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▶ オックスフォード バイオメディカ（ユーケー）リミテッドの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-12-08
(54)【発明の名称】ポリマー／核酸複合体の溶液の調製
(51)【国際特許分類】
C12N 15/09 20060101AFI20231201BHJP
C12N 15/11 20060101ALI20231201BHJP
C12N 15/867 20060101ALI20231201BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20231201BHJP
【ＦＩ】
C12N15/09 Z
C12N15/11 Z
C12N15/867 Z
C12N5/10
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023528105
(86)(22)【出願日】2021-11-10
(85)【翻訳文提出日】2023-06-28
(86)【国際出願番号】 GB2021052901
(87)【国際公開番号】W WO2022101617
(87)【国際公開日】2022-05-19
(31)【優先権主張番号】2017725.9
(32)【優先日】2020-11-10
(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】306034996
【氏名又は名称】オックスフォード バイオメディカ（ユーケー）リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100107984
【弁理士】
【氏名又は名称】廣田 雅紀
(74)【代理人】
【識別番号】100182305
【弁理士】
【氏名又は名称】廣田 鉄平
(74)【代理人】
【識別番号】100096482
【弁理士】
【氏名又は名称】東海 裕作
(74)【代理人】
【識別番号】100131093
【弁理士】
【氏名又は名称】堀内 真
(74)【代理人】
【識別番号】100150902
【弁理士】
【氏名又は名称】山内 正子
(74)【代理人】
【識別番号】100141391
【弁理士】
【氏名又は名称】園元 修一
(74)【代理人】
【識別番号】100221958
【弁理士】
【氏名又は名称】篠田 真希恵
(74)【代理人】
【識別番号】100192441
【弁理士】
【氏名又は名称】渡辺 仁
(72)【発明者】
【氏名】グッドイヤー オリバー
(72)【発明者】
【氏名】デイビース リー
(72)【発明者】
【氏名】キングウッド モーリー
(72)【発明者】
【氏名】サンチェス ルイ
(72)【発明者】
【氏名】ラモント シアラン
【テーマコード（参考）】
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B065AA93X
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA24
4B065CA46
(57)【要約】
本発明は、ポリマー／核酸複合体の溶液の調製、及び細胞のトランスフェクションのための方法におけるそのような溶液の使用に関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ポリマー／核酸複合体の溶液を製造するためのインビトロ方法であって、ａ）実質的に塩を含まない水溶液中で核酸及びカチオン性ポリマーを混合する工程、
ｂ）工程ａ）で製造された混合物に塩を添加して塩溶液を形成する工程、
ｃ）場合により、工程ｂ）で製造された前記塩溶液をインキュベーションする工程、並びに／或いは
ｄ）場合により、工程ｂ）で製造された前記塩溶液を希釈する工程、又は工程ｃ）のインキュベーション後に前記塩溶液を希釈する工程、
を含み、
前記塩が、バルプロ酸塩、イソ酪酸塩又はイソ吉草酸塩ではない、前記ポリマー／核酸複合体の溶液を製造するためのインビトロ方法。
【請求項2】
ポリマー／核酸複合体の溶液を製造するためのインビトロ方法であって、ａ）実質的に塩を含まない水溶液中で核酸及びカチオン性ポリマーを混合する工程、
ｂ）工程ａ）で製造された混合物に塩を添加して塩溶液を形成する工程、
ｃ）場合により、工程ｂ）で製造された前記塩溶液をインキュベーションする工程、並びに／或いは
ｄ）場合により、工程ｂ）で製造された前記塩溶液を希釈する工程、又は工程ｃ）のインキュベーション後に前記塩溶液を希釈する工程、
を含み、
前記塩が、ポリマー／核酸複合体の溶液を細胞と接触させる前にのみ添加される、前記ポリマー／核酸複合体の溶液を製造するためのインビトロ方法。
【請求項3】
ポリマー／核酸複合体の溶液を製造するためのインビトロ方法であって、ａ）実質的に塩を含まない水溶液中で核酸及びカチオン性ポリマーを混合する工程、
ｂ）工程ａ）で製造された混合物に塩を添加して塩溶液を形成する工程、
ｃ）場合により、工程ｂ）で製造された前記塩溶液をインキュベーションする工程、並びに／或いは
ｄ）場合により、工程ｂ）で製造された前記塩溶液を希釈する工程、又は工程ｃ）のインキュベーション後に前記塩溶液を希釈する工程、
を含み、
工程ｂ）における最終塩濃度が約１０ｍＭ～約１００ｍＭである、前記ポリマー／核酸複合体の溶液を製造するためのインビトロ方法。
【請求項4】
ポリマー／核酸複合体の溶液を製造するためのインビトロ方法であって、ａ）実質的に塩を含まない水溶液中で核酸及びカチオン性ポリマーを混合する工程、
ｂ）工程ａ）で製造された混合物に塩を添加して塩溶液を形成する工程、
ｃ）場合により、工程ｂ）で製造された前記塩溶液をインキュベーションする工程、並びに／或いは
ｄ）場合により、工程ｂ）で製造された前記塩溶液を希釈する工程、又は工程ｃ）のインキュベーション後に前記塩溶液を希釈する工程、
を含み、
前記塩が、前記実質的に塩を含まない水溶液中で少なくとも０．９５の解離度を有する、前記ポリマー／核酸複合体の溶液を製造するためのインビトロ方法。
【請求項5】
ポリマー／核酸複合体の溶液を製造するためのインビトロ方法であって、ａ）実質的に塩を含まない水溶液中で核酸及びカチオン性ポリマーを混合する工程、
ｂ）工程ａ）で製造された混合物に塩を添加して塩溶液を形成する工程、
ｃ）場合により、工程ｂ）で製造された前記塩溶液をインキュベーションする工程、並びに／或いは
ｄ）工程ｂ）で製造された前記塩溶液を希釈する工程、又は工程ｃ）のインキュベーション後に前記塩溶液を希釈する工程、
を含む、前記ポリマー／核酸複合体の溶液を製造するためのインビトロ方法。
【請求項6】
ポリマー／核酸複合体の溶液を製造するためのインビトロ方法であって、ａ）実質的に塩を含まない水溶液中で核酸及びカチオン性ポリマーを混合する工程、
ｂ）工程ａ）で製造された混合物に塩を添加して塩溶液を形成する工程、
ｃ）工程ｂ）で製造された前記塩溶液をインキュベーションする工程；及び／又は
ｄ）場合により、工程ｂ）で製造された前記塩溶液を希釈する工程、又は工程ｃ）のインキュベーション後に前記塩溶液を希釈する工程、
を含む、前記ポリマー／核酸複合体の溶液を製造するためのインビトロ方法。
【請求項7】
前記核酸が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチド分子、及びそれらの混合物から選択される、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
前記核酸がＤＮＡ、好ましくはプラスミドＤＮＡである、請求項７に記載の方法。
【請求項9】
前記カチオン性ポリマーが、ポリマーベースのトランスフェクション試薬である、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項10】
前記カチオン性ポリマーが、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、デンドリマー、ＤＥＡＥ－デキストラン、ポリプロピレンイミン（ＰＰＩ）、キトサン［ポリ－（β－１／４）－２－アミノ－２－デオキシ－Ｄ－グルコピラノース］、ポリ－Ｌ－リジン（ＰＬＬ）、ポリ（乳酸－ｃｏ－グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、ポリ（カプロラクトン）（ＰＣＬ）、及びそれらの誘導体から選択される、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項11】
前記カチオン性ポリマーが、ＰＥＩ又はその誘導体であり、好ましくは直鎖ＰＥＩ、分枝ＰＥＩ、ＰＥＧ化ＰＥＩ、ＪｅｔＰＥＩ、ＰＥＩＰｒｏ（登録商標）、ＰＥＩ ＭＡＸ及びＰＴＧ１＋から選択される、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項12】
前記塩が、ナトリウム塩、マグネシウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、リン酸塩及びそれらの混合物から選択される、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項13】
前記塩がリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）である、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項14】
前記塩がＰＢＳであり、ＰＢＳが工程ｂ）において約０．１Ｘ ＰＢＳ～約１．０Ｘ ＰＢＳの最終濃度まで添加され、好ましくは前記ＰＢＳが約０．１Ｘ ＰＢＳ～約０．３Ｘ ＰＢＳの最終濃度まで添加される、請求項１、２及び４～１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項15】
前記塩が、工程ｂ）において約１０ｍＭ～約１００ｍＭの最終濃度まで添加され、好ましくは、前記塩が、工程ｂ）において約２０ｍＭ～約１００ｍＭの最終濃度まで添加される、請求項１、２及び４～１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項16】
工程ａ）が、実質的に塩を含まない水溶液中で複数の核酸分子及び複数のカチオン性ポリマー分子を混合することを含む、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項17】
工程ｂ）で製造された前記塩溶液をインキュベートする工程を含む、請求項１～５及び７～１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項18】
前記塩溶液を約１分間～最大約２時間インキュベートし、好ましくは前記塩溶液を約２０分間～約９０分間インキュベートする、請求項６又は請求項１７に記載の方法。
【請求項19】
前記塩溶液を約６０分間インキュベートする、請求項１８に記載の方法。
【請求項20】
工程ｂ）で製造された前記塩溶液又は工程ｃ）のインキュベーション後の前記塩溶液を希釈する工程を含む、請求項１～４及び６～１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項21】
前記塩がＰＢＳであり、前記塩溶液が、約０．０５Ｘ ＰＢＳ～約０．１５Ｘ ＰＢＳの最終濃度に希釈され、好ましくは、前記塩溶液が、約０．１Ｘ ＰＢＳの最終濃度に希釈される、請求項５又は請求項２０に記載の方法。
【請求項22】
前記核酸がレトロウイルスベクターコンポーネントをコードする、請求項１～２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項23】
前記レトロウイルスベクターが複製欠損レトロウイルスベクターである、請求項２２に記載の方法。
【請求項24】
前記レトロウイルスベクターがレンチウイルスベクターであり、好ましくは前記レンチウイルスベクターがＨＩＶ－１、ＨＩＶ－２、ＳＩＶ、ＦＩＶ、ＢＩＶ、ＥＩＡＶ、ＣＡＥＶ又はＶｉｓｎａである、請求項２２又は請求項２３に記載の方法。
【請求項25】
前記ベクターコンポーネントが、ａ）前記レンチウイルスベクターのＲＮＡゲノム、
ｂ）ｅｎｖ又はその機能的代用物、
ｃ）ｇａｇ－ｐｏｌ又はその機能的代用物、並びに／或いは
ｄ）ｒｅｖ又はその機能的代用物
から選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項26】
ｅ）場合により、灌流培養物中で哺乳動物細胞を培養する工程と、ｆ）請求項１～２５のいずれか一項に記載の方法によって得られたポリマー／核酸複合体の溶液を使用して哺乳動物細胞をトランスフェクトする工程と、
ｇ）場合により、ポリマー／核酸複合体の溶液の核酸とは異なる核酸を、前記哺乳動物細胞に導入する工程と、
ｈ）場合により、そのゲノム内に組み込まれた前記核酸を有する哺乳動物細胞を選択する工程と、
ｉ）場合により、前記核酸が発現される条件下で前記哺乳動物細胞を培養する工程と、
ｊ）場合により、前記レトロウイルスベクターが産生される条件下で前記哺乳動物細胞を培養する工程と、
ｋ）場合により、前記レトロウイルスベクターを単離する工程と、
を更に含む、請求項１～２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項27】
哺乳動物細胞を灌流培養で培養する工程を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項28】
哺乳動物細胞を灌流培養で培養する前記工程が、約１０時間～約９６時間行われる、請求項２６又は請求項２７に記載の方法。
【請求項29】
前記核酸が発現される条件下で前記哺乳動物細胞を培養する工程を含む、請求項２６～２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項30】
前記レトロウイルスベクターが産生される条件下で前記哺乳動物細胞を培養する工程を含む、請求項２６～２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項31】
前記レトロウイルスベクターを単離する工程を含む、請求項２６～３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項32】
前記哺乳動物細胞がＨＥＫ２９３Ｔ細胞である、請求項２６～３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項33】
前記哺乳動物細胞が懸濁液適合哺乳動物細胞である、請求項２６～３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項34】
前記トランスフェクション、導入及び／又は培養工程が、無血清培地中の懸濁液中で行われる、請求項２６～３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項35】
前記トランスフェクションが一過性トランスフェクションである、請求項２６～３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項36】
前記トランスフェクション、導入及び／又は培養工程が少なくとも５０Ｌの容量で行われ、好ましくは前記トランスフェクション、導入及び培養工程が少なくとも５０Ｌの容量で行われる、請求項２６～３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項37】
前記ポリマー／核酸複合体の溶液の核酸とは異なる核酸が、トランスフェクション又はエレクトロポレーションによって前記哺乳動物細胞に導入される、請求項２６～３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項38】
前記ポリマー／核酸複合体の溶液の核酸とは異なる核酸が、前記ポリマー／核酸複合体の溶液の核酸によってコードされない、以下のもの：ａ）レンチウイルスベクターのＲＮＡゲノム；
ｂ）ｅｎｖ又はその機能的代用物；
ｃ）ｇａｇ－ｐｏｌ又はその機能的代用物；並びに／或いは
ｄ）ｒｅｖ又はその機能的代用物；
から選択される任意のウイルスベクターコンポーネントをコードする、請求項２６～３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項39】
請求項１～３８のいずれか一項に記載の方法によって得られる又は得ることができるポリマー／核酸複合体の溶液。
【請求項40】
請求項２２～２５のいずれか一項に記載の方法によって得られる又は得ることができる、請求項３９に記載のポリマー／核酸複合体の溶液。
【請求項41】
ポリマー／核酸複合体及び塩を含む溶液であって、塩濃度が約１０ｍＭ～約１００ｍＭである、前記ポリマー／核酸複合体及び塩を含む溶液。
【請求項42】
前記塩濃度が約９０ｍＭ未満であるか、又は前記塩がＰＢＳであり、前記ＰＢＳの濃度が約０．３Ｘ ＰＢＳ未満である、請求項４１に記載のポリマー／核酸複合体の溶液。
【請求項43】
前記核酸が、レトロウイルスベクターを産生するためのコンポーネントをコードし、好ましくは、前記レトロウイルスベクターがレンチウイルスベクターであり、レンチウイルスベクターを産生するためのコンポーネントが、（ｉ）前記レンチウイルスベクターのＲＮＡゲノム；
（ｉｉ）ｅｎｖ又はその機能的代用物；
（ｉｉｉ）ｇａｇ－ｐｏｌ又はその機能的代用物；並びに／或いは
（ｉｖ）ｒｅｖ又はその機能的代用物
から選択される、請求項４１又は請求項４２に記載のポリマー／核酸複合体の溶液。
【請求項44】
前記レトロウイルスベクターがレンチウイルスベクターであり、好ましくは、前記レンチウイルスベクターがＨＩＶ－１、ＨＩＶ－２、ＳＩＶ、ＦＩＶ、ＢＩＶ、ＥＩＡＶ、ＣＡＥＶ又はＶｉｓｎａである、請求項４３に記載のポリマー／核酸複合体の溶液。
【請求項45】
細胞への前記核酸のトランスフェクションのための、請求項３９～４４のいずれか一項に記載のポリマー／核酸複合体の溶液の使用。
【請求項46】
レトロウイルスベクターの製造方法における、請求項４０、４３又は４４のいずれか一項に記載のポリマー／核酸複合体の溶液の使用。
【請求項47】
レトロウイルスベクターの製造方法であって、ａ）場合により、灌流培養物中で哺乳動物細胞を培養する工程と、
ｂ）請求項２２～２５のいずれか一項に記載のポリマー／核酸複合体の溶液又は請求項４０、４３若しくは４４のいずれか一項に記載のポリマー／核酸複合体の溶液を使用して前記哺乳動物細胞をトランスフェクトする工程と、
ｃ）場合により、ポリマー／核酸複合体の溶液の核酸とは異なる少なくとも１つの核酸を前記哺乳動物細胞に導入する工程と、
ｄ）場合により、そのゲノム内に組み込まれた前記ウイルスベクターコンポーネントをコードする核酸配列を有する哺乳動物細胞を選択する工程と、
ｅ）前記レトロウイルスベクターが産生される条件下で前記哺乳動物細胞を培養する工程と、
を含む、レトロウイルスベクターの製造方法。
【請求項48】
前記レトロウイルスベクターを単離する工程を更に含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項49】
前記レトロウイルスベクターが複製欠損レトロウイルスベクターである、請求項４７又は請求項４８に記載の方法。
【請求項50】
前記レトロウイルスベクターがレンチウイルスベクターであり、好ましくはレンチウイルスベクターがＨＩＶ－１、ＨＩＶ－２、ＳＩＶ、ＦＩＶ、ＢＩＶ、ＥＩＡＶ、ＣＡＥＶ又はＶｉｓｎａである、請求項４７～４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項51】
前記哺乳動物細胞がＨＥＫ２９３Ｔ細胞である、請求項４７～５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項52】
前記哺乳動物細胞が懸濁液適合細胞である、請求項４７～５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項53】
無血清培地に懸濁して実施される、請求項４７～５２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項54】
哺乳動物細胞を灌流培養で培養する工程を含む、請求項４７～５３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項55】
哺乳動物細胞を灌流培養で培養する前記工程が、約１０時間～約９６時間行われる、請求項４７～５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項56】
工程ａ）、工程ｂ）、工程ｃ）及び／又は工程ｅ）が少なくとも５０Ｌの容量で行われ、好ましくは工程ａ）、工程ｂ）、工程ｃ）及び工程ｅ）が少なくとも５０Ｌの容量で行われる、請求項４７～５５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項57】
前記核酸が、工程ｃ）におけるトランスフェクション又はエレクトロポレーションによって前記細胞に導入される、請求項４７～５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項58】
前記トランスフェクションが一過性トランスフェクションである、請求項４７～５７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項59】
工程ｂ）において前記哺乳動物細胞に場合により導入される前記少なくとも１つの核酸が、前記ポリマー／核酸複合体の溶液の核酸によってコードされない、（ｉ）前記レンチウイルスベクターのＲＮＡゲノム；
（ｉｉ）ｅｎｖ又はその機能的代用物；
（ｉｉｉ）ｇａｇ－ｐｏｌ又はその機能的代用物；並びに／或いは
（ｉｖ）ｒｅｖ又はその機能的代用物；
からなる群から選択される任意のレンチウイルスベクターコンポーネントをコードする、請求項４７～５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項60】
ａ）灌流培養において哺乳動物細胞を培養する工程と、ｂ）請求項２２～２５のいずれか一項に記載のポリマー／核酸複合体の溶液又は請求項４０、４３若しくは４４のいずれか一項に記載のポリマー／核酸複合体の溶液を使用して前記哺乳動物細胞をトランスフェクトする工程と、
を含む、哺乳動物細胞をトランスフェクトするための方法。
【請求項61】
哺乳動物細胞を灌流培養で培養する前記工程が、約１０時間～約９６時間行われる、請求項６０に記載の方法。
【請求項62】
前記哺乳動物細胞がＨＥＫ２９３Ｔ細胞である、請求項６０又は請求項６１に記載の方法。
【請求項63】
前記哺乳動物細胞が懸濁液適合細胞である、請求項６０～６２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項64】
無血清培地に懸濁して実施される、請求項６０～６３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項65】
工程ａ）及び／又は工程ｂ）が少なくとも５０Ｌの容量で行われ、好ましくは工程ａ）及び工程ｂ）が少なくとも５０Ｌの容量で行われる、請求項６０～６４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項66】
前記トランスフェクションが一過性トランスフェクションである、請求項６０～６５のいずれか一項に記載の方法。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ポリマー／核酸複合体の溶液の調製、及び細胞のトランスフェクションのための方法におけるそのような溶液の使用に関する。
【背景技術】
【0002】
トランスフェクションは、核酸を真核細胞に意図的に導入するプロセスである。様々なタイプの外因性核酸を真核細胞に導入することが望ましいか又は有利であり得る多くの状況が存在する。一般的に使用される外因性核酸は、プラスミドＤＮＡ、ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ及びオリゴヌクレオチドである。細胞に送達されると、核酸は、目的の遺伝子の過剰発現又はサイレンシングを駆動することによって遺伝子発現を調節する。
【0003】
遺伝子過剰発現は、目的の遺伝子の役割（遺伝子研究、ハイスループットスクリーニング）の理解から、特に治療目的（例えば遺伝子及び細胞療法のためのウイルス産生）のための抗体（タンパク質産生）及び組換えウイルス粒子等の生物製剤の産生まで、いくつかの用途に不可欠なツールである。
【0004】
遺伝子サイレンシングは、目的の遺伝子の発現を防止するために使用される方法である。遺伝子の発現は、部分的に低減され得るか（遺伝子ノックダウン）又は完全にブロックされ得る（遺伝子ノックアウト）。任意の遺伝子が潜在的に標的とされ得るため、遺伝子サイレンシングは、単一遺伝子の病状、癌及び免疫療法戦略に対処するための遺伝子ベースの療法を開発するために使用される一般的な技術である。トランスフェクションは、多数の異なる用途において多くの有用性を有することが分かる。特に興味深いのは、組換えタンパク質及びウイルスベクターを含む生物学的薬剤の産生に広く使用されている発現ベクターによる細胞のトランスフェクションである。例えば、ウイルスベクター製造の一般的な方法には、ベクターＤＮＡコンポーネントによる初代細胞又は哺乳動物／昆虫細胞株のトランスフェクション、それに続く限られたインキュベーション期間、次いで培養培地及び／又は細胞からの粗ベクターの回収が含まれる（Ｍｅｒｔｅｎ，Ｏ－Ｗ．ｅｔ ａｌ．，２０１４，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ，２：１８３－２０３）。レンチウイルスベクター製造の効率は、典型的には、［１］使用されるウイルス血清型／偽型、［２］トランスジェニック配列の組成及びサイズ、［３］培地組成／ガス処理／ｐＨ、［４］トランスフェクション試薬／プロセス、［５］化学的誘導及びベクター回収のタイミング、［６］細胞の脆弱性／生存性、［７］バイオリアクター剪断力及び［８］不純物を含む、「上流相」におけるいくつかの因子によって影響される。明らかに、「下流」の精製／濃縮段階の間に考慮すべき他の要因が存在する（Ｍｅｒｔｅｎ，Ｏ－Ｗ．ｅｔ ａｌ．，２０１４，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ，２：２３７－２５１）。
【0005】
臨床試験におけるウイルスベクターアプローチの成功が規制上の承認及び商業化に向けて構築され始めるにつれて、医薬品の製造管理及び品質管理に関する基準（ＧＭＰ）グレードのベクター材料の大量生産における新たなボトルネックに注目が集まっている（Ｖａｎ ｄｅｒ Ｌｏｏ ＪＣＭ，Ｗｒｉｇｈｔ ＪＦ．，２０１６，Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２５（Ｒ１）：Ｒ４２－Ｒ５２）。ＧＭＰグレードの組換えタンパク質の産生にも同様の障害が存在する。
【0006】
この課題を克服する方法は、ウイルスベクター又は組換えタンパク質の産生中にトランスフェクション効率を最大化する新しい方法を見出すことである。したがって、当技術分野では、ＧＭＰグレードのベクター材料等のＧＭＰグレードの材料の大量生産に関連する既知の問題に対処するのに役立つ、例えばウイルスベクター及び他の生物学的薬剤の生産に使用するための代替の改良されたトランスフェクション方法を提供する必要がある。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0007】
本発明者らは、ポリマー／核酸複合体が、トランスフェクション効率に悪影響を及ぼす前に塩の存在下で短時間だけ安定であることを示した。これは、最適なインキュベーション期間が短すぎて大規模ＧＭＰ製造で実際に可能ではないため、生物学的薬剤の大量生産におけるカチオン性ポリマーの使用を制限する。
【0008】
本発明は、細胞トランスフェクションのための改良された方法を提供する。これに関して、本発明者らは、驚くべきことに、核酸及びカチオン性ポリマーを、実質的に塩を含まない水溶液（例えば水）中で混合し、続いて塩を添加してポリマー／核酸複合体の成熟を誘導することによって調製されたポリマー／核酸複合体が、最適なポリマー／核酸複合体の成熟のための時間を延長し、高いトランスフェクション効率を提供することを見出した。したがって、最適な濃度の塩を使用して、最適なポリマー／核酸複合体成熟のための時間（すなわち、インキュベーション時間）を延長することができる。本発明者らは更に驚くべきことに、ポリマー／核酸複合体の成長を抑制し、複合体をポリマー／核酸複合体の溶液の希釈（それにより塩を希釈）によって安定化してインキュベーション時間を更に延長できることを見出した。したがって、本明細書に記載の方法は、ポリマー／核酸複合体の成熟の開始及び／又は終了を制御する能力を提供するため有利である。これは、トランスフェクションプロセスの問題としての時間制約を取り除く、すなわち製造プロセスの柔軟性を改善するので、ＧＭＰグレードの材料の大量生産にとって非常に有利である。
【0009】
本発明者らは、驚くべきことに、低下した細胞毒性と組み合わせて、ポリマー／核酸複合体の成熟の開始及び／又は終了を制御する能力が、トランスフェクション中の細胞数でポリマー／核酸複合体の調製をスケーリングする能力を提供するので有利であることを見出した。これは、トランスフェクションプロセスのためにより高い細胞密度（例えば、灌流培養を用いて達成される細胞密度）の使用を可能にする、すなわち、製造プロセスの能力及び収率を改善するので、ＧＭＰグレードの材料の大量生産にとって非常に有利である。
【0010】
本発明は、ポリマー／核酸複合体の溶液を調製するためのそのようなプロセス、及び例えばレンチウイルスベクターの製造における細胞のトランスフェクションのための溶液の使用に関する。
【0011】
一態様では、本発明は、ポリマー／核酸複合体の溶液を製造するためのインビトロ方法を提供し、
ａ）実質的に塩を含まない水溶液中で核酸及びカチオン性ポリマーを混合する工程、
ｂ）工程ａ）で製造された混合物に塩を添加して塩溶液を形成する工程、
ｃ）場合により、工程ｂ）で製造された塩溶液をインキュベーションする工程、及び／又は
ｄ）場合により、工程ｂ）で製造された塩溶液を希釈する工程、又は工程ｃ）のインキュベーション後に塩溶液を希釈する工程、
を含み、
塩は、バルプロ酸塩、イソ酪酸塩又はイソ吉草酸塩ではない。
ａ）実質的に塩を含まない水溶液中で核酸及びカチオン性ポリマーを混合する工程、
ｂ）工程ａ）で製造された混合物に塩を添加して塩溶液を形成する工程、
ｃ）場合により、工程ｂ）で製造された塩溶液をインキュベーションする工程、及び／又は
ｄ）場合により、工程ｂ）で製造された塩溶液を希釈する工程、又は工程ｃ）のインキュベーション後に塩溶液を希釈する工程、
を含み、
塩は、バルプロ酸塩、イソ酪酸塩又はイソ吉草酸塩ではない。
【0012】
更なる態様では、本発明は、ポリマー／核酸複合体の溶液を製造するためのインビトロ方法を提供し、
ａ）実質的に塩を含まない水溶液中で核酸及びカチオン性ポリマーを混合する工程、
ｂ）工程ａ）で製造された混合物に塩を添加して塩溶液を形成する工程、
ｃ）場合により、工程ｂ）で製造された塩溶液をインキュベーションする工程、及び／又は
ｄ）場合により、工程ｂ）で製造された塩溶液を希釈する工程、又は工程ｃ）のインキュベーション後に塩溶液を希釈する工程、
を含み、
塩は、ポリマー／核酸複合体の溶液を細胞と接触させる前にのみ添加される。
ａ）実質的に塩を含まない水溶液中で核酸及びカチオン性ポリマーを混合する工程、
ｂ）工程ａ）で製造された混合物に塩を添加して塩溶液を形成する工程、
ｃ）場合により、工程ｂ）で製造された塩溶液をインキュベーションする工程、及び／又は
ｄ）場合により、工程ｂ）で製造された塩溶液を希釈する工程、又は工程ｃ）のインキュベーション後に塩溶液を希釈する工程、
を含み、
塩は、ポリマー／核酸複合体の溶液を細胞と接触させる前にのみ添加される。
【0013】
更なる態様では、本発明は、ポリマー／核酸複合体の溶液を製造するためのインビトロ方法を提供し、
ａ）実質的に塩を含まない水溶液中で核酸及びカチオン性ポリマーを混合する工程、
ｂ）工程ａ）で製造された混合物に塩を添加して塩溶液を形成する工程、
ｃ）場合により、工程ｂ）で製造された塩溶液をインキュベーションする工程、及び／又は
ｄ）場合により、工程ｂ）で製造された塩溶液を希釈する工程、又は工程ｃ）のインキュベーション後に塩溶液を希釈する工程、
を含み、
工程ｂ）における最終塩濃度は約１０ｍＭ～約１００ｍＭである。
ａ）実質的に塩を含まない水溶液中で核酸及びカチオン性ポリマーを混合する工程、
ｂ）工程ａ）で製造された混合物に塩を添加して塩溶液を形成する工程、
ｃ）場合により、工程ｂ）で製造された塩溶液をインキュベーションする工程、及び／又は
ｄ）場合により、工程ｂ）で製造された塩溶液を希釈する工程、又は工程ｃ）のインキュベーション後に塩溶液を希釈する工程、
を含み、
工程ｂ）における最終塩濃度は約１０ｍＭ～約１００ｍＭである。
【0014】
更なる態様では、本発明は、ポリマー／核酸複合体の溶液を製造するためのインビトロ方法を提供し、
ａ）実質的に塩を含まない水溶液中で核酸及びカチオン性ポリマーを混合する工程、
ｂ）工程ａ）で製造された混合物に塩を添加して塩溶液を形成する工程、
ｃ）場合により、工程ｂ）で製造された塩溶液をインキュベーションする工程、及び／又は
ｄ）場合により、工程ｂ）で製造された塩溶液を希釈する工程、又は工程ｃ）のインキュベーション後に塩溶液を希釈する工程、
を含み、
塩は、実質的に塩を含まない水溶液中で少なくとも０．９５の解離度を有する。
ａ）実質的に塩を含まない水溶液中で核酸及びカチオン性ポリマーを混合する工程、
ｂ）工程ａ）で製造された混合物に塩を添加して塩溶液を形成する工程、
ｃ）場合により、工程ｂ）で製造された塩溶液をインキュベーションする工程、及び／又は
ｄ）場合により、工程ｂ）で製造された塩溶液を希釈する工程、又は工程ｃ）のインキュベーション後に塩溶液を希釈する工程、
を含み、
塩は、実質的に塩を含まない水溶液中で少なくとも０．９５の解離度を有する。
【0015】
更なる態様では、本発明は、ポリマー／核酸複合体の溶液を製造するためのインビトロ方法を提供し、
ａ）実質的に塩を含まない水溶液中で核酸及びカチオン性ポリマーを混合する工程、
ｂ）工程ａ）で製造された混合物に塩を添加して塩溶液を形成する工程、
ｃ）場合により、工程ｂ）で製造された塩溶液をインキュベーションする工程、及び／又は
ｄ）工程ｂ）で製造された塩溶液を希釈する工程、又は工程ｃ）のインキュベーション後に塩溶液を希釈する工程、
を含む。
ａ）実質的に塩を含まない水溶液中で核酸及びカチオン性ポリマーを混合する工程、
ｂ）工程ａ）で製造された混合物に塩を添加して塩溶液を形成する工程、
ｃ）場合により、工程ｂ）で製造された塩溶液をインキュベーションする工程、及び／又は
ｄ）工程ｂ）で製造された塩溶液を希釈する工程、又は工程ｃ）のインキュベーション後に塩溶液を希釈する工程、
を含む。
【0016】
更なる態様では、本発明は、ポリマー／核酸複合体の溶液を製造するためのインビトロ方法を提供し、
ａ）実質的に塩を含まない水溶液中で核酸及びカチオン性ポリマーを混合する工程、
ｂ）工程ａ）で製造された混合物に塩を添加して塩溶液を形成する工程、
ｃ）工程ｂ）で製造された塩溶液をインキュベーションする工程、及び／又は
ｄ）場合により、工程ｂ）で製造された塩溶液を希釈する工程、又は工程ｃ）のインキュベーション後に塩溶液を希釈する工程、
を含む。
ａ）実質的に塩を含まない水溶液中で核酸及びカチオン性ポリマーを混合する工程、
ｂ）工程ａ）で製造された混合物に塩を添加して塩溶液を形成する工程、
ｃ）工程ｂ）で製造された塩溶液をインキュベーションする工程、及び／又は
ｄ）場合により、工程ｂ）で製造された塩溶液を希釈する工程、又は工程ｃ）のインキュベーション後に塩溶液を希釈する工程、
を含む。
【0017】
更なる態様では、本発明は、本発明の方法によって得られる又は得ることができるポリマー／核酸複合体の溶液を提供する。
【0018】
更なる態様では、本発明は、ポリマー／核酸複合体及び塩を含む溶液を提供し、塩濃度は約１０ｍＭ～約１００ｍＭである。
【0019】
更なる態様では、本発明は、細胞への核酸のトランスフェクションのための本発明のポリマー／核酸複合体の溶液の使用を提供する。
【0020】
更なる態様では、本発明は、レトロウイルスベクターの製造方法における本発明のポリマー／核酸複合体の溶液の使用を提供する。
【0021】
いくつかの実施形態では、核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチド分子、及びそれらの混合物から選択される。
【0022】
いくつかの実施形態では、核酸はＤＮＡ、好ましくはプラスミドＤＮＡである。
【0023】
いくつかの実施形態では、カチオン性ポリマーはポリマーベースのトランスフェクション試薬である。
【0024】
