特表 2023-551982 マルチシストロン性ＲＮＡワクチン及びその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-12-13

(54)【発明の名称】マルチシストロン性ＲＮＡワクチン及びその使用

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/40 20060101AFI20231206BHJP

   C12N 15/50 20060101ALI20231206BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20231206BHJP

   A61K 39/145 20060101ALI20231206BHJP

   A61K 39/215 20060101ALI20231206BHJP

   A61K 39/235 20060101ALI20231206BHJP

   A61K 39/12 20060101ALI20231206BHJP

   A61K 39/23 20060101ALI20231206BHJP

   A61K 39/155 20060101ALI20231206BHJP

   A61P 37/04 20060101ALI20231206BHJP

   A61P 31/12 20060101ALI20231206BHJP

   A61P 11/00 20060101ALI20231206BHJP

   A61P 31/16 20060101ALI20231206BHJP

   A61P 31/14 20060101ALI20231206BHJP

   A61K 9/14 20060101ALI20231206BHJP

   C12N 15/44 20060101ALN20231206BHJP

【ＦＩ】

C12N15/40

C12N15/50

C12N15/09 Z

A61K39/145

A61K39/215

A61K39/235

A61K39/12

A61K39/23

A61K39/155

A61P37/04

A61P31/12

A61P11/00

A61P31/16

A61P31/14

A61K9/14

C12N15/44

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023534301

(86)(22)【出願日】2021-12-02

(85)【翻訳文提出日】2023-07-31

(86)【国際出願番号】 IB2021061203

(87)【国際公開番号】W WO2022118226

(87)【国際公開日】2022-06-09

(31)【優先権主張番号】63/120,362

(32)【優先日】2020-12-02

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】523207227

【氏名又は名称】セキラス インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100149076

【弁理士】

【氏名又は名称】梅田 慎介

(74)【代理人】

【識別番号】100119183

【弁理士】

【氏名又は名称】松任谷 優子

(74)【代理人】

【識別番号】100173185

【弁理士】

【氏名又は名称】森田 裕

(74)【代理人】

【識別番号】100162503

【弁理士】

【氏名又は名称】今野 智介

(74)【代理人】

【識別番号】100144794

【弁理士】

【氏名又は名称】大木 信人

(74)【代理人】

【識別番号】100204582

【弁理士】

【氏名又は名称】大栗 由美

(72)【発明者】

【氏名】アレン，ピラダ

(72)【発明者】

【氏名】デ ソウザ，イヴナ

(72)【発明者】

【氏名】ウェン，インシア

(72)【発明者】

【氏名】ベディ，スクマニ

(72)【発明者】

【氏名】チャン，チェン

【テーマコード（参考）】

4C076

4C085

【Ｆターム（参考）】

4C076AA31

4C076CC35

4C085AA03

4C085BA51

4C085BA52

4C085BA55

4C085BA57

4C085BA71

4C085BA75

4C085BA77

4C085EE05

(57)【要約】

本開示は、マルチシストロン性ＲＮＡワクチン及びその使用に関する。本開示はまた、マルチシストロン性従来ｍＲＮＡワクチン及びその使用に関する。本開示は更に、マルチシストロン性自己複製ＲＮＡワクチン及びその使用に関する。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

マルチシストロン性自己複製ＲＮＡであって、
ａ）サブゲノム（ＳＧ）プロモーターに作動可能に連結された第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、並びに
ｂ）ＳＧプロモーター及び内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）からなる群から選択される調節エレメントに作動可能に連結された第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列を含む、マルチシストロン性自己複製ＲＮＡ。

【請求項2】

前記ＲＮＡが、５’から３’への順に、
ａ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、及び
ｂ）ＩＲＥＳ又はＳＧプロモーターに作動可能に連結された第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載のマルチシストロン性自己複製ＲＮＡ。

【請求項3】

前記ＲＮＡが、１つ以上の追加のヌクレオチド配列を含み、各配列が、ＳＧプロモーター及びＩＲＥＳからなる群から選択される調節エレメントに作動可能に連結された追加の抗原をコードし、前記１つ以上のヌクレオチド配列が、前記第２のヌクレオチド配列の３’に位置している、請求項２に記載のマルチシストロン性自己複製ＲＮＡ。

【請求項4】

前記ＳＧプロモーターが、最小ＳＧプロモーター又は延長ＳＧプロモーターである、請求項１～３のいずれか一項に記載のマルチシストロン性自己複製ＲＮＡ。

【請求項5】

前記延長ＳＧプロモーターが、ＲＮＡウイルスの非構造タンパク質をコードする配列中に生じるヌクレオチドにより５’末端で延長されている、請求項４に記載のマルチシストロン性自己複製ＲＮＡ。

【請求項6】

前記ＩＲＥＳが、脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）に由来する野生型ＩＲＥＳである、請求項１～５のいずれか一項に記載のマルチシストロン性自己複製ＲＮＡ。

【請求項7】

前記ＲＮＡが、５’から３’への順に、
ａ）最小ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、及び最小ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列、又は
ｂ）最小ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、及び延長ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列、又は
ｃ）最小ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、及び野生型ＥＭＣＶ ＩＲＥＳに作動可能に連結された第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載のマルチシストロン性自己複製ＲＮＡ。

【請求項8】

前記最小ＳＧプロモーターが、配列番号１に記述されている配列によってコードされている、請求項４～７のいずれか一項に記載のマルチシストロン性自己複製ＲＮＡ。

【請求項9】

前記延長ＳＧプロモーターが、配列番号２又は配列番号３又は配列番号４７に記述されている配列によってコードされている、請求項４～７のいずれか一項に記載のマルチシストロン性自己複製ＲＮＡ。

【請求項10】

前記野生型ＥＭＣＶ ＩＲＥＳが、配列番号４に記述されている配列によってコードされている、請求項６～９のいずれか一項に記載のマルチシストロン性自己複製ＲＮＡ。

【請求項11】

前記抗原が、実質的に同じレベルで発現される、請求項１～１０のいずれか一項に記載のマルチシストロン性自己複製ＲＮＡ。

【請求項12】

前記自己複製ＲＮＡが、アルファウイルス由来である、請求項１～１１のいずれか一項に記載のマルチシストロン性自己複製ＲＮＡ。

【請求項13】

前記アルファウイルスが、セムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）、シンドビスウイルス（ＳＩＮ）、及びベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥ）、並びにこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１２に記載のマルチシストロン性自己複製ＲＮＡ。

【請求項14】

前記抗原が、呼吸器ウイルス由来のウイルス抗原である、請求項１～１３のいずれか一項に記載のマルチシストロン性自己複製ＲＮＡ。

【請求項15】

前記呼吸器ウイルスが、インフルエンザウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、パラインフルエンザウイルス、メタニューモウイルス、ライノウイルス、コロナウイルス、アデノウイルス、及びボカウイルスからなる群から選択される、請求項１４に記載のマルチシストロン性自己複製ＲＮＡ。

【請求項16】

前記抗原が、前記インフルエンザウイルスの異なる株由来である、請求項１５に記載のマルチシストロン性自己複製ＲＮＡ。

【請求項17】

前記抗原が、前記インフルエンザウイルスの異なるサブタイプ由来である、請求項１５又は１６に記載のマルチシストロン性自己複製ＲＮＡ。

【請求項18】

前記抗原が、インフルエンザウイルス赤血球凝集素（ＨＡ）タンパク質、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）タンパク質、マトリックス（Ｍ）タンパク質、ヌクレオタンパク質（ＮＰ）、及び／又は非構造（ＮＳ）タンパク質である、請求項１５～１７のいずれか一項に記載のマルチシストロン性自己複製ＲＮＡ。

【請求項19】

前記抗原が、Ｈ５タンパク質及び／又はＮ１タンパク質である、請求項１５～１８のいずれか一項に記載のマルチシストロン性自己複製ＲＮＡ。

【請求項20】

前記ＲＮＡが、５’から３’への順に、
ａ）前記Ｈ５タンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、及び前記Ｎ１タンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列、又は
ｂ）前記Ｎ１タンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、及び前記Ｈ５タンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列を含む、請求項１９に記載のマルチシストロン性自己複製ＲＮＡ。

【請求項21】

前記コロナウイルスが、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）である、請求項１５に記載のマルチシストロン性自己複製ＲＮＡ。

【請求項22】

前記抗原が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシド（Ｎ）タンパク質及び／又はスパイク（Ｓ）タンパク質である、請求項２１に記載のマルチシストロン性自己複製ＲＮＡ。

【請求項23】

前記ＲＮＡが、５’から３’への順に、
ａ）前記Ｎタンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、及び前記Ｓタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列、又は
ｂ）前記Ｓタンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、及び前記Ｎタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列を含む、請求項２２に記載のマルチシストロン性自己複製ＲＮＡ。

【請求項24】

前記ＲＮＡが、配列番号１０～１４、又は配列番号１９～２７、又は配列番号３０～３１のいずれか１つに記述されている配列によってコードされている、請求項１～２３のいずれか一項に記載のマルチシストロン性自己複製ＲＮＡ。

【請求項25】

請求項１～２４のいずれか一項に記載の自己複製ＲＮＡを含む、免疫原性組成物。

【請求項26】

請求項１～２４のいずれか一項に記載の複数のマルチシストロン性自己複製ＲＮＡを含み、各マルチシストロン性自己複製ＲＮＡが、異なるポリペプチド抗原配列をコードする、請求項２５に記載の免疫原性組成物。

【請求項27】

請求項２５又は２６に記載の免疫原性組成物、及び薬学的に許容される担体を含む、薬学的組成物。

【請求項28】

脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）、高分子微粒子、又は水中油型エマルションを更に含む、請求項２７に記載の薬学的組成物。

【請求項29】

前記自己複製ＲＮＡが、ＬＮＰ、高分子微粒子、又は水中油型エマルション中に封入されているか、それに結合されているか、又はそれに吸着されている、請求項２８に記載の薬学的組成物。

【請求項30】

ワクチンとして使用するための、請求項２５若しくは２６に記載の免疫原性組成物、又は請求項２７～２９のいずれか一項に記載の薬学的組成物。

【請求項31】

呼吸器ウイルス感染の治療、若しくは予防、又はその進行を遅延させることに使用するための、請求項２５若しくは２６に記載の免疫原性組成物、又は請求項２７～２９のいずれか一項に記載の薬学的組成物。

【請求項32】

前記呼吸器ウイルス感染が、インフルエンザ、インフルエンザウイルス感染、細気管支炎、肺炎、クループ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染、コロナウイルス病２０１９（ＣＯＶＩＤ－１９）、急性呼吸器疾患症候群（ＡＲＤＳ）、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項３１に記載の免疫原性組成物。

【請求項33】

対象における疾患又は状態の治療、若しくは予防、又はその進行を遅延させる方法であって、請求項２５若しくは２６に記載の免疫原性組成物、又は請求項２７～２９のいずれか一項に記載の薬学的組成物を、それを必要としている対象に投与することを含む、方法。

【請求項34】

疾患又は状態の治療、若しくは予防、又はその進行を遅延させることを必要としている対象においてそれを行うための医薬の製造における、請求項１～２４のいずれか一項に記載の自己複製ＲＮＡ、又は請求項２５若しくは２６に記載の免疫原性組成物、又は請求項２７若しくは２８に記載の薬学的組成物の使用。

【請求項35】

前記疾患又は状態が、呼吸器ウイルス感染である、請求項３３に記載の方法、又は請求項３４に記載の使用。

【請求項36】

前記呼吸器ウイルス感染が、インフルエンザ、インフルエンザウイルス感染、細気管支炎、肺炎、クループ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染、ＣＯＶＩＤ－１９、ＡＲＤＳ、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項３５に記載の方法又は使用。

【請求項37】

対象において免疫応答を誘導する方法であって、請求項２５若しくは２６に記載の免疫原性組成物、又は請求項２７～２９のいずれか一項に記載の薬学的組成物を、それを必要としている対象に投与することを含む、方法。

【請求項38】

前記免疫応答が、体液性及び／又は細胞媒介性免疫応答である、請求項３７に記載の方法。

【請求項39】

免疫応答を誘導することを必要としている対象においてそれを行うための医薬の製造における、請求項１～２４のいずれか一項に記載の自己複製ＲＮＡ、又は請求項２５若しくは２６に記載の免疫原性組成物、又は請求項２７～２９のいずれか一項に記載の薬学的組成物の使用。

【請求項40】

請求項１～２４のいずれか一項に記載の自己複製ＲＮＡをコードする、ポリヌクレオチド。

【請求項41】

前記ポリヌクレオチドが、組換えＤＮＡである、請求項４０に記載のポリヌクレオチド。

【請求項42】

前記組換えＤＮＡが、プラスミドである、請求項４２に記載のポリヌクレオチド。

【請求項43】

前記プラスミドが、配列番号１０～１４、又は配列番号１９～２７、又は配列番号３０～３１のいずれか１つに記述されている配列を含む、請求項４２に記載のポリヌクレオチド。

【請求項44】

ポリヌクレオチドであって、
ａ）第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、並びに
ｂ）ＳＧプロモーター及び内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）からなる群から選択される調節エレメントに作動可能に連結された第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチド。

【請求項45】

前記ポリヌクレオチドが、５’から３’への順に、
ｃ）第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、及び
ｄ）ＩＲＥＳ又はＳＧプロモーターに作動可能に連結された第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列を含む、請求項４４に記載のポリヌクレチド。

【請求項46】

従来ｍＲＮＡ（ｃＲＮＡ）であって、
ｃ）第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、並びに
ｄ）ＳＧプロモーター及び内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）からなる群から選択される調節エレメントに作動可能に連結された第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列を含む、従来ｍＲＮＡ（ｃＲＮＡ）。

【請求項47】

前記ｃＲＮＡが、５’から３’への順に、
ｅ）第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、及び
ｆ）ＩＲＥＳ又はＳＧプロモーターに作動可能に連結された第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列を含む、請求項４６に記載のｃＲＮＡ。

【請求項48】

前記第１のヌクレオチド配列が、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列、ＩＲＥＳ、ＳＧプロモーター、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される調節エレメントに作動可能に連結されている、請求項４４若しくは４５に記載のポリヌクレオチド、又は請求項４６若しくは４７に記載のｃＲＮＡ。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願データ
本出願は、２０２０年１２月２日に出願された「Ｍｕｌｔｉｃｉｓｔｒｏｎｉｃ ｓｅｌｆ－ｒｅｐｌｉｃａｔｉｎｇ ＲＮＡ ａｎｄ ｕｓｅｓ ｔｈｅｒｅｏｆ」と題する米国特許出願第６３／１２０，３６２号からの優先権を主張し、その全体の内容が参照により本明細書に組み込まれる。

【0002】

配列リスト
本出願は、電子形態における配列リストとともに出願される。配列リストの全内容が、参照により本明細書に組み込まれる。

【0003】

本開示は、マルチシストロン性ＲＮＡワクチン及びその使用に関する。本開示はまた、マルチシストロン性従来ｍＲＮＡワクチン及びその使用に関する。本開示は更に、マルチシストロン性自己複製ＲＮＡワクチン及びその使用に関する。

【背景技術】

【0004】

呼吸器ウイルス感染は、ヒトの健康及び生命に対する重大な脅威である。インフルエンザウイルス及び重症急性呼吸器症候群コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）によって引き起こされるものなどの感染は、世界的なパンデミックを引き起こし、世界中で何百万人もの人々を死に至らしめることが知られている。最近では、ＳＡＲ－ＣｏＶ－２は、重症感染コロナウイルス病２０１９（ＣＯＶＩＤ－１９）の現在進行中の世界的なパンデミックを引き起こす原因となっている。

【0005】

現在、インフルエンザなどの感染は、抗ウイルス薬又は他の薬によって治療されている。しかしながら、現在、ほとんどの呼吸器ウイルス感染に対する特定のかつ効果的な治療は存在していない。いくつかの呼吸器ウイルス感染に利用可能なそれらの特定の治療、例えば、ＣＯＶＩＤ－１９に対するｍＲＮＡワクチンについて、それらの有効性を増加させるために更なる改善を行うことができる。

【0006】

インフルエンザのためのものなどのウイルスワクチンは、ウイルスを中和するか、又はウイルスの細胞への進入をブロックすることによって感染に対して保護する抗体の誘導に依存する。体液性免疫応答は、ウイルス表面タンパク質を標的とするが、しかしながら、これらの表面タンパク質は各株内で保存されるため、抗体媒介性保護は、血清学的に異なる表面タンパク質を有する株に対して不適合である。更に、多くのウイルスの表面タンパク質は、急速に変異する可能性がある。これは、ほとんどのワクチンが多価でなければならないことを意味し、すなわち、所与の期間内に最も普及すると予測される株由来の抗原を含む。

【0007】

インフルエンザウイルス表面タンパク質に搭載された免疫応答（例えば、抗体応答）を増強するために、種々のアジュバント及び免疫増強剤がワクチン製剤に含まれる。しかしながら、安全性及び有効性の問題が残っている。

【0008】

現在、卵ベースの製造プロセスは、インフルエンザワクチンが生産される最も一般的な方法である。このプロセスは、卵内のウイルス増殖を最適化するのにかなりの時間を必要とし、かつ特にパンデミック中に十分な量のワクチンを生産するための資源（すなわち、卵）を必要とする。更に、必要とされる長い開発時間を考慮すると、ワクチンが利用可能になる前にワクチン株の選択が行われ、ウイルスにおける変化に対応することが困難になる。インフルエンザワクチンはまた、卵の代わりに培養された哺乳動物細胞（例えば、マディンダービーイヌ腎、又はＭＤＣＫ細胞）を伴う細胞ベースの製造プロセス、及び組換えウイルス（例えば、インフルエンザの抗原をコードするバキュロウイルス）を伴うウイルスベースのプラットフォームを使用して生産されている。

【0009】

インフルエンザ及びＣＯＶＩＤ－１９などの呼吸器ウイルス感染の治療又は予防のために、現在の卵ベースの技術よりも迅速に生産することができる特定のかつ効率的なウイルスワクチンの開発が依然として必要である。核酸ベースのワクチンは、現在の卵ベースの製造プラットフォームよりも明確な利点を提供するが、いくつかの課題が残っている。例えば、ｍＲＮＡの本質的に不安定な性質により、結果的に、ほとんどのＲＮＡベースのワクチンは、強力で耐久性のある免疫応答を生成するのに必要とされる用量及び持続時間で抗原を提供する能力が限定されている。したがって、当業者には、当該技術分野において、外因性核酸を対象に送達するための改善された手段に対する必要性が存在することが明らかであろう。また、当該技術分野において、対象の標的細胞内の安定性を増強させ、抗原の発現を改善したｍＲＮＡワクチンに対する必要性も存在する。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0010】

本開示の発明者らは、活性を改善し、２つ以上の抗原（すなわち、マルチシストロン性ＲＮＡ）の効率的な発現を可能にするＲＮＡを同定している。本開示は、改善された活性を有する自己複製ＲＮＡの本発明者らの同定に基づく。特に、本発明者らは、２つ以上の抗原の効率的な発現を可能にし、望ましくない融合タンパク質の形成をもたらさない自己複製ＲＮＡを同定している。

【0011】

本発明者らによる知見は、マルチシストロン性ＲＮＡについての基礎を提供する。本発明者らによる知見はまた、マルチシストロン性自己複製ＲＮＡについての基礎を提供する。更に、本発明者らによる知見は、マルチシストロン性従来（すなわち、非自己複製）ＲＮＡについての基礎を提供する。本発明者らによる知見はまた、対象における疾患又は障害（例えば、インフルエンザ、ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２感染、ＣＯＶＩＤ－１９又はＡＲＤＳなどの呼吸器ウイルス感染によって引き起こされる疾患）の治療、若しくは予防、又はその進行を遅延させる方法についての基礎も提供する。

【0012】

したがって、本開示は、ａ）目的の第１のポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列、並びにｂ）サブゲノム（ＳＧ）プロモーター及び内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）からなる群から選択される調節エレメントに作動可能に連結された目的の第２のポリペプチドをコードする第２のヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチドを提供する。

【0013】

一実施例において、ポリヌクレオチドは、５’から３’への順に、ａ）目的の第１のポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列、並びにｂ）ＳＧプロモーター及びＩＲＥＳからなる群から選択される調節エレメントに作動可能に連結された目的の第２のポリペプチドをコードする第２のヌクレオチド配列を含む。

【0014】

本開示はまた、ａ）目的の第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、並びにｂ）ＳＧプロモーター及びＩＲＥＳからなる群から選択される調節エレメントに作動可能に連結された目的の第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチドを提供する。

【0015】

一実施例において、ポリヌクレオチドは、５’から３’への順に、ａ）目的の第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、並びにｂ）ＳＧプロモーター及びＩＲＥＳからなる群から選択される調節エレメントに作動可能に連結された目的の第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列を含む。

【0016】

一実施例において、ポリヌクレオチドは、ＲＮＡ又はＤＮＡである。例えば、ポリヌクレオチドは、ＲＮＡである。一実施例において、ポリヌクレオチドは、ＤＮＡである。

【0017】

一実施例において、ＲＮＡは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）である。一実施例において、ｍＲＮＡは、従来ｍＲＮＡ（ｃＲＮＡ）又は自己複製ｍＲＮＡである。

【0018】

したがって、本開示は、ａ）目的の第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、並びにｂ）ＳＧプロモーター及びＩＲＥＳからなる群から選択される調節エレメントに作動可能に連結された目的の第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列を含む、ＲＮＡを提供する。

【0019】

一実施例において、ＲＮＡは、５’から３’への順に、ａ）目的の第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、並びにｂ）ＳＧプロモーター及びＩＲＥＳからなる群から選択される調節エレメントに作動可能に連結された目的の第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列を含む。

【0020】

本開示はまた、ａ）目的の第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、並びにｂ）ＳＧプロモーター及びＩＲＥＳからなる群から選択される調節エレメントに作動可能に連結された目的の第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列を含む、ｃＲＮＡを提供する。

【0021】

一実施例において、ｃＲＮＡは、５’から３’への順に、ａ）目的の第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、並びにｂ）ＳＧプロモーター及びＩＲＥＳからなる群から選択される調節エレメントに作動可能に連結された目的の第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列を含む。

【0022】

本開示は更に、ａ）目的の第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、並びにｂ）ＳＧプロモーター及びＩＲＥＳからなる群から選択される調節エレメントに作動可能に連結された目的の第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列を含む、自己複製ｍＲＮＡを提供する。

【0023】

一実施例において、自己複製ｍＲＮＡは、５’から３’への順に、ａ）目的の第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、並びにｂ）ＳＧプロモーター及びＩＲＥＳからなる群から選択される調節エレメントに作動可能に連結された目的の第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列を含む。

【0024】

一実施例において、目的の第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列は、調節エレメントに作動可能に連結されている。例えば、調節エレメントは、第１のヌクレオチド配列の５’末端に作動可能に連結されている。一実施例において、調節エレメントは、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列、ＩＲＥＳ、ＳＧプロモーター、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される。例えば、調節エレメントは、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列である。例えば、調節エレメントは、ＩＲＥＳである。例えば、調節エレメントは、ＳＧプロモーターである。

【0025】

一実施例において、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列は、配列番号３８に記述されている配列を含むか又はそれからなる。一実施例において、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列は、配列番号３８に記述されている配列からなる。一実施例において、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列は、配列番号３８に記述されている配列を含む。例えば、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列は、ＡＣＣＡＴＧＧである。

【0026】

一実施例において、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列は、配列番号３９に記述されている配列を含むか又はそれからなる。一実施例において、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列は、配列番号３９に記述されている配列からなる。一実施例において、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列は、配列番号３９に記述されている配列を含む。例えば、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列は、ＡＣＣＡＴＧである。

【0027】

本開示は、ａ）Ｋｏｚａｋコンセンサス配列、ＩＲＥＳ、ＳＧプロモーター、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される調節エレメントに作動可能に連結された目的の第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、並びにｂ）ＳＧプロモーター及びＩＲＥＳからなる群から選択される調節エレメントに作動可能に連結された目的の第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチドを提供する。

【0028】

一実施例において、ポリヌクレオチドは、５’から３’への順に、ａ）Ｋｏｚａｋコンセンサス配列、ＩＲＥＳ、ＳＧプロモーター、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される調節エレメントに作動可能に連結された目的の第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、並びにｂ）ＳＧプロモーター及びＩＲＥＳからなる群から選択される調節エレメントに作動可能に連結された目的の第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列を含む。

【0029】

本開示は、ａ）Ｋｏｚａｋコンセンサス配列、ＩＲＥＳ、ＳＧプロモーター、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される調節エレメントに作動可能に連結された目的の第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、並びにｂ）ＳＧプロモーター及びＩＲＥＳからなる群から選択される調節エレメントに作動可能に連結された目的の第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列を含む、ＲＮＡを提供する。

【0030】

一実施例において、ＲＮＡは、５’から３’への順に、ａ）Ｋｏｚａｋコンセンサス配列、ＩＲＥＳ、ＳＧプロモーター、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される調節エレメントに作動可能に連結された目的の第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、並びにｂ）ＳＧプロモーター及びＩＲＥＳからなる群から選択される調節エレメントに作動可能に連結された目的の第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列を含む。

【0031】

本開示は、ａ）Ｋｏｚａｋコンセンサス配列、ＩＲＥＳ、ＳＧプロモーター、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される調節エレメントに作動可能に連結された目的の第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、並びにｂ）ＳＧプロモーター及びＩＲＥＳからなる群から選択される調節エレメントに作動可能に連結された目的の第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列を含む、ｃＲＮＡを提供する。

【0032】

一実施例において、ｃＲＮＡは、５’から３’への順に、ａ）Ｋｏｚａｋコンセンサス配列、ＩＲＥＳ、ＳＧプロモーター、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される調節エレメントに作動可能に連結された目的の第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、並びにｂ）ＳＧプロモーター及びＩＲＥＳからなる群から選択される調節エレメントに作動可能に連結された目的の第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列を含む。

【0033】

本開示は、ａ）Ｋｏｚａｋコンセンサス配列、ＩＲＥＳ、ＳＧプロモーター、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される調節エレメントに作動可能に連結された目的の第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、並びにｂ）ＳＧプロモーター及びＩＲＥＳからなる群から選択される調節エレメントに作動可能に連結された目的の第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列を含む、自己複製ｍＲＮＡを提供する。

【0034】

一実施例において、自己複製ｍＲＮＡは、５’から３’への順に、ａ）Ｋｏｚａｋコンセンサス配列、ＩＲＥＳ、ＳＧプロモーター、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される調節エレメントに作動可能に連結された目的の第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、並びにｂ）ＳＧプロモーター及びＩＲＥＳからなる群から選択される調節エレメントに作動可能に連結された目的の第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列を含む。

【0035】

一実施例において、目的の第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列は、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列に作動可能に連結されている。

【0036】

一実施例において、目的の第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列は、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列及びＳＧプロモーターに作動可能に連結されている。例えば、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列は、目的の第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列の５’末端に作動可能に連結されているＳＧプロモーターの５’末端に作動可能に連結されている。

【0037】

一実施例において、目的の第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列は、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列及びＩＲＥＳに作動可能に連結されている。例えば、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列は、目的の第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列の５’末端に作動可能に連結されているＩＲＥＳの５’末端に作動可能に連結されている。

【0038】

一実施例において、目的の第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列は、ＳＧプロモーターに作動可能に連結されている。

【0039】

一実施例において、目的の第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列は、ＩＲＥＳに作動可能に連結されている。

【0040】

本開示は、ａ）Ｋｏｚａｋコンセンサス配列に作動可能に連結された目的の第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、並びにｂ）ＳＧプロモーター及びＩＲＥＳからなる群から選択される調節エレメントに作動可能に連結された目的の第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチドを提供する。

【0041】

一実施例において、ポリヌクレオチドは、５’から３’への順に、ａ）Ｋｏｚａｋコンセンサス配列に作動可能に連結された目的の第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、並びにｂ）ＳＧプロモーター及びＩＲＥＳからなる群から選択される調節エレメントに作動可能に連結された目的の第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列を含む。

【0042】

本開示は、ａ）Ｋｏｚａｋコンセンサス配列及びＳＧプロモーターに作動可能に連結された目的の第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、並びにｂ）ＳＧプロモーター及びＩＲＥＳからなる群から選択される調節エレメントに作動可能に連結された目的の第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチドを提供する。

【0043】

一実施例において、ポリヌクレオチドは、５’から３’への順に、ａ）Ｋｏｚａｋコンセンサス配列及びＳＧプロモーターに作動可能に連結された目的の第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、並びにｂ）ＳＧプロモーター及びＩＲＥＳからなる群から選択される調節エレメントに作動可能に連結された目的の第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列を含む。

【0044】

本開示は、ａ）Ｋｏｚａｋコンセンサス配列及びＩＲＥＳに作動可能に連結された目的の第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、並びにｂ）ＳＧプロモーター及びＩＲＥＳからなる群から選択される調節エレメントに作動可能に連結された目的の第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチドを提供する。

【0045】

一実施例において、ポリヌクレオチドは、５’から３’への順に、ａ）Ｋｏｚａｋコンセンサス配列及びＩＲＥＳに作動可能に連結された目的の第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、並びにｂ）ＳＧプロモーター及びＩＲＥＳからなる群から選択される調節エレメントに作動可能に連結された目的の第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列を含む。

【0046】

本開示は、ａ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された目的の第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、並びにｂ）ＳＧプロモーター及びＩＲＥＳからなる群から選択される調節エレメントに作動可能に連結された目的の第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチドを提供する。

【0047】

一実施例において、ポリヌクレオチドは、５’から３’への順に、ａ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された目的の第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、並びにｂ）ＳＧプロモーター及びＩＲＥＳからなる群から選択される調節エレメントに作動可能に連結された目的の第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列を含む。

【0048】

本開示は、ａ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された目的の第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、並びにｂ）ＳＧプロモーター及びＩＲＥＳからなる群から選択される調節エレメントに作動可能に連結された目的の第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチドを提供する。

【0049】

一実施例において、ポリヌクレオチドは、５’から３’への順に、ａ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された目的の第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、並びにｂ）ＳＧプロモーター及びＩＲＥＳからなる群から選択される調節エレメントに作動可能に連結された目的の第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列を含む。

【0050】

本開示は、ａ）Ｋｏｚａｋコンセンサス配列に作動可能に連結された目的の第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、並びにｂ）ＳＧプロモーター及びＩＲＥＳからなる群から選択される調節エレメントに作動可能に連結された目的の第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列を含む、ＲＮＡを提供する。

【0051】

一実施例において、ＲＮＡは、５’から３’への順に、ａ）Ｋｏｚａｋコンセンサス配列に作動可能に連結された目的の第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、並びにｂ）ＳＧプロモーター及びＩＲＥＳからなる群から選択される調節エレメントに作動可能に連結された目的の第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列を含む。

【0052】

本開示は、ａ）Ｋｏｚａｋコンセンサス配列及びＳＧプロモーターに作動可能に連結された目的の第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、並びにｂ）ＳＧプロモーター及びＩＲＥＳからなる群から選択される調節エレメントに作動可能に連結された目的の第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列を含む、ＲＮＡを提供する。

【0053】

一実施例において、ＲＮＡは、５’から３’への順に、ａ）Ｋｏｚａｋコンセンサス配列及びＳＧプロモーターに作動可能に連結された目的の第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、並びにｂ）ＳＧプロモーター及びＩＲＥＳからなる群から選択される調節エレメントに作動可能に連結された目的の第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列を含む。

【0054】

本開示は、ａ）Ｋｏｚａｋコンセンサス配列及びＩＲＥＳに作動可能に連結された目的の第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、並びにｂ）ＳＧプロモーター及びＩＲＥＳからなる群から選択される調節エレメントに作動可能に連結された目的の第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列を含む、ＲＮＡを提供する。

【0055】

一実施例において、ＲＮＡは、５’から３’への順に、ａ）Ｋｏｚａｋコンセンサス配列及びＩＲＥＳに作動可能に連結された目的の第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、並びにｂ）ＳＧプロモーター及びＩＲＥＳからなる群から選択される調節エレメントに作動可能に連結された目的の第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列を含む。

【0056】

本開示は、ａ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された目的の第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、並びにｂ）ＳＧプロモーター及びＩＲＥＳからなる群から選択される調節エレメントに作動可能に連結された目的の第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列を含む、ＲＮＡを提供する。

【0057】

一実施例において、ＲＮＡは、５’から３’への順に、ａ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された目的の第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、並びにｂ）ＳＧプロモーター及びＩＲＥＳからなる群から選択される調節エレメントに作動可能に連結された目的の第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列を含む。

【0058】

本開示は、ａ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された目的の第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、並びにｂ）ＳＧプロモーター及びＩＲＥＳからなる群から選択される調節エレメントに作動可能に連結された目的の第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列を含む、ＲＮＡを提供する。

【0059】

一実施例において、ＲＮＡは、５’から３’への順に、ａ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された目的の第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、並びにｂ）ＳＧプロモーター及びＩＲＥＳからなる群から選択される調節エレメントに作動可能に連結された目的の第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列を含む。

【0060】

本開示は、ａ）Ｋｏｚａｋコンセンサス配列に作動可能に連結された目的の第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、並びにｂ）ＳＧプロモーター及びＩＲＥＳからなる群から選択される調節エレメントに作動可能に連結された目的の第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列を含む、ｃＲＮＡを提供する。

【0061】

一実施例において、ｃＲＮＡは、５’から３’への順に、ａ）Ｋｏｚａｋコンセンサス配列に作動可能に連結された目的の第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、並びにｂ）ＳＧプロモーター及びＩＲＥＳからなる群から選択される調節エレメントに作動可能に連結された目的の第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列を含む。

【0062】

本開示は、ａ）Ｋｏｚａｋコンセンサス配列及びＳＧプロモーターに作動可能に連結された目的の第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、並びにｂ）ＳＧプロモーター及びＩＲＥＳからなる群から選択される調節エレメントに作動可能に連結された目的の第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列を含む、ｃＲＮＡを提供する。

【0063】

一実施例において、ｃＲＮＡは、５’から３’への順に、ａ）Ｋｏｚａｋコンセンサス配列及びＳＧプロモーターに作動可能に連結された目的の第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、並びにｂ）ＳＧプロモーター及びＩＲＥＳからなる群から選択される調節エレメントに作動可能に連結された目的の第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列を含む。

【0064】

本開示は、ａ）Ｋｏｚａｋコンセンサス配列及びＩＲＥＳに作動可能に連結された目的の第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、並びにｂ）ＳＧプロモーター及びＩＲＥＳからなる群から選択される調節エレメントに作動可能に連結された目的の第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列を含む、ｃＲＮＡを提供する。

【0065】

一実施例において、ｃＲＮＡは、５’から３’への順に、ａ）Ｋｏｚａｋコンセンサス配列及びＩＲＥＳに作動可能に連結された目的の第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、並びにｂ）ＳＧプロモーター及びＩＲＥＳからなる群から選択される調節エレメントに作動可能に連結された目的の第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列を含む。

【0066】

本開示は、ａ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された目的の第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、並びにｂ）ＳＧプロモーター及びＩＲＥＳからなる群から選択される調節エレメントに作動可能に連結された目的の第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列を含む、ｃＲＮＡを提供する。

【0067】

一実施例において、ｃＲＮＡは、５’から３’への順に、ａ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された目的の第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、並びにｂ）ＳＧプロモーター及びＩＲＥＳからなる群から選択される調節エレメントに作動可能に連結された目的の第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列を含む。

【0068】

本開示は、ａ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された目的の第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、並びにｂ）ＳＧプロモーター及びＩＲＥＳからなる群から選択される調節エレメントに作動可能に連結された目的の第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列を含む、ｃＲＮＡを提供する。

【0069】

一実施例において、ｃＲＮＡは、５’から３’への順に、ａ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された目的の第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、並びにｂ）ＳＧプロモーター及びＩＲＥＳからなる群から選択される調節エレメントに作動可能に連結された目的の第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列を含む。

【0070】

本開示は、ａ）サブゲノム（ＳＧ）プロモーターに作動可能に連結された第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、並びにｂ）ＳＧプロモーター及び内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）からなる群から選択される調節エレメントに作動可能に連結された第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列を含む、マルチシストロン性自己複製ＲＮＡを提供する。

