特表 2023-551431 ＥＧＦの生産方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-12-08

(54)【発明の名称】ＥＧＦの生産方法

(51)【国際特許分類】

   C07K 1/10 20060101AFI20231201BHJP

【ＦＩ】

C07K1/10

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023530177

(86)(22)【出願日】2021-11-05

(85)【翻訳文提出日】2023-07-18

(86)【国際出願番号】 IB2021060271

(87)【国際公開番号】W WO2022106951

(87)【国際公開日】2022-05-27

(31)【優先権主張番号】20200100690

(32)【優先日】2020-11-20

(33)【優先権主張国・地域又は機関】GR

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】513042676

【氏名又は名称】ケミカル アンド バイオファーマシューティカル ラボラトリーズ オブ パトラ エス．エー．

(74)【代理人】

【識別番号】100099759

【弁理士】

【氏名又は名称】青木 篤

(74)【代理人】

【識別番号】100123582

【弁理士】

【氏名又は名称】三橋 真二

(74)【代理人】

【識別番号】100117019

【弁理士】

【氏名又は名称】渡辺 陽一

(74)【代理人】

【識別番号】100141977

【弁理士】

【氏名又は名称】中島 勝

(74)【代理人】

【識別番号】100138210

【弁理士】

【氏名又は名称】池田 達則

(72)【発明者】

【氏名】クレオメニス バルロス

(72)【発明者】

【氏名】コンスタンティノス バルロス

【テーマコード（参考）】

4H045

【Ｆターム（参考）】

4H045AA10

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA09

4H045BA10

4H045BA16

4H045BA20

4H045BA40

4H045DA20

4H045EA20

4H045FA20

4H045FA33

(57)【要約】

本発明は、上皮成長因子様ペプチド（ＥＧＦ様ペプチド）を調製する方法であって、
前記ペプチドは、以下のアミノ酸配列Ｃ^１（Ｘ）_７Ｃ^２（Ｘ）_４－５Ｃ^３（Ｘ）_{１０－１３}Ｃ^４（Ｘ）Ｃ^５（Ｘ）_８Ｃ^６［配列番号４９］を有し、前記Ｃ^１－Ｃ^６はそれぞれシステインであって、そして、前記各Ｘは、独立に、天然のアミノ酸または非天然のアミノ酸であり、そして、前記ＥＧＦ様ペプチドは３つの分子内ジスルフィド結合を有し、前記方法は以下のステップを有する：
（Ｉ）Ｎ末端のアミノ酸が、保護基ＰＧ_１により、保護されており、それが、Ｂｏｃ及びＦｍｏｃから選択される第１のペプチド断片を調製し；
（II）Ｃ末端のアミノ酸が、保護基ＰＧ_２により、保護されており、それが、トリチル、クロロトリチル及びｔ－ブチルから選択される第２のペプチド断片を調製し、そして、前記第１のペプチド断片及び第２のペプチド断片中のアミノ酸側鎖は任意に保護されており；
（III）溶液中で、前記第１のペプチド断片のＣ末端アミノ酸と、前記第２のペプチド断片のＮ末端アミノ酸をカップリングし、直鎖状の保護されたＥＧＦ様ペプチドを形成し；
（ＩＶ）（ａ）
（ｉ）ステップ（III）で形成された直鎖状の保護されたＥＧＦ様ペプチドをヨウ素で処理し、酸化混合物を形成し；
（ii）トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）で処理し、ステップ（IV）（ａ）（ｉ）で得られた前記酸化混合物を全体的に脱保護し、
（iii）ステップ（IV）（ａ）（ii）で得られた前記脱保護された酸化混合物をＤＭＳＯ／ＤＴＴで処理し、未精製のＥＧＦ様ペプチドを形成する；又は
（ＩＶ）（ｂ）
（ｉ）トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）で処理し、ステップ（III）で得られた直鎖状の保護されたＥＧＦ様ペプチドを全体的に脱保護し；
（ii）ステップ（ＩＶ）（ｂ）（ｉ）で得られた脱保護された混合物をＤＭＳＯで処理し、未精製のＥＧＦ様ペプチドを形成する；そして、
（Ｖ）任意に前記未精製のＥＧＦ様ペプチドを精製する。
さらに、本発明の態様は、様々な断片縮合を用いた、ＥＧＦ様ペプチド調製の過程に関する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

以下のアミノ酸配列を含む上皮増殖因子様ペプチド（ＥＧＦ様ペプチド）を調製する方法であって、
Ｃ^１（Ｘ）_７Ｃ^２（Ｘ）_４－５Ｃ^３（Ｘ）_{１０－１３}Ｃ^４（Ｘ）Ｃ^５（Ｘ）_８Ｃ^６［配列番号４９］
前記Ｃ^１－Ｃ^６はそれぞれシステインであって、そして、前記各Ｘは、独立に、天然のアミノ酸または非天然のアミノ酸であり、そして、前記ＥＧＦ様ペプチドは３つの分子内ジスルフィド結合を有し、前記方法は以下のステップを有する：
（Ｉ）Ｎ末端のアミノ酸が、Ｂｏｃ及びＦｍｏｃから選択される保護基ＰＧ_１により、保護されている第１のペプチド断片を調製し；
（ＩＩ）Ｃ末端のアミノ酸が、トリチル、クロロトリチル及びｔ－ブチルから選択される保護基ＰＧ２により、保護されている第２のペプチド断片を調製し、そして、前記第１のペプチド断片及び第２のペプチド断片中のアミノ酸側鎖は任意に保護されており；
（III）溶液中で、前記第１のペプチド断片のＣ末端アミノ酸と、前記第２のペプチド断片のＮ末端アミノ酸をカップリングし、直鎖状の保護されたＥＧＦ様ペプチドを形成し；
（ＩＶ）（ａ）
（ｉ）ステップ（III）で形成された直鎖状の保護されたＥＧＦ様ペプチドをヨウ素で処理して、酸化混合物を形成し；
（ii）トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）で処理することにより、ステップ（IV）（ａ）（ｉ）で得られた前記酸化混合物を全体的に脱保護し、
（iii）ステップ（IV）（ａ）（ii）で得られた前記脱保護された酸化混合物をＤＭＳＯ／ＤＴＴで処理して、未精製のＥＧＦ様ペプチドを形成するか；又は
（ＩＶ）（ｂ）
（ｉ）トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）で処理することにより、ステップ（III）で得られた直鎖状の保護されたＥＧＦ様ペプチドを全体的に脱保護し；
（ii）ステップ （ＩＶ）（ｂ）（ｉ）で得られた脱保護された混合物をＤＭＳＯで処理して、未精製のＥＧＦ様ペプチドを形成する；そして、
（Ｖ）任意に前記未精製のＥＧＦ様ペプチドを精製する、調製方法。

【請求項2】

前記第１のペプチド断片が、２又はそれよりも多いペプチドサブ断片のカップリングにより調製される、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記第１のペプチド断片が、固相ペプチド合成により調製される、請求項１に記載の方法。

【請求項4】

前記第２のペプチド断片が、２又はそれよりも多いペプチドサブ断片のカップリングにより調製される、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項5】

前記第２のペプチド断片が、固相ペプチド合成により調製される、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項6】

前記ＥＧＦ様ペプチドが、ＥＧＦ又はそのアナログ又はＥＧＦのバリアントである、請求項１に記載の方法。

【請求項7】

前記ＥＧＦ様ペプチドが、マウスのＥＧＦ又はそのアナログ又はＥＧＦのバリアントである、請求項１に記載の方法。

【請求項8】

前記ＥＧＦ様ペプチドが、ヒトのＥＧＦ又はそのアナログ又はＥＧＦのバリアントである、請求項１に記載の方法。

【請求項9】

前記第１のペプチド断片のＣ末端アミノ酸がグリシンである、請求項１に記載の方法。

【請求項10】

前記ＥＧＦ様ペプチドが、以下の配列を有するペプチド：
Ｈ－Ａｓｎ^１－Ｓｅｒ^２－Ａｓｐ^３－Ｓｅｒ^４－Ｇｌｕ^５－Ｃｙｓ^６－Ｐｒｏ^７－Ｌｅｕ^８－Ｓｅｒ^９－Ｈｉｓ^１０－Ａｓｐ^１１－Ｇｌｙ^１２－Ｔｙｒ^１３－Ｃｙｓ^１４－Ｌｅｕ^１５－Ｈｉｓ^１６－Ａｓｐ^１７－Ｇｌｙ^１８－Ｖａｌ^１９－Ｃｙｓ^２０－Ｍｅｔ^２１－Ｔｙｒ^２２－Ｉｌｅ^２３－Ｇｌｕ^２４－Ａｌａ^２５－Ｌｅｕ^２６－Ａｓｐ^２７－Ｌｙｓ^２８－Ｔｙｒ^２９－Ａｌａ^３０－Ｃｙｓ^３１－Ａｓｎ^３２－Ｃｙｓ^３３－Ｖａｌ^３４－Ｖａｌ^３５－Ｇｌｙ^３６－Ｔｙｒ^３７－Ｉｌｅ^３８－Ｇｌｙ^３９－Ｇｌｕ^４０－Ａｒｇ^４１－Ｃｙｓ^４２－Ｇｌｎ^４３－Ｔｙｒ^４４－Ａｒｇ^４５－Ａｓｐ^４６－Ｌｅｕ^４７－Ｌｙｓ^４８－Ｔｒｐ^４９－Ｔｒｐ^５０－Ｇｌｕ^５１－Ｌｅｕ^５２－Ａｒｇ^５３－ＯＨ ［配列番号１］
又はそのバリアントであって、
かつ、前記方法は以下の過程を有する；
以下の配列を有する第１のペプチド断片；ＰＧ_１－Ａｓｎ^１－Ｓｅｒ^２－Ａｓｐ^３－Ｓｅｒ^４－Ｇｌｕ^５－Ｃｙｓ^６－Ｐｒｏ^７－Ｌｅｕ^８－Ｓｅｒ^９－Ｈｉｓ^１０－Ａｓｐ^１１－Ｇｌｙ^１２－Ｔｙｒ^１３－Ｃｙｓ^１４－Ｌｅｕ^１５－Ｈｉｓ^１６－Ａｓｐ^１７－Ｇｌｙ^１８－ＯＨ ［配列番号２］
又はそのバリアントであって、ＰＧ_１が、Ｂｏｃ及びＦｍｏｃから選択されるＮ末端保護基であって、そして、前記Ｃ末端アミノ酸が、任意に、活性化されたカルボン酸誘導体の形態であって、
以下の配列を有する第２のペプチド断片；Ｈ－Ｖａｌ^１９－Ｃｙｓ^２０－Ｍｅｔ^２１－Ｔｙｒ^２２－Ｉｌｅ^２３－Ｇｌｕ^２４－Ａｌａ^２５－Ｌｅｕ^２６－Ａｓｐ^２７－Ｌｙｓ^２８－Ｔｙｒ^２９－Ａｌａ^３０－Ｃｙｓ^３１－Ａｓｎ^３２－Ｃｙｓ^３３－Ｖａｌ^３４－Ｖａｌ^３５－Ｇｌｙ^３６－Ｔｙｒ^３７－Ｉｌｅ^３８－Ｇｌｙ^３９－Ｇｌｕ^４０－Ａｒｇ^４１－Ｃｙｓ^４２－Ｇｌｎ^４３－Ｔｙｒ^４４－Ａｒｇ^４５－Ａｓｐ^４６－Ｌｅｕ^４７－Ｌｙｓ^４８－Ｔｒｐ^４９－Ｔｒｐ^５０－Ｇｌｕ^５１－Ｌｅｕ^５２－Ａｒｇ^５３－Ｏ－ＰＧ_２ ［配列番号３］
又はそのバリアントであって、ＰＧ_２が、クロロトリチル及びｔ－ブチルから選択される保護基であって、そして、前記第１の及び第２のペプチド断片における１または複数のアミノ酸残基が、好ましくは、酸開裂性保護基で任意に保護されている、前記第１のペプチド断片と、前記第２のペプチド断片を、溶液中でカップリングする方法を有する、請求項１に記載の方法。

【請求項11】

前記ＥＧＦ様ペプチドが、以下の配列を有するペプチド；Ｈ－Ａｓｎ^１（Ｐ）－Ｓｅｒ^２（Ｐ）－Ａｓｐ^３（Ｐ）－ΨＳｅｒ^４－Ｇｌｕ^５（Ｐ）－Ｃｙｓ^６（Ｐ）－Ｐｒｏ^７－Ｌｅｕ^８－ΨＳｅｒ^９－Ｈｉｓ^１０（Ｐ）－Ａｓｐ^１１（Ｐ）－Ｇｌｙ^１２－Ｔｙｒ^１３（Ｐ）－Ｃｙｓ^１４（Ｐ）－Ｌｅｕ^１５－Ｈｉｓ^１６（Ｐ）－Ａｓｐ^１７（Ｐ）－Ｇｌｙ^１８－Ｖａｌ^１９－Ｃｙｓ^２０（Ｐ）－Ｍｅｔ^２１－Ｔｙｒ^２２（Ｐ）－Ｉｌｅ^２３－Ｇｌｕ^２４（Ｐ）－Ａｌａ^２５－Ｌｅｕ^２６－Ａｓｐ^２７（Ｐ）－Ｌｙｓ^２８（Ｐ）－Ｔｙｒ^２９（Ｐ）－Ａｌａ^３０－Ｃｙｓ^３１（Ｐ）－Ａｓｎ^３２（Ｐ）－Ｃｙｓ^３３（Ｐ）－Ｖａｌ^３４－Ｖａｌ^３５－Ｇｌｙ^３６－Ｔｙｒ^３７（Ｐ）－Ｉｌｅ^３８－Ｇｌｙ^３９－Ｇｌｕ^４０（Ｐ）－Ａｒｇ^４１（Ｐ）－Ｃｙｓ^４２（Ｐ）－Ｇｌｎ^４３（Ｐ）－Ｔｙｒ^４４（Ｐ）－Ａｒｇ^４５（Ｐ）－Ａｓｐ^４６（Ｐ）－Ｌｅｕ^４７－Ｌｙｓ^４８（Ｐ）－Ｔｒｐ^４９（Ｐ）－Ｔｒｐ^５０（Ｐ）－Ｇｌｕ^５１（Ｐ）－Ｌｅｕ^５２－Ａｒｇ^５３（Ｐ）－ＯＨ ［配列番号９］
又はそのバリアントであって、
前記第１のペプチド断片が、以下の配列を有するペプチド断片；ＰＧ_１－Ａｓｎ^１（Ｐ）－Ｓｅｒ^２（Ｐ）－Ａｓｐ^３（Ｐ）－ΨＳｅｒ^４－Ｇｌｕ^５（Ｐ）－Ｃｙｓ^６（Ｐ）－Ｐｒｏ^７－Ｌｅｕ^８－ΨＳｅｒ^９－Ｈｉｓ^１０（Ｐ）－Ａｓｐ^１１（Ｐ）－Ｇｌｙ^１２－Ｔｙｒ^１３（Ｐ）－Ｃｙｓ^１４（Ｐ）－Ｌｅｕ^１５－Ｈｉｓ^１６（Ｐ）－Ａｓｐ^１７（Ｐ）－Ｇｌｙ^１８－ＯＨ ［配列番号１０］
又はそのバリアントであって、
そして、前記第２のペプチド断片が、以下の配列を有するペプチド断片；Ｈ－Ｖａｌ^１９－Ｃｙｓ^２０（Ｐ）－Ｍｅｔ^２１－Ｔｙｒ^２２（Ｐ）－Ｉｌｅ^２３－Ｇｌｕ^２４（Ｐ）－Ａｌａ^２５－Ｌｅｕ^２６－Ａｓｐ^２７（Ｐ）－Ｌｙｓ^２８（Ｐ）－Ｔｙｒ^２９（Ｐ）－Ａｌａ^３０－Ｃｙｓ^３１（Ｐ）－Ａｓｎ^３２（Ｐ）－Ｃｙｓ^３３（Ｐ）－Ｖａｌ^３４－Ｖａｌ^３５－Ｇｌｙ^３６－Ｔｙｒ^３７（Ｐ）－Ｉｌｅ^３８－Ｇｌｙ^３９－Ｇｌｕ^４０（Ｐ）－Ａｒｇ^４１（Ｐ）－Ｃｙｓ^４２（Ｐ）－Ｇｌｎ^４３（Ｐ）－Ｔｙｒ^４４（Ｐ）－Ａｒｇ^４５（Ｐ）－Ａｓｐ^４６（Ｐ）－Ｌｅｕ^４７－Ｌｙｓ^４８（Ｐ）－Ｔｒｐ^４９（Ｐ）－Ｔｒｐ^５０（Ｐ）－Ｇｌｕ^５１（Ｐ）－Ｌｅｕ^５２－Ａｒｇ^５３（Ｐ）－Ｏ－ＰＧ_２ ［配列番号１１］
又はそのバリアントであって、
それぞれのＰが、同じ又は異なっていてもよい側鎖保護基を表している、請求項１０に記載の方法。

【請求項12】

前記ＥＧＦ様ペプチドが、以下の配列を有するペプチド；Ｈ－Ａｓｎ^１（Ｔｒｔ）－Ｓｅｒ^２（ｔＢｕ）－Ａｓｐ^３（ｔＢｕ）－ΨＳｅｒ^４－Ｇｌｕ^５（ｔＢｕ）－Ｃｙｓ^６（Ｔｒｔ）－Ｐｒｏ^７－Ｌｅｕ^８－ΨＳｅｒ^９－Ｈｉｓ^１０（Ｔｒｔ）－Ａｓｐ^１１（ｔＢｕ）－Ｇｌｙ^１２－Ｔｙｒ^１３（ｔＢｕ）－Ｃｙｓ^１４（Ｔｒｔ）－Ｌｅｕ^１５－Ｈｉｓ^１６（Ｔｒｔ）－Ａｓｐ^１７（ｔＢｕ）－Ｇｌｙ^１８－Ｖａｌ^１９－Ｃｙｓ^２０（Ｔｒｔ）－Ｍｅｔ^２１－Ｔｙｒ^２２（ｔＢｕ）－Ｉｌｅ^２３－Ｇｌｕ^２４（ｔＢｕ）－Ａｌａ^２５－Ｌｅｕ^２６－Ａｓｐ^２７（ｔＢｕ）－Ｌｙｓ^２８（Ｂｏｃ）－Ｔｙｒ^２９（ｔＢｕ）－Ａｌａ^３０－Ｃｙｓ^３１（Ｔｒｔ）－Ａｓｎ^３２（Ｔｒｔ）－Ｃｙｓ^３３（Ｔｒｔ）－Ｖａｌ^３４－Ｖａｌ^３５－Ｇｌｙ^３６－Ｔｙｒ^３７（ｔＢｕ）－Ｉｌｅ^３８－Ｇｌｙ^３９－Ｇｌｕ（ｔＢｕ）^４０－Ａｒｇ^４１（Ｐｂｆ）－Ｃｙｓ^４２（Ｔｒｔ）－Ｇｌｎ^４３（Ｔｒｔ）－Ｔｙｒ^４４（ｔＢｕ）－Ａｒｇ^４５（Ｐｂｆ）－Ａｓｐ^４６（ｔＢｕ）－Ｌｅｕ^４７－Ｌｙｓ^４８（Ｂｏｃ）－Ｔｒｐ^４９（Ｂｏｃ）－Ｔｒｐ^５０（Ｂｏｃ）－Ｇｌｕ^５１（ｔＢｕ）－Ｌｅｕ^５２－Ａｒｇ^５３（Ｐｂｆ）－ＯＨ ［配列番号１２］
又はそのバリアントであって、
そして、前記第１のペプチド断片が、以下の配列を有するペプチド断片；ＰＧ_１－Ａｓｎ^１（Ｔｒｔ）－Ｓｅｒ^２（ｔＢｕ）－Ａｓｐ^３（ｔＢｕ）－ΨＳｅｒ^４－Ｇｌｕ^５（ｔＢｕ）－Ｃｙｓ^６（Ｔｒｔ）－Ｐｒｏ^７－Ｌｅｕ^８－ΨＳｅｒ^９－Ｈｉｓ^１０（Ｔｒｔ）－Ａｓｐ^１１（ｔＢｕ）－Ｇｌｙ^１２－Ｔｙｒ^１３（ｔＢｕ）－Ｃｙｓ^１４（Ｔｒｔ）－Ｌｅｕ^１５－Ｈｉｓ^１６（Ｔｒｔ）－Ａｓｐ^１７（ｔＢｕ）－Ｇｌｙ^１８－ＯＨ ［配列番号１３］
又はそのバリアントであって、
そして、前記第２のペプチド断片が、以下の配列を有するペプチド断片；Ｈ－Ｖａｌ^１９－Ｃｙｓ^２０（Ｔｒｔ）－Ｍｅｔ^２１－Ｔｙｒ^２２（ｔＢｕ）－Ｉｌｅ^２３－Ｇｌｕ^２４（ｔＢｕ）－Ａｌａ^２５－Ｌｅｕ^２６－Ａｓｐ^２７（ｔＢｕ）－Ｌｙｓ^２８（Ｂｏｃ）－Ｔｙｒ^２９（ｔＢｕ）－Ａｌａ^３０－Ｃｙｓ^３１（Ｔｒｔ）－Ａｓｎ^３２（Ｔｒｔ）－Ｃｙｓ^３３（Ｔｒｔ）－Ｖａｌ^３４－Ｖａｌ^３５－Ｇｌｙ^３６－Ｔｙｒ^３７（ｔＢｕ）－Ｉｌｅ^３８－Ｇｌｙ^３９－Ｇｌｕ（ｔＢｕ）^４０－Ａｒｇ^４１（Ｐｂｆ）－Ｃｙｓ^４２（Ｔｒｔ）－Ｇｌｎ^４３（Ｔｒｔ）－Ｔｙｒ^４４（ｔＢｕ）－Ａｒｇ^４５（Ｐｂｆ）－Ａｓｐ^４６（ｔＢｕ）－Ｌｅｕ^４７－ＡＬｙｓ^４８（Ｂｏｃ）－Ｔｒｐ^４９（Ｂｏｃ）－Ｔｒｐ^５０（Ｂｏｃ）－Ｇｌｕ^５１（ｔＢｕ）－Ｌｅｕ^５２－Ａｒｇ^５３（Ｐｂｆ）－Ｏ－ＰＧ_２ ［配列番号１４］
又はそのバリアントである、請求項１０に記載の方法。

【請求項13】

配列；ＰＧ_１－Ａｓｎ^１（Ｐ）－Ｓｅｒ^２（Ｐ）－Ａｓｐ^３（Ｐ）－ ΨＳｅｒ^４－Ｇｌｕ^５（Ｐ）－Ｃｙｓ^６（Ｐ）－Ｐｒｏ^７－Ｌｅｕ^８－ΨＳｅｒ^９－Ｈｉｓ^１０（Ｐ）－Ａｓｐ^１１（Ｐ）－Ｇｌｙ^１２－Ｔｙｒ^１３（Ｐ）－Ｃｙｓ^１４（Ｐ）－Ｌｅｕ^１５－Ｈｉｓ^１６（Ｐ）－Ａｓｐ^１７（Ｐ）－Ｇｌｙ^１８－ＯＨ ［配列番号１０］又は配列；ＰＧ_１－Ａｓｎ^１（Ｔｒｔ）－Ｓｅｒ^２（ｔＢｕ）－Ａｓｐ^３（ｔＢｕ）－ΨＳｅｒ^４－Ｇｌｕ^５（ｔＢｕ）－Ｃｙｓ^６（Ｔｒｔ）－Ｐｒｏ^７－Ｌｅｕ^８－ΨＳｅｒ^９－Ｈｉｓ^１０（Ｔｒｔ）－Ａｓｐ^１１（ｔＢｕ）－Ｇｌｙ^１２－Ｔｙｒ^１３（ｔＢｕ）－Ｃｙｓ^１４（Ｔｒｔ）－Ｌｅｕ^１５－Ｈｉｓ^１６（Ｔｒｔ）－Ａｓｐ^１７（ｔＢｕ）－Ｇｌｙ^１８－ＯＨ ［配列番号１３］を有する第１のペプチド断片が、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ－ＯＨから開始する固相合成によって調製される、請求項１１又は請求項１２に記載の方法。

【請求項14】

配列；ＰＧ_１－Ａｓｎ^１（Ｐ）－Ｓｅｒ^２（Ｐ）－Ａｓｐ^３（Ｐ）－ΨＳｅｒ^４－Ｇｌｕ^５（Ｐ）－Ｃｙｓ^６（Ｐ）－Ｐｒｏ^７－Ｌｅｕ^８－ΨＳｅｒ^９－Ｈｉｓ^１０（Ｐ）－Ａｓｐ^１１（Ｐ）－Ｇｌｙ^１２－Ｔｙｒ^１３（Ｐ）－Ｃｙｓ^１４（Ｐ）－Ｌｅｕ^１５－Ｈｉｓ^１６（Ｐ）－Ａｓｐ^１７（Ｐ）－Ｇｌｙ^１８－ＯＨ ［配列番号１５］を有する第１のペプチド断片が、ＰＧ_１－Ａｓｎ^１（Ｐ）－Ｓｅｒ^２（Ｐ）－Ａｓｐ^３（Ｐ）－ΨＳｅｒ^４－Ｇｌｕ^５（Ｐ）－Ｃｙｓ^６（Ｐ）－Ｐｒｏ^７－Ｌｅｕ^８－ΨＳｅｒ^９－Ｈｉｓ^１０（Ｐ）－Ａｓｐ^１１（Ｐ）－Ｇｌｙ^１２－ＯＨ ［配列番号２０］と Ｈ－Ｔｙｒ^１３（Ｐ）－Ｃｙｓ^１４（Ｐ）－Ｌｅｕ^１５－Ｈｉｓ^１６（Ｐ）－Ａｓｐ^１７（Ｐ）－Ｇｌｙ^１８－Ｏ－ＰＧ_２ ［配列番号１７］との断片縮合、その後の保護基ＰＧ_２の除去により調製される、請求項１１に記載の方法。

【請求項15】

配列；ＰＧ_１－Ａｓｎ^１（Ｔｒｔ）－Ｓｅｒ^２（ｔＢｕ）－Ａｓｐ^３（ｔＢｕ）－ΨＳｅｒ^４－Ｇｌｕ^５（ｔＢｕ）－Ｃｙｓ^６（Ｔｒｔ）－Ｐｒｏ^７－Ｌｅｕ^８－ΨＳｅｒ^９－Ｈｉｓ^１０（Ｔｒｔ）－Ａｓｐ^１１（ｔＢｕ）－Ｇｌｙ^１２－Ｔｙｒ^１３（ｔＢｕ）－Ｃｙｓ^１４（Ｔｒｔ）－Ｌｅｕ^１５－Ｈｉｓ^１６（Ｔｒｔ）－Ａｓｐ^１７（ｔＢｕ）－Ｇｌｙ^１８－ＯＨ ［配列番号１３］を有する第１のペプチド断片が、ＰＧ_１－Ａｓｎ^１（Ｔｒｔ）－Ｓｅｒ^２（ｔＢｕ）－Ａｓｐ^３（ｔＢｕ）－ΨＳｅｒ^４－Ｇｌｕ^５（ｔＢｕ）－Ｃｙｓ^６（Ｔｒｔ）－Ｐｒｏ^７－Ｌｅｕ^８－ΨＳｅｒ^９－Ｈｉｓ^１０（Ｔｒｔ）－Ａｓｐ^１１（ｔＢｕ）－Ｇｌｙ^１２－ＯＨ ［配列番号１８］とＨ－Ｔｙｒ^１３（ｔＢｕ）－Ｃｙｓ^１４（Ｔｒｔ）－Ｌｅｕ^１５－Ｈｉｓ^１６（Ｔｒｔ）－Ａｓｐ^１７（ｔＢｕ）－Ｇｌｙ^１８－Ｏ－ＰＧ_２ ［配列番号１９］との断片縮合、その後の保護基ＰＧ_２の除去により調製される、請求項１２に記載の方法。

【請求項16】

配列；ＰＧ_１－Ａｓｎ^１（Ｐ）－Ｓｅｒ^２（Ｐ）－Ａｓｐ^３（Ｐ）－ΨＳｅｒ^４－Ｇｌｕ^５（Ｐ）－Ｃｙｓ^６（Ｐ）－Ｐｒｏ^７－Ｌｅｕ^８－ΨＳｅｒ^９－Ｈｉｓ^１０（Ｐ）－Ａｓｐ^１１（Ｐ）－Ｇｌｙ^１２－ＯＨ ［配列番号２０］又はＰＧ_１－Ａｓｎ^１（Ｔｒｔ）－Ｓｅｒ^２（ｔＢｕ）－Ａｓｐ^３（ｔＢｕ）－ΨＳｅｒ^４－Ｇｌｕ^５（ｔＢｕ）－Ｃｙｓ^６（Ｔｒｔ）－Ｐｒｏ^７－Ｌｅｕ^８－ΨＳｅｒ^９－Ｈｉｓ^１０（Ｔｒｔ） －Ａｓｐ^１１（ｔＢｕ）－Ｇｌｙ^１２－ＯＨ ［配列番号２１］を有する第１のペプチド断片が、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ－ＯＨから開始する固相合成によって調製される、請求項１４又は請求項１５に記載の方法。

【請求項17】

配列；Ｈ－Ｔｙｒ^１３（Ｐ）－Ｃｙｓ^１４（Ｐ）－Ｌｅｕ^１５－Ｈｉｓ^１６（Ｐ）－Ａｓｐ^１７（Ｐ）－Ｇｌｙ^１８－Ｏ－ＰＧ_２ ［配列番号１７］又は配列；Ｈ－Ｔｙｒ^１３（ｔＢｕ）－Ｃｙｓ^１４（Ｔｒｔ）－Ｌｅｕ^１５－Ｈｉｓ^１６（Ｔｒｔ）－Ａｓｐ^１７（ｔＢｕ）－Ｇｌｙ^１８－Ｏ－ＰＧ_２ ［配列番号１９］を有するペプチド断片が、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ－ＯＨから開始する固相合成によって調製される、請求項１４又は請求項１５に記載の方法。

【請求項18】

配列； Ｈ－Ｖａｌ^１９－Ｃｙｓ^２０（Ｐ）－Ｍｅｔ^２１－Ｔｙｒ^２２（Ｐ）－Ｉｌｅ^２３－Ｇｌｕ^２４（Ｐ）－Ａｌａ^２５－Ｌｅｕ^２６－Ａｓｐ^２７（Ｐ）－Ｌｙｓ^２８（Ｐ）－Ｔｙｒ^２９（Ｐ）－Ａｌａ^３０－Ｃｙｓ^３１（Ｐ）－Ａｓｎ^３２（Ｐ）－Ｃｙｓ^３３（Ｐ）－Ｖａｌ^３４－Ｖａｌ^３５－Ｇｌｙ^３６－Ｔｙｒ^３７（Ｐ）－Ｉｌｅ^３８－Ｇｌｙ^３９－Ｇｌｕ^４０（Ｐ）－Ａｒｇ^４１（Ｐ）－Ｃｙｓ^４２（Ｐ）－Ｇｌｎ^４３（Ｐ）－Ｔｙｒ^４４（Ｐ）－Ａｒｇ^４５（Ｐ）－Ａｓｐ^４６（Ｐ）－Ｌｅｕ^４７－Ｌｙｓ^４８（Ｐ）－Ｔｒｐ^４９（Ｐ）－Ｔｒｐ^５０（Ｐ）－Ｇｌｕ^５１（Ｐ）－Ｌｅｕ^５２－Ａｒｇ^５３（Ｐ）－Ｏ－ＰＧ_２ ［配列番号１１］を有する第２のペプチドが、ＰＧ_１－Ｖａｌ^１９－Ｃｙｓ^２０（Ｐ）－Ｍｅｔ^２１－Ｔｙｒ^２２（Ｐ）－Ｉｌｅ^２３－Ｇｌｕ^２４（Ｐ）－Ａｌａ^２５－Ｌｅｕ^２６－Ａｓｐ^２７（Ｐ）－Ｌｙｓ^２８（Ｐ）－Ｔｙｒ^２９（Ｐ）－Ａｌａ^３０－Ｃｙｓ^３１（Ｐ）－Ａｓｎ^３２（Ｐ）－Ｃｙｓ^３３（Ｐ）－Ｖａｌ^３４－Ｖａｌ^３５－Ｇｌｙ^３６－ＯＨ ［配列番号２２］とＨ－Ｔｙｒ^３７（Ｐ）－Ｉｌｅ^３８－Ｇｌｙ^３９－Ｇｌｕ^４０（Ｐ）－Ａｒｇ^４１（Ｐ）－Ｃｙｓ^４２（Ｐ）－Ｇｌｎ^４３（Ｐ）－Ｔｙｒ^４４（Ｐ）－Ａｒｇ^４５（Ｐ）－Ａｓｐ^４６（Ｐ）－Ｌｅｕ^４７－Ｌｙｓ^４８（Ｐ）－Ｔｒｐ^４９（Ｐ）－Ｔｒｐ^５０（Ｐ）－Ｇｌｕ^５１（Ｐ）－Ｌｅｕ^５２－Ａｒｇ^５３（Ｐ）－Ｏ－ＰＧ_２ ［配列番号２３］との断片縮合、その後の保護基ＰＧ_１の除去により調製される、請求項１１に記載の方法。

【請求項19】

配列；Ｈ－Ｖａｌ^１９－Ｃｙｓ^２０（Ｔｒｔ）－Ｍｅｔ^２１－Ｔｙｒ^２２（ｔＢｕ）－Ｉｌｅ^２３－Ｇｌｕ^２４（ｔＢｕ）－Ａｌａ^２５－Ｌｅｕ^２６－Ａｓｐ^２７（ｔＢｕ）－Ｌｙｓ^２８（Ｂｏｃ）－Ｔｙｒ^２９（ｔＢｕ）－Ａｌａ^３０－Ｃｙｓ^３１（Ｔｒｔ）－Ａｓｎ^３２（Ｔｒｔ）－Ｃｙｓ^３３（Ｔｒｔ）－Ｖａｌ^３４－Ｖａｌ^３５－Ｇｌｙ^３６－Ｔｙｒ^３７（ｔＢｕ）－Ｉｌｅ^３８－Ｇｌｙ^３９－Ｇｌｕ（ｔＢｕ）^４０－Ａｒｇ^４１（Ｐｂｆ）－Ｃｙｓ^４２（Ｔｒｔ）－Ｇｌｎ^４３（Ｔｒｔ）－Ｔｙｒ^４４（ｔＢｕ）－Ａｒｇ^４５（Ｐｂｆ）－Ａｓｐ^４６（ｔＢｕ）－Ｌｅｕ^４７－Ｌｙｓ^４８（Ｂｏｃ）－Ｔｒｐ^４９（Ｂｏｃ）－Ｔｒｐ^５０（Ｂｏｃ）－Ｇｌｕ^５１（ｔＢｕ）－Ｌｅｕ^５２－Ａｒｇ^５３（Ｐｂｆ）－Ｏ－ＰＧ_２ ［配列番号１４］を有する第２のペプチド断片が、ＰＧ_１－Ｖａｌ^１９－Ｃｙｓ^２０（Ｔｒｔ）－Ｍｅｔ^２１－Ｔｙｒ^２２（ｔＢｕ）－Ｉｌｅ^２３－Ｇｌｕ^２４（ｔＢｕ）－Ａｌａ^２５－Ｌｅｕ^２６－Ａｓｐ^２７（ｔＢｕ）－Ｌｙｓ^２８（Ｂｏｃ）－Ｔｙｒ^２９（ｔＢｕ）－Ａｌａ^３０－Ｃｙｓ^３１（Ｔｒｔ）－Ａｓｎ^３２（Ｔｒｔ）－Ｃｙｓ^３３（Ｔｒｔ）－Ｖａｌ^３４－Ｖａｌ^３５－Ｇｌｙ^３６－ＯＨ ［配列番号２４］とＨ－Ｔｙｒ^３７（ｔＢｕ）－Ｉｌｅ^３８－Ｇｌｙ^３９－Ｇｌｕ（ｔＢｕ）^４０－Ａｒｇ^４１（Ｐｂｆ）－Ｃｙｓ^４２（Ｔｒｔ）－Ｇｌｎ^４３（Ｔｒｔ）－Ｔｙｒ^４４（ｔＢｕ）－Ａｒｇ^４５（Ｐｂｆ）－Ａｓｐ^４６（ｔＢｕ）－Ｌｅｕ^４７－Ｌｙｓ^４８（Ｂｏｃ）－Ｔｒｐ^４９（Ｂｏｃ）－Ｔｒｐ^５０（Ｂｏｃ）－Ｇｌｕ^５１（ｔＢｕ）－Ｌｅｕ^５２－Ａｒｇ^５３（Ｐｂｆ）－Ｏ－ＰＧ_２ ［配列番号２５］との断片縮合、その後の保護基ＰＧ_１の除去により調製される、請求項１２に記載の方法。

【請求項20】

配列； Ｈ－Ｖａｌ^１９－Ｃｙｓ^２０（Ｐ）－Ｍｅｔ^２１－Ｔｙｒ^２２（Ｐ）－Ｉｌｅ^２３－Ｇｌｕ^２４（Ｐ）－Ａｌａ^２５－Ｌｅｕ^２６－Ａｓｐ^２７（Ｐ）－Ｌｙｓ^２８（Ｐ）－Ｔｙｒ^２９（Ｐ）－Ａｌａ^３０－Ｃｙｓ^３１（Ｐ）－Ａｓｎ^３２（Ｐ）－Ｃｙｓ^３３（Ｐ）－Ｖａｌ^３４－Ｖａｌ^３５－Ｇｌｙ^３６－Ｔｙｒ^３７（Ｐ）－Ｉｌｅ^３８－Ｇｌｙ^３９－Ｇｌｕ^４０（Ｐ）－Ａｒｇ^４１（Ｐ）－Ｃｙｓ^４２（Ｐ）－Ｇｌｎ^４３（Ｐ）－Ｔｙｒ^４４（Ｐ）－Ａｒｇ^４５（Ｐ）－Ａｓｐ^４６（Ｐ）－Ｌｅｕ^４７－Ｌｙｓ^４８（Ｐ）－Ｔｒｐ^４９（Ｐ）－Ｔｒｐ^５０（Ｐ）－Ｇｌｕ^５１（Ｐ）－Ｌｅｕ^５２－Ａｒｇ^５３（Ｐ）－Ｏ－ＰＧ_２ ［配列番号１１］を有する第２のペプチド断片が、ＰＧ_１－Ｖａｌ^１９－Ｃｙｓ^２０（Ｐ）－Ｍｅｔ^２１－Ｔｙｒ^２２（Ｐ）－Ｉｌｅ^２３－Ｇｌｕ^２４（Ｐ）－Ａｌａ^２５－Ｌｅｕ^２６－Ａｓｐ^２７（Ｐ）－Ｌｙｓ^２８（Ｐ）－Ｔｙｒ^２９（Ｐ）－Ａｌａ^３０－Ｃｙｓ^３１（Ｐ）－Ａｓｎ^３２（Ｐ）－Ｃｙｓ^３３（Ｐ）－Ｖａｌ^３４－Ｖａｌ^３５－Ｇｌｙ^３６－Ｔｙｒ^３７（Ｐ）－Ｉｌｅ^３８－Ｇｌｙ^３９－ＯＨ ［配列番号２６］と、Ｈ－Ｇｌｕ^４０（Ｐ）－Ａｒｇ^４１（Ｐ）－Ｃｙｓ^４２（Ｐ）－Ｇｌｎ^４３（Ｐ）－Ｔｙｒ^４４（Ｐ）－Ａｒｇ^４５（Ｐ）－Ａｓｐ^４６（Ｐ）－Ｌｅｕ^４７－Ｌｙｓ^４８（Ｐ）－Ｔｒｐ^４９（Ｐ）－Ｔｒｐ^５０（Ｐ）－Ｇｌｕ^５１（Ｐ）－Ｌｅｕ^５２－Ａｒｇ^５３（Ｐ）－Ｏ－ＰＧ_２ ［配列番号２７］との断片縮合、その後の保護基ＰＧ_１の除去により調製される、請求項１１に記載の方法。

【請求項21】

配列；Ｈ－Ｖａｌ^１９－Ｃｙｓ^２０（Ｔｒｔ）－Ｍｅｔ^２１－Ｔｙｒ^２２（ｔＢｕ）－Ｉｌｅ^２３－Ｇｌｕ^２４（ｔＢｕ）－Ａｌａ^２５－Ｌｅｕ^２６－Ａｓｐ^２７（ｔＢｕ）－Ｌｙｓ^２８（Ｂｏｃ）－Ｔｙｒ^２９（ｔＢｕ）－Ａｌａ^３０－Ｃｙｓ^３１（Ｔｒｔ）－Ａｓｎ^３２（Ｔｒｔ）－Ｃｙｓ^３３（Ｔｒｔ）－Ｖａｌ^３４－Ｖａｌ^３５－Ｇｌｙ^３６－Ｔｙｒ^３７（ｔＢｕ）－Ｉｌｅ^３８－Ｇｌｙ^３９－Ｇｌｕ（ｔＢｕ）^４０－Ａｒｇ^４１（Ｐｂｆ）－Ｃｙｓ^４２（Ｔｒｔ）－Ｇｌｎ^４３（Ｔｒｔ）－Ｔｙｒ^４４（ｔＢｕ）－Ａｒｇ^４５（Ｐｂｆ）－Ａｓｐ^４６（ｔＢｕ）－Ｌｅｕ^４７－Ｌｙｓ^４８（Ｂｏｃ）－Ｔｒｐ^４９（Ｂｏｃ）－Ｔｒｐ^５０（Ｂｏｃ）－Ｇｌｕ^５１（ｔＢｕ）－Ｌｅｕ^５２－Ａｒｇ^５３（Ｐｂｆ）－Ｏ－ＰＧ_２ ［配列番号１４］を有する第２のペプチド断片が、ＰＧ_１－Ｖａｌ^１９－Ｃｙｓ^２０（Ｔｒｔ）－Ｍｅｔ^２１－Ｔｙｒ^２２（ｔＢｕ）－Ｉｌｅ^２３－Ｇｌｕ^２４（ｔＢｕ）－Ａｌａ^２５－Ｌｅｕ^２６－Ａｓｐ^２７（ｔＢｕ）－Ｌｙｓ^２８（Ｂｏｃ）－Ｔｙｒ^２９（ｔＢｕ）－Ａｌａ^３０－Ｃｙｓ^３１（Ｔｒｔ）－Ａｓｎ^３２（Ｔｒｔ）－Ｃｙｓ^３３（Ｔｒｔ）－Ｖａｌ^３４－Ｖａｌ^３５－Ｇｌｙ^３６－Ｔｙｒ^３７（ｔＢｕ）－Ｉｌｅ^３８－Ｇｌｙ^３９－－ＯＨ ［配列番号２８］とＨ－Ｇｌｕ（ｔＢｕ）^４０－Ａｒｇ^４１（Ｐｂｆ）－Ｃｙｓ^４２（Ｔｒｔ）－Ｇｌｎ^４３（Ｔｒｔ）－Ｔｙｒ^４４（ｔＢｕ）－Ａｒｇ^４５（Ｐｂｆ）－Ａｓｐ^４６（ｔＢｕ）－Ｌｅｕ^４７－Ｌｙｓ^４８（Ｂｏｃ）－Ｔｒｐ^４９（Ｂｏｃ）－Ｔｒｐ^５０（Ｂｏｃ）－Ｇｌｕ^５１（ｔＢｕ）－Ｌｅｕ^５２－Ａｒｇ^５３（Ｐｂｆ）－Ｏ－ＰＧ_２ ［配列番号２９］との断片縮合、その後の保護基ＰＧ_１の除去により調製される、請求項１２に記載の方法。

