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▶ コモンウェルス サイエンティフィック アンド インダストリアル リサーチ オーガナイゼーションの特許一覧 ▶ インスティテュート オブ ボタニー，チャイニーズ アカデミー オブ サイエンシズの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-12-12
(54)【発明の名称】肥厚アリューロンを有する穀物粒
(51)【国際特許分類】
C12N 15/113 20100101AFI20231205BHJP
A01H 5/10 20180101ALI20231205BHJP
C12N 15/29 20060101ALI20231205BHJP
A01H 6/46 20180101ALI20231205BHJP
C07K 14/415 20060101ALI20231205BHJP
C12N 15/82 20060101ALI20231205BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20231205BHJP
C12N 5/04 20060101ALI20231205BHJP
C12Q 1/6888 20180101ALI20231205BHJP
A23L 7/10 20160101ALI20231205BHJP
A21D 13/06 20170101ALI20231205BHJP
A23L 7/135 20160101ALI20231205BHJP
A23L 2/38 20210101ALI20231205BHJP
C12G 3/021 20190101ALI20231205BHJP
A23L 7/109 20160101ALI20231205BHJP
A23L 23/00 20160101ALI20231205BHJP
A23L 2/52 20060101ALI20231205BHJP
【ＦＩ】
C12N15/113 Z
A01H5/10 ZNA
C12N15/29
A01H6/46
C07K14/415
C12N15/82 Z
C12N5/10
C12N5/04
C12Q1/6888 Z
A23L7/10 Z
A21D13/06
A23L7/135
A23L2/38 J
C12G3/021
A23L7/109 A
A23L23/00
A23L2/00 F
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023533403
(86)(22)【出願日】2021-11-30
(85)【翻訳文提出日】2023-07-26
(86)【国際出願番号】 AU2021051425
(87)【国際公開番号】W WO2022115902
(87)【国際公開日】2022-06-09
(31)【優先権主張番号】2020904452
(32)【優先日】2020-12-01
(33)【優先権主張国・地域又は機関】AU
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＲＩＴＯＮ
(71)【出願人】
【識別番号】317002869
【氏名又は名称】コモンウェルス サイエンティフィック アンド インダストリアル リサーチ オーガナイゼーション
(71)【出願人】
【識別番号】518174891
【氏名又は名称】インスティテュート オブ ボタニー，チャイニーズ アカデミー オブ サイエンシズ
(74)【代理人】
【識別番号】100120891
【弁理士】
【氏名又は名称】林 一好
(74)【代理人】
【識別番号】100165157
【弁理士】
【氏名又は名称】芝 哲央
(74)【代理人】
【識別番号】100205659
【弁理士】
【氏名又は名称】齋藤 拓也
(74)【代理人】
【識別番号】100126000
【弁理士】
【氏名又は名称】岩池 満
(74)【代理人】
【識別番号】100185269
【弁理士】
【氏名又は名称】小菅 一弘
(72)【発明者】
【氏名】リウ チュン－ミン
(72)【発明者】
【氏名】リー ドン－チー
(72)【発明者】
【氏名】ウー シャオ－バー
(72)【発明者】
【氏名】ヤオ シュエ－フェン
(72)【発明者】
【氏名】リウ ジン－シン
(72)【発明者】
【氏名】ユー ロナルド チュン－ワイ
(72)【発明者】
【氏名】ホウィット クリスピン アレクサンダー
(72)【発明者】
【氏名】ラーキン フィリップ ジョン
【テーマコード（参考）】
2B030
4B023
4B025
4B032
4B036
4B046
4B063
4B065
4B115
4B117
4H045
【Ｆターム（参考）】
2B030AA02
2B030AB02
2B030AD08
2B030CA14
2B030CB02
4B023LC09
4B023LE19
4B023LE30
4B023LP20
4B025LB02
4B025LG01
4B025LP20
4B032DB01
4B032DB05
4B032DB13
4B032DG20
4B036LC06
4B036LF03
4B036LG01
4B036LH22
4B046LA01
4B046LG26
4B063QA01
4B063QA18
4B063QQ04
4B063QQ42
4B063QR55
4B065AA88X
4B065AA88Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA24
4B065CA41
4B115AG02
4B117LC04
4B117LG12
4B117LG13
4B117LG14
4B117LG16
4H045AA10
4H045BA10
4H045CA31
4H045EA01
4H045EA05
4H045FA74
(57)【要約】
本発明は、アリューロンと、胚と、デンプン性胚乳と、低減されたレベル及び／又は活性のミトコンドリア一本鎖ＤＮＡ結合（ｍｔＳＳＢ）ポリペプチド、ＲＥＣＡ３ポリペプチド、又はＴＷＩＮＫＬＥポリペプチドと、を含む、穀物粒に関する。本発明の穀粒又はそれからのアリューロンは、改善された栄養特性を有し、したがって、ヒト及び動物飼料製品に特に有用である。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
アリューロンと、胚と、デンプン性胚乳と、対応する野生型穀物粒に対して低減されたレベル及び／又は活性の少なくとも１つのミトコンドリアポリペプチドと、を含む、穀物粒であって、レベル及び／又は活性が低減した前記ミトコンドリアポリペプチドが、ミトコンドリア一本鎖ＤＮＡ結合（ｍｔＳＳＢ）ポリペプチド、ＲＥＣＡ３ポリペプチド、及びＴＷＩＮＫＬＥポリペプチドのうちの少なくとも１つである、穀物粒。
【請求項2】
前記穀粒が、遺伝的変動を含み、前記遺伝的変動が、前記対応する野生型穀物粒に対して、前記穀粒内の前記少なくとも１つのミトコンドリアポリペプチドのレベル及び／又は活性を低減する、請求項１に記載の穀粒。
【請求項3】
前記遺伝的変動が、（ｉ）内在性遺伝子内の変異であって、前記内在性遺伝子が、前記ミトコンドリアポリペプチドをコードし、それによって、前記変異が、前記低減されたレベル及び／若しくは活性のミトコンドリアポリペプチドをもたらす、変異、又は
（ｉｉ）サイレンシングＲＮＡ分子をコードする外来性ポリヌクレオチドであって、前記サイレンシングＲＮＡ分子及び／若しくは前記サイレンシングＲＮＡ分子から産生されるプロセシングされたＲＮＡ分子が、前記内在性遺伝子の発現を低減し、好ましくは、前記外来性ポリヌクレオチドが、前記サイレンシングＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ領域を含み、前記サイレンシングＲＮＡ分子が、穀類植物の発達中の穀粒内で発現されるプロモーターに動作可能に連結されており、前記プロモーターが、好ましくは、少なくとも受粉時と受粉後３０日目との間の時点で発現される、外来性ポリヌクレオチドを含む、請求項２に記載の穀粒。
【請求項4】
前記遺伝的変動が、（ａ）前記ミトコンドリアポリペプチドをコードする内在性遺伝子のＲＮＡ転写物の、改変されたスプライシング、好ましくは、低減されたスプライシングをもたらす、スプライス部位変異であって、前記スプライス部位変異が、好ましくは、スプライス部位における単一ヌクレオチド置換であり、より好ましくは、配列番号４のヌクレオチド番号２１２６に対応する位置におけるアデニンヌクレオチドである、スプライス部位変異、
（ｂ）前記ミトコンドリアポリペプチドをコードする前記内在性遺伝子内の欠失若しくは挿入、好ましくは、前駆穀類植物細胞の変異誘発によって導入された欠失、
（ｃ）前記ミトコンドリアポリペプチドをコードする内在性遺伝子のタンパク質コード領域内の中途翻訳終止コドン、
（ｄ）内在性遺伝子内の変異であって、前記内在性遺伝子が、前記ミトコンドリアポリペプチドをコードし、これにより、前記内在性遺伝子が、野生型ポリペプチドに対して低減された活性を有するポリペプチドをコードし、好ましくは、前記変異が、前記内在性遺伝子内のヌクレオチド置換であり、それによって、前記変異を含む前記内在性遺伝子が、配列番号３に対してアミノ酸置換を有するポリペプチドをコードする、変異、又は
（ｅ）内在性遺伝子内の変異であって、前記内在性遺伝子が、前記ミトコンドリアポリペプチドをコードし、これにより、前記変異を有する前記遺伝子が発現されたときに、前記遺伝子が、対応する野生型遺伝子に対して低減されたレベルの前記ポリペプチドを産生する、変異を含む、請求項２又は３に記載の穀粒。
【請求項5】
前記遺伝的変動が、導入された遺伝的変動である、請求項２～４のいずれか一項に記載の穀粒。
【請求項6】
前記遺伝的変動についてホモ接合性である、請求項２～５のいずれか一項以上に記載の穀粒。
【請求項7】
肥厚アリューロンを有する、請求項１～６のいずれか一項に記載の穀粒。
【請求項8】
肥厚アリューロンを、受粉後２０日目に有する、請求項７に記載の穀粒。
【請求項9】
前記肥厚アリューロンが、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、若しくは少なくとも５つの細胞層、約３つ、約４つ、約５つ、若しくは約６つの細胞層、又は２つ～８つ、２つ～７つ、２つ～６つ、２つ～５つ、若しくは３つ～５つの細胞層、又は２～８、２～７、若しくは２～６の細胞層数を含む、請求項７又は８に記載の穀粒。
【請求項10】
（ａ）前記穀粒が、対応する野生型穀物粒と比較して、各々重量基準で、以下：ｉ）より高い脂肪含有量、
ｉｉ）より高い灰含有量、
ｉｉｉ）より高い繊維含有量、
ｉｖ）より低いデンプン含有量、
ｖ）より高いミネラル含有量であって、好ましくは、前記ミネラル含有量が、カルシウム、鉄、亜鉛、カリウム、マグネシウム、リン、及び硫黄のうちの１つ以上又は全ての含有量である、より高いミネラル含有量、
ｖｉ）より高い抗酸化物質含有量、
ｖｉｉ）より高いフィテート含有量、
ｖｉｉｉ）ビタミンＢ３、Ｂ６、及びＢ９のうちの１つ以上又は全てのより高い含有量、
ｉｘ）より高いスクロース含有量、
ｘ）より高い中性非デンプン多糖含有量、並びに
ｘｉ）より高い単糖含有量のうちの１つ以上又は全てを含むこと、
（ｂ）前記穀粒が、対応する野生型穀物粒と比較して、より高い程度の白亜性を含むこと、
（ｃ）前記穀粒が、対応する野生型穀物粒と比較して、より高いアリューロン細胞数を含むこと、
（ｄ）前記穀粒が、全穀粒又は胴割れ穀粒であること、
（ｅ）前記穀粒が、対応する野生型穀物粒の発芽率に対して、約４０～約１００％である発芽率を有すること、
（ｆ）前記穀粒が、対応する野生型穀物粒と比較して、発芽中に増加したα－アミラーゼ活性を有すること、
（ｇ）前記穀粒が、対応する野生型穀物粒と比較して、不規則な形状のデンプン顆粒のより緩い充填を有すること、並びに
（ｈ）前記穀粒が、対応する野生型穀物粒と比較して、ほぼ同じ長さ、幅、厚さ、タンパク質レベル、及び穎花形態のうちの１つ以上又は全てを有することのうちの１つ以上を更に特徴とする、請求項１～９のいずれか一項以上に記載の穀粒。
【請求項11】
もはや発芽することができないように加工されており、好ましくは、熱処理によって加工されており、より好ましくは、調理されている、請求項１～１０のいずれか一項以上に記載の穀粒。
【請求項12】
前記ポリペプチドが、発達中の穀粒の発達中の胚乳、種皮、アリューロン、及び胚のうちの１つ以上又は全てにおいて発現される、請求項１～１１のいずれか一項に記載の穀粒。
【請求項13】
前記穀粒の外層が着色されている、請求項１～１２のいずれか一項に記載の穀粒。
【請求項14】
米穀粒、コムギ穀粒、オオムギ穀粒、トウモロコシ穀粒、モロコシ穀粒、又はカラスムギ穀粒である、請求項１～１３のいずれか一項に記載の穀粒。
【請求項15】
米穀粒である、請求項１～１４のいずれか一項に記載の穀粒。
【請求項16】
玄米穀粒又は黒米穀粒である、請求項１５に記載の穀粒。
【請求項17】
前記野生型穀粒が、ｍｔＳＳＢポリペプチドを含み、前記ｍｔＳＳＢポリペプチドが、配列番号３若しくは１５～３９のうちのいずれか１つで提供されるアミノ酸配列、又は配列番号３若しくは１５～３９のうちのいずれか１つ以上と少なくとも７５％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載の穀粒。
【請求項18】
前記ｍｔＳＳＢポリペプチドが、ｍｔＳＳＢ－１ａポリペプチドである、請求項１７に記載の穀粒。
【請求項19】
前記野生型穀粒が、ｍｔＳＳＢ－１ａポリペプチドを含み、前記ｍｔＳＳＢ－１ａポリペプチドが、配列番号３若しくは１５～２３のうちのいずれか１つで提供されるアミノ酸配列、又は配列番号３若しくは１５～２３のうちのいずれか１つ以上と少なくとも７５％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１８に記載の穀粒。
【請求項20】
前記野生型穀粒が、ｍｔＳＳＢ－１ａポリペプチドを含み、前記ｍｔＳＳＢ－１ａポリペプチドが、配列番号３で提供されるアミノ酸配列、又は配列番号３と少なくとも７５％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１８又は１９に記載の穀粒。
【請求項21】
前記穀粒が、内在性遺伝子を含み、前記内在性遺伝子が、短縮型ｍｔＳＳＢポリペプチド、好ましくは、短縮型ｍｔＳＳＢ－１ａポリペプチドをコードする、請求項１～２０のいずれか一項に記載の穀粒。
【請求項22】
前記短縮型ｍｔＳＳＢポリペプチドが、配列番号８、配列番号９、配列番号１０から選択されるアミノ酸配列、又はそれらのうちのいずれか１つの短縮型バージョンからなる、請求項２１に記載の穀粒。
【請求項23】
低減されたｍｔＳＳＢ活性が、ｉ）低減された、一本鎖ＤＮＡに結合する能力、
ｉｉ）低減された、ＲＥＣＡ３ポリペプチドに結合する能力、及び
ｉｉｉ）低減された、ＴＷＩＮＫＬＥポリペプチドに結合する能力のうちの１つ以上又は全てである、請求項１～２２のいずれか一項に記載の穀粒。
【請求項24】
前記野生型穀粒が、ＲＥＣＡ３ポリペプチドを含み、前記ＲＥＣＡ３ポリペプチドが、配列番号６１、６７、６９、７１、７３、７５、７７、若しくは７９のうちのいずれか１つで提供されるアミノ酸配列、又は配列番号６１、６７、６９、７１、７３、７５、７７、若しくは７９のうちのいずれか１つ以上と少なくとも７５％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１～２３のいずれか一項に記載の穀粒。
【請求項25】
前記低減されたＲＥＣＡ３ポリペプチド活性が、ｉ）低減された、ｍｔＳＳＢポリペプチドに結合する能力、及び
ｉｉ）低減されたリコンビナーゼ活性のうちの１つ又は両方である、請求項１～２４のいずれか一項に記載の穀粒。
【請求項26】
前記野生型穀粒が、ＴＷＩＮＫＬＥポリペプチドを含み、前記ＴＷＩＮＫＬＥポリペプチドが、配列番号６４、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、若しくは９６のうちのいずれか１つで提供されるアミノ酸配列、又は配列番号６４、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、若しくは９６のうちのいずれか１つ以上と少なくとも７５％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１～２５のいずれか一項に記載の穀粒。
【請求項27】
前記低減されたＴＷＩＮＫＬＥポリペプチド活性が、ｉ）低減された、ｍｔＳＳＢポリペプチドに結合する能力、及び
ｉｉ）低減されたヘリカーゼ活性のうちの１つ又は両方である、請求項１～２６のいずれか一項に記載の穀粒。
【請求項28】
変異型ミトコンドリア一本鎖ＤＮＡ結合（ｍｔＳＳＢ）ポリペプチド、変異型ＲＥＣＡ３ポリペプチド、又は変異型ＴＷＩＮＫＬＥポリペプチドであって、それぞれ、対応する野生型ミトコンドリア一本鎖ＤＮＡ結合（ｍｔＳＳＢ）ポリペプチド、ＲＥＣＡ３ポリペプチド、又はＴＷＩＮＫＬＥポリペプチドのアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有し、前記対応する野生型ポリペプチドと比較して低減された活性を有し、好ましくは、請求項３～５のいずれか一項に記載の遺伝的変動を含む穀類植物の内在性遺伝子によってコードされている、変異型ｍｔＳＳＢポリペプチド、変異型ＲＥＣＡ３ポリペプチド、又は変異型ＴＷＩＮＫＬＥポリペプチド。
【請求項29】
請求項２８に記載のポリペプチド、好ましくは、請求項３～５のいずれか一項に記載の遺伝的変動を含む穀類植物の内在性遺伝子をコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項30】
穀類植物の穀粒内に存在するときに、ミトコンドリア一本鎖ＤＮＡ結合（ｍｔＳＳＢ）ポリペプチド、ＲＥＣＡ３ポリペプチド、又はＴＷＩＮＫＬＥポリペプチドをコードする遺伝子の発現を低減する、単離及び／又は外来性ポリヌクレオチド。
【請求項31】
穀類植物の発達中の穀粒内の遺伝子の発現を、少なくとも受粉時と受粉後３０日目との間の時点で低減するために使用されるときの、請求項３０に記載のポリヌクレオチド。
【請求項32】
請求項２９～３１のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドをコードする核酸構築物及び／又はベクターであって、前記核酸構築物又はベクターが、前記ポリヌクレオチドをコードするＤＮＡ領域を含み、前記ポリヌクレオチドが、プロモーターに動作可能に連結されており、前記プロモーターが、穀類植物の発達中の穀粒内で、少なくとも受粉時と受粉後３０日目との間の時点で発現される、核酸構築物及び／又はベクター。
【請求項33】
請求項２９～３１のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、又は請求項３２に記載の核酸構築物及び／若しくはベクターを含む、細胞、組織、器官、植物部分、又は植物。
【請求項34】
前記ポリヌクレオチド、核酸構築物又はベクターが、前記細胞、組織、器官、植物部分、又は植物のゲノム内に、好ましくは、核ゲノム内に組み込まれている、請求項３３に記載の植物細胞、組織、器官、植物部分、又は植物。
【請求項35】
対応する野生型穀類植物細胞に対して低減されたレベル及び／又は活性の少なくとも１つのミトコンドリアポリペプチドを含む、穀類植物細胞、それからの種子又は組織であって、レベル及び／又は活性が低減した前記ミトコンドリアポリペプチドが、ミトコンドリア一本鎖ＤＮＡ結合（ｍｔＳＳＢ）ポリペプチド、ＲＥＣＡ３ポリペプチド、及びＴＷＩＮＫＬＥポリペプチドのうちの少なくとも１つである、穀類植物細胞、それからの種子又は組織。
【請求項36】
胚乳、種皮、アリューロン、若しくは胚細胞であるか、又はこれを含む、請求項３５に記載の細胞、それからの種子又は組織。
【請求項37】
アリューロン細胞である、請求項３５に記載の細胞、それからの種子又は組織。
【請求項38】
請求項１～１０又は１２～２７のいずれか一項に記載の穀粒を産生し、かつ／あるいは請求項２８に記載のポリペプチド、請求項２９～３１のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、請求項３２に記載の核酸構築物及び／若しくはベクター、又は請求項３３～３７のいずれか一項に記載の細胞、種子若しくは組織のうちの１つ以上又は全てを含む、穀類植物。
【請求項39】
（ａ）対応する野生型植物とほぼ同じ高さを有すること、（ｂ）前記植物が、稔性雄及び雌であること、並びに
（ｃ）前記植物が、穀粒成熟の遅延を示すことのうちの１つ以上又は全てを特徴とする、請求項３８に記載の穀類植物。
【請求項40】
圃場で成長する、少なくとも１００個の請求項３８又は３９に記載の穀類植物の集団。
【請求項41】
請求項３３～３７のいずれか一項に記載の細胞を産生する方法であって、請求項２～５のいずれか一項で定義される遺伝的変動、請求項２９～３１のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、又は請求項３２に記載の核酸構築物及び／若しくはベクターを、細胞、好ましくは、穀類植物細胞内に導入するステップを含む、方法。
【請求項42】
請求項３８若しくは３９に記載の穀類植物又はそれからの穀粒を産生する方法であって、ｉ）請求項２～５のいずれか一項で定義される遺伝的変動、請求項２９～３１のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、又は請求項３２に記載の核酸構築物及び／若しくはベクターを、穀類植物細胞内に導入するステップと、
ｉｉ）前記遺伝的変動又はポリヌクレオチドを含む穀類植物を、ステップｉ）から得られた細胞から得るステップと、
ｉｉｉ）任意選択で、穀粒をステップｉｉ）の前記植物から収穫するステップであって、前記穀粒が、前記遺伝的変動を含むか又は前記ポリヌクレオチド、核酸構築物若しくはベクターについてのトランスジェニックである、収穫するステップと、
ｉｖ）任意選択で、１世代以上の子孫植物を前記穀粒から産生するステップであって、前記子孫植物が、前記遺伝的変動を含むか又は前記ポリヌクレオチド、核酸構築物若しくはベクターについてのトランスジェニックである、産生するステップと、を含み、
それによって、前記穀類植物又は穀粒を産生する、方法。
【請求項43】
請求項３８若しくは３９に記載の穀類植物又はそれからの穀粒を産生する方法であって、ｉ）内在性遺伝子に対する変異を穀類植物細胞内に導入するステップであって、前記内在性遺伝子が、ミトコンドリア一本鎖ＤＮＡ結合（ｍｔＳＳＢ）ポリペプチド、ＲＥＣＡ３ポリペプチド、又はＴＷＩＮＫＬＥポリペプチドをコードし、これにより、前記細胞が、対応する野生型穀類植物細胞に対して低減されたレベル及び／又は活性の前記ミトコンドリア一本鎖ＤＮＡ結合（ｍｔＳＳＢ）ポリペプチド、ＲＥＣＡ３ポリペプチド、又はＴＷＩＮＫＬＥポリペプチドを有する、導入するステップと、
ｉｉ）穀類植物をステップｉ）の細胞から得ることであって、前記穀類植物が、前記内在性遺伝子の前記変異を含む、得るステップと、
ｉｉｉ）任意選択で、穀粒をステップｉｉ）の前記植物から収穫するステップであって、前記穀粒が、前記変異を含む、収穫するステップと、
ｉｖ）任意選択で、１世代以上の子孫植物を前記穀粒から産生するステップであって、前記子孫植物が、前記変異を含む、産生するステップと、を含み、
それによって、前記穀類植物又は穀粒を産生する、方法。
【請求項44】
請求項３８若しくは３９に記載の穀類植物又は請求項１～２７のいずれか一項に記載の穀粒を選択する方法であって、ｉ）穀類植物の集団又は穀粒をスクリーニングするステップであって、前記穀類植物の集団又は穀粒の各々が、前駆穀類植物細胞、穀粒、又は植物の変異誘発処理から得られたものであり、前記穀類植物の集団又は穀粒を、請求項１～１０若しくは１２～２７のいずれか一項に記載の穀粒の産生について、又はミトコンドリア一本鎖ＤＮＡ結合（ｍｔＳＳＢ）ポリペプチド、ＲＥＣＡ３ポリペプチド、若しくはＴＷＩＮＫＬＥポリペプチドをコードする遺伝子内の変異の存在についてスクリーニングするステップと、
ｉｉ）穀類植物をステップ（ｉ）の前記集団から選択するステップであって、前記穀類植物が、請求項１～１０若しくは１２～２７のいずれか一項に記載の穀粒を産生するか又は変異を前記遺伝子内に含む、選択するステップと、を含み、
それによって、前記穀類植物又は穀粒を選択する、方法。
【請求項45】
請求項３８又は３９に記載の穀類植物を選択する方法であって、ｉ）１つ以上の子孫植物を穀物粒から産生するステップであって、前記穀物粒が、２つの親穀類植物の交雑に由来したものである、産生するステップと、
ｉｉ）ステップｉ）の前記１つ以上の子孫植物を、請求項１～１０又は１２～２７のいずれか一項に記載の穀粒の産生についてスクリーニングするステップと、
ｉｉｉ）前記穀粒を産生する子孫植物を選択するステップと、を含み、
それによって、前記穀類植物を選択する、方法。
【請求項46】
ステップｉｉ）が、ｉ）子孫植物からのＤＮＡを含む試料を、前記遺伝的変動について解析すること、
ｉｉ）子孫植物から得られた穀粒のアリューロンの厚さを解析すること、及び
ｉｉｉ）前記穀粒又はその一部分の栄養含有量を解析することのうちの１つ以上又は全てを含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項47】
ステップｉｉｉ）が、ｉ）子孫植物を選択することであって、前記子孫植物が、前記遺伝的変動についてホモ接合性である、選択すること、
ｉｉ）子孫植物を選択することであって、前記子孫植物の穀粒が、対応する野生型穀物粒と比較して増加したアリューロン厚さを有する、選択すること、
ｉｉｉ）子孫植物を選択することであって、前記子孫植物の穀粒又はその一部分が、対応する野生型穀物粒又はその一部分と比較して変更された栄養含有量を有する、選択することのうちの１つ以上又は全てを含む、請求項４５又は４６に記載の方法。
【請求項48】
ｉ）２つの親穀類植物を交雑することであって、好ましくは、前記親穀類植物のうちの１つが、請求項１～１０若しくは１２～２７のいずれか一項に記載の穀粒を産生する、交雑すること、又はｉｉ）ステップｉ）からの１つ以上の子孫植物を、請求項１～１０若しくは１２～２７のいずれか一項に記載の穀粒を産生しない最初の親穀類植物と同じ遺伝子型の植物と、前記最初の親穀類植物の前記遺伝子型の大部分を有するが請求項１～１０若しくは１２～２７のいずれか一項に記載の穀粒を産生する植物を産生するのに十分な回数戻し交雑すること、及び
ｉｉｉ）請求項１～１０又は１２～２７のいずれか一項に記載の穀粒を産生する子孫植物を選択することを更に含む、請求項４５～４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項49】
請求項４２～４８のいずれか一項に記載の方法を使用して産生される穀類植物。
【請求項50】
細胞、穀類植物、又は穀物粒などの植物部分を産生するための、請求項２９～３１のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、又は請求項３２に記載の核酸構築物及び／若しくはベクターの使用。
【請求項51】
請求項１～２７のいずれか一項に記載の穀粒を産生するために使用されるときの、請求項５０に記載の使用。
【請求項52】
請求項１～１０又は１２～２７のいずれか一項に記載の穀粒を産生する穀類植物を同定するための方法であって、ｉ）核酸試料を穀類植物から得るステップと、
ｉｉ）前記試料を遺伝的変動の存在又は非存在についてスクリーニングするステップであって、前記遺伝的変動が、対応する野生型穀類植物と比較して、前記植物内のミトコンドリア一本鎖ＤＮＡ結合（ｍｔＳＳＢ）ポリペプチド、ＲＥＣＡ３ポリペプチド、又はＴＷＩＮＫＬＥポリペプチドの活性のレベルを低減する、スクリーニングするステップと、を含む、方法。
【請求項53】
前記遺伝的変動が、ａ）ポリヌクレオチドを発現する核酸構築物又はそれによってコードされた前記ポリヌクレオチドであって、穀類植物内に存在するときに、ミトコンドリア一本鎖ＤＮＡ結合（ｍｔＳＳＢ）ポリペプチド、ＲＥＣＡ３ポリペプチド、又はＴＷＩＮＫＬＥポリペプチドをコードする遺伝子の発現を低減する、ポリヌクレオチドを発現する核酸構築物又はそれによってコードされた前記ポリヌクレオチド、及び
ｂ）遺伝子又はそれによってコードされたｍＲＮＡであって、低減された活性を有する、変異型ミトコンドリア一本鎖ＤＮＡ結合（ｍｔＳＳＢ）ポリペプチド、ＲＥＣＡ３ポリペプチド、又はＴＷＩＮＫＬＥポリペプチド、好ましくは、短縮型ｍｔＳＳＢポリペプチド、ＲＥＣＡ３ポリペプチド、又はＴＷＩＮＫＬＥポリペプチドを発現する、遺伝子又はそれによってコードされたｍＲＮＡのうちの１つ又は両方である、請求項５２に記載の方法。
【請求項54】
前記遺伝的変動の存在が、前記穀類植物の穀粒が、前記遺伝的変動を欠く対応する穀類植物と比較して、肥厚アリューロンを有することを示す、請求項５２又は５３に記載の方法。
【請求項55】
請求項１～１０又は１２～２７のいずれか一項に記載の穀粒を産生する穀類植物を同定するための方法であって、ｉ）穀粒を穀類植物から得るステップと、
ｉｉ）前記穀粒又はその一部分を、
ａ）肥厚アリューロン、
ｂ）前記穀粒内の、ミトコンドリア一本鎖ＤＮＡ結合（ｍｔＳＳＢ）ポリペプチド、ＲＥＣＡ３ポリペプチド、若しくはＴＷＩＮＫＬＥポリペプチドの量及び／又は活性、並びに
ｃ）前記穀粒内の、ミトコンドリア一本鎖ＤＮＡ結合（ｍｔＳＳＢ）ポリペプチド、ＲＥＣＡ３ポリペプチド、又はＴＷＩＮＫＬＥポリペプチドをコードする遺伝子によってコードされたｍＲＮＡの量のうちの１つ以上についてスクリーニングするステップと、を含む、方法。
【請求項56】
請求項２８、３８、又は３９のいずれか一項に記載の穀類植物を同定する、請求項５２～５５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項57】
穀類植物部分を産生する方法であって、ａ）請求項２８、３８又は３９のいずれか一項に記載の穀類植物又は少なくとも１００個の前記穀類植物を圃場で成長させることと、
ｂ）前記穀類植物部分を前記穀類植物又は複数の穀類植物から収穫することと、を含む、方法。
【請求項58】
穀粒から得られる加工穀粒、又は粉、ふすま、全粒粉、麦芽、デンプン、若しくは油を製造する方法であって、ａ）請求項１～２７のいずれか一項に記載の穀粒を得ることと、
ｂ）前記穀粒を加工して、前記加工穀粒、粉、ふすま、全粒粉、麦芽、デンプン、又は油を製造することと、を含む、方法。
【請求項59】
請求項１～２７のいずれか一項に記載の穀粒、又は請求項２８、３８、若しくは３９のいずれか一項に記載の穀類植物から、あるいは前記遺伝的変動を含む前記穀粒又は穀類植物の一部分から製造される、製品。
【請求項60】
前記遺伝的変動、前記ポリヌクレオチド、前記核酸構築物又は前記ベクター、及び前記肥厚アリューロンのうちの１つ以上又は全てを含む、請求項５９に記載の製品。
【請求項61】
前記一部分が、調理された、煮沸された、湯引かれた、焙煎された、ベーキングされた、精白された、割られた、膨化した、製粉された、又は薄片にされた穀粒又はふすまである、請求項５９又は６０に記載の製品。
【請求項62】
前記製品が、食品成分、飲料成分、食品製品、又は飲料製品である、請求項５９～６１のいずれか一項に記載の製品。
【請求項63】
ｉ）前記食品成分若しくは飲料成分が、焙煎された穀粒、精白された穀粒、割られた穀粒、膨化した穀粒、製粉された穀粒、薄片にされた穀粒、全粒粉、粉、ふすま、デンプン、麦芽、及び油からなる群から選択されるか、又はｉｉ）前記食品製品が、加工穀粒、調理された穀粒、煮沸された穀粒、かゆ、発酵若しくは無発酵パン、パスタ、ヌードル、動物飼料、朝食用シリアル、スナック食品、ケーキ、ペーストリ、及び粉ベースのソースを含有する食品からなる群から選択されるか、又は
ｉｉｉ）前記飲料製品が、茶、包装された飲料、若しくはエタノールを含む飲料である、請求項６２に記載の製品。
【請求項64】
請求項６２又は６３に記載の食品又は飲料成分を調製する方法であって、請求項１～２７のいずれか一項に記載の穀粒又は前記穀粒からのふすま、粉、全粒粉、麦芽、デンプン、若しくは油を加工して、前記食品又は飲料成分を製造することを含む、方法。
【請求項65】
請求項６２又は６３に記載の食品又は飲料製品を調製する方法であって、好ましくは、請求項１～２７のいずれか一項に記載の穀粒を調理する、煮沸する、焙煎する、又は薄片にすることによって、あるいは前記穀粒又は前記穀粒からのふすま、粉、全粒粉、麦芽、デンプン、若しくは油を、別の食品又は飲料成分と混合することによって、穀粒を加工することを含む、方法。
【請求項66】
動物飼料若しくは食品としての、又は動物摂取のための飼料若しくはヒト摂取のための食品を製造するための、請求項１～２７のいずれか一項に記載の穀粒又はその一部分、あるいは請求項２８、３８、若しくは３９のいずれか一項に記載の穀類植物又はその一部分の使用。
【請求項67】
請求項２８に記載のポリペプチド、請求項２９～３１のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、請求項３２に記載の核酸構築物及び／若しくはベクター、又は請求項３３～３７のいずれか一項に記載の細胞のうちの１つ以上と、１つ以上の許容可能な担体、好ましくは、別の食品成分と、を含む、組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、アリューロンと、胚と、デンプン性胚乳と、低減されたレベル及び／又は活性のミトコンドリア一本鎖ＤＮＡ結合（ｍｔＳＳＢ）ポリペプチド、ＲＥＣＡ３ポリペプチド、又はＴＷＩＮＫＬＥポリペプチドと、を含む、穀物粒に関する。本発明の穀粒又はそれからのアリューロンは、改善された栄養特性を有し、したがって、ヒト及び動物飼料製品に特に有用である。
【背景技術】
【0002】
世界的に、コムギ、米、トウモロコシ、並びにより少ない程度でオオムギ、カラスムギ、及びライムギなどの穀物粒が、穀粒のデンプン含有量からのヒトカロリー摂取量の主要な供給源である。穀物粒はまた、タンパク質、ビタミン、ミネラル、及び食物繊維などの他の栄養構成要素の供給において重要である。穀粒の異なる部分は、これらの栄養構成要素について異なって寄与する。デンプンは、穀物粒のデンプン性胚乳内に貯蔵されており、他の栄養構成要素は、胚及びふすま内により集中している（Ｂｕｒｉ ｅｔ ａｌ．，２００４）。しかしながら、ふすまは、しばしば、食品における使用前に除去され、特に、米において除去され、次いで、米は、白米として食べられる。
【0003】
穀物粒は、母性配偶体と父性配偶体との間の重複受精事象から発達する。花粉管からの２つの精子細胞のうちの一方は、卵子と融合して、接合体を産生し、接合体は、胚に発達し、他方の精子細胞は、雌性配偶体の二倍体中央細胞と融合して、一次胚乳核を産生し、一次胚乳核から、遺伝的三倍体胚乳が発達する。したがって、アリューロンを含む胚乳は、三倍体であり、母性一倍体ゲノムの２つのコピーと、父性一倍体ゲノムの１つのコピーと、を有する。双子葉種子内では、胚乳は、発達中の胚によって消費され、米などの単子葉植物内では、胚乳は、存続して、成熟穀粒の大部分を構成する。
【0004】
穀類の成熟胚乳は、異なる特徴を有する４つの細胞型、すなわち、デンプン顆粒及び貯蔵タンパク質の豊富な含有量によって特徴付けられるデンプン性胚乳と、デンプン性胚乳のほとんどを包囲する１つの細胞層の厚さをより頻繁に有する表皮様アリューロンと、主要な母性脈管構造の上の種子の基部における輸送細胞と、穀粒発達の早期に胚のための裏層を形成するが、その後、胚とデンプン性胚乳とを接続する胚柄のみを包囲し得る胚包囲細胞の層と、を有する（Ｂｅｃｒａｆｔ ｅｔ ａｌ．，２００１ａ）。胚は、デンプン性胚乳内の空洞内に形成される。したがって、穀類アリューロン組織は、穀物粒内の胚乳の最外層を含み、デンプン性胚乳及び胚の一部分を包囲する。
【0005】
アリューロン細胞は、アリューロン細胞の形態、生化学的組成、及び遺伝子発現プロファイルによって、デンプン性胚乳細胞と区別される（Ｂｅｃｒａｆｔ ａｎｄ Ｙｉ，２０１１）。アリューロン細胞は、概して、油及びタンパク質に富み、種子発芽中に胚乳貯蔵の動員を可能にする酵素を分泌する。各々のアリューロン細胞は、繊維状細胞壁内に封入されており、繊維状細胞壁は、胚乳細胞壁よりも厚く、様々な比のアラビノキシラン及びベータグルカンから主に構成されており、高度に自家蛍光である。アリューロン層は、穀類内でアントシアニンでしばしば着色されている、胚乳の唯一の層である。
【0006】
穀類アリューロンは、コムギ及び野生型トウモロコシ内で、１つの細胞層の厚さのみを有し（Ｂｕｔｔｒｏｓｅ １９６３、Ｗａｌｂｏｔ，１９９４）、ほとんど、１つの細胞層の厚さを有するが、米内の胚乳の背側領域内で、最大３つの細胞層の厚さを有し（Ｈｏｓｈｉｋａｗａ，１９９３）、野生型オオムギ内で、３つの細胞層の厚さを有する（Ｊｏｎｅｓ，１９６９）。通常の胚乳内で、アリューロンは、非常に規則的であり、細胞分裂のパターンは、高度に組織化されている。野生型成熟アリューロン細胞は、高密度な細胞質を有するほぼ立方体の断面を有し、高密度な細胞質は、顆粒、小さい液胞、及び封入体を含み、顆粒、小さい液胞、及び封入体は、タンパク質、脂質、及びフィチンから、又はタンパク質プラス炭水化物から作製されている。成熟穀物粒内で、アリューロンは、休眠性乾燥形態であるが、依然として生存している唯一の胚乳組織である。吸水の際に、胚は、ジベレリンを産生し、ジベレリンは、アリューロンによるアミラーゼ及び他のヒドロラーゼの合成を誘導し、アミラーゼ及び他のヒドロラーゼは、デンプン性胚乳内に放出されて、貯蔵化合物を分解して、実生苗への胚の早期成長のための糖及びアミノ酸を形成する。
【0007】
穀物粒内のアリューロン発達の調節は、Ｂｅｃｒａｆｔ ａｎｄ Ｙｉ（２０１１）によって概説されている。複数のレベルの遺伝的調節が、アリューロン細胞運命、分化、組織を制御し、多くの遺伝子が、プロセスに関与しており、これらの遺伝子のうちのいくつかのみが同定されている。例えば、トウモロコシ欠陥穀粒１（ｄｅｋ１）機能喪失型変異体は、アリューロン層を有さず、これは、野生型Ｄｅｋ１ポリペプチドが、外側細胞層をアリューロンとして特定するために必要とされることを示す（Ｂｅｃｒａｆｔ ｅｔ ａｌ．，２００２）。Ｄｅｋ１ポリペプチドは、大きい膜内在性タンパク質であり、膜内在性タンパク質は、２１個の膜貫通ドメインと、活性カルパインプロテアーゼを含有する細胞質ドメインと、を有する。トウモロコシ内の別の遺伝子であるＣＲＩＮＫＬＹ４（ＣＲ４）は、受容体キナーゼをコードし、受容体キナーゼは、アリューロン運命の正調節因子として機能し、ｃｒ４変異体は、低減されたアリューロンを有する（Ｂｅｃｒａｆｔ ｅｔ ａｌ．，２００１ｂ）。
【0008】
穀物粒変異体内の肥厚アリューロンのいくつかの事例が、文献で報告されているが、多指向性効果又は農学的及び産生問題のため、いずれも有用であると判明されていない。
【0009】
Ｓｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（２００３）は、過剰アリューロン層１（ｓａｌ１）遺伝子内のトウモロコシ変異体の同定を報告しており、異なる変異体内で、ｓａｌ１遺伝子は、通常の単一層の代わりに、２つ～３つの層又は最大７つの層のアリューロン細胞を有した。ＳＡＬ１ポリペプチドが、クラスＥ液胞局在タンパク質として同定された。ホモ接合性ｓａｌ１－１変異型穀粒は、発芽することができなかった欠陥胚を有し、はるかに低減されたデンプン性胚乳を有した。ｓａｌ１－２アレルについてホモ接合性であったより完全でない変異体は、２つの細胞層のアリューロンを示した。しかしながら、変異型植物は、野生型の３０％のみの高さまで成長し、低減された根量を有し、結実に乏しかった（Ｓｈｅｎ ｅｔ ａｌ．２００３）。これらの植物は、農学的に有用でなかった。
【0010】
Ｙｉ ｅｔ ａｌ．（２０１１）は、トウモロコシ内の厚アリューロン１（ｔｈｋ１）変異体の同定を報告した。変異型穀粒は、多層アリューロンを示した。しかしながら、変異型穀粒は、良好に発達した胚を欠き、播種されたときに発芽しなかった。野生型Ｔｈｋ１遺伝子は、Ｔｈｋ１ポリペプチドをコードし、Ｔｈｋ１ポリペプチドは、トウモロコシ内のアリューロン発達のために必要とされるＤｅｋ１ポリペプチドの下流で作用した（Ｂｅｃｒａｆｔ ｅｔ ａｌ．，２００２）。
【0011】
トウモロコシ余剰細胞層（Ｘｃｌ）遺伝子変異体が、葉形態へのＸｃｌ遺伝子変異の効果によって同定された。Ｘｃｌ遺伝子変異は、二重アリューロン層及び多層葉表皮を産生した（Ｋｅｓｓｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００２）。Ｘｃｌ変異は、半顕性変異であり、半顕性変異は、トウモロコシ内の細胞分裂及び分化パターンを破壊して、異常な光沢のある外観を有する厚い狭い葉を産生した。
【0012】
ｄｉｓｏｒｇａｌ１及びｄｉｓｏｒｇａｌ２（ｄｉｌ１及びｄｉｌ２）遺伝子内のトウモロコシ変異体は、可変数の層を有し不規則な形状及びサイズの細胞を有するアリューロンを示した（Ｌｉｄ ｅｔ ａｌ．，２００４）。しかしながら、ホモ接合性ｄｉｌ１及びｄｉｌ２変異型穀粒は、低減されたデンプン蓄積に起因して収縮し、成熟変異型穀粒は、低い速度で発芽し、生存植物に発達しなかった。
【0013】
オオムギ内で、ｅｌｏ２変異体は、同様に、アリューロン層の無秩序な細胞及び不規則性を示し、これは、異常な並層細胞分裂からもたらされた（Ｌｅｗｉｓ ｅｔ ａｌ．，２００９）。植物はまた、葉表皮内の増加した細胞層を示し、隆起し歪んだ細胞を表皮上に有した。重要なことに、ホモ接合性変異型植物は、矮化されて、野生型の６０％未満の穀粒重量を産生し、穀粒産生に有用ではなかった。
【0014】
米内で、種子貯蔵タンパク質の発現を制御する２つの転写因子もまた、アリューロン細胞運命に影響する（Ｋａｗａｋａｔｓｕ ｅｔ ａｌ．，２００９）。ＤＯＦ亜鉛フィンガー転写因子クラス内にある米プロラミンボックス結合因子（ＲＰＢＦ）ポリペプチドをコードする遺伝子の共抑制構築物による発現の低減は、大きい無秩序な細胞からなる散発性多層アリューロンをもたらした。種子貯蔵タンパク質発現及び蓄積の有意な低減もあり、デンプン及び脂質が、実質的に低減されたレベルで蓄積された。トウモロコシＤｅｋ１、ＣＲ４、及びＳＡＬ１遺伝子の米相同体の発現もまた、低減され、これは、ＲＰＢＦ及びＲＩＳＢＺ１因子が、これらの遺伝子と同じ調節経路内で動作したことを示した。
【0015】
より最近では、変異型ＲＯＳ１ａ遺伝子が、米内で肥厚アリューロンをもたらすことができることが判定された（ＷＯ２０１７／０８３９２０）。
【0016】
農業的にも有用である植物、特に、米植物からの、肥厚アリューロンを有する穀物粒が必要とされている。
【発明の概要】
【0017】
本発明者らは、穀物粒内のアリューロン発達に影響する、多数の遺伝子及びそれらによってコードされたタンパク質を同定した。
【0018】
したがって、一態様では、本発明は、アリューロンと、胚と、デンプン性胚乳と、対応する野生型穀物粒に対して低減されたレベル及び／又は活性の少なくとも１つのミトコンドリアポリペプチドと、を含む、穀物粒であって、レベル及び／又は活性が低減したミトコンドリアポリペプチドが、ミトコンドリア一本鎖ＤＮＡ結合（ｍｔＳＳＢ）ポリペプチド、ＲＥＣＡ３ポリペプチド、及びＴＷＩＮＫＬＥポリペプチドのうちの少なくとも１つである、穀物粒を提供する。
【0019】
好ましい実施形態では、穀粒は、遺伝的変動を含み、遺伝的変動は、対応する野生型穀物粒に対して、穀粒内の少なくとも１つのミトコンドリアポリペプチドのレベル及び／又は活性を低減する。この実施形態の一例では、穀粒は、２つ以上の遺伝的変動を含み、２つ以上の遺伝的変動は、対応する野生型穀物粒に対して、穀粒内の少なくとも１つのミトコンドリアポリペプチドのレベル及び／又は活性を低減する。この実施形態の別の例では、穀粒は、２つ以上の遺伝的変動を含み、２つ以上の遺伝的変動は、対応する野生型穀物粒に対して、穀粒内のミトコンドリアポリペプチドのうちの２つ又は３つのレベル及び／又は活性を低減する。
【0020】
一実施形態では、遺伝的変動は、内在性遺伝子内の変異であって、内在性遺伝子が、ミトコンドリアポリペプチドをコードし、それによって、変異が、低減されたレベル及び／又は活性のミトコンドリアポリペプチドをもたらす、変異を含む。
【0021】
一実施形態では、遺伝的変動は、サイレンシングＲＮＡ分子をコードする外来性ポリヌクレオチドであって、サイレンシングＲＮＡ分子及び／又はサイレンシングＲＮＡ分子から産生されるプロセシングされたＲＮＡ分子が、内在性遺伝子の発現を低減し、好ましくは、外来性ポリヌクレオチドが、サイレンシングＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ領域を含み、サイレンシングＲＮＡ分子が、穀類植物の発達中の穀粒内で発現されるプロモーターに動作可能に連結されており、プロモーターが、好ましくは、少なくとも受粉時と受粉後３０日目との間の時点で発現される、外来性ポリヌクレオチドを含む。
【0022】
一実施形態では、遺伝的変動は、ミトコンドリアポリペプチドをコードする内在性遺伝子のＲＮＡ転写物の、改変されたスプライシング、好ましくは、低減されたスプライシングをもたらす、スプライス部位変異であって、スプライス部位変異が、好ましくは、スプライス部位における単一ヌクレオチド置換であり、より好ましくは、配列番号４のヌクレオチド番号２１２６に対応する位置におけるアデニンヌクレオチドである、スプライス部位変異を含む。
【0023】
一実施形態では、遺伝的変動は、ミトコンドリアポリペプチドをコードする内在性遺伝子内の欠失又は挿入、好ましくは、前駆穀類植物細胞の変異誘発によって導入された欠失を含む。
【0024】
一実施形態では、遺伝的変動は、ミトコンドリアポリペプチドをコードする内在性遺伝子のタンパク質コード領域内の中途翻訳終止コドンを含む。
【0025】
一実施形態では、遺伝的変動は、内在性遺伝子内の変異であって、内在性遺伝子が、ミトコンドリアポリペプチドをコードし、これにより、内在性遺伝子が、野生型ポリペプチドに対して低減された活性を有するポリペプチドをコードし、好ましくは、変異が、内在性遺伝子内のヌクレオチド置換であり、それによって、変異を含む内在性遺伝子が、配列番号３に対してアミノ酸置換を有するポリペプチドをコードする、変異を含む。
【0026】
一実施形態では、遺伝的変動は、内在性遺伝子内の変異であって、内在性遺伝子が、ミトコンドリアポリペプチドをコードし、これにより、変異を有する遺伝子が発現されたときに、遺伝子が、対応する野生型遺伝子に対して低減されたレベルのポリペプチドを産生する、変異を含む。例えば、遺伝的変動は、遺伝子の発現の低減されたレベルをもたらすスプライス部位変異を含むか、又はこの遺伝子は、遺伝子の低減された発現をもたらす、遺伝子のプロモーター内の変異を含む。
【0027】
一実施形態では、遺伝的変動は、導入された遺伝的変動である。
【0028】
一実施形態では、穀粒は、遺伝的変動についてヘテロ接合性である。一実施形態では、穀粒は、遺伝的変動についてホモ接合性である。
【0029】
好ましい実施形態では、穀粒は、肥厚アリューロンを有する。一実施形態では、穀粒は、肥厚アリューロンを、受粉後２０日目に有する。一実施形態では、肥厚アリューロンは、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、若しくは少なくとも５つの細胞層、約３つ、約４つ、約５つ、若しくは約６つの細胞層、又は２つ～８つ、２つ～７つ、２つ～６つ、２つ～５つ、若しくは３つ～５つの細胞層、又は２～８、２～７、若しくは２～６の細胞層数を含む。
【0030】
一実施形態では、穀粒は、対応する野生型穀物粒と比較して、各々重量基準で、以下：
ｉ）より高い脂肪含有量、
ｉｉ）より高い灰含有量、
ｉｉｉ）より高い繊維含有量、
ｉｖ）より低いデンプン含有量、
ｖ）より高いミネラル含有量であって、好ましくは、ミネラル含有量が、カルシウム、鉄、亜鉛、カリウム、マグネシウム、リン、及び硫黄のうちの１つ以上又は全ての含有量である、より高いミネラル含有量、
ｖｉ）より高い抗酸化物質含有量、
ｖｉｉ）より高いフィテート含有量、
ｖｉｉｉ）ビタミンＢ３、Ｂ６、及びＢ９のうちの１つ以上又は全てのより高い含有量、
ｉｘ）より高いスクロース含有量、
ｘ）より高い中性非デンプン多糖含有量、並びに
ｘｉ）より高い単糖含有量のうちの１つ以上又は全てを含む。
ｉ）より高い脂肪含有量、
ｉｉ）より高い灰含有量、
ｉｉｉ）より高い繊維含有量、
ｉｖ）より低いデンプン含有量、
ｖ）より高いミネラル含有量であって、好ましくは、ミネラル含有量が、カルシウム、鉄、亜鉛、カリウム、マグネシウム、リン、及び硫黄のうちの１つ以上又は全ての含有量である、より高いミネラル含有量、
ｖｉ）より高い抗酸化物質含有量、
ｖｉｉ）より高いフィテート含有量、
ｖｉｉｉ）ビタミンＢ３、Ｂ６、及びＢ９のうちの１つ以上又は全てのより高い含有量、
ｉｘ）より高いスクロース含有量、
ｘ）より高い中性非デンプン多糖含有量、並びに
ｘｉ）より高い単糖含有量のうちの１つ以上又は全てを含む。
【0031】
一実施形態では、穀粒は、対応する野生型穀物粒と比較して、より高い程度の白亜性を含む。
【0032】
一実施形態では、穀粒は、対応する野生型穀物粒と比較して、より高いアリューロン細胞数を含む。
【0033】
一実施形態では、穀粒は、全穀粒又は胴割れ穀粒である。
【0034】
一実施形態では、穀粒は、対応する野生型穀物粒の発芽率に対して、約４０～約１００％である発芽率を有する。
【0035】
一実施形態では、穀粒は、対応する野生型穀物粒と比較して、発芽中に増加したα－アミラーゼ活性を有する。
【0036】
一実施形態では、穀粒は、対応する野生型穀物粒と比較して、不規則な形状のデンプン顆粒のより緩い充填を有する。
【0037】
一実施形態では、穀粒は、対応する野生型穀物粒と比較して、ほぼ同じ長さ、幅、厚さ、タンパク質レベル、及び穎花形態のうちの１つ以上又は全てを有する。
【0038】
一実施形態では、穀粒は、もはや発芽することができないように加工されており、好ましくは、熱処理によって加工されており、より好ましくは、調理されている。
【0039】
一実施形態では、ポリペプチドは、発達中の穀粒の発達中の胚乳、種皮、アリューロン、及び胚のうちの１つ以上又は全てにおいて発現される。
【0040】
一実施形態では、穀粒の外層が着色されている穀粒。
【0041】
本発明の穀物粒の例としては、米穀粒、コムギ穀粒、オオムギ穀粒、トウモロコシ穀粒、モロコシ穀粒、又はカラスムギ穀粒が挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、穀粒は、米穀粒である。一実施形態では、穀粒は、玄米穀粒又は黒米穀粒である。
【0042】
一実施形態では、野生型穀粒は、ｍｔＳＳＢポリペプチドを含み、ｍｔＳＳＢポリペプチドは、配列番号３若しくは１５～３９のうちのいずれか１つで提供されるアミノ酸配列、又は配列番号３若しくは１５～３９のうちのいずれか１つ以上と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む。
【0043】
一実施形態では、ｍｔＳＳＢポリペプチドは、ｍｔＳＳＢ－１ａポリペプチドである。一実施形態では、野生型穀粒は、ｍｔＳＳＢ－１ａポリペプチドを含み、ｍｔＳＳＢ－１ａポリペプチドは、配列番号３若しくは１５～２３のうちのいずれか１つで提供されるアミノ酸配列、又は配列番号３若しくは１５～２３のうちのいずれか１つ以上と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む。
【0044】
一実施形態では、野生型穀粒は、ｍｔＳＳＢ－１ａポリペプチドを含み、ｍｔＳＳＢ－１ａポリペプチドは、配列番号３で提供されるアミノ酸配列、又は配列番号３と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む。
【0045】
一実施形態では、野生型穀粒は、ｍｔＳＳＢポリペプチドを含み、ｍｔＳＳＢポリペプチドは、以下のモチーフ：ＦＲＧＶＨＲＡＩ（Ｉ／Ｌ）ＣＧＫＶＧＱ（Ｖ／Ａ）Ｐ（Ｖ／Ｌ）ＱＫＩＬＲＮＧ（Ｒ／Ｈ）Ｔ（Ｖ／Ｉ）Ｔ（Ｖ／Ｉ）ＦＴ（Ｖ／Ｉ）ＧＴＧＧＭＦＤＱＲ（配列番号４５）、Ｐ（Ｋ／Ｍ）ＰＡＱＷＨＲＩ（Ａ／Ｓ）（Ｖ／Ｉ）Ｈ（Ｎ／Ｓ）（Ｄ／Ｅ）（配列番号４６）、ＡＶＱ（Ｋ／Ｑ）Ｌ（Ｖ／Ｔ）ＫＮＳ（Ａ／Ｓ）ＶＹ（Ｖ／Ｉ）ＥＧ（Ｄ／Ｅ）ＩＥ（Ｔ／Ｉ）Ｒ（Ｖ／Ｉ）ＹＮＤ（配列番号４７）、及びＩＣ（Ｌ／Ｖ／Ｉ）Ｒ（Ｒ／Ｇ）ＤＧＫＩ（配列番号４８）のうちの１つ以上又は全てを含む。
【0046】
一実施形態では、穀粒は、内在性遺伝子を含み、内在性遺伝子は、短縮型ｍｔＳＳＢポリペプチド、好ましくは、短縮型ｍｔＳＳＢ－１ａポリペプチドをコードする。一実施形態では、短縮型ｍｔＳＳＢポリペプチドは、Ｃ末端短縮されている。一実施形態では、短縮型ｍｔＳＳＢポリペプチドは、２００個のアミノ酸未満の長さである。本発明の穀物粒の短縮型ｍｔＳＳＢポリペプチドの例としては、配列番号８、配列番号９、配列番号１０から選択されるアミノ酸配列からなるもの、又はそれらのうちのいずれか１つの短縮型バージョンが挙げられるが、これらに限定されない。
【0047】
一実施形態では、低減されたｍｔＳＳＢ活性は、
ｉ）低減された、一本鎖ＤＮＡに結合する能力、
ｉｉ）低減された、ＲＥＣＡ３ポリペプチドに結合する能力、及び
ｉｉｉ）低減された、ＴＷＩＮＫＬＥポリペプチドに結合する能力のうちの１つ以上又は全てである。
ｉ）低減された、一本鎖ＤＮＡに結合する能力、
ｉｉ）低減された、ＲＥＣＡ３ポリペプチドに結合する能力、及び
ｉｉｉ）低減された、ＴＷＩＮＫＬＥポリペプチドに結合する能力のうちの１つ以上又は全てである。
【0048】
一実施形態では、野生型穀粒は、ＲＥＣＡ３ポリペプチドを含み、ＲＥＣＡ３ポリペプチドは、配列番号６１、６７、６９、７１、７３、７５、７７、若しくは７９のうちのいずれか１つで提供されるアミノ酸配列、又は配列番号６１、６７、６９、７１、７３、７５、７７、若しくは７９のうちのいずれか１つ以上と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む。
【0049】
一実施形態では、野生型穀粒は、ＲＥＣＡ３ポリペプチドを含み、ＲＥＣＡ３ポリペプチドは、配列番号６１で提供されるアミノ酸配列、又は配列番号６１と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む。
【0050】
一実施形態では、低減されたＲＥＣＡ３ポリペプチド活性は、
ｉ）低減された、ｍｔＳＳＢポリペプチドに結合する能力、及び
ｉｉ）低減されたリコンビナーゼ活性のうちの１つ又は両方である。
ｉ）低減された、ｍｔＳＳＢポリペプチドに結合する能力、及び
ｉｉ）低減されたリコンビナーゼ活性のうちの１つ又は両方である。
【0051】
一実施形態では、野生型穀粒は、ＴＷＩＮＫＬＥポリペプチドを含み、ＴＷＩＮＫＬＥポリペプチドは、配列番号６４、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、若しくは９６のうちのいずれか１つで提供されるアミノ酸配列、又は配列番号６４、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、若しくは９６のうちのいずれか１つ以上と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む。
【0052】
一実施形態では、野生型穀粒は、ＴＷＩＮＫＬＥポリペプチドを含み、ＴＷＩＮＫＬＥポリペプチドは、配列番号６４で提供されるアミノ酸配列、又は配列番号６４と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む。
【0053】
一実施形態では、低減されたＴＷＩＮＫＬＥポリペプチド活性は、
ｉ）低減された、ｍｔＳＳＢポリペプチドに結合する能力、及び
ｉｉ）低減されたヘリカーゼ活性のうちの１つ又は両方である。
ｉ）低減された、ｍｔＳＳＢポリペプチドに結合する能力、及び
ｉｉ）低減されたヘリカーゼ活性のうちの１つ又は両方である。
【0054】
また、変異型ミトコンドリア一本鎖ＤＮＡ結合（ｍｔＳＳＢ）ポリペプチド、変異型ＲＥＣＡ３ポリペプチド、又は変異型ＴＷＩＮＫＬＥポリペプチドであって、それぞれ、対応する野生型ミトコンドリア一本鎖ＤＮＡ結合（ｍｔＳＳＢ）ポリペプチド、ＲＥＣＡ３ポリペプチド、又はＴＷＩＮＫＬＥポリペプチドのアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有し、対応する野生型ポリペプチドと比較して低減された活性を有し、好ましくは、本発明の遺伝的変動を含む穀類植物の内在性遺伝子によってコードされている、変異型ｍｔＳＳＢポリペプチド、変異型ＲＥＣＡ３ポリペプチド、又は変異型ＴＷＩＮＫＬＥポリペプチドが提供される。
【0055】
別の態様では、本発明は、本発明の変異型ミトコンドリア一本鎖ＤＮＡ結合（ｍｔＳＳＢ）ポリペプチド、ＲＥＣＡ３ポリペプチド、又はＴＷＩＮＫＬＥポリペプチド、好ましくは、本発明の遺伝的変動を含む穀類植物の内在性遺伝子をコードする、ポリヌクレオチドを提供する。
【0056】
一実施形態では、ポリヌクレオチドは、穀類植物の穀粒内で発現されるプロモーターに動作可能に連結されている。
【0057】
更なる態様では、本発明は、穀類植物の穀粒内に存在するときに、ミトコンドリア一本鎖ＤＮＡ結合（ｍｔＳＳＢ）ポリペプチド、ＲＥＣＡ３ポリペプチド、又はＴＷＩＮＫＬＥポリペプチドをコードする遺伝子の発現を低減する、単離及び／又は外来性ポリヌクレオチドを提供する。
【0058】
一実施形態では、ポリヌクレオチドは、穀類植物の穀粒内で発現されるプロモーターに動作可能に連結されている。
【0059】
また、穀類植物の発達中の穀粒内の遺伝子の発現を、少なくとも受粉時と受粉後３０日目との間の時点で低減するために使用されるときの、上記の態様のポリヌクレオチドが提供される。
【0060】
当業者は、標的遺伝子の発現を低減するために使用され得る異なるタイプのポリヌクレオチド、及びどのようにこれらのポリヌクレオチドが設計され得るかを十分に認識している。例としては、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子若しくはそのプロセシングされたＲＮＡ産物、マイクロＲＮＡ、アンチセンスポリヌクレオチド、センスポリヌクレオチド、又は触媒ポリヌクレオチドが挙げられるが、これらに限定されない。
【0061】
一実施形態では、ポリヌクレオチドは、ｄｓＲＮＡ分子又はそのプロセシングされたＲＮＡ産物であり、ｄｓＲＮＡ分子又はそのプロセシングされたＲＮＡ産物は、少なくとも１９個、少なくとも２０個、又は少なくとも２１個の連続したヌクレオチドを含み、少なくとも１９個、少なくとも２０個、又は少なくとも２１個の連続したヌクレオチドは、穀類ミトコンドリア一本鎖ＤＮＡ結合（ｍｔＳＳＢ）ポリペプチド、ＲＥＣＡ３ポリペプチド、若しくはＴＷＩＮＫＬＥポリペプチド（ここで、チミン（Ｔ）は、ウラシル（Ｕ）である）をコードする遺伝子の補体と少なくとも９５％同一であるか、又は穀類ミトコンドリア一本鎖ＤＮＡ結合（ｍｔＳＳＢ）ポリペプチド、ＲＥＣＡ３ポリペプチド、若しくはＴＷＩＮＫＬＥポリペプチドをコードするｍＲＮＡの補体と少なくとも９５％同一である。例えば、一実施形態では、ポリヌクレオチドは、ｄｓＲＮＡ分子又はそのプロセシングされたＲＮＡ産物であり、ｄｓＲＮＡ分子又はそのプロセシングされたＲＮＡ産物は、少なくとも１９個の連続したヌクレオチドを含み、少なくとも１９個の連続したヌクレオチドは、配列番号１の補体（ここで、チミン（Ｔ）は、ウラシル（Ｕ）である）と少なくとも９５％同一であるか、又は配列番号３として提供されるアミノ酸配列を含むｍｔＳＳＢポリペプチドをコードするｍＲＮＡの補体と少なくとも９５％同一である。
