－Ｄ－システイン（Ｄ－ＮＡＣ）からなる群より選ばれる、リガンド結合金クラスター。

【請求項6】

請求項４記載の前記脳卒中を治療するためのリガンド結合金クラスターであって、前記システイン含有オリゴペプチドとそれらの誘導体が、システイン含有ジペプチドであり、前記システイン含有ジペプチドが、Ｌ（Ｄ）－システイン－Ｌ（Ｄ）－アルギニンジペプチド（ＣＲ）、Ｌ（Ｄ）－アルギニン－Ｌ（Ｄ）－システインジペプチド（ＲＣ）、Ｌ（Ｄ）－ヒスチジン－Ｌ（Ｄ）－システインジペプチド（ＨＣ）、およびＬ（Ｄ）－システイン－Ｌ（Ｄ）－ヒスチジンジペプチド（ＣＨ）からなる群より選ばれる、リガンド結合金クラスター。

【請求項7】

請求項４記載の前記脳卒中を治療するためのリガンド結合金クラスターであって、前記システイン含有オリゴペプチドとそれらの誘導体が、システイン含有トリペプチドであり、前記システイン含有トリペプチドが、グリシン－Ｌ（Ｄ）－システイン－Ｌ（Ｄ）－アルギニントリペプチド（ＧＣＲ）、Ｌ（Ｄ）－プロリン－Ｌ（Ｄ）－システイン－Ｌ（Ｄ）－アルギニントリペプチド（ＰＣＲ）、Ｌ（Ｄ）－リシン－Ｌ（Ｄ）－システイン－Ｌ（Ｄ）－プロリントリペプチド（ＫＣＰ）、およびＬ（Ｄ）－グルタチオン（ＧＳＨ）からなる群より選ばれる、リガンド結合金クラスター。

【請求項8】

請求項４記載の前記脳卒中を治療するためのリガンド結合金クラスターであって、前記システイン含有オリゴペプチドとそれらの誘導体が、システイン含有テトラペプチドであり、前記システイン含有テトラペプチドが、グリシン－Ｌ（Ｄ）－セリン－Ｌ（Ｄ）－システイン－Ｌ（Ｄ）－アルギニンテトラペプチド（ＧＳＣＲ）、およびグリシン－Ｌ（Ｄ）－システイン－Ｌ（Ｄ）－セリン－Ｌ（Ｄ）－アルギニンテトラペプチド（ＧＣＳＲ）からなる群より選ばれる、リガンド結合金クラスター。

【請求項9】

請求項４記載の前記脳卒中を治療するためのリガンド結合金クラスターであって、前記システイン含有オリゴペプチドとそれらの誘導体が、システイン含有ペンタペプチドであり、前記システイン含有ペンタペプチドが、システイン－アスパラギン酸－グルタミン酸－バリン－アスパラギン酸（ＣＤＥＶＤ）およびアスパラギン酸－グルタミン酸－バリン－アスパラギン酸－システイン（ＤＥＶＤＣ）からなる群より選ばれる、リガンド結合金クラスター。

【請求項10】

請求項４記載の前記脳卒中を治療するためのリガンド結合金クラスターであって、前記その他のチオール含有化合物が、１－［（２Ｓ）－２－メチル－３－チオール－１－オキソプロピル］－Ｌ（Ｄ）－プロリン、チオグリコール酸、メルカプトエタノール、チオフェノール、Ｄ－ペニシラミン、Ｎ－（２－メルカプトプロピオニル）－グリシン、ドデシルメルカプタン、２－アミノエタンチオール（ＣＳＨ）、３－メルカプトプロピオン酸（ＭＰＡ）、および４－メルカプト安息香酸（ｐ－ＭＢＡ）からなる群より選ばれる、リガンド結合金クラスター。

【請求項11】

対象の脳卒中を治療するための医薬の製造のためのリガンド結合金クラスター（ＡｕＣ）、前記リガンド結合金クラスターが、
金コアと、
前記金コアに結合したリガンドとを含み、
前記脳卒中が、出血性脳卒中、虚血性脳卒中、および一過性虚血発作（ＴＩＡ）からなる群より選ばれる、リガンド結合金クラスター。

【請求項12】

請求項１１記載の医薬の製造のためのリガンド結合金クラスター（ＡｕＣ）であって、前記金コアの直径が、０．５～３ｎｍである、リガンド結合金クラスター。

【請求項13】

請求項１１記載の医薬の製造のためのリガンド結合金クラスター（ＡｕＣ）であって、前記金コアの直径が、０．５～２．６ｎｍである、リガンド結合金クラスター。

【請求項14】

請求項１１記載の医薬の製造のためのリガンド結合金クラスター（ＡｕＣ）であって、前記リガンドが、Ｌ－システインとその誘導体、Ｄ－システインとその誘導体、システイン含有オリゴペプチドとそれらの誘導体、およびその他のチオール含有化合物からなる群より選ばれる一つである、リガンド結合金クラスター。

【請求項15】

請求項１４記載の医薬の製造のためのリガンド結合金クラスター（ＡｕＣ）であって、前記Ｌ－システインとその誘導体が、Ｌ－システイン、Ｎ－イソブチリル－Ｌ－システイン（Ｌ－ＮＩＢＣ）、およびＮ－アセチル－Ｌ－システイン（Ｌ－ＮＡＣ）からなる群より選ばれ、前記Ｄ－システインとその誘導体が、Ｄ－システイン、Ｎ－イソブチリル－Ｄ－システイン（Ｄ－ＮＩＢＣ）、およびＮ－アセチル－Ｄ－システイン（Ｄ－ＮＡＣ）からなる群より選ばれる、リガンド結合金クラスター。

【請求項16】

請求項１４記載の医薬の製造のためのリガンド結合金クラスター（ＡｕＣ）であって、前記システイン含有オリゴペプチドとそれらの誘導体が、システイン含有ジペプチドであり、前記システイン含有ジペプチドが、Ｌ（Ｄ）－システイン－Ｌ（Ｄ）－アルギニンジペプチド（ＣＲ）、Ｌ（Ｄ）－アルギニン－Ｌ（Ｄ）－システインジペプチド（ＲＣ）、Ｌ（Ｄ）－ヒスチジン－Ｌ（Ｄ）－システインジペプチド（ＨＣ）、およびＬ（Ｄ）－システイン－Ｌ（Ｄ）－ヒスチジンジペプチド（ＣＨ）からなる群より選ばれる、リガンド結合金クラスター。

【請求項17】

請求項１４記載の医薬の製造のためのリガンド結合金クラスター（ＡｕＣ）であって、前記システイン含有オリゴペプチドとそれらの誘導体が、システイン含有トリペプチドであり、前記システイン含有トリペプチドが、グリシン－（Ｄ）Ｌ－システイン－Ｌ（Ｄ）－アルギニントリペプチド（ＧＣＲ）、Ｌ（Ｄ）－プロリン－Ｌ（Ｄ）－システイン－Ｌ（Ｄ）－アルギニントリペプチド（ＰＣＲ）、Ｌ（Ｄ）－リシン－Ｌ（Ｄ）－システイン－Ｌ（Ｄ）－プロリントリペプチド（ＫＣＰ）、およびＬ（Ｄ）－グルタチオン（ＧＳＨ）からなる群より選ばれる、リガンド結合金クラスター。

【請求項18】

請求項１４記載の医薬の製造のためのリガンド結合金クラスター（ＡｕＣ）であって、前記システイン含有オリゴペプチドとそれらの誘導体が、システイン含有テトラペプチドであり、前記システイン含有テトラペプチドが、グリシン－Ｌ（Ｄ）－セリン－Ｌ（Ｄ）－システイン－Ｌ（Ｄ）－アルギニンテトラペプチド（ＧＳＣＲ）、およびグリシン－Ｌ（Ｄ）－システイン－Ｌ（Ｄ）－セリン－Ｌ（Ｄ）－アルギニンテトラペプチド（ＧＣＳＲ）からなる群より選ばれる、リガンド結合金クラスター。

【請求項19】

請求項１４記載の医薬の製造のためのリガンド結合金クラスター（ＡｕＣ）であって、前記システイン含有オリゴペプチドとそれらの誘導体が、システイン含有ペンタペプチドであり、前記システイン含有ペンタペプチドが、システイン－アスパラギン酸－グルタミン酸－バリン－アスパラギン酸（ＣＤＥＶＤ）およびアスパラギン酸－グルタミン酸－バリン－アスパラギン酸－システイン（ＤＥＶＤＣ）からなる群より選ばれる、リガンド結合金クラスター。

【請求項20】

請求項１４記載の医薬の製造のためのリガンド結合金クラスター（ＡｕＣ）であって、前記その他のチオール含有化合物が、１－［（２Ｓ）－２－メチル－３－チオール－１－オキソプロピル］－Ｌ（Ｄ）－プロリン、チオグリコール酸、メルカプトエタノール、チオフェノール、Ｄ－ペニシラミン、Ｎ－（２－メルカプトプロピオニル）－グリシン、ドデシルメルカプタン、２－アミノエタンチオール（ＣＳＨ）、３－メルカプトプロピオン酸（ＭＰＡ）、および４－メルカプト安息香酸（ｐ－ＭＢＡ）からなる群より選ばれる、リガンド結合金クラスター。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、脳疾患治療の技術分野に関し、特にリガンド結合金クラスター（ＡｕＣｓ）、前記リガンド結合ＡｕＣｓを含む組成物、前記リガンド結合ＡｕＣｓの脳卒中の治療のための医薬の製造における使用、および前記リガンド結合ＡｕＣｓおよび組成物を利用して脳卒中を治療する方法に関する。

【背景技術】

【0002】

血管が血栓で詰まったり、破れたりすると、脳卒中は発症する。脳卒中には、出血性脳卒中、虚血性脳卒中、一過性脳虚血発作（ＴＩＡ）の三つのタイプがある。

【0003】

出血性脳卒中は、血管が破れて、脳への血流が妨げられることで起こる。一般的な症状としては、突然の脱力感、体のどこかの麻痺、発話障害、嘔吐、歩行困難、昏睡、意識消失、首こり、めまいなどがある。特効薬はまだ存在しない。

【0004】

虚血性脳卒中は、脳虚血（brain ischemia）や脳の虚血（cerebral ischemia）とも呼ばれ、ヒトに最も多く見られる病気の一つであり、死亡や身体障害の主な原因となっている。虚血性脳卒中は、脳卒中全体の８７％程度を占めている。虚血性脳卒中は、脳に血液を供給する動脈に血栓やプラークなどの塊が生じることで発症し、その塊が首や頭蓋骨に現れ、脳への血流や酸素が減少し、脳細胞の損傷や死滅を引き起こす。血液の循環が速やかに回復しない場合、永久的な脳損傷になる可能性がある。

【0005】

虚血性脳卒中の具体的な症状は、影響を受けた脳の部位によって異なる。ほとんどの虚血性脳卒中に共通する症状としては、視力障害、手足の脱力や麻痺、浮動性めまい（dizziness）や回転性めまい（vertigo）、混乱、協調性の喪失、顔面の片側の垂れ下がりなどがある。症状が出現したら、できるだけ早く治療を受けることが重要で、そうすることで、永続的な障害が残る可能性を低くすることができる。

【0006】

虚血性脳卒中の治療法は、非常に限られている。虚血性脳卒中の主な臨床的治療薬は、血栓を分解する組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔＰＡ）であるが、このｔＰＡを脳卒中の発症から４時間半以内に静脈内投与しなければ、効果がない。しかし、ｔＰＡは出血を引き起こすため、出血性脳卒中、脳内出血、最近の大手術や頭部外傷の既往歴のある患者の場合は、ｔＰＡによる治療を受けることができない。長期的な治療法としては、血栓の進展を防ぐためにアスピリンや抗凝固剤を使用することが挙げられる。

【0007】

Ａｍａｎｉらは、２５ｎｍのコロイド状金ナノ粒子の表面にＯＸ２６－ＰＥＧを結合させたＯＸ２６＠ＧＮＰｓが壊死した脳組織を著しく増加させ、裸のＧＮＰとＰＥＧ化したＧＮＰは壊死した体積に影響を及ぼさなかったことから、ＯＸ２６＠ＧＮＰは脳卒中の治療に適さないことを示していることを開示している。

【0008】

Ｚｈｅｎｇらは、ＯＧＤ／Ｒ損傷ラットモデルにおいて、２０ｎｍのＡｕ－ＮＰｓが細胞生存率を高め、神経細胞のアポトーシスと酸化ストレスを緩和し、ミトコンドリア呼吸を改善することを明らかにしている。しかし、Ｚｈｅｎｇらは、５ｎｍのＡｕＮＰｓは逆の効果を示し、脳卒中の治療には適さないことも実証している。

【0009】

ＴＩＡは、一時的な血栓によって引き起こされるものである。一般的な症状としては、体の片側の脱力感やしびれ、麻痺、言葉が不明瞭になること、目が見えなくなること、めまいなどがある。特効薬はまだ存在しない。

【0010】

脳卒中の治療は、脳虚血または脳出血に起因して脳神経細胞が損傷または死亡することによる患者の神経機能不全または死亡を回避または軽減するために、タイムリーに行う必要がある。出血性脳卒中およびＴＩＡを治療するための特異的な治療薬は存在せず、虚血性脳卒中を治療するためのｔＰＡなどの主要な薬物は、出血を引き起こす。よって、患者が出血性脳卒中ではなく虚血性脳卒中であると断定的に診断された場合のみ、虚血性脳卒中の治療のための薬物を使用することが決定される。しかしながら、この断定的診断のプロセスは、虚血性脳卒中をタイムリーに治療するための貴重な時間を費やしている。

【0011】

脳卒中を治療するための効果的な方法および薬物、特に、出血性脳卒中および虚血性脳卒中の両方に治療効果のある薬物が求められている。出血性脳卒中および虚血性脳卒中の原因が根本的に異なるため、文献中のすべての薬物開発は、いずれも出血性脳卒中又は虚血性脳卒中のうちのどちらかを対象としている。よって、出血性脳卒中や虚血性脳卒中を問わず、脳卒中の患者を治療することができる薬物を開発することは、想像を絶する挑戦であり、業界ではタブーとされることができる。

【発明の概要】

【0012】

本発明は、対象の脳卒中を治療するためのリガンド結合金クラスター、リガンド結合金クラスターで対象の脳卒中を治療する方法、および対象の脳卒中を治療するための医薬の製造のためのリガンド結合金クラスターの使用を提供する。

【0013】

特定の実施形態では、リガンド結合金クラスターが、対象の脳卒中を治療するために用いられ、前記リガンド結合金クラスターが、金コアと、前記金コアに結合したリガンドとを含み；前記脳卒中が、出血性脳卒中、虚血性脳卒中、および一過性虚血発作（ＴＩＡ）からなる群より選ばれる。

【0014】

前記脳卒中を治療するためのリガンド結合金クラスターの特定の実施形態では、前記金コアの直径が、０．５～３ｎｍである。

【0015】

前記脳卒中を治療するためのリガンド結合金クラスターの特定の実施形態では、前記金コアの直径が、０．５～２．６ｎｍである。

【0016】

前記脳卒中を治療するためのリガンド結合金クラスターの特定の実施形態では、前記リガンドが、Ｌ－システインとその誘導体、Ｄ－システインとその誘導体、システイン含有オリゴペプチドとそれらの誘導体、およびその他のチオール含有化合物からなる群より選ばれる一つである。

【0017】

前記脳卒中を治療するためのリガンド結合金クラスターの特定の実施形態では、前記Ｌ－システインとその誘導体が、Ｌ－システイン、Ｎ－イソブチリル－Ｌ－システイン（Ｌ－ＮＩＢＣ）、およびＮ－アセチル－Ｌ－システイン（Ｌ－ＮＡＣ）からなる群より選ばれ、そして前記Ｄ－システインとその誘導体が、Ｄ－システイン、Ｎ－イソブチリル－Ｄ－システイン（Ｄ－ＮＩＢＣ）、およびＮ－アセチル－Ｄ－システイン（Ｄ－ＮＡＣ）からなる群より選ばれる。