【請求項22】

配列；Ｈ－Ｔｙｒ^３７（Ｐ）－Ｉｌｅ^３８－Ｇｌｙ^３９－Ｇｌｕ^４０（Ｐ）－Ａｒｇ^４１（Ｐ）－Ｃｙｓ^４２（Ｐ）－Ｇｌｎ^４３（Ｐ）－Ｔｙｒ^４４（Ｐ）－Ａｒｇ^４５（Ｐ）－Ａｓｐ^４６（Ｐ）－Ｌｅｕ^４７－Ｌｙｓ^４８（Ｐ）－Ｔｒｐ^４９（Ｐ）－Ｔｒｐ^５０（Ｐ）－Ｇｌｕ^５１（Ｐ）－Ｌｅｕ^５２－Ａｒｇ^５３（Ｐ）－Ｏ－ＰＧ_２ ［配列番号２３］を有するペプチド断片が、ＰＧ_１－Ｔｙｒ^３７（Ｐ）－Ｉｌｅ^３８－Ｇｌｙ^３９－ＯＨ ［配列番号３０］と、Ｈ－Ｇｌｕ^４０（Ｐ）－Ａｒｇ^４１（Ｐ）－Ｃｙｓ^４２（Ｐ）－Ｇｌｎ^４３（Ｐ）－Ｔｙｒ^４４（Ｐ）－Ａｒｇ^４５（Ｐ）－Ａｓｐ^４６（Ｐ）－Ｌｅｕ^４７－Ｌｙｓ^４８（Ｐ）－Ｔｒｐ^４９（Ｐ）－Ｔｒｐ^５０（Ｐ）－Ｇｌｕ^５１（Ｐ）－Ｌｅｕ^５２－Ａｒｇ^５３（Ｐ）－Ｏ－ＰＧ_２ ［配列番号２７］との断片縮合、その後の保護基ＰＧ_１の除去により調製される、請求項１８に記載の方法。

【請求項23】

配列；Ｈ－Ｔｙｒ^３７（ｔＢｕ）－Ｉｌｅ^３８－Ｇｌｙ^３９－Ｇｌｕ（ｔＢｕ）^４０－Ａｒｇ^４１（Ｐｂｆ）－Ｃｙｓ^４２（Ｔｒｔ）－Ｇｌｎ^４３（Ｔｒｔ）－Ｔｙｒ^４４（ｔＢｕ）－Ａｒｇ^４５（Ｐｂｆ）－Ａｓｐ^４６（ｔＢｕ）－Ｌｅｕ^４７－Ｌｙｓ^４８（Ｂｏｃ）－Ｔｒｐ^４９（Ｂｏｃ）－Ｔｒｐ^５０（Ｂｏｃ）－Ｇｌｕ^５１（ｔＢｕ）－Ｌｅｕ^５２－Ａｒｇ^５３（Ｐｂｆ）－Ｏ－ＰＧ_２ ［配列番号２５］ を有するペプチド断片が、ＰＧ_１－Ｔｙｒ^３７（ｔＢｕ）－Ｉｌｅ^３８－Ｇｌｙ^３９－ＯＨ ［配列番号３１］とＨ－Ｇｌｕ（ｔＢｕ）^４０－Ａｒｇ^４１（Ｐｂｆ）－Ｃｙｓ^４２（Ｔｒｔ）－Ｇｌｎ^４３（Ｔｒｔ）－Ｔｙｒ^４４（ｔＢｕ）－Ａｒｇ^４５（Ｐｂｆ）－Ａｓｐ^４６（ｔＢｕ）－Ｌｅｕ^４７－Ｌｙｓ^４８（Ｂｏｃ）－Ｔｒｐ^４９（Ｂｏｃ）－Ｔｒｐ^５０（Ｂｏｃ）－Ｇｌｕ^５１（ｔＢｕ）－Ｌｅｕ^５２－Ａｒｇ^５３（Ｐｂｆ）－Ｏ－ＰＧ_２ ［配列番号２９］との断片縮合、その後の保護基ＰＧ_１の除去により調製される、請求項１９に記載の方法。

【請求項24】

前記ペプチド断片； ＰＧ_１－Ｖａｌ^１９－Ｃｙｓ^２０（Ｐ）－Ｍｅｔ^２１－Ｔｙｒ^２２（Ｐ）－Ｉｌｅ^２３－Ｇｌｕ^２４（Ｐ）－Ａｌａ^２５－Ｌｅｕ^２６－Ａｓｐ^２７（Ｐ）－Ｌｙｓ^２８（Ｐ）－Ｔｙｒ^２９（Ｐ）－Ａｌａ^３０－Ｃｙｓ^３１（Ｐ）－Ａｓｎ^３２（Ｐ）－Ｃｙｓ^３３（Ｐ）－Ｖａｌ^３４－Ｖａｌ^３５－Ｇｌｙ^３６－ＯＨ ［配列番号２２］又はＣｙｓ^２０（Ｔｒｔ）－Ｍｅｔ^２１－Ｔｙｒ^２２（ｔＢｕ）－Ｉｌｅ^２３－Ｇｌｕ^２４（ｔＢｕ）－Ａｌａ^２５－Ｌｅｕ^２６－Ａｓｐ^２７（ｔＢｕ）－Ｌｙｓ^２８（Ｂｏｃ）－Ｔｙｒ^２９（ｔＢｕ）－Ａｌａ^３０－Ｃｙｓ^３１（Ｔｒｔ）－Ａｓｎ^３２（Ｔｒｔ）－Ｃｙｓ^３３（Ｔｒｔ）－Ｖａｌ^３４－Ｖａｌ^３５－Ｇｌｙ^３６－ＯＨ ［配列番号２４］が、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ－ＯＨから開始する固相ペプチド合成により調製される、請求項１８又は請求項１９に記載の方法。

【請求項25】

前記ペプチド断片； Ｈ－Ｔｙｒ^３７（Ｐ）－Ｉｌｅ^３８－Ｇｌｙ^３９－Ｇｌｕ^４０（Ｐ）－Ａｒｇ^４１（Ｐ）－Ｃｙｓ^４２（Ｐ）－Ｇｌｎ^４３（Ｐ）－Ｔｙｒ^４４（Ｐ）－Ａｒｇ^４５（Ｐ）－Ａｓｐ^４６（Ｐ）－Ｌｅｕ^４７－Ｌｙｓ^４８（Ｐ）－Ｔｒｐ^４９（Ｐ）－Ｔｒｐ^５０（Ｐ）－Ｇｌｕ^５１（Ｐ）－Ｌｅｕ^５２－Ａｒｇ^５３（Ｐ）－Ｏ－ＰＧ_２ ［配列番号２３］又はＨ－Ｔｙｒ^３７（ｔＢｕ）－Ｉｌｅ^３８－Ｇｌｙ^３９－Ｇｌｕ（ｔＢｕ）^４０－Ａｒｇ^４１（Ｐｂｆ）－Ｃｙｓ^４２（Ｔｒｔ）－Ｇｌｎ^４３（Ｔｒｔ）－Ｔｙｒ^４４（ｔＢｕ）－Ａｒｇ^４５（Ｐｂｆ）－Ａｓｐ^４６（ｔＢｕ）－Ｌｅｕ^４７－Ｌｙｓ^４８（Ｂｏｃ）－Ｔｒｐ^４９（Ｂｏｃ）－Ｔｒｐ^５０（Ｂｏｃ）－Ｇｌｕ^５１（ｔＢｕ）－Ｌｅｕ^５２－Ａｒｇ^５３（Ｐｂｆ）－Ｏ－ＰＧ_２ ［配列番号２５］が、Ｆｍｏｃ－Ａｒｇ（Ｐ） 又は Ｆｍｏｃ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）から開始する固相ペプチド合成により調製される、請求項１８又は請求項１９に記載の方法。

【請求項26】

前記ペプチド断片； ＰＧ_１－Ｖａｌ^１９－Ｃｙｓ^２０（Ｐ）－Ｍｅｔ^２１－Ｔｙｒ^２２（Ｐ）－Ｉｌｅ^２３－Ｇｌｕ^２４（Ｐ）－Ａｌａ^２５－Ｌｅｕ^２６－Ａｓｐ^２７（Ｐ）－Ｌｙｓ^２８（Ｐ）－Ｔｙｒ^２９（Ｐ）－Ａｌａ^３０－Ｃｙｓ^３１（Ｐ）－Ａｓｎ^３２（Ｐ）－Ｃｙｓ^３３（Ｐ）－Ｖａｌ^３４－Ｖａｌ^３５－Ｇｌｙ^３６－Ｔｙｒ^３７（Ｐ）－Ｉｌｅ^３８－Ｇｌｙ^３９－ＯＨ ［配列番号２６］又はＰＧ_１－Ｖａｌ^１９－Ｃｙｓ^２０（Ｔｒｔ）－Ｍｅｔ^２１－Ｔｙｒ^２２（ｔＢｕ）－Ｉｌｅ^２３－Ｇｌｕ^２４（ｔＢｕ）－Ａｌａ^２５－Ｌｅｕ^２６－Ａｓｐ^２７（ｔＢｕ）－Ｌｙｓ^２８（Ｂｏｃ）－Ｔｙｒ^２９（ｔＢｕ）－Ａｌａ^３０－Ｃｙｓ^３１（Ｔｒｔ）－Ａｓｎ^３２（Ｔｒｔ）－Ｃｙｓ^３３（Ｔｒｔ）－Ｖａｌ^３４－Ｖａｌ^３５－Ｇｌｙ^３６－Ｔｙｒ^３７（ｔＢｕ）－Ｉｌｅ^３８－Ｇｌｙ^３９ _－－ＯＨ ［配列番号２８］が、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ－ＯＨから開始する固相ペプチド合成により調製される、請求項２０又は請求項２１に記載の方法。

【請求項27】

前記ペプチド断片； Ｈ－Ｇｌｕ^４０（Ｐ）－Ａｒｇ^４１（Ｐ）－Ｃｙｓ^４２（Ｐ）－Ｇｌｎ^４３（Ｐ）－Ｔｙｒ^４４（Ｐ）－Ａｒｇ^４５（Ｐ）－Ａｓｐ^４６（Ｐ）－Ｌｅｕ^４７－Ｌｙｓ^４８（Ｐ）－Ｔｒｐ^４９（Ｐ）－Ｔｒｐ^５０（Ｐ）－Ｇｌｕ^５１（Ｐ）－Ｌｅｕ^５２－Ａｒｇ^５３（Ｐ）－Ｏ－ＰＧ_２ ［配列番号２７］又はＨ－Ｇｌｕ（ｔＢｕ）^４０－Ａｒｇ^４１（Ｐｂｆ）－Ｃｙｓ^４２（Ｔｒｔ）－Ｇｌｎ^４３（Ｔｒｔ）－Ｔｙｒ^４４（ｔＢｕ）－Ａｒｇ^４５（Ｐｂｆ）－Ａｓｐ^４６（ｔＢｕ）－Ｌｅｕ^４７－Ｌｙｓ^４８（Ｂｏｃ）－Ｔｒｐ^４９（Ｂｏｃ）－Ｔｒｐ^５０（Ｂｏｃ）－Ｇｌｕ^５１（ｔＢｕ）－Ｌｅｕ^５２－Ａｒｇ^５３（Ｐｂｆ）－Ｏ－ＰＧ_２ ［配列番号２９］が、Ｆｍｏｃ－Ａｒｇ（Ｐ）又はＦｍｏｃ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）を使用している固相ペプチド合成により調製される、請求項２０又は請求項２１に記載の方法。

【請求項28】

前記ＥＧＦ様ペプチドが、以下の配列を有するペプチド；Ｈ－Ａｓｎ^１－Ｓｅｒ^２－Ａｓｐ^３－Ｓｅｒ^４－Ｇｌｕ^５－Ｃｙｓ^６－Ｐｒｏ^７－Ｌｅｕ^８－Ｓｅｒ^９－Ｈｉｓ^１０－Ａｓｐ^１１－Ｇｌｙ^１２－Ｔｙｒ^１３－Ｃｙｓ^１４－Ｌｅｕ^１５－Ｈｉｓ^１６－Ａｓｐ^１７－Ｇｌｙ^１８－Ｖａｌ^１９－Ｃｙｓ^２０－Ｍｅｔ^２１－Ｔｙｒ^２２－Ｉｌｅ^２３－Ｇｌｕ^２４－Ａｌａ^２５－Ｌｅｕ^２６－Ａｓｐ^２７－Ｌｙｓ^２８－Ｔｙｒ^２９－Ａｌａ^３０－Ｃｙｓ^３１－Ａｓｎ^３２－Ｃｙｓ^３３－Ｖａｌ^３４－Ｖａｌ^３５－Ｇｌｙ^３６－Ｔｙｒ^３７－Ｉｌｅ^３８－Ｇｌｙ^３９－Ｇｌｕ^４０－Ａｒｇ^４１－Ｃｙｓ^４２－Ｇｌｎ^４３－Ｔｙｒ^４４－Ａｒｇ^４５－Ａｓｐ^４６－Ｌｅｕ^４７－Ｌｙｓ^４８－Ｔｒｐ^４９－Ｔｒｐ^５０－Ｇｌｕ^５１－Ｌｅｕ^５２－Ａｒｇ^５３－ＯＨ ［配列番号１］
又はそのバリアントであって、
そして、前記方法は、以下を含んでいる；
第１のペプチド断片が、以下の配列を有するペプチド断片；ＰＧ_１－Ａｓｎ^１－Ｓｅｒ^２－Ａｓｐ^３－Ｓｅｒ^４－Ｇｌｕ^５－Ｃｙｓ^６－Ｐｒｏ^７－Ｌｅｕ^８－Ｓｅｒ^９－Ｈｉｓ^１０－Ａｓｐ^１１－Ｇｌｙ^１２－ＯＨ ［配列番号４］
又はそのバリアントであって；
ＰＧ_１がＢｏｃ及びＦｍｏｃから選択されたＮ末端保護基であり；そして、当該Ｃ末端アミノ酸は、任意に、活性化されたカルボン酸誘導体の形態であり；
第２のペプチド断片が、以下の配列を有するペプチド断片；Ｈ－Ｔｙｒ^１３－Ｃｙｓ^１４－Ｌｅｕ^１５－Ｈｉｓ^１６－Ａｓｐ^１７－Ｇｌｙ^１８－Ｖａｌ^１９－Ｃｙｓ^２０－Ｍｅｔ^２１－Ｔｙｒ^２２－Ｉｌｅ^２３－Ｇｌｕ^２４－Ａｌａ^２５－Ｌｅｕ^２６－Ａｓｐ^２７－Ｌｙｓ^２８－Ｔｙｒ^２９－Ａｌａ^３０－Ｃｙｓ^３１－Ａｓｎ^３２－Ｃｙｓ^３３－Ｖａｌ^３４－Ｖａｌ^３５－Ｇｌｙ^３６－Ｔｙｒ^３７－Ｉｌｅ^３８－Ｇｌｙ^３９－Ｇｌｕ^４０－Ａｒｇ^４１－Ｃｙｓ^４２－Ｇｌｎ^４３－Ｔｙｒ^４４－Ａｒｇ^４５－Ａｓｐ^４６－Ｌｅｕ^４７－Ｌｙｓ^４８－Ｔｒｐ^４９－Ｔｒｐ^５０－Ｇｌｕ^５１－Ｌｅｕ^５２－Ａｒｇ^５３－Ｏ－ＰＧ_２ ［配列番号５］又はそのバリアントであって；ＰＧ_２が、クロロトリチル及びｔ－ブチルから選択される保護基であって、；そして、前記第１の及び第２のペプチド断片における１または複数のアミノ酸残基が、好ましくは、酸開裂性保護基で任意に保護されている、前記第１のペプチド断片と、前記第２のペプチド断片を、溶液中でカップリングする方法を有する、請求項１に記載の方法。

【請求項29】

前記ＥＧＦ様ペプチドが、以下の配列を有するペプチド；Ｈ－Ａｓｎ^１（Ｐ）－Ｓｅｒ^２（Ｐ）－Ａｓｐ^３（Ｐ）－ΨＳｅｒ^４－Ｇｌｕ^５（Ｐ）－Ｃｙｓ^６（Ｐ）－Ｐｒｏ^７－Ｌｅｕ^８－ΨＳｅｒ^９－Ｈｉｓ^１０（Ｐ）－Ａｓｐ^１１（Ｐ）－Ｇｌｙ^１２－Ｔｙｒ^１３（Ｐ）－Ｃｙｓ^１４（Ｐ）－Ｌｅｕ^１５－Ｈｉｓ^１６（Ｐ）－Ａｓｐ^１７（Ｐ）－Ｇｌｙ^１８－Ｖａｌ^１９－Ｃｙｓ^２０（Ｐ）－Ｍｅｔ^２１－Ｔｙｒ^２２（Ｐ）－Ｉｌｅ^２３－Ｇｌｕ^２４（Ｐ）－Ａｌａ^２５－Ｌｅｕ^２６－Ａｓｐ^２７（Ｐ）－Ｌｙｓ^２８（Ｐ）－Ｔｙｒ^２９（Ｐ）－Ａｌａ^３０－Ｃｙｓ^３１（Ｐ）－Ａｓｎ^３２（Ｐ）－Ｃｙｓ^３３（Ｐ）－Ｖａｌ^３４－Ｖａｌ^３５－Ｇｌｙ^３６－Ｔｙｒ^３７（Ｐ）－Ｉｌｅ^３８－Ｇｌｙ^３９－Ｇｌｕ^４０（Ｐ）－Ａｒｇ^４１（Ｐ）－Ｃｙｓ^４２（Ｐ）－Ｇｌｎ^４３（Ｐ）－Ｔｙｒ^４４（Ｐ）－Ａｒｇ^４５（Ｐ）－Ａｓｐ^４６（Ｐ）－Ｌｅｕ^４７－Ｌｙｓ^４８（Ｐ）－Ｔｒｐ^４９（Ｐ）－Ｔｒｐ^５０（Ｐ）－Ｇｌｕ^５１（Ｐ）－Ｌｅｕ^５２－Ａｒｇ^５３（Ｐ）－ＯＨ ［配列番号９］
又はそのバリアントであって、
前記第１のペプチド断片が、以下の配列を有するペプチド断片；ＰＧ_１－Ａｓｎ^１（Ｐ）－Ｓｅｒ^２（Ｐ）－Ａｓｐ^３（Ｐ）－ΨＳｅｒ^４－Ｇｌｕ^５（Ｐ）－Ｃｙｓ^６（Ｐ）－Ｐｒｏ^７－Ｌｅｕ^８－ΨＳｅｒ^９－Ｈｉｓ^１０（Ｐ）－Ａｓｐ^１１（Ｐ）－Ｇｌｙ^１２－ＯＨ ［配列番号３４］
又はそのバリアントであって、
そして、前記第２のペプチド断片が、以下の配列を有するペプチド断片；Ｈ－Ｔｙｒ^１３（Ｐ）－Ｃｙｓ^１４（Ｐ）－Ｌｅｕ^１５－Ｈｉｓ^１６（Ｐ）－Ａｓｐ^１７（Ｐ）－Ｇｌｙ^１８－Ｖａｌ^１９－Ｃｙｓ^２０（Ｐ）－Ｍｅｔ^２１－Ｔｙｒ^２２（Ｐ）－Ｉｌｅ^２３－Ｇｌｕ^２４（Ｐ）－Ａｌａ^２５－Ｌｅｕ^２６－Ａｓｐ^２７（Ｐ）－Ｌｙｓ^２８（Ｐ）－Ｔｙｒ^２９（Ｐ）－Ａｌａ^３０－Ｃｙｓ^３１（Ｐ）－Ａｓｎ^３２（Ｐ）－Ｃｙｓ^３３（Ｐ）－Ｖａｌ^３４－Ｖａｌ^３５－Ｇｌｙ^３６－Ｔｙｒ^３７（Ｐ）－Ｉｌｅ^３８－Ｇｌｙ^３９－Ｇｌｕ^４０（Ｐ）－Ａｒｇ^４１（Ｐ）－Ｃｙｓ^４２（Ｐ）－Ｇｌｎ^４３（Ｐ）－Ｔｙｒ^４４（Ｐ）－Ａｒｇ^４５（Ｐ）－Ａｓｐ^４６（Ｐ）－Ｌｅｕ^４７－Ｌｙｓ^４８（Ｐ）－Ｔｒｐ^４９（Ｐ）－Ｔｒｐ^５０（Ｐ）－Ｇｌｕ^５１（Ｐ）－Ｌｅｕ^５２－Ａｒｇ^５３（Ｐ）－Ｏ－ＰＧ_２ ［配列番号３２］又はそのバリアントであって、
それぞれのＰが、同じ又は異なっていてもよい側鎖保護基を表している、請求項２８に記載の方法。

【請求項30】

前記ＥＧＦ様ペプチドが、以下の配列を有するペプチド断片；Ｈ－Ａｓｎ^１（Ｔｒｔ）－Ｓｅｒ^２（ｔＢｕ）－Ａｓｐ^３（ｔＢｕ）－ΨＳｅｒ^４－Ｇｌｕ^５（ｔＢｕ）－Ｃｙｓ^６（Ｔｒｔ）－Ｐｒｏ^７－Ｌｅｕ^８－ΨＳｅｒ^９－Ｈｉｓ^１０（Ｔｒｔ）－Ａｓｐ^１１（ｔＢｕ）－Ｇｌｙ^１２－Ｔｙｒ^１３（ｔＢｕ）－Ｃｙｓ^１４（Ｔｒｔ）－Ｌｅｕ^１５－Ｈｉｓ^１６（Ｔｒｔ）－Ａｓｐ^１７（ｔＢｕ）－Ｇｌｙ^１８－Ｖａｌ^１９－Ｃｙｓ^２０（Ｔｒｔ）－Ｍｅｔ^２１－Ｔｙｒ^２２（ｔＢｕ）－Ｉｌｅ^２３－Ｇｌｕ^２４（ｔＢｕ）－Ａｌａ^２５－Ｌｅｕ^２６－Ａｓｐ^２７（ｔＢｕ）－Ｌｙｓ^２８（Ｂｏｃ）－Ｔｙｒ^２９（ｔＢｕ）－Ａｌａ^３０－Ｃｙｓ^３１（Ｔｒｔ）－Ａｓｎ^３２（Ｔｒｔ）－Ｃｙｓ^３３（Ｔｒｔ）－Ｖａｌ^３４－Ｖａｌ^３５－Ｇｌｙ^３６－Ｔｙｒ^３７（ｔＢｕ）－Ｉｌｅ^３８－Ｇｌｙ^３９－Ｇｌｕ（ｔＢｕ）^４０－Ａｒｇ^４１（Ｐｂｆ）－Ｃｙｓ^４２（Ｔｒｔ）－Ｇｌｎ^４３（Ｔｒｔ）－Ｔｙｒ^４４（ｔＢｕ）－Ａｒｇ^４５（Ｐｂｆ）－Ａｓｐ^４６（ｔＢｕ）－Ｌｅｕ^４７－Ｌｙｓ^４８（Ｂｏｃ）－Ｔｒｐ^４９（Ｂｏｃ）－Ｔｒｐ^５０（Ｂｏｃ）－Ｇｌｕ^５１（ｔＢｕ）－Ｌｅｕ^５２－Ａｒｇ^５３（Ｐｂｆ）－ＯＨ ［配列番号１２］
又はそのバリアントであって；
そして、前記第１のペプチド断片が、以下の配列を有するペプチド断片；ＰＧ_１－Ａｓｎ^１（Ｔｒｔ）－Ｓｅｒ^２（ｔＢｕ）－Ａｓｐ^３（ｔＢｕ）－ΨＳｅｒ^４－Ｇｌｕ^５（ｔＢｕ）－Ｃｙｓ^６（Ｔｒｔ）－Ｐｒｏ^７－Ｌｅｕ^８－ΨＳｅｒ^９－Ｈｉｓ^１０（Ｔｒｔ）－Ａｓｐ^１１（ｔＢｕ）－Ｇｌｙ^１２－ＯＨ ［配列番号１８］
又はそのバリアントであって；
そして、前記第２のペプチド断片が以下の配列を有するペプチド断片；Ｈ－Ｔｙｒ^１３（ｔＢｕ）－Ｃｙｓ^１４（Ｔｒｔ）－Ｌｅｕ^１５－Ｈｉｓ^１６（Ｔｒｔ）－Ａｓｐ^１７（ｔＢｕ）－Ｇｌｙ^１８－Ｖａｌ^１９－Ｃｙｓ^２０（Ｔｒｔ）－Ｍｅｔ^２１－Ｔｙｒ^２２（ｔＢｕ）－Ｉｌｅ^２３－Ｇｌｕ^２４（ｔＢｕ）－Ａｌａ^２５－Ｌｅｕ^２６－Ａｓｐ^２７（ｔＢｕ）－Ｌｙｓ^２８（Ｂｏｃ）－Ｔｙｒ^２９（ｔＢｕ）－Ａｌａ^３０－Ｃｙｓ^３１（Ｔｒｔ）－Ａｓｎ^３２（Ｔｒｔ）－Ｃｙｓ^３３（Ｔｒｔ）－Ｖａｌ^３４－Ｖａｌ^３５－Ｇｌｙ^３６－Ｔｙｒ^３７（ｔＢｕ）－Ｉｌｅ^３８－Ｇｌｙ^３９－Ｇｌｕ（ｔＢｕ）^４０－Ａｒｇ^４１（Ｐｂｆ）－Ｃｙｓ^４２（Ｔｒｔ）－Ｇｌｎ^４３（Ｔｒｔ）－Ｔｙｒ^４４（ｔＢｕ）－Ａｒｇ^４５（Ｐｂｆ）－Ａｓｐ^４６（ｔＢｕ）－Ｌｅｕ^４７－Ｌｙｓ^４８（Ｂｏｃ）－Ｔｒｐ^４９（Ｂｏｃ）－Ｔｒｐ^５０（Ｂｏｃ）－Ｇｌｕ^５１（ｔＢｕ）－Ｌｅｕ^５２－Ａｒｇ^５３（Ｐｂｆ）－Ｏ－ＰＧ_２ ［配列番号３３］
又はそのバリアントである、請求項２８に記載の方法。

【請求項31】

前記第１のペプチド断片；ＰＧ_１－Ａｓｎ^１（Ｐ）－Ｓｅｒ^２（Ｐ）－Ａｓｐ^３（Ｐ）－ΨＳｅｒ^４－Ｇｌｕ^５（Ｐ）－Ｃｙｓ^６（Ｐ）－Ｐｒｏ^７－Ｌｅｕ^８－ΨＳｅｒ^９－Ｈｉｓ^１０（Ｐ）－Ａｓｐ^１１（Ｐ）－Ｇｌｙ^１２－ＯＨ ［配列番号３４］又はＰＧ_１－Ａｓｎ^１（Ｔｒｔ）－Ｓｅｒ^２（ｔＢｕ）－Ａｓｐ^３（ｔＢｕ）－ΨＳｅｒ^４－Ｇｌｕ^５（ｔＢｕ）－Ｃｙｓ^６（Ｔｒｔ）－Ｐｒｏ^７－Ｌｅｕ^８－ΨＳｅｒ^９－Ｈｉｓ^１０（Ｔｒｔ）－Ａｓｐ^１１（ｔＢｕ）－Ｇｌｙ^１２－ＯＨ ［配列番号１８］が、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ－ＯＨから開始する固相ペプチド合成により調製される、請求項２９又は請求項３０に記載の方法。

【請求項32】

前記第２のペプチド断片； Ｈ－Ｔｙｒ^１３（Ｐ）－Ｃｙｓ^１４（Ｐ）－Ｌｅｕ^１５－Ｈｉｓ^１６（Ｐ）－Ａｓｐ^１７（Ｐ）－Ｇｌｙ^１８－Ｖａｌ^１９－Ｃｙｓ^２０（Ｐ）－Ｍｅｔ^２１－Ｔｙｒ^２２（Ｐ）－Ｉｌｅ^２３－Ｇｌｕ^２４（Ｐ）－Ａｌａ^２５－Ｌｅｕ^２６－Ａｓｐ^２７（Ｐ）－Ｌｙｓ^２８（Ｐ）－Ｔｙｒ^２９（Ｐ）－Ａｌａ^３０－Ｃｙｓ^３１（Ｐ）－Ａｓｎ^３２（Ｐ）－Ｃｙｓ^３３（Ｐ）－Ｖａｌ^３４－Ｖａｌ^３５－Ｇｌｙ^３６－Ｔｙｒ^３７（Ｐ）－Ｉｌｅ^３８－Ｇｌｙ^３９－Ｇｌｕ^４０（Ｐ）－Ａｒｇ^４１（Ｐ）－Ｃｙｓ^４２（Ｐ）－Ｇｌｎ^４３（Ｐ）－Ｔｙｒ^４４（Ｐ）－Ａｒｇ^４５（Ｐ）－Ａｓｐ^４６（Ｐ）－Ｌｅｕ^４７－Ｌｙｓ^４８（Ｐ）－Ｔｒｐ^４９（Ｐ）－Ｔｒｐ^５０（Ｐ）－Ｇｌｕ^５１（Ｐ）－Ｌｅｕ^５２－Ａｒｇ^５３（Ｐ）－Ｏ－ＰＧ_２ ［配列番号３２］又はＨ－Ｔｙｒ^１３（ｔＢｕ）－Ｃｙｓ^１４（Ｔｒｔ）－Ｌｅｕ^１５－Ｈｉｓ^１６（Ｔｒｔ）－Ａｓｐ^１７（ｔＢｕ）－Ｇｌｙ^１８－Ｖａｌ^１９－Ｃｙｓ^２０（Ｔｒｔ）－Ｍｅｔ^２１－Ｔｙｒ^２２（ｔＢｕ）－Ｉｌｅ^２３－Ｇｌｕ^２４（ｔＢｕ）－Ａｌａ^２５－Ｌｅｕ^２６－Ａｓｐ^２７（ｔＢｕ）－Ｌｙｓ^２８（Ｂｏｃ）－Ｔｙｒ^２９（ｔＢｕ）－Ａｌａ^３０－Ｃｙｓ^３１（Ｔｒｔ）－Ａｓｎ^３２（Ｔｒｔ）－Ｃｙｓ^３３（Ｔｒｔ）－Ｖａｌ^３４－Ｖａｌ^３５－Ｇｌｙ^３６－Ｔｙｒ^３７（ｔＢｕ）－Ｉｌｅ^３８－Ｇｌｙ^３９－Ｇｌｕ（ｔＢｕ）^４０－Ａｒｇ^４１（Ｐｂｆ）－Ｃｙｓ^４２（Ｔｒｔ）－Ｇｌｎ^４３（Ｔｒｔ）－Ｔｙｒ^４４（ｔＢｕ）－Ａｒｇ^４５（Ｐｂｆ）－Ａｓｐ^４６（ｔＢｕ）－Ｌｅｕ^４７－Ｌｙｓ^４８（Ｂｏｃ）－Ｔｒｐ^４９（Ｂｏｃ）－Ｔｒｐ^５０（Ｂｏｃ）－Ｇｌｕ^５１（ｔＢｕ）－Ｌｅｕ^５２－Ａｒｇ^５３（Ｐｂｆ）－Ｏ－ＰＧ_２ ［配列番号３３］が、Ｆｍｏｃ－Ａｒｇ（Ｐ）又はＦｍｏｃ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）から開始する固相ペプチド合成により調製される、請求項２９又は請求項３０に記載の方法。

【請求項33】

前記第２のペプチド断片；Ｈ－Ｔｙｒ^１３（Ｐ）－Ｃｙｓ^１４（Ｐ）－Ｌｅｕ^１５－Ｈｉｓ^１６（Ｐ）－Ａｓｐ^１７（Ｐ）－Ｇｌｙ^１８－Ｖａｌ^１９－Ｃｙｓ^２０（Ｐ）－Ｍｅｔ^２１－Ｔｙｒ^２２（Ｐ）－Ｉｌｅ^２３－Ｇｌｕ^２４（Ｐ）－Ａｌａ^２５－Ｌｅｕ^２６－Ａｓｐ^２７（Ｐ）－Ｌｙｓ^２８（Ｐ）－Ｔｙｒ^２９（Ｐ）－Ａｌａ^３０－Ｃｙｓ^３１（Ｐ）－Ａｓｎ^３２（Ｐ）－Ｃｙｓ^３３（Ｐ）－Ｖａｌ^３４－Ｖａｌ^３５－Ｇｌｙ^３６－Ｔｙｒ^３７（Ｐ）－Ｉｌｅ^３８－Ｇｌｙ^３９－Ｇｌｕ^４０（Ｐ）－Ａｒｇ^４１（Ｐ）－Ｃｙｓ^４２（Ｐ）－Ｇｌｎ^４３（Ｐ）－Ｔｙｒ^４４（Ｐ）－Ａｒｇ^４５（Ｐ）－Ａｓｐ^４６（Ｐ）－Ｌｅｕ^４７－Ｌｙｓ^４８（Ｐ）－Ｔｒｐ^４９（Ｐ）－Ｔｒｐ^５０（Ｐ）－Ｇｌｕ^５１（Ｐ）－Ｌｅｕ^５２－Ａｒｇ^５３（Ｐ）－Ｏ－ＰＧ_２ ［配列番号３２］が、ＰＧ_１－Ｔｙｒ^１３（Ｐ）－Ｃｙｓ^１４（Ｐ）－Ｌｅｕ^１５－Ｈｉｓ^１６（Ｐ）－Ａｓｐ^１７（Ｐ）－Ｇｌｙ^１８－Ｖａｌ^１９－Ｃｙｓ^２０（Ｐ）－Ｍｅｔ^２１－Ｔｙｒ^２２（Ｐ）－Ｉｌｅ^２３－Ｇｌｕ^２４（Ｐ）－Ａｌａ^２５－Ｌｅｕ^２６－Ａｓｐ^２７（Ｐ）－Ｌｙｓ^２８（Ｐ）－Ｔｙｒ^２９（Ｐ）－Ａｌａ^３０－Ｃｙｓ^３１（Ｐ）－Ａｓｎ^３２（Ｐ）－Ｃｙｓ^３３（Ｐ）－Ｖａｌ^３４－Ｖａｌ^３５－Ｇｌｙ^３６－ＯＨ ［配列番号３５］と、Ｈ－Ｔｙｒ^３７（Ｐ）－Ｉｌｅ^３８－Ｇｌｙ^３９－Ｇｌｕ^４０（Ｐ）－Ａｒｇ^４１（Ｐ）－Ｃｙｓ^４２（Ｐ）－Ｇｌｎ^４３（Ｐ）－Ｔｙｒ^４４（Ｐ）－Ａｒｇ^４５（Ｐ）－Ａｓｐ^４６（Ｐ）－Ｌｅｕ^４７－Ｌｙｓ^４８（Ｐ）－Ｔｒｐ^４９（Ｐ）－Ｔｒｐ^５０（Ｐ）－Ｇｌｕ^５１（Ｐ）－Ｌｅｕ^５２－Ａｒｇ^５３（Ｐ）－Ｏ－ＰＧ_２ ［配列番号２３］との断片縮合、その後の保護基ＰＧ_１の除去により調製される、請求項２９に記載の方法。

【請求項34】

前記第２のペプチド断片又はＨ－Ｔｙｒ^１３（ｔＢｕ）－Ｃｙｓ^１４（Ｔｒｔ）－Ｌｅｕ^１５－Ｈｉｓ^１６（Ｔｒｔ）－Ａｓｐ^１７（ｔＢｕ）－Ｇｌｙ^１８－Ｖａｌ^１９－Ｃｙｓ^２０（Ｔｒｔ）－Ｍｅｔ^２１－Ｔｙｒ^２２（ｔＢｕ）－Ｉｌｅ^２３－Ｇｌｕ^２４（ｔＢｕ）－Ａｌａ^２５－Ｌｅｕ^２６－Ａｓｐ^２７（ｔＢｕ）－Ｌｙｓ^２８（Ｂｏｃ）－Ｔｙｒ^２９（ｔＢｕ）－Ａｌａ^３０－Ｃｙｓ^３１（Ｔｒｔ）－Ａｓｎ^３２（Ｔｒｔ）－Ｃｙｓ^３３（Ｔｒｔ）－Ｖａｌ^３４－Ｖａｌ^３５－Ｇｌｙ^３６－Ｔｙｒ^３７（ｔＢｕ）－Ｉｌｅ^３８－Ｇｌｙ^３９－Ｇｌｕ（ｔＢｕ）^４０－Ａｒｇ^４１（Ｐｂｆ）－Ｃｙｓ^４２（Ｔｒｔ）－Ｇｌｎ^４３（Ｔｒｔ）－Ｔｙｒ^４４（ｔＢｕ）－Ａｒｇ^４５（Ｐｂｆ）－Ａｓｐ^４６（ｔＢｕ）－Ｌｅｕ^４７－Ｌｙｓ^４８（Ｂｏｃ）－Ｔｒｐ^４９（Ｂｏｃ）－Ｔｒｐ^５０（Ｂｏｃ）－Ｇｌｕ^５１（ｔＢｕ）－Ｌｅｕ^５２－Ａｒｇ^５３（Ｐｂｆ）－Ｏ－ＰＧ_２ ［配列番号３３］が、ＰＧ_１－Ｔｙｒ^１３（ｔＢｕ）－Ｃｙｓ^１４（Ｔｒｔ）－Ｌｅｕ^１５－Ｈｉｓ^１６（Ｔｒｔ）－Ａｓｐ^１７（ｔＢｕ）－Ｇｌｙ^１８－Ｖａｌ^１９－Ｃｙｓ^２０（Ｔｒｔ）－Ｍｅｔ^２１－Ｔｙｒ^２２（ｔＢｕ）－Ｉｌｅ^２３－Ｇｌｕ^２４（ｔＢｕ）－Ａｌａ^２５－Ｌｅｕ^２６－Ａｓｐ^２７（ｔＢｕ）－Ｌｙｓ^２８（Ｂｏｃ）－Ｔｙｒ^２９（ｔＢｕ）－Ａｌａ^３０－Ｃｙｓ^３１（Ｔｒｔ）－Ａｓｎ^３２（Ｔｒｔ）－Ｃｙｓ^３３（Ｔｒｔ）－Ｖａｌ^３４－Ｖａｌ^３５－Ｇｌｙ^３６－ＯＨ ［配列番号３６］とＨ－Ｔｙｒ^３７（ｔＢｕ）－Ｉｌｅ^３８－Ｇｌｙ^３９－Ｇｌｕ（ｔＢｕ）^４０－Ａｒｇ^４１（Ｐｂｆ）－Ｃｙｓ^４２（Ｔｒｔ）－Ｇｌｎ^４３（Ｔｒｔ）－Ｔｙｒ^４４（ｔＢｕ）－Ａｒｇ^４５（Ｐｂｆ）－Ａｓｐ^４６（ｔＢｕ）－Ｌｅｕ^４７－Ｌｙｓ^４８（Ｂｏｃ）－Ｔｒｐ^４９（Ｂｏｃ）－Ｔｒｐ^５０（Ｂｏｃ）－Ｇｌｕ^５１（ｔＢｕ）－Ｌｅｕ^５２－Ａｒｇ^５３（Ｐｂｆ）－Ｏ－ＰＧ_２ ［配列番号２５］との断片縮合、その後の保護基ＰＧ_１の除去により調製される、請求項３０に記載の方法。

【請求項35】

前記ペプチド断片；ＰＧ_１－Ｔｙｒ^１３（Ｐ）－Ｃｙｓ^１４（Ｐ）－Ｌｅｕ^１５－Ｈｉｓ^１６（Ｐ）－Ａｓｐ^１７（Ｐ）－Ｇｌｙ^１８－Ｖａｌ^１９－Ｃｙｓ^２０（Ｐ）－Ｍｅｔ^２１－Ｔｙｒ^２２（Ｐ）－Ｉｌｅ^２３－Ｇｌｕ^２４（Ｐ）－Ａｌａ^２５－Ｌｅｕ^２６－Ａｓｐ^２７（Ｐ）－Ｌｙｓ^２８（Ｐ）－Ｔｙｒ^２９（Ｐ）－Ａｌａ^３０－Ｃｙｓ^３１（Ｐ）－Ａｓｎ^３２（Ｐ）－Ｃｙｓ^３３（Ｐ）－Ｖａｌ^３４－Ｖａｌ^３５－Ｇｌｙ^３６－ＯＨ ［配列番号３５］又はＰＧ_１－Ｔｙｒ^１３（ｔＢｕ）－Ｃｙｓ^１４（Ｔｒｔ）－Ｌｅｕ^１５－Ｈｉｓ^１６（Ｔｒｔ）－Ａｓｐ^１７（ｔＢｕ）－Ｇｌｙ^１８－Ｖａｌ^１９－Ｃｙｓ^２０（Ｔｒｔ）－Ｍｅｔ^２１－Ｔｙｒ^２２（ｔＢｕ）－Ｉｌｅ^２３－Ｇｌｕ^２４（ｔＢｕ）－Ａｌａ^２５－Ｌｅｕ^２６－Ａｓｐ^２７（ｔＢｕ）－Ｌｙｓ^２８（Ｂｏｃ）－Ｔｙｒ^２９（ｔＢｕ）－Ａｌａ^３０－Ｃｙｓ^３１（Ｔｒｔ）－Ａｓｎ^３２（Ｔｒｔ）－Ｃｙｓ^３３（Ｔｒｔ）－Ｖａｌ^３４－Ｖａｌ^３５－Ｇｌｙ^３６－ＯＨ ［配列番号３６］が、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ－ＯＨから開始する固相ペプチド合成により調製される、請求項３３又は請求項３４に記載の方法。

【請求項36】

前記ペプチド断片；Ｈ－Ｔｙｒ^３７（Ｐ）－Ｉｌｅ^３８－Ｇｌｙ^３９－Ｇｌｕ^４０（Ｐ）－Ａｒｇ^４１（Ｐ）－Ｃｙｓ^４２（Ｐ）－Ｇｌｎ^４３（Ｐ）－Ｔｙｒ^４４（Ｐ）－Ａｒｇ^４５（Ｐ）－Ａｓｐ^４６（Ｐ）－Ｌｅｕ^４７－Ｌｙｓ^４８（Ｐ）－Ｔｒｐ^４９（Ｐ）－Ｔｒｐ^５０（Ｐ）－Ｇｌｕ^５１（Ｐ）－Ｌｅｕ^５２－Ａｒｇ^５３（Ｐ）－Ｏ－ＰＧ_２ ［配列番号２３］又はＨ－Ｔｙｒ^３７（ｔＢｕ）－Ｉｌｅ^３８－Ｇｌｙ^３９－Ｇｌｕ（ｔＢｕ）^４０－Ａｒｇ^４１（Ｐｂｆ）－Ｃｙｓ^４２（Ｔｒｔ）－Ｇｌｎ^４３（Ｔｒｔ）－Ｔｙｒ^４４（ｔＢｕ）－Ａｒｇ^４５（Ｐｂｆ）－Ａｓｐ^４６（ｔＢｕ）－Ｌｅｕ^４７－Ｌｙｓ^４８（Ｂｏｃ）－Ｔｒｐ^４９（Ｂｏｃ）－Ｔｒｐ^５０（Ｂｏｃ）－Ｇｌｕ^５１（ｔＢｕ）－Ｌｅｕ^５２－Ａｒｇ^５３（Ｐｂｆ）－Ｏ－ＰＧ_２ ［配列番号２５］が、Ｆｍｏｃ－Ａｒｇ（Ｐ）又はＦｍｏｃ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）から開始する固相ペプチド合成により調製される、請求項３３又は請求項３４に記載の方法。

