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特表2023-551790組換え微生物、その調製方法及びタガトースの生産におけるその使用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-12-13
(54)【発明の名称】組換え微生物、その調製方法及びタガトースの生産におけるその使用
(51)【国際特許分類】
C12N 1/19 20060101AFI20231206BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20231206BHJP
C12N 15/54 20060101ALI20231206BHJP
C12N 15/61 20060101ALI20231206BHJP
C12P 19/02 20060101ALI20231206BHJP
C12N 9/16 20060101ALI20231206BHJP
C12N 9/12 20060101ALI20231206BHJP
C12N 9/90 20060101ALI20231206BHJP
C12N 15/55 20060101ALI20231206BHJP
【ＦＩ】
C12N1/19 ZNA
C12N1/21
C12N15/54
C12N15/61
C12P19/02
C12N9/16 B
C12N9/12
C12N9/90
C12N15/55
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023528015
(86)(22)【出願日】2021-10-18
(85)【翻訳文提出日】2023-05-02
(86)【国際出願番号】 CN2021124427
(87)【国際公開番号】W WO2022095684
(87)【国際公開日】2022-05-12
(31)【優先権主張番号】202011224203.0
(32)【優先日】2020-11-05
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】517265912
【氏名又は名称】中国科学院天津工業生物技術研究所
(71)【出願人】
【識別番号】523166348
【氏名又は名称】天工生物科技（天津）有限公司
(74)【代理人】
【識別番号】100120891
【弁理士】
【氏名又は名称】林 一好
(74)【代理人】
【識別番号】100165157
【弁理士】
【氏名又は名称】芝 哲央
(74)【代理人】
【識別番号】100205659
【弁理士】
【氏名又は名称】齋藤 拓也
(74)【代理人】
【識別番号】100126000
【弁理士】
【氏名又は名称】岩池 満
(74)【代理人】
【識別番号】100185269
【弁理士】
【氏名又は名称】小菅 一弘
(72)【発明者】
【氏名】馬 延和
(72)【発明者】
【氏名】シー ティン
(72)【発明者】
【氏名】宋 雲洪
(72)【発明者】
【氏名】チャン ティン
(72)【発明者】
【氏名】李 運杰
【テーマコード（参考）】
4B064
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B064AF02
4B064CC24
4B064DA03
4B064DA10
4B065AA19X
4B065AA24X
4B065AA26X
4B065AA26Y
4B065AA30X
4B065AA80X
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA20
4B065CA41
4B065CA44
(57)【要約】
遺伝子工学的に改変された組み換え微生物及びタガトースの生産におけるその使用、該組み換え微生物の調製方法、並びに、タガトース生産菌株及びタガトースの生産方法を提供する。該組み換え微生物は、グルコース又はグリセロールとグルコースを基質としてタガトースを生産することを可能とし、転化によるタガトースの生産効率が高く、多酵素精製プロセスのステップを不要としない。
【選択図】図１
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
組換え微生物であって、前記組換え微生物は野生型微生物と比べて、
（ａ）低下又は解消したホスホトランスフェラーゼ系（ｐｈｏｓｐｈｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｓｙｓｔｅｍ）のグルコース特異的トランスファータンパク質のタンパク質活性及び／又はそのコード遺伝子の発現レベル
（ｂ）向上させたタガトース－６－リン酸エピメラーゼ（ｔａｇａｔｏｓｅ－６－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｅｐｉｍｅｒａｓｅ）の酵素活性及び／又はそのコード遺伝子の発現レベル
（ｃ）向上させたタガトース－６－リン酸ホスファターゼ（ｔａｇａｔｏｓｅ－６－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）の酵素活性及び／又はそのコード遺伝子の発現レベルの少なくとも１つに示される特徴を有する、前記組換え微生物。
【請求項2】
前記グルコース特異的トランスファータンパク質は、（ａ１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示されるアミノ酸配列を含み、かつグルコース特異的トランスファータンパク質活性を有するポリペプチド（ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）、
（ａ２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示されるアミノ酸配列について１つ又は複数のアミノ酸を置換、反復、欠失又は追加し、かつグルコース特異的トランスファータンパク質活性を有するポリペプチド、
（ａ３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示されるヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドのいずれか１項に示される群から選択され、
好ましくは、前記タガトース－６－リン酸エピメラーゼは、
（ｂ１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に示されるアミノ酸配列を含み、かつタガトース－６－リン酸エピメラーゼ活性を有するポリペプチド、
（ｂ２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に示されるアミノ酸配列について１つ又は複数のアミノ酸を置換、反復、欠失又は追加し、かつタガトース－６－リン酸エピメラーゼ活性を有するポリペプチド、
（ｂ３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に示されるヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドのいずれか１つに示される群から選択され、
好ましくは、前記タガトース－６－リン酸ホスファターゼは、
（ｃ１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５４に示されるアミノ酸配列を含み、かつタガトース－６－リン酸ホスファターゼ活性を有するポリペプチド、
（ｃ２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５４に示されるアミノ酸配列について１つ又は複数のアミノ酸を置換、反復、欠失又は追加し、かつタガトース－６－リン酸ホスファターゼ活性を有するポリペプチド、
（ｃ３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５５に示されるヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドのいずれか１つに示される群から選択される請求項１に記載の組換え微生物。
【請求項3】
前記組換え微生物は野生型微生物と比べて、（ｄ）向上させたグルコキナーゼ（ｇｌｕｃｏｋｉｎａｓｅ）の酵素活性及び／又はそのコード遺伝子の発現レベル、
（ｅ）向上させたグルコース－６－リン酸イソメラーゼ（ｇｌｕｃｏｓｅ－６－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ）の酵素活性及び／又はそのコード遺伝子の発現レベル、
（ｆ）低下又は解消したフルクトース－６－リン酸キナーゼ（ｆｒｕｃｔｏｓｅ－６－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｋｉｎａｓｅ）の酵素活性及び／又はそのコード遺伝子の発現レベル、
（ｇ）低下又は解消したピルビン酸キナーゼ（ｐｙｒｕｖａｔｅ ｋｉｎａｓｅ）の酵素活性及び／又はそのコード遺伝子の発現レベル、
（ｈ）低下又は解消したホスホグルコムターゼ（ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｕｃｏｍｕｔａｓｅ）の酵素活性及び／又はそのコード遺伝子の発現レベル、
（ｉ）低下又は解消したグルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ（ｇｌｕｃｏｓｅ－６－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）の酵素活性及び／又はそのコード遺伝子の発現レベル、
（ｊ）低下又は解消したＨＰｒキナーゼ（ｋｉｎａｓｅ）の酵素活性及び／又はそのコード遺伝子の発現レベルの少なくとも１つに示される特徴をさらに有する
請求項１又は２に記載の組換え微生物。
【請求項4】
前記グルコキナーゼは、（ｄ１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１に示されるアミノ酸配列を含み、かつグルコキナーゼ活性を有するポリペプチド、
（ｄ２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１に示されるアミノ酸配列について１つ又は複数のアミノ酸を置換、反復、欠失又は追加し、かつグルコキナーゼ活性を有するポリペプチド、
（ｄ３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に示されるヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドのいずれか１つに示される群から選択され、
好ましくは、前記グルコース－６－リン酸イソメラーゼは、
（ｅ１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５に示されるアミノ酸配列を含み、かつグルコース－６－リン酸イソメラーゼ活性を有するポリペプチド、
（ｅ２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５に示されるアミノ酸配列について１つ又は複数のアミノ酸を置換、反復、欠失又は追加し、かつグルコース－６－リン酸イソメラーゼ活性を有するポリペプチド、
（ｅ３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６に示されるヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドのいずれか１つに示される群から選択される
請求項３に記載の組換え微生物。
【請求項5】
前記組換え微生物は、大腸菌、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、乳酸菌又はサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に由来する請求項１～４のいずれか１項に記載の組換え微生物。
【請求項6】
野生型微生物内のホスホトランスフェラーゼ系のグルコース特異的トランスファータンパク質のコード遺伝子に対して遺伝子ノックアウト又はノックダウンを行うステップと、タガトース－６－リン酸エピメラーゼ及びタガトース－６－リン酸ホスファターゼを発現させる組換え発現ベクターを前記組換え微生物に導入するステップ、又は、前記タガトース－６－リン酸エピメラーゼ及び前記タガトース－６－リン酸ホスファターゼをそれぞれ発現させる組換え発現ベクターを前記組換え微生物に導入するステップと、を含む
請求項１～５のいずれか１項に記載の組換え微生物の調製方法。
【請求項7】
前記組換え微生物内のグルコキナーゼのコード遺伝子の発現レベルを向上させるステップと、前記組換え微生物内のグルコース－６－リン酸イソメラーゼのコード遺伝子の発現レベルを向上させるステップと、
前記組換え微生物内のフルクトース－６－リン酸キナーゼのコード遺伝子をノックアウト又はノックダウンするステップと、
前記組換え微生物内のピルビン酸キナーゼのコード遺伝子をノックアウト又はノックダウンするステップと、
前記組換え微生物内のホスホグルコムターゼのコード遺伝子をノックアウト又はノックダウンするステップと、
前記組換え微生物内のグルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼのコード遺伝子をノックアウト又はノックダウンするステップと、
前記組換え微生物内のＨＰｒキナーゼのコード遺伝子をノックアウト又はノックダウンするステップとの少なくとも１つをさらに含む請求項６に記載の調製方法。
【請求項8】
請求項１～５のいずれか１項に記載の組換え微生物、又は請求項６又は７に記載の方法で調製された組換え微生物の、タガトースの生産における使用。
【請求項9】
タガトース生産菌株であって、前記タガトース生産菌株は、請求項１～５のいずれか１項に記載の組換え微生物、又は請求項６又は７に記載の方法で調製された組換え微生物である、前記タガトース生産菌株。
【請求項10】
前記タガトース生産菌株は、グルコース又はグルコースとグリセロール（ｇｌｙｃｅｒｏｌ）を基質とし、好ましくは、前記タガトース生産菌株は大腸菌、コリネバクテリウム・グルタミカム、枯草菌、乳酸菌又はサッカロマイセス・セレビシエに由来する
請求項９に記載のタガトース生産菌株。
【請求項11】
タガトースの生産方法であって、グルコース又はグルコースとグリセロールを基質とし、請求項１～５のいずれか１項に記載の組換え微生物、請求項６又は７に記載の方法で調製された組換え微生物、又は請求項９～１０のいずれか１項に記載のタガトース生産菌株を利用して発酵反応を行うステップを含む、前記タガトースの生産方法。
【請求項12】
前記発酵反応終了後、前記発酵反応液からタガトースを分離するステップをさらに含む請求項１１に記載のタガトースの生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本開示は、生物技術及び遺伝子工学の技術分野に属し、具体的には、組換え微生物、組換え微生物の調製方法及びタガトースの生産におけるその使用、並びにタガトース生産菌株及びタガトースの生産方法に関する。
【背景技術】
【0002】
タガトース（Ｔａｇａｔｏｓｅ）は天然に存在する希少なケトヘキソース（ｋｅｔｏｈｅｘｏｓｅ）であり、アルドースのガラクトース（ａｌｄｏｓｅ ｇａｌａｃｔｏｓｅ）の同分異性体でありながら、フルクトースのエピマー（ｅｐｉｍｅｒ）でもある。タガトースは甘味特性がショ糖に似ており、カロリーがショ糖の３分の１程度で、低カロリー甘味料と呼ばれている。天然のタガトースは主に酸乳や粉ミルクなどの乳製品に含まれている。タガトースは、非常に新鮮でピュアな甘さを提供し、フルクトースに似た味の特徴を持つ。研究により、タガトースは低カロリー、低糖質指数、抗虫歯、抗酸化、プレバイオティクス（Ｐｒｅｂｉｏｔｉｃｓ）、腸管機能改善、免疫調節、薬物前駆体（Ｐｒｏｄｒｕｇ）などの重要な生理機能を持ち、食品、飲料、医薬、健康維持などの分野に広く応用でき、巨大な経済価値を持つ［１］。
【0003】
現在、タガトースの生産方法には主に化学合成法と生物転化法の２種類がある。化学合成法は、主としてガラクトース（ｇａｌａｃｔｏｓｅ）を原料とし、アルカリ金属塩を触媒としてガラクトースを異性化してタガトース－金属水酸化物複合体沈殿を生成し、次に、酸を用いて中和してタガトースを得ることである。化学合成法は、エネルギー消費量が多く、副反応が多く、産物が複雑であるため、タガトースの分離と精製の過程が困難であり、酸、アルカリ、金属イオンの排出により化学汚染も生じやすい。
【0004】
化学合成法に比べ、生物転化法は、転化効率が高く、特異性が強く、副産物が少なく、精製ステップが簡単であるため、タガトースを生産する主要な手段となっている。生物転化法は、主にガラクチトール（Ｇａｌａｃｔｉｔｏｌ）又はガラクトースを原料とし、酵素又は微生物の触媒作用により対応する基質をタガトースに転化することである。しかし、ガラクチトールは、価格が高く、しかも入手されにくいため、工業的生産の原料として使用するのに適さない。ガラクトースを原料とし、異性化、脱塩、脱色、分離、濃縮、結晶化などのステップを経てタガトース純品を製造することはタガトースの主流の生産方法である。しかし、ガラクトースは完全にタガトースに転化できず、最終的に得られた産物はガラクトースとタガトースの混合物であり、複雑な分離プロセスによりそこからタガトース純品を分離する必要があり、プロセスの難度とコストを増加させ、一方、ガラクトースの価格が高いことの影響により、タガトースの生産コストが高くなっている［２－４］。そのため、どのようにタガトースの転化効率を確保すると同時に、タガトースを生産するプロセスのコストと難度を下げることは、現在解決すべき重要な課題である。
【0005】
特許文献１には、多酵素触媒転化によるタガトースの生産方法が開示されており、触媒用酵素は、ホスホフルクトキナーゼ（ｆｒｕｃｔｏｋｉｎａｓｅ）、６－ホスホタガートエピメラーゼ（６－ＰｈｏｓｐｈｏＴａｇａｔｏ ｅｐｉｍｅｒａｓｅ）、６－ホスホタガートホスファターゼ（６－ＰｈｏｓｐｈｏＴａｇａｔｏ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）であり、フルクトースをタガトースに転化することができる。しかし、ホスホフルクトキナーゼがフルクトースをフルクトース６－リン酸（ｆｒｕｃｔｏｓｅ ６－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）に転化する過程を触媒するには、追加のＡＴＰを添加して、フルクトースに対して基質リン酸化を行う必要があるため、高価なＡＴＰを添加すると、タガトースの生産コストが高くなり、工業的な生産価値がない。
【0006】
特許文献２には、改良されたヘキスロン酸Ｃ４－エピメラーゼ（Ｈｅｘｕｒｏｎａｔｅ Ｃ４－ｅｐｉｍｅｒａｓｅ）転化活性を有するヘキスロン酸Ｃ４－エピメラーゼ変異体が開示されており、ヘキスロン酸Ｃ４－エピメラーゼ変異体はフルクトースをタガトースに転化することができる。しかし、改変されたヘキスロン酸Ｃ４－エピメラーゼ変異体は依然として活性が低く、タガトースの転化効率が低く、工業的生産の需要を満たすことができないという問題がある。
【0007】
特許文献３には、デンプン、マルトデキストリン（ｍａｌｔｏｄｅｘｔｒｉｎ）、スクロース等を基質として、これらを転化してタガトースを生産するプロセスに有用であるタガトース－６－リン酸ホスファターゼ（ｔａｇａｔｏｓｅ－６－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）が開示されている。しかし、このタガトース－６－リン酸ホスファターゼは依然として酵素活性が低く、実際の工業的生産における利用価値が低いという問題がある。
【0008】
特許文献４には、タガトースの調製方法が開示されており、デンプン又はデンプン誘導体を基質とし、α－グルカンホスホリラーゼ（ａ－ｇｌｕｃａｎ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）、ホスホグルコムターゼ（Ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｕｃｏｍｕｔａｓｅ）、ホスホグルコースイソメラーゼ（Ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｕｃｏｓｅ ｉｓｏｍａｒａｓｅ）、タガトース－６－リン酸エピメラーゼ、タガトース－６－リン酸ホスファターゼ及び無機リン酸根イオンを添加して、多酵素分子マシンを構築し、多酵素触媒反応を行い、タガトースを得る。引用文献４の調製方法は、原料の転化率とタガトースの収率を向上させるが、タガトースを合成した後には複数の酵素の混合液からタガトースを精製する必要があり、精製プロセスのステップの数を増加し、その難度を向上させる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0009】
【非特許文献1】［１］ Ｏｈ Ｄ－Ｋ： Ｔａｇａｔｏｓｅ： ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ａｎｄ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ． Ａｐｐ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２００７，７６：１－８．
【非特許文献2】［２］ Ｒｈｉｍｉ Ｍ，Ａｇｈａｊａｒｉ Ｎ，Ｊｕｙ Ｍ，Ｃｈｏｕａｙｅｋｈ Ｈ，Ｍａｇｕｉｎ Ｅ，Ｈａｓｅｒ Ｒ，Ｂｅｊａｒ Ｓ： Ｒａｔｉｏｎａｌ ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＵＳ１００ｌ－ａｒａｂｉｎｏｓｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ： Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｄ－ｔａｇａｔｏｓｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ． Ｂｉｏｃｈｉｍ． ２００９，９１：６５０－６５３．
【非特許文献3】［３］ Ｏｈ Ｈ－Ｊ，Ｋｉｍ Ｈ－Ｊ，Ｏｈ Ｄ－Ｋ： Ｉｎｃｒｅａｓｅ ｉｎ ｄ－ｔａｇａｔｏｓｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｂｙ ｓｉｔｅ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ ｌ－ａｒａｂｉｎｏｓｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ ｆｒｏｍ Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｅｒｍｏｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｌｅｔｔ． ２００６，２８：１４５－１４９．
【非特許文献4】［４］ Ｂｏｓｓｈａｒｔ Ａ，Ｈｅｅ ＣＳ，Ｂｅｃｈｔｏｌｄ Ｍ，Ｓｃｈｉｒｍｅｒ Ｔ，Ｐａｎｋｅ Ｓ： Ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｄｉｖｅｒｇｅｎｔ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ Ｄ－ｔａｇａｔｏｓｅ ｅｐｉｍｅｒａｓｅ ｔｏｗａｒｄｓ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｆｏｒ ｔｗｏ ｈｅｘｏｓｅ ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ． ＣｈｅｍＢｉ℃ｈｅｍ ２０１５，１６：５９２－６０１．
【特許文献】
【0010】
【特許文献1】ＷＯ２０１５０１６５４４Ａ１
【特許文献2】ＣＮ１０９４１５７１５Ａ
【特許文献3】ＷＯ２０１８００４３１０Ａ１
【特許文献4】ＣＮ１０６３９９４２７Ａ
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0011】
従来技術に存在する技術的課題、例えば、原料コストが高く、転化率が低く、多酵素精製ステップが必要であり、タガトースの生産プロセスが複雑であるという従来のタガトースの生産方法に存在する欠陥に鑑み、本開示は、グリセロール（ｇｌｙｃｅｒｏｌ）とグルコースを基質として転化し、タガトースを生産することができ、しかも、転化効率が高く、環境にやさしく、多酵素精製を必要とせず、生産コストが低いような利点があり、タガトースの工業的生産に好適である組換え微生物を提供する。
【課題を解決するための手段】
【0012】
（１）組換え微生物であって、
前記組換え微生物は野生型微生物と比べて、
（ａ）低下又は解消したホスホトランスフェラーゼ系（ｐｈｏｓｐｈｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｓｙｓｔｅｍ）のグルコース特異的トランスファータンパク質のタンパク質活性及び／又はそのコード遺伝子の発現レベル、
（ｂ）向上させたタガトース－６－リン酸エピメラーゼ（ｔａｇａｔｏｓｅ－６－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｅｐｉｍｅｒａｓｅ）の酵素活性及び／又はそのコード遺伝子の発現レベル、
（ｃ）向上させたタガトース－６－リン酸ホスファターゼ（ｔａｇａｔｏｓｅ－６－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）の酵素活性及び／又はそのコード遺伝子の発現レベルの少なくとも１つに示される特性を有する。
前記組換え微生物は野生型微生物と比べて、
（ａ）低下又は解消したホスホトランスフェラーゼ系（ｐｈｏｓｐｈｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｓｙｓｔｅｍ）のグルコース特異的トランスファータンパク質のタンパク質活性及び／又はそのコード遺伝子の発現レベル、
（ｂ）向上させたタガトース－６－リン酸エピメラーゼ（ｔａｇａｔｏｓｅ－６－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｅｐｉｍｅｒａｓｅ）の酵素活性及び／又はそのコード遺伝子の発現レベル、
（ｃ）向上させたタガトース－６－リン酸ホスファターゼ（ｔａｇａｔｏｓｅ－６－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）の酵素活性及び／又はそのコード遺伝子の発現レベルの少なくとも１つに示される特性を有する。
【0013】
（２）前記グルコース特異的トランスファータンパク質は、
（ａ１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示されるアミノ酸配列を含み、かつグルコース特異的トランスファータンパク質活性を有するポリペプチド（ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）、
（ａ２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示されるアミノ酸配列について１つ又は複数のアミノ酸を置換、反復、欠失又は追加し、かつグルコース特異的トランスファータンパク質活性を有するポリペプチド、
（ａ３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示されるヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドのいずれか１つに示される群から選択され、
好ましくは、前記タガトース－６－リン酸エピメラーゼは、
（ｂ１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に示されるアミノ酸配列を含み、かつタガトース－６－リン酸エピメラーゼ活性を有するポリペプチド、
（ｂ２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に示されるアミノ酸配列について１つ又は複数のアミノ酸を置換、反復、欠失又は追加し、かつタガトース－６－リン酸エピメラーゼ活性を有するポリペプチド、
（ｂ３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に示されるヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドのいずれか１つに示される群から選択され、
好ましくは、前記タガトース－６－リン酸ホスファターゼは、
（ｃ１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５４に示されるアミノ酸配列を含み、かつタガトース－６－リン酸ホスファターゼ活性を有するポリペプチド、
（ｃ２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５４に示されるアミノ酸配列について１つ又は複数のアミノ酸を置換、反復、欠失又は追加し、かつタガトース－６－リン酸ホスファターゼ活性を有するポリペプチド、
（ｃ３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５５に示されるヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドのいずれか１つに示される群から選択される（１）に記載の組換え微生物。
（ａ１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示されるアミノ酸配列を含み、かつグルコース特異的トランスファータンパク質活性を有するポリペプチド（ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）、
（ａ２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示されるアミノ酸配列について１つ又は複数のアミノ酸を置換、反復、欠失又は追加し、かつグルコース特異的トランスファータンパク質活性を有するポリペプチド、
（ａ３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示されるヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドのいずれか１つに示される群から選択され、
好ましくは、前記タガトース－６－リン酸エピメラーゼは、
