特表 2023-551396 オリゴヌクレオチドベースの親和性クロマトグラフィーの方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-12-08

(54)【発明の名称】オリゴヌクレオチドベースの親和性クロマトグラフィーの方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/10 20060101AFI20231201BHJP

   B01D 15/38 20060101ALI20231201BHJP

   B01J 20/281 20060101ALI20231201BHJP

   B01J 20/285 20060101ALI20231201BHJP

   G01N 30/88 20060101ALI20231201BHJP

   G01N 30/26 20060101ALI20231201BHJP

【ＦＩ】

C12N15/10 112Z

B01D15/38

B01J20/281 G

B01J20/281 X

B01J20/285 T

G01N30/88 D

G01N30/26 A

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023527800

(86)(22)【出願日】2021-11-15

(85)【翻訳文提出日】2023-06-01

(86)【国際出願番号】 US2021059363

(87)【国際公開番号】W WO2022104197

(87)【国際公開日】2022-05-19

(31)【優先権主張番号】63/113,594

(32)【優先日】2020-11-13

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】591163214

【氏名又は名称】ドナルドソン カンパニー，インコーポレイティド

(74)【代理人】

【識別番号】110003281

【氏名又は名称】弁理士法人大塚国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】シュウ， ジンシャン

(72)【発明者】

【氏名】テンプルズ， グラハム

【テーマコード（参考）】

4D017

【Ｆターム（参考）】

4D017AA20

4D017BA07

4D017CA12

4D017CA13

4D017CB01

4D017DA03

4D017DB01

4D017EA05

4D017EB05

(57)【要約】

オリゴヌクレオチド親和性カラムを、０．５ＣＶ／分～１０００ＣＶ／分の流量で使用して、ポリヌクレオチドを供給液から精製するための方法が開示される。方法は、標的ポリヌクレオチドを含有する混合物を、表面に結合したオリゴヌクレオチド親和性リガンドを有するマクロ多孔性支持体を運ぶクロマトグラフィー媒体、例えば、カラム上に装填することを含むいくつかの工程を含み得る。親和性リガンドは、標的化ポリヌクレオチドをハイブリダイズすることができ、標的の分離及び精製を可能にする。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ポリヌクレオチドを精製するための方法であって、
前記ポリヌクレオチドを含む供給液をクロマトグラフィー媒体上に装填することであって、前記クロマトグラフィー媒体が、約１ｍ^２／ｍＬ～約２０ｍ^２／ｍＬの比表面積を有するマクロ多孔性支持体を含み、前記マクロ多孔性支持体が、前記マクロ多孔性支持体の表面に結合し、前記供給液と流体連通したオリゴヌクレオチド親和性リガンドを含み、前記オリゴヌクレオチド親和性リガンドが、前記ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列を含み、前記クロマトグラフィー媒体が、約０．２ｍｇのポリヌクレオチド／ｍＬ～約１５ｍｇのポリヌクレオチド／ｍＬの動的結合容量を示す、装填することと、
前記供給液を、前記クロマトグラフィー媒体を通して流すことであって、流す際に、前記ポリヌクレオチドが前記親和性リガンドとのハイブリダイゼーションを介して前記マクロ多孔性支持体上に保持され、前記供給液の不純物が前記クロマトグラフィー媒体を通過する、流すことと、
前記ポリヌクレオチドの前記マクロ多孔性支持体からの分離後に、前記ポリヌクレオチドを回収することと、を含む、方法。

【請求項2】

前記マクロ多孔性支持体から前記ポリヌクレオチドを溶離させることを更に含み、溶離液が任意選択で加熱され、前記方法が任意選択で、前記溶離の前に洗浄工程を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記溶離が前記クロマトグラフィー媒体を通して導電性溶離液を流すことを含み、及び／又は前記任意選択の洗浄工程が流体の導電性洗浄を含む、請求項２に記載の方法。

【請求項4】

前記供給液が、約１ＣＶ／分～約１，０００ＣＶ／分など、約０．５ＣＶ／分～約５ＣＶ／分など、約５ＣＶ／分～約５００ＣＶ／分などの約０．５カラムボリューム毎分（ＣＶ／分）～約１，０００ＣＶ／分の流量で前記クロマトグラフィー媒体を通して流れる、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項5】

前記マクロ多孔性支持体が、ポリオレフィン、ポリエーテルスルホン、ポリ（テトラフルオロエチレン）、ナイロン、ファイバーグラス、ヒドロゲル、ポリビニルアルコール、天然ポリマー、セルロース、濾紙、又はそれらの組み合わせを含み、例えば、前記マクロ多孔性支持体が、セルロースエステル、セルロースアセテート、再生セルロース、セルロースナノファイバーから選択されるセルロースを含み、及び／又は前記マクロ多孔性支持体が、約９０重量％以上のセルロースを含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項6】

前記マクロ多孔性支持体が膜を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項7】

前記オリゴヌクレオチド親和性リガンドが、約５～約５０塩基の長さなど、約１０～約４０塩基の長さなど、約２０～約２５塩基の長さなどの約５～約１００塩基の長さのものである、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項8】

前記オリゴヌクレオチド親和性リガンドが、オリゴ－デオキシチミジン配列を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項9】

前記マクロ多孔性支持体が、前記オリゴヌクレオチド親和性リガンドと前記マクロ多孔性支持体の前記表面との間にスペーサーを含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項10】

前記オリゴヌクレオチド親和性リガンドが、１つ以上の塩基置換を含み、例えば、前記オリゴヌクレオチド親和性リガンドが、１つ以上のロックド核酸塩基及び／又は１つ以上のペプチド核酸塩基を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項11】

前記マクロ多孔性支持体が、約０．２ミリリットル～約１０リットルなど、約１００ミリリットル～約１リットルなどの約０．２ミリリットル～約１００リットルの容積を画定する、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項12】