【0018】

前記脳卒中を治療するためのリガンド結合金クラスターの特定の実施形態では、前記システイン含有オリゴペプチドとそれらの誘導体が、システイン含有ジペプチドであり、前記システイン含有ジペプチドが、Ｌ（Ｄ）－システイン－Ｌ（Ｄ）－アルギニンジペプチド（ＣＲ）、Ｌ（Ｄ）－アルギニン－Ｌ（Ｄ）－システインジペプチド（ＲＣ）、Ｌ（Ｄ）－ヒスチジン－Ｌ（Ｄ）－システインジペプチド（ＨＣ）、およびＬ（Ｄ）－システイン－Ｌ（Ｄ）－ヒスチジンジペプチド（ＣＨ）からなる群より選ばれる。

【0019】

前記脳卒中を治療するためのリガンド結合金クラスターの特定の実施形態では、前記システイン含有オリゴペプチドとそれらの誘導体が、システイン含有トリペプチドであり、前記システイン含有トリペプチドが、グリシン－Ｌ（Ｄ）－システイン－Ｌ（Ｄ）－アルギニントリペプチド（ＧＣＲ）、Ｌ（Ｄ）－プロリン－Ｌ（Ｄ）－システイン－Ｌ（Ｄ）－アルギニントリペプチド（ＰＣＲ）、Ｌ（Ｄ）－リシン－Ｌ（Ｄ）－システイン－Ｌ（Ｄ）－プロリントリペプチド（ＫＣＰ）、およびＬ（Ｄ）－グルタチオン（ＧＳＨ）からなる群より選ばれる。

【0020】

前記脳卒中を治療するためのリガンド結合金クラスターの特定の実施形態では、前記システイン含有オリゴペプチドとそれらの誘導体が、システイン含有テトラペプチドであり、前記システイン含有テトラペプチドが、グリシン－Ｌ（Ｄ）－セリン－Ｌ（Ｄ）－システイン－Ｌ（Ｄ）－アルギニンテトラペプチド（ＧＳＣＲ）、およびグリシン－Ｌ（Ｄ）－システイン－Ｌ（Ｄ）－セリン－Ｌ（Ｄ）－アルギニンテトラペプチド（ＧＣＳＲ）からなる群より選ばれる。

【0021】

前記脳卒中を治療するためのリガンド結合金クラスターの特定の実施形態では、前記システイン含有オリゴペプチドとそれらの誘導体が、システイン含有ペンタペプチドであり、前記システイン含有ペンタペプチドが、システイン－アスパラギン酸－グルタミン酸－バリン－アスパラギン酸（ＣＤＥＶＤ）およびアスパラギン酸－グルタミン酸－バリン－アスパラギン酸－システイン（ＤＥＶＤＣ）からなる群より選ばれる。

【0022】

前記脳卒中を治療するためのリガンド結合金クラスターの特定の実施形態では、前記その他のチオール含有化合物が、１－［（２Ｓ）－２－メチル－３－チオール－１－オキソプロピル］－Ｌ（Ｄ）－プロリン、チオグリコール酸、メルカプトエタノール、チオフェノール、Ｄ－ペニシラミン、Ｎ－（２－メルカプトプロピオニル）－グリシン、ドデシルメルカプタン、２－アミノエタンチオール（ＣＳＨ）、３－メルカプトプロピオン酸（ＭＰＡ）、および４－メルカプト安息香酸（ｐ－ＭＢＡ）からなる群より選ばれる。

【0023】

特定の実施形態では、リガンド結合金クラスター（ＡｕＣ）が、前記対象の脳卒中を治療するための医薬の製造のために用いられ、前記リガンド結合金クラスターが、金コアと、前記金コアに結合したリガンドとを含み；前記脳卒中が、出血性脳卒中、虚血性脳卒中、および一過性虚血発作（ＴＩＡ）からなる群より選ばれる。

【0024】

前記医薬の製造のためのリガンド結合金クラスター（ＡｕＣ）の特定の実施形態では、前記金コアの直径が、０．５～３ｎｍである。

【0025】

前記医薬の製造のためのリガンド結合金クラスター（ＡｕＣ）の特定の実施形態では、前記金コアの直径が、０．５～２．６ｎｍである。

【0026】

前記医薬の製造のためのリガンド結合金クラスター（ＡｕＣ）の特定の実施形態では、前記リガンドが、Ｌ－システインとその誘導体、Ｄ－システインとその誘導体、システイン含有オリゴペプチドとそれらの誘導体、およびその他のチオール含有化合物からなる群より選ばれる一つである。

【0027】

前記医薬の製造のためのリガンド結合金クラスター（ＡｕＣ）の特定の実施形態では、前記Ｌ－システインとその誘導体が、Ｌ－システイン、Ｎ－イソブチリル－Ｌ－システイン（Ｌ－ＮＩＢＣ）、およびＮ－アセチル－Ｌ－システイン（Ｌ－ＮＡＣ）からなる群より選ばれ、そして前記Ｄ－システインとその誘導体が、Ｄ－システイン、Ｎ－イソブチリル－Ｄ－システイン（Ｄ－ＮＩＢＣ）、およびＮ－アセチル－Ｄ－システイン（Ｄ－ＮＡＣ）からなる群より選ばれる。

【0028】

前記医薬の製造のためのリガンド結合金クラスター（ＡｕＣ）の特定の実施形態では、前記システイン含有オリゴペプチドとそれらの誘導体が、システイン含有ジペプチドであり、前記システイン含有ジペプチドが、Ｌ（Ｄ）－システイン－Ｌ（Ｄ）－アルギニンジペプチド（ＣＲ）、Ｌ（Ｄ）－アルギニン－Ｌ（Ｄ）－システインジペプチド（ＲＣ）、Ｌ（Ｄ）－ヒスチジン－Ｌ（Ｄ）－システインジペプチド（ＨＣ）、およびＬ（Ｄ）－システイン－Ｌ（Ｄ）－ヒスチジンジペプチド（ＣＨ）からなる群より選ばれる。

【0029】

前記医薬の製造のためのリガンド結合金クラスター（ＡｕＣ）の特定の実施形態では、前記システイン含有オリゴペプチドとそれらの誘導体が、システイン含有トリペプチドであり、前記システイン含有トリペプチドが、グリシン－（Ｄ）Ｌ－システイン－Ｌ（Ｄ）－アルギニントリペプチド（ＧＣＲ）、Ｌ（Ｄ）－プロリン－Ｌ（Ｄ）－システイン－Ｌ（Ｄ）－アルギニントリペプチド（ＰＣＲ）、Ｌ（Ｄ）－リシン－Ｌ（Ｄ）－システイン－Ｌ（Ｄ）－プロリントリペプチド（ＫＣＰ）、およびＬ（Ｄ）－グルタチオン（ＧＳＨ）からなる群より選ばれる。

【0030】

前記医薬の製造のためのリガンド結合金クラスター（ＡｕＣ）の特定の実施形態では、前記システイン含有オリゴペプチドとそれらの誘導体が、システイン含有テトラペプチドであり、前記システイン含有テトラペプチドが、グリシン－Ｌ（Ｄ）－セリン－Ｌ（Ｄ）－システイン－Ｌ（Ｄ）－アルギニンテトラペプチド（ＧＳＣＲ）、およびグリシン－Ｌ（Ｄ）－システイン－Ｌ（Ｄ）－セリン－Ｌ（Ｄ）－アルギニンテトラペプチド（ＧＣＳＲ）からなる群より選ばれる。

【0031】

前記医薬の製造のためのリガンド結合金クラスター（ＡｕＣ）の特定の実施形態では、前記システイン含有オリゴペプチドとそれらの誘導体が、システイン含有ペンタペプチドであり、前記システイン含有ペンタペプチドが、システイン－アスパラギン酸－グルタミン酸－バリン－アスパラギン酸（ＣＤＥＶＤ）およびアスパラギン酸－グルタミン酸－バリン－アスパラギン酸－システイン（ＤＥＶＤＣ）からなる群より選ばれる。

【0032】

前記医薬の製造のためのリガンド結合金クラスター（ＡｕＣ）の特定の実施形態では、前記その他のチオール含有化合物が、１－［（２Ｓ）－２－メチル－３－チオール－１－オキソプロピル］－Ｌ（Ｄ）－プロリン、チオグリコール酸、メルカプトエタノール、チオフェノール、Ｄ－ペニシラミン、Ｎ－（２－メルカプトプロピオニル）－グリシン、ドデシルメルカプタン、２－アミノエタンチオール（ＣＳＨ）、３－メルカプトプロピオン酸（ＭＰＡ）、および４－メルカプト安息香酸（ｐ－ＭＢＡ）からなる群より選ばれる。

【0033】

本発明の目的および利点は、添付の図面に関連するその好ましい実施形態の以下の詳細な説明から明らかになる。

【図面の簡単な説明】

【0034】

次に、本発明による好ましい実施形態を、同様の参照番号が同様の要素を示す図を参照して説明する。

【0035】

【図1】様々な粒子サイズのリガンドＬ－ＮＩＢＣ修飾金ナノ粒子（Ｌ－ＮＩＢＣ－ＡｕＮＰ）の紫外線可視（ＵＶ）スペクトル、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）画像および粒子サイズ分布図を示す。図１Ａが、３．６ｎｍ Ｌ－ＮＩＢＣ－ＡｕＮＰのＵＶスペクトルを示す。図１Ｂが、３．６ｎｍ Ｌ－ＮＩＢＣ－ＡｕＮＰのＴＥＭ画像を示す。図１Ｃが、３．６ｎｍ Ｌ－ＮＩＢＣ－ＡｕＮＰの粒子サイズ分布図を示す。図１Ｄが、６．０ｎｍ Ｌ－ＮＩＢＣ－ＡｕＮＰのＵＶスペクトルを示す。図１Ｅが、６．０ｎｍ Ｌ－ＮＩＢＣ－ＡｕＮＰのＴＥＭ画像を示す。図１Ｆが、６．０ｎｍ Ｌ－ＮＩＢＣ－ＡｕＮＰの粒子サイズ分布図を示す。図１Ｇが、１０．１ｎｍ Ｌ－ＮＩＢＣ－ＡｕＮＰのＵＶスペクトルを示す。図１Ｈが、１０．１ｎｍ Ｌ－ＮＩＢＣ－ＡｕＮＰのＴＥＭ画像を示す。図１Ｉが、１０．１ｎｍ Ｌ－ＮＩＢＣ－ＡｕＮＰの粒子サイズ分布図を示す。図１Ｊが、１８．２ｎｍ Ｌ－ＮＩＢＣ－ＡｕＮＰのＵＶスペクトルを示す。図１Ｋが、１８．２ｎｍ Ｌ－ＮＩＢＣ－ＡｕＮＰのＴＥＭ画像を示す。図１Ｌが、１８．２ｎｍ Ｌ－ＮＩＢＣ－ＡｕＮＰの粒子サイズ分布図を示す。

【0036】

【図2】様々な粒子サイズのリガンドＬ－ＮＩＢＣ結合金クラスター（Ｌ－ＮＩＢＣ－ＡｕＣ）の紫外線可視（ＵＶ）スペクトル、ＴＥＭ画像および粒子サイズ分布図を示す。図２Ａが、１．１ｎｍ Ｌ－ＮＩＢＣ－ＡｕＣのＵＶスペクトルを示す。図２Ｂが、１．１ｎｍ Ｌ－ＮＩＢＣ－ＡｕＣのＴＥＭ画像を示す。図２Ｃが、１．１ｎｍ Ｌ－ＮＩＢＣ－ＡｕＣの粒子サイズ分布図を示す。図２Ｄが、１．８ｎｍ Ｌ－ＮＩＢＣ－ＡｕＣのＵＶスペクトルを示す。図２Ｅが、１．８ｎｍ Ｌ－ＮＩＢＣ－ＡｕＣのＴＥＭ画像を示す。図２Ｆが、１．８ｎｍ Ｌ－ＮＩＢＣ－ＡｕＣの粒子サイズ分布図を示す。図２Ｇが、２．６ｎｍ Ｌ－ＮＩＢＣ－ＡｕＣのＵＶスペクトルを示す。図２Ｈが、２．６ｎｍ Ｌ－ＮＩＢＣ－ＡｕＣのＴＥＭ画像を示す。図２Ｉが、２．６ｎｍ Ｌ－ＮＩＢＣ－ＡｕＣの粒子サイズ分布図を示す。

【0037】

【図3】１．１ｎｍ、１．８ｎｍおよび２．６ｎｍのＬ－ＮＩＢＣ－ＡｕＣの赤外線スペクトルを示す。

【0038】

【図4】リガンドＣＲ結合金クラスター（ＣＲ－ＡｕＣ）のＵＶ、赤外線、ＴＥＭ、および粒子サイズ分布図を示す。図４Ａが、ＣＲ－ＡｕＣのＵＶスペクトルを示す。図４Ｂが、ＣＲ－ＡｕＣの赤外線スペクトルを示す。図４Ｃが、ＣＲ－ＡｕＣのＴＥＭ画像を示す。図４Ｄが、ＣＲ－ＡｕＣの粒子サイズ分布図を示す。

【0039】

【図5】リガンドＲＣ結合金クラスター（ＲＣ－ＡｕＣ）のＵＶ、赤外線、ＴＥＭ、および粒子サイズ分布図を示す。図５Ａが、ＲＣ－ＡｕＣのＵＶスペクトルを示す。図５Ｂが、ＲＣ－ＡｕＣの赤外線スペクトルを示す。図５Ｃが、ＲＣ－ＡｕＣのＴＥＭ画像を示す。図５Ｄが、ＲＣ－ＡｕＣの粒子サイズ分布図を示す。

【0040】

【図6】リガンド１－［（２Ｓ）－２－メチル－３－チオール－１－オキソプロピル］－Ｌ－プロリン（即ち、Ｃａｐ）結合金クラスター（Ｃａｐ－ＡｕＣ）のＵＶ、赤外線、ＴＥＭ、および粒子サイズ分布図を示す。図６Ａが、Ｃａｐ－ＡｕＣのＵＶスペクトルを示す。図６Ｂが、Ｃａｐ－ＡｕＣの赤外線スペクトルを示す。図６Ｃが、Ｃａｐ－ＡｕＣのＴＥＭ画像を示す。図６Ｄが、Ｃａｐ－ＡｕＣの粒子サイズ分布図を示す。

【0041】

【図7】リガンドＧＳＨ結合金クラスター（ＧＳＨ－ＡｕＣ）のＵＶ、赤外線、ＴＥＭ、および粒子サイズ分布図を示す。図７Ａが、ＧＳＨ－ＡｕＣのＵＶスペクトルを示す。図７Ｂが、ＧＳＨ－ＡｕＣの赤外線スペクトルを示す。図７Ｃが、ＧＳＨ－ＡｕＣのＴＥＭ画像を示す。図７Ｄが、ＧＳＨ－ＡｕＣの粒子サイズ分布図を示す。

【0042】

【図8】リガンドＤ－ＮＩＢＣ結合金クラスター（Ｄ－ＮＩＢＣ－ＡｕＣ）のＵＶ、赤外線、ＴＥＭ、および粒子サイズ分布図を示す。図８Ａが、Ｄ－ＮＩＢＣ－ＡｕＣのＵＶスペクトルを示す。図８Ｂが、Ｄ－ＮＩＢＣ－ＡｕＣの赤外線スペクトルを示す。図８Ｃが、Ｄ－ＮＩＢＣ－ＡｕＣのＴＥＭ画像を示す。図８Ｄが、Ｄ－ＮＩＢＣ－ＡｕＣの粒子サイズ分布図を示す。