いくつかの実施形態では、カチオン性ポリマーは、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、デンドリマー、ＤＥＡＥ－デキストラン、ポリプロピレンイミン（ＰＰＩ）、キトサン［ポリ－（β－１／４）－２－アミノ－２－デオキシ－Ｄ－グルコピラノース］、ポリ－Ｌ－リジン（ＰＬＬ）、ポリ（乳酸－ｃｏ－グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、ポリ（カプロラクトン）（ＰＣＬ）、及びそれらの誘導体から選択される。
【0025】
いくつかの実施形態では、カチオン性ポリマーは、ＰＥＩ又はその誘導体であり、好ましくは直鎖ＰＥＩ、分枝ＰＥＩ、ＰＥＧ化ＰＥＩ、ＪｅｔＰＥＩ、ＰＥＩＰｒｏ（登録商標）、ＰＥＩ ＭＡＸ及びＰＴＧ１＋から選択される。
【0026】
いくつかの実施形態では、塩は、ナトリウム塩、マグネシウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、リン酸塩及びそれらの混合物から選択される。
【0027】
いくつかの実施形態では、塩はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）である。
【0028】
いくつかの実施形態では、塩はＰＢＳであり、ＰＢＳは工程ｂ）において約０．１Ｘ ＰＢＳ～約１．０Ｘ ＰＢＳの最終濃度まで添加され、好ましくはＰＢＳは約０．１Ｘ ＰＢＳ～約０．３Ｘ ＰＢＳの最終濃度まで添加される。
【0029】
いくつかの実施形態では、塩は、工程ｂ）において、約１０ｍＭ～約１００ｍＭの最終濃度まで添加され、好ましくは、塩は、工程ｂ）において、約２０ｍＭ～約１００ｍＭの最終濃度まで添加される。
【0030】
いくつかの実施形態では、工程ａ）は、実質的に塩を含まない水溶液中で複数の核酸分子及び複数のカチオン性ポリマー分子を混合することを含む。
【0031】
いくつかの実施形態では、方法は、工程ｂ）で生成された塩溶液をインキュベートする工程を含む。
【0032】
いくつかの実施形態では、塩溶液は、約１分間～最大約２時間インキュベートされ、好ましくは塩溶液は約２０分間～約９０分間インキュベートされる。
【0033】
いくつかの実施形態では、塩溶液は約６０分間インキュベートされる。
【0034】
いくつかの実施形態では、方法は、工程ｂ）で製造された塩溶液又は工程ｃ）のインキュベーション後の塩溶液を希釈する工程を含む。
【0035】
いくつかの実施形態では、塩はＰＢＳであり、塩溶液は、約０．０５Ｘ ＰＢＳ～約０．１５Ｘ ＰＢＳの最終濃度に希釈され、好ましくは、塩溶液は、約０．１Ｘ ＰＢＳの最終濃度に希釈される。
【0036】
いくつかの実施形態では、核酸は、レトロウイルスベクターコンポーネントをコードする。
【0037】
いくつかの実施形態では、レトロウイルスベクターは複製欠損レトロウイルスベクターである。
【0038】
いくつかの実施形態では、レトロウイルスベクターはレンチウイルスベクターであり、好ましくはレンチウイルスベクターは、ＨＩＶ－１、ＨＩＶ－２、ＳＩＶ、ＦＩＶ、ＢＩＶ、ＥＩＡＶ、ＣＡＥＶ又はＶｉｓｎａである。
【0039】
いくつかの実施形態では、ベクターコンポーネントは、
ａ）レンチウイルスベクターのＲＮＡゲノム、
ｂ）ｅｎｖ又はその機能的代用物、
ｃ）ｇａｇ－ｐｏｌ又はその機能的代用物、並びに／或いは
ｄ）ｒｅｖ又はその機能的代用物
から選択される。
ａ）レンチウイルスベクターのＲＮＡゲノム、
ｂ）ｅｎｖ又はその機能的代用物、
ｃ）ｇａｇ－ｐｏｌ又はその機能的代用物、並びに／或いは
ｄ）ｒｅｖ又はその機能的代用物
から選択される。
【0040】
いくつかの実施形態では、方法は、
ｅ）場合により、哺乳動物細胞を培養する工程と、
ｆ）先行する請求項のいずれか一項に記載の方法によって得られたポリマー／核酸複合体の溶液を使用して哺乳動物細胞をトランスフェクトする工程と、
ｇ）場合により、ポリマー／核酸複合体の溶液の核酸とは異なる核酸を、哺乳動物細胞に導入する工程と、
ｈ）場合により、そのゲノム内に組み込まれた核酸を有する哺乳動物細胞を選択する工程と、
ｉ）場合により、核酸が発現される条件下で哺乳動物細胞を培養する工程と、
ｊ）場合により、レトロウイルスベクターが産生される条件下で哺乳動物細胞を培養する工程と、
ｋ）場合により、レトロウイルスベクターを単離する工程と、
を更に含む。
ｅ）場合により、哺乳動物細胞を培養する工程と、
ｆ）先行する請求項のいずれか一項に記載の方法によって得られたポリマー／核酸複合体の溶液を使用して哺乳動物細胞をトランスフェクトする工程と、
ｇ）場合により、ポリマー／核酸複合体の溶液の核酸とは異なる核酸を、哺乳動物細胞に導入する工程と、
ｈ）場合により、そのゲノム内に組み込まれた核酸を有する哺乳動物細胞を選択する工程と、
ｉ）場合により、核酸が発現される条件下で哺乳動物細胞を培養する工程と、
ｊ）場合により、レトロウイルスベクターが産生される条件下で哺乳動物細胞を培養する工程と、
ｋ）場合により、レトロウイルスベクターを単離する工程と、
を更に含む。
【0041】
いくつかの実施形態では、方法は哺乳動物細胞を培養する工程を含む。
【0042】
いくつかの実施形態では、培養は灌流培養によるものである。
【0043】
いくつかの実施形態では、哺乳動物細胞を灌流培養で培養する工程は、約１０時間～約９６時間行われる。
【0044】
いくつかの実施形態では、方法は、哺乳動物細胞を培養する工程の前に、細胞培養容器（例えばバイオリアクター）に哺乳動物細胞を接種する工程を更に含む。
【0045】
いくつかの実施形態では、方法は、細胞を接種する工程の後で、且つ細胞をトランスフェクトする工程の前に、迅速な培地交換を行う工程を更に含む。適切には、哺乳動物細胞を培養する工程は、少なくとも１回の迅速な培地交換を含む。
【0046】
いくつかの実施形態では、方法は、核酸が発現される条件下で哺乳動物細胞を培養する工程を含む。
【0047】
いくつかの実施形態では、方法は、レトロウイルスベクターが産生される条件下で哺乳動物細胞を培養する工程を含む。
【0048】
いくつかの実施形態では、方法はレトロウイルスベクターを単離する工程を含む。
【0049】
いくつかの実施形態では、哺乳動物細胞はＨＥＫ２９３Ｔ細胞である。
【0050】
いくつかの実施形態では、哺乳動物細胞は懸濁液適合哺乳動物細胞である。
【0051】
いくつかの実施形態では、トランスフェクション、導入及び／又は培養工程は、無血清培地中の懸濁液中で行われる。
【0052】
いくつかの実施形態では、トランスフェクションは一過性トランスフェクションである。
【0053】
いくつかの実施形態では、トランスフェクション、導入及び／又は培養工程は少なくとも５０Ｌの容量で行われ、好ましくはトランスフェクション、導入及び培養工程は少なくとも５０Ｌの容量で行われる。
【0054】
いくつかの実施形態では、ポリマー／核酸複合体の溶液の核酸とは異なる核酸は、トランスフェクション又はエレクトロポレーションによって哺乳動物細胞に導入される。
【0055】
いくつかの実施形態では、ポリマー／核酸複合体の溶液の核酸とは異なる核酸は、ポリマー／核酸複合体の溶液の核酸によってコードされない、以下のもの：
ａ）レンチウイルスベクターのＲＮＡゲノム、
ｂ）ｅｎｖ又はその機能的代用物、
ｃ）ｇａｇ－ｐｏｌ又はその機能的代用物、並びに／或いは
ｄ）ｒｅｖ又はその機能的代用物、
から選択される任意のウイルスベクターコンポーネントをコードする。
ａ）レンチウイルスベクターのＲＮＡゲノム、
ｂ）ｅｎｖ又はその機能的代用物、
ｃ）ｇａｇ－ｐｏｌ又はその機能的代用物、並びに／或いは
ｄ）ｒｅｖ又はその機能的代用物、
から選択される任意のウイルスベクターコンポーネントをコードする。
【0056】
更なる態様において、本発明は、レトロウイルスベクターを産生するための方法を提供し、
ａ）必要に応じて哺乳動物細胞を培養する工程と、
ｂ）本発明のポリマー／核酸複合体の溶液又は本発明のポリマー／核酸複合体の溶液を使用して哺乳動物細胞をトランスフェクトする工程と、
ｃ）場合により、ポリマー／核酸複合体の溶液の核酸とは異なる少なくとも１つの核酸を哺乳動物細胞に導入する工程と、
ｄ）場合により、そのゲノム内に組み込まれたウイルスベクターコンポーネントをコードする核酸配列を有する哺乳動物細胞を選択する工程と、
ｅ）レトロウイルスベクターが産生される条件下で哺乳動物細胞を培養する工程と、
を含む。
ａ）必要に応じて哺乳動物細胞を培養する工程と、
ｂ）本発明のポリマー／核酸複合体の溶液又は本発明のポリマー／核酸複合体の溶液を使用して哺乳動物細胞をトランスフェクトする工程と、
ｃ）場合により、ポリマー／核酸複合体の溶液の核酸とは異なる少なくとも１つの核酸を哺乳動物細胞に導入する工程と、
ｄ）場合により、そのゲノム内に組み込まれたウイルスベクターコンポーネントをコードする核酸配列を有する哺乳動物細胞を選択する工程と、
ｅ）レトロウイルスベクターが産生される条件下で哺乳動物細胞を培養する工程と、
を含む。
【0057】
いくつかの実施形態では、培養は灌流培養によるものである。
【0058】
いくつかの実施形態では、細胞を灌流培養で培養する工程は、約１０時間～約９６時間行われる。
【0059】
いくつかの実施形態では、方法はレトロウイルスベクターを単離する工程を更に含む。
【0060】
いくつかの実施形態では、レトロウイルスベクターは複製欠損レトロウイルスベクターである。
【0061】
いくつかの実施形態では、レトロウイルスベクターはレンチウイルスベクターであり、好ましくはレンチウイルスベクターは、ＨＩＶ－１、ＨＩＶ－２、ＳＩＶ、ＦＩＶ、ＢＩＶ、ＥＩＡＶ、ＣＡＥＶ又はＶｉｓｎａである。
【0062】
いくつかの実施形態では、哺乳動物細胞はＨＥＫ２９３Ｔ細胞である。
【0063】
いくつかの実施形態では、哺乳動物細胞は懸濁液適合細胞である。
【0064】
いくつかの実施形態では、方法は、無血清培地中の懸濁液中で実施される。
【0065】
いくつかの実施形態では、工程ａ）、工程ｂ）、工程ｃ）及び／又は工程ｅ）は少なくとも５０Ｌの容量で行われ、好ましくは工程ａ）、工程ｂ）、工程ｃ）及び工程ｅ）は少なくとも５０Ｌの容量で行われる。
【0066】
いくつかの実施形態では、核酸は、工程ｃ）におけるトランスフェクション又はエレクトロポレーションによって細胞に導入される。
【0067】
いくつかの実施形態では、トランスフェクションは一過性トランスフェクションである。
【0068】
いくつかの実施形態では、工程ｂ）において哺乳動物細胞に場合により導入される少なくとも１つの核酸は、ポリマー／核酸複合体の溶液の核酸によってコードされない、
（ｉ）レンチウイルスベクターのＲＮＡゲノム、
（ｉｉ）ｅｎｖ又はその機能的代用物、
（ｉｉｉ）ｇａｇ－ｐｏｌ又はその機能的代用物、並びに／或いは
（ｉｖ）ｒｅｖ又はその機能的代用物、
からなる群から選択される任意のレンチウイルスベクターコンポーネントをコードする。
（ｉ）レンチウイルスベクターのＲＮＡゲノム、
（ｉｉ）ｅｎｖ又はその機能的代用物、
（ｉｉｉ）ｇａｇ－ｐｏｌ又はその機能的代用物、並びに／或いは
（ｉｖ）ｒｅｖ又はその機能的代用物、
からなる群から選択される任意のレンチウイルスベクターコンポーネントをコードする。
【0069】
更なる態様において、本発明は、哺乳動物細胞をトランスフェクトするための方法を提供し、
ａ）灌流培養において哺乳動物細胞を培養する工程と、
ｂ）本明細書に記載のポリマー／核酸複合体の溶液を使用して哺乳動物細胞をトランスフェクトする工程と、
を含む。
ａ）灌流培養において哺乳動物細胞を培養する工程と、
ｂ）本明細書に記載のポリマー／核酸複合体の溶液を使用して哺乳動物細胞をトランスフェクトする工程と、
を含む。
【0070】
いくつかの実施形態では、哺乳動物細胞を灌流培養で培養する工程は、約１０時間～約９６時間行われる。
【0071】
適切には、哺乳動物細胞は、本明細書に記載の哺乳動物細胞である。
【0072】
いくつかの実施形態では、方法は、無血清培地中の懸濁液中で実施される。
【0073】
いくつかの実施形態では、工程ａ）及び／又は工程ｂ）は少なくとも５０Ｌの容量で行われ、好ましくは工程ａ）及び工程ｂ）は少なくとも５０Ｌの容量で行われる。
【0074】
いくつかの実施形態では、トランスフェクションは一過性トランスフェクションである。
【図面の簡単な説明】
【0075】
【図1】異なる時間間隔でインキュベートしたＰＥＩＰｒｏ（登録商標）トランスフェクションミックスを使用して個々の振盪フラスコをトランスフェクトした振盪フラスコの時間経過研究からの機能的力価（ＴＵ／ｍＬ）の結果を示す図である。ＤＮＡ／ＰＥＩＰｒｏ（登録商標）複合体のインキュベーション期間は、その後のトランスフェクション及びレンチウイルスベクター産生に有意に影響を与える。データは、最高の機能的力価をもたらす最適なインキュベーション時間が３分であり、インキュベーション時間が１５分又は３０分に延長される場合、これは急速に減少することを示す。
【図2】水中でトランスフェクションミックスを調製し、様々なＰＢＳ濃度でスパイクすることによって複合体形成の動態を改変できることを示す図である。ＤＮＡ／ＰＥＩｐｒｏ複合体を塩を含まない水溶液（Ｈ２Ｏ）中で調製し、複合体成長をＰＢＳスパイクで開始した。（Ａ）トランスフェクション複合体を１Ｘ ＰＢＳでスパイクした場合、３分間のインキュベーション後に最適な力価が達成された。（Ｂ）トランスフェクション複合体に低濃度のＰＢＳを添加すると、インキュベーション時間を延長することができ、０．２Ｘ ＰＢＳは最適なインキュベーション時間を約２５分に延長する。Ｎ．Ｂ．陰性対照として、複合体を水中で調製し、次いで、ＰＢＳをスパイクせずに細胞をトランスフェクトするために使用した。ＰＢＳが複合体増殖を開始するために必要であることを示すベクターは作製されなかった。
【図3】塩濃度を低下させる（及び複合体増殖を停止させる）ための複合体の希釈後、最大１２時間、潜在的には最大１週間、トランスフェクション効率が安定していることを示す図である。トランスフェクションミックスを０．２Ｘ ＰＢＳでスパイクして複合体の増殖を開始させ、次いで３０分間インキュベートして複合体の最適サイズに到達させた。次いで、トランスフェクションミックスを、ＰＢＳの最終濃度が０．１Ｘになるように、塩を含まない水溶液（例えば、Ｈ２Ｏ）を用いて希釈した。次いで、トランスフェクションミックスを４℃で最大１週間保存した。次いで、トランスフェクションミックスの一定分量を使用してＧＦＰレンチウイルスを作製し、得られた機能的力価を測定した。グラフは、１２時間のインキュベーション後、トランスフェクションミックスがレンチウイルスベクターの作製に依然として効率的であり、「新鮮な」トランスフェクションミックスと同等の機能的力価をもたらしたことを示している。
【図4】ＤＮＡ：ＰＥＩｐｒｏ複合体をＨ２Ｏ中で調製した場合、複合体の成長が観察されないことを示すＤＬＳ分析の図である。これは、水中で調製され、ＰＢＳでスパイクされていない複合体がベクター産生をもたらさなかったことを実証した図２Ｂに示されるデータと相関する。これは、８０～８６ｎｍのサイズ範囲内の複合体が小さすぎてトランスフェクションに成功しないことを示唆している。
【図5】ＤＮＡ／ＰＥＩｐｒｏ複合体を水中で調製し、粒子成長をＰＢＳ（０．２Ｘ）の添加によって開始した。最高の機能的力価を達成するための最適時間に相当するので、複合体を２５分間インキュベートした（図２Ｂ）。次いで、複合体を２倍希釈して、０．１Ｘの最終ＰＢＳ濃度を達成した。次いで、複合体サイズを更に４５分間にわたって経時的に測定した。ＤＬＳ測定は、トランスフェクションミックスを２倍希釈すると、複合体の成長が停止し、サイズは６００～８００ｎｍの間のままであることが分かったことを示す。このデータを図２及び図３に示すデータと相関させると、最高の力価を達成する最適な複合体サイズは６００～８００ｎｍであることが示唆される。
【図6】トランスフェクションミックスが、異なる濃度のＰＢＳでスパイクされた場合、複合体がトランスフェクションのための好ましいサイズに成長する速度は、添加されたＰＢＳの濃度に応じて異なることを示す図である。ＰＢＳの濃度が低すぎる（≦０．１Ｘ ＰＢＳ）場合、複合体成長は開始されない。
【図7】複合増殖を開始させるために任意の塩が使用され得ることを示す図である。複合体の成長速度が速いほど、複合体の成長を引き起こすのに必要な塩の濃度は低くなる。グラフ（Ａ）及び表２は、トランスフェクションミックスに５つの異なる濃度のＮａＣｌ（１０ｍＭ；２０ｍＭ；５０ｍＭ；８０ｍＭ及び１００ｍＭ）をスパイクすることの影響を示す。８０ｍＭ及び１００ｍＭの濃度のみが有意な複合体増殖を開始させた。グラフ（Ｂ）及び表３は、トランスフェクションミックスに５つの異なる濃度のＭｇＣｌ２（１０ｍＭ；２０ｍＭ；５０ｍＭ；８０ｍＭ；１００ｍＭ）をスパイクすることの影響を示す。
【図8】５Ｌバイオリアクタスケールでの産生後の治療用ベクターの機能的力価を示す図である。この結果は、「ａｑＰＥＩＰｒｏ」トランスフェクション方法がスケーラブルであり、カチオン性脂質ベースのトランスフェクション方法を使用して達成されるものと同等のレンチウイルスベクターの力価を実証することを示す。「ａｑＰＥＩＰｒｏ」トランスフェクション方法についてはｎ＝２、カチオン性脂質ベースのトランスフェクション方法についてはｎ＝４。
【発明を実施するための形態】
【0076】
ポリマー／核酸複合体の溶液を製造するためのインビトロ方法
本発明は、ポリマー／核酸複合体の溶液を製造するためのインビトロ方法を提供し、
ａ）実質的に塩を含まない水溶液中で核酸及びカチオン性ポリマーを混合する工程、
ｂ）工程ａ）で製造された混合物に塩を添加して塩溶液を形成する工程、
ｃ）場合により、工程ｂ）で製造された塩溶液をインキュベーションする工程、及び／又は
ｄ）任意選択的に、工程ｂ）で製造された塩溶液を希釈する工程、又は工程ｃ）のインキュベーション後に塩溶液を希釈する工程、
を含む。
本発明は、ポリマー／核酸複合体の溶液を製造するためのインビトロ方法を提供し、
ａ）実質的に塩を含まない水溶液中で核酸及びカチオン性ポリマーを混合する工程、
ｂ）工程ａ）で製造された混合物に塩を添加して塩溶液を形成する工程、
ｃ）場合により、工程ｂ）で製造された塩溶液をインキュベーションする工程、及び／又は
ｄ）任意選択的に、工程ｂ）で製造された塩溶液を希釈する工程、又は工程ｃ）のインキュベーション後に塩溶液を希釈する工程、
を含む。
【0077】
外因性核酸による細胞のトランスフェクションは当技術分野で周知であり、様々なウイルス及び非ウイルストランスフェクション試薬を使用して実施することができる。トランスフェクションは、負に帯電した分子（例えば、ＤＮＡ及びＲＮＡのリン酸骨格）を負に帯電した膜を有する細胞に導入する固有の課題を克服する。トランスフェクション試薬は、化学試薬、カチオン性脂質及び物理的方法の３つのクラスに分けることができる。
【0078】
化学試薬としては、カチオン性ポリマーであるＤＥＡＥ－デキストランが挙げられ、これは、培養哺乳動物細胞をトランスフェクトするために使用された最初の化学試薬の１つであった（Ｖａｈｅｒｉ ａｎｄ Ｐａｇａｎｏ，１９６５；ＭｃＣｕｔｃｈａｎ ａｎｄ Ｐａｇａｎｏ，１９６８）。ポリブレン（Ｋａｗａｉ ａｎｄ Ｎｉｓｈｉｚａｗａ，１９８４）、ポリエチレンイミン（Ｂｏｕｓｓｉｆ ｅｔ ａｌ．１９９５）及びデンドリマー（Ｈａｅｎｓｌｅｒ ａｎｄ Ｓｚｏｋａ，１９９３；Ｋｕｋｏｗｓｋａ－Ｌａｔａｌｌｏ ｅｔ ａｌ．１９９６）を含む他の合成カチオン性ポリマーが、ＤＮＡを細胞に移入するために使用されてきた。トランスフェクション法としてのリン酸カルシウム共沈殿は、１９７０年代初期（Ｇｒａｈａｍ ａｎｄ ｖａｎ ｄｅｒ Ｅｂ，１９７３）に導入され、別の化学トランスフェクション試薬に相当する。
【0079】
リポフェクトアミン等のカチオン性脂質は、外来遺伝物質を細胞に導入するための最も一般的な方法の１つを表す。用語「リポソーム」は、水性媒体中でコロイド粒子を形成する脂質二重層を指す（Ｓｅｓｓａ ａｎｄ Ｗｅｉｓｓｍａｎｎ，１９６８）。人工リポソームを最初に使用して、１９８０年に細胞にＤＮＡを送達した（Ｆｒａｌｅｙ ｅｔ ａｌ．１９８０）。リポソームビヒクルの次の進歩は、合成カチオン性脂質の開発であった（Ｆｅｌｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．１９８７）。脂質化合物のカチオン性頭部基は、核酸上の負に帯電したリン酸と会合する。リポソーム媒介送達は、比較的高い遺伝子導入効率、リン酸カルシウム又はＤＥＡＥ－デキストランに耐性のある特定の細胞型をトランスフェクトする能力、インビトロ及びインビボ用途、オリゴヌクレオチドから酵母人工染色体への全てのサイズのＤＮＡの送達の成功、ＲＮＡの送達、及びタンパク質の送達等の利点を提供する（Ｋｉｍ ａｎｄ Ｅｂｅｒｗｉｎｅ，２０１０；Ｓｔｅｗａｒｔ ｅｔ ａｌ．２０１６において概説される）。非リポソーム試薬は、リポソーム媒介トランスフェクション法の代替を提供する。脂質ナノ粒子は、臨床研究及び治療用途における小分子薬物の送達に特に適したこのトランスフェクション方法の拡張を表す（Ｃｕｌｌｉｓ ａｎｄ Ｈｏｐｅ，２０１７において概説される）。
【0080】
遺伝子移入のための物理的方法は１９８０年代初期に開発され、最初に培養細胞又は核への直接マイクロインジェクションを伴った（Ｃａｐｐｅｃｈｉ，１９８０）。最近、マイクロインジェクションは、遺伝子編集用途において人気を取り戻し、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ＤＮＡを接合子前核に送達してノックアウトブタを作製するために使用されている（Ｃｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．２０１７）。エレクトロポレーションは別の物理的方法を表し、マウス細胞における遺伝子移入研究について最初に報告された（Ｗｏｎｇ ａｎｄ Ｎｅｕｍａｎｎ，１９８２）。この機構は、細胞膜を摂動させ、核酸の細胞内への通過を可能にする一時的な細孔を形成するための電気パルスの使用に基づく（Ｓｈｉｇｅｋａｗａ ａｎｄ Ｄｏｗｅｒ，１９８８）。
【0081】
最も広く使用されている非ウイルストランスフェクション試薬には、リポフェクタミン等の脂質ベースの試薬及びＰＥＩ等のカチオン性ポリマーが含まれる。多数のトランスフェクション方法が当技術分野で公知である（例えば、Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．（１９７３），Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２：４５６；Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、及びＣｈｕ ｅｔ ａｌ．（１９８１），Ｇｅｎｅ，１３：１９７を参照されたい）。そのような技術は、１つ以上の外因性核酸を適切な宿主細胞に導入するために使用され得る。
【0082】
本明細書で使用される場合、「トランスフェクトする」及び「形質導入する」という用語は、宿主細胞への外因性核酸（例えば、ＤＮＡプラスミド）の導入を指す。したがって、「トランスフェクション」及び「形質導入」という用語は、外因性核酸（例えば、ＤＮＡプラスミド）を宿主細胞に導入するプロセスを指す。外因性核酸が細胞膜の内側に導入されている場合、細胞は「形質導入されている」か、又は「トランスフェクトされている」。宿主細胞に導入された外因性核酸は、宿主細胞のゲノムに安定に組み込まれ得るか、又は染色体外であり得る。組み込まれた核酸は、その細胞内で維持され得、子孫細胞によって継承され得る。或いは、宿主細胞に導入される外因性核酸は、宿主細胞中に一過性に存在し得る。
【0083】
したがって、本明細書で使用される場合、「形質導入／トランスフェクト細胞」という用語は、外因性核酸が導入された細胞、又は外因性核酸が存在するその子孫を指す。形質導入／トランスフェクト細胞を培養し（すなわち、伝播される）、導入された外因性核酸を転写及び／又はタンパク質を発現させることができる。
【0084】
本明細書で使用される場合、「トランスフェクション試薬」という用語は、核酸による細胞形質導入／トランスフェクションを容易にするウイルス又は非ウイルス剤を指す。
【0085】
本明細書で使用される場合、「ポリマー／核酸複合体」、「ポリカチオン／核酸複合体」及び「複合体」という用語は、カチオン性ポリマー及び核酸の凝集体を指す。そのような複合体は、ポリマー縮合核酸としても当技術分野で公知であり、広範囲の細胞をトランスフェクトするために使用することができる。
【0086】
特定の条件下及びイオンの存在下でカチオン性ポリマー及び核酸を混合すると、カチオン性ポリマーと核酸との間の静電相互作用に起因するポリマー／核酸複合体の成熟がもたらされる。したがって、本発明は、任意のカチオン性ポリマー及び任意の核酸を使用することができる。更に、本発明は、任意の生物学的薬剤、例えば組換えタンパク質又はレンチウイルスベクターの産生中の細胞への任意の外因性核酸のトランスフェクションに使用することができる。
【0087】
カチオン性ポリマーによるトランスフェクションは、核酸の縮合及びその後の外因性核酸の細胞内への放出を含む。したがって、カチオン性ポリマーを使用するトランスフェクション効率は、ポリマーの核酸結合及び解離に関連する。
【0088】
従来、トランスフェクション複合体（例えば、ポリマー／核酸複合体）は、核酸コンポーネント、並びにリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）溶液、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）溶液又は培地で希釈することによって調製されたトランスフェクション試薬（リポソーム／ポリマー）の両方を用いて生成される。コンポーネントが混合されると、通常、トランスフェクションに最適なサイズへのこれらの複合体の物理的成長に関連するトランスフェクション複合体（トランスフェクション試薬／核酸複合体）の「成熟」期間が存在する。この最適な複合体サイズを超えると、小さすぎる複合体は十分な核酸を細胞に送達せず、大きすぎる複合体はエンドサイトーシスを妨げるため、細胞トランスフェクションの効率が低下する。トランスフェクション複合体の成熟の動的プロセスは、最適なサイズ生成にかかる時間が大規模製造環境での使用に不適切であり得るという点で問題となり得る。多くの場合、大量のＤＮＡとトランスフェクション試薬とを物理的に混合するのにかかる時間は、複合体の成熟に最適な時間を超える可能性があり、複合体を産生バイオリアクターに送達するのにかかる時間もトランスフェクションプロトコルに考慮しなければならない。
【0089】
本発明者らは、ポリマー／核酸複合体が、トランスフェクション効率に悪影響を及ぼす前に塩の存在下で短時間だけ安定であることを示した。これは他の者によっても報告されている。例えば、製造業者は、カチオン性ポリマーＰＥＩＰｒｏ（登録商標）とＤＮＡとのインキュベーション時間が、良好なトランスフェクション効率を確実にするために３０分を超えてはならないことを推奨する（ウイルス産生プロトコルＣＰＴ１１５ ｖＬについて、ＰｏｌｙｐｌｕｓトランスフェクションＰＥＩＰｒｏ（登録商標）ＤＮＡトランスフェクションキット（Ｊｕｌｙ２０２０）：ｈｔｔｐｓ：／／ｆｎｋｐｒｄｄａｔａ．ｂｌｏｂ．ｃｏｒｅ．ｗｉｎｄｏｗｓ．ｎｅｔ／ｄｏｍｅｓｔｉｃ／ｄａｔａ／ｄａｔａｓｈｅｅｔ／ＰＰＵ／１１５－０１Ｋ．ｐｄｆを参照されたい）。最適なインキュベーション期間が、大規模なＧＭＰ生産、例えば２００Ｌ規模で実際に可能であるには短すぎるために、これは、生物学的薬剤、例えば組換えタンパク質又はレンチウイルスベクターの大量生産におけるカチオン性ポリマーの使用を制限する。
【0090】
本発明者らは、驚くべきことに、以下を見出した。
１．実質的に塩を含まない溶液（例えば水中で）中でポリマー／核酸複合体を混合し、続いて塩をスパイクしてポリマー／核酸複合体の成熟を誘導することにより、良好なトランスフェクション効率、それによって良好な機能性レンチウイルスベクター力価を与えるポリマー／核酸複合体の溶液を提供する。換言すれば、最適な濃度の塩を使用して、最適なポリマー／核酸複合体成熟のための時間（すなわち、インキュベーション時間）を延長することができる。
２．ポリマー／核酸複合体の成長を抑制し、複合体をポリマー／核酸複合体の溶液の希釈（それにより塩を希釈）によって安定化してインキュベーション時間を更に延長できる。
１．実質的に塩を含まない溶液（例えば水中で）中でポリマー／核酸複合体を混合し、続いて塩をスパイクしてポリマー／核酸複合体の成熟を誘導することにより、良好なトランスフェクション効率、それによって良好な機能性レンチウイルスベクター力価を与えるポリマー／核酸複合体の溶液を提供する。換言すれば、最適な濃度の塩を使用して、最適なポリマー／核酸複合体成熟のための時間（すなわち、インキュベーション時間）を延長することができる。
２．ポリマー／核酸複合体の成長を抑制し、複合体をポリマー／核酸複合体の溶液の希釈（それにより塩を希釈）によって安定化してインキュベーション時間を更に延長できる。
【0091】
本明細書に記載の方法は、ポリマー／核酸複合体の成熟の開始及び終了の両方を制御する能力を提供するため有利である。これは、トランスフェクションプロセスの問題としての時間制約を取り除き、すなわち製造プロセスの柔軟性を改善するので、ＧＭＰ規模で非常に有利である。
【0092】
実質的に塩を含まない水溶液（例えば水）中でのポリマー／核酸複合体の調製もまた、従来のプロセスを超える利点を提供する。例えば、これは、複合体が塩の存在下（例えば、媒体中）で調製される場合に可能であるよりも高い濃度でポリマー／核酸複合体を調製することを可能にし、バイオリアクターに添加されるポリマー／核酸複合体の溶液の容量を著しく減少させる。これはまた、生産性を高めると予想されるトランスフェクション工程でのバイオリアクター内の細胞の総数を増加させる。したがって、有利には、本発明の方法は、トランスフェクション工程の前に灌流細胞培養工程と共に使用され得る。灌流細胞培養の使用は、バイオリアクター内の細胞密度、すなわち細胞数を有利に増加させることができる。
【0093】
更なる例として、本発明者らは、実質的に塩を含まない水溶液（例えば水）中で混合した場合、ポリマー及び核酸は複合体の成長／凝集を示さず、典型的には直径１００ｎＭ未満の複合体を生成することを示した。したがって、コンポーネント及び／又は混合物の両方を、複合体形成（すなわち、複合体の成熟）及びその後の製造プロセス中の添加の前に効率的に滅菌濾過することができる。これは、製造プロセスに添加する前（例えばバイオリアクタへの添加前）に、複合体の無菌性を確保することができるため、任意の製造プロセスにおいて非常に価値のある安全性工程を追加する。
【0094】
また更なる例として、本発明者らは、実質的に塩を含まない水溶液（例えば水）中で一旦成熟し、及び／又は複合体成熟後に希釈すると、ポリマー／核酸複合体は数日間及び実際には数週間安定であることも示した。これにより、トランスフェクション工程の十分前に複合体を調製することが可能になり、製造中のこの工程に関連する作業負荷が大幅に低減され、プロセスの柔軟性を向上させる。それはまた、製造に使用する前に複合体のトランスフェクション効率の小規模試験を可能にする。
【0095】
また更なる例として、本発明者らは、実質的に塩を含まない水溶液（例えば水）中でのポリマー／核酸複合体の成熟に対する制御が、トランスフェクトされる細胞の数に比例した複合体の調製を可能にすること（すなわち、トランスフェクトされる細胞の数に応じてポリマー／核酸複合体の調製物の濃度及び／又は容量をスケーリングすること）を見出した。更に、本発明のポリマー／核酸複合体に関連する毒性の欠如は、特定の従来のトランスフェクション試薬（例えばリポフェクタミン）と比較して高い濃度でのそれらの使用を可能にする。これにより、生産性を高めると予想されるバイオリアクター内のより多くの細胞の総数のトランスフェクションが可能になる。これはまた、トランスフェクション工程のためのバイオリアクター内の細胞の総数を増加させるために、灌流培養を使用してトランスフェクションのための細胞を調製することを可能にする。
【0096】
したがって、本明細書に記載の方法は、材料の大規模ＧＭＰ製造に使用するのに適しているだけでなく、そのような製造プロセスにおいて利点も有する。本明細書で使用される「大規模」とは、標準的なバイオリアクタサイズ、例えば５０Ｌ、２００Ｌ、５００Ｌ、１０００Ｌ及び１０，０００Ｌを包含する。
【0097】
トランスフェクション性能及び例えば遺伝子発現を増強するためのトランスフェクション増強剤の使用は、当技術分野で周知である。トランスフェクション増強剤としては、酪酸、バルプロ酸、イソ酪酸及びイソ吉草酸、又はそれらの塩が挙げられる。酪酸、バルプロ酸、イソ酪酸及びイソ吉草酸の塩は、ナトリウム塩又はカリウム塩（例えば、酪酸ナトリウム）等の任意の塩であってもよい。トランスフェクション増強剤は、典型的には、トランスフェクション工程後の細胞の培養中に添加される。しかし、そのような薬剤は、トランスフェクション工程の前又は間に、すなわちトランスフェクションミックスを細胞と接触させる前又は間に添加されてもよい。
【0098】
本明細書で使用される場合、「トランスフェクション増強剤」という用語は、核酸による細胞形質導入／トランスフェクションを増加させる化合物を指す。
【0099】
いくつかの実施形態では、当該塩は、トランスフェクション増強剤ではない。いくつかの実施形態では、当該塩は、酪酸塩、バルプロ酸塩、イソ酪酸塩又はイソ吉草酸塩ではない。好ましくは、当該塩は、バルプロ酸塩、イソ酪酸塩又はイソ吉草酸塩ではない。好ましくは、当該塩は酪酸ナトリウムではない。
【0100】
いくつかの実施形態では、塩は、トランスフェクション工程の間又は後、すなわちトランスフェクションミックス（例えば、ポリマー／核酸複合体の溶液）を細胞と接触させる間又は後に添加されない。いくつかの好ましい実施形態では、塩は、ポリマー／核酸複合体の溶液を細胞と接触させる前にのみ添加される。したがって、実質的に塩を含まない溶液中で調製されたカチオン性ポリマーと核酸との混合物に塩を添加して、複合体の成熟及び成長を開始させ、その後トランスフェクションに使用することができるポリマー／核酸複合体の溶液を得ることができる。
【0101】
いくつかの実施形態では、塩の最終濃度は、約１０ｍＭ～約５００ｍＭである。いくつかの好ましい実施形態では、塩の最終濃度は、約５０ｍＭ～約５００ｍＭである。いくつかの実施形態では、塩はＰＢＳであり、ＰＢＳは、約０．１Ｘ ＰＢＳ～約３Ｘ ＰＢＳの最終濃度まで添加される。
【0102】
いくつかの実施形態では、塩の最終濃度は、約２０ｍＭ～約１００ｍＭである。いくつかの実施形態では、塩はＰＢＳであり、ＰＢＳは、約０．１５Ｘ ＰＢＳ～約０．３Ｘ ＰＢＳの最終濃度まで添加される。
【0103】
いくつかの実施形態では、塩は、実質的に塩を含まない溶液中で少なくとも０．９０（適切には、少なくとも０．９５、少なくとも０．９６、少なくとも０．９７、少なくとも０．９８、少なくとも０．９９又は１）の解離度を有する。
【0104】
本明細書で使用される場合、「解離度」という用語は、実質的に塩を含まない溶液中でイオンに解離した塩分子の割合を指す。解離度は、当技術分野で公知の方法（例えば、Ｄｒ Ｗｏｌｆｇａｎｇ Ｓｃｈａｒｔｌ，Ｂａｓｉｃ Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ａ Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｎ Ｂａｃｈｅｌｏｒ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｅｖｅｌ（１ｓｔ Ｅｄ．２０１４）ｐ．１０９，Ｂｏｏｋｂｏｏｎ，ＩＳＢＮ ９７８－８７－４０３－０６６９－９）を使用して計算することができる。
【0105】
解離定数は、物質ＭｘＮｙが溶液（しばしば水性）中でより小さなコンポーネントＭ及びＮに可逆的に解離する（分離する）傾向を規定する。
ＭｘＮｙ（ａｑ）＋Ｈ２Ｏ（ｌ）⇔ｘＭ（ａｑ）＋ｙＮ（ａｑ）
ＭｘＮｙ（ａｑ）＋Ｈ２Ｏ（ｌ）⇔ｘＭ（ａｑ）＋ｙＮ（ａｑ）
【0106】
解離定数はＫｄで示され、以下によって計算される。
式中、αは種の活性を表し、［Ｍ］、［Ｎ］、及び［ＭｘＮｙ］は実体Ｍ、Ｎ、及びＭｘＮｙのモル濃度である（ｈｔｔｐｓ：／／ｃｈｅｍ．ｌｉｂｒｅｔｅｘｔｓ．ｏｒｇ／Ｂｏｏｋｓｈｅｌｖｅｓ／Ｐｈｙｓｉｃａｌ＿ａｎｄ＿Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ＿Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ＿Ｔｅｘｔｂｏｏｋ＿Ｍａｐｓ／Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｌ＿Ｍｏｄｕｌｅｓ＿（Ｐｈｙｓｉｃａｌ＿ａｎｄ＿Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ＿Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）／Ｅｑｕｉｌｉｂｒｉａ／Ｃｈｅｍｉｃａｌ＿Ｅｑｕｉｌｉｂｒｉａ／Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ＿Ｃｏｎｓｔａｎｔ）。水は溶媒であり、溶液は希釈される仮定するので、水は純粋であると仮定し、純水の活性を１と定義する。溶質の活性はモル濃度で近似される。解離定数は、より一般的な方法で平衡を記述する質量作用の法則の直接の結果である。解離定数は、塩に適用される場合、イオン化定数と呼ばれることもある。