【請求項37】

前記ＥＧＦ様ペプチドが、トランスフォーミング増殖因子α（ＴＧＦ－α）又そのアナログ又はＴＧＦのバリアントである、請求項１に記載の方法。

【請求項38】

前記ＥＧＦ様ペプチドが、ヒトトランスフォーミング増殖因子α（ｈＴＧＦ－α）又はそのアナログ又はｈＴＧＦ－αのバリアントである、請求項３７に記載の発明。

【請求項39】

前記ＥＧＦ様ペプチドが以下の配列を有するペプチド断片；Ｈ－Ｖａｌ^１－Ｖａｌ^２－Ｓｅｒ^３－Ｈｉｓ^４－Ｐｈｅ^５－Ａｓｎ^６－Ａｓｐ^７－Ｃｙｓ^８－Ｐｒｏ^９－Ａｓｐ^１０－Ｓｅｒ^１１－Ｈｉｓ^１２－Ｔｈｒ^１３－Ｇｌｎ^１４－Ｐｈｅ^１５－Ｃｙｓ^１６－Ｐｈｅ^１７－Ｈｉｓ^１８－Ｇｌｙ^１９－Ｔｈｒ^２０－Ｃｙｓ^２１－Ａｒｇ^２２－Ｐｈｅ^２３－Ｌｅｕ^２４－Ｖａｌ^２５－Ｇｌｎ^２６－Ｇｌｕ^２７－Ａｓｐ^２８－Ｌｙｓ^２９－Ｐｒｏ^３０－Ａｌａ^３１－Ｃｙｓ^３２－Ｖａｌ^３３－Ｃｙｓ^３４－Ｈｉｓ^３５－Ｓｅｒ^３６－Ｇｌｙ^３７－Ｔｙｒ^３８－Ｖａｌ^３９－Ｇｌｙ^４０－Ａｌａ^４１－Ａｒｇ^４２－Ｃｙｓ^４３－Ｇｌｕ^４４－Ｈｉｓ^４５－Ａｌａ^４６－Ａｓｐ^４７－Ｌｅｕ^４８－Ｌｅｕ^４９－Ａｌａ^５０－ＯＨ ［配列番号６］
又はそのバリアントであり；
そして、前記方法は、以下のステップを含んでいる；
以下の配列を有する第１のペプチド断片；ＰＧ_１－Ｖａｌ^１－Ｖａｌ^２－Ｓｅｒ^３－Ｈｉｓ^４－Ｐｈｅ^５－Ａｓｎ^６－Ａｓｐ^７－Ｃｙｓ^８－Ｐｒｏ^９－Ａｓｐ^１０－Ｓｅｒ^１１－Ｈｉｓ^１２－Ｔｈｒ^１３－Ｇｌｎ^１４－Ｐｈｅ^１５－Ｃｙｓ^１６－Ｐｈｅ^１７－Ｈｉｓ^１８－Ｇｌｙ^１９－ＯＨ ［配列番号７］
又はそのバリアントであって；
ＰＧ_１がＢｏｃ及びＦｍｏｃから選択されたＮ末端保護基であり；そして、当該Ｃ末端アミノ酸は、任意に、活性化されたカルボン酸誘導体の形態であり；
第２のペプチド断片が、以下の配列を有するペプチド断片；Ｈ－Ｔｈｒ^２０－Ｃｙｓ^２１－Ａｒｇ^２２－Ｐｈｅ^２３－Ｌｅｕ^２４－Ｖａｌ^２５－Ｇｌｎ^２６－Ｇｌｕ^２７－Ａｓｐ^２８－Ｌｙｓ^２９－Ｐｒｏ^３０－Ａｌａ^３１－Ｃｙｓ^３２－Ｖａｌ^３３－Ｃｙｓ^３４－Ｈｉｓ^３５－Ｓｅｒ^３６－Ｇｌｙ^３７－Ｔｙｒ^３８－Ｖａｌ^３９－Ｇｌｙ^４０－Ａｌａ^４１－Ａｒｇ^４２－Ｃｙｓ^４３－Ｇｌｕ^４４－Ｈｉｓ^４５－Ａｌａ^４６－Ａｓｐ^４７－Ｌｅｕ^４８－Ｌｅｕ^４９－Ａｌａ^５０－Ｏ－ＰＧ_２ ［配列番号８］又はそのバリアントであって；ＰＧ_２が、クロロトリチル及びｔ－ブチルから選択される保護基であって、；そして、前記第１の及び第２のペプチド断片における１または複数のアミノ酸残基が、好ましくは、酸開裂性保護基で任意に保護されている、前記第１のペプチド断片と、前記第２のペプチド断片とを、溶液中でカップリングする方法を有する、請求項３７に記載の方法。

【請求項40】

前記ＥＧＦ様ペプチドが、以下の配列を有するペプチド；Ｈ－Ｖａｌ^１－Ｖａｌ^２－Ｓｅｒ^３（Ｐ）－Ｈｉｓ^４（Ｐ）－Ｐｈｅ^５－Ａｓｎ^６（Ｐ）－Ａｓｐ^７（Ｐ）－Ｃｙｓ^８（Ｐ）－Ｐｒｏ^９－Ａｓｐ^１０（Ｐ）－ΨＳｅｒ^１１－Ｈｉｓ^１２（Ｐ）－Ｔｈｒ^１３（Ｐ）－Ｇｌｎ^１４（Ｐ）－Ｐｈｅ^１５－Ｃｙｓ^１６（Ｐ）－Ｐｈｅ^１７－Ｈｉｓ^１８（Ｐ）－Ｇｌｙ^１９－Ｔｈｒ^２０（Ｐ）－Ｃｙｓ^２１（Ｐ）－Ａｒｇ^２２（Ｐ）－Ｐｈｅ^２３－Ｌｅｕ^２４－Ｖａｌ^２５－Ｇｌｎ^２６－Ｇｌｕ^２７（Ｐ）－Ａｓｐ^２８（Ｐ）－Ｌｙｓ^２９（Ｐ）－Ｐｒｏ^３０－Ａｌａ^３１－Ｃｙｓ^３２（Ｐ）－Ｖａｌ^３３－Ｃｙｓ^３４（Ｐ）－Ｈｉｓ^３５－Ｓｅｒ^３６（Ｐ）－Ｇｌｙ^３７－Ｔｙｒ^３８（Ｐ）－Ｖａｌ^３９－Ｇｌｙ^４０－Ａｌａ^４１－Ａｒｇ^４２（Ｐ）－Ｃｙｓ^４３（Ｐ）－Ｇｌｕ^４４（Ｐ）－Ｈｉｓ^４５（Ｐ）－Ａｌａ^４６－Ａｓｐ^４７（Ｐ）－ Ｌｅｕ^４８－Ｌｅｕ^４９－Ａｌａ^５０－ＯＨ ［配列番号５０］
又はそのバリアントであって、
前記第１のペプチド断片が、以下の配列を有するペプチド断片；ＰＧ_１－Ｖａｌ^１－Ｖａｌ^２－Ｓｅｒ^３（Ｐ）－Ｈｉｓ^４（Ｐ）－Ｐｈｅ^５－Ａｓｎ^６（Ｐ）－Ａｓｐ^７（Ｐ）－Ｃｙｓ^８（Ｐ）－Ｐｒｏ^９－Ａｓｐ^１０（Ｐ）－ΨＳｅｒ^１１－Ｈｉｓ^１２（Ｐ）－Ｔｈｒ^１３（Ｐ）－Ｇｌｎ^１４（Ｐ）－Ｐｈｅ^１５－Ｃｙｓ^１６（Ｐ）－Ｐｈｅ^１７－Ｈｉｓ^１８（Ｐ）－Ｇｌｙ^１９－ＯＨ ［配列番号３８］
又はそのバリアントであって、
そして、前記第２のペプチド断片が、以下の配列を有するペプチド断片；Ｈ－Ｔｈｒ^２０（Ｐ）－Ｃｙｓ^２１（Ｐ）－Ａｒｇ^２２（Ｐ）－Ｐｈｅ^２３－Ｌｅｕ^２４－Ｖａｌ^２５－Ｇｌｎ^２６－Ｇｌｕ^２７（Ｐ）－Ａｓｐ^２８（Ｐ）－Ｌｙｓ^２９（Ｐ）－Ｐｒｏ^３０－Ａｌａ^３１－Ｃｙｓ^３２（Ｐ）－Ｖａｌ^３３－Ｃｙｓ^３４（Ｐ）－Ｈｉｓ^３５－Ｓｅｒ^３６（Ｐ）－Ｇｌｙ^３７－Ｔｙｒ^３８（Ｐ）－Ｖａｌ^３９－Ｇｌｙ^４０－Ａｌａ^４１－Ａｒｇ^４２（Ｐ）－Ｃｙｓ^４３（Ｐ）－Ｇｌｕ^４４（Ｐ）－Ｈｉｓ^４５（Ｐ）－Ａｌａ^４６－Ａｓｐ^４７（Ｐ）－ Ｌｅｕ^４８－Ｌｅｕ^４９－Ａｌａ^５０－Ｏ－ＰＧ_２ ［配列番号３９］
又はそのバリアントであって、
それぞれのＰが、同じ又は異なっていてもよい側鎖保護基を表している、請求項３７に記載の方法。

【請求項41】

前記ＥＧＦ様ペプチドが、以下の配列を有するペプチド；Ｈ－Ｖａｌ^１－Ｖａｌ^２－Ｓｅｒ^３（ｔＢｕ）－Ｈｉｓ^４（Ｔｒｔ）－Ｐｈｅ^５－Ａｓｎ^６（Ｔｒｔ）－Ａｓｐ^７（ｔＢｕ）－Ｃｙｓ^８（Ｔｒｔ）－Ｐｒｏ^９－Ａｓｐ^１０（ｔＢｕ）－ΨＳｅｒ^１１－Ｈｉｓ^１２（Ｔｒｔ）－Ｔｈｒ^１３（ｔＢｕ）－Ｇｌｎ^１４（Ｔｒｔ）－Ｐｈｅ^１５－Ｃｙｓ^１６（Ｔｒｔ）－Ｐｈｅ^１７－Ｈｉｓ^１８（Ｔｒｔ）－Ｇｌｙ^１９－Ｔｈｒ^２０（ｔＢｕ）－Ｃｙｓ^２１（Ｔｒｔ）－Ａｒｇ^２２（Ｐｂｆ）－Ｐｈｅ^２３－Ｌｅｕ^２４－Ｖａｌ^２５－Ｇｌｎ^２６－Ｇｌｕ^２７（ｔＢｕ）－Ａｓｐ^２８（ｔＢｕ）－Ｌｙｓ^２９（Ｂｏｃ）－Ｐｒｏ^３０－Ａｌａ^３１－Ｃｙｓ^３２（Ｔｒｔ）－Ｖａｌ^３３－Ｃｙｓ^３４（Ｔｒｔ）－Ｈｉｓ^３５－Ｓｅｒ^３６（ｔＢｕ）－Ｇｌｙ^３７－Ｔｙｒ^３８（ｔＢｕ）－Ｖａｌ^３９－Ｇｌｙ^４０－Ａｌａ^４１－Ａｒｇ^４２（Ｐｂｆ）－Ｃｙｓ^４３（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ^４４（ｔＢｕ）－Ｈｉｓ^４５（Ｔｒｔ）－Ａｌａ^４６－Ａｓｐ^４７（ｔＢｕ）－ Ｌｅｕ^４８－Ｌｅｕ^４９－Ａｌａ^５０－ＯＨ ［配列番号５１］
又はそのバリアントであって、
前記第１のペプチド断片が、以下の配列を有するペプチド断片；
ＰＧ_１－Ｖａｌ^１－Ｖａｌ^２－Ｓｅｒ^３（ｔＢｕ）－Ｈｉｓ^４（Ｔｒｔ）－Ｐｈｅ^５－Ａｓｎ^６（Ｔｒｔ）－Ａｓｐ^７（ｔＢｕ）－Ｃｙｓ^８（Ｔｒｔ）－Ｐｒｏ^９－Ａｓｐ^１０（ｔＢｕ）－ΨＳｅｒ^１１－Ｈｉｓ^１２（Ｔｒｔ）－Ｔｈｒ^１３（ｔＢｕ）－Ｇｌｎ^１４（Ｔｒｔ）－Ｐｈｅ^１５－Ｃｙｓ^１６（Ｔｒｔ）－Ｐｈｅ^１７－Ｈｉｓ^１８（Ｔｒｔ）－Ｇｌｙ^１９－ＯＨ ［配列番号４１］
又はそのバリアントであって、
そして、前記第２のペプチド断片が、以下の配列を有するペプチド断片；Ｈ－Ｔｈｒ^２０（ｔＢｕ）－Ｃｙｓ^２１（Ｔｒｔ）－Ａｒｇ^２２（Ｐｂｆ）－Ｐｈｅ^２３－Ｌｅｕ^２４－Ｖａｌ^２５－Ｇｌｎ^２６－Ｇｌｕ^２７（ｔＢｕ）－Ａｓｐ^２８（ｔＢｕ）－Ｌｙｓ^２９（Ｂｏｃ）－Ｐｒｏ^３０－Ａｌａ^３１－Ｃｙｓ^３２（Ｔｒｔ）－Ｖａｌ^３３－Ｃｙｓ^３４（Ｔｒｔ）－Ｈｉｓ^３５－Ｓｅｒ^３６（ｔＢｕ）－Ｇｌｙ^３７－Ｔｙｒ^３８（ｔＢｕ）－Ｖａｌ^３９－Ｇｌｙ^４０－Ａｌａ^４１－Ａｒｇ^４２（Ｐｂｆ）－Ｃｙｓ^４３（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ^４４（ｔＢｕ）－Ｈｉｓ^４５（Ｔｒｔ）－Ａｌａ^４６－Ａｓｐ^４７（ｔＢｕ）－Ｌｅｕ^４８－Ｌｅｕ^４９－Ａｌａ^５０－Ｏ－ＰＧ_２ ［配列番号４２］
又はそのバリアントである、請求項３７に記載の方法。

【請求項42】

前記第１のペプチド断片；ＰＧ_１－Ｖａｌ^１－Ｖａｌ^２－Ｓｅｒ^３（Ｐ）－Ｈｉｓ^４（Ｐ）－Ｐｈｅ^５－Ａｓｎ^６（Ｐ）－Ａｓｐ^７（Ｐ）－Ｃｙｓ^８（Ｐ）－Ｐｒｏ^９－Ａｓｐ^１０（Ｐ）－ΨＳｅｒ^１１－Ｈｉｓ^１２（Ｐ）－Ｔｈｒ^１３（Ｐ）－Ｇｌｎ^１４（Ｐ）－Ｐｈｅ^１５－Ｃｙｓ^１６（Ｐ）－Ｐｈｅ^１７－Ｈｉｓ^１８（Ｐ）－Ｇｌｙ^１９－ＯＨ ［配列番号３８］又はＰＧ_１－Ｖａｌ^１－Ｖａｌ^２－Ｓｅｒ^３（ｔＢｕ）－Ｈｉｓ^４（Ｔｒｔ）－Ｐｈｅ^５－Ａｓｎ^６（Ｔｒｔ）－Ａｓｐ^７（ｔＢｕ）－Ｃｙｓ^８（Ｔｒｔ）－Ｐｒｏ^９－Ａｓｐ^１０（ｔＢｕ）－ΨＳｅｒ^１１－Ｈｉｓ^１２（Ｔｒｔ）－Ｔｈｒ^１３（ｔＢｕ）－Ｇｌｎ^１４（Ｔｒｔ）－Ｐｈｅ^１５－Ｃｙｓ^１６（Ｔｒｔ）－Ｐｈｅ^１７－Ｈｉｓ^１８（Ｔｒｔ）－Ｇｌｙ^１９－ＯＨ ［配列番号４１］が、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ－ＯＨから開始する固相ペプチド合成により調製される、請求項４０又は請求項４１に記載の方法。

【請求項43】

配列；Ｈ－Ｔｈｒ^２０（Ｐ）－Ｃｙｓ^２１（Ｐ）－Ａｒｇ^２２（Ｐ）－Ｐｈｅ^２３－Ｌｅｕ^２４－Ｖａｌ^２５－Ｇｌｎ^２６－Ｇｌｕ^２７（Ｐ）－Ａｓｐ^２８（Ｐ）－Ｌｙｓ^２９（Ｐ）－Ｐｒｏ^３０－Ａｌａ^３１－Ｃｙｓ^３２（Ｐ）－Ｖａｌ^３３－Ｃｙｓ^３４（Ｐ）－Ｈｉｓ^３５－Ｓｅｒ^３６（Ｐ）－Ｇｌｙ^３７－Ｔｙｒ^３８（Ｐ）－Ｖａｌ^３９－Ｇｌｙ^４０－Ａｌａ^４１－Ａｒｇ^４２（Ｐ）－Ｃｙｓ^４３（Ｐ）－Ｇｌｕ^４４（Ｐ）－Ｈｉｓ^４５（Ｐ）－Ａｌａ^４６－Ａｓｐ^４７（Ｐ）－ Ｌｅｕ^４８－Ｌｅｕ^４９－Ａｌａ^５０－Ｏ－ＰＧ_２ ［配列番号３９］を有する前記第２のペプチド断片が、ＰＧ_１－Ｔｈｒ^２０（Ｐ）－Ｃｙｓ^２１（Ｐ）－Ａｒｇ^２２（Ｐ）－Ｐｈｅ^２３－Ｌｅｕ^２４－Ｖａｌ^２５－Ｇｌｎ^２６－Ｇｌｕ^２７（Ｐ）－Ａｓｐ^２８（Ｐ）－Ｌｙｓ^２９（Ｐ）－Ｐｒｏ^３０－Ａｌａ^３１－Ｃｙｓ^３２（Ｐ）－Ｖａｌ^３３－Ｃｙｓ^３４（Ｐ）－Ｈｉｓ^３５－Ｓｅｒ^３６（Ｐ）－Ｇｌｙ^３７－ＯＨ ［配列番号４３］と、Ｈ－Ｔｙｒ^３８（Ｐ）－Ｖａｌ^３９－Ｇｌｙ^４０－Ａｌａ^４１－Ａｒｇ^４２（Ｐ）－Ｃｙｓ^４３（Ｐ）－Ｇｌｕ^４４（Ｐ）－Ｈｉｓ^４５（Ｐ）－Ａｌａ^４６－Ａｓｐ^４７（Ｐ）－ Ｌｅｕ^４８－Ｌｅｕ^４９－Ａｌａ^５０－Ｏ－ＰＧ_２ ［配列番号４４］との断片縮合、その後の保護基ＰＧ_１の除去により調製される、請求項４０に記載の方法。

【請求項44】

配列； Ｈ－Ｔｈｒ^２０（ｔＢｕ）－Ｃｙｓ^２１（Ｔｒｔ）－Ａｒｇ^２２（Ｐｂｆ）－Ｐｈｅ^２３－Ｌｅｕ^２４－Ｖａｌ^２５－Ｇｌｎ^２６－Ｇｌｕ^２７（ｔＢｕ）－Ａｓｐ^２８（ｔＢｕ）－Ｌｙｓ^２９（Ｂｏｃ）－Ｐｒｏ^３０－Ａｌａ^３１－Ｃｙｓ^３２（Ｔｒｔ）－Ｖａｌ^３３－Ｃｙｓ^３４（Ｔｒｔ）－Ｈｉｓ^３５－Ｓｅｒ^３６（ｔＢｕ）－Ｇｌｙ^３７－Ｔｙｒ^３８（ｔＢｕ）－Ｖａｌ^３９－Ｇｌｙ^４０－Ａｌａ^４１－Ａｒｇ^４２（Ｐｂｆ）－Ｃｙｓ^４３（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ^４４（ｔＢｕ）－Ｈｉｓ^４５（Ｔｒｔ）－Ａｌａ^４６－Ａｓｐ^４７（ｔＢｕ）－Ｌｅｕ^４８－Ｌｅｕ^４９－Ａｌａ^５０－Ｏ－ＰＧ_２ ［配列番号４５］を有する前記第２のペプチド断片が、ＰＧ_１－Ｔｈｒ^２０（ｔＢｕ）－Ｃｙｓ^２１（Ｔｒｔ）－Ａｒｇ^２２（Ｐｂｆ）－Ｐｈｅ^２３－Ｌｅｕ^２４－Ｖａｌ^２５－Ｇｌｎ^２６－Ｇｌｕ^２７（ｔＢｕ）－Ａｓｐ^２８（ｔＢｕ）－Ｌｙｓ^２９（Ｂｏｃ）－Ｐｒｏ^３０－Ａｌａ^３１－Ｃｙｓ^３２（Ｔｒｔ）－Ｖａｌ^３３－Ｃｙｓ^３４（Ｔｒｔ）－Ｈｉｓ^３５－Ｓｅｒ^３６（ｔＢｕ）－Ｇｌｙ^３７－ＯＨ ［配列番号４６］と、Ｈ－Ｔｙｒ^３８（ｔＢｕ）－Ｖａｌ^３９－Ｇｌｙ^４０－Ａｌａ^４１－Ａｒｇ^４２（Ｐｂｆ）－Ｃｙｓ^４３（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ^４４（ｔＢｕ）－Ｈｉｓ^４５（Ｔｒｔ）－Ａｌａ^４６－Ａｓｐ^４７（ｔＢｕ）－ Ｌｅｕ^４８－Ｌｅｕ^４９－Ａｌａ^５０－Ｏ－ＰＧ_２ ［配列番号４７］との断片縮合、その後の保護基ＰＧ_１の除去により調製される、請求項４１に記載の方法。

【請求項45】

前記ペプチド断片Ｈ－Ｔｙｒ^３８（Ｐ）－Ｖａｌ^３９－Ｇｌｙ^４０－Ａｌａ^４１－Ａｒｇ^４２（Ｐ）－Ｃｙｓ^４３（Ｐ）－Ｇｌｕ^４４（Ｐ）－Ｈｉｓ^４５（Ｐ）－Ａｌａ^４６－Ａｓｐ^４７（Ｐ）－Ｌｅｕ^４８－Ｌｅｕ^４９－Ａｌａ^５０－Ｏ－ＰＧ_２ ［配列番号４８］又はＨ－Ｔｙｒ^３８（ｔＢｕ）－Ｖａｌ^３９－Ｇｌｙ^４０－Ａｌａ^４１－Ａｒｇ^４２（Ｐｂｆ）－Ｃｙｓ^４３（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ^４４（ｔＢｕ）－Ｈｉｓ^４５（Ｔｒｔ）－Ａｌａ^４６－Ａｓｐ^４７（ｔＢｕ）－ Ｌｅｕ^４８－Ｌｅｕ^４９－Ａｌａ^５０－Ｏ－ＰＧ_２ ［配列番号４７］が、Ｆｍｏｃ－Ａｌａ－ＯＨから開始する固相ペプチド合成により調製される、請求項４３又は請求項４４に記載の方法。

【請求項46】

前記ペプチド断片ＰＧ_１－Ｔｈｒ^２０（Ｐ）－Ｃｙｓ^２１（Ｐ）－Ａｒｇ^２２（Ｐ）－Ｐｈｅ^２３－Ｌｅｕ^２４－Ｖａｌ^２５－Ｇｌｎ^２６－Ｇｌｕ^２７（Ｐ）－Ａｓｐ^２８（Ｐ）－Ｌｙｓ^２９（Ｐ）－Ｐｒｏ^３０－Ａｌａ^３１－Ｃｙｓ^３２（Ｐ）－Ｖａｌ^３３－Ｃｙｓ^３４（Ｐ）－Ｈｉｓ^３５－Ｓｅｒ^３６（Ｐ）－Ｇｌｙ^３７－ＯＨ ［配列番号４３］又はＰＧ_１－Ｔｈｒ^２０（ｔＢｕ）－Ｃｙｓ^２１（Ｔｒｔ）－Ａｒｇ^２２（Ｐｂｆ）－Ｐｈｅ^２３－Ｌｅｕ^２４－Ｖａｌ^２５－Ｇｌｎ^２６－Ｇｌｕ^２７（ｔＢｕ）－Ａｓｐ^２８（ｔＢｕ）－Ｌｙｓ^２９（Ｂｏｃ）－Ｐｒｏ^３０－Ａｌａ^３１－Ｃｙｓ^３２（Ｔｒｔ）－Ｖａｌ^３３－Ｃｙｓ^３４（Ｔｒｔ）－Ｈｉｓ^３５－Ｓｅｒ^３６（ｔＢｕ）－Ｇｌｙ^３７－ＯＨ ［配列番号４６］が、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ－ＯＨを用いて開始する固相ペプチド合成により調製される、請求項４３又は請求項４４に記載の方法。

【請求項47】

ＰＧ_２がクロロトリチルである、請求項１～請求項４６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項48】

ＰＧ_１がＢｏｃである、請求項１～請求項４７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項49】

以下の配列を有するＥＧＦ様ペプチド；Ｈ－Ａｓｎ^１－Ｓｅｒ^２－Ａｓｐ^３－Ｓｅｒ^４－Ｇｌｕ^５－Ｃｙｓ^６－Ｐｒｏ^７－Ｌｅｕ^８－Ｓｅｒ^９－Ｈｉｓ^１０－Ａｓｐ^１１－Ｇｌｙ^１２－Ｔｙｒ^１３－Ｃｙｓ^１４－Ｌｅｕ^１５－Ｈｉｓ^１６－Ａｓｐ^１７－Ｇｌｙ^１８－Ｖａｌ^１９－Ｃｙｓ^２０－Ｍｅｔ^２１－Ｔｙｒ^２２－Ｉｌｅ^２３－Ｇｌｕ^２４－Ａｌａ^２５－Ｌｅｕ^２６－Ａｓｐ^２７－Ｌｙｓ^２８－Ｔｙｒ^２９－Ａｌａ^３０－Ｃｙｓ^３１－Ａｓｎ^３２－Ｃｙｓ^３３－Ｖａｌ^３４－Ｖａｌ^３５－Ｇｌｙ^３６－Ｔｙｒ^３７－Ｉｌｅ^３８－Ｇｌｙ^３９－Ｇｌｕ^４０－Ａｒｇ^４１－Ｃｙｓ^４２－Ｇｌｎ^４３－Ｔｙｒ^４４－Ａｒｇ^４５－Ａｓｐ^４６－Ｌｅｕ^４７－Ｌｙｓ^４８－Ｔｒｐ^４９－Ｔｒｐ^５０－Ｇｌｕ^５１－Ｌｅｕ^５２－Ａｒｇ^５３－ＯＨ ［配列番号１］又はそのバリアントを調製する方法であって、
前記方法は、以下のステップを含んでいる；
以下の配列を有する第１のペプチド断片；ＰＧ_１－Ａｓｎ^１－Ｓｅｒ^２－Ａｓｐ^３－Ｓｅｒ^４－Ｇｌｕ^５－Ｃｙｓ^６－Ｐｒｏ^７－Ｌｅｕ^８－Ｓｅｒ^９－Ｈｉｓ^１０－Ａｓｐ^１１－Ｇｌｙ^１２－Ｔｙｒ^１３－Ｃｙｓ^１４－Ｌｅｕ^１５－Ｈｉｓ^１６－Ａｓｐ^１７－Ｇｌｙ^１８－ＯＨ ［配列番号２］
又はそのバリアントであって、ＰＧ_１が、好ましくは、Ｂｏｃ及びＦｍｏｃから選択されるＮ末端保護基であり；そして、当該Ｃ末端アミノ酸は、任意に、活性化されたカルボン酸誘導体の形態であり；
第２のペプチド断片が、以下の配列を有するペプチド断片；Ｈ－Ｖａｌ^１９－Ｃｙｓ^２０－Ｍｅｔ^２１－Ｔｙｒ^２２－Ｉｌｅ^２３－Ｇｌｕ^２４－Ａｌａ^２５－Ｌｅｕ^２６－Ａｓｐ^２７－Ｌｙｓ^２８－Ｔｙｒ^２９－Ａｌａ^３０－Ｃｙｓ^３１－Ａｓｎ^３２－Ｃｙｓ^３３－Ｖａｌ^３４－Ｖａｌ^３５－Ｇｌｙ^３６－Ｔｙｒ^３７－Ｉｌｅ^３８－Ｇｌｙ^３９－Ｇｌｕ^４０－Ａｒｇ^４１－Ｃｙｓ^４２－Ｇｌｎ^４３－Ｔｙｒ^４４－Ａｒｇ^４５－Ａｓｐ^４６－Ｌｅｕ^４７－Ｌｙｓ^４８－Ｔｒｐ^４９－Ｔｒｐ^５０－Ｇｌｕ^５１－Ｌｅｕ^５２－Ａｒｇ^５３－Ｏ－ＰＧ_２ ［配列番号３］
又はそのバリアントであって；
ＰＧ_２が、クロロトリチル及びｔ－ブチルから選択される保護基であって、；そして、前記第１の及び第２のペプチド断片における１または複数のアミノ酸残基が、好ましくは、酸開裂性保護基で任意に保護されており、そして、任意に保護基ＰＧ_１及びＰＧ_２を除去している、前記第１のペプチド断片と、前記第２のペプチド断片とを、溶液中でカップリングする方法を有する、調製方法。

【請求項50】

以下の配列を有するＥＧＦ様ペプチド；Ｈ－Ａｓｎ^１－Ｓｅｒ^２－Ａｓｐ^３－Ｓｅｒ^４－Ｇｌｕ^５－Ｃｙｓ^６－Ｐｒｏ^７－Ｌｅｕ^８－Ｓｅｒ^９－Ｈｉｓ^１０－Ａｓｐ^１１－Ｇｌｙ^１２－Ｔｙｒ^１３－Ｃｙｓ^１４－Ｌｅｕ^１５－Ｈｉｓ^１６－Ａｓｐ^１７－Ｇｌｙ^１８－Ｖａｌ^１９－Ｃｙｓ^２０－Ｍｅｔ^２１－Ｔｙｒ^２２－Ｉｌｅ^２３－Ｇｌｕ^２４－Ａｌａ^２５－Ｌｅｕ^２６－Ａｓｐ^２７－Ｌｙｓ^２８－Ｔｙｒ^２９－Ａｌａ^３０－Ｃｙｓ^３１－Ａｓｎ^３２－Ｃｙｓ^３３－Ｖａｌ^３４－Ｖａｌ^３５－Ｇｌｙ^３６－Ｔｙｒ^３７－Ｉｌｅ^３８－Ｇｌｙ^３９－Ｇｌｕ^４０－Ａｒｇ^４１－Ｃｙｓ^４２－Ｇｌｎ^４３－Ｔｙｒ^４４－Ａｒｇ^４５－Ａｓｐ^４６－Ｌｅｕ^４７－Ｌｙｓ^４８－Ｔｒｐ^４９－Ｔｒｐ^５０－Ｇｌｕ^５１－Ｌｅｕ^５２－Ａｒｇ^５３－ＯＨ ［配列番号１］
又はそのバリアントを調製する方法であって、
前記方法は、以下のステップを含んでいる；
以下の配列を有する第１のペプチド断片；ＰＧ_１－Ａｓｎ^１－Ｓｅｒ^２－Ａｓｐ^３－Ｓｅｒ^４－Ｇｌｕ^５－Ｃｙｓ^６－Ｐｒｏ^７－Ｌｅｕ^８－ΨＳｅｒ^９－Ｈｉｓ^１０－Ａｓｐ^１１－Ｇｌｙ^１２－ＯＨ ［配列番号４］
又はそのバリアントであって、ＰＧ_１が、好ましくは、Ｂｏｃ及びＦｍｏｃから選択されるＮ末端保護基であり；そして、当該Ｃ末端アミノ酸は、任意に、活性化されたカルボン酸誘導体の形態であり；
第２のペプチド断片が、以下の配列を有するペプチド断片；Ｈ－Ｔｙｒ^１３－Ｃｙｓ^１４－Ｌｅｕ^１５－Ｈｉｓ^１６－Ａｓｐ^１７－Ｇｌｙ^１８－Ｖａｌ^１９－Ｃｙｓ^２０－Ｍｅｔ^２１－Ｔｙｒ^２２－Ｉｌｅ^２３－Ｇｌｕ^２４－Ａｌａ^２５－Ｌｅｕ^２６－Ａｓｐ^２７－Ｌｙｓ^２８－Ｔｙｒ^２９－Ａｌａ^３０－Ｃｙｓ^３１－Ａｓｎ^３２－Ｃｙｓ^３３－Ｖａｌ^３４－Ｖａｌ^３５－Ｇｌｙ^３６－Ｔｙｒ^３７－Ｉｌｅ^３８－Ｇｌｙ^３９－Ｇｌｕ^４０－Ａｒｇ^４１－Ｃｙｓ^４２－Ｇｌｎ^４３－Ｔｙｒ^４４－Ａｒｇ^４５－Ａｓｐ^４６－Ｌｅｕ^４７－Ｌｙｓ^４８－Ｔｒｐ^４９－Ｔｒｐ^５０－Ｇｌｕ^５１－Ｌｅｕ^５２－Ａｒｇ^５３－Ｏ－ＰＧ_２ ［配列番号５］
又はそのバリアントであって；
ＰＧ_２が、クロロトリチル及びｔ－ブチルから選択される保護基であって、；そして、前記第１の及び第２のペプチド断片における１または複数のアミノ酸残基が、好ましくは、酸開裂性保護基で任意に保護されており、そして、任意に保護基ＰＧ_１及びＰＧ_２を除去している、前記第１のペプチド断片と、前記第２のペプチド断片とを、溶液中でカップリングする方法を有する、調製方法。

【請求項51】

以下の配列を有するＥＧＦ様ペプチド；Ｈ－Ｖａｌ^１－Ｖａｌ^２－Ｓｅｒ^３－Ｈｉｓ^４－Ｐｈｅ^５－Ａｓｎ^６－Ａｓｐ^７－Ｃｙｓ^８－Ｐｒｏ^９－Ａｓｐ^１０－Ｓｅｒ^１１－Ｈｉｓ^１２－Ｔｈｒ^１３－Ｇｌｎ^１４－Ｐｈｅ^１５－Ｃｙｓ^１６－Ｐｈｅ^１７－Ｈｉｓ^１８－Ｇｌｙ^１９－Ｔｈｒ^２０－Ｃｙｓ^２１－Ａｒｇ^２２－Ｐｈｅ^２３－Ｌｅｕ^２４－Ｖａｌ^２５－Ｇｌｎ^２６－Ｇｌｕ^２７－Ａｓｐ^２８－Ｌｙｓ^２９－Ｐｒｏ^３０－Ａｌａ^３１－Ｃｙｓ^３２－Ｖａｌ^３３－Ｃｙｓ^３４－Ｈｉｓ^３５－Ｓｅｒ^３６－Ｇｌｙ^３７－Ｔｙｒ^３８－Ｖａｌ^３９－Ｇｌｙ^４０－Ａｌａ^４１－Ａｒｇ^４２－Ｃｙｓ^４３－Ｇｌｕ^４４－Ｈｉｓ^４５－Ａｌａ^４６－Ａｓｐ^４７－Ｌｅｕ^４８－Ｌｅｕ^４９－Ａｌａ^５０－ＯＨ ［配列番号６］
又はそのバリアントを調製する方法であって、
前記方法は、以下のステップを含んでいる；
以下の配列を有する第１のペプチド断片；ＰＧ_１－Ｖａｌ^１－Ｖａｌ^２－Ｓｅｒ^３－Ｈｉｓ^４－Ｐｈｅ^５－Ａｓｎ^６－Ａｓｐ^７－Ｃｙｓ^８－Ｐｒｏ^９－Ａｓｐ^１０－Ｓｅｒ^１１－Ｈｉｓ^１２－Ｔｈｒ^１３－Ｇｌｎ^１４－Ｐｈｅ^１５－Ｃｙｓ^１６－Ｐｈｅ^１７－Ｈｉｓ^１８－Ｇｌｙ^１９－ＯＨ ［配列番号７］
又はそのバリアントであって、ＰＧ_１が、好ましくは、Ｂｏｃ及びＦｍｏｃから選択されるＮ末端保護基であり；そして、当該Ｃ末端アミノ酸は、任意に、活性化されたカルボン酸誘導体の形態であり；
第２のペプチド断片が、以下の配列を有するペプチド断片；Ｈ－Ｔｈｒ^２０－Ｃｙｓ^２１－Ａｒｇ^２２－Ｐｈｅ^２３－Ｌｅｕ^２４－Ｖａｌ^２５－Ｇｌｎ^２６－Ｇｌｕ^２７－Ａｓｐ^２８－Ｌｙｓ^２９－Ｐｒｏ^３０－Ａｌａ^３１－Ｃｙｓ^３２－Ｖａｌ^３３－Ｃｙｓ^３４－Ｈｉｓ^３５－Ｓｅｒ^３６－Ｇｌｙ^３７－Ｔｙｒ^３８－Ｖａｌ^３９－Ｇｌｙ^４０－Ａｌａ^４１－Ａｒｇ^４２－Ｃｙｓ^４３－Ｇｌｕ^４４－Ｈｉｓ^４５－Ａｌａ^４６－Ａｓｐ^４７－Ｌｅｕ^４８－Ｌｅｕ^４９－Ａｌａ^５０－Ｏ－ＰＧ_２ ［配列番号８］
又はそのバリアントであって；
ＰＧ_２が、クロロトリチル及びｔ－ブチルから選択される保護基であって、；そして、前記第１の及び第２のペプチド断片における１または複数のアミノ酸残基が、好ましくは、酸開裂性保護基で任意に保護されており、そして、任意に保護基ＰＧ_１ 及びＰＧ_２を除去している、前記第１のペプチド断片と、前記第２のペプチド断片とを、溶液中でカップリングする方法を有する、調製方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ＥＧＦ及びトランスフォーミング増殖因子α（ＴＧＦ－α）を含むがこれに限定されない、上皮成長因子様ペプチド（ＥＧＦ様ペプチド）およびそのアナログおよびそのバリアントの化学合成のための方法について記述する。

【背景技術】

【0002】

上皮成長因子（ＥＧＦ）は、ＥＧＦファミリータンパク質の初期メンバーである。このタンパク質ファミリーのメンバーは、非常に類似した構造特性及び機能特性を有している。ＥＧＦ自体の他に、他のファミリーメンバーは、ヘパリン結合性ＥＧＦ様増殖因子（ＨＢ－ＥＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子α（ＴＧＦ－α）、アンフィレギュリン（ＡＲ）、エピレグリン（ＥＰＲ）、エピジェン、ベータセルリン（ＢＴＣ）、ニューレグリン１（ＮＲＧ１）、ニューレグリン２（ＮＲＧ２）、ニューレグリン３（ＮＲＧ３）、及びニューレグリン４（ＮＲＧ４）を含む。

【0003】

すべてのファミリーメンバーは、保存されたアミノ酸配列の１又は複数の繰り返しを含んでいる：
Ｃ^１（Ｘ）_７Ｃ^２（Ｘ）_４－５Ｃ^３（Ｘ）_{１０－１３}Ｃ^４（Ｘ）Ｃ^５（Ｘ）_８Ｃ^６ ［配列番号４９］
ここで、Ｃ^１－Ｃ^６はそれぞれシステインであり、そして、各Ｘは独立してアミノ酸である（ＨａｒｒｉｓＲ．Ｃ．， Ｃｈｕｎｇ Ｅ．， Ｃｏｆｆｅｙ， Ｒ．Ｊ．， Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２８４ （２００３） ２－１３）。この配列には、３つの分子内ジスルフィド結合（Ｃ^１－Ｃ^３， Ｃ^２－Ｃ^４ 及びＣ^５－Ｃ^６）を形成する６つのシステイン残基が含んでいる。ジスルフィド結合の形成は、ＥＧＦファミリーメンバーとその細胞表面受容体の間の高親和性結合に不可欠な３つの構造ループをもたらす。

【0004】

ＥＧＦは、その受容体であるＥＧＦＲと結合することにより、細胞の増殖や分化を刺激するタンパク質である。ヒト上皮成長因子（ｈＥＧＦ）は、５３個のアミノ酸と３つの分子内ジスルフィド結合を含んでいる機能的に多用途の６ｋＤａのポリペプチドであり、以下の配列を有する：
Ｈ－Ａｓｎ^１－Ｓｅｒ^２－Ａｓｐ^３－Ｓｅｒ^４－Ｇｌｕ^５－Ｃｙｓ^６－Ｐｒｏ^７－Ｌｅｕ^８－Ｓｅｒ^９－Ｈｉｓ^１０－Ａｓｐ^１１－Ｇｌｙ^１２－Ｔｙｒ^１３－Ｃｙｓ^１４－Ｌｅｕ^１５－Ｈｉｓ^１６－Ａｓｐ^１７－Ｇｌｙ^１８－Ｖａｌ^１９－Ｃｙｓ^２０－Ｍｅｔ^２１－Ｔｙｒ^２２－Ｉｌｅ^２３－Ｇｌｕ^２４－Ａｌａ^２５－Ｌｅｕ^２６－Ａｓｐ^２７－Ｌｙｓ^２８－Ｔｙｒ^２９－Ａｌａ^３０－Ｃｙｓ^３１－Ａｓｎ^３２－Ｃｙｓ^３３－Ｖａｌ^３４－Ｖａｌ^３５－Ｇｌｙ^３６－Ｔｙｒ^３７－Ｉｌｅ^３８－Ｇｌｙ^３９－Ｇｌｕ^４０－Ａｒｇ^４１－Ｃｙｓ^４２－Ｇｌｎ^４３－Ｔｙｒ^４４－Ａｒｇ^４５－Ａｓｐ^４６－Ｌｅｕ^４７－Ｌｙｓ^４８－Ｔｒｐ^４９－Ｔｒｐ^５０－Ｇｌｕ^５１－Ｌｅｕ^５２－Ａｒｇ^５３－ＯＨ ［配列番号１］
前記３つの分子内ジスルフィド結合は、Ｃｙｓ^６とＣｙｓ^２０、Ｃｙｓ^１４とＣｙｓ^３１、そして、Ｃｙｓ^３３とＣｙｓ^４２の間である。

【0005】

上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）は、抗がん剤及び抗がん剤開発のメインターゲットの１つである。ヒト上皮成長因子（ｈＥＧＦ）は、治療活性のある抗がん性の抗体又は抗がん剤をｈＥＧＦＲに選択的に輸送するためのビヒクルとして、これらの治療アプローチの多くで、使用されている。加えて、蛍光標識されたＥＧＦ様ペプチドなど、いくつかのＥＧＦコンジュゲートが診断薬として使用されている。ＥＧＦ様ペプチド、特にｈＥＧＦ、及びヒトトランスフォーミング増殖因子（ｈＴＧＦ）は、化粧品、スキンケア、及び薬、例えば糖尿病性足潰瘍（ＤＦＵ）の治療にいくつかの用途を見出している。

