特表 2023-551502 トリ種における腸炎症状態を分類する方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-12-08

(54)【発明の名称】トリ種における腸炎症状態を分類する方法

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/68 20180101AFI20231201BHJP

   C12Q 1/6869 20180101ALI20231201BHJP

   C12Q 1/6883 20180101ALN20231201BHJP

【ＦＩ】

C12Q1/68

C12Q1/6869 Z

C12Q1/6883 Z

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023532521

(86)(22)【出願日】2021-11-22

(85)【翻訳文提出日】2023-07-11

(86)【国際出願番号】 EP2021082444

(87)【国際公開番号】W WO2022117382

(87)【国際公開日】2022-06-09

(31)【優先権主張番号】20211764.4

(32)【優先日】2020-12-04

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】519414848

【氏名又は名称】エボニック オペレーションズ ゲーエムベーハー

【氏名又は名称原語表記】Ｅｖｏｎｉｋ Ｏｐｅｒａｔｉｏｎｓ ＧｍｂＨ

【住所又は居所原語表記】Ｒｅｌｌｉｎｇｈａｕｓｅｒ Ｓｔｒａｓｓｅ １－１１， ４５１２８ Ｅｓｓｅｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ

(74)【代理人】

【識別番号】110002538

【氏名又は名称】弁理士法人あしたば国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】フロリアン ボウル

(72)【発明者】

【氏名】フランク リッコー

(72)【発明者】

【氏名】ウォルター フェファルル

(72)【発明者】

【氏名】アンドレアス カッペル

(72)【発明者】

【氏名】ローズ ウェラン

(72)【発明者】

【氏名】グンテル ラダッズ

(72)【発明者】

【氏名】モニカ フルーゲル

(72)【発明者】

【氏名】ステファン ペルゼル

(72)【発明者】

【氏名】アチム マークス

(72)【発明者】

【氏名】エメリー ステファンズ

(72)【発明者】

【氏名】フランク シーマン

(72)【発明者】

【氏名】エメカ イグナチウス イグーウ

【テーマコード（参考）】

4B063

【Ｆターム（参考）】

4B063QA13

4B063QA19

4B063QQ02

4B063QQ08

4B063QQ42

4B063QR32

4B063QR72

4B063QS25

4B063QS36

4B063QX02

(57)【要約】

本発明は、トリ対象又は試験されるトリ対象の群の腸炎症状態を分類する方法であって、個々のトリ対象又は試験されるトリ対象の群に由来する腸試料材料から単離されたゲノムＤＮＡ中の予め選択されたＬＭＲのパネル内の平均メチル化レベルと、陰性の腸炎症状態を有する１つ又は複数の参照試料に関するゲノムＤＮＡ中のＬＭＲの同じパネルの平均メチル化レベルとの比較を含む方法を提供する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

トリ対象又は試験されるトリ対象の群、トリ試験対象の腸炎症状態を分類するための方法であって、前記方法が、
ａ．前記トリ試験対象に由来する腸試験試料から単離されたゲノムＤＮＡ中の予め選択された低メチル化領域（Ｌｏｗ－Ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ Ｒｅｇｉｏｎｓ、ＬＭＲ）のパネルの試験平均メチル化レベルを決定することと、
ｂ．ステップ（ａ）で得られた試験平均メチル化レベルを、腸炎症状態が陰性である少なくとも１つのトリ腸試料から単離されたゲノムＤＮＡ中のＬＭＲの同じパネルの参照平均メチル化レベルと比較することと、を含み、
前記試験平均メチル化レベルが、前記参照平均メチル化レベルと実質的に同様である場合、前記試験対象が陰性の腸炎症状態を有し、前記試験平均メチル化レベルが、前記参照平均メチル化レベルと異なる場合、前記試験対象が、陽性の腸炎症状態を有する、方法。

【請求項2】

前記ゲノムＤＮＡ中の前記ＬＭＲが、
‐１０％～５０％の範囲の平均メチル化を有し、
‐低ＣＧ密度の領域であり、
‐リジン４でモノメチル化されたヒストンＨ３（Ｈ３Ｋ４ｍｅ１）、ＤＮａｓｅ Ｉ高感受性部位（ＤＨＳ）及び転写コアクチベーターＣＲＥＢ結合タンパク質（ＣＰＢ）及びｐ３００が濃縮されており、
‐主に、遺伝子間領域又はイントロン領域のプロモーターの遠位に位置し、かつ
‐ＣｐＧ位置のいずれにも一塩基多型（ＳＮＰ）がない、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記陽性の腸炎症状態が、前記平均メチル化レベルに基づいて、重度に炎症を起こした、中程度に炎症を起こした、又は弱く炎症を起こしたクラスに更に分類される、請求項１又は２に記載の方法。

【請求項4】

前記ＬＭＲの予め選択されたパネルが、少なくとも１つの機械学習技術を使用して同定され得る、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項5】

前記ＬＭＲの予め選択されたパネルが、ランダムフォレスト解析と呼ばれる少なくとも１つの機械学習技術を使用して同定される、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項6】

前記予め選択されたＬＭＲのパネルが、ＬＭＲ１～ＬＭＲ１５のＬＭＲの以下のリストから選択される少なくとも５つのＬＭＲである、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項7】

前記予め選択されたＬＭＲのパネルが、ＬＭＲ１６～ＬＭＲ３０のＬＭＲの以下のリストから選択される少なくとも５つのＬＭＲである、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項8】

