知財求人 - 知財ポータルサイト「IP Force」
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-12-13
(54)【発明の名称】電気化学センサー
(51)【国際特許分類】
G01N 27/30 20060101AFI20231206BHJP
G01N 33/483 20060101ALI20231206BHJP
G01N 33/569 20060101ALI20231206BHJP
C12M 1/34 20060101ALI20231206BHJP
C12Q 1/70 20060101ALI20231206BHJP
C12Q 1/37 20060101ALI20231206BHJP
G01N 27/327 20060101ALI20231206BHJP
【ＦＩ】
G01N27/30 B
G01N33/483 F
G01N33/569 L
C12M1/34 B
C12M1/34 E
C12Q1/70
C12Q1/37
G01N27/327 357
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023525568
(86)(22)【出願日】2021-10-26
(85)【翻訳文提出日】2023-06-21
(86)【国際出願番号】 GB2021052781
(87)【国際公開番号】W WO2022090706
(87)【国際公開日】2022-05-05
(31)【優先権主張番号】2017047.8
(32)【優先日】2020-10-27
(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】523346445
【氏名又は名称】アウレウム ダイアグノスティクス リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100083806
【弁理士】
【氏名又は名称】三好 秀和
(74)【代理人】
【識別番号】100111235
【弁理士】
【氏名又は名称】原 裕子
(74)【代理人】
【識別番号】100195257
【弁理士】
【氏名又は名称】大渕 一志
(72)【発明者】
【氏名】コリガン、 ダミオン ケー．
(72)【発明者】
【氏名】ヴェッツァ、 ヴィンセント ジェームズ
【テーマコード（参考）】
2G045
4B029
4B063
【Ｆターム（参考）】
2G045CB21
2G045DA13
2G045DA14
2G045DA20
2G045DA36
2G045DA37
2G045DA44
2G045FB05
4B029AA07
4B029BB13
4B029BB16
4B029CC03
4B029FA01
4B029FA05
4B029FA12
4B063QA18
4B063QA19
4B063QQ03
4B063QQ10
4B063QQ36
4B063QQ79
4B063QR16
4B063QR48
4B063QR72
4B063QR79
4B063QR82
4B063QS32
4B063QS36
4B063QX01
4B063QX02
4B063QX04
(57)【要約】
本開示は、診断試験における使用のための、自己組織化単分子層（ＳＡＭ）の形成においてフルオロオルガノチオールまたはフルオロオルガノシランを使用する、電気化学センサーに関する。開示される電気化学センサーを用いて患者試料を試験する方法もまた提供する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ターゲット分析物を検出する際に使用するための電気化学バイオセンサーであって、自己組織化単分子層（ＳＡＭ）でコーティングされた表面を含む少なくとも１つの検出電極を含み、前記ＳＡＭは、ハイドロフルオロカーボンまたはフルオロカーボン上に存在する反応性イオウまたはケイ素基を通じて前記電極表面上に結合する前記ハイドロフルオロカーボンまたはフルオロカーボン分子を含むか、これらから本質的になるか、またはこれらからなる、
電気化学バイオセンサー。
【請求項2】
前記ハイドロフルオロカーボンまたはフルオロカーボン分子が、単一または複数の反応性イオウまたはケイ素基を有する、直鎖、分枝鎖または環状アルカン、アルケンまたはアルキン分子である、請求項１に記載の電気化学バイオセンサー。
【請求項3】
前記反応性イオウ基が、チオールまたはシラン基である、請求項１または２に記載の電気化学バイオセンサー。
【請求項4】
前記フルオロカーボン分子が、直鎖フルオロアルカンチオールまたはフルオロアルカンシランである、請求項１～３のいずれかに記載の電気化学バイオセンサー。
【請求項5】
前記直鎖フルオロアルカンチオールまたはフルオロアルカンシランが：１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈ－ペルフルオロデカンチオール、
３，３，４，４，５，５，６，６，７，７，８，８，８－トリデカフルオロ－１－オクタンチオール、
３，３，４，４，５，５，６，６，７，７，８，８，９，９，１０，１０，１０－ヘプタデカフルオロ－１－デカンチオール、
３，３，４，４，５，５，６，６，６－ノナフルオロ－１－ヘキサンチオール、
２，２，２－トリフルオロエタンチオール、
１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈ－ペルフルオロオクチルトリエトキシシラン、
１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈ－ペルフルオロデシルトリエトキシシラン、および
１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈ－ペルフルオロドデシルトリクロロシラン
からなる群より選択される、請求項４に記載の電気化学バイオセンサー。
【請求項6】
前記直鎖フルオロアルカンチオールが１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈ－ペルフルオロデカンチオールである、請求項４に記載の電気化学バイオセンサー。
【請求項7】
前記電極表面が、ガラス状炭素；金属酸化物；導電性ポリマー；または金、ルテニウム、ロジウム、パラジウム、白金および銀を含む貴金属から形成される、請求項１～６のいずれかに記載の電気化学バイオセンサー。
【請求項8】
前記電極表面が金である、請求項７に記載の電気化学バイオセンサー。
【請求項9】
前記電極表面上にコーティングされた前記ＳＡＭ層によって捕捉される生物学的薬剤をさらに含む、請求項１～８のいずれかに記載の電気化学バイオセンサー。
【請求項10】
前記生物学的薬剤が物理吸着によって前記ＳＡＭ層に捕捉される、請求項９に記載の電気化学バイオセンサー。
【請求項11】
請求項１～８のいずれかに記載の電気化学バイオセンサーを作製する方法であって：有機溶媒および本明細書に上述されるハイドロフルオロカーボンまたはフルオロカーボン分子を含む溶液と、少なくとも１つの検出電極表面とを接触させることによって、前記少なくとも１つの検出電極の表面上にＳＡＭを形成させる工程と、
前記溶媒を蒸発させ、前記ＳＡＭが少なくとも１つの検出電極の表面上に形成されることを可能にする工程と
を含む、方法。
【請求項12】
前記ＳＡＭでコーティングされた電極と、前記生物学的薬剤を含む溶液とを接触させ、前記電極上にコーティングされた前記ＳＡＭ層によって前記生物学的薬剤が捕捉されることを可能にする工程をさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項13】
前記の少なくとも１つの検出電極に電気的にカップリングされている、少なくとも１つの参照電極および／またはカウンター電極をさらに含む、請求項１～１０のいずれかに記載の電気化学バイオセンサー。
【請求項14】
前記電極が、基板上に備えられる、請求項１～１０のいずれかに記載の電気化学バイオセンサー。
【請求項15】
スクリーン印刷電極；マイクロ電極；印刷回路基板上；またはＦＥＴＳ／ＯＦＥＴＳ上などの形で提供される、請求項１４に記載の電気化学バイオセンサー。
【請求項16】