前記供給液が導電性溶液であり、例えば、前記供給液が約１．５ｍＳ／ｃｍ～約３．３５ｍＳ／ｃｍなどの最大約３．３５ミリジーメンス・パー・センチメートル（ｍＳ／ｃｍ）の導電率を示す、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項13】

前記供給液が、約１～約８．５又は約６～約１０のｐＨを示す、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項14】

前記方法が複数回繰り返され、前記方法の前記結合容量が２０サイクルにわたって初期結合容量の約９５％以上の値で保持される、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項15】

前記ポリヌクレオチドが、一本鎖ＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、ハイブリダイズされたＤＮＡ／ＲＮＡ二重鎖、ＤＮＡ／ペプチドコンジュゲート、ＲＮＡ／ペプチドコンジュゲート、ＤＮＡ／ポリペプチドコンジュゲート、又はＲＮＡ／ポリペプチドコンジュゲートを含み、例えば、前記ポリヌクレオチドがｍＲＮＡを含み、更に、前記ポリヌクレオチドが、約１，０００塩基～約１２，０００塩基の長さなど、約８００塩基～約４，０００塩基の長さなど、約１０，０００～約１５，０００塩基の長さなどの約５００塩基～約１５，０００塩基の長さである、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、“Ｕｓｅ ｏｆ Ｏｌｉｇｏ－ＤＴ Ｂａｓｅｄ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｍｅｍｂｒａｎｅ”と題される、２０２０年１１月１３日の出願日を有する、米国仮特許出願第６３／１１３，５９４号明細書の出願利益を主張するものである。

【背景技術】

【0002】

治療用ｍＲＮＡはタンパク質置換療法を促進する可能性を有し、多種多様な病態に対処し、ワクチンの安全性を増大させ、ワクチンのタイムラインを短縮し、このことはパンデミックのシナリオにおいて特に重要である。例えば、Ｍｏｄｅｒｎａ（登録商標）はそれらのワクチンのメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）プラットフォームを使用して、米国で新型コロナウイルス感染症（Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ－１９（ＣＯＶＩＤ－１９））に対応した最初の臨床試験用ワクチンを記録的な速さで開発し、発見から臨床試験への移行にわずか３ヶ月を要したのみであった。しかしながら、ｍＲＮＡベースの医薬品の開発の先駆的な企業であるＣｕｒｅＶａｃのＣＥＯによれば、ｍＲＮＡの質と量、すなわち一貫した純度が、それらの製造についての障害のままである。特に、ハイスループットのダウンストリーム精製プロセスの欠如が、工業的ｍＲＮＡ製造のアップスケーリングにおける主な課題である。

【0003】

既存の精製プロセスの一例としては、細胞抽出物、インビトロ転写（ＩＶＴ）反応、又は他のバイオエンジニアリング若しくは合成手段から生成されたｍＲＮＡの精製に使用されるクロマトグラフィー処理がある。適切な精製のために、ｍＲＮＡは、タンパク質、核酸、及び／又は細胞若しくは培地からの他の成分、並びに宿主細胞からの抽出で使用される添加剤又は溶媒から分離されねばならない。ＩＶＴ反応又は他の合成手段からの精製において、キャッピング成分、遊離ヌクレオチド、Ｔ７ポリメラーゼなどの酵素、ＲＮａｓｅ阻害剤（存在する場合）、鋳型ＤＮＡ、並びにあらゆる非ｍＲＮＡ成分及び／又はポリアデニル化されていないＲＮＡは精製中に除去されねばならない。

【0004】

個々の粒子（又は樹脂）の形態の固相を含む樹脂クロマトグラフィーカラムが、スケーラブルな抗体製造に使用されてきた。しかしながら、治療用ｍＲＮＡ（３００～１，０００ｋＤａ）は、抗体（約１５０ｋＤａ）よりも非常に大きい。例えば、図１に例示するように、治療用ｍＲＮＡは、通常、５～３００ヌクレオチドのポリアデニル酸（ポリ－Ａ）テールを有し、これは未翻訳領域（ＵＴＲ）、キャップ及びコーディング領域と共にタンパク質翻訳プロセスに不可欠な要素である。そのような大きなサイズのために、樹脂カラムの有効表面積及び容量は、抗体精製の場合よりもｍＲＮＡの場合に、はるかに低くなる。

【0005】

オリゴ－デオキシチミジン（オリゴ－ｄＴ）リガンドは、図２に示されるように、ポリ－Ａテール中のアデニンとオリゴ－ｄＴ中のデオキシチミジンとの間のワトソン・クリック塩基対合後のハイブリダイゼーションを介してのポリアデニル化ｍＲＮＡを供給流から単離するために有効な親和性リガンドとして認識されている。オリゴ－ｄＴ親和性ベースの樹脂クロマトグラフィーの製品が提案されているが、残念なことに、それらは２００～４，０００塩基の長さの範囲のｍＲＮＡに対して、０．６～５ｍｇのｍＲＮＡ／ｍＬ樹脂の低～中程度の結合容量によって特徴付けられている。更に、これらの樹脂製品は固相の細孔への質量移動が遅く、樹脂ベースのカラムの流動特性が不良なため、有効に機能するために長い滞留時間（数分程度）が必要である。加えて、樹脂ベースのカラムは、一般に、１カラムボリューム（ＣＶ）／分を下回る最大操作可能流量によって制限される。樹脂の床圧縮及び／又は構造的変形もまた、最適ではない性能並びに背圧の増加をもたらす。これと共に、樹脂カラムの低～中程度の結合容量及び長い滞留時間が、不十分な精製の生産性をもたらす。

【0006】

陰イオン交換クロマトグラフィー製品も、ｍＲＮＡ精製のために提案されている。陰イオン交換クロマトグラフィー製品は、親和性ベースのシステムと比較して、より高い結合容量を提供することができるが、ｍＲＮＡをカラムから高収率で溶出させることが非常に難しく、それらを魅力のない代替品にしている。