【0043】

【図9】リガンドＬ－システイン結合金クラスター（Ｌ－Ｃｙｓ－ＡｕＣ）のＵＶ、赤外線、ＴＥＭ、および粒子サイズ分布図を示す。図９Ａが、Ｌ－Ｃｙｓ－ＡｕＣのＵＶスペクトルを示す。図９Ｂが、Ｌ－Ｃｙｓ－ＡｕＣの赤外線スペクトルを示す。図９Ｃが、Ｌ－Ｃｙｓ－ＡｕＣのＴＥＭ画像を示す。図９Ｄが、Ｌ－Ｃｙｓ－ＡｕＣの粒子サイズ分布図を示す。

【0044】

【図10】リガンド２－アミノエタンチオール結合金クラスター（ＣＳＨ－ＡｕＣ）のＵＶ、赤外線、ＴＥＭ、および粒子サイズ分布図を示す。図１０Ａが、ＣＳＨ－ＡｕＣのＵＶスペクトルを示す。図１０Ｂが、ＣＳＨ－ＡｕＣの赤外線スペクトルを示す。図１０Ｃが、ＣＳＨ－ＡｕＣのＴＥＭ画像を示す。図１０Ｄが、ＣＳＨ－ＡｕＣの粒子サイズ分布図を示す。

【0045】

【図11】リガンド３－メルカプトプロピオン酸結合金クラスター（ＭＰＡ－ＡｕＣ）のＵＶ、赤外線、ＴＥＭ、および粒子サイズ分布図を示す。図１１Ａが、ＭＰＡ－ＡｕＣのＵＶスペクトルを示す。図１１Ｂが、ＭＰＡ－ＡｕＣの赤外線スペクトルを示す。図１１Ｃが、ＭＰＡ－ＡｕＣのＴＥＭ画像を示す。図１１Ｄが、ＭＰＡ－ＡｕＣの粒子サイズ分布図を示す。

【0046】

【図12】リガンド４－メルカプト安息香酸結合金クラスター（ｐ－ＭＢＡ－ＡｕＣ）のＵＶ、赤外線、ＴＥＭ、および粒子サイズ分布図を示す。図１２Ａが、ｐ－ＭＢＡ－ＡｕＣのＵＶスペクトルを示す。図１２Ｂが、ｐ－ＭＢＡ－ＡｕＣの赤外線スペクトルを示す。図１２Ｃが、ｐ－ＭＢＡ－ＡｕＣのＴＥＭ画像を示す。図１２Ｄが、ｐ－ＭＢＡ－ＡｕＣの粒子サイズ分布図を示す。

【0047】

【図13】リガンド４－システイン－アスパラギン酸－グルタミン酸－バリン－アスパラギン酸（ＣＤＥＶＤ）結合金クラスター（ＣＤＥＶＤ－ＡｕＣ）のＵＶ、ＴＥＭ、および粒子サイズ分布図を示す。図１３Ａが、ＣＤＥＶＤ－ＡｕＣのＵＶスペクトルを示す。図１３Ｂが、ＣＤＥＶＤ－ＡｕＣのＴＥＭ画像を示す。図１３Ｃが、ＣＤＥＶＤ－ＡｕＣの粒子サイズ分布図を示す。

【0048】

【図14】リガンド４－アスパラギン酸－グルタミン酸－バリン－アスパラギン酸－システイン（ＤＥＶＤＣ）結合金クラスター（ＤＥＶＤＣ－ＡｕＣ）のＵＶ、ＴＥＭ、および粒子サイズ分布図を示す。図１４Ａが、ＤＥＶＤＣ－ＡｕＣのＵＶスペクトルを示す。図１４Ｂが、ＤＥＶＤＣ－ＡｕＣのＴＥＭ画像を示す。図１４Ｃが、ＤＥＶＤＣ－ＡｕＣの粒子サイズ分布図を示す。

【0049】

【図15】各群のラットの神経学的行動スコアを示す（各時点のヒストグラムにおいて、左から右へ順に、偽手術群（ブランク）、モデル対照群、Ａ１低用量群、Ａ１高用量群、Ａ２低用量群、Ａ２高用量群、Ａ３低用量群、Ａ３高用量群、Ａ４低用量群、Ａ４高用量群、Ｂ１低用量群、Ｂ１高用量群、Ｂ２低用量群 およびＢ２高用量群）。

【0050】

【図16】各群のラットの脳梗塞面積の割合を示す（ヒストグラムにおいて、左から右へ順に、偽手術群（ブランク）、モデル対照群、Ａ１低用量群、Ａ１高用量群、Ａ２低用量群、Ａ２高用量群、Ａ３低用量群、Ａ３高用量群、Ａ４低用量群、Ａ４高用量群、Ｂ１低用量群、Ｂ１高用量群、Ｂ２低用量群 およびＢ２高用量群）。

【0051】

【図17】金クラスター薬物と金ナノ粒子投与後のＭＣＡＯラットの脳組織の例示的ＴＴＣ染色画像である。図１７Ａが、偽手術群の例示的ＴＴＣ染色画像を示す。図１７Ｂが、モデル対照群の例示的ＴＴＣ染色画像を示す。図１７Ｃが、Ａ１低用量群の例示的ＴＴＣ染色画像を示す。図１７Ｄが、Ａ１高用量群の例示的ＴＴＣ染色画像を示す。図１７Ｅが、Ｂ１低用量群の例示的ＴＴＣ染色画像を示す。図１７Ｆが、Ｂ１高用量群の例示的ＴＴＣ染色画像を示す。

【0052】

【図18】モデリング化完了後の異なる時点でのｍＮＳＳ神経機能スコアの結果を示す。ここで、ＮＣ：正常対照群；ＳＨＡＭ：偽手術群；ＩＶＨ：モデル対照群；ＡＬ：薬物Ａ低用量投与群；ＡＨ：薬物Ａ高用量投与群；ＢＬ：薬物Ｂ低用量投与群；ＢＨ：薬物Ｂ高用量投与群。図１８Ａが、モデリング後１２時間のｍＮＳＳ神経機能スコアを示す。図１８Ｂが、モデリング後１日目のｍＮＳＳ神経機能スコアを示す。図１８Ｃが、モデリング後２日目のｍＮＳＳ神経機能スコアを示す。図１８Ｄが、モデリング後４日目のｍＮＳＳ神経機能スコアを示す。図１８Ｅが、モデリング後７日目のｍＮＳＳ神経機能スコアを示す。＊＊＊：ＩＶＨ群と比較して、Ｐ＜０．００１。

【0053】

【図19】エバンスブルー染色による血液脳関門（ＢＢＢ）の透過性測定において、全群のラット脳組織ホモジネートの上清におけるエバンスブルー含有量を示す。ここで、ＮＣ：正常対照群；ＳＨＡＭ：偽手術群；ＩＶＨ：モデル対照群；ＡＬ：薬物Ａ低用量投与群；ＡＨ：薬物Ａ高用量投与群。＊：ＩＶＨ群ラットと比較して、Ｐ＜０．０５；＊＊：ＩＶＨ群ラットと比較して、Ｐ＜０．０１；＊＊＊：ＩＶＨ群ラットと比較して、Ｐ＜０．００１。

【0054】

【図20】乾湿重量法により測定されたラット脳組織の含水量を示す。ここで、ＮＣ：正常対照群；ＳＨＡＭ：偽手術群；ＩＶＨ：モデル対照群；ＡＬ：薬物Ａ低用量投与群；ＡＨ：薬物Ａ高用量投与群。＊：ＩＶＨ群ラットと比較して、Ｐ＜０．０５；＊＊：ＩＶＨ群ラットと比較して、Ｐ＜０．０１；＊＊＊：ＩＶＨ群ラットと比較して、Ｐ＜０．００１。

【0055】

【図21】異なる群における脳組織の例示的Ｈ&Ｅ染色画像を示す。図２１Ａ：ＮＣ群。図２１Ｂ：ＳＨＡＭ群。図２１Ｃ：ＩＶＨ群。図２１Ｄ：ＡＬ群。図２１Ｅ：ＡＨ群。

【0056】

【図22】ラット脳組織のｉＮＯＳ免疫蛍光染色の例示的画像を示す。図２２Ａ：ＮＣ群。図２２Ｂ：ＳＨＡＭ群。図２２Ｃ：ＩＶＨ群。図２２Ｄ：ＡＬ群。図２２Ｅ：ＡＨ群。

【0057】

【図23】ＷＢ試験において、各群のラットの脳組織におけるＭＭＰ９タンパク質発現を示す。ここで、ＮＣ：正常対照群；ＳＨＡＭ：偽手術群；ＩＶＨ：モデル対照群；ＡＬ：薬物Ａ低用量投与群；ＡＨ：薬物Ａ高用量投与群。図２３Ａが、ＭＭＰ９タンパク質バンドが６並列サンプルにおいて検出されたことを示す。図２３Ｂが、ＭＭＰ９タンパク質の相対タンパク質発現（ＧＡＰＤＨを参照とする）を示す。ＩＶＨ群と比較して、＊、Ｐ＜０．０５。

【0058】

【図24】各群のラットの脳組織におけるＭＤＡレベルを示す。ここで、ＮＣ：正常対照群；ＳＨＡＭ：偽手術群；ＩＶＨ：モデル対照群；ＡＬ：薬物Ａ低用量投与群；ＡＨ：薬物Ａ高用量投与群。＊＊＊：ＩＶＨ群と比較して、Ｐ＜０．００１；＊＊：ＩＶＨ群と比較して、Ｐ＜０．０１。

【0059】

【図25】各群のラットの脳組織におけるＳＯＤレベルを示す。ここで、ＮＣ：正常対照群；ＳＨＡＭ：偽手術群；ＩＶＨ：モデル対照群；ＡＬ：薬物Ａ低用量投与群；ＡＨ：薬物Ａ高用量投与群。＊＊＊：ＩＶＨ群と比較して、Ｐ＜０．００１。

【0060】

【図26】脳組織の超薄切片の透過型電子顕微鏡検査の結果を示す。図２６Ａ：ＮＣ群。図２６Ｂ：ＳＨＡＭ群。図２６Ｃ：ＩＶＨ群。図２６Ｄ：ＡＬ群。図２６Ｅ：ＡＨ群。

【発明を実施するための形態】

【0061】

本発明は、以下の本発明の特定の実施形態に対する詳細な説明を参照することによって、より容易に理解することができる。

【0062】

本出願全体において、刊行物が参照される。これらの刊行物の開示は、本発明が属する技術の現状をより十分に説明するために、参照によりその全体が本出願に組み込まれる。

【0063】

本明細書で使用される「投与」とは、経口（「ｐｏ」）投与、座薬としての投与、局所接触、静脈内（「ｉｖ」）、腹腔内（「ｉｐ」）、筋肉内（「ｉｍ」）、病変内、海馬内、脳室内、鼻腔内または皮下（「ｓｃ」）投与、または対象へのミニ浸透圧ポンプや侵食性インプラントのような徐放デバイスの埋め込みを意味する。投与は、非経口および経粘膜（例えば、経口、鼻腔、膣、直腸、または経皮）を含む任意の経路によるものである。非経口投与には、例えば、静脈内、筋肉内、動脈内、皮内、皮下、腹腔内、脳室内、および頭蓋内などの投与が含まれる。他の送達形態としては、リポソーム製剤の使用、静脈内注入、経皮パッチなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。

【0064】

用語「全身投与」および「全身的投与」とは、化合物又は組成物が循環系を介して、医薬作用の標的部位を含む体内の部位に送達されるように、哺乳動物に化合物又は組成物を投与する方法を意味する。全身投与には、経口、鼻腔内、直腸および非経口投与（すなわち、筋肉内、静脈内、動脈内、経皮および皮下などの消化管経由以外の投与）が含まれるが、これらに限定されない。ただし、本明細書において、全身投与は、髄腔内注射および頭蓋内投与などの循環系経由以外の手段による脳領域への直接投与を含まない。

【0065】

本明細書で使用される用語「治療する」および「治療」とは、その用語が適用される疾患もしくは状態、またはそのような疾患もしくは状態の１つもしくは複数の症状のいずれかの発症を遅らせること、進行を遅らせることもしくは逆転させること、または緩和もしくは予防することを意味する。

【0066】

用語「患者」、「対象」又は「個体」とは、互換的に、哺乳動物、例えば、ヒト又は霊長類（例えば、マカク、チンパンジー、ポンゴ）、家畜（例えば、ネコ、イヌ）、農業用哺乳動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ）、実験用哺乳動物またはげっ歯類（例えば、ラット、ネズミ、ラグモルファ、ハムスター、モルモット）などが挙げられる。

【0067】

金クラスター（ＡｕＣｓ）は、金原子と金ナノ粒子の間にある特殊な形態の金である。ＡｕＣｓは、サイズが３ｎｍ未満であり、数個から数百個の金原子で構成されているため、金ナノ粒子の面心立方積層構造が崩壊する。その結果、ＡｕＣｓは、金ナノ粒子の連続又は準連続エネルギー準位とは異なり、違うＨＯＭＯ－ＬＵＭＯギャップを持つ分子のような離散化した電子構造を示す。これにより、従来の金ナノ粒子が持つ表面プラズモン共鳴効果と、ｕｖ－ｖｉｓスペクトルでの対応するプラズモン共鳴吸収帯（５２０±２０ｎｍ）が消失する。

【0068】

本発明は、リガンド結合ＡｕＣを提供する。

【0069】

特定の実施形態では、前記リガンド結合ＡｕＣは、リガンドと、金コアとを含み、前記リガンドが前記金コアに結合している。前記リガンドと金コアとの結合とは、リガンドが、共有結合、水素結合、静電気力、疎水性力（hydrophobic force）、ファンデルワールス力等を介して金コアと溶液中で安定している複合体を形成することを意味する。特定の実施形態では、前記金コアの直径が、０．５～３ｎｍの範囲にある。特定の実施形態では、前記金コアの直径が０．５～２．６ｎｍの範囲にある。

【0070】

特定の実施形態では、前記リガンド結合ＡｕＣの前記リガンドが、チオール含有化合物またはオリゴペプチドである。特定の実施形態では、前記リガンドが、Ａｕ－Ｓ結合を介して金コアに結合してリガンド結合ＡｕＣを形成する。

【0071】

特定の実施形態では、前記リガンドが、Ｌ－システイン、Ｄ－システイン、またはシステイン誘導体であるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、前記システイン誘導体が、Ｎ－イソブチリル－Ｌ－システイン（Ｌ－ＮＩＢＣ）、Ｎ－イソブチリル－Ｄ－システイン（Ｄ－ＮＩＢＣ）、Ｎ－アセチル－Ｌ－システイン（Ｌ－ＮＡＣ）、またはＮ－アセチル－Ｄ－システイン（Ｄ－ＮＡＣ）である。