（ｂ１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に示されるアミノ酸配列を含み、かつタガトース－６－リン酸エピメラーゼ活性を有するポリペプチド、
（ｂ２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に示されるアミノ酸配列について１つ又は複数のアミノ酸を置換、反復、欠失又は追加し、かつタガトース－６－リン酸エピメラーゼ活性を有するポリペプチド、
（ｂ３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に示されるヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドのいずれか１つに示される群から選択され、
好ましくは、前記タガトース－６－リン酸ホスファターゼは、
（ｃ１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５４に示されるアミノ酸配列を含み、かつタガトース－６－リン酸ホスファターゼ活性を有するポリペプチド、
（ｃ２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５４に示されるアミノ酸配列について１つ又は複数のアミノ酸を置換、反復、欠失又は追加し、かつタガトース－６－リン酸ホスファターゼ活性を有するポリペプチド、
（ｃ３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５５に示されるヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドのいずれか１つに示される群から選択される（１）に記載の組換え微生物。
【0014】
（３）前記組換え微生物は野生型微生物と比べて、
（ｄ）向上させたグルコキナーゼ（ｇｌｕｃｏｋｉｎａｓｅ）の酵素活性及び／又はそのコード遺伝子の発現レベル、
（ｅ）向上させたグルコース－６－リン酸イソメラーゼ（ｇｌｕｃｏｓｅ－６－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ）の酵素活性及び／又はそのコード遺伝子の発現レベル、
（ｆ）低下又は解消したフルクトース－６－リン酸キナーゼ（ｆｒｕｃｔｏｓｅ－６－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｋｉｎａｓｅ）の酵素活性及び／又はそのコード遺伝子の発現レベル、
（ｇ）低下又は解消したピルビン酸キナーゼ（ｐｙｒｕｖａｔｅ ｋｉｎａｓｅ）の酵素活性及び／又はそのコード遺伝子の発現レベル、
（ｈ）低下又は解消したホスホグルコムターゼ（ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｕｃｏｍｕｔａｓｅ）の酵素活性及び／又はそのコード遺伝子の発現レベル、
（ｉ）低下又は解消したグルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ（ｇｌｕｃｏｓｅ－６－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）の酵素活性及び／又はそのコード遺伝子の発現レベル、
（ｊ）低下又は解消したＨＰｒキナーゼ（ｋｉｎａｓｅ）の酵素活性及び／又はそのコード遺伝子の発現レベルの少なくとも１つに示される特徴をさらに有する（１）又は（２）に記載の組換え微生物。
（ｄ）向上させたグルコキナーゼ（ｇｌｕｃｏｋｉｎａｓｅ）の酵素活性及び／又はそのコード遺伝子の発現レベル、
（ｅ）向上させたグルコース－６－リン酸イソメラーゼ（ｇｌｕｃｏｓｅ－６－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ）の酵素活性及び／又はそのコード遺伝子の発現レベル、
（ｆ）低下又は解消したフルクトース－６－リン酸キナーゼ（ｆｒｕｃｔｏｓｅ－６－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｋｉｎａｓｅ）の酵素活性及び／又はそのコード遺伝子の発現レベル、
（ｇ）低下又は解消したピルビン酸キナーゼ（ｐｙｒｕｖａｔｅ ｋｉｎａｓｅ）の酵素活性及び／又はそのコード遺伝子の発現レベル、
（ｈ）低下又は解消したホスホグルコムターゼ（ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｕｃｏｍｕｔａｓｅ）の酵素活性及び／又はそのコード遺伝子の発現レベル、
（ｉ）低下又は解消したグルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ（ｇｌｕｃｏｓｅ－６－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）の酵素活性及び／又はそのコード遺伝子の発現レベル、
（ｊ）低下又は解消したＨＰｒキナーゼ（ｋｉｎａｓｅ）の酵素活性及び／又はそのコード遺伝子の発現レベルの少なくとも１つに示される特徴をさらに有する（１）又は（２）に記載の組換え微生物。
【0015】
（４）前記グルコキナーゼは、
（ｄ１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１に示されるアミノ酸配列を含み、かつグルコキナーゼ活性を有するポリペプチド、
（ｄ２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１に示されるアミノ酸配列について１つ又は複数のアミノ酸を置換、反復、欠失又は追加し、かつグルコキナーゼ活性を有するポリペプチド、
（ｄ３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に示されるヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドのいずれか１つに示される群から選択され、
好ましくは、前記グルコース－６－リン酸イソメラーゼは、
（ｅ１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５に示されるアミノ酸配列を含み、かつグルコース－６－リン酸イソメラーゼ活性を有するポリペプチド、
（ｅ２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５に示されるアミノ酸配列について１つ又は複数のアミノ酸を置換、反復、欠失又は追加し、かつグルコース－６－リン酸イソメラーゼ活性を有するポリペプチド、
（ｅ３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６に示されるヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドのいずれか１つに示される群から選択されるポリペプチド（３）に記載の組換え微生物。
（ｄ１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１に示されるアミノ酸配列を含み、かつグルコキナーゼ活性を有するポリペプチド、
（ｄ２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１に示されるアミノ酸配列について１つ又は複数のアミノ酸を置換、反復、欠失又は追加し、かつグルコキナーゼ活性を有するポリペプチド、
（ｄ３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に示されるヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドのいずれか１つに示される群から選択され、
好ましくは、前記グルコース－６－リン酸イソメラーゼは、
（ｅ１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５に示されるアミノ酸配列を含み、かつグルコース－６－リン酸イソメラーゼ活性を有するポリペプチド、
（ｅ２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５に示されるアミノ酸配列について１つ又は複数のアミノ酸を置換、反復、欠失又は追加し、かつグルコース－６－リン酸イソメラーゼ活性を有するポリペプチド、
（ｅ３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６に示されるヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドのいずれか１つに示される群から選択されるポリペプチド（３）に記載の組換え微生物。
【0016】
（５）大腸菌、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、乳酸菌又はサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に由来する（１）～（４）のいずれか１項に記載の組換え微生物。
【0017】
（６）野生型微生物内のホスホトランスフェラーゼ系のグルコース特異的トランスファータンパク質のコード遺伝子に対して遺伝子ノックアウト又はノックダウンを行うステップと、
タガトース－６－リン酸エピメラーゼ及びタガトース－６－リン酸ホスファターゼを発現させる組換え発現ベクターを前記組換え微生物に導入するステップ、又は、前記タガトース－６－リン酸エピメラーゼ及び前記タガトース－６－リン酸ホスファターゼをそれぞれ発現させる組換え発現ベクターを前記組換え微生物に導入するステップと、を含む（１）～（５）のいずれか１項に記載の組換え微生物の調製方法。
タガトース－６－リン酸エピメラーゼ及びタガトース－６－リン酸ホスファターゼを発現させる組換え発現ベクターを前記組換え微生物に導入するステップ、又は、前記タガトース－６－リン酸エピメラーゼ及び前記タガトース－６－リン酸ホスファターゼをそれぞれ発現させる組換え発現ベクターを前記組換え微生物に導入するステップと、を含む（１）～（５）のいずれか１項に記載の組換え微生物の調製方法。
【0018】
（７）前記組換え微生物内のグルコキナーゼのコード遺伝子の発現レベルを向上させるステップと、
前記組換え微生物内のグルコース－６－リン酸イソメラーゼのコード遺伝子の発現レベルを向上させるステップと、
前記組換え微生物内のフルクトース－６－リン酸キナーゼのコード遺伝子をノックアウト又はノックダウンするステップと、
前記組換え微生物内のピルビン酸キナーゼのコード遺伝子をノックアウト又はノックダウンするステップと、
前記組換え微生物内のホスホグルコムターゼのコード遺伝子をノックアウト又はノックダウンするステップと、
前記組換え微生物内のグルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼのコード遺伝子をノックアウト又はノックダウンするステップと、
前記組換え微生物内のＨＰｒキナーゼのコード遺伝子をノックアウト又はノックダウンするステップとの少なくとも１つをさらに含むステップ（６）に記載の調製方法。
前記組換え微生物内のグルコース－６－リン酸イソメラーゼのコード遺伝子の発現レベルを向上させるステップと、
前記組換え微生物内のフルクトース－６－リン酸キナーゼのコード遺伝子をノックアウト又はノックダウンするステップと、
前記組換え微生物内のピルビン酸キナーゼのコード遺伝子をノックアウト又はノックダウンするステップと、
前記組換え微生物内のホスホグルコムターゼのコード遺伝子をノックアウト又はノックダウンするステップと、
前記組換え微生物内のグルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼのコード遺伝子をノックアウト又はノックダウンするステップと、
前記組換え微生物内のＨＰｒキナーゼのコード遺伝子をノックアウト又はノックダウンするステップとの少なくとも１つをさらに含むステップ（６）に記載の調製方法。
【0019】
（８）（１）～（５）のいずれか１項に記載の組換え微生物、又は（６）又は（７）前記方法で調製された組換え微生物のタガトースの生産におけるその使用。
【0020】
（９）タガトース生産菌株であって、前記タガトース生産菌株は、（１）～（５）のいずれか１項に記載の組換え微生物、又は（６）又は（７）に記載の方法で調製された組換え微生物である。
【0021】
（１０）前記タガトース生産菌株は、グルコース又はグルコースとグリセロール（ｇｌｙｃｅｒｏｌ）を基質とし、
好ましくは、大腸菌、コリネバクテリウム・グルタミカム、枯草菌、乳酸菌又はサッカロマイセス・セレビシエに由来する（９）に記載のタガトース生産菌株。
好ましくは、大腸菌、コリネバクテリウム・グルタミカム、枯草菌、乳酸菌又はサッカロマイセス・セレビシエに由来する（９）に記載のタガトース生産菌株。
【0022】
（１１）タガトースの生産方法であって、グルコース又はグルコースとグリセロールを基質とし、（１）～（５）のいずれか１項に記載の組換え微生物、（６）又は（７）に記載の方法で調製された組換え微生物、又は（９）～（１０）のいずれか１項に記載のタガトース生産菌株を利用して発酵反応を行うステップを含む。
【0023】
（１２）前記発酵反応終了後、前記発酵反応液からタガトースを分離するステップをさらに含む（１１）に記載のタガトースの生産方法。
【発明の効果】
【0024】
一実施形態では、本開示は、ホスホトランスフェラーゼ系のグルコース特異的トランスファータンパク質活性を低下又は解消することにより、組換え微生物がグリセロールを基質として利用することに対するグルコースの抑制作用を低下又は解消し、グリセロールとグルコースを基質としてタガトースを生産することを可能とする組換え微生物を提供する。原料価格が低く、入手されやすく、タガトースの転化効率が高く、多酵素精製プロセスのステップを必要とせず、生産コストを低下させ、環境汚染を低減させ、工業的な応用化値が期待できる。
【0025】
一実施形態では、本開示による組換え微生物の調製方法は、調製過程が簡単で、実現されやすく、グルコースとグリセロールを基質としてタガトースを生産する組換え微生物を得ることができる。
【0026】
一実施形態では、本開示によるタガトース生産菌株は、グリセロールとグルコースを基質とし、これらのうち、グリセロールは炭素源として菌株内代謝を行って菌株の成長に用いられ、これにより、菌株が成長に適切な条件でグルコースを利用してタガトース合成を行い、収率の向上したタガトースが得られる。
【0027】
一実施形態では、本開示によるタガトースの生産方法は、組換え微生物又はタガトース生産菌株を用いて発酵してタガトースを生産するものであり、原料転化効率が高く、タガトース収率が高く、プロセスが簡素化し、コストが低下するという利点を有し、タガトースの工業的生産に適している。
【図面の簡単な説明】
【0028】
【図1】組換え微生物がグルコースとグリセロールを基質とし、タガトースを生産する代謝過程の概略図を示す。
【図4】タガトースを生産する大腸菌組み換え工学菌株ＹＨ６－２がグリセロールとグルコースを発酵してタガトースを生産することの高速液体クロマトグラムの分析結果を示す。
【図5】タガトースを生産する枯草菌組み換え工学菌株ＹＪ１４－１がグリセロールとグルコースを発酵してタガトースを生産する高速液体クロマトグラムの分析結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【0029】
定義
「一（ａ）」又は「一（ａｎ）」という用語は、「含む」という用語とともに、特許請求の範囲及び／又は明細書において使用される場合、「１つ」を意味することができるが、「１つ又は複数」、「少なくとも１つ」、「１つ以上」を意味することもできる。
「一（ａ）」又は「一（ａｎ）」という用語は、「含む」という用語とともに、特許請求の範囲及び／又は明細書において使用される場合、「１つ」を意味することができるが、「１つ又は複数」、「少なくとも１つ」、「１つ以上」を意味することもできる。
【0030】
特許請求の範囲及び明細書において使用される場合、「包含」、「有する」、「含む」、又は「含有する」という用語は、含まれている又はオープンであることを意味し、引用されていない追加の構成要素又は方法ステップを除外しない。
【0031】
出願を通じて、「約」という用語は、１つの値がその値を測定するために使用される装置又は方法の誤差の標準偏差を含むことを意味する。
【0032】
開示されている内容は、単に代替物であること、及び「及び／又は」であるという用語「又は」の定義をサポートしているが、単に代替物であること、又は代替物が相互に排他的であることが明示的に示されていない限り、特許請求の範囲における「又は」という用語は、「及び／又は」を意味する。
【0033】
特許請求の範囲又は明細書において使用される場合、選択的／好ましい／好適「数値範囲」は、範囲の両端の数値端点と、前記数値端点に対して前記数値端点の中間に含まれているすべての自然数との両方を含む。
【0034】
本開示で使用される場合、他の有機又は無機触媒を使用することができるが、「転化（ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ）」という用語は、１つの分子から別の分子への化学転化を、主として１つ又は複数のポリペプチド（酵素）によって触媒することを意味する。これはまた、所望の産物のモル量と基質の所定のモル量との間の比（％単位）を指すこともできる。
【0035】
本開示で使用される場合、「ポリペプチド」、「酵素」、「ポリペプチド又は酵素」、「ポリペプチド／酵素」という用語は同じ意味を有し、本開示では交換することができる。前述の用語はペプチド結合を介して多くのアミノ酸からなる重合体を意味し、リン酸基やホルミル基のような修飾を含む場合と含まない場合がある。
【0036】
本開示で使用される場合、「ホスホトランスフェラーゼ系のグルコース特異的トランスファータンパク質」という用語は、ホスホトランスフェラーゼ系（Ｐｈｏｓｐｈｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｓｙｓｔｅｍ、ＰＴＳ）に関与するグルコース特異的トランスファータンパク質を意味する。ＰＴＳ系は細菌、真菌、一部の古細菌に広く存在するが、動植物には存在しない。ＰＴＳ系は生体の炭素代謝調節を媒介し、誘導物質排除（Ｉｎｄｕｃｅｒ ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ）現象が存在する。誘導物質排除とは、１つの好適な炭素源（例えば、ＰＴＳ炭素源－グルコース）が輸送代謝を行うときに、他の好適ではない炭素源の吸収利用を阻害することである。大腸菌の例では、培地中にグルコースと他の炭素源（例えば、ラクトース、マルトース、グリセロールなど）が同時に存在する場合、グルコースが優先的に利用され、ＰＴＳ系のグルコース特異的トランスファータンパク質間でリン酸基がカスケード移動し、グルコース特異的トランスファータンパク質の脱リン酸化が増加する。リン酸化されていないグルコース特異的トランスファータンパク質は、それぞれのトランスポーター又はキナーゼ（ＬａｃＹ、ＭａｌＫ、ＧｌｐＫなど）に結合することにより、ラクトース、マルトースやグリセロールなどの炭素源の輸送及びリン酸化を抑制する。
【0037】
本開示で使用される場合、「６－ホスホタガートエピメラーゼ」とも呼ばれる「タガトース－６－リン酸エピメラーゼ」（Ｔａｇａｔｏｓｅ－６－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ４－ｅｐｉｍｅｒａｓ、Ｔ６ＰＥ）という用語は、フルクトース－６－リン酸とタガトース－６－リン酸との相互転化を触媒することができる。いくつかの実施形態では、本開示のタガトース－６－リン酸エピメラーゼはアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）に由来する。１つの具体的な実施形態において、本開示におけるタガトース－６－リン酸エピメラーゼは、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓｓｔｒ．Ｃ５８株に由来する。
【0038】
本開示で使用される場合、「６－ホスホタガートホスファターゼ」とも呼ばれる「タガトース－６－リン酸ホスファターゼ」（Ｔａｇａｔｏｓｅ－６－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ、Ｔ６ＰＰ）という用語は、タガトース－６－リン酸のタガトースへの転化を触媒することができる。いくつかの実施形態では、本開示のタガトース－６－リン酸ホスファターゼは、アルカエオグロブス属Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｆｕｌｇｉｄｕｓ、Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｐｒｏｆｕｎｄｕｓに由来する。
【0039】
本開示で使用される場合、「グルコキナーゼ」（Ｇｌｕｃｏｋｉｎａｓｅ、ｇｌｋ）という用語は、ヘキソキナーゼアイソザイムの１種であり、グルコースがリン酸化されてグルコース－６－リン酸（Ｇｌｕｃｏｓｅ６－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、Ｇ６Ｐ）を生成するプロセスに関与し、このプロセスは１つのＡＴＰを消費してＡＤＰに転化し、Ｍｇ２＋を必要とする。いくつかの実施形態では、本開示のグルコキナーゼは大腸菌由来であり、別のいくつかの実施形態では、グルコキナーゼは、コリネバクテリウム・グルタミカム、枯草菌、乳酸菌、又はサッカロミセス・セレビシエのような、グルコースを基質として糖代謝を行う菌株に由来することもできる。
【0040】
本開示で使用される場合、「６－ホスホグルコイソメラーゼ」とも呼ばれる「グルコース－６－リン酸イソメラーゼ」（Ｇｌｕｃｏｓｅ－６－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ、Ｇ６ＰＩ、ｐｇｉ）という用語は、細胞質及び細胞外液中に存在し、その主要な機能は、Ｄ－グルコース－６－リン酸とＤ－フルクトース－６－リン酸との間の転化を触媒することであり、解糖及び糖新生の重要な酵素であり、酵素活性に加えて細胞及び成長因子の活性を有する。いくつかの実施形態では、本開示のグルコース－６－リン酸イソメラーゼは大腸菌由来であり、いくつかの実施形態では、本開示のグルコース－６－リン酸イソメラーゼは枯草菌由来であり、他のいくつかの実施形態では、グルコース－６－リン酸イソメラーゼは、コリネバクテリウム・グルタミカム、乳酸菌、又はサッカロミセス・セレビシエのような、グルコースを基質として糖代謝を行う菌株に由来することもできる。
【0041】
本開示で使用される場合、グルコースホスホムターゼとも呼ばれる「ホスホグルコムターゼ」（Ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｕｃｏｍｕｔａｓｅ、ｐｇｍ）という用語は、グルコース－１－リン酸とグルコース－６－リン酸との相互転化を触媒することができ、糖代謝において重要な役割を果たす。いくつかの実施形態では、本開示のホスホグルコムターゼは、大腸菌由来であり、いくつかの実施形態では、本開示のホスホグルコムターゼは枯草菌由来であり、他のいくつかの実施形態では、ホスホグルコムターゼは、コリネバクテリウム・グルタミカム、乳酸菌、又はサッカロミセス・セレビシエのような、グルコースを基質として糖代謝を行う菌株に由来することもできる。
【0042】
本開示で使用される場合、「グルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ」（Ｇｌｕｃｏｓｅ ６－ｐｈｏｓｐｈａｔｅｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）という用語は、ＮＡＤ＋又はＮＡＤＰ＋を受容体とし、ドナーのＣＨ－ＯＨ基に作用する酸化還元酵素である。この酵素は以下の酵素反応を触媒することができる。Ｄ－グルコース－６－リン酸＋ＮＡＤＰ＋＝Ｄ－グルコン酸－１，５－ラクトン－６－リン酸＋ＮＡＤＰＨ＋Ｈ＋。グルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼは主にペントースリン酸経路に関与し、β－Ｄ－グルコースなど他の糖類にも緩やかに作用することができる。いくつかの実施形態では、本開示のグルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼは大腸菌由来であり、いくつかの実施形態では、本開示のグルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼは枯草菌由来であり、他の実施形態では、グルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼは、コリネバクテリウム・グルタミカム、乳酸菌、又はサッカロミセス・セレビシエのような、グルコースを基質として糖代謝を行う菌株に由来することもできる。
【0043】
本開示で使用される場合、６－ホスホフルクトキナーゼとも呼ばれる「フルクトース－６－ホスホキナーゼ」（Ｐｈｏｓｐｈｏｆｒｕｃｔｏｋｉｎａｓｅ、ｐｆｋ）という用語はフルクトース－６－リン酸に作用することができるキナーゼの１種であり、ホスホフルクトキナーゼ１（Ｐｈｏｓｐｈｏｆｒｕｃｔｏｋｉｎａｓｅ－１、ｐｆｋ－１）が作用するとフルクトース－１，６－二リン酸が得られ、ホスホフルクトキナーゼ２（Ｐｈｏｓｐｈｏｆｒｕｃｔｏｋｉｎａｓｅ－２、ｐｆｋ－２）が作用すると、フルクトース－２，６－二リン酸が得られる。いくつかの実施形態では、本開示のフルクトース－６－ホスホキナーゼは大腸菌由来であり、ｐｆｋＡ及びｐｆｋＢを含み、いくつかの実施形態では、本開示のフルクトース－６－ホスホキナーゼは、枯草菌由来であり、ｐｆｋＡを含み、他のいくつかの実施形態では、グルコキナーゼは、コリネバクテリウム・グルタミカム、乳酸菌、又はサッカロミセス・セレビシエのような糖代謝を行う菌株に由来することもできる。
【0044】
本開示で使用される場合、「ピルビン酸キナーゼ」（Ｐｙｒｕｖａｔｅ ｋｉｎａｓｅ、ＰＫ）という用語は、ピルビン酸リントランスフェラーゼ、ホスホピルビン酸キナーゼとも呼ばれ、ホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）からＡＤＰへのリン酸基の転移反応を触媒し、１分子のピルビン酸と１分子のＡＴＰを生成する。ピルビン酸キナーゼはホスホエノールピルビン酸とＡＤＰをＡＴＰとピルビン酸に転化し、解糖過程における主要な速度制限酵素の１つである。いくつかの実施形態では、本開示のピルビン酸キナーゼは、大腸菌由来であり、ｐｙｋＡ及びｐｙｋＦを含む。他のいくつかの実施形態では、ピルビン酸キナーゼは、コリネバクテリウム・グルタミカム、枯草菌、乳酸菌、又はサッカロミセス・セレビシエのような菌株に由来することもできる。
【0045】
本開示で使用される用語「ＨＰｒキナーゼ」（ＨＰｒＫ）は、ホスホトランスフェラーゼ系（Ｐｈｏｓｐｈｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｓｙｓｔｅｍ、ＰＴＳ）に関与する特異的トランスフェラーゼ要素を意味する。グルコースなどのＰＴＳ輸送糖類の存在下では、フルクトース－１，６－二リン酸がＨｐｒキナーゼ（ＨＰｒＫ）によるＨＰｒの４６位セリンのリン酸化を促進し、リン酸化産物Ｐ－Ｓｅｒ－ＨＰｒを生成する。リン酸化産物Ｐ－Ｓｅｒ－ＨＰｒは更にカタボライト制御タンパク質（ＣｃｐＡ）と結合し、結合産物はＨｐｒキナーゼのコード遺伝子の前のカタボライト応答素子（ｃｒｅ）領域と作用してカタボライト抑制効果を発揮し、細胞がグリセロールを細胞内に輸送して代謝を行うことができないようにする。
【0046】
本開示で使用される場合、「酵素活性」、「タンパク質活性」という用語は、本開示において同じ意味を有する「比活性」としても表現され、交換して使用することができる。これはポリペプチド（酵素、タンパク）１ｍｇ当たりの酵素活性（Ｕ／ｍｇ）、タンパク質活性（Ｕ／ｍｇ）を指す。
【0047】
本開示における用語「発現」は、転写、転写後修飾、翻訳、翻訳後修飾、及び分泌を含むがこれに限定されない、ＲＮＡ産生及びタンパク質産生に関するあらゆるステップを含む。
【0048】
本開示における「コード遺伝子」という用語は、ある規則によってタンパク質の合成を指導することができるＤＮＡ分子を意味し、タンパク質のコード遺伝子がタンパク質合成を指導するプロセスは、一般に、二本鎖ＤＮＡをテンプレートとする転写プロセスと、ｍＲＮＡをテンプレートとする翻訳プロセスとを含む。コード遺伝子はＣＤＳ配列（Ｃｏｄｉｎｇ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を含み、タンパク質をコードするｍＲＮＡの産生を指導することができる。本開示に係るコード遺伝子は、ホスホトランスフェラーゼ系のグルコース特異的トランスファータンパク質、タガトース－６－リン酸エピメラーゼ、タガトース－６－リン酸ホスファターゼ、グルコキナーゼ、グルコース－６－リン酸イソメラーゼ、フルクトース－６－リン酸キナーゼ、ピルビン酸キナーゼ、ホスホグルコムターゼ、グルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ、ＨＰｒキナーゼ等のタンパク質及び該酵素のコード遺伝子を含む。
【0049】
本開示で使用される場合、「野生型」という用語は、自然界において発見され得る対象を指す。例えば、自然界の１つのソースから単離することができ、ヒトによって実験室で意図的に改変されていないポリペプチド、ポリヌクレオチド配列又は微生物が天然に存在する。本開示で使用される場合、「天然存在」と「野生型」は同義語である。
【0050】
本開示で使用される場合、「微生物」という用語は、肉眼では観測が困難な、細菌、真菌などを含む微小生物の総称である。微生物は表面積と体積との比が大きいため、外部環境と迅速に物質交換を行い、代謝産物を産生することができる。本開示の微生物は、特に、発酵培養により糖類、脂質、アミノ酸、ヌクレオチド等の代謝産物を生産し得る発酵微生物を指す。
【0051】
本開示で使用される場合、「組換え微生物」という用語は、遺伝子工学的手法で組換えられ、得られた改変微生物を意味する。実施形態には、組換え遺伝子の導入、微生物の内因性遺伝子のノックアウト、ノックダウン処理等の操作が含まれるが、これらに限定されない。ここで、「組換え遺伝子」という用語は、天然に存在しない遺伝子であり、組換え遺伝子は、発現制御配列に動作可能に連結されたタンパク質コード配列を含む。実施形態には、微生物に導入された外来遺伝子、異種プロモータに作動可能に連結された内因性タンパク質コード配列、及び改変されたタンパク質コード配列を有する遺伝子が含まれるが、これらに限定されない。組換え遺伝子は、微生物のゲノム上、微生物のプラスミド上、又は微生物のファージ上に保存されている。