前記予め選択されたＬＭＲのパネルの平均メチル化レベルが、バイサルファイトシーケンシングを使用して決定される、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項9】

前記試験されるトリ対象又はトリ対象の群が、ニワトリ又はニワトリの群である、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項10】

前記腸試料及び腸試験試料が腸組織であり、前記腸組織が好ましくは回腸又は空腸である、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項11】

前記腸試験試料が、試験されるトリ対象の群に由来するプール試料である、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項12】

トリの腸試料の腸炎症状態を分類するための試験システムを開発するための方法であって、前記方法が、
ａ．既知の腸炎症状態を有するトリ対象又はトリ対象の群から得られた腸試料中のゲノムＤＮＡ中の低メチル化領域（ＬＭＲ）を検出することと、
ｂ．ＬＭＲの選択されたパネルの分類信頼性が前記既知の腸炎症状態の割り当てのために最適化されるように、各既知の腸炎症状態に適したステップ（ａ）の前記ＬＭＲからＬＭＲのパネルを選択することと、
ｃ．前記各既知の腸炎症状態について前記ＬＭＲの選択されたパネルの平均メチル化レベルを測定することと、
ｄ．それぞれの既知の腸炎症状態について、前記ＬＭＲの選択されたパネルの異なる参照平均メチル化レベルのライブラリーを生成することと、を含み、
腸試験試料から得られた平均メチル化レベルと前記ＬＭＲの前記選択されたパネルの前記参照平均メチル化レベルとの比較により、前記腸試験試料の前記腸炎症状態を分類することが可能になる、方法。

【請求項13】

前記ゲノムＤＮＡ中の前記ＬＭＲが、
‐１０％～５０％の範囲の平均メチル化を有し、
‐低ＣＧ密度の領域であり、
‐リジン４でモノメチル化されたヒストンＨ３（Ｈ３Ｋ４ｍｅ１）、ＤＮａｓｅ Ｉ高感受性部位（ＤＨＳ）及び転写コアクチベーターＣＲＥＢ結合タンパク質（ＣＰＢ）及びｐ３００が濃縮されており、
‐主に、遺伝子間領域又はイントロン領域のプロモーターの遠位に位置し、かつ
‐ＣｐＧ位置のいずれにも一塩基多型（ＳＮＰ）がない、請求項１２に記載の方法。

【請求項14】

前記ＬＭＲの選択されたパネルが、ＬＭＲ１～ＬＭＲ１５のＬＭＲの以下のリストから選択される少なくとも５つのＬＭＲである、請求項１２又は１３に記載の方法。

【請求項15】

前記ＬＭＲの選択されたパネルが、ＬＭＲ１６～ＬＭＲ３０のＬＭＲの以下のリストから選択される少なくとも５つのＬＭＲである、請求項１２～１４のいずれか一項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、腸炎症状態を分類するためのエピジェネティクスベースの方法、及びトリ腸試料の腸炎症状態をそれぞれ分類するための試験システムを開発するための方法に関する。

【背景技術】

【0002】

腸の健康は、家畜動物、特に家禽／ニワトリなどのトリ種の福祉及び性能にとって極めて重要である。胃腸管（ＧＩＴ）の構造的完全性に影響を及ぼす腸内疾患及び炎症過程は、体重増加の減少、飼料変換効率の低下、死亡率の増加及び薬剤費の増加による高い経済的損失をもたらす。

【0003】

無傷の腸バリアは、栄養素の消化及び吸収、宿主の代謝及びエネルギー生成、安定な微生物叢、粘液層の発達、バリア機能、及び粘膜免疫応答を含む多くの生理学的及び機能的特徴を提供する。体内の最大の器官として、腸は、望ましくない分子及び病原体を排除しながら、栄養素及び流体を体内に取り込むための選択的バリアとして機能する。したがって、適切な腸機能は、最適な健康状態及び身体全体のバランスを維持するために不可欠であり、環境からの外来抗原に対する防御の重要なラインを表す。

【0004】

最近、ニワトリにおける腸透過性に関する研究への関心が高まっており、小腸炎及び付随する腸バリア不全を測定するための異なる戦略がもたらされている。しかしながら、提案された戦略はいずれも、現場条件下で適用できないか、又は小腸炎に非特異的であるため、ブロイラー産業にとって良好なマーカーとはならない。

【0005】

したがって、トリ種における小腸炎及び付随する腸の完全性の乱れを正確に検出することができるマーカー又はマーカーのセットが非常に望ましいであろう。

【0006】

「エピジェネティック変化」、すなわちＤＮＡメチル化パターンの変化は、自然に起こるが、年齢、環境／生活様式、及び疾患状態を含むいくつかの因子によっても影響され得る。ＤＮＡメチル化は、遺伝子型の変化なしに遺伝子発現を調節し、したがって基礎となるＤＮＡ配列の変化を伴わない表現型の遺伝的変化であるが、代わりに、ＣｐＧジヌクレオチド（５’－Ｃ－リン酸－Ｇ－３’）、すなわち、その５’→３’方向に沿った塩基の線形配列においてシトシンヌクレオチドの後にグアニンヌクレオチドが続くＤＮＡの領域のメチル化によるＤＮＡの化学修飾を介して作用する。年齢及び／又は環境に応じて、多くの生物は、ＣｐＧアイランド及びキャニオン（低メチル化／メチル化なし、多くの場合プロモーター領域に関連する）及び低メチル化領域（ＬＭＲ）によって中断された組織特異的メチル化パターンを発症する。ＬＭＲは、動的メチロームの重要な特徴を表し、通常、転写因子結合の領域又は部位と一致し、これは環境因子に応答して占有されてもされなくてもよい。エピジェネティックパターンを変化させる環境の影響は、例えば、食事、疾患、微生物叢、温度、ストレスである。したがって、これらのメチル化パターンは、身体／組織とその環境との相互作用を示し、したがって、試験対象ｖｓ．対照群の年齢又は健康状態を分子レベルで評価するのに適した読み出しである。