【0062】
別の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）前駆体であり、かつ／又はそのプロセシングされたＲＮＡ産物は、ｍｉＲＮＡである。
【0063】
別の態様では、本発明は、本発明のポリヌクレオチドをコードする核酸構築物及び／又はベクターであって、核酸構築物又はベクターが、ポリヌクレオチドをコードするＤＮＡ領域を含み、ポリヌクレオチドが、プロモーターに動作可能に連結されており、プロモーターが、穀類植物の発達中の穀粒内で、少なくとも受粉時と受粉後３０日目との間の時点で発現される、核酸構築物及び／又はベクターを提供する。
【0064】
別の態様では、本発明は、本発明のポリヌクレオチド、又は本発明の核酸構築物及び／若しくはベクターを含む、細胞、組織、器官、植物部分、又は植物を提供する。
【0065】
一実施形態では、ポリヌクレオチド、核酸構築物又はベクターは、細胞、組織、器官、植物部分、又は植物のゲノム内に、好ましくは、核ゲノム内に組み込まれている。
【0066】
別の態様では、本発明は、対応する野生型穀類植物細胞に対して低減されたレベル及び／又は活性の少なくとも１つのミトコンドリアポリペプチドを含む、穀類植物細胞、それからの種子又は組織であって、レベル及び／又は活性が低減したミトコンドリアポリペプチドが、ミトコンドリア一本鎖ＤＮＡ結合（ｍｔＳＳＢ）ポリペプチド、ＲＥＣＡ３ポリペプチド、及びＴＷＩＮＫＬＥポリペプチドのうちの少なくとも１つである、穀類植物細胞、それからの種子又は組織を提供する。
【0067】
一実施形態では、細胞、それからの種子又は組織は、胚乳、種皮、アリューロン、若しくは胚細胞であるか、又はこれを含む。
【0068】
一実施形態では、細胞は、アリューロン細胞である。
【0069】
別の態様では、本発明は、本発明の穀粒を産生し、かつ／あるいは本発明のポリペプチド、本発明のポリヌクレオチド、本発明の核酸構築物及び／若しくはベクター、又は本発明の細胞、種子若しくは組織のうちの１つ以上又は全てを含む、穀類植物を提供する。
【0070】
一実施形態では、本発明の植物は、対応する野生型植物とほぼ同じ高さを有する。
【0071】
一実施形態では、本発明の植物は、稔性雄及び雌である。
【0072】
一実施形態では、本発明の植物は、穀粒成熟の遅延を示す。
【0073】
また、圃場で成長する、少なくとも１００個の本発明の穀類植物の集団が提供される。
【0074】
別の態様では、本発明は、本発明の細胞を産生する方法であって、本発明の遺伝的変動、本発明のポリヌクレオチド、又は本発明の核酸構築物及び／若しくはベクターを、細胞、好ましくは、穀類植物細胞内に導入するステップを含む、方法を提供する。
【0075】
別の態様では、本発明は、本発明の穀類植物又はそれからの穀粒を産生する方法であって、
ｉ）本発明の遺伝的変動、本発明のポリヌクレオチド、又は本発明の核酸構築物及び／若しくはベクターを、穀類植物細胞内に導入するステップと、
ｉｉ）遺伝的変動又はポリヌクレオチドを含む穀類植物を、ステップｉ）から得られた細胞から得るステップと、
ｉｉｉ）任意選択で、穀粒をステップｉｉ）の植物から収穫するステップであって、穀粒が、遺伝的変動を含むか又はポリヌクレオチド、核酸構築物若しくはベクターについてのトランスジェニックである、収穫するステップと、
ｉｖ）任意選択で、１世代以上の子孫植物を穀粒から産生するステップであって、子孫植物が、遺伝的変動を含むか又はポリヌクレオチド、核酸構築物若しくはベクターについてのトランスジェニックである、産生するステップと、を含み、
それによって、穀類植物又は穀粒を産生する、方法を提供する。
ｉ）本発明の遺伝的変動、本発明のポリヌクレオチド、又は本発明の核酸構築物及び／若しくはベクターを、穀類植物細胞内に導入するステップと、
ｉｉ）遺伝的変動又はポリヌクレオチドを含む穀類植物を、ステップｉ）から得られた細胞から得るステップと、
ｉｉｉ）任意選択で、穀粒をステップｉｉ）の植物から収穫するステップであって、穀粒が、遺伝的変動を含むか又はポリヌクレオチド、核酸構築物若しくはベクターについてのトランスジェニックである、収穫するステップと、
ｉｖ）任意選択で、１世代以上の子孫植物を穀粒から産生するステップであって、子孫植物が、遺伝的変動を含むか又はポリヌクレオチド、核酸構築物若しくはベクターについてのトランスジェニックである、産生するステップと、を含み、
それによって、穀類植物又は穀粒を産生する、方法を提供する。
【0076】
別の態様では、本発明は、本発明の穀類植物又はそれからの穀粒を産生する方法であって、
ｉ）内在性遺伝子に対する変異を穀類植物細胞内に導入するステップであって、内在性遺伝子が、ミトコンドリア一本鎖ＤＮＡ結合（ｍｔＳＳＢ）ポリペプチド、ＲＥＣＡ３ポリペプチド、又はＴＷＩＮＫＬＥポリペプチドをコードし、これにより、細胞が、対応する野生型穀類植物細胞に対して低減されたレベル及び／又は活性のミトコンドリア一本鎖ＤＮＡ結合（ｍｔＳＳＢ）ポリペプチド、ＲＥＣＡ３ポリペプチド、又はＴＷＩＮＫＬＥポリペプチドを有する、導入するステップと、
ｉｉ）穀類植物をステップｉ）の細胞から得ることであって、穀類植物が、内在性遺伝子の変異を含む、得るステップと、
ｉｉｉ）任意選択で、穀粒をステップｉｉ）の植物から収穫するステップであって、穀粒が、変異を含む、収穫するステップと、
ｉｖ）任意選択で、１世代以上の子孫植物を穀粒から産生するステップであって、子孫植物が、変異を含む、産生するステップと、を含み、
それによって、穀類植物又は穀粒を産生する、方法を提供する。
ｉ）内在性遺伝子に対する変異を穀類植物細胞内に導入するステップであって、内在性遺伝子が、ミトコンドリア一本鎖ＤＮＡ結合（ｍｔＳＳＢ）ポリペプチド、ＲＥＣＡ３ポリペプチド、又はＴＷＩＮＫＬＥポリペプチドをコードし、これにより、細胞が、対応する野生型穀類植物細胞に対して低減されたレベル及び／又は活性のミトコンドリア一本鎖ＤＮＡ結合（ｍｔＳＳＢ）ポリペプチド、ＲＥＣＡ３ポリペプチド、又はＴＷＩＮＫＬＥポリペプチドを有する、導入するステップと、
ｉｉ）穀類植物をステップｉ）の細胞から得ることであって、穀類植物が、内在性遺伝子の変異を含む、得るステップと、
ｉｉｉ）任意選択で、穀粒をステップｉｉ）の植物から収穫するステップであって、穀粒が、変異を含む、収穫するステップと、
ｉｖ）任意選択で、１世代以上の子孫植物を穀粒から産生するステップであって、子孫植物が、変異を含む、産生するステップと、を含み、
それによって、穀類植物又は穀粒を産生する、方法を提供する。
【0077】
別の態様では、本発明は、本発明の穀類植物又は本発明の穀粒を選択する方法であって、
ｉ）穀類植物の集団又は穀粒をスクリーニングするステップであって、穀類植物の集団又は穀粒の各々が、前駆穀類植物細胞、穀粒、又は植物の変異誘発処理から得られたものであり、穀類植物の集団又は穀粒を、本発明の穀粒の産生について、又はミトコンドリア一本鎖ＤＮＡ結合（ｍｔＳＳＢ）ポリペプチド、ＲＥＣＡ３ポリペプチド、若しくはＴＷＩＮＫＬＥポリペプチドをコードする遺伝子内の変異の存在についてスクリーニングするステップと、
ｉｉ）穀類植物をステップ（ｉ）の集団から選択するステップであって、穀類植物が、本発明の穀粒を産生するか又は変異を遺伝子内に含む、選択するステップと、を含み、
それによって、穀類植物又は穀粒を選択する、方法を提供する。
ｉ）穀類植物の集団又は穀粒をスクリーニングするステップであって、穀類植物の集団又は穀粒の各々が、前駆穀類植物細胞、穀粒、又は植物の変異誘発処理から得られたものであり、穀類植物の集団又は穀粒を、本発明の穀粒の産生について、又はミトコンドリア一本鎖ＤＮＡ結合（ｍｔＳＳＢ）ポリペプチド、ＲＥＣＡ３ポリペプチド、若しくはＴＷＩＮＫＬＥポリペプチドをコードする遺伝子内の変異の存在についてスクリーニングするステップと、
ｉｉ）穀類植物をステップ（ｉ）の集団から選択するステップであって、穀類植物が、本発明の穀粒を産生するか又は変異を遺伝子内に含む、選択するステップと、を含み、
それによって、穀類植物又は穀粒を選択する、方法を提供する。
【0078】
別の態様では、本発明は、本発明の穀類植物を選択する方法であって、
ｉ）１つ以上の子孫植物を穀物粒から産生するステップであって、穀物粒が、２つの親穀類植物の交雑に由来したものである、産生するステップと、
ｉｉ）ステップｉ）の１つ以上の子孫植物を、本発明の穀粒の産生についてスクリーニングするステップと、
ｉｉｉ）穀粒を産生する子孫植物を選択するステップと、を含み、
それによって、穀類植物を選択する、方法を提供する。
ｉ）１つ以上の子孫植物を穀物粒から産生するステップであって、穀物粒が、２つの親穀類植物の交雑に由来したものである、産生するステップと、
ｉｉ）ステップｉ）の１つ以上の子孫植物を、本発明の穀粒の産生についてスクリーニングするステップと、
ｉｉｉ）穀粒を産生する子孫植物を選択するステップと、を含み、
それによって、穀類植物を選択する、方法を提供する。
【0079】
一実施形態では、ステップｉｉ）は、子孫植物からのＤＮＡを含む試料を、遺伝的変動について解析することを含む。
【0080】
一実施形態では、ステップｉｉ）は、子孫植物から得られた穀粒のアリューロンの厚さを解析することを含む。
【0081】
一実施形態では、ステップｉｉ）は、穀粒又はその一部分の栄養含有量を解析することを含む。
【0082】
一実施形態では、ステップｉｉｉ）は、子孫植物を選択することであって、子孫植物が、遺伝的変動についてホモ接合性である、選択することを含む。
【0083】
一実施形態では、子孫植物の穀粒が、対応する野生型穀物粒と比較して増加したアリューロン厚さを有する、子孫植物を選択するステップｉｉｉ）。
【0084】
一実施形態では、子孫植物の穀粒又はその一部分が、対応する野生型穀物粒又はその一部分と比較して変更された栄養含有量を有する、子孫植物を選択するステップｉｉｉ）。
【0085】
一実施形態では、方法は、
ｉ）２つの親穀類植物を交雑することであって、好ましくは、親穀類植物のうちの１つが、本発明の穀粒を産生する、交雑すること、又は
ｉｉ）ステップｉ）からの１つ以上の子孫植物を、本発明の穀粒を産生しない最初の親穀類植物と同じ遺伝子型の植物と、最初の親穀類植物の遺伝子型の大部分を有するが本発明を産生するのに十分な回数戻し交雑すること、及び
ｉｉｉ）本発明の穀粒を産生する子孫植物を選択することを更に含む。
ｉ）２つの親穀類植物を交雑することであって、好ましくは、親穀類植物のうちの１つが、本発明の穀粒を産生する、交雑すること、又は
ｉｉ）ステップｉ）からの１つ以上の子孫植物を、本発明の穀粒を産生しない最初の親穀類植物と同じ遺伝子型の植物と、最初の親穀類植物の遺伝子型の大部分を有するが本発明を産生するのに十分な回数戻し交雑すること、及び
ｉｉｉ）本発明の穀粒を産生する子孫植物を選択することを更に含む。
【0086】
また、本発明の方法を使用して産生される穀類植物が提供される。
【0087】
また、細胞、穀類植物、又は穀物粒などの植物部分を産生するための、本発明のポリヌクレオチド、又は本発明の核酸構築物及び／若しくはベクターの使用が提供される。
【0088】
一実施形態では、使用は、本発明の穀粒を産生するための使用である。
【0089】
更なる態様では、本発明は、本発明の穀粒を産生する穀類植物を同定するための方法であって、
ｉ）核酸試料を穀類植物から得るステップと、
ｉｉ）試料を遺伝的変動の存在又は非存在についてスクリーニングするステップであって、遺伝的変動が、対応する野生型穀類植物と比較して、植物内のミトコンドリア一本鎖ＤＮＡ結合（ｍｔＳＳＢ）ポリペプチド、ＲＥＣＡ３ポリペプチド、又はＴＷＩＮＫＬＥポリペプチドの活性のレベルを低減する、スクリーニングするステップと、を含む、方法を提供する。
ｉ）核酸試料を穀類植物から得るステップと、
ｉｉ）試料を遺伝的変動の存在又は非存在についてスクリーニングするステップであって、遺伝的変動が、対応する野生型穀類植物と比較して、植物内のミトコンドリア一本鎖ＤＮＡ結合（ｍｔＳＳＢ）ポリペプチド、ＲＥＣＡ３ポリペプチド、又はＴＷＩＮＫＬＥポリペプチドの活性のレベルを低減する、スクリーニングするステップと、を含む、方法を提供する。
【0090】
一実施形態では、遺伝的変動は、
ａ）ポリヌクレオチドを発現する核酸構築物又はそれによってコードされたポリヌクレオチドであって、穀類植物内に存在するときに、ミトコンドリア一本鎖ＤＮＡ結合（ｍｔＳＳＢ）ポリペプチド、ＲＥＣＡ３ポリペプチド、又はＴＷＩＮＫＬＥポリペプチドをコードする遺伝子の発現を低減する、ポリヌクレオチドを発現する核酸構築物又はそれによってコードされたポリヌクレオチド、及び
ｂ）遺伝子又はそれによってコードされたｍＲＮＡであって、低減された活性を有する、変異型ミトコンドリア一本鎖ＤＮＡ結合（ｍｔＳＳＢ）ポリペプチド、ＲＥＣＡ３ポリペプチド、又はＴＷＩＮＫＬＥポリペプチド、好ましくは、短縮型ｍｔＳＳＢポリペプチド、ＲＥＣＡ３ポリペプチド、又はＴＷＩＮＫＬＥポリペプチドを発現する、遺伝子又はそれによってコードされたｍＲＮＡのうちの１つ又は両方である。
ａ）ポリヌクレオチドを発現する核酸構築物又はそれによってコードされたポリヌクレオチドであって、穀類植物内に存在するときに、ミトコンドリア一本鎖ＤＮＡ結合（ｍｔＳＳＢ）ポリペプチド、ＲＥＣＡ３ポリペプチド、又はＴＷＩＮＫＬＥポリペプチドをコードする遺伝子の発現を低減する、ポリヌクレオチドを発現する核酸構築物又はそれによってコードされたポリヌクレオチド、及び
ｂ）遺伝子又はそれによってコードされたｍＲＮＡであって、低減された活性を有する、変異型ミトコンドリア一本鎖ＤＮＡ結合（ｍｔＳＳＢ）ポリペプチド、ＲＥＣＡ３ポリペプチド、又はＴＷＩＮＫＬＥポリペプチド、好ましくは、短縮型ｍｔＳＳＢポリペプチド、ＲＥＣＡ３ポリペプチド、又はＴＷＩＮＫＬＥポリペプチドを発現する、遺伝子又はそれによってコードされたｍＲＮＡのうちの１つ又は両方である。
【0091】
一実施形態では、遺伝的変動の存在は、穀類植物の穀粒が、遺伝的変動を欠く対応する穀類植物と比較して、肥厚アリューロンを有することを示す。
【0092】
別の態様では、本発明は、本発明の穀粒を産生する穀類植物を同定するための方法であって、
ｉ）穀粒を穀類植物から得るステップと、
ｉｉ）穀粒又はその一部分を、
ａ）肥厚アリューロン、
ｂ）穀粒内の、ミトコンドリア一本鎖ＤＮＡ結合（ｍｔＳＳＢ）ポリペプチド、ＲＥＣＡ３ポリペプチド、若しくはＴＷＩＮＫＬＥポリペプチドの量及び／又は活性、並びに
ｃ）穀粒内の、ミトコンドリア一本鎖ＤＮＡ結合（ｍｔＳＳＢ）ポリペプチド、ＲＥＣＡ３ポリペプチド、又はＴＷＩＮＫＬＥポリペプチドをコードする遺伝子によってコードされたｍＲＮＡの量のうちの１つ以上についてスクリーニングするステップと、を含む、方法を提供する。
ｉ）穀粒を穀類植物から得るステップと、
ｉｉ）穀粒又はその一部分を、
ａ）肥厚アリューロン、
ｂ）穀粒内の、ミトコンドリア一本鎖ＤＮＡ結合（ｍｔＳＳＢ）ポリペプチド、ＲＥＣＡ３ポリペプチド、若しくはＴＷＩＮＫＬＥポリペプチドの量及び／又は活性、並びに
ｃ）穀粒内の、ミトコンドリア一本鎖ＤＮＡ結合（ｍｔＳＳＢ）ポリペプチド、ＲＥＣＡ３ポリペプチド、又はＴＷＩＮＫＬＥポリペプチドをコードする遺伝子によってコードされたｍＲＮＡの量のうちの１つ以上についてスクリーニングするステップと、を含む、方法を提供する。
【0093】
一実施形態では、方法は、本発明の穀類植物を同定する。
【0094】
更なる態様では、本発明は、穀類植物部分を産生する方法であって、
ａ）本発明の穀類植物又は少なくとも１００個のこのような穀類植物を圃場で成長させることと、
ｂ）穀類植物部分を穀類植物又は複数の穀類植物から収穫することと、を含む、方法を提供する。
ａ）本発明の穀類植物又は少なくとも１００個のこのような穀類植物を圃場で成長させることと、
ｂ）穀類植物部分を穀類植物又は複数の穀類植物から収穫することと、を含む、方法を提供する。
【0095】
更なる態様では、本発明は、穀粒から得られる加工穀粒、又は粉、ふすま、全粒粉、麦芽、デンプン、若しくは油を製造する方法であって、
ａ）本発明の穀粒を得ることと、
ｂ）穀粒を加工して、加工穀粒、粉、ふすま、全粒粉、麦芽、デンプン、又は油を製造することと、を含む、方法を提供する。
ａ）本発明の穀粒を得ることと、
ｂ）穀粒を加工して、加工穀粒、粉、ふすま、全粒粉、麦芽、デンプン、又は油を製造することと、を含む、方法を提供する。
【0096】
また、本発明の穀粒若しくは本発明の穀類植物から、又は遺伝的変動を含む当該穀粒若しくは穀類植物の一部分から製造される製品が提供される。
【0097】
一実施形態では、製品は、遺伝的変動、ポリヌクレオチド、核酸構築物又はベクター、及び肥厚アリューロンのうちの１つ以上又は全てを含む。
【0098】
一実施形態では、一部分は、調理された、煮沸された、湯引かれた、焙煎された、ベーキングされた、精白された、割られた、膨化した、製粉された、又は薄片にされた穀粒又はふすまである。
【0099】
一実施形態では、製品は、食品成分、飲料成分、食品製品、又は飲料製品である。
【0100】
一実施形態では、食品成分又は飲料成分は、焙煎された穀粒、精白された穀粒、割られた穀粒、膨化した穀粒、製粉された穀粒、薄片にされた穀粒、全粒粉、粉、ふすま、デンプン、麦芽、及び油からなる群から選択される。
【0101】
一実施形態では、食品製品は、加工穀粒、調理された穀粒、煮沸された穀粒、かゆ、発酵若しくは無発酵パン、パスタ、ヌードル、動物飼料、朝食用シリアル、スナック食品、ケーキ、ペーストリ、及び粉ベースのソースを含有する食品からなる群から選択される。
【0102】
一実施形態では、飲料製品は、茶、包装された飲料、又はエタノールを含む飲料である。
【0103】
更なる態様では、本発明は、本発明の食品又は飲料成分を調製する方法であって、本発明の穀粒又は穀粒からのふすま、粉、全粒粉、麦芽、デンプン、若しくは油を加工して、食品又は飲料成分を製造することを含む、方法を提供する。
【0104】
更なる態様では、本発明は、本発明の食品又は飲料製品を調製する方法であって、好ましくは、本発明の穀粒を調理する、煮沸する、焙煎する、又は薄片にすることによって、あるいは本発明の穀粒又は穀粒からのふすま、粉、全粒粉、麦芽、デンプン、若しくは油を、別の食品又は飲料成分と混合することによって、穀粒を加工することを含む、方法を提供する。
【0105】
また、動物飼料若しくは食品としての、又は動物摂取のための飼料若しくはヒト摂取のための食品を製造するための、本発明の穀粒若しくはその一部分、又は本発明の穀類植物若しくはその一部分の使用が提供される。
【0106】
別の態様では、本発明は、本発明のポリペプチド、本発明のポリヌクレオチド、本発明の核酸構築物及び／若しくはベクター、又は本発明の細胞のうちの１つ以上と、１つ以上の許容可能な担体、好ましくは、別の食品成分と、を含む、組成物を提供する。
【0107】
本明細書のいずれの実施形態も、別途具体的に記載されない限り、任意の他の実施形態に準用すると解釈される。
【0108】
本発明の範囲は、本明細書に記載される具体的な実施形態によって限定されず、具体的な実施形態は、例示のみの目的で意図されている。機能的に均等な製品、組成物、及び方法は、明らかに、本明細書に記載される本発明の範囲内である。
【0109】
本明細書全体にわたって、別途具体的に記載されない限り又は文脈により別途必要とされない限り、単一ステップ、物質の組成物、ステップの群、又は物質の組成物の群への言及は、これらのステップ、物質の組成物、ステップの群、又は物質の組成物の群のうちの１つ及び複数（すなわち、１つ以上）を包含すると解釈される。
【0110】
本発明は、以下の非限定的な実施例によってかつ添付の図を参照して、以下に記載される。
【図面の簡単な説明】
【0111】
【図1】ｔａ１－１成熟穎花は、厚アリューロン表現型を示した。野生型（ＺＨ１１、Ａ）及びｔａ１－１（Ｂ）の成熟穎花；ＺＨ１１（Ｃ）及びｔａ１－１（Ｄ）成熟穎花の横断面；ＺＨ１１（Ｅ）及びｔａ１－１（Ｆ）成熟穎花のルゴール染色、矢印は、アリューロンを指す；ＤＡＰ５日目（Ｇ）、ＤＡＰ１０日目（Ｉ）、ＤＡＰ３０日目（Ｋ）のＺＨ１１の穎花準超薄切片、及びＤＡＰ５日目（Ｈ）、ＤＡＰ１０日目（Ｊ）、ＤＡＰ３０日目（Ｌ）のｔａ１－１の穎花準超薄切片のＰＡＳ及びクーマシーブリリアントブルー（Ｇ－２５０）染色。バー＝Ａ及びＢにおいて２ｍｍ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、及びＦにおいて１ｍｍ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｊ、Ｋ、及びＬにおいて２０μｍ。ＤＡＰ：受粉後の日数。
【図2】穎花の異なる位置における野生型及びｔａ１－１の成熟穀粒内のアリューロン細胞層の平均数。値は、平均±ＳＤ（ｎ＝１５）を表し、＊＊Ｐ＜０．０１。
【図3】穀粒乾燥重量の経時変化の解析。ＤＡＰ：受粉後の日数。データは、平均±ＳＤ（ｎ＝１０）を示し、＊＊Ｐ＜０．０１。
【図4】ＺＨ１１（野生型）及びｔａ１－１成熟穎花の栄養素含有量。成熟穎花内の総タンパク質（Ａ）、粗脂質（Ｂ）、食物繊維（Ｃ）、カルシウム（Ｄ）、鉄（Ｅ）、亜鉛（Ｆ）、ビタミンＢ２（Ｇ）、及びビタミンＢ３（Ｈ）含有量が測定された。平均±ＳＥＭとして示されるデータ、ｎ＝３、（＊、Ｐ＜０．０５；＊＊、Ｐ＜０．０１）。
【図5】吸水後の発芽した穀粒からのｔａ１－１胚乳及びアリューロンのα－アミラーゼ活性アッセイ。より暗いバーは、ｔａ１－１穀粒についてである。スチューデントｔ検定によって判定された場合、ＺＨ１１とｔａ１との間の差は有意であった。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。各々のバーは、３つの試料の平均を表した。
【図6】米の染色体５にマッピングされたＩｎｄｅｌマーカーを示す、ＴＡ１マップベースのクローニング。各々の線形マップは、直上のマップからのセグメントの拡大を表す。ｎは、マッピングプロセスの各々の段階において使用された組換え体の数を示す。Ｉｎｄｅｌ＝番号で同定された挿入又は欠失。各々の垂直線の下の数字は、Ｉｎｄｅｌマーカーとｔａ１－１変異との間の組換え体の数を示す。Ｍｂ、１００万個の塩基対、Ｋｂ、１０００個の塩基対。最下の線は、ＴＡ１遺伝子の概略図であり、塗りつぶし長方形ボックスは、タンパク質コード領域内のエクソン（アラビア数字１～６）を表し、線は、タンパク質コード領域内のイントロン（ローマ数字Ｉ～Ｖ）を表す。Ｇ～Ａと標識された矢印は、厚アリューロン表現型の要因であるｔａ１－１アレル内のＧ～Ａ点変異の位置を示す。
【図7】野生型ＴＡ１ ｃＤＮＡ（ＺＨ１１）の対応する領域のヌクレオチド配列（配列番号１１）と比較しての、ｔａ１ Ｉ、ｔａ１ ＩＩ、及びｔａ１ ＩＩＩと標識された異なるｔａ１－１ ＲＮＡから産生されたｃＤＮＡの領域の３つのヌクレオチド配列（配列番号１２～１４）のアライメント。この領域は、変異型ｔａ１－１遺伝子からの転写物の選択的スプライシングに関与していた。
【図8】野生型ＴＡ１ポリペプチド配列（ＺＨ１１、配列番号３）と比較しての、ｔａ１－１穀粒内で産生された３つの異なるＲＮＡから翻訳されたポリペプチドの予測アミノ酸配列（配列番号８、９、及び１０）。
【図9】野生型ＯｓＴＡ１ポリペプチド（配列番号３）のアミノ酸配列と、Ｚｅａ ｍａｙｓ（配列番号１６）、Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒ（配列番号１７）、オオムギＨｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ（配列番号１８）、コムギＴｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ（配列番号１９）、Ｂｒａｃｈｙｐｏｄｉｕｍ ｄｉｓｔａｃｈｙｏｎ（配列番号２０）、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ（配列番号１５）、及びポプラ（配列番号２１）内の相同体のアミノ酸配列とのアライメント。また、関連米配列（ＯｓＴＡ１Ｌ；配列番号２４）が、アライメントにおいて使用された。９つの配列内の完全に保存されたアミノ酸は、アスタリスクで示され、ほとんど保存されたアミノ酸は、セミコロンで示され、同様のアミノ酸は、ドットで示される。一本鎖ＤＮＡ結合（ＳＳＢ）ドメインは、実バーによって示され、ミトコンドリア輸送ペプチド（ＭＴＰ）を除去するための予測切断部位は、矢印によって示される。
【図10】異なる米組織内のＴＡ１遺伝子の相対発現レベル。ＳＡＭ：茎頂分裂組織、ＤＡＰ：受粉後の日数。全ての発現レベルは、アクチン遺伝子に正規化される。各々の試料についての３つの複製が作製され、平均±ＳＤとして示された。
【図11】ビオチン標識された４５個のヌクレオチドのｓｓＤＮＡ分子をプローブとして使用する、ｓｓＤＮＡへの６ｘＨｉｓ－ＴＡ１タンパク質結合（レーン２）。非標識ｓｓＤＮＡを、２×（レーン３）、２０×（レーン４）、及び２００×（レーン５）において、競合相手ｓｓＤＮＡとして付加することは、移動度シフトされたビオチン標識ｓｓＤＮＡの量を、ＴＡ１タンパク質の存在下で漸進的に減らした。
【図12】６ｘＨｉｓ－ＴＡ１及びその変異型形態６ｘＨｉｓ－ｔａ１－１ポリペプチド（短縮型ＴＡ１ポリペプチド）が、ｓｓＤＮＡへのこれらの結合を、ＥＭＳＡ実験によって、ビオチン標識された４５個のヌクレオチドのｓｓＤＮＡ分子をプローブとして使用して検査するために使用された。２μｇの組換えＴＡ１タンパク質が、図１１に関するアッセイを実行するために使用され、２μｇ、４μｇ、及び８μｇの組換え６ｘＨｉｓ－ｔａ１－１ポリペプチドの勾配が、同じ条件下で使用された。
【図13】異なる発達段階における米穎花のアリューロン及び胚内のＴＡ１の発現。ｐＴＡ１：ＴＡ１－ＧＵＳトランスジェニック植物からの穎花が、ＧＵＳ活性について、ＤＡＰ５日目（Ａ及びＧ）、ＤＡＰ７日目（Ｂ及びＨ）、ＤＡＰ９日目（Ｃ及びＩ）、ＤＡＰ１１日目（Ｄ及びＪ）、ＤＡＰ１８日目（Ｅ及びＫ）、及びＤＡＰ２４日目（Ｆ及びＬ）に染色された。Ｃ、Ｄ、Ｉ、及びＪにおける矢印は、アリューロン細胞層を示す。バー＝Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、及びＦにおいて０．２ｃｍ、バー＝Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｊ、Ｋ、及びＬにおいて０．１ｃｍ。ＤＡＰ：受粉後の日数。
【図14】Ａ．ＤＡＰ１５日目での、野生型と比較しての、発達中のｔａ１－１穀粒のアリューロン細胞の各々の切片内のミトコンドリアの数（ｎ＝１０）。Ｂ．ＤＡＰ１１日目での野生型及びｔａ１－１アリューロン内のＡＴＰ含有量。データは、平均±ＳＤとして示される。ｎ＝３；＊＊は、Ｐ＜０．０１を示す。
【図15】ＲＮＡｉを使用する、米内のＲｅｃＡ３及びＴＷＩＮＫＬＥ遺伝子の下向き調節。上部パネルは、ＲｅｃＡ３及びＴＷＩＮＫＬＥ遺伝子についての概略マップを示し、エクソンが、黒ボックスとして示され、イントロンが、ボックス間の線として示される。ＲＮＡｉ構築物のために選択された遺伝子の領域（エクソンのみ）が示される。ｂ及びｃ。定量的ＲＴ－ＰＣＲが、３つの形質転換された米植物の穀粒内のｍＲＮＡレベルを、ＲＮＡｉ構築物の各々について測定するために使用され、これは、低減された発現を、選択された植物の各々内で示した。
【図16】異なる植物種、主に、穀類からのｍｔＳＳＢタンパク質の系統発生解析。タンパク質配列は、ＣｌｕｓｔａｌＷでアライメントされ、系統発生は、ＭＥＧＡ７で、近隣結合法を使用して生成された。
【図17】いくつかの穀類を含む異なる植物種からのＴＷＩＮＫＬＥタンパク質の系統発生解析。タンパク質配列は、ＣｌｕｓｔａｌＷでアライメントされ、系統発生は、ＭＥＧＡ７で、近隣結合法を使用して生成された。
【0112】
配列表の鍵
配列番号１－野生型米ＴＡ１遺伝子のヌクレオチド配列、遺伝子座Ｏｓ０５ｇ４３４４０。ヌクレオチド１～１０２４、ＴＡ１プロモーター及び５’ＵＴＲ；１０２５～１０２７、ＡＴＧ翻訳開始コドン；タンパク質コード領域は、ヌクレオチド１０２５～１０９４、１１７６～１３３９、１４２５～１６３３、１７７１～１８７１、２１２７～２１８６、及び２３５３～２３６９である。ヌクレオチド１０９５～１１７５、イントロン１；１３４０～１４２４、イントロン２；１６３４～１７７０、イントロン３；１８７２～２１２６、イントロン４；２１８７～２３５２、イントロン５。翻訳終止は、ヌクレオチド２３６７～２３６９である。
配列番号１－野生型米ＴＡ１遺伝子のヌクレオチド配列、遺伝子座Ｏｓ０５ｇ４３４４０。ヌクレオチド１～１０２４、ＴＡ１プロモーター及び５’ＵＴＲ；１０２５～１０２７、ＡＴＧ翻訳開始コドン；タンパク質コード領域は、ヌクレオチド１０２５～１０９４、１１７６～１３３９、１４２５～１６３３、１７７１～１８７１、２１２７～２１８６、及び２３５３～２３６９である。ヌクレオチド１０９５～１１７５、イントロン１；１３４０～１４２４、イントロン２；１６３４～１７７０、イントロン３；１８７２～２１２６、イントロン４；２１８７～２３５２、イントロン５。翻訳終止は、ヌクレオチド２３６７～２３６９である。
【0113】
配列番号２－ＴＡＧ終止コドンを含む野生型ＴＡ１遺伝子のｃＤＮＡのタンパク質コード領域のヌクレオチド配列。
【0114】
配列番号３－野生型ＴＡ１（ＯｓｍｔＳＳＢ）ポリペプチドのアミノ酸配列。
【0115】
配列番号４－米ｔａ１－１（変異型）遺伝子のヌクレオチド配列、遺伝子座Ｏｓ０５ｇ４３４４０。ｔａ１－１変異は、イントロン４の最後のヌクレオチドであるヌクレオチド２１２６（Ｇ２１２６Ａ）にある。ヌクレオチド１～１０２４、ＴＡ１プロモーター及び５’ＵＴＲ；１０２５～１０２７、ＡＴＧ翻訳開始コドン；タンパク質コード領域は、ヌクレオチド１０２５～１０９４、１１７６～１３３９、１４２５～１６３３、１７７１～１８７１、２１２７～２１８６、及び２３５３～２３６９である。ヌクレオチド１０９５～１１７５、イントロン１；１３４０～１４２４、イントロン２；１６３４～１７７０、イントロン３；１８７２～２１２６、イントロン４；２１８７～２３５２、イントロン５。翻訳終止は、ヌクレオチド２３６７～２３６９である。
【0116】
配列番号５－翻訳開始ＡＴＧから野生型ＴＡ１終止コドンＴＡＧまでのｔａ１－１ Ｉ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列。
【0117】
配列番号６－翻訳開始ＡＴＧから野生型ＴＡ１終止コドンＴＡＧまでのｔａ１－１ ＩＩ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列。
【0118】
配列番号７－翻訳開始ＡＴＧから野生型ＴＡ１終止コドンＴＡＧまでのｔａ１－１ ＩＩＩ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列。
【0119】
配列番号８－ｔａ１－１ Ｉポリペプチドの予測アミノ酸配列。
【0120】
配列番号９－ｔａ１－１ ＩＩポリペプチドの予測アミノ酸配列。
【0121】
配列番号１０－ｔａ１－１ ＩＩポリペプチドの予測アミノ酸配列。
【0122】
配列番号１１－野生型ＴＡ１遺伝子からのｃＤＮＡの領域のヌクレオチド配列。
【0123】
配列番号１２－ｔａ１－１遺伝子からのｃＤＮＡ Ｉの領域のヌクレオチド配列。
【0124】
配列番号１３－ｔａ１－１遺伝子からのｃＤＮＡ ＩＩの領域のヌクレオチド配列。
【0125】
配列番号１４－ｔａ１－１遺伝子からのｃＤＮＡ ＩＩＩの領域のヌクレオチド配列。
【0126】
配列番号１５－Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ内のＴＡ１相同タンパク質のアミノ酸配列。
【0127】
配列番号１６－Ｚｅａ ｍａｙｓ内のＴＡ１相同タンパク質のアミノ酸配列。
【0128】
配列番号１７－Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒ内のＴＡ１相同タンパク質のアミノ酸配列。
【0129】
配列番号１８－Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ内のＴＡ１相同タンパク質のアミノ酸配列。
【0130】
配列番号１９－ＴａｍｔＳＳＢ－１ａの予測アミノ酸配列；Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ内のＤ。
【0131】
配列番号２０－Ｂｒａｃｈｙｐｏｄｉｕｍ ｄｉｓｔａｃｈｙｏｎ内のＴＡ１相同タンパク質のアミノ酸配列。
【0132】
配列番号２１－ポプラ、Ｐｏｐｕｌｕｓ ｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ内のＴＡ１相同タンパク質のアミノ酸配列。
【0133】
配列番号２２－ＴａｍｔＳＳＢ－１ａの予測アミノ酸配列；Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ内のＢ。
【0134】
配列番号２３－Ｓｅｔａｒｉａ ｉｔａｌｉｃａ内のＳｉｍｔＳＳＢ－１ａの予測アミノ酸配列。
【0135】
配列番号２４－Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ内のＴＡ１様（ＯｓｍｔＳＳＢ－１ｂ）タンパク質のアミノ酸配列。
【0136】
配列番号２５－Ｓｅｔａｒｉａ ｉｔａｌｉｃａ内のＳｉｍｔＳＳＢ－１ｂの予測アミノ酸配列。
【0137】
配列番号２６－Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ、亜種ｖｕｌｇａｒｅ内のＨｖｍｔＳＳＢ－１ｂの予測アミノ酸配列。
【0138】
配列番号２７－ＴａｍｔＳＳＢ－１ｂの予測アミノ酸配列；Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ内のＡ。
【0139】
配列番号２８－ＴａｍｔＳＳＢ－１ｂの予測アミノ酸配列；Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ内のＢ。
【0140】
配列番号２９－ＴａｍｔＳＳＢ－１ｂの予測アミノ酸配列；Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ内のＤ。
【0141】
配列番号３０－Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ、Ｊａｐｏｎｉｃａ群内のＯｓｍｔＳＳＢ－２の予測アミノ酸配列。
【0142】
配列番号３１－Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ内のＡｔｍｔＳＳＢ－２の予測アミノ酸配列。
【0143】
配列番号３２－Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒ内のＳｂｍｔＳＳＢ－２の予測アミノ酸配列。
【0144】
配列番号３３－Ｚｅａ ｍａｙｓ内のＺｍｍｔＳＳＢ－２の予測アミノ酸配列。
【0145】
配列番号３４－Ｓｅｔａｒｉａ ｉｔａｌｉｃａ内のＳｉｍｔＳＳＢ－２の予測アミノ酸配列。
【0146】
配列番号３５－Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ、亜種ｖｕｌｇａｒｅ内のＨｖｍｔＳＳＢ－２の予測アミノ酸配列。
【0147】
配列番号３６－ＴａｍｔＳＳＢ－２の予測アミノ酸配列；Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ内のＡ。
【0148】
配列番号３７－ＴａｍｔＳＳＢ－２の予測アミノ酸配列；Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ内のＢ。
【0149】
配列番号３８－ＴａｍｔＳＳＢ－２の予測アミノ酸配列；Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ内のＤ。
【0150】
配列番号３９－Ｐｏｐｕｌｕｓ ｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ内のＰｔｍｔＳＳＢ－２の予測アミノ酸配列。
【0151】
配列番号４０－Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ内のＭｍｍｔＳＳＢの予測アミノ酸配列。
【0152】
配列番号４１－Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ内のＨｓｍｔＳＳＢの予測アミノ酸配列。
【0153】
配列番号４２－Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ内のＤｍｍｔＳＳＢの予測アミノ酸配列。
【0154】
配列番号４３－Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ内のＳｃｍｔＳＳＢの予測アミノ酸配列。
【0155】
配列番号４４－Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ内のＥｃｍｔＳＳＢの予測アミノ酸配列。
【0156】
配列番号４５－アミノ酸モチーフ；４２ａａ。
【0157】
配列番号４６－アミノ酸モチーフ；１４ａａ。
【0158】
配列番号４７－アミノ酸モチーフ；２４ａａ。
【0159】
配列番号４８－アミノ酸モチーフ；９ａａ。
【0160】
配列番号４９－ＴＡ１発現パターンを解析するために使用されるヌクレオチド配列。ヌクレオチド１～３２０８は、ＴＡ１プロモーター及び５’ＵＴＲを含有した；３２０９～３２１１、ＡＴＧ翻訳開始コドン；タンパク質コード領域は、ヌクレオチド３２０９～３２７８、３３６０～３５２３、３６０９～３８１７、３９５５～４０５５、４３１１～４３７０、及び４５３７～４５５３である。ヌクレオチド３２７９～３３５９、イントロン１；３５２４～３６０８、イントロン２；３８１８～３９５４、イントロン３；４０５６～４３１０、イントロン４；４３７１～４５３６、イントロン５。翻訳終止及び以下のＧＵＳタンパク質コード領域は、この配列内に含まれない。
【0161】
配列番号５０－ｔａ１マッピングのための分子マーカーＩｎｄｅｌ ５５９を検出するためのフォワードプライマーのヌクレオチド配列。
【0162】
配列番号５１－ｔａ１マッピングのための分子マーカーＩｎｄｅｌ ５５９を検出するためのリバースプライマーのヌクレオチド配列。
【0163】
配列番号５２－ｔａ１マッピングのための分子マーカーＩｎｄｅｌ ５４８を検出するためのフォワードプライマーのヌクレオチド配列。
【0164】
配列番号５３－ｔａ１マッピングのための分子マーカーＩｎｄｅｌ ５４８を検出するためのリバースプライマーのヌクレオチド配列。
【0165】
配列番号５４－ｔａ１マッピングのための分子マーカーＩｎｄｅｌ ５６２を検出するためのフォワードプライマーのヌクレオチド配列。
【0166】
配列番号５５－ｔａ１マッピングのための分子マーカーＩｎｄｅｌ ５６２を検出するためのリバースプライマーのヌクレオチド配列。
【0167】
配列番号５６－ｔａ１マッピングのための分子マーカーＩｎｄｅｌ ５８３を検出するためのフォワードプライマーのヌクレオチド配列。
【0168】
配列番号５７－ｔａ１マッピングのための分子マーカーＩｎｄｅｌ ５８３を検出するためのリバースプライマーのヌクレオチド配列。
【0169】
配列番号５８－ＴＡ１及びｔａ１－１遺伝子の転写物を検出するためのフォワードプライマーのヌクレオチド配列。
【0170】
配列番号５９－ＴＡ１及びｔａ１－１遺伝子の転写物を検出するためのリバースプライマーのヌクレオチド配列。
【0171】
配列番号６０－ＥＭＳＡ実験において使用されるプローブのヌクレオチド配列。
【0172】
配列番号６１－米ＲＥＣＡ３ ＤＮＡ修復タンパク質、Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ、Ｊａｐｏｎｉｃａ群のアミノ酸配列。
【0173】
配列番号６２－米ＲＥＣＡ３遺伝子、Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ、Ｊａｐｏｎｉｃａ群、品種Ｎｉｐｐｏｎｂａｒｅ染色体１のヌクレオチド配列。
【0174】
配列番号６３－米ＲＥＣＡ３遺伝子、ミトコンドリアＲＥＣＡ３、Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ、Ｊａｐｏｎｉｃａ群、品種ＮｉｐｐｏｎｂａｒｅについてのｃＤＮＡのヌクレオチド配列。
【0175】
配列番号６４－米ＴＷＩＮＫＬＥ葉緑体／ミトコンドリアＤＮＡ修復タンパク質、Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ、Ｊａｐｏｎｉｃａ群のアミノ酸配列。
【0176】
配列番号６５－米ＴＷＩＮＫＬＥ遺伝子、Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ、Ｊａｐｏｎｉｃａ群、品種Ｎｉｐｐｏｎｂａｒｅ染色体６のヌクレオチド配列。
【0177】
配列番号６６－Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ、Ｊａｐｏｎｉｃａ群、品種Ｎｉｐｐｏｎｂａｒｅからの米ＴＷＩＮＫＬＥ遺伝子、葉緑体／ミトコンドリアについてのｃＤＮＡのヌクレオチド配列。タンパク質コード領域は、ヌクレオチド１５３～２３２１である。
【0178】
配列番号６７－ＲＥＣＡ３ ＤＮＡ修復タンパク質、ミトコンドリア、Ｂｒａｃｈｙｐｏｄｉｕｍ ｄｉｓｔａｃｈｙｏｎのアミノ酸配列。
【0179】
配列番号６８－ＲＥＣＡ３遺伝子、ミトコンドリアＲＥＣＡ３、Ｂｒａｃｈｙｐｏｄｉｕｍ ｄｉｓｔａｃｈｙｏｎについてのｃＤＮＡのヌクレオチド配列。タンパク質コード領域は、ヌクレオチド１９６～１４８２である。
【0180】
配列番号６９－ＲＥＣＡ３ ＤＮＡ修復タンパク質、ミトコンドリア、Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒのアミノ酸配列。
【0181】
配列番号７０－モロコシＲＥＣＡ３遺伝子、ミトコンドリアＲＥＣＡ３、Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒについてのｃＤＮＡのヌクレオチド配列。タンパク質コード領域は、ヌクレオチド２３０～１５１０である。
【0182】
配列番号７１－トウモロコシＲＥＣＡ３ ＤＮＡ修復タンパク質、ミトコンドリア、Ｚｅａ ｍａｙｓのアミノ酸配列。
【0183】
配列番号７２－トウモロコシＲＥＣＡ３遺伝子、ミトコンドリアＲＥＣＡ３、Ｚｅａ ｍａｙｓについてのｃＤＮＡのヌクレオチド配列。タンパク質コード領域は、ヌクレオチド５９～１３３３である。
【0184】
配列番号７３－オオムギＲＥＣＡ３ ＤＮＡ修復タンパク質、ミトコンドリア、Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ、亜種ｖｕｌｇａｒｅのアミノ酸配列。
【0185】
配列番号７４－オオムギＲＥＣＡ３遺伝子、ミトコンドリアＲＥＣＡ３、Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ、亜種ｖｕｌｇａｒｅについてのｃＤＮＡのヌクレオチド配列。タンパク質コード領域は、ヌクレオチド１２２～１４０８である。
【0186】
配列番号７５－コムギＲＥＣＡ３ ＤＮＡ修復タンパク質、ミトコンドリア、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ品種のアミノ酸配列。
【0187】
配列番号７６－Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ、品種Ｃｈｉｎｅｓｅ ＳｐｒｉｎｇからのコムギＲＥＣＡ３遺伝子についてのｃＤＮＡのヌクレオチド配列。タンパク質コード領域は、ヌクレオチド１１２～１４１６である。
【0188】
配列番号７７－Ａｅｇｉｌｏｐｓ ｔａｕｓｃｈｉｉ、亜種ｔａｕｓｃｈｉｉからのＲＥＣＡ３ ＤＮＡ修復タンパク質、ミトコンドリアのアミノ酸配列。
【0189】
配列番号７８－Ａｅｇｉｌｏｐｓ ｔａｕｓｃｈｉｉ、亜種ｔａｕｓｃｈｉｉからのミトコンドリアＲＥＣＡ３をコードするＲＥＣＡ３遺伝子についてのｃＤＮＡのヌクレオチド配列。タンパク質コード領域は、ヌクレオチド１２９～１４２７である。
【0190】
配列番号７９－Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ｔｕｒｇｉｄｕｍ、亜種ｄｕｒｕｍからのＲＥＣＡ３ ＤＮＡ修復タンパク質、ミトコンドリアのアミノ酸配列。
【0191】
配列番号８０－Ｂｒａｃｈｙｐｏｄｉｕｍ ｄｉｓｔａｃｈｙｏｎからのＴＷＩＮＫＬＥ相同タンパク質、葉緑体／ミトコンドリアのアミノ酸配列。
【0192】
配列番号８１－Ｂｒａｃｈｙｐｏｄｉｕｍ ｄｉｓｔａｃｈｙｏｎからの葉緑体／ミトコンドリアＴＷＩＮＫＬＥタンパク質をコードするＴＷＩＮＫＬＥ遺伝子についてのｃＤＮＡのヌクレオチド配列。タンパク質コード領域は、ヌクレオチド１３２～２３００である。
【0193】
配列番号８２－Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒからのＴＷＩＮＫＬＥ相同タンパク質、葉緑体／ミトコンドリアのアミノ酸配列。
【0194】
配列番号８３－Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒからの葉緑体／ミトコンドリアＴＷＩＮＫＬＥタンパク質をコードするＴＷＩＮＫＬＥ遺伝子についてのｃＤＮＡのヌクレオチド配列。タンパク質コード領域は、ヌクレオチド１５４～２４３６である。
【0195】
配列番号８４－Ｚｅａ ｍａｙｓからのＴＷＩＮＫＬＥ相同タンパク質、葉緑体／ミトコンドリアのアミノ酸配列。
【0196】
配列番号８５－Ｚｅａ ｍａｙｓからの葉緑体／ミトコンドリアＴＷＩＮＫＬＥタンパク質をコードするＴＷＩＮＫＬＥ遺伝子についてのｃＤＮＡのヌクレオチド配列。タンパク質コード領域は、ヌクレオチド１４４～２３５１である。
【0197】
配列番号８６－Ａｅｇｉｌｏｐｓ ｔａｕｓｃｈｉｉ、亜種ｔａｕｓｃｈｉｉからのＴＷＩＮＫＬＥ相同タンパク質、葉緑体／ミトコンドリアのアミノ酸配列。
【0198】
配列番号８７－Ａｅｇｉｌｏｐｓ ｔａｕｓｃｈｉｉ、亜種ｔａｕｓｃｈｉｉ、転写物バリアントＸ１からの葉緑体／ミトコンドリアＴＷＩＮＫＬＥタンパク質をコードするＴＷＩＮＫＬＥ遺伝子についてのｃＤＮＡのヌクレオチド配列。タンパク質コード領域は、ヌクレオチド３２～２２０９である。
【0199】
配列番号８８－Ｐａｎｉｃｕｍ ｈａｌｌｉｉ、アイソフォームＸ１からのＴＷＩＮＫＬＥ相同タンパク質、葉緑体／ミトコンドリアのアミノ酸配列。
【0200】
配列番号８９－Ｐａｎｉｃｕｍ ｈａｌｌｉｉ、転写物バリアントＸ１からの葉緑体／ミトコンドリアＴＷＩＮＫＬＥタンパク質をコードするＴＷＩＮＫＬＥ遺伝子についてのｃＤＮＡのヌクレオチド配列。タンパク質コード領域は、ヌクレオチド１００～２３４３である。
【0201】
配列番号９０－Ｓｅｔａｒｉａ ｖｉｒｉｄｉｓ、アイソフォームＸ１からのＴＷＩＮＫＬＥ相同タンパク質、葉緑体／ミトコンドリアのアミノ酸配列。
【0202】
配列番号９１－Ｓｅｔａｒｉａ ｖｉｒｉｄｉｓ、転写物バリアントＸ１からの葉緑体／ミトコンドリアＴＷＩＮＫＬＥタンパク質をコードするＴＷＩＮＫＬＥ遺伝子についてのｃＤＮＡのヌクレオチド配列。タンパク質コード領域は、ヌクレオチド７０～２３４６である。
【0203】
配列番号９２－Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍからのＴＷＩＮＫＬＥ相同タンパク質、葉緑体／ミトコンドリアのアミノ酸配列。
【0204】
配列番号９３－Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍからの葉緑体／ミトコンドリアＴＷＩＮＫＬＥタンパク質をコードするＴＷＩＮＫＬＥ遺伝子についてのｃＤＮＡのヌクレオチド配列。タンパク質コード領域は、ヌクレオチド１０３～２１９９である。
【0205】
配列番号９４－Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍからのＴＷＩＮＫＬＥ相同タンパク質、葉緑体／ミトコンドリアのアミノ酸配列。
【0206】
配列番号９５－Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍからの葉緑体／ミトコンドリアのＴＷＩＮＫＬＥタンパク質をコードするＴＷＩＮＫＬＥ遺伝子についてのｃＤＮＡのヌクレオチド配列。タンパク質コード領域は、ヌクレオチド９２～２１７６である。
【0207】
配列番号９６－Ｓｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ、アイソフォームＸ１からのＴＷＩＮＫＬＥ相同タンパク質、葉緑体／ミトコンドリアのアミノ酸配列。
【0208】
配列番号９７－Ｓｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ、転写物バリアントＸ１からの葉緑体／ミトコンドリアＴＷＩＮＫＬＥタンパク質をコードするＴＷＩＮＫＬＥ遺伝子についてのｃＤＮＡのヌクレオチド配列。タンパク質コード領域は、ヌクレオチド１３８～２２２８である。
【0209】
配列番号９８－ＴＩＬＬＩＮＧアッセイにおいて使用されるＴＡ１－１Ｆプライマー。
【0210】
配列番号９９－ＴＩＬＬＩＮＧアッセイにおいて使用されるＴＡ１－１Ｒプライマー。
【発明を実施するための形態】
【0211】
一般的な技法及び定義
別途具体的に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術及び科学用語は、（例えば、細胞培養、分子遺伝学、植物分子生物学、タンパク質化学、及び生化学における）当業者によって一般的に理解される意味と同じ意味を有すると解釈される。
別途具体的に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術及び科学用語は、（例えば、細胞培養、分子遺伝学、植物分子生物学、タンパク質化学、及び生化学における）当業者によって一般的に理解される意味と同じ意味を有すると解釈される。
【0212】
別途示されない限り、本発明で使用される組換えタンパク質、細胞培養、及び免疫学的技法は、当業者に周知の標準的な手順である。このような技法は、Ｊ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ（１９８４）、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）、Ｔ．Ａ．Ｂｒｏｗｎ（ｅｄｉｔｏｒ），Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅｓ １ ａｎｄ ２，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ（１９９１）、Ｄ．Ｍ．Ｇｌｏｖｅｒ ａｎｄ Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ（ｅｄｉｔｏｒｓ），ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅｓ １－４，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ（１９９５及び１９９６）、及びＦ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｉｔｏｒｓ），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８、現在までの全ての更新を含む）、Ｅｄ Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｄａｖｉｄ Ｌａｎｅ（ｅｄｉｔｏｒｓ）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，（１９８８）、及びＪ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｉｔｏｒｓ）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（現在までの全ての更新を含む）などの供給源の文献全体にわたって記載及び説明されている。
【0213】
「及び／又は」という用語、例えば、「Ｘ及び／又はＹ」は、「Ｘ及びＹ」又は「Ｘ又はＹ」のいずれかを意味すると理解され、両方の意味又はいずれかの意味の明白な支持を提供すると解釈される。
【0214】
本明細書で使用される場合、「約」という用語は、反して記載されない限り、指定される値の＋／－１０％、より好ましくは、＋／－５％、より好ましくは、＋／－２．５％、更により好ましくは、＋／－１％を指す。「約」という用語は、正確な指定される値を含む。
【0215】
本明細書全体にわたって、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という語、又は「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」若しくは「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変形は、記載される要素、整数、若しくはステップ、又は要素、整数、若しくはステップの群の包含を意味するが、任意の他の要素、整数、若しくはステップ、又は要素、整数、若しくはステップの群の除外を意味しないと理解される。
【0216】
選択された定義
「アリューロン」及び「アリューロン層」という用語は、互換的に本明細書で使用される。アリューロン層は、穀物粒の胚乳の最外層であり、内側のデンプン性胚乳とは異なり、デンプン性胚乳と、胚の一部分と、を包囲する。したがって、アリューロン層を構成する細胞は、穀粒のデンプン構成要素である胚乳の最外細胞である。アリューロンは、技術的には胚乳の一部分であり、しばしば、周囲胚乳と称されるが、穀粒が精白されるときに、例えば、米穀粒が製粉されて「白米」が製造されるときに、アリューロンは、ふすまの果皮及び種皮層とともに除去されるため、実用的な観点から、ふすまの一部分と考えられる。デンプン性胚乳の細胞とは異なり、アリューロン細胞は、穀粒成熟において依然として生存している。アリューロン層は、ミネラル、ビタミンＡ及びＢ群ビタミンなどのビタミン、植物化学物質、並びに繊維を含む穀物粒の栄養価の重要な部分である。
「アリューロン」及び「アリューロン層」という用語は、互換的に本明細書で使用される。アリューロン層は、穀物粒の胚乳の最外層であり、内側のデンプン性胚乳とは異なり、デンプン性胚乳と、胚の一部分と、を包囲する。したがって、アリューロン層を構成する細胞は、穀粒のデンプン構成要素である胚乳の最外細胞である。アリューロンは、技術的には胚乳の一部分であり、しばしば、周囲胚乳と称されるが、穀粒が精白されるときに、例えば、米穀粒が製粉されて「白米」が製造されるときに、アリューロンは、ふすまの果皮及び種皮層とともに除去されるため、実用的な観点から、ふすまの一部分と考えられる。デンプン性胚乳の細胞とは異なり、アリューロン細胞は、穀粒成熟において依然として生存している。アリューロン層は、ミネラル、ビタミンＡ及びＢ群ビタミンなどのビタミン、植物化学物質、並びに繊維を含む穀物粒の栄養価の重要な部分である。
【0217】
本発明の穀粒のいずれかの１つの断面点において、断面内のいずれかの単一点において又は断面間で観察される細胞層は、ある程度変動し得ることに少なくとも部分的に起因して、本発明の実施形態は、一連の数の「細胞層」に関する。より具体的には、例えば、７つの細胞層を有するアリューロンは、内側のデンプン性胚乳全体を包囲する７つの層を有さなくてもよいが、内側のデンプン性胚乳の少なくとも一部分、好ましくは、デンプン性胚乳の少なくとも半分を包囲する７つの層を有する。
【0218】
本発明の穀粒のアリューロンに関して使用されるときに、「肥厚」という用語は、本発明の穀粒を対応する野生型穀物粒と比較するときに使用される相対用語である。この文脈において、本発明の穀粒は、遺伝子改変を含み、遺伝子改変は、遺伝子改変を欠く野生型穀粒に対して肥厚アリューロンをもたらす。本発明の穀粒のアリューロンは、対応する野生型穀物粒のアリューロンと比較して増加した細胞数及び／又は増加した細胞層数、好ましくは、両方を有する。それによって、アリューロンは、μｍで測定された場合、例えば、顕微鏡法によって判定された場合、増加した厚さを有する。一実施形態では、厚さは、少なくとも５０％、好ましくは、少なくとも１００％増加し、５００％又は６００％と同程度に増加し得、各々の百分率は、対応する野生型穀物粒のアリューロンの厚さに対してである。一実施形態では、増加は、５０％～１００％、又は１００％～２００％、又は２００％～３００％、又は３００％～４００％若しくは５００％である。一実施形態では、各々の百分率増加又は増加の百分率の範囲は、少なくとも穀粒の腹側にわたる、好ましくは、全穀粒にわたる平均増加である。好ましい実施形態では、アリューロン層の厚さは、穀粒の断面全体にわたって判定される。一実施形態では、アリューロンの厚さは、少なくとも穀粒の腹側における解析によって判定される。別の実施形態では、本発明の穀粒の肥厚アリューロンは、対応する野生型穀物粒の細胞と比較して、様々なサイズ及び不規則な配向の細胞を含み、対応する野生型穀物粒において、アリューロンは、概して、規則的に配向された長方形細胞を有する。「肥厚アリューロン」のこれらの特徴の組み合わせの全てが企図される。
【0219】
ポリペプチド
「ポリペプチド」及び「タンパク質」という用語は、概して、互換的に本明細書で使用され、ペプチド結合と連結されたアミノ酸のポリマーを意味する。
「ポリペプチド」及び「タンパク質」という用語は、概して、互換的に本明細書で使用され、ペプチド結合と連結されたアミノ酸のポリマーを意味する。
【0220】
本明細書で使用される場合、対応する野生型穀物粒に対して「低減されたレベル」の少なくとも１つのミトコンドリアポリペプチドという用語又は同様の語句は、タンパク質の総量が低減されるという相対用語である。これは、当技術分野の標準的な技法によって、例えば、ポリペプチドをコードする遺伝子の一部分又は全体の欠失によって達成され得、これは、ポリペプチドを欠く穀粒をもたらす。このような変異は、ヌル変異である。一実施形態では、タンパク質のレベル／量は、対応する野生型穀物粒と比較して、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％低減される又は完全に欠ける。
【0221】
本明細書で使用される場合、対応する野生型穀物粒内の対応するポリペプチドに対して「低減された活性」の少なくとも１つのミトコンドリアポリペプチドという用語又は同様の語句は、特定のタンパク質活性の総量が低減されるという相対用語である。一実施形態では、タンパク質の活性は、対応する野生型穀物粒と比較して、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％低減される又は完全に消失する。この事例では、タンパク質の総量は、対応する野生型穀粒と比較して、本発明の穀粒内でほぼ同じであることができるが、本発明の穀粒内のポリペプチドは、対応する野生型穀粒内の対応するポリペプチドと比較して、少なくとも１つのアミノ酸の差を有し、これにより、本発明の穀粒内のタンパク質機能が低減される。