【0052】
いくつかの実施形態では、組換え微生物における、低下又は解消したタンパク質活性、低下又は解消したタンパク質のコード遺伝子の発現レベル、低下又は解消した酵素活性、低下又は解消した酵素のコード遺伝子の発現レベルを有するものには、微生物の細胞に弱いプロモータ、弱いリボソーム結合部位を導入し、タンパク、酵素のコード遺伝子をノックアウト又はノックダウンし、タンパク、酵素のコード遺伝子にランダムな断片を挿入してタンパク、酵素の活性を失わせる、遺伝子工学的手法で改変して得られた組換え微生物が含まれる。
【0053】
いくつかの実施形態では、組換え微生物における、向上させたタンパク質活性、向上させたタンパク質のコード遺伝子の発現レベル、向上させた酵素活性、向上させた酵素のコード遺伝子の発現レベルを有するものには、微生物の細胞に強いプロモータ、強いリボソーム結合部位を導入し、非組み込み型のタンパク質、酵素の組換え発現ベクターを導入し、染色体組み込み型のタンパク質、酵素の組換え発現ベクターを導入する、遺伝子工学的手法で改変して得られた組換え微生物が含まれる。
【0054】
いくつかの実施形態では、本開示の組換え微生物は、野生型微生物として大腸菌を用いて、遺伝子工学的手法で改変された組換え菌株であり、いくつかの実施形態では、本開示の組換え微生物は、野生型微生物として枯草菌を用いて、遺伝子工学的手法で改変された組換え菌株であり、他のいくつかの実施形態では、本開示の組換え微生物は、野生型微生物としてコリネバクテリウム・グルタミカム、乳酸菌、又はサッカロミセス・セレビシエのような発酵菌株を用いて、遺伝子工学的手法で改変された組換え菌株であってもよい。
【0055】
本開示で使用される場合、「動作可能に連結される」という用語は、制御配列がポリヌクレオチドのコード配列に対して適切な位置に配置され、それにより、制御配列がこのコード配列の表現を指導するようになる構造を意味する。一例として、前記制御配列は、プロモータ及び／又はエンハンサーによりコードされた配列から選択されてもよい。
【0056】
本開示で使用される場合、「内因性」という用語は、生物又は細胞内で自然に発現又は生産されるポリヌクレオチド、ポリペプチド、又は他の化合物を意味する。すなわち、内因性ポリヌクレオチド、ポリペプチド又は他の化合物は、外因性ではない。例えば、細胞が自然界から最初に分離されたとき、細胞内には「内因性」のポリヌクレオチド又はポリペプチドが存在する。
【0057】
本開示で使用される場合、「外因性」という用語は、発現を必要とする特定の細胞又は有機体において天然に発見又は発現された任意のポリヌクレオチド又はポリペプチドを意味する。外因性ポリヌクレオチド、ポリペプチド又は他の化合物は内因性ではない。
【0058】
本開示で使用される場合、「アミノ酸突然変異」又は「ヌクレオチド突然変異」という用語は、「１つ又は複数のアミノ酸又はヌクレオチドの置換、反復、欠失、又は付加」を含む。本開示において、「突然変異」という用語は、ヌクレオチド配列又はアミノ酸配列の変化を意味する。１つの特定の実施形態では、「突然変異」という用語は「置換」を意味する。
【0059】
一実施形態では、本開示の「突然変異」は、「保存的突然変異」から選択されることができる。本開示において、「保存的突然変異」という用語は、タンパク質の機能を正常に維持することができる突然変異を意味する。保存的突然変異の代表的な例は保存的置換である。
【0060】
本開示で使用される場合、「保存的置換」という用語は、アミノ酸残基を類似の側鎖を有するアミノ酸残基に置換することを意味する。当分野では、類似の側鎖を有するアミノ酸残基ファミリーが定義されており、これには、塩基性側鎖（例えばリジン、アルギニン及びヒスチジン）、酸性側鎖（例えばアスパラギン酸とグルタミン酸）、非帯電極性側鎖（例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、及びシステイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、及びトリプトファン）、β－分岐鎖（例えば、スレオニン、バリン、及びイソロイシン）、及び芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、及びヒスチジン）が含まれている。本開示で使用される場合、「保存的置換」は、通常、タンパク質の１つ又は複数の部位でアミノ酸を交換する。この置換は保存的であってもよい。保存的置換とみなされる置換としては、このほか、保存的突然変異には、遺伝子由来の個体差、株、種の違いなどに起因して自然に生じた突然変異も含まれる。
【0061】
本開示で使用される場合、「ポリヌクレオチド」という用語は、ヌクレオチドからなる重合体を意味する。ポリヌクレオチドは、個々の断片の形態であってもよく、また、少なくとも量又は濃度で１回単離されたヌクレオチド配列から誘導され、標準的な分子生物学的方法（例えば、クローニングベクターの使用）によって、配列及びその構成ヌクレオチド配列を認識、操作及び回復することができる、より大きなヌクレオチド配列構造の１つの構成要素であってもよい。ヌクレオチド配列がＤＮＡ配列（すなわち、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ）で表される場合、ＲＮＡ配列（すなわち、Ａ、Ｕ、Ｇ、Ｃ）も含み、ここで、「Ｕ」が「Ｔ」に置換される。言い換えれば、「ポリヌクレオチド」とは、他のヌクレオチド（個々の断片又は断片全体）から取り除かれたヌクレオチド重合体、又は発現ベクター又は多重シストロン配列のような、より大きなヌクレオチド構造の構成要素又は成分であってもよい。ポリヌクレオチドはＤＮＡ、ＲＮＡ及びｃＤＮＡ配列を含む。「組換えポリヌクレオチド」は「ポリヌクレオチド」の１種である。
【0062】
本開示で使用される場合、「ベクター」という用語は、目的遺伝子を適切な宿主で発現させるために適切な制御配列に動作可能に連結されたＤＮＡ配列を含むＤＮＡ構築体を意味する。「組換え発現ベクター」とは、例えば、所望のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現するためのＤＮＡ構造を指す。組換え発現ベクターは、例えば、ｉ）プロモータ及びエンハンサーのような、遺伝子発現の調節作用を有する遺伝子要素の集合体；ｉｉ）ｍＲＮＡに転写され、タンパク質に翻訳される構造又はコード配列；ｉｉｉ）適切な転写及び翻訳の開始と終了配列の転写サブユニットを含んでもよい。組換え発現ベクターは、任意の適切な方法で構築され得る。ベクターの性質は重要ではなく、プラスミド、ウイルス、ファージ及びトランスポゾンを含む任意のベクターを使用することができる。本開示のための可能なベクターは、染色体、非染色体及び合成ＤＮＡ配列、例えば細菌プラスミド、ファージＤＮＡ、酵母プラスミド及びプラスミドとファージＤＮＡとの組み合わせから誘導されるベクター、例えば、牛痘、アデノウイルス、ニワトリ痘、バキュロウイルス、ＳＶ４０、及び疑似狂犬病などのウイルス由来のＤＮＡを含むが、これらに限定されない。
【0063】
本開示で使用される場合、「形質導入」という用語は、当業者に一般的に理解されている意味、すなわち外因性ＤＮＡを宿主に導入するプロセスを意味する。前記形質転換方法は、細胞内に核酸を導入する任意の方法を含み、これらの方法には、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム（ＣａＰＯ４）沈殿法、リン酸カルシウム（ＣａＰＯ２）沈殿法、マイクロインジェクション（ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）法、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）法、ＤＥＡＥ－グルカン法、陽イオンリポソーム法及び酢酸リチウム－ＤＭＳＯ法などが含まれるが、これらに限定されない。
【0064】
本開示で使用される場合、「タガトース収率」という用語は、当業者に一般的に理解されている意味、すなわち、タガトースを生成するために消費される基質の基質全体に占める割合である。本開示において、「タガトース収率」及び「基質転化率」は、互いに代替的に使用することができる。
【0065】
本開示の組換え微生物の培養は、ウェル付きプレート培養、フラスコ培養、バッチ培養、連続培養、流加培養等の従来の方法に基づいて行うことができるが、これらに限定されず、培地の温度、時間、ｐＨ等の種々の培養条件は実際の状況に応じて適切に調整することができる。
【0066】
別段に定義されていない限り、又は背景によって明確に示されていない限り、本開示におけるすべての科学用語及び技術用語は本開示の当業者が一般に理解するものと同じ意味を有する。
【0067】
タガトース生産菌株
１つの技術案では、本開示は、野生型微生物を遺伝子的に改変して、組換え微生物を得て、タガトースを生産する。
１つの技術案では、本開示は、野生型微生物を遺伝子的に改変して、組換え微生物を得て、タガトースを生産する。
【0068】
１つの特定実施形態では、本開示に使用される組換え微生物は大腸菌、コリネバクテリウム・グルタミカム、枯草菌、乳酸菌又はサッカロマイセス・セレビシエに由来する。
【0069】
１つの特定実施形態では、本開示は大腸菌及び枯草菌を野生型微生物として、大腸菌及び枯草菌のそれぞれについて遺伝子工学的改変を行う。
【0070】
１つの特定実施形態では、本開示では、ＰＴＳ系のグルコース特異的トランスファータンパク質の酵素活性を解消し、例えばＰＴＳ系のグルコース特異的トランスファータンパク質のコード遺伝子をノックアウトしたり、ＰＴＳ系のグルコース特異的トランスファータンパク質のコード遺伝子にランダムな断片を導入したりすることにより、ＰＴＳ系のグルコース特異的トランスファータンパク質の酵素活性を失わせる。
【0071】
１つの特定実施形態では、本開示において、ＰＴＳ系のグルコース特異的トランスファータンパク質を解消する目的は、グリセロール基質の利用に対するグルコースの抑制作用を解消することであり、大腸菌又は枯草菌の組換え菌株はグリセロールとグルコースの両方を基質として利用し、これらのうち、グリセロールは炭素源として細胞に入って代謝されて菌株成長に用いられ、菌株は成長に適した条件でグルコースを炭素源として細胞に入れて、タガトース合成経路によりタガトースを合成することができる（図１）。
【0072】
１つの特定実施形態では、本開示において、グルコキナーゼ及びグルコース－６－リン酸イソメラーゼの酵素活性を向上させ、例えば強いプロモータを導入したりプラスミド遊離発現形式を採用したりすることにより、グルコキナーゼ及びグルコース－６－リン酸イソメラーゼのコード遺伝子の発現強度を高めるか、又は染色体組み込みによって他の物種に由来の、より高酵素活性のグルコキナーゼ及びグルコース－６－リン酸イソメラーゼのコード遺伝子を組み込む。
【0073】
１つの特定実施形態では、本開示において、フルクトース－６－リン酸キナーゼの酵素活性を解消し、例えばフルクトース－６－リン酸キナーゼのコード遺伝子をノックアウトしたり、フルクトース－６－リン酸キナーゼのコード遺伝子にランダムな断片を挿入したりすることにより、フルクトース－６－リン酸キナーゼの酵素活性を失わせる。
【0074】
１つの特定実施形態では、本開示において、タガトース－６－リン酸エピメラーゼ及びタガトース－６－リン酸ホスファターゼの酵素活性を向上させ、例えば強いプロモータ、強力なリボソーム結合部位、染色体組み込み又はプラスミド遊離発現形式によって 、タガトース－６－リン酸エピメラーゼ及びタガトース－６－リン酸ホスファターゼのコード遺伝子の発現強度を向上させる。
【0075】
１つの特定実施形態では、本開示において、ピルビン酸キナーゼの酵素活性を解消し、例えばピルビン酸キナーゼのコード遺伝子をノックアウトしたり、ピルビン酸キナーゼのコード遺伝子にランダムな断片を挿入したりすることにより、ピルビン酸キナーゼの酵素活性を失わせる。
【0076】
ホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）は、グリセロール代謝経路、すなわちグリセロールが細胞に入ってグリセロール－３－リン酸（Ｇ３Ｐ）を生成するステップにおいて、高エネルギーリン酸基を提供し、グリセロールからのＧ３Ｐの生成を促進し、グリセロールの代謝を速めるものであり、このようなステップは菌株がグリセロールに依存して成長することに寄与する。
【0077】
１つの特定実施形態では、本開示において、ホスホグルコムターゼの酵素活性を解消し、例えばホスホグルコムターゼのコード遺伝子をノックアウトしたり、ホスホグルコムターゼのコード遺伝子にランダムな断片を挿入したりすることにより、ホスホグルコムターゼの酵素活性を失わせる。
【0078】
１つの特定実施形態では、本開示において、グルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼの酵素活性を低下させ、例えばグルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼのコード遺伝子をノックアウトしたり、グルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼのコード遺伝子にランダムな断片を挿入したりすることにより、グルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼの酵素活性を失わせ、弱いプロモータ又は弱いリボソーム結合部位によってグルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼのコード遺伝子の転写発現レベルを低下させることによって、グルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼの酵素活性を低下させる。
【0079】
１つの特定実施形態では、本開示において、ＨＰｒキナーゼの酵素活性を解消し、例えばＨＰｒキナーゼのコード遺伝子をノックアウトしたり、ＨＰｒキナーゼのコード遺伝子にランダムな断片を挿入したりすることにより、ＨＰｒキナーゼの酵素活性を失わせる。ＨＰｒキナーゼを解消する目的は、グリセロール基質の利用に対するグルコースの抑制作用を解消することである。
【0080】
タガトースを生産する大腸菌組み換え工学菌株の構築方法
１つの技術案では、本開示は、タガトースを生産する大腸菌組み換え工学菌株の構築方法を提供する。
１つの技術案では、本開示は、タガトースを生産する大腸菌組み換え工学菌株の構築方法を提供する。
【0081】
１つの特定実施形態では、本開示において、大腸菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉのＰＴＳ系のグルコース特異的トランスファータンパク質のコード遺伝子ｐｔｓＧの上下流相同性アームを含有するプライマーを設計し、ＰＣＲ技術によってベクターｐＴＫＳＣＳ（図２Ａ）のＳｃｅＩ－ｔｅｔ－ＳｃｅＩ断片を増幅し、相同組換え断片を大腸菌ＭＧ１６５５（ＤＥ３）に形質転換し、λ－Ｒｅｄ相同組換え技術によってＰＴＳ系のグルコース特異的トランスファータンパク質のコード遺伝子ｐｔｓＧ遺伝子をノックアウトして、組換え菌株ＹＨ１を得る。
【0082】
１つの特定実施形態では、本開示において、大腸菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉに由来のグルコキナーゼのコード遺伝子ｇｌｃＫと大腸菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉに由来のグルコース－６－リン酸イソメラーゼのコード遺伝子ｐｇｉを増幅し、これらを発現ベクターｐＡＣＹＣＤｕｅｔに構築し、組換え発現ベクターｐＡＣＹＣＤｕｅｔ－ｇｌｃＫ－ｐｇｉを得、組換え発現ベクターｐＡＣＹＣＤｕｅｔ－ｇｌｃＫ－ｐｇｉを大腸菌ＹＨ１に形質転換して、組換え菌株ＹＨ２を得る。
【0083】
１つの特定実施形態では、本開示において、大腸菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉのフルクトース－６－リン酸キナーゼのコード遺伝子ｐｆｋＡの上下流相同性アーム（ａｒｍ）を含有するプライマーを設計し、ＰＣＲ技術によってベクターｐＴＫＳＣＳ（図２Ａ）のＳｃｅＩ－ｔｅｔ－ＳｃｅＩ断片を増幅し、相同組換え断片を組換え菌株ＹＨ２に形質転換し、λ－Ｒｅｄ相同組換え技術によってフルクトース－６－リン酸キナーゼのコード遺伝子ｐｆｋＡ遺伝子をノックアウトし、組換え菌株ＹＨ３を得、組換え発現ベクターｐＡＣＹＣＤｕｅｔ－ｇｌｃＫ－ｐｇｉを大腸菌ＹＨ３に形質転換して、組換え菌株ＹＨ３－１を得る。
【0084】
１つの特定実施形態では、本開示において、大腸菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉのピルビン酸キナーゼのコード遺伝子ｐｙｋＦの上下流相同性アームを含有するプライマーを設計し、ＰＣＲ技術によってベクターｐＴＫＳＣＳ（図２Ａ）のＳｃｅＩ－ｔｅｔ－ＳｃｅＩ断片を増幅し、相同組換え断片を組換え菌株ＹＨ３に形質転換し、λ－Ｒｅｄ相同組換え技術によってピルビン酸キナーゼのコード遺伝子ｐｙｋＦ遺伝子をノックアウトし、組換え菌株ＹＨ４を得、組換え発現ベクターｐＡＣＹＣＤｕｅｔ－ｇｌｃＫ－ｐｇｉを大腸菌ＹＨ４に形質転換して、組換え菌株ＹＨ４－１を得る。
【0085】
１つの特定実施形態では、本開示において、大腸菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉのホスホグルコムターゼのコード遺伝子ｐｇｍの上下流相同性アームを含有するプライマーを設計し、ＰＣＲ技術によってベクターｐＴＫＳＣＳ（図２Ａ）のＳｃｅＩ－ｔｅｔ－ＳｃｅＩ断片を増幅し、相同組換え断片を組換え菌株ＹＨ４に形質転換し、λ－Ｒｅｄ相同組換え技術によってホスホグルコムターゼのコード遺伝子ｐｇｍ遺伝子をノックアウトし、組換え菌株ＹＨ５を得、組換え発現ベクターｐＡＣＹＣＤｕｅｔ－ｇｌｃＫ－ｐｇｉを大腸菌ＹＨ５に形質転換して、組換え菌株ＹＨ５－１を得る。
【0086】
１つの特定実施形態では、本開示において、大腸菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉのグルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼのコード遺伝子ｚｗｆの上下流相同性アームを含有するプライマーを設計し、ＰＣＲ技術によってベクターｐＴＫＳＣＳ（図２Ａ）のＳｃｅＩ－ｔｅｔ－ＳｃｅＩ断片を増幅し、相同組換え断片を組換え菌株ＹＨ５に形質転換し、λ－Ｒｅｄ相同組換え技術によってグルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼのコード遺伝子ｚｗｆ遺伝子をノックアウトし、組換え菌株ＹＨ６を得、組換え発現ベクターｐＡＣＹＣＤｕｅｔ－ｇｌｃＫ－ｐｇｉを大腸菌ＹＨ６に形質転換して、組換え菌株ＹＨ６－１を得る。
【0087】
１つの特定実施形態では、本開示において、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ ｓｔｒ． Ｃ５８に由来のタガトース－６－リン酸エピメラーゼＴ６ＰＥとアルカエオグロブス属Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｆｕｌｇｉｄｕｓ 及び／又はＡｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｐｒｏｆｕｎｄｕｓに由来のタガトース－６－リン酸ホスファターゼＴ６ＰＰ遺伝子を増幅し、発現ベクターｐＥＴＤｕｅｔに構築し、組換え発現ベクターｐＥＴＤｕｅｔ－Ｔ６ＰＥ－Ｔ６ＰＰを得、組換え発現ベクターｐＥＴＤｕｅｔ－Ｔ６ＰＥ－Ｔ６ＰＰを大腸菌ＭＧ１６５５（ＤＥ３）に形質転換して、組換え菌株ＭＧ１６５５－１を得る。
【0088】
１つの特定実施形態では、本開示において、タガトース－６－リン酸エピメラーゼＴ６ＰＥとタガトース－６－リン酸ホスファターゼＴ６ＰＰ遺伝子を持つ組換え発現ベクターｐＥＴＤｕｅｔ－Ｔ６ＰＥ－Ｔ６ＰＰを組換え菌株ＹＨ１に構築して、組換え菌株ＹＨ１－１を得る。
【0089】
１つの特定実施形態では、本開示において、タガトース－６－リン酸エピメラーゼＴ６ＰＥとタガトース－６－リン酸ホスファターゼＴ６ＰＰ遺伝子を持つ組換え発現ベクターｐＥＴＤｕｅｔ－Ｔ６ＰＥ－Ｔ６ＰＰを組換え菌株ＹＨ２に構築して、組換え菌株ＹＨ２－１を得る。
【0090】
１つの特定実施形態では、本開示において、タガトース－６－リン酸エピメラーゼＴ６ＰＥとタガトース－６－リン酸ホスファターゼＴ６ＰＰ遺伝子を持つ組換え発現ベクターｐＥＴＤｕｅｔ－Ｔ６ＰＥ－Ｔ６ＰＰを組換え菌株ＹＨ３－１に構築して、組換え菌株ＹＨ３－２を得る。
【0091】
１つの特定実施形態では、本開示において、タガトース－６－リン酸エピメラーゼＴ６ＰＥとタガトース－６－リン酸ホスファターゼＴ６ＰＰ遺伝子を持つ組換え発現ベクターｐＥＴＤｕｅｔ－Ｔ６ＰＥ－Ｔ６ＰＰを組換え菌株ＹＨ４－１に構築して、組換え菌株ＹＨ４－２を得る。
【0092】
１つの特定実施形態では、本開示において、タガトース－６－リン酸エピメラーゼＴ６ＰＥとタガトース－６－リン酸ホスファターゼＴ６ＰＰ遺伝子を持つ組換え発現ベクターｐＥＴＤｕｅｔ－Ｔ６ＰＥ－Ｔ６ＰＰを組換え菌株ＹＨ５－１に構築して、組換え菌株ＹＨ５－２を得る。
【0093】
１つの特定実施形態では、本開示において、タガトース－６－リン酸エピメラーゼＴ６ＰＥとタガトース－６－リン酸ホスファターゼＴ６ＰＰ遺伝子の組換え発現ベクターｐＥＴＤｕｅｔ－Ｔ６ＰＥ－Ｔ６ＰＰを組換え菌株ＹＨ６－１に構築して、組換え菌株ＹＨ６－２を得る。
【0094】
本開示のいくつかの特定実施形態では、組換え菌株ＢＭＧ１６５５－１、ＹＨ１－１、ＹＨ２－１、ＹＨ３－２、ＹＨ４－２、ＹＨ５－２及びＹＨ６－２は、タガトースを生産する大腸菌組み換え工学菌株として、グルコース又はグルコースとグリセロールの混合培地を発酵してタガトースを生産することができる。
【0095】
タガトースを生産する枯草菌組み換え工学菌株の構築方法
１つの技術案では、本開示は、タガトースを生産する枯草菌組み換え工学菌株の構築方法を提供する。
１つの技術案では、本開示は、タガトースを生産する枯草菌組み換え工学菌株の構築方法を提供する。
【0096】
１つの特定実施形態では、本開示において、枯草菌Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ １６８ウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼのコード遺伝子ｕｐｐの上下流相同性アームを含有するプライマーを設計し、ＰＣＲ技術によってウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼのコード遺伝子ｕｐｐの上下流相同性アームを増幅し、これを組み込みベクターｐＳＳに構築して、組換え組み込みベクターｐＳＳ－ｕｐｐ－ＦＲを得、組換え組み込みベクターｐＳＳ－ｕｐｐ－ＦＲを枯草菌ＳＣＫ６に形質転換し、次に、分子内相同組換え技術によって、ウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼのコード遺伝子ｕｐｐ遺伝子がノックアウトされた組み換え工学菌株ＹＪ８を得る。
【0097】
１つの特定実施形態では、本開示において、枯草菌Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ １６８のＰＴＳ系のグルコース特異的トランスファータンパク質のコード遺伝子ｐｔｓＧの上下流相同性アームを含有するプライマーを設計し、ＰＣＲ技術によってＰＴＳ系のグルコース特異的トランスファータンパク質のコード遺伝子ｐｔｓＧの上下流相同性アームを増幅し、これを組み込みベクターｐＳＳに構築し、組換え組み込みベクターｐＳＳ－ｐｔｓＧ－ＦＲを得て、組換え組み込みベクターｐＳＳ－ｐｔｓＧ－ＦＲを枯草菌ＹＪ８に形質転換し、次に、分子内相同組換え技術によって、ＰＴＳ系のグルコース特異的トランスファータンパク質のコード遺伝子ｐｔｓＧがノックアウトされた組み換え工学菌株ＹＪ９を得る。
【0098】
１つの特定実施形態では、本開示において、枯草菌Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ １６８のＨＰｒキナーゼのコード遺伝子ｈｐｒＫの上下流相同性アームを含有するプライマーを設計し、ＰＣＲ技術によってＨＰｒキナーゼのコード遺伝子ｈｐｒＫの上下流相同性アームを増幅し、これを組み込みベクターｐＳＳに構築し、組換え組み込みベクターｐＳＳ－ｈｐｒＫ－ＦＲを得、組換え組み込みベクターｐＳＳ－ｈｐｒＫ－ＦＲを枯草菌ＹＪ９に形質転換し、次に、分子内相同組換え技術によって、ＨＰｒキナーゼのコード遺伝子ｈｐｒＫがノックアウトされた組み換え工学菌株ＹＪ１０を得る。
【0099】
１つの特定実施形態では、本開示において、枯草菌Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ １６８に由来のグルコキナーゼのコード遺伝子ｇｌｃＫと枯草菌Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ １６８に由来のグルコース－６－リン酸イソメラーゼのコード遺伝子ｐｇｉを増幅し、これを組み込みベクターｐＳＳ－ｐｔｓＧ－ＦＲに構築し、組換え組み込みベクターｐＳＳ－ｐｔｓＧ－ＦＲ－ｇｌｃＫ－ｐｇｉを得、組換え組み込みベクターｐＳＳ－ｐｔｓＧ－ＦＲ－ｇｌｃＫ－ｐｇｉを枯草菌ＹＪ１０に形質転換し、次に、分子内相同組換え技術によって、グルコキナーゼのコード遺伝子ｇｌｃＫ及びグルコース－６－リン酸イソメラーゼのコード遺伝子であるコード遺伝子ｐｇｉがゲノムに組み込まれた組み換え工学菌株ＹＪ１１を得る。
【0100】
１つの特定実施形態では、本開示において、枯草菌Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ １６８フルクトース－６－リン酸キナーゼのコード遺伝子ｐｆｋＡの上下流相同性アームを含有するプライマーを設計し、ＰＣＲ技術によって、フルクトース６－リン酸キナーゼのコード遺伝子ｐｆｋＡの上下流相同性アームを増幅し、これを組み込みベクターｐＳＳに構築し、組換え組み込みベクターｐＳＳ－ｐｆｋＡ－ＦＲを得、組換え組み込みベクターｐＳＳ－ｐｆｋＡ－ＦＲを枯草菌ＹＪ１１に形質転換し、次に、分子内相同組換え技術によって、フルクトース－６－リン酸キナーゼのコード遺伝子ｐｆｋＡ遺伝子がノックアウトされた組み換え工学菌株ＹＪ１２を得る。
【0101】
１つの特定実施形態では、本開示において、枯草菌Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ １６８ホスホグルコムターゼのコード遺伝子ｐｇｍの上下流相同性アームを含有するプライマーを設計し、ＰＣＲ技術によってホスホグルコムターゼのコード遺伝子ｐｇｍの上下流相同性アームを増幅し、これを組み込みベクターｐＳＳに構築し、組換え組み込みベクターｐＳＳ－ｐｇｍ－ＦＲを得、組換え組み込みベクターｐＳＳ－ｐｇｍ－ＦＲを枯草菌ＹＪ１２に形質転換し、次に、分子内相同組換え技術によって、ホスホグルコムターゼのコード遺伝子ｐｇｍがノックアウトされた組み換え工学菌株ＹＪ１３を得る。
【0102】
１つの特定実施形態では、本開示において、枯草菌Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ １６８グルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼのコード遺伝子ｚｗｆの上下流相同性アームを含有するプライマーを設計し、ＰＣＲ技術によってグルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼのコード遺伝子ｚｗｆの上下流相同性アームを増幅し、これを組み込みベクターｐＳＳに構築し、組換え組み込みベクターｐＳＳ－ｚｗｆ－ＦＲを得、組換え組み込みベクターｐＳＳ－ｚｗｆ－ＦＲを枯草菌ＹＪ１３に形質転換し、次に、分子内相同組換え技術によって、グルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼのコード遺伝子ｚｗｆがノックアウトされた組み換え工学菌株ＹＪ１４を得る。
【0103】
１つの特定実施形態では、本開示において、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ ｓｔｒ． Ｃ５８に由来のタガトース－６－リン酸エピメラーゼＴ６ＰＥとアルカエオグロブス属Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｆｕｌｇｉｄｕｓ及び／又はＡｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｐｒｏｆｕｎｄｕｓに由来のタガトース－６－リン酸ホスファターゼＴ６ＰＰ遺伝子を増幅し、これを発現ベクターｐＷＢ９８０に構築して、組換え発現ベクターｐＷＢ９８０－Ｔ６ＰＥ－Ｔ６ＰＰを得、組換え発現ベクターｐＷＢ９８０－Ｔ６ＰＥ－Ｔ６ＰＰを枯草菌ＳＣＫ６に形質転換して、組換え菌株ＳＣＫ６－１を得る。
【0104】
１つの特定実施形態では、本開示において、タガトース－６－リン酸エピメラーゼＴ６ＰＥとタガトース－６－リン酸ホスファターゼＴ６ＰＰ遺伝子を持つ組換え発現ベクターｐＷＢ９８０－Ｔ６ＰＥ－Ｔ６ＰＰを組換え菌株ＹＪ８に構築して、組換え菌株ＹＪ８－１を得る。
【0105】
１つの特定実施形態では、本開示において、タガトース－６－リン酸エピメラーゼＴ６ＰＥとタガトース－６－リン酸ホスファターゼＴ６ＰＰ遺伝子を持つ組換え発現ベクターｐＷＢ９８０－Ｔ６ＰＥ－Ｔ６ＰＰを組換え菌株ＹＪ９に構築して、組換え菌株ＹＪ９－１を得る。
【0106】
１つの特定実施形態では、本開示において、タガトース－６－リン酸エピメラーゼＴ６ＰＥとタガトース－６－リン酸ホスファターゼＴ６ＰＰ遺伝子を持つ組換え発現ベクターｐＷＢ９８０－Ｔ６ＰＥ－Ｔ６ＰＰを組換え菌株ＹＪ１０に構築して、組換え菌株ＹＪ１０－１を得る。
【0107】
１つの特定実施形態では、本開示において、タガトース－６－リン酸エピメラーゼＴ６ＰＥとタガトース－６－リン酸ホスファターゼＴ６ＰＰ遺伝子を持つ組換え発現ベクターｐＷＢ９８０－Ｔ６ＰＥ－Ｔ６ＰＰを組換え菌株ＹＪ１１に構築して、組換え菌株ＹＪ１１－１を得る。
【0108】