【0071】

一実施例において、本開示のマルチシストロン性自己複製ＲＮＡは、５’から３’への順に、ａ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、及びｂ）ＩＲＥＳ又はＳＧプロモーターに作動可能に連結された第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列を含む。

【0072】

一実施例において、ポリヌクレオチドは、バイシストロン性ＲＮＡである。例えば、ポリヌクレオチドは、バイシストロン性ｃＲＮＡである。一実施例において、ｃＲＮＡは、バイシストロン性ｃＲＮＡである。別の実施例において、ポリヌクレオチドは、バイシストロン性自己複製ｍＲＮＡである。例えば、自己複製ＲＮＡは、バイシストロン性自己複製ＲＮＡである。

【0073】

一実施例において、第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列は、ＩＲＥＳに作動可能に連結されている。

【0074】

一実施例において、第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列は、ＳＧプロモーターに作動可能に連結されている。

【0075】

一実施例において、ポリヌクレオチドは、マルチシストロン性ＲＮＡである。例えば、ポリヌクレオチドは、マルチシストロン性ｃＲＮＡである。例えば、ｃＲＮＡは、マルチシストロン性ｃＲＮＡである。別の実施例において、ポリヌクレオチドは、マルチシストロン性自己複製ｍＲＮＡである。例えば、自己複製ＲＮＡは、マルチシストロン性自己複製ｍＲＮＡである。

【0076】

一実施例において、ポリヌクレオチドは、１つ以上の追加のヌクレオチド配列を含み、各配列は、ＳＧプロモーター及びＩＲＥＳからなる群から選択される調節エレメントに作動可能に連結された目的の追加の抗原をコードし、１つ以上のヌクレオチド配列は、第２のヌクレオチド配列の３’に位置している。例えば、ポリヌクレオチドは、少なくとも３つのヌクレオチド配列、又は少なくとも４つのヌクレオチド配列、又は少なくとも５つのヌクレオチド配列を含み、各ヌクレオチド配列は、抗原をコードする。

【0077】

一実施例において、マルチシストロン性ＲＮＡは、１つ以上の追加のヌクレオチド配列を含み、各配列は、ＳＧプロモーター及びＩＲＥＳからなる群から選択される調節エレメントに作動可能に連結された目的の追加の抗原をコードし、１つ以上のヌクレオチド配列は、第２のヌクレオチド配列の３’に位置している。例えば、マルチシストロン性ＲＮＡは、少なくとも３つのヌクレオチド配列、又は少なくとも４つのヌクレオチド配列、又は少なくとも５つのヌクレオチド配列を含み、各ヌクレオチド配列は、抗原をコードする。

【0078】

一実施例において、マルチシストロン性ｃＲＮＡは、１つ以上の追加のヌクレオチド配列を含み、各配列は、ＳＧプロモーター及びＩＲＥＳからなる群から選択される調節エレメントに作動可能に連結された目的の追加の抗原をコードし、１つ以上のヌクレオチド配列は、第２のヌクレオチド配列の３’に位置している。例えば、マルチシストロン性ｃＲＮＡは、少なくとも３つのヌクレオチド配列、又は少なくとも４つのヌクレオチド配列、又は少なくとも５つのヌクレオチド配列を含み、各ヌクレオチド配列は、抗原をコードする。

【0079】

一実施例において、マルチシストロン性自己複製ＲＮＡは、１つ以上の追加のヌクレオチド配列を含み、各ヌクレオチド配列は、ＳＧプロモーター及びＩＲＥＳからなる群から選択される調節エレメントに作動可能に連結された追加の抗原をコードし、追加の抗原をコードする１つ以上のヌクレオチド配列は、第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列の３’に位置している。例えば、マルチシストロン性自己複製ＲＮＡは、少なくとも３つのヌクレオチド配列、又は少なくとも４つのヌクレオチド配列、又は少なくとも５つのヌクレオチド配列を含み、各ヌクレオチド配列は、抗原をコードする。

【0080】

一実施例において、ポリヌクレオチドは、少なくとも３つのヌクレオチド配列を含み、各ヌクレオチド配列は、抗原をコードする。

【0081】

一実施例において、マルチシストロン性ＲＮＡは、少なくとも３つのヌクレオチド配列を含み、各ヌクレオチド配列は、抗原をコードする。例えば、ＲＮＡは、トリシストロン性ＲＮＡである。

【0082】

一実施例において、マルチシストロン性ｃＲＮＡは、少なくとも３つのヌクレオチド配列を含み、各ヌクレオチド配列は、抗原をコードする。例えば、ｃＲＮＡは、トリシストロン性ＲＮＡである。

【0083】

一実施例において、マルチシストロン性自己複製ＲＮＡは、少なくとも３つのヌクレオチド配列を含み、各ヌクレオチド配列は、抗原をコードする。例えば、自己複製ＲＮＡは、トリシストロン性自己複製ＲＮＡである。

【0084】

一実施例において、ポリヌクレオチドは、５’から３’への順に、ａ）第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、ｂ）ＩＲＥＳ又はＳＧプロモーターに作動可能に連結された第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列、及びｃ）ＩＲＥＳ又はＳＧプロモーターに作動可能に連結された第３の抗原をコードする第３のヌクレオチド配列を含む。

【0085】

一実施例において、マルチシストロン性ＲＮＡは、５’から３’への順に、ａ）第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、ｂ）ＩＲＥＳ又はＳＧプロモーターに作動可能に連結された第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列、及びｃ）ＩＲＥＳ又はＳＧプロモーターに作動可能に連結された第３の抗原をコードする第３のヌクレオチド配列を含む。

【0086】

一実施例において、マルチシストロン性ｃＲＮＡは、５’から３’への順に、ａ）第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、ｂ）ＩＲＥＳ又はＳＧプロモーターに作動可能に連結された第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列、及びｃ）ＩＲＥＳ又はＳＧプロモーターに作動可能に連結された第３の抗原をコードする第３のヌクレオチド配列を含む。

【0087】

一実施例において、マルチシストロン性自己複製ｍＲＮＡは、５’から３’への順に、ａ）第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、ｂ）ＩＲＥＳ又はＳＧプロモーターに作動可能に連結された第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列、及びｃ）ＩＲＥＳ又はＳＧプロモーターに作動可能に連結された第３の抗原をコードする第３のヌクレオチド配列を含む。

【0088】

一実施例において、マルチシストロン性自己複製ＲＮＡは、５’から３’への順に、ａ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、ｂ）ＩＲＥＳ又はＳＧプロモーターに作動可能に連結された第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列、及びｃ）ＩＲＥＳ又はＳＧプロモーターに作動可能に連結された第３の抗原をコードする第３のヌクレオチド配列を含む。

【0089】

一実施例において、ポリヌクレオチドは、５’から３’への順に、ａ）第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、ｂ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列、及びｃ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第３の抗原をコードする第３のヌクレオチド配列を含む。別の実施例において、ポリヌクレオチドは、５’から３’への順に、ａ）第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、ｂ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列、及びｃ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第３の抗原をコードする第３のヌクレオチド配列を含む。

【0090】

一実施例において、マルチシストロン性ＲＮＡは、５’から３’への順に、ａ）第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、ｂ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列、及びｃ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第３の抗原をコードする第３のヌクレオチド配列を含む。別の実施例において、マルチシストロン性ＲＮＡは、５’から３’への順に、ａ）第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、ｂ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列、及びｃ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第３の抗原をコードする第３のヌクレオチド配列を含む。

【0091】

一実施例において、マルチシストロン性ｃＲＮＡは、５’から３’への順に、ａ）第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、ｂ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列、及びｃ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第３の抗原をコードする第３のヌクレオチド配列を含む。別の実施例において、マルチシストロン性ｃＲＮＡは、５’から３’への順に、ａ）第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、ｂ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列、及びｃ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第３の抗原をコードする第３のヌクレオチド配列を含む。

【0092】

一実施例において、マルチシストロン性自己複製ｍＲＮＡは、５’から３’への順に、ａ）第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、ｂ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列、及びｃ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第３の抗原をコードする第３のヌクレオチド配列を含む。別の実施例において、マルチシストロン性自己複製ｍＲＮＡは、５’から３’への順に、ａ）第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、ｂ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列、及びｃ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第３の抗原をコードする第３のヌクレオチド配列を含む。

【0093】

一実施例において、マルチシストロン性自己複製ＲＮＡは、５’から３’への順に、ａ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、ｂ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列、及びｃ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第３の抗原をコードする第３のヌクレオチド配列を含む。別の実施例において、マルチシストロン性自己複製ＲＮＡは、５’から３’への順に、ａ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、ｂ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列、及びｃ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第３の抗原をコードする第３のヌクレオチド配列を含む。

【0094】

別の実施例において、ポリヌクレオチドは、５’から３’への順に、ａ）第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、ｂ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列、及びｃ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第３の抗原をコードする第３のヌクレオチド配列を含む。別の実施例において、ポリヌクレオチドは、５’から３’への順に、ａ）第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、ｂ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列、及びｃ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第３の抗原をコードする第３のヌクレオチド配列を含む。

【0095】

別の実施例において、マルチシストロン性ＲＮＡは、５’から３’への順に、ａ）第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、ｂ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列、及びｃ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第３の抗原をコードする第３のヌクレオチド配列を含む。別の実施例において、マルチシストロン性ＲＮＡは、５’から３’への順に、ａ）第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、ｂ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列、及びｃ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第３の抗原をコードする第３のヌクレオチド配列を含む。

【0096】

別の実施例において、マルチシストロン性ｃＲＮＡは、５’から３’への順に、ａ）第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、ｂ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列、及びｃ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第３の抗原をコードする第３のヌクレオチド配列を含む。別の実施例において、マルチシストロン性ｃＲＮＡは、５’から３’への順に、ａ）第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、ｂ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列、及びｃ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第３の抗原をコードする第３のヌクレオチド配列を含む。

【0097】

別の実施例において、マルチシストロン性自己複製ｍＲＮＡは、５’から３’への順に、ａ）第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、ｂ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列、及びｃ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第３の抗原をコードする第３のヌクレオチド配列を含む。別の実施例において、マルチシストロン性自己複製ｍＲＮＡは、５’から３’への順に、ａ）第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、ｂ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列、及びｃ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第３の抗原をコードする第３のヌクレオチド配列を含む。

【0098】

別の実施例において、マルチシストロン性自己複製ＲＮＡは、５’から３’への順に、ａ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、ｂ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列、及びｃ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第３の抗原をコードする第３のヌクレオチド配列を含む。別の実施例において、マルチシストロン性自己複製ＲＮＡは、５’から３’への順に、ａ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、ｂ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列、及びｃ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第３の抗原をコードする第３のヌクレオチド配列を含む。

【0099】

一実施例において、ポリヌクレオチドは、少なくとも４つのヌクレオチド配列を含み、各ヌクレオチド配列は、抗原をコードする。

【0100】

一実施例において、マルチシストロン性ＲＮＡは、少なくとも４つのヌクレオチド配列を含み、各ヌクレオチド配列は、抗原をコードする。

【0101】

一実施例において、マルチシストロン性ｃＲＮＡは、少なくとも４つのヌクレオチド配列を含み、各ヌクレオチド配列は、抗原をコードする。

【0102】

一実施例において、マルチシストロン性自己複製ＲＮＡは、少なくとも４つのヌクレオチド配列を含み、各ヌクレオチド配列は、抗原をコードする。

【0103】

一実施例において、ポリヌクレオチドは、５’から３’への順に、ａ）第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、ｂ）ＩＲＥＳ又はＳＧプロモーターに作動可能に連結された第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列、ｃ）ＩＲＥＳ又はＳＧプロモーターに作動可能に連結された第３の抗原をコードする第３のヌクレオチド配列、及びｄ）ＩＲＥＳ又はＳＧプロモーターに作動可能に連結された第４の抗原をコードする第４のヌクレオチド配列を含む。

【0104】

一実施例において、マルチシストロン性ＲＮＡは、５’から３’への順に、ａ）第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、ｂ）ＩＲＥＳ又はＳＧプロモーターに作動可能に連結された第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列、ｃ）ＩＲＥＳ又はＳＧプロモーターに作動可能に連結された第３の抗原をコードする第３のヌクレオチド配列、及びｄ）ＩＲＥＳ又はＳＧプロモーターに作動可能に連結された第４の抗原をコードする第４のヌクレオチド配列を含む。

【0105】

一実施例において、マルチシストロン性ｃＲＮＡは、５’から３’への順に、ａ）第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、ｂ）ＩＲＥＳ又はＳＧプロモーターに作動可能に連結された第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列、ｃ）ＩＲＥＳ又はＳＧプロモーターに作動可能に連結された第３の抗原をコードする第３のヌクレオチド配列、及びｄ）ＩＲＥＳ又はＳＧプロモーターに作動可能に連結された第４の抗原をコードする第４のヌクレオチド配列を含む。

【0106】

一実施例において、マルチシストロン性自己複製ｍＲＮＡは、５’から３’への順に、ａ）第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、ｂ）ＩＲＥＳ又はＳＧプロモーターに作動可能に連結された第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列、ｃ）ＩＲＥＳ又はＳＧプロモーターに作動可能に連結された第３の抗原をコードする第３のヌクレオチド配列、及びｄ）ＩＲＥＳ又はＳＧプロモーターに作動可能に連結された第４の抗原をコードする第４のヌクレオチド配列を含む。

【0107】

一実施例において、マルチシストロン性自己複製ＲＮＡは、５’から３’への順に、ａ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、ｂ）ＩＲＥＳ又はＳＧプロモーターに作動可能に連結された第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列、ｃ）ＩＲＥＳ又はＳＧプロモーターに作動可能に連結された第３の抗原をコードする第３のヌクレオチド配列、及びｄ）ＩＲＥＳ又はＳＧプロモーターに作動可能に連結された第４の抗原をコードする第４のヌクレオチド配列を含む。

【0108】

一実施例において、ポリヌクレオチドは、５’から３’への順に、ａ）第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、ｂ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列、ｃ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第３の抗原をコードする第３のヌクレオチド配列、及びｄ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第４の抗原をコードする第４のヌクレオチド配列を含む。別の実施例において、ポリヌクレオチドは、５’から３’への順に、ａ）第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、ｂ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列、ｃ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第３の抗原をコードする第３のヌクレオチド配列、及びｄ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第４の抗原をコードする第４のヌクレオチド配列を含む。更なる実施例において、ポリヌクレオチドは、５’から３’への順に、ａ）第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、ｂ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列、ｃ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第３の抗原をコードする第３のヌクレオチド配列、及びｄ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第４の抗原をコードする第４のヌクレオチド配列を含む。別の実施例において、ポリヌクレオチドは、５’から３’への順に、ａ）第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、ｂ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列、ｃ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第３の抗原をコードする第３のヌクレオチド配列、及びｄ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第４の抗原をコードする第４のヌクレオチド配列を含む。

【0109】

一実施例において、マルチシストロン性ＲＮＡは、５’から３’への順に、ａ）第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、ｂ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列、ｃ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第３の抗原をコードする第３のヌクレオチド配列、及びｄ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第４の抗原をコードする第４のヌクレオチド配列を含む。別の実施例において、マルチシストロン性ＲＮＡは、５’から３’への順に、ａ）第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、ｂ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列、ｃ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第３の抗原をコードする第３のヌクレオチド配列、及びｄ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第４の抗原をコードする第４のヌクレオチド配列を含む。更なる実施例において、マルチシストロン性ＲＮＡは、５’から３’への順に、ａ）第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、ｂ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列、ｃ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第３の抗原をコードする第３のヌクレオチド配列、及びｄ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第４の抗原をコードする第４のヌクレオチド配列を含む。別の実施例において、マルチシストロン性ＲＮＡは、５’から３’への順に、ａ）第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、ｂ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列、ｃ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第３の抗原をコードする第３のヌクレオチド配列、及びｄ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第４の抗原をコードする第４のヌクレオチド配列を含む。

【0110】

一実施例において、マルチシストロン性ｃＲＮＡは、５’から３’への順に、ａ）第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、ｂ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列、ｃ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第３の抗原をコードする第３のヌクレオチド配列、及びｄ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第４の抗原をコードする第４のヌクレオチド配列を含む。別の実施例において、マルチシストロン性ｃＲＮＡは、５’から３’への順に、ａ）第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、ｂ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列、ｃ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第３の抗原をコードする第３のヌクレオチド配列、及びｄ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第４の抗原をコードする第４のヌクレオチド配列を含む。更なる実施例において、マルチシストロン性ｃＲＮＡは、５’から３’への順に、ａ）第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、ｂ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列、ｃ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第３の抗原をコードする第３のヌクレオチド配列、及びｄ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第４の抗原をコードする第４のヌクレオチド配列を含む。別の実施例において、マルチシストロン性ｃＲＮＡは、５’から３’への順に、ａ）第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、ｂ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列、ｃ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第３の抗原をコードする第３のヌクレオチド配列、及びｄ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第４の抗原をコードする第４のヌクレオチド配列を含む。

【0111】

一実施例において、マルチシストロン性自己複製ｍＲＮＡは、５’から３’への順に、ａ）第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、ｂ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列、ｃ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第３の抗原をコードする第３のヌクレオチド配列、及びｄ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第４の抗原をコードする第４のヌクレオチド配列を含む。別の実施例において、マルチシストロン性自己複製ｍＲＮＡは、５’から３’への順に、ａ）第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、ｂ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列、ｃ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第３の抗原をコードする第３のヌクレオチド配列、及びｄ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第４の抗原をコードする第４のヌクレオチド配列を含む。更なる実施例において、マルチシストロン性自己複製ｍＲＮＡは、５’から３’への順に、ａ）第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、ｂ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列、ｃ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第３の抗原をコードする第３のヌクレオチド配列、及びｄ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第４の抗原をコードする第４のヌクレオチド配列を含む。別の実施例において、マルチシストロン性自己複製ｍＲＮＡは、５’から３’への順に、ａ）第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、ｂ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列、ｃ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第３の抗原をコードする第３のヌクレオチド配列、及びｄ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第４の抗原をコードする第４のヌクレオチド配列を含む。

【0112】

一実施例において、マルチシストロン性自己複製ＲＮＡは、５’から３’への順に、ａ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、ｂ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列、ｃ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第３の抗原をコードする第３のヌクレオチド配列、及びｄ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第４の抗原をコードする第４のヌクレオチド配列を含む。別の実施例において、マルチシストロン性自己複製ＲＮＡは、５’から３’への順に、ａ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、ｂ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列、ｃ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第３の抗原をコードする第３のヌクレオチド配列、及びｄ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第４の抗原をコードする第４のヌクレオチド配列を含む。更なる実施例において、マルチシストロン性自己複製ＲＮＡは、５’から３’への順に、ａ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、ｂ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列、ｃ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第３の抗原をコードする第３のヌクレオチド配列、及びｄ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第４の抗原をコードする第４のヌクレオチド配列を含む。別の実施例において、マルチシストロン性自己複製ＲＮＡは、５’から３’への順に、ａ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、ｂ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列、ｃ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第３の抗原をコードする第３のヌクレオチド配列、及びｄ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第４の抗原をコードする第４のヌクレオチド配列を含む。

【0113】

一実施例において、ポリヌクレオチドは、５’から３’への順に、ａ）第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、ｂ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列、ｃ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第３の抗原をコードする第３のヌクレオチド配列、及びｄ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第４の抗原をコードする第４のヌクレオチド配列を含む。別の実施例において、ポリヌクレオチドは、５’から３’への順に、ａ）第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、ｂ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列、ｃ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第３の抗原をコードする第３のヌクレオチド配列、及びｄ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第４の抗原をコードする第４のヌクレオチド配列を含む。

【0114】

一実施例において、マルチシストロン性ＲＮＡは、５’から３’への順に、ａ）第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、ｂ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列、ｃ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第３の抗原をコードする第３のヌクレオチド配列、及びｄ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第４の抗原をコードする第４のヌクレオチド配列を含む。別の実施例において、マルチシストロン性ＲＮＡは、５’から３’への順に、ａ）第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、ｂ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列、ｃ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第３の抗原をコードする第３のヌクレオチド配列、及びｄ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第４の抗原をコードする第４のヌクレオチド配列を含む。

【0115】

一実施例において、マルチシストロン性ｃＲＮＡは、５’から３’への順に、ａ）第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、ｂ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列、ｃ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第３の抗原をコードする第３のヌクレオチド配列、及びｄ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第４の抗原をコードする第４のヌクレオチド配列を含む。別の実施例において、マルチシストロン性ｃＲＮＡは、５’から３’への順に、ａ）第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、ｂ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列、ｃ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第３の抗原をコードする第３のヌクレオチド配列、及びｄ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第４の抗原をコードする第４のヌクレオチド配列を含む。

【0116】

一実施例において、マルチシストロン性自己複製ｍＲＮＡは、５’から３’への順に、ａ）第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、ｂ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列、ｃ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第３の抗原をコードする第３のヌクレオチド配列、及びｄ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第４の抗原をコードする第４のヌクレオチド配列を含む。別の実施例において、マルチシストロン性自己複製ｍＲＮＡは、５’から３’への順に、ａ）第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、ｂ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列、ｃ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第３の抗原をコードする第３のヌクレオチド配列、及びｄ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第４の抗原をコードする第４のヌクレオチド配列を含む。

【0117】

一実施例において、マルチシストロン性自己複製ＲＮＡは、５’から３’への順に、ａ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、ｂ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列、ｃ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第３の抗原をコードする第３のヌクレオチド配列、及びｄ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第４の抗原をコードする第４のヌクレオチド配列を含む。別の実施例において、マルチシストロン性自己複製ＲＮＡは、５’から３’への順に、ａ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、ｂ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列、ｃ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第３の抗原をコードする第３のヌクレオチド配列、及びｄ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第４の抗原をコードする第４のヌクレオチド配列を含む。

【0118】

一実施例において、ポリヌクレオチドは、５’から３’への順に、ａ）第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、ｂ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列、ｃ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第３の抗原をコードする第３のヌクレオチド配列、及びｄ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第４の抗原をコードする第４のヌクレオチド配列を含む。更なる実施例において、ポリヌクレオチドは、５’から３’への順に、ａ）第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、ｂ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列、ｃ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第３の抗原をコードする第３のヌクレオチド配列、及びｄ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第４の抗原をコードする第４のヌクレオチド配列を含む。

【0119】

一実施例において、マルチシストロン性ＲＮＡは、５’から３’への順に、ａ）第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、ｂ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列、ｃ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第３の抗原をコードする第３のヌクレオチド配列、及びｄ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第４の抗原をコードする第４のヌクレオチド配列を含む。更なる実施例において、マルチシストロン性ＲＮＡは、５’から３’への順に、ａ）第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、ｂ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列、ｃ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第３の抗原をコードする第３のヌクレオチド配列、及びｄ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第４の抗原をコードする第４のヌクレオチド配列を含む。

【0120】

一実施例において、マルチシストロン性ｃＲＮＡは、５’から３’への順に、ａ）第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、ｂ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列、ｃ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第３の抗原をコードする第３のヌクレオチド配列、及びｄ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第４の抗原をコードする第４のヌクレオチド配列を含む。更なる実施例において、マルチシストロン性ｃＲＮＡは、５’から３’への順に、ａ）第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、ｂ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列、ｃ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第３の抗原をコードする第３のヌクレオチド配列、及びｄ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第４の抗原をコードする第４のヌクレオチド配列を含む。

【0121】

一実施例において、マルチシストロン性自己複製ｍＲＮＡは、５’から３’への順に、ａ）第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、ｂ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列、ｃ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第３の抗原をコードする第３のヌクレオチド配列、及びｄ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第４の抗原をコードする第４のヌクレオチド配列を含む。更なる実施例において、マルチシストロン性自己複製ｍＲＮＡは、５’から３’への順に、ａ）第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、ｂ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列、ｃ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第３の抗原をコードする第３のヌクレオチド配列、及びｄ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第４の抗原をコードする第４のヌクレオチド配列を含む。

【0122】

一実施例において、マルチシストロン性自己複製ＲＮＡは、５’から３’への順に、ａ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、ｂ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列、ｃ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第３の抗原をコードする第３のヌクレオチド配列、及びｄ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第４の抗原をコードする第４のヌクレオチド配列を含む。更なる実施例において、マルチシストロン性自己複製ＲＮＡは、５’から３’への順に、ａ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、ｂ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列、ｃ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第３の抗原をコードする第３のヌクレオチド配列、及びｄ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第４の抗原をコードする第４のヌクレオチド配列を含む。

【0123】

一実施例において、ポリヌクレオチドは、少なくとも５つのヌクレオチド配列を含み、各ヌクレオチド配列は、抗原をコードする。

【0124】

一実施例において、マルチシストロン性ＲＮＡは、少なくとも５つのヌクレオチド配列を含み、各ヌクレオチド配列は、抗原をコードする。

【0125】

一実施例において、マルチシストロン性ｃＲＮＡは、少なくとも５つのヌクレオチド配列を含み、各ヌクレオチド配列は、抗原をコードする。

【0126】

一実施例において、マルチシストロン性自己複製ＲＮＡは、少なくとも５つのヌクレオチド配列を含み、各ヌクレオチド配列は、抗原をコードする。

【0127】

一実施例において、ポリヌクレオチドは、５’から３’への順に、ａ）第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、ｂ）ＩＲＥＳ又はＳＧプロモーターに作動可能に連結された第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列、ｃ）ＩＲＥＳ又はＳＧプロモーターに作動可能に連結された第３の抗原をコードする第３のヌクレオチド配列、ｄ）ＩＲＥＳ又はＳＧプロモーターに作動可能に連結された第４の抗原をコードする第４のヌクレオチド配列、及びｅ）ＩＲＥＳ又はＳＧプロモーターに作動可能に連結された第５の抗原をコードする第５のヌクレオチド配列を含む。

【0128】

一実施例において、マルチシストロン性ＲＮＡは、５’から３’への順に、ａ）第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、ｂ）ＩＲＥＳ又はＳＧプロモーターに作動可能に連結された第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列、ｃ）ＩＲＥＳ又はＳＧプロモーターに作動可能に連結された第３の抗原をコードする第３のヌクレオチド配列、ｄ）ＩＲＥＳ又はＳＧプロモーターに作動可能に連結された第４の抗原をコードする第４のヌクレオチド配列、及びｅ）ＩＲＥＳ又はＳＧプロモーターに作動可能に連結された第５の抗原をコードする第５のヌクレオチド配列を含む。

【0129】

一実施例において、マルチシストロン性ｃＲＮＡは、５’から３’への順に、ａ）第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、ｂ）ＩＲＥＳ又はＳＧプロモーターに作動可能に連結された第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列、ｃ）ＩＲＥＳ又はＳＧプロモーターに作動可能に連結された第３の抗原をコードする第３のヌクレオチド配列、ｄ）ＩＲＥＳ又はＳＧプロモーターに作動可能に連結された第４の抗原をコードする第４のヌクレオチド配列、及びｅ）ＩＲＥＳ又はＳＧプロモーターに作動可能に連結された第５の抗原をコードする第５のヌクレオチド配列を含む。

【0130】

一実施例において、マルチシストロン性自己複製ｍＲＮＡは、５’から３’への順に、ａ）第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、ｂ）ＩＲＥＳ又はＳＧプロモーターに作動可能に連結された第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列、ｃ）ＩＲＥＳ又はＳＧプロモーターに作動可能に連結された第３の抗原をコードする第３のヌクレオチド配列、ｄ）ＩＲＥＳ又はＳＧプロモーターに作動可能に連結された第４の抗原をコードする第４のヌクレオチド配列、及びｅ）ＩＲＥＳ又はＳＧプロモーターに作動可能に連結された第５の抗原をコードする第５のヌクレオチド配列を含む。

【0131】

一実施例において、マルチシストロン性自己複製ＲＮＡは、５’から３’への順に、ａ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、ｂ）ＩＲＥＳ又はＳＧプロモーターに作動可能に連結された第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列、ｃ）ＩＲＥＳ又はＳＧプロモーターに作動可能に連結された第３の抗原をコードする第３のヌクレオチド配列、ｄ）ＩＲＥＳ又はＳＧプロモーターに作動可能に連結された第４の抗原をコードする第４のヌクレオチド配列、及びｅ）ＩＲＥＳ又はＳＧプロモーターに作動可能に連結された第５の抗原をコードする第５のヌクレオチド配列を含む。

【0132】

一実施例において、ポリヌクレオチドは、５’から３’への順に、ａ）第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、ｂ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列、ｃ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第３の抗原をコードする第３のヌクレオチド配列、ｄ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第４の抗原をコードする第４のヌクレオチド配列、及びｅ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第５の抗原をコードする第５のヌクレオチド配列を含む。別の実施例において、ポリヌクレオチドは、５’から３’への順に、ａ）第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、ｂ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列、ｃ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第３の抗原をコードする第３のヌクレオチド配列、ｄ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第４の抗原をコードする第４のヌクレオチド配列、及びｅ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第５の抗原をコードする第５のヌクレオチド配列を含む。更なる実施例において、ポリヌクレオチドは、５’から３’への順に、ａ）第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、ｂ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列、ｃ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第３の抗原をコードする第３のヌクレオチド配列、ｄ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第４の抗原をコードする第４のヌクレオチド配列、及びｅ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第５の抗原をコードする第５のヌクレオチド配列を含む。別の実施例において、ポリヌクレオチドは、５’から３’への順に、ａ）第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、ｂ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列、ｃ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第３の抗原をコードする第３のヌクレオチド配列、ｄ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第４の抗原をコードする第４のヌクレオチド配列、及びｅ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第５の抗原をコードする第５のヌクレオチド配列を含む。更なる実施例において、ポリヌクレオチドは、５’から３’への順に、ａ）第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、ｂ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列、ｃ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第３の抗原をコードする第３のヌクレオチド配列、ｄ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第４の抗原をコードする第４のヌクレオチド配列、及びｅ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第５の抗原をコードする第５のヌクレオチド配列を含む。

【0133】

一実施例において、マルチシストロン性ＲＮＡは、５’から３’への順に、ａ）第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、ｂ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列、ｃ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第３の抗原をコードする第３のヌクレオチド配列、ｄ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第４の抗原をコードする第４のヌクレオチド配列、及びｅ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第５の抗原をコードする第５のヌクレオチド配列を含む。別の実施例において、マルチシストロン性ＲＮＡは、５’から３’への順に、ａ）第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、ｂ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列、ｃ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第３の抗原をコードする第３のヌクレオチド配列、ｄ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第４の抗原をコードする第４のヌクレオチド配列、及びｅ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第５の抗原をコードする第５のヌクレオチド配列を含む。更なる実施例において、マルチシストロン性ＲＮＡは、５’から３’への順に、ａ）第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、ｂ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列、ｃ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第３の抗原をコードする第３のヌクレオチド配列、ｄ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第４の抗原をコードする第４のヌクレオチド配列、及びｅ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第５の抗原をコードする第５のヌクレオチド配列を含む。別の実施例において、マルチシストロン性ＲＮＡは、５’から３’への順に、ａ）第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、ｂ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列、ｃ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第３の抗原をコードする第３のヌクレオチド配列、ｄ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第４の抗原をコードする第４のヌクレオチド配列、及びｅ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第５の抗原をコードする第５のヌクレオチド配列を含む。更なる実施例において、マルチシストロン性ＲＮＡは、５’から３’への順に、ａ）第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、ｂ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列、ｃ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第３の抗原をコードする第３のヌクレオチド配列、ｄ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第４の抗原をコードする第４のヌクレオチド配列、及びｅ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第５の抗原をコードする第５のヌクレオチド配列を含む。

【0134】

一実施例において、マルチシストロン性ｃＲＮＡは、５’から３’への順に、ａ）第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、ｂ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列、ｃ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第３の抗原をコードする第３のヌクレオチド配列、ｄ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第４の抗原をコードする第４のヌクレオチド配列、及びｅ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第５の抗原をコードする第５のヌクレオチド配列を含む。別の実施例において、マルチシストロン性ｃＲＮＡは、５’から３’への順に、ａ）第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、ｂ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列、ｃ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第３の抗原をコードする第３のヌクレオチド配列、ｄ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第４の抗原をコードする第４のヌクレオチド配列、及びｅ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第５の抗原をコードする第５のヌクレオチド配列を含む。更なる実施例において、マルチシストロン性ｃＲＮＡは、５’から３’への順に、ａ）第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、ｂ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列、ｃ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第３の抗原をコードする第３のヌクレオチド配列、ｄ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第４の抗原をコードする第４のヌクレオチド配列、及びｅ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第５の抗原をコードする第５のヌクレオチド配列を含む。別の実施例において、マルチシストロン性ｃＲＮＡは、５’から３’への順に、ａ）第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、ｂ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列、ｃ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第３の抗原をコードする第３のヌクレオチド配列、ｄ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第４の抗原をコードする第４のヌクレオチド配列、及びｅ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第５の抗原をコードする第５のヌクレオチド配列を含む。更なる実施例において、マルチシストロン性ｃＲＮＡは、５’から３’への順に、ａ）第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、ｂ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列、ｃ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第３の抗原をコードする第３のヌクレオチド配列、ｄ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第４の抗原をコードする第４のヌクレオチド配列、及びｅ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第５の抗原をコードする第５のヌクレオチド配列を含む。

【0135】

一実施例において、マルチシストロン性自己複製ｍＲＮＡは、５’から３’への順に、ａ）第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、ｂ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列、ｃ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第３の抗原をコードする第３のヌクレオチド配列、ｄ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第４の抗原をコードする第４のヌクレオチド配列、及びｅ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第５の抗原をコードする第５のヌクレオチド配列を含む。別の実施例において、マルチシストロン性自己複製ｍＲＮＡは、５’から３’への順に、ａ）第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、ｂ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列、ｃ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第３の抗原をコードする第３のヌクレオチド配列、ｄ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第４の抗原をコードする第４のヌクレオチド配列、及びｅ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第５の抗原をコードする第５のヌクレオチド配列を含む。更なる実施例において、マルチシストロン性自己複製ｍＲＮＡは、５’から３’への順に、ａ）第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、ｂ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列、ｃ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第３の抗原をコードする第３のヌクレオチド配列、ｄ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第４の抗原をコードする第４のヌクレオチド配列、及びｅ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第５の抗原をコードする第５のヌクレオチド配列を含む。別の実施例において、マルチシストロン性自己複製ｍＲＮＡは、５’から３’への順に、ａ）第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、ｂ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列、ｃ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第３の抗原をコードする第３のヌクレオチド配列、ｄ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第４の抗原をコードする第４のヌクレオチド配列、及びｅ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第５の抗原をコードする第５のヌクレオチド配列を含む。更なる実施例において、マルチシストロン性自己複製ｍＲＮＡは、５’から３’への順に、ａ）第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、ｂ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列、ｃ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第３の抗原をコードする第３のヌクレオチド配列、ｄ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第４の抗原をコードする第４のヌクレオチド配列、及びｅ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第５の抗原をコードする第５のヌクレオチド配列を含む。

【0136】

一実施例において、マルチシストロン性自己複製ＲＮＡは、５’から３’への順に、ａ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、ｂ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列、ｃ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第３の抗原をコードする第３のヌクレオチド配列、ｄ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第４の抗原をコードする第４のヌクレオチド配列、及びｅ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第５の抗原をコードする第５のヌクレオチド配列を含む。別の実施例において、マルチシストロン性自己複製ＲＮＡは、５’から３’への順に、ａ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、ｂ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列、ｃ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第３の抗原をコードする第３のヌクレオチド配列、ｄ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第４の抗原をコードする第４のヌクレオチド配列、及びｅ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第５の抗原をコードする第５のヌクレオチド配列を含む。更なる実施例において、マルチシストロン性自己複製ＲＮＡは、５’から３’への順に、ａ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、ｂ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列、ｃ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第３の抗原をコードする第３のヌクレオチド配列、ｄ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第４の抗原をコードする第４のヌクレオチド配列、及びｅ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第５の抗原をコードする第５のヌクレオチド配列を含む。別の実施例において、マルチシストロン性自己複製ＲＮＡは、５’から３’への順に、ａ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、ｂ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列、ｃ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第３の抗原をコードする第３のヌクレオチド配列、ｄ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第４の抗原をコードする第４のヌクレオチド配列、及びｅ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第５の抗原をコードする第５のヌクレオチド配列を含む。更なる実施例において、マルチシストロン性自己複製ＲＮＡは、５’から３’への順に、ａ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、ｂ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列、ｃ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第３の抗原をコードする第３のヌクレオチド配列、ｄ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第４の抗原をコードする第４のヌクレオチド配列、及びｅ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第５の抗原をコードする第５のヌクレオチド配列を含む。

