特表 2023-551440 持効型神経成長因子ポリペプチド及びその用途

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-12-08

(54)【発明の名称】持効型神経成長因子ポリペプチド及びその用途

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/62 20060101AFI20231201BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20231201BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20231201BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20231201BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20231201BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20231201BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20231201BHJP

   A61K 38/18 20060101ALI20231201BHJP

   A61P 25/00 20060101ALI20231201BHJP

   A61P 27/16 20060101ALI20231201BHJP

   A61P 17/02 20060101ALI20231201BHJP

   A61P 9/10 20060101ALI20231201BHJP

   A61P 21/00 20060101ALI20231201BHJP

   A61P 27/02 20060101ALI20231201BHJP

   A61P 27/06 20060101ALI20231201BHJP

   A61P 13/00 20060101ALI20231201BHJP

   A61P 25/28 20060101ALI20231201BHJP

   A61P 25/16 20060101ALI20231201BHJP

   A61P 25/14 20060101ALI20231201BHJP

   A61P 9/00 20060101ALI20231201BHJP

   A61P 17/00 20060101ALI20231201BHJP

   A61P 7/00 20060101ALI20231201BHJP

   A61P 15/00 20060101ALI20231201BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20231201BHJP

   A61P 37/06 20060101ALI20231201BHJP

   A61P 1/16 20060101ALI20231201BHJP

   A61P 1/02 20060101ALI20231201BHJP

   A61K 47/68 20170101ALI20231201BHJP

   C07K 14/48 20060101ALN20231201BHJP

   C07K 16/00 20060101ALN20231201BHJP

   C12N 15/13 20060101ALN20231201BHJP

   C12N 15/12 20060101ALN20231201BHJP

【ＦＩ】

C12N15/62 Z

C07K19/00 ZNA

C12N15/63 Z

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

A61K38/18

A61P25/00

A61P27/16

A61P17/02

A61P9/10

A61P21/00

A61P27/02

A61P27/06

A61P13/00

A61P25/28

A61P25/16

A61P25/14

A61P9/00

A61P17/00

A61P7/00

A61P15/00

A61P29/00 101

A61P37/06

A61P1/16

A61P1/02

A61K47/68

C07K14/48

C07K16/00

C12N15/13

C12N15/12

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023530581

(86)(22)【出願日】2021-11-19

(85)【翻訳文提出日】2023-07-10

(86)【国際出願番号】 CN2021131614

(87)【国際公開番号】W WO2022105847

(87)【国際公開日】2022-05-27

(31)【優先権主張番号】PCT/CN2020/129925

(32)【優先日】2020-11-19

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】521225823

【氏名又は名称】舒泰神（北京）生物製薬股フン有限公司

【氏名又は名称原語表記】ＳＴＡＩＤＳＯＮ （ＢＥＩＪＩＮＧ） ＢＩＯＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬＳ ＣＯ．， ＬＴＤ．

【住所又は居所原語表記】Ｎｏ．３６， Ｊｉｎｇｈａｉ Ｅｒ Ｒｏａｄ， Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｅｃｏｎｏｍｉｃ－Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ａｒｅａ Ｂｅｉｊｉｎｇ １００１７６， Ｃｈｉｎａ

(74)【代理人】

【識別番号】110000084

【氏名又は名称】弁理士法人アルガ特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】リ，ピン

(72)【発明者】

【氏名】ツェン，レイ

【テーマコード（参考）】

4B065

4C076

4C084

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B065AA93X

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA24

4B065CA44

4C076AA94

4C076BB01

4C076BB13

4C076BB15

4C076BB16

4C076BB21

4C076BB24

4C076BB25

4C076BB29

4C076BB30

4C076BB31

4C076CC01

4C076CC29

4C076EE41

4C076EE59

4C076FF31

4C084AA02

4C084AA07

4C084BA01

4C084BA02

4C084BA08

4C084BA21

4C084BA22

4C084BA23

4C084BA41

4C084CA53

4C084DB59

4C084MA52

4C084MA55

4C084MA56

4C084MA58

4C084MA59

4C084MA60

4C084MA63

4C084MA65

4C084MA66

4C084NA12

4C084NA14

4C084ZA011

4C084ZA012

4C084ZA021

4C084ZA022

4C084ZA151

4C084ZA152

4C084ZA161

4C084ZA162

4C084ZA331

4C084ZA332

4C084ZA341

4C084ZA342

4C084ZA361

4C084ZA362

4C084ZA511

4C084ZA512

4C084ZA671

4C084ZA672

4C084ZA751

4C084ZA752

4C084ZA811

4C084ZA812

4C084ZA891

4C084ZA892

4C084ZA941

4C084ZA942

4C084ZA961

4C084ZA962

4C084ZB081

4C084ZB082

4C084ZB151

4C084ZB152

4H045AA10

4H045AA30

4H045BA41

4H045DA21

4H045DA75

4H045EA28

4H045FA72

4H045FA74

4H045GA26

(57)【要約】

本発明は、Ｎ端からＣ端までＮＧＦ部分とＦｃ部分とを含む持効型神経成長因子（ＮＧＦ）ポリペプチド、及びその製造方法と用途に関する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

Ｎ端からＣ端までＮＧＦ部分とＦｃ部分とを含むポリペプチドであって、前記ＮＧＦ部分は配列番号１～３のうちのいずれか１つで示されるアミノ酸配列を含み、前記Ｆｃ部分はＩｇＧ１ Ｆｃ又はＩｇＧ４ Ｆｃに由来する、持効型神経成長因子（ＮＧＦ）ポリペプチド。

【請求項2】

前記ＮＧＦ部分がポリペプチドリンカーを介してＦｃ部分に融合されている、請求項１に記載の持効型ＮＧＦポリペプチド。

【請求項3】

前記ポリペプチドリンカーが配列番号６８～７２のうちのいずれか１つで示されるアミノ酸配列を含む、請求項２に記載の持効型ＮＧＦポリペプチド。

【請求項4】

前記ポリペプチドリンカーがアミノ酸配列（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号７０、ただし、前記ｎが１、２、３、４、５及び６のうちのいずれか１つである）を含む、請求項２又は３に記載の持効型ＮＧＦポリペプチド。

【請求項5】

前記Ｆｃ部分が配列番号７又は８のアミノ酸配列を含むＩｇＧ１ Ｆｃに由来する、請求項１～４のいずれか１項に記載の持効型ＮＧＦポリペプチド。

【請求項6】

前記Ｆｃ部分が、配列番号８に対するＥ２３３、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｇ２３６、Ｇ２３７、Ｎ２９７、Ａ３２７、Ａ３３０及びＰ３３１から選択された１つ又は複数の位置に変異を含む、請求項５に記載の持効型ＮＧＦポリペプチド。

【請求項7】

前記Ｆｃ部分が、配列番号８に対してＥ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ｖ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｇ２３６ｄｅｌ、Ｇ２３７Ａ、Ｎ２９７Ａ、Ａ３２７Ｇ、Ａ３３０Ｓ及びＰ３３１Ｓから選択された１つ又は複数の変異を含む、請求項５又は６に記載の持効型ＮＧＦポリペプチド。

【請求項8】

前記Ｆｃ部分が、配列番号７又は８のアミノ酸配列の最初の５個のアミノ酸をさらに欠失している、請求項５～７のいずれか１項に記載の持効型ＮＧＦポリペプチド。

【請求項9】

前記Ｆｃ部分が、配列番号８に対してＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、およびＰ３３１Ｓ変異を含む、請求項５～８のいずれか１項に記載の持効型ＮＧＦポリペプチド。

【請求項10】

前記Ｆｃ部分が配列番号１１又は１２のアミノ酸配列を含む、請求項９に記載の持効型ＮＧＦポリペプチド。

【請求項11】

前記持効型ＮＧＦポリペプチドが、配列番号６２～６４のうちのいずれか１つで示されるアミノ酸配列を含む、請求項９に記載の持効型ＮＧＦポリペプチド。

【請求項12】

前記Ｆｃ部分が、配列番号８に対してＥ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ｖ、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３６ｄｅｌ、Ａ３２７Ｇ、Ａ３３０Ｓ及びＰ３３１Ｓ変異を含む、請求項５～８のいずれか１項に記載の持効型ＮＧＦポリペプチド。

【請求項13】

前記Ｆｃ部分が配列番号１５又は１６のアミノ酸配列を含む、請求項１２に記載の持効型ＮＧＦポリペプチド。

【請求項14】

前記持効型ＮＧＦポリペプチドが配列番号６６のアミノ酸配列を含む、請求項１３に記載の持効型ＮＧＦポリペプチド。

【請求項15】

前記Ｆｃ部分が、配列番号８に対してＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｇ２３７Ａ、Ａ３３０Ｓ及びＰ３３１Ｓ変異を含む、請求項５～８のいずれか１項に記載の持効型ＮＧＦポリペプチド。

【請求項16】

前記Ｆｃ部分が配列番号１３又は１４のアミノ酸配列を含む、請求項１５に記載の持効型ＮＧＦポリペプチド。

【請求項17】

前記持効型ＮＧＦポリペプチドが配列番号６５のアミノ酸配列を含む、請求項１６に記載の持効型ＮＧＦポリペプチド。

【請求項18】

前記Ｆｃ部分が配列番号８に対してＮ２９７Ａ変異を含む、請求項５～８のいずれか１項に記載の持効型ＮＧＦポリペプチド。

【請求項19】

前記Ｆｃ部分が配列番号９又は１０のアミノ酸配列を含む、請求項１８に記載の持効型ＮＧＦポリペプチド。

【請求項20】

前記持効型ＮＧＦポリペプチドが配列番号６１のアミノ酸配列を含む、請求項１９に記載の持効型ＮＧＦポリペプチド。

【請求項21】

前記Ｆｃ部分が配列番号１７のアミノ酸配列を含むＩｇＧ４ Ｆｃに由来する、請求項１～４のいずれか１項に記載の持効型ＮＧＦポリペプチド。

【請求項22】

前記Ｆｃ部分が、配列番号１７に対するＳ２２８、Ｆ２３４及びＬ２３５から選択された１つ又は複数の位置に変異を含む、請求項２１に記載の持効型ＮＧＦポリペプチド。

【請求項23】

前記Ｆｃ部分が、配列番号１７に対してＳ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ及びＬ２３５Ａから選択された１つ又は複数の変異を含む、請求項２１又は２２に記載の持効型ＮＧＦポリペプチド。

【請求項24】

前記Ｆｃ部分が配列番号１８のアミノ酸配列を含む、請求項２１～２３のいずれか１項に記載の持効型ＮＧＦポリペプチド。

【請求項25】

前記持効型ＮＧＦポリペプチドが配列番号６７のアミノ酸配列を含む、請求項２４に記載の持効型ＮＧＦポリペプチド。

【請求項26】

静脈注射、筋肉注射、眼内注射又は皮下注射によってヒト個体に投与された場合、少なくとも１０時間の半減期を有する、請求項１～２５のいずれか１項に記載の持効型ＮＧＦポリペプチド。

【請求項27】

前記持効型ＮＧＦポリペプチドは、配列番号３又は４のアミノ酸配列を有するＮＧＦ部分を含むＮＧＦポリペプチドと比較して、引き起こした痛みが少ない、請求項１～２６のいずれか１項に記載の持効型ＮＧＦポリペプチド。

【請求項28】

請求項１～２７のいずれか１項に記載の持効型ＮＧＦポリペプチドをコードする、単離された核酸。

【請求項29】

請求項２８に記載の核酸を含む、ベクター。

【請求項30】

請求項２９に記載のベクターを含む、宿主細胞。

【請求項31】

請求項１～２７のいずれか１項に記載の持効型ＮＧＦポリペプチドと、薬学的に許容されるキャリア及び／又は賦形剤とを含む、医薬組成物。

【請求項32】

ＮＧＦ関連疾患を治療するための医薬品の調製における、請求項１～２７のいずれか１項に記載の持効型ＮＧＦポリペプチド、請求項２８に記載の単離された核酸、請求項２９に記載のベクター、請求項３０に記載の宿主細胞、又は請求項３１に記載の医薬組成物、の使用。

【請求項33】

前記ＮＧＦ関連疾患が神経系疾患である、請求項３２に記載の使用。

【請求項34】

前記神経系疾患が、新生児低酸素性虚血性脳症、脳性麻痺、重症疾患ミオパシー、神経性難聴、反回神経損傷、外傷性脳損傷、歯神経損傷、脳卒中、ダウン症、筋萎縮性脊髓側索硬化症、多発性硬化症、脊髓性筋萎縮症、びまん性脳損傷、胸腺異形成、視神経挫傷、濾胞性異形成、脊髓損傷、緑内障、神経栄養性角膜炎、視神経損傷、視神経脊髄炎、網膜関連疾患、尿失禁、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、認知症、高血圧性脳出血神経機能障害、脳小血管疾患、急性虚血性脳卒中、角膜内皮ジストロフィー、糖尿病性神経障害、糖尿病性足潰瘍、神経性皮膚潰瘍、褥瘡、神経栄養性角膜潰瘍、糖尿病性角膜潰瘍及び黄斑円孔からなる群より選択される、請求項３３に記載の使用。

【請求項35】

前記神経系疾患が、糖尿病性神経障害、アルツハイマー病、又は神経栄養性角膜炎である、請求項３３又は３４に記載の使用。

【請求項36】

前記ＮＧＦ関連疾患が非神経系疾患である、請求項３２に記載の使用。

【請求項37】

前記非神経系疾患が、脾臓萎縮、脾臓挫傷、卵巣予備能低下、早発卵巣不全、卵巣過剰刺激症候群、卵巣遺残症候群、卵胞異形成、精子形成障害（例えば、精子軽減症、精子無力症、精子軽減無力症）、虚血性潰瘍、ストレス性潰瘍、リウマチ性潰瘍、肝線維症、角膜潰瘍、火傷、口腔潰瘍及び静脈性下肢潰瘍からなる群より選択される、請求項３６に記載の使用。

【請求項38】

前記非神経系疾患が早発卵巣不全又は精子形成障害である、請求項３６又は３７に記載の使用。

【請求項39】

前記医薬組成物が一個体当たり０．０１μｇ～１０００μｇの用量で投与される、請求項３２～３８のいずれか１項に記載の使用。

【請求項40】

前記医薬組成物が１週間に１回又は１ヶ月間に１回の投与頻度で投与される、請求項３２～３９のいずれか１項に記載の使用。

【請求項41】

前記医薬組成物が、経口、皮下、静脈、脳内、鼻腔内、経皮、腹腔内、筋肉内、肺内、膣内、直腸内、又は眼内より投与されるか、或いは局所に投与される、請求項３２～４０のいずれか１項に記載の使用。

【発明の詳細な説明】

【相互参照】

【0001】

本出願は、２０２０年１１月１９日に出願された国際特許出願Ｎｏ．ＰＣＴ／ＣＮ２０２０／１２９９２５の優先権を主張し、その全ての内容が参照により本明細書に組み込まれる。
（配列表をＡＳＣＩＩ ＴＥＸＴテキストファイルとして提出）

【0002】

以下に提出されたＡＳＣＩＩ ＴＥＸＴテキストファイル（ファイル名：２０２００９０９４９８２＿ＳＥＱＬＩＳＴ．ｔｘｔ、記録日：２０２０．０９．０９、サイズ：１６９ＫＢ）の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる：コンピューター読み取り可能な形式（ＣＲＦ）の配列表。

【技術分野】

【0003】

本発明は、Ｎ端からＣ端までＮＧＦ部分とＦｃ部分とを含む持効型神経成長因子（ＮＧＦ）ポリペプチド、及びその製造方法と用途に関する。

【背景技術】

【0004】

神経栄養因子は、脊椎動物の神経系の発生及び成熟段階におけるニューロンの生存と維持に重要な、相同性の高い成長因子のファミリーである。神経栄養因子の産生が制限されるのは、末梢神経系（ＰＮＳ）又は中枢神経系（ＣＮＳ）ニューロンの変性又は死亡につながる恐れがある。

【0005】

神経成長因子（ＮＧＦ）は、神経栄養因子ファミリー中の最初に発見されたメンバーであり、１９５３年にイタリアの科学者Ｌｅｖｉ－Ｍｏｎｔｌｃｉｎｉによってマウスの肉腫細胞で最初に発見された。ＮＧＦは神経成長調節因子であり、ニューロンに栄養を提供し、神経突起成長を促進するという２つの生物学的機能を持ち、中枢及び末梢神経ニューロンの発生、分化、成長、再生及び機能発現において重要な調節的役割を果たす。ＮＧＦはα、β及びγの３つのサブユニットを含む。βサブユニットは、２本の一本鎖が非共有結合で結合した活性領域である。

【0006】

ＮＧＦは何十年も研究されてきた。しかし、実用化における制限や問題などの根本的な原因で、市販されているＮＧＦ製品は非常に少なく、その大半の製品は主に角膜潰瘍、視神経挫傷及び視覚障害などの眼科疾患の治療に使用されるものである。

【0007】

他のタンパク質と同様に、ＮＧＦの生物活性はその二次構造と三次構造に依存するため、調製、精製、保存及び投与中にその生物活性を維持することが特に重要である。

【0008】

さらに、治療中、ＮＧＦは一部の患者に耐え難い疼痛を引き起こすことが、その使用をある程度制限している。疼痛は、神経生理学的メカニズムに従って、感覚痛と神経因性疼痛の２つに分類される。前者は、侵害刺激によって直接引き起こされ、組織損傷又は炎症反応に関連し、炎症性疼痛とも呼ばれる。後者は、体性感覚神経系損傷又は疾患によって直接引き起こされる慢性疼痛である。ＮＧＦは、炎症媒質の放出、イオンチャネルの開放及び神経線維の成長の促進に影響を与えることで疼痛を引き起こし、疼痛の病態生理学的プロセスに関与する。イオンチャネルと分子シグナル伝達を調節することで疼痛の発生に関与する。一部の学者は、ＮＧＦが疼痛誘発物質の発現を促進することによって疼痛を引き起こす場合もあり、しかも生物の損傷後のニューロンの出芽と再生を変化させる可能性があると推測している。研究によると、ヒトに痛覚過敏を引き起こさないＮＧＦの最大投与量は０．０３μｇ／ｋｇであった（Ｐｅｔｔｙ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ Ｎｅｕｒｏｌ．１９９４, ３６（２）：２４４－２４６）。しかしながら、このような低用量はＮＧＦの適用を制限し、中枢神経系などの適応症の拡大も制限する。

【0009】

ＮＧＦは、タンパク質薬剤として、神経成長を促進する活性部分が主にβ－ＮＧＦにある。β－ＮＧＦは、沈降係数が２．５Ｓ、分子量が１３．５ＫＤａであり、そして代謝過程で糸球体によって容易にろ過されるため、体内での半減期が短くなる。研究によると、β－ＮＧＦ薬剤が１日１回の注射頻度としてマウスに筋肉注射されると、Ｔ１／２（β）＝２．２ｈ、Ｔｍａｘ＝０．５ｈであった。ＮＧＦは、注射期限において注射部位又は注射側下肢に有害な疼痛反応を示すために、総投与回数及び投与頻度を減らすことが望ましい。

【0010】

本明細書で言及されるすべての刊行物、特許、特許出願及び開示された特許出願の開示は、参照によりその全部が本明細書に組み込まれる。

【発明の概要】

【0011】

本発明の一態様は、Ｎ端からＣ端までＮＧＦ部分とＦｃ部分とを含むポリペプチドであって、前記ＮＧＦ部分が配列番号１～４のうちのいずれか１つで示されるアミノ酸配列（例えば、配列番号１～３のうちのいずれか１つで示されるアミノ酸配列）を含み、前記Ｆｃ部分がＩｇＧ１ Ｆｃ又はＩｇＧ４ Ｆｃに由来する、持効型神経成長因子（ＮＧＦ）ポリペプチドに関する。

【0012】

いくつかの実施形態において、上記のいずれかの持効型ＮＦＧポリペプチドは、ＮＧＦ部分がペプチドリンカーを介してＦｃ部分に融合されている。いくつかの実施形態において、ペプチドリンカーは、配列番号６８～９９のうちのいずれか１つで示されるアミノ酸配列を含み、例えば、配列番号６８～７２或いは配列番号６８又は６９のうちのいずれか１つで示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ペプチドリンカーは、アミノ酸配列（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号７０、ただし、ｎは１、２、３、４、５又は６である）を含む。

【0013】

いくつかの実施形態において、上記のいずれかの持効型ＮＧＦポリペプチドは、Ｆｃ部分が配列番号７又は８のアミノ酸配列を含むＩｇＧ１ Ｆｃに由来する。いくつかの実施形態において、Ｆｃ部分は、配列番号８に対するＥ２３３、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｇ２３６、Ｇ２３７、Ｎ２９７、Ａ３２７、Ａ３３０及びＰ３３１から選択された１つ又は複数の位置に変異を含む。いくつかの実施形態において、Ｆｃ部分は、配列番号８に対して、Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ｖ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｇ２３６ｄｅｌ、Ｇ２３７Ａ、Ｎ２９７Ａ、Ａ３２７Ｇ、Ａ３３０Ｓ及びＰ３３１Ｓから選択された１つ又は複数の変異を含む。いくつかの実施形態において、Ｆｃ部分は、配列番号７又は８の最初の５個のアミノ酸をさらに欠失している。いくつかの実施形態において、Ｆｃ部分は、配列番号８に対してＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、およびＰ３３１Ｓ変異を含む。いくつかの実施形態において、Ｆｃ部分は配列番号１１又は１２のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、持効型ＮＧＦポリペプチドは配列番号６２～６４のうちのいずれか１つで示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、Ｆｃ部分は、配列番号８に対してＥ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ｖ、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３６ｄｅｌ、Ａ３２７Ｇ、Ａ３３０Ｓ及びＰ３３１Ｓ変異を含む。いくつかの実施形態において、Ｆｃ部分は配列番号１５又は１６のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、持効型ＮＧＦポリペプチドは配列番号６６のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、Ｆｃ部分は、配列番号８に対してＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｇ２３７Ａ、Ａ３３０Ｓ及びＰ３３１Ｓ変異を含む。いくつかの実施形態において、Ｆｃ部分は配列番号１３又は１４のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、持効型ＮＧＦポリペプチドは配列番号６５のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、Ｆｃ部分は配列番号８に対してＮ２９７Ａ変異を含む。いくつかの実施形態において、Ｆｃ部分は配列番号９又は１０のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、持効型ＮＧＦポリペプチドは配列番号６１のアミノ酸配列を含む。

【0014】

いくつかの実施形態において、上記のいずれかの持効型ＮＧＦポリペプチドは、Ｆｃ部分が、配列番号１７のアミノ酸配列を含むＩｇＧ４ Ｆｃに由来する。いくつかの実施形態において、Ｆｃ部分は、配列番号１７に対するＳ２２８、Ｆ２３４及びＬ２３５から選択された１つ又は複数の位置に変異を含む。いくつかの実施形態において、Ｆｃ部分は、配列番号１７に対してＳ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ及びＬ２３５Ａから選択された１つ又は複数の変異を含む。いくつかの実施形態において、Ｆｃ部分は配列番号１８のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、持効型ＮＧＦポリペプチドは配列番号６７のアミノ酸配列を含む。

【0015】

いくつかの実施形態において、上記のいずれかの持効型ＮＧＦポリペプチドは、静脈注射、筋肉注射又は皮下注射によって個体（例えば、ヒト）に投与された場合、持効型ＮＧＦポリペプチドの半減期が、少なくとも１０時間（例えば、半減期が１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、７０、８０、９０および１００時間のうちの少なくとも一つである）である。

【0016】

いくつかの実施形態において、上記のいずれかの持効型ＮＧＦポリペプチドは、配列番号４のアミノ酸配列のＮＧＦ部分を含むＮＧＦポリペプチドと比較して、引き起こした痛みが少ない（例えば、痛みを少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％減らす）。

【0017】

また、本発明の他の態様は、本明細書に記載されている任意の持効型ＮＧＦポリペプチドをコードする単離された核酸、前記核酸を含むベクター、前記核酸又はベクターを含む宿主細胞（例えば、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、Ｈｅｌａ細胞又はＣＯＳ細胞）、組成物（例えば、医薬組成物）又はキット、及び本明細書に記載されている任意の持効型ＮＧＦポリペプチドを含む製品に関する。本発明の別の態様は、個体（例えば、ヒト）におけるＮＧＦ関連疾患（例えば、神経系疾患又は非神経系疾患）を治療するために、本明細書に記載されている任意の持効型ＮＧＦポリペプチド又はそれを含む医薬組成物を使用する方法に関する。

【図面の簡単な説明】

【0018】

【図1A】図１Ａは、ヒト野生型ＩｇＧ１ Ｆｃ ＩＧＨＧ１＊０５とＩｇＧ１ Ｆｃ天然変異体ＩＧＨＧ１＊０３（図１Ａ）の配列アラインメントを示すものである。

【図1B】図１Ｂは、修飾されたＩｇＧ１ Ｆｃ Ｍ１－５とＩＧＨＧ１＊０３（図１Ｂ）配列アラインメントを示すものである。

【図1C】図１Ｃは、修飾されたＩｇＧ１ Ｆｃ Ｍ３－５とＩＧＨＧ１＊０３（図１Ｃ）配列アラインメントを示すものである。

【図1D】図１Ｄは、修飾されたＩｇＧ１ Ｆｃ Ｍ５－５とＩＧＨＧ１＊０３（図１Ｄ）の配列アラインメントを示すものである。

【図1E】図１Ｅは、修飾されたＩｇＧ１ Ｆｃ Ｍ７とＩＧＨＧ１＊０３（図１Ｅ）配列アラインメントを示すものである。

【図1F】図１Ｆは、修飾されたＩｇＧ４ Ｆｃとヒト野生型ＩｇＧ４ Ｆｃ（図１Ｆ）の配列アラインメントを示すものである。

【図2】図２は、シグナルペプチド（ＳＰ）、プロペプチド及び成熟ＮＧＦを含むプレプロＮＧＦ構造を示すものである。主要な切断部位でのフリン切断は、プロＮＧＦから成熟ＮＧＦへのプロセッシングの責任を担当する。

【図3A】図３Ａは、サイズ除去クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により測定した４０℃安定性加速試験における異なる時点での成熟ＮＧＦ－Ｆｃ融合タンパク質（ＮＧＦ－４－１２ＰＡＡ）の凝集体パーセンテージ、断片含有量パーセンテージ及び単量体含有量パーセンテージを示すものである。

【図3B】図３Ｂは、サイズ除去クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により測定した４０℃安定性加速試験における異なる時点での成熟ＮＧＦ－Ｆｃ融合タンパク質（ＦＤ－Ｇ４Ｆｃ）の凝集体パーセンテージ、断片含有量パーセンテージ及び単量体含有量パーセンテージを示すものである。

【図3C】図３Ｃは、サイズ除去クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により測定した４０℃安定性加速試験における異なる時点での成熟ＮＧＦ－Ｆｃ融合タンパク質（ＷＭ－Ｇ２４Ｆｃ）の凝集体パーセンテージ、断片含有量パーセンテージ及び単量体含有量パーセンテージを示すものである。

【図3D】図３Ｄは、サイズ除去クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により測定した４０℃安定性加速試験における異なる時点での成熟ＮＧＦ－Ｆｃ融合タンパク質（2-118-Ｌ３Ｇ４－ＢＭ）の凝集体パーセンテージ、断片含有量パーセンテージ及び単量体含有量パーセンテージを示すものである。

【図3E】図３Ｅは、サイズ除去クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により測定した４０℃安定性加速試験における異なる時点での成熟ＮＧＦ－Ｆｃ融合タンパク質（ＮＧＦ－１－１５Ｍ７）の凝集体パーセンテージ、断片含有量パーセンテージ及び単量体含有量パーセンテージを示すものである。

【図3F】図３Ｆは、サイズ除去クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により測定した４０℃安定性加速試験における異なる時点での成熟ＮＧＦ－Ｆｃ融合タンパク質（２-１-15Ｍ７）の凝集体パーセンテージ、断片含有量パーセンテージ及び単量体含有量パーセンテージを示すものである。

【図3G】図３Ｇは、サイズ除去クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により測定した４０℃安定性加速試験における異なる時点での成熟ＮＧＦ－Ｆｃ融合タンパク質（ＮＧＦ－Ｌ３Ｆｃ１０Ｍ７）の凝集体パーセンテージ、断片含有量パーセンテージ及び単量体含有量パーセンテージを示すものである。

【図3H】図３Ｈは、サイズ除去クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により測定した４０℃安定性加速試験における異なる時点での成熟ＮＧＦ－Ｆｃ融合タンパク質（2-Ｌ３Ｆｃ１０－Ｍ３－５）の凝集体パーセンテージ、断片含有量パーセンテージ及び単量体含有量パーセンテージを示すものである。

【図3I】図３Ｉは、サイズ除去クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により測定した４０℃安定性加速試験における異なる時点での成熟ＮＧＦ－Ｆｃ融合タンパク質（ＮＧＦ－１１８－Ｌ３Ｆｃ１０－Ｍ３－５）の凝集体パーセンテージ、断片含有量パーセンテージ及び単量体含有量パーセンテージを示すものである。

【図3J】図３Ｊは、サイズ除去クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により測定した４０℃安定性加速試験における異なる時点での成熟ＮＧＦ－Ｆｃ融合タンパク質（2-118-Ｌ３Ｆｃ１０－Ｍ３－５）の凝集体パーセンテージ、断片含有量パーセンテージ及び単量体含有量パーセンテージを示すものである。

【図3K】図３Ｋは、サイズ除去クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により測定した４０℃安定性加速試験における異なる時点での成熟ＮＧＦ－Ｆｃ融合タンパク質（2-118-ＬＦｃ１０－Ｍ１－５）の凝集体パーセンテージ、断片含有量パーセンテージ及び単量体含有量パーセンテージを示すものである。

【図3L】図３Ｌは、サイズ除去クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により測定した４０℃安定性加速試験における異なる時点での成熟ＮＧＦ－Ｆｃ融合タンパク質（2-118-Ｌ３Ｆｃ１０－Ｍ５－５）の凝集体パーセンテージ、断片含有量パーセンテージ及び単量体含有量パーセンテージを示すものである。

【図3M】図３Ｍは、サイズ除去クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により測定した４０℃安定性加速試験における異なる時点での成熟ＮＧＦ－Ｆｃ融合タンパク質（2-118-Ｌ３Ｆｃ１оＭ７－５）の凝集体パーセンテージ、断片含有量パーセンテージ及び単量体含有量パーセンテージを示すものである。

【図4A】図４Ａは、ドデシル硫酸ナトリウムキャピラリー電気泳動（ＣＥ－ＳＤＳ）法により測定した４０℃安定性加速試験における異なる時点での成熟ＮＧＦ－Ｆｃ融合タンパク質（ＮＧＦ－４－１２ＰＡＡ）の検出結果を示すものである。

【図4B】図４Ｂは、ドデシル硫酸ナトリウムキャピラリー電気泳動（ＣＥ－ＳＤＳ）法により測定した４０℃安定性加速試験における異なる時点での成熟ＮＧＦ－Ｆｃ融合タンパク質（ＦＤ－Ｇ４Ｆｃ）の検出結果を示すものである。

【図4C】図４Ｃは、ドデシル硫酸ナトリウムキャピラリー電気泳動（ＣＥ－ＳＤＳ）法により測定した４０℃安定性加速試験における異なる時点での成熟ＮＧＦ－Ｆｃ融合タンパク質（ＷＭ－Ｇ２４Ｆｃ）の検出結果を示すものである。

【図4D】図４Ｄは、ドデシル硫酸ナトリウムキャピラリー電気泳動（ＣＥ－ＳＤＳ）法により測定した４０℃安定性加速試験における異なる時点での成熟ＮＧＦ－Ｆｃ融合タンパク質（2-118-Ｌ３Ｇ４－ＢＭ）の検出結果を示すものである。

【図4E】図４Ｅは、ドデシル硫酸ナトリウムキャピラリー電気泳動（ＣＥ－ＳＤＳ）法により測定した４０℃安定性加速試験における異なる時点での成熟ＮＧＦ－Ｆｃ融合タンパク質（ＮＧＦ－１－１５Ｍ７）の検出結果を示すものである。

【図4F】図４Ｆは、ドデシル硫酸ナトリウムキャピラリー電気泳動（ＣＥ－ＳＤＳ）法により測定した４０℃安定性加速試験における異なる時点での成熟ＮＧＦ－Ｆｃ融合タンパク質（2-1-15Ｍ７）の検出結果を示すものである。

【図4G】図４Ｇは、ドデシル硫酸ナトリウムキャピラリー電気泳動（ＣＥ－ＳＤＳ）法により測定した４０℃安定性加速試験における異なる時点での成熟ＮＧＦ－Ｆｃ融合タンパク質（ＮＧＦ－Ｌ３Ｆｃ１０Ｍ７－５）の検出結果を示すものである。

【図4H】図４Ｈは、ドデシル硫酸ナトリウムキャピラリー電気泳動（ＣＥ－ＳＤＳ）法により測定した４０℃安定性加速試験における異なる時点での成熟ＮＧＦ－Ｆｃ融合タンパク質（2-Ｌ３Ｆｃ１０－Ｍ３－５）の検出結果を示すものである。

【図4I】図４Ｉは、ドデシル硫酸ナトリウムキャピラリー電気泳動（ＣＥ－ＳＤＳ）法により測定した４０℃安定性加速試験における異なる時点での成熟ＮＧＦ－Ｆｃ融合タンパク質（ＮＧＦ－１１８－Ｌ３Ｆｃ１０－Ｍ３－５）の検出結果を示すものである。

【図4J】図４Ｊは、ドデシル硫酸ナトリウムキャピラリー電気泳動（ＣＥ－ＳＤＳ）法により測定した４０℃安定性加速試験における異なる時点での成熟ＮＧＦ－Ｆｃ融合タンパク質（2-118-Ｌ３Ｆｃ１０－Ｍ３－５）の検出結果を示すものである。

【図4K】図４Ｋは、ドデシル硫酸ナトリウムキャピラリー電気泳動（ＣＥ－ＳＤＳ）法により測定した４０℃安定性加速試験における異なる時点での成熟ＮＧＦ－Ｆｃ融合タンパク質（2-118-Ｌ３Ｆｃ１０－Ｍ１－５）の検出結果を示すものである。

【図4L】図４Ｌは、ドデシル硫酸ナトリウムキャピラリー電気泳動（ＣＥ－ＳＤＳ）法により測定した４０℃安定性加速試験における異なる時点での成熟ＮＧＦ－Ｆｃ融合タンパク質（2-118-Ｌ３Ｆｃ１０－Ｍ５－５）の検出結果を示すものである。

【図4M】図４Ｍは、ドデシル硫酸ナトリウムキャピラリー電気泳動（ＣＥ－ＳＤＳ）法により測定した４０℃安定性加速試験における異なる時点での成熟ＮＧＦ－Ｆｃ融合タンパク質（2-118-Ｌ３Ｆｃ１０Ｍ７－５）の検出結果を示すものである。

【図5A】図５Ａは、各ＮＧＦ－Ｆｃ融合タンパク質処理下でのＴＦ－１細胞の増殖活性の結果を示すグラフである。ただし、ＳｕＴａｉＳｈｅｎｇ^RマウスＮＧＦ、ＮＧＦ改変体１１８ａａ（ｍＮＧＦ１１８）及び組換えヒトＮＧＦ（ｒｈＮＧＦ）は対照とした。

【図5B】図５Ｂは、各ＮＧＦ－Ｆｃ融合タンパク質処理下でのＴＦ－１細胞の増殖活性の結果を示すグラフである。ただし、ＳｕＴａｉＳｈｅｎｇ^RマウスＮＧＦ、ＮＧＦ改変体１１８ａａ（ｍＮＧＦ１１８）及び組換えヒトＮＧＦ（ｒｈＮＧＦ）は対照とした。

【図6A】図６Ａは、ラットにおける上頸神経節（ＳＣＧ）の成長に対する各ＮＧＦ－Ｆｃ融合タンパク質の生物活性の結果を示すグラフである。ただし、ＳｕＴａｉＳｈｅｎｇ^RマウスＮＧＦ及びｍＮＧＦ１１８は対照とする。ＰＢＳは陰性対照とした。

【図6B】図６Ｂは、ラットにおける上頸神経節（ＳＣＧ）の成長に対する各ＮＧＦ－Ｆｃ融合タンパク質の生物活性の結果を示すグラフである。ただし、ＳｕＴａｉＳｈｅｎｇ^RマウスＮＧＦ及びｍＮＧＦ１１８は対照とする。ＰＢＳは陰性対照とした。

【図6C】図６Ｃは、ラットにおける上頸神経節（ＳＣＧ）の成長に対する各ＮＧＦ－Ｆｃ融合タンパク質の生物活性の結果を示すグラフである。ただし、ＳｕＴａｉＳｈｅｎｇ^RマウスＮＧＦ及びｍＮＧＦ１１８は対照とする。ＰＢＳは陰性対照とした。

【図6D】図６Ｄは、ラットにおける上頸神経節（ＳＣＧ）の成長に対する各ＮＧＦ－Ｆｃ融合タンパク質の生物活性の結果を示すグラフである。ただし、ＳｕＴａｉＳｈｅｎｇ^RマウスＮＧＦ及びｍＮＧＦ１１８は対照とする。ＰＢＳは陰性対照とした。

【図7A】図７Ａは、血漿中の２－１１８－Ｌ３Ｆｃ１０－Ｍ３－５、２－１１８－Ｌ３Ｇ４－ＢＭ及び対照群ｍＮＧＦ１１８（Ｆｃ融合のないβ－ＮＧＦ１１８ａａ変異体）の薬物動態学（ＰＫ）曲線を示すグラフである。

【図7B】図７Ｂは、筋肉注射用量が２３５μｇ／ｋｇであった場合のそれら（図７Ａ）のインビボでの半減期を示すものである。

【図8】図８は、ＮＧＦ（ＳｕＴａｉＳｈｅｎｇ^RマウスＮＧＦ又はｍＮＧＦ１１８）又はＮＧＦ－Ｆｃ融合タンパク質（２－１１８－Ｌ３Ｆｃ１０－Ｍ３－５又は２－１１８－Ｌ３Ｇ４－ＢＭ）で処理された糖尿病マウスの創傷治癒率を示すグラフである。ただし、ＰＢＳ処理は陰性対照とした。

【図9A】図９Ａは、ＮＧＦ（ＳｕＴａｉＳｈｅｎｇ^RマウスＮＧＦ又はｍＮＧＦ１１８）又はＮＧＦ－Ｆｃ融合タンパク質（２－１１８－Ｌ３Ｆｃ１０－Ｍ３－５又は２－１１８－Ｌ３Ｇ４－ＢＭ）で処理されたヒト卵巣顆粒膜腫瘍細胞株（ＫＧＮ）の増殖率を示すグラフである。

【図9B】図９Ｂは、ＮＧＦ（ＳｕＴａｉＳｈｅｎｇ^RマウスＮＧＦ又はｍＮＧＦ１１８）又はＮＧＦ－Ｆｃ融合タンパク質（２－１１８－Ｌ３Ｆｃ１０－Ｍ３－５又は２－１１８－Ｌ３Ｇ４－ＢＭ）で処理されたヒト卵巣顆粒膜腫瘍細胞株（ＫＧＮ）の分泌されたエストロゲン濃度を示すグラフである。

【図9C】図９Ｃは、ＮＧＦ（ＳｕＴａｉＳｈｅｎｇ^RマウスＮＧＦ又はｍＮＧＦ１１８）又はＮＧＦ－Ｆｃ融合タンパク質（２－１１８－Ｌ３Ｆｃ１０－Ｍ３－５又は２－１１８－Ｌ３Ｇ４－ＢＭ）で処理されたラット早発卵巣不全動物疾患モデルにおける異なるレベルでの卵胞の数を示すグラフである。

【図10A】図１０Ａは、ＮＧＦ（ＳｕＴａｉＳｈｅｎｇ^RマウスＮＧＦ又はｍＮＧＦ１１８）、ＮＧＦ－Ｆｃ融合タンパク質（２－１１８－Ｌ３Ｆｃ１０－Ｍ３－５又は２－１１８－Ｌ３Ｇ４－ＢＭ）又は陰性対照になる０．９％塩化ナトリウム溶液で処理された神経栄養性角膜炎動物モデルにおける角膜フルオレセインナトリウム染色スコアを示すグラフである。

【図10B】図１０Ｂは、ＮＧＦ（ＳｕＴａｉＳｈｅｎｇ^RマウスＮＧＦ又はｍＮＧＦ１１８）、ＮＧＦ－Ｆｃ融合タンパク質（２－１１８－Ｌ３Ｆｃ１０－Ｍ３－５又は２－１１８－Ｌ３Ｇ４－ＢＭ）又は陰性対照になる０．９％塩化ナトリウム溶液で処理された神経栄養性角膜炎動物モデルにおける平均角膜神経長を示すグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0019】

本発明は、Ｎ端からＣ端までＮＧＦ部分とＦｃ部分とを含む持効型ＮＧＦポリペプチドに関する。用語「持効型ＮＧＦポリペプチド」、「持効型ＮＧＦ－Ｆｃ融合タンパク質」及び「持効型ＮＧＦ構築物」は交換可能に使用される。

【0020】

ＮＧＦは、中枢及び末梢神経ニューロンの発生、分化、成長、再生及び機能的発現において重要な調節的役割を果たす。ＮＧＦは、弱視、神経腫、様々な神経損傷及び神経系疾患などの神経系の成長異常の治療に使用されている。しかし、ＮＧＦは、痛みを引き起こすか、インビボでの半減期が短いので、痛覚過敏を避けるための低用量制限、及び頻繁ななどの副作用により、ＮＧＦの幅広い適用が制限される。より長い半減期及び／又はより大きい分子量を有する部分にタンパク質系薬剤を融合させることは、特定のタンパク質薬剤に持効型活性を付与するための１つの戦略である。しかし、タンパク質薬剤の半減期を延長しながら生物活性を増加又は維持するかは、依然として臨床的に困難な問題である。

【0021】

本明細書に記載されている持効型ＮＧＦポリペプチドは、以下の一つまたは複数の優れた効果を有する。１）本発明による持効型ＮＧＦポリペプチドではインビトロとインビボの両方で生物活性が高く（例えば、上頸神経節の成長を促進する）、既存のＮＧＦ－Ｆｃ融合タンパク質又はＮＧＦ薬物よりも優れている。２）本発明による持効型ＮＧＦポリペプチドでは、インビボで半減期が長く、融合部分のないＮＧＦタンパク質よりもはるかに長いだけでなく、既存のＮＧＦ－Ｆｃ融合タンパク質よりも大幅に長いため、投与頻度及び総投与回数が軽減し、患者に利便性を提供し、コストを削減することが図れる。３）本発明による持効型ＮＧＦポリペプチドによれば、痛みなどの副作用の軽減、さらには無痛を図れるため、患者の耐用量が増加し、適応症範囲の拡大及び中枢神経系への適用が可能になる。４）本発明による持効型ＮＧＦポリペプチドによれば、抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）及び／又は補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）が低減又は最小化されるので、治療中に望ましくない免疫応答を回避する。５）本発明による持効型ＮＧＦポリペプチドでは、優れた熱安定性を有する（例えば、高い融解温度（Ｔｍ）及び／又は高い凝集開始温度（Ｔａｇｇ））。６）本発明による持効型ＮＧＦポリペプチドでは、断片化、凝集体の形成及び／又は凝集体の成長が少ないか全くないという、加速ストレス（例えば、加熱）下で優れた安定性を示し、薬物特性が維持される。７）本発明による持効型ＮＧＦポリペプチドでは、例えば、糖尿病性神経障害、アルツハイマー病及び神経栄養性角膜炎などの神経系疾患、早発卵巣不全及び精子形成障害（例えば、精子軽減症、精子無力症、精子軽減無力症）などの非神経系疾患といったＮＧＦ関連疾患のインビボでの治療に非常に有効であり、Ｆｃに融合されていないＮＧＦ部分と比較して、同等又はそれ以上の治療効果を有する。

【0022】

そこで、本発明の一態様は、Ｎ端からＣ端までＮＧＦ部分とＦｃ部分とを含むポリペプチドであって、前記ＮＧＦ部分が配列番号１～４のうちのいずれか１つで示されるアミノ酸配列を含み、前記Ｆｃ部分がＩｇＧ１ Ｆｃ又はＩｇＧ４ Ｆｃに由来する、持効型ＮＧＦポリペプチドに関する。

【0023】

また、本発明の別の態様は、前記持効型ＮＧＦポリペプチドをコードする単離された核酸、前記核酸を含むベクター、前記核酸又はベクターを含む宿主細胞、前記持効型ＮＧＦポリペプチドの生産方法、医薬組成物、及び前記持効型ＮＧＦポリペプチドを含む生産製品、ならびに疾患（例えば、糖尿病性神経障害や、アルツハイマー病、神経栄養性角膜炎などのニューロンの変性又は損傷に関連する神経系疾患、早発卵巣不全や精子形成障害などの非神経系疾患）を治療するために前記持効型ＮＧＦポリペプチド又は医薬組成物を使用する方法に関する。
Ｉ．定義

【0024】

文脈が明確に別段の指示をしない限り、本発明の実施には、以下に詳述される当技術分野の技術的範囲内のウイルス学、免疫学、微生物学、分子生物学及び組換えＤＮＡ技術の従来の方法を採用する。前記技術については、文献で十分に説明されていて、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｒ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（２００９）；Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，３ｒｄ ｅｄ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，１９９５；Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，２００１）；Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （１９８２）；ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ｖｏｌ．Ｉ＆ＩＩ （Ｄ．Ｇｌｏｖｅｒ，ｅｄ．）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ （Ｎ．Ｇａｉｔ，ｅｄ．，１９８４）；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ （Ｂ．Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．，１９８５）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ （Ｂ．Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．，１９８４）；Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ （Ｒ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．，１９８６）；Ｐｅｒｂａｌ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ （１９８４）及び他の同様の参考資料を参照のこと。

【0025】

本明細書で使用される場合、「処理」又は「治療すること」は、臨床結果を含む、有益又は望ましい結果を図るためのアプローチである。本発明の目的によれば、前記有益又は望ましい臨床結果としては、以下に限定されないが、疾患によって引き起こされた一つ又は複数の症状を緩和すること、疾患の範囲を軽減すること、疾患を安定させる（例えば、疾患の悪化を予防又は遅延させる）こと、疾患の蔓延を予防又は遅延させること、疾患の再発を予防又は遅延させること、疾患の進行を遅延又は遅らせること、疾患の状態を改善すること、疾患を緩和する（部分的又は全体的）こと、疾患の治療に必要な一つ又は複数の他の薬物の用量を減らすこと、疾患の進行を遅延させること、生存の品質を改善すること及び／又は生存期間を延長することのうちの一つ又は複数が挙げられる。また、「治療」には、疾患の病理学的結果を軽減することも含まれる。本発明の方法は、治療に関するこれらの任意の１つ又は複数の側面を考慮してなされるものである。例えば、この疾患によって引き起こされた症状の軽減、この疾患を患う患者の生活の質の改善、疾患の治療に必要な他の薬物の用量の削減、及び／又は個体の生存期間の延長を含むがこれらに限定されない、この疾患に関連する１つ又は複数の症状が緩和又は除去される場合は、この患者は「治療」に成功したと見なされる。

【0026】

用語「予防」、及び「予防される」、「予防する」などの類似の単語は、疾患又は病気の再発の可能性を予防、阻害又は低減する方法を意味する。また、これは、疾患又は病気の再発を遅延させること或いは疾患又は病気の再発を遅延させることも指す。本明細書で使用される場合、「予防」及び類似の単語には、疾患又は病気が再発する前に、疾患又は病気の強度、影響、症状及び／又は負担を軽減することも含まれる。

【0027】

本明細書で使用される場合、疾患の進行を「遅延させる」ことは、疾患の進行を延ばすこと、阻害すること、遷延すること、遅らせること、安定させること及び／又は遅くすることを意味する。遅延される時間は、疾患の病歴及び／又は治療を受ける個体によって異なる場合がある。疾患の進行を「遅延させる」方法とは、この方法を使用しない場合と比較して、特定の時間範囲内で疾患の進行確率を低下させ、かつ／又は特定の時間範囲内で疾患の程度を低下させる方法を指す。このような比較は、通常、統計的に有意な個体数を使用した臨床研究に基づいて行われる。

【0028】

本明細書で使用される場合、用語「有効量」とは、特定の障害、病気又は疾患を治療する、例えば、１つ又は複数の症状を改善、軽減、減弱及び／又は遅延させるのに十分な薬物の用量又は医薬組成物の用量を指す。いくつかの実施形態において、有效量は、疾患の進行を遅延させるのに十分な量である。いくつかの実施形態において、有效量は、疾患の再発を予防又は遅延させるのに十分な量である。有效量は１回又は複数回で投与される量とされてもよい。いくつかの実施形態において、薬物又は組成物の有效量によれば、（ｉ）ニューロンの生存を支持すること、（ｉｉ）神経突起成長を促進すること、（ｉｉｉ）神経化学的分化を増強すること、（ｉｖ）膵β細胞の増殖を促進すること、（ｖ）自然免疫及び／又は獲得免疫を誘導すること、（ｖｉ）疾患の発生及び／又は再発を予防又は遅延させること、かつ／又は（ｖｉｉ）この疾患に関連する１つ又は複数の症状をある程度緩和することを図れる。

【0029】

本明細書で使用される場合、「個体」又は「主体」とは、ヒト、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、げっ歯類又は霊長類を含むがこれらに限定されない哺乳動物を指す。いくつかの実施形態において、前記個体とはヒトを指す。

【0030】

用語「定常ドメイン」とは、免疫グロブリン分子の一部を指し、抗原結合部位の可変ドメインを含む免疫グロブリン分子の別の部分と比較して、さらなる保存性のアミノ酸配列を有するものである。定常ドメインは、重鎖のＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３ドメイン（ＣＨと通称される）及び軽鎖のＣＨＬ（又はＣＬ）ドメインを含む。免疫グロブリン重鎖（ＣＨ）定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンは異なるクラス又はサブタイプに分類することができる。免疫グロブリンには、重鎖がそれぞれα、δ、ε、γ及びμであるＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭの５つのクラスがある。ＣＨ配列および機能の比較的小さな違いに基づいて、γおよびαはさらにサブクラスに分類され、例えば、ヒトには、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２Ａ、ＩｇＧ２Ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２のサブクラスが発現される。

【0031】

本明細書で使用される場合、用語「Ｆｃ領域」、「断片結晶領域」、「Ｆｃドメイン」又は「Ｆｃ部分」は、免疫グロブリン重鎖のＣ端領域を定義するために使用され、天然配列Ｆｃ領域及び変異体Ｆｃ領域を含む。免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の区画は場合によって異なることがあるが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、Ｃｙｓ２２６位置のアミノ酸残基又はＰｒｏ２３０から始まり、そのカルボキシル末端まで伸びると定義されるのが一般である。Ｆｃ領域のＣ端のリジン（ＥＵ番号付けシステムによる４４７残基）は、例えば、タンバク質の生産又は精製中に除去されてもよく、タンバク質をコードする核酸の組換え操作によって除去されてもよい。本明細書に記載されている構築物で使用するための適切な天然配列Ｆｃ領域には、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２（ＩｇＧ２Ａ、ＩｇＧ２Ｂ）、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４が含まれる。

【0032】

本明細書で使用される場合、用語ＩｇＧ「サブタイプ」又は「サブクラス」とは、定常ドメインの化学的及び抗原的特性によって定義される免疫グロブリンの任意のサブクラスを指す。免疫グロブリンは、主にＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭの５つのクラスに分類され、さらにその幾つがＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２などのサブクラス（サブタイプ）に分類されることがある。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、γ、Ｅ、γ及びμと呼ばれる。クラスが異なる免疫グロブリンのサブユニット構造及び三次元配置は周知であり、Ａｂｂａｓらの《細胞及び分子免疫学》第４版（Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ，Ｃｏ．，２０００）に詳細に記載されている。