１つの特定実施形態では、本開示において、タガトース－６－リン酸エピメラーゼＴ６ＰＥとタガトース－６－リン酸ホスファターゼＴ６ＰＰ遺伝子を持つ組換え発現ベクターｐＷＢ９８０－Ｔ６ＰＥ－Ｔ６ＰＰを組換え菌株ＹＪ１２に構築して、組換え菌株ＹＪ１２－１を得る。
【0109】
１つの特定実施形態では、本開示において、タガトース－６－リン酸エピメラーゼＴ６ＰＥとタガトース－６－リン酸ホスファターゼＴ６ＰＰ遺伝子を持つ組換え発現ベクターｐＷＢ９８０－Ｔ６ＰＥ－Ｔ６ＰＰを組換え菌株ＹＪ１３に構築して、組換え菌株ＹＪ１３－１を得る。
【0110】
１つの特定実施形態では、本開示において、タガトース－６－リン酸エピメラーゼＴ６ＰＥとタガトース－６－リン酸ホスファターゼＴ６ＰＰ遺伝子を持つ組換え発現ベクターｐＷＢ９８０－Ｔ６ＰＥ－Ｔ６ＰＰを組換え菌株ＹＪ１４に構築して、組換え菌株ＹＪ１４－１を得る。
【0111】
本開示のいくつかの特定実施形態では、組換え菌株ＳＣＫ６－１、ＹＪ８－１、ＹＪ９－１、ＹＪ１０－１、ＹＪ１１－１、ＹＪ１２－１、ＹＪ１３－１及びＹＪ１４－１は、タガトースを生産する枯草菌組み換え工学菌株として、グルコース又はグルコースとグリセロールの混合培地を発酵してタガトースを生産することができる。
【0112】
タガトースの生産方法
１つの技術案では、本開示はタガトースの生産方法を提供する。
１つの技術案では、本開示はタガトースの生産方法を提供する。
【0113】
１つの特定実施形態では、本開示によるタガトースの生産方法においては、
タガトース生産菌株を発酵培養するステップ（１）と、
発酵反応終了後、発酵反応液を収集して、これからタガトースを分離するステップ（２）と、を含んでもよい。
タガトース生産菌株を発酵培養するステップ（１）と、
発酵反応終了後、発酵反応液を収集して、これからタガトースを分離するステップ（２）と、を含んでもよい。
【0114】
上記の生産過程において、タガトース生産菌株は、グルコースとグリセロールを基質として、効率的に転化してタガトースを生産し、タガトースを高収率で得ることができる。本開示のタガトースの生産方法は、グルコースとグリセロールを基質とするので、原料が入手されやすく、価格が低く、多酵素分離プロセスを必要とせず、環境にやさしく、生産コストが低く、工業的な応用化値が期待できる。
【0115】
いくつかの実施形態では、タガトースを生産する大腸菌組み換え工学菌株を発酵培養する培地はＬＢ培地（１０ｇ／Ｌペプトン、５ｇ／Ｌ酵母抽出物、１０ｇ／Ｌ塩化ナトリウム、カナマイシン２５ｎｇ／ｍＬ、アンピシリン１００ｎｇ／ｍＬ）に、終濃度２０ｇ／Ｌのグルコースを加えたものである。
【0116】
いくつかの実施形態では、タガトースを生産する大腸菌組み換え工学菌株を発酵培養する培地はＭ９Ｙ 培地（１０ｇ／Ｌ グリセロール、２０ｇ／Ｌ グルコース、６ｇ／Ｌ Ｎａ２ＨＰＯ４、０．５ｇ／Ｌ ＮａＣｌ、３ｇ／Ｌ ＫＨ２ＰＯ４、１ｇ／Ｌ ＮＨ４Ｃｌ、１ｍＭ ＭｇＳＯ４、０．１ｍＭ ＣａＣｌ２、及び２ｇ／Ｌ酵母抽出物）である。
【0117】
いくつかの実施形態では、タガトースを生産する枯草菌組み換え工学菌株を発酵培養する培地はＳＲ培地（１５ｇ／Ｌペプトン、２５ｇ／Ｌ酵母抽出物、３ｇ／Ｌ Ｋ２ＨＰＯ４、カナマイシン２５ｎｇ／ｍＬ）に、終濃度２０ｇ／Ｌのグルコースを加えたものである。
【0118】
いくつかの実施形態では、タガトースを生産する枯草菌組み換え工学菌株を発酵培養する培地はＳＲ培地（１５ｇ／Ｌペプトン、２５ｇ／Ｌ酵母抽出物、３ｇ／Ｌ Ｋ２ＨＰＯ４、カナマイシン２５ｎｇ／ｍＬ）に、終濃度２０ｇ／Ｌのグルコース及び２０ｇ／Ｌのグリセロールを加えたものである。
【0119】
いくつかの実施形態では、タガトース生産菌株の発酵培養条件として、３７℃、２００ｒｍｐの条件でタガトース生産菌株を１２～２４ｈ培養する。
【0120】
いくつかの実施形態では、タガトースの分離方法は、濾過、脱色、脱塩、濃縮、結晶化及びＨＰＬＣ検出を含むが、これらに限定されない本分野の常法であってもよい。
【0121】
本分野では、微生物を操縦する方法は、『分子生物学現代方法』（Ｏｎｌｉｎｅ ＩＳＢＮ： ９７８０４７１１４２７２０， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．）、『微生物代謝工学：方法と手順』（Ｑｉｏｎｇ Ｃｈｅｎｇ Ｅｄ．， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ）や『システム代謝工学：方法と手順』（Ｈａｌ Ｓ． Ａｌｐｅｒ Ｅｄ．， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ）などの出版物に解釈されるように、知られているものである。
【0122】
本開示では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５４～ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５５に示されるヌクレオチド又はアミノ酸の番号の意味は以下のとおりである。
【0123】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示される配列は大腸菌のグルコース特異的トランスファータンパク質のアミノ酸配列である。
【0124】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示される配列は大腸菌のグルコース特異的トランスファータンパク質をコードするヌクレオチド配列である。
【0125】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示される配列は枯草菌のグルコース特異的トランスファータンパク質のアミノ酸配列である。
【0126】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示される配列は枯草菌のグルコース特異的トランスファータンパク質をコードするヌクレオチド配列である。
【0127】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に示される配列はアグロバクテリウム・ツメファシエンスタガトース－６－リン酸エピメラーゼのアミノ酸配列である。
【0128】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に示される配列はアグロバクテリウム・ツメファシエンスのタガトース－６－リン酸エピメラーゼをコードするヌクレオチド配列である。
【0129】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に示される配列はアルカエオグロブス属Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｆｕｌｇｉｄｕｓのタガトース－６－リン酸ホスファターゼのアミノ酸配列である。
【0130】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に示される配列はアルカエオグロブス属Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｆｕｌｇｉｄｕｓタガトース－６－リン酸ホスファターゼをコードするヌクレオチド配列である。
【0131】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９に示される配列は大腸菌のグルコキナーゼのアミノ酸配列である。
【0132】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に示される配列は大腸菌のグルコキナーゼをコードするヌクレオチド配列である。
【0133】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１に示される配列は枯草菌のグルコキナーゼのアミノ酸配列である。
【0134】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に示される配列は枯草菌のグルコキナーゼをコードするヌクレオチド配列である。
【0135】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３に示される配列は大腸菌のグルコース－６－リン酸イソメラーゼのアミノ酸配列である。
【0136】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４に示される配列は大腸菌のグルコース－６－リン酸イソメラーゼをコードするヌクレオチド配列である。
【0137】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５に示される配列は枯草菌のグルコース－６－リン酸イソメラーゼのアミノ酸配列である。
【0138】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６に示される配列は枯草菌のグルコース－６－リン酸イソメラーゼをコードするヌクレオチド配列である。
【0139】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７に示される配列はＳｃｅＩ－ｔｅｔ－ＳｃｅＩ断片のヌクレオチド配列である。
【0140】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５４に示される配列はアルカエオグロブス属Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｐｒｏｆｕｎｄｕｓのタガトース－６－リン酸ホスファターゼのアミノ酸配列である。
【0141】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５５に示される配列はアルカエオグロブス属Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｐｒｏｆｕｎｄｕｓのタガトース－６－リン酸ホスファターゼをコードするヌクレオチド配列である。
【0142】
実施例
本開示の他の目的、特徴、及び利点は、以下の詳細な説明から明らかになる。しかし、詳細な説明及び具体的な実施例（本開示の具体的な実施形態を示すが）は説明目的のためにのみ与えられるのであり、本開示の精神及び範囲内でなされた様々な変更及び修飾が、詳細な説明を読むと当業者にとって自明になることを理解すべきである。
本開示の他の目的、特徴、及び利点は、以下の詳細な説明から明らかになる。しかし、詳細な説明及び具体的な実施例（本開示の具体的な実施形態を示すが）は説明目的のためにのみ与えられるのであり、本開示の精神及び範囲内でなされた様々な変更及び修飾が、詳細な説明を読むと当業者にとって自明になることを理解すべきである。
【0143】
本実施例で使用される実験技術及び実験方法は、特別な説明がない限り、いずれも通常の技術的方法であり、例えば、以下の実施例において具体的な条件が明記されていない実験方法は、通常、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、分子クローニング：実験室マニュアル（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９）に記載された条件、又はメーカーが提案した条件に従ったものである。実施例において使用される材料、試薬等は、特別な説明がない限り、正規の商業ルートを通じて入手することができる。
【0144】
実施例１ 大腸菌組換え菌株ＹＨ１の構築
（１）ＫＥＧＧデータベースにおける、大腸菌ＭＧ１６５５に由来のＰＴＳ系のグルコース特異的トランスファータンパク質のコード遺伝子ｐｔｓＧに従って、ＰＴＳ系のグルコース特異的トランスファータンパク質のコード遺伝子ｐｔｓＧ上流６５ｂｐ相同断片及び下流６５ｂｐ相同断片を含むプライマー１とプライマー２を設計し、ＰＣＲによってｐＴＫＳＣＳベクターのＳｃｅＩ－ｔｅｔ－ＳｃｅＩ断片（ＳｃｅＩ－ｔｅｔ－ＳｃｅＩ断片のヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７に示される）を増幅し、ｐｔｓＧ遺伝子の上下流相同断片を含有する耐性断片１を得た。具体的なプライマー配列を以下に示す。
（１）ＫＥＧＧデータベースにおける、大腸菌ＭＧ１６５５に由来のＰＴＳ系のグルコース特異的トランスファータンパク質のコード遺伝子ｐｔｓＧに従って、ＰＴＳ系のグルコース特異的トランスファータンパク質のコード遺伝子ｐｔｓＧ上流６５ｂｐ相同断片及び下流６５ｂｐ相同断片を含むプライマー１とプライマー２を設計し、ＰＣＲによってｐＴＫＳＣＳベクターのＳｃｅＩ－ｔｅｔ－ＳｃｅＩ断片（ＳｃｅＩ－ｔｅｔ－ＳｃｅＩ断片のヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７に示される）を増幅し、ｐｔｓＧ遺伝子の上下流相同断片を含有する耐性断片１を得た。具体的なプライマー配列を以下に示す。
【0145】
プライマー１、配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８に示される：ＣＡＧＧＡＧＣＡＣＴＣＴＣＡＡＴＴＡＴＧＴＴＴＡＡＧＡＡＴＧＣＡＴＴＴＧＣＴＡＡＣＣＴＧＣＡＡＡＡＧＧＴＣＧＧＴＡＡＡＴＣＧＣＴＧＴＡＣＧＧＣＣＣＣＡＡＧＧＴＣＣＡＡＡＣＧＧＴＧＡ
プライマー２、配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９に示される：ＧＣＣＡＴＣＴＧＧＣＴＧＣＣＴＴＡＧＴＣＴＣＣＣＣＡＡＣＧＴＣＴＴＡＣＧＧＡＴＴＡＧＴＧＧＴＴＡＣＧＧＡＴＧＴＡＣＴＣＡＴＣＣＡＴＣＡＧＣＧＡＴＴＴＡＣＣＧＡＣＣＴＴＴＴＧＣＡＧＧＴＴＡＧＣＴＴＧＧＣＴＴＣＡＧＧＧＡＴＧＡＧＧＣＧＣＣＡＴＣ
（２）大腸菌組換え菌株ＹＨ１の構築
大腸菌ＭＧ１６５５（ＤＥ３）コンピテント細胞（１００μＬ）を調製し、Ｒｅｄ組換えに必要なプラスミドｐＴＫＲｅｄ（温度感受性プラスミド）（図２Ｂ）をトランスフェクションし、スペクチノマイシン（ｓｐｅｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ）を含有する耐性プレートに塗布し、３０℃で一晩培養した。その後、プレートから単一コロニーを選択して、スペクチノマイシンとＩＰＴＧを含有する液体ＬＢに移し、３０℃で培養し、ｐＴＫＲｅｄを含有するＭＧ１６５５（ＤＥ３）エレクトロポレーションコンピテント（Ｅｌｅｃｔｒｏｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）（１００μＬ）を調製した。
プライマー２、配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９に示される：ＧＣＣＡＴＣＴＧＧＣＴＧＣＣＴＴＡＧＴＣＴＣＣＣＣＡＡＣＧＴＣＴＴＡＣＧＧＡＴＴＡＧＴＧＧＴＴＡＣＧＧＡＴＧＴＡＣＴＣＡＴＣＣＡＴＣＡＧＣＧＡＴＴＴＡＣＣＧＡＣＣＴＴＴＴＧＣＡＧＧＴＴＡＧＣＴＴＧＧＣＴＴＣＡＧＧＧＡＴＧＡＧＧＣＧＣＣＡＴＣ
（２）大腸菌組換え菌株ＹＨ１の構築
大腸菌ＭＧ１６５５（ＤＥ３）コンピテント細胞（１００μＬ）を調製し、Ｒｅｄ組換えに必要なプラスミドｐＴＫＲｅｄ（温度感受性プラスミド）（図２Ｂ）をトランスフェクションし、スペクチノマイシン（ｓｐｅｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ）を含有する耐性プレートに塗布し、３０℃で一晩培養した。その後、プレートから単一コロニーを選択して、スペクチノマイシンとＩＰＴＧを含有する液体ＬＢに移し、３０℃で培養し、ｐＴＫＲｅｄを含有するＭＧ１６５５（ＤＥ３）エレクトロポレーションコンピテント（Ｅｌｅｃｔｒｏｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）（１００μＬ）を調製した。
【0146】
ステップ１で得られた断片１をエレクトロポレーションコンピテントと均一に混合し、電気ショック後、スペクチノマイシンとクロラムフェニコール（ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ）の二重抗体を含有するプレートに塗布し、３０℃で３０時間培養した。単一クローンを選択して、コロニーのＰＣＲ検証を行った結果（検証プライマーはプライマー３とプライマー４）、ＰＣＲ産物のサイズが約１７７５ｂｐ（ゲノム上のｐｔｓＧ遺伝子上流断片、ＳｃｅＩ－ｔｅｔ－ＳｃｅＩ断片及びゲノム上のｐｔｓＧ遺伝子下流断片を含有する）の菌株は正しい二重交換菌株である。
【0147】
陽性クローンを選択して、スペクチノマイシン、ＩＰＴＧ及びアラビノース（ａｒａｂｉｎｏｓｅ）を含有するＬＢ液体培地に接種し、８～１２ｈ培養し、その後、菌液を希釈してスペクチノマイシン、ＩＰＴＧ及びアラビノースを含有するプレートに塗布し、一晩培養した。このステップの目的はアラビノースでＳｃｅＩの発現を誘導し、ＳｃｅＩ認識部位を含有するＤＮＡを切断し、陽性形質転換体の分子内の相同組換えを促進して、ｔｅｔ耐性断片を除去することである。複数の単一クローンをプレートから選択して、コロニーのＰＣＲを再度行った結果（検証プライマーはプライマー３とプライマー４）、ＰＣＲ産物が約３８２ｂｐのＤＮＡの形質転換体は陽性クローンであった。陽性クローンを抗体無し液体ＬＢに接種し、３７℃で８～１２時間培養すると、ｐＴＫＲｅｄプラスミドを除去した。形質転換体ＰＣＲをシーケンシングに付して検証を行い、正しい菌株、すなわち、ＰＴＳ系のグルコース特異的トランスファータンパク質のコード遺伝子がノックアウトされた大腸菌組み換え工学菌株、すなわち、ＰＴＳ系グルコース特異的トランスファープロテアーゼ活性のない大腸菌組み換え工学菌株を保存し、ＹＨ１と命名した。具体的なプライマー配列を以下に示す。
【0148】
プライマー３、配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０に示される：ＣＧＴＣＡＡＡＣＡＡＡＴＴＧＧＣＡＣＴＧ
プライマー４、配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１に示される：ＧＡＡＣＧＴＣＡＡＴＡＡＣＣＴＧＴＴＣＧ
プライマー４、配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１に示される：ＧＡＡＣＧＴＣＡＡＴＡＡＣＣＴＧＴＴＣＧ
【0149】
実施例２ 大腸菌組換え菌株ＹＨ２の構築
（１）組換え発現ベクターｐＡＣＹＣＤｕｅｔ－ｇｌｋ－ｐｇｉの構築
ＫＥＧＧデータベースにおける、大腸菌に由来のグルコキナーゼのコード遺伝子ｇｌｋ及びグルコース－６－リン酸イソメラーゼのコード遺伝子ｐｇｉに従って、プライマーとしてプライマー５とプライマー６を設計してｇｌｋを増幅し、プライマー７とプライマー８を設計してｐｇｉを増幅した。プライマー９とプライマー１０を設計してプラスミド骨架ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ（図２Ｃ）を増幅し、ｓｉｍｐｌｅ ｃｌｏｎｉｎｇ連結方式［５］によって組換え発現ベクターｐＡＣＹＣＤｕｅｔ－ｇｌｃＫを構築した。その後、さらに、プライマー１１とプライマー１２を設計してプラスミド骨架ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ－ｇｌｋを増幅し、ｓｉｍｐｌｅ ｃｌｏｎｉｎｇ方法によって組換え発現ベクターｐＡＣＹＣＤｕｅｔ－ｇｌｋ－ｐｇｉを得た。具体的なプライマー配列を以下に示す。
（１）組換え発現ベクターｐＡＣＹＣＤｕｅｔ－ｇｌｋ－ｐｇｉの構築
ＫＥＧＧデータベースにおける、大腸菌に由来のグルコキナーゼのコード遺伝子ｇｌｋ及びグルコース－６－リン酸イソメラーゼのコード遺伝子ｐｇｉに従って、プライマーとしてプライマー５とプライマー６を設計してｇｌｋを増幅し、プライマー７とプライマー８を設計してｐｇｉを増幅した。プライマー９とプライマー１０を設計してプラスミド骨架ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ（図２Ｃ）を増幅し、ｓｉｍｐｌｅ ｃｌｏｎｉｎｇ連結方式［５］によって組換え発現ベクターｐＡＣＹＣＤｕｅｔ－ｇｌｃＫを構築した。その後、さらに、プライマー１１とプライマー１２を設計してプラスミド骨架ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ－ｇｌｋを増幅し、ｓｉｍｐｌｅ ｃｌｏｎｉｎｇ方法によって組換え発現ベクターｐＡＣＹＣＤｕｅｔ－ｇｌｋ－ｐｇｉを得た。具体的なプライマー配列を以下に示す。
【0150】
プライマー５、配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２に示される：ＧＴＴＴＡＡＣＴＴＴＡＡＴＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＣＡＴＧＡＣＡＡＡＧＴＡＴＧＣＡＴＴＡＧＴＣＧＧＴＧ
【0151】
プライマー６、配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３に示される：
ＣＧＡＴＴＡＣＴＴＴＣＴＧＴＴＣＧＡＣＴＴＡＡＧＣＡＴＴＡＣＡＧＡＡＴＧＴＧＡＣＣＴＡＡＧＧＴＣＴＧ
ＣＧＡＴＴＡＣＴＴＴＣＴＧＴＴＣＧＡＣＴＴＡＡＧＣＡＴＴＡＣＡＧＡＡＴＧＴＧＡＣＣＴＡＡＧＧＴＣＴＧ
【0152】
プライマー７、配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４に示される：ＧＴＴＡＡＧＴＡＴＡＡＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＡＴＡＴＧＡＡＡＡＡＣＡＴＣＡＡＴＣＣＡＡＣＧＣＡＧ
【0153】
プライマー８、配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５に示される：ＴＣＡＧＣＧＧＴＧＧＣＡＧＣＡＧＣＣＴＡＧＧＴＴＡＡＴＴＡＡＣＣＧＣＧＣＣＡＣＧＣＴＴＴＡＴＡＧＣＧ
【0154】
プライマー９、配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６に示される：ＣＡＧＡＣＣＴＴＡＧＧＴＣＡＣＡＴＴＣＴＧＴＡＡＴＧＣＴＴＡＡＧＴＣＧＡＡＣＡＧＡＡＡＧＴＡＡＴＣＧ
【0155】
プライマー１０、配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７に示される：ＣＡＣＣＧＡＣＴＡＡＴＧＣＡＴＡＣＴＴＴＧＴＣＡＴＧＧＴＡＴＡＴＣＴＣＣＴＴＡＴＴＡＡＡＧＴＴＡＡＡＣ
【0156】
プライマー１１、配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８に示される：ＧＣＴＡＴＡＡＡＧＣＧＴＧＧＣＧＣＧＧＴＴＡＡＴＴＡＡＣＣＴＡＧＧＣＴＧＣＴＧＣＣＡＣＣＧＣＴＧＡＧ
【0157】
プライマー１２、配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９に示される：
ＣＴＧＣＧＴＴＧＧＡＴＴＧＡＴＧＴＴＴＴＴＣＡＴＡＴＧＴＡＴＡＴＣＴＣＣＴＴＣＴＴＡＴＡＣＴＴＡＡＣ
ＣＴＧＣＧＴＴＧＧＡＴＴＧＡＴＧＴＴＴＴＴＣＡＴＡＴＧＴＡＴＡＴＣＴＣＣＴＴＣＴＴＡＴＡＣＴＴＡＡＣ
【0158】
（２）大腸菌組換え菌株ＹＨ２の構築
【0159】
組換え発現ベクターｐＡＣＹＣＤｕｅｔ－ｇｌｋ－ｐｇｉを組換え菌株ＹＨ１に形質転換し、組換え菌株ＹＨ２を得た。
【0160】
実施例３ 大腸菌組換え菌株ＹＨ３－１の構築
（１）ｐｆｋＡ遺伝子ノックアウト組換え断片の構築
ＫＥＧＧデータベースにおける、大腸菌ＭＧ１６５５に由来のフルクトース－６－リン酸キナーゼのコード遺伝子ｐｆｋＡに従って、ｐｆｋＡ上流６５ｂｐ相同断片及び下流６５ｂｐ相同断片のプライマー１３とプライマー１４を設計し、ＰＣＲによってｐＴＫＳＣＳベクター上のＳｃｅＩ－ｔｅｔ－ＳｃｅＩ断片を増幅して、ｐｆｋＡ遺伝子の上下流相同断片を含有する耐性断片２を得た。具体的なプライマー配列を以下に示す。
（１）ｐｆｋＡ遺伝子ノックアウト組換え断片の構築
ＫＥＧＧデータベースにおける、大腸菌ＭＧ１６５５に由来のフルクトース－６－リン酸キナーゼのコード遺伝子ｐｆｋＡに従って、ｐｆｋＡ上流６５ｂｐ相同断片及び下流６５ｂｐ相同断片のプライマー１３とプライマー１４を設計し、ＰＣＲによってｐＴＫＳＣＳベクター上のＳｃｅＩ－ｔｅｔ－ＳｃｅＩ断片を増幅して、ｐｆｋＡ遺伝子の上下流相同断片を含有する耐性断片２を得た。具体的なプライマー配列を以下に示す。
【0161】
プライマー１３、配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０に示される：ＣＡＴＴＣＣＡＡＡＧＴＴＣＡＧＡＧＧＴＡＧＴＣＡＴＧＡＴＴＡＡＧＡＡＡＡＴＣＧＧＴＧＴＧＴＴＧＡＣＡＡＧＣＧＧＣＧＧＴＧＡＴＧＣＧｔａｃｇｇｃｃｃｃａａｇｇｔｃｃａａａｃｇｇｔｇａ
【0162】
プライマー１４、配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１に示される：ＧＣＣＴＴＴＴＴＣＣＧＡＡＡＴＣＡＴＴＡＡＴＡＣＡＧＴＴＴＴＴＴＣＧＣＧＣＡＧＴＣＣＡＧＣＣＡＧＴＣＡＣＣＴＴＴＧＡＡＣＧＧＡＣＧＣＧＣＡＴＣＡＣＣＧＣＣＧＣＴＴＧＴＣＡＡＣＡＣＡＣＣＧＡＴｔｔｇｇｃｔｔｃａｇｇｇａｔｇａｇｇｃｇｃｃａｔｃ
【0163】
（２）大腸菌組換え菌株ＹＨ３の構築
大腸菌ＹＨ２コンピテント細胞（１００μＬ）を調製し、Ｒｅｄ組換えに必要なプラスミドｐＴＫＲｅｄ（温度感受性プラスミド）をトランスフェクションし、スペクチノマイシンを含有する耐性プレートに塗布し、３０℃で一晩培養した。その後、プレートから単一コロニーを選択して、スペクチノマイシンとＩＰＴＧを含有する液体ＬＢに移し、３０℃で培養し、ｐＴＫＲｅｄを含有するＹＨ２エレクトロポレーションコンピテント（１００μＬ）を調製した。
大腸菌ＹＨ２コンピテント細胞（１００μＬ）を調製し、Ｒｅｄ組換えに必要なプラスミドｐＴＫＲｅｄ（温度感受性プラスミド）をトランスフェクションし、スペクチノマイシンを含有する耐性プレートに塗布し、３０℃で一晩培養した。その後、プレートから単一コロニーを選択して、スペクチノマイシンとＩＰＴＧを含有する液体ＬＢに移し、３０℃で培養し、ｐＴＫＲｅｄを含有するＹＨ２エレクトロポレーションコンピテント（１００μＬ）を調製した。
【0164】
ステップ１で得られた断片２をエレクトロポレーションコンピテントと均一に混合し、電気ショック後、スペクチノマイシンとクロラムフェニコールの二重抗体を含有するプレートに塗布し、３０℃で３０時間培養した。単一クローンを選択して、コロニーのＰＣＲ検証を行った結果（検証プライマーはプライマー１５とプライマー１６）、ＰＣＲ産物サイズが約１７５７ｂｐ（ゲノム上のｐｆｋＡ遺伝子上流断片、ＳｃｅＩ－ｔｅｔ－ＳｃｅＩ断片及びゲノム上のｐｆｋＡ遺伝子下流断片を含有する）の菌株は正しい二重交換菌株であった。
【0165】
陽性クローンを選択して、スペクチノマイシン、ＩＰＴＧ及びアラビノースを含有するＬＢ液体培地に移し、８～１２ｈ培養し、その後、菌液を希釈してスペクチノマイシン、ＩＰＴＧ及びアラビノースを含有するプレートに塗布し、一晩培養した。このステップの目的は、アラビノースでＳｃｅＩの発現を誘導し、ＳｃｅＩ認識部位を含有するＤＮＡを切断し、陽性形質転換体の分子内の相同組換えを促進し、ｔｅｔ耐性断片を除去することである。複数の単一クローンをプレートから選択して、コロニーのＰＣＲを再度行った結果（検証プライマーはプライマー１５とプライマー１６）、ＰＣＲ産物が約３６４ｂｐのＤＮＡの形質転換体は陽性クローンであった。陽性クローンを抗体無し液体ＬＢに接種し、３７℃で８～１２時間培養すると、ｐＴＫＲｅｄプラスミドを除去した。形質転換体ＰＣＲをシーケンシングに付して検証を行い、正しい菌株、すなわち、フルクトース６－リン酸キナーゼのコード遺伝子ｐｆｋＡがノックアウトされた大腸菌組み換え工学菌株、すなわち、フルクトース６－リン酸キナーゼのコード遺伝子ｐｆｋＡのない大腸菌組み換え工学菌株を保存し、ＹＨ３と命名した。具体的なプライマー配列を以下に示す。
【0166】
プライマー１５、配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２に示される：ＣＡＴＴＴＧＧＣＣＴＧＡＣＣＴＧＡＡＴＣ
【0167】
プライマー１６、配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３に示される：ＣＧＡＡＣＧＣＣＴＴＡＴＣＣＧＧＣＣＴＡＣ
【0168】
（３）大腸菌組換え菌株ＹＨ３－１の構築
組換え発現ベクターｐＡＣＹＣＤｕｅｔ－ｇｌｋ－ｐｇｉを組換え菌株ＹＨ３に形質転換し、組換え菌株ＹＨ３－１を得た。
組換え発現ベクターｐＡＣＹＣＤｕｅｔ－ｇｌｋ－ｐｇｉを組換え菌株ＹＨ３に形質転換し、組換え菌株ＹＨ３－１を得た。
【0169】
実施例４ 大腸菌組換え菌株ＹＨ４－１の構築
（１）ｐｙｋＦ遺伝子ノックアウト組換え断片の構築
ＫＥＧＧデータベースにおける、大腸菌に由来のピルビン酸キナーゼのコード遺伝子ｐｙｋＦに従って、ｐｙｋＦ上流６５ｂｐ相同断片及び下流６５ｂｐ相同断片のプライマー１７とプライマー１８を設計し、ＰＣＲによってｐＴＫＳＣＳベクター上のＳｃｅＩ－ｔｅｔ－ＳｃｅＩ断片を増幅し、ｐｙｋＦ遺伝子の上下流相同断片を含む耐性断片３を得た。具体的なプライマー配列を以下に示す。
（１）ｐｙｋＦ遺伝子ノックアウト組換え断片の構築
ＫＥＧＧデータベースにおける、大腸菌に由来のピルビン酸キナーゼのコード遺伝子ｐｙｋＦに従って、ｐｙｋＦ上流６５ｂｐ相同断片及び下流６５ｂｐ相同断片のプライマー１７とプライマー１８を設計し、ＰＣＲによってｐＴＫＳＣＳベクター上のＳｃｅＩ－ｔｅｔ－ＳｃｅＩ断片を増幅し、ｐｙｋＦ遺伝子の上下流相同断片を含む耐性断片３を得た。具体的なプライマー配列を以下に示す。
【0170】
プライマー１７、配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４に示される：ＡＧＡＣＴＧＴＣＡＴＧＡＡＡＡＡＧＡＣＣＡＡＡＡＴＴＧＴＴＴＧＣＡＣＣＡＴＣＧＧＡＣＣＧＡＡＡＡＣＣＧＡＡＴＣＴＧＡＡＧＡＧＡＴＧｔａｃｇｇｃｃｃｃａａｇｇｔｃｃａａａｃｇｇｔｇａ
【0171】
プライマー１８、配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５に示される：ＣＡＡＡＡＧＣＡＡＴＡＴＴＡＣＡＧＧＡＣＧＴＧＡＡＣＡＧＡＴＧＣＧＧＴＧＴＴＡＧＴＡＧＴＧＣＣＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＡＧＴＧＣＡＣＣＣＡＴＣＴＣＴＴＣＡＧＡＴＴＣＧＧＴＴＴＴＣＧＧＴＣＣＧＡＴｔｔｇｇｃｔｔｃａｇｇｇａｔｇａｇｇｃｇｃｃａｔｃ