【0137】

一実施例において、ポリヌクレオチドは、５’から３’への順に、ａ）第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、ｂ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列、ｃ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第３の抗原をコードする第３のヌクレオチド配列、ｄ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第４の抗原をコードする第４のヌクレオチド配列、及びｅ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第５の抗原をコードする第５のヌクレオチド配列を含む。別の実施例において、ポリヌクレオチドは、５’から３’への順に、ａ）第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、ｂ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列、ｃ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第３の抗原をコードする第３のヌクレオチド配列、ｄ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第４の抗原をコードする第４のヌクレオチド配列、及びｅ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第５の抗原をコードする第５のヌクレオチド配列を含む。更なる実施例において、ポリヌクレオチドは、５’から３’への順に、ａ）第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、ｂ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列、ｃ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第３の抗原をコードする第３のヌクレオチド配列、ｄ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第４の抗原をコードする第４のヌクレオチド配列、及びｅ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第５の抗原をコードする第５のヌクレオチド配列を含む。

【0138】

一実施例において、マルチシストロン性ＲＮＡは、５’から３’への順に、ａ）第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、ｂ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列、ｃ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第３の抗原をコードする第３のヌクレオチド配列、ｄ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第４の抗原をコードする第４のヌクレオチド配列、及びｅ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第５の抗原をコードする第５のヌクレオチド配列を含む。別の実施例において、マルチシストロン性ＲＮＡは、５’から３’への順に、ａ）第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、ｂ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列、ｃ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第３の抗原をコードする第３のヌクレオチド配列、ｄ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第４の抗原をコードする第４のヌクレオチド配列、及びｅ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第５の抗原をコードする第５のヌクレオチド配列を含む。更なる実施例において、マルチシストロン性ＲＮＡは、５’から３’への順に、ａ）第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、ｂ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列、ｃ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第３の抗原をコードする第３のヌクレオチド配列、ｄ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第４の抗原をコードする第４のヌクレオチド配列、及びｅ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第５の抗原をコードする第５のヌクレオチド配列を含む。

【0139】

一実施例において、マルチシストロン性ｃＲＮＡは、５’から３’への順に、ａ）第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、ｂ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列、ｃ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第３の抗原をコードする第３のヌクレオチド配列、ｄ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第４の抗原をコードする第４のヌクレオチド配列、及びｅ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第５の抗原をコードする第５のヌクレオチド配列を含む。別の実施例において、マルチシストロン性ｃＲＮＡは、５’から３’への順に、ａ）第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、ｂ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列、ｃ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第３の抗原をコードする第３のヌクレオチド配列、ｄ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第４の抗原をコードする第４のヌクレオチド配列、及びｅ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第５の抗原をコードする第５のヌクレオチド配列を含む。更なる実施例において、マルチシストロン性ｃＲＮＡは、５’から３’への順に、ａ）第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、ｂ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列、ｃ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第３の抗原をコードする第３のヌクレオチド配列、ｄ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第４の抗原をコードする第４のヌクレオチド配列、及びｅ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第５の抗原をコードする第５のヌクレオチド配列を含む。

【0140】

一実施例において、マルチシストロン性自己複製ｍＲＮＡは、５’から３’への順に、ａ）第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、ｂ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列、ｃ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第３の抗原をコードする第３のヌクレオチド配列、ｄ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第４の抗原をコードする第４のヌクレオチド配列、及びｅ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第５の抗原をコードする第５のヌクレオチド配列を含む。別の実施例において、マルチシストロン性自己複製ｍＲＮＡは、５’から３’への順に、ａ）第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、ｂ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列、ｃ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第３の抗原をコードする第３のヌクレオチド配列、ｄ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第４の抗原をコードする第４のヌクレオチド配列、及びｅ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第５の抗原をコードする第５のヌクレオチド配列を含む。更なる実施例において、マルチシストロン性自己複製ｍＲＮＡは、５’から３’への順に、ａ）第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、ｂ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列、ｃ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第３の抗原をコードする第３のヌクレオチド配列、ｄ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第４の抗原をコードする第４のヌクレオチド配列、及びｅ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第５の抗原をコードする第５のヌクレオチド配列を含む。

【0141】

一実施例において、マルチシストロン性自己複製ＲＮＡは、５’から３’への順に、ａ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、ｂ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列、ｃ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第３の抗原をコードする第３のヌクレオチド配列、ｄ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第４の抗原をコードする第４のヌクレオチド配列、及びｅ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第５の抗原をコードする第５のヌクレオチド配列を含む。別の実施例において、マルチシストロン性自己複製ＲＮＡは、５’から３’への順に、ａ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、ｂ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列、ｃ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第３の抗原をコードする第３のヌクレオチド配列、ｄ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第４の抗原をコードする第４のヌクレオチド配列、及びｅ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第５の抗原をコードする第５のヌクレオチド配列を含む。更なる実施例において、マルチシストロン性自己複製ＲＮＡは、５’から３’への順に、ａ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、ｂ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列、ｃ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第３の抗原をコードする第３のヌクレオチド配列、ｄ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第４の抗原をコードする第４のヌクレオチド配列、及びｅ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第５の抗原をコードする第５のヌクレオチド配列を含む。

【0142】

一実施例において、ポリヌクレオチドは、５’から３’への順に、ａ）第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、ｂ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列、ｃ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第３の抗原をコードする第３のヌクレオチド配列、ｄ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第４の抗原をコードする第４のヌクレオチド配列、及びｅ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第５の抗原をコードする第５のヌクレオチド配列を含む。別の実施例において、ポリヌクレオチドは、５’から３’への順に、ａ）第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、ｂ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列、ｃ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第３の抗原をコードする第３のヌクレオチド配列、ｄ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第４の抗原をコードする第４のヌクレオチド配列、及びｅ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第５の抗原をコードする第５のヌクレオチド配列を含む。更なる実施例において、ポリヌクレオチドは、５’から３’への順に、ａ）第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、ｂ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列、ｃ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第３の抗原をコードする第３のヌクレオチド配列、ｄ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第４の抗原をコードする第４のヌクレオチド配列、及びｅ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第５の抗原をコードする第５のヌクレオチド配列を含む。

【0143】

一実施例において、マルチシストロン性ＲＮＡは、５’から３’への順に、ａ）第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、ｂ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列、ｃ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第３の抗原をコードする第３のヌクレオチド配列、ｄ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第４の抗原をコードする第４のヌクレオチド配列、及びｅ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第５の抗原をコードする第５のヌクレオチド配列を含む。別の実施例において、マルチシストロン性ＲＮＡは、５’から３’への順に、ａ）第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、ｂ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列、ｃ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第３の抗原をコードする第３のヌクレオチド配列、ｄ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第４の抗原をコードする第４のヌクレオチド配列、及びｅ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第５の抗原をコードする第５のヌクレオチド配列を含む。更なる実施例において、マルチシストロン性ＲＮＡは、５’から３’への順に、ａ）第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、ｂ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列、ｃ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第３の抗原をコードする第３のヌクレオチド配列、ｄ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第４の抗原をコードする第４のヌクレオチド配列、及びｅ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第５の抗原をコードする第５のヌクレオチド配列を含む。

【0144】

一実施例において、マルチシストロン性ｃＲＮＡは、５’から３’への順に、ａ）第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、ｂ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列、ｃ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第３の抗原をコードする第３のヌクレオチド配列、ｄ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第４の抗原をコードする第４のヌクレオチド配列、及びｅ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第５の抗原をコードする第５のヌクレオチド配列を含む。別の実施例において、マルチシストロン性ｃＲＮＡは、５’から３’への順に、ａ）第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、ｂ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列、ｃ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第３の抗原をコードする第３のヌクレオチド配列、ｄ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第４の抗原をコードする第４のヌクレオチド配列、及びｅ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第５の抗原をコードする第５のヌクレオチド配列を含む。更なる実施例において、マルチシストロン性ｃＲＮＡは、５’から３’への順に、ａ）第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、ｂ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列、ｃ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第３の抗原をコードする第３のヌクレオチド配列、ｄ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第４の抗原をコードする第４のヌクレオチド配列、及びｅ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第５の抗原をコードする第５のヌクレオチド配列を含む。

【0145】

一実施例において、マルチシストロン性自己複製ｍＲＮＡは、５’から３’への順に、ａ）第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、ｂ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列、ｃ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第３の抗原をコードする第３のヌクレオチド配列、ｄ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第４の抗原をコードする第４のヌクレオチド配列、及びｅ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第５の抗原をコードする第５のヌクレオチド配列を含む。別の実施例において、マルチシストロン性自己複製ｍＲＮＡは、５’から３’への順に、ａ）第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、ｂ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列、ｃ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第３の抗原をコードする第３のヌクレオチド配列、ｄ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第４の抗原をコードする第４のヌクレオチド配列、及びｅ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第５の抗原をコードする第５のヌクレオチド配列を含む。更なる実施例において、マルチシストロン性自己複製ｍＲＮＡは、５’から３’への順に、ａ）第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、ｂ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列、ｃ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第３の抗原をコードする第３のヌクレオチド配列、ｄ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第４の抗原をコードする第４のヌクレオチド配列、及びｅ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第５の抗原をコードする第５のヌクレオチド配列を含む。

【0146】

一実施例において、マルチシストロン性自己複製ＲＮＡは、５’から３’への順に、ａ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、ｂ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列、ｃ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第３の抗原をコードする第３のヌクレオチド配列、ｄ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第４の抗原をコードする第４のヌクレオチド配列、及びｅ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第５の抗原をコードする第５のヌクレオチド配列を含む。別の実施例において、マルチシストロン性自己複製ＲＮＡは、５’から３’への順に、ａ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、ｂ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列、ｃ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第３の抗原をコードする第３のヌクレオチド配列、ｄ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第４の抗原をコードする第４のヌクレオチド配列、及びｅ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第５の抗原をコードする第５のヌクレオチド配列を含む。更なる実施例において、マルチシストロン性自己複製ＲＮＡは、５’から３’への順に、ａ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、ｂ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列、ｃ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第３の抗原をコードする第３のヌクレオチド配列、ｄ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第４の抗原をコードする第４のヌクレオチド配列、及びｅ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第５の抗原をコードする第５のヌクレオチド配列を含む。

【0147】

一実施例において、ポリヌクレオチドは、５’から３’への順に、ａ）第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、ｂ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列、ｃ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第３の抗原をコードする第３のヌクレオチド配列、ｄ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第４の抗原をコードする第４のヌクレオチド配列、及びｅ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第５の抗原をコードする第５のヌクレオチド配列を含む。別の実施例において、ポリヌクレオチドは、５’から３’への順に、ａ）第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、ｂ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列、ｃ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第３の抗原をコードする第３のヌクレオチド配列、ｄ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第４の抗原をコードする第４のヌクレオチド配列、及びｅ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第５の抗原をコードする第５のヌクレオチド配列を含む。

【0148】

一実施例において、マルチシストロン性ＲＮＡは、５’から３’への順に、ａ）第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、ｂ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列、ｃ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第３の抗原をコードする第３のヌクレオチド配列、ｄ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第４の抗原をコードする第４のヌクレオチド配列、及びｅ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第５の抗原をコードする第５のヌクレオチド配列を含む。別の実施例において、マルチシストロン性ＲＮＡは、５’から３’への順に、ａ）第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、ｂ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列、ｃ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第３の抗原をコードする第３のヌクレオチド配列、ｄ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第４の抗原をコードする第４のヌクレオチド配列、及びｅ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第５の抗原をコードする第５のヌクレオチド配列を含む。

【0149】

一実施例において、マルチシストロン性ｃＲＮＡは、５’から３’への順に、ａ）第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、ｂ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列、ｃ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第３の抗原をコードする第３のヌクレオチド配列、ｄ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第４の抗原をコードする第４のヌクレオチド配列、及びｅ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第５の抗原をコードする第５のヌクレオチド配列を含む。別の実施例において、マルチシストロン性ｃＲＮＡは、５’から３’への順に、ａ）第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、ｂ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列、ｃ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第３の抗原をコードする第３のヌクレオチド配列、ｄ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第４の抗原をコードする第４のヌクレオチド配列、及びｅ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第５の抗原をコードする第５のヌクレオチド配列を含む。

【0150】

一実施例において、マルチシストロン性自己複製ｍＲＮＡは、５’から３’への順に、ａ）第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、ｂ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列、ｃ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第３の抗原をコードする第３のヌクレオチド配列、ｄ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第４の抗原をコードする第４のヌクレオチド配列、及びｅ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第５の抗原をコードする第５のヌクレオチド配列を含む。別の実施例において、マルチシストロン性自己複製ｍＲＮＡは、５’から３’への順に、ａ）第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、ｂ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列、ｃ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第３の抗原をコードする第３のヌクレオチド配列、ｄ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第４の抗原をコードする第４のヌクレオチド配列、及びｅ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第５の抗原をコードする第５のヌクレオチド配列を含む。

【0151】

一実施例において、マルチシストロン性自己複製ＲＮＡは、５’から３’への順に、ａ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、ｂ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列、ｃ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第３の抗原をコードする第３のヌクレオチド配列、ｄ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第４の抗原をコードする第４のヌクレオチド配列、及びｅ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第５の抗原をコードする第５のヌクレオチド配列を含む。別の実施例において、マルチシストロン性自己複製ＲＮＡは、５’から３’への順に、ａ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、ｂ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列、ｃ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第３の抗原をコードする第３のヌクレオチド配列、ｄ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第４の抗原をコードする第４のヌクレオチド配列、及びｅ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第５の抗原をコードする第５のヌクレオチド配列を含む。

【0152】

一実施例において、ポリヌクレオチドは、５’から３’への順に、ａ）第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、ｂ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列、ｃ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第３の抗原をコードする第３のヌクレオチド配列、ｄ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第４の抗原をコードする第４のヌクレオチド配列、及びｅ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第５の抗原をコードする第５のヌクレオチド配列を含む。

【0153】

一実施例において、マルチシストロン性ＲＮＡは、５’から３’への順に、ａ）第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、ｂ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列、ｃ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第３の抗原をコードする第３のヌクレオチド配列、ｄ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第４の抗原をコードする第４のヌクレオチド配列、及びｅ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第５の抗原をコードする第５のヌクレオチド配列を含む。

【0154】

一実施例において、マルチシストロン性ｃＲＮＡは、５’から３’への順に、ａ）第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、ｂ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列、ｃ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第３の抗原をコードする第３のヌクレオチド配列、ｄ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第４の抗原をコードする第４のヌクレオチド配列、及びｅ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第５の抗原をコードする第５のヌクレオチド配列を含む。

【0155】

一実施例において、マルチシストロン性自己複製ｍＲＮＡは、５’から３’への順に、ａ）第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、ｂ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列、ｃ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第３の抗原をコードする第３のヌクレオチド配列、ｄ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第４の抗原をコードする第４のヌクレオチド配列、及びｅ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第５の抗原をコードする第５のヌクレオチド配列を含む。

【0156】

一実施例において、マルチシストロン性自己複製ＲＮＡは、５’から３’への順に、ａ）ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、ｂ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列、ｃ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第３の抗原をコードする第３のヌクレオチド配列、ｄ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第４の抗原をコードする第４のヌクレオチド配列、及びｅ）ＩＲＥＳに作動可能に連結された第５の抗原をコードする第５のヌクレオチド配列を含む。

【0157】

一実施例において、ＳＧプロモーターは、天然ＳＧプロモーターである。例えば、天然ＳＧプロモーターは、ＲＮＡウイルスに由来し、かつ／又はそれに基づく（例えば、アルファウイルス）ＲＮＡウイルスに天然であるプロモーターである。一実施例において、天然ＳＧプロモーターは、天然アルファウイルスＳＧプロモーターである。

【0158】

一実施例において、ＳＧプロモーターは、最小ＳＧプロモーター又は延長ＳＧプロモーターである。

【0159】

一実施例において、ＳＧプロモーターは、最小ＳＧプロモーターである。一実施例において、天然ＳＧプロモーターは、最小ＳＧプロモーターである。例えば、最小ＳＧプロモーターは、転写の開始のために必要とされる最小配列である。一実施例において、最小天然ＳＧプロモーターは、４９個のヌクレオチド長である。一実施例において、最小ＳＧプロモーターは、４９個のヌクレオチド長である。一実施例において、最小天然ＳＧプロモーターは、配列番号１に記述されている配列を含むか又はそれからなる配列によってコードされている。一実施例において、最小ＳＧプロモーターは、配列番号１に記述されている配列を含むか又はそれからなる配列によってコードされている。

【0160】

一実施例において、ＳＧプロモーターは、延長ＳＧプロモーターである。一実施例において、天然ＳＧプロモーターは、延長ＳＧプロモーターである。例えば、延長ＳＧプロモーターは、ＲＮＡウイルス（例えば、アルファウイルス）の非構造タンパク質（例えば、ＮＳＰ４）をコードする配列中に生じるヌクレオチドにより５’末端で延長されている。一実施例において、延長ＳＧプロモーターは、アルファウイルスＮＳＰ４をコードする配列中に生じるヌクレオチドにより５’末端で延長されている。ＳＧプロモーター配列の５’末端へのヌクレオチドの付加は、非構造タンパク質及びウイルスレプリカーゼ、例えば、アルファウイルスＮＳＰ４の発現を阻害することはなかった。

【0161】

驚くべきことに、本発明者らは、発現を増強するためにＳＧプロモーターの５’末端に付加されるヌクレオチドの数が限られていることを見出した。例えば、本発明者らは、非構造タンパク質（例えば、アルファウイルスＮＳＰ４）をコードする配列中に生じる５２個のヌクレオチドによって５’末端で延長したＳＧプロモーターが機能しないことを見出した。特に、非構造タンパク質をコードする配列中に生じる５２個のヌクレオチドによって５’末端で延長したＳＧプロモーターを使用した場合、抗原発現は検出されなかった。したがって、一実施例において、ＳＧプロモーターは、非構造タンパク質（例えば、アルファウイルスＮＳＰ４）をコードする配列中に生じる５１個以下のヌクレオチドによって５’末端で延長されている。一実施例において、延長ＳＧプロモーターは、非構造タンパク質（例えば、アルファウイルスＮＳＰ４）をコードする配列中に生じる５１個以下のヌクレオチドによって５’末端で延長した最小ＳＧプロモーターである。一実施例において、延長ＳＧプロモーターは、非構造タンパク質（例えば、アルファウイルスＮＳＰ４）をコードする配列中に生じる５１個以下のヌクレオチドによって５’末端で延長した、配列番号１に記述されている配列を含むか又はそれからなる配列によってコードされている。例えば、延長ＳＧプロモーターは、１００個以下のヌクレオチド長である。一実施例において、延長ＳＧプロモーターは、配列番号１５のヌクレオチド２～１０１を含むか又はそれからなる配列によってコードされている。

【0162】

一実施例において、ＳＧプロモーターは、非構造タンパク質（例えば、アルファウイルスＮＳＰ４）をコードする配列中に生じる、約５個のヌクレオチド～約２０個のヌクレオチドによって、例えば、約５個のヌクレオチド、又は約１０個のヌクレオチド、又は約１２個、又は約１５個のヌクレオチド、又は約２０個のヌクレオチドによって５’末端で延長されている。。別の実施例において、ＳＧプロモーターは、非構造タンパク質（例えば、アルファウイルスＮＳＰ４）をコードする配列中に生じる、約２０個～約３５個のヌクレオチドによって、例えば、約２５個のヌクレオチド、又は約２７個のヌクレオチド、又は約３０個のヌクレオチド、又は約３５個のヌクレオチドによって５’末端で延長されている。

【0163】

一実施例において、ＳＧプロモーターは、非構造タンパク質（例えば、アルファウイルスＮＳＰ４）をコードする配列中に生じる約１２個のヌクレオチドによって５’末端で延長されている。一実施例において、延長ＳＧプロモーターは、非構造タンパク質（例えば、アルファウイルスＮＳＰ４）をコードする配列中に生じる１２個のヌクレオチドによって５’末端で延長した、配列番号１に記述されている配列によってコードされている。例えば、延長ＳＧプロモーターは、６１個以下のヌクレオチド長である。一実施例において、延長ＳＧプロモーターは、配列番号１５のヌクレオチド４１～１０１を含むか又はそれからなる配列によってコードされている。別の実施例において、延長ＳＧプロモーターは、配列番号２に記述されている配列を含むか又はそれからなる配列によってコードされている。

【0164】

一実施例において、ＳＧプロモーターは、非構造タンパク質（例えば、アルファウイルスＮＳＰ４）をコードする配列中に生じる約３１個のヌクレオチドによって５’末端で延長されている。一実施例において、延長ＳＧプロモーターは、非構造タンパク質（例えば、アルファウイルスＮＳＰ４）をコードする配列中に生じる３１個のヌクレオチドによって５’末端で延長した、配列番号１に記述されている配列によってコードされている。例えば、延長ＳＧプロモーターは、８０個以下のヌクレオチド長である。一実施例において、延長ＳＧプロモーターは、配列番号１５のヌクレオチド２２～１０１を含むか又はそれからなる配列によってコードされている。別の実施例において、延長ＳＧプロモーターは、配列番号３に記述されている配列を含むか又はそれからなる配列によってコードされている。

【0165】

一実施例において、延長ＳＧプロモーターは、配列番号１５のヌクレオチド６６～７５に対応する反復配列を含む。例えば、延長ＳＧプロモーターは、配列番号１５のヌクレオチド５０～７５及び配列番号１５のヌクレオチド６６～１０１を含む配列によってコードされている。例えば、延長ＳＧプロモーターは、配列番号４７に記述されている配列によってコードされている。

【0166】

一実施例において、ＩＲＥＳは、脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）に由来する野生型ＩＲＥＳである。例えば、野生型ＥＭＣＶ ＩＲＥＳは、配列番号４に記述されている配列を含む。

【0167】

一実施例において、第１及び／若しくは第２のヌクレオチド配列、並びに／又は１つ以上の追加のヌクレオチド配列は、コドン最適化される。

【0168】

一実施例において、第１及び／若しくは第２のヌクレオチド配列、並びに／又は１つ以上の追加のヌクレオチド配列のＧ／Ｃ含有量は、修飾される。

【0169】

一実施例において、第１及び／若しくは第２のヌクレオチド配列、並びに／又は１つ以上の追加のヌクレオチド配列のＧ／Ｃ含有量は、非修飾配列のＧ／Ｃ含有量と比較して少なくとも５％増加する。例えば、第１及び／若しくは第２のヌクレオチド配列、並びに／又は１つ以上の追加のヌクレオチド配列のＧ／Ｃ含有量は、非修飾配列のＧ／Ｃ含有量と比較して、少なくとも１０％、又は１５％、又は２０％、又は２５％、又は３０％、又は３５％、又は４０％増加する。

【0170】

一実施例において、ポリヌクレオチドは、少なくとも１つの化学修飾されたヌクレオチドを含む。

【0171】

一実施例において、化学修飾されたヌクレオチドは、Ｎ６，２’－Ｏ－ジメチル－アデノシン（ｍ６Ａｍ）、５－メチルウリジン（ｍ５Ｕ）、Ｎ４－アセチルシチジン（ａｃ４Ｃ）、２－チオシチジン（ｓ２Ｃ）、２－チオウリジン（ｓ２Ｕ）、５－メチルシチジン（ｍ５Ｃ）、Ｎ６－メチルアデノシン（ｍ６ａ）、シュードウリジン（ψ）、１－メチルシュードウリジン（ｍ１ψ）、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される。例えば、化学修飾されたヌクレオチドは、Ｎ６，２’－Ｏ－ジメチル－アデノシン（ｍ６Ａｍ）である。例えば、化学修飾されたヌクレオチドは、５－メチルウリジン（ｍ５Ｕ）である。例えば、化学修飾されたヌクレオチドは、Ｎ４－アセチルシチジン（ａｃ４Ｃ）である。例えば、化学修飾されたヌクレオチドは、２－チオシチジン（ｓ２Ｃ）である。例えば、化学修飾されたヌクレオチドは、２－チオウリジン（ｓ２Ｕ）である。例えば、化学修飾されたヌクレオチドは、５－メチルシチジン（ｍ５Ｃ）である。例えば、化学修飾されたヌクレオチドは、Ｎ６－メチルアデノシン（ｍ６ａ）である。例えば、化学修飾されたヌクレオチドは、シュードウリジン（ψ）である。例えば、化学修飾されたヌクレオチドは、１－メチルシュードウリジン（ｍ１ψ）である。

【0172】

一実施例において、第１のヌクレオチド配列は、ハプトグロビン（ＨＰ）、フィブリノーゲンベータ鎖（ＦＧＢ）、ハプトグロビン関連タンパク質（ＨＰＲ）、アルブミン（ＡＬＢ）、補体成分３（Ｃ３）、フィブリノーゲンアルファ鎖（ＦＧＡ）、アルファ６コラーゲン（Ｃｏｌ６Ａ）、アルファ－１－アンチトリプシン（ＳＥＲＰＩＮＡ１）、アルファ－１－アンチキモトリプシン（ＳＥＲＰＩＮＡ３）の５’－ＵＴＲ その断片及び／又は変異体を含む。

【0173】

一実施例において、５’ＵＴＲは、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）又はその修飾された形態の５’ＵＴＲである。例えば、５’ＵＴＲは、配列番号４５に記述されている配列を含む。

【0174】

一実施例において、５’－ＵＴＲ、その断片及び／又は変異体は、４０～２０００個のヌクレオチド長である。例えば、５’－ＵＴＲ、その断片及び／又は変異体は、４０～１００個のヌクレオチド長である。例えば、５’－ＵＴＲ、その断片及び／又は変異体は、１００～２５０個のヌクレオチド長である。例えば、５’－ＵＴＲ、その断片及び／又は変異体は、２５０～５００個のヌクレオチド長である。例えば、５’－ＵＴＲ、その断片及び／又は変異体は、５００～７５０個のヌクレオチド長である。例えば、５’－ＵＴＲ、その断片及び／又は変異体は、７５０～１０００個のヌクレオチド長である。例えば、５’－ＵＴＲ、その断片及び／又は変異体は、１０００～１２５０個のヌクレオチド長である。例えば、５’－ＵＴＲ、その断片及び／又は変異体は、１２５０～１５００個のヌクレオチド長である。例えば、５’－ＵＴＲ、その断片及び／又は変異体は、１５００～１７５０個のヌクレオチド長である。例えば、５’－ＵＴＲ、その断片及び／又は変異体は、１７５０～２０００個のヌクレオチド長である。

【0175】

一実施例において、５’－ＵＴＲ、その断片及び／又は変異体は、配列番号４０～５４のいずれか１つに記述されているヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％同一のヌクレオチド配列を含む。例えば、５’－ＵＴＲ、その断片及び／又は変異体は、配列番号４０～５４のいずれか１つに記述されているヌクレオチド配列に対して９０％、又は９１％、又は９２％、又は９３％、又は９４％、又は９５％、又は９６％、又は９７％、又は９８％、又は９９％同一のヌクレオチド配列を含む。

【0176】

一実施例において、ポリヌクレオチドは、２つ以上の５’－ＵＴＲ、その断片及び／又は変異体の組み合わせを含む。一実施例において、２つ以上の５’－ＵＴＲは、同じである。一実施例において、２つ以上の５’－ＵＴＲは、異なっている。

【0177】

一実施例において、５’ＵＴＲを含むヌクレオチド配列は、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位、ＡＵリッチエレメント（ＡＲＥ）、ＧＣリッチエレメント、ステムループ、及びこれらの組み合わせを含む。一実施例において、ヌクレオチド配列は、マイクロＲＮＡ結合部位を含む。一実施例において、ヌクレオチド配列は、ＡＵリッチエレメント（ＡＲＥ）を含む。一実施例において、ヌクレオチドは、ＧＣリッチエレメントを含む。一実施例において、ヌクレオチド配列は、ステムループを含む。例えば、ステムループは、ヒストンステムループである。

【0178】

一実施例において、ポリヌクレオチドは、３’ＵＴＲを含むヌクレオチド配列を更に含む。一実施例において、３’ＵＴＲを含むヌクレオチド配列は、第２の又は１つ以上の追加のヌクレオチド配列の３’に位置している。例えば、３’ＵＴＲを含むヌクレオチド配列は、第２のヌクレオチド配列の３’に位置している。一実施例において、３’ＵＴＲは、アラキドン酸５－リポキシゲナーゼ（ＡＬＯＸ５）、アルファＩコラーゲン（ＣＯＬ１Ａ１）、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）遺伝子、スプリットのアミノ末端エンハンサー（ＡＥＳ）、ヒトミトコンドリア１２Ｓ ｒＲＮＡ（ｍｔＲＮＲ１）の３’－ＵＴＲ、その断片及び／又は変異体を含む。

【0179】

一実施例において、３’ＵＴＲは、シンドビスウイルス（ＳＩＮＶ）又はその修飾された形態の３’ＵＴＲである。例えば、３’ＵＴＲは、配列番号４６に記述されている配列を含む。

【0180】

一実施例において、３’ＵＴＲ、その断片及び／又は変異体は、４０～４００個のヌクレオチド長である。例えば、３’－ＵＴＲは、４０～５０、又は５０～６０、又は６０～７０、又は７０～８０、又は８０～９０、又は９０～１００、又は１００～１２５、又は１２５～１５０、又は１５０～１７５、又は１７５～２００、又は２００～２２５、又は２２５～２５０、又は２５０～２７５、又は２７５～３００、又は３００～３２５、又は３２５～３５０、又は３５０～３７５、又は３７５～４００個のヌクレオチド長である。例えば、３’－ＵＴＲ、その断片及び／又は変異体は、４０～５０個のヌクレオチド長である。例えば、３’－ＵＴＲ、その断片及び／又は変異体は、５０～６０個のヌクレオチド長である。例えば、３’－ＵＴＲ、その断片及び／又は変異体は、６０～７０個のヌクレオチド長である。例えば、３’－ＵＴＲ、その断片及び／又は変異体は、７０～８０個のヌクレオチド長である。例えば、３’－ＵＴＲ、その断片及び／又は変異体は、８０～９０個のヌクレオチド長である。例えば、３’－ＵＴＲ、その断片及び／又は変異体は、９０～１００個のヌクレオチド長である。例えば、３’－ＵＴＲ、その断片及び／又は変異体は、１００～１２５個のヌクレオチド長である。例えば、３’－ＵＴＲ、その断片及び／又は変異体は、１２５～１５０個のヌクレオチド長である。例えば、３’－ＵＴＲ、その断片及び／又は変異体は、１５０～１７５個のヌクレオチド長である。例えば、３’－ＵＴＲ、その断片及び／又は変異体は、１７５～２００個のヌクレオチド長である。例えば、３’－ＵＴＲ、その断片及び／又は変異体は、２００～２２５個のヌクレオチド長である。例えば、３’－ＵＴＲ、その断片及び／又は変異体は、２２５～２５０個のヌクレオチド長である。例えば、３’－ＵＴＲ、その断片及び／又は変異体は、２５０～２７５個のヌクレオチド長である。例えば、３’－ＵＴＲ、その断片及び／又は変異体は、２７５～３００個のヌクレオチド長である。例えば、３’－ＵＴＲ、その断片及び／又は変異体は、３００～３２５個のヌクレオチド長である。例えば、３’－ＵＴＲ、その断片及び／又は変異体は、３２５～３５０個のヌクレオチド長である。例えば、３’－ＵＴＲ、その断片及び／又は変異体は、３５０～３７５個のヌクレオチド長である。例えば、３’－ＵＴＲ、その断片及び／又は変異体は、３７５～４００個のヌクレオチド長である。

【0181】

一実施例において、ポリヌクレオチドは、２つ以上の３’－ＵＴＲ、その断片及び／又は変異体の組み合わせを含む。一実施例において、２つ以上の３’－ＵＴＲは、同じである。一実施例において、２つ以上の３’－ＵＴＲは、異なっている。

【0182】

一実施例において、３’ＵＴＲ、その断片及び／又は変異体を含むヌクレオチド配列は、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位、ＡＵリッチエレメント（ＡＲＥ）、ＧＣリッチエレメント、三重らせん体、ステムループ、１つ以上の停止コドン、及びこれらの組み合わせを含む。一実施例において、ヌクレオチド配列は、マイクロＲＮＡ結合部位を含む。一実施例において、ヌクレオチド配列は、ＡＵリッチエレメント（ＡＲＥ）を含む。一実施例において、ヌクレオチド配列は、ＧＣリッチエレメントを含む。一実施例において、ヌクレオチド配列は、三重らせん体を含む。一実施例において、ヌクレオチド配列は、ステムループを含む。例えば、ステムループは、ヒストンステムループである。一実施例において、ヌクレオチド配列は、１つ以上の停止コドンを含む。例えば、１つ以上の停止コドンは、３’－ＵＴＲの５’末端に位置している。

【0183】

一実施例において、ポリヌクレオチドは、３’ＵＴＲを含むヌクレオチド配列の３’末端に位置した１つ以上の３’テーリング配列を含む、ヌクレオチド配列を含む。一実施例において、１つ以上の３’テーリング配列は、ポリＡ配列、ポリアデニル化シグナル、Ｇ四重鎖、ポリＣ配列、ステムループ、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される。例えば、３’テーリング配列は、ポリＡ配列を含む。一実施例において、３’テーリング配列は、ポリアデニル化シグナルを含む。一実施例において、３’テーリング配列は、Ｇ四重鎖を含む。一実施例において、３’テーリング配列は、ポリＣ配列を含む。一実施例において、３’テーリング配列は、ステムループを含む。例えば、ステムループは、ヒストンステムループである。一実施例において、３’テーリング配列は、ポリＡ配列及びＧ四重鎖を含む。一実施例において、３’テーリング配列は、ステムループ（例えば、ヒストンステムループ）及びポリＡ配列を含む。

【0184】

一実施例において、１つ以上の３’テーリング配列は、各々１０～３００個の連続するアデノシンヌクレオチドを含む、１つ以上のポリＡ配列を含む。例えば、ポリＡ配列は、各々、１０～２０、又は２０～３０、又は３０～４０、又は４０～５０、又は５０～６０、又は６０～７０、又は７０～８０、又は８０～９０、又は９０～１００、又は１００～１２５、又は１２５～１５０、又は１５０～１７５、又は１７５～２００、又は２００～２２５、又は２２５～２５０、又は２５０～２７５、又は２７５～３００個の連続するアデノシンヌクレオチドを含む。例えば、１つ以上のポリＡ配列は、各々、１０～２０個の連続するアデノシンヌクレオチドを含む。例えば、１つ以上のポリＡ配列は、各々、２０～３０個の連続するアデノシンヌクレオチドを含む。例えば、１つ以上のポリＡ配列は、各々、３０～４０個の連続するアデノシンヌクレオチドを含む。例えば、１つ以上のポリＡ配列は、各々、３６個の連続するアデノシンヌクレオチドを含む。例えば、１つ以上のポリＡ配列は、各々、４０～５０個の連続するアデノシンヌクレオチドを含む。例えば、１つ以上のポリＡ配列は、各々、５０～６０個の連続するアデノシンヌクレオチドを含む。例えば、１つ以上のポリＡ配列は、各々、６０～７０個の連続するアデノシンヌクレオチドを含む。例えば、１つ以上のポリＡ配列は、各々、７０～８０個の連続するアデノシンヌクレオチドを含む。例えば、１つ以上のポリＡ配列は、各々、８０～９０個の連続するアデノシンヌクレオチドを含む。例えば、１つ以上のポリＡ配列は、各々、９０～１００個の連続するアデノシンヌクレオチドを含む。例えば、１つ以上のポリＡ配列は、各々、１００～１２５個の連続するアデノシンヌクレオチドを含む。例えば、１つ以上のポリＡ配列は、各々、１２５～１５０個の連続するアデノシンヌクレオチドを含む。例えば、１つ以上のポリＡ配列は、各々、１５０～１７５個の連続するアデノシンヌクレオチドを含む。例えば、１つ以上のポリＡ配列は、各々、１７５～２００個の連続するアデノシンヌクレオチドを含む。例えば、１つ以上のポリＡ配列は、各々、２００～２２５個の連続するアデノシンヌクレオチドを含む。例えば、１つ以上のポリＡ配列は、各々、２２５～２５０個の連続するアデノシンヌクレオチドを含む。例えば、１つ以上のポリＡ配列は、各々、２５０～２７５個の連続するアデノシンヌクレオチドを含む。例えば、１つ以上のポリＡ配列は、各々、２７５～３００個の連続するアデノシンヌクレオチドを含む。