【0033】

「Ｆｃ受容体」又は「ＦｃＲ」は、Ｆｃ含有構造（例えば、抗体）中のＦｃ領域に結合する受容体を表す。好ましいＦｃＲはヒトＦｃＲ天然配列である。さらに、好ましいＦｃＲとしては、ＩｇＧ抗体（γ受容体）に結合するものであり、例えば、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩなどの受容体サブクラス、ならびにこれらの受容体の対立遺伝子多様体及び選択的にスプライシングされたこれらの形態が挙げられる。ＦｃγＲＩＩ受容体には、ＦｃγＲＩＩＡ（「活性化受容体」）及びＦｃγＲＩＩＢ（「阻害受容体」）が含まれ、それらは類似のアミノ酸配列を持ち、主に細胞質ドメインが異なる。活性化受容体ＦｃγＲＩＩＡは、その細胞質ドメインに免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含む。阻害受容体ＦｃγＲＩＩＢは、その細胞質ドメインに免疫受容体チロシンベースの阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）を含む（Ｍ．Ｄａeｒｏｎ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５：２０３－２３４（１９９７）を参照のこと）。Ｒａｖｅｔｃｈ ａｎｄ Ｋｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ ９：４５７－９２（１９９１）；Ｃａｐｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ ４：２５－３４（１９９４）及びｄｅ Ｈａａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．１２６：３３０－４１（１９９５）には、ＦｃＲｓについて概説されている。本明細書における用語「ＦｃＲ」には、将来にＦｃＲｓとして同定される可能性のあるものを含むほかのＦｃＲｓが包含される。

【0034】

用語「Ｆｃ受容体」又は「ＦｃＲ」には、胎児への母体ＩｇＧの転移を担う新生児受容体ＦｃＲｎも含まれる。Ｇｕｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１７：５８７（１９７６）及びＫｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：２４９（１９９４）を参照のこと。ＦｃＲｎへの結合を測定する方法は周知である（Ｇｈｅｔｉｅ ａｎｄ Ｗａｒｄ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ １８：（１２）：５９２－８（１９９７）；Ｇｈｅｔｉｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １５（７）：６３７－４０（１９９７）；Ｈｉｎｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９（８）：６２１３－６（２００４）；ＷＯ ２００４／９２２１９（Ｈｉｎｔｏｎ ｅｔ ａｌ．）を参照のこと）。インビボ及び血清中のＦｃＲｎに結合するヒトＦｃＲｎ高親和力結合ポリペプチドの半減期は、例えば、ヒトＦｃＲｎを発現するトランスジェニックマウス又はトランスフェクトされたヒト細胞株、或いは多様体Ｆｃ領域を有するポリペプチドを投与した霊長類において測定することができる。ＷＯ２００４／４２０７２（Ｐｒｅｓｔａ）には、ＦｃＲｓへの結合を増強又は減弱する抗体改変体について詳述されている。Ｓｈｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．９（２）：６５９１－６６０４（２００１）を参照のこと。

【0035】

「抗体エフェクター機能」とは、Ｆｃ含有構造（例えば、抗体）中のＦｃ領域（天然配列Ｆｃ領域又はアミノ酸配列改変体Ｆｃ領域）によって引き起こされる生物活性を指し、Ｆｃサブタイプに従って変化する。抗体エフェクター機能の例としては、Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、食作用、細胞表面受容体のダウンレギュレーション（例えば、Ｂ細胞受容体）及びＢ細胞活性化が挙げられる。抗体エフェクター機能を「低下又は最小化する」とは、野生型又は修飾されていないＦｃ含有構造（例えば、抗体）の場合と比較して少なくとも５０％（或いは６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％）と低下することを意味する。抗体エフェクター機能は、当業者なら容易に決定及び測定し得る。好ましい実施形態では、補体結合、補体依存性細胞傷害及び抗体依存性細胞傷害の抗体エフェクター機能は影響を受けることがある。いくつかの実施形態において、エフェクター機能は、グリコシル化を除去した定常ドメインにおける変異、例えば「エフェクター機能のない変異」によって除去される。いくつかの実施形態において、エフェクター機能のない変異体は、ＣＨ２領域におけるＮ２９７Ａ又はＤＡＮＡ変異（Ｄ２６５Ａ＋Ｎ２９７Ａ）である。Ｓｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６（９）：６５９１－６６０４（２００１）を参照のこと。また、エフェクター機能の低下又は除去をもたらす他の変異には、Ｋ３２２Ａ及びＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ（ＬＡＬＡ）がある。また、エフェクター機能は、グリコシル化しない宿主細胞（例えば、大腸菌）又はエフェクター機能の促進に無効又は有効性の低いグリコシル化パターンの変化を引き起こす宿主細胞において発現されるような生産技術により、低下又は除去することができる（例えば、Ｓｈｉｎｋａｗ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８（５）：３４６６－３４７３（２００３）を参照のこと）。

【0036】

「抗体依存性細胞介在性細胞傷害」又はＡＤＣＣとは、分泌型Ｉｇ（又はリガンド－Ｆｃ構造）が特定の細胞傷害性細胞（例えば、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ）、好中球及びマクロファージ）の上に存在するＦｃ受容体（ＦｃＲｓ）に結合することにより、これらの細胞傷害性エフェクター細胞が抗原を持っている（又はリガンド受容体を持っている）標的細胞に特異的に結合できるようにし、その後に細胞毒素で標的細胞を殺すという細胞傷害の形態を指す。抗体（又はＦｃを含む構造）は、細胞傷害性細胞を「武装」させ、このメカニズムによって標的細胞を殺すために必要である。ＡＤＣＣを媒介する主な細胞は、ＮＫ細胞であり、ＦｃγＲＩＩＩのみを発現するが、単球はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞Ｆｃの発現は、Ｒａｖｅｔｃｈ及びＫｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ ９：４５７－９２（１９９１）第４６４頁のＴａｂｌｅ ２に要約されている。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するためには、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，５００，３６２又は５，８２１，３３７に詳述されているように、インビトロＡＤＣＣアッセイを行うことができる。このタイプのアッセイに適したエフェクター細胞には、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー細胞（ＮＫ）が含まれる。代替としてまたは追加として、目的の分子のＡＤＣＣ活性は、例えば、Ｃｌｙｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）９５：６５２～６５６（１９９８）に開示されているような動物モデルにおいて、インビボで評価することもできる。

【0037】

「補体依存性細胞傷害」又は「ＣＤＣ」とは、補体の存在下で標的細胞が溶解することになることを指す。古典的な補体経路の活性化は、補体系の第１成分（Ｃ１ｑ）が、Ｆｃに融合したリガンドを介して同族受容体に結合している（適切なサブクラスの）Ｆｃ含有構造に結合することによって開始する。補体活性化を評価するために、Ｇａｚｚａｎｏ－Ｓａｎｔｏｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０２：１６３（１９９６）に記載されているように、ＣＤＣアッセイを行うことができる。Ｆｃ領域のアミノ酸配列が改変されてＣ１ｑ結合能力が増加又は軽減した抗体改変体は、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．６，１９４，５５１Ｂ１及びＷＯ９９／５１６４２に詳述されている。これらの特許刊行物の内容は、参照により本明細書に組み込まれる。Ｉｄｕｓｏｇｉｅ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：４１７８－４１８４（２０００）を参照のこと。

【0038】

本明細書で使用される場合、用語「特異的に結合する」、「特異的に認識する」又は「特異的に用いられる」とは、測定可能かつ再現可能な相互作用のことを指し、例えば、リガンドと受容体との間の結合について、生体分子を包含する分子の不均一な集団が存在する場合はリガンドの存在を決定することができる。例えば、受容体に特異的に結合するリガンドは、他の受容体に結合する場合によりも、高い親和性、高い親和力、容易にかつ／又は長い持続時間で目的の受容体に結合する。いくつかの実施形態において、例えばラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）法によって測定されるところ、無関係の受容体へのリガンド結合の程度は、目的の受容体へのリガンド結合の程度に対する１０％未満であった。いくつかの実施形態において、標的受容体に特異的に結合するリガンドの平衡解離定数は（Ｋ_d）≦１０^-5Ｍ、≦１０^-6Ｍ、≦１０^-7Ｍ、≦１０^-8Ｍ、≦１０^-9Ｍ、≦１０^-10Ｍ、≦１０^-11Ｍ又は≦１０^-12Ｍである。いくつかの実施形態において、リガンドは、異なる種で保存性受容体に特異的に結合する。いくつかの実施形態において、特異的結合は排他的結合を含むが、これを必要としない。リガンドの結合特異性は、当技術分野で知られている方法を使用して実験的に決定することができる。例としては、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ－、ＲＩＡ－、ＥＣＬ－、ＩＲＭＡ－、ＥＩＡ－、ＢＩＡＣＯＲＥ^TM－テスト及びペプチドスキャンが挙げられるが、これらに限定されない。

【0039】

「結合親和力」とは、一般に、分子（例えば、リガンド）の単一の結合部位とその結合パートナー（例えば、受容体）との間の非共有相互作用の合計の強度を指す。特に断りがない限り、本明細書で使用される場合、「結合親和力」とは、結合対のメンバー間の１：１相互作用を反映可能な固有の結合親和力を指す。結合親和力は、Ｋ_d、Ｋ_off、Ｋ_on又はＫ_aで表すことができる。本明細書で使用される場合、用語「Ｋ_off」とは、リガンド／受容体複合体からのリガンドの解離の速度定数を指し、動力学的選択装置によって決定され、ｓ^-1の単位で表される。本明細書で使用される場合、用語「Ｋ_on」とは、リガンドが受容体に結合してリガンド／受容体複合体を形成するところの結合速度定数を指し、Ｍ^-1ｓ^-1の単位で表される。本明細書で使用される場合、平衡解離定数「Ｋ_d」という用語は、特定のリガンドと受容体とが相互作用する場合の解離定数を指し、受容体溶液でリガンドが全体の受容体結合部位の半分を占めて平衡に達したときに必要なリガンド濃度を指し、Ｋ_off／Ｋ_onに等しく、Ｍの単位で表される。Ｋ_dの測定は、すべての結合分子が溶液中にあることを前提条件とする。受容体が細胞膜上にある場合、対応する解離速度定数はＥＣ₅₀として表され、Ｋ_dの適切な近似値である。親和定数Ｋ_aは、解離定数Ｋ_dの逆数であり、Ｍ^-1の単位で表される。解離定数（Ｋ_d）は、リガンドと受容体の間の親和力を反映する指標として使用される。前記方法を使用して得られたＫ_d値は、Ｍ（ｍｏｌ／Ｌ）の単位で表される。

【0040】

半阻害濃度（ＩＣ₅₀）は、特定の生物学的又は生化学的機能を阻害する中の物質（例えば、リガンド）の有効性の尺度であり、特定の生物学的プロセスを半分に阻害するために必要な特定の薬物又は他の物質（阻害剤、例えばリガンド）の量を表し、その値が通常にモル濃度として表される。ＩＣ₅₀は、アゴニスト薬物又は他の物質（例えば、リガンド）の「ＥＣ₅₀」に相当する。ＥＣ₅₀は、インビボで最大効果の５０％を得るために必要な血漿濃度を表すこともある。本明細書で使用される場合、「ＩＣ₅₀」は、インビトロで受容体生物活性の５０％を中和するために必要なリガンドの有効濃度を示すために使用される。ＩＣ₅₀又はＥＣ₅₀は、ＦＡＣＳ分析（競合的結合アッセイ）によるリガンド結合の阻害、細胞ベースのサイトカイン放出アッセイ又は増幅された発光近接均一アッセイ結合免疫吸着アッセイ（ＡｌｐｈａＬＩＳＡ）といったバイオアッセイによって測定することができる。

【0041】

本明細書で使用される場合、「共有結合」とは、２つの原子間に１つ又は複数の電子を共用することによって形成される安定した結合を指す。共有結合の例としては、ペプチド結合及びジスルフィド結合が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書で使用される場合、「ペプチド結合」とは、アミノ酸のカルボキシ基と隣接するアミノ酸のアミン基との間に形成した共有結合を指す。本明細書で使用される場合、「ジスルフィド結合」とは、２つの硫黄原子間で形成される共有結合を指し、例えば、２つのＦｃ断片が１つ又は複数のジスルフィド結合によって結合される。２つの断片の間にある１つ又は複数のジスルフィド結合は、２つの断片におけるチオール基を連結することによって形成された場合がある。いくつかの実施形態において、２つのＦｃ断片の１つ又は複数のシステインの間に１つ又は複数のジスルフィド結合が形成された場合がある。ジスルフィド結合は、２つのチオール基の酸化により形成された場合がある。いくつかの実施形態において、共有連結は、共有結合によって直接になされる。いくつかの実施形態において、共有連結は、ペプチド結合又はジスルフィド結合による直接な連結である。

【0042】

ペプチド又はポリペプチド配列の「アミノ酸配列同一性のパーセンテージ（％）」又は「相同性」は、特定のポリペプチド又はポリペプチド配列におけるアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージとして定義され、配列が整列されてギャップが導入された（必要な場合）後に配列同一性のパーセンテージが最大化され、しかも任意の保存的置換を配列同一性の一部とするように考慮しなかったものである。アミノ酸配列同一性パーセンテージを決定するためには、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮ、Ｍｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）、又はＭＵＳＣＬＥソフトウェアなどの公的に入手可能なコンピューターソフトウェアを使用して、当技術分野の技術範囲内の様々なアラインメント態様により行うことができる。比較される配列の全長にわたって最大のアラインメントを実現するために必要な任意のアルゴリズムを含むアラインメント測定に用いられる適切なパラメータは、当業者が決定し得るものである。

【0043】

本明細書で使用される場合、ポリペプチドの「Ｃ端」とは、隣接するアミノ酸残基のカルボキシ基とペプチド結合を形成するためにアミン基を給与する、ポリペプチドの最後のアミノ酸残基を指す。本明細書で使用される場合、ポリペプチドの「Ｎ末端」とは、隣接するアミノ酸残基のアミン基とペプチド結合を形成するためにカルボキシ基を給与する、該ポリペプチドの最初のアミノ酸を指す。

【0044】

「単離された」ポリペプチドとは、それが生産されたための環境（例えば、天然又は組換え）の成分から同定、単離及び／又は回收されたポリペプチドを指す。単離されたポリペプチドは、それが生産されたための環境における他のすべての成分と関連していないことが好ましい。組換えトランスフェクト細胞によって産生された汚染成分などの生産環境の汚染成分は、ポリペプチドの研究、診断又は治療を妨げることが多く、酵素、ホルモン及び他のタンパク質溶質又は非タンパク質溶質を含む場合がある。（１）いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、ポリペプチド含有量が重量で９５％を超えるように精製され、例えば、ポリペプチド含有量が重量で９９％を超えることがローリー法によって決定されたいくつかの実施形態がある。（２）いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、スピニングカップシーケンサーを使用して少なくとも１５個のＮ端残基又は内部アミノ酸配列を得るのに十分な程度に精製される。（３）いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、クーマシーブルー又は好ましい銀染色を用いた非還元性又は還元性条件下でのＳＤＳ－ＰＡＧＥにより均一性を達成するまで精製される。単離されたポリペプチドには、ポリペプチドの天然環境の少なくとも１つの要素が存在しないため、組換え細胞内のインサイチューのポリペプチドが含まれる。けれども、単離されたポリペプチドは少なくとも１つの精製工程を受けるのが普通である。

【0045】

構築物（本明細書に記載されているＮＧＦポリペプチドのように）をコードする「単離された」核酸分子は、それが生産されたための環境に一般的に関連する少なくとも１つの不純物を含む核酸分子から同定及び単離されたものである。単離された核酸は、それが生産されたための環境のすべての成分に関連していないことが好ましい。例えば、本明細書に記載されているポリペプチドをコードする単離された核酸分子は、自然界で発見された時の形式又は形態ではないもので存在する。従って、単離された核酸分子は、細胞に自然に存在する、本明細書に記載されているポリペプチドをコードする核酸とは異なる。単離された核酸は、該核酸分子を含む細胞に含まれる核酸分子を含むが、該核酸分子は染色体外に、又はその自然の染色体位置とは異なる染色体位置に存在する。

【0046】

用語「制御配列」とは、特定の宿主生物において作動可能に連結されたコード配列の発現に必要なＤＮＡ配列を指す。例えば、原核生物に適した制御配列には、プロモーター、任意のオペレーター配列及びリボソーム結合部位が含まれる。また、真核細胞がプロモーター、ポリアデニル化シグナル及びエンハンサーを利用することが知られている。

【0047】

「作動可能に連結されること」は、核酸が別の核酸配列と機能的に関係を確立したということである。例えば、プレ配列又は分泌リーダーのＤＮＡがポリペプチド分泌に関与するプレタンパク質として発現される場合、前記ＤＮＡはポリペプチドのＤＮＡに作動可能に連結されるようになる。プロモーター又はエンハンサーが配列の転写に影響を及ぼす場合、前記プロモーター又はエンハンサーはコード配列に作動可能に連結されるようになる。或いは、リボソーム結合部位が翻訳を容易にする位置にある場合、前記リボソーム結合部位はコード配列に作動可能に連結されるようになる。一般に、「作動可能に連結されたこと」は、連結されているＤＮＡ配列が連続していることを意味し、分泌リーダーの場合、連続しているだけでなく読み取る段階（ｒｅａｄｉｎｇ ｐｈａｓｅ）にもあることを意味する。ただし、エンハンサーは連続している必要はない。連結は、適切な制限部位での連結によって達成される。このような部位は存在しない場合、常法に従って合成されたオリゴヌクレオチドアプタマー又はリンカーが使用される。

【0048】

本明細書で使用される場合、用語「ベクター」とは、それが連結された別の核酸分子を増幅することができる核酸分子を指す。この用語には、自己複製核酸構造であるベクター、及び既知の宿主細胞のゲノムに導入されるベクターが含まれる。特定のベクターは、それらが連結された核酸の発現を指示することができる。このようなベクターは、本明細書では「発現ベクター」と呼ばれる。

【0049】

本明細書で使用される場合、用語「トランスフェクト」又は「形質転換」又は「形質導入」とは、外因性核酸が宿主細胞に移入又は導入されるプロセス過程を指す。「トランスフェクトされた」又は「形質転換された」又は「形質導入された」細胞は、外因性核酸でトランスフェクト、形質転換又は形質導入されたものである。前記細胞には、初代試験細胞とその子孫が含まれる。

【0050】

用語「宿主細胞」、「宿主細胞株」及び「宿主細胞培養」は、交換可能に使用され、外因性核酸が導入された細胞（このような細胞の子孫を含む）を指す。宿主細胞には、「形質転換体」及び「形質転換細胞」が含まれ、一次形質転換細胞及び継代数にかかわらずそれから生じた子孫が含まれる。子孫は、変異を含んで、その核酸が親細胞と同一でない場合がある。本明細書には、元の形質転換細胞からスクリーニング又は選択されたそれと同じ機能又は生物活性を有する変異子孫が含まれる。

【0051】

用語「医薬製剤」又は「医薬組成物」とは、有効成分の生物活性を有効にする形態であり、しかも投与される被検者に対して許容できないほどの毒性を示す追加成分を含まない制剤を指す。このような制剤は無菌である。「無菌」制剤は、無菌であるか、又は任意の生きている微生物やその胞子を含まないものである。

【0052】

本明細書に記載されている本発明の実施形態は、「．．．からなる」及び／又は「本質的に．．．からなる」実施形態を含むと理解されるべきである。

【0053】

本明細書に言及される「約」は、値又はパラメータであり、その値又はパラメータ自体に対するバリアントを含む（及び説明する）ものである。例えば、「約Ｘ」に関する記述には、「Ｘ」の記述が含まれる。

【0054】

本明細書で使用される場合、値又はパラメータ「ではない」と言及することは、一般に、特定の値又はパラメータを「除く」ことを意味して示している。例えば、この方法はＸ型がんの治療に使用できないことは、この方法は通常にＸ型がん以外のがんの治療に使用されることを意味する。

【0055】

本明細書で使用される場合、用語「約Ｘ～Ｙ」は、「約Ｘ～約Ｙ」と同じ意味を有する。

【0056】

本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される単数形「一」、「１つ」、「この」及び「該」は、別段の指示をしない限り、複数の対象を含むことがある。
ＩＩ．持効型ＮＧＦポリペプチド

【0057】

本発明の一態様は、Ｎ端からＣ端までＮＧＦ部分とＦｃ部分とを含む持効型ＮＧＦポリペプチドに関する。いくつかの実施形態において、前記持効型ＮＧＦポリペプチドは、Ｎ端からＣ端まで、配列番号１～４のいずれか（例えば、配列番号１～３のいずれか）のアミノ酸配列を含む（或いは、本質的に該アミノ酸配列からなるか、又は該アミノ酸配列からなる）ＮＧＦ部分と、ＩｇＧ１ Ｆｃ又はＩｇＧ４ Ｆｃに由来するＦｃ部分とを含む。いくつかの実施形態において、ＮＧＦ部分は、配列番号１のアミノ酸配列を含む（或いは、本質的に該アミノ酸配列からなるか、又は該アミノ酸配列からなる）。いくつかの実施形態において、持効型ＮＧＦポリペプチドは、静脈注射、筋肉注射又は皮下注射によって個体（例えば、ヒト）に投与された場合、少なくとも１０時間（例えば、少なくとも１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、７０、８０、９０および１００時間のうちのいずれか）の半減期を有する。いくつかの実施形態において、持効型ＮＧＦポリペプチドは、配列番号４のアミノ酸配列を含むＮＧＦ部分に比較して、引き起こした痛みが少ない（例えば、痛みを少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％減らす）。

【0058】

いくつかの実施形態において、ＮＧＦ部分はペプチドリンカーを介してＦｃ部分に融合されている。そして、いくつかの実施形態において、本発明は、Ｎ端からＣ端まで、配列番号１～４のいずれか（例えば、配列番号１～３のいずれか）のアミノ酸配列を含む（或いは、本質的に該アミノ酸配列からなるか、又は該アミノ酸配列からなる）ＮＧＦ部分と、ペプチドリンカー（例えば、配列番号６８～９９のうちのいずれか１つであるか、又は配列番号６８～７２のうちのいずれか１つである）と、Ｆｃ部分ＩｇＧ１ Ｆｃ又はＩｇＧ４ Ｆｃに由来するＦｃ部分とを含む持効型ＮＧＦポリペプチドに関する。いくつかの実施形態において、ペプチドリンカーは、アミノ酸配列（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号７０、ただし、ｎは１、２、３、４、５又は６である）を含む（或いは、本質的に該アミノ酸配列からなるか、又は該アミノ酸配列からなる）。いくつかの実施形態において、ペプチドリンカーは、配列番号６８又は６９のアミノ酸配列を含む（或いは、本質的に該アミノ酸配列からなるか、又は該アミノ酸配列からなる）。いくつかの実施形態において、ＮＧＦ部分は、配列番号１のアミノ酸配列を含む（或いは、本質的に該アミノ酸配列からなるか、又は該アミノ酸配列からなる）。いくつかの実施形態において、静脈注射、筋肉注射又は皮下注射によって個体（例えば、ヒト）に投与された場合、持効型ＮＧＦポリペプチドは、なくとも約１０時間（例えば、少なくとも約１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、７０、８０、９０又は１００時間のいずれか）の半減期を有する。いくつかの実施形態において、持効型ＮＧＦポリペプチドは、配列番号４のアミノ酸配列を含むＮＧＦ部分と比較して、引き起こした痛みが少ない（例えば、痛みを少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％減らす）。

【0059】

いくつかの実施形態において、Ｆｃ部分はヒトＩｇＧ１ ＦｃなどのＩｇＧ１ Ｆｃに由来する。いくつかの実施形態において、Ｆｃ部分は、野生型ＩｇＧ１ Ｆｃ（例えば、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ）又はその天然変異体である。いくつかの実施形態において、Ｆｃ部分は、配列番号７又は８のアミノ酸配列を含むＩｇＧ１ Ｆｃに由来する。そして、いくつかの実施形態において、本発明は、Ｎ端からＣ端まで、配列番号１～４のいずれか（例えば、配列番号１～３のいずれか）のアミノ酸配列を含む（或いは、本質的に該アミノ酸配列からなるか、又は該アミノ酸配列からなる）ＮＧＦ部分と、任意選択的なペプチドリンカー（例えば、配列番号６８～９９のうちのいずれか１つであるか、又は配列番号６８～７２のうちのいずれか１つである）と、配列番号７又は８のアミノ酸配列を含む（或いは、本質的に該アミノ酸配列からなるか、又は該アミノ酸配列からなる）Ｆｃ部分とを含む持効型ＮＧＦポリペプチドに関する。いくつかの実施形態において、本発明は、Ｎ端からＣ端まで、配列番号１～４のいずれか（例えば、配列番号１～３のいずれか）のアミノ酸配列を含む（或いは、本質的に該アミノ酸配列からなるか、又は該アミノ酸配列からなる）ＮＧＦ部分と、任意選択的なペプチドリンカー（例えば、配列番号６８～９９のうちのいずれか１つであるか、又は配列番号６８～７２のうちのいずれか１つである）と、配列番号７又は８（例えば、配列番号８）のアミノ酸配列を含むＩｇＧ１ Ｆｃに由来するＦｃ部分とを含む持効型ＮＧＦポリペプチドに関する。いくつかの実施形態において、Ｆｃ部分は、配列番号７又は８の最初の５個のアミノ酸を欠失している。いくつかの実施形態において、本発明は、Ｎ端からＣ端まで、配列番号１～４のいずれか（例えば、配列番号１～３のいずれか）のアミノ酸配列を含む（或いは、本質的に該アミノ酸配列からなるか、又は該アミノ酸配列からなる）ＮＧＦ部分と、任意選択的なペプチドリンカー（例えば、配列番号６８～９９のうちのいずれか１つであるか、又は配列番号６８～７２のうちのいずれか１つである）と、配列番号７又は８（例えば、配列番号８）のアミノ酸配列を含むＩｇＧ１ Ｆｃに由来し、かつ、配列番号７又は８（例えば、配列番号８）に対するＥ２３３、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｇ２３６、Ｇ２３７、Ｎ２９７、Ａ３２７、Ａ３３０及びＰ３３１から選択された１つ又は複数の位置に変異を含む（或いは、本質的にそれからなるか、又はそれからなる）Ｆｃ部分とを含む持効型ＮＧＦポリペプチドに関する。いくつかの実施形態において、本発明は、Ｎ端からＣ端まで、配列番号１～４のいずれか（例えば、配列番号１～３のいずれか）のアミノ酸配列を含む（或いは、本質的に該アミノ酸配列からなるか、又は該アミノ酸配列からなる）ＮＧＦ部分と、任意選択的なペプチドリンカー（例えば、配列番号６８～９９のうちのいずれか１つであるか、又は配列番号６８～７２のうちのいずれか１つである）と、配列番号７又は８（例えば、配列番号８）のアミノ酸配列を含む（或いは、本質的に該アミノ酸配列からなるか、又は該アミノ酸配列からなる）ＩｇＧ１ Ｆｃに由来し、かつ、配列番号７又は８（例えば、配列番号８）に対してＥ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ｖ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｇ２３６ｄｅｌ、Ｇ２３７Ａ、Ｎ２９７Ａ、Ａ３２７Ｇ、Ａ３３０Ｓ及びＰ３３１Ｓから選択された１つ又は複数の変異を含むＦｃ部分とを含む持効型ＮＧＦポリペプチドに関する。いくつかの実施形態において、Ｆｃ部分は、配列番号７又は８の最初の５個のアミノ酸をさらに欠失している。いくつかの実施形態において、ペプチドリンカーは、アミノ酸配列（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号７０、ただし、ｎは１、２、３、４、５又は６である）を含む（或いは、本質的に該アミノ酸配列からなるか、又は該アミノ酸配列からなる）。いくつかの実施形態において、ペプチドリンカーは、配列番号６８又は６９のアミノ酸配列を含む（或いは、本質的に該アミノ酸配列からなるか、又は該アミノ酸配列からなる）。いくつかの実施形態において、ＮＧＦ部分は、配列番号１のアミノ酸配列を含む（或いは、本質的に該アミノ酸配列からなるか、又は該アミノ酸配列からなる）。いくつかの実施形態において、持効型ＮＧＦポリペプチドは、静脈注射、筋肉注射又は皮下注射によって個体（例えば、ヒト）に投与された場合、少なくとも１０時間（例えば、半減期が１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、７０、８０、９０および１００時間のうちの少なくとも一つである）の半減期を有する。いくつかの実施形態において、持効型ＮＧＦポリペプチドは、配列番号４のアミノ酸配列を含むＮＧＦ部分と比較して、引き起こした痛みが少ない（例えば、痛みを少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％減らす）。

【0060】

いくつかの実施形態において、本発明は、Ｎ端からＣ端まで、配列番号１～４のいずれか（例えば、配列番号１～３のいずれか）のアミノ酸配列を含む（或いは、本質的に該アミノ酸配列からなるか、又は該アミノ酸配列からなる）ＮＧＦ部分と、任意選択的なペプチドリンカー（例えば、配列番号６８～９９のうちのいずれか１つであるか、又は配列番号６８～７２のうちのいずれか１つである）と、配列番号７又は８（例えば、配列番号８）のアミノ酸配列を含むＩｇＧ１ Ｆｃに由来し、かつ配列番号７又は８（例えば、配列番号８）に対するＬ２３４、Ｌ２３５及びＰ３３１である位置に変異を含む（或いは、本質的にそれからなるか、又はそれからなる）Ｆｃ部分とを含む持効型ＮＧＦポリペプチドに関する。いくつかの実施形態において、Ｆｃ部分は、配列番号７又は８（例えば、配列番号８）の最初の５個のアミノ酸をさらに欠失している。いくつかの実施形態において、本発明は、Ｎ端からＣ端まで、配列番号１～４のいずれか（例えば、配列番号１～３のいずれか）のアミノ酸配列を含む（或いは、本質的に該アミノ酸配列からなるか、又は該アミノ酸配列からなる）ＮＧＦ部分と、任意選択的なペプチドリンカー（例えば、配列番号６８～９９のうちのいずれか１つであるか、又は配列番号６８～７２のうちのいずれか１つである）と、配列番号７又は８（例えば、配列番号８）のアミノ酸配列を含むＩｇＧ１ Ｆｃに由来し、かつ配列番号７又は８（例えば、配列番号８）に対してＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３３１Ｓ変異を含む（或いは、本質的にそれからなるか、又はそれからなる）Ｆｃ部分とを含む持効型ＮＧＦポリペプチドに関する。いくつかの実施形態において、本発明は、Ｎ端からＣ端まで、配列番号１～４のいずれか（例えば、配列番号１～３のいずれか）のアミノ酸配列を含む（或いは、本質的に該アミノ酸配列からなるか、又は該アミノ酸配列からなる）ＮＧＦ部分と、任意選択的なペプチドリンカー（例えば、配列番号６８～９９のうちのいずれか１つであるか、又は配列番号６８～７２のうちのいずれか１つである）と、配列番号７又は８（例えば、配列番号８）のアミノ酸配列を含むＩｇＧ１ Ｆｃに由来し、配列番号７又は８（例えば、配列番号８）に対してＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３３１Ｓ変異を含み（或いは本質的にそれからなり、又はそれからなり）、かつ配列番号７又は８（例えば、配列番号８）の最初の５個のアミノ酸をさらに欠失しているＦｃ部分とを含む持効型ＮＧＦポリペプチドに関する。いくつかの実施形態において、本発明は、Ｎ端からＣ端まで、配列番号１～４のいずれか（例えば、配列番号１～３のいずれか）のアミノ酸配列を含む（或いは、本質的に該アミノ酸配列からなるか、又は該アミノ酸配列からなる）ＮＧＦ部分と、任意選択的なペプチドリンカー（例えば、配列番号６８～９９のうちのいずれか１つであるか、又は配列番号６８～７２のうちのいずれか１つである）と、配列番号１１又は１２のアミノ酸配列を含む（或いは、本質的に該アミノ酸配列からなるか、又は該アミノ酸配列からなる）Ｆｃ部分とを含む持効型ＮＧＦポリペプチドに関する。いくつかの実施形態において、ペプチドリンカーは、アミノ酸配列（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号７０、ただし、ｎは１、２、３、４、５又は６である）を含む（或いは、本質的に該アミノ酸配列からなるか、又は該アミノ酸配列からなる）。いくつかの実施形態において、ペプチドリンカーは、配列番号６８又は６９のアミノ酸配列を含む（或いは、本質的に該アミノ酸配列からなるか、又は該アミノ酸配列からなる）。いくつかの実施形態において、ＮＧＦ部分は、配列番号１のアミノ酸配列を含む（或いは、本質的に該アミノ酸配列からなるか、又は該アミノ酸配列からなる）。いくつかの実施形態において、本発明は、配列番号６２～６４のうちのいずれか１つで示されるアミノ酸配列を含む（或いは、本質的に該アミノ酸配列からなるか、又は該アミノ酸配列からなる）持効型ＮＧＦポリペプチドに関する。いくつかの実施形態において、持効型ＮＧＦポリペプチドは、静脈注射、筋肉注射又は皮下注射によって個体（例えば、ヒト）に投与された場合、少なくとも１０時間（例えば、半減期が１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、７０、８０、９０および１００時間のうちの少なくとも一つである）の半減期を有する。いくつかの実施形態において、持効型ＮＧＦポリペプチドは、配列番号４のアミノ酸配列を含むＮＧＦ部分と比較して、引き起こした痛みが少ない（例えば、痛みを少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％減らす）。

【0061】

いくつかの実施形態において、本発明は、Ｎ端からＣ端まで、配列番号１～４のいずれか（例えば、配列番号１～３のいずれか）のアミノ酸配列を含む（或いは、本質的に該アミノ酸配列からなるか、又は該アミノ酸配列からなる）ＮＧＦ部分と、任意選択的なペプチドリンカー（例えば、配列番号６８～９９のうちのいずれか１つであるか、又は配列番号６８～７２のうちのいずれか１つである）と、配列番号７又は８（例えば、配列番号８）のアミノ酸配列を含むＩｇＧ１ Ｆｃに由来し、かつ配列番号７又は８（例えば、配列番号８）に対するＥ２３３、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｇ２３６、Ａ３２７、Ａ３３０及びＰ３３１である位置に変異を含む（或いは、本質的にそれからなるか、又はそれからなる）Ｆｃ部分とを含む持効型ＮＧＦポリペプチドに関する。いくつかの実施形態において、Ｆｃ部分は、配列番号７又は８（例えば、配列番号８）の最初の５個のアミノ酸をさらに欠失している。いくつかの実施形態において、本発明は、Ｎ端からＣ端まで、配列番号１～４のいずれか（例えば、配列番号１～３のいずれか）のアミノ酸配列を含む（或いは、本質的に該アミノ酸配列からなるか、又は該アミノ酸配列からなる）ＮＧＦ部分と、任意選択的なペプチドリンカー（例えば、配列番号６８～９９のうちのいずれか１つであるか、又は配列番号６８～７２のうちのいずれか１つである）と、配列番号７又は８（例えば、配列番号８）のアミノ酸配列を含むＩｇＧ１ Ｆｃに由来し、かつ配列番号７又は８（例えば、配列番号８）に対するＥ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ｖ、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３６ｄｅｌ、Ａ３２７Ｇ、Ａ３３０Ｓ及びＰ３３１Ｓ変異を含む（或いは、本質的にそれからなるか、又はそれからなる）Ｆｃ部分とを含む持効型ＮＧＦポリペプチドに関する。いくつかの実施形態において、本発明は、Ｎ端からＣ端まで、配列番号１～４のいずれか（例えば、配列番号１～３のいずれか）のアミノ酸配列を含む（或いは、本質的に該アミノ酸配列からなるか、又は該アミノ酸配列からなる）ＮＧＦ部分と、任意選択的なペプチドリンカー（例えば、配列番号６８～９９のうちのいずれか１つであるか、又は配列番号６８～７２のうちのいずれか１つである）と、配列番号７又は８（例えば、配列番号８）のアミノ酸配列を含むＩｇＧ１ Ｆｃに由来し、配列番号７又は８（例えば、配列番号８）に対してＥ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ｖ、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３６ｄｅｌ、Ａ３２７Ｇ、Ａ３３０Ｓ及びＰ３３１Ｓ変異を含み（或いは本質的にそれからなり、又はそれからなり）、かつ配列番号７又は８（例えば、配列番号８）の最初の５個のアミノ酸をさらに欠失しているＦｃ部分とを含む持効型ＮＧＦポリペプチドに関する。いくつかの実施形態において、本発明は、Ｎ端からＣ端まで、配列番号１～４のいずれか（例えば、配列番号１～３のいずれか）のアミノ酸配列を含む（或いは、本質的に該アミノ酸配列からなるか、又は該アミノ酸配列からなる）ＮＧＦ部分と、任意選択的なペプチドリンカー（例えば、配列番号６８～９９のうちのいずれか１つであるか、又は配列番号６８～７２のうちのいずれか１つである）と、配列番号１５又は１６のアミノ酸配列を含む（或いは、本質的に該アミノ酸配列からなるか、又は該アミノ酸配列からなる）Ｆｃ部分とを含む持効型ＮＧＦポリペプチドに関する。いくつかの実施形態において、ペプチドリンカーは、アミノ酸配列（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号７０、ただし、ｎは１、２、３、４、５又は６である）を含む（或いは、本質的に該アミノ酸配列からなるか、又は該アミノ酸配列からなる）。いくつかの実施形態において、ペプチドリンカーは、配列番号６８又は６９のアミノ酸配列を含む（或いは、本質的に該アミノ酸配列からなるか、又は該アミノ酸配列からなる）。いくつかの実施形態において、ＮＧＦ部分は、配列番号１のアミノ酸配列を含む（或いは、本質的に該アミノ酸配列からなるか、又は該アミノ酸配列からなる）。いくつかの実施形態において、本発明は、配列番号６６のアミノ酸配列を含む（或いは、本質的に該アミノ酸配列からなるか、又は該アミノ酸配列からなる）持効型ＮＧＦポリペプチドに関する。いくつかの実施形態において、持効型ＮＧＦポリペプチドは、静脈注射、筋肉注射又は皮下注射によって個体（例えば、ヒト）に投与された場合、少なくとも１０時間（例えば、半減期が１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、７０、８０、９０および１００時間のうちの少なくとも一つである）の半減期を有する。いくつかの実施形態において、持効型ＮＧＦポリペプチドは、配列番号４のアミノ酸配列を含むＮＧＦ部分と比較して、引き起こした痛みが少ない（例えば、痛みを少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％減らす）。

【0062】

いくつかの実施形態において、本発明は、Ｎ端からＣ端まで、配列番号１～４のいずれか（例えば、配列番号１～３のいずれか）のアミノ酸配列を含む（或いは、本質的に該アミノ酸配列からなるか、又は該アミノ酸配列からなる）ＮＧＦ部分と、任意選択的なペプチドリンカー（例えば、配列番号６８～９９のうちのいずれか１つであるか、又は配列番号６８～７２のうちのいずれか１つである）と、配列番号７又は８（例えば、配列番号８）のアミノ酸配列を含むＩｇＧ１ Ｆｃに由来し、かつ配列番号７又は８（例えば、配列番号８）に対するＬ２３４、Ｌ２３５、Ｇ２３７、Ａ３３０及びＰ３３１である位置に変異を含む（或いは、本質的にそれからなるか、又はそれからなる）Ｆｃ部分とを含む持効型ＮＧＦポリペプチドに関する。いくつかの実施形態において、Ｆｃ部分は、配列番号７又は８（例えば、配列番号８）の最初の５個のアミノ酸をさらに欠失している。いくつかの実施形態において、本発明は、Ｎ端からＣ端まで、配列番号１～４のいずれか（例えば、配列番号１～３のいずれか）のアミノ酸配列を含む（或いは、本質的に該アミノ酸配列からなるか、又は該アミノ酸配列からなる）ＮＧＦ部分と、任意選択的なペプチドリンカー（例えば、配列番号６８～９９のうちのいずれか１つであるか、又は配列番号６８～７２のうちのいずれか１つである）と、配列番号７又は８（例えば、配列番号８）のアミノ酸配列を含むＩｇＧ１ Ｆｃに由来し、かつ配列番号７又は８（例えば、配列番号８）に対してＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｇ２３７Ａ、Ａ３３０Ｓ及びＰ３３１Ｓ変異を含む（或いは、本質的にそれからなるか、又はそれからなる）Ｆｃ部分とを含む持効型ＮＧＦポリペプチドに関する。いくつかの実施形態において、本発明は、Ｎ端からＣ端まで、配列番号１～４のいずれか（例えば、配列番号１～３のいずれか）のアミノ酸配列を含む（或いは、本質的に該アミノ酸配列からなるか、又は該アミノ酸配列からなる）ＮＧＦ部分と、任意選択的なペプチドリンカー（例えば、配列番号６８～９９のうちのいずれか１つであるか、又は配列番号６８～７２のうちのいずれか１つである）と、配列番号７又は８（例えば、配列番号８）のアミノ酸配列を含むＩｇＧ１ Ｆｃに由来し、配列番号７又は８（例えば、配列番号８）に対してＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｇ２３７Ａ、Ａ３３０Ｓ及びＰ３３１Ｓ変異を含み（或いは本質的にそれからなり、又はそれからなり）、かつ配列番号７又は８（例えば、配列番号８）の最初の５個のアミノ酸をさらに欠失しているＦｃ部分とを含む持効型ＮＧＦポリペプチドに関する。そして、いくつかの実施形態において、本発明は、Ｎ端からＣ端まで、配列番号１～４のいずれか（例えば、配列番号１～３のいずれか）のアミノ酸配列を含む（或いは、本質的に該アミノ酸配列からなるか、又は該アミノ酸配列からなる）ＮＧＦ部分と、任意選択的なペプチドリンカー（例えば、配列番号６８～９９のうちのいずれか１つであるか、又は配列番号６８～７２のうちのいずれか１つである）と、配列番号１３又は１４のアミノ酸配列を含む（或いは、本質的に該アミノ酸配列からなるか、又は該アミノ酸配列からなる）Ｆｃ部分とを含む持効型ＮＧＦポリペプチドに関する。いくつかの実施形態において、ペプチドリンカーは、アミノ酸配列（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号７０、ただし、ｎは１、２、３、４、５又は６である）を含む（或いは、本質的に該アミノ酸配列からなるか、又は該アミノ酸配列からなる）。いくつかの実施形態において、ペプチドリンカーは、配列番号６８又は６９のアミノ酸配列を含む（或いは、本質的に該アミノ酸配列からなるか、又は該アミノ酸配列からなる）。いくつかの実施形態において、ＮＧＦ部分は、配列番号１のアミノ酸配列を含む（或いは、本質的に該アミノ酸配列からなるか、又は該アミノ酸配列からなる）。従って、いくつかの実施形態において、配列番号６５のアミノ酸配列を含む（或いは、本質的に該アミノ酸配列からなるか、又は該アミノ酸配列からなる）持効型ＮＧＦポリペプチドに関する。いくつかの実施形態において、持効型ＮＧＦポリペプチドは、静脈注射、筋肉注射又は皮下注射によって個体（例えば、ヒト）に投与された場合、少なくとも１０時間（例えば、半減期が１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、７０、８０、９０および１００時間のうちの少なくとも一つである）の半減期を有する。いくつかの実施形態において、持効型ＮＧＦポリペプチドは、配列番号４のアミノ酸配列を含むＮＧＦ部分と比較して、引き起こした痛みが少ない（例えば、痛みを少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％減らす）。

【0063】

いくつかの実施形態において、本発明は、Ｎ端からＣ端まで、配列番号１～４のいずれか（例えば、配列番号１～３のいずれか）のアミノ酸配列を含む（或いは、本質的に該アミノ酸配列からなるか、又は該アミノ酸配列からなる）ＮＧＦ部分と、任意選択的なペプチドリンカー（例えば、配列番号６８～９９のうちのいずれか１つであるか、又は配列番号６８～７２のうちのいずれか１つである）と、配列番号７又は８（例えば、配列番号８）のアミノ酸配列を含むＩｇＧ１ Ｆｃに由来し、かつ配列番号７又は８（例えば、配列番号８）に対する位置Ｎ２９７に１つの変異を含む（或いは、本質的にそれからなるか、又はそれからなる）Ｆｃ部分とを含む持効型ＮＧＦポリペプチドに関する。いくつかの実施形態において、Ｆｃ部分は、配列番号７又は８（例えば、配列番号８）の最初の５個のアミノ酸をさらに欠失している。いくつかの実施形態において、本発明は、Ｎ端からＣ端まで、配列番号１～４のいずれか（例えば、配列番号１～３のいずれか）のアミノ酸配列を含む（或いは、本質的に該アミノ酸配列からなるか、又は該アミノ酸配列からなる）ＮＧＦ部分と、任意選択的なペプチドリンカー（例えば、配列番号６８～９９のうちのいずれか１つであるか、又は配列番号６８～７２のうちのいずれか１つである）と、配列番号７又は８（例えば、配列番号８）のアミノ酸配列を含むＩｇＧ１ Ｆｃに由来し、かつ配列番号７又は８（例えば、配列番号８）に対する１つのＮ２９７Ａ変異を含む（或いは、本質的にそれからなるか、又はそれからなる）Ｆｃ部分とを含む持効型ＮＧＦポリペプチドに関する。いくつかの実施形態において、本発明は、Ｎ端からＣ端まで、配列番号１～４のいずれか（例えば、配列番号１～３のいずれか）のアミノ酸配列を含む（或いは、本質的に該アミノ酸配列からなるか、又は該アミノ酸配列からなる）ＮＧＦ部分と、任意選択的なペプチドリンカー（例えば、配列番号６８～９９のうちのいずれか１つであるか、又は配列番号６８～７２のうちのいずれか１つである）と、配列番号７又は８（例えば、配列番号８）のアミノ酸配列を含むＩｇＧ１ Ｆｃに由来し、配列番号７又は８（例えば、配列番号８）に対する１つのＮ２９７Ａ変異を含み（或いは本質的にそれからなり、又はそれからなり）、かつ配列番号７又は８（例えば、配列番号８）の最初の５個のアミノ酸をさらに欠失しているＦｃ部分とを含む持効型ＮＧＦポリペプチドに関する。従って、いくつかの実施形態において、本発明は、Ｎ端からＣ端まで、配列番号１～４のいずれか（例えば、配列番号１～３のいずれか）のアミノ酸配列を含む（或いは、本質的に該アミノ酸配列からなるか、又は該アミノ酸配列からなる）ＮＧＦ部分と、任意選択的なペプチドリンカー（例えば、配列番号６８～９９のうちのいずれか１つであるか、又は配列番号６８～７２のうちのいずれか１つである）と、配列番号９又は１０のアミノ酸配列を含む（或いは、本質的に該アミノ酸配列からなるか、又は該アミノ酸配列からなる）Ｆｃ部分とを含む持効型ＮＧＦポリペプチドに関する。いくつかの実施形態において、ペプチドリンカーは、アミノ酸配列（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号７０、ただし、ｎは１、２、３、４、５又は６である）を含む（或いは、本質的に該アミノ酸配列からなるか、又は該アミノ酸配列からなる）。いくつかの実施形態において、ペプチドリンカーは、配列番号６８又は６９のアミノ酸配列を含む（或いは、本質的に該アミノ酸配列からなるか、又は該アミノ酸配列からなる）。いくつかの実施形態において、ＮＧＦ部分は、配列番号１のアミノ酸配列を含む（或いは、本質的に該アミノ酸配列からなるか、又は該アミノ酸配列からなる）。いくつかの実施形態において、本発明は、配列番号６１のアミノ酸配列を含む（或いは、本質的に該アミノ酸配列からなるか、又は該アミノ酸配列からなる）持効型ＮＧＦポリペプチドに関する。いくつかの実施形態において、持効型ＮＧＦポリペプチドは、静脈注射、筋肉注射又は皮下注射によって個体（例えば、ヒト）に投与された場合、少なくとも１０時間（例えば、半減期が１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、７０、８０、９０および１００時間のうちの少なくとも一つである）の半減期を有する。いくつかの実施形態において、持効型ＮＧＦポリペプチドは、配列番号４のアミノ酸配列を含むＮＧＦ部分と比較して、引き起こした痛みが少ない（例えば、痛みを少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％減らす）。