前記センサーによって捕捉された前記生物学的薬剤に結合、典型的には特異的に結合可能であるターゲット分析物の検出における、請求項１～１０および１４～１５のいずれかに記載の電気化学バイオセンサーの使用。
【請求項17】
前記ターゲット分析物が、化学物質（例えばホルモン、麻薬または汚染物質）または生物学的分子（例えばペプチド、タンパク質、糖タンパク質、酵素、糖脂質、細胞表面受容体、サイトカイン、抗体、核酸）である、請求項１６に記載の使用。
【請求項18】
前記ターゲット分析物が、分析しようとする試料内に遊離しているか、またはその中に前記ターゲット分析物がｉｎ ｓｉｔｕで通常見られる、細胞、細胞膜、ウイルスコート等の一部のままである、請求項１６または１７に記載の使用。
【請求項19】
前記ターゲット分析物がウイルスコートタンパク質である、請求項１８に記載の使用。
【請求項20】
前記電気化学バイオセンサーによって捕捉される前記生物学的巨大分子がＡＣＥ－２であり、前記ターゲット分析物がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２またはそのコートタンパク質である、請求項１６に記載の使用。
【請求項21】
前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２がＣＯＶＩＤ－１９である、請求項２０に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本開示は、診断試験における使用のための電気化学センサーに関する。開示される電気化学センサーを用いて患者試料を試験する方法もまた提供する。
【背景技術】
【0002】
電気化学バイオセンサーは、広範囲の病原体および臨床的に重要なバイオマーカーの迅速かつ高感度な検出を達成する、有望な経路である１。最もよく知られる例は、グルコースバイオセンサー（最も一般的にはアンペロメトリックセンサー（ａｍｐｅｒｏｍｅｔｒｉｃ ｓｅｎｓｏｒ））であり、これは血中グルコースレベルの家庭での試験に広く用いられ、血糖レベルのルーチンのモニタリングにおいて、糖尿病患者に非常に役立つ２。サイクリックボルタンメトリー（ｃｙｃｌｉｃ ｖｏｌｔａｍｍｅｔｒｙ）（ＣＶ）４、リニアスイープボルタンメトリー（ｌｉｎｅａｒ ｓｗｅｅｐ ｖｏｌｔａｍｍｅｔｒｙ）（ＬＳＶ）５、電気化学インピーダンススペクトロスコピー（ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｉｍｐｅｄａｎｃｅ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）（ＥＩＳ）６および微分パルスボルタンメトリー（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｐｕｌｓｅ ｖｏｌｔａｍｍｅｔｒｙ）（ＤＰＶ）７を含む、広範囲の原理によって作動する３、多くの他のバイオセンサーが開発されてきている。ＥＩＳは、小さいＡＣ励起電位が作業電極で（しばしば開路電位下で）課される測定セットアップを伴い、それにより生じる電気化学セルの電流反応が測定される。セルに関連する多様なパラメータおよびその反応をＥＩＳ反応から抽出可能であり、これらには、液抵抗（ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）（Ｒｓ）、二重層容量（ｄｏｕｂｌｅ ｌａｙｅｒ ｃａｐａｃｉｔａｎｃｅ）（ＣＤＬ）、電荷移動抵抗（ｃｈａｒｇｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）（ＲＣＴ）およびワールブルグインピーダンス（Ｗａｒｂｕｒｇ ｉｍｐｅｄａｎｃｅ）（Ｗ）８が含まれる。二重層容量および電荷移動抵抗は、生物学的に官能化された電極表面での結合の標識不含（ｌａｂｅｌ－ｆｒｅｅ）モニタリングに特に有効であることが示されてきている。これらの技術は、ＤＮＡおよびタンパク質バイオマーカーの高感度で特異的な測定を可能にし、これは文献において繰り返し示されてきている９。
【0003】
上述のもののような多くの電気化学バイオセンサーに関して、表面官能化および付着化学は、センサー設計および性能に重要な役割を果たす１０，１１。金センサーに関しては、生物学的分子の付着は、しばしば、金－チオール付着の使用を通じて、より具体的には自己組織化単分子層（ｓｅｌｆ－ａｓｓｅｍｂｌｅｄ ｍｏｎｏｌａｙｅｒ）（ＳＡＭ）の形成を通じて行われる１２。ＳＡＭは、試料媒体中のタンパク質、細胞および他の構成要素の非特異的結合から電極表面をブロッキングし、かつバイオ認識要素（ｂｉｏ－ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｅｌｅｍｅｎｔ）（例えばＤＮＡ配列、抗体または酵素）の正しい配向を確実にしうる、二重の目的を果たす１３。自己組織化単分子層は、しばしば、金表面とチオール化生体分子の溶液とのインキュベーションによって形成され、受容体の適切な配向および表面ファウリングに対する優れた耐性を確実にするために、単一分子（単層）またはさらなる複雑性が導入される多構成要素を含有しうる。
【発明の概要】
【0004】
本開示は、診断使用のためのセンサー開発に関する本研究者らによって行われた研究であって、ＳＡＭの形成にフルオロオルガノチオール（ｆｌｕｏｒｏ ｏｒｇａｎｏｔｈｉｏｌ）またはフルオロオルガノシラン（ｆｌｕｏｒｏ ｏｒｇａｎｏｓｉｌａｎｅ）分子を使用する研究に基づく。１つの実施形態において、ＳＡＭは、センサー表面上の１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈ－ペルフルオロデカンチオール（ＰＦＤＴ）を用い、次いで生物学的薬剤（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｇｅｎｔ）で生物官能化されて、形成される。ＰＦＤＴは、自発的に、金表面上に高密度の疎水性ＳＡＭを形成し、表面バイオファウリング（ｓｕｒｆａｃｅ ｂｉｏｆｏｕｌｉｎｇ）を減少させる１４。ＰＦＤＴは、以前、有機トランジスターの性能を増進させ１５、ＤＮＡをマイクロパターン化基板上に可逆的に構造化する１６ために用いられてきている。
【0005】
第一の教示において、本開示は、ターゲット分析物を検出する際に使用するための電気化学バイオセンサーであって、
自己組織化単分子層（ＳＡＭ）でコーティングされた表面を含む少なくとも１つの検出電極を含み、ＳＡＭは、ハイドロフルオロカーボンまたはフルオロカーボン上に存在する反応性イオウまたはケイ素基を通じて、電極表面上に結合するハイドロフルオロカーボンまたはフルオロカーボン分子を含むか、これらから本質的になるか、またはこれらからなる、検出電極を含む、電気化学バイオセンサーを提供する。
自己組織化単分子層（ＳＡＭ）でコーティングされた表面を含む少なくとも１つの検出電極を含み、ＳＡＭは、ハイドロフルオロカーボンまたはフルオロカーボン上に存在する反応性イオウまたはケイ素基を通じて、電極表面上に結合するハイドロフルオロカーボンまたはフルオロカーボン分子を含むか、これらから本質的になるか、またはこれらからなる、検出電極を含む、電気化学バイオセンサーを提供する。
【0006】
ハイドロフルオロカーボンは、フッ素および水素原子を含有する有機化合物である。フルオロカーボンは、すべてのＣ－Ｈ結合がＣ－Ｆ結合によって置換されている化合物である。ハイドロフルオロカーボンまたはフルオロカーボン分子は、単一または複数の反応性イオウまたはケイ素基を有する、直鎖、分枝鎖または環状アルカン、アルケンまたはアルキン分子の形を取りうる。
【0007】
１つの実施形態において、反応性イオウ基（ｒｅａｃｔｉｖｅ ｓｕｌｐｈｕｒ ｇｒｏｕｐ（ｓ））は、チオールであってもよく、こうしたものとして、分子は、フルオロオルガノチオールであってよい。１つの実施形態において、反応性ケイ素基（ｒｅａｃｔｉｖｅ ｓｉｌｉｃｏｎ ｇｒｏｕｐ（ｓ））は、シランであってもよく、こうしたものとして、分子はフルオロオルガノシランであってよい。
【0008】
１つの実施形態において、フルオロカーボン分子は、直鎖フルオロアルカンチオールまたはフルオロアルカンシランである。
【0009】
本開示において使用に適した例示的な化合物には：