【0007】

上記を考慮して、本発明の目的は、トリ対象又は対象群における小腸炎を正確かつ確実に検出することを可能にするエピジェネティックマーカーを提供することであった。

【発明の概要】

【0008】

上記の目的は、本発明による方法によって解決された。より具体的には、本発明は、トリ対象又は試験されるトリ対象の群の腸炎症状態を分類する方法に関し、個々のトリ対象又は試験されるトリ対象の群に由来している／由来する腸試料材料から単離されたゲノムＤＮＡ中の予め選択されたＬＭＲのパネル内の平均メチル化レベルと、陰性の腸炎症状態を有する１つ又は複数の参照試料に関するゲノムＤＮＡ中のＬＭＲの同じパネルの平均メチル化レベルとの比較を含む。

【0009】

本発明の別の態様では、提供されるのは、トリ対象又は試験されるトリ対象の群、トリ試験対象の腸炎症状態を分類するための方法であって、方法が、
ａ．トリ試験対象に由来する腸試験試料から単離されたゲノムＤＮＡ中の予め選択された低メチル化領域（Ｌｏｗ－Ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ Ｒｅｇｉｏｎｓ、ＬＭＲ）のパネルの試験平均メチル化レベルを決定することと、
ｂ．ステップ（ａ）で得られた試験平均メチル化レベルを、腸炎症状態が陰性である少なくとも１つのトリ腸試料から単離されたゲノムＤＮＡ中のＬＭＲの同じパネルの参照平均メチル化レベルと比較することと、を含み、
試験平均メチル化レベルが、参照平均メチル化レベルと実質的に同様である場合、試験対象が陰性の腸炎症状態を有し、試験平均メチル化レベルが、参照平均メチル化レベルと異なる場合、試験対象が、陽性の腸炎症状態を有する、方法である。

【0010】

本開示の文脈における「有意に類似する」という用語は、統計的手段（すなわち、バイオインフォマティクス）又は経験的観察のいずれかによって観察される類似性である。

【0011】

本発明の別の態様では、トリ腸試料の腸炎症状態を分類するための試験システム（「分類器」）を開発するための方法が提供される。特に、本方法は、
ａ．既知の腸炎症状態を有するトリ対象又はトリ対象の群から得られた腸試料中のゲノムＤＮＡ中の低メチル化領域（ＬＭＲ）を検出することと、
ｂ．ＬＭＲの選択されたパネルの分類信頼性が既知の腸炎症状態の割り当てのために最適化されるように、各既知の腸炎症状態に適したステップ（ａ）のＬＭＲからＬＭＲのパネルを選択するステップと、
ｃ．各既知の腸炎症状態についてＬＭＲの選択されたパネルの平均メチル化レベルを測定するステップと、
ｄ．それぞれの既知の腸炎症状態について、ＬＭＲの選択されたパネルの異なる参照平均メチル化レベルのライブラリーを生成するステップと、
を含み、
腸試験試料から得られた平均メチル化レベルとＬＭＲの選択されたパネルの参照平均メチル化レベルとの比較により、腸試験試料の腸炎症状態を分類することが可能になる。

【発明を実施するための形態】

【0012】

以下、本発明の要素を説明する。本明細書で使用される「［本］発明の」、「本発明に従って」、「本発明による」などの用語は、本明細書に記載及び／又は特許請求される本発明のすべての態様及び実施形態を指すことを意図している。本明細書で使用される場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」及び「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」の両方を包含すると解釈されるべきであり、両方の意味は具体的に意図されており、したがって本発明による個々に開示された実施形態である。

【0013】

文脈上別段の指示がない限り、上記の特徴の説明及び定義は、本発明の特定の態様又は実施形態に限定されず、記載されているすべての態様及び実施形態に等しく適用される。
「メチル化レベル」という用語は、０（＝非メチル化）～１（＝完全メチル化）の範囲であり得る特定のメチル化部位のレベルを指す。したがって、１つ又は複数のメチル化部位のメチル化レベルに基づいて、メチル化プロファイルを決定することができる。したがって、「メチル化」プロファイル」又は「メチル化パターン」という用語は、生物学的試料中の残基の任意の特定のストレッチにおけるメチル化Ｃ又は非メチル化Ｃの相対濃度又は絶対濃度を指す。例えば、ＤＮＡ配列内で典型的にメチル化されていないシトシン（Ｃ）残基が試料中でよりメチル化されている場合、それは「過剰メチル化」と呼ばれ得る。一方、ＤＮＡ配列内で典型的にメチル化されたシトシン（Ｃ）残基があまりメチル化されていない場合、「低メチル化」と呼ぶことができる。同様に、ＤＮＡ配列（例えば、試料核酸）内のシトシン（Ｃ）残基が、異なる領域又は異なる個体（例えば、正常な核酸と比較して）由来の別の配列と比較した場合、よりメチル化されている場合、その配列は、他の配列と比較して過剰メチル化されていると考えられる。あるいは、ＤＮＡ配列内のシトシン（Ｃ）残基が、異なる領域又は異なる個体に由来する別の配列と比較してメチル化が少ない場合、その配列は、他の配列と比較して低メチル化されていると考えられる。これらの配列は、「差次的にメチル化された」と言われる。例えば、炎症組織と非炎症組織との間でメチル化状態が異なる場合、配列は「差次的にメチル化されている」と考えられる。差次的メチル化のレベルの測定は、当業者に既知の様々な方法によって行われ得る。１つの方法は、非限定的な例として、バイサルファイトシーケンシング法によって決定された個々の調査されたＣｐＧ部位のメチル化レベルを測定することである。