【数1】
式中、αは種の活性を表し、［Ｍ］、［Ｎ］、及び［ＭｘＮｙ］は実体Ｍ、Ｎ、及びＭｘＮｙのモル濃度である（ｈｔｔｐｓ：／／ｃｈｅｍ．ｌｉｂｒｅｔｅｘｔｓ．ｏｒｇ／Ｂｏｏｋｓｈｅｌｖｅｓ／Ｐｈｙｓｉｃａｌ＿ａｎｄ＿Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ＿Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ＿Ｔｅｘｔｂｏｏｋ＿Ｍａｐｓ／Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｌ＿Ｍｏｄｕｌｅｓ＿（Ｐｈｙｓｉｃａｌ＿ａｎｄ＿Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ＿Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）／Ｅｑｕｉｌｉｂｒｉａ／Ｃｈｅｍｉｃａｌ＿Ｅｑｕｉｌｉｂｒｉａ／Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ＿Ｃｏｎｓｔａｎｔ）。水は溶媒であり、溶液は希釈される仮定するので、水は純粋であると仮定し、純水の活性を１と定義する。溶質の活性はモル濃度で近似される。解離定数は、より一般的な方法で平衡を記述する質量作用の法則の直接の結果である。解離定数は、塩に適用される場合、イオン化定数と呼ばれることもある。
【0107】
解離度は、解離した元の溶質分子の割合である。これは通常、ギリシャ記号αによって示される。より正確には、解離度は、１モル当たりのイオン又はラジカルに解離する溶質の量を指す。非常に強い酸及び塩基の場合、解離度は１に近い。あまり強力でない酸及び塩基は、より低い解離度を有する。このパラメータとファントホッフの因子ｉとの間には単純な関係が存在する。溶質物質がｎイオンに解離する場合、
ｉ＝１＋α（ｎ－１）
ｉ＝１＋α（ｎ－１）
【0108】
例えば、以下の解離について、
ＫＣＩ⇔Ｋ＋＋ＣＩ－
ｎ＝２として、ｉ＝１＋αとなる（Ａｔｋｉｎｓ Ｐ．ａｎｄ ｄｅ Ｐａｕｌａ Ｊ．Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（８ｔｈ ｅｄ．Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ２００６）ｐ．７６３，ＩＳＢＮ ９７８－０－７１６７－８７５９－４）。
ＫＣＩ⇔Ｋ＋＋ＣＩ－
ｎ＝２として、ｉ＝１＋αとなる（Ａｔｋｉｎｓ Ｐ．ａｎｄ ｄｅ Ｐａｕｌａ Ｊ．Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（８ｔｈ ｅｄ．Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ２００６）ｐ．７６３，ＩＳＢＮ ９７８－０－７１６７－８７５９－４）。
【0109】
したがって、更なる態様では、本発明は、ポリマー／核酸複合体の溶液を製造するためのインビトロ方法を提供し、
ａ）実質的に塩を含まない水溶液中で核酸及びカチオン性ポリマーを混合する工程、
ｂ）工程ａ）で製造された混合物に塩を添加して塩溶液を形成する工程、
ｃ）場合により、工程ｂ）で製造された塩溶液をインキュベーションする工程、及び／又は
ｄ）場合により、工程ｂ）で製造された塩溶液を希釈する工程、又は工程ｃ）のインキュベーション後に塩溶液を希釈する工程、
を含み、
塩は、バルプロ酸塩、イソ酪酸塩又はイソ吉草酸塩ではない。
ａ）実質的に塩を含まない水溶液中で核酸及びカチオン性ポリマーを混合する工程、
ｂ）工程ａ）で製造された混合物に塩を添加して塩溶液を形成する工程、
ｃ）場合により、工程ｂ）で製造された塩溶液をインキュベーションする工程、及び／又は
ｄ）場合により、工程ｂ）で製造された塩溶液を希釈する工程、又は工程ｃ）のインキュベーション後に塩溶液を希釈する工程、
を含み、
塩は、バルプロ酸塩、イソ酪酸塩又はイソ吉草酸塩ではない。
【0110】
更なる態様では、本発明は、ポリマー／核酸複合体の溶液を製造するためのインビトロ方法を提供し、
ａ）実質的に塩を含まない水溶液中で核酸及びカチオン性ポリマーを混合する工程、
ｂ）工程ａ）で製造された混合物に塩を添加して塩溶液を形成する工程、
ｃ）場合により、工程ｂ）で製造された塩溶液をインキュベーションする工程、及び／又は
ｄ）場合により、工程ｂ）で製造された塩溶液を希釈する工程、又は工程ｃ）のインキュベーション後に塩溶液を希釈する工程、
を含み、
塩は、ポリマー／核酸複合体の溶液を細胞と接触させる前にのみ添加される。
ａ）実質的に塩を含まない水溶液中で核酸及びカチオン性ポリマーを混合する工程、
ｂ）工程ａ）で製造された混合物に塩を添加して塩溶液を形成する工程、
ｃ）場合により、工程ｂ）で製造された塩溶液をインキュベーションする工程、及び／又は
ｄ）場合により、工程ｂ）で製造された塩溶液を希釈する工程、又は工程ｃ）のインキュベーション後に塩溶液を希釈する工程、
を含み、
塩は、ポリマー／核酸複合体の溶液を細胞と接触させる前にのみ添加される。
【0111】
更なる態様では、本発明は、ポリマー／核酸複合体の溶液を製造するためのインビトロ方法を提供し、
ａ）実質的に塩を含まない水溶液中で核酸及びカチオン性ポリマーを混合する工程、
ｂ）工程ａ）で製造された混合物に塩を添加して塩溶液を形成する工程、
ｃ）場合により、工程ｂ）で製造された塩溶液をインキュベーションする工程、及び／又は
ｄ）場合により、工程ｂ）で製造された塩溶液を希釈する工程、又は工程ｃ）のインキュベーション後に塩溶液を希釈する工程、
を含み、
工程ｂ）における最終塩濃度は約１０ｍＭ～約１００ｍＭである。
ａ）実質的に塩を含まない水溶液中で核酸及びカチオン性ポリマーを混合する工程、
ｂ）工程ａ）で製造された混合物に塩を添加して塩溶液を形成する工程、
ｃ）場合により、工程ｂ）で製造された塩溶液をインキュベーションする工程、及び／又は
ｄ）場合により、工程ｂ）で製造された塩溶液を希釈する工程、又は工程ｃ）のインキュベーション後に塩溶液を希釈する工程、
を含み、
工程ｂ）における最終塩濃度は約１０ｍＭ～約１００ｍＭである。
【0112】
更なる態様では、本発明は、ポリマー／核酸複合体の溶液を製造するためのインビトロ方法を提供し、
ａ）実質的に塩を含まない水溶液中で核酸及びカチオン性ポリマーを混合する工程、
ｂ）工程ａ）で製造された混合物に塩を添加して塩溶液を形成する工程、
ｃ）場合により、工程ｂ）で製造された塩溶液をインキュベーションする工程、及び／又は
ｄ）場合により、工程ｂ）で製造された塩溶液を希釈する工程、又は工程ｃ）のインキュベーション後に塩溶液を希釈する工程、
を含み、
塩は、実質的に塩を含まない水溶液中で少なくとも０．９５の解離度を有する。
ａ）実質的に塩を含まない水溶液中で核酸及びカチオン性ポリマーを混合する工程、
ｂ）工程ａ）で製造された混合物に塩を添加して塩溶液を形成する工程、
ｃ）場合により、工程ｂ）で製造された塩溶液をインキュベーションする工程、及び／又は
ｄ）場合により、工程ｂ）で製造された塩溶液を希釈する工程、又は工程ｃ）のインキュベーション後に塩溶液を希釈する工程、
を含み、
塩は、実質的に塩を含まない水溶液中で少なくとも０．９５の解離度を有する。
【0113】
更なる態様では、本発明は、ポリマー／核酸複合体の溶液を製造するためのインビトロ方法を提供し、
ａ）実質的に塩を含まない水溶液中で核酸及びカチオン性ポリマーを混合する工程、
ｂ）工程ａ）で製造された混合物に塩を添加して塩溶液を形成する工程、
ｃ）場合により、工程ｂ）で製造された塩溶液をインキュベーションする工程、及び／又は
ｄ）工程ｂ）で製造された塩溶液を希釈する工程、又は工程ｃ）のインキュベーション後に塩溶液を希釈する工程、
を含む。
ａ）実質的に塩を含まない水溶液中で核酸及びカチオン性ポリマーを混合する工程、
ｂ）工程ａ）で製造された混合物に塩を添加して塩溶液を形成する工程、
ｃ）場合により、工程ｂ）で製造された塩溶液をインキュベーションする工程、及び／又は
ｄ）工程ｂ）で製造された塩溶液を希釈する工程、又は工程ｃ）のインキュベーション後に塩溶液を希釈する工程、
を含む。
【0114】
更なる態様では、本発明は、ポリマー／核酸複合体の溶液を製造するためのインビトロ方法を提供し、
ａ）実質的に塩を含まない水溶液中で核酸及びカチオン性ポリマーを混合する工程、
ｂ）工程ａ）で製造された混合物に塩を添加して塩溶液を形成する工程、
ｃ）工程ｂ）で製造された塩溶液をインキュベーションする工程、及び／又は
ｄ）場合により、工程ｂ）で製造された塩溶液を希釈する工程、又は工程ｃ）のインキュベーション後に塩溶液を希釈する工程、
を含む。
ａ）実質的に塩を含まない水溶液中で核酸及びカチオン性ポリマーを混合する工程、
ｂ）工程ａ）で製造された混合物に塩を添加して塩溶液を形成する工程、
ｃ）工程ｂ）で製造された塩溶液をインキュベーションする工程、及び／又は
ｄ）場合により、工程ｂ）で製造された塩溶液を希釈する工程、又は工程ｃ）のインキュベーション後に塩溶液を希釈する工程、
を含む。
【0115】
いくつかの実施形態では、工程ａ）は、実質的に塩を含まない水溶液中で複数の核酸分子及び複数のカチオン性ポリマー分子を混合することを含む。
【0116】
本明細書で使用される場合、「実質的に塩を含まない」という用語は、水溶液が塩を含まないか、又は微量の塩のみを含むことを意味する。水溶液の塩含有量は、例えば、約１０ｍＭ未満（適切には、約７．５ｍＭ未満、約５ｍＭ未満、約２．５ｍＭ未満、約１ｍＭ未満、約０．５ｍＭ未満、又は約０．１ｍＭ未満）であり得る。実質的に塩を含まない水溶液は、約１ｍＭ未満の塩、適切には約０．５ｍＭ未満の塩を含み得る。実質的に塩を含まない水溶液の塩濃度は、ポリマー／核酸複合体の成熟を開始するには低すぎる場合があり、すなわち、ポリマー／核酸複合体の形成は水溶液中で開始されない。水溶液の塩濃度は、当技術分野で公知の方法を使用して、例えば塩分濃度計を使用して決定することができる。塩濃度は、一般に、光学屈折計を使用する直接法を使用して測定されるか、又は導電率計によって間接法に従って決定される。多数の市販の選択肢が利用可能である（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｐｃｅ－ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ．ｃｏｍ／ｅｎｇｌｉｓｈ／ｍｅａｓｕｒｉｎｇ－ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ／ｔｅｓｔ－ｍｅｔｅｒｓ／ｓａｌｔ－ｍｅｔｅｒ－ｋａｔ＿４００９３．ｈｔｍ）。
【0117】
適切には、固体の水への溶解度を求めるために、以下の手順を使用することができる。
１）水１００ｃｍ３を正確に測定し、ビーカーに加える
２）溶解しなくなるまで少量の溶質を添加する
３）蒸発皿の質量を記録する
４）未溶解の固体が残り、溶液が蒸発皿にあるように混合物を濾過する
５）加熱又は蒸発によって水を除去する
６）溶質を含む蒸発皿を秤量し、溶解した溶質の質量を計算する（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｂｂｃ．ｃｏ．ｕｋ／ｂｉｔｅｓｉｚｅ／ｇｕｉｄｅｓ／ｚ４ｓ４８ｍｉｎ／ｒｅｖｉｓｉｏｎ／１）。
１）水１００ｃｍ３を正確に測定し、ビーカーに加える
２）溶解しなくなるまで少量の溶質を添加する
３）蒸発皿の質量を記録する
４）未溶解の固体が残り、溶液が蒸発皿にあるように混合物を濾過する
５）加熱又は蒸発によって水を除去する
６）溶質を含む蒸発皿を秤量し、溶解した溶質の質量を計算する（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｂｂｃ．ｃｏ．ｕｋ／ｂｉｔｅｓｉｚｅ／ｇｕｉｄｅｓ／ｚ４ｓ４８ｍｉｎ／ｒｅｖｉｓｉｏｎ／１）。
【0118】
いくつかの好ましい実施形態では、工程ａ）は、塩を含まない水溶液中で核酸及びカチオン性ポリマーを混合することを含む。
【0119】
いくつかの好ましい実施形態では、実質的に塩を含まない水溶液は水である。したがって、工程ａ）は、水中で核酸とカチオン性ポリマーとを混合することを含み得る。
【0120】
本明細書で使用される場合、「核酸」という用語は、ＤＮＡ、ＲＮＡ及びオリゴヌクレオチドを含む核酸の全ての形態を指す。したがって、核酸には、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、スプライシングされた又はスプライシングされていないｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、阻害性ＤＮＡ又はＲＮＡ（例えば、ＲＮＡｉ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子干渉（ｓｉ）ＲＮＡ、短鎖ヘアピン（ｓｈ）ＲＮＡ、トランススプライシングＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ又はアンチセンスＤＮＡ）、天然に存在する配列、合成配列、及び意図的に修飾又は変更された配列（例えば、変異体核酸）が含まれる。
【0121】
したがって、いくつかの実施形態では、核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチド分子、及びそれらの混合物から選択される。好ましくは、核酸はＤＮＡ、より好ましくはプラスミドＤＮＡである。
【0122】
いくつかの実施形態では、カチオン性ポリマーはポリマーベースのトランスフェクション試薬である。カチオン性ポリマーベースのトランスフェクション試薬には、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、デンドリマー、ＤＥＡＥ－デキストラン、ポリプロピレンイミン（ＰＰＩ）、キトサン［ポリ－（β－１／４）－２－アミノ－２－デオキシ－Ｄ－グルコピラノース］、ポリ－Ｌ－リジン（ＰＬＬ）、ポリ（乳酸－ｃｏ－グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、ポリ（カプロラクトン）（ＰＣＬ）、及びそれらの誘導体が含まれる。誘導体は、カチオン性ポリマーの化学修飾変異体、例えばＰＥＧ化変異体又はヒスチジン化変異体であり得る。
【0123】
カチオン性ポリマーは、水、中性溶液／緩衝液又は酸性溶液等の実質的に塩を含まない水溶液で提供されてもよい。カチオン性ポリマーは、カチオン性ポリマーを水性溶媒、中性溶媒／緩衝液又は酸性溶媒に溶解することによって調製することができる。中性カチオン性ポリマー溶液は、典型的には、約ｐＨ６．０～約ｐＨ８．０（適切には、約ｐＨ６．５～約ｐＨ７．５、約ｐＨ６．８～約ｐＨ７．２、又は約ｐＨ７．０～約ｐＨ７．２）のｐＨを有する。酸性カチオン性ポリマー溶液は、典型的には、約ｐＨ０～約ｐＨ３．０（適切には、約ｐＨ０．５～約ｐＨ２．０）のｐＨを有する。中性溶媒／緩衝液の例としては、トリス（トリズマ塩基）及びＨＥＰＥＳが挙げられる。緩衝液濃度は、約１ｍＭ～約１００ｍＭ（適切には約２ｍＭ～約５０ｍＭ又は約５ｍＭ～約２０ｍＭ）の範囲であり得る。酸性溶媒の例としては、鉱酸（例えば塩酸）又は有機酸（例えばグリシン塩酸溶液）が挙げられる。カチオン性ポリマーのトランスフェクション活性を低下させることなく、カチオン性ポリマー溶液のｐＨを適切な範囲内に確立又は維持するために、任意の溶媒又は緩衝液を使用することができる。本明細書に記載されるように、カチオン性ポリマー溶液は、塩を実質的に含まなくてもよい。
【0124】
ＰＥＩは、外因性ＤＮＡを哺乳動物細胞に導入するための最も高いトランスフェクション効率の１つを提供するカチオン性ポリマーであり、したがって当技術分野で最も広く使用されている非ウイルストランスフェクション試薬の１つである。ＰＥＩは、直鎖ＰＥＩ又は分枝ＰＥＩであり得る。ＰＥＩは、約４ｋＤａ～約１６０ｋＤａ（適切には、約４ｋＤａ～約１６０ｋＤａ、約４０ｋＤａ又は約２５ｋＤａ）の範囲の分子量を有することができる。直鎖ＰＥＩ、分枝ＰＥＩ及びそれらの誘導体は市販されている。具体的には、４０ｋＤａの直鎖ＰＥＩ及び２５ｋＤａの直鎖ＰＥＩが市販されている。ＰＥＩの市販形態としては、直鎖ＰＥＩ、分枝ＰＥＩ、ＰＥＧ化ＰＥＩ、ＪｅｔＰＥＩ、ＰＥＩＰｒｏ（登録商標）、ＰＥＩ ＭＡＸ及びＰＴＧ１＋が挙げられる。
【0125】
したがって、いくつかの好ましい実施形態では、カチオン性ポリマーはＰＥＩ（分枝若しくは直鎖ＰＥＩ）又はその誘導体である。いくつかの好ましい実施形態では、カチオン性ポリマーは、直鎖ＰＥＩ、分枝ＰＥＩ、ＰＥＧ化ＰＥＩ、ＪｅｔＰＥＩ、ＰＥＩＰｒｏ（登録商標）、ＰＥＩ ＭＡＸ及びＰＴＧ１＋から選択される。
【0126】
カチオン性ポリマー及び核酸は、溶液中で混合され得る。混合は、カチオン性ポリマーベースの細胞形質導入に適合する任意の溶液中で行うことができる。適切な溶液の非限定的な例を本明細書に記載する。核酸とカチオン性ポリマーとのモル比又は重量比は限定されず、典型的な比は、約１００：１～約１：１００（適切には、約１：１～約１：１０、約１：１～約１：５、約１：２～約１：４）のモル比及び約１：１０～約５：１（適切には、約１：１～約５：１）の重量比を含む。核酸及びカチオン性ポリマーの量は、カチオン性ポリマー中の全窒素（Ｎ）と核酸中のホスファート（Ｐ）とのモル比で表すこともでき、また限定されない。典型的なＮ：Ｐ比は、約１：１～約５０：１（適切には、約１：１～約１０：１、約１０：１、約９：１、約８：１、約７：１、約６：１又は約５：１）を含む。
【0127】
塩は、細胞培養における使用に適し得る。当業者は、塩が低い毒性を有するべきであることを理解するであろう。細胞培養に適合する塩は、当技術分野で周知である。塩は、単純な塩又は単純な塩の混合物であってもよい。塩は、ナトリウム（Ｎａ）塩、カリウム（Ｋ）塩、マグネシウム（Ｍｇ）塩、カルシウム（Ｃａ）塩、リン酸（ＰＯ４）塩又はそれらの組合せから選択され得るが、これらに限定されない。例えば、塩は、ＮａＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＮａＮＯ３、ＰＢＳ又はそれらの組合せであってもよい。当業者は、適切な塩には、強塩基のカチオン（例えば、Ｋ、Ｎａ、Ｃａ、Ｍｇ、Ｂａ等の周期表の第１及び第２の群から選択される）及び／又は強酸のアニオン（例えば、Ｃｌ－、ＮＯ３
－、ＳＯ４
２－）を有するものが含まれることを理解するであろう。
【0128】
いくつかの実施形態では、塩は、カチオン性ポリマー及び核酸の混合物に（すなわち、工程ｂ）において）、約４０ｍＭ～約５００ｍＭ（適切には、約５０ｍＭ～約４５０ｍＭ、約５０ｍＭ～約４００ｍＭ、約６０ｍＭ～約３５０ｍＭ、約７０ｍＭ～約３００ｍＭ、約７５ｍＭ～約２５０ｍＭ、又は約８０ｍＭ～２００ｍＭ）の最終濃度まで添加される。いくつかの実施形態では、塩は、カチオン性ポリマー及び核酸の混合物に（すなわち、工程ｂ）において）、約１０ｍＭ～約１００ｍＭ（適切には、約３０ｍＭ～約１００ｍＭ又は約５０ｍＭ～約１００ｍＭ）の最終濃度まで添加される。いくつかの実施形態では、塩は、約５００ｍＭ未満（適切には、約４５０ｍＭ未満、約４００ｍＭ未満、約３５０ｍＭ未満、約３００ｍＭ未満、約２５０ｍＭ未満、約２００ｍＭ未満、約１５０ｍＭ未満、約１００ｍＭ未満、約８０ｍＭ未満、又は約５０ｍＭ未満）の最終濃度まで添加される。
【0129】
いくつかの実施形態では、塩は、カチオン性ポリマー及び核酸の混合物に（すなわち、工程ｂ）において）、約０．０１ｍＭ～約４９ｍＭ（適切には、約０．１ｍＭ～約４５ｍＭ、約５ｍＭ～約４５ｍＭ、約１０ｍＭ～約４０ｍＭ、約２０ｍＭ～約３５ｍＭ）の最終濃度まで添加される。いくつかの実施形態では、塩は、カチオン性ポリマー及び核酸の混合物に（すなわち、工程ｂ）において）、約２７．５ｍＭの最終濃度まで添加される。いくつかの実施形態では、塩は、約４９ｍＭ未満（適切には、約４５ｍＭ未満、約４０ｍＭ未満、約３５ｍＭ未満、約３２ｍＭ未満、約３０ｍＭ未満、約２５ｍＭ未満、又は約２０ｍＭ未満）の最終濃度まで添加される。
【0130】
いくつかの好ましい実施形態では、塩はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）である。いくつかの実施形態では、ＰＢＳは、工程ｂ）において、約０．２Ｘ ＰＢＳ～約１０Ｘ ＰＢＳ（適切には、約０．２Ｘ ＰＢＳ～約７．５Ｘ ＰＢＳ又は約０．２Ｘ ＰＢＳ～約５Ｘ ＰＢＳ）の最終濃度まで添加される。いくつかの実施形態では、ＰＢＳは、工程ｂ）において、約１０Ｘ未満のＰＢＳ（適切には、約９Ｘ未満のＰＢＳ、約８Ｘ未満のＰＢＳ、約７Ｘ未満のＰＢＳ、約６Ｘ未満のＰＢＳ、約５Ｘ未満のＰＢＳ、又は約４Ｘ未満のＰＢＳ）の最終濃度まで添加される。いくつかの実施形態では、ＰＢＳは、工程ｂ）において、約０．２Ｘ ＰＢＳ～約３Ｘ ＰＢＳ（適切には、約０．２Ｘ ＰＢＳ～約２．５Ｘ ＰＢＳ、約０．２Ｘ ＰＢＳ～約２Ｘ ＰＢＳ、約０．２Ｘ ＰＢＳ～約１Ｘ ＰＢＳ又は約０．２Ｘ ＰＢＳ～約０．５Ｘ ＰＢＳ）の最終濃度まで添加される。いくつかの好ましい実施形態では、ＰＢＳは、約０．２Ｘ ＰＢＳ～約１Ｘ ＰＢＳの最終濃度まで添加される。いくつかの実施形態では、ＰＢＳは、工程ｂ）において、約３Ｘ ＰＢＳ未満（適切には、約２．５Ｘ未満のＰＢＳ、約２Ｘ未満のＰＢＳ、約１Ｘ未満のＰＢＳ、又は約０．５Ｘ未満のＰＢＳ）の最終濃度まで添加される。
【0131】
いくつかの好ましい実施形態では、ＰＢＳは、工程ｂ）において、約０．１５Ｘ ＰＢＳ～約０．３５Ｘ ＰＢＳ（適切には、約０．２０Ｘ ＰＢＳ～約０．３０Ｘ ＰＢＳ）の最終濃度まで添加される。いくつかの実施形態では、ＰＢＳは、約０．４５Ｘ未満のＰＢＳ（適切には、約０．４０Ｘ未満のＰＢＳ、約０．３５Ｘ未満のＰＢＳ、約０．３０Ｘ未満のＰＢＳ、又は約０．２５Ｘ未満のＰＢＳ）の最終濃度まで添加される。いくつかの実施形態では、ＰＢＳは、工程ｂ）において、約０．２Ｘ ＰＢＳ（適切には、約０．２５Ｘ ＰＢＳ、約０．３Ｘ ＰＢＳ又は約０．３５Ｘ ＰＢＳ）の最終濃度まで添加される。
【0132】
カチオン性ポリマー及び核酸の混合物は、イオンの存在下、例えば塩溶液中で、ポリマー／核酸複合体形成を開始し、複合体を効率的なトランスフェクションのために最適なサイズに成長させるために所望の期間インキュベートすることができる。いくつかの好ましい実施形態では、カチオン性ポリマー及び核酸の混合物は塩の存在下でインキュベートされる。
【0133】
いくつかの好ましい実施形態では、方法は、工程ｂ）で生成された塩溶液をインキュベートする工程を含む。核酸及びカチオン性ポリマーの混合物（すなわち、工程ｂ）で生成された塩溶液））は、約１０秒間～約４時間（適切には、約３０秒間～約３時間、約１分間～約２時間、約５分間～約９０分間、約１０分間～約７５分間、約２０分間～約６０分間又は約３０分間～約４５分間）インキュベートされ得る。核酸及びカチオン性ポリマーの混合物（すなわち、工程ｂ）で生成された塩溶液）は、約２０分間、約２５分間、約３０分間、約３５分間、約４０分間、約４５分間、約５０分間、約５５分間、約６０分間、約６５分間、約７０分間又は約７５分間インキュベートされ得る。いくつかの好ましい実施形態では、工程ｂ）で生成された塩溶液は、約２０分間～約６０分間、好ましくは約６０分間インキュベートされる。インキュベーションは、ポリマー／核酸複合体の形成及び／又は成長に適した任意の温度、例えば室温で行うことができる。
【0134】
イオンの存在下、例えば塩溶液中のカチオン性ポリマー及び核酸の混合物を、混合物のインキュベーションの有無にかかわらず希釈して、例えば貯蔵及びその後の使用のためにポリマー／核酸複合体を安定化することができる。いくつかの好ましい実施形態では、カチオン性ポリマー及び核酸の混合物を希釈する。いくつかの好ましい実施形態では、カチオン性ポリマー及び核酸の混合物は、インキュベーション工程後に希釈される。したがって、いくつかの好ましい実施形態では、ポリマー／核酸複合体の溶液は、インキュベーション工程後に希釈される。
【0135】
いくつかの実施形態では、方法は、工程ｂ）で製造された塩溶液又は工程ｃ）のインキュベーション後の塩溶液を希釈する工程を含む。いくつかの好ましい実施形態では、方法は、工程ｃ）のインキュベーション後に塩溶液を希釈する工程を含む。希釈剤は、本明細書に記載のように、実質的に塩を含まない又は塩を含まない溶液、例えば水であってもよい。
【0136】
いくつかの実施形態では、当該塩溶液は、約０．０５Ｘ ＰＢＳ～約０．１５Ｘ ＰＢＳの最終濃度に希釈され、好ましくは、当該塩溶液は、約０．１０Ｘ ＰＢＳの最終濃度に希釈される。
【0137】
いくつかの実施形態では、当該塩溶液は、約５ｍＭ～約５０ｍＭ（適切には、約１０ｍＭ～約４０ｍＭ又は約１５ｍＭ～約３０ｍＭ）の最終濃度に希釈される。いくつかの実施形態では、当該塩溶液は、約５０ｍＭ未満、約４０ｍＭ未満、約３０ｍＭ未満又は約２０ｍＭ未満の最終濃度に希釈される。
【0138】
ポリマー／核酸複合体の溶液は、使用前に、例えばトランスフェクションのために希釈した後、例えば４℃で保存され得る。
【0139】
複合体形成の開始又は複合体形成を安定化するための希釈に適した塩濃度は、使用される塩のイオン強度に応じて変化することが当業者には理解されよう。既知のイオン強度の特定の塩のための本発明の方法における使用のための適切な塩濃度の選択は、当業者の能力の範囲内である。
【0140】
いくつかの実施形態では、核酸は、レトロウイルスベクターコンポーネントをコードする。
【0141】
いくつかの実施形態では、レトロウイルスベクターは複製欠損レトロウイルスベクターである。
【0142】
いくつかの実施形態では、レトロウイルスベクターはレンチウイルスベクターであり、好ましくはレンチウイルスベクターは、ＨＩＶ－１、ＨＩＶ－２、ＳＩＶ、ＦＩＶ、ＢＩＶ、ＥＩＡＶ、ＣＡＥＶ又はＶｉｓｎａである。レンチウイルスベクターは、複製欠損レンチウイルスベクターであり得る。
【0143】
いくつかの実施形態では、ベクターコンポーネントは、
ａ）レンチウイルスベクターのＲＮＡゲノム、
ｂ）ｅｎｖ又はその機能的代用物、
ｃ）ｇａｇ－ｐｏｌ又はその機能的代用物、並びに／或いは
ｄ）ｒｅｖ又はその機能的代用物
から選択される。
ａ）レンチウイルスベクターのＲＮＡゲノム、
ｂ）ｅｎｖ又はその機能的代用物、
ｃ）ｇａｇ－ｐｏｌ又はその機能的代用物、並びに／或いは
ｄ）ｒｅｖ又はその機能的代用物
から選択される。
【0144】
ベクター／発現カセット
ベクターは、ある環境から別の環境への実体の転送を可能にする、又は容易にするツールである。本発明によれば、及び例として、組換え核酸技術で使用されるいくつかのベクターは、核酸のセグメント（例えば異種ＤＮＡセグメント、例えば異種ｃＤＮＡセグメント）等の実体が標的細胞に移入され、標的細胞によって発現されることを可能にする。ベクターは、ウイルスベクターコンポーネントをコードするヌクレオチド配列及び標的細胞内でのその発現を維持するために、ウイルスベクターコンポーネントをコードするヌクレオチド配列の統合を促進し得る。
ベクターは、ある環境から別の環境への実体の転送を可能にする、又は容易にするツールである。本発明によれば、及び例として、組換え核酸技術で使用されるいくつかのベクターは、核酸のセグメント（例えば異種ＤＮＡセグメント、例えば異種ｃＤＮＡセグメント）等の実体が標的細胞に移入され、標的細胞によって発現されることを可能にする。ベクターは、ウイルスベクターコンポーネントをコードするヌクレオチド配列及び標的細胞内でのその発現を維持するために、ウイルスベクターコンポーネントをコードするヌクレオチド配列の統合を促進し得る。
【0145】
ベクターは、発現カセット（発現構築物とも呼ばれる）であり得るか、又はそれを含み得る。本明細書に記載の発現カセットは、転写され得る核酸含有配列の領域を含む。したがって、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ及びｒＲＮＡをコードする配列は、この定義内に含まれる。
【0146】
ベクターは、１つ以上の選択マーカ遺伝子（例えば、ネオマイシン耐性遺伝子）及び／又は追跡可能なマーカ遺伝子（例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする遺伝子）を含み得る。ベクターは、例えば、標的細胞に感染及び／又は形質導入するために使用され得る。ベクターは、ベクターが問題の宿主細胞において複製することを可能にするヌクレオチド配列、例えば条件付きで複製する腫瘍溶解性ベクターを更に含み得る。
【0147】
「カセット」という用語は、「コンジュゲート」、「構築物」及び「ハイブリッド」等の用語と同義であり、プロモーターに直接又は間接的に結合したポリヌクレオチド配列を含む。本発明で使用するための発現カセットは、ウイルスベクターコンポーネントをコードするヌクレオチド配列の発現のためのプロモーターと、場合によりウイルスベクターコンポーネントをコードするヌクレオチド配列の調節因子とを含む。好ましくは、カセットは、プロモーターに作動可能に連結された少なくとも１つのポリヌクレオチド配列を含む。
【0148】
発現カセット、例えばプラスミド、コスミド、ウイルス又はファージベクターの選択は、導入される宿主細胞に依存することが多い。発現カセットは、ＤＮＡプラスミド（スーパーコイル状、ニック入り又は線状化）、ミニサークルＤＮＡ（線状又はスーパーコイル状）、制限酵素消化及び精製によるプラスミド骨格の除去によって目的の領域のみを含有するプラスミドＤＮＡ、酵素ＤＮＡ増幅プラットフォーム、例えば、使用される最終ＤＮＡが閉環形態であるか、又は開放切断端を有するように調製されている（例えば、制限酵素消化）ｄｏｇｇｙｂｏｎｅ ＤＮＡ（ｄｂＤＮＡ（商標））を使用して生成されたＤＮＡであり得る。
【0149】
レトロウイルスベクター産生系及び細胞
レトロウイルスベクター産生系（例えば、レンチウイルスベクター産生系）は、レトロウイルスベクター（例えばレンチウイルスベクター）の産生に必要なコンポーネントをコードするヌクレオチド配列のセットを含む。したがって、ベクター産生系は、レトロウイルスベクター粒子（例えばレンチウイルスベクター粒子）を作製するために必要なウイルスベクターコンポーネントをコードするヌクレオチド配列のセットを含む。
レトロウイルスベクター産生系（例えば、レンチウイルスベクター産生系）は、レトロウイルスベクター（例えばレンチウイルスベクター）の産生に必要なコンポーネントをコードするヌクレオチド配列のセットを含む。したがって、ベクター産生系は、レトロウイルスベクター粒子（例えばレンチウイルスベクター粒子）を作製するために必要なウイルスベクターコンポーネントをコードするヌクレオチド配列のセットを含む。
【0150】
「ウイルスベクター産生系」又は「ベクター産生系」又は「産生系」は、レンチウイルスベクター産生に必要なコンポーネントを含む系として理解されるべきである。
【0151】
一実施形態では、ウイルスベクター産生系は、Ｇａｇ及びＧａｇ／Ｐｏｌタンパク質、並びにＥｎｖタンパク質及びベクターゲノム配列をコードするヌクレオチド配列を含む。産生系は、場合により、Ｒｅｖタンパク質又はその機能的置換物をコードするヌクレオチド配列を含み得る。
【0152】
本発明の一実施形態では、少なくとも１つの導入遺伝子コンポーネントは、反転であっても逆向きであってもよい。
【0153】
一実施形態では、少なくとも１つの導入遺伝子コンポーネントは、ベクターゲノムＲＮＡの５’－３’方向性に対して反転又は逆向き方向であり得る。導入遺伝子カセットが反転している、すなわち転写ユニットがベクターゲノムカセットを駆動するプロモーターに対向しているレンチウイルスベクターゲノムを利用することができる。更に、導入遺伝子カセットの１つのコンポーネントが逆向きであり、別のコンポーネントが順向きである場合、例えば、双方向導入遺伝子カセット又は複数の別個のカセットを使用する場合があり得る。
【0154】
一実施形態では、ウイルスベクター産生系は、モジュール式核酸構築物（モジュール式構築物）を含む。モジュール構築物は、レンチウイルスベクターの産生に使用される２つ以上の核酸を含むＤＮＡ発現構築物である。モジュール構築物は、レンチウイルスベクターの産生に使用される２つ以上の核酸を含むＤＮＡプラスミドであり得る。プラスミドは細菌プラスミドであり得る。核酸は、例えば、ｇａｇ－ｐｏｌ、ｒｅｖ、ｅｎｖ、ベクターゲノムをコードし得る。更に、パッケージング細胞株及びプロデューサ細胞株の作製のために設計されたモジュール構築物は、転写調節タンパク質（例えば、ＴｅｔＲ、ＣｙｍＲ）及び／又は翻訳抑制タンパク質（例えば、ＴＲＡＰ）並びに選択マーカ（例えば、Ｚｅｏｃｉｎ（商標）、ハイグロマイシン、ブラストサイジン、ピューロマイシン、ネオマイシン耐性遺伝子）をコードすることを更に必要とし得る。本発明での使用に適したモジュール式構築物は、欧州特許第３５０２２６０号明細書に記載されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0155】
本発明に従って使用するためのモジュール式構築物は、１つの構築物に２つ以上のレトロウイルスコンポーネントをコードする核酸配列を含むため、これらのモジュール式構築物の安全性プロファイルが考慮されており、更なる安全性の特徴が構築物に直接操作されている。これらの特徴には、レトロウイルスベクターコンポーネントの複数のオープンリーディングフレームのためのインスレータの使用、並びに／或いはモジュール式構築物におけるレトロウイルス遺伝子の特異的な配向及び配置が含まれる。これらの特徴を使用することにより、複製可能なウイルス粒子を生成するための直接的なリードスルーが防止されると考えられる。
【0156】
ウイルスベクターコンポーネントをコードする核酸配列は、モジュール式構築物において逆及び／又は交互の転写配向であり得る。したがって、ウイルスベクターコンポーネントをコードする核酸配列は、同じ５’から３’方向に提示されず、その結果、ウイルスベクターコンポーネントは、同じｍＲＮＡ分子から産生することができない。逆配向とは、異なるベクターコンポーネントに対する少なくとも２つのコード配列が、「ｈｅａｄ－ｔｏ－ｈｅａｄ」及び「ｔａｉｌ－ｔｏ－ｔａｉｌ」転写配向で提示されることを意味し得る。これは、モジュール式構築物の一方の鎖上の１つのベクターコンポーネント、例えばｅｎｖに対するコード配列及び反対側の鎖上の別のベクターコンポーネント、例えばｒｅｖに対するコード配列を提供することによって達成され得る。好ましくは、３つ以上のベクターコンポーネントのコード配列がモジュール式構築物中に存在する場合、コード配列の少なくとも２つは逆転写配向で存在する。したがって、モジュール式構築物中に３つ以上のベクターコンポーネントのコード配列が存在する場合、各コンポーネントは、それが隣接する他のベクターコンポーネントの全ての隣接コード配列に対して反対の５’から３’方向に存在するように配向され得る、すなわち、各コード配列に対して交互の５’から３’（又は転写）方向が使用され得る。
【0157】
本発明に従って使用するためのモジュール式構築物は、以下のベクターコンポーネント：ｇａｇ－ｐｏｌ、ｒｅｖ、ｅｎｖ、ベクターゲノムのうちの２つ以上をコードする核酸配列を含み得る。モジュール構築物は、ベクターコンポーネントの任意の組合せをコードする核酸配列を含み得る。一実施形態では、モジュール式構築物は、以下のもの、
ｉ）レンチウイルスベクターのＲＮＡゲノム及びｒｅｖ、又はその機能的置換物、
ｉｉ）レンチウイルスベクターのＲＮＡゲノム及びｇａｇ－ｐｏｌ、
ｉｉｉ）レンチウイルスベクターのＲＮＡゲノム及びｅｎｖ、
ｉｖ）ｇａｇ－ｐｏｌ及びｒｅｖ、又はその機能的代用物、
ｖ）ｇａｇ－ｐｏｌ及びｅｎｖ、
ｖｉ）ｅｎｖ及びｒｅｖ、又はその機能的置換物、
ｖｉｉ）レンチウイルスベクターのＲＮＡゲノム、ｒｅｖ又はその機能的置換物、及びｇａｇ－ｐｏｌ、
ｖｉｉｉ）レンチウイルスベクターのＲＮＡゲノム、ｒｅｖ又はその機能的置換物、及びｅｎｖ、
ｉｘ）レンチウイルスベクターのＲＮＡゲノム、ｇａｇ－ｐｏｌ及びｅｎｖ、又は
ｘ）ｇａｇ－ｐｏｌ、ｒｅｖ、又はそれらの機能的代用物、及びｅｎｖ、
をコードする核酸配列を含み得、
核酸配列は、逆及び／又は交互配向である。
ｉ）レンチウイルスベクターのＲＮＡゲノム及びｒｅｖ、又はその機能的置換物、
ｉｉ）レンチウイルスベクターのＲＮＡゲノム及びｇａｇ－ｐｏｌ、
ｉｉｉ）レンチウイルスベクターのＲＮＡゲノム及びｅｎｖ、
ｉｖ）ｇａｇ－ｐｏｌ及びｒｅｖ、又はその機能的代用物、
ｖ）ｇａｇ－ｐｏｌ及びｅｎｖ、
ｖｉ）ｅｎｖ及びｒｅｖ、又はその機能的置換物、
ｖｉｉ）レンチウイルスベクターのＲＮＡゲノム、ｒｅｖ又はその機能的置換物、及びｇａｇ－ｐｏｌ、
ｖｉｉｉ）レンチウイルスベクターのＲＮＡゲノム、ｒｅｖ又はその機能的置換物、及びｅｎｖ、
ｉｘ）レンチウイルスベクターのＲＮＡゲノム、ｇａｇ－ｐｏｌ及びｅｎｖ、又は