【0222】
本明細書で使用される場合、「ミトコンドリア一本鎖ＤＮＡ結合ポリペプチド」又は「ｍｔＳＳＢ」という用語は、一本鎖ＤＮＡに結合し、穀物粒のミトコンドリア内に見出され得るタンパク質のファミリーのメンバー、及び改変され、それによって、低減された結合活性を有する又は結合活性を有しない相同タンパク質を指す。野生型タンパク質は、改変されたタンパク質が行い得るように、一本鎖ＤＮＡへの結合を介して、ＤＮＡ複製、組換え、及び修復において役割を果たす。穀物粒のミトコンドリアは、典型的には、ｍｔＳＳＢ－１ａ、ｍｔＳＳＢ－１ｂ、及びｍｔＳＳＢ－２と称される、ｍｔＳＳＢの３つの異なるサブファミリーを有するが、いくつかの穀類は、２つのサブファミリー、すなわち、ｍｔＳＳＢ－１及びｍｔＳＳＢ－２のみを有する。本発明者らは、野生型に対して、穀物粒内のｍｔＳＳＢ－１ａ又はｍｔＳＳＢ－１結合活性を低減することは、アリューロン厚さの増加をもたらすことを見出した。ｍｔＳＳＢポリペプチドは、野生型穀類植物内に見出されるこのようなポリペプチド、並びに人工的に産生されるか又は自然に見出されるそのバリアントを含み、一本鎖ＤＮＡ結合活性ＤＮＡ活性を有してもよく又は有さず、これは、ある一本鎖ＤＮＡ結合活性を有するが、対応する野生型ｍｔＳＳＢポリペプチドと比較して低減されたレベルで有するｍｔＳＳＢポリペプチドを含む。本明細書で実証されるように、野生型ｍｔＳＳＢ－１ａポリペプチドは、ｓｓＤＮＡに結合するのみでなく、２つの他のミトコンドリアポリペプチド、すなわち、ＴＷＩＮＫＬＥ及びＲＥＣＡ３にも結合する。一実施形態では、低減された活性を有するｍｔＳＳＢバリアントを含む本発明のｍｔＳＳＢポリペプチドは、ＴＷＩＮＫＬＥポリペプチドに結合する。一実施形態では、低減された活性を有するｍｔＳＳＢバリアントを含む本発明のｍｔＳＳＢポリペプチドは、ＲＥＣＡ３ポリペプチドに結合する。一実施形態では、本発明のｍｔＳＳＢポリペプチドは、ｍｔＳＳＢのオリゴマー、特に、ホモ二量体を形成することが可能である。一実施形態では、野生型穀粒ｍｔＳＳＢポリペプチドは、配列番号３若しくは１５～３９のうちのいずれか１つで提供されるアミノ酸配列、又は配列番号３若しくは１５～３９のうちのいずれか１つ以上と少なくとも７５％同一であるアミノ酸配列を含む。好ましい実施形態では、野生型穀粒ｍｔＳＳＢポリペプチドは、配列番号３、１６～２０若しくは２３のうちのいずれか１つで提供されるアミノ酸配列、又は参照配列の完全長に沿って、配列番号３、１６～２０若しくは２３のうちのいずれか１つ以上と少なくとも７５％同一であるアミノ酸配列を含む。
【0223】
本明細書に開示される野生型ｍｔＳＳＢは、典型的には、ミトコンドリア標的ペプチド（ＭＴＰ）をＮ末端において含むときに、２００個～２１５個のアミノ酸残基の長さを有し、ＭＴＰによる切断後に、１７０個～１９０個の残基の長さを有する。本発明の変異型ｍｔＳＳＢポリペプチドは、ＭＴＰを有して、ｍｔＳＳＢ遺伝子内の挿入の非存在下で、最大２１５個のアミノ酸残基の長さであってもよいが、変異型ｍｔＳＳＢポリペプチドが、中途翻訳終結変異を含む変異型遺伝子によってＣ末端短縮又はコードされている場合、より短く、更にはるかに短くてもよい。一実施形態では、本発明のｍｔＳＳＢポリペプチドは、ＤＮＡ結合ドメインの少なくとも一部分を欠き、例えば、アミノ酸ＧＫＩを、ＤＮＡ結合ドメインのＣ末端において欠く（例えば、図８を参照されたい）。
【0224】
一実施形態では、本発明の穀粒は、少なくとも１つのｍｔＳＳＢポリペプチドを有し、少なくとも１つのｍｔＳＳＢポリペプチドは、対応する野生型ｍｔＳＳＢポリペプチドのアミノ酸配列とは異なる配列を有するか又は野生型ｍｔＳＳＢポリペプチドを欠く。関連する実施形態では、本発明の穀粒は、内在性遺伝子を有し、内在性遺伝子は、少なくとも１つの（変異型）ｍｔＳＳＢポリペプチドをコードし、少なくとも１つの（変異型）ｍｔＳＳＢポリペプチドが、穀粒内で発現されないか又は不安定であり、穀粒内に蓄積しない場合でも、この変異型ポリペプチドは、対応する野生型ｍｔＳＳＢポリペプチドのアミノ酸配列とは異なる配列を有する。
【0225】
本明細書で使用される場合、「対応する野生型ｍｔＳＳＢポリペプチドのアミノ酸配列とは異なる配列を有する」という用語又は同様の語句は、本発明のかつ／又は本発明の穀粒内のｍｔＳＳＢポリペプチドのアミノ酸配列が、ｍｔＳＳＢポリペプチドが由来しかつ／又は最も密接に関連する、自然に存在するタンパク質のアミノ酸配列とは異なるという比較用語である。一実施形態では、ｍｔＳＳＢポリペプチドのアミノ酸配列は、対応する野生型アミノ酸配列に対して、１つ以上の挿入、欠失、又はアミノ酸置換（又はこれらの組み合わせ）を有し得る。ｍｔＳＳＢポリペプチドは、対応する野生型ｍｔＳＳＢポリペプチドに対して、２つ、３つ、４つ、５つ、又は６つ～１０個のアミノ酸置換を有し得る。好ましい実施形態では、ｍｔＳＳＢポリペプチドは、Ｃ末端短縮されており、例えば、野生型ｍｔＳＳＢポリペプチドのＣ末端１４個のアミノ酸、又は２０個のアミノ酸、又は２１個のアミノ酸以上を欠く（例えば、表４を参照されたい）。このような短縮型ｍｔＳＳＢポリペプチドは、例えば、ｍｔＳＳＢ遺伝子であって、ｍｔＳＳＢ遺伝子が由来する野生型ｍｔＳＳＢ遺伝子に対して、中途翻訳終止コドンをタンパク質オープンリーディングフレーム内に含む、ｍｔＳＳＢ遺伝子によってコードされてもよく、又は変異型遺伝子であって、野生型ＲＮＡ転写物とは異なってスプライシングされたＲＮＡ転写物を産生する、変異型遺伝子、例えば、スプライス部位変異を含む遺伝子によってコードされてもよい。別の実施形態では、低減された活性を有するｍｔＳＳＢポリペプチドは、対応する野生型ポリペプチドに対して、単一挿入、単一欠失、又は単一アミノ酸置換のみを有する。この文脈において、「単一挿入」及び「単一欠失」は、複数（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０個以上）の連続したアミノ酸が、それぞれ、挿入されている又は欠失している場合を含み、「対応する野生型ポリペプチド」とは、バリアントが由来する野生型ポリペプチド及び／又はバリアントが最も密接に関連する自然ポリペプチドを意味する。実施例１３に実証されるように、このような変異は、タンパク質のコード領域内のいずれかの位置、好ましくは、ｍｔＳＳＢポリペプチドのＤＮＡ結合ドメインをコードする遺伝子の領域内のいずれかの位置にあることができる。
【0226】
本明細書で使用される場合、「ｍｔＳＳＢポリペプチド活性」という用語又はその変形は、野生型ｍｔＳＳＢポリペプチド又はそのバリアントの少なくとも１つの生物学的作用を指す。一例では、この用語は、一本鎖ＤＮＡへのポリペプチド又はそのオリゴマーの結合の強度又はその欠如を指す。したがって、一実施形態では、短縮型ｍｔＳＳＢポリペプチドなどの本発明のｍｔＳＳＢポリペプチドは、野生型ｍｔＳＳＢポリペプチド、例えば、配列番号３又は１５～３９のうちのいずれか１つで提供されるアミノ酸配列を含むものと比較して、低減された一本鎖ＤＮＡ結合活性を有するか又は一本鎖ＤＮＡ結合活性を有しない。この文脈において、比較は、既知のｍｔＳＳＢポリペプチド配列とのアミノ酸アライメントによって判定された場合、本発明のｍｔＳＳＢポリペプチドに最も近い配列である野生型ｍｔＳＳＢポリペプチドとの比較、又は本発明のｍｔＳＳＢポリペプチドが変異によって由来する野生型ｍｔＳＳＢポリペプチドとの比較である。一実施形態では、本発明のｍｔＳＳＢポリペプチドは、ＤＮＡ結合ドメインの少なくとも一部分を欠くか（図９を参照されたい）、又は一本鎖ＤＮＡに、対応する野生型ｍｔＳＳＢポリペプチド（例えば、配列番号３で提供されるものなど）よりも弱く結合する（Ｃ末端短縮型バリアントなどの）バリアントＤＮＡ結合ドメインを有する。一例では、この用語は、本発明のＴＷＩＮＫＬＥポリペプチドへのポリペプチド又はそのオリゴマーの結合の強度又はその欠如を指す。一例では、この用語は、本発明のＲＥＣＡ３ポリペプチドへのポリペプチド又はそのオリゴマーの結合の強度又はその欠如を指す。
【0227】
低減された一本鎖ＤＮＡ結合活性は、当該技術分野の標準的なアッセイを使用することによって容易に判定され得る。例えば、一本鎖ＤＮＡ結合は、（ゲル移動度シフトアッセイとしても既知の）電気泳動移動度シフトアッセイ、例えば、Ｆａｒｒ ｅｔ ａｌ．（２００４）及びＣｉｅｓｉｅｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．（２０１６）に記載されているもの、又は好ましくは、本明細書の実施例１及び９に記載されるものを使用して測定され得る。このようなアッセイにおいて、一本鎖ＤＮＡ基質及びポリペプチドが、反応混合物に付加され、一本鎖ＤＮＡ基質及びポリペプチドがタンパク質－ＤＮＡ複合体内にアセンブルするかを判定するために使用されるゲル電気泳動。
【0228】
本明細書で使用される場合、「ミトコンドリア一本鎖ＤＮＡ結合ポリペプチド－１ａ」、「ｍｔＳＳＢ－１ａ」、又は「ＴＡ１」という用語及びそれらの変形は、ｍｔＳＳＢのサブファミリーであって、ｍｔＳＳＢのサブファミリーの野生型タンパク質が、例えば、配列番号３若しくは１５～２３のうちのいずれか１つで提供されるアミノ酸配列、又は参照配列の完全長に沿って、配列番号３若しくは１５～２３のうちのいずれか１つ以上と少なくとも７５％同一であるアミノ酸配列を含む、ｍｔＳＳＢのサブファミリーを指す。これらの用語の変形には、ｍｔＳＳＢ－１ａポリペプチドが含まれ、ｍｔＳＳＢ－１ａポリペプチドは、ポリペプチドをコードする内在性遺伝子内の変異の結果として、低減されたｓｓＤＮＡ結合活性を有するか又はｓｓＤＮＡ結合活性を欠く。一実施形態では、野生型ＯｓｍｔＳＳＢ－１ａポリペプチドは、以下のモチーフ：配列番号３のアミノ酸７３～１１４に対応するＦＲＧＶＨＲＡＩ（Ｉ／Ｌ）ＣＧＫＶＧＱ（Ｖ／Ａ）Ｐ（Ｖ／Ｌ）ＱＫＩＬＲＮＧ（Ｒ／Ｈ）Ｔ（Ｖ／Ｉ）Ｔ（Ｖ／Ｉ）ＦＴ（Ｖ／Ｉ）ＧＴＧＧＭＦＤＱＲ（モチーフＩ、配列番号４５）、配列番号３のアミノ酸１２２～１３５に対応するＰ（Ｋ／Ｍ）ＰＡＱＷＨＲＩ（Ａ／Ｓ）（Ｖ／Ｉ）Ｈ（Ｎ／Ｓ）（Ｄ／Ｅ）（モチーフＩＩ、配列番号４６）、配列番号３のアミノ酸１４１～１６４に対応するＡＶＱ（Ｋ／Ｑ）Ｌ（Ｖ／Ｔ）ＫＮＳ（Ａ／Ｓ）ＶＹ（Ｖ／Ｉ）ＥＧ（Ｄ／Ｅ）ＩＥ（Ｔ／Ｉ）Ｒ（Ｖ／Ｉ）ＹＮＤ（モチーフＩＩＩ、配列番号４７）、及び配列番号３のアミノ酸１７６～１８４に対応するＩＣ（Ｌ／Ｖ／Ｉ）Ｒ（Ｒ／Ｇ）ＤＧＫＩ（モチーフＩＶ、配列番号４８）のうちの１つ以上又は全てを有する。低減されたＯｓｍｔＳＳＢ－１ａポリペプチド活性を有するポリペプチドの例としては、配列番号８、配列番号９、若しくは配列番号１０として記載のアミノ酸配列又はその短縮型バージョンを有するもの、あるいは参照配列の完全長に沿って、配列番号８、配列番号９、又は配列番号１０として記載のアミノ酸配列のうちの１つ以上と少なくとも７５％同一であるアミノ酸配列を有するものが挙げられる。
【0229】
本明細書で使用される場合、「ミトコンドリア一本鎖ＤＮＡ結合ポリペプチド－１ｂ」又は「ｍｔＳＳＢ－１ｂ」という用語及びそれら変形は、ｍｔＳＳＢのサブファミリーであって、ｍｔＳＳＢのサブファミリーの野生型タンパク質が、例えば、配列番号２４～２９のうちのいずれか１つで提供されるアミノ酸配列、又は参照配列の完全長に沿って、配列番号２４～２９のうちのいずれか１つ以上と少なくとも７５％同一であるアミノ酸配列を含む、ｍｔＳＳＢのサブファミリーを指す。ｍｔＳＳＢ－１ａポリペプチドは、ｍｔＳＳＢ－１ｂポリペプチドのセット内に含まれない。
【0230】
本明細書で使用される場合、「ミトコンドリア一本鎖ＤＮＡ結合ポリペプチド－２」又は「ｍｔＳＳＢ－２」という用語及びそれらの変形は、ｍｔＳＳＢのサブファミリーであって、ｍｔＳＳＢのサブファミリーの野生型タンパク質が、例えば、配列番号３０～３９のうちのいずれか１つで提供されるアミノ酸配列、又は参照配列の完全長に沿って、配列番号３０～３９のうちのいずれか１つ以上と少なくとも７５％同一であるアミノ酸配列を含む、ｍｔＳＳＢのサブファミリーを指す。ｍｔＳＳＢ－１ａポリペプチドは、ｍｔＳＳＢ－２ポリペプチドのセット内に含まれない。
【0231】
本明細書で使用される場合、「ＴＷＩＮＫＬＥ」という用語は、野生型穀物粒のミトコンドリア内に見出され得、かつヘリカーゼ活性を有するタンパク質ファミリー及びその変異型バリアントを指す。野生型ＴＷＩＮＫＬＥタンパク質は、ミトコンドリアＤＮＡ複製において役割を果たす。ヘリカーゼは、ヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）加水分解からのエネルギーを使用して、二本鎖ＤＮＡの巻き戻しを触媒する。本発明者らは、穀物粒内、好ましくは、米穀粒内の野生型ＴＷＩＮＫＬＥ活性を低減する（が、排除しない）ことが、アリューロン厚さの増加をもたらすことを見出した（実施例１５を参照されたい）。ＴＷＩＮＫＬＥポリペプチドは、野生型穀類植物内に見出されるこのようなポリペプチド及び人工的に産生されるか又は自然に見出されるそのバリアントを含み、いずれもヘリカーゼ活性を有するか又は有さず、これは、あるヘリカーゼ活性を有するが、対応する野生型ＴＷＩＮＫＬＥポリペプチドと比較して低減されたレベルで有するＴＷＩＮＫＬＥポリペプチドを含む。この文脈において、比較は、アミノ酸アライメントによって判定された場合、本発明のＴＷＩＮＫＬＥポリペプチドに最も近い配列である野生型ＴＷＩＮＫＬＥポリペプチドとの比較、又は本発明のＴＷＩＮＫＬＥポリペプチドが変異によって由来する野生型ＴＷＩＮＫＬＥポリペプチドとの比較である。一実施形態では、ＴＷＩＮＫＬＥポリペプチドは、ｍｔＳＳＢポリペプチドに結合する。一実施形態では、ＴＷＩＮＫＬＥポリペプチドは、ヘリカーゼ活性を有する。一実施形態では、ＴＷＩＮＫＬＥポリペプチドは、ＴＷＩＮＫＬＥポリペプチドの多量体を形成することが可能である。ＴＷＩＮＫＬＥは、典型的には、以下の５つの保存ヘリカーゼモチーフ：（１）ＮＴＰリン酸を安定化するＨ１／Ｗａｌｋｅｒ Ａモチーフ、（２）ＮＴＰ結合／加水分解に関与するＨ１ａ、（３）結合ＮＴＰの配置及び安定化並びに結合Ｍｇ２＋イオンの安定化のために必要とされるアルギニンフィンガー及び塩基スタック残基を含有するＨ２／Ｗａｌｋｅｒ Ｂモチーフ、（４）Ｈ１ａとともにＮＴＰ結合／加水分解に関与するＨ３、及び（５）ＤＮＡ結合に寄与するＨ４を有する。更に、多くのＴＷＩＮＫＬＥヘリカーゼのＣ末端領域は、レプリソーム内の他の因子との相互作用のために必要とされる。一実施形態では、ＴＷＩＮＫＬＥポリペプチドは、配列番号６４、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、若しくは９６のうちのいずれか１つで提供されるアミノ酸配列、又は参照配列の完全長に沿って、配列番号６４、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、若しくは９６のうちのいずれか１つ以上と少なくとも７５％同一であるアミノ酸配列を含む。
【0232】
低減されたヘリカーゼ活性は、当該技術分野の標準的なアッセイを使用することによって容易に判定され得る。例えば、ヘリカーゼ活性は、ＡＤＰ、無機ホスホネート、及び／又は一本鎖ＤＮＡなどのヘリカーゼ反応産物の量を測定することによって判定され得る。これらのアッセイにおいて、蛍光標識タンパク質は、標的分子、例えば、ＡＤＰ、無機ホスホネート、又は一本鎖ＤＮＡを検出する（Ｔｏｓｅｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。一例では、二本鎖ＤＮＡ巻き戻しが、ヘリカーゼ活性を判定するために測定され得る。この測定は、フルオロフォア（例えば、Ｃｙ３）及び消光剤（例えば、ダブシル）対を使用し、フルオロフォア及び消光剤対は、二本鎖の末端において配置され、１つが、ＤＮＡの各々の鎖上に配置される。ヘリカーゼ誘導性ＤＮＡ巻き戻しの際に、フルオロフォア及び消光剤は、互いに分離されて、蛍光の増加をもたらす（Ｔｏｓｅｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。別の例では、短い５’一本鎖ＤＮＡオーバーハングを有する部分的に二本鎖ＤＮＡ基質からなるヘリカーゼ基質が産生される（Ｋｏｒｈｏｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００３）。ヘリカーゼ反応は、ヘリカーゼ基質及びポリペプチドを含有する反応緩衝液中で実行される。次いで、塩基対基質及び一本鎖ＤＮＡ産物の分画量が、単離され得、ゲル電気泳動によって解析され得る。
【0233】
本明細書で使用される場合、「ＲＥＣＡ３」という用語は、野生型穀物粒のミトコンドリア内に見出され得、ミトコンドリアＤＮＡ内の不適切な組換え事象の発生の低減を助長する植物組換え体関連タンパク質のサブファミリー及びそれらの変異型バリアントを指す。理論によって束縛されることを望まないが、現在の証拠は、ＲＥＣＡ３が、監視機構に関与し、監視機構が、短い反復間の変換事象を指示しつつ、組換え依存性複製が長い反復で開始されることを可能にすることを示唆する（Ｓｈｅｄｇｅ ｅｔ ａｌ．，２００７）。本発明者らは、穀物粒内、好ましくは、米穀粒内の野生型ＲＥＣＡ３活性を低減する（が、排除しない）ことが、アリューロン厚さの増加をもたらすことを見出した。ＲＥＣＡ３ポリペプチドは、野生型穀類植物内に見出されるこのようなポリペプチド及び人工的に産生されるか又は自然に見出されるそのバリアントを含み、いずれもリコンビナーゼ活性を有するか又は有さず、これは、あるリコンビナーゼ活性を有するが、対応する野生型ＲＥＣＡ３ポリペプチドと比較して低減されたレベルで有するＲＥＣＡ３ポリペプチドを含む。一実施形態では、ＲＥＣＡ３ポリペプチドは、ｍｔＳＳＢポリペプチドに結合する。一実施形態では、ＲＥＣＡ３ポリペプチドは、リコンビナーゼ活性を有する。ＲＥＣＡ３ポリペプチドは、典型的には、ＲｅｃＡ／ＲＡＤ５１ドメインを有し、ＲｅｃＡ／ＲＡＤ５１ドメインは、２つの高度に保存されたコンセンサスモチーフであるＷａｌｋｅｒ Ａ及びＷａｌｋｅｒ Ｂを含み、Ｗａｌｋｅｒ Ａ及びＷａｌｋｅｒ Ｂは、ＡＴＰアーゼ内に存在し、ＡＴＰ結合及び加水分解活性を付与する。一実施形態では、ＲＥＣＡ３ポリペプチドは、配列番号６１、６７、６９、７１、７３、７５、７７、若しくは７９として記載のアミノ酸配列、又は参照配列の完全長に沿って、配列番号６１、６７、６９、７１、７３、７５、７７、若しくは７９のうちのいずれか１つ以上と少なくとも７５％同一であるアミノ酸配列を含む。
【0234】
低減されたリコンビナーゼ活性は、当該技術分野の標準的なアッセイを使用することによって容易に判定され得る。一例では、フルオロフォア標識一本鎖ＤＮＡ基質及びポリペプチドが、反応混合物中でインキュベートされる（Ｓｉｌｖａ ｅｔ ａｌ．，２０１７）。蛍光消光効果は、リコンビナーゼ結合の際に発生する。蛍光の解析は、蛍光分光法を使用して実行され得る。別の例では、リコンビナーゼ活性は、鎖融合（又は「Ｄループ」）アッセイを使用して測定され得る（Ｊａｙａｔｈｉｌａｋａ ｅｔ ａｌ．，２００８）。このアッセイにおいて、ポリペプチドは最初に、放射標識一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド上にアセンブルすることが可能にされる。次いで、ホモロジー含有スーパーコイル標的プラスミドが付加され、これらの２つは、「Ｄループ」と称されるホモロジー依存性接合分子を形成することが可能にされる。Ｄループタンパク質は、単離され得、ゲル電気泳動及び蛍光イメージングによって解析され得る。
【0235】
本明細書で使用される場合、「実質的に精製されたポリペプチド」又は「精製されたポリペプチド」という用語は、ポリペプチドが天然状態で会合している脂質、核酸、他のペプチド、及び他の混入分子から少なくとも部分的に分離されたポリペプチドを意味する。好ましくは、実質的に精製されたポリペプチドは、ポリペプチドが自然に会合している他の構成要素を少なくとも９０％含まない。一実施形態では、本発明のポリペプチドは、自然発生穀類ｍｔＳＳＢ、ＴＷＩＮＫＬＥ、又はＲＥＣＡ３ポリペプチドとは異なるアミノ酸配列を有し、すなわち、上記で定義されるアミノ酸配列バリアントである。
【0236】
本発明の穀粒、植物、及び宿主細胞は、本発明のバリアントポリペプチドをコードする変異を含む内在性遺伝子、又は本発明のポリペプチドをコードする外来性ポリヌクレオチドを含み得る。これらの事例では、穀粒、植物、及び細胞は、変異型又は組換えポリペプチドを産生する。この文脈において、「変異型」という用語は、ポリペプチドが最も密接に関連する又は変異によって由来する野生型ポリペプチドとは異なるアミノ酸配列であるポリペプチドを意味する。変異型ポリペプチドは、変異型ポリペプチドが最も密接に関連する及び／又は由来する野生型ポリペプチドと比較して、異なるレベルで又は異なる細胞内で又は異なるタイミングで発現され得る。ポリペプチドの文脈において、「組換え」という用語は、細胞によって産生されたときに外来性ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドであって、細胞又は前駆細胞内に、組換えＤＮＡ又はＲＮＡ技法、例えば、形質転換などによって導入されている、ポリペプチドを指す。一実施形態では、組換えポリペプチドは、野生型ポリペプチドと同一のアミノ酸配列であるが、組換えポリペプチドは、野生型ポリペプチドと比較して、異なるレベルで又は異なる細胞内で又は異なるタイミングで発現され得る。代替の実施形態では、組換えポリペプチドは、組換えポリペプチドが最も密接に関連する又は由来する野生型ポリペプチドとは異なるアミノ酸配列である。同様に、この組換えポリペプチドは、野生型ポリペプチドと比較して、異なるレベルで又は異なる細胞内で又は異なるタイミングで発現され得る。典型的には、細胞は、変更された量のポリペプチドの産生を引き起こす非内在性遺伝子を含む。一実施形態では、「組換えポリペプチド」は、植物細胞内の外来性（組換え）ポリヌクレオチドの発現によって作製されるポリペプチドである。
【0237】
ポリペプチドの％同一性は、ＧＡＰ（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０）解析（ＧＣＧプログラム）によって、ギャップ生成ペナルティ＝５及びギャップ伸長ペナルティ＝０．３で判定される。一実施形態では、クエリ配列は、少なくとも１５０個のアミノ酸の長さであり、ＧＡＰ解析は、２つの配列を少なくとも１５０個のアミノ酸の領域にわたってアライメントする。一実施形態では、クエリ配列は、少なくとも１７５個のアミノ酸の長さであり、ＧＡＰ解析は、２つの配列を少なくとも１７５個のアミノ酸の領域にわたってアライメントする。一実施形態では、クエリ配列は、少なくとも２００個のアミノ酸の長さであり、ＧＡＰ解析は、２つの配列を少なくとも２００個のアミノ酸の領域にわたってアライメントする。一実施形態では、クエリ配列は、少なくとも３００個のアミノ酸の長さであり、ＧＡＰ解析は、２つの配列を少なくとも３００個のアミノ酸の領域にわたってアライメントする。一実施形態では、クエリ配列は、少なくとも４００個のアミノ酸の長さであり、ＧＡＰ解析は、２つの配列を少なくとも４００個のアミノ酸の領域にわたってアライメントする。一実施形態では、クエリ配列は、少なくとも５００個のアミノ酸の長さであり、ＧＡＰ解析は、２つの配列を少なくとも５００個のアミノ酸の領域にわたってアライメントする。一実施形態では、クエリ配列は、少なくとも６００個のアミノ酸の長さであり、ＧＡＰ解析は、２つの配列を少なくとも６００個のアミノ酸の領域にわたってアライメントする。一実施形態では、クエリ配列は、少なくとも７００個のアミノ酸の長さであり、ＧＡＰ解析は、２つの配列を少なくとも７００個のアミノ酸の領域にわたってアライメントする。更により好ましくは、ＧＡＰ解析は、２つの配列をこれらの配列の長さ全体にわたってアライメントする。
【0238】
定義されるポリペプチドに関しては、上記で提供される％同一性数値よりも高い％同一性数値が好ましい実施形態を包含することが理解されよう。したがって、適用可能な場合、最小％同一性数値の観点から、ポリペプチドは、関連する指定される配列番号と少なくとも７５％、より好ましくは、少なくとも８０％、より好ましくは、少なくとも８５％、より好ましくは、少なくとも９０％、より好ましくは、少なくとも９１％、より好ましくは、少なくとも９２％、より好ましくは、少なくとも９３％、より好ましくは、少なくとも９４％、より好ましくは、少なくとも９５％、より好ましくは、少なくとも９６％、より好ましくは、少なくとも９７％、より好ましくは、少なくとも９８％、より好ましくは、少なくとも９９％、より好ましくは、少なくとも９９．１％、より好ましくは、少なくとも９９．２％、より好ましくは、少なくとも９９．３％、より好ましくは、少なくとも９９．４％、より好ましくは、少なくとも９９．５％、より好ましくは、少なくとも９９．６％、より好ましくは、少なくとも９９．７％、より好ましくは、少なくとも９９．８％、更により好ましくは、少なくとも９９．９％同一であるアミノ酸配列を含むことが好ましい。
【0239】
本明細書で使用される場合、「アミノ酸番号に対応する位置における」という語句又はその変形は、１つ以上の特定のアミノ酸配列の文脈において、周囲のアミノ酸と比較して、アミノ酸の相対位置を指す。いくつかの実施形態では、本発明のポリペプチドは、欠失又は置換変異を有し得、欠失又は置換変異は、例えば、配列番号３に対してアライメントされたときに、アミノ酸の相対配置を変更する。２つの密接に関連するタンパク質間の対応するアミノ酸位置を判定することは、当業者の能力の範囲内に十分ある。
【0240】
ｍｔＳＳＢ、ＴＷＩＮＫＬＥ、及びＲＥＣＡ３ポリペプチドの保存されたアミノ酸は、野生型ポリペプチド、例えば、本明細書に記載されるものについてのアミノ酸配列をアライメントすることによって容易に同定され得る。例えば、米ＯｓｍｔＳＳＢ－１ａ（ＴＡ１）アミノ酸配列（配列番号３）は、他の種からのｍｔＳＳＢ－１ａポリペプチドとアライメントされてもよく、又は更に、米若しくは他の種、特に、植物種、例えば、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ（配列番号１５）、Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒ（配列番号１７）、Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ（配列番号１８）、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ（配列番号１９及び２２）、Ｂｒａｃｈｙｐｏｄｉｕｍ ｄｉｓｔａｃｈｙｏｎ（配列番号２０）、及びＰｏｐｕｌｕｓ ｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ（配列番号２１）からのｍｔＳＳＢポリペプチドとアライメントされてもよい（例えば、図９を参照されたい）。
【0241】
本発明のポリペプチドのアミノ酸配列変異体は、変異誘発物質でのランダム変異誘発、続いて、ポリペプチドをコードする内在性遺伝子内の変異体についての変異誘発された集団のスクリーニング、又は標的変異誘発、例えば、遺伝子編集ツールでの標的変異誘発のいずれかによる、前駆穀類植物細胞の変異誘発、例えば、穀類の種子の変異誘発によって調製され得る。アミノ酸配列変異体はまた、適切なヌクレオチド変化を本発明の核酸内に導入することによって調製され得る。このような変異体は、例えば、アミノ酸配列内の残基の欠失、挿入、又は置換を含み、欠失、挿入、又は置換は、野生型ポリペプチドの長さに沿っていずれかの位置で発生することができる。欠失、挿入、及び置換の組み合わせは、最終ペプチド産物が所望の特徴を有する限り、最終構築物に到達するようになされ得る。好ましいアミノ酸配列変異体は、参照野生型ポリペプチドに対して、１つ、２つ、３つ、４つ、又は１０個未満のアミノ酸変化のみを有する。本発明の変異型ポリペプチドは、対応する野生型自然発生ポリペプチド、例えば、配列番号８、配列番号９、若しくは配列番号１０として記載のアミノ酸配列であるポリペプチド又はその短縮型バージョン、あるいは参照配列の完全長に沿って、配列番号８、配列番号９、又は配列番号１０として記載のアミノ酸配列のうちの１つ以上と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、好ましくは、少なくとも９０％、又はより好ましくは、少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドと比較して、「低減された活性」を有する。
【0242】
変異型（変更された）ポリペプチドは、当該技術分野で既知のいずれかの技法を使用して、例えば、指向性進化又は合理的設計戦略を使用して調製され得る。変異した／変更されたＤＮＡに由来する産物は、産物が低減された活性を有するかを判定するために、本明細書に記載される技法を使用して容易にスクリーニングされ得、例えば、ＴＩＬＬＩＮＧによってスクリーニングされ得る（実施例１を参照されたい）。例えば、方法は、変異した／変更されたＤＮＡを発現するトランスジェニック植物を産生することと、ｉ）アリューロン厚さへの変異した／変更されたＤＮＡの効果、及びｉｉ）ｍｔＳＳＢ、ＴＷＩＮＫＬＥ、又はＲＥＣＡ３遺伝子が変異した／変更されたかを（例えば、実施例１３に記載される方法を使用して）判定することと、を含み得る。したがって、本発明のポリペプチド及びポリヌクレオチドは、ポリペプチド及びポリヌクレオチドの生物学的効果を判定するためのスクリーニングアッセイにおいて使用され得る。
【0243】
アミノ酸配列変異体の設計において、変異部位の位置及び変異の性質は、改変される特徴に依存する。変異のための部位は、例えば、（１）非保存的アミノ酸選択で置換すること、（２）標的残基を欠失させること、又は（３）位置する部位に隣接する他の残基を挿入することによって、個別に又は連続して改変され得る。
【0244】
アミノ酸配列欠失は、概して、約１つ～１５個の残基、より好ましくは、約１つ～１０個の残基、及び典型的には、約１つ～５つの連続した残基の範囲である。
【0245】
置換変異体は、ポリペプチド分子内の少なくとも１つのアミノ酸残基が除去されており、異なる残基がその代わりに挿入されている。ある活性を維持すること又はある活性を低減することが望ましくない場合、非保存的置換を、特に、関連するタンパク質ファミリー内で高度に保存されたアミノ酸位置において行うことが好ましい。保存的置換の例が、表１に示され、したがって、非保存的置換は、表１に示されないものである。
【表1】
【0246】
一実施形態では、変異型／バリアントポリペプチドは、自然発生ポリペプチドと比較して、１つ又は２つ又は３つ又は４つのアミノ酸変化を有する。好ましい実施形態では、変化は、本明細書で提供される異なるｍｔＳＳＢ、ＴＷＩＮＫＬＥ、又はＲＥＣＡ３ポリペプチドの間で高度に保存されたモチーフのうちの１つ以上内、特に、既知の保存構造ドメイン内にある。当業者が認識しているように、このような変化は、細胞又は穀物粒内で発現されたときにポリペプチドの活性を低減するために、合理的に予測され得る。
【0247】
本発明のポリペプチドの一次アミノ酸配列は、密接に関連する酵素との比較に基づいて、そのバリアント／変異体を設計するために使用され得る。当業者が理解するように、密接に関連するタンパク質のうちで高度に保存された残基の変更は、より低度に保存された残基の変更よりも、活性を低減する可能性が高い。この文脈において、一連の供給源からのｍｔＳＳＢ、ＴＷＩＮＫＬＥ、又はＲＥＣＡ３タンパク質のアミノ酸配列のアライメントが、より高度に保存されたアミノ酸残基及びより低度に保存されたアミノ酸残基を同定するために使用される。
【0248】
ポリヌクレオチド及び遺伝子
本発明は、様々なポリヌクレオチドを指す。本明細書で使用される場合、「ポリヌクレオチド」又は「核酸」又は「核酸分子」は、ＤＮＡ又はＲＮＡであり得るヌクレオチドのポリマーを意味し、ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、及びｃＤＮＡを含む。これは、細胞、ゲノム、又は合成起源のＤＮＡ又はＲＮＡ、例えば、自動シンセサイザにおいて作製されるＤＮＡ又はＲＮＡであり得、本明細書で定義される特定の活性を実行するために、炭水化物、脂質、タンパク質、若しくは他の材料と組み合わされてもよく、蛍光若しくは他の基で標識されてもよく、又は固体支持体に取り付けられてもよく、あるいは当業者に周知の、自然に見出されない１つ以上の改変されたヌクレオチドを含んでもよい。ポリマーは、一本鎖であってもよく、本質的に、二本鎖であってもよく、又は部分的に、二本鎖であってもよい。本明細書で使用される場合、塩基対合とは、Ｇ：Ｕ塩基対を含む、ヌクレオチド間の標準的な塩基対合を指す。「相補的」とは、２つのポリヌクレオチドが、２つのポリヌクレオチドの長さの一部分に沿って、又は一方若しくは両方の完全長に沿って塩基対合（ハイブリダイゼーション）することが可能であることを意味する。「ハイブリダイゼーションされたポリヌクレオチド」とは、ポリヌクレオチドが実際に、ポリヌクレオチドの補体に塩基対合されていることを意味する。「ポリヌクレオチド」という用語は、「核酸」という用語と互換的に本明細書で使用される。本発明の好ましいポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドをコードする。
本発明は、様々なポリヌクレオチドを指す。本明細書で使用される場合、「ポリヌクレオチド」又は「核酸」又は「核酸分子」は、ＤＮＡ又はＲＮＡであり得るヌクレオチドのポリマーを意味し、ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、及びｃＤＮＡを含む。これは、細胞、ゲノム、又は合成起源のＤＮＡ又はＲＮＡ、例えば、自動シンセサイザにおいて作製されるＤＮＡ又はＲＮＡであり得、本明細書で定義される特定の活性を実行するために、炭水化物、脂質、タンパク質、若しくは他の材料と組み合わされてもよく、蛍光若しくは他の基で標識されてもよく、又は固体支持体に取り付けられてもよく、あるいは当業者に周知の、自然に見出されない１つ以上の改変されたヌクレオチドを含んでもよい。ポリマーは、一本鎖であってもよく、本質的に、二本鎖であってもよく、又は部分的に、二本鎖であってもよい。本明細書で使用される場合、塩基対合とは、Ｇ：Ｕ塩基対を含む、ヌクレオチド間の標準的な塩基対合を指す。「相補的」とは、２つのポリヌクレオチドが、２つのポリヌクレオチドの長さの一部分に沿って、又は一方若しくは両方の完全長に沿って塩基対合（ハイブリダイゼーション）することが可能であることを意味する。「ハイブリダイゼーションされたポリヌクレオチド」とは、ポリヌクレオチドが実際に、ポリヌクレオチドの補体に塩基対合されていることを意味する。「ポリヌクレオチド」という用語は、「核酸」という用語と互換的に本明細書で使用される。本発明の好ましいポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドをコードする。
【0249】
「単離されたポリヌクレオチド」とは、ポリヌクレオチドが自然に見出される場合、ポリヌクレオチドが天然状態で会合している又は連結されているポリヌクレオチド配列から少なくとも部分的に分離されたポリヌクレオチドを意味する。好ましくは、単離されたポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドが自然に見出される場合、ポリヌクレオチドが自然に会合している他の構成要素を少なくとも９０％含まない。好ましくは、ポリヌクレオチドは、例えば、２つのより短いポリヌクレオチド配列を、自然に見出されない様式で共有結合することによって、自然発生ポリヌクレオチドでない（キメラポリヌクレオチド）。
【0250】
本発明は、遺伝子活性の低減、並びにキメラ遺伝子の構築及び使用を含む。本明細書で使用される場合、「遺伝子」という用語は、タンパク質コード領域を含む又は細胞内で転写されているが翻訳されていないいずれかのデオキシリボヌクレオチド配列、及び関連する非コード領域及び調節領域を含む。このような関連する領域は、典型的には、５’及び３’末端の両方の上のコード領域又は転写された領域に隣接して、いずれの側でも約２ｋｂの距離にわたって位置する。これに関して、遺伝子は、所与の遺伝子と自然に会合しているプロモーター、エンハンサー、終結及び／若しくはポリアデニル化シグナルなどの制御シグナル、又は異種制御シグナルを含み得、この場合、遺伝子は、「キメラ遺伝子」と称される。コード領域の５’に位置しｍＲＮＡ上に存在する配列は、５’非翻訳配列と称される。コード領域の３’又は下流に位置しｍＲＮＡ上に存在する配列は、３’非翻訳配列と称される。「遺伝子」という用語は、遺伝子のｃＤＮＡ及びゲノム形態の両方を包含する。
【0251】
「アレル」は、細胞内、個別の植物内、又は集団内の（遺伝子などの）遺伝子配列の１つの特定の形態を指し、特定の形態は、遺伝子の配列内の少なくとも１つのバリアント部位、頻繁に、２つ以上のバリアント部位の配列内の同じ遺伝子の他の形態とは異なる。異なるアレル間で異なるこれらのバリアント部位における配列は、「バリアンス」又は「多型」と称される。本明細書で使用される場合、「多型」は、植物の異なる種、品種、系、又は個体の、本発明の遺伝子座におけるアレル間のヌクレオチド配列内の変動を指す。「多型位置」は、配列差が発生する、遺伝子の配列内の事前選択されたヌクレオチド位置である。いくつかの場合、遺伝的多型は、遺伝子によってコードされたポリペプチド内のアミノ酸配列変動を引き起こし、したがって、多型位置は、ポリペプチドの配列内の所定の位置における、アミノ酸配列内の多型の位置をもたらすことができる。他の事例では、多型領域は、遺伝子の非ポリペプチドコード領域内、例えば、プロモーター領域内にあり得、それによって、遺伝子の発現レベルに影響し得る。典型的な多型は、欠失、挿入、又は置換である。これらは、単一ヌクレオチド（単一ヌクレオチド多型又はＳＮＰ）又は２つ以上のヌクレオチドを含み得る。
【0252】
本明細書で使用される場合、「変異」は、植物又はその一部分内の表現型変化をもたらす多型である。この文脈において、一次表現型変化は、野生型（非変異型）形態に対する穀物粒のアリューロンの肥厚である。当該技術分野で既知であるように、いくつかの多型は、サイレントであり、例えば、タンパク質コード領域内の単一ヌクレオチド変化であり、これは、遺伝コードの冗長性に起因して、コードされたポリペプチドのアミノ酸配列を変化させない。二倍体植物は、典型的には、単一遺伝子の１つ又は２つの異なるアレルを有するが、遺伝子の両方のコピーが同一である場合、すなわち、植物がアレルについてホモ接合性である場合、１つのアレルのみを有する。多倍体植物は、概して、いずれかの特定の遺伝子の２つ以上のホメオログを有する。例えば、六倍体コムギは、Ａ、Ｂ、及びＤゲノムと称される３つの（しばしば「ゲノム」と称される）サブゲノムを有し、したがって、六倍体コムギの遺伝子のほとんどの３つのホメオログを有し、１つのホメオログをＡ、Ｂ、及びＤゲノムの各々内に有する。
【0253】
「遺伝子」という用語は、本明細書で定義されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を指す。遺伝子は、内在性自然発生遺伝子であってもよく、又は本明細書で定義される、遺伝的変動、好ましくは、導入された遺伝的変動を含んでもよい。本発明の穀粒内のポリペプチドをコードする遺伝子は、イントロンを有し得るか又は有しない場合がある。一例では、本発明の穀粒は、米からであり、ＯｓｍｔＳＳＢ－１ａ遺伝子の少なくとも１つのアレルは、ＯｓｍｔＳＳＢ－１ａポリペプチドをコードし、ＯｓｍｔＳＳＢ－１ａポリペプチドは、対応する野生型米植物（例えば、配列番号３で提供されるアミノ酸の配列を含むもの）からのＯｓｍｔＳＳＢ－１ａポリペプチドと比較して低減されたＯｓｍｔＳＳＢ－１ａポリペプチド活性を有する。低減されたＯｓｍｔＳＳＢ－１ａポリペプチド活性を有するこのようなＯｓｍｔＳＳＢ－１ａポリペプチドの例としては、配列番号８、配列番号９、又は配列番号１０で提供されるアミノ酸からなるアミノ酸配列を有するもの若しくはその短縮型バージョン、又は配列番号８、配列番号９、又は配列番号１０に記載のアミノ酸配列のうちの１つ以上と少なくとも７５％、少なくとも９０％、若しくは好ましくは、少なくとも９５％同一であるが、より長くないアミノ酸配列を有するもののうちの１つ以上が挙げられる。
【0254】
一実施形態では、遺伝的変動は、本明細書に記載される野生型ミトコンドリアポリペプチドをコードする内在性遺伝子の発現を低減する。本明細書で使用される場合、「内在性遺伝子の発現を低減する」という語句又はその変形は、本明細書で定義される機能的ポリペプチドをコードする遺伝子の発現を（部分的に）低減又は完全に防止するいずれかの遺伝的変動を指す。このような遺伝的変動は、遺伝子のプロモーター領域内の変異であって、例えば、遺伝子編集を使用して、ヌクレオチドを遺伝子のプロモーターから欠失させる若しくは置換することによって、遺伝子の転写を低減する、変異、又はイントロンスプライシング変異であって、スプライシングの量又は位置を変更してｍＲＮＡを形成する、イントロンスプライシング変異を含む。
【0255】
転写された領域を含有する遺伝子のゲノム形態又はクローンは、遺伝子の「エクソン」に対して相同又は異種のいずれかであり得る「イントロン」又は「介在領域」又は「介在配列」と称される非コード配列で中断され得る。本明細書で使用される場合、「イントロン」は、遺伝子のセグメントであって、一次ＲＮＡ転写物の一部分として転写されているが、成熟ｍＲＮＡ分子内に存在しない、セグメントである。イントロンは、核又は一次転写物から除去又は「スプライシング除去」され、したがって、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）内に存在しない。本明細書で使用される場合、「エクソン」は、ＲＮＡ分子が翻訳されていない場合、成熟ｍＲＮＡ又は成熟ＲＮＡ分子内に存在するＲＮＡ配列に対応するＤＮＡ領域を指す。ｍＲＮＡは、新生ポリペプチド内のアミノ酸の配列又は順序を特定するように、翻訳中に機能する。「遺伝子」という用語は、本明細書に記載される本発明のタンパク質の全て又は一部分をコードする合成又は融合分子、及び上記のうちのいずれか１つに相補的ヌクレオチド配列を含む。遺伝子は、細胞内の染色体外維持に、又は好ましくは、宿主ゲノム内への組み込みに適切なベクター内に導入され得る。
【0256】
本明細書で使用される場合、「キメラ遺伝子」とは、結合していることが自然に見出されない共有結合した配列を含むいずれかの遺伝子を指す。典型的には、キメラ遺伝子は、一緒に自然に見出されない調節及び転写又はタンパク質コード配列を含む。したがって、キメラ遺伝子は、異なる供給源に由来する調節配列及びコード配列、又は同一の供給源に由来するが、自然に見出される様式とは異なる様式で編成されている調節配列及びコード配列を含み得る。一実施形態では、遺伝子のタンパク質コード領域は、遺伝子に異種であるプロモーター又はポリアデニル化／終結領域に動作可能に連結されており、それによって、キメラ遺伝子を形成する。代替の実施形態では、ポリヌクレオチドをコードする遺伝子は、穀類植物の穀粒内に存在するときに、穀粒内のポリペプチドの産生及び／又は活性を下向き調節し、この遺伝子は、ポリヌクレオチドに異種であるプロモーター又はポリアデニル化／終結領域に動作可能に連結されており、それによって、キメラ遺伝子を形成する。
【0257】
「内在性」という用語は、調査対象の植物と同じ発達段階における改変されていない穀類植物内に通常存在する又は産生される物質を指すために本明細書で使用される。「内在性遺伝子」とは、生物のゲノム内の自然の位置における天然遺伝子を指す。本明細書で使用される場合、「組換え核酸分子」、「組換えポリヌクレオチド」又はそれらの変形は、組換えＤＮＡ技術によって構築又は改変された核酸分子を指し、これは、改変された内在性遺伝子である核酸分子であって、改変された内在性遺伝子が、遺伝子編集技術によって、例えば、ＴＡＬＥＮＳ又はＣＲＩＳＰＲ技術によって変異している、核酸分子を含む「異質ポリヌクレオチド」又は「外来性ポリヌクレオチド」又は「異種ポリヌクレオチド」という用語などは、遺伝子編集技術を含む実験的操作によって細胞のゲノム内に導入されたいずれかの核酸を指す。
【0258】
異質又は外来性遺伝子は、非天然生物内に挿入された遺伝子、天然宿主内の新しい位置内に導入された天然遺伝子、キメラ遺伝子、又は遺伝子編集技術によって改変された内在性遺伝子であり得る。「トランスジーン」は、形質転換手順によってゲノム内に導入された遺伝子である。「遺伝子改変された」という用語は、より広く、形質転換又は形質導入によって遺伝子を細胞内に導入することのみでなく、細胞内の遺伝子を変異させること、例えば、遺伝子編集技術によって挿入、欠失、又は置換を内在性遺伝子内に導入すること、及びこれらの行為が行われた細胞若しくは生物内又は前駆細胞若しくは生物内の遺伝子の調節を変更する又は変えることも含む。
【0259】
更に、ポリヌクレオチド（核酸）の文脈において、「外来性」という用語は、ポリヌクレオチドを自然に含まない細胞内に存在するときのポリヌクレオチドを指す。細胞は、コードされたポリペプチドの産生の変更された量をもたらす非内在性ポリヌクレオチドを含む細胞、例えば、内在性ポリペプチドの発現を増加させる外来性ポリヌクレオチド、又は天然状態でポリペプチドを産生しない細胞であり得る。本発明のポリペプチドの増加した産生は、「過剰発現」とも本明細書で称される。本発明の外来性ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドが存在するトランスジェニック（組換え）細胞若しくは無細胞発現系の他の構成要素から分離されていないポリヌクレオチド、及びこのような細胞若しくは無細胞系内で産生され、その後、少なくともいくつかの他の構成要素から精製されて分離されたポリヌクレオチドを含む。外来性ポリヌクレオチド（核酸）は、自然に存在する連続した伸長のヌクレオチドであってもよく、又は外来性ポリヌクレオチド（核酸）は、結合して単一ポリヌクレオチドを形成する、異なる（自然発生及び／又は合成）供給源からの２つ以上の連続した伸長のヌクレオチドを含んでもよい。典型的には、このようなキメラポリヌクレオチドは、少なくともオープンリーディングフレームを含み、オープンリーディングフレームは、本発明のポリペプチドをコードし、本発明のポリペプチドは、対象の細胞内のオープンリーディングフレームの転写の駆動に好適なプロモーターに動作可能に連結されている。
【0260】
ポリヌクレオチドの％同一性は、ＧＡＰ（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０）解析（ＧＣＧプログラム）によって、ギャップ生成ペナルティ＝５及びギャップ伸長ペナルティ＝０．３で判定される。一実施形態では、クエリ配列は、少なくとも４５０個のヌクレオチドの長さであり、ＧＡＰ解析は、２つの配列を少なくとも４５０個のヌクレオチドの領域にわたってアライメントする。一実施形態では、クエリ配列は、少なくとも５２５個のヌクレオチドの長さであり、ＧＡＰ解析は、２つの配列を少なくとも５２５個のヌクレオチドの領域にわたってアライメントする。一実施形態では、クエリ配列は、少なくとも６００個のヌクレオチドの長さであり、ＧＡＰ解析は、２つの配列を少なくとも６００個のヌクレオチドの領域にわたってアライメントする。一実施形態では、クエリ配列は、少なくとも９００個のヌクレオチドの長さであり、ＧＡＰ解析は、２つの配列を少なくとも９００個のヌクレオチドの領域にわたってアライメントする。一実施形態では、クエリ配列は、少なくとも１，２００個のヌクレオチドの長さであり、ＧＡＰ解析は、２つの配列を少なくとも１，２００個のヌクレオチドの領域にわたってアライメントする。一実施形態では、クエリ配列は、少なくとも１，５００個のヌクレオチドの長さであり、ＧＡＰ解析は、２つの配列を少なくとも１，５００個のヌクレオチドの領域にわたってアライメントする。一実施形態では、クエリ配列は、少なくとも１，８００個のヌクレオチドの長さであり、ＧＡＰ解析は、２つの配列を少なくとも１，８００個のヌクレオチドの領域にわたってアライメントする。一実施形態では、クエリ配列は、少なくとも２，１００個のヌクレオチドの長さであり、ＧＡＰ解析は、２つの配列を少なくとも２，１００個のヌクレオチドの領域にわたってアライメントする。更により好ましくは、ＧＡＰ解析は、２つの配列をこれらの配列の長さ全体にわたってアライメントする
【0261】
定義されるポリヌクレオチドに関しては、上記で提供される％同一性数値よりも高い％同一性数値が好ましい実施形態を包含することが理解されよう。したがって、適用可能な場合、最小％同一性数値の観点から、ポリヌクレオチドは、関連する指定される配列番号と少なくとも７５％、より好ましくは、少なくとも８０％、より好ましくは、少なくとも９０％、より好ましくは、少なくとも９１％、より好ましくは、少なくとも９２％、より好ましくは、少なくとも９３％、より好ましくは、少なくとも９４％、より好ましくは、少なくとも９５％、より好ましくは、少なくとも９６％、より好ましくは、少なくとも９７％、より好ましくは、少なくとも９８％、より好ましくは、少なくとも９９％、より好ましくは、少なくとも９９．１％、より好ましくは、少なくとも９９．２％、より好ましくは、少なくとも９９．３％、より好ましくは、少なくとも９９．４％、より好ましくは、少なくとも９９．５％、より好ましくは、少なくとも９９．６％、より好ましくは、少なくとも９９．７％、より好ましくは、少なくとも９９．８％、更により好ましくは、少なくとも９９．９％同一であるポリヌクレオチド配列を含むことが好ましい。％同一性は、参照配列の完全長に沿って計算されることが好ましい。一実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、参照ポリヌクレオチドを越えて、５’末端、３’末端、又は両方の末端において伸長する。
【0262】
本発明はまた、オリゴヌクレオチドの使用、例えば、本発明のポリヌクレオチドについてのスクリーニングの方法における、又は本発明のポリペプチドをコードする方法におけるオリゴヌクレオチドの使用に関する。本明細書で使用される場合、「オリゴヌクレオチド」は、最大５０個のヌクレオチドの長さのポリヌクレオチドである。このようなオリゴヌクレオチドの最小サイズは、本発明の核酸分子上のオリゴヌクレオチドと相補的配列との間の安定したハイブリッドの形成に必要とされるサイズである。これらは、ＲＮＡ、ＤＮＡ、又はいずれかの組み合わせ若しくは誘導体であることができる。オリゴヌクレオチドは、典型的には、１０個～３０個のヌクレオチド、一般的には、１５個～２５個のヌクレオチドの長さの比較的短い一本鎖分子である。増幅反応においてプローブ又はプライマーとして使用されたときに、このようなオリゴヌクレオチドの最小サイズは、標的核酸分子上のオリゴヌクレオチドと相補的配列との間の安定したハイブリッドの形成に必要とされるサイズである。好ましくは、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１５個のヌクレオチド、より好ましくは、少なくとも１８個のヌクレオチド、より好ましくは、少なくとも１９個のヌクレオチド、より好ましくは、少なくとも２０個のヌクレオチド、更により好ましくは、少なくとも２５個のヌクレオチドの長さである。プローブとして使用される本発明のオリゴヌクレオチドは、典型的には、放射性同位体、酵素、ビオチン、蛍光分子、又は化学発光分子などの標識とコンジュゲートされる。
【0263】
本発明は、例えば、核酸分子を同定するためのプローブ若しくは核酸分子を産生するためのプライマーとして、又は遺伝子編集のためのガイド配列として使用され得るオリゴヌクレオチドを含む。プローブ及び／又はプライマーは、本発明のポリヌクレオチドの相同体を他の種からクローニングするために使用され得る。更に、当該技術分野で既知のハイブリダイゼーション技法もまた、ゲノム又はｃＤＮＡライブラリをこのような相同体についてスクリーニングするために使用され得る。
【0264】
本発明のポリヌクレオチド及びオリゴヌクレオチドは、ストリンジェントな条件下で、配列番号１、２、４～７、１１～１４、４９～６０、６２、６３、６５、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、又は９７として提供される配列のうちの１つ以上にハイブリダイゼーションするものを含む。本明細書で使用される場合、ストリンジェントな条件は、（１）洗浄のために低イオン強度及び高温を使用する条件、例えば、０．０１５ＭのＮａＣｌ／０．００１５Ｍのクエン酸ナトリウム／０．１％のＮａＤｏｄＳＯ４を５０℃で使用する条件、（２）ハイブリダイゼーション中に、ホルムアミドなどの変性剤、例えば、０．１％ウシ血清アルブミンとの５０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ホルムアミド、０．１％フィコール、０．１％ポリビニルピロリドン、７５０ｍＭのＮａＣｌとのｐＨ６．５での５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液、７５ｍＭのクエン酸ナトリウムを４２℃で使用する条件、又は（３）５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（０．７５ＭのＮａＣｌ、０．０７５Ｍのクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％ピロリン酸ナトリウム、５×デンハート溶液、超音波処理サケ精子ＤＮＡ（５０ｇ／ｍｌ）、０．１％のＳＤＳ、及び１０％デキストラン硫酸を４２℃で０．２×ＳＳＣ及び０．１％のＳＤＳ中で使用する条件である。
【0265】
本発明のポリヌクレオチドは、自然発生分子と比較して、１つ以上の変異を有し得、１つ以上の変異は、ヌクレオチド残基の欠失、挿入、又は置換である。変異体は、自然発生（すなわち、自然供給源から単離されたもの）又は（例えば、部位指向性変異誘発を核酸に実行することによる）合成のいずれかであり得る。本発明のポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドのバリアントは、本明細書で定義される参照ポリヌクレオチド若しくはオリゴヌクレオチド分子、好ましくは、内在性遺伝子の穀類ゲノムに近い穀類ゲノムの様々なサイズの分子、及び／又はこの穀類ゲノムにハイブリダイゼーションすることが可能である分子を含む。例えば、バリアントは、ヌクレオチドが依然として標的領域にハイブリダイゼーションする限り、追加のヌクレオチド（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ以上）、又はより少ないヌクレオチドを含み得る。更に、いくつかのヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドが標的領域にハイブリダイゼーションする能力に影響することなく置換され得る。加えて、本明細書で定義される特定のオリゴヌクレオチドがハイブリダイゼーションする植物ゲノムの領域に、近くに、例えば、５０個のヌクレオチド以内でハイブリダイゼーションするバリアントが、容易に設計され得る。特に、これは、同じポリペプチド又はアミノ酸配列をコードするがヌクレオチド配列が遺伝コードの冗長性によって変動するポリヌクレオチドを含む。「ポリヌクレオチドバリアント」及び「バリアント」という用語は、自然発生アレルバリアントを含む。
【0266】
遺伝的変動
本明細書で使用される場合、「遺伝的変動」という用語は、穀粒の１つ以上の細胞、好ましくは、発達中の穀粒の発達中の胚乳、種皮、アリューロン、及び胚のうちの少なくとも１つ以上又は全てにおける細胞、より好ましくは、本発明の発達中の穀粒又は植物若しくはその一部分の種皮、アリューロン、及び胚のうちの１つ以上又は全てにおける細胞が、遺伝子改変を有し、遺伝子改変が、人間によって導入されてもよく、又は穀類植物内で自然発生してもよい（例えば、交雑されて本発明の植物を産生する）ことを指す。穀粒は、２つ、３つ、４つ以上の遺伝的変動を、同じ又は異なる遺伝子内で含み得る。一例では、ｍｔＳＳＢ遺伝子は、２つの遺伝的変動を含み、２つの遺伝的変動は、穀物粒内のｍｔＳＳＢポリペプチドレベル及び／又は活性を低減する。別の例では、穀物粒は、穀物粒内のｍｔＳＳＢポリペプチドレベル及び／若しくは活性を低減する、ｍｔＳＳＢ遺伝子内の遺伝的変動、及び／又は穀物粒内のＴＷＩＮＫＬＥポリペプチドレベル及び／若しくは活性を低減する、ＴＷＩＮＫＬＥ遺伝子内の遺伝的変動、及び／又は穀物粒内のＲＥＣＡ３ポリペプチドレベル及び／若しくは活性を低減する、ＲＥＣＡ３遺伝子内の遺伝的変動を含む。好ましい実施形態では、穀粒又は植物若しくはその一部分内の全ての細胞は、導入された遺伝的変動を含む。一実施形態では、本発明の細胞、穀粒、又は植物は、１つ以上の遺伝的変動についてホモ接合性である。代替の実施形態では、本発明の細胞、穀粒、又は植物は、１つ以上の遺伝的変動についてヘテロ接合性である、又は１つの遺伝的変動についてヘテロ接合性であり、別の遺伝的変動についてホモ接合性である。当業者が理解するように、多くの異なるタイプの遺伝子改変がなされ得、例えば、ポリペプチドをコードする内在性遺伝子内の変異であって、遺伝子のタンパク質コード領域内にあってもよく、又はプロモーターなどの発現エレメント内にあってもよい、変異、例えば、内在性遺伝子の活性を低減する、遺伝子編集によって導入された変異、又はＴＩＬＬＩＮＧを使用して変異を導入することと、低減されたポリペプチド活性を有する穀粒を産生する植物のために選択することとによって導入された変異があるが、これらに限定されない。代替として、遺伝子改変は、外来性ポリヌクレオチドをコードする導入された核構築物であって、外来性ポリヌクレオチドが、遺伝子の発現、例えば、ｄｓＲＮＡ分子若しくはマイクロＲＮＡなどの発現を低減する、核構築物、又は外来性ポリヌクレオチドをコードする核構築物であって、外来性ポリヌクレオチドが、ポリペプチドをコードし、ポリペプチドのアミノ酸配列が、対応する野生型ポリペプチドのアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有し、ポリペプチドが、対応する野生型ポリペプチドと比較して低減されたポリペプチド活性を有する、核構築物を含む。