【0185】

一実施例において、１つ以上のポリＡ配列は、各々、１０個、又は２０個、又は３０個、又は４０個、又は５０個、又は６０個、又は７０個、又は８０個、又は９０個、又は１００個、又は１２５個、又は１５０個、又は１７５個、又は２００個、又は２２５個、又は２５０個、又は２７５個、又は３００個の連続するアデノシンヌクレオチドを含む。例えば、１つ以上のポリＡ配列は、各々、１０個の連続するアデノシンヌクレオチドを含む。例えば、１つ以上のポリＡ配列は、各々、２０個の連続するアデノシンヌクレオチドを含む。例えば、１つ以上のポリＡ配列は、各々、３０個の連続するアデノシンヌクレオチドを含む。例えば、１つ以上のポリＡ配列は、各々、４０個の連続するアデノシンヌクレオチドを含む。例えば、１つ以上のポリＡ配列は、各々、５０個の連続するアデノシンヌクレオチドを含む。例えば、１つ以上のポリＡ配列は、各々、６０個の連続するアデノシンヌクレオチドを含む。例えば、１つ以上のポリＡ配列は、各々、７０個の連続するアデノシンヌクレオチドを含む。例えば、１つ以上のポリＡ配列は、各々、８０個の連続するアデノシンヌクレオチドを含む。例えば、１つ以上のポリＡ配列は、各々、９０個の連続するアデノシンヌクレオチドを含む。例えば、１つ以上のポリＡ配列は、各々、１００個の連続するアデノシンヌクレオチドを含む。例えば、１つ以上のポリＡ配列は、各々、１２５個の連続するアデノシンヌクレオチドを含む。例えば、１つ以上のポリＡ配列は、各々、１５０個の連続するアデノシンヌクレオチドを含む。例えば、１つ以上のポリＡ配列は、各々、１７５個の連続するアデノシンヌクレオチドを含む。例えば、１つ以上のポリＡ配列は、各々、２００個の連続するアデノシンヌクレオチドを含む。例えば、１つ以上のポリＡ配列は、各々、２２５個の連続するアデノシンヌクレオチドを含む。例えば、１つ以上のポリＡ配列は、各々、２５０個の連続するアデノシンヌクレオチドを含む。例えば、１つ以上のポリＡ配列は、各々、２７５個の連続するアデノシンヌクレオチドを含む。例えば、１つ以上のポリＡ配列は、各々、３００個の連続するアデノシンヌクレオチドを含む。

【0186】

一実施例において、ポリＡ配列は、３６個の連続するアデノシンヌクレオチドを含む。例えば、ポリＡ配列は、配列番号４８に記述されている配列を含む。

【0187】

一実施例において、１つ以上のポリＡ配列は、中断リンカーによって分離される。例えば、３’テーリング配列は、５’から３’への順に、連続するアデノシンヌクレオチドを含むポリＡ配列、中断リンカー、及び連続するアデノシンヌクレオチドを含む更なるポリＡ配列を含む。

【0188】

一実施例において、中断リンカーは、１０～５０、又は５０～１００、又は１００～１５０個のヌクレオチド長である。例えば、中断リンカーは、１０～５０個のヌクレオチド長である。例えば、中断リンカーは、５０～１００個のヌクレオチド長である。例えば、中断リンカーは、１００～１５０個のヌクレオチド長である。

【0189】

一実施例において、中断リンカーは、１個、又は２個、又は３個、又は４個、又は５個、又は６個、又は７個、又は８個、又は９個、又は１０個、又は１１個、又は１２個、又は１３個、又は１４個、又は１５個、又は１６個、又は１７個、又は１８個、又は１９個、又は２０個、又は２５個、又は３０個、又は３５個、又は４０個、又は４５個、又は５０個、又は５５個、又は６０個、又は６５個、又は７０個、又は７５個、又は８０個、又は８５個、又は９０個、又は９５個、又は１００個、又は１１０個、又は１２０個、又は１３０個、又は１４０個、又は１５０個のヌクレオチド長である。例えば、中断リンカーは、１個のヌクレオチド長である。例えば、中断リンカーは、２個のヌクレオチド長である。例えば、中断リンカーは、３個のヌクレオチド長である。例えば、中断リンカーは、４個のヌクレオチド長である。例えば、中断リンカーは、５個のヌクレオチド長である。例えば、中断リンカーは、６個のヌクレオチド長である。例えば、中断リンカーは、７個のヌクレオチド長である。例えば、中断リンカーは、８個のヌクレオチド長である。例えば、中断リンカーは、９個のヌクレオチド長である。例えば、中断リンカーは、１０個のヌクレオチド長である。例えば、中断リンカーは、１１個のヌクレオチド長である。例えば、中断リンカーは、１２個のヌクレオチド長である。例えば、中断リンカーは、１３個のヌクレオチド長である。例えば、中断リンカーは、１４個のヌクレオチド長である。例えば、中断リンカーは、１５個のヌクレオチド長である。例えば、中断リンカーは、１６個のヌクレオチド長である。例えば、中断リンカーは、１７個のヌクレオチド長である。例えば、中断リンカーは、１８個のヌクレオチド長である。例えば、中断リンカーは、１９個のヌクレオチド長である。例えば、中断リンカーは、２０個のヌクレオチド長である。例えば、中断リンカーは、２５個のヌクレオチド長である。例えば、中断リンカーは、３０個のヌクレオチド長である。例えば、中断リンカーは、３５個のヌクレオチド長である。例えば、中断リンカーは、４０個のヌクレオチド長である。例えば、中断リンカーは、４５個のヌクレオチド長である。例えば、中断リンカーは、５０個のヌクレオチド長である。例えば、中断リンカーは、５５個のヌクレオチド長である。例えば、中断リンカーは、６０個のヌクレオチド長である。例えば、中断リンカーは、６５個のヌクレオチド長である。例えば、中断リンカーは、７０個のヌクレオチド長である。例えば、中断リンカーは、７５個のヌクレオチド長である。例えば、中断リンカーは、８０個のヌクレオチド長である。例えば、中断リンカーは、８５個のヌクレオチド長である。例えば、中断リンカーは、９０個のヌクレオチド長である。例えば、中断リンカーは、９５個のヌクレオチド長である。例えば、中断リンカーは、１００個のヌクレオチド長である。例えば、中断リンカーは、１１０個のヌクレオチド長である。例えば、中断リンカーは、１２０個のヌクレオチド長である。例えば、中断リンカーは、１３０個のヌクレオチド長である。例えば、中断リンカーは、１４０個のヌクレオチド長である。例えば、中断リンカーは、１５０個のヌクレオチド長である。

【0190】

一実施例において、中断リンカーは、１０個のヌクレオチド長である。一実施例において、中断リンカーは、配列番号４０に記述されているヌクレオチド配列を含むか又はそれからなる。例えば、中断リンカーは、ヌクレオチド配列ＧＣＡＵＡＵＧＡＣＵを含むか又はそれからなる。

【0191】

一実施例において、３’テーリング配列は、５’から３’への順に、３０個の連続するアデノシンヌクレオチドを含むポリＡ配列、１０個のヌクレオチドの中断リンカー、及び７０個の連続するアデノシンヌクレオチドを含む更なるポリＡ配列を含む。

【0192】

一実施例において、３’テーリング配列は、５’から３’への順に、３０個の連続するアデノシンヌクレオチドを含むポリＡ配列、配列番号４０に記述されているヌクレオチド配列を含むか又はそれからなる中断リンカー、及び７０個の連続するアデノシンヌクレオチドを含む更なるポリＡ配列を含む。

【0193】

一実施例において、ポリヌクレオチドは、５’から３’への順に、
ａ）５’－ＵＴＲ、その断片及び／又は変異体、
ｂ）Ｋｏｚａｋコンセンサス配列、ＩＲＥＳ、ＳＧプロモーター、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される調節エレメント、
ｃ）目的の第１のポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列、
ｄ）ＳＧプロモーター及びＩＲＥＳからなる群から選択される調節エレメントに作動可能に連結された目的の第２のポリペプチドをコードする第２のヌクレオチド配列、
ｅ）３’－ＵＴＲ、その断片及び／又は変異体、並びに
ｆ）ポリＡ配列、ポリアデニル化シグナル、Ｇ四重鎖、ポリＣ配列、ステムループ、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される１つ以上の３’テーリング配列を含む。

【0194】

一実施例において、ＲＮＡは、５’から３’への順に、
ａ）５’－ＵＴＲ、その断片及び／又は変異体、
ｂ）Ｋｏｚａｋコンセンサス配列、ＩＲＥＳ、ＳＧプロモーター、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される調節エレメント、
ｃ）目的の第１のポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列、
ｄ）ＳＧプロモーター及びＩＲＥＳからなる群から選択される調節エレメントに作動可能に連結された目的の第２のポリペプチドをコードする第２のヌクレオチド配列、
ｅ）３’－ＵＴＲ、その断片及び／又は変異体、並びに
ｆ）ポリＡ配列、ポリアデニル化シグナル、Ｇ四重鎖、ポリＣ配列、ステムループ、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される１つ以上の３’テーリング配列を含む。

【0195】

一実施例において、ｃＲＮＡは、５’から３’への順に、
ａ）５’－ＵＴＲ、その断片及び／又は変異体、
ｂ）Ｋｏｚａｋコンセンサス配列、ＩＲＥＳ、ＳＧプロモーター、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される調節エレメント、
ｃ）目的の第１のポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列、
ｄ）ＳＧプロモーター及びＩＲＥＳからなる群から選択される調節エレメントに作動可能に連結された目的の第２のポリペプチドをコードする第２のヌクレオチド配列、
ｅ）３’－ＵＴＲ、その断片及び／又は変異体、並びに
ｆ）ポリＡ配列、ポリアデニル化シグナル、Ｇ四重鎖、ポリＣ配列、ステムループ、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される１つ以上の３’テーリング配列を含む。

【0196】

一実施例において、ｓａ－ｍＲＮＡは、５’から３’への順に、
ａ）５’－ＵＴＲ、その断片及び／又は変異体、
ｂ）Ｋｏｚａｋコンセンサス配列、ＩＲＥＳ、ＳＧプロモーター、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される調節エレメント、
ｃ）目的の第１のポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列、
ｄ）ＳＧプロモーター及びＩＲＥＳからなる群から選択される調節エレメントに作動可能に連結された目的の第２のポリペプチドをコードする第２のヌクレオチド配列、
ｅ）３’－ＵＴＲ、その断片及び／又は変異体、並びに
ｆ）ポリＡ配列、ポリアデニル化シグナル、Ｇ四重鎖、ポリＣ配列、ステムループ、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される１つ以上の３’テーリング配列を含む。

【0197】

一実施例において、本開示のマルチシストロン性自己複製ＲＮＡは、５’から３’への順に、
ａ）最小ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、及び最小ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列、又は
ｂ）最小ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、及び延長ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列、又は
ｃ）最小ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、及び野生型ＥＭＣＶ ＩＲＥＳに作動可能に連結された第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列を含む。

【0198】

一実施例において、本開示のマルチシストロン性自己複製ＲＮＡは、５’から３’への順に、最小ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、及び最小ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列を含む。

【0199】

例えば、本開示のマルチシストロン性自己複製ＲＮＡは、５’から３’への順に、配列番号１に記述されている配列を含む最小ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、及び配列番号１に記述されている配列を含む最小ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列を含む。

【0200】

一実施例において、本開示のマルチシストロン性自己複製ＲＮＡは、５’から３’への順に、最小ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、及び延長ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列を含む。

【0201】

一実施例において、本開示のマルチシストロン性自己複製ＲＮＡは、５’から３’への順に、配列番号１に記述されている配列によってコードされる最小ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、及び配列番号２に記述されている配列によってコードされる延長ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列を含む。

【0202】

一実施例において、本開示のマルチシストロン性自己複製ＲＮＡは、５’から３’への順に、配列番号１に記述されている配列によってコードされる最小ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、及び配列番号３に記述されている配列によってコードされる延長ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列を含む。

【0203】

一実施例において、本開示のマルチシストロン性自己複製ＲＮＡは、５’から３’への順に、最小ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、及び野生型ＥＭＣＶ ＩＲＥＳに作動可能に連結された第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列を含む。

【0204】

一実施例において、本開示のマルチシストロン性自己複製ＲＮＡは、５’から３’への順に、配列番号１に記述されている配列によってコードされる最小ＳＧプロモーターに作動可能に連結された第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、及び配列番号４に記述されている配列によってコードされる野生型ＥＭＣＶ ＩＲＥＳに作動可能に連結された第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列を含む。

【0205】

一実施例において、ＲＮＡは、５’末端キャップ構造を更に含む。

【0206】

一実施例において、５’末端キャップ構造は、内因性キャップ又はその類似体である。例えば、５’末端キャップ構造は、内在性キャップである。例えば、５’末端キャップ構造は、内因性キャップの類似体である。

【0207】

一実施例において、５’末端キャップ構造は、グアニン又はそのグアニン類似体を含む。例えば、５’末端キャップ構造は、グアニンを含む。例えば、５’末端キャップ構造は、グアニンのグアニン類似体を含む。

【0208】

一実施例において、５’末端キャップ構造は、抗逆キャップ類似体（ＡＲＣＡ）、Ｎ７，２’－０－ジメチル－グアノシン（ｍＣＡＰ）、イノシン、Ｎ１－メチル－グアノシン、２’フルオロ－グアノシン、７－デアザ－グアノシン、８－オキソ－グアノシン、２－アミノ－グアノシン、ＬＮＡ－グアノシン、２－アジド－グアノシン、Ｎ６，２’－Ｏ－ジメチルアデノシン、７－メチルグアノシン（ｍ７Ｇ）、キャップ１、及びキャップ２からなる群から選択される。例えば、５’末端キャップ構造は、抗逆キャップ類似体（ＡＲＣＡ）である。例えば、５’末端キャップ構造は、Ｎ７，２’－０－ジメチル－グアノシン（ｍＣＡＰ）である。例えば、５’末端キャップ構造は、イノシンである。例えば、５’末端キャップ構造は、Ｎ１－メチル－グアノシンである。例えば、５’末端キャップ構造は、２’フルオロ－グアノシンである。例えば、５’末端キャップ構造は、７－デアザ－グアノシンである。例えば、５’末端キャップ構造は、８－オキソ－グアノシンである。例えば、５’末端キャップ構造は、２－アミノ－グアノシンである。例えば、５’末端キャップ構造は、ＬＮＡ－グアノシンである。例えば、５’末端キャップ構造は、２－アジド－グアノシンである。例えば、５’末端キャップ構造は、Ｎ６，２’－Ｏ－ジメチルアデノシンである。例えば、５’末端キャップ構造は、７－メチルグアノシン（ｍ７Ｇ）である。例えば、５’末端キャップ構造は、キャップ１である。例えば、５’末端キャップ構造は、キャップ２である。

【0209】

一実施例において、５’末端キャップ構造は、５’－５’－トリホスフェート結合又は５’－５’ホスホロチオエート結合によってＲＮＡの５’末端に連結される。例えば、５’末端キャップ構造は、５’－５’－トリホスフェート結合によってＲＮＡの５’末端に連結される。例えば、５’末端キャップ構造は、５’－５’ホスホロチオエート結合によってＲＮＡの５’末端に連結される。

【0210】

一実施例において、抗原は、実質的に同じレベルで発現される。例えば、抗原は、互いの約１０％、又は約５％、又は約１％以内の発現のレベルを有する。別の実施例において、抗原は、異なるレベルで発現される。例えば、抗原は、互いの約１０％、又は約１５％、又は約２０％を超える発現のレベルを有する。発現のレベルを決定するための方法は、当該技術分野で既知であるか、及び／又は本明細書に記載される。

【0211】

一実施例において、自己複製ＲＮＡは、アルファウイルス由来である。例えば、アルファウイルスは、セムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）、シンドビスウイルス（ＳＩＮ）、及びベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥ）、並びにこれらの組み合わせからなる群から選択される。

【0212】

一実施例において、自己複製ＲＮＡは、セムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）由来である。

【0213】

一実施例において、自己複製ＲＮＡは、シンドビスウイルス（ＳＩＮ）由来である。

【0214】

一実施例において、自己複製ＲＮＡは、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥ）由来である。

【0215】

一実施例において、抗原は、ウイルス抗原である。例えば、ウイルス抗原は、呼吸器ウイルス由来である。一実施例において、呼吸器ウイルスは、インフルエンザウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、パラインフルエンザウイルス、メタニューモウイルス、ライノウイルス、コロナウイルス、アデノウイルス、及びボカウイルスからなる群から選択される。

【0216】

一実施例において、ウイルス抗原は、インフルエンザウイルス由来である。

【0217】

一実施例において、ウイルス抗原は、呼吸器合胞体ウイルス由来である。

【0218】

一実施例において、ウイルス抗原は、パラインフルエンザウイルス由来である。

【0219】

一実施例において、ウイルス抗原は、メタニューモウイルス由来である。

【0220】

一実施例において、ウイルス抗原は、ライノウイルス由来である。

【0221】

一実施例において、ウイルス抗原は、コロナウイルス由来である。

【0222】

一実施例において、ウイルス抗原は、アデノウイルス由来である。

【0223】

一実施例において、ウイルス抗原は、ボカウイルス由来である。

【0224】

一実施例において、抗原は、インフルエンザウイルス又はコロナウイルス由来のウイルス抗原である。

【0225】

一実施例において、抗原は、インフルエンザウイルスの単一株（すなわち、一価）由来、又は複数株（すなわち、多価）由来である。例えば、自己複製ＲＮＡは、１つ以上の（例えば、１つ又は２つ又は３つの）インフルエンザウイルス株由来の抗原を含む。

【0226】

一実施例において、第１及び第２のインフルエンザウイルス抗原は、インフルエンザウイルスの異なる株由来である。例えば、第１及び第２の抗原は、インフルエンザＡ、Ｂ及び／又はＣウイルス株由来である。

【0227】

一実施例において、抗原は、インフルエンザＡウイルス株由来である。例えば、抗原は、インフルエンザＡウイルス赤血球凝集素（ＨＡ）タンパク質、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）タンパク質、マトリックス（Ｍ）タンパク質、ヌクレオタンパク質（ＮＰ）、非構造（ＮＳ）タンパク質、又はその免疫原性断片若しくは変異体である。一実施例において、抗原は、インフルエンザＡ赤血球凝集素（ＨＡ）サブタイプＨ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、若しくはＨ１６、及び／又はインフルエンザＡノイラミニダーゼ（ＮＡ）サブタイプＮ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、Ｎ５、Ｎ６、Ｎ７、Ｎ８若しくはＮ９、及び／又はインフルエンザＡマトリックス（Ｍ）タンパク質サブタイプＭ１若しくはＭ２、及び／又はインフルエンザＡ非構造（ＮＳ）タンパク質サブタイプＮＳ１若しくはＮＳ２である。

【0228】

一実施例において、インフルエンザウイルス抗原は、インフルエンザウイルスの異なるサブタイプ由来である。例えば、異なる赤血球凝集素サブタイプ、及び／又は異なるノイラミニダーゼサブタイプ、及び／又はマトリックスタンパク質サブタイプ、及び／又はヌクレオタンパク質サブタイプ、及び／又は非構造タンパク質サブタイプ。

【0229】

当業者は、インフルエンザウイルスのパンデミック株が、一般に、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、又はＨ９サブタイプインフルエンザＡウイルス株であることを認識するであろう。例えば、Ｈ１Ｎ１、Ｈ２Ｎ２、Ｈ３Ｎ２、Ｈ５Ｎ１、Ｈ５Ｎ３、Ｈ６Ｎ１、Ｈ７Ｎ２、Ｈ７Ｎ３、Ｈ７Ｎ７、Ｈ７Ｎ９、及びＨ９Ｎ２、株。

【0230】

一実施例において、抗原は、同じ赤血球凝集素サブタイプを有するインフルエンザＡウイルス株由来である。別の実施例において、抗原は、異なる赤血球凝集素サブタイプを有するインフルエンザＡウイルス株である。一実施例において、抗原は、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、又はＨ９サブタイプインフルエンザＡウイルス株である。例えば、抗原は、Ｈ１赤血球凝集素、又はＨ２赤血球凝集素、又はＨ３赤血球凝集素、又はＨ５赤血球凝集素、又はＨ６赤血球凝集素、又はＨ７赤血球凝集素、又はＨ９赤血球凝集素である。例えば、抗原は、Ｈ５サブタイプインフルエンザＡウイルス株（すなわち、Ｈ５赤血球凝集素）である。一実施例において、Ｈ５赤血球凝集素は、Ａ／シチメンチョウ／Ｔｕｒｋｅｙ／１／２００５ウイルス株である。例えば、Ｈ５赤血球凝集素は、配列番号５に記述されている配列によってコードされている。一実施例において、Ｈ３赤血球凝集素は、Ａ／Ｄｅｌａｗａｒｅ／３９／２０１９ウイルス株である。例えば、Ｈ３赤血球凝集素は、配列番号５４に記述されている配列によってコードされている。

【0231】

一実施例において、抗原は、同じノイラミニダーゼサブタイプを有するインフルエンザＡウイルス株である。別の実施例において、抗原は、異なるノイラミニダーゼサブタイプを有するインフルエンザＡウイルス株である。一実施例において、抗原は、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ７、又はＮ９サブタイプインフルエンザＡウイルス株である。例えば、抗原は、Ｎ１ノイラミニダーゼ、又はＮ２ノイラミニダーゼ、又はＮ３ノイラミニダーゼ、又はＮ７ノイラミニダーゼ、又はＮ９ノイラミニダーゼである。例えば、抗原は、Ｎ１ノイラミニダーゼサブタイプインフルエンザＡウイルス株である。一実施例において、Ｎ１ノイラミニダーゼは、Ａ／シチメンチョウ／Ｔｕｒｋｅｙ／１／２００５株である。例えば、Ｎ１ノイラミニダーゼは、配列番号６に記述されている配列によってコードされている。一実施例において、Ｎ２ノイラミニダーゼは、Ａ／Ｄｅｌａｗａｒｅ／３９／２０１９ウイルス株である。例えば、Ｎ２ノイラミニダーゼは、配列番号５５に記述されている配列によってコードされている

【0232】

一実施例において、抗原は、Ｈ５赤血球凝集素タンパク質及び／又はＮ１ノイラミニダーゼタンパク質である。例えば、第１の抗原は、Ｈ５赤血球凝集素サブタイプインフルエンザＡウイルス株であり、第２の抗原は、Ｎ１ノイラミニダーゼサブタイプインフルエンザＡウイルス株である。一実施例において、第１の抗原は、配列番号５に記述されている配列によってコードされるＨ５赤血球凝集素サブタイプインフルエンザＡウイルス株であり、第２の抗原は、配列番号６に記述されている配列によってコードされるＮ１ノイラミニダーゼサブタイプインフルエンザＡウイルス株である。

【0233】

一実施例において、本開示は、ポリヌクレオチドを提供し、ポリヌクレオチドは、５’から３’への順に、
ａ）Ｈ５赤血球凝集素タンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、及びＮ１ノイラミニダーゼタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列、又は
ｂ）Ｎ１ノイラミニダーゼタンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、及びＨ５赤血球凝集素タンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列を含む。

【0234】

一実施例において、本開示は、ポリヌクレオチドを提供し、ポリヌクレオチドは、５’から３’への順に、Ｈ５赤血球凝集素タンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、及びＮ１ノイラミニダーゼタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列を含む。

【0235】

一実施例において、本開示は、ポリヌクレオチドを提供し、ポリヌクレオチドは、５’から３’への順に、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列、ＩＲＥＳ、ＳＧプロモーター、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される調節エレメントに作動可能に連結されたＨ５赤血球凝集素タンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、並びにＳＧプロモーター及びＩＲＥＳからなる群から選択される調節エレメントに作動可能に連結されたＮ１ノイラミニダーゼタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列を含む。

【0236】

一実施例において、本開示は、ポリヌクレオチドを提供し、ポリヌクレオチドは、５’から３’への順に、Ｎ１ノイラミニダーゼタンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、及びＨ５赤血球凝集素タンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列を含む。

【0237】

一実施例において、本開示は、ポリヌクレオチドを提供し、ポリヌクレオチドは、５’から３’への順に、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列、ＩＲＥＳ、ＳＧプロモーター、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される調節エレメントに作動可能に連結されたＮ１ノイラミニダーゼタンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、並びにＳＧプロモーター及びＩＲＥＳからなる群から選択される調節エレメントに作動可能に連結されたＨ５赤血球凝集素タンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列を含む。

【0238】

一実施例において、本開示は、ＲＮＡを提供し、ＲＮＡは、５’から３’への順に、
ａ）Ｈ５赤血球凝集素タンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、及びＮ１ノイラミニダーゼタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列、又は
ｂ）Ｎ１ノイラミニダーゼタンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、及びＨ５赤血球凝集素タンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列を含む。

【0239】

一実施例において、本開示は、ＲＮＡを提供し、ＲＮＡは、５’から３’への順に、Ｈ５赤血球凝集素タンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、及びＮ１ノイラミニダーゼタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列を含む。

【0240】

一実施例において、本開示は、ＲＮＡを提供し、ＲＮＡは、５’から３’への順に、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列、ＩＲＥＳ、ＳＧプロモーター、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される調節エレメントに作動可能に連結されたＨ５赤血球凝集素タンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、並びにＳＧプロモーター及びＩＲＥＳからなる群から選択される調節エレメントに作動可能に連結されたＮ１ノイラミニダーゼタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列を含む。

【0241】

一実施例において、本開示は、ＲＮＡを提供し、ＲＮＡは、５’から３’への順に、Ｎ１ノイラミニダーゼタンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、及びＨ５赤血球凝集素タンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列を含む。

【0242】

一実施例において、本開示は、ＲＮＡを提供し、ＲＮＡは、５’から３’への順に、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列、ＩＲＥＳ、ＳＧプロモーター、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される調節エレメントに作動可能に連結されたＮ１ノイラミニダーゼタンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、並びにＳＧプロモーター及びＩＲＥＳからなる群から選択される調節エレメントに作動可能に連結されたＨ５赤血球凝集素タンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列を含む。

【0243】

一実施例において、本開示は、ｃＲＮＡを提供し、ｃＲＮＡは、５’から３’への順に、
ａ）Ｈ５赤血球凝集素タンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、及びＮ１ノイラミニダーゼタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列、又は
ｂ）Ｎ１ノイラミニダーゼタンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、及びＨ５赤血球凝集素タンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列を含む。

【0244】

一実施例において、本開示は、ｃＲＮＡを提供し、ｃＲＮＡは、５’から３’への順に、Ｈ５赤血球凝集素タンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、及びＮ１ノイラミニダーゼタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列を含む。

【0245】

一実施例において、本開示は、ｃＲＮＡを提供し、ｃＲＮＡは、５’から３’への順に、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列、ＩＲＥＳ、ＳＧプロモーター、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される調節エレメントに作動可能に連結されたＨ５赤血球凝集素タンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、並びにＳＧプロモーター及びＩＲＥＳからなる群から選択される調節エレメントに作動可能に連結されたＮ１ノイラミニダーゼタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列を含む。

【0246】

一実施例において、本開示は、ｃＲＮＡを提供し、ｃＲＮＡは、５’から３’への順に、Ｎ１ノイラミニダーゼタンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、及びＨ５赤血球凝集素タンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列を含む。

【0247】

一実施例において、本開示は、ｃＲＮＡを提供し、ｃＲＮＡは、５’から３’への順に、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列、ＩＲＥＳ、ＳＧプロモーター、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される調節エレメントに作動可能に連結されたＮ１ノイラミニダーゼタンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、並びにＳＧプロモーター及びＩＲＥＳからなる群から選択される調節エレメントに作動可能に連結されたＨ５赤血球凝集素タンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列を含む。

【0248】

一実施例において、本開示は、マルチシストロン性自己複製ＲＮＡを提供し、ＲＮＡは、５’から３’への順に、
ａ）Ｈ５赤血球凝集素タンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、及びＮ１ノイラミニダーゼタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列、又は
ｂ）Ｎ１ノイラミニダーゼタンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、及びＨ５赤血球凝集素タンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列を含む。

【0249】

一実施例において、本開示は、マルチシストロン性自己複製ＲＮＡを提供し、ＲＮＡは、５’から３’への順に、Ｈ５赤血球凝集素タンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、及びＮ１ノイラミニダーゼタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列を含む。

【0250】

一実施例において、本開示は、マルチシストロン性自己複製ＲＮＡを提供し、ＲＮＡは、５’から３’への順に、ＳＧプロモーターに作動可能に連結されたＨ５赤血球凝集素タンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、並びにＳＧプロモーター及びＩＲＥＳからなる群から選択される調節エレメントに作動可能に連結されたＮ１ノイラミニダーゼタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列を含む。

【0251】

一実施例において、本開示は、マルチシストロン性自己複製ＲＮＡを提供し、ＲＮＡは、５’から３’への順に、
ａ）配列番号１に記述されている配列によってコードされる最小ＳＧプロモーターに作動可能に連結されたＨ５赤血球凝集素タンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、及び
ｂ）配列番号１に記述されている配列によってコードされる最小ＳＧプロモーターに作動可能に連結されたＮ１ノイラミニダーゼタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列を含む。

【0252】

一実施例において、本開示は、マルチシストロン性自己複製ＲＮＡを提供し、ＲＮＡは、５’から３’への順に、
ａ）配列番号１に記述されている配列によってコードされる最小ＳＧプロモーターに作動可能に連結されたＨ５赤血球凝集素タンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、及び
ｂ）配列番号２に記述されている配列によってコードされる延長ＳＧプロモーターに作動可能に連結されたＮ１ノイラミニダーゼタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列を含む。

【0253】

一実施例において、本開示は、マルチシストロン性自己複製ＲＮＡを提供し、ＲＮＡは、５’から３’への順に、
ａ）配列番号１に記述されている配列によってコードされる最小ＳＧプロモーターに作動可能に連結されたＨ５赤血球凝集素タンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、及び
ｂ）配列番号３に記述されている配列によってコードされる延長ＳＧプロモーターに作動可能に連結されたＮ１ノイラミニダーゼタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列を含む。

【0254】

一実施例において、本開示は、マルチシストロン性自己複製ＲＮＡを提供し、ＲＮＡは、５’から３’への順に、
ａ）配列番号１に記述されている配列によってコードされる最小ＳＧプロモーターに作動可能に連結されたＨ５赤血球凝集素タンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、及び
ｂ）配列番号４に記述されている配列によってコードされるＩＲＥＳに作動可能に連結されたＮ１ノイラミニダーゼタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列を含む。

【0255】

一実施例において、本開示は、マルチシストロン性自己複製ＲＮＡを提供し、ＲＮＡは、５’から３’への順に、Ｎ１ノイラミニダーゼタンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、及びＨ５赤血球凝集素タンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列を含む。

【0256】

一実施例において、本開示は、マルチシストロン性自己複製ＲＮＡを提供し、ＲＮＡは、５’から３’への順に、ＳＧプロモーターに作動可能に連結されたＮ１ノイラミニダーゼタンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、並びにＳＧプロモーター及びＩＲＥＳからなる群から選択される調節エレメントに作動可能に連結されたＨ５赤血球凝集素タンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列を含む。

【0257】

一実施例において、本開示は、マルチシストロン性自己複製ＲＮＡを提供し、ＲＮＡは、５’から３’への順に、
ａ）配列番号１に記述されている配列によってコードされる最小ＳＧプロモーターに作動可能に連結されたＮ１ノイラミニダーゼタンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、及び
ｂ）配列番号１に記述されている配列によってコードされる最小ＳＧプロモーターに作動可能に連結されたＨ５赤血球凝集素タンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列を含む。

【0258】

一実施例において、本開示は、マルチシストロン性自己複製ＲＮＡを提供し、ＲＮＡは、５’から３’への順に、
ａ）配列番号１に記述されている配列によってコードされる最小ＳＧプロモーターに作動可能に連結されたＮ１ノイラミニダーゼタンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、及び
ｂ）配列番号２に記述されている配列によってコードされる延長ＳＧプロモーターに作動可能に連結されたＨ５赤血球凝集素タンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列を含む。

【0259】

一実施例において、本開示は、マルチシストロン性自己複製ＲＮＡを提供し、ＲＮＡは、５’から３’への順に、
ａ）配列番号１に記述されている配列によってコードされる最小ＳＧプロモーターに作動可能に連結されたＮ１ノイラミニダーゼタンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、及び
ｂ）配列番号３に記述されている配列によってコードされる延長ＳＧプロモーターに作動可能に連結されたＨ５赤血球凝集素タンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列を含む。

【0260】

一実施例において、本開示は、マルチシストロン性自己複製ＲＮＡを提供し、ＲＮＡは、５’から３’への順に、
ａ）配列番号１に記述されている配列によってコードされる最小ＳＧプロモーターに作動可能に連結されたＮ１ノイラミニダーゼをコードする第１のヌクレオチド配列、及び
ｂ）配列番号４に記述されている配列によってコードされるＩＲＥＳに作動可能に連結されたＨ５赤血球凝集素タンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列を含む。

【0261】

一実施例において、抗原は、インフルエンザＡウイルス赤血球凝集素（ＨＡ）タンパク質及びマトリックス（Ｍ）タンパク質である。例えば、抗原は、Ｈ５赤血球凝集素タンパク質及び／又はＭ１マトリックスタンパク質である。一実施例において、Ｍ１ノイラミニダーゼは、Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／１９３４（ＰＲ８－Ｘ）株である。別の実施例において、Ｍ１ノイラミニダーゼは、Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／０９株である。一実施例において、抗原は、配列番号５に記述されている配列によってコードされるＨ５赤血球凝集素サブタイプインフルエンザＡウイルス株、及び配列番号１６又は配列番号２９に記述されている配列によってコードされるＭ１マトリックスタンパク質サブタイプインフルエンザＡウイルス株である。

【0262】

一実施例において、本開示は、ポリヌクレオチドを提供し、ポリヌクレオチドは、５’から３’への順に、
ａ）Ｈ５赤血球凝集素タンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、及びＭ１マトリックスタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列、又は
ｂ）Ｍ１マトリックスタンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、及びＨ５赤血球凝集素タンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列を含む。

【0263】

一実施例において、本開示は、ポリヌクレオチドを提供し、ポリヌクレオチドは、５’から３’への順に、Ｈ５赤血球凝集素タンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、及びＭ１マトリックスタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列を含む。

【0264】

一実施例において、本開示は、ポリヌクレオチドを提供し、ポリヌクレオチドは、５’から３’への順に、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列、ＩＲＥＳ、ＳＧプロモーター、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される調節エレメントに作動可能に連結されたＨ５赤血球凝集素タンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、並びにＳＧプロモーター及びＩＲＥＳからなる群から選択される調節エレメントに作動可能に連結されたＭ１マトリックスタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列を含む。

【0265】

一実施例において、本開示は、ＲＮＡを提供し、ＲＮＡは、５’から３’への順に、
ａ）Ｈ５赤血球凝集素タンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、及びＭ１マトリックスタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列、又は
ｂ）Ｍ１マトリックスタンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、及びＨ５赤血球凝集素タンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列を含む。