【0007】

モノリス及びマクロ多孔性膜などの移流分離媒体は、多くの生物製剤の精製に対して、樹脂よりも少なくとも１０倍速い処理速度を提供することが示されている。例えば、ＢＩＡ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓのモノリスベースのオリゴ－ｄＴ親和性カラム製品は、滞留時間を適度に短縮する（推奨滞留時間は１２～４８秒であり、最小滞留時間は３．３秒である）。

【0008】

以上、当該技術分野における改善を述べてきたが、更なる改善の余地がある。当該技術分野において、必要とされるものは、ｍＲＮＡ精製のための親和性ベースの膜クロマトグラフィー製品である。例えば、ｍＲＮＡ精製用のオリゴ－ｄＴベースの親和性膜クロマトグラフィー製品は、当該技術分野において大きな利益をもたらすであろう。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0009】

一実施形態によれば、ポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡ、ＤＮＡなどを精製するための方法が開示される。方法は、ポリヌクレオチドを含む供給液をクロマトグラフィー媒体上に装填することを含み得る。クロマトグラフィー媒体は、マクロ多孔性支持体を含むことができ、これはまたマクロ支持体の表面上にオリゴヌクレオチド親和性リガンドを含むことができる。オリゴヌクレオチド親和性リガンドは、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列に対して相補的であるヌクレオチド配列を含み得る。したがって、供給液が媒体を通して流れると、標的とされるポリヌクレオチドは親和性リガンドとのハイブリダイゼーションを介して保持されることができ、供給液の不純物はクロマトグラフィー媒体を通過することができる。クロマトグラフィー媒体は、約０．２ｍｇポリヌクレオチド／ｍＬ～約１５ｍｇポリヌクレオチド／ｍＬの動的結合容量を示すことができ、本方法は高流量で、例えば、約０．５カラムボリューム（ＣＶ）／分～約１０００ＣＶ／分で行うことができる。方法はまた、多孔性支持体からのポリヌクレオチドの分離後、例えば、マクロ多孔性支持体からのポリヌクレオチドの溶出後にポリヌクレオチドを回収することも含み得る。

【0010】

本主題の完全且つ有効な開示（当業者にとってその最適な方法を含む）は、添付の図面への参照を含めて、本明細書の残りの部分においてより詳細に記載される。

【図面の簡単な説明】

【0011】

【図1】キャップ、５’未翻訳領域（ＵＴＲ）、コーディング領域、３’ＵＴＲ、及びポリ－Ａ３’テールを含むヒトタンパク質をコードする典型的なｍＲＮＡの構造を模式的に示す。

【図2】ハイブリダイゼーション時のアデニンとチミン塩基との間の水素結合構造を示す。

【図3】５ＣＶ／分で異なる細孔径を有する本明細書に開示されるオリゴ－ｄＴ親和性膜のｍＲＮＡ動的結合容量を示す。

【図4】最大５００ＣＶ／分の異なる流量における本明細書に開示されるオリゴ－ｄＴ親和性膜のｍＲＮＡ動的結合容量を示す。

【図5】８０ＣＶ／分を介しての様々な流量における０．１ｍＬのデバイスについての精製収率を示す。

【図6】様々なオリゴ－ｄＴ製品の理論的及び相対的装填工程生産性（最大ＤＢＣ_１０％まで結合したｍｇ／分単位での滞留時間）を示す。

【図7】２つの異なるｍＲＮＡ標的についての２つの異なる流量での市販の樹脂ベースの分離媒体の１０％動的結合容量値（ＤＢＣ_１０％）を比較する。

【図8】複数の異なる流量での異なるサイズのｍＲＮＡ標的について、本明細書に記載される方法で得られるＤＢＣ_１０％値を提供する。

【図9】開示された方法論の長期結合容量を決定するための定置洗浄（ｃｌｅａｎ ｉｎ ｐｌａｃｅ）プロトコルを含む２０サイクル結合溶離（ｂｉｎｄ－ａｎｄ－ｅｌｕｔｅ）試験の結果を示す。

【発明を実施するための形態】

【0012】

開示される主題の様々な実施形態についてここで詳細に言及し、そのうちの１つ以上の例が以下に記載されている。各実施形態は、主題の説明として提供されており、それを限定するものではない。実際、当業者には、主題の範囲又は趣旨から逸脱することなく、本開示において様々な修正及び変更を行うことができることが明らかであろう。例えば、一実施形態の一部として例示又は記載される特徴は、他の更なる実施形態をもたらすために別の実施形態で使用されてもよい。

【0013】

別途指定のある場合を除き、本文書で使用される用語及び語句、並びにその変形は、特に明示的に示されない限り、限定的なものではなく、オープンエンドとして解釈されるべきである。同じく、接続詞「及び（ａｎｄ）」と結びついた項目のグループは、それらの項目の各々及び全てのものがグループに存在することを必要とするものとして読み取るべきではなく、むしろ、明示的に別段の記載がない限り、「及び／又は（ａｎｄ／ｏｒ）」と読み取るべきである。同様に、接続詞「又は（ｏｒ）」と結びついた項目のグループは、そのグループ間の相互排他性を必要とするものと解釈されるべきではなく、明示的に別段の記載がない限り「及び／又は」と解釈されるべきである。更に、本開示の項目、要素若しくは構成要素は単数形で記述又は主張され得るが、単数形に限定が明示されていない限り、複数形がその範囲内であると見なされる。「１つ以上」、「少なくとも」、「これらに限定されないが」又はその他同類の語句などの広義の単語や語句の存在は、場合によっては、そのような広義の語句が存在しないより狭いケースが意図されているか、又は必要とすることを意味するものとして読み取るべきではない。

【0014】

一般に、多孔性支持体上にオリゴヌクレオチドリガンドを含む分離デバイスを利用する親和性ベースのクロマトグラフィープロセスが、本明細書に開示される。開示される方法は、約０．５ＣＶ／分～約１０００ＣＶ／分の流量での低い背圧を伴う高い不純物クリアランスを含むポリヌクレオチド精製の性能において高い結合容量を提供することができる。開示される方法は、約８０％以上で完全な標的配列回収値を有利に提供することができる。