【0064】

いくつかの実施形態において、Ｆｃ部分はヒトＩｇＧ４ ＦｃのようなＩｇＧ４ Ｆｃに由来する。いくつかの実施形態において、Ｆｃ部分は野生型ＩｇＧ４ Ｆｃ（例えば、ヒトＩｇＧ４ Ｆｃ）又はその天然変異体である。いくつかの実施形態において、Ｆｃ部分は配列番号１７のアミノ酸配列を含むＩｇＧ４ Ｆｃに由来する。従って、いくつかの実施形態において、本発明は、Ｎ端からＣ端まで、配列番号１～４のいずれか（例えば、配列番号１～３のいずれか）のアミノ酸配列を含む（或いは、本質的に該アミノ酸配列からなるか、又は該アミノ酸配列からなる）ＮＧＦ部分と、任意選択的なペプチドリンカー（例えば、配列番号６８～９９のうちのいずれか１つであるか、又は配列番号６８～７２のうちのいずれか１つである）と、配列番号１７のアミノ酸配列を含む（或いは、本質的に該アミノ酸配列からなるか、又は該アミノ酸配列からなる）Ｆｃ部分とを含む持効型ＮＧＦポリペプチドに関する。いくつかの実施形態において、本発明は、Ｎ端からＣ端まで、配列番号１～４のいずれか（例えば、配列番号１～３のいずれか）のアミノ酸配列を含む（或いは、本質的に該アミノ酸配列からなるか、又は該アミノ酸配列からなる）ＮＧＦ部分と、任意選択的なペプチドリンカー（例えば、配列番号６８～９９のうちのいずれか１つであるか、又は配列番号６８～７２のうちのいずれか１つである）と、配列番号１７のアミノ酸配列を含むＩｇＧ４ Ｆｃに由来するＦｃ部分とを含む持効型ＮＧＦポリペプチドに関する。いくつかの実施形態において、Ｆｃ部分は、配列番号１７の最初の５個のアミノ酸を欠失している。いくつかの実施形態において、本発明は、Ｎ端からＣ端まで、配列番号１～４のいずれか（例えば、配列番号１～３のいずれか）のアミノ酸配列を含む（或いは、本質的に該アミノ酸配列からなるか、又は該アミノ酸配列からなる）ＮＧＦ部分と、任意選択的なペプチドリンカー（例えば、配列番号６８～９９のうちのいずれか１つであるか、又は配列番号６８～７２のうちのいずれか１つである）と、配列番号１７のアミノ酸配列を含むＩｇＧ４ Ｆｃに由来し、かつ配列番号１７に対するＳ２２８、Ｆ２３４及びＬ２３５から選択された１つ又は複数の位置に変異を含む（或いは、本質的にそれからなるか、又はそれからなる）Ｆｃ部分とを含む持効型ＮＧＦポリペプチドに関する。いくつかの実施形態において、本発明は、Ｎ端からＣ端まで、配列番号１～４のいずれか（例えば、配列番号１～３のいずれか）のアミノ酸配列を含む（或いは、本質的に該アミノ酸配列からなるか、又は該アミノ酸配列からなる）ＮＧＦ部分と、任意選択的なペプチドリンカー（例えば、配列番号６８～９９のうちのいずれか１つであるか、又は配列番号６８～７２のうちのいずれか１つである）と、配列番号１７のアミノ酸配列を含むＩｇＧ４ Ｆｃに由来し、配列番号１７に対するＳ２２８、Ｆ２３４及びＬ２３５である位置に変異を含む（或いは、本質的にそれからなるか、又はそれからなる）Ｆｃ部分とを含む持効型ＮＧＦポリペプチドに関する。いくつかの実施形態において、本発明は、Ｎ端からＣ端まで、配列番号１～４のいずれか（例えば、配列番号１～３のいずれか）のアミノ酸配列を含む（或いは、本質的に該アミノ酸配列からなるか、又は該アミノ酸配列からなる）ＮＧＦ部分と、任意選択的なペプチドリンカー（例えば、配列番号６８～９９のうちのいずれか１つであるか、又は配列番号６８～７２のうちのいずれか１つである）と、配列番号１７のアミノ酸配列を含むＩｇＧ４ Ｆｃに由来し、かつ配列番号１７に対してＳ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ及びＬ２３５Ａから選択された１つ又は複数の変異を含む（或いは、本質的にそれからなるか、又はそれからなる）Ｆｃ部分とを含む持効型ＮＧＦポリペプチドに関する。いくつかの実施形態において、本発明は、Ｎ端からＣ端まで、配列番号１～４のいずれか（例えば、配列番号１～３のいずれか）のアミノ酸配列を含む（或いは、本質的に該アミノ酸配列からなるか、又は該アミノ酸配列からなる）ＮＧＦ部分と、任意選択的なペプチドリンカー（例えば、配列番号６８～９９のうちのいずれか１つであるか、又は配列番号６８～７２のうちのいずれか１つである）と、配列番号１７のアミノ酸配列を含むＩｇＧ４ Ｆｃに由来し、かつ配列番号１７に対するＳ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ変異を含む（或いは、本質的にそれからなるか、又はそれからなる）Ｆｃ部分とを含む持効型ＮＧＦポリペプチドに関する。いくつかの実施形態において、Ｆｃ部分は、配列番号１７の最初の５個のアミノ酸をさらに欠失している。従って、いくつかの実施形態において、本発明は、Ｎ端からＣ端まで、配列番号１～４のいずれか（例えば、配列番号１～３のいずれか）のアミノ酸配列を含む（或いは、本質的に該アミノ酸配列からなるか、又は該アミノ酸配列からなる）ＮＧＦ部分と、任意選択的なペプチドリンカー（例えば、配列番号６８～９９のうちのいずれか１つであるか、又は配列番号６８～７２のうちのいずれか１つである）と、配列番号１８のアミノ酸配列を含む（或いは、本質的に該アミノ酸配列からなるか、又は該アミノ酸配列からなる）Ｆｃ部分とを含む持効型ＮＧＦポリペプチドに関する。いくつかの実施形態において、ペプチドリンカーは、アミノ酸配列（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号７０、ただし、ｎは１、２、３、４、５又は６である）を含む（或いは、本質的に該アミノ酸配列からなるか、又は該アミノ酸配列からなる）。いくつかの実施形態において、ペプチドリンカーは、配列番号６８又は６９のアミノ酸配列を含む（或いは、本質的に該アミノ酸配列からなるか、又は該アミノ酸配列からなる）。いくつかの実施形態において、ＮＧＦ部分は、配列番号１のアミノ酸配列を含む（或いは、本質的に該アミノ酸配列からなるか、又は該アミノ酸配列からなる）。いくつかの実施形態において、本発明は、配列番号６７のアミノ酸配列を含む（或いは、本質的に該アミノ酸配列からなるか、又は該アミノ酸配列からなる）持効型ＮＧＦポリペプチドに関する。いくつかの実施形態において、持効型ＮＧＦポリペプチドは、静脈注射、筋肉注射又は皮下注射によって個体（例えば、ヒト）に投与された場合、少なくとも１０時間（例えば、半減期が１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、７０、８０、９０および１００時間のうちの少なくとも一つである）の半減期を有する。いくつかの実施形態において、持効型ＮＧＦポリペプチドは、配列番号４のアミノ酸配列を含むＮＧＦ部分と比較して、引き起こした痛みが少ない（例えば、痛みを少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％減らす）。

【0065】

いくつかの実施形態において、本発明は、配列番号３４、３６、３８、４０、４２、４４及び４６のうちのいずれか１つで示されるアミノ酸配列を含む（或いは、本質的に該アミノ酸配列からなるか、又は該アミノ酸配列からなる）持効型ＮＧＦポリペプチドに関する。いくつかの実施形態において、本発明は、配列番号３４、３６、３８、４０、４２、４４及び４６のうちのいずれか１つで示されるアミノ酸配列を含み（或いは本質的に該アミノ酸配列からなり、又は該アミノ酸配列からなり）、かつ配列番号６のシグナルペプチド配列を含まない持効型ＮＧＦポリペプチドに関する。いくつかの実施形態において、持効型ＮＧＦポリペプチドは、静脈注射、筋肉注射又は皮下注射によって個体（例えば、ヒト）に投与された場合、少なくとも１０時間（例えば、半減期が１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、７０、８０、９０および１００時間のうちの少なくとも一つである）の半減期を有する。いくつかの実施形態においてにおいて、持効型ＮＧＦポリペプチドは、配列番号４のアミノ酸配列を含むＮＧＦ部分と比較して、引き起こした痛みが少ない（例えば、痛みを少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％減らす）。
ＮＧＦ部分

【0066】

発現した最初のＮＧＦは、α－ＮＧＦ、β－ＮＧＦ及びγ－ＮＧＦという３つのタンパク質（比率２：１：２）からなる７Ｓ、１３０ｋＤａの複合体である。前記複合体のγサブユニットは、セリンプロテアーゼとしてβサブユニットのＮ端を切断し、それによってタンバク質を機能的なＮＧＦに活性化する。ヒトＮＧＦ遺伝子は、第１染色体の短腕に位置し、完全なＮＧＦエクソンが２４１個のアミノ酸をコードし、プレプロＮＧＦ（ｐｒｅｐｒｏＮＧＦ）前駆体（配列番号５０）として一般に呼ばれている。プレプロＮＧＦ前駆体は、シグナルペプチド配列（配列番号６）、プロペプチド（配列番号５）及び成熟のＮＧＦ配列（β－ＮＧＦ、配列番号４）を含む。プレプロＮＧＦ前駆体のシグナルペプチドはプロＮＧＦ（ｐｒｏＮＧＦ）前駆体（２２３個のアミノ酸、配列番号５４）を形成するように小胞体で切断される。プロＮＧＦ前駆体は、小胞体にホモ二量体として存在し、その後ゴルジ体に移動する。ゴルジ体において、プロＮＧＦ前駆体の二量体は、プロペプチドの３つのフリンモチーフ（Ｆｕｒｉｎ ｍｏｔｉｆ）でフリンによって切断される。成熟β－ＮＧＦ二量体は、成熟ＮＧＦ配列－１及び－２位置に位置するフリンモチーフがフリンによって切断されて形成し、各単量体が１１８又は１２０個のアミノ酸を含む。その後、成熟したβ－ＮＧＦ二量体は細胞外に輸送される。一部の切断されていないプロＮＧＦ前駆体は同様に細胞外に分泌される。ＮＧＦの構造は図２に示されている。

【0067】

ＮＧＦは、雄マウス顎下腺や、ウシ精漿、ヘビ毒、モルモット前立腺、ヒト胎盤組織などの様々な種に豊富に存在する。マウスＮＧＦとヒトＮＧＦとは、９０％と高いアミノ酸配列相同性を有する。

【0068】

ＮＧＦがトロポミオシン受容体キナーゼＡ（ＴｒｋＡ）および低親和力のＮＧＦ受容体（ＬＮＧＦＲ／ｐ７５ＮＴＲ）のいずれかに結合することは、神経変性疾患に関連する。ＮＧＦはＴｒｋＡ受容体に結合すると、受容体のホモ二量体化が促進され、そしてチロシンキナーゼ断片の自己リン酸化が引き起こされ、ＰＩ３－キナーゼ、ｒａｓ及びＰＬＣシグナル経路が活性化される。ｐ７５ＮＴＲ受容体がＴｒｋＡと同様に形成し得るヘテロ二量体がＮＧＦに対してもっと高い親和力と特異性を持っている。一方、プロＮＧＦがｐ７５ＮＴＲ及びソーティリンに高親和力で結合し、シグナル複合体を生じる。該シグナル複合体は、ＮＲＡＧＥ及びＲａｃを動員してＪＮＫシグナル伝達カスケードを活性化し、その結果、主にアポトーシスが促進される。プロＮＧＦがｐ７５ＮＴＲに結合すると、ＮＦκＢの活性化が促進され、それによってニューロンの生存が誘導されることもある。

【0069】

本明細書で使用される場合、用語「ＮＧＦ部分」とは、ＮＧＦ分子、その種変異体、断片、変異体又はその誘導体を指す。ＮＧＦ部分は、切断されたバージョン、翻訳後修飾されたバージョン、ハイブリッド変異体、ペプチド模倣物、生物学的に活性な断片、欠失変異体、置換変異体又は挿入変異体でよい。これらの変異体は、ＮＧＦ受容体によりシグナル伝達を誘導するようにＮＧＦ受容体に結合するという親ＮＧＦの活性を少なくともある程度で維持できるものである。本明細書に記載されている「親としてのＮＧＦ」又は「親ＮＧＦ」とは、それから設計、修飾又は誘導体化してＮＧＦ部分を得るＮＧＦ参照配列を指す。

【0070】

いくつかの実施形態において、ＮＧＦ部分は野生型ＮＧＦである。いくつかの実施形態において、ＮＧＦ部分はＮＧＦ天然変異体である。いくつかの実施形態において、ＮＧＦ部分は、ＮＧＦ類似物であり、一例として、６個以下のアミノ酸（例えば、６、５、４、３、２及び１個のアミノ酸）の変異を含むＮＧＦである。いくつかの実施形態において、ＮＧＦ部分はＮＧＦ誘導体である。本明細書で使用される場合、用語「ＮＧＦ誘導体」とは、ＮＧＦアミノ酸配列又はＮＧＦ類似物を有する分子を指すが、１つ又は複数のアミノ酸基、α炭素原子、アミノ末端又はカルボキシル末端で付加された化学修飾をさらに有することがある。化学修飾としては、化学基の付加、新しい化学結合の生成、及び化学基の除去が挙げられるが、これらに限定されない。アミノ酸側基の修飾としては、リジンのεアミノアシル化；アルギニン、ヒスチジン又はリジンのＮ－アルキル化；グルタミン酸又はアスパラギン酸のカルボキシ基のアルキル化；グルタミン又はアスパラギンの脱アミノ化が挙げられるが、これらに限定されない。アミノ末端の修飾としては、脱アミノ化、Ｎ－低級アルキル、Ｎ－ジ低級アルキル及びＮ－アシル修飾が挙げられるが、これらに限定されない。カルボキシル末端の修飾としては、アミド、低級アルキルアシル、ジアルキルアミド及び低級アルキルエステル修飾が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、低級アルキル基はＣ１～Ｃ４アルキル基である。さらに、１つ又は複数の側基又は末端基については、化学分野の当業者が知られている保護基により保護されてもよい。アミノ酸のα炭素は、モノメチル化されてもよく、ジメチル化されてもい。いくつかの実施形態において、ＮＧＦ部分は、ポリエチレングリコール化ＮＧＦのような修飾ＮＧＦ、又はグリコシル化ＮＧＦのような共有結合修飾ＮＧＦである。

【0071】

ＮＧＦ部分は、任意の生物に由来することができ、例えば、家畜（例えば、ウシや、ヒツジ、ヤギ、ネコ、イヌ、ロバ、ウマなど）、霊長類（例えば、ヒトおよび、サルやチンパンジーなどのヒト以外の霊長類）、ウサギ、及びげっ歯類（例えば、マウスや、ラット、アレチネズミ、ハムスターなど）を含むがこれらに限定されない哺乳動物に由来することができる。

【0072】

いくつかの実施形態において、ＮＧＦ部分はヒトＮＧＦ（ｈＮＧＦ）である。いくつかの実施形態において、ＮＧＦ部分は野生型（ｗｔ）ｈＮＧＦである。いくつかの実施形態において、ＮＧＦ部分はｈＮＧＦ天然変異体である。いくつかの実施形態において、ＮＧＦ部分は、６個以下のアミノ酸（例えば、６、５、４、３、２又は１個のアミノ酸）変異を含むｈＮＧＦのようなｈＮＧＦ類似物である。いくつかの実施形態において、ＮＧＦ部分はｈＮＧＦ誘導体である。本出願に適用されるＮＧＦ部分は、当技術分野で周知されているｈＮＧＦの多くの活性断片、類似物及び誘導体うちのいずれかの一種とされてもよい。

【0073】

本明細書に記載されているように、ＮＧＦ部分は、ヒト組織又は他の供給源などの様々な供給源から単離されたＮＧＦとされてもよいし、組換え又は合成法によって調製されたＮＧＦとされてもよい。いくつかの実施形態において、ＮＧＦ部分は、組換えＮＧＦであり、例えば、組換えｈＮＧＦ（ｒｈＮＧＦ）である。いくつかの実施形態において、ＮＧＦ部分は、マウスＮＧＦであり、例えば、組換えマウスＮＧＦである。

【0074】

いくつかの実施形態において、ＮＧＦ部分は全長ＮＧＦである。いくつかの実施形態において、ＮＧＦ部分は、ＮＧＦの機能的断片である。該ＮＧＦの機能的断片は、全長ＮＧＦ分子の大半又は全部の生物活性を産生可能なものであり、例えば、全長β－ＮＧＦの大半又は全部の生物活性を産生することができる。いくつかの実施形態において、ＮＧＦ部分は、プレプロＮＧＦ（例えば、ヒトプレプロＮＧＦ）又はその活性断片であり、つまり、シグナルペプチド、プロペプチド及びβ－ＮＧＦの全長又は断片を全部含む。いくつかの実施形態において、ＮＧＦ部分は、配列番号４７～５０のうちのいずれか１つで示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＮＧＦ部分は、プロＮＧＦ（例えば、ヒトｐｒｏＮＧＦ）又はその活性断片、つまり、プロペプチド及びβ－ＮＧＦの全長又は断片を含む。いくつかの実施形態において、ＮＧＦ部分は、配列番号５１～５４のうちのいずれか１つで示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＮＧＦ部分は成熟ＮＧＦ又はその活性断片、つまり、β－ＮＧＦ（例えば、ヒトβ－ＮＧＦ）の全長又は活性断片を含む。いくつかの実施形態において、ＮＧＦ部分は、配列番号１～４のうちのいずれか１つで示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＮＧＦ部分は野生型ヒトβ－ＮＧＦ（配列番号４）である。いくつかの実施形態において、ＮＧＦ部分は、最後の２個のアミノ酸が切断された野生型ヒトβ－ＮＧＦ（配列番号３）である。いくつかの実施形態において、ＮＧＦ部分は、β－ＮＧＦのＮ端に、異なる又は同じのＮＧＦ分子に由来するシグナルペプチドを含む。いくつかの実施形態において、シグナルペプチドは、配列番号６のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＮＧＦ部分は、β－ＮＧＦのＮ端にプロペプチドを含む。いくつかの実施形態において、プロペプチドは、配列番号５のアミノ酸配列を含む。

【0075】

いくつかの実施形態において、ＮＧＦ部分は、変異体又はＮＧＦ改変体であり、例えば、野生型ＮＧＦの大半或いは全部の生物活性を産生可能なＮＧＦ改変体又は変異体である。変異ＮＧＦ部分には、ＮＧＦ分子（例えば、成熟β－ＮＧＦ）における１つ又は複数のアミノ酸部位での変異が含まれることがある。いくつかの実施形態において、変異ＮＧＦ部分には、ＮＧＦにおける１つ又は複数のアミノ酸部位でのアミノ酸置換が含まれることがある。いくつかの実施形態において、変異ＮＧＦ部分には、ＮＧＦにおける１つ又は複数のアミノ酸部位でのアミノ酸欠失又は挿入が含まれる。いくつかの実施形態において、変異ＮＧＦ部分には、ＮＧＦにおける１つ又は複数のアミノ酸の修飾が含まれる。

【0076】

いくつかの実施形態において、ＮＧＦ部分は、１つ又は複数の保存的アミノ酸配列置換を有する。「保存的置換」とは、置換されるアミノ酸と同じの正味電荷、ほぼ同じのサイズ及び形状を有する別のアミノ酸で置換を行うことを指す。側鎖での炭素原子とヘテロ原子の総数の差が４を超えない場合、脂肪族又は置換脂肪族アミノ酸側鎖を持っているアミノ酸のサイズがほぼ同じであると考えられる。その側鎖の分岐数の差が１を超えない場合、アミノ酸の形状がほぼ同じであると考えられる。側鎖にフェニル基又は置換フェニル基を有するアミノ酸は、サイズ及び形状がほぼ同じであると考えられる。特に断りがない限り、保存的置換には、天然アミノ酸を使用することが好ましい。それについて、以下の「アミノ酸置換基」節を参照のこと。

【0077】

「アミノ酸」は、本明細書でその最も広い定義で使用されており、つまり、天然に存在するアミノ酸配列と非天然に存在するアミノ酸配列とも包含し、またアミノ酸の類似物及び誘導体を包含する。後者には、アミノ酸部分を含む分子が含まれる。本明細書に記載されているアミノ酸には、例えば、タンバク質の形成に関与する天然Ｌ－アミノ酸；Ｄ－アミノ酸；アミノ酸の類似物や誘導体などの化学的に修飾されたアミノ酸；ノルロイシンや、β－アラニン、オルニチン、ＧＡＢＡなどのタンバク質の形成に関与しない天然アミノ酸；ならびに当技術分野で知られているアミノ酸特性を有する化学合成的化合物が含まれる。これは、前記広い定義によれば、当業者が分かれることである。本明細書で使用される場合、用語「タンバク質の形成」とは、代謝経路を介して細胞のペプチド、ポリペプチド又はタンバク質を合成できるアミノ酸を指す。

【0078】

合成的非天然アミノ酸、置換アミノ酸又は一つ又は複数のＤ－アミノ酸を含む非天然アミノ酸を本発明の持効型ＮＧＦポリペプチド（又はＮＧＦ部分）に挿入することにより、様々な利点が得られる。Ｄ－アミノ酸を含むポリペプチドは、Ｌ－アミノ酸を含むポリペプチドと比較して、インビトロ及びインビボで示した安定性が高い。従って、良好な細胞内安定性を図る場合に、Ｄ－アミノ酸を添加することによりポリペプチドを構築するのが特に有用である。特に、Ｄ－ペプチド及びその類似物は、内在性ペプチダーゼ及びプロテアーゼ活性に耐性があるため、必要に応じて分子のバイオアベイラビリティの向上、およびインビボでのその寿命の延長に用いられる。ただし、Ｄ－ペプチド及びその類似物は、ＩＩ型主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）によるヘルパーＴ細胞への提示が制限されているために効率的に処理することができなく、被検者において体液性免疫応答を誘発するのが困難である。

【0079】

いくつかの実施形態において、ＮＧＦ部分は、変異体又はＮＧＦ改変体であり、野生型ＮＧＦに比較すると、副作用（例えば、痛み）を軽減又は解消する程度が高い。いくつかの実施形態において、変異体又はＮＧＦ改変体であるＮＧＦ部分は、野生型ＮＧＦと比較すると、少なくとも５％（例えば、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％又は１００％のうちのいずれか１つ）の痛みを軽減し、例えば、投与後の１つ又は複数の時点（例えば、すべての時点）で少なくとも５％の痛みを軽減する。いくつかの実施形態において、変異体又はＮＧＦ改変体であるＮＧＦ部分は、野生型ＮＧＦと比較すると、少なくとも５％（例えば、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％又は１００％のうちのいずれか１つ）の疼痛閾値を増加させる。例えば、いくつかの実施形態において、個体の疼痛閾値は約８であり、野生型ＮＧＦを投与した後、疼痛閾値は約６に低下したが、変異体又はＮＧＦ改変体（あるいは本明細書に記載されているそれを含む持効型ＮＧＦポリペプチド）を投与した後、疼痛閾値は８程度に維持され、例えば、痛みは約２５％軽減したか又は疼痛閾値は約２５％増加した。いくつかの実施形態において、ＮＧＦ部分は、特許ＣＮ１０７２８６２３３Ａ、ＷＯ２０１７１５７３２５及びＷＯ２０１７１５７３２６に記載された変異体又はＮＧＦ改変体であり、その全内容は参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態において、ＮＧＦ部分は、ヒト野生型β－ＮＧＦ配列（配列番号４）に対して、ヒト野生型β－ＮＧＦ配列（配列番号４）に対するＦ１２Ｅ変異を含む。いくつかの実施形態において、ＮＧＦ部分は、配列番号２のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＮＧＦ部分は、ヒト野生型β－ＮＧＦ配列（配列番号４）に対してＦ１２Ｅ変異を含み、かつ最後の２個のアミノ酸が切断される。いくつかの実施形態において、ＮＧＦ部分は、配列番号１で示されるアミノ酸配列（以下、「ｍＮＧＦ１１８」とも呼ばれる）を含む。

【0080】

本明細書に記載されているように、ＮＧＦ部分又は持効型ＮＧＦポリペプチドのアミノ酸配列改変体は、タンバク質をコードする核酸配列に適切な修飾を導入することによって、又はペプチド合成によって調製することがある。前記修飾には、例えば、ＮＧＦ部分又は持効型ＮＧＦポリペプチドのアミノ酸配列における残基の欠失及び／又は挿入及び／又は置換が含まれる。最終構築物は、リガンド－受容体結合の保持・改良、生物活性の保持・増強（例えば、ニューロンの成長、維持、増殖及び／又は生存の促進）、半減期の保持・増強、ＡＤＣＣ／ＣＤＣの保持・低減、疼痛誘発活性の保持・軽減といった所望の特性を有する限り、欠失、挿入、置換又はそれらの任意の組み合わせにより得ることができる。

【0081】

表Ａには保存的置換が示されている。より多くの実質的な置換は、アミノ酸側鎖クラスに関する以下のセクションでさらに詳述されるように、表１で「置換の例」という表題の欄で提供される。アミノ酸は、一般的な側鎖の特性に従って、（１）疎水性のノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；（２）中性親水性のＣｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；（３）酸性のＡｓｐ、Ｇｌｕ；（４）塩基性のＨｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；（５）鎖の向きに影響を与える残基であるＧｌｙ、Ｐｒｏ；（６）芳香族のＴｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅと分類される。非保存的置換では、これらのカテゴリにおける１つのメンバーを別のカテゴリにおけるメンバーに置換する必要がある。アミノ酸置換をタンバク質構築物に導入し、そしてスクリーニングにより上記した所望の活性に適合する製品を得ることができる。

【0082】

【表1】

【0083】

本明細書に記載されているように、持効型ＮＧＦポリペプチドはＣ端にＦｃ部分を含む。
いくつかの実施形態において、Ｆｃ部分は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭ、ならびにそれらのサブクラスのうちのいずれか１つに由来する。すべての免疫グロブリンの中で、ＩｇＧは血清含有量が最も高く、半減期が最も長い。他の免疫グロブリンとは異なり、Ｆｃ受容体（ＦｃＲｓ）に結合した後、ＩｇＧは効果的に再利用される可能性がある。いくつかの実施形態において、Ｆｃ部分は、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４）に由来する。いくつかの実施形態において、Ｆｃ部分はヒトＩｇＧに由来する。いくつかの実施形態において、Ｆｃ部分はＣＨ２及びＣＨ３を含む。いくつかの実施形態において、Ｆｃ部分は、ヒンジ領域の全部又は一部をさらに含む。いくつかの実施形態において、Ｆｃ部分はヒトＩｇＧ１又はヒトＩｇＧ４に由来する。いくつかの実施形態において、Ｆｃ部分の２つのサブユニットは、１つ又は複数（例えば、１、２、３、４又はそれ以上）のジスルフィド結合を介して二量体化される。いくつかの実施形態において、Ｆｃ部分は、各サブユニットが全長Ｆｃ配列を含む。いくつかの実施形態において、Ｆｃ部分は、二量体化過程におけるジスルフィド結合のミスペアリングが低減するように、各サブユニットがＮ端切断型Ｆｃ配列を含み、例えば、各サブユニットがＮ端システインが少ない切断型Ｆｃドメインを含む。いくつかの実施形態において、Ｆｃ部分はＮ端で切断され、例えば、完全な免疫グロブリンＦｃドメインの最初の１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個のアミノ酸が欠失している。いくつかの実施形態において、Ｆｃ部分は、挿入、欠失及び／又は置換といった１つ又は複数の変異を含む。

【0084】

本発明では、本明細書に記載されているような高い生物活性、長い半減期及び低い免疫毒性（例えば、ＡＤＣＣ及び／又はＣＤＣ）を持効型ＮＧＦポリペプチドに提供できるＦｃ断片をスクリーニングにより得ることを期待している。

【0085】

Ｆｃドメインによれば、Ｆｃ含有タンパク質は、補体を活性化してＦｃ受容体（ＦｃＲｓ）と相互作用する可能性がある。このような固有の免疫グロブリン特性は、ＮＧＦ－Ｆｃ融合タンパク質がＮＧＦ受容体を発現する好ましい細胞を標的とするかわりにＦｃ受容体を発現する細胞を標的とすることを引き起こす恐れがあるので、不利であると考えられている。さらに、Ｆｃ融合タンパク質は、半減期が長く、全身毒性を有するために、治療に適用されることが困難になっている。従って、いくつかの実施形態において、Ｆｃ部分は、ＦｃＲへの結合を改変するために、特に、Ｆｃγ受容体（ＡＤＣＣに関与する）への結合及び／又はエフェクター機能を改変するために、例えば、抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）及び／又は補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を改変するために、改造される（例えば、１つ又は複数のアミノ酸変異を含む）。好ましくは、このようなアミノ酸の変異は、ＦｃＲｎ受容体（半減期に関与する）への結合を軽減させるものではない。

【0086】

１つ又は複数のＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ又はＣＤＣといったエフェクター機能を除去するように変異されたＦｃ部分（例えば、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ）は、以下、「エフェクター機能のない」又は「エフェクター機能がほぼない」Ｆｃ部分と呼ばれる。いくつかの実施形態において、Ｆｃ部分は、例えば、（例えば、各Ｆｃサブユニット内に）Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｇ２３７Ａ、Ａ３３０Ｓ及びＰ３３１Ｓに選択された１つ又は複数の変異を含むエフェクター機能のないヒトＩｇＧ１ Ｆｃである。ＩｇＧ１ ＦｃにおけるＫ３２２Ａ、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａの組み合わせによれば、ＦｃγＲとＣ１ｑの結合を完全に無効にするのに十分である（Ｈｅｚａｒｅｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７５，１２１６１－１２１６８，２００１）。Ｌ２３４Ｆ／Ｌ２３５Ｅ／Ｐ３３１Ｓの三重変異が非常に類似した効果を持っていることはＭｅｄＩｍｍｕｎｅにより発見された（Ｏｇａｎｅｓｙａｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃａ ６４，７００－７０４，２００８）。いくつかの実施形態において、Ｆｃ部分は、ＩｇＧ１ ＦｃドメインのＮ２９７上のグリコシル化修飾を含み、これは最適なＦｃＲ相互作用に必要であることが知られている。Ｆｃ部分修飾は、Ｗａｎｇらによって言及された任意の適切なＩｇＧ Ｆｃ操作であってもよい。参照になる「抗体エフェクター機能を調節するためのＩｇＧ Ｆｃエンジニアリング」、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｅｌｌ．２０１８ Ｊａｎ；９（１）：６３－７３」の内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0087】

いくつかの実施形態において、持効型ＮＧＦポリペプチドは、本明細書に記載されているように、ＡＤＣＣ及び／又はＣＤＣを有さないか、又は検出可能なＡＤＣＣ及び／又はＣＤＣを有さない。いくつかの実施形態において、持効型ＮＧＦポリペプチドは、本明細書に記載されているように、同じＮＧＦ部分を含むが野生型又は非修飾Ｆｃ断片であるＮＧＦ－Ｆｃ構築物と比較して、ＡＤＣＣ及び／又はＣＤＣが少なくとも５％（少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％又は１００％のうちのいずれか１つ）軽減した。
グリコシル化変異体

【0088】

いくつかの実施形態において、Ｆｃ部分又は持効型ＮＧＦポリペプチドを改変することにより構築物のグリコシル化の程度を増加又は軽減する。アミノ酸配列を改変することによりＦｃ部分にグリコシル化部位を追加又は削除することが可能になり、１つ又は複数のグリコシル化部位を作成又は除去するようにする。

【0089】

哺乳動物細胞によって産生された天然のＦｃ含有タンパク質は、Ｎ－結合を介してＦｃ領域のＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７に一般に連結されている、２分岐糖鎖構造のオリゴ糖を含むことが一般である。Ｗｒｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．，ＴＩＢＴＥＣＨ １５：２６－３２（１９９７）を参照のこと。オリゴ糖には、マンノース、Ｎ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ガラクトース及びシアル酸、ならびに２分岐糖鎖構造のオリゴ糖における「ステム」上のＧｌｃＮＡｃに付着されたフコースなどの様々な炭水化物が含まれることがある。いくつかの実施形態において、Ｆｃ部分におけるオリゴ糖に対しては、特定の改善特性を生じるように修飾を行うことができる。

【0090】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載されているＦｃ部分又は持効型ＮＧＦポリペプチドは、Ｆｃ部分に（直接的又は間接的に）付着されているフコースを欠いた炭水化物構造を有する。例えば、そのようなＦｃ部分又は持効型ＮＧＦポリペプチドは、その中のフコース含有量が１％～８０％、１％～６５％、５％～６５％又は２０％～４０％の範囲である可能性がある。ＷＯ２００８／０７７５４６に記載されるように、フコースの含有量は、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析を使用してＡｓｎ２９７（例えば、複合体、ハイブリッド及び高マンノース構造）に連結した全部の糖構造の合計に対するＡｓｎ２９７に連結した糖鎖内のフコースの平均含有量を測定することによって決定される。Ａｓｎ２９７とは、Ｆｃ領域の２９７位にあるアスパラギン残基を指す（Ｆｃ領域残基についてＥＵ番号付けシステムを使用した）。ただし、Ｆｃ領域に小さな配列変化があるため、Ａｓｎ２９７は、２９７位の約±３個のアミノ酸の上流又は下流、つまり、２９４と３００位の間に位置することもある。このようなフコシル化改変体は、増強されたＡＤＣＣ機能を有する可能性がある。ＵＳ Ｐａｔｅｎｔ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏｓ．ＵＳ ２００３／０１５７１０８（Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ．），ＵＳ ２００４／００９３６２１（Ｋｙｏｗａ Ｈａｋｋｏ Ｋｏｇｙｏ Ｃｏ．，Ｌｔｄ）を参照のこと。「アフコシル化」又は「フコース欠損」の抗体改変体に関連する刊行物の例としては、ＵＳ ２００３／０１５７１０８；ＷＯ ２０００／６１７３９；ＷＯ ２００１／２９２４６；ＵＳ ２００３／０１１５６１４；ＵＳ ２００２／０１６４３２８；ＵＳ ２００４／００９３６２１；ＵＳ ２００４／０１３２１４０；ＵＳ ２００４／０１１０７０４；ＵＳ ２００４／０１１０２８２；ＵＳ ２００４／０１０９８６５；ＷＯ ２００３／０８５１１９；ＷＯ ２００３／０８４５７０；ＷＯ ２００５／０３５５８６；ＷＯ ２００５／０３５７７８；ＷＯ２００５／０５３７４２；ＷＯ２００２／０３１１４０；Ｏｋａｚａｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３６：１２３９－１２４９（２００４）；Ｙａｍａｎｅ－Ｏｈｎｕｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．８７：６１４（２００４）が挙げられる。アフコシル化Ｆｃ含有タンパク質を産生できる細胞株の例としては、タンパク質フコシル化機能を欠いたＬｅｃ１３ ＣＨＯ細胞（Ｒｉｐｋａ ｅｔ ａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２４９：５３３－５４５（１９８６）；ＵＳ Ｐａｔ Ａｐｐｌ Ｎｏ ＵＳ ２００３／０１５７１０８ Ａ１，Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ；及びＷＯ ２００４／０５６３１２ Ａ１，Ａｄａｍｓ ｅｔ ａｌ．，特に実施例１１を参照のこと）、α－１，６－フコシルトランスフェラーゼ遺伝子やＦＵＴ８ノックアウトＣＨＯ細胞などのノックアウト細胞株（Ｙａｍａｎｅ－Ｏｈｎｕｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．８７：６１４（２００４）；Ｋａｎｄａ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，９４（４）：６８０－６８８（２００６）；及びＷＯ２００３／０８５１０７を参照のこと）が挙げられる。
エフェクター機能変異体

【0091】

いくつかの実施形態において、本発明では、ある適用にとって理想的な候補になるように、Ｆｃ部分又は持効型ＮＧＦポリペプチドとしてＦｃエフェクター機能の全部ではないが一部を有するものを使用する。該適用においては持効型ＮＧＦポリペプチドのインビボでの半減期が重要であるが、あるエフェクター機能（ＣＤＣやＡＤＣＣなど）は必須ではないか或いは有害である。ＣＤＣ及び／又はＡＤＣＣ活性の軽減／枯渇を決定するためには、細胞毒性アッセイをインビトロ又はインビボで行うことができる。例えば、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）結合アッセイを実施することにより、Ｆｃ部分又は持効型ＮＧＦポリペプチドはＦｃ(Ｒ結合を欠いている（従って、ＡＤＣＣ活性を欠いている可能性がある）がＦｃＲｎ結合能力を保持していることを確認できる。ＡＤＣＣを媒介する主要な細胞としては、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ）はＦｃγＲＩＩＩのみを発現するが、単球はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞上のＦｃＲの発現については、Ｒａｖｅｔｃｈ及びＫｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：４５７－４９２（１９９１）第４６４頁の表２に要約されている。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するために使用されるインビトロアッセイの非限定的な例としては、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．５，５００，３６２（Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ，Ｉ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３：７０５９－７０６３（１９８６）参照）及びＨｅｌｌｓｔｒｏｍ，Ｉ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：１４９９－１５０２（１９８５）；５，８２１，３３７（Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６６：１３５１－１３６１（１９８７）参照）に詳述されている。或いは、非放射性検出法（フローサイトメトリー用のＡＣＴＩ^TM非放射性毒性アッセイ（ＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ）及びＣｙｔｏＴｏｘ ９６^R非放射性毒性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）参照）を使用してもよい。この検出に適したエフェクター細胞としては、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）及びＮＫ細胞がある。さらに、目的の分子のＡＤＣＣ活性は、例えば、Ｃｌｙｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：６５２～６５６（１９９８）に記載された動物モデルにおいて、インビボで評価されてもよい。また、Ｃ１ｑ結合アッセイを行うことにより、持効型ＮＧＦポリペプチドがＣ１ｑに結合することができないからＣＤＣ活性を欠いていることを決定することもできる。それについて、ＷＯ２００６／０２９８７９及びＷＯ２００５／１００４０２のＣ１ｑとＣ３ｃを組み合わせた酵素結合免疫吸着アッセイを参照のこと。補体活性を評価するためにＣＤＣアッセイを行うことができる（Ｇａｚｚａｎｏ－Ｓａｎｔｏｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０２：１６３（１９９６）；Ｃｒａｇｇ，Ｍ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ １０１：１０４５－１０５２（２００３）及びＣｒａｇｇ，Ｍ．Ｓ．及びＭ．Ｊ．Ｇｌｅｎｎｉｅ，Ｂｌｏｏｄ １０３：２７３８－２７４３（２００４）参照）。ＦｃＲｎ結合及びインビボクリアランス／半減期は、当技術分野で知られている方法を使用して決定することができる（Ｐｅｔｋｏｖａ，Ｓ．Ｂ．ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ’ｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８（１２）：１７５９－１７６９（２００６）参照）。

【0092】

エフェクター機能が低下したＦｃ部分は、Ｆｃ領域における第２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７及び３２９位のうちの１つ又は複数の残基の置換を含む（Ｕ．Ｓ．特許Ｎｏ．６，７３７，０５６）。このようなＦｃ変異体は、アミノ酸部位２６５、２６９、２７０、２９７及び３２７のうちの２つ以上の部位での置換を含み、また、２６５及び２９７残基がアラニンに置換されたいわゆる「ＤＡＮＡ」Ｆｃ変異体を含む（ＵＳ特許Ｎｏ．７，３３２，５８１）。ＦｃＲｓへの結合が増強又は軽減された特定の抗体改変体については、Ｕ．Ｓ．特許Ｎｏ．６，７３７，０５６；ＷＯ ２００４／０５６３１２，及びＳｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．９（２）： ６５９１－６６０４（２００１）に詳述されている。いくつかの実施形態において、Ｆｃ領域は、ＵＳ特許Ｎｏ．６，１９４，５５１、ＷＯ９９／５１６４２及びＩｄｕｓｏｇｉｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：４ １７８－４１８４（２０００）に記載されるように、Ｃ１ｑ結合及び／又はＣＤＣを改変する（即ち、増加又は軽減させる）ように改造されている。

【0093】

いくつかの実施形態において、Ｆｃ部分は、１つ又は複数のアミノ酸置換を含むことにより、半減期および／又は新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）への結合が向上するようになる。半減期及び新生児ＦｃＲｎへの結合が増強された抗体は、母体ＩｇＧｓの胎児への移行に関与し（Ｇｕｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１７：５８７（１９７６）及びＫｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：２４９（１９９４）参照）、また、ＵＳ２００５／００１４９３４Ａ１（Ｈｉｎｔｏｎら）に詳述されている。１つ又は複数の置換を有するＦｃドメインを含むそれらの抗体により、Ｆｃ領域のＦｃＲｎへの結合が向上する。このようなＦｃ変異体には、Ｆｃ領域の１つ又は複数の残基置換、例えばＦｃ領域の４３４残基の置換を有するものが含まれる（ＵＳ特許Ｎｏ．７，３７１，８２６）。

【0094】

Ｆｃドメイン変異体のさらなる例については、Ｄｕｎｃａｎ及びＷｉｎｔｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ ３２２：７３８－４０（１９８８）；Ｕ．Ｓ．特許Ｎｏ．５，６４８，２６０；Ｕ．Ｓ．特許Ｎｏ．５，６２４，８２１；及びＷＯ ９４／２９３５１を参照のこと。
システイン操作変異体

【0095】

いくつかの実施形態においては、Ｆｃドメインの１つ又は複数の残基がシステイン残基で置換される、システイン操作のＦｃ部分又は持効型ＮＧＦポリペプチドを作成することが望ましい場合がある。いくつかの実施形態において、置換残基は、Ｆｃ部分又は持効型ＮＧＦポリペプチド上の接近可能な部位で現れる。これらの残基をシステインで置換することにより、活性チオール基はＦｃ部分又は持効型ＮＧＦポリペプチドの接近可能な部位に配置され、また持効型ＮＧＦポリペプチド複合物を作成するために、分子を薬物部分やリンカー－薬物部分などの他の部分に結合させるために使用できる。いくつかの実施形態において、重鎖Ａ１１８（ＥＵ番号付けシステム）及び重鎖ＦｃドメインＳ４００（ＥＵ番号付けシステム）のうちのいずれか１つ又は複数の残基がシステインで置換されていることがある。システイン操作分子は、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．７，５２１，５４１に記載されるように生成することができる。

【0096】

いくつかの実施形態において、Ｆｃ部分はＩｇＧ１ Ｆｃに由来する。いくつかの実施形態において、Ｆｃ部分はヒトＩｇＧ１ Ｆｃに由来する。いくつかの実施形態において、Ｆｃ部分は野生型ＩｇＧ１ Ｆｃ（ＩＧＨＧ１＊０５）に由来する。いくつかの実施形態において、Ｆｃ部分は、配列番号７のアミノ酸配列を含む（或いは、本質的に該アミノ酸配列からなるか、又は該アミノ酸配列からなる）。いくつかの実施形態において、Ｆｃ部分はＩｇＧ１天然変異体（例えば、ＩＧＨＧ１＊０５に対してＤ２３９Ｅ及びＬ２４１Ｍの二重変異を含むＩＧＨＧ１＊０３）である。いくつかの実施形態において、Ｆｃ部分は、配列番号８のアミノ酸配列を含む（或いは、本質的に該アミノ酸配列からなるか、又は該アミノ酸配列からなる）。いくつかの実施形態において、Ｆｃ部分はｇＧ１ Ｆｃのヒンジ領域を含まない。いくつかの実施形態において、Ｆｃ部分は、ＩｇＧ１ ＦｃのＮ端から最大５個のアミノ酸を切断したものを含み、例えばＩｇＧ１ ＦｃのＮ端から１番目、最初の２個、最初の３個、最初の４個又は最初の５個のアミノ酸を切断したものを含む。いくつかの実施形態において、Ｆｃ部分は、１つ又は複数のエフェクター機能のない変異及び／又は脱グリコシル化変異を含む。いくつかの実施形態において、Ｆｃ部分は、配列番号７又は８に対するＥ２３３、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｇ２３６、Ｇ２３７、Ｎ２９７、Ａ３２７、Ａ３３０及びＰ３３１から選択された１つ又は複数の位置に変異を含む（或いは、本質的にそれからなるか、又はそれからなる）。いくつかの実施形態において、Ｆｃ部分は、配列番号７又は８に対するＥ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ｖ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｇ２３６ｄｅｌ、Ｇ２３７Ａ、Ｎ２９７Ａ、Ａ３２７Ｇ、Ａ３３０Ｓ及びＰ３３１Ｓから選択された１つ又は複数の変異を含む。いくつかの実施形態において、Ｆｃ部分は、配列番号７又は８の最初（Ｎ端）の５個のアミノ酸をさらに欠失している。いくつかの実施形態において、Ｆｃ部分は、配列番号７又は８に対する位置Ｎ２９７に変異を含む（或いは、本質的にそれからなるか、又はそれからなる）。いくつかの実施形態において、Ｆｃ部分は、配列番号７又は８に対してＮ２９７Ａ変異を含む（或いは、本質的にそれからなるか、又はそれからなる）。いくつかの実施形態において、Ｆｃ部分は、配列番号９又は１０のアミノ酸配列を含む（或いは、本質的に該アミノ酸配列からなるか、又は該アミノ酸配列からなる）。いくつかの実施形態において、Ｆｃ部分は、配列番号７又は８に対するＬ２３４、Ｌ２３５及びＰ３３１である位置に変異を含む（或いは、本質的にそれからなるか、又はそれからなる）。いくつかの実施形態において、Ｆｃ部分は、配列番号７又は８に対するＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３３１Ｓ変異を含む（或いは、本質的にそれからなるか、又はそれからなる）。いくつかの実施形態において、Ｆｃ部分は、配列番号１１又は１２のアミノ酸配列を含む（或いは、本質的に該アミノ酸配列からなるか、又は該アミノ酸配列からなる）。いくつかの実施形態において、Ｆｃ部分は、配列番号７又は８に対するＬ２３４、Ｌ２３５、Ｇ２３７、Ａ３３０及びＰ３３１である位置に変異を含む（或いは、本質的にそれからなるか、又はそれからなる）。いくつかの実施形態において、Ｆｃ部分は、配列番号７又は８に対してＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｇ２３７Ａ、Ａ３３０Ｓ及びＰ３３１Ｓ変異を含む（或いは、本質的にそれからなるか、又はそれからなる）。いくつかの実施形態において、Ｆｃ部分は、配列番号１３又は１４のアミノ酸配列を含む（或いは、本質的に該アミノ酸配列からなるか、又は該アミノ酸配列からなる）。いくつかの実施形態において、Ｆｃ部分は、配列番号７又は８に対するＥ２３３、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｇ２３６、Ａ３２７、Ａ３３０及びＰ３３１である位置に変異を含む（或いは、本質的にそれからなるか、又はそれからなる）。いくつかの実施形態において、Ｆｃ部分は、配列番号７又は８に対してＥ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ｖ、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３６ｄｅｌ、Ａ３２７Ｇ、Ａ３３０Ｓ及びＰ３３１Ｓ変異を含む（或いは、本質的にそれからなるか、又はそれからなる）。いくつかの実施形態において、Ｆｃ部分は、配列番号１５又は１６のアミノ酸配列を含む（或いは、本質的に該アミノ酸配列からなるか、又は該アミノ酸配列からなる）。

【0097】

いくつかの実施形態において、Ｆｃ部分はＩｇＧ４ Ｆｃに由来する。いくつかの実施形態において、Ｆｃ部分はヒトＩｇＧ４ Ｆｃに由来する。いくつかの実施形態において、Ｆｃ部分は野生型ＩｇＧ４ Ｆｃである。いくつかの実施形態において、Ｆｃ部分は、配列番号１７のアミノ酸配列を含む（或いは、本質的に該アミノ酸配列からなるか、又は該アミノ酸配列からなる）。いくつかの実施形態において、Ｆｃ部分はＩｇＧ４天然変異体である。いくつかの実施形態において、Ｆｃ部分はＩｇＧ４のヒンジ領域を含まない。いくつかの実施形態において、Ｆｃ部は、ＩｇＧ４のＮ端から最大５個のアミノ酸を切断したものを含み、例えば、ＩｇＧ４のＮ端から１番目、最初の２個、最初の３個、最初の４個又は最初の５個のアミノ酸を切断したものを含む。いくつかの実施形態において、Ｆｃ部分は、１つ又は複数のエフェクター機能のない変異及び／又は脱グリコシル化変異を含む。いくつかの実施形態において、Ｆｃ部分は、配列番号１７に対するＳ２２８、Ｆ２３４及びＬ２３５から選択された１つ又は複数の位置に変異を含む（或いは、本質的にそれからなるか、又はそれからなる）。いくつかの実施形態において、Ｆｃ部分は、配列番号１７に対するＳ２２８、Ｆ２３４及びＬ２３５である位置に変異を含む（或いは、本質的にそれからなるか、又はそれからなる）。いくつかの実施形態において、Ｆｃ部分は、配列番号１７に対してＳ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ及びＬ２３５Ａから選択された一つまたは複数の変異を含む。いくつかの実施形態において、Ｆｃ部分は、配列番号１７に対するＳ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ及びＬ２３５Ａから選択された変異を含む。いくつかの実施形態において、Ｆｃ部分は、配列番号１８のアミノ酸配列を含む（或いは、本質的に該アミノ酸配列からなるか、又は該アミノ酸配列からなる）。いくつかの実施形態において、Ｆｃ部分は、配列番号１７の最初（Ｎ端）の５個のアミノ酸をさらに欠失している。いくつかの実施形態において、Ｆｃ部分は、配列番号１９又は２０のアミノ酸配列を含む（或いは、本質的に該アミノ酸配列からなるか、又は該アミノ酸配列からなる）。
リンカー

【0098】

ＮＧＦ部分及びＦｃ部分は、任意選択的なリンカー（例えば、ペプチドリンカー、非ペプチドリンカー）によって連結されている。いくつかの実施形態において、このリンカーは柔軟なリンカーである。いくつかの実施形態において、このリンカーは安定したリンカーである。理想的なリンカーは、一般に、本明細書に記載されている持効型ＮＧＦポリペプチドの正確な折り畳み及び立体配座に影響を与えないか、又は著しく影響を与えない。好ましくは、このリンカーは、持効型ＮＧＦポリペプチドに柔軟性を付与し、ＮＧＦの生物学的機能を保持・改善し、かつ／又はインビボでの持効型ＮＧＦポリペプチドの半減期及び／又は安定性に著しく影響を与えない。いくつかの実施形態において、リンカーは安定したリンカーである（例えば、プロテアーゼ、特にＭＭＰによって切断できないもの）。

【0099】

いくつかの実施形態において、このリンカーはペプチドリンカーである。ペプチドリンカーは、長さが任意でよい。いくつかの実施形態において、ペプチドリンカーの長さは、１個～１０個のアミノ酸、３個～１８個のアミノ酸、１個～２０個のアミノ酸、１０個～２０個のアミノ酸、２１個～３０個のアミノ酸、１個～３０個のアミノ酸、１０個～３０個のアミノ酸、１個～５０個のアミノ酸、５個～４０個のアミノ酸、１２個～１８個のアミノ酸、４個～２５個のアミノ酸である。いくつかの実施形態において、このペプチドリンカーの長さは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０個のアミノ酸のうちのいずれか１つである。いくつかの実施形態において、このペプチドリンカーの長さは、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０個のアミノ酸のうちのいずれか１つである。いくつかの実施形態において、このペプチドリンカーの長さは、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９又は５０個のアミノ酸のうちのいずれか１つである。好ましくは、本明細書に記載されている持効型ＮＧＦポリペプチドに対しては、潜在的な望ましくないドメイン相互作用を防止するために、ペプチドリンカーを添加することによりインビボでの機能及び安定性の最適化が行われる。いくつかの実施形態において、リンカーの長さは、望ましくないドメイン相互作用を防止するか、かつ／又は生物学的機能及び／又は安定性を最適化するために必要な長さを超えない。いくつかの実施形態において、ペプチドリンカーの長さは、最大３０個のアミノ酸であり、例えば、最大２０個のアミノ酸、又は最大１５個のアミノ酸である。いくつかの実施形態において、リンカーの長さは、５個～３０個のアミノ酸、又は５個～１８個のアミノ酸である。

【0100】

ペプチドリンカーは、天然に存在する配列を有しても良いし、非天然に存在する配列を有していてもよい。例えば、抗体重鎖ヒンジ領域に由来する配列をリンカーとして使用することができる。一例としては、ＷＯ１９９６／３４１０３を参照のこと。いくつかの実施形態において、ペプチドリンカーは、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４ヒンジである。いくつかの実施形態において、ペプチドリンカーは、変異ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４ヒンジである。いくつかの実施形態において、リンカーは柔軟なリンカーである。典型的な柔軟なリンカーとしては、グリシンポリマー（Ｇ）ｎ（配列番号７３）、グリシン－セリンポリマー（例えば、（ＧＳ）ｎ（配列番号７４）、（ＧＧＳ）ｎ（配列番号７５）、（ＧＧＧＳ）ｎ（配列番号７６）、（ＧＧＳ）ｎ（ＧＧＧＳ）ｎ（配列番号７７）、（ＧＳＧＧＳ）ｎ（配列番号７８）、（ＧＧＳＧＳ）ｎ（配列番号７９）又は（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号７０）を含み、ただし、ｎは少なくとも１の整数である。）、グリシン－アラニンポリマー、アラニン－セリンポリマー、及び当技術分野で知られている他の柔軟なリンカーが挙げられるが、これらに限定されない。グリシン及びグリシン－セリンポリマーは、比較的構造化されていないため、成分間の中性鎖として機能する。グリシンは、アラニンよりも多くのｐｈｉ－ｐｓｉ空間を持ち、かつより長い側鎖を持つ残基を持ち、制限が少なくなる（Ｓｃｈｅｒａｇａ，Ｒｅｖ．Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｃｈｅｍ．１１ １７３－１４２（１９９２）参照）。柔軟なリンカーの例としては、ＧＧ（配列番号８６）、ＧＧＳＧ（配列番号８７）、ＧＧＳＧＧ（配列番号８８）、ＧＳＧＳＧ（配列番号８９）、ＧＳＧＧＧ（配列番号９０）、ＧＧＧＳＧ（配列番号９１）、ＧＳＳＳＧ（配列番号９２）、ＧＧＳＧＧＳ（配列番号９３）、ＳＧＧＧＧＳ（配列番号９４）、ＧＧＧＧＳ（配列番号９５）、（ＧＡ）ｎ（配列番号９６、ｎは少なくとも１の整数）、ＧＲＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧ（配列番号９７）、ＧＲＡＧＧＧ（配列番号９８）、ＧＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号８０）、ＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号８１）、ＧＧＧＳＧＧＳＧＧＳ（配列番号８２）、ＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＧ（配列番号８３）、ＧＧＳＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号８４）、ＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳ（配列番号８５）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号６８）、ＧＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＡ（配列番号６９）、ＧＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号７１）、ＫＴＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号７２）などが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、リンカーは、配列ＡＳＴＫＧＰ（配列番号９９）を含む。設計された持効型ＮＧＦポリペプチドは、理想的な持効型ＮＧＦポリペプチドの構造や機能を提供するように、全部又は一部の柔軟なリンカーを含有させることによりリンカーが１つの柔軟なリンカー部分とより少ない柔軟な構造を提供する１つ又は複数の部分とを含むことを可能にすることができるのは、当業者なら一般に認識できるだろう。いくつかの実施形態において、ペプチドリンカーは、セリン－グリシンリッチである。いくつかの実施形態において、ペプチドリンカーは、配列番号６８～７２のうちのいずれか１つで示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ペプチドリンカーは、アミノ酸配列（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号７０、ただし、前記ｎは１、２、３、４、５及び６のうちのいずれか１つの整数であり、好ましくはｎは２～６の整数であり、より好ましくはｎは３又は４の整数である。）を含む。いくつかの実施形態において、ペプチドリンカーは、配列番号６８又は６９のアミノ酸配列を含む（或いは、本質的に該アミノ酸配列からなるか、又は該アミノ酸配列からなる）。