ｘ）ｇａｇ－ｐｏｌ、ｒｅｖ、又はそれらの機能的代用物、及びｅｎｖ、
をコードする核酸配列を含み得、
核酸配列は、逆及び／又は交互配向である。
【0158】
一実施形態では、レンチウイルスベクターを産生するための細胞は、上記ｉ）～ｘ）の組合せのいずれか１つをコードする核酸配列を含み得、核酸配列は、同じ遺伝子座に位置し、逆向き及び／又は交互の配向にある。同じ遺伝子座は、細胞内の単一の染色体外遺伝子座、例えば単一のプラスミド、又は細胞のゲノム内の単一の遺伝子座（すなわち、単一の挿入部位）を指し得る。細胞は、レトロウイルスベクター、例えばレンチウイルスベクターを産生するための安定細胞又は一過性細胞であり得る。
【0159】
ＤＮＡ発現構築物は、ＤＮＡプラスミド（スーパーコイル状、ニック入り又は線状化）、ミニサークルＤＮＡ（線状又はスーパーコイル状）、制限酵素消化及び精製によるプラスミド骨格の除去によって目的の領域のみを含有するプラスミドＤＮＡ、酵素ＤＮＡ増幅プラットフォーム、例えば、使用される最終ＤＮＡが閉環形態であるか、又は開放切断端を有するように調製されている（例えば、制限酵素消化）ｄｏｇｇｙｂｏｎｅ ＤＮＡ（ｄｂＤＮＡ（商標））を使用して生成されたＤＮＡであり得る。
【0160】
一実施形態では、レンチウイルスベクターは、ＨＩＶ－１、ＨＩＶ－２、ＳＩＶ、ＦＩＶ、ＢＩＶ、ＥＩＡＶ、ＣＡＥＶ又はビスナレンチウイルスに由来する。
【0161】
「ウイルスベクター産生細胞」、「ベクター産生細胞」、又は「産生細胞」は、レンチウイルスベクター又はレンチウイルスベクター粒子を産生することができる細胞として理解されるべきである。レンチウイルスベクター産生細胞は、「プロデューサ細胞」又は「パッケージング細胞」であり得る。ウイルスベクターシステムの１つ又は複数のＤＮＡ構築物は、ウイルスベクター産生細胞内に安定に組み込まれるか、又はエピソーム的に維持され得る。或いは、ウイルスベクター系の全てのＤＮＡコンポーネントをウイルスベクター産生細胞に一過性にトランスフェクトしてもよい。更に別の代替法では、コンポーネントのいくつかを安定に発現する産生細胞を、ベクター産生に必要な残りのコンポーネントで一過性にトランスフェクトすることができる。
【0162】
本明細書で使用される場合、「パッケージング細胞」という用語は、レンチウイルスベクター粒子の産生に必要な要素を含むが、ベクターゲノムを欠く細胞を指す。場合により、そのようなパッケージング細胞は、ウイルス構造タンパク質（例えば、ｇａｇ、ｇａｇ／ｐｏｌ及びｅｎｖ）、典型的にはｒｅｖを発現することができる１つ以上の発現カセットを含有する。
【0163】
プロデューサ細胞／パッケージング細胞は、任意の適切な細胞型であり得る。プロデューサ細胞は一般に哺乳動物細胞であるが、例えば昆虫細胞であり得る。
【0164】
本明細書で使用される場合、「プロデューサ細胞」又は「ベクター産生／プロデューサ細胞」という用語は、レンチウイルスベクター粒子の産生に必要な全ての要素を含む細胞を指す。産生細胞は、安定なプロデューサ細胞株であるか、又は一過性に誘導されるか、又はレトロウイルスゲノムが一過性に発現される安定なパッケージング細胞であり得る。
【0165】
ベクター産生細胞は、組織培養細胞株等のインビトロで培養された細胞であり得る。適切な細胞株には、マウス線維芽細胞由来細胞株又はヒト細胞株等の哺乳動物細胞が含まれるが、これらに限定されない。好ましくは、ベクター産生細胞はヒト細胞株に由来する。
【0166】
細胞及び製造方法
本明細書に記載のインビトロ方法によって得られる又は得ることができるポリマー／核酸複合体の溶液又は本明細書に記載のポリマー核酸複合体の溶液は、細胞のトランスフェクションに使用され得る。
本明細書に記載のインビトロ方法によって得られる又は得ることができるポリマー／核酸複合体の溶液又は本明細書に記載のポリマー核酸複合体の溶液は、細胞のトランスフェクションに使用され得る。
【0167】
したがって、いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリマー／核酸複合体の溶液を生成するためのインビトロ方法は、
ｅ）必要に応じて哺乳動物細胞を培養する工程と、
ｆ）本明細書に記載の方法によって得られたポリマー／核酸複合体の溶液を使用して哺乳動物細胞をトランスフェクトする工程と、
ｇ）場合により、ポリマー／核酸複合体の溶液の核酸とは異なる核酸を哺乳動物細胞に導入する工程と、
ｈ）場合により、そのゲノム内に組み込まれた核酸を有する哺乳動物細胞を選択する工程と、
ｉ）場合により、核酸が発現される条件下で哺乳動物細胞を培養する工程と、
ｊ）場合により、レトロウイルスベクターが産生される条件下で哺乳動物細胞を培養する工程と、
ｋ）場合により、レトロウイルスベクターを単離する工程と、
を更に含む。
ｅ）必要に応じて哺乳動物細胞を培養する工程と、
ｆ）本明細書に記載の方法によって得られたポリマー／核酸複合体の溶液を使用して哺乳動物細胞をトランスフェクトする工程と、
ｇ）場合により、ポリマー／核酸複合体の溶液の核酸とは異なる核酸を哺乳動物細胞に導入する工程と、
ｈ）場合により、そのゲノム内に組み込まれた核酸を有する哺乳動物細胞を選択する工程と、
ｉ）場合により、核酸が発現される条件下で哺乳動物細胞を培養する工程と、
ｊ）場合により、レトロウイルスベクターが産生される条件下で哺乳動物細胞を培養する工程と、
ｋ）場合により、レトロウイルスベクターを単離する工程と、
を更に含む。
【0168】
適切には、工程ｅ）は、工程ａ）、ｂ）、ｃ）及び／又はｄ）の前に、例えば工程ａ）～ｄ）の前に実施される。
【0169】
適切には、工程ｅ）は、工程ａ）、ｂ）、ｃ）及び／又はｄ）と同時に、例えば工程ａ）～ｄ）と同時に実施される。
【0170】
適切には、工程ｅ）は、工程ａ）、ｂ）、ｃ）及び／又はｄ）の後に、例えば以下の工程ａ）～ｄ）の後に実施される。
【0171】
更なる態様では、本発明は、細胞への核酸のトランスフェクションのための、本明細書に記載のポリマー／核酸複合体の溶液の使用を提供する。
【0172】
更なる態様では、本発明は、レトロウイルスベクターの製造方法における、本明細書に記載のポリマー／核酸複合体の溶液の使用を提供する。
【0173】
更なる態様において、本発明は、レトロウイルスベクターを産生するための方法を提供し、
ａ）必要に応じて哺乳動物細胞を培養する工程と、
ｂ）本明細書に記載のポリマー／核酸複合体の溶液を使用して哺乳動物細胞をトランスフェクトする工程と、
ｃ）場合により、ポリマー／核酸複合体の溶液の核酸とは異なる少なくとも１つの核酸を哺乳動物細胞に導入する工程と、
ｄ）場合により、そのゲノム内に組み込まれたウイルスベクターコンポーネントをコードする核酸配列を有する哺乳動物細胞を選択する工程と、
ｅ）レトロウイルスベクターが産生される条件下で哺乳動物細胞を更に培養する工程と、
を含む。
ａ）必要に応じて哺乳動物細胞を培養する工程と、
ｂ）本明細書に記載のポリマー／核酸複合体の溶液を使用して哺乳動物細胞をトランスフェクトする工程と、
ｃ）場合により、ポリマー／核酸複合体の溶液の核酸とは異なる少なくとも１つの核酸を哺乳動物細胞に導入する工程と、
ｄ）場合により、そのゲノム内に組み込まれたウイルスベクターコンポーネントをコードする核酸配列を有する哺乳動物細胞を選択する工程と、
ｅ）レトロウイルスベクターが産生される条件下で哺乳動物細胞を更に培養する工程と、
を含む。
【0174】
更なる態様では、本発明は、本発明の任意の方法によって産生されたレンチウイルスベクターを提供する。
【0175】
更なる態様では、本発明は、レンチウイルスベクターを産生するための産生細胞を生成する方法を提供し、
ａ）必要に応じて哺乳動物細胞を培養する工程と、
ｂ）本明細書に記載のポリマー／核酸複合体の溶液を使用して哺乳動物細胞をトランスフェクトする工程と、
ｃ）場合により、ポリマー／核酸複合体の溶液の核酸とは異なる少なくとも１つの核酸を哺乳動物細胞に導入する工程と、
ｄ）場合により、ウイルスベクターコンポーネントをコードする核酸配列を含む哺乳動物細胞を選択する工程と、
を含む。
ａ）必要に応じて哺乳動物細胞を培養する工程と、
ｂ）本明細書に記載のポリマー／核酸複合体の溶液を使用して哺乳動物細胞をトランスフェクトする工程と、
ｃ）場合により、ポリマー／核酸複合体の溶液の核酸とは異なる少なくとも１つの核酸を哺乳動物細胞に導入する工程と、
ｄ）場合により、ウイルスベクターコンポーネントをコードする核酸配列を含む哺乳動物細胞を選択する工程と、
を含む。
【0176】
更なる態様では、本発明は、レンチウイルスベクターを産生するための安定な産生細胞を生成する方法を提供し、
ａ）必要に応じて哺乳動物細胞を培養する工程と、
ｂ）本明細書に記載のポリマー／核酸複合体の溶液を使用して哺乳動物細胞をトランスフェクトする工程と、
ｃ）場合により、ポリマー／核酸複合体の溶液の核酸とは異なる少なくとも１つの核酸を哺乳動物細胞に導入する工程と、
ｄ）そのゲノム内に組み込まれたベクターコンポーネントをコードする当該核酸を含む細胞を選択する工程と、
を含む。
ａ）必要に応じて哺乳動物細胞を培養する工程と、
ｂ）本明細書に記載のポリマー／核酸複合体の溶液を使用して哺乳動物細胞をトランスフェクトする工程と、
ｃ）場合により、ポリマー／核酸複合体の溶液の核酸とは異なる少なくとも１つの核酸を哺乳動物細胞に導入する工程と、
ｄ）そのゲノム内に組み込まれたベクターコンポーネントをコードする当該核酸を含む細胞を選択する工程と、
を含む。
【0177】
更なる態様では、本発明は、レンチウイルスベクターを産生するための一過性産生細胞を作製する方法を提供し、場合により哺乳動物細胞を培養する工程と、本明細書に記載のポリマー／核酸複合体の溶液を使用して哺乳動物細胞をトランスフェクトする工程と、場合によりポリマー／核酸複合体の溶液の核酸とは異なる少なくとも１つの核酸を哺乳動物細胞に導入する工程と、を含む。
【0178】
更なる態様では、本発明は、本発明の任意の方法によって産生されたレンチウイルスベクターを産生するための細胞を提供する。
【0179】
更なる態様では、本発明は、本発明の任意の方法によって産生されたレンチウイルスベクターを産生するための安定な産生細胞を提供する。
【0180】
更なる態様では、本発明は、本発明の任意の方法によって産生されたレンチウイルスベクターを産生するための一過性産生細胞を提供する。
【0181】
いくつかの実施形態では、ポリマー／核酸複合体の核酸は、レトロウイルスベクターコンポーネントをコードする。いくつかの実施形態では、ベクターコンポーネントは、
ａ）ウイルスベクターのゲノム、
ｂ）ｅｎｖ又はその機能的代用物、
ｃ）ｇａｇ－ｐｏｌ又はその機能的代用物、並びに／或いは
ｄ）ｒｅｖ又はその機能的代用物
から選択される。
ａ）ウイルスベクターのゲノム、
ｂ）ｅｎｖ又はその機能的代用物、
ｃ）ｇａｇ－ｐｏｌ又はその機能的代用物、並びに／或いは
ｄ）ｒｅｖ又はその機能的代用物
から選択される。
【0182】
いくつかの実施形態では、レトロウイルスベクターは複製欠損レトロウイルスベクターである。
【0183】
いくつかの実施形態では、レトロウイルスベクターはレンチウイルスベクターであり、好ましくはレンチウイルスベクターは、ＨＩＶ－１、ＨＩＶ－２、ＳＩＶ、ＦＩＶ、ＢＩＶ、ＥＩＡＶ、ＣＡＥＶ又はＶｉｓｎａである。
【0184】
いくつかの実施形態では、ベクターコンポーネントは、
ａ）レンチウイルスベクターのＲＮＡゲノム、
ｂ）ｅｎｖ又はその機能的代用物、
ｃ）ｇａｇ－ｐｏｌ又はその機能的代用物、並びに／或いは
ｄ）ｒｅｖ又はその機能的代用物
から選択される。
ａ）レンチウイルスベクターのＲＮＡゲノム、
ｂ）ｅｎｖ又はその機能的代用物、
ｃ）ｇａｇ－ｐｏｌ又はその機能的代用物、並びに／或いは
ｄ）ｒｅｖ又はその機能的代用物
から選択される。
【0185】
いくつかの実施形態では、方法は哺乳動物細胞を培養する工程を含む。適切には、哺乳動物細胞を培養する工程は、バッチ培養、流加培養、濃縮流加培養又は灌流培養で実施され得る。
【0186】
本明細書で使用される場合、「バッチ培養」という用語は、栄養素を含有する培地の限られた供給が細胞に提供される、すなわち細胞が、新鮮な培地及び／又はサプリメントの添加なしに、及び不純物を含有する栄養枯渇培地の除去なしに、同じ培地で培養される、ウイルスベクター産生を含むバイオテクノロジープロセスのための運用技術を指す。したがって、栄養素が使い果たされると、又は廃棄物又は副生成物の生成等の別の要因が制限されると、培養物は減少する。典型的には、ウイルスベクター産物は、プロセスの最後に回収される。バッチ培養は、ウイルスベクター等の生体材料又は細胞産物の産生における上流処理技術である。
【0187】
本明細書で使用される場合、「流加培養」という用語は、細胞増殖及びウイルスベクター産生に必要な１つ又は複数の栄養素（例えば、そうでなければ制限になるであろう栄養素）が培養中に培養容器、例えばバイオリアクター内の細胞に供給される、ウイルスベクター産生を含むバイオテクノロジープロセスのための運用技術を指す。ウイルスベクター産物は、ウイルスベクターが回収されるプロセス実行の終わりまで培養容器、例えばバイオリアクター内に留まる。１つ以上の栄養素は、不純物を含有する栄養欠乏培地を除去することなく、少なくとも１つの供給流を介して連続的又は定期的に供給されてもよく、すなわち、１つ以上の栄養素は、別のバッチプロセスに添加される。プロセス実行の終了時に細胞が生存可能なままである場合、プロセスを繰り返してもよい。流加培養は、ウイルスベクター等の生体材料又は細胞産物の産生における上流処理技術である。
【0188】
本明細書で使用される場合、「濃縮流加培養」という用語は、交互接線流（ＡＴＦ）又は接線流濾過（ＴＦＦ）であり得る灌流培養システムが限外濾過膜と共に使用される、ウイルスベクター産生を含むバイオテクノロジープロセスのための運用技術を指す。濃縮流加培養では、細胞が培養容器、例えばバイオリアクターの内部に保持される一方で、不純物を含有する栄養枯渇培地が除去され、新鮮な培地が細胞に供給される。このプロセスは、従来の流加培養のようにプロセスが終了するまで培養容器、例えばバイオリアクター内に生成物を保持するが、培養容器内のより高い細胞及び生成物濃度を得る。
【0189】
本明細書で使用される場合、「灌流培養」（「連続灌流培養」又は「灌流」としても知られる）という用語は、細胞が培養容器、例えばバイオリアクターの内部に保持される一方で、不純物を含有する栄養枯渇培地が連続的に除去され、新鮮な培地が細胞に連続的に提供される、ウイルスベクター産生を含むバイオテクノロジープロセスのための運用技術を指す。新鮮な培地は、典型的には、不純物を含有する栄養枯渇培地が除去されるのと同じ速度で細胞に提供される。したがって、連続灌流は、少量のバイオリアクター作業容量の連続的な除去と、典型的には除去された培地と同等の容量の新鮮な培地のバイオリアクターへの導入とを含む。灌流培養は、ウイルスベクター等の生体材料又は細胞産物の産生における上流連続処理技術である。ウイルスベクター産物は、ウイルスベクターが回収されるプロセス実行の終わりまで培養容器、例えばバイオリアクター内に留まり得る。例えば、これは、アデノウイルスベクター及びアデノ随伴ウイルスベクター等の細胞内で産生されるウイルスベクターの場合であり得る。或いは、ウイルスベクター産物を培養容器、例えばバイオリアクターから灌流し、続いて灌流液からウイルスベクター産物を回収してもよい。例えば、これは、ウイルスベクター産生が開始された後に灌流が行われる場合、レンチウイルスベクター等の分泌ウイルスベクターの場合であり得る。
【0190】
一実施形態では、方法は、灌流培養（例えば、灌流培養系において）において哺乳動物細胞を培養する工程を含む。連続灌流培養は、生産力価及び純度を制限する不純物の蓄積が培地交換によって減少するため、ウイルスベクターの生産においてバッチ培養又は流加培養よりも有利である。
【0191】
本発明の製造プロセスは、好ましくは、治療薬としてヒトに投与するのに適した臨床グレードの製剤を製造するための大規模スケールプロセスである。本明細書に記載のウイルスベクター組成物は、好ましくは治療薬としてヒトに投与するのに適している。
【0192】
本明細書に記載の本発明による方法は、細胞培養容器に哺乳動物細胞を接種する工程を更に含み得る。適切には、細胞培養容器に哺乳動物細胞を接種する工程は、哺乳動物細胞を培養する工程（例えば、灌流培養物中で哺乳動物細胞を培養する工程）の前に行われる。「接種する」とは、例えば培養容器内の培養培地に細胞を導入することを意味する。
【0193】
適切には、哺乳動物細胞を培養する工程（例えば、灌流培養物中で哺乳動物細胞を培養する工程）は、細胞培養容器に哺乳動物細胞を接種する工程の直後に行われる。
【0194】
いくつかの実施形態では、方法は、細胞を接種する工程の後で、且つ細胞をトランスフェクトする工程の前に、迅速な培地交換を実施する工程を更に含み、好ましくは、培地は、接種後約２０～約２８時間で交換される。適切には、培地は、接種後約２１時間（適切には、２２、２３、２４、２５、２６、又は２７）～約２８時間で交換され得る。適切には、培地は、トランスフェクションの約２１～約２７、２２～約２６、又は２３～約２５時間前に交換され得る。適切には、培地は、トランスフェクションの約２４時間前に交換され得る。適切には、培地は、接種後約２１時間未満（適切には、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７又は約２８時間未満）で交換され得る。適切には、哺乳動物細胞を培養する工程は、少なくとも１回の迅速な培地交換を含む。迅速な培地交換を使用する細胞培養は、灌流培養と同じ理由で、すなわち、生産力価及び純度を制限する不純物の蓄積が培地交換によって減少するため、ウイルスベクターの生産においてバッチ培養又は流加培養よりも有利である。
【0195】
本明細書で使用される場合、「迅速な培地交換」という用語は、細胞が培養容器、例えば本明細書に記載のバイオリアクターの内部に保持されながら、規定量の細胞培養容器作業容量を除去し、規定量の新鮮な培地を短い離散時間で細胞培養容器に導入する、ウイルスベクター産生を含むバイオテクノロジープロセスのための運用技術を指す。したがって、細胞代謝によって栄養素が枯渇した培地、並びにトランスフェクション試薬等のウイルスベクター産生に悪影響を及ぼし得る不純物及び他の薬剤が除去され、迅速な培地交換中に新鮮な培地が細胞に提供される。迅速な培地交換は逐次プロセスであり、すなわち、使用済み培地を最初に細胞培養容器（例えばバイオリアクター）から取り出し、次いで新鮮培地を細胞培養容器（例えばバイオリアクター）に導入する。細胞培養容器に導入される規定量の新鮮な培地は、除去される規定量の細胞培養容器作業量よりも高くてもよく、低くてもよく、同等であってもよく、又は等しくてもよい。除去された不純物を含有する栄養欠乏培地の容量は、典型的には、導入される新鮮な培地の容量と同等である。規定量の細胞培養容器作業容量は、典型的には、細胞培養容器から除去され、続いて規定量の新鮮な培地が細胞培養容器に導入される、すなわち、細胞培養容器の作業容量は、新鮮な培地の添加前の迅速な培地交換中に一時的に減少する。これは、細胞培養容器作業容量の除去及び新鮮な培地の導入が典型的には同時に起こる従来の灌流プロセスとは異なる。迅速な培地交換は、ウイルスベクター等の生体材料又は細胞産物の産生における上流連続処理技術である。
【0196】
適切には、培養容器は、バイオリアクター、ウェーブバッグ、ローラーボトル又はフラスコであり得る。好ましくは、培養容器はバイオリアクターである。
【0197】
一実施形態では、懸濁培養物は、バイオリアクター等の培養容器内にあってもよい。バイオリアクターは、例えば、約０．１リットル～約１０００リットル、例えば約０．１リットル～約５００リットルの容量（例えば、作業容量）を有し得る。
【0198】
例えば、作業容量等の容量は、約０．１リットル～約０．２５リットル、約０．５リットル～約２５０リットル、約１リットル～約２００リットル、約５～約１８０リットル、約１０～約１５０リットル、約１５～約１００リットル、約２０～約８０リットル、又は約３０～約５０リットルであり得る。
【0199】
一実施形態では、作業容量等の容量は、約０．１、０．２５、０．５、０．７５、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５，１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、１０００又は２０００リットルであり得る。
【0200】
一実施形態では、作業容量は、約２リットル～約１００リットルであり得る。
【0201】
一実施形態では、作業容量は約５リットルであり得る。
【0202】
一実施形態では、作業容量は約５０リットルであり得る。
【0203】
一実施形態では、作業容量は約２００リットルであり得る。
【0204】
一実施形態では、作業容量は約１０００リットルであり得る。
【0205】
いくつかの実施形態では、方法は、核酸が発現される条件下で哺乳動物細胞を培養する工程を含む。
【0206】
いくつかの実施形態では、方法は、レトロウイルスベクターが産生される条件下で哺乳動物細胞を培養する工程を含む。
【0207】
いくつかの実施形態では、方法はレトロウイルスベクターを単離する工程を含む。
【0208】
いくつかの実施形態では、哺乳動物細胞はＨＥＫ２９３Ｔ細胞である。
【0209】
いくつかの実施形態では、哺乳動物細胞は懸濁液適合哺乳動物細胞である。
【0210】
本明細書で使用される場合、「懸濁液適合細胞」という用語は、懸濁増殖に適合した接着様式で典型的に増殖する細胞を指す。細胞を懸濁液に適合させるための方法は、当技術分野で公知である。例えば、懸濁増殖への適応は、細胞の継代中の連続的な血清減少によって行うことができる。これにより、無血清培地中、すなわちウシ胎児血清（ＦＢＳ）等の血清の非存在下で懸濁状態で増殖する懸濁液適合細胞が得られる。
【0211】
したがって、いくつかの実施形態では、トランスフェクション、導入及び／又は培養工程は、無血清培地中の懸濁液中で行われる。
【0212】
本発明の方法は、懸濁系で培養された接着細胞に対して実施され得る。例えば、接着細胞は、懸濁系においてマイクロキャリア上で培養され得る。
【0213】
いくつかの実施形態では、トランスフェクションは一過性トランスフェクションである。
【0214】
本明細書に記載のポリマー／核酸複合体の方法及び溶液は、材料の大規模生産における使用に適している。本発明での使用に適した大容量培養容器の非限定的な例としては、スピナーフラスコ（最大約３６Ｌ容量）、ウェーブバッグ（最大約１００Ｌ容量）及びバイオリアクター（最大約１００００Ｌ容量）が挙げられる。
【0215】
いくつかの実施形態では、トランスフェクション、導入及び／又は培養工程は少なくとも５０Ｌ（適切には、少なくとも６０Ｌ、少なくとも７５Ｌ、少なくとも１００Ｌ、少なくとも２００Ｌ）の容量で行われ、好ましくはトランスフェクション、導入及び培養工程は少なくとも５０Ｌ（適切には、少なくとも６０Ｌ、少なくとも７５Ｌ、少なくとも１００Ｌ、少なくとも２００Ｌ）の容量で行われる。
【0216】
いくつかの実施形態では、ポリマー／核酸複合体の溶液の核酸とは異なる核酸は、トランスフェクション又はエレクトロポレーションによって哺乳動物細胞に導入される。
【0217】
いくつかの実施形態では、ポリマー／核酸複合体の溶液の核酸とは異なる核酸は、ポリマー／核酸複合体の溶液の核酸によってコードされない、以下のもの：
ａ）レンチウイルスベクターのＲＮＡゲノム、
ｂ）ｅｎｖ又はその機能的代用物、
ｃ）ｇａｇ－ｐｏｌ又はその機能的代用物、並びに／或いは
ｄ）ｒｅｖ又はその機能的代用物、
から選択される任意のウイルスベクターコンポーネントをコードする。
ａ）レンチウイルスベクターのＲＮＡゲノム、
ｂ）ｅｎｖ又はその機能的代用物、
ｃ）ｇａｇ－ｐｏｌ又はその機能的代用物、並びに／或いは
ｄ）ｒｅｖ又はその機能的代用物、
から選択される任意のウイルスベクターコンポーネントをコードする。
【0218】
いくつかの実施形態では、方法は、工程（ｉ）、（ｊ）及び／又は（ｋ）を繰り返す工程を更に含む。いくつかの実施形態では、方法は、工程（ｉ）、（ｊ）及び（ｋ）を繰り返す工程を更に含む。いくつかの実施形態では、方法は、工程（ｉ）及び（ｋ）を繰り返す工程を更に含む。いくつかの実施形態では、方法は、工程（ｊ）及び（ｋ）を繰り返す工程を更に含む。工程（ｉ）、（ｊ）及び／又は（ｋ）は、複数回繰り返されてもよい。
【0219】
上に記載されるように、灌流培養は、生産力価及び純度を制限する不純物の蓄積が培地交換によって減少するため、ウイルスベクターの生産においてバッチ培養又は流加培養よりも有利である。これにより、より高い細胞密度に達することが可能になる。したがって、灌流工程の長さは、トランスフェクションのための標的細胞密度に応じて変えることができる。適切には、細胞は、長期間にわたって灌流細胞培養系において連続的に培養され得る。適切には、細胞は、接種からトランスフェクション工程まで、又はトランスフェクション工程の直前まで、灌流細胞培養系内で連続的に培養され得る。
【0220】
いくつかの実施形態では、細胞は、本明細書に記載のポリマー／核酸複合体の溶液を使用して哺乳動物細胞をトランスフェクトする工程の前に、灌流培養系で、約０．５時間～約１６８時間（適切には、約０．５時間～約１５６時間、約０．５時間～約１４４時間、約０．５時間～約１３２時間、約０．５時間～約１２０時間、約０．５時間～約１０８時間、約０．５時間～約９６時間、約０．５時間～約８４時間、約０．５時間～約７２時間、約０．５時間～約６０時間、約０．５時間～約４８時間、約０．５時間～約３６時間、約０．５時間～約３２時間、約０．５時間～約２８時間、約０．５時間～約２４時間、約０．５時間～約２２時間、約０．５時間～約２０時間、約０．５時間～約１８時間、又は約０．５時間～約１６時間）培養される。好ましくは、細胞は、灌流培養系中で約０．５時間～約２４時間、約０．５時間～約２２時間、約０．５時間～約２０時間、又は約０．５時間～約１８時間、例えば約０．５時間～約２０時間培養される。
【0221】
いくつかの実施形態では、細胞は、本明細書に記載のポリマー／核酸複合体の溶液を使用して哺乳動物細胞をトランスフェクトする工程の前に、灌流培養系で、約１時間～約１６８時間（適切には、約１時間～約１５６時間、約１時間～約１４４時間、約１時間～約１３２時間、約１時間～約１２０時間、約１時間～約１０８時間、約１時間～約９６時間、約１時間～約８４時間、約１時間～約７２時間、約１時間～約６０時間、約１時間～約４８時間、約１時間～約３６時間、約１時間～約３２時間、約１時間～約２８時間、約１時間～約２４時間、約１時間～約２２時間、約１時間～約２０時間、約１時間～約１８時間、又は約１時間～約１６時間）培養される。好ましくは、細胞は、灌流培養系中で約１時間～約２４時間、約１時間～約２２時間、約１時間～約２０時間、又は約１時間～約１８時間、例えば約１時間～約２０時間培養される。
【0222】
いくつかの実施形態では、細胞は、本明細書に記載のポリマー／核酸複合体の溶液を使用して哺乳動物細胞をトランスフェクトする工程の前に、灌流培養系で約１２時間～約１６８時間（適切には、約１２時間～約１５６時間、約１２時間～約１４４時間、約１２時間～約１３２時間、約１２時間～約１２０時間、約１２時間～約１０８時間、約１２時間～約９６時間、約１２時間～約８４時間、約１２時間～約７２時間、約１２時間～約６０時間、約１２時間～約４８時間、約１２時間～約３６時間、約１２時間～約３２時間、約１２時間～約２８時間、約１２時間～約２４時間、約１２時間～約２２時間、約１２時間～約２０時間、約１２時間～約１８時間、又は約１２時間～約１６時間）培養される。好ましくは、細胞は、灌流培養系中で約１２時間～約２４時間、約１２時間～約２２時間、約１２時間～約２０時間、又は約１２時間～約１８時間、例えば約１２時間～約２０時間培養される。
【0223】
いくつかの実施形態では、トランスフェクション工程は、哺乳動物細胞を灌流培養において培養する工程の直後に行われる。
【0224】
いくつかの実施形態では、トランスフェクション工程は、哺乳動物細胞を灌流培養において培養する工程の後で約０．５時間～約２４時間（適切には、約０．５時間、約１時間、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約７時間、約８時間、約９時間、約１０時間、約１１時間、約１２時間、約１３時間、約１４時間、約１５時間、約１６時間、約１７時間、約１８時間、約１９時間、約２０時間、約２１時間、約２２時間、約２３時間又は約２４時間、好ましくは約１時間）行われる。
【0225】
いくつかの実施形態では、トランスフェクション工程は、灌流培養において哺乳動物細胞を培養する工程の後、少なくとも約０．５時間～少なくとも約２４時間（適切には、少なくとも約０．５時間、少なくとも約１時間、少なくとも約２時間、少なくとも約３時間、少なくとも約４時間、少なくとも約５時間、少なくとも約６時間、少なくとも約７時間、少なくとも約８時間、少なくとも約９時間、少なくとも約１０時間、少なくとも約１１時間、少なくとも約１２時間、少なくとも約１３時間、少なくとも約１４時間、少なくとも約１５時間、少なくとも約１６時間、少なくとも約１７時間、少なくとも約１８時間、少なくとも約１９時間、少なくとも約２０時間、少なくとも約２１時間、少なくとも約２２時間、少なくとも約２３時間、又は少なくとも約２４時間、好ましくは少なくとも約１時間）行われる。
【0226】
いくつかの実施形態では、灌流培養は、約５０％～約１０００％（適切には、約５０％～約９００％、約５０％～約８００％、約５０％～約７００％、約５０％～約６００％、約５０％～約５００％、約５０％～約４００％、約５０％～約３００％、約５０％～約２５０％、約５０％～約２００％、約５０％～約１５０％、約５０％～約１００％、約１００％、約１５０％、約２００％、約３００％、約４００％、約５００％、約６００％、約７００％、約８００％、約９００％又は約１０００％）の懸濁細胞培養容量を除去し、適切な容量の新鮮な培地を灌流培養の全期間にわたって懸濁細胞培養に導入することによって行われる。したがって、いくつかの実施形態では、灌流培養は、約５０％～約１０００％（適切には、約５０％～約９００％、約５０％～約８００％、約５０％～約７００％、約５０％～約６００％、約５０％～約５００％、約５０％～約４００％、約５０％～約３００％、約５０％～約２５０％、約５０％～約２００％、約５０％～約１５０％、約５０％～約１００％、約１００％、約１５０％、約２００％、約３００％、約４００％、約５００％、約６００％、約７００％、約８００％、約９００％又は約１０００％）の細胞培養容器の作業容量、例えばバイオリアクターの作業容量を除去し、適切な容量の新鮮な培地を細胞培養容器、例えばバイオリアクターに導入することによって行われる。適切には、この容量は、灌流培養の全期間にわたって除去される。細胞培養容器に導入される新鮮な培地の容量は、灌流培養中に除去される細胞培養容器の作業容量よりも大きくてもよく、小さくてもよく、同等であってもよく、又は等しくてもよい。好ましい実施形態では、懸濁細胞培養物に導入される新鮮な培地の容量は、灌流培養中に除去される懸濁細胞培養物の容量と同等である。
【0227】
適切には、約５０％～約１０００％（適切には、約５０％～約９００％、約５０％～約８００％、約５０％～約７００％、約５０％～約６００％、約５０％～約５００％、約５０％～約４００％、約５０％～約３００％、約５０％～約２５０％、約５０％～約２００％、約５０％～約１５０％、約５０％～１００％、約１００％、約１５０％、約２００％）の懸濁細胞培養物の容量が除去され得、懸濁細胞培養物に導入される新鮮な培地の容量は、除去される懸濁細胞培養物の容量と同等であり得る。
【0228】
灌流培養工程で除去される懸濁細胞培養容量は、懸濁細胞培養容量の少なくとも約５０％（適切には、少なくとも約１００％、少なくとも約１５０％、少なくとも約２００％、少なくとも約２５０％、少なくとも約３００％、少なくとも約４００％、少なくとも約５００％、少なくとも約６００％、少なくとも約７００％、少なくとも約８００％、少なくとも約９００％又は少なくとも約１０００％）であり得る。
【0229】
灌流培養工程で除去される懸濁細胞培養容量は、懸濁細胞培養容量の約５０％未満（適切には、約１００％未満、約１５０％未満、約２００％未満、約２５０％未満、約３００％％未満、約４００％未満、約５００％未満、約６００％未満、約７００％未満、約８００％未満、約９００％未満又は約１０００％未満）であり得る。
【0230】
好ましい実施形態では、懸濁細胞培養容量の約１００％～約２００％（適切には約１５０％）が灌流培養工程において除去され、懸濁細胞培養物に導入される新鮮な培地の容量は、除去される懸濁細胞培養容量と同等であり得る。
【0231】
いくつかの実施形態では、灌流培養は、１日当たりの懸濁細胞培養容量の約５０％～約５００％（適切には、約５０％～約４５０％、約５０％～約４００％、約５０％～約３５０％、約５０％～約３００％、約５０％～約２５０％、約５０％～約２００％、約５０％～約１５０％、約５０％～１００％、約１００％、約１５０％、約２００％）の流量を用いて行われる。したがって、いくつかの実施形態では、灌流培養は、細胞培養容器作業容量、例えばバイオリアクター作業容量の１日当たり約５０％～約５００％（適切には、約５０％～約４５０％、約５０％～約４００％、約５０％～約３５０％、約５０％～約３００％、約５０％～約２５０％、約５０％～約２００％、約５０％～約１５０％、約５０％～１００％、約１００％、約１５０％、約２００％）の流量を用いて行われる。好ましくは、灌流培養は、１日当たりの懸濁細胞培養容量の約５０％～約２００％（適切には、約５０％～約１５０％又は約５０％～１００％）の流量を用いて行われる。好ましくは、灌流培養は、１日当たりの浮遊細胞培養容量の約２００％、約１５０％又は約１００％の流量を用いて行われる。好ましくは、灌流培養は、１日当たりの浮遊細胞培養容量の約１５０％の流量を用いて行われる。
【0232】
上記のように、迅速な培地交換の使用は、生産力価及び純度を制限する不純物の蓄積が培地交換によって減少するため、ウイルスベクターの生産においてバッチ培養又は流加培養よりも有利である。これにより、より高い細胞密度に達することが可能になる。
【0233】
いくつかの実施形態では、迅速な培地交換は、約０．１～約８時間（適切には、約０．２～約８時間、約０．３～約８時間、約０．４～約８時間、約０．５～約８時間、約１～約８時間、約１．５～約８時間、約２～約８時間、約２．５～約８時間、約３～約８時間、約４～約８時間、約５～約８時間）以内に完了する。
【0234】
迅速な培地交換は、約０．１～約５時間（適切には、約０．２～約５時間、約０．３～約５時間、約０．４～約５時間、約０．５～約５時間、約１～約５時間、約１．５～約５時間、約２～約５時間、約２．５～約５時間、約３～約５時間、約４～約５時間）以内に完了し得る。迅速な培地交換は、約０．１～約３時間（適切には、約０．２～約３時間、約０．３～約３時間、約０．４～約３時間、約０．５～約３時間、約１～約３時間、約１．５～約３時間、約２～約３時間、約２．５～約３時間）以内に完了し得る。
【0235】
迅速な培地交換は、約０．５時間未満（適切には、約１、約１．５、約２、約２．５、約３、約３．５、約４、約４．５、約５、約５．５、約６、約６．５、約７、約７．５、約８時間未満）で完了し得る。
【0236】
いくつかの実施形態では、迅速な培地交換は、懸濁細胞培養物の容量の約５０％～約９９％を除去し、適切な容量の新鮮な培地を懸濁細胞培養物に導入することによって行われる。したがって、いくつかの実施形態では、迅速な培地交換は、細胞培養容器作業容量、例えばバイオリアクター作業容量の約５０％～約９９％を除去し、適切な容量の新鮮な培地を細胞培養容器、例えばバイオリアクターに導入することによって行われる。細胞培養容器に導入される新鮮な培地の容量は、迅速な培地交換中に除去される細胞培養容器の作業容量よりも大きくてもよく、小さくてもよく、同等であってもよく、又は等しくてもよい。好ましい実施形態では、懸濁細胞培養物に導入される新鮮な培地の容量は、迅速な培地交換中に除去される浮遊細胞培養物の容量と同等である。
【0237】
適切には、懸濁細胞培養容量の約５５％～約９９％（適切には、約６０％～約９９％、約６５％～約９９％、約７０％～約９９％、約７５％～約９９％、約８０％～約９９％、約８５％～約９９％、約９０％～約９９％）が迅速培地交換ｐ中に除去され得、懸濁細胞培養物に導入される新鮮な培地の容量は、除去される懸濁細胞培養容量と同等であり得る。
【0238】
適切には、懸濁細胞培養容量の約５５％～約９５％（適切には、約６０％～約９０％、約６５％～約８５％、約７０％～約８０％、約７０％～約８５％、約７５％～約８５％）が迅速な培地交換中に除去され得、懸濁細胞培養物に導入される新鮮な培地の容量は、除去される懸濁細胞培養容量と同等であり得る。
【0239】
好ましい実施形態では、懸濁細胞培養物の容量の約７０％～約８５％（適切には約７５％又は約８０％）が除去され、懸濁細胞培養物に導入される新鮮な培地の容量は、除去される懸濁細胞培養物の容量と同等であり得る。
【0240】