【0006】

ＥＧＦ様ドメインの１または複数のコピーが、以下の多種多様な機能性タンパク質に含まれている：
脂肪細胞分化抑制剤（遺伝子ＰＲＥＦ－１）、アグリン、アンフィレギュリン、βセルリン（βｃｅｌｌｕｌｉｎ）、胞胚タンパク質ＢＰ１０、ＢＭ８６、骨形成タンパク質１ （ＢＭＰ－１） 、ショウジョウバエ（背側・腹側パターニングタンパク質トロイド）（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ （ｔｈｅ ｄｏｒｓａｌ－ｖｅｎｔｒａｌ ｐａｔｔｅｒｎｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｏｌｌｏｉｄ））、線虫発生タンパク質 ｌｉｎ－１２ 及びｇｌｐ－１ 、線虫 ａｐｘ－１タンパク質、 カルシウム依存性セリンプロテアーゼ（ＣＡＳＰ）、軟骨マトリックスタンパク質ＣＭＰ、軟骨オリゴマーマトリックスタンパク質ＣＯＭＰ、細胞表面抗原１１４／Ａ１０、細胞表面糖タンパク質複合体膜貫通サブユニットＡＳＧＰ－２ 凝固関連タンパク質Ｃ、Ｚ、及びＳ、凝固因子ＶＩＩ、ＩＸ、Ｘ、及びＸＩＩ、補体Ｃ１ｒ、補体Ｃ１ｓ、Ｒａ反応性因子（ＲＡＲＦ）の補体活性化成分、補体成分Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８α鎖およびβ鎖、およびＣ９、クラム（Ｃｒｕｍｂｓ）、上皮成長因子前駆体、外腸胚誘導ペプチドＡ、Ｃ、ＤおよびＸ、脂肪タンパク質、胎児抗原１、フィブリリン１およびフィブリリン２、フィブロペリンＩＡ、ＩＢ．ＩＣ、ＩＩおよびＩＩＩ、フィブリン－１およびフィブリン－２、Ｇｉａｎｔ－ｌｅｎｓタンパク質（Ａｒｇｏｓタンパク質）、様々なポックスウイルス由来の成長因子関連タンパク質、Ｇｕｒｋｅｎタンパク質、ヘパリン結合性ＥＧＦ様増殖因子（ＨＢ－ＥＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子α（ＴＧＦ－α）、成長因子Ｌｉｎ－３とＳｐｉｔｚ、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）活性化物質、ＬＤＬおよびＶＬＤＬ受容体、ＬＤＬ受容体関連タンパク質（ＬＲＰ）、白血球抗原ＣＤ９７、細胞表面糖タンパク質ＥＭＲ１および細胞表面糖タンパク質Ｆ４／８０、リムルス凝固因子Ｃ、メプリンＡαサブユニット、乳脂肪球－ＥＧＦ因子８（ＭＦＧ－Ｅ８）、ニューレグリンＧＧＦ－ＩおよびＧＧＦ－ＩＩ、ニューレキシン、神経性タンパク質ノッチ、ナイドジェン、オーキネート表面タンパク質（２４Ｋｄ、２５Ｋｄ、２８Ｋｄ）、膵臓分泌顆粒膜主要糖タンパク質ＧＰ２、パーフォリン、プロテオグリカンアグレカン、バーシカン、パーレカン、ブレビカン及びコンドロイチン硫酸プロテオグリカン、プロスタグランジンＧ／Ｈシンターゼ１および２、リーリン、Ｓ１－５、シュワン腫由来成長因子（ＳＤＧＦ）、 セレクチン、セリン／スレオニンプロテインキナーゼホモログ（遺伝子Ｐｒｏ２５）、精子卵融合タンパク質ＰＨ－３０αおよびβ、精子べん毛膜タンパク質、間質細胞由来タンパク質－１（ＳＣＰ－１）、ＴＤＧＦ－１、ヒト奇形癌由来成長因子１、テネイシン（またはニューロンネクチン）、トロンボモジュリン（フェトモジュリン）、 トロンボスポンジン１、２、３、及び４、甲状腺ペルオキシダーゼ１、トランスフォーミング増殖因子β－１結合タンパク質（ＴＧＦ－Ｂ１－ＢＰ）、チロシン－タンパク質キナーゼ受容体ＴｅｋおよびＴｉｅ、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子および組織プラスミノーゲン（ＴＰＡ）ウロモジュリン、ビタミンＫ依存性の抗凝血剤タンパク質Ｃおよびタンパク質Ｓ及びタンパク質Ｚ。

【0007】

ＥＧＦ様ペプチドは、一般的に組換えＤＮＡ技術によって製造される。ＥＧＦ様ペプチドを調製するための化学的方法は、一般的に、低収量及び／又は低純度の材料を生成し、非常に手間がかかり、及び／又は非常に有毒で、かつ非常に腐食性のＨＦを使用することを必要とする。

【0008】

ウロガストロン（ｈ－ＥＧＦ）の最初の全合成は、アミノ保護基としてＢｏｃ、チオール保護基としてＡｃｍ、及びカルボキシ保護基としてＰａｃを用いて合成された１０の小さな断片の断片縮合によって行われた（Ｎｅｙａ Ｍ．， Ｈａｇｉｗａｒａ Ｄ．， Ｍｉｙａｚａｋｉ Ｙ．， Ｎａｋａｍｕｒａ Ｔ．， Ｈｅｍｍｉ Ｋ． ａｎｄ Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ Ｍ．， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ， Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ １， １９８９， Ｉｓｓｕｅ： １２， ２１８７－２１９８）。その後、得られた直鎖状の保護されたＥＧＦペプチドは、毒性があり、かつ非常に腐食性のある液体のＨＦを用いて脱保護された。ＨＦの使用は、特にＴｒｐ、Ｔｙｒ、Ｍｅｔ、及びＣｙｓのような感受性の求核性アミノ酸を含むペプチド（ｈＥＧＦはその配列中に１つのＭｅｔ残基、２つのＴｒｐ残基、５つのＴｙｒ残基、及び６つのＣｙｓ残基を含む）の場合、いくつかの副反応の原因である。ＨＦを使用することに加え、この方法は、非常に手間がかかり、そして、医薬用ペプチドの大量生産には不向きである。

【0009】

同様に、ＥＧＦの合成も９つの保護された断片の断片縮合によって行われている（Ｓｈｉｎ Ｓ．Ｙ．， Ｋａｂｕｒａｋｉ Ｙ．， Ｗａｔａｎａｂｅ Ｍ．， ａｎｄ Ｍｕｎｅｋａｔａ Ｅ．， Ｂｉｏｓｃｉ． Ｂｉｏｔｅｃｈ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．、５６ （３）， ４０４－４０８， １９９２； Ｎｅｙａ Ｍ．， Ｈａｇｉｗａｒａ Ｄ．， Ｈｅｍｍｉ Ｋ．， ａｎｄ Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ Ｍ．， Ｊ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．， Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ． １， １９８９， ２１９９－２２０５）。これらの断片は、溶液中で順次縮合されたＢｏｃ／Ｂｅｎｚｙｌアミノ酸を使用して、溶液中で調製された。その後、得られた直鎖状の保護されたＥＧＦペプチドは、液体ＨＦで脱保護された。

【0010】

固相ペプチド合成による断片のＥＧＦの合成は文献に記載されている（Ｇｅｌｌ Ａ．Ｌ．， Ｇｒｏｙｓｂｅｃｋ Ｎ．， Ｂｅｃｋｅｒ Ｃ．Ｆ．Ｗ．， Ｃｏｎｉｂｅａｒ Ａ．Ｃ．， Ｊ Ｐｅｐｔ Ｓｃｉ． ２０１７ Ｄｅｃ；２３（１２）：８７１－８７９． ｄｏｉ： １０．１００２／ｐｓｃ．３０５１． Ｅｐｕｂ ２０１７ Ｎｏｖ ６）。 Ｃ１ｒのＥＧＦ様モジュールの構造を決定し、そして、カルシウム結合へのその寄与を評価する目的で、Ｂｏｃ／ベンジル戦略を用いた自動固相法により、Ｃ１ｒ（１２３－１７５）が合成された。（Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ Ｊ．Ｆ．， Ｂｅｒｓｃｈ Ｂ．， Ｐeｔｉｌｌｏｔ Ｙ．， Ａｒｌａｕｄ Ｇ．Ｊ．， Ｊ Ｐｅｐｔ Ｒｅｓ． １９９７， ４９（３）， ２２１－３１）。４０アミノ酸の上皮成長因子様ヒトクリプトドメイン（ヒト奇形癌由来成長因子１、ＴＤＧＦ－１としても知られている）の合成も記載されている（Ｌｏｈｍｅｙｅｒ Ｍ．， Ｈａｒｒｉｓｏｎ Ｐ．Ｍ．， Ｋａｎｎａｎ Ｓ．， ＤｅＳａｎｔｉｓ Ｍ．， Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ Ｎ．Ｊ．， Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ Ｍ．Ｊ．Ｅ．， Ｓａｌｏｍｏｎ Ｄ．Ｓ．， ａｎｄ Ｇｕｌｌｉｃｋ Ｗ．Ｊ．， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， １９９７， ３６ （１３）， ｐｐ ３８３７－３８４５）。

【0011】

トランスフォーミング増殖因子α（ＴＧＦ－α）は、ＥＧＦファミリーのもう一つのメンバーである。ＴＧＦ－αはヒトではＴＧＦＡ遺伝子によってコードされているタンパク質である。ＴＧＦ－αは上皮成長因子受容体のリガンドであり、そして、それは、細胞の増殖、分化、及び発達のためのシグナル伝達経路を活性化する。このタンパク質は、膜貫通結合リガンドとしても、又は可溶性リガンドとしても機能する可能性がある。ＴＧＦ－αは、一部のヒトのがんで上方制御される。ＴＧＦ－αは、マクロファージ、脳細胞、及びケラチノサイトで産生され、そして、上皮の発達を誘導する。

【0012】

ＴＧＦ－αは、１６０（ヒト）または１５９（ラット）アミノ酸の膜貫通前駆体の一部として内部で合成される（Ｆｅｒｒｅｒ Ｉ．， Ａｌｃａｎｔａｒａ Ｓ．， Ｂａｌｌａｂｒｉｇａ Ｊ．， Ｏｌｉｖｅ Ｍ．， Ｂｌａｎｃｏ Ｒ．， Ｒｉｖｅｒａ Ｒ．， Ｃａｒｍｏｎａ Ｍ．， Ｂｅｒｒｕｅｚｏ Ｍ．， Ｐｉｔａｒｃｈ Ｓ．， Ｐｌａｎａｓ Ａ．； Ｐｒｏｇ． Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ． １９９６， ４９（２）， ９９－１２３）． 当該前駆体は疎水性の膜貫通ドメインを含む細胞外ドメイン、５０アミノ酸のＴＧＦ－α、３５残基長の細胞質ドメインで構成されている。その最も小さな形態において、ＴＧＦ－αは、３つのジスルフィド結合を通じて、互いに結合された６つのシステインを持っている。全体として、ＥＧＦ／ＴＧＦ－αファミリーのすべてのメンバーが、この構造を共有している。

【0013】

ＴＧＦ－αの直鎖状５０アミノ酸残基の段階的な固相合成は、Ｂｏｃ／ベンジルアミノ酸を用いて行われた（Ｔａｍ Ｊ．Ｐ．， Ｓｈｅｉｋｈ Ｍ．Ａ．， Ｓｏｌｏｍｏｎ Ｄ．Ｓ．， ａｎｄ Ｏｓｓｏｗｓｋｉ Ｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８３（２１）， ８０８２－８０８６， １９８６）。ペプチドはレジンから切り離され、そして、液体ＨＦで脱保護された。また、ＨＦを使用するため、この方法はスケールアップには不向きである。さらに、長いペプチドの段階的な合成は、通常、制御し、かつ、所望の製品から分離することが非常に困難な非常に類似した多数の欠失及び付加ペプチドとの混合物をもたらす。したがって、このような方法は、医薬用ペプチドの大規模合成には不向きである。

【0014】

現在までのところ、ＥＧＦ様ペプチドの大量生産のための既存の方法は、完全に満足できるものではない。したがって、本発明は、ＥＧＦ様ペプチドの合成のための代替方法、理想的には、より効率的で、そして、改善された収率及び／又は純度をもたらす方法を提供しようとする。特に、工業的なスケールアップに適し、そして、毒性またはその他の望ましくない試薬の使用を回避する方法を提供するニーズが存在する。

【発明の概要】

【0015】

本発明の第１の態様は、以下のアミノ酸配列を有する上皮成長因子様ペプチド（ＥＧＦ様ペプチド）を調製する方法に関し；
Ｃ^１（Ｘ）_７Ｃ^２（Ｘ）_４－５Ｃ^３（Ｘ）_{１０－１３}Ｃ^４（Ｘ）Ｃ^５（Ｘ）_８Ｃ^６ ［配列番号４９］
Ｃ^１－Ｃ^６はそれぞれシステインであって、そして、各Ｘは、独立に、天然のアミノ酸または非天然のアミノ酸であり、そして、前記ＥＧＦ様ペプチドは３つの分子内ジスルフィド結合を有し；
前記方法は以下のステップを有する：
（Ｉ）Ｎ末端のアミノ酸が、保護基ＰＧ_１により、保護されており、それが、Ｂｏｃ及びＦｍｏｃから選択される第１のペプチド断片を調製し；
（II）Ｃ末端のアミノ酸が、保護基ＰＧ_２により、保護されており、それが、トリチル、クロロトリチル及びｔ－ブチルから選択される第２のペプチド断片を調製し、そして、前記第１のペプチド断片及び第２のペプチド断片中のアミノ酸側鎖は任意に保護されており；
（III）溶液中で、前記第１のペプチド断片のＣ末端アミノ酸と、前記第２のペプチド断片のＮ末端アミノ酸をカップリングし、直鎖状の保護されたＥＧＦ様ペプチドを形成し；
（ＩＶ）（ａ）
（ｉ）ステップ（III）で形成された直鎖状の保護されたＥＧＦ様ペプチドをヨウ素で処理し、酸化混合物を形成し；
（ii）トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）で処理し、ステップ（IV）（ａ）（ｉ）で得られた前記酸化混合物を全体的に脱保護し、
（iii）ステップ（IV）（ａ）（ii）で得られた前記脱保護された酸化混合物をＤＭＳＯ／ＤＴＴで処理し、未精製のＥＧＦ様ペプチドを形成する；又は
（ＩＶ）（ｂ）
（ｉ）トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）で処理し、ステップ（III）で得られた直鎖状の保護されたＥＧＦ様ペプチドを全体的に脱保護し；
（ii）ステップ（ＩＶ）（ｂ）（ｉ）で得られた脱保護された混合物をＤＭＳＯで処理し、未精製のＥＧＦ様ペプチドを形成する；そして、
（Ｖ）任意に前記未精製のＥＧＦ様ペプチドを精製する、調製方法に関する。

【0016】

有利なことに、本発明の方法は、優れた収率と純度で、断片縮合による、ヒトＥＧＦ様ペプチドおよびマウスＥＧＦ様ペプチドの化学合成を可能にする。さらに、本発明の方法は、極めて毒性が高く腐食性の高い試薬であるＨＦの使用を避け、それによって、医薬用ペプチドの大規模製造により適した方法とする。

【0017】

本発明の第２の態様は、以下の配列を有する（又はより好ましくはからなる）ＥＧＦ様ペプチド又はそのバリアントを調製する方法に関し：
Ｈ－Ａｓｎ^１－Ｓｅｒ^２－Ａｓｐ^３－Ｓｅｒ^４－Ｇｌｕ^５－Ｃｙｓ^６－Ｐｒｏ^７－Ｌｅｕ^８－Ｓｅｒ^９－Ｈｉｓ^１０－Ａｓｐ^１１－Ｇｌｙ^１２－Ｔｙｒ^１３－Ｃｙｓ^１４－Ｌｅｕ^１５－Ｈｉｓ^１６－Ａｓｐ^１７－Ｇｌｙ^１８－Ｖａｌ^１９－Ｃｙｓ^２０－Ｍｅｔ^２１－Ｔｙｒ^２２－Ｉｌｅ^２３－Ｇｌｕ^２４－Ａｌａ^２５－Ｌｅｕ^２６－Ａｓｐ^２７－Ｌｙｓ^２８－Ｔｙｒ^２９－Ａｌａ^３０－Ｃｙｓ^３１－Ａｓｎ^３２－Ｃｙｓ^３３－Ｖａｌ^３４－Ｖａｌ^３５－Ｇｌｙ^３６－Ｔｙｒ^３７－Ｉｌｅ^３８－Ｇｌｙ^３９－Ｇｌｕ^４０－Ａｒｇ^４１－Ｃｙｓ^４２－Ｇｌｎ^４３－Ｔｙｒ^４４－Ａｒｇ^４５－Ａｓｐ^４６－Ｌｅｕ^４７－Ｌｙｓ^４８－Ｔｒｐ^４９－Ｔｒｐ^５０－Ｇｌｕ^５１－Ｌｅｕ^５２－Ａｒｇ^５３－ＯＨ ［配列番号１］
そして、前記方法は以下のステップを有し：
以下の配列を有する（又はより好ましくはからなる）第１のペプチド断片：
ＰＧ_１－Ａｓｎ^１－Ｓｅｒ^２－Ａｓｐ^３－Ｓｅｒ^４－Ｇｌｕ^５－Ｃｙｓ^６－Ｐｒｏ^７－Ｌｅｕ^８－Ｓｅｒ^９－Ｈｉｓ^１０－Ａｓｐ^１１－Ｇｌｙ^１２－Ｔｙｒ^１３－Ｃｙｓ^１４－Ｌｅｕ^１５－Ｈｉｓ^１６－Ａｓｐ^１７－Ｇｌｙ^１８－ＯＨ ［配列番号２］
又はそのバリアントであって、
ＰＧ_１が、Ｂｏｃ及びＦｍｏｃから選択されるＮ末端保護基であって、そして、前記Ｃ末端アミノ酸が、任意に、活性化されたカルボン酸誘導体の形態であって、
以下の配列を有する（又はより好ましくはからなる）第２のペプチド断片：
Ｈ－Ｖａｌ^１９－Ｃｙｓ^２０－Ｍｅｔ^２１－Ｔｙｒ^２２－Ｉｌｅ^２３－Ｇｌｕ^２４－Ａｌａ^２５－Ｌｅｕ^２６－Ａｓｐ^２７－Ｌｙｓ^２８－Ｔｙｒ^２９－Ａｌａ^３０－Ｃｙｓ^３１－Ａｓｎ^３２－Ｃｙｓ^３３－Ｖａｌ^３４－Ｖａｌ^３５－Ｇｌｙ^３６－Ｔｙｒ^３７－Ｉｌｅ^３８－Ｇｌｙ^３９－Ｇｌｕ^４０－Ａｒｇ^４１－Ｃｙｓ^４２－Ｇｌｎ^４３－Ｔｙｒ^４４－Ａｒｇ^４５－Ａｓｐ^４６－Ｌｅｕ^４７－Ｌｙｓ^４８－Ｔｒｐ^４９－Ｔｒｐ^５０－Ｇｌｕ^５１－Ｌｅｕ^５２－Ａｒｇ^５３－Ｏ－ＰＧ_２ ［配列番号３］
又はそのバリアントであって、
ＰＧ_２が、クロロトリチル及びｔ－ブチルから選択される保護基であって、そして、前記第１の及び第２のペプチド断片における１または複数のアミノ酸残基が、好ましくは、酸開裂性保護基で任意に保護されており；そして、任意に保護基ＰＧ_１及びＰＧ_２を取り除き、前記第１のペプチド断片と、前記第２のペプチド断片を、溶液中でカップリングする方法を有する、調製方法に関する。

【0018】

本発明の３つ目の態様は、以下の配列を有する（又はより好ましくはからなる）ＥＧＦ様ペプチド又はそのバリアントを調製する方法に関し：
Ｈ－Ａｓｎ^１－Ｓｅｒ^２－Ａｓｐ^３－Ｓｅｒ^４－Ｇｌｕ^５－Ｃｙｓ^６－Ｐｒｏ^７－Ｌｅｕ^８－Ｓｅｒ^９－Ｈｉｓ^１０－Ａｓｐ^１１－Ｇｌｙ^１２－Ｔｙｒ^１３－Ｃｙｓ^１４－Ｌｅｕ^１５－Ｈｉｓ^１６－Ａｓｐ^１７－Ｇｌｙ^１８－Ｖａｌ^１９－Ｃｙｓ^２０－Ｍｅｔ^２１－Ｔｙｒ^２２－Ｉｌｅ^２３－Ｇｌｕ^２４－Ａｌａ^２５－Ｌｅｕ^２６－Ａｓｐ^２７－Ｌｙｓ^２８－Ｔｙｒ^２９－Ａｌａ^３０－Ｃｙｓ^３１－Ａｓｎ^３２－Ｃｙｓ^３３－Ｖａｌ^３４－Ｖａｌ^３５－Ｇｌｙ^３６－Ｔｙｒ^３７－Ｉｌｅ^３８－Ｇｌｙ^３９－Ｇｌｕ^４０－Ａｒｇ^４１－Ｃｙｓ^４２－Ｇｌｎ^４３－Ｔｙｒ^４４－Ａｒｇ^４５－Ａｓｐ^４６－Ｌｅｕ^４７－Ｌｙｓ^４８－Ｔｒｐ^４９－Ｔｒｐ^５０－Ｇｌｕ^５１－Ｌｅｕ^５２－Ａｒｇ^５３－ＯＨ ［配列番号１］
そして、前記方法は以下のステップを有し：
以下の配列を有する（又はより好ましくはからなる）第１のペプチド断片：
ＰＧ_１－Ａｓｎ^１－Ｓｅｒ^２－Ａｓｐ^３－Ｓｅｒ^４－Ｇｌｕ^５－Ｃｙｓ^６－Ｐｒｏ^７－Ｌｅｕ^８－ΨＳｅｒ^９－Ｈｉｓ^１０－Ａｓｐ^１１－Ｇｌｙ^１２－ＯＨ ［配列番号４］
又はそのバリアントであって、
ＰＧ_１が、Ｂｏｃ及びＦｍｏｃから選択されるＮ末端保護基であって、そして、前記Ｃ末端アミノ酸が、任意に、活性化されたカルボン酸誘導体の形態であって、
以下の配列を有する（又はより好ましくはからなる）第２のペプチド断片：
Ｈ－Ｔｙｒ^１３－Ｃｙｓ^１４－Ｌｅｕ^１５－Ｈｉｓ^１６－Ａｓｐ^１７－Ｇｌｙ^１８－Ｖａｌ^１９－Ｃｙｓ^２０－Ｍｅｔ^２１－Ｔｙｒ^２２－Ｉｌｅ^２３－Ｇｌｕ^２４－Ａｌａ^２５－Ｌｅｕ^２６－Ａｓｐ^２７－Ｌｙｓ^２８－Ｔｙｒ^２９－Ａｌａ^３０－Ｃｙｓ^３１－Ａｓｎ^３２－Ｃｙｓ^３３－Ｖａｌ^３４－Ｖａｌ^３５－Ｇｌｙ^３６－Ｔｙｒ^３７－Ｉｌｅ^３８－Ｇｌｙ^３９－Ｇｌｕ^４０－Ａｒｇ^４１－Ｃｙｓ^４２－Ｇｌｎ^４３－Ｔｙｒ^４４－Ａｒｇ^４５－Ａｓｐ^４６－Ｌｅｕ^４７－Ｌｙｓ^４８－Ｔｒｐ^４９－Ｔｒｐ^５０－Ｇｌｕ^５１－Ｌｅｕ^５２－Ａｒｇ^５３－Ｏ－ＰＧ_２ ［配列番号５］
又はそのバリアントであって、
ＰＧ_２が、クロロトリチル及びｔ－ブチルから選択される保護基であって、そして、前記第１の及び第２のペプチド断片における１または複数のアミノ酸残基が、好ましくは、酸開裂性保護基で任意に保護されており；そして、任意に保護基ＰＧ_１及びＰＧ_２を取り除き、前記第１のペプチド断片と、前記第２のペプチド断片を、溶液中でカップリングする方法を有する、調製方法に関する。

【0019】

本発明の４つ目の態様は、以下の配列を有する（又はより好ましくはからなる）ＥＧＦ様ペプチド又はそのバリアントを調製する方法に関し：
Ｈ－Ｖａｌ^１－Ｖａｌ^２－Ｓｅｒ^３－Ｈｉｓ^４－Ｐｈｅ^５－Ａｓｎ^６－Ａｓｐ^７－Ｃｙｓ^８－Ｐｒｏ^９－Ａｓｐ^１０－Ｓｅｒ^１１－Ｈｉｓ^１２－Ｔｈｒ^１３－Ｇｌｎ^１４－Ｐｈｅ^１５－Ｃｙｓ^１６－Ｐｈｅ^１７－Ｈｉｓ^１８－Ｇｌｙ^１９－Ｔｈｒ^２０－Ｃｙｓ^２１－Ａｒｇ^２２－Ｐｈｅ^２３－Ｌｅｕ^２４－Ｖａｌ^２５－Ｇｌｎ^２６－Ｇｌｕ^２７－Ａｓｐ^２８－Ｌｙｓ^２９－Ｐｒｏ^３０－Ａｌａ^３１－Ｃｙｓ^３２－Ｖａｌ^３３－Ｃｙｓ^３４－Ｈｉｓ^３５－Ｓｅｒ^３６－Ｇｌｙ^３７－Ｔｙｒ^３８－Ｖａｌ^３９－Ｇｌｙ^４０－Ａｌａ^４１－Ａｒｇ^４２－Ｃｙｓ^４３－Ｇｌｕ^４４－Ｈｉｓ^４５－Ａｌａ^４６－Ａｓｐ^４７－Ｌｅｕ^４８－Ｌｅｕ^４９－Ａｌａ^５０－ＯＨ ［配列番号６］
そして、前記方法は以下のステップを有し：
以下の配列を有する（又はより好ましくはからなる）第１のペプチド断片：
ＰＧ_１－Ｖａｌ^１－Ｖａｌ^２－Ｓｅｒ^３－Ｈｉｓ^４－Ｐｈｅ^５－Ａｓｎ^６－Ａｓｐ^７－Ｃｙｓ^８－Ｐｒｏ^９－Ａｓｐ^１０－Ｓｅｒ^１１－Ｈｉｓ^１２－Ｔｈｒ^１３－Ｇｌｎ^１４－Ｐｈｅ^１５－Ｃｙｓ^１６－Ｐｈｅ^１７－Ｈｉｓ^１８－Ｇｌｙ^１９－ＯＨ ［配列番号７］
又はそのバリアントであって、
ＰＧ_１が、Ｂｏｃ及びＦｍｏｃから選択されるＮ末端保護基であって、そして、前記Ｃ末端アミノ酸が、任意に、活性化されたカルボン酸誘導体の形態であって、
以下の配列を有する（又はより好ましくはからなる）第２のペプチド断片：
Ｈ－Ｔｈｒ^２０－Ｃｙｓ^２１－Ａｒｇ^２２－Ｐｈｅ^２３－Ｌｅｕ^２４－Ｖａｌ^２５－Ｇｌｎ^２６－Ｇｌｕ^２７－Ａｓｐ^２８－Ｌｙｓ^２９－Ｐｒｏ^３０－Ａｌａ^３１－Ｃｙｓ^３２－Ｖａｌ^３３－Ｃｙｓ^３４－Ｈｉｓ^３５－Ｓｅｒ^３６－Ｇｌｙ^３７－Ｔｙｒ^３８－Ｖａｌ^３９－Ｇｌｙ^４０－Ａｌａ^４１－Ａｒｇ^４２－Ｃｙｓ^４３－Ｇｌｕ^４４－Ｈｉｓ^４５－Ａｌａ^４６－Ａｓｐ^４７－Ｌｅｕ^４８－Ｌｅｕ^４９－Ａｌａ^５０－Ｏ－ＰＧ_２ ［配列番号８］
又はそのバリアントであって、
ＰＧ_２が、クロロトリチル及びｔ－ブチルから選択される保護基であって、そして、前記第１の及び第２のペプチド断片における１または複数のアミノ酸残基が、好ましくは、酸開裂性保護基で任意に保護されており；そして、任意に保護基ＰＧ_１及びＰＧ_２を取り除き、前記第１のペプチド断片と、前記第２のペプチド断片を、溶液中でカップリングする方法を有する、調製方法に関する。

【0020】

（発明の詳細な説明）
ＥＧＦ様ペプチド調製の一般的な方法
本発明の第１の態様は、上述した、以下のアミノ酸配列を有する上皮成長因子様ペプチド（ＥＧＦ様ペプチド）の調製方法に関し；
Ｃ^１（Ｘ）_７Ｃ^２（Ｘ）_４－５Ｃ^３（Ｘ）_{１０－１３}Ｃ^４（Ｘ）Ｃ^５（Ｘ）_８Ｃ^６ ［配列番号４９］
Ｃ^１－Ｃ^６はそれぞれシステインであって、そして、各Ｘは、独立に、天然のアミノ酸または非天然のアミノ酸であり、そして、前記ＥＧＦ様ペプチドは、Ｃ^１とＣ^３、Ｃ^２とＣ^４、及びＣ^５とＣ^６の間の３つの分子内ジスルフィド結合を有する。

【0021】

好ましい一実施形態では、ＥＧＦ様ペプチドは、［配列番号４９］のＮ末端に、１～２０、又は好ましくは２～１５、又はより好ましくは５～１０の追加の天然アミノ酸または非天然アミノ酸を含んでいる。特に好ましい一実施形態では、当該ＥＧＦ様ペプチドは、Ｎ末端に５の追加の天然アミノ酸を含んでいる。別の特に好ましい実施形態では、当該ＥＧＦ様ペプチドは、Ｎ末端に７の追加の天然アミノ酸を含んでいる。好ましい一実施形態では、当該ＥＧＦ様ペプチドは、［配列番号４９］のＣ末端に、１～２０、又は好ましくは２～１５、又はより好ましくは５～１２または５～１０の追加の天然または非天然アミノ酸を含んでいる。特に好ましい一実施形態では、当該ＥＧＦ様ペプチドは、Ｃ末端に１１の追加の天然アミノ酸を含んでいる。別の特に好ましい実施形態では、当該ＥＧＦ様ペプチドは、Ｃ末端に７の追加の天然アミノ酸を含んでいる。

【0022】

好ましい一実施形態では、当該ＥＧＦ様ペプチドは、［配列番号４９］のＮ末端に１～２０、又は好ましくは２～１５、又はより好ましくは５～１０の追加の天然アミノ酸または非天然アミノ酸を含み、かつ、［配列番号４９］のＣ末端に１～２０、又は好ましくは２～１５、又はより好ましくは５４～１２または５～１０の追加の天然アミノ酸または非天然アミノ酸を含む。特に好ましい一実施形態では、当該ＥＧＦ様ペプチドは、Ｎ末端に５の追加の天然アミノ酸を含み、かつ、Ｃ末端に１１の追加の天然アミノ酸を含んでいる。別の特に好ましい実施形態では、当該ＥＧＦ様ペプチドは、Ｎ末端に７の追加の天然アミノ酸を含み、かつ、Ｃ末端に追加の天然アミノ酸を含む。

【0023】

本明細書で使用されるように、用語「非天然アミノ酸（ｎｏｎ－ｎａｔｕｒａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ）」又は「非天然アミノ酸（ｕｎｎａｔｕｒａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ）」は、αおよびα－二置換アミノ酸、Ｎ－アルキルアミノ酸、乳酸、トリフルオロチロシン等の天然アミノ酸のハロゲン誘導体、ｐ－Ｃｌ－フェニルアラニン、ｐ－Ｆ－フェニルアラニン、ｐ－Ｂｒ－フェニルアラニン、ｐ－ＮＯ_２－フェニルアラニン、フェニルグリシン、サルコシン、ペニシラミン、Ｄ－２－メチルトリプトファン、ホスホセリン、ホスホトレオニン、ホスホチロシン、 ｐ－Ｉ－フェニルアラニン、Ｌ－アリルグリシン、β－アラニン、β－アスパラギン酸、β－シクロヘキシルアラニン、シトルリン、ホモセリン、ホモシステイン、ピログルタミン酸、Ｌ－α－アミノ酪酸、 Ｌ－γ－アミノ酪酸、Ｌ－α－アミノイソ酪酸、α－シクロヘキシルグリシン、ジアミノ酪酸、ジアミノピメリン酸、Ｎ－ε－ジニトロフェニル－リシン、Ｌ－１－ナフチルアラニン、 Ｌ－２－ナフチルアラニン、３－（２－ピリジル）－Ｌ－アラニン、３－（３－ピリジル）－Ｌ－アラニン、３－（４－ピリジル）－Ｌ－アラニン、Ｎ－ε－メチル－リジン、Ｎ，Ｎ－ε－ジメチル－リジン、Ｎ，Ｎ，Ｎ －ε－トリメチル－リジン、 ３－メルカプトプロピオン酸、Ｌ－ε－アミノカプロン酸、７－アミノヘプタン酸、６－アミノヘキサン酸Ｌ－メチオニンスルホン、オルニチン、Ｌ－ノルロイシン、Ｌ－ノルバリン、 ｐ－ニトロ－Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－ヒドロキシプロリン、γ－グルタミン酸、γ－アミノ酪酸Ｌ－チオプロリン、４－メチルＰｈｅ、ペンタメチル－Ｐｈｅ、Ｌ－Ｐｈｅ（４－アミノ）、Ｌ－Ｔｙｒ（メチル）、Ｌ－Ｐｈｅ（４－イソプロピル）、Ｌ－Ｔｉｃ（１，２，３，４テトラヒドロイソキノリン－３－カルボン酸）、Ｌ－ジアミンプロピオン酸、及びＬ－Ｐｈｅ（４－ベンジル）などのフェニルアラニン（Ｐｈｅ）のメチル誘導体を含んでいる。好ましい一実施形態では、各Ｘは、独立に、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、及びバリンから選択される天然アミノ酸である。

【0024】

好ましい一実施形態では、当該ＥＧＦ様タンパク質は、下記から選択される：
ＥＧＦ、ヘパリン結合性ＥＧＦ様増殖因子（ＨＢ－ＥＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子α（ＴＧＦ－α）、アンフィレギュリン（ＡＲ）、エピレグリン（ＥＰＲ）、エピジェン、ベータセルリン（ＢＴＣ）、ニューレグリン１（ＮＲＧ１）、ニューレグリン２（ＮＲＧ２）、ニューレグリン３（ＮＲＧ３）、及びニューレグリン４（ＮＲＧ４）。より好ましくは、当該ＥＧＦ様タンパク質は、ＥＧＦ及びトランスフォーミング増殖因子α（ＴＧＦ－α）から選択される。

【0025】

特に好ましい一実施形態では、当該ＥＧＦ様タンパク質はＥＧＦであり、より好ましくはヒトＥＧＦまたはマウスＥＧＦであり、よりいっそう好ましくは、ヒトＥＧＦである。

【0026】

別の特に好ましい実施形態では、当該ＥＧＦ様タンパク質は、トランスフォーミング増殖因子α（ＴＧＦ－α）、より好ましくはヒトＴＧＦ－αである。

【0027】

本明細書で言及した特定のペプチドに加えて、本発明は、そのバリアント、誘導体、アナログ、ホモログおよび断片も包含する。

【0028】

本明細書で使用される場合、任意の与えられた配列の「バリアント」とは、アミノ酸残基の特定の配列が、問題のペプチドがその内因性機能の少なくとも１つを保持するような方法で変更されている配列である。バリアント配列は、天然に存在するペプチドに存在する少なくとも１つの残基の付加、欠失、置換（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）、修飾、置換（ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）および／または変動によって得ることができる。

【0029】

本明細書に記載されるペプチドに関連して本明細書で使用される用語「誘導体」は、結果として生じるペプチドがその内因性機能の少なくとも１つを保持することを条件として、配列からまたは配列への１つ（または複数）のアミノ酸残基の置換（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）、変動、修飾、置換（ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）、欠失および／または付加のいずれかを含む。

【0030】

ペプチドに関連して本明細書で使用される「アナログ」という用語は、任意の模倣物、すなわち、それが模倣するペプチドの内因性機能の少なくとも１つを保有する化学化合物を含む。典型的には、修飾された配列が必要な活性または能力を保持することを条件として、アミノ酸置換は、例えば、１、２または３から１０または２０の置換がなされてもよい。アミノ酸置換は、非天然に存在するアナログの使用を含んでいてもよい。

【0031】

本明細書に記載のペプチドは、サイレントチェンジを生じ、そして、機能的に同等のペプチドをもたらすアミノ酸残基の欠失、挿入または置換を有することもできる。内因性機能が維持される限り、当該残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性、及び／又は両親媒性の類似性に基づいて、意図的なアミノ酸置換が行われてもよい。例えば、負に帯電したアミノ酸は、アスパラギン酸、グルタミン酸を含み、正に帯電したアミノ酸は、リジン、アルギニンを含み、そして、類似の親水性の値を示す非荷電の極性頭部基を持つアミノ酸は、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、及びチロシンを含んでいる。

【0032】

保守的な置換は、例えば、以下の表に従って行われてもよい。第２列の同じブロック、及び好ましくは第３列の同じ行にあるアミノ酸は、互いに置換されてもよい：

【表1】

【0033】

本明細書で使用される「ホモログ」という用語は、野生型アミノ酸配列と一定の相同性を有する実体を意味する。用語「ホモログ」は、「同一性」と同一視されてもよい。

【0034】

本文脈において、ホモログ配列は、対象配列と少なくとも５０％、５５％、６５％、７５％、８５％または９０％、好ましくは少なくとも９５％、９６％または９７％または９８％または９９％同一であり得るアミノ酸配列を含むものと理解される。典型的には、ホモログは、対象のアミノ酸配列と同じ活性部位等を含んでいるだろう。ホモログは、類似性（すなわち、同様の化学的特性／機能を有するアミノ酸残基）の観点からも考えられてもよいが、本発明の文脈では、配列同一性の観点でホモログを表現することが好ましいとされる。

【0035】

好ましくは、本明細書で詳述する配列番号のいずれか１つと同一性パーセントを有する配列への言及は、言及された配列番号の全長にわたって記載の同一性パーセントを有する配列のことを指す。

【0036】

相同性比較は、目視で行われてもよい、又は、より通常には、容易に入手できる配列比較プログラムを用いて行う。これらの市販のコンピュータプログラムは、２又はそれ以上の配列の間の相同性または同一性のパーセントを計算することができる。

【0037】

相同性パーセントは、連続した配列にわたって計算されていることができる。つまり、一方の配列を他方の配列と整列させ、そして、一方の配列の各アミノ酸を、一度に１残基ずつ、他方の配列の対応するアミノ酸と直接比較される。これはアンギャップアライメント（“ｕｎｇａｐｐｅｄ” ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）と呼ばれる。通常、このようなアンギャップアラインメントは、比較的短い残基数に対してのみ実行される。

【0038】

これは非常にシンプルで一貫性のある方法であるが、例えば、他の点では同一である配列ペアにおいて、アミノ酸配列の１の挿入または欠失により、次の残基またはコドンがアライメントから外れてしまい、従って、全体的なアライメントを行った際に、相同性パーセントが大きく低下する可能性を考慮することができない。そのため、ほとんどの配列比較手法は、全体的な相同性スコアに過度のペナルティを与えることなく、挿入や欠失の可能性を考慮した最適なアラインメントを生成するように設計されている。これは、局所的な相同性を最大化するために、配列アライメントに「ギャップ」を挿入することで達成される。しかし、これらのより複雑な方法では、アラインメントに発生する各ギャップに「ギャップペナルティ」を設定し、そのため、同じ数の同一アミノ酸やヌクレオチドでは、できるだけギャップの少ない配列アラインメントは、２つの比較された配列の間でより高い関連性を反映し、ギャップの多い配列よりも高いスコアになるだろう。ギャップの存在に対して比較的高いコストを課し、そして、ギャップ内の後続の各残基に対してより小さなペナルティを課す「アフィンギャップコスト（Ａｆｆｉｎｅ ｇａｐ ｃｏｓｔｓ）」が一般的に使用されている。これは、最も一般的に使用されているギャップスコアリング方式である。もちろん、高いギャップペナルティは、よりギャップの少ない最適化されたアラインメントを生み出すだろう。ほとんどのアライメントプログラムでは、ギャップペナルティは変更されることが可能である。しかし、このようなソフトウェアを配列比較に使用する場合は、デフォルト値を使用することが好ましい。例えば、ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｂｅｓｔｆｉｔパッケージを使用する場合、アミノ酸配列のデフォルトのギャップペナルティは、ギャップに対しては－１２、各エクステンションに対しては－４である。

【0039】

したがって、最大相同性パーセントの計算は、まず、ギャップペナルティを考慮した最適なアライメントを作成することを必要とする。このようなアライメントを実施するための適切なコンピュータプログラムは、ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｂｅｓｔｆｉｔパッケージ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ， ＵＳＡ； Ｄｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ． （１９８４） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １２： ３８７）である。配列比較を行うことができる他のソフトウェアの例としては、比較ツールのＢＬＡＳＴ ｐａｃｋａｇｅ（Ａｕｓｕｂｅｌら（１９９９）同上－Ｃｈ．１８参照）、ＦＡＳＴＡ（Ａｔｓｃｈｕｌら（１９９０）Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．４０３－４１０）およびＧＥＮＥＷＯＲＫＳ ｓｕｉｔｅが挙げられるが、これには限定されない。ＢＬＡＳＴとＦＡＳＴＡの両方は、オフラインおよびオンライン検索に利用可能である（Ａｕｓｕｂｅｌら（１９９９）同書、７－５８～７－６０頁を参照）。しかし、用途によっては、ＧＣＧ Ｂｅｓｔｆｉｔプログラムを使用することが好ましい。また、タンパク質とヌクレオチド配列を比較するための別のツール、ＢＬＡＳＴ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓも利用可能である（ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｌｅｔｔ． （１９９９） １７４（２）：２４７－５０； ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｌｅｔｔ． （１９９９） １７７（１）：１８７－８）。

【0040】

最終的な相同性パーセントは同一性の観点から測定されることができるが、アライメントプロセス自体は、通常、オール・オア・ナッシングのペア比較（ａｌｌ－ｏｒ－ｎｏｔｈｉｎｇ ｐａｉｒ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ）に基づくものではない。その代わりに、化学的類似性又は進化的距離に基づいて各一対の比較にスコアを割り当てる、スケール付き類似性スコアマトリックスが一般的に使用される。一般に使用されるそのようなマトリックスの例は、ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックス（ＢＬＡＳＴ ｓｕｉｔｅ プログラムのデフォルトマトリックス）である。ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ プログラムは通常、公開されているデフォルト値または提供されている場合はカスタムシンボル比較テーブルを使用する（詳細はユーザーマニュアルを参照）。いくつかの用途では、ＧＣＧパッケージの公開デフォルト値または他のソフトウェアの場合はＢＬＯＳＵＭ６２のようなデフォルトマトリックスを使用することが好ましい。

【0041】

いったん前記ソフトウェアが最適なアライメントを生成したら、相同性パーセント、好ましくは配列同一性パーセントを計算することが可能である。前記ソフトウェアは通常、配列比較の一部としてこれを行い、そして、数値結果を生成する。

【0042】

断片は、またバリアントであり、そして、当該用語は、一般に、機能的にまたは、例えば、アッセイのいずれかにおいて関心のあるペプチドの選択された領域を指す。したがって、「断片」は、全長ペプチドの一部であるアミノ酸配列のことを指す。

【0043】

より好ましくは、「バリアント」という用語は、任意の変異、（ａ）１または複数のアミノ酸残基が天然または非天然に存在するアミノ酸残基で置換されている、（ｂ）２以上のアミノ酸残基の順序が逆になっている、（ｃ）１、２または３のアミノ酸が欠失されている、 （ｄ）任意の２つのアミノ酸残基の間にスペーサー基が存在する、（ｅ）１または複数のアミノ酸残基がペプトイド形態である、（ｆ）ペプチドの１または複数のアミノ酸残基の（Ｎ－Ｃ－Ｃ）骨格が改変されている、（ｇ）１または複数の追加のアミノ酸がＮ末端および／またはＣ末端に存在する、または（ａ）～（ｇ）のいずれかが組み合わせを含んでいる。 好ましくは、バリアントは、（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のうちの１から生じる。