１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈ－ペルフルオロデカンチオール
３，３，４，４，５，５，６，６，７，７，８，８，８－トリデカフルオロ－１－オクタンチオール
３，３，４，４，５，５，６，６，７，７，８，８，９，９，１０，１０，１０－ヘプタデカフルオロ－１－デカンチオール
３，３，４，４，５，５，６，６，６－ノナフルオロ－１－ヘキサンチオール
２，２，２－トリフルオロエタンチオール
１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈ－ペルフルオロオクチルトリエトキシシラン
１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈ－ペルフルオロデシルトリエトキシシラン、および
１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈ－ペルフルオロドデシルトリクロロシラン
が含まれる。
１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈ－ペルフルオロデカンチオール
３，３，４，４，５，５，６，６，７，７，８，８，８－トリデカフルオロ－１－オクタンチオール
３，３，４，４，５，５，６，６，７，７，８，８，９，９，１０，１０，１０－ヘプタデカフルオロ－１－デカンチオール
３，３，４，４，５，５，６，６，６－ノナフルオロ－１－ヘキサンチオール
２，２，２－トリフルオロエタンチオール
１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈ－ペルフルオロオクチルトリエトキシシラン
１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈ－ペルフルオロデシルトリエトキシシラン、および
１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈ－ペルフルオロドデシルトリクロロシラン
が含まれる。
【0010】
１つの実施形態において、ＳＡＭを形成する際に使用するための化合物は、１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈ－ペルフルオロデカンチオールである。
【0011】
本開示の電極は、本明細書に記載されるようなハイドロフルオロカーボンまたはフルオロカーボン分子によってコーティングされていてもよい、任意の適切な導電性物質で作製されてもよい。適切な物質には、ガラス状炭素；金属酸化物；導電性ポリマー；ならびに金、ルテニウム、ロジウム、パラジウム、白金および銀を含む貴金属が含まれる。１つの特定の実施形態において、電極は金である。
【0012】
自己組織化単分子層（ＳＡＭ）は、典型的には両親媒性分子の自己構造化層であり、この中で分子の一方の端が基板物質に特異的アフィニティを示す。ＳＡＭ分子には、分子を基板に係留する頭部基、ならびに末端のテール部分または官能基が含まれうる。ＳＡＭ層は、例えば蒸気または液相から基板物質上への頭部基、例えば反応性イオウ（例えばチオール）およびケイ素（例えばシラン）の化学吸着によって形成されうる。本開示に従ったＳＡＭのテール部分基は、既知のフルオラス効果１７を利用し、本質的に疎水性であり、本明細書により詳細に記載されるように、多様な生物学的薬剤の捕捉または物理吸着を可能にする。
【0013】
好適には、ＳＡＭの疎水性の性質は、適切な生物学的薬剤がＳＡＭによって捕捉されることを可能にするだけでなく、試料とともに存在しうる他の物質、例えばタンパク質、細胞および他の分子によるファウリングおよび／または干渉を減少させるように働くバリア層を提供する。試料は被験体から得られてもよく、血液、唾液または任意の他の適切な生物学的液体、例えば尿、精液、または組織試料であってもよい。あるいは、試料は、環境試料、例えば水試料、土壌試料、またはさらに植物試料であってもよい。
【0014】
さらなる教示において、本開示は、例えば物理吸着によって、電極表面上にコーティングされたＳＡＭ層により捕捉される生物学的薬剤をさらに含む、第一の教示および実施形態に記載されるような電気化学バイオセンサーをさらに提供する。
【0015】
さらなる教示において、本開示は、上述の第一のまたはさらなる教示および実施形態に記載される電気化学バイオセンサーを作製する方法であって：
有機溶媒および本明細書に上述されるハイドロフルオロカーボンまたはフルオロカーボン分子を含む溶液と、少なくとも１つの検出電極表面とを接触させることによって、少なくとも１つの検出電極の表面上にＳＡＭを形成させる工程と、
溶媒を蒸発させ、ＳＡＭが少なくとも１つの検出電極の表面上に形成されることを可能にする工程と；
任意選択で、続いて、ＳＡＭでコーティングされた電極と、生物学的薬剤を含む溶液を接触させ、電極上にコーティングされたＳＡＭ層によって生物学的薬剤が捕捉されることを可能にする工程と
を含む、方法を提供する。
有機溶媒および本明細書に上述されるハイドロフルオロカーボンまたはフルオロカーボン分子を含む溶液と、少なくとも１つの検出電極表面とを接触させることによって、少なくとも１つの検出電極の表面上にＳＡＭを形成させる工程と、
溶媒を蒸発させ、ＳＡＭが少なくとも１つの検出電極の表面上に形成されることを可能にする工程と；
任意選択で、続いて、ＳＡＭでコーティングされた電極と、生物学的薬剤を含む溶液を接触させ、電極上にコーティングされたＳＡＭ層によって生物学的薬剤が捕捉されることを可能にする工程と
を含む、方法を提供する。
【0016】
本開示のいくつかの実施形態において、電気化学バイオセンサーは、例えば測定系または測定系に連結するための連結を通じて、前記の少なくとも１つの検出電極に電気的にカップリングされていてもよい、少なくとも１つの参照電極および／またはカウンター電極をさらに含む。電極は、典型的には基板上にあり、例えばスクリーン印刷電極；マイクロ電極；印刷回路基板上；ＦＥＴＳ／ＯＦＥＴＳ等の形で提供されてもよい。電気化学バイオセンサーは、測定系に連結するための連結を含むかまたはこうした連結とともに提供されてもよい。測定系は、少なくとも１つの検出電極および少なくとも１つの参照および／またはカウンター電極の間に電気シグナルを適用するように設定されていてもよい。測定系は、生物学的薬剤による分析物の検出から生じる電気反応を測定するように設定されていてもよい。測定系は、インピーダンス、ボルタンメトリー、またはアンペロメトリー測定を実行するように設定されていてもよい。測定系は電気化学インピーダンススペクトロスコピー（ＥＩＳ）を実行するように設定されていてもよい。
【0017】
本開示に従った電気化学バイオセンサーは、センサーによって捕捉された生物学的薬剤に結合、典型的には特異的に結合可能であるターゲット分析物を検出するために用いられてもよい。ターゲット分析物は、化学物質（例えばホルモン、麻薬または汚染物質）または生物学的分子、例えばペプチド、タンパク質、糖タンパク質、酵素、糖脂質、細胞表面受容体、サイトカイン、抗体、核酸等であってもよい。ターゲット分析物は、分析しようとする試料内で遊離していてもよいし、またはその中にターゲット分析物、例えば生物学的分子がｉｎ ｓｉｔｕで通常見られる、細胞、細胞膜、ウイルスコート等の一部のままであってもよい。生物学的薬剤およびターゲット分析物の間の結合は、引力（ａｔｔｒａｃｔｉｖｅ ｆｏｒｃｅｓ）によってともに保持される２つ以上の種の誘引結合（ａｔｔｒａｃｔｉｖｅ ｂｉｎｄｉｎｇ）（すなわち非反発性）を伴う。こうした結合は、試料中の生物学的薬剤およびターゲット分析物をともに引っ張る（または引き寄せる）、生物学的薬剤およびターゲット分析物の間の相互作用を含む。結合には、限定されるわけではないが、共有相互作用；静電相互作用；イオン－イオン相互作用、例えば誘引性のまたは反対の電荷間のもの；双極子相互作用；イオン－双極子相互作用；水素結合相互作用；ファンデルワールス相互作用；πスタッキング相互作用；電子密度の共有またはそれらの組み合わせが含まれる。
【0018】
