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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-12-12
(54)【発明の名称】抗ヒトＢ７－Ｈ３抗体及びその利用
(51)【国際特許分類】
C07K 16/28 20060101AFI20231205BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20231205BHJP
C12P 21/08 20060101ALI20231205BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20231205BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20231205BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20231205BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20231205BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20231205BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20231205BHJP
A61K 35/12 20150101ALI20231205BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20231205BHJP
A61K 47/68 20170101ALI20231205BHJP
【ＦＩ】
C07K16/28
C12N15/13
C12P21/08
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
A61K39/395 N
A61K39/395 L
A61K48/00
A61K35/12
A61P35/00
A61K47/68
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023533633
(86)(22)【出願日】2021-12-02
(85)【翻訳文提出日】2023-07-31
(86)【国際出願番号】 CN2021135091
(87)【国際公開番号】W WO2022117040
(87)【国際公開日】2022-06-09
(31)【優先権主張番号】202011398727.1
(32)【優先日】2020-12-02
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】522261352
【氏名又は名称】▲邁▼威（上海）生物科技股▲フン▼有限公司
(74)【代理人】
【識別番号】110003845
【氏名又は名称】弁理士法人籾井特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】焦 莎莎
(72)【発明者】
【氏名】王 ▲栄▼娟
(72)【発明者】
【氏名】王 双
(72)【発明者】
【氏名】▲張▼ ▲ジャオ▼
(72)【発明者】
【氏名】▲張▼ ▲暢▼
(72)【発明者】
【氏名】▲曾▼ 大地
【テーマコード（参考）】
4B064
4B065
4C076
4C084
4C085
4C087
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B064AG27
4B064CA19
4B064CC24
4B064CE12
4B064DA01
4B064DA13
4B065AA01X
4B065AA57X
4B065AA72X
4B065AA88X
4B065AA90X
4B065AA90Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA25
4B065CA44
4B065CA46
4C076AA95
4C076CC27
4C076CC41
4C076EE41
4C076EE59
4C076FF70
4C084AA13
4C084NA14
4C084ZB26
4C085AA14
4C085AA21
4C085AA26
4C085AA27
4C085BB11
4C085BB31
4C085DD62
4C085EE01
4C087AA01
4C087AA02
4C087BB65
4C087CA12
4C087NA14
4C087ZB26
4H045AA11
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA72
4H045CA40
4H045DA76
4H045EA20
4H045EA50
4H045FA74
4H045GA26
(57)【要約】
抗ヒトＢ７－Ｈ３モノクローナル抗体及びその利用が提供される。組換えヒトＢ７－Ｈ３細胞外領域を免疫原として使用することによって、ハイブリドーマ技術によりマウス抗ヒトＢ７－Ｈ３モノクローナル抗体を作製することができ、マウス抗ヒトＢ７－Ｈ３抗体は、Ｂ７－Ｈ３細胞外領域の様々なドメインに結合することができる。マウス抗体に基づいて構築されたヒト－マウスキメラ抗体は、細胞表面のＢ７－Ｈ３に特異的に結合することができる。ＣＤＲ移植（CDRs transplantation）及びＣＤＲ領域突然変異によって作製されたヒト化抗体は、ヒトＢ７－Ｈ３細胞外領域及び細胞膜表面Ｂ７－Ｈ３に特異的に結合する能力を保持しており、細胞膜表面のＢ７－Ｈ３による細胞内移行を媒介することができる。
【選択図】図１３
【選択図】図１３
【特許請求の範囲】
【請求項1】
抗ヒトＢ７－Ｈ３抗体又はそのフラグメントであって、相補性決定領域（ＣＤＲ）１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、
ここで、前記ＶＨのＣＤＲ１は、選択されたＶＨのＣＤＲ１のアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記ＶＨのＣＤＲ２は、選択されたＶＨのＣＤＲ２のアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ前記ＶＨのＣＤＲ３は、選択されたＶＨのＣＤＲ３のアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む；
ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）と、
ここで、前記ＶＬのＣＤＲ１は、選択されたＶＬのＣＤＲ１のアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記ＶＬのＣＤＲ２は、選択されたＶＬのＣＤＲ２のアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ前記ＶＬのＣＤＲ３は、選択されたＶＬのＣＤＲ３のアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む；
を含み、ここで、前記選択されたＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列、並びに前記選択されたＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列は、以下からなる群から選択される：
前記選択されたＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号４０、配列番号４１、及び配列番号４２に示される通りであり、かつ前記選択されたＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号４３、配列番号４４、及び配列番号４５に示される通りであり、
前記選択されたＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号４６、配列番号４７、及び配列番号４８に示される通りであり、かつ前記選択されたＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号４９、配列番号５０、及び配列番号５１に示される通りであり、かつ、
前記選択されたＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号５２、配列番号５３、及び配列番号５４に示される通りであり、かつ前記選択されたＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号５５、配列番号５６、及び配列番号５７に示される通りであることを特徴とする、抗ヒトＢ７－Ｈ３抗体又はそのフラグメント。
【請求項2】
配列番号５１に示されるアミノ酸配列を含む前記選択されたＶＬのＣＤＲ３に対して少なくとも７５％の同一性を有する前記アミノ酸配列は、ＱＱＷＳＸ１Ｘ２ＰＬＴ（ここで、Ｘ１はＳ又はＡであり、かつＸ２はＮ、Ａ、Ｓ、又はＱである）であることを特徴とする、請求項１に記載の抗ヒトＢ７－Ｈ３抗体又はそのフラグメント。
【請求項3】
前記ＶＨは、配列番号１に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ前記ＶＬは、配列番号２に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項１に記載の抗ヒトＢ７－Ｈ３抗体又はそのフラグメント。
【請求項4】
前記ＶＨは、配列番号３に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ前記ＶＬは、配列番号４に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項１に記載の抗ヒトＢ７－Ｈ３抗体又はそのフラグメント。
【請求項5】
前記ＶＨは、配列番号５に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ前記ＶＬは、配列番号６に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項１に記載の抗ヒトＢ７－Ｈ３抗体又はそのフラグメント。
【請求項6】
前記ＶＨは、配列番号１１又は配列番号１７に示されるアミノ酸配列を含み、かつ前記ＶＬは、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、又は配列番号１６に示されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項３に記載の抗ヒトＢ７－Ｈ３抗体又はそのフラグメント。
【請求項7】
前記ＶＨは、配列番号１８、配列番号２１、配列番号２２、又は配列番号２３に示されるアミノ酸配列を含み、かつ前記ＶＬは、配列番号１９、配列番号２０、配列番号５８、配列番号５９、又は配列番号６０に示されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項４に記載の抗ヒトＢ７－Ｈ３抗体又はそのフラグメント。
【請求項8】
前記ＶＨは、配列番号２４、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、又は配列番号３７に示されるアミノ酸配列を含み、かつ前記ＶＬは、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、又は配列番号３３に示されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項５に記載の抗ヒトＢ７－Ｈ３抗体又はそのフラグメント。
【請求項9】
前記抗ヒトＢ７－Ｈ３抗体又はそのフラグメントは、ヒトＢ７－Ｈ３細胞外ドメインに特異的に結合することができ、かつ前記ヒトＢ７－Ｈ３細胞外ドメインに対して５×１０－１０Ｍ未満の親和性定数（ＫＤ）を有することを特徴とする、請求項１に記載の抗ヒトＢ７－Ｈ３抗体又はそのフラグメント。
【請求項10】
前記抗ヒトＢ７－Ｈ３抗体又はそのフラグメントは、サルＢ７－Ｈ３と交差反応を有し、かつマウスＢ７－Ｈ３への結合活性を有しないことを特徴とする、請求項１に記載の抗ヒトＢ７－Ｈ３抗体又はそのフラグメント。
【請求項11】
前記抗ヒトＢ７－Ｈ３抗体又はそのフラグメントは、サルＢ７－Ｈ３と弱い交差反応を有し、かつサルＢ７－Ｈ３へのその結合活性は、ヒトＢ７－Ｈ３へのその結合活性よりも低いことを特徴とする、請求項１に記載の抗ヒトＢ７－Ｈ３抗体又はそのフラグメント。
【請求項12】
前記抗ヒトＢ７－Ｈ３抗体又はそのフラグメントは、細胞表面上のＢ７－Ｈ３に特異的に結合することができ、かつＢ７－Ｈ３により介在されて前記細胞内に細胞内移行することができることを特徴とする、請求項１に記載の抗ヒトＢ７－Ｈ３抗体又はそのフラグメント。
【請求項13】
抗ヒトＢ７－Ｈ３ヒト化抗体又はそのフラグメントを作製する方法であって、非ヒト抗Ｂ７－Ｈ３抗体又はそのフラグメントを基礎として、ＣＤＲグラフト技術を利用して重鎖可変領域のヒト化及び／又は軽鎖可変領域のヒト化を達成して、請求項１～１２のいずれか一項に記載の抗ヒトＢ７－Ｈ３抗体又はそのフラグメントを得ることを含むことを特徴とする、方法。
【請求項14】
ＣＤＲグラフティング技術を利用して重鎖可変領域のヒト化を達成する工程は、（１）非ヒト抗Ｂ７－Ｈ３抗体又はそのフラグメントの重鎖可変領域配列を使用して相同性アラインメントを行い、類似のヒト抗体重鎖テンプレートを選択することと、
（２）前記非ヒト抗Ｂ７－Ｈ３抗体又はそのフラグメントのＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を、前記ヒト抗体重鎖テンプレートへとグラフトすることと、
（３）前記ＶＨのＣＤＲ３の配列に従ってＪ領域配列を選択して、重鎖可変領域のヒト化を達成し、請求項１～１２のいずれか一項に記載の抗ヒトＢ７－Ｈ３抗体又はそのフラグメントを得ることと、
を含むことを特徴とする、請求項１３に記載の抗ヒトＢ７－Ｈ３ヒト化抗体又はそのフラグメントを作製する方法。
【請求項15】
ＣＤＲグラフティング技術を利用して軽鎖可変領域のヒト化を達成する工程は、（１）非ヒト抗Ｂ７－Ｈ３抗体又はそのフラグメントの軽鎖可変領域配列を使用して相同性アラインメントを行い、類似のヒト抗体軽鎖テンプレートを選択することと、
（２）前記非ヒト抗Ｂ７－Ｈ３抗体又はそのフラグメントのＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を、前記ヒト抗体軽鎖テンプレートへとグラフトすることと、
（３）前記ＶＬのＣＤＲ３の配列に従ってＪＫ領域配列を選択して、軽鎖可変領域のヒト化を達成し、請求項１～１２のいずれか一項に記載の抗ヒトＢ７－Ｈ３抗体又はそのフラグメントを得ることと、
を含むことを特徴とする、請求項１３に記載の抗ヒトＢ７－Ｈ３ヒト化抗体又はそのフラグメントを作製する方法。
【請求項16】
前記ＣＤＲグラフティング後に、親和性成熟、前記ＣＤＲ配列における部位特異的突然変異誘発、及び／又は前記ヒト化抗体の化学修飾を行うことを更に含むことを特徴とする、請求項１３～１５のいずれか一項に記載の抗ヒトＢ７－Ｈ３ヒト化抗体又はそのフラグメントを作製する方法。
【請求項17】
融合分子であって、（１）請求項１～１２のいずれか一項に記載の抗ヒトＢ７－Ｈ３抗体又はそのフラグメントを含む第１の標的化部分である第１の活性エレメントと、
（２）エフェクターエレメント及び／又は第２の標的化部分を含む１つ以上の第２の活性エレメントと、
を含み、ここで、前記第１の活性エレメントは、結合又はリンカーを介して前記第２の活性エレメントに連結されており、かつ前記１つ以上の第２の活性エレメントは、同一であっても、又は異なっていてもよいことを特徴とする、融合分子。
【請求項18】
ポリヌクレオチドであって、請求項１～１２のいずれか一項に記載の抗ヒトＢ７－Ｈ３抗体若しくはそのフラグメント、又は請求項１７に記載の融合分子をコードすることを特徴とする、ポリヌクレオチド。
【請求項19】
コンストラクトであって、請求項１８に記載のポリヌクレオチドを含むことを特徴とする、コンストラクト。
【請求項20】
宿主細胞であって、請求項１８に記載のポリヌクレオチド、又は請求項１９に記載の核酸コンストラクトを含むことを特徴とする、宿主細胞。
【請求項21】
コンジュゲートであって、請求項１～１２のいずれか一項に記載の抗ヒトＢ７－Ｈ３抗体又はそのフラグメントを含む第１の標的化部分である第１の活性エレメントを含むことを特徴とする、コンジュゲート。
【請求項22】
前記コンジュゲートは、少なくとも１つの第２の活性エレメントを更に含み、ここで、前記第１の活性エレメントは、前記第２の活性エレメントに共有結合により連結されていることを特徴とする、請求項２１に記載のコンジュゲート。
【請求項23】
前記第２の活性エレメントは、１つ以上のエフェクター部分を含むことを特徴とする、請求項２２に記載のコンジュゲート。
【請求項24】
前記エフェクター部分は、以下の群（１）～群（３）における１つ以上のエフェクター分子又はそれらの誘導体：（１）チューブリン阻害剤である小分子化合物：メイタンシノイド、モノメチルアウリスタチンＥ、モノメチルアウリスタチンＦ、モノメチルドラスタチン１０、チューブリシン及びその誘導体、クリプトフィシン及びその誘導体、並びにタルトブリン、
（２）トポイソメラーゼ阻害剤である小分子化合物：ＰＮＵ－１５９６８２（ドキソルビシンの代謝物）及びその誘導体、ＳＮ３８（イリノテカンの代謝物）及びその誘導体、並びにエキサテカン、
（３）ＤＮＡ結合剤である小分子化合物：ＰＢＤ及びその誘導体、並びにデュオカルマイシン及びその誘導体、
からなる群から選択される小分子薬物コンジュゲートであることを特徴とする、請求項２３に記載のコンジュゲート。
【請求項25】
請求項１～１２のいずれか一項に記載の抗ヒトＢ７－Ｈ３抗体又はそのフラグメント、請求項１７に記載の融合分子、請求項１８に記載のポリヌクレオチド、請求項１９に記載の核酸コンストラクト、請求項２０に記載の宿主細胞、又は請求項２１～２４のいずれか一項に記載のコンジュゲートと、任意に、薬学的に許容可能な添加剤（複数の場合もある）と、
を含む組成物。
【請求項26】
抗ヒトＢ７－Ｈ３抗体又はそのフラグメントを作製する方法であって、（１）請求項２０に記載の宿主細胞を適切な条件下で培養することと、
（２）抗ヒトＢ７－Ｈ３モノクローナル抗体若しくはそのフラグメント、抗ヒトＢ７－Ｈ３キメラ抗体若しくはそのフラグメント、又は抗ヒトＢ７－Ｈ３ヒト化抗体若しくはそのフラグメントを分離し回収することと、
を含む、方法。
【請求項27】
Ｂ７－Ｈ３過剰発現と関連する疾患を診断する作用物質の作製における、請求項１～１２のいずれか一項に記載の抗ヒトＢ７－Ｈ３抗体又はそのフラグメント、請求項１７に記載の融合分子、請求項１８に記載のポリヌクレオチド、請求項１９に記載の核酸コンストラクト、請求項２０に記載の宿主細胞、請求項２１～２４のいずれか一項に記載のコンジュゲート、及び請求項２５に記載の組成物の使用。
【請求項28】