除去される懸濁細胞培養容量は、少なくとも約５０％（適切には、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％）であり得る。
【0241】
除去される懸濁細胞培養容量は、約５５％未満、約６０％未満、約６５％未満、約７０％未満、約７５％未満、約８０％未満、約８５％未満、約９０％未満、約９５％未満、約９９％未満）であり得る。
【0242】
いくつかの実施形態では、迅速な培地交換は、トランスフェクション前に０～約２４時間（適切には、約０．１、約０．２、約０．３、約０．４、約０．５、約１、約１．５、約２、約２．５、約３、約３．５、約４、約４．５、約５、約５．５、約６、約６．５、約７、約７．５、約８、約８．５、約９、約９．５、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３～約２４時間）行われる。いくつかの実施形態では、迅速な培地交換は、トランスフェクション前に０～約３時間（適切には、約０．１、約０．２、約０．３、約０．４、約０．５、約１、約１．５、約２又は約２．５～約３時間）行われる。迅速な培地交換は、トランスフェクションの前に０～約２時間（適切には、約０．１、約０．２、約０．３、約０．４、約０．５、約１又は約１．５～約２時間）実施され得る。迅速な培地交換は、トランスフェクション前に、約０．１時間未満、約０．２時間未満、約０．３時間未満、約０．４時間未満、約０．５時間未満、約１時間未満、約１．５時間未満、約２時間未満、約２．５時間未満、約３時間未満、約３．５時間未満、約４時間未満、約４．５時間未満、約５時間未満、約５．５時間未満、約６時間未満、約６．５時間未満、約７時間未満、約７．５時間未満、約８時間未満、約８．５時間未満、約９時間未満、約９．５時間未満、約１０時間未満、約１１時間未満、約１２時間未満、約１３時間未満、約１４時間未満、約１５時間未満、約１６時間未満、約１７時間未満、約１８時間未満、約１９時間未満、約２０時間未満、約２１時間未満、約２２時間未満、約２３時間未満、又は約２４時間未満行われてもよい。好ましい実施形態では、迅速な培地交換は、トランスフェクションの約１時間前に行われる。
【0243】
いくつかの実施形態では、細胞は、灌流培養時に指数増殖期にあり得る。細胞は、灌流培養工程後に約１ｘ１０５細胞／ｍＬ～約１ｘ１０９細胞／ｍＬ（適切には、約２ｘ１０５細胞／ｍＬ～約５ｘ１０８細胞／ｍＬ、約３ｘ１０５細胞／ｍＬ～約１ｘ１０８細胞／ｍＬ、約４ｘ１０５細胞／ｍＬ～約５ｘ１０７細胞／ｍＬ、約５ｘ１０５細胞／ｍＬ～約１ｘ１０７細胞／ｍＬ、約６ｘ１０５細胞／ｍＬ～約５ｘ１０６細胞／ｍＬ、約７ｘ１０５細胞／ｍＬ～約１ｘ１０６細胞／ｍＬ）の最終細胞密度を有し得る。細胞は、灌流培養工程後に約１ｘ１０５細胞／ｍＬ～約５ｘ１０７細胞／ｍＬ（適切には、約２ｘ１０５細胞／ｍＬ～約１ｘ１０７細胞／ｍＬ、約３ｘ１０５細胞／ｍＬ～約５ｘ１０６細胞／ｍＬ、約４ｘ１０５細胞／ｍＬ～約１ｘ１０６細胞／ｍＬ、約５ｘ１０５細胞／ｍＬ～約１ｘ１０６細胞／ｍＬ）の最終細胞密度を有し得る。細胞数は、灌流培養工程中に少なくとも約２５％（適切には、少なくとも約５０％、少なくとも約７０％、少なくとも約１００％、少なくとも約１５０％、少なくとも約２００％、少なくとも約２５０％、少なくとも約３００％、少なくとも約３５０％、少なくとも約４００％、少なくとも約４５０％、少なくとも約５００％、少なくとも約６００％、少なくとも約７００％、少なくとも約８００％、少なくとも約９００％、又は少なくとも約１０００％）増加し得る。細胞数は、灌流培養工程中に約２５％（適切には、約５０％、約７０％、約１００％、約１５０％、約２００％、約２５０％、約３００％、約３５０％、約４００％、約４５０％、約５００％、約６００％、約７００％、約８００％、約９００％又は約１０００％）増加し得る。細胞数は、灌流培養工程中に約０．５倍（適切には、約１倍、約１．５倍、約２倍、約２．５倍、約３倍、約３．５倍、約４倍、約４．５倍、約５倍、約６倍、約７倍、約８倍、約９倍、約１０倍、約１５倍、約２０倍、約２５倍）増加し得る。
【0244】
ポリマー／核酸複合体の溶液は、限定されない期間、トランスフェクションのために細胞と接触（すなわち、インキュベート）され得る。例えば、時間は、約２０分間～約２４時間（適切には、約３０分間～約２０時間、約１時間～約１６時間、約２時間～約１２時間、約３時間～約８時間）であり得る。細胞に対するカチオン性ポリマーの細胞傷害効果を低下させるために、培養培地をトランスフェクション後に新鮮な培地と交換することができる。
【0245】
細胞は、ポリマー／核酸複合体の溶液との接触前又は接触時に指数増殖期にあり得る。細胞は、ポリマー／核酸複合体の溶液との接触前又は接触時に、約１ｘ１０５細胞／ｍＬ～約１ｘ１０８細胞／ｍＬ（適切には、約２ｘ１０５細胞／ｍＬ～約５ｘ１０６細胞／ｍＬ、約３ｘ１０５細胞／ｍＬ～約４ｘ１０６細胞／ｍＬ、約４ｘ１０５細胞／ｍＬ～約３ｘ１０６細胞／ｍＬ、約５ｘ１０５細胞／ｍＬ～約２ｘ１０６細胞／ｍＬ、約６ｘ１０５細胞／ｍＬ～約１ｘ１０６細胞／ｍＬ）の細胞密度を有し得る。
【0246】
いくつかの実施形態では、トランスフェクション工程で使用されるポリマー／核酸複合体：細胞の比は、１ｘ１０６細胞当たり約０．１μｇのＤＮＡ（適切には、１ｘ１０６細胞当たり約０．２μｇのＤＮＡ、１ｘ１０６細胞当たり約０．３μｇのＤＮＡ、１ｘ１０６細胞当たり約０．４μｇのＤＮＡ、１ｘ１０６細胞当たり約０．５μｇのＤＮＡ、１ｘ１０６細胞当たり約０．６μｇのＤＮＡ、１ｘ１０６細胞当たり約０．７μｇのＤＮＡ、１ｘ１０６細胞当たり約０．８μｇのＤＮＡ、１ｘ１０６細胞当たり約０．９μｇのＤＮＡ、１ｘ１０６細胞当たり約１μｇのＤＮＡ、１ｘ１０６細胞当たり１．５μｇのＤＮＡ又は１ｘ１０６細胞当たり２μｇのＤＮＡ）である。好ましくは、トランスフェクション工程で使用されるポリマー／核酸複合体：細胞の比は、１ｘ１０６細胞当たり約０．６μｇのＤＮＡである。
【0247】
いくつかの実施形態では、トランスフェクション工程で使用されるポリマー／核酸複合体：細胞の比は、１ｘ１０６細胞当たり約０．３μｇのＤＮＡ（適切には、１ｘ１０６細胞当たり約０．６μｇのＤＮＡ、１ｘ１０６細胞当たり約１μｇのＤＮＡ、１ｘ１０６細胞当たり１．５μｇのＤＮＡ又は１ｘ１０６細胞当たり２μｇのＤＮＡ）である。好ましくは、トランスフェクション工程で使用されるポリマー／核酸複合体：細胞の比は、１ｘ１０６細胞当たり約０．６μｇのＤＮＡである。
【0248】
本発明の方法において、ベクターコンポーネントは、ウイルスベクターのｇａｇ、ｅｎｖ、ｒｅｖ及び／又はＲＮＡゲノムを含み得る。ベクターコンポーネントをコードするヌクレオチド配列は、同時に又は任意の順序で連続的に細胞に導入され得る。
【0249】
本発明の方法及び使用のいくつかの実施形態では、レンチウイルスベクターを産生するための適切な産生細胞又は細胞は、適切な条件下で培養した場合にウイルスベクター又はウイルスベクター粒子を産生することができる細胞である。したがって、細胞は、典型的には、ｇａｇ、ｅｎｖ、ｒｅｖ及びレンチウイルスベクターのＲＮＡゲノムを含み得るベクターコンポーネントをコードするヌクレオチド配列を含む。適切な細胞株には、マウス線維芽細胞由来細胞株又はヒト細胞株等の哺乳動物細胞が含まれるが、これらに限定されない。それらは、一般に、ヒト細胞、例えばＨＥＫ２９３Ｔ、ＨＥＫ２９３、ＣＡＰ、ＣＡＰ－Ｔ又はＣＨＯ細胞を含む哺乳動物であるが、例えばＳＦ９細胞等の昆虫細胞であり得る。好ましくは、ベクター産生細胞はヒト細胞株に由来する。したがって、そのような適切な産生細胞は、本発明の方法又は使用のいずれかにおいて使用され得る。
【0250】
ヌクレオチド配列を細胞に導入する方法は当技術分野で周知であり、以前に記載されている。したがって、分子生物学及び細胞生物学における従来の技術を使用したレンチウイルスベクターのｇａｇ、ｅｎｖ、ｒｅｖ及びＲＮＡゲノムを含むベクターコンポーネントをコードするヌクレオチド配列の細胞への導入は、当業者の能力の範囲内である。
【0251】
安定な産生細胞は、パッケージング又はプロデューサ細胞であり得る。パッケージング細胞からプロデューサ細胞を作製するために、ベクターゲノムＤＮＡ構築物を安定に又は一過性に導入することができる。パッケージング／プロデューサ細胞は、国際公開第２００４／０２２７６１号パンフレットに記載されているように、ベクターのコンポーネントの１つ、すなわちゲノム、ｇａｇ－ｐｏｌコンポーネント及びエンベロープを発現するレトロウイルスベクターを適切な細胞株に形質導入することによって作製することができる。
【0252】
或いは、ヌクレオチド配列を細胞にトランスフェクトすることができ、次いで産生細胞ゲノムへの組込みがまれに且つランダムに起こる。本明細書に記載のポリマー／核酸複合体の溶液を使用するトランスフェクション方法は、当技術分野で周知の方法を使用して実施することができる。例えば、安定なトランスフェクションプロセスは、コンカテマー化を助けるように操作された構築物を使用し得る。当業者は、ヌクレオチド配列の産生細胞への組込みを促進する方法を認識しているであろう。例えば、核酸構築物を線形化することは、それが天然に環状である場合に役立ち得る。よりランダムでない組込み方法論は、内因性ゲノム内の選択された部位への組込みを誘導するために、哺乳動物宿主細胞の内因性染色体と相同性の共有領域を含む核酸構築物を含み得る。更に、組換え部位が構築物上に存在する場合、これらを標的化組換えに使用することができる。例えば、核酸構築物は、Ｃｒｅリコンビナーゼ（すなわち、Ｐ１バクテリオファージ由来のＣｒｅ／ｌｏｘ系を使用する）と組み合わせた場合に標的化された組込みを可能にするｌｏｘＰ部位を含み得る。代替において、又は加えて、組換え部位は、ラムダインテグラーゼの存在下での部位特異的組込みを可能にするａｔｔ部位（例えばλファージから）である。これにより、レンチウイルス遺伝子を、高い及び／又は安定な発現を可能にする宿主細胞ゲノム内の遺伝子座に標的化することが可能になる。
【0253】
標的化組込みの他の方法は、当技術分野で周知である。例えば、ゲノムＤＮＡの標的化切断を誘導する方法を使用して、選択された染色体遺伝子座での標的化組換えを促進することができる。これらの方法は、二本鎖切断（ＤＳＢ）、例えば、内因性ゲノムにおけるニックを誘導して、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）等の生理学的機構による切断の修復を誘導するための方法又はシステムの使用を含むことが多い。切断は、操作されたジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）等の特異的ヌクレアーゼの使用、特異的切断をガイドするための操作されたｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒ ＲＮＡ（「単一ガイドＲＮＡ」）を有するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムの使用、及び／又はアルゴノート系に基づくヌクレアーゼ（例えば、Ｔ．サーモフィルス（Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）から）の使用によって起こり得る。
【0254】
レンチウイルス形質導入のみ若しくは核酸トランスフェクションのみ、又は両方の組合せの方法を使用してヌクレオチド配列の組込みによって作製することができるパッケージング／プロデューサ細胞株が使用され得る。
【0255】
産生細胞からレトロウイルスベクターを作製するための方法、特にレトロウイルスベクターの処理は、国際公開第２００９／１５３５６３号パンフレットに記載されている。
【0256】
一実施形態では、産生細胞は、ＲＮＡ結合タンパク質（例えばトリプトファンＲＮＡ結合減衰タンパク質、ＴＲＡＰ）及び／又はＴｅｔリプレッサー（ＴｅｔＲ）タンパク質若しくは代替的な調節タンパク質（例えば、ＣｙｍＲ）を含み得る。
【0257】
産生細胞からのレンチウイルスベクターの産生は、トランスフェクション法によるもの、誘導工程（例えばドキシサイクリン誘導）を含み得る安定な細胞株からの産生によるもの、又は両方の組合せによるものであり得る。トランスフェクション方法は、当技術分野で周知の方法を使用して実施することができ、例は以前に記載されている。
【0258】
産生細胞、パッケージング細胞株若しくはプロデューサ細胞株、又はレンチウイルスベクターをコードするコンポーネントで一過性にトランスフェクトされたものを培養して、細胞数及びウイルス数及び／又はウイルス力価を増加させる。細胞の培養は、本発明による目的のウイルスベクターを代謝及び／又は成長及び／又は分裂及び／又は産生することを可能にするために行われる。これは、当業者に周知の方法によって達成することができ、例えば適切な培養培地中で細胞に栄養素を提供することを含むが、これに限定されない。方法は、表面に接着する成長、懸濁液中での成長、又はそれらの組合せを含み得る。培養は、例えば、バッチ、フェドバッチ、連続システム等を使用して、組織培養フラスコ、組織培養マルチウェルプレート、皿、ローラーボトル、ウェーブバッグ又はバイオリアクターで行うことができる。細胞培養によってウイルスベクターの大規模生産を達成するために、当技術分野では、懸濁状態で増殖することができる細胞を有することが好ましい。細胞を培養するための好適な条件は公知である（例えば、Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｋｒｕｓｅ ａｎｄ Ｐａｔｅｒｓｏｎ，ｅｄｉｔｏｒｓ（１９７３），ａｎｄ Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ ａｎｉｍａｌ ｃｅｌｌｓ：Ａ ｍａｎｕａｌ ｏｆ ｂａｓｉｃ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，ｆｏｕｒｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｗｉｌｅｙ－Ｌｉｓｓ Ｉｎｃ．，２０００，ＩＳＢＮ ０－４７１－３４８８９－９を参照されたい）。
【0259】
好ましくは、細胞は、最初に組織培養フラスコ又はバイオリアクターで「バルクアップ」され、続いて多層培養容器又は大型バイオリアクター（５０Ｌ超）で増殖させて、本発明のベクター産生細胞を生成する。
【0260】
好ましくは、細胞を接着様式で成長させて、本発明のベクター産生細胞を作製する。
【0261】
好ましくは、細胞を懸濁モードで成長させて、本発明のベクター産生細胞を作製する。
【0262】
ポリマー／核酸複合体の溶液
更なる態様では、本発明は、本明細書に記載のインビトロ方法のいずれかによって得られる又は得ることができるポリマー／核酸複合体の溶液を提供する。
更なる態様では、本発明は、本明細書に記載のインビトロ方法のいずれかによって得られる又は得ることができるポリマー／核酸複合体の溶液を提供する。
【0263】
したがって、更なる態様では、本発明は、ポリマー／核酸複合体及び塩を含む溶液を提供し、塩濃度は約１０ｍＭ～約５００ｍＭである。いくつかの実施形態では、塩濃度は、約５０ｍＭ～約５００ｍＭである。
【0264】
更なる態様では、本発明は、ポリマー／核酸複合体及び塩を含む溶液を提供し、塩濃度は約０．１ｍＭ～約４９ｍＭである。いくつかの実施形態では、塩濃度は、約１０ｍＭ～約４９ｍＭである。
【0265】
いくつかの実施形態では、塩はＰＢＳであり、ＰＢＳ濃度は約０．１５Ｘ ＰＢＳ～約３Ｘ ＰＢＳである。
【0266】
いくつかの実施形態では、ＰＢＳの濃度は、約０．３Ｘ ＰＢＳ未満である。
【0267】
哺乳動物細胞をトランスフェクトする方法
更なる態様において、本発明は、哺乳動物細胞をトランスフェクトするための方法を提供し、
ａ）哺乳動物細胞を培養する工程と、
ｂ）本明細書に記載のポリマー／核酸複合体の溶液を使用して哺乳動物細胞をトランスフェクトする工程と、
を含む。
更なる態様において、本発明は、哺乳動物細胞をトランスフェクトするための方法を提供し、
ａ）哺乳動物細胞を培養する工程と、
ｂ）本明細書に記載のポリマー／核酸複合体の溶液を使用して哺乳動物細胞をトランスフェクトする工程と、
を含む。
【0268】
いくつかの実施形態では、哺乳動物細胞を培養する工程は灌流培養で行われる。
【0269】
したがって、更なる態様において、本発明は、哺乳動物細胞をトランスフェクトするための方法を提供し、
ａ）灌流培養において哺乳動物細胞を培養する工程と、
ｂ）本明細書に記載のポリマー／核酸複合体の溶液を使用して哺乳動物細胞をトランスフェクトする工程と、
を含む。
ａ）灌流培養において哺乳動物細胞を培養する工程と、
ｂ）本明細書に記載のポリマー／核酸複合体の溶液を使用して哺乳動物細胞をトランスフェクトする工程と、
を含む。
【0270】
適切には、哺乳動物細胞は、本明細書に記載の哺乳動物細胞である。
【0271】
いくつかの実施形態では、方法は、無血清培地中の懸濁液中で実施される。
【0272】
いくつかの実施形態では、工程ａ）及び／又は工程ｂ）は少なくとも５０Ｌの容量で行われ、好ましくは工程ａ）及び工程ｂ）は少なくとも５０Ｌの容量で行われる。
【0273】
いくつかの実施形態では、トランスフェクションは一過性トランスフェクションである。
【0274】
適切には、哺乳動物細胞（例えば、灌流培養において）を培養する工程及び哺乳動物細胞をトランスフェクトする工程は、本明細書に記載のように実施される。
【0275】
レトロウイルスベクター及びレンチウイルスベクター
ウイルスベクターは、ベクター、ベクタービリオン又はベクター粒子とも呼ばれ得る。
ウイルスベクターは、ベクター、ベクタービリオン又はベクター粒子とも呼ばれ得る。
【0276】
レトロウイルスベクターは、任意の適切なレトロウイルスに由来し得るか、又は任意の適切なレトロウイルスから導き出される。多数の異なるレトロウイルスが同定されている。例としては、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）、ヒトＴ細胞白血病ウイルス（ＨＴＬＶ）、マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、藤波肉腫ウイルス（ＦｕＳＶ）、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）、ＦＢＲマウス骨肉腫ウイルス（ＦＢＲ ＭＳＶ）、モロニーマウス肉腫ウイルス（Ｍｏ－ＭＳＶ）、アベルソンマウス白血病ウイルス（Ａ－ＭＬＶ）、トリ骨髄細胞腫症ウイルス－２９（ＭＣ２９）及びトリ赤芽球症ウイルス（ＡＥＶ）が挙げられる。レトロウイルスの詳細なリストは、Ｃｏｆｆｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９９７）“Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ”，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ Ｅｄｓ：ＪＭ Ｃｏｆｆｉｎ，ＳＭ Ｈｕｇｈｅｓ，ＨＥ Ｖａｒｍｕｓ ｐｐ ７５８－７６３に見出すことができる。
【0277】
レトロウイルスは、２つのカテゴリー、すなわち「単純」及び「複合」に大別され得る。レトロウイルスは更に７つの群に分けられ得る。これらの群のうちの５つは、発癌能を有するレトロウイルスを表す。残りの２つの群は、レンチウイルス及びスプーマウイルスである。これらのレトロウイルスの総説は、Ｃｏｆｆｉｎ ｅｔ ａｌ（１９９７）同書に提示されている。
【0278】
レンチウイルスは、レトロウイルスのより大きな群の一部である。レンチウイルスの詳細なリストは、Ｃｏｆｆｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９９７）“Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ”，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ Ｅｄｓ：ＪＭ Ｃｏｆｆｉｎ，ＳＭ Ｈｕｇｈｅｓ，ＨＥ Ｖａｒｍｕｓ ｐｐ ７５８－７６３に見出すことができる。手短に言えば、レンチウイルスを霊長類群と非霊長類群に分けることができる。霊長類レンチウイルスの例には、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒト自己免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の原因物質、及びサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）が含まれるが、これらに限定されない。非霊長類レンチウイルス群には、プロトタイプ型「スローウイルス」ビスナ・マエディウイルス（ＶＭＶ）、並びに関連するヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）、ウマ感染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、マエディビスナウイルス（ＭＶＶ）及びウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）が含まれる。一実施形態では、レンチウイルスベクターは、ＨＩＶ－１、ＨＩＶ－２、ＳＩＶ、ＦＩＶ、ＢＩＶ、ＥＩＡＶ、ＣＡＥＶ又はビスナレンチウイルスに由来する。
【0279】
レンチウイルス科は、レンチウイルスが分裂細胞及び非分裂細胞の両方に感染する能力を有するという点でレトロウイルスとは異なる（Ｌｅｗｉｓ ｅｔ ａｌ（１９９２）ＥＭＢＯ Ｊ １１（８）：３０５３－３０５８及びＬｅｗｉｓ ａｎｄ Ｅｍｅｒｍａｎ（１９９４）Ｊ Ｖｉｒｏｌ ６８（１）：５１０－５１６）。対照的に、ＭＬＶ等の他のレトロウイルスは、例えば筋肉、脳、肺及び肝臓組織を構成する細胞等の非分裂細胞又はゆっくりと分裂する細胞に感染することができない。
【0280】
レンチウイルスベクターは、本明細書で使用される場合、レトロウイルスから誘導可能な少なくとも１つのコンポーネント部分を含むベクターである。好ましくは、そのコンポーネント部分は、ベクターが標的細胞に感染又は形質導入し、ＮＯＩを発現する生物学的機構に関与する。
【0281】
レトロウイルスベクターは、インビトロで適合性の標的細胞においてＮＯＩを複製するために使用され得る。したがって、本明細書には、本発明のベクターを適合する標的細胞にインビトロで導入し、ＮＯＩの発現をもたらす条件下で標的細胞を増殖させることによってインビトロでタンパク質を作製する方法が記載される。タンパク質及びＮＯＩは、当技術分野で周知の方法によって標的細胞から回収され得る。適切な標的細胞には、哺乳動物細胞株及び他の真核細胞株が含まれる。
【0282】
いくつかの態様では、ベクターは、プロモーターとエンハンサーとの間の相互作用を遮断し、隣接遺伝子からのリードスルーを減少させるバリアとして作用する「インシュレータ」－遺伝子配列を有し得る。
【0283】
一実施形態では、隣接遺伝子からのプロモーター干渉及びリードスルーを防ぐために、１つ又は複数のレトロウイルス核酸配列の間にインシュレータが存在する。１つ又は複数のレトロウイルス核酸配列の間のベクター中にインシュレータが存在する場合、これらのインシュレータ遺伝子のそれぞれは、個々の発現単位として配置され得る。
【0284】
レトロウイルスゲノム及びレンチウイルスゲノムの基本構造は、ゲノムをパッケージングすることを可能にするパッケージングシグナル、プライマー結合部位、標的細胞ゲノムへの組込みを可能にする組込み部位、並びにパッケージングコンポーネントをコードするｇａｇ／ｐｏｌ遺伝子及びｅｎｖ遺伝子（これらはウイルス粒子の集合に必要なポリペプチドである）の間又はその中に位置する５’ＬＴＲ及び３’ＬＴＲ等の多くの共通の特徴を共有する。レンチウイルスは、ＨＩＶ中のｒｅｖ遺伝子及びＲＲＥ配列等の更なる特徴を有し、感染した標的細胞の核から細胞質への組込みプロウイルスのＲＮＡ転写物の効率的な輸送を可能にする。
【0285】
プロウイルスでは、これらの遺伝子は、長末端反復配列（ＬＴＲ）と呼ばれる領域に両端で隣接している。ＬＴＲは、プロウイルスの組込み及び転写を担う。ＬＴＲはエンハンサープロモーター配列としても機能し、ウイルス遺伝子の発現を制御することができる。
【0286】
ＬＴＲ自体は、Ｕ３、Ｒ及びＵ５と呼ばれる３つの要素に分けることができる同一の配列である。Ｕ３は、ＲＮＡの３’末端に固有の配列に由来する。ＲはＲＮＡの両端で繰り返される配列に由来し、Ｕ５はＲＮＡの５’末端に固有の配列に由来する。３つの要素のサイズは、異なるレトロウイルス間でかなり異なり得る。
【0287】
本明細書に記載の典型的なレトロウイルスベクターでは、複製に必須の１つ以上のタンパク質コード領域の少なくとも一部をウイルスから除去することができ、例えば、ｇａｇ／ｐｏｌ及びｅｎｖは存在しなくてもよく、又は機能しなくてもよい。これにより、ウイルスベクターの複製が欠損する。
【0288】
レンチウイルスベクターは、霊長類レンチウイルス（例えばＨＩＶ－１）又は非霊長類レンチウイルス（例えばＥＩＡＶ）のいずれかに由来し得る。
【0289】
一般的に言えば、典型的なレトロウイルスベクター産生系は、必須のウイルスパッケージング機能からのウイルスゲノムの分離を含む。これらのコンポーネントは、通常、別個のＤＮＡ発現カセット（或いは、プラスミド、発現プラスミド、ＤＮＡ構築物又は発現構築物として知られる）上で産生細胞に提供される。
【0290】
ベクターゲノムは、ＮＯＩを含む。ベクターゲノムは、典型的には、ＮＯＩを有する内部発現カセットであるパッケージングシグナル（ψ）、（場合により）転写後エレメント（ＰＲＥ）、典型的には中央ポリプリントラクト（ｃｐｐｔ）、３’－ｐｐｕ及び自己不活性化（ＳＩＮ）ＬＴＲを必要とする。Ｒ－Ｕ５領域は、ベクターゲノムＲＮＡ及びＮＯＩ ｍＲＮＡの両方の正しいポリアデニル化、並びに逆転写のプロセスに必要である。ベクターゲノムは、国際公開第２００３／０６４６６５号パンフレットに記載されているように、ｒｅｖの非存在下でのベクター産生を可能にするオープンリーディングフレームを場合により含み得る。
【0291】
パッケージング機能には、ｇａｇ／ｐｏｌ遺伝子及びｅｎｖ遺伝子が含まれる。これらは、産生細胞によるベクター粒子の製造に必要である。これらの機能をゲノムに対してトランスで提供することにより、複製欠損ウイルスベクターの産生が容易になる。
【0292】
ガンマレトロウイルスベクターの生産系は、典型的には、ゲノム、ｇａｇ／ｐｏｌ及びｅｎｖ発現構築物を必要とする３コンポーネント系である。ＨＩＶ－１系レンチウイルスベクターの製造システムは、更に、アクセサリー遺伝子ｒｅｖが提供され、ベクターゲノムがｒｅｖ応答配列（ＲＲＥ）を含むことを必要とし得る。ＥＩＡＶベースのレンチウイルスベクターは、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）がゲノム内に存在する場合、ｒｅｖがトランスで提供されることを必要としない（国際公開第２００３／０６４６６５号パンフレット参照）。
【0293】
通常、ベクターゲノムカセット内にコードされる「外部」プロモーター（ベクターゲノムカセットを駆動する）及び「内部」プロモーター（ＮＯＩカセットを駆動する）の両方は、他のベクター系コンポーネントを駆動するものと同様に、強力な真核生物又はウイルスプロモーターである。そのようなプロモーターの例としては、ＣＭＶ、ＥＦ１α、ＰＧＫ、ＣＡＧ、ＴＫ、ＳＶ４０及びユビキチンプロモーターが挙げられる。ＤＮＡライブラリによって生成されるもの等、強力な「合成」プロモーター（例えばＪｅＴプロモーター）もまた、転写を駆動するために使用され得る。或いは、組織特異的プロモーター、例えば、ロドプシン（Ｒｈｏ）、ロドプシンキナーゼ（ＲｈｏＫ）、コーンロッドホメオボックス含有遺伝子（ＣＲＸ）、神経網膜特異的ロイシンジッパータンパク質（ＮＲＬ）、卵黄様黄斑ジストロフィー２（ＶＭＤ２）、チロシンヒドロキシラーゼ、ニューロン特異的ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）プロモーター、アストロサイト特異的グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）プロモーター、ヒトα１－アンチトリプシン（ｈＡＡＴ）プロモーター、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（ＰＥＰＣＫ）、肝臓脂肪酸結合タンパク質プロモーター、Ｆｌｔ－１プロモーター、ＩＮＦ－βプロモーター、Ｍｂプロモーター、ＳＰ－Ｂプロモーター、ＳＹＮ１プロモーター、ＷＡＳＰプロモーター、ＳＶ４０／ｈＡｌｂプロモーター、ＳＶ４０／ＣＤ４３、ＳＶ４０／ＣＤ４５、ＮＳＥ／ＲＵ５’プロモーター、ＩＣＡＭ－２プロモーター、ＧＰＩＩｂプロモーター、ＧＦＡＰプロモーター、フィブロネクチンプロモーター、エンドグリンプロモーター、エラスターゼ－１プロモーター、デスミンプロモーター、ＣＤ６８プロモーター、ＣＤ１４プロモーター及びＢ２９プロモーターを使用して転写を駆動することができる。
【0294】
レトロウイルスベクターの産生は、産生細胞とこれらのＤＮＡコンポーネントとの一過性コトランスフェクション、又は全てのコンポーネントが産生細胞ゲノム内に安定に組み込まれている安定な産生細胞株の使用のいずれかを含む（例えば、Ｓｔｅｗａｒｔ ＨＪ，Ｆｏｎｇ－Ｗｏｎｇ Ｌ，Ｓｔｒｉｃｋｌａｎｄ Ｉ，Ｃｈｉｐｃｈａｓｅ Ｄ，Ｋｅｌｌｅｈｅｒ Ｍ，Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ Ｌ，Ｔｈｏｒｅｅ Ｖ，ＭｃＣａｒｔｈｙ Ｊ，Ｒａｌｐｈ ＧＳ，Ｍｉｔｒｏｐｈａｎｏｕｓ ＫＡ ａｎｄ Ｒａｄｃｌｉｆｆｅ ＰＡ．（２０１１）．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．Ｍａｒ；２２（３）：３５７－６９）。別のアプローチは、安定なパッケージング細胞（パッケージングコンポーネントが安定に組み込まれている）を使用し、次いで必要に応じてベクターゲノムプラスミドに一過性にトランスフェクトすることである（例えば、Ｓｔｅｗａｒｔ，Ｈ．Ｊ．，Ｍ．Ａ．Ｌｅｒｏｕｘ－Ｃａｒｌｕｃｃｉ，Ｃ．Ｊ．Ｓｉｏｎ，Ｋ．Ａ．Ｍｉｔｒｏｐｈａｎｏｕｓ ａｎｄ Ｐ．Ａ．Ｒａｄｃｌｉｆｆｅ（２００９）．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．Ｊｕｎ；１６（６）：８０５－１４）。完全ではない代替的なパッケージング細胞株を作製し（ただ１つ又は２つのパッケージングコンポーネントが細胞株に安定に組み込まれる）、ベクターを作製するために、欠損コンポーネントを一過性にトランスフェクトすることも可能である。産生細胞はまた、転写調節因子のｔｅｔリプレッサー（ＴｅｔＲ）タンパク質群のメンバー（例えば、Ｔ－Ｒｅｘ、Ｔｅｔ－Ｏｎ、及びＴｅｔ－Ｏｆｆ）、転写調節因子のクメート誘導性スイッチ系群のメンバー（例えば、クマートリプレッサー（ＣｙｍＲ）タンパク質）、又はＲＮＡ結合タンパク質（例えば、ＴＲＡＰ－トリプトファン活性化ＲＮＡ結合タンパク質）等の調節タンパク質を発現し得る。
【0295】
本発明の一実施形態では、ウイルスベクターはＥＩＡＶに由来する。ＥＩＡＶは、レンチウイルスの最も単純なゲノム構造を有し、本発明での使用に特に好ましい。ｇａｇ／ｐｏｌ遺伝子及びｅｎｖ遺伝子に加えて、ＥＩＡＶは３つの他の遺伝子：ｔａｔ、ｒｅｖ及びＳ２をコードする。ｔａｔはウイルスＬＴＲの転写活性化因子として作用し（Ｄｅｒｓｅ ａｎｄ Ｎｅｗｂｏｌｄ（１９９３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９４（２）：５３０－５３６ ａｎｄ Ｍａｕｒｙ ｅｔ ａｌ（１９９４）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２００（２）：６３２－６４２）、ｒｅｖはｒｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）を介してウイルス遺伝子の発現を調節及び調整する（Ｍａｒｔａｒａｎｏ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｊ Ｖｉｒｏｌ ６８（５）：３１０２－３１１１）。これらの２つのタンパク質の作用機序は、霊長類ウイルスにおける類似の機序と広く類似していると考えられている（Ｍａｒｔａｒａｎｏ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｊ Ｖｉｒｏｌ ６８（５）：３１０２－３１１１）。Ｓ２の機能は未知である。更に、膜貫通タンパク質の開始時にｅｎｖコード配列にスプライシングされたｔａｔの第１のエクソンによってコードされるＥＩＡＶタンパク質、Ｔｔｍが同定されている。本発明の代替実施形態では、ウイルスベクターはＨＩＶに由来し、ＨＩＶは、Ｓ２をコードしないが、ＥＩＡＶとは異なり、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ及びｎｅｆをコードする。
【0296】
「組換えレトロウイルスベクター又はレンチウイルスベクター」（ＲＲＶ）という用語は、パッケージングコンポーネントの存在下で、標的細胞を形質導入することができるウイルス粒子へのＲＮＡゲノムのパッケージングを可能にするのに十分なレトロウイルス遺伝情報を有するベクターを指す。標的細胞の形質導入は、逆転写及び標的細胞ゲノムへの組込みを含み得る。ＲＲＶは、ベクターによって標的細胞に送達される非ウイルスコード配列を担持する。ＲＲＶは、独立した複製ができず、標的細胞内に感染性レトロウイルス粒子を産生することができない。通常、ＲＲＶは、機能的ｇａｇ／ｐｏｌ及び／又はｅｎｖ遺伝子、及び／又は複製に必須の他の遺伝子を欠く。
【0297】
好ましくは、本発明のＲＲＶベクターは、最小のウイルスゲノムを有する。
【0298】
本明細書で使用される場合、「最小ウイルスゲノム」という用語は、標的細胞にＮＯＩを感染させ、形質導入し、送達するのに必要な機能を提供するのに必須の要素を保持しながら、非必須要素を除去するようにウイルスベクターが操作されていることを意味する。この戦略の更なる詳細は、国際公開第１９９８／１７８１５号パンフレット及び国際公開第９９／３２６４６号パンフレットに見出すことができる。最小のＥＩＡＶベクターは、ｔａｔ、Ｓ２遺伝子、及び必要に応じてｒｅｖを欠き、どちらも産生系においてトランスで提供されない。最小ＨＩＶベクターは、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ、ｔａｔ及びｎｅｆを欠く。
【0299】
産生細胞内でベクターゲノムを産生するために使用される発現プラスミドは、産生細胞／パッケージング細胞におけるゲノムの転写を指示するために、レトロウイルスゲノムに作動可能に連結された転写調節制御配列を含み得る。全ての第３世代レンチウイルスベクターは、５’Ｕ３エンハンサー－プロモーター領域において欠失されており、ベクターゲノムＲＮＡの転写は、後述するように、別のウイルスプロモーター、例えばＣＭＶプロモーター等の異種プロモーターによって駆動される。この特徴は、ｔａｔとは無関係にベクトル生成を可能にする。一部のレンチウイルスベクターゲノムは、効率的なウイルス産生のために追加の配列を必要とする。例えば、特にＨＩＶの場合、ＲＲＥ配列が含まれ得る。しかしながら、（別個の）ＧａｇＰｏｌカセットに対するＲＲＥの必要性（及びトランスで提供されるｒｅｖへの依存性）は、ＧａｇＰｏｌ ＯＲＦのコドン最適化によって低減又は排除され得る。この戦略の更なる詳細は、国際公開第２００１／７９５１８号パンフレットに見出すことができる。
【0300】
ｒｅｖ／ＲＲＥ系と同じ機能を果たす別の配列も知られている。例えば、ｒｅｖ／ＲＲＥ系の機能的類似体は、メイソンファイザーサルウイルスに見出される。これは構成的輸送要素（ＣＴＥ）として知られており、感染細胞中の因子と相互作用すると考えられるゲノム中のＲＲＥ型配列を含む。細胞因子は、ｒｅｖ類似体と考えることができる。したがって、ＣＴＥは、ｒｅｖ／ＲＲＥシステムの代替として使用することができる。公知であるか又は利用可能になるＲｅｖタンパク質の任意の他の機能的等価物が本発明に関連し得る。例えば、ＨＴＬＶ－ＩのＲｅｘタンパク質がＨＩＶ－１のＲｅｖタンパク質を機能的に置換し得ることも知られている。Ｒｅｖ及びＲＲＥは、本発明の方法で使用するためのベクター中に存在しなくてもよく、又は非機能的であってもよく、代替的なｒｅｖ及びＲＲＥ、又は機能的に等価なシステムが存在してもよい。
【0301】
本明細書で使用される場合、「機能的置換物」という用語は、別のタンパク質又は配列と同じ機能を果たす代替配列を有するタンパク質又は配列を意味する。「機能的代替物」という用語は、本明細書では同じ意味で「機能的等価物」及び「機能的類似物」と互換的に使用される。
【0302】
ＳＩＮベクター
本明細書に記載のウイルスベクターは、ウイルスエンハンサー及びプロモーター配列が欠失された自己不活性化（ＳＩＮ）配置で使用され得る。ＳＩＮベクターが作製され得、非ＳＩＮベクターの有効性と同様の有効性で、インビボ、エクスビボ又はインビトロで非分裂標的細胞に形質導入され得る。ＳＩＮプロウイルスにおける長い末端反復配列（ＬＴＲ）の転写不活性化は、ｖＲＮＡの動員を防止すべきであり、複製能ウイルスの形成の可能性を更に低下させる特徴である。これはまた、ＬＴＲのシス作用効果を排除することによって、内部プロモーターからの遺伝子の調節された発現を可能にするはずである。