本開示の電気化学センサーは、生物学的薬剤へのターゲット分析物のいかなる結合も、プロセシングおよび／またはディスプレイのためのシグナルに変換可能である、シグナル変換法を提供する。生物学的薬剤は、ターゲット分析物と類似であってもよく、タンパク質、酵素、抗体、核酸等を含んでもよい。バイオセンサーは、ターゲット分析物を同定するため、特異的化学相互作用特性（例えば酵素およびその基質）または分子認識機構（例えば受容体へのタンパク質結合または抗原への抗体結合）を使用するよう設定されてもよい。バイオセンサーは、電極を使用して、生物学的薬剤による分析物の検出から生じる電気シグナルを、光学的、電子的または他の手段によって現されうる異なるシグナルに変換しうる。
【0019】
１つの実施形態において、インピーダンス、ボルタンメトリー、またはアンペロメトリー測定は、電気化学センサーによって、シグナル、またはシグナルにおける変化を検出するために実行されてもよい。１つの実施形態において、ターゲット分析物の電気化学検出は、電気化学インピーダンススペクトロスコピー（ＥＩＳ）によって実行される。この方式では、本開示の電気化学バイオセンサーは、ターゲット分析物への生物学的巨大分子結合によって誘導される電極および電解質の間の界面特性の変化を、電気シグナルに変換する。典型的には、レドックス対、例えばＫ３［Ｆｅ（ＣＮ）６］／Ｋ４［Ｆｅ（ＣＮ）６］を、界面での電極動力学に関するレドックス指標として用いてもよい。ＥＩＳ検出の使用に基づくセンサーは標識不含であり、従って、コストが低く、単純であり小型化が容易であるという利点を有する。ＥＩＳは、表面相互作用に感受性であり、荷電レドックスプローブと関連する界面電荷移動抵抗（ＲＣＴ）を定量化するため、特に有用である。ＲＣＴは、試料溶液中の電極－溶液界面近傍の電荷分布の変化によって強く影響を受け、これが表面感受性を生じる。
【0020】
本開示のバイオセンサーは、多くの異なる診断適用に適用を見出し、これには、例えば、感染性病原体、例えば細菌、ウイルス（インフルエンザ、ＳＡＲＳ－ＣＯＶ２を含む）等；敗血症に関連する分子、例えばＩＬ－１６およびプロカルシトニン；心臓バイオマーカー、例えばトロポニン；および肝臓バイオマーカーの検出が含まれる。好適には、本発明のセンサーを用いる検出の原理は、製造が相対的に容易であり、検出が速やかであるため、広い適用可能性を有する。
【0021】
１つの限定されない実施形態において、本開示はＣＯＶＩＤ－１９の検出に関する。この例において、電気化学バイオセンサーによって捕捉される生物学的巨大分子は、ＣＯＶＩＤ－１９の原因ウイルスであるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の進入受容体として同定されているＡＣＥ－２である。従って、１つの実施形態において、生物学的巨大分子がＡＣＥ－２である本開示に従った電気化学バイオセンサーは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、例えばＣＯＶＩＤ １９の検出に使用されうる。あるいは、ＣＯＶＩＤ １９特異的抗体１８、例えばＣＯＶＩＤ １９のスパイクタンパク質に特異的に結合可能である抗体は、生物学的巨大分子として使用されうる。この方式で、検出されるべきターゲット分析物は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２またはより具体的にはＣＯＶＩＤ １９のウイルスまたはコートタンパク質である。
【0022】
本明細書で使用される化学的専門用語は、明確に言及されない限り、ＩＵＰＡＣ Ｇｏｌｄｂｏｏｋに従い、当該技術分野に知られる標準的な意味を有する。文脈（ｃｏｎｔｅｘｔ）が明らかに別のものを必要としない限り、明細書および請求項全体で、単語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」等は、排他的または網羅的意味とは反対の包含的な意味と見なされ、すなわち、「限定されるわけではないが、含む」の意味である。
【0023】
本開示は、ここで、例として、かつ以下の図に言及して、さらに記載される。
【図面の簡単な説明】
【0024】
【図1】（Ａ）オンチップＡｕカウンター電極および参照電極を含む８ｘＡｕ作業電極ＰＣＢの画像。（Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ）以下の状態：清浄（Ｂ）、ＰＦＤＴ官能化（Ｃ）およびＡＣＥ２官能化（Ｄ）ならびにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質または不活性化ウイルスの結合を伴うもの（Ｅ）のＡｕセンサー表面の描写。（Ｆ）ＡＣＥ２官能化センサー（黒）および組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質への曝露後（赤）のシグナルを示すナイキストプロット例。
【図2】（Ａ）清浄化（黒）、ＰＦＤＴ官能化（赤）およびＡＣＥ２インキュベーション（青）後の代表的な電極からのナイキストプロット例。（Ｂ）電極官能化の３つの段階（清浄化、ＳＡＭ形成およびＡＣＥ２固定）を通じたＲｃｔ値を示すボックスプロット。（Ｃ）ＡＣＥ２（１Ｒ４２）のタンパク質構造１９。（Ｄ）ＰＦＤＴの構造式。
【図3】（Ａ）ＡＣＥ２官能化電極対ＨＲＰコンジュゲート化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質溶液およびＨＲＰコンジュゲート化ストレプトアビジン溶液に関する正規化Ｒｃｔ値を示すボックスプロット。（Ｂ）ＨＲＰコンジュゲート化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質の増加に対するインピーダンス測定反応（ｉｍｐｅｄｉｍｅｔｒｉｃ ｒｅｓｐｏｎｓｅ）を示すナイキストプロット。（Ｃ）ＨＲＰコンジュゲート化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクおよびＨＲＰコンジュゲート化ストレプトアビジンタンパク質の添加に反応したΔＲＣＴ％変化を示す棒グラフ。（Ｄ）ＨＲＰコンジュゲート化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質に関する用量反応曲線。（Ｅ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質（６ＸＭ４）２０およびストレプトアビジン（４ＢＸ５）２１のタンパク質構造。
【図4】（Ａ）ＨＲＰコンジュゲート化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質の増加に対するインピーダンス測定反応を示すナイキストプロット。（Ｂ）ＨＲＰコンジュゲート化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクおよびＩＬ－６の添加に反応したΔＲＣＴ％変化を示す棒グラフ。（Ｃ）ＡＣＥ２官能化電極対ＨＲＰコンジュゲート化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質溶液およびＩＬ－６溶液に関する正規化Ｒｃｔ値を示すボックスプロット。（Ｄ）ＨＲＰコンジュゲート化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質に関する用量反応曲線。（Ｅ）ＩＬ－６（２ＩＬ６）２４のタンパク質構造。
【図5】（Ａ）不活性化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス濃度の増加に対するインピーダンス測定反応を示すナイキストプロット。（Ｂ）不活性化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の陰性および陽性試料の添加に反応したΔＲＣＴ％変化を示す棒グラフ。（Ｃ）ＡＣＥ２官能化電極対不活性化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の陽性および陰性試料に関する正規化Ｒｃｔ値を示すボックスプロット。（Ｄ）不活性化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に関する用量反応曲線。（Ｅ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構造（Ｍａｙａ Ｐｅｔｅｒｓ Ｋｏｓｔｍａｎ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ． ｈｔｔｐｓ：／／ｃｒｅａｔｉｖｅｃｏｍｍｏｎｓ．ｏｒｇ／ｌｉｃｅｎｓｅｓ／ｂｙ－ｎｃ－ｓａ／４．０／ｌｅｇａｌｃｏｄｅによる画像から適合）。