本明細書で使用される場合、「遺伝的変動」という用語は、穀粒の１つ以上の細胞、好ましくは、発達中の穀粒の発達中の胚乳、種皮、アリューロン、及び胚のうちの少なくとも１つ以上又は全てにおける細胞、より好ましくは、本発明の発達中の穀粒又は植物若しくはその一部分の種皮、アリューロン、及び胚のうちの１つ以上又は全てにおける細胞が、遺伝子改変を有し、遺伝子改変が、人間によって導入されてもよく、又は穀類植物内で自然発生してもよい（例えば、交雑されて本発明の植物を産生する）ことを指す。穀粒は、２つ、３つ、４つ以上の遺伝的変動を、同じ又は異なる遺伝子内で含み得る。一例では、ｍｔＳＳＢ遺伝子は、２つの遺伝的変動を含み、２つの遺伝的変動は、穀物粒内のｍｔＳＳＢポリペプチドレベル及び／又は活性を低減する。別の例では、穀物粒は、穀物粒内のｍｔＳＳＢポリペプチドレベル及び／若しくは活性を低減する、ｍｔＳＳＢ遺伝子内の遺伝的変動、及び／又は穀物粒内のＴＷＩＮＫＬＥポリペプチドレベル及び／若しくは活性を低減する、ＴＷＩＮＫＬＥ遺伝子内の遺伝的変動、及び／又は穀物粒内のＲＥＣＡ３ポリペプチドレベル及び／若しくは活性を低減する、ＲＥＣＡ３遺伝子内の遺伝的変動を含む。好ましい実施形態では、穀粒又は植物若しくはその一部分内の全ての細胞は、導入された遺伝的変動を含む。一実施形態では、本発明の細胞、穀粒、又は植物は、１つ以上の遺伝的変動についてホモ接合性である。代替の実施形態では、本発明の細胞、穀粒、又は植物は、１つ以上の遺伝的変動についてヘテロ接合性である、又は１つの遺伝的変動についてヘテロ接合性であり、別の遺伝的変動についてホモ接合性である。当業者が理解するように、多くの異なるタイプの遺伝子改変がなされ得、例えば、ポリペプチドをコードする内在性遺伝子内の変異であって、遺伝子のタンパク質コード領域内にあってもよく、又はプロモーターなどの発現エレメント内にあってもよい、変異、例えば、内在性遺伝子の活性を低減する、遺伝子編集によって導入された変異、又はＴＩＬＬＩＮＧを使用して変異を導入することと、低減されたポリペプチド活性を有する穀粒を産生する植物のために選択することとによって導入された変異があるが、これらに限定されない。代替として、遺伝子改変は、外来性ポリヌクレオチドをコードする導入された核構築物であって、外来性ポリヌクレオチドが、遺伝子の発現、例えば、ｄｓＲＮＡ分子若しくはマイクロＲＮＡなどの発現を低減する、核構築物、又は外来性ポリヌクレオチドをコードする核構築物であって、外来性ポリヌクレオチドが、ポリペプチドをコードし、ポリペプチドのアミノ酸配列が、対応する野生型ポリペプチドのアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有し、ポリペプチドが、対応する野生型ポリペプチドと比較して低減されたポリペプチド活性を有する、核構築物を含む。
【0267】
変異誘発
本発明の植物は、変異誘発後に産生及び同定され得る。これは、いくつかの市場において望ましい非トランスジェニック植物を提供し得る。
本発明の植物は、変異誘発後に産生及び同定され得る。これは、いくつかの市場において望ましい非トランスジェニック植物を提供し得る。
【0268】
変異体は、自然発生（すなわち、自然供給源から単離されたもの）又は（例えば、変異誘発を核酸に実行することによる）合成又は誘導のいずれかであることができる。概して、前駆穀類植物細胞、組織、種子、又は植物は、単一又は複数の変異、例えば、ヌクレオチド置換、欠失、付加、及び／又はコドン改変をもたらすために変異誘発に供され得る。本出願の文脈において、「誘導変異」は、人工的に誘導された遺伝的変動であって、化学、放射線、又は生物学ベースの変異誘発、例えば、トランスポゾン又はＴ－ＤＮＡ挿入からもたらされ得る、遺伝的変動である。いくつかの実施形態では、変異は、遺伝子を完全に不活性化する、ヌル変異、例えば、ナンセンス変異、フレームシフト変異、挿入変異、又はスプライス部位バリアントである。ヌクレオチド挿入誘導体は、単一又は複数のヌクレオチドの５’及び３’末端融合並びに配列内挿入を含む。挿入ヌクレオチド配列バリアントは、１つ以上のヌクレオチドがヌクレオチド配列内に導入されるものであり、これは、ランダム挿入と、得られた産物の好適なスクリーニングとによって得られ得る。欠失バリアントは、１つ以上のヌクレオチドが配列から除去されていることによって特徴付けられる。好ましくは、変異型遺伝子は、野生型遺伝子に対して、ヌクレオチドの配列の単一挿入又は欠失のみを有する。置換ヌクレオチドバリアントは、配列内の少なくとも１つのヌクレオチドが除去されており異なるヌクレオチドがこの代わりに挿入されているものである。野生型遺伝子に対する変異型遺伝子内の置換によって影響されるヌクレオチドの好ましい数は、最大１０個のヌクレオチド、より好ましくは、最大９つ、８つ、７つ、６つ、５つ、４つ、３つ、若しくは２つのヌクレオチド、又は１つのヌクレオチドのみである。このような置換は、置換がコドンによって定義されるアミノ酸を変化させないという点で、「サイレント」であり得る。代替として、保存的置換は、１つのアミノ酸を別の同様の作用アミノ酸に変更するように設計される。典型的な保存的置換は、表１に従ってなされるものである。
【0269】
本明細書で使用される場合、「変異」という用語は、遺伝子の活性に影響しないサイレントヌクレオチド置換を含まず、したがって、遺伝子活性に影響する遺伝子配列内の変更のみを含む。「多型」という用語は、このようなサイレントヌクレオチド置換を含むヌクレオチド配列内のいずれかの変化を指す。
【0270】
いくつかの実施形態では、穀物粒は、ｍｔＳＳＢ遺伝子、ＴＷＩＮＫＬＥ遺伝子、若しくはＲＥＣＡ３遺伝子の少なくとも一部分、又はこのような遺伝子内のフレームシフト若しくはスプライス部位変動の非保存的置換欠失を含む。
【0271】
いくつかの実施形態では、１つ以上の変異体は、配列番号４５～４８に記載のアミノ酸配列を含む保存モチーフなどの保存モチーフをコードするｍｔＳＳＢポリペプチドをコードする遺伝子の保存領域内にある。いくつかの実施形態では、１つ以上の変異が、ＯｓｍｔＳＳＢ－１ａのＤＮＡ結合ドメインをコードするＯｓｍｔＳＳＢ－１ａの領域内にある。
【0272】
変異誘発は、化学的又は放射線手段、例えば、ＥＭＳ又はアジ化ナトリウムによって達成され得る（Ｚｗａｒ ａｎｄ Ｃｈａｎｄｌｅｒ，１９９５）。化学的変異誘発は、ヌクレオチド置換が欠失よりも好都合である傾向がある。重イオンビーム（ＨＩＢ）照射は、新しい植物品種を産生するための変異育種に有効な技法として既知であり、例えば、Ｈａｙａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．（２００４）及びＫａｚａｍａ ｅｔ ａｌ．（２００８）を参照されたい。イオンビーム照射は、ＤＮＡ損傷の量及びＤＮＡ欠失のサイズを判定する生物学的効果についての２つの物理条件、線量（ｇｙ）及びＬＥＴ（線エネルギー付与、ｋｅＶ／ｕｍ）を有し、これらは、変異誘発の所望の程度に従って調整され得る。ＨＩＢは、変異体の収集物を産生し、変異体の収集物の多くは欠失を含み、これらは、ｍｔＳＳＢ遺伝子内の変異についてスクリーニングされ得る。同定される有用な変異体は、変異誘発ゲノム内の非連結変異の効果を除去し、したがって、低減するために、反復親としての非変異型植物と戻し交雑され得る。
【0273】
部位特異的変異体の産生において有用な生物学的薬剤は、内在性修復機構を刺激するＤＮＡ内の二本鎖切断を含む酵素を含む。これらは、エンドヌクレアーゼ、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ、トランスポザーゼ、及び部位特異的リコンビナーゼを含む。亜鉛フィンガーヌクレアーゼ技術は、Ｌｅ Ｐｒｏｖｏｓｔ ｅｔ ａｌ．（２００９）、Ｄｕｒａｉ ｅｔ ａｌ．（２００５）、及びＬｉｕ ｅｔ ａｌ．（２０１０）で概説されている。
【0274】
変異体の単離は、変異誘発植物又は種子をスクリーニングすることによって達成され得る。例えば、穀類植物の変異誘発集団は、厚アリューロンについて又は遺伝子のうちの１つの低減された発現について、ＲＴ－ＰＣＲによってスクリーニングされてもよく、あるいは遺伝子のうちの１つの変異について、直接、又はＰＣＲ若しくはヘテロ二本鎖ベースのアッセイによってスクリーニングされてもよく、あるいはタンパク質の低減について、ＥＬＩＳＡ又はウエスタンブロット解析によってスクリーニングされてもよい。代替として、変異は、ＥＭＳなどの薬剤で変異誘発された集団においてＴＩＬＬＩＮＧなどの技法を使用して（Ｓｌａｄｅ ａｎｄ Ｋｎａｕｆ，２００５）、又は変異誘発プールのディープシークエンシングによって同定され得る。次いで、このような変異は、変異体を所望の遺伝的背景の植物と交雑することと、本来望ましくない親背景を削除するのに好適な回数の戻し交雑を実行することとによって、所望の遺伝的背景内に導入され得る。
【0275】
変異は、植物内に、変異誘発によって直接導入されていてもよく、又は２つの親植物の交雑であって、２つの親植物のうちの１つは、導入された変異を含んだ、交雑によって間接的に導入されていてもよい。改変された植物は、トランスジェニックであってもよく、又は非トランスジェニックであってもよい。変異誘発を使用して、低減されたｍｔＳＳＢ－１ａレベル若しくは活性を有するか、又はｍｔＳＳＢ－１ａを本質的に有しない非トランスジェニック植物が産生され得る。本発明はまた、植物から産生される穀粒又は他の植物部分、及び所望の特徴を有する植物を産生するために使用され得る、植物のいずれかの繁殖材料、例えば、培養された組織又は細胞にわたる。本発明は、このような植物又はこのような植物によって産生される穀粒を産生又は同定する方法に明白にわたる。
【0276】
ＴＩＬＬＩＮＧ
本発明の植物は、例えば、本明細書の実施例１３に記載されるように、ＴＩＬＬＩＮＧ（ゲノム内の誘導性局所損傷の標的化（Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｌｏｃａｌ Ｌｅｓｉｏｎｓ ＩＮ Ｇｅｎｏｍｅｓ））として既知のプロセスを使用して産生され得る。第１のステップでは、新規の単一塩基対変化などの導入された変異は、種子（又は花粉）を化学的変異誘発物質で処理することと、次いで、植物を、変異を安定して遺伝する世代に進行させることとによって、植物の集団において誘導される。これは、典型的には、Ｍ２世代である。ＤＮＡは、個別の植物又は植物の小さいプールから抽出され、種子は、集団の全てのメンバーから貯蔵されて、経時的に繰り返しアクセスされ得る資源を作製する。
本発明の植物は、例えば、本明細書の実施例１３に記載されるように、ＴＩＬＬＩＮＧ（ゲノム内の誘導性局所損傷の標的化（Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｌｏｃａｌ Ｌｅｓｉｏｎｓ ＩＮ Ｇｅｎｏｍｅｓ））として既知のプロセスを使用して産生され得る。第１のステップでは、新規の単一塩基対変化などの導入された変異は、種子（又は花粉）を化学的変異誘発物質で処理することと、次いで、植物を、変異を安定して遺伝する世代に進行させることとによって、植物の集団において誘導される。これは、典型的には、Ｍ２世代である。ＤＮＡは、個別の植物又は植物の小さいプールから抽出され、種子は、集団の全てのメンバーから貯蔵されて、経時的に繰り返しアクセスされ得る資源を作製する。
【0277】
ＴＩＬＬＩＮＧアッセイのために、ＰＣＲプライマーは、対象の単一遺伝子標的、例えば、ｍｔＳＳＢ－１ａ、ＴＷＩＮＫＬＥ、又はＲＥＣＡ３をコードする遺伝子を特異的に増幅するように設計される。標的が、遺伝子ファミリーのメンバー、又は多倍体ゲノムの一部分、例えば、六倍体若しくは四倍体コムギ内の多倍体ゲノムの一部分である場合、特異性は、特に重要である。次に、染料標識プライマーが、複数の個体のプールされたＤＮＡからのＰＣＲ産物を増幅するために使用され得る。これらのＰＣＲ産物は、変性させ、再アニールされて、ミスマッチ塩基対の形成を可能にする。ミスマッチ又はヘテロ二本鎖は、自然発生単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）（すなわち、集団からのいくつかの植物が同じ多型を保有する可能性がある）及び誘導ＳＮＰ（すなわち、稀な個別の植物のみが変異を示す可能性がある）の両方を表す。ヘテロ二本鎖形成後に、ミスマッチＤＮＡを認識及び切断するＣｅｌＩなどのエンドヌクレアーゼの使用は、ＴＩＬＬＩＮＧ集団内の新規のＳＮＰを発見するための鍵である。
【0278】
この手法を使用して、何千もの植物が、いずれかの遺伝子内又はゲノムのいずれかの特定の領域内の単一塩基変化及び小さい挿入又は欠失（１～３０ｂｐ）を有するいずれかの個体を同定するためにスクリーニングされ得る。アッセイされるゲノム断片のサイズは、０．３～１．６ｋｂの範囲であることができる。８倍プーリング、（ＳＮＰ検出がノイズに起因して問題になる断片の末端を差引く）１．４ｋｂの断片、及び１アッセイ当たり９６個のレーンで、この組み合わせは、ゲノムＤＮＡの最大１００万個の塩基対が単一アッセイ当たりスクリーニングされることを可能にし、これは、ＴＩＬＬＩＮＧを高スループット技法にする。
【0279】
ＴＩＬＬＩＮＧは、Ｓｌａｄｅ ａｎｄ Ｋｎａｕｆ（２００５）及びＨｅｎｉｋｏｆｆ ｅｔ ａｌ．（２００４）に更に記載されている。
【0280】
変異の効率的な検出を可能にすることに加えて、ハイスループットＴＩＬＬＩＮＧ技術は、自然多型の検出に理想的である。したがって、未知の相同ＤＮＡを既知の配列へのヘテロ二本鎖化によって調べることにより、多型部位の数及び位置が判明する。ヌクレオチド変化並びに小さい挿入及び欠失の両方が、同定され、これは、少なくともある反復数の多型を含む。これは、Ｅｃｏｔｉｌｌｉｎｇと称されている（Ｃｏｍａｉ ｅｔ ａｌ．，２００４）。
【0281】
各々のＳＮＰは、いくつかのヌクレオチド内のＳＮＰのおおよその位置によって記録される。したがって、各々のハプロタイプは、ハプロタイプの移動度に基づいてアーカイブされ得る。配列データは、ミスマッチ切断アッセイのために使用される同じ増幅ＤＮＡのアリコートを使用して、比較的小さい増分労力で得られ得る。単一反応のための左又は右のシークエンシングプライマーは、多型へのシークエンシングプライマーの近接度によって選択される。シークエンシャーソフトウェアは、複数のアライメントを実行し、塩基変化を発見し、これは、各々の場合、ゲルバンドを確認した。
【0282】
Ｅｃｏｔｉｌｌｉｎｇは、ほとんどのＳＮＰ発見のために現在使用されている方法であるフルシークエンシングよりも安価に実行され得る。変異誘発植物からのＤＮＡのプールではなく、生態型ＤＮＡのアレイを収容するプレートがスクリーニングされ得る。検出は、ほぼ塩基対解像度を有するゲル上にあり、バックグラウンドパターンは、レーンにわたって均一であるため、同一のサイズのバンドが、マッチされ得、したがって、ＳＮＰが、単一ステップで発見及び遺伝子型判定され得る。このように、ＳＮＰの究極のシークエンシングは、単純かつ効率的であり、スクリーニングのために使用される同じＰＣＲ産物のアリコートがＤＮＡシークエンシングに供され得るということによって、より単純かつ効率的にされる。
【0283】
部位特異的ヌクレアーゼを使用するゲノム編集
ゲノム編集は、本明細書で定義されるポリペプチドをコードする遺伝子を改変するために使用され得る。ゲノム編集は、非特異的ＤＮＡ切断モジュールに融合した配列特異的ＤＮＡ結合ドメインから構成されている操作されたヌクレアーゼを使用する。これらのキメラヌクレアーゼは、誘導された切断を修復するために細胞の内在性細胞ＤＮＡ修復機構を刺激する標的ＤＮＡ二本鎖切断を誘導することによって、効率的かつ正確な遺伝子改変を可能にする。このような機構は、例えば、エラープローン非相同末端結合（ＮＨＥＪ）及びホモロジー指向性修復（ＨＤＲ）を含む。
ゲノム編集は、本明細書で定義されるポリペプチドをコードする遺伝子を改変するために使用され得る。ゲノム編集は、非特異的ＤＮＡ切断モジュールに融合した配列特異的ＤＮＡ結合ドメインから構成されている操作されたヌクレアーゼを使用する。これらのキメラヌクレアーゼは、誘導された切断を修復するために細胞の内在性細胞ＤＮＡ修復機構を刺激する標的ＤＮＡ二本鎖切断を誘導することによって、効率的かつ正確な遺伝子改変を可能にする。このような機構は、例えば、エラープローン非相同末端結合（ＮＨＥＪ）及びホモロジー指向性修復（ＨＤＲ）を含む。
【0284】
伸長ホモロジーアームを有するドナープラスミドの存在下で、ＨＤＲは、存在する遺伝子を修正又は置き換えるための単一又は複数のトランスジーンの導入をもたらすことができる。ドナープラスミドの非存在下では、ＮＨＥＪ媒介修復は、遺伝子破壊を引き起こす標的の小さい挿入又は欠失変異をもたらす。
【0285】
本発明の方法において有用な操作されたヌクレアーゼは、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様（ＴＡＬ）エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、及びＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９又はＣａｓ１２型部位特異的ヌクレアーゼを含む。
【0286】
典型的に、ヌクレアーゼコード遺伝子は、プラスミドＤＮＡ、ウイルスベクター、又はインビトロ転写ｍＲＮＡによって、細胞内に送達される。蛍光サロゲートレポーターベクターの使用はまた、ＺＦＮ－、ＴＡＬＥＮ－、又はＣＲＩＳＰＲ改変細胞の富化を可能にする。
【0287】
複雑なゲノムは、しばしば、意図されたＤＮＡ標的と同一又は高度に相同である配列の複数のコピーを含有し、これは、潜在的に、オフターゲット活性及び細胞毒性をもたらす。これに対処するために、構造（Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００７、Ｓｚｃｚｅｐｅｋ ｅｔ ａｌ．，２００７）及び選択ベース（Ｄｏｙｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１１、Ｇｕｏ ｅｔ ａｌ．，２０１０）の手法が、最適化された切断特異性及び低減された毒性を有する改善されたＺＦＮ及びＴＡＬＥＮヘテロ二量体を産生するために使用され得る。
【0288】
本発明の好ましい実施形態による、ＺＦＮによる遺伝的組換え又は変異を標的とするためには、２つの９ｂｐの亜鉛フィンガーＤＮＡ認識配列が、宿主ＤＮＡ内で同定されなければならない。これらの認識部位は、互いに対して逆の配向であり、約６ｂｐのＤＮＡによって分離されている。次いで、ＺＦＮは、標的遺伝子座でＤＮＡに特異的に結合する亜鉛フィンガー組み合わせを設計及び産生することと、次いで、亜鉛フィンガーをＤＮＡ切断ドメインに連結することとによって産生される。
【0289】
転写活性化因子様（ＴＡＬ）エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）は、ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメイン及びエンドヌクレアーゼドメインを含む。
【0290】
ＴＡＬエフェクターは、植物病原性細菌のタンパク質であって、病原体によって植物細胞内に注入され、植物細胞内で、核に移動し、特定の植物遺伝子を活性化するための転写因子として機能する、タンパク質である。ＴＡＬエフェクターの一次アミノ酸配列は、ＴＡＬエフェクターが結合するヌクレオチド配列を指示する。したがって、標的部位は、ＴＡＬエフェクターについて予測され得、ＴＡＬエフェクターは、特定のヌクレオチド配列に結合する目的で操作及び産生され得る。
【0291】
ＴＡＬエフェクターコード核酸配列に融合した配列は、ヌクレアーゼ又はヌクレアーゼの一部分、典型的には、ＦｏｋＩなどのＩＩ型制限エンドヌクレアーゼからの非特異的切断ドメインをコードする配列である（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，１９９６）。他の有用なエンドヌクレアーゼは、例えば、ＨｈａＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、Ｎｏｄ、ＢｂｖＣＩ、ＥｃｏＲＩ、ＢｇｌＩ、及びＡｌｗＩを含み得る。いくつかのエンドヌクレアーゼ（例えば、ＦｏｋＩ）が二量体としてのみ機能するということは、ＴＡＬエフェクターの標的特異性を増強するために利用され得る。例えば、いくつかの場合、各々のＦｏｋＩ単量体は、異なるＤＮＡ標的配列を認識するＴＡＬエフェクター配列に融合することができ、２つの認識部位が近接しているときにのみ、非活性単量体を一緒にさせて、機能的酵素を作製する。ＤＮＡ結合がヌクレアーゼを活性化することを必要とすることによって、高度に部位特異的制限酵素が作製され得る。
【0292】
配列特異的ＴＡＬＥＮは、細胞内に存在する事前に選択された標的ヌクレオチド配列内の特定の配列を認識することができる。したがって、いくつかの実施形態では、標的ヌクレオチド配列は、ヌクレアーゼ認識部位についてスキャンされ得、特定のヌクレアーゼが、標的配列に基づいて選択され得る。他の場合、ＴＡＬＥＮは、特定の細胞配列を標的にするように操作され得る。
【0293】
ＣＲＩＳＰＲを使用するゲノム編集（遺伝子編集）
エンドヌクレアーゼは、一本鎖又は二本鎖切断を、ゲノムＤＮＡ内に、配列特異的な様式で、すなわち、定義されるヌクレオチド配列を標的にする様式で産生するために使用され得る。真核細胞内のゲノムＤＮＡ切断は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）又はホモロジー指向性修復（ＨＤＲ）経路を使用して修復される。ＮＨＥＪは、変異の産生をもたらす不完全な修復をもたらし得、しばしば、短い欠失、例えば１つ～３０個の塩基対をもたらし得る。対照的に、ＨＤＲは、外来性供給修復ＤＮＡテンプレートを使用することによって、正確な遺伝子挿入を可能にすることができる。転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）及び亜鉛フィンガーヌクレアーゼが依然として有用であるが、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質は、著明な関心を得ており、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は、ゲノム改変のためのより単純な汎用性のあるより安価なツールを提供する（Ｄｏｕｄｎａ ａｎｄ Ｃｈａｒｐｅｎｔｉｅｒ，２０１４）。
エンドヌクレアーゼは、一本鎖又は二本鎖切断を、ゲノムＤＮＡ内に、配列特異的な様式で、すなわち、定義されるヌクレオチド配列を標的にする様式で産生するために使用され得る。真核細胞内のゲノムＤＮＡ切断は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）又はホモロジー指向性修復（ＨＤＲ）経路を使用して修復される。ＮＨＥＪは、変異の産生をもたらす不完全な修復をもたらし得、しばしば、短い欠失、例えば１つ～３０個の塩基対をもたらし得る。対照的に、ＨＤＲは、外来性供給修復ＤＮＡテンプレートを使用することによって、正確な遺伝子挿入を可能にすることができる。転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）及び亜鉛フィンガーヌクレアーゼが依然として有用であるが、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質は、著明な関心を得ており、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は、ゲノム改変のためのより単純な汎用性のあるより安価なツールを提供する（Ｄｏｕｄｎａ ａｎｄ Ｃｈａｒｐｅｎｔｉｅｒ，２０１４）。
【0294】
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は、様々なヌクレアーゼ又はヌクレアーゼの組み合わせを使用して、２つの主要なグループに分類される。クラス１ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系（Ｉ型、ＩＩＩ型、及びＩＶ型）内で、エフェクターモジュールは、多タンパク質複合体からなり、クラス２系（ＩＩ型、Ｖ型、及びＶＩ型）は、１つのエフェクタータンパク質のみを使用する（Ｍａｋａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。Ｃａｓは、隣接するＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に結合している又はこの近くに又はこの付近に局在する遺伝子を含む。Ｈａｆｔ ｅｔ ａｌ．（２００５）は、Ｃａｓタンパク質ファミリーの概説を提供する。
【0295】
ヌクレアーゼは、合成小ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ又はｇＲＮＡ）によってガイドされ、合成小ガイドＲＮＡは、ｔｒａｃＲＮＡを含み得るか、又は含まない場合があり、ｔｒａｃＲＮＡは、２つの遺伝子への、すなわち、エンドヌクレアーゼ及びｓｇＲＮＡへのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系の単純化をもたらす（Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．２０１２）。ｓｇＲＮＡは、典型的には、Ｕ３又はＵ６小核ＲＮＡプロモーターなどのＰｏｌＩＩＩプロモーターの調節制御下にある。ｓｇＲＮＡは、概して、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）スペーサー及び反復配列、並びにＣａｓエフェクタータンパク質を複合体のために一緒に含んで、標的ヌクレオチド配列内に存在するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を認識する。ｓｇＲＮＡは、配列ホモロジーによる標的化のための特定の遺伝子及び遺伝子の一部分を認識する。プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）は、ゲノム内の潜在的なＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ標的の数を制限する標的部位に隣接するが、ヌクレアーゼの拡大はまた、使用可能なＰＡＭの数を増加させる。Ｃａｓヌクレアーゼは、ｃｒＲＮＡ空間と相補的標的ヌクレオチド配列との間の塩基対合によって活性化される。ｇＲＮＡを設計するために使用可能な多数のウェブツールがあり、ウェブツールは、ＣＨＯＰＣＨＯＰ（ｈｔｔｐ：／／ｃｈｏｐｃｈｏｐ．ｃｂｕ．ｕｉｂ．ｎｏ）、ＣＲＩＳＰＲ設計ｈｔｔｐｓ：／／ｏｍｉｃｔｏｏｌｓ．ｃｏｍ／ｃｒｉｓｐｒ－ｄｅｓｉｇｎ－ｔｏｏｌ、Ｅ－ＣＲＩＳＰ ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅ－ｃｒｉｓｐ．ｏｒｇ／Ｅ－ＣＲＩＳＰ／、及びＧｅｎｅｉｏｕｓ又はＢｅｎｃｈｌｉｎｇ ｈｔｔｐｓ：／／ｂｅｎｃｈｌｉｎｇ．ｃｏｍ／ｃｒｉｓｐｒを含む。
【0296】
一例では、約１７個、１８個、１９個、又は２０個のヌクレオチドのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）標的配列、直ぐに続いて、３つのヌクレオチドのＰＡＭ（プロトスペーサー隣接モチーフ）配列が、本明細書で定義されるポリペプチド、好ましくは、ｍｔＳＳＢ－１若しくはｍｔＳＳＢ－１ａポリペプチド、ＴＷＩＮＫＬＥポリペプチド、又はＲＥＣＡ３ポリペプチドのうちの１つ以上をコードする遺伝子にのｃＤＮＡ配列から同定される。
【0297】
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は、遺伝子編集のための植物遺伝子の改変において最も頻繁に採用されており、これは、しばしば、ＲＮＡガイド性Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９などのＣａｓ９エフェクタータンパク質又は複数の植物種内の最適化された配列バリアントを使用する（Ｌｕｏ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。Ｌｕｏ ｅｔ ａｌ．（２０１６）は、多数の研究の概要を述べており、これらの研究において、遺伝子は、様々な植物種内で成功裏に標的とされて、内在性遺伝子オープンリーディングフレーム及び／又はプロモーター内のｉｎｄｅｌ及び機能喪失型変異体表現型を生じさせる。ｘＣａｓ９などの改変Ｃａｓ９は、バリアントＰＡＭ配列が必要とされる場合の使用のために使用可能である（Ｈｕ ｅｔ ａｌ．，２０１８）。植物細胞上の細胞壁に起因して、細胞内へのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ機構の送達及び成功裏のトランスジェニック再生は、典型的には、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ感染（Ｌｕｏ ｅｔ ａｌ．，２０１６）又はプラスミドＤＮＡ粒子衝突若しくは微粒子銃送達を使用してきた。穀類形質転換に好適なベクターとしては、ｐＣＸＵＮｃａｓ９（Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ，２０１６）又はＡｄｄｇｅｎｅから入手可能なｐＹＬＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９Ｐｕｂｉ－Ｈ（Ｍａ ｅｔ ａｌ．，２０１５、受入番号ＫＲ０２９１０９．１）が挙げられる。
【0298】
代替のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は、多数であり、エフェクター酵素を含み、エフェクター酵素は、ヌクレアーゼＲｕｖＣドメインを含有するが、Ｃａｓ１２酵素を含むＨＮＨドメインを含有せず、Ｃａｓ１２酵素は、Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｆ、Ｃｐｆ１、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ３、及び操作された誘導体を含む。植物内で、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ及びＦｒａｎｃｉｓｅｌｌａからのＣｐｆ１は、Ｃａｓ９の代替として成功裏に使用されている。Ｃｐｆ１は、二本鎖切断を、ねじれ型様式でＰＡＭ遠位位置において作製し、より小さいエンドヌクレアーゼであることは、ある種について利点を提供し得る（Ｂｅｇｅｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，２０１７）。他のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は、Ｃａｓ１３、Ｃａｓ１３ａ（Ｃ２ｃ２）、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃを含むＲＮＡガイド性リボヌクレアーゼを含む。代替のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は、変異を内在性植物遺伝子内に産生する文脈で設計及び適用される複合ヌクレアーゼ及びエフェクター系、例えば、ＣＲＩＳＰＲ ＴｉＤ系（Ｏｓａｋａｂｅ ｅｔ ａｌ．，２０２０）を含み、又は複合ヌクレアーゼ及び修復酵素、例えば、Ａｎｚａｌｏｎｅ ｅｔ ａｌ，（２０１９）によって記載されているプライム編集系は、ＤＮＡ切断後に発生する細胞修復及び配列挿入を厳密に制御することができる。
【0299】
配列挿入又は組み込み
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は、ゲノム内への配列の挿入についての相同修復を指示するための核酸配列の提供と組み合わされ得る。植物トランスジーンの標的ゲノム組み込みは、同じ遺伝子座におけるトランスジーンの逐次的付加を可能にする。この「シス遺伝子スタッキング」は、後続の育種労力を、単一遺伝子座として遺伝する全てのトランスジーンで大きく単純化する。標的部位のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９切断と結合しているときに、トランスジーンは、隣接配列ホモロジーによって容易にされるホモロジー指向性修復によって、この遺伝子座内に組み込まれ得る。この手法は、リンケージドラッグなしで新しいアレルを迅速に導入するために、又は自然に存在しないアレルバリアントを導入するために使用され得る。
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は、ゲノム内への配列の挿入についての相同修復を指示するための核酸配列の提供と組み合わされ得る。植物トランスジーンの標的ゲノム組み込みは、同じ遺伝子座におけるトランスジーンの逐次的付加を可能にする。この「シス遺伝子スタッキング」は、後続の育種労力を、単一遺伝子座として遺伝する全てのトランスジーンで大きく単純化する。標的部位のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９切断と結合しているときに、トランスジーンは、隣接配列ホモロジーによって容易にされるホモロジー指向性修復によって、この遺伝子座内に組み込まれ得る。この手法は、リンケージドラッグなしで新しいアレルを迅速に導入するために、又は自然に存在しないアレルバリアントを導入するために使用され得る。
【0300】
ニッカーゼ
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ＩＩ系は、２つの酵素切断ドメイン、すなわち、ＲｕｖＣドメイン及びＨＮＨドメインを有するＣａｓ９ヌクレアーゼを使用する。変異は、二本鎖切断を一本鎖切断に変更し、ニッカーゼ又はヌクレアーゼ不活性化Ｃａｓ９と称される技術バリアントをもたらすことが示されている。ＲｕｖＣサブドメインは、非相補的ＤＮＡ鎖を切断し、ＨＮＨサブドメインは、ｇＲＮＡに相補的なこのＤＮＡ鎖を切断する。ニッカーゼ又はヌクレアーゼ不活性化Ｃａｓ９は、ｇＲＮＡによって指示されるＤＮＡ結合能力を保持する。サブドメイン内の変異、例えば、Ｄ１０Ａ変異又はＨ８４０Ａ変異を有するＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、当該技術分野で既知である。
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ＩＩ系は、２つの酵素切断ドメイン、すなわち、ＲｕｖＣドメイン及びＨＮＨドメインを有するＣａｓ９ヌクレアーゼを使用する。変異は、二本鎖切断を一本鎖切断に変更し、ニッカーゼ又はヌクレアーゼ不活性化Ｃａｓ９と称される技術バリアントをもたらすことが示されている。ＲｕｖＣサブドメインは、非相補的ＤＮＡ鎖を切断し、ＨＮＨサブドメインは、ｇＲＮＡに相補的なこのＤＮＡ鎖を切断する。ニッカーゼ又はヌクレアーゼ不活性化Ｃａｓ９は、ｇＲＮＡによって指示されるＤＮＡ結合能力を保持する。サブドメイン内の変異、例えば、Ｄ１０Ａ変異又はＨ８４０Ａ変異を有するＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、当該技術分野で既知である。
【0301】
ゲノム塩基編集又は改変
塩基エディタは、シトシンデアミナーゼをＣａｓ９ドメインと融合させることによって作製されてきた（ＷＯ２０１８／０８６６２３）。デアミナーゼを融合することによって、塩基エディタは、ｇＲＮＡによって指示される配列標的を使用して、ＤＮＡ内のシチジンの脱アミノ化による標的シチジン（Ｃ）からウラシル（Ｕ）への置換を行う。次いで、細胞のミスマッチ修復機構は、ＵをＴで置き換える。好適なシチジンデアミナーゼとしては、ＡＰＯＢＥＣ１デアミナーゼ、活性化誘導性シチジンデアミナーゼ（ＡＩＤ）、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ、及びＣＤＡ１が挙げられる。更に、Ｃａｓ９－デアミナーゼ融合は、一本鎖切断を産生するためのニッカーゼ活性を有する変異型Ｃａｓ９を含み得る。ニッカーゼタンパク質は、ホモロジー指向性修復の促進において潜在的により効率的であることが示唆されている（Ｌｕｏ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。
塩基エディタは、シトシンデアミナーゼをＣａｓ９ドメインと融合させることによって作製されてきた（ＷＯ２０１８／０８６６２３）。デアミナーゼを融合することによって、塩基エディタは、ｇＲＮＡによって指示される配列標的を使用して、ＤＮＡ内のシチジンの脱アミノ化による標的シチジン（Ｃ）からウラシル（Ｕ）への置換を行う。次いで、細胞のミスマッチ修復機構は、ＵをＴで置き換える。好適なシチジンデアミナーゼとしては、ＡＰＯＢＥＣ１デアミナーゼ、活性化誘導性シチジンデアミナーゼ（ＡＩＤ）、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ、及びＣＤＡ１が挙げられる。更に、Ｃａｓ９－デアミナーゼ融合は、一本鎖切断を産生するためのニッカーゼ活性を有する変異型Ｃａｓ９を含み得る。ニッカーゼタンパク質は、ホモロジー指向性修復の促進において潜在的により効率的であることが示唆されている（Ｌｕｏ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。
【0302】
ベクターフリーゲノム編集又はゲノム改変
より最近では、Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡリボヌクレオタンパク質を使用するベクターフリー手法を使用するための方法は、オフターゲット事象を成功裏に低減することが記載されている。方法は、プロトプラストなどの細胞内に形質転換されるＣａｓ９リボヌクレオタンパク質（ＲＮＰ）のインビトロ発現を必要とする。これは、宿主ゲノム内に組み込まれているＣａｓ９コード配列に依存せず、それによって、ランダムでの部位内へのＣａｓ９遺伝子の組み込みで発生し得る望ましくない非特異的切断を低減する。短い隣接配列のみが、安定したＣａｓ９及びｓｇＲＮＡ安定したリボヌクレオタンパク質をインビトロで形成するために必要とされる。Ｗｏｏ ｅｔ ａｌ．（２０１５）は、予めアセンブルされたＣａｓ９／ｓｇＲＮＡタンパク質／ＲＮＡ複合体を、産生し、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓのプロトプラスト、米、レタス、及びタバコ内に導入し、最大４５％の標的変異誘発頻度を再生植物内で観察した。ＲＮＰのインビトロ導入は、双子葉植物（Ｗｏｏ ｅｔ ａｌ．，２０１５）及び単子葉植物トウモロコシ（Ｓｖｉｔａｓｈｅｖ ｅｔ ａｌ．，２０１６）及びコムギ（Ｌｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１７）を含むいくつかの種内で実証された。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９インビトロ転写物又はリボヌクレオタンパク質を使用する植物のゲノム編集は、Ｌｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１８）及びＬｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１９）に記載されている。
より最近では、Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡリボヌクレオタンパク質を使用するベクターフリー手法を使用するための方法は、オフターゲット事象を成功裏に低減することが記載されている。方法は、プロトプラストなどの細胞内に形質転換されるＣａｓ９リボヌクレオタンパク質（ＲＮＰ）のインビトロ発現を必要とする。これは、宿主ゲノム内に組み込まれているＣａｓ９コード配列に依存せず、それによって、ランダムでの部位内へのＣａｓ９遺伝子の組み込みで発生し得る望ましくない非特異的切断を低減する。短い隣接配列のみが、安定したＣａｓ９及びｓｇＲＮＡ安定したリボヌクレオタンパク質をインビトロで形成するために必要とされる。Ｗｏｏ ｅｔ ａｌ．（２０１５）は、予めアセンブルされたＣａｓ９／ｓｇＲＮＡタンパク質／ＲＮＡ複合体を、産生し、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓのプロトプラスト、米、レタス、及びタバコ内に導入し、最大４５％の標的変異誘発頻度を再生植物内で観察した。ＲＮＰのインビトロ導入は、双子葉植物（Ｗｏｏ ｅｔ ａｌ．，２０１５）及び単子葉植物トウモロコシ（Ｓｖｉｔａｓｈｅｖ ｅｔ ａｌ．，２０１６）及びコムギ（Ｌｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１７）を含むいくつかの種内で実証された。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９インビトロ転写物又はリボヌクレオタンパク質を使用する植物のゲノム編集は、Ｌｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１８）及びＬｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１９）に記載されている。
【0303】
遺伝子挿入のための方法
植物胚は、組み込みの部位を標的とするＣａｓ９遺伝子及びｓｇＲＮＡ遺伝子で、ＤＮＡ修復テンプレートとともに衝撃され得る。ＤＮＡ修復テンプレートは、合成されたＤＮＡ断片、１２７量体ポリヌクレオチド以上であり得、各々が、挿入される対象の遺伝子をコードする。例えば、衝撃された細胞は、組織培地上で成長する。ＤＮＡは、ＣＴＡＢ ＤＮＡ抽出法を使用して、再生植物のカルス又は葉組織から抽出され、ＰＣＲによって解析されて、遺伝子組み込みが確認される。Ｔ１子孫植物は、対象の挿入遺伝子を含有することが確認された植物から選択され得る。
植物胚は、組み込みの部位を標的とするＣａｓ９遺伝子及びｓｇＲＮＡ遺伝子で、ＤＮＡ修復テンプレートとともに衝撃され得る。ＤＮＡ修復テンプレートは、合成されたＤＮＡ断片、１２７量体ポリヌクレオチド以上であり得、各々が、挿入される対象の遺伝子をコードする。例えば、衝撃された細胞は、組織培地上で成長する。ＤＮＡは、ＣＴＡＢ ＤＮＡ抽出法を使用して、再生植物のカルス又は葉組織から抽出され、ＰＣＲによって解析されて、遺伝子組み込みが確認される。Ｔ１子孫植物は、対象の挿入遺伝子を含有することが確認された植物から選択され得る。
【0304】
方法は、ドナーＤＮＡ及びエンドヌクレアーゼと称される対象のＤＮＡ配列を植物細胞内に導入することを含む。エンドヌクレアーゼは、切断を標的部位内に産生し、これは、ドナーＤＮＡのホモロジーの第１及び第２の領域が、ホモロジーのこれらの対応するゲノム領域との相同組換えを行うことを可能にする。切断されたゲノムＤＮＡは、ＤＮＡ配列のアクセプターとして作用する。ドナーとゲノムとの間のＤＮＡの得られた交換は、植物ゲノム内の標的部位内の鎖切断内へのドナーＤＮＡの対象のポリヌクレオチドの組み込みをもたらし、それによって、本来の標的部位を変更し、変更されたゲノム配列を産生する。
【0305】
ドナーＤＮＡは、当該技術分野で既知のいずれかの手段によって導入され得る。例えば、標的部位を有する植物が提供される。ドナーＤＮＡは、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介形質転換又は微粒子銃粒子衝撃を含む既知の形質転換方法によって、植物に提供され得る。ＲＮＡガイド性Ｃａｓ又はＣｐｆ１エンドヌクレアーゼは、標的部位において切断され、ドナーＤＮＡは、植物ゲノム内に挿入される。
【0306】
相同組換えは、植物の体細胞内で低頻度で発生するが、プロセスは、選択されたエンドヌクレアーゼ標的部位における二本鎖切断（ＤＳＢ）の導入によって増加する／刺激されると考えられる。
【0307】
ＲＮＡ干渉
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、遺伝子の発現を特異的に低減するのに特に有用であり、これは、遺伝子がタンパク質をコードする場合、特定のタンパク質の低減された産生をもたらす。理論に束縛されることを望まないが、Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ ｅｔ ａｌ．（１９９８）は、ｄｓＲＮＡ（二本鎖ＲＮＡ）がタンパク質産生を低減するために使用され得る機構のためのモデルを提供している。この技術は、対象の遺伝子のｍＲＮＡ又はその一部分と本質的に同一である配列を含有するｄｓＲＮＡ分子の存在に依存する。好都合には、ｄｓＲＮＡは、組換えベクター又は宿主細胞内の単一プロモーターから産生され得、センス及びアンチセンス配列は、非関連配列に隣接し、非関連配列は、センス及びアンチセンス配列がハイブリダイゼーションして、ｄｓＲＮＡ分子を形成することを可能にし、ｄｓＲＮＡ分子は、ループ構造を形成する非関連配列を有する。好適なｄｓＲＮＡ分子の設計及び産生は、特に、Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ ｅｔ ａｌ．（１９９８）、Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．（２０００）、ＷＯ９９／３２６１９、ＷＯ９９／５３０５０、ＷＯ９９／４９０２９、ＷＯ０１／３４８１５、ＷＯ１９／０５１５６３、及びＷＯ２０／０２４０１９を考慮すれば、当業者の能力の範囲内に十分ある。
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、遺伝子の発現を特異的に低減するのに特に有用であり、これは、遺伝子がタンパク質をコードする場合、特定のタンパク質の低減された産生をもたらす。理論に束縛されることを望まないが、Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ ｅｔ ａｌ．（１９９８）は、ｄｓＲＮＡ（二本鎖ＲＮＡ）がタンパク質産生を低減するために使用され得る機構のためのモデルを提供している。この技術は、対象の遺伝子のｍＲＮＡ又はその一部分と本質的に同一である配列を含有するｄｓＲＮＡ分子の存在に依存する。好都合には、ｄｓＲＮＡは、組換えベクター又は宿主細胞内の単一プロモーターから産生され得、センス及びアンチセンス配列は、非関連配列に隣接し、非関連配列は、センス及びアンチセンス配列がハイブリダイゼーションして、ｄｓＲＮＡ分子を形成することを可能にし、ｄｓＲＮＡ分子は、ループ構造を形成する非関連配列を有する。好適なｄｓＲＮＡ分子の設計及び産生は、特に、Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ ｅｔ ａｌ．（１９９８）、Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．（２０００）、ＷＯ９９／３２６１９、ＷＯ９９／５３０５０、ＷＯ９９／４９０２９、ＷＯ０１／３４８１５、ＷＯ１９／０５１５６３、及びＷＯ２０／０２４０１９を考慮すれば、当業者の能力の範囲内に十分ある。
【0308】
一例では、本明細書で定義されるポリペプチド、好ましくは、ｍｔＳＳＢ－１若しくはｍｔＳＳＢ－１ａポリペプチド、ＴＷＩＮＫＬＥポリペプチド、又はＲＥＣＡ３ポリペプチドのうちの１つ以上をコードする遺伝子とホモロジーを有する少なくとも部分的に二本鎖ＲＮＡ産物の合成を指示するＤＮＡが導入される。したがって、ＤＮＡは、センス及びアンチセンス配列の両方を含み、センス及びアンチセンス配列の両方は、ＲＮＡ内に転写されたときに、ハイブリダイゼーションして、二本鎖ＲＮＡ領域を形成することができる。本発明の一実施形態では、センス及びアンチセンス配列は、スペーサー領域によって分離されており、スペーサー領域は、イントロンを含み、イントロンは、ＲＮＡ内に転写されたときに、スプライシング除去される。この編成は、遺伝子サイレンシングのより高い効率をもたらすことが示されている（Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，２０００）。二本鎖領域は、１つ又は２つのＤＮＡ領域のいずれかから転写された１つ又は２つのＲＮＡ分子を含み得る。二本鎖分子の存在は、内在性系からの応答をトリガーし、内在性系は、標的遺伝子からの二本鎖ＲＮＡ及び相同ＲＮＡ転写物の両方を破壊して、標的遺伝子の活性を効率的に低減又は排除すると考えられる。
【0309】
ハイブリダイゼーションするセンス及びアンチセンス配列の長さは各々、少なくとも１９個の連続したヌクレオチド、好ましくは、少なくとも３０個、少なくとも３２個、少なくとも４０個、又は少なくとも５０個の連続したヌクレオチド、より好ましくは、少なくとも１００個又は少なくとも２００個の連続したヌクレオチドであるべきである。概して、標的遺伝子ｍＲＮＡの領域に対応する１００個～１０００個のヌクレオチドの配列が使用される。遺伝子転写物全体に対応する完全長配列が使用され得る。標的転写物とのセンス配列の同一性の程度（したがって、同様に、標的転写物の補体とのアンチセンス配列の同一性）は、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は９５～１００％であるべきであり、好ましくは、標的配列と同一である。もちろん、ＲＮＡ分子は、分子を安定化するように機能し得る非関連配列を含んでもよい。ＲＮＡ分子は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ又はＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターの制御下で発現され得る。後者の例としては、ｔＲＮＡ又はｓｎＲＮＡプロモーターが挙げられる。
【0310】
好ましい低分子干渉ＲＮＡ（「ｓｉＲＮＡ」）分子は、標的ｍＲＮＡの約１９個～２５個の連続したヌクレオチドと同一であるヌクレオチド配列を含む。好ましくは、ｓｉＲＮＡ配列は、ジヌクレオチドＡＡで開始し、約３０～７０％（好ましくは、３０～６０％、より好ましくは、４０～６０％、より好ましくは、約４５％～５５％）のＧＣ含有量を含み、例えば、標準的なＢＬＡＳＴ検索によって判定された場合、これが導入される生物のゲノム内の標的以外のいずれかのヌクレオチド配列との高い百分率同一性を有しない。
【0311】
一実施形態では、ｄｓＲＮＡは、ＷＯ２０１９／０５１５６３に記載されているように、「ｌｅｄＲＮＡ」構造を含み、かつ／又はＷＯ２０２０／０２４０１９に記載されているように、Ｇ：Ｕ塩基対を含む。
【0312】
本発明に有用なｄｓＲＮＡは、通例の手順を使用して容易に産生され得る。
【0313】
マイクロＲＮＡ
（ｍｉＲＮＡと略される）マイクロＲＮＡは、非コードＲＮＡ分子であり、非コードＲＮＡ分子は、概して１９個～２５個のヌクレオチド（一般的に、植物内で約２０個～２４個のヌクレオチド）の長さを有し、これらは、不完全な幹ループ構造を形成するより大きい前駆体に由来する。ｍｉＲＮＡは、典型的には、発現が低減される標的ｍＲＮＡの領域に完全に相補的であるが、完全に相補的である必要はない。
（ｍｉＲＮＡと略される）マイクロＲＮＡは、非コードＲＮＡ分子であり、非コードＲＮＡ分子は、概して１９個～２５個のヌクレオチド（一般的に、植物内で約２０個～２４個のヌクレオチド）の長さを有し、これらは、不完全な幹ループ構造を形成するより大きい前駆体に由来する。ｍｉＲＮＡは、典型的には、発現が低減される標的ｍＲＮＡの領域に完全に相補的であるが、完全に相補的である必要はない。
【0314】
ｍｉＲＮＡは、標的メッセンジャーＲＮＡ転写物（ｍＲＮＡ）内の相補的配列に結合し、これは、通常、翻訳抑制又は標的分解及び遺伝子サイレンシングをもたらす。人工ｍｉＲＮＡ（ａｍｉＲＮＡ）は、当該技術分野で周知のように、対象のいずれかの遺伝子の発現を低減するための自然ｍｉＲＮＡに基づいて設計され得る。
【0315】
植物細胞内で、ｍｉＲＮＡ前駆体分子は、主に核内でプロセシングされると考えられる。（１つ以上の局所二本鎖又は「ヘアピン」領域と、ｍＲＮＡの通常の５’「キャップ」及びポリアデニル化テールと、を含有する）ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡは、短いｍｉＲＮＡ前駆体分子にプロセシングされ、短いｍｉＲＮＡ前駆体分子はまた、ステムループ又はフォールドバック構造を含み、「ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ」と称される。植物内で、ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡは、異なるＤＩＣＥＲ様（ＤＣＬ）酵素によって切断され、ｍｉＲＮＡ：ｍｉＲＮＡ＊二本鎖が得られる。核からの輸送前に、これらの二本鎖は、メチル化される。
【0316】
細胞質内で、ｍｉＲＮＡ：ｍｉＲＮＡ二本鎖からのｍｉＲＮＡ鎖は、標的認識のための活性ＲＮＡ誘導性サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）内に選択的に組み込まれる。ＲＩＳＣ複合体は、配列特異的遺伝子抑制を発揮する特定のサブセットのＡｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質を含有する（例えば、Ｍｉｌｌａｒ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ，２００５、Ｐａｓｑｕｉｎｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．，２００５、Ａｌｍｅｉｄａ ａｎｄ Ａｌｌｓｈｉｒｅ，２００５を参照されたい）。
【0317】
本発明に有用なマイクロＲＮＡは、通例の手順を使用して容易に産生され得る。例えば、ＯｓｍｔＳＳＢ－１ａ ａｍｉＲＮＡ（人工マイクロＲＮＡ）構築物の設計は、Ｆａｈｉｍ ｅｔ ａｌ．（２０１２）に記載されている一般的な方法に基づき得る。ＷＭＤ３ソフトウェア（ｗｗｗ．ｗｍｄ３．ｗｅｉｇｅｌｗｏｒｌｄ．ｏｒｇ／）が、ＯｓｍｔＳＳＢ－１ａ遺伝子内の好適なａｍｉＲＮＡ標的を同定するために使用され得る。ａｍｉＲＮＡ標的は、以下の４つの基準：１）５’末端においてＡＴに富み、３’末端においてＧＣに富む配列を使用することによる相対５’不安定性、２）１位におけるＵ及び切断部位におけるＡ（１０位と１１位との間）、３）それぞれ１～９位及び１３～２１位における最大１つ及び４つのミスマッチ、並びに４）ａｍｉＲＮＡが標的ＲＮＡにハイブリダイゼーションするときに、－３０ｋｃａｌ ｍｏｌ－１未満の予測自由エネルギー（ΔＧ）を有すること（Ｏｓｓｏｗｓｋｉ ｅｔ．ａｌ．，２００８）に従って選択される。発現の遺伝子特異的低減のために、候補ａｍｉＲＮＡ配列は、ＯｓＯｓｍｔＳＳＢ－１ａの全ての相同体のアライメントの際に最も低いホモロジーを示す領域内で選択され、したがって、ＯｓｍｔＳＳＢ－１ａ相同体及びホメオログの発現のオフターゲット低減についての潜在性を低減する。米ｍｉＲ３９５の前駆体（Ｇｕｄｄｅｔｉ ｅｔ ａｌ．，２００５、Ｊｏｎｅｓ－Ｒｈｏａｄｅｓ ａｎｄ Ｂａｒｔｅｌ，２００４、Ｋａｗａｓｈｉｍａ ｅｔ ａｌ．，２００９）が、ａｍｉＲＮＡ配列の挿入のためのａｍｉＲＮＡ骨格として選択され得る。例えば、構築物を設計及び作製するために、ｍｉＲ３９５内の５つの内在性ｍｉＲＮＡ標的は、ｍｔＳＳＢ、ＴＷＩＮＫＬＥ、又はＲＥＣＡ３ノックダウンのための５つのａｍｉＲＮＡ標的によって置き換えられる。
【0318】
共抑制
遺伝子は、ゲノム内に既に存在する関連内在性遺伝子及び／又はトランスジーンの発現を抑制することができ、これは、ホモロジー依存性遺伝子サイレンシングと称される現象である。ホモロジー依存性遺伝子サイレンシングの事例のほとんどは、２つのクラスに分類され、２つのクラスは、トランスジーンの転写のレベルで機能するもの、及び転写後に動作するものである。
遺伝子は、ゲノム内に既に存在する関連内在性遺伝子及び／又はトランスジーンの発現を抑制することができ、これは、ホモロジー依存性遺伝子サイレンシングと称される現象である。ホモロジー依存性遺伝子サイレンシングの事例のほとんどは、２つのクラスに分類され、２つのクラスは、トランスジーンの転写のレベルで機能するもの、及び転写後に動作するものである。
【0319】
転写後ホモロジー依存性遺伝子サイレンシング（すなわち、共抑制）は、トランスジェニック植物内のトランスジーン及び関連内在性又はウイルス遺伝子の発現の喪失を記述する。トランスジーン転写物が豊富であり、概して、トランスジーン転写物がｍＲＮＡプロセシング、局在化、及び／又は分解のレベルでトリガーされると考えられるときに、共抑制は、しばしば発生するが、必ずしもそうではない。どのように共抑制が機能するかを説明するためのＳｅｖｅｒａ１モデルが存在する（Ｔａｙｌｏｒ，１９９７を参照されたい）。
【0320】
共抑制は、遺伝子又はその断片の余分なコピーを、コピーの発現のためのプロモーターに対してセンス配向で植物内に導入することを含む。センス断片のサイズ、標的遺伝子領域とのセンス断片の一致、及び標的遺伝子とのセンス断片の配列同一性の程度は、当業者によって判定され得る。いくつかの事例では、遺伝子配列の追加のコピーは、標的植物遺伝子の発現に干渉する。共抑制手法を実施する方法について、ＷＯ９７／２０９３６及びＥＰ０４６５５７２を参照されたい。
【0321】
アンチセンスポリヌクレオチド
「アンチセンスポリヌクレオチド」という用語は、内在性ポリペプチドをコードする特定のｍＲＮＡ分子の少なくとも一部分に相補的であり、ｍＲＮＡ翻訳などの転写後事象に干渉することが可能であるＤＮＡ又はＲＮＡ分子を意味すると解釈される。アンチセンス方法の使用は、当該技術分野で周知である（例えば、Ｇ．Ｈａｒｔｍａｎｎ ａｎｄ Ｓ．Ｅｎｄｒｅｓ，Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ，Ｋｌｕｗｅｒ（１９９９）を参照されたい）。植物におけるアンチセンス技法の使用は、Ｂｏｕｒｑｕｅ（１９９５）及びＳｅｎｉｏｒ（１９９８）によって概略されている。Ｂｏｕｒｑｕｅ（１９９５）は、どのようにアンチセンス配列が遺伝子不活性化の方法として植物系内で使用されてきたかの多数の例を列挙している。Ｂｏｕｒｑｕｅはまた、部分的な阻害が、系の測定可能な変化をもたらす可能性がより高いため、任意の酵素活性の１００％阻害を達成することは必要でないことがあると述べている。Ｓｅｎｉｏｒ（１９９８）は、アンチセンス法が現在、遺伝子発現を操作するための非常に確立された技法であると述べている。
「アンチセンスポリヌクレオチド」という用語は、内在性ポリペプチドをコードする特定のｍＲＮＡ分子の少なくとも一部分に相補的であり、ｍＲＮＡ翻訳などの転写後事象に干渉することが可能であるＤＮＡ又はＲＮＡ分子を意味すると解釈される。アンチセンス方法の使用は、当該技術分野で周知である（例えば、Ｇ．Ｈａｒｔｍａｎｎ ａｎｄ Ｓ．Ｅｎｄｒｅｓ，Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ，Ｋｌｕｗｅｒ（１９９９）を参照されたい）。植物におけるアンチセンス技法の使用は、Ｂｏｕｒｑｕｅ（１９９５）及びＳｅｎｉｏｒ（１９９８）によって概略されている。Ｂｏｕｒｑｕｅ（１９９５）は、どのようにアンチセンス配列が遺伝子不活性化の方法として植物系内で使用されてきたかの多数の例を列挙している。Ｂｏｕｒｑｕｅはまた、部分的な阻害が、系の測定可能な変化をもたらす可能性がより高いため、任意の酵素活性の１００％阻害を達成することは必要でないことがあると述べている。Ｓｅｎｉｏｒ（１９９８）は、アンチセンス法が現在、遺伝子発現を操作するための非常に確立された技法であると述べている。
【0322】
一実施形態では、アンチセンスポリヌクレオチドは、生理学的条件下でハイブリダイゼーションする、すなわち、（完全に又は部分的に一本鎖である）アンチセンスポリヌクレオチドは、少なくとも、二本鎖ポリヌクレオチドを、内在性ｍｔＳＳＢ、ＴＷＩＮＫＬＥ、又はＲＥＣＡ３ポリペプチドをコードするｍＲＮＡで、通常の条件下で、細胞内に形成することが可能である。
【0323】
アンチセンス分子は、構造遺伝子に対応する配列を含んでもよく、又は遺伝子発現若しくはスプライシング事象の制御をもたらす配列のために含んでもよい。例えば、アンチセンス配列は、内在性遺伝子の標的コード領域、若しくは５’非翻訳領域（ＵＴＲ）、若しくは３’－ＵＴＲ、又はこれらの組み合わせに対応し得る。アンチセンス配列は、転写中又は転写後にスプライシング除去され得るイントロン配列に部分的に相補的であり得、好ましくは、標的遺伝子のエクソン配列のみに相補的であり得る。ＵＴＲの概してより大きい分岐を鑑みて、これらの領域を標的にすることは、遺伝子阻害のより大きい特異性を提供する。