【0044】

本発明は、１又は複数のシュードプロリン（Ψと表記）の組み込みによって修飾されたアミノ酸配列も包含する。シュードプロリンは、ペプチドのＦＭＯＣ固相合成中の凝集を最小化する人工的に作られたジペプチドである。シュードプロリンは、セリン－（Ｏｘａ）またはスレオニン由来のオキサゾリジン［Ｏｘａ（５－Ｍｅ）］とシステイン由来のチアゾリジン（ＴＨｚ）からなり、プロリン様環構造を有する（下記参照）。

【化1】

Ｃ２置換シュードプロリンの先行残基とのシスアミド結合が優先されるため、これらを組み込むとペプチド骨格がねじれ構造になり、それにより、ペプチドの凝集、自己会合、又はβ構造の形成を妨げる。すなわち、シュードプロリンは２つの機能を同時に実現する：第一に、それらは、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、及びＣｙｓの一時的な側鎖保護として機能し、そして、第二に、それらは、可溶化ビルディングブロック（ｓｏｌｕｂｉｌｉｚｉｎｇ ｂｕｉｌｄｉｎｇ ｂｌｏｃｋｓ）として機能し、ペプチド合成の間およびその後の鎖の組み立てにおいて、溶媒和およびカップリング速度を高める。

【0045】

シュードプロリンは、遊離アミノ酸をアルデヒドまたはケトンと反応させることにより得られる。シュードプロリンジペプチドは、他のアミノ酸誘導体と同じ方法で導入することができる。好ましくは、シュードプロリンは、Ｓｅｒ－Ｘ、Ｔｈｒ－ＸまたはＣｙｓ－Ｘ基から誘導され、ここでＸは、天然または非天然アミノ酸である。セリンやスレオニンを含むペプチドのＦＭＯＣ固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）において、シュードプロリン（オキサゾリジン）ジペプチドをルーチンに使用することにより、未精製生成物の品質と収率が大幅に改善をもたらす。いったん、前記ペプチドが脱保護されると、前記シュードプロリンはＸ－Ｓｅｒ、Ｘ－ＴｈｒまたはＸ－Ｃｙｓの形の従来のジペプチドとなり、ここでＸは天然または非天然アミノ酸である。

【0046】

より好ましくは、当該バリアントは、１または複数の他のアミノ酸残基によって置換された１～５、または１～４、または１～３のアミノ酸残基を有する。さらに好ましくは、２のアミノ酸残基が別のアミノ酸残基によって置換されている。よりいっそう好ましくは、１のアミノ酸残基が別のアミノ酸残基によって置換されている。好ましくは、当該置換はホモログである。

【0047】

ホモログ置換（置換（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）と置換（ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）はともに本明細書で使用されており、既存のアミノ酸残基を代替残基と交換することを意味する）は行われてもよく、すなわち、塩基性と塩基性、酸性と酸性、極性と極性などの同種交換の置換である。非ホモログ置換はまた行われてもよい。すなわち、あるクラスの残基から別のクラスの残基へ、あるいは代わりに、オルニチン、ジアミノ酪酸オルニチン、ノルロイシンオルニチン、ピリジルアラニン、チエニルアラニン、ナフチルアラニン、及びフェニルグリシンなどの非天然アミノ酸の包含を伴い、その詳細なリストは以下の通りである。一度に、１超のアミノ酸残基が修飾されてもよい。

【0048】

キャリア部分の任意の２のアミノ酸残基の間に挿入され得る適切なスペーサー基は、グリシンまたはβ－アラニン残基などのアミノ酸スペーサーに加えて、メチル基、エチル基またはプロピル基などのアルキル基を含んでいる。ペプトイド形態の１又は複数のアミノ酸残基の存在を伴う、さらなるバリエーションの形態であるタイプ（ｅ）は、当業者にはよく理解されるであろう。誤解を避けるために、「ペプトイド形態」は、α－炭素の置換基が、α－炭素というよりはむしろ、残基の窒素原子上にあるバリアントアミノ酸残基を指すために使用される。ペプトイド形態のペプチドを調製するためのプロセスは当技術分野で知られており、例えば、Ｓｉｍｏｎ ＲＪら、ＰＮＡＳ（１９９２）８９（２０）、９３６７－９３７１ ａｎｄ Ｈｏｒｗｅｌｌ ＤＣ， Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． （１９９５） １３（４）， １３２－１３４である。タイプ（ｆ）の修飾は、国際出願ＰＣＴ／ＧＢ９９／０１８５５（ＷＯ ９９／６４５７４）に記載されているような方法によって行ってもよい。

【0049】

アミノ酸のバリアント、好ましくは（ａ）型または（ｂ）型が、任意の位置で独立して起こることが好ましい。上記のように、１超のホモログ置換または非ホモログ置換が同時に発生してもよい。さらなる変異は、配列内のいくつかのアミノ酸残基の配列を逆転させることによっても起こり得る。

【0050】

一実施形態では、置換アミノ酸残基は、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシンおよびバリンの残基から選ばれた天然アミノ酸である。置換アミノ酸残基は、さらに、非天然アミノ酸から選ばれてもよい。

【0051】

本発明の方法は、以下のステップを含んでいる：
（Ｉ）Ｎ末端のアミノ酸が、保護基ＰＧ_１により、保護されており、それが、Ｂｏｃ及びＦｍｏｃから選択される第１のペプチド断片を調製し；
（II）Ｃ末端のアミノ酸が、保護基ＰＧ_２により、保護されており、それが、トリチル、クロロトリチル及びｔ－ブチルから選択される第２のペプチド断片を調製し、そして、前記第１のペプチド断片及び第２のペプチド断片中のアミノ酸側鎖は任意に保護されており；
（III）溶液中で、前記第１のペプチド断片のＣ末端アミノ酸と、前記第２のペプチド断片のＮ末端アミノ酸をカップリングし、直鎖状の保護されたＥＧＦ様ペプチドを形成し；
（ＩＶ）（ａ）
（ｉ）ステップ（III）で形成された直鎖状の保護されたＥＧＦ様ペプチドをヨウ素で処理し、酸化混合物を形成し；
（ii）トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）で処理し、ステップ（IV）（ａ）（ｉ）で得られた前記酸化混合物を全体的に脱保護し、
（iii）ステップ（IV）（ａ）（ii）で得られた前記脱保護された酸化混合物をＤＭＳＯ／ＤＴＴで処理し、未精製のＥＧＦ様ペプチドを形成する；又は
（ＩＶ）（ｂ）
（ｉ）トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）で処理し、ステップ（III）で得られた直鎖状の保護されたＥＧＦ様ペプチドを全体的に脱保護し；
（ii）ステップ （ＩＶ）（ｂ）（ｉ）で得られた脱保護された混合物をＤＭＳＯで処理し、未精製のＥＧＦ様ペプチドを形成する；そして、
（Ｖ）任意に前記未精製のＥＧＦ様ペプチドを精製する。

【0052】

前記方法のステップ（Ｉ）は、Ｎ末端のアミノ酸が、保護基ＰＧ_１により、保護されており、それが、Ｂｏｃ及びＦｍｏｃから選択される第１のペプチド断片を調製することを含んでいる。

【0053】

一の好ましい実施形態では、前記第１のペプチド断片は、２又はそれ以上のペプチドサブ断片をカップリングすることで、調製される。

【0054】

別の好ましい実施形態では、前記第１のペプチド断片は、固相ペプチド合成によって調製される。

【0055】

前記方法のステップ（II）は、Ｃ末端のアミノ酸が、保護基ＰＧ_２により、保護されており、それが、クロロトリチル及びｔ－ブチルから選択される第２のペプチド断片を調製することを含んでいる。

【0056】

一の好ましい実施形態では、前記第２のペプチド断片は、２又はそれ以上のペプチドサブ断片をカップリングすることで、調製される。

【0057】

一の好ましい実施形態では、前記第２のペプチド断片は、固相ペプチド合成によって調製される。

【0058】

前記方法のステップ（III）は、溶液中で、前記第１のペプチド断片のＣ末端アミノ酸と、前記第２のペプチド断片のＮ末端アミノ酸をカップリングし、保護されたＥＧＦ様ペプチドを形成することを含んでいる。第１のペプチド断片および第２のペプチド断片のそれぞれの配列は、ステップ（ＩＩＩ）におけるそれらのカップリングにより、保護された直鎖状である配列Ｃ^１（Ｘ）_７Ｃ^２（Ｘ）_４－５Ｃ^３（Ｘ）_{１０－１３}Ｃ^４（Ｘ）Ｃ^５（Ｘ）_８Ｃ^６ ［配列番号４９］のペプチドを生じさせるようになっている。この直鎖状の保護されたペプチドは、その後脱保護され、そして、再編成を受けて、分子内ジスルフィド結合の正しい配置を有する最終的なＥＧＦ様ペプチドを形成する（ステップ（ＩＶ）（ａ）または（ＩＶ）（ｂ）参照）。例えば、前記ＥＧＦ様ペプチドがＥＧＦ（以下参照）の場合、Ｃｙｓ^６とＣｙｓ^２０、Ｃｙｓ^１４とＣｙｓ^３１、及びＣｙｓ^３３とＣｙｓ^４２の間に３つの分子内ジスルフィド結合が形成される。

【0059】

好ましくは、前記第１のペプチド断片は、例えばＨＯＢｔ．Ｈ_２Ｏで処理することによって活性化され、その後、カップリング試薬および溶媒の存在下で前記第２のペプチド断片とカップリングされる。好ましくは、酸活性化（例えば、ＨＯＢｔ．Ｈ_２Ｏによる）は、ＣＯＯＨ基で終結する第１のペプチド断片が第２のペプチド断片の遊離ＮＨ_２基とカップリングされる、本明細書に記載のすべての断片縮合反応に適用する。

【0060】

活性化エステルを生成するため、ＨＯＢｔは使用される。得られたエステルは、次に前記第２のペプチド断片のアミン基と反応し、アミド結合を形成する。他のベンゾトリアゾール活性化剤も使用されることができ、そして、当業者にはよく知られているであろう。適当な代替品は、クロロベンゾトリアゾールおよびアザベンゾトリアゾールを含んでいるが、これらに限定されない。また、活性化及びカップリングは、ＨＢＴＵ、ＴＢＴＵ等のウラン塩を用いて、行われてもよい。適切なカップリング試薬は当業者にはよく知られているであろうし、例えば、ＤＩＣ（Ｎ，Ｎ’－ジイソプロピルカルボジイミド）、ＤＣＣ（Ｎ，Ｎ′－ジシクロヘキシルカルボジイミド）およびＥＤＡＣ（１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド）といったカルボジイミドカップリング試薬などを含んでいる。好ましくは、カップリング試薬はＥＤＡＣであり、より好ましくは、そのＨＣｌ塩の形態である。

【0061】

カップリングステップのための適切な溶媒は、当業者にはよく知られているだろう。 好ましくは、溶媒は、Ｎ－メチルピロリドン（ＮＭＰ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルアセトアミド（ＤＭＡＣ）、ジクロロメタン（ＤＣＭ）およびこれらの混合物から選択される。より好ましくは、当該溶媒はＮＭＰである。

【0062】

本発明の方法は、以下で記述する通り、その後、ステップ（ＩＶ）（ａ）又はステップ（ＩＶ）（ｂ）を介して進行する。

【0063】

一の好ましい実施形態では、前記プロセスはステップ（ＩＶ）（ａ）を介して進行する。ステップ（ＩＶ）（ａ）は、ステップ（ｉ）～（ｉｉｉ）を含んでいる。ステップ（ＩＶ）（ａ）（ｉ）は、ステップ（III）で形成された保護されたＥＧＦ様ペプチドをヨウ素で処理し、酸化混合物を形成することを含んでいる。前記ヨウ素は同時にシステイン側鎖の保護基を除去し、さらにその後、システインを酸化してジスルフィドを形成する。これは、システイン残基が互いに架橋した広範囲の異なる製品をもたらす。好ましくは、前記ヨウ素酸化ステップ（ＩＶ）（ａ）（ｉ）は、適切な有機溶媒中で行われる。 適切な溶媒は、当業者にはよく知られているであろうし、例えば、ジクロロメタンを含んでいる。 好ましくは、前記ヨウ素酸化ステップは、ＴＦＡ／ジクロロメタン中のヨウ素の溶液、より好ましくはＴＦＡ／ジクロロメタン中のヨウ素の１％溶液を使用して行われる。

【0064】

本方法のステップ（ＩＶ）（ａ）（ｉｉ）は、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）で処理し、ステップ（IV）（ａ）（ｉ）で得られた前記酸化混合物を全体的に脱保護することを含んでいる。このステップは、前記ペプチドから残りの保護基をすべて除去する。好ましくは、このステップは、ステップ（ＩＶ）（ａ）（ｉ）で得られた酸化混合物を、ＴＦＡ／Ｈ_２Ｏ／ＤＴＴを含んでいる混合物、より好ましくは９４：３：３の比率で処理することを含んでいる。前記ＤＴＴはスカベンジャーとして機能し、そして、起こり得る早期の酸化を回避する。

【0065】

本方法のステップ（ＩＶ）（ａ）（ｉｉｉ）は、ステップ（IV）（ａ）（ii）で得られた前記脱保護された酸化混合物をジチオスレイトール（ＤＴＴ）及びＤＭＳＯで処理し、未精製のＥＧＦ様ペプチドを形成することを含んでいる。ＤＴＴはジスルフィド結合の還元剤であり、ＤＭＳＯは穏やかな酸化剤である。ＤＭＳＯとＤＴＴで処理すると、ジスルフィド結合が平衡化（または「リシャッフル」）し、熱力学的に最も有利な生成物を形成する。この方法は酸化的フォールディングとして知られており、そして、ＥＧＦＲによる認識に不可欠なループ構造を形成するための正しいジスルフィド結合配置を持つＥＧＦ様ペプチドをもたらす。好ましくは、このステップは、水／ＤＭＳＯ中で行う。より好ましくは、このステップは、ＤＭＳＯ及びＴｒｉｓと塩酸グアニジンを含む水溶液で行われ、後者はカオトロープとして機能する。他の実施形態では、本方法のステップ（ＩＶ）（ａ）（ｉｉｉ）は、ステップ（ＩＶ）（ａ）（ｉｉ）で得られた前記脱保護された酸化混合物を、ＤＭＳＯ及びＴｒｉｓと塩酸グアニジンを含む水溶液で処理し、未精製のＥＧＦ様ペプチドを形成することを含んでいる。代わりの好ましい実施形態では、本方法は、ステップ（ＩＶ）（ｂ）を介して進行する。ステップ（ＩＶ）（ｂ）はステップ（ｉ）－（ｉｉ）を含んでいる。ステップ（ＩＶ）（ｂ）は、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）で処理し、ステップ（III）で得られた直鎖状の保護されたＥＧＦ様ペプチドを全体的に脱保護することを含んでいる。このステップは、前記ペプチドから残りの保護基をすべて除去する。好ましくは、このステップは、ステップ（ＩＩＩ）で得られた酸化混合物を、ＴＦＡ／Ｈ_２Ｏ／ＤＴＴを含む混 合物、より好ましくは９４：３：３の比率で処理することを含む。前記ＤＴＴはスカベンジャーとして機能し、そして、起こり得る早期の酸化を回避する。

【0066】

ステップ（ＩＶ）（ｂ）（ｉｉ）は、ステップ （ＩＶ）（ｂ）（ｉ）で得られた脱保護された混合物をＤＭＳＯで処理し、未精製のＥＧＦ様ペプチドを形成することを含んでいる。好ましい実施形態では、本方法のステップ（ＩＶ）（ｂ）（ｉｉ）は、ステップ（ＩＶ）（ｂ）（ｉ）で得られた脱保護された酸化混合物を、ＤＭＳＯ及びＴｒｉｓと塩酸グアニジンを含む水溶液で処理し、未精製のＥＧＦ様ペプチドを形成することを含んでいる。

【0067】

本方法のステップ（Ｖ）は、任意に前記未精製のＥＧＦ様ペプチドを精製することを含んでいる。適切な精製方法は当技術分野で一般的に知られており、そして、例えばＨＰＬＣを含んでいる。当業者は、ペプチドのＨＰＬＣ精製に適した溶媒およびカラム材料に精通しているであろう。精製のための適切な溶媒、カラム材料および条件は、添付の実施例に例示されている。

【0068】

一の好ましい実施形態では、前記第１のペプチド断片は、２又はそれ以上のペプチドサブ断片をカップリングすることで、調製される。

【0069】

一の好ましい実施形態では、前記第１のペプチド断片は、固相ペプチド合成によって調製される。

【0070】

一の好ましい実施形態では、前記第２のペプチド断片は、２又はそれ以上のペプチドサブ断片をカップリングすることで、調製される。

【0071】

一の好ましい実施形態では、前記第２のペプチド断片は、固相ペプチド合成によって調製される。

【0072】

上皮成長因子（ＥＧＦ）を調製するための方法
一の好ましい実施形態では、前記ＥＧＦ様ペプチドは、ＥＧＦ、又はそのアナログ又はそのバリアントである。

【0073】

一の好ましい実施形態では、前記ＥＧＦ様ペプチドは、マウスＥＧＦ、又はそのアナログ又はそのバリアントである。

【0074】

一の好ましい実施形態では、前記ＥＧＦ様ペプチドは、ヒトＥＧＦ、又はそのアナログ又はそのバリアントである。

【0075】

一の好ましい実施形態では、前記第１のペプチド断片のＣ末端アミノ酸はグリシンである。

【0076】

一の好ましい実施形態では、前記ＥＧＦ様ペプチドは以下の配列：
Ｈ－Ａｓｎ^１－Ｓｅｒ^２－Ａｓｐ^３－Ｓｅｒ^４－Ｇｌｕ^５－Ｃｙｓ^６－Ｐｒｏ^７－Ｌｅｕ^８－Ｓｅｒ^９－Ｈｉｓ^１０－Ａｓｐ^１１－Ｇｌｙ^１２－Ｔｙｒ^１３－Ｃｙｓ^１４－Ｌｅｕ^１５－Ｈｉｓ^１６－Ａｓｐ^１７－Ｇｌｙ^１８－Ｖａｌ^１９－Ｃｙｓ^２０－Ｍｅｔ^２１－Ｔｙｒ^２２－Ｉｌｅ^２３－Ｇｌｕ^２４－Ａｌａ^２５－Ｌｅｕ^２６－Ａｓｐ^２７－Ｌｙｓ^２８－Ｔｙｒ^２９－Ａｌａ^３０－Ｃｙｓ^３１－Ａｓｎ^３２－Ｃｙｓ^３３－Ｖａｌ^３４－Ｖａｌ^３５－Ｇｌｙ^３６－Ｔｙｒ^３７－Ｉｌｅ^３８－Ｇｌｙ^３９－Ｇｌｕ^４０－Ａｒｇ^４１－Ｃｙｓ^４２－Ｇｌｎ^４３－Ｔｙｒ^４４－Ａｒｇ^４５－Ａｓｐ^４６－Ｌｅｕ^４７－Ｌｙｓ^４８－Ｔｒｐ^４９－Ｔｒｐ^５０－Ｇｌｕ^５１－Ｌｅｕ^５２－Ａｒｇ^５３－ＯＨ ［配列番号１］
又はそのバリアントを有する（またはより好ましくは、からなる）；
そして、前記方法は、以下のステップを含んでいる：
以下の配列を有する（またはより好ましくは、からなる）第１のペプチド断片：
ＰＧ_１－Ａｓｎ^１－Ｓｅｒ^２－Ａｓｐ^３－Ｓｅｒ^４－Ｇｌｕ^５－Ｃｙｓ^６－Ｐｒｏ^７－Ｌｅｕ^８－Ｓｅｒ^９－Ｈｉｓ^１０－Ａｓｐ^１１－Ｇｌｙ^１２－Ｔｙｒ^１３－Ｃｙｓ^１４－Ｌｅｕ^１５－Ｈｉｓ^１６－Ａｓｐ^１７－Ｇｌｙ^１８－ＯＨ ［配列番号２］
又はそのバリアントであって、
ＰＧ_１が、Ｂｏｃ及びＦｍｏｃから選択されるＮ末端保護基であって、そして、前記Ｃ末端アミノ酸が、任意に、活性化されたカルボン酸誘導体の形態であって、
以下の配列を有する（またはより好ましくは、からなる）第２のペプチド断片：
Ｈ－Ｖａｌ^１９－Ｃｙｓ^２０－Ｍｅｔ^２１－Ｔｙｒ^２２－Ｉｌｅ^２３－Ｇｌｕ^２４－Ａｌａ^２５－Ｌｅｕ^２６－Ａｓｐ^２７－Ｌｙｓ^２８－Ｔｙｒ^２９－Ａｌａ^３０－Ｃｙｓ^３１－Ａｓｎ^３２－Ｃｙｓ^３３－Ｖａｌ^３４－Ｖａｌ^３５－Ｇｌｙ^３６－Ｔｙｒ^３７－Ｉｌｅ^３８－Ｇｌｙ^３９－Ｇｌｕ^４０－Ａｒｇ^４１－Ｃｙｓ^４２－Ｇｌｎ^４３－Ｔｙｒ^４４－Ａｒｇ^４５－Ａｓｐ^４６－Ｌｅｕ^４７－Ｌｙｓ^４８－Ｔｒｐ^４９－Ｔｒｐ^５０－Ｇｌｕ^５１－Ｌｅｕ^５２－Ａｒｇ^５３－Ｏ－ＰＧ_２ ［配列番号３］
又はそのバリアントであって、
ＰＧ_２が、クロロトリチル及びｔ－ブチルから選択される保護基であって；
そして、前記第１の及び第２のペプチド断片における１または複数のアミノ酸残基が、好ましくは、酸開裂性保護基で任意に保護されており、前記第１のペプチド断片と、前記第２のペプチド断片を、溶液中でカップリングする方法を有する。

【0077】

酸開裂性保護基は、^ｔＢｕ、Ｂｏｃ、Ａｃｍ、Ｏ^ｔＢｕ、Ｔｒｔ、Ｍｍｔ、Ｍｔｔ 及びＰｂｆを含んでいるが、これには限定されない。一の好ましい実施形態では、第１のペプチド断片及び第２のペプチド断片中の１又は複数のアミノ酸残基のアミノ酸側鎖は、^ｔＢｕ， Ｔｔｒ，Ｐｂｆ及びＢｏｃから選択される酸開裂性保護基で任意に保護されている。

【0078】

一の好ましい実施形態では、前記ＥＧＦ様ペプチドは以下の配列：
Ｈ－Ａｓｎ^１（Ｐ）－Ｓｅｒ^２（Ｐ）－Ａｓｐ^３（Ｐ）－ ΨＳｅｒ^４－Ｇｌｕ^５（Ｐ）－Ｃｙｓ^６（Ｐ）－Ｐｒｏ^７－Ｌｅｕ^８－ΨＳｅｒ^９－Ｈｉｓ^１０（Ｐ）－Ａｓｐ^１１（Ｐ）－Ｇｌｙ^１２－Ｔｙｒ^１３（Ｐ）－Ｃｙｓ^１４（Ｐ）－Ｌｅｕ^１５－Ｈｉｓ^１６（Ｐ）－Ａｓｐ^１７（Ｐ）－Ｇｌｙ^１８－Ｖａｌ^１９－Ｃｙｓ^２０（Ｐ）－Ｍｅｔ^２１－Ｔｙｒ^２２（Ｐ）－Ｉｌｅ^２３－Ｇｌｕ^２４（Ｐ）－Ａｌａ^２５－Ｌｅｕ^２６－Ａｓｐ^２７（Ｐ）－Ｌｙｓ^２８（Ｐ）－Ｔｙｒ^２９（Ｐ）－Ａｌａ^３０－Ｃｙｓ^３１（Ｐ）－Ａｓｎ^３２（Ｐ）－Ｃｙｓ^３３（Ｐ）－Ｖａｌ^３４－Ｖａｌ^３５－Ｇｌｙ^３６－Ｔｙｒ^３７（Ｐ）－Ｉｌｅ^３８－Ｇｌｙ^３９－Ｇｌｕ^４０（Ｐ）－Ａｒｇ^４１（Ｐ）－Ｃｙｓ^４２（Ｐ）－Ｇｌｎ^４３（Ｐ）－Ｔｙｒ^４４（Ｐ）－Ａｒｇ^４５（Ｐ）－Ａｓｐ^４６（Ｐ）－Ｌｅｕ^４７－Ｌｙｓ^４８（Ｐ）－Ｔｒｐ^４９（Ｐ）－Ｔｒｐ^５０（Ｐ）－Ｇｌｕ^５１（Ｐ）－Ｌｅｕ^５２－Ａｒｇ^５３（Ｐ）－ＯＨ ［配列番号９］
又はそのバリアントを有し（またはより好ましくは、からなる）；
ここで、以下の配列を有する（またはより好ましくは、からなる）第１のペプチド断片：
ＰＧ_１－Ａｓｎ^１（Ｐ）－Ｓｅｒ^２（Ｐ）－Ａｓｐ^３（Ｐ）－ ΨＳｅｒ^４－Ｇｌｕ^５（Ｐ）－Ｃｙｓ^６（Ｐ）－Ｐｒｏ^７－Ｌｅｕ^８－ΨＳｅｒ^９－Ｈｉｓ^１０（Ｐ）－Ａｓｐ^１１（Ｐ）－Ｇｌｙ^１２－Ｔｙｒ^１３（Ｐ）－Ｃｙｓ^１４（Ｐ）－Ｌｅｕ^１５－Ｈｉｓ^１６（Ｐ）－Ａｓｐ^１７（Ｐ）－Ｇｌｙ^１８－ＯＨ ［配列番号１０］
またはそのバリアントであって；
以下の配列を有する（またはより好ましくは、からなる）第２のペプチド断片：
Ｈ－Ｖａｌ^１９－Ｃｙｓ^２０（Ｐ）－Ｍｅｔ^２１－Ｔｙｒ^２２（Ｐ）－Ｉｌｅ^２３－Ｇｌｕ^２４（Ｐ）－Ａｌａ^２５－Ｌｅｕ^２６－Ａｓｐ^２７（Ｐ）－Ｌｙｓ^２８（Ｐ）－Ｔｙｒ^２９（Ｐ）－Ａｌａ^３０－Ｃｙｓ^３１（Ｐ）－Ａｓｎ^３２（Ｐ）－Ｃｙｓ^３３（Ｐ）－Ｖａｌ^３４－Ｖａｌ^３５－Ｇｌｙ^３６－Ｔｙｒ^３７（Ｐ）－Ｉｌｅ^３８－Ｇｌｙ^３９－Ｇｌｕ^４０（Ｐ）－Ａｒｇ^４１（Ｐ）－Ｃｙｓ^４２（Ｐ）－Ｇｌｎ^４３（Ｐ）－Ｔｙｒ^４４（Ｐ）－Ａｒｇ^４５（Ｐ）－Ａｓｐ^４６（Ｐ）－Ｌｅｕ^４７－Ｌｙｓ^４８（Ｐ）－Ｔｒｐ^４９（Ｐ）－Ｔｒｐ^５０（Ｐ）－Ｇｌｕ^５１（Ｐ）－Ｌｅｕ^５２－Ａｒｇ^５３（Ｐ）－Ｏ－ＰＧ_２ ［配列番号１１］
またはそのバリアントであって；
それぞれのＰが、同じ又は異なっていてもよい側鎖保護基を表している。

【0079】

一の好ましい実施形態では、前記ＥＧＦ様ペプチドは以下の配列：
Ｈ－Ａｓｎ^１（Ｔｒｔ）－Ｓｅｒ^２（ｔＢｕ）－Ａｓｐ^３（ｔＢｕ）－ΨＳｅｒ^４－Ｇｌｕ^５（ｔＢｕ）－Ｃｙｓ^６（Ｔｒｔ）－Ｐｒｏ^７－Ｌｅｕ^８－ΨＳｅｒ^９－Ｈｉｓ^１０（Ｔｒｔ）－Ａｓｐ^１１（ｔＢｕ）－Ｇｌｙ^１２－Ｔｙｒ^１３（ｔＢｕ）－Ｃｙｓ^１４（Ｔｒｔ）－Ｌｅｕ^１５－Ｈｉｓ^１６（Ｔｒｔ）－Ａｓｐ^１７（ｔＢｕ）－Ｇｌｙ^１８－Ｖａｌ^１９－Ｃｙｓ^２０（Ｔｒｔ）－Ｍｅｔ^２１－Ｔｙｒ^２２（ｔＢｕ）－Ｉｌｅ^２３－Ｇｌｕ^２４（ｔＢｕ）－Ａｌａ^２５－Ｌｅｕ^２６－Ａｓｐ^２７（ｔＢｕ）－Ｌｙｓ^２８（Ｂｏｃ）－Ｔｙｒ^２９（ｔＢｕ）－Ａｌａ^３０－Ｃｙｓ^３１（Ｔｒｔ）－Ａｓｎ^３２（Ｔｒｔ）－Ｃｙｓ^３３（Ｔｒｔ）－Ｖａｌ^３４－Ｖａｌ^３５－Ｇｌｙ^３６－Ｔｙｒ^３７（ｔＢｕ）－Ｉｌｅ^３８－Ｇｌｙ^３９－Ｇｌｕ（ｔＢｕ）^４０－Ａｒｇ^４１（Ｐｂｆ）－Ｃｙｓ^４２（Ｔｒｔ）－Ｇｌｎ^４３（Ｔｒｔ）－Ｔｙｒ^４４（ｔＢｕ）－Ａｒｇ^４５（Ｐｂｆ）－Ａｓｐ^４６（ｔＢｕ）－Ｌｅｕ^４７－Ｌｙｓ^４８（Ｂｏｃ）－Ｔｒｐ^４９（Ｂｏｃ）－Ｔｒｐ^５０（Ｂｏｃ）－Ｇｌｕ^５１（ｔＢｕ）－Ｌｅｕ^５２－Ａｒｇ^５３（Ｐｂｆ）－ＯＨ ［配列番号１２］
又はそのバリアントを有し（またはより好ましくは、からなる）；
そして、ここで、以下の配列を有する（またはより好ましくは、からなる）前記第１のペプチド断片：
ＰＧ_１－Ａｓｎ^１（Ｔｒｔ）－Ｓｅｒ^２（ｔＢｕ）－Ａｓｐ^３（ｔＢｕ）－ΨＳｅｒ^４－Ｇｌｕ^５（ｔＢｕ）－Ｃｙｓ^６（Ｔｒｔ）－Ｐｒｏ^７－Ｌｅｕ^８－ΨＳｅｒ^９－Ｈｉｓ^１０（Ｔｒｔ）－Ａｓｐ^１１（ｔＢｕ）－Ｇｌｙ^１２－Ｔｙｒ^１３（ｔＢｕ）－Ｃｙｓ^１４（Ｔｒｔ）－Ｌｅｕ^１５－Ｈｉｓ^１６（Ｔｒｔ）－Ａｓｐ^１７（ｔＢｕ）－Ｇｌｙ^１８－ＯＨ ［配列番号１３］
またはそのバリアントであって、
そして、以下の配列を有する（またはより好ましくは、からなる）第２のペプチド断片：
Ｈ－Ｖａｌ^１９－Ｃｙｓ^２０（Ｔｒｔ）－Ｍｅｔ^２１－Ｔｙｒ^２２（ｔＢｕ）－Ｉｌｅ^２３－Ｇｌｕ^２４（ｔＢｕ）－Ａｌａ^２５－Ｌｅｕ^２６－Ａｓｐ^２７（ｔＢｕ）－Ｌｙｓ^２８（Ｂｏｃ）－Ｔｙｒ^２９（ｔＢｕ）－Ａｌａ^３０－Ｃｙｓ^３１（Ｔｒｔ）－Ａｓｎ^３２（Ｔｒｔ）－Ｃｙｓ^３３（Ｔｒｔ）－Ｖａｌ^３４－Ｖａｌ^３５－Ｇｌｙ^３６－Ｔｙｒ^３７（ｔＢｕ）－Ｉｌｅ^３８－Ｇｌｙ^３９－Ｇｌｕ（ｔＢｕ）^４０－Ａｒｇ^４１（Ｐｂｆ）－Ｃｙｓ^４２（Ｔｒｔ）－Ｇｌｎ^４３（Ｔｒｔ）－Ｔｙｒ^４４（ｔＢｕ）－Ａｒｇ^４５（Ｐｂｆ）－Ａｓｐ^４６（ｔＢｕ）－Ｌｅｕ^４７－Ｌｙｓ^４８（Ｂｏｃ）－Ｔｒｐ^４９（Ｂｏｃ）－Ｔｒｐ^５０（Ｂｏｃ）－Ｇｌｕ^５１（ｔＢｕ）－Ｌｅｕ^５２－Ａｒｇ^５３（Ｐｂｆ）－Ｏ－ＰＧ_２ ［配列番号１４］
またはそのバリアントである。

【0080】

一の好ましい実施形態では、前記第１のペプチド断片ＰＧ_１－Ａｓｎ^１（Ｐ）－Ｓｅｒ^２（Ｐ）－Ａｓｐ^３（Ｐ）－ ΨＳｅｒ^４－Ｇｌｕ^５（Ｐ）－Ｃｙｓ^６（Ｐ）－Ｐｒｏ^７－Ｌｅｕ^８－ΨＳｅｒ^９－Ｈｉｓ^１０（Ｐ）－Ａｓｐ^１１（Ｐ）－Ｇｌｙ^１２－Ｔｙｒ^１３（Ｐ）－Ｃｙｓ^１４（Ｐ）－Ｌｅｕ^１５－Ｈｉｓ^１６（Ｐ）－Ａｓｐ^１７（Ｐ）－Ｇｌｙ^１８－ＯＨ ［配列番号１０］又はＰＧ_１－Ａｓｎ^１（Ｔｒｔ）－Ｓｅｒ^２（ｔＢｕ）－Ａｓｐ^３（ｔＢｕ）－ΨＳｅｒ^４－Ｇｌｕ^５（ｔＢｕ）－Ｃｙｓ^６（Ｔｒｔ）－Ｐｒｏ^７－Ｌｅｕ^８－ΨＳｅｒ^９－Ｈｉｓ^１０（Ｔｒｔ）－Ａｓｐ^１１（ｔＢｕ）－Ｇｌｙ^１２－Ｔｙｒ^１３（ｔＢｕ）－Ｃｙｓ^１４（Ｔｒｔ）－Ｌｅｕ^１５－Ｈｉｓ^１６（Ｔｒｔ）－Ａｓｐ^１７（ｔＢｕ）－Ｇｌｙ^１８－ＯＨ ［配列番号１３］は、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ－ＯＨから開始する固相合成により、調製される。

【0081】

一の好ましい実施形態では、前記第１のペプチド断片ＰＧ_１－Ａｓｎ^１（Ｐ）－Ｓｅｒ^２（Ｐ）－Ａｓｐ^３（Ｐ）－ΨＳｅｒ^４－Ｇｌｕ^５（Ｐ）－Ｃｙｓ^６（Ｐ）－Ｐｒｏ^７－Ｌｅｕ^８－ΨＳｅｒ^９－Ｈｉｓ^１０（Ｐ）－Ａｓｐ^１１（Ｐ）－Ｇｌｙ^１２－Ｔｙｒ^１３（Ｐ）－Ｃｙｓ^１４（Ｐ）－Ｌｅｕ^１５－Ｈｉｓ^１６（Ｐ）－Ａｓｐ^１７（Ｐ）－Ｇｌｙ^１８－ＯＨ ［配列番号１５］は、ＰＧ_１－Ａｓｎ^１（Ｐ）－Ｓｅｒ^２（Ｐ）－Ａｓｐ^３（Ｐ）－ΨＳｅｒ^４－Ｇｌｕ^５（Ｐ）－Ｃｙｓ^６（Ｐ）－Ｐｒｏ^７－Ｌｅｕ^８－ΨＳｅｒ^９－Ｈｉｓ^１０ （Ｐ）－Ａｓｐ^１１（Ｐ）－Ｇｌｙ^１２－ＯＨ ［配列番号１６］とＨ－Ｔｙｒ^１３（Ｐ）－Ｃｙｓ^１４（Ｐ）－Ｌｅｕ^１５－Ｈｉｓ^１６（Ｐ）－Ａｓｐ^１７（Ｐ）－Ｇｌｙ^１８－Ｏ－ＰＧ_２ ［配列番号１７］の断片縮合により調製される。好ましくは、前記保護基ＰＧ_２は、その後除去される。

【0082】

一の好ましい実施形態では、前記第１のペプチド断片ＰＧ_１－Ａｓｎ^１（Ｔｒｔ）－Ｓｅｒ^２（ｔＢｕ）－Ａｓｐ^３（ｔＢｕ）－ΨＳｅｒ^４－Ｇｌｕ^５（ｔＢｕ）－Ｃｙｓ^６（Ｔｒｔ）－Ｐｒｏ^７－Ｌｅｕ^８－ΨＳｅｒ^９－Ｈｉｓ^１０（Ｔｒｔ）－Ａｓｐ^１１（ｔＢｕ）－Ｇｌｙ^１２－Ｔｙｒ^１３（ｔＢｕ）－Ｃｙｓ^１４（Ｔｒｔ）－Ｌｅｕ^１５－Ｈｉｓ^１６（Ｔｒｔ）－Ａｓｐ^１７（ｔＢｕ）－Ｇｌｙ^１８－ＯＨ ［配列番号１３］は、ＰＧ_１－Ａｓｎ^１（Ｔｒｔ）－Ｓｅｒ^２（ｔＢｕ）－Ａｓｐ^３（ｔＢｕ）－ΨＳｅｒ^４－Ｇｌｕ^５（ｔＢｕ）－Ｃｙｓ^６（Ｔｒｔ）－Ｐｒｏ^７－Ｌｅｕ^８－ΨＳｅｒ^９－Ｈｉｓ^１０（Ｔｒｔ）－Ａｓｐ^１１（ｔＢｕ）－Ｇｌｙ^１２－ＯＨ ［配列番号１８］とＨ－Ｔｙｒ^１３（ｔＢｕ）－Ｃｙｓ^１４（Ｔｒｔ）－Ｌｅｕ^１５－Ｈｉｓ^１６（Ｔｒｔ）－Ａｓｐ^１７（ｔＢｕ）－Ｇｌｙ^１８－Ｏ－ＰＧ_２ ［配列番号１９］の断片縮合により調製される。好ましくは、前記保護基ＰＧ_２は、その後除去される。

【0083】

一の好ましい実施形態では、前記ペプチド断片ＰＧ_１－Ａｓｎ^１（Ｐ）－Ｓｅｒ^２（Ｐ）－Ａｓｐ^３（Ｐ）－ΨＳｅｒ^４－Ｇｌｕ^５（Ｐ）－Ｃｙｓ^６（Ｐ）－Ｐｒｏ^７－Ｌｅｕ^８－ΨＳｅｒ^９－Ｈｉｓ^１０（Ｐ）－Ａｓｐ^１１（Ｐ）－Ｇｌｙ^１２－ＯＨ ［配列番号２０］又はＰＧ_１－Ａｓｎ^１（Ｔｒｔ）－Ｓｅｒ^２（ｔＢｕ）－Ａｓｐ^３（ｔＢｕ）－ΨＳｅｒ^４－Ｇｌｕ^５（ｔＢｕ）－Ｃｙｓ^６（Ｔｒｔ）－Ｐｒｏ^７－Ｌｅｕ^８－ΨＳｅｒ^９－Ｈｉｓ^１０（Ｔｒｔ） －Ａｓｐ^１１（ｔＢｕ）－Ｇｌｙ^１２－ＯＨ ［配列番号２１］は、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ－ＯＨから開始する固相合成により、調製される。

【0084】

一の好ましい実施形態では、前記ペプチド断片Ｈ－Ｔｙｒ^１３（Ｐ）－Ｃｙｓ^１４（Ｐ）－Ｌｅｕ^１５－Ｈｉｓ^１６（Ｐ）－Ａｓｐ^１７（Ｐ）－Ｇｌｙ^１８－Ｏ－ＰＧ_２ ［配列番号１７］又はＨ－Ｔｙｒ^１３（ｔＢｕ）－Ｃｙｓ^１４（Ｔｒｔ）－Ｌｅｕ^１５－Ｈｉｓ^１６（Ｔｒｔ）－Ａｓｐ^１７（ｔＢｕ）－Ｇｌｙ^１８－Ｏ－ＰＧ_２ ［配列番号１９］は、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ－ＯＨから開始する固相合成により、調製される。

【0085】

一の好ましい実施形態では、前記第２のペプチド断片Ｈ－Ｖａｌ^１９－Ｃｙｓ^２０（Ｐ）－Ｍｅｔ^２１－Ｔｙｒ^２２（Ｐ）－Ｉｌｅ^２３－Ｇｌｕ^２４（Ｐ）－Ａｌａ^２５－Ｌｅｕ^２６－Ａｓｐ^２７（Ｐ）－Ｌｙｓ^２８（Ｐ）－Ｔｙｒ^２９（Ｐ）－Ａｌａ^３０－Ｃｙｓ^３１（Ｐ）－Ａｓｎ^３２（Ｐ）－Ｃｙｓ^３３（Ｐ）－Ｖａｌ^３４－Ｖａｌ^３５－Ｇｌｙ^３６－Ｔｙｒ^３７（Ｐ）－Ｉｌｅ^３８－Ｇｌｙ^３９－Ｇｌｕ^４０（Ｐ）－Ａｒｇ^４１（Ｐ）－Ｃｙｓ^４２（Ｐ）－Ｇｌｎ^４３（Ｐ）－Ｔｙｒ^４４（Ｐ）－Ａｒｇ^４５（Ｐ）－Ａｓｐ^４６（Ｐ）－Ｌｅｕ^４７－Ｌｙｓ^４８（Ｐ）－Ｔｒｐ^４９（Ｐ）－Ｔｒｐ^５０（Ｐ）－Ｇｌｕ^５１（Ｐ）－Ｌｅｕ^５２－Ａｒｇ^５３（Ｐ）－Ｏ－ＰＧ_２ ［配列番号１１］は、ＰＧ_１－Ｖａｌ^１９－Ｃｙｓ^２０（Ｐ）－Ｍｅｔ^２１－Ｔｙｒ^２２（Ｐ）－Ｉｌｅ^２３－Ｇｌｕ^２４（Ｐ）－Ａｌａ^２５－Ｌｅｕ^２６－Ａｓｐ^２７（Ｐ）－Ｌｙｓ^２８（Ｐ）－Ｔｙｒ^２９（Ｐ）－Ａｌａ^３０－Ｃｙｓ^３１（Ｐ）－Ａｓｎ^３２（Ｐ）－Ｃｙｓ^３３（Ｐ）－Ｖａｌ^３４－Ｖａｌ^３５－Ｇｌｙ^３６－ＯＨ ［配列番号２２］と、Ｈ－Ｔｙｒ^３７（Ｐ）－Ｉｌｅ^３８－Ｇｌｙ^３９－Ｇｌｕ^４０（Ｐ）－Ａｒｇ^４１（Ｐ）－Ｃｙｓ^４２（Ｐ）－Ｇｌｎ^４３（Ｐ）－Ｔｙｒ^４４（Ｐ）－Ａｒｇ^４５（Ｐ）－Ａｓｐ^４６（Ｐ）－Ｌｅｕ^４７－Ｌｙｓ^４８（Ｐ）－Ｔｒｐ^４９（Ｐ）－Ｔｒｐ^５０（Ｐ）－Ｇｌｕ^５１（Ｐ）－Ｌｅｕ^５２－Ａｒｇ^５３（Ｐ）－Ｏ－ＰＧ_２ ［配列番号２３］との断片縮合により、調製される。好ましくは、前記保護基ＰＧ_１は、その後除去される。