【0014】

本明細書で使用される場合、「メチル化ヌクレオチド」又は「メチル化ヌクレオチド塩基」は、ヌクレオチド塩基上のメチル部分の存在を指し、メチル部分は、認識された典型的なヌクレオチド塩基には存在しない。例えば、シトシンは、そのピリミジン環にメチル部分を含有しないが、５－メチルシトシンは、そのピリミジン環の５位にメチル部分を含有する。したがって、シトシンはメチル化ヌクレオチドではなく、５－メチルシトシンはメチル化ヌクレオチドである。別の例では、チミンはそのピリミジン環の５位にメチル部分を含有するが、本明細書の目的では、チミンはＤＮＡの典型的なヌクレオチド塩基であるので、チミンはＤＮＡ中に存在する場合メチル化ヌクレオチドとは見なされない。ＤＮＡの典型的なヌクレオシド塩基は、チミン、アデニン、シトシン及びグアニンである。ＲＮＡの典型的な塩基は、ウラシル、アデニン、シトシン及びグアニンである。これに対応して、「メチル化部位」は、メチル化が起こる可能性がある標的遺伝子核酸領域内の位置である。例えば、ＣｐＧを含む位置は、シトシンがメチル化されていてもよいか、又はされていなくてもよいメチル化部位である。

【0015】

本明細書で使用される場合、「ＣｐＧ部位」又は「メチル化部位」は、インビボでの自然発生事象又はインビトロでヌクレオチドを化学的にメチル化するように開始された事象のいずれかによってメチル化されやすい核酸内のヌクレオチド又はヌクレオチドの配列である。

【0016】

本明細書で使用される場合、「メチル化核酸分子」は、メチル化されている／メチル化されている１つ又は複数のヌクレオチドを含む核酸分子を指す。

【0017】

本明細書で使用される「ＣｐＧアイランド」は、ＣｐＧ密度が上昇したＤＮＡ配列のセグメントを表す。例えば、Ｙａｍａｄａらは、ＣｐＧアイランドを決定するための一連の基準を記載している。それは少なくとも４００ヌクレオチド長でなければならず、５０％を超えるＧＣ含有量及び０．６を超えるＯＣＦ／ＥＣＦ比を有する（Ｙａｍａｄａ他、２００４、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１４、２４７～２６６）。他のものは、５０％を超えるＧＣ含有量及び０．６を超えるＯＣＦ／ＥＣＦ比を有する、少なくとも２００ヌクレオチド長の配列としてあまり厳密でないＣｐＧアイランドを定義している（Ｔａｋａｉら、２００２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．米国、９９、３７４０～３７４５）。

【0018】

本明細書で使用される「バイサルファイト」という用語は、亜硫酸水素ナトリウムなどの任意の適切な種類のバイサルファイト、又はメチル化シトシンを化学的に修飾することなくシトシン（Ｃ）をウラシル（Ｕ）に化学的に変換することができ、したがってＤＮＡのメチル化状態に基づいてＤＮＡ配列を差次的に修飾するために使用することができる他の化学薬剤を包含する、例えば、米国特許出願公開第２０１０／０１１２５９５号明細書（Ｍｅｎｃｈｅｎら）。本明細書で使用される場合、メチル化ＤＮＡ又は非メチル化ＤＮＡを「差次的に修飾する」試薬は、識別可能な生成物がメチル化ＤＮＡ及び非メチル化ＤＮＡから生じるプロセスにおいてメチル化ＤＮＡ及び／又は非メチル化ＤＮＡを修飾し、それによってＤＮＡメチル化状態の同定を可能にする任意の試薬を包含する。そのようなプロセスには、化学反応（例えば、バイサルファイトによるＣからＵへの変換）及び酵素処理（例えば、メチル化依存性エンドヌクレアーゼによる切断）が含まれ得るが、これらに限定されない。したがって、メチル化ＤＮＡを優先的に切断又は消化する酵素は、ＤＮＡがメチル化されている場合、ＤＮＡ分子をはるかに高い効率で切断又は消化することができる酵素であり、一方、非メチル化ＤＮＡを優先的に切断又は消化する酵素は、ＤＮＡがメチル化されていない場合、著しく高い効率を示す。