【0072】

特定の実施形態では、前記リガンドが、システイン含有オリゴペプチドとその誘導体であるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、前記システイン含有オリゴペプチドが、システイン含有ジペプチドである。特定の実施形態では、前記システイン含有ジペプチドが、Ｌ（Ｄ）－システイン－Ｌ（Ｄ）－アルギニンジペプチド（ＣＲ）、Ｌ（Ｄ）－アルギニン－Ｌ（Ｄ）－システインジペプチド（ＲＣ）、またはＬ（Ｄ）－システイン－Ｌ（Ｄ）－ヒスチジンジペプチド（ＣＨ）である。特定の実施形態では、前記システイン含有オリゴペプチドが、システイン含有トリペプチドである。特定の実施形態では、前記システイン含有トリペプチドが、グリシン－Ｌ（Ｄ）－システイン－Ｌ（Ｄ）－アルギニントリペプチド（ＧＣＲ）、Ｌ（Ｄ）－プロリン－Ｌ（Ｄ）－システイン－Ｌ（Ｄ）－アルギニントリペプチド（ＰＣＲ）、またはＬ－グルタチオン（ＧＳＨ）である。特定の実施形態では、前記システイン含有オリゴペプチドが、システイン含有テトラペプチドである。特定の実施形態では、前記システイン含有テトラペプチドが、グリシン－Ｌ（Ｄ）－セリン－Ｌ（Ｄ）－システイン－Ｌ（Ｄ）－アルギニンテトラペプチド（ＧＳＣＲ）またはグリシン－Ｌ（Ｄ）－システイン－Ｌ（Ｄ）－セリン－Ｌ－アルギニンテトラペプチド（ＧＣＳＲ）である。特定の実施形態では、前記システイン含有オリゴペプチドが、システイン含有ペンタペプチドである。特定の実施形態では、前記システイン含有ペンタペプチドが、システイン－アスパラギン酸－グルタミン酸－バリン－アスパラギン酸（ＣＤＥＶＤ）、またはアスパラギン酸－グルタミン酸－バリン－アスパラギン酸－システイン（ＤＥＶＤＣ）である。

【0073】

特定の実施形態では、前記リガンドが、チオール含有化合物である。特定の実施形態では、チオール含有化合物が、１－［（２Ｓ）－２－メチル－３－チオール－１－オキソプロピル］－Ｌ（Ｄ）－プロリン、チオグリコール酸、メルカプトエタノール、チオフェノール、Ｄ－ペニシラミン、ドデシルメルカプタン、２－アミノエタンチオール（ＣＳＨ）、３－メルカプトプロピオン酸（ＭＰＡ）、または４－メルカプト安息香酸（ｐ－ＭＢＡ）である。

【0074】

本発明は、脳卒中の治療のための医薬組成物であって、前記脳卒中が、出血性脳卒中、虚血性脳卒中、および一過性虚血発作（ＴＩＡ）からなる群より選ばれる、医薬組成物を提供する。特定の実施形態では、前記対象が、ヒトである。特定の実施形態では、前記対象が、犬のようなペット動物である。

【0075】

特定の実施形態では、前記医薬組成物が、上述のリガンド結合ＡｕＣと、薬理学的に許容される賦形剤とを含む。特定の実施形態では、前記賦形剤が、リン酸緩衝液、または生理食塩水である。

【0076】

本発明は、脳卒中の治療のための医薬の製造における上述のリガンド結合ＡｕＣｓの使用であって、前記脳卒中が、出血性脳卒中、虚血性脳卒中、および一過性虚血発作（ＴＩＡ）からなる群より選ばれる、使用を提供する。

【0077】

本発明は、脳卒中を有する対象を治療するための上述のリガンド結合ＡｕＣｓの使用、または上述のリガンド結合ＡｕＣｓを使用して脳卒中を有する対象を治療する方法であって、前記脳卒中が、出血性脳卒中、虚血性脳卒中、および一過性虚血発作（ＴＩＡ）からなる群より選ばれる、使用または方法を提供する。特定の実施形態では、前記治療方法は、前記対象に薬理学的有効な量のリガンド結合ＡｕＣｓを投与することを含む。前記薬理学的有効な量は、通常の体内研究により決定することができる。特定の実施形態では、リガンド結合ＡｕＣｓの前記薬理学的有効な量は、少なくとも０．００１ｍｇ／ｋｇ／日、０．００５ｍｇ／ｋｇ／日、０．０１ｍｇ／ｋｇ／日、０．０５ｍｇ／ｋｇ／日、０．１ｍｇ／ｋｇ／日、０．５ｍｇ／ｋｇ／日、１ｍｇ／ｋｇ／日、２ｍｇ／ｋｇ／日、３ｍｇ／ｋｇ／日、４ｍｇ／ｋｇ／日、５ｍｇ／ｋｇ／日、６ｍｇ／ｋｇ／日、７ｍｇ／ｋｇ／日、８ｍｇ／ｋｇ／日、９ｍｇ／ｋｇ／日、１０ｍｇ／ｋｇ／日、１５ｍｇ／ｋｇ／日、２０ｍｇ／ｋｇ／日、３０ｍｇ／ｋｇ／日、４０ｍｇ／ｋｇ／日、５０ｍｇ／ｋｇ／日、６０ｍｇ／ｋｇ／日、７０ｍｇ／ｋｇ／日、８０ｍｇ／ｋｇ／日、または１００ｍｇ／ｋｇ／日の用量である。

【0078】

以下の実施例は、本発明の原理を説明することのみを目的として提供されている。それらは、決して本発明の範囲を制限することを意図するものではない。

【0079】

実施例

【0080】

実施例１． リガンド結合ＡｕＣsの製造

【0081】

１．１ ＨＡｕＣｌ_４をメタノール、水、エタノール、ｎ－プロパノール、又は酢酸エチルにを溶解して、ＨＡｕＣｌ_４濃度０．０１～０．０３Ｍの溶液Ａが得られた。

【0082】

１．２ リガンドを溶媒にを溶解して、リガンド濃度０．０１～０．１８Ｍの溶液Ｂが得られた。前記リガンドは、Ｌ－システイン、Ｄ－システイン、及び、Ｎ－イソブチリル－Ｌ－システイン（Ｌ－ＮＩＢＣ）、Ｎ－イソブチリル－Ｄ－システイン（Ｄ－ＮＩＢＣ）、Ｎ－アセチル－Ｌ－システイン（Ｌ－ＮＡＣ）、及びＮ－アセチル－Ｄ－システイン（Ｄ－ＮＡＣ）等のその他のシステイン誘導体；システイン含有オリゴペプチドとそれらの誘導体（Ｌ（Ｄ）－システイン－Ｌ（Ｄ）－アルギニンジペプチド（ＣＲ）、Ｌ（Ｄ）－アルギニン－Ｌ（Ｄ）－システインジペプチド（ＲＣ）、Ｌ（Ｄ）－システイン－Ｌ（Ｄ）－ヒスチジン（ＣＨ）、グリシン－Ｌ（Ｄ）－システイン－Ｌ（Ｄ）－アルギニントリペプチド（ＧＣＲ）、Ｌ（Ｄ）－プロリン－Ｌ（Ｄ）－システイン－Ｌ（Ｄ）－アルギニントリペプチド（ＰＣＲ）、Ｌ（Ｄ）－グルタチオン（ＧＳＨ）、グリシン－Ｌ（Ｄ）－セリン－Ｌ（Ｄ）－システイン－Ｌ（Ｄ）－アルギニンテトラペプチド（ＧＳＣＲ）及びグリシン－Ｌ（Ｄ）－システイン－Ｌ（Ｄ）－セリン－Ｌ（Ｄ）－アルギニンテトラペプチド（ＧＣＳＲ）、システイン－アスパラギン酸－グルタミン酸－バリン－アスパラギン酸 ペンタペプチド（ＣＤＥＶＤ）およびアスパラギン酸－グルタミン酸－バリン－アスパラギン酸－システインペンタペプチド（ＤＥＶＤＣ）等の、ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド、ペンタペプチド及びその他のシステイン含有ペプチドを含むが、これらに限定されない）；及び１－［（２Ｓ）－２－メチル－３－チオール－１－オキソプロピル］－Ｌ（Ｄ）－プロリン、チオグリコール酸、メルカプトエタノール、チオフェノール、Ｄ－ペニシラミン、ドデシルメルカプタン、２－アミノエタンチオール（ＣＳＨ）、３－メルカプトプロピオン酸（ＭＰＡ）、および４－メルカプト安息香酸（ｐ－ＭＢＡ）のうちの一つ又は複数等のその他のチオール含有化合物を含むが、これらに限定されない。前記溶媒は、メタノール、酢酸エチル、水、エタノール、ｎ－プロパノール、ペンタン、ギ酸、酢酸、ジエチルエーテル、アセトン、アニソール、１－プロパノール、２－プロパノール、１－ブタノール、２－ブタノール、ペンタノール、酢酸ブチル、ｔ－ブチルメチルエーテル、酢酸イソプロピル、ジメチルスルホキシド、ギ酸エチル、酢酸イソブチル、酢酸メチル、２－メチル－１－プロパノール及び酢酸プロピルのうちの一つ又は複数であった。

【0083】

１．３ ＨＡｕＣｌ_４とリガンドとのモル比が１：（０．０１～１００）となるように、溶液Ａと溶液Ｂを混合して、氷浴において０．１～４８時間撹拌し、０．０２５～０．８Ｍ ＮａＢＨ_４の水、エタノール又はメタノール溶液を加えて、氷水浴において引き続き撹拌し、そして０．１～１２時間反応させた。ＮａＢＨ_４とリガンドとのモル比は、１：（０．０１～１００）であった。

【0084】

１．４ 反応終了した後、ＭＷＣＯが３Ｋ～３０Ｋの限外ろ過チューブを使用して、８０００～１７５００ｒ／分の勾配で反応溶液を１０～１００分間遠心することにより、異なる平均粒子サイズを有するリガンド結合ＡｕＣｓ沈殿を得た。異なるＭＷＣＯの限外ろ過チューブのろ過メンブレンの開きは、直接的に、前記メンブレンを通過できるリガンド結合ＡｕＣｓのサイズを決定した。当該ステップは、任意に省略されてもよい。

【0085】

１．５ ステップ（１．４）で得られた異なる平均粒子サイズを有するリガンド結合ＡｕＣｓ沈殿を水に溶解し、透析バッグに投入し、そして水において室温で１～７日間透析した。

【0086】

１．６ 透析後、リガンド結合ＡｕＣｓを１２～２４時間凍結乾燥して、粉末状又は凝集状物質であるリガンド結合ＡｕＣｓを得た。

【0087】

測定からわかるように、前記方法により得られた粉末状又は凝集状物質の粒子サイズは、３ｎｍ未満であった（全体的に、０．５～２．６ｎｍにわたって分布した）。５２０ｎｍで明らかな吸収ピークがなかった。得られた粉末又は凝集体がリガンド結合ＡｕＣｓであったことが特定された。

【0088】

実施例２． 異なるリガンドが結合されたＡｕＣｓの製造及び同定

【0089】

２．１ Ｌ－ＮＩＢＣ結合ＡｕＣｓ、即ち、Ｌ－ＮＩＢＣ－ＡｕＣｓの製造

【0090】

リガンドであるＬ－ＮＩＢＣを例とし、Ｌ－ＮＩＢＣが結合したＡｕＣｓの製造及び確認について以下で詳細に説明する。

【0091】

２．１．１ １．００ｇのＨＡｕＣｌ_４を量り、そして１００ｍＬのメタノールに溶解して、０．０３Ｍの溶液Ａを得た。

【0092】

２．１．２ ０．５７ｇのＬ－ＮＩＢＣを量り、そして１００ｍＬの氷酢酸（酢酸）に溶解して、０．０３Ｍの溶液Ｂを得た。

【0093】

２．１．３ １ｍＬの溶液Ａを量り、０．５ｍＬ、１ｍＬ、２ｍＬ、３ｍＬ、４ｍＬ、又は５ｍＬの溶液Ｂとそれぞれ混合し（すなわち、ＨＡｕＣｌ_４とＬ－ＮＩＢＣとのモル比が、それぞれ、１：０．５、１：１、１：２、１：３、１：４、１：５であった。）、氷浴において撹拌しながら２時間反応させ、溶液が明るい黄色から無色になると、速やかに１ｍＬの新たに製造された０．０３Ｍ（１１．３ｍｇのＮａＢＨ_４を量り、そして１０ｍＬのエタノールに溶解することにより製造された。）のＮａＢＨ_４エタノール溶液を加えて、溶液が濃褐色になった後、引き続き３０分間反応し、そして１０ｍＬのアセトンを加えて反応を停止させた。

【0094】

２．１．４ 反応後、反応溶液に対して勾配遠心を行い、異なる粒子サイズを有するＬ－ＮＩＢＣ－ＡｕＣｓ粉末を得た。具体的な方法は以下のとおりである。即ち、反応完了後、反応溶液を３０ＫのＭＷＣＯ及び５０ｍＬの体積を有する限外ろ過チューブに転移し、１００００ｒ／分で２０分間遠心し、そして内チューブ中の保持液（ｒｅｔｅｎｔａｔｅ）を超純水に溶解して、約２．６ｎｍの粒子サイズを有する粉末を得た。その後、外チューブ中の混合液を５０ｍＬの体積及び１０ＫのＭＷＣＯを有する限外ろ過チューブに転移し、１３,０００ｒ／分で３０分間遠心した。内チューブ中の保持液を超純水に溶解して、約１．８ｎｍの粒子サイズを有する粉末を得た。その後、外チューブ中の混合液を５０ｍＬの体積及び３ＫのＭＷＣＯを有する限外ろ過チューブに転移し、１７,５００ｒ／分で４０分間遠心した。内チューブ中の保持液を超純水に溶解して、約１．１ｎｍの粒子サイズを有する粉末を得た。

【0095】

２．１．５ 勾配遠心により得られた３つの異なる粒子サイズでの粉末を沈殿させ、それぞれ溶媒を除去し、粗生成物をＮ_２でブロー乾燥させて、５ｍＬの超純水に溶解し、透析バッグ（ＭＷＣＯが３ＫＤａ）に入れ、透析バッグを２Ｌの超純水に入れ、一日おきに水を交換し、７日間透析し、凍結乾燥し、将来の使用のために保持した。

【0096】

２．２ Ｌ－ＮＩＢＣ－ＡｕＣｓの同定

【0097】

上記で得られた粉末（Ｌ－ＮＩＢＣ－ＡｕＣｓ）に対して同定実験は行われた。同時に、リガンドであるＬ－ＮＩＢＣにより修飾した金ナノ粒子（Ｌ－ＮＩＢＣ－ＡｕＮＰｓ）は、対照として使用された。前記リガンドがＬ－ＮＩＢＣである金ナノ粒子の製造方法は、参考文献（Ｗ．Ｙａｎ、Ｌ．Ｘｕ、Ｃ．Ｘｕ、Ｗ．Ｍａ、Ｈ．Ｋｕａｎｇ、Ｌ．Ｗａｎｇ及びＮ．Ａ．Ｋｏｔｏｖ、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ２０１２、１３４、１５１１４；Ｘ．Ｙｕａｎ、Ｂ．Ｚｈａｎｇ、Ｚ．Ｌｕｏ、Ｑ．Ｙａｏ、Ｄ．Ｔ．Ｌｅｏｎｇ、Ｎ．Ｙａｎ及びＪ．Ｘｉｅ、Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ ２０１４、５３、４６２３）に参照する。

【0098】

２．２．１ 透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）によるモーフォロジーの観察

【0099】

試験粉末（Ｌ－ＮＩＢＣ－ＡｕＣｓサンプル及びＬ－ＮＩＢＣ－ＡｕＮＰｓサンプル）を超純水に２ｍｇ／Ｌになるまで溶解してサンプルとし、そして懸滴法により試験サンプルを製造した。より具体的に、５μＬのサンプルを超薄型カーボンフィルムに滴下し、水滴がなくなるまで自然蒸発させ、そしてＪＥＭ－２１００Ｆ ＳＴＥＭ／ＥＤＳ電界放出形高分解能ＴＥＭによりサンプルのモーフォロジーを観察した。

【0100】

Ｌ－ＮＩＢＣ－ＡｕＮＰｓの４つのＴＥＭ画像は、図１の図１Ｂ、図１Ｅ、図１Ｈ、及び図１Ｋに示され、Ｌ－ＮＩＢＣ－ＡｕＣｓの３つのＴＥＭ画像は、図２の図２Ｂ、図２Ｅ、及び図２Ｈに示される。