【図6】スパイクタンパク質結合に際する電荷移動抵抗増加に特徴的な、ＰＦＤＴ修飾電極に関して観察されるもののようなインピーダンス変化は、下層のＳＡＭ層が１－オクタンチオールまたは１－ウンデカンチオールで構成されていた際には観察不能であることを示す。
【発明を実施するための形態】
【0025】
材料および方法
【0026】
略語
ＰＦＤＴ、１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈ－ペルフルオロデカンチオール；ＡＣＥ２、アンギオテンシン変換酵素２；ＩＬ－６、インターロイキン－６；ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、重度急性呼吸器症候群コロナウイルス２；ＨＲＰ、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ；ＥＩＳ、電気化学インピーダンススペクトロスコピー；ＡＲＤＳ、急性呼吸器促拍症候群；ＰＣＢ、印刷回路基板；ＰＢＳ、リン酸緩衝生理食塩水；ＳＡＭ、自己組織化単分子層；Ｒｃｔ、電荷移動抵抗；ＯＣＰ、開路電位；ＩＱＲ、四分位範囲。
ＰＦＤＴ、１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈ－ペルフルオロデカンチオール；ＡＣＥ２、アンギオテンシン変換酵素２；ＩＬ－６、インターロイキン－６；ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、重度急性呼吸器症候群コロナウイルス２；ＨＲＰ、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ；ＥＩＳ、電気化学インピーダンススペクトロスコピー；ＡＲＤＳ、急性呼吸器促拍症候群；ＰＣＢ、印刷回路基板；ＰＢＳ、リン酸緩衝生理食塩水；ＳＡＭ、自己組織化単分子層；Ｒｃｔ、電荷移動抵抗；ＯＣＰ、開路電位；ＩＱＲ、四分位範囲。
【0027】
化学物質。Ｋ３［Ｆｅ（ＣＮ）６］、Ｋ４［Ｆｅ（ＣＮ）６］、１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈ－ペルフルオロデカンチオール、ＫＯＨおよびＨ２Ｏ２ ３０％（ｖ／ｖ）を、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから得た。トルエンをＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＵＫ Ｌｔｄ（Ｌｏｕｇｈｂｏｒｏｕｇｈ，ＵＫ）から得た。脱イオン水（５．００μＳ／ｃｍ、２５℃）をＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｓｕｐｐｌｉｅｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ（Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍ，ＵＫ）から購入した。不活性化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２および陰性対照をＲａｎｄｏｘ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｌｔｄ（Ｃｒｕｍｌｉｎ，ＵＫ）から得た。ＡＣＥ２をＡｂｃａｍ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）から購入し、ＨＲＰコンジュゲート化スパイクタンパク質をＴｈｅ Ｎａｔｉｖｅ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ）より購入し、ＨＲＰコンジュゲート化ストレプトアビジンを、Ｂｉｏ－ｔｅｃｈｎｅ（Ａｂｉｎｇｄｏｎ，ＵＫ）のＩＬ－６診断キットの一部として購入した。
【0028】
条件付け（Ｐｒｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ）。ＳＥＰ１ ＢＩＯＴＩＰマルチチャネル電極ＰＣＢプラットフォーム（ｂｉｏｔｉｐ ｌｔｄ，Ｂａｔｈ，ＵＫ）を、供給されるプロトコルに従って清浄化した。これは、Ｈ２Ｏ２３０％（ｖ／ｖ）中の５０ｍＭ ＫＯＨの溶液中、室温で１５分間浸すことからなった。次いで、ＰＣＢをＤＩ水でリンスし、圧縮空気を用いて乾燥させた。次いで、ＰＣＢを、外部白金カウンター電極 （Ｍｅｔｒｏｈｍ，Ｒｕｎｃｏｒｎ，ＵＫ）および３Ｍ ＮａＣｌ Ａｇ／ＡｇＣｌ参照電極（ＩＪ Ｃａｍｂｒｉａ，Ｌｌａｎｅｌｌｉ，ＵＫ）とともに、５０ｍＭ ＫＯＨ（溶媒としてＤＩ水）に浸すことによって電気化学的に清浄化した。以下のパラメータを用いて、ＰＣＢ上のすべての作業電極に対して、サイクリックボルタンメトリーを行った：電位窓（ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｗｉｎｄｏｗ）は－１．２～０．６Ｖ、スキャン速度は０．１Ｖ／ｓ、電極あたり１５スキャン。次いで、ＰＣＢをＤＩ水でリンスし、再度、圧縮空気を用いて乾燥させた。どちらもＰａｌｍｓｅｎｓ ＢＶ（Ｈｏｕｔｅｎ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）によって供給されるＰａｌｍＳｅｎｓ４ポテンシオスタットおよび付随するＰＳＴｒａｃｅソフトウェアを用いて、すべての電気化学測定を行った。
【0029】
フルオラスＳＡＭおよびＡＣＥ２固定。トルエンを磁気攪拌し、１ｍＭ溶液が形成されるまでＰＦＤＴを添加することによって、ＳＡＭ溶液を調製した。攪拌は、ＰＦＤＴが溶液全体に分散されることを補助する。フルオロカーボンは、有機溶媒中で低混和性を有する可能性があり、自己相互作用の傾向を有し、フルオラス効果を通じて、別個の相を形成する１７。ＰＣＢを小型のガラスペトリ皿中に水平に配向し、ＰＣＢを過剰な溶液で覆うように、ＰＦＤＴ溶液を添加した。トルエンは迅速に蒸発するため、過剰な溶液を用い、フィルムで覆い、蒸発ロスを減少させた。ＰＣＢを室温で一晩インキュベーションし、次いでＤＩ水でリンスし（電極あたり１０秒間の水ボトル流）、圧縮空気で乾燥させた。トルエンでのすべての作業を、適切なハロゲン化溶媒廃棄物処理経路を備えた適切なドラフト中で行った。
【0030】
ＡＣＥ２を１ｘＰＢＳ中のストックから１μｇ／ｍｌに希釈し、１０μｌアリコットをＰＣＢ上の各作業電極に適用し、室温で１時間インキュベーションした。インキュベーション後、ＰＣＢを１ｘＰＢＳ（電極あたり１０秒間の水ボトル流）でリンスし、圧縮空気で乾燥させた。
【0031】
タンパク質ターゲット検出。リガンド（ＡＣＥ２）およびタンパク質（ＨＲＰコンジュゲート化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質）の間の特異的結合の証拠を調べるため、陽性対照ＨＲＰコンジュゲート化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質および類似のサイズのタンパク質の陰性対照（ＨＲＰコンジュゲート化ストレプトアビジンおよびＩＬ－６）の一連の希釈物（ｄｉｌｕｔｉｏｎｓ）を、ＰＣＢセンサーアレイ上、室温で３０分間インキュベーションし、１ｘＰＢＳ（電極あたり１０秒間の水ボトル流）でリンスし、各濃度のインキュベーション間でＥＩＳ測定した。用いたＨＲＰコンジュゲート化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質およびＩＬ－６濃度は、１、１０、５０および１００ｎｇ／ｍｌ（すべて１ｘＰＢＳ中の希釈）であった。ＨＲＰコンジュゲート化ストレプトアビジンはＥＬＩＳＡキットの一部として得られ、濃度は開示されていなかった。付随する使用説明書は、ＥＬＩＳＡアッセイのため、１：４０希釈を推奨した。用いる一連の希釈物（１：１００、１：７５、１：５０、１：２５および１：５）は、１：４０推奨希釈周囲に分布した。