Ｂ７－Ｈ３過剰発現と関連する疾患を治療する医薬の作製における、請求項１～１２のいずれか一項に記載の抗ヒトＢ７－Ｈ３抗体又はそのフラグメント、請求項１７に記載の融合分子、請求項１８に記載のポリヌクレオチド、請求項１９に記載の核酸コンストラクト、請求項２０に記載の宿主細胞、請求項２１～２４のいずれか一項に記載のコンジュゲート、及び請求項２５に記載の組成物の使用。
【請求項29】
前記Ｂ７－Ｈ３過剰発現と関連する疾患は、固形腫瘍癌であることを特徴とする、請求項２７又は２８に記載の使用。
【請求項30】
前記固形腫瘍癌は、胃癌、結腸直腸癌、肝臓癌、膵臓癌、食道癌、非小細胞癌、前立腺癌、卵巣癌、神経芽腫、横紋筋肉腫、骨肉腫、ユーイング肉腫、ウィルムス腫瘍、及び線維形成性小円形細胞腫瘍を含むことを特徴とする、請求項２９に記載の使用。
【請求項31】
癌を有する被験体を治療する方法であって、前記被験体に、治療的有効量の請求項２５に記載の組成物である組成物を投与することを含む、方法。
【請求項32】
前記癌は、固形腫瘍癌であることを特徴とする、請求項３１に記載の方法。
【請求項33】
前記固形腫瘍癌は、胃癌、結腸直腸癌、肝臓癌、膵臓癌、食道癌、非小細胞癌、前立腺癌、卵巣癌、神経芽腫、横紋筋肉腫、骨肉腫、ユーイング肉腫、ウィルムス腫瘍、及び線維形成性小円形細胞腫瘍を含むことを特徴とする、請求項３２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本願は、２０２０年１２月２日に中国国家知識産権局に出願され、中国特許出願第２０２０１１３９８７２７．１号に対する優先権及びその利益を主張する。この特許出願は、その内容全体が引用することにより本明細書の一部をなす。
【0002】
本発明は抗体工学の分野に属し、特に抗ヒトＢ７－Ｈ３モノクローナル抗体及びその利用に関する。特に、本発明は、ヒトＢ７－Ｈ３に対して高い親和性を有し、サルＢ７－Ｈ３と交差反応を有し、かつマウスＢ７－Ｈ３には結合しないモノクローナル抗体、キメラ抗体、及びヒト化抗体、並びにそれらの利用に関する。
【背景技術】
【0003】
ＣＤ２７６としても知られるＢ７－Ｈ３は、Ｂ７－ＣＤ２８スーパーファミリーに属するＩ型膜貫通タンパク質である。Ｂ７ファミリーの分子は、Ｔ細胞免疫応答を増強し維持する刺激シグナルを提供することができ、Ｔ細胞免疫反応を制限し減弱させる抑制シグナルを生成することもできる。ヒトＢ７－Ｈ３タンパク質は、膜結合型及び可溶性型の２つの形態で存在する。膜結合型Ｂ７－Ｈ３タンパク質は主に腫瘍細胞の表面上に分布しており、細胞内の核、トランスポーター、エクソソーム等にも見られる。可溶性Ｂ７－Ｈ３はプロテアーゼによって細胞膜から加水分解され、腫瘍患者の血清中に高レベルの可溶性Ｂ７－Ｈ３が検出され得ることから、Ｂ７－Ｈ３をバイオマーカーとして使用することができることが示唆されている（非特許文献１）。抗癌抗体の最近の臨床的成功及び商業的成功により、抗体ベースの療法薬において大きな関心が寄せられている。したがって、癌の治療用のＢ７－Ｈ３に基づく抗体療法薬にはまだ研究の余地がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0004】
【非特許文献1】xiec, 2016
【発明の概要】
【0005】
膜表面上のＢ７－Ｈ３タンパク質に対する従来技術における抗ヒトＢ７－Ｈ３抗体の不十分な親和性及び特異性によりオフターゲット効果及び有害反応が引き起こされるという欠陥に対処するために、本開示は、抗ヒトＢ７－Ｈ３モノクローナル抗体及びその利用を提供することである。マウス抗ヒトＢ７－Ｈ３モノクローナル抗体は、組換えヒトＢ７－Ｈ３細胞外ドメインを免疫原として用いてハイブリドーマ技術によって作製された。マウス抗ヒトＢ７－Ｈ３抗体は、様々なＢ７－Ｈ３細胞外ドメインに特異的に結合することができ、マウス抗体に基づいて構築されたヒト－マウスキメラ抗体は、細胞表面上のＢ７－Ｈ３に特異的に結合することができた。ＣＤＲグラフティング及びＣＤＲ突然変異によって作製されたヒト化抗体は、ヒトＢ７－Ｈ３細胞外ドメイン及び細胞膜表面上のＢ７－Ｈ３に特異的に結合する能力を保持しており、細胞膜表面上のＢ７－Ｈ３により介在されて細胞内移行することもできた。抗ヒトＢ７－Ｈ３ヒト化抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）は、細胞学的実験及びヌードマウス移植腫瘍モデルにおいて腫瘍細胞を特異的に殺傷し得ることが明らかにされた。抗ヒトＢ７－Ｈ３抗体は、ヒトＢ７－Ｈ３細胞外ドメインに対して５×１０－１０Ｍ未満の親和性を有し、組換え細胞及び腫瘍細胞の表面上のＢ７－Ｈ３に特異的に結合することができ、細胞及び動物モデルにおいて顕著な腫瘍殺傷効果に寄与し、明らかな有害反応は観察されなかった。したがって、抗ヒトＢ７－Ｈ３抗体は、臨床的な抗腫瘍利用への素晴らしい見通しを有する。
【0006】
抗体及びその作製方法
本発明の実施の形態の一態様によれば、本開示は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む抗ヒトＢ７－Ｈ３抗体又はそのフラグメントを提供する。本発明の実施の形態によれば、重鎖可変領域（ＶＨ）は、相補性決定領域（ＣＤＲ）１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含み、ここで、ＶＨのＣＤＲ１は、選択されたＶＨのＣＤＲ１のアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＨのＣＤＲ２は、選択されたＶＨのＣＤＲ２のアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつＶＨのＣＤＲ３は、選択されたＶＨのＣＤＲ３のアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域（ＶＬ）は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含み、ここで、ＶＬのＣＤＲ１は、選択されたＶＬのＣＤＲ１のアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬのＣＤＲ２は、選択されたＶＬのＣＤＲ２のアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつＶＬのＣＤＲ３は、選択されたＶＬのＣＤＲ３のアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここで、選択されたＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列、並びに選択されたＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列は、以下からなる群から選択される：
選択されたＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号４０、配列番号４１、及び配列番号４２に示される通りであり、かつ選択されたＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号４３、配列番号４４、及び配列番号４５に示される通りであり、
選択されたＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号４６、配列番号４７、及び配列番号４８に示される通りであり、かつ選択されたＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号４９、配列番号５０、及び配列番号５１に示される通りであり、かつ、
選択されたＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号５２、配列番号５３、及び配列番号５４に示される通りであり、かつ選択されたＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号５５、配列番号５６、及び配列番号５７に示される通りである。
本発明の実施の形態の一態様によれば、本開示は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む抗ヒトＢ７－Ｈ３抗体又はそのフラグメントを提供する。本発明の実施の形態によれば、重鎖可変領域（ＶＨ）は、相補性決定領域（ＣＤＲ）１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含み、ここで、ＶＨのＣＤＲ１は、選択されたＶＨのＣＤＲ１のアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＨのＣＤＲ２は、選択されたＶＨのＣＤＲ２のアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつＶＨのＣＤＲ３は、選択されたＶＨのＣＤＲ３のアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域（ＶＬ）は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含み、ここで、ＶＬのＣＤＲ１は、選択されたＶＬのＣＤＲ１のアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬのＣＤＲ２は、選択されたＶＬのＣＤＲ２のアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつＶＬのＣＤＲ３は、選択されたＶＬのＣＤＲ３のアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここで、選択されたＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列、並びに選択されたＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列は、以下からなる群から選択される：
選択されたＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号４０、配列番号４１、及び配列番号４２に示される通りであり、かつ選択されたＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号４３、配列番号４４、及び配列番号４５に示される通りであり、
選択されたＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号４６、配列番号４７、及び配列番号４８に示される通りであり、かつ選択されたＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号４９、配列番号５０、及び配列番号５１に示される通りであり、かつ、
選択されたＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号５２、配列番号５３、及び配列番号５４に示される通りであり、かつ選択されたＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号５５、配列番号５６、及び配列番号５７に示される通りである。
【0007】
本発明の実施の形態による抗ヒトＢ７－Ｈ３抗体又はそのフラグメントは、ヒトＢ７－Ｈ３細胞外ドメイン及び細胞膜表面上のＢ７－Ｈ３における部位に特異的に結合することができ、強い親和性、例えば、幾つかの実施の形態において、５×１０－１０Ｍ未満の親和性を有するのに加えて、良好な腫瘍阻害効果及び低い毒性を有するため、臨床的利用への素晴らしい見通しを有する。
【0008】
さらに、本発明の上記の実施の形態による抗体又は抗原結合フラグメントは、以下の追加の技術的特徴を有し得る：
【0009】
本発明の実施の形態によれば、配列番号５１に示されるアミノ酸配列を含む選択されたＶＬのＣＤＲ３に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列は、ＱＱＷＳＸ１Ｘ２ＰＬＴ（ここで、Ｘ１はＳ又はＡであり、かつＸ２はＮ、Ａ、Ｓ、又はＱである）である。
【0010】
本発明の実施の形態によれば、ＶＨは、配列番号１に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつＶＬは、配列番号２に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0011】
本発明の実施の形態によれば、ＶＨは、配列番号３に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつＶＬは、配列番号４に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0012】
本発明の実施の形態によれば、ＶＨは、配列番号５に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつＶＬは、配列番号６に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0013】
具体的には、少なくとも７５％の同一性は、少なくとも８２％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、更に好ましくは少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは更には９９％の同一性、又は７５％以上のあらゆる同一性のパーセンテージであり得る。より具体的には、０個、１個、２個、又はそれより多くのアミノ酸が挿入、欠失、又は置換されていてもよい。
【0014】
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、若しくは配列番号６に示されるアミノ酸配列に１つ以上のアミノ酸を挿入すること、これらのアミノ酸配列から１つ以上のアミノ酸を欠失させること、これらのアミノ酸配列における１つ以上のアミノ酸を突然変異させること、又はこれらのアミノ酸配列における１つ以上のアミノ酸を修飾することによって、抗体又は抗原結合フラグメントの重鎖可変領域の配列を得ることができることが更に説明される。
【0015】
本発明の実施の形態によれば、ＶＨは、配列番号１１又は配列番号１７に示されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬは、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、又は配列番号１６に示されるアミノ酸配列を含む。
【0016】
本発明の実施の形態によれば、ＶＨは、配列番号１８、配列番号２１、配列番号２２、又は配列番号２３に示されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬは、配列番号１９、配列番号２０、配列番号５８、配列番号５９、又は配列番号６０に示されるアミノ酸配列を含む。
【0017】
本発明の実施の形態によれば、ＶＨは、配列番号２４、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、又は配列番号３７に示されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬは、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、又は配列番号３３に示されるアミノ酸配列を含む。
【0018】
本発明の実施の形態によれば、抗ヒトＢ７－Ｈ３抗体又はそのフラグメントは、ヒトＢ７－Ｈ３細胞外ドメインに特異的に結合することができ、かつヒトＢ７－Ｈ３細胞外ドメインに対して５×１０－１０Ｍ未満の親和性定数（ＫＤ）を有する。
【0019】
本発明の実施の形態によれば、抗ヒトＢ７－Ｈ３抗体又はそのフラグメントは、サルＢ７－Ｈ３と交差反応を有し、かつマウスＢ７－Ｈ３への結合活性を有しない。
【0020】
本発明の実施の形態によれば、抗ヒトＢ７－Ｈ３抗体又はそのフラグメントは、サルＢ７－Ｈ３と弱い交差反応を有し、かつサルＢ７－Ｈ３へのその結合活性は、ヒトＢ７－Ｈ３へのその結合活性よりも低い。
【0021】
本発明の実施の形態によれば、抗ヒトＢ７－Ｈ３抗体又はそのフラグメントは、細胞表面上のＢ７－Ｈ３に特異的に結合することができ、かつＢ７－Ｈ３により介在されて細胞内に細胞内移行することができる。
【0022】
さらに、本発明の別の態様によれば、本開示は、抗ヒトＢ７－Ｈ３抗体又はそれらのフラグメントを提供する。本発明の実施の形態によれば、抗ヒトＢ７－Ｈ３抗体又はそのフラグメントは、ヒトＢ７－Ｈ３細胞外ドメインに特異的に結合することができ、かつヒトＢ７－Ｈ３細胞外ドメインに対して５×１０－１０Ｍ未満の親和性定数（ＫＤ）を有する。
【0023】
本発明の実施の形態によれば、抗ヒトＢ７－Ｈ３抗体又はそのフラグメントは、サルＢ７－Ｈ３と交差反応を有し、かつマウスＢ７－Ｈ３への結合活性を有しない。
【0024】
本発明の実施の形態によれば、抗ヒトＢ７－Ｈ３抗体又はそのフラグメントは、サルＢ７－Ｈ３と弱い交差反応を有し、かつサルＢ７－Ｈ３へのその結合活性は、ヒトＢ７－Ｈ３へのその結合活性よりも低い。
【0025】
本発明の実施の形態によれば、抗ヒトＢ７－Ｈ３抗体又はそのフラグメントは、細胞表面上のＢ７－Ｈ３に特異的に結合することができ、かつＢ７－Ｈ３により介在されて細胞内に細胞内移行することができる。
【0026】
本発明の実施の形態によれば、抗体としては、マウス抗体、ウサギ抗体、ヒト抗体、及びキメラ抗体が挙げられる。
【0027】
本発明の実施の形態によれば、抗ヒトＢ７－Ｈ３抗体又はそのフラグメントは、配列番号１、配列番号３、及び配列番号５からなる群から選択されるいずれか１つのアミノ酸配列によって示される重鎖可変領域の重鎖ＣＤＲ、及び／又は配列番号２、配列番号４、及び配列番号６からなる群から選択されるいずれか１つのアミノ酸配列によって示される軽鎖可変領域の軽鎖ＣＤＲを有する。
【0028】
本発明の実施の形態によれば、抗ヒトＢ７－Ｈ３抗体又はそのフラグメントは、配列番号１、配列番号３、及び配列番号５からなる群から選択されるいずれか１つのアミノ酸配列によって示される重鎖可変領域、及び／又は配列番号２、配列番号４、及び配列番号６からなる群から選択されるいずれか１つのアミノ酸配列によって示される軽鎖可変領域を有する。
【0029】
本発明の実施の形態によれば、抗ヒトＢ７－Ｈ３抗体又はそのフラグメントは、
配列番号１に示される重鎖可変領域及び配列番号２に示される軽鎖可変領域、
配列番号３に示される重鎖可変領域及び配列番号４に示される軽鎖可変領域、又は、
配列番号５に示される重鎖可変領域及び配列番号６に示される軽鎖可変領域、
を有する。
配列番号１に示される重鎖可変領域及び配列番号２に示される軽鎖可変領域、
配列番号３に示される重鎖可変領域及び配列番号４に示される軽鎖可変領域、又は、
配列番号５に示される重鎖可変領域及び配列番号６に示される軽鎖可変領域、
を有する。
【0030】
本発明のまた別の態様によれば、本開示は、抗ヒトＢ７－Ｈ３ヒト化抗体又はそのフラグメントを提供する。本発明の実施の形態によれば、抗ヒトＢ７－Ｈ３ヒト化抗体又はそのフラグメントは、上記の抗ヒトＢ７－Ｈ３抗体又はそのフラグメントを基礎としてＣＤＲグラフティングによって得られる。
【0031】