【0101】

リンカーに関する他の考慮事項には、得られた持効型ＮＧＦポリペプチドの物理的又は薬物動態学的特性への影響が含まれ、例えば、溶解性や、親油性、親水性、疎水性、安定性（多かれ少なかれ安定性及び計画的分解）、剛性、柔軟性、免疫原性、ＮＧＦ部分／ＮＧＦ受容体への結合、コロイド又はリポソームの結合能力などがある。
結合親和力

【0102】

分子（例えば、ＮＧＦ部分又はＮＧＦ部分を含むＮＧＦポリペプチド）とその結合対象（例えば、ＴｒｋＡなどのＮＧＦ受容体）の結合親和力は、ウエスタンブロット、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、メソスケールディスカバリー（ＭＳＤ）電気化学発光、ビーズベースのマルチプレックスイムノアッセイ（ＭＩＡ）、ＲＩＡ、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、ＥＣＬ、ＩＲＭＡ、ＥＩＡ、Ｂｉａｃｏｒｅアッセイ、オクテット分析、ペプチドスキャンなど、当技術分野で知られている任意の適切なリガンド結合アッセイ又は抗体／抗原結合アッセイによって決定することができる。例えば、様々な標識試薬で標識されたＮＧＦ部分、ＮＧＦ部分を含むＮＧＦポリペプチド又はその受容体（例えば、ＴｒｋＡ）、又はそのサブユニットを使用して、簡単に分析することが可能であり、またＢｉａｃｏｒｅＸ（アマシャムバイオサイエンス）を使用することができる。なお、ＢｉａｃｏｒｅＸは、市販の測定キット又は類似のキットであり、キットに付属の取扱説明書及び実験操作方法に従って操作することができる。

【0103】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載されているＮＧＦ部分又は持効型ＮＧＦポリペプチドとそれらの受容体との相互作用、機能及び活性は、タンバク質マイクロアレイを使用して大規模に分析される。タンバク質マイクロアレイは、一連の捕捉タンパク質（例えば、ＮＧＦ受容体又はそのサブユニット）に結合する支持面を持っている。その後、蛍光標識プローブ分子（例えば、本明細書に記載されているＮＧＦ部分又は持効型ＮＧＦポリペプチド）をアレイに添加し、結合した捕捉タンパク質と相互作用させ、蛍光シグナルを放出してレーザースキャナーによって読み取る。

【0104】

結合親和力は、ＳＰＲ（Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ－２００）を用いて測定することもできる。例えば、ＥＤＣ／ＮＨＳ化学法を使用して抗ヒトＩｇＧ抗体をＣＭ－５センサーチップの表面に結合する。次に、ヒトＴｒｋＡ－Ｆｃ融合タンパク質を、この表面の捕捉リガンドとして使用する。本明細書に記載されているＮＧＦ部分又は持効型ＮＧＦポリペプチドの一連の希釈液を捕捉したリガンドに結合させ、そしてＮＧＦとＴｒｋＡとの結合及び解離をリアルタイムでモニターすることができる。解離定数（Ｋ_d）と解離速度定数は、ＢＩＡ評価ソフトウェアを使用した動力学的分析によって決定することができる。

【0105】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載されているＮＧＦ部分又は持効型ＮＧＦポリペプチドは、その受容体（例えば、ＴｒｋＡ）又はそのサブユニットとの結合Ｋｄは、≦１０^-5Ｍ、≦１０^-6Ｍ、≦１０^-7Ｍ、≦１０^-8Ｍ、≦１０^-9Ｍ、≦１０^-10Ｍ、≦１０^-11Ｍ及び≦１０^-12Ｍのうちのいずれか１つである。いくつかの実施形態において、野生型ＮＧＦは、その受容体（例えば、ＴｒｋＡ）又はそのサブユニットとの結合Ｋ_dが、本明細書に記載されているＮＧＦ部分又は持効型ＮＧＦポリペプチドと同受容体（例えば、ＴｒｋＡ）又はそのサブユニットとの間の結合Ｋ_d値に近い（例えば、等しい）か、又は少なくとも約１．５倍（例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、５００及び１０００倍のうちのいずれか１つ）である。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されているＮＧＦ部分又は持効型ＮＧＦポリペプチドは、その受容体（例えば、Ｐ７５）又はそのサブユニットとの結合Ｋ_dが、野生型ＮＧＦと同受容体（例えば、Ｐ７５）又はそのサブユニットとの間の結合Ｋ_dに近い（例えば、等しい）か、又は少なくとも約２倍（例えば、少なくとも約３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、５００及び１０００倍のうちのいずれか１つ）である。

【0106】

いくつかの実施形態において、ＮＧＦ部分は、変異又は修飾（例えば、翻訳後修飾）を含み、変異／修飾ＮＧＦ部分（又は持効型ＮＧＦポリペプチド）とその受容体（例えば、ＴｒｋＡ）又はそのサブユニットとの間の結合のＫ_dは、野生型ＮＧＦと同受容体（例えば、ＴｒｋＡ）との間の結合のＫ_dに近い（例えば、等しい）か、又は少なくとも約２倍（例えば、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、５００及び１０００倍のうちのいずれか１つ）である。いくつかの実施形態において、ＮＧＦ部分は、変異又は修飾（例えば、翻訳後修飾）を含み、野生型ＮＧＦとその受容体（例えば、Ｐ７５）又はそのサブユニットとの間の結合のＫ_dは、変異／修飾ＮＧＦ部分（又は持効型ＮＧＦポリペプチド）と同受容体（例えば、Ｐ７５）との間の結合のＫ_dに近い（例えば、等しい）か、又は少なくとも約２倍（例えば、少なくとも約３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、５００及び１０００倍のうちのいずれか１つ）である。
生物活性

【0107】

ＮＧＦ、ＮＧＦ部分又は持効型ＮＧＦポリペプチドの生物活性を決定するための本明細書に記載されている様々な方法は、当技術分野で知られている。例えば、生物活性は、ＣＮ１０３３７６２４８Ａ及びＣＮ１０８７２７４８６Ａに記載されるように（その全内容は参照により本明細書に組み込まれる）、ＴＦ－１細胞増殖試験によって評価することができる。以下の実施例４を参照のこと。また、生物活性は、新生児ラットの上頸神経節（ＳＣＧ）の成長を促進する能力（以下の実施例５を参照）、又はニワトリ胚後根神経節の成長を促進する能力（ＷＯ２０１７１５７３２６を参照、その全内容は参照により本明細書に組み込まれる）に基づいて決定することもできる。また、生物活性は、以下の状況：ｉ）糖尿病性神経障害の動物モデル／患者における創傷治癒の改善（例えば、実施例７を参照）；ｉｉ）アルツハイマー病の動物モデル／患者における空間認識、記憶及び／又は学習能力の改善（例えば、実施例８を参照）；ｉｉｉ）卵巣顆粒膜腫瘍細胞株の増殖及び／又はエストロゲン分泌の改善及び／又は早発卵巣不全動物モデル／患者における卵胞軽減の改善（例えば、実施例９を参照）；ｉｖ）精子形成障害動物モデル／患者における、精子数及び／又は運動性の軽減の救済、及び／又は精巣精細管萎縮、精細管精子形成障害及び／又は精巣上体管細胞断片に対する治療効果（例えば、実施例１０を参照）；又はｖ）神経栄養性角膜炎動物モデル／患者における、損傷した角膜の完全性の回復（例えば、フルオレセインナトリウム染色試験による）及び／又は損傷した角膜神経の救済（例えば、角膜神経の長さの測定による）（例えば、実施例１１を参照）が存在するかどうかに基づいて決定することもできる。なお、当技術分野で知られている任意の適切なアッセイプロトコルを本明細書に記載されているＮＧＦ部分又は持効型ＮＧＦポリペプチドの生物活性の検出に適用することができる。

【0108】

バイオアッセイは、ＮＧＦの生物活性に焦点を当て、それを読み取り値として使用する。バイオアッセイでは、敏感な細胞株（例えば、初代細胞培養物又は試験サンプルに依存及び／又は応答するインビトロ適応細胞株）又は動物モデル／ＮＧＦ関連疾患を有するヒトにおいてサンプルの活性がテストされ、そして該活性（例えば、細胞増殖）の結果が標準的なＮＧＦ製剤又は対照群（例えば、マウスＮＧＦ、ｍＮＧＦ１１８又は既知の持効型ＮＧＦポリペプチド）と比較される。ＮＧＦの生物活性の他の側面には、（ｉ）ニューロンの生存の支持；（ｉｉ）神経突起成長の促進；（ｉｉｉ）神経化学的分化の増強；（ｉｖ）膵β細胞の増殖の促進；（ｖ）自然免疫及び／又は獲得免疫の誘導；（ｖｉ）損傷した神経細胞の修復及び／又は損傷の予防（例えば、神経栄養性角膜炎）；（ｖｉｉ）卵巣顆粒膜腫瘍細胞株の増殖及び／又はエストロゲン分泌の促進；（ｖｉｉｉ）創傷治癒の促進（例えば、糖尿病性神経障害において）；（ｉｘ）神経変性疾患（例えば、アルツハイマー病）を有する被検者における空間認識、記憶及び／又は学習能力の改善；（ｘ）神経変性疾患の治療及び／又は予防；（ｘｉ）精巣精細管萎縮、精細管精子形成障害及び／又は精巣上体管細胞断片の治療；（ｘｉｉ）精子数及び／又は運動性の軽減の救済、又は精子数及び／又は運動性の増加（例えば、精子形成障害において）；及び／又は（ｘｉｉｉ）卵胞数及び／又は機能の軽減の改善、又は卵胞数及び／又は機能の増加（例えば、早発卵巣不全において）が含まれる。これらのすべての活性は、ニューロン生存アッセイ又は神経突起成長アッセイなどのインビトロ及び／又はインビボアッセイを使用して測定できる。

【0109】

例えば、ＴＦ－１細胞増殖試験において、９６ウェルプレートでサンプル（例えば、持効型ＮＧＦポリペプチド）と対照群（例えば、ベクター又はＳｕＴａｉＳｈｅｎｇ^RマウスＮＧＦ）の連続希釈液を調製し、次にＴＦ－１細胞を各ウェルに加え、３７°Ｃ、５％ＣＯ₂の加湿インキュベーターで培養する。数日間（例えば、３日間）培養した後、ＭＴＳ溶液を細胞懸濁液の各ウェルに加え、３７°Ｃ、５％ＣＯ₂の条件下で３時間培養した。その後、４９０ｎｍと６５０ｎｍでの吸光度を分光光度計で測定することにより、ＮＧＦ部分又は持効型ＮＧＦポリペプチドがどうようにＴＦ－１細胞増殖を促進するかを示す。対照試料に対してデータを正規化することができる。例示的な方法については、実施例４を参照のこと。

【0110】

本明細書に記載されているＮＧＦ部分又は持効型ＮＧＦポリペプチドの生物活性を測定するには、細胞シグナルアッセイを使用することもできる。市販されている様々な細胞シグナルアッセイキットを使用して、シグナル伝達に関与する酵素反応中に生成されたＡＤＰや、ＡＭＰ、ＵＤＰ、ＧＤＰ、成長因子などの分析物を検出したり、総シグナルタンパク質とリン酸化形態のシグナルタンパク質を定量するためのホスファターゼアッセイを行ったりする。例えば、本明細書に記載されているＮＧＦ部分又は持効型ＮＧＦポリペプチドを細胞と共培養した後、特定のキナーゼが活性であるかどうかを決定するために、細胞溶解物を放射性リン酸塩の存在下で酵素の既知のマトリックスに曝露させる。生成物を電気泳動（免疫沈殿の有無にかかわらず）によって分離し、次にゲルをＸ線フィルムに曝させることにより、タンバク質に同位体が含まれているかどうかが判断される。いくつかの実施形態において、シグナルタンパク質の位置を確定するには、免疫組織化学により本明細書に記載されているＮＧＦ部分又は持効型ＮＧＦポリペプチドの細胞での生物活性を測定する。例えば、シグナルタンパク質自体又は活性化された状態にあるシグナルタンパク質に対する抗体を使用することができる。これらの抗体は、リン酸塩又は他の活性化立体配座を含む認識エピトープを持っている。いくつかの実施形態において、蛍光タンパク質遺伝子、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を目的のタンバク質をコードする遺伝子ベクターに組み込むことにより、特定のシグナルタンパク質の移動（例えば、シグナル分子の核移行）を追跡することができる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されているＮＧＦ部分又は持効型ＮＧＦポリペプチドの細胞での生物活性は、ウエスタンブロットによって検出される。例えば、すべてのチロシンリン酸化タンパク質（又はセリンやスレオニンなどの他のリン酸化アミノ酸）は、抗リン酸化チロシン抗体（又は他のリン酸化アミノ酸に対する抗体）による経時的刺激後に得られた細胞溶解液によるウエスタンブロットで検出することができる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されているＮＧＦ部分又は持効型ＮＧＦポリペプチドの細胞での生物活性は、免疫沈殿によって決定することができる。例えば、特定のシグナルタンパク質又はすべてのチロシンリン酸化タンパク質に対する一次抗体をビーズに架橋する。そして、本明細書に記載されているＮＧＦ部分又は持効型ＮＧＦポリペプチドとともにインキュベートした細胞を、プロテアーゼ阻害剤を含む緩衝液で溶解し、次に抗体被覆ビーズとともにインキュベートする。次に、ＳＤＳ電気泳動を使用してタンバク質を単離し、そして前記のウエスタンブロットステップによってタンバク質を同定する。いくつかの実施形態において、タンバク質－タンバク質（例えば、シグナルタンパク質）の直接的な相互作用は、グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）結合又は「プルダウン」アッセイを使用することにより決定してもよい。

【0111】

例えば、細胞成長の促進におけるＮＧＦの生物活性を反映するためには、ＲＡＳ／ＥＲＫ１／２シグナルを測定することができ、例えば当技術分野で知られている任意の適切な方法を使用してＥＲＫ１／２をリン酸化する。例えば、ＥＲＫ１／２リン酸化を測定するためには、この分子のリン酸化状態にある特異的な抗体を使用できる（任意選択にフローサイトメトリー分析と組み合わせてもよい）。例えば、本明細書に記載されているＮＧＦ部分又は持効型ＮＧＦポリペプチドとともに３７℃でニワトリ胚後根神経節（ＤＲＧｓ）又はＴＦ－１細胞をインキュベートする。インキュベート直後に、リン酸化状態と透過性を維持するために細胞を固定する。抗リン酸化ＥＲＫ１／２の抗体、例えば、Ａｌｅｘａ４８８結合抗ＥＲＫ１／２ ｐＴ２０２／ｐＹ２０４（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で細胞を染色し、そしてフローサイトメトリーで分析を行う。ＮＧＦの生物活性を反映するためには、当技術分野で知られている任意の適切な方法を使用してＰＩ ３－キナーゼシグナルを測定することもできる。例えば、リン酸化Ｓ６リボソームタンパク質に特異的な抗体を使用してＰＩ ３－キナーゼシグナル伝達を測定することができる（任意選択にフローサイトメトリー分析と組み合わせてもよい）。

【0112】

また、本明細書に記載されているＮＧＦ部分又は持効型ＮＧＦポリペプチドの生物活性は、例えば、指示細胞の増殖、シグナル伝達の誘導又は阻害、あるいは組織の体積及び／又は重量を測定するようなインビボ又はインビトロでの実験により反映することができる。

【0113】

例えば、ＮＧＦ部分又は持効型ＮＧＦポリペプチドのＳＣＧインビボ成長の促進における生物活性を研究するためには、ＳＣＧインビボ成長アッセイにおいて、新生児ラットの首に単回注射又は複数回注射でサンプル（例えば、持効型ＮＧＦポリペプチド）及び対照群（例えば、ＰＢＳ又はＳｕＴａｉＳｈｅｎｇ^RマウスＮＧＦ）を皮下注射し、注射の数日後、これらのラットを殺してＳＣＧを分離し、ＳＣＧを秤量し、また形態を記録することができる。例示的な方法については、実施例５を参照のこと。

【0114】

また、後根神経節の成長を促進する際のＮＧＦ部分又は持効型ＮＧＦポリペプチドの生物活性を反映するためには、後根神経節成長アッセイにおいて、様々な濃度のサンプル（例えば、持効型ＮＧＦポリペプチド）又は対照群（例えば、ＰＢＳ又はＳｕＴａｉＳｈｅｎｇ^RマウスＮＧＦ）の培地にニワトリ胚後根神経節（例えば、８日齢）を添加し、５％ＣＯ₂及び３７°Ｃの飽和湿度インキュベーターで例えば２４時間培養し、そして後根神経節の成長状態をモニターすることができる。なお、実験にＮＧＦ標準品を用いられた場合、サンプルの特定の生物活性をＡＵ／ｍｇとして計算する可能性もある。被験サンプルの比活性（ＡＵ／ｍｇ）＝参照物質の比活性（ＡＵ／ｍｌ）×［サンプルの前希釈係数×この希釈点での対応する参照物質の比活性（ＡＵ／ｍｌ）／参照物質の実際の比活性（ＡＵ／ｍｌ）］。例示的な方法については、ＷＯ２０１７１５７３２６の実施例５を参照のこと。

【0115】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載されているＮＧＦ部分（又は持効型ＮＧＦポリペプチド）は、野生型ＮＧＦ（又は野生型ＮＧＦを含むのポリペプチド）と比較してその生物活性が保持／増強／低減するように、変異又は修飾（例えば、翻訳後修飾）を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されている変異又は修飾ＮＧＦ部分又は持効型ＮＧＦポリペプチドは、野生型ＮＧＦ（又は野生型ＮＧＦを含むポリペプチド）と比較して、生物活性（例えば、細胞成長の促進）が同様（例えば、等しい）又は少なくとも２倍（例えば、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、５００、１０００、５０００又は１００００倍又はそれ以上）になる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されている持効型ＮＧＦポリペプチドは、ＮＧＦ部分（例えば、持効型ＮＧＦポリペプチドの対応するＮＧＦ部分）と比較して、生物活性が同様（例えば、等しい）又は少なくとも１．１倍（例えば、少なくとも１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．５、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００倍又はそれ以上）になる。
薬物動態学（ＰＫ）

【0116】

薬物動態学（ＰＫ）とは、被検者に投与された薬物（例えば、本明細書に記載されているＮＧＦ部分又は持効型ＮＧＦポリペプチド）の吸收、分布、代謝及び排泄のことを指す。臨床的有用性を決定するのに使用できる薬物動態パラメータとしては、血清／血漿中濃度、経時的な血清／血漿中濃度、最高血清／血漿中濃度（Ｃ_max）、最高濃度到達時間（Ｔ_max）、消失半減期（ｔ_1/2）、投与間隔内の濃度－時間曲線下面積（ＡＵＣτ）などが挙げられるが、これらに限定されない。

【0117】

薬物、例えば、本明細書に記載されているＮＧＦ部分又は持効型ＮＧＦポリペプチド又は対照薬物（例えば、ＳｕＴａｉＳｈｅｎｇ^RマウスＮＧＦ）のＰＫ曲線を得るための技術は、当技術分野で知られているものである。Ｈｅｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ，１１，２０１８；Ｇｈａｎｄｆｏｒｏｕｓｈ Ｓａｔｔａｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ，Ａｒｔｉｃｌｅ ＩＤ ３４６２３７，Ｖｏｌｕｍｅ ２０１０を参照のこと。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されているＮＧＦ部分又は持効型ＮＧＦポリペプチドのＰＫ曲線は、個体の血液、血漿又は血清サンプルで測定される。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されているＮＧＦ部分又は持効型ＮＧＦポリペプチドの個体におけるＰＫ曲線は、質量分析技術（例えば、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ又はＥＬＩＳＡ）により測定される。また、ＰＫ曲線において、当技術分野で知られている任意の方法によってＰＫＳｏｌｖｅｒ Ｖ２ソフトウェアを使用して、非コンパートメント分析などのＰＫ分析を行うことができる（Ｚｈａｎｇ Ｙ．ｅｔ ａｌ．，"ＰＫＳｏｌｖｅｒ：Ａｎ ａｄｄ－ｉｎ ｐｒｏｇｒａｍ ｆｏｒ ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ ａｎｄ ｐｈａｒｍａｃｏｄｙｎａｍｉｃ ｄａｔａ ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ，"Ｃｏｍｐｕｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｐｒｏｇｒａｍｓ Ｂｉｏｍｅｄ．２０１０；９９（３）：３０６－１）。例示的な方法については、実施例６を参照のこと。

【0118】

「Ｃ」は、被検者血漿、血清又は任意の適切な体液又は組織中の薬物（例えば、ＮＧＦ部分又は持効型ＮＧＦポリペプチド）濃度を表し、通常に、ナノグラム／ミリリットルなどの単位体積当たりの質量として表される。便宜上、血清又は血漿中の薬物濃度は、本明細書で「血清濃度」又は「血漿濃度」と呼ばれる。投与後の任意の時点（例えば、ＮＧＦ部分又は持効型ＮＧＦポリペプチド、例えば、静脈注射、腹腔注射又は皮下注射）での血清／血漿濃度は、Ｃ_time又はＣ_tと呼ばれる。投与期間中の最大血清／血漿薬物濃度はＣ_maxと呼ばれる。Ｃ_minとは、投与間隔の終点での最小血清／血漿薬物濃度を指す。Ｃ_aveは、投与間隔中の平均濃度を指す。

【0119】

用語「バイオアベイラビリティ」とは、薬物（例えば、ＮＧＦ部分又は持効型ＮＧＦポリペプチド）が体循環を通過して作用部位に入る程度又は速度を指す。

【0120】

「ＡＵＣ」は、血清／血漿中濃度－時間曲線下面積を表し、具体的に、投与間隔内の濃度－時間曲線下面積（ＡＵＣτ）、「総曝露」又は「経時的な総薬物曝露」（ＡＵＣ_0-last又はＡＵＣ_0-inf）、投与後ｔ時間までの濃度－時間曲線下面積（ＡＵＣ_0-t）があり、バイオアベイラビリティの最も信頼できるスケールであると考えられている。

【0121】

最高血清／血漿中濃度到達時間（Ｔ_max）は、投与（例えば、ＮＧＦ部分又は持効型ＮＧＦポリペプチド）後に最高血清／血漿中濃度（Ｃ_max）に達するまでの時間である。

【0122】

消失半減期（ｔ_1/2）とは、血漿又は血清（又は他の生物的マトリックス）中に測定された薬物濃度（例えば、ＮＧＦ部分又は持効型ＮＧＦポリペプチド）が、特定の時点でのその濃度又は量の半分に低下するのに必要な時間を指す。例えば、薬物が静脈投与後に分散及び消失するので、血漿又は血清中の薬物濃度が低下する。静脈投与後の血漿又は血清中薬物濃度の経時的な曲線では、最初の段階又は急速な低下段階が主に分散に起因し、その後段階の低下が通常により遅くて主に消失に起因したと考えられているが、分散及び消失の両方がその二つ段階で起こることがある。分布は、十分な時間が経過した後に完了すると想定される。消失半減期は、血漿／血清中濃度－時間曲線の終末期又は消失（主要）段階によって决定されるのが一般である。それについて、Ｍｉｃｈａｅｌ Ｓｃｈｒａｇ及びＫｅｌｌｙ Ｒｅｇａｌ、「臨床前薬物開発における毒理学の総合ガイド」の「第３章－薬物動態学及び毒性動態学」２０１３を参照のこと。

【0123】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載されている持効型ＮＧＦポリペプチドは、少なくとも５時間の半減期（例えば、ヒトへの注射などの静脈注射、皮下注射又は筋肉注射）を有し、例えば、少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０又は３００時間のうちのいずれか１つ、あるいはそれ以上の半減期を有する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されている持効型ＮＧＦポリペプチドは、５時間～３００時間の半減期（例えば、ヒトへの注射などの静脈注射）を有し、例えば、８時間～１００時間、１０時間～６０時間、１５時間～６０時間及び２０時間～５８時間のうちのいずれか１つの半減期を有する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されている持効型ＮＧＦポリペプチドは、単回静脈注射又は注入、単回筋肉注射又は単回皮下注射などの単回投与として投与される。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されている持効型ＮＧＦポリペプチドは、約５５時間の循環半減期を有する。

【0124】

いくつかの実施形態において、ＮＧＦ部分は、半減期が１時間～２．５時間であり、例えば、半減期が１．５時間～２．４時間である。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されている持効型ＮＧＦポリペプチドの循環半減期は、対応するＮＧＦ部分（即ち、持効型ＮＧＦポリペプチドに含まれるＦｃに融合されていないＮＧＦ部分）又は野生型ＮＧＦの循環半減期に対する５倍になり、例えば、対応するＮＧＦ部分又は野生型ＮＧＦの循環半減期に対する少なくとも約６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０及び１００倍のうちのいずれか１つ又はそれ以上になる。
疼痛誘発活性

【0125】

ＮＧＦは、動物及びヒトに痛みを引き起こす可能性があるので、痛みの標的として知られている。ＮＧＦは、特に成人において、中枢及び末梢神経サブセットの健康と生存を促進する可能性がある（Ｈｕａｎｇ及びＲｅｉｃｈａｒｄｔ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２４：６７７－７３６（２００１））。また、ＮＧＦは、これらのニューロンの機能・特性の調節にも寄与し、侵害受容器と呼ばれる感覚痛受容体の感受性又は興奮性に対して緊張制御することができる（Ｐｒｉｅｓｔｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．８０：４９５－５０５（２００２）；Ｂｅｎｎｅｔｔ，Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｔｉｓｔ ７：１３－１７（２００１））。侵害受容器により、様々な有害な刺激が知覚されて中枢神経系に伝達され、痛みが生じる（侵害受容）。侵害受容器にＮＧＦ受容体がある。ＮＧＦの発現は、損傷した組織や炎症を起こした組織で増加し、またヒトの痛みの状態でアップレギュレートされる。ＮＧＦによる侵害受容・痛みは、高親和力ＮＧＦ受容体であるｔｒｋＡ（チロシン受容体キナーゼＡ）によって媒介される（Ｓａｈ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃ．２：４６０－７２（２００３））。

【0126】

「痛み」とは、経験的現象として広く定義されており、痛みを経験する個体にとって非常に主観的ものであり、環境や文化的背景を含む個体の心理状態にも影響される。「生理的」痛みは、実際又は潜在的な組織損傷を引き起こす原因になる、第三者が知覚する刺激に関連している場合が多い。痛みは、この意味で、国際疼痛学会（ＩＡＳＰ）によると、「実際の又は潜在的な組織損傷に関連する感覚的及び感情的な経験、又はそのような損傷の観点から記述されるもの」とされている。ただし、識別可能な原因がない痛みの幾つの例がある。一例としては、知覚可能な痛みを引き起こすいわゆる証拠もない状況下で、心理的障害のある人が心因性要因又は時々持続して現れる知覚可能な痛みの症候群に起因した既存の身体的痛みの悪化を含む心因性疼痛がある。

【0127】

痛みには、侵害受容性疼痛、神経因性／神経性疼痛、突発的な痛み、アロディニア、痛覚過敏、知覚過敏、異常感覚、感覚異常、痛覚過敏、幻肢痛、心因性疼痛、無感覚麻痺、神経痛、神経炎が含まれる。また、他の分類として、悪性疼痛、狭心症痛及び／又は原発性疼痛、複雑性局所疼痛症候群Ｉ、複雑性局所疼痛症候群ＩＩが含まれる。痛みの種類と症状が相互に排他的である必要はない。これらの用語の定義はＩＡＳＰと一致している。

【0128】

侵害受容性疼痛は、末梢神経ニューロンにおける特殊な侵害受容器が侵害刺激に応答して、侵害刺激を活動電位としてコードすることによって引き起こされる。侵害受容器は、一般にＡδ線維及び（ポリモーダル）Ｃ線維にあり、皮膚の下方、腱、関節及び体の器官で終了する遊離な神経終末である。後根神経節（ＤＲＧ）ニューロンにより、末梢と脊髓の間の通信部位が提供される。脊髓で処理され、脳幹及び視床部位に到達した後、最後的に大脳皮質に到達したシグナルは、いつもではないがそこで痛みを引き起こす。侵害受容性疼痛は、身体組織を刺激又は損傷する可能な様々な化学的や、熱的、生物学的（例えば、炎症）、機械的事象によって引き起こされる可能性があり、侵害受容器で侵害受容活性を引き起こすのに必要な強度の特定の最小閾値を超えることが一般である。

【0129】

神経因性疼痛は、通常、末梢神経系又は中枢神経系の機能異常に起因し、それぞれ末梢神経因性疼痛又は中枢神経因性疼痛を引き起こし、ＩＡＳＰによって、神経系の原発性病変又は機能障害に起因するかまたは引き起こされる痛みとして定義される。神経因性疼痛は、特に慢性疾患において、神経系への実際の損傷を伴うことがよくある。炎症性侵害受容性疼痛は、通常、組織の損傷及びそれが引き起こした炎症過程に起因する。神経因性疼痛は、組織への観察可能な損傷が明らかに治癒した後（例えば、数か月又は数年）も持続する可能性がある。

【0130】

神経因性疼痛が存在する場合、影響された領域による感覚情報処理が異常になり、また、通常に痛みを引き起こさない無害な刺激（例えば、熱刺激、触覚／圧力刺激）が痛みを引き起こす恐れ（即ち、アロディニア）、または有害な刺激が正常な痛み刺激に対して過剰な痛みの知覚（即ち、痛覚過敏）を誘発する恐れになる。さらに、正常な刺激は、電気的なうずき又はショック又は「しびれ」に似た感覚（即ち、感覚異常）及び／又は不快な感覚（即ち、異常感覚）を引き起こす可能性がある。突発的な痛みは、既存の慢性疼痛の悪化である。痛覚過敏は、刺激に対する異常な痛み反応によって引き起こされる疼痛症候群である。なお、その刺激は、反復的であり、またそれに伴って、患者が痛み経験として識別できる最小の痛みと考えられている疼痛の閾値が増加する場合が多い。

【0131】

神経因性疼痛の例としては、触覚性アロディニア（例えば、神経損傷後に誘発される）、神経痛（例えば、疱疹後（又は帯状疱疹後）神経痛、三叉神経痛）、反射性交感神経性ジストロフィー／カウザルギー（神経外傷）、がん性疼痛（例えば、がん自体又は炎症などの関連状態による痛み、又は化学療法、手術又は放射線療法などの治療による痛み）、幻肢痛、閉じ込め神経障害（例えば、手根管症候群）、及び末梢神経障害などの神経障害（例えば、糖尿病、エイズ、慢性的なアルコール使用、他の毒素への曝露（多くの化学療法を含む）、ビタミン欠乏症、及び他の様々な疾患）が挙げられる。神経因性疼痛は、様々な原因（例えば、外科手術、創傷、帯状疱疹、糖尿病性神経障害、脚又は腕の切断、がんなど）による神経損傷後の神経系の病理学的手術によって引き起こされる痛みを含む。神経因性疼痛に関連する疾患は、外傷性神経損傷、脳卒中、多発性硬化症、脊髓空洞症、脊髓損傷及びがんを含む。

【0132】

痛みを引き起こす刺激は、よく炎症反応を引き起こすが、その炎症反応自体が痛みを引き起こす場合もある。痛みは、侵害受容因子と神経障害因子の複雑な混合因子によって引き起こされるような場合もある。例えば、慢性疼痛は、通常、炎症性侵害受容性疼痛又は神経因性疼痛、又はその両方の混合を含む。最初の神経系の機能障害又は損傷は、炎症性メディエーターの神経放出及びその後の神経因性炎症を引き起こす可能性がある。例えば、片頭痛は、神経因性疼痛と侵害受容性疼痛の混合として現れることがある。さらに、筋膜痛は、筋肉からの侵害受容入力に続発する可能性があるが、異常な筋肉活動は、神経系疾患の結果である可能性がある。

【0133】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載されている持効型ＮＧＦポリペプチドは、Ｆｃ融合のない対応するＮＧＦ部分、野生型ＮＧＦ、又は本明細書に記載されていない他のＮＧＦ－Ｆｃ融合タンパク質と比較して（以下、「対照ＮＧＦ構築物」と呼ばれる）、被検者に疼痛を誘発する活性が低下しているか、又は全くない。いくつかの実施形態において、疼痛は、急性疼痛、短期疼痛、持続性又は慢性侵害受容性疼痛、あるいは持続性又は慢性神経因性疼痛である。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されている持効型ＮＧＦポリペプチドは、対照ＮＧＦ構築物（例えば、野生型β－ＮＧＦ）と比較すると、引き起こした痛みが少なくとも１０％軽減し、また、対照のＮＧＦ構築物と比較すると、痛みが少なくとも２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％又は１００％軽減する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されている持効型ＮＧＦポリペプチドは、被検者に投与されると、痛みを引き起こさない。

【0134】

疼痛誘発活性は、ＷＯ２０１７１５７３２５、ＷＯ２０１７１５７３２６及びＣＮ１０８７２７４８６Ａ（その全内容は参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるように、当技術分野で知られている任意の方法によって測定することができる。いくつかの実施形態においては、疼痛が疼痛閾値によって測定される。疼痛閾値は高いほど疼痛は少ない。

【0135】

例えば、痛みを引き起こす活動は、患者に経験した痛みの質と強さを様々な評価スケールで評価するように依頼することで測定できる。言葉による痛み評価スケールでは、それぞれ０～３のスコアとして言葉で痛みなし、軽度の痛み、中等度の痛み及び重度の痛みの程度を説明する。或いは、０（痛みなし）から１０（最悪な痛み）までの数値の疼痛評価スケールに従って痛みを評価するように患者が要求される場合がある。そこに痛みのない状態から最悪と考えられる痛みまでの痛みを表す言葉がある垂直線又はレベル線のあるビジュアルアナログスケール（ＶＡＳ）では、患者が当時の痛みのレベルを表す点に記号ように求められる。ＭｃＧｉｌｌペインインデックスによれば、患者が、パンディング、バーニング、ピンチングなどの一連の短いリストから自分の痛みを最もよく表す単語を選択することで、痛みの質と強さの両方を説明できる。ＶＡＳ又は数値スケールの使用が困難になる成人（例えば、ＦＡＣＥＳ顔面又は非言語患者）では、行動評価尺度などの他の痛み評価スケールを使用できる。機能的活動性スコアでは、患者に痛みのある領域に関連するタスクを実行するように求めることによって、痛みによって患者が妨げられている程度を反映する。これらのタイプの評価スケールを使用して疼痛スコアを改善する。例えば、疼痛スコアの改善は、被験ＮＧＦ構築物（例えば、本明細書に記載されている持効型ＮＧＦポリペプチド）は対照ＮＧＦ構築物に比べて、痛みの副作用が少なくなること、を潜在的に示している。

【0136】

いくつかの実施形態において、ホットプレート法（５４～５５℃）によりマウスで本明細書に記載されている持効型ＮＧＦポリペプチドの疼痛誘発活性を測定して疼痛閾値を決定することができる。簡単に言えば、反応条件を満たしたマウスに麻酔をかけた後、神経クランプ法によりマウス坐骨神経損傷モデルを確立し、それに対して、偽手術群には坐骨神経をクランプせずに坐骨神経のみを分離する。次に、マウスが偽手術群、損傷対照群（正常生理食塩水）及び実験群（本明細書に記載されている持効型ＮＧＦポリペプチドで処理、及び／又はマウスβ－ＮＧＦなどの対照ＮＧＦで処理）という３つの群に分けられる。各マウスの疼痛閾値は、手術前と手術後の様々な時点で測定できる後足をなめる潜伏時間で表される。疼痛閾値の増加％＝（損傷後１０日目の疼痛閾値－損傷前の疼痛閾値）×１００％／損傷前の疼痛閾値。

【0137】

本明細書に記載されている持効型ＮＧＦポリペプチドの疼痛誘発活性は、機械的刺激に対するマウスの足屈曲反応を測定して疼痛閾値を決定することにより、マウスで試験することもでき、また、短期間の疼痛誘発条件でも長期間の疼痛誘発条件下でも測定できる。簡単に言えば、反応条件を満たしたマウスに本明細書に記載されているベクター又は本明細書に記載されている持効型ＮＧＦポリペプチド（又はマウスβ－ＮＧＦなどの対照ＮＧＦ；様々な濃度で行われる）を皮下注射し、次に、注射後の機械的刺激に対する足屈曲反応（例えば、異なる時点で）を測定することにより、治療後の疼痛閾値が反映される。

【0138】

本明細書に記載されている持効型ＮＧＦポリペプチドの疼痛誘発活性は、行動アッセイによっても試験してもよい。例えば、ラットの関節に本明細書に記載されているベクター又は持効型ＮＧＦポリペプチド（又はマウスβ－ＮＧＦなどの対照ＮＧＦ；様々な濃度で行われる）を投与し、次に、投与後（例えば、異なる時点で）の脚上げの持続時間及び脚上げの回数を記録することにより被験薬が痛みを引き起こすかどうかを検出し、脚上げの合計持続時間を計算する。脚上げの合計時間が短い場合は、疼痛誘発活性が少ないことを意味する。
安定性

【0139】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載されている持効型ＮＧＦポリペプチドは、物理的安定性、化学的安定性及び／又は生物学的安定性などの優れた安定性を有する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されている持効型ＮＧＦポリペプチドは、熱安定性に優れ、例えば、高い融解温度（Ｔｍ）及び／又は高い凝集開始温度（Ｔａｇｇ）を有する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されている持効型ＮＧＦポリペプチドは、加速ストレス（例えば、高温）で安定性に優れていて、例えば、断片化、凝集体の形成及び／又は凝集体の増加が少ないか又は全くない。

【0140】

タンバク質の安定性、特に凝集に対する感受性は、主にタンバク質分子の立体配座及びコロイド安定性に依存する。最も一般的な凝集形式である非天然タンバク質の凝集の最初のステップは、分子構造のわずかな摂動、例えば、タンバク質の部分的なアンフォールディング、即ち立体配座変化であると考えられていて、タンバク質の立体配座安定性によって决定される。２番目のステップには、部分的に展開された分子は、拡散とランダムなブラウン運動によって駆動されて近接し、凝集体を形成する。２番目のステップは、主に分子のコロイド安定性によって决定される（Ｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｒｏｌｅｓ ｏｆ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｃｏｌｌｏｉｄａｌ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｉｎ ｔｈｅ ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ ｃｏｌｏｎｙ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００３ Ｍａｙ；１２（５）：９０３－９１３を参照のこと）。本明細書で使用される場合、用語「安定性」は、一般に、生物活性物質（例えば、タンバク質）の完全性を維持するか、又は分解、変性、凝集又はアンフォールディングを最小限に抑えることを指す。本明細書で使用される場合、「改良された安定性」とは、分解、変性、凝集又はアンフォールディングを引き起こす可能な条件下で、目的タンバク質（例えば、本明細書に記載されている持効型ＮＧＦポリペプチド）は、対照群タンバク質（例えば、他のＮＧＦ－Ｆｃ融合タンパク質）より、安定性がもっと優れていることを意味する。

【0141】

示差走査熱量測定（ＤＳＣ）及び示差走査蛍光（ＤＳＦ）は、タンバク質製剤の安定性を予測するための手段として当技術分野でよく知られていて、具体的には、所定の製剤中のタンバク質のアンフォールディング温度（Ｔｍ）を決定するために使用できる。所定の製剤中のタンバク質の高いＴｍ測定値を、長期安定保存に利用可能な高信頼性かつ安定したタンバク質製剤と相関させることは、当技術分野における標準的な慣行である。

【0142】

「安定した」タンバク質（又は製剤）、例えば、本明細書に記載されている持効型ＮＧＦポリペプチドでは、製造及び／又は保存中、その物理的安定性及び／又は化学的安定性及び／又は生物学的活性を実質的に保持している。タンバク質安定性を測定するためには、Ｐｅｐｔｉｄｅ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，２４７－３０１，Ｖｉｎｃｅｎｔ Ｌｅｅ Ｅｄ．，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，Ｐｕｂｓ．（１９９１）、およびＪｏｎｅｓ，Ａ．（１９９３）Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖ．１０：２９－９０に概説されているように、当技術分野において様々な分析技術がある。例えば、一実施形態において、タンバク質の安定性については、溶液中の単量体タンバク質のパーセンテージに基づいて決定したところ、分解（例えば、断片化）及び／又は凝集タンバク質のパーセンテージが比較的に低い。好ましくは、タンバク質（又は製剤）は、室温（約３０°Ｃ）又は４０°Ｃで少なくとも１か月安定し、かつ／あるいは約２～８°Ｃで少なくとも６か月又は少なくとも１年間又は少なくとも２年間安定する。さらに、このタンバク質（又は製剤）は、冷凍（例えば、－７０℃）及び解凍後（以下で「凍結-解凍サイクル」と呼ばれる）に安定することが好ましい。

【0143】

タンバク質、例えば本明細書に記載されている持効型ＮＧＦポリペプチドは、色及び／又は透明度の目視的検査、あるいは紫外線光散乱又はサイズ除去クロマトグラフィーによる測定で、凝集、沈殿及び／又は変性などの不安定の徴候が実質的になければ、製剤中で「その物理的安定性が保持される」と言える。なお、凝集は、個々のタンバク質分子又は複合体が共有結合又は非共有結合して凝集体を形成するプロセスであり、目に見える沈殿物が形成された程度まで進行する場合がある。

【0144】

タンバク質、例えば本明細書に記載されている持効型ＮＧＦポリペプチドは、所与の期間の化学的安定性によりその生物活性（例えば、上記の「生物活性」節に記載された）が依然として保持できれば、このタンバク質が製剤中で「その化学的安定性を保持している」と言える。化学的安定性は、例えばタンバク質の化学的変化形態を検出及び定量化することにより評価することができる。また、化学変化は、サイズ変化（例えば、剪断）を伴う場合があるが、サイズ除去クロマトグラフィー、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及び／又はマトリックス支援レーザー脱離イオン化／飛行時間型質量分析（ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ ＭＳ）を使用して評価できる。他のタイプの化学変化は、例えば、電荷変化（例えば、脱アミド化又は酸化による変化）を包含し、例えばイオン交換クロマトグラフィーにより評価できる。

【0145】

タンバク質、例えば、本明細書に記載されている持効型ＮＧＦポリペプチドは、医薬製剤において所望の目的に対して生物活性を示した場合、このタンバク質は製剤中で「その生物活性を保持している」と言える。例えば、タンバク質は、製剤中の生物活性が、製剤に調製されたときの生物活性に対する３０％、２０％又は１０％（分析誤差範囲内）になる場合、その生物活性が保持されている。

【0146】

タンバク質（例えば、本明細書に記載されている持効型ＮＧＦポリペプチド）の安定性は、製剤の組成以外の他の特性に依存することが当業者に知られている。例えば、安定性は、温度、圧力、湿度、ｐＨ値及び外部放射に影響される場合がある。タンバク質製剤中のタンバク質（例えば、本明細書に記載されている持効型ＮＧＦポリペプチド）の安定性は、様々な方法で決定することができる。いくつかの実施形態において、タンバク質の安定性は、サイズ除去クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により決定する。ＳＥＣは、分析物（例えば、タンバク質などの高分子）の流体力学的サイズ、拡散係数及び表面特性に基づいて分析物を分離するものである。従って、例えば、ＳＥＣによれば、様々な変性状態のタンバク質及び／又は分解されたタンバク質から、本明細書に記載されている天然の三次元立体配座の持効型ＮＧＦポリペプチドを分離することができる。ＳＥＣは、通常、固定相が、ガラス又はスチールカラム内の緻密な三次元マトリックスに充填された不活性粒子で構成され、移動相が純水、水性緩衝液、有機溶媒、それらの混合物又は他の溶媒である。固定相の粒子は、所定のサイズより小さい物質しか侵入できない小さなウェル及び／又はチャネルを具備する。従って、大粒子はこれらの細孔及びチャネルから除去されるが、小粒子は移動相から転送される。粒子が固定細孔に固定化されている時間は、粒子が細孔にどれだけ侵入できるかに依存する。移動相の流れから転送されることによりクロマトカラムから溶出するのに必要な時間が長くなるので、粒子はサイズの違いに基づいて分離されるようになる。実施例３に提供される例示的な方法を参照のこと。

【0147】

いくつかの実施形態において、タンバク質（例えば、本明細書に記載されている持効型ＮＧＦポリペプチド）又はその断片は、ＳＥＣを同定技術と組み合わせることにより、同定されるか又は特徴付けられる。タンバク質の同定及び特徴付け手段としては、様々であり、例えば、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、ドデシル硫酸ナトリウムキャピラリー電気泳動（ＣＥ－ＳＤＳ）、イムノアッセイ、電気泳動、紫外／可視／赤外分光法、ラマン分光法、表面増強ラマン分光法、質量分析法、ガスクロマトグラフィー、静的光散乱（ＳＬＳ）、フーリエ変換赤外分光法（ＦＴＩＲ）、円二色性（ＣＤ）、尿素誘導タンバク質アンフォールディング技術、固有トリプトファン蛍光、示差走査熱量測定及び／又はＡＮＳタンパク質結合などのクロマトグラフィー技術が挙げられるが、これらに限定されない。

【0148】

いくつかの実施形態において、サンプル製剤（例えば、本明細書に記載されている持効型ＮＧＦポリペプチドを含む）及び対照製剤（例えば、他のＮＧＦ－Ｆｃ融合タンパク質又は標準品を含む）は、以下の実施例３に記載されるように、単量体の含有量、凝集体及び／又は断片化タンパク質（及び／又は断片の増加パーセンテージ、凝集体の増加パーセンテージなど）を決定するために、処理段階の前に任意選択に測定される。次に、各タンバク質製剤は処理段階を経る。例えば、各タンバク質製剤を特定の温度（例えば、４０℃、２５℃又は５℃）で長期間（例えば、３ヶ月、６ヶ月、１２ヶ月又はそれ以上）保存する。いくつかの実施形態において、タンバク質製剤は、攪拌ストレス試験などの物理的ストレス試験を受ける。いくつかの実施形態において、タンバク質製剤は、加速安定性試験を受け、例えば高温（例えば、４０℃）、高湿度及び／又は低ｐＨ値などを含む加速ストレス下で処理される。いくつかの実施形態において、タンバク質製剤は冷凍-解凍サイクルを経る。いくつかの実施形態において、同じタンバク質製剤のサンプルは、異なる処理を受け、例えば、異なる温度で一定時間保存される。処理段階の後、タンバク質製剤を測定し、タンバク質の単量体、凝集体及び／又は断片の含有量（及び／又は断片の増加パーセンテージ、凝集体の増加パーセンテージなど）を決定する。いくつかの実施形態において、タンバク質製剤は、融解温度（Ｔｍ）及び／又は凝集開始温度（Ｔａｇｇ）を測定するために、連続加熱下で処理され、例えば、約２０℃から約９５℃まで温度を上昇させる（例えば、約０．３℃／ｍｉｎの加熱速度で）。ＴｍとＴａｇｇは、蛍光タンパク質分析装置を使用して、それぞれ２６６ｎｍ／４７３ｎｍでの蛍光吸光度と光散乱の変化によって測定できる。Ｔｍが高いほど、熱安定性が高くなる。Ｔａｇｇが高いほど、凝集が難くなる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されている持効型ＮＧＦポリペプチドは、Ｔｍが５０℃以上であり、例えば、Ｔｍが５１℃、５２℃、５３℃、５４℃、５５℃、５６℃、５７℃、５８℃、５９℃、６０℃、６１℃、６２℃、６３℃、６４℃、６６℃、６７℃、６８℃、６９℃、７０℃又は７５℃のうちのいずれか１つである。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されている持効型ＮＧＦポリペプチドは、Ｔａｇｇが５０℃以上であり、例えば、Ｔａｇｇが５１℃、５２℃、５３℃、５４℃、５５℃、５６℃、５７℃、５８℃、５９℃、６０℃、６１℃、６２℃、６３℃、６４℃、６５℃、６６℃、６７℃、６８℃、６９℃、７０℃、７１℃、７２℃、７３℃、７４℃、７５℃、７６℃、７７℃、７８℃、７９℃、８０℃又は８５℃のうちのいずれか１つである。

【0149】

安定性、例えば組成物又は製剤の物理的安定性は、サンプルの見かけの光減衰（吸光度又は光密度）の測定などの、当技術分野で周知の方法によって評価することができる。この光減衰測定は、製剤の濁度に関連している。製剤の濁度は、溶液に溶解したタンバク質の固有の特性であり、比濁分析法によって比濁分析法濁度単位（ＮＴＵ）で測定される。

【0150】

濁度は、例えば、溶液中の一つ又は複数の成分（例えば、タンバク質及び／又は塩）の濃度の関数として、製剤の「乳白色」又は「乳白色の外観」とも呼ばれ、濁度が既知の懸濁液から作成された標準曲線を使用して計算できる。医薬組成物の濁度を測定するためには、参照基準として欧州薬局方基準（欧州薬局方、第４版、欧州委員会薬品品質局（ＥＤＱＭ）、ストラスブール、フランス）を使用することができる。欧州薬局方基準によれば、透明な溶液は、濁度が約３である対照懸濁液に対して、その以下の濁度を有するものとして定義される。相関又は非理想的な効果がない場合に、濁度の測定には通常、濃度に従って直線的に変化するレイリー散乱が検出される可能性がある。医薬タンバク質の物理的安定性を評価するための他の方法は、当技術分野で周知であり、例えば、サイズ除去クロマトグラフィー又は分析用超遠心法である。

【0151】

いくつかの実施形態において、安定性とは、本明細書に記載されている持効型ＮＧＦポリペプチドを含む製剤が検出できないほどの低粒子形成レベルを有することを指す。本明細書に用いられる語句「検出できないほどの低粒子形成レベル」とは、ＨＩＡＣ分析又は目視的分析によって決定される場合、３０個の粒子／ｍｌ未満、２０個の粒子／ｍｌ未満、１５個の粒子／ｍｌ未満、１０個の粒子／ｍｌ未満、５個の粒子／ｍｌ未満、２個の粒子／ｍｌ未満又は１個の粒子／ｍｌ未満を含むサンプルを指す。いくつかの実施形態において、ＨＩＡＣ分析又は目視的分析によって、持効型ＮＧＦポリペプチド製剤中の粒子は検出されない。

【0152】

「実質的なタンバク質凝集」とは、タンバク質製剤におけるタンバク質の凝集レベルが、対照タンバク質製剤におけるタンバク質の凝集レベルよりも著しく高いことを指す。対照タンバク質製剤としては、保存又は処理前（例えば、高温、湿度、ｐＨ及び／又は長期保存の前などの不安定な条件に供する前）の同じのタンバク質製剤であってもよく、同じ条件下で測定される異なるタンバク質製剤（例えば、他のＮＧＦ－Ｆｃ融合タンパク質、又はＦｃと融合されていないＮＧＦ部分）であってもよい。