【0172】
（２）大腸菌組換え菌株ＹＨ４の構築
大腸菌ＹＨ３コンピテント細胞（１００μＬ）を調製し、Ｒｅｄ組換えに必要なプラスミドｐＴＫＲｅｄ（温度感受性プラスミド）をトランスフェクションし、スペクチノマイシンを含有する耐性プレートに塗布し、３０℃で一晩培養した。その後、プレートから単一コロニーを選択して、スペクチノマイシンとＩＰＴＧを含有する液体ＬＢに移し、３０℃で培養し、ｐＴＫＲｅｄを含有するＹＨ３エレクトロポレーションコンピテント（１００μＬ）を調製した。
大腸菌ＹＨ３コンピテント細胞（１００μＬ）を調製し、Ｒｅｄ組換えに必要なプラスミドｐＴＫＲｅｄ（温度感受性プラスミド）をトランスフェクションし、スペクチノマイシンを含有する耐性プレートに塗布し、３０℃で一晩培養した。その後、プレートから単一コロニーを選択して、スペクチノマイシンとＩＰＴＧを含有する液体ＬＢに移し、３０℃で培養し、ｐＴＫＲｅｄを含有するＹＨ３エレクトロポレーションコンピテント（１００μＬ）を調製した。
【0173】
ステップ１で得られた断片３をエレクトロポレーションコンピテントと均一に混合し、電気ショック後、スペクチノマイシンとクロラムフェニコールの二重抗体を含有するプレートに塗布し、３０℃で３０時間培養した。単一クローンを選択して、コロニーのＰＣＲ検証を行った結果（検証プライマーはプライマー１９とプライマー２０）、ＰＣＲ産物サイズが約２３１０ｂｐ（ゲノム上のｐｙｋＦ遺伝子上流断片、ＳｃｅＩ－ｔｅｔ－ＳｃｅＩ断片及びゲノム上のｐｙｋＦ遺伝子下流断片を含有する）の菌株は正しい二重交換菌株であった。
【0174】
陽性クローンを選択して、スペクチノマイシン、ＩＰＴＧ及びアラビノースを含有するＬＢ液体培地に移し、８～１２ｈ培養し、その後、菌液を希釈してスペクチノマイシン、ＩＰＴＧ及びアラビノースを含有するプレートに塗布し、一晩培養した。このステップの目的は、アラビノースでＳｃｅＩの発現を誘導し、ＳｃｅＩ認識部位を含有するＤＮＡを切断し、陽性形質転換体の分子内の相同組換えを促進し、ｔｅｔ耐性断片を除去することである。複数の単一クローンをプレートから選択して、コロニーのＰＣＲを再度行った結果（検証プライマーはプライマー１５とプライマー１６）、ＰＣＲ産物が約３６４ｂｐのＤＮＡの形質転換体は陽性クローンであった。陽性クローンを抗体無し液体ＬＢに接種し、３７℃で８～１２時間培養すると、ｐＴＫＲｅｄプラスミドを除去した。形質転換体ＰＣＲをシーケンシングに付して検証を行い、正しい菌株、すなわち、ピルビン酸キナーゼのコード遺伝子ｐｙｋＦがノックアウトされた大腸菌組み換え工学菌株、すなわち、ピルビン酸キナーゼのコード遺伝子ｐｙｋＦのない大腸菌組み換え工学菌株を保存し、ＹＨ４と命名した。具体的なプライマー配列を以下に示す。
【0175】
プライマー１９、配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６に示される：ＡＡＣＴＴＣＧＧＣＡＣＣＡＧＡＣＧＴＴＧ
【0176】
プライマー２０、配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７に示される：ＴＣＴＧＡＡＣＧＴＣＡＧＡＡＧＡＣＡＧＣ
【0177】
（３）大腸菌組換え菌株ＹＨ４－１の構築
組換え発現ベクターｐＡＣＹＣＤｕｅｔ－ｇｌｋ－ｐｇｉを組換え菌株ＹＨ４に形質転換し、組換え菌株ＹＨ４－１を得た。
組換え発現ベクターｐＡＣＹＣＤｕｅｔ－ｇｌｋ－ｐｇｉを組換え菌株ＹＨ４に形質転換し、組換え菌株ＹＨ４－１を得た。
【0178】
実施例５ 大腸菌組換え菌株ＹＨ５－１の構築
（１）ｐｇｍ遺伝子ノックアウト組換え断片の構築
ＫＥＧＧデータベースにおける、大腸菌に由来のホスホグルコムターゼのコード遺伝子ｐｇｍに従って、ｐｇｍ上流６５ｂｐ相同断片及び下流６５ｂｐ相同断片のプライマー２１とプライマー２２を設計し、ＰＣＲによってｐＴＫＳＣＳベクター上のＳｃｅＩ－ｔｅｔ－ＳｃｅＩ断片を増幅し、ｐｇｍ遺伝子の上下流相同断片を含有する耐性断片４を得た。具体的なプライマー配列を以下に示す。
（１）ｐｇｍ遺伝子ノックアウト組換え断片の構築
ＫＥＧＧデータベースにおける、大腸菌に由来のホスホグルコムターゼのコード遺伝子ｐｇｍに従って、ｐｇｍ上流６５ｂｐ相同断片及び下流６５ｂｐ相同断片のプライマー２１とプライマー２２を設計し、ＰＣＲによってｐＴＫＳＣＳベクター上のＳｃｅＩ－ｔｅｔ－ＳｃｅＩ断片を増幅し、ｐｇｍ遺伝子の上下流相同断片を含有する耐性断片４を得た。具体的なプライマー配列を以下に示す。
【0179】
プライマー２１、配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８に示される：ＡＡＡＣＧＴＴＧＣＡＧＡＣＡＡＡＧＧＡＣＡＡＡＧＣＡＡＴＧＧＣＡＡＴＣＣＡＣＡＡＴＣＧＴＧＣＡＧＧＣＣＡＡＣＣＴＧＣＡＣＡＡＣＡＧｔａｃｇｇｃｃｃｃａａｇｇｔｃｃａａａｃｇｇｔｇａ
【0180】
プライマー２２、配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９に示される：ＧＴＧＴＴＴＡＣＧＣＧＴＴＴＴＴＣＡＧＡＡＣＴＴＣＧＣＴＡＡＣＡＡＴＣＴＣＡＡＣＣＧＣＴＴＣＴＴＴＣＴＣＡＡＴＣＴＧＣＴＴＧＣＧＣＴＧＴＴＧＴＧＣＡＧＧＴＴＧＧＣＣＴＧＣＡＣＧＡＴＴＧＴＧｔｔｇｇｃｔｔｃａｇｇｇａｔｇａｇｇｃｇｃｃａｔｃ
【0181】
（２）大腸菌組換え菌株ＹＨ５の構築
大腸菌ＹＨ４コンピテント細胞（１００μＬ）を調製し、Ｒｅｄ組換えに必要なプラスミドｐＴＫＲｅｄ（温度感受性プラスミド）をトランスフェクションし、スペクチノマイシンを含有する耐性プレートに塗布し、３０℃で一晩培養した。その後、プレートから単一コロニーを選択して、スペクチノマイシンとＩＰＴＧを含有する液体ＬＢに移し、３０℃で培養し、ｐＴＫＲｅｄを含有するＹＨ４エレクトロポレーションコンピテント（１００μＬ）を調製した。
大腸菌ＹＨ４コンピテント細胞（１００μＬ）を調製し、Ｒｅｄ組換えに必要なプラスミドｐＴＫＲｅｄ（温度感受性プラスミド）をトランスフェクションし、スペクチノマイシンを含有する耐性プレートに塗布し、３０℃で一晩培養した。その後、プレートから単一コロニーを選択して、スペクチノマイシンとＩＰＴＧを含有する液体ＬＢに移し、３０℃で培養し、ｐＴＫＲｅｄを含有するＹＨ４エレクトロポレーションコンピテント（１００μＬ）を調製した。
【0182】
ステップ１で得られた断片４をエレクトロポレーションコンピテントと均一に混合し、電気ショック後、スペクチノマイシンとクロラムフェニコールの二重抗体を含有するプレートに塗布し、３０℃で３０時間培養した。単一クローンを選択して、コロニーのＰＣＲ検証を行った結果（検証プライマーはプライマー２３とプライマー２４）、ＰＣＲ産物サイズが約２２００ｂｐ（ゲノム上のｐｇｍ遺伝子上流断片、ＳｃｅＩ－ｔｅｔ－ＳｃｅＩ断片及びゲノム上のｐｇｍ遺伝子下流断片を含有する）の菌株は正しい二重交換菌株であった。
【0183】
陽性クローンを選択して、スペクチノマイシン、ＩＰＴＧ及びアラビノースを含有するＬＢ液体培地に移し、８～１２ｈ培養し、その後、菌液を希釈してスペクチノマイシン、ＩＰＴＧ及びアラビノースを含有するプレートに塗布し、一晩培養した。このステップの目的は、アラビノースでＳｃｅＩの発現を誘導し、ＳｃｅＩ認識部位を含有するＤＮＡを切断し、陽性形質転換体の分子内の相同組換えを促進し、ｔｅｔ耐性断片を除去することである。複数の単一クローンをプレートから選択して、コロニーのＰＣＲを再度行った結果（検証プライマーはプライマー１５とプライマー１６）、ＰＣＲ産物が約８０７ｂｐのＤＮＡの形質転換体は陽性クローンであった。陽性クローンを抗体無し液体ＬＢに接種し、３７℃で８～１２時間培養すると、ｐＴＫＲｅｄプラスミドを除去した。形質転換体ＰＣＲをシーケンシングに付して検証を行い、正しい菌株、すなわち、ホスホグルコムターゼのコード遺伝子ｐｇｍがノックアウトされた大腸菌組み換え工学菌株、すなわち、ホスホグルコムターゼのコード遺伝子ｐｇｍのない大腸菌組み換え工学菌株を保存し、ＹＨ５と命名した。具体的なプライマー配列を以下に示す。
【0184】
プライマー２３、配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０に示される：ＣＧＧＴＣＡＡＡＡＣＧＡＴＴＡＡＡＧＡＣＡＡＧ
【0185】
プライマー２４、配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１に示される：ＣＣＡＧＴＣＧＣＣＡＧＣＴＡＡＴＧＡＴＧ
【0186】
（３）大腸菌組換え菌株ＹＨ５－１の構築
組換え発現ベクターｐＡＣＹＣＤｕｅｔ－ｇｌｋ－ｐｇｉを組換え菌株ＹＨ５に形質転換し、組換え菌株ＹＨ５－１を得た。
組換え発現ベクターｐＡＣＹＣＤｕｅｔ－ｇｌｋ－ｐｇｉを組換え菌株ＹＨ５に形質転換し、組換え菌株ＹＨ５－１を得た。
【0187】
実施例６ 大腸菌組換え菌株ＹＨ６－１の構築
（１）ｚｗｆ遺伝子ノックアウト組換え断片の構築
ＫＥＧＧデータベースにおける、大腸菌に由来のグルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼのコード遺伝子ｚｗｆに従って、ｚｗｆ上流６５ｂｐ相同断片及び下流６５ｂｐ相同断片のプライマー２１とプライマー２２を設計し、ＰＣＲによってｐＴＫＳＣＳベクター上のＳｃｅＩ－ｔｅｔ－ＳｃｅＩ断片を増幅し、ｚｗｆ遺伝子の上下流相同断片を含有する耐性断片５を得た。具体的なプライマー配列を以下に示す。
（１）ｚｗｆ遺伝子ノックアウト組換え断片の構築
ＫＥＧＧデータベースにおける、大腸菌に由来のグルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼのコード遺伝子ｚｗｆに従って、ｚｗｆ上流６５ｂｐ相同断片及び下流６５ｂｐ相同断片のプライマー２１とプライマー２２を設計し、ＰＣＲによってｐＴＫＳＣＳベクター上のＳｃｅＩ－ｔｅｔ－ＳｃｅＩ断片を増幅し、ｚｗｆ遺伝子の上下流相同断片を含有する耐性断片５を得た。具体的なプライマー配列を以下に示す。
【0188】
プライマー２５、配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２に示される：ＧＴＴＡＡＣＴＴＡＡＧＧＡＧＡＡＴＧＡＣＡＴＧＧＣＧＧＴＡＡＣＧＣＡＡＡＣＡＧＣＣＣＡＧＧＣＣＴＧＴＧＡＣＣＴＧＧＴＣＡＴＴＴＴＣｔａｃｇｇｃｃｃｃａａｇｇｔｃｃａａａｃｇｇｔｇａ
【0189】
プライマー２６、配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３に示される：ＡＡＧＣＧＣＡＧＡＴＡＴＴＡＣＴＣＡＡＡＣＴＣＡＴＴＣＣＡＧＧＡＡＣＧＡＣＣＡＴＣＡＣＧＧＧＴＡＡＴＣＡＴＣＧＣＣＡＣＣＧＡＧＧＣＧＡＡＡＡＴＧＡＣＣＡＧＧＴＣＡＣＡＧＧＣＣＴＧＧＧＣＴＧＴｔｔｇｇｃｔｔｃａｇｇｇａｔｇａｇｇｃｇｃｃａｔｃ
【0190】
（２）大腸菌組換え菌株ＹＨ６の構築
大腸菌ＹＨ５コンピテント細胞（１００μＬ）を調製し、Ｒｅｄ組換えに必要なプラスミドｐＴＫＲｅｄ（温度感受性プラスミド）をトランスフェクションし、スペクチノマイシンを含有する耐性プレートに塗布し、３０℃で一晩培養した。その後、プレートから単一コロニーを選択して、スペクチノマイシンとＩＰＴＧを含有する液体ＬＢに移し、３０℃で培養し、ｐＴＫＲｅｄを含有するＹＨ５エレクトロポレーションコンピテント（１００μＬ）を調製した。
大腸菌ＹＨ５コンピテント細胞（１００μＬ）を調製し、Ｒｅｄ組換えに必要なプラスミドｐＴＫＲｅｄ（温度感受性プラスミド）をトランスフェクションし、スペクチノマイシンを含有する耐性プレートに塗布し、３０℃で一晩培養した。その後、プレートから単一コロニーを選択して、スペクチノマイシンとＩＰＴＧを含有する液体ＬＢに移し、３０℃で培養し、ｐＴＫＲｅｄを含有するＹＨ５エレクトロポレーションコンピテント（１００μＬ）を調製した。
【0191】
ステップ１で得られた断片５をエレクトロポレーションコンピテントと均一に混合し、電気ショック後、スペクチノマイシンとクロラムフェニコールの二重抗体を含有するプレートに塗布し、３０℃で３０時間培養した。単一クローンを選択して、コロニーのＰＣＲ検証を行った結果（検証プライマーはプライマー２７とプライマー２８）、ＰＣＲ産物サイズが約２３０６ｂｐ（ゲノム上のｚｗｆ遺伝子上流断片、ＳｃｅＩ－ｔｅｔ－ＳｃｅＩ断片及びゲノム上のｚｗｆ遺伝子下流断片を含有する）の菌株は正しい二重交換菌株であった。
【0192】
陽性クローンを選択して、スペクチノマイシン、ＩＰＴＧ及びアラビノースを含有するＬＢ液体培地に移し、８～１２ｈ培養し、その後、菌液を希釈してスペクチノマイシン、ＩＰＴＧ及びアラビノースを含有するプレートに塗布し、一晩培養した。このステップの目的はアラビノースでＳｃｅＩの発現を誘導し、ＳｃｅＩ認識部位を含有するＤＮＡを切断し、陽性形質転換体の分子内の相同組換えを促進し、ｔｅｔ耐性断片を除去することである。複数の単一クローンをプレートから選択して、コロニーのＰＣＲを再度行った結果（検証プライマーはプライマー２７とプライマー２８）、ＰＣＲ産物が約９１３ｂｐのＤＮＡの形質転換体は陽性クローンであった。陽性クローンを抗体無し液体ＬＢに接種し、３７℃で８～１２時間培養すると、ｐＴＫＲｅｄプラスミドを除去した。形質転換体ＰＣＲをシーケンシングに付して検証を行い、正しい菌株、すなわち、グルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼのコード遺伝子ｚｗｆがノックアウトされた大腸菌組み換え工学菌株、すなわち、グルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼのコード遺伝子ｚｗｆのない大腸菌組み換え工学菌株を保存し、ＹＨ６と命名した。具体的なプライマー配列を以下に示す。
【0193】
プライマー２７、配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４に示される：ＧＡＴＴＴＧＣＴＣＡＡＡＴＧＴＴＣＣＡＧＣ
【0194】
プライマー２８、配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５に示される：ＧＣＡＡＣＡＴＧＣＴＴＴＴＣＡＡＡＧＡＧ
【0195】
（３）構築大腸菌組換え菌株ＹＨ６－１
組換え発現ベクターｐＡＣＹＣＤｕｅｔ－ｇｌｋ－ｐｇｉを組換え菌株ＹＨ６に形質転換し、組換え菌株ＹＨ６－１を得た。
組換え発現ベクターｐＡＣＹＣＤｕｅｔ－ｇｌｋ－ｐｇｉを組換え菌株ＹＨ６に形質転換し、組換え菌株ＹＨ６－１を得た。
【0196】
実施例７ 大腸菌組換え菌株ＭＧ１６５５－１の構築
（１）組換え発現ベクターｐＥＴＤｕｅｔ－ｔ６ｐｅ－ｔ６ｐｐの構築
ＫＥＧＧデータベースにおける、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ ｓｔｒ． Ｃ５８に由来のタガトース－６－リン酸エピメラーゼＴ６ＰＥとアルカエオグロブス属Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｆｕｌｇｉｄｕｓ又はＡｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｐｒｏｆｕｎｄｕｓに由来のタガトース－６－リン酸ホスファターゼＴ６ＰＰ遺伝子に従って、プライマー２９とプライマー３０を設計してｔ６ｐｅを増幅し、プライマー３１とプライマー３２を設計してｔ６ｐｐを増幅した。プライマー３３とプライマー３４を設計して、プラスミド骨架ｐＥＴＤｕｅｔ（図２Ｄ）を増幅し、ｓｉｍｐｌｅ ｃｌｏｎｉｎｇ連結方式［５］によって組換え発現ベクターｐＥＴＤｕｅｔ－ｔ６ｐｅを構築した。その後、さらに、プライマー３５とプライマー３６を設計して、プラスミド骨架ｐＥＴＤｕｅｔ－ｔ６ｐｅを増幅し、ｓｉｍｐｌｅ ｃｌｏｎｉｎｇ方法によって組換え発現ベクターｐＥＴＤｕｅｔ－ｔ６ｐｅ－ｔ６ｐｐを得た。具体的なプライマー配列を以下に示す。
（１）組換え発現ベクターｐＥＴＤｕｅｔ－ｔ６ｐｅ－ｔ６ｐｐの構築
ＫＥＧＧデータベースにおける、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ ｓｔｒ． Ｃ５８に由来のタガトース－６－リン酸エピメラーゼＴ６ＰＥとアルカエオグロブス属Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｆｕｌｇｉｄｕｓ又はＡｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｐｒｏｆｕｎｄｕｓに由来のタガトース－６－リン酸ホスファターゼＴ６ＰＰ遺伝子に従って、プライマー２９とプライマー３０を設計してｔ６ｐｅを増幅し、プライマー３１とプライマー３２を設計してｔ６ｐｐを増幅した。プライマー３３とプライマー３４を設計して、プラスミド骨架ｐＥＴＤｕｅｔ（図２Ｄ）を増幅し、ｓｉｍｐｌｅ ｃｌｏｎｉｎｇ連結方式［５］によって組換え発現ベクターｐＥＴＤｕｅｔ－ｔ６ｐｅを構築した。その後、さらに、プライマー３５とプライマー３６を設計して、プラスミド骨架ｐＥＴＤｕｅｔ－ｔ６ｐｅを増幅し、ｓｉｍｐｌｅ ｃｌｏｎｉｎｇ方法によって組換え発現ベクターｐＥＴＤｕｅｔ－ｔ６ｐｅ－ｔ６ｐｐを得た。具体的なプライマー配列を以下に示す。
【0197】
プライマー２９、配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６に示される：ＧＴＴＡＡＧＴＡＴＡＡＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＡＴＡＴＧＡＡＣＡＣＣＧＡＡＣＡＴＣＣＧＣＴＧＡＡＡＡＡＴＧ
【0198】
プライマー３０、配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７に示される：ＣＧＧＴＧＧＣＡＧＣＡＧＣＣＴＡＧＧＴＴＡＡＴＴＡＣＴＣＧＡＧＡＡＴＣＡＧＴＴＴＧＡＡＴＴＣＡＣＣＧ
【0199】
プライマー３１、配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８に示される：ＧＴＴＴＡＡＣＴＴＴＡＡＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＣＡＴＧＴＴＣＡＡＧＣＣＧＡＡＡＧＣＧＡＴＣＧＣＧ
【0200】
プライマー３２、配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９に示される：ＧＡＴＴＡＣＴＴＴＣＴＧＴＴＣＧＡＣＴＴＡＡＧＣＡＴＴＡＡＣＧＣＡＧＣＡＧＧＣＣＣＡＧＡＡＡＣＴＧＣＡＧ
【0201】
プライマー３３、配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０に示される：ＣＡＴＴＴＴＴＣＡＧＣＧＧＡＴＧＴＴＣＧＧＴＧＴＴＣＡＴＡＴＧＴＡＴＡＴＣＴＣＣＴＴＣＴＴＡＴＡＣＴＴＡＡＣ
【0202】
プライマー３４、配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５１に示される：ＣＧＧＴＧＡＡＴＴＣＡＡＡＣＴＧＡＴＴＣＴＣＧＡＧＴＡＡＴＴＡＡＣＣＴＡＧＧＣＴＧＣＴＧＣＣＡＣＣＧ
【0203】
プライマー３５、配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５２に示される：ＣＴＧＣＡＧＴＴＴＣＴＧＧＧＣＣＴＧＣＴＧＣＧＴＴＡＡＴＧＣＴＴＡＡＧＴＣＧＡＡＣＡＧＡＡＡＧＴＡＡＴＣ
【0204】
プライマー３６、配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５３に示される：ＣＧＣＧＡＴＣＧＣＴＴＴＣＧＧＣＴＴＧＡＡＣＡＴＧＧＴＡＴＡＴＣＴＣＣＴＴＣＴＴＡＡＡＧＴＴＡＡＡＣ
【0205】
（２）大腸菌組換え菌株ＭＧ１６５５－１の構築
組換え発現ベクターｐＥＴＤｕｅｔ－ｔ６ｐｅ－ｔ６ｐｐを大腸菌ＭＧ１６５５（ＤＥ３）に形質転換し、組換え菌株ＭＧ１６５５－１を得た。
組換え発現ベクターｐＥＴＤｕｅｔ－ｔ６ｐｅ－ｔ６ｐｐを大腸菌ＭＧ１６５５（ＤＥ３）に形質転換し、組換え菌株ＭＧ１６５５－１を得た。
【0206】
同様な方法によって、組換え発現ベクターｐＥＴＤｕｅｔ－ｔ６ｐｅ－ｔ６ｐｐを大腸菌組換え菌株ＹＨ１、ＹＨ２、ＹＨ３－１、ＹＨ４－１、ＹＨ５－１、ＹＨ６－１に挿入し、タガトース６－リン酸エピメラーゼ及びタガトース６－リン酸ホスファターゼの酵素活性を向上させた大腸菌組換え菌株ＹＨ１－１、ＹＨ２－１、ＹＨ３－２、ＹＨ４－２、ＹＨ５－２、ＹＨ６－２を得た。
【0207】
実施例８ 大腸菌組換え菌株ＭＧ１６５５－１のタガトース生産における使用
（１）大腸菌組換え菌株ＭＧ１６５５－１を用いたグルコース発酵によるタガトースの合成
ＬＢ培地（１０ｇ／Ｌペプトン、５ｇ／Ｌ酵母抽出物、１０ｇ／Ｌ塩化ナトリウム、カナマイシン２５ｎｇ／ｍＬ）１００ｍＬに、終濃度２０ｇ／Ｌのグルコースを加え、３７℃、２００ｒｍｐの条件で、大腸菌組換え菌株ＭＧ１６５５－１を１２～２４ｈ培養し、発酵終了後、サンプルを１４０００ｒｍｐで２０ｍｉｎ遠心分離し、０．２２μｍの微孔性濾過膜で濾過し、濾液についてＨＰＬＣを行った。高速液体クロマトグラフィー分析は以下のような条件で行われた。器具：アジレント社製高速液体クロマトグラフ１２００、分析カラム：ＨＰＸ－８７Ｈ、移動相：５ｍＭ Ｈ２ＳＯ４、流速：０．６ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度：６０℃、検出器：示差屈折率検出器、注入量：２０μｌ。１２ｈ発酵後、タガトースの収率は１．０％であった。
（１）大腸菌組換え菌株ＭＧ１６５５－１を用いたグルコース発酵によるタガトースの合成
ＬＢ培地（１０ｇ／Ｌペプトン、５ｇ／Ｌ酵母抽出物、１０ｇ／Ｌ塩化ナトリウム、カナマイシン２５ｎｇ／ｍＬ）１００ｍＬに、終濃度２０ｇ／Ｌのグルコースを加え、３７℃、２００ｒｍｐの条件で、大腸菌組換え菌株ＭＧ１６５５－１を１２～２４ｈ培養し、発酵終了後、サンプルを１４０００ｒｍｐで２０ｍｉｎ遠心分離し、０．２２μｍの微孔性濾過膜で濾過し、濾液についてＨＰＬＣを行った。高速液体クロマトグラフィー分析は以下のような条件で行われた。器具：アジレント社製高速液体クロマトグラフ１２００、分析カラム：ＨＰＸ－８７Ｈ、移動相：５ｍＭ Ｈ２ＳＯ４、流速：０．６ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度：６０℃、検出器：示差屈折率検出器、注入量：２０μｌ。１２ｈ発酵後、タガトースの収率は１．０％であった。
【0208】
（２）大腸菌組換え菌株ＭＧ１６５５－１を用いたグルコースとグリセロールの発酵によるタガトースの合成
Ｍ９Ｙ 培地（１０ｇ／Ｌ グリセロール、２０ｇ／Ｌ グルコース、６ｇ／Ｌ Ｎａ２ＨＰＯ４、０．５ｇ／Ｌ ＮａＣｌ、３ｇ／Ｌ ＫＨ２ＰＯ４、１ｇ／Ｌ ＮＨ４Ｃｌ、１ｍＭ ＭｇＳＯ４、０．１ｍＭ ＣａＣｌ２、及び２ｇ／Ｌ酵母抽出物）１００ｍＬを用いて、３７℃、２００ｒｍｐの条件で、大腸菌組換え菌株ＭＧ１６５５－１を１２～２４ｈ培養し、発酵終了後、サンプルを１４０００ｒｍｐで２０ｍｉｎ遠心分離し、０．２２μｍの微孔性濾過膜で濾過し、濾液についてＨＰＬＣを行った。高速液体クロマトグラフィー分析は以下のような条件で行われた。器具：アジレント社製高速液体クロマトグラフ１２００、分析カラム：ＨＰＸ－８７Ｈ、移動相：５ｍＭ Ｈ２ＳＯ４、流速：０．６ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度：６０℃、検出器：示差屈折率検出器、注入量：２０μｌ。１２ｈ発酵後、タガトースの収率は１．０％であった。
Ｍ９Ｙ 培地（１０ｇ／Ｌ グリセロール、２０ｇ／Ｌ グルコース、６ｇ／Ｌ Ｎａ２ＨＰＯ４、０．５ｇ／Ｌ ＮａＣｌ、３ｇ／Ｌ ＫＨ２ＰＯ４、１ｇ／Ｌ ＮＨ４Ｃｌ、１ｍＭ ＭｇＳＯ４、０．１ｍＭ ＣａＣｌ２、及び２ｇ／Ｌ酵母抽出物）１００ｍＬを用いて、３７℃、２００ｒｍｐの条件で、大腸菌組換え菌株ＭＧ１６５５－１を１２～２４ｈ培養し、発酵終了後、サンプルを１４０００ｒｍｐで２０ｍｉｎ遠心分離し、０．２２μｍの微孔性濾過膜で濾過し、濾液についてＨＰＬＣを行った。高速液体クロマトグラフィー分析は以下のような条件で行われた。器具：アジレント社製高速液体クロマトグラフ１２００、分析カラム：ＨＰＸ－８７Ｈ、移動相：５ｍＭ Ｈ２ＳＯ４、流速：０．６ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度：６０℃、検出器：示差屈折率検出器、注入量：２０μｌ。１２ｈ発酵後、タガトースの収率は１．０％であった。
【0209】
実施例９ 大腸菌組換え菌株ＹＨ１－１のタガトース生産における使用
（１）大腸菌組換え菌株ＹＨ１－１を用いたグルコース発酵によるタガトースの合成
ＬＢ培地（１０ｇ／Ｌ ペプトン、５ｇ／Ｌ酵母抽出物、１０ｇ／Ｌ 塩化ナトリウム、カナマイシン２５ｎｇ／ｍＬ）１００ｍＬに、終濃度２０ｇ／Ｌのグルコースを加え、３７℃、２００ｒｍｐの条件で、大腸菌組換え菌株ＹＨ１－１を１２～２４ｈ培養し、発酵終了後、サンプルを１４０００ｒｍｐで２０ｍｉｎ遠心分離し、０．２２μｍの微孔性濾過膜で濾過し、濾液についてＨＰＬＣを行った。高速液体クロマトグラフィー分析は以下のような条件で行われた。器具：アジレント社製高速液体クロマトグラフ１２００、分析カラム：ＨＰＸ－８７Ｈ、移動相：５ｍＭ Ｈ２ＳＯ４、流速：０．６ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度：６０℃、検出器：示差屈折率検出器、注入量：２０μｌ。１２ｈ発酵後、タガトースの収率は２．０％であった。
（１）大腸菌組換え菌株ＹＨ１－１を用いたグルコース発酵によるタガトースの合成
ＬＢ培地（１０ｇ／Ｌ ペプトン、５ｇ／Ｌ酵母抽出物、１０ｇ／Ｌ 塩化ナトリウム、カナマイシン２５ｎｇ／ｍＬ）１００ｍＬに、終濃度２０ｇ／Ｌのグルコースを加え、３７℃、２００ｒｍｐの条件で、大腸菌組換え菌株ＹＨ１－１を１２～２４ｈ培養し、発酵終了後、サンプルを１４０００ｒｍｐで２０ｍｉｎ遠心分離し、０．２２μｍの微孔性濾過膜で濾過し、濾液についてＨＰＬＣを行った。高速液体クロマトグラフィー分析は以下のような条件で行われた。器具：アジレント社製高速液体クロマトグラフ１２００、分析カラム：ＨＰＸ－８７Ｈ、移動相：５ｍＭ Ｈ２ＳＯ４、流速：０．６ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度：６０℃、検出器：示差屈折率検出器、注入量：２０μｌ。１２ｈ発酵後、タガトースの収率は２．０％であった。
【0210】
（２）大腸菌組換え菌株ＹＨ１－１を用いたグルコースとグリセロールの発酵によるタガトースの合成
Ｍ９Ｙ 培地（１０ｇ／Ｌグリセロール、２０ｇ／Ｌグルコース、６ｇ／Ｌ Ｎａ２ＨＰＯ４、０．５ｇ／Ｌ ＮａＣｌ、３ｇ／Ｌ ＫＨ２ＰＯ４、１ｇ／Ｌ ＮＨ４Ｃｌ、１ｍＭ ＭｇＳＯ４、０．１ｍＭ ＣａＣｌ２、及び２ｇ／Ｌ酵母抽出物）１００ｍＬを用いて、３７℃、２００ｒｍｐの条件で、大腸菌組換え菌株ＹＨ１－１を１２～２４ｈ培養し、発酵終了後、サンプルを１４０００ｒｍｐで２０ｍｉｎ遠心分離し、０．２２μｍの微孔性濾過膜で濾過し、濾液についてＨＰＬＣを行った。高速液体クロマトグラフィー分析は以下のような条件で行われた。器具：アジレント社製高速液体クロマトグラフ１２００、分析カラム：ＨＰＸ－８７Ｈ、移動相：５ｍＭ Ｈ２ＳＯ４、流速：０．６ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度：６０℃、検出器：示差屈折率検出器、注入量：２０μｌ。１２ｈ発酵後、タガトースの収率は６．０％であった。
Ｍ９Ｙ 培地（１０ｇ／Ｌグリセロール、２０ｇ／Ｌグルコース、６ｇ／Ｌ Ｎａ２ＨＰＯ４、０．５ｇ／Ｌ ＮａＣｌ、３ｇ／Ｌ ＫＨ２ＰＯ４、１ｇ／Ｌ ＮＨ４Ｃｌ、１ｍＭ ＭｇＳＯ４、０．１ｍＭ ＣａＣｌ２、及び２ｇ／Ｌ酵母抽出物）１００ｍＬを用いて、３７℃、２００ｒｍｐの条件で、大腸菌組換え菌株ＹＨ１－１を１２～２４ｈ培養し、発酵終了後、サンプルを１４０００ｒｍｐで２０ｍｉｎ遠心分離し、０．２２μｍの微孔性濾過膜で濾過し、濾液についてＨＰＬＣを行った。高速液体クロマトグラフィー分析は以下のような条件で行われた。器具：アジレント社製高速液体クロマトグラフ１２００、分析カラム：ＨＰＸ－８７Ｈ、移動相：５ｍＭ Ｈ２ＳＯ４、流速：０．６ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度：６０℃、検出器：示差屈折率検出器、注入量：２０μｌ。１２ｈ発酵後、タガトースの収率は６．０％であった。
【0211】
実施例１０ 大腸菌組換え菌株ＹＨ２－１のタガトース生産における使用
（１）大腸菌組換え菌株ＹＨ２－１を用いたグルコース発酵によるタガトースの合成
ＬＢ培地（１０ｇ／Ｌペプトン、５ｇ／Ｌ酵母抽出物、１０ｇ／Ｌ塩化ナトリウム、カナマイシン２５ｎｇ／ｍＬ）１００ｍＬに、終濃度２０ｇ／Ｌのグルコースを加え、３７℃、２００ｒｍｐの条件で、大腸菌組換え菌株ＹＨ２－１を１２～２４ｈ培養し、発酵終了後、サンプルを１４０００ｒｍｐで２０ｍｉｎ遠心分離し、０．２２μｍの微孔性濾過膜で濾過し、濾液についてＨＰＬＣを行った。高速液体クロマトグラフィー分析は以下のような条件で行われた。器具：アジレント社製高速液体クロマトグラフ１２００、分析カラム：ＨＰＸ－８７Ｈ、移動相：５ｍＭ Ｈ２ＳＯ４、流速：０．６ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度：６０℃、検出器：示差屈折率検出器、注入量：２０μｌ。１２ｈ発酵後、タガトースの収率は２．０％であった。
（１）大腸菌組換え菌株ＹＨ２－１を用いたグルコース発酵によるタガトースの合成
ＬＢ培地（１０ｇ／Ｌペプトン、５ｇ／Ｌ酵母抽出物、１０ｇ／Ｌ塩化ナトリウム、カナマイシン２５ｎｇ／ｍＬ）１００ｍＬに、終濃度２０ｇ／Ｌのグルコースを加え、３７℃、２００ｒｍｐの条件で、大腸菌組換え菌株ＹＨ２－１を１２～２４ｈ培養し、発酵終了後、サンプルを１４０００ｒｍｐで２０ｍｉｎ遠心分離し、０．２２μｍの微孔性濾過膜で濾過し、濾液についてＨＰＬＣを行った。高速液体クロマトグラフィー分析は以下のような条件で行われた。器具：アジレント社製高速液体クロマトグラフ１２００、分析カラム：ＨＰＸ－８７Ｈ、移動相：５ｍＭ Ｈ２ＳＯ４、流速：０．６ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度：６０℃、検出器：示差屈折率検出器、注入量：２０μｌ。１２ｈ発酵後、タガトースの収率は２．０％であった。
【0212】
（２）大腸菌組換え菌株ＹＨ２－１を用いたグルコースとグリセロールの発酵によるタガトースの合成