本発明の実施の形態によれば、抗ヒトＢ７－Ｈ３ヒト化抗体又はそのフラグメントは、
配列番号１１及び配列番号１７からなる群から選択されるいずれか１つの配列によって示される重鎖可変領域、又はそれらの重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２、及び重鎖ＣＤＲ３、
配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、及び配列番号１６からなる群から選択されるいずれか１つの配列によって示される軽鎖可変領域、又はそれらの軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２、及び軽鎖ＣＤＲ３、
を有する。
配列番号１１及び配列番号１７からなる群から選択されるいずれか１つの配列によって示される重鎖可変領域、又はそれらの重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２、及び重鎖ＣＤＲ３、
配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、及び配列番号１６からなる群から選択されるいずれか１つの配列によって示される軽鎖可変領域、又はそれらの軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２、及び軽鎖ＣＤＲ３、
を有する。
【0032】
本発明の実施の形態によれば、抗ヒトＢ７－Ｈ３ヒト化抗体又はそのフラグメントは、
配列番号１８、配列番号２１、配列番号２２、及び配列番号２３からなる群から選択されるいずれか１つの配列によって示される重鎖可変領域、又はそれらの重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２、及び重鎖ＣＤＲ３、
配列番号１９及び配列番号２０からなる群から選択されるいずれか１つの配列によって示される軽鎖可変領域、又はそれらの軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２、及び軽鎖ＣＤＲ３、
を有する。
配列番号１８、配列番号２１、配列番号２２、及び配列番号２３からなる群から選択されるいずれか１つの配列によって示される重鎖可変領域、又はそれらの重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２、及び重鎖ＣＤＲ３、
配列番号１９及び配列番号２０からなる群から選択されるいずれか１つの配列によって示される軽鎖可変領域、又はそれらの軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２、及び軽鎖ＣＤＲ３、
を有する。
【0033】
本発明の実施の形態によれば、抗ヒトＢ７－Ｈ３ヒト化抗体又はそのフラグメントは、
配列番号２４、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、及び配列番号３７からなる群から選択されるいずれか１つの配列によって示される重鎖可変領域、又はそれらの重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２、及び重鎖ＣＤＲ３、
配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、及び配列番号３３からなる群から選択されるいずれか１つの配列によって示される軽鎖可変領域、又はそれらの軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２、及び軽鎖ＣＤＲ３、
を有する。
配列番号２４、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、及び配列番号３７からなる群から選択されるいずれか１つの配列によって示される重鎖可変領域、又はそれらの重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２、及び重鎖ＣＤＲ３、
配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、及び配列番号３３からなる群から選択されるいずれか１つの配列によって示される軽鎖可変領域、又はそれらの軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２、及び軽鎖ＣＤＲ３、
を有する。
【0034】
本発明のまた別の態様によれば、本開示は、抗ヒトＢ７－Ｈ３ヒト化抗体又はそのフラグメントを作製する方法を提供する。本発明の実施の形態によれば、非ヒト抗Ｂ７－Ｈ３抗体又はそのフラグメントを基礎として、ＣＤＲグラフト技術を利用して重鎖可変領域のヒト化及び／又は軽鎖可変領域のヒト化を達成して、上記の抗ヒトＢ７－Ｈ３抗体又はそのフラグメントを得る。
【0035】
本発明の実施の形態による抗ヒトＢ７－Ｈ３ヒト化抗体又はそのフラグメントを作製する方法において、非ヒトモノクローナル抗体を、遺伝子クローニング、ＤＮＡ組換え技術等を使用することで操作してヒト化し、この操作後に、ヒト標的に結合する発現された抗体は、アミノ酸配列の大部分がヒト配列に置き換えられており、非ヒトモノクローナル親抗体の親和性及び特異性を実質的に保持し、またこれは異種性もより低いため、人体に好適に適用することができる。例えば、本発明の実施の形態による抗体又は抗原結合フラグメントは、ヒト化された後に、ヒトＢ７－Ｈ３に特異的に結合することができる。
【0036】
本発明の実施の形態によれば、非ヒト抗Ｂ７－Ｈ３抗体又はそのフラグメントは、マウス抗Ｂ７－Ｈ３抗体又はそのフラグメントである。
【0037】
本発明の実施の形態によれば、ＣＤＲグラフティング技術を利用して重鎖可変領域のヒト化を達成する工程は、
（１）非ヒト抗Ｂ７－Ｈ３抗体又はそのフラグメントの重鎖可変領域配列を使用して相同性アラインメントを行い、類似のヒト抗体重鎖テンプレートを選択することと、
（２）非ヒト抗Ｂ７－Ｈ３抗体又はそのフラグメントのＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を、ヒト抗体重鎖テンプレートへとグラフトすることと、
（３）ＶＨのＣＤＲ３の配列に従ってＪ領域配列を選択して、重鎖可変領域のヒト化を達成し、上記の抗ヒトＢ７－Ｈ３抗体又はそのフラグメントを得ることと、
を含む。
（１）非ヒト抗Ｂ７－Ｈ３抗体又はそのフラグメントの重鎖可変領域配列を使用して相同性アラインメントを行い、類似のヒト抗体重鎖テンプレートを選択することと、
（２）非ヒト抗Ｂ７－Ｈ３抗体又はそのフラグメントのＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を、ヒト抗体重鎖テンプレートへとグラフトすることと、
（３）ＶＨのＣＤＲ３の配列に従ってＪ領域配列を選択して、重鎖可変領域のヒト化を達成し、上記の抗ヒトＢ７－Ｈ３抗体又はそのフラグメントを得ることと、
を含む。
【0038】
本発明の実施の形態によれば、ＣＤＲグラフティング技術を利用して軽鎖可変領域のヒト化を達成する工程は、
（１）非ヒト抗Ｂ７－Ｈ３抗体又はそのフラグメントの軽鎖可変領域配列を使用して相同性アラインメントを行い、類似のヒト抗体軽鎖テンプレートを選択することと、
（２）非ヒト抗Ｂ７－Ｈ３抗体又はそのフラグメントのＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を、ヒト抗体軽鎖テンプレートへとグラフトすることと、
（３）ＶＬのＣＤＲ３の配列に従ってＪＫ領域配列を選択して、軽鎖可変領域のヒト化を達成し、上記の抗ヒトＢ７－Ｈ３抗体又はそのフラグメントを得ることと、
を含む。
（１）非ヒト抗Ｂ７－Ｈ３抗体又はそのフラグメントの軽鎖可変領域配列を使用して相同性アラインメントを行い、類似のヒト抗体軽鎖テンプレートを選択することと、
（２）非ヒト抗Ｂ７－Ｈ３抗体又はそのフラグメントのＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を、ヒト抗体軽鎖テンプレートへとグラフトすることと、
（３）ＶＬのＣＤＲ３の配列に従ってＪＫ領域配列を選択して、軽鎖可変領域のヒト化を達成し、上記の抗ヒトＢ７－Ｈ３抗体又はそのフラグメントを得ることと、
を含む。
【0039】
本発明のまた別の態様によれば、本開示は、抗ヒトＢ７－Ｈ３ヒト化抗体又はそのフラグメントを作製する方法を提供する。本発明の実施の形態によれば、抗ヒトＢ７－Ｈ３ヒト化抗体又はそのフラグメントを作製する方法は、上記の非ヒト抗Ｂ７－Ｈ３抗体又はそのフラグメントを基礎として、ＣＤＲグラフト技術を利用して重鎖可変領域のヒト化及び／又は軽鎖可変領域のヒト化を達成して、上記の抗ヒトＢ７－Ｈ３抗体又はそのフラグメントを得ることを含む。
【0040】
本発明の実施の形態によれば、上記のＣＤＲグラフティング技術を利用して重鎖可変領域のヒト化を達成する工程は、
（１）上記の非ヒト抗Ｂ７－Ｈ３抗体又はそのフラグメントの重鎖可変領域配列を使用して相同性アラインメントを行い、類似のヒト抗体重鎖テンプレートを選択することと、
（２）非ヒト抗Ｂ７－Ｈ３抗体又はそのフラグメントのＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を、ヒト抗体重鎖テンプレートへとグラフトすることと、
（３）ＶＨのＣＤＲ３の配列に従ってＪ領域配列を選択して、重鎖可変領域のヒト化を達成し、上記の抗ヒトＢ７－Ｈ３抗体又はそのフラグメントを得ることと、
を含む。
（１）上記の非ヒト抗Ｂ７－Ｈ３抗体又はそのフラグメントの重鎖可変領域配列を使用して相同性アラインメントを行い、類似のヒト抗体重鎖テンプレートを選択することと、
（２）非ヒト抗Ｂ７－Ｈ３抗体又はそのフラグメントのＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を、ヒト抗体重鎖テンプレートへとグラフトすることと、
（３）ＶＨのＣＤＲ３の配列に従ってＪ領域配列を選択して、重鎖可変領域のヒト化を達成し、上記の抗ヒトＢ７－Ｈ３抗体又はそのフラグメントを得ることと、
を含む。
【0041】
本発明の実施の形態によれば、上記のＣＤＲグラフティング技術を利用して軽鎖可変領域のヒト化を達成する工程は、
（１）上記の非ヒト抗Ｂ７－Ｈ３抗体又はそのフラグメントの軽鎖可変領域配列を使用して相同性アラインメントを行い、類似のヒト抗体軽鎖テンプレートを選択することと、
（２）非ヒト抗Ｂ７－Ｈ３抗体又はそのフラグメントのＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を、ヒト抗体軽鎖テンプレートへとグラフトすることと、
（３）ＶＬのＣＤＲ３の配列に従ってＪＫ領域配列を選択して、軽鎖可変領域のヒト化を達成し、上記の抗ヒトＢ７－Ｈ３抗体又はそのフラグメントを得ることと、
を含む。
（１）上記の非ヒト抗Ｂ７－Ｈ３抗体又はそのフラグメントの軽鎖可変領域配列を使用して相同性アラインメントを行い、類似のヒト抗体軽鎖テンプレートを選択することと、
（２）非ヒト抗Ｂ７－Ｈ３抗体又はそのフラグメントのＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を、ヒト抗体軽鎖テンプレートへとグラフトすることと、
（３）ＶＬのＣＤＲ３の配列に従ってＪＫ領域配列を選択して、軽鎖可変領域のヒト化を達成し、上記の抗ヒトＢ７－Ｈ３抗体又はそのフラグメントを得ることと、
を含む。
【0042】
本発明の実施の形態によれば、抗ヒトＢ７－Ｈ３ヒト化抗体又はそのフラグメントを作製する方法は、ＣＤＲグラフティング後に、親和性成熟、ＣＤＲ配列における部位特異的突然変異誘発、及び／又はヒト化抗体の化学修飾を行うことを更に含む。
【0043】
抗体の利用
本発明の別の態様によれば、本開示は、融合分子を提供する。本発明の実施の形態によれば、融合分子は、
（１）上記の抗ヒトＢ７－Ｈ３抗体又はそのフラグメントを含む第１の標的化部分である第１の活性エレメントと、
（２）エフェクターエレメント及び／又は第２の標的化部分を含む１つ以上の第２の活性エレメントと、
を含み、ここで、第１の活性エレメントは、結合又はリンカーを介して第２の活性エレメントに連結されており、かつ１つ以上の第２の活性エレメントは、同一であっても、又は異なっていてもよい。
本発明の別の態様によれば、本開示は、融合分子を提供する。本発明の実施の形態によれば、融合分子は、
（１）上記の抗ヒトＢ７－Ｈ３抗体又はそのフラグメントを含む第１の標的化部分である第１の活性エレメントと、
（２）エフェクターエレメント及び／又は第２の標的化部分を含む１つ以上の第２の活性エレメントと、
を含み、ここで、第１の活性エレメントは、結合又はリンカーを介して第２の活性エレメントに連結されており、かつ１つ以上の第２の活性エレメントは、同一であっても、又は異なっていてもよい。
【0044】
本発明の別の態様によれば、本開示は、ポリヌクレオチドを提供する。本発明の実施の形態によれば、このポリヌクレオチドは、上記の抗ヒトＢ７－Ｈ３抗体若しくはそのフラグメント、又は上記の融合分子をコードする。したがって、このポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドは、Ｂ７－Ｈ３に特異的に結合することができる。
【0045】
本発明の別の態様によれば、本開示は、核酸コンストラクトを提供する。本発明の実施の形態によれば、この核酸コンストラクトは、本開示において上記のポリヌクレオチドを含む。
【0046】
本発明の別の態様によれば、本開示は、宿主細胞を提供する。本発明の実施の形態によれば、宿主細胞は、本開示において上記のポリヌクレオチド、又は核酸コンストラクトを含む。
【0047】
本発明の別の態様によれば、本開示は、コンジュゲートを提供する。本発明の実施の形態によれば、コンジュゲートは、上記の抗ヒトＢ７－Ｈ３抗体又はそのフラグメントを含む第１の標的化部分である第１の活性エレメントを含む。
【0048】
本発明の実施の形態によれば、コンジュゲートは、少なくとも１つの第２の活性エレメントを更に含み、ここで、第１の活性エレメントは、第２の活性エレメントに共有結合により連結されていて、第２の活性エレメントは、１つ以上のエフェクター部分を含む。
【0049】
本発明の実施の形態によれば、エフェクター部分は、以下の群（１）～群（３）における１つ以上のエフェクター分子又はそれらの誘導体：
（１）チューブリン阻害剤である小分子化合物：メイタンシノイド、モノメチルアウリスタチンＥ、モノメチルアウリスタチンＦ、モノメチルドラスタチン１０、チューブリシン及びその誘導体、クリプトフィシン及びその誘導体、並びにタルトブリン、
（２）トポイソメラーゼ阻害剤である小分子化合物：ＰＮＵ－１５９６８２（ドキソルビシンの代謝物）及びその誘導体、ＳＮ３８（イリノテカンの代謝物）及びその誘導体、並びにエキサテカン、
（３）ＤＮＡ結合剤である小分子化合物：ＰＢＤ及びその誘導体、並びにデュオカルマイシン及びその誘導体、
からなる群から選択される小分子薬物コンジュゲートである。
（１）チューブリン阻害剤である小分子化合物：メイタンシノイド、モノメチルアウリスタチンＥ、モノメチルアウリスタチンＦ、モノメチルドラスタチン１０、チューブリシン及びその誘導体、クリプトフィシン及びその誘導体、並びにタルトブリン、
（２）トポイソメラーゼ阻害剤である小分子化合物：ＰＮＵ－１５９６８２（ドキソルビシンの代謝物）及びその誘導体、ＳＮ３８（イリノテカンの代謝物）及びその誘導体、並びにエキサテカン、
（３）ＤＮＡ結合剤である小分子化合物：ＰＢＤ及びその誘導体、並びにデュオカルマイシン及びその誘導体、
からなる群から選択される小分子薬物コンジュゲートである。
【0050】
本発明の別の態様によれば、本開示は、組成物を提供する。本発明の実施の形態によれば、組成物は、上記の抗ヒトＢ７－Ｈ３抗体又はそのフラグメント、上記の融合分子、上記のポリヌクレオチド、上記の核酸コンストラクト、上記の宿主細胞、又は上記のコンジュゲートと、任意に、薬学的に許容可能な添加剤（複数の場合もある）とを含む。したがって、この組成物は、Ｂ７－Ｈ３に特異的に結合することができ、強い特異性及び良好な効力を有する。
【0051】
本発明の別の態様によれば、本開示は、抗ヒトＢ７－Ｈ３抗体又はそのフラグメントを作製する方法を提供する。本発明の実施の形態によれば、抗ヒトＢ７－Ｈ３抗体又はそのフラグメントを作製する方法は、
（１）上記の宿主細胞を適切な条件下で培養することと、
（２）抗ヒトＢ７－Ｈ３モノクローナル抗体若しくはそのフラグメント、抗ヒトＢ７－Ｈ３キメラ抗体若しくはそのフラグメント、又は抗ヒトＢ７－Ｈ３ヒト化抗体若しくはそのフラグメントを分離し回収することと、
を含む。
（１）上記の宿主細胞を適切な条件下で培養することと、
（２）抗ヒトＢ７－Ｈ３モノクローナル抗体若しくはそのフラグメント、抗ヒトＢ７－Ｈ３キメラ抗体若しくはそのフラグメント、又は抗ヒトＢ７－Ｈ３ヒト化抗体若しくはそのフラグメントを分離し回収することと、
を含む。
【0052】
したがって、本発明の実施の形態による方法によって作製された抗体は、ヒトＢ７－Ｈ３に特異的に結合することができ、強い特異性を有する。
【0053】
本発明の別の態様によれば、本開示は、Ｂ７－Ｈ３過剰発現と関連する疾患を診断する作用物質の作製における、上記の抗ヒトＢ７－Ｈ３抗体又はそのフラグメント、上記の融合分子、上記のポリヌクレオチド、上記の核酸コンストラクト、上記の宿主細胞、上記のコンジュゲート、及び上記の組成物の使用を提供する。
【0054】
本発明の別の態様によれば、本開示は、Ｂ７－Ｈ３過剰発現と関連する疾患を治療する医薬の作製における、上記の抗ヒトＢ７－Ｈ３抗体又はそのフラグメント、上記の融合分子、上記のポリヌクレオチド、上記の核酸コンストラクト、上記の宿主細胞、上記のコンジュゲート、及び上記の組成物の使用を提供する。
【0055】
本発明の実施の形態によれば、Ｂ７－Ｈ３過剰発現と関連する疾患は、固形腫瘍癌である。
【0056】
本発明の実施の形態によれば、固形腫瘍癌は、胃癌、結腸直腸癌、肝臓癌、膵臓癌、食道癌、非小細胞癌、前立腺癌、卵巣癌、神経芽腫、横紋筋肉腫、骨肉腫、ユーイング肉腫、ウィルムス腫瘍、及び線維形成性小円形細胞腫瘍を含む。
【0057】
本発明の実施の形態による抗ヒトＢ７－Ｈ３抗体又はそのフラグメントは、腫瘍細胞を特異的に殺傷し、組換え細胞及び腫瘍細胞の表面上のＢ７－Ｈ３に特異的に結合することができ、細胞及び動物モデルにおける顕著な腫瘍殺傷効果に寄与し、また明らかな有害反応は観察されない。したがって、膜表面上のＢ７－Ｈ３タンパク質に対する従来技術における抗ヒトＢ７－Ｈ３抗体の不十分な親和性及び特異性によりオフターゲット効果及び有害反応が引き起こされるという欠陥は克服される。
【0058】
さらに、本発明の更に別の態様によれば、本開示は、癌を有する被験体を治療する方法を提供する。本発明の実施の形態によれば、本方法は、被験体に、治療的有効量の上記の組成物である組成物を投与することを含む。
【0059】
本発明の実施の形態によれば、癌は、固形腫瘍癌である。
【0060】
本発明の実施の形態によれば、固形腫瘍癌は、胃癌、結腸直腸癌、肝臓癌、膵臓癌、食道癌、非小細胞癌、前立腺癌、卵巣癌、神経芽腫、横紋筋肉腫、骨肉腫、ユーイング肉腫、ウィルムス腫瘍、及び線維形成性小円形細胞腫瘍を含む。