本明細書に記載のウイルスベクターは、ウイルスエンハンサー及びプロモーター配列が欠失された自己不活性化（ＳＩＮ）配置で使用され得る。ＳＩＮベクターが作製され得、非ＳＩＮベクターの有効性と同様の有効性で、インビボ、エクスビボ又はインビトロで非分裂標的細胞に形質導入され得る。ＳＩＮプロウイルスにおける長い末端反復配列（ＬＴＲ）の転写不活性化は、ｖＲＮＡの動員を防止すべきであり、複製能ウイルスの形成の可能性を更に低下させる特徴である。これはまた、ＬＴＲのシス作用効果を排除することによって、内部プロモーターからの遺伝子の調節された発現を可能にするはずである。
【0303】
例として、自己不活性化レトロウイルスベクター系は、３’ＬＴＲのＵ３領域内の転写エンハンサー又はエンハンサー及びプロモーターを欠失させることによって構築されている。一連のベクター逆転写及び組込みの後、これらの変化は、転写的に不活性な「プロウイルス」を産生する５’ＬＴＲ及び３’ＬＴＲの両方にコピーされる。しかしながら、そのようなベクター中のＬＴＲの内部の任意のプロモーターは依然として転写活性である。この戦略は、内部に配置された遺伝子からの転写に対するウイルスＬＴＲのエンハンサー及びプロモーターの影響を排除するために使用されている。そのような効果には、転写の増加又は転写の抑制が含まれる。この戦略はまた、３’ＬＴＲからゲノムＤＮＡへの下流転写を排除するために使用され得る。これは、内因性癌遺伝子の偶発的活性化を防ぐことが重要であるヒト遺伝子治療において特に懸念される（Ｙｕ ｅｔ ａｌ．，（１９８６）ＰＮＡＳ ８３：３１９４－９８；Ｍａｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，（１９９０）Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ ７２：８８５－７；Ｎａｖｉａｕｘ ｅｔ ａｌ．，（１９９６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：５７０１－５；Ｉｗａｋｕｍａ ｅｔ ａｌ．，（１９９９）Ｖｉｒｏｌ．２６１：１２０－３２；Ｄｅｇｌｏｎ ｅｔ ａｌ．，（２０００）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ１１：１７９－９０）。ＳＩＮレンチウイルスベクターは、米国特許第６，９２４，１２３号明細書及び米国特許第７，０５６，６９９号明細書に記載されている。
【0304】
複製欠損レンチウイルスベクター
複製欠損レンチウイルスベクターのゲノムにおいて、ｇａｇ／ｐｏｌ及び／又はｅｎｖの配列は、変異していてもよく、及び／又は機能していなくてもよい。
複製欠損レンチウイルスベクターのゲノムにおいて、ｇａｇ／ｐｏｌ及び／又はｅｎｖの配列は、変異していてもよく、及び／又は機能していなくてもよい。
【0305】
本明細書に記載の典型的なレンチウイルスベクターでは、ウイルス複製に必須のタンパク質の１つ以上のコード領域の少なくとも一部をベクターから除去することができる。これにより、ウイルスベクターの複製が欠損する。非分裂標的細胞に形質導入すること、及び／又はそのゲノムを標的細胞ゲノムに組み込むことができるＮＯＩを含むベクターを作製するために、ウイルスゲノムの一部をＮＯＩで置き換えることもできる。
【0306】
一実施形態では、レンチウイルスベクターは、国際公開第２００６／０１０８３４号パンフレット及び国際公開第２００７／０７１９９４号パンフレットに記載されているような非組込み型ベクターである。
【0307】
更なる実施形態では、ベクターは、ウイルスＲＮＡを有さないか又は欠く配列を送達する能力を有する。更なる実施形態では、送達されるＲＮＡ上に位置する異種結合ドメイン（ｇａｇに対して異種）及びＧａｇ又はＧａｇＰｏｌ上の同族結合ドメインを使用して、送達されるＲＮＡのパッケージングを確実にすることができる。これらのベクターの両方は、国際公開第２００７／０７２０５６号パンフレットに記載されている。
【0308】
ベクター力価
当業者は、ウイルスベクターの力価を決定する多数の異なる方法があることを理解するであろう。力価は、しばしば、形質導入単位／ｍＬ（ＴＵ／ｍＬ）として記載される。感染性粒子の数を増加させることによって、及びベクター調製物の比活性を増加させることによって、力価を増加させ得る。
当業者は、ウイルスベクターの力価を決定する多数の異なる方法があることを理解するであろう。力価は、しばしば、形質導入単位／ｍＬ（ＴＵ／ｍＬ）として記載される。感染性粒子の数を増加させることによって、及びベクター調製物の比活性を増加させることによって、力価を増加させ得る。
【0309】
ＮＯＩ及びポリヌクレオチド
本発明のポリヌクレオチドは、ＤＮＡ又はＲＮＡを含み得る。それらは一本鎖又は二本鎖であり得る。多数の異なるポリヌクレオチドが、遺伝暗号の縮重の結果として同じポリペプチドをコードすることができることが当業者によって理解されるであろう。更に、当業者は、日常的な技術を使用して、本発明のポリペプチドが発現される任意の特定の宿主生物のコドン使用を反映するために、本発明のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド配列に影響を及ぼさないヌクレオチド置換を行うことができることを理解されたい。
本発明のポリヌクレオチドは、ＤＮＡ又はＲＮＡを含み得る。それらは一本鎖又は二本鎖であり得る。多数の異なるポリヌクレオチドが、遺伝暗号の縮重の結果として同じポリペプチドをコードすることができることが当業者によって理解されるであろう。更に、当業者は、日常的な技術を使用して、本発明のポリペプチドが発現される任意の特定の宿主生物のコドン使用を反映するために、本発明のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド配列に影響を及ぼさないヌクレオチド置換を行うことができることを理解されたい。
【0310】
ポリヌクレオチドは、当技術分野で利用可能な任意の方法によって修飾され得る。そのような修飾は、本発明のポリヌクレオチドのインビボ活性又は寿命を増強するために行われ得る。
【0311】
ＤＮＡポリヌクレオチド等のポリヌクレオチドは、組換え的に、合成的に、又は当業者に利用可能な任意の手段によって作製され得る。それらはまた、標準的な技術によってクローニングされ得る。
【0312】
より長いポリヌクレオチドが、一般に、組換え手段を使用して、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）クローニング技術を使用して作製されるであろう。これは、クローニングすることが望まれる標的配列に隣接するプライマー対（例えば、約１５～３０ヌクレオチド）を作製することと、プライマーを動物又はヒト細胞から得られたｍＲＮＡ又はｃＤＮＡと接触させることと、所望の領域の増幅をもたらす条件下でＰＣＲを行うことと、増幅された断片を（例えば、反応混合物をアガロースゲルで精製することによって）単離することと、増幅されたＤＮＡを回収することと、を含む。プライマーは、増幅されたＤＮＡを適切なベクターにクローニングできるように、適切な制限酵素認識部位を含むように設計され得る。
【0313】
一般的なレトロウイルスベクター要素
プロモーター及びエンハンサー
ＮＯＩ及びポリヌクレオチドの発現は、制御配列、例えば、プロモーター、エンハンサー及び他の発現制御シグナル（例えば、ｔｅｔリプレッサー（ＴｅｔＲ）系）を含む転写制御エレメント又は翻訳抑制エレメント、或いはベクター産生細胞系（ＴＲＩＰ）における導入遺伝子抑制又は本明細書に記載のＮＯＩの他の調節因子を用いて制御され得る。
プロモーター及びエンハンサー
ＮＯＩ及びポリヌクレオチドの発現は、制御配列、例えば、プロモーター、エンハンサー及び他の発現制御シグナル（例えば、ｔｅｔリプレッサー（ＴｅｔＲ）系）を含む転写制御エレメント又は翻訳抑制エレメント、或いはベクター産生細胞系（ＴＲＩＰ）における導入遺伝子抑制又は本明細書に記載のＮＯＩの他の調節因子を用いて制御され得る。
【0314】
真核細胞において機能的な原核生物プロモーター及びプロモーターを使用することができる。組織特異的又は刺激特異的プロモーターが使用され得る。２つ以上の異なるプロモーター由来の配列要素を含むキメラプロモーターも使用され得る。
【0315】
適切な促進配列は、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、レトロウイルス及びサルウイルス４０（ＳＶ４０）等のウイルスのゲノムに由来するもの、又はアクチンプロモーター、ＥＦ１α、ＣＡＧ、ＴＫ、ＳＶ４０、ユビキチン、ＰＧＫ若しくはリボソームタンパク質プロモーター等の異種哺乳動物プロモーターに由来するものを含む強力なプロモーターである。或いは、組織特異的プロモーター、例えば、ロドプシン（Ｒｈｏ）、ロドプシンキナーゼ（ＲｈｏＫ）、コーンロッドホメオボックス含有遺伝子（ＣＲＸ）、神経網膜特異的ロイシンジッパータンパク質（ＮＲＬ）、卵黄様黄斑ジストロフィー２（ＶＭＤ２）、チロシンヒドロキシラーゼ、ニューロン特異的ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）プロモーター、アストロサイト特異的グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）プロモーター、ヒトα１－アンチトリプシン（ｈＡＡＴ）プロモーター、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（ＰＥＰＣＫ）、肝臓脂肪酸結合タンパク質プロモーター、Ｆｌｔ－１プロモーター、ＩＮＦ－βプロモーター、Ｍｂプロモーター、ＳＰ－Ｂプロモーター、ＳＹＮ１プロモーター、ＷＡＳＰプロモーター、ＳＶ４０／ｈＡｌｂプロモーター、ＳＶ４０／ＣＤ４３、ＳＶ４０／ＣＤ４５、ＮＳＥ／ＲＵ５’プロモーター、ＩＣＡＭ－２プロモーター、ＧＰＩＩｂプロモーター、ＧＦＡＰプロモーター、フィブロネクチンプロモーター、エンドグリンプロモーター、エラスターゼ－１プロモーター、デスミンプロモーター、ＣＤ６８プロモーター、ＣＤ１４プロモーター及びＢ２９プロモーターを使用して転写を駆動することができる。
【0316】
ＮＯＩの転写は、エンハンサー配列をベクターに挿入することによって更に増加させることができる。エンハンサーは、相対的に配向及び位置に依存しないが、ＳＶ４０エンハンサー及びＣＭＶ初期プロモーターエンハンサー等の真核細胞ウイルス由来のエンハンサーを使用してもよい。エンハンサーは、プロモーターに対して５’又は３’の位置でベクターにスプライシングされ得るが、好ましくはプロモーターから５’の部位に位置する。
【0317】
プロモーターは、適切な標的細胞における発現を確実にするか又は増加させるための特徴を更に含み得る。例えば、特徴は、保存領域、例えば、Ｐｒｉｂｎｏｗボックス又はＴＡＴＡボックスであり得る。プロモーターは、ヌクレオチド配列の発現レベルに影響を及ぼす（例えば、維持する、増強する、又は減少させる）他の配列を含み得る。適切な他の配列には、Ｓｈ１－イントロン又はＡＤＨイントロンが含まれる。他の配列は、温度、化学的、光又は応力誘導性要素等の誘導性要素を含む。また、転写又は翻訳を増強するための適切な要素が存在し得る。
【0318】
ＮＯＩの調節因子
レトロウイルスパッケージング／プロデューサ細胞株の生成及びレトロウイルスベクター産生における複雑な要因は、特定のレトロウイルスベクターコンポーネント及びＮＯＩの構成的発現が細胞傷害性であり、これらのコンポーネントを発現する細胞の死をもたらし、したがってベクターを産生することができないことである。したがって、これらのコンポーネント（例えば、ｇａｇ－ｐｏｌ及びエンベロープタンパク質、例えばＶＳＶ－Ｇ）の発現を調節することができる。他の非細胞傷害性ベクターコンポーネント、例えばｒｅｖの発現も、細胞に対する代謝負荷を最小化するように調節することができる。したがって、本明細書に記載のベクターコンポーネント及び／又は細胞をコードするモジュール式構築物又はヌクレオチド配列は、少なくとも１つの調節要素に関連する細胞傷害性及び／又は非細胞傷害性ベクターコンポーネントを含み得る。本明細書で使用される場合、「調節エレメント」という用語は、関連する遺伝子又はタンパク質の発現に影響を及ぼす、増加又は減少させることができる任意のエレメントを指す。調節エレメントは、遺伝子スイッチ系、転写調節エレメント及び翻訳抑制エレメントを含む。
レトロウイルスパッケージング／プロデューサ細胞株の生成及びレトロウイルスベクター産生における複雑な要因は、特定のレトロウイルスベクターコンポーネント及びＮＯＩの構成的発現が細胞傷害性であり、これらのコンポーネントを発現する細胞の死をもたらし、したがってベクターを産生することができないことである。したがって、これらのコンポーネント（例えば、ｇａｇ－ｐｏｌ及びエンベロープタンパク質、例えばＶＳＶ－Ｇ）の発現を調節することができる。他の非細胞傷害性ベクターコンポーネント、例えばｒｅｖの発現も、細胞に対する代謝負荷を最小化するように調節することができる。したがって、本明細書に記載のベクターコンポーネント及び／又は細胞をコードするモジュール式構築物又はヌクレオチド配列は、少なくとも１つの調節要素に関連する細胞傷害性及び／又は非細胞傷害性ベクターコンポーネントを含み得る。本明細書で使用される場合、「調節エレメント」という用語は、関連する遺伝子又はタンパク質の発現に影響を及ぼす、増加又は減少させることができる任意のエレメントを指す。調節エレメントは、遺伝子スイッチ系、転写調節エレメント及び翻訳抑制エレメントを含む。
【0319】
哺乳動物細胞において遺伝子スイッチを生成するために、多数の原核生物調節システムが適合されている。多くのレトロウイルスパッケージング及びプロデューサ細胞株は、遺伝子スイッチシステム（例えば、テトラサイクリン及びクメート誘導スイッチシステム）を使用して制御されており、したがって、ベクター産生時に１つ又は複数のレトロウイルスベクターコンポーネントの発現をオンにすることができる。遺伝子スイッチ系には、転写調節因子の（ＴｅｔＲ）タンパク質群のもの（例えば、Ｔ－Ｒｅｘ、Ｔｅｔ－Ｏｎ、及びＴｅｔ－Ｏｆｆ）、転写調節因子のクメート誘導性スイッチ系群のもの（例えばＣｙｍＲタンパク質）、及びＲＮＡ結合タンパク質を含むもの（例えば、ＴＲＡＰ）が含まれる。
【0320】
そのようなテトラサイクリン誘導性系の１つは、Ｔ－ＲＥｘ（商標）系に基づくテトラサイクリンリプレッサー（ＴｅｔＲ）系である。例として、このような系では、テトラサイクリンオペレーター（ＴｅｔＯ２）は、最初のヌクレオチドがヒトサイトメガロウイルス主要前初期プロモーター（ｈＣＭＶｐ）のＴＡＴＡＴＡＡエレメントの最後のヌクレオチドの３’末端から１０ｂｐになるような位置に配置され、次いでＴｅｔＲ単独でリプレッサーとして作用することができる（Ｙａｏ Ｆ，Ｓｖｅｎｓｊｏ Ｔ，Ｗｉｎｋｌｅｒ Ｔ，Ｌｕ Ｍ，Ｅｒｉｋｓｓｏｎ Ｃ，Ｅｒｉｋｓｓｏｎ Ｅ．，１９９８，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ；９：１９３９－１９５０）。このような系では、ＮＯＩの発現は、２コピーのＴｅｔＯ２配列がタンデムに挿入されたＣＭＶプロモーターによって制御することができる。ＴｅｔＲホモ二量体は、誘導剤（テトラサイクリン又はその類似体ドキシサイクリン［ｄｏｘ］）の非存在下で、ＴｅｔＯ２配列に結合し、上流ＣＭＶプロモーターからの転写を物理的に遮断する。存在する場合、誘導剤はＴｅｔＲホモ二量体に結合し、それがもはやＴｅｔＯ２配列に結合できないようなアロステリック変化を引き起こし、遺伝子発現をもたらす。ＴｅｔＲ遺伝子は、ＴｅｔＯ２制御遺伝子発現のより厳密な制御をもたらす翻訳効率を改善することが見出されたので、コドン最適化され得る。
【0321】
ＴＲＩＰシステムは、国際公開第２０１５／０９２４４０号パンフレットに記載されており、ベクター産生中の産生細胞におけるＮＯＩの発現を抑制する別の方法を提供する。ＴＲＡＰ結合配列（例えばＴＲＡＰ－ｔｂｓ）相互作用は、組織特異的プロモーターを含む構成的及び／又は強力なプロモーターが導入遺伝子を駆動することが望ましい場合、特に、産生細胞における導入遺伝子タンパク質の発現が、ベクターの力価の低下をもたらし、及び／又は導入遺伝子由来タンパク質のウイルスベクター送達に起因してインビボで免疫応答を誘発する場合、レトロウイルスベクターの産生のための導入遺伝子タンパク質抑制系の基礎を形成する（Ｍａｕｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ．（２０１７）Ｍａｒ２７；８）。
【0322】
簡潔には、ＴＲＡＰ－ｔｂｓ相互作用は翻訳ブロックを形成し、導入遺伝子タンパク質の翻訳を抑制する（Ｍａｕｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ．（２０１７）Ｍａｒ２７；８）。翻訳ブロックは、産生細胞においてのみ有効であり、したがって、ＤＮＡ又はＲＮＡに基づくベクター系を妨げない。ＴＲｉＰシステムは、導入遺伝子タンパク質が、単一又は複数のシストロン性ｍＲＮＡ由来の組織特異的プロモーターを含む構成的及び／又は強力なプロモーターから発現される場合、翻訳を抑制することができる。導入遺伝子タンパク質の調節されない発現は、ベクターの力価を低下させ、ベクター産物の品質に影響を及ぼし得ることが実証されている。一過性及び安定なＰａＣＬ／ＰＣＬベクター産生系の両方に対する導入遺伝子タンパク質の抑制は、ベクターの力価の低下を防ぐために産生細胞にとって有益であり、ここで、毒性又は分子量の問題が細胞ストレスにつながる可能性があり、導入遺伝子タンパク質は、導入遺伝子由来タンパク質のウイルスベクター送達に起因してインビボで免疫応答を誘発し、遺伝子編集導入遺伝子の使用は、オン／オフ標的影響をもたらし得、導入遺伝子タンパク質は、ベクター及び／又はエンベロープ糖タンパク質の排除に影響を及ぼし得る。
【0323】
エンベロープ及びシュードタイプ化
１つの好ましい態様では、本明細書に記載のレンチウイルスベクターはシュードタイプ化されている。これに関して、シュードタイプ化は１つ又は複数の利点を与えることができる。例えば、ＨＩＶベースのベクターのｅｎｖ遺伝子産物は、ＣＤ４と呼ばれるタンパク質を発現する細胞のみに感染するようにこれらのベクターを制限する。しかし、これらのベクター中のｅｎｖ遺伝子が他のエンベロープウイルス由来のｅｎｖ配列で置換されている場合、それらはより広い感染スペクトルを有し得る（Ｖｅｒｍａ ａｎｄ Ｓｏｍｉａ（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ３８９（６６４８）：２３９－２４２）。例として、作業者は、ＶＳＶ由来の糖タンパク質を有するＨＩＶベースのベクターをシュードタイプ化した（Ｖｅｒｍａ ａｎｄ Ｓｏｍｉａ（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ３８９（６６４８）：２３９－２４２）。
１つの好ましい態様では、本明細書に記載のレンチウイルスベクターはシュードタイプ化されている。これに関して、シュードタイプ化は１つ又は複数の利点を与えることができる。例えば、ＨＩＶベースのベクターのｅｎｖ遺伝子産物は、ＣＤ４と呼ばれるタンパク質を発現する細胞のみに感染するようにこれらのベクターを制限する。しかし、これらのベクター中のｅｎｖ遺伝子が他のエンベロープウイルス由来のｅｎｖ配列で置換されている場合、それらはより広い感染スペクトルを有し得る（Ｖｅｒｍａ ａｎｄ Ｓｏｍｉａ（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ３８９（６６４８）：２３９－２４２）。例として、作業者は、ＶＳＶ由来の糖タンパク質を有するＨＩＶベースのベクターをシュードタイプ化した（Ｖｅｒｍａ ａｎｄ Ｓｏｍｉａ（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ３８９（６６４８）：２３９－２４２）。
【0324】
別の実施形態では、Ｅｎｖタンパク質は、変異Ｅｎｖタンパク質又は操作されたＥｎｖタンパク質等の改変Ｅｎｖタンパク質であり得る。改変は、標的化能力を導入するために、又は毒性を低減するために、又は別の目的のために作製又は選択され得る（Ｖａｌｓｅｓｉａ－Ｗｉｔｔｍａｎ ｅｔ ａｌ １９９６ Ｊ Ｖｉｒｏｌ７０：２０５６－６４；Ｎｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ（１９９６）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ３（４）：２８０－２８６；及びＦｉｅｌｄｉｎｇ ｅｔ ａｌ（１９９８）Ｂｌｏｏｄ９１（５）：１８０２－１８０９及びそこに引用されている参考文献）。
【0325】
ベクターは、選択された任意の分子でシュードタイプ化され得る。
【0326】
本明細書で使用される場合、「ｅｎｖ」は、本明細書に記載の内因性レンチウイルスエンベロープ又は異種エンベロープを意味するものとする。
【0327】
ＶＳＶ－Ｇ
ラブドウイルスである水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）のエンベロープ糖タンパク質（Ｇ）は、特定のエンベロープウイルス及びウイルスベクタービリオンをシュードタイプ化することができることが示されているエンベロープタンパク質である。
ラブドウイルスである水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）のエンベロープ糖タンパク質（Ｇ）は、特定のエンベロープウイルス及びウイルスベクタービリオンをシュードタイプ化することができることが示されているエンベロープタンパク質である。
【0328】
レトロウイルスエンベロープタンパク質の非存在下でのシュードタイプＭｏＭＬＶベースのレトロウイルスベクターに対するその能力は、Ｅｍｉ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ６５：１２０２－１２０７によって最初に示された。国際公開第１９９４／２９４４４０号パンフレットは、レトロウイルスベクターがＶＳＶ－Ｇで首尾よくシュードタイプ化され得ることを教示している。これらのシュードタイプ化ＶＳＶ－Ｇベクターは、広範囲の哺乳動物細胞を形質導入するために使用され得る。より最近では、Ａｂｅ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｊ Ｖｉｒｏｌ７２（８）６３５６－６３６１は、ＶＳＶ－Ｇの添加によって非感染性レトロウイルス粒子を感染性にすることができることを教示している。
【0329】
Ｂｕｒｎｓ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：８０３３－７は、ＶＳＶ－Ｇを有するレトロウイルスＭＬＶのシュードタイプ化に成功し、これにより、その天然型のＭＬＶと比較して宿主域が変化したベクターが得られた。ＶＳＶ－Ｇシュードタイプ化ベクターは、哺乳動物細胞だけでなく、魚、爬虫類及び昆虫に由来する細胞株にも感染することが示されている（Ｂｕｒｎｓ ｅｔ ａｌ．（１９９３）同上）。それらはまた、様々な細胞株に対して従来の両指向性エンベロープよりも効率的であることが示されている（Ｙｅｅ ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９１：９５６４－９５６８，Ｅｍｉ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ６５：１２０２－１２０７）。ＶＳＶ－Ｇタンパク質は、その細胞質尾部がレトロウイルスコアと相互作用することができるので、特定のレトロウイルスをシュードタイプ化するために使用することができる。
【0330】
ＶＳＶ－Ｇタンパク質等の非レトロウイルスシュードタイプ化エンベロープの提供は、感染性を失うことなくベクター粒子を高力価に濃縮できるという利点をもたらす（Ａｋｋｉｎａ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：２５８１－５）。レトロウイルスエンベロープタンパク質は、おそらく２つの非共有結合的に連結されたサブユニットからなるため、超遠心分離中の剪断力に明らかに耐えることができない。サブユニット間の相互作用は、遠心分離によって破壊され得る。比較すると、ＶＳＶ糖タンパク質は単一単位から構成される。したがって、ＶＳＶ－Ｇタンパク質シュードタイプ化は、効率的な標的細胞感染／形質導入及び製造プロセス中の両方に潜在的な利点を提供することができる。
【0331】
国際公開第２０００／５２１８８号パンフレットは、膜結合型ウイルスエンベロープタンパク質として水疱性口内炎ウイルス－Ｇタンパク質（ＶＳＶ－Ｇ）を有する、安定したプロデューサ細胞株からのシュードタイプ化レトロウイルスベクターの作製を記載しており、ＶＳＶ－Ｇタンパク質の遺伝子配列を提供している。
【0332】
Ｒｏｓｓ Ｒｉｖｅｒウイルス
Ｒｏｓｓ Ｒｉｖｅｒウイルスエンベロープは、非霊長類レンチウイルスベクター（ＦＩＶ）をシュードタイプ化するために使用されており、全身投与後に主に肝臓を形質導入した（Ｋａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７６：９３７８－９３８８）。効率は、ＶＳＶ－Ｇシュードタイプ化ベクターで得られたものよりも２０倍大きく、肝毒性を示唆する肝酵素の血清レベルによって測定されるように、細胞傷害性をあまり引き起こさなかったことが報告された。
Ｒｏｓｓ Ｒｉｖｅｒウイルスエンベロープは、非霊長類レンチウイルスベクター（ＦＩＶ）をシュードタイプ化するために使用されており、全身投与後に主に肝臓を形質導入した（Ｋａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７６：９３７８－９３８８）。効率は、ＶＳＶ－Ｇシュードタイプ化ベクターで得られたものよりも２０倍大きく、肝毒性を示唆する肝酵素の血清レベルによって測定されるように、細胞傷害性をあまり引き起こさなかったことが報告された。
【0333】
バキュロウイルスＧＰ６４
バキュロウイルスＧＰ６４タンパク質は、臨床用途及び商業用途に必要な高力価ウイルスの大規模生産に使用されるウイルスベクターのＶＳＶ－Ｇの代替物であることが示されている（Ｋｕｍａｒ Ｍ，Ｂｒａｄｏｗ ＢＰ，Ｚｉｍｍｅｒｂｅｒｇ Ｊ（２００３）Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１４（１）：６７－７７）。ＶＳＶ－Ｇ－シュードタイプ化ベクターと比較して、ＧＰ６４シュードタイプ化ベクターは、類似の広範な向性及び類似の天然の力価を有する。ＧＰ６４発現は細胞を死滅させないので、ＧＰ６４を構成的に発現するＨＥＫ２９３Ｔ系細胞株を作製することができる。
バキュロウイルスＧＰ６４タンパク質は、臨床用途及び商業用途に必要な高力価ウイルスの大規模生産に使用されるウイルスベクターのＶＳＶ－Ｇの代替物であることが示されている（Ｋｕｍａｒ Ｍ，Ｂｒａｄｏｗ ＢＰ，Ｚｉｍｍｅｒｂｅｒｇ Ｊ（２００３）Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１４（１）：６７－７７）。ＶＳＶ－Ｇ－シュードタイプ化ベクターと比較して、ＧＰ６４シュードタイプ化ベクターは、類似の広範な向性及び類似の天然の力価を有する。ＧＰ６４発現は細胞を死滅させないので、ＧＰ６４を構成的に発現するＨＥＫ２９３Ｔ系細胞株を作製することができる。
【0334】
代替エンベロープ
シュードタイプ化ＥＩＡＶに使用した場合に妥当な力価を与える他のエンベロープとしては、モコラ、狂犬病、エボラ及びＬＣＭＶ（リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス）が挙げられる。４０７０Ａでシュードタイプ化されたレンチウイルスのマウスへの静脈内注入は、肝臓における最大の遺伝子発現をもたらした。
シュードタイプ化ＥＩＡＶに使用した場合に妥当な力価を与える他のエンベロープとしては、モコラ、狂犬病、エボラ及びＬＣＭＶ（リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス）が挙げられる。４０７０Ａでシュードタイプ化されたレンチウイルスのマウスへの静脈内注入は、肝臓における最大の遺伝子発現をもたらした。
【0335】
パッケージング配列
本発明の文脈内で利用される場合、「パッケージング配列」又は「ｐｓｉ」と互換的に呼ばれる「パッケージングシグナル」という用語は、ウイルス粒子形成中のレトロウイルスＲＮＡ鎖のカプシド形成に必要な非コードシス作用配列に関して使用される。ＨＩＶ－１では、この配列は、主要スプライスドナー部位（ＳＤ）の上流から少なくともｇａｇ開始コドンまで延在する遺伝子座にマッピングされている（ｇａｇのヌクレオチド６８８に対する５’配列の一部又は全部が含まれ得る）。ＥＩＡＶにおいて、パッケージングシグナルは、Ｇａｇの５’コーディング領域へのＲ領域を含む。
本発明の文脈内で利用される場合、「パッケージング配列」又は「ｐｓｉ」と互換的に呼ばれる「パッケージングシグナル」という用語は、ウイルス粒子形成中のレトロウイルスＲＮＡ鎖のカプシド形成に必要な非コードシス作用配列に関して使用される。ＨＩＶ－１では、この配列は、主要スプライスドナー部位（ＳＤ）の上流から少なくともｇａｇ開始コドンまで延在する遺伝子座にマッピングされている（ｇａｇのヌクレオチド６８８に対する５’配列の一部又は全部が含まれ得る）。ＥＩＡＶにおいて、パッケージングシグナルは、Ｇａｇの５’コーディング領域へのＲ領域を含む。
【0336】
本明細書で使用される場合、「伸長パッケージングシグナル」又は「伸長パッケージング配列」という用語は、ｇａｇ遺伝子内に更に伸長するｐｓｉ配列の周りの配列の使用を指す。これらの追加のパッケージング配列を含めることにより、ウイルス粒子へのベクターＲＮＡの挿入効率を高めることができる。
【0337】
ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）ＲＮＡキャプシド形成決定基は、ゲノムｍＲＮＡの５’末端の一方の領域（Ｒ－Ｕ５）及びｇａｇの近位３１１ｎｔ内にマッピングされたもう一方の領域を含む別個且つ非連続的であることが示されている（Ｋａｙｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ．Ｏｃｔ；６９（１０）：６５８８－９２（１９９５）。
【0338】
内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）
ＩＲＥＳエレメントの挿入は、単一のプロモーターからの複数のコード領域の発現を可能にする（Ａｄａｍ ｅｔ ａｌ（上記）；Ｋｏｏ ｅｔ ａｌ（１９９２）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ１８６：６６９－６７５；Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ１９９３Ｊ．Ｖｉｒｏｌ６７：２１４２－２１４８）。ＩＲＥＳエレメントは、ウイルスタンパク質のキャップ非依存性翻訳を促進するピコルナウイルスの非翻訳５’末端に最初に見出された（Ｊａｎｇ ｅｔ ａｌ（１９９０）Ｅｎｚｙｍｅ４４：２９２－３０９）。ＲＮＡのオープンリーディングフレームの間に位置する場合、ＩＲＥＳエレメントは、ＩＲＥＳエレメントにおけるリボソームの進入を促進し、続いて翻訳の下流開始を促進することによって、下流のオープンリーディングフレームの効率的な翻訳を可能にする。
ＩＲＥＳエレメントの挿入は、単一のプロモーターからの複数のコード領域の発現を可能にする（Ａｄａｍ ｅｔ ａｌ（上記）；Ｋｏｏ ｅｔ ａｌ（１９９２）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ１８６：６６９－６７５；Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ１９９３Ｊ．Ｖｉｒｏｌ６７：２１４２－２１４８）。ＩＲＥＳエレメントは、ウイルスタンパク質のキャップ非依存性翻訳を促進するピコルナウイルスの非翻訳５’末端に最初に見出された（Ｊａｎｇ ｅｔ ａｌ（１９９０）Ｅｎｚｙｍｅ４４：２９２－３０９）。ＲＮＡのオープンリーディングフレームの間に位置する場合、ＩＲＥＳエレメントは、ＩＲＥＳエレメントにおけるリボソームの進入を促進し、続いて翻訳の下流開始を促進することによって、下流のオープンリーディングフレームの効率的な翻訳を可能にする。
【0339】
ＩＲＥＳに関する総説が、Ｍｏｕｎｔｆｏｒｄ及びＳｍｉｔｈによって提示される（ＴＩＧ Ｍａｙ１９９５ｖｏｌ１１，Ｎｏ５：１７９－１８４）。脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）（Ｇｈａｔｔａｓ，Ｉ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１１：５８４８－５８５９（１９９１）；ＢｉＰタンパク質［Ｍａｃｅｊａｋ ａｎｄ Ｓａｒｎｏｗ，Ｎａｔｕｒｅ ３５３：９１（１９９１）］；ショウジョウバエのアンテナペディア遺伝子（エクソンｄ及びｅ）［Ｏｈ，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ＆Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，６：１６４３－１６５３（１９９２）］並びにポリオウイルス（ＰＶ）のアンテナペディア遺伝子［Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ ａｎｄ Ｓｏｎｅｎｂｅｒｇ，Ｎａｔｕｒｅ３３４：３２０－３２５（１９８８）；Ｍｏｕｎｔｆｏｒｄ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ，ＴＩＧ１１，１７９－１８４（１９８５）も参照されたい］由来のものを含む多数の異なるＩＲＥＳ配列が知られている。
【0340】
ＰＶ、ＥＭＣＶ及びブタ水疱病ウイルス由来のＩＲＥＳ要素は、レトロウイルスベクターにおいて以前から使用されている（上記のＣｏｆｆｉｎ ｅｔ ａｌ）。
【0341】
「ＩＲＥＳ」という用語は、ＩＲＥＳとして機能するか又はＩＲＥＳの機能を改善する任意の配列又は配列の組合せを含む。ＩＲＥＳは、ウイルス起源（例えばＥＭＣＶ ＩＲＥＳ、ＰＶ ＩＲＥＳ、又はＦＭＤＶ ２Ａ様配列）又は細胞起源（例えば、ＦＧＦ２ ＩＲＥＳ、ＮＲＦ ＩＲＥＳ、ノッチ２ＩＲＥＳ又はＥＩＦ４ ＩＲＥＳ）であり得る。
【0342】
ＩＲＥＳが各ポリヌクレオチドの翻訳を開始することができるようにするために、ＩＲＥＳは、モジュール構築物中のポリヌクレオチドの間又はポリヌクレオチドの前に配置されるべきである。
【0343】
安定な細胞株の開発のために利用されるヌクレオチド配列は、安定な組込みが起こった細胞を選択するための選択マーカの添加を必要とする。これらの選択マーカは、ヌクレオチド配列内の単一の転写単位として発現させることができるか、又はＩＲＥＳエレメントを使用してポリシストロニックなメッセージで選択マーカの翻訳を開始することが好ましい場合がある（Ａｄａｍ ｅｔ ａｌ１９９１Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５，４９８５）。
【0344】
遺伝子配向及びインシュレータ
核酸が指向性であり、これが最終的に細胞における転写及び複製等の機構に影響を及ぼすことは周知である。したがって、遺伝子は、同じ核酸構築物の一部である場合、互いに対して相対的な配向を有することができる。
核酸が指向性であり、これが最終的に細胞における転写及び複製等の機構に影響を及ぼすことは周知である。したがって、遺伝子は、同じ核酸構築物の一部である場合、互いに対して相対的な配向を有することができる。
【0345】
本発明の特定の実施形態では、細胞又は構築物中の同じ遺伝子座に存在する少なくとも２つの核酸配列は、逆向き及び／又は交互の配向であり得る。換言すれば、この特定の遺伝子座における本発明の特定の実施形態では、一対の連続する遺伝子は同じ配向を有さない。これは、領域が宿主細胞の同じ物理的位置内で発現される場合、転写及び翻訳の両方のリードスルーを防止するのに役立ち得る。
【0346】
交互の配向を有することは、ベクター産生に必要な核酸が細胞内の同じ遺伝子座に基づく場合、レトロウイルスベクター産生に利益をもたらす。これはまた、結果として生じる構築物の安全性を、複製可能なレトロウイルスベクターの生成の防止において改善することができる。
【0347】
核酸配列が逆及び／又は交互の配向にある場合、インシュレータの使用は、その遺伝的周囲からのＮＯＩの不適切な発現又はサイレンシングを防止することができる。
【0348】