Ｍ９Ｙ 培地（１０ｇ／Ｌ グリセロール、２０ｇ／Ｌグルコース、６ｇ／Ｌ Ｎａ２ＨＰＯ４、０．５ｇ／Ｌ ＮａＣｌ、３ｇ／Ｌ ＫＨ２ＰＯ４、１ｇ／Ｌ ＮＨ４Ｃｌ、１ｍＭ ＭｇＳＯ４、０．１ｍＭ ＣａＣｌ２、及び２ｇ／Ｌ酵母抽出物）１００ｍＬを用いて、３７℃、２００ｒｍｐの条件で、大腸菌組換え菌株ＹＨ２－１を１２～２４ｈ培養し、発酵終了後、サンプルを１４０００ｒｍｐで２０ｍｉｎ遠心分離し、０．２２μｍの微孔性濾過膜で濾過し、濾液についてＨＰＬＣを行った。高速液体クロマトグラフィー分析は以下のような条件で行われた。器具：アジレント社製高速液体クロマトグラフ１２００、分析カラム：ＨＰＸ－８７Ｈ、移動相：５ｍＭ Ｈ２ＳＯ４、流速：０．６ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度：６０℃、検出器：示差屈折率検出器、注入量：２０μｌ。１２ｈ発酵後、タガトースの収率は８．０％であった。
Ｍ９Ｙ 培地（１０ｇ／Ｌ グリセロール、２０ｇ／Ｌグルコース、６ｇ／Ｌ Ｎａ２ＨＰＯ４、０．５ｇ／Ｌ ＮａＣｌ、３ｇ／Ｌ ＫＨ２ＰＯ４、１ｇ／Ｌ ＮＨ４Ｃｌ、１ｍＭ ＭｇＳＯ４、０．１ｍＭ ＣａＣｌ２、及び２ｇ／Ｌ酵母抽出物）１００ｍＬを用いて、３７℃、２００ｒｍｐの条件で、大腸菌組換え菌株ＹＨ２－１を１２～２４ｈ培養し、発酵終了後、サンプルを１４０００ｒｍｐで２０ｍｉｎ遠心分離し、０．２２μｍの微孔性濾過膜で濾過し、濾液についてＨＰＬＣを行った。高速液体クロマトグラフィー分析は以下のような条件で行われた。器具：アジレント社製高速液体クロマトグラフ１２００、分析カラム：ＨＰＸ－８７Ｈ、移動相：５ｍＭ Ｈ２ＳＯ４、流速：０．６ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度：６０℃、検出器：示差屈折率検出器、注入量：２０μｌ。１２ｈ発酵後、タガトースの収率は８．０％であった。
【0213】
実施例１１ 大腸菌組換え菌株ＹＨ３－２のタガトース生産における使用
（１）大腸菌組換え菌株ＹＨ３－２を用いたグルコース発酵によるタガトースの合成
ＬＢ培地（１０ｇ／Ｌペプトン、５ｇ／Ｌ酵母抽出物、５ｇ／Ｌ塩化ナトリウム、カナマイシン２５ｎｇ／ｍＬ、アンピシリン１００ｎｇ／ｍＬ）１００ｍＬに、終濃度２０ｇ／Ｌのグルコースを加え、３７℃、２００ｒｍｐの条件で、大腸菌組換え菌株ＹＨ３－２を１２～２４ｈ培養し、発酵終了後、サンプルを１４０００ｒｍｐで２０ｍｉｎ遠心分離し、０．２２μｍの微孔性濾過膜で濾過し、濾液についてＨＰＬＣを行った。高速液体クロマトグラフィー分析は以下のような条件で行われた。器具：アジレント社製高速液体クロマトグラフ１２００、分析カラム：ＨＰＸ－８７Ｈ、移動相：５ｍＭ Ｈ２ＳＯ４、流速：０．６ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度：６０℃、検出器：示差屈折率検出器、注入量：２０μｌ。１２ｈ発酵後、タガトースの収率は２０％であった。
（１）大腸菌組換え菌株ＹＨ３－２を用いたグルコース発酵によるタガトースの合成
ＬＢ培地（１０ｇ／Ｌペプトン、５ｇ／Ｌ酵母抽出物、５ｇ／Ｌ塩化ナトリウム、カナマイシン２５ｎｇ／ｍＬ、アンピシリン１００ｎｇ／ｍＬ）１００ｍＬに、終濃度２０ｇ／Ｌのグルコースを加え、３７℃、２００ｒｍｐの条件で、大腸菌組換え菌株ＹＨ３－２を１２～２４ｈ培養し、発酵終了後、サンプルを１４０００ｒｍｐで２０ｍｉｎ遠心分離し、０．２２μｍの微孔性濾過膜で濾過し、濾液についてＨＰＬＣを行った。高速液体クロマトグラフィー分析は以下のような条件で行われた。器具：アジレント社製高速液体クロマトグラフ１２００、分析カラム：ＨＰＸ－８７Ｈ、移動相：５ｍＭ Ｈ２ＳＯ４、流速：０．６ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度：６０℃、検出器：示差屈折率検出器、注入量：２０μｌ。１２ｈ発酵後、タガトースの収率は２０％であった。
【0214】
（２）大腸菌組換え菌株ＹＨ３－２を用いたグルコースとグリセロールの発酵によるタガトースの合成
Ｍ９Ｙ 培地（１０ｇ／Ｌ グリセロール、２０ｇ／Ｌ グルコース、６ｇ／Ｌ Ｎａ２ＨＰＯ４、０．５ｇ／Ｌ ＮａＣｌ、３ｇ／Ｌ ＫＨ２ＰＯ４、１ｇ／Ｌ ＮＨ４Ｃｌ、１ｍＭ ＭｇＳＯ４、０．１ｍＭ ＣａＣｌ２、及び２ｇ／Ｌ酵母抽出物）１００ｍＬを用いて、３７℃、２００ｒｍｐの条件で、大腸菌組換え菌株ＹＨ３－２を１２～２４ｈ培養し、発酵終了後、サンプルを１４０００ｒｍｐで２０ｍｉｎ遠心分離し、０．２２μｍの微孔性濾過膜で濾過し、濾液についてＨＰＬＣを行った。高速液体クロマトグラフィー分析は以下のような条件で行われた。器具：アジレント社製高速液体クロマトグラフ１２００、分析カラム：ＨＰＸ－８７Ｈ、移動相：５ｍＭ Ｈ２ＳＯ４、流速：０．６ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度：６０℃、検出器：示差屈折率検出器、注入量：２０μｌ。１２ｈ発酵後、タガトースの収率は３０％であった。
Ｍ９Ｙ 培地（１０ｇ／Ｌ グリセロール、２０ｇ／Ｌ グルコース、６ｇ／Ｌ Ｎａ２ＨＰＯ４、０．５ｇ／Ｌ ＮａＣｌ、３ｇ／Ｌ ＫＨ２ＰＯ４、１ｇ／Ｌ ＮＨ４Ｃｌ、１ｍＭ ＭｇＳＯ４、０．１ｍＭ ＣａＣｌ２、及び２ｇ／Ｌ酵母抽出物）１００ｍＬを用いて、３７℃、２００ｒｍｐの条件で、大腸菌組換え菌株ＹＨ３－２を１２～２４ｈ培養し、発酵終了後、サンプルを１４０００ｒｍｐで２０ｍｉｎ遠心分離し、０．２２μｍの微孔性濾過膜で濾過し、濾液についてＨＰＬＣを行った。高速液体クロマトグラフィー分析は以下のような条件で行われた。器具：アジレント社製高速液体クロマトグラフ１２００、分析カラム：ＨＰＸ－８７Ｈ、移動相：５ｍＭ Ｈ２ＳＯ４、流速：０．６ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度：６０℃、検出器：示差屈折率検出器、注入量：２０μｌ。１２ｈ発酵後、タガトースの収率は３０％であった。
【0215】
実施例１２ 大腸菌組換え菌株ＹＨ４－２のタガトース生産における使用
（１）大腸菌組換え菌株ＹＨ４－２を用いたグルコース発酵によるタガトースの合成
ＬＢ培地（１０ｇ／Ｌ ペプトン、５ｇ／Ｌ酵母抽出物、５ｇ／Ｌ 塩化ナトリウム、カナマイシン２５ｎｇ／ｍＬ、アンピシリン１００ｎｇ／ｍＬ）１００ｍＬに、終濃度２０ｇ／Ｌのグルコースを加え、３７℃、２００ｒｍｐの条件で、大腸菌組換え菌株ＹＨ４－２を１２～２４ｈ培養し、発酵終了後、サンプルを１４０００ｒｍｐで２０ｍｉｎ遠心分離し、０．２２μｍの微孔性濾過膜で濾過し、濾液についてＨＰＬＣを行った。高速液体クロマトグラフィー分析は以下のような条件で行われた。器具：アジレント社製高速液体クロマトグラフ１２００、分析カラム：ＨＰＸ－８７Ｈ、移動相：５ｍＭ Ｈ２ＳＯ４、流速：０．６ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度：６０℃、検出器：示差屈折率検出器、注入量：２０μｌ。１２ｈ発酵後、タガトースの収率は１６％であった。
（１）大腸菌組換え菌株ＹＨ４－２を用いたグルコース発酵によるタガトースの合成
ＬＢ培地（１０ｇ／Ｌ ペプトン、５ｇ／Ｌ酵母抽出物、５ｇ／Ｌ 塩化ナトリウム、カナマイシン２５ｎｇ／ｍＬ、アンピシリン１００ｎｇ／ｍＬ）１００ｍＬに、終濃度２０ｇ／Ｌのグルコースを加え、３７℃、２００ｒｍｐの条件で、大腸菌組換え菌株ＹＨ４－２を１２～２４ｈ培養し、発酵終了後、サンプルを１４０００ｒｍｐで２０ｍｉｎ遠心分離し、０．２２μｍの微孔性濾過膜で濾過し、濾液についてＨＰＬＣを行った。高速液体クロマトグラフィー分析は以下のような条件で行われた。器具：アジレント社製高速液体クロマトグラフ１２００、分析カラム：ＨＰＸ－８７Ｈ、移動相：５ｍＭ Ｈ２ＳＯ４、流速：０．６ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度：６０℃、検出器：示差屈折率検出器、注入量：２０μｌ。１２ｈ発酵後、タガトースの収率は１６％であった。
【0216】
（２）大腸菌組換え菌株ＹＨ４－２を用いたグルコースとグリセロールの発酵によるタガトースの合成
Ｍ９Ｙ 培地（１０ｇ／Ｌ グリセロール、２０ｇ／Ｌ グルコース、６ｇ／Ｌ Ｎａ２ＨＰＯ４、０．５ｇ／Ｌ ＮａＣｌ、３ｇ／Ｌ ＫＨ２ＰＯ４、１ｇ／Ｌ ＮＨ４Ｃｌ、１ｍＭ ＭｇＳＯ４、０．１ｍＭ ＣａＣｌ２、及び２ｇ／Ｌ酵母抽出物）１００ｍＬを用いて、３７℃、２００ｒｍｐの条件で、大腸菌組換え菌株ＹＨ４－２を１２～２４ｈ培養し、発酵終了後、サンプルを１４０００ｒｍｐで２０ｍｉｎ遠心分離し、０．２２μｍの微孔性濾過膜で濾過し、濾液についてＨＰＬＣを行った。高速液体クロマトグラフィー分析は以下のような条件で行われた。器具：アジレント社製高速液体クロマトグラフ１２００、分析カラム：ＨＰＸ－８７Ｈ、移動相：５ｍＭ Ｈ２ＳＯ４、流速：０．６ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度：６０℃、検出器：示差屈折率検出器、注入量：２０μｌ。１２ｈ発酵後、タガトースの収率は３２％であった。
Ｍ９Ｙ 培地（１０ｇ／Ｌ グリセロール、２０ｇ／Ｌ グルコース、６ｇ／Ｌ Ｎａ２ＨＰＯ４、０．５ｇ／Ｌ ＮａＣｌ、３ｇ／Ｌ ＫＨ２ＰＯ４、１ｇ／Ｌ ＮＨ４Ｃｌ、１ｍＭ ＭｇＳＯ４、０．１ｍＭ ＣａＣｌ２、及び２ｇ／Ｌ酵母抽出物）１００ｍＬを用いて、３７℃、２００ｒｍｐの条件で、大腸菌組換え菌株ＹＨ４－２を１２～２４ｈ培養し、発酵終了後、サンプルを１４０００ｒｍｐで２０ｍｉｎ遠心分離し、０．２２μｍの微孔性濾過膜で濾過し、濾液についてＨＰＬＣを行った。高速液体クロマトグラフィー分析は以下のような条件で行われた。器具：アジレント社製高速液体クロマトグラフ１２００、分析カラム：ＨＰＸ－８７Ｈ、移動相：５ｍＭ Ｈ２ＳＯ４、流速：０．６ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度：６０℃、検出器：示差屈折率検出器、注入量：２０μｌ。１２ｈ発酵後、タガトースの収率は３２％であった。
【0217】
実施例１３ 大腸菌組換え菌株ＹＨ５－２のタガトース生産における使用
（１）大腸菌組換え菌株ＹＨ５－２を用いたグルコース発酵によるタガトースの合成
ＬＢ培地（１０ｇ／Ｌ ペプトン、５ｇ／Ｌ酵母抽出物、５ｇ／Ｌ 塩化ナトリウム、カナマイシン２５ｎｇ／ｍＬ、アンピシリン１００ｎｇ／ｍＬ）１００ｍＬに、終濃度２０ｇ／Ｌのグルコースを加え、３７℃、２００ｒｍｐの条件で、大腸菌組換え菌株ＹＨ５－２を１２～２４ｈ培養し、発酵終了後、サンプルを１４０００ｒｍｐで２０ｍｉｎ遠心分離し、０．２２μｍの微孔性濾過膜で濾過し、濾液についてＨＰＬＣを行った。高速液体クロマトグラフィー分析は以下のような条件で行われた。器具：アジレント社製高速液体クロマトグラフ１２００、分析カラム：ＨＰＸ－８７Ｈ、移動相：５ｍＭ Ｈ２ＳＯ４、流速：０．６ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度：６０℃、検出器：示差屈折率検出器、注入量：２０μｌ。１２ｈ発酵後、タガトースの収率は２４％であった。
（１）大腸菌組換え菌株ＹＨ５－２を用いたグルコース発酵によるタガトースの合成
ＬＢ培地（１０ｇ／Ｌ ペプトン、５ｇ／Ｌ酵母抽出物、５ｇ／Ｌ 塩化ナトリウム、カナマイシン２５ｎｇ／ｍＬ、アンピシリン１００ｎｇ／ｍＬ）１００ｍＬに、終濃度２０ｇ／Ｌのグルコースを加え、３７℃、２００ｒｍｐの条件で、大腸菌組換え菌株ＹＨ５－２を１２～２４ｈ培養し、発酵終了後、サンプルを１４０００ｒｍｐで２０ｍｉｎ遠心分離し、０．２２μｍの微孔性濾過膜で濾過し、濾液についてＨＰＬＣを行った。高速液体クロマトグラフィー分析は以下のような条件で行われた。器具：アジレント社製高速液体クロマトグラフ１２００、分析カラム：ＨＰＸ－８７Ｈ、移動相：５ｍＭ Ｈ２ＳＯ４、流速：０．６ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度：６０℃、検出器：示差屈折率検出器、注入量：２０μｌ。１２ｈ発酵後、タガトースの収率は２４％であった。
【0218】
（２）大腸菌組換え菌株ＹＨ５－２を用いたグルコースとグリセロールの発酵によるタガトースの合成
Ｍ９Ｙ 培地（１０ｇ／Ｌグリセロール、２０ｇ／Ｌグルコース、６ｇ／Ｌ Ｎａ２ＨＰＯ４、０．５ｇ／Ｌ ＮａＣｌ、３ｇ／Ｌ ＫＨ２ＰＯ４、１ｇ／Ｌ ＮＨ４Ｃｌ、１ｍＭ ＭｇＳＯ４、０．１ｍＭ ＣａＣｌ２、及び２ｇ／Ｌ酵母抽出物）１００ｍＬを用いて、３７℃、２００ｒｍｐの条件で、大腸菌組換え菌株ＹＨ５－２を１２～２４ｈ培養し、発酵終了後、サンプルを１４０００ｒｍｐで２０ｍｉｎ遠心分離し、０．２２μｍの微孔性濾過膜で濾過し、濾液についてＨＰＬＣを行った。高速液体クロマトグラフィー分析は以下のような条件で行われた。器具：アジレント社製高速液体クロマトグラフ１２００、分析カラム：ＨＰＸ－８７Ｈ、移動相：５ｍＭ Ｈ２ＳＯ４、流速：０．６ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度：６０℃、検出器：示差屈折率検出器、注入量：２０μｌ。１２ｈ発酵後、タガトースの収率は６０％であった。
Ｍ９Ｙ 培地（１０ｇ／Ｌグリセロール、２０ｇ／Ｌグルコース、６ｇ／Ｌ Ｎａ２ＨＰＯ４、０．５ｇ／Ｌ ＮａＣｌ、３ｇ／Ｌ ＫＨ２ＰＯ４、１ｇ／Ｌ ＮＨ４Ｃｌ、１ｍＭ ＭｇＳＯ４、０．１ｍＭ ＣａＣｌ２、及び２ｇ／Ｌ酵母抽出物）１００ｍＬを用いて、３７℃、２００ｒｍｐの条件で、大腸菌組換え菌株ＹＨ５－２を１２～２４ｈ培養し、発酵終了後、サンプルを１４０００ｒｍｐで２０ｍｉｎ遠心分離し、０．２２μｍの微孔性濾過膜で濾過し、濾液についてＨＰＬＣを行った。高速液体クロマトグラフィー分析は以下のような条件で行われた。器具：アジレント社製高速液体クロマトグラフ１２００、分析カラム：ＨＰＸ－８７Ｈ、移動相：５ｍＭ Ｈ２ＳＯ４、流速：０．６ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度：６０℃、検出器：示差屈折率検出器、注入量：２０μｌ。１２ｈ発酵後、タガトースの収率は６０％であった。
【0219】
実施例１４ 大腸菌組換え菌株ＹＨ６－２のタガトース生産における使用
（１）大腸菌組換え菌株ＹＨ６－２を用いたグルコース発酵によるタガトースの合成
ＬＢ培地（１０ｇ／Ｌペプトン、５ｇ／Ｌ酵母抽出物、５ｇ／Ｌ塩化ナトリウム、カナマイシン２５ｎｇ／ｍＬ、アンピシリン１００ｎｇ／ｍＬ）１００ｍＬに、終濃度２０ｇ／Ｌのグルコースを加え、３７℃、２００ｒｍｐの条件で、大腸菌組換え菌株ＹＨ６－２を１２～２４ｈ培養し、発酵終了後、サンプルを１４０００ｒｍｐで２０ｍｉｎ遠心分離し、０．２２μｍの微孔性濾過膜で濾過し、濾液についてＨＰＬＣを行った。高速液体クロマトグラフィー分析は以下のような条件で行われた。器具：アジレント社製高速液体クロマトグラフ１２００、分析カラム：ＨＰＸ－８７Ｈ、移動相：５ｍＭ Ｈ２ＳＯ４、流速：０．６ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度：６０℃、検出器：示差屈折率検出器、注入量：２０μｌ。１２ｈ発酵後、タガトースの収率は４１％であった。
（１）大腸菌組換え菌株ＹＨ６－２を用いたグルコース発酵によるタガトースの合成
ＬＢ培地（１０ｇ／Ｌペプトン、５ｇ／Ｌ酵母抽出物、５ｇ／Ｌ塩化ナトリウム、カナマイシン２５ｎｇ／ｍＬ、アンピシリン１００ｎｇ／ｍＬ）１００ｍＬに、終濃度２０ｇ／Ｌのグルコースを加え、３７℃、２００ｒｍｐの条件で、大腸菌組換え菌株ＹＨ６－２を１２～２４ｈ培養し、発酵終了後、サンプルを１４０００ｒｍｐで２０ｍｉｎ遠心分離し、０．２２μｍの微孔性濾過膜で濾過し、濾液についてＨＰＬＣを行った。高速液体クロマトグラフィー分析は以下のような条件で行われた。器具：アジレント社製高速液体クロマトグラフ１２００、分析カラム：ＨＰＸ－８７Ｈ、移動相：５ｍＭ Ｈ２ＳＯ４、流速：０．６ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度：６０℃、検出器：示差屈折率検出器、注入量：２０μｌ。１２ｈ発酵後、タガトースの収率は４１％であった。
【0220】
（２）大腸菌組換え菌株ＹＨ６－２を用いたグルコースとグリセロールの発酵によるタガトースの合成
Ｍ９Ｙ 培地（１０ｇ／Ｌグリセロール、２０ｇ／Ｌグルコース、６ｇ／Ｌ Ｎａ２ＨＰＯ４、０．５ｇ／Ｌ ＮａＣｌ、３ｇ／Ｌ ＫＨ２ＰＯ４、１ｇ／Ｌ ＮＨ４Ｃｌ、１ｍＭ ＭｇＳＯ４、０．１ｍＭ ＣａＣｌ２、及び２ｇ／Ｌ酵母抽出物）１００ｍＬを用いて、３７℃、２００ｒｍｐの条件で、大腸菌組換え菌株ＹＨ６－２を１２～２４ｈ培養し、発酵終了後、サンプルを１４０００ｒｍｐで２０ｍｉｎ遠心分離し、０．２２μｍの微孔性濾過膜で濾過し、濾液についてＨＰＬＣを行った。高速液体クロマトグラフィー分析は以下のような条件で行われた。器具：アジレント社製高速液体クロマトグラフ１２００、分析カラム：ＨＰＸ－８７Ｈ、移動相：５ｍＭ Ｈ２ＳＯ４、流速：０．６ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度：６０℃、検出器：示差屈折率検出器、注入量：２０μｌ。１２ｈ発酵後、タガトースの収率は７９％であった。
Ｍ９Ｙ 培地（１０ｇ／Ｌグリセロール、２０ｇ／Ｌグルコース、６ｇ／Ｌ Ｎａ２ＨＰＯ４、０．５ｇ／Ｌ ＮａＣｌ、３ｇ／Ｌ ＫＨ２ＰＯ４、１ｇ／Ｌ ＮＨ４Ｃｌ、１ｍＭ ＭｇＳＯ４、０．１ｍＭ ＣａＣｌ２、及び２ｇ／Ｌ酵母抽出物）１００ｍＬを用いて、３７℃、２００ｒｍｐの条件で、大腸菌組換え菌株ＹＨ６－２を１２～２４ｈ培養し、発酵終了後、サンプルを１４０００ｒｍｐで２０ｍｉｎ遠心分離し、０．２２μｍの微孔性濾過膜で濾過し、濾液についてＨＰＬＣを行った。高速液体クロマトグラフィー分析は以下のような条件で行われた。器具：アジレント社製高速液体クロマトグラフ１２００、分析カラム：ＨＰＸ－８７Ｈ、移動相：５ｍＭ Ｈ２ＳＯ４、流速：０．６ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度：６０℃、検出器：示差屈折率検出器、注入量：２０μｌ。１２ｈ発酵後、タガトースの収率は７９％であった。
【0221】
図４は大腸菌組換え菌株ＹＨ６－２がグルコースとグリセロールを発酵してタガトースを生産する高速液体クロマトグラフィーの分析結果を示し、大腸菌組換え菌株はグルコースとグリセロールの両方を利用して発酵し、タガトースを効率的に生産することができ、しかも、発酵反応液中の成分が簡単であり、タガトースの分離精製が容易である。
【0222】
実施例１５ 枯草菌組換え菌株ＹＪ８の構築
（１）組換え組み込みベクターｐＳＳ－ｕｐｐ－ＦＲの構築
ＫＥＧＧデータベースにおける、枯草菌Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ １６８に由来のウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼのコード遺伝子ｕｐｐ遺伝子配列に従って、プライマーを設計し、ＰＣＲによって増幅しウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼのコード遺伝子の上流５００ｂｐ相同断片及び下流５００ｂｐの相同断片を得て、ｓｉｍｐｌｅ ｃｌｏｎｉｎｇ連結方式によって組み込みベクターｐＳＳに構築し、組換え組み込みベクターｐＳＳ－ｕｐｐ－ＦＲを得た。
（１）組換え組み込みベクターｐＳＳ－ｕｐｐ－ＦＲの構築
ＫＥＧＧデータベースにおける、枯草菌Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ １６８に由来のウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼのコード遺伝子ｕｐｐ遺伝子配列に従って、プライマーを設計し、ＰＣＲによって増幅しウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼのコード遺伝子の上流５００ｂｐ相同断片及び下流５００ｂｐの相同断片を得て、ｓｉｍｐｌｅ ｃｌｏｎｉｎｇ連結方式によって組み込みベクターｐＳＳに構築し、組換え組み込みベクターｐＳＳ－ｕｐｐ－ＦＲを得た。
【0223】
（２）枯草菌組換え菌株ＹＪ８の構築
枯草菌菌株ＳＣＫ６スーパーコンピテント細胞［６］（２００μＬ）を調製し、組換え組み込みベクターｐＳＳ－ｕｐｐ－ＦＲ（１μｇ）と枯草菌菌株ＳＣＫ６スーパーコンピテント細胞（２００μＬ）とを均一に混合し、続いて、３７℃シェーカーに入れて９０ｍｉｎ蘇生させ、菌液をクロラムフェニコール（５μｇ／ｍＬ）を含有する固体培地ＬＢ（酵母抽出物５ｇ／Ｌ、ペプトン１０ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム１０ｇ／Ｌ）に塗布し、３７℃インキュベーターに入れて、１４～１６ｈ培養した。
枯草菌菌株ＳＣＫ６スーパーコンピテント細胞［６］（２００μＬ）を調製し、組換え組み込みベクターｐＳＳ－ｕｐｐ－ＦＲ（１μｇ）と枯草菌菌株ＳＣＫ６スーパーコンピテント細胞（２００μＬ）とを均一に混合し、続いて、３７℃シェーカーに入れて９０ｍｉｎ蘇生させ、菌液をクロラムフェニコール（５μｇ／ｍＬ）を含有する固体培地ＬＢ（酵母抽出物５ｇ／Ｌ、ペプトン１０ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム１０ｇ／Ｌ）に塗布し、３７℃インキュベーターに入れて、１４～１６ｈ培養した。
【0224】
クロラムフェニコール耐性プレートで成長している陽性単一交叉形質転換体コロニーを選択してコロニーのＰＣＲ検証を行い、ＰＣＲ増幅の結果、１０００ｂｐ ＤＮＡ断片及び２０００ｂｐ ＤＮＡ断片の２本のバンド（１０００ｂｐ ＤＮＡ断片のサイズはベクターｐＳＳ－ｕｐｐ－ＦＲにおけるベクター中のｕｐｐコード遺伝子の上下流相同性アームの断片のサイズであり、２０００ｂｐ ＤＮＡ断片のサイズはゲノムにおいてｕｐｐコード遺伝子の上流相同性アーム、ｕｐｐコード遺伝子及びｕｐｐコード遺伝子の下流相同性アームを含む断片のサイズである）を得るものは陽性クローンであった。
【0225】
陽性クローンを選択して抗生物質を添加していないＬＢ培地に移して８～１２ｈ培養し、その後、菌液２００μＬを遠心分離して上清を除去し、次に、無菌水を用いて再懸濁させて、５－ＦＵ基礎塩培地固体プレート（４０％ｇｌｕｃｏｓｅ ２０．０ｍｌ／Ｌ、４％ｇｌｕｔａｍｉｎｅ ５０．０ｍＬ／Ｌ、０．５％ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ １０．０ｍＬ／Ｌ、１％ｖｉｔａｍｉｎ Ｂ１ １．０ｍＬ／Ｌ、２０ｍＭ ５－ＦＵ ５００μＬ／Ｌ、１０×ｓｐｉｚｉｚｅｎ １００．０ｍＬ／Ｌ、１０００×微量元素１．０ｍＬ／Ｌ）に塗布し、３７℃インキュベーターに入れて２４ｈ培養した。このステップの目的は、抗生物質を添加していないＬＢ培地で培養することにより、陽性形質転換体の分子内の相同組換えを促進し、５－ＦＵ基礎塩培地でスクリーニング培養をし、ｕｐｐがノックアウトされた目的形質転換体を得ることである。
【0226】
５－ＦＵ基礎塩培地固体プレートから複数のコロニーを選択して、さらにコロニーのＰＣＲ検証を行い、ＰＣＲ増幅の結果、１０００ｂｐのＤＮＡ断片だけを有する形質転換体は陽性クローンであった。形質転換体をＰＣＲシーケンシングして検証した結果、正しい菌株、すなわち、ウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼのコード遺伝子がノックアウトされた枯草菌組み換え工学菌株、すなわち、ウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ酵素活性のない枯草菌組み換え工学菌株を保存し、ＹＪ８と命名した。
【0227】
実施例１６ 枯草菌組換え菌株ＹＪ９の構築
（１）組換え組み込みベクターｐＳＳ－ｐｔｓＧ－ＦＲの構築
ＫＥＧＧデータベースにおける、枯草菌Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ １６８に由来のＰＴＳ系のグルコース特異的トランスファータンパク質のコード遺伝子ｐｔｓＧ遺伝子配列に従って、プライマーを設計し、ＰＣＲによって増幅し、ＰＴＳ系のグルコース特異的トランスファータンパク質のコード遺伝子の上流５００ｂｐの相同断片及び下流５００ｂｐの相同断片を得、ｓｉｍｐｌｅ ｃｌｏｎｉｎｇ連結方式によって組み込みベクターｐＳＳに構築し、組換え組み込みベクターｐＳＳ－ｐｔｓＧ－ＦＲを得た。
（１）組換え組み込みベクターｐＳＳ－ｐｔｓＧ－ＦＲの構築
ＫＥＧＧデータベースにおける、枯草菌Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ １６８に由来のＰＴＳ系のグルコース特異的トランスファータンパク質のコード遺伝子ｐｔｓＧ遺伝子配列に従って、プライマーを設計し、ＰＣＲによって増幅し、ＰＴＳ系のグルコース特異的トランスファータンパク質のコード遺伝子の上流５００ｂｐの相同断片及び下流５００ｂｐの相同断片を得、ｓｉｍｐｌｅ ｃｌｏｎｉｎｇ連結方式によって組み込みベクターｐＳＳに構築し、組換え組み込みベクターｐＳＳ－ｐｔｓＧ－ＦＲを得た。
【0228】
（２）枯草菌組換え菌株ＹＪ９の構築
枯草菌菌株ＹＪ８スーパーコンピテント細胞（２００μＬ）を調製し、組換え組み込みベクターｐＳＳ－ｐｔｓＧ－ＦＲ （１μｇ）と枯草菌菌株ＹＪ８スーパーコンピテント細胞（２００μＬ）とを均一に混合し、続いて、３７℃シェーカーに入れて９０ｍｉｎ蘇生させ、菌液をクロラムフェニコール（５μｇ／ｍＬ）を含有する固体培地ＬＢ（酵母抽出物５ｇ／Ｌ、ペプトン１０ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム１０ｇ／Ｌ）に塗布し、３７℃インキュベーターに入れて、１４～１６ｈ培養した。
枯草菌菌株ＹＪ８スーパーコンピテント細胞（２００μＬ）を調製し、組換え組み込みベクターｐＳＳ－ｐｔｓＧ－ＦＲ （１μｇ）と枯草菌菌株ＹＪ８スーパーコンピテント細胞（２００μＬ）とを均一に混合し、続いて、３７℃シェーカーに入れて９０ｍｉｎ蘇生させ、菌液をクロラムフェニコール（５μｇ／ｍＬ）を含有する固体培地ＬＢ（酵母抽出物５ｇ／Ｌ、ペプトン１０ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム１０ｇ／Ｌ）に塗布し、３７℃インキュベーターに入れて、１４～１６ｈ培養した。
【0229】
クロラムフェニコール耐性プレートで成長している陽性単一交叉形質転換体コロニーを選択してコロニーのＰＣＲ検証を行い、ＰＣＲ増幅の結果、１０００ｂｐ ＤＮＡ断片及び２０００ｂｐ ＤＮＡ断片の２本のバンド（１０００ｂｐ ＤＮＡ断片のサイズはベクターｐＳＳ－ｐｔｓＧ－ＦＲにおけるベクター中のｐｔｓＧコード遺伝子の上下流相同性アームの断片のサイズであり、２０００ｂｐ ＤＮＡ断片のサイズはゲノムにおいてｐｔｓＧコード遺伝子の上流相同性アーム、ｐｔｓＧコード遺伝子及びｐｔｓＧコード遺伝子の下流相同性アームを含む断片のサイズである）を得るものは陽性クローンであった。
【0230】
陽性クローンを選択して抗生物質を添加していないＬＢ培地に移して８～１２ｈ培養し、その後、菌液２００μＬを遠心分離して上清を除去し、次に、無菌水を用いて再懸濁させて、５－ＦＵ基礎塩培地固体プレート（４０％ｇｌｕｃｏｓｅ ２０．０ｍｌ／Ｌ、４％ｇｌｕｔａｍｉｎｅ ５０．０ｍＬ／Ｌ、０．５％ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ １０．０ｍＬ／Ｌ、１％ｖｉｔａｍｉｎ Ｂ１ １．０ｍＬ／Ｌ、２０ｍＭ ５－ＦＵ ５００μＬ／Ｌ、１０×ｓｐｉｚｉｚｅｎ １００．０ｍＬ／Ｌ、１０００×微量元素１．０ｍＬ／Ｌ）に塗布し、３７℃インキュベーターに入れて２４ｈ培養した。このステップの目的は、抗生物質を添加していないＬＢ培地で培養することにより、陽性形質転換体の分子内の相同組換えを促進し、５－ＦＵ基礎塩培地でスクリーニング培養をし、ｐｔｓＧがノックアウトされた目的形質転換体を得た。
【0231】
５－ＦＵ基礎塩培地固体プレートから複数のコロニーを選択して、さらにコロニーのＰＣＲ検証を行い、ＰＣＲ増幅の結果、１０００ｂｐのＤＮＡ断片だけを有する形質転換体は陽性クローンであった。形質転換体をＰＣＲシーケンシングして検証した結果、正しい菌株、すなわち、ＰＴＳ系のグルコース特異的トランスファータンパク質のコード遺伝子がノックアウトされた枯草菌組み換え工学菌株、すなわち、ＰＴＳ系グルコース特異的トランスファープロテアーゼ活性のない枯草菌組み換え工学菌株を保存し、ＹＪ９と命名した。
【0232】
実施例１７ 枯草菌組換え菌株ＹＪ１０の構築
（１）組換え組み込みベクターｐＳＳ－ｈｐｒＫ－ＦＲの構築
ＫＥＧＧデータベースにおける、枯草菌Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ １６８に由来のＨＰｒキナーゼのコード遺伝子ｈｐｒＫ遺伝子配列に従って、プライマーを設計し、ＰＣＲによって増幅し、ＨＰｒキナーゼのコード遺伝子の上流５００ｂｐの相同断片及び下流５００ｂｐの相同断片を得、ｓｉｍｐｌｅ ｃｌｏｎｉｎｇ連結方式によって組み込みベクターｐＳＳに構築し、組換え組み込みベクターｐＳＳ－ｈｐｒＫ－ＦＲを得た。
（１）組換え組み込みベクターｐＳＳ－ｈｐｒＫ－ＦＲの構築
ＫＥＧＧデータベースにおける、枯草菌Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ １６８に由来のＨＰｒキナーゼのコード遺伝子ｈｐｒＫ遺伝子配列に従って、プライマーを設計し、ＰＣＲによって増幅し、ＨＰｒキナーゼのコード遺伝子の上流５００ｂｐの相同断片及び下流５００ｂｐの相同断片を得、ｓｉｍｐｌｅ ｃｌｏｎｉｎｇ連結方式によって組み込みベクターｐＳＳに構築し、組換え組み込みベクターｐＳＳ－ｈｐｒＫ－ＦＲを得た。
【0233】
（２）枯草菌組換え菌株ＹＪ１０の構築
枯草菌菌株ＹＪ９スーパーコンピテント細胞（２００μＬ）を調製し、組換え組み込みベクターｐＳＳ－ｈｐｒＫ－ＦＲ（１μｇ）と枯草菌菌株ＹＪ９スーパーコンピテント細胞（２００μＬ）とを均一に混合し、続いて、３７℃シェーカーに入れて９０ｍｉｎ蘇生させ、菌液をクロラムフェニコール（５μｇ／ｍＬ）を含有する固体培地ＬＢ（酵母抽出物５ｇ／Ｌ、ペプトン１０ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム１０ｇ／Ｌ）に塗布し、３７℃インキュベーターに入れて、１４～１６ｈ培養した。