【0061】
本発明をよりよく理解するために、或る特定の用語を最初に定義する。他の定義は、詳細な説明全体にわたって記述されている。
【0062】
「Ｂ７－Ｈ３」という用語は、Ｂ７ホモログ３を指す。Ｂ７－Ｈ３は、２Ｉｇ－Ｂ７－Ｈ３及び４Ｉｇ－Ｂ７－Ｈ３の２つの形態において存在する。２００１年に、Chapovalらは、公開された全てのＢ７ファミリーメンバーの細胞外ドメインを用いて、アメリカ国立生物工学情報センター（National Center for Biotechnology Information）（ＮＣＢＩ）及びHuman Genome Sciences Inc.のデータベースを検索した。Chapovalらは、ヒト樹状細胞由来のｃＤＮＡライブラリーにおいてＢ７様分子を特定し、ヒト腫瘍細胞系統ＴＨＰ－１ライブラリー、そしてまたＤＣライブラリーにおいても、ＲＴ－ＰＣＲを使用して核酸配列を確認した。Ｂ７－Ｈ３遺伝子は、シグナルペプチドと、単一の可変様及び定常様の免疫グロブリンドメインと、膜貫通領域と、４５アミノ酸の細胞質尾部とを含む３１６アミノ酸のタンパク質をコードしていることが判明した。Steinbergerらは、ヒト樹状細胞に対するモノクローナル抗体を産生させることにより、ｉｎ ｖｉｔｒｏで樹状細胞に分化された単球上で誘導された分子を認識した。レトロウイルス発現クローニングにより、この分子は４つのＩｇ様ドメインを有するＩ型膜タンパク質であるＢ７－Ｈ３として特定され、したがって特定された分子は４Ｉｇ－Ｂ７－Ｈ３と命名された。ＲＴ－ＰＣＲ分析及びウエスタンブロッティング実験により、Ｂ７－Ｈ３の一般的な形態として４Ｉｇ－Ｂ７－Ｈ３が示された。Steinbergerらによって論じられているように、ヒトＢ７－Ｈ３は１５番染色体上にコードされており、４Ｉｇ－Ｂ７－Ｈ３は、Ｂ７－Ｈ３－ＩｇＶエクソン及びＢ７－Ｈ３－ＩｇＣエクソンをコードする遺伝子座の重複の結果のようである。
【0063】
「特異的結合」という用語は、抗体とその抗体が指向される抗原との間の反応等の２つの分子間の非無作為な結合反応を指す。「免疫学的結合」という用語は、抗体分子とその抗体の特異抗原との間で起こる特異的な結合反応を指す。免疫学的結合相互作用の強度又は親和性は、相互作用の平衡解離定数（ＫＤ）の面で測定することができ、ＫＤ値が小さいほど親和性が高いことを示す。２つの分子間の免疫学的結合特性を、当該技術分野において一般に知られる方法を使用して定量化することができる。１つの方法には、抗原結合部位／抗原複合体の形成速度及び解離速度を測定することが含まれる。特定の抗体－抗原相互作用の「会合速度定数」（Ｋａ又はＫｏｎ）及び「解離速度定数」（Ｋｄ又はＫｏｆｆ）は両方とも、濃度並びに実際の会合速度及び解離速度によって計算することができる（Malmqvist M, 1993, Nature, 361: 186-187を参照）。Ｋｄ／Ｋａの比率は、解離定数ＫＤに等しい（Davies DR et al., 1990, Annual Rev Biochem., 59: 439-473を参照）。ＫＤ値、Ｋａ値、及びＫｄ値は、あらゆる有用な方法によって測定することができる。好ましい実施の形態において、解離定数は生物発光干渉法を使用して測定される。他の好ましい実施の形態において、解離定数は、表面プラズモン共鳴技術（例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ）又はＫｉｎＥｘａを使用して測定することができる。
【0064】
本明細書で使用される「抗体」という用語は、完全長抗体及びその任意の抗原結合フラグメント（すなわち、抗原結合部分）又は単鎖を包含することを意図している。完全長抗体は、少なくとも２つの重（Ｈ）鎖及び２つの軽（Ｌ）鎖を含み、重鎖と軽鎖とがジスルフィド結合によって連結される糖タンパク質を指す。各重鎖は、重鎖可変領域（ＶＨと略される）と重鎖定常領域とから構成される。重鎖定常領域は３つのドメイン、すなわちＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３から構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（ＶＬと略される）と軽鎖定常領域とから構成される。軽鎖定常領域は、１つのドメインＣＬから構成される。ＶＨ領域及びＶＬ領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される超可変領域と、ＣＤＲを隔てる、より保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）とに更に分けることができる。ＶＨ及びＶＬはそれぞれ、アミノ末端からカルボキシル末端に向かってＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順に配置された３つのＣＤＲ及び４つのＦＲから構成される。重鎖及び軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域は、様々な免疫系細胞（例えばエフェクター細胞）及び古典的補体系の第１成分（Ｃ１ｑ）を含む宿主内の組織又は因子への免疫グロブリンの結合を媒介することができる。
【0065】
「モノクローナル抗体」又は「ｍＡｂ」又は「モノクローナル抗体組成物」という用語は、単一分子からなる抗体分子調製物を指す。モノクローナル抗体組成物は、特定のエピトープに対する単一の結合特異性及び親和性を示す。
【0066】
本明細書で使用される抗体の「抗原結合フラグメント」という用語（又は抗体のフラグメントと略される）は、抗原に特異的に結合する能力を保持する抗体の１つ以上のフラグメントを指す。抗体の抗原結合機能が完全長抗体のフラグメントによって実現され得ることが実証されている。抗体の「抗原結合部分」に包含される結合フラグメントの例としては、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１から構成される一価フラグメントであるＦａｂフラグメント、（ｉｉ）ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結される２つのＦａｂフラグメントを含む二価フラグメントであるＦ（ａｂ’）２フラグメント、（ｉｉｉ）ＶＨ及びＣＨ１から構成されるＦｄフラグメント、（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬ及びＶＨから構成されるＦｖフラグメント、（ｖ）ＶＨから構成されるｄＡｂフラグメント（Ward et al, (1989) Nature 341: 544-546）、（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）、並びに（ｖｉｉ）単一の可変ドメイン及び２つの定常ドメインを含む重鎖可変領域であるナノボディが挙げられる。さらに、Ｆｖフラグメントの２つのドメインＶＬ及びＶＨは、異なる遺伝子にコードされるが、合成リンカーを介して組換えにより接合されて、ＶＬ領域及びＶＨ領域が対になって一価分子を形成する単一タンパク質鎖を形成することができる（一本鎖Ｆｃ（ｓｃＦｖ）と称される；例えば、Bird et al, (1988) Science 242: 423-426及びHuston et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883を参照）。これらの一本鎖抗体も、この用語の意味に包含されることが意図される。これらの抗体フラグメントは、当業者に既知の従来の手法を用いて得ることができ、インタクト抗体と同様に機能的にスクリーニングすることができる。
【0067】
本発明の抗原結合フラグメントには、抗原分子に特異的に結合することができるものが含まれる。抗原結合フラグメントの例としては、例えばＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖフラグメント、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）フラグメント、及び単一ドメインフラグメントが挙げられるが、これらに限定されない。
【0068】
Ｆａｂフラグメントは、軽鎖の定常ドメインと重鎖の第１定常ドメイン（ＣＨ１）とを含む。Ｆａｂ’フラグメントは、抗体ヒンジ領域からの１つ以上のシステインを含む数残基が重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシル末端に付加している点でＦａｂフラグメントとは異なる。Ｆ（ａｂ’）フラグメントは、Ｆ（ａｂ’）２ペプシン消化産物のヒンジシステインでのジスルフィド結合の切断によって生成する。抗体フラグメントの付加的な化学的結合は、当業者に既知である。Ｆａｂ及びＦ（ａｂ’）２フラグメントは、インタクト抗体のフラグメント結晶化可能（Ｆｃ）領域を欠き、動物の循環からより迅速に除去され、インタクト抗体よりも非特異的組織結合が少ない可能性がある（例えば、Wahl et al, 1983, J. Nucl. Med. 24:316を参照）。
【0069】
当該技術分野において一般に理解されているように、「Ｆｃ」領域は、抗原特異的結合領域を含まない抗体のフラグメント結晶化可能定常領域である。ＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＤの抗体アイソタイプでは、Ｆｃ領域は、抗体の２つの重鎖の第２の定常ドメイン及び第３の定常ドメイン（それぞれＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメイン）に由来する２つの同一のタンパク質フラグメントからなる。ＩｇＭ及びＩｇＥのＦｃ領域は、各ポリペプチド鎖に３つの重鎖定常ドメイン（ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン及びＣＨ４ドメイン）を含む。
【0070】
「ヒト化抗体」という用語は主に、遺伝子クローニング技術及びＤＮＡ組換え技術を使用してマウスモノクローナル抗体を操作した後に発現された抗体を指す。この抗体は、アミノ酸配列の大部分がヒト配列で置き換えられており、マウスモノクローナル親抗体の親和性及び特異性を実質的に保持しており、また異種性もより低い。
【0071】
「キメラ抗体」という用語は、重鎖及び／又は軽鎖の一部が、特定の種に由来する抗体、又は特定の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一又は相同であるが、鎖（複数の場合もある）の残部が、別の種に由来する抗体、又は別の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体、並びに所望の生物学的活性を示す限りそのような抗体のフラグメントにおける対応する配列と同一又は相同である抗体を指す（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号、及びMorrison SL et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851-6855, 1984を参照）。例えば、「キメラ抗体」という用語には、抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域が、第１の抗体（例えば、マウス抗体）に由来するが、抗体の重鎖定常領域及び軽鎖定常領域が、第２の抗体（例えば、ヒト抗体）に由来する抗体（例えば、ヒトマウスキメラ抗体）が含まれ得る。
【0072】
「重鎖」という用語に関して、重鎖（Ｈ鎖）は、軽鎖の約２倍のサイズであり、４５０個～５５０個のアミノ酸残基を含み、約５５ｋＤａ又は７５ｋＤａの分子量を有する。各Ｈ鎖は、４個又は５個の鎖内ジスルフィド結合を介して形成された環状ペプチドを含む。異なるＨ鎖は、アミノ酸残基の並び順、ジスルフィド結合の数及び位置、並びにジスルフィド結合の種類及び数の違いにより異なる抗原性を有し、Ｈ鎖抗原性の違いによりμ鎖、γ鎖、α鎖、δ鎖、及びε鎖の５つの種類に分類され得る。異なるＨ鎖及びＬ鎖（κ鎖又はλ鎖）から構成される免疫グロブリン分子全体はそれぞれＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＥと呼ばれる。γ鎖、α鎖、及びδ鎖は４つのペプチドを含み、μ鎖及びε鎖は５つの環状ペプチドを含む。
【0073】
「軽鎖」という用語に関して、軽鎖（Ｌ鎖）は、免疫グロブリン単量体分子において重鎖と比べて分子量が小さいポリペプチド鎖を指す。各軽鎖のアミノ末端（Ｎ末端）に近い１／２領域内のより一層多様なアミノ酸組成を有する部分が軽鎖可変領域（ＶＬ）であり、Ｉｇ分子が抗原と結合する領域の１つの部分である。
【0074】
比較的安定したアミノ酸組成及び配置を有する残りの１／２領域が軽鎖定常領域（ＣＬ）である。軽鎖は、軽鎖定常領域内のアミノ酸配列における幾つかの違いによりκ及びλの２つの形態で存在する。
【0075】
「生殖細胞系統」という用語は、生殖細胞系としても知られている。抗体形成細胞は、Ｉｇ分子をコードする全ての遺伝子（すなわち、限られた数のＣ遺伝子及び未知の数のＶ遺伝子）を有し、生殖細胞系統は長時間の進化によって形成され、生殖細胞によって親から子へと受け継がれ、ヒト免疫グロブリンの重鎖遺伝子はＶ－Ｄ－Ｊ－Ｃ遺伝子セグメントによってコードされ、ヒト免疫グロブリンの軽鎖遺伝子はＶ－Ｊ－Ｃ遺伝子セグメントによってコードされ、遺伝子セグメントの数は様々である。ヒト重鎖遺伝子は、１４番染色体の長腕に位置し、約１１００ｋｂにまたがり、４個の遺伝子セグメントＶ、Ｄ、Ｊ、及びＣからなり、かつ６５個の機能的遺伝子セグメントを含む約９５個のＶａ遺伝子セグメント（７つのファミリー、すなわちＶＨ１～ＶＨ７に属する）と、２７個のＤ遺伝子セグメントと、６個のＪＨ遺伝子セグメントと、９個のＣＨ遺伝子セグメントとを含む。Ｖａ遺伝子セグメントは上流に位置し、Ｄ遺伝子セグメントはＶＨ遺伝子クラスターとＪＨ遺伝子クラスターとの間に位置し、ＪＨ遺伝子はＤＨの下流に位置し、下流のＣ遺伝子領域から約７ｋｂ離れており、ＣＨ遺伝子はクラスター状に配置されており、約２００ｋｂにまたがり、ＪＨ遺伝子セグメントのすぐ下流にＰ遺伝子及びＳ遺伝子が位置し、Ｃ８の下流には順にＣγ、Ｃα、そしてＣεがある。ヒト軽鎖遺伝子は、λ遺伝子及びｘ遺伝子に群分けされ、それぞれ２２番染色体の長腕及び２番染色体の短腕に位置している。約４０個の機能的なＶＫ遺伝子セグメントがあり、Ｖｃ遺伝子セグメントの後には５個の機能的なＪ及び１個のＣκがあり、約３０個のＶλ遺伝子セグメント、４個のＪλ遺伝子セグメント、及び４個のＣλ遺伝子セグメントがある。
【0076】
「ＥＣ５０」という用語は、半数効果濃度としても知られ、最大効果の５０％を起こす抗体濃度を指す。
【0077】
「ベクター」又は「核酸コンストラクト」という用語は、連結された別の核酸を輸送することができる核酸分子を指す。ベクターの１つの種類は「プラスミド」であり、これは、追加のＤＮＡセグメントがライゲーションされ得る環状二本鎖ＤＮＡループを指す。別の種類のベクターはウイルスベクターであり、ここで、追加のＤＮＡセグメントはウイルスゲノム内にライゲーションされ得る。或る特定のベクターは、これらが導入される宿主細胞内で自律複製することができる（例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクター及びエピソーマル哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーマル哺乳類ベクター）は、宿主細胞への導入時に宿主細胞のゲノム内に組み込まれる場合があり、それにより宿主ゲノムとともに複製される。さらに、或る特定のベクターは、これらが作動可能に連結されている遺伝子の発現を誘導することができる。このようなベクターは、本明細書において「組換え発現ベクター」（又は単に「組換えベクター」）と呼ばれる。概して、組換えＤＮＡ技術で有用な発現ベクターは、しばしばプラスミドの形態である。しかしながら、他の形態の発現ベクター、例えば、同等の機能を果たすウイルスベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、及びアデノ随伴ウイルス）が包含され得る。
【0078】
「核酸分子」という用語は、ＤＮＡ分子及びＲＮＡ分子の両方を含むことを意図している。核酸分子は一本鎖であっても又は二本鎖であってもよく、ｃＤＮＡであってもよい。
【0079】
「ポリペプチド」という用語は、少なくとも２個の連続的に連結されたアミノ酸残基を含む鎖を指し、鎖の長さに上限はない。タンパク質内の１個以上のアミノ酸残基は、限定されるものではないが、グリコシル化、リン酸化、又はジスルフィド結合等の修飾を含み得る。「タンパク質」は、１つ以上のポリペプチドを含み得る。
【0080】
「宿主細胞」という用語は、ベクターを増幅することができ、そのＤＮＡを発現することができる細胞を指し、この細胞は原核細胞であっても又は真核細胞であってもよい。この用語はまた、対象の宿主細胞のあらゆる子孫を包含する。複製中に突然変異が起こる可能性があり、そのような子孫が包含されるため、全ての子孫が親細胞と同一である必要はないことが理解される。
【0081】
「癌」及び「腫瘍」という用語は、細胞の集団が制御不能な細胞成長を特徴とする哺乳動物の生理学的病態を指す又はそれを説明する。癌の例としては、限定されるものではないが、癌腫、リンパ腫、芽腫、肉腫、白血病、及び良性腫瘍又は悪性腫瘍が挙げられる。癌のより具体的な例としては、扁平上皮癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌、肺扁平上皮癌、腹膜癌、肝細胞癌、消化器癌、膵臓癌、膠芽腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝細胞癌、乳癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌又は子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌、肝臓癌、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、脳癌、肝癌、及び様々な種類の頭頸部癌、並びに神経線維腫症Ｉ型又は神経線維腫症ＩＩ型が挙げられる。癌の他の例としては、治療抵抗性、難治性、又は転移性の癌が挙げられる。
【0082】