【0266】

一実施例において、本開示は、ＲＮＡを提供し、ＲＮＡは、５’から３’への順に、Ｈ５赤血球凝集素タンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、及びＭ１マトリックスタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列を含む。

【0267】

一実施例において、本開示は、ＲＮＡを提供し、ＲＮＡは、５’から３’への順に、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列、ＩＲＥＳ、ＳＧプロモーター、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される調節エレメントに作動可能に連結されたＨ５赤血球凝集素タンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、並びにＳＧプロモーター及びＩＲＥＳからなる群から選択される調節エレメントに作動可能に連結されたＭ１マトリックスタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列を含む。

【0268】

一実施例において、本開示は、ｃＲＮＡを提供し、ｃＲＮＡは、５’から３’への順に、
ａ）Ｈ５赤血球凝集素タンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、及びＭ１マトリックスタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列、又は
ｂ）Ｍ１マトリックスタンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、及びＨ５赤血球凝集素タンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列を含む。

【0269】

一実施例において、本開示は、ｃＲＮＡを提供し、ｃＲＮＡは、５’から３’への順に、Ｈ５赤血球凝集素タンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、及びＭ１マトリックスタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列を含む。

【0270】

一実施例において、本開示は、ｃＲＮＡを提供し、ｃＲＮＡは、５’から３’への順に、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列、ＩＲＥＳ、ＳＧプロモーター、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される調節エレメントに作動可能に連結されたＨ５赤血球凝集素タンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、並びにＳＧプロモーター及びＩＲＥＳからなる群から選択される調節エレメントに作動可能に連結されたＭ１マトリックスタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列を含む。

【0271】

一実施例において、本開示は、マルチシストロン性自己複製ＲＮＡを提供し、ＲＮＡは、５’から３’への順に、
ａ）Ｈ５赤血球凝集素タンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、及びＭ１マトリックスタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列、又は
ｂ）Ｍ１マトリックスタンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、及びＨ５赤血球凝集素タンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列を含む。

【0272】

一実施例において、本開示は、マルチシストロン性自己複製ＲＮＡを提供し、ＲＮＡは、５’から３’への順に、Ｈ５赤血球凝集素タンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、及びＭ１マトリックスタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列を含む。

【0273】

一実施例において、本開示は、マルチシストロン性自己複製ＲＮＡを提供し、ＲＮＡは、５’から３’への順に、ＳＧプロモーターに作動可能に連結されたＨ５赤血球凝集素タンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、並びにＳＧプロモーター及びＩＲＥＳからなる群から選択される調節エレメントに作動可能に連結されたＭ１マトリックスタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列を含む。

【0274】

一実施例において、本開示は、マルチシストロン性自己複製ＲＮＡを提供し、ＲＮＡは、５’から３’への順に、
ａ）配列番号１に記述されている配列によってコードされる最小ＳＧプロモーターに作動可能に連結されたＨ５赤血球凝集素タンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、及び
ｂ）配列番号１に記述されている配列によってコードされる最小ＳＧプロモーターに作動可能に連結されたＭ１マトリックスタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列を含む。

【0275】

一実施例において、抗原は、インフルエンザＡウイルス赤血球凝集素（ＨＡ）タンパク質、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）タンパク質、及びマトリックス（Ｍ）タンパク質である。例えば、抗原は、Ｈ５赤血球凝集素タンパク質、及び／又はＮ１ノイラミニダーゼタンパク質、及び／又はＭ１マトリックスタンパク質である。一実施例において、抗原は、配列番号５に記述されている配列によってコードされるＨ５赤血球凝集素サブタイプインフルエンザＡウイルス株、配列番号６に記述されている配列によってコードされるＮ１ノイラミニダーゼサブタイプインフルエンザＡウイルス株、及び配列番号１６又は配列番号２９に記述されている配列によってコードされるＭ１マトリックスタンパク質サブタイプインフルエンザＡウイルス株である。

【0276】

一実施例において、本開示は、ポリヌクレオチドを提供し、ポリヌクレオチドは、５’から３’への順に、
ａ）Ｈ５赤血球凝集素タンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、Ｎ１ノイラミニダーゼタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列、及びＭ１マトリックスタンパク質をコードする第３のヌクレオチド配列、又は
ｂ）Ｍ１マトリックスタンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、Ｎ１ノイラミニダーゼタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列、及びＨ５赤血球凝集素タンパク質をコードする第３のヌクレオチド配列を含む。

【0277】

一実施例において、本開示は、ポリヌクレオチドを提供し、ポリヌクレオチドは、５’から３’への順に、Ｈ５赤血球凝集素タンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、Ｎ１ノイラミニダーゼタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列、及びＭ１マトリックスタンパク質をコードする第３のヌクレオチド配列を含む。

【0278】

一実施例において、本開示は、ポリヌクレオチドを提供し、ポリヌクレオチドは、５’から３’への順に、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列、ＩＲＥＳ、ＳＧプロモーター、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される調節エレメントに作動可能に連結されたＨ５赤血球凝集素タンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、ＳＧプロモーター及びＩＲＥＳからなる群から選択される調節エレメントに作動可能に連結されたＮ１ノイラミニダーゼタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列、並びにＳＧプロモーター及びＩＲＥＳからなる群から選択される調節エレメントに作動可能に連結されたＭ１マトリックスタンパク質をコードする第３のヌクレオチド配列を含む。

【0279】

一実施例において、本開示は、ポリヌクレオチドを提供し、ポリヌクレオチドは、５’から３’への順に、Ｍ１マトリックスタンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、Ｎ１ノイラミニダーゼタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列、及びＨ５赤血球凝集素タンパク質をコードする第３のヌクレオチド配列を含む。

【0280】

一実施例において、本開示は、ポリヌクレオチドを提供し、ポリヌクレオチドは、５’から３’への順に、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列、ＩＲＥＳ、ＳＧプロモーター、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される調節エレメントに作動可能に連結されたＭ１マトリックスタンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、ＳＧプロモーター及びＩＲＥＳからなる群から選択される調節エレメントに作動可能に連結されたＮ１ノイラミニダーゼタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列、並びにＳＧプロモーター及びＩＲＥＳからなる群から選択される調節エレメントに作動可能に連結されたＨ５赤血球凝集素タンパク質をコードする第３のヌクレオチド配列を含む。

【0281】

一実施例において、本開示は、ＲＮＡを提供し、ＲＮＡは、５’から３’への順に、
ａ）Ｈ５赤血球凝集素タンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、Ｎ１ノイラミニダーゼタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列、及びＭ１マトリックスタンパク質をコードする第３のヌクレオチド配列、又は
ｂ）Ｍ１マトリックスタンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、Ｎ１ノイラミニダーゼタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列、及びＨ５赤血球凝集素タンパク質をコードする第３のヌクレオチド配列を含む。

【0282】

一実施例において、本開示は、ＲＮＡを提供し、ＲＮＡは、５’から３’への順に、Ｈ５赤血球凝集素タンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、Ｎ１ノイラミニダーゼタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列、及びＭ１マトリックスタンパク質をコードする第３のヌクレオチド配列を含む。

【0283】

一実施例において、本開示は、ＲＮＡを提供し、ＲＮＡは、５’から３’への順に、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列、ＩＲＥＳ、ＳＧプロモーター、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される調節エレメントに作動可能に連結されたＨ５赤血球凝集素タンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、ＳＧプロモーター及びＩＲＥＳからなる群から選択される調節エレメントに作動可能に連結されたＮ１ノイラミニダーゼタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列、並びにＳＧプロモーター及びＩＲＥＳからなる群から選択される調節エレメントに作動可能に連結されたＭ１マトリックスタンパク質をコードする第３のヌクレオチド配列を含む。

【0284】

一実施例において、本開示は、ＲＮＡを提供し、ＲＮＡは、５’から３’への順に、Ｍ１マトリックスタンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、Ｎ１ノイラミニダーゼタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列、及びＨ５赤血球凝集素タンパク質をコードする第３のヌクレオチド配列を含む。

【0285】

一実施例において、本開示は、ＲＮＡを提供し、ＲＮＡは、５’から３’への順に、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列、ＩＲＥＳ、ＳＧプロモーター、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される調節エレメントに作動可能に連結されたＭ１マトリックスタンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、ＳＧプロモーター及びＩＲＥＳからなる群から選択される調節エレメントに作動可能に連結されたＮ１ノイラミニダーゼタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列、並びにＳＧプロモーター及びＩＲＥＳからなる群から選択される調節エレメントに作動可能に連結されたＨ５赤血球凝集素タンパク質をコードする第３のヌクレオチド配列を含む。

【0286】

一実施例において、本開示は、ｃＲＮＡを提供し、ｃＲＮＡは、５’から３’への順に、
ａ）Ｈ５赤血球凝集素タンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、Ｎ１ノイラミニダーゼタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列、及びＭ１マトリックスタンパク質をコードする第３のヌクレオチド配列、又は
ｂ）Ｍ１マトリックスタンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、Ｎ１ノイラミニダーゼタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列、及びＨ５赤血球凝集素タンパク質をコードする第３のヌクレオチド配列を含む。

【0287】

一実施例において、本開示は、ｃＲＮＡを提供し、ｃＲＮＡは、５’から３’への順に、Ｈ５赤血球凝集素タンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、Ｎ１ノイラミニダーゼタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列、及びＭ１マトリックスタンパク質をコードする第３のヌクレオチド配列を含む。

【0288】

一実施例において、本開示は、ｃＲＮＡを提供し、ｃＲＮＡは、５’から３’への順に、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列、ＩＲＥＳ、ＳＧプロモーター、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される調節エレメントに作動可能に連結されたＨ５赤血球凝集素タンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、ＳＧプロモーター及びＩＲＥＳからなる群から選択される調節エレメントに作動可能に連結されたＮ１ノイラミニダーゼタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列、並びにＳＧプロモーター及びＩＲＥＳからなる群から選択される調節エレメントに作動可能に連結されたＭ１マトリックスタンパク質をコードする第３のヌクレオチド配列を含む。

【0289】

一実施例において、本開示は、ｃＲＮＡを提供し、ＲＮＡは、５’から３’への順に、Ｍ１マトリックスタンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、Ｎ１ノイラミニダーゼタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列、及びＨ５赤血球凝集素タンパク質をコードする第３のヌクレオチド配列を含む。

【0290】

一実施例において、本開示は、ｃＲＮＡを提供し、ＲＮＡは、５’から３’への順に、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列、ＩＲＥＳ、ＳＧプロモーター、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される調節エレメントに作動可能に連結されたＭ１マトリックスタンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、ＳＧプロモーター及びＩＲＥＳからなる群から選択される調節エレメントに作動可能に連結されたＮ１ノイラミニダーゼタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列、並びにＳＧプロモーター及びＩＲＥＳからなる群から選択される調節エレメントに作動可能に連結されたＨ５赤血球凝集素タンパク質をコードする第３のヌクレオチド配列を含む。

【0291】

一実施例において、本開示は、マルチシストロン性自己複製ＲＮＡを提供し、ＲＮＡは、５’から３’への順に、
ａ）Ｈ５赤血球凝集素タンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、Ｎ１ノイラミニダーゼタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列、及びＭ１マトリックスタンパク質をコードする第３のヌクレオチド配列、又は
ｂ）Ｍ１マトリックスタンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、Ｎ１ノイラミニダーゼタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列、及びＨ５赤血球凝集素タンパク質をコードする第３のヌクレオチド配列を含む。

【0292】

一実施例において、本開示は、マルチシストロン性自己複製ＲＮＡを提供し、ＲＮＡは、５’から３’への順に、Ｈ５赤血球凝集素タンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、Ｎ１ノイラミニダーゼタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列、及びＭ１マトリックスタンパク質をコードする第３のヌクレオチド配列を含む。

【0293】

一実施例において、本開示は、マルチシストロン性自己複製ＲＮＡを提供し、ＲＮＡは、５’から３’への順に、ＳＧプロモーターに作動可能に連結されたＨ５赤血球凝集素タンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、ＳＧプロモーター及びＩＲＥＳからなる群から選択される調節エレメントに作動可能に連結されたＮ１ノイラミニダーゼタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列、並びにＳＧプロモーター及びＩＲＥＳからなる群から選択される調節エレメントに作動可能に連結されたＭ１マトリックスタンパク質をコードする第３のヌクレオチド配列を含む。

【0294】

一実施例において、本開示は、マルチシストロン性自己複製ＲＮＡを提供し、ＲＮＡは、５’から３’への順に、
ａ）配列番号１に記述されている配列によってコードされる最小ＳＧプロモーターに作動可能に連結されたＨ５赤血球凝集素タンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、
ｂ）配列番号１に記述されている配列によってコードされる最小ＳＧプロモーターに作動可能に連結されたＮ１ノイラミニダーゼタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列、及び
ｃ）配列番号１に記述されている配列によってコードされる最小ＳＧプロモーターに作動可能に連結されたＭ１マトリックスタンパク質をコードする第３のヌクレオチド配列を含む。

【0295】

一実施例において、本開示は、マルチシストロン性自己複製ＲＮＡを提供し、ＲＮＡは、５’から３’への順に、Ｍ１マトリックスタンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、Ｎ１ノイラミニダーゼタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列、及びＨ５赤血球凝集素タンパク質をコードする第３のヌクレオチド配列を含む。

【0296】

一実施例において、本開示は、マルチシストロン性自己複製ＲＮＡを提供し、ＲＮＡは、５’から３’への順に、ＳＧプロモーターに作動可能に連結されたＭ１マトリックスタンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、ＳＧプロモーター及びＩＲＥＳからなる群から選択される調節エレメントに作動可能に連結されたＮ１ノイラミニダーゼタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列、並びにＳＧプロモーター及びＩＲＥＳからなる群から選択される調節エレメントに作動可能に連結されたＨ５赤血球凝集素タンパク質をコードする第３のヌクレオチド配列を含む。

【0297】

一実施例において、本開示は、マルチシストロン性自己複製ＲＮＡを提供し、ＲＮＡは、５’から３’への順に、
ａ）配列番号１に記述されている配列によってコードされる最小ＳＧプロモーターに作動可能に連結されたＭ１マトリックスタンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、
ｂ）配列番号１に記述されている配列によってコードされる最小ＳＧプロモーターに作動可能に連結されたＮ１ノイラミニダーゼタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列、及び
ｃ）配列番号１に記述されている配列によってコードされる最小ＳＧプロモーターに作動可能に連結されたＨ５赤血球凝集素タンパク質をコードする第３のヌクレオチド配列を含む。

【0298】

一実施例において、抗原は、インフルエンザＡウイルスＨＡタンパク質、ＮＡタンパク質、及びＭタンパク質である。例えば、抗原は、Ｈ５赤血球凝集素タンパク質、及び／又はＮ１ノイラミニダーゼタンパク質、及び／又はＭ１マトリックスタンパク質、及び／又はＭ２マトリックスタンパク質である。一実施例において、抗原は、配列番号５に記述されている配列によってコードされるＨ５赤血球凝集素サブタイプインフルエンザＡウイルス株、配列番号６に記述されている配列によってコードされるＮ１ノイラミニダーゼサブタイプインフルエンザＡウイルス株、配列番号１６又は配列番号２９に記述されている配列によってコードされるＭ１マトリックスタンパク質サブタイプインフルエンザＡウイルス株、及び配列番号１７に記述されている配列によってコードされるＭ２マトリックスタンパク質サブタイプインフルエンザＡウイルス株である。

【0299】

一実施例において、本開示は、ポリヌクレオチドを提供し、ポリヌクレオチドは、５’から３’への順に、Ｍ１マトリックスタンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、Ｍ２マトリックスタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列、Ｎ１ノイラミニダーゼタンパク質をコードする第３のヌクレオチド配列、及びＨ５赤血球凝集素タンパク質をコードする第４のヌクレオチド配列を含む。

【0300】

一実施例において、本開示は、ポリヌクレオチドを提供し、ポリヌクレオチドは、５’から３’への順に、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列、ＩＲＥＳ、ＳＧプロモーター、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される調節エレメントに作動可能に連結されたＭ１マトリックスタンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、ＳＧプロモーター及びＩＲＥＳからなる群から選択される調節エレメントに作動可能に連結されたＭ２マトリックスタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列、ＳＧプロモーター及びＩＲＥＳからなる群から選択される調節エレメントに作動可能に連結されたＮ１ノイラミニダーゼタンパク質をコードする第３のヌクレオチド配列、並びにＳＧプロモーター及びＩＲＥＳからなる群から選択される調節エレメントに作動可能に連結されたＨ５赤血球凝集素タンパク質をコードする第４のヌクレオチド配列を含む。

【0301】

一実施例において、本開示は、ＲＮＡを提供し、ＲＮＡは、５’から３’への順に、Ｍ１マトリックスタンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、Ｍ２マトリックスタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列、Ｎ１ノイラミニダーゼタンパク質をコードする第３のヌクレオチド配列、及びＨ５赤血球凝集素タンパク質をコードする第４のヌクレオチド配列を含む。

【0302】

一実施例において、本開示は、ＲＮＡを提供し、ＲＮＡは、５’から３’への順に、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列、ＩＲＥＳ、ＳＧプロモーター、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される調節エレメントに作動可能に連結されたＭ１マトリックスタンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、ＳＧプロモーター及びＩＲＥＳからなる群から選択される調節エレメントに作動可能に連結されたＭ２マトリックスタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列、ＳＧプロモーター及びＩＲＥＳからなる群から選択される調節エレメントに作動可能に連結されたＮ１ノイラミニダーゼタンパク質をコードする第３のヌクレオチド配列、並びにＳＧプロモーター及びＩＲＥＳからなる群から選択される調節エレメントに作動可能に連結されたＨ５赤血球凝集素タンパク質をコードする第４のヌクレオチド配列を含む。

【0303】

一実施例において、本開示は、ｃＲＮＡを提供し、ＲＮＡは、５’から３’への順に、Ｍ１マトリックスタンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、Ｍ２マトリックスタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列、Ｎ１ノイラミニダーゼタンパク質をコードする第３のヌクレオチド配列、及びＨ５赤血球凝集素タンパク質をコードする第４のヌクレオチド配列を含む。

【0304】

一実施例において、本開示は、ｃＲＮＡを提供し、ＲＮＡは、５’から３’への順に、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列、ＩＲＥＳ、ＳＧプロモーター、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される調節エレメントに作動可能に連結されたＭ１マトリックスタンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、ＳＧプロモーター及びＩＲＥＳからなる群から選択される調節エレメントに作動可能に連結されたＭ２マトリックスタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列、ＳＧプロモーター及びＩＲＥＳからなる群から選択される調節エレメントに作動可能に連結されたＮ１ノイラミニダーゼタンパク質をコードする第３のヌクレオチド配列、並びにＳＧプロモーター及びＩＲＥＳからなる群から選択される調節エレメントに作動可能に連結されたＨ５赤血球凝集素タンパク質をコードする第４のヌクレオチド配列を含む。

【0305】

一実施例において、本開示は、マルチシストロン性自己複製ＲＮＡを提供し、ＲＮＡは、５’から３’への順に、Ｍ１マトリックスタンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、Ｍ２マトリックスタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列、Ｎ１ノイラミニダーゼタンパク質をコードする第３のヌクレオチド配列、及びＨ５赤血球凝集素タンパク質をコードする第４のヌクレオチド配列を含む。

【0306】

一実施例において、本開示は、マルチシストロン性自己複製ＲＮＡを提供し、ＲＮＡは、５’から３’への順に、ＳＧプロモーターに作動可能に連結されたＭ１マトリックスタンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、ＳＧプロモーター及びＩＲＥＳからなる群から選択される調節エレメントに作動可能に連結されたＭ２マトリックスタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列、ＳＧプロモーター及びＩＲＥＳからなる群から選択される調節エレメントに作動可能に連結されたＮ１ノイラミニダーゼタンパク質をコードする第３のヌクレオチド配列、並びにＳＧプロモーター及びＩＲＥＳからなる群から選択される調節エレメントに作動可能に連結されたＨ５赤血球凝集素タンパク質をコードする第４のヌクレオチド配列を含む。

【0307】

一実施例において、本開示は、マルチシストロン性自己複製ＲＮＡを提供し、ＲＮＡは、５’から３’への順に、
ａ）配列番号１に記述されている配列によってコードされる最小ＳＧプロモーターに作動可能に連結されたＭ１マトリックスタンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、
ｂ）配列番号１に記述されている配列によってコードされる最小ＳＧプロモーターに作動可能に連結されたＭ２マトリックスタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列
ｃ）配列番号１に記述されている配列によってコードされる最小ＳＧプロモーターに作動可能に連結されたＮ１ノイラミニダーゼタンパク質をコードする第３のヌクレオチド配列、及び
ｄ）配列番号１に記述されている配列によってコードされる最小ＳＧプロモーターに作動可能に連結されたＨ５赤血球凝集素タンパク質をコードする第４のヌクレオチド配列を含む。

【0308】

一実施例において、抗原は、インフルエンザＡウイルスＨＡタンパク質及びＮＳタンパク質である。例えば、抗原は、Ｈ５赤血球凝集素タンパク質及び／又はＮＳ１非構造タンパク質である。一実施例において、抗原は、配列番号５に記述されている配列によってコードされるＨ５赤血球凝集素サブタイプインフルエンザＡウイルス株、及び配列番号１８に記述されている配列によってコードされるＮＳ１非構造タンパク質サブタイプインフルエンザＡウイルス株である。

【0309】

一実施例において、本開示は、ポリヌクレオチドを提供し、ポリヌクレオチドは、５’から３’への順に、
ａ）Ｈ５赤血球凝集素タンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、及びＮＳ１非構造タンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列、又は
ｂ）ＮＳ１非構造タンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、及びＨ５赤血球凝集素タンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列を含む。

【0310】

一実施例において、本開示は、ポリヌクレオチドを提供し、ポリヌクレオチドは、５’から３’への順に、Ｈ５赤血球凝集素タンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、及びＮＳ１非構造タンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列を含む。

【0311】

一実施例において、本開示は、ポリヌクレオチドを提供し、ポリヌクレオチドは、５’から３’への順に、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列、ＩＲＥＳ、ＳＧプロモーター、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される調節エレメントに作動可能に連結されたＨ５赤血球凝集素タンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、ＳＧプロモーター及びＩＲＥＳからなる群から選択される調節エレメントに作動可能に連結されたＮＳ１非構造タンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列を含む。

【0312】

一実施例において、本開示は、ポリヌクレオチドを提供し、ポリヌクレオチドは、５’から３’への順に、ＮＳ１非構造タンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、及びＨ５赤血球凝集素タンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列を含む。

【0313】

一実施例において、本開示は、ポリヌクレオチドを提供し、ポリヌクレオチドは、５’から３’への順に、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列、ＩＲＥＳ、ＳＧプロモーター、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される調節エレメントに作動可能に連結されたＮＳ１非構造タンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、ＳＧプロモーター及びＩＲＥＳからなる群から選択される調節エレメントに作動可能に連結されたＨ５赤血球凝集素タンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列を含む。

【0314】

一実施例において、本開示は、ＲＮＡを提供し、ＲＮＡは、５’から３’への順に、
ａ）Ｈ５赤血球凝集素タンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、及びＮＳ１非構造タンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列、又は
ｂ）ＮＳ１非構造タンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、及びＨ５赤血球凝集素タンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列を含む。

【0315】

一実施例において、本開示は、ＲＮＡを提供し、ＲＮＡは、５’から３’への順に、Ｈ５赤血球凝集素タンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、及びＮＳ１非構造タンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列を含む。

【0316】

一実施例において、本開示は、ＲＮＡを提供し、ＲＮＡは、５’から３’への順に、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列、ＩＲＥＳ、ＳＧプロモーター、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される調節エレメントに作動可能に連結されたＨ５赤血球凝集素タンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、ＳＧプロモーター及びＩＲＥＳからなる群から選択される調節エレメントに作動可能に連結されたＮＳ１非構造タンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列を含む。

【0317】

一実施例において、本開示は、ＲＮＡを提供し、ＲＮＡは、５’から３’への順に、ＮＳ１非構造タンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、及びＨ５赤血球凝集素タンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列を含む。

【0318】

一実施例において、本開示は、ＲＮＡを提供し、ＲＮＡは、５’から３’への順に、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列、ＩＲＥＳ、ＳＧプロモーター、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される調節エレメントに作動可能に連結されたＮＳ１非構造タンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、ＳＧプロモーター及びＩＲＥＳからなる群から選択される調節エレメントに作動可能に連結されたＨ５赤血球凝集素タンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列を含む。

【0319】

一実施例において、本開示は、ｃＲＮＡを提供し、ｃＲＮＡは、５’から３’への順に、
ａ）Ｈ５赤血球凝集素タンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、及びＮＳ１非構造タンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列、又は
ｂ）ＮＳ１非構造タンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、及びＨ５赤血球凝集素タンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列を含む。

【0320】

一実施例において、本開示は、ｃＲＮＡを提供し、ｃＲＮＡは、５’から３’への順に、Ｈ５赤血球凝集素タンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、及びＮＳ１非構造タンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列を含む。

【0321】

一実施例において、本開示は、ｃＲＮＡを提供し、ｃＲＮＡは、５’から３’への順に、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列、ＩＲＥＳ、ＳＧプロモーター、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される調節エレメントに作動可能に連結されたＨ５赤血球凝集素タンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、ＳＧプロモーター及びＩＲＥＳからなる群から選択される調節エレメントに作動可能に連結されたＮＳ１非構造タンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列を含む。

【0322】

一実施例において、本開示は、ｃＲＮＡを提供し、ｃＲＮＡは、５’から３’への順に、ＮＳ１非構造タンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、及びＨ５赤血球凝集素タンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列を含む。

【0323】

一実施例において、本開示は、ｃＲＮＡを提供し、ｃＲＮＡは、５’から３’への順に、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列、ＩＲＥＳ、ＳＧプロモーター、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される調節エレメントに作動可能に連結されたＮＳ１非構造タンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、ＳＧプロモーター及びＩＲＥＳからなる群から選択される調節エレメントに作動可能に連結されたＨ５赤血球凝集素タンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列を含む。

【0324】

一実施例において、本開示は、マルチシストロン性自己複製ＲＮＡを提供し、ＲＮＡは、５’から３’への順に、
ａ）Ｈ５赤血球凝集素タンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、及びＮＳ１非構造タンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列、又は
ｂ）ＮＳ１非構造タンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、及びＨ５赤血球凝集素タンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列を含む。

【0325】

一実施例において、本開示は、マルチシストロン性自己複製ＲＮＡを提供し、ＲＮＡは、５’から３’への順に、Ｈ５赤血球凝集素タンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、及びＮＳ１非構造タンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列を含む。

【0326】

一実施例において、本開示は、マルチシストロン性自己複製ＲＮＡを提供し、ＲＮＡは、５’から３’への順に、ＳＧプロモーターに作動可能に連結されたＨ５赤血球凝集素タンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、ＳＧプロモーター及びＩＲＥＳからなる群から選択される調節エレメントに作動可能に連結されたＮＳ１非構造タンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列を含む。

【0327】

一実施例において、本開示は、マルチシストロン性自己複製ＲＮＡを提供し、ＲＮＡは、５’から３’への順に、
ａ）配列番号１に記述されている配列によってコードされる最小ＳＧプロモーターに作動可能に連結されたＨ５赤血球凝集素タンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、及び
ｂ）配列番号１に記述されている配列によってコードされる最小ＳＧプロモーターに作動可能に連結されたＮＳ１非構造タンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列を含む。

【0328】

一実施例において、本開示は、マルチシストロン性自己複製ＲＮＡを提供し、ＲＮＡは、５’から３’への順に、ＮＳ１非構造タンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、及びＨ５赤血球凝集素タンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列を含む。

【0329】

一実施例において、本開示は、マルチシストロン性自己複製ＲＮＡを提供し、ＲＮＡは、５’から３’への順に、ＳＧプロモーターに作動可能に連結されたＮＳ１非構造タンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、ＳＧプロモーター及びＩＲＥＳからなる群から選択される調節エレメントに作動可能に連結されたＨ５赤血球凝集素タンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列を含む。

【0330】

一実施例において、本開示は、マルチシストロン性自己複製ＲＮＡを提供し、ＲＮＡは、５’から３’への順に、
ａ）配列番号１に記述されている配列によってコードされる最小ＳＧプロモーターに作動可能に連結されたＮＳ１非構造タンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、及び
ｂ）配列番号１に記述されている配列によってコードされる最小ＳＧプロモーターに作動可能に連結されたＨ５赤血球凝集素タンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列を含む。

【0331】

一実施例において、抗原は、インフルエンザＡウイルスＭタンパク質及びＮＰである。例えば、抗原は、Ｍ１マトリックスタンパク質及び／又はＮＰタンパク質である。一実施例において、ＮＰタンパク質は、Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／０９株である。一実施例において、抗原は、配列番号１６又は配列番号２９に記述されている配列によってコードされるＭ１マトリックスタンパク質サブタイプインフルエンザＡウイルス株、及び配列番号２８に記述されている配列によってコードされるＮＰヌクレオタンパク質である。

【0332】

一実施例において、本開示は、ポリヌクレオチドを提供し、ポリヌクレオチドは、５’から３’への順に、
ａ）Ｍ１マトリックスタンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、及びＮＰヌクレオタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列、又は
ｂ）ＮＰヌクレオタンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、及びＭ１マトリックスタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列を含む。

【0333】

一実施例において、本開示は、ポリヌクレオチドを提供し、ポリヌクレオチドは、５’から３’への順に、Ｍ１マトリックスタンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、及びＮＰヌクレオタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列を含む。

【0334】

一実施例において、本開示は、ポリヌクレオチドを提供し、ポリヌクレオチドは、５’から３’への順に、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列、ＩＲＥＳ、ＳＧプロモーター、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される調節エレメントに作動可能に連結されたＭ１マトリックスタンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、ＳＧプロモーター及びＩＲＥＳからなる群から選択される調節エレメントに作動可能に連結されたＮＰヌクレオタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列を含む。

【0335】

一実施例において、本開示は、ＲＮＡを提供し、ＲＮＡは、５’から３’への順に、
ａ）Ｍ１マトリックスタンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、及びＮＰヌクレオタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列、又は
ｂ）ＮＰヌクレオタンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、及びＭ１マトリックスタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列を含む。

【0336】

一実施例において、本開示は、ＲＮＡを提供し、ＲＮＡは、５’から３’への順に、Ｍ１マトリックスタンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、及びＮＰヌクレオタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列を含む。

【0337】

一実施例において、本開示は、ＲＮＡを提供し、ＲＮＡは、５’から３’への順に、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列、ＩＲＥＳ、ＳＧプロモーター、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される調節エレメントに作動可能に連結されたＭ１マトリックスタンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、ＳＧプロモーター及びＩＲＥＳからなる群から選択される調節エレメントに作動可能に連結されたＮＰヌクレオタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列を含む。

【0338】

一実施例において、本開示は、マルチシストロン性自己複製ＲＮＡを提供し、ＲＮＡは、５’から３’への順に、
ａ）Ｍ１マトリックスタンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、及びＮＰヌクレオタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列、又は
ｂ）ＮＰヌクレオタンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、及びＭ１マトリックスタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列を含む。

【0339】

一実施例において、本開示は、マルチシストロン性自己複製ＲＮＡを提供し、ＲＮＡは、５’から３’への順に、Ｍ１マトリックスタンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、及びＮＰヌクレオタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列を含む。

【0340】

一実施例において、本開示は、マルチシストロン性自己複製ＲＮＡを提供し、ＲＮＡは、５’から３’への順に、ＳＧプロモーターに作動可能に連結されたＭ１マトリックスタンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、ＳＧプロモーター及びＩＲＥＳからなる群から選択される調節エレメントに作動可能に連結されたＮＰヌクレオタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列を含む。

【0341】

一実施例において、本開示は、マルチシストロン性自己複製ＲＮＡを提供し、ＲＮＡは、５’から３’への順に、
ａ）配列番号１に記述されている配列によってコードされる最小ＳＧプロモーターに作動可能に連結されたＭ１マトリックスタンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、及び
ｂ）配列番号１に記述されている配列によってコードされる最小ＳＧプロモーターに作動可能に連結されたＮＰヌクレオタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列を含む。

【0342】

一実施例において、本開示は、マルチシストロン性自己複製ＲＮＡを提供し、ＲＮＡは、５’から３’への順に、
ａ）配列番号１に記述されている配列によってコードされる最小ＳＧプロモーターに作動可能に連結されたＭ１マトリックスタンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、及び
ｂ）配列番号２に記述されている配列によってコードされる延長ＳＧプロモーターに作動可能に連結されたＮＰヌクレオタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列を含む。

【0343】

一実施例において、本開示は、ポリヌクレオチドを提供し、ポリヌクレオチドは、５’から３’への順に、
ｃ）Ｈ３赤血球凝集素タンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、及びＮ２ノイラミニダーゼタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列、又は
ｄ）Ｎ２ノイラミニダーゼタンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、及びＨ３赤血球凝集素タンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列を含む。

【0344】

一実施例において、本開示は、ポリヌクレオチドを提供し、ポリヌクレオチドは、５’から３’への順に、Ｈ３赤血球凝集素タンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、及びＮ２ノイラミニダーゼタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列を含む。

【0345】

一実施例において、本開示は、ポリヌクレオチドを提供し、ポリヌクレオチドは、５’から３’への順に、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列、ＩＲＥＳ、ＳＧプロモーター、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される調節エレメントに作動可能に連結されたＨ３赤血球凝集素タンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、ＳＧプロモーター及びＩＲＥＳからなる群から選択される調節エレメントに作動可能に連結されたＮ２ノイラミニダーゼタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列を含む。

【0346】

一実施例において、本開示は、ポリヌクレオチドを提供し、ポリヌクレオチドは、５’から３’への順に、Ｎ２ノイラミニダーゼタンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、及びＨ３赤血球凝集素タンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列を含む。

【0347】

一実施例において、本開示は、ポリヌクレオチドを提供し、ポリヌクレオチドは、５’から３’への順に、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列、ＩＲＥＳ、ＳＧプロモーター、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される調節エレメントに作動可能に連結されたＮ２ノイラミニダーゼタンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、ＳＧプロモーター及びＩＲＥＳからなる群から選択される調節エレメントに作動可能に連結されたＨ３赤血球凝集素タンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列を含む。

【0348】

一実施例において、本開示は、ＲＮＡを提供し、ＲＮＡは、５’から３’への順に、
ｃ）Ｈ３赤血球凝集素タンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、及びＮ２ノイラミニダーゼタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列、又は
ｄ）Ｎ２ノイラミニダーゼタンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、及びＨ３赤血球凝集素タンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列を含む。

【0349】

一実施例において、本開示は、ＲＮＡを提供し、ＲＮＡは、５’から３’への順に、Ｈ３赤血球凝集素タンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、及びＮ２ノイラミニダーゼタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列を含む。

【0350】

一実施例において、本開示は、ＲＮＡを提供し、ＲＮＡは、５’から３’への順に、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列、ＩＲＥＳ、ＳＧプロモーター、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される調節エレメントに作動可能に連結されたＨ３赤血球凝集素タンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、ＳＧプロモーター及びＩＲＥＳからなる群から選択される調節エレメントに作動可能に連結されたＮ２ノイラミニダーゼタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列を含む。

【0351】

一実施例において、本開示は、ＲＮＡを提供し、ＲＮＡは、５’から３’への順に、Ｎ２ノイラミニダーゼタンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、及びＨ３赤血球凝集素タンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列を含む。

【0352】

一実施例において、本開示は、ＲＮＡを提供し、ＲＮＡは、５’から３’への順に、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列、ＩＲＥＳ、ＳＧプロモーター、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される調節エレメントに作動可能に連結されたＮ２ノイラミニダーゼタンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、ＳＧプロモーター及びＩＲＥＳからなる群から選択される調節エレメントに作動可能に連結されたＨ３赤血球凝集素タンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列を含む。