「インシュレータ」という用語は、インシュレータ結合タンパク質に結合したときに、周囲の調節シグナルから遺伝子を保護する能力を有するＤＮＡ配列エレメントのクラスを指す。２つのタイプのインシュレータ：エンハンサーブロッキング機能及びクロマチンバリア機能が存在する。インシュレータがプロモーターとエンハンサーとの間に位置する場合、インシュレータのエンハンサー遮断機能は、プロモーターをエンハンサーの転写促進作用から遮蔽する（Ｇｅｙｅｒ ａｎｄ Ｃｏｒｃｅｓ１９９２；Ｋｅｌｌｕｍ ａｎｄ Ｓｃｈｅｄｌ１９９２）。クロマチンバリアインシュレータは、転写的に不活性なクロマチン領域に変わる転写的に活性なクロマチン領域をもたらし、遺伝子発現のサイレンシングをもたらす近くの凝縮したクロマチンの進行を妨げることによって機能する。ヘテロクロマチンの拡散、したがって遺伝子サイレンシングを阻害するインシュレータは、ヒストン修飾に関与する酵素を動員してこのプロセスを防止する（Ｙａｎｇ Ｊ，Ｃｏｒｃｅｓ ＶＧ．２０１１；１１０：４３－７６；Ｈｕａｎｇ，Ｌｉ ｅｔ ａｌ．２００７；Ｄｈｉｌｌｏｎ，Ｒａａｂ ｅｔ ａｌ．２００９）。インシュレータはこれらの機能の一方又は両方を有することができ、ニワトリβグロビン絶縁体（ｃＨＳ４）はそのような例の１つである。このインシュレータは、最も広く研究されている脊椎動物インシュレータであり、Ｇ＋Ｃが非常に豊富であり、エンハンサー遮断機能及びヘテロクロマティックバリア機能の両方を有する（Ｃｈｕｎｇ Ｊ Ｈ，Ｗｈｉｔｅｌｙ Ｍ，Ｆｅｌｓｅｎｆｅｌｄ Ｇ．Ｃｅｌｌ．１９９３；７４：５０５－５１４）。エンハンサー遮断機能を有する他のそのようなインシュレータは限定されないが、以下を含む。ヒトβ－グロビンインシュレータ５（ＨＳ５）、ヒトβ－グロビンインシュレータ１（ＨＳ１）、及びニワトリβ－グロビンインシュレータ（ｃＨＳ３）（Ｆａｒｒｅｌｌ ＣＭ１，Ｗｅｓｔ ＡＧ，Ｆｅｌｓｅｎｆｅｌｄ Ｇ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２００２ Ｊｕｎ；２２（１１）：３８２０－３１；Ｊ Ｅｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．ＥＭＢＯ Ｊ．１９９６Ｆｅｂ１；１５（３）：５６２－５６８）。望ましくない遠位相互作用を減少させることに加えて、インシュレータはまた、隣接するレトロウイルス核酸配列間のプロモーター干渉（すなわち、１つの転写単位由来のプロモーターが隣接する転写単位の発現を損なう場合）を防止するのに役立つ。レトロウイルスベクター核酸配列のそれぞれの間にインシュレータが使用される場合、直接リードスルーの減少は、複製可能なレトロウイルスベクター粒子の形成の防止に役立つ。
【0349】
インシュレータは、レトロウイルス核酸配列のそれぞれの間に存在し得る。一実施形態では、インシュレータの使用は、ベクターコンポーネントをコードするヌクレオチド配列中の別のＮＯＩ発現カセットと相互作用する１つのＮＯＩ発現カセットからのプロモーター－エンハンサー相互作用を防止する。
【0350】
ベクターゲノムとｇａｇ－ｐｏｌ配列との間にインシュレータが存在し得る。したがって、これは、複製可能なレトロウイルスベクター及び「野生型」様ＲＮＡ転写物の産生の可能性を制限し、構築物の安全性プロファイルを改善する。安定に組み込まれた多重遺伝子ベクターの発現を改善するためのインシュレータ要素の使用は、Ｍｏｒｉａｒｉｔｙ ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０１３Ａｐｒ；４１（８）：ｅ９２に記載される。
【0351】
ベクター力価
当業者は、レンチウイルスベクターの力価を決定する多数の異なる方法があることを理解するであろう。力価は、しばしば、形質導入単位／ｍＬ（ＴＵ／ｍＬ）として記載される。ベクター粒子の数を増加させることによって、及びベクター調製物の比活性を増加させることによって、力価を増加させ得る。
当業者は、レンチウイルスベクターの力価を決定する多数の異なる方法があることを理解するであろう。力価は、しばしば、形質導入単位／ｍＬ（ＴＵ／ｍＬ）として記載される。ベクター粒子の数を増加させることによって、及びベクター調製物の比活性を増加させることによって、力価を増加させ得る。
【0352】
治療的使用
本明細書に記載のレンチウイルスベクター又は本明細書に記載のレンチウイルスベクターで形質導入された細胞又は組織は、医学で使用され得る。
本明細書に記載のレンチウイルスベクター又は本明細書に記載のレンチウイルスベクターで形質導入された細胞又は組織は、医学で使用され得る。
【0353】
更に、本明細書に記載のレンチウイルスベクター、本発明の産生細胞、又は本明細書に記載のレンチウイルスベクターで形質導入された細胞若しくは組織は、目的のヌクレオチドをそれを必要とする標的部位に送達するための医薬品の調製に使用され得る。本発明のレンチウイルスベクター又は形質導入細胞のそのような使用は、前述のように、治療目的又は診断目的のためであり得る。
【0354】
したがって、本明細書に記載のレンチウイルスベクターによって形質導入された細胞が提供される。
【0355】
「ウイルスベクター粒子によって形質導入された細胞」は、ウイルスベクター粒子によって担持された核酸が移入された細胞、特に標的細胞として理解される。
【0356】
好ましい実施形態では、目的のヌクレオチドは治療効果をもたらす。
【0357】
「標的細胞」は、ＮＯＩを発現することが望ましい細胞として理解されるべきである。ＮＯＩは、本発明のウイルスベクターを用いて標的細胞に導入することができる。標的細胞への送達は、インビボ、エクスビボ又はインビトロで行われ得る。
【0358】
ＮＯＩは、治療的又は診断的用途を有し得る。適切なＮＯＩには、酵素、補因子、サイトカイン、ケモカイン、ホルモン、抗体、抗酸化分子、操作された免疫グロブリン様分子、一本鎖抗体、融合タンパク質、免疫共刺激分子、免疫調節分子、キメラ抗原受容体、標的タンパク質のトランスドメインネガティブ変異体、毒素、コンディショナル毒素、抗原、転写因子、構造タンパク質、レポータータンパク質、細胞内局在化シグナル、腫瘍抑制タンパク質、成長因子、膜タンパク質、受容体、血管活性タンパク質及びペプチド、抗ウイルスタンパク質及びリボザイム、並びにそれらの誘導体（関連レポーター基を有する誘導体等）をコードする配列が含まれるが、これらに限定されない。ＮＯＩはまた、マイクロＲＮＡをコードし得る。理論に拘束されることを望むものではないが、マイクロＲＮＡのプロセシングはＴＲＡＰによって阻害されると考えられる。
【0359】
一実施形態では、ＮＯＩは、神経変性障害の治療に有用であり得る。
【0360】
別の実施形態では、ＮＯＩはパーキンソン病の治療に有用であり得る。
【0361】
別の実施形態では、ＮＯＩは、ドーパミン合成に関与する１つ又は複数の酵素をコードし得る。例えば、酵素は、以下のうちの１つ又は複数であり得る。チロシンヒドロキシラーゼ、ＧＴＰ－シクロヒドロラーゼＩ及び／又は芳香族アミノ酸ドーパデカルボキシラーゼ。３つ全ての遺伝子の配列が利用可能である（それぞれＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）受託番号Ｘ０５２９０、Ｕ１９５２３及びＭ７６１８０）。
【0362】
別の実施形態では、ＮＯＩは、小胞モノアミントランスポーター２（ＶＭＡＴ２）をコードし得る。代替の実施形態では、ウイルスゲノムは、芳香族アミノ酸ドーパデカルボキシラーゼをコードするＮＯＩ及びＶＭＡＴ２をコードするＮＯＩを含み得る。そのようなゲノムは、パーキンソン病の治療において、特にＬ－ＤＯＰＡの末梢投与と併せて使用され得る。
【0363】
別の実施形態では、ＮＯＩは、治療用タンパク質又は治療用タンパク質の組合せをコードし得る。
【0364】
別の実施形態では、ＮＯＩは、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、ニューロトロフィン－３（ＮＴ－３）、酸性線維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、インターロイキン－１β（ＩＬ－１β）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ－α）、インスリン増殖因子－２、ＶＥＧＦ－Ａ、ＶＥＧＦ－Ｂ、ＶＥＧＦ－Ｃ／ＶＥＧＦ－２、ＶＥＧＦ－Ｄ、ＶＥＧＦ－Ｅ、ＰＤＧＦ－Ａ、ＰＤＧＦ－Ｂ、ＰＤＦＧ－Ａ及びＰＤＦＧ－Ｂのヘテロ二量体及びホモ二量体からなる群から選択される１つ又は複数のタンパク質をコードし得る。
【0365】
別の実施形態では、ＮＯＩは、アンジオスタチン、エンドスタチン、血小板因子４、色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）、胎盤成長因子、レスチン、インターフェロン－α、インターフェロン誘導性タンパク質、ｇｒｏ－ｂｅｔａ及びチューブダウン－１、インターロイキン（ＩＬ）－１、ＩＬ－１２、レチノイン酸、抗ＶＥＧＦ抗体又はその断片／変異体、例えばアフリベルセプト、トロンボスポンジン、ＶＥＧＦ受容体タンパク質、例えば米国特許第５，９５２，１９９号明細書及び米国特許第６，１００，０７１号明細書に記載されているもの、並びに抗ＶＥＧＦ受容体抗体からなる群から選択される、１つ又は複数の抗血管新生タンパク質をコードし得る。
【0366】
別の実施形態では、ＮＯＩは、ＮＦ－ｋＢ阻害剤、ＩＬ１β阻害剤、ＴＧＦβ阻害剤、ＩＬ－６阻害剤、ＩＬ－２３阻害剤、ＩＬ－１８阻害剤、腫瘍壊死因子α及び腫瘍壊死因子β、リンホトキシンα及びリンホトキシンβ、ＬＩＧＨＴ阻害剤、αシヌクレイン阻害剤、タウ阻害剤、βアミロイド阻害剤、ＩＬ－１７阻害剤から選択される抗炎症タンパク質、抗体又はタンパク質若しくは抗体の断片／変異体をコードし得る。
【0367】
別の実施形態では、ＮＯＩは、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）をコードし得る。
【0368】
別の実施形態では、ＮＯＩは、眼細胞において通常発現されるタンパク質をコードし得る。
【0369】
別の実施形態では、ＮＯＩは、光受容細胞及び／又は網膜色素上皮細胞において通常発現されるタンパク質をコードし得る。
【0370】
別の実施形態では、ＮＯＩは、ＲＰＥ６５、アリール炭化水素相互作用受容体タンパク質様１（ＡＩＰＬ１）、ＣＲＢ１、レシチンレチナールアセチルトランスフェラーゼ（ＬＲＡＴ）、光受容体特異的ホメオボックス（ＣＲＸ）、レチナールグアニレートシクリース（ＧＵＣＹ２Ｄ）、ＲＰＧＲ相互作用タンパク質１（ＲＰＧＲＩＰ１）、ＬＣＡ２、ＬＣＡ３、ＬＣＡ５、ジストロフィン、ＰＲＰＨ２、ＣＮＴＦ、ＡＢＣＲ／ＡＢＣＡ４、ＥＭＰ１、ＴＩＭＰ３、ＭＥＲＴＫ、ＥＬＯＶＬ４、ＭＹＯ７Ａ、ＵＳＨ２Ａ、ＶＭＤ２、ＲＬＢＰ１、ＣＯＸ－２、ＦＰＲ、ｈａｒｍｏｎｉｎ、Ｒａｂエスコートタンパク質１、ＣＮＧＢ２、ＣＮＧＡ３、ＣＥＰ２９０、ＲＰＧＲ、ＲＳ１、ＲＰ１、ＰＲＥＬＰ、グルタチオン経路酵素及びオプチシンを含む群から選択されるタンパク質をコードし得る。
【0371】
他の実施形態では、ＮＯＩは、ヒト凝固第ＶＩＩＩ因子又は第ＩＸ因子をコードし得る。
【0372】
他の実施形態では、ＮＯＩは、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）、メチルマロニルＣｏＡムターゼ、プロピオニルＣｏＡカルボキシラーゼ、イソバレリルＣｏＡデヒドロゲナーゼ、分岐鎖ケト酸デヒドロゲナーゼ複合体、グルタリルＣｏＡデヒドロゲナーゼ、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ、プロピオニルＣｏＡカルボキシラーゼ、３メチルクロトニルＣｏＡカルボキシラーゼ、ピルビン酸カルボキシラーゼ、カルバモイル－リン酸シンターゼアンモニア、オルニチントランスカルバアミラーゼ、グルコシルセラミダーゼβ、αガラクトシダーゼＡ、グルコシルセラミダーゼβ、シスチノシン、グルコサミン（Ｎ－アセチル）－６－スルファターゼ、Ｎ－アセチル－α－グルコサミニダーゼ、Ｎ－スルホグルコサミンスルホヒドロラーゼ、ガラクトサミン－６スルファターゼ、アリールスルファターゼＡ、シトクロムＢ－２４５β、ＡＢＣＤ１、オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ、アルギニノコハク酸シンターゼ、アルギニノコハク酸リアーゼ、アルギナーゼ１、アラニングリコキシレートアミノトランスフェラーゼ、ＡＴＰ結合カセット、サブファミリーＢメンバーを含む群から選択される代謝に関与する１つ又は複数のタンパク質をコードし得る。
【0373】
他の実施形態では、ＮＯＩは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）又はＴ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードし得る。一実施形態では、ＣＡＲは抗５Ｔ４ ＣＡＲである。他の実施形態では、ＮＯＩは、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ２０、ＣＤ４７、ＣＤ１３８、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ１２３、ＣＤ７０、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、ルイスＹ抗原（ＬｅＹ）、チロシン－プロテインキナーゼ膜貫通受容体（ＲＯＲ１）、ムシン１、細胞表面結合（Ｍｕｃ１）、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、内皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、インスリン、タンパク質チロシンホスファターゼ、非受容体型２２、インターロイキン２受容体α、ヘリカーゼＣドメイン１で誘導されたインターフェロン、ヒト上皮増殖因子受容体（ＨＥＲ２）、グリピカン３（ＧＰＣ３）、ジシアロガングリオシド（ＧＤ２）、メソテリン、小胞内皮増殖因子受容体２（ＶＥＧＦＲ２）をコードし得る。
【0374】
他の実施形態では、ＮＯＩは、ＵＬＢＰ１、２及び３、Ｈ６０、Ｒａｅ－１ａ、ｂ、ｇ、ｄ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢを含む群から選択されるＮＫＧ２Ｄリガンドに対するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードし得る。
【0375】
更なる実施形態では、ＮＯＩは、ＳＧＳＨ、ＳＵＭＦ１、ＧＡＡ、共通ガンマ鎖（ＣＤ１３２）、アデノシンデアミナーゼ、ＷＡＳタンパク質、グロビン、αガラクトシダーゼＡ、δ－アミノレブリン酸（ＡＬＡ）シンターゼ、δ－アミノレブリン酸デヒドラターゼ（ＡＬＡＤ）、ヒドロキシメチルビラン（ＨＭＢ）シンターゼ、ウロポルフィリノーゲン（ＵＲＯ）シンターゼ、ウロポルフィリノーゲン（ＵＲＯ）デカルボキシラーゼ、コプロポルフィリノーゲン（ＣＯＰＲＯ）オキシダーゼ、プロトポルフィリノーゲン（ＰＲＯＴＯ）オキシダーゼ、フェロケラターゼ、α－Ｌ－イズロニダーゼ、イズロン酸スルファターゼ、ヘパランスルファミダーゼ、Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ、ヘパリン－α－グルコサミニドＮ－アセチルトランスフェラーゼ、３Ｎ－アセチルグルコサミン６－スルファターゼ、ガラクトース－６－硫酸スルファターゼ、β－ガラクトシダーゼ、Ｎ－アセチルガラクトサミン－４－スルファターゼ、β－グルクロニダーゼ及びヒアルロニダーゼをコードし得る。
【0376】
ＮＯＩに加えて、ベクターはまた、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ又は調節ｓｈＲＮＡを含むか又はコードし得る。（Ｄｉｃｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ３７：１２８９－１２９５，Ｓｉｌｖａ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ３７：１２８１－１２８８）。
【0377】
適応症
本発明によるレトロウイルスベクター及びＡＡＶベクターを含むベクターは、国際公開第１９９８／０５６３５号パンフレット、国際公開第１９９８／０７８５９号パンフレット、国際公開第１９９８／０９９８５号パンフレットに列挙されている障害の治療に有用な１つ又は複数のＮＯＩを送達するために使用することができる。目的のヌクレオチドは、ＤＮＡ又はＲＮＡであり得る。そのような疾患の例を以下に示す。
本発明によるレトロウイルスベクター及びＡＡＶベクターを含むベクターは、国際公開第１９９８／０５６３５号パンフレット、国際公開第１９９８／０７８５９号パンフレット、国際公開第１９９８／０９９８５号パンフレットに列挙されている障害の治療に有用な１つ又は複数のＮＯＩを送達するために使用することができる。目的のヌクレオチドは、ＤＮＡ又はＲＮＡであり得る。そのような疾患の例を以下に示す。
【0378】
サイトカイン及び細胞増殖／分化活性に応答する障害；免疫抑制剤又は免疫刺激活性（例えば、ヒト免疫不全ウイルスによる感染を含む免疫不全を治療するため、リンパ球増殖の調節のため；癌及び多くの自己免疫疾患を治療するため、並びに移植拒絶を防止するため、又は腫瘍免疫を誘導するため）；造血の調節（例えば骨髄性又はリンパ性疾患の治療）；骨、軟骨、腱、靭帯及び神経組織の成長の促進（例えば創傷治癒、熱傷、潰瘍及び歯周疾患並びに神経変性の治療のために）；卵胞刺激ホルモンの阻害又は活性化（妊孕性の調節）；走化性／走化性活性（例えば、特定の細胞型を損傷又は感染の部位に動員するため）；止血及び血栓溶解活性（例えば、血友病及び脳卒中を治療するため）；抗炎症活性（例えば、敗血症性ショック又はクローン病を治療するため）；マクロファージ阻害活性及び／又はＴ細胞阻害活性、したがって抗炎症活性；抗免疫活性（すなわち、炎症に関連しない応答を含む、細胞性及び／又は体液性免疫応答に対する阻害効果）；マクロファージ及びＴ細胞が細胞外マトリックスコンポーネント及びフィブロネクチンに接着する能力の阻害、並びにＴ細胞におけるｆａｓ受容体発現の上方制御。
【0379】
癌、白血病、良性及び悪性腫瘍の成長、浸潤及び広がり、血管新生、転移、腹水及び悪性胸水貯留を含む悪性障害。
【0380】
関節リウマチ、過敏症、アレルギー反応、喘息、全身性エリテマトーデス、コラーゲン疾患及び他の疾患を含む関節炎を含む自己免疫疾患。
【0381】
動脈硬化症、アテローム硬化性心疾患、再灌流傷害、心停止、心筋梗塞、血管炎症性障害、呼吸窮迫症候群、心血管作用、末梢血管疾患、片頭痛及びアスピリン依存性抗血栓症、脳卒中、脳虚血、虚血性心疾患又は他の疾患を含む血管疾患。
【0382】
消化性潰瘍、潰瘍性大腸炎、クローン病及び他の疾患を含む胃腸管の疾患。
【0383】
肝線維症、肝硬変を含む肝疾患。
【0384】
フェニルケトン尿症ＰＫＵ、ウィルソン病、有機酸血症、尿素サイクル障害、胆汁うっ滞、及び他の疾患を含む遺伝性代謝障害。
【0385】
甲状腺炎又は他の腺疾患、糸球体腎炎又は他の疾患を含む腎臓及び泌尿器の疾患。
【0386】
耳炎又は他の耳鼻咽頭疾患、皮膚炎又は他の皮膚疾患を含む耳、鼻及び喉の障害。
【0387】
歯周疾患、歯周炎、歯肉炎又は他の歯／口腔疾患を含む歯及び口腔障害。
【0388】
精巣炎又は精巣上体－精巣炎、不妊症、精巣外傷又は他の精巣疾患を含む精巣疾患。
【0389】
胎盤機能障害、胎盤機能不全、習慣性流産、子癇、子癇前症、子宮内膜症及び他の婦人科疾患を含む婦人科疾患。
【0390】
眼科学的障害、例えば、ＬＣＡ１０を含むレーバー先天性黒内障（ＬＣＡ）、後部ブドウ膜炎、中間ブドウ膜炎、前部ブドウ膜炎、結膜炎、脈絡網膜炎、ブドウ膜炎、視神経炎、緑内障（開放隅角緑内障及び若年性先天緑内障を含む）、眼内炎症、例えば網膜炎又は嚢胞様黄斑浮腫、交感性眼炎、強膜炎、網膜色素変性、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）を含む黄斑変性、及びベスト病を含む若年性黄斑変性、ベスト病、ベスト卵黄様黄斑変性、シュタルガルト病、アッシャー症候群、ドイン蜂巣状網膜ジストロフィー、ソービー黄斑ジストロフィー、若年性網膜分離症、コンドロッドジストロフィー、角膜ジストロフィー、フックスジストロフィー、レーバー先天性黒内障、レーバー遺伝性視神経症（ＬＨＯＮ）、アデイ症候群、オグチ病、変性フォンダス病、眼外傷、感染によって引き起こされる眼炎症、増殖性硝子体網膜症、急性虚血性視神経症、例えば緑内障濾過手術後の過度の瘢痕化、眼移植片拒絶反応、並びに糖尿病性黄斑浮腫、網膜静脈閉塞症、ＲＬＢＰ１関連網膜ジストロフィー、脈絡膜血症及び無色素視症等の他の眼疾患。
【0391】
パーキンソン病、パーキンソン病の治療による合併症及び／又は副作用、ＡＩＤＳ関連認知症複合ＨＩＶ関連脳症、デビック病、シデナム舞踏病、アルツハイマー病及び他の変性疾患、ＣＮＳの状態又は障害、脳卒中、ポリオ後症候群、精神障害、脊髄炎、脳炎、亜急性硬化性全脳炎、脳脊髄炎、急性ニューロパシー、亜急性ニューロパシー、慢性ニューロパシー、ファブリー病、ゴーシェ病、シスチノーシス、ポンペ病、異染性白質ジストロフィー、ウィスコットアルドリッチ症候群、副腎白質ジストロフィー、ベータサラセミア、鎌状赤血球症、ギライムバレー症候群、シデナム舞踏病、重症筋無力症、偽腫瘍脳、ダウン症候群、ハンチントン病、ＣＮＳ圧迫又はＣＮＳ外傷又はＣＮＳの感染、筋萎縮症及びジストロフィー、中枢及び末梢神経系の疾患、状態又は障害、筋萎縮性側索硬化症、脊髄筋萎縮症、脊髄及び剥離損傷を含む運動ニューロン疾患を含む神経及び神経変性障害。
【0392】
嚢胞性線維症、ムコ多糖症、例えば、サンフィリポ症候群Ａ、サンフィリポ症候群Ｂ、サンフィリポ症候群Ｃ、サンフィリポ症候群Ｄを含むムコ多糖症、Ｈｕｎｔｅｒ症候群、Ｈｕｒｌｅｒ－Ｓｃｈｅｉｅ症候群、モルキオ症候群、ＡＤＡ－ＳＣＩＤ、Ｘ連鎖ＳＣＩＤ、Ｘ連鎖性慢性肉芽腫性疾患、ポルフィリン症、血友病Ａ、血友病Ｂ、外傷後炎症、出血、凝固及び急性期反応、悪液質、食欲不振、急性感染症、敗血症性ショック、感染性疾患、糖尿病、手術の合併症若しくは副作用、骨髄移植又は他の移植合併症及び／又は副作用、例えばウイルス担体又はＡＩＤＳによる感染による遺伝子治療の合併症及び副作用、体液性及び／又は細胞性免疫応答を抑制又は阻害するための、天然細胞又は人工細胞移植の場合における移植片拒絶の予防及び／又は治療のための、角膜、骨髄、器官、レンズ、ペースメーカー、天然又は人工皮膚組織等の組織及び器官等の他の疾患又は状態。
【0393】
ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ及びｓｈＲＮＡ
特定の他の実施形態では、ＮＯＩはマイクロＲＮＡを含む。マイクロＲＮＡは、生物において天然に産生される小さなＲＮＡの非常に大きな群であり、その少なくとも一部は標的遺伝子の発現を調節する。マイクロＲＮＡファミリーの形成メンバーはｌｅｔ－７及びｌｉｎ－４である。ｌｅｔ－７遺伝子は、虫発達中に内因性タンパク質コード遺伝子の発現を調節する、小さく高度に保存されたＲＮＡ種をコードする。活性ＲＮＡ種は最初に約７０ｎｔの前駆体として転写され、これは転写後に成熟約２１ｎｔ形態に処理される。ｌｅｔ－７及びｌｉｎ－４の両方は、ダイサー酵素によってそれらの成熟形態にプロセシングされるヘアピンＲＮＡ前駆体として転写される。
特定の他の実施形態では、ＮＯＩはマイクロＲＮＡを含む。マイクロＲＮＡは、生物において天然に産生される小さなＲＮＡの非常に大きな群であり、その少なくとも一部は標的遺伝子の発現を調節する。マイクロＲＮＡファミリーの形成メンバーはｌｅｔ－７及びｌｉｎ－４である。ｌｅｔ－７遺伝子は、虫発達中に内因性タンパク質コード遺伝子の発現を調節する、小さく高度に保存されたＲＮＡ種をコードする。活性ＲＮＡ種は最初に約７０ｎｔの前駆体として転写され、これは転写後に成熟約２１ｎｔ形態に処理される。ｌｅｔ－７及びｌｉｎ－４の両方は、ダイサー酵素によってそれらの成熟形態にプロセシングされるヘアピンＲＮＡ前駆体として転写される。
【0394】
ＮＯＩに加えて、ベクターはまた、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ又は調節ｓｈＲＮＡを含むか又はコードし得る（Ｄｉｃｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ３７：１２８９－１２９５，Ｓｉｌｖａ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ３７：１２８１－１２８８）。
【0395】
二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）によって媒介される転写後遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）は、外来遺伝子の発現を制御するための保存された細胞防御機構である。トランスポゾン又はウイルス等の要素のランダムな組込みは、相同な一本鎖ｍＲＮＡ又はウイルスゲノムＲＮＡの配列特異的分解を活性化するｄｓＲＮＡの発現を引き起こすと考えられる。サイレンシング効果は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）として知られている（Ｒａｌｐｈ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ１１：４２９－４３３）。ＲＮＡｉの機構は、長いｄｓＲＮＡを約２１～２５ヌクレオチド（ｎｔ）ＲＮＡの二重鎖にプロセシングすることを含む。これらの産物は、ｍＲＮＡ分解の配列特異的メディエーターである低分子干渉ＲＮＡ又はサイレンシングＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）と呼ばれる。分化した哺乳動物細胞では、３０ｂｐ超のｄｓＲＮＡがインターフェロン応答を活性化し、タンパク質合成及び非特異的ｍＲＮＡ分解のシャットダウンをもたらすことが見出されている（Ｓｔａｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ６７：２２７－６４（１９９８））。しかしながら、この応答は、培養哺乳動物細胞において遺伝子機能を分析することを可能にする２１ｎｔのｓｉＲＮＡ二重鎖を使用することによって回避することができる（Ｅｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．Ｄｅｃ３；２０（２３）：６８７７－８８（２００１），Ｈｕｔｖａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．Ａｕｇ３，２９３（５５３１）：８３４－８．Ｅｕｐｕｂ Ｊｕｌ１２（２００１））。
【0396】
医薬組成物
本開示は、薬学的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤と組み合わせて、本明細書に記載のレンチウイルスベクター又は本明細書に記載のウイルスベクターで形質導入された細胞若しくは組織を含む医薬組成物を提供する。
本開示は、薬学的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤と組み合わせて、本明細書に記載のレンチウイルスベクター又は本明細書に記載のウイルスベクターで形質導入された細胞若しくは組織を含む医薬組成物を提供する。
【0397】
本開示は、遺伝子療法によって個体を治療するための医薬組成物であって、治療有効量のレンチウイルスベクターを含む医薬組成物を提供する。医薬組成物は、ヒト又は動物の使用のためのものであり得る。
【0398】
組成物は、薬学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤又はアジュバントを含み得る。薬学的担体、賦形剤又は希釈剤の選択は、意図された投与経路及び標準的な製薬実務に関して行うことができる。医薬組成物は、担体、賦形剤又は希釈剤に加えて、任意の適切な結合剤、潤滑剤、懸濁化剤、コーティング剤、可溶化剤、及び標的部位（例えば、脂質送達系等）へのベクターの進入を補助又は増加させることができる他の担体剤を含んでもよい。
【0399】
適切な場合、組成物は、任意の１つ以上の吸入；坐剤又はペッサリーの形態で；ローション、溶液、クリーム、軟膏又は粉剤の形態で局所的に；皮膚貼付剤の使用による；デンプン若しくはラクトース等の賦形剤を含有する錠剤の形態で経口的に、又は単独で若しくは賦形剤と混合したカプセル若しくは卵の形態で、又は香味料若しくは着色剤を含有するエリキシル剤、溶液若しくは懸濁液の形態の任意の１つ又は複数によって投与され得、或いは非経口的に、例えば、空洞内、静脈内、筋肉内、頭蓋内、眼内、腹腔内又は皮下に注射することができる。非経口投与の場合、組成物は、他の物質、例えば溶液を血液と等張にするのに十分な塩又は単糖類を含有し得る滅菌水溶液の形態で最もよく使用され得る。頬側又は舌下投与の場合、組成物は、従来の様式で製剤化することができる錠剤又はトローチ剤の形態で投与することができる。
【0400】
本明細書に記載されるレンチウイルスベクターはまた、標的細胞又は標的組織を必要とする患者にそれを移入する前に、エクスビボで当該標的細胞又は標的組織を形質導入するために使用され得る。そのような細胞の例は自己Ｔ細胞であり得、そのような組織の例はドナー角膜であり得る。
【0401】
変異体、誘導体、類似体、ホモログ及び断片
本明細書で言及される特定のタンパク質及びヌクレオチドに加えて、本発明はまた、その変異体、誘導体、類似体、ホモログ及び断片の使用も包含する。
本明細書で言及される特定のタンパク質及びヌクレオチドに加えて、本発明はまた、その変異体、誘導体、類似体、ホモログ及び断片の使用も包含する。
【0402】
本発明の文脈において、任意の所与の配列の変異体は、残基の特定の配列（アミノ酸残基又は核酸残基にかかわらず）が、問題のポリペプチド又はポリヌクレオチドがその内因性機能の少なくとも１つを保持するように改変されている配列である。変異体配列は、天然に存在するタンパク質中に存在する少なくとも１つの残基の付加、欠失、置換、修飾、置換え及び／又は変異によって得ることができる。
【0403】
本発明のタンパク質又はポリペプチドに関して本明細書で使用される「誘導体」という用語は、得られるタンパク質又はポリペプチドがその内因性機能の少なくとも１つを保持することを条件として、配列からの、又は配列への１つ（又は複数）のアミノ酸残基の任意の置換、変異、修飾、置換え、欠失及び／又は付加を含む。
【0404】
ポリペプチド又はポリヌクレオチドに関して本明細書で使用される「類似体」という用語は、任意の模倣物、すなわち、それが模倣するポリペプチド又はポリヌクレオチドの内因性機能の少なくとも１つを有する化学化合物を含む。
【0405】
典型的には、改変された配列が必要な活性又は能力を保持する限り、アミノ酸置換、例えば１、２又は３～１０又は２０個の置換が行われ得る。アミノ酸置換は、天然に存在しない類似体の使用を含み得る。
【0406】
本発明で使用されるタンパク質はまた、サイレント変化を生成し、機能的に等価なタンパク質をもたらすアミノ酸残基の欠失、挿入又は置換を有し得る。意図的なアミノ酸置換は、内因性機能が保持される限り、残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性及び／又は両親媒性の性質の類似性に基づいて行われ得る。例えば、負に荷電したアミノ酸には、アスパラギン酸及びグルタミン酸が含まれ、正に荷電したアミノ酸には、リジン及びアルギニンが含まれ、同様の親水性値を有する非荷電極性頭部基を有するアミノ酸には、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン及びチロシンが含まれる。
【0407】
保存的置換は、例えば以下の表に従って行うことができる。第２のカラム内の同じブロック内の、好ましくは第３のカラム内の同じライン内のアミノ酸は、互いに置換されてもよい。
【0408】
【表1】
【0409】
「ホモログ」という用語は、野生型アミノ酸配列及び野生型ヌクレオチド配列と一定の相同性を有する実体を意味する。「相同性」という用語は、「同一性」と同一視することができる。
【0410】
本文脈において、相同配列は、対象配列と少なくとも５０％、５５％、６５％、７５％、８５％又は９０％同一、好ましくは少なくとも９５％、９７又は９９％同一であり得るアミノ酸配列を含むと解釈される。典型的には、相同性は、対象のアミノ酸配列と同じ活性部位等を含む。相同性は類似性（すなわち、類似の化学的特性／機能を有するアミノ酸残基）に関しても考慮することができるが、本発明の文脈では、配列同一性に関して相同性を表現することが好ましい。
【0411】
本文脈において、相同配列は、対象配列と少なくとも５０％、５５％、６５％、７５％、８５％又は９０％同一、好ましくは少なくとも９５％、９７％、９８％又は９９％同一であり得るヌクレオチド配列を含むと解釈される。相同性は類似性に関しても考慮することができるが、本発明の文脈では、配列同一性の観点から相同性を表現することが好ましい。
【0412】
相同性比較は、眼によって、又はより一般的には、容易に利用可能な配列比較プログラムの助けを借りて行うことができる。これらの市販のコンピュータプログラムは、２つ以上の配列間の相同性又は同一性のパーセンテージを計算することができる。
【0413】
相同性パーセントは、連続した配列にわたって計算することができ、すなわち、一方の配列を他方の配列と整列させ、一方の配列中の各アミノ酸を他方の配列中の対応するアミノ酸と一度に１残基ずつ直接比較する。これは「ギャップなし」アラインメントと呼ばれる。典型的には、そのような非ギャップ整列は、比較的少数の残基にわたってのみ行われる。
【0414】
これは非常に単純で一貫した方法であるが、例えば、他の点では同一の配列対において、ヌクレオチド配列における１つの挿入又は欠失が、以下のコドンをアラインメントから外す原因となり得ることを考慮に入れることができず、したがって、全体的なアラインメントが行われるとき、相同性パーセントの大きな低下をもたらす可能性がある。その結果、ほとんどの配列比較方法は、全体的な相同性スコアを過度に不利にすることなく、可能性のある挿入及び欠失を考慮した最適なアラインメントを生成するように設計される。これは、局所相同性を最大化しようとするために配列アラインメントに「ギャップ」を挿入することによって達成される。
【0415】
しかしながら、これらのより複雑な方法は、アラインメントにおいて生じる各ギャップに「ギャップペナルティ」を割り当て、それにより、同じ数の同一のアミノ酸について、２つの比較される配列間のより高い関連性を反映して、可能な限り少ないギャップを有する配列アラインメントが、多くのギャップを有する配列よりも高いスコアを達成する。「アフィンギャップコスト」は、典型的には、ギャップの存在に対して比較的高いコストを課し、ギャップ内の各後続残差に対してより小さいペナルティを課す。これは、最も一般的に使用されるギャップスコアリングシステムである。高いギャップペナルティは、当然ながら、より少ないギャップで最適化されたアラインメントを生成する。ほとんどのアラインメントプログラムは、ギャップペナルティを修正することを可能にする。しかしながら、配列比較のためにそのようなソフトウェアを使用する場合、デフォルト値を使用することが好ましい。例えば、ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｂｅｓｔｆｉｔパッケージを使用する場合、アミノ酸配列のデフォルトのギャップペナルティは、ギャップに対して－１２、各伸長に対して－４である。
【0416】
したがって、最大パーセンテージの相同性の計算は、ギャップペナルティを考慮して、最適なアラインメントの生成を最初に必要とする。そのようなアラインメントを実施するための適切なコンピュータプログラムは、ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｂｅｓｔｆｉｔ ｐａｃｋａｇｅ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｕ．Ｓ．Ａ．；Ｄｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ１２：３８７）である。配列比較を実行することができる他のソフトウェアの例には、ＢＬＡＳＴパッケージ（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（１９９９）同上－Ｃｈ．１８を参照）、ＦＡＳＴＡ（Ａｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４０３－４１０）及びＧＥＮＥＷＯＲＫＳ比較ツール一式が含まれるが、これらに限定されない。ＢＬＡＳＴ及びＦＡＳＴＡの両方は、オフライン及びオンライン検索に利用可能である（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（１９９９）ｉｂｉｄ，ｐａｇｅｓ７－５８ ｔｏ７－６０を参照）。しかしながら、いくつかの用途では、ＧＣＧ Ｂｅｓｔｆｉｔプログラムを使用することが好ましい。ＢＬＡＳＴ２配列と呼ばれる別のツールもまた、タンパク質及びヌクレオチド配列を比較するために利用可能である（ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ（１９９９）１７４（２）：２４７－５０；ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ（１９９９）１７７（１）：１８７－８を参照されたい）。