【0324】
アンチセンス配列の長さは、少なくとも１９個の連続したヌクレオチド、好ましくは、少なくとも３０個又は少なくとも５０個のヌクレオチド、より好ましくは、少なくとも１００個、２００個、５００個、又は１０００個のヌクレオチドであるべきである。遺伝子転写物全体に相補的な完全長配列が使用され得る。長さは、最も好ましくは、１００個～２０００個のヌクレオチドである。標的転写物とのアンチセンス配列の同一性の程度は、少なくとも９０％、より好ましくは、９５～１００％、典型的には、１００％同一であるべきである。もちろん、アンチセンスＲＮＡ分子は、分子を安定化するように機能し得る非関連配列を含んでもよい。
【0325】
核酸構築物
本発明は、本発明のポリヌクレオチド又は本発明に有用なポリヌクレオチドを含む核酸構築物、並びにこれらを含有するベクター及び宿主細胞、それらの産生及び使用の方法、並びにそれらの使用を含む。
本発明は、本発明のポリヌクレオチド又は本発明に有用なポリヌクレオチドを含む核酸構築物、並びにこれらを含有するベクター及び宿主細胞、それらの産生及び使用の方法、並びにそれらの使用を含む。
【0326】
本発明は、動作可能に接続又は連結されたエレメントに言及する。「動作可能に接続された」又は「動作可能に連結された」などとは、機能的関係におけるポリヌクレオチドエレメントの結合を指す。典型的には、動作可能に接続された核酸配列は、連続して連結されており、２つのタンパク質コード領域を結合する必要がある場合、連続しており、読み取りフレーム内にある。ＲＮＡポリメラーゼが、２つのコード配列を単一ＲＮＡ内に転写するときに、コード配列は、別のコード配列に「動作可能に接続されており」、ＲＮＡは、翻訳された場合、次いで、両方のコード配列に由来するアミノ酸を有する単一ポリペプチド内に翻訳される。コード配列は、発現された配列が最終的にプロセシングされて所望のタンパク質を産生する限り、互いに連続している必要はない。
【0327】
本明細書で使用される場合、「シス作用配列」、「シス作用エレメント」、又は「シス調節領域」若しくは「調節領域」という用語あるいは同様の用語は、発現可能な遺伝子配列に対して適切に配置され接続されたときに、遺伝子配列の発現を少なくとも部分的に調節することが可能である、ヌクレオチドのいずれかの配列を意味すると解釈される。当業者は、シス調節領域が、転写又は転写後レベルでの遺伝子配列の発現及び／又は細胞型特異性及び／又は発達特異性のレベルを活性化、サイレンシング、増強、抑制、又はそうでなければ変更することが可能であり得ることを認識している。本発明の好ましい実施形態では、シス作用配列は、発現可能な遺伝子配列の発現を増強又は刺激する活性化因子配列である。
【0328】
プロモーター又はエンハンサーエレメントを転写可能なポリヌクレオチドに「動作可能に接続する」とは、転写可能なポリヌクレオチド（例えば、タンパク質コードポリヌクレオチド又は他の転写物）をプロモーターの調節制御下に置き、次いで、プロモーターが、このポリヌクレオチドの転写を制御することを意味する。異種プロモーター／構造遺伝子組み合わせの構築において、概して、プロモーター又はそのバリアントを、転写可能なポリヌクレオチドの転写開始部位からある距離をおいて配置し、この距離は、このプロモーターと、プロモーターが自然状況で制御するタンパク質コード領域、すなわち、プロモーターが由来する遺伝子との間の距離とほぼ同じであることが好ましい。当該技術分野で既知であるように、この距離のある変動は、機能の喪失なく許容され得る。同様に、調節配列エレメント（例えば、オペレータ、エンハンサーなど）の制御下に置かれる転写可能なポリヌクレオチドに対する調節配列エレメントの好ましい配置は、エレメントの自然状況でのエレメントの配置、すなわち、エレメントが由来する遺伝子の配置によって定義される。
【0329】
本明細書で使用される場合、「プロモーター」又は「プロモーター配列」とは、対象の細胞内の転写の開始及びレベルを制御する、遺伝子の領域、概して、ＲＮＡコード領域の上流（５’）を指す。「プロモーター」は、ＴＡＴＡボックス及びＣＣＡＡＴボックス配列などの古典的ゲノム遺伝子の転写調節配列、並びに発達及び／若しくは環境刺激に応答して又は組織特異的若しくは細胞型特異的な様式で遺伝子発現を変更する追加の調節エレメント（すなわち、上流活性化配列、エンハンサー、及びサイレンサー）を含む。プロモーターは、通常、プロモーターが発現を調節する構造遺伝子の上流に配置されているが、必ずしもそうではない（例えば、いくつかのＰｏｌＩＩＩプロモーター）。更に、プロモーターを含む調節エレメントは、通常、遺伝子の転写の開始部位の２ｋｂ以内に配置されている。プロモーターは、追加の特異的調節エレメントを含有し得、追加の特異的調節エレメントは、開始部位により遠位に位置して、細胞内の発現を更に増強し、かつ／又は追加の特異的調節エレメントが動作可能に接続された構造遺伝子の発現のタイミング又は誘導性を変更する。
【0330】
「構成的プロモーター」とは、植物などの生物の多く又は全ての組織内の動作可能に連結された転写配列の発現を指示するプロモーターを指す。本明細書で使用される場合、構成的という用語は、遺伝子が全ての細胞型内で同じレベルで発現されることを必ずしも示さないが、レベルのある変動がしばしば検出可能であるが、遺伝子が広範囲の細胞型内で発現されることを示す。本明細書で使用される場合、「選択的発現」とは、例えば、植物の、ほぼ排他的に特定の器官、例えば、胚乳、胚、葉、果実、塊茎、又は根内の発現を指す。好ましい実施形態では、プロモーターは、米植物などの穀類植物の穀粒内で選択的又は優先的に発現される。したがって、選択的発現は、植物が経験する条件の大部分又は全ての下での植物の多く又は全ての組織内の発現を指す構成的発現と対照的であり得る。
【0331】
選択的発現はまた、特定の植物組織内の、器官内の、又は発達段階における遺伝子発現の産物の区画化をもたらし得る。プラスチド、サイトゾル、液胞、又はアポプラスト空間などの特定の細胞内位置における区画化は、必要とされる細胞区画への輸送に適切なシグナル、例えば、シグナルペプチドを遺伝子産物の構造内に含めることによって達成されてもよく、又は半自律性オルガネラ（プラスチド及びミトコンドリア）の場合、適切な調節配列を有するトランスジーンをオルガネラゲノム内に直接組み込むことによって達成されてもよい。
【0332】
「組織特異的プロモーター」又は「器官特異的プロモーター」は、例えば、植物内の、多くの他の組織又は器官に対して、好ましくは、全ての他の組織又は器官ではなくてもほとんどの他の組織又は器官に対して、１つの組織又は器官内で優先的に発現されるプロモーターである。典型的には、プロモーターは、特定の組織又は器官内で、他の組織又は器官内でよりも１０倍高いレベルで発現される。
【0333】
好適であり、当該技術分野で周知の穀類内の種子特異的発現をもたらすプロモーターを含む、本発明のための種子特異的プロモーター。好適である顕著なプロモーターは、オオムギＬＰＴ２若しくはＬＰＴ１遺伝子プロモーター（ＷＯ９５／１５３８９及びＷＯ９５／２３２３０）、又はＷＯ９９／１６８９０に記載されているプロモーター（オオムギホルデイン遺伝子からのプロモーター）である。他のプロモーターは、Ｂｒｏｕｎ ｅｔ ａｌ．（１９９８）、Ｐｏｔｅｎｚａ ｅｔ ａｌ．（２００４）、ＵＳ２００７／０１９２９０２、及びＵＳ２００３／０１５９１７３によって記載されているものを含む。一実施形態では、種子特異的プロモーターは、種子の定義される部分、例えば、胚乳、好ましくは、発達中のアリューロン内で優先的に発現される。更なる実施形態では、種子特異的プロモーターは、種子発芽後に発現されない又は低レベルでのみ発現される。
【0334】
一実施形態では、プロモーターは、少なくとも開花時と開花後３０日目との間の時点で活性である又はこの期間全体中に活性である。このようなプロモーターの例は、ＯｓｍｔＳＳＢ－１ａ遺伝子プロモーター、ＴＷＩＮＫＬＥプロモーター、ＲＥＣＡ３プロモーター、又はＴＡ２プロモーターである（ＷＯ２０１７／０８３９２０）。
【0335】
本発明によって企図されるプロモーターは、形質転換される宿主植物の原産であってもよく、又は領域が宿主植物内で機能的である代替の供給源に由来してもよい。単子葉植物内で機能的である多数のプロモーターは、当該技術分野で周知である、プロモーター活性を評価するための非限定的な方法は、Ｍｅｄｂｅｒｒｙ ｅｔ ａｌ．（１９９２及び１９９３）、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（１９８９、上記）、及びＵＳ５，１６４，３１６によって開示されている。
【0336】
代替として又は加えて、プロモーターは、誘導性プロモーター又は発達的に調節されたプロモーターであり得、誘導性プロモーター又は発達的に調節されたプロモーターは、導入されたポリヌクレオチドの発現を、穀類植物の適切な発達段階において駆動することが可能である。使用され得る他のシス作用配列は、転写及び／又は翻訳エンハンサーを含む。エンハンサー領域は、当業者に周知であり、ＡＴＧ翻訳開始コドン及び隣接配列を含むことができる。含まれている場合、開始コドンは、配列全体が翻訳される場合には、配列全体の翻訳を確実にするために、異質又は外来性ポリヌクレオチドに関連するコード配列の読み取りフレームと一致すべきである。翻訳開始領域は、転写開始領域の供給源から、又は異質若しくは外来性ポリヌクレオチドから提供され得る。配列はまた、転写を駆動するために選択されたプロモーターの供給源に由来し得、ｍＲＮＡの翻訳を増加させるように特異的に改変され得る。
【0337】
本発明の核酸構築物は、転写終結配列を含み得る約５０個～１，０００個のヌクレオチド塩基対の３’非翻訳配列を含み得る。３’非翻訳配列は、転写終結シグナルを含有し得、転写終結シグナルは、ポリアデニル化シグナル及びｍＲＮＡプロセシングをもたらすことが可能であるいずれかの他の調節シグナルを含み得るか、又は含まない場合がある。ポリアデニル化シグナルは、ｍＲＮＡ前駆体の３’末端へのポリアデニル酸路の付加のために機能する。ポリアデニル化シグナルは、基準の形態５’ＡＡＴＡＡＡ－３’とのホモロジーの存在によって一般的に認識されるが、変動は珍しくない。好適な３’非翻訳配列の例は、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓのオクトピンシンターゼ（ｏｃｓ）遺伝子又はノパリンシンターゼ（ｎｏｓ）遺伝子からのポリアデニル化シグナルを含有する３’転写非翻訳領域である（Ｂｅｖａｎ ｅｔ ａｌ．，１９８３）。好適な３’非翻訳配列はまた、リブロース－１，５－ビスホスフェートカルボキシラーゼ（ｓｓＲＵＢＩＳＣＯ）遺伝子などの植物遺伝子に由来してもよいが、当業者に既知の他の３’エレメントもまた、使用されてもよい。
【0338】
転写開始部位とコード配列の開始との間に挿入されたＤＮＡ配列、すなわち、非翻訳５’リーダー配列（５’ＵＴＲ）が翻訳及び転写される場合、５’ＵＴＲは、遺伝子発現に影響し得るため、特定のリーダー配列もまた、使用され得る。好適なリーダー配列は、異質又は内在性ＤＮＡ配列の最適な発現を指示するように選択される配列を含むものを含む。例えば、このようなリーダー配列は、好ましいコンセンサス配列を含み、コンセンサス配列は、例えば、Ｊｏｓｈｉ（１９８７）によって記載されているように、ｍＲＮＡ安定性を増加又は維持することができ、翻訳の不適切な開始を防止することができる。
【0339】
ベクター
本発明は、遺伝子構築物の操作又は転移のためのベクターの使用を含む。「キメラベクター」とは、例えば、プラスミド又は植物ウイルスに由来する核酸分子であって、プラスミド又は植物ウイルス内に挿入又はクローニングされ得る、核酸分子、好ましくは、ＤＮＡ分子を意味する。ベクターは、好ましくは、二本鎖ＤＮＡであり、１つ以上の固有の制限部位を含有し、標的細胞若しくは組織又はその前駆細胞若しくは組織を含む定義される宿主細胞内での自律複製が可能であってもよく、あるいはクローニングされた配列が再現可能であるように、定義される宿主のゲノム内への組み込みが可能であってもよい。したがって、ベクターは、自律複製ベクター、すなわち、染色体外実体として存在するベクターであり得、ベクターの複製は、染色体複製、例えば、線状又は閉環状プラスミド、染色体外エレメント、ミニ染色体、又は人工染色体とは独立している。ベクターは、自己複製を確実にするためのいずれかの手段を含有し得る。代替として、ベクターは、細胞内に導入されたときに、レシピエント細胞のゲノム内に組み込まれるベクターであって、ベクターが組み込まれた染色体と一緒に複製される、ベクターであり得る。ベクター系は、宿主細胞のゲノム内に導入される全ＤＮＡを一緒に含有する、単一ベクター若しくはプラスミド、２つ以上のベクター若しくはプラスミド、又はトランスポゾンを含み得る。ベクターの選択は、典型的には、ベクターが導入される細胞とのベクターの適合性に依存する。ベクターはまた、選択マーカー、例えば、抗生物質耐性遺伝子、除草剤耐性遺伝子、又は好適な形質転換体の選択のために使用され得る他の遺伝子を含み得る。このような遺伝子の例は、当業者に周知である。
本発明は、遺伝子構築物の操作又は転移のためのベクターの使用を含む。「キメラベクター」とは、例えば、プラスミド又は植物ウイルスに由来する核酸分子であって、プラスミド又は植物ウイルス内に挿入又はクローニングされ得る、核酸分子、好ましくは、ＤＮＡ分子を意味する。ベクターは、好ましくは、二本鎖ＤＮＡであり、１つ以上の固有の制限部位を含有し、標的細胞若しくは組織又はその前駆細胞若しくは組織を含む定義される宿主細胞内での自律複製が可能であってもよく、あるいはクローニングされた配列が再現可能であるように、定義される宿主のゲノム内への組み込みが可能であってもよい。したがって、ベクターは、自律複製ベクター、すなわち、染色体外実体として存在するベクターであり得、ベクターの複製は、染色体複製、例えば、線状又は閉環状プラスミド、染色体外エレメント、ミニ染色体、又は人工染色体とは独立している。ベクターは、自己複製を確実にするためのいずれかの手段を含有し得る。代替として、ベクターは、細胞内に導入されたときに、レシピエント細胞のゲノム内に組み込まれるベクターであって、ベクターが組み込まれた染色体と一緒に複製される、ベクターであり得る。ベクター系は、宿主細胞のゲノム内に導入される全ＤＮＡを一緒に含有する、単一ベクター若しくはプラスミド、２つ以上のベクター若しくはプラスミド、又はトランスポゾンを含み得る。ベクターの選択は、典型的には、ベクターが導入される細胞とのベクターの適合性に依存する。ベクターはまた、選択マーカー、例えば、抗生物質耐性遺伝子、除草剤耐性遺伝子、又は好適な形質転換体の選択のために使用され得る他の遺伝子を含み得る。このような遺伝子の例は、当業者に周知である。
【0340】
本発明の核酸構築物は、プラスミドなどのベクター内に導入され得る。プラスミドベクターは、典型的には、原核及び真核細胞内の発現カセットの容易な選択、増幅、及び形質転換を提供する追加の核酸配列を含み、例えば、ｐＵＣ由来ベクター、ｐＳＫ由来ベクター、ｐＧＥＭ由来ベクター、ｐＳＰ由来ベクター、ｐＢＳ由来ベクター、又は１つ以上のＴ－ＤＮＡ領域を含有するバイナリベクターを含む。追加の核酸配列は、ベクターの自律複製を提供するための複製起点、選択可能なマーカー遺伝子、好ましくは、抗生物質又は除草剤耐性をコードする選択可能マーカー遺伝子、核酸構築物内でコードされた核酸配列又は遺伝子を挿入するための複数の部位を提供する固有の複数のクローニング部位、並びに原核及び真核細胞（特に植物）細胞の形質転換を増強する配列を含む。
【0341】
「マーカー遺伝子」とは、異なる表現型を、マーカー遺伝子を発現する細胞に付与し、したがって、このような形質転換された細胞が、マーカーを有しない細胞と区別されることを可能にする遺伝子を意味する。選択可能マーカー遺伝子は、選択剤（例えば、除草剤、抗生物質、放射線、熱、又は未形質転換細胞を損傷する他の処理）に対する耐性に基づく「選択」を可能にする形質を付与する。スクリーニング可能マーカー遺伝子（又はレポーター遺伝子）は、観察又は試験による、すなわち、「スクリーニング」（例えば、β－グルクロニダーゼ、ルシフェラーゼ、ＧＦＰ、又は未形質転換細胞内に存在しない他の酵素活性）による同定を可能にする形質を付与する。マーカー遺伝子及び対象のヌクレオチド配列は、連結されている必要はない。
【0342】
形質転換体の同定を容易にするために、核酸構築物は、望ましくは、異質若しくは外来性ポリヌクレオチドとして又はこれに加えて、選択可能又はスクリーニング可能マーカー遺伝子を含む。マーカーが、選択の植物細胞と組み合わせて機能的（すなわち、選択的）である限り、マーカーの実際の選択は重要ではない。例えば、ＵＳ４，３９９，２１６に記載されているように、非連結遺伝子の共形質転換もまた、植物形質転換における効率的なプロセスであるため、マーカー遺伝子及び対象の異質又は外来性ポリヌクレオチドは、連結されている必要はない。
【0343】
細菌選択可能マーカーの例は、アンピシリン、エリスロマイシン、クロラムフェニコール、又はテトラサイクリン耐性、好ましくは、カナマイシン耐性などの抗生物質耐性を付与するマーカーである。植物形質転換体の選択のための例示的な選択可能マーカーは、ヒグロマイシンＢ耐性をコードするｈｙｇ遺伝子、カナマイシン、パロモマイシン、Ｇ４１８に対する耐性を付与するネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｐｔＩＩ）遺伝子、例えば、ＥＰ２５６２２３に記載されているように、グルタチオン由来除草剤に対する耐性を付与するラット肝臓からのグルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ遺伝子、例えば、ＷＯ８７／０５３２７に記載されているように、過剰発現の際に、ホスフィノトリシンなどのグルタミンシンターゼ阻害剤に対する耐性を付与するグルタミンシンターゼ遺伝子、例えば、ＥＰ２７５９５７に記載されているように、選択剤ホスフィノトリシンに対する耐性を付与するＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓからのアセチルトランスフェラーゼ遺伝子、例えば、Ｈｉｎｃｈｅｅ ｅｔ ａｌ．（１９８８）によって記載されているように、Ｎ－ホスホノメチルグリシンに対する耐性を付与する５－エノールピルビルシキミ酸－３－リン酸シンターゼ（ＥＰＳＰＳ）をコードする遺伝子、例えば、ＷＯ９１／０２０７１に記載されているように、ビアラホスに対する耐性を付与するｂａｒ遺伝子、ブロモキシニルに対する耐性を付与するＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｚａｅｎａｅからのｂｘｎなどのニトリラーゼ遺伝子（Ｓｔａｌｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８８）、メトトレキサートに対する耐性を付与するジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子（Ｔｈｉｌｌｅｔ ｅｔ ａｌ．，１９８８）、イミダゾリノン、スルホニルウレア、若しくは他のＡＬＳ阻害化学物質に対する耐性を付与する変異型アセト乳酸シンターゼ遺伝子（ＡＬＳ）（ＥＰ１５４，２０４）、５－メチルトリプトファンに対する耐性を付与する変異型アントラニル酸シンターゼ遺伝子、又は除草剤に対する耐性を付与するダラポンデハロゲナーゼ遺伝子を含むが、これらに限定されない。
【0344】
好ましいスクリーニング可能マーカーは、様々な発色基質が既知であるβ－グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）酵素をコードするｕｉｄＡ遺伝子、発色基質が既知である酵素をコードするβ－ガラクトシダーゼ遺伝子、カルシウム感受性生物発光検出において使用され得るエクオリン遺伝子（Ｐｒａｓｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８５）、緑色蛍光タンパク質遺伝子（Ｎｉｅｄｚ ｅｔ ａｌ．，１９９５）又はその誘導体、生物発光検出を可能にするルシフェラーゼ（ｌｕｃ）遺伝子（Ｏｗ ｅｔ ａｌ．，１９８６）、及び当該技術分野で既知の他のものを含むが、これらに限定されない。本明細書で使用される場合、「レポーター分子」とは、分子の化学的性質によって、解析的に同定可能なシグナルを提供する分子であって、解析的に同定可能なシグナルが、タンパク質産物への参照によるプロモーター活性の判定を容易にする、分子を意味する。
【0345】
好ましくは、核酸構築物は、ゲノム内に、例えば、本発明の植物又は細胞のゲノム内に安定して組み込まれる。したがって、核酸は、分子がゲノム内に組み込まれることを可能にする適切なエレメントを含むか、又は構築物は、植物細胞の染色体内に組み込まれ得る適切なベクター内に置かれる。
【0346】
本発明の一実施形態は、組換えベクターを含み、組換えベクターは、本発明の少なくとも１つのポリヌクレオチド分子を含み、本発明の少なくとも１つのポリヌクレオチド分子は、核酸分子を宿主細胞内に送達することが可能であるいずれかのベクター内に挿入される。このようなベクターは、異種核酸配列、すなわち、本発明の核酸分子に隣接して自然に見出されず、好ましくは、核酸分子が由来する種以外の種に由来する核酸配列を含有する。ベクターは、ＲＮＡ又はＤＮＡのいずれか、原核細胞又は真核細胞のいずれかであることができ、典型的には、ウイルス又はプラスミドである。
【0347】
植物細胞の安定したトランスフェクションに好適な、又はトランスジェニック植物の確立に好適な多数のベクターは、例えば、Ｐｏｕｗｅｌｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，１９８５，上記１９８７、Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ ａｎｄ Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９８９、及びＧｅｌｖｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｋｌｕｗｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，１９９０に記載されている。典型的に、植物発現ベクターは、例えば、５’及び３’調節配列の転写制御下の１つ以上のクローニングされた植物遺伝子、並びに顕性選択可能マーカーを含む。このような植物発現ベクターはまた、プロモーター調節領域（例えば、誘導性若しくは構成的発現、環境的若しくは発達的に調節された発現、又は細胞若しくは組織特異的発現を制御する調節領域）、転写開始部位、リボソーム結合部位、ＲＮＡプロセシングシグナル、転写終結部位、及び／又はポリアデニル化シグナルを含有することができる。
【0348】
ｍｔＳＳＢ、ＴＷＩＮＫＬＥ、又はＲＥＣＡ３ポリペプチドのレベルは、穀類植物内のタンパク質をコードする遺伝子の発現のレベルを減少することによって変えられ得、これは、増加したアリューロン厚さをもたらす。遺伝子の発現レベルは、１細胞当たりのコピー数を変更することによって、例えば、コード配列と、コード配列に動作可能に接続されており、細胞内で機能的である転写制御エレメントと、を含む、合成遺伝子構築物を導入することによって、変えられ得る。複数の形質転換体が、トランスジーン組み込み部位の近傍における内在性配列の影響から生じるトランスジーン発現の好ましいレベル及び／又は特異性を有するものについて選択及びスクリーニングされ得る。トランスジーン発現の好ましいレベル及びパターンは、増加したアリューロン厚さをもたらすものである。代替として、変異誘発種子の集団又は育種プログラムからの植物の集団が、増加したアリューロン厚さを有する個別の系統についてスクリーニングされ得る。
【0349】
組換え細胞
本発明の別の実施形態は、組換え細胞を含み、組換え細胞は、変異型内在性遺伝子、例えば、遺伝子編集によって改変された遺伝子、又は本発明の１つ以上の組換え分子で形質転換された宿主細胞若しくはその子孫細胞を含む。遺伝子編集を含む様々なタイプの変異誘発は、上記のものであり、組換え細胞を産生するために使用され得る。細胞内への核酸分子の形質転換は、核酸分子が細胞内に挿入され得るいずれかの方法によって達成され得る。形質転換技法は、トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポフェクション、吸着、及びプロトプラスト融合を含むが、これらに限定されない。組換え細胞は、依然として単細胞であってもよく、又は組織、器官、若しくは多細胞生物、例えば、トランスジェニック植物に成長してもよい。本発明の形質転換核酸分子は、依然として染色体外であってもよく、又は形質転換核酸分子の発現される能力が保持される様式で、形質転換細胞の染色体内の１つ以上の部位内に組み込まれてもよい。好ましい宿主細胞は、植物細胞、より好ましくは、穀物粒細胞である。
本発明の別の実施形態は、組換え細胞を含み、組換え細胞は、変異型内在性遺伝子、例えば、遺伝子編集によって改変された遺伝子、又は本発明の１つ以上の組換え分子で形質転換された宿主細胞若しくはその子孫細胞を含む。遺伝子編集を含む様々なタイプの変異誘発は、上記のものであり、組換え細胞を産生するために使用され得る。細胞内への核酸分子の形質転換は、核酸分子が細胞内に挿入され得るいずれかの方法によって達成され得る。形質転換技法は、トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポフェクション、吸着、及びプロトプラスト融合を含むが、これらに限定されない。組換え細胞は、依然として単細胞であってもよく、又は組織、器官、若しくは多細胞生物、例えば、トランスジェニック植物に成長してもよい。本発明の形質転換核酸分子は、依然として染色体外であってもよく、又は形質転換核酸分子の発現される能力が保持される様式で、形質転換細胞の染色体内の１つ以上の部位内に組み込まれてもよい。好ましい宿主細胞は、植物細胞、より好ましくは、穀物粒細胞である。
【0350】
遺伝的変動を有する植物
本明細書で名詞として使用される場合、「植物」という用語は、植物全体を指し、植物界のいずれかのメンバーを指すが、形容詞として使用される場合、植物内に存在する、又は植物から得られる、又は植物に由来する、又は植物に関連するいずれかの物質、例えば、植物器官（例えば、葉、茎、根、花）、単一細胞（例えば、花粉）、種子、及び植物細胞などを指す。根及び苗条が出芽した小植物及び発芽した種子もまた、「植物」の意味に含まれる。本明細書で使用される場合、「植物部分」という用語は、植物から得られ植物のゲノムＤＮＡを含む１つ以上の植物組織又は器官を指す。植物部分は、植生構造（例えば、葉、茎）、根、花器官／構造、（胚、子葉、及び種皮を含む）種子、植物組織（例えば、維管束組織、及び基本組織など）、細胞及びその子孫を含む。本明細書で使用される場合、「植物細胞」という用語は、植物から得られる又は植物内の細胞を指し、植物に由来するプロトプラスト又は他の細胞、配偶子産生細胞、及び全植物に再生する細胞を含む。植物細胞は、培養物内の細胞、すなわち、インビトロの細胞であり得る。「植物組織」とは、植物内の又は植物から得られる分化組織（「外植体」）、又は未成熟若しくは成熟胚に由来する未分化組織、種子、根、苗条、果実、塊茎、花粉、及びカルスなどの、培養物内の植物細胞の様々な形態の集合を意味する。種子内の又は種子からの例示的な植物組織は、子葉、胚及び胚軸、又は胚盤、胚乳、若しくはアリューロンである。したがって、本発明は、植物及び植物部分、並びにこれらを含む製品を含む。
本明細書で名詞として使用される場合、「植物」という用語は、植物全体を指し、植物界のいずれかのメンバーを指すが、形容詞として使用される場合、植物内に存在する、又は植物から得られる、又は植物に由来する、又は植物に関連するいずれかの物質、例えば、植物器官（例えば、葉、茎、根、花）、単一細胞（例えば、花粉）、種子、及び植物細胞などを指す。根及び苗条が出芽した小植物及び発芽した種子もまた、「植物」の意味に含まれる。本明細書で使用される場合、「植物部分」という用語は、植物から得られ植物のゲノムＤＮＡを含む１つ以上の植物組織又は器官を指す。植物部分は、植生構造（例えば、葉、茎）、根、花器官／構造、（胚、子葉、及び種皮を含む）種子、植物組織（例えば、維管束組織、及び基本組織など）、細胞及びその子孫を含む。本明細書で使用される場合、「植物細胞」という用語は、植物から得られる又は植物内の細胞を指し、植物に由来するプロトプラスト又は他の細胞、配偶子産生細胞、及び全植物に再生する細胞を含む。植物細胞は、培養物内の細胞、すなわち、インビトロの細胞であり得る。「植物組織」とは、植物内の又は植物から得られる分化組織（「外植体」）、又は未成熟若しくは成熟胚に由来する未分化組織、種子、根、苗条、果実、塊茎、花粉、及びカルスなどの、培養物内の植物細胞の様々な形態の集合を意味する。種子内の又は種子からの例示的な植物組織は、子葉、胚及び胚軸、又は胚盤、胚乳、若しくはアリューロンである。したがって、本発明は、植物及び植物部分、並びにこれらを含む製品を含む。
【0351】
「穀粒」及び「種子」という用語は、互換的に本明細書で使用される。「穀粒」とは、文脈に従って、植物内の成熟穀粒、植物内の発達中の種子、収穫された穀粒を指してもよく、あるいは例えば、製粉若しくは精白などの加工後の穀粒であって、穀粒のほとんどが無傷のままである、加工後の穀粒、又は吸水若しくは発芽後の穀粒を指してもよい。成熟穀粒は、一般的に、約１８～２０重量％未満、典型的には、約８～１２重量％の含水量を有する。一実施形態では、発達中の本発明の穀粒は、少なくとも受粉後（ＤＡＰ）約１０日目である。一実施形態では、発達中の本発明の種子は、受粉時と受粉後３０日目との間の種子であり、この種子は、植物内に含まれてもよく、又は切除されてもよい。
【0352】
本明細書で使用される場合、「トランスジェニック植物」とは、本明細書で定義されるように、１つ以上の遺伝的変動を有する植物であって、同じ種、変種、又は品種の野生型植物内に見出されない１つ以上の外来性ポリヌクレオチドを含有する植物を指す。すなわち、トランスジェニック植物（形質転換植物）は、トランスジェニック植物が形質転換前に含有しなかった遺伝物質（トランスジーン）を含有する。トランスジーンは、植物細胞若しくは別の植物細胞若しくは非植物供給源から得られる若しくはこれに由来する遺伝子配列、又は合成配列を含み得る。典型的には、トランスジーンは、ヒト操作によって、例えば、形質転換などによって植物内に導入されているが、当業者が認識するように、任意の方法が使用され得る。トランスジーンは、好ましくは、植物の核ゲノム内に安定して組み込まれている。トランスジーンは、同じ種内で自然発生するが、再編成された順序で、又はエレメント、例えば、アンチセンス配列の異なる編成で発生する配列を含み得る。このような配列を含有する植物は、「トランスジェニック植物」に本明細書で含まれる。
【0353】
「非トランスジェニック植物」は、組換えＤＮＡ技法による遺伝物質の導入によって遺伝子改変されていない植物である。
【0354】
本明細書で使用される場合、「野生型」とは、本発明により改変されていない細胞、ポリペプチド、遺伝子、組織、穀粒、又は植物を指す。野生型細胞、組織、又は植物は、内在性遺伝子の発現のレベル、本発明のポリペプチド又は他のポリペプチドの量、外来性核酸、又は形質改変の程度及び性質、特に、アリューロン厚さの表現型を、本明細書に記載されるように改変された細胞、組織、穀粒、又は植物と比較するために、対照として使用され得る。
【0355】
本明細書で使用される場合、「対応する野生型」穀類植物又は穀粒という用語又は同様の語句は、本発明の穀類植物又は穀粒の遺伝子型の少なくとも７５％、より好ましくは、少なくとも９５％、より好ましくは、少なくとも９７％、より好ましくは、少なくとも９９％、更により好ましくは、９９．５％を含むが、各々が植物若しくは穀粒内のポリペプチドの活性を低減する（導入された変異などの）遺伝的変動及び／又は肥厚アリューロンを含まない穀類植物又は穀粒を指す。好ましい実施形態では、本発明の穀物粒又は植物は、１つ以上の（導入された変異などの）遺伝的変動を除いて、野生型穀物粒又は植物対して同質遺伝子穀粒又は植物である。好ましくは、対応する野生型植物又は穀粒は、本発明の植物／穀粒の前駆体と同じ品種若しくは変種のもの若しくはこれからのもの、又は１つ以上の遺伝子改変を欠きかつ／若しくは肥厚アリューロンを有しない、しばしば「分離体」と称される同胞植物系統のもの若しくはこれからのものである。一実施形態では、本発明の米植物又は穀粒は、野生型米品種Ｚｈｏｎｇｈｕａ １１（ＺＨ１１）の遺伝子型と５０％未満同一である遺伝子型を有する。ＺＨ１１は、１９８６年から市販されている。
【0356】
本発明の文脈で定義されるように、トランスジェニック植物は、本発明により遺伝子改変された穀類植物の子孫を含み、子孫は、遺伝的変動、例えば、対象の変異又はトランスジーンを含む。このような子孫は、一次トランスジェニック植物の自家受精によって、又はこのような植物を別の穀類植物と交雑することによって得られ得る。これは、概して、所望の植物又はその穀粒内の本明細書で定義される少なくとも１つのタンパク質の産生を変えることである。トランスジェニック植物部分は、トランスジーンを含むトランスジェニック植物の全ての部分及び細胞、例えば、培養組織、カルス、及びプロトプラスト、好ましくは、穀粒などを含む。
【0357】
本明細書で使用される場合、「穀類」は、一般的に草と称されるＰｏａｃｅａｅ科のいずれかの植物であって、この植物の穀粒の可食構成要素のために栽培される、植物を指す。したがって、穀類は、単子葉顕花植物の１つの科である。本発明の穀類植物／穀粒の例としては、米、コムギ、オオムギ、ライムギ、トウモロコシ、モロコシ、カラスムギ、及びライコムギが挙げられるが、これらに限定されない。
【0358】
本明細書で使用される場合、「米」という用語は、Ｏｒｙｚａ属の植物の系、変種、又は品種を含むいずれかの植物又はその一部分であって、この植物の穀粒の可食構成要素のために栽培される、植物又はその一部分を指す。米の植物は、Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ種のものであることが好ましい。
【0359】
本明細書で使用される場合、「玄米」とは、ふすま層及び胚（胚芽）を含むが、通常収穫中に除去された外皮を含まない米の全穀粒を意味する。すなわち、玄米は、アリューロン及び胚を除去するために精白されていない。「茶色」は、ふすま層内の茶色又は黄褐色の色素の存在を指す。玄米は、全穀粒と考えられる。本明細書で使用される場合、「白米」（精白米）とは、ふすま及び胚芽が除去された米穀粒、すなわち、本質的に、全米穀粒の残りのデンプン性胚乳を意味する。米穀粒のこれらのクラスの両方は、短、中、又は長穀粒の形態になり得る。白米と比較して、玄米は、タンパク質、ミネラル、及びビタミンのより高い含有量、並びに玄米のタンパク質含有量中のより高いリジン含有量を有する。
【0360】
本明細書で使用される場合、「コムギ」という用語は、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ属の植物の系、変種、又は品種を含むいずれかの植物又はその一部分であって、この植物の穀粒の可食構成要素のために栽培される、植物又はその一部分を指し、これは、その前駆体、及び他の種との交雑によって産生されるその子孫を含む。コムギは、４２個の染色体から構成されたＡＡＢＢＤＤのゲノム構成を有する「六倍体コムギ」、及び２８個の染色体から構成されたＡＡＢＢのゲノム構成を有する「四倍体コムギ」を含む。六倍体コムギは、Ｔ．ａｅｓｔｉｖｕｍ、Ｔ．ｓｐｅｌｔａ、Ｔ．ｍａｃｈａ、Ｔ．ｃｏｍｐａｃｔｕｍ、Ｔ．ｓｐｈａｅｒｏｃｏｃｃｕｍ、Ｔ．ｖａｖｉｌｏｖｉｉ、及びそれらの種間交雑を含む。六倍体コムギの好ましい種は、（「パンコムギ」とも称される）Ｔ．ａｅｓｔｉｖｕｍ、亜種ａｅｓｔｉｖｕｍである。四倍体コムギは、（デュラムコムギ又はＴｒｉｔｉｃｕｍ ｔｕｒｇｉｄｕｍ、亜種ｄｕｒｕｍとも本明細書で称される）Ｔ．ｄｕｒｕｍ、Ｔ．ｄｉｃｏｃｃｏｉｄｅｓ、Ｔ．ｄｉｃｏｃｃｕｍ、Ｔ．ｐｏｌｏｎｉｃｕｍ、及びそれらの種間交雑を含む。加えて、「コムギ」という用語は、六倍体又は四倍体Ｔｒｉｔｉｃｕｍ種の潜在的な前駆体、例えば、ＡゲノムについてのＴ．ｕａｒｔｕ、Ｔ．ｍｏｎｏｃｏｃｃｕｍ、又はＴ．ｂｏｅｏｔｉｃｕｍ、ＢゲノムについてのＡｅｇｉｌｏｐｓ ｓｐｅｌｔｏｉｄｅｓ、及びＤゲノムについての（Ａｅｇｉｌｏｐｓ ｓｑｕａｒｒｏｓａ又はＡｅｇｉｌｏｐｓ ｔａｕｓｃｈｉｉとしても既知の）Ｔ．ｔａｕｓｃｈｉｉを含む。特に好ましい前駆体は、Ａゲノムのものであり、更により好ましくは、Ａゲノム前駆体は、Ｔ．ｍｏｎｏｃｏｃｃｕｍである。本発明における使用のためのコムギ品種は、上記で列挙される種のうちのいずれかに属し得るが、これらに限定されない。また、従来の技法によって、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ種を親として（ライムギ［Ｓｅｃａｌｅ ｃｅｒｅａｌｅ］などの）非Ｔｒｉｔｉｃｕｍ種との性交雑において使用して産生される植物が包含され、これは、Ｔｒｉｔｉｃａｌｅを含むが、これに限定されない。
【0361】
本明細書で使用される場合、「オオムギ」という用語は、Ｈｏｒｄｅｕｍ属の植物の系、変種、又は品種を含むいずれかの植物又はその一部分であって、この植物の穀粒の可食構成要素のために栽培される、植物又はその一部分を指し、これは、その前駆体、及び他の種との交雑によって産生されるその子孫を含む。植物は、Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ種のものであることが好ましい。
【0362】
本明細書で使用される場合、「着色された」は、非定型色を含む穀粒を指す。例としては、黒米、赤米、赤コムギ、紫米、紫オオムギ、及び紫トウモロコシが挙げられる。黒米及び赤米の各々は、色素、特に、アントシアニジン及びアントシアニンをアリューロン層内に含有する。着色された米は、着色されていない米よりも高いリボフラビン含有量を有するが、同様のチアミン含有量を有する。「黒米」は、アントシアニンの濃度に起因して、黒色又はほぼ黒色のふすま層を有し、調理の際に深い紫色になり得る。（「紫黒米」としても既知の）「紫米」は、黒米の短穀粒バリアントであり、ここで定義されるように、黒米に含まれる。紫米は、調理されていない状態で紫色であり、調理されたときに深い紫色である。「赤米」は、ふすまに赤色／くり色を与える様々なアントシアニンを含有し、これらのアントシアニンは、シアニジン－３－グルコシド（クリサンテミン）及びペオニジン－３－グルコシド（オキシコシシ－アニン（ｏｘｙｃｏｃｃｉｃｙ－ａｎｉｎ）））を含む。
【0363】
これらのタイプの穀物粒の各々は、発芽を防止するように処理され得、例えば、調理（煮沸）によって又は乾燥加熱（焙煎）によって処理され得る。例えば、玄米及び着色された米は、典型的には、所望の食感に依存して、１０～４０分間調理され、白米は、典型的には、１２～１８分間調理される。調理又は加熱は、穀粒内の抗栄養因子、例えば、トリプシン阻害剤、オリザシスタチン、及びヘムアグルチニン（レクチン）などのレベルを、これらのタンパク質の変性によって低減するが、フィテート含有量のレベルを低減しない。穀物粒はまた、当該技術分野で既知のように、調理前に水中に浸漬されてもよく、又はより長い時間ゆっくり調理されてもよい。穀物粒はまた、割られてもよく、煮沸されてもよく、又は熱安定化されてもよい。穀物粒のこれらの形態の各々は、加工穀粒のクラスに含まれ、加工穀粒は、発芽することができず、生存植物を産生するために使用されることがない。ふすまは、ふすまを安定化するために、例えば、約６分間１００℃で蒸気処理され得る。
【0364】
一実施形態では、本発明の穀粒は、対応する野生型穀物粒と比較して、穀粒成熟の遅延を有する。本発明の植物は、野生型植物に対して低減された結実度（％）を有し得、結実度は、成熟穀粒成長段階において種子によって満たされた、植物内の小花の百分率を計算することを伴う。
【0365】
一実施形態では、本発明の穀粒は、対応する野生型穀物粒と比較して、減少した発芽能を有する。例えば、穀粒は、２８℃で１２時間の明／１２時間の暗サイクル下で湿度制御なしで、グロースチャンバ内で培養されたときに、対応する野生型穀物粒の発芽能の約５０％を有する。本明細書で使用される場合、「発芽」という用語は、小根が種皮を通って可視的に出芽したときとして定義される。
【0366】
一実施形態では、本発明の植物は、配列番号３として提供されるアミノ酸の配列を有するＯｓｍｔＳＳＢ－１ａポリペプチドを含む同質遺伝子植物などの野生型親変種に対して、通常の植物高さ、稔性（雄及び雌）、種子長さ、種子幅、及び種子厚さのうちの１つ以上又は全てを有する。一実施形態では、本発明の穀粒は、野生型親変種に対して、通常の植物高さ、稔性（雄及び雌）、種子長さ、種子幅、及び種子厚さのうちの１つ以上又は全てを有する穀類植物を産生することが可能である。本明細書で使用される場合、「通常」という用語は、本発明の植物と同じ条件下で成長した野生型親変種内の同じ形質を測定することによって判定され得る。一実施形態では、通常であるために、本発明の植物は、野生型親変種と比較して、定義される特徴のレベル／数などの＋／－２０％、より好ましくは、＋／－１０％、より好ましくは、＋／－５％、更により好ましくは、＋／－２．５％を有する。
【0367】
本発明の文脈で定義される場合、トランスジェニック植物は、本発明の少なくとも１つのポリペプチドの産生を所望の植物又は植物器官内で引き起こすための組換え技法を使用して遺伝子改変された植物（並びにこの植物の一部分及び細胞）及びこの植物の子孫を含む。トランスジェニック植物は、当該技術分野で既知の技法、例えば、Ａ．Ｓｌａｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ－Ｔｈｅ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｌａｎｔｓ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（２００３）、及びＰ．Ｃｈｒｉｓｔｏｕ ａｎｄ Ｈ．Ｋｌｅｅ，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ（２００４）に概略的に記載されている技法などを使用して産生され得る。
【0368】
好ましい実施形態では、本発明の植物は、導入された遺伝的変動、遺伝子、若しくは核酸構築物（トランスジーン）、又は変異の各々全てについてホモ接合性であり、このため、本発明の植物の子孫は、所望の表現型について分離しない。トランスジェニック植物はまた、例えば、ハイブリッド種子から成長したＦ１子孫などにおいて、導入された遺伝的変動、遺伝子、又は核酸構築物についてヘテロ接合性であり得る。このような植物は、当該技術分野で周知の、雑種強勢などの利点を提供し得る。
【0369】
一実施形態では、本発明の植物を選択する方法は、植物からのＤＮＡ試料を、少なくとも１つの「他の遺伝子マーカー」について解析することを更に含む。本明細書で使用される場合、「他の遺伝子マーカー」は、植物の所望の形質に連結されたいずれかの分子であり得る。このようなマーカーは、当業者に周知であり、形質、このような耐病性、収量、植物形態、穀粒質、休眠形質、穀粒色、種子内のジベレリン酸含有量、植物高さ、及び粉色などを決定する遺伝子に連結された分子マーカーを含む。このような遺伝子の例は、Ｒｈｔ遺伝子であり、Ｒｈｔ遺伝子は、半矮性成長習性、したがって、耐倒伏性を決定する。
【0370】
細胞内への遺伝子の直接送達のための以下の４つの一般的な方法：（１）化学的方法（Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，１９７３）、（２）物理的方法、例えば、マイクロインジェクション（Ｃａｐｅｃｃｈｉ，１９８０）、エレクトロポレーション（例えば、ＷＯ８７／０６６１４、ＵＳ５，４７２，８６９、５，３８４，２５３、ＷＯ９２／０９６９６、及びＷＯ９３／２１３３５を参照されたい）、及び遺伝子銃（例えば、ＵＳ４，９４５，０５０及びＵＳ５，１４１，１３１を参照されたい）、（３）ウイルスベクター（Ｃｌａｐｐ．１９９３、Ｌｕ ｅｔ ａｌ．，１９９３、Ｅｇｌｉｔｉｓ ｅｔ ａｌ．，１９８８）、並びに（４）受容体媒介機構（Ｃｕｒｉｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９２、Ｗａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９２）が記載されている。
【0371】
使用され得る加速方法は、例えば、マイクロプロジェクタイル衝撃などを含む。核酸分子を植物細胞に送達する形質転換するための方法の一例は、マイクロプロジェクタイル衝撃である。この方法は、Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．．Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ．Ｏｘｆｏｒｄ Ｐｒｅｓｓ．Ｏｘｆｏｒｄ．Ｅｎｇｌａｎｄ（１９９４）によって概説されている。核酸でコーティングされ得、推進力によって細胞内に送達され得る非生物学的粒子（マイクロプロジェクタイル）。例示的な粒子としては、タングステン、金、及び白金などから構成された粒子が挙げられる。マイクロプロジェクタイル衝撃は、単子葉植物を再現可能に形質転換する有効な手段であることに加えて、マイクロプロジェクタイル衝撃の利点は、特に、プロトプラストの単離もＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ感染の感受性も必要とされないことである。本発明での使用に好適な粒子送達システムは、ヘリウム加速ＰＤＳ－１０００／Ｈｅ銃であるＢｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手可能である。衝撃のために、未成熟胚又は未成熟胚に由来する標的細胞、例えば、胚盤若しくはカルスが、固体培地上に配置され得る。
【0372】
別の代替の実施形態では、プラスチドが、安定して形質転換され得る。高等植物内のプラスチド形質転換について開示されている方法は、選択可能マーカーを含有するＤＮＡの粒子銃送達、及び相同組換えによるプラスチドゲノムへのＤＮＡの標的化を含む（ＵＳ５，４５１，５１３、ＵＳ５，５４５，８１８、ＵＳ５，８７７，４０２、ＵＳ５，９３２４７９、及びＷＯ９９／０５２６５）。
【0373】
Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介転移は、ＤＮＡが全植物組織内に導入され得、それによって、プロトプラストからの無傷の植物の再生の必要性をバイパスするため、遺伝子を植物細胞内に導入するための広く適用可能なシステムである。ＤＮＡを植物細胞内に導入するための、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介植物組み込みベクターの使用は、当該技術分野で周知である（例えば、ＵＳ５，１７７，０１０、ＵＳ５，１０４，３１０、ＵＳ５，００４，８６３、ＵＳ５，１５９，１３５を参照されたい）。更に、Ｔ－ＤＮＡの組み込みは、少ない再編成をもたらす比較的正確なプロセスである。転移されるＤＮＡの領域は、境界配列によって定義され、介在ＤＮＡは、通常、植物ゲノム内に挿入される。
【0374】
Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ形質転換法を使用して形成されるトランスジェニック植物は、典型的には、単一遺伝子座を１つの染色体上に含有する。このようなトランスジェニック植物は、付加遺伝子についてヘミ接合性であると称され得る。付加構造遺伝子についてホモ接合性であるトランスジェニック植物、すなわち、２つの付加遺伝子を含有し、１つの遺伝子を染色体対の各々の染色体上の同じ遺伝子座において含有するトランスジェニック植物がより好ましい。ホモ接合性トランスジェニック植物は、単一付加遺伝子を含有する独立した分離個体トランスジェニック植物を性交雑（自家受粉）することと、産生された種子の一部分を発芽させることと、得られた植物を対象の遺伝子について解析することとによって得られ得る。
【0375】
細胞形質転換の他の方法もまた、使用されてもよく、花粉内への直接ＤＮＡ転移によって、植物の生殖器官内へのＤＮＡの直接注入によって、又は未成熟胚の細胞内へのＤＮＡの直接注入、続いて、乾燥した胚の再水和によって、ＤＮＡを植物内に導入することを含むが、これらに限定されない。
【0376】
単一植物プロトプラスト形質転換体からの又は様々な形質転換された外植体からの植物の再生、発達、及び栽培は、当該技術分野で周知である（Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，（１９８８））。この再生及び成長プロセスは、典型的には、形質転換された細胞の選択のステップ、これらの個別化された細胞を、胚発達の通常の段階にわたって、根付いた小植物段階にわたって培養するステップを含む。トランスジェニック胚及び種子は、同様に再生される。したがって、得られた根付いたトランスジェニック苗条は、その後、土壌などの適切な植物成長培地に植えられる。
【0377】
異質外来性遺伝子を含有する植物の発達又は再生は、当該技術分野で周知である。好ましくは、再生された植物は、自家受粉されて、ホモ接合性トランスジェニック植物を提供する。そうでなければ、再生された植物から得られた花粉が、農業的に重要な系統の採種栽培植物と交雑される。逆に、これらの重要な系統の植物からの花粉は、再生された植物を受粉するために使用される。所望の外来性核酸を含有する本発明のトランスジェニック植物は、当業者に周知の方法を使用して栽培される。
【0378】
トランスジェニック細胞及び植物内のトランスジーンの存在を確認するために、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅又はサザンブロット解析が、当業者に既知の方法を使用して実行され得る。トランスジーンの発現産物は、産物の性質に依存して、様々な方法のうちのいずれかで検出され得、ウエスタンブロット及び酵素アッセイを含む。タンパク質発現を定量化し、異なる植物組織内の複製を検出するための特に有用な１つの方法は、ＧＵＳなどのレポーター遺伝子を使用することである。トランスジェニック植物が得られた際に、トランスジェニック植物は、成長させて、所望の表現型を有する植物組織又は部分を産生し得る。植物組織又は植物部分は、収穫され得、かつ／又は種子は、収集され得る。種子は、所望の特徴を有する組織又は部分を有する追加の植物を成長させるための供給源として機能し得る。
【0379】
マーカー支援選択
マーカー支援選択は、古典的な育種プログラムにおいて反復親と戻し交雑するときに必要とされるヘテロ接合性植物を選択する、十分認識された方法である。各々の戻し交雑世代における植物の集団は、戻し交雑集団において１：１の比で通常存在する対象の遺伝子についてヘテロ接合性であり、分子マーカーが、遺伝子の２つのアレルを区別するために使用され得る。ＤＮＡを、例えば、若い苗条から抽出することと、特定のマーカーで、遺伝子移入された望ましい形質について試験することとによって、エネルギー及び資源がより少ない植物に集中しつつ、更なる戻し交雑のための植物の早期選択がなされる。戻し交雑プログラムを更に迅速化するために、未成熟種子（開花後２５日目）からの胚は、完全種子成熟を可能にするのではなく、切除され、滅菌条件下で栄養培地上で成長させてもよい。３つの葉の段階におけるＤＮＡ抽出、及びｍｔＳＳＢ、ＴＷＩＮＫＬＥ、又はＲＥＣＡ３活性を変更し、増加したアリューロン厚さを植物に付与する少なくとも１つの遺伝的変動の解析と組み合わせて使用される、「胚レスキュー」と称されるこのプロセスは、所望の形質を保有する植物の迅速な選択を可能にし、植物は、反復親との後続の更なる戻し交雑のために、温室又は圃場で成熟まで養育され得る。
マーカー支援選択は、古典的な育種プログラムにおいて反復親と戻し交雑するときに必要とされるヘテロ接合性植物を選択する、十分認識された方法である。各々の戻し交雑世代における植物の集団は、戻し交雑集団において１：１の比で通常存在する対象の遺伝子についてヘテロ接合性であり、分子マーカーが、遺伝子の２つのアレルを区別するために使用され得る。ＤＮＡを、例えば、若い苗条から抽出することと、特定のマーカーで、遺伝子移入された望ましい形質について試験することとによって、エネルギー及び資源がより少ない植物に集中しつつ、更なる戻し交雑のための植物の早期選択がなされる。戻し交雑プログラムを更に迅速化するために、未成熟種子（開花後２５日目）からの胚は、完全種子成熟を可能にするのではなく、切除され、滅菌条件下で栄養培地上で成長させてもよい。３つの葉の段階におけるＤＮＡ抽出、及びｍｔＳＳＢ、ＴＷＩＮＫＬＥ、又はＲＥＣＡ３活性を変更し、増加したアリューロン厚さを植物に付与する少なくとも１つの遺伝的変動の解析と組み合わせて使用される、「胚レスキュー」と称されるこのプロセスは、所望の形質を保有する植物の迅速な選択を可能にし、植物は、反復親との後続の更なる戻し交雑のために、温室又は圃場で成熟まで養育され得る。
【0380】
当該技術分野で既知のいずれか分子生物学的技法を、本発明の方法において使用し得る。このような方法は、核酸増幅、核酸シークエンシング、好適に標識されたプローブでの核酸ハイブリダイゼーション、一本鎖高次構造解析（ＳＳＣＡ）、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動法（ＤＧＧＥ）、ヘテロ二本鎖解析（ＨＥＴ）、化学的切断解析（ＣＣＭ）、触媒核酸切断、又はこれらの組み合わせの使用を含むが、これらに限定されない（例えば、Ｌｅｍｉｅｕｘ，２０００、Ｌａｎｇｒｉｄｇｅ ｅｔ ａｌ．，２００１を参照されたい）。本発明はまた、（例えば）ｍｔＳＳＢ、ＴＷＩＮＫＬＥ、又はＲＥＣＡ３遺伝子のアレルに連結された多型を検出するための分子マーカー技法の使用であって、ｍｔＳＳＢ、ＴＷＩＮＫＬＥ、又はＲＥＣＡ３遺伝子が、それぞれ、ｍｔＳＳＢ、ＴＷＩＮＫＬＥ、又はＲＥＣＡ３活性を変更し、増加したアリューロン厚さを植物に付与する、使用を含む。このような方法は、制限断片長多型（ＲＦＬＰ）、ＲＡＰＤ、増幅断片長多型（ＡＦＬＰ）、及びマイクロサテライト（単純配列反復、ＳＳＲ）多型の検出又は解析を含む。密接に連結されたマーカーは、当該技術分野で周知の方法によって、例えば、Ｌａｎｇｒｉｄｇｅ ｅｔ ａｌ．（２００１）によって概説されているバルク分離個体解析などによって容易に得られ得る。
【0381】
一実施形態では、マーカー支援選択のための連結された遺伝子座は、本発明のポリペプチドをコードする遺伝子から少なくとも１ｃＭ、又は０．５ｃＭ、又は０．１ｃＭ、又は０．０１ｃＭ以内である。
【0382】
「ポリメラーゼ連鎖反応」（「ＰＣＲ」）は、複製コピーが、「上流」及び「下流」プライマーからなる「プライマーの対」又は「プライマーのセット」と、重合の触媒、例えば、ＤＮＡポリメラーゼ、及び典型的には、熱安定性ポリメラーゼ酵素と、を使用して、標的ポリヌクレオチドから作製される、反応である。ＰＣＲのための方法は、当該技術分野で既知であり、例えば、「ＰＣＲ」（Ｍ．Ｊ．ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ ａｎｄ Ｓ．Ｇ Ｍｏｌｌｅｒ（ｅｄｉｔｏｒｓ），ＢＩＯＳ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ Ｌｔｄ，Ｏｘｆｏｒｄ，（２０００））で教示されている。ＰＣＲは、増加したアリューロン厚さを植物にｍｔＳＳＢ、ＴＷＩＮＫＬＥ、又はＲＥＣＡ３遺伝子又はアレルを発現する植物細胞から単離されたｍＲＮＡを逆転写することから得られたｃＤＮＡ上で実行され得る。しかしながら、ＰＣＲが、植物から単離されたゲノムＤＮＡ上で実行される場合、ＰＣＲは、概して、より容易である。
【0383】
プライマーは、配列特異的な様式で標的配列にハイブリダイゼーションしＰＣＲ中に伸長することが可能であるオリゴヌクレオチド配列である。アンプリコン若しくはＰＣＲ産物、又はＰＣＲ断片若しくは増幅産物は、プライマー及び新たに合成された標的配列コピーを含む伸長産物である。マルチプレックスＰＣＲシステムは、プライマーの複数のセットを含有し、プライマーの複数のセットは、２つ以上のアンプリコンの同時産生をもたらす。プライマーは、標的配列に完全にマッチしてもよく、又はプライマーは、特定の標的配列内への制限酵素又は触媒核酸認識／切断部位の導入をもたらし得る内部ミスマッチ塩基を含有してもよい。プライマーはまた、アンプリコンの捕捉又は検出を容易にするために、追加の配列を含有し得、かつ／又は改変若しくは標識ヌクレオチドを含有し得る。ＤＮＡの熱変性、プライマーの相補的配列へのプライマーのアニーリング、及びポリメラーゼでのアニールされたプライマーの伸長の反復サイクルは、標的配列の指数関数的増幅をもたらす。標的又は標的配列又はテンプレートという用語は、増幅された核酸配列を指す。
【0384】
ヌクレオチド配列の直接シークエンシングのための方法は、当業者に周知であり、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，（上記）及びＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，（上記）で見出され得る。シークエンシングは、任意の好適な方法、例えば、ジデオキシシークエンシング、化学シークエンシング、又はそれらの変形によって実施され得る。直接シークエンシングは、特定の配列のいずれかの塩基対内の変動を判定する利点を有する。
【0385】
穀粒加工
肥厚アリューロンに起因して、本発明の穀物粒、並びにそれからの粉及びふすまは、改善された栄養含有量を有する。単離されたアリューロン組織は、低レベルのデンプン及び果皮を含有すべきであり、ヒトの栄養のために穀粒の生理学的に有益な物質の大部分を表す。例えば、本発明の穀粒及び／又はそれからの産生される粉は、対応する野生型穀物粒及び／又はそれからの産生される粉と比較して、各々重量基準で、以下：
ｉ）より高い脂肪含有量、例えば、野生型よりも、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、若しくは少なくとも約３０％、又は約３０％高く、最大約５０％まで高い脂肪含有量、
ｉｉ）より高い灰含有量、例えば、野生型よりも、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、若しくは少なくとも約２０％、又は約２０％高く、最大約２５％まで高い灰含有量、
ｉｉｉ）より高い繊維含有量、例えば、野生型よりも、総繊維が少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、若しくは少なくとも約９４％、又は約９４％高く、最大約１５０％まで高い繊維含有量、
ｉｖ）より低いデンプン含有量、例えば、対応する野生型穀物粒のデンプン含有量に対して、約１重量％～約１０重量％低減されたデンプン含有量、