【0101】

図２中の画像で示されるように、Ｌ－ＮＩＢＣ－ＡｕＣｓサンプルは、均一な粒子サイズ及び良好な分散性を有し、かつ、Ｌ－ＮＩＢＣ－ＡｕＣｓの平均直径（金コアの直径と指す）がそれぞれ１．１ｎｍ、１．８ｎｍ及び２．６ｎｍであり、図２の図２Ｃ、図２Ｆ及び図２Ｉ中の結果とよく一致した。これに対して、Ｌ－ＮＩＢＣ－ＡｕＮＰｓサンプルは、より大きい粒子サイズを有した。それらの平均直径（金コアの直径と指す）がそれぞれ３．６ｎｍ、６．０ｎｍ、１０．１ｎｍ及び１８．２ｎｍであり、図１の図１Ｃ、図１Ｆ、図１Ｉ及び図１Ｌ中の結果とよく一致した。

【0102】

２．２．２ 紫外線（ＵＶ）－可視光（ｖｉｓ）吸収スペクトル

【0103】

試験粉末（Ｌ－ＮＩＢＣ－ＡｕＣｓサンプル及びＬ－ＮＩＢＣ－ＡｕＮＰｓサンプル）を超純水に濃度が１０ｍｇ・Ｌ^－１になるまで溶解し、室温でＵＶ－ｖｉｓ吸収スペクトルが測定された。走査範囲が１９０～１１００ｎｍであり、サンプルセルが光路長１ｃｍの標準石英キュベットであり、参照セルが超純水により充填された。

【0104】

異なるサイズを有する４つのＬ－ＮＩＢＣ－ＡｕＮＰｓサンプルのＵＶ－ｖｉｓ吸収スペクトルは、図１の図１Ａ、図１Ｄ、図１Ｇ及び図１Ｊに示され、粒子サイズの統計学的分布は、図１の図１Ｃ、図１Ｆ、図１Ｉ及び図１Ｌに示され、異なるサイズを有する３つのＬ－ＮＩＢＣ－ＡｕＣｓサンプルのＵＶ－ｖｉｓ吸収スペクトルは、図２の図２Ａ、図２Ｄ及び図２Ｇに示され、粒子サイズの統計学的分布は、図２の図２Ｃ、図２Ｆ及び図２Ｉに示される。

【0105】

図１で示されるように、表面プラズモン作用により、Ｌ－ＮＩＢＣ－ＡｕＮＰｓは、約５２０ｎｍで吸収ピークを有した。吸収ピークの位置は、粒子サイズに関連した。粒子サイズが３．６ｎｍである場合、ＵＶ吸収ピークが５１６ｎｍで現れ；粒子サイズが６．０ｎｍである場合、ＵＶ吸収ピークが５１７ｎｍで現れ、粒子サイズが１０．１ｎｍである場合、ＵＶ吸収ピークが５２０ｎｍで現れ、粒子サイズが１８．２ｎｍである場合、吸収ピークが５２３ｎｍで現れた。４つのサンプルは、いずれも５６０ｎｍ以上で吸収ピークを有しなかった。

【0106】

図２で示されるように、異なる粒子サイズを有するＬ－ＮＩＢＣ－ＡｕＣｓサンプルのＵＶ吸収スペクトルでは、５２０ｎｍでの表面プラズモン作用による吸収ピークがなくなり、５６０ｎｍ以上で２つの明らかな吸収ピークが現れ、吸収ピークの位置がＡｕＣｓの粒子サイズによって僅かな相違があった。これは、ＡｕＣｓが、面心立方構造の崩壊により分子のような特性を示し、ＡｕＣｓの状態密度の不連続性、エネルギー準位の分裂、プラズモン共鳴効果の消失、及び長波方向の新しい吸収ピークに繋がったためである。上記で得られた異なる粒子サイズでの３つの粉末サンプルは、いずれもリガンド結合ＡｕＣｓであったと結論付けることができる。

【0107】

２．２．３ フーリエ変換赤外線分光法

【0108】

赤外線スペクトルは、Ｂｒｕｋｅｒ製のＶＥＲＴＥＸ８０Ｖフーリエ変換赤外線分光計を利用して固体粉末高真空全反射モードで測定された。走査範囲は、４０００～４００ ｃｍ^－１であり、走査回数が６４であった。Ｌ－ＮＩＢＣ－ＡｕＣｓサンプルを例とし、試験サンプルは、異なる３つの粒子サイズを有するＬ－ＮＩＢＣ－ＡｕＣｓ乾燥粉末であり、対照サンプルは、純粋なＬ－ＮＩＢＣ粉末であった。結果は、図３に示した。

【0109】

図３は、異なる粒子サイズを有するＬ－ＮＩＢＣ－ＡｕＣｓの赤外線スペクトルを示す。純粋なＬ－ＮＩＢＣ（下部の曲線）と比較すると、異なる粒子サイズを有するＬ－ＮＩＢＣ－ＡｕＣｓのＳＨ伸縮振動は、全て、２５００～２６００ｃｍ^－１で完全に消失したが、Ｌ－ＮＩＢＣの他の特徴的なピークは、依然として残っていて、Ｌ－ＮＩＢＣ分子がＡｕ－Ｓ結合を介してＡｕＣの表面に成功に固定されていたことが証明された。この図は、リガンド結合ＡｕＣｓの赤外スペクトルがそのサイズとは無関係であることも示した。

【0110】

溶液Ｂの溶媒、ＨＡｕＣｌ４とリガンドとの仕込み比、反応時間及び添加されたＮａＢＨ４の量をわずかに調整した以外、上記方法と同様な方法で、その他のリガンドが結合したＡｕＣｓを製造した。例えば、Ｌ－システイン、Ｄ－システイン、Ｎ－イソブチリル－Ｌ－システイン（Ｌ－ＮＩＢＣ）又はＮ－イソブチリル－Ｄ－システイン（Ｄ－ＮＩＢＣ）がリガンドとして使用される場合、溶媒として酢酸が選択され、ジペプチドＣＲ、ジペプチドＲＣ又は１－［（２Ｓ）－２－メチル－３－チオール－１－オキソプロピル］－Ｌ－プロリンがリガンドとして使用される場合、溶媒として水が選択されることなど、その他のステップについても同じようにするため、更なる詳細はここで省略する。

【0111】

本発明は、前述の方法により、一連のリガンド結合ＡｕＣｓを製造して得た。リガンドと製造プロセスのパラメーターを表１に示す。

【0112】

表１．本発明において異なるリガンドにより結合されたＡｕＣｓの製造パラメーター

【0113】

表１に挙げられたサンプルは、前記方法により確認された。１１つの異なるリガンド結合ＡｕＣｓの特性を図４（ＣＲ－ＡｕＣｓ）、図５（ＲＣ－ＡｕＣｓ）、図６（Ｃａｐ－ＡｕＣｓ）（Ｃａｐは１－［（２Ｓ）－２－メチル－３－チオール－１－オキソプロピル］－Ｌ－プロリンである）、図７（ＧＳＨ－ＡｕＣｓ）、図８（Ｄ－ＮＩＢＣ－ＡｕＣｓ）、図９（Ｌ－Ｃｙｓ－ＡｕＣｓ）、図１０（ＣＳＨ－ＡｕＣｓ）、図１１（ＭＰＡ－ＡｕＣｓ）、図１２（ｐ－ＭＢＡ－ＡｕＣｓ）、図１３（ＣＤＥＶＤ－ＡｕＣｓ）、および図１３（ＤＥＶＤＣ－ＡｕＣｓ）に示す。図４Ａ～図１２Ａは、ＵＶスペクトルを示す。図４Ｂ～図１２Ｂは、赤外線スペクトルを示す。図４Ｃ～図１２Ｃは、ＴＥＭ画像を示す。図４Ｄ～図１２Ｄは、粒子サイズ分布を示す。図１３Ａおよび図１４Ａは、ＵＶスペクトルを示す。図１３Ｂおよび図１４Ｂは、ＴＥＭ画像を示す。図１３Ｃおよび図１４Ｃは、粒子サイズ分布を示す。

【0114】

その結果、表１から得られた異なるリガンドが結合したＡｕＣｓの直径は、いずれも、３ｎｍ未満であることがわかった。紫外線スペクトルは、５２０±２０ｎｍでのピークの消失、及び他の位置での吸収ピークの出現も示した。この吸収ピークの位置は、リガンド、粒子サイズ、及び構造によって異なった。特定の状況で、特殊な吸収ピークが形成されないが、主な原因は、粒子径や構造の異なるＡｕＣｓの混合物が形成されたこと、または、ある特殊なＡｕＣｓにより吸収ピークの位置が紫外線可視スペクトルの範囲外に移動されたことである。一方、フーリエ変換赤外スペクトルは、リガンドチオール赤外線吸収ピーク（図４Ｂ～図８Ｂの点線の間）の消失も示したが、他の赤外特性ピークはいずれも保持されていることから、全てのリガンド分子がＡｕＣの表面に成功に固定されており、本発明が表１に記載されたリガンドの結合したＡｕＣｓを取得することに成功したことを示した。

【0115】

実施例３． 虚血性脳卒中動物モデル実験

【0116】

３．１ 試験サンプル

【0117】

金クラスター：

【0118】

Ａ１：リガンドＬ－ＮＩＢＣ結合金クラスター（Ｌ－ＮＩＢＣ－ＡｕＣｓ）、粒子サイズ分布０．５～３．０ｎｍ；

【0119】

Ａ２：リガンドＬ－システイン結合金クラスター（Ｌ－Ｃｙｓ－ＡｕＣｓ）、粒子サイズ分布０．５～３．０ｎｍ；

【0120】

Ａ３：リガンドＮ－アセチル－Ｌ－システイン結合金クラスター（Ｌ－ＮＡＣ－ＡｕＣｓ）、粒子サイズ分布０．５～３．０ｎｍ；および

【0121】

Ａ４：リガンドＤＥＶＤＣ結合金クラスター（ＤＥＶＤＣ－ＡｕＣｓ）、粒子サイズ分布０．５～３．０ｎｍ。

【0122】

金ナノ粒子：

【0123】

Ｂ１：Ｌ－ＮＩＢＣ結合金ナノ粒子（Ｌ－ＮＩＢＣ－ＡｕＮＰｓ）、粒子サイズ分布６．１±１．５ｎｍ；および

【0124】

Ｂ２：Ｌ－ＮＡＣ結合金ナノ粒子（Ｌ－ＮＡＣ－ＡｕＮＰｓ）、粒子サイズ分布９．０±２．４ｎｍ。

【0125】

すべての試験サンプルは、上記の方法に従って調製されたがわずかな変更を加えた。それらの品質は上記の方法を使用して特徴づけられた。

【0126】

３．２ 実験プロトコル

【0127】

３．２．１ ラット中大脳動脈閉塞（ＭＣＡＯ）モデルの作製と被験物質の投与

【0128】

Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｓｈｒｅｋ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃｏ．，ＬｔｄからＳＰＦグレードの雄のＳｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）系ラット（２２０～２６０ｇ）を購入した。すべてのラットに対して、実験前に７日間の環境馴化を行った。ラットを無作為に、偽手術群、モデル対照群、金クラスター薬物Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４の低用量群（２ｍｇ／ｋｇラット体重）および高用量群（１０ｍｇ／ｋｇラット体重）、金ナノ粒子Ｂ１、Ｂ２の低用量群（２ｍｇ／ｋｇラット体重）および高用量群（１０ｍｇ／ｋｇラット体重）を含む１４群（ｎ＝１０）に分けた。実験当日、ラットは１０％クロラールハイドレート（３５０ｍｇ／ｋｇ体重）で麻酔をかけた。正中切開により、右総頸動脈、内頸動脈、外頸動脈を露出させた。ＭＣＡ領域の血液供給が遮断されるまで、縫合糸を内頸動脈（ＩＣＡ）に１８ｍｍ±０．５ｍｍ、外頸動脈（ＥＣＡ）から挿入し、脳梗塞を発症させた。１．５時間後、再灌流のために縫合糸をＥＣＡ入口まで引き抜いた。手術前と塞栓後の基本脳血流（ＣＢＦ）をフローメーターで測定した。ＣＢＦが持続的に低下した動物（ｒＣＢＦ≧７０％）を中大脳動脈閉塞（ＭＣＡＯ）成功モデルとした。再灌流後、０時間、２４時間、４８時間、７２時間にそれぞれ薬物または溶媒（通常の生理食塩水）をラットに腹腔内注射した。０時間後、２４時間後、４８時間後、７２時間後、９６時間後に神経学的行動スコアを評価した。実験は、手術後９６時間で終了した。安楽死後、脳の採取とＴＴＣ染色を行った。脳切片の画像を撮影し、脳梗塞面積の割合を算出した。

【0129】

３．２．２ 神経行動学的スコア

【0130】

０点：正常なラットと差がない。１点：右前足の伸展がまっすぐでなく、頭は反対側へ向かう。２点：オープンスペースで不連続な円を歩く。３点：オープンスペースで連続した円を歩く。４点：無意識に歩き、片側に倒れる。５点：死亡。

【0131】

３．２．３ 梗塞領域（ＴＴＣ染色）

【0132】

ラットは炭酸ガス吸入により安楽死させた。脳を採取し、脳トラフに入れて、冠状切片（２ｍｍ）にした。染色は２％ＴＴＣを用い、室温で暗所にて行った。写真撮影後、ＩｍａｇｅＪで梗塞面積を解析した。梗塞面積の割合（％）＝（対側半球面積－（同側半球面積－梗塞面積））／対側半球面積×１００％とした。

【0133】

３．２．４ 統計解析

【0134】

統計解析は、Ｇｒａｐｈ Ｐａｄ Ｐｒｉｓｍ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ７．０（ＣＡ，ＵＳ）により行った。データは平均値±標準誤差で表し、統計解析はＤｕｎｎｅｔｔ検定により行った。Ｐ＜０．０５は、統計的に有意であることを示す。

【0135】

３．３ 結果

【0136】

３．３．１ 脳虚血領域における脳血流量

【0137】

ラット脳血流量が７０％以上減少（脳血流量減少、ｒＣＢＦ≧７０％）することは、ＭＡＣＯモデルの作製に成功したことを示す。偽手術群を除いだ各群でｒＣＢＦは７０％以上、平均約８０％であり、ＭＣＡＯモデルの作製に成功したことを示す。

【0138】

３．３．２ 各薬物のラット神経行動への影響

【0139】

図１５は、各群のラットの神経学的行動スコアを示す（各時点のヒストグラムにおいて、左から右へ順に、偽手術群（ブランク）、モデル対照群、Ａ１低用量群、Ａ１高用量群、Ａ２低用量群、Ａ２高用量群、Ａ３低用量群、Ａ３高用量群、Ａ４低用量群、Ａ４高用量群、Ｂ１低用量群、Ｂ１高用量群、Ｂ２低用量群 およびＢ２高用量群）。偽手術群のラットは神経学的行動が正常であり、行動スコアは０であった。モデル対照群のラットは、手術後０時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間に重度の行動機能障害を示した（偽手術群と比較、Ｐ＜０．００１、＃）。モデル対照群と比較して、Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４低用量群および高用量群の神経学的行動スコアは、手術後２４時間において有意な改善が見られなかった。術後４８時間で、Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４低用量群および高用量群の神経学的行動スコアは低下し始めたが、統計的な差はなかった（モデル対照群との比較、Ｐ＞０．０５）。術後７２時間では、４つの薬物の神経学的行動スコアがさらに低下し、中でもＡ１低用量群、Ａ１高用量群、Ａ２高用量群には有意差が認められた（モデル対照群と比較、Ｐ＜０．０５、＊）。また、術後９６時間では、４つの薬物の低用量群、高用量群のいずれにも有意差が認められた（モデル対照群と比較、Ｐ＜０．０５、＊）。これらの結果から、４種類の金クラスター薬物はいずれも虚血性脳卒中によって引き起こされる神経行動障害を有意に改善することができ、その効果はある程度用量依存的であることが示唆された。