【0153】

「タンバク質凝集を実質的に含まない」とは、本発明のタンバク質（又は製剤）が対照製剤よりも明らかに高いレベル又はパーセンテージのタンバク質凝集を有さないことを意味し、例えば、タンバク質（又は製剤）の凝集レベルが、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．２％又は０．１％未満である。タンバク質の凝集レベルは、本明細書の実施例３に記載されるように、当技術分野で知られている標準的な技術を使用して決定することができる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されている持効型ＮＧＦポリペプチドは、タンバク質の凝集が（例えば、加速安定性試験において）実質的にない。いくつかの実施形態において、持効型ＮＧＦポリペプチドは、最大１５％のタンバク質の凝集を有し、例えば、最大１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％又は０．５％などタンバク質凝集を有する（例えば、加熱などの加速安定性試験条件下）。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されている持効型ＮＧＦポリペプチドは、（例えば、加熱などの加速安定性試験条件下で）タンバク質の凝集がない。いくつかの実施形態において、持効型ＮＧＦポリペプチドは、１５％を超えない凝集体の増加を有し、例えば、（例えば、加速加熱などの加速安定性試験条件下で）１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％又は１％を超えない凝集体の増加を有する。いくつかの実施形態において、安定性はＳＥＣによって測定される。いくつかの実施形態において、安定性はＣＥ－ＳＤＳによって測定される。

【0154】

いくつかの実施形態において、安定性とは、本明細書に記載されている持効型ＮＧＦポリペプチド断片化の軽減を指す。本明細書に用いられる用語「検出できないほどの低断片化レベル」とは、サンプルは８０％、８５％、９０％、９５％、９８％又は９９％以上の全タンバク質を含み、例えば、ＨＰＳＥＣによって決定した単一のピーク、又は還元キャピラリーゲル電気泳動（ｒＣＧＥ）によって決定した複数のピーク（例えば、サブユニットと同じ数のあるピーク）において、分解されていないタンバク質又はその分解されていない断片を表し、全タンバク質の５％、４％、３％、２％、１％又は０．５％を超える他の単一のピークを含まないことを指す。本明細書に用いられる用語「還元キャピラリーゲル電気泳動」とは、本明細書に記載されている持効型ＮＧＦポリペプチドなどのＦｃ含有タンバク質中のジスルフィド結合を還元するのに十分な還元条件下でのキャピラリーゲル電気泳動を指す。いくつかの実施形態において、持効型ＮＧＦポリペプチドは、０％～１５％の断片、例えば、（例えば、加速加熱などの加速安定性試験条件下で）０％～１２％の断片を有する。いくつかの実施形態において、持効型ＮＧＦポリペプチドは、３０％を超えない断片を有し、例えば、（例えば、加速加熱などの加速安定性試験条件下で）２９％、２８％、２７％、２６％、２５％、２４％、２３％、２２％、２１％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％又は１％を超えない断片を有する。いくつかの実施形態において、持効型ＮＧＦポリペプチドは、（例えば、加速加熱などの加速安定性試験条件下で）断片がない。いくつかの実施形態において、持効型ＮＧＦポリペプチドは、断片の増加が３０％を超えなく、例えば、（例えば、加速加熱などの加速安定性試験条件下で）断片の増加が２９％、２８％、２７％、２６％、２５％、２４％、２３％、２２％、２１％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％又は１％を超えない。いくつかの実施形態において、持効型ＮＧＦポリペプチドは、少なくとも７５％のメインピークを有し、例えば、（例えば、加速加熱などの加速安定性試験条件下で）少なくとも７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％のメインピークを有する。いくつかの実施形態において、安定性はＳＥＣによって測定される。いくつかの実施形態において、安定性はＣＥ－ＳＤＳによって測定される。
持効型ＮＧＦポリペプチド誘導体

【0155】

いくつかの実施形態において、本明細書に言及される持効型ＮＧＦポリペプチドは、当技術分野で知られており、かつ容易に入手できる追加の非タンパク質部分を含むように、さらに修飾することができる。持効型ＮＧＦポリペプチド誘導体に適した非タンパク質部分としては、水溶性ポリマーが挙げられるが、これらに限定されない。水溶性ポリマーの非限定的な例としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコール共重合体、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ－１，３－ジオキソラン、ポリ－１，３，６－トリオキソラン、エチレン／無水マレイン酸共重合体、ポリアミド酸（ホモポリマー又はランダム共重合体）、デキストラン又はポリ（ｎ－ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、プロピレンオキサイド／エチレンオキシド共重合体、ポリオキシエチレンポリオール（例えば、グリセリン）、ポリビニルアルコール及びその混合物が挙げられるが、これらに限定されない。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、水中での安定性により、製造に利点がある場合がある。ポリマーは、任意の分子量であってもよく、分岐鎖又は非分岐鎖であってもよい。持効型ＮＧＦポリペプチドに連結されるポリマーは、数が異なってもよく、また、ポリマーが複数連結される場合、ポリマーは同じ分子であってもよいし、異なる分子であってもよい。一般に、誘導体化に使用されるポリマーの数及び／又はタイプは、改善される持効型ＮＧＦポリペプチドの特定の特性又は機能、持効型ＮＧＦポリペプチド誘導体が特定の条件下で治療に使用されるかどうかなどを含むがこれらに限定されない考慮事項に基づいて決定することができる。

【0156】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載されている持効型ＮＧＦポリペプチドは、発色団、蛍光団（例えば、クマリン、キサンテン、シアニン、ピレン、ボラポリアザインダセン、オキサジン、及びその誘導体）、蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ、フィコビリタンパク質及びその誘導体）、リン光系染料（例えば、ジオキセタン、キサンテン又はカルボシアニン色素、ランタニドキレート）、タンデム系染料（ｔａｎｄｅｍ ｄｙｅ）（例えば、シアニン－フィコビリプロテイン誘導体、及びキサンテン－フィコビリプロテイン誘導体）、粒子（例えば、金クラスター、コロイド金、ミクロスフェア、量子ドット）、ハプテン、酵素（例えば、ペルオキシダーゼ、ホスファターゼ、グリコシダーゼ、ルシフェラーゼ）及び放射性同位体（例えば、¹²⁵Ｉ、³Ｈ、¹⁴Ｃ、³²Ｐ）から選択されたラベルをさらに含む。

【0157】

いくつかの実施形態において、持効型ＮＧＦポリペプチドは、生物学的に活性なタンバク質、ポリペプチド又はその断片を一つ又は複数含むように、さらに修飾することができる。本明細書で使用される場合、「生物活性」又は「生物学的活性」は交換可能に使用され、特定の機能を実行するためにインビボで生物活性を示すことを指す。例えば、タンバク質、ＤＮＡなどの特定の生体分子に結合し、この生体分子の活性を促進又は阻害することを意味する。いくつかの実施形態において、生物学的に活性なタンバク質又はその断片には、疾患又は症状の予防又は治療のために活性医薬品として患者に投与されるタンバク質及びポリペプチド、診断試験又はインビトロ検出で使用される酵素などの診断目的で使用されるタンバク質及びポリペプチド、ならびにワクチンなどの疾患を予防するために患者に投与されるタンバク質及びポリペプチドが含まれる。いくつかの実施形態において、生物学的に活性なタンバク質又はその断片は、免疫刺激／免疫調節、膜輸送又は酵素活性を有する。いくつかの実施形態において、生物学的に活性なタンバク質、ポリペプチド又はその断片は、酵素、ホルモン、成長因子、サイトカイン又はそれらの混合物である。いくつかの実施形態において、生物学的に活性なタンバク質、ポリペプチド又は断片は、目的ペプチド（例えば、抗原又は他のタンバク質）を特異的に認識することができる。

【0158】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載されている持効型ＮＧＦポリペプチドに含まれ得る生物学的に活性なタンバク質又はその断片は、抗原結合タンバク質（例えば、抗体）である。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されている持効型ＮＧＦポリペプチドに含まれ得る生物学的に活性なタンバク質又はその断片は、抗体を連想させる抗原結合ドメインを含む小さな人工タンバク質である抗体模倣物である（ＧＧｅｅｒｉｎｇ及びＦｕｓｓｅｎｅｇｇｅｒ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３３（２）：６５－７９，２０１５）。これらの分子は、既存のヒト足場タンパク質に由来し、単一のポリペプチドで構成される。本明細書に記載されている持効型ＮＧＦポリペプチドに含まれ得る抗体模倣物としては、例えば、設計されたアンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ；完全合成アンキリンリピート配列を３～５個含み、かつ両端にＮ端及びＣ端のキャップドメインがあるもの）、親和力多量体（アビマー；標的に対する親和力が低い複数のＡドメインを含む高親和力タンバク質）、又は抗凝固剤（脂質足場に基づいて、４つのアクセス可能な、かつ配列がランダムである可能なループを備えるもの）が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されている持効型ＮＧＦポリペプチドに含まれ得る生物学的に活性なタンバク質又はその断片は、アルマジロリピートユニット（特性、リピートアミノ酸配列の長さが約４０個の残基である）を含むアルマジロリピートタンパク質（例えば、β－カテニン、α－インポーチン、プラコグロビン、腺腫性ポリープ症（ＡＰＣ））である。各アルマジロリピートユニットは、ヘアピン構造を形成する一対のαヘリックスで構成される。前記のαソレノイド構造は、繰り返しの複数のコピーにより形成される。アルマジロリピートタンパク質は、特定の保存性側鎖あるいはペプチドの遊離Ｎ－又はＣ－末端との相互作用を必要とせずに、ペプチド主鎖の固定の結合態様に依存して、様々な種類のペプチドに結合することができる。残基によりペプチド残基を認識する可能性、およびリピートタンパク質の固有のモジュール性により、アルマジロリピートタンパク質がペプチド結合のための汎用的な足場として用いられるのは期待されている。
ＩＩＩ．持効型ＮＧＦポリペプチドをコードするベクター

【0159】

また、本発明は、本明細書に記載されている任意の持効型ＮＧＦポリペプチドをコードする単離された核酸、本明細書に記載されている任意の持効型ＮＧＦポリペプチドをコードする核酸を含むベクターに関する。また、本発明は、本明細書に記載されている任意の持効型ＮＧＦポリペプチドをコードする核酸を含む単離された宿主細胞（例えば、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ ２９３細胞、Ｈｅｌａ細胞又はＣＯＳ細胞）、又は本明細書に記載されている任意の持効型ＮＧＦポリペプチドをコードする核酸を含むベクターに関する。いくつかの実施形態において、単離された核酸は、持効型ＮＧＦポリペプチドのＮ端のシグナルペプチド配列（例えば、配列番号６）をさらにコードする。いくつかの実施形態において、単離された核酸は、持効型ＮＧＦポリペプチドのＮ端のプロペプチド配列（例えば、配列番号５）をさらにコードする。いくつかの実施形態において、単離された核酸は、その後に持効型ＮＧＦポリペプチドのＮ端のプロペプチド配列（例えば、配列番号５）が続いているシグナルペプチド配列（例えば、配列番号６）をさらにコードする。

【0160】

従って、いくつかの実施形態において、本発明は、Ｎ端からＣ端まで、配列番号１～４のうちのいずれか１つで示されるアミノ酸配列（例えば、配列番号１～３のいずれか）を含む（或いは、本質的に該アミノ酸配列からなるか、又は該アミノ酸配列からなる）ＮＧＦ部分と、ＩｇＧ１ Ｆｃ又はＩｇＧ４ Ｆｃに由来するＦｃ部分とを含む持効型ＮＧＦポリペプチドをコードする単離された核酸に関する。いくつかの実施形態において、本発明は、配列番号６１～６７のうちのいずれか１つで示されるアミノ酸配列を含む（或いは、本質的に該アミノ酸配列からなるか、又は該アミノ酸配列からなる）持効型ＮＧＦポリペプチドをコードする単離された核酸に関する。いくつかの実施形態において、単離された核酸は、５’端に配列番号６のシグナルペプチド配列をコードする核酸配列をさらに含む。いくつかの実施形態において、単離された核酸は、５’端に配列番号５のプロペプチド配列をコードする核酸配列をさらに含む。いくつかの実施形態において、単離された核酸（５’から３’まで）は、配列番号６のシグナルペプチド配列をコードする核酸配列、およびその後の５’端に位置する配列番号５のプロペプチド配列をコードする核
酸配列をさらに含む。

【0161】

いくつかの実施形態において、本発明は、配列番号３４、３６、３８、４０、４２、４４及び４６のうちのいずれか１つで示されるアミノ酸配列を含む（或いは、本質的に該アミノ酸配列からなるか、又は該アミノ酸配列からなる）持効型ＮＧＦポリペプチドをコードする単離された核酸に関する。いくつかの実施形態において、配列番号６のシグナルペプチド配列を含まずに、配列番号３４、３６、３８、４０、４２、４４及び４６のうちのいずれか１つで示されるアミノ酸配列を含む（或いは、本質的に該アミノ酸配列からなるか、又は該アミノ酸配列からなる）持効型ＮＧＦポリペプチドをコードする単離された核酸に関する。いくつかの実施形態において、配列番号３３、３５、３７、３９、４１、４３及び４５のいずれかの核酸配列を含む（或いは、本質的に該アミノ酸配列からなるか、又は該アミノ酸配列からなる）単離された核酸に関する。

【0162】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載されている任意の持効型ＮＧＦポリペプチドをコードする核酸を含むベクターは、哺乳動物の細胞（例えば、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ ２９３細胞、Ｈｅｌａ細胞、ＣＯＳ細胞）などの真核細胞における複製及び統合に適している。いくつかの実施形態において、ベクターはウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、ベクターはｐＴＴ５などの非ウイルスベクターである。

【0163】

哺乳動物の細胞へ遺伝子を導入するためには、多数のウイルスベースの系が開発されてきた。ウイルスベクターの例としては、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、及びそれらの誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。ウイルスベクター技術は、当技術分野で周知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（２００１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、ならびにウイルス学及び分子生物学の他のハンドブックに詳述されている。レトロウイルスは、遺伝子送達システムの便利なプラットフォームを提供する。当技術分野で知られている技術を使用して、異種核酸をベクターに挿入してレトロウイルス粒子にパッケージングすることができる。次に、組換えウイルスを単離してインビトロ又はエクスビボで遺伝子操作された哺乳動物の細胞に送達することができる。多くのレトロウイルス系は当技術分野で知られている。いくつかの実施形態において、アデノウイルスベクターを使用する。多くのアデノウイルスベクターは当技術分野で知られている。いくつかの実施形態において、レンチウイルスベクターを使用する。いくつかの実施形態において、自己不活化型レンチウイルスベクターを使用する。例えば、構築物のタンパク質コード配列を有する自己不活化型レンチウイルスベクターは、当技術分野で知られている実験方法を使用してパッケージングすることができる。得られたレンチウイルスベクターは、当技術分野で知られている方法を使用して哺乳動物の細胞に形質導入するために使用することができる。レトロウイルス（例えば、レンチウイルス）に由来するベクターは、導入遺伝子の長期的かつ安定した統合と子孫細胞での増殖を可能にするため、長期的な遺伝子形質導入を実現するのに適したツールである。レンチウイルスベクターも免疫原性が低く、非増殖細胞に形質導入できる。

【0164】

いくつかの実施形態において、ベクターは非ウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、ベクターはｐＴＴ５ベクターである。いくつかの実施形態において、ベクターは、眠れる森の美女（Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙ（ＳＢ））トランスポゾンシステム又はＰｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンシステムなどのトランスポゾンである。いくつかの実施形態において、ベクターは、ポリマーベースの非ウイルスベクターであり、例えば、ポリ（乳酸－ｃｏ－グリコール酸）（ＰＬＧＡ）及びポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリ（エチレンイミン）（ＰＥＩ）、またはデンドリマーである。いくつかの実施形態において、ベクターは、例えば、カチオン性リポソーム、脂質ナノエマルジョン及び固体脂質ナノ粒子（ＳＬＮ）などのカチオン性脂質ベースの非ウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、ベクターは、ペプチドベースの非ウイルス遺伝子ベクター、例えば、ポリ－Ｌ－リジンである。ゲノム編集に適した任意の既知の非ウイルスベクターは、持効型ＮＧＦポリペプチドをコードする核酸を宿主細胞に導入するために使用することができる。それについて、Ｙｉｎ Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（２０１４） １５：５２１－５５５； Ａｒｏｎｏｖｉｃｈ ＥＬ ｅｔ ａｌ．，「Ｔｈｅ Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙ ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ ｓｙｓｔｅｍ：ａ ｎｏｎ－ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ．」 Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．（２０１１） Ｒ１： Ｒ１４－２０和Ｚｈａｏ Ｓ．ｅｔ ａｌ．，「ＰｉｇｇｙＢａｃ ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ ｖｅｃｔｏｒｓ：ｔｈｅ ｔｏｏｌｓ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｇｅｎｅ ｅｄｉｔｉｎｇ．」 Ｔｒａｎｓｌ．Ｌｕｎｇ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．（２０１６）５（１）：１２０－１２５（援用により本明細書に組み込まれる）を参照のこと。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されている持効型ＮＧＦポリペプチドをコードする任意の１つ又は複数の核酸又はベクターは、エレクトロポレーション、ソノポレーション、フォトポレーション、マグネトフェクション、ハイドロポレーションを含むがこれらに限定されない物理的手段によって宿主細胞（例えば、ＣＨＯ、ＨＥＫ ２９３、Ｈｅｌａ又はＣＯＳ）に導入される。

【0165】

いくつかの実施形態において、ベクターは、ベクター（例えば、レンチウイルスベクター、ｐＴＴ５ベクター）でトランスフェクトされた宿主細胞の集団から、本明細書に記載されている持効型ＮＧＦポリペプチドを発現する細胞を選択するための選択マーカー遺伝子又はレポーター遺伝子を含む。宿主細胞で発現できるように、選択可能なマーカーとレポーター遺伝子の両方が適切な調節配列で囲まれることができる。例えば、ベクターは、転写及び翻訳ターミネーター、開始配列、及び核酸配列の発現を調節するためのプロモーターを含むことがある。

【0166】

核酸は、当技術分野で既知の任意の分子クローニング法によりベクターにクローニングすることができ、例えば、制限エンドヌクレアーゼ部位及び１つ又は複数の任意選択的なマーカーを使用してクローニングする。いくつかの実施形態において、核酸はプロモーターに作動可能に連結されている。原核細胞又は真核細胞（例えば、哺乳動物の細胞）において遺伝子発現を行うための様々なプロモーターが開発された。本発明には、当技術分野で知られている任意のプロモーターを使用することができる。プロモーターは、構成的プロモーターと、誘導性プロモーターなどの調節プロモーターに大別される。

【0167】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載されている持効型ＮＧＦポリペプチドをコードする核酸は、作動可能に構成的プロモーターに連結されている。構成的プロモーターは、異種遺伝子（導入遺伝子としても知られる）が宿主細胞において構成的発現することを可能にする。本明細書のプロモーターとしては、例えば、ＣＭＶプロモーター（ＣＭＶ）、ヒト伸長因子－１α（ｈＥＦ１α）、ユビキチンＣプロモーター（ＵｂｉＣ）、ホスホグリセロキナーゼプロモーター（ＰＧＫ）、シミアンウイルス４０初期プロモーター（ＳＶ４０）、ＣＭＶ初期エンハンサー（ＣＡＧＧ）と結合したニワトリβ－アクチンプロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、ポリオーマエンハンサー／単純ヘルペスチミジンキナーゼ（ＭＣ１）プロモーター、βアクチン（β－ＡＣＴ）プロモーター、「骨髓増生性肉腫ウイルスエンハンサー、陰性対照領域の削除、ｄ１５８７ｒｅｖプライマー結合部位置換（ＭＮＤ）」プロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。これらの構成的プロモーターが導入遺伝子の発現を駆動するところの效率は、多くの研究で広く比較されている。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されている持効型ＮＧＦポリペプチドをコードする核酸は、ＣＭＶプロモーターに作動可能に連結されている。

【0168】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載されている持効型ＮＧＦポリペプチドをコードする核酸は、誘導性プロモーターに作動可能に連結されている。誘導性プロモーターは、調節プロモーターのカテゴリーに属する。誘導性プロモーターは、物理的条件、宿主細胞の微小環境又は宿主細胞の生理学的状態、誘導剤（即ち、誘導薬剤）又はそれらの組み合わせなどの１つ又は複数の条件によって誘導されることができる。いくつかの実施形態において、誘導条件は、宿主細胞において内在性遺伝子の発現を誘導しない。いくつかの実施形態において、誘導条件は、誘導剤、放射線（例えば、電離放射線、光）、温度（例えば、熱）、レドックス状態及び宿主細胞の活性化状態から選択される。いくつかの実施形態において、誘導性プロモーターは、ＮＦＡＴプロモーター、ＴＥＴＯＮ^Rプロモーター、又はＮＦκＢプロモーターでよい。
ＩＶ．製造方法

【0169】

本発明は、本明細書に記載されている任意の持効型ＮＧＦポリペプチドを作成する方法にも関する。従って、いくつかの実施形態において、（ａ）コードされる持効型ＮＧＦポリペプチドを効果的に発現できる条件下で、本明細書に記載されている任意の持効型ＮＧＦポリペプチドをコードする核酸又はベクターを含む宿主細胞（例えば、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ ２９３細胞、Ｈｅｌａ細胞又はＣＯＳ細胞）を培養する工程；及び（ｂ）発現された持効型ＮＧＦポリペプチドを前記宿主細胞から得る工程を含む、持効型ＮＧＦポリペプチドを調製する方法に関する。いくつかの実施形態において、工程（ａ）は、本明細書に記載されている持効型ＮＧＦポリペプチドをコードする核酸又はベクターを含む宿主細胞を産生することをさらに含む。本明細書に記載されている持効型ＮＧＦポリペプチドは、当技術分野で知られているか、又は本明細書に記載されている任意の方法を使用して作成することができる。例示的な方法については、実施例１を参照のこと。

【0170】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載されている持効型ＮＧＦポリペプチドは、真核細胞、例えば、哺乳動物の細胞で発現される。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されている持効型ＮＧＦポリペプチドは原核細胞で発現される。本明細書に記載されている持効型ＮＧＦポリペプチドが原核細胞で発現される場合、産生されたプロＮＧＦ－（任意選択的なリンカー）－Ｆｃ部分は、プロペプチド配列にプロセッシングされることができない。従って、原核細胞発現に使用される場合、持効型ＮＧＦポリペプチドをコードする核酸は、プロペプチド配列（例えば、配列番号５）をコードする核酸配列なしで設計することができる。
１．原核細胞の組換え生成物
ａ）ベクター構築

【0171】

本発明のタンバク質構築物をコードするポリ核酸配列は、標準的な組換え技術を使用して得ることができる。ポリヌクレオチドは、ヌクレオチド合成機又はＰＣＲ技術を使用して合成できる。ポリペプチドをコードする配列を得たら、すぐにその配列を原核宿主において異種ポリヌクレオチドを複製及び発現できる組換えベクターに挿入する。本発明には、当技術分野で知られる入手可能な多くのベクターを使用することができる。ベクターは、ベクターに挿入される核酸のサイズ、及びベクターでトランスフェクションされる特定の宿主細胞に主に考慮して、適切に選択する。各ベクターは、このベクターの機能（異種ポリヌクレオチドの増幅又は発現、又はその両方）及びこのベクターとそれが存在する特定の宿主細胞との適合性に応じて、様々な成分を含む。ベクター構成要素は、一般に、複製起点、選択マーカー遺伝子、プロモーター、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）、シグナル配列、異種核酸挿入及び転写終結配列を含むが、これらに限定されない。

【0172】

一般に、プラスミドベクターは、宿主細胞と適合する種に由来するレプリコン及び制御配列を含有し、これらの宿主細胞とともに使用されている。ベクターは、通常、複製部位と、形質転換細胞において表現型選択を提供できるマーカー配列とを有する。例えば、大腸菌は、通常、大腸菌に由来するプラスミドであるｐＢＲ３２２で形質転換される。ｐＢＲ３２２は、アンピシリン（Ａｍｐ）及びテトラサイクリン（Ｔｅｔ）耐性をコードする遺伝子を含むため、形質転換細胞を識別する簡単な方法を提供する。ｐＢＲ３２２、その誘導体、又は他の細菌プラスミド又はファージは、微生物が内在性タンバク質を発現するために用いられるプロモーターを含むか、又は修飾されてそのプロモーターを含むことがある。特異的抗体の発現に用いられるｐＢＲ３２２誘導体の例については、Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，６４８，２３７に詳述されている。

【0173】

さらに、宿主微生物と適合するレプリコンと制御配列とを含むファージベクターは、これらの宿主細胞とともに形質転換ベクターとして使用することができる。例えば、ＧＥＭ^TM－１１などのファージは、大腸菌ＬＥ３９２などの感受性宿主細胞を形質転換するために用いられる組換えベクターの作成に使用することがある。

【0174】

プロモーターは、下流の遺伝子発現を調節する、シストロンの上流（５′）に位置する非翻訳調節配列である。原核生物のプロモーターは、一般に、誘導性と構成性の２つのクラスに分類される。誘導性プロモーターは、培養条件の変化（例えば、栄養素の有無や温度の変化）に応答して、シストロンの転写レベルを開始及び増加させるプロモーターである。

【0175】

潜在的な宿主細胞によって認識される多くのプロモーターはよく知られている。プロモーター配列は、制限エンドヌクレアーゼによってソースＤＮＡから移動・単離されて、そして、プロモーターポリペプチドをコードするシストロンＤＮＡに作動可能に連結されるように、本出願のベクターに挿入される。天然のプロモーター配列及び多くの異種プロモーターのいずれか一方も、標的遺伝子の増幅及び／又は発現を指示するために利用可能である。いくつかの実施形態において、異種プロモーターは、天然の標的ポリペプチドプロモーターと比較して、より多くの転写を可能にし、かつ発現された標的遺伝子の収量が高いので、利用される。

【0176】

原核宿主に適するプロモーターには、ＰｈｏＡプロモーター、－ガラクトシダーゼ及びラクトースプロモーター系、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系、及びｔａｃやｔｒｃプロモーターなどのハイブリッドプロモーターが含まれる。ただし、細菌で機能できる他のプロモーター（例えば、他の既知の細菌又はファージプロモーター）を適用してもよい。それらの核酸配列は開示されているので、当業者がリンカー又はアプタマーを使用して任意の所望の制限部位を提供し、そして、目的の軽鎖及び重鎖をコードするシストロンにそれらを連結することができる（Ｓｉｅｂｅｎｌｉｓｔ ｅｔ ａｌ．，（１９８０） Ｃｅｌｌ ２０：２６９）。

【0177】

いくつかの実施形態において、組換えベクター内の各シストロンは、発現されるポリペプチドの膜貫通移動を直接指示する分泌シグナル配列成分を含む。一般に、シグナル配列は、ベクターの成分であってもよいし、ベクターに挿入される標的ポリペプチドＤＮＡの一部であってもよい。本発明に選択されるシグナル配列としては、宿主細胞によって認識・処理される（即ち、シグナルペプチダーゼによって切断される）可能性のあるものである。異種ポリペプチドの固有シグナル配列を認識及び処理できない原核宿主細胞では、シグナル配列が、例えば、アルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、Ｉｐｐ又は熱安定性エンテロトキシンＩＩ（ＳＴＩＩ）リーダー、ＬａｍＰ、ＰｈｏＥ、ＰｅｌＢ、ＯｍｐＡ及びＭＢＰからなる群から選択された原核シグナル配列によって置換される。

【0178】

いくつかの実施形態において、本出願のタンバク質構築物の生産は、宿主細胞の細胞質で起こり得るため、いずれかのシストロン内に分泌シグナル配列が存在する必要はない。いくつかの実施形態において、ポリペプチド成分が発現され、折り畳まれ、組み立てられて、細胞質内でタンバク質構築物を形成する。いくつの宿主株（例えば、大腸菌ｔｒｘＢ－株）により、ジスルフィド結合の形成に有利な細胞質条件を提供し、それによって発現されたタンバク質サブユニットが適切に折り畳まれかつ組み立てれることが可能になる。それについて、Ｐｒｏｂａ及びＰｕｌｌｔｈｕｎ，Ｇｅｎｅ，１５９：２０３（１９９５）を参照のこと。
ｂ）原核宿主細胞

【0179】

本出願のタンバク質を発現するのに適する原核宿主細胞としては、古細菌及び真正細菌が含まれ、例えば、グラム陰性菌又はグラム陽性菌である。使用可能な細菌の例としては、大腸菌、バチルス（例えば、枯草菌）、エンテロバクター、シュードモナス（例えば、緑膿菌）、サルモネラ菌、セラチア・マルセッセンス、クレブシエラ、プロテウス、シゲラ、リゾビア、ビトレオシラ、およびパラコッカスが挙げられる。いくつかの実施形態において、グラム陰性細胞を使用する。いくつかの実施形態において、大腸菌細胞が本発明の宿主として使用される。大腸菌株の例としては、Ｗ３１１０株（Ｂａｃｈｍａｎｎ，Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．２（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．：Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９８７），ｐｐ．１１９０－１２１９；ＡＴＣＣ Ｄｅｐｏｓｉｔ Ｎｏ．２７，３２５）及びその誘導体が挙げられ、遺伝子型Ｗ３１１０ ＡｆｈｕＡ（ＡｔｏｎＡ）ｐｔｒ３ ｌａｃ Ｉｑ ｌａｃＬ８ ＡｏｍｐＴ Ａ（ｎｍｐｃ ｆｅｐＥ）ｄｅｇＰ４１ ｋａｎ^Rを有する３３Ｄ３株（Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，６３９，６３５）が挙げられる。また、Ｅ．ｃｏｌｉ ２９４（ＡＴＣＣ ３１４４６）、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｂ、Ｅ．ｃｏｌｉ １７７６（ＡＴＣＣ ３１５３７）及びＥ．ｃｏｌｉ ＲＶ３０８（ＡＴＣＣ ３１６０８）などの他の株及びそれらの誘導体を適用してもよい。これらの例は説明のためのものであり、限定的なものではない。上述の既知の遺伝子型のいずれかの細菌誘導体を構築するための方法は、当技術分野で知られており、例えばＢａｓｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，８：３０９－３１４（１９９０）に詳述されている。細菌細胞におけるレプリコンの複製可能性を考慮すれば、通常、適切な細菌を選択する必要がある。例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＡＣＹＣ１７７又はｐＫＮ４１０などの既知のプラスミドを使用してレプリコンを提供する場合、大腸菌、セラチア又はサルモネラが宿主として使用される。

【0180】

一般に、宿主細胞は最小量のタンパク質分解酵素を分泌し、細胞培養に追加のプロテアーゼ阻害剤を適切に添加する必要がある。
ｃ）タンパク質生産

【0181】

宿主細胞を上記の発現ベクターでトランスフェクションし、適切に改良された従来の栄養培地で培養し、それにより、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、又は所望の配列をコードする遺伝子を増幅する。トランスフェクションとは、原核宿主にＤＮＡを導入して、ＤＮＡが染色体外のエレメントとして又は染色体統合によって複製されることを可能にすることを意味する。トランスフェクションは、使用される宿主細胞に応じて、そのような細胞に適用できる標準的な技術を使用して行われる。通常、多量の細胞壁バリアを持つ細菌細胞には、塩化カルシウムによるカルシウム処理が使用される。別のトランスフェクション法としては、ポリエチレングリコール／ジメチルスルホキシドの使用、エレクトロポレーションがある。

【0182】

本発明のタンバク質構築物を生産するために使用される原核細胞は、当技術分野で知られており、選択される宿主細胞の培養に適した培地で成長される。適切な培地は、ルリア ブロス（ＬＢ）及び必要な栄養補助剤を含む。いくつかの実施形態において、培地は、発現ベクターを含む原核細胞の成長を選択的に可能にするために、発現ベクターの構造に基づいて選択された選択剤をさらに含む。例えば、アンピシリンは、アンピシリン耐性遺伝子を発現する細胞の成長のために培地に添加される。

【0183】

培地には、炭素源、窒素源及び無機リン酸塩源に加えて、任意の必要な補助剤を、適切な濃度で単独で、又は他の補助剤又は培地（例えば、複合窒素源）との混合物として追加することもできる。任意選択に、培地は、グルタチオン、システイン、シスタミン、チオグリコレート、ジチオエリスリトール及びジチオスレイトールからなる群から選択された一つ又は複数の還元剤を含んでもよい。原核宿主細胞は、適切な温度で培養される。例えば、大腸菌の成長の場合、温度範囲は、２０°Ｃ～３９°Ｃであることが好ましく、２５°Ｃ～３７°Ｃであることがより好ましく、３０°Ｃであることがさらに好ましい。培地のｐＨ値は、主に宿主生物によって決められるが、５から９までの間の任意のｐＨ値でよい。大腸菌の場合、ｐＨ値は、６．８～７．４であることが好ましく、７．０であることがより好ましい。

【0184】

誘導性プロモーターが本発明の発現ベクターに使用される場合、タンバク質発現は、プロモーターの活性化に適した条件下で誘導される。本発明の一態様では、ＰｈｏＡプロモーターはポリペプチドの転写を制御するために使用される。従って、形質転換された宿主細胞は、リン酸塩制限培地で培養されて誘導される。リン酸塩制限培地は、Ｃ．Ｒ．Ａ．Ｐ培地である（Ｓｉｍｍｏｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ（２００２），２６３：１３３－１４７を参照のこと）ことが好ましい。なお、当分野において知られているように、使用されるベクター構造によっては、当技術分野で知られている他の様々な誘導剤を使用してもよい。

【0185】

本発明で発現されるタンバク質構築物は、宿主細胞のペリプラズムに分泌され、そこから回収される。タンバク質の回収には、通常、浸透圧ショックや、超音波処理、溶解などの手段によって、微生物を破壊することが含まれる。細胞が破壊されると、遠心又はろ過によって細胞断片又は細胞全体を除去できる。例えば、アフィニティー樹脂クロマトグラフィーによってタンバク質をさらに精製することができる。或いは、タンバク質を培地に輸送してそこで単離することができる。細胞を培地から除去し、培地の上清をろ過及び濃縮して、産生されたタンバク質をさらに精製することができる。発現されたポリペプチドは、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）及びウエスタンブロット試験などの一般的な方法によってさらに単離及び同定することができる。

【0186】

或いは、発酵プロセスを通じてタンバク質を大規模に生産する。組換えタンパク質の生産には、様々な大規模フェドバッチ発酵の手順を利用することができる。大規模な発酵は、容量が少なくとも１０００リットル、好ましく１０００～１０００００リットルであり、発酵槽として、攪拌翼により酸素および栄養物質、特にグルコース（炭素／エネルギーが優先）を分配するものが使用される。小規模発酵とは、一般に、容量が１００リットルであり、１リットル～１００リットルの範囲である発酵槽での発酵を指す。

【0187】

発酵中には、通常、細胞が適切な条件下で所望の密度に増殖した後にタンバク質発現の誘導が開始し、例えば、ＯＤ₅₅₀が約１８０～２２０である時に、細胞が初期静止期にある。使用されるベクター構造に応じて、当技術分野で知られている誘導剤、および上記の様々な誘導剤を使用することができる。誘導前には、細胞を短期間増殖させることができる。細胞が約１２～５０時間誘導されるのが普通であるが、それより長い又は短い誘導時間で行われることもある。

【0188】

本発明のタンバク質構築物の収量及び品質を改善するために、様々な発酵条件を改善することができる。例えば、分泌されたポリペプチドの正しい組み立てと折り畳みを改善するためには、Ｄｓｂタンパク質（ＤｓｂＡ、ＤｓｂＢ、ＤｓｂＣ、ＤｓｂＤ又はＤｓｂＧ）やＦｋｐＡ（シャペロン活性を持つペプチジルプロリルシス-トランスイソメラーゼ）などのシャペロンタンパク質を過剰発現するための追加のベクターを使用して、宿主原核細胞を同時形質転換することができる。シャペロンタンパク質は、細菌宿主細胞で産生された異種タンパク質の正確な折り畳みおよび溶解を促進するのに役立つことが示されている。Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９９）Ｊ Ｂｉｏ Ｃｈｅｍ ２７４：１９６０１－１９６０５；Ｇｅｏｒｇｉｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．６，０８３，７１５；Ｇｅｏｒｇｉｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．６，０２７，８８８；ＢｏｔｈｍａｎｎおよびＰｌｕｃｋｔｈｕｎ（２０００）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：１７１００－１７１０５；ＲａｍｍおよびＰｌｕｃｋｔｈｕｎ（２０００）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：１７１０６－１７１１３；Ａｒｉｅ ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３９：１９９－２１０。

【0189】

発現した異種タンバク質（特にタンパク質分解感受性タンバク質）の加水分解を最小限に抑えるためには、タンパク質分解酵素を欠いた特定の宿主株を本発明に使用することができる。例えば、宿主細胞株を改変して、プロテアーゼＩＩＩ、ＯｍｐＴ、ＤｅｇＰ、Ｔｓｐ、プロテアーゼＩ、プロテアーゼＭｉ、プロテアーゼＶ、プロテアーゼＶＩ及びそれらの組み合わせなどの既知の細菌プロテアーゼをコードする遺伝子が遺伝子変異を起こることを可能にする。また、Ｊｏｌｙ ｅｔ ａｌ．，（１９９８），ｓｕｐｒａ；Ｇｅｏｒｇｉｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，２６４，３６５；Ｇｅｏｒｇｉｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，５０８，１９２；Ｈａｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｄｒｕｇ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ，２：６３－７２（１９９６）に詳述されているように、いくつかの大腸菌プロテアーゼ欠損株を使用することができる。

【0190】

本発明に記載されるタンバク質構築物をコードする発現系における宿主細胞としては、タンパク質分解酵素を欠いていて、かつ一つ又は複数のシャペロンタンパク質を過剰発現するプラスミドで形質転換された大腸菌株を使用することができる。
ｄ）タンパク質の精製

【0191】

本発明で生産されるタンバク質構築物は、さらなる分析及び使用に用いられる実質的に均一な製剤を得るために、当技術分野で知られている標準的なタンバク質精製法を使用してさらに精製することができる。適切な精製手順の例としては、イムノアフィニティーカラム又はイオン交換カラムによる分留、エタノール沈殿、逆相液相クロマトグラフィーＨＰＬＣ、シリカ又は陽イオン交換樹脂（例えば、ＤＥＡＥ）クロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、硫酸アンモニウム沈殿、及びデキストランゲルＧ－７５などのゲルによるろ過が挙げられる。

【0192】

いくつかの実施形態において、固相に固定化されたプロテインＡは、本明細書に記載されているＦｃ領域を含むタンバク質構築物の免疫親和性精製に使用される。プロテインＡは、黄色ブドウ球菌に由来する４２ ｋＤａの表面タンパク質であり、Ｆｃ含有構造、例えば、本明細書に記載されている持効型ＮＧＦポリペプチドに対して高い結合親和力を有する。Ｌｉｎｄｍａｒｋ ｅｔ ａｌ．，（１９８３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．６２：１－１。プロテインＡを固定化するための固相は、ガラス又はシリカ表面を含むカラムであることが好ましく、制御細孔ガラスカラム又はケイ酸カラムであることがより好ましい。一部の適用では、夾雑物の非特異的付着を防ぐために、グリセロールなどの試薬でクロマトカラムがコーティングされている。次に、固相を洗浄して固相に非特異的に結合した夾雑物を除去する。最後に、溶出により固相から目的のタンパク質構築物を回収する。
２．真核細胞の組換え生成物

【0193】

真核発現の場合は、ベクター成分として、一般に、シグナル配列、複製起点、１つ又は複数のマーカー遺伝子、エンハンサー要素、プロモーター及び転写終結配列のうちの１つ又は複数がふくまれるが、これらに限定されない。
ａ）シグナル配列要素

【0194】

真核宿主用のベクターは、シグナル配列、あるいは成熟したタンパク質又はポリペプチドのＮ端に特定の切断部位を有する他のポリペプチドをコードするための挿入物であってもよい。選択される異種シグナル配列としては、宿主細胞によって認識されて加工された（即ち、シグナルペプチダーゼによって切断される）ものが好ましい。哺乳動物の細胞の発現では、哺乳動物シグナル配列及び単純ヘルペスｇＤシグナルといったウイルス分泌リーダーが得られる。この前駆体領域のＤＮＡは、リーディングフレームで本出願のタンバク質構築物をコードするＤＮＡに連結されている。
ｂ）複製起点

【0195】

一般に、哺乳動物発現ベクターには、複製起点要素を必要としない（ただし、ＳＶ４０起点は、初期プロモーターを含むという理由だけでよく使用されている）。
ｃ）選択遺伝子要素

【0196】

発現及びクローニングのベクターは、選択マーカーとも呼ばれる選択遺伝子を含むことができる。典型的な選択遺伝子は、以下のタンバク質：（ａ）抗生物質又は他の毒素、例えばアンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサート又はテトラサイクリンに耐性があるタンバク質、（ｂ）栄養要求性欠乏症を補うタンバク質、又は（ｃ）複雑な培地には提供できない重要な栄養素を提供するためのタンバク質、をコードするものであり、例えばバチルスＤ－アラニンラセマーゼをコードする遺伝子である。

【0197】

薬物を利用して宿主細胞の成長を阻止するのが選択スキームの一例である。異種遺伝子により成功にトランスフェクションされたこれらの細胞は、薬剤耐性を有するタンバク質を産生するため、選択スキームを生き延びる。このような優性選択の例として、ネオマイシン、ミコフェノール酸及びハイグロマイシンといった薬剤が使用される。

【0198】

哺乳動物の細胞に適する選択マーカーの別の例としては、本出願に記載されるタンバク質構築物をコードする核酸を取り込む能力のある細胞を識別できる選択的なマーカーであり、例えば、ＤＨＦＲ、チミジンキナーゼ、メタロチオネイン－Ｉ及び－ＩＩであり、霊長類のメタロチオネイン遺伝子、アデノシンデアミナーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼなどであることが好ましい。

【0199】

例えば、ＤＨＦＲ選択遺伝子でトランスフェクションされた細胞に対しては、ＤＨＦＲの競合的アンタゴニストであるメトトレキサート（Ｍｔｘ）を含む培地ですべての形質転換体を培養することにより同定する。野生型ＤＨＦＲを使用する場合、宿主細胞としては、ＤＨＦＲ活性を欠くチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株（例えば、ＡＴＣＣ ＣＲＬ－９０９６）を適用することができる。

【0200】

或いは、ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列、野生型ＤＨＦＲタンパク質、及びアミノグリコシド３′－ホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）や同時トランスフェクションされた宿主細胞（特に、内在性ＤＨＦＲ含有野生型宿主）などの別の選択マーカーを使用して、選択的標識を含有する培地で細胞を成長させることによって選択してもよい。ここで、前記選択的標識は、例えば、カナマイシンや、ネオマイシン、Ｇ４１８などのアミノグリコシド系抗生物質である。Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．４，９６５，１９９を参照のこと。
ｄ）プロモーター要素

【0201】

発現及びクローニングベクターは、一般に、宿主によって認識され、所望のポリペプチド配列をコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含む。真核遺伝子は、ほどんど、転写起点から約２５～３０個の塩基上流にＡＴリッチ領域を持っている。遺伝子の転写起点から７０～８０個の塩基上流には、ＣＮＣＡＡＴ領域（ただし、Ｎは任意のヌクレオチドである）という別の配列が見られることが多い。また、ほとんどの真核生物の３′端には、コード配列の３′端にポリＡテールを追加するためのシグナルである可能性があるＡＡＴＡＡＡ配列がある。これらの配列は、真核細胞発現ベクターに挿入できる。上記のセクション「ＩＩＩ．持効型ＮＧＦポリペプチドをコードするベクター」を参照のこと。

【0202】

哺乳動物宿主細胞ベクターにおけるポリペプチドの転写は、プロモーターよって制御される。このようなプロモーターとしては、宿主細胞系と適合性があれば、例えば、ポリオーマ、ニワトリ痘ウイルス、アデノウイルス（例えば、アデノウイルス２）、ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウィルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、及び最適なシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）などのウイルスゲノムから得られたプロモーター；アクチンプロモーターや、免疫グロブリンプロモーターなどの異種哺乳動物に由来するプロモーター；熱ショックプロモーターからのプロモーターを使用することができる。

【0203】

ＳＶ４０ウイルスの初期及び後期プロモーターは、ＳＶ４０ウイルスの複製起点も含むＳＶ４０制限断片として便利に得られる。ヒトサイトメガロウィルスの前初期プロモーターは、ＨｉｎｄＩＩＩ Ｅ制限断片として便利に得られる。ベクターとしてウシパピローマウイルスを使用して哺乳動物宿主中でＤＮＡを発現させるためのシステムは、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．４，４１９，４４６に開示されている。このシステムに関する改良は、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．４，６０１，９７８にさらに詳述されている。インターフェロンｃＤＮＡが単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼプロモーターの制御下でヒトマウス細胞に発現されることについては、Ｒｅｙｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ２９７：５９８－６０１（１９８２）を参照のこと。或いは、ラウス肉腫ウイルスの長い末端リピード配列をプロモーターとして使用することができる。
ｅ）エンハンサー要素

【0204】

本出願タンバク質構築物をコードするＤＮＡの高等真核生物による転写は、エンハンサー配列をベクターに挿入することによって増加されることが普通である。多くのエンハンサー配列（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α－フェトプロテイン、及びインスリン）は、哺乳動物の遺伝子から発見された。なお、通常に、真核細胞ウイルスのエンハンサーが使用される。例としては、複製起点の末端（１００－２７０ ｂｐ）にあるＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウィルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の末端にあるポリオーマエンハンサー及びアデノウイルスエンハンサーが挙げられる。真核生物のプロモーターを活性化する増強要素については、Ｙａｎｉｖ，Ｎａｔｕｒｅ ２９７：１７－１８（１９８２）を参照のこと。エンハンサーは、ポリペプチドコード配列の５′又は３′でベクターにスプライシングすることができるが、好ましくはプロモーターの５′に位置する。
ｆ）転写終結要素

【0205】

真核宿主細胞（酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト又は他の多細胞生物の有核細胞）で使用される発現ベクターは、ｍＲＮＡの転写終結および安定化に必要な配列をさらに含む。これらの配列は、通常に、真核又はウイルスのＤＮＡ又はｃＤＮＡの５′端の非翻訳領域、たまには３′端の非翻訳領域から得ることができる。これらの領域は、ポリペプチドをコードするｍＲＮＡの非翻訳部分にポリアデニル化断片として転写されるヌクレオチド断片を含む。適切な転写終結要素としては、ウシ成長ホルモンのポリアデニル化領域がある。ＷＯ９４／１１０２６及びそこに開示された発現ベクターを参照のこと。
ｇ）宿主細胞の選択とトランスフェクション

【0206】

本明細書に記載されているベクターにおけるＤＮＡのクローニング又は発現に好適な宿主細胞には、脊椎動物宿主細胞のような本明細書に記載されている高等真核細胞が含まれる。脊椎動物細胞の培養増殖（組織培養）は、日常の手順になっている。有用な哺乳動物宿主細胞株の例としては、ＳＶ４０形質転換サル腎臓ＣＶ１系（ＣＯＳ－７，ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）；サル腎臓組織に由来するＣＯＳ線維芽細胞様細胞株；ヒト胎児腎臓系（懸濁培養成長のための２９３又は２９３細胞サブクローン，Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．３６：５９（１９７７））；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ，ＡＴＣＣ ＣＣＬ １０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞／－ＤＨＦＲ（ＣＨＯ，Ｕｒｌａｕｂ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：４２１６（１９８０））；マウスのセルトリ細胞（ＴＭ４，Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３－２５１（１９８０））；サル腎臓細胞（ＣＶ１ ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）；アフリカミドリサル腎臓細胞（ＶＥＲＯ－７６，ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１５８７）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ，ＡＴＣＣ－ｃｃｌ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ，ＡＴＣＣ－ｃｃｌ３４）；バッファロ－ラット肝細胞（ＢＲＬ ３Ａ，ＡＴＣＣ ＣＲＬ １４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８，ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７５）；ヒト肝細胞（Ｈｅｐ Ｇ２，ＨＢ ８０６５）；マウス乳房腫瘍（ＭＭＴ ０６０５６２，ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１）；ＴＲ１細胞（Ｍａｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３：４４－６８（１９８２））；ＭＲＣ５細胞；ＦＳ４細胞及びヒト肝癌細胞株（Ｈｅｐ Ｇ２）が挙げられる。

【0207】

宿主細胞を上記の発現ベクター又はクローニングベクターでトランスフェクションしてタンバク質構造を産生し、そして適切に改良された従来の栄養培地で培養することより、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、又は所望の配列をコードする遺伝子を増幅する。
ｈ）宿主細胞の培養

【0208】

本発明のタンバク質構築物を生産するために使用される宿主細胞は、様々な培地で培養することができる。市販されている培地は、Ｈａｍ’ｓ Ｆ１０（Ｓｉｇｍａ）、最小必須培地（（ＭＥＭ），Ｓｉｇｍａ）、ＲＰＭＩ－１６４０（Ｓｉｇｍａ）及びダルベッコ修飾イーグル培地（（ＤＭＥＭ），Ｓｉｇｍａ）などを挙げることができ、宿主細胞の培養に好適である。また、宿主細胞の培地としては、Ｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．５８：４４（１９７９）、Ｂａｒｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０２：２５５（１９８０）、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．４，７６７，７０４；４，６５７，８６６；４，９２７，７６２；４，５６０，６５５又は５，１２２，４６９、ＷＯ ９０／０３４３０、ＷＯ ８７／００１９５又はＵ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｒｅ．３０，９８５に記載された任意の培地を使用することができる。これらの培地には、必要に応じて、ホルモン及び／又は他の成長因子（例えば、インスリンや、トランスフェリン、上皮成長因子）、塩（例えば、塩化ナトリウムや、カルシウム、マグネシウム、リン酸塩）、緩衝液（例えば、ＨＥＰＥ）、ヌクレオチド（例えば、アデノシンやチミジン）、抗生物質（例えば、ＧＥＮＴＡＭＹＣＩＮ^TM薬物）、微量元素（通常に、マイクロモル範囲の最終濃度で存在する無機化合物として定義されている）及びグルコース若しくは同等のエネルギー源を補充してもよいし、他の任意の必要な補助剤を当業者に知られている適切な濃度で添加してもよい。温度やｐＨなどの培養条件は、業者なら自明であるように、宿主細胞の発現に使用された条件とされる。
ｉ）タンパク質精製

【0209】

組換え技術を使用する場合、本発明のタンバク質構築物は、ペリプラズム中、細胞内で産生されてもよいし、培地に直接分泌されてもよい。タンバク質構築物が細胞内で産生された場合、単離のためには、まず、遠心又は限外ろ過によって粒子断片（即ち、宿主細胞又は溶解断片）を除去する。大腸菌のペリプラズムに分泌された抗体の単離手順について、Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：１６３－１６７（１９９２）に詳述されている。簡単に言えば、酢酸ナトリウム（ｐＨ３．５）、ＥＤＴＡ及びフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）の存在下で細胞体を約３０分間熔解し、そして細胞断片を遠心により除去する。タンバク質構築物が培地に分泌された場合は、通常に、まずにＡｍｉｃｏｎ又はＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｅｌｌｉｃｏｎ限外ろ過装置などの市販のタンバク質濃縮フィルターを使用してそのような発現系の上清を濃縮させる。上記の任意の操作には、タンバク質分解を阻害するためにＰＭＳＦなどのプロテアーゼ阻害剤を添加してもよく、また外来夾雑物の成長を防ぐために抗生物質を添加してもよい。