【0019】

任意の所与のメチル化部位におけるメチル化状態について試験するという文脈において、本発明はまた、任意の「非バイサルファイトベースの方法」及び「非バイサルファイトベースの定量的方法」を含む。そのような用語は、バイサルファイトの使用を必要としないメチル化又は非メチル化核酸を定量するための任意の方法を指す。この用語はまた、バイサルファイト処理を必要としない定量される核酸を調製するための方法を指す。非バイサルファイトベースの方法の例には、１つ又は複数のメチル化感受性酵素を使用して核酸を消化する方法、及びメチル化状態に基づいて核酸に結合する薬剤を使用して核酸を分離する方法が含まれるが、これらに限定されない。「メチル感受性酵素」及び「メチル化感受性制限酵素」という用語は、活性についてそれらのＤＮＡ認識部位のメチル化状態に依存するＤＮＡ制限エンドヌクレアーゼである。例えば、メチル化されていない場合にのみＤＮＡ認識配列で切断又は消化するメチル感受性酵素がある。したがって、非メチル化ＤＮＡ試料は、メチル化ＤＮＡ試料よりも小さな断片にカットされる。同様に、過剰メチル化ＤＮＡ試料は切断されない。対照的に、メチル化されている場合にのみＤＮＡ認識配列で切断するメチル感受性酵素が存在する。本明細書で使用される場合、「切断する」、「カットする」及び「消化する」という用語は互換的に使用される。

【0020】

本発明者らは、予想外にも、試験腸試料から単離されたゲノムＤＮＡ中の予め選択されたＬＭＲのパネル内の平均メチル化レベルを、陰性の腸炎症状態を有する１つ又は複数の参照試料に属するＬＭＲの同じパネルの平均メチル化レベルと比較することによって、トリ腸物質の炎症状態をうまく分類できることを見出した。「陰性の腸炎症状態」という用語は、炎症過程の徴候を含まない腸物質を指す。

【0021】

本発明の文脈において、「腸炎症」及び「小腸炎」という用語は互換的に使用され、同一の意味を有する。「腸炎症状態を分類する」という表現は、進行中の炎症過程があるか否かの分類（ＹＥＳ／ＮＯ）、並びに異なる炎症グレード（例えば、重度、中程度又は弱い炎症）への分類の両方を指す。特に、陽性の腸炎症状態は、平均メチル化レベルに基づいて、重度に炎症を起こした、中程度に炎症を起こした、又は弱く炎症を起こしたクラスに更に分類される。

【0022】

本発明の特定の態様では、方法は、
ａ．試験される対象又はトリ集団の腸試料からゲノムＤＮＡを単離するステップと、
ｂ．ステップ（ａ）で得られたゲノムＤＮＡ中の予め選択されたＬＭＲのパネルの平均メチル化レベルを決定するステップと、
ｃ．ステップ（ｂ）で得られた予め選択されたＬＭＲのパネルの平均メチル化レベルを、陰性の腸炎症状態を有する１つ又は複数の参照試料に属するゲノムＤＮＡ内のＬＭＲの同じパネルの平均メチル化レベルと比較するステップと、を含み、
試験試料のパネルＬＭＲの平均メチル化レベルが、１つ又は複数の所定の参照試料のうちの１つと有意に類似している場合、トリ対象又は試験されるトリ集団の腸炎症状態が、それぞれの参照試料の炎症状態と類似している。

【0023】

特に、方法は、
ａ．トリ試験対象に由来する腸試験試料から単離されたゲノムＤＮＡ中の予め選択された低メチル化領域（Ｌｏｗ－Ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ Ｒｅｇｉｏｎｓ、ＬＭＲ）のパネルの試験平均メチル化レベルを決定するステップと、
ｂ．ステップ（ａ）で得られた試験平均メチル化レベルを、腸炎症状態が陰性である少なくとも１つのトリ腸試料から単離されたゲノムＤＮＡ中のＬＭＲの同じパネルの参照平均メチル化レベルと比較するステップと、を含み、
試験平均メチル化レベルが、参照平均メチル化レベルと実質的に同様である場合、試験対象が陰性の腸炎症状態を有し、試験平均メチル化レベルが、参照平均メチル化レベルと異なる場合、試験対象が、陽性の腸炎症状態を有する。

【0024】

本明細書で使用される場合、「予め選択されたＬＭＲのパネル」という用語は、５以上の鎖特異的カバレッジを示すＣｐＧを有するＬＭＲのパネルを指す。更に、一塩基多型（ＳＮＰ）として既知のＣｐＧ部位を除外することができる。特に、当技術分野で既知の任意の方法を使用して、ゲノムＤＮＡ中のＬＭＲを同定又は検出することができる。周知の方法には、ＭｅｔｈｙｌＳｅｅｋＲなどのプログラムを使用することが含まれる。特に、ゲノムＤＮＡ中のＬＭＲは、少なくとも３つの連続するＣｐＧを有し、ＣｐＧ位置のいずれにも一塩基多型（ＳＮＰ）を有さない。更に、ＬＭＲは、その領域中のＣｐＧの６０％未満がメチル化されているゲノムの領域である。より具体的には、ＬＭＲ中のＣｐＧの５０％、４０％、３０％、２０％又は１０％未満がメチル化されている。更により具体的には、ゲノムＤＮＡ中のＬＭＲは、少なくともＢｕｒｇｅｒ，Ｌ．、（２０１３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、４１（１６）：ｅ１５５及び／又はＳｔａｄｌｅｒ，Ｍ．、（２０１１）Ｎａｔｕｒｅ ４８０、４９０－４９５に開示されている方法に基づいて同定される。ＬＭＲは、１０％～５０％の範囲の平均メチル化を有することが既知であり、低ＣＧ密度の領域であり、Ｈ３Ｋ４ｍｅ１、ＤＨＳ及びｐ３００／ＣＢＰが濃縮される傾向があり、かつ／又は主として遺伝子間領域又はイントロン領域のプロモーターの遠位に位置する。特に、ＬＭＲは
・１０％～５０％の範囲の平均メチル化を有し、
・低ＣＧ密度の領域であり、
・リジン４でモノメチル化されたヒストンＨ３（Ｈ３Ｋ４ｍｅ１）、ＤＮａｓｅ Ｉ高感受性部位（ＤＨＳ）及び転写コアクチベーターＣＲＥＢ結合タンパク質（ＣＰＢ）及びｐ３００が濃縮されており、
・主に、遺伝子間領域又はイントロン領域のプロモーターの遠位に位置し、かつ／又は
・ＣｐＧ位置のいずれにも一塩基多型（ＳＮＰ）がない。