【0353】

一実施例において、本開示は、ｃＲＮＡを提供し、ｃＲＮＡは、５’から３’への順に、
ｃ）Ｈ３赤血球凝集素タンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、及びＮ２ノイラミニダーゼタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列、又は
ｄ）Ｎ２ノイラミニダーゼタンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、及びＨ３赤血球凝集素タンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列を含む。

【0354】

一実施例において、本開示は、ｃＲＮＡを提供し、ｃＲＮＡは、５’から３’への順に、Ｈ３赤血球凝集素タンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、及びＮ２ノイラミニダーゼタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列を含む。

【0355】

一実施例において、本開示は、ｃＲＮＡを提供し、ｃＲＮＡは、５’から３’への順に、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列、ＩＲＥＳ、ＳＧプロモーター、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される調節エレメントに作動可能に連結されたＨ３赤血球凝集素タンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、ＳＧプロモーター及びＩＲＥＳからなる群から選択される調節エレメントに作動可能に連結されたＮ２ノイラミニダーゼタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列を含む。

【0356】

一実施例において、本開示は、ｃＲＮＡを提供し、ｃＲＮＡは、５’から３’への順に、Ｎ２ノイラミニダーゼタンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、及びＨ３赤血球凝集素タンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列を含む。

【0357】

一実施例において、本開示は、ｃＲＮＡを提供し、ｃＲＮＡは、５’から３’への順に、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列、ＩＲＥＳ、ＳＧプロモーター、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される調節エレメントに作動可能に連結されたＮ２ノイラミニダーゼタンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、ＳＧプロモーター及びＩＲＥＳからなる群から選択される調節エレメントに作動可能に連結されたＨ３赤血球凝集素タンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列を含む。

【0358】

一実施例において、本開示は、マルチシストロン性自己複製ＲＮＡを提供し、ＲＮＡは、５’から３’への順に、
ｃ）Ｈ３赤血球凝集素タンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、及びＮ２ノイラミニダーゼタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列、又は
ｄ）Ｎ２ノイラミニダーゼタンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、及びＨ３赤血球凝集素タンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列を含む。

【0359】

一実施例において、本開示は、マルチシストロン性自己複製ＲＮＡを提供し、ＲＮＡは、５’から３’への順に、Ｈ３赤血球凝集素タンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、及びＮ２ノイラミニダーゼタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列を含む。

【0360】

一実施例において、本開示は、マルチシストロン性自己複製ＲＮＡを提供し、ＲＮＡは、５’から３’への順に、ＳＧプロモーターに作動可能に連結されたＨ３赤血球凝集素タンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、ＳＧプロモーター及びＩＲＥＳからなる群から選択される調節エレメントに作動可能に連結されたＮ２ノイラミニダーゼタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列を含む。

【0361】

一実施例において、本開示は、マルチシストロン性自己複製ＲＮＡを提供し、ＲＮＡは、５’から３’への順に、
ｃ）配列番号１に記述されている配列によってコードされる最小ＳＧプロモーターに作動可能に連結されたＨ３赤血球凝集素タンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、及び
ｄ）配列番号１に記述されている配列によってコードされる最小ＳＧプロモーターに作動可能に連結されたＮ２ノイラミニダーゼタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列を含む。

【0362】

一実施例において、本開示は、マルチシストロン性自己複製ＲＮＡを提供し、ＲＮＡは、５’から３’への順に、Ｎ２ノイラミニダーゼタンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、及びＨ３赤血球凝集素タンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列を含む。

【0363】

一実施例において、本開示は、マルチシストロン性自己複製ＲＮＡを提供し、ＲＮＡは、５’から３’への順に、ＳＧプロモーターに作動可能に連結されたＮ２ノイラミニダーゼタンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、ＳＧプロモーター及びＩＲＥＳからなる群から選択される調節エレメントに作動可能に連結されたＨ３赤血球凝集素タンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列を含む。

【0364】

一実施例において、本開示は、マルチシストロン性自己複製ＲＮＡを提供し、ＲＮＡは、５’から３’への順に、
ｃ）配列番号１に記述されている配列によってコードされる最小ＳＧプロモーターに作動可能に連結されたＮ２ノイラミニダーゼタンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、及び
ｄ）配列番号１に記述されている配列によってコードされる最小ＳＧプロモーターに作動可能に連結されたＨ３赤血球凝集素タンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列を含む。

【0365】

一実施例において、抗原は、インフルエンザＢウイルス株である。当業者は、インフルエンザＢウイルスがサブタイプに分けられるのではなく、２つの系統、すなわち、Ｂ／Ｙａｍａｇａｔａ及びＢ／Ｖｉｃｔｏｒｉａに分類されることを認識するであろう。

【0366】

一実施例において、抗原は、Ｂ／ＹａｍａｇａｔａインフルエンザＢウイルス株である。例えば、インフルエンザＢウイルス株は、Ｂ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／ＩＮＦＴＴ １６ ０６１０／１６（Ｂｙ）ウイルス株である。別の実施例において、抗原は、Ｂ／ＶｉｃｔｏｒｉａインフルエンザＢウイルス株である。一実施例において、抗原は、同じ系統におけるインフルエンザＢウイルス株である。別の実施例において、抗原は、異なる系統におけるインフルエンザＢウイルス株である。

【0367】

一実施例において、抗原は、インフルエンザＢウイルスＨｙａｍタンパク質及び／又はＮｙａｍタンパク質である。例えば、抗原は、インフルエンザＢウイルスＨｙａｍタンパク質である。別の実施例において、抗原は、インフルエンザＢウイルスＮｙａｍタンパク質である。更なる実施例において、抗原は、インフルエンザＢウイルスＨｙａｍ及びＮｙａｍタンパク質である。一実施例において、抗原は、配列番号５６に記述されている配列によってコードされるＨｙａｍサブタイプインフルエンザＢウイルス株、及び配列番号５７に記述されている配列によってコードされるＮｙａｍサブタイプインフルエンザＢウイルス株である。

【0368】

一実施例において、本開示は、ポリヌクレオチドを提供し、ポリヌクレオチドは、５’から３’への順に、
ｅ）Ｈｙａｍタンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、及びＮｙａｍタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列、又は
ｆ）Ｎｙａｍタンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、及びＨｙａｍタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列を含む。

【0369】

一実施例において、本開示は、ポリヌクレオチドを提供し、ポリヌクレオチドは、５’から３’への順に、Ｈｙａｍタンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、及びＮｙａｍタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列を含む。

【0370】

一実施例において、本開示は、ポリヌクレオチドを提供し、ポリヌクレオチドは、５’から３’への順に、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列、ＩＲＥＳ、ＳＧプロモーター、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される調節エレメントに作動可能に連結されたＨｙａｍタンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、ＳＧプロモーター及びＩＲＥＳからなる群から選択される調節エレメントに作動可能に連結されたＮｙａｍタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列を含む。

【0371】

一実施例において、本開示は、ポリヌクレオチドを提供し、ポリヌクレオチドは、５’から３’への順に、Ｎｙａｍタンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、及びＨｙａｍタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列を含む。

【0372】

一実施例において、本開示は、ポリヌクレオチドを提供し、ポリヌクレオチドは、５’から３’への順に、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列、ＩＲＥＳ、ＳＧプロモーター、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される調節エレメントに作動可能に連結されたＮｙａｍタンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、ＳＧプロモーター及びＩＲＥＳからなる群から選択される調節エレメントに作動可能に連結されたＨｙａｍタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列を含む。

【0373】

一実施例において、本開示は、ＲＮＡを提供し、ＲＮＡは、５’から３’への順に、
ｅ）Ｈｙａｍタンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、及びＮｙａｍタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列、又は
ｆ）Ｎｙａｍタンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、及びＨｙａｍタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列を含む。

【0374】

一実施例において、本開示は、ＲＮＡを提供し、ＲＮＡは、５’から３’への順に、Ｈｙａｍタンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、及びＮｙａｍタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列を含む。

【0375】

一実施例において、本開示は、ＲＮＡを提供し、ＲＮＡは、５’から３’への順に、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列、ＩＲＥＳ、ＳＧプロモーター、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される調節エレメントに作動可能に連結されたＨｙａｍタンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、ＳＧプロモーター及びＩＲＥＳからなる群から選択される調節エレメントに作動可能に連結されたＮｙａｍタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列を含む。

【0376】

一実施例において、本開示は、ＲＮＡを提供し、ＲＮＡは、５’から３’への順に、Ｎｙａｍタンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、及びＨｙａｍタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列を含む。

【0377】

一実施例において、本開示は、ＲＮＡを提供し、ＲＮＡは、５’から３’への順に、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列、ＩＲＥＳ、ＳＧプロモーター、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される調節エレメントに作動可能に連結されたＮｙａｍタンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、ＳＧプロモーター及びＩＲＥＳからなる群から選択される調節エレメントに作動可能に連結されたＨｙａｍタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列を含む。

【0378】

一実施例において、本開示は、ｃＲＮＡを提供し、ｃＲＮＡは、５’から３’への順に、
ｅ）Ｈｙａｍタンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、及びＮｙａｍタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列、又は
ｆ）Ｎｙａｍタンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、及びＨｙａｍタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列を含む。

【0379】

一実施例において、本開示は、ｃＲＮＡを提供し、ｃＲＮＡは、５’から３’への順に、Ｈｙａｍタンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、及びＮｙａｍタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列を含む。

【0380】

一実施例において、本開示は、ｃＲＮＡを提供し、ｃＲＮＡは、５’から３’への順に、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列、ＩＲＥＳ、ＳＧプロモーター、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される調節エレメントに作動可能に連結されたＨｙａｍタンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、ＳＧプロモーター及びＩＲＥＳからなる群から選択される調節エレメントに作動可能に連結されたＮｙａｍタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列を含む。

【0381】

一実施例において、本開示は、ｃＲＮＡを提供し、ｃＲＮＡは、５’から３’への順に、Ｎｙａｍタンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、及びＨｙａｍタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列を含む。

【0382】

一実施例において、本開示は、ｃＲＮＡを提供し、ｃＲＮＡは、５’から３’への順に、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列、ＩＲＥＳ、ＳＧプロモーター、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される調節エレメントに作動可能に連結されたＮｙａｍタンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、ＳＧプロモーター及びＩＲＥＳからなる群から選択される調節エレメントに作動可能に連結されたＨｙａｍタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列を含む。

【0383】

一実施例において、本開示は、マルチシストロン性自己複製ＲＮＡを提供し、ＲＮＡは、５’から３’への順に、
ｅ）Ｈｙａｍタンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、及びＮｙａｍタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列、又は
ｆ）Ｎｙａｍタンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、及びＨｙａｍタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列を含む。

【0384】

一実施例において、本開示は、マルチシストロン性自己複製ＲＮＡを提供し、ＲＮＡは、５’から３’への順に、Ｈｙａｍタンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、及びＮｙａｍタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列を含む。

【0385】

一実施例において、本開示は、マルチシストロン性自己複製ＲＮＡを提供し、ＲＮＡは、５’から３’への順に、ＳＧプロモーターに作動可能に連結されたＨｙａｍタンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、ＳＧプロモーター及びＩＲＥＳからなる群から選択される調節エレメントに作動可能に連結されたＮｙａｍタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列を含む。

【0386】

一実施例において、本開示は、マルチシストロン性自己複製ＲＮＡを提供し、ＲＮＡは、５’から３’への順に、
ｅ）配列番号１に記述されている配列によってコードされる最小ＳＧプロモーターに作動可能に連結されたＨｙａｍタンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、及び
ｆ）配列番号１に記述されている配列によってコードされる最小ＳＧプロモーターに作動可能に連結されたＮｙａｍタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列を含む。

【0387】

一実施例において、本開示は、マルチシストロン性自己複製ＲＮＡを提供し、ＲＮＡは、５’から３’への順に、Ｎｙａｍタンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、及びＨｙａｍタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列を含む。

【0388】

一実施例において、本開示は、マルチシストロン性自己複製ＲＮＡを提供し、ＲＮＡは、５’から３’への順に、ＳＧプロモーターに作動可能に連結されたＮｙａｍタンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、ＳＧプロモーター及びＩＲＥＳからなる群から選択される調節エレメントに作動可能に連結されたＨｙａｍタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列を含む。

【0389】

一実施例において、本開示は、マルチシストロン性自己複製ＲＮＡを提供し、ＲＮＡは、５’から３’への順に、
ｅ）配列番号１に記述されている配列によってコードされる最小ＳＧプロモーターに作動可能に連結されたＮｙａｍタンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、及び
ｆ）配列番号１に記述されている配列によってコードされる最小ＳＧプロモーターに作動可能に連結されたＨｙａｍタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列を含む。

【0390】

一実施例において、抗原は、コロナウイルス由来のウイルス抗原である。

【0391】

一実施例において、抗原は、アルファコロナウイルス、ベータコロナウイルス、ガンマコロナウイルス、及び／又はデルタコロナウイルス株である。

【0392】

一実施例において、抗原は、アルファコロナウイルスである。例えば、アルファコロナウイルスは、アルファコロナウイルス１、ヒトコロナウイルス２２９Ｅ（ＨＣｏＶ ２２９Ｅ）、ヒトコロナウイルスＮＬ６３（ＨＣｏＶ ＮＬ６３）、Ｍｉｎｉｏｐｔｅｒｕｓコウモリコロナウイルス１、ＭｉｎｉｏｐｔｅｒｕｓコウモリコロナウイルスＨＫＵ８、ブタ流行性下痢ウイルス、ＲｈｉｎｏｌｏｐｈｕｓコウモリコロナウイルスＨＫＵ２、及びＳｃｏｔｏｐｈｉｌｕｓコウモリコロナウイルス５１２からなる群から選択される。

【0393】

一実施例において、抗原は、ベータコロナウイルスである。例えば、ベータコロナウイルスは、ベータコロナウイルス１（ウシコロナウイルス、ヒトコロナウイルスＯＣ４３）、ハリネズミコロナウイルス１、ヒトコロナウイルスＨＫＵ１（ＨＣｏＶ ＨＫＵ１）、中東呼吸器症候群関連コロナウイルス（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）、マウスコロナウイルス、ＰｉｐｉｓｔｒｅｌｌｕｓコウモリコロナウイルスＨＫＵ５、ＲｏｕｓｅｔｔｕｓコウモリコロナウイルスＨＫＵ９、重症急性呼吸器症候群関連コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）、及びＴｙｌｏｎｙｃｔｅｒｉｓコウモリコロナウイルスＨＫＵ４からなる群から選択される。一実施例において、抗原は、中東呼吸器症候群関連コロナウイルス（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）、及び重症急性呼吸器症候群関連コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）からなる群から選択されるベータコロナウイルスに由来する。例えば、抗原は、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ由来である。別の実施例において、抗原は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ由来である。更なる実施例において、抗原は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来である。例えば、コロナウイルスは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２である。

【0394】

一実施例において、抗原は、ガンマコロナウイルスである。例えば、ガンマコロナウイルスは、トリコロナウイルス及びシロイルカコロナウイルスＳＷ１からなる群から選択される。

【0395】

一実施例において、抗原は、デルタコロナウイルスである。例えば、デルタコロナウイルスは、ヒヨドリコロナウイルスＨＫＵ１１及びブタコロナウイルスＨＫＵ１５からなる群から選択される。

【0396】

一実施例において、抗原は、コロナウイルスのスパイク（Ｓ）タンパク質及び／又はヌクレオカプシド（Ｎ）タンパク質である。例えば、抗原は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｎタンパク質及び／又はＳタンパク質である。一実施例において、抗原は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株２０１９－ｎＣｏＶ／ＵＳＡ－ＷＡ１／２０２０由来のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｎタンパク質及び／又はＳタンパク質である。

【0397】

一実施例において、抗原は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｎタンパク質である。例えば、抗原は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｎタンパク質であり、配列番号７に記述されている配列によってコードされている。

【0398】

別の実施例において、抗原は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質である。例えば、抗原は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質であり、配列番号８に記述されている配列によってコードされている。

【0399】

別の実施例において、Ｓタンパク質は、変異Ｓタンパク質である。

【0400】

一実施例において、変異Ｓタンパク質は、受容体結合ドメイン内の変異を含む。例えば、変異は、Ｓ４３８Ｆ、Ｎ４３９Ｋ、Ｎ４４０Ｋ、Ｌ４４１Ｉ、Ｋ４４４Ｒ、Ｖ４４５Ａ、Ｖ４４５Ｉ、Ｇ４４６Ｖ、Ｇ４４６Ｓ、Ｎ４５０Ｋ、Ｌ４５２Ｒ、Ｌ４５２Ｐ、Ｌ４５５Ｆ、Ｋ４５８Ｎ、Ｎ４６０Ｔ、Ｄ４６７Ｖ、Ｉ４６８Ｆ、Ｉ４６８Ｔ、Ｉ４６８Ｖ、Ｅ４７１Ｏ、Ｉ４７２Ｖ、Ａ４７５Ｖ、Ｇ４７６Ｓ、Ｓ４７７Ｇ、Ｓ４７７Ｉ、Ｓ４７７Ｎ、Ｓ４７７Ｒ、Ｔ４７８Ｉ、Ｐ４７９Ｌ、Ｐ４７９Ｌ、Ｐ４７９Ｓ、Ｎ４８１Ｄ、Ｎ４８１Ｈ、Ｖ４８３Ｆ、Ｖ４８３Ａ、Ｅ４８４Ｄ、Ｅ４８４Ｋ、Ｅ４８４Ｋ、Ｅ４８４Ｏ、Ｇ４８５Ｓ、Ｙ４８９Ｈ、Ｙ４８９Ｄ、Ｙ４８９Ｆ、Ｙ４８９Ｃ、Ｙ４８９Ｎ、Ｆ４９０Ｌ、Ｆ４９０Ｓ、Ｐ４９１Ｒ、Ｑ４９３Ｌ、Ｓ４９４Ｐ、Ｙ４９５Ｎ、Ｔ５００Ｎ、Ｎ５０１Ｓ、及びＹ５０５Ｈ、Ｙ５０８Ｈからなる群から選択される。一実施例において、変異Ｓタンパク質は、Ｎ４３９Ｋ、Ｎ４３９Ｌ、Ｌ４５２Ｒ、Ｓ４７７Ｎ、Ｔ４７８Ｉ、Ｖ４８３Ａ、及びＥ４８４Ｄからなる群から選択される受容体結合ドメイン内の変異を含む。

【0401】

一実施例において、変異Ｓタンパク質は、受容体結合ドメイン内の変異を含む。例えば、変異は、Ｒ３４６Ｋ、Ｋ４１７Ｎ、Ｋ４１７Ｔ、Ｓ４３８Ｆ、Ｎ４３９Ｋ、Ｎ４４０Ｋ、Ｌ４４１Ｉ、Ｋ４４４Ｒ、Ｖ４４５Ａ、Ｖ４４５Ｉ、Ｇ４４６Ｖ、Ｇ４４６Ｓ、Ｎ４５０Ｋ、Ｌ４５２Ｒ、Ｌ４５２Ｐ、Ｌ４５５Ｆ、Ｋ４５８Ｎ、Ｎ４６０Ｔ、Ｄ４６７Ｖ、Ｉ４６８Ｆ、Ｉ４６８Ｔ、Ｉ４６８Ｖ、Ｅ４７１Ｏ、Ｉ４７２Ｖ、Ａ４７５Ｖ、Ｇ４７６Ｓ、Ｓ４７７Ｇ、Ｓ４７７Ｉ、Ｓ４７７Ｎ、Ｓ４７７Ｒ、Ｔ４７８Ｉ、Ｔ４７８Ｋ、Ｐ４７９Ｌ、Ｐ４７９Ｓ、Ｎ４８１Ｄ、Ｎ４８１Ｈ、Ｖ４８３Ｆ、Ｖ４８３Ａ、Ｅ４８４Ｄ、Ｅ４８４Ｋ、Ｅ４８４Ｋ、Ｅ４８４Ｏ、Ｇ４８５Ｓ、Ｙ４８９Ｈ、Ｙ４８９Ｄ、Ｙ４８９Ｆ、Ｙ４８９Ｃ、Ｙ４８９Ｎ、Ｆ４９０Ｌ、Ｆ４９０Ｓ、Ｐ４９１Ｒ、Ｑ４９３Ｌ、Ｓ４９４Ｐ、Ｙ４９５Ｎ、Ｔ５００Ｎ、Ｎ５０１Ｓ、Ｎ５０１Ｙ、Ｙ５０５Ｈ、及びＹ５０８Ｈからなる群から選択される。一実施例において、変異Ｓタンパク質は、Ｒ３４６Ｋ、Ｋ４１７Ｎ、Ｋ４１７Ｔ、Ｎ４３９Ｋ、Ｎ４３９Ｌ、Ｌ４５２Ｒ、Ｓ４７７Ｎ、Ｔ４７８Ｉ、Ｖ４８３Ａ、Ｅ４８４Ｄ、Ｅ４８４Ｋ、及びＮ５０１Ｙからなる群から選択される受容体結合ドメイン内の変異を含む。

【0402】

一実施例において、変異Ｓタンパク質は、Ｐ３３７Ｓ、Ｆ３３８Ｌ、Ｆ３３８Ｃ、Ｇ３３９Ｄ、Ｅ３４０Ｋ、Ｖ３４１Ｉ、Ａ３４４Ｓ、Ｔ３４５Ｓ、Ｒ３４６Ｋ、Ａ３４８Ｓ、Ａ３４８Ｔ、Ｗ３５３Ｒ、Ｎ３５４Ｄ、Ｎ３５４Ｋ、Ｎ３５４Ｓ、Ｓ３５９Ｎ、Ｄ３６４Ｙ、Ｖ３６７Ｆ、Ｓ３７３Ｌ、Ｖ３８２Ｌ、Ｐ３８４Ｌ、Ｐ３８４Ｓ、Ｔ３８５Ａ、Ｔ３９３Ｐ、Ｖ３９５Ｉ、Ｆ４００Ｃ、Ｒ４０３Ｋ、Ｒ４０３Ｓ、Ｄ４０５Ｖ、Ｒ４０８Ｉ、Ｑ４１４Ｅ、Ｑ４１４Ｋ、Ｑ４１４Ｐ、Ｑ４１４Ｒ、Ｔ４１５Ｓ、Ｋ４１７Ｒ、Ｋ４１７Ｎ、Ｉ４１８Ｖ、Ｙ４２１Ｓ、Ｙ４２３Ｃ、Ｙ４２３Ｆ、Ｙ４２３Ｓ、Ｄ４２７Ｙ、Ｒ５０９Ｋ、Ｖ５１０Ｌ、Ｖ５１１Ｅ、Ｖ５１２Ｌ、Ｌ５１８Ｉ、Ｈ５１９Ｏ、Ａ５２０Ｓ、Ａ５２０Ｖ、Ｐ５２１Ｒ、Ｐ５２１Ｓ、Ａ５２２Ｐ、Ａ５２２Ｓ、及びＤ６１４Ｇからなる群から選択される変異を含む。

【0403】

一実施例において、変異Ｓタンパク質は、Ｌ１８Ｆ、Ｄ８０Ａ、Ｔ９５Ｉ、Ｙ１４４Ｓ、Ｙ１４５Ｎ、Ｄ２１５Ｇ、Ｐ３３７Ｓ、Ｆ３３８Ｌ、Ｆ３３８Ｃ、Ｇ３３９Ｄ、Ｅ３４０Ｋ、Ｖ３４１Ｉ、Ａ３４４Ｓ、Ｔ３４５Ｓ、Ｒ３４６Ｋ、Ａ３４８Ｓ、Ａ３４８Ｔ、Ｗ３５３Ｒ、Ｎ３５４Ｄ、Ｎ３５４Ｋ、Ｎ３５４Ｓ、Ｓ３５９Ｎ、Ｄ３６４Ｙ、Ｖ３６７Ｆ、Ｓ３７３Ｌ、Ｖ３８２Ｌ、Ｐ３８４Ｌ、Ｐ３８４Ｓ、Ｔ３８５Ａ、Ｔ３９３Ｐ、Ｖ３９５Ｉ、Ｆ４００Ｃ、Ｒ４０３Ｋ、Ｒ４０３Ｓ、Ｄ４０５Ｖ、Ｒ４０８Ｉ、Ｑ４１４Ｅ、Ｑ４１４Ｋ、Ｑ４１４Ｐ、Ｑ４１４Ｒ、Ｔ４１５Ｓ、Ｋ４１７Ｎ、Ｋ４１７Ｔ、Ｋ４１７Ｒ、Ｉ４１８Ｖ、Ｙ４２１Ｓ、Ｙ４２３Ｃ、Ｙ４２３Ｆ、Ｙ４２３Ｓ、Ｄ４２７Ｙ、Ｓ４３８Ｆ、Ｎ４３９Ｋ、Ｎ４４０Ｋ、Ｌ４４１Ｉ、Ｋ４４４Ｒ、Ｖ４４５Ａ、Ｖ４４５Ｉ、Ｇ４４６Ｖ、Ｇ４４６Ｓ、Ｎ４５０Ｋ、Ｌ４５２Ｒ、Ｌ４５２Ｐ、Ｌ４５５Ｆ、Ｋ４５８Ｎ、Ｎ４６０Ｔ、Ｄ４６７Ｖ、Ｉ４６８Ｆ、Ｉ４６８Ｔ、Ｉ４６８Ｖ、Ｅ４７１Ｏ、Ｉ４７２Ｖ、Ａ４７５Ｖ、Ｇ４７６Ｓ、Ｓ４７７Ｇ、Ｓ４７７Ｉ、Ｓ４７７Ｎ、Ｓ４７７Ｒ、Ｔ４７８Ｉ、Ｔ４７８Ｋ、Ｐ４７９Ｌ、Ｐ４７９Ｓ、Ｎ４８１Ｄ、Ｎ４８１Ｈ、Ｖ４８３Ｆ、Ｖ４８３Ａ、Ｅ４８４Ｄ、Ｅ４８４Ｋ、Ｅ４８４Ｋ、Ｅ４８４Ｏ、Ｇ４８５Ｓ、Ｙ４８９Ｈ、Ｙ４８９Ｄ、Ｙ４８９Ｆ、Ｙ４８９Ｃ、Ｙ４８９Ｎ、Ｆ４９０Ｌ、Ｆ４９０Ｓ、Ｐ４９１Ｒ、Ｑ４９３Ｌ、Ｓ４９４Ｐ、Ｙ４９５Ｎ、Ｔ５００Ｎ、Ｎ５０１Ｓ、Ｎ５０１Ｙ、Ｙ５０５Ｈ、Ｙ５０８Ｈ、Ｒ５０９Ｋ、Ｖ５１０Ｌ、Ｖ５１１Ｅ、Ｖ５１２Ｌ、Ｌ５１８Ｉ、Ｈ５１９Ｏ、Ａ５２０Ｓ、Ａ５２０Ｖ、Ｐ５２１Ｒ、Ｐ５２１Ｓ、Ａ５２２Ｐ、Ａ５２２Ｓ、Ａ５７０Ｄ、Ｄ６１４Ｇ、Ｐ６８０Ｈ、Ｐ６８１Ｈ、Ａ７０１Ｖ、Ｔ７１６Ｉ、及びＤ９５０Ｎからなる群から選択される変異を含む。

【0404】

一実施例において、変異Ｓタンパク質は、（ｉ）Ｓ１／Ｓ２境界でのフーリン切断部位を欠いており、配列番号３７のヌクレオチド６８２～６８５に対応する残基にＲＲＡＲからＱＱＡＡへの変異を含み、かつ／又は（ｉｉ）Ｓ２’部位でのフーリン切断部位を欠いており、かつ／又は（ｉｉｉ）配列番号３７のヌクレオチド６１４に対応する残基にＤからＧへの変異を含み、かつ／又は（ｉｖ）配列番号３７のヌクレオチド９８６及び９８７に対応する残基間の２つのプロリン残基の挿入を含む。

【0405】

一実施例において、Ｓタンパク質は、Ｓ１／Ｓ２境界でのフーリン切断部位を欠いており、配列番号３７のヌクレオチド６８２～６８５に対応する残基にＲＲＡＲからＱＱＡＡへの変異を含む。例えば、変異Ｓタンパク質は、配列番号９に記述されている配列によってコードされている。

【0406】

一実施例において、Ｓタンパク質は、Ｓ２’部位でのフーリン切断部位を欠いている。

【0407】

一実施例において、Ｓタンパク質は、配列番号３７のヌクレオチド６１４に対応する残基にＤからＧへの変異を含む。例えば、変異Ｓタンパク質は、配列番号３６に記述されている配列によってコードされている。

【0408】

一実施例において、Ｓタンパク質は、配列番号３７のヌクレオチド９８６及び９８７に対応する残基間の２つのプロリン残基の挿入を含む。

【0409】

一実施例において、Ｓタンパク質は、（ｉ）Ｓ１／Ｓ２境界でのフーリン切断部位を欠いており、配列番号３７のヌクレオチド６８２～６８５に対応する残基にＲＲＡＲからＱＱＡＡへの変異を含み、かつ（ｉｉ）Ｓ２’部位でのフーリン切断部位を欠いている。例えば、変異Ｓタンパク質は、配列番号３４に記述されている配列によってコードされている。

【0410】

一実施例において、Ｓタンパク質は、（ｉ）Ｓ１／Ｓ２境界でのフーリン切断部位を欠いており、配列番号３７のヌクレオチド６８２～６８５に対応する残基にＲＲＡＲからＱＱＡＡへの変異を含み、かつ（ｉｉ）配列番号３７のヌクレオチド６１４に対応する残基にＤからＧへの変異を含む。例えば、変異Ｓタンパク質は、配列番号３３に記述されている配列によってコードされている。

【0411】

一実施例において、Ｓタンパク質は、（ｉ）Ｓ１／Ｓ２境界でのフーリン切断部位を欠いており、配列番号３７のヌクレオチド６８２～６８５に対応する残基にＲＲＡＲからＱＱＡＡへの変異を含み、かつ（ｉｉ）配列番号３７のヌクレオチド９８６及び９８７に対応する残基間の２つのプロリン残基の挿入を含む。例えば、変異Ｓタンパク質は、配列番号３２に記述されている配列によってコードされている。

【0412】

一実施例において、Ｓタンパク質は、（ｉ）Ｓ１／Ｓ２境界でのフーリン切断部位を欠いており、配列番号３７のヌクレオチド６８２～６８５に対応する残基にＲＲＡＲからＱＱＡＡへの変異を含み、かつ（ｉｉ）Ｓ２’部位にフーリン切断部位を欠いており、かつ（ｉｉｉ）配列番号３７のヌクレオチド６１４に対応する残基にＤからＧへの変異を含む。例えば、変異Ｓタンパク質は、配列番号３５に記述されている配列によってコードされている。

【0413】

一実施例において、Ｓタンパク質は、（ｉ）Ｓ１／Ｓ２境界でのフーリン切断部位を欠いており、配列番号３７のヌクレオチド６８２～６８５に対応する残基にＲＲＡＲからＱＱＡＡへの変異を含み、かつ（ｉｉ）Ｓ２’部位でのフーリン切断部位を欠いており、かつ（ｉｉｉ）配列番号３７のヌクレオチド９８６及び９８７に対応する残基間の２つのプロリン残基の挿入を含む。

【0414】

一実施例において、Ｓタンパク質は、（ｉ）Ｓ２’部位にフーリン切断部位を欠いており、かつ（ｉｉ）配列番号３７のヌクレオチド６１４に対応する残基にＤからＧへの変異を含む。

【0415】

一実施例において、Ｓタンパク質は、（ｉ）Ｓ２’部位でのフーリン切断部位を欠いており、かつ（ｉｉ）配列番号３７のヌクレオチド９８６及び９８７に対応する残基間の２つのプロリン残基の挿入を含む。

【0416】

一実施例において、Ｓタンパク質は、（ｉ）Ｓ２’部位でのフーリン切断部位を欠いており、かつ（ｉｉ）配列番号３７のヌクレオチド６１４に対応する残基にＤからＧへの変異を含み、かつ（ｉｉｉ）配列番号３７のヌクレオチド９８６及び９８７に対応する残基間の２つのプロリン残基の挿入を含む。

【0417】

一実施例において、Ｓタンパク質は、（ｉ）配列番号３７のヌクレオチド６１４に対応する残基にＤからＧへの変異を含み、かつ（ｉｉ）配列番号３７のヌクレオチド９８６及び９８７に対応する残基間の２つのプロリン残基の挿入を含む。

【0418】

一実施例において、Ｓタンパク質は、（ｉ）Ｓ１／Ｓ２境界でのフーリン切断部位を欠いており、配列番号３７のヌクレオチド６８２～６８５に対応する残基にＲＲＡＲからＱＱＡＡへの変異を含み、かつ（ｉｉ）Ｓ２’部位でのフーリン切断部位を欠いており、かつ（ｉｉｉ）配列番号３７のヌクレオチド６１４に対応する残基にＤからＧへの変異を含み、かつ（ｉｖ）配列番号３７のヌクレオチド９８６及び９８７に対応する残基間の２つのプロリン残基の挿入を含む。

【0419】

一実施例において、変異Ｓタンパク質は、（ｉ）配列番号３７のヌクレオチド５０１に対応する残基にＮからＹへの変異、並びに／又は（ｉｉ）配列番号３７のヌクレオチド６９及び７０に対応する２つの残基の欠失、並びに／又は（ｉｉｉ）配列番号３７のヌクレオチド６８１に対応する残基にＰからＨへの変異を含む。

【0420】

一実施例において、変異Ｓタンパク質は、配列番号３７のヌクレオチド５０１に対応する残基にＮからＹへの変異、並びに配列番号３７のヌクレオチド６９及び７０に対応する２つの残基の欠失、並びに配列番号３７のヌクレオチド６８１に対応する残基にＰからＨへの変異を含む。

【0421】

一実施例において、変異Ｓタンパク質は、配列番号３７のヌクレオチド６８１に対応する残基にＰからＨへの変異を含む。

【0422】

一実施例において、変異Ｓタンパク質は、（ｉ）配列番号３７のヌクレオチド４１７に対応する残基にＫからＮへの変異、及び／又は（ｉｉ）配列番号３７のヌクレオチド４８４に対応する残基にＥからＫへの変異、及び／又は（ｉｉｉ）配列番号３７のヌクレオチド５０１に対応する残基にＮからＹへの変異を含む。

【0423】

一実施例において、変異Ｓタンパク質は、配列番号３７のヌクレオチド４１７に対応する残基にＫからＮへの変異を含む。

【0424】

一実施例において、変異Ｓタンパク質は、配列番号３７のヌクレオチド４８４に対応する残基にＥからＫへの変異を含む。

【0425】

一実施例において、変異Ｓタンパク質は、配列番号３７のヌクレオチド４１７に対応する残基にＫからＮへの変異、及び配列番号３７のヌクレオチド４８４に対応する残基にＥからＫへの変異、及び配列番号３７のヌクレオチド５０１に対応する残基にＮからＹへの変異を含む。

【0426】

一実施例において、変異Ｓタンパク質は、（ｉ）配列番号３７のヌクレオチド４１７に対応する残基にＫからＴへの変異、及び／又は（ｉｉ）配列番号３７のヌクレオチド４８４に対応する残基にＥからＫへの変異、及び／又は（ｉｉｉ）配列番号３７のヌクレオチド５０１に対応する残基にＮからＹへの変異を含む。

【0427】

一実施例において、変異Ｓタンパク質は、配列番号３７のヌクレオチド４１７に対応する残基にＫからＴへの変異を含む。

【0428】

一実施例において、変異Ｓタンパク質は、配列番号３７のヌクレオチド４１７に対応する残基にＫからＴへの変異、及び配列番号３７のヌクレオチド４８４に対応する残基にＥからＫへの変異、及び配列番号３７のヌクレオチド５０１に対応する残基にＮからＹへの変異を含む。