【0140】

モデル対照群と比較して、金ナノ粒子Ｂ１およびＢ２の低用量群および高用量群は、術後２４時間、４８時間、７２時間および９６時間において、ＭＡＣＯモデルラットの神経行動スコアを有意に改善することが認められなかったことから、金ナノ粒子は虚血性脳卒中による行動障害を有意に改善することができないことが示された。

【0141】

３．３．３ ＭＡＣＯモデルラットの脳梗塞部位に対する各薬物の影響

【0142】

図１６は、各群のラットの脳梗塞面積の割合を示す（ヒストグラムにおいて、左から右へ順に、偽手術群（ブランク）、モデル対照群、Ａ１低用量群、Ａ１高用量群、Ａ２低用量群、Ａ２高用量群、Ａ３低用量群、Ａ３高用量群、Ａ４低用量群、Ａ４高用量群、Ｂ１低用量群、Ｂ１高用量群、Ｂ２低用量群 およびＢ２高用量群）。偽手術群では、脳組織は正常で梗塞は発生せず、梗塞面積は０％であった。モデル対照群では、梗塞面積は４４．７％±４．５％（Ｐ＜０．００１、###）であった。モデル対照群と比較して、Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４低用量群および高用量群の脳梗塞面積の割合は明らかに減少したが、低用量群では有意差はなく、高用量群で有意差が認められた（モデル対照群と比較、Ｐ＜０．０５、＊）。Ａ１を例にとると、低用量群の梗塞面積は４４．７±４．５％から３６．０±４．０％に減少し（モデル対照群と比較、Ｐ＞０．０５）、高用量群の梗塞面積は２７．８±３．４％に減少（モデル対照群と比較、Ｐ＜０．０５、＊）した。

【0143】

図１７は、金クラスター薬物と金ナノ粒子投与後のＭＣＡＯラットの脳組織の例示的ＴＴＣ染色画像である。図１７において、図１７Ａ：偽手術群；図１７Ｂ：モデル対照群；図１７Ｃ：Ａ１低用量群；図１７Ｄ：Ａ１高用量群；図１７Ｅ：Ｂ１低用量群；図１７Ｆ：Ｂ１高用量群。図１７からわかるように、偽手術群のラットには脳梗塞がなかったが、モデル対照群には大きな脳梗塞（右側の白い部分）があった。Ａ１剤の低用量投与により脳梗塞の面積は減少し（右側の白い部分が減少）、Ａ１剤の高用量投与により脳梗塞の面積は大幅に減少し（右側の白い部分が大幅に減少）、Ｂ１剤の低用量及び高用量投与は脳梗塞の面積に影響を与えなかった（右側の白い部分が減少しなかった）。Ａ２、Ａ３、Ａ４はＡ１と同様の梗塞面積の減少効果を示し、Ｂ２はＢ１と同様で梗塞面積の減少効果はなかった。

【0144】

他のリガンド結合ＡｕＣｓも虚血性脳卒中治療において同様の効果を示すが、その効果は一定程度に異なる。これらについては、ここでは詳しく説明しない。

【0145】

実施例４．出血性脳卒中動物モデル実験

【0146】

４．１ 材料および方法

【0147】

４．１．１ 被験薬物

【0148】

薬物Ａ：Ｌ－ＮＩＢＣ修飾金ナノクラスター（Ｌ－ＮＩＢＣ－ＡｕＣｓ）、金コアの直径０．５～３．０ｎｍ;

【0149】

薬物Ｂ：Ｌ－Ｃｙｓ修飾金ナノクラスター（Ｌ－Ｃｙｓ－ＡｕＣｓ）、金コアの直径０．５～３．０ｎｍ。

【0150】

４．１．２ 動物および群分け

【0151】

１４０匹のＳＤ系雌ラット（８週齢、１９０～２２０ｇ）をＳＰＦで７日間適応的に飼育した後、７つの群に無作為に分けた。

【0152】

（１）正常対照（ＮＣ）群、２０匹ラット、平均体重２１４．０±５．１ｇ;

【0153】

（２）偽手術（ＳＨＡＭ）群、２０匹ラット、平均体重２１３．５±６．５ｇ;

【0154】

（３）モデル対照（ＩＶＨ）群、２０匹ラット、平均体重２１４．７±６．１ｇ;

【0155】

（４）薬物Ａの低用量（４ｍｇ／ｋｇ体重）投与（ＡＬ）群、２０匹ラット、平均体重２１２．５±７．３ｇ;

【0156】

（５）薬物Ａの高用量（１０ｍｇ／ｋｇ体重）投与（ＡＨ）群、２０匹ラット、平均体重２１２．１±６．８ｇ;

【0157】

（６）薬物Ｂの低用量（４ｍｇ／ｋｇ体重）投与（ＢＬ）群、２０匹ラット、平均体重２１３．２±６．３ｇ；および

【0158】

（７）薬物Ｂの高用量（１０ｍｇ／ｋｇ体重）投与（ＢＨ）群、２０匹ラット、平均体重２１１．２±７．１ｇ。

【0159】

群同士の間では、体重に有意な差異はなかった。

【0160】

４．１．３ モデリング、薬物投与、および試験プロトコル

【0161】

ラットの心室内出血（ＩＶＨ）モデルの作製

【0162】

ＩＶＨ群および各薬物投与群のラットを、２％のバルビツール（５０ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注射によって麻酔した。麻酔後、頭部の皮膚を消毒し、ラットを伏臥位のステレオロケータ上に固定した。ステレオロケータを調整することによって、ラットの切歯を切歯フックに固定し、前方および後方の泉門は同じ高さになるようにした。その後、ラットの頭が動かないように、イヤーロッドを調整し、固定した。ラットの頭部の皮膚と毛皮を消毒した後、ラット頭部の中央で皮膚を切開し、３％の過酸化水素で骨膜を剥離し、前方および後方の泉門と冠状縫合を露出させた。硬膜及び脳組織を損傷させることなく、大泉門の０．２ｍｍ後方、正中線の３ｍｍ横に、歯科用ドリルで直径約１ｍｍの小孔を開けた。次いで、ラットの尾を４０℃の温水で洗浄した。充血後、ラットの尾をエタノールで消毒し、１ｍｌのシリンジで５０μｌの非抗凝固性動脈血を採取した。血液の入ったシリンジをステレオロケータに固定した。マイクロシリンジを孔を通して６ｍｍの深さまで挿入し、自己動脈血を２回注入した。１０μｌの動脈血を均等に注入して、血の注入を２分間停止させ、再び４０μｌの動脈血を均等にゆっくりと注入し、針を４分間留まらせ、針を約２．０ｍｍ引き抜き、再び針を４分間停止させ、その後、注射器を完全にゆっくりと引き抜いた。切開を縫合した後、滅菌綿球をで圧迫し止血した。ラットを毎日チェックし、創傷治癒と感染の可能性を観察した。

【0163】

ラットの挙動は、ラットが目覚めた後に観察された。ｍＮＳＳ神経機能スコアを用いてラットのモデリングを評価した。手術後、１日目、２日目、３日目、４日目、５日目、６日目、７日目の毎日腹腔内注射により薬物を投与し、投与量はＡＬ群が４ｍｇ／ｋｇ体重、ＡＨ群が１０ｍｇ／ｋｇ体重とした。ＮＣ群およびＳＨＡＭ群のラットには、対応する時点で同量の生理食塩水を腹腔内に注射した。すべてのラットは、腹腔内注射後１２時間、２４時間、３日目、５日目、７日目にｍＮＳＳスコアで評価された。

【0164】

４．１．４ エバンスブルー染色による血液脳関門の透過性の測定

【0165】

処理されたラットは、エバンスブルー染色（０．５％）で静脈注射し、ラットの眼および皮膚が青くなった。０．５～１時間後、ラットを犠牲にして脳組織を取り出した。脳組織を１．５ｍｌの遠沈管に入れ、１ｍｌのＰＢＳを添加し、組織ホモジナイザーで脳組織を迅速にホモジナイズし、遠心分離した。上清を取り出し、同じ量のトリクロロ酢酸を添加し、４℃でインキュベートした。１５分間遠心分離した。上清を取り出し、分光光度計で６２０ｎｍの吸光度値（ＯＤ値）を測定した。同時に、既知の異なる勾配を有する標準エバンスブルーのＯＤ値を測定し、標準曲線を描いた。標準曲線に従って、被験サンプルのエバンスブルー含有量を算出した。

【0166】

４．１．５ 脳含水量の測定

【0167】

乾湿重量法が採用された。虚血再灌流から２４時間後、ラットに過剰な麻酔をかけた。断頭後、脳を取り出して、嗅球、小脳、低脳幹を摘出し、左右の大脳半球を分離し、直ちに重量を測定し、湿重量を記録した。次いで、脳組織を１１０℃の電気オーブンで２４時間乾燥させ、乾燥した脳組織を速やかに秤量して乾燥重量を記録した。算出された脳含水率（％）＝（湿重量－乾燥重量）／湿重量×１００％とした。

【0168】

４．１．６ Ｈ&Ｅ染色

【0169】

脳組織を取り出し、包埋箱（embedding boxes）に入れた。脱水、透明化、ワックス浸漬、包埋、スライス、ベーキングの各工程を順次行った後、Ｈ&Ｅ染色を行った。オーブンからスライスを取り出し、キシレンで２回、各回１５分間処理した後、それぞれ１００％、９５％、８０％、７０％エタノールで５分間処理し、超純水で２回、各回５分間処理して脱ろう工程を完了した。ヘマトキシリン染料で５分間染色後、超純水で３回洗浄し、水道水で１０分間洗浄し、細胞核が青色に変化した後、０．５％のエオシン染料で５分間染色し、水道水で５回洗浄し、６０℃のオーブンで乾燥させ、最後に中性樹脂で封止した。光学顕微鏡を用いて２００倍の視野で観察し、画像を収集した。

【0170】

４．１．７ 免疫蛍光（ＩＦ）染色

【0171】

ラットの脳組織を取り出し、包埋箱に入れた。脱水、透明化、ワックス浸漬、包埋、スライス、ベーキングの各工程を順次実施した。スライスをオーブンから取り出して脱ろうした。その後、抗原修復、洗浄、透過、ｉＮＯＳ一次抗体処理、ヤギ抗ウサギ二次抗体処理、およびＤＡＰＩ染色の工程を実施した。最終工程は乾燥し、封止した。蛍光顕微鏡を用いて、２００倍の視野の下で観察し画像を収集した。

【0172】

４．１．８ ウェスタンブロット（ＷＢ）

【0173】

まず、タンパク質サンプルを調製した。冷凍された組織を冷蔵庫から取り出し、適量の組織を秤量し、１：９の比に従ってプロテアーゼ阻害剤を含む溶解緩衝液を添加し、全ての組織片が破壊されるまで４℃で振盪した。サンプルを氷に２０分間静置した後、１２０００ｒｐｍ、４℃で２０分間遠心分離し、上清を回収した。ＢＣＡタンパク質濃度アッセイキットを用いて、各サンプルのタンパク質濃度を測定した。濃度測定の結果に応じてタンパク質濃度を調整することにより、異なる群間のタンパク質濃度の整合性を確保した。９５℃で５分間煮沸した後、サンプルを投入し、残りのサンプルを－８０℃で保存した。

【0174】

そして、以下の工程に従ってＷＢを行った。

【0175】

電気泳動ゲルの調製：洗浄および乾燥ガラス板を洗浄および乾燥した後、ゲル製造器上に固定し、その後、分離ゲルを調製し、分離ゲルをガラス板の間隙に適切な高さまで注入し、ゲルが完全に重合されるまで分離ゲルを無水エタノールで被覆した。無水エタノールを注ぎ、二重の蒸留水で緩やかに洗浄した後、フィルター紙で吸引して乾燥させた。次いで、濃縮ゲルを適切な高さに添加し、櫛を挿入した。濃縮ゲルを完全に重合させた後、櫛を取り出した。

【0176】

電気泳動：処理されたサンプルを合計４０μｇの量で装填した。電気泳動は、濃縮ゲル用８０Ｖ、分離ゲル用１２０Ｖ、定電圧電源で行い、標的タンパク質の位置は、染色前マーカーと標的タンパク質の分子量の相対位置に応じて決定した。標的タンパク質が分離ゲルの下１／３の最良の分解能位置にあった場合、電気泳動分離は停止された。

【0177】

膜転写：カットＰＶＤＦ膜をメタノール中に１０秒間浸漬した後、新しい膜転写溶液に入れて使用する。ゲルを取り出し、マーカーにしたがって標的ストリップを切断し、蒸留水でリンスし、同じサイズのＰＶＤＦフィルムおよび濾紙をＰＡＧＥゲルで切断し、ＰＶＤＦフィルムおよび濾紙を電解移送バッファに浸漬した。黒色版－繊維マット－フィルター紙－ゲル－ＰＶＤＦ膜－フィルター紙－繊維マット－白色板の順に、これらを順次挟持して膜転写装置に入れ、黒色板側を黒負極に接続した。電解移送タンクに膜移送バッファを充填し、膜移送を開始した。この工程を４℃で行い、条件を２００ｍＡ、９０分間（０．４５μｍ膜）または２００ｍＡ、６０分間（０．２５μｍ膜）とした。

【0178】

ブロッキング：膜をＴＢＳＴで３回洗浄した後、ミルクを含むＴＢＳＴブロッキング溶液で室温、振とう台上で２時間ブロッキングした。

【0179】

一次抗体：対応する一次抗体を３％ＢＳＡを含むＴＢＳＴで希釈し、ＰＶＤＦ膜を一次抗体培養液に浸漬し、４℃で一晩インキュベートした。ＭＭＰ９は１：１０００、ｉＮＯＳは１：２０００で希釈し、インキュベーション後、ＰＶＤＦ膜をＴＢＳＴで各１０分間、３回洗浄し、過剰な一次抗体を除去した。

【0180】

二次抗体：ＨＲＰ標識された二次抗体（１：５０００）をブロッキング溶液で希釈し、ＰＶＤＦ膜を二次抗体培養液に浸漬し、室温で１時間インキュベートし、インキュベーション後、ＰＶＤＦ膜をＴＢＳＴで各１０分間、３回洗浄し、過剰な二次抗体を除去した。

【0181】

露光：ＥＣＬキットから安定なペルオキシダーゼ溶液を１：１の割合で混合して加工液を調製し、適量の加工液をＰＶＤＦフィルム上に滴下し、自動化学発光画像解析システムで露光した。

【0182】

露光後、ＴＢＳＴを用いてＰＶＤＦ膜を各５分間、３回洗浄し、適量の膜再生溶液を加えて、ＰＶＤＦ膜を膜再生溶液に浸漬し、室温で２０分間振とう台上に溶出することにより、膜の再生を行った。溶出後、ＴＢＳＴを用いてＰＶＤＦ膜を各５分間、３回完全に洗浄し、過剰な膜再生溶液を除去した。

【0183】

第２のブロッキング、内部コントロールインキュベーション、二次抗体結合および曝露のための特定のプロセスは、上記の実験プロセスと同じであり、ここで、β－チューブリンおよびＧＡＰＤＨの両方は、１：５０００の比で希釈された。

【0184】

露光の結果をＩｍａｇｅ Ｊソフトウェアにより解析した。

【0185】

４．１．９ 脂質過酸化アッセイ

【0186】

サンプルの調製：ＰＢＳを組織（ｗ／ｖ：１：９）に添加し、完全にホモジナイズし、氷上で１０分間インキュベートし、４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、アッセイ用の上清を取り出した。

【0187】

マロンジアルデヒド（ＭＤＡ）キットをアッセイに使用した。ブランクチューブ、標準チューブ、測定チューブおよび対照チューブを、説明書に従って準備した。５３２ｎｍにおける吸光度（ＯＤ）値を検出した。上清中のＭＤＡの含有量は、ＭＤＡ含有量（ｎｍｏｌ／ｍｌ）＝（測定ＯＤ値－対照ＯＤ値）／（標準ＯＤ値－ブランクＯＤ値）×標準濃度（１０ｎｍｏｌ／ｍｌ）として算出した。