【0015】

開示される方法は、オリゴヌクレオチドベースの親和性媒体を使用して、ポリヌクレオチドを迅速且つ効率的に精製するために利用することができる。例として、開示される方法は、約０．５ＣＶ／分～約１０００ＣＶ／分の流量で標的ポリヌクレオチドを成功裏に精製することができる。一実施形態では、方法は、約０．５ＣＶ／分～約５００ＣＶ／分の流量で行うことができる。一実施形態では、方法は、約１ＣＶ／分～約１０００ＣＶ／分の流量で行うことができる。一実施形態では、方法は、約１ＣＶ／分～約５００ＣＶ／分の流量で行うことができる。一実施形態では、方法は、約５ＣＶ／分～約１０００ＣＶ／分の流量で行うことができる。一実施形態では、方法は、約５ＣＶ／分～約５００ＣＶ／分の流量で行うことができる。

【0016】

開示される方法で使用するためのデバイスは、その上にオリゴヌクレオチド親和性リガンドを含むマクロ多孔性膜支持材料を含むことができる。一実施形態において、開示される方法は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｚｈｏｕらの米国特許出願公開第２０２０／０１８８８５９号明細書に記載されるようなマクロ多孔性オリゴヌクレオチドベースの親和性媒体を利用することができる。例として、マクロ多孔性支持体としては、限定されるものではないが、ポリオレフィン膜、ポリエーテルスルホン膜、ポリ（テトラフルオロエチレン）膜、ナイロン膜、ファイバーグラス膜、ヒドロゲル膜、ヒドロゲルモノリス、ポリビニルアルコール膜、天然ポリマー膜、セルロース膜（例えば、セルロースエステル膜、セルロースアセテート膜、再生セルロース膜、セルロースナノファイバー膜、セルロースモノリス、セルロース若しくはその誘導体を実質的に含有する（例えば、約９０重量％以上）膜）、濾紙膜、及びそれらの組み合わせを挙げることができる。

【0017】

マクロ多孔性支持体は、任意選択で、天然の反応性部位又は膜に結合した反応性部位を含むカップリング基を介して、表面でオリゴヌクレオチド親和性リガンドを呈示するように誘導体化され得る。例えば、マクロ多孔性支持体は、反応性部位を膜に付加するために、活性化剤（例えば、Ｎ，Ｎ’－炭酸ジスクシンイミジル）と併せて、膨潤溶媒（例えば、ジメチルスルホキシド、アセトニトリル、テトラヒドロフラン、ジメチルホルムアミドなど）中に膜が浸漬される多段階誘導化プロセスに供されてもよい。続いて、反応性部位は、親和性リガンドと直接反応することができるか、又は任意選択で中間体基（例えば、本明細書で更に述べられるスペーサー基としてのアルキル鎖を任意選択で伴う親和性リガンドに対する更なる反応性を含む中間体基）と反応して、本明細書に記載されるように使用するためのマクロ多孔性支持体を形成することができる。当然ながら、当該技術分野において一般的に知られているような他の形成方法を代替的に利用して、開示される方法で使用するためのマクロ多孔性支持体を提供してもよい。一般に、開示される方法で使用するためのマクロ多孔性支持体は、約１ｍ^２／ｍＬ～約２０ｍ^２／ｍＬの比表面積を含み得る。

【0018】

一般に、方法は、標的ポリヌクレオチドに対して相補的配列である配列（例えば、リガンド全体の約２つ以上の個々の配列）を含むオリゴヌクレオチド親和性リガンドを利用することができる。当該技術分野において既知であるように、親和性リガンド及び標的の相補的部分は２つの長さ全体にわたって伸びている必要はなく、各々の一部は、任意選択的で、互いにハイブリダイズする各々の不連続セグメントとハイブリダイズすることができる。例えば、それらの実施形態において、親和性リガンドが修飾塩基（例えば、本明細書で更に述べられるようなＰＮＡ又はＬＮＡ塩基）を含むそのような実施形態において、その特定の塩基は標的の塩基とハイブリダイズしなくてもよいが、修飾塩基の片側又は両側の塩基の配列は標的ポリヌクレオチドの塩基とハイブリダイズすることができる。例えば、マクロ多孔性支持体は、いくつかの実施形態において、約０．２ｍｇポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ）／ｍＬ～約１５ｍｇポリヌクレオチド／ｍＬの動的結合容量を有する標的化ポリヌクレオチドに結合することができるオリゴヌクレオチドリガンド部分を担持することができる。

【0019】

一実施形態において、方法は、約５～約１００塩基の長さのオリゴ－ｄＴを親和性リガンドとして利用することができるが、いくつかの実施形態において、より長い長さを使用してもよい。例えば、親和性媒体に固定化されたオリゴヌクレオチド親和性リガンドは、いくつかの実施形態において、約５～約２０塩基の長さなど、約１０～約１００塩基の長さなど、約１０～約５０塩基の長さなど、約１０～約４０塩基の長さなど、約１０～約３０塩基の長さなど、約１０～約２０塩基の長さなど、約２０～約１００塩基の長さなど、約２０～約４０塩基の長さなど、約２０～約３０塩基の長さなどの、約５～約２５塩基の長さであり得る。

【0020】

いくつかの実施形態において、スペーサーは、マクロ多孔性支持体とオリゴヌクレオチド親和性リガンドとの間で共有結合され得る。一般に、スペーサーは、炭素系モノマー又はオリゴマーを含み得る。例として、スペーサーは、炭素系モノマー（例えば、－ＣＨ_２－）を含むことができるか、又は最大約５０個の炭素原子の鎖長を含む炭素系オリゴマーであり得る。例えば、スペーサーは、いくつかの実施形態において、最大約２０個の炭素又は最大約１０個の炭素の長さの鎖長を含み得る。一実施形態では、炭素系スペーサーは、約５～約２０個の炭素の長さなど、約５～約１０個の炭素の長さなどの、約５～約５０個の炭素の長さであり得る。