【0210】

細胞から調製されたタンバク質組成物を精製するには、例えばヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析及びアフィニティークロマトグラフィーを用いることができ、好ましくはアフィニティークロマトグラフィーの精製技術を使用する。Ｆｃ含有タンパク質構築物に存在する免疫グロブリンＦｃドメインの種及びサブタイプによっては、親和リガンドとしてプロテインＡを適用する場合がある。プロテインＡは、１、２又は４つの重鎖を含むヒト免疫グロブリンに基づくＦｃ含有タンバク質の精製に使用できる（Ｌｉｎｄｍａｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．６２：１－１３（１９８３））。タンバク質Ｇは、マウスサブタイプ及びヒト３型（Ｇｕｓｓ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．５：１５６７１５７５（１９８６））に推奨される。親和リガンドを連結するためのマトリックスとしては、通常にアガロースを使用するが、他のマトリックスを利用してもよい。アガロースに比べて、機械的に安定したマトリックス（例えば、制御細孔ガラスやポリ（スチレン－ジビニル）ベンゼン）を使用すれば、より速い流速及びより短い時間で処理できる。ＣＨ３ドメインを含むタンバク質構築物を精製する場合には、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ ＡＢＸＴＭｒｅｓｉｎを使用することができる（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ，Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ，Ｎ．Ｊ．）。また、回収されるタンバク質構築物によっては、イオン交換カラム分留や、エタノール沈殿、逆相液相クロマトグラフィーＨＰＬＣ、シリカゲルクロマトグラフィー、ヘパリンＳＥＰＨＡＲＯＳＥ^TMクロマトグラフィー、陰イオン又は陽イオン交換樹脂（例えば、ポリアスパラギン酸カラム）、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、硫酸アンモニウム沈殿などの他のタンバク質精製技術を使用することもある。

【0211】

いずれかの前精製工程の後、目的のタンバク質構築物と夾雑物とを含む混合物については、ｐＨ値約２．５～４．５の溶出緩衝液を使用するような低ｐＨ疎水性相互作用クロマトグラフィーに供してもよく、また低塩濃度（例えば、０～０．２５Ｍの塩）で実施することが好ましい。
Ｖ．医薬組成物

【0212】

さらに、本発明は、本明細書に記載されている任意の持効型ＮＧＦポリペプチド、ならびに任意選択に薬学的に許容されるキャリア及び／又は賦形剤を含む医薬組成物に関する。従って、いくつかの実施形態において、本発明は、Ｎ端からＣ端まで、配列番号１～４のうちのいずれか１つで示されるアミノ酸配列を含むＮＧＦ部分と、ＩｇＧ１ Ｆｃ又はＩｇＧ４ Ｆｃに由来するＦｃ部分とを含む持効型ＮＧＦポリペプチド、及び任意選択に薬学的に許容されるキャリアを含む医薬組成物に関する。医薬組成物は、凍結乾燥製剤又は水溶液の形態として、所望の純度を有する本明細書に記載されている持効型ＮＧＦポリペプチドを任意選択に薬学的に許容されるキャリア、賦形剤又は安定剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０））と混合することにより調製することができる。

【0213】

凍結乾燥した持効型ＮＧＦポリペプチドを希釈剤に溶解してタンバク質を均一に分散させることにより、組換え製剤を調製することができる。本発明に用いられる医薬的に許容される（ヒトに投与されると、安全で毒性のないものである）希釈剤の例としては、無菌水、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、ｐＨ緩衝溶液（例えば、リン酸塩緩衝生理食塩水）、無菌生理食塩水、リンゲル液又はデキストロース溶液、又は塩及び／又は緩衝剤の水溶液が挙げられるが、これらに限定されない。

【0214】

いくつかの実施形態において、医薬組成物は、本明細書に記載されている持効型ＮＧＦポリペプチドの均一な集団を含む。均一な集団とは、持効型ＮＧＦポリペプチドが互いに同一であること、例えば、同じ持効型ＮＧＦポリペプチド構造、同じＮＧＦ部分、同じリンカー（もしあれば）、及び同じＦｃ部分のことを意味する。いくつかの実施形態において、医薬組成物における持効型ＮＧＦポリペプチドは、少なくとも７０％（例えば、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％のいずれか）が均質である。

【0215】

いくつかの実施形態において、医薬組成物は、本質的に、本明細書に記載されている持効型ＮＧＦポリペプチド及び任意選択に薬学的に許容されるキャリアからなる（例えば、からなる）。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、プロＮＧＦ－Ｆｃ又はプレプロＮＧＦ－Ｆｃ融合タンパク質を含まない。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、最大５％（例えば、最大４％、３％、２％及び１％のうちのいずれか）のプロＮＧＦ－Ｆｃ又はプレプロＮＧＦ－Ｆｃ融合タンパク質を含む。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、宿主細胞（例えば、ＣＨＯ）タンバク質を含まない。

【0216】

医薬組成物は、好ましく安定であり、その中に含まれるタンバク質が、貯蔵中にその物理的安定性、化学的安定性及び完全性を本質的に保持している。タンバク質の安定性を測定するためには、Ｐｅｐｔｉｄｅ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，２４７－３０１，Ｖｉｎｃｅｎｔ Ｌｅｅ Ｅｄ．，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，Ｐｕｂｓ．（１９９１）；Ｊｏｎｅｓ，Ａ．Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖ．１０：２９－９０（１９９３）で概説されているように、当技術分野おいて様々な分析技術が利用可能である。安定性は、選択した温度及び選択した時間で測定すればいい。加速スクリーニングの場合、製剤を４０℃で２週間から１か月保存している間で安定性を測定すればいい。製剤が２～８℃で保存される場合は、製剤が一般に３０℃又は４０℃で少なくとも１か月安定であり、かつ／又は２～８℃で少なくとも２年間安定である必要がある。製剤が３０℃で保存される場合は、製剤が一般に３０℃で少なくとも２年間安定であり、かつ／又は４０℃で少なくとも６か月間安定である必要がある。タンバク質の安定性の指標としては、例えば、貯蔵中の凝集の程度が使用できる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されている持効型ＮＧＦポリペプチドの安定製剤は、１０％未満（好ましくは５％未満）の本明細書に記載されている持効型ＮＧＦポリペプチドの凝集体を含有すればよい。

【0217】

いくつかの実施形態において、医薬組成物は、例えば、２～２５℃（例えば、２～８℃）で、少なくとも２０日、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、６ヶ月、１年、２年、３年又はそれ以上など、少なくとも１５日の貯蔵寿命を有する。本明細書で使用されている「貯蔵期間」とは、医薬製剤が特定の保存条件下、例えば２～８℃で保存される場合に、その保存期間において医薬製剤中の治療用タンバク質（例えば、本明細書に記載されている持効型ＮＧＦポリペプチド）などの有効成分が最小の分解（例えば、５％を超えない分解、具体的に、４％、３％、又は２％を超えない分解）を有することを指す。タンバク質又は製剤の安定性を評価するための例示的な技術としては、凝集などを検出するためのサイズ除去クロマトグラフィー（ＳＥＣ）－ＨＰＬＣ、タンバク質断片などを検出するための逆相液相クロマトグラフィー（ＲＰ）－ＨＰＬＣ、タンバク質の電荷の変化を検出するためのイオン交換ＨＰＬＣ、タンバク質の立体配座の変化を検出するための質量分析、蛍光分光法、円二色性（ＣＤ）分光法、フーリエ変換赤外分光法（ＦＴ－ＩＲ）及びラマン分光法がある。これらの技術を単独又は組み合わせて使用すれば、医薬製剤中のタンバク質の分解を評価し、そしてその製剤の貯蔵寿命を決定することができる。いくつかの実施形態において、本発明の医薬製剤は、２～８°Ｃで保存される場合、少なくとも１５日以内（例えば、少なくとも２０日、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、６ヶ月、１年、２年、３年又はそれ以上）で５％を超えない（例えば、４％、３％、２％又は１％を超えない）分解（例えば、断片化、凝集又はアンフォールディング）を示す。

【0218】

許容されるベクター、賦形剤又は安定剤としては、使用される用量及び濃度で被検者に対して無毒であるものであり、例えば、緩衝液；アスコルビン酸、メチオニン、ビタミンＥ、メタ重亜硫酸ナトリウムなどの抗酸化剤；防腐剤、等張剤（例えば、塩化ナトリウム）、安定剤、金属錯体（例えば、亜鉛－タンバク質錯体）；ＥＤＴＡなどのキレート剤、及び／又は非イオン性界面活性剤が挙げられる。

【0219】

生理学的に許容されるベクターの例としては、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸などの緩衝液；アスコルビン酸及びメチオニンなどの抗酸化剤；防腐剤（例えば、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロライド；塩化ヘキサメチルアンモニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブタノール又はベンジルアルコール；メチル又はプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３－ペンタノール；及びｍ－クレゾール）；低分子量（１０個の残基未満）ポリペプチド；血清アルブミンや、ゼラチン、免疫グロブリンなどのタンバク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン又はリジンなどのアミノ酸；単糖類、二糖類、及びグルコースや、マンノース、デキストリンなどの他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；スクロースや、マンニトール、トレハロース、ソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例えば、亜鉛－タンバク質錯体）；及び／又はＴＷＥＥＮ^TMや、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ^TMなどの非イオン性界面活性剤が挙げられる。

【0220】

緩衝液は、特に安定性がｐＨ値に依存する場合に、治療効果を最適化する範囲内でｐＨ値を制御するために使用される。緩衝液は、約５０ｍＭ～約２５０ｍＭの濃度範囲で存在することが好ましい。本出願に好適な緩衝液としては、有機酸及び無機酸ならびにそれらの塩があり、例えば、クエン酸塩、リン酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、フマル酸塩、グルコン酸塩、シュウ酸塩、乳酸塩、または酢酸塩である。さらに、緩衝液は、ヒスチジン、またはトリメチルアミン塩であってもよく、例えば、トリス（Ｔｒｉｓ）である。

【0221】

防腐剤は、微生物の増殖を防ぐために添加され、通常に０．２％～１．０％（ｗ／ｖ）の範囲で存在する。例えば、防腐剤の添加により、複数回使用（複数回の投与量）のための製剤の生産を容易にすることができる。本出願に好適な防腐剤としては、例えば、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロライド；塩化ヘキサメチルアンモニウム；塩化ベンザルコニウム（例えば、塩化物、臭化物、ヨウ化物）、塩化ベンゼトニウム；チメロサール、フェノール、ブタノール又はベンジルアルコール；メチルやプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール、３－ペンタノール及びｍ－クレゾールが挙げられる。

【0222】

「安定剤」とも呼ばれる等張化剤は、組成物中液体の張性を調節・維持するために使用される。等張化剤は、大きな荷電生体分子（例えば、タンバク質）と一緒に使用される場合、アミノ酸側鎖の荷電基と相互作用することにより、分子間や分子内に相互作用が起こる可能性が少なくなるため、「安定剤」と呼ばれることがよくある。また、等張化剤は、他の成分の相対量を考慮して、０．１％～２５％（重量として）、好ましくは１％～５％の間の任意の量で存在し得る。等張化剤は、多価糖アルコールであることが好ましく、グリセリン、エリスリトール、アラビトール、キシリトール、ソルビトール及びマンニトールなどの三価以上の糖アルコールであることがより好ましい。

【0223】

他の賦形剤には、（１）充填剤、（２）溶解促進剤、（３）安定剤、及び（４）変性又は容器壁への付着を防止するための製剤のうちの一つ又は複数の製剤が含まれる。そのような賦形剤には、多価糖アルコール（上記の通り）；アラニン、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、リジン、オルニチン、ロイシン、２－フェニルアラニン、グルタミン酸、スレオニンなどのアミノ酸；スクロース、ラクトース、ラクチトール、トレハロース、スタキオース、マンノース、ソルボース、キシロース、リボース、リビトール、ミオイニシトース、ミオイニシトース、ガラクトース、ガラクチトール、グリセリン、シクロヘキサノール（例えば、イノシトール）、ポリエチレングリコールなどの有機糖又は糖アルコール；尿素、グルタチオン、リポ酸、チオグリコール酸ナトリウム、チオグリセロール、α－モノチオグリセロール及びチオ硫酸ナトリウムなどの硫黄含有還元剤；ヒト血清アルブミンや、ウシ血清アルブミン、ゼラチン、他の免疫グロブリンなどの低分子量タンバク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；単糖類（例えば、キシロース、マンノース、フルクトース、グルコース）；二糖類（例えば、ラクトース、マルトース、スクロース）；ラフィノースなどの三糖類；デキストリンやデキストランなどの多糖類が含まれる。

【0224】

非イオン性界面活性剤又は洗浄剤（「湿潤剤」とも呼ばれる）の存在は、タンバク質の可溶化に寄与し、そして攪拌による凝集からタンバク質を保護する。これにより、活性タンパク質を変性させることなく、製剤をせん断表面にさらすことが可能になる。非イオン性界面活性剤は０．０５ｍｇ／ｍｌ～１．０ｍｇ／ｍｌ、好ましく０．０７ｍｇ／ｍｌ～０．２ｍｇ／ｍｌの範囲で存在する。

【0225】

適切な非イオン性界面活性剤としては、ポリソルベート（２０、４０、６０、６５、８０など）、ポリオキサマー（１８４、１８８など）、ＰＬＵＲＯＮＩＣ^Rポリオール、ＴＲＩＴＯＮ^R、ポリオキシエチレンソルビタンモノエーテル（ＴＷＥＥＮ^R－２０、ＴＷＥＥＮ^R－８０など）、ラウロマクロゴール４００、ステアリン酸ポリオキシル４０、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油１０、５０及び６０、モノステアリン酸グリセリル、ショ糖脂肪酸エステル、メチルセルロース、ならびにカルボキシメチルセルロースが挙げられる。陰イオン洗浄剤としては、ドデシル硫酸ナトリウム、スルホコハク酸ジオクチルナトリウム、及びスルホン酸ジオクチルナトリウムなどを使用することができる。カチオン洗浄剤としては、塩化ベンザルコニウム又は塩化ベンゼトニウムが挙げられる。

【0226】

医薬組成物は、インビボ投与に用いられるために、無菌にしなければならない。無菌フィルターによるろ過によって医薬組成物を無菌にすることができる。前記医薬組成物は、通常に、無菌アクセスポートを有する容器、例えば皮下注射針が突き刺せる栓を有する静脈注射溶液バッグ又はバイアルに入れられる。

【0227】

持続放出製剤として調製されることができる。持続放出製剤の適切な例としては、そのマトリックスがフィルム又はマイクロカプセルといった成形品の形態でアンタゴニストを含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスが挙げられる。持続放出マトリックスの例としては、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２－ヒドロキシエチル－メタクリレート）又はポリ（ビニルアルコール））、ポリ乳酸（Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．３，７７３，９１９）、Ｌ－グルタミン酸とＬ－グルタミン酸エチルの共重合体、非分解性エチレン－酢酸ビニル、ＬＵＰＲＯＮ ＤＥＰＯＴ^TM（乳酸－グリコール酸共重合体と酢酸ロイプロリドからなる注射ミクロスフェア）といった分解性乳酸－グリコール酸共重合体、及びポリ－Ｄ－（－）－３－ヒドロキシ酪酸が挙げられる。

【0228】

治療される特定の適応症の必要に応じて、本明細書に記載されている医薬組成物は、複数の活性化合物、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を有する化合物を含んでいてもよい。そのような分子は、所望の目的を達成するために適切な量で組み合わされる。

【0229】

有効成分は、例えば、ゲル技術又は界面重合によって調製されたマイクロカプセル、コロイド薬物送達システム（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル）、又はマクロエマルションにおけるヒドロキシメチルセルロースマイクロカプセル若しくはゼラチンマイクロカプセル、及びポリメチルメタクリレートマイクロカプセルに封入されることもある。これらの技術については、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓに開示されている。

【0230】

いくつかの実施形態において、医薬組成物は使い捨て密封バイアルなどの使い捨てバイアルに装入されている。いくつかの実施形態において、医薬組成物は再利用可能なバイアルに装入されている。いくつかの実施形態において、医薬組成物は容器にバルクで装入されている。いくつかの実施形態において、医薬組成物は凍結保存される。
ＶＩ．疾患の治療方法

【0231】

本明細書に記載されている持効型ＮＧＦポリペプチド及びそれらの組成物（例えば、医薬組成物）は、診断、分子検出、及び治療などの様々な用途において有用である。いくつかの実施形態において、本発明は、本明細書に記載されている任意の持効型ＮＧＦポリペプチド又はその医薬組成物を個体に有効量で投与することを含む、個体（例えば、ヒト）の疾患（例えば、神経系疾患などのＮＧＦ関連疾患）を治療する方法に関する。本明細書に用いられる用語「ＮＧＦ関連疾患」とは、ＮＧＦ受容体シグナル伝達の障害によって引き起こされるか、あるいはそれに関連する任意の疾患又は障害（例えば、ＮＧＦの量が不十分であること、及び／又は結合親和力が低下することによるもの）、あるいは治療ためにＮＧＦの生物活性を必要とする疾患又は障害（例えば、治療時にニューロンの成長、維持、増殖及び／又は生存を必要とする傷害／損傷）を指す。いくつかの実施形態において、持効型ＮＧＦポリペプチド（又はその医薬組成物）は、静脈注射、筋肉注射又は皮下注射によって投与される。

【0232】

従って、いくつかの実施形態において、本発明は、Ｎ端からＣ端まで、配列番号１～４のうちのいずれか１つで示されるアミノ酸配列（例えば、配列番号１～３のいずれか）を含む（或いは、本質的に該アミノ酸配列からなるか、又は該アミノ酸配列からなる）ＮＧＦ部分と、ＩｇＧ１ Ｆｃ又はＩｇＧ４ Ｆｃに由来するＦｃ部分とを含む持効型ＮＧＦポリペプチド（又はその医薬組成物）を個体に有効量で投与することを含む、個体（例えば、ヒト）の疾患（例えば、神経系疾患（例えば、糖尿病性神経障害、アルツハイマー病、又は神経栄養性角膜炎）或いは非神経系疾患（例えば、早発卵巣不全又は精子形成障害）などのＮＧＦ関連疾患）を治療する方法に関する。いくつかの実施形態において、本発明は、配列番号６１～６７のうちのいずれか１つで示されるアミノ酸配列を含む（或いは、本質的に該アミノ酸配列からなるか、又は該アミノ酸配列からなる）持効型ＮＧＦポリペプチド（又はその医薬組成物）を個体に有効量で投与することを含む、個体（例えば、ヒト）の疾患（例えば、神経系疾患（例えば、糖尿病性神経障害、アルツハイマー病又は神経栄養性角膜炎）又は非神経系疾患（例えば、早発卵巣不全又は精子形成障害）などのＮＧＦ関連疾患）を治療する方法に関する。いくつかの実施形態において、持効型ＮＧＦポリペプチド（又はその医薬組成物）は、静脈注射、筋肉注射又は皮下注射によって投与される。

【0233】

本明細書に記載されている方法は、神経系疾患（ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ ｄｉｓｅａｓｅ）及び非神経系疾患（ｎｏｎ－ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ ｄｉｓｅａｓｅ）の治療に適用可能である。

【0234】

神経系疾患（ｎｅｒｖｏｕｓ ｓｙｓｔｅｍ ｄｉｓｅａｓｅ）とは、中枢神経系及び／又は末梢神経系のニューロン変性又は損傷に関連する疾患を指す。神経系疾患の具体例としては、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、脳卒中、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、顔面神経炎、頭蓋脳若しくは脊髓の外傷、急性脳血管疾患、脳萎縮、末梢神経障害、及び他のニューロンの壊死又は喪失を特徴とする疾患、ならびに中枢ニューロン、末梢神経ニューロン若しくは運動ニューロンの損傷（ただし、外傷、火傷、腎不全、損傷又は化学品／薬物によって引き起こされた神経損傷、例えば、化学品／薬物によって引き起こされた急性脳血管中枢神経損傷を除く）が挙げられるが、これらに限定されない。神経系疾患には、糖尿病、エイズ又は化学療法に関連する神経障害などの特定の疾患に関連する末梢神経障害がさらに含まれる。いくつかの実施形態において、神経系疾患は、多発性梗塞性認知症、血管性認知症、アルコール依存症による器質的脳疾患による認知障害、アルツハイマー病、パーキンソン病、てんかん、多発性硬化症、ハンチントン舞踏病、ダウン症、神経性難聴、メニエール病、脳卒中、ＡＬＳ、ベル麻痺、脊髄性筋萎縮症を伴う疾患、麻痺を伴う疾患、末梢神経障害、外傷による神経損傷、火傷による神経損傷、腎機能障害による神経損傷、損傷による神経損傷、化学療法の毒副作用による神経損傷、手術による神経損傷、虚血による神経損傷、感染による神経損傷、代謝性疾患による神経損傷及び栄養不足による神経損傷からなる群より選択される。いくつかの実施形態において、神経系疾患は、糖尿病末梢神経障害、毒素誘発性末梢神経障害、化学療法誘発性末梢神経障害、ＨＩＶ関連末梢神経障害、及び運動ニューロンに影響を及ぼす末梢神経障害からなる群より選択された末梢神経障害である。いくつかの実施形態において、神経系疾患は、新生児低酸素性虚血性脳病、脳性麻痺、重症疾患ミオパシー、神経性難聴、反回神経損傷、外傷性脳損傷、歯神経損傷、脳卒中、ダウン症、ＡＬＳ、多発性硬化症、脊髄性筋萎縮症、びまん性脳損傷、胸腺異形成、視神経挫傷、濾胞性異形成、脊髓損傷、緑内障、神経栄養性角膜炎、視神経損傷、視神経脊髄炎、網膜関連疾患、尿失禁、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、認知症、高血圧性脳出血神経機能障害、脳小血管疾患、急性虚血性脳卒中、角膜内皮ジストロフィー、糖尿病性足潰瘍、神経性皮膚潰瘍、褥瘡、神経栄養性角膜潰瘍、糖尿病性角膜潰瘍及び黄斑円孔からなる群より選択される。

【0235】

非神経系疾患には、脾臓萎縮、脾臓挫傷、卵巣予備能低下、早発卵巣不全（ＰＯＦ）、卵巣過剰刺激症候群、卵巣遺残症候群、卵胞異形成、精子形成障害（例えば、精子軽減症（ｏｌｉｇｏｚｏｏｓｐｅｒｍｉａ又はｏｌｉｇｏｓｐｅｒｍｉａ）、精子無力症、精子軽減無力症、無精子症、奇形精子症、無奇形精子症（ｏｌｉｇｏａｓｔｈｅｎｏｔｅｒａｔｏｚｏｏｓｐｅｒｍｉａ，ＯＡＴ症候群））、虚血性潰瘍、ストレス性潰瘍、リウマチ性潰瘍、肝線維化、角膜潰瘍、火傷、口腔潰瘍、及び静脈性下肢潰瘍が含まれる。

【0236】

いくつかの実施形態において、疾患（例えば、神経系疾患（例えば、糖尿病性神経障害、アルツハイマー病又は神経栄養性角膜炎）又は非神経系疾患（例えば、早発卵巣不全又は精子形成障害）などのＮＧＦ関連疾患）を治療する方法は、以下の一つ又は複数の生物活性を有する：（ｉ）ニューロンの生存の支持；（ｉｉ）神経突起成長の促進；（ｉｉｉ）神経化学的分化の増強；（ｉｖ）膵β細胞の増殖の促進；（ｖ）自然免疫及び／又は獲得免疫の誘導；（ｖｉ）損傷した神経細胞（例えば、角膜神経）の修復及び／又は損傷の防止（例えば、神経栄養性角膜炎中）；（ｖｉｉ）卵胞細胞の増殖及び／又はエストロゲン分泌の促進；（ｖｉｉｉ）創傷治癒の促進（例えば、糖尿病性神経障害中）；（ｉｘ）神経変性疾患（例えば、アルツハイマー病）を有する被検者における空間認識、記憶及び／又は学習能力の改善；（ｘ）神経変性疾患の治療及び／又は予防；（ｘｉ）精巣精細管萎縮、精細管精子形成障害及び／又は精巣上体管細胞断片の治療；（ｘｉｉ）精子数及び／又は運動性の軽減の救済、或いは精子数及び／又は運動性の増加（例えば、精子形成障害中）；（ｘｉｉｉ）卵胞数及び／又は機能の軽減の予防／逆転、或いは卵胞数及び／又は機能の増加（例えば、早発卵巣不全中）；及び／又は（ｘｉｖ）患者の生存期間の延長。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されている持効型ＮＧＦポリペプチド又は医薬組成物によって媒介されるニューロン生存を支持する方法によれば、少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％又はそれ以上のニューロン生存率を実現することができる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されている持効型ＮＧＦポリペプチド又は医薬組成物によって媒介される神経突起成長を促進する方法によれば、少なくとも２倍（例えば、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０又は５０倍以上を含む）の神経突起成長を促進することができる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されている持効型ＮＧＦポリペプチド又は医薬組成物によって媒介される神経化学的分化を増強する方法によれば、少なくとも２倍（例えば、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０又は５０倍以上）の神経化学的分化を増強することができる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されている持効型ＮＧＦポリペプチド又は医薬組成物によって媒介される膵β細胞増殖を促進する方法によれば、少なくとも２倍（例えば、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０又は５０倍以上を含む）の膵β細胞増殖を促進することができる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されている持効型ＮＧＦポリペプチド又は医薬組成物によって媒介される排卵を誘発する方法によれば、少なくとも２倍（例えば、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０又は５０倍以上）の排卵を増強することができる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されている持効型ＮＧＦポリペプチド又は医薬組成物によって媒介される自然免疫及び／又は獲得免疫を誘導する方法によれば、少なくとも１．１倍（例えば、少なくとも１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０又は５０倍以上）の自然免疫及び／又は獲得免疫を誘導することができる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されている持効型ＮＧＦポリペプチド又は医薬組成物によって媒介されるニューロン損傷を修復及び／又は予防する方法によれば、少なくとも５％（例えば、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％又はそれ以上）のニューロン損傷を修復及び／又は予防するか、又は少なくとも１．１倍（例えば、少なくとも１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０又は５０倍以上）の修復及び／又は予防効果を有することができる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されている持効型ＮＧＦポリペプチド又は医薬組成物によって媒介される卵巣顆粒膜細胞増殖及び／又はエストロゲン分泌を促進する方法によれば、少なくとも１．１倍（例えば、少なくとも１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０又は５０倍以上）の卵巣顆粒膜細胞増殖及び／又はエストロゲン分泌を促進することができる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されている持効型ＮＧＦポリペプチド又は医薬組成物によって媒介される創傷治癒を促進する方法によれば、少なくとも１．１倍（例えば、少なくとも１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０又は５０倍以上）の創傷治癒を促進することができる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されている持効型ＮＧＦポリペプチド又は医薬組成物によって媒介される神経変性疾患（例えば、アルツハイマー病）を有する患者の空間認識、記憶及び／又は学習能力を改善する方法によれば、少なくとも１．１倍（例えば、少なくとも１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０又は５０倍以上を含む）の空間認識、記憶及び／又は学習能力を改善することができる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されている持効型ＮＧＦポリペプチド又は医薬組成物によって媒介される神経変性疾患を治療及び／又は予防する方法によれば、少なくとも５％（例えば、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％又はそれ以上）の神経変性疾患を治療及び／又は予防することができる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されている持効型ＮＧＦポリペプチド又は医薬組成物によって媒介される精巣精細管萎縮、精細管精子形成障害及び／又は精巣上体管細胞断片を治療する方法によれば、少なくとも５％（例えば、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％又はそれ以上）の精巣精細管萎縮、精細管精子形成障害及び／又は精巣上体管細胞断片を治療することができる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されている持効型ＮＧＦポリペプチド又は医薬組成物によって媒介される精子数及び／又は運動性の軽減を救済する方法によれば、少なくとも５％（例えば、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％又はそれ以上）の精子数及び／又は運動性の軽減を救済することができる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されている持効型ＮＧＦポリペプチド又は医薬組成物によって媒介される精子数及び／又は運動性を増加させる方法によれば、少なくとも５％（例えば、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１５０％、２００％又はそれ以上）の精子数及び／又は運動性を増加させることができる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されている持効型ＮＧＦポリペプチド又は医薬組成物によって媒介される卵胞数及び／又は機能の低下を救済する方法によれば、少なくとも５％（例えば、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％又はそれ以上）の卵胞数及び／又は機能の低下を救済することができる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されている持効型ＮＧＦポリペプチド又は医薬組成物によって媒介される卵胞数及び／又は機能を増加させる方法によれば、少なくとも５％（例えば、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１５０％、２００％又はそれ以上）の卵胞数及び／又は機能を増加させることができる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されている持効型ＮＧＦポリペプチド又は医薬組成物によって媒介される個体（例えば、ヒト）の生存期間を延長する方法によれば、個体の生存期間を少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１８、２４か月又は２、３、４、５、６、７、８、９、１０年又はそれ以上の時間を延長することができる。

【0237】

本明細書に記載されている持効型ＮＧＦポリペプチド又はその医薬組成物の投与は、注射又は注入を含む任意の便利な方法で行うことができる。投与経路は、単回又は複数回のボーラス注射又は適切な方法での長期注入など、既知・認識されている方法に従う。持効型ＮＧＦポリペプチド又はその医薬組成物は、経口、皮下、静脈、脳内、鼻腔内、経皮、腹腔内、筋肉内、肺内、膣内、直腸内、眼内、局所、経動脈、皮内、結節内、腔内、髓内、髄腔内、脳室内、脳内、脊髓内、髄腔内、病巣内又は眼内より投与することができる。いくつかの実施形態において、持効型ＮＧＦポリペプチド又はその医薬組成物は全身投与される。いくつかの実施形態において、持効型ＮＧＦポリペプチド又はその医薬組成物は、注入（例えば、静脈注入）によって個体に投与される。免疫治療に用いられる注入技術は、当技術分野で知られている（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｗ Ｅｎｇ．Ｊ．ｏｆＭｅｄ．３１９：１６７６（１９８８）を参照）ものである。いくつかの実施形態において、持効型ＮＧＦポリペプチド又はその医薬組成物は、皮内又は皮下（即ち、皮膚下）注射によって個体に投与される。皮下注射の場合、注射器を使用して持効型ＮＧＦポリペプチド又はその医薬組成物を注射することができる。また、持効型ＮＧＦポリペプチド又はその医薬組成物を投与するための他の装置としては、例えば、注射装置；注射ペン；自動注射器装置、無針装置；及び皮下パッチ送達システムがある。いくつかの実施形態において、持効型ＮＧＦポリペプチド又はその医薬組成物は、静脈注射によって投与される。いくつかの実施形態において、持効型ＮＧＦポリペプチド又はその医薬組成物は、脳又は脊椎に直接注射される。いくつかの実施形態において、持効型ＮＧＦポリペプチド又はその医薬組成物は、損傷又は傷害部位に局所投与され、例えば、創傷組織に直接に投与される。いくつかの実施形態において、持効型ＮＧＦポリペプチド又はその医薬組成物は、持続放出又は徐放技術によって投与される。

【0238】

本発明の医薬組成物の用量及び所望の薬物濃度は、特定の用途に応じて変化してもよい。投与用量又は投与経路は、当業者がその能力範囲で適切に決定し得るものである。人間の治療に有効な投与量は、動物実験から提供された信頼性のある情報により決定することができる。有効量の種間類推は、Ｍｏｒｄｅｎｔｉ，Ｊ．Ｃｈａｐｐｅｌｌ，Ｗ．"Ｔｈｅ Ｕｓｅ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｓｐｅｃｉｅｓ Ｓｃａｌｉｎｇ ｉｎ Ｔｏｘｉｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ，"Ｉｎ Ｔｏｘｉｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｎｅｗ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｙａｃｏｂｉ ｅｔ ａｌ．，Ｅｄｓ，Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １９８９，ｐｐ．４２－４６の原則に従って行うことができる。

【0239】

持効型ＮＧＦポリペプチド又はその医薬組成物のインビボ投与が使用される場合、通常の用量は、投与経路及び哺乳動物の種類に応じて、哺乳動物の体重１ｋｇ当たり０．０１μｇから１０ｍｇまで変化すればいい。本出願の範囲内では、異なる製剤が異なる治療及び異なる疾患に有効であり、また特定の器官又は組織を治療するために用いられる投与経路が別の器官又は組織への投与経路とは異なり得ることを意図している。さらに、用量は、１回又は複数回の個別投与によって、或いは持続注入によって投与されることがある。数日以上の反復投与の場合、治療は、病状に応じて、疾患症状が所望のように抑制される程度までに持続すればよい。ただし、他の用量スキームも有用であり得る。この治療の進行状況は、従来の技術と分析によって簡単に監視できる。いくつかの実施形態において、持効型ＮＧＦポリペプチド又はその医薬組成物は、０．０１μｇ／ｋｇ～１０ｍｇ／ｋｇの用量で投与され、例えば、０．０１μｇ／ｋｇ～１μｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ～１００μｇ／ｋｇ、１００μｇ／ｋｇ～５００μｇ／ｋｇ、５００μｇ／ｋｇ～１ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ～１０ｍｇ／ｋｇ、又は０．０１μｇ／ｋｇ～１ｍｇ／ｋｇの範囲のいずれかの用量で投与される。いくつかの実施形態において、持効型ＮＧＦポリペプチド又はその医薬組成物は、個体（例えば、ヒト）当たり０．０１μｇ～１０００μｇの用量で投与され、例えば、個体当たり０．０１μｇ～１μｇ、１μｇ～５００μｇ、５００μｇ～１０００μｇ、１μｇ～３００μｇ、又は１００μｇ～１０００μｇの範囲のいずれかの用量で投与される。

【0240】

いくつかの実施形態において、持効型ＮＧＦポリペプチド又はその医薬組成物は、１回投与される（例えば、ボーラス注射）。いくつかの実施形態において、持効型ＮＧＦポリペプチド又はその医薬組成物は、複数回（例えば、２、３、４、５、６又はそれ以上）投与される。複数回投与される場合、それらは同じ又は異なる経路で行っても良いし、同じ部位又は他の部位で行ってもよい。持効型ＮＧＦポリペプチド又はその医薬組成物は、１日に１回の頻度から１年に１回の頻度で投与することができる。投与間隔は、２４時間から１年の範囲内の任意の時間としてもよく、不規則になることもある（例えば、腫瘍の進行に伴う）。いくつかの実施形態において、投与計画に中断はない。特定の患者に対する最適な用量及び治療計画は、医学分野の当業者が患者の疾患の徴候を監視し、それに応じて調整すればよい。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されている持効型ＮＧＦポリペプチド又はその医薬組成物は、１日１回（毎日投与）、２日に１回、３日に１回、４日に１回、５日に１回、６日に１回、１週間に１回、１０日に１回、２週間に１回、３週間に１回、４週間に１回、１か月に１回、２か月に１回、３か月に１回、４か月に１回、５か月に１回、６か月に１回、７か月に１回、８か月に１回、９か月に１回又は１年に１回投与される。いくつかの実施形態において、持効型ＮＧＦポリペプチド又はその医薬組成物は、３日に１回投与される。いくつかの実施形態において、持効型ＮＧＦポリペプチド又はその医薬組成物は、1週間に１回投与される。いくつかの実施形態において、持効型ＮＧＦポリペプチド又はその医薬組成物は、１ヶ月間に１回投与される。いくつかの実施形態において、持効型ＮＧＦポリペプチド又はその医薬組成物は、１日１回点滴投与される。いくつかの実施形態において、持効型ＮＧＦポリペプチド又はその医薬組成物は、１日３回点滴投与される。いくつかの実施形態において、持効型ＮＧＦポリペプチド又はその医薬組成物は、１日５回点滴投与される。

【0241】

いくつかの実施形態において、持効型ＮＧＦポリペプチド又はその医薬組成物は、２、３、４、５又はそれ以上の用量のいずれかなどの分割用量で投与される。いくつかの実施形態において、分割用量は、１週間、１か月、２か月、３か月又はそれ以上にわたって投与される。いくつかの実施形態において、用量は均等に分割される。いくつかの実施形態において、分割用量は、総用量に対する２０％、３０％及び５０％である。いくつかの実施形態において、連続する分割用量間の間隔は、１日、２日、３日、１週間、２週間、３週間、１か月、３か月、６か月又はそれ以上である。数日以上に反復投与される場合、治療は、病状に応じて、疾患症状が所望のように抑制される程度まで持続される。ただし、他の用量スキームも有用であり得る。このような治療の進行状況は、従来の技術と分析によって容易に監視される。
ＶＩＩ．製品及びキット

【0242】

また、本発明は、本明細書に記載されている任意の持効型ＮＧＦポリペプチドを含むキット、単位用量、及び製品に関する。いくつかの実施形態において、本発明は、本明細書に記載されている任意の１つの医薬組成物を含むキットに関し、また該キットには好ましく本明細書に記載されている疾患（例えば、神経系疾患）の治療における使用などに関するその使用説明書が提供される。

【0243】

本発明に係るキットは、例えば疾患の治療に用いられる、本明細書に記載されている持効型ＮＧＦポリペプチドを含む１つ又は複数の容器を含む。例えば、疾患（例えば、神経系疾患）を治療するために持効型ＮＧＦポリペプチドを投与することを説明する説明書が含まれる。キットは、個体が疾患を患うかどうか、及び疾患の段階を特定することに基づいて、治療に適する個体（例えば、ヒト）を選択するための説明をさらに含んでもよい。持効型ＮＧＦポリペプチドの使用に関する説明書には、一般に、予測される治療の用量、投与計画、及び投与経路に関する情報が含まれる。容器は、単位用量、バルクパッケージ（例えば、複数用量パッケージ）又はサブユニット用量でよい。本発明に係るキットに提供される説明書としては、典型的に、ラベル又は添付文書（例えば、キットに含まれる紙）に書かれた説明書であるが、機械可読の説明（例えば、磁気ディスク又は光ディスクに保存された説明書）であってもよい。本出願のキットは、適切な包装に入っている。適切な包装としては、バイアル、ボトル、ジャー、柔軟な包装（例えば、密封されたマイラー又はビニール袋）などが挙げられるが、これらに限定されない。なお、包装としては、特定のデバイスと組み合わせて使用される包装であってもよく、例えば、ミニポンプなどの注入装置である。キットは、無菌アクセスポートを有することがある（例えば、容器は、静脈注射溶液バッグであってもよく、皮下注射針が突き刺せる栓を有するバイアルであってもよい）。ただし、この組成物中の少なくとも１つの活性剤は、本明細書に記載されている持効型ＮＧＦポリペプチドである。容器は、第２の医薬活性剤をさらに含んでも良い。キットは、必要に応じて、緩衝液や解釈情報などの追加の成分を提供する場合がある。一般に、キットは、容器と、容器上又は容器に付随するラベル又は添付文書とを含む。

【0244】

従って、本発明は、またバイアル（例えば、密封されたバイアル）、ボルト、ジャー、柔軟な包装などを含む製品にも関する。この製品は、容器と、容器上又は容器に付随するラベル又は添付文書とを含む。適切な容器には、例えば、ボトル、バイアル、注射器などが含まれる。容器は、ガラスやプラスチックなどの様々な素材で作成したものであればよい。一般に、容器は、本明細書に記載されている疾患又は障害（例えば、神経系疾患）を治療するのに有効な組成物を収容し、しかも無菌アクセスポートを有してもよい（例えば、容器は、静脈注射溶液バッグであってもよく、皮下注射針が突き刺せる栓を有するバイアルであってもよい）。ラベル又は添付文書には、この組成物が個体の特定の病気を治療するために使用されることが示されている。ラベル又は添付文書には、個体に組成物を投与するための説明書がさらに含まれる。ラベルには、再構成及び／又は使用の指示が示されていることがある。医薬組成物を収容する容器は、製剤再構成のために繰り返して使用（例えば、２～６回の投与）できるような複数回使用可能なバイアルであってもよい。添付文書とは、治療製品の市販パッケージに通常含まれる説明書を指し、そこにそのような治療用製品の使用に関する適応症、使用法、用量、投与、禁忌症、及び／又は警告に関する情報が含まれる。さらに、製品は、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）や、リン酸塩緩衝生理食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液などの薬学的に許容される緩衝液を具備する第２の容器をさらに含んでもよいし、商業的及び使用者の観点から、他の緩衝液や、希釈剤、フィルター、針、注射器などの他の必要な材料をさらに含んでもよい。

【0245】

キット又は製品は、複数の単位用量の医薬組成物及び使用説明書を含み、病院薬局及び調剤薬局などの薬局で保管及び使用するのに十分な量で包装される。

【実施例】

【0246】

以下の実施例は、本発明の例示として用いられるものであることを意図し、従って、本発明を限定するものと解釈されるべきではない。なお、以下の実施例及び詳細な説明は、限定ではなく例示として提供されている。
実施例１：ＮＧＦポリペプチドの調製
プラスミドの構築

【0247】

プレプロＮＧＦ－Ｆｃ融合タンパク質２－１１８－Ｌ３Ｆｃ１０－Ｍ１－５（配列番号３４）を例として、プラスミドの構築を説明する。他のプレプロＮＧＦ－Ｆｃ融合タンパク質及び対照プレプロ－ｍＮＧＦ１１８（配列番号４７）に対して、同様な方法を使用してプラスミドを構築した。ただし、対照プレプロ－ｍＮＧＦ１１８は、Ｆ１２Ｅ変異を有し、β－ＮＧＦ部分のＣ端で２つのアミノ酸（Ａｒｇ－Ａｌａ）が切断されたプレプロＮＧＦであった。ＦＤ－Ｇ４Ｆｃ（ＣＮ１０５２７３０８７Ａを参照）及びＷＭ－Ｇ２４Ｆｃ（ＣＮ１０６００８７２２Ａを参照）構築物を対照とした。ＮＧＦ－１－１５Ｍ７（ｒｈＮＧＦ－Ｆｃ１）、ＮＧＦ－Ｌ３Ｆｃ１０Ｍ７－５（ｒｈＮＧＦ－Ｌｉ－Ｆｃ１）、２－１－１５Ｍ７（ｒｈＮＧＦ－（Ｆ１２Ｅ）－Ｆｃ１）及びＮＧＦ－４－１２ＰＡＡ（ｒｈＮＧＦ－Ｆｃ４）を、ＷＯ２０１７１５７３２５に記載される通りに構築した。異なるＮＧＦポリペプチドの構造を表２に示し、Ｆｃ部分の配列アラインメントを図１Ａ～１Ｆに示す。

【0248】

【表2】

【0249】

様々なプレプロＮＧＦ－Ｆｃ融合タンパク質（例えば、「２－１１８－Ｌ３Ｆｃ１０－Ｍ１－５」）又はプレプロ－ｍＮＧＦ１１８対照をコードする核酸を合成し、ｐＳＣ－Ｔベクターにクローニングした（例えば、「ｐＳＣ－２－１１８－Ｌ３Ｆｃ１０－Ｍ１－５」）（Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｊｉｅｒｕｉ Ｂｉｏ－Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｂｒａｎｃｈによって合成及びクローニングされた）。様々なプレプロＮＧＦ－Ｆｃ融合タンパク質又はプレプロ－ｍＮＧＦ１１８対照をコードする核酸を、それぞれＨｉｎｄＩＩＩ及びＸｈｏＩ制限部位を持つＰＣＲプライマーを使用して増幅し、次にＰＣＲ生成物を内在性真核細胞発現ベクターｐＴＴ５にサブクローンした（例えば、「ｐＴＴ５－２－１１８－Ｌ３Ｆｃ１０－Ｍ１－５」）。
組換えタンパク質の発現

【0250】

２９３Ｆ細胞を、様々なプレプロＮＧＦ－Ｆｃ融合タンパク質（例えば、ｐＴＴ５－２－１１８－Ｌ３Ｆｃ１０－Ｍ１－５）又はプレプロ－ｍＮＧＦ１１８対照をコードする核酸を持っている真核細胞発現ベクターｐＴＴ５でトランスフェクトし、３７℃、８％ＣＯ₂、１２０ｒｐｍで５日間培養した。発現タンパク質を含む上清を回収した。
組換えタンパク質の精製
発現したＮＧＦ－Ｆｃ融合タンパク質は、まずにプロテインＡアフィニティー精製によって前精製し、次に異なる疎水性に基づいて、ＨｉＴｒａｐ^TM Ｂｕｔｙｌ ＨＰカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して宿主タンパク質からさらに単離した。次に、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ゲルろ過カラム（ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して残留凝集物を除去し、精製された成熟ＮＧＦ－Ｆｃ融合タンパク質を得た。成熟したｍＮＧＦ１１８対照は、ＨｉＴｒａｐ^TM Ｂｕｔｙｌ ＨＰカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で精製した後に、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ゲルろ過カラム（ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）で精製した。これらのタンパク質は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって同定したところ、純度が９０％以上であった。
実施例２：成熟ＮＧＦ－Ｆｃ融合タンパク質の熱安定性の研究

【0251】

蛍光タンパク質分析装置ＵＮｃｌｅ（Ｕｎｃｈｅｅｄ Ｌａｂｓ）により２６６ｎｍ／４７３ｎｍで加熱中のサンプルの蛍光吸光度及び光散乱の変化を測定し、サンプルの融解温度（Ｔｍ）及び凝集開始温度（Ｔａｇｇ）をそれぞれ計算した。ただし、初期温度を２０℃、最終温度を９５℃に設定し、加熱速度を０．３℃／ｍｉｎとし、各サンプルに対して３回繰り返して測定した。結果を表３にまとめる。

【0252】

【表3】

【0253】

融解温度（Ｔｍ）
表３に示すように、ＩｇＧ４由来のＦｃ断片を含むすべての成熟ＮＧＦ－Ｆｃ融合タンパク質の中で（ＦＤ－Ｇ４Ｆｃ、ＷＭ－Ｇ２４Ｆｃ、ＮＧＦ－４－１２ＰＡＡ、及び２－１１８－Ｌ３Ｇ４－ＢＭ）、ひいては検出したすべての成熟ＮＧＦ－Ｆｃ融合タンパク質の中でも、２－１１８－Ｌ３Ｇ４－ＢＭは、融解温度（Ｔｍ）最高であり、即ち熱安定性が最適であった。
ＩｇＧ１由来のＦｃ断片を含むすべての成熟ＮＧＦ－Ｆｃ融合タンパク質の中で、２－１１８－Ｌ３Ｆｃ１０－Ｍ１－５は、類似のＴｍを示した他のタンパク質より、Ｔｍ（即ち、より悪い熱安定性）が低かった。
凝集開始温度（Ｔａｇｇ）

【0254】

表３に示すように、ＩｇＧ１由来のＦｃ断片を含む成熟ＮＧＦ－Ｆｃ融合タンパク質（２－１１８－Ｌ３Ｆｃ１０－Ｍ１－５を除く）は、ＩｇＧ４由来のＦｃ断片を含む成熟ＮＧＦ－Ｆｃ融合タンパク質と比較して、Ｔａｇｇが高かった。これは、ＩｇＧ１由来のＦｃ断片を含む成熟ＮＧＦ－Ｆｃ融合タンパク質が加熱中に凝集し難いことを示した。

【0255】

２－１１８－Ｌ３Ｇ４－ＢＭはＩｇＧ４由来のＦｃ断片を含むすべての成熟ＮＧＦ－Ｆｃ融合タンパク質の中で一番Ｔａｇｇが高かったことから、２－１１８－Ｌ３Ｇ４－ＢＭは他のＩｇＧ４由来のＦｃ融合構築物と比較して加熱中の抗凝集性能が優れていることが分かった。

【0256】

２－１１８－Ｌ３Ｆｃ１０－Ｍ１－５はＩｇＧ１由来のＦｃ断片を含むすべての成熟ＮＧＦ－Ｆｃ融合タンパク質の中で一番Ｔａｇｇが低かった（一番加熱中の抗凝集性能が悪かった）ことに対して、ＮＧＦ－１－１５Ｍ７及び２－１－１５Ｍ７は比較的低いＴａｇｇを示し、残りのＩｇＧ１由来のＦｃ融合構築物は、類似した高いＴａｇｇを示した。
実施例３：成熟ＮＧＦ－Ｆｃ融合タンパク質の加速安定性試験

【0257】

成熟ＮＧＦ－Ｆｃ融合タンパク質をＰＢＳで最終濃度２ｍｇ／ｍｌまで希釈し、４０℃でインキュベートした。インキュベーション期間に０日目（図では「０時間」）、３日目、７日目、９日目及び１４日目にサンプルを採取し、－８０℃で保存した。サイズ除去クロマトグラフィー（ＳＥＣ）およびドデシル硫酸ナトリウムキャピラリー電気泳動（ＣＥ－ＳＤＳ）によって、サンプルの分解と凝集を検出した。
サイズ除去クロマトグラフィー（ＳＥＣ）検出法

【0258】

ＳＥＣは、分子がカラムに充填された樹脂を通過するときに、分子のサイズが異なることにより分子を分離するものである。タンバク質サンプルを４℃で、１００００ｇで５分間遠心し、そして沈殿をＰＢＳで再懸濁した。、Ｗａｔｅｒｓ^R ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ^RＨ－Ｃｌａｓｓ Ｂｉｏ Ｔｕｎａｂｌｅ ＵＶ（ＴＵＶ）検出器を使用して、注入量を２０μｌ、波長を２８０ｎｍ、流速を０．２５ｍｌ／ｍｉｎ、総実行時間を１７分間とした条件下で、３８４ウェルプレートに移した８０～１００μｌのサンプルを検出した。なお、移動相緩衝液は、１００ｍＭのＰＢ（８０ｍＭのＮａ₂ＨＰＯ₄、２０ｍＭのＮａＨ₂ＰＯ₄）、３００ｍＭのＮａＣｌ、１０％アセトニトリルを含み、ｐＨ７．２であった。

【0259】

表３及び図３Ａ～３Ｄに示すように、ＩｇＧ４由来のＦｃ断片を含むすべての成熟ＮＧＦ－Ｆｃ融合タンパク質の中で、２－１１８－Ｌ３Ｇ４－ＢＭ及びＦＤ－Ｇ４Ｆｃは、凝集体の増加及び断片生成の面でＷＭ－Ｇ２４Ｆｃ及びＮＧＦ－４－１２ＰＡＡより安定性が優れた。加速ストレス中に、２－１１８－Ｌ３Ｇ４－ＢＭ及びＦＤ－Ｇ４Ｆｃは断片のパーセンテージが２．１％未満であったが、ＮＧＦ－４－１２ＰＡＡは、断片のパーセンテージが４９．５９％に達し（図３Ａ）、明らかに断片化された。ＷＭ－Ｇ２４Ｆｃは、凝集体が大幅に増加し（凝集体のパーセンテージが４９．１５％に達した）、しかも加速ストレス中に明らかに断片化も示した（図３Ｃ）。２－１１８－Ｌ３Ｇ４－ＢＭ及びＦＤ－Ｇ４Ｆｃは単量体のパーセンテージが８５％以上であったが、ＷＭ－Ｇ２４Ｆｃ及びＮＧＦ－４－１２ＰＡＡは単量体のパーセンテージが時間とともに大幅に低下した。ＦＤ－Ｇ４Ｆｃは２－１１８－Ｌ３Ｇ４－ＢＭより加速ストレス中に凝集体の形成が多くてもっと断片化されたことから、２－１１８－Ｌ３Ｇ４－ＢＭはＦＤ－Ｇ４Ｆｃより抗断片化及び抗凝集活性が優れたことが分かった。

【0260】

表４及び図３Ｅ～３Ｍに示すように、ＩｇＧ１由来のＦｃ断片を含むすべての成熟ＮＧＦ－Ｆｃ融合タンパク質の中で、２－１１８－Ｌ３Ｆｃ１０－Ｍ３－５、２－１１８－Ｌ３Ｆｃ１０－Ｍ５－５、２－１１８－Ｌ３Ｆｃ１０－Ｍ７－５及びＮＧＦ－１１８－Ｌ３Ｆｃ１０－Ｍ３－５は、加速ストレス中に他のＩｇＧ１由来のＦｃ融合タンパク質よりも安定性が優れていて、断片の形成が検出（０％）できないほど少なく、凝集体の増加が少なかった。２－１１８－Ｌ３Ｆｃ１０－Ｍ１－５は、ＮＧＦ－１－１５Ｍ７や、ＮＧＦ－Ｌ３Ｆｃ１０Ｍ７－５、２－１－１５Ｍ７などのＩｇＧ１由来のＦｃ融合タンパク質より安定性が優れたが、或いはそれらに匹敵した。