【0188】

４．１．１０ スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）指標のアッセイ

【0189】

サンプルの調製：ＰＢＳを組織（ｗ／ｖ：１：９）に添加し、完全にホモジナイズし、氷上で１０分間インキュベートし、４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、アッセイ用の上清を取り出した。

【0190】

ＳＯＤキットを、説明書に従ってアッセイに使用した。以下の式に従って算出した：ＳＯＤ阻害率（％）＝（（対照ウェルのＯＤ値－対照ブランクウェルのＯＤ値）－（測定ウェルのＯＤ値－測定ブランクウェルのＯＤ値））／（対照ウェルのＯＤ値－対照ブランクウェルのＯＤ値）×１００％；ＳＯＤ活性（Ｕ／ｍｇｐｒｏｔ）＝ＳＯＤ阻害率÷５０％×反応系の希釈倍率÷サンプルのタンパク質濃度（ｍｇｐｒｏｔ／ｍｌ）。

【0191】

４．１．１１ 電子顕微鏡検査

【0192】

組織ブロックを約１立方ミリメートルとした。固定、脱水、包埋および硬化後、組織ブロックを、厚さ７０ｎｍのスライスに超薄スライサーでスライスした。次いで、２％ウリル酢酸鉛－クエン酸鉛を用いてスライスを二重染色した。透過型電子顕微鏡を用いて写真を観察し、撮影した。

【0193】

４．２ 結果

【0194】

図１８が、モデリング化完了後の異なる時点でのｍＮＳＳ神経機能スコアの結果を示す。ここで、ＮＣ：正常対照群；ＳＨＡＭ：偽手術群；ＩＶＨ：モデル対照群；ＡＬ：薬物Ａ低用量投与群；ＡＨ：薬物Ａ高用量投与群；ＢＬ：薬物Ｂ低用量投与群；ＢＨ：薬物Ｂ高用量投与群。

【0195】

図１８Ａに示されるように、結果として、モデリング後１２時間、神経機能の平均ｍＮＳＳスコア：正常対照（ＮＣ）群（０．０±０．０）、偽手術（ＳＨＡＭ）群（０．０±０．０）、モデル対照（ＩＶＨ）群（１４．７±１．２）、薬物Ａ投与低用量（ＡＬ）群（１４．７±１．０）、薬物Ａ投与高用量（ＡＨ）群（１４．４±１．１）および薬物Ｂ投与低用量（ＢＬ）群（１４．７±１．３）、薬物Ｂ投与高用量（ＢＨ）群（１４．７±１．１）。ＩＶＨ群と比較して、ＮＣ群およびＳＨＡＭ群において有意な差異が存在したが（Ｐ＜０．００１、＊＊＊）、ＩＶＨ群と比較して、その他の群において有意な差異が存在しなかった。

【0196】

図１８Ｂに示されるように、結果として、モデリング後１日目、神経機能の平均ｍＮＳＳスコア：ＮＣ群（０．０±０．０）、ＳＨＡＭ群（０．０±０．０）、ＩＶＨ群（１４．３±１．３）、ＡＬ群（１４．６±１．１）、ＡＨ群（１４．３±１．０）、ＢＬ群（１４．９±０．９）、ＢＨ群（１４．３±１．０）。ＩＶＨ群と比較して、ＮＣ群およびＳＨＡＭ群およびＩＶＨ群において有意な差異が存在したが（Ｐ＜０．００１、＊＊＊）、ＩＶＨ群と比較して、その他の群において有意な差異が存在しなかった。

【0197】

図１８Ｃに示されるように、結果として、モデリング後２日目、神経機能の平均ｍＮＳＳスコア：ＮＣ群（０．０±０．０）、ＳＨＡＭ群（０．０±０．０）、ＩＶＨ群（１１．０±０．９）、ＡＬ群（８．６±１．５）、ＡＨ群（７．７±１．７）、ＢＬ群（９．９±１．８）、ＢＨ群（１０．２±１．９）。ＩＶＨ群と比較して、ＮＣ群、ＳＨＡＭ群、ＡＬ群およびＡＨ群において有意な差異が存在した（Ｐ＜０．００１、＊＊）。しかしながら、ＩＶＨ群と比較して、ＢＬおよびＢＨ群が、それらのｍＮＳＳスコアがＩＶＨ群よりも低いものの、有意な差異が存在しなかった。

【0198】

図１８Ｄに示されるように、結果として、モデリング後４日目、神経機能の平均ｍＮＳＳスコア：ＮＣ群（０．０±０．０）、ＳＨＡＭ群（０．０±０．０）、ＩＶＨ群（８．０±１．５）、ＡＬ群（６．０±１．８）、ＡＨ群（６．１±１．７）、ＢＬ群（７．２±１．８）、ＢＨ群（７．０±１．８）。ＩＶＨ群と比較して、ＢＬおよびＢＨ群が、有意な差異が存在しなかったが、すべてのその他の群が、有意な差異が存在した（Ｐ＜０．００１、＊＊）。

【0199】

図１８Ｅに示されるように、結果として、モデリング後７日目、神経機能の平均ｍＮＳＳスコア：ＮＣ群（０．０±０．０）、ＳＨＡＭ群（０．０±０．０）、ＩＶＨ群（５．４±１．７）、ＡＬ群（２．９±０．９）、ＡＨ群（２．８±１．０）、ＢＬ群（４．５±１．８）、ＢＨ群（４．１±１．６）。ＩＶＨ群と比較して、ＢＬおよびＢＨ群が、有意な差異が存在しなかったが、すべてのその他の群が、有意な差異が存在した（Ｐ＜０．００１、＊＊）。

【0200】

結果として、異なる用量の薬物Ａが、モデリング後２日目からＩＶＨラットのｍＮＳＳ神経機能スコアを有意に改善することができ、薬物ＡがＩＶＨラットの治療において優れた効果を有したことを示す。しかしながら、薬物Ｂは、２日目から、ｍＮＳＳスコアがＩＶＨ群のｍＮＳＳスコアよりも低かったが、有意差（Ｐ＞０．０５）がなく、ＩＶＨモデルラットの治療において、薬物Ｂが有効でなかったことを示した。

【0201】

ＩＶＨモデルラットに対する薬物Ａの治療効果をさらに研究するために、複数の視点から研究を行った。

【0202】

図１９は、血液脳関門（ＢＢＢ）の透過性を測定するためのエバンスブルー染色の結果を示す。エバンスブルー染色後、ＩＶＨ群におけるエバンスブルーの含有量は、ＮＣ及びＳＨＡＭ群よりも有意に高かった（Ｐ＜０．００１、＊＊＊）ことが分かる。低用量投与（ＡＬ）群および高用量投与（ＡＨ）群のラットの脳組織におけるエバンスブルーの含有量は、ＩＶＨ群よりも有意に低かった（Ｐ＜０．０５、＊；Ｐ＜０．０１，＊＊）。結果として、ＩＶＨモデリングがラットにおける血液脳関門の透過性を有意に増加させたことを示し、薬物Ａの低用量および高用量投与の両方がＩＶＨモデリングによって引き起こされる血液脳関門の増加した透過性を有意に改善することができたことを示す。

【0203】

ＩＶＨモデリングによって引き起こされる脳浮腫は、頭蓋内圧、脳のヘルニアおよび動物の死の増加の重要な原因である。乾湿重量法を用いてラット脳組織の含水量を検出することにより、ラット脳浮腫の状況を評価することができる。図２０は、乾湿重量法により測定されたラット脳組織中の含水量の結果を示す。分析により、ＮＣ群およびＳＨＡＭ群における脳組織の含水量は、ＩＶＨモデルラットに比べて有意に低く（Ｐ＜０．００１、＊＊＊）、薬物Ａ低用量投与（ＡＬ）群および高用量投与（ＡＨ）群における脳組織の含水率は、ＩＶＨ群よりも有意に低かった（Ｐ＜０．０５、＊；Ｐ＜０．０１，＊＊）ことが分かる。結果として、薬物Ａ低用量および高用量投与の両方がＩＶＨモデリングによって引き起こされる脳浮腫を有意に改善することができ、動物の予後を改善したことを示す。

【0204】

図２１は、Ｈ&Ｅ染色の例示的な画像を示す。結果として、ＮＣ群における血管および細胞の周囲にいくつかの間隙（図２１Ａ）、ＳＨＡＭ群におけるわずかな損傷（図２１Ｂ）、およびＩＶＨ群における血管および細胞の周囲の間隙を、細胞変性および液胞で明らかに拡大し、重度の脳損傷を示す（図２１Ｃ）。薬物Ａの低用量（ＡＬ）投与（図２１Ｄ）および高用量（ＡＨ）投与（図２１Ｅ）は、ＩＶＨモデルラットの脳損傷を有意に低減することができる。

【0205】

傷害誘導一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）は、脳損傷後に発現される。図２２は、ラット脳組織におけるｉＮＯＳ免疫蛍光染色の例示的な画像を示す。ＩＶＨ群におけるｉＮＯＳの正の発現（図２２Ｃ）は、相対的に高いことが分かる。ＮＣ群（図２２Ａ）、ＳＨＡＭ群（図２２Ｂ）、ＡＬ群（図２２Ｄ）およびＡＨ群（図２２Ｅ）を含む他の群におけるｉＮＯＳの発現は、ＩＶＨ群に比べて異なる度合いで減少した。これはＩＶＨモデリング後のラット脳組織におけるｉＮＯＳの発現が増加し、薬物Ａの低用量投与及び高用量投与がいずれもｉＮＯＳの発現を低減し、脳損傷に対して保護効果を発揮したことを示す。

【0206】

ゼラチナーゼＢ（ＭＭＰ９）は、正常脳組織における発現がないか又は低発現である。しかしながら、ＩＶＨモデリングによる脳損傷の後、ＭＭＰ９は、血液脳関門を破壊することによって、血管新生脳浮腫および他の脳損傷のプロセスにおいて重要な役割を果たす。図２３は、各群のラットの脳組織におけるＭＭＰ９タンパク質の発現を示す。図２３Ａは、ＷＢ試験から得られた６並列サンプルのＭＭＰ９タンパク質バンドを示す。図２３Ｂは、ＭＭＰ９（ＧＡＰＤＨを群準とする）の相対タンパク質発現を示す。ＮＣ群、ＳＨＡＭ群、ＡＬ群、ＡＨ群の脳組織におけるＭＭＰ９の相対発現は、ＩＶＨ群よりも有意に低い（Ｐ＜０．０５、＊）ことが分かる。これらの結果から、低用量および高用量の薬剤Ａが、モデルラットの脳損傷によって誘導されたＭＭＰ９タンパク質の発現増加を有意に抑制できることを示しており、薬剤Ａが脳損傷に対して保護作用を有することを示している。

【0207】

マロンジアルデヒド（ＭＤＡ）は、フリーラジカルと細胞膜の不飽和脂肪酸との間の過酸化反応の最終産物である。それは脂質酸化損傷の重要なバイオマーカーである。ＭＤＡは、組織過酸化損傷の程度を間接的に反映することができる。そのレベルは、脳卒中の病因における臨床症状の重症度に密接に関連しており、脳卒中の診断、治療および予後において重要な臨床的意義を有する。図２４は、各群のラットの脳組織におけるＭＤＡの発現を示す。ＮＣ、ＳＨＡＭ、ＡＬ、ＡＨ群におけるＭＤＡ発現はＩＶＨ群のＭＤＡ発現よりも有意に低く、ＩＶＨモデリングに起因する脳損傷が脳内のＭＤＡ発現の有意な増加を引き起こしたが（ＩＶＨ群と比較して、ＮＣ群およびＳＨＡＭ群において、Ｐ<０．００１）、低、高用量の薬物Ａ投与では、脳損傷に関連するＭＤＡ発現（ＩＶＨ群と比較して、それぞれ、Ｐ＜０．０１、＊＊および０．００１、＊＊＊）を有意に減少させたことができる。

【0208】

スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）は、体内の最も有効なフリーラジカル捕捉酵素である。体内で生成されたＳＯＤは、体内のフリーラジカルの状況を反映させることができる。出血性脳卒中脳組織におけるＳＯＤの発現および活性は、通常の脳組織に比べて有意に低いことが示されている。図２５は、各群におけるラットの脳組織におけるＳＯＤの発現レベルを示す。結果は、ＮＣ、ＳＨＡＭ、ＡＬ及びＡＨ群のＳＯＤの発現レベルがＩＶＨ群の発現レベルよりも有意に高いことを示し、ＩＶＨモデリングに起因する脳損傷は、脳内のＳＯＤ発現の有意な減少に起因する脳損傷（ＩＶＨ群と比較して、ＮＣ群およびＳＨＡＭ群の両方：Ｐ＜０．００１、＊＊＊）であり、一方、薬物Ａの低用量及び高用量の投与は、脳内のＳＯＤ発現を有意に増加させることができる（ＩＶＨ群と比較して、Ｐ＜０．００１、＊＊＊）。

【0209】

図２６が、脳組織の超薄切片の透過型電子顕微鏡検査の結果を示す。

【0210】

図２６Ａに示されるように、ＮＣ群では、グリア細胞の形態が、正常またはわずかに不規則であり；核（Ｎ）が、不規則に楕円形であり；細胞質中のミトコンドリア（Ｍ）が、短い丸形または短い棒状であり、構造的に完全であり、わずかに内側隆起があり；および小胞体（ＥＲ）がわずかに膨張していた。

【0211】

図２６Ｂに示されるように、ＳＨＡＭ群では、グリア細胞の形態が、わずかに不規則であり；核（Ｎ）が、楕円形であり；細胞質中のミトコンドリア（Ｍ）が、内側隆起を持つダンベル形であり；および小胞体（ＥＲ）が、わずかに膨張していた。

【0212】

に示されるように図２６Ｃ、ＩＶＨ群では、グリア細胞の形態が、不規則であり；（Ｎ）が、不規則であり；細胞質中のミトコンドリア（Ｍ）が、丸形であり、および明らかに膨潤していて；小胞体（ＥＲ）が、明らかに膨張していて；およびオートファジー体（ＡＰ）が視認され；ＩＶＨ モデリングが脳組織の細胞の重大な損傷をもたらすことを示した。

【0213】

図２６Ｄに示されるように、Ａｌ群では、グリア細胞の形態が、わずかに不規則であり；核（Ｎ）が、楕円形であり；細胞質中のミトコンドリア（Ｍ）が、丸形または楕円形であり、わずかに膨潤していて、一部の破断した内部隆起があり；小胞体（ＥＲ）が、わずかに膨張していて、および少量のリポフスチン（Ｌ）が見られ；低用量の薬物Ａ投与ＩＶＨモデリングによって引き起こされた脳組織の細胞損傷を改善または修復することができたことを示す。

【0214】

図２６Ｅに示されるように、ＡＨ群では、グリア細胞の形態が、基本的に規則またはわずかに不規則であり；核（Ｎ）が、楕円形であり；細胞質中のミトコンドリア（Ｍ）が、明確な内側隆起および完全な構造を有する楕円形または長棒状であり、小胞体（ＥＲ）はわずかに膨張し、少量のリポフスチン（Ｌ）がいくつかの部分で見られた。高用量の薬物Ａ投与により、ＩＶＨモデリングに起因する脳組織の細胞損傷を改善または修復することができ、ＮＣ群とＡＨ群との間の脳組織細胞の差異が少ないことを示す。

【0215】

上記の結果から、Ｌ－ＮＩＢＣをリガンドとする金クラスターは、出血性脳卒中の治療に対して予期せぬ治療効果を有し、出血性脳卒中の治療薬の開発にも使用することができることが実証された。

【0216】

特定の実施形態を参照して本発明を説明したが、実施形態は例示であり、本発明の範囲はこれに限定されないことが理解される。本発明の代替の実施形態は、本発明が関連する当業者には明らかになる。このような代替実施形態は、本発明の範囲内に包含されると考えられる。したがって、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によって定義され、上記の説明によって支持される。

[参考文献]
Amani H,Mostafavi E,Mahmoud Reza Alebouyeh MR,Arzaghi H,Akbarzadeh A Pazoki-Toroudi H,Webster TJ. Would Colloidal Gold Nanocarriers Present An Effective Diagnosis Or Treatment For Ischemic Stroke？Int J Nanomedicine.2019 Oct 7;14:8013-8031.