【0025】

ゲノムＤＮＡのＬＭＲが同定されると、ＬＭＲのパネルが選択され得る。ＬＭＲのパネルは、当技術分野で既知の任意の方法を使用して選択され得る。特に、ＬＭＲの同じパネルを使用してトリ腸炎症を分類することができる。すなわち、ＬＭＲの同じパネルの平均メチル化レベルを使用して、試験試料が陽性又は陰性の腸炎症を有するかどうかを分類し、陽性に炎症を起こした腸が重度、中程度又は弱に炎症を起こしているかどうかを更に分類することができる。

【0026】

一例では、本発明の任意の態様に従って使用されるＬＭＲのパネルは、ランダムフォレスト（Ｂｒｅｉｍａｎ Ｌ（２００１）．「Ｒａｎｄｏｍ Ｆｏｒｅｓｔｓ」．Ｍａｃｈｉｎｅ Ｌｅａｒｎｉｎｇ．４５（１）：５－３２．ｄｏｉ：１０．１０２３／Ａ：１０１０９３３４０４３２４）などの機械学習技術を使用して最終的に選択され得る。有利にはランダムフォレスト予測器である機械学習システムは、ゲノムＬＭＲ内の平均メチル化値に基づいて、個別化された動物の腸炎症状態を学習する。前記プロセスは、例示的なセクションに更に示されている。

【0027】

ＬＭＲのパネルは、有利には、分類信頼性が異なる炎症状態クラスの割り当てのために最適化されるように予め選択される。

【0028】

予め選択されたＬＭＲのパネルは、ランダムフォレスト解析のような機械学習技術を使用して精度を最適化することができる。特に、予め選択されたＬＭＲのパネルは、ＬＭＲ１～ＬＭＲ１５のＬＭＲの以下のリストから選択される少なくとも２つのＬＭＲである。

【0029】

【表0-1】

【0030】

より具体的には、予め選択されたＬＭＲのパネルは、ＬＭＲ１～ＬＭＲ１５のＬＭＲのリストから選択された少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５個のＬＭＲである。更により具体的には、予め選択されたＬＭＲのパネルは少なくとも１２個であり、ＬＭＲはＬＭＲ１～ＬＭＲ１５のＬＭＲのリストから選択される。

【0031】

別の例では、ＬＭＲのパネルは、陰性の腸炎症状態を有する少なくとも１つのトリ腸試料由来のゲノムＤＮＡ由来のＬＭＲと、陽性の腸炎症状態を有する少なくとも１つのトリ腸試料由来のゲノムＤＮＡ由来のＬＭＲとの間の最大メチル化差などの他の方法に基づいて選択され得る。これらの方法を実施することは、十分に当業者の一般的な知識の範囲内である。特に、予め選択されたＬＭＲのパネルは、ＬＭＲ１６～ＬＭＲ３０のＬＭＲの以下のリストから選択される少なくとも２つのＬＭＲである。

【0032】

【表0-2】

【0033】

より具体的には、予め選択されたＬＭＲのパネルは、ＬＭＲ１６～ＬＭＲ３０のＬＭＲのリストから選択された少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５個のＬＭＲである。更により具体的には、予め選択されたＬＭＲのパネルは少なくとも１２個であり、ＬＭＲはＬＭＲ１６～ＬＭＲ３０のＬＭＲのリストから選択される。
試験される個々のトリ対象又はトリ対象の群に由来する腸試料材料から単離されたゲノムＤＮＡ中の予め選択されたＬＭＲのパネル内の平均メチル化レベルを決定するステップは、バイサルファイト変換プロセスを含み得る。ここで、ゲノムＤＮＡ中のシトシン残基はウラシルに変換され、ゲノムＤＮＡ中の５－メチルシトシン残基はウラシルに変換されない。

【0034】

全ゲノムバイサルファイトシーケンシングは、ゲノムＤＮＡの亜硫酸水素ナトリウム変換に基づくＤＮＡメチル化のゲノムワイド分析であり、次いで次世代シーケンシングプラットフォームでシーケンシングされる。次いで、配列を参照ゲノムにアラインメントして、非メチル化シトシンのウラシルへの変換から生じるミスマッチに基づいてＣｐＧジヌクレオチドのメチル化状態を決定する。

【0035】

例えば、メチル化レベルは、市販のＩｌｌｕｍｉｎａ（商標）シーケンシング又はアレイプラットフォームを使用して測定することができる。

【0036】

試験されるトリ対象又はトリ対象の群は、ニワトリ、シチメンチョウ、アヒル及びガチョウなどの家禽であり得る。好ましくは、試験されるトリ対象又はトリ対象の群は、ニワトリである。