【0086】

一の好ましい実施形態では、前記第２のペプチド断片Ｈ－Ｖａｌ^１９－Ｃｙｓ^２０（Ｔｒｔ）－Ｍｅｔ^２１－Ｔｙｒ^２２（ｔＢｕ）－Ｉｌｅ^２３－Ｇｌｕ^２４（ｔＢｕ）－Ａｌａ^２５－Ｌｅｕ^２６－Ａｓｐ^２７（ｔＢｕ）－Ｌｙｓ^２８（Ｂｏｃ）－Ｔｙｒ^２９（ｔＢｕ）－Ａｌａ^３０－Ｃｙｓ^３１（Ｔｒｔ）－Ａｓｎ^３２（Ｔｒｔ）－Ｃｙｓ^３３（Ｔｒｔ）－Ｖａｌ^３４－Ｖａｌ^３５－Ｇｌｙ^３６－Ｔｙｒ^３７（ｔＢｕ）－Ｉｌｅ^３８－Ｇｌｙ^３９－Ｇｌｕ（ｔＢｕ）^４０－Ａｒｇ^４１（Ｐｂｆ）－Ｃｙｓ^４２（Ｔｒｔ）－Ｇｌｎ^４３（Ｔｒｔ）－Ｔｙｒ^４４（ｔＢｕ）－Ａｒｇ^４５（Ｐｂｆ）－Ａｓｐ^４６（ｔＢｕ）－Ｌｅｕ^４７－Ｌｙｓ^４８（Ｂｏｃ）－Ｔｒｐ^４９（Ｂｏｃ）－Ｔｒｐ^５０（Ｂｏｃ）－Ｇｌｕ^５１（ｔＢｕ）－Ｌｅｕ^５２－Ａｒｇ^５３（Ｐｂｆ）－Ｏ－ＰＧ_２ ［配列番号１４］は、ＰＧ_１－Ｖａｌ^１９－Ｃｙｓ^２０（Ｔｒｔ）－Ｍｅｔ^２１－Ｔｙｒ^２２（ｔＢｕ）－Ｉｌｅ^２３－Ｇｌｕ^２４（ｔＢｕ）－Ａｌａ^２５－Ｌｅｕ^２６－Ａｓｐ^２７（ｔＢｕ）－Ｌｙｓ^２８（Ｂｏｃ）－Ｔｙｒ^２９（ｔＢｕ）－Ａｌａ^３０－Ｃｙｓ^３１（Ｔｒｔ）－Ａｓｎ^３２（Ｔｒｔ）－Ｃｙｓ^３３（Ｔｒｔ）－Ｖａｌ^３４－Ｖａｌ^３５－Ｇｌｙ^３６－ＯＨ ［配列番号２４］と、Ｈ－Ｔｙｒ^３７（ｔＢｕ）－Ｉｌｅ^３８－Ｇｌｙ^３９－Ｇｌｕ（ｔＢｕ）^４０－Ａｒｇ^４１（Ｐｂｆ）－Ｃｙｓ^４２（Ｔｒｔ）－Ｇｌｎ^４３（Ｔｒｔ）－Ｔｙｒ^４４（ｔＢｕ）－Ａｒｇ^４５（Ｐｂｆ）－Ａｓｐ^４６（ｔＢｕ）－Ｌｅｕ^４７－Ｌｙｓ^４８（Ｂｏｃ）－Ｔｒｐ^４９（Ｂｏｃ）－Ｔｒｐ^５０（Ｂｏｃ）－Ｇｌｕ^５１（ｔＢｕ）－Ｌｅｕ^５２－Ａｒｇ^５３（Ｐｂｆ）－Ｏ－ＰＧ_２ ［配列番号２５］との断片縮合により、調製される。好ましくは、前記保護基ＰＧ_１は、その後除去される。

【0087】

一の好ましい実施形態では、前記第２のペプチド断片Ｈ－Ｖａｌ^１９－Ｃｙｓ^２０（Ｐ）－Ｍｅｔ^２１－Ｔｙｒ^２２（Ｐ）－Ｉｌｅ^２３－Ｇｌｕ^２４（Ｐ）－Ａｌａ^２５－Ｌｅｕ^２６－Ａｓｐ^２７（Ｐ）－Ｌｙｓ^２８（Ｐ）－Ｔｙｒ^２９（Ｐ）－Ａｌａ^３０－Ｃｙｓ^３１（Ｐ）－Ａｓｎ^３２（Ｐ）－Ｃｙｓ^３３（Ｐ）－Ｖａｌ^３４－Ｖａｌ^３５－Ｇｌｙ^３６－Ｔｙｒ^３７（Ｐ）－Ｉｌｅ^３８－Ｇｌｙ^３９－Ｇｌｕ^４０（Ｐ）－Ａｒｇ^４１（Ｐ）－Ｃｙｓ^４２（Ｐ）－Ｇｌｎ^４３（Ｐ）－Ｔｙｒ^４４（Ｐ）－Ａｒｇ^４５（Ｐ）－Ａｓｐ^４６（Ｐ）－Ｌｅｕ^４７－Ｌｙｓ^４８（Ｐ）－Ｔｒｐ^４９（Ｐ）－Ｔｒｐ^５０（Ｐ）－Ｇｌｕ^５１（Ｐ）－Ｌｅｕ^５２－Ａｒｇ^５３（Ｐ）－Ｏ－ＰＧ_２ ［配列番号１１］は、ＰＧ_１－Ｖａｌ^１９－Ｃｙｓ^２０（Ｐ）－Ｍｅｔ^２１－Ｔｙｒ^２２（Ｐ）－Ｉｌｅ^２３－Ｇｌｕ^２４（Ｐ）－Ａｌａ^２５－Ｌｅｕ^２６－Ａｓｐ^２７（Ｐ）－Ｌｙｓ^２８（Ｐ）－Ｔｙｒ^２９（Ｐ）－Ａｌａ^３０－Ｃｙｓ^３１（Ｐ）－Ａｓｎ^３２（Ｐ）－Ｃｙｓ^３３（Ｐ）－Ｖａｌ^３４－Ｖａｌ^３５－Ｇｌｙ^３６－Ｔｙｒ^３７（Ｐ）－Ｉｌｅ^３８－Ｇｌｙ^３９－ＯＨ ［配列番号２６］と、Ｈ－Ｇｌｕ^４０（Ｐ）－Ａｒｇ^４１（Ｐ）－Ｃｙｓ^４２（Ｐ）－Ｇｌｎ^４３（Ｐ）－Ｔｙｒ^４４（Ｐ）－Ａｒｇ^４５（Ｐ）－Ａｓｐ^４６（Ｐ）－Ｌｅｕ^４７－Ｌｙｓ^４８（Ｐ）－Ｔｒｐ^４９（Ｐ）－Ｔｒｐ^５０（Ｐ）－Ｇｌｕ^５１（Ｐ）－Ｌｅｕ^５２－Ａｒｇ^５３（Ｐ）－Ｏ－ＰＧ_２ ［配列番号２７］との断片縮合により、調製される。好ましくは、前記保護基ＰＧ_１は、その後除去される。

【0088】

一の好ましい実施形態では、前記第２のペプチド断片Ｈ－Ｖａｌ^１９－Ｃｙｓ^２０（Ｔｒｔ）－Ｍｅｔ^２１－Ｔｙｒ^２２（ｔＢｕ）－Ｉｌｅ^２３－Ｇｌｕ^２４（ｔＢｕ）－Ａｌａ^２５－Ｌｅｕ^２６－Ａｓｐ^２７（ｔＢｕ）－Ｌｙｓ^２８（Ｂｏｃ）－Ｔｙｒ^２９（ｔＢｕ）－Ａｌａ^３０－Ｃｙｓ^３１（Ｔｒｔ）－Ａｓｎ^３２（Ｔｒｔ）－Ｃｙｓ^３３（Ｔｒｔ）－Ｖａｌ^３４－Ｖａｌ^３５－Ｇｌｙ^３６－Ｔｙｒ^３７（ｔＢｕ）－Ｉｌｅ^３８－Ｇｌｙ^３９－Ｇｌｕ（ｔＢｕ）^４０－Ａｒｇ^４１（Ｐｂｆ）－Ｃｙｓ^４２（Ｔｒｔ）－Ｇｌｎ^４３（Ｔｒｔ）－Ｔｙｒ^４４（ｔＢｕ）－Ａｒｇ^４５（Ｐｂｆ）－Ａｓｐ^４６（ｔＢｕ）－Ｌｅｕ^４７－Ｌｙｓ^４８（Ｂｏｃ）－Ｔｒｐ^４９（Ｂｏｃ）－Ｔｒｐ^５０（Ｂｏｃ）－Ｇｌｕ^５１（ｔＢｕ）－Ｌｅｕ^５２－Ａｒｇ^５３（Ｐｂｆ）－Ｏ－ＰＧ_２ ［配列番号１４］は、ＰＧ_１－Ｖａｌ^１９－Ｃｙｓ^２０（Ｔｒｔ）－Ｍｅｔ^２１－Ｔｙｒ^２２（ｔＢｕ）－Ｉｌｅ^２３－Ｇｌｕ^２４（ｔＢｕ）－Ａｌａ^２５－Ｌｅｕ^２６－Ａｓｐ^２７（ｔＢｕ）－Ｌｙｓ^２８（Ｂｏｃ）－Ｔｙｒ^２９（ｔＢｕ）－Ａｌａ^３０－Ｃｙｓ^３１（Ｔｒｔ）－Ａｓｎ^３２（Ｔｒｔ）－Ｃｙｓ^３３（Ｔｒｔ）－Ｖａｌ^３４－Ｖａｌ^３５－Ｇｌｙ^３６－Ｔｙｒ^３７（ｔＢｕ）－Ｉｌｅ^３８－Ｇｌｙ^３９－－ＯＨ ［配列番号２８］と、Ｈ－Ｇｌｕ（ｔＢｕ）^４０－Ａｒｇ^４１（Ｐｂｆ）－Ｃｙｓ^４２（Ｔｒｔ）－Ｇｌｎ^４３（Ｔｒｔ）－Ｔｙｒ^４４（ｔＢｕ）－Ａｒｇ^４５（Ｐｂｆ）－Ａｓｐ^４６（ｔＢｕ）－Ｌｅｕ^４７－Ｌｙｓ^４８（Ｂｏｃ）－Ｔｒｐ^４９（Ｂｏｃ）－Ｔｒｐ^５０（Ｂｏｃ）－Ｇｌｕ^５１（ｔＢｕ）－Ｌｅｕ^５２－Ａｒｇ^５３（Ｐｂｆ）－Ｏ－ＰＧ_２ ［配列番号２９］との断片縮合により、調製される。好ましくは、前記保護基ＰＧ_１は、その後除去される。

【0089】

一の好ましい実施形態では、前記ペプチド断片Ｈ－Ｔｙｒ^３７（Ｐ）－Ｉｌｅ^３８－Ｇｌｙ^３９－Ｇｌｕ^４０（Ｐ）－Ａｒｇ^４１（Ｐ）－Ｃｙｓ^４２（Ｐ）－Ｇｌｎ^４３（Ｐ）－Ｔｙｒ^４４（Ｐ）－Ａｒｇ^４５（Ｐ）－Ａｓｐ^４６（Ｐ）－Ｌｅｕ^４７－Ｌｙｓ^４８（Ｐ）－Ｔｒｐ^４９（Ｐ）－Ｔｒｐ^５０（Ｐ）－Ｇｌｕ^５１（Ｐ）－Ｌｅｕ^５２－Ａｒｇ^５３（Ｐ）－Ｏ－ＰＧ_２ ［配列番号２３］は、ＰＧ_１－Ｔｙｒ^３７（Ｐ）－Ｉｌｅ^３８－Ｇｌｙ^３９－ＯＨ ［配列番号３０］と、Ｈ－Ｇｌｕ^４０（Ｐ）－Ａｒｇ^４１（Ｐ）－Ｃｙｓ^４２（Ｐ）－Ｇｌｎ^４３（Ｐ）－Ｔｙｒ^４４（Ｐ）－Ａｒｇ^４５（Ｐ）－Ａｓｐ^４６（Ｐ）－Ｌｅｕ^４７－Ｌｙｓ^４８（Ｐ）－Ｔｒｐ^４９（Ｐ）－Ｔｒｐ^５０（Ｐ）－Ｇｌｕ^５１（Ｐ）－Ｌｅｕ^５２－Ａｒｇ^５３（Ｐ）－Ｏ－ＰＧ_２ ［配列番号２７］との断片縮合により、調製される。好ましくは、前記保護基ＰＧ_１は、その後除去される。

【0090】

一の好ましい実施形態では、前記ペプチド断片Ｈ－Ｔｙｒ^３７（ｔＢｕ）－Ｉｌｅ^３８－Ｇｌｙ^３９－Ｇｌｕ（ｔＢｕ）^４０－Ａｒｇ^４１（Ｐｂｆ）－Ｃｙｓ^４２（Ｔｒｔ）－Ｇｌｎ^４３（Ｔｒｔ）－Ｔｙｒ^４４（ｔＢｕ）－Ａｒｇ^４５（Ｐｂｆ）－Ａｓｐ^４６（ｔＢｕ）－Ｌｅｕ^４７－Ｌｙｓ^４８（Ｂｏｃ）－Ｔｒｐ^４９（Ｂｏｃ）－Ｔｒｐ^５０（Ｂｏｃ）－Ｇｌｕ^５１（ｔＢｕ）－Ｌｅｕ^５２－Ａｒｇ^５３（Ｐｂｆ）－Ｏ－ＰＧ_２ ［配列番号２５］は、ＰＧ_１－Ｔｙｒ^３７（ｔＢｕ）－Ｉｌｅ^３８－Ｇｌｙ^３９－ＯＨ ［配列番号３１］と、Ｈ－Ｇｌｕ（ｔＢｕ）^４０－Ａｒｇ^４１（Ｐｂｆ）－Ｃｙｓ^４２（Ｔｒｔ）－Ｇｌｎ^４３（Ｔｒｔ）－Ｔｙｒ^４４（ｔＢｕ）－Ａｒｇ^４５（Ｐｂｆ）－Ａｓｐ^４６（ｔＢｕ）－Ｌｅｕ^４７－Ｌｙｓ^４８（Ｂｏｃ）－Ｔｒｐ^４９（Ｂｏｃ）－Ｔｒｐ^５０（Ｂｏｃ）－Ｇｌｕ^５１（ｔＢｕ）－Ｌｅｕ^５２－Ａｒｇ^５３（Ｐｂｆ）－Ｏ－ＰＧ_２ ［配列番号２９］との断片縮合により、調製される。好ましくは、前記保護基ＰＧ_１は、その後除去される。

【0091】

一の好ましい実施形態では、前記ペプチド断片ＰＧ_１－Ｖａｌ^１９－Ｃｙｓ^２０（Ｐ）－Ｍｅｔ^２１－Ｔｙｒ^２２（Ｐ）－Ｉｌｅ^２３－Ｇｌｕ^２４（Ｐ）－Ａｌａ^２５－Ｌｅｕ^２６－Ａｓｐ^２７（Ｐ）－Ｌｙｓ^２８（Ｐ）－Ｔｙｒ^２９（Ｐ）－Ａｌａ^３０－Ｃｙｓ^３１（Ｐ）－Ａｓｎ^３２（Ｐ）－Ｃｙｓ^３３（Ｐ）－Ｖａｌ^３４－Ｖａｌ^３５－Ｇｌｙ^３６－ＯＨ ［配列番号２２］又はＰＧ_１－Ｖａｌ^１９－Ｃｙｓ^２０（Ｔｒｔ）－Ｍｅｔ^２１－Ｔｙｒ^２２（ｔＢｕ）－Ｉｌｅ^２３－Ｇｌｕ^２４（ｔＢｕ）－Ａｌａ^２５－Ｌｅｕ^２６－Ａｓｐ^２７（ｔＢｕ）－Ｌｙｓ^２８（Ｂｏｃ）－Ｔｙｒ^２９（ｔＢｕ）－Ａｌａ^３０－Ｃｙｓ^３１（Ｔｒｔ）－Ａｓｎ^３２（Ｔｒｔ）－Ｃｙｓ^３３（Ｔｒｔ）－Ｖａｌ^３４－Ｖａｌ^３５－Ｇｌｙ^３６－ＯＨ ［配列番号２４］は、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ－ＯＨから開始する固相ペプチド合成により、調製される。

【0092】

一の好ましい実施形態では、前記ペプチド断片Ｈ－Ｔｙｒ^３７（Ｐ）－Ｉｌｅ^３８－Ｇｌｙ^３９－Ｇｌｕ^４０（Ｐ）－Ａｒｇ^４１（Ｐ）－Ｃｙｓ^４２（Ｐ）－Ｇｌｎ^４３（Ｐ）－Ｔｙｒ^４４（Ｐ）－Ａｒｇ^４５（Ｐ）－Ａｓｐ^４６（Ｐ）－Ｌｅｕ^４７－Ｌｙｓ^４８（Ｐ）－Ｔｒｐ^４９（Ｐ）－Ｔｒｐ^５０（Ｐ）－Ｇｌｕ^５１（Ｐ）－Ｌｅｕ^５２－Ａｒｇ^５３（Ｐ）－Ｏ－ＰＧ_２ ［配列番号２３］又はＨ－Ｔｙｒ^３７（ｔＢｕ）－Ｉｌｅ^３８－Ｇｌｙ^３９－Ｇｌｕ（ｔＢｕ）^４０－Ａｒｇ^４１（Ｐｂｆ）－Ｃｙｓ^４２（Ｔｒｔ）－Ｇｌｎ^４３（Ｔｒｔ）－Ｔｙｒ^４４（ｔＢｕ）－Ａｒｇ^４５（Ｐｂｆ）－Ａｓｐ^４６（ｔＢｕ）－Ｌｅｕ^４７－Ｌｙｓ^４８（Ｂｏｃ）－Ｔｒｐ^４９（Ｂｏｃ）－Ｔｒｐ^５０（Ｂｏｃ）－Ｇｌｕ^５１（ｔＢｕ）－Ｌｅｕ^５２－Ａｒｇ^５３（Ｐｂｆ）－Ｏ－ＰＧ_２ ［配列番号２５］は、Ｆｍｏｃ－Ａｒｇ（Ｐ）又はＦｍｏｃ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）から開始する固相ペプチド合成により、調製される。

【0093】

一の好ましい実施形態では、前記ペプチド断片ＰＧ_１－Ｖａｌ^１９－Ｃｙｓ^２０（Ｐ）－Ｍｅｔ^２１－Ｔｙｒ^２２（Ｐ）－Ｉｌｅ^２３－Ｇｌｕ^２４（Ｐ）－Ａｌａ^２５－Ｌｅｕ^２６－Ａｓｐ^２７（Ｐ）－Ｌｙｓ^２８（Ｐ）－Ｔｙｒ^２９（Ｐ）－Ａｌａ^３０－Ｃｙｓ^３１（Ｐ）－Ａｓｎ^３２（Ｐ）－Ｃｙｓ^３３（Ｐ）－Ｖａｌ^３４－Ｖａｌ^３５－Ｇｌｙ^３６－Ｔｙｒ^３７（Ｐ）－Ｉｌｅ^３８－Ｇｌｙ^３９－ＯＨ ［配列番号２６］又はＰＧ_１－Ｖａｌ^１９－Ｃｙｓ^２０（Ｔｒｔ）－Ｍｅｔ^２１－Ｔｙｒ^２２（ｔＢｕ）－Ｉｌｅ^２３－Ｇｌｕ^２４（ｔＢｕ）－Ａｌａ^２５－Ｌｅｕ^２６－Ａｓｐ^２７（ｔＢｕ）－Ｌｙｓ^２８（Ｂｏｃ）－Ｔｙｒ^２９（ｔＢｕ）－Ａｌａ^３０－Ｃｙｓ^３１（Ｔｒｔ）－Ａｓｎ^３２（Ｔｒｔ）－Ｃｙｓ^３３（Ｔｒｔ）－Ｖａｌ^３４－Ｖａｌ^３５－Ｇｌｙ^３６－Ｔｙｒ^３７（ｔＢｕ）－Ｉｌｅ^３８－Ｇｌｙ^３９ _－－ＯＨ ［配列番号２８］は、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ－ＯＨから開始する固相ペプチド合成により、調製される。

【0094】

一の好ましい実施形態では、前記ペプチド断片Ｈ－Ｇｌｕ^４０（Ｐ）－Ａｒｇ^４１（Ｐ）－Ｃｙｓ^４２（Ｐ）－Ｇｌｎ^４３（Ｐ）－Ｔｙｒ^４４（Ｐ）－Ａｒｇ^４５（Ｐ）－Ａｓｐ^４６（Ｐ）－Ｌｅｕ^４７－Ｌｙｓ^４８（Ｐ）－Ｔｒｐ^４９（Ｐ）－Ｔｒｐ^５０（Ｐ）－Ｇｌｕ^５１（Ｐ）－Ｌｅｕ^５２－Ａｒｇ^５３（Ｐ）－Ｏ－ＰＧ_２ ［配列番号２７］又はＨ－Ｇｌｕ（ｔＢｕ）^４０－Ａｒｇ^４１（Ｐｂｆ）－Ｃｙｓ^４２（Ｔｒｔ）－Ｇｌｎ^４３（Ｔｒｔ）－Ｔｙｒ^４４（ｔＢｕ）－Ａｒｇ^４５（Ｐｂｆ）－Ａｓｐ^４６（ｔＢｕ）－Ｌｅｕ^４７－Ｌｙｓ^４８（Ｂｏｃ）－Ｔｒｐ^４９（Ｂｏｃ）－Ｔｒｐ^５０（Ｂｏｃ）－Ｇｌｕ^５１（ｔＢｕ）－Ｌｅｕ^５２－Ａｒｇ^５３（Ｐｂｆ）－Ｏ－ＰＧ_２ ［配列番号２９］は、Ｆｍｏｃ－Ａｒｇ（Ｐ）又はＦｍｏｃ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）を使用する固相ペプチド合成により、調製される。

【0095】

一の好ましい実施形態では、前記ＥＧＦ様ペプチドは以下の配列：
Ｈ－Ａｓｎ^１－Ｓｅｒ^２－Ａｓｐ^３－Ｓｅｒ^４－Ｇｌｕ^５－Ｃｙｓ^６－Ｐｒｏ^７－Ｌｅｕ^８－Ｓｅｒ^９－Ｈｉｓ^１０－Ａｓｐ^１１－Ｇｌｙ^１２－Ｔｙｒ^１３－Ｃｙｓ^１４－Ｌｅｕ^１５－Ｈｉｓ^１６－Ａｓｐ^１７－Ｇｌｙ^１８－Ｖａｌ^１９－Ｃｙｓ^２０－Ｍｅｔ^２１－Ｔｙｒ^２２－Ｉｌｅ^２３－Ｇｌｕ^２４－Ａｌａ^２５－Ｌｅｕ^２６－Ａｓｐ^２７－Ｌｙｓ^２８－Ｔｙｒ^２９－Ａｌａ^３０－Ｃｙｓ^３１－Ａｓｎ^３２－Ｃｙｓ^３３－Ｖａｌ^３４－Ｖａｌ^３５－Ｇｌｙ^３６－Ｔｙｒ^３７－Ｉｌｅ^３８－Ｇｌｙ^３９－Ｇｌｕ^４０－Ａｒｇ^４１－Ｃｙｓ^４２－Ｇｌｎ^４３－Ｔｙｒ^４４－Ａｒｇ^４５－Ａｓｐ^４６－Ｌｅｕ^４７－Ｌｙｓ^４８－Ｔｒｐ^４９－Ｔｒｐ^５０－Ｇｌｕ^５１－Ｌｅｕ^５２－Ａｒｇ^５３－ＯＨ ［配列番号１］
又はそのバリアントを有し（またはより好ましくは、からなる）、
そして、前記方法は、以下のステップを含んでいる：
以下の配列を有する（またはより好ましくは、からなる）第１のペプチド断片：
ＰＧ_１－Ａｓｎ^１－Ｓｅｒ^２－Ａｓｐ^３－Ｓｅｒ^４－Ｇｌｕ^５－Ｃｙｓ^６－Ｐｒｏ^７－Ｌｅｕ^８－ΨＳｅｒ^９－Ｈｉｓ^１０－Ａｓｐ^１１－Ｇｌｙ^１２－ＯＨ ［配列番号４］
又はそのバリアントであって、
ＰＧ_１が、Ｂｏｃ及びＦｍｏｃから選択されるＮ末端保護基であって；そして、前記Ｃ末端アミノ酸が、任意に、活性化されたカルボン酸誘導体の形態であって；
以下の配列を有する（またはより好ましくは、からなる）第２のペプチド断片：
Ｈ－Ｔｙｒ^１３－Ｃｙｓ^１４－Ｌｅｕ^１５－Ｈｉｓ^１６－Ａｓｐ^１７－Ｇｌｙ^１８－Ｖａｌ^１９－Ｃｙｓ^２０－Ｍｅｔ^２１－Ｔｙｒ^２２－Ｉｌｅ^２３－Ｇｌｕ^２４－Ａｌａ^２５－Ｌｅｕ^２６－Ａｓｐ^２７－Ｌｙｓ^２８－Ｔｙｒ^２９－Ａｌａ^３０－Ｃｙｓ^３１－Ａｓｎ^３２－Ｃｙｓ^３３－Ｖａｌ^３４－Ｖａｌ^３５－Ｇｌｙ^３６－Ｔｙｒ^３７－Ｉｌｅ^３８－Ｇｌｙ^３９－Ｇｌｕ^４０－Ａｒｇ^４１－Ｃｙｓ^４２－Ｇｌｎ^４３－Ｔｙｒ^４４－Ａｒｇ^４５－Ａｓｐ^４６－Ｌｅｕ^４７－Ｌｙｓ^４８－Ｔｒｐ^４９－Ｔｒｐ^５０－Ｇｌｕ^５１－Ｌｅｕ^５２－Ａｒｇ^５３－Ｏ－ＰＧ_２ ［配列番号５］
又はそのバリアントであって、
ＰＧ_２が、クロロトリチル及びｔ－ブチルから選択される保護基であって；
そして、前記第１の及び第２のペプチド断片における１または複数のアミノ酸残基が、好ましくは、酸開裂性保護基で任意に保護されており、前記第１のペプチド断片と、前記第２のペプチド断片を、溶液中でカップリングする方法を有する。

【0096】

一の好ましい実施形態では、前記ＥＧＦ様ペプチドは以下の配列：
Ｈ－Ａｓｎ^１（Ｐ）－Ｓｅｒ^２（Ｐ）－Ａｓｐ^３（Ｐ）－ ΨＳｅｒ^４－Ｇｌｕ^５（Ｐ）－Ｃｙｓ^６（Ｐ）－Ｐｒｏ^７－Ｌｅｕ^８－ΨＳｅｒ^９－Ｈｉｓ^１０（Ｐ）－Ａｓｐ^１１（Ｐ）－Ｇｌｙ^１２－Ｔｙｒ^１３（Ｐ）－Ｃｙｓ^１４（Ｐ）－Ｌｅｕ^１５－Ｈｉｓ^１６（Ｐ）－Ａｓｐ^１７（Ｐ）－Ｇｌｙ^１８－Ｖａｌ^１９－Ｃｙｓ^２０（Ｐ）－Ｍｅｔ^２１－Ｔｙｒ^２２（Ｐ）－Ｉｌｅ^２３－Ｇｌｕ^２４（Ｐ）－Ａｌａ^２５－Ｌｅｕ^２６－Ａｓｐ^２７（Ｐ）－Ｌｙｓ^２８（Ｐ）－Ｔｙｒ^２９（Ｐ）－Ａｌａ^３０－Ｃｙｓ^３１（Ｐ）－Ａｓｎ^３２（Ｐ）－Ｃｙｓ^３３（Ｐ）－Ｖａｌ^３４－Ｖａｌ^３５－Ｇｌｙ^３６－Ｔｙｒ^３７（Ｐ）－Ｉｌｅ^３８－Ｇｌｙ^３９－Ｇｌｕ^４０（Ｐ）－Ａｒｇ^４１（Ｐ）－Ｃｙｓ^４２（Ｐ）－Ｇｌｎ^４３（Ｐ）－Ｔｙｒ^４４（Ｐ）－Ａｒｇ^４５（Ｐ）－Ａｓｐ^４６（Ｐ）－Ｌｅｕ^４７－Ｌｙｓ^４８（Ｐ）－Ｔｒｐ^４９（Ｐ）－Ｔｒｐ^５０（Ｐ）－Ｇｌｕ^５１（Ｐ）－Ｌｅｕ^５２－Ａｒｇ^５３（Ｐ）－ＯＨ ［配列番号９］
又はそのバリアントを有し（またはより好ましくは、からなる）、
ここで、以下の配列を有する（またはより好ましくは、からなる）第１のペプチド断片：
ＰＧ_１－Ａｓｎ^１（Ｐ）－Ｓｅｒ^２（Ｐ）－Ａｓｐ^３（Ｐ）－ΨＳｅｒ^４－Ｇｌｕ^５（Ｐ）－Ｃｙｓ^６（Ｐ）－Ｐｒｏ^７－Ｌｅｕ^８－ΨＳｅｒ^９－Ｈｉｓ^１０（Ｐ）－Ａｓｐ^１１（Ｐ）－Ｇｌｙ^１２－ＯＨ ［配列番号２０］
またはそのバリアントであって；
そして、以下の配列を有する（またはより好ましくは、からなる）第２のペプチド断片：
Ｈ－Ｔｙｒ^１３（Ｐ）－Ｃｙｓ^１４（Ｐ）－Ｌｅｕ^１５－Ｈｉｓ^１６（Ｐ）－Ａｓｐ^１７（Ｐ）－Ｇｌｙ^１８－Ｖａｌ^１９－Ｃｙｓ^２０（Ｐ）－Ｍｅｔ^２１－Ｔｙｒ^２２（Ｐ）－Ｉｌｅ^２３－Ｇｌｕ^２４（Ｐ）－Ａｌａ^２５－Ｌｅｕ^２６－Ａｓｐ^２７（Ｐ）－Ｌｙｓ^２８（Ｐ）－Ｔｙｒ^２９（Ｐ）－Ａｌａ^３０－Ｃｙｓ^３１（Ｐ）－Ａｓｎ^３２（Ｐ）－Ｃｙｓ^３３（Ｐ）－Ｖａｌ^３４－Ｖａｌ^３５－Ｇｌｙ^３６－Ｔｙｒ^３７（Ｐ）－Ｉｌｅ^３８－Ｇｌｙ^３９－Ｇｌｕ^４０（Ｐ）－Ａｒｇ^４１（Ｐ）－Ｃｙｓ^４２（Ｐ）－Ｇｌｎ^４３（Ｐ）－Ｔｙｒ^４４（Ｐ）－Ａｒｇ^４５（Ｐ）－Ａｓｐ^４６（Ｐ）－Ｌｅｕ^４７－Ｌｙｓ^４８（Ｐ）－Ｔｒｐ^４９（Ｐ）－Ｔｒｐ^５０（Ｐ）－Ｇｌｕ^５１（Ｐ）－Ｌｅｕ^５２－Ａｒｇ^５３（Ｐ）－Ｏ－ＰＧ_２ ［配列番号３２］
またはそのバリアントであって；
それぞれのＰが、同じ又は異なっていてもよい側鎖保護基を表している。

【0097】

一の好ましい実施形態では、前記ＥＧＦ様ペプチドは以下の配列：
Ｈ－Ａｓｎ^１（Ｔｒｔ）－Ｓｅｒ^２（ｔＢｕ）－Ａｓｐ^３（ｔＢｕ）－ΨＳｅｒ^４－Ｇｌｕ^５（ｔＢｕ）－Ｃｙｓ^６（Ｔｒｔ）－Ｐｒｏ^７－Ｌｅｕ^８－ΨＳｅｒ^９－Ｈｉｓ^１０（Ｔｒｔ）－Ａｓｐ^１１（ｔＢｕ）－Ｇｌｙ^１２－Ｔｙｒ^１３（ｔＢｕ）－Ｃｙｓ^１４（Ｔｒｔ）－Ｌｅｕ^１５－Ｈｉｓ^１６（Ｔｒｔ）－Ａｓｐ^１７（ｔＢｕ）－Ｇｌｙ^１８－Ｖａｌ^１９－Ｃｙｓ^２０（Ｔｒｔ）－Ｍｅｔ^２１－Ｔｙｒ^２２（ｔＢｕ）－Ｉｌｅ^２３－Ｇｌｕ^２４（ｔＢｕ）－Ａｌａ^２５－Ｌｅｕ^２６－Ａｓｐ^２７（ｔＢｕ）－Ｌｙｓ^２８（Ｂｏｃ）－Ｔｙｒ^２９（ｔＢｕ）－Ａｌａ^３０－Ｃｙｓ^３１（Ｔｒｔ）－Ａｓｎ^３２（Ｔｒｔ）－Ｃｙｓ^３３（Ｔｒｔ）－Ｖａｌ^３４－Ｖａｌ^３５－Ｇｌｙ^３６－Ｔｙｒ^３７（ｔＢｕ）－Ｉｌｅ^３８－Ｇｌｙ^３９－Ｇｌｕ（ｔＢｕ）^４０－Ａｒｇ^４１（Ｐｂｆ）－Ｃｙｓ^４２（Ｔｒｔ）－Ｇｌｎ^４３（Ｔｒｔ）－Ｔｙｒ^４４（ｔＢｕ）－Ａｒｇ^４５（Ｐｂｆ）－Ａｓｐ^４６（ｔＢｕ）－Ｌｅｕ^４７－Ｌｙｓ^４８（Ｂｏｃ）－Ｔｒｐ^４９（Ｂｏｃ）－Ｔｒｐ^５０（Ｂｏｃ）－Ｇｌｕ^５１（ｔＢｕ）－Ｌｅｕ^５２－Ａｒｇ^５３（Ｐｂｆ）－ＯＨ ［配列番号１２］
又はそのバリアントを有し（またはより好ましくは、からなる）、
そして、ここで、以下の配列を有する（またはより好ましくは、からなる）第１のペプチド断片：
ＰＧ_１－Ａｓｎ^１（Ｔｒｔ）－Ｓｅｒ^２（ｔＢｕ）－Ａｓｐ^３（ｔＢｕ）－ΨＳｅｒ^４－Ｇｌｕ^５（ｔＢｕ）－Ｃｙｓ^６（Ｔｒｔ）－Ｐｒｏ^７－Ｌｅｕ^８－ΨＳｅｒ^９－Ｈｉｓ^１０（Ｔｒｔ）－Ａｓｐ^１１（ｔＢｕ）－Ｇｌｙ^１２－ＯＨ ［配列番号１８］
またはそのバリアントであって、
そして、以下の配列を有する（またはより好ましくは、からなる）第２のペプチド断片：
Ｈ－Ｔｙｒ^１３（ｔＢｕ）－Ｃｙｓ^１４（Ｔｒｔ）－Ｌｅｕ^１５－Ｈｉｓ^１６（Ｔｒｔ）－Ａｓｐ^１７（ｔＢｕ）－Ｇｌｙ^１８－Ｖａｌ^１９－Ｃｙｓ^２０（Ｔｒｔ）－Ｍｅｔ^２１－Ｔｙｒ^２２（ｔＢｕ）－Ｉｌｅ^２３－Ｇｌｕ^２４（ｔＢｕ）－Ａｌａ^２５－Ｌｅｕ^２６－Ａｓｐ^２７（ｔＢｕ）－Ｌｙｓ^２８（Ｂｏｃ）－Ｔｙｒ^２９（ｔＢｕ）－Ａｌａ^３０－Ｃｙｓ^３１（Ｔｒｔ）－Ａｓｎ^３２（Ｔｒｔ）－Ｃｙｓ^３３（Ｔｒｔ）－Ｖａｌ^３４－Ｖａｌ^３５－Ｇｌｙ^３６－Ｔｙｒ^３７（ｔＢｕ）－Ｉｌｅ^３８－Ｇｌｙ^３９－Ｇｌｕ（ｔＢｕ）^４０－Ａｒｇ^４１（Ｐｂｆ）－Ｃｙｓ^４２（Ｔｒｔ）－Ｇｌｎ^４３（Ｔｒｔ）－Ｔｙｒ^４４（ｔＢｕ）－Ａｒｇ^４５（Ｐｂｆ）－Ａｓｐ^４６（ｔＢｕ）－Ｌｅｕ^４７－Ｌｙｓ^４８（Ｂｏｃ）－Ｔｒｐ^４９（Ｂｏｃ）－Ｔｒｐ^５０（Ｂｏｃ）－Ｇｌｕ^５１（ｔＢｕ）－Ｌｅｕ^５２－Ａｒｇ^５３（Ｐｂｆ）－Ｏ－ＰＧ_２ ［配列番号３３］
またはそのバリアントである。

【0098】

一の好ましい実施形態では、前記第１のペプチド断片ＰＧ_１－Ａｓｎ^１（Ｐ）－Ｓｅｒ^２（Ｐ）－Ａｓｐ^３（Ｐ）－ ΨＳｅｒ^４－Ｇｌｕ^５（Ｐ）－Ｃｙｓ^６（Ｐ）－Ｐｒｏ^７－Ｌｅｕ^８－ΨＳｅｒ^９－Ｈｉｓ^１０（Ｐ）－Ａｓｐ^１１（Ｐ）－Ｇｌｙ^１２－ＯＨ ［配列番号３４］又はＰＧ_１－Ａｓｎ^１（Ｔｒｔ）－Ｓｅｒ^２（ｔＢｕ）－Ａｓｐ^３（ｔＢｕ）－ΨＳｅｒ^４－Ｇｌｕ^５（ｔＢｕ）－Ｃｙｓ^６（Ｔｒｔ）－Ｐｒｏ^７－Ｌｅｕ^８－ΨＳｅｒ^９－Ｈｉｓ^１０（Ｔｒｔ）－Ａｓｐ^１１（ｔＢｕ）－Ｇｌｙ^１２－ＯＨ ［配列番号１８］は、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ－ＯＨから開始する固相ペプチド合成により、調製される。

【0099】

一の好ましい実施形態では、前記第２のペプチド断片Ｈ－Ｔｙｒ^１３（Ｐ）－Ｃｙｓ^１４（Ｐ）－Ｌｅｕ^１５－Ｈｉｓ^１６（Ｐ）－Ａｓｐ^１７（Ｐ）－Ｇｌｙ^１８－Ｖａｌ^１９－Ｃｙｓ^２０（Ｐ）－Ｍｅｔ^２１－Ｔｙｒ^２２（Ｐ）－Ｉｌｅ^２３－Ｇｌｕ^２４（Ｐ）－Ａｌａ^２５－Ｌｅｕ^２６－Ａｓｐ^２７（Ｐ）－Ｌｙｓ^２８（Ｐ）－Ｔｙｒ^２９（Ｐ）－Ａｌａ^３０－Ｃｙｓ^３１（Ｐ）－Ａｓｎ^３２（Ｐ）－Ｃｙｓ^３３（Ｐ）－Ｖａｌ^３４－Ｖａｌ^３５－Ｇｌｙ^３６－Ｔｙｒ^３７（Ｐ）－Ｉｌｅ^３８－Ｇｌｙ^３９－Ｇｌｕ^４０（Ｐ）－Ａｒｇ^４１（Ｐ）－Ｃｙｓ^４２（Ｐ）－Ｇｌｎ^４３（Ｐ）－Ｔｙｒ^４４（Ｐ）－Ａｒｇ^４５（Ｐ）－Ａｓｐ^４６（Ｐ）－Ｌｅｕ^４７－Ｌｙｓ^４８（Ｐ）－Ｔｒｐ^４９（Ｐ）－Ｔｒｐ^５０（Ｐ）－Ｇｌｕ^５１（Ｐ）－Ｌｅｕ^５２－Ａｒｇ^５３（Ｐ）－Ｏ－ＰＧ_２ ［配列番号３２］又はＨ－Ｔｙｒ^１３（ｔＢｕ）－Ｃｙｓ^１４（Ｔｒｔ）－Ｌｅｕ^１５－Ｈｉｓ^１６（Ｔｒｔ）－Ａｓｐ^１７（ｔＢｕ）－Ｇｌｙ^１８－Ｖａｌ^１９－Ｃｙｓ^２０（Ｔｒｔ）－Ｍｅｔ^２１－Ｔｙｒ^２２（ｔＢｕ）－Ｉｌｅ^２３－Ｇｌｕ^２４（ｔＢｕ）－Ａｌａ^２５－Ｌｅｕ^２６－Ａｓｐ^２７（ｔＢｕ）－Ｌｙｓ^２８（Ｂｏｃ）－Ｔｙｒ^２９（ｔＢｕ）－Ａｌａ^３０－Ｃｙｓ^３１（Ｔｒｔ）－Ａｓｎ^３２（Ｔｒｔ）－Ｃｙｓ^３３（Ｔｒｔ）－Ｖａｌ^３４－Ｖａｌ^３５－Ｇｌｙ^３６－Ｔｙｒ^３７（ｔＢｕ）－Ｉｌｅ^３８－Ｇｌｙ^３９－Ｇｌｕ（ｔＢｕ）^４０－Ａｒｇ^４１（Ｐｂｆ）－Ｃｙｓ^４２（Ｔｒｔ）－Ｇｌｎ^４３（Ｔｒｔ）－Ｔｙｒ^４４（ｔＢｕ）－Ａｒｇ^４５（Ｐｂｆ）－Ａｓｐ^４６（ｔＢｕ）－Ｌｅｕ^４７－Ｌｙｓ^４８（Ｂｏｃ）－Ｔｒｐ^４９（Ｂｏｃ）－Ｔｒｐ^５０（Ｂｏｃ）－Ｇｌｕ^５１（ｔＢｕ）－Ｌｅｕ^５２－Ａｒｇ^５３（Ｐｂｆ）－Ｏ－ＰＧ_２ ［配列番号３３］は、Ｆｍｏｃ－Ａｒｇ（Ｐ）又はＦｍｏｃ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）から開始する固相ペプチド合成により、調製される。