【0021】

一実施形態において、親和性リガンドは、リガンドの性能を変更し得る、標的ポリヌクレオチドに対して相補的な配列の天然塩基と比較して１つ以上の塩基置換を含み得る。１つのそのような修飾は、ロックド核酸（Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）（ＬＮＡ）塩基の使用である。ＬＮＡはリボース糖上の２’酸素と４’炭素とを連結する共有結合を有する修飾ＲＮＡ塩基である。

【0022】

一実施形態において、ペプチド核酸（Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）（ＰＮＡ）リガンドを親和性リガンドとして利用することができる。ＰＮＡは、負に帯電した骨格鎖なしに、塩基を結合するためにペプチド結合を利用する。この親和性を強化する構成に加えて、リガンド上の負電荷の欠如は、導電性をほとんど示さない供給物で結合操作及び精製プロセスが実施されることを可能にすることができる。

【0023】

塩基修飾は、親和性リガンドの１つ以上のヌクレオチドのための置換として使用することができる。そのような修飾は、親和性リガンドと標的ヌクレオチドとの間の相互作用を更に増強することができ、クロマトグラフィー生産性を改善するために、高流量が使用されることを可能にする。一実施形態において、親和性リガンドは、単一の修飾塩基を含み得る。他の実施形態において、親和性リガンドは、複数の修飾塩基を含み得る。例えば、親和性リガンドは、親和性リガンドの２番目の位置ごとに、３番目の位置ごとに、４番目の位置ごとに、又は５番目の位置ごとにＬＮＡ若しくはＰＮＡ塩基を含むことができる。更に、天然塩基が散在する修飾塩基の不連続なトラクトが存在することもあり、例えば、３つのＬＮＡ若しくはＰＮＡのトラクトが３つの天然塩基のトラクトと交互に存在するが、トラクトは均等に釣り合いがとれるか、又は規則的に間隔を空ける必要はなく、例えば、３つのＬＮＡ若しくはＰＮＡのトラクトが５つの天然塩基のトラクトと交互になるか、又は３つのＬＮＡ若しくはＰＮＡのトラクトに続いて５つの天然塩基があり、続いて２つのＬＮＡ若しくはＰＮＡ、続いて７つの天然塩基の繰り返しがあってもよい。更に、塩基置換は、同じタイプであるか又は異なるタイプのものであり得る。例えば、親和性リガンドは、全ての塩基置換がＬＮＡ塩基若しくはＰＮＡ塩基である状態で複数の塩基置換を含むことができるか、又は複数の塩基置換は、ＬＮＡ塩基とＰＮＡ塩基との両方の混合物を任意の組み合わせで含み得るが、他の実施形態では、１つのタイプの置換のみが従来の修飾されていない塩基の標的分子の相補的配列から修飾された親和性リガンドに含まれてもよく、例えば、１つ以上のＬＮＡ置換のみ、１つ以上のＰＮＡ置換のみ、又は修飾された塩基に対して天然塩基の１つの置換のみが含まれ得、その例を更に以下に提供する。

【0024】

いくつかの実施形態では、塩基修飾により潜在的に低下した導電率での結合が可能となり、大規模な結合後の洗浄工程の必要性が軽減され、精製プロトコルの処理速度を更に向上させることができる。例えば、完全ＰＮＡ置換を含むオリゴヌクレオチドリガンドは、１．５ｍＳ／ｃｍ未満の導電率でハイブリダイゼーション特性を維持することができる。塩基修飾は、いくつかの実施形態において、より優れた相補的塩基認識を促進することができ、これは単一塩基置換変異体の分離又はポリアデニル化を伴わない配列の標的精製などの新しい核酸分離技術の機会を提供することができる。当然ながら、オリゴヌクレオチド親和性リガンドの完全なＰＮＡ若しくはＬＮＡ塩基置換は必須ではなく、塩基置換はオリゴヌクレオチド親和性リガンドの塩基に対して存在しないか、１つの塩基、又は複数の塩基に存在してもよい。一実施形態において、オリゴヌクレオチドリガンドの個々の塩基に対する部分的又は完全なＬＮＡ若しくはＰＮＡ置換を含む親和性リガンドは、フーグスティーン（Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ）型水素結合相互作用を介して、オリゴヌクレオチドリガンドと標的との三本鎖形成から生じる二本鎖核酸の標的精製の可能性を増大させることができる。

【0025】

本明細書に包含される修飾は、ＰＮＡ及び／又はＬＮＡ塩基置換に限定されない。例えば、塩基修飾は、限定されないが、５－ヨードシチジン－５’－三リン酸、５－メチルシチジン－５’－三リン酸、２－チオシチジン－５’－三リン酸、６－アザシチジン－５’－三リン酸、５－ブロモシチジン－５’－三リン酸、５－アミノアリルシチジン－５’－三リン酸、シュードイソシチジン－５’－三リン酸、Ｎ^４－メチルシチジン－５’－三リン酸、５－カルボキシシチジン－５’－三リン酸、５－ホルミルシチジン－５’－三リン酸、５－ヒドロキシメチルシチジン－５’－三リン酸、５－ヒドロキシシチジン－５’－三リン酸、５－メドキシシチジン－５’－三リン酸、チエノシチジン－５’－三リン酸、５－ブロモ－２’－デオキシシチジン－５’－三リン酸、５－プロピニル－２’デオキシシチジン－５’－三リン酸、５－ヨード－２’－デオキシシチジン－５’－三リン酸、５－メチル－２’－デオキシシチジン－５’－三リン酸、２’－デオキシ－Ｐ－ヌクレオシド－５’－三リン酸、５－ヒドロキシ－２’デオキシシチジン－５’－三リン酸、２－チオ－２’－デオキシシチジン－５’－三リン酸、５－アミノアリル－２’－デオキシシチジン－５’－三リン酸、シュードウリジン－５’－三リン酸、２’－Ｏ－メチルシュードウリジン－５’－三リン酸、Ｎ^１－メチルシュードウリジン－５’－三リン酸、Ｎ^１－エチルシュードウリジン－５’－三リン酸、Ｎ^１－メチル－２’－Ｏ－メチルシュードウリジン－５’－三リン酸、Ｎ^１－メトキシメチルシュードウリジン－５’－三リン酸、又はＮ^１－プロピルシュードウリジン－５’－三リン酸のうちの１つ以上が含まれるオリゴヌクレオチド親和性リガンドのシチジン又はウリジン塩基に対する塩基置換を含み得る。