【0037】

腸試料材料は、腸組織であってよく、前記腸組織は好ましくは回腸又は空腸である。あるいは、腸試料材料は、糞便などの腸粘膜を含む試料材料であり得る。

【0038】

特定の例では、腸試料材料は、試験されるトリ対象の群に由来するプール試料である。

【0039】

本発明の別の態様によれば、トリ腸試料の腸炎症状態を分類するための試験システムを開発するための方法が提供され、
方法は、
ａ．既知の腸炎症状態を有するトリ対象又はトリ対象の群から得られた１つ又は複数の腸試料を提供するステップと、
ｂ．ステップ（ａ）で得られた１つ又は複数の腸試料のそれぞれに含まれるゲノムＤＮＡ内の１つ又は複数のＬＭＲの平均メチル化レベルを決定するステップと、
ｃ．ステップ（ｂ）の１つ又は複数のＬＭＲから、ＬＭＲのパネルの分類信頼性が各既知の炎症状態の割り当てのために最適化されるように、ＬＭＲのパネルを選択するステップと、
ｄ．各既知の腸炎症状態についてパネルＬＭＲ参照メチル化プロファイルを割り当てるステップと、を含み、
腸試験試料から得られた平均メチル化レベルとパネルＬＭＲ参照メチル化プロファイルとの比較が、腸試験試料の腸炎症状態を分類することを可能にする。
特に、提供されるのは、トリの腸試料の腸炎症状態を分類するための試験システムを開発するための方法であって、方法が、
ａ．既知の腸炎症状態を有するトリ対象又はトリ対象の群から得られた腸試料中のゲノムＤＮＡ中の低メチル化領域（ＬＭＲ）を検出することと、
ｂ．ＬＭＲの選択されたパネルの分類信頼性が既知の腸炎症状態の割り当てのために最適化されるように、各既知の腸炎症状態に適したステップ（ａ）のＬＭＲからＬＭＲのパネルを選択することと、
ｃ．各既知の腸炎症状態についてＬＭＲの選択されたパネルの平均メチル化レベルを測定することと、
ｄ．それぞれの既知の腸炎症状態について、ＬＭＲの選択されたパネルの異なる参照平均メチル化レベルのライブラリーを生成することと、を含み、
腸試験試料から得られた平均メチル化レベルとＬＭＲの選択されたパネルの参照平均メチル化レベルとの比較により、腸試験試料の腸炎症状態を分類することが可能になる、方法である。

【0040】

特に、異なる参照平均メチル化レベルのライブラリーは、参照試料が陽性又は陰性の腸炎症を有したかどうか、更に陽性の腸炎症が重度、中程度又は弱いかどうかに応じて、異なる参照平均メチル化レベルを有するＬＭＲの単一パネルに基づく。

【図面の簡単な説明】

【0041】

【図1】Ｒパッケージランダムフォレストのコマンドｒｆｃｖを適用した、１００個のＬＭＲを開始入力とする反復ランダムフォレスト３倍交差検証の分類誤差。この図は、誤差が１３個のＬＭＲから始まって非常に小さくなることを示している。６個のＬＭＲでは、予測電力が減少し、誤差が大幅に増加する。

【図2】例示的なセクションで記載されるような腸炎症状態のニワトリＤＮＡメチル化ランダムフォレスト分類器の確立。

【実施例】

【0042】

本発明の特定の態様及び実施形態を、例として、本明細書に記載の説明、図及び表を参照して説明する。本発明の方法、使用及び他の態様のそのような例は、代表的なものにすぎず、本発明の範囲をそのような代表的な例のみに限定するものと解釈されるべきではない。
方法

【0043】

ブロイラー研究を、業界標準の三相トウモロコシ－ダイズミール食餌を与えたＲｏｓｓ ３０８雄ブロイラーを用いて、１－３５日目からのすべての栄養要求を満たすように配合して行った（表１）。

【0044】

【表1】

【0045】

ＤＮＡ抽出（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＰｕｒｅＬｉｎｋゲノムＤＮＡ単離キット）及びバイサルファイトシーケンシングのために、生理学的に健康な３羽の鳥を、それぞれ３、１５及び３５日目に安楽死させて脾臓、腸（回腸）及び筋肉（大胸筋）試料を切除した。
試料

【0046】

動物を２つの群（それぞれ３つの時点で炎症あり及び非炎症あり）に層別化した。これらの２つの群のそれぞれから、９匹の独立した動物からＤＮＡを調製し、１８個のゲノムＤＮＡ試料を得た。
全ゲノムバイサルファイトシーケンシング

【0047】

ライブラリーは、Ｓｗｉｆｔ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製のＡｃｃｅｌ－ＮＧＳメチル－Ｓｅｑ ＤＮＡライブラリーキットを使用して調製した。２つのシーケンシングライブラリーを１つのシーケンシングレーンにバーコード化した。シーケンシングを、１０５ヌクレオチドのリード長を有する標準的なペアエンドシーケンシングプロトコルを使用してＩｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ Ｘプラットフォームで行った。

【0048】

【表2】

【0049】

リードをトリミングし、参照配列としてＧａｌｌｕｓ ｇａｌｌｕｓゲノムアセンブリバージョン５．０（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｅｎａ／ｄａｔａ／ｖｉｅｗ／ＧＣＡ＿０００００２３１５．３）を使用して、ＢＳＭＡＰ ２．５（Ｘｉ Ｙ，Ｌｉ Ｗ．２００９．ＢＳＭＡＰ：全ゲノムバイサルファイト配列ＭＡＰｐｉｎｇプログラム．ＢＭＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ １０：２３２．ｄｏｉ：１０．１１８６／１４７１－２１０５－１０－２３２．）でマッピングした。Ｐｉｃａｒｄツール（ｈｔｔｐ：／／ｂｒｏａｄｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．ｇｉｔｈｕｂ．ｉｏ／ｐｉｃａｒｄ）を用いて重複物を除去した。メチル化レベルは、ＢＳＭＡＰパッケージと共に配布されるＰｙｔｈｏｎスクリプト（ｍｅｔｈｒａｔｉｏ．ｐｙ）を使用して、あるゲノム位置にメチル化ＣｐＧを有するリードの数をこの位置をカバーする全リードの数で割ることによって決定した。
メチル化データのＳＮＰフィルタリング