【0261】

【表4】

【0262】

ドデシル硫酸ナトリウムキャピラリー電気泳動（ＣＥ－ＳＤＳ）検出法
キャピラリー電気泳動では、分子の電荷とサイズによって変化する電気泳動移動度に従って、サンプルがキャピラリー内で分離される。まず、４０μｌの１×サンプル緩衝液と１０μｌのタンバク質サンプルを遠心管で混合し、タンバク質の最終濃度が０．４μｇ／μｌの混合液５０μｌを得た。混合液に、再構成された２５×内部標準（Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｓｔａｎｄａｒｄ）１μｌを添加した後、２５０ｍＭヨードアセトアミド２．５μｌを添加した。混合液全体をボルテックスして７０℃で１０分間培養し、冷却後、よく混合して遠心した。処理されたサンプル上清５０μｌを９６ウェルプレートに移した。９６ウェルプレートを１０００ｇで１０分間遠心した後、標準的な実験方法に従ってＭａｕｒｉｃｅシステム（ＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅ）に置いてＣＥ－ＳＤＳ検出を行った。

【0263】

表５及び図４Ａ～４Ｄに示すように、ＩｇＧ４由来のＦｃ断片を含むすべての成熟ＮＧＦ－Ｆｃ融合タンパク質の中で、加速ストレス中に、ＮＧＦ－４－１２ＰＡＡ及びＷＭ－Ｇ２４Ｆｃは非常に明らかに断片化されたが、２－１１８－Ｌ３Ｇ４－ＢＭは断片化の程度が最も低かった。これは、ＳＥＣの結果と一致している。ＦＤ－Ｇ４Ｆｃ（図４Ｂ）はメインピークの右側に凝集体ピークが現れたが、２－１１８－Ｌ３Ｇ４－ＢＭ（図４Ｄ）では凝集体ピークが見られなかった。このように、ＳＥＣの結果と一致しているように、２－１１８－Ｌ３Ｇ４－ＢＭは他のＩｇＧ４由来のＦｃ融合タンパク質より加速ストレス中の安定性が優れた。

【0264】

表５及び図４Ｅ～４Ｍに示すように、ＩｇＧ１由来のＦｃ断片を含むすべての成熟ＮＧＦ－Ｆｃ融合タンパク質の中で、２－１１８－Ｌ３Ｆｃ１０Ｍ７－５、ＮＧＦ－１１８－Ｌ３Ｆｃ１０－Ｍ３－５及び２－１１８－Ｌ３Ｆｃ１０－Ｍ３－５は、加速ストレス中の安定性が最も良く、断片ピークが見られなく（図４Ｉ、４Ｊ及び４Ｍを参照）、１４日目のサンプルの断片の増加が０％であった。２－１１８－Ｌ３Ｆｃ１０－Ｍ５－５は、断片の増加が少なく（１４日目に断片が５．８％増加した）、安定性が良好であった。それに対して、ＩｇＧ１由来のＦｃ断片を含む他のＮＧＦ－Ｆｃ融合タンパク質（例えば、ＮＧＦ－Ｌ３Ｆｃ１０Ｍ７－５）は、断片を形成しやすかった。

【0265】

【表5】

【0266】

ＳＥＣ及びＣＥ－ＳＤＳの結果をまとめると、１）ＩｇＧ４由来のＦｃ断片を含むすべての成熟ＮＧＦ－Ｆｃ融合タンパク質の中で、２－１１８－Ｌ３Ｇ４－ＢＭはＦＤ－Ｇ４Ｆｃより加速安定性が優れていて、またＷＭ－Ｇ２４Ｆｃ及びＮＧＦ－４－１２ＰＡＡよりも加速安定性が明らかに優れたこと；２）ＩｇＧ１由来のＦｃ断片を含むすべての成熟ＮＧＦ－Ｆｃ融合タンパク質の中で、２－１１８－Ｌ３Ｆｃ１０Ｍ５－５は良好な加速安定性を有するが、それにもまして、２－１１８－Ｌ３Ｆｃ１０－Ｍ３－５、ＮＧＦ－１１８－Ｌ３Ｆｃ１０－Ｍ３－５及び２－１１８－Ｌ３Ｆｃ１０Ｍ７－５は、他のすべての構築物と比べて加速安定性が一番優れたこと；３）ＩｇＧ１由来のＦｃ断片を含む成熟ＮＧＦ－Ｆｃ融合タンパク質は、ＩｇＧ４由来のＦｃ断片を含む成熟ＮＧＦ－Ｆｃ融合タンパク質と比較して、加速ストレス条件下での抗凝集特性が優れていること、が分かった。
実施例４：ＮＧＦ－Ｆｃ融合タンパク質の生物活性を評価するためのＴＦ－１細胞増殖試験

【0267】

ＴＦ－１細胞増殖試験を使用して、様々なＮＧＦ－Ｆｃ融合タンパク質の生物活性を検出した。
ＴＦ－１細胞は、因子依存性ヒト赤血球白血病細胞株である。ＴＦ－１細胞を基本培地（ＲＰＭＩ １６４０培地＋１０％ＦＢＳ）に再懸濁し、５．０×１０⁴個の細胞／ｍｌの懸濁液を得た。ＳｕＴａｉＳｈｅｎｇ^RマウスＮＧＦ（標準対照）標準溶液を調製し、様々なＮＧＦ－Ｆｃ融合タンパク質のテスト溶液及びｍＮＧＦ１１８（変異体β－ＮＧＦ １１８ａａ）とｒｈＮＧＦ（組換えヒト野生型β－ＮＧＦ １２０個のアミノ酸、配列番号４、実施例１に記載される調製及び精製のように）対照溶液を調製し、最終的なタンパク質が事前に標識された９６ウェルプレートで２００Ｕ／ｍｌ×１００μｌ／ウェルになるようにした。次に、標準対照（ＳｕＴａｉＳｈｅｎｇ^RマウスＮＧＦ）、被験ＮＧＦ－Ｆｃ融合タンパク質、又は対照溶液を含む９６ウェルプレートの各ウェルに、５．０×１０⁴個の細胞／ｍｌのＴＦ－１細胞懸濁液１００μｌを加え、３７℃、５％ＣＯ₂の加湿インキュベーターで７２時間培養した。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６^R ＡＱｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｃａｔ＃Ｇ３５８１）中の分析溶液２０μｌを細胞懸濁液の各ウェルに加え、３７°Ｃ、５％ＣＯ₂で３時間培養した。分光光度計を使用して、４９０ｎｍと６５０ｎｍでウェルプレートの吸光度を測定した。記録したデータを標準ＮＧＦ対照（ＳｕＴａｉＳｈｅｎｇ^RマウスＮＧＦ）に対して標準化した。

【0268】

図５Ａに示すように、ＩｇＧ１由来のＦｃ断片を含むすべての成熟ＮＧＦ－Ｆｃ融合タンパク質中で（ｒｈＮＧＦ、ｍＮＧＦ１１８及びＳｕＴａｉＳｈｅｎｇ^RマウスＮＧＦを含むすべてのＮＧＦ構築物中でも）、２－１１８－Ｌ３Ｆｃ１０－Ｍ３－５は一番生物活性が高かった。加速安定性試験で（実施例３を参照）、２－１１８－Ｌ３Ｆｃ１０－Ｍ３－５は、３つの最も安定な構築物の中で（２－１１８－Ｌ３Ｆｃ１０－Ｍ３－５、ＮＧＦ－１１８－Ｌ３Ｆｃ１０－Ｍ３－５及び２－１１８－Ｌ３Ｆｃ１０Ｍ７－５）一番生物活性が高かった。図５Ｂに示すように、ＩｇＧ４由来のＦｃ断片を含むすべての成熟ＮＧＦ－Ｆｃ融合タンパク質は、ＴＦ－１細胞の増殖を促進する生物活性を有する。また、２－１１８－Ｌ３Ｇ４－ＢＭは、標準対照ＳｕＴａｉＳｈｅｎｇ^RマウスＮＧＦに匹敵する生物活性を示した。
実施例５：ラットにおける様々なＮＧＦ－Ｆｃ融合タンパク質の生物活性試験

【0269】

上頸神経節（ＳＣＧ）は、約３００００個のニューロンで構成される組織であり、特に出生前及び出生後の発達中に、ＮＧＦに対して最も敏感な組織の１つである。ＴＦ－１細胞増殖試験において（実施例４を参照）、ＩｇＧ１－又はＩｇＧ４－由来のＦｃ断片を含む特定のＮＧＦ－Ｆｃ融合タンパク質は、非常に高い生物活性を示した。各種のＮＧＦ－Ｆｃ融合タンパク質をラットＳＣＧに注射し、注射後の様々な時点でＳＣＧサイズを測定し、インビボでＳＣＧ増殖を促進するＮＧＦ－Ｆｃ融合タンパク質の活性を評価した。

【0270】

新生児Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）ラットの首に、各種のＮＧＦ－Ｆｃ融合タンパク質又はＮＧＦ対照（ＳｕＴａｉＳｈｅｎｇ^RマウスＮＧＦ又は変異体ＮＧＦ１１８）を皮下注射し、次にラットを犠牲にしてＳＣＧを分離した。ＰＢＳインフュジョンを陰性対照とした。図６Ａに示すように、ＮＧＦ対照タンパク質（ＳｕＴａｉＳｈｅｎｇ^RマウスＮＧＦ又は変異体ＮＧＦ１１８）又はＰＢＳを０日目、１日目、２日目及び３日目に１日１回注射し、次に４日目にＳＣＧを得た。２－１１８－Ｌ３Ｆｃ１０－Ｍ３－５又は２－１１８－Ｌ３Ｇ４－ＢＭを０日目に同じ用量で単回注射し、次に４日目にＳＣＧを得た。簡単に言えば、断頭後、ラットの頭を手術台に固定し、綿球で血液を吸い取り、まず気管と大後頭孔を見つけ、次に気管の斜め後方側の頸動脈鞘組織を見つけ、マイクロピンセットでＳＣＧを取り出し、ＰＢＳを含有するペトリ皿に入れた後、解剖顕微鏡下でＳＣＧを分離した。単離されたＳＣＧの表面の余分な液体をティッシュペーパーで取り除き、次にＳＣＧをきれいな表面皿に置いて重量を測定した。ＳＣＧの形態を図６Ｂに示す。記録されたデータをＳｔｕｄｅｎｔ ｔ検定で分析した。＊＊はＰＢＳ治療群と比較して有意差があることを示し、ｎ．ｓ．はＰＢＳ治療群と比較して「有意差なし」を示した。図６Ｃに示すように、２ｎＭの用量で、変異体β－ＮＧＦ １１８ａａ（ｍＮＧＦ１１８）、ＳｕＴａｉＳｈｅｎｇ^RマウスＮＧＦ及び２－１１８－Ｌ３Ｆｃ１０－Ｍ３－５は、ＰＢＳ陰性対照群と比較してＳＣＧ増殖に有意な促進効果がなく、統計的に有意差がなかった。一方、２－１１８－Ｌ３Ｇ４－ＢＭは、ＰＢＳ対照群と比較してＳＣＧ増殖を有意に促進した（＊＊ｐ＜０．０１）。５ｎＭの用量の場合、ＮＧＦ対照群（ＳｕＴａｉＳｈｅｎｇ^RマウスＮＧＦ又はｍＮＧＦ１１８）とＮＧＦ－Ｆｃ融合タンパク質（２－１１８－Ｌ３Ｇ４－ＢＭ又は２－１１８－Ｌ３Ｆｃ１０－Ｍ３－５）のどちらも、ＰＢＳ治療群と比較してインビボでＳＣＧ増殖を有意に促進し（＊＊ｐ＜０．０１）、試験された４つのＮＧＦタンパク質の間にはＳＣＧ増殖を促進する活性に有意差が見られなかった（ｎ．ｓ．はｐ＞０．０５を示す）（図６Ｄ）。従って、用量を２ｎＭにした場合でも、２－１１８－Ｌ３Ｇ４－ＢＭは、ＳｕＴａｉＳｈｅｎｇ^RマウスＮＧＦ又は変異体β－ＮＧＦ １１８ａａ（ｍＮＧＦ１１８）と比較して、単回皮下注射によりインビボでＳＣＧ増殖を促進する活性が優れた。高用量（５ｎＭ）の場合では、２－１１８－Ｌ３Ｇ４－ＢＭまたは２－１１８－Ｌ３Ｆｃ１０－Ｍ３－５のうちのどちらによる単回治療も、ＳＣＧ増殖の促進に対して同様な活性を示した。
実施例６：ラットにおける各種のＮＧＦポリペプチドの薬物動態学（ＰＫ）研究

【0271】

各種のＮＧＦ構築物を成体ラットに注射して、ＰＫプロファイルを検出した。

【0272】

２４匹の雄ＳＤラット（６～８週齢、約２５０ｇ～３００ｇ／匹）をランダムに３群（各群８匹）に分け、２－１１８－Ｌ３Ｆｃ１０－Ｍ３－５、２－１１８－Ｌ３Ｇ４－ＢＭ、およびｍＮＧＦ１１８（Ｆｃ融合を伴わない変異体β－ＮＧＦ １１８個のアミノ酸）をそれぞれ２３５μｇ／ｋｇ筋肉注射した。注射前（０時間）又は注射後１時間、４時間、８時間、２４時間、４８時間、７２時間、１２０時間、１６８時間、２１６時間及び２８８時間に、眼窩後静脈血１５０μｌをそれぞれ採取した。採血後に血漿を分離し、次にＮＧＦ含有量をＨｕｍａｎ ＮＧＦ Ｍａｔｃｈｅｄ ＥＬＩＳＡ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐａｉｒ Ｓｅｔ（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ，ＳＥＫ１１０５０）で検出した。Ｙ軸に４５０ｎｍ～６３０ｎｍでの標準の平均ＯＤｓ値をプロットし、Ｘ軸に標準の濃度をプロットし、Ｒ²＞０．９８の要件で標準曲線の線形方程式を作成した。次に、標準曲線の線形方程式に従って、それぞれのサンプルの血漿濃度を計算した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ５．０を使用してサンプル濃度対時間の半対数プロットを作成し、Ｐｈｏｅｎｉｘ ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ ６．２をＰＫ分析に使用し、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ５．０を使用して半減期散布図をプロットした。

【0273】

図７Ａに示すように、単回筋肉注射後、ＮＧＦ－Ｆｃ融合タンパク質の群は、Ｆｃに融合されていないｍＮＧＦ１１８対照群と比較して、経時的な血漿濃度が高かった。単回筋肉注射後、２－１１８－Ｌ３Ｇ４－ＢＭは、２－１１８－Ｌ３Ｆｃ１０－Ｍ３－５と経時的に同様の血漿濃度を示した。図７Ｂに示すように、２－１１８－Ｌ３Ｇ４－ＢＭ（５５時間）と２－１１８－Ｌ３Ｆｃ１０－Ｍ３－５（５５時間）とは、半減期がほぼ同じであるが、Ｆｃに融合されていないｍＮＧＦ１１８対照群（半減期１．７５時間）と比べると、半減期がかなり長かった（約３１倍）。これらの結果から、２－１１８－Ｌ３Ｇ４－ＢＭ又は２－１１８－Ｌ３Ｆｃ１０－Ｍ３－５の単回投与がインビボでのＳＣＧ増殖の促進に対して、Ｆｃに融合されていないＮＧＦ対照群の連続注射（ＳｕＴａｉＳｈｅｎｇ^RマウスＮＧＦ又はｍＮＧＦ１１８）と同様の活性を示したことの原因は、さらに明らかになった（図６Ｄを参照）。

【0274】

ｗｔＮＧＦ１２０（即ち、「ｒｈＮＧＦ」、ヒト野生型β－ＮＧＦ １２０個のアミノ酸、配列番号４）、ＮＧＦ－１－１５Ｍ７（ｒｈＮＧＦ－Ｆｃ１）、ＮＧＦ－Ｌ３Ｆｃ１０Ｍ７－５（ｒｈＮＧＦ－Ｌｉ－Ｆｃ１）、２－１－１５Ｍ７（ｒｈＮＧＦ－（Ｆ１２Ｅ）－Ｆｃ１）及びＮＧＦ－４－１２ＰＡＡ（ｒｈＮＧＦ－Ｆｃ４）の半減期は、ＷＯ２０１７１５７３２５の表２に詳述されていて、表６にまとめた。この実験で検出したｍＮＧＦ１１８の半減期（１．７５時間）は、ＷＯ２０１７１５７３２５で検出したｗｔＮＧＦ１２０の半減期（１．８時間）と同様であった。表６に示すように、ＮＧＦ－１－１５Ｍ７（ｒｈＮＧＦ－Ｆｃ１）、ＮＧＦ－Ｌ３Ｆｃ１０Ｍ７－５（ｒｈＮＧＦ－Ｌｉ－Ｆｃ１）及び２－１－１５Ｍ７（ｒｈＮＧＦ－（Ｆ１２Ｅ）－Ｆｃ１）構築物は、Ｆｃ融合のないｗｔＮＧＦ１２０又はｍＮＧＦ１１８対照群よりも、インビボ半減期が１７倍以上延長し、ＮＧＦ－４－１２ＰＡＡ（ｒｈＮＧＦ－Ｆｃ４）よりも１．４倍長かった。ここで検出した２－１１８－Ｌ３Ｇ４－ＢＭ（５５時間）の半減期は、２－１１８－Ｌ３Ｆｃ１０－Ｍ３－５（５５時間）の半減期とほぼ同じになり、両方ともＦｃ融合のないｗｔＮＧＦ１２０又はｍＮＧＦ１１８対照群の３１倍程度であり、また、以前に測定されたＩｇＧ１－又はＩｇＧ４－由来のＦｃ断片を含むすべての成熟ＮＧＦ－Ｆｃ融合タンパク質よりもはるかに長かった。

【0275】

【表6】

【0276】

実施例７：ＮＧＦ－Ｆｃ融合タンパク質による糖尿病性神経障害の創傷治癒の促進
糖尿病性神経障害は、糖尿病に伴う一般的な慢性合併症の１つであり、それを患う患者には、創傷治癒の遅延、局所での様々な程度の感染や、潰瘍、炭疽などが現れ、足趾や下肢切断の恐れもある。この実施例には、糖尿病性神経障害の動物モデルに対するＮＧＦ－Ｆｃ融合タンパク質による治療効果に関する研究を記述した（例えば、創傷治癒に基づいた評価）。
ＣＤ－１マウスは、北京維通利華実験動物技術有限公司から入手された。標準的な方法を採用して糖尿病の動物モデルを構築した（例えば、Ｇｒａｉａｎｉ Ｇ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｒｖｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｒｅｐａｒａｔｉｖｅ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎ ｃｕｔａｎｅｏｕｓ ｗｏｕｎｄｓ ｏｆ Ｔｙｐｅ １ ｄｉａｂｅｔｉｃ ｍｉｃｅ．Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ．２００４，４７（６）：１０４７－５４を参照のこと）。糖尿病誘発の４週間後、マウスを麻酔し、使い捨ての皮膚穿孔装置を使用して肩甲骨の間の左右に直径４ｍｍの全層皮膚創傷１つずつを得た。５０μｇ／ｍｌＳｕＴａｉＳｈｅｎｇ^RマウスＮＧＦ、ｍＮＧＦ１１８又はＮＧＦ－Ｆｃ融合タンパク質（２－１１８－Ｌ３Ｆｃ１０－Ｍ３－５又は２－１１８－Ｌ３Ｇ４－ＢＭ）を２０μｌ／回の用量で右側創傷に投与した。等量のＰＢＳインフュジョンを左側創傷に投与した（陰性対照とした）。ＰＢＳ、ＳｕＴａｉＳｈｅｎｇ^RマウスＮＧＦ又はｍＮＧＦ１１８を０日目（マウスの背中に穿孔した後）、１日目、２日目及び３日目に１日１回投与した。２－１１８－Ｌ３Ｆｃ１０－Ｍ３－５又は２－１１８－Ｌ３Ｇ４－ＢＭを、０日目に同じ用量で単回投与した。穿孔直後の創傷面積を測定し、０日目の創傷面積として記録し、４日目及び７日目で創傷面積を測定して創傷治癒率を計算した。記録されたデータをＳｔｕｄｅｎｔ ｔ検定によって分析し、縦棒グラフとしてＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ８．０．１によってプロットした。

【0277】

図８に示すように、７日目には、４日目と比較して、すべての群で創傷治癒が改善された。ＳｕＴａｉＳｈｅｎｇ^RマウスＮＧＦ、ｍＮＧＦ１１８及びＮＧＦ－Ｆｃ融合タンパク質（２－１１８－Ｌ３Ｇ４－ＢＭ又は２－１１８－Ｌ３Ｆｃ１０－Ｍ３－５）はすべて、ＰＢＳ陰性対照と比較して糖尿病の創傷治癒を有意に促進した（ｐ＜０．０１）。具体的には、４日目に、ＰＢＳ治療群の平均創傷面積は、ＳｕＴａｉＳｈｅｎｇ^RマウスＮＧＦ、ｍＮＧＦ１１８又はＮＧＦ－Ｆｃ融合タンパク質治療群の約１．３倍であった。上記の結果は、ＳｕＴａｉＳｈｅｎｇ^RマウスＮＧＦ、ｍＮＧＦ１１８又はＮＧＦ－Ｆｃ融合タンパク質により、糖尿病マウスの創傷治癒が遅いという欠陥を効果的に改善することができたことを示した。さらに、７日目に、ＮＧＦ－Ｆｃ融合タンパク質の投与による糖尿病マウスの創傷治癒率は、ＳｕＴａｉＳｈｅｎｇ^RマウスＮＧＦ及びｍＮＧＦ１１８治療群よりも高かった。この結果から、ＮＧＦ－Ｆｃ融合タンパク質はＮＧＦ（例えば、ＳｕＴａｉＳｈｅｎｇ^RマウスＮＧＦ又はｍＮＧＦ１１８）よりインビボ治療効果が優れたことが示された。
実施例８：アルツハイマー病に対するＮＧＦ－Ｆｃ融合タンパク質の治療効果

【0278】

アルツハイマー病は、主な臨床症状として進行性記憶喪失を伴う中枢神経系の変性疾患であり、高齢者に発症する場合が多く、病因が複雑である。この実施例には、インビボでのＡＤに対するＮＧＦ－Ｆｃ融合タンパク質の治療効果の研究を記述した（例えば、動物の行動変化による評価）。

【0279】

Ｗｉｓｔａｒラットを採用し、標準的な方法でＡＤ動物モデルを構築した（例えば、「Ｗｅｎｋ ＧＬ，Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ ＣＡ，Ｔｕｃｋｅｒ ＤＡ，ｅｔ ａｌ．Ｂａｓａｌ ｆｏｒｅｂｒａｉｎ ｎｅｕｒｏｎｓ ａｎｄ ｍｅｍｏｒｙ： ａ ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ，ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ ｂｅｈａｖｉｏｕｒａｌ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｖｕｌｎｅｒａｂｉｌｉｔｙ ｔｏ ｉｂｏｔｅｎａｔｅ ａｎｄ ｑｕｉｓｑｕａｌａｔｅ．Ｂｅｈａｖ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ，１９９２，１０６： ９０９－９２３．」を参照のこと）。簡単に言えば、Ｗｉｓｔａｒラットにイボテン酸（ＩＢＯ）を定位注射した。ＩＢＯ注射の２日後、ＡＤモデルラットを麻酔して仰向けに寝かせた。１５０μｇ／ｍｌのＮＧＦ（ＳｕＴａｉＳｈｅｎｇ^RマウスＮＧＦ又はｍＮＧＦ１１８実験群）又はＮＧＦ－Ｆｃ融合タンパク質（２－１１８－Ｌ３Ｇ４－ＢＭ又は２－１１８－Ｌ３Ｆｃ１０－Ｍ３－５）を、１００μｌ／回の総用量で鼻腔投与した。同体積量のＰＢＳを投与したＡＤモデルラットを陰性対照とした。ＮＧＦ又はＰＢＳを１日１回、連続７日間投与した。ＮＧＦ－Ｆｃ融合タンパク質は、１日目のみに単回投与した。７日目にモリス水迷路試験によってラットの行動変化を評価した。簡単に言えば、モリス水迷路装置を使用して、実験前にラットをプラットホームに登るように訓練し、実験当日、ラットがプラットホームを探すのにかかる時間（潜伏時間；水に入ってからプラットホームに登ったまでの時間）及びプラットホームを取り外してから１２０ｓ以内に元のプラットホームの位置を横切った回数を記録した。記録されたデータをＳｔｕｄｅｎｔ ｔ検定で分析した。

【0280】

表７に示すように、ＳｕＴａｉＳｈｅｎｇ^RマウスＮＧＦ、ｍＮＧＦ１１８又はＮＧＦ－Ｆｃ融合タンパク質（２－１１８－Ｌ３Ｇ４－ＢＭ又は２－１１８－Ｌ３Ｆｃ１０－Ｍ３－５）で処理されたＡＤモデルラットは、陰性対照群と比較してプラットホームを探すのにかかる時間が有意に短くなり（＊ｐ＜０．０５）、プラットフォームを横切った回数が有意に増加した（＊ｐ＜０．０５）。従って、本明細書に記載されているＮＧＦおよびＮＧＦ－Ｆｃ融合タンパク質のいずれか一方によれば、ＡＤモデルラットの空間認知、記憶及び学習能力を効果的に改善することができる。さらに、２－１１８－Ｌ３Ｇ４－ＢＭ又は２－１１８－Ｌ３Ｆｃ１０－Ｍ３－５で処理されたＡＤモデルラットは、ＮＧＦ（ＳｕＴａｉＳｈｅｎｇ^RマウスＮＧＦ又はｍＮＧＦ１１８）で処理されたラットと比較してプラットホームを探すのにかかる時間が短く、プラットフォームを横切った頻度が高かった。これらのデータから、ＮＧＦ－Ｆｃ融合タンパク質はＡＤに対するインビボ治療効果が優れたことが示された。

【0281】

【表7】

【0282】

実施例９：早発卵巣不全に対するＮＧＦ－Ｆｃ融合タンパク質の治療効果
早発卵巣不全（ＰＯＦ）とは、エストロゲン値の低下、卵胞生成ホルモン値の上昇及びゴナドトロピン値の上昇を伴うことが多く、その病因とメカニズムが複雑で、卵巣の機能不全に起因した４０歳未満の自然無月経を指す。この実施例には、インビトロヒト卵巣顆粒膜腫瘍細胞株（ＫＧＮ）増殖試験及びＫＧＮエストロゲン分泌アッセイならびにＰＯＦモデルラットを用いたＰＯＦの治療に対するＮＧＦ－Ｆｃ融合タンパク質の効果に関する研究について記述した。

【0283】

ＫＧＮ増殖試験においては、試験の前日に１００ｕｌのＫＧＮ懸濁液（１×１０⁴細胞／ｍＬ）を９６ウェルプレートの各ウェルに加えた。実験前に無血清ＤＭＥＭ培地を交換した。培地交換後、培地中の最終濃度が１０μｇ／ｍＬになるように、ＳｕＴａｉＳｈｅｎｇ^RマウスＮＧＦ、ｍＮＧＦ１１８又はＮＧＦ－Ｆｃ融合タンパク質（２－１１８－Ｌ３Ｇ４－ＢＭ又は２－１１８－Ｌ３Ｆｃ１０－Ｍ３－５）を実験群のウェルにそれぞれ加え、陰性対照群に対しては、培地交換後に何の処理も行われなかった。各群に４つの重複ウェルを設置し、４８時間後に１０ｕＬのＣＣＫ－８（ＤＯＪＩＮＤＯ、＃ＣＫ０４）を各ウェルに加えて生細胞を測定した。１時間インキュベート後、４５０ｎｍでの吸光値を測定し、記録されたデータをＳｔｕｄｅｎｔ ｔ検定で分析し、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ８．０．１を使用して縦棒グラフをプロットした。

【0284】

図９Ａに示すように、ＮＧＦ（ＳｕＴａｉＳｈｅｎｇ^RマウスＮＧＦ又はｍＮＧＦ１１８）及ＮＧＦ－Ｆｃ融合タンパク質（２－１１８－Ｌ３Ｇ４－ＢＭ又は２－１１８－Ｌ３Ｆｃ１０－Ｍ３－５）のいずれか一方も、ＰＢＳ陰性対照群と比較してＫＧＮの増殖を有意に促進した（ｐ＜０．０５）。それに対して、ＮＧＦ－Ｆｃ融合タンパク質（２－１１８－Ｌ３Ｇ４－ＢＭ又は２－１１８－Ｌ３Ｆｃ１０－Ｍ３－５）で処理されたＫＧＮは、ＮＧＦで処理されたＫＧＮと比較して増殖率がわずかに高かった。

【0285】

ＫＧＮエストロゲン分泌アッセイでは、２４ウェルプレートに１×１０⁵細胞／ウェルで播種し（細胞のコンフルエンスが約８０％であった）、次に無血清培地に交換した。培地交換後、培地中の最終濃度が１０μｇ／ｍｌになるように、ＳｕＴａｉＳｈｅｎｇ^RマウスＮＧＦ、ｍＮＧＦ１１８又はＮＧＦ－Ｆｃ融合タンパク質（２－１１８－Ｌ３Ｇ４－ＢＭ又は２－１１８－Ｌ３Ｆｃ１０－Ｍ３－５）を実験群のウェルにそれぞれ加えた。陰性対照群は、培地交換後に何の処理も行われなかった。各群に４つの重複ウェルを設置し、１８時間インキュベート後、２回洗浄し、２．２×１０^-8Ｍのテストステロン（Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｓｏｌａｒｂｉｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ＆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．，Ｌｔｄ，、＃ＩＴ０１１０）及び０．０１ＩＵ／ｍｌのヒツジ卵胞刺激ホルモン（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｈｅａｌｔｈ Ｐｈｙｓｉｃｓ Ｐｒｏｇｒａｍ、Ｏｖｉｎｅ ＦＳＨ）で２４時間処理後、上清を採取して１．６倍に希釈し、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ製のエストロゲン測定キット（ＫＧＥ０１４）を使用して、４５０ｎｍでの吸光値を測定し、分泌されたエストロゲン濃度を計算し、記録されたデータをＳｔｕｄｅｎｔ ｔ検定で分析し、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ８．０．１を使用して縦棒グラフをプロットした。

【0286】

図９Ｂに示すように、ＮＧＦ（ＳｕＴａｉＳｈｅｎｇ^RマウスＮＧＦ又はｍＮＧＦ１１８）及ＮＧＦ－Ｆｃ融合タンパク質（２－１１８－Ｌ３Ｇ４－ＢＭ又は２－１１８－Ｌ３Ｆｃ１０－Ｍ３－５）のいずれか一方も、陰性対照群と比較してＫＧＮエストロゲン分泌を有意に促進した（ｐ＜０．０５）。それに対して、ＮＧＦ－Ｆｃ融合タンパク質（２－１１８－Ｌ３Ｇ４－ＢＭ又は２－１１８－Ｌ３Ｆｃ１０－Ｍ３－５）で処理されたＫＧＮは、ＮＧＦで処理されたＫＧＮと比較してわずかに高いエストロゲン分泌を示した。

【0287】

４－ビニルシクロヘキセンジエポキシド（ＶＣＤ）は、雌マウスの卵巣の原始卵胞と一次卵胞を選択的に破壊できるが、二次卵胞と和洞卵胞には影響せず、雌マウスのＰＯＦをもたらした。ＰＯＦの治療におけるＮＧＦ－Ｆｃ融合タンパク質のインビボ効果をさらに研究するために、ＶＣＤをＳＤラットに２週間連続して腹腔注射してＰＯＦラットモデルを構築した（例えば、Ｍｕｈａｍｍａｄ ＦＳ ｅｔ ａｌ．，Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ４－ｖｉｎｙｌｃｙｃｌｏｈｅｘｅｎｅ ｄｉｅｐｏｘｉｄｅ ｏｎ ｐｅｒｉｐｕｂｅｒｔａｌ ａｎｄ ａｄｕｌｔ Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙ ｒａｔｓ：ｏｖａｒｉａｎ，ｃｌｉｎｉｃａｌ，ａｎｄ ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃ ｏｕｔｃｏｍｅｓ［Ｊ］．Ｃｏｍｐ Ｍｅｄ，２００９，５９（１）：４６－５９．を参照）。ＮＧＦ投与は、モデル確立の開始時に行われ、１日目として記録された。皮下注射が採用され、ＮＧＦ（ＳｕＴａｉＳｈｅｎｇ^RマウスＮＧＦ又はｍＮＧＦ１１８）又はＮＧＦ－Ｆｃ融合タンパク質（２－１１８－Ｌ３Ｇ４－ＢＭ又は２－１１８－Ｌ３Ｆｃ１０－Ｍ３－５）実験群の注射用量は１０μｇ／ｋｇ ｂｗであり、同量の無菌生理食塩水を陰性対照とした。ＳｕＴａｉＳｈｅｎｇ^RマウスＮＧＦ、ｍＮＧＦ１１８又は無菌生理食塩水を隔日で投与し、ＮＧＦ－Ｆｃ融合タンパク質（２－１１８－Ｌ３Ｇ４－ＢＭ又は２－１１８－Ｌ３Ｆｃ１０－Ｍ３－５）を週１回投与した。４２日後、すべてのラットを安楽死させ、卵巣組織を固定した後に定期的にパラフィンに包埋し、切片にしてＨ＆Ｅ（ヘマトキシリンとエオシン）で染色し、すべてのレベルの卵胞を数えた。記録されたデータをＳｔｕｄｅｎｔ ｔ検定で分析し、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ８．０．１を使用して縦棒グラフをプロットした。

【0288】

図９Ｃに示すように、ＳｕＴａｉＳｈｅｎｇ^RマウスＮＧＦ、ｍＮＧＦ１１８及びＮＧＦ－Ｆｃ融合タンパク質（２－１１８－Ｌ３Ｇ４－ＢＭ又は２－１１８－Ｌ３Ｆｃ１０－Ｍ３－５）はすべて、陰性対照群と比較して一次卵胞の数を有意に増加させており（ｐ＜０．０５）、ＰＯＦによる一次卵胞数の軽減を逆転させるのに優れた効果があることを示した。ＳｕＴａｉＳｈｅｎｇ^RマウスＮＧＦ、ｍＮＧＦ１１８又はＮＧＦ－Ｆｃ融合タンパク質（２－１１８－Ｌ３Ｇ４－ＢＭ又は２－１１８－Ｌ３Ｆｃ１０－Ｍ３－５）で処理されたＰＯＦラットモデルは、陰性対照群と比較して、原始卵胞及び二次卵胞の数が多かった。
実施例１０：精子軽減無力症に対するＮＧＦ－Ｆｃ融合タンパク質の治療効果

【0289】

精子軽減無力症は、主に精子数の軽減及び／又は精子の運動性の低下として現れる。精子は、精巣の精細管で増殖能力を持つ生殖細胞が一連の分裂分化によって形成されるが、熱ストレスは、増殖細胞の分裂、分化及び精子形成に影響を与える可能性がある。この実施例には、マウス精子形成障害モデルにおける精子軽減無力症（精子軽減症及び精子無力症）に対するＮＧＦ－Ｆｃ融合タンパク質の治療効果の研究について記述した。
本実験では、Ｃ５７ＢＬ／６ＪＳＨｊｈマウス（Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｊｉｈｕｉ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ Ｃｏ．，Ｌｔｄ）を使用した。実験群には、鼠径部皮下注射の投与方法を採用し、２０μｇ／ｋｇ ｂｗ／回のＮＧＦ（ＳｕＴａｉＳｈｅｎｇ^RマウスＮＧＦ又はｍＮＧＦ１１８）又は６０μｇ／ｋｇ ｂｗ／回のＮＧＦ－Ｆｃ融合タンパク質（２－１１８－Ｌ３Ｇ４－ＢＭ又は２－１１８－Ｌ３Ｆｃ１０－Ｍ３－５）をそれぞれ注射した。正常対照群又は精子形成障害モデル対照群には、等量の０．９％塩化ナトリウムインフュジョンを注射した。初回投与（ＮＧＦ、ＮＧＦ－Ｆｃ融合タンパク質又は塩化ナトリウム）の日を１日目とした。マウス精巣における熱ストレスによる精子形成障害の動物モデルを構築するために、初回投与から４時間後にマウスを麻酔し、マウス精巣が陰嚢に下降した後、精子形成障害モデル対照群、ＮＧＦ実験群及びＮＧＦ－Ｆｃ融合タンパク質実験群のマウスの下腹部（後肢、テール及び陰嚢）を４２℃の恒温水槽に３０分間浸し、正常対照群のマウスの下腹（後肢、テール及び陰嚢）を２５℃の恒温水槽に３０分間浸した。ＳｕＴａｉＳｈｅｎｇ^RマウスＮＧＦ又はｍＮＧＦ１１８は隔日で１回投与し、２－１１８－Ｌ３Ｇ４－ＢＭ又は２－１１８－Ｌ３Ｆｃ１０－Ｍ３－５は週２回投与した。正常対照群又はモデル対照群には、隔日で等量の０．９％塩化ナトリウムインフュジョンを注射した。合計５週間投与した。投与後３７日目にマウスを安楽死させ、精巣上体の左尾を採取して重量を量り、３７℃に予熱したＭ１９９培養液に入れ、細かく切ってインキュベーターに３７℃で５分間インキュベートし、精子懸濁液を吸引し、Ｍ１９９培養液で１：６で希釈し、均一に混合した後に希釈液を取り、ＴＯＸ ＩＶＯＳ精子分析装置で精子数及び精子の運動性を検出した。記録したデータはＳｔｕｄｅｎｔ ｔ検定で分析した。

【0290】

表８に示すように、精子形成障害モデル対照群は、正常対照群よりも精子数及び精子の運動性が有意に低く、動物モデルの構築に成功したことが示された。ＮＧＦ（ＳｕＴａｉＳｈｅｎｇ^RマウスＮＧＦ又はｍＮＧＦ１１８）又はＮＧＦ－Ｆｃ融合タンパク質（２－１１８－Ｌ３Ｆｃ１０－Ｍ３－５和２－１１８－Ｌ３Ｇ４－ＢＭ）実験群におけるマウスの精子数和精子の運動性は、精子形成障害モデル対照群と比較して有意に増加した。これらの結果から、ＮＧＦ又はＮＧＦ－Ｆｃ融合タンパク質の皮下注射が、精子形成障害（例えば、精子無力症、精子軽減症及び精子軽減無力症）における精子数の軽減及び精子の運動性の低下を効果的に救済できたことが分かった。

【0291】

【表8】

【0292】

ＮＧＦ及びＮＧＦ－Ｆｃの治療効果をさらに研究するために、上記の安楽死させたマウスの右の精巣及び精巣上体を採取し、重量を量った後に１０％中性ホルマリンで固定し、包埋し、切片にしてＨ＆Ｅで染色し、組織病理学的病変を評価した。表８に示すように、ＮＧＦ（ＳｕＴａｉＳｈｅｎｇ^RマウスＮＧＦ又はｍＮＧＦ１１８）及びＮＧＦ－Ｆｃ融合タンパク質（２－１１８－Ｌ３Ｆｃ１０－Ｍ３－５和２－１１８－Ｌ３Ｇ４－ＢＭ）は、熱ストレスによる精巣精細管萎縮、精細管精子形成障害及び精巣上体管細胞断片症状に対して有意な治療効果を示した。

【0293】

さらに、ＮＧＦ－Ｆｃ融合タンパク質は、ＮＧＦと同等又はそれ以上の治療効果（精子数、精子の運動性、組織病理学）を示した。

【0294】

【表9】

【0295】

実施例１１：神経栄養性角膜炎に対するＮＧＦ－Ｆｃ融合タンパク質の治療効果
神経栄養性角膜炎は、角膜上皮の治癒障害に起因した変性疾患であり、主に角膜の感受性の低下を特徴としている。この実施例には、神経栄養性角膜炎のラットモデルにおける神経栄養性角膜炎に対するＮＧＦ－Ｆｃ融合タンパク質の治療効果の研究について記述した（例えば、角膜フルオレセインナトリウム染色試験及び角膜神経長測定により行われる）。

【0296】

神経栄養性角膜炎の動物モデルを確立するために、３日齢のＳＤラットに８ｍｇ／ｍｌのカプサイシン溶液（Ｓｈａｎｇｈａｉ ＭｃＬｅａｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．、＃Ｃ１０８３１８８４）を５０μｌ／匹の用量で単回皮下注射した。カプサイシン注射の２週間後、６０μｇ／ｍｌのＮＧＦ（ＳｕＴａｉＳｈｅｎｇ^RマウスＮＧＦ又はｍＮＧＦ１１８）又はＮＧＦ－Ｆｃ融合タンパク質（２－１１８－Ｌ３Ｆｃ１０－Ｍ３－５又は２－１１８－Ｌ３Ｇ４－ＢＭ）を、点眼剤の形で約２時間間隔で１日６回、２０μｌ／目／回で両眼に投与した。陰性対照として、同量の０．９％塩化ナトリウム溶液を同頻度で投与した。投与の初日をＤ１と記録した。２週間連続投与し、Ｄ１５に各群で１回投与した。

【0297】

次に、角膜フルオレセインナトリウム染色を行い、ＮＧＦ－Ｆｃ融合タンパク質の治療効果を評価した。角膜フルオレセインナトリウム染色スコアにより、角膜の完全性と損傷の程度を直接に示すことができる。無傷の角膜は着色されず、損傷した角膜のみが着色され、スコアが高いほど角膜損傷の程度が高くなる。簡単に言えば、フルオレセインナトリウム溶液（３μＬ、０．５％）を動物の目に滴下して１．５分間染色した。次に、動物の結膜嚢を１．２５ｍＬの無菌生理食塩水で約１０ｓごとに３回連続して洗浄した。各洗浄後、動物の目の周りの残留生理食塩水をティッシュペーパーで吸い取った。染色５分間後、細隙灯（＋コバルトブルーフィルター）で眼球表面を観察し、写真を撮影してスコアを付けた。改良されたＮＥＩ蛍光染色グレーディング法はスコアリング標準として使用した。具体的には、各角膜を５つの領域（１－中央領域、２－上方、３－側頭、４－鼻側、５－下方）に分割し、各領域の染色スコアは最大８点であった。ここで、０点は着色されていないことを示し、１点は点状着色の面積が対応する領域の面積の１％～２５％であることを示し、２点は点状着色の面積が対応する領域の面積の２６％～５０％であることを示し、３点は点状着色の面積が対応する領域の面積の５１％～７５％であることを示し、４点は点状着色の面積が対応する領域の面積の７６％～１００％であることを示した。着色されあ領域が緻密でありかつ／又はその領域に明らかな融合が見られる場合、対応する領域の着色された領域に占める面積に応じて、１、２、３、４の追加点がさらに与えられた。即ち、着色面積１％～２５％で１点の加点、着色面積２６％～５０％で２点の加点、着色面加５１％～７５％で３点の加点、着色面積７６％～１００％で４点の加点が与えられた。各目の最大合計スコアは４０点であった。０日目（最初の治療前）、４日目、８日目及び１４日目に合計４回測定した。角膜フルオレセインナトリウム染色の合計スコアを計算した。記録されたデータをＳＰＳＳ１３．０で処理し、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ８．０．１を使用して縦棒グラフをプロットした。

【0298】

図１０Ａに示すように、ＮＧＦ（ＳｕＴａｉＳｈｅｎｇ^RマウスＮＧＦ又はｍＮＧＦ１１８）又はＮＧＦ－Ｆｃ融合タンパク質（２－１１８－Ｌ３Ｇ４－ＢＭ又は２－１１８－Ｌ３Ｆｃ１０－Ｍ３－５）で処理された実験群は、陰性対照群よりも神経栄養性角膜炎ラットモデルの角膜フルオレセインナトリウム染色スコアが有意に低かった（４日目及び８日目にｐ＜０．０１；１４日目にｐ＜０．００１）ことから、ＮＧＦ（ＳｕＴａｉＳｈｅｎｇ^RマウスＮＧＦ又はｍＮＧＦ１１８）又はＮＧＦ－Ｆｃ融合タンパク質（２－１１８－Ｌ３Ｇ４－ＢＭ又は２－１１８－Ｌ３Ｆｃ１０－Ｍ３－５）が損傷角膜の完全性を有意に回復できたことが示された。それに対して、ＮＧＦ－Ｆｃ融合タンパク質（２－１１８－Ｌ３Ｇ４－ＢＭ又は２－１１８－Ｌ３Ｆｃ１０－Ｍ３－５）で処理された角膜は、ＮＧＦで処理された角膜と比較して角膜フルオレセインナトリウム染色スコアがわずかに低かった。

【0299】

角膜神経計数試験をさらに実施してその治療効果を研究した。１５日目に、投与の１時間後にラットを安楽死させ、右眼球を採取し、角膜縁に沿って角膜を摘出し、洗浄し、平らにし、染色してスライドガラスに固定した。光学顕微鏡（×２００倍）で角膜神経線維の形態を観察し、角膜を中心から放射状に４葉に分割し、４葉のそれぞれから角膜神経が最も多い鮮明な視野を選んで撮影し、各視野における角膜神経の長さを測定し、４つの視野の角膜神経の平均長を最終結果とした。データは、ＳＰＳＳ１３．０を使用して処理し、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ８．０．１により縦棒グラフとしてプロットした。

【0300】

図１０Ｂに示すように、ＮＧＦ（ＳｕＴａｉＳｈｅｎｇ^RマウスＮＧＦ又はｍＮＧＦ１１８）又はＮＧＦ－Ｆｃ融合タンパク質（２－１１８－Ｌ３Ｇ４－ＢＭ又は２－１１８－Ｌ３Ｆｃ１０－Ｍ３－５）で処理された神経栄養性角膜炎ラットモデルは、陰性対照群よりも平均角膜神経長が有意に長かった（ｐ＜０．０５）。具体的には、ＳｕＴａｉＳｈｅｎｇ^RマウスＮＧＦ、ｍＮＧＦ１１８、２－１１８－Ｌ３Ｇ４－ＢＭおよび２－１１８－Ｌ３Ｆｃ１０－Ｍ３－５）で処理された平均角膜神経長は、それぞれ陰性対照群の約１．１４倍、１．１４倍、１．２１倍及び１．１８倍であった。上記の実験結果は、ＮＧＦ（ＳｕＴａｉＳｈｅｎｇ^RマウスＮＧＦ又はｍＮＧＦ１１８）又はＮＧＦ－Ｆｃ融合タンパク質（２－１１８－Ｌ３Ｇ４－ＢＭ又は２－１１８－Ｌ３Ｆｃ１０－Ｍ３－５）が、神経栄養性角膜炎によって引き起こされた角膜神経の損傷を効果的に改善できることを示した。

【0301】

配列表
配列番号1(変異型ヒト β-NGF, 118aa)
SSSHPIFHRGEESVCDSVSVWVGDKTTATDIKGKEVMVLGEVNINNSVFKQYFFETKCRDPNPVDSGCRGIDSKHWNSYCTTTHTFVKALTMDGKQAAWRFIRIDTACVCVLSRKAVR

配列番号2(変異型ヒト β-NGF, 120aa)
SSSHPIFHRGEESVCDSVSVWVGDKTTATDIKGKEVMVLGEVNINNSVFKQYFFETKCRDPNPVDSGCRGIDSKHWNSYCTTTHTFVKALTMDGKQAAWRFIRIDTACVCVLSRKAVRRA

配列番号3(野生型ヒト β-NGF, 118aa)
SSSHPIFHRGEFSVCDSVSVWVGDKTTATDIKGKEVMVLGEVNINNSVFKQYFFETKCRDPNPVDSGCRGIDSKHWNSYCTTTHTFVKALTMDGKQAAWRFIRIDTACVCVLSRKAVR

配列番号4(野生型ヒト β-NGF, 120aa)
SSSHPIFHRGEFSVCDSVSVWVGDKTTATDIKGKEVMVLGEVNINNSVFKQYFFETKCRDPNPVDSGCRGIDSKHWNSYCTTTHTFVKALTMDGKQAAWRFIRIDTACVCVLSRKAVRRA

配列番号5(NGF ポリペプチド, 103aa)
EPHSESNVPAGHTIPQAHWTKLQHSLDTALRRARSAPAAAIAARVAGQTRNITVDPRLFKKRRLRSPRVLFSTQPPREAADTQDLDFEVGGAAPFNRTHRSKR

配列番号6(NGF シグナルペプチド, 18aa)
MSMLFYTLITAFLIGIQA

配列番号7(ヒト野生型 IgG1 Fc IGHG1*05)
EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

配列番号8(ヒト野生型 IgG1 Fc IGHG1*03, 天然変異体)
EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

配列番号9(修飾 IgG1 Fc M1 [IGHG1*03に対するN297A])
EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

配列番号10(修飾 IgG1 Fc M1-5 [IGHG1*03に対するN297A, N' 5aa 切断])
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

配列番号11(修飾 IgG1 Fc M3 [IGHG1*03に対するL234A+L235A+P331S])
EPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPASIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

配列番号12(修飾 IgG1 Fc M3-5 [IGHG1*03に対するL234A+L235A+P331S, N' 5aa 切断])
DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPASIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

配列番号13(修飾 IgG1 Fc M5 [IGHG1*03に対するL234A+L235E+G237A+A330S+P331S])
EPKSCDKTHTCPPCPAPEAEGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

配列番号14(修飾 IgG1 Fc M5-5 [IGHG1*03に対するL234A+L235E+G237A+A330S+P331S, N' 5aa 切断])
DKTHTCPPCPAPEAEGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

配列番号15(修飾 IgG1 Fc M7 [IGHG1*03に対するE233P+L234V+L235A+G236del+A327G+A330S+P331S])
EPKSCDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

配列番号16(修飾 IgG1 Fc M7-5 [IGHG1*03に対するE233P+L234V+L235A+G236del+A327G+A330S+P331S, N' 5aa 切断])
DKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

配列番号17(ヒト野生型 IgG4 Fc)
ESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK

配列番号18(修飾 IgG4 Fc [S228P+F234A+L235A])
ESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK

配列番号19(修飾 IgG4 Fc-FD)
SKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

配列番号20(修飾 IgG2/4 Fc)
VERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK

配列番号21(FD-G4Fc核酸配列; シグナルペプチドはイタリック体、 プロペプチドは四角内、 β-NGF(野生型 118aa) は太字、リンカーに下線が引かれ、 修飾 IgG4 Fc はイタリック体で太字)
atgagcatgttgttctacactctgatcacagcttttctgatcggcatacaggcggaaccacactcagagagcaatgtccctgcaggacacaccatcccccaagcccactggactaaacttcagcattcccttgacactgcccttcgcagagcccgcagcgccccggcagcggcgatagctgcacgcgtggcggggcagacccgcaacattactgtggaccccaggctgtttaaaaagcggcgactccgttcaccccgtgtgctgtttagcacccagcctccccgtgaagctgcagacactcaggatctggacttcgaggtcggtggtgctgcccccttcaacaggactcacaggagcaagcggtcatcatcccatcccatcttccacaggggcgaattctcggtgtgtgacagtgtcagcgtgtgggttggggataagaccaccgccacagacatcaagggcaaggaggtgatggtgttgggagaggtgaacattaacaacagtgtattcaaacagtacttttttgagaccaagtgccgggacccaaatcccgttgacagcgggtgccggggcattgactcaaagcactggaactcatattgtaccacgactcacacctttgtcaaggcgctgaccatggatggcaagcaggctgcctggcggtttatccggatagatacggcctgtgtgtgtgtgctcagcaggaaggctgtgagaGGCTCCGGCGGCGGCTCCGGTGGCGGCGGCTCAGGAGGAGGAGGCTCCGGTGGTGGTGGTTCCTCCAAGTATGGCCCCCCCTGCCCCCCCTGCCCAGCACCTGAGTTCGAGGGGggaccatcagtcttcctgttccccccaaaacccaaggacactctcatgatctcccggacccctgaggtcacgtgcgtggtggtggacgtgagccaggaagaccccgaggtccagttcaactggtacgtggatggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagttcaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaacggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaaggcctcccgtcctccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagagccacaggtgtacaccctgcccccatcccaggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctaccccagcgacatcgccgtggagtgggaaagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaggctaaccgtggacaagagcaggtggcaggaggggaatgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacacagaagagcctctccctgtctCCGggtaaa