【0032】
不活性化ウイルス検出。不活性化ウイルス検出のため、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２臨床分子標準キット（Ｑｎｏｓｔｉｃｓ）を購入した。キットは、臨床試料の代わりとなる複雑な「輸送媒体」中に存在するウイルスの陽性および陰性試料を含んでいた。陽性対照（不活性化ウイルス＋輸送媒体およびヒト細胞）の一連の希釈物を、ＰＣＢ上、室温で３０分間インキュベーションした。用いた濃度は、１０２、１０３、１０４、１０５および１０６ｄＣ／ｍｌ（ｍｌあたりのデジタルコピー）であった。提供される溶液体積が小さいため、陰性対照（輸送媒体＋ヒト細胞）を室温で３０分間、２回インキュベーションした。診断デバイスに必要となる可能性が高い操作環境条件を複製するため、室温インキュベーションを選択した。ＰＣＢを１ｘＰＢＳ（電極あたり１０秒間の水ボトル流）でリンスし、各インキュベーションの間でＥＩＳ測定を行った。
【0033】
ＥＩＳパラメータ。すべてのＥＩＳ測定は以下のパラメータを用いた。Ｅａｃ＝０．０１Ｖｒｍｓ、Ｅｄｃ＝０Ｖ、周波数範囲＝５０周波数、９．８／ディケードで１００ｋＨｚ～１Ｈｚ、測定を開路電位（ＯＣＰ）に対して行った。１ｘＰＢＳ中の５ｍＭ Ｋ３［Ｆｅ（ＣＮ）６］／Ｋ４［Ｆｅ（ＣＮ）６］を用いて、すべての測定を得た。
【0034】
結果および考察
フルオロカーボンＳＡＭ官能化。一般的な電気化学バイオセンサーは、センサー表面に直接付着し（共有結合、物理吸着および化学吸着を通じて）、ハイドロカーボンに基づくＳＡＭに囲まれたプローブ分子を有するであろう。より一般的でない場合、ハイドロカーボンＳＡＭが最初に固定され、生体分子は疎水性物理吸着相互作用によってこれに吸着し、これはプローブ生体分子のより優れた配向を達成可能であり、受容体－ターゲット結合の可能性を増加させうる。しかし、こうしたアプローチは共有付着よりもより弱い固定法でもあり、従って、インキュベーションおよび洗浄工程中に除去される可能性がより高い、不都合な点を有する。本研究者らは、より強い物理吸着および抗バイオファウリング特性を提供する、ハイドロカーボンを超える非常に増加した両親媒性（疎水性および疎油性特性）を提供可能であるため、フルオロカーボンの使用を考慮しようと努めた１７。フルオロカーボンがＰＣＢ電極表面上にＳＡＭを形成する能力を調べた。１ｍＭ ＰＦＤＴの一晩インキュベーションは、電極の測定インピーダンスの増加に影響を及ぼし、これは、ナイキストプロット中の清浄インピーダンスに比較して、より大きいＲｃｔ半円（ＳＡＭ）として明らかである（図２Ａ）。定量的に、これは、図２Ｂおよび図２Ｃ中の平均Ｒｃｔ＝２．５ｋΩを有する清浄電極およびＳＡＭ段階Ｒｃｔ＝１３ｋΩで、９２８％のＲｃｔの平均パーセント増加として見られうる。
フルオロカーボンＳＡＭ官能化。一般的な電気化学バイオセンサーは、センサー表面に直接付着し（共有結合、物理吸着および化学吸着を通じて）、ハイドロカーボンに基づくＳＡＭに囲まれたプローブ分子を有するであろう。より一般的でない場合、ハイドロカーボンＳＡＭが最初に固定され、生体分子は疎水性物理吸着相互作用によってこれに吸着し、これはプローブ生体分子のより優れた配向を達成可能であり、受容体－ターゲット結合の可能性を増加させうる。しかし、こうしたアプローチは共有付着よりもより弱い固定法でもあり、従って、インキュベーションおよび洗浄工程中に除去される可能性がより高い、不都合な点を有する。本研究者らは、より強い物理吸着および抗バイオファウリング特性を提供する、ハイドロカーボンを超える非常に増加した両親媒性（疎水性および疎油性特性）を提供可能であるため、フルオロカーボンの使用を考慮しようと努めた１７。フルオロカーボンがＰＣＢ電極表面上にＳＡＭを形成する能力を調べた。１ｍＭ ＰＦＤＴの一晩インキュベーションは、電極の測定インピーダンスの増加に影響を及ぼし、これは、ナイキストプロット中の清浄インピーダンスに比較して、より大きいＲｃｔ半円（ＳＡＭ）として明らかである（図２Ａ）。定量的に、これは、図２Ｂおよび図２Ｃ中の平均Ｒｃｔ＝２．５ｋΩを有する清浄電極およびＳＡＭ段階Ｒｃｔ＝１３ｋΩで、９２８％のＲｃｔの平均パーセント増加として見られうる。
【0035】
【数1】
【0036】
式１を用いてパーセント変化を計算した。式中、Δ％はパーセント変化であり、Ｒｃｔ前は初期段階のＲｃｔであり、Ｒｃｔ後は、インキュベーション段階のＲｃｔである。有意な相違をボックスプロットから評価した。１つの群の中央値が別の群の四分位範囲（ＩＱＲ）の外にある場合、群間で有意な相違がある可能性が高い。これらの実験は、念頭にある仮説試験では設計されず、こうしたものとして誤った結果を報告する可能性があるため、Ｔ検定分析は行われなかった。ボックスプロット（図２Ｃ）は、清浄およびＳＡＭ段階が、両群のＩＱＲが重ならず、従ってＳＡＭ形成中に形成されるＰＦＤＴ層が電極インピーダンスの有意な増加を引き起こすため、有意に異なる可能性があることを示し、固定ＰＦＤＴ層形成の強い証拠を提供した。これは、表面に付着するＳＡＭ分子でのＳＡＭ形成および表面上での秩序だった層形成のよく確立されたプロセスのためであると仮定された。こうした層は、測定緩衝液中のレドックス活性Ｆｅ（ＣＮ）６
３－／４－イオンがレドックス反応を経る可能性がある量または速度を制限して、インピーダンス測定の増加を生じさせうる。要約すると、これらのデータは、フルオロカーボンＳＡＭがＰＣＢ電極上に成功裡に形成されることを示した。
【0037】
ＡＣＥ２疎水性固定。強疎水性フルオラスＳＡＭのさらなる利点は、ＡＣＥ２生体分子の疎水性物理吸着を促進するために理想的な環境を提供することである。これを試験するため、ＡＣＥ２タンパク質を電極ＳＡＭの存在下でインキュベーションした。ＳＡＭ官能化電極上で、１μｇ／ｍｌのＡＣＥ２溶液とともに１時間インキュベーションした後、わずかなインピーダンス増加が明らかであった（図２Ａ）。絶対的には、これはＳＡＭ単独を超えるさらなる２ｋΩ Ｒｃｔ増加であった（図２Ｃ）。これは、支持ＳＡＭ層内への酵素の疎水性物理吸着の指標であった。ＡＣＥ２電極は、清浄群とは有意に異なったが、ＳＡＭ群とは有意には異ならなかった。フルオラスＳＡＭは、以前は清浄であった表面を、大きなインピーダンス変化を生じる高密度のパッキングされた層で覆っているため、この知見は、完全に予期されないものではなかった。ＡＣＥ２は、フルオラスＳＡＭ内に吸着され、さらに電極表面をブロッキングすることによって、この層に添加された；が、表面上に存在するフルオラス分子に比較して、相対的により少数のＡＣＥ２分子であるため、インピーダンスの小さい相対変化の原因となる。ＰＦＤＴ ＳＡＭの集合成功が立証され、ＳＡＭ構造内へのＡＣＥ２取り込みの証拠が見られたため、一連のリガンド結合実験を次に行った。
【0038】