ｖ）より高いミネラル含有量、例えば、野生型よりも、約少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、又は少なくとも約２５％高く、最大約４０％まで高いミネラル含有量であって、好ましくは、ミネラル含有量が、亜鉛（例えば、野生型よりも、少なくとも約１０％又は少なくとも約１５％高く、最大約３０％まで高い）、鉄（例えば、野生型よりも、少なくとも約２．５％又は少なくとも約５％高く、最大約１０％まで高い）、カリウム（例えば、野生型よりも、少なくとも約２０％又は少なくとも約２５％高く、最大約４０％まで高い）、マグネシウム（例えば、野生型よりも、少なくとも約１８％又は少なくとも約２３％高く、最大約４０％まで高い）、リン（例えば、野生型よりも、少なくとも約１７％又は少なくとも約２２％高く、最大約４０％まで高い）、及び硫黄（例えば、野生型よりも、少なくとも約５％又は少なくとも約１０％高く、最大約２０％まで高い）のうちの１つ以上又は全ての含有量である、より高いミネラル含有量、
ｖｉ）より高い抗酸化物質含有量、例えば、野生型よりも、総フェノール化合物が、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、若しくは少なくとも約３０％多く、かつ／又は抗酸化能が、少なくとも約３５％若しくは少なくとも約４６％多く、最大約６０％まで高い抗酸化物質含有量、
ｖｉｉ）より高いフィテート含有量、例えば、野生型よりも、少なくとも約１０％又は少なくとも約１５％高く、最大約２５％まで高いフィテート含有量、
ｖｉｉｉ）ビタミンＢ３（例えば、少なくとも５％又は少なくとも９％）、Ｂ６（例えば、野生型よりも、少なくとも１００％又は少なくとも１２０％高く、最大約２００％まで高い）、及びＢ９（例えば、野生型よりも、少なくとも５０％又は少なくとも６１％高く、最大約１００％まで高い）のうちの１つ以上又は全てのより高い含有量、
ｉｘ）より高いスクロース含有量、例えば、野生型よりも、少なくとも６０％又は少なくとも７６％高く、最大約１００％まで高いスクロース含有量、
ｘ）より高い中性非デンプン多糖含有量、例えば、野生型よりも、少なくとも約３８％又は少なくとも約４８％高く、最大約８０％まで高い中性非デンプン多糖含有量、
ｘｉ）より高い単糖含有量（例えば、アラビノース、キシロース、ガラクトース、グルコース含有量）、例えば、野生型よりも、少なくとも約４２％又は少なくとも約５９％高く、最大約１００％まで高い単糖含有量、並びに
ｘｉｉ）同様の窒素レベルのうちの１つ以上又は全てを含む。
肥厚アリューロンに起因して、本発明の穀物粒、並びにそれからの粉及びふすまは、改善された栄養含有量を有する。単離されたアリューロン組織は、低レベルのデンプン及び果皮を含有すべきであり、ヒトの栄養のために穀粒の生理学的に有益な物質の大部分を表す。例えば、本発明の穀粒及び／又はそれからの産生される粉は、対応する野生型穀物粒及び／又はそれからの産生される粉と比較して、各々重量基準で、以下：
ｉ）より高い脂肪含有量、例えば、野生型よりも、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、若しくは少なくとも約３０％、又は約３０％高く、最大約５０％まで高い脂肪含有量、
ｉｉ）より高い灰含有量、例えば、野生型よりも、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、若しくは少なくとも約２０％、又は約２０％高く、最大約２５％まで高い灰含有量、
ｉｉｉ）より高い繊維含有量、例えば、野生型よりも、総繊維が少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、若しくは少なくとも約９４％、又は約９４％高く、最大約１５０％まで高い繊維含有量、
ｉｖ）より低いデンプン含有量、例えば、対応する野生型穀物粒のデンプン含有量に対して、約１重量％～約１０重量％低減されたデンプン含有量、
ｖ）より高いミネラル含有量、例えば、野生型よりも、約少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、又は少なくとも約２５％高く、最大約４０％まで高いミネラル含有量であって、好ましくは、ミネラル含有量が、亜鉛（例えば、野生型よりも、少なくとも約１０％又は少なくとも約１５％高く、最大約３０％まで高い）、鉄（例えば、野生型よりも、少なくとも約２．５％又は少なくとも約５％高く、最大約１０％まで高い）、カリウム（例えば、野生型よりも、少なくとも約２０％又は少なくとも約２５％高く、最大約４０％まで高い）、マグネシウム（例えば、野生型よりも、少なくとも約１８％又は少なくとも約２３％高く、最大約４０％まで高い）、リン（例えば、野生型よりも、少なくとも約１７％又は少なくとも約２２％高く、最大約４０％まで高い）、及び硫黄（例えば、野生型よりも、少なくとも約５％又は少なくとも約１０％高く、最大約２０％まで高い）のうちの１つ以上又は全ての含有量である、より高いミネラル含有量、
ｖｉ）より高い抗酸化物質含有量、例えば、野生型よりも、総フェノール化合物が、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、若しくは少なくとも約３０％多く、かつ／又は抗酸化能が、少なくとも約３５％若しくは少なくとも約４６％多く、最大約６０％まで高い抗酸化物質含有量、
ｖｉｉ）より高いフィテート含有量、例えば、野生型よりも、少なくとも約１０％又は少なくとも約１５％高く、最大約２５％まで高いフィテート含有量、
ｖｉｉｉ）ビタミンＢ３（例えば、少なくとも５％又は少なくとも９％）、Ｂ６（例えば、野生型よりも、少なくとも１００％又は少なくとも１２０％高く、最大約２００％まで高い）、及びＢ９（例えば、野生型よりも、少なくとも５０％又は少なくとも６１％高く、最大約１００％まで高い）のうちの１つ以上又は全てのより高い含有量、
ｉｘ）より高いスクロース含有量、例えば、野生型よりも、少なくとも６０％又は少なくとも７６％高く、最大約１００％まで高いスクロース含有量、
ｘ）より高い中性非デンプン多糖含有量、例えば、野生型よりも、少なくとも約３８％又は少なくとも約４８％高く、最大約８０％まで高い中性非デンプン多糖含有量、
ｘｉ）より高い単糖含有量（例えば、アラビノース、キシロース、ガラクトース、グルコース含有量）、例えば、野生型よりも、少なくとも約４２％又は少なくとも約５９％高く、最大約１００％まで高い単糖含有量、並びに
ｘｉｉ）同様の窒素レベルのうちの１つ以上又は全てを含む。
【0386】
穀粒のこれらの栄養構成要素の各々は、実施例１及び４に概説されるような通例の技法を使用して判定され得る。
【0387】
一実施形態では、穀粒は、対応する野生型穀物粒と比較して、穀粒の総デンプン含有量中のアミロースの増加した割合を含む。このような穀粒を産生する方法は、例えば、ＷＯ２００２／０３７９５５、ＷＯ２００３／０９４６００、ＷＯ２００５／０４０３８１、ＷＯ２００５／００１０９８、ＷＯ２０１１／０１１８３３、及びＷＯ２０１２／１０３５９４に記載されている。
【0388】
一実施形態では、本発明の穀粒は、対応する野生型穀物粒と比較して、穀粒の総脂肪酸含有量中のオレイン酸の増加した割合及び／又はパルミチン酸の減少した割合を含む。このような穀粒を産生する方法は、例えば、ＷＯ２００８／００６１７１及びＷＯ２０１３／１５９１４９に記載されている。
【0389】
更なる実施形態では、本発明の穀粒又は植物は、ＲＯＳ１ａポリペプチドをコードするＲＯＳ１ａ遺伝子と、１つ以上の遺伝的変動と、を更に含み、１つ以上の遺伝的変動は各々、対応する野生型植物と比較して、植物内の少なくとも１つのＲＯＳ１ａ遺伝子の活性を低減する。このような穀粒及び植物は、ＷＯ２０１７／０８３９２０に記載されている。好ましくは、このような穀粒又は植物は、それぞれ、米穀粒又は米植物である。
【0390】
本発明の穀粒／種子、又は本発明の他の植物部分は、当該技術分野で既知のいずれかの技法を使用して、食品成分、食品又は非食品製品を製造するために加工され得る。
【0391】
本明細書で使用される場合、「他の食品又は飲料成分」という用語は、食品又は飲料の一部分として提供されるときに、動物による摂取に好適な任意の物質、好ましくは、ヒトによる摂取に好適な任意の物質を指す。例としては、水を除いて、他の植物種からの穀粒、砂糖などが挙げられるが、これらに限定されない。
【0392】
一実施形態では、製品は、全穀粒粉、例えば、超微細製粉された全穀粒粉、又は穀粒の約１００％から作製される粉などである。全穀粒粉は、精粉構成物（精粉又は精粉）、及び粗分（超微細製粉された粗分）を含む。
【0393】
精粉は、例えば、洗浄された穀粒を粉砕及びふるい分けすることによって調製される粉であり得る。精粉の粒子サイズは、９８％以上が、「２１２マイクロメートル（Ｕ．Ｓ．金網７０）」と指定される織金網の開口よりも大きくない開口を有する布を通過する粉として記載される。粗分は、ふすま及び胚芽のうちの少なくとも１つを含む。例えば、胚芽は、穀粒内に見出される胚植物である。胚芽は、脂質、繊維、ビタミン、タンパク質、ミネラル、及び植物栄養素、例えば、フラボノイドを含む。ふすまは、いくつかの細胞層を含み、有意な量の脂質、繊維、ビタミン、タンパク質、ミネラル、及び植物栄養素、例えば、フラボノイドを有する。更に、粗分は、アリューロン層を含み得、アリューロン層もまた、脂質、繊維、ビタミン、タンパク質、ミネラル、及び植物栄養素、例えば、フラボノイドを含む。アリューロン層は、技術的には胚乳の一部分と考えられるが、ふすまと同じ特徴のうちの多くを示し、したがって、典型的には、製粉プロセス中に、ふすま及び胚芽とともに除去される。アリューロン層は、タンパク質、ビタミン、及び植物栄養素、例えば、フェルラ酸を含有する。
【0394】
更に、粗分は、精粉構成物とブレンドされ得る。粗分は、全穀粒粉を形成するために、精粉構成物と混合され得、したがって、精粉と比較して増加した栄養価、繊維含有量、及び抗酸化能を有する全穀粒粉を提供する。例えば、粗分又は全穀粒粉は、精粉又は全穀粒粉に取って代わる様々な量で、ベイクド食品、スナック製品、及び食品製品において使用され得る。本発明の全穀粒粉（すなわち、超微細製粉された全穀粒粉）はまた、消費者に、消費者の自家製ベイクド製品における使用のために直接市販され得る。例示的な実施形態では、全穀粒粉の顆粒化プロファイルは、全穀粒粉の粒子の９８重量％が、２１２マイクロメートル未満である、顆粒化プロファイルである。
【0395】
更なる実施形態では、全穀粒粉及び／又は粗分のふすま及び胚芽内に見出される酵素は、全穀粒粉及び／又は粗分を安定化するために不活性化される。安定化は、蒸気、熱、放射線、又は他の処理を使用して、ふすま及び胚芽層内に見出される酵素を不活性化するプロセスである。安定化された粉は、粉の調理特徴を保持し、より長い貯蔵寿命を有する。
【0396】
追加の実施形態では、全穀粒粉、粗分、又は精粉は、食品製品の構成要素（成分）であり得、食品製品を製造するために使用され得る。例えば、食品製品は、ベーグル、ビスケット、パン、バンズ、クロワッサン、ダンプリング、イングリッシュマフィン、マフィン、ピタパン、クイックブレッド、冷蔵／冷凍生地製品、生地、ベイクドビーンズ、ブリトー、チリ、タコス、タマレス、トルティーヤ、ポットパイ、準備済みシリアル、準備済み食品、スタッフィング、電子オーブン加熱可能食品、ブラウニー、ケーキ、チーズケーキ、コーヒーケーキ、クッキー、デザート、ペーストリ、スイートロール、キャンディーバー、パイクラスト、パイフィリング、ベビーフード、ベーキングミックス、バッター、ブレッディング、グレービーミックス、肉増量剤、肉代用品、調味料ミックス、スープミックス、グレービー、ルー、サラダドレッシング、スープ、サワークリーム、ヌードル、パスタ、ラーメンヌードル、チャーメンヌードル、ローミーヌードル、アイスクリーム含有物、アイスクリームバー、アイスクリームコーン、アイスクリームサンドイッチ、クラッカー、クルトン、ドーナッツ、エッグロール、押し出しスナック、果物及び穀粒バー、電子オーブン加熱可能スナック製品、栄養バー、パンケーキ、パーベイクドベーカリー製品、プレッツェル、プディング、グラノーラベースの製品、スナックチップ、スナックフード、スナックミックス、ワッフル、ピザクラスト、動物食品又はペットフードであり得る。好ましい食品製品は、調理された米、米かゆ、米ヌードル、及び加工米穀粒を含有するバーであり、好ましい飲料は、米茶である。本明細書の実施例１９を参照されたい。
【0397】
代替の実施形態では、全穀粒粉、精粉、又は粗分は、栄養補助食品の構成要素であり得る。例えば、栄養補助食品は、食事に付加される製品であり得、１つ以上の追加の成分を含有し、典型的には、ビタミン、ミネラル、ハーブ、アミノ酸、酵素、抗酸化物質、ハーブ、スパイス、プロバイオティクス、エキス、プレバイオティクス、及び繊維を含む。本発明の全穀粒粉、精粉、又は粗分は、ビタミン、ミネラル、アミノ酸、酵素、及び繊維を含む。例えば、粗分は、濃縮された量の食物繊維、並びに他の必須栄養素、例えば、保健食に必須であるＢ－ビタミン、セレン、クロム、マンガン、マグネシウム、及び抗酸化物質を含有する。例えば、２２グラムの本発明の粗分は、繊維の個体の１日推奨摂取量の３３％を送達する。栄養補助食品は、個体の全体的な健康を支援するいずれかの既知の栄養成分を含み得、例として、ビタミン、ミネラル、他の繊維構成要素、脂肪酸、抗酸化物質、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、ルテイン、リボース、オメガ３脂肪酸、及び／又は他の栄養成分が挙げられるが、これらに限定されない。補助食品は、以下の形態：インスタント飲料ミックス、準備済み飲料、栄養バー、ウエハース、クッキー、クラッカー、ゲルショット、カプセル、チュー、チュアブル錠、及びピルで送達され得るが、これらに限定されない。一実施形態は、繊維補助食品を、風味付きシェイク又は麦芽タイプ飲料の形態で送達するが、この実施形態は、小児のための繊維補助食品として特に魅力的であり得る。
【0398】
追加の実施形態では、製粉プロセスは、多穀粒粉又は多穀粒粗分を作製するために使用され得る。例えば、１つのタイプの穀粒からのふすま及び胚芽は、粉砕され、別のタイプの穀類の粉砕された胚乳又は全穀粒穀粉とブレンドされ得る。代替として、１つのタイプの穀粒のふすま及び胚芽は、粉砕され、別のタイプの穀粒の粉砕された胚乳又は全穀粒粉とブレンドされ得る。本発明は、１つ以上の穀粒のふすま、胚芽、胚乳、及び全穀粒粉のうちの１つ以上のいずれかの組み合わせを混合することを包含することが企図される。この多穀粒手法は、カスタム粉を作製するために、かつ複数のタイプの穀物粒の質及び栄養含有量を利用して１つの粉を作製するために使用され得る。
【0399】
本発明の全穀粒粉、粗分、及び／又は穀粒製品は、当該技術分野で既知のいずれかの製粉プロセスによって製造され得ることが企図される。例示的な実施形態は、穀粒を、単一の流れで、穀粒の胚乳、ふすま、及び胚芽を別個の流れに分離することなく粉砕することを含む。洗浄及びテンパリングされた穀粒は、第１の通過粉砕機、例えば、ハンマミル、ローラーミル、ピンミル、インパクトミル、ディスクミル、エアーアトリションミル、又はギャップミルなどに搬送される。粉砕後に、穀粒は、排出され、ふるいに搬送される。更に、本発明の全穀粒粉、粗分、及び／又は穀粒製品は、多数の他のプロセス、例えば、発酵、インスタンタイジング、押し出し、カプセル封入、トースティング、又は焙煎などによって改変又は増強され得ることが企図される。
【実施例】
【0400】
実施例１．一般的な材料及び方法
スダンレッド溶液での染色によるアリューロンの観察
１ｇのスダンレッドＩＶを５０ｍｌのポリエチレングリコール溶液（平均分子量４００、Ｓｉｇｍａ、カタログ番号２０２３９８）に付加し、９０℃で１時間インキュベートし、等容積の９０％グリセロールと混合することによって、染色溶液を調製した。各々の穀粒の果実皮（内穎及び外穎）を除去した後に、成熟米穀粒を、蒸留水中で５時間インキュベートし、次いで、レザーブレードを使用して横方向又は縦方向に薄切した。切片を、スダンレッド溶液中で、室温で２４～７２時間染色した。次いで、切片を、ルゴール染色溶液（Ｓｉｇｍａ、３２９２２）で、室温で２０分間対比染色し、解剖顕微鏡下で観察した（Ｓｒｅｅｎｉｖａｓｕｌｕ，２０１０）。
スダンレッド溶液での染色によるアリューロンの観察
１ｇのスダンレッドＩＶを５０ｍｌのポリエチレングリコール溶液（平均分子量４００、Ｓｉｇｍａ、カタログ番号２０２３９８）に付加し、９０℃で１時間インキュベートし、等容積の９０％グリセロールと混合することによって、染色溶液を調製した。各々の穀粒の果実皮（内穎及び外穎）を除去した後に、成熟米穀粒を、蒸留水中で５時間インキュベートし、次いで、レザーブレードを使用して横方向又は縦方向に薄切した。切片を、スダンレッド溶液中で、室温で２４～７２時間染色した。次いで、切片を、ルゴール染色溶液（Ｓｉｇｍａ、３２９２２）で、室温で２０分間対比染色し、解剖顕微鏡下で観察した（Ｓｒｅｅｎｉｖａｓｕｌｕ，２０１０）。
【0401】
エバンスブルーでのアリューロンの染色
０．１ｇのエバンスブルー（Ｓｉｇｍａ、Ｅ２１２９）を１００ｍｌの蒸留水中に溶解させることによって、エバンスブルー染色溶液を調製した。各々の穀粒の果実皮を除去した後に、成熟米穀粒を、レザーブレードを使用して横方向に薄切した。切片を、蒸留水中で、室温で３０分間インキュベートし、染色を、付加し、室温で２分間放置した。次いで、染色溶液を廃棄し、切片を、蒸留水で２回洗浄し、解剖顕微鏡下で観察した。
０．１ｇのエバンスブルー（Ｓｉｇｍａ、Ｅ２１２９）を１００ｍｌの蒸留水中に溶解させることによって、エバンスブルー染色溶液を調製した。各々の穀粒の果実皮を除去した後に、成熟米穀粒を、レザーブレードを使用して横方向に薄切した。切片を、蒸留水中で、室温で３０分間インキュベートし、染色を、付加し、室温で２分間放置した。次いで、染色溶液を廃棄し、切片を、蒸留水で２回洗浄し、解剖顕微鏡下で観察した。
【0402】
米胚乳の光学顕微鏡観察
米穀粒を、ホルマリン酢酸アルコール（ＦＡＡ）溶液（６０％エタノール、３３％のＨ２Ｏ、５％氷酢酸、及び２％ホルムアルデヒド；ｖ／ｖ／ｖ／ｖ）中に固定し、１時間脱気し、７０％、８０％、９５％、次いで１００％エタノールを含有する一連のアルコール溶液中で脱水し、ＬＲ白色樹脂（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１４３８０）によって浸透させ、２４時間６０℃で重合した。ミクロトーム薄切を、Ｌｅｉｃａ ＵＣ７ミクロトームを使用して行った。切片を、０．１％トルイジンブルー溶液（Ｓｉｇｍａ、Ｔ３２６０）中で、室温で２分間染色し、次いで、蒸留水で２回洗浄し、光学顕微鏡法によって検査した。代替として、切片を、０．０１％カルコフロールホワイト溶液（Ｓｉｇｍａ、１８９０９）中で、室温で２分間染色し、光学顕微鏡法によって、ＵＶ励起（励起３６５ｎｍ及び発光約４４０ｎｍ）で検査した。
米穀粒を、ホルマリン酢酸アルコール（ＦＡＡ）溶液（６０％エタノール、３３％のＨ２Ｏ、５％氷酢酸、及び２％ホルムアルデヒド；ｖ／ｖ／ｖ／ｖ）中に固定し、１時間脱気し、７０％、８０％、９５％、次いで１００％エタノールを含有する一連のアルコール溶液中で脱水し、ＬＲ白色樹脂（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１４３８０）によって浸透させ、２４時間６０℃で重合した。ミクロトーム薄切を、Ｌｅｉｃａ ＵＣ７ミクロトームを使用して行った。切片を、０．１％トルイジンブルー溶液（Ｓｉｇｍａ、Ｔ３２６０）中で、室温で２分間染色し、次いで、蒸留水で２回洗浄し、光学顕微鏡法によって検査した。代替として、切片を、０．０１％カルコフロールホワイト溶液（Ｓｉｇｍａ、１８９０９）中で、室温で２分間染色し、光学顕微鏡法によって、ＵＶ励起（励起３６５ｎｍ及び発光約４４０ｎｍ）で検査した。
【0403】
過ヨウ素酸シッフ（ＰＡＳ）試薬及びクーマシーブルーでの染色
スライド上の固定された切片を、予備加熱された０．４％過ヨウ素酸（Ｓｉｇｍａ、３７５８１０）中で、５７℃で３０分間インキュベートし、次いで、蒸留水中で３回すすいだ。シッフ試薬（Ｓｉｇｍａ、３９５２０１６）を適用し、スライドを、室温で１５分間インキュベートし、次いで、蒸留水中で３回すすいだ。次いで、切片を、１％クーマシーブルー（Ｒ－２５０、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、２０２７８）中で、室温で２分間インキュベートし、蒸留水中で３回すすいだ。３０％、５０％、６０％、７５％、８５％、９５％、及び１００％エタノールを有する一連のアルコール溶液を、各々２分間使用して、切片の脱水を達成し、続いて、各々のスライドを、５０％キシレン及び１００％キシレン溶液（Ｓｉｇｍａ、５３４０５６）中で、各々２分間透明化した。次いで、カバーガラスに、Ｅｕｋｉｔｔ（登録商標）急硬性封入剤（Ｆｌｕｋａ、０３９８９）を載せ、切片を光学顕微鏡下で観察した。
スライド上の固定された切片を、予備加熱された０．４％過ヨウ素酸（Ｓｉｇｍａ、３７５８１０）中で、５７℃で３０分間インキュベートし、次いで、蒸留水中で３回すすいだ。シッフ試薬（Ｓｉｇｍａ、３９５２０１６）を適用し、スライドを、室温で１５分間インキュベートし、次いで、蒸留水中で３回すすいだ。次いで、切片を、１％クーマシーブルー（Ｒ－２５０、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、２０２７８）中で、室温で２分間インキュベートし、蒸留水中で３回すすいだ。３０％、５０％、６０％、７５％、８５％、９５％、及び１００％エタノールを有する一連のアルコール溶液を、各々２分間使用して、切片の脱水を達成し、続いて、各々のスライドを、５０％キシレン及び１００％キシレン溶液（Ｓｉｇｍａ、５３４０５６）中で、各々２分間透明化した。次いで、カバーガラスに、Ｅｕｋｉｔｔ（登録商標）急硬性封入剤（Ｆｌｕｋａ、０３９８９）を載せ、切片を光学顕微鏡下で観察した。
【0404】
ＤＮＡ抽出及びＰＣＲ条件
植物葉試料からのＤＮＡ抽出のために、以下の２つの方法：より純粋でないＤＮＡ試料を提供するための迅速なＤＮＡ抽出方法、及びＫｉｍ ｅｔ ａｌ．（２０１６）から修正された、より純粋なＤＮＡのためのより広範なＤＮＡ抽出方法を使用した。第１の方法において、２ｍｍの直径を有する４つのガラスビーズ（Ｓｉｇｍａ、２７３６２７）、１～２ｍｇの米葉組織、及び１５０μｌの抽出緩衝液（１０ｍＭのトリス、ｐＨ９．５、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、１００ｍＭのＫＣｌ）を、９６ウェルＰＣＲプレートの各々のウェルに付加した。プレートを密封し、混合物を、Ｍｉｎｉ－Ｂｅａｄｂｅａｔｅｒ－９６ミキサ（ＧｌｅｎＭｉｌｌｓ、１００１）を使用して１分間ホモジナイズした。プレートを３０００ｒｐｍで５分間遠心分離した後に、抽出されたＤＮＡを含有する上清のアリコートを、ＰＣＲ反応において使用した。
植物葉試料からのＤＮＡ抽出のために、以下の２つの方法：より純粋でないＤＮＡ試料を提供するための迅速なＤＮＡ抽出方法、及びＫｉｍ ｅｔ ａｌ．（２０１６）から修正された、より純粋なＤＮＡのためのより広範なＤＮＡ抽出方法を使用した。第１の方法において、２ｍｍの直径を有する４つのガラスビーズ（Ｓｉｇｍａ、２７３６２７）、１～２ｍｇの米葉組織、及び１５０μｌの抽出緩衝液（１０ｍＭのトリス、ｐＨ９．５、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、１００ｍＭのＫＣｌ）を、９６ウェルＰＣＲプレートの各々のウェルに付加した。プレートを密封し、混合物を、Ｍｉｎｉ－Ｂｅａｄｂｅａｔｅｒ－９６ミキサ（ＧｌｅｎＭｉｌｌｓ、１００１）を使用して１分間ホモジナイズした。プレートを３０００ｒｐｍで５分間遠心分離した後に、抽出されたＤＮＡを含有する上清のアリコートを、ＰＣＲ反応において使用した。
【0405】
第２の方法において、０．２ｇの葉試料各々を、２つの２ｍｍ直径のガラスビーズとともに１．５ｍｌのＥｐｐｅｎｄｏｒｆチューブ内で、液体窒素中で１０分間冷却した。次いで、試料を、Ｍｉｎｉ－Ｂｅａｄｂｅａｔｅｒ－９６において、１分間ホモジナイズし、次いで、６００μｌのＤＮＡ抽出緩衝液（２％のＳＤＳ、０．４ＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＥＤＴＡ、１０ｍＭのトリス－ＨＣｌ、ｐＨ８．０）を、各々のチューブに付加し、混合物を、６５℃で１時間インキュベートした。混合物を冷却した後に、４５０μｌの６ＭのＮａＣｌを、各々のチューブに付加した。チューブを、ボルテックスし、１２０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。各々の上清を、新しいチューブに移し、ＤＮＡを、等容量の２－プロパノールを使用して、－２０℃で１時間沈殿させた。ＤＮＡを、２４００ｒｐｍで４℃で２０分間遠心分離することによって回収し、ペレットを、７５％エタノールで２回洗浄した。ペレットを、室温で風乾し、各々を、１０ｎｇ／μｌのリボヌクレアーゼ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＥＮ０２０１）を含有する６００μｌの蒸留水中に再懸濁し、ＰＣＲ反応において使用した。
【0406】
ＰＣＲ反応において、Ｔａｑポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｋ０１７１）を含有する５μｌの２×ＰＣＲ緩衝液、５’及び３’オリゴヌクレオチドプライマー、並びに１μｌのＤＮＡ試料を、１０μｌの総容積で使用した。増幅を、３０秒間９４℃、３０秒間５５℃、及び３０秒間７２℃の３５サイクルを使用して実行した。増幅産物を、ゲル電気泳動によって、３％アガロースゲルを使用して解析した。対照ＰＣＲ反応において、親野生型Ｊａｐｏｎｉｃａ米変種であるホモ接合性Ｚｈｏｎｇｈｕａ １１（ＺＨ１１）植物又は穀粒からのＤＮＡ調製物、野生型Ｉｎｄｉｃａ米変種としてのホモ接合性ＮＪ６植物からのＤＮＡ調製物、並びにＺＨ１１及びＮＪ６からのＤＮＡの混合物を使用した。
【0407】
ｔａ１アレルの遺伝子マッピングのために、遺伝子マーカーについてのＰＣＲ増幅は、以下のプライマー対（５’から３’の配列）：Ｉｎｄｅｌ ５５９（染色体５上の２５位、１４９位、２４９位）、フォワードプライマーＴＴＡＴＣＡＧＣＴＴＣＴＣＧＧＴＴＣＡＴＣＣＡＡ（配列番号５０）、リバースプライマーＡＡＡＣＡＧＧＧＴＴＡＧＣＡＡＴＴＴＣＧＴＴＴＴ（配列番号５１）；Ｉｎｄｅｌ ５４８（染色体５上の２５位、２６５位、５３３位、フォワードプライマーＴＣＴＧＴＣＣＣＡＴＡＴＡＴＡＣＡＡＣＣＧ（配列番号５２）、リバースプライマーＡＴＴＴＧＴＧＴＴＴＣＡＡＴＣＣＴＡＴＡＴＡ（配列番号５３）；Ｉｎｄｅｌ ５６２（染色体５上の２５位、２３７位、２１８位）、フォワードプライマーＧＧＴＣＣＴＴＴＣＡＡＡＣＡＣＴＣＣＡＣＡ（配列番号５４）、リバースプライマーＣＣＡＡＣＴＴＴＧＣＣＴＴＡＧＣＡＴＴＣＡ（配列番号５５）；Ｉｎｄｅｌ ５８３（染色体５上の２５位、２６５位、３２６位）、フォワードプライマーＡＣＴＡＣＴＣＣＣＴＡＴＴＴＣＴＧＴＡＴＴＣＡＣＴ（配列番号５６）、リバースプライマーＧＡＧＣＧＴＣＡＴＧＧＴＴＣＡＣＣＴＣＴＴ（配列番号５７）を使用した。
【0408】
ＴＩＬＬＩＮＧアッセイ
ＴＩＬＬＩＮＧアッセイにおいて使用されたプライマーは、以下のヌクレオチド配列：ＴＡ１－１Ｆ：ＣＡＴＴＣＡＴＡＡＴＧＡＣＣＡＧＣＴＡＧＧＴＧＣＴ（配列番号９８）、及びＴＡ１－１Ｒ：ＧＡＧＴＴＧＡＡＡＣＡＴＧＣＣＴＧＴＡＣＴＣＣＴＧ（配列番号９９）を有した。ＥｘＴａｑでのＰＣＲ増幅を、以下の反応条件：１ｋｂのアンプリコン長さ毎に、２分間９５℃；２０秒間９４℃、３０秒間６８℃の８回のサイクル（１サイクル当たり１℃減少）、及び６０秒間７２℃、続いて、１ｋｂのアンプリコン長さ毎に、２０秒間９４℃、３０秒間６０℃、及び６０秒間７２℃の３５回のサイクル、並びに７２℃で５分間の最終伸長で実行した。野生型及び試験試料からのＰＣＲ産物を、混合し、完全変性－遅いアニーリングプログラムに供して、ヘテロ二本鎖を、以下の条件下：変性のための１０分間９９℃、続いて、サイクル各々７０℃で２０秒間での開始及び１サイクル当たり０．３℃減少の７０回の漸減サイクル、次いで、１５℃で保持して変性ＰＣＲ産物を再アニールしてヘテロ二本鎖を形成することで形成した。アニールされたＰＣＲ産物のＣｅｌＩ消化を、ＣｅｌＩ緩衝液（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、１０ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＭｇＳＯ４、０．００２％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、及び０．２μｇ／ｍＬのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、４μＬのＰＣＲ産物、並びにＰＣＲ産物がＥｘ Ｔａｑによって重合された場合、１単位のＣｅｌＩ（１０単位／μＬ）、又はＰＣＲ産物がＫＯＤによって重合された場合、２０単位のＣｅｌＩを含有する１５μＬの反応混合物中で、４５℃で１５分間実行し、続いて、２μＬの０．５ＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）を付加して反応を停止した。代替として、消化を、ＭＢＮ緩衝液（２０ｍＭのビス－トリス、ｐＨ６．５、１０ｍＭのＭｇＳＯ４、０．２ｍＭのＺｎＳＯ４、０．００２％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、及び０．２μｇ／ｍＬのＢＳＡ）中の４μＬのＰＣＲ産物及び２単位のマングビーンヌクレアーゼ（ＭＢＮ、１０単位／μＬ、カタログ番号Ｍ０２５０Ｓ；Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、ＵＳＡ）を含有する１５μＬの反応混合物中で、６０℃で３０分間実行し、続いて、２μＬの０．２％のＳＤＳを付加して反応を停止した。
ＴＩＬＬＩＮＧアッセイにおいて使用されたプライマーは、以下のヌクレオチド配列：ＴＡ１－１Ｆ：ＣＡＴＴＣＡＴＡＡＴＧＡＣＣＡＧＣＴＡＧＧＴＧＣＴ（配列番号９８）、及びＴＡ１－１Ｒ：ＧＡＧＴＴＧＡＡＡＣＡＴＧＣＣＴＧＴＡＣＴＣＣＴＧ（配列番号９９）を有した。ＥｘＴａｑでのＰＣＲ増幅を、以下の反応条件：１ｋｂのアンプリコン長さ毎に、２分間９５℃；２０秒間９４℃、３０秒間６８℃の８回のサイクル（１サイクル当たり１℃減少）、及び６０秒間７２℃、続いて、１ｋｂのアンプリコン長さ毎に、２０秒間９４℃、３０秒間６０℃、及び６０秒間７２℃の３５回のサイクル、並びに７２℃で５分間の最終伸長で実行した。野生型及び試験試料からのＰＣＲ産物を、混合し、完全変性－遅いアニーリングプログラムに供して、ヘテロ二本鎖を、以下の条件下：変性のための１０分間９９℃、続いて、サイクル各々７０℃で２０秒間での開始及び１サイクル当たり０．３℃減少の７０回の漸減サイクル、次いで、１５℃で保持して変性ＰＣＲ産物を再アニールしてヘテロ二本鎖を形成することで形成した。アニールされたＰＣＲ産物のＣｅｌＩ消化を、ＣｅｌＩ緩衝液（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、１０ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＭｇＳＯ４、０．００２％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、及び０．２μｇ／ｍＬのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、４μＬのＰＣＲ産物、並びにＰＣＲ産物がＥｘ Ｔａｑによって重合された場合、１単位のＣｅｌＩ（１０単位／μＬ）、又はＰＣＲ産物がＫＯＤによって重合された場合、２０単位のＣｅｌＩを含有する１５μＬの反応混合物中で、４５℃で１５分間実行し、続いて、２μＬの０．５ＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）を付加して反応を停止した。代替として、消化を、ＭＢＮ緩衝液（２０ｍＭのビス－トリス、ｐＨ６．５、１０ｍＭのＭｇＳＯ４、０．２ｍＭのＺｎＳＯ４、０．００２％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、及び０．２μｇ／ｍＬのＢＳＡ）中の４μＬのＰＣＲ産物及び２単位のマングビーンヌクレアーゼ（ＭＢＮ、１０単位／μＬ、カタログ番号Ｍ０２５０Ｓ；Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、ＵＳＡ）を含有する１５μＬの反応混合物中で、６０℃で３０分間実行し、続いて、２μＬの０．２％のＳＤＳを付加して反応を停止した。
【0409】
総ＣｅｌＩ消化ＰＣＲ産物を、２％アガロースゲル中で電気泳動して、変異を検出した。
【0410】
高解像度ＤＮＡ融解曲線（ＨＲＭ）解析
若葉組織（２ｍｍ×２ｍｍ）を、１０ｍＭのトリス（ｐＨ９．５）、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、１００ｍＭのＫＣｌを含有する１５０μＬの溶解緩衝液で、ガラスビーズ（２ｍｍの直径）を使用して、９６ウェルプレートのウェル内でホモジナイズし、ＤＮＡ抽出について上記のようにホモジナイズした。ＰＣＲ反応を、１０μＬの容積の以下：５μＬの２×マスターミックス（Ｒｏｃｈｅ、カタログ番号０４９０９６３１００１）、１０μＭのフォワードプライマー、１０μＭのリバースプライマー、１．０μＬの２５ｍＭのＭｇＣｌ２、１．５μＬのＤＮＡテンプレートで実行した。混合物を、９５℃で１０分間サイクルし、次いで、１０秒間９５℃の４５回のサイクルに供して、５３℃で１５秒間及び７２℃で１５秒間アニールした。次いで、以下の変性プログラム：９５℃６０秒間、４０℃６０秒間、６５℃１秒間、９７℃１秒間；勾配４．４℃／秒、持続時間６０秒間、ターゲット温度９５℃。
若葉組織（２ｍｍ×２ｍｍ）を、１０ｍＭのトリス（ｐＨ９．５）、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、１００ｍＭのＫＣｌを含有する１５０μＬの溶解緩衝液で、ガラスビーズ（２ｍｍの直径）を使用して、９６ウェルプレートのウェル内でホモジナイズし、ＤＮＡ抽出について上記のようにホモジナイズした。ＰＣＲ反応を、１０μＬの容積の以下：５μＬの２×マスターミックス（Ｒｏｃｈｅ、カタログ番号０４９０９６３１００１）、１０μＭのフォワードプライマー、１０μＭのリバースプライマー、１．０μＬの２５ｍＭのＭｇＣｌ２、１．５μＬのＤＮＡテンプレートで実行した。混合物を、９５℃で１０分間サイクルし、次いで、１０秒間９５℃の４５回のサイクルに供して、５３℃で１５秒間及び７２℃で１５秒間アニールした。次いで、以下の変性プログラム：９５℃６０秒間、４０℃６０秒間、６５℃１秒間、９７℃１秒間；勾配４．４℃／秒、持続時間６０秒間、ターゲット温度９５℃。
【0411】
ＴＡ１の一本鎖ＤＮＡ結合機能研究
以下に記載されるように、ＴＡ１遺伝子産物を、ミトコンドリア標的一本鎖ＤＮＡ結合（ｍｔＳＳＢ）タンパク質として同定した。一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）の結合におけるＴＡ１ポリペプチドの機能を研究するために、６ｘＨｉｓタグと融合した精製組換えＴＡ１タンパク質を、電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）によって解析して、ｓｓＤＮＡへの精製組換えＴＡ１タンパク質の親和性を判定した。
以下に記載されるように、ＴＡ１遺伝子産物を、ミトコンドリア標的一本鎖ＤＮＡ結合（ｍｔＳＳＢ）タンパク質として同定した。一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）の結合におけるＴＡ１ポリペプチドの機能を研究するために、６ｘＨｉｓタグと融合した精製組換えＴＡ１タンパク質を、電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）によって解析して、ｓｓＤＮＡへの精製組換えＴＡ１タンパク質の親和性を判定した。
【0412】
Ｅ．ｃｏｌｉ内のＨｉｓタグ付きＴＡ１タンパク質の発現
成熟ＴＡ１タンパク質についての６２１ｂｐのタンパク質コード領域（配列番号２）を、ＰＣＲによって増幅し、ｐＥＴ－３０ａベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ、カタログ番号６９９０９－３）中にクローニングし、ｐＥＴ－３０ａ上のプロモーターに対する遺伝子挿入物の所望の配向を確認した。この構築物を、ｐＥＴ－３０ａ－ＴＡ１と称した。ｐＥＴ－３０ａ－ＴＡ１は、発現されたＴＡ１ポリペプチドのＮ末端において翻訳融合してニッケルカラムへの結合を可能にする、ｐＥＴ－３０ａベクターに由来する６ｘＨｉｓタグを含有した。組換えＴＡ１を、Ｔｒａｎｓｅｔｔａ（ＤＥ３）化学成分Ｅ．ｃｏｌｉ細胞（Ｔｒａｎｓｇｅｎ、カタログ番号ＣＤ８０１）内で発現し、ＬＢ培地中で一晩成長させた。細胞を、１×ＳＤＳローディング緩衝液（１２ｍＭのトリス ｐＨ６．８、５％グリセロール、０．４％のＳＤＳ、１％のβ－メルカプトエタノール、０．０２％ブロモフェノールブルー）中で１００℃で５分間加熱することによって溶解させた。可溶性タンパク質を、電気泳動によって、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）上で分画し、ＰＶＤＦ膜（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）に移した。次いで、組換えタンパク質を、ウエスタン解析によって、６ｘＨｉｓタグに対するモノクローナル抗体（Ｍａｒｉｎｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）を使用して可視化した。
成熟ＴＡ１タンパク質についての６２１ｂｐのタンパク質コード領域（配列番号２）を、ＰＣＲによって増幅し、ｐＥＴ－３０ａベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ、カタログ番号６９９０９－３）中にクローニングし、ｐＥＴ－３０ａ上のプロモーターに対する遺伝子挿入物の所望の配向を確認した。この構築物を、ｐＥＴ－３０ａ－ＴＡ１と称した。ｐＥＴ－３０ａ－ＴＡ１は、発現されたＴＡ１ポリペプチドのＮ末端において翻訳融合してニッケルカラムへの結合を可能にする、ｐＥＴ－３０ａベクターに由来する６ｘＨｉｓタグを含有した。組換えＴＡ１を、Ｔｒａｎｓｅｔｔａ（ＤＥ３）化学成分Ｅ．ｃｏｌｉ細胞（Ｔｒａｎｓｇｅｎ、カタログ番号ＣＤ８０１）内で発現し、ＬＢ培地中で一晩成長させた。細胞を、１×ＳＤＳローディング緩衝液（１２ｍＭのトリス ｐＨ６．８、５％グリセロール、０．４％のＳＤＳ、１％のβ－メルカプトエタノール、０．０２％ブロモフェノールブルー）中で１００℃で５分間加熱することによって溶解させた。可溶性タンパク質を、電気泳動によって、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）上で分画し、ＰＶＤＦ膜（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）に移した。次いで、組換えタンパク質を、ウエスタン解析によって、６ｘＨｉｓタグに対するモノクローナル抗体（Ｍａｒｉｎｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）を使用して可視化した。
【0413】
解析方法
穀粒、食品成分、及び食品試料内の近似物及び他の主要構成物を、標準的な方法を使用して、例えば、以下に記載されるように判定した。
穀粒、食品成分、及び食品試料内の近似物及び他の主要構成物を、標準的な方法を使用して、例えば、以下に記載されるように判定した。
【0414】
穀粒含水量を、Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ｏｆｆｉｃｉａｌ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｓ（ＡＯＡＣ）法９２５．１０に従って測定した。簡潔には、約２ｇの穀粒試料を、恒量まで、オーブン内で１３０℃で約１時間乾燥させた。
【0415】
灰含有量を、ＡＯＡＣ法９２３．０３に従って測定した。水分判定のために使用された試料を、マッフル炉内で５２０℃で１５時間灰にした。
【0416】
穀粒、食品成分、及び食品試料のタンパク質含有量
タンパク質含有量を、ＡＯＡＣ法９９２．２３に従って測定した。簡潔には、総窒素を、デュマ燃焼法によって、自動窒素分析計（Ｅｌｅｍｅｎｔａｒ Ｒａｐｉｄ Ｎ ｃｕｂｅ、Ｅｌｅｍｅｎｔａｒ Ａｎａｌｙｓｅｎｓｙｓｔｅｍｅ ＧｍｂＨ、Ｈａｎａｕ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して解析した。穀粒又は食品試料のタンパク質含有量（ｇ／１００ｇ）を、窒素含有量に６．２５を乗じることによって推定した。
タンパク質含有量を、ＡＯＡＣ法９９２．２３に従って測定した。簡潔には、総窒素を、デュマ燃焼法によって、自動窒素分析計（Ｅｌｅｍｅｎｔａｒ Ｒａｐｉｄ Ｎ ｃｕｂｅ、Ｅｌｅｍｅｎｔａｒ Ａｎａｌｙｓｅｎｓｙｓｔｅｍｅ ＧｍｂＨ、Ｈａｎａｕ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して解析した。穀粒又は食品試料のタンパク質含有量（ｇ／１００ｇ）を、窒素含有量に６．２５を乗じることによって推定した。
【0417】
糖、デンプン、及び他の多糖
総デンプン含有量を、ＭｃＣｌｅａｒｙ ｅｔ ａｌ．（１９９７）の酵素法を使用するＡＯＡＣ法９９６．１１に従って測定した。
総デンプン含有量を、ＭｃＣｌｅａｒｙ ｅｔ ａｌ．（１９９７）の酵素法を使用するＡＯＡＣ法９９６．１１に従って測定した。
【0418】
糖の量を、ＡＯＡＣ法９８２．１４に従って測定した。簡潔には、単糖を、水性エタノール（８０％エタノール）で抽出し、次いで、アセトニトリル：水（７５：２５ｖ／ｖ）を移動相として使用するポリアミン結合高分子ゲルカラムを使用するＨＰＬＣによって、蒸発光散乱検出器を使用して定量化した。
【0419】
総中性非デンプン多糖（ＮＮＳＰ）を、若干修正された、Ｔｈｅａｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９５）のガスクロマトグラフィー手順によって測定し、ガスクロマトグラフィー手順は、１Ｍの硫酸での２時間の加水分解、続いて、遠心分離を含んだ。
【0420】
フラクタン（フラクトオリゴ糖）を、ＡＯＡＣ法９９９．０３によって詳述されている方法によって解析した。簡潔には、フラクトオリゴ糖を、水中に抽出し、続いて、スクラーゼ／マルターゼ／インベルターゼ混合物で消化した。次いで、得られた遊離糖を、水素化ホウ素ナトリウムで還元し、フルクタノースでフルクトース／グルコースに消化した。遊離されたフルクトース／グルコースを、ｐ－ヒドロキシ安息香酸ヒドラジン（ＰＡＨＢＡＨ）を使用して測定した。
【0421】
繊維含有量
総食物繊維（ＴＤＦ）を、ＡＯＡＣ法９８５．２９に従って測定し、可溶性及び不溶性繊維（ＳＩＦ）を、ＡＯＡＣ法９９１．４３に従って測定した。簡潔には、ＴＤＦを、Ｐｒｏｓｋｙ ｅｔ ａｌ．（１９８５）の重量測定技法によって、ＡＯＡＣ法９８５．２９に詳述されているように判定し、ＳＩＦを、重量測定技法によって、ＡＯＡＣ ９９１．４３に記載されているように判定した。
総食物繊維（ＴＤＦ）を、ＡＯＡＣ法９８５．２９に従って測定し、可溶性及び不溶性繊維（ＳＩＦ）を、ＡＯＡＣ法９９１．４３に従って測定した。簡潔には、ＴＤＦを、Ｐｒｏｓｋｙ ｅｔ ａｌ．（１９８５）の重量測定技法によって、ＡＯＡＣ法９８５．２９に詳述されているように判定し、ＳＩＦを、重量測定技法によって、ＡＯＡＣ ９９１．４３に記載されているように判定した。
【0422】
総脂質
５ｇの粉の試料を、１％クララーゼ４００００（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、ＭＣ２３．３１）とともに、４５℃で１時間インキュベートした。脂質を、複数回の抽出によって、試料からクロロホルム／メタノール中に抽出した。別個の相への遠心分離後に、クロロホルム／メタノール画分を除去し、１０１℃で３０分間乾燥させて、脂質を回収した。残った残留物の質量は、試料内の全脂質を表した（ＡＯＡＣ法９８３．２３）。
５ｇの粉の試料を、１％クララーゼ４００００（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、ＭＣ２３．３１）とともに、４５℃で１時間インキュベートした。脂質を、複数回の抽出によって、試料からクロロホルム／メタノール中に抽出した。別個の相への遠心分離後に、クロロホルム／メタノール画分を除去し、１０１℃で３０分間乾燥させて、脂質を回収した。残った残留物の質量は、試料内の全脂質を表した（ＡＯＡＣ法９８３．２３）。
【0423】
脂質の脂肪酸プロファイル
脂質を、ＡＯＡＣ法９８３．２３に従って、製粉された粉からクロロホルム中に抽出した。内部標準としてヘプタデカン酸のアリコートを付加した後に、脂質を含有するクロロホルム画分の一部分を、窒素流下で蒸発させた。残留物を、乾燥メタノール中の１％硫酸中に懸濁し、混合物を、５０℃で１６時間加熱した。混合物を、水で希釈し、ヘキサンで２回抽出した。組み合わされたヘキサン溶液を、Ｆｌｏｒｉｓｉｌの小さいカラム上にロードし、カラムを、ヘキサン及び脂肪酸メチルエステルで洗浄し、次いで、ヘキサン中の１０％エーテルで溶出した。溶出液を、蒸発させて乾燥させ、残留物を、イソオクタン中に溶解させて、ＧＣ上に注入した。脂肪酸メチルエステルを、標準的な脂肪酸の混合物に対して定量化した。ＧＣ条件：カラム ＳＧＥ ＢＰＸ７０ ３０ｍ×０．３２ｍｍ×０．２５μｍ；注入 ０．５μＬ；注入器 ２５０°Ｃ；１５：１のスプリット；流量 １．７２３ｍｌ／分の定流量；オーブン ０．５分間１５０°Ｃ、１０°Ｃ／分で１８０°Ｃまで、１．５°Ｃ／分で２２０°Ｃまで、３０°Ｃ／分で２６０°Ｃまで、総実行時間３３分；検出器 ２８０°ＣでのＦＩＤ。
脂質を、ＡＯＡＣ法９８３．２３に従って、製粉された粉からクロロホルム中に抽出した。内部標準としてヘプタデカン酸のアリコートを付加した後に、脂質を含有するクロロホルム画分の一部分を、窒素流下で蒸発させた。残留物を、乾燥メタノール中の１％硫酸中に懸濁し、混合物を、５０℃で１６時間加熱した。混合物を、水で希釈し、ヘキサンで２回抽出した。組み合わされたヘキサン溶液を、Ｆｌｏｒｉｓｉｌの小さいカラム上にロードし、カラムを、ヘキサン及び脂肪酸メチルエステルで洗浄し、次いで、ヘキサン中の１０％エーテルで溶出した。溶出液を、蒸発させて乾燥させ、残留物を、イソオクタン中に溶解させて、ＧＣ上に注入した。脂肪酸メチルエステルを、標準的な脂肪酸の混合物に対して定量化した。ＧＣ条件：カラム ＳＧＥ ＢＰＸ７０ ３０ｍ×０．３２ｍｍ×０．２５μｍ；注入 ０．５μＬ；注入器 ２５０°Ｃ；１５：１のスプリット；流量 １．７２３ｍｌ／分の定流量；オーブン ０．５分間１５０°Ｃ、１０°Ｃ／分で１８０°Ｃまで、１．５°Ｃ／分で２２０°Ｃまで、３０°Ｃ／分で２６０°Ｃまで、総実行時間３３分；検出器 ２８０°ＣでのＦＩＤ。
【0424】
抗酸化物質活性（ＯＲＡＣ－Ｈ）
親水性抗酸化物質活性（ＯＲＡＣ－Ｈ）を、Ｗｏｌｂａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１０）によって記載されているように修正された、Ｈｕａｎｇ（２００２ａ及び２００２ｂ）の方法に従って判定した。試料を、親油性抗酸化物質について抽出し、続いて、親水性抗酸化物質を、１００ｍｇの試料を、２ｍＬのマイクロチューブ内に３回秤量することによって抽出した。次いで、１ｍＬのヘキサン：ジクロロメタン（５０：５０）を付加し、２分間激しく混合し、１３，０００ｒｐｍで２分間１０℃で遠心分離した。上清をガラスバイアルに移し、ペレットを、更なる２ｍＬのヘキサン：ジクロロメタンミックスで再抽出した。次いで、混合及び遠心分離ステップを反復し、上清を同じガラスバイアルに移した。ペレットからの残留溶媒を、穏やかな窒素流下で蒸発させた。次いで、１ｍＬのアセトン：水：酢酸ミックス（７０：２９．５：０．５）を付加し、試料を、２分間激しく混合した。次いで、混合物を、上記のように遠心分離し、上清を、ＯＲＡＣ－Ｈプレートアッセイにおいて使用した。試料を、必要に応じて、リン酸緩衝液で希釈した。曲線下面積（ＡＵＣ）を計算し、Ｔｒｏｌｏｘ標準についてのＡＵＣ値に対して比較した。ＯＲＡＣ値を、μＭのＴｒｏｌｏｘ当量／ｇ試料として報告する。
親水性抗酸化物質活性（ＯＲＡＣ－Ｈ）を、Ｗｏｌｂａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１０）によって記載されているように修正された、Ｈｕａｎｇ（２００２ａ及び２００２ｂ）の方法に従って判定した。試料を、親油性抗酸化物質について抽出し、続いて、親水性抗酸化物質を、１００ｍｇの試料を、２ｍＬのマイクロチューブ内に３回秤量することによって抽出した。次いで、１ｍＬのヘキサン：ジクロロメタン（５０：５０）を付加し、２分間激しく混合し、１３，０００ｒｐｍで２分間１０℃で遠心分離した。上清をガラスバイアルに移し、ペレットを、更なる２ｍＬのヘキサン：ジクロロメタンミックスで再抽出した。次いで、混合及び遠心分離ステップを反復し、上清を同じガラスバイアルに移した。ペレットからの残留溶媒を、穏やかな窒素流下で蒸発させた。次いで、１ｍＬのアセトン：水：酢酸ミックス（７０：２９．５：０．５）を付加し、試料を、２分間激しく混合した。次いで、混合物を、上記のように遠心分離し、上清を、ＯＲＡＣ－Ｈプレートアッセイにおいて使用した。試料を、必要に応じて、リン酸緩衝液で希釈した。曲線下面積（ＡＵＣ）を計算し、Ｔｒｏｌｏｘ標準についてのＡＵＣ値に対して比較した。ＯＲＡＣ値を、μＭのＴｒｏｌｏｘ当量／ｇ試料として報告する。
【0425】
フェノール
総フェノール含有量、並びに遊離、コンジュゲート、及び結合状態におけるフェノールを、抽出後に、若干修正された、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．（２００８）によって記載されている方法に従って判定した。簡潔には、遊離フェノールを、ガラスバイアル（８ｍｌの容量）内で１０分間超音波処理することによって２ｍＬの８０％メタノール中に抽出した後に、１００ｍｇの試料内で判定した。上清を、第２のガラスバイアルに移し、残留物の抽出を反復した。組み合わされた上清を、窒素下で蒸発させて乾燥させた。２ｍＬの２％酢酸を付加して、ｐＨを約２に調整し、次いで、３ｍＬの酢酸エチルを付加して、振盪しながらフェノールを２分間抽出した。バイアルを、２０００×ｇで５分間１０℃で遠心分離した。上清を、清浄なガラスバイアルに移し、抽出を、更に２回反復した。組み合わされた上清を、窒素下３７℃で蒸発させた。残留物を、２ｍＬの８０％メタノール中に溶解させ、冷蔵した。
総フェノール含有量、並びに遊離、コンジュゲート、及び結合状態におけるフェノールを、抽出後に、若干修正された、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．（２００８）によって記載されている方法に従って判定した。簡潔には、遊離フェノールを、ガラスバイアル（８ｍｌの容量）内で１０分間超音波処理することによって２ｍＬの８０％メタノール中に抽出した後に、１００ｍｇの試料内で判定した。上清を、第２のガラスバイアルに移し、残留物の抽出を反復した。組み合わされた上清を、窒素下で蒸発させて乾燥させた。２ｍＬの２％酢酸を付加して、ｐＨを約２に調整し、次いで、３ｍＬの酢酸エチルを付加して、振盪しながらフェノールを２分間抽出した。バイアルを、２０００×ｇで５分間１０℃で遠心分離した。上清を、清浄なガラスバイアルに移し、抽出を、更に２回反復した。組み合わされた上清を、窒素下３７℃で蒸発させた。残留物を、２ｍＬの８０％メタノール中に溶解させ、冷蔵した。
【0426】
コンジュゲートされたフェノールについての試料を、初期の８０％メタノール抽出のための遊離フェノールアッセイについて処理した。この時点で、２．５ｍＬの２Ｍの水酸化ナトリウム及び磁気棒を、ガラスバイアル内の蒸発させた上清に付加し、次いで、ガラスバイアルを、窒素で充填し、堅固にキャップを閉めた。バイアルを、混合し、撹拌しながら１１０℃で１時間加熱した。試料を、氷上で冷却した後に、３ｍＬの酢酸エチルで、振盪によって２分間抽出した。バイアルを、２０００×ｇで５分間１０℃で遠心分離した。上清を廃棄し、ｐＨを、１２ＭのＨＣｌで約２に調整した。フェノールを、遊離フェノールについて記載されるように、３×３ｍＬの酢酸エチルアリコートを使用して抽出した。上清を、組み合わせ、窒素下で３７℃で蒸発させて乾燥させ、残留物を、２ｍＬの８０％メタノール中に取り込み、冷蔵した。
【0427】
結合したフェノールを、遊離フェノールのメタノール抽出後の残留物から測定した。２．５ｍＬの２Ｍの水酸化ナトリウム及び磁気棒を、残留物に付加した後に、バイアルを、窒素で充填し、堅固にキャップを閉めた。バイアルを、混合し、撹拌しながら１１０℃で１時間加熱した。試料を、氷上で冷却した後に、３ｍＬの酢酸エチルで、振盪によって２分間抽出した。バイアルを、２０００×ｇで５分間１０℃で遠心分離した。上清を廃棄し、ｐＨを、１２ＭのＨＣｌで約２に調整した。フェノールを、遊離フェノールについて記載されるように、３×３ｍＬの酢酸エチルアリコートで抽出した。上清を、組み合わせ、窒素下で３７℃で蒸発させて乾燥させ、残留物を、２ｍＬの８０％メタノール中に取り込み、冷蔵した。
【0428】
総フェノールを、１００ｍｇの試料を使用して、２００μＬの８０％メタノールを付加して試料を湿らせた後に加水分解することによって判定した。２．５ｍＬの２Ｍの水酸化ナトリウム及び磁気棒を付加した後に、バイアルを、窒素で充填し、堅固にキャップを閉めた。バイアルを、混合し、撹拌しながら１１０℃で１時間加熱した。試料を、氷上で冷却した後に、３ｍＬの酢酸エチルで、振盪によって２分間抽出した。バイアルを、２０００×ｇで５分間１０℃で遠心分離した。上清を廃棄し、ｐＨを、１２ＭのＨＣｌで約２に調整した。フェノールを、遊離フェノールについて記載されるように、３×３ｍＬの酢酸エチルアリコートで抽出した。上清を、組み合わせ、窒素下で３７℃で蒸発させて乾燥させ、残留物を、４ｍＬの８０％メタノール中に取り込み、冷蔵した。
【0429】
処理された／抽出された試料内のフェノールの量を、フェノールの判定のためのフォリンシオカルトアッセイを使用して測定した。０、１．５６、３．１３、６．２５、１２．５、及び２５μｇ／ｍＬでの没食子酸標準物を使用して、標準曲線を調製した。１ｍＬの標準物を、４ｍＬのガラスチューブに付加した。試験試料について、１００μＬの完全に混合された試料アリコートを、４ｍＬのガラスチューブ内の９００μＬの水に付加した。次いで、１００ｍＬのフォリンシオカルト試薬を、各々のチューブに付加し、各々のチューブを直ちにボルテックスした。７００μＬの１Ｍの炭酸水素ナトリウム溶液を、２分後に付加し、次いで、ボルテックスによって混合した。各々の溶液を、室温で暗所で１時間インキュベートし、次いで、吸光度を７６５ｎｍで読み取った。結果を、μｇの没食子酸当量／ｇ試料で表した。
【0430】
フィテート
粉試料のフィテート含有量の判定は、ＡＯＡＣ Ｏｆｆｉｃｉａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ａｎａｌｙｓｉｓ（１９９０）に記載されているように、Ｈａｒｌａｎｄ ａｎｄ Ｏｂｅｒｌｅａｓの方法に基づいた。簡潔には、０．５ｇの粉試料を、秤量し、２．４％のＨＣｌで、回転輪（３０ｒｐｍ）を使用して１時間室温で抽出した。次いで、混合物を、２０００×ｇで１０分間遠心分離し、上清を、抽出し、ｍｉｌｌｉ－Ｑ水で２０倍に希釈した。アニオン交換カラム（５００ｍｇ Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を、真空マニホールド上に置き、製造業者の説明書に従って使用するためにコンディショニングした。次いで、希釈された上清を、カラム上にロードし、非フィテート種を、０．０５ＭのＨＣｌで洗浄することによって除去した。次いで、フィテートを、２ＭのＨＣｌで溶出した。収集された溶出物を、加熱ブロックを使用して消化した。試料を冷却し、容積を、ｍｉｌｌｉ－Ｑ水で最大１０ｍＬにした。リンレベルを、分光光度法によって、モリブデン酸、スルホン酸着色法を使用して、６４０ｎｍでの吸光度読み取りで判定した。フィテートを、以下の式を使用して計算した：
フィテート（ｍｇ／ｇ）＝Ｐ ｃｏｎｃ＊Ｖ１＊Ｖ２／（１０００＊試料重量＊０．２８２）
式中、Ｐ ｃｏｎｃは、分光光度法によって判定された場合、リンの濃度（μｇ／ｍＬ）であり、Ｖ１は、最終溶液の容積であり、Ｖ２は、抽出されたフィテート溶液の容積であり、０．２８２は、リンからフィテートへの変換係数である。
粉試料のフィテート含有量の判定は、ＡＯＡＣ Ｏｆｆｉｃｉａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ａｎａｌｙｓｉｓ（１９９０）に記載されているように、Ｈａｒｌａｎｄ ａｎｄ Ｏｂｅｒｌｅａｓの方法に基づいた。簡潔には、０．５ｇの粉試料を、秤量し、２．４％のＨＣｌで、回転輪（３０ｒｐｍ）を使用して１時間室温で抽出した。次いで、混合物を、２０００×ｇで１０分間遠心分離し、上清を、抽出し、ｍｉｌｌｉ－Ｑ水で２０倍に希釈した。アニオン交換カラム（５００ｍｇ Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を、真空マニホールド上に置き、製造業者の説明書に従って使用するためにコンディショニングした。次いで、希釈された上清を、カラム上にロードし、非フィテート種を、０．０５ＭのＨＣｌで洗浄することによって除去した。次いで、フィテートを、２ＭのＨＣｌで溶出した。収集された溶出物を、加熱ブロックを使用して消化した。試料を冷却し、容積を、ｍｉｌｌｉ－Ｑ水で最大１０ｍＬにした。リンレベルを、分光光度法によって、モリブデン酸、スルホン酸着色法を使用して、６４０ｎｍでの吸光度読み取りで判定した。フィテートを、以下の式を使用して計算した：
フィテート（ｍｇ／ｇ）＝Ｐ ｃｏｎｃ＊Ｖ１＊Ｖ２／（１０００＊試料重量＊０．２８２）
式中、Ｐ ｃｏｎｃは、分光光度法によって判定された場合、リンの濃度（μｇ／ｍＬ）であり、Ｖ１は、最終溶液の容積であり、Ｖ２は、抽出されたフィテート溶液の容積であり、０．２８２は、リンからフィテートへの変換係数である。
【0431】
総ミネラル含有量の推定
試料の全ミネラル含有量を、灰アッセイによって、ＡＯＡＣ法９２３．０３及び９３０．２２を使用して測定した。約２ｇの粉を、５４０℃で１５時間加熱し、次いで、灰残留物の質量を秤量した。０．５ｇの全粒粉試料を、チューブブロック消化を使用して、８Ｍの硝酸で、１４０℃で８時間消化した。次いで、亜鉛、鉄、カリウム、マグネシウム、リン、及び硫黄含有量を、誘導結合プラズマ原子発光分析（ＩＣＰ－ＡＥＳ）を使用して、Ｚａｒｃｉｎａｓ（１９８３ａ及び１９８３ｂ）に従って解析した。
試料の全ミネラル含有量を、灰アッセイによって、ＡＯＡＣ法９２３．０３及び９３０．２２を使用して測定した。約２ｇの粉を、５４０℃で１５時間加熱し、次いで、灰残留物の質量を秤量した。０．５ｇの全粒粉試料を、チューブブロック消化を使用して、８Ｍの硝酸で、１４０℃で８時間消化した。次いで、亜鉛、鉄、カリウム、マグネシウム、リン、及び硫黄含有量を、誘導結合プラズマ原子発光分析（ＩＣＰ－ＡＥＳ）を使用して、Ｚａｒｃｉｎａｓ（１９８３ａ及び１９８３ｂ）に従って解析した。
【0432】