【0429】

一実施例において、変異Ｓタンパク質は、（ｉ）配列番号３７のヌクレオチド９５に対応する残基にＴからＩへの変異、及び／又は（ｉｉ）配列番号３７のヌクレオチド１４４に対応する残基にＹからＳへの変異、及び／又は（ｉｉｉ）配列番号３７のヌクレオチド１４５に対応する残基にＹからＮへの変異、及び／又は（ｉｖ）配列番号３７のヌクレオチド３４６に対応する残基にＲからＫへの変異、及び／又は（ｖ）配列番号３７のヌクレオチド４８４に対応する残基にＥからＫへの変異、及び／又は（ｖｉ）配列番号３７のヌクレオチド５０１に対応する残基にＮからＹへの変異、及び／又は（ｖｉｉ）配列番号３７のヌクレオチド６１４に対応する残基にＤからＧへの変異、及び／又は（ｖｉｉｉ）配列番号３７のヌクレオチド６８１に対応する残基にＰからＨへの変異、及び／又は（ｉｘ）配列番号３７のヌクレオチド９５０に対応する残基にＤからＮへの変異を含む。

【0430】

一実施例において、変異Ｓタンパク質は、配列番号３７のヌクレオチド９５に対応する残基にＴからＩへの変異を含む。

【0431】

一実施例において、変異Ｓタンパク質は、配列番号３７のヌクレオチド１４４に対応する残基にＹからＳへの変異を含む。

【0432】

一実施例において、変異Ｓタンパク質は、配列番号３７のヌクレオチド１４５に対応する残基にＹからＮへの変異を含む。

【0433】

一実施例において、変異Ｓタンパク質は、配列番号３７のヌクレオチド３４６に対応する残基にＲからＫへの変異を含む。

【0434】

一実施例において、変異Ｓタンパク質は、配列番号３７のヌクレオチド９５０に対応する残基にＤからＮへの変異を含む。

【0435】

一実施例において、変異Ｓタンパク質は、（ｉ）配列番号３７のヌクレオチド９５に対応する残基にＴからＩへの変異、及び（ｉｉ）配列番号３７のヌクレオチド１４４に対応する残基にＹからＳへの変異、及び（ｉｉｉ）配列番号３７のヌクレオチド１４５に対応する残基にＹからＮへの変異、及び（ｉｖ）配列番号３７のヌクレオチド３４６に対応する残基にＲからＫへの変異、及び（ｖ）配列番号３７のヌクレオチド４８４に対応する残基にＥからＫへの変異、及び（ｖｉ）配列番号３７のヌクレオチド５０１に対応する残基にＮからＹへの変異、及び（ｖｉｉ）配列番号３７のヌクレオチド６１４に対応する残基にＤからＧへの変異、（ｖｉｉｉ）配列番号３７のヌクレオチド６８１に対応する残基にＰからＨへの変異、（ｉｘ）配列番号３７のヌクレオチド９５０に対応する残基にＤからＮへの変異を含む。

【0436】

一実施例において、変異Ｓタンパク質は、（ｉ）配列番号３７のヌクレオチド４７８に対応する残基にＴからＫへの変異、及び／又は（ｉｉ）配列番号３７のヌクレオチド６８１に対応する残基にＰからＲへの変異、及び／又は（ｉｉｉ）配列番号３７のヌクレオチド４５２に対応する残基にＬからＲへの変異を含む。

【0437】

一実施例において、変異Ｓタンパク質は、配列番号３７のヌクレオチド４７８に対応する残基にＴからＫへの変異を含む。

【0438】

一実施例において、変異Ｓタンパク質は、配列番号３７のヌクレオチド６８１に対応する残基にＰからＲへの変異を含む。

【0439】

一実施例において、変異Ｓタンパク質は、配列番号３７のヌクレオチド４５２に対応する残基にＬからＲへの変異を含む。

【0440】

一実施例において、変異Ｓタンパク質は、（ｉ）配列番号３７のヌクレオチド４７８に対応する残基にＴからＫへの変異、及び（ｉｉ）配列番号３７のヌクレオチド６８１に対応する残基にＰからＲへの変異、及び（ｉｉｉ）配列番号３７のヌクレオチド４５２に対応する残基にＬからＲへの変異を含む。

【0441】

一実施例において、Ｓタンパク質は、配列番号３７のヌクレオチド６９及び７０に対応する２つの残基の欠失を含む。

【0442】

一実施例において、Ｓタンパク質は、配列番号３７のヌクレオチド１４４に対応する１つの残基の欠失を含む。

【0443】

一実施例において、Ｓタンパク質は、（ｉ）配列番号３７のヌクレオチド６８２～６８５に対応する残基にＲＲＡＲからＱＱＡＡへの変異を含み、かつ（ｉｉ）配列番号３７のヌクレオチド６９及び７０に対応する２つの残基の欠失を含み、かつ（ｉｉｉ）配列番号３７のヌクレオチド１４４に対応する１つの残基の欠失を含み、かつ（ｉｖ）配列番号３７のヌクレオチド５０１に対応する残基にＮからＹへの変異を含み、かつ（ｖ）配列番号３７のヌクレオチド６１４に対応する残基にＤからＧへの変異を含む。例えば、変異Ｓタンパク質は、配列番号５８に記述されている配列によってコードされている。

【0444】

一実施例において、Ｓタンパク質は、配列番号３７のヌクレオチド２４２～２４４に対応する３つの残基の欠失を含む。

【0445】

一実施例において、Ｓタンパク質は、（ｉ）配列番号３７のヌクレオチド６８２～６８５に対応する残基にＲＲＡＲからＱＱＡＡへの変異を含み、かつ（ｉｉ）配列番号３７のヌクレオチド２４２～２４４に対応する３つの残基の欠失を含み、かつ（ｉｉｉ）配列番号３７のヌクレオチド４１７に対応する残基にＫからＮへの変異を含み、かつ（ｉｖ）配列番号３７のヌクレオチド４８４に対応する残基にＥからＫへの変異を含み、かつ（ｖ）配列番号３７のヌクレオチド５０１に対応する残基にＮからＹへの変異を含み、かつ（ｖｉ）配列番号３７のヌクレオチド６１４に対応する残基にＤからＧへの変異を含む。例えば、変異Ｓタンパク質は、配列番号５９に記述されている配列によってコードされている。

【0446】

一実施例において、Ｓタンパク質は、（ｉ）配列番号３７のヌクレオチド６８２～６８５に対応する残基にＲＲＡＲからＱＱＡＡへの変異を含み、かつ（ｉｉ）配列番号３７のヌクレオチド６９及び７０に対応する２つの残基の欠失を含み、かつ（ｉｉｉ）配列番号３７のヌクレオチド２４２～２４４に対応する３つの残基の欠失を含み、かつ（ｉｖ）配列番号３７のヌクレオチド４１７に対応する残基にＫからＮへの変異を含み、かつ（ｖ）配列番号３７のヌクレオチド４８４に対応する残基にＥからＫへの変異を含み、かつ（ｖｉ）配列番号３７のヌクレオチド５０１に対応する残基にＮからＹへの変異を含み、かつ（ｖｉｉ）配列番号３７のヌクレオチド６１４に対応する残基にＤからＧへの変異を含む。例えば、変異Ｓタンパク質は、配列番号６０に記述されている配列によってコードされている。

【0447】

一実施例において、Ｓタンパク質は、配列番号３７のヌクレオチド５７０に対応する残基にＡからＤへの変異を含む。

【0448】

一実施例において、Ｓタンパク質は、配列番号３７のヌクレオチド６８０に対応する残基にＰからＨへの変異を含む。

【0449】

一実施例において、Ｓタンパク質は、配列番号３７のヌクレオチド７１６に対応する残基にＴからＩへの変異を含む。

【0450】

一実施例において、Ｓタンパク質は、（ｉ）配列番号３７のヌクレオチド６８２～６８５に対応する残基にＲＲＡＲからＱＱＡＡへの変異を含み、かつ（ｉｉ）配列番号３７のヌクレオチド６９及び７０に対応する２つの残基の欠失を含み、かつ（ｉｉｉ）配列番号３７のヌクレオチド１４４に対応する１つの残基の欠失を含み、かつ（ｉｖ）配列番号３７のヌクレオチド５０１に対応する残基にＮからＹへの変異を含み、かつ（ｖ）配列番号３７のヌクレオチド５７０に対応する残基にＡからＤへの変異を含み、かつ（ｖｉ）配列番号３７のヌクレオチド６１４に対応する残基にＤからＧへの変異を含み、かつ（ｖｉｉ）配列番号３７のヌクレオチド６８０に対応する残基にＰからＨへの変異を含み、かつ（ｖｉｉｉ）配列番号３７のヌクレオチド７１６に対応する残基にＴからＩへの変異を含む。例えば、変異Ｓタンパク質は、配列番号６１に記述されている配列によってコードされている。

【0451】

一実施例において、Ｓタンパク質は、配列番号３７のヌクレオチド１８に対応する残基にＬからＦへの変異を含む。

【0452】

一実施例において、Ｓタンパク質は、配列番号３７のヌクレオチド８０に対応する残基にＤからＡへの変異を含む。

【0453】

一実施例において、Ｓタンパク質は、配列番号３７のヌクレオチド２１５に対応する残基にＤからＧへの変異を含む。

【0454】

一実施例において、Ｓタンパク質は、配列番号３７のヌクレオチド７０１に対応する残基にＡからＶへの変異を含む。

【0455】

一実施例において、Ｓタンパク質は、（ｉ）配列番号３７のヌクレオチド６８２～６８５に対応する残基にＲＲＡＲからＱＱＡＡへの変異を含み、かつ（ｉｉ）配列番号３７のヌクレオチド１８に対応する残基にＬからＦへの変異を含み、かつ（ｉｉｉ）配列番号３７のヌクレオチド８０に対応する残基にＤからＡへの変異を含み、かつ（ｉｖ）配列番号３７のヌクレオチド２１５に対応する残基にＤからＧへの変異を含み、かつ（ｖ）配列番号３７のヌクレオチド２４２～２４４に対応する３つの残基の欠失を含み、かつ（ｖｉ）配列番号３７のヌクレオチド４１７に対応する残基にＫからＮへの変異を含み、かつ（ｖｉｉ）配列番号３７のヌクレオチド４８４に対応する残基にＥからＫへの変異を含み、かつ（ｖｉｉｉ）配列番号３７のヌクレオチド５０１に対応する残基にＮからＹへの変異を含み、かつ（ｉｘ）配列番号３７のヌクレオチド６１４に対応する残基にＤからＧへの変異を含み、かつ（ｘ）配列番号３７のヌクレオチド７０１に対応する残基にＡからＶへの変異を含む。例えば、変異Ｓタンパク質は、配列番号６２に記述されている配列によってコードされている。

【0456】

一実施例において、変異Ｓタンパク質は、（ｉ）Ｓ１／Ｓ２境界でのフーリン切断部位を欠いており、配列番号３７のヌクレオチド６８２～６８５に対応する残基にＲＲＡＲからＱＱＡＡへの変異を含み、かつ／又は（ｉｉ）Ｓ２’部位でのフーリン切断部位を欠いており、かつ／又は（ｉｉｉ）配列番号３７のヌクレオチド６１４に対応する残基にＤからＧへの変異を含み、かつ／又は（ｉｖ）配列番号３７のヌクレオチド９８６及び９８７に対応する残基間の２つのプロリン残基の挿入を含み、かつ／又は（ｖ）配列番号３７のヌクレオチド５０１に対応する残基にＮからＹへの変異を含み、かつ／又は（ｖｉ）配列番号３７のヌクレオチド６９及び７０に対応する２つの残基の欠失を含み、かつ／又は（ｖｉｉ）配列番号３７のヌクレオチド１４４に対応する１つの残基の欠失を含み、かつ／又は（ｖｉｉｉ）配列番号３７のヌクレオチド２４２～２４４に対応する３つの残基の欠失を含み、かつ／又は（ｉｘ）配列番号３７のヌクレオチド４１７に対応する残基にＫからＮへの変異を含み、かつ／又は（ｘ）配列番号３７のヌクレオチド４８４に対応する残基にＥからＫへの変異を含み、かつ／又は（ｘｉ）配列番号３７のヌクレオチド５７０に対応する残基にＡからＤへの変異を含み、かつ／又は（ｘｉｉ）配列番号３７のヌクレオチド６８０に対応する残基にＰからＨへの変異を含み、かつ／又は（ｘｉｉｉ）配列番号３７のヌクレオチド７１６に対応する残基にＴからＩへの変異を含み、かつ／又は（ｘｉｘ）配列番号３７のヌクレオチド１８に対応する残基にＬからＦへの変異を含み、かつ／又は（ｘｘ）、かつ／又は配列番号３７のヌクレオチド８０に対応する残基にＤからＡへの変異を含み、かつ／又は（ｘｘｉ）配列番号３７のヌクレオチド２１５に対応する残基にＤからＧへの変異を含み、かつ／又は（ｘｘｉｉ）配列番号３７のヌクレオチド７０１に対応する残基にＡからＶへの変異を含む。

【0457】

一実施例において、変異Ｓタンパク質は、配列番号９又は配列番号３２～３６のいずれか１つに記述されている配列によってコードされている。

【0458】

一実施例において、変異Ｓタンパク質は、配列番号９又は配列番号３２～３６又は配列番号５８～６２のいずれか１つに記述されている配列によってコードされている。

【0459】

一実施例において、変異Ｓタンパク質は、配列番号９に記述されている配列によってコードされている。

【0460】

一実施例において、変異Ｓタンパク質は、配列番号３２に記述されている配列によってコードされている。

【0461】

一実施例において、変異Ｓタンパク質は、配列番号３３に記述されている配列によってコードされている。

【0462】

一実施例において、変異Ｓタンパク質は、配列番号３４に記述されている配列によってコードされている。

【0463】

一実施例において、変異Ｓタンパク質は、配列番号３５に記述されている配列によってコードされている。

【0464】

一実施例において、変異Ｓタンパク質は、配列番号３６に記述されている配列によってコードされている。

【0465】

一実施例において、変異Ｓタンパク質は、配列番号５８に記述されている配列によってコードされている。

【0466】

一実施例において、変異Ｓタンパク質は、配列番号５９に記述されている配列によってコードされている。

【0467】

一実施例において、変異Ｓタンパク質は、配列番号６０に記述されている配列によってコードされている。

【0468】

一実施例において、変異Ｓタンパク質は、配列番号６１に記述されている配列によってコードされている。

【0469】

一実施例において、変異Ｓタンパク質は、配列番号６２に記述されている配列によってコードされている。

【0470】

一実施例において、本開示は、ポリヌクレオチドを提供し、ポリヌクレオチドは、５’から３’への順に、
ａ）Ｓタンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、及びＮタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列、又は
ｂ）Ｎタンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、及びＳタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列を含む。

【0471】

一実施例において、本開示は、ポリヌクレオチドを提供し、ポリヌクレオチドは、５’から３’への順に、Ｓタンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、及びＮタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列を含む。

【0472】

一実施例において、本開示は、ポリヌクレオチドを提供し、ポリヌクレオチドは、５’から３’への順に、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列、ＩＲＥＳ、ＳＧプロモーター、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される調節エレメントに作動可能に連結されたＳタンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、並びにＳＧプロモーター及びＩＲＥＳからなる群から選択される調節エレメントに作動可能に連結されたＮタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列を含む。

【0473】

一実施例において、本開示は、ポリヌクレオチドを提供し、ポリヌクレオチドは、５’から３’への順に、Ｎタンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、及びＳタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列を含む。

【0474】

一実施例において、本開示は、ポリヌクレオチドを提供し、ポリヌクレオチドは、５’から３’への順に、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列、ＩＲＥＳ、ＳＧプロモーター、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される調節エレメントに作動可能に連結されたＮタンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、並びにＳＧプロモーター及びＩＲＥＳからなる群から選択される調節エレメントに作動可能に連結されたＳタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列を含む。

【0475】

一実施例において、本開示は、ＲＮＡを提供し、ＲＮＡは、５’から３’への順に、
ａ）Ｓタンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、及びＮタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列、又は
ｂ）Ｎタンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、及びＳタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列を含む。

【0476】

一実施例において、本開示は、ＲＮＡを提供し、ＲＮＡは、５’から３’への順に、Ｓタンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、及びＮタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列を含む。

【0477】

一実施例において、本開示は、ＲＮＡを提供し、ＲＮＡは、５’から３’への順に、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列、ＩＲＥＳ、ＳＧプロモーター、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される調節エレメントに作動可能に連結されたＳタンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、並びにＳＧプロモーター及びＩＲＥＳからなる群から選択される調節エレメントに作動可能に連結されたＮタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列を含む。

【0478】

一実施例において、本開示は、ＲＮＡを提供し、ＲＮＡは、５’から３’への順に、Ｎタンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、及びＳタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列を含む。

【0479】

一実施例において、本開示は、ＲＮＡを提供し、ＲＮＡは、５’から３’への順に、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列、ＩＲＥＳ、ＳＧプロモーター、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される調節エレメントに作動可能に連結されたＮタンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、並びにＳＧプロモーター及びＩＲＥＳからなる群から選択される調節エレメントに作動可能に連結されたＳタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列を含む。

【0480】

一実施例において、本開示は、ｃＲＮＡを提供し、ｃＲＮＡは、５’から３’への順に、
ａ）Ｓタンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、及びＮタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列、又は
ｂ）Ｎタンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、及びＳタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列を含む。

【0481】

一実施例において、本開示は、ｃＲＮＡを提供し、ｃＲＮＡは、５’から３’への順に、Ｓタンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、及びＮタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列を含む。

【0482】

一実施例において、本開示は、ｃＲＮＡを提供し、ｃＲＮＡは、５’から３’への順に、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列、ＩＲＥＳ、ＳＧプロモーター、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される調節エレメントに作動可能に連結されたＳタンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、並びにＳＧプロモーター及びＩＲＥＳからなる群から選択される調節エレメントに作動可能に連結されたＮタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列を含む。

【0483】

一実施例において、本開示は、ｃＲＮＡを提供し、ｃＲＮＡは、５’から３’への順に、Ｎタンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、及びＳタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列を含む。

【0484】

一実施例において、本開示は、ｃＲＮＡを提供し、ｃＲＮＡは、５’から３’への順に、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列、ＩＲＥＳ、ＳＧプロモーター、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される調節エレメントに作動可能に連結されたＮタンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、並びにＳＧプロモーター及びＩＲＥＳからなる群から選択される調節エレメントに作動可能に連結されたＳタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列を含む。

【0485】

一実施例において、本開示は、マルチシストロン性自己複製ＲＮＡを提供し、ＲＮＡは、５’から３’への順に、
ａ）Ｓタンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、及びＮタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列、又は
ｂ）Ｎタンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、及びＳタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列を含む。

【0486】

一実施例において、本開示は、マルチシストロン性自己複製ＲＮＡを提供し、ＲＮＡは、５’から３’への順に、Ｓタンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、及びＮタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列を含む。

【0487】

一実施例において、本開示は、マルチシストロン性自己複製ＲＮＡを提供し、ＲＮＡは、５’から３’への順に、ＳＧプロモーターに作動可能に連結されたＳタンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、並びにＳＧプロモーター及びＩＲＥＳからなる群から選択される調節エレメントに作動可能に連結されたＮタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列を含む。

【0488】

一実施例において、本開示は、マルチシストロン性自己複製ＲＮＡを提供し、分子は、５’から３’への順に、
ａ）配列番号１に記述されている配列によってコードされる最小ＳＧプロモーターに作動可能に連結されたＳタンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、及び
ｂ）配列番号１に記述されている配列によってコードされる最小ＳＧプロモーターに作動可能に連結されたＮタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列を含む。

【0489】

一実施例において、本開示は、マルチシストロン性自己複製ＲＮＡを提供し、ＲＮＡは、５’から３’への順に、
ａ）配列番号１に記述されている配列によってコードされる最小ＳＧプロモーターに作動可能に連結されたＳタンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、及び
ｂ）配列番号２に記述されている配列によってコードされる延長ＳＧプロモーターに作動可能に連結されたＮタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列を含む。

【0490】

一実施例において、本開示は、マルチシストロン性自己複製ＲＮＡを提供し、ＲＮＡは、５’から３’への順に、
ａ）配列番号１に記述されている配列によってコードされる最小ＳＧプロモーターに作動可能に連結されたＳタンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、及び
ｂ）配列番号３に記述されている配列によってコードされる延長ＳＧプロモーターに作動可能に連結されたＮタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列を含む。

【0491】

一実施例において、本開示は、マルチシストロン性自己複製ＲＮＡを提供し、分子は、５’から３’への順に、
ａ）配列番号１に記述されている配列によってコードされる最小ＳＧプロモーターに作動可能に連結された変異したＳタンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、及び
ｂ）配列番号１に記述されている配列によってコードされる最小ＳＧプロモーターに作動可能に連結されたＮタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列を含む。

【0492】

一実施例において、本開示は、マルチシストロン性自己複製ＲＮＡを提供し、ＲＮＡは、５’から３’への順に、
ａ）配列番号１に記述されている配列によってコードされる最小ＳＧプロモーターに作動可能に連結された変異したＳタンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、及び
ｂ）配列番号２に記述されている配列によってコードされる延長ＳＧプロモーターに作動可能に連結されたＮタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列を含む。

【0493】

一実施例において、本開示は、マルチシストロン性自己複製ＲＮＡを提供し、ＲＮＡは、５’から３’への順に、
ａ）配列番号１に記述されている配列によってコードされる最小ＳＧプロモーターに作動可能に連結された変異したＳタンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、及び
ｂ）配列番号３に記述されている配列によってコードされる延長ＳＧプロモーターに作動可能に連結されたＮタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列を含む。

【0494】

一実施例において、本開示は、マルチシストロン性自己複製ＲＮＡを提供し、ＲＮＡは、５’から３’への順に、
ａ）配列番号１に記述されている配列によってコードされる最小ＳＧプロモーターに作動可能に連結されたＳタンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、及び
ｂ）配列番号４に記述されている配列によってコードされるＩＲＥＳに作動可能に連結されたＮタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列を含む。

【0495】

一実施例において、本開示は、マルチシストロン性自己複製ＲＮＡを提供し、ＲＮＡは、５’から３’への順に、Ｎタンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、及びＳタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列を含む。

【0496】

一実施例において、本開示は、マルチシストロン性自己複製ＲＮＡを提供し、ＲＮＡは、５’から３’への順に、ＳＧプロモーターに作動可能に連結されたＮタンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、並びにＳＧプロモーター及びＩＲＥＳからなる群から選択される調節エレメントに作動可能に連結されたＳタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列を含む。

【0497】

一実施例において、本開示は、マルチシストロン性自己複製ＲＮＡを提供し、分子は、５’から３’への順に、
ａ）配列番号１に記述されている配列によってコードされる最小ＳＧプロモーターに作動可能に連結されたＮタンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、及び
ｂ）配列番号１に記述されている配列によってコードされる最小ＳＧプロモーターに作動可能に連結されたＳタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列を含む。

【0498】

一実施例において、本開示は、マルチシストロン性自己複製ＲＮＡを提供し、ＲＮＡは、５’から３’への順に、
ａ）配列番号１に記述されている配列によってコードされる最小ＳＧプロモーターに作動可能に連結されたＮタンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、及び
ｂ）配列番号２に記述されている配列によってコードされる延長ＳＧプロモーターに作動可能に連結されたＳタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列を含む。

【0499】

一実施例において、本開示は、マルチシストロン性自己複製ＲＮＡを提供し、ＲＮＡは、５’から３’への順に、
ａ）配列番号１に記述されている配列によってコードされる最小ＳＧプロモーターに作動可能に連結されたＮタンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、及び
ｂ）配列番号３に記述されている配列によってコードされる延長ＳＧプロモーターに作動可能に連結されたＳタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列を含む。

【0500】

一実施例において、本開示は、マルチシストロン性自己複製ＲＮＡを提供し、ＲＮＡは、５’から３’への順に、
ａ）配列番号１に記述されている配列によってコードされる最小ＳＧプロモーターに作動可能に連結されたＮタンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、及び
ｂ）配列番号４に記述されている配列によってコードされるＩＲＥＳに作動可能に連結されたＳタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列を含む。

【0501】

一実施例において、本開示は、配列番号１０～１４、又は配列番号１９～２７、又は配列番号３０～３１のいずれか１つに記述されている配列によってコードされるマルチシストロン性自己複製ＲＮＡを提供する。一実施例において、本開示は、配列番号１０～１４、又は配列番号１９～２７、又は配列番号３０～３１、又は配列番号４９～５３のいずれか１つに記述されている配列によってコードされるマルチシストロン性自己複製ＲＮＡを提供する。例えば、本開示は、配列番号１０～１４又は配列番号１９～２７のいずれか１つに記述されている配列によってコードされるマルチシストロン性自己複製ＲＮＡを提供する。別の実施例において、本開示は、配列番号３０～３１のいずれか１つに記述されている配列によってコードされるマルチシストロン性自己複製ＲＮＡを提供する。別の実施例において、本開示は、配列番号４９～５３のいずれか１つに記述されている配列によってコードされるマルチシストロン性自己複製ＲＮＡを提供する。

【0502】

一実施例において、本開示は、配列番号１０（Ｆ５４８）に記述されている配列によってコードされるマルチシストロン性自己複製ＲＮＡを提供する。

【0503】

一実施例において、本開示は、配列番号１１（Ｆ５４９）に記述されている配列によってコードされるマルチシストロン性自己複製ＲＮＡを提供する。

【0504】

一実施例において、本開示は、配列番号１２（Ｆ５５６）に記述されている配列によってコードされるマルチシストロン性自己複製ＲＮＡを提供する。

【0505】

一実施例において、本開示は、配列番号１３（Ｆ５５７）に記述されている配列によってコードされるマルチシストロン性自己複製ＲＮＡを提供する。

【0506】

一実施例において、本開示は、配列番号１４（Ｆ６０２）に記述されている配列によってコードされるマルチシストロン性自己複製ＲＮＡを提供する。

【0507】

一実施例において、本開示は、配列番号１９（Ｆ５５４）に記述されている配列によってコードされるマルチシストロン性自己複製ＲＮＡを提供する。

【0508】

一実施例において、本開示は、配列番号２０（Ｆ５６８）に記述されている配列によってコードされるマルチシストロン性自己複製ＲＮＡを提供する。

【0509】

一実施例において、本開示は、配列番号２１（Ｆ５６９）に記述されている配列によってコードされるマルチシストロン性自己複製ＲＮＡを提供する。

【0510】

一実施例において、本開示は、配列番号２２（Ｆ５７０）に記述されている配列によってコードされるマルチシストロン性自己複製ＲＮＡを提供する。

【0511】

一実施例において、本開示は、配列番号２３（Ｆ５７６）に記述されている配列によってコードされるマルチシストロン性自己複製ＲＮＡを提供する。

【0512】

一実施例において、本開示は、配列番号２４（Ｆ５８４）に記述されている配列によってコードされるマルチシストロン性自己複製ＲＮＡを提供する。

【0513】

一実施例において、本開示は、配列番号２５（Ｆ５９０）に記述されている配列によってコードされるマルチシストロン性自己複製ＲＮＡを提供する。

【0514】

一実施例において、本開示は、配列番号２６（Ｆ６１６）に記述されている配列によってコードされるマルチシストロン性自己複製ＲＮＡを提供する。

【0515】

一実施例において、本開示は、配列番号２７（Ｆ６２０）に記述されている配列によってコードされるマルチシストロン性自己複製ＲＮＡを提供する。

【0516】

一実施例において、本開示は、配列番号３０（Ｃｏ１８）に記述されている配列によってコードされるマルチシストロン性自己複製ＲＮＡを提供する。

【0517】

一実施例において、本開示は、配列番号３１（Ｃｏ１９）に記述されている配列によってコードされるマルチシストロン性自己複製ＲＮＡを提供する。

【0518】

一実施例において、本開示は、配列番号４９（Ｆ６３１）に記述されている配列によってコードされるマルチシストロン性自己複製ＲＮＡを提供する。

【0519】

一実施例において、本開示は、配列番号５０（Ｆ６３２）に記述されている配列によってコードされるマルチシストロン性自己複製ＲＮＡを提供する。

【0520】

一実施例において、本開示は、配列番号５１（Ｆ６２９）に記述されている配列によってコードされるマルチシストロン性自己複製ＲＮＡを提供する。

【0521】

一実施例において、本開示は、配列番号５２（Ｆ６９５）に記述されている配列によってコードされるマルチシストロン性自己複製ＲＮＡを提供する。

【0522】

一実施例において、本開示は、配列番号５３（７０３）に記述されている配列によってコードされるマルチシストロン性自己複製ＲＮＡを提供する。

【0523】

本開示は、本開示のポリヌクレオチドを含む免疫原性組成物を提供する。本開示は、本開示のＲＮＡを含む免疫原性組成物を更に提供する。例えば、本開示は、本開示のｃＲＮＡを含む免疫原性組成物を提供する。本開示はまた、本開示の自己複製ＲＮＡを含む免疫原性組成物を提供する。例えば、本開示の組成物は、投与されるとき、対象において免疫応答を誘導することができる。例えば、組成物の投与は、体液性及び／又は細胞媒介性免疫応答を誘導する。一実施例において、組成物は、対象において体液性免疫応答を誘導する。例えば、体液性免疫応答は、抗体媒介性免疫応答である。別の実施例において、組成物は、細胞媒介性免疫応答を誘導する。例えば、細胞媒介性免疫応答は、抗原特異的細胞傷害性Ｔ細胞の活性化を含む。

【0524】

一実施例において、本開示の免疫原性組成物は、複数のポリヌクレオチドを含み、各ポリヌクレオチドは、異なるポリペプチド抗原配列をコードする。別の実施例において、本開示の免疫原性組成物は、複数のＲＮＡを含み、各ＲＮＡは、異なるポリペプチド抗原配列をコードする。更なる実施例において、本開示の免疫原性組成物は、複数のｃＲＮＡを含み、各ｃＲＮＡは、異なるポリペプチド抗原配列をコードする。一実施例において、免疫原性組成物は、複数のマルチシストロン性自己複製ＲＮＡを含み、各マルチシストロン性自己複製ＲＮＡは、異なるポリペプチド抗原配列をコードする。例えば、異なるポリペプチド抗原配列は、同じウイルス由来である（例えば、同じインフルエンザＡウイルス株由来の抗原をコードする）。一実施例において、異なるポリペプチド抗原配列は、異なるウイルス由来である。例えば、配列は、異なるインフルエンザＡウイルス株をコードする。

【0525】

本開示はまた、本開示の免疫原性組成物、及び薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物を提供する。本開示における使用に好適な薬学的に許容される担体は、当業者には明らかであるか、及び／又は本明細書に記載される。

【0526】

一実施例において、薬学的組成物は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）、高分子微粒子、及び水中油型エマルションを更に含む。例えば、ポリヌクレオチド、ＲＮＡ、ｃＲＮＡ、又は自己複製ＲＮＡは、ＬＮＰ、高分子微粒子、及び水中油型エマルション中に封入されているか、それに結合されているか、又はそれに吸着されている。一実施例において、ポリヌクレオチドは、ＬＮＰ、高分子微粒子、及び水中油型エマルション中に封入されているか、それに結合されているか、又はそれに吸着されている。別の実施例において、ＲＮＡは、ＬＮＰ、高分子微粒子、及び水中油型エマルション中に封入されているか、それに結合されているか、又はそれに吸着されている。例えば、ｃＲＮＡは、ＬＮＰ、高分子微粒子、及び水中油型エマルション中に封入されているか、それに結合されているか、又はそれに吸着されている。例えば、自己複製ＲＮＡは、ＬＮＰ、高分子微粒子、及び水中油型エマルション中に封入されているか、それに結合されているか、又はそれに吸着されている。

【0527】

一実施例において、薬学的組成物は、ＬＮＰを更に含む。例えば、ポリヌクレオチドは、ＬＮＰ中に封入されている。別の実施例において、ＲＮＡは、ＬＮＰ中に封入されている。例えば、ｃＲＮＡは、ＬＮＰ中に封入されている。例えば、自己複製ＲＮＡは、ＬＮＰ中に封入されている。例えば、ポリヌクレオチドは、ＬＮＰに結合されている。別の実施例において、ＲＮＡは、ＬＮＰに結合されている。例えば、ｃＲＮＡは、ＬＮＰに結合されている。別の実施例において、自己複製ＲＮＡは、ＬＮＰに結合されている。例えば、ポリヌクレオチドは、ＬＮＰに吸着されている。別の実施例において、ＲＮＡは、ＬＮＰに吸着されている。例えば、ｃＲＮＡは、ＬＮＰに吸着されている。更なる実施例において、自己複製ＲＮＡは、ＬＮＰに吸着されている。

【0528】

一実施例において、ＬＮＰは、ＰＥＧ脂質、構造脂質、及び／又は中性脂質を含む。例えば、ＬＮＰは、ＰＥＧ脂質、構造脂質、及び中性脂質を含む。別の実施例において、ＬＮＰは、ＰＥＧ脂質、構造脂質、又は中性脂質を含む。

【0529】

一実施例において、ＬＮＰは、カチオン性脂質を更に含む。別の実施例において、ＬＮＰは、カチオン性脂質を含まない。

【0530】

一実施例において、薬学的組成物は、高分子微粒子を更に含む。例えば、ポリヌクレオチドは、高分子微粒子中に封入されている。別の実施例において、ＲＮＡは、高分子微粒子中に封入されている。例えば、ｃＲＮＡは、高分子微粒子中に封入されている。例えば、自己複製ＲＮＡは、高分子微粒子中に封入されている。例えば、ポリヌクレオチドは、高分子微粒子に結合されている。別の実施例において、ＲＮＡは、高分子微粒子に結合されている。例えば、ｃＲＮＡは、高分子微粒子に結合されている。別の実施例において、自己複製ＲＮＡは、高分子微粒子に結合されている。例えば、ポリヌクレオチドは、高分子微粒子に吸着されている。別の実施例において、ＲＮＡは、高分子微粒子に吸着されている。例えば、ｃＲＮＡは、高分子微粒子に吸着されている。更なる実施例において、自己複製ＲＮＡは、高分子微粒子に吸着されている。

【0531】

一実施例において、薬学的組成物は、水中油型エマルションを更に含む。例えば、ポリヌクレオチドは、水中油型エマルション中に封入されている。別の実施例において、ＲＮＡは、水中油型エマルション中に封入されている。例えば、ｃＲＮＡは、水中油型エマルション中に封入されている。例えば、自己複製ＲＮＡは、水中油型エマルション中に封入されている。例えば、ポリヌクレオチドは、水中油型エマルションに結合されている。別の実施例において、ＲＮＡは、水中油型エマルションに結合されている。例えば、ｃＲＮＡは、水中油型エマルションに結合されている。別の実施例において、自己複製ＲＮＡは、水中油型エマルションに結合されている。更なる実施例において、自己複製ＲＮＡは、水中油型エマルションに吸着されている。更なる実施例において、自己複製ＲＮＡは、水中油型エマルション中に再懸濁されている。

【0532】

本開示はまた、ワクチンとして使用するための、本開示の免疫原性組成物又は薬学的組成物を提供する。

【0533】

一実施例において、ポリヌクレオチドは、ＤＮＡである。一実施例において、本開示は、本開示のｃＲＮＡワクチンをコードするＤＮＡを提供する。一実施例において、本開示は、本開示の自己複製ＲＮＡワクチンをコードするＤＮＡを提供する。

【0534】

一実施例において、ＤＮＡは、プラスミドである。

【0535】

本開示は、呼吸器ウイルス感染の治療、若しくは予防、又はその進行を遅延させることに使用するための、本開示の免疫原性組成物又は薬学的組成物を更に提供する。例えば、本開示は、呼吸器ウイルス感染の治療に使用するための、本開示の免疫原性組成物又は薬学的組成物を提供する。一実施例において、本開示は、呼吸器ウイルス感染の予防に使用するための、本開示の免疫原性組成物又は薬学的組成物を提供する。別の実施例において、本開示は、呼吸器ウイルス感染の進行を遅延させることに使用するための、本開示の免疫原性組成物又は薬学的組成物を提供する。例えば、本開示の免疫原性組成物又は薬学的組成物は、インフルエンザ、インフルエンザウイルス感染、細気管支炎、肺炎、クループ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染、ＣＯＶＩＤ－１９、及び／又はＡＲＤＳの治療、若しくは予防、又はその進行を遅延させることに使用するためのものである。一実施例において、本開示の免疫原性組成物又は薬学的組成物は、インフルエンザ、インフルエンザウイルス感染、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染、ＣＯＶＩＤ、及び／又はＡＲＤＳの治療、若しくは予防、又はその進行を遅延させることに使用するためのものである。