【0026】

開示される方法論で利用されるオリゴヌクレオチドリガンドベースの親和性膜カラムは、結合溶離モード又はフロースルー（ｆｌｏｗ－ｔｈｒｏｕｇｈ）モードのいずれかで動作することができる。

【0027】

分離のプロセス生産性は、以下の等式を使用して定義することができる。等式中、Ｖ_ｔｏｔは、装填、すすぎ、溶離、及び再生工程を含む分離プロトコル中にカラムを通過する溶液の総容量を表す。ＢＶは、オリゴヌクレオチド媒体床体積を表す。装填容量は、オリゴヌクレオチド媒体の動的結合容量に比例することができる。したがって、プロセス生産性は、結合容量の増加及び滞留時間の減少と共に増加することができる。

【数1】

【0028】

開示される方法は、既存の樹脂クロマトグラフィーベースの方法と比較して、１０倍以上のより高い生産性を提供することができる。例えば、図６に示すように、本明細書に開示される方法（図６の膜１、２及び３の使用によって表示される）は、非常に短い滞留時間でより高い結合容量を提供することができ、以前から知られる樹脂ベースの分離材料を利用する方法と比較して、生産性を大きく改善した。更に、本明細書に開示されるポリヌクレオチド精製用のオリゴヌクレオチドリガンドベースの親和性クロマトグラフィーは、いくつかの実施形態において、０．５ＣＶ／分～１０００ＣＶ／分の流量で動作することができるが、一方、現行のオリゴ－ｄＴ樹脂カラム製品は、１ＣＶ／分未満の流量で動作する。例えば、現行のオリゴ－ｄＴ樹脂カラム製品は、３６０秒の滞留時間を必要とし得るが、一方、開示された方法は、図６に示すように、非常に速い滞留時間を用いて実行することができる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるようなポリヌクレオチド精製用のオリゴヌクレオチドリガンドベースの親和性クロマトグラフィーは、０．０６秒程度の短い滞留時間で効果的に動作することができる。

【0029】

開示される方法のための分離デバイスのサイズ（すなわち、内部容積）は、特に限定されない。一般に、好ましいデバイスサイズは、調製のスケールに基づいて選択することができ、異なるスケールの調製には異なるデバイスサイズが使用される。したがって、分離プロトコルのマクロ多孔性支持体の容積は変化することもできる。一実施形態において、マクロ多孔性支持体の容積は、約０．２ｍＬ～約５ｍＬなど、約１ｍＬ～約１００ｍＬなど、約１００ｍＬ～約１リットルなど、約０．２ｍＬ～約１リットルなど、約０．２ｍＬ～約１０リットルなど、約１リットル～約１０リットルなど、約１０リットル～約１００リットルなどの、約０．０２５ｍＬ～約１００リットルであり得る。

【0030】

本明細書に開示されるようなオリゴヌクレオチド親和性ベースの精製プロセスは、一般に、複数の工程を含み得る。プロトコルの１つの工程は、分離用のポリヌクレオチドを含有する供給液を、マクロ多孔性支持体を含み得るクロマトグラフィー媒体上に装填することを含み得る。クロマトグラフィー媒体に供給される供給液は、いくつかの実施形態において、導電性を示し得る。例えば、一実施形態において、例えば、親和性リガンドが１つ以上の塩基置換（例えば、ＬＮＡ及び／又はＰＮＡ置換）を組み込む場合、供給液の導電率は最大約３．３５ｍＳ／ｃｍであり得るか、又はいくつかの実施形態において、それよりも更に高い。一実施形態において、供給物の導電率は、約１．５～約３．３５ｍＳ／ｃｍなどの０～３．３５ｍＳ／ｃｍであり得る。前に述べたように、ＬＮＡ塩基及び／又はＰＮＡ塩基へのオリゴヌクレオチド親和性リガンドの少なくとも１つの置換は、導電性を示す供給液を考慮する場合、分離プロトコルの態様を改善するために利用することができる。

【0031】

供給液の標的化ポリヌクレオチドは、任意の構造又は塩基含有量を有し得る。一実施形態において、精製標的は、一本鎖ＲＮＡ又はＤＮＡであり得る。これは必要条件ではないが、一実施形態では、精製標的は、二本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、ハイブリダイズされたＤＮＡ／ＲＮＡ二重鎖、ＤＮＡ／ペプチドコンジュゲート、ＲＮＡ／ペプチドコンジュゲート、ＤＮＡ／ポリペプチドコンジュゲート、又はＲＮＡ／ポリペプチドコンジュゲートであり得る。一実施形態において、標的化ポリヌクレオチドは、約３００～約５，０００塩基のサイズを有し得る。例えば、標的化ポリヌクレオチドは、いくつかの実施形態において、約５００塩基／塩基対～約１５，０００塩基／塩基対など、いくつかの実施形態において、約１，０００塩基／塩基対～約１２，０００塩基／塩基対など、約４，０００塩基／塩基対～約１０，０００塩基／塩基対など、約８００塩基／塩基対～約４，０００塩基／塩基対など、約１０，０００塩基／塩基対～約１５，０００塩基／塩基対などの、約８００塩基／塩基対（二本鎖の場合）の長さ又はそれ以上の長さの一本鎖若しくは二本鎖のＲＮＡ又はＤＮＡであり得るが、より長いまたより短い標的ポリヌクレオチドが本明細書に包含される。