「抗体薬物コンジュゲート」という用語は、「コンジュゲート」と略され、抗体と、リンカーと、薬物とからなり、ここで、リンカーは切断可能なリンカー又は切断可能でないリンカーのいずれかである。抗体は、薬物－リンカーのカップリングに使用することができる一連のアミノ酸部位を含む球状タンパク質である。それらの三次構造及び四次構造のため、溶媒に到達可能なアミノ酸のみがカップリングに利用可能である。実際、通常、リジン残基のε－アミノ基又はシステイン残基のスルフヒドリル基で高収率のカップリングが起こる。抗体タンパク質の表面上の多数のリジン側鎖は、薬物のコンジュゲートに利用可能な多数の部位をもたらすことから、結果として、様々な数の薬物コンジュゲート（薬物／抗体比、ＤＡＲ）及び様々なコンジュゲート部位を含む混合物である抗体薬物コンジュゲートが生成される。本開示によって提供されるコンジュゲート生成物は、依然として混合物であるものの、従来のコンジュゲート様式において得られる抗体薬物コンジュゲートと比較して狭い分布範囲のＤＡＲ値を有する。平均ＤＡＲ値は４に近く、抗体薬物コンジュゲートのＤＡＲ値の最適平均範囲（２～４）に近い。さらに、コンジュゲート生成物は、細胞の殺傷に有効でない成分である裸抗体（ＤＡＲ＝０）を滅多に含まない。また、コンジュゲート生成物は、低いＤＡＲ値を有する成分と比べてｉｎ ｖｉｖｏで急速に除去される多大にカップリングされた生成物（ＤＡＲ＝８）を含まない。したがって、本開示によって提供される抗体薬物コンジュゲート生成物は、大幅に改善された不均一性を有する。
【0083】
本開示によって提供される抗体薬物コンジュゲートを構成する抗体は、天然状態でのその当初の抗原結合能力をより良好に保持することとなる。したがって、本開示における抗体は、好ましくは、その抗原に特異的に結合することができる。癌の診断及び治療に有効な細胞レベルの標的を開発するために、研究者らは膜貫通型ポリペプチド又は他の腫瘍関連ポリペプチドを見つけようとしてきた。これらの標的は１つ以上の癌細胞の表面上で特異的に発現することができるのに対して、１つ以上の非癌細胞の表面上では発現されないか、又は滅多に発現されない。典型的には、そのような腫瘍関連ポリペプチドは、非癌細胞の表面と比べて癌細胞の表面上でより過剰発現される。このような腫瘍関連因子の特定は、抗体ベースの癌治療の特異的な標的化特性を大きく改善することができる。
【0084】
本開示によって提供される抗体は、Ｂ７－Ｈ３に関して相対的により高い結合能力を有し、５×１０－１０Ｍ未満の親和性定数ＫＤ値を有する。抗Ｂ７－Ｈ３ヒト化抗体のｈｚ９Ｂ１１、ｈｚ１０Ｂ４、及びｈｚ１７Ａ３は、ヒトＢ７－Ｈ３タンパク質に特異的に結合することができ、それらの親和性（ＫＤ）は、それぞれ２．１９×１０－１０Ｍ、１．４２×１０－１０Ｍ、及び１．７７×１０－１０Ｍであったのに対して、コントロール抗体のＭＧＣ－０１８及びエノブリツズマブの親和性（ＫＤ）は、それぞれ５．９７×１０－１０Ｍ及び９．５０×１０－１０Ｍであった。結合能力はそれらの優れた効力についての分子的基礎を提供する。
【0085】
本開示によって提供される抗体は、良好な生物学的活性を有する。抗体のｈｚ９Ｂ１１、ｈｚ１０Ｂ４、及びｈｚ１７Ａ３は、細胞表面上の組換えヒトＢ７－Ｈ３に効果的に結合することができ、それらの半数効果結合濃度（half maximal effective binding concentration）（ＥＣ５０）値は、それぞれ０．０８２７７μｇ／ｍｌ、０．１１８３μｇ／ｍｌ、及び０．０４４０７μｇ／ｍｌであり、コントロール抗体のエノブリツズマブ（ＥＣ５０値：０．１９０６μｇ／ｍｌ）の値よりも優れており、ｈｚ９Ｂ１１及びｈｚ１７Ａ３のＥＣ５０値は、コントロール抗体のＭＧＣ－０１８のＥＣ５０値（ＥＣ５０値：０．０５６４９μｇ／ｍｌ）に近かった。さらに、ｈｚ９Ｂ１１、ｈｚ１０Ｂ４、及びｈｚ１７Ａ３は、良好な細胞内移行能力を有していた。
【0086】
本開示によって提供される抗体は、ｉｎ ｖｉｖｏ（マウス）で良好な効力を有する。ヌードマウスにおけるＡ４３１細胞の皮下移植腫瘍モデルにおいて、ｈｚ１０Ｂ４－Ｍと命名された抗Ｂ７－Ｈ３抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）は、コントロール抗体薬物コンジュゲートのＭＧＣ－０１８－Ｍ及びエノブリツズマブ－Ｍよりも良好な効力を有し、かつｈｚ１７Ａ３－Ｍは、コントロール抗体薬物コンジュゲートのエノブリツズマブ－Ｍよりも良好な効力を有していた。ｈｚ９Ｂ１１－Ｍは或る特定の効力を示したが、ｈｚ１０Ｂ４－Ｍ及びｈｚ１７Ａ３－Ｍの効力よりも弱かった。さらに、ＡＤＣの作製に使用された小分子ＭＭＡＥの明らかな毒性効果は観察されず、各実験群における動物の体重は着実に増加し、実験群とコントロール群との間で体重に明らかな差は見られなかった。
【0087】
本発明の上記の及び／又は追加の態様及び利点は、以下の添付図面を参照して実施の形態の説明から明らかとなり、容易に理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【0088】
【図1】ＥＬＩＳＡによって検出されたＢ７－Ｈ３抗原へのハイブリドーマ上清の結合を示す図である。
【図2】ＥＬＩＳＡによって検出された様々な組換えＢ７－Ｈ３タンパク質ドメインへの抗ヒトＢ７－Ｈ３キメラ抗体の結合を示す図である。
【図3】ＦＡＣＳによって検出された２９３／ｈＢ７－Ｈ３細胞の表面上のＢ７－Ｈ３への抗ヒトＢ７－Ｈ３キメラ抗体の結合を示す図である。
【図4】ＦＡＣＳによって検出されたＡ４３１細胞の表面上のＢ７－Ｈ３への抗ヒトＢ７－Ｈ３キメラ抗体の結合を示す図である。
【図5】組換えヒトＢ７－Ｈ３へのヒト化抗体の結合を示すＥＬＩＳＡ曲線を示す図である。
【図6】組換えサルＢ７－Ｈ３へのヒト化抗体の結合を示すＥＬＩＳＡ曲線を示す図である。
【図7】組換えマウスＢ７－Ｈ３へのヒト化抗体の結合を示すＥＬＩＳＡ曲線を示す図である。
【図8A】組換えヒトＢ７－Ｈ３細胞外ドメインタンパク質に対するｈｚ１０Ｂ４の親和性の分析を示す図である。
【図8B】組換えヒトＢ７－Ｈ３細胞外ドメインタンパク質に対するｈｚ１７Ａ３の親和性の分析を示す図である。
【図8C】組換えヒトＢ７－Ｈ３細胞外ドメインタンパク質に対するｈｚ９Ｂ１１の親和性の分析を示す図である。
【図8D】組換えヒトＢ７－Ｈ３細胞外ドメインタンパク質に対するＭＧＣ－０１８の親和性の分析を示す図である。
【図8E】組換えヒトＢ７－Ｈ３細胞外ドメインタンパク質に対するエノブリツズマブの親和性の分析を示す図である。
【図9】ＦＡＣＳによって検出されたＳＫＶＯ３細胞への抗ヒトＢ７－Ｈ３ヒト化抗体の結合を示す図である。
【図10】細胞表面上のＢ７－Ｈ３によって媒介される抗ヒトＢ７－Ｈ３ヒト化抗体の細胞内移行率を示す図である。
【図11】Ａ４３１細胞に対する抗ヒトＢ７－Ｈ３抗体薬物コンジュゲートの検出された殺傷活性を示す図である。
【図12】ＳＫＶＯ３細胞に対する抗ヒトＢ７－Ｈ３抗体薬物コンジュゲートの検出された殺傷活性を示す図である。
【図13】ヌードマウスにおけるＡ４３１細胞の皮下移植腫瘍モデルにおけるマウスの腫瘍体積変化曲線を示す図である。
【図14】ヌードマウスにおけるＡ４３１細胞の皮下移植腫瘍モデルにおけるマウスの重量変化曲線を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0089】
本発明の実施形態を以下で詳細に説明し、添付の図面に図解する。ここで、同じ又は類似の参照符号は、同じ若しくは類似の要素、又は全体を通じて同じ若しくは類似の機能を有する要素を指す。添付の図面を参照して以下に説明される実施形態は、例示的なものであり、本発明の説明に使用されるにすぎず、本発明を限定するものとして解釈されるべきではない。
【0090】
「第１」及び「第２」という用語は、説明の目的で使用されるにすぎず、相対的な重要性を示し若しくは暗示し、又は示される技術的特徴の数を暗黙的に示すものとして理解されるべきではないことに留意されたい。したがって、「第１」及び「第２」で定義される特徴は、明示的に又は暗黙的に１つ以上の特徴を含み得る。さらに、本開示の説明において、「複数」とは、特段の指示がない限り２以上を意味する。
【0091】
本発明の解決策を、実施例を参照して以下に例示する。以下の実施例は単に本発明を例示するものであり、本発明の範囲を限定するものと見なされないことは当業者によって理解されよう。実施例において具体的な技術又は条件が示されていなければ、当該技術分野の文献（例えば、Molecular Cloning: A Laboratory Manual (第3版), J. Sambrook編及びPeitang HANG他訳, Scientific Pressを参照）に記載される技術若しくは条件又は製品の使用説明書に従うものとする。製造業者の指示を伴わない使用される試薬又は機器は、例えば、Sigma Inc.から商業的に入手可能な慣用の製品である。
【実施例】
【0092】
実施例１：抗ヒトＢ７－Ｈ３抗体を産生するハイブリドーマ細胞の作製及びスクリーニング
１．１ ハイブリドーマの作製
免疫化：Ｂａｌｂ／ｃマウスを組換えヒトＢ７－Ｈ３細胞外ドメインタンパク質（アクセッション番号：ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｑ５ＺＰＲ３、１位アミノ酸～４６１位アミノ酸）を使用して免疫化し、血清力価を組換えヒトＢ７－Ｈ３－ｈｉｓタンパク質（アクセッション番号：ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｑ５ＺＰＲ３、１位アミノ酸～４６１位アミノ酸）がコーティングされた９６ウェルのＥＬＩＳＡプレートにおいてＥＬＩＳＡによって検出した。融合の要件を満たすマウスを次の細胞融合に使用した。
１．１ ハイブリドーマの作製
免疫化：Ｂａｌｂ／ｃマウスを組換えヒトＢ７－Ｈ３細胞外ドメインタンパク質（アクセッション番号：ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｑ５ＺＰＲ３、１位アミノ酸～４６１位アミノ酸）を使用して免疫化し、血清力価を組換えヒトＢ７－Ｈ３－ｈｉｓタンパク質（アクセッション番号：ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｑ５ＺＰＲ３、１位アミノ酸～４６１位アミノ酸）がコーティングされた９６ウェルのＥＬＩＳＡプレートにおいてＥＬＩＳＡによって検出した。融合の要件を満たすマウスを次の細胞融合に使用した。
【0093】
細胞融合及びハイブリドーマの作製：要件を満たす力価を有するマウスを選択して、最終ブーストを行った。３日後に、マウスの脾臓を無菌的に採取し、Ｂリンパ球の懸濁液を調製し、ＳＰ２／０骨髄腫細胞と融合させた。融合した細胞をＨＡＴ培地中で再懸濁した後に、９６ウェルの細胞培養プレートに播種し、次いでこれらを３７℃、５％のＣＯ２のインキュベーター内で培養した。
【0094】
１．２ 陽性ハイブリドーマの結合スクリーニング
融合から１０日～１４日後に、ＥＬＩＳＡプレートを組換えヒトＢ７－Ｈ３－ｈｉｓ細胞外ドメインタンパク質（アクセッション番号：ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｑ５ＺＰＲ３、１位アミノ酸～４６１位アミノ酸）（２０ｎｇ／ｍｌ）で４℃にて一晩コーティングした。ＰＢＳで３回洗浄し、プレートを４％の脱脂粉乳－ＰＢＳで室温にて１時間ブロッキングした。引き続き、プレートをＰＢＳで３回洗浄し、ハイブリドーマクローンの培養上清をプレートに加え、室温で１時間インキュベートした。以下のコントロールを準備した：（１）ポジティブコントロール（ＰＣ）：免疫化後のマウス血清（１：１０００でのＰＢＳによる希釈）、及び（２）ネガティブコントロール（ＮＣ）：免疫化前のマウス血清（１：１０００でのＰＢＳによる希釈）。プレートをＰＢＳＴ（０．０５％のＴｗｅｅｎ ２０－ＰＢＳ）で３回洗浄し、ＰＢＳで２回洗浄した後に、ＨＲＰコンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｆｃγ）をプレートに加え、３７℃で０．５時間インキュベートした。再度、プレートをＰＢＳＴ（０．０５％のＴｗｅｅｎ ２０－ＰＢＳ）で３回洗浄し、ＴＭＢ基質を加えて、暗所で１５分間～３０分間発色させた。ＥＬＩＳＡ停止溶液を加えて反応を停止させ、４５０ｎｍでの吸光度をマイクロプレートリーダーで読み取った。最高から最低まで順序づけされた読み取り値を有する上位１６個のクローンを選択し、それらの培養上清を確認用に２回目のＥＬＩＳＡに供した。最後に、クローン番号４４５（９Ｂ１１）、クローン番号４８５（１０Ｂ４）、及びクローン番号８７０（１７Ａ３）を配列クローニング用の候補クローンとして選択した。ＥＬＩＳＡの結果を図１に示す。
融合から１０日～１４日後に、ＥＬＩＳＡプレートを組換えヒトＢ７－Ｈ３－ｈｉｓ細胞外ドメインタンパク質（アクセッション番号：ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｑ５ＺＰＲ３、１位アミノ酸～４６１位アミノ酸）（２０ｎｇ／ｍｌ）で４℃にて一晩コーティングした。ＰＢＳで３回洗浄し、プレートを４％の脱脂粉乳－ＰＢＳで室温にて１時間ブロッキングした。引き続き、プレートをＰＢＳで３回洗浄し、ハイブリドーマクローンの培養上清をプレートに加え、室温で１時間インキュベートした。以下のコントロールを準備した：（１）ポジティブコントロール（ＰＣ）：免疫化後のマウス血清（１：１０００でのＰＢＳによる希釈）、及び（２）ネガティブコントロール（ＮＣ）：免疫化前のマウス血清（１：１０００でのＰＢＳによる希釈）。プレートをＰＢＳＴ（０．０５％のＴｗｅｅｎ ２０－ＰＢＳ）で３回洗浄し、ＰＢＳで２回洗浄した後に、ＨＲＰコンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｆｃγ）をプレートに加え、３７℃で０．５時間インキュベートした。再度、プレートをＰＢＳＴ（０．０５％のＴｗｅｅｎ ２０－ＰＢＳ）で３回洗浄し、ＴＭＢ基質を加えて、暗所で１５分間～３０分間発色させた。ＥＬＩＳＡ停止溶液を加えて反応を停止させ、４５０ｎｍでの吸光度をマイクロプレートリーダーで読み取った。最高から最低まで順序づけされた読み取り値を有する上位１６個のクローンを選択し、それらの培養上清を確認用に２回目のＥＬＩＳＡに供した。最後に、クローン番号４４５（９Ｂ１１）、クローン番号４８５（１０Ｂ４）、及びクローン番号８７０（１７Ａ３）を配列クローニング用の候補クローンとして選択した。ＥＬＩＳＡの結果を図１に示す。
【0095】
実施例２：マウス抗ヒトＢ７－Ｈ３抗体のシーケンシング
抗ヒトＢ７－Ｈ３抗体を分泌するモノクローナルハイブリドーマ細胞の９Ｂ１１、１０Ｂ４、及び１７Ａ３を拡大培養に供し、ＴＲＩｚｏｌキット（カタログ：１５５９６０２６、Invitrogen）を使用して、キットに付属の使用説明書に記載される工程に従って細胞の全ＲＮＡを抽出し、得られたハイブリドーマ細胞の全ＲＮＡを、Ｍ－ＭｕＬＶ逆転写酵素（カタログ：Ｍ０２５３Ｓ、NEB）を使用してｃＤＮＡに逆転写し、縮重プライマー及びＰｈｕｓｉｏｎキット（カタログ：Ｅ０５５３Ｌ、NEB）を使用して抗体の軽鎖可変領域ＩｇＶＬ（κ）及び重鎖可変領域ＶＨの配列を増幅させた。ＰＣＲ増幅産物を、ゲル回収キット（カタログ：ＡＰ－ＧＸ－２５０、Axygen）を使用して精製し、Ｔベクタークローニングキット（カタログ：ＺＣ２０５、ZOMANBIO）を使用して、キットに付属の使用説明書に従って、Ｔ－ベクターに連結し、コンピテントＥ．コリ（E. coli）細胞に形質転換した。菌株の増幅及びプラスミドの抽出の後に、モノクローナル抗体の可変領域配列をＤＮＡシーケンシングによって取得した。マウス抗体９Ｂ１１の重鎖可変領域配列は配列番号１に示される通りであり、マウス抗体９Ｂ１１の軽鎖可変領域配列は配列番号２に示される通りである。マウス抗体１０Ｂ４の重鎖可変領域配列は配列番号３に示される通りであり、マウス抗体１０Ｂ４の軽鎖可変領域配列は配列番号４に示される通りである。マウス抗体１７Ａ３の重鎖可変領域配列は配列番号５に示される通りであり、マウス抗体１７Ａ３の軽鎖可変領域配列は配列番号６に示される通りである。
抗ヒトＢ７－Ｈ３抗体を分泌するモノクローナルハイブリドーマ細胞の９Ｂ１１、１０Ｂ４、及び１７Ａ３を拡大培養に供し、ＴＲＩｚｏｌキット（カタログ：１５５９６０２６、Invitrogen）を使用して、キットに付属の使用説明書に記載される工程に従って細胞の全ＲＮＡを抽出し、得られたハイブリドーマ細胞の全ＲＮＡを、Ｍ－ＭｕＬＶ逆転写酵素（カタログ：Ｍ０２５３Ｓ、NEB）を使用してｃＤＮＡに逆転写し、縮重プライマー及びＰｈｕｓｉｏｎキット（カタログ：Ｅ０５５３Ｌ、NEB）を使用して抗体の軽鎖可変領域ＩｇＶＬ（κ）及び重鎖可変領域ＶＨの配列を増幅させた。ＰＣＲ増幅産物を、ゲル回収キット（カタログ：ＡＰ－ＧＸ－２５０、Axygen）を使用して精製し、Ｔベクタークローニングキット（カタログ：ＺＣ２０５、ZOMANBIO）を使用して、キットに付属の使用説明書に従って、Ｔ－ベクターに連結し、コンピテントＥ．コリ（E. coli）細胞に形質転換した。菌株の増幅及びプラスミドの抽出の後に、モノクローナル抗体の可変領域配列をＤＮＡシーケンシングによって取得した。マウス抗体９Ｂ１１の重鎖可変領域配列は配列番号１に示される通りであり、マウス抗体９Ｂ１１の軽鎖可変領域配列は配列番号２に示される通りである。マウス抗体１０Ｂ４の重鎖可変領域配列は配列番号３に示される通りであり、マウス抗体１０Ｂ４の軽鎖可変領域配列は配列番号４に示される通りである。マウス抗体１７Ａ３の重鎖可変領域配列は配列番号５に示される通りであり、マウス抗体１７Ａ３の軽鎖可変領域配列は配列番号６に示される通りである。
【0096】
実施例３：抗ヒトＢ７－Ｈ３キメラ抗体及びコントロール抗体の作製
コントロール抗体のエノブリツズマブ及びＭＧＣ－０１８の軽鎖配列及び重鎖配列を完全に合成し、それぞれ真核生物一過性発現ベクターにクローニングして、コントロール抗体の軽鎖及び重鎖を発現するプラスミドを得た。プラスミドをＥ．コリ細胞に形質転換して増幅させ、それぞれコントロール抗体の軽鎖及び重鎖を含む多数のプラスミドを回収により取得した。コントロール抗体の軽鎖及び重鎖を含むプラスミドを、今度は、２９３ｆｅｃｔｉｎ（カタログ：１２３４７０１９、Gibco）トランスフェクション試薬を使用して、組換え発現に関する製造業者の使用説明書に従って、それぞれＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクションした。細胞トランスフェクションから５日～６日後に、培養上清を採取し、ＰｒｏＡアフィニティークロマトグラフィーカラムを通して精製して、コントロール抗体を得た。コントロール抗体のエノブリツズマブのアミノ酸配列は、WHO Drug Information（第３０巻、第４号、２０１６年）から導き出され、重鎖のアミノ酸配列は配列番号７に示される通りであり、軽鎖のアミノ酸配列は配列番号８に示される通りである。コントロール抗体のＭＧＣ－０１８のアミノ酸配列は、国際公開第２０１７／１８０８１３号の特許文献から導き出され、重鎖のアミノ酸配列は配列番号９に示される通りであり、軽鎖のアミノ酸配列は配列番号１０に示される通りである。
コントロール抗体のエノブリツズマブ及びＭＧＣ－０１８の軽鎖配列及び重鎖配列を完全に合成し、それぞれ真核生物一過性発現ベクターにクローニングして、コントロール抗体の軽鎖及び重鎖を発現するプラスミドを得た。プラスミドをＥ．コリ細胞に形質転換して増幅させ、それぞれコントロール抗体の軽鎖及び重鎖を含む多数のプラスミドを回収により取得した。コントロール抗体の軽鎖及び重鎖を含むプラスミドを、今度は、２９３ｆｅｃｔｉｎ（カタログ：１２３４７０１９、Gibco）トランスフェクション試薬を使用して、組換え発現に関する製造業者の使用説明書に従って、それぞれＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクションした。細胞トランスフェクションから５日～６日後に、培養上清を採取し、ＰｒｏＡアフィニティークロマトグラフィーカラムを通して精製して、コントロール抗体を得た。コントロール抗体のエノブリツズマブのアミノ酸配列は、WHO Drug Information（第３０巻、第４号、２０１６年）から導き出され、重鎖のアミノ酸配列は配列番号７に示される通りであり、軽鎖のアミノ酸配列は配列番号８に示される通りである。コントロール抗体のＭＧＣ－０１８のアミノ酸配列は、国際公開第２０１７／１８０８１３号の特許文献から導き出され、重鎖のアミノ酸配列は配列番号９に示される通りであり、軽鎖のアミノ酸配列は配列番号１０に示される通りである。