枯草菌菌株ＹＪ９スーパーコンピテント細胞（２００μＬ）を調製し、組換え組み込みベクターｐＳＳ－ｈｐｒＫ－ＦＲ（１μｇ）と枯草菌菌株ＹＪ９スーパーコンピテント細胞（２００μＬ）とを均一に混合し、続いて、３７℃シェーカーに入れて９０ｍｉｎ蘇生させ、菌液をクロラムフェニコール（５μｇ／ｍＬ）を含有する固体培地ＬＢ（酵母抽出物５ｇ／Ｌ、ペプトン１０ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム１０ｇ／Ｌ）に塗布し、３７℃インキュベーターに入れて、１４～１６ｈ培養した。
【0234】
クロラムフェニコール耐性プレートで成長している陽性単一交叉形質転換体コロニーを選択してコロニーのＰＣＲ検証を行い、ＰＣＲ増幅の結果、１０００ｂｐ ＤＮＡ断片及び２０００ｂｐ ＤＮＡ断片の２本のバンド（１０００ｂｐ ＤＮＡ断片のサイズはベクターｐＳＳ－ｈｐｒＫ－ＦＲにおけるベクター中のｈｐｒＫコード遺伝子の上下流相同性アームの断片のサイズであり、２０００ｂｐ ＤＮＡ断片のサイズはゲノムにおいてｈｐｒＫコード遺伝子の上流相同性アーム、ｈｐｒＫコード遺伝子及びｈｐｒＫコード遺伝子の下流相同性アームを含む断片のサイズである）を得るものは陽性クローンであった。
【0235】
陽性クローンを選択して抗生物質を添加していないＬＢ培地に移して８～１２ｈ培養し、その後、菌液２００μＬを遠心分離して上清を除去し、次に、無菌水を用いて再懸濁させて、５－ＦＵ基礎塩培地固体プレート（４０％ｇｌｕｃｏｓｅ ２０．０ｍｌ／Ｌ、４％ｇｌｕｔａｍｉｎｅ ５０．０ｍＬ／Ｌ、０．５％ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ １０．０ｍＬ／Ｌ、１％ｖｉｔａｍｉｎ Ｂ１ １．０ｍＬ／Ｌ、２０ｍＭ ５－ＦＵ ５００μＬ／Ｌ、１０×ｓｐｉｚｉｚｅｎ １００．０ｍＬ／Ｌ、１０００×微量元素 １．０ｍＬ／Ｌ）に塗布し、３７℃インキュベーターに入れて２４ｈ培養した。このステップの目的は、抗生物質を添加していないＬＢ培地で培養することにより、陽性形質転換体の分子内の相同組換えを促進し、５－ＦＵ基礎塩培地でスクリーニング培養をし、ｐｔｓＧがノックアウトされた目的形質転換体を得ることである。
【0236】
５－ＦＵ基礎塩培地固体プレートから複数のコロニーを選択して、さらにコロニーのＰＣＲ検証を行い、ＰＣＲ増幅の結果、１０００ｂｐのＤＮＡ断片だけを有する形質転換体は陽性クローンであった。形質転換体をＰＣＲシーケンシングして検証した結果、正しい菌株、すなわち、ＨＰｒキナーゼのコード遺伝子がノックアウトされた枯草菌組み換え工学菌株、すなわち、ＨＰｒキナーゼ酵素活性のない枯草菌組み換え工学菌株を保存し、ＹＪ１０と命名した。
【0237】
実施例１８ 枯草菌組換え菌株ＹＪ１１の構築
（１）組換え組み込みベクターｐＳＳ－ｐｔｓＧ－ＦＲ－ｇｌｃＫ－ｐｇｉの構築
ＫＥＧＧデータベースにおける、枯草菌Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ １６８に由来のグルコキナーゼのコード遺伝子ｇｌｃＫ遺伝子配列と枯草菌Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ １６８に由来のグルコース－６－リン酸イソメラーゼのコード遺伝子ｐｇｉ遺伝子配列に従って、プライマーを設計してｇｌｃＫ遺伝子及びｐｇｉ遺伝子を増幅し、ｓｉｍｐｌｅ ｃｌｏｎｉｎｇ連結方式によって組み込みベクターｐＳＳ－ｐｔｓＧ－ＦＲに構築し、組換え組み込みベクターｐＳＳ－ｐｔｓＧ－ＦＲ－ｇｌｃＫ－ｐｇｉを得た。
（１）組換え組み込みベクターｐＳＳ－ｐｔｓＧ－ＦＲ－ｇｌｃＫ－ｐｇｉの構築
ＫＥＧＧデータベースにおける、枯草菌Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ １６８に由来のグルコキナーゼのコード遺伝子ｇｌｃＫ遺伝子配列と枯草菌Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ １６８に由来のグルコース－６－リン酸イソメラーゼのコード遺伝子ｐｇｉ遺伝子配列に従って、プライマーを設計してｇｌｃＫ遺伝子及びｐｇｉ遺伝子を増幅し、ｓｉｍｐｌｅ ｃｌｏｎｉｎｇ連結方式によって組み込みベクターｐＳＳ－ｐｔｓＧ－ＦＲに構築し、組換え組み込みベクターｐＳＳ－ｐｔｓＧ－ＦＲ－ｇｌｃＫ－ｐｇｉを得た。
【0238】
（２）枯草菌組換え菌株ＹＪ１１の構築
枯草菌菌株ＹＪ１０スーパーコンピテント細胞（２００μＬ）を調製し、組換え組み込みベクターｐＳＳ－ｐｔｓＧ－ＦＲ－ｇｌｃＫ－ｐｇｉ（１μｇ）と枯草菌菌株ＹＪ１０スーパーコンピテント細胞（２００μＬ）とを均一に混合し、続いて、３７℃シェーカーに入れて９０ｍｉｎ蘇生させ、菌液をクロラムフェニコール（５μｇ／ｍＬ）を含有する固体培地ＬＢ（酵母抽出物５ｇ／Ｌ、ペプトン１０ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム１０ｇ／Ｌ）に塗布し、３７℃インキュベーターに入れて、１４～１６ｈ培養した。
枯草菌菌株ＹＪ１０スーパーコンピテント細胞（２００μＬ）を調製し、組換え組み込みベクターｐＳＳ－ｐｔｓＧ－ＦＲ－ｇｌｃＫ－ｐｇｉ（１μｇ）と枯草菌菌株ＹＪ１０スーパーコンピテント細胞（２００μＬ）とを均一に混合し、続いて、３７℃シェーカーに入れて９０ｍｉｎ蘇生させ、菌液をクロラムフェニコール（５μｇ／ｍＬ）を含有する固体培地ＬＢ（酵母抽出物５ｇ／Ｌ、ペプトン１０ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム１０ｇ／Ｌ）に塗布し、３７℃インキュベーターに入れて、１４～１６ｈ培養した。
【0239】
クロラムフェニコール耐性プレートで成長している陽性単一交叉形質転換体コロニーを選択してコロニーのＰＣＲ検証を行い、ＰＣＲ増幅の結果、２０００ｂｐ ＤＮＡ断片及び４０００ｂｐ ＤＮＡ断片の２本のバンド（２０００ｂｐ ＤＮＡ断片のサイズはゲノムにおいてｐｔｓＧコード遺伝子の上流相同性アーム、ｐｔｓＧコード遺伝子及びｐｔｓＧコード遺伝子の下流相同性アームを含む断片のサイズであり、４０００ｂｐ ＤＮＡ断片のサイズはベクターｐＳＳ－ｐｔｓＧ－ＦＲ－ｇｌｃＫ－ｐｇｉにおいてｐｔｓＧコード遺伝子の上流相同性アーム、ｇｌｃＫ遺伝子、ｐｇｉ遺伝子及びｐｔｓＧ下流相同性アームを含む断片のサイズである）を得るものは陽性クローンであった。
【0240】
陽性クローンを選択して抗生物質を添加していないＬＢ培地に移して８～１２ｈ培養し、その後、菌液２００μＬを遠心分離して上清を除去し、次に、無菌水を用いて再懸濁させて、５－ＦＵ基礎塩培地固体プレート（４０％ｇｌｕｃｏｓｅ ２０．０ｍｌ／Ｌ、４％ｇｌｕｔａｍｉｎｅ ５０．０ｍＬ／Ｌ、０．５％ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ １０．０ｍＬ／Ｌ、１％ｖｉｔａｍｉｎ Ｂ１ １．０ｍＬ／Ｌ、２０ｍＭ ５－ＦＵ ５００μＬ／Ｌ、１０×ｓｐｉｚｉｚｅｎ １００．０ｍＬ／Ｌ、１０００×微量元素１．０ｍＬ／Ｌ）に塗布し、３７℃インキュベーターに入れて２４ｈ培養した。このステップの目的は、抗生物質を添加していないＬＢ培地で培養することにより、陽性形質転換体の分子内の相同組換えを促進し、５－ＦＵ基礎塩培地でスクリーニング培養をし、ｇｌｃＫ遺伝子及びｐｇｉ遺伝子がｐｔｓＧ遺伝子部位に組み込まれた目的形質転換体を得ることである。
【0241】
５－ＦＵ基礎塩培地固体プレートから複数のコロニーを選択して、さらにコロニーのＰＣＲ検証を行い、ＰＣＲ増幅の結果、４０００ｂｐのＤＮＡ断片だけを有する形質転換体は陽性クローンであった。形質転換体をＰＣＲシーケンシングして検証した結果、正しい菌株、すなわち、グルコキナーゼのコード遺伝子ｇｌｃＫ遺伝子配列及びグルコース－６－リン酸イソメラーゼのコード遺伝子ｐｇｉがｐｔｓＧ部位に組み込まれた枯草菌組み換え工学菌株、すなわち、グルコキナーゼ及びグルコース－６－リン酸イソメラーゼの酵素活性を向上させた枯草菌組み換え工学菌株を保存し、ＹＪ１１と命名した。
【0242】
実施例１９ 枯草菌組換え菌株ＹＪ１２の構築
（１）組換え組み込みベクターｐＳＳ－ｐｆｋＡ－ＦＲの構築
ＫＥＧＧデータベースにおける、枯草菌Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ １６８に由来のフルクトース－６－リン酸キナーゼのコード遺伝子ｐｆｋＡ遺伝子配列に従って、プライマーを設計し、ＰＣＲによって増幅し、フルクトース－６－リン酸キナーゼのコード遺伝子の上流５００ｂｐの相同断片及び下流５００ｂｐの相同断片を得、ｓｉｍｐｌｅ ｃｌｏｎｉｎｇ連結方式によって組み込みベクターｐＳＳに構築し、組換え組み込みベクターｐＳＳ－ｐｆｋＡ－ＦＲを得た。
（１）組換え組み込みベクターｐＳＳ－ｐｆｋＡ－ＦＲの構築
ＫＥＧＧデータベースにおける、枯草菌Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ １６８に由来のフルクトース－６－リン酸キナーゼのコード遺伝子ｐｆｋＡ遺伝子配列に従って、プライマーを設計し、ＰＣＲによって増幅し、フルクトース－６－リン酸キナーゼのコード遺伝子の上流５００ｂｐの相同断片及び下流５００ｂｐの相同断片を得、ｓｉｍｐｌｅ ｃｌｏｎｉｎｇ連結方式によって組み込みベクターｐＳＳに構築し、組換え組み込みベクターｐＳＳ－ｐｆｋＡ－ＦＲを得た。
【0243】
（２）枯草菌組換え菌株ＹＪ１２の構築
枯草菌菌株ＹＪ１１スーパーコンピテント細胞（２００μＬ）を調製し、組換え組み込みベクターｐＳＳ－ｐｆｋＡ－ＦＲ（１μｇ）と枯草菌菌株ＹＪ１１スーパーコンピテント細胞（２００μＬ）とを均一に混合し、続いて、３７℃シェーカーに入れて９０ｍｉｎ蘇生させ、菌液をクロラムフェニコール（５μｇ／ｍＬ）を含有する固体培地ＬＢ（酵母抽出物５ｇ／Ｌ、ペプトン１０ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム１０ｇ／Ｌ）に塗布し、３７℃インキュベーターに入れて、１４～１６ｈ培養した。
枯草菌菌株ＹＪ１１スーパーコンピテント細胞（２００μＬ）を調製し、組換え組み込みベクターｐＳＳ－ｐｆｋＡ－ＦＲ（１μｇ）と枯草菌菌株ＹＪ１１スーパーコンピテント細胞（２００μＬ）とを均一に混合し、続いて、３７℃シェーカーに入れて９０ｍｉｎ蘇生させ、菌液をクロラムフェニコール（５μｇ／ｍＬ）を含有する固体培地ＬＢ（酵母抽出物５ｇ／Ｌ、ペプトン１０ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム１０ｇ／Ｌ）に塗布し、３７℃インキュベーターに入れて、１４～１６ｈ培養した。
【0244】
クロラムフェニコール耐性プレートで成長している陽性単一交叉形質転換体コロニーを選択してコロニーのＰＣＲ検証を行い、ＰＣＲ増幅の結果、１０００ｂｐ ＤＮＡ断片及び２０００ｂｐ ＤＮＡ断片の２本のバンド（１０００ｂｐ ＤＮＡ断片のサイズはベクターｐＳＳ－ｐｆｋＡ－ＦＲにおけるベクター中のｐｆｋＡコード遺伝子の上下流相同性アームの断片のサイズであり、２０００ｂｐ ＤＮＡ断片のサイズはゲノムにおいてｐｆｋＡコード遺伝子の上流相同性アーム、ｐｆｋＡコード遺伝子及びｐｆｋＡコード遺伝子の下流相同性アームを含む断片のサイズである）を得るものは陽性クローンであった。
【0245】
陽性クローンを選択して抗生物質を添加していないＬＢ培地に移して８～１２ｈ培養し、その後、菌液２００μＬを遠心分離して上清を除去し、次に、無菌水を用いて再懸濁させて、５－ＦＵ基礎塩培地固体プレート（４０％ｇｌｕｃｏｓｅ ２０．０ｍｌ／Ｌ、４％ｇｌｕｔａｍｉｎｅ ５０．０ｍＬ／Ｌ、０．５％ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ １０．０ｍＬ／Ｌ、１％ｖｉｔａｍｉｎ Ｂ１ １．０ｍＬ／Ｌ、２０ｍＭ ５－ＦＵ ５００μＬ／Ｌ、１０×ｓｐｉｚｉｚｅｎ １００．０ｍＬ／Ｌ、１０００×微量元素１．０ｍＬ／Ｌ）に塗布し、３７℃インキュベーターに入れて２４ｈ培養した。このステップの目的は、抗生物質を添加していないＬＢ培地で培養することにより、陽性形質転換体の分子内の相同組換えを促進し、５－ＦＵ基礎塩培地でスクリーニング培養をし、ｐｆｋＡがノックアウトされた目的形質転換体を得ることである。
【0246】
５－ＦＵ基礎塩培地固体プレートから複数のコロニーを選択して、さらにコロニーのＰＣＲ検証を行い、ＰＣＲ増幅の結果、１０００ｂｐのＤＮＡ断片だけを有する形質転換体は陽性クローンであった。形質転換体をＰＣＲシーケンシングして検証した結果、正しい菌株、すなわち、フルクトース－６－リン酸キナーゼのコード遺伝子がノックアウトされた枯草菌組み換え工学菌株、すなわち、フルクトース－６－リン酸キナーゼ酵素活性のない枯草菌組み換え工学菌株を保存し、ＹＪ１２と命名した。
【0247】
実施例２０ 枯草菌組換え菌株ＹＪ１３の構築
（１）組換え組み込みベクターｐＳＳ－ｐｇｍ－ＦＲの構築
ＫＥＧＧデータベースにおける、枯草菌Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ １６８に由来のホスホグルコムターゼのコード遺伝子ｐｇｍ遺伝子配列に従って、プライマーを設計し、ＰＣＲによって増幅し、ホスホグルコムターゼのコード遺伝子の上流５００ｂｐの相同断片及び下流５００ｂｐの相同断片を得、ｓｉｍｐｌｅ ｃｌｏｎｉｎｇ連結方式によって組み込みベクターｐＳＳに構築し、組換え組み込みベクターｐＳＳ－ｐｇｍ－ＦＲを得た。
（１）組換え組み込みベクターｐＳＳ－ｐｇｍ－ＦＲの構築
ＫＥＧＧデータベースにおける、枯草菌Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ １６８に由来のホスホグルコムターゼのコード遺伝子ｐｇｍ遺伝子配列に従って、プライマーを設計し、ＰＣＲによって増幅し、ホスホグルコムターゼのコード遺伝子の上流５００ｂｐの相同断片及び下流５００ｂｐの相同断片を得、ｓｉｍｐｌｅ ｃｌｏｎｉｎｇ連結方式によって組み込みベクターｐＳＳに構築し、組換え組み込みベクターｐＳＳ－ｐｇｍ－ＦＲを得た。
【0248】
（２）枯草菌組換え菌株ＹＪ１３の構築
枯草菌菌株ＹＪ１２スーパーコンピテント細胞（２００μＬ）を調製し、組換え組み込みベクターｐＳＳ－ｐｇｍ－ＦＲ （１μｇ）と枯草菌菌株ＹＪ１２スーパーコンピテント細胞（２００μＬ）とを均一に混合し、続いて、３７℃シェーカーに入れて９０ｍｉｎ蘇生させ、菌液をクロラムフェニコール（５μｇ／ｍＬ）を含有する固体培地ＬＢ（酵母抽出物５ｇ／Ｌ、ペプトン１０ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム１０ｇ／Ｌ）に塗布し、３７℃インキュベーターに入れて、１４～１６ｈ培養した。
枯草菌菌株ＹＪ１２スーパーコンピテント細胞（２００μＬ）を調製し、組換え組み込みベクターｐＳＳ－ｐｇｍ－ＦＲ （１μｇ）と枯草菌菌株ＹＪ１２スーパーコンピテント細胞（２００μＬ）とを均一に混合し、続いて、３７℃シェーカーに入れて９０ｍｉｎ蘇生させ、菌液をクロラムフェニコール（５μｇ／ｍＬ）を含有する固体培地ＬＢ（酵母抽出物５ｇ／Ｌ、ペプトン１０ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム１０ｇ／Ｌ）に塗布し、３７℃インキュベーターに入れて、１４～１６ｈ培養した。
【0249】
クロラムフェニコール耐性プレートで成長している陽性単一交叉形質転換体コロニーを選択してコロニーのＰＣＲ検証を行い、ＰＣＲ増幅の結果、１０００ｂｐ ＤＮＡ断片及び２０００ｂｐ ＤＮＡ断片の２本のバンド（１０００ｂｐ ＤＮＡ断片のサイズはベクターｐＳＳ－ｐｇｍ－ＦＲにおけるベクター中のｐｇｍコード遺伝子の上下流相同性アームの断片のサイズであり、２０００ｂｐ ＤＮＡ断片のサイズはゲノムにおいてｐｇｍコード遺伝子の上流相同性アーム、ｐｇｍコード遺伝子及びｐｇｍコード遺伝子の下流相同性アームを含む断片のサイズである）を得るものは陽性クローンであった。
【0250】
陽性クローンを選択して抗生物質を添加していないＬＢ培地に移して８～１２ｈ培養し、その後、菌液２００μＬを遠心分離して上清を除去し、次に、無菌水を用いて再懸濁させて、５－ＦＵ基礎塩培地固体プレート（４０％ｇｌｕｃｏｓｅ ２０．０ｍｌ／Ｌ、４％ｇｌｕｔａｍｉｎｅ ５０．０ｍＬ／Ｌ、０．５％ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ １０．０ｍＬ／Ｌ、１％ｖｉｔａｍｉｎ Ｂ１ １．０ｍＬ／Ｌ、２０ｍＭ ５－ＦＵ ５００μＬ／Ｌ、１０×ｓｐｉｚｉｚｅｎ １００．０ｍＬ／Ｌ、１０００×微量元素１．０ｍＬ／Ｌ）に塗布し、３７℃インキュベーターに入れて２４ｈ培養した。このステップの目的は、抗生物質を添加していないＬＢ培地で培養することにより、陽性形質転換体の分子内の相同組換えを促進し、５－ＦＵ基礎塩培地でスクリーニング培養をし、ｐｇｍがノックアウトされた目的形質転換体を得ることである。
【0251】
５－ＦＵ基礎塩培地固体プレートから複数のコロニーを選択して、さらにコロニーのＰＣＲ検証を行い、ＰＣＲ増幅の結果、１０００ｂｐのＤＮＡ断片だけを有する形質転換体は陽性クローンであった。形質転換体をＰＣＲシーケンシングして検証した結果、正しい菌株、すなわち、ホスホグルコムターゼのコード遺伝子がノックアウトされた枯草菌組み換え工学菌株、すなわち、ホスホグルコムターゼ酵素活性のない枯草菌組み換え工学菌株を保存し、ＹＪ１３と命名した。
【0252】
実施例２１ 枯草菌組換え菌株ＹＪ１４の構築
（１）組換え組み込みベクターｐＳＳ－ｚｗｆ－ＦＲの構築
ＫＥＧＧデータベースにおける、枯草菌Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ １６８に由来のグルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼのコード遺伝子ｚｗｆ遺伝子配列に従って、プライマーを設計し、ＰＣＲによって増幅し、グルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼのコード遺伝子の上流５００ｂｐの相同断片及び下流５００ｂｐの相同断片を得、ｓｉｍｐｌｅ ｃｌｏｎｉｎｇ連結方式によって組み込みベクターｐＳＳに構築し、組換え組み込みベクターｐＳＳ－ｚｗｆ－ＦＲを得た。
（１）組換え組み込みベクターｐＳＳ－ｚｗｆ－ＦＲの構築
ＫＥＧＧデータベースにおける、枯草菌Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ １６８に由来のグルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼのコード遺伝子ｚｗｆ遺伝子配列に従って、プライマーを設計し、ＰＣＲによって増幅し、グルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼのコード遺伝子の上流５００ｂｐの相同断片及び下流５００ｂｐの相同断片を得、ｓｉｍｐｌｅ ｃｌｏｎｉｎｇ連結方式によって組み込みベクターｐＳＳに構築し、組換え組み込みベクターｐＳＳ－ｚｗｆ－ＦＲを得た。
【0253】
（２）枯草菌組換え菌株ＹＪ１４の構築
枯草菌菌株ＹＪ１３スーパーコンピテント細胞（２００μＬ）を調製し、組換え組み込みベクターｐＳＳ－ｚｗｆ－ＦＲ（１μｇ）と枯草菌菌株ＹＪ１３スーパーコンピテント細胞（２００μＬ）とを均一に混合し、続いて、３７℃シェーカーに入れて９０ｍｉｎ蘇生させ、菌液をクロラムフェニコール（５μｇ／ｍＬ）を含有する固体培地ＬＢ（酵母抽出物５ｇ／Ｌ、ペプトン１０ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム１０ｇ／Ｌ）に塗布し、３７℃インキュベーターに入れて、１４～１６ｈ培養した。
枯草菌菌株ＹＪ１３スーパーコンピテント細胞（２００μＬ）を調製し、組換え組み込みベクターｐＳＳ－ｚｗｆ－ＦＲ（１μｇ）と枯草菌菌株ＹＪ１３スーパーコンピテント細胞（２００μＬ）とを均一に混合し、続いて、３７℃シェーカーに入れて９０ｍｉｎ蘇生させ、菌液をクロラムフェニコール（５μｇ／ｍＬ）を含有する固体培地ＬＢ（酵母抽出物５ｇ／Ｌ、ペプトン１０ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム１０ｇ／Ｌ）に塗布し、３７℃インキュベーターに入れて、１４～１６ｈ培養した。
【0254】
クロラムフェニコール耐性プレートで成長している陽性単一交叉形質転換体コロニーを選択してコロニーのＰＣＲ検証を行い、ＰＣＲ増幅の結果、１０００ｂｐ ＤＮＡ断片及び２０００ｂｐ ＤＮＡ断片の２本のバンド（１０００ｂｐ ＤＮＡ断片のサイズはベクターｐＳＳ－ｐｇｍ－ＦＲにおけるベクター中のｚｗｆコード遺伝子の上下流相同性アームの断片のサイズであり、２０００ｂｐ ＤＮＡ断片のサイズはゲノムにおいてｚｗｆコード遺伝子の上流相同性アーム、ｚｗｆコード遺伝子及びｚｗｆコード遺伝子の下流相同性アームを含む断片のサイズである）を得るものは陽性クローンであった。
【0255】
陽性クローンを選択して抗生物質を添加していないＬＢ培地に移して８～１２ｈ培養し、その後、菌液２００μＬを遠心分離して上清を除去し、次に、無菌水を用いて再懸濁させて、５－ＦＵ基礎塩培地固体プレート（４０％ｇｌｕｃｏｓｅ ２０．０ｍｌ／Ｌ、４％ｇｌｕｔａｍｉｎｅ ５０．０ｍＬ／Ｌ、０．５％ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ １０．０ｍＬ／Ｌ、１％ｖｉｔａｍｉｎ Ｂ１ １．０ｍＬ／Ｌ、２０ｍＭ ５－ＦＵ ５００μＬ／Ｌ、１０×ｓｐｉｚｉｚｅｎ １００．０ｍＬ／Ｌ、１０００×微量元素 １．０ｍＬ／Ｌ）に塗布し、３７℃インキュベーターに入れて２４ｈ培養した。このステップの目的は、抗生物質を添加していないＬＢ培地で培養することにより、陽性形質転換体の分子内の相同組換えを促進し、５－ＦＵ基礎塩培地でスクリーニング培養をし、ｚｗｆがノックアウトされた目的形質転換体を得ることである。
【0256】
５－ＦＵ基礎塩培地固体プレートから複数のコロニーを選択して、さらにコロニーのＰＣＲ検証を行い、ＰＣＲ増幅の結果、１０００ｂｐのＤＮＡ断片だけを有する形質転換体は陽性クローンであった。形質転換体をＰＣＲシーケンシングして検証した結果、正しい菌株、すなわち、グルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼのコード遺伝子がノックアウトされた枯草菌組み換え工学菌株、すなわち、グルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ酵素活性のない枯草菌組み換え工学菌株を保存し、ＹＪ１４と命名した。
【0257】
実施例２２ 枯草菌組換え菌株ＳＫＣ６－１の構築
（１）組換え発現ベクターｐＷＢ９８０－Ｔ６ＰＥ－Ｔ６ＰＰの構築
ＫＥＧＧデータベースにおける、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ ｓｔｒ． Ｃ５８に由来のタガトース－６－リン酸エピメラーゼＴ６ＰＥとアルカエオグロブス属Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｆｕｌｇｉｄｕｓ又はＡｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｐｒｏｆｕｎｄｕｓに由来のタガトース－６－リン酸ホスファターゼＴ６ＰＰ遺伝子に従って、プライマーを設計してＰＣＲによって増幅し、タガトース－６－リン酸エピメラーゼ及びタガトース－６－リン酸ホスファターゼの遺伝子断片を得、ｓｉｍｐｌｅ ｃｌｏｎｉｎｇ連結方式によって発現ベクターｐＷＢ９８０に構築し、組換え発現ベクターｐＷＢ９８０－Ｔ６ＰＥ－Ｔ６ＰＰを得た。
（１）組換え発現ベクターｐＷＢ９８０－Ｔ６ＰＥ－Ｔ６ＰＰの構築
ＫＥＧＧデータベースにおける、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ ｓｔｒ． Ｃ５８に由来のタガトース－６－リン酸エピメラーゼＴ６ＰＥとアルカエオグロブス属Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｆｕｌｇｉｄｕｓ又はＡｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｐｒｏｆｕｎｄｕｓに由来のタガトース－６－リン酸ホスファターゼＴ６ＰＰ遺伝子に従って、プライマーを設計してＰＣＲによって増幅し、タガトース－６－リン酸エピメラーゼ及びタガトース－６－リン酸ホスファターゼの遺伝子断片を得、ｓｉｍｐｌｅ ｃｌｏｎｉｎｇ連結方式によって発現ベクターｐＷＢ９８０に構築し、組換え発現ベクターｐＷＢ９８０－Ｔ６ＰＥ－Ｔ６ＰＰを得た。
【0258】
（２）枯草菌組換え菌株ＳＣＫ６－１の構築
枯草菌菌株ＳＣＫ６スーパーコンピテント細胞（２００μＬ）を調製し、組換え発現ベクターｐＷＢ９８０－Ｔ６ＰＥ－Ｔ６ＰＰ（１μｇ）と枯草菌菌株ＳＣＫ６スーパーコンピテント細胞（２００μＬ）とを均一に混合し、続いて、３７℃シェーカーに入れて９０ｍｉｎ蘇生させ、菌液をカナマイシン（２５μｇ／ｍＬ）を含有する固体培地ＬＢ（酵母抽出物５ｇ／Ｌ、ペプトン１０ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム１０ｇ／Ｌ）に塗布し、３７℃インキュベーターに入れて、１４～１６ｈ培養した。カナマイシン耐性プレートで成長している陽性単一交叉形質転換体を選択してコロニーコロニーのＰＣＲ検証を行い、ＰＣＲ増幅の結果、２０００ｂｐのＤＮＡ断片の形質転換体は陽性クローンであった。形質転換体をＰＣＲシーケンシングして検証した結果、正しい菌株、すなわち、タガトース－６－リン酸エピメラーゼ及びタガトース６－リン酸ホスファターゼ酵素活性を向上させた枯草菌組み換え工学菌株を保存し、ＳＣＫ６－１と命名した。
枯草菌菌株ＳＣＫ６スーパーコンピテント細胞（２００μＬ）を調製し、組換え発現ベクターｐＷＢ９８０－Ｔ６ＰＥ－Ｔ６ＰＰ（１μｇ）と枯草菌菌株ＳＣＫ６スーパーコンピテント細胞（２００μＬ）とを均一に混合し、続いて、３７℃シェーカーに入れて９０ｍｉｎ蘇生させ、菌液をカナマイシン（２５μｇ／ｍＬ）を含有する固体培地ＬＢ（酵母抽出物５ｇ／Ｌ、ペプトン１０ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム１０ｇ／Ｌ）に塗布し、３７℃インキュベーターに入れて、１４～１６ｈ培養した。カナマイシン耐性プレートで成長している陽性単一交叉形質転換体を選択してコロニーコロニーのＰＣＲ検証を行い、ＰＣＲ増幅の結果、２０００ｂｐのＤＮＡ断片の形質転換体は陽性クローンであった。形質転換体をＰＣＲシーケンシングして検証した結果、正しい菌株、すなわち、タガトース－６－リン酸エピメラーゼ及びタガトース６－リン酸ホスファターゼ酵素活性を向上させた枯草菌組み換え工学菌株を保存し、ＳＣＫ６－１と命名した。
【0259】
以上と同じ方法によって、プラスミドｐＷＢ９８０－Ｔ６ＰＥ－Ｔ６ＰＰを枯草菌組換え菌株ＹＪ８、ＹＪ９、ＹＪ１０、ＹＪ１１、ＹＪ１２、ＹＪ１３、ＹＪ１４に導入し、タガトース－６－リン酸エピメラーゼ及びタガトース－６－リン酸ホスファターゼ酵素活性を向上させた枯草菌組み換え工学菌株ＹＪ８－１、ＹＪ９－１、ＹＪ１０－１、ＹＪ１１－１、ＹＪ１２－１、ＹＪ１３－１、ＹＪ１４－１を得た。
【0260】
実施例２３ 枯草菌組み換え工学菌株ＳＣＫ６－１のタガトース生産における使用
（１）枯草菌組み換え工学菌株ＳＣＫ６－１を用いたグルコース発酵によるタガトースの合成
ＳＲ培地（１５ｇ／Ｌ ペプトン、 ２５ｇ／Ｌ酵母抽出物、３ｇ／Ｌ Ｋ２ＨＰＯ４、カナマイシン２５ｎｇ／ｍＬ）１００ｍＬに、終濃度２０ｇ／Ｌのグルコースを加え、３７℃、２００ｒｍｐの条件で、枯草菌組み換え工学菌株ＳＣＫ６－１を１２～２４ｈ培養し、発酵終了後、サンプルを１４０００ｒｍｐで２０ｍｉｎ遠心分離し、０．２２μｍの微孔性濾過膜で濾過し、濾液についてＨＰＬＣを行った。高速液体クロマトグラフィー分析は以下のような条件で行われた。器具：アジレント社製高速液体クロマトグラフ１２００、分析カラム：ＨＰＸ－８７Ｈ、移動相：５ｍＭ Ｈ２ＳＯ４、流速：０．６ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度：６０℃、検出器：示差屈折率検出器、注入量：２０μｌ。１２ｈ発酵後、タガトースの収率は１．０％であった。
（１）枯草菌組み換え工学菌株ＳＣＫ６－１を用いたグルコース発酵によるタガトースの合成
ＳＲ培地（１５ｇ／Ｌ ペプトン、 ２５ｇ／Ｌ酵母抽出物、３ｇ／Ｌ Ｋ２ＨＰＯ４、カナマイシン２５ｎｇ／ｍＬ）１００ｍＬに、終濃度２０ｇ／Ｌのグルコースを加え、３７℃、２００ｒｍｐの条件で、枯草菌組み換え工学菌株ＳＣＫ６－１を１２～２４ｈ培養し、発酵終了後、サンプルを１４０００ｒｍｐで２０ｍｉｎ遠心分離し、０．２２μｍの微孔性濾過膜で濾過し、濾液についてＨＰＬＣを行った。高速液体クロマトグラフィー分析は以下のような条件で行われた。器具：アジレント社製高速液体クロマトグラフ１２００、分析カラム：ＨＰＸ－８７Ｈ、移動相：５ｍＭ Ｈ２ＳＯ４、流速：０．６ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度：６０℃、検出器：示差屈折率検出器、注入量：２０μｌ。１２ｈ発酵後、タガトースの収率は１．０％であった。
【0261】
（２）枯草菌組み換え工学菌株ＳＣＫ６－１を用いたグルコースとグリセロールの発酵によるタガトースの合成
ＳＲ培地（１５ｇ／Ｌペプトン、２５ｇ／Ｌ酵母抽出物、３ｇ／Ｌ Ｋ２ＨＰＯ４、カナマイシン２５ｎｇ／ｍＬ）１００ｍＬに、終濃度２０ｇ／Ｌのグルコース、２０ｇ／Ｌのグリセロールを加え、３７℃、２００ｒｍｐの条件で、枯草菌組み換え工学菌株ＳＣＫ６－１を１２～２４ｈ培養し、発酵終了後、サンプルを１４０００ｒｍｐで２０ｍｉｎ遠心分離し、０．２２μｍの微孔性濾過膜で濾過し、濾液についてＨＰＬＣを行った。高速液体クロマトグラフィー分析は以下のような条件で行われた。器具：アジレント社製高速液体クロマトグラフ１２００、分析カラム：ＨＰＸ－８７Ｈ、移動相：５ｍＭ Ｈ２ＳＯ４、流速：０．６ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度：６０℃、検出器：示差屈折率検出器、注入量：２０μｌ。１２ｈ発酵後、タガトースの収率は１．０％であった。