【0032】

供給液の他の特性は、特に限定されない。一実施形態において、供給液のｐＨは、約１～約８．５の範囲であり得る。一実施形態において、供給液のｐＨは、約６～約１０の範囲であり得る。いくつかの実施形態において、高ｐＨの供給液がＤＮＡを標的化するプロトコルで利用することができ、いくつかの実施形態において、より低いｐＨの供給液がＲＮＡを標的化するプロトコルで利用することができるが、これは開示される方法論の必要条件ではない。

【0033】

いくつかの実施形態において、分離プロトコルは、結合工程の後及び溶離の前に洗浄工程を含むことができる。例えば、洗浄工程は、溶離の前に媒体から１つ以上の不純物を洗浄するために利用され得る。一実施形態において、洗浄工程は、導電性を示す洗浄流体を利用することができる（例えば、当該技術分野において既知であるように１つ以上の好適な塩を添加することによって）。そのような実施形態において、導電性洗浄（例えば、高い塩含有量）を結合工程中に低導電性の供給液又は非導電性の供給液を含むプロトコルで利用することができるか、或いは比較的高い導電性の供給溶液で、すなわち、高導電性結合で利用することができる。例えば、洗浄工程で使用される流体の導電率は、いくつかの実施形態において、非導電性洗浄溶液から約３．３５ｍＳ／ｃｍまでの範囲であり得る。例えば、洗浄工程に使用される流体は、導電性又は非導電性供給流のものと本質的に同じ（例えば、約１０％以下の範囲内）の導電率を示し得るか、又は供給流のものとは異なる導電率を示し得、例えば、洗浄流体は、いくつかの実施形態において、約１．５～約３．３５ｍＳ／ｃｍなどの約１．５ｍＳ／ｃｍ以下、又は約３．３５ｍＳ／ｃｍの供給流の導電率とは異なる導電率を示し得る。当然ながら、洗浄工程は開示されるプロトコルの必要条件ではなく、一実施形態において、非ローディングバッファー条件下での洗浄工程を実行する必要はない。例えば、オリゴヌクレオチド親和性リガンドがリガンド中に１つ以上のＰＮＡ塩基置換を含む実施形態においては、非ローディングバッファー条件下で洗浄工程を実行する必要がない、又は望ましくない可能性がある。

【0034】

分離プロトコルは、標的化ポリヌクレオチドをクロマトグラフィー媒体から溶離させる工程を含み得る。溶離液は、当該技術分野において既知であるように、開示された方法において利用することができ、これらには、限定されないが、水（例えば、脱イオン水、ＲＮａｓｅフリー水）、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩酸塩（トリス－ＨＣｌ）（例えば、１０ｍＭのトリス－ＨＣｌ ｐＨ７．０～７．５、一般的にＲＮａｓｅフリーなど）が挙げられる。

【0035】

一般に、標的化ポリヌクレオチドの溶離は、不純物がポリヌクレオチドから著しく分離された後に行うことができる。一実施形態において、溶離溶液は、導電率を示し得る。例として、溶離溶液は、０～約１．５ｍＳ／ｃｍなどの約１．５ｍＳ／ｃｍ以下の導電率を示し得る。一実施形態において、溶離溶液の温度は、いくつかの実施形態において、約２５℃～約６５℃、又は約１５℃～約９０℃などの周囲温度（すなわち、室温又は約２５℃）～約９０℃であり得る。一実施形態において、溶離溶液は、約４０℃を超える温度を有し得る。例えば、高温の溶離溶液は、オリゴヌクレオチド親和性リガンドがリガンド上に１つ以上のＰＮＡ塩基を含む一実施形態において利用され得る。一般に、分離プロトコル全体にわたる分離媒体に対する圧力（例えば、膜横断圧力又はカラム横断圧力）は、いくつかの実施形態において、約０．５ＭＰａ以下などの、約１ＭＰａ以下であり得る。

【0036】

開示される分離プロトコルは、任意のサイズのポリヌクレオチドの精製に高流量での高容量結合を提供し得る。更に、開示される分離プロトコルは、長期の結合容量を提供することができ、複数の結合溶離サイクルにわたって、例えば、いくつかの実施形態において、２０結合溶離サイクルにわたって、５０結合溶離サイクルにわたって、又は１００結合溶離サイクルにわたって、約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９５％以上、９６％以上、又は９７％以上の値で結合容量が保持される。

【0037】

本開示は、以下に記載される実施例を参照することでよりよく理解することができる。

【実施例】

【0038】

実施例１
オリゴ－ｄＴベースの親和性膜カラムのｍＲＮＡ動的結合容量を調べた。この実施例において、１０％動的結合容量値（ＤＢＣ_１０％）を決定した。ＤＢＣ_１０％は、膜床からの溶離液中の標的濃度が供給液中の標的濃度の１０％に達するときのクロマトグラフィー媒体の単位容積当たりに結合した標的の質量を表す。

【0039】

図３は、３つの異なる細孔径を有する膜を使用したオリゴ－ｄＴベースの膜カラムのＤＢＣ_１０％を示す。前に参照により本明細書に組み込まれた米国特許出願公開第２０２０／０１８８８５９号明細書に記載される方法に従って、膜を形成した。簡単に言うと、膜は２５塩基のオリゴ－ｄＴ親和性リガンドを含み、マクロ多孔性マトリックスとオリゴ－ｄＴ親和性リガンドとの間に６Ｃスペーサーを含んでいた。３つの膜カラムの公称細孔径は、０．２μｍ、０．４５μｍ、及び１．０μｍであった。標的とされるｍＲＮＡは、約８００の塩基とポリ－Ａテールを有する緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）ｍＲＮＡであった。ｍＲＮＡを５０ｍＭのリン酸塩、２５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．０緩衝液の供給液中に溶解した。ｍＲＮＡの濃度は、供給液中で０．１ｍｇ／ｍＬであった。装填流量を１２秒の滞留時間を表す５ＣＶ／分で固定した。試験は室温で実施した。図３に示すように、ＤＢＣ_１０％はより小さな細孔を有する膜カラムでより高く、ＤＢＣ_１０％は、示すように、１０ｍｇ／ｍＬを超える値に達した。