【0097】
上記のようなクローニングによって得られたマウス抗体の９Ｂ１１、１０Ｂ４、及び１７Ａ３の軽鎖可変領域遺伝子及び重鎖可変領域遺伝子をＰＣＲにより制限酵素の切断部位で導入し、それぞれ真核生物一過性発現ベクターに含まれるヒトκ軽鎖定常領域をコードする遺伝子の上流及びヒトＩｇＧ１重鎖定常領域をコードする遺伝子の上流にクローニングした。ヒト－マウスキメラ軽鎖を発現するプラスミド（ｐＫＮ０１９－ｃｈ９Ｂ１１Ｌ、ｐＫＮ０１９－ｃｈ１０Ｂ４Ｌ、及びｐＫＮ０１９－ｃｈ１７Ａ３Ｌ）及びヒト－マウスキメラ重鎖を発現するプラスミド（ｐＫＮ０２５－ｃｈ９Ｂ１１Ｈ、ｐＫＮ０２５－ｃｈ１０Ｂ４Ｈ、及びｐＫＮ０２５－ｃｈ１７Ａ３Ｈ）を取得し、Ｅ．コリ細胞に形質転換して増幅させ、ヒト－マウスキメラ軽鎖及び重鎖をそれぞれ含む多数のプラスミドを回収により取得した。キメラ抗体の９Ｂ１１、１０Ｂ４、及び１７Ａ３の軽鎖及び重鎖を含むプラスミドを、今度は、２９３ｆｅｃｔｉｎ（カタログ：１２３４７０１９、Gibco）トランスフェクション試薬を使用して、組換え発現に関する製造業者の使用説明書に従って、それぞれＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクションした。細胞トランスフェクションから５日～６日後に、培養上清を採取し、ＰｒｏＡアフィニティークロマトグラフィーカラムを通して精製して、キメラ抗体の９Ｂ１１、１０Ｂ４、及び１７Ａ３（ｃｈ９Ｂ１１、ｃｈ１０Ｂ４、及びｃｈ１７Ａ３）を得た。
【0098】
実施例４：キメラ抗体の親和性の分析
抗体の親和性を、抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ捕捉（ＡＨＣ）バイオセンサーにより抗体のＦｃフラグメントを捕捉することを含むアッセイによってFortebio製のＯｃｔｅｔ ＱＫｅシステム機器を使用して決定した。アッセイのために、キメラ抗体のｃｈ９Ｂ１１、ｃｈ１０Ｂ４、ｃｈ１７Ａ３、及びコントロール抗体のエノブリツズマブのそれぞれをＰＢＳ中で４μｇ／ｍｌに希釈し、ＡＨＣバイオセンサー（カタログ：１８－００１５、PALL）の表面に１２０秒間流過させた。組換えヒトＢ７－Ｈ３細胞外ドメインタンパク質（アクセッション番号：ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｑ５ＺＰＲ３、１位アミノ酸～４６１位アミノ酸、Ｃ－ｈｉｓタグ）（６０ｎＭ）を移動相として使用した。会合時間は３００秒であり、解離時間は３００秒であった。アッセイが完了したら、ブランクコントロールの応答値を差し引いたデータを、ソフトウェアを使用して１：１ラングミュア結合モデルにフィッティングさせ、次いで、抗原－抗体結合についての速度定数を計算した。速度定数を以下の表１に示す。表１における結果は、全てのクローンが正しくクローニングされ、組換えヒトＢ７－Ｈ３タンパク質に結合することができることを示している。
抗体の親和性を、抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ捕捉（ＡＨＣ）バイオセンサーにより抗体のＦｃフラグメントを捕捉することを含むアッセイによってFortebio製のＯｃｔｅｔ ＱＫｅシステム機器を使用して決定した。アッセイのために、キメラ抗体のｃｈ９Ｂ１１、ｃｈ１０Ｂ４、ｃｈ１７Ａ３、及びコントロール抗体のエノブリツズマブのそれぞれをＰＢＳ中で４μｇ／ｍｌに希釈し、ＡＨＣバイオセンサー（カタログ：１８－００１５、PALL）の表面に１２０秒間流過させた。組換えヒトＢ７－Ｈ３細胞外ドメインタンパク質（アクセッション番号：ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｑ５ＺＰＲ３、１位アミノ酸～４６１位アミノ酸、Ｃ－ｈｉｓタグ）（６０ｎＭ）を移動相として使用した。会合時間は３００秒であり、解離時間は３００秒であった。アッセイが完了したら、ブランクコントロールの応答値を差し引いたデータを、ソフトウェアを使用して１：１ラングミュア結合モデルにフィッティングさせ、次いで、抗原－抗体結合についての速度定数を計算した。速度定数を以下の表１に示す。表１における結果は、全てのクローンが正しくクローニングされ、組換えヒトＢ７－Ｈ３タンパク質に結合することができることを示している。
【0099】
【表1】
【0100】
実施例５：ＥＬＩＳＡによって検出された様々な組換えＢ７－Ｈ３タンパク質及び様々なドメインへのキメラ抗体の結合
プレートを組換えヒトＢ７－Ｈ３－ｈｉｓタンパク質（アクセッション番号：ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｑ５ＺＰＲ３、１位アミノ酸～４６１位アミノ酸）、組換えヒトＢ７－Ｈ３ ＩｇＶ１－ＩｇＶ２－ｈｉｓ細胞外ドメインタンパク質（アクセッション番号：ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｑ５ＺＰＲ３、１位アミノ酸～３６２位アミノ酸）、組換えヒトＢ７－Ｈ３ ＩｇＶ１－ＩｇＣ１－ｈｉｓ細胞外ドメインタンパク質（アクセッション番号：ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｑ５ＺＰＲ３、１位アミノ酸～２３８位アミノ酸）、組換えヒトＢ７－Ｈ３ ＩｇＣ２－ｍＦｃ細胞外ドメインタンパク質（アクセッション番号：ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｑ５ＺＰＲ３、３６３位アミノ酸～４５６位アミノ酸）、及び組換えサルＢ７－Ｈ３－ｈｉｓ細胞外ドメインタンパク質（アクセッション番号：ＸＰ－００５５６００５６．１、１位アミノ酸～４６５位アミノ酸）でそれぞれ４℃にて一晩コーティングした。ここで、各タンパク質は１００μｌ中０．２μｇ／ｍｌの濃度を有していた。次いで、プレートを３７℃の恒温インキュベーターにおいて５％のＢＳＡで６０分間ブロッキングし、その後ＰＢＳＴで３回洗浄した。０．５μｇ／ｍｌの濃度を有する１００μｌのｃｈ９Ｂ１１、ｃｈ１０Ｂ４、及びｃｈ１７Ａ３、並びにコントロール抗体のエノブリツズマブ及びアイソタイプコントロール抗体（ＮＣ）のそれぞれを加えた後に、３７℃の恒温インキュベーター内で６０分間反応させた。インキュベートした後に、プレートをＰＢＳＴで４回洗浄し、１：５０００に希釈したＨＲＰ－抗ヒトＦｃ（カタログ：１０９－０３５－０９８、Jackson Immuno Research）をプレートに加えて４５分間反応させた。ＴＭＢ（カタログ：ＭＥ１４２、GalaxyBio、北京）基質を加えて１５分間発色させた後に、２ＭのＨＣｌを加えて反応を停止させた。４５０ｎｍ及び６３０ｎｍ（参照波長として）での吸光度を読み取り、プレート内のウェルのＡ４５０ｎｍ～６３０ｎｍの値を記録した。
プレートを組換えヒトＢ７－Ｈ３－ｈｉｓタンパク質（アクセッション番号：ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｑ５ＺＰＲ３、１位アミノ酸～４６１位アミノ酸）、組換えヒトＢ７－Ｈ３ ＩｇＶ１－ＩｇＶ２－ｈｉｓ細胞外ドメインタンパク質（アクセッション番号：ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｑ５ＺＰＲ３、１位アミノ酸～３６２位アミノ酸）、組換えヒトＢ７－Ｈ３ ＩｇＶ１－ＩｇＣ１－ｈｉｓ細胞外ドメインタンパク質（アクセッション番号：ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｑ５ＺＰＲ３、１位アミノ酸～２３８位アミノ酸）、組換えヒトＢ７－Ｈ３ ＩｇＣ２－ｍＦｃ細胞外ドメインタンパク質（アクセッション番号：ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｑ５ＺＰＲ３、３６３位アミノ酸～４５６位アミノ酸）、及び組換えサルＢ７－Ｈ３－ｈｉｓ細胞外ドメインタンパク質（アクセッション番号：ＸＰ－００５５６００５６．１、１位アミノ酸～４６５位アミノ酸）でそれぞれ４℃にて一晩コーティングした。ここで、各タンパク質は１００μｌ中０．２μｇ／ｍｌの濃度を有していた。次いで、プレートを３７℃の恒温インキュベーターにおいて５％のＢＳＡで６０分間ブロッキングし、その後ＰＢＳＴで３回洗浄した。０．５μｇ／ｍｌの濃度を有する１００μｌのｃｈ９Ｂ１１、ｃｈ１０Ｂ４、及びｃｈ１７Ａ３、並びにコントロール抗体のエノブリツズマブ及びアイソタイプコントロール抗体（ＮＣ）のそれぞれを加えた後に、３７℃の恒温インキュベーター内で６０分間反応させた。インキュベートした後に、プレートをＰＢＳＴで４回洗浄し、１：５０００に希釈したＨＲＰ－抗ヒトＦｃ（カタログ：１０９－０３５－０９８、Jackson Immuno Research）をプレートに加えて４５分間反応させた。ＴＭＢ（カタログ：ＭＥ１４２、GalaxyBio、北京）基質を加えて１５分間発色させた後に、２ＭのＨＣｌを加えて反応を停止させた。４５０ｎｍ及び６３０ｎｍ（参照波長として）での吸光度を読み取り、プレート内のウェルのＡ４５０ｎｍ～６３０ｎｍの値を記録した。
【0101】
ＥＬＩＳＡによって検出されたように、ｃｈ９Ｂ１１、ｃｈ１０Ｂ４、及びｃｈ１７Ａ３、並びにコントロール抗体のエノブリツズマブは全て、組換えヒトＢ７－Ｈ３ドメインタンパク質及び組換えサルＢ７－Ｈ３細胞外ドメインタンパク質に結合した（図２）。これらの抗体の中で、ｃｈ１０Ｂ４のサルＢ７－Ｈ３への結合活性は他の抗体の結合活性よりも明らかに弱かったことから、弱い交差結合活性が示され、Ｂ７Ｈ３－ＩｇＣ２への抗体の結合は全て、他のドメインへのこれらの結合よりも僅かに弱く、ｃｈ９Ｂ１１が最も明らかな抗体であった。
【0102】
実施例６：ＦＡＣＳによって検出された２９３細胞表面上の組換えヒトＢ７－Ｈ３タンパク質への抗ヒトＢ７－Ｈ３キメラ抗体の結合
ヒトＢ７－Ｈ３を一過的に発現する２９３細胞系統の構築：ＨＥＫ２９３細胞を１０ｍｌの容量において１ｍｌ当たり６×１０５個の細胞の密度で振盪フラスコ中に接種し、次いで、３７℃、５％のＣＯ２の振盪インキュベーター内で１３０ｒｐｍにて２４時間振盪培養に供した。全長ヒトＢ７－Ｈ３（アクセッション番号：ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｑ５ＺＰＲ３、１位アミノ酸～５３４位アミノ酸）をコードする発現プラスミド及び２９３ｆｅｃｔｉｎ（カタログ：１２３４７０１９、Gibco）を１：１．２の比率にて０．５ｍＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭ（カタログ：１１０５８０２１、Gibco）培地中でそれぞれ５分間静置させた後に、混合して室温で１５分間放置した。次いで、混合物をＨＥＫ２９３細胞に加えた後に、これらを３７℃、５％のＣＯ２の振盪インキュベーター内で１３０ｒｐｍにて４８時間振盪培養に供した。得られた細胞、すなわち２９３／ｈＢ７－Ｈ３細胞を使用して、以下のようにＦＡＣＳを介して検出を行った。
ヒトＢ７－Ｈ３を一過的に発現する２９３細胞系統の構築：ＨＥＫ２９３細胞を１０ｍｌの容量において１ｍｌ当たり６×１０５個の細胞の密度で振盪フラスコ中に接種し、次いで、３７℃、５％のＣＯ２の振盪インキュベーター内で１３０ｒｐｍにて２４時間振盪培養に供した。全長ヒトＢ７－Ｈ３（アクセッション番号：ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｑ５ＺＰＲ３、１位アミノ酸～５３４位アミノ酸）をコードする発現プラスミド及び２９３ｆｅｃｔｉｎ（カタログ：１２３４７０１９、Gibco）を１：１．２の比率にて０．５ｍＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭ（カタログ：１１０５８０２１、Gibco）培地中でそれぞれ５分間静置させた後に、混合して室温で１５分間放置した。次いで、混合物をＨＥＫ２９３細胞に加えた後に、これらを３７℃、５％のＣＯ２の振盪インキュベーター内で１３０ｒｐｍにて４８時間振盪培養に供した。得られた細胞、すなわち２９３／ｈＢ７－Ｈ３細胞を使用して、以下のようにＦＡＣＳを介して検出を行った。
【0103】
ヒトＢ７－Ｈ３を組換え発現する２９３細胞（２９３／ｈＢ７－Ｈ３細胞）の懸濁液をキメラ抗体（それぞれ１μｇ／ｍｌ、０．１μｇ／ｍｌ、及び０．０１μｇ／ｍｌの濃度でのｃｈ９Ｂ１１、ｃｈ１０Ｂ４、及びｃｈ１７Ａ３）とともに３７℃で３０分間インキュベートした。以下のようなコントロールを準備した：（１）ポジティブコントロール（ＰＣ）：コントロール抗体のエノブリツズマブ、（２）ネガティブコントロール（ＮＣ）：アイソタイプコントロール抗体。細胞をＰＢＳで３回洗浄し、１：２００に希釈したヤギ抗ヒトＩｇＧ－ＦＩＴＣ（カタログ：Ｆ９５１２、Sigma）を細胞に加えた後に、これらを３０分間インキュベートした。次いで、細胞を再度ＰＢＳで３回洗浄し、フローサイトメーター（モデルＢ４９００７ＡＤ、ＳＮＡＷ３１２１１、BECKMAN COULTER）によって細胞の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を測定して、２９３細胞の表面上のヒトＢ７－Ｈ３タンパク質へのキメラ抗体の結合能力を検出した。ＦＡＣＳによって検出されたように、ｃｈ９Ｂ１１、ｃｈ１０Ｂ４、及びｃｈ１７Ａ３は全て、コントロール抗体のエノブリツズマブの結合能力よりも優れた結合能力で２９３細胞の表面上の組換えヒトＢ７－Ｈ３タンパク質に結合することができた（図３）。
【0104】
実施例７：ＦＡＣＳによって検出されたＡ４３１細胞（ヒト皮膚扁平上皮癌細胞）への抗ヒトＢ７－Ｈ３キメラ抗体の結合
ヒトＢ７－Ｈ３を天然に発現するＡ４３１細胞の懸濁液をキメラ抗体（ｃｈ９Ｂ１１、ｃｈ１０Ｂ４、及びｃｈ１７Ａ３；１０μｇ／ｍｌの濃度から３倍勾配で希釈、合計１１通りの濃度）とともに３７℃で３０分間インキュベートした。以下のようなコントロールを準備した：（１）ポジティブコントロール（ＰＣ）：コントロール抗体のエノブリツズマブ、（２）ネガティブコントロール（ＮＣ）：アイソタイプコントロール抗体。細胞をＰＢＳで３回洗浄し、１：２００に希釈したヤギ抗ヒトＩｇＧ－ＦＩＴＣ（カタログ：Ｆ９５１２、Sigma）を細胞に加えた後に、これらを３０分間インキュベートした。次いで、細胞を再度ＰＢＳで３回洗浄し、フローサイトメーター（モデルＢ４９００７ＡＤ、ＳＮＡＷ３１２１１、BECKMAN COULTER）によって細胞の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を測定して、Ａ４３１細胞の表面上のＢ７－Ｈ３タンパク質へのキメラ抗体の結合能力を検出した。ＦＡＣＳによって検出されたように、ｃｈ９Ｂ１１、ｃｈ１０Ｂ４、及びｃｈ１７Ａ３は全て、コントロール抗体のエノブリツズマブの結合能力よりも優れた結合能力でＡ４３１細胞の表面上のＢ７－Ｈ３タンパク質に結合することができた。抗体のそれぞれの半数効果結合濃度（ＥＣ５０）値を表２に示し、結合を図４に示す。
ヒトＢ７－Ｈ３を天然に発現するＡ４３１細胞の懸濁液をキメラ抗体（ｃｈ９Ｂ１１、ｃｈ１０Ｂ４、及びｃｈ１７Ａ３；１０μｇ／ｍｌの濃度から３倍勾配で希釈、合計１１通りの濃度）とともに３７℃で３０分間インキュベートした。以下のようなコントロールを準備した：（１）ポジティブコントロール（ＰＣ）：コントロール抗体のエノブリツズマブ、（２）ネガティブコントロール（ＮＣ）：アイソタイプコントロール抗体。細胞をＰＢＳで３回洗浄し、１：２００に希釈したヤギ抗ヒトＩｇＧ－ＦＩＴＣ（カタログ：Ｆ９５１２、Sigma）を細胞に加えた後に、これらを３０分間インキュベートした。次いで、細胞を再度ＰＢＳで３回洗浄し、フローサイトメーター（モデルＢ４９００７ＡＤ、ＳＮＡＷ３１２１１、BECKMAN COULTER）によって細胞の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を測定して、Ａ４３１細胞の表面上のＢ７－Ｈ３タンパク質へのキメラ抗体の結合能力を検出した。ＦＡＣＳによって検出されたように、ｃｈ９Ｂ１１、ｃｈ１０Ｂ４、及びｃｈ１７Ａ３は全て、コントロール抗体のエノブリツズマブの結合能力よりも優れた結合能力でＡ４３１細胞の表面上のＢ７－Ｈ３タンパク質に結合することができた。抗体のそれぞれの半数効果結合濃度（ＥＣ５０）値を表２に示し、結合を図４に示す。
【0105】
【表2】
【0106】
実施例８：抗ヒトＢ７－Ｈ３モノクローナル抗体のヒト化及び突然変異設計
８．１ マウスモノクローナル抗体９Ｂ１１のヒト化
（１）ＣＤＲグラフティング
最初に、マウス抗体の重鎖配列を網羅的に解析し、抗原－抗体結合を担う相補性決定領域（ＣＤＲ）及び抗体の保存された三次元立体構造を支えるフレームワーク領域を決定した。引き続き、相同性アラインメントの結果に従って、最も類似したヒトテンプレートＶＨ１（１－０３）を基本テンプレートとして選択し、全配列ＢＬＡＳＴの結果と組み合わせてＣＤＲグラフティングを実施し、ＣＤＲグラフティングのために、ＣＤＲ３の配列（ＳＴＴＴＡＴＦＹＷＹＦＤＶ；配列番号４２）に基づいてＪ領域配列としてＪＨ６（ｗｇｑｇｔＴｖｔｖｓｓ）を選択し、次いで、９Ｂ１１の重鎖可変領域（ＶＨ）のフレームワーク領域においてヒト化を達成した。同様にして、最も類似したヒトテンプレートＶＫ ＩＩＩ（Ａ２７）及びＶＫ ＶＩ（Ａ２６）を基本テンプレートとして選択し、全配列ＢＬＡＳＴの結果と組み合わせてＣＤＲグラフティングを実施し、ＣＤＲグラフティングのために、ＣＤＲ３の配列（ＱＱＳＨＳＷＰＹＴ；配列番号４５）に基づいてＪＫ領域配列としてＪＫ２（ＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ）を選択し、次いで、軽鎖のフレームワーク領域においてヒト化を達成した。抗体９Ｂ１１からグラフトされたＣＤＲを有するヒト化重鎖可変領域ｈｚ９Ｂ１１＿ＶＨ１のアミノ酸配列は配列番号１１に示される通りであり、抗体９Ｂ１１からグラフトされたＣＤＲを有するヒト化軽鎖可変領域ｈｚ９Ｂ１１＿ＶＬ１のアミノ酸配列は配列番号１２に示される通りであり、抗体９Ｂ１１からグラフトされたＣＤＲを有するヒト化軽鎖可変領域ｈｚ９Ｂ１１＿ＶＬ２のアミノ酸配列は配列番号１３に示される通りである。
８．１ マウスモノクローナル抗体９Ｂ１１のヒト化
（１）ＣＤＲグラフティング