【0050】

Ｇａｌｌｕｓ ｇａｌｌｕｓゲノムについてデータベースｄｂＳＮＰにＳＮＰとして列挙されているすべてのＣｐＧを除外した。ＬＭＲベースのランダムフォレストについては、分析を低メチル化領域内のＣｐＧに限定し、シーケンシングされた試料のいずれにおいても５を超える鎖特異的カバレッジを示し、６７，６５１個のＬＭＲのセットを得た。
腸炎症状態のニワトリＤＮＡメチル化ランダムフォレスト分類器の確立
ランダムフォレスト予測値（Ｒパッケージランダムフォレスト［ｈｔｔｐｓ：／／ｃｒａｎ．ｒ－ｐｒｏｊｅｃｔ．ｏｒｇ／ｗｅｂ／ｐａｃｋａｇｅｓ／ｒａｎｄｏｍＦｏｒｅｓｔ／］に実装）を適用して、ＬＭＲの平均メチル化値に基づいて動物の腸炎症状態を学習した。これは、ＬＭＲのセット全体を１０．０００個のＬＭＲのチャンクに分割し、各分割で２５０個の候補特徴（ＬＭＲ）を使用して１００の木を適合させることによって、各チャンクをアルゴリズムの入力として使用することによって行われた。可変重要度「減少＿精度」について０より大きい値を示した各チャンクからのすべてのＬＭＲをプールした。これを１０回繰り返し、各ＬＭＲについて、これらの１０回の繰り返しのプールされたセットにおいてそれが見出された頻度をカウントした。最も多く発生した１００個のＬＭＲを保持した。次に、入力として使用される特徴の数を段階的に減少させるパッケージランダムフォレストのコマンドｒｆｃｖを適用して、これらの１００個のＬＭＲを入力とする反復ランダムフォレスト３倍交差検証を実行した。得られた分類誤差を記録し、非ゼロの分類誤差をもたらしたＬＭＲの数を評価した。この値は１３個のＬＭＲであることが分かった。本発明者らは、ゼロに近い分類には１５個のＬＭＲで十分であると判断した。「減少＿精度」の値が最も高い１５個のＬＭＲが、結果として得られた特徴セットであると考えられる（表３）。
第２のステップでは、対照と炎症試料との間の全ＬＭＲの平均メチル化差を評価し、最も高い平均メチル化差を示す１５個のＬＭＲを保持した（表４）。

【0051】

【表3】

【0052】

【表4】

【0053】

表５は、Ｒパッケージランダムフォレストのコマンド「ランダムフォレスト」で構築された、表３からの１５個のＬＭＲを使用する訓練されたランダムフォレストの一例である。入力データとして、９つのｃｏｎ（対照）試料及び９つのｉｎｆｌ（炎症）試料の１５個のＬＭＲのメチル化値を使用し、各値をＬＭＲ全体の平均として計算した。森は、１００本の木を含み、分割ごとに４個のＬＭＲを使用した（パラメータｍｔｒｙ）。この森は、ＯＯＢ（ｏｕｔ－ｏｆ－ｂａｇ）データを使用した内部検証に基づいて、１８個すべての試料を対照又は炎症として正しく分類したため選択された。

【0054】

各試料のＬＭＲメチル化値に応じて、終端ノードに到達するまで木が移動される。この終端ノードは、「ｃｏｎ」（対照）又は「ｉｎｆｌ」（炎症）のいずれかに割り当てられ、このようにして分類が実行される。その結果、非終端ノードは、「予測」列に「ＮＡ」（適用できない）を含み、これは、終端ノードに到達したときにのみ可能である、この時点での試料の分類を可能にしないためである。表の各行には以下が適用される。
フィールド１（ｌｅｆｔ＿ｄａｕｇｈｔｅｒ）：左娘ノードの数；値が０であり、存在しない場合
フィールド２（ｒｉｇｈｔ＿ｄａｕｇｈｔｅｒ）：右娘ノードの数；存在しない場合、値が０である
フィールド３（ｓｐｌｉｔ＿ｖａｒ）：どの娘ノードが選択されるかを決定するために使用されるＬＭＲ；
終端ノードに適用できない（ＮＡ）
フィールド４（ｓｐｌｉｔ＿ｐｏｉｎｔ）：必ず下回るべき「ｓｐｌｉｔ＿ｖａｒ」の数値
（左娘ノードを選択するため）又はそれを超える（右娘ノードを選択するため）。
フィールド５（状態）：終端ノード（－１）又は非終端ノード（１）
フィールド６：（予測）：終端ノードの対照（ｃｏｎ）又は炎症（ｉｎｆｌ）における分類；ノードが終端でない場合、ＮＡ

【0055】

【表5-1】

【0056】

【表5-2】

【0057】

【表5-3】

【0058】

【表5-4】

【図1】

【図2】

【国際調査報告】