ＳＲ培地（１５ｇ／Ｌペプトン、２５ｇ／Ｌ酵母抽出物、３ｇ／Ｌ Ｋ２ＨＰＯ４、カナマイシン２５ｎｇ／ｍＬ）１００ｍＬに、終濃度２０ｇ／Ｌのグルコース、２０ｇ／Ｌのグリセロールを加え、３７℃、２００ｒｍｐの条件で、枯草菌組み換え工学菌株ＳＣＫ６－１を１２～２４ｈ培養し、発酵終了後、サンプルを１４０００ｒｍｐで２０ｍｉｎ遠心分離し、０．２２μｍの微孔性濾過膜で濾過し、濾液についてＨＰＬＣを行った。高速液体クロマトグラフィー分析は以下のような条件で行われた。器具：アジレント社製高速液体クロマトグラフ１２００、分析カラム：ＨＰＸ－８７Ｈ、移動相：５ｍＭ Ｈ２ＳＯ４、流速：０．６ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度：６０℃、検出器：示差屈折率検出器、注入量：２０μｌ。１２ｈ発酵後、タガトースの収率は１．０％であった。
【0262】
実施例２４ 枯草菌組み換え工学菌株ＹＪ８－１のタガトース生産における使用
（１）枯草菌組み換え工学菌株ＹＪ８－１を用いたグルコース発酵によるタガトースの合成
ＳＲ培地（１５ｇ／Ｌペプトン、２５ｇ／Ｌ酵母抽出物、３ｇ／Ｌ Ｋ２ＨＰＯ４、カナマイシン２５ｎｇ／ｍＬ）１００ｍＬに、終濃度２０ｇ／Ｌのグルコースを加え、３７℃、２００ｒｍｐの条件で、枯草菌組み換え工学菌株ＹＪ８－１を１２～２４ｈ培養し、発酵終了後、サンプルを１４０００ｒｍｐで２０ｍｉｎ遠心分離し、０．２２μｍの微孔性濾過膜で濾過し、濾液についてＨＰＬＣを行った。高速液体クロマトグラフィー分析は以下のような条件で行われた。器具：アジレント社製高速液体クロマトグラフ１２００、分析カラム：ＨＰＸ－８７Ｈ、移動相：５ｍＭ Ｈ２ＳＯ４、流速：０．６ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度：６０℃、検出器：示差屈折率検出器、注入量：２０μｌ。１２ｈ発酵後、タガトースの収率は２．０％であった。
（１）枯草菌組み換え工学菌株ＹＪ８－１を用いたグルコース発酵によるタガトースの合成
ＳＲ培地（１５ｇ／Ｌペプトン、２５ｇ／Ｌ酵母抽出物、３ｇ／Ｌ Ｋ２ＨＰＯ４、カナマイシン２５ｎｇ／ｍＬ）１００ｍＬに、終濃度２０ｇ／Ｌのグルコースを加え、３７℃、２００ｒｍｐの条件で、枯草菌組み換え工学菌株ＹＪ８－１を１２～２４ｈ培養し、発酵終了後、サンプルを１４０００ｒｍｐで２０ｍｉｎ遠心分離し、０．２２μｍの微孔性濾過膜で濾過し、濾液についてＨＰＬＣを行った。高速液体クロマトグラフィー分析は以下のような条件で行われた。器具：アジレント社製高速液体クロマトグラフ１２００、分析カラム：ＨＰＸ－８７Ｈ、移動相：５ｍＭ Ｈ２ＳＯ４、流速：０．６ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度：６０℃、検出器：示差屈折率検出器、注入量：２０μｌ。１２ｈ発酵後、タガトースの収率は２．０％であった。
【0263】
（２）枯草菌組み換え工学菌株ＹＪ８－１を用いたグルコースとグリセロールの発酵によるタガトースの合成
ＳＲ培地（１５ｇ／Ｌペプトン、２５ｇ／Ｌ酵母抽出物、３ｇ／Ｌ Ｋ２ＨＰＯ４、カナマイシン２５ｎｇ／ｍＬ）１００ｍＬに、終濃度２０ｇ／Ｌのグルコース、２０ｇ／Ｌのグリセロールを加え、３７℃、２００ｒｍｐの条件で、枯草菌組み換え工学菌株ＹＪ８－１を１２～２４ｈ培養し、発酵終了後、サンプルを１４０００ｒｍｐで２０ｍｉｎ遠心分離し、０．２２μｍの微孔性濾過膜で濾過し、濾液についてＨＰＬＣを行った。高速液体クロマトグラフィー分析は以下のような条件で行われた。器具：アジレント社製高速液体クロマトグラフ１２００、分析カラム：ＨＰＸ－８７Ｈ、移動相：５ｍＭ Ｈ２ＳＯ４、流速：０．６ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度：６０℃、検出器：示差屈折率検出器、注入量：２０μｌ。１２ｈ発酵後、タガトースの収率は２．０％であった。
ＳＲ培地（１５ｇ／Ｌペプトン、２５ｇ／Ｌ酵母抽出物、３ｇ／Ｌ Ｋ２ＨＰＯ４、カナマイシン２５ｎｇ／ｍＬ）１００ｍＬに、終濃度２０ｇ／Ｌのグルコース、２０ｇ／Ｌのグリセロールを加え、３７℃、２００ｒｍｐの条件で、枯草菌組み換え工学菌株ＹＪ８－１を１２～２４ｈ培養し、発酵終了後、サンプルを１４０００ｒｍｐで２０ｍｉｎ遠心分離し、０．２２μｍの微孔性濾過膜で濾過し、濾液についてＨＰＬＣを行った。高速液体クロマトグラフィー分析は以下のような条件で行われた。器具：アジレント社製高速液体クロマトグラフ１２００、分析カラム：ＨＰＸ－８７Ｈ、移動相：５ｍＭ Ｈ２ＳＯ４、流速：０．６ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度：６０℃、検出器：示差屈折率検出器、注入量：２０μｌ。１２ｈ発酵後、タガトースの収率は２．０％であった。
【0264】
実施例２５ 枯草菌組み換え工学菌株ＹＪ９－１のタガトース生産における使用
（１）枯草菌組み換え工学菌株ＹＪ９－１を用いたグルコース発酵によるタガトースの合成
ＳＲ培地（１５ｇ／Ｌペプトン、２５ｇ／Ｌ酵母抽出物、３ｇ／Ｌ Ｋ２ＨＰＯ４、カナマイシン２５ｎｇ／ｍＬ）１００ｍＬに、終濃度２０ｇ／Ｌのグルコースを加え、３７℃、２００ｒｍｐの条件で、枯草菌組み換え工学菌株ＹＪ９－１を１２～２４ｈ培養し、発酵終了後、サンプルを１４０００ｒｍｐで２０ｍｉｎ遠心分離し、０．２２μｍの微孔性濾過膜で濾過し、濾液についてＨＰＬＣを行った。高速液体クロマトグラフィー分析は以下のような条件で行われた。器具：アジレント社製高速液体クロマトグラフ１２００、分析カラム：ＨＰＸ－８７Ｈ、移動相：５ｍＭ Ｈ２ＳＯ４、流速：０．６ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度：６０℃、検出器：示差屈折率検出器、注入量：２０μｌ。１２ｈ発酵後、タガトースの収率は２．３％であった。
（１）枯草菌組み換え工学菌株ＹＪ９－１を用いたグルコース発酵によるタガトースの合成
ＳＲ培地（１５ｇ／Ｌペプトン、２５ｇ／Ｌ酵母抽出物、３ｇ／Ｌ Ｋ２ＨＰＯ４、カナマイシン２５ｎｇ／ｍＬ）１００ｍＬに、終濃度２０ｇ／Ｌのグルコースを加え、３７℃、２００ｒｍｐの条件で、枯草菌組み換え工学菌株ＹＪ９－１を１２～２４ｈ培養し、発酵終了後、サンプルを１４０００ｒｍｐで２０ｍｉｎ遠心分離し、０．２２μｍの微孔性濾過膜で濾過し、濾液についてＨＰＬＣを行った。高速液体クロマトグラフィー分析は以下のような条件で行われた。器具：アジレント社製高速液体クロマトグラフ１２００、分析カラム：ＨＰＸ－８７Ｈ、移動相：５ｍＭ Ｈ２ＳＯ４、流速：０．６ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度：６０℃、検出器：示差屈折率検出器、注入量：２０μｌ。１２ｈ発酵後、タガトースの収率は２．３％であった。
【0265】
（２）枯草菌組み換え工学菌株ＹＪ９－１を用いたグルコースとグリセロールの発酵によるタガトースの合成
ＳＲ培地（１５ｇ／Ｌペプトン、２５ｇ／Ｌ酵母抽出物、３ｇ／Ｌ Ｋ２ＨＰＯ４、カナマイシン２５ｎｇ／ｍＬ）１００ｍＬに、終濃度２０ｇ／Ｌのグルコース、２０ｇ／Ｌのグリセロールを加え、３７℃、２００ｒｍｐの条件で、枯草菌組み換え工学菌株ＹＪ９－１を１２～２４ｈ培養し、発酵終了後、サンプルを１４０００ｒｍｐで２０ｍｉｎ遠心分離し、０．２２μｍの微孔性濾過膜で濾過し、濾液についてＨＰＬＣを行った。高速液体クロマトグラフィー分析は以下のような条件で行われた。器具：アジレント社製高速液体クロマトグラフ１２００、分析カラム：ＨＰＸ－８７Ｈ、移動相：５ｍＭ Ｈ２ＳＯ４、流速：０．６ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度：６０℃、検出器：示差屈折率検出器、注入量：２０μｌ。１２ｈ発酵後、タガトースの収率は２．５％であった。
ＳＲ培地（１５ｇ／Ｌペプトン、２５ｇ／Ｌ酵母抽出物、３ｇ／Ｌ Ｋ２ＨＰＯ４、カナマイシン２５ｎｇ／ｍＬ）１００ｍＬに、終濃度２０ｇ／Ｌのグルコース、２０ｇ／Ｌのグリセロールを加え、３７℃、２００ｒｍｐの条件で、枯草菌組み換え工学菌株ＹＪ９－１を１２～２４ｈ培養し、発酵終了後、サンプルを１４０００ｒｍｐで２０ｍｉｎ遠心分離し、０．２２μｍの微孔性濾過膜で濾過し、濾液についてＨＰＬＣを行った。高速液体クロマトグラフィー分析は以下のような条件で行われた。器具：アジレント社製高速液体クロマトグラフ１２００、分析カラム：ＨＰＸ－８７Ｈ、移動相：５ｍＭ Ｈ２ＳＯ４、流速：０．６ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度：６０℃、検出器：示差屈折率検出器、注入量：２０μｌ。１２ｈ発酵後、タガトースの収率は２．５％であった。
【0266】
実施例２６ 枯草菌組み換え工学菌株ＹＪ１０－１のタガトース生産における使用
（１）枯草菌組み換え工学菌株ＹＪ１０－１を用いたグルコース発酵によるタガトースの合成
ＳＲ培地（１５ｇ／Ｌペプトン、２５ｇ／Ｌ酵母抽出物、３ｇ／Ｌ Ｋ２ＨＰＯ４、カナマイシン２５ｎｇ／ｍＬ）１００ｍＬに、終濃度２０ｇ／Ｌのグルコースを加え、３７℃、２００ｒｍｐの条件で、枯草菌組み換え工学菌株ＹＪ１０－１を１２～２４ｈ培養し、発酵終了後、サンプルを１４０００ｒｍｐで２０ｍｉｎ遠心分離し、０．２２μｍの微孔性濾過膜で濾過し、濾液についてＨＰＬＣを行った。高速液体クロマトグラフィー分析は以下のような条件で行われた。器具：アジレント社製高速液体クロマトグラフ１２００、分析カラム：ＨＰＸ－８７Ｈ、移動相：５ｍＭ Ｈ２ＳＯ４、流速：０．６ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度：６０℃、検出器：示差屈折率検出器、注入量：２０μｌ。１２ｈ発酵後、タガトースの収率は２．７％であった。
（１）枯草菌組み換え工学菌株ＹＪ１０－１を用いたグルコース発酵によるタガトースの合成
ＳＲ培地（１５ｇ／Ｌペプトン、２５ｇ／Ｌ酵母抽出物、３ｇ／Ｌ Ｋ２ＨＰＯ４、カナマイシン２５ｎｇ／ｍＬ）１００ｍＬに、終濃度２０ｇ／Ｌのグルコースを加え、３７℃、２００ｒｍｐの条件で、枯草菌組み換え工学菌株ＹＪ１０－１を１２～２４ｈ培養し、発酵終了後、サンプルを１４０００ｒｍｐで２０ｍｉｎ遠心分離し、０．２２μｍの微孔性濾過膜で濾過し、濾液についてＨＰＬＣを行った。高速液体クロマトグラフィー分析は以下のような条件で行われた。器具：アジレント社製高速液体クロマトグラフ１２００、分析カラム：ＨＰＸ－８７Ｈ、移動相：５ｍＭ Ｈ２ＳＯ４、流速：０．６ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度：６０℃、検出器：示差屈折率検出器、注入量：２０μｌ。１２ｈ発酵後、タガトースの収率は２．７％であった。
【0267】
（２）枯草菌組み換え工学菌株ＹＪ１０－１を用いたグルコースとグリセロールの発酵によるタガトースの合成
ＳＲ培地（１５ｇ／Ｌペプトン、２５ｇ／Ｌ酵母抽出物、３ｇ／Ｌ Ｋ２ＨＰＯ４、カナマイシン２５ｎｇ／ｍＬ）１００ｍＬに、終濃度２０ｇ／Ｌのグルコース、２０ｇ／Ｌのグリセロールを加え、３７℃、２００ｒｍｐの条件で、枯草菌組み換え工学菌株ＹＪ１０－１を１２～２４ｈ培養し、発酵終了後、サンプルを１４０００ｒｍｐで２０ｍｉｎ遠心分離し、０．２２μｍの微孔性濾過膜で濾過し、濾液についてＨＰＬＣを行った。高速液体クロマトグラフィー分析は以下のような条件で行われた。器具：アジレント社製高速液体クロマトグラフ１２００、分析カラム：ＨＰＸ－８７Ｈ、移動相：５ｍＭ Ｈ２ＳＯ４、流速：０．６ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度：６０℃、検出器：示差屈折率検出器、注入量：２０μｌ。１２ｈ発酵後、タガトースの収率は４．０％であった。
ＳＲ培地（１５ｇ／Ｌペプトン、２５ｇ／Ｌ酵母抽出物、３ｇ／Ｌ Ｋ２ＨＰＯ４、カナマイシン２５ｎｇ／ｍＬ）１００ｍＬに、終濃度２０ｇ／Ｌのグルコース、２０ｇ／Ｌのグリセロールを加え、３７℃、２００ｒｍｐの条件で、枯草菌組み換え工学菌株ＹＪ１０－１を１２～２４ｈ培養し、発酵終了後、サンプルを１４０００ｒｍｐで２０ｍｉｎ遠心分離し、０．２２μｍの微孔性濾過膜で濾過し、濾液についてＨＰＬＣを行った。高速液体クロマトグラフィー分析は以下のような条件で行われた。器具：アジレント社製高速液体クロマトグラフ１２００、分析カラム：ＨＰＸ－８７Ｈ、移動相：５ｍＭ Ｈ２ＳＯ４、流速：０．６ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度：６０℃、検出器：示差屈折率検出器、注入量：２０μｌ。１２ｈ発酵後、タガトースの収率は４．０％であった。
【0268】
実施例２７ 枯草菌組み換え工学菌株ＹＪ１１－１のタガトース生産における使用
（１）枯草菌組み換え工学菌株ＹＪ１１－１を用いたグルコース発酵によるタガトースの合成
ＳＲ培地（１５ｇ／Ｌペプトン、２５ｇ／Ｌ酵母抽出物、３ｇ／Ｌ Ｋ２ＨＰＯ４、カナマイシン２５ｎｇ／ｍＬ）１００ｍＬに、終濃度２０ｇ／Ｌのグルコースを加え、３７℃、２００ｒｍｐの条件で、枯草菌組み換え工学菌株ＹＪ１１－１を１２～２４ｈ培養し、発酵終了後、サンプルを１４０００ｒｍｐで２０ｍｉｎ遠心分離し、０．２２μｍの微孔性濾過膜で濾過し、濾液についてＨＰＬＣを行った。高速液体クロマトグラフィー分析は以下のような条件で行われた。器具：アジレント社製高速液体クロマトグラフ１２００、分析カラム：ＨＰＸ－８７Ｈ、移動相：５ｍＭ Ｈ２ＳＯ４、流速：０．６ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度：６０℃、検出器：示差屈折率検出器、注入量：２０μｌ。１２ｈ発酵後、タガトースの収率は３．０％であった。
（１）枯草菌組み換え工学菌株ＹＪ１１－１を用いたグルコース発酵によるタガトースの合成
ＳＲ培地（１５ｇ／Ｌペプトン、２５ｇ／Ｌ酵母抽出物、３ｇ／Ｌ Ｋ２ＨＰＯ４、カナマイシン２５ｎｇ／ｍＬ）１００ｍＬに、終濃度２０ｇ／Ｌのグルコースを加え、３７℃、２００ｒｍｐの条件で、枯草菌組み換え工学菌株ＹＪ１１－１を１２～２４ｈ培養し、発酵終了後、サンプルを１４０００ｒｍｐで２０ｍｉｎ遠心分離し、０．２２μｍの微孔性濾過膜で濾過し、濾液についてＨＰＬＣを行った。高速液体クロマトグラフィー分析は以下のような条件で行われた。器具：アジレント社製高速液体クロマトグラフ１２００、分析カラム：ＨＰＸ－８７Ｈ、移動相：５ｍＭ Ｈ２ＳＯ４、流速：０．６ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度：６０℃、検出器：示差屈折率検出器、注入量：２０μｌ。１２ｈ発酵後、タガトースの収率は３．０％であった。
【0269】
（２）枯草菌組み換え工学菌株ＹＪ１１－１を用いたグルコースとグリセロールの発酵によるタガトースの合成
ＳＲ培地（１５ｇ／Ｌペプトン、２５ｇ／Ｌ酵母抽出物、３ｇ／Ｌ Ｋ２ＨＰＯ４、カナマイシン２５ｎｇ／ｍＬ）１００ｍＬに、終濃度２０ｇ／Ｌのグルコース、２０ｇ／Ｌのグリセロールを加え、３７℃、２００ｒｍｐの条件で、枯草菌組み換え工学菌株ＹＪ１１－１を１２～２４ｈ培養し、発酵終了後、サンプルを１４０００ｒｍｐで２０ｍｉｎ遠心分離し、０．２２μｍの微孔性濾過膜で濾過し、濾液についてＨＰＬＣを行った。高速液体クロマトグラフィー分析は以下のような条件で行われた。器具：アジレント社製高速液体クロマトグラフ１２００、分析カラム：ＨＰＸ－８７Ｈ、移動相：５ｍＭ Ｈ２ＳＯ４、流速：０．６ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度：６０℃、検出器：示差屈折率検出器、注入量：２０μｌ。１２ｈ発酵後、タガトースの収率は５．０％であった。
ＳＲ培地（１５ｇ／Ｌペプトン、２５ｇ／Ｌ酵母抽出物、３ｇ／Ｌ Ｋ２ＨＰＯ４、カナマイシン２５ｎｇ／ｍＬ）１００ｍＬに、終濃度２０ｇ／Ｌのグルコース、２０ｇ／Ｌのグリセロールを加え、３７℃、２００ｒｍｐの条件で、枯草菌組み換え工学菌株ＹＪ１１－１を１２～２４ｈ培養し、発酵終了後、サンプルを１４０００ｒｍｐで２０ｍｉｎ遠心分離し、０．２２μｍの微孔性濾過膜で濾過し、濾液についてＨＰＬＣを行った。高速液体クロマトグラフィー分析は以下のような条件で行われた。器具：アジレント社製高速液体クロマトグラフ１２００、分析カラム：ＨＰＸ－８７Ｈ、移動相：５ｍＭ Ｈ２ＳＯ４、流速：０．６ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度：６０℃、検出器：示差屈折率検出器、注入量：２０μｌ。１２ｈ発酵後、タガトースの収率は５．０％であった。
【0270】
実施例２８ 枯草菌組み換え工学菌株ＹＪ１２－１のタガトース生産における使用
（１）枯草菌組み換え工学菌株ＹＪ１２－１を用いたグルコース発酵によるタガトースの合成
ＳＲ培地（１５ｇ／Ｌペプトン、２５ｇ／Ｌ酵母抽出物、３ｇ／Ｌ Ｋ２ＨＰＯ４、カナマイシン２５ｎｇ／ｍＬ）１００ｍＬに、終濃度２０ｇ／Ｌのグルコースを加え、３７℃、２００ｒｍｐの条件で、枯草菌組み換え工学菌株ＹＪ１２－１を１２～２４ｈ培養し、発酵終了後、サンプルを１４０００ｒｍｐで２０ｍｉｎ遠心分離し、０．２２μｍの微孔性濾過膜で濾過し、濾液についてＨＰＬＣを行った。高速液体クロマトグラフィー分析は以下のような条件で行われた。器具：アジレント社製高速液体クロマトグラフ１２００、分析カラム：ＨＰＸ－８７Ｈ、移動相：５ｍＭ Ｈ２ＳＯ４、流速：０．６ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度：６０℃、検出器：示差屈折率検出器、注入量：２０μｌ。１２ｈ発酵後、タガトースの収率は８．０％であった。
（１）枯草菌組み換え工学菌株ＹＪ１２－１を用いたグルコース発酵によるタガトースの合成
ＳＲ培地（１５ｇ／Ｌペプトン、２５ｇ／Ｌ酵母抽出物、３ｇ／Ｌ Ｋ２ＨＰＯ４、カナマイシン２５ｎｇ／ｍＬ）１００ｍＬに、終濃度２０ｇ／Ｌのグルコースを加え、３７℃、２００ｒｍｐの条件で、枯草菌組み換え工学菌株ＹＪ１２－１を１２～２４ｈ培養し、発酵終了後、サンプルを１４０００ｒｍｐで２０ｍｉｎ遠心分離し、０．２２μｍの微孔性濾過膜で濾過し、濾液についてＨＰＬＣを行った。高速液体クロマトグラフィー分析は以下のような条件で行われた。器具：アジレント社製高速液体クロマトグラフ１２００、分析カラム：ＨＰＸ－８７Ｈ、移動相：５ｍＭ Ｈ２ＳＯ４、流速：０．６ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度：６０℃、検出器：示差屈折率検出器、注入量：２０μｌ。１２ｈ発酵後、タガトースの収率は８．０％であった。
【0271】
（２）枯草菌組み換え工学菌株ＹＪ１２－１を用いたグルコースとグリセロールの発酵によるタガトースの合成
ＳＲ培地（１５ｇ／Ｌペプトン、２５ｇ／Ｌ酵母抽出物、３ｇ／Ｌ Ｋ２ＨＰＯ４、カナマイシン２５ｎｇ／ｍＬ）１００ｍＬに、終濃度２０ｇ／Ｌのグルコース、２０ｇ／Ｌのグリセロールを加え、３７℃、２００ｒｍｐの条件で、枯草菌組み換え工学菌株ＹＪ１２－１を１２～２４ｈ培養し、発酵終了後、サンプルを１４０００ｒｍｐで２０ｍｉｎ遠心分離し、０．２２μｍの微孔性濾過膜で濾過し、濾液についてＨＰＬＣを行った。高速液体クロマトグラフィー分析は以下のような条件で行われた。器具：アジレント社製高速液体クロマトグラフ１２００、分析カラム：ＨＰＸ－８７Ｈ、移動相：５ｍＭ Ｈ２ＳＯ４、流速：０．６ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度：６０℃、検出器：示差屈折率検出器、注入量：２０μｌ。１２ｈ発酵後、タガトースの収率は１６．０％であった。
ＳＲ培地（１５ｇ／Ｌペプトン、２５ｇ／Ｌ酵母抽出物、３ｇ／Ｌ Ｋ２ＨＰＯ４、カナマイシン２５ｎｇ／ｍＬ）１００ｍＬに、終濃度２０ｇ／Ｌのグルコース、２０ｇ／Ｌのグリセロールを加え、３７℃、２００ｒｍｐの条件で、枯草菌組み換え工学菌株ＹＪ１２－１を１２～２４ｈ培養し、発酵終了後、サンプルを１４０００ｒｍｐで２０ｍｉｎ遠心分離し、０．２２μｍの微孔性濾過膜で濾過し、濾液についてＨＰＬＣを行った。高速液体クロマトグラフィー分析は以下のような条件で行われた。器具：アジレント社製高速液体クロマトグラフ１２００、分析カラム：ＨＰＸ－８７Ｈ、移動相：５ｍＭ Ｈ２ＳＯ４、流速：０．６ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度：６０℃、検出器：示差屈折率検出器、注入量：２０μｌ。１２ｈ発酵後、タガトースの収率は１６．０％であった。
【0272】
実施例２９ 枯草菌組み換え工学菌株ＹＪ１３－１のタガトース生産における使用
（１）枯草菌組み換え工学菌株ＹＪ１３－１を用いたグルコース発酵によるタガトースの合成
ＳＲ培地（１５ｇ／Ｌペプトン、２５ｇ／Ｌ酵母抽出物、３ｇ／Ｌ Ｋ２ＨＰＯ４、カナマイシン２５ｎｇ／ｍＬ）１００ｍＬに、終濃度２０ｇ／Ｌのグルコースを加え、３７℃、２００ｒｍｐの条件で、枯草菌組み換え工学菌株ＹＪ１３－１を１２～２４ｈ培養し、発酵終了後、サンプルを１４０００ｒｍｐで２０ｍｉｎ遠心分離し、０．２２μｍの微孔性濾過膜で濾過し、濾液についてＨＰＬＣを行った。高速液体クロマトグラフィー分析は以下のような条件で行われた。器具：アジレント社製高速液体クロマトグラフ１２００、分析カラム：ＨＰＸ－８７Ｈ、移動相：５ｍＭ Ｈ２ＳＯ４、流速：０．６ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度：６０℃、検出器：示差屈折率検出器、注入量：２０μｌ。１２ｈ発酵後、タガトースの収率は１６％であった。
（１）枯草菌組み換え工学菌株ＹＪ１３－１を用いたグルコース発酵によるタガトースの合成
ＳＲ培地（１５ｇ／Ｌペプトン、２５ｇ／Ｌ酵母抽出物、３ｇ／Ｌ Ｋ２ＨＰＯ４、カナマイシン２５ｎｇ／ｍＬ）１００ｍＬに、終濃度２０ｇ／Ｌのグルコースを加え、３７℃、２００ｒｍｐの条件で、枯草菌組み換え工学菌株ＹＪ１３－１を１２～２４ｈ培養し、発酵終了後、サンプルを１４０００ｒｍｐで２０ｍｉｎ遠心分離し、０．２２μｍの微孔性濾過膜で濾過し、濾液についてＨＰＬＣを行った。高速液体クロマトグラフィー分析は以下のような条件で行われた。器具：アジレント社製高速液体クロマトグラフ１２００、分析カラム：ＨＰＸ－８７Ｈ、移動相：５ｍＭ Ｈ２ＳＯ４、流速：０．６ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度：６０℃、検出器：示差屈折率検出器、注入量：２０μｌ。１２ｈ発酵後、タガトースの収率は１６％であった。
【0273】
（２）枯草菌組み換え工学菌株ＹＪ１３－１を用いたグルコースとグリセロールの発酵によるタガトースの合成
ＳＲ培地（１５ｇ／Ｌペプトン、２５ｇ／Ｌ酵母抽出物、３ｇ／Ｌ Ｋ２ＨＰＯ４、カナマイシン２５ｎｇ／ｍＬ）１００ｍＬに、終濃度２０ｇ／Ｌのグルコース、２０ｇ／Ｌのグリセロールを加え、３７℃、２００ｒｍｐの条件で、枯草菌組み換え工学菌株ＹＪ１３－１を１２～２４ｈ培養し、発酵終了後、サンプルを１４０００ｒｍｐで２０ｍｉｎ遠心分離し、０．２２μｍの微孔性濾過膜で濾過し、濾液についてＨＰＬＣを行った。高速液体クロマトグラフィー分析は以下のような条件で行われた。器具：アジレント社製高速液体クロマトグラフ１２００、分析カラム：ＨＰＸ－８７Ｈ、移動相：５ｍＭ Ｈ２ＳＯ４、流速：０．６ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度：６０℃、検出器：示差屈折率検出器、注入量：２０μｌ。１２ｈ発酵後、タガトースの収率は３５％であった。
ＳＲ培地（１５ｇ／Ｌペプトン、２５ｇ／Ｌ酵母抽出物、３ｇ／Ｌ Ｋ２ＨＰＯ４、カナマイシン２５ｎｇ／ｍＬ）１００ｍＬに、終濃度２０ｇ／Ｌのグルコース、２０ｇ／Ｌのグリセロールを加え、３７℃、２００ｒｍｐの条件で、枯草菌組み換え工学菌株ＹＪ１３－１を１２～２４ｈ培養し、発酵終了後、サンプルを１４０００ｒｍｐで２０ｍｉｎ遠心分離し、０．２２μｍの微孔性濾過膜で濾過し、濾液についてＨＰＬＣを行った。高速液体クロマトグラフィー分析は以下のような条件で行われた。器具：アジレント社製高速液体クロマトグラフ１２００、分析カラム：ＨＰＸ－８７Ｈ、移動相：５ｍＭ Ｈ２ＳＯ４、流速：０．６ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度：６０℃、検出器：示差屈折率検出器、注入量：２０μｌ。１２ｈ発酵後、タガトースの収率は３５％であった。
【0274】
実施例３０ 枯草菌組み換え工学菌株ＹＪ１４－１のタガトース生産における使用
（１）枯草菌組み換え工学菌株ＹＪ１４－１を用いたグルコース発酵によるタガトースの合成
ＳＲ培地（１５ｇ／Ｌペプトン、２５ｇ／Ｌ酵母抽出物、３ｇ／Ｌ Ｋ２ＨＰＯ４、カナマイシン２５ｎｇ／ｍＬ）１００ｍＬに、終濃度２０ｇ／Ｌのグルコースを加え、３７℃、２００ｒｍｐの条件で、枯草菌組み換え工学菌株ＹＪ１４－１を１２～２４ｈ培養し、発酵終了後、サンプルを１４０００ｒｍｐで２０ｍｉｎ遠心分離し、０．２２μｍの微孔性濾過膜で濾過し、濾液についてＨＰＬＣを行った。高速液体クロマトグラフィー分析は以下のような条件で行われた。器具：アジレント社製高速液体クロマトグラフ１２００、分析カラム：ＨＰＸ－８７Ｈ、移動相：５ｍＭ Ｈ２ＳＯ４、流速：０．６ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度：６０℃、検出器：示差屈折率検出器、注入量：２０μｌ。１２ｈ発酵後、タガトースの収率は３３％であった。
（１）枯草菌組み換え工学菌株ＹＪ１４－１を用いたグルコース発酵によるタガトースの合成
ＳＲ培地（１５ｇ／Ｌペプトン、２５ｇ／Ｌ酵母抽出物、３ｇ／Ｌ Ｋ２ＨＰＯ４、カナマイシン２５ｎｇ／ｍＬ）１００ｍＬに、終濃度２０ｇ／Ｌのグルコースを加え、３７℃、２００ｒｍｐの条件で、枯草菌組み換え工学菌株ＹＪ１４－１を１２～２４ｈ培養し、発酵終了後、サンプルを１４０００ｒｍｐで２０ｍｉｎ遠心分離し、０．２２μｍの微孔性濾過膜で濾過し、濾液についてＨＰＬＣを行った。高速液体クロマトグラフィー分析は以下のような条件で行われた。器具：アジレント社製高速液体クロマトグラフ１２００、分析カラム：ＨＰＸ－８７Ｈ、移動相：５ｍＭ Ｈ２ＳＯ４、流速：０．６ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度：６０℃、検出器：示差屈折率検出器、注入量：２０μｌ。１２ｈ発酵後、タガトースの収率は３３％であった。
【0275】
（２）枯草菌組み換え工学菌株ＹＪ１４－１を用いたグルコースとグリセロールの発酵によるタガトースの合成
ＳＲ培地（１５ｇ／Ｌペプトン、２５ｇ／Ｌ酵母抽出物、３ｇ／Ｌ Ｋ２ＨＰＯ４、カナマイシン２５ｎｇ／ｍＬ）１００ｍＬに、終濃度２０ｇ／Ｌのグルコース、２０ｇ／Ｌのグリセロールを加え、３７℃、２００ｒｍｐの条件で、枯草菌組み換え工学菌株ＹＪ１４－１を１２～２４ｈ培養し、発酵終了後、サンプルを１４０００ｒｍｐで２０ｍｉｎ遠心分離し、０．２２μｍの微孔性濾過膜で濾過し、濾液についてＨＰＬＣを行った。高速液体クロマトグラフィー分析は以下のような条件で行われた。器具：アジレント社製高速液体クロマトグラフ１２００、分析カラム：ＨＰＸ－８７Ｈ、移動相：５ｍＭ Ｈ２ＳＯ４、流速：０．６ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度：６０℃、検出器：示差屈折率検出器、注入量：２０μｌ。１２ｈ発酵後、タガトースの収率は７０％であった。
ＳＲ培地（１５ｇ／Ｌペプトン、２５ｇ／Ｌ酵母抽出物、３ｇ／Ｌ Ｋ２ＨＰＯ４、カナマイシン２５ｎｇ／ｍＬ）１００ｍＬに、終濃度２０ｇ／Ｌのグルコース、２０ｇ／Ｌのグリセロールを加え、３７℃、２００ｒｍｐの条件で、枯草菌組み換え工学菌株ＹＪ１４－１を１２～２４ｈ培養し、発酵終了後、サンプルを１４０００ｒｍｐで２０ｍｉｎ遠心分離し、０．２２μｍの微孔性濾過膜で濾過し、濾液についてＨＰＬＣを行った。高速液体クロマトグラフィー分析は以下のような条件で行われた。器具：アジレント社製高速液体クロマトグラフ１２００、分析カラム：ＨＰＸ－８７Ｈ、移動相：５ｍＭ Ｈ２ＳＯ４、流速：０．６ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度：６０℃、検出器：示差屈折率検出器、注入量：２０μｌ。１２ｈ発酵後、タガトースの収率は７０％であった。
【0276】
図５は枯草菌組み換え工学菌株ＹＪ１４－１がグルコースとグリセロールを発酵してタガトースを生産することの高速液体クロマトグラフィーの分析結果を示し、枯草菌組み換え工学菌株はグルコースとグリセロールの両方を利用して発酵し、タガトースを効率的に生産することができ、しかも、発酵反応液中の成分が簡単であり、タガトースの分離精製が容易である。
【0277】
［５］ Ｙｏｕ， Ｃ．， Ｚｈａｎｇ， Ｘ． Ｚ．， ＆ Ｚｈａｎｇ， Ｙ． Ｈ． （２０１２）． Ｓｉｍｐｌｅ ｃｌｏｎｉｎｇ ｖｉａ ｄｉｒｅｃｔ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔ （ＤＮＡ Ｍｕｌｔｉｍｅｒ） ｔｏ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ａｎｄ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ． Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．， ７８（５）， １５９３－１５９５． ｄｏｉ：１０．１１２８／ＡＥＭ．０７１０５－１１．
【0278】
［６］ Ｚｈａｎｇ， Ｘ． Ｚ．， ＆ Ｚｈａｎｇ， Ｙ． Ｈ． Ｐ． （２０１１）． Ｓｉｍｐｌｅ， ｆａｓｔ ａｎｄ ｈｉｇｈ－ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｃｅｌｌｕｌａｓｅ ｉｎ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ． Ｍｉｃｒｏｂ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．， ４（１）， ９８－１０５． ｄｏｉ：１０．１１１１／ｊ．１７５１－７９１５．２０１０．００２３０．ｘ．
【0279】
本明細書に開示されたすべての技術的特徴は、いかなる組合せ方法でも組み合わせることができる。本明細書に開示された各特徴は、同一、等価、又は類似の作用を有する他の特徴に置き換えられてもよい。したがって、特に断らない限り、開示されている各特徴は、等価又は類似の特徴の一連の例にすぎない。
【0280】
さらに、上記の説明から、当業者は、本開示の重要な特徴を本開示から容易に明らかにすることができ、本開示の精神及び範囲から逸脱することなく、様々な使用目的や条件に適合するように発明を多く修正することができ、したがって、このような修正も特許請求の範囲の範囲内に入ることも意図される。
【図1】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図2D】
【図3A】
【図3B】
【図4】
【図5】
【配列表】
【国際調査報告】