最初に、マウス抗体の重鎖配列を網羅的に解析し、抗原－抗体結合を担う相補性決定領域（ＣＤＲ）及び抗体の保存された三次元立体構造を支えるフレームワーク領域を決定した。引き続き、相同性アラインメントの結果に従って、最も類似したヒトテンプレートＶＨ１（１－０３）を基本テンプレートとして選択し、全配列ＢＬＡＳＴの結果と組み合わせてＣＤＲグラフティングを実施し、ＣＤＲグラフティングのために、ＣＤＲ３の配列（ＳＴＴＴＡＴＦＹＷＹＦＤＶ；配列番号４２）に基づいてＪ領域配列としてＪＨ６（ｗｇｑｇｔＴｖｔｖｓｓ）を選択し、次いで、９Ｂ１１の重鎖可変領域（ＶＨ）のフレームワーク領域においてヒト化を達成した。同様にして、最も類似したヒトテンプレートＶＫ ＩＩＩ（Ａ２７）及びＶＫ ＶＩ（Ａ２６）を基本テンプレートとして選択し、全配列ＢＬＡＳＴの結果と組み合わせてＣＤＲグラフティングを実施し、ＣＤＲグラフティングのために、ＣＤＲ３の配列（ＱＱＳＨＳＷＰＹＴ；配列番号４５）に基づいてＪＫ領域配列としてＪＫ２（ＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ）を選択し、次いで、軽鎖のフレームワーク領域においてヒト化を達成した。抗体９Ｂ１１からグラフトされたＣＤＲを有するヒト化重鎖可変領域ｈｚ９Ｂ１１＿ＶＨ１のアミノ酸配列は配列番号１１に示される通りであり、抗体９Ｂ１１からグラフトされたＣＤＲを有するヒト化軽鎖可変領域ｈｚ９Ｂ１１＿ＶＬ１のアミノ酸配列は配列番号１２に示される通りであり、抗体９Ｂ１１からグラフトされたＣＤＲを有するヒト化軽鎖可変領域ｈｚ９Ｂ１１＿ＶＬ２のアミノ酸配列は配列番号１３に示される通りである。
【0107】
（２）ＣＤＲにおける突然変異設計
マウス抗体９Ｂ１１の配列特質に従って、グラフトされたＣＤＲを有するヒト化重鎖可変領域及びヒト化軽鎖可変領域の配列における突然変異を設計し、突然変異部位を以下の表３に示す。
マウス抗体９Ｂ１１の配列特質に従って、グラフトされたＣＤＲを有するヒト化重鎖可変領域及びヒト化軽鎖可変領域の配列における突然変異を設計し、突然変異部位を以下の表３に示す。
【0108】
【表3】
【0109】
８．２ マウスモノクローナル抗体１０Ｂ４のヒト化
（１）ＣＤＲグラフティング
最初に、マウス抗体の重鎖配列を網羅的に解析し、抗原－抗体結合を担う相補性決定領域（ＣＤＲ）及び抗体の保存された三次元立体構造を支えるフレームワーク領域を決定した。引き続き、相同性アラインメントの結果に従って、ＶＨ１（１－０３）を基本テンプレートとして選択し、全配列ＢＬＡＳＴの結果と組み合わせてＣＤＲグラフティングを実施し、ＣＤＲグラフティングのために、ＣＤＲ３の配列（ＫＧＫＤＹＦＤＷＹＦＤＶ；配列番号４８）に基づいてＪ領域配列としてＪＨ６（ＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ）を選択し、次いで、１０Ｂ４の重鎖可変領域（ＶＨ）のフレームワーク領域においてヒト化を達成した。相同性アラインメントの結果に従って、最も類似したヒトテンプレートＶＫ Ｉ（Ｏ１２）を基本テンプレートとして選択し、全配列ＢＬＡＳＴの結果と組み合わせてＣＤＲグラフティングを実施し、ＣＤＲグラフティングのために、ＣＤＲ３の配列（ＱＱＷＳＳＮＰＬＴ；配列番号５１）に基づいてＪＫ領域配列としてＪＫ４（ＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ）を選択し、次いで、軽鎖のフレームワーク領域においてヒト化を達成した。抗体１０Ｂ４からグラフトされたＣＤＲを有するヒト化重鎖可変領域ｈｚ１０Ｂ４＿ＶＨ１のアミノ酸配列は配列番号１８に示される通りであり、抗体１０Ｂ４からグラフトされたＣＤＲを有する軽鎖可変領域ｈｚ１０Ｂ４＿ＶＬ１のアミノ酸配列は配列番号１９に示される通りである。
（１）ＣＤＲグラフティング
最初に、マウス抗体の重鎖配列を網羅的に解析し、抗原－抗体結合を担う相補性決定領域（ＣＤＲ）及び抗体の保存された三次元立体構造を支えるフレームワーク領域を決定した。引き続き、相同性アラインメントの結果に従って、ＶＨ１（１－０３）を基本テンプレートとして選択し、全配列ＢＬＡＳＴの結果と組み合わせてＣＤＲグラフティングを実施し、ＣＤＲグラフティングのために、ＣＤＲ３の配列（ＫＧＫＤＹＦＤＷＹＦＤＶ；配列番号４８）に基づいてＪ領域配列としてＪＨ６（ＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ）を選択し、次いで、１０Ｂ４の重鎖可変領域（ＶＨ）のフレームワーク領域においてヒト化を達成した。相同性アラインメントの結果に従って、最も類似したヒトテンプレートＶＫ Ｉ（Ｏ１２）を基本テンプレートとして選択し、全配列ＢＬＡＳＴの結果と組み合わせてＣＤＲグラフティングを実施し、ＣＤＲグラフティングのために、ＣＤＲ３の配列（ＱＱＷＳＳＮＰＬＴ；配列番号５１）に基づいてＪＫ領域配列としてＪＫ４（ＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ）を選択し、次いで、軽鎖のフレームワーク領域においてヒト化を達成した。抗体１０Ｂ４からグラフトされたＣＤＲを有するヒト化重鎖可変領域ｈｚ１０Ｂ４＿ＶＨ１のアミノ酸配列は配列番号１８に示される通りであり、抗体１０Ｂ４からグラフトされたＣＤＲを有する軽鎖可変領域ｈｚ１０Ｂ４＿ＶＬ１のアミノ酸配列は配列番号１９に示される通りである。
【0110】
（２）ＣＤＲにおける突然変異設計
マウス抗体１０Ｂ４の配列特質に従って、グラフトされたＣＤＲを有するヒト化重鎖可変領域及びヒト化軽鎖可変領域の配列における突然変異を設計し、突然変異部位を以下の表４に示す。
マウス抗体１０Ｂ４の配列特質に従って、グラフトされたＣＤＲを有するヒト化重鎖可変領域及びヒト化軽鎖可変領域の配列における突然変異を設計し、突然変異部位を以下の表４に示す。
【0111】
【表4】
【0112】
８．３ マウスモノクローナル抗体１７Ａ３のヒト化
（１）ＣＤＲグラフティング
最初に、マウス抗体の重鎖配列を網羅的に解析し、抗原－抗体結合を担う相補性決定領域（ＣＤＲ）及び抗体の保存された三次元立体構造を支えるフレームワーク領域を決定した。引き続き、相同性アラインメントの結果に従って、最も類似したヒトテンプレートＶＨ１（１－０２）を基本テンプレートとして選択し、全配列ＢＬＡＳＴの結果と組み合わせてＣＤＲグラフティングを実施し、ＣＤＲグラフティングのために、ＣＤＲ３の配列（ＧＩＴＡＶＶＧＴＲＹＹＡＭＤＹ）に基づいてＪ領域配列としてＪＨ４（ＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ）を選択し、次いで、１７Ａ３の重鎖可変領域（ＶＨ）のフレームワーク領域においてヒト化を達成した。相同性アラインメントの結果に従って、ＶＫ ＩＩＩ（Ａ２７）及びＶＫ ＶＩ（Ａ２６）を基本テンプレートとして選択し、全配列ＢＬＡＳＴの結果と組み合わせてＣＤＲグラフティングを実施し、ＣＤＲグラフティングのために、ＣＤＲ３の配列（ＱＱＳＹＳＷＰＬＴ）に基づいてＪＫ領域配列としてＪＫ４（ＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ）を選択し、次いで、軽鎖のフレームワーク領域においてヒト化を達成した。抗体１７Ａ３からグラフトされたＣＤＲを有するヒト化重鎖可変領域ｈｚ１７Ａ３＿ＶＨ１のアミノ酸配列は配列番号２４に示される通りであり、抗体１７Ａ３からグラフトされたＣＤＲを有する軽鎖可変領域ｈｚ１７Ａ３＿ＶＬ１のアミノ酸配列は配列番号２５に示される通りであり、抗体１７Ａ３からグラフトされたＣＤＲを有する軽鎖可変領域ｈｚ１７Ａ３＿ＶＬ２のアミノ酸配列は配列番号２６に示される通りである。
（１）ＣＤＲグラフティング
最初に、マウス抗体の重鎖配列を網羅的に解析し、抗原－抗体結合を担う相補性決定領域（ＣＤＲ）及び抗体の保存された三次元立体構造を支えるフレームワーク領域を決定した。引き続き、相同性アラインメントの結果に従って、最も類似したヒトテンプレートＶＨ１（１－０２）を基本テンプレートとして選択し、全配列ＢＬＡＳＴの結果と組み合わせてＣＤＲグラフティングを実施し、ＣＤＲグラフティングのために、ＣＤＲ３の配列（ＧＩＴＡＶＶＧＴＲＹＹＡＭＤＹ）に基づいてＪ領域配列としてＪＨ４（ＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ）を選択し、次いで、１７Ａ３の重鎖可変領域（ＶＨ）のフレームワーク領域においてヒト化を達成した。相同性アラインメントの結果に従って、ＶＫ ＩＩＩ（Ａ２７）及びＶＫ ＶＩ（Ａ２６）を基本テンプレートとして選択し、全配列ＢＬＡＳＴの結果と組み合わせてＣＤＲグラフティングを実施し、ＣＤＲグラフティングのために、ＣＤＲ３の配列（ＱＱＳＹＳＷＰＬＴ）に基づいてＪＫ領域配列としてＪＫ４（ＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ）を選択し、次いで、軽鎖のフレームワーク領域においてヒト化を達成した。抗体１７Ａ３からグラフトされたＣＤＲを有するヒト化重鎖可変領域ｈｚ１７Ａ３＿ＶＨ１のアミノ酸配列は配列番号２４に示される通りであり、抗体１７Ａ３からグラフトされたＣＤＲを有する軽鎖可変領域ｈｚ１７Ａ３＿ＶＬ１のアミノ酸配列は配列番号２５に示される通りであり、抗体１７Ａ３からグラフトされたＣＤＲを有する軽鎖可変領域ｈｚ１７Ａ３＿ＶＬ２のアミノ酸配列は配列番号２６に示される通りである。
【0113】
（２）ＣＤＲにおける突然変異設計
マウス抗体１７Ａ３の配列特質に従って、グラフトされたＣＤＲを有するヒト化重鎖可変領域及びヒト化軽鎖可変領域の配列における突然変異を設計し、突然変異部位を以下の表５に示す。
マウス抗体１７Ａ３の配列特質に従って、グラフトされたＣＤＲを有するヒト化重鎖可変領域及びヒト化軽鎖可変領域の配列における突然変異を設計し、突然変異部位を以下の表５に示す。
【0114】
【表5】
【0115】
実施例９：抗ヒトＢ７－Ｈ３ヒト化モノクローナル抗体の組換え発現
抗体の９Ｂ１１、１０Ｂ４、及び１７Ａ３に基づくヒト化設計によって得られた軽鎖可変領域及び重鎖可変領域の配列（ｈｚ９Ｂ１１＿ＶＬ１、ｈｚ９Ｂ１１＿ＶＬ２、ｈｚ９Ｂ１１＿ＶＨ１、ｈｚ１０Ｂ４＿ＶＬ１、ｈｚ１０Ｂ４＿ＶＨ１、ｈｚ１７Ａ３＿ＶＬ１、ｈｚ１７Ａ３＿ＶＬ２、及びｈｚ１７Ａ３＿ＶＨ１）を完全に合成した。ヒト化重鎖可変領域を、酵素消化によりヒトＩｇＧ１の重鎖定常領域をコードする遺伝子の上流で真核生物一過性発現ベクターｐＫＮ０４１にクローニングし（重鎖定常領域のアミノ酸配列は配列番号３８に示される通りである）、ヒト化軽鎖可変領域を、酵素消化によりヒトＣκ軽鎖をコードする遺伝子の上流で真核生物一過性発現ベクターｐＫＮ０１９にクローニングし（軽鎖定常領域のアミノ酸配列は配列番号３９に示される通りである）、それにより抗体の９Ｂ１１、１０Ｂ４、及び１７Ａ３に基づくヒト化軽鎖及びヒト化重鎖を発現するプラスミドを構築した。突然変異設計に従って、ヒト化軽鎖及びヒト化重鎖をそれぞれ発現するプラスミドにおいて、ＳｔａｒＭｕｔ遺伝子部位特異的突然変異誘発キット（カタログ：Ｔ１１１－０１、GenStar）を使用して部位特異的突然変異誘発を実施した。突然変異されたプラスミドをＥ．コリ細胞へと形質転換して増幅させ、抗体の９Ｂ１１、１０Ｂ４、及び１７Ａ３に基づいてヒト化及び突然変異された軽鎖及び重鎖を発現するプラスミドを得た。抗体の９Ｂ１１、１０Ｂ４、及び１７Ａ３に基づく様々なヒト化軽鎖及びヒト化重鎖を含む全てのプラスミドを、表６～表８に示されるように組み合わせ、２９３ｆｅｃｔｉｎ（カタログ：１２３４７０１９、Gibco）トランスフェクション試薬を使用して、組換え発現に関する製造業者の使用説明書に従って、ＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクションした。細胞トランスフェクションから５日～６日後に、ＰｒｏＡアフィニティークロマトグラフィーカラムを通して培養上清を精製して、様々なヒト化抗体を得た。抗体の親和性を、抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ捕捉（ＡＨＣ）バイオセンサーにより抗体のＦｃフラグメントを捕捉することを含むアッセイによってFortebio製のＯｃｔｅｔ ＱＫｅシステム機器を使用して決定した。アッセイのために、抗体の９Ｂ１１、１０Ｂ４、及び１７Ａ３に基づくヒト化抗体及びキメラ抗体のそれぞれをＰＢＳ中で４μｇ／ｍｌに希釈し、ＡＨＣバイオセンサー（カタログ：１８－００１５、PALL）の表面に３００秒間流過させた。組換えヒトＢ７－Ｈ３－ｈｉｓタンパク質（アクセッション番号：ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｑ５ＺＰＲ３、１位アミノ酸～４６１位アミノ酸）を移動相として使用し、その濃度は６０ｎＭであった。会合時間は１００秒であり、解離時間は３００秒であった。アッセイが完了したら、ブランクコントロールの応答値を差し引いたデータを、ソフトウェアを使用して１：１ラングミュア結合モデルにフィッティングさせた後に、抗原－抗体結合についての速度定数を計算した。抗体の９Ｂ１１、１０Ｂ４、及び１７Ａ３に基づくヒト化抗体及び突然変異抗体の軽鎖及び重鎖の組合せ並びに親和性定数ＫＤ値をそれぞれ表６～表８に示す。
抗体の９Ｂ１１、１０Ｂ４、及び１７Ａ３に基づくヒト化設計によって得られた軽鎖可変領域及び重鎖可変領域の配列（ｈｚ９Ｂ１１＿ＶＬ１、ｈｚ９Ｂ１１＿ＶＬ２、ｈｚ９Ｂ１１＿ＶＨ１、ｈｚ１０Ｂ４＿ＶＬ１、ｈｚ１０Ｂ４＿ＶＨ１、ｈｚ１７Ａ３＿ＶＬ１、ｈｚ１７Ａ３＿ＶＬ２、及びｈｚ１７Ａ３＿ＶＨ１）を完全に合成した。ヒト化重鎖可変領域を、酵素消化によりヒトＩｇＧ１の重鎖定常領域をコードする遺伝子の上流で真核生物一過性発現ベクターｐＫＮ０４１にクローニングし（重鎖定常領域のアミノ酸配列は配列番号３８に示される通りである）、ヒト化軽鎖可変領域を、酵素消化によりヒトＣκ軽鎖をコードする遺伝子の上流で真核生物一過性発現ベクターｐＫＮ０１９にクローニングし（軽鎖定常領域のアミノ酸配列は配列番号３９に示される通りである）、それにより抗体の９Ｂ１１、１０Ｂ４、及び１７Ａ３に基づくヒト化軽鎖及びヒト化重鎖を発現するプラスミドを構築した。突然変異設計に従って、ヒト化軽鎖及びヒト化重鎖をそれぞれ発現するプラスミドにおいて、ＳｔａｒＭｕｔ遺伝子部位特異的突然変異誘発キット（カタログ：Ｔ１１１－０１、GenStar）を使用して部位特異的突然変異誘発を実施した。突然変異されたプラスミドをＥ．コリ細胞へと形質転換して増幅させ、抗体の９Ｂ１１、１０Ｂ４、及び１７Ａ３に基づいてヒト化及び突然変異された軽鎖及び重鎖を発現するプラスミドを得た。抗体の９Ｂ１１、１０Ｂ４、及び１７Ａ３に基づく様々なヒト化軽鎖及びヒト化重鎖を含む全てのプラスミドを、表６～表８に示されるように組み合わせ、２９３ｆｅｃｔｉｎ（カタログ：１２３４７０１９、Gibco）トランスフェクション試薬を使用して、組換え発現に関する製造業者の使用説明書に従って、ＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクションした。細胞トランスフェクションから５日～６日後に、ＰｒｏＡアフィニティークロマトグラフィーカラムを通して培養上清を精製して、様々なヒト化抗体を得た。抗体の親和性を、抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ捕捉（ＡＨＣ）バイオセンサーにより抗体のＦｃフラグメントを捕捉することを含むアッセイによってFortebio製のＯｃｔｅｔ ＱＫｅシステム機器を使用して決定した。アッセイのために、抗体の９Ｂ１１、１０Ｂ４、及び１７Ａ３に基づくヒト化抗体及びキメラ抗体のそれぞれをＰＢＳ中で４μｇ／ｍｌに希釈し、ＡＨＣバイオセンサー（カタログ：１８－００１５、PALL）の表面に３００秒間流過させた。組換えヒトＢ７－Ｈ３－ｈｉｓタンパク質（アクセッション番号：ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｑ５ＺＰＲ３、１位アミノ酸～４６１位アミノ酸）を移動相として使用し、その濃度は６０ｎＭであった。会合時間は１００秒であり、解離時間は３００秒であった。アッセイが完了したら、ブランクコントロールの応答値を差し引いたデータを、ソフトウェアを使用して１：１ラングミュア結合モデルにフィッティングさせた後に、抗原－抗体結合についての速度定数を計算した。抗体の９Ｂ１１、１０Ｂ４、及び１７Ａ３に基づくヒト化抗体及び突然変異抗体の軽鎖及び重鎖の組合せ並びに親和性定数ＫＤ値をそれぞれ表６～表８に示す。
【0116】
これらの突然変異抗体の親和性の検出結果により、異なる部位での突然変異により抗体の親和性が大きく変化することが明らかになった。抗体の中で、１．５５×１０－１０Ｍの親和性（ＫＤ）を示す抗体ｈｚ９Ｂ１１－６を選択し、「ｈｚ９Ｂ１１」と命名し、１．６１×１０－１０Ｍの親和性（ＫＤ）を示す抗体ｈｚ１０Ｂ４－７を選択し、「ｈｚ１０Ｂ４」と命名し、３．０１×１０－１０Ｍの親和性（ＫＤ）を示す抗体ｈｚ１７Ａ３－１４を選択し、「ｈｚ１７Ａ３」と命名し、これら３つの抗体を選択して、その後の研究において機能的検証を行った。
【0117】
【表6】
【0118】
【表7】
【0119】
【表8】
【0120】
実施例１０：ＥＬＩＳＡによって検出されたＢ７－Ｈ３への抗Ｂ７－Ｈ３ヒト化抗体の結合に対する種特異性研究
プレートを組換えヒトＢ７－Ｈ３－ｈｉｓ細胞外ドメインタンパク質（アクセッション番号：ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｑ５ＺＰＲ３、１位アミノ酸～４６１位アミノ酸）、組換えカニクイザルＢ７－Ｈ３－ｈｉｓタンパク質（カタログ：９０８０６－Ｃ０８Ｈ、Beijing Yiqiao Shenzhou Science and Technology Co., Ltd.）、及び組換えマウスＢ７－Ｈ３－ｈｉｓタンパク質（カタログ：ＣＭ８３、Beijing Yiqiao Shenzhou Science and Technology Co., Ltd.）でそれぞれ４℃にて一晩コーティングした。ここで、各タンパク質は１μｇ／ｍｌのコーティング濃度を有していた。ＰＢＳで３回洗浄し、プレートを５％のＢＳＡ ＰＢＳの添加により３７℃で６０分間ブロッキングし、次いでＰＢＳＴで３回洗浄した。ｈｚ１０Ｂ４（１０μｇ／ｍｌの出発濃度から３倍勾配で希釈、合計１２通りの濃度）、ｈｚ１７Ａ３（３μｇ／ｍｌの出発濃度から３倍勾配で希釈、合計１２通りの濃度）、ｈｚ９Ｂ１１（１０μｇ／ｍｌの出発濃度から３倍勾配で希釈、合計１２通りの濃度）、エノブリツズマブ（１０μｇ／ｍｌの出発濃度から３倍勾配で希釈、合計１２通りの濃度）、及びＭＧＣ－０１８（１０μｇ／ｍｌの出発濃度から３倍勾配で希釈、合計１２通りの濃度）の様々な希釈物をプレートに加えた。プレートを３７℃で６０分間インキュベートした後に、ＰＢＳＴで４回洗浄した。１：５０００に希釈したＨＲＰ－抗ヒトＦｃ（カタログ：１０９－０３５－０９８、Jackson Immuno Research）をプレートに加えて、３７℃で３０分間インキュベートした。その後、プレートをＰＢＳＴで４回洗浄し、ＴＭＢ基質を加えて発色させた。３７℃で１０分間インキュベートした後に、２ＭのＨＣｌを加えて反応を停止させ、４５０ｎｍ及び６３０ｎｍ（参照波長として）での吸光度を読み取り、プレート内のウェルのＡ４５０ｎｍ～６３０ｎｍの値を記録した。