【0040】

実施例２
オリゴ－ｄＴベースの親和性膜カラムのｍＲＮＡ動的結合容量に対する流量の影響を調べた。分離媒体は、上記の実施例１に記載される通りであった。

【0041】

図４は、様々な流量を使用したオリゴ－ｄＴベースのクロマトグラフィー媒体の１０％動的結合容量（ＤＢＣ_１０％）を提供する。供給液は、５０ｍＭのリン酸塩、２５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．０中の０．１ｍｇ／ｍＬのＧＦＰ ｍＲＮＡであった。滞留時間は、所与のクロマトグラフィーカラムについての流量に反比例する。この実施例において、滞留時間は１２秒～０．１２秒まで変化し、これは利用される比較的小さい容積のカラムにおける５ＣＶ／分～５００ＣＶ／分の流量に相当する（図４）。図示するように、ＤＢＣ_１０％は、所与の床容積に対する流量によってわずかに影響を受けた。

【0042】

図５は、上述したように、調製されたマクロ多孔質マトリックスと親和性リガンドとの間に６個の炭素のスペーサーを有する２５塩基のオリゴ－ｄＴを含む０．４５μｍ細孔径のマクロ多孔質支持体を使用した０．１ｍＬのデバイスについての収量％（注入されたｍＲＮＡのｍｇ／溶離液中で回収されたｍＲＮＡのｍｇ）を提供する。図示するように、収率は、最大少なくとも８０ＣＶ／分の流量に対して一致していた。

【0043】

図６は、文献で報告されていた製品についての理論的装填工程生産性（ｍＲＮＡのｍｇ／分）並びに０．２μｍ、０．４５μｍ、又は１．０μｍのいずれかの細孔径を有し、記載されたように、６Ｃスペーサーを有する２５塩基のオリゴ－ｄＴで官能化されたマクロ多孔性膜分離媒体を組み込む０．２ｍＬのデバイスを使用して、５ＣＶ／分で動作させて収集したデータを含む。示すように、開示された方法の装填工程生産性は、操作可能な速度の１／２００を使用した樹脂ベースの分離材料を利用する以前から知られている方法の性能を超えることができる。

【0044】

実施例３
標的化ｍＲＮＡの結合容量を、異なるサイズの標的及び異なる分離媒体について調べた。検討した材料は、市販の製品（ＰＯＲＯＳ（商標）－ＯｄＴ樹脂）及び６Ｃスペーサーを介して、マクロ多孔性膜に取り付けられた２５塩基のオリゴ－ｄＴ親和性リガンドで官能化された０．４５μｍの細孔径を有する多孔性膜媒体を含んだ。標的化ｍＲＮＡには、４０００塩基のｍＲＮＡ及び８００塩基のｍＲＮＡが含まれる。供給液は、５０ｍＭのリン酸塩、２５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．０中に０．１ｍｇ／ｍＬの標的化ｍＲＮＡのうちの１つを含んだ。

【0045】

市販の製品が、０．２５ＣＶ／分の流量で使用するために推奨される。０．２５ＣＶ／分の推奨される流量、並びに１ＣＶ／分のより高い流量において、両方のｍＲＮＡ標的に対してこの市販の製品を使用して、分離プロトコルを実行した。結果を図７に示す。示されるように、４０００塩基のｍＲＮＡについての結合容量は、０．２５ＣＶ／分の推奨された流量において、８００塩基のｍＲＮＡについてのものよりも３２％低かった。推奨された限界を超えて流量を増加させることによって、８００塩基のｍＲＮＡでは３８％の容量減少をもたらし、４０００塩基のｍＲＮＡについては６６％の容量減少をもたらした。

【0046】

膜ベースの分離材料を、２つの異なるサイズのｍＲＮＡの分離について、及び１０ＣＶ／分～８０ＣＶ／分の複数の流量でも検討した。結果を図８に示す。図示するように、４，０００塩基のｍＲＮＡについての結合容量は、８００塩基のｍＲＮＡについてのものよりもわずか７％低かった。更に、最低流量から最高流量まで（１０～８０ＣＶ／分）において、８００塩基のｍＲＮＡプロトコルでは、容量の２０％のみの減少があり、４，０００塩基のｍＲＮＡプロトコルでは２６％の減少があった。

【0047】

精製プロトコルは、製造業者の推奨する条件下で、樹脂ベースの分離プロトコルと比較して、開示された方法論では、１０～１６０倍速かった。更に、開示された方法は、９３％～９６％の標的回収をもたらした。開示された方法論は、特に大量のｍＲＮＡ標的の精製を考慮する場合、樹脂ベースの方法と比較して、より堅牢な性能を発揮する。

【0048】

実施例４
０．１ＭのＮａＯＨ及び５分の接触時間を使用して、定置洗浄プロトコルを実施例４の膜分離デバイスで行った。プロトコルを２０結合溶離サイクルで実施した。図９は、デバイスの結合容量が２０サイクル試験の平均で９８％に維持され、決定された最低値が試験の過程にわたって、９６．５％であったことを示す結果を提供している。

【0049】

本発明の主題を、特定の例示的な実施形態及びその方法に関して詳細に説明してきたが、前述を理解した上で、そのような実施形態に対して変更、バリエーション及び等価物を容易に生じ得ることが当業者には理解されよう。したがって、本開示の範囲は限定的ではなく、例示的なものであり、主題の開示は、本明細書に開示されている教示を使用して、当業者に容易に明らかになるように、本発明の主題に対する変更、バリエーション及び／又は追加を含めることを排除するものではない。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【国際調査報告】