【0417】
最終的な相同性パーセントは、同一性に関して測定することができるが、アラインメントプロセス自体は、典型的には、全か無かの対の比較に基づいていない。代わりに、化学的類似性又は進化的距離に基づいて各対比較にスコアを割り当てるスケーリングされた類似性スコア行列が一般に使用される。一般的に使用されるそのような行列の例は、ＢＬＡＳＴプログラム一式のデフォルト行列であるＢＬＯＳＵＭ６２行列である。ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎプログラムは、一般に、提供される場合、パブリックデフォルト値又はカスタムシンボル比較表のいずれかを使用する（更なる詳細についてはユーザマニュアルを参照）。いくつかの用途では、ＧＣＧパッケージの公開デフォルト値、又は他のソフトウェアの場合はＢＬＯＳＵＭ６２等のデフォルト行列を使用することが好ましい。
【0418】
ソフトウェアが最適なアラインメントを生成したら、相同性パーセント、好ましくは配列同一性パーセントを計算することが可能である。ソフトウェアは通常、配列比較の一部としてこれを行い、数値結果を生成する。
【0419】
「断片」もまた変異体であり、この用語は、典型的には、機能的に又は例えばアッセイのいずれかにおいて目的のポリペプチド又はポリヌクレオチドの選択された領域を指す。したがって、「断片」は、全長ポリペプチド又はポリヌクレオチドの一部であるアミノ酸又は核酸配列を指す。
【0420】
そのような変異体は、部位特異的突然変異誘発等の標準的な組換えＤＮＡ技術を使用して調製され得る。挿入が行われる場合、挿入部位の両側の天然に存在する配列に対応する５’及び３’フランキング領域と共に挿入をコードする合成ＤＮＡが作製され得る。フランキング領域は、配列が適切な酵素で切断され、合成ＤＮＡが断裂に連結されるように、天然に存在する配列の部位に対応する便利な制限部位を含む。次いで、ＤＮＡを本発明に従って発現させて、コードされたタンパク質を作製する。これらの方法は、ＤＮＡ配列の操作のための当技術分野で公知の多数の標準的な技術の例示にすぎず、他の公知の技術も使用することができる。
【0421】
本発明の細胞及び／又はモジュール式構築物における使用に適した調節タンパク質の全ての変異体、断片又はホモログは、ＮＯＩの翻訳がウイルスベクター産生細胞において抑制又は防止されるように、ＮＯＩの同族結合部位に結合する能力を保持する。
【0422】
結合部位の全ての変異体断片又はホモログは、ＮＯＩの翻訳がウイルスベクター産生細胞において抑制又は防止されるように、同族ＲＮＡ結合タンパク質に結合する能力を保持する。
【0423】
コドン最適化
本発明で使用されるポリヌクレオチド（ベクター産生系のＮＯＩ及び／又はコンポーネントを含む）は、コドン最適化され得る。コドン最適化は、国際公開第１９９９／４１３９７号パンフレット及び国際公開第２００１／７９５１８号パンフレットに以前に記載されている。異なる細胞は、特定のコドンの使用が異なる。このコドンバイアスは、細胞型における特定のｔＲＮＡの相対的存在量におけるバイアスに対応する。対応するｔＲＮＡの相対的存在量と一致するように調整されるように配列中のコドンを変化させることによって、発現を増加させることが可能である。同様に、対応するｔＲＮＡが特定の細胞型において稀であることが知られているコドンを意図的に選択することによって、発現を減少させることが可能である。したがって、更なる程度の翻訳制御が利用可能である。
本発明で使用されるポリヌクレオチド（ベクター産生系のＮＯＩ及び／又はコンポーネントを含む）は、コドン最適化され得る。コドン最適化は、国際公開第１９９９／４１３９７号パンフレット及び国際公開第２００１／７９５１８号パンフレットに以前に記載されている。異なる細胞は、特定のコドンの使用が異なる。このコドンバイアスは、細胞型における特定のｔＲＮＡの相対的存在量におけるバイアスに対応する。対応するｔＲＮＡの相対的存在量と一致するように調整されるように配列中のコドンを変化させることによって、発現を増加させることが可能である。同様に、対応するｔＲＮＡが特定の細胞型において稀であることが知られているコドンを意図的に選択することによって、発現を減少させることが可能である。したがって、更なる程度の翻訳制御が利用可能である。
【0424】
レトロウイルスを含む多くのウイルスは、多数の稀少コドンを使用し、これらを一般的に使用される哺乳動物コドンに対応するように変化させ、目的の遺伝子、例えばＮＯＩの発現又は哺乳動物産生細胞中のパッケージングコンポーネントの発現の増加が達成され得る。コドン使用頻度表は、哺乳動物細胞及び様々な他の生物について当技術分野で公知である。
【0425】
ウイルスベクターコンポーネントのコドン最適化には、多数の他の利点がある。それらの配列の変化により、プロデューサ細胞／パッケージング細胞におけるウイルス粒子の集合に必要なウイルス粒子のパッケージングコンポーネントをコードするヌクレオチド配列は、それらから除去されたＲＮＡ不安定性配列（ＩＮＳ）を有する。同時に、パッケージングコンポーネントのアミノ酸配列コード配列は、配列によってコードされるウイルスコンポーネントが同じままであるか、又はパッケージングコンポーネントの機能が損なわれないように少なくとも十分に類似するように保持される。レンチウイルスベクターでは、コドン最適化はまた、エクスポートのためのＲｅｖ／ＲＲＥ要件を克服し、最適化された配列をＲｅｖ非依存性にする。コドン最適化はまた、ベクター系内の異なる構築物間（例えば、ｇａｇ－ｐｏｌ及びｅｎｖオープンリーディングフレームにおける重複領域間）の相同組換えを減少させる。したがって、コドン最適化の全体的な効果は、ウイルス力価の顕著な増加及び安全性の改善である。
【0426】
一実施形態では、ＩＮＳに関連するコドンのみがコドン最適化される。しかしながら、はるかに好ましい実用的な実施形態では、配列は、いくつかの例外を除いて、例えば、ｇａｇ－ｐｏｌのフレームシフト部位を包含する配列（下記参照）を除いて、それらの全体がコドン最適化される。
【0427】
レンチウイルスベクターのｇａｇ－ｐｏｌ遺伝子は、ｇａｇ－ｐｏｌタンパク質をコードする２つの重複するリーディングフレームを含む。両方のタンパク質の発現は、翻訳中のフレームシフトに依存する。このフレームシフトは、翻訳中のリボソーム「滑り」の結果として起こる。この滑りは、少なくとも部分的にはリボソーム停止ＲＮＡ二次構造によって引き起こされると考えられる。このような二次構造は、ｇａｇ－ｐｏｌ遺伝子のフレームシフト部位の下流に存在する。ＨＩＶの場合、重複領域は、ｇａｇの始まりの下流のヌクレオチド１２２２（ヌクレオチド１はｇａｇ ＡＴＧのＡである）からｇａｇの終わり（ｎｔ １５０３）まで延在する。その結果、フレームシフト部位及び２つのリーディングフレームの重複領域にまたがる２８１ｂｐ断片は、好ましくはコドン最適化されない。このフラグメントを保持することにより、Ｇａｇ－Ｐｏｌタンパク質のより効率的な発現が可能になる。ＥＩＡＶの場合、重複の開始はｎｔ １２６２（ヌクレオチド１はｇａｇ ＡＴＧのＡである）であると解釈され、重複の終了はｎｔ １４６１であると解釈されている。フレームシフト部位及びｇａｇ－ｐｏｌ重複が保存されることを確実にするために、野生型配列はｎｔ １１５６～１４６５に保持されている。
【0428】
最適なコドン使用頻度からの誘導体が、例えば、好都合な制限部位に適応するために作製される場合があり、保存的なアミノ酸変化がＧａｇ－Ｐｏｌタンパク質に導入される場合がある。
【0429】
一実施形態では、コドン最適化は、低発現哺乳動物遺伝子に基づく。第３の塩基、場合によっては第２の塩基及び第３の塩基を変更することができる。
【0430】
遺伝暗号の縮重性に起因して、多数のｇａｇ－ｐｏｌ配列が当業者によって達成され得ることが理解されるであろう。また、コドン最適化されたｇａｇ－ｐｏｌ配列を生成するための出発点として使用することができる多くのレトロウイルス変異体が記載されている。レンチウイルスのゲノムは非常に多様であり得る。例えば、依然として機能的であるＨＩＶ－１の多くの準種が存在する。これはＥＩＡＶにも当てはまる。これらの変異体は、形質導入プロセスの特定の部分を強化するために使用され得る。ＨＩＶ－１変異体の例は、Ｌｏｓ Ａｌａｍｏｓ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｅｃｕｒｉｔｙ，ＬＬＣによって運営されているＨＩＶ Ｄａｔａｂａｓｅのｈｔｔｐ：／／ｈｉｖ－ｗｅｂ．ｌａｎｌ．ｇｏｖ．に見出すことができる。ＥＩＡＶクローンの詳細は、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．に位置するＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）データベースで見出すことができる。
【0431】
コドン最適化されたｇａｇ－ｐｏｌ配列に対する戦略は、任意のレトロウイルスに関して使用され得る。これは、ＥＩＡＶ、ＦＩＶ、ＢＩＶ、ＣＡＥＶ、ＶＭＲ、ＳＩＶ、ＨＩＶ－１及びＨＩＶ－２を含む全てのレンチウイルスに適用される。更に、この方法は、ＨＴＬＶ－１、ＨＴＬＶ－２、ＨＦＶ、ＨＳＲＶ及びヒト内因性レトロウイルス（ＨＥＲＶ）、ＭＬＶ及び他のレトロウイルス由来の遺伝子の発現を増加させるために使用することができる。
【0432】
コドン最適化は、ｇａｇ－ｐｏｌ発現をＲｅｖ非依存性にすることができる。しかしながら、レンチウイルスベクターにおける抗ｒｅｖ因子又はＲＲＥ因子の使用を可能にするためには、ウイルスベクター産生系を完全にＲｅｖ／ＲＲＥ非依存性にすることが必要であろう。したがって、ゲノムも改変される必要がある。これは、ベクターゲノムコンポーネントを最適化することによって達成される。有利には、これらの改変はまた、プロデューサ細胞及び形質導入細胞の両方に全ての追加のタンパク質が存在しないより安全な系の産生をもたらす。
【0433】
本開示は、本明細書に開示される例示的な方法及び材料によって限定されず、本明細書に記載されるものと同様又は同等の任意の方法及び材料を、本開示の実施形態の実施又は試験に使用することができる。数値範囲は、範囲を定義する数を含む。別段示されない限り、任意の核酸配列は、５’から３’配向に左から右に書かれ、アミノ酸配列は、それぞれアミノからカルボキシへの配向で左から右に書かれている。
【0434】
値の範囲が提供される場合、その範囲の上限と下限との間の、文脈上明確に指示されない限り、下限の単位の１０分の１までの各介在値も具体的に開示されることが理解される。記載された範囲内の任意の記載された値又は介在する値と、その記載された範囲内の任意の他の記載された値又は介在する値との間のより小さい各範囲は、本開示内に包含される。これらのより小さい範囲の上限及び下限は、独立して範囲に含まれても除外されてもよく、記載された範囲内の任意の具体的に除外された限界を条件として、より小さい範囲に含まれるいずれかの限界、どちらでもない限界、両方の限界の各範囲も本開示内に包含される。記載された範囲が限界の一方又は両方を含む場合、それらの含まれる限界の一方又は両方を除外した範囲も本開示に含まれる。
【0435】
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈上他に明確に指示されない限り、複数の指示対象を含むことに留意されたい。
【0436】
本明細書で使用される場合、「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、及び「から構成される（ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ ｏｆ）」という用語は、「含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、又は「含有すること（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」と同義であり、包括的又はオープンエンドであり、追加の列挙されていない部材、要素又は方法工程を排除しない。「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、及び「から構成される（ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ ｏｆ）」という用語は、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」も含む。
【0437】
本明細書で論じられる刊行物は、本出願の出願日前のそれらの開示のためにのみ提供される。本明細書のいかなるものも、そのような刊行物が添付の特許請求の範囲に対する先行技術を構成することの承認として解釈されるべきではない。
【0438】
ここで、本発明を実施例によって更に説明するが、これらは当業者が本発明を実施するのを助けるのに役立つことを意図しており、決して本発明の範囲を限定することを意図していない。
【実施例】
【0439】
材料及び方法
ＰＥＩＰｒｏ／ＤＮＡ複合体の調製
標準的なＰＥＩｐｒｏ調製方法は以下の通りである。
１．「ＰＥＩミックス」を作製する。ＰＥＩＰｒｏを約１：２０の比で培養培地に添加する。添加が完了した後、旋回によって簡単に混合する。
２．「ＤＮＡミックス」を作製する。ＤＮＡプラスミドをおよそ１：２０の比で培地に添加する。
３．ＰＥＩ及びＤＮＡミックスを組み合わせる。次いで、ＰＥＩ混合物を、注ぎ又は圧送のいずれかによって、１：１の比でＤＮＡ混合物に添加する。次いで、トランスフェクション混合物を室温でインキュベートして複合体形成を可能にする。
ＰＥＩＰｒｏ／ＤＮＡ複合体の調製
標準的なＰＥＩｐｒｏ調製方法は以下の通りである。
１．「ＰＥＩミックス」を作製する。ＰＥＩＰｒｏを約１：２０の比で培養培地に添加する。添加が完了した後、旋回によって簡単に混合する。
２．「ＤＮＡミックス」を作製する。ＤＮＡプラスミドをおよそ１：２０の比で培地に添加する。
３．ＰＥＩ及びＤＮＡミックスを組み合わせる。次いで、ＰＥＩ混合物を、注ぎ又は圧送のいずれかによって、１：１の比でＤＮＡ混合物に添加する。次いで、トランスフェクション混合物を室温でインキュベートして複合体形成を可能にする。
【0440】
水性ＰＥＩｐｒｏ法は以下の通りである。
１．「ＰＥＩミックス」を作製する。ＰＥＩＰｒｏを約１：２０の比で水に添加する。添加が完了した後、旋回によって簡単に混合する。添加時間も、添加後のインキュベーション時間も、時間依存性ではない。
２．「ＤＮＡミックス」を作製する。ＤＮＡプラスミドを約１：２０の比で水に添加する。添加時間も、添加後のインキュベーション時間も、時間依存性ではない。
３．ＰＥＩ及びＤＮＡミックスを組み合わせる。次いで、ＰＥＩ混合物を、注ぎ又は圧送のいずれかによって、１：１の比でＤＮＡ混合物に添加する。完了後に混合物を簡単に旋回させる。添加時間も、添加後のインキュベーション時間も、時間依存性ではない。
４．ＰＢＳをスパイクする。ＰＢＳの最終濃度が０．２Ｘに等しくなるように、１０Ｘ ＰＢＳを１０Ｘ ＰＢＳと最終トランスフェクション容量との約１：５０の比で添加する。添加直後に混合物を短時間旋回させ、タイマーを開始させる。混合物を室温でインキュベートして複合体形成を可能にする。
１．「ＰＥＩミックス」を作製する。ＰＥＩＰｒｏを約１：２０の比で水に添加する。添加が完了した後、旋回によって簡単に混合する。添加時間も、添加後のインキュベーション時間も、時間依存性ではない。
２．「ＤＮＡミックス」を作製する。ＤＮＡプラスミドを約１：２０の比で水に添加する。添加時間も、添加後のインキュベーション時間も、時間依存性ではない。
３．ＰＥＩ及びＤＮＡミックスを組み合わせる。次いで、ＰＥＩ混合物を、注ぎ又は圧送のいずれかによって、１：１の比でＤＮＡ混合物に添加する。完了後に混合物を簡単に旋回させる。添加時間も、添加後のインキュベーション時間も、時間依存性ではない。
４．ＰＢＳをスパイクする。ＰＢＳの最終濃度が０．２Ｘに等しくなるように、１０Ｘ ＰＢＳを１０Ｘ ＰＢＳと最終トランスフェクション容量との約１：５０の比で添加する。添加直後に混合物を短時間旋回させ、タイマーを開始させる。混合物を室温でインキュベートして複合体形成を可能にする。
【0441】
上記工程の後にトランスフェクションを行ってもよい。バイオリアクター実験のために、３０分間のインキュベーション後に、トランスフェクションミックスをハンドポンプを介してバイオリアクターに添加した。インキュベーション期間は、時間経過実験が実行された振盪フラスコ試験では変化した。
【0442】
振盪フラスコ実験条件
培養培地中で調製したＤＮＡ／ＰＥＩＰｒｏ複合体を使用したＧＦＰベクター産生に対するトランスフェクション複合体インキュベーション時間の影響を調べるために、上記のように単一のトランスフェクションミックスを調製し、複合体形成後に室温で最大６０分間放置した。所定の間隔で、バルクトランスフェクションミックスからおよそ２ｍＬの一定分量を取り出し、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を播種した個々のＥ１２５エルレンマイヤーフラスコをトランスフェクトするために使用した。振盪フラスコ中の最終容量は４０ｍＬであったので、トランスフェクション容量は１：２０の比を示した。
培養培地中で調製したＤＮＡ／ＰＥＩＰｒｏ複合体を使用したＧＦＰベクター産生に対するトランスフェクション複合体インキュベーション時間の影響を調べるために、上記のように単一のトランスフェクションミックスを調製し、複合体形成後に室温で最大６０分間放置した。所定の間隔で、バルクトランスフェクションミックスからおよそ２ｍＬの一定分量を取り出し、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を播種した個々のＥ１２５エルレンマイヤーフラスコをトランスフェクトするために使用した。振盪フラスコ中の最終容量は４０ｍＬであったので、トランスフェクション容量は１：２０の比を示した。
【0443】
実施例１－トランスフェクションミックスを培地中で調製する場合、最高力価をもたらす最適なインキュベーション時間が短すぎてＧＭＰ製造に適用できない
データは、ＤＮＡ／ＰＥＩＰｒｏ（登録商標）複合体のインキュベーション期間が、その後のトランスフェクション及びレンチウイルスベクター産生に有意に影響を及ぼすことを実証している（図１）。データは、最も高い力価をもたらす最適なインキュベーション時間が約３分であり、インキュベーション時間が１５分又は３０分に延長される場合、これは急速に減少することを示す。これは、大規模ＧＭＰ製造目的のためのＰＥＩＰｒｏ（登録商標）プロセスを開発することに関して重大な問題を表す。最大６時間の複合体安定性が最小限の時間制限である堅牢なプロセスを可能にする標準的なリポフェクタミン２０００ＣＤベースのプロセスと比較して、複合体を調製し、５分以内にバイオリアクターに添加しなければならないという要件は、大規模なＧＭＰ生産には実用的ではないプロセス自体に著しい時間制限を課す。
データは、ＤＮＡ／ＰＥＩＰｒｏ（登録商標）複合体のインキュベーション期間が、その後のトランスフェクション及びレンチウイルスベクター産生に有意に影響を及ぼすことを実証している（図１）。データは、最も高い力価をもたらす最適なインキュベーション時間が約３分であり、インキュベーション時間が１５分又は３０分に延長される場合、これは急速に減少することを示す。これは、大規模ＧＭＰ製造目的のためのＰＥＩＰｒｏ（登録商標）プロセスを開発することに関して重大な問題を表す。最大６時間の複合体安定性が最小限の時間制限である堅牢なプロセスを可能にする標準的なリポフェクタミン２０００ＣＤベースのプロセスと比較して、複合体を調製し、５分以内にバイオリアクターに添加しなければならないという要件は、大規模なＧＭＰ生産には実用的ではないプロセス自体に著しい時間制限を課す。
【0444】
実施例２－複合体形成の速度論は、トランスフェクションミックスを水中で調製し、ＤＮＡ／ＰＥＩＰｒｏ（登録商標）複合体形成を開始するために使用されるＰＢＳ濃度を変化させることによって改変することができる
トランスフェクション複合体は、ＧＦＰベクターを使用して、「ＰＥＩＰｒｏ／ＤＮＡ複合体の調製」という小見出しの下で上記のように調製した。バルクトランスフェクションミックスを水中で調製し、３つの方法に分けた。ＰＢＳの最終濃度が１Ｘに等しくなるように、トランスフェクション複合体の割合を１０Ｘ ＰＢＳの容量でスパイクした。トランスフェクションミックスの一部を、最終濃度が０．２Ｘに等しくなるように１０Ｘ ＰＢＳでスパイクした。残りのトランスフェクションミックスは触れないままにし、ＰＢＳでスパイクしなかった。次いで、ＰＢＳをスパイクした２つの調製物を室温で最大２時間インキュベートした。所定の間隔で、バルクトランスフェクションミックスからおよそ２ｍＬの一定分量を取り出し、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を播種した個々のＥ１２５エルレンマイヤーフラスコをトランスフェクトするために使用した。振盪フラスコ中の最終容量は４０ｍＬであったので、トランスフェクション容量は１：２０の比を示した。
トランスフェクション複合体は、ＧＦＰベクターを使用して、「ＰＥＩＰｒｏ／ＤＮＡ複合体の調製」という小見出しの下で上記のように調製した。バルクトランスフェクションミックスを水中で調製し、３つの方法に分けた。ＰＢＳの最終濃度が１Ｘに等しくなるように、トランスフェクション複合体の割合を１０Ｘ ＰＢＳの容量でスパイクした。トランスフェクションミックスの一部を、最終濃度が０．２Ｘに等しくなるように１０Ｘ ＰＢＳでスパイクした。残りのトランスフェクションミックスは触れないままにし、ＰＢＳでスパイクしなかった。次いで、ＰＢＳをスパイクした２つの調製物を室温で最大２時間インキュベートした。所定の間隔で、バルクトランスフェクションミックスからおよそ２ｍＬの一定分量を取り出し、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を播種した個々のＥ１２５エルレンマイヤーフラスコをトランスフェクトするために使用した。振盪フラスコ中の最終容量は４０ｍＬであったので、トランスフェクション容量は１：２０の比を示した。
【0445】
１Ｘスパイクのトランスフェクションミックスについて、９つの振盪フラスコを以下の時間間隔；１分；２分；３分；４分；５分；６分；７分；１５分；３０分及び６０分及び１２０分でトランスフェクトした。更なる１２の振盪フラスコに、０．２Ｘ ＰＢＳトランスフェクションミックスを１分；２分；３分；４分；６分；１０分；１５分；２０分；２５分；３０分及び４０分でトランスフェクトした。
【0446】
ＧＦＰベクター産生プロセスの最後に、各振盪フラスコから試料を採取し、フローサイトメトリーに基づく形質導入アッセイを使用して機能的力価を決定した。結果は、ＰＢＳ濃度を変えることによって複合体成長の速度論を修正できることを示している（図２）。図２Ａは、トランスフェクション複合体を１Ｘ ＰＢＳでスパイクした場合、３分のインキュベーション後に最適な力価が達成されたことを示す。図２Ｂは、トランスフェクション複合体に低濃度のＰＢＳでスパイクすると、インキュベーション時間を延長できることを示す。０．２Ｘ ＰＢＳによるスパイクは、最適なインキュベーション時間を約２５分に延長する。陰性対照として、複合体を水中で調製し、次いで、ＰＢＳをスパイクせずに細胞をトランスフェクトするために使用した。ＰＢＳが複合体増殖を開始するために必要であることを示すベクターは作製されなかった。
【0447】
実施例３－トランスフェクション効率は、トランスフェクション混合物を希釈して塩濃度を低下させた後（及び複合体成長を停止させた後）、最大１２時間、潜在的には最大１週間安定である
トランスフェクションミックスを上記のように調製し、０．２Ｘ ＰＢＳでスパイクして複合体の増殖を開始させ、次いで３０分間インキュベートして複合体の最適サイズに到達させた。次いで、ＰＢＳの最終濃度が０．１Ｘになるように、トランスフェクションミックスを塩を含まない水溶液（すなわち、Ｈ２Ｏ）を用いて希釈した。次いで、トランスフェクションミックスを４℃で最大１週間保存した。希釈ＰＥＩＰｒｏ（登録商標）／ＤＮＡ複合体の安定性を試験するために、希釈後の様々なインキュベーション時間後に複合体を使用して達成された機能性レンチウイルスベクターの力価を評価した。次いで、トランスフェクションミックスの一定分量を使用してＧＦＰレンチウイルスを作製し、得られた機能的力価を測定した。結果は、希釈複合体のトランスフェクション効率が経時的に保持され（図３）、４℃で少なくとも１週間安定であることを実証している。特に、グラフは、１２時間のインキュベーション後、トランスフェクションミックスがレンチウイルスベクターを生成するのに依然として効率的であり、「新鮮な」トランスフェクションミックスと比較して同等の機能的力価をもたらしたことを示している。
トランスフェクションミックスを上記のように調製し、０．２Ｘ ＰＢＳでスパイクして複合体の増殖を開始させ、次いで３０分間インキュベートして複合体の最適サイズに到達させた。次いで、ＰＢＳの最終濃度が０．１Ｘになるように、トランスフェクションミックスを塩を含まない水溶液（すなわち、Ｈ２Ｏ）を用いて希釈した。次いで、トランスフェクションミックスを４℃で最大１週間保存した。希釈ＰＥＩＰｒｏ（登録商標）／ＤＮＡ複合体の安定性を試験するために、希釈後の様々なインキュベーション時間後に複合体を使用して達成された機能性レンチウイルスベクターの力価を評価した。次いで、トランスフェクションミックスの一定分量を使用してＧＦＰレンチウイルスを作製し、得られた機能的力価を測定した。結果は、希釈複合体のトランスフェクション効率が経時的に保持され（図３）、４℃で少なくとも１週間安定であることを実証している。特に、グラフは、１２時間のインキュベーション後、トランスフェクションミックスがレンチウイルスベクターを生成するのに依然として効率的であり、「新鮮な」トランスフェクションミックスと比較して同等の機能的力価をもたらしたことを示している。
【0448】
実施例４－ＤＮＡ：ＰＥＩｐｒｏ複合体をＨ２Ｏ中で作製した場合の経時的なサイズを示す動的光散乱分析（Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏｍｅｔｅｒ ＺＳ Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ，Ｍａｌｖｅｒｎ，ＵＫ）。
ＤＮＡ／ＰＥＩｐｒｏ複合体を上記のようにＨ２Ｏ中で調製し、次いで、トランスフェクション混合物のサンプルを６０分間にわたって２分間隔で取り出し、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒを用いて分析して複合体サイズを測定した。図４は、複合体が６０分間にわたってサイズが増加しなかったことを示す。これは、水のみで構成された複合体がベクター産生をもたらさなかったことを実証した図２Ｂに示されるデータと相関する。このデータは、ＤＬＳ測定と共に、８０～８６ｎｍのサイズ範囲内の複合体が小さすぎてトランスフェクションに成功しないことを示唆している。
ＤＮＡ／ＰＥＩｐｒｏ複合体を上記のようにＨ２Ｏ中で調製し、次いで、トランスフェクション混合物のサンプルを６０分間にわたって２分間隔で取り出し、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒを用いて分析して複合体サイズを測定した。図４は、複合体が６０分間にわたってサイズが増加しなかったことを示す。これは、水のみで構成された複合体がベクター産生をもたらさなかったことを実証した図２Ｂに示されるデータと相関する。このデータは、ＤＬＳ測定と共に、８０～８６ｎｍのサイズ範囲内の複合体が小さすぎてトランスフェクションに成功しないことを示唆している。
【0449】
実施例５－トランスフェクションミックスを２倍希釈すると、最適な粒径での成長が停止する。
ＤＮＡ／ＰＥＩｐｒｏ複合体を上記のようにＨ２Ｏ中で構成し、ＰＢＳを０．２Ｘの最終濃度まで添加することによって粒子成長を開始した。複合体を室温で２５分間インキュベートしたが、これは最高の機能的力価を達成するための最適時間に相当した（図２Ｂ参照）。次いで、複合体をＰＢＳ濃度が０．１Ｘになるように２倍希釈した。次いで、複合体サイズを最大４５分間にわたって経時的に測定した。ＤＬＳ測定は、トランスフェクションミックスを２倍希釈すると、複合体の成長が停止し、サイズは６００～８００ｎｍの間のままであることが分かったことを示す（図５）。このデータを上記の実施例２及び３で生成された関数データと相関させることにより、最高の力価を達成する最適な複合体サイズが６００～８００ｎｍであることが示唆される。
ＤＮＡ／ＰＥＩｐｒｏ複合体を上記のようにＨ２Ｏ中で構成し、ＰＢＳを０．２Ｘの最終濃度まで添加することによって粒子成長を開始した。複合体を室温で２５分間インキュベートしたが、これは最高の機能的力価を達成するための最適時間に相当した（図２Ｂ参照）。次いで、複合体をＰＢＳ濃度が０．１Ｘになるように２倍希釈した。次いで、複合体サイズを最大４５分間にわたって経時的に測定した。ＤＬＳ測定は、トランスフェクションミックスを２倍希釈すると、複合体の成長が停止し、サイズは６００～８００ｎｍの間のままであることが分かったことを示す（図５）。このデータを上記の実施例２及び３で生成された関数データと相関させることにより、最高の力価を達成する最適な複合体サイズが６００～８００ｎｍであることが示唆される。
【0450】
実施例６－ＤＬＳ分析は、異なる濃度のＰＢＳが複合体成長の速度論に影響を及ぼすことを示す。
ＤＮＡ／ＰＥＩｐｒｏ複合体を上記のように水中で構成し、３つの異なる濃度のＰＢＳ（０．１Ｘ；０．１５Ｘ及び０．２Ｘ）の添加によって粒子成長を開始させ、室温でインキュベートした。次いで、サンプルを２分毎に取り出し、ゼータサイザーＺｅｔａｓｉｚｅｒ（Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏｍｅｔｅｒ ＺＳ Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ，Ｍａｌｖｅｒｎ，ＵＫ）を用いて分析した。結果は、トランスフェクションミックスに異なる濃度のＰＢＳでスパイクした場合、複合体がトランスフェクションに最適なサイズに成長する速度が、添加されたＰＢＳの濃度に応じて異なることを示す。ＰＢＳの濃度が＜０．１５Ｘ ＰＢＳで低すぎる場合、これは複合体成長を開始するのに十分に濃縮されていない（図６）。表１は、最適なサイズに達するのにかかる時間に対する複合体成長に対する異なるＰＢＳ濃度の効果を示す。
ＤＮＡ／ＰＥＩｐｒｏ複合体を上記のように水中で構成し、３つの異なる濃度のＰＢＳ（０．１Ｘ；０．１５Ｘ及び０．２Ｘ）の添加によって粒子成長を開始させ、室温でインキュベートした。次いで、サンプルを２分毎に取り出し、ゼータサイザーＺｅｔａｓｉｚｅｒ（Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏｍｅｔｅｒ ＺＳ Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ，Ｍａｌｖｅｒｎ，ＵＫ）を用いて分析した。結果は、トランスフェクションミックスに異なる濃度のＰＢＳでスパイクした場合、複合体がトランスフェクションに最適なサイズに成長する速度が、添加されたＰＢＳの濃度に応じて異なることを示す。ＰＢＳの濃度が＜０．１５Ｘ ＰＢＳで低すぎる場合、これは複合体成長を開始するのに十分に濃縮されていない（図６）。表１は、最適なサイズに達するのにかかる時間に対する複合体成長に対する異なるＰＢＳ濃度の効果を示す。
【0451】
【表2】
【0452】
実施例７－複合増殖を開始するために任意の塩を使用することができる
ＤＮＡ／ＰＥＩｐｒｏ複合体をＨ２Ｏ中で調製し、次いで、異なる濃度のＮａＣｌ又はＭｇＣｌ２でスパイクした。図７Ａ及び表２は、４つの異なる濃度のＮａＣｌ（１０ｍＭ；２０ｍＭ；５０ｍＭ；８０ｍＭ及び１００ｍＭ）でトランスフェクションミックスをスパイクすることの影響を示す。８０ｍＭ及び１００ｍＭの濃度のみが有意な複合体成長を開始させた。図７Ｂ及び表３は、４つの異なる濃度のＭｇＣｌ２（１０ｍＭ；２０ｍＭ；５０ｍＭ；８０ｍＭ；１００ｍＭ）でトランスフェクションミックスをスパイクすることの影響を示す。ＭｇＣｌ２はより高いイオン強度を有するので、より低い濃度で錯体成長を開始し、最適な複合体サイズに達するのにかかる時間はＮａＣｌより速かった。
ＤＮＡ／ＰＥＩｐｒｏ複合体をＨ２Ｏ中で調製し、次いで、異なる濃度のＮａＣｌ又はＭｇＣｌ２でスパイクした。図７Ａ及び表２は、４つの異なる濃度のＮａＣｌ（１０ｍＭ；２０ｍＭ；５０ｍＭ；８０ｍＭ及び１００ｍＭ）でトランスフェクションミックスをスパイクすることの影響を示す。８０ｍＭ及び１００ｍＭの濃度のみが有意な複合体成長を開始させた。図７Ｂ及び表３は、４つの異なる濃度のＭｇＣｌ２（１０ｍＭ；２０ｍＭ；５０ｍＭ；８０ｍＭ；１００ｍＭ）でトランスフェクションミックスをスパイクすることの影響を示す。ＭｇＣｌ２はより高いイオン強度を有するので、より低い濃度で錯体成長を開始し、最適な複合体サイズに達するのにかかる時間はＮａＣｌより速かった。
【0453】
【表3】
【0454】
【表4】
【0455】
実施例８－ａｑＰＥＩＰｒｏトランスフェクション法を使用して５Ｌスケールで得られた機能的力価値は、カチオン性脂質ベースのトランスフェクション法を使用して治療用ベクター産物を製造した場合に得られたものと比較して有利である。
６つの５Ｌバイオリアクターをこの研究で使用し、４つのバイオリアクターをカチオン性脂質ベースのトランスフェクション法を使用して一過性にトランスフェクトし、他の２つのバイオリアクターを記載のａｑＰＥＩＰｒｏ（登録商標）法を使用してトランスフェクトした。両バイオリアクターを、５Ｔ４－ＣＡＲをコードするＨＩＶ－１ベクターゲノムで一過性にトランスフェクトした。この治療用ベクターは、抗原５Ｔ４を発現する腫瘍細胞を標的化し、死滅させることを可能にするＴ細胞の遺伝子改変のためのものである（Ｏｗｅｎｓ，Ｌ．Ｇ；Ｓｈｅａｒｄ，Ｖ．Ｅ ｅｔ ａｌ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２０１８Ａｐｒ；４１（３）：１３０－１４０）。
６つの５Ｌバイオリアクターをこの研究で使用し、４つのバイオリアクターをカチオン性脂質ベースのトランスフェクション法を使用して一過性にトランスフェクトし、他の２つのバイオリアクターを記載のａｑＰＥＩＰｒｏ（登録商標）法を使用してトランスフェクトした。両バイオリアクターを、５Ｔ４－ＣＡＲをコードするＨＩＶ－１ベクターゲノムで一過性にトランスフェクトした。この治療用ベクターは、抗原５Ｔ４を発現する腫瘍細胞を標的化し、死滅させることを可能にするＴ細胞の遺伝子改変のためのものである（Ｏｗｅｎｓ，Ｌ．Ｇ；Ｓｈｅａｒｄ，Ｖ．Ｅ ｅｔ ａｌ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２０１８Ａｐｒ；４１（３）：１３０－１４０）。
【0456】
製造プロセスの最後に試料を採取し、形質導入アッセイ及びフローサイトメトリー分析を使用して機能的力価を決定した。
【0457】
この試験で５Ｌスケールで得られた機能的力価値は、カチオン性脂質ベースのトランスフェクション法を使用して生成物を製造した場合に得られたものと比較して有利であり、データはより一貫しているようであった（ｎ＝２）。水性ＰＥＩＰｒｏ法を使用して得られた平均粗収穫値は、カチオン性脂質ベースのトランスフェクション法（ｎ＝４）を使用した３．５３７５ｘ１０５ＴＵ／ｍＬ（標準偏差＝＋／－１．８ｘ１０５ＴＵ／ｍＬ）と比較して、４．８２．２５ｘ１０５ＴＵ／ｍＬ（標準偏差＝＋／－６．８ｘ１０４ＴＵ／ｍＬ）の力価をもたらしたことが分かる。これは、ａｑＰＥＩＰｒｏトランスフェクション法がカチオン性脂質ベースのトランスフェクション法と同等にうまく機能し、５Ｌに拡張可能であることを示唆している（図８）。
【0458】
上記の明細書で言及された全ての刊行物は、参照により本明細書に組み込まれる。本発明の記載された方法及びシステムの様々な修正及び変形は、本発明の範囲及び趣旨から逸脱することなく当業者には明らかであろう。本発明を特定の好ましい実施形態に関連して説明したが、特許請求される本発明はそのような特定の実施形態に過度に限定されるべきではないことを理解されるべきである。実際、分子生物学又は関連分野の当業者に明らかな、本発明を実施するための記載された様式の様々な改変は、以下の特許請求の範囲内であることが意図される。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【国際調査報告】