ミネラルを、ＣＳＩＲＯ、Ｕｒｒｂｒａｅ，Ａｄｅｌａｉｄｅ Ｓｏｕｔｈ Ａｕｓｔｒａｌｉａ、Ｗａｉｔｅ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｓｅｒｖｉｃｅ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ａｄｅｌａｉｄｅ、Ｗａｉｔｅ，Ｓｏｕｔｈ Ａｕｓｔｒａｌｉａ）、及びＤａｉｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（ＤＴＳ、Ｎｏｒｔｈ Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ，Ｖｉｃｔｏｒｉａ）において解析した。要素を、ＣＳＩＲＯにおいて、硝酸溶液での消化後に、誘導結合プラズマ発光分析（ＩＣＰ－ＯＥＳ）によって、又はＤＴＳにおいて、希硝酸及び過酸化水素での消化後に、若しくは硝酸／過塩素酸溶液での消化後に、ＩＣＰ－ＡＥＳによって判定した。
【0433】
ビタミン
ビタミンＢ３（ナイアシン）、Ｂ６（ピリドキシン）、及び総フォレート解析を、ＤＴＳ及びＮａｔｉｏｎａｌ Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＮＭＩ）によって実行した。ナイアシンを、ＡＯＡＣ Ｍｅｔｈｏｄｓ １３ｔｈ Ｅｄ（１９８０）４３．０４５によって、Ｌａｈｅｙ，ｅｔ ａｌ．（１９９９）に従って測定した。ピリドキシンを、Ｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（２００１）に従って測定した。方法は、ピリドキシン（ピリドキソール）内へのリン酸化及び遊離ビタミンＢ６形態のプレカラム変換を組み込んだ。酸性ホスファターゼ加水分解を使用して、脱リン酸化し、続いて、グリオキシル酸でＦｅ２＋の存在下で脱アミノ化して、ピリドキサミンをピリドキサールに変換した。次いで、ピリドキサールを、水素化ホウ素ナトリウムによってピリドキシンに還元した。
ビタミンＢ３（ナイアシン）、Ｂ６（ピリドキシン）、及び総フォレート解析を、ＤＴＳ及びＮａｔｉｏｎａｌ Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＮＭＩ）によって実行した。ナイアシンを、ＡＯＡＣ Ｍｅｔｈｏｄｓ １３ｔｈ Ｅｄ（１９８０）４３．０４５によって、Ｌａｈｅｙ，ｅｔ ａｌ．（１９９９）に従って測定した。ピリドキシンを、Ｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（２００１）に従って測定した。方法は、ピリドキシン（ピリドキソール）内へのリン酸化及び遊離ビタミンＢ６形態のプレカラム変換を組み込んだ。酸性ホスファターゼ加水分解を使用して、脱リン酸化し、続いて、グリオキシル酸でＦｅ２＋の存在下で脱アミノ化して、ピリドキサミンをピリドキサールに変換した。次いで、ピリドキサールを、水素化ホウ素ナトリウムによってピリドキシンに還元した。
【0434】
葉酸を、ＶｉｔａＦａｓｔ葉酸キットに従って、製造業者の説明書を使用して、又はＡＯＡＣ法２００４．０５に従って測定した。
【0435】
実施例２．厚アリューロン（ｔａ）変異体の単離及び特徴付け
変異誘発米集団の確立及び栽培
野生型米品種Ｚｈｏｎｇｈｕａ １１（ＺＨ１１）からの約８０００個の（Ｍ０穀粒と称する）穀粒を、６０ｍＭのメタンスルホン酸エチル（ＥＭＳ）での処理によって、標準的な条件を使用して変異誘発させた。変異誘発穀粒を、圃場に播種し、得られた植物を、栽培して、Ｍ１穀粒を産生した。Ｍ１穀粒を、収穫し、次いで、圃場に播種して、Ｍ１植物を産生した。８９２５個の穂を、１３２７個の個別のＭ１植物から収穫した。これらの植物から、各々の穂から少なくとも４つの穀粒を含む、３６，４２０個のＭ２穀粒がスクリーニングされた。
変異誘発米集団の確立及び栽培
野生型米品種Ｚｈｏｎｇｈｕａ １１（ＺＨ１１）からの約８０００個の（Ｍ０穀粒と称する）穀粒を、６０ｍＭのメタンスルホン酸エチル（ＥＭＳ）での処理によって、標準的な条件を使用して変異誘発させた。変異誘発穀粒を、圃場に播種し、得られた植物を、栽培して、Ｍ１穀粒を産生した。Ｍ１穀粒を、収穫し、次いで、圃場に播種して、Ｍ１植物を産生した。８９２５個の穂を、１３２７個の個別のＭ１植物から収穫した。これらの植物から、各々の穂から少なくとも４つの穀粒を含む、３６，４２０個のＭ２穀粒がスクリーニングされた。
【0436】
半穀粒の染色による変異体スクリーニング
Ｍ２米穀粒の果実皮（内穎及び外穎）を除去した。３６，４２０個の穀粒の各々を、横方向に二分した。胚を含有する半分を、後続の発芽のために９６ウェルプレート内に保存し、胚を有しない各々の半穀粒を、エバンスブルーで染色し、解剖顕微鏡下で観察して、野生型に対して肥厚アリューロンを有する変異型穀粒を検出した。染色は、エバンスブルーが、非生存細胞、例えば、デンプン性胚乳の細胞などのみに浸透及び染色することができ、色変化が、生存アリューロン層内で観察されないという原理に基づいた。初期のエバンスブルー染色及び組織学的解析から、アリューロン厚さの有意な増加を示す個別の穀粒、及び種子の腹側アリューロンの有意な肥厚を示す穀粒が観察された。他の穀粒は、アリューロン厚さの増加を示したが、より少ない程度であった。各々の種子の腹側の未染色領域を、アリューロン層の厚さについて特に検査した。また、穀粒の背側におけるアリューロン層の厚さの増加を有するバリアントを観察した。断面全体にわたってアリューロン層の厚さの有意な増加を有するバリアントのみを、更なる解析のために選択した。
Ｍ２米穀粒の果実皮（内穎及び外穎）を除去した。３６，４２０個の穀粒の各々を、横方向に二分した。胚を含有する半分を、後続の発芽のために９６ウェルプレート内に保存し、胚を有しない各々の半穀粒を、エバンスブルーで染色し、解剖顕微鏡下で観察して、野生型に対して肥厚アリューロンを有する変異型穀粒を検出した。染色は、エバンスブルーが、非生存細胞、例えば、デンプン性胚乳の細胞などのみに浸透及び染色することができ、色変化が、生存アリューロン層内で観察されないという原理に基づいた。初期のエバンスブルー染色及び組織学的解析から、アリューロン厚さの有意な増加を示す個別の穀粒、及び種子の腹側アリューロンの有意な肥厚を示す穀粒が観察された。他の穀粒は、アリューロン厚さの増加を示したが、より少ない程度であった。各々の種子の腹側の未染色領域を、アリューロン層の厚さについて特に検査した。また、穀粒の背側におけるアリューロン層の厚さの増加を有するバリアントを観察した。断面全体にわたってアリューロン層の厚さの有意な増加を有するバリアントのみを、更なる解析のために選択した。
【0437】
野生型の半穀粒と比較して、エバンスブルーでの未染色領域がより厚い半穀粒を選択した。検査された３６，４２０個の穀粒のうち、アリューロン厚さにおいて差を有する２１９個の穀粒（０．６０％）が同定及び選択された。これらは、１４０個の個別のＭ１植物からの１６２個の穂から得られ、したがって、大部分が、独立した変異体を表した。特に、厚アリューロン１（ｔａ１）と称される遺伝子内に変異を有する１つの変異型穀粒を、以下に記載するように同定し更に特徴付けた。対応する野生型遺伝子を、ＴＡ１と称し、この名称を本明細書で使用する。変異型アレルを、ＴＡ１遺伝子内の最初に同定された変異として、ｔａ１－１と称した。
【0438】
推定変異型系統を維持するために、各々の対応する有胚半穀粒を、１％のＢａｃｔｏ寒天（Ｂａｃｔｏ、２１４０３０）で固化させた半強度ＭＳ塩培地（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ ａｎｄ Ｓｋｏｏｇ，１９６２）を含有する培地上で発芽させ、２５℃で１５００～２０００ルクスの光強度下で、１６時間の明／８時間の暗サイクルで培養した。小植物を、２つ～３つの小葉の段階において土壌に移し、得られた植物を、成熟まで成長させた。対応する有胚半穀粒の発芽及び栽培の際に、１１５個の種子（５２．５％の生存率）を成長させて、成熟稔性植物を産生した。
【0439】
全般的な農学的形質においてほとんど又は全く欠陥を示さない候補変異型植物、例えば、野生型親変種に対して通常の植物高さ、稔性（雄及び雌稔性）、穀粒サイズ、及び１，０００個の穀粒重量であり、肥厚アリューロン形質の安定した遺伝を示す候補変異型植物を、同定、選択、及び更に解析した。これらのうち、３つ～５つの細胞層をアリューロンの少なくとも一部分内に示したＭ３世代の穀粒を選択し、詳細に解析し、Ｍ３世代の穀粒は、ｔａ１－１変異型アレルを有した。野生型ＺＨ１１穀粒は、予想とおりに、１つ～２つの細胞層のアリューロンを穀粒のほとんどの周りに示した。
【0440】
ｔａ１－１変異型穀粒の組織学的解析
野生型ＺＨ１１及びホモ接合性ｔａ１－１変異型植物からの発達中の穀粒を、研究し、受粉後（ＤＡＰ）１～３０日目の形態変化について比較した。米穀粒の登熟期は、乳穀粒段階、生地穀粒段階、及び成熟穀粒段階の３つの段階を有すると言える。生地穀粒段階において、野生型穂内の穀粒は、緑色から黄色に変化し始め、続いて、軸と穎花とを接続する小胞組織が徐々に破壊する。ｔａ１－１穂内の穀粒は、色の変化が遅延した。また、米穀粒の横断面の顕微鏡検査は、ｔａ１－１変異型穀粒内の白亜性（不透明感）の程度の増加を示した。次いで、走査電子顕微鏡法（ＳＥＭ）を使用して、デンプン性胚乳の中央部分内のデンプン顆粒組織の構造を研究した。野生型穀粒内では、デンプン顆粒は、堅固に充填されており、滑らかな表面及び規則的な形状を示し、ｔａ１－１穀粒内では、不規則な形状のデンプン顆粒のより緩い充填が観察された。要約すると、穀粒成熟の遅延、穀粒の白亜性の程度の増加、及びデンプン顆粒構造の増加の少なくとも３つの変化が、ｔａ１－１変異を有する植物及び穀粒において観察された。
野生型ＺＨ１１及びホモ接合性ｔａ１－１変異型植物からの発達中の穀粒を、研究し、受粉後（ＤＡＰ）１～３０日目の形態変化について比較した。米穀粒の登熟期は、乳穀粒段階、生地穀粒段階、及び成熟穀粒段階の３つの段階を有すると言える。生地穀粒段階において、野生型穂内の穀粒は、緑色から黄色に変化し始め、続いて、軸と穎花とを接続する小胞組織が徐々に破壊する。ｔａ１－１穂内の穀粒は、色の変化が遅延した。また、米穀粒の横断面の顕微鏡検査は、ｔａ１－１変異型穀粒内の白亜性（不透明感）の程度の増加を示した。次いで、走査電子顕微鏡法（ＳＥＭ）を使用して、デンプン性胚乳の中央部分内のデンプン顆粒組織の構造を研究した。野生型穀粒内では、デンプン顆粒は、堅固に充填されており、滑らかな表面及び規則的な形状を示し、ｔａ１－１穀粒内では、不規則な形状のデンプン顆粒のより緩い充填が観察された。要約すると、穀粒成熟の遅延、穀粒の白亜性の程度の増加、及びデンプン顆粒構造の増加の少なくとも３つの変化が、ｔａ１－１変異を有する植物及び穀粒において観察された。
【0441】
ＤＡＰ６、７、８、９、１０、１２、１５、１８、２１、２４、２７、及び３０日目の発達中の変異型及び野生型穀粒を、エバンスブルーで染色し、アリューロン層を、光学顕微鏡法によって検査した。発達中のアリューロン層の厚さにおける有意差は、最大ＤＡＰ１０日目まで、野生型穀粒とｔａ１－１変異型穀粒との間で観察されなかった。ＤＡＰ１０日目後に、ｔａ１－１変異体のアリューロン層は、野生型穀粒内のアリューロン層よりも厚く、差は、ＤＡＰ約２０日目で最大に達した。図１は、デンプン性胚乳を強調するルゴール試薬での種子切片の染色（図１、パネルＥ及びＦ）、並びに種子の準超薄切片のＰＡＳ及びクーマシーブリリアントブルー（Ｇ－２５０）染色を示して、３つの発達時点での野生型（ＺＨ１１）及びｔａ１－１変異体内のアリューロンの発達を実証する。
【0442】
野生型及びｔａ１－１変異型穀粒（ＤＡＰ３０日目）を、薄切（１μｍ）、染色、及び光学顕微鏡法によって、組織学的差について更に検査した。核酸を青色に染色し多糖を紫色に染色する０．１％トルイジンブルーで染色した後に、単一層の大きい規則的に配向された長方形細胞が、野生型アリューロン内で観察された。対照的に、ｔａ１－１変異型穀粒の切片は、３つ～５つの細胞層のアリューロン層を有し、細胞はまた、様々なサイズ及び不規則な配向を有した。これらの観察は、ｔａ１－１穀粒内の肥厚アリューロンが、主に、個別のアリューロン細胞の拡大ではなく、細胞層の数の増加によって引き起こされたことを示した。
【0443】
蛍光細胞壁染色である０．０１％カルコフロールホワイトでの更なる染色は、野生型穀粒とｔａ１－１変異型穀粒との間の細胞壁厚さにおける差を、アリューロン層内で示さなかった。野生型及びｔａ１－１穀粒の両方について、アリューロン細胞の細胞壁は、デンプン性胚乳内の細胞壁よりも厚かった。
【0444】
成熟野生型及びｔａ１－１穀粒を、横方向に薄切し、実施例１に記載されるように、ＰＡＳで染色した。各々の遺伝子型の１５個の穀粒について、穀粒の背側、上側、側、下側、及び腹側位置におけるアリューロンの厚さを、細胞層の数として計算し、計数し、統計的に解析した。結果を、図２に示す。野生型及び変異型穀粒の両方について、細胞層の数は、成熟穀粒の５つの異なる位置において均一でなかったが、全ての位置において、変異型穀粒についての細胞層の数は、野生型穀粒についてよりも有意に多かった（Ｐ＜０．０１）ことが観察された。
【0445】
植物成長及び発達中の登熟を、穀粒乾燥重量をＤＡＰ３、６、９、１２、１８、２６、３４、及び４２日目に測定することによって検査し、野生型穀粒と比較した。結果（図３）は、ｔａ１－１穀粒について、低減された登熟を示した。
【0446】
ｔａ１変異型植物及び穀粒の農学的特徴の解析
野生型（ＺＨ１１）植物と３世代にわたって圃場で戻し交雑して、ＢＣ３Ｆ３世代を得、それによって、変異誘発処理から生じ得た追加の非連結変異を除去して、ｔａ１－１変異型植物を、いくつかの農学的形質について解析した。ｔａ１－１変異型植物及び穀粒は、野生型植物及び穀粒と比較して、植物高さ、長さ、幅、及び厚さに関する穀粒サイズ、並びに穎花形態において有意に異ならなかった（表２）。対照的に、野生型植物は、９８．９０％の結実度を示し、ホモ接合性ｔａ１－１変異型植物は、８９．３２％の結実度の減少を示した。結実度を、成熟穀粒段階によって種子によって満たされた、植物内の小花の百分率として計算した。また、ｔａ１－１変異型穀粒は、２８℃で１２時間の明／１２時間の暗サイクル下で湿度制御なしで、グロースチャンバ内で培養されたときに、野生型穀粒の９７．３％の発芽能と比較して、４９．８％の発芽能の減少を示した。発芽を、小根が種皮を通って可視的に出芽したときとして定義した。
野生型（ＺＨ１１）植物と３世代にわたって圃場で戻し交雑して、ＢＣ３Ｆ３世代を得、それによって、変異誘発処理から生じ得た追加の非連結変異を除去して、ｔａ１－１変異型植物を、いくつかの農学的形質について解析した。ｔａ１－１変異型植物及び穀粒は、野生型植物及び穀粒と比較して、植物高さ、長さ、幅、及び厚さに関する穀粒サイズ、並びに穎花形態において有意に異ならなかった（表２）。対照的に、野生型植物は、９８．９０％の結実度を示し、ホモ接合性ｔａ１－１変異型植物は、８９．３２％の結実度の減少を示した。結実度を、成熟穀粒段階によって種子によって満たされた、植物内の小花の百分率として計算した。また、ｔａ１－１変異型穀粒は、２８℃で１２時間の明／１２時間の暗サイクル下で湿度制御なしで、グロースチャンバ内で培養されたときに、野生型穀粒の９７．３％の発芽能と比較して、４９．８％の発芽能の減少を示した。発芽を、小根が種皮を通って可視的に出芽したときとして定義した。
【表2】
【0447】
実施例３．ｔａ１－１変異の遺伝子解析
交雑を行って、ｔａ１変異の遺伝的制御、特に、変異が顕性又は潜性であるか、並びに変異が雄及び雌親の一方又は両方から遺伝したかを判定した。２つの遺伝子実験を実行して、厚アリューロン表現型が母性的に決定されたかを判定した。第一に、試験交雑を、母性ホモ接合性ｔａ１－１植物と野生型ＺＨ１１植物からの花粉との間で実行した。Ｆ２子孫穀粒を得た。Ｆ２穀粒のうち、２４．１％（ｎ＝１０９３）は、厚アリューロン表現型を示し、これは、Ｆ２集団内の潜性核コード変異のメンデル遺伝について予測された３：１（野生型：変異型）比と一致する。Ｆ１種子の９８．７％（ｎ＝２１８）は、野生型アリューロン表現型を有することが観察されたが、種子の残りの１．３％は、スコア化するのが困難であったが、Ｆ２世代における野生型アリューロンを有すると判明された。第二に、相互交雑を、野生型植物に雌親として適用された、ｔａ１－１植物からの花粉を使用して実行した。相互交雑から、Ｆ１種子の９９．７％（ｎ＝３２５）が、野生型アリューロン表現型を示した。これらのデータは、ｔａ１－１の厚アリューロン表現型が、変異型アレルが野生型アレルに対して潜性であった単一核遺伝子によって制御されたことを示した。
交雑を行って、ｔａ１変異の遺伝的制御、特に、変異が顕性又は潜性であるか、並びに変異が雄及び雌親の一方又は両方から遺伝したかを判定した。２つの遺伝子実験を実行して、厚アリューロン表現型が母性的に決定されたかを判定した。第一に、試験交雑を、母性ホモ接合性ｔａ１－１植物と野生型ＺＨ１１植物からの花粉との間で実行した。Ｆ２子孫穀粒を得た。Ｆ２穀粒のうち、２４．１％（ｎ＝１０９３）は、厚アリューロン表現型を示し、これは、Ｆ２集団内の潜性核コード変異のメンデル遺伝について予測された３：１（野生型：変異型）比と一致する。Ｆ１種子の９８．７％（ｎ＝２１８）は、野生型アリューロン表現型を有することが観察されたが、種子の残りの１．３％は、スコア化するのが困難であったが、Ｆ２世代における野生型アリューロンを有すると判明された。第二に、相互交雑を、野生型植物に雌親として適用された、ｔａ１－１植物からの花粉を使用して実行した。相互交雑から、Ｆ１種子の９９．７％（ｎ＝３２５）が、野生型アリューロン表現型を示した。これらのデータは、ｔａ１－１の厚アリューロン表現型が、変異型アレルが野生型アレルに対して潜性であった単一核遺伝子によって制御されたことを示した。
【0448】
実施例４．ｔａ１－１変異型穀粒内の栄養構成要素の解析
変異型穀粒の組成を、特に、栄養的に重要な構成要素について測定するために、ＺＨ１１及びホモ接合性ｔａ１－１植物を、圃場で同時に同じ条件下で成長させた。全粒粉又は玄米粉とも本明細書で称される全穀粒粉の試料を、植物から収穫された穀粒から調製し、実施例１に記載される方法を使用して、組成解析のために使用した。粉の近似分析の結果を、表３に示し、二重反復測定値の平均を示す。
変異型穀粒の組成を、特に、栄養的に重要な構成要素について測定するために、ＺＨ１１及びホモ接合性ｔａ１－１植物を、圃場で同時に同じ条件下で成長させた。全粒粉又は玄米粉とも本明細書で称される全穀粒粉の試料を、植物から収穫された穀粒から調製し、実施例１に記載される方法を使用して、組成解析のために使用した。粉の近似分析の結果を、表３に示し、二重反復測定値の平均を示す。
【0449】
近似分析は、ｔａ１－１変異型粉内の総脂肪含有量の約３０％の増加を示した。総窒素解析は、ｔａ１－１変異型穀粒と野生型穀粒との間のタンパク質レベルの有意な変化を示さなかった。除湿された粉試料の燃焼後に残された材料の量を測定した灰アッセイは、野生型に対して、ｔａ１－１穀粒内で２０％の増加を実証した。総繊維レベルは、ｔａ１－１穀粒内で約９４％増加した。デンプン含有量は、野生型に対して、ｔａ１－１穀粒内で５％減少した。これらのデータは、ｔａ１－１変異体内のアリューロン層の厚さの増加が、アリューロンに富む栄養素、例えば、脂質、ミネラル、及び総食物繊維のレベルの増加を、種子のサイズを変化させることなく引き起こしたことを実証した。これらの変化及び他の変化をより詳細に理解するために、広範な解析を、以下のように行った。
【表3】
【0450】
更なる組成解析を、図４に記録し、更なる組成解析は、玄米粉内のタンパク質、食物繊維、カルシウム、鉄、亜鉛、ビタミンＢ２、及びビタミンＢ３の統計的に有意な増加を確認した。
【0451】
ミネラル
ミネラル含有量を測定するために、誘導結合プラズマ（ＩＣＰ）を原子発光分析（ＡＥＳ）技法と組み合わせたＩＣＰ－ＡＥＳを使用した（実施例１）。これは、ミネラル含有量を測定するための標準的な方法であり、単一解析における多数の要素の高感度高スループット定量化を提供した。解析から得られたデータは、ｔａ１－１変異型穀粒が、１３．９ｍｇ／ｋｇから１５．６８ｍｇ／ｋｇに約１５％増加した亜鉛レベルを有したことを示した。圃場で成長したｔａ１－１全穀粒粉の同じ試料内で、鉄は、１２．４３ｍｇ／ｋｇから１３．０３ｍｇ／ｋｇに５％増加した。
ミネラル含有量を測定するために、誘導結合プラズマ（ＩＣＰ）を原子発光分析（ＡＥＳ）技法と組み合わせたＩＣＰ－ＡＥＳを使用した（実施例１）。これは、ミネラル含有量を測定するための標準的な方法であり、単一解析における多数の要素の高感度高スループット定量化を提供した。解析から得られたデータは、ｔａ１－１変異型穀粒が、１３．９ｍｇ／ｋｇから１５．６８ｍｇ／ｋｇに約１５％増加した亜鉛レベルを有したことを示した。圃場で成長したｔａ１－１全穀粒粉の同じ試料内で、鉄は、１２．４３ｍｇ／ｋｇから１３．０３ｍｇ／ｋｇに５％増加した。
【0452】
また、カリウム、マグネシウム、リン、及び硫黄の増加が、観察され、それぞれ、約２６％、２３％、２２％及び１０％増加した。これらの結果は、ｔａ１－１穀粒内の灰含有量の増加と一致し、これは、ほとんどミネラルを測定した。
【0453】
抗酸化物質
抗酸化物質は、動物組織内の酸化のマイナス効果に対抗することが可能である生体分子であり、したがって、酸化ストレス関連疾患、例えば、炎症、心血管疾患、がん、及び老化関連障害から保護する（Ｈｕａｎｇ，２００５）。
抗酸化物質は、動物組織内の酸化のマイナス効果に対抗することが可能である生体分子であり、したがって、酸化ストレス関連疾患、例えば、炎症、心血管疾患、がん、及び老化関連障害から保護する（Ｈｕａｎｇ，２００５）。
【0454】
ｔａ１－１変異型及び野生型米穀粒から得られた全粒粉内の抗酸化能を、実施例１に記載されるように、酸素ラジカル吸収能（ＯＲＡＣ）アッセイによって測定した。ＯＲＡＣアッセイにおいて、抗酸化能は、ＡＡＰＨ（２，２’－アゾビス（２－アミジノ－プロパン）二塩酸塩）によって産生される合成フリーラジカルに対する、内在性ラジカル捕捉生体分子と酸化可能分子蛍光プローブフルオレセインとの間のきっ抗動力学によって表される。抗酸化能を、穀粒についての分子プローブフルオレセインの蛍光分解速度論を表す運動曲線（ＡＵＣ）下面積とトロロクス標準物によって生成されたＡＵＣとの比較によって計算した（Ｐｒｉｏｒ、２００５）。抗酸化能を定量化するための代替の手法は、フォリン－シオカルト試薬（ＦＣＲ）の使用による手法であり、これは、食品試料内の総フェノール化合物の低減する抗酸化能を測定することによって、抗酸化能を表した。ＦＣＲアッセイは、比較的単純、好都合、かつ再現可能であった。しかしながら、より時間のかかるＯＲＡＣアッセイは、より生物学的に関連する活性を測定した。抗酸化物質は、広範囲なポリフェノール、還元剤、求核試薬を含むため、ＦＣＲ及びＯＲＡＣの両方による測定は、総抗酸化能のより良好なカバレッジを提供し、総抗酸化能をより包括的に表すことができる。Ｐｒｉｏｒ（２００５）によって報告されているように、ＦＣＲアッセイ及びＯＲＡＣ測定の結果は、通常一致する。
【0455】
ＦＣＲ及びＯＲＡＣアッセイの両方は、野生型ＺＨ１１全穀粒粉に対して、ｔａ１－１変異型全穀粒粉からの粉の増加した抗酸化能を示した。ＯＲＡＣは、ｔａ１－１変異型穀粒内の抗酸化能の約４６％の増加、及び総フェノールの３０％の増加を実証した。
【0456】
フィテート
適切なリンを有する条件下で成長したときに、米穀粒内の総リン含有量の約７０％が、フィテート又はフィチン酸の形態である（ミオ－イノシトール－１，２，３，４，５，６－六リン酸）。食物フィテートはまた、強力な抗酸化物質として健康に有益な役割を果たし得る（Ｓｃｈｌｅｍｍｅｒ、２００９）。総フィテート解析は、野生型ＺＨ１１穀粒と比較して、約１０．８ｍｇ／ｇから約１２．４ｍｇ／ｇへの増加である、ｔａ１－１穀粒内のフィテート含量の約１５％増加を示した。
適切なリンを有する条件下で成長したときに、米穀粒内の総リン含有量の約７０％が、フィテート又はフィチン酸の形態である（ミオ－イノシトール－１，２，３，４，５，６－六リン酸）。食物フィテートはまた、強力な抗酸化物質として健康に有益な役割を果たし得る（Ｓｃｈｌｅｍｍｅｒ、２００９）。総フィテート解析は、野生型ＺＨ１１穀粒と比較して、約１０．８ｍｇ／ｇから約１２．４ｍｇ／ｇへの増加である、ｔａ１－１穀粒内のフィテート含量の約１５％増加を示した。
【0457】
Ｂビタミン
ｔａ１－１粉内のビタミンＢ３（ナイアシン）、Ｂ６（ピリドキシン）、及びＢ９（フォレート）のレベルは、野生型粉内のものよりも、それぞれ、約９％、１２０％、及び６１％高かった。アリューロンは、胚乳よりもビタミンＢ３、Ｂ６、及びＢ９に富むことが既知であり（Ｃａｌｈｏｕｎ，１９６０）、このため、ｔａ１－１変異型穀粒内のアリューロン厚さの増加は、これらのビタミン及びおそらく他のビタミンについてのより強力なシンクをもたらした可能性があった。
ｔａ１－１粉内のビタミンＢ３（ナイアシン）、Ｂ６（ピリドキシン）、及びＢ９（フォレート）のレベルは、野生型粉内のものよりも、それぞれ、約９％、１２０％、及び６１％高かった。アリューロンは、胚乳よりもビタミンＢ３、Ｂ６、及びＢ９に富むことが既知であり（Ｃａｌｈｏｕｎ，１９６０）、このため、ｔａ１－１変異型穀粒内のアリューロン厚さの増加は、これらのビタミン及びおそらく他のビタミンについてのより強力なシンクをもたらした可能性があった。
【0458】
炭水化物
重量基準での、ｔａ１－１穀粒のデンプン含有量の６％減少があった。対照的に、スクロースレベルは、変異型穀粒内で７６％増加した。野生型に対して、中性非デンプン多糖（ＮＮＳＰ）は、４８％増加し、ＮＮＳＰの単糖構成要素（アラビノース、キシロース、ガラクトース、グルコース）は全て、４２％～５９％増加した。
重量基準での、ｔａ１－１穀粒のデンプン含有量の６％減少があった。対照的に、スクロースレベルは、変異型穀粒内で７６％増加した。野生型に対して、中性非デンプン多糖（ＮＮＳＰ）は、４８％増加し、ＮＮＳＰの単糖構成要素（アラビノース、キシロース、ガラクトース、グルコース）は全て、４２％～５９％増加した。
【0459】
結論
栄養解析は、圃場で成長したｔａ１－１穀粒から産生された全穀粒粉、したがって、全穀粒の粉の、脂質及び繊維などの多量栄養素、少なくとも鉄、亜鉛、カリウム、マグネシウム、リン、及び硫黄レベルを含むミネラルなどの微量栄養素、Ｂ３、Ｂ６、及びＢ９などのＢビタミン、抗酸化物質、並びにフェノール化合物及びフィテートなどのアリューロン関連生体分子を含む、アリューロンに富む栄養素のほとんどが、野生型粉に対して有意に増加したことを示した。また、遊離スクロースの有意な増加があった。これらの栄養素及び微量栄養素の増加に付随して、重量基準で、相対百分率として、ｔａ１－１変異体内のデンプン含有量の小さい減少があった。
栄養解析は、圃場で成長したｔａ１－１穀粒から産生された全穀粒粉、したがって、全穀粒の粉の、脂質及び繊維などの多量栄養素、少なくとも鉄、亜鉛、カリウム、マグネシウム、リン、及び硫黄レベルを含むミネラルなどの微量栄養素、Ｂ３、Ｂ６、及びＢ９などのＢビタミン、抗酸化物質、並びにフェノール化合物及びフィテートなどのアリューロン関連生体分子を含む、アリューロンに富む栄養素のほとんどが、野生型粉に対して有意に増加したことを示した。また、遊離スクロースの有意な増加があった。これらの栄養素及び微量栄養素の増加に付随して、重量基準で、相対百分率として、ｔａ１－１変異体内のデンプン含有量の小さい減少があった。
【0460】
実施例５．ｔａ１－１変異型穀粒のα－アミラーゼ活性アッセイ
穀類種子発芽中に、吸水後にアリューロン層から産生されるα－アミラーゼは、根及び苗条の成長のためのエネルギーを提供する、代謝可な糖への胚乳デンプンの加水分解において、重要な役割を果たす（Ａｋａｚａｗａ ａｎｄ Ｈａｒａ－Ｍｉｓｈｉｍｕｒａ，１９８５、Ｂｅｃｋ ａｎｄ Ｚｉｅｇｌｅｒ，１９８９）。ｔａ１変異型穀粒は、増加したアリューロン細胞層を有したため、発芽した米穀粒のα－アミラーゼ活性を、数日間にわたってアッセイした。アミラーゼ活性測定キット（Ｓｉｇｍａ、ＭＡＫ００９）を使用して、アッセイを行い、詳細な方法は、以下のようであった。
穀類種子発芽中に、吸水後にアリューロン層から産生されるα－アミラーゼは、根及び苗条の成長のためのエネルギーを提供する、代謝可な糖への胚乳デンプンの加水分解において、重要な役割を果たす（Ａｋａｚａｗａ ａｎｄ Ｈａｒａ－Ｍｉｓｈｉｍｕｒａ，１９８５、Ｂｅｃｋ ａｎｄ Ｚｉｅｇｌｅｒ，１９８９）。ｔａ１変異型穀粒は、増加したアリューロン細胞層を有したため、発芽した米穀粒のα－アミラーゼ活性を、数日間にわたってアッセイした。アミラーゼ活性測定キット（Ｓｉｇｍａ、ＭＡＫ００９）を使用して、アッセイを行い、詳細な方法は、以下のようであった。
【0461】
試料調製
１００ｍｇの発芽した米穀粒を、各々解剖して、実生苗を除去した。残りの胚乳及びアリューロン組織を、０．５ｍＬのアミラーゼアッセイ緩衝液中でホモジナイズし、混合物を、１３，０００ｇで１０分間遠心分離して、不溶性材料を除去した。１～５０μＬの試料を、９６ウェルプレートの１ウェル当たりに付加し、各々の試料を、アミラーゼアッセイ緩衝液で５０μＬの容積にした。正対照のために、５μＬのアミラーゼ正対照溶液を、使用し、アミラーゼアッセイ緩衝液で５０μＬに調整した。１ウェル当たり０、２、４、６、８、１０μＬの２ｍＭのニトロフェノール標準物から構成された標準物を、５０μＬの容積にして、０、４、８、１２、１６、及び２０ｎｍｏｌ／ウェルの標準物を産生した。
１００ｍｇの発芽した米穀粒を、各々解剖して、実生苗を除去した。残りの胚乳及びアリューロン組織を、０．５ｍＬのアミラーゼアッセイ緩衝液中でホモジナイズし、混合物を、１３，０００ｇで１０分間遠心分離して、不溶性材料を除去した。１～５０μＬの試料を、９６ウェルプレートの１ウェル当たりに付加し、各々の試料を、アミラーゼアッセイ緩衝液で５０μＬの容積にした。正対照のために、５μＬのアミラーゼ正対照溶液を、使用し、アミラーゼアッセイ緩衝液で５０μＬに調整した。１ウェル当たり０、２、４、６、８、１０μＬの２ｍＭのニトロフェノール標準物から構成された標準物を、５０μＬの容積にして、０、４、８、１２、１６、及び２０ｎｍｏｌ／ウェルの標準物を産生した。
【0462】
アッセイ反応
１．マスター反応ミックスを、５０ｍＬのアミラーゼアッセイ緩衝液と５０ｍＬのアミラーゼ基質ミックスとを混合することによって調製した。
１．マスター反応ミックスを、５０ｍＬのアミラーゼアッセイ緩衝液と５０ｍＬのアミラーゼ基質ミックスとを混合することによって調製した。
【0463】
２．１００μＬのマスター反応ミックスを、試料、標準物、及び正対照ウェルの各々に付加して、各々の試料をピペッティングによって混合した。
【0464】
３．２～３分後（Ｔｉｎｉｔｉａｌ）に、吸光度を、４０５ｎｍで測定し、（Ａ４０５）ｉｎｉｔｉａｌと称した。
【0465】
４．プレートを、２５℃でインキュベートして、吸光度（Ａ４０５）を５分毎に測定した。プレートを、インキュベーション中に光から保護した。
【0466】
５．最も活性な試料の値が、最も高い標準物（２０ｎｍｏｌ／ウェル）の値よりも大きくなるまで、測定値を取った。この時点で、最も活発な試料は、標準曲線の線形範囲の端の付近にあった。
【0467】
６．酵素活性を計算するために使用された最終吸光度測定値［（Ａ４０５）ｆｉｎａｌ］は、最も活性な試料が標準曲線の線形範囲の端の付近になる直前の時点での値であった。ペナルチメート読み取りの時間を、Ｔｆｉｎａｌと称した。
【0468】
０ニトロフェノール標準物について得られた最終測定値（Ａ４０５）ｆｉｎａｌを、標準物及び試料の（Ａ４０５）ｆｉｎａｌ測定値から減算することによって、修正を背景について行った。ＴｉｎｉｔｉａｌからＴｆｉｎａｌへの吸光度の変化を、以下のように計算した：ΔＡ４０５＝（Ａ４０５）ｆｉｎａｌ－（Ａ４０５）ｉｎｉｔｉａｌ
【0469】
各々の試料のΔＡ４０５を、標準曲線と比較して、アミラーゼによってＴｉｎｉｔｉａｌからＴｆｉｎａｌの間に産生されたニトロフェノール（Ｂ）の量を判定した。試料のアミラーゼ活性を、以下の式によって判定した：
アミラーゼ活性＝Ｂ×試料希釈因子
（反応時間）×Ｖ
Ｂ＝ＴｉｎｉｔｉａｌとＴｆｉｎａｌとの間で産生されたニトロフェノールの量（ｎｍｏｌ）
反応時間＝Ｔｆｉｎａｌ－Ｔｉｎｉｔｉａｌ（分）
Ｖ＝ウェルに付加された試料容積（ｍＬ）
アミラーゼ活性＝Ｂ×試料希釈因子
（反応時間）×Ｖ
Ｂ＝ＴｉｎｉｔｉａｌとＴｆｉｎａｌとの間で産生されたニトロフェノールの量（ｎｍｏｌ）
反応時間＝Ｔｆｉｎａｌ－Ｔｉｎｉｔｉａｌ（分）
Ｖ＝ウェルに付加された試料容積（ｍＬ）
【0470】
各々の試料についてのアミラーゼ活性を、ｎｍｏｌ／分／ｍＬ（ミリ単位）として報告した。アミラーゼの１単位は、エチリデン－ｐＮＰ－Ｇ７を切断して１．０μｍｏｌのｐ－ニトロフェノールを２５℃で１分毎に産生したアミラーゼの量であった。
【0471】
アッセイの結果（図５）は、発芽したｔａ１－１穀粒が、ＺＨ１１と比較してより高いα－アミラーゼ活性を、３日目以降から有し、増加の程度が、経時的に増加し、吸水の開始後（ＤＡＧ）７日目に最大であったことを示した。
【0472】
実施例６．遺伝子マッピング及び配列解析によるＴＡ１遺伝子及びｔａ１－１変異の同定
遺伝子マッピングのためのＳＳＲ及びＩｎｄｅｌマーカーの同定及び使用
遺伝子マッピングのために、植物のＦ２集団を、Ｊａｐｏｎｉｃａ変種であるＺＨ１１の遺伝的背景内のｔａ１－１変異を含有する植物と、Ｉｎｄｉｃａ変種であるＮＪ６の植物との間の遺伝的交雑から産生した。ＺＨ１１とＮＪ６との間で多型であり、次いで、遺伝子マッピングにおいて使用され得る遺伝子マーカーを同定するために、のＰＣＲ実験のセットを、ホモ接合性ＺＨ１１植物、ホモ接合性ＮＪ６植物、及びＤＮＡの１：１混合物からの葉ＤＮＡ試料上で実行した。ゲル電気泳動によるＰＣＲ産物の解析は、ＺＨ１１、ＮＪ６、及び混合物からの産物の比較を可能にして、多型マーカーを同定した。別個のＺＨ１１及びＮＪ６ ＤＮＡでの増幅が、別々の異なる増幅産物を示し、混合されたＤＮＡが、両方の産物の組み合わせを示した場合にのみ、プライマー対を、遺伝子マッピングのために選択した。それによって、５４個の挿入欠失多型（ＩＮＤＥＬ）及び７０個の短い配列反復（ＳＳＲ）多型を含む合計１２４個のプライマー対を選択した。これらの遺伝子マーカーを、約３～４Ｍｂｐの間隔で、米ゲノムに沿って分布させ、遺伝子マッピングのための良好なカバレッジを与えた。
遺伝子マッピングのためのＳＳＲ及びＩｎｄｅｌマーカーの同定及び使用
遺伝子マッピングのために、植物のＦ２集団を、Ｊａｐｏｎｉｃａ変種であるＺＨ１１の遺伝的背景内のｔａ１－１変異を含有する植物と、Ｉｎｄｉｃａ変種であるＮＪ６の植物との間の遺伝的交雑から産生した。ＺＨ１１とＮＪ６との間で多型であり、次いで、遺伝子マッピングにおいて使用され得る遺伝子マーカーを同定するために、のＰＣＲ実験のセットを、ホモ接合性ＺＨ１１植物、ホモ接合性ＮＪ６植物、及びＤＮＡの１：１混合物からの葉ＤＮＡ試料上で実行した。ゲル電気泳動によるＰＣＲ産物の解析は、ＺＨ１１、ＮＪ６、及び混合物からの産物の比較を可能にして、多型マーカーを同定した。別個のＺＨ１１及びＮＪ６ ＤＮＡでの増幅が、別々の異なる増幅産物を示し、混合されたＤＮＡが、両方の産物の組み合わせを示した場合にのみ、プライマー対を、遺伝子マッピングのために選択した。それによって、５４個の挿入欠失多型（ＩＮＤＥＬ）及び７０個の短い配列反復（ＳＳＲ）多型を含む合計１２４個のプライマー対を選択した。これらの遺伝子マーカーを、約３～４Ｍｂｐの間隔で、米ゲノムに沿って分布させ、遺伝子マッピングのための良好なカバレッジを与えた。
【0473】
ｔａ１－１アレルの遺伝子マッピングのために、Ｆ２集団からの１３２個の植物を、１２４個の多型マーカーでスコア化した。アリューロン表現型についてのマッピング集団内の個別のＦ２植物のホモ接合性又はヘテロ接合性を、各々のＦ２植物から得られたＦ３子孫穀粒の表現型決定によって慎重に評価した。葉ＤＮＡを、実施例１に記載されるように抽出した。ＰＣＲ増幅を、実施例１に記載されるように行い、産物を、ゲル電気泳動によって、３％アガロースを介して分離した。結果から、ｔａ１遺伝子座は、染色体５上のマーカーＩｎｄｅｌ ５３７とＩｎｄｅｌ ５４１との間に位置し（図６）、これは、米のゲノム配列から、約４００ｋｂの物理的距離に対応するものであったと結論された。
【0474】
別の８０００個のＦ２植物を、このマーカーの対でスクリーニングした。組換えをＩｎｄｅｌ ５３７マーカーとＩｎｄｅｌ ５４１マーカーとの間に示した１０７６個の個体を同定及び選択した。これらの組換え植物を表現型決定したときに、それによって、ｔａ１遺伝子座を、Ｉｎｄｅｌ ５６２マーカーとＩｎｄｅｌ ５８３マーカーとの間に位置する２８ｋｂの領域にマッピングした（図６）。
【0475】
ｔａ１－１変異型植物内のこの領域のヌクレオチド配列を得、ヌクレオチド配列を野生型配列と比較し、それによって、ｔａ１－１アレルに対応する変異を同定するために、ゲノム領域に隣接するプライマーを設計し、ＤＮＡシークエンシングを実施した。ゲノムＤＮＡ配列の比較は、米ゲノム配列（ＥｎｓｅｍｂｌＰｌａｎｔｓ）上でＯｓ０５ｇ０５０９７００とアノテートされた遺伝子内のシークエンシングされた領域内の単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）を同定した。この遺伝子は、染色体５の位置：２５、２５４、９９０～２５、２５９、７４７にあり、リバース鎖を、ミトコンドリアｓｓＤＮＡ結合タンパク質とアノテートした。Ｊａｐｏｎｉｃａ遺伝子Ｏｓ０５ｇ０５０９７００に連結されたタンパク質について、同じ遺伝子を、ＵｎｉＰＡＲＣゲノム配列内で、ＬＯＣ＿Ｏｓ０５ｇ４３４４０とアノテートした。単一ヌクレオチドＧ（野生型）からＡ多型を、Ｊａｐｏｎｉｃａ変種のＥｎｓｅｍｂｌＰｌａｎｔｓ米ゲノム配列を参照して、ヌクレオチド位置Ｃｈｒ５：２５２５７６２２において同定した。配列番号４を参照して、このヌクレオチド置換Ｇ２１２６Ａは、染色体５内の遺伝子Ｏｓ０５ｇ０５０９７００のエクソン４とエクソン５との間のイントロンＩＶの最後のヌクレオチドであった（図６、最下の線）。イントロン番号付けを、Ｏｓ０５ｇ０５０９７００のタンパク質コード領域アノテーションから行ったが、遺伝子の５’－ＵＴＲ内の長いイントロンを含まない。変異は、スプライス部位内のイントロンの最後のヌクレオチドを含むので、本発明者らには、変異がＴＡ１遺伝子のスプライシングの破壊を含むと思われた。以下に記載される後続の実験は、この多型がｔａ１－１変異であることが確認した。
【0476】
この実験はまた、ｔａ１－１変異が、異なる遺伝的背景、例えば、Ｉｎｄｉｃａ変種内に導入され得、依然として厚アリューロン表現型を付与したことを示した。
【0477】
実施例７．ｔａ１－１変異の性質
ｔａ１－１遺伝子の発現及びスプライシングを解析するために、実施例１に記載されるように、ＲＮＡを葉から抽出し、ｔａ１－１植物からの穀粒を発達させた。ＲＮＡを、組み合わせ、逆転写し、個別のｃＤＮＡのヌクレオチド配列を得た。３つの異なるｃＤＮＡ配列を、ｔａ１－１ ｃＤＮＡから得、ｔａ１－１ ｃＤＮＡ Ｉ、ＩＩ、及びＩＩＩと称し、ｔａ１－１ ｃＤＮＡ Ｉ、ＩＩ、及びＩＩＩは、各々、ＺＨ１１からの野生型ｃＤＮＡ配列とは異なる配列を有した。ｔａ１－１ ｃＤＮＡヌクレオチド配列と野生型ｃＤＮＡ（配列番号２）との比較は、ヌクレオチド位置２１２６におけるイントロンＩＶ内のＧからＡ多型（Ｇ２１２６Ａ）が、ｔａ１－１穀粒内の３つの異なる成熟ｍＲＮＡと会合していたことを示した。この解析及び以下に記載される更なる解析から、本発明者らは、ｔａ１転写物の選択的スプライシングのため、これらのバリアントが生じたと結論した。
ｔａ１－１遺伝子の発現及びスプライシングを解析するために、実施例１に記載されるように、ＲＮＡを葉から抽出し、ｔａ１－１植物からの穀粒を発達させた。ＲＮＡを、組み合わせ、逆転写し、個別のｃＤＮＡのヌクレオチド配列を得た。３つの異なるｃＤＮＡ配列を、ｔａ１－１ ｃＤＮＡから得、ｔａ１－１ ｃＤＮＡ Ｉ、ＩＩ、及びＩＩＩと称し、ｔａ１－１ ｃＤＮＡ Ｉ、ＩＩ、及びＩＩＩは、各々、ＺＨ１１からの野生型ｃＤＮＡ配列とは異なる配列を有した。ｔａ１－１ ｃＤＮＡヌクレオチド配列と野生型ｃＤＮＡ（配列番号２）との比較は、ヌクレオチド位置２１２６におけるイントロンＩＶ内のＧからＡ多型（Ｇ２１２６Ａ）が、ｔａ１－１穀粒内の３つの異なる成熟ｍＲＮＡと会合していたことを示した。この解析及び以下に記載される更なる解析から、本発明者らは、ｔａ１転写物の選択的スプライシングのため、これらのバリアントが生じたと結論した。
【0478】
３つのｔａ１－１転写物を、ＲＴ－ＰＣＲによって、変異部位、したがって、選択的スプライシング領域に及ぶオリゴヌクレオチドプライマー（配列番号５８及び配列番号５９）を使用して更に解析した。次いで、ＰＣＲ産物を、回収し、Ｂｌｕｎｔベクター中にクローニングし、続いて、個別のクローンのヌクレオチドシークエンシングを行った。図７は、野生型ｃＤＮＡ配列とアライメントされた、変異部位に及ぶｃＤＮＡの領域のアライメントされた配列を示す。ｃＤＮＡ Ｉ、ＩＩ、及びＩＩＩは、エクソン４の終了まで、すなわち、イントロンＩＶの開始まで、野生型ｃＤＮＡと同一のヌクレオチド配列を有したが、次いで、ｃＤＮＡ Ｉ内のイントロンＩＶの最後の３１個のヌクレオチドの挿入、又はエクソン５配列の欠失（ｃＤＮＡ ＩＩ）、又はエクソン５の開始からの単一ヌクレオチドの欠失（ｃＤＮＡ ＩＩＩ）のいずれかで相違したことが観察された。ｔａ１－１ ｃＤＮＡ Ｉ（配列番号１２）は、３１ｂｐの挿入をエクソン５の直前に有したため、このｃＤＮＡは、ポリペプチド（配列番号８）をコードし、ポリペプチド（配列番号８）は、野生型ＴＡ１タンパク質（配列番号３）のアミノ酸配列に対して、アミノ酸位置１８２位における翻訳フレームシフトからもたらされ、１９３位における中途翻訳終止コドンをもたらした。ｔａ１－１ ｃＤＮＡ ＩＩ（配列番号１３）は、エクソン５全体の欠失を有したため、このｃＤＮＡは、ポリペプチド（配列番号９）をコードし、ポリペプチド（配列番号９）は、アミノ酸位置１８２位における翻訳フレームシフトからもたらされ、１８６位における中途翻訳終止をもたらした。ｔａ１－１ ｃＤＮＡ ＩＩＩ（配列番号１４）は、エクソン５内の最初のＧヌクレオチドの欠失を有したため、このｃＤＮＡは、ポリペプチド（配列番号１０）をコードし、ポリペプチド（配列番号１０）は、野生型ＴＡ１タンパク質に対して、１８２位における翻訳フレームシフトからもたらされ、１８５位アミノ酸における中途翻訳終止をもたらした。図８で、予測完全長アミノ酸配列を、野生型ＴＡ１配列と比較した。
【0479】
ｔａ１－１ Ｉ、ＩＩ、及びＩＩＩ ｃＤＮＡの相対存在量は、それぞれ、総転写物の６７％、２９％、及び４％であった。野生型転写物は、ｃＤＮＡ解析によって、ｔａ１－１変異型植物の葉及び発達中の穀粒内で検出されず、本発明者らは、変異型植物内の野生型ｍＲＮＡの非存在から、この野生型スプライシングが消失したと結論した。以下に記載される以下の実験からのデータによって確認されたこれらのデータから、ｔａ１－１遺伝子のイントロンＩＶ内の多型が、変化、すなわち、この植物及びその穀粒内のｔａ１－１変異を引き起こしたと結論された。また、変異は、野生型ＴＡ１遺伝子に対して、ｔａ１－１遺伝子のＲＮＡ転写物のスプライシングパターンの変化をもたらし、それによって、ｔａ１－１アレルについてのｔａ１変異体表現型を引き起こしたと結論された。
【0480】
米ゲノムの染色体５内のＯｓ０５ｇ０５０９７００位における遺伝子は、ミトコンドリア標的一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質をコードするＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ ｍｔＳＳＢ－１遺伝子（ＡｔｍｔＳＳＢ－１）の相同体である米ｍｔＳＳＢ－１ａ遺伝子（ＯｓｍｔＳＳＢ－１ａ）とアノテートされている（Ｅｄｍｏｎｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００５）。
【0481】
野生型米ｍｔＳＳＢ－１ａ（ＴＡ１）遺伝子のヌクレオチド配列を、配列番号１として提供し、配列番号１は、１０２４個のヌクレオチドのプロモーター及び５’－ＵＴＲ（非翻訳領域）、５つのイントロンを含むヌクレオチド１０２５～２３６９からのタンパク質コード領域、並びに４１１個のヌクレオチドの３’－ＵＴＲを含む。５つのイントロンのヌクレオチド位置を、配列番号１のレジェンドで提供する。野生型ＴＡ１（ＯｓｍｔＳＳＢ－１ａ）遺伝子に対応するｃＤＮＡのヌクレオチド配列を、配列番号２として提供し、２０６個のアミノ酸のコードされた野生型ＴＡ１ポリペプチドのアミノ酸配列を、配列番号３として提供する。
【0482】
野生型米ＴＡ１ポリペプチド内の構造特徴の説明
米ＴＡ１遺伝子がＯｓｍｔＳＳＢ－１ａと同じであることを見出した後に、ＯｓＴＡ１（ＯｓｍｔＳＳＢ－１ａ）ポリペプチドアミノ酸配列を検査した。配列番号３のアミノ酸７３～１８４に対応する１つの典型的な一本鎖ＤＮＡ結合ドメインを同定した（図９）。アミノ酸配列を、概して、被子植物の代表的なもの、すなわち、Ｚｅａ ｍａｙｓ（配列番号１６）、Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒ（配列番号１７）、Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ（配列番号１８）、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ（配列番号１９）、及び穀類に関連するモデル単子葉植物であるＢｒａｃｈｙｐｏｄｉｕｍ ｄｉｓｔａｃｈｙｏｎ（配列番号２０）、モデル双子葉植物であるＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ（配列番号１５）、及びモデル樹木であるポプラ（配列番号２１）である７つの他の植物種のゲノムによってコードされた最も相同の配列と比較した（実施例１２を参照されたい）。十分にアセンブルされアノテートされたゲノム配列が、これらの種について入手可能であった。ｍｔＳＳＢアミノ酸配列がアライメントされたときに（図９）、ＳＳＢドメインは、Ｎ末端及びＣ末端隣接配列よりも、高度に保存されており、ＯｓＴＡ１のＳＳＢドメインの１１２個のアミノ酸にわたって少なくとも８０％の同一性を有したことが明らかであった。配列番号３の完全長との全体的なアミノ酸配列同一性は、単子葉植物ＴＡ１配列について、少なくとも６０％であり、少なくとも７９％を含んだ。図９に示される９つのＴＡ１ポリペプチドについてのＳＳＢドメインは、配列番号３のアミノ酸７３～１１４に対応する保存アミノ酸モチーフＦＲＧＶＨＲＡＩ（Ｉ／Ｌ）ＣＧＫＶＧＱ（Ｖ／Ａ）Ｐ（Ｖ／Ｌ）ＱＫＩＬＲＮＧ（Ｒ／Ｈ）Ｔ（Ｖ／Ｉ）Ｔ（Ｖ／Ｉ）ＦＴ（Ｖ／Ｉ）ＧＴＧＧＭＦＤＱＲ（モチーフＩ、配列番号４５）、配列番号３のアミノ酸１２２～１３５に対応するＰ（Ｋ／Ｍ）ＰＡＱＷＨＲＩ（Ａ／Ｓ）（Ｖ／Ｉ）Ｈ（Ｎ／Ｓ）（Ｄ／Ｅ）（モチーフＩＩ、配列番号４６）、配列番号３のアミノ酸１４１～１６４に対応するＡＶＱ（Ｋ／Ｑ）Ｌ（Ｖ／Ｔ）ＫＮＳ（Ａ／Ｓ）ＶＹ（Ｖ／Ｉ）ＥＧ（Ｄ／Ｅ）ＩＥ（Ｔ／Ｉ）Ｒ（Ｖ／Ｉ）ＹＮＤ（モチーフＩＩＩ、配列番号４７）、及び配列番号３のアミノ酸１７６～１８４に対応するＩＣ（Ｌ／Ｖ／Ｉ）Ｒ（Ｒ／Ｇ）ＤＧＫＩ（モチーフＩＶ、配列番号４８）を含んだ。これら４つのモチーフは、ポプラ配列を除いてスペーシングが各々のモチーフ間にあるとおり、アライメントされたＴＡ１配列のうちの全ての９つ内で完全に保存されていた（図９）。４つのモチーフ及び４つのモチーフのスペーシングは、植物内のＴＡ１ポリペプチドの完全な機能のために必要とされる可能性があったと結論された。
米ＴＡ１遺伝子がＯｓｍｔＳＳＢ－１ａと同じであることを見出した後に、ＯｓＴＡ１（ＯｓｍｔＳＳＢ－１ａ）ポリペプチドアミノ酸配列を検査した。配列番号３のアミノ酸７３～１８４に対応する１つの典型的な一本鎖ＤＮＡ結合ドメインを同定した（図９）。アミノ酸配列を、概して、被子植物の代表的なもの、すなわち、Ｚｅａ ｍａｙｓ（配列番号１６）、Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒ（配列番号１７）、Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ（配列番号１８）、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ（配列番号１９）、及び穀類に関連するモデル単子葉植物であるＢｒａｃｈｙｐｏｄｉｕｍ ｄｉｓｔａｃｈｙｏｎ（配列番号２０）、モデル双子葉植物であるＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ（配列番号１５）、及びモデル樹木であるポプラ（配列番号２１）である７つの他の植物種のゲノムによってコードされた最も相同の配列と比較した（実施例１２を参照されたい）。十分にアセンブルされアノテートされたゲノム配列が、これらの種について入手可能であった。ｍｔＳＳＢアミノ酸配列がアライメントされたときに（図９）、ＳＳＢドメインは、Ｎ末端及びＣ末端隣接配列よりも、高度に保存されており、ＯｓＴＡ１のＳＳＢドメインの１１２個のアミノ酸にわたって少なくとも８０％の同一性を有したことが明らかであった。配列番号３の完全長との全体的なアミノ酸配列同一性は、単子葉植物ＴＡ１配列について、少なくとも６０％であり、少なくとも７９％を含んだ。図９に示される９つのＴＡ１ポリペプチドについてのＳＳＢドメインは、配列番号３のアミノ酸７３～１１４に対応する保存アミノ酸モチーフＦＲＧＶＨＲＡＩ（Ｉ／Ｌ）ＣＧＫＶＧＱ（Ｖ／Ａ）Ｐ（Ｖ／Ｌ）ＱＫＩＬＲＮＧ（Ｒ／Ｈ）Ｔ（Ｖ／Ｉ）Ｔ（Ｖ／Ｉ）ＦＴ（Ｖ／Ｉ）ＧＴＧＧＭＦＤＱＲ（モチーフＩ、配列番号４５）、配列番号３のアミノ酸１２２～１３５に対応するＰ（Ｋ／Ｍ）ＰＡＱＷＨＲＩ（Ａ／Ｓ）（Ｖ／Ｉ）Ｈ（Ｎ／Ｓ）（Ｄ／Ｅ）（モチーフＩＩ、配列番号４６）、配列番号３のアミノ酸１４１～１６４に対応するＡＶＱ（Ｋ／Ｑ）Ｌ（Ｖ／Ｔ）ＫＮＳ（Ａ／Ｓ）ＶＹ（Ｖ／Ｉ）ＥＧ（Ｄ／Ｅ）ＩＥ（Ｔ／Ｉ）Ｒ（Ｖ／Ｉ）ＹＮＤ（モチーフＩＩＩ、配列番号４７）、及び配列番号３のアミノ酸１７６～１８４に対応するＩＣ（Ｌ／Ｖ／Ｉ）Ｒ（Ｒ／Ｇ）ＤＧＫＩ（モチーフＩＶ、配列番号４８）を含んだ。これら４つのモチーフは、ポプラ配列を除いてスペーシングが各々のモチーフ間にあるとおり、アライメントされたＴＡ１配列のうちの全ての９つ内で完全に保存されていた（図９）。４つのモチーフ及び４つのモチーフのスペーシングは、植物内のＴＡ１ポリペプチドの完全な機能のために必要とされる可能性があったと結論された。
【0483】
ＯｓｍｔＳＳＢ－１ａアミノ酸配列（配列番号３）を、Ｍｉｔｏｆａｔｅｓソフトウェアで、植物設定を使用して解析したときに、ミトコンドリアプロテアーゼ切断部位を、配列番号３のアミノ酸２８とアミノ酸２９との間で予測して（図９）、米細胞内のミトコンドリア内への侵入の際に除去されて１７８個のアミノ酸の成熟ポリペプチドを産生する、ポリペプチドのＮ末端における２８個のアミノ酸のミトコンドリア輸送ペプチドの存在を予測した。この予測部位を、ＡｔｍｔＳＳＢ－１のＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ配列についての予測と比較して、１つのアミノ酸残基内にアライメントした（Ｅｄｍｏｎｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００５）。
【0484】
野生型ＯｓＴＡ１（ＯｓｍｔＳＳＢ－１ａ）ポリペプチドのＤＮＡ結合ドメインの最後の３つのアミノ酸（ＧＫＩ）が、ｔａ１－１ ｃＤＮＡ Ｉ、ＩＩ、及びＩＩＩの予測翻訳産物（図６）、並びにＤＮＡ結合ドメイン後のＴＡ１ポリペプチドのＣ末端領域から欠損していたことが見出された。
【0485】
実施例８．米内のＴＡ１遺伝子の発現
発達中の穀粒の一部分、具体的には、胚、デンプン性胚乳、及びアリューロンを含む異なる米組織内のＴＡ１遺伝子の発現を解析するために、実験を実施した。第１の実験において、ＴＡ１ ｍＲＮＡを、インサイツハイブリダイゼーションによって、Ｂｒｅｗｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００６）によって記載されているように、米組織切片内で検出した。簡潔には、様々な米組織を、真空浸透後に、ＦＡＡ固定剤中で、８時間４℃で固定し、段階的な一連のエタノール、続いて一連のキシレンを使用して脱水し、実施例１に記載されるように、Ｐａｒａｐｌａｓｔ Ｐｌｕｓ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）中に包埋した。８μｍの厚さのミクロトーム切片を、Ｐｒｏｂｅ－Ｏｎ Ｐｌｕｓ顕微鏡スライド（Ｆｉｓｈｅｒ）上に載せた。
発達中の穀粒の一部分、具体的には、胚、デンプン性胚乳、及びアリューロンを含む異なる米組織内のＴＡ１遺伝子の発現を解析するために、実験を実施した。第１の実験において、ＴＡ１ ｍＲＮＡを、インサイツハイブリダイゼーションによって、Ｂｒｅｗｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００６）によって記載されているように、米組織切片内で検出した。簡潔には、様々な米組織を、真空浸透後に、ＦＡＡ固定剤中で、８時間４℃で固定し、段階的な一連のエタノール、続いて一連のキシレンを使用して脱水し、実施例１に記載されるように、Ｐａｒａｐｌａｓｔ Ｐｌｕｓ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）中に包埋した。８μｍの厚さのミクロトーム切片を、Ｐｒｏｂｅ－Ｏｎ Ｐｌｕｓ顕微鏡スライド（Ｆｉｓｈｅｒ）上に載せた。
【0486】
ハイブリダイゼーションシグナルから、ＴＡ１遺伝子は、発達中の穀粒の種皮、アリューロン組織、及び胚内で発現されるが、維管束内で発現されないと結論された。ＴＡ１はまた、発達中の花序内で発現されたが、葉及び茎内で発現されなかった。
【0487】
リアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）を使用して、異なる植物組織内の相対発現レベルをアッセイした。発現レベルを、同じ組織内の構成的に発現される遺伝子であるアクチン遺伝子の発現に正規化した。驚くべきことに、結果は、花粉内で最も高い相対発現を示し、続いて、胚、茎頂分裂組織、及びアリューロン組織内の相対発現を示した（図１０）。活性成長組織内のＴＡ１の特異的発現は、細胞分裂に関与し得ると考えられた。予測ＳＳＢタンパク質として、ＴＡ１タンパク質は、これらの活性成長組織内で、ＤＮＡ複製、組換え、転写、及びＤＮＡ修復中に、一本鎖ＤＮＡを保護し、他の関連タンパク質を動員するように機能すると考えられた。
【0488】
実施例９．ＴＡ１タンパク質のｓｓＤＮＡ結合活性
ＴＡ１融合タンパク質の精製
ＴＡ１ポリペプチドのＤＮＡ結合活性をインビトロで試験するために、６ｘＨｉｓタグをＮ末端において有する組換えＴＡ１融合タンパク質（６ｘＨｉｓ－ＴＡ１）を、実施例１に記載されるように、Ｅ．ｃｏｌｉ内の発現ベクターから産生した。６ｘＨｉｓタグを組み込んで、ニッケルカラムへの結合による融合タンパク質の迅速かつ単純な精製を可能にした。融合タンパク質を発現するＥ．ｃｏｌｉ細胞を、液体窒素中で凍結し氷上で解凍し３０分間超音波処理（１０秒間隔で５秒のパルス）することによって破壊した。６ｘＨｉｓ－ＴＡ１タンパク質を、リン酸カリウム緩衝液中での４０％硫酸アンモニウム塩沈殿によって富化した。沈殿したタンパク質を、再懸濁し、リン酸ナトリウム緩衝液（５０ｍＭのＮａＰＯ４、５００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．８）に対して一晩透析した。次いで、タンパク質を、ニッケルカラム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）上にロードし、１０ｍＭのイミダゾールを含有するリン酸ナトリウム緩衝液で広範囲に洗浄して、非結合タンパク質を除去した。精製された６ｘＨｉｓ－ＴＡ１タンパク質を、リン酸ナトリウム緩衝液中のイミダゾールの１０～５００ｍＭの直線勾配を使用して、カラムから単離した。各々の画分内のタンパク質濃度を、分光光度法によって判定し、試料を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分離し、続いて、クーマシーブルーによって染色した。精製された６ｘＨｉｓ－ＴＡ１タンパク質を、貯蔵緩衝液（５０ｍＭのトリス－ＨＣｌ ｐＨ７．４、１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＤＴＴ、０．２ＭのＮａＣｌ、５０％（ｖ／ｖ）グリセロール）に移し、－８０℃で貯蔵した。
ＴＡ１融合タンパク質の精製
ＴＡ１ポリペプチドのＤＮＡ結合活性をインビトロで試験するために、６ｘＨｉｓタグをＮ末端において有する組換えＴＡ１融合タンパク質（６ｘＨｉｓ－ＴＡ１）を、実施例１に記載されるように、Ｅ．ｃｏｌｉ内の発現ベクターから産生した。６ｘＨｉｓタグを組み込んで、ニッケルカラムへの結合による融合タンパク質の迅速かつ単純な精製を可能にした。融合タンパク質を発現するＥ．ｃｏｌｉ細胞を、液体窒素中で凍結し氷上で解凍し３０分間超音波処理（１０秒間隔で５秒のパルス）することによって破壊した。６ｘＨｉｓ－ＴＡ１タンパク質を、リン酸カリウム緩衝液中での４０％硫酸アンモニウム塩沈殿によって富化した。沈殿したタンパク質を、再懸濁し、リン酸ナトリウム緩衝液（５０ｍＭのＮａＰＯ４、５００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．８）に対して一晩透析した。次いで、タンパク質を、ニッケルカラム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）上にロードし、１０ｍＭのイミダゾールを含有するリン酸ナトリウム緩衝液で広範囲に洗浄して、非結合タンパク質を除去した。精製された６ｘＨｉｓ－ＴＡ１タンパク質を、リン酸ナトリウム緩衝液中のイミダゾールの１０～５００ｍＭの直線勾配を使用して、カラムから単離した。各々の画分内のタンパク質濃度を、分光光度法によって判定し、試料を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分離し、続いて、クーマシーブルーによって染色した。精製された６ｘＨｉｓ－ＴＡ１タンパク質を、貯蔵緩衝液（５０ｍＭのトリス－ＨＣｌ ｐＨ７．４、１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＤＴＴ、０．２ＭのＮａＣｌ、５０％（ｖ／ｖ）グリセロール）に移し、－８０℃で貯蔵した。
【0489】
電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）