【0100】

一の好ましい実施形態では、前記第２のペプチド断片Ｈ－Ｔｙｒ^１３（Ｐ）－Ｃｙｓ^１４（Ｐ）－Ｌｅｕ^１５－Ｈｉｓ^１６（Ｐ）－Ａｓｐ^１７（Ｐ）－Ｇｌｙ^１８－Ｖａｌ^１９－Ｃｙｓ^２０（Ｐ）－Ｍｅｔ^２１－Ｔｙｒ^２２（Ｐ）－Ｉｌｅ^２３－Ｇｌｕ^２４（Ｐ）－Ａｌａ^２５－Ｌｅｕ^２６－Ａｓｐ^２７（Ｐ）－Ｌｙｓ^２８（Ｐ）－Ｔｙｒ^２９（Ｐ）－Ａｌａ^３０－Ｃｙｓ^３１（Ｐ）－Ａｓｎ^３２（Ｐ）－Ｃｙｓ^３３（Ｐ）－Ｖａｌ^３４－Ｖａｌ^３５－Ｇｌｙ^３６－Ｔｙｒ^３７（Ｐ）－Ｉｌｅ^３８－Ｇｌｙ^３９－Ｇｌｕ^４０（Ｐ）－Ａｒｇ^４１（Ｐ）－Ｃｙｓ^４２（Ｐ）－Ｇｌｎ^４３（Ｐ）－Ｔｙｒ^４４（Ｐ）－Ａｒｇ^４５（Ｐ）－Ａｓｐ^４６（Ｐ）－Ｌｅｕ^４７－Ｌｙｓ^４８（Ｐ）－Ｔｒｐ^４９（Ｐ）－Ｔｒｐ^５０（Ｐ）－Ｇｌｕ^５１（Ｐ）－Ｌｅｕ^５２－Ａｒｇ^５３（Ｐ）－Ｏ－ＰＧ_２ ［配列番号３２］は、ＰＧ_１－Ｔｙｒ^１３（Ｐ）－Ｃｙｓ^１４（Ｐ）－Ｌｅｕ^１５－Ｈｉｓ^１６（Ｐ）－Ａｓｐ^１７（Ｐ）－Ｇｌｙ^１８－Ｖａｌ^１９－Ｃｙｓ^２０（Ｐ）－Ｍｅｔ^２１－Ｔｙｒ^２２（Ｐ）－Ｉｌｅ^２３－Ｇｌｕ^２４（Ｐ）－Ａｌａ^２５－Ｌｅｕ^２６－Ａｓｐ^２７（Ｐ）－Ｌｙｓ^２８（Ｐ）－Ｔｙｒ^２９（Ｐ）－Ａｌａ^３０－Ｃｙｓ^３１（Ｐ）－Ａｓｎ^３２（Ｐ）－Ｃｙｓ^３３（Ｐ）－Ｖａｌ^３４－Ｖａｌ^３５－Ｇｌｙ^３６－ＯＨ ［配列番号３５］と、Ｈ－Ｔｙｒ^３７（Ｐ）－Ｉｌｅ^３８－Ｇｌｙ^３９－Ｇｌｕ^４０（Ｐ）－Ａｒｇ^４１（Ｐ）－Ｃｙｓ^４２（Ｐ）－Ｇｌｎ^４３（Ｐ）－Ｔｙｒ^４４（Ｐ）－Ａｒｇ^４５（Ｐ）－Ａｓｐ^４６（Ｐ）－Ｌｅｕ^４７－Ｌｙｓ^４８（Ｐ）－Ｔｒｐ^４９（Ｐ）－Ｔｒｐ^５０（Ｐ）－Ｇｌｕ^５１（Ｐ）－Ｌｅｕ^５２－Ａｒｇ^５３（Ｐ）－Ｏ－ＰＧ_２ ［配列番号２３］との断片縮合により、調製される。好ましくは、前記保護基ＰＧ_１は、その後除去される。

【0101】

一の好ましい実施形態では、前記第２のペプチド断片Ｈ－Ｔｙｒ^１３（ｔＢｕ）－Ｃｙｓ^１４（Ｔｒｔ）－Ｌｅｕ^１５－Ｈｉｓ^１６（Ｔｒｔ）－Ａｓｐ^１７（ｔＢｕ）－Ｇｌｙ^１８－Ｖａｌ^１９－Ｃｙｓ^２０（Ｔｒｔ）－Ｍｅｔ^２１－Ｔｙｒ^２２（ｔＢｕ）－Ｉｌｅ^２３－Ｇｌｕ^２４（ｔＢｕ）－Ａｌａ^２５－Ｌｅｕ^２６－Ａｓｐ^２７（ｔＢｕ）－Ｌｙｓ^２８（Ｂｏｃ）－Ｔｙｒ^２９（ｔＢｕ）－Ａｌａ^３０－Ｃｙｓ^３１（Ｔｒｔ）－Ａｓｎ^３２（Ｔｒｔ）－Ｃｙｓ^３３（Ｔｒｔ）－Ｖａｌ^３４－Ｖａｌ^３５－Ｇｌｙ^３６－Ｔｙｒ^３７（ｔＢｕ）－Ｉｌｅ^３８－Ｇｌｙ^３９－Ｇｌｕ（ｔＢｕ）^４０－Ａｒｇ^４１（Ｐｂｆ）－Ｃｙｓ^４２（Ｔｒｔ）－Ｇｌｎ^４３（Ｔｒｔ）－Ｔｙｒ^４４（ｔＢｕ）－Ａｒｇ^４５（Ｐｂｆ）－Ａｓｐ^４６（ｔＢｕ）－Ｌｅｕ^４７－Ｌｙｓ^４８（Ｂｏｃ）－Ｔｒｐ^４９（Ｂｏｃ）－Ｔｒｐ^５０（Ｂｏｃ）－Ｇｌｕ^５１（ｔＢｕ）－Ｌｅｕ^５２－Ａｒｇ^５３（Ｐｂｆ）－Ｏ－ＰＧ_２ ［配列番号３３］は、ＰＧ_１－Ｔｙｒ^１３（ｔＢｕ）－Ｃｙｓ^１４（Ｔｒｔ）－Ｌｅｕ^１５－Ｈｉｓ^１６（Ｔｒｔ）－Ａｓｐ^１７（ｔＢｕ）－Ｇｌｙ^１８－Ｖａｌ^１９－Ｃｙｓ^２０（Ｔｒｔ）－Ｍｅｔ^２１－Ｔｙｒ^２２（ｔＢｕ）－Ｉｌｅ^２３－Ｇｌｕ^２４（ｔＢｕ）－Ａｌａ^２５－Ｌｅｕ^２６－Ａｓｐ^２７（ｔＢｕ）－Ｌｙｓ^２８（Ｂｏｃ）－Ｔｙｒ^２９（ｔＢｕ）－Ａｌａ^３０－Ｃｙｓ^３１（Ｔｒｔ）－Ａｓｎ^３２（Ｔｒｔ）－Ｃｙｓ^３３（Ｔｒｔ）－Ｖａｌ^３４－Ｖａｌ^３５－Ｇｌｙ^３６－ＯＨ ［配列番号３６］と、Ｈ－Ｔｙｒ^３７（ｔＢｕ）－Ｉｌｅ^３８－Ｇｌｙ^３９－Ｇｌｕ（ｔＢｕ）^４０－Ａｒｇ^４１（Ｐｂｆ）－Ｃｙｓ^４２（Ｔｒｔ）－Ｇｌｎ^４３（Ｔｒｔ）－Ｔｙｒ^４４（ｔＢｕ）－Ａｒｇ^４５（Ｐｂｆ）－Ａｓｐ^４６（ｔＢｕ）－Ｌｅｕ^４７－Ｌｙｓ^４８（Ｂｏｃ）－Ｔｒｐ^４９（Ｂｏｃ）－Ｔｒｐ^５０（Ｂｏｃ）－Ｇｌｕ^５１（ｔＢｕ）－Ｌｅｕ^５２－Ａｒｇ^５３（Ｐｂｆ）－Ｏ－ＰＧ_２ ［配列番号２５］との断片縮合により、調製される。好ましくは、前記保護基ＰＧ_１は、その後除去される。

【0102】

一の好ましい実施形態では、前記ペプチド断片ＰＧ_１－Ｔｙｒ^１３（Ｐ）－Ｃｙｓ^１４（Ｐ）－Ｌｅｕ^１５－Ｈｉｓ^１６（Ｐ）－Ａｓｐ^１７（Ｐ）－Ｇｌｙ^１８－Ｖａｌ^１９－Ｃｙｓ^２０（Ｐ）－Ｍｅｔ^２１－Ｔｙｒ^２２（Ｐ）－Ｉｌｅ^２３－Ｇｌｕ^２４（Ｐ）－Ａｌａ^２５－Ｌｅｕ^２６－Ａｓｐ^２７（Ｐ）－Ｌｙｓ^２８（Ｐ）－Ｔｙｒ^２９（Ｐ）－Ａｌａ^３０－Ｃｙｓ^３１（Ｐ）－Ａｓｎ^３２（Ｐ）－Ｃｙｓ^３３（Ｐ）－Ｖａｌ^３４－Ｖａｌ^３５－Ｇｌｙ^３６－ＯＨ ［配列番号３５］又はＰＧ_１－Ｔｙｒ^１３（ｔＢｕ）－Ｃｙｓ^１４（Ｔｒｔ）－Ｌｅｕ^１５－Ｈｉｓ^１６（Ｔｒｔ）－Ａｓｐ^１７（ｔＢｕ）－Ｇｌｙ^１８－Ｖａｌ^１９－Ｃｙｓ^２０（Ｔｒｔ）－Ｍｅｔ^２１－Ｔｙｒ^２２（ｔＢｕ）－Ｉｌｅ^２３－Ｇｌｕ^２４（ｔＢｕ）－Ａｌａ^２５－Ｌｅｕ^２６－Ａｓｐ^２７（ｔＢｕ）－Ｌｙｓ^２８（Ｂｏｃ）－Ｔｙｒ^２９（ｔＢｕ）－Ａｌａ^３０－Ｃｙｓ^３１（Ｔｒｔ）－Ａｓｎ^３２（Ｔｒｔ）－Ｃｙｓ^３３（Ｔｒｔ）－Ｖａｌ^３４－Ｖａｌ^３５－Ｇｌｙ^３６－ＯＨ ［配列番号３６］は、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ－ＯＨから開始する固相ペプチド合成により、調製される。

【0103】

一の好ましい実施形態では、前記ペプチド断片Ｈ－Ｔｙｒ^３７（Ｐ）－Ｉｌｅ^３８－Ｇｌｙ^３９－Ｇｌｕ^４０（Ｐ）－Ａｒｇ^４１（Ｐ）－Ｃｙｓ^４２（Ｐ）－Ｇｌｎ^４３（Ｐ）－Ｔｙｒ^４４（Ｐ）－Ａｒｇ^４５（Ｐ）－Ａｓｐ^４６（Ｐ）－Ｌｅｕ^４７－Ｌｙｓ^４８（Ｐ）－Ｔｒｐ^４９（Ｐ）－Ｔｒｐ^５０（Ｐ）－Ｇｌｕ^５１（Ｐ）－Ｌｅｕ^５２－Ａｒｇ^５３（Ｐ）－Ｏ－ＰＧ_２ ［配列番号２３］又はＨ－Ｔｙｒ^３７（ｔＢｕ）－Ｉｌｅ^３８－Ｇｌｙ^３９－Ｇｌｕ（ｔＢｕ）^４０－Ａｒｇ^４１（Ｐｂｆ）－Ｃｙｓ^４２（Ｔｒｔ）－Ｇｌｎ^４３（Ｔｒｔ）－Ｔｙｒ^４４（ｔＢｕ）－Ａｒｇ^４５（Ｐｂｆ）－Ａｓｐ^４６（ｔＢｕ）－Ｌｅｕ^４７－Ｌｙｓ^４８（Ｂｏｃ）－Ｔｒｐ^４９（Ｂｏｃ）－Ｔｒｐ^５０（Ｂｏｃ）－Ｇｌｕ^５１（ｔＢｕ）－Ｌｅｕ^５２－Ａｒｇ^５３（Ｐｂｆ）－Ｏ－ＰＧ_２ ［配列番号２５］は、Ｆｍｏｃ－Ａｒｇ（Ｐ）又はＦｍｏｃ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）から開始する固相ペプチド合成により、調製される。

【0104】

一の好ましい実施形態では、本発明は、ＥＧＦ（１－５３）を調製する方法に関し、前記方法は、
以下のステップを含んでいる：
(a) Ｆｍｏｃ－ＥＧＦ（１９－３６）－ＯＨ断片と、Ｈ－ＥＧＦ（３７－５３）－ＯＣｌｔ断片とをカップリングし、Ｆｍｏｃ－ＥＧＦ（１９－５３）－ＯＣｌｔを形成し；
(b) Ｆｍｏｃ－ＥＧＦ（１９－５３）－ＯＣｌｔ断片からＦｍｏｃ基を除去し、Ｈ－ＥＧＦ（１９－５３）－ＯＣｌｔを形成し；
(c) 前記Ｈ－ＥＧＦ（１９－５３）－ＯＣｌｔ断片と、Ｂｏｃ－ＥＧＦ（１－１８）－ＯＨ断片とをカップリングし、保護された直鎖上ペプチドＢｏｃ－ＥＧＦ（１－５３）－ＯＣｌｔを形成し；
(d) 前記保護された直鎖上ペプチドＢｏｃ－ＥＧＦ（１－５３）－ＯＣｌｔを、ＴＦＡ／ジクロロメタン中でヨウ素溶液処理をし；
(e) ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ／ＤＴＴで処理し、ステップ（ｄ）の生成物を全体的に脱保護し、未精製の直鎖ペプチドＥＧＦ（１－５３）を形成し；
(f) ステップ（ｅ）の生成物をＤＭＳＯ及びＴｒｉｓと塩酸グアニジンを含む水溶液で処理し、
(g) 任意に、ＨＰＬＣで、ステップ（ｆ）の生成物を精製する。
好ましくは、ステップ（ａ）のＦｍｏｃ－ＥＧＦ（１９－３６）－ＯＨ断片は、例えば、ＨＯＢｔ．Ｈ_２Ｏで処理することで、活性化される。

【0105】

トランスフォーミング増殖因子－α （ＴＧＦ－α）を調製する方法
一の好ましい実施形態では、前記ＥＧＦ様ペプチドは、トランスフォーミング増殖因子－α（ＴＧＦ－α）、又はそのアナログ又はそのバリアントである。

【0106】

一の好ましい実施形態では、前記ＥＧＦ様ペプチドは、ヒトトランスフォーミング増殖因子－α（ｈＴＧＦ－α）、又はそのアナログ又はそのバリアントである。

【0107】

一の好ましい実施形態では、前記ＥＧＦ様ペプチドは以下の配列：
Ｈ－Ｖａｌ^１－Ｖａｌ^２－Ｓｅｒ^３－Ｈｉｓ^４－Ｐｈｅ^５－Ａｓｎ^６－Ａｓｐ^７－Ｃｙｓ^８－Ｐｒｏ^９－Ａｓｐ^１０－Ｓｅｒ^１１－Ｈｉｓ^１２－Ｔｈｒ^１３－Ｇｌｎ^１４－Ｐｈｅ^１５－Ｃｙｓ^１６－Ｐｈｅ^１７－Ｈｉｓ^１８－Ｇｌｙ^１９－Ｔｈｒ^２０－Ｃｙｓ^２１－Ａｒｇ^２２－Ｐｈｅ^２３－Ｌｅｕ^２４－Ｖａｌ^２５－Ｇｌｎ^２６－Ｇｌｕ^２７－Ａｓｐ^２８－Ｌｙｓ^２９－Ｐｒｏ^３０－Ａｌａ^３１－Ｃｙｓ^３２－Ｖａｌ^３３－Ｃｙｓ^３４－Ｈｉｓ^３５－Ｓｅｒ^３６－Ｇｌｙ^３７－Ｔｙｒ^３８－Ｖａｌ^３９－Ｇｌｙ^４０－Ａｌａ^４１－Ａｒｇ^４２－Ｃｙｓ^４３－Ｇｌｕ^４４－Ｈｉｓ^４５－Ａｌａ^４６－Ａｓｐ^４７－Ｌｅｕ^４８－Ｌｅｕ^４９－Ａｌａ^５０－ＯＨ ［配列番号６］
又はそのバリアントを有し（またはより好ましくは、からなる）、
そして、前記方法は、以下のステップを含んでいる：
以下の配列を有する（またはより好ましくは、からなる）第１のペプチド断片：
ＰＧ_１－Ｖａｌ^１－Ｖａｌ^２－Ｓｅｒ^３－Ｈｉｓ^４－Ｐｈｅ^５－Ａｓｎ^６－Ａｓｐ^７－Ｃｙｓ^８－Ｐｒｏ^９－Ａｓｐ^１０－Ｓｅｒ^１１－Ｈｉｓ^１２－Ｔｈｒ^１３－Ｇｌｎ^１４－Ｐｈｅ^１５－Ｃｙｓ^１６－Ｐｈｅ^１７－Ｈｉｓ^１８－Ｇｌｙ^１９－ＯＨ ［配列番号７］
又はそのバリアントであって、
ＰＧ_１が、Ｂｏｃ及びＦｍｏｃから選択されるＮ末端保護基であって；そして、前記Ｃ末端アミノ酸が、任意に、活性化されたカルボン酸誘導体の形態であって；
以下の配列を有する（またはより好ましくは、からなる）第２のペプチド断片：
Ｈ－Ｔｈｒ^２０－Ｃｙｓ^２１－Ａｒｇ^２２－Ｐｈｅ^２３－Ｌｅｕ^２４－Ｖａｌ^２５－Ｇｌｎ^２６－Ｇｌｕ^２７－Ａｓｐ^２８－Ｌｙｓ^２９－Ｐｒｏ^３０－Ａｌａ^３１－Ｃｙｓ^３２－Ｖａｌ^３３－Ｃｙｓ^３４－Ｈｉｓ^３５－Ｓｅｒ^３６－Ｇｌｙ^３７－Ｔｙｒ^３８－Ｖａｌ^３９－Ｇｌｙ^４０－Ａｌａ^４１－Ａｒｇ^４２－Ｃｙｓ^４３－Ｇｌｕ^４４－Ｈｉｓ^４５－Ａｌａ^４６－Ａｓｐ^４７－Ｌｅｕ^４８－Ｌｅｕ^４９－Ａｌａ^５０－Ｏ－ＰＧ_２ ［配列番号８］
又はそのバリアントであって、
ＰＧ_２が、クロロトリチル及びｔ－ブチルから選択される保護基であって；
そして、前記第１の及び第２のペプチド断片における１または複数のアミノ酸残基が、好ましくは、酸開裂性保護基で任意に保護されており、前記第１のペプチド断片と、前記第２のペプチド断片を、溶液中でカップリングする方法を有する。

【0108】

一の好ましい実施形態では、前記ＥＧＦ様ペプチドは以下の配列：
ＰＧ_１－Ｖａｌ^１－Ｖａｌ^２－Ｓｅｒ^３（Ｐ）－Ｈｉｓ^４（Ｐ）－Ｐｈｅ^５－Ａｓｎ^６（Ｐ）－Ａｓｐ^７（Ｐ）－Ｃｙｓ^８（Ｐ）－Ｐｒｏ^９－Ａｓｐ^１０（Ｐ）－ΨＳｅｒ^１１－Ｈｉｓ^１２（Ｐ）－Ｔｈｒ^１３（Ｐ）－Ｇｌｎ^１４（Ｐ）－Ｐｈｅ^１５－Ｃｙｓ^１６（Ｐ）－Ｐｈｅ^１７－Ｈｉｓ^１８（Ｐ）－Ｇｌｙ^１９－Ｔｈｒ^２０（Ｐ）－Ｃｙｓ^２１（Ｐ）－Ａｒｇ^２２（Ｐ）－Ｐｈｅ^２３－Ｌｅｕ^２４－Ｖａｌ^２５－Ｇｌｎ^２６－Ｇｌｕ^２７（Ｐ）－Ａｓｐ^２８（Ｐ）－Ｌｙｓ^２９（Ｐ）－Ｐｒｏ^３０－Ａｌａ^３１－Ｃｙｓ^３２（Ｐ）－Ｖａｌ^３３－Ｃｙｓ^３４（Ｐ）－Ｈｉｓ^３５－Ｓｅｒ^３６（Ｐ）－Ｇｌｙ^３７－Ｔｙｒ^３８（Ｐ）－Ｖａｌ^３９－Ｇｌｙ^４０－Ａｌａ^４１－Ａｒｇ^４２（Ｐ）－Ｃｙｓ^４３（Ｐ）－Ｇｌｕ^４４（Ｐ）－Ｈｉｓ^４５（Ｐ）－Ａｌａ^４６－Ａｓｐ^４７（Ｐ）－ Ｌｅｕ^４８－Ｌｅｕ^４９－Ａｌａ^５０－Ｏ－ＰＧ_２ ［配列番号３７］
又はそのバリアントを有し（またはより好ましくは、からなる）、
ここで、前記第１のペプチド断片は以下の配列：
ＰＧ_１－Ｖａｌ^１－Ｖａｌ^２－Ｓｅｒ^３（Ｐ）－Ｈｉｓ^４（Ｐ）－Ｐｈｅ^５－Ａｓｎ^６（Ｐ）－Ａｓｐ^７（Ｐ）－Ｃｙｓ^８（Ｐ）－Ｐｒｏ^９－Ａｓｐ^１０（Ｐ）－ΨＳｅｒ^１１－Ｈｉｓ^１２（Ｐ）－Ｔｈｒ^１３（Ｐ）－Ｇｌｎ^１４（Ｐ）－Ｐｈｅ^１５－Ｃｙｓ^１６（Ｐ）－Ｐｈｅ^１７－Ｈｉｓ^１８（Ｐ）－Ｇｌｙ^１９－ＯＨ ［配列番号３８］
又はそのバリアントを有し（またはより好ましくは、からなる）、
そして、前記第２のペプチド断片は以下の配列：
Ｈ－Ｔｈｒ^２０（Ｐ）－Ｃｙｓ^２１（Ｐ）－Ａｒｇ^２２（Ｐ）－Ｐｈｅ^２３－Ｌｅｕ^２４－Ｖａｌ^２５－Ｇｌｎ^２６－Ｇｌｕ^２７（Ｐ）－Ａｓｐ^２８（Ｐ）－Ｌｙｓ^２９（Ｐ）－Ｐｒｏ^３０－Ａｌａ^３１－Ｃｙｓ^３２（Ｐ）－Ｖａｌ^３３－Ｃｙｓ^３４（Ｐ）－Ｈｉｓ^３５－Ｓｅｒ^３６（Ｐ）－Ｇｌｙ^３７－Ｔｙｒ^３８（Ｐ）－Ｖａｌ^３９－Ｇｌｙ^４０－Ａｌａ^４１－Ａｒｇ^４２（Ｐ）－Ｃｙｓ^４３（Ｐ）－Ｇｌｕ^４４（Ｐ）－Ｈｉｓ^４５（Ｐ）－Ａｌａ^４６－Ａｓｐ^４７（Ｐ）－Ｌｅｕ^４８－Ｌｅｕ^４９－Ａｌａ^５０－Ｏ－ＰＧ_２ ［配列番号３９］
又はそのバリアントを有し（またはより好ましくは、からなる）、
それぞれのＰが、同じ又は異なっていてもよい側鎖保護基を表している。

【0109】

一の好ましい実施形態では、前記ＥＧＦ様ペプチドは以下の配列：
ＰＧ_１－Ｖａｌ^１－Ｖａｌ^２－Ｓｅｒ^３（ｔＢｕ）－Ｈｉｓ^４（Ｔｒｔ）－Ｐｈｅ^５－Ａｓｎ^６（Ｔｒｔ）－Ａｓｐ^７（ｔＢｕ）－Ｃｙｓ^８（Ｔｒｔ）－Ｐｒｏ^９－Ａｓｐ^１０（ｔＢｕ）－ΨＳｅｒ^１１－Ｈｉｓ^１２（Ｔｒｔ）－Ｔｈｒ^１３（ｔＢｕ）－Ｇｌｎ^１４（Ｔｒｔ）－Ｐｈｅ^１５－Ｃｙｓ^１６（Ｔｒｔ）－Ｐｈｅ^１７－Ｈｉｓ^１８（Ｔｒｔ）－Ｇｌｙ^１９－Ｔｈｒ^２０（ｔＢｕ）－Ｃｙｓ^２１（Ｔｒｔ）－Ａｒｇ^２２（Ｐｂｆ）－Ｐｈｅ^２３－Ｌｅｕ^２４－Ｖａｌ^２５－Ｇｌｎ^２６－Ｇｌｕ^２７（ｔＢｕ）－Ａｓｐ^２８（ｔＢｕ）－Ｌｙｓ^２９（Ｂｏｃ）－Ｐｒｏ^３０－Ａｌａ^３１－Ｃｙｓ^３２（Ｔｒｔ）－Ｖａｌ^３３－Ｃｙｓ^３４（Ｔｒｔ）－Ｈｉｓ^３５－Ｓｅｒ^３６（ｔＢｕ）－Ｇｌｙ^３７－Ｔｙｒ^３８（ｔＢｕ）－Ｖａｌ^３９－Ｇｌｙ^４０－Ａｌａ^４１－Ａｒｇ^４２（Ｐｂｆ）－Ｃｙｓ^４３（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ^４４（ｔＢｕ）－Ｈｉｓ^４５（Ｔｒｔ）－Ａｌａ^４６－Ａｓｐ^４７（ｔＢｕ）－Ｌｅｕ^４８－Ｌｅｕ^４９－Ａｌａ^５０－Ｏ－ＰＧ_２ ［配列番号４０］
又はそのバリアントを有し（またはより好ましくは、からなる）、
ここで、前記第１のペプチド断片は以下の配列：
ＰＧ_１－Ｖａｌ^１－Ｖａｌ^２－Ｓｅｒ^３（ｔＢｕ）－Ｈｉｓ^４（Ｔｒｔ）－Ｐｈｅ^５－Ａｓｎ^６（Ｔｒｔ）－Ａｓｐ^７（ｔＢｕ）－Ｃｙｓ^８（Ｔｒｔ）－Ｐｒｏ^９－Ａｓｐ^１０（ｔＢｕ）－ΨＳｅｒ^１１－Ｈｉｓ^１２（Ｔｒｔ）－Ｔｈｒ^１３（ｔＢｕ）－Ｇｌｎ^１４（Ｔｒｔ）－Ｐｈｅ^１５－Ｃｙｓ^１６（Ｔｒｔ）－Ｐｈｅ^１７－Ｈｉｓ^１８（Ｔｒｔ）－Ｇｌｙ^１９－ＯＨ ［配列番号４１］
又はそのバリアントを有し（またはより好ましくは、からなる）、
そして、前記第２のペプチド断片は以下の配列：
Ｈ－Ｔｈｒ^２０（ｔＢｕ）－Ｃｙｓ^２１（Ｔｒｔ）－Ａｒｇ^２２（Ｐｂｆ）－Ｐｈｅ^２３－Ｌｅｕ^２４－Ｖａｌ^２５－Ｇｌｎ^２６－Ｇｌｕ^２７（ｔＢｕ）－Ａｓｐ^２８（ｔＢｕ）－Ｌｙｓ^２９（Ｂｏｃ）－Ｐｒｏ^３０－Ａｌａ^３１－Ｃｙｓ^３２（Ｔｒｔ）－Ｖａｌ^３３－Ｃｙｓ^３４（Ｔｒｔ）－Ｈｉｓ^３５－Ｓｅｒ^３６（ｔＢｕ）－Ｇｌｙ^３７－Ｔｙｒ^３８（ｔＢｕ）－Ｖａｌ^３９－Ｇｌｙ^４０－Ａｌａ^４１－Ａｒｇ^４２（Ｐｂｆ）－Ｃｙｓ^４３（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ^４４（ｔＢｕ）－Ｈｉｓ^４５（Ｔｒｔ）－Ａｌａ^４６－Ａｓｐ^４７（ｔＢｕ）－Ｌｅｕ^４８－Ｌｅｕ^４９－Ａｌａ^５０－Ｏ－ＰＧ_２ ［配列番号４２］
又はそのバリアントを有する（またはより好ましくは、からなる）。

【0110】

一の好ましい実施形態では、前記第１のペプチド断片ＰＧ_１－Ｖａｌ^１－Ｖａｌ^２－Ｓｅｒ^３（Ｐ）－Ｈｉｓ^４（Ｐ）－Ｐｈｅ^５－Ａｓｎ^６（Ｐ）－Ａｓｐ^７（Ｐ）－Ｃｙｓ^８（Ｐ）－Ｐｒｏ^９－Ａｓｐ^１０（Ｐ）－ΨＳｅｒ^１１－Ｈｉｓ^１２（Ｐ）－Ｔｈｒ^１３（Ｐ）－Ｇｌｎ^１４（Ｐ）－Ｐｈｅ^１５－Ｃｙｓ^１６（Ｐ）－Ｐｈｅ^１７－Ｈｉｓ^１８（Ｐ）－Ｇｌｙ^１９－ＯＨ ［配列番号３８］又はＰＧ_１－Ｖａｌ^１－Ｖａｌ^２－Ｓｅｒ^３（ｔＢｕ）－Ｈｉｓ^４（Ｔｒｔ）－Ｐｈｅ^５－Ａｓｎ^６（Ｔｒｔ）－Ａｓｐ^７（ｔＢｕ）－Ｃｙｓ^８（Ｔｒｔ）－Ｐｒｏ^９－Ａｓｐ^１０（ｔＢｕ）－ΨＳｅｒ^１１－Ｈｉｓ^１２（Ｔｒｔ）－Ｔｈｒ^１３（ｔＢｕ）－Ｇｌｎ^１４（Ｔｒｔ）－Ｐｈｅ^１５－Ｃｙｓ^１６（Ｔｒｔ）－Ｐｈｅ^１７－Ｈｉｓ^１８（Ｔｒｔ）－Ｇｌｙ^１９－ＯＨ ［配列番号４１］は、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ－ＯＨから開始する固相ペプチド合成により、調製される。

【0111】

一の好ましい実施形態では、配列Ｈ－Ｔｈｒ^２０（Ｐ）－Ｃｙｓ^２１（Ｐ）－Ａｒｇ^２２（Ｐ）－Ｐｈｅ^２３－Ｌｅｕ^２４－Ｖａｌ^２５－Ｇｌｎ^２６－Ｇｌｕ^２７（Ｐ）－Ａｓｐ^２８（Ｐ）－Ｌｙｓ^２９（Ｐ）－Ｐｒｏ^３０－Ａｌａ^３１－Ｃｙｓ^３２（Ｐ）－Ｖａｌ^３３－Ｃｙｓ^３４（Ｐ）－Ｈｉｓ^３５－Ｓｅｒ^３６（Ｐ）－Ｇｌｙ^３７－Ｔｙｒ^３８（Ｐ）－Ｖａｌ^３９－Ｇｌｙ^４０－Ａｌａ^４１－Ａｒｇ^４２（Ｐ）－Ｃｙｓ^４３（Ｐ）－Ｇｌｕ^４４（Ｐ）－Ｈｉｓ^４５（Ｐ）－Ａｌａ^４６－Ａｓｐ^４７（Ｐ）－ Ｌｅｕ^４８－Ｌｅｕ^４９－Ａｌａ^５０－Ｏ－ＰＧ_２ ［配列番号３９］を有する（またはより好ましくは、からなる）前記第２のペプチド断片は、ＰＧ_１－Ｔｈｒ^２０（Ｐ）－Ｃｙｓ^２１（Ｐ）－Ａｒｇ^２２（Ｐ）－Ｐｈｅ^２３－Ｌｅｕ^２４－Ｖａｌ^２５－Ｇｌｎ^２６－Ｇｌｕ^２７（Ｐ）－Ａｓｐ^２８（Ｐ）－Ｌｙｓ^２９（Ｐ）－Ｐｒｏ^３０－Ａｌａ^３１－Ｃｙｓ^３２（Ｐ）－Ｖａｌ^３３－Ｃｙｓ^３４（Ｐ）－Ｈｉｓ^３５－Ｓｅｒ^３６（Ｐ）－Ｇｌｙ^３７－ＯＨ ［配列番号４３］及びＨ－Ｔｙｒ^３８（Ｐ）－Ｖａｌ^３９－Ｇｌｙ^４０－Ａｌａ^４１－Ａｒｇ^４２（Ｐ）－Ｃｙｓ^４３（Ｐ）－Ｇｌｕ^４４（Ｐ）－Ｈｉｓ^４５（Ｐ）－Ａｌａ^４６－Ａｓｐ^４７（Ｐ）－ Ｌｅｕ^４８－Ｌｅｕ^４９－Ａｌａ^５０－Ｏ－ＰＧ_２ ［配列番号４４］との断片縮合により、調製される。好ましくは、前記保護基ＰＧ_１は、その後除去される。

【0112】

一の好ましい実施形態では、配列Ｈ－Ｔｈｒ^２０（ｔＢｕ）－Ｃｙｓ^２１（Ｔｒｔ）－Ａｒｇ^２２（Ｐｂｆ）－Ｐｈｅ^２３－Ｌｅｕ^２４－Ｖａｌ^２５－Ｇｌｎ^２６－Ｇｌｕ^２７（ｔＢｕ）－Ａｓｐ^２８（ｔＢｕ）－Ｌｙｓ^２９（Ｂｏｃ）－Ｐｒｏ^３０－Ａｌａ^３１－Ｃｙｓ^３２（Ｔｒｔ）－Ｖａｌ^３３－Ｃｙｓ^３４（Ｔｒｔ）－Ｈｉｓ^３５－Ｓｅｒ^３６（ｔＢｕ）－Ｇｌｙ^３７－Ｔｙｒ^３８（ｔＢｕ）－Ｖａｌ^３９－Ｇｌｙ^４０－Ａｌａ^４１－Ａｒｇ^４２（Ｐｂｆ）－Ｃｙｓ^４３（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ^４４（ｔＢｕ）－Ｈｉｓ^４５（Ｔｒｔ）－Ａｌａ^４６－Ａｓｐ^４７（ｔＢｕ）－Ｌｅｕ^４８－Ｌｅｕ^４９－Ａｌａ^５０－Ｏ－ＰＧ_２ ［配列番号４５］を有する（またはより好ましくは、からなる）前記第２のペプチド断片は、ＰＧ_１－Ｔｈｒ^２０（ｔＢｕ）－Ｃｙｓ^２１（Ｔｒｔ）－Ａｒｇ^２２（Ｐｂｆ）－Ｐｈｅ^２３－Ｌｅｕ^２４－Ｖａｌ^２５－Ｇｌｎ^２６－Ｇｌｕ^２７（ｔＢｕ）－Ａｓｐ^２８（ｔＢｕ）－Ｌｙｓ^２９（Ｂｏｃ）－Ｐｒｏ^３０－Ａｌａ^３１－Ｃｙｓ^３２（Ｔｒｔ）－Ｖａｌ^３３－Ｃｙｓ^３４（Ｔｒｔ）－Ｈｉｓ^３５－Ｓｅｒ^３６（ｔＢｕ）－Ｇｌｙ^３７－ＯＨ ［配列番号４６］とＨ－Ｔｙｒ^３８（ｔＢｕ）－Ｖａｌ^３９－Ｇｌｙ^４０－Ａｌａ^４１－Ａｒｇ^４２（Ｐｂｆ）－Ｃｙｓ^４３（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ^４４（ｔＢｕ）－Ｈｉｓ^４５（Ｔｒｔ）－Ａｌａ^４６－Ａｓｐ^４７（ｔＢｕ）－ Ｌｅｕ^４８－Ｌｅｕ^４９－Ａｌａ^５０－Ｏ－ＰＧ_２ ［配列番号４７］との断片縮合により、調製される。好ましくは、前記保護基ＰＧ_１は、その後除去される。

【0113】

一の好ましい実施形態では、前記ペプチド断片Ｈ－Ｔｙｒ^３８（Ｐ）－Ｖａｌ^３９－Ｇｌｙ^４０－Ａｌａ^４１－Ａｒｇ^４２（Ｐ）－Ｃｙｓ^４３（Ｐ）－Ｇｌｕ^４４（Ｐ）－Ｈｉｓ^４５（Ｐ）－Ａｌａ^４６－Ａｓｐ^４７（Ｐ）－Ｌｅｕ^４８－Ｌｅｕ^４９－Ａｌａ^５０－Ｏ－ＰＧ_２ ［配列番号４８］又はＨ－Ｔｙｒ^３８（ｔＢｕ）－Ｖａｌ^３９－Ｇｌｙ^４０－Ａｌａ^４１－Ａｒｇ^４２（Ｐｂｆ）－Ｃｙｓ^４３（Ｔｒｔ）－Ｇｌｕ^４４（ｔＢｕ）－Ｈｉｓ^４５（Ｔｒｔ）－Ａｌａ^４６－Ａｓｐ^４７（ｔＢｕ）－ Ｌｅｕ^４８－Ｌｅｕ^４９－Ａｌａ^５０－Ｏ－ＰＧ_２ ［配列番号４７］は、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ－ＯＨから開始する固相ペプチド合成により、調製される。

【0114】

一の好ましい実施形態では、前記第２のペプチド断片ＰＧ_１－Ｔｈｒ^２０（Ｐ）－Ｃｙｓ^２１（Ｐ）－Ａｒｇ^２２（Ｐ）－Ｐｈｅ^２３－Ｌｅｕ^２４－Ｖａｌ^２５－Ｇｌｎ^２６－Ｇｌｕ^２７（Ｐ）－Ａｓｐ^２８（Ｐ）－Ｌｙｓ^２９（Ｐ）－Ｐｒｏ^３０－Ａｌａ^３１－Ｃｙｓ^３２（Ｐ）－Ｖａｌ^３３－Ｃｙｓ^３４（Ｐ）－Ｈｉｓ^３５－Ｓｅｒ^３６（Ｐ）－Ｇｌｙ^３７－ＯＨ ［配列番号４３］又はＰＧ_１－Ｔｈｒ^２０（ｔＢｕ）－Ｃｙｓ^２１（Ｔｒｔ）－Ａｒｇ^２２（Ｐｂｆ）－Ｐｈｅ^２３－Ｌｅｕ^２４－Ｖａｌ^２５－Ｇｌｎ^２６－Ｇｌｕ^２７（ｔＢｕ）－Ａｓｐ^２８（ｔＢｕ）－Ｌｙｓ^２９（Ｂｏｃ）－Ｐｒｏ^３０－Ａｌａ^３１－Ｃｙｓ^３２（Ｔｒｔ）－Ｖａｌ^３３－Ｃｙｓ^３４（Ｔｒｔ）－Ｈｉｓ^３５－Ｓｅｒ^３６（ｔＢｕ）－Ｇｌｙ^３７－ＯＨ ［配列番号４６］は、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ－ＯＨから開始する固相ペプチド合成により、調製される。

【0115】

一の好ましい実施形態では、本発明は、ＴＧＦ（１－５０）を調製する方法に関し、前記方法は、以下のステップを含んでいる：
(a) Ｆｍｏｃ－ＴＧＦ（２０－３７）－ＯＨ断片と、Ｈ－ＴＧＦ（３８－５０）－ＯＣｌｔ断片とをカップリングし、Ｆｍｏｃ－ＥＧＦ（２０－５０）－ＯＣｌｔを形成し；
(b) Ｆｍｏｃ－ＴＧＦ（２０－５０）－ＯＣｌｔ断片からＦｍｏｃ基を除去し、Ｈ－ＴＧＦ（２０－５０）－ＯＣｌｔを形成し；
(c) 前記Ｈ－ＴＧＦ（２０－５０）－ＯＣｌｔ断片と、Ｂｏｃ－ＴＧＦ（１－１９）－ＯＨ断片とをカップリングし、保護された直鎖上ペプチドＢｏｃ－ＴＧＦ（１－５０）－ＯＣｌｔを形成し；
(d) 前記保護された直鎖上ペプチドＢｏｃ－ＴＧＦ（１－５０）－ＯＣｌｔを、ＴＦＡ／ジクロロメタン中でヨウ素溶液処理をし；
(e) ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ／ＤＴＴで処理し、ステップ（ｄ）の生成物を全体的に脱保護し、未精製の直鎖ペプチドＴＧＦ（１－５０）を形成し；
(f) ステップ（ｅ）の生成物をＤＭＳＯ及びＴｒｉｓと塩酸グアニジンを含む水溶液で処理し、
(g) 任意に、ＨＰＬＣで、ステップ（ｆ）の生成物を精製する。
好ましくは、ステップ（ａ）のＦｍｏｃ－ＴＧＦ（２０－３７）－ＯＨ断片は、例えば、ＨＯＢｔ．Ｈ_２Ｏで処理することで、活性化される。

【0116】

本明細書に記載されるすべての実施形態について、好ましくは、ＰＧ_２は、クロロトリチル又はトリチルであり、より好ましくは、クロロトリチルである。有利には、前記合成においてクロロトリチル保護基を使用すると、前記全収率が優位に増加する。例えば、いくつかの事例では、クロロトリチル保護基を使用することで、所望のペプチドの収率が全体として２５％程度向上することがある。

【0117】

一の好ましい実施形態では、ＰＧ_１はＢｏｃ（ブチルオキシカルボニル）である。

【0118】

本明細書に記載されるすべての実施形態について、好ましくは、前記第１の断片は、固相または溶液中で調製される。前記第１の断片が、固相上で調製される場合、溶液中で前記第２の断片とカップリングする前に、第１の断片はレジンから切断される。

【0119】

本明細書に記載されるすべての実施形態について、好ましくは、前記第２の断片は、固相または溶液中で調製される。前記第２の断片が、固相上で調製される場合、溶液中で前記第１の断片とカップリングする前に、第２の断片はレジンから切断される。

【0120】

本明細書に記載されるすべての実施形態について、好ましくは、前記第第２の断片は、２又はそれ以上のサブ断片をカップリングすることによって調製される。

【0121】

一の好ましい実施形態では、前記未精製のＥＧＦ様ペプチドは、水／アセトニトリル又は水／メタノール中の種々の緩衝液を用いた分取ＨＰＬＣにより精製される。

【0122】

本発明の他の態様は、ＥＧＦ様ペプチド又はそのアナログ又はそのバリアント、より好ましくは、ＥＧＦ又はＴＧＦ－αの合成における、本明細書で記載された１又は複数のペプチド断片に関する。