Zheng Y,Wu Y,Liu Y,Guo Z,Bai T,Zhou P,Wu J,Yang Q,Liu Z,Lu X.Intrinsic Effects of Gold Nanoparticles on Oxygen-Glucose Deprivation/Reperfusion Injury in Rat Cortical Neurons.Neurochem Res.2019 Jul;44(7):1549-1566.

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26】

【手続補正書】

【提出日】2023-07-25

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【請求項1】

対象の脳卒中を治療するための医薬組成物であって、リガンド結合金クラスターを含み、前記リガンド結合金クラスターが、
金コアと、
前記金コアに結合したリガンドとを含み、
前記脳卒中が、出血性脳卒中、虚血性脳卒中、および一過性虚血発作（ＴＩＡ）からなる群より選ばれる、医薬組成物。

【請求項2】

請求項１記載の医薬組成物であって、前記金コアの直径が、０．５～３ｎｍである、医薬組成物。

【請求項3】

請求項１記載の医薬組成物であって、前記金コアの直径が、０．５～２．６ｎｍである、医薬組成物。

【請求項4】

請求項１記載の医薬組成物であって、前記リガンドが、Ｌ－システインとその誘導体、Ｄ－システインとその誘導体、システイン含有オリゴペプチドとそれらの誘導体、およびその他のチオール含有化合物からなる群より選ばれる一つである、医薬組成物。

【請求項5】

請求項４記載の医薬組成物であって、前記Ｌ－システインとその誘導体が、Ｌ－システイン、Ｎ－イソブチリル－Ｌ－システイン（Ｌ－ＮＩＢＣ）、およびＮ－アセチル－Ｌ－システイン（Ｌ－ＮＡＣ）からなる群より選ばれ、前記Ｄ－システインとその誘導体が、Ｄ－システイン、Ｎ－イソブチリル－Ｄ－システイン（Ｄ－ＮＩＢＣ）、およびＮ－アセチル－Ｄ－システイン（Ｄ－ＮＡＣ）からなる群より選ばれる、医薬組成物。

【請求項6】

請求項４記載の医薬組成物であって、前記システイン含有オリゴペプチドとそれらの誘導体が、システイン含有ジペプチドであり、前記システイン含有ジペプチドが、Ｌ（Ｄ）－システイン－Ｌ（Ｄ）－アルギニンジペプチド（ＣＲ）、Ｌ（Ｄ）－アルギニン－Ｌ（Ｄ）－システインジペプチド（ＲＣ）、Ｌ（Ｄ）－ヒスチジン－Ｌ（Ｄ）－システインジペプチド（ＨＣ）、およびＬ（Ｄ）－システイン－Ｌ（Ｄ）－ヒスチジンジペプチド（ＣＨ）からなる群より選ばれる、医薬組成物。

【請求項7】

請求項４記載の医薬組成物であって、前記システイン含有オリゴペプチドとそれらの誘導体が、システイン含有トリペプチドであり、前記システイン含有トリペプチドが、グリシン－Ｌ（Ｄ）－システイン－Ｌ（Ｄ）－アルギニントリペプチド（ＧＣＲ）、Ｌ（Ｄ）－プロリン－Ｌ（Ｄ）－システイン－Ｌ（Ｄ）－アルギニントリペプチド（ＰＣＲ）、Ｌ（Ｄ）－リシン－Ｌ（Ｄ）－システイン－Ｌ（Ｄ）－プロリントリペプチド（ＫＣＰ）、およびＬ（Ｄ）－グルタチオン（ＧＳＨ）からなる群より選ばれる、医薬組成物。

【請求項8】

請求項４記載の医薬組成物であって、前記システイン含有オリゴペプチドとそれらの誘導体が、システイン含有テトラペプチドであり、前記システイン含有テトラペプチドが、グリシン－Ｌ（Ｄ）－セリン－Ｌ（Ｄ）－システイン－Ｌ（Ｄ）－アルギニンテトラペプチド（ＧＳＣＲ）、およびグリシン－Ｌ（Ｄ）－システイン－Ｌ（Ｄ）－セリン－Ｌ（Ｄ）－アルギニンテトラペプチド（ＧＣＳＲ）からなる群より選ばれる、医薬組成物。

【請求項9】

請求項４記載の医薬組成物であって、前記システイン含有オリゴペプチドとそれらの誘導体が、システイン含有ペンタペプチドであり、前記システイン含有ペンタペプチドが、システイン－アスパラギン酸－グルタミン酸－バリン－アスパラギン酸（ＣＤＥＶＤ）およびアスパラギン酸－グルタミン酸－バリン－アスパラギン酸－システイン（ＤＥＶＤＣ）からなる群より選ばれる、医薬組成物。

【請求項10】

請求項４記載の医薬組成物であって、前記その他のチオール含有化合物が、１－［（２Ｓ）－２－メチル－３－チオール－１－オキソプロピル］－Ｌ（Ｄ）－プロリン、チオグリコール酸、メルカプトエタノール、チオフェノール、Ｄ－ペニシラミン、Ｎ－（２－メルカプトプロピオニル）－グリシン、ドデシルメルカプタン、２－アミノエタンチオール（ＣＳＨ）、３－メルカプトプロピオン酸（ＭＰＡ）、および４－メルカプト安息香酸（ｐ－ＭＢＡ）からなる群より選ばれる、医薬組成物。

【手続補正2】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、脳疾患治療の技術分野に関し、特にリガンド結合金クラスター（ＡｕＣｓ）、前記リガンド結合ＡｕＣｓを含む組成物、前記リガンド結合ＡｕＣｓの脳卒中の治療のための医薬の製造における使用、および前記リガンド結合ＡｕＣｓおよび組成物を利用して脳卒中を治療する方法に関する。

【背景技術】

【0002】

血管が血栓で詰まったり、破れたりすると、脳卒中は発症する。脳卒中には、出血性脳卒中、虚血性脳卒中、一過性脳虚血発作（ＴＩＡ）の三つのタイプがある。

【0003】

出血性脳卒中は、血管が破れて、脳への血流が妨げられることで起こる。一般的な症状としては、突然の脱力感、体のどこかの麻痺、発話障害、嘔吐、歩行困難、昏睡、意識消失、首こり、めまいなどがある。特効薬はまだ存在しない。

【0004】

虚血性脳卒中は、脳虚血（brain ischemia）や脳の虚血（cerebral ischemia）とも呼ばれ、ヒトに最も多く見られる病気の一つであり、死亡や身体障害の主な原因となっている。虚血性脳卒中は、脳卒中全体の８７％程度を占めている。虚血性脳卒中は、脳に血液を供給する動脈に血栓やプラークなどの塊が生じることで発症し、その塊が首や頭蓋骨に現れ、脳への血流や酸素が減少し、脳細胞の損傷や死滅を引き起こす。血液の循環が速やかに回復しない場合、永久的な脳損傷になる可能性がある。

【0005】

虚血性脳卒中の具体的な症状は、影響を受けた脳の部位によって異なる。ほとんどの虚血性脳卒中に共通する症状としては、視力障害、手足の脱力や麻痺、浮動性めまい（dizziness）や回転性めまい（vertigo）、混乱、協調性の喪失、顔面の片側の垂れ下がりなどがある。症状が出現したら、できるだけ早く治療を受けることが重要で、そうすることで、永続的な障害が残る可能性を低くすることができる。

【0006】

虚血性脳卒中の治療法は、非常に限られている。虚血性脳卒中の主な臨床的治療薬は、血栓を分解する組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔＰＡ）であるが、このｔＰＡを脳卒中の発症から４時間半以内に静脈内投与しなければ、効果がない。しかし、ｔＰＡは出血を引き起こすため、出血性脳卒中、脳内出血、最近の大手術や頭部外傷の既往歴のある患者の場合は、ｔＰＡによる治療を受けることができない。長期的な治療法としては、血栓の進展を防ぐためにアスピリンや抗凝固剤を使用することが挙げられる。

【0007】

Ａｍａｎｉらは、２５ｎｍのコロイド状金ナノ粒子の表面にＯＸ２６－ＰＥＧを結合させたＯＸ２６＠ＧＮＰｓが壊死した脳組織を著しく増加させ、裸のＧＮＰとＰＥＧ化したＧＮＰは壊死した体積に影響を及ぼさなかったことから、ＯＸ２６＠ＧＮＰは脳卒中の治療に適さないことを示していることを開示している。

【0008】

Ｚｈｅｎｇらは、ＯＧＤ／Ｒ損傷ラットモデルにおいて、２０ｎｍのＡｕ－ＮＰｓが細胞生存率を高め、神経細胞のアポトーシスと酸化ストレスを緩和し、ミトコンドリア呼吸を改善することを明らかにしている。しかし、Ｚｈｅｎｇらは、５ｎｍのＡｕＮＰｓは逆の効果を示し、脳卒中の治療には適さないことも実証している。

【0009】

ＴＩＡは、一時的な血栓によって引き起こされるものである。一般的な症状としては、体の片側の脱力感やしびれ、麻痺、言葉が不明瞭になること、目が見えなくなること、めまいなどがある。特効薬はまだ存在しない。

【0010】

脳卒中の治療は、脳虚血または脳出血に起因して脳神経細胞が損傷または死亡することによる患者の神経機能不全または死亡を回避または軽減するために、タイムリーに行う必要がある。出血性脳卒中およびＴＩＡを治療するための特異的な治療薬は存在せず、虚血性脳卒中を治療するためのｔＰＡなどの主要な薬物は、出血を引き起こす。よって、患者が出血性脳卒中ではなく虚血性脳卒中であると断定的に診断された場合のみ、虚血性脳卒中の治療のための薬物を使用することが決定される。しかしながら、この断定的診断のプロセスは、虚血性脳卒中をタイムリーに治療するための貴重な時間を費やしている。

【0011】

脳卒中を治療するための効果的な方法および薬物、特に、出血性脳卒中および虚血性脳卒中の両方に治療効果のある薬物が求められている。出血性脳卒中および虚血性脳卒中の原因が根本的に異なるため、文献中のすべての薬物開発は、いずれも出血性脳卒中又は虚血性脳卒中のうちのどちらかを対象としている。よって、出血性脳卒中や虚血性脳卒中を問わず、脳卒中の患者を治療することができる薬物を開発することは、想像を絶する挑戦であり、業界ではタブーとされることができる。

【発明の概要】

【0012】

本発明は、リガンド結合金クラスターを含む、対象の脳卒中を治療するための医薬組成物を提供する。

【0013】

特定の実施形態では、リガンド結合金クラスターを含む、対象の脳卒中を治療するための医薬組成物が提供され、前記リガンド結合金クラスターが、金コアと、前記金コアに結合したリガンドとを含み、前記脳卒中が、出血性脳卒中、虚血性脳卒中、および一過性虚血発作（ＴＩＡ）からなる群より選ばれる。

【0014】

前記医薬組成物の特定の実施形態では、前記金コアの直径が、０．５～３ｎｍである。

【0015】

前記医薬組成物の特定の実施形態では、前記金コアの直径が、０．５～２．６ｎｍである。

【0016】

前記医薬組成物の特定の実施形態では、前記リガンドが、Ｌ－システインとその誘導体、Ｄ－システインとその誘導体、システイン含有オリゴペプチドとそれらの誘導体、およびその他のチオール含有化合物からなる群より選ばれる一つである。

【0017】

前記医薬組成物の特定の実施形態では、前記Ｌ－システインとその誘導体が、Ｌ－システイン、Ｎ－イソブチリル－Ｌ－システイン（Ｌ－ＮＩＢＣ）、およびＮ－アセチル－Ｌ－システイン（Ｌ－ＮＡＣ）からなる群より選ばれ、そして前記Ｄ－システインとその誘導体が、Ｄ－システイン、Ｎ－イソブチリル－Ｄ－システイン（Ｄ－ＮＩＢＣ）、およびＮ－アセチル－Ｄ－システイン（Ｄ－ＮＡＣ）からなる群より選ばれる。

【0018】

前記医薬組成物の特定の実施形態では、前記システイン含有オリゴペプチドとそれらの誘導体が、システイン含有ジペプチドであり、前記システイン含有ジペプチドが、Ｌ（Ｄ）－システイン－Ｌ（Ｄ）－アルギニンジペプチド（ＣＲ）、Ｌ（Ｄ）－アルギニン－Ｌ（Ｄ）－システインジペプチド（ＲＣ）、Ｌ（Ｄ）－ヒスチジン－Ｌ（Ｄ）－システインジペプチド（ＨＣ）、およびＬ（Ｄ）－システイン－Ｌ（Ｄ）－ヒスチジンジペプチド（ＣＨ）からなる群より選ばれる。

【0019】

前記医薬組成物の特定の実施形態では、前記システイン含有オリゴペプチドとそれらの誘導体が、システイン含有トリペプチドであり、前記システイン含有トリペプチドが、グリシン－Ｌ（Ｄ）－システイン－Ｌ（Ｄ）－アルギニントリペプチド（ＧＣＲ）、Ｌ（Ｄ）－プロリン－Ｌ（Ｄ）－システイン－Ｌ（Ｄ）－アルギニントリペプチド（ＰＣＲ）、Ｌ（Ｄ）－リシン－Ｌ（Ｄ）－システイン－Ｌ（Ｄ）－プロリントリペプチド（ＫＣＰ）、およびＬ（Ｄ）－グルタチオン（ＧＳＨ）からなる群より選ばれる。

【0020】

前記医薬組成物の特定の実施形態では、前記システイン含有オリゴペプチドとそれらの誘導体が、システイン含有テトラペプチドであり、前記システイン含有テトラペプチドが、グリシン－Ｌ（Ｄ）－セリン－Ｌ（Ｄ）－システイン－Ｌ（Ｄ）－アルギニンテトラペプチド（ＧＳＣＲ）、およびグリシン－Ｌ（Ｄ）－システイン－Ｌ（Ｄ）－セリン－Ｌ（Ｄ）－アルギニンテトラペプチド（ＧＣＳＲ）からなる群より選ばれる。

【0021】

前記医薬組成物の特定の実施形態では、前記システイン含有オリゴペプチドとそれらの誘導体が、システイン含有ペンタペプチドであり、前記システイン含有ペンタペプチドが、システイン－アスパラギン酸－グルタミン酸－バリン－アスパラギン酸（ＣＤＥＶＤ）およびアスパラギン酸－グルタミン酸－バリン－アスパラギン酸－システイン（ＤＥＶＤＣ）からなる群より選ばれる。

【0022】

前記医薬組成物の特定の実施形態では、前記その他のチオール含有化合物が、１－［（２Ｓ）－２－メチル－３－チオール－１－オキソプロピル］－Ｌ（Ｄ）－プロリン、チオグリコール酸、メルカプトエタノール、チオフェノール、Ｄ－ペニシラミン、Ｎ－（２－メルカプトプロピオニル）－グリシン、ドデシルメルカプタン、２－アミノエタンチオール（ＣＳＨ）、３－メルカプトプロピオン酸（ＭＰＡ）、および４－メルカプト安息香酸（ｐ－ＭＢＡ）からなる群より選ばれる。

【国際調査報告】