ＨＲＰコンジュゲート化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質（陽性）およびＨＲＰコンジュゲート化ストレプトアビジンタンパク質（陰性）。ＡＣＥ２の固定成功が確認されたため、ＨＲＰコンジュゲート化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質（結合の視覚的決定を可能にするため、ＨＲＰコンジュゲート化型を用いた）を官能化センサー表面と３０分間インキュベーションした。１、１０、５０および１００ｎｇ／ｍｌの測定インピーダンスは、前の濃度に比較して一貫して増加し、用量依存性の振る舞いを示した（図３Ａ）。Ｒｃｔの平均パーセント変化（ｎ＝４）は、最低濃度の９６％から最高濃度の１５６％までであった（図３Ｂ、赤）。これは、ＨＲＰコンジュゲート化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質が、ＰＦＤＴ－ＡＣＥ２修飾センサーに結合したことを示した。ＨＲＰコンジュゲート化ストレプトアビジンの一連の希釈物（陰性対照１：１００、１：７５、１：５０、１：２５および１：５）の添加によって、ＨＲＰコンジュゲート化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質の特異的結合の確認が可能になった。陰性対照のＲｃｔの平均パーセント変化（ｎ＝４）は、最低濃度の６．２％から最高濃度の５２．８％の範囲であった（図３Ｂ、青）。陰性反応は、１：２５（５３．１％）および１：５（５２．８％）の２つの連続パーセント変化測定でプラトーであるようであり、２つの類似のデータスプレッドおよび値であった（図２Ｃ、青）。これらの実験におけるすべての正規化データは、正規化因子としてＡＣＥ２シグナルを用いた。ＡＣＥ２およびすべての陽性対照濃度の間には、有意な相違があるようであり、強いＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質結合をさらに立証した（図２Ｃ、赤）。陰性対照実験は、一連の希釈で有意に異ならず、ＰＦＤＴ－ＡＣＥ２修飾センサーへの弱い結合が示された。すべての陽性群は、陽性群のＩＱＲの外に陰性データの中央値があることによって示されるように、すべての陰性群とは有意に異なる可能性が高い。この証拠を考慮すると、陽性ＨＲＰコンジュゲート化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質は、ＡＣＥ２受容体に成功裡にかつ特異的に結合する一方、ＨＲＰコンジュゲート化ストレプトアビジンは特異的に結合しないと結論付けられた。陰性対照によって生成されるシグナルは、フルオラスＳＡＭ内への少量の吸収による可能性が最も高い。シグナルは、陽性対照に比較して低く、低レベルで飽和するようであり、フルオラスＳＡＭ層が抗バイオファウリング特性を提供し、陽性シグナルが優位を占めることを可能にすることが示唆される。また、ＨＲＰ標識ストレプトアビジン溶液の出発濃度が１ｍｇ／ｍＬの領域中にあり、つまり、陰性対照タンパク質溶液の一連の希釈がＨＲＰコンジュゲート化スパイクタンパク質溶液よりも有意に濃縮されている（少なくとも１桁）ことも指摘されるべきである。陽性の特異的結合および陰性の比較的より弱い結合の強い証拠があるという事実はまた、ＡＣＥ２が、陽性リガンドに結合するために有意に十分な量および配向でフルオラスＳＡＭ内に物理吸着されることを確認する。ＡＣＥ２が好ましくない配向で結合するならば、受容体結合部位へのリガンドアクセスは妨げられ、陽性シグナルは非常に減少するであろう。
【0039】
より短い８炭素オクタンチオールおよびより長い１１鎖ウンデカンチオールを用いた際、結合効率が有意に減少することもまた確認された（図６）。これは、ＰＦＤＴ層の強い疎水性特性がセンサーの振る舞いに関与する吸着機構を生じることをさらに示す。ＨＲＰ標識は、陽性タンパク質試料に使用されたため、ＨＲＰが結合シグナルに寄与する潜在能力を考慮するために、ＨＲＰ標識陰性対照もまた用いることが良識的であった。ＨＲＰコンジュゲート化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質はおよそ１５４ｋＤａであり、ＨＲＰコンジュゲート化ストレプトアビジンはおよそ１０４ｋＤａである。２つのタンパク質は従って、相対的に類似のサイズであり、どちらもＨＲＰ標識を含有し、２つの間の優れた比較が可能であった。式２：
（式中、ＹＬＯＤは、Ｙ軸パラメータ（正規化Ｒｃｔ）の検出限界であり、Ｙｉはデータの線形回帰から得られるｙ切片であり、ＳＤｉはｙ切片の付随する標準偏差である）
を用いて、検出のＹ軸限界の指標（ＬＯＤ）を計算した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＨＲＰコンジュゲート化スパイクタンパク質の正規化Ｒｃｔ ＹＬＯＤに関して得られる値は２．１であった（図３Ｄ）。試験した最低濃度シグナルは、この限界の閾値であった。すべての他の濃度は限界より上であった。Ｘ軸の検出限界もまた、線形回帰データから計算した（Ｒ２＝０．９９３４２）。ＹＬＯＤおよび適合線の式を用いると、ＳＡＲ－ＣｏＶ－２ ＨＲＰコンジュゲート化スパイクタンパク質に関して、１．０６ｎｇ／ｍｌのＸＬＯＤが生じた。
【数2】
を用いて、検出のＹ軸限界の指標（ＬＯＤ）を計算した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＨＲＰコンジュゲート化スパイクタンパク質の正規化Ｒｃｔ ＹＬＯＤに関して得られる値は２．１であった（図３Ｄ）。試験した最低濃度シグナルは、この限界の閾値であった。すべての他の濃度は限界より上であった。Ｘ軸の検出限界もまた、線形回帰データから計算した（Ｒ２＝０．９９３４２）。ＹＬＯＤおよび適合線の式を用いると、ＳＡＲ－ＣｏＶ－２ ＨＲＰコンジュゲート化スパイクタンパク質に関して、１．０６ｎｇ／ｍｌのＸＬＯＤが生じた。
【0040】
ＨＲＰコンジュゲート化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質（陽性）対ＩＬ－６（陰性）。陽性対照に関して用いたものと等しい濃度（１、５、１０、５０、１００ｎｇ／ｍｌ）のタンパク質ＩＬ－６（２６ｋＤａ）を用いて、第二の陰性対照を調べた。ＩＬ－６は、正常環境下、特に運動後に人体中によく見られるマイオカインおよびサイトカインである。ＩＬ－６は、細菌およびウイルス感染を含む多数の疾患において、炎症および免疫効果を有する。ＩＬ－６は、ＣＯＶＩＤ－１９の多くの進行した症例で観察される「サイトカインストーム」において上昇したレベルで存在することが示されてきている。従って、特異的ウイルス検出に影響を及ぼしうるアーチファクトの潜在的な供給源に相当し、従って、陰性対照として選択された。今回、各対照群は、単一のボードを陽性および陰性セクションに分ける代わりに、単一のＰＣＢアレイを用いた。これは、両群に関して、収集されるデータ量をｎ＝４からｎ＝８に増加させた。増加する濃度に関するＨＲＰコンジュゲート化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質反応は再び、連続して増加することが示された（図４Ａ）。これはまた、最低濃度の２４．４％から最高濃度の３００％の範囲のＲｃｔパーセント変化からも明らかであった（図４Ｂ、赤）。これは再び、ＨＲＰコンジュゲート化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質がＰＦＤＴ－ＡＣＥ２複合体に結合していることを示した。陰性対照ＩＬ－６は、１０および５０ｎｇ／ｍｌで、類似の５７％および５９％のより小さいパーセント増加を示した（図４Ｂ、青）。平均は、最低濃度の１４％から最高濃度の７７％の範囲であった。１、５０および１００ｎｇ／ｍｌ濃度の陽性および陰性対照の間で、同様の相違があった（図４Ｃ）。陽性データ（図４Ｂおよび４Ｃ）は、以前示された増加する用量依存性の振る舞いを示した。陰性データは、小さい平均パーセント変化と一致して、ゆっくりと増加した（図４Ｂ）。これらの結果は、ＨＲＰコンジュゲート化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質が、成功裡にかつ特異的に検出され、陰性ＩＬ－６シグナルは抑制されており、再び、フルオラスＳＡＭから生じる抗バイオファウリング特性が示唆された。用いるＩＬ－６濃度が、ＣＯＶＩＤ－１９患者で検出されるＩＬ－６レベルよりも１０３～１０５倍高いことに注目することが重要である。急性呼吸器促拍症候群（ＡＲＤＳ）に進行した患者は、７．３９ｐｇ／ｍＬの中央値を有し２２、死亡した患者は、１１．４ｐｇ／ｍＬの中央値を有した２３。この実験は、臨床ＣＯＶＩＤ－１９試料において見られるものをはるかに超える混入レベルでの区別を示すことが可能であった。正規化Ｒｃｔ ＹＬＯＤは１．２１であることが見出され（図４Ｄ）、これは、以前のセクションで報告されるもの（ＹＬＯＤ＝２．１）よりもわずかに改善された。１ｎｇ／ｍｌ濃度データポイントのみがこの限界と交差することから、１ｎｇ／ｍｌは、明らかな検出のための信頼可能な値ではない可能性が示唆される。しかし、濃度ＸＬＯＤは１．６８ｎｇ／ｍｌであることが見出された（Ｒ２＝０．９９）。
【0041】