【0123】

特有断片組み合わせによるＥＧＦの合成。
本発明の第２の態様は、以下の配列を有するＥＧＦ様ペプチド；
Ｈ－Ａｓｎ^１－Ｓｅｒ^２－Ａｓｐ^３－Ｓｅｒ^４－Ｇｌｕ^５－Ｃｙｓ^６－Ｐｒｏ^７－Ｌｅｕ^８－Ｓｅｒ^９－Ｈｉｓ^１０－Ａｓｐ^１１－Ｇｌｙ^１２－Ｔｙｒ^１３－Ｃｙｓ^１４－Ｌｅｕ^１５－Ｈｉｓ^１６－Ａｓｐ^１７－Ｇｌｙ^１８－Ｖａｌ^１９－Ｃｙｓ^２０－Ｍｅｔ^２１－Ｔｙｒ^２２－Ｉｌｅ^２３－Ｇｌｕ^２４－Ａｌａ^２５－Ｌｅｕ^２６－Ａｓｐ^２７－Ｌｙｓ^２８－Ｔｙｒ^２９－Ａｌａ^３０－Ｃｙｓ^３１－Ａｓｎ^３２－Ｃｙｓ^３３－Ｖａｌ^３４－Ｖａｌ^３５－Ｇｌｙ^３６－Ｔｙｒ^３７－Ｉｌｅ^３８－Ｇｌｙ^３９－Ｇｌｕ^４０－Ａｒｇ^４１－Ｃｙｓ^４２－Ｇｌｎ^４３－Ｔｙｒ^４４－Ａｒｇ^４５－Ａｓｐ^４６－Ｌｅｕ^４７－Ｌｙｓ^４８－Ｔｒｐ^４９－Ｔｒｐ^５０－Ｇｌｕ^５１－Ｌｅｕ^５２－Ａｒｇ^５３－ＯＨ ［配列番号１］
又はそのバリアントを調製する方法に関し、
前記方法は、以下のステップを含んでいる；
以下の配列を有する（またはより好ましくは、からなる）第１のペプチド断片；
ＰＧ_１－Ａｓｎ^１－Ｓｅｒ^２－Ａｓｐ^３－Ｓｅｒ^４－Ｇｌｕ^５－Ｃｙｓ^６－Ｐｒｏ^７－Ｌｅｕ^８－Ｓｅｒ^９－Ｈｉｓ^１０－Ａｓｐ^１１－Ｇｌｙ^１２－Ｔｙｒ^１３－Ｃｙｓ^１４－Ｌｅｕ^１５－Ｈｉｓ^１６－Ａｓｐ^１７－Ｇｌｙ^１８－ＯＨ ［配列番号２］
又はそのバリアントであって、
ＰＧ_１が、好ましくは、Ｂｏｃ及びＦｍｏｃから選択されるＮ末端保護基であり；そして、当該Ｃ末端アミノ酸は、任意に、活性化されたカルボン酸誘導体の形態であり；
第２のペプチド断片が、以下の配列を有する（またはより好ましくは、からなる）ペプチド断片；
Ｈ－Ｖａｌ^１９－Ｃｙｓ^２０－Ｍｅｔ^２１－Ｔｙｒ^２２－Ｉｌｅ^２３－Ｇｌｕ^２４－Ａｌａ^２５－Ｌｅｕ^２６－Ａｓｐ^２７－Ｌｙｓ^２８－Ｔｙｒ^２９－Ａｌａ^３０－Ｃｙｓ^３１－Ａｓｎ^３２－Ｃｙｓ^３３－Ｖａｌ^３４－Ｖａｌ^３５－Ｇｌｙ^３６－Ｔｙｒ^３７－Ｉｌｅ^３８－Ｇｌｙ^３９－Ｇｌｕ^４０－Ａｒｇ^４１－Ｃｙｓ^４２－Ｇｌｎ^４３－Ｔｙｒ^４４－Ａｒｇ^４５－Ａｓｐ^４６－Ｌｅｕ^４７－Ｌｙｓ^４８－Ｔｒｐ^４９－Ｔｒｐ^５０－Ｇｌｕ^５１－Ｌｅｕ^５２－Ａｒｇ^５３－Ｏ－ＰＧ_２ ［配列番号３］
又はそのバリアントであって；
ＰＧ_２が、好ましくは、クロロトリチル及びｔ－ブチルから選択されるＣ末端保護基であって、；そして、前記第１の及び第２のペプチド断片における１または複数のアミノ酸残基が、好ましくは、酸開裂性保護基で任意に保護されており、そして、任意に保護基ＰＧ_１ 及びＰＧ_２を除去している、前記第１のペプチド断片と、前記第２のペプチド断片とを、溶液中でカップリングする方法を有する。

【0124】

本発明の第３の態様は、以下の配列を有する（またはより好ましくは、からなる）ＥＧＦ様ペプチド；
Ｈ－Ａｓｎ^１－Ｓｅｒ^２－Ａｓｐ^３－Ｓｅｒ^４－Ｇｌｕ^５－Ｃｙｓ^６－Ｐｒｏ^７－Ｌｅｕ^８－Ｓｅｒ^９－Ｈｉｓ^１０－Ａｓｐ^１１－Ｇｌｙ^１２－Ｔｙｒ^１３－Ｃｙｓ^１４－Ｌｅｕ^１５－Ｈｉｓ^１６－Ａｓｐ^１７－Ｇｌｙ^１８－Ｖａｌ^１９－Ｃｙｓ^２０－Ｍｅｔ^２１－Ｔｙｒ^２２－Ｉｌｅ^２３－Ｇｌｕ^２４－Ａｌａ^２５－Ｌｅｕ^２６－Ａｓｐ^２７－Ｌｙｓ^２８－Ｔｙｒ^２９－Ａｌａ^３０－Ｃｙｓ^３１－Ａｓｎ^３２－Ｃｙｓ^３３－Ｖａｌ^３４－Ｖａｌ^３５－Ｇｌｙ^３６－Ｔｙｒ^３７－Ｉｌｅ^３８－Ｇｌｙ^３９－Ｇｌｕ^４０－Ａｒｇ^４１－Ｃｙｓ^４２－Ｇｌｎ^４３－Ｔｙｒ^４４－Ａｒｇ^４５－Ａｓｐ^４６－Ｌｅｕ^４７－Ｌｙｓ^４８－Ｔｒｐ^４９－Ｔｒｐ^５０－Ｇｌｕ^５１－Ｌｅｕ^５２－Ａｒｇ^５３－ＯＨ ［配列番号１］
又はそのバリアントを調製する方法に関し、
前記方法は、以下のステップを含んでいる；
以下の配列を有する（またはより好ましくは、からなる）第１のペプチド断片；
ＰＧ_１－Ａｓｎ^１－Ｓｅｒ^２－Ａｓｐ^３－Ｓｅｒ^４－Ｇｌｕ^５－Ｃｙｓ^６－Ｐｒｏ^７－Ｌｅｕ^８－ΨＳｅｒ^９－Ｈｉｓ^１０－Ａｓｐ^１１－Ｇｌｙ^１２－ＯＨ ［配列番号４］
又はそのバリアントであって、
ＰＧ_１が、好ましくは、Ｂｏｃ及びＦｍｏｃから選択されるＮ末端保護基であり；そして、当該Ｃ末端アミノ酸は、任意に、活性化されたカルボン酸誘導体の形態であり；
第２のペプチド断片が、以下の配列を有する（またはより好ましくは、からなる）ペプチド断片；
Ｈ－Ｔｙｒ^１３－Ｃｙｓ^１４－Ｌｅｕ^１５－Ｈｉｓ^１６－Ａｓｐ^１７－Ｇｌｙ^１８－Ｖａｌ^１９－Ｃｙｓ^２０－Ｍｅｔ^２１－Ｔｙｒ^２２－Ｉｌｅ^２３－Ｇｌｕ^２４－Ａｌａ^２５－Ｌｅｕ^２６－Ａｓｐ^２７－Ｌｙｓ^２８－Ｔｙｒ^２９－Ａｌａ^３０－Ｃｙｓ^３１－Ａｓｎ^３２－Ｃｙｓ^３３－Ｖａｌ^３４－Ｖａｌ^３５－Ｇｌｙ^３６－Ｔｙｒ^３７－Ｉｌｅ^３８－Ｇｌｙ^３９－Ｇｌｕ^４０－Ａｒｇ^４１－Ｃｙｓ^４２－Ｇｌｎ^４３－Ｔｙｒ^４４－Ａｒｇ^４５－Ａｓｐ^４６－Ｌｅｕ^４７－Ｌｙｓ^４８－Ｔｒｐ^４９－Ｔｒｐ^５０－Ｇｌｕ^５１－Ｌｅｕ^５２－Ａｒｇ^５３－Ｏ－ＰＧ_２ ［配列番号５］
又はそのバリアントであって；
ＰＧ_２が、好ましくは、クロロトリチル及びｔ－ブチルから選択されるＣ末端保護基であって、；そして、前記第１の及び第２のペプチド断片における１または複数のアミノ酸残基が、好ましくは、酸開裂性保護基で任意に保護されており、そして、任意に保護基ＰＧ_１及びＰＧ_２を除去している、前記第１のペプチド断片と、前記第２のペプチド断片とを、溶液中でカップリングする方法を有する。

【0125】

特有断片組み合わせによるＴＧＦ－αの合成。
本発明の第４の態様は、以下の配列を有する（またはより好ましくは、からなる）ＥＧＦ様ペプチド；
Ｈ－Ｖａｌ^１－Ｖａｌ^２－Ｓｅｒ^３－Ｈｉｓ^４－Ｐｈｅ^５－Ａｓｎ^６－Ａｓｐ^７－Ｃｙｓ^８－Ｐｒｏ^９－Ａｓｐ^１０－Ｓｅｒ^１１－Ｈｉｓ^１２－Ｔｈｒ^１３－Ｇｌｎ^１４－Ｐｈｅ^１５－Ｃｙｓ^１６－Ｐｈｅ^１７－Ｈｉｓ^１８－Ｇｌｙ^１９－Ｔｈｒ^２０－Ｃｙｓ^２１－Ａｒｇ^２２－Ｐｈｅ^２３－Ｌｅｕ^２４－Ｖａｌ^２５－Ｇｌｎ^２６－Ｇｌｕ^２７－Ａｓｐ^２８－Ｌｙｓ^２９－Ｐｒｏ^３０－Ａｌａ^３１－Ｃｙｓ^３２－Ｖａｌ^３３－Ｃｙｓ^３４－Ｈｉｓ^３５－Ｓｅｒ^３６－Ｇｌｙ^３７－Ｔｙｒ^３８－Ｖａｌ^３９－Ｇｌｙ^４０－Ａｌａ^４１－Ａｒｇ^４２－Ｃｙｓ^４３－Ｇｌｕ^４４－Ｈｉｓ^４５－Ａｌａ^４６－Ａｓｐ^４７－Ｌｅｕ^４８－Ｌｅｕ^４９－Ａｌａ^５０－ＯＨ ［配列番号６］
又はそのバリアントを調製する方法に関し、
前記方法は、以下のステップを含んでいる；
以下の配列を有する第１のペプチド断片；
ＰＧ_１－Ｖａｌ^１－Ｖａｌ^２－Ｓｅｒ^３－Ｈｉｓ^４－Ｐｈｅ^５－Ａｓｎ^６－Ａｓｐ^７－Ｃｙｓ^８－Ｐｒｏ^９－Ａｓｐ^１０－Ｓｅｒ^１１－Ｈｉｓ^１２－Ｔｈｒ^１３－Ｇｌｎ^１４－Ｐｈｅ^１５－Ｃｙｓ^１６－Ｐｈｅ^１７－Ｈｉｓ^１８－Ｇｌｙ^１９－ＯＨ ［配列番号７］
又はそのバリアントであって、
ＰＧ_１が、好ましくは、Ｂｏｃ及びＦｍｏｃから選択されるＮ末端保護基であり；そして、当該Ｃ末端アミノ酸は、任意に、活性化されたカルボン酸誘導体の形態であり；
第２のペプチド断片が、以下の配列を有するペプチド断片；
Ｈ－Ｔｈｒ^２０－Ｃｙｓ^２１－Ａｒｇ^２２－Ｐｈｅ^２３－Ｌｅｕ^２４－Ｖａｌ^２５－Ｇｌｎ^２６－Ｇｌｕ^２７－Ａｓｐ^２８－Ｌｙｓ^２９－Ｐｒｏ^３０－Ａｌａ^３１－Ｃｙｓ^３２－Ｖａｌ^３３－Ｃｙｓ^３４－Ｈｉｓ^３５－Ｓｅｒ^３６－Ｇｌｙ^３７－Ｔｙｒ^３８－Ｖａｌ^３９－Ｇｌｙ^４０－Ａｌａ^４１－Ａｒｇ^４２－Ｃｙｓ^４３－Ｇｌｕ^４４－Ｈｉｓ^４５－Ａｌａ^４６－Ａｓｐ^４７－Ｌｅｕ^４８－Ｌｅｕ^４９－Ａｌａ^５０－Ｏ－ＰＧ_２ ［配列番号８］
又はそのバリアントであって；
ＰＧ_２が、好ましくは、クロロトリチル及びｔ－ブチルから選択されるＣ末端保護基であって、；そして、前記第１の及び第２のペプチド断片における１または複数のアミノ酸残基が、好ましくは、酸開裂性保護基で任意に保護されており、そして、任意に保護基ＰＧ_１及びＰＧ_２を除去している、前記第１のペプチド断片と、前記第２のペプチド断片とを、溶液中でカップリングする方法を有する。

【0126】

本発明の上述した第２、第３及び第４の態様について、好ましくは、それぞれの場合において前記方法は、断片縮合により形成された前記保護された又は保護されていない直鎖ＥＧＦ様ペプチドを、ある条件にかけて、前記ＥＧＦ様ペプチドの三次構造を形成することをさらに含んでいる。好ましい条件は、前記第１の態様に示したステップ（ＩＶ）（ａ）、（ＩＶ）（ｂ）及び（Ｖ）を含む。

【0127】

従って、１つの実施形態では、上述した本発明の２番目、第３及び４番目の態様について、好ましくは、前記方法は、以下のステップを含む：
（III）溶液中で、前記第１のペプチド断片のＣ末端アミノ酸と、前記第２のペプチド断片のＮ末端アミノ酸をカップリングし、直鎖状の保護されたＥＧＦ様ペプチドを形成し；
（ＩＶ）（ａ）
（ｉ）ステップ（III）で形成された直鎖状の保護されたＥＧＦ様ペプチドをヨウ素で処理し、酸化混合物を形成し；
（ii）トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）で処理し、ステップ（IV）（ａ）（ｉ）で得られた前記酸化混合物を全体的に脱保護し、
（iii）ステップ（IV）（ａ）（ii）で得られた前記脱保護された酸化混合物をＤＭＳＯ／ＤＴＴで処理し、未精製のＥＧＦ様ペプチドを形成する；又は
（ＩＶ）（ｂ）
（ｉ）トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）で処理し、ステップ（III）で得られた直鎖状の保護されたＥＧＦ様ペプチドを全体的に脱保護し；
（ii）ステップ （ＩＶ）（ｂ）（ｉ）で得られた脱保護された混合物をＤＭＳＯで処理し、未精製のＥＧＦ様ペプチドを形成する；そして、
（Ｖ）任意に前記未精製のＥＧＦ様ペプチドを精製する。

【0128】

一の特に好ましい実施形態では、本方法は、以下のステップを含む：
溶液中で、前記第１のペプチド断片のＣ末端アミノ酸と、前記第２のペプチド断片のＮ末端アミノ酸をカップリングし、保護されたＥＧＦ様ペプチドを形成し；
ステップ（ａ）で形成された前記保護されたＥＧＥ様ペプチドをヨウ素で処理し、酸化混合物を形成し；
ステップ（ｉｖ）で得られた前記酸化混合物を、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）で処理することで、全体的に脱保護し；
ステップ（ｖ）で得られた前記脱保護された酸化混合物を、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）及びＤＭＳＯで処理し、未精製のＥＧＥ様ペプチドを形成し；そして
任意に前記未精製のＥＧＦ様ペプチドを精製する。

【0129】

上述した本発明の第２、第３および第４の態様について、各方法ステップの好ましい実施形態は、本発明の第１の態様について上述したとおりである。

【0130】

本発明の上記第２、第３および第４の態様について、アミノ酸のための適切なＮ末端保護基およびＣ末端保護基は、当業者に周知であろう。例は、Ｔ．Ｗ． Ｇｒｅｅｎｅ ＆ Ｐ．Ｇ．Ｍ． Ｗｕｔｓ， Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ （２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ） Ｊ． Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， １９９１； 及びＰ． Ｊ． Ｋｏｃｉｅｎｓｋｉ， Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐｓ， Ｇｅｏｒｇ Ｔｈｉｅｍｅ Ｖｅｒｌａｇ， １９９４で見つけられてもよい。

【0131】

アミノ酸の好ましいＮ末端保護基の例は、Ｂｏｃ（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）およびＦｍｏｃ（９－フルオレニルメチルオキシ－カルボニル）を含むが、これらに限定されない。その不安定さは、不可逆的なデカップリングステップのためにＣＯ２を容易に放出するカルバメート基によるものである。 カルバメート基をベースにした別の適切な基はベンジルオキシカルボニル（ＺまたはＣｂｚ）基で、これはより過酷な条件下で除去される。ＢｏｃおよびＦｍｏｃが特に好ましい。

【0132】

アミノ酸のＣ末端保護基の例は、クロロトリチルおよびｔ－ブチルを含んでいる。クロロトリチルが特に好ましい。

【0133】

本発明の上記第２、第３および第４の態様について、好ましくは、一実施形態において、前記第１のペプチド断片は、２又はそれ以上のペプチドサブ断片をカップリングすることにより調製される。好ましくは、前記サブ断片は、本発明の第１の態様について上述した通りである。

【0134】

本発明の上記第２、第３および第４の態様について、好ましくは、一実施形態において、前記第１のペプチド断片は、固相ペプチド合成により調製される。

【0135】

本発明の上記第２、第３および第４の態様について、好ましくは、一実施形態において、前記第２のペプチド断片は、２又はそれ以上のペプチドサブ断片をカップリングすることにより調製される。好ましくは、前記サブ断片は、本発明の第１の態様について上述した通りである。

【0136】

本発明の上記第２、第３および第４の態様について、好ましくは、一実施形態において、前記第２のペプチド断片は、固相ペプチド合成により調製される。

【0137】

上記の各カップリング反応について、好ましくは、例えばＨＯＢｔ．Ｈ_２Ｏで処理することにより、ＣＯＯＨ基は活性化されている。

【0138】

本発明の上記第２、第３および第４の態様について、好ましい第１のペプチド断片及び第２のペプチド断片およびそのサブ断片は、その調製方法と共に、本発明の第１の態様について上述した通りである。

【0139】

本発明は、以下の非限定的な例によってさらに説明される。

【実施例】

【0140】

略語
Ａｃｍ アセトアミドメチル（ａｃｅｔａｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ）
ＡＩＢ （又はＡｉｂ） ２－アミノイソ酪酸（２－ａｍｉｎｏｉｓｏｂｕｔｙｒｉｃ ａｃｉｄ）又はα－アミノイソ酪酸（α－ａｍｉｎｏｉｓｏｂｕｔｙｒｉｃ ａｃｉｄ）
Ｂｏｃ又はｔ－Ｂｏｃ ｔ－ブチルオキシカルボニル（ｔ－ｂｕｔｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）
Ｂｔ ベンゾトリアゾール（ｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌｅ）
Ｂｚ ベンジル（ｂｅｎｚｙｌ）
Ｄｄｅ １－（４，４－ジメチル －２，６－ジオキソシクロヘキ －１－イリデン）エチル（１－（４，４－Ｄｉｍｅｔｈｙｌ－２，６－ｄｉｏｘｏｃｙｃｌｏｈｅｘ－１－ｙｌｉｄｅｎｅ）ｅｔｈｙｌ）
ＥＤＣ．ＨＣｌ １－エチル －３－（３ ’－ジメチル －アミノ
プロピルカルボジイミドハイドロクロライド＃（１－ｅｔｈｙｌ－３－（３ ’－ｄｉｍｅｔｈｙｌ－ａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ＃）
ＤＭＡＣ ジメチルアセトアミド（ｄｉｍｅｔｈｙｌ ａｃｅｔａｍｉｄｅ）
ＤＭＦ ジメチルホルムアルデヒド（ｄｉｍｅｔｈｙｌ ｆｏｍａｍｉｄｅ）
ＤＰＭ ジフェニルメチル（ｄｉｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌ）
ＤＣＭ ジクロロメタン（ｄｉｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈａｎｅ）
ＤＭＳＯ ジメチルスルホキシド（ｄｉｍｅｔｈｙｌ ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）
ＤＩＣ Ｎ，Ｎ’－ジイソプロピルカルボジイミド （Ｎ，Ｎ’－Ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ）
ＤＩＰＥＡ Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（Ｎ，Ｎ－ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ）
ＨＢＴＵ （２－（１Ｈ－ベンゾトリアゾール －１－イル）－１，１，
３，３－テトラメチルウロニウム ヘキサフルオロ ホスフェート，
（ヘキサフルオロホスフェートベンゾトリアゾールＴテトラメチルウロニウム）
（２－（１Ｈ－ｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌ－１－ｙｌ）－１，１，３，３－ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｕｒｏｎｉｕｍ ｈｅｘａｆｌｕｏｒｏ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ， （Ｈｅｘａｆｌｕｏｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌｅ Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ Ｕｒｏｎｉｕｍ）
ＭｅＤＰＭ メチルージフェニルメチル（ｍｅｔｈｙｌ－ｄｉｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌ）
ＭｅＯＤＰＭ メトキシージフェニルメチル（ｍｅｔｈｏｘｙ－ｄｉｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌ）
ＭｅＯＨ メタノール（ｍｅｔｈａｎｏｌ）
ｉｖＤｄｅ １－（４，４－ジメチル －２，６－ジオキソシクロヘキシリデン）－３－メチルブチル（１－（４，４－Ｄｉｍｅｔｈｙｌ－２，６－ｄｉｏｘｏｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌｉｄｅｎｅ）－３－ｍｅｔｈｙｌｂｕｔｙｌ）
Ｆｍｏｃ ９－フルオレニルメトキシカルボニル（９－ｆｌｕｏｒｅｎｙｌｍｅｔｈｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）
ＨＰＬＣ 高速液体クロマトグラフィー（Ｈｉｇｈ
Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）
ＨＯＢｔ ヒドロキシベンゾトリアゾール（Ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌｅ）
Ｍｍｔ モノメトキシトリチル［（４－メトキシフェニル）ジフェニルメチル］（ｍｏｎｏｍｅｔｈｏｘｙｔｒｉｔｙｌ ［（４－ｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）ｄｉｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌ］）
Ｍｔｔ ４－メチルトリチル（４－ｍｅｔｈｙｌｔｒｉｔｙｌ）
ＮＭＰ Ｎ－メチルピロリドン（Ｎ－ｍｅｔｈｙｌｐｙｒｒｏｌｉｄｏｎｅ）
Ｐｆｐ ペンタフルオロフェニル（ｐｅｎｔａｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）
Ｓｕ サクシンイミド（ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ）
ｔＢｕ ｔ－ブチル（ｔｅｒｔ－ｂｕｔｙｌ）
Ｐａｌ パルミトイル（ｐａｌｍｉｔｏｙｌ）
Ｐｂｆ ２，２，４，６，７－ペンタメチル －ジヒドロベンゾフラン －５－スルホニル （２，２，４，６，７－ｐｅｎｔａｍｅｔｈｙｌ－ｄｉｈｙｄｒｏｂｅｎｚｏｆｕｒａｎ－５－ｓｕｌｆｏｎｙｌ）
ＴＢＴＵ Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′－テトラメチル －Ｏ－（ベンゾトリアゾール －１－イル）ウロニウムテトラフルオロボレート（Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′－Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ－Ｏ－（ｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌ－１－ｙｌ）ｕｒｏｎｉｕｍ ｔｅｔｒａｆｌｕｏｒｏｂｏｒａｔｅ）
ＴＦＡ トリフルオロ酢酸（ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）
Ｔｒｉｓ トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅ）
Ｔｒｔ トリチル（ｔｒｉｔｙｌ）
Ｃｌｔ クロロトリチル（ｃｈｌｏｒｏｔｒｉｔｙｌ）

【0141】

実験セクション：
Ｆｍｏｃ－ＥＧＦ（３７－５３）－ＯＨの合成：
９６ｇの２－クロロトリチルクロリドレジンを７００ｍｌのＤＣＭで膨潤する。５６ｍｌのＤＩＰＥＡと２５．２ｇのＦｍｏｃ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）－ＯＨを加える。前記反応を３時間放置し、そして、２８ｍｌのメタノールを加える。前記レジンを濾過し、そして、２８８ｍｌのＤＣＭ／ＭｅＯＨ／ＤＩＰＥＡで中和する。Ｆｍｏｃ－開裂は、３８４ｍｌのピペリジン／ＮＭＰ（１５％）の混合物の添加で行う。全てのカップリングは、ＮＭＰ（０．５Ｍ）中の２．５ｍｍｏｌ過剰のＦｍｏｃ－アミノ酸／ＨＯＢｔ／ＤＩＣ（１：１．２：１．１）で実施した。前記保護されたペプチドを、１３４４ｍｌのＴＦＡ／ＤＣＭ（２％）の混合物でレジンから開裂した。ＴＦＡを水（３３００ｍｌ）で抽出し、そして、縮合後、ヘキサン（８００ｍｌ）を加えてペプチドを沈殿した。最終収量 １０４ｇ（７２％）。

【0142】

Ｆｍｏｃ－ＥＧＦ（３７－５３）－ＯＨのクロロトリチル保護：
前記保護されたペプチド８０ｇを２９６ｍｌのＤＣＭで溶解し、そして、３２ｇの２－クロロトリチルクロリドと３６ｍｌのＤＩＰＥＡを添加する。前記反応は２時間放置し、そして、ＨＰＬＣでモニターする。ＤＩＰＥＡをジクロロメタン混合物から５９２ｍｌの０．１Ｎ塩酸で抽出し、Ｆｍｏｃ－ＥＧＦ（３７－５３）－ＯＣｌｔを１６００ｍｌのヘキサンで縮合後沈殿させ、そして、真空下で乾燥する。ＮＭＰ（１６８ｍｌ）中６ｍｍｏｌ過剰のピペリジンを用いてＦｍｏｃ開裂を行う。反応混合物中に５０４ｍｌのＤＣＭを加え、そして、ピペリジンを５０４ｍｌの０．０１Ｎ塩酸でジクロロメタン溶液から抽出する。Ｈ－ＥＧＦ（３７－５３）－ＯＣｌｔを１０５６ｍｌのヘキサンで縮合した後に沈殿させ、３９２ｍｌのジエチルエーテルで６回洗浄し、そして、真空下で乾燥する。最終収量 ７８ｇ（９２％）

【0143】

Ｆｍｏｃ－ＥＧＦ（１９－３６）－ＯＨの合成：
４２ｇの２－クロロトリチルクロリドレジンを２３２ｍｌのＤＣＭで膨潤する。２６ｍｌのＤＩＰＥＡと５ｇのＦｍｏｃ－Ｇｌｙ－ＯＨを加える。前記反応を３時間放置し、そして、１４ｍｌのメタノールを添加する。前記レジンを濾過し、そして、１２６ｍｌのＤＣＭ／ＭｅＯＨ／ＤＩＰＥＡで中和する。Ｆｍｏｃ－開裂は、１９２ｍｌのピペリジン／ＮＭＰ（１５％）の混合物の添加で行う。すべてのカップリングは、ＮＭＰ（０．５Ｍ）中の２．５ｍｍｏｌ過剰のＦｍｏｃ－アミノ酸／ＨＯＢｔ／ＤＩＣ（１：１．２：１．１）で行った。前記保護されたペプチドを、５８８ｍｌのＴＦＡ／ＤＣＭ（２％）の混合物でレジンから開裂する。ＴＦＡを水（１４５０ｍｌ）で抽出し、そして、縮合後、ヘキサン（４００ｍｌ）を加えてペプチドを沈殿する。最終収量 ４２ｇ（８２％）。

【0144】

Ｂｏｃ－ＥＧＦ（１－１８）－ＯＨの合成：
４２ｇの２－クロロトリチルクロリドレジンを２３２ｍｌのＤＣＭで膨潤する。２６ｍｌのＤＩＰＥＡと５ｇのＦｍｏｃ－Ｇｌｙ－ＯＨを加える。前記反応を３時間放置し、そして、１４ｍｌのメタノールを添加する。前記レジンを濾過し、そして、６．３ｍｌのＤＣＭ／ＭｅＯＨ／ＤＩＰＥＡで中和する。Ｆｍｏｃ－開裂は、１９２ｍｌのピペリジン／ＮＭＰ（１５％）の混合物の添加で行う。すべてのカップリングは、ＮＭＰ（０．５Ｍ）中の２．５ｍｍｏｌ過剰のＦｍｏｃ－アミノ酸／ＨＯＢｔ／ＤＩＣ（１：１．２：１．１）で行った。前記保護されたペプチドを、５８８ｍｌのＴＦＡ／ＤＣＭ（２％）の混合物でレジンから開裂する。ＴＦＡを水（１４５０ｍｌ）で抽出し、そして、縮合後、ヘキサン（４００ｍｌ）を加えペプチドを沈殿する。最終収量 ４２ｇ（８０％）

【0145】

保護されたＥＧＦ（１－５３）の合成：
４０ｇのＦｍｏｃ－ＥＧＦ（１９－３６）－ＯＨを１４０ｍｌのＮＭＰ中のＨＯＢｔ．Ｈ２Ｏ（２．１ｇ）とＥＤＡＣ．ＨＣｌ（２．４ｇ）で活性化し、Ｈ－ＥＧＦ（３７－５３）－ＯＣｌ（５２ｇ）を活性化した保護ペプチド中に添加する。前記反応の完了は、ＨＰＬＣでモニターする。Ｆｍｏｃ－ＥＧＦ（１９－３６）－ＯＨが対応するＦｍｏｃ－ＥＧＦ（１９－５３）－ＯＣｌｔと比較して面積で＜０．５％であるとき、Ｆｍｏｃ－開裂のためにピペリジン７ｍｌを添加する。反応混合物中に４３２ｍｌのＤＣＭを加え、そして、ピペリジンを４３２ｍｌの０．０１Ｎ塩酸でジクロロメタン溶液から抽出する。Ｈ－ＥＧＦ（１９－５３）－ＯＣｌｔを１８５０ｍｌのヘキサンで縮合した後に沈殿させ、４６０ｍｌのジエチルエーテルで６回洗浄し、そして、真空下で乾燥する。最終収量 ８４．６ｇ（９４％）

【0146】

４２０ｍｌのＮＭＰに溶解した保護された８４ｇのＨ－ＥＧＦ（１９－５３）－ＯＣｌｔに、３１０ｍｌのＮＭＰに溶解した活性化Ｂｏｃ－ＥＧＦ（１－１８）－ＯＨ（４０ｇ）、ＨＯＢｔ．Ｈ_２Ｏ（１．９ｇ）、ＥＤＡＣ．ＨＣｌ（２．３ｇ）を添加する。前記反応はＨＰＬＣでモニターする。Ｈ－ＥＧＦ（１９－５３）－ＯＣｌｔが未精製ＥＧＦと比較して面積で＜１％であるとき、前記反応は７．３Ｌｔの水の添加によって停止し、そして濾過する。最終的に保護されたペプチドを水（４００ｍｌ）で３回洗浄し、そして、水分含有量が＜３％になるまで真空下で乾燥する。最終収量 １１５．２ｇ（９６％）

【0147】

同様の合成戦略は、Ｆｍｏｃ－ＥＧＦ（１３－３６）－ＯＨを調製し、そして、Ｈ－ＥＧＦ（３７－５３）－ＯＣｌｔとカップリングし、Ｆｍｏｃ－ＥＧＦ（１３－５３）－ＯＣｌｔを形成し、その後、Ｆｍｏｃ基を除去してＨ－ＥＧＦ（１３－５３）－ＯＣｌｔを形成することで、使用してもよい。その後、Ｈ－ＥＧＦ（１３－５３）－ＯＣｌｔをＢｏｃ－ＥＧＦ（１－１２）－ＯＨとカップリングし、保護された直鎖ＥＧＦペプチドを形成することができる。

【0148】

保護されたＥＧＦ（１－５３）のヨウ素酸化：
前記保護されたペプチド（１１０ｇ）を８００ｍｌのＤＣＭに溶解し、そして、８００ｍｌの１％ＴＦＡ／ＤＣＭ中のヨウ素溶液（３．７ｇ）を添加する。前記反応を１時間放置し、そして、硫酸ナトリウム五水和物（７．３ｇ）の水溶液（１．６Ｌｔ）を加える。前記ＤＣＭ／ペプチド溶液を水１．６Ｌｔでさらに２回抽出し、真空下で濃縮し、ヘキサン（１．２Ｌｔ）で沈殿させ、そして、ジエチルエーテル（５００ｍｌ）で３回洗浄する。最終収量 ９５．７ｇ（９９％）

【0149】

全体的な脱保護：
９５ｇのＢｏｃ－ＥＧＦ（１－５３）－ＯＣｌｔは、ＴＦＡ／Ｈ_２Ｏ／ＤＴＴ（９４：３：３）からなる混合物を５．６Ｌｔ加え、２．５時間ＲＴで保護基を脱保護する。前記ＤＴＴはスカベンジャーとして機能し、そして、起こり得る早期の酸化を回避する。前記反応を真空下で濃縮し、そして、未精製の直鎖状ＥＧＦを９４０ｍｌのジエチルエーテルの添加により沈殿させ、そして、ジエチルエーテル（２４０ｍｌ）で３回洗浄する。最終収量４７．２ｇ（１００％）。

【0150】

ＤＭＳＯ／ＤＴＴ酸化：
未精製の直鎖ＥＧＦ（４０ｇ）を５．２８Ｌｔ ＤＭＳＯに溶解し、そして、Ｔｒｉｓ（２００ｇ）と塩酸グアニジン（２６０ｇ）を含む水溶液（２１．４Ｌｔ）をＲＴで添加する。塩酸グアニジンはカオトロープとして機能する。前記反応は２４時間放置し、そして、その完了をＨＰＬＣでモニターする。最終収率１５％。

【0151】

ＨＰＬＣ精製：
０．２％ＴＦＡで酸性化した後、前記未精製の直鎖ＥＧＦ溶液をＫｒｏｍａｓｉｌ Ｃ－１８， １００Ａ， １３μｍを充填した分取ＨＰＬＣカラムに直接ロードする。未精製のネイティブｈ－ＥＧＦは、２段階の精製プロセスで精製され、１回目は０．１％ＴＦＡで、そして、２回目は重炭酸アンモニウム（ｐＨ７．８）で精製する。有機修飾剤にはアセトニトリルを使用する。純度９８％以上のネイティブＥＧＦを含むフラクションをさらに凍結乾燥する。最終収量 １．０４ｇ（７０％）

【0152】

Ｆｍｏｃ－ＴＧＦ（３８－５０）－ＯＨの合成：
７０ｇの２－クロロトリチルクロリドレジンを３５０ｍｌのＤＣＭで膨潤する。４８ｍｌのＤＩＰＥＡと１０ｇのＦｍｏｃ－Ａｌａ－ＯＨを加える。前記反応を３時間放置し、そして、２１ｍｌのメタノールを加える。前記レジンを濾過し、そして、２５０ｍｌのＤＣＭ／ＭｅＯＨ／ＤＩＰＥＡで中和する。Ｆｍｏｃ－開裂は、２３０ｍｌのピペリジン／ＮＭＰ（１５％）の混合物の添加で行われる。すべてのカップリングは、ＮＭＰ（０．５Ｍ）中の２．５ｍｍｏｌ過剰のＦｍｏｃ－アミノ酸／ＨＯＢｔ／ＤＩＣ（１：１．２：１．１）で行った。前記保護されたペプチドを、４９０ｍｌのＴＦＡ／ＤＣＭ（２％）の混合物でレジンから開裂する。ＴＦＡを水（４９０ｍｌ）で抽出し、そして、縮合後、ヘキサン（１４００ｍｌ）を加えて、ペプチドを沈殿する。最終収量 ５９ｇ（８３％）。

【0153】

Ｆｍｏｃ－ＴＧＦ（３８－５０）－ＯＨのクロロトリチル保護：
６５ｇの前記保護されたペプチドを１３００ｍｌのＤＣＭに溶解し、そして、１６ｇの２－クロロトリチルクロライドと１７．５ｍｌのＤＩＰＥＡを添加する。前記反応は２時間放置し、そして、ＨＰＬＣでモニターする。ＤＩＰＥＡをジクロロメタン混合物から１３００ｍｌの０．１Ｎ塩酸で抽出し、そして、Ｆｍｏｃ－ＴＧＦ（３８－５０）－ＯＣｌｔを１４００ｍｌのヘキサンで縮合した後に沈殿させ、そして、真空下で乾燥させる。Ｆｍｏｃ開裂は、ＮＭＰ（１５ｍｌ）中の６ｍｍｏｌ過剰のピペリジンで行う。４８０ｍｌのＤＣＭを前記反応混合物中に加え、そして、ピペリジンを４８０ｍｌの０．０１Ｎ塩酸でジクロロメタン溶液から抽出する。Ｈ－ＴＧＦ（３８－５０）－ＯＣｌｔを１４００ｍｌのヘキサンで縮合した後に沈殿させ、４００ｍｌのジエチルエーテルで６回洗浄し、そして、真空下で乾燥する。最終収量 ５６ｇ（９５％）

【0154】

Ｆｍｏｃ－ＴＧＦ（２０－３７）－ＯＨの合成：
７０ｇの２－クロロトリチルクロライドレジンを３５０ｍｌのＤＣＭで膨潤する。４８ ｍｌのＤＩＰＥＡと８．４ｇのＦｍｏｃ－Ｇｌｙ－ＯＨを加える。前記反応を３時間放置し、そして、２１ｍｌのメタノールを添加する。前記レジンを濾過し、そして、２５０ｍｌのＤＣＭ／ＭｅＯＨ／ＤＩＰＥＡで中和する。Ｆｍｏｃ－開裂は、２３０ｍｌのピペリジン／ＮＭＰ（１５％）の混合物の添加で行う。全てのカップリングは、ＮＭＰ（０．５Ｍ）中の２．５ｍｍｏｌ過剰のＦｍｏｃ－アミノ酸／ＨＯＢｔ／ＤＩＣ（１：１．２：１．１）で行った。前記保護されたペプチドを、４９０ｍｌのＴＦＡ／ＤＣＭ（２％）の混合物でレジンから開裂する。ＴＦＡを水（４９０ｍｌ）で抽出し、そして、縮合後、ヘキサン（１４００ｍｌ）を加えて、ペプチドを沈殿する。最終収量 ６９ｇ（６％）。

【0155】

Ｂｏｃ－ＴＧＦ（１－１９）－ＯＨの合成：
７０ｇの２－クロロトリチルクロライドレジンを３５０ｍｌのＤＣＭで膨潤する。４８ ｍｌのＤＩＰＥＡと８．４ｇのＦｍｏｃ－Ｇｌｙ－ＯＨを加える。前記反応を３時間放置し、そして、２１ｍｌのメタノールを添加する。前記レジンを濾過し、そして、２５０ｍｌのＤＣＭ／ＭｅＯＨ／ＤＩＰＥＡで中和する。Ｆｍｏｃ－開裂は、２３０ｍｌのピペリジン／ＮＭＰ（１５％）の混合物の添加で行う。全てのカップリングは、ＮＭＰ（０．５Ｍ）中の２．５ｍｍｏｌ過剰のＦｍｏｃ－アミノ酸／ＨＯＢｔ／ＤＩＣ（１：１．２：１．１）で行った。保護されたペプチドを、４９０ｍｌのＴＦＡ／ＤＣＭ（２％）の混合物で樹脂から開裂させる。ＴＦＡを水（４９０ｍｌ）で抽出し、縮合後、ヘキサン（２０００ｍｌ）を加えて、ペプチドを沈殿させる。最終収量８３ｇ（８０％）。

【0156】

保護されたＴＧＦ（１－５０）の合成：
６５ｇのＦｍｏｃ－ＴＧＦ（２０－３７）－ＯＨを１２０ｍｌのＮＭＰ中のＨＯＢｔ．Ｈ_２Ｏ（２．５ｇ）とＥＤＡＣ．ＨＣｌ（２．８３ｇ）で活性化し、そして、Ｈ－ＴＧＦ（３８－５０）－ＯＣＴ（３７ｇ）を、前記活性化保護されたペプチド中に加える。前記反応の完了は、ＨＰＬＣでモニターする。Ｆｍｏｃ－ＴＧＦ（２０－３７）－ＯＨが対応するＦｍｏｃ－ＴＧＦ（２０－５０）－ＯＣｌｔと比較して面積で＜０．５％であるとき、Ｆｍｏｃ－開裂のためにピペリジン８ｍｌを添加する。反応混合物中に３６０ｍｌのＤＣＭを加え、そして、ピペリジンを３６０ｍｌの０．０１Ｎ塩酸でジクロロメタン溶液から抽出する。Ｈ－ＴＧＦ（２０－５０）－ＯＣｌｔを１７００ｍｌのヘキサンで縮合した後に沈殿させ、４２０ｍｌのジエチルエーテルで６回洗浄し、そして、真空下で乾燥する。最終収量 ８０．２ｇ （９５％）

【0157】

４００ｍｌのＮＭＰに溶解した保護された７８ｇのＨ－ＴＧＦ（２０－５０）－ＯＣｌｔに、２８０ｍｌのＮＭＰに溶解した前記活性化Ｂｏｃ－ＴＧＦ（１－１９）－ＯＨ （５５ｇ）， ＨＯＢｔ．Ｈ_２Ｏ （２．４ｇ）， ＥＤＡＣ．ＨＣｌ（２．７３ｇ）を加える。前記反応はＨＰＬＣでモニターする。Ｈ－ＴＧＦ（２０－５０）－ＯＣｌｔが未精製のＥＧＦと比較して面積で＜１％の時、３．２Ｌｔの水を加えて反応を停止させ、そして、濾過する。最終的に保護されたペプチドを水（８００ｍｌ）で３回洗浄し、そして、水分含有量が＜３％になるまで真空下で乾燥する。最終収量 １２１ｇ（９８％）

【0158】

保護されたＴＧＦ（１－５０）ヨウ素酸化：
前記保護されたペプチド（１１０ｇ）を１０００ｍｌのＤＣＭに溶解し、そして、６００ｍｌの１％ＴＦＡ／ＤＣＭ中のヨウ素溶液（５．４ｇ）を添加する。前記反応を１時間放置し、そして、硫酸ナトリウム五水和物（９．６ｇ）の水溶液（１．６Ｌｔ）を加える。ＤＣＭ／ ペプチド溶液を１．６Ｌｔの水でさらに２回抽出し、真空下で濃縮し、ヘキサン（１．２Ｌｔ）で沈殿させ、そして、ジエチルエーテル（４４０ｍｌ）で３回洗浄する。最終収量 ８６ｇ（９７％）

【0159】

全体的な脱保護：
８０ｇのＢｏｃ－ΤＧＦ（１－５０）－ＯＣｌｔを、ＴＦＡ／Ｈ_２Ｏ／ＤＴＴ（９４：３：３）からなる混合物５．３Ｌｔの添加により、２．５時間ＲＴで、その保護基から脱保護する。前記ＤＴＴはスカベンジャーとして機能し、そして、起こり得る早期の酸化を回避する。前記反応を真空下で濃縮し、そして、未精製の直鎖状ＥＧＦを１０００ｍｌのジエチルエーテルの添加により沈殿させ、そして、ジエチルエーテル（２５０ｍｌ）で３回洗浄する。最終収量４８．６ｇ（９７％）

【0160】

ＤＭＳＯ／ＤＴＴ酸化：
未精製の直鎖上ＴＧＦ（４５ｇ）を６ＬｔのＤＭＳＯに溶解し、そして、Ｔｒｉｓ（２２０ｇ）と塩酸グアニジン（２８０ｇ）を含む水溶液（２４Ｌｔ）をＲＴで添加する。塩酸グアニジンはカオトロープとして機能する。前記反応は２４時間放置し、そして、その完了をＨＰＬＣでモニターする。最終収率２２％。

【0161】

ＨＰＬＣ精製：
０．２％ＴＦＡで酸性化した後、前記未精製の直鎖ＴＧＦ溶液をＫｒｏｍａｓｉｌ Ｃ－１８， １００Ａ， １３μｍを充填した分取ＨＰＬＣカラムに直接ロードする。未精製のネイティブｈ－ＴＧＦは、２段階の精製プロセスで精製され、１回目は０．１％ＴＦＡで、そして、２回目は重炭酸アンモニウム（ｐＨ６）で精製する。アセトニトリルを有機修飾剤として使用する。純度９７％以上のネイティブＴＧＦを含むフラクションをさらに凍結乾燥する。最終収量 ２．１ｇ（７８％）

【0162】

本発明の説明された態様の様々な修正および変形は、本発明の範囲および精神から逸脱することなく、当業者に明らかであろう。本発明は、特定の好ましい実施形態に関連して説明されてきたが、請求される本発明は、そのような特定の実施形態に不当に制限されるべきではないと理解されるべきである。実際、関連分野の当業者に明らかな、本発明を実施するための記載された態様の様々な修正は、以下の請求項の範囲内にあることを意図されている。

【配列表】

2023551431000001.app

【国際調査報告】