ｓｓＤＮＡへの精製された６ｘＨｉｓ－ＴＡ１タンパク質の親和性を、ＥＭＳＡ（Ｔｈｅｒｍｏ、カタログ番号２０１４８Ｘ）を使用して、Ｒｅｄｄｙ ｅｔ ａｌ．（２００１）によって概略的に記載されているように判定した。４５個のヌクレオチドの一本鎖オリゴヌクレオチド（配列番号６０）を、３’末端において、ビオチン化ＣＴＰ（Ｔｈｅｒｍｏ、カタログ番号８９８１８）で、製造業者の説明書に従って標識した。組換え６ｘＨｉｓ－ＴＡ１タンパク質（２μｇ）を、７５０アトモルのビオチン標識オリゴヌクレオチドに付加し、混合物を、室温で１０分間インキュベートした。６ｘＨｉｓ－ＴＡ１タンパク質を欠いた対照試料を、図１１のレーン１に適用した。別個の反応を、６０ｂｐの二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ；Ｔｈｅｒｍｏ ＥＭＳＡキットからの対照断片）の存在下で実施して、移動度シフトがｓｓＤＮＡに特異的であるかを判定した。結合反応産物を、電気泳動によって、０．５×ＴＢＥ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）中の５％天然ポリアクリルアミドゲル中で分離し、ナイロン膜（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）に移した。ＤＮＡバンドを、ストレプトアビジンコンジュゲートホースラディッシュペルオキシダーゼ（Ｔｈｅｒｍｏ）を使用して可視化した。図１１に示されるように、ｓｓＤＮＡに結合した６ｘＨｉｓ－ＴＡ１タンパク質及び結合が、未標識ｓｓＤＮＡとの競合によって減った。ｄｓＤＮＡは、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）へのＴＡ１タンパク質の結合を競合せず、これは、タンパク質が、一本鎖ＤＮＡ結合（ＳＳＢ）タンパク質というこのタンパク質の名称と一致して、ｓｓＤＮＡに特異的であることを示した。
ｓｓＤＮＡへの精製された６ｘＨｉｓ－ＴＡ１タンパク質の親和性を、ＥＭＳＡ（Ｔｈｅｒｍｏ、カタログ番号２０１４８Ｘ）を使用して、Ｒｅｄｄｙ ｅｔ ａｌ．（２００１）によって概略的に記載されているように判定した。４５個のヌクレオチドの一本鎖オリゴヌクレオチド（配列番号６０）を、３’末端において、ビオチン化ＣＴＰ（Ｔｈｅｒｍｏ、カタログ番号８９８１８）で、製造業者の説明書に従って標識した。組換え６ｘＨｉｓ－ＴＡ１タンパク質（２μｇ）を、７５０アトモルのビオチン標識オリゴヌクレオチドに付加し、混合物を、室温で１０分間インキュベートした。６ｘＨｉｓ－ＴＡ１タンパク質を欠いた対照試料を、図１１のレーン１に適用した。別個の反応を、６０ｂｐの二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ；Ｔｈｅｒｍｏ ＥＭＳＡキットからの対照断片）の存在下で実施して、移動度シフトがｓｓＤＮＡに特異的であるかを判定した。結合反応産物を、電気泳動によって、０．５×ＴＢＥ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）中の５％天然ポリアクリルアミドゲル中で分離し、ナイロン膜（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）に移した。ＤＮＡバンドを、ストレプトアビジンコンジュゲートホースラディッシュペルオキシダーゼ（Ｔｈｅｒｍｏ）を使用して可視化した。図１１に示されるように、ｓｓＤＮＡに結合した６ｘＨｉｓ－ＴＡ１タンパク質及び結合が、未標識ｓｓＤＮＡとの競合によって減った。ｄｓＤＮＡは、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）へのＴＡ１タンパク質の結合を競合せず、これは、タンパク質が、一本鎖ＤＮＡ結合（ＳＳＢ）タンパク質というこのタンパク質の名称と一致して、ｓｓＤＮＡに特異的であることを示した。
【0490】
変異型ｔａ１－１ Ｉポリペプチドが、ｓｓＤＮＡに結合する能力を保持したかを検査するために、ｔａ１－１ ｃＤＮＡ Ｉによってコードされた予測ポリペプチドをコードし、６ｘＨｉｓタグをＮ末端において有し、Ｅ．ｃｏｌｉ内で発現された類似の遺伝子構築物を作製した。対応するｍＲＮＡが、変異型ｔａ１－１遺伝子からの顕性スプライシング転写物であり、ｔａ１－１遺伝子からの総転写の約７０％を表すため、ｃＤＮＡ Ｉ配列を選択した。変異型６ｘＨｉｓ－ｔａ１－１融合ポリペプチドを、野生型６ｘＨｉｓ－ＴＡ１タンパク質についての方法と同じ方法で精製した。精製された６ｘＨｉｓ－ｔａ１－１ Ｉ融合ポリペプチドを、ＥＭＳＡ実験において、対応する野生型タンパク質についての上記のように使用して、ｓｓＤＮＡへの野生型及び変異型ポリペプチドの結合を比較した。結合実験は、変異型（短縮型）ポリペプチドが、ｓｓＤＮＡに結合したが、野生型ＴＡ１タンパク質と比較して、低減された効率のみで、約３～４倍減少した効率でｓｓＤＮＡに結合したことを示した（図１２）。ＴＡ１及びその短縮型形態（６ｘＨｉｓ－ｔａ１－１ Ｉ）の両方が、ｓｓＤＮＡプローブに結合することができたが、６ｘＨｉｓ－ＴＡ１の結合活性は、その短縮型形態（６ｘＨｉｓ－ｔａ１－１ Ｉ）よりも高く、２μｇの６ｘＨｉｓ－ＴＡ１は、シフトされたプローブの強度が８μｇの短縮型６ｘＨｉｓ－ｔａ１－１ Ｉポリペプチドと同様であった。本発明者らは、このデータから、少なくともｔａ１－１ Ｉポリペプチドが、あるＳＳＢ活性を保持し、ｔａ１－１アレルが、ヌルアレルでなかったと結論した。ｔａ１－１遺伝子は、活性が野生型ＴＡ１遺伝子に対して少なくとも６７％低減されたと考えられた。
【0491】
実施例１０．ｔａ１－１変異体の相補性解析
ＴＡ１遺伝子内の変異が、ｔａ１－１変異体内で見出される肥厚アリューロン及び関連する表現型の要因であったという結論を強化するために、２つの相補性実験を実行した。第１の実験において、天然ＴＡ１プロモーターを含むＴＡ１遺伝子の野生型コピーを、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介形質転換によって、ｔａ１－１変異型植物内に導入した。導入されるＤＮＡ配列を、一連のオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、ＺＨ１１ゲノムＤＮＡから増幅し、次いで、バイナリベクターｐＰＬＶ１５内にアセンブルした。このベクターはまた、ハイグロマイシン耐性遺伝子を、選択可能マーカー遺伝子として含有した。形質転換のためのプラスミド、及び対照プラスミド（空ベクター）を、各々Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ系ＥＨＡ１０５内に導入し、これらを使用して、ｔａ１－１米レシピエント細胞を、Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．（２００６）に記載されている方法を使用して形質転換した。合計５３個のＴ０トランスジェニック植物を、野生型ＴＡ１遺伝子での形質転換から再生した。これらの植物を、土壌に移し、グロースチャンバ内で成熟まで成長させた。ＰＣＲを使用して、ヒグロマイシン耐性遺伝子の存在について試験したときに、３４個の形質転換体系統を確認し、ヒグロマイシン遺伝子を保有する形質転換体系統を選択した。これらを成熟まで成長させ、穀粒（Ｔ１種子）を各々の植物から収穫した。ＰＣＲアッセイによって実証された場合、これらの植物の各々は、野生型ＴＡ１遺伝子を含有するベクターからのＴ－ＤＮＡを含有した。
ＴＡ１遺伝子内の変異が、ｔａ１－１変異体内で見出される肥厚アリューロン及び関連する表現型の要因であったという結論を強化するために、２つの相補性実験を実行した。第１の実験において、天然ＴＡ１プロモーターを含むＴＡ１遺伝子の野生型コピーを、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介形質転換によって、ｔａ１－１変異型植物内に導入した。導入されるＤＮＡ配列を、一連のオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、ＺＨ１１ゲノムＤＮＡから増幅し、次いで、バイナリベクターｐＰＬＶ１５内にアセンブルした。このベクターはまた、ハイグロマイシン耐性遺伝子を、選択可能マーカー遺伝子として含有した。形質転換のためのプラスミド、及び対照プラスミド（空ベクター）を、各々Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ系ＥＨＡ１０５内に導入し、これらを使用して、ｔａ１－１米レシピエント細胞を、Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．（２００６）に記載されている方法を使用して形質転換した。合計５３個のＴ０トランスジェニック植物を、野生型ＴＡ１遺伝子での形質転換から再生した。これらの植物を、土壌に移し、グロースチャンバ内で成熟まで成長させた。ＰＣＲを使用して、ヒグロマイシン耐性遺伝子の存在について試験したときに、３４個の形質転換体系統を確認し、ヒグロマイシン遺伝子を保有する形質転換体系統を選択した。これらを成熟まで成長させ、穀粒（Ｔ１種子）を各々の植物から収穫した。ＰＣＲアッセイによって実証された場合、これらの植物の各々は、野生型ＴＡ１遺伝子を含有するベクターからのＴ－ＤＮＡを含有した。
【0492】
これらの植物から収穫された穀粒を、エバンスブルーで染色することによって、アリューロン表現型について検査した。８つの独立した形質転換植物を試験し、これらの全てが、野生型のような通常のアリューロンを有する穀粒を産生し、これは、導入された遺伝子の正発現、したがって、ｔａ１－１変異の相補性を示した。結論として、これにより、ＴＡ１遺伝子内の変異が変異体表現型を引き起こしたことが判明した。
【0493】
第２の相補性実験において、かつＴＡ１プロモーターからの発現の観察を可能にするために、第２の遺伝子構築物を調製し、形質転換のために使用した。この構築物は、ＴＡ１タンパク質コード配列が野生型米ゲノムから単離された後に翻訳融合したＧＵＳレポーター配列を含んだ。遺伝子構築物は、４，５５０個のヌクレオチドのＤＮＡ断片（配列番号４９として提供されるヌクレオチド配列）を含み、このヌクレオチドＤＮＡ断片は、順に、ＴＡ１遺伝子のプロモーターを含有すると考えられた３２０８ｂｐの上流配列、イントロンの全てを含むＴＡ１タンパク質コード領域全体、次いで、ＴＡ１配列のＣ末端に翻訳融合したＧＵＳレポーターコード領域、最後に、ｎｏｓ ３’ポリアデニル化／転写終結領域を含有した。このＧＵＳ翻訳融合は、ＴＡ１－ＧＵＳ融合タンパク質が発現されたか、及び形質転換植物のどの組織内で発現されたかを試験するように設計された。
【0494】
この第２の構築物を、上記のように、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介形質転換によって、ｔａ１－１植物内に導入した。発達中の種子を含む形質転換された植物の様々な組織を、ＧＵＳ活性のために染色した。トランスジェニック植物のアリューロン及び胚内のＴＡ１－ＧＵＳ融合遺伝子の発現パターンを、図１３に示す。ＧＵＳ活性は、トランスジェニック植物の発達中の米穀粒のアリューロン及び胚内で、特に、ＤＡＰ５～１１日目に観察された。ＧＵＳの強い発現が、依然として、胚内で、ＤＡＰ１８及び２４日目に観察され、より弱い発現が、アリューロン内で、これらの時点で観察された。非常に低いレベルの発現のみが、胚乳内で見出された。
【0495】
また、天然ＴＡ１プロモーターの制御下でＴＡ１－ＧＵＳ融合ポリペプチドをコードする遺伝子構築物が、ｔａ１－１変異に相補的であり、通常の野生型アリューロン表現型を有する植物を得た。これは、ｔａ１－１植物内で同定された変異が、厚アリューロン表現型の要因であることが更に確認した。また、ＴＡ１ポリペプチドへのＧＵＳ融合Ｃ末端は、ＴＡ１機能を損なわなかったと結論された。
【0496】
実施例１１．ＴＡ１タンパク質の細胞内局在
野生型米ＴＡ１ポリペプチド（配列番号３）のタンパク質コード領域、及びＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの制御下でのベクター内の緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、及びｎｏｓ ３’ポリアデニル化領域／転写終結因子に翻訳融合した、植物細胞内で一過性発現するように設計されている遺伝子構築物を作製した。次いで、この構築物を、タバコ葉内に導入して、融合タンパク質の細胞内局在を、融合タンパク質のＧＦＰ蛍光を介して判定した。導入された融合遺伝子の発現を可能にするために数日後に、ＧＦＰシグナルの局在を、ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒのミトコンドリア特異的染色のものと比較した。共焦点蛍光顕微鏡法によって、葉表皮細胞内の構築物から発現されたＴＡ１－ＧＦＰ融合タンパク質が、ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ染色と共局在していることが観察された。ＴＡ１タンパク質は、ＴＡ１タンパク質の代替の名称であるＯｓｍｔＳＳＢ－１ａと一致して、ミトコンドリア局在を提供したＮ末端ミトコンドリア輸送ペプチド（ＭＴＰ）を有したと結論された。これらのデータ及び結論は、ＭＴＰ配列の存在に関する、実施例７に記載される解析と一致した。
野生型米ＴＡ１ポリペプチド（配列番号３）のタンパク質コード領域、及びＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの制御下でのベクター内の緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、及びｎｏｓ ３’ポリアデニル化領域／転写終結因子に翻訳融合した、植物細胞内で一過性発現するように設計されている遺伝子構築物を作製した。次いで、この構築物を、タバコ葉内に導入して、融合タンパク質の細胞内局在を、融合タンパク質のＧＦＰ蛍光を介して判定した。導入された融合遺伝子の発現を可能にするために数日後に、ＧＦＰシグナルの局在を、ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒのミトコンドリア特異的染色のものと比較した。共焦点蛍光顕微鏡法によって、葉表皮細胞内の構築物から発現されたＴＡ１－ＧＦＰ融合タンパク質が、ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ染色と共局在していることが観察された。ＴＡ１タンパク質は、ＴＡ１タンパク質の代替の名称であるＯｓｍｔＳＳＢ－１ａと一致して、ミトコンドリア局在を提供したＮ末端ミトコンドリア輸送ペプチド（ＭＴＰ）を有したと結論された。これらのデータ及び結論は、ＭＴＰ配列の存在に関する、実施例７に記載される解析と一致した。
【0497】
実施例１２．ｔａ１米アリューロン内のミトコンドリア機能及びエネルギー恒常性
野生型ＴＡ１タンパク質のミトコンドリア局在、及び発達中の穀粒内の細胞のミトコンドリア内のＳＳＢタンパク質としての野生型ＴＡ１タンパク質の明らかな機能を鑑みて、本発明者らは、発達中のｔａ１－１穀粒のアリューロン内のミトコンドリアを検査した。透過電子顕微鏡法によるＤＡＰ１５日目でのアリューロン細胞の検査は、変異型穀粒内のミトコンドリアが異常な形状及び形態を有したことを示した。ミトコンドリアは、野生型アリューロン内のより細長い形状と比較して、より環状の形状であり、同じ内部構造を有さず、異なる十分に発達したクリステを有した。
野生型ＴＡ１タンパク質のミトコンドリア局在、及び発達中の穀粒内の細胞のミトコンドリア内のＳＳＢタンパク質としての野生型ＴＡ１タンパク質の明らかな機能を鑑みて、本発明者らは、発達中のｔａ１－１穀粒のアリューロン内のミトコンドリアを検査した。透過電子顕微鏡法によるＤＡＰ１５日目でのアリューロン細胞の検査は、変異型穀粒内のミトコンドリアが異常な形状及び形態を有したことを示した。ミトコンドリアは、野生型アリューロン内のより細長い形状と比較して、より環状の形状であり、同じ内部構造を有さず、異なる十分に発達したクリステを有した。
【0498】
ミトコンドリアの数を、ｔａ１－１及び野生型穀粒のＤＡＰ１５日目の穎花のアリューロン細胞の各々の切片内で計数した。また、ＤＡＰ１１日目の野生型及びｔａ１－１アリューロン内のＡＴＰ含有量を測定した。結果（図１４）は、ｔａ１アリューロン細胞内のミトコンドリアの数が、野生型と比較して増加したが、ＡＴＰ含有量が、有意に低減されたことを示した。
【0499】
更に、ｔａ１－１穀粒のトランスクリプトームを野生型と比較したときに、解糖、酸化リン酸化、及びクエン酸回路に関与する多数の遺伝子が、ｔａ１－１穀粒内で上向き調節されていることが観察された。
【0500】
本発明者らは、これらのデータから、発達中の穀粒の細胞が、変異型ｔａ１遺伝子、及びｍｔＳＳＢタンパク質の関連する低減された機能を補償しようとするため、ＴＡ１遺伝子の変異が、ミトコンドリア機能の欠陥をもたらし、ミトコンドリア機能の欠陥が、ミトコンドリア及び上向き調節された遺伝子の数の増加に関連し、この増加が、ミトコンドリア機能に関連したと結論した。
【0501】
実施例１３．ＴＡ１遺伝子内の追加の変異型アレルについてのスクリーニング
ＴＡ１遺伝子の可能なノックアウト（ヌル）変異を含む更なる変異を提供するために、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９遺伝子編集法を、以下のように使用した。４つの別個のＣＲＩＳＰＲ構築物を、Ｄｒ．Ｙａｏｇｕａｎｇ Ｌｉｕ（Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓｏｕｔｈ Ｃｈｉｎａ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ｃｈｉｎａ）によって提供されたベクターｐＹＬＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９－ＭＨを改変することによって作製した。最初に、２０個のヌクレオチドの４つの領域であって、４つの領域の各々の直後に、３つのヌクレオチドのＰＡＭ（プロトスペーサー隣接モチーフ）配列を有する、４つの領域を、ＴＡ１ ｃＤＮＡヌクレオチド配列から、潜在的ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）標的配列として同定した。Ｃａｓｇ１、Ｃａｓｇ２、Ｃａｓｇ３、及びＣａｓｇ４と称されるｇＲＮＡ標的を、それぞれ、第２の（ｇ１及びｇ２）、第３の（ｇ３）、及び第４の（ｇ４）エクソン内の変異を産生する目的で選択した。次いで、ｇＲＮＡ標的がｇＲＮＡ骨格内に組み込まれており、米からのＵ３プロモーターによって駆動されるｇＲＮＡ標的構築物を合成した。合成されたＤＮＡを、制限酵素ＢｓａＩを使用して切除し、ｐＹＬＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９－ＭＨベクター内に挿入した。次いで、合成遺伝子構築物を、単離し、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ系ＥＨＡ１０５内に形質転換した。米の形質転換を、Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．（２００６）による方法によって実行した。トランスジェニック米植物を、形質転換されたカルスから再生した。変異型植物の種子を、成熟穎花を薄切することによって、種子のアリューロン表現型について検査して、アリューロン層細胞数を解析した。
ＴＡ１遺伝子の可能なノックアウト（ヌル）変異を含む更なる変異を提供するために、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９遺伝子編集法を、以下のように使用した。４つの別個のＣＲＩＳＰＲ構築物を、Ｄｒ．Ｙａｏｇｕａｎｇ Ｌｉｕ（Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓｏｕｔｈ Ｃｈｉｎａ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ｃｈｉｎａ）によって提供されたベクターｐＹＬＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９－ＭＨを改変することによって作製した。最初に、２０個のヌクレオチドの４つの領域であって、４つの領域の各々の直後に、３つのヌクレオチドのＰＡＭ（プロトスペーサー隣接モチーフ）配列を有する、４つの領域を、ＴＡ１ ｃＤＮＡヌクレオチド配列から、潜在的ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）標的配列として同定した。Ｃａｓｇ１、Ｃａｓｇ２、Ｃａｓｇ３、及びＣａｓｇ４と称されるｇＲＮＡ標的を、それぞれ、第２の（ｇ１及びｇ２）、第３の（ｇ３）、及び第４の（ｇ４）エクソン内の変異を産生する目的で選択した。次いで、ｇＲＮＡ標的がｇＲＮＡ骨格内に組み込まれており、米からのＵ３プロモーターによって駆動されるｇＲＮＡ標的構築物を合成した。合成されたＤＮＡを、制限酵素ＢｓａＩを使用して切除し、ｐＹＬＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９－ＭＨベクター内に挿入した。次いで、合成遺伝子構築物を、単離し、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ系ＥＨＡ１０５内に形質転換した。米の形質転換を、Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．（２００６）による方法によって実行した。トランスジェニック米植物を、形質転換されたカルスから再生した。変異型植物の種子を、成熟穎花を薄切することによって、種子のアリューロン表現型について検査して、アリューロン層細胞数を解析した。
【0502】
表４は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９法を使用して産生された少なくとも１３個の独立した系統を含む２８個の系統内のＴＡ１変異を列挙する。これらの系統の全ては、タンパク質コード領域内のフレームシフト変異を有し、フレームシフト変異は、中途翻訳終結を引き起こした終止コドンをもたらし、このため、ヌル変異であった。重要なことに、変異型系統の全ての種子は、厚アリューロン表現型を示した。変異型系統のうちのいくつかの穀粒は、加えて、野生型に対して、白亜色の胚乳、低減された結実、及び低減された１０００個の穀粒の重量のうちの１つ以上を含む他の表現型変化を有した。ＴＡ１遺伝子のヌルアレル（配列番号１、配列番号３をコードする、及び相同ＴＡ１遺伝子）が、厚アリューロン及び関連する表現型を付与したと結論された。米及び穀類を含む他の植物における遺伝子編集技法の現在の効率で、ＣＲＩＳＰＲ又はＴＡＬＥＮＳを使用するものなどの遺伝子編集は、厚アリューロン表現型を得るための好ましい方法である。
【表4】
【0503】
実施例１４．ＴＡ１タンパク質は、ＲＥＣＡ３及びＴＷＩＮＫＬＥポリペプチドと会合する
ＳＳＢタンパク質は、ＤＮＡ複製、密接に関連する又は同一の染色体間の相同組換え、及びＤＮＡ修復において重要な役割を有する。細菌内で、ＲｅｃＡタンパク質は、相同鎖交換を触媒し、ＳＳＢタンパク質は、おそらく、ＤＮＡ鎖分離を安定化させることによって、反応を増強する。ミトコンドリアＳＳＢタンパク質は、植物細胞内の複数のミトコンドリアゲノムの複製及び組換えにおいて同様の役割を有すると考えられる（Ｅｄｍｏｎｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００５）。ミトコンドリアＤＮＡ複製は、複数の核コードタンパク質を必要とし、核コードタンパク質は、植物オルガネラＤＮＡポリメラーゼ又はＰＯＰとして既知のＤＮＡポリメラーゼ（Ｍｏｒｉｙａｍａ ａｎｄ Ｓａｔｏ，２０１４）、ＲＮＡプライマーを合成するために作用するプライマーゼ、ジャイレースとも称されるＤＮＡトポイソメラーゼ、ｍｔＳＳＢ、及びＴＷＩＮＫＬＥとしても既知の、二本鎖ＤＮＡを巻き戻すヘリカーゼを含む。ミトコンドリアに局在する、植物内のＴＷＩＮＫＬＥ酵素は、プリマーゼ及びヘリカーゼ活性の両方を有し、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼＩによって伸長された少なくとも１５個のヌクレオチドの長さのＲＮＡプライマーを高分子量ＤＮＡに合成することが可能である（Ｄｉｒａｙ－Ａｒｃｅ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。
ＳＳＢタンパク質は、ＤＮＡ複製、密接に関連する又は同一の染色体間の相同組換え、及びＤＮＡ修復において重要な役割を有する。細菌内で、ＲｅｃＡタンパク質は、相同鎖交換を触媒し、ＳＳＢタンパク質は、おそらく、ＤＮＡ鎖分離を安定化させることによって、反応を増強する。ミトコンドリアＳＳＢタンパク質は、植物細胞内の複数のミトコンドリアゲノムの複製及び組換えにおいて同様の役割を有すると考えられる（Ｅｄｍｏｎｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００５）。ミトコンドリアＤＮＡ複製は、複数の核コードタンパク質を必要とし、核コードタンパク質は、植物オルガネラＤＮＡポリメラーゼ又はＰＯＰとして既知のＤＮＡポリメラーゼ（Ｍｏｒｉｙａｍａ ａｎｄ Ｓａｔｏ，２０１４）、ＲＮＡプライマーを合成するために作用するプライマーゼ、ジャイレースとも称されるＤＮＡトポイソメラーゼ、ｍｔＳＳＢ、及びＴＷＩＮＫＬＥとしても既知の、二本鎖ＤＮＡを巻き戻すヘリカーゼを含む。ミトコンドリアに局在する、植物内のＴＷＩＮＫＬＥ酵素は、プリマーゼ及びヘリカーゼ活性の両方を有し、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼＩによって伸長された少なくとも１５個のヌクレオチドの長さのＲＮＡプライマーを高分子量ＤＮＡに合成することが可能である（Ｄｉｒａｙ－Ａｒｃｅ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。
【0504】
被子植物の複数のミトコンドリア染色体は、しばしば、特に、関与する反復配列を再編成し組換えて、多様な配列重複、反転、欠失、及び挿入を産生する（Ｇｕａｌｂｅｒｔｏ ａｎｄ Ｎｅｗｔｏｎ，２０１７）。いくつかの核遺伝子は、ミトコンドリアＤＮＡ組換え及びゲノム安定性を制御することが既知である。通常、これらの遺伝子は、ＤＮＡ複製、組換え、又は修復の忠実度に影響するタンパク質をコードし、これらの遺伝子内の変異体は、しばしば、ミトコンドリアＤＮＡの組換えられた代替の構成の蓄積をもたらす。これらのタンパク質は、細菌内のＲｅｃＡと同様に鎖交換を触媒するリコンビナーゼを含む。Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａは、３つのＲｅｃＡ様タンパク質（ＲＥＣＡ１～ＲＥＣＡ３）を有する（Ｓｈｅｄｇｅ ｅｔ ａｌ．，２００７）。ＲＥＣＡ１は、全ての植物内で保存されており、プラスチドを標的にする。ＲＥＣＡ２は、顕花植物及びコケ内に存在し、ミトコンドリア及びプラスチドの両方を標的にする。対照的に、ＲＥＣＡ３タンパク質は、ミトコンドリアのみを標的にする。Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ内で、ｒｅｃＡ２及びｒｅｃＡ３変異の両方が、中間サイズの反復にわたって異所性組換えの増加をトリガーする。ｒｅｃＡ２変異は、通常、早期実生段階において致死的であり、ｒｅｃＡ３ノックアウト植物は、通常、第１世代において表現型的に通常であるが、後続の世代において効果を示すことができる。
【0505】
したがって、本発明者らは、ＴＷＩＮＫＬＥ及びＲＥＣＡ３が米内でＴＡ１と同じプロセスに関与し得るかを試験した。米ＴＷＩＮＫＬＥ及びＲＥＣＡ３配列を、クエリとしてＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ配列で検索することによって、米ゲノム配列から同定した。米タンパク質のアミノ酸配列、これらのタンパク質をコードする遺伝子のヌクレオチド配列、及びこれらの遺伝子についてのｃＤＮＡのタンパク質コード配列のヌクレオチド配列を、配列番号６１～６６として提供する。
【0506】
一連の実験において、ＴＷＩＮＫＬＥ及びＲＥＣＡ３タンパク質とＴＡ１との相互作用が示された。１つの実験において、スプリット黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）アッセイを、融合タンパク質をコードする構築物の対との共形質転換によって、タバコ葉内で実行した。各々の対において、一方は、ＹＦＰのＮ末端半分をコードし、他方は、ＹＦＰのＣ末端半分をコードした。一方の構築物は、キメラ遺伝子ｐ３５Ｓ：ＴＡ１－ｎＹＰＦを有し、他方は、ｐ３５Ｓ：ＲＥＣＡ３－ｃＹＦＰ又はｐ３５Ｓ：ＴＷＩＮＫＬＥ－ｃＹＰＦのいずれかを有した。形質転換された細胞を、共焦点顕微鏡下で検査した。蛍光ドットが、細胞質内で観察された。この染色及びミトコンドリア特異的染色から、ＴＡ１タンパク質は、ＲＥＣＡ３及びＴＷＩＮＫＬＥの両方と相互作用し、全ての３つが、ミトコンドリア内に局在すると結論された。
【0507】
また、ＴＡ１とＲＥＣＡ３及びＴＷＩＮＫＬＥとのインビボ相互作用を、ポリペプチドのうちの一方を特異的に回収し他方のポリペプチドが共沈殿する免疫沈降実験によって実証した。これを行うために、タグ付きタンパク質の一過性発現のために、構築物ｐ３５Ｓ：ＴＡ１－ＭＹＣを、ｐ３５Ｓ：ＲＥＣＡ３－ＨＡ構築物又はｐ３５Ｓ：ＴＷＩＮＫＬＥ－ＨＡ構築物のいずれかとともに、タバコ葉内に共浸透させた。総タンパク質を、浸透した組織から抽出し、共免疫沈降に供し、得られたタンパク質画分を、ウエスタンブロットを使用して試験した。別の実験において、スプリットルシフェラーゼアッセイを、浸透したタバコ葉内で実施して、ＴＡ１がＲＥＣＡ３及びＴＷＩＮＫＬＥの両方と相互作用することを示した。
【0508】
これらの実験の各々から、本発明者らは、ＴＡ１タンパク質が、ＲＥＣＡ３及びＴＷＩＮＫＬＥタンパク質と会合し、これらが、ミトコンドリア内に局在したと結論した。
【0509】
実施例１５．ＲＥＣＡ３又はＴＷＩＮＫＬＥ遺伝子の下向き調節は、米内で肥厚アリューロンを産生する
ＴＡ１タンパク質がミトコンドリア内のＲＥＣＡ３及びＴＷＩＮＫＬＥと会合したことを示す観察を鑑みて、本発明者らは、米内のＲＥＣＡ３及びＴＷＩＮＫＬＥをコードする遺伝子の発現の低減もまた、穀粒内のより厚いアリューロンをもたらすかを試験した。これを、ＲｅｃＡ３及びＴＷＩＮＫＬＥ遺伝子の発現を低減するために、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を使用して試験した。ＲＮＡｉ構築物を作製するために、ＲｅｃＡ３及びＴＷＩＮＫＬＥ遺伝子の各々の領域を選択し、この領域を使用して、ヘアピンＲＮＡを発現する逆方向反復構築物を作製した。これらの構築物を、標準的な方法を使用する野生型米のＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介形質転換のために使用し、形質転換体を選択した。ｑＲＴ－ＰＣＲによって示された場合、穀粒内の遺伝子の低減された発現を有する植物を選択した（図１５）。３つの系統を、各々の構築物について選択した。
ＴＡ１タンパク質がミトコンドリア内のＲＥＣＡ３及びＴＷＩＮＫＬＥと会合したことを示す観察を鑑みて、本発明者らは、米内のＲＥＣＡ３及びＴＷＩＮＫＬＥをコードする遺伝子の発現の低減もまた、穀粒内のより厚いアリューロンをもたらすかを試験した。これを、ＲｅｃＡ３及びＴＷＩＮＫＬＥ遺伝子の発現を低減するために、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を使用して試験した。ＲＮＡｉ構築物を作製するために、ＲｅｃＡ３及びＴＷＩＮＫＬＥ遺伝子の各々の領域を選択し、この領域を使用して、ヘアピンＲＮＡを発現する逆方向反復構築物を作製した。これらの構築物を、標準的な方法を使用する野生型米のＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介形質転換のために使用し、形質転換体を選択した。ｑＲＴ－ＰＣＲによって示された場合、穀粒内の遺伝子の低減された発現を有する植物を選択した（図１５）。３つの系統を、各々の構築物について選択した。
【0510】
選択された系統からの穎花を、顕微鏡法によって、横断面によるＰＡＳで染色されたアリューロン厚さについて検査したときに、トランスジェニック穎花の全てが、野生型と比較して肥厚アリューロンを有したことが観察された。ＲｅｃＡ３及びＴＷＩＮＫＬＥ遺伝子についてより低減された系統は、より影響され、アリューロンの少なくともいくつかのゾーンにおいて２～８層の範囲であるより厚いアリューロンを有した。また、トランスジェニック穀粒のデンプン性胚乳が、白亜色又は不透明な外観を有したことが観察された。
【0511】
これらの実験に基づいて、本発明者らは、ＴＡ１－ＲＥＣＡ３／ＴＷＩＮＫＬＥ複合体によって媒介されるアリューロン細胞層内のエネルギー恒常性の調節を記載するモデルを開発した。これは、穀粒発達中のｍｔＤＮＡの非正統的組換えを抑制し、したがって、サブアリューロン細胞運命の分化を決定し、サブアリューロン細胞運命の分化において、野生型穀粒内のデンプン性胚乳の最外側細胞を形成する細胞が、代わりに、アリューロン細胞としての同一性を保持して、肥厚アリューロンをもたらす。
【0512】
実施例１６．他の穀類内の米ＴＡ１遺伝子の相同体
一本鎖ＤＮＡ結合（ＳＳＢ）タンパク質は、ＤＮＡ複製、相同組換え、及びＤＮＡ修復において重要な役割を果たす（Ｍｏｒｉｙａｍａ ａｎｄ Ｓａｔｏ，２０１４）。細菌内で、ＲｅｃＡタンパク質は、相同鎖交換を触媒し、ＳＳＢタンパク質は、この反応を増強する（ＭｃＥｎｔｅｅ ｅｔ ａｌ．１９８０、Ｓｔｅｆｆｅｎ ａｎｄ Ｂｒｙａｎｔ ２００１）。ミトコンドリア標的一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ｍｔＳＳＢ）をコードする植物遺伝子は、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａにおいて特徴付けられており、これは、ＲｅｃＡ、ＳＳＢ、又はミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）組換えに関与する他のタンパク質のミトコンドリア標的相同体が植物内に存在するという最も早期の直接的証拠であった（Ｅｄｍｏｎｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００５）。配列番号３をクエリとして使用して、Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ ＳＳＢ遺伝子である、以下それぞれＡｔｍｔＳＳＢ－１及びＡｔｍｔＳＳＢ－２と称されるＡｔ４ｇ１１０６０及びＡｔ３ｇ１８５８０を、Ｔｈｅ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ（ＴＡＩＲ）データベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ．ｏｒｇ）におけるＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓゲノムのＢＬＡＳＴ検索によって同定した。ＡｔｍｔＳＳＢ－１ポリペプチドは、配列番号３の完全長と６６％同一のアミノ酸配列であり、ＡｔｍｔＳＳＢ－２ポリペプチドは、はるかにより少なく相同であり、２６％の同一性であった（表５）。したがって、Ａ．ｔｈａｌｉａｎａは、２つのｍｔＳＳＢ遺伝子を有する。Ａｔ４ｇ１１０６０は、２８個の残基の推定ミトコンドリア標的ペプチド（ＭＴＰ）を含む、２０１個のアミノ酸（配列番号１５）のタンパク質をコードする。Ａｔ３ｇ１８５８０は、２３個の残基の推定ＭＴＰを含む、２１７個のアミノ酸（配列番号３１）のタンパク質をコードする。また、モデル樹木種Ｐｏｐｕｌｕｓ ｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ（ポプラ）は、２つのｍｔＳＳＢ配列、すなわち、ＰｔｍｔＳＳＢ－１（配列番号２１）及びＰｔｍｔＳＳＢ－２（配列番号３９）を有した。
一本鎖ＤＮＡ結合（ＳＳＢ）タンパク質は、ＤＮＡ複製、相同組換え、及びＤＮＡ修復において重要な役割を果たす（Ｍｏｒｉｙａｍａ ａｎｄ Ｓａｔｏ，２０１４）。細菌内で、ＲｅｃＡタンパク質は、相同鎖交換を触媒し、ＳＳＢタンパク質は、この反応を増強する（ＭｃＥｎｔｅｅ ｅｔ ａｌ．１９８０、Ｓｔｅｆｆｅｎ ａｎｄ Ｂｒｙａｎｔ ２００１）。ミトコンドリア標的一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ｍｔＳＳＢ）をコードする植物遺伝子は、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａにおいて特徴付けられており、これは、ＲｅｃＡ、ＳＳＢ、又はミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）組換えに関与する他のタンパク質のミトコンドリア標的相同体が植物内に存在するという最も早期の直接的証拠であった（Ｅｄｍｏｎｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００５）。配列番号３をクエリとして使用して、Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ ＳＳＢ遺伝子である、以下それぞれＡｔｍｔＳＳＢ－１及びＡｔｍｔＳＳＢ－２と称されるＡｔ４ｇ１１０６０及びＡｔ３ｇ１８５８０を、Ｔｈｅ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ（ＴＡＩＲ）データベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ．ｏｒｇ）におけるＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓゲノムのＢＬＡＳＴ検索によって同定した。ＡｔｍｔＳＳＢ－１ポリペプチドは、配列番号３の完全長と６６％同一のアミノ酸配列であり、ＡｔｍｔＳＳＢ－２ポリペプチドは、はるかにより少なく相同であり、２６％の同一性であった（表５）。したがって、Ａ．ｔｈａｌｉａｎａは、２つのｍｔＳＳＢ遺伝子を有する。Ａｔ４ｇ１１０６０は、２８個の残基の推定ミトコンドリア標的ペプチド（ＭＴＰ）を含む、２０１個のアミノ酸（配列番号１５）のタンパク質をコードする。Ａｔ３ｇ１８５８０は、２３個の残基の推定ＭＴＰを含む、２１７個のアミノ酸（配列番号３１）のタンパク質をコードする。また、モデル樹木種Ｐｏｐｕｌｕｓ ｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ（ポプラ）は、２つのｍｔＳＳＢ配列、すなわち、ＰｔｍｔＳＳＢ－１（配列番号２１）及びＰｔｍｔＳＳＢ－２（配列番号３９）を有した。
【0513】
米（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ、Ｊａｐｏｎｉｃａ群）ゲノムは、（ＯｓＴＡ１＝ＯｓｍｔＳＳＢ－１ａをコードする）Ｏｓ０５ｇ０５０９７００に関連する２つの他の遺伝子、すなわち、Ｒｉｃｅ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ Ｐｒｏｊｅｃｔ（ＲＧＡＰ）データベース（ｈｔｔｐ：／／ｒｉｃｅ．ｐｌａｎｔｂｉｏｌｏｇｙ．ｍｓｕ．ｅｄｕ／）における米ゲノム及びアミノ酸配列のＢＬＡＳＴ検索によって同定された、以下それぞれＯｓｍｔＳＳＢ－１ｂ及びＯｓｍｔＳＳＢ－２と称されるＯｓ０４ｇ０３６３７００及びＯｓ０１ｇ０６４２９００を有することが観察された。ＯｓｍｔＳＳＢ－１ｂは、配列番号３の完全長と７２％の同一性でＯｓｔｍｔＳＳＢ－１ａに近い配列であり、ＯｓｔｍｔＳＳＢ－２は、より少なく相同であり、３２％の同一性であった。Ｏｓｔｍｔ－ＳＳＢ－１ｂは、ＯｓＴＡ１様又はＯｓＴＡ１Ｌとも本明細書で称される。したがって、米は、３つのｍｔＳＳＢ遺伝子を有する。ＡｔｍｔＳＳＢタンパク質と同様に、ＯｓｍｔＳＳＢポリペプチドの全ての３つが、ＳＳＢドメインを有し、これは、ＯｓｍｔＳＳＢ－１ｂについて、検査された植物ＴＡ１ポリペプチド配列の全てに存在するモチーフＩ～ＩＶを含んだ。
【0514】
表５は、一連の相同植物ポリペプチドとの米ＴＡ１（ＯｓｍｔＳＳＢ－１ａ；配列番号３）ポリペプチド及びＯｓＴＡ１Ｌのアミノ酸配列同一性を提供する。図７は、これらの植物配列のうちのいくつかのアライメントを示す。検査された２つの双子葉種は、単子葉種のうちのいくつかと同様に、各々２つのｍｔＳＳＢ配列のみを有し、他の単子葉種は、ＯｓＴＡ１に最も近いもの（少なくとも８０％同一）及びＯｓＴＡ１Ｌにより近い配列のものを含む３つのｍｔＳＳＢ配列を有した。全体的に、植物ｍｔＳＳＢ－１配列は、配列番号３と少なくとも６０％の同一性を有し、ｍｔＳＳＢ－２配列は、配列番号３と３２％以下の同一性を有した。
【0515】
図１６は、他の植物種、主に、穀類種からのＴＡ１（ＯｓｍｔＳＳＢ－１ａ）ポリペプチドの相同体の関連性を示す系統発生樹を提供する。各々の場合、最も相同のアミノ酸配列は、配列番号３の完全長に沿って、配列番号３と少なくとも６０％同一であった。解析において使用されたアミノ酸配列は、ＯｓＴＡ１に最も関連するｍｔＳＳＢ－１又はｍｔＳＳＢ－１ａ配列についての配列番号１５～２３、ＯｓＴＡ１よりもＯｓＴＡ１Ｌに密接に関連するｍｔＳＳＢ－１ｂ配列についての配列番号２４～２９、及びｍｔＳＳＢ－２配列についての配列番号３０～３９として提供される。
【0516】
本発明者らは、植物種が、２つ又は３つのｍｔＳＳＢ配列を有し、これらの全てが、機能的であることが予想され、これは、ある程度の機能的冗長性を提供すると結論した。この解析は、異なるｍｔＳＳＢ遺伝子の組織特異性には取り組まなかった。
【表5】
【0517】
実施例１７．他の植物種内の米ＲＥＣＡ３及びＴＷＩＮＫＬＥ遺伝子の相同体
配列番号６１（米ＲＥＣＡ３ポリペプチド）をクエリとして使用して、様々な穀類及び関連する単子葉植物、並びにいくつかの双子葉植物からの相同アミノ酸配列を、配列データベースのＢＬＡＳＴ検索によって同定した。異なる植物種内のＲＥＣＡ３ポリペプチドの高度な配列保存に起因して、相同配列を容易に同定した。ポリペプチドは、ミトコンドリア又はプラスチド転座のためのＮ末端シグナル配列を含む長さが、４２５個～４３５個のアミノ酸残基であった（表６）。また、これらのＲＥＣＡ３タンパク質をコードする遺伝子についての対応するｃＤＮＡ配列を同定した（表６）。穀類及び草ＲＥＣＡ３ポリペプチドは、配列番号６１の完全長と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列であり、双子葉植物からのＲＥＣＡ３ポリペプチドは、より少なく相同であり、配列番号６１と６７～７２％同一であった。アミノ酸配列の各々は、ミトコンドリア標的ペプチド（ＭＴＰ）をＮ末端において含むと推定され、これは、ポリペプチドがミトコンドリアに転座するにつれて切断除去されると予測された。
配列番号６１（米ＲＥＣＡ３ポリペプチド）をクエリとして使用して、様々な穀類及び関連する単子葉植物、並びにいくつかの双子葉植物からの相同アミノ酸配列を、配列データベースのＢＬＡＳＴ検索によって同定した。異なる植物種内のＲＥＣＡ３ポリペプチドの高度な配列保存に起因して、相同配列を容易に同定した。ポリペプチドは、ミトコンドリア又はプラスチド転座のためのＮ末端シグナル配列を含む長さが、４２５個～４３５個のアミノ酸残基であった（表６）。また、これらのＲＥＣＡ３タンパク質をコードする遺伝子についての対応するｃＤＮＡ配列を同定した（表６）。穀類及び草ＲＥＣＡ３ポリペプチドは、配列番号６１の完全長と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列であり、双子葉植物からのＲＥＣＡ３ポリペプチドは、より少なく相同であり、配列番号６１と６７～７２％同一であった。アミノ酸配列の各々は、ミトコンドリア標的ペプチド（ＭＴＰ）をＮ末端において含むと推定され、これは、ポリペプチドがミトコンドリアに転座するにつれて切断除去されると予測された。
【0518】
本発明者らは、植物種が、野生型ＲＥＣＡ３配列を有し、野生型ＲＥＣＡ３配列が、ミトコンドリア内で機能的であり、サイレンシングＲＮＡによる変異誘発又は下向き調節によって改変され得ると結論した。
【0519】
また、配列番号６４（米ＴＷＩＮＫＬＥポリペプチド）をクエリとして使用して、様々な単子葉植物及び双子葉植物からの相同アミノ酸配列を、配列データベースのＢＬＡＳＴ検索によって同定した。同様に、異なる植物種内のＴＷＩＮＫＬＥポリペプチドの高度な配列保存に起因して、相同配列を容易に同定した。ポリペプチドは、ミトコンドリア又はプラスチド転座のためのＮ末端シグナル配列を含む長さが、６９５個～７６１個のアミノ酸残基であった（表７）。また、これらのＲＥＣＡ３タンパク質をコードする遺伝子についての対応するｃＤＮＡ配列を同定した（表７）。これらの植物種のうちの多くについて、複数のｃＤＮＡ配列を同定し、これは、おそらく、遺伝子からの転写物の選択的スプライシングを示す。穀類及び草ＲＥＣＡ３ポリペプチドは、配列番号６４の完全長と少なくとも７７％同一のアミノ酸配列であり、双子葉植物からのＲＥＣＡ３ポリペプチドは、より少なく相同であり、配列番号６４と６７～７５％同一であった。アミノ酸配列の各々は、ミトコンドリア標的ペプチド（ＭＴＰ）をＮ末端において含むと推定され、これは、ポリペプチドがミトコンドリアに転座するにつれて切断除去されると予測された。
【0520】
図１７は、穀類種を含む他の植物種からの米ＴＷＩＮＫＬＥポリペプチドの相同体の関連性を示す系統発生樹を提供する。各々の場合、最も相同のアミノ酸配列は、配列番号６４の完全長に沿って、配列番号６４と少なくとも６０％同一であった。本発明者らは、植物種が、ミトコンドリア内で機能的である野生型ＴＷＩＮＫＬＥ配列を有すると結論した。
【表6】
【表7】
【0521】
実施例１８．黒米内へのｔａ１変異の育種
「黒米」は、外層であるふすま及び外皮がアントシアニンで着色された米穀粒を記載するために使用される用語である。これらの色素は、実際に、深い紫色であり、黒色でないが、色素の高濃度は、穀粒を黒色又は濃い灰色に見せる。色素は、強力な抗酸化物質であり、抗酸化物質は、様々な健康利益を有すると考えられる（Ｙａｏ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。
「黒米」は、外層であるふすま及び外皮がアントシアニンで着色された米穀粒を記載するために使用される用語である。これらの色素は、実際に、深い紫色であり、黒色でないが、色素の高濃度は、穀粒を黒色又は濃い灰色に見せる。色素は、強力な抗酸化物質であり、抗酸化物質は、様々な健康利益を有すると考えられる（Ｙａｏ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。
【0522】
ｔａ１変異型アレルを異なる遺伝的背景内に導入するために、黒米変種Ｚｉｘｉａｎｇｎｕｏ １３０６を最初に、反復親として選択した。この変種は、Ｊａｐｏｎｉｃａ米であり、ＴＡ１遺伝子についての野生型である。この変種は、中国のより北部地域において成長させるのに好適であり、良好な耐寒性、塩類土壌への耐性、及び耐病性を有する。成熟において、Ｚｉｘｉａｎｇｎｕｏ １３０６の葉の数は、約１５であり、植物高さは、理想的な範囲で、７０～８５ｃｍであり、葉色は、濃い緑色であり、実生苗及び植物は、芳香性である。１ミュー当たりの穀粒の総数は、約１００であり、結実度は、少なくとも８５％である。内穎の色は、穂の始まりにおいて緑色であり、穀粒が登熟段階に達したときに薄紫色であり、成熟において銀白色である。１０００個の成熟穀粒の重量は、典型的には、約２３ｇである。概して、１ミュー当たりの収量は、良好であり、３００～４００ｋｇであり、理想的な成長条件下で、４５０ｋｇ／ミュー超に達する。穀粒のデンプンのアミロース含有量は、約５～６％であり、調理された穀粒は、食べられるときに柔らかい食感であると考えられる。
【0523】
ｔａ１－１アレルを導入するために、交雑を、雌親としてのｔａ１－１アレルを保有するＺｈｏｎｇｈｕａ １１植物と、雄親としてのＺｉｘｉａｎｇｎｕｏ １３０６（ＴＡ１）の植物との間で行った。次いで、交雑からのＦ１子孫植物を、２世代にわたって反復親としてＺｉｘｉａｎｇｎｕｏ １３０６の植物と戻し交雑して、ＢＣ２Ｆ１戻し交雑子孫植物の集団を確立した。これらの植物のうちのいくつかを、自家受粉して、ＢＣ２Ｆ２植物を産生し、ＢＣ２Ｆ２植物から、ＢＣ２Ｆ３子孫を同定し、ｔａ１－１アレルについてホモ接合性であるＢＣ２Ｆ３子孫を選択した。この育種プログラムにおいて、ＴＡ１及びｔａ１－１アレルを、実施例１に記載されるように、ＰＣＲ産物の酵素消化（２０１４～１７年）によって、又は高解像度ＤＮＡ融解曲線（ＨＲＭ、２０１８年～現在）によって検出した。アリューロン層肥厚を、米穀粒の断面におけるアリューロン層を観察することによって監視した。ｔａ１－１についてホモ接合性である４つの遺伝的に安定した系統を得、Ｚｈｏｎｇｚｉ１、Ｚｈｏｎｇｚｉ２、Ｚｈｏｎｇｚｉ３、Ｚｈｏｎｇｚｉ４と称した。これらの系統は、上記のＺｉｘｉａｎｇｎｕｏ １３０６の好ましい特徴のほとんど、例えば、イモチ耐病性及び導入されたｔａ１－１アレルによって付与された肥厚アリューロンを遺伝した。
【0524】
新しい変種を、圃場で成長させ、一連のパラメータを測定され、野生型と比較した。データを、表８に示す。これらの試験における野生型変種（ＷＴ）は、Ｚｉｘｉａｎｇｎｕｏ １３０６であった。
【0525】
Ｚｈｏｎｇｚｉ ｔａ１変異型穀粒の栄養組成を、一連の栄養素について判定し、ＴＡ１遺伝子及び通常のアリューロンを有する野生型Ｚｈｏｎｇｈｕａ １１（ＺＨ１１）、又は肥厚アリューロンを有するＺＨ１１遺伝的背景内のｔａ１－１である野生型Ｚｉｘｉａｎｇｎｕｏ １３０６（黒米、ＴＡ１）及びＺｈｏｎｇｚｉ（黒米、ｔａ１）と比較した。ｔａ１黒米は、タンパク質、食物繊維、ミネラル、及びビタミンＢを含む、測定された栄養素の全ての量が有意により高いことが観察された。鉄、亜鉛、及びビタミンＢ６の増加は、特に、本発明者らにとって印象的で驚くべきものであった。
【0526】
したがって、黒米変種内のｔａ１変異を有するこれらのＺｈｏｎｇｚｉ高栄養米変種を産生するための成功裏の育種は、より栄養のある米食品及び飲料のために使用され得る新しい米変種を提供した。
【表8(1)】
【表8(2)】
【0527】
Ｚｈｏｎｇｚｉ ｔａ１変異型穀粒の栄養組成を、一連の栄養素について判定し、ＴＡ１遺伝子及び通常のアリューロンを有する野生型Ｚｈｏｎｇｈｕａ １１（ＺＨ１１）、又は肥厚アリューロンを有するＺＨ１１遺伝的背景内のｔａ１－１である野生型Ｚｉｘｉａｎｇｎｕｏ １３０６（黒米、ＴＡ１）及びＺｈｏｎｇｚｉ（黒米、ｔａ１）と比較した。ｔａ１黒米は、タンパク質、食物繊維、ミネラル、及びビタミンＢを含む、測定された栄養素の全ての量が有意により高いことが観察された（表９）。鉄、亜鉛、及びビタミンＢ６の増加は、特に、本発明者らにとって印象的で驚くべきものであった。
【0528】
したがって、黒米変種内のｔａ１変異を有するこれらのＺｈｏｎｇｚｉ高栄養米変種を産生するための成功裏の育種は、より栄養のある米食品及び飲料のために使用され得る新しい米変種を提供した。
【表9】
【0529】
実施例１９．ｔａ１変異型米からの食品及び飲料の製造
肥厚アリューロンを有する米穀粒は、当量の野生型米で作製された対応する成分、食品、又は飲料に対して増加した栄養素量を有する、食品成分、飲料成分、並びに食品及び飲料の製造に有用であると考えられた。したがって、様々な食品及び飲料を調製し、ヒトボランティアによって質、香り、味について試験した。これに使用された米穀粒は、変種Ｚｈｏｎｇｚｉ１、Ｚｈｏｎｇｚｉ２、Ｚｈｏｎｇｚｉ３、及びＺｈｏｎｇｚｉ４（実施例１８）であった。収穫後の米穀粒は、１１．６５％の含水量及び７６０ｇ／Ｌの密度を有した。
肥厚アリューロンを有する米穀粒は、当量の野生型米で作製された対応する成分、食品、又は飲料に対して増加した栄養素量を有する、食品成分、飲料成分、並びに食品及び飲料の製造に有用であると考えられた。したがって、様々な食品及び飲料を調製し、ヒトボランティアによって質、香り、味について試験した。これに使用された米穀粒は、変種Ｚｈｏｎｇｚｉ１、Ｚｈｏｎｇｚｉ２、Ｚｈｏｎｇｚｉ３、及びＺｈｏｎｇｚｉ４（実施例１８）であった。収穫後の米穀粒は、１１．６５％の含水量及び７６０ｇ／Ｌの密度を有した。
【0530】
焙煎された米穀粒及び黒米茶
米茶を、全穀粒を浸漬することと、全穀粒をある期間焙煎する（ベーキングする）ことと、次いで、穀粒を沸騰水中に浸漬する（漬ける又は茶を入れる）こととによって調製した。焙煎温度及び時間を試験するための１つの実験において、５０ｇの穀粒の試料を、水中に１４時間浸漬し、排水し、米穀粒を、異なる条件下で焙煎した（表１０）。結果は、焙煎温度を約２１０℃で６分間超保ったときに、焙煎された穀粒の香りが、強く好ましかったことを示した。香りは、ヒトのボランティアによって、発酵ソースを連想させると考えられた。焙煎温度が１８０℃超であり、時間が３．５分間超であったときに、顆粒の香りは、より低い温度又はより少ない時間でよりも明白であった。ボランティアは、粒子完全性及び香りによれば、焼飯の強い感覚を有する特有の「特別な焼けた」香りを有すると、香りを記述した。
米茶を、全穀粒を浸漬することと、全穀粒をある期間焙煎する（ベーキングする）ことと、次いで、穀粒を沸騰水中に浸漬する（漬ける又は茶を入れる）こととによって調製した。焙煎温度及び時間を試験するための１つの実験において、５０ｇの穀粒の試料を、水中に１４時間浸漬し、排水し、米穀粒を、異なる条件下で焙煎した（表１０）。結果は、焙煎温度を約２１０℃で６分間超保ったときに、焙煎された穀粒の香りが、強く好ましかったことを示した。香りは、ヒトのボランティアによって、発酵ソースを連想させると考えられた。焙煎温度が１８０℃超であり、時間が３．５分間超であったときに、顆粒の香りは、より低い温度又はより少ない時間でよりも明白であった。ボランティアは、粒子完全性及び香りによれば、焼飯の強い感覚を有する特有の「特別な焼けた」香りを有すると、香りを記述した。
【表10】
【0531】
黒米茶を作製するために、黒米穀粒を、沸騰水中に１０分間浸漬し、次いで排水した。５０ｇを、異なる条件下での焙煎試験のために、毎回秤量した。焙煎された黒米穀粒の香りは、柔らかく焼けた香りがないと記述された。粒子完全性及び香りの評価によれば、試料Ｔ２の米穀粒が最良であった。
【0532】
Ｚｈｏｎｇｚｉ１、Ｚｈｏｎｇｚｉ２、Ｚｈｏｎｇｚｉ３、及びＺｈｏｎｇｚｉ４の穀粒試料を、１８０℃で３．５分間焙煎した。茶を入れるために、６ｇの焙煎された米穀粒の試料を、１５０ｍＬの沸騰水に１０分間付加した。茶を入れる前後の穀粒の色及び味、並びに得られた飲料の色及び味を、７人のボランティアの官能パネルによって評価した。Ｚｈｏｎｇｚｉ１、Ｚｈｏｎｇｚｉ２、及びＺｈｏｎｇｚｉ３穀粒試料の各々は、茶を入れる前に強い香り及び風味を提供し、茶を入れた後に最良の茶色を提供した。Ｚｈｏｎｇｚｉ１穀粒の味及び粒子完全性は、Ｚｈｏｎｇｚｉ２と同様であった。Ｚｈｏｎｇｚｉ４の香りは、茶を入れる前後により魅力的でなく、一部のボランティアによって「乏しい」と記述され、得られた茶の色は、茶を入れた後に最も薄かった。
【0533】
米かゆ
米かゆを、１００ｇの黒米穀粒を水中に少なくとも１時間、最大１６時間浸漬することによって調製した。１６時間の浸漬が、１時間と比較して推奨された。米穀粒を、水で２回すすぎ、次いで、１Ｌの水中で９０分間、電気調理器において調理した。かゆを試食したボランティアは、かゆが、硬すぎでも柔らかすぎでもなく、好ましい味及び「特別な香り」を有し、小児及び成人、例えば、腸の不快感を患う成人に好適であると記述した。
米かゆを、１００ｇの黒米穀粒を水中に少なくとも１時間、最大１６時間浸漬することによって調製した。１６時間の浸漬が、１時間と比較して推奨された。米穀粒を、水で２回すすぎ、次いで、１Ｌの水中で９０分間、電気調理器において調理した。かゆを試食したボランティアは、かゆが、硬すぎでも柔らかすぎでもなく、好ましい味及び「特別な香り」を有し、小児及び成人、例えば、腸の不快感を患う成人に好適であると記述した。
【0534】
幼児のための食品として好適な黒米ペーストを作製するために、５００ｇの米穀粒を、９０℃で６０分間焙煎した。焙煎された穀粒を、粉砕し、次いで、ふるいにかけて（１００メッシュ）、微細な製粉を製造した。２０ｇの黒米粉の試料を、１００ｍＬの沸騰水中に浸漬し、黒米ペーストが製造されるまで混合した。米ペーストを試食したボランティアは、米ペーストを、食べるのに好都合なファーストフードであるだけでなく、乳児に好適であるとみなした。米ペーストは、ボランティアが予想したよりも甘くなかった。
【0535】
調理された米穀粒
５０ｇの黒米穀粒を、２００ｇの白米と混合し、２回の水で２回すすぎ、６０分間３００～３５０ｍＬの水で、電気調理器において調理した。黒米穀粒は、白米と同じ程度に均一に調理されていた。黒米は、調理後に、依然として深い色であり、柔らかい食感、及び「特別な香り」と記述された味及び香りを有した。
５０ｇの黒米穀粒を、２００ｇの白米と混合し、２回の水で２回すすぎ、６０分間３００～３５０ｍＬの水で、電気調理器において調理した。黒米穀粒は、白米と同じ程度に均一に調理されていた。黒米は、調理後に、依然として深い色であり、柔らかい食感、及び「特別な香り」と記述された味及び香りを有した。
【0536】
米バー
５００ｇの黒米穀粒を、９０℃で少なくとも６０分焙煎し、粉砕し、ふるいにかけ（１００メッシュ）、チョコレートバー製造機を使用して、バーに成形する。これは、固有の味を有する、摂取に好適な食品としてバーを製造する。
５００ｇの黒米穀粒を、９０℃で少なくとも６０分焙煎し、粉砕し、ふるいにかけ（１００メッシュ）、チョコレートバー製造機を使用して、バーに成形する。これは、固有の味を有する、摂取に好適な食品としてバーを製造する。
【0537】
黒米油
黒米穀粒を、製粉し、製粉から製造された、果皮及びアリューロン層を含むふすまを、精白された穀粒から分離する。油を、コールドプレスによって、ふすまから製造して、米ふすま油を製造する。油は、野生型米からの米ふすま油に対して比較的高いレベルの抗酸化物質及びオリザノールを含有する。
黒米穀粒を、製粉し、製粉から製造された、果皮及びアリューロン層を含むふすまを、精白された穀粒から分離する。油を、コールドプレスによって、ふすまから製造して、米ふすま油を製造する。油は、野生型米からの米ふすま油に対して比較的高いレベルの抗酸化物質及びオリザノールを含有する。
【0538】
本出願は、２０２０年１２月１日に出願されたＡＵ２０２０／９０４４５２からの優先権を主張し、この全体の内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【0539】
具体的な実施形態に示されるように、広範に記載される本発明の趣旨又は範囲から逸脱することなく、本発明に多数の変形及び／又は修正が本発明になされてもよいことが、当業者には理解されよう。したがって、本実施形態は、全ての点において例示的であり、限定的ではないと考えられる。
【0540】
本明細書で考察されかつ／又は参照される全ての刊行物は、これらの全体が本明細書に組み込まれる。
【0541】
本明細書に含まれる文書、行為、材料、装置、又は物品などのいずれの考察も、本発明のための文脈を提供する目的のみである。これらの事項のうちのいずれか又は全てが、本出願の各々の請求項の優先日よりも前に存在したように、先行技術基礎の一部分を形成する、又は本発明に関連する分野における一般的知識であったということを認めるとして解釈されるべきでない。
【0542】
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【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【配列表】
【国際調査報告】