プレートを組換えヒトＢ７－Ｈ３－ｈｉｓ細胞外ドメインタンパク質（アクセッション番号：ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｑ５ＺＰＲ３、１位アミノ酸～４６１位アミノ酸）、組換えカニクイザルＢ７－Ｈ３－ｈｉｓタンパク質（カタログ：９０８０６－Ｃ０８Ｈ、Beijing Yiqiao Shenzhou Science and Technology Co., Ltd.）、及び組換えマウスＢ７－Ｈ３－ｈｉｓタンパク質（カタログ：ＣＭ８３、Beijing Yiqiao Shenzhou Science and Technology Co., Ltd.）でそれぞれ４℃にて一晩コーティングした。ここで、各タンパク質は１μｇ／ｍｌのコーティング濃度を有していた。ＰＢＳで３回洗浄し、プレートを５％のＢＳＡ ＰＢＳの添加により３７℃で６０分間ブロッキングし、次いでＰＢＳＴで３回洗浄した。ｈｚ１０Ｂ４（１０μｇ／ｍｌの出発濃度から３倍勾配で希釈、合計１２通りの濃度）、ｈｚ１７Ａ３（３μｇ／ｍｌの出発濃度から３倍勾配で希釈、合計１２通りの濃度）、ｈｚ９Ｂ１１（１０μｇ／ｍｌの出発濃度から３倍勾配で希釈、合計１２通りの濃度）、エノブリツズマブ（１０μｇ／ｍｌの出発濃度から３倍勾配で希釈、合計１２通りの濃度）、及びＭＧＣ－０１８（１０μｇ／ｍｌの出発濃度から３倍勾配で希釈、合計１２通りの濃度）の様々な希釈物をプレートに加えた。プレートを３７℃で６０分間インキュベートした後に、ＰＢＳＴで４回洗浄した。１：５０００に希釈したＨＲＰ－抗ヒトＦｃ（カタログ：１０９－０３５－０９８、Jackson Immuno Research）をプレートに加えて、３７℃で３０分間インキュベートした。その後、プレートをＰＢＳＴで４回洗浄し、ＴＭＢ基質を加えて発色させた。３７℃で１０分間インキュベートした後に、２ＭのＨＣｌを加えて反応を停止させ、４５０ｎｍ及び６３０ｎｍ（参照波長として）での吸光度を読み取り、プレート内のウェルのＡ４５０ｎｍ～６３０ｎｍの値を記録した。
【0121】
これらの実験結果により、ｈｚ１０Ｂ４、ｈｚ１７Ａ３、及びｈｚ９Ｂ１１、並びにコントロール抗体のエノブリツズマブは全て、組換えヒトＢ７Ｈ３及びカニクイザルＢ７Ｈ３に特異的に結合することができたが、組換えマウスＢ７Ｈ３には結合活性を有しないことが明らかになった（図５、図６、及び図７）。抗体のそれぞれの半数効果結合濃度（ＥＣ５０）値を表９に示す。
【0122】
【表9】
【0123】
実施例１１：抗Ｂ７－Ｈ３ヒト化抗体の親和性の分析
抗体の親和性を、抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ捕捉（ＡＨＣ）バイオセンサーにより抗体のＦｃフラグメントを捕捉することを含むアッセイによってFortebio製のＯｃｔｅｔ ＱＫｅシステム機器を使用して決定した。アッセイのために、抗体（ｈｚ１０Ｂ４、ｈｚ１７Ａ３、及びｈｚ９Ｂ１１、並びにコントロール抗体のＭＧＣ－０１８及びエノブリツズマブ）のそれぞれをＰＢＳ中で４μｇ／ｍｌに希釈し、ＡＨＣバイオセンサー（カタログ：１８－００１５、PALL）の表面に１２０秒間流過させた。組換えヒトＢ７－Ｈ３－ｈｉｓ細胞外ドメインタンパク質（アクセッション番号：ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｑ５ＺＰＲ３、１位アミノ酸～４６１位アミノ酸）を移動相として使用した。会合時間は３００秒であり、解離時間は３００秒であった。アッセイが完了したら、ブランクコントロールの応答値を差し引いたデータを、ソフトウェアを使用して１：１ラングミュア結合モデルにフィッティングさせ、次いで、抗原－抗体結合についての速度定数を計算した。
抗体の親和性を、抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ捕捉（ＡＨＣ）バイオセンサーにより抗体のＦｃフラグメントを捕捉することを含むアッセイによってFortebio製のＯｃｔｅｔ ＱＫｅシステム機器を使用して決定した。アッセイのために、抗体（ｈｚ１０Ｂ４、ｈｚ１７Ａ３、及びｈｚ９Ｂ１１、並びにコントロール抗体のＭＧＣ－０１８及びエノブリツズマブ）のそれぞれをＰＢＳ中で４μｇ／ｍｌに希釈し、ＡＨＣバイオセンサー（カタログ：１８－００１５、PALL）の表面に１２０秒間流過させた。組換えヒトＢ７－Ｈ３－ｈｉｓ細胞外ドメインタンパク質（アクセッション番号：ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｑ５ＺＰＲ３、１位アミノ酸～４６１位アミノ酸）を移動相として使用した。会合時間は３００秒であり、解離時間は３００秒であった。アッセイが完了したら、ブランクコントロールの応答値を差し引いたデータを、ソフトウェアを使用して１：１ラングミュア結合モデルにフィッティングさせ、次いで、抗原－抗体結合についての速度定数を計算した。
【0124】
ｈｚ１０Ｂ４、ｈｚ１７Ａ３、ｈｚ９Ｂ１１、及びコントロール抗体のＭＧＣ－０１８、エノブリツズマブと、組換えヒトＢ７－Ｈ３タンパク質との反応曲線を図８Ａ－Ｅに示す。曲線をフィッティングし、親和性を計算した：ｈｚ１０Ｂ４の親和性（ＫＤ）は１．４２×１０－１０Ｍであり、ｈｚ１７Ａ３の親和性（ＫＤ）は１．７７×１０－１０Ｍであり、ｈｚ９Ｂ１１の親和性（ＫＤ）は２．１９×１０－１０Ｍであり、ＭＧＣ－０１８の親和性（ＫＤ）は５．９７×１０－１０Ｍであり、エノブリツズマブの親和性（ＫＤ）は９．５０×１０－１０Ｍであった。詳細な動態パラメーターを以下の表１０に示す。これらの結果により、ｈｚ１０Ｂ４、ｈｚ１７Ａ３、及びｈｚ９Ｂ１１がヒトＢ７－Ｈ３に対して高い親和性を有し、コントロール抗体の親和性よりも優れていることが明らかになった。
【0125】
【表10】
【0126】
実施例１２：ＦＡＣＳによって検出されたヒトＢ７－Ｈ３を天然に発現する細胞への抗Ｂ７－Ｈ３ヒト化抗体の結合
ヒトＢ７－Ｈ３を天然に発現するヒト卵巣癌細胞（ＳＫＶＯ３細胞）の懸濁液をヒト化抗体（ｈｚ９Ｂ１１、ｈｚ１０Ｂ４、及びｈｚ１７Ａ３；１０μｇ／ｍｌの濃度から３倍勾配で希釈、合計１０通りの濃度）とともに３７℃で３０分間インキュベートした。以下のようなコントロールを準備した：（１）ポジティブコントロール（ＰＣ）：コントロール抗体のエノブリツズマブ及びＭＧＣ－０１８、（２）ネガティブコントロール（ＮＣ）：アイソタイプコントロール抗体。細胞をＰＢＳで３回洗浄し、１：２００に希釈したヤギ抗ヒトＩｇＧ－ＦＩＴＣ（カタログ：Ｆ９５１２、Sigma）を細胞に加えた後に、これらを３０分間インキュベートした。次いで、細胞を再度ＰＢＳで３回洗浄し、フローサイトメーター（モデルＢ４９００７ＡＤ、ＳＮＡＷ３１２１１、BECKMAN COULTER）によって細胞の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を測定して、ＳＫＶＯ３細胞の表面上のＢ７－Ｈ３タンパク質へのヒト化抗体の結合能力を検出した。ＦＡＣＳによって検出されたように、ヒト化抗体のｈｚ９Ｂ１１、ｈｚ１０Ｂ４、及びｈｚ１７Ａ３は全て、コントロール抗体のエノブリツズマブの結合能力よりも優れた結合能力でＳＫＶＯ３細胞の表面上のＢ７－Ｈ３タンパク質に結合することができた。抗体のそれぞれの半数効果結合濃度（ＥＣ５０）値を表１１に示し、結合を図９に示す。
ヒトＢ７－Ｈ３を天然に発現するヒト卵巣癌細胞（ＳＫＶＯ３細胞）の懸濁液をヒト化抗体（ｈｚ９Ｂ１１、ｈｚ１０Ｂ４、及びｈｚ１７Ａ３；１０μｇ／ｍｌの濃度から３倍勾配で希釈、合計１０通りの濃度）とともに３７℃で３０分間インキュベートした。以下のようなコントロールを準備した：（１）ポジティブコントロール（ＰＣ）：コントロール抗体のエノブリツズマブ及びＭＧＣ－０１８、（２）ネガティブコントロール（ＮＣ）：アイソタイプコントロール抗体。細胞をＰＢＳで３回洗浄し、１：２００に希釈したヤギ抗ヒトＩｇＧ－ＦＩＴＣ（カタログ：Ｆ９５１２、Sigma）を細胞に加えた後に、これらを３０分間インキュベートした。次いで、細胞を再度ＰＢＳで３回洗浄し、フローサイトメーター（モデルＢ４９００７ＡＤ、ＳＮＡＷ３１２１１、BECKMAN COULTER）によって細胞の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を測定して、ＳＫＶＯ３細胞の表面上のＢ７－Ｈ３タンパク質へのヒト化抗体の結合能力を検出した。ＦＡＣＳによって検出されたように、ヒト化抗体のｈｚ９Ｂ１１、ｈｚ１０Ｂ４、及びｈｚ１７Ａ３は全て、コントロール抗体のエノブリツズマブの結合能力よりも優れた結合能力でＳＫＶＯ３細胞の表面上のＢ７－Ｈ３タンパク質に結合することができた。抗体のそれぞれの半数効果結合濃度（ＥＣ５０）値を表１１に示し、結合を図９に示す。
【0127】
【表11】
【0128】
実施例１３：細胞の表面上のＢ７－Ｈ３に結合する抗ヒトＢ７－Ｈ３ヒト化抗体の細胞内移行活性
ヒトＢ７－Ｈ３を天然に発現するＭＢＡ－ＭＢ－４６８ヒト乳癌細胞を１ウェル当たり３×１０３個の細胞の密度で９６ウェルの細胞培養プレートに接種し、２４時間培養した。細胞をＰＢＳで１回洗浄し、上清を廃棄した。ヒト化抗体のｈｚ９Ｂ１１、ｈｚ１０Ｂ４、及びｈｚ１７Ａ３、並びにポジティブコントロールのエノブリツズマブ及びネガティブコントロール（アイソタイプコントロール抗体）をＲＰＭＩ １６４０（１０％のＦＢＳを含む）で１０μｇ／ｍｌに希釈し、ＭＢＡ－ＭＢ－４６８細胞に加えた。次いで、プレートを２つの群に分けた：１つの群を３７℃の電気加熱式恒温インキュベーター内に入れ、１つの群をネガティブコントロールとして４℃の冷蔵庫内に入れた。ネガティブコントロールとしてのプレートを１時間インキュベートし、ＰＢＳで３回洗浄し、１：２００に希釈したヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ－ＦＩＴＣ二次抗体を細胞に加えた後に、これを４℃で３０分間インキュベートした。次いで、細胞を再度ＰＢＳで３回洗浄し、細胞の平均蛍光強度（ＭＦＩ）をＦＡＣＳによって測定した。実験群のプレートを３７℃で５時間インキュベートし、１：２００に希釈したヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ－ＦＩＴＣ二次抗体を細胞に加えた後に、これを４℃で３０分間インキュベートした。次いで、細胞を再度ＰＢＳで３回洗浄し、細胞の平均蛍光強度（ＭＦＩ）をＦＡＣＳによって測定した。抗体の細胞内移行効率を、式：細胞内移行率％＝１００－（３７℃でインキュベートした試料のＭＦＩ×１００／４℃でインキュベートしたコントロール試料のＭＦＩ）に従って計算した。
ヒトＢ７－Ｈ３を天然に発現するＭＢＡ－ＭＢ－４６８ヒト乳癌細胞を１ウェル当たり３×１０３個の細胞の密度で９６ウェルの細胞培養プレートに接種し、２４時間培養した。細胞をＰＢＳで１回洗浄し、上清を廃棄した。ヒト化抗体のｈｚ９Ｂ１１、ｈｚ１０Ｂ４、及びｈｚ１７Ａ３、並びにポジティブコントロールのエノブリツズマブ及びネガティブコントロール（アイソタイプコントロール抗体）をＲＰＭＩ １６４０（１０％のＦＢＳを含む）で１０μｇ／ｍｌに希釈し、ＭＢＡ－ＭＢ－４６８細胞に加えた。次いで、プレートを２つの群に分けた：１つの群を３７℃の電気加熱式恒温インキュベーター内に入れ、１つの群をネガティブコントロールとして４℃の冷蔵庫内に入れた。ネガティブコントロールとしてのプレートを１時間インキュベートし、ＰＢＳで３回洗浄し、１：２００に希釈したヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ－ＦＩＴＣ二次抗体を細胞に加えた後に、これを４℃で３０分間インキュベートした。次いで、細胞を再度ＰＢＳで３回洗浄し、細胞の平均蛍光強度（ＭＦＩ）をＦＡＣＳによって測定した。実験群のプレートを３７℃で５時間インキュベートし、１：２００に希釈したヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ－ＦＩＴＣ二次抗体を細胞に加えた後に、これを４℃で３０分間インキュベートした。次いで、細胞を再度ＰＢＳで３回洗浄し、細胞の平均蛍光強度（ＭＦＩ）をＦＡＣＳによって測定した。抗体の細胞内移行効率を、式：細胞内移行率％＝１００－（３７℃でインキュベートした試料のＭＦＩ×１００／４℃でインキュベートしたコントロール試料のＭＦＩ）に従って計算した。
【0129】
これらの実験結果（図１０）により、ヒト化抗体のｈｚ９Ｂ１１、ｈｚ１０Ｂ４、及びｈｚ１７Ａ３、並びにコントロール抗体のエノブリツズマブが全てＢ７－Ｈ３により介在されてエンドサイトーシスされ得ることが明らかになった。
【0130】
実施例１４：腫瘍細胞における抗ヒトＢ７－Ｈ３抗体薬物コンジュゲートの殺傷活性の検出
ヒトＢ７－Ｈ３を天然に発現するＳＫＶＯ３細胞及びＡ４３１細胞の懸濁液を１ウェル当たり１×１０３個の細胞の密度で９６ウェルの細胞培養プレートに接種した後に、これらを３７℃、５％のＣＯ２のインキュベーター内に入れて一晩培養した。ＭＭＡＥをコンジュゲートすることによって作製されたｈｚ９Ｂ１１－Ｍ、ｈｚ１０Ｂ４－Ｍ、ｈｚ１７Ａ３－Ｍと命名された抗ヒトＢ７－Ｈ３抗体薬物コンジュゲート、並びにポジティブコントロールのエノブリツズマブ－Ｍ及びＭＧＣ－０１８－Ｍ、並びに作製されたＡＤＣコントロールのＭＷ１４－Ｍを様々な濃度で（１１．１μｇ／ｍｌから３倍希釈、合計６通りの濃度、それぞれ３連のウェルにて）細胞に加えた後に、これらを３７℃、５％のＣＯ２のインキュベーター内に入れて培養した。４日後に、Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ－８（ＣＣＫ－８キット）を使用して、抗Ｂ７－Ｈ３抗体薬物コンジュゲートの細胞殺傷活性を検出した。
ヒトＢ７－Ｈ３を天然に発現するＳＫＶＯ３細胞及びＡ４３１細胞の懸濁液を１ウェル当たり１×１０３個の細胞の密度で９６ウェルの細胞培養プレートに接種した後に、これらを３７℃、５％のＣＯ２のインキュベーター内に入れて一晩培養した。ＭＭＡＥをコンジュゲートすることによって作製されたｈｚ９Ｂ１１－Ｍ、ｈｚ１０Ｂ４－Ｍ、ｈｚ１７Ａ３－Ｍと命名された抗ヒトＢ７－Ｈ３抗体薬物コンジュゲート、並びにポジティブコントロールのエノブリツズマブ－Ｍ及びＭＧＣ－０１８－Ｍ、並びに作製されたＡＤＣコントロールのＭＷ１４－Ｍを様々な濃度で（１１．１μｇ／ｍｌから３倍希釈、合計６通りの濃度、それぞれ３連のウェルにて）細胞に加えた後に、これらを３７℃、５％のＣＯ２のインキュベーター内に入れて培養した。４日後に、Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ－８（ＣＣＫ－８キット）を使用して、抗Ｂ７－Ｈ３抗体薬物コンジュゲートの細胞殺傷活性を検出した。
【0131】
これらの結果（図１１及び図１２）により、各抗Ｂ７－Ｈ３抗体薬物コンジュゲートが用量依存的に腫瘍細胞を殺傷し得ることが明らかになった。Ａ４３１細胞においては、ｈｚ１０Ｂ４－Ｍがｈｚ９Ｂ１１－Ｍ及びｈｚ１７Ａ３－Ｍの活性よりも僅かに良好な活性を有し、コントロール抗体薬物コンジュゲートのＭＧＣ－０１８－Ｍの活性に匹敵し、エノブリツズマブ－Ｍの活性よりも明らかに優れていた。ＳＫＯＶ－３細胞においては、低濃度のｈｚ９Ｂ１１－Ｍ及びｈｚ１７Ａ３－Ｍは、コントロール抗体薬物コンジュゲートの活性よりも明らかに優れた或る特定の活性を示し、ｈｚ１０Ｂ４－Ｍは、コントロール抗体薬物コンジュゲートのＭＧＣ－０１８－Ｍの活性に匹敵する活性を示し、エノブリツズマブ－Ｍの活性よりも明らかに優れていた。
【0132】
実施例１５：ヌードマウスにおけるＡ４３１細胞の皮下移植腫瘍モデルにおける抗Ｂ７－Ｈ３抗体薬物コンジュゲートの薬力学的評価
５週齢の雄のＢＡＬＢ／ｃヌードマウスに３×１０６個のＡ４３１細胞を皮下接種し、腫瘍がおよそ１００ｍｍ３に成長したときに１群当たり５匹のマウスで無作為に群分けした。群分け並びに各群についての投与量及び頻度を表１５に示す。各群におけるマウスに週２回で合計４回静脈内注射し、同時に各マウスの腫瘍体積及び体重を測定した。投与を止めた後に、マウスを２週間にわたり継続的に観察し、ヌードマウスが１５％超減量した場合、又はヌードマウスが３０００ｍｍ３を超える腫瘍体積を有した場合、又はヌードマウスの群全体が２０００ｍｍ３を超える平均腫瘍体積を有した場合に、実験を中止し、マウス（複数の場合もある）を安楽死させた。ヌードマウスの群分け及び投与スキームを表１２に示し、ヌードマウスの腫瘍体積変化曲線及び体重変化曲線をそれぞれ図１３及び図１４に示す。
５週齢の雄のＢＡＬＢ／ｃヌードマウスに３×１０６個のＡ４３１細胞を皮下接種し、腫瘍がおよそ１００ｍｍ３に成長したときに１群当たり５匹のマウスで無作為に群分けした。群分け並びに各群についての投与量及び頻度を表１５に示す。各群におけるマウスに週２回で合計４回静脈内注射し、同時に各マウスの腫瘍体積及び体重を測定した。投与を止めた後に、マウスを２週間にわたり継続的に観察し、ヌードマウスが１５％超減量した場合、又はヌードマウスが３０００ｍｍ３を超える腫瘍体積を有した場合、又はヌードマウスの群全体が２０００ｍｍ３を超える平均腫瘍体積を有した場合に、実験を中止し、マウス（複数の場合もある）を安楽死させた。ヌードマウスの群分け及び投与スキームを表１２に示し、ヌードマウスの腫瘍体積変化曲線及び体重変化曲線をそれぞれ図１３及び図１４に示す。
【0133】
【表12】
【0134】
図１３及び図１４に示されるように、ヌードマウスにおけるＡ４３１細胞の皮下移植腫瘍モデルにおいて、ｈｚ１０Ｂ４－Ｍは最良の抗腫瘍効果を示し、これはＭＧＣ－０１８－Ｍの効果と基本的に同等か、又はそれより僅かに良好であり、ｈｚ１７Ａ３－Ｍの抗腫瘍効果は第２位であり、エノブリツズマブ－Ｍの抗腫瘍効果よりも優れており、ｈｚ９Ｂ１１－Ｍは或る特定の効力を示したが、ｈｚ１０Ｂ４－Ｍ及びｈｚ１７Ａ３－Ｍの効力よりも弱かった。ＡＤＣの作製に使用された小分子ＭＭＡＥの明らかな毒性効果は観察されず、各実験群における動物の体重は着実に増加し、実験群とコントロール群との間で体重に明らかな差は見られなかった。
【0135】
本発明の具体的な実施形態を詳細に説明してきたが、当業者であれば、開示された全ての教示に従って、それらの詳細に対して様々な変更及び置換を行うことができ、これらの変更は全て本発明の保護範囲内であることを理解するであろう。本発明の全範囲は、添付の特許請求の範囲及びそのあらゆる同等物によって与えられる。
【0136】
本明細書の記載において、「一実施形態」、「幾つかの実施形態」、「例示的な実施形態」、「例」、「具体的な例」、「幾つかの例」等のような用語に関する記載は、実施形態又は例に関して記載された具体的な特徴、構造、材料、又は特質が本開示の少なくとも１つの実施形態又は例に含まれることを意味する。本明細書において、上述の用語の例示的記載は、必ずしも同じ実施形態又は例を指すものではない。さらに、記載された具体的な特徴、構造、材料、又は特質を、あらゆる１つ以上の実施形態又は例において適切に組み合わせることができる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8A】
【図8B】
【図8C】
【図8D】
【図8E】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【国際調査報告】