配列番号22(FD-G4Fcのアミノ酸配列; シグナルペプチドはイタリック体、 プロペプチドは四角内、 β-NGF(野生型 118aa) は太字、リンカーに下線が引かれ、 修飾 IgG4 Fc はイタリック体で太字)
MSMLFYTLITAFLIGIQAEPHSESNVPAGHTIPQAHWTKLQHSLDTALRRARSAPAAAIAARVAGQTRNITVDPRLFKKRRLRSPRVLFSTQPPREAADTQDLDFEVGGAAPFNRTHRSKRSSSHPIFHRGEFSVCDSVSVWVGDKTTATDIKGKEVMVLGEVNINNSVFKQYFFETKCRDPNPVDSGCRGIDSKHWNSYCTTTHTFVKALTMDGKQAAWRFIRIDTACVCVLSRKAVRGSGGGSGGGGSGGGGSGGGGSSKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

配列番号23(WM-G24Fcの核酸配列; シグナルペプチドはイタリック体、 プロペプチドは四角内、 β-NGF(野生型 118aa) は太字、リンカーに下線が引かれ、 修飾 IgG2/4 Fc はイタリック体で太字)
atgagcatgttgttctacactctgatcacagcttttctgatcggcatacaggcggaaccacactcagagagcaatgtccctgcaggacacaccatcccccaagcccactggactaaacttcagcattcccttgacactgcccttcgcagagcccgcagcgccccggcagcggcgatagctgcacgcgtggcggggcagacccgcaacattactgtggaccccaggctgtttaaaaagcggcgactccgttcaccccgtgtgctgtttagcacccagcctccccgtgaagctgcagacactcaggatctggacttcgaggtcggtggtgctgcccccttcaacaggactcacaggagcaagcggtcatcatcccatcccatcttccacaggggcgaattctcggtgtgtgacagtgtcagcgtgtgggttggggataagaccaccgccacagacatcaagggcaaggaggtgatggtgttgggagaggtgaacattaacaacagtgtattcaaacagtacttttttgagaccaagtgccgggacccaaatcccgttgacagcgggtgccggggcattgactcaaagcactggaactcatattgtaccacgactcacacctttgtcaaggcgctgaccatggatggcaagcaggctgcctggcggtttatccggatagatacggcctgtgtgtgtgtgctcagcaggaaggctgtgagaAAGACCGGCGGTGGCTCCGGCGGCGGCTCCGTGGAGCGGAAGTGCTGCGTGGAGTGCCCCCCCTGCCCCGCTCCCCCCGTGGCTGGACCATCAGTCTTCCTGTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCGTCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAGCCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAAAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAGGCTAACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGGAGGGGAATGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCTGGGTAAA

配列番号24(WM-G24Fcのアミノ酸配列; シグナルペプチドはイタリック体、 プロペプチドは四角内、 β-NGF(野生型 118aa) は太字、リンカーに下線が引かれ、 修飾 IgG2/4 Fc はイタリック体で太字)
MSMLFYTLITAFLIGIQAEPHSESNVPAGHTIPQAHWTKLQHSLDTALRRARSAPAAAIAARVAGQTRNITVDPRLFKKRRLRSPRVLFSTQPPREAADTQDLDFEVGGAAPFNRTHRSKRSSSHPIFHRGEFSVCDSVSVWVGDKTTATDIKGKEVMVLGEVNINNSVFKQYFFETKCRDPNPVDSGCRGIDSKHWNSYCTTTHTFVKALTMDGKQAAWRFIRIDTACVCVLSRKAVRKTGGGSGGGSVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK

配列番号25(NGF-1-15M7の核酸配列; シグナルペプチドはイタリック体、 プロペプチドは四角内、β-NGF(野生型 120aa) は太字、修飾IgG1 Fcはイタリック体で太字)
atgagcatgttgttctacactctgatcacagcttttctgatcggcatacaggcggaaccacactcagagagcaatgtccctgcaggacacaccatcccccaagcccactggactaaacttcagcattcccttgacactgcccttcgcagagcccgcagcgccccggcagcggcgatagctgcacgcgtggcggggcagacccgcaacattactgtggaccccaggctgtttaaaaagcggcgactccgttcaccccgtgtgctgtttagcacccagcctccccgtgaagctgcagacactcaggatctggacttcgaggtcggtggtgctgcccccttcaacaggactcacaggagcaagcggtcatcatcccatcccatcttccacaggggcgaattctcggtgtgtgacagtgtcagcgtgtgggttggggataagaccaccgccacagacatcaagggcaaggaggtgatggtgttgggagaggtgaacattaacaacagtgtattcaaacagtacttttttgagaccaagtgccgggacccaaatcccgttgacagcgggtgccggggcattgactcaaagcactggaactcatattgtaccacgactcacacctttgtcaaggcgctgaccatggatggcaagcaggctgcctggcggtttatccggatagatacggcctgtgtgtgtgtgctcagcaggaaggctgtgagaagagccGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTCCAGTCGCAGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCATCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCCCCGGGTAAA

配列番号26(NGF-1-15M7のアミノ酸配列; シグナルペプチドはイタリック体、 プロペプチドは四角内、β-NGF(野生型 120aa) は太字、 修飾IgG1 Fcはイタリック体で太字)
MSMLFYTLITAFLIGIQAEPHSESNVPAGHTIPQAHWTKLQHSLDTALRRARSAPAAAIAARVAGQTRNITVDPRLFKKRRLRSPRVLFSTQPPREAADTQDLDFEVGGAAPFNRTHRSKRSSSHPIFHRGEFSVCDSVSVWVGDKTTATDIKGKEVMVLGEVNINNSVFKQYFFETKCRDPNPVDSGCRGIDSKHWNSYCTTTHTFVKALTMDGKQAAWRFIRIDTACVCVLSRKAVRRAEPKSCDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

配列番号27(NGF-L3Fc10M7-5の核酸配列; シグナルペプチドはイタリック体、 プロペプチドは四角内、β-NGF(野生型 120aa) は太字、リンカーに下線が引かれ、 修飾IgG1 Fcはイタリック体で太字)
atgagcatgttgttctacactctgatcacagcttttctgatcggcatacaggcggaaccacactcagagagcaatgtccctgcaggacacaccatcccccaagcccactggactaaacttcagcattcccttgacactgcccttcgcagagcccgcagcgccccggcagcggcgatagctgcacgcgtggcggggcagacccgcaacattactgtggaccccaggctgtttaaaaagcggcgactccgttcaccccgtgtgctgtttagcacccagcctccccgtgaagctgcagacactcaggatctggacttcgaggtcggtggtgctgcccccttcaacaggactcacaggagcaagcggtcatcatcccatcccatcttccacaggggcgaattctcggtgtgtgacagtgtcagcgtgtgggttggggataagaccaccgccacagacatcaagggcaaggaggtgatggtgttgggagaggtgaacattaacaacagtgtattcaaacagtacttttttgagaccaagtgccgggacccaaatcccgttgacagcgggtgccggggcattgactcaaagcactggaactcatattgtaccacgactcacacctttgtcaaggcgctgaccatggatggcaagcaggctgcctggcggtttatccggatagatacggcctgtgtgtgtgtgctcagcaggaaggctgtgagaagagccggcggtggcggctccggcggtggcggctccggcggtggcggctccGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTCCTGTCGCCGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCATCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCCCCGGGTAAA

配列番号28(NGF-L3Fc10M7-5のアミノ酸配列; シグナルペプチドはイタリック体、 プロペプチドは四角内、β-NGF(野生型 120aa) は太字、リンカーに下線が引かれ、 修飾IgG1 Fcはイタリック体で太字)
MSMLFYTLITAFLIGIQAEPHSESNVPAGHTIPQAHWTKLQHSLDTALRRARSAPAAAIAARVAGQTRNITVDPRLFKKRRLRSPRVLFSTQPPREAADTQDLDFEVGGAAPFNRTHRSKRSSSHPIFHRGEFSVCDSVSVWVGDKTTATDIKGKEVMVLGEVNINNSVFKQYFFETKCRDPNPVDSGCRGIDSKHWNSYCTTTHTFVKALTMDGKQAAWRFIRIDTACVCVLSRKAVRRAGGGGSGGGGSGGGGSDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

配列番号29(2-1-15M7の核酸配列; シグナルペプチドはイタリック体、 プロペプチドは四角内、β-NGF(変異体120aa) は太字、修飾IgG1 Fcはイタリック体で太字)
atgagcatgttgttctacactctgatcacagcttttctgatcggcatacaggcggaaccacactcagagagcaatgtccctgcaggacacaccatcccccaagcccactggactaaacttcagcattcccttgacactgcccttcgcagagcccgcagcgccccggcagcggcgatagctgcacgcgtggcggggcagacccgcaacattactgtggaccccaggctgtttaaaaagcggcgactccgttcaccccgtgtgctgtttagcacccagcctccccgtgaagctgcagacactcaggatctggacttcgaggtcggtggtgctgcccccttcaacaggactcacaggagcaagcggtcatcatcccatcccatcttccacaggggcgaagagtcggtgtgtgacagtgtcagcgtgtgggttggggataagaccaccgccacagacatcaagggcaaggaggtgatggtgttgggagaggtgaacattaacaacagtgtattcaaacagtacttttttgagaccaagtgccgggacccaaatcccgttgacagcgggtgccggggcattgactcaaagcactggaactcatattgtaccacgactcacacctttgtcaaggcgctgaccatggatggcaagcaggctgcctggcggtttatccggatagatacggcctgtgtgtgtgtgctcagcaggaaggctgtgagaagagccGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTCCAGTCGCAGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCATCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCCCCGGGTAAA

配列番号30(2-1-15M7のアミノ酸配列; シグナルペプチドはイタリック体、 プロペプチドは四角内、β-NGF(変異体120aa) は太字、 修飾IgG1 Fcはイタリック体で太字)
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配列番号31(NGF-4-12PAAの核酸配列; シグナルペプチドはイタリック体、 プロペプチドは四角内、β-NGF(野生型 120aa) は太字、修飾IgG4 Fcはイタリック体で太字)
atgagcatgttgttctacactctgatcacagcttttctgatcggcatacaggcggaaccacactcagagagcaatgtccctgcaggacacaccatcccccaagcccactggactaaacttcagcattcccttgacactgcccttcgcagagcccgcagcgccccggcagcggcgatagctgcacgcgtggcggggcagacccgcaacattactgtggaccccaggctgtttaaaaagcggcgactccgttcaccccgtgtgctgtttagcacccagcctccccgtgaagctgcagacactcaggatctggacttcgaggtcggtggtgctgcccccttcaacaggactcacaggagcaagcggtcatcatcccatcccatcttccacaggggcgaattctcggtgtgtgacagtgtcagcgtgtgggttggggataagaccaccgccacagacatcaagggcaaggaggtgatggtgttgggagaggtgaacattaacaacagtgtattcaaacagtacttttttgagaccaagtgccgggacccaaatcccgttgacagcgggtgccggggcattgactcaaagcactggaactcatattgtaccacgactcacacctttgtcaaggcgctgaccatggatggcaagcaggctgcctggcggtttatccggatagatacggcctgtgtgtgtgtgctcagcaggaaggctgtgagaagagccgagtccaaatatggtcccccatgcccaccctgcccagcacctgaggctgcggggggaccatcagtcttcctgttccccccaaaacccaaggacactctcatgatctcccggacccctgaggtcacgtgcgtggtggtggacgtgagccaggaagaccccgaggtccagttcaactggtacgtggatggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagttcaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaacggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaaggcctcccgtcctccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagagccacaggtgtacaccctgcccccatcccaggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctaccccagcgacatcgccgtggagtgggaaagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaggctaaccgtggacaagagcaggtggcaggaggggaatgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacacagaagagcctctccctgtctctgggtaaa

配列番号32(NGF-4-12PAAのアミノ酸配列; シグナルペプチドはイタリック体、 プロペプチドは四角内、β-NGF(野生型 120aa) は太字、修飾IgG4 Fcはイタリック体で太字)
MSMLFYTLITAFLIGIQAEPHSESNVPAGHTIPQAHWTKLQHSLDTALRRARSAPAAAIAARVAGQTRNITVDPRLFKKRRLRSPRVLFSTQPPREAADTQDLDFEVGGAAPFNRTHRSKRSSSHPIFHRGEFSVCDSVSVWVGDKTTATDIKGKEVMVLGEVNINNSVFKQYFFETKCRDPNPVDSGCRGIDSKHWNSYCTTTHTFVKALTMDGKQAAWRFIRIDTACVCVLSRKAVRRAESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK

配列番号33(2-118-L3Fc10-M1-5の核酸配列; シグナルペプチドはイタリック体、 プロペプチドは四角内、β-NGF(変異体118aa)は太字、リンカーに下線が引かれ、 修飾IgG1 Fcはイタリック体で太字)
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配列番号34(2-118-L3Fc10-M1-5のアミノ酸配列; シグナルペプチドはイタリック体、 プロペプチドは四角内、β-NGF(変異体118aa)は太字、リンカーに下線が引かれ、 修飾IgG1 Fcはイタリック体で太字)
MSMLFYTLITAFLIGIQAEPHSESNVPAGHTIPQAHWTKLQHSLDTALRRARSAPAAAIAARVAGQTRNITVDPRLFKKRRLRSPRVLFSTQPPREAADTQDLDFEVGGAAPFNRTHRSKRSSSHPIFHRGEESVCDSVSVWVGDKTTATDIKGKEVMVLGEVNINNSVFKQYFFETKCRDPNPVDSGCRGIDSKHWNSYCTTTHTFVKALTMDGKQAAWRFIRIDTACVCVLSRKAVRGGGGSGGGGSGGGGSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

配列番号35(2-118-L3Fc10-M3-5の核酸配列; シグナルペプチドはイタリック体、 プロペプチドは四角内、β-NGF(変異体118aa)は太字、リンカーに下線が引かれ、 修飾IgG1 Fcはイタリック体で太字)
atgagcatgttgttctacactctgatcacagcttttctgatcggcatacaggcggaaccacactcagagagcaatgtccctgcaggacacaccatcccccaagcccactggactaaacttcagcattcccttgacactgcccttcgcagagcccgcagcgccccggcagcggcgatagctgcacgcgtggcggggcagacccgcaacattactgtggaccccaggctgtttaaaaagcggcgactccgttcaccccgtgtgctgtttagcacccagcctccccgtgaagctgcagacactcaggatctggacttcgaggtcggtggtgctgcccccttcaacaggactcacaggagcaagcggtcatcatcccatcccatcttccacaggggcgaagagtcggtgtgtgacagtgtcagcgtgtgggttggggataagaccaccgccacagacatcaagggcaaggaggtgatggtgttgggagaggtgaacattaacaacagtgtattcaaacagtacttttttgagaccaagtgccgggacccaaatcccgttgacagcgggtgccggggcattgactcaaagcactggaactcatattgtaccacgactcacacctttgtcaaggcgctgaccatggatggcaagcaggctgcctggcggtttatccggatagatacggcctgtgtgtgtgtgctcagcaggaaggctgtgagaggcggtggcggctccggcggtggcggctccggcggtggcggctccgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaagccgctgggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcctccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctatagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtccccgggtaaa

配列番号36(2-118-L3Fc10-M3-5のアミノ酸配列; シグナルペプチドはイタリック体、 プロペプチドは四角内、β-NGF(変異体118aa)は太字、リンカーに下線が引かれ、 修飾IgG1 Fcはイタリック体で太字)
MSMLFYTLITAFLIGIQAEPHSESNVPAGHTIPQAHWTKLQHSLDTALRRARSAPAAAIAARVAGQTRNITVDPRLFKKRRLRSPRVLFSTQPPREAADTQDLDFEVGGAAPFNRTHRSKRSSSHPIFHRGEESVCDSVSVWVGDKTTATDIKGKEVMVLGEVNINNSVFKQYFFETKCRDPNPVDSGCRGIDSKHWNSYCTTTHTFVKALTMDGKQAAWRFIRIDTACVCVLSRKAVRGGGGSGGGGSGGGGSDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPASIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

配列番号37(NGF-118-L3Fc10-M3-5の核酸配列; シグナルペプチドはイタリック体、 プロペプチドは四角内、β-NGF(野生型 118aa)は太字、リンカーに下線が引かれ、 修飾IgG1 Fcはイタリック体で太字)
atgagcatgttgttctacactctgatcacagcttttctgatcggcatacaggcggaaccacactcagagagcaatgtccctgcaggacacaccatcccccaagcccactggactaaacttcagcattcccttgacactgcccttcgcagagcccgcagcgccccggcagcggcgatagctgcacgcgtggcggggcagacccgcaacattactgtggaccccaggctgtttaaaaagcggcgactccgttcaccccgtgtgctgtttagcacccagcctccccgtgaagctgcagacactcaggatctggacttcgaggtcggtggtgctgcccccttcaacaggactcacaggagcaagcggtcatcatcccatcccatcttccacaggggcgaattctcggtgtgtgacagtgtcagcgtgtgggttggggataagaccaccgccacagacatcaagggcaaggaggtgatggtgttgggagaggtgaacattaacaacagtgtattcaaacagtacttttttgagaccaagtgccgggacccaaatcccgttgacagcgggtgccggggcattgactcaaagcactggaactcatattgtaccacgactcacacctttgtcaaggcgctgaccatggatggcaagcaggctgcctggcggtttatccggatagatacggcctgtgtgtgtgtgctcagcaggaaggctgtgagaggcggtggcggctccggcggtggcggctccggcggtggcggctccgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaagccgctgggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcctccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctatagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtccccgggtaaa

配列番号38(NGF-118-L3Fc10-M3-5のアミノ酸配列; シグナルペプチドはイタリック体、 プロペプチドは四角内、β-NGF(野生型 118aa)は太字、リンカーに下線が引かれ、 修飾IgG1 Fcはイタリック体で太字)
MSMLFYTLITAFLIGIQAEPHSESNVPAGHTIPQAHWTKLQHSLDTALRRARSAPAAAIAARVAGQTRNITVDPRLFKKRRLRSPRVLFSTQPPREAADTQDLDFEVGGAAPFNRTHRSKRSSSHPIFHRGEFSVCDSVSVWVGDKTTATDIKGKEVMVLGEVNINNSVFKQYFFETKCRDPNPVDSGCRGIDSKHWNSYCTTTHTFVKALTMDGKQAAWRFIRIDTACVCVLSRKAVRGGGGSGGGGSGGGGSDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPASIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

配列番号39(2-L3Fc10-M3-5の核酸配列; シグナルペプチドはイタリック体、 プロペプチドは四角内、β-NGF(変異体120aa)は太字、リンカーに下線が引かれ、 修飾IgG1 Fcはイタリック体で太字)
atgagcatgttgttctacactctgatcacagcttttctgatcggcatacaggcggaaccacactcagagagcaatgtccctgcaggacacaccatcccccaagcccactggactaaacttcagcattcccttgacactgcccttcgcagagcccgcagcgccccggcagcggcgatagctgcacgcgtggcggggcagacccgcaacattactgtggaccccaggctgtttaaaaagcggcgactccgttcaccccgtgtgctgtttagcacccagcctccccgtgaagctgcagacactcaggatctggacttcgaggtcggtggtgctgcccccttcaacaggactcacaggagcaagcggtcatcatcccatcccatcttccacaggggcgaagagtcggtgtgtgacagtgtcagcgtgtgggttggggataagaccaccgccacagacatcaagggcaaggaggtgatggtgttgggagaggtgaacattaacaacagtgtattcaaacagtacttttttgagaccaagtgccgggacccaaatcccgttgacagcgggtgccggggcattgactcaaagcactggaactcatattgtaccacgactcacacctttgtcaaggcgctgaccatggatggcaagcaggctgcctggcggtttatccggatagatacggcctgtgtgtgtgtgctcagcaggaaggctgtgagaagagccggcggtggcggctccggcggtggcggctccggcggtggcggctccgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaagccgctgggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcctccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctatagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtccccgggtaaa

配列番号40(2-L3Fc10-M3-5のアミノ酸配列; シグナルペプチドはイタリック体、 プロペプチドは四角内、β-NGF(変異体120aa)は太字、リンカーに下線が引かれ、 修飾IgG1 Fcはイタリック体で太字)
MSMLFYTLITAFLIGIQAEPHSESNVPAGHTIPQAHWTKLQHSLDTALRRARSAPAAAIAARVAGQTRNITVDPRLFKKRRLRSPRVLFSTQPPREAADTQDLDFEVGGAAPFNRTHRSKRSSSHPIFHRGEESVCDSVSVWVGDKTTATDIKGKEVMVLGEVNINNSVFKQYFFETKCRDPNPVDSGCRGIDSKHWNSYCTTTHTFVKALTMDGKQAAWRFIRIDTACVCVLSRKAVRRAGGGGSGGGGSGGGGSDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPASIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

配列番号41(2-118-L3Fc10-M5-5の核酸配列; シグナルペプチドはイタリック体、 プロペプチドは四角内、β-NGF(変異体118aa)は太字、リンカーに下線が引かれ、 修飾IgG1 Fcはイタリック体で太字)
atgagcatgttgttctacactctgatcacagcttttctgatcggcatacaggcggaaccacactcagagagcaatgtccctgcaggacacaccatcccccaagcccactggactaaacttcagcattcccttgacactgcccttcgcagagcccgcagcgccccggcagcggcgatagctgcacgcgtggcggggcagacccgcaacattactgtggaccccaggctgtttaaaaagcggcgactccgttcaccccgtgtgctgtttagcacccagcctccccgtgaagctgcagacactcaggatctggacttcgaggtcggtggtgctgcccccttcaacaggactcacaggagcaagcggtcatcatcccatcccatcttccacaggggcgaagagtcggtgtgtgacagtgtcagcgtgtgggttggggataagaccaccgccacagacatcaagggcaaggaggtgatggtgttgggagaggtgaacattaacaacagtgtattcaaacagtacttttttgagaccaagtgccgggacccaaatcccgttgacagcgggtgccggggcattgactcaaagcactggaactcatattgtaccacgactcacacctttgtcaaggcgctgaccatggatggcaagcaggctgcctggcggtttatccggatagatacggcctgtgtgtgtgtgctcagcaggaaggctgtgagaggcggtggcggctccggcggtggcggctccggcggtggcggctccGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCTGAGGGGGCACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAAGCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCCCCGGGTAAA

配列番号42(2-118-L3Fc10-M5-5のアミノ酸配列; シグナルペプチドはイタリック体、 プロペプチドは四角内、β-NGF(変異体118aa)は太字、リンカーに下線が引かれ、 修飾IgG1 Fcはイタリック体で太字)
MSMLFYTLITAFLIGIQAEPHSESNVPAGHTIPQAHWTKLQHSLDTALRRARSAPAAAIAARVAGQTRNITVDPRLFKKRRLRSPRVLFSTQPPREAADTQDLDFEVGGAAPFNRTHRSKRSSSHPIFHRGEESVCDSVSVWVGDKTTATDIKGKEVMVLGEVNINNSVFKQYFFETKCRDPNPVDSGCRGIDSKHWNSYCTTTHTFVKALTMDGKQAAWRFIRIDTACVCVLSRKAVRGGGGSGGGGSGGGGSDKTHTCPPCPAPEAEGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

配列番号43(2-118-L3Fc10M7-5の核酸配列; シグナルペプチドはイタリック体、 プロペプチドは四角内、β-NGF(変異体118aa)は太字、リンカーに下線が引かれ、 修飾IgG1 Fcはイタリック体で太字)
atgagcatgttgttctacactctgatcacagcttttctgatcggcatacaggcggaaccacactcagagagcaatgtccctgcaggacacaccatcccccaagcccactggactaaacttcagcattcccttgacactgcccttcgcagagcccgcagcgccccggcagcggcgatagctgcacgcgtggcggggcagacccgcaacattactgtggaccccaggctgtttaaaaagcggcgactccgttcaccccgtgtgctgtttagcacccagcctccccgtgaagctgcagacactcaggatctggacttcgaggtcggtggtgctgcccccttcaacaggactcacaggagcaagcggtcatcatcccatcccatcttccacaggggcgaagagtcggtgtgtgacagtgtcagcgtgtgggttggggataagaccaccgccacagacatcaagggcaaggaggtgatggtgttgggagaggtgaacattaacaacagtgtattcaaacagtacttttttgagaccaagtgccgggacccaaatcccgttgacagcgggtgccggggcattgactcaaagcactggaactcatattgtaccacgactcacacctttgtcaaggcgctgaccatggatggcaagcaggctgcctggcggtttatccggatagatacggcctgtgtgtgtgtgctcagcaggaaggctgtgagaggcggtggcggctccggcggtggcggctccggcggtggcggctccGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTCCTGTCGCCGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCATCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCCCCGGGTAAA

配列番号44(2-118-L3Fc10M7-5のアミノ酸配列; シグナルペプチドはイタリック体、 プロペプチドは四角内、β-NGF(変異体118aa)は太字、リンカーに下線が引かれ、 修飾IgG1 Fcはイタリック体で太字)
MSMLFYTLITAFLIGIQAEPHSESNVPAGHTIPQAHWTKLQHSLDTALRRARSAPAAAIAARVAGQTRNITVDPRLFKKRRLRSPRVLFSTQPPREAADTQDLDFEVGGAAPFNRTHRSKRSSSHPIFHRGEESVCDSVSVWVGDKTTATDIKGKEVMVLGEVNINNSVFKQYFFETKCRDPNPVDSGCRGIDSKHWNSYCTTTHTFVKALTMDGKQAAWRFIRIDTACVCVLSRKAVRGGGGSGGGGSGGGGSDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

配列番号45(2-118-L3G4-BMの核酸配列; シグナルペプチドはイタリック体、 プロペプチドは四角内、β-NGF(変異体118aa)は太字、リンカーに下線が引かれ、 修飾IgG4 Fcはイタリック体で太字)
atgagcatgttgttctacactctgatcacagcttttctgatcggcatacaggcggaaccacactcagagagcaatgtccctgcaggacacaccatcccccaagcccactggactaaacttcagcattcccttgacactgcccttcgcagagcccgcagcgccccggcagcggcgatagctgcacgcgtggcggggcagacccgcaacattactgtggaccccaggctgtttaaaaagcggcgactccgttcaccccgtgtgctgtttagcacccagcctccccgtgaagctgcagacactcaggatctggacttcgaggtcggtggtgctgcccccttcaacaggactcacaggagcaagcggtcatcatcccatcccatcttccacaggggcgaagagtcggtgtgtgacagtgtcagcgtgtgggttggggataagaccaccgccacagacatcaagggcaaggaggtgatggtgttgggagaggtgaacattaacaacagtgtattcaaacagtacttttttgagaccaagtgccgggacccaaatcccgttgacagcgggtgccggggcattgactcaaagcactggaactcatattgtaccacgactcacacctttgtcaaggcgctgaccatggatggcaagcaggctgcctggcggtttatccggatagatacggcctgtgtgtgtgtgctcagcaggaaggctgtgagaGGAGGGGGAGGCGGAGGTTCAGGGGGTGGTGGTTCCGGcGGCGGGGGATCCGCCgagtccaaatatggtcccccatgcccaccctgcccagcacctgaggctgcggggggaccatcagtcttcctgttccccccaaaacccaaggacactctcatgatctcccggacccctgaggtcacgtgcgtggtggtggacgtgagccaggaagaccccgaggtccagttcaactggtacgtggatggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagttcaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaacggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaaggcctcccgtcctccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagagccacaggtgtacaccctgcccccatcccaggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctaccccagcgacatcgccgtggagtgggaaagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaggctaaccgtggacaagagcaggtggcaggaggggaatgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacacagaagagcctctccctgtctctgggtaaa

配列番号46(2-118-L3G4-BMのアミノ酸配列; シグナルペプチドはイタリック体、 プロペプチドは四角内、β-NGF(変異体118aa)は太字、リンカーに下線が引かれ、 修飾IgG4 Fcはイタリック体で太字)
MSMLFYTLITAFLIGIQAEPHSESNVPAGHTIPQAHWTKLQHSLDTALRRARSAPAAAIAARVAGQTRNITVDPRLFKKRRLRSPRVLFSTQPPREAADTQDLDFEVGGAAPFNRTHRSKRSSSHPIFHRGEESVCDSVSVWVGDKTTATDIKGKEVMVLGEVNINNSVFKQYFFETKCRDPNPVDSGCRGIDSKHWNSYCTTTHTFVKALTMDGKQAAWRFIRIDTACVCVLSRKAVRGGGGGGSGGGGSGGGGSAESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK

配列番号47(変異型ヒト プレプロNGF, 239aa; シグナルペプチドはイタリック体、 プロペプチドは四角内、β-NGF(変異体118aa)は太字)
MSMLFYTLITAFLIGIQAEPHSESNVPAGHTIPQAHWTKLQHSLDTALRRARSAPAAAIAARVAGQTRNITVDPRLFKKRRLRSPRVLFSTQPPREAADTQDLDFEVGGAAPFNRTHRSKRSSSHPIFHRGEESVCDSVSVWVGDKTTATDIKGKEVMVLGEVNINNSVFKQYFFETKCRDPNPVDSGCRGIDSKHWNSYCTTTHTFVKALTMDGKQAAWRFIRIDTACVCVLSRKAVR

配列番号48(変異型ヒト プレプロNGF, 241aa; シグナルペプチドはイタリック体、 プロペプチドは四角内、β-NGF(変異体120aa)は太字)
MSMLFYTLITAFLIGIQAEPHSESNVPAGHTIPQAHWTKLQHSLDTALRRARSAPAAAIAARVAGQTRNITVDPRLFKKRRLRSPRVLFSTQPPREAADTQDLDFEVGGAAPFNRTHRSKRSSSHPIFHRGEESVCDSVSVWVGDKTTATDIKGKEVMVLGEVNINNSVFKQYFFETKCRDPNPVDSGCRGIDSKHWNSYCTTTHTFVKALTMDGKQAAWRFIRIDTACVCVLSRKAVRRA

配列番号49(野生型ヒト プレプロNGF, 239aa; シグナルペプチドはイタリック体、 プロペプチドは四角内、β-NGF(野生型 118aa)は太字)
MSMLFYTLITAFLIGIQAEPHSESNVPAGHTIPQAHWTKLQHSLDTALRRARSAPAAAIAARVAGQTRNITVDPRLFKKRRLRSPRVLFSTQPPREAADTQDLDFEVGGAAPFNRTHRSKRSSSHPIFHRGEFSVCDSVSVWVGDKTTATDIKGKEVMVLGEVNINNSVFKQYFFETKCRDPNPVDSGCRGIDSKHWNSYCTTTHTFVKALTMDGKQAAWRFIRIDTACVCVLSRKAVR

配列番号50(野生型ヒト プレプロNGF, 241aa; シグナルペプチドはイタリック体、 プロペプチドは四角内、β-NGF(野生型 120aa)は太字)
MSMLFYTLITAFLIGIQAEPHSESNVPAGHTIPQAHWTKLQHSLDTALRRARSAPAAAIAARVAGQTRNITVDPRLFKKRRLRSPRVLFSTQPPREAADTQDLDFEVGGAAPFNRTHRSKRSSSHPIFHRGEFSVCDSVSVWVGDKTTATDIKGKEVMVLGEVNINNSVFKQYFFETKCRDPNPVDSGCRGIDSKHWNSYCTTTHTFVKALTMDGKQAAWRFIRIDTACVCVLSRKAVRRA

配列番号51(変異型ヒト proNGF, 221aa; プロペプチドは四角内、β-NGF(変異体118aa)は太字)
EPHSESNVPAGHTIPQAHWTKLQHSLDTALRRARSAPAAAIAARVAGQTRNITVDPRLFKKRRLRSPRVLFSTQPPREAADTQDLDFEVGGAAPFNRTHRSKRSSSHPIFHRGEESVCDSVSVWVGDKTTATDIKGKEVMVLGEVNINNSVFKQYFFETKCRDPNPVDSGCRGIDSKHWNSYCTTTHTFVKALTMDGKQAAWRFIRIDTACVCVLSRKAVR

配列番号52(変異型ヒト proNGF, 223aa; プロペプチドは四角内、β-NGF(変異体120aa)は太字)
EPHSESNVPAGHTIPQAHWTKLQHSLDTALRRARSAPAAAIAARVAGQTRNITVDPRLFKKRRLRSPRVLFSTQPPREAADTQDLDFEVGGAAPFNRTHRSKRSSSHPIFHRGEESVCDSVSVWVGDKTTATDIKGKEVMVLGEVNINNSVFKQYFFETKCRDPNPVDSGCRGIDSKHWNSYCTTTHTFVKALTMDGKQAAWRFIRIDTACVCVLSRKAVRRA

配列番号53(野生型ヒト proNGF, 221aa; プロペプチドは四角内、β-NGF(野生型 118aa)は太字)
EPHSESNVPAGHTIPQAHWTKLQHSLDTALRRARSAPAAAIAARVAGQTRNITVDPRLFKKRRLRSPRVLFSTQPPREAADTQDLDFEVGGAAPFNRTHRSKRSSSHPIFHRGEFSVCDSVSVWVGDKTTATDIKGKEVMVLGEVNINNSVFKQYFFETKCRDPNPVDSGCRGIDSKHWNSYCTTTHTFVKALTMDGKQAAWRFIRIDTACVCVLSRKAVR

配列番号54(野生型ヒト proNGF, 223aa; プロペプチドは四角内、β-NGF(野生型 120aa)は太字)
EPHSESNVPAGHTIPQAHWTKLQHSLDTALRRARSAPAAAIAARVAGQTRNITVDPRLFKKRRLRSPRVLFSTQPPREAADTQDLDFEVGGAAPFNRTHRSKRSSSHPIFHRGEFSVCDSVSVWVGDKTTATDIKGKEVMVLGEVNINNSVFKQYFFETKCRDPNPVDSGCRGIDSKHWNSYCTTTHTFVKALTMDGKQAAWRFIRIDTACVCVLSRKAVRRA

配列番号55(成熟FD-G4Fcのアミノ酸配列; β-NGF(野生型 118aa) は太字、リンカーに下線が引かれ、修飾 IgG4 Fcはイタリック体で太字)
SSSHPIFHRGEFSVCDSVSVWVGDKTTATDIKGKEVMVLGEVNINNSVFKQYFFETKCRDPNPVDSGCRGIDSKHWNSYCTTTHTFVKALTMDGKQAAWRFIRIDTACVCVLSRKAVRGSGGGSGGGGSGGGGSGGGGSSKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

配列番号56(成熟WM-G24Fcのアミノ酸配列;β-NGF(野生型 118aa) は太字、リンカーに下線が引かれ、修飾 IgG2/4 Fcはイタリック体で太字)
SSSHPIFHRGEFSVCDSVSVWVGDKTTATDIKGKEVMVLGEVNINNSVFKQYFFETKCRDPNPVDSGCRGIDSKHWNSYCTTTHTFVKALTMDGKQAAWRFIRIDTACVCVLSRKAVRKTGGGSGGGSVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK

配列番号57(成熟NGF-1-15M7のアミノ酸配列;β-NGF(野生型 120aa) は太字、修飾 IgG1 Fcはイタリック体で太字)
SSSHPIFHRGEFSVCDSVSVWVGDKTTATDIKGKEVMVLGEVNINNSVFKQYFFETKCRDPNPVDSGCRGIDSKHWNSYCTTTHTFVKALTMDGKQAAWRFIRIDTACVCVLSRKAVRRAEPKSCDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

配列番号58(成熟NGF-L3Fc10M7-5のアミノ酸配列;β-NGF(野生型 120aa) は太字、リンカーに下線が引かれ、修飾 IgG1 Fcはイタリック体で太字)
SSSHPIFHRGEFSVCDSVSVWVGDKTTATDIKGKEVMVLGEVNINNSVFKQYFFETKCRDPNPVDSGCRGIDSKHWNSYCTTTHTFVKALTMDGKQAAWRFIRIDTACVCVLSRKAVRRAGGGGSGGGGSGGGGSDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

配列番号59( 成熟2-1-15M7のアミノ酸配列;β-NGF(変異体120aa)は太字、修飾 IgG1 Fcはイタリック体で太字)
SSSHPIFHRGEESVCDSVSVWVGDKTTATDIKGKEVMVLGEVNINNSVFKQYFFETKCRDPNPVDSGCRGIDSKHWNSYCTTTHTFVKALTMDGKQAAWRFIRIDTACVCVLSRKAVRRAEPKSCDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

配列番号60(成熟NGF-4-12PAAのアミノ酸配列;β-NGF(野生型 120aa)は太字、修飾 IgG4 Fcはイタリック体で太字)
SSSHPIFHRGEFSVCDSVSVWVGDKTTATDIKGKEVMVLGEVNINNSVFKQYFFETKCRDPNPVDSGCRGIDSKHWNSYCTTTHTFVKALTMDGKQAAWRFIRIDTACVCVLSRKAVRRAESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK

配列番号61(成熟2-118-L3Fc10-M1-5のアミノ酸配列;β-NGF(変異体118aa)は太字、リンカーに下線が引かれ、修飾 IgG1 Fcはイタリック体で太字)
SSSHPIFHRGEESVCDSVSVWVGDKTTATDIKGKEVMVLGEVNINNSVFKQYFFETKCRDPNPVDSGCRGIDSKHWNSYCTTTHTFVKALTMDGKQAAWRFIRIDTACVCVLSRKAVRGGGGSGGGGSGGGGSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

配列番号62(成熟2-118-L3Fc10-M3-5のアミノ酸配列;β-NGF(変異体118aa)は太字、リンカーに下線が引かれ、修飾 IgG1 Fcはイタリック体で太字)
SSSHPIFHRGEESVCDSVSVWVGDKTTATDIKGKEVMVLGEVNINNSVFKQYFFETKCRDPNPVDSGCRGIDSKHWNSYCTTTHTFVKALTMDGKQAAWRFIRIDTACVCVLSRKAVRGGGGSGGGGSGGGGSDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPASIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

配列番号63(成熟NGF-118-L3Fc10-M3-5のアミノ酸配列;β-NGF(野生型 118aa)は太字、リンカーに下線が引かれ、修飾 IgG1 Fcはイタリック体で太字)
SSSHPIFHRGEFSVCDSVSVWVGDKTTATDIKGKEVMVLGEVNINNSVFKQYFFETKCRDPNPVDSGCRGIDSKHWNSYCTTTHTFVKALTMDGKQAAWRFIRIDTACVCVLSRKAVRGGGGSGGGGSGGGGSDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPASIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

配列番号64(成熟2-L3Fc10-M3-5のアミノ酸配列;β-NGF(変異体120aa)は太字、リンカーに下線が引かれ、修飾 IgG1 Fcはイタリック体で太字)
SSSHPIFHRGEESVCDSVSVWVGDKTTATDIKGKEVMVLGEVNINNSVFKQYFFETKCRDPNPVDSGCRGIDSKHWNSYCTTTHTFVKALTMDGKQAAWRFIRIDTACVCVLSRKAVRRAGGGGSGGGGSGGGGSDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPASIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

配列番号65(成熟2-118-L3Fc10-M5-5のアミノ酸配列;β-NGF(変異体118aa)は太字、リンカーに下線が引かれ、修飾 IgG1 Fcはイタリック体で太字)
SSSHPIFHRGEESVCDSVSVWVGDKTTATDIKGKEVMVLGEVNINNSVFKQYFFETKCRDPNPVDSGCRGIDSKHWNSYCTTTHTFVKALTMDGKQAAWRFIRIDTACVCVLSRKAVRGGGGSGGGGSGGGGSDKTHTCPPCPAPEAEGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

配列番号66(成熟2-118-L3Fc10M7-5のアミノ酸配列;β-NGF(変異体118aa)は太字、リンカーに下線が引かれ、修飾 IgG1 Fcはイタリック体で太字)
SSSHPIFHRGEESVCDSVSVWVGDKTTATDIKGKEVMVLGEVNINNSVFKQYFFETKCRDPNPVDSGCRGIDSKHWNSYCTTTHTFVKALTMDGKQAAWRFIRIDTACVCVLSRKAVRGGGGSGGGGSGGGGSDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

配列番号67(成熟2-118-L3G4-BMのアミノ酸配列;β-NGF(変異体118aa)は太字、リンカーに下線が引かれ、修飾 IgG4 Fcはイタリック体で太字)
SSSHPIFHRGEESVCDSVSVWVGDKTTATDIKGKEVMVLGEVNINNSVFKQYFFETKCRDPNPVDSGCRGIDSKHWNSYCTTTHTFVKALTMDGKQAAWRFIRIDTACVCVLSRKAVRGGGGGGSGGGGSGGGGSAESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK

配列番号68(リンカー)
GGGGSGGGGSGGGGS

配列番号69(リンカー)
GGGGGGSGGGGSGGGGSA

配列番号70(リンカー; nは少なくとも1の整数である)
(GGGGS)_n

配列番号71(リンカー)
GSGGGSGGGGSGGGGSGGGGS

配列番号72(リンカー)
KTGGGSGGGS

配列番号73(リンカー; nは少なくとも1の整数である)
(G)_n

配列番号74(リンカー; nは少なくとも1の整数である)
(GS)_n

配列番号75(リンカー; nは少なくとも1の整数である)
(GGS)_n

配列番号76(リンカー; nは少なくとも1の整数である)
(GGGS)_n

配列番号77(リンカー; nは少なくとも1の整数である)
(GGS)_n(GGGS)_n

配列番号78(リンカー; nは少なくとも1の整数である)
(GSGGS)_n

配列番号79(リンカー; nは少なくとも1の整数である)
(GGSGS)_n

配列番号80(リンカー)
GSGGGSGGGGSGGGGS

配列番号81(リンカー)
GGGSGGGGSGGGGS

配列番号82(リンカー)
GGGSGGSGGS

配列番号83(リンカー)
GGSGGSGGSGGSGGG

配列番号84(リンカー)
GGSGGSGGGGSGGGGS

配列番号85(リンカー)
GGSGGSGGSGGSGGSGGS

配列番号86(リンカー)
GG

配列番号87(リンカー)
GGSG

配列番号88(リンカー)
GGSGG

配列番号89(リンカー)
GSGSG

配列番号90(リンカー)
GSGGG

配列番号91(リンカー)
GGGSG

配列番号92(リンカー)
GSSSG

配列番号93(リンカー)
GGSGGS

配列番号94(リンカー)
SGGGGS

配列番号95(リンカー)
GGGGS

配列番号96(リンカー; nは少なくとも1の整数である)
(GA)_n

配列番号97(リンカー)
GRAGGGGAGGGG

配列番号98(リンカー)
GRAGGG

配列番号99(リンカー)
ASTKGP

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図1D】

【図1E】

【図1F】

【図2】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図3D】

【図3E】

【図3F】

【図3G】

【図3H】

【図3I】

【図3J】

【図3K】

【図3L】

【図3M】

【図4A】

【図4B】

【図4C】

【図4D】

【図4E】

【図4F】

【図4G】

【図4H】

【図4I】

【図4J】

【図4K】

【図4L】

【図4M】

【図5A】

【図5B】

【図6A】

【図6B】

【図6C】

【図6D】

【図7A】

【図7B】

【図8】

【図9A】

【図9B】

【図9C】

【図10A】

【図10B】

【配列表】

2023551440000001.app

【手続補正書】

【提出日】2023-07-27

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【請求項1】

Ｎ端からＣ端までＮＧＦ部分とＦｃ部分とを含むポリペプチドであって、前記ＮＧＦ部分は配列番号１～３のうちのいずれか１つで示されるアミノ酸配列を含み、前記Ｆｃ部分はＩｇＧ１ Ｆｃ又はＩｇＧ４ Ｆｃに由来する、持効型神経成長因子（ＮＧＦ）ポリペプチド。

【請求項2】

前記ＮＧＦ部分がポリペプチドリンカーを介してＦｃ部分に融合されていて、
前記ポリペプチドリンカーは配列番号６８～７２のうちのいずれか１つで示されるアミノ酸配列を含み、かつ／或いは、
前記ポリペプチドリンカーはアミノ酸配列（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号７０、ただし、前記ｎが１、２、３、４、５及び６のうちのいずれか１つである）を含む、請求項１に記載の持効型ＮＧＦポリペプチド。

【請求項3】

前記Ｆｃ部分がＩｇＧ１ Ｆｃに由来し、
前記Ｆｃ部分が配列番号７又は８のアミノ酸配列を含み、かつ／或いは、
前記Ｆｃ部分が、配列番号８に対するＥ２３３、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｇ２３６、Ｇ２３７、Ｎ２９７、Ａ３２７、Ａ３３０及びＰ３３１から選択された１つ又は複数の位置に変異を含み、かつ／或いは、
前記Ｆｃ部分が、配列番号８に対してＥ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ｖ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｇ２３６ｄｅｌ、Ｇ２３７Ａ、Ｎ２９７Ａ、Ａ３２７Ｇ、Ａ３３０Ｓ及びＰ３３１Ｓから選択された１つ又は複数の変異を含み、かつ／或いは、
前記Ｆｃ部分が、配列番号７又は８のアミノ酸配列の最初の５個のアミノ酸をさらに欠失している、請求項１又は２に記載の持効型ＮＧＦポリペプチド。

【請求項4】

前記Ｆｃ部分が、配列番号８に対してＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、およびＰ３３１Ｓ変異を含み、かつ／或いは、
前記Ｆｃ部分が配列番号１１又は１２のアミノ酸配列を含む、請求項３に記載の持効型ＮＧＦポリペプチド。

【請求項5】

前記持効型ＮＧＦポリペプチドが、配列番号６２～６４のうちのいずれか１つで示されるアミノ酸配列を含む、請求項４に記載の持効型ＮＧＦポリペプチド。

【請求項6】

前記Ｆｃ部分が、配列番号８に対してＥ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ｖ、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３６ｄｅｌ、Ａ３２７Ｇ、Ａ３３０Ｓ及びＰ３３１Ｓ変異を含み、かつ／或いは、
前記Ｆｃ部分が配列番号１５又は１６のアミノ酸配列を含む、請求項３に記載の持効型ＮＧＦポリペプチド。

【請求項7】

前記持効型ＮＧＦポリペプチドが配列番号６６のアミノ酸配列を含む、請求項６に記載の持効型ＮＧＦポリペプチド。

【請求項8】

前記Ｆｃ部分が、配列番号８に対してＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｇ２３７Ａ、Ａ３３０Ｓ及びＰ３３１Ｓ変異を含み、かつ／或いは、
前記Ｆｃ部分が配列番号１３又は１４のアミノ酸配列を含む、請求項３に記載の持効型ＮＧＦポリペプチド。

【請求項9】

前記持効型ＮＧＦポリペプチドが配列番号６５のアミノ酸配列を含む、請求項８に記載の持効型ＮＧＦポリペプチド。

【請求項10】

前記Ｆｃ部分が配列番号８に対してＮ２９７Ａ変異を含み、かつ／或いは、
前記Ｆｃ部分が配列番号９又は１０のアミノ酸配列を含む、請求項３に記載の持効型ＮＧＦポリペプチド。

【請求項11】

前記持効型ＮＧＦポリペプチドが配列番号６１のアミノ酸配列を含む、請求項１０に記載の持効型ＮＧＦポリペプチド。

【請求項12】

前記Ｆｃ部分がＩｇＧ４ Ｆｃに由来し、
前記Ｆｃ部分が配列番号１７のアミノ酸配列を含み、かつ／或いは、
前記Ｆｃ部分が、配列番号１７に対するＳ２２８、Ｆ２３４及びＬ２３５から選択された１つ又は複数の位置に変異を含み、かつ／或いは、
前記Ｆｃ部分が、配列番号１７に対してＳ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ及びＬ２３５Ａから選択された１つ又は複数の変異を含み、かつ／或いは、
前記Ｆｃ部分が配列番号１８のアミノ酸配列を含む、請求項１又は２に記載の持効型ＮＧＦポリペプチド。

【請求項13】

前記持効型ＮＧＦポリペプチドが配列番号６７のアミノ酸配列を含む、請求項１２に記載の持効型ＮＧＦポリペプチド。

【請求項14】

静脈注射、筋肉注射、眼内注射又は皮下注射によってヒト個体に投与された場合、少なくとも１０時間の半減期を有し、かつ／或いは、
前記持効型ＮＧＦポリペプチドは、配列番号３又は４のアミノ酸配列を有するＮＧＦ部分を含むＮＧＦポリペプチドと比較して、引き起こした痛みが少ない、請求項１又は２に記載の持効型ＮＧＦポリペプチド。

【請求項15】

請求項１～１４のいずれか１項に記載の持効型ＮＧＦポリペプチドをコードする、単離された核酸。

【請求項16】

請求項１５に記載の単離された核酸を含む、ベクター。

【請求項17】

請求項１６に記載のベクターを含む、宿主細胞。

【請求項18】

請求項１～１４のいずれか１項に記載の持効型ＮＧＦポリペプチド、又は請求項１５に記載の単離された核酸、又は請求項１６に記載のベクター、又は請求項１７に記載の宿主細胞と、薬学的に許容されるキャリア及び／又は賦形剤とを含む、医薬組成物。

【請求項19】

個体におけるＮＧＦ関連疾患を治療するために用いられ、
前記ＮＧＦ関連疾患は、神経系疾患又は非神経系疾患であり；
好ましくは、
前記神経系疾患は、新生児低酸素性虚血性脳症、脳性麻痺、重症疾患ミオパシー、神経性難聴、反回神経損傷、外傷性脳損傷、歯神経損傷、脳卒中、ダウン症、筋萎縮性脊髓側索硬化症、多発性硬化症、脊髓性筋萎縮症、びまん性脳損傷、胸腺異形成、視神経挫傷、濾胞性異形成、脊髓損傷、緑内障、神経栄養性角膜炎、視神経損傷、視神経脊髄炎、網膜関連疾患、尿失禁、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、認知症、高血圧性脳出血神経機能障害、脳小血管疾患、急性虚血性脳卒中、角膜内皮ジストロフィー、糖尿病性神経障害、糖尿病性足潰瘍、神経性皮膚潰瘍、褥瘡、神経栄養性角膜潰瘍、糖尿病性角膜潰瘍及び黄斑円孔からなる群より選択され、かつ／或いは、
前記非神経系疾患は、脾臓萎縮、脾臓挫傷、卵巣予備能低下、早発卵巣不全、卵巣過剰刺激症候群、卵巣遺残症候群、卵胞異形成、精子形成障害（例えば、精子軽減症、精子無力症、精子軽減無力症）、虚血性潰瘍、ストレス性潰瘍、リウマチ性潰瘍、肝線維症、角膜潰瘍、火傷、口腔潰瘍及び静脈性下肢潰瘍からなる群より選択され；
より好ましくは、
前記神経系疾患は、糖尿病性神経障害、アルツハイマー病、又は神経栄養性角膜炎であり、かつ／或いは、
前記非神経系疾患は、早発卵巣不全又は精子形成障害である、請求項１８に記載の医薬組成物。

【請求項20】

前記医薬組成物が一個体当たり０．０１μｇ～１０００μｇの用量で投与され、かつ／或いは、
前記医薬組成物が１週間に１回又は１ヶ月間に１回の投与頻度で投与され、かつ／或いは、
前記医薬組成物が経口、皮下、静脈、脳内、鼻腔内、経皮、腹腔内、筋肉内、肺内、膣内、直腸内若しくは眼内より投与されるか、又は局所に投与される、請求項１８に記載の医薬組成物。

【国際調査報告】