不活性化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２検出。スパイクタンパク質リガンドが陰性対照タンパク質の存在下で、ＡＣＥ２受容体に特異的に結合可能であることが示されたため、焦点をウイルス検出に変更した。不活性化全ウイルスの一連の希釈（１０２、１０３、１０４、１０５および１０６ｄＣ／ｍｌ）を、同じ分子標準キット由来であり、複雑な臨床試料を模倣するため、「輸送媒体（ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｍｅｄｉｕｍ）」中に溶解細胞およびタンパク質を含有する、未希釈陰性対照試料に対して試験した。インキュベーションは、一貫して増加するＲｃｔを生じた（図５Ａ）。陽性対照に関する平均パーセント変化（ｎ＝７）は、最低の１０６％から二番目に高い濃度の２１１％の範囲であった（図５Ａ、赤）。最高の濃度は、２１１％から１６８％への減少を示した。これはおそらく、ウイルスまたはウイルス＋ＡＣＥ２複合体の除去、あるいは連続する実験を通じた、多量のウイルスの存在から生じるＳＡＭの続く再配置（ｒｅｏｒｄｅｒｉｎｇ）または吸収によるものである。類似の効果が本発明者らのグループ内の他の研究で見られている（非公開データ）。陰性対照は、同じバックグラウンド輸送媒体に加えて、陽性対照としてのヒト細胞を含有するが、全ウイルスを欠いた。実際の濃度および組成は、業者によって提供されていないが、試料は臨床ヒト標本の代わりとなると言及され、定量化データはｍＬあたりのデジタルコピー（ｄＣ／ｍＬ）の形で供給された。第一の陰性試料は第一の陽性対照と同時に適用され、同じ処理を経た。第二の陰性適用は、第二の陽性と同じ時点で行われた。必要な試料体積に対して、供給される体積が少ないため、２回の陰性処理のみ可能であった。どちらの陰性反応も、１１４．４％および１１３．９％のほぼ同一の平均パーセント変化を示した（図５Ｂ、青）。これは、バックグラウンド溶液が、高いシグナルを生じるが、直ちに飽和することを示した。対照的に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を含有する試料からのシグナルは、ウイルス濃度の増加とともに増え続けた。正規化データは、１０２および１０３ｄＣ／ｍｌ濃度が陰性と有意に異ならないが、１０４、１０５および１０６ｄＣ／ｍｌは有意に異なるようであることを示した（図５Ｃ）。このデータは、ウイルスがＡＣＥ２受容体に特異的に結合し、１０４ｄＣ／ｍｌ以上で陰性から区別可能であることを示した。臨床レベルは１０４～１０１１ ＲＮＡコピー／ｍｌの範囲である２５，２６。これは提示される区別可能領域内である。センサー自体の性能は、１．８３の正規化Ｒｃｔ ＹＬＯＤによって示された（図５Ｄ）。この限界と交差するデータポイントはなく、最低の１０２濃度が検出成功であることが示された。ＸＬＯＤは、３７．８ｄＣ／ｍｌであった（Ｒ２＝０．９６０６４）。従って、センサーは、試験した全範囲に渡って検出する性能を有し、陽性対陰性シグナル比が改善されるならば、より低い濃度を区別する潜在能力を有する。不活性化ウイルスでの試験の結果は、非常に説得力があった：まず、ウイルスを６５℃で３０分間加熱し、ガンマ照射したため、その三次元構造は有意に破壊されており、陽性および陰性ウイルス試料は、ウイルスを産生する細胞を培養するために用いられる複雑な培地中に存在し、従って、唾液および血清などの他の生物学的媒体と類似性があった。３０分間のインキュベーション時間は、説得力があるシグナル増加を提供し、これは、特に判断基準である核酸増幅検出と比較して、測定が比較的迅速であることを意味する。最後に、アッセイプロトコルの最適化にはかなりの余地があり、例えばウイルスインキュベーション工程の短縮化、および識別力を最大化するため、洗浄法の最適化がある。
【0042】
結論
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に関する試料の調製および試験、ならびに容易に産生される電気化学バイオセンサーを示した。センサーは、層内に疎水性に吸収されるＡＣＥ２を含む、完全にＰＦＤＴで構成される、基盤ＳＡＭからなる。ＨＲＰコンジュゲート化スパイクタンパク質（陽性）ならびにＨＲＰコンジュゲート化ストレプトアビジンおよびＩＬ－６（陰性）の溶液を用いて、高感度、特異的および用量依存方式で、ウイルススパイクタンパク質を検出することが可能であった。複雑な媒体（細胞培養溶解物）中に存在する不活性化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出および区別は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の有用なバイオセンサーに必要な、感度、特異性および生物学的ファウリングに対する耐性を確実にすることが立証された。センサーを調製可能な容易さおよび調製工程の大量製造技術との適合性は、アッセイが存在する商業的バイオセンサー形式に潜在的に採用可能であることを意味する。これは、ＣＯＶＩＤ－１９パンデミックを制御するための努力の中核をなす、試験センターでの診断を伴う集団の迅速な試験、接触の追跡およびトレーシングのためのポイントオブケアアッセイの広い流通を可能にする。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に関する試料の調製および試験、ならびに容易に産生される電気化学バイオセンサーを示した。センサーは、層内に疎水性に吸収されるＡＣＥ２を含む、完全にＰＦＤＴで構成される、基盤ＳＡＭからなる。ＨＲＰコンジュゲート化スパイクタンパク質（陽性）ならびにＨＲＰコンジュゲート化ストレプトアビジンおよびＩＬ－６（陰性）の溶液を用いて、高感度、特異的および用量依存方式で、ウイルススパイクタンパク質を検出することが可能であった。複雑な媒体（細胞培養溶解物）中に存在する不活性化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出および区別は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の有用なバイオセンサーに必要な、感度、特異性および生物学的ファウリングに対する耐性を確実にすることが立証された。センサーを調製可能な容易さおよび調製工程の大量製造技術との適合性は、アッセイが存在する商業的バイオセンサー形式に潜在的に採用可能であることを意味する。これは、ＣＯＶＩＤ－１９パンデミックを制御するための努力の中核をなす、試験センターでの診断を伴う集団の迅速な試験、接触の追跡およびトレーシングのためのポイントオブケアアッセイの広い流通を可能にする。
【0043】
提示されるセンサーはＥＩＳを使用して、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質、ならびに完全に検証された分子標準キット由来の不活性化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の陽性及び陰性試料の溶液からの結合を検出する。センサー設計の利点は、結果が標識不含方式で生じうることであり（すなわちアッセイ工程中に蛍光または電気化学標識を添加する必要がない）、試験は唾液中のウイルス粒子を測定するように設計され、従って、感染後の残渣ウイルスＲＮＡを検出する可能性はなく、重大なことに、センサーは、２つの試料産生工程：（１）容易なＳＡＭ形成および（２）ＡＣＥ２官能化でのアップスケーリングおよび製造の容易さのために設計されている。作業において、アッセイは、低コストの８作業電極ＰＣＢセンサー系に関して立証されるが、アッセイはさらにより大量製造可能なプラットフォーム、例えばスクリーン印刷デバイスまたはグルコース形式試験ストリップなどに導入されてもよい。重要なことに、これは、よく確立された大容量産生環境との統合を解き放ち、広範囲の迅速な必要とされる地点での使用に関する潜在能力を持つ診断につながる。
【0044】
参考文献
【0045】
【表1-1】
【表1-2】
【表1-3】
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【国際調査報告】