【0536】

一実施例において、本開示は、インフルエンザの治療、若しくは予防、又はその進行を遅延させることに使用するための、本開示の免疫原性組成物又は薬学的組成物を提供する。例えば、本開示は、インフルエンザの治療に使用するための、本開示の免疫原性組成物又は薬学的組成物を提供する。別の実施例において、本開示は、インフルエンザの予防に使用するための、本開示の免疫原性組成物又は薬学的組成物を提供する。更なる実施例において、本開示は、インフルエンザの進行を遅延させることに使用するための、本開示の免疫原性組成物又は薬学的組成物を提供する。

【0537】

一実施例において、本開示は、インフルエンザウイルス感染の治療、若しくは予防、又はその進行を遅延させることに使用するための、本開示の免疫原性組成物又は薬学的組成物を提供する。例えば、本開示は、インフルエンザウイルス感染の治療に使用するための、本開示の免疫原性組成物又は薬学的組成物を提供する。別の実施例において、本開示は、インフルエンザウイルス感染の予防に使用するための、本開示の免疫原性組成物又は薬学的組成物を提供する。更なる実施例において、本開示は、インフルエンザウイルス感染の進行を遅延させることに使用するための、本開示の免疫原性組成物又は薬学的組成物を提供する。

【0538】

一実施例において、本開示は、ＣＯＶＩＤ－１９の治療、若しくは予防、又はその進行を遅延させることに使用するための、本開示の免疫原性組成物又は薬学的組成物を提供する。例えば、本開示は、ＣＯＶＩＤ－１９の治療に使用するための、本開示の免疫原性組成物又は薬学的組成物を提供する。別の実施例において、本開示は、ＣＯＶＩＤ－１９の予防に使用するための、本開示の免疫原性組成物又は薬学的組成物を提供する。更なる実施例において、本開示は、ＣＯＶＩＤ－１９の進行を遅延させることに使用するための、本開示の免疫原性組成物又は薬学的組成物を提供する。

【0539】

一実施例において、本開示は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の治療、若しくは予防、又はその進行を遅延させることに使用するための、本開示の免疫原性組成物又は薬学的組成物を提供する。例えば、本開示は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の治療に使用するための、本開示の免疫原性組成物又は薬学的組成物を提供する。別の実施例において、本開示は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の予防に使用するための、本開示の免疫原性組成物又は薬学的組成物を提供する。更なる実施例において、本開示は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の進行を遅延させることに使用するための、本開示の免疫原性組成物又は薬学的組成物を提供する。

【0540】

一実施例において、本開示は、ＡＲＤＳの治療、若しくは予防、又はその進行を遅延させることに使用するための、本開示の免疫原性組成物又は薬学的組成物を提供する。例えば、本開示は、ＡＲＤＳの治療に使用するための、本開示の免疫原性組成物又は薬学的組成物を提供する。別の実施例において、本開示は、ＡＲＤＳの予防に使用するための、本開示の免疫原性組成物又は薬学的組成物を提供する。更なる実施例において、本開示は、ＡＲＤＳの進行を遅延させることに使用するための、本開示の免疫原性組成物又は薬学的組成物を提供する。

【0541】

本開示は、対象における疾患又は状態の治療、若しくは予防、又はその進行を遅延させる方法であって、本開示の免疫原性組成物又は薬学的組成物を、それを必要としている対象に投与することを含む、方法を提供する。一実施例において、本開示は、対象における疾患又は状態を治療する方法であって、本開示の免疫原性組成物又は薬学的組成物を、それを必要としている対象に投与することを含む、方法を提供する。別の実施例において、本開示は、対象における疾患又は状態を予防する方法であって、本開示の免疫原性組成物又は薬学的組成物を、それを必要としている対象に投与することを含む、方法を提供する。更なる実施例において、本開示は、対象における疾患又は状態の進行を遅延させる方法であって、本開示の免疫原性組成物又は薬学的組成物を、それを必要としている対象に投与することを含む、方法を提供する。

【0542】

一実施例において、本開示は、疾患又は状態の治療、若しくは予防、又はその進行を遅延させることを必要としている対象においてそれを行うための医薬の製造における、本開示のポリヌクレオチドの使用を提供する。例えば、本開示は、疾患又は状態の治療を必要としている対象においてそれを行うための医薬の製造における、本開示のポリヌクレオチドの使用を提供する。別の実施例において、本開示は、疾患又は状態の予防を必要としている対象においてそれを行うための医薬の製造における、本開示のポリヌクレオチドの使用を提供する。更なる実施例において、本開示は、疾患又は状態の進行を遅延させることを必要としている対象においてそれを行うための医薬の製造における、本開示のポリヌクレオチドの使用を提供する。

【0543】

一実施例において、本開示は、疾患又は状態の治療、若しくは予防、又はその進行を遅延させることを必要としている対象においてそれを行うための医薬の製造における、本開示のＲＮＡの使用を提供する。例えば、本開示は、疾患又は状態の治療を必要としている対象においてそれを行うための医薬の製造における、本開示のＲＮＡの使用を提供する。別の実施例において、本開示は、疾患又は状態の予防を必要としている対象においてそれを行うための医薬の製造における、本開示のＲＮＡの使用を提供する。更なる実施例において、本開示は、疾患又は状態の進行を遅延させることを必要としている対象においてそれを行うための医薬の製造における、本開示のＲＮＡの使用を提供する。

【0544】

一実施例において、本開示は、疾患又は状態の治療、若しくは予防、又はその進行を遅延させることを必要としている対象においてそれを行うための医薬の製造における、本開示のｃＲＮＡの使用を提供する。例えば、本開示は、疾患又は状態の治療を必要としている対象においてそれを行うための医薬の製造における、本開示のｃＲＮＡの使用を提供する。別の実施例において、本開示は、疾患又は状態の予防を必要としている対象においてそれを行うための医薬の製造における、本開示のｃＲＮＡの使用を提供する。更なる実施例において、本開示は、疾患又は状態の進行を遅延させることを必要としている対象においてそれを行うための医薬の製造における、本開示のｃＲＮＡの使用を提供する。

【0545】

一実施例において、本開示は、疾患又は状態の治療、若しくは予防、又はその進行を遅延させることを必要としている対象においてそれを行うための医薬の製造における、本開示の自己複製ＲＮＡの使用を提供する。例えば、本開示は、疾患又は状態の治療を必要としている対象においてそれを行うための医薬の製造における、本開示の自己複製ＲＮＡの使用を提供する。別の実施例において、本開示は、疾患又は状態の予防を必要としている対象においてそれを行うための医薬の製造における、本開示の自己複製ＲＮＡの使用を提供する。更なる実施例において、本開示は、疾患又は状態の進行を遅延させることを必要としている対象においてそれを行うための医薬の製造における、本開示の自己複製ＲＮＡの使用を提供する。

【0546】

一実施例において、対象は、疾患又は状態に罹患している。一実施例において、対象は、疾患又は状態に罹患していると診断されている。一実施例において、対象は、疾患又は状態のための治療を受けている。

【0547】

一実施例において、疾患又は状態は、呼吸器ウイルス感染である。例えば、呼吸器ウイルス感染は、インフルエンザ、インフルエンザウイルス感染、細気管支炎、肺炎、クループ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染、ＣＯＶＩＤ－１９、及びＡＲＤＳからなる群から選択される。一実施例において、疾患又は状態は、インフルエンザ、インフルエンザウイルス感染、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染、ＣＯＶＩＤ－１９、及び／又はＡＲＤＳである。一実施例において、疾患又は状態は、インフルエンザである。別の実施例において、疾患又は状態は、インフルエンザウイルス感染である。別の実施例において、疾患又は状態は、細気管支炎である。更なる実施例において、疾患又は状態は、肺炎である。一実施例において、疾患又は状態は、クループである。別の実施例において、疾患又は状態は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染である。別の実施例において、疾患又は状態は、ＣＯＶＩＤ－１９である。更なる実施例において、疾患又は状態は、ＡＲＤＳである。一実施例において、ＡＲＤＳは、インフルエンザ、インフルエンザウイルス感染、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染、及び／又はＣＯＶＩＤ－１９と関連している。

【0548】

本明細書に記載される任意の方法の一実施例において、本開示の自己複製ＲＮＡは、対象におけるインフルエンザ、インフルエンザウイルス感染、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染、ＣＯＶＩＤ－１９、及び／又はＡＲＤＳの発症の前又は後に投与される。本明細書に記載される任意の方法の一実施例において、本開示の自己複製ＲＮＡは、対象におけるインフルエンザ、インフルエンザウイルス感染、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染、ＣＯＶＩＤ－１９、及び／又はＡＲＤＳの発症の前に投与される。本明細書に記載される任意の方法の一実施例において、本開示の自己複製ＲＮＡは、対象におけるインフルエンザ、インフルエンザウイルス感染、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染、ＣＯＶＩＤ－１９、及び／又はＡＲＤＳの発症の後に投与される。

【0549】

本明細書に記載される任意の方法の一実施例において、本開示の自己複製ＲＮＡは、呼吸器ウイルス感染の検出の後に投与される。例えば、本開示の自己複製ＲＮＡは、対象におけるインフルエンザ、インフルエンザウイルス感染、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染、ＣＯＶＩＤ－１９、及び／又はＡＲＤＳの検出の後に投与される。本明細書に記載される任意の方法の一実施例において、本開示の自己複製ＲＮＡは、対象におけるインフルエンザ、インフルエンザウイルス感染、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染、ＣＯＶＩＤ－１９、及び／又はＡＲＤＳの検出の後に投与される。本明細書に記載される任意の方法の更なる実施例において、本開示の自己複製ＲＮＡは、インフルエンザウイルス感染の検出の後に投与される。本明細書に記載される任意の方法の一実施例において、本開示の自己複製ＲＮＡは、インフルエンザウイルス感染の検出の後であるが、インフルエンザの発症前に投与される。本明細書に記載される任意の方法の別の実施例において、本開示の自己複製ＲＮＡは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の検出の後に投与される。一実施例において、本開示の自己複製ＲＮＡは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の検出の後であるが、ＣＯＶＩＤ－１９の発症前に投与される。本明細書に記載される任意の方法の更なる実施例において、本開示の自己複製ＲＮＡは、ＣＯＶＩＤ－１９の検出の後に投与される。本明細書に記載される任意の方法の一実施例において、本開示の自己複製ＲＮＡは、ＣＯＶＩＤ－１９の検出の後であるが、ＡＲＤＳの発症前に投与される。本明細書に記載される任意の方法の別の実施例において、本開示の自己複製ＲＮＡは、ＡＲＤＳの検出の後に投与される。

【0550】

一実施例において、対象は、インフルエンザ、ＣＯＶＩＤ－１９、又はＡＲＤＳを発症するリスクにある。例えば、対象は、インフルエンザを発症するリスクにある。別の実施例において、対象は、ＣＯＶＩＤ－１９を発症するリスクにある。更なる実施例において、対象は、ＡＲＤＳを発症するリスクにある。

【0551】

一実施例において、本開示の組成物は、インフルエンザ、インフルエンザウイルス感染、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染、ＣＯＶＩＤ－１９、及び／又はＡＲＤＳのうちの１つ以上の症状の重症度を低減するか、又は発生を予防するのに十分な量で投与される。インフルエンザ、インフルエンザウイルス感染、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染、ＣＯＶＩＤ－１９、及び／又はＡＲＤＳの症状は、当業者には明らかであるか、及び／又は本明細書に記載される。

【0552】

本開示は、対象において免疫応答を誘導する方法であって、本開示の自己複製ＲＮＡ、免疫原性組成物、又は薬学的組成物を、それを必要としている対象に投与することを含む、方法を提供する。

【0553】

本開示はまた、免疫応答を誘導することを必要としている対象においてそれを行うための医薬の製造における、本開示の自己複製ＲＮＡ、免疫原性組成物、又は薬学的組成物の使用を提供する。

【0554】

一実施例において、本開示の自己複製ＲＮＡ、免疫原性組成物、又は薬学的組成物は、体液性及び／又は細胞媒介性免疫応答を誘導する。一実施例において、組成物は、対象において体液性免疫応答を誘導する。例えば、体液性免疫応答は、抗体媒介性免疫応答である。例えば、中和抗体の産生。別の実施例において、組成物は、細胞媒介性免疫応答を誘導する。例えば、細胞媒介性免疫応答は、抗原特異的細胞傷害性Ｔ細胞の活性化を含む。例えば、Ｔ細胞は、ＣＤ４ Ｔ細胞及び／又はＣＤ８ Ｔ細胞である。一実施例において、Ｔ細胞は、ＣＤ４ Ｔ細胞である。別の実施例において、Ｔ細胞は、ＣＤ８ Ｔ細胞である。更なる実施例において、Ｔ細胞は、ＣＤ４及びＣＤ８ Ｔ細胞である。

【0555】

一実施例において、本開示の自己複製ＲＮＡ、免疫原性組成物、又は薬学的組成物の投与は、ＣＤ４ Ｔ細胞媒介性免疫応答を誘導する。

【0556】

一実施例において、本開示の自己複製ＲＮＡ、免疫原性組成物、又は薬学的組成物の投与は、ＣＤ８ Ｔ細胞媒介性免疫応答を誘導する。

【0557】

一実施例において、本開示の自己複製ＲＮＡ、免疫原性組成物、又は薬学的組成物の投与は、ＣＤ４及びＣＤ８ Ｔ細胞媒介性免疫応答を誘導する。

【0558】

本開示はまた、本開示の自己複製ＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを提供する。例えば、ポリヌクレオチドは、組換えＤＮＡである。一実施例において、組換えＤＮＡは、プラスミドである。一実施例において、プラスミドは、配列番号１０～１４、又は配列番号１９～２７、又は配列番号３０～３１のいずれか１つに記述されている配列を含む。

【0559】

本開示はまた、対象における疾患又は障害（例えば、インフルエンザ、インフルエンザウイルス感染、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染、ＣＯＶＩＤ－１９、及び／又はＡＲＤＳ）の治療、若しくは予防、又はその進行を遅延させることに使用するための、使用説明書とともにパッケージングされた、任意選択的に送達系及び／又は薬学的に許容される担体若しくは希釈剤中に本開示の少なくとも１つの自己複製ＲＮＡを含む、キットを提供する。

【0560】

本開示はまた、疾患又は障害（例えば、インフルエンザ、インフルエンザウイルス感染、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染、ＣＯＶＩＤ－１９、及び／又はＡＲＤＳ）に罹患しているか、又は罹患しているリスクにある対象にＲＮＡを投与するための、使用説明書とともにパッケージングされた、任意選択的に送達系及び／又は薬学的に許容される担体若しくは希釈剤中に本開示の少なくとも１つの自己複製ＲＮＡを含む、キットを提供する。

【0561】

一実施例において、本開示の自己複製ＲＮＡ、免疫原性組成物、又は薬学的組成物は、バイアルにおいて供給される。別の実施例において、本開示の自己複製ＲＮＡ、免疫原性組成物、又は薬学的組成物は、注射器において供給される。

【図面の簡単な説明】

【0562】

【図1】（Ａ）は、Ａ／シチメンチョウ／Ｔｕｒｋｅｙ／１／２００５に由来するＨＡ及びＮＡサブタイプを使用して調製した自己複製ＲＮＡの概略図である。（Ｂ）及び（Ｃ）は、構築物中の５’キャップ駆動抗原発現を示す。

【図2-1】平均蛍光強度（ＭＦＩ）分析によって決定される場合の、非製剤化ＲＮＡ構築物（Ａ）Ｆ５４８（Ｂ）Ｆ５４９（Ｃ）Ｆ６０２（Ｄ）Ｆ６１６（Ｅ）Ｆ５５６（Ｆ）Ｆ５５７（Ｇ）Ｆ５６８（Ｈ）Ｆ５６９（Ｉ）Ｆ５７６（Ｊ）Ｆ６２０（Ｋ）Ｆ５８４（Ｌ）Ｆ５９０における、目的のＨ５及びＮ１遺伝子の遺伝子発現のパターンを示す。

【図2-2】平均蛍光強度（ＭＦＩ）分析によって決定される場合の、非製剤化ＲＮＡ構築物（Ａ）Ｆ５４８（Ｂ）Ｆ５４９（Ｃ）Ｆ６０２（Ｄ）Ｆ６１６（Ｅ）Ｆ５５６（Ｆ）Ｆ５５７（Ｇ）Ｆ５６８（Ｈ）Ｆ５６９（Ｉ）Ｆ５７６（Ｊ）Ｆ６２０（Ｋ）Ｆ５８４（Ｌ）Ｆ５９０における、目的のＨ５及びＮ１遺伝子の遺伝子発現のパターンを示す。

【図2-3】平均蛍光強度（ＭＦＩ）分析によって決定される場合の、非製剤化ＲＮＡ構築物（Ａ）Ｆ５４８（Ｂ）Ｆ５４９（Ｃ）Ｆ６０２（Ｄ）Ｆ６１６（Ｅ）Ｆ５５６（Ｆ）Ｆ５５７（Ｇ）Ｆ５６８（Ｈ）Ｆ５６９（Ｉ）Ｆ５７６（Ｊ）Ｆ６２０（Ｋ）Ｆ５８４（Ｌ）Ｆ５９０における、目的のＨ５及びＮ１遺伝子の遺伝子発現のパターンを示す。

【図3-1】平均蛍光強度分析によって決定される場合の、脂質ナノ粒子中で製剤化されるＲＮＡの目的の第１及び第２の遺伝子の遺伝子発現のパターンを示す。（Ａ）Ｆ５５６及びＦ５４８構築物におけるＨ５及びＮ１抗原の発現。（Ｂ）Ｆ５５７及びＦ５４９構築物におけるＨ５及びＮ１抗原の発現。（Ｃ）Ｈ５抗原のみを発現する対照構築物Ｆ５００．３と比較した場合の、Ｆ５５６、Ｆ６０２、及びＦ６１６構築物におけるＨ５抗原の発現。（Ｄ）Ｎ１抗原のみを発現する対照構築物Ｆ５４３と比較した場合の、Ｆ５５６、Ｆ６０２、及びＦ６１６構築物におけるＮ１抗原の発現。（Ｅ）Ｆ５５４構築物におけるＨ５、Ｎ１、及びＭ１抗原の発現。（Ｆ）Ｆ５８４構築物におけるＨ５、Ｎ１、及びＭ１抗原の発現。（Ｇ）Ｆ５９０構築物におけるＨ５、Ｎ１、Ｍ１、及びＭ２抗原の発現。

【図3-2】平均蛍光強度分析によって決定される場合の、脂質ナノ粒子中で製剤化されるＲＮＡの目的の第１及び第２の遺伝子の遺伝子発現のパターンを示す。（Ａ）Ｆ５５６及びＦ５４８構築物におけるＨ５及びＮ１抗原の発現。（Ｂ）Ｆ５５７及びＦ５４９構築物におけるＨ５及びＮ１抗原の発現。（Ｃ）Ｈ５抗原のみを発現する対照構築物Ｆ５００．３と比較した場合の、Ｆ５５６、Ｆ６０２、及びＦ６１６構築物におけるＨ５抗原の発現。（Ｄ）Ｎ１抗原のみを発現する対照構築物Ｆ５４３と比較した場合の、Ｆ５５６、Ｆ６０２、及びＦ６１６構築物におけるＮ１抗原の発現。（Ｅ）Ｆ５５４構築物におけるＨ５、Ｎ１、及びＭ１抗原の発現。（Ｆ）Ｆ５８４構築物におけるＨ５、Ｎ１、及びＭ１抗原の発現。（Ｇ）Ｆ５９０構築物におけるＨ５、Ｎ１、Ｍ１、及びＭ２抗原の発現。

【図4】（Ａ）短い、及び（Ｂ）長い形態のマイクロ中和アッセイにおける自己複製ＲＮＡにより免疫化したマウスからのマイクロ中和力価を示す。

【図5】自己複製ＲＮＡにより免疫化したマウスからの赤血球凝集素力価を示す。

【図6】抗原特異的ＣＤ４及びＣＤ８ Ｔ細胞応答を示す。（Ａ）Ｆ５４８、Ｆ５４９、Ｆ５５６、及びＦ５５７におけるＨ５及びＮ１抗原特異的ＣＤ８ Ｔ細胞応答。（Ｂ）Ｆ５５６、Ｆ５５７、Ｆ６０２、及びＦ６１６におけるＨ５及びＮ１抗原特異的ＣＤ８ Ｔ細胞応答。（Ｃ）Ｆ５４８、Ｆ５４９、Ｆ５５６、及びＦ５５７におけるＨ５及びＮ１抗原特異的ＣＤ４ Ｔ細胞応答。（Ｄ）Ｆ５５６、Ｆ５５７、Ｆ６０２、及びＦ６１６におけるＨ５及びＮ１抗原特異的ＣＤ４ Ｔ細胞応答。

【図7】（Ａ）マイクロ中和アッセイによって評価される場合の抗体応答、及び（Ｂ）ＡＣＥ２結合の阻害を示す。

【図8】抗原特異的ＣＤ４及びＣＤ８ Ｔ細胞応答を示す。（Ａ）ペプチド混合物１（白色バー）及びペプチド混合物２（黒色バー）によるＳ特異的ＣＤ４ Ｔ細胞応答。（Ｂ）ペプチド混合物１（白色バー）及びペプチド混合物２（黒色バー）によるＳ特異的ＣＤ８ Ｔ細胞応答。（Ｃ）Ｎ特異的ＣＤ４ Ｔ細胞応答、及び（Ｄ）Ｎ特異的ＣＤ８ Ｔ細胞応答。

【図9】Ｃｏ１８によって誘導される抗原特異的Ｔ細胞を示す一連のグラフ表示である。（Ａ）Ｓ１特異的ＣＤ４ Ｔ細胞、（Ｂ）Ｓ１特異的ＣＤ８ Ｔ細胞（Ｃ）Ｓ２特異的ＣＤ４ Ｔ細胞、（Ｄ）Ｓ２特異的ＣＤ８ Ｔ細胞、及び（Ｅ）Ｎ特異的ＣＤ４ Ｔ細胞について、誘導される正味の（抗原特異的）％サイトカイン産生ＣＤ４及びＣＤ８ Ｔ細胞を示す。

【図10-1】（Ａ）正味％抗原特異的ＣＤ４＋応答、（Ｂ）正味％抗原特異的ＣＤ８＋応答、並びに（Ｃ）抗原特異的ＣＤ４応答、及び（Ｄ）抗原特異的ＣＤ８応答の正規化された頻度を示す一連のグラフ表示である。

【図10-2】（Ａ）正味％抗原特異的ＣＤ４＋応答、（Ｂ）正味％抗原特異的ＣＤ８＋応答、並びに（Ｃ）抗原特異的ＣＤ４応答、及び（Ｄ）抗原特異的ＣＤ８応答の正規化された頻度を示す一連のグラフ表示である。

【表A】

【表B】

【表C】

【発明を実施するための形態】

【0563】

全般
本明細書全体を通して、特に別段の明記がない限り、又は文脈が別段に必要としない限り、単一のステップ、物質の組成物、ステップの群、又は物質の組成物の群への言及は、それらのステップ、物質の組成物、ステップの群、又は物質の組成物の群のうちの１つ及び複数（すなわち、１つ以上）を包含すると解釈されるものとする。

【0564】

当業者は、本開示が、具体的に記載されるもの以外の変形及び修正を受けやすいことを理解するであろう。本開示は、そのような全ての変形及び修正を含むことが理解されるべきである。本開示はまた、本明細書中で個別に又は集合的に言及又は示されるステップ、特徴、組成物、及び化合物のうちの全て、並びに当該ステップ又は特徴のうちのいずれか及び全ての組み合わせ又は任意の２つ以上を含む。

【0565】

本開示は、例示のみの目的を意図する、本明細書に記載される特定の実施例によって範囲が限定されるべきではない。機能的に等価な産物、組成物、及び方法は、本開示の範囲内であることは明らかである。

【0566】

本明細書における本開示の任意の実施例は、特に別段の明記がない限り、本開示の任意の他の実施例に変更すべき点を変更して適用されると解釈されるものとする。別の言い方をすると、本開示の任意の特定の実施例は、本開示の任意の他の特定の実施例と組み合わせることができる（相互に排他的な場合を除く）。

【0567】

特定の特徴、又は特徴の群、又は方法、又は方法のステップを開示する本開示の任意の実施例は、特定の特徴、又は特徴の群、又は方法、又は方法のステップを否定するための明示的な支持を提供するために行われる。

【0568】

特に別段の定義がない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有すると解釈されるものとする（例えば、細胞培養、分子遺伝学、免疫学、免疫組織化学、タンパク質化学、及び生化学）。

【0569】

別段の指示がない限り、本開示で利用される組換えタンパク質、細胞培養、及び免疫学的技術は、当業者に周知の標準的な手順である。そのような技術は、Ｊ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ（１９８４）、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）、Ｔ．Ａ．Ｂｒｏｗｎ（ｅｄｉｔｏｒ），Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅｓ １ ａｎｄ ２，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ（１９９１）、Ｄ．Ｍ．Ｇｌｏｖｅｒ ａｎｄ Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ（ｅｄｉｔｏｒｓ），ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅｓ １－４，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ（１９９５ ａｎｄ １９９６）、及びＦ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｉｔｏｒｓ），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８、現在までの全ての更新を含む）、Ｅｄ Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｄａｖｉｄ Ｌａｎｅ（ｅｄｉｔｏｒｓ）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，（１９８８）、及びＪ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｉｔｏｒｓ）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（現在までの全ての更新を含む）などの供給元における文献を通して記載、かつ説明されている。

【0570】

「及び／又は」という用語、例えば、「Ｘ及び／又はＹ」は、「Ｘ及びＹ」又は「Ｘ又はＹ」のいずれかを意味すると理解されるものとし、両方の意味又はいずれかの意味のための明示的な支持を提供すると解釈されるものとする。

【0571】

本明細書全体を通して、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という単語、又は「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」若しくは「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変形は、明記された要素、整数若しくはステップ、又は要素、整数若しくはステップの群の包含を意味するが、任意の他の要素、整数若しくはステップ、又は要素、整数若しくはステップの群の除外を意味するものではないことが理解されるであろう。

【0572】

本明細書で使用される場合、「に由来する」という用語は、特定の整数が特定の供給元から取得され得るが、必ずしもその供給元から直接取得されるとは限らないことを示すと解釈されるものとする。同様に、「に基づく」という用語は、特定の整数が特定の供給元から開発又は使用され得るが、必ずしもその供給元から直接開発又は使用されるとは限らないことを示すと解釈されるものとする。

【0573】

選択した定義
本明細書で使用される場合、ポリヌクレオチド、ＲＮＡ、ｃＲＮＡ、及び／又は自己複製ＲＮＡに関して「マルチシストロン性」（「多シストロン性」としても既知である）という用語は、２つ以上のポリペプチドをコードするＲＮＡを指す。この用語は、「バイシストロン性」（又は「ジシストロン性」、すなわち、２つのポリペプチドをコードする）及び「トリシストロン性」（すなわち、３つのポリペプチドをコードする）分子を包含する。「バイシストロン性」は、核酸の異なる領域からの２つの異なるポリペプチドをコードすることができる単一の核酸を意味する。

【0574】

本明細書で使用される場合、「従来ｍＲＮＡ」又は「ｃＲＮＡ」又は「非増幅ＲＮＡ」という用語は、異種ＲＮＡ及びタンパク質の発現を可能にする構築物であるが、宿主細胞内で増幅できないＲＮＡを指す。

【0575】

本明細書で使用される場合、「自己複製ＲＮＡ」という用語は、異種ｍＲＮＡ及びタンパク質の発現を可能にするように操作されているＲＮＡウイルスに基づく構築物を指す。自己複製ＲＮＡ（例えば、裸のＲＮＡの形態で）は、宿主細胞内で増幅し、宿主細胞内で所望の遺伝子産物の発現をもたらすことができる。

【0576】

本明細書で使用される「裸の」という用語は、脂質、ポリマー、及びタンパク質などの他の巨大分子を実質的に含まない核酸を指す。自己複製ＲＮＡなどの「裸の」核酸は、細胞の取り込みを改善するために他の巨大分子とともに製剤化されない。したがって、裸の核酸は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）、リポソーム、高分子微粒子、又は水中油型エマルション中に封入されていないか、それに吸着されていないか、又はそれに結合されていない。

【0577】

本明細書で使用される場合、「ヌクレオチド配列」又は「核酸配列」という用語は、ホスホジエステル骨格に共有結合した一連の連続するヌクレオチド（又は塩基）を意味すると理解されるであろう。慣例により、配列は、別段の定めがない限り、５’末端から３’末端まで提示される。核酸の明確な説明を容易にするために、特定の配列構成成分は、例えば、「第１のヌクレオチド配列」及び「第２のヌクレオチド配列」と称される。第１及び第２の配列は、別段の定めがない限り、任意の所望の順序又は向きで現れることができ、特定の順序又は向きは、「第１の」、「第２の」という単語などによって意図されないことが理解されるべきである。

【0578】

本明細書で使用される場合、「抗原」という用語は、細胞及び／又は体液性免疫応答を誘導、誘発、増大、又はブーストする１つ以上のエピトープを含有する分子又は構造を指す。抗原は、例えば、ウイルス、細菌、真菌、原生動物、植物などの病原体由来、又は腫瘍由来のタンパク質及びペプチドを含み得る。

【0579】

本明細書で使用される場合、「に作動可能に連結された」という用語は、核酸の発現がエレメントによって制御又は調節されるように、サブゲノムプロモーター又は調節エレメント（例えば、ＩＲＥＳ）を核酸に対して配置することを意味する。例えば、サブゲノムプロモーターは、例えば、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）などの別の調節エレメントを介して、多数の核酸に作動可能に連結され得る。

【0580】

本明細書で使用される場合、「サブゲノムプロモーター」（「ジャンクション領域」プロモーターとしても既知である）という用語は、異種ヌクレオチド配列の発現を指示し、タンパク質発現を調節するプロモーターを指す。

【0581】

本明細書で使用される場合、「内部リボソーム進入部位」又は「ＩＲＥＳ」という用語は、リボソーム又はその構成成分、例えば、リボソームの４０Ｓサブユニットが結合することができるｍＲＮＡ内のヌクレオチドの配列を指す。ＩＲＥＳは、ｍＲＮＡの翻訳を誘導する核酸（例えば、開始コドン；ＡＵＧ）を必ずしも含む必要はない。

【0582】

「ポリペプチド」又は「ポリペプチド鎖」という用語は、ペプチド結合によって連結される一連の連続するアミノ酸を意味することが理解されるであろう。例えば、タンパク質は、単一のポリペプチド鎖、すなわち、ペプチド結合によって連結された一連の連続するアミノ酸、又は互いに共有結合若しくは非共有結合された一連のポリペプチド鎖（すなわち、ポリペプチド複合体）を含むと解釈されるものとする。一連のポリペプチド鎖は、好適な化学結合又はジスルフィド結合を使用して共有結合され得る。非共有結合の例としては、水素結合、イオン結合、ファンデルワールス力、及び疎水性相互作用が挙げられる。

【0583】

「組換え」という用語は、人工遺伝子組換えの産物を意味すると理解されるものとする。

【0584】

本明細書で使用される場合、発現のレベルに関して「実質的に同じ」という用語は、第１及び第２の抗原が、互いの約１０％以下における発現のレベルを（少なくとも）有することを意味する。

【0585】

本明細書で使用される場合、「疾患」、「障害」、又は「状態」という用語は、正常な機能の破壊又はそれとの干渉を指し、任意の特定の状態に限定されず、疾患（ｄｉｓｅａｓｅｓ）又は障害（ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ）を含む。

【0586】

本明細書で使用される場合、疾患又は状態を発症する「リスクにある」対象は、検出可能な疾患又は疾患の症状を有してもよく、又は有しなくてもよく、本開示による治療の前に検出可能な疾患又は疾患の症状を示していてもよく、又は示していなくてもよい。「リスクにある」は、対象が、当該技術分野で既知であるか、及び／又は本明細書に記載されるように、疾患又は状態の発症と相関する測定可能なパラメータである、１つ以上のリスク因子を有することを示す。

【0587】

本明細書で使用される場合、「治療すること」、「治療する」、又は「治療」という用語は、本明細書に記載されるＲＮＡ又は組成物を投与し、それによって、特定の疾患又は状態のうちの少なくとも１つの症状を低減又は排除することを含む。

【0588】

本明細書で使用される場合、「予防すること」、「予防する」、又は「予防」という用語は、個体における特定の疾患又は状態の発生又は再発に関する予防法を提供することを含む。個体は、疾患を発症する素因があり得るか、又は疾患を発症するリスクにあり得るが、まだ疾患と診断されていない。

【0589】

本明細書で使用される場合、「の進行を遅延させる」という語句は、個体における疾患若しくは状態、及び／又は疾患若しくは状態のうちの少なくとも１つの症状の進行を低減又は遅らせることを含む。

【0590】

「有効量」は、所望の結果を達成するために必要な投与量及び期間において少なくとも有効な量を指す。例えば、所望の結果は、治療的又は予防的結果であってもよい。有効量は、１つ以上の投与において提供され得る。本開示のいくつかの実施例において、「有効量」という用語は、上に記載されるような疾患又は状態の治療を有効にするために必要な量を意味する。本開示のいくつかの実施例において、「有効量」という用語は、上に記載されるような疾患又は状態と関連する変化を有効にするために必要な量を意味する。有効量は、治療される疾患若しくは状態又は変更される因子に応じて、また、体重、年齢、人種的背景、性別、健康及び／又は身体的状態、並びに治療される哺乳動物に関連する他の因子に応じて変化し得る。典型的には、有効量は、医師による日常的な試験及び実験を通して決定され得る比較的広い範囲（例えば、「投与量」範囲）内に入るであろう。したがって、本用語は、本開示を特定の量、例えば、ＲＮＡの重量又は数に限定すると解釈されるべきではない。有効量は、単回用量で、又は治療期間にわたって１回若しくは複数回繰り返される用量で投与され得る。

【0591】

「治療有効量」は、特定の疾患又は状態の測定可能な改善を有効にするために必要とされる少なくとも最小濃度である。本明細書における治療有効量は、患者の疾患状態、年齢、性別、及び体重、並びに個体における所望の応答を誘発する本開示のＲＮＡの能力などの因子に応じて変化し得る。治療有効量はまた、ＲＮＡの任意の毒性又は有害な効果が治療的に有益な効果によって上回るものである。

【0592】

本明細書で使用される場合、「予防的有効量」という用語は、本明細書に記載されるような疾患又は障害のうちの１つ以上の検出可能な症状の発生を予防又は阻害又は遅延させるのに十分な量の本開示のＲＮＡを意味すると解釈されるものとする。

【0593】

本明細書で使用される場合、「対象」という用語は、ヒト、例えば哺乳動物を含む任意の動物を意味すると解釈されるものとする。例示的な対象としては、ヒト及び非ヒト霊長類が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、対象は、ヒトである。

【0594】

本明細書で使用される場合、「脂質ナノ粒子」又は「ＬＮＰ」という用語は、ナノメートル（例えば、１～１，０００ｎｍ）のオーダーにおける少なくとも１つの寸法を有し、本明細書に記載される任意の式の化合物を含む脂質ベースの粒子を指すと理解されるものとする。実施形態において、ＬＮＰは、所望の標的、例えば、細胞、組織、臓器、腫瘍などへのポリヌクレオチドの送達のための組成物中で製剤化される。例えば、脂質ナノ粒子又はＬＮＰは、リポソーム又は小胞から選択され得るものを含むが、これらに限定されない、任意の脂質組成物を指し、水性体積は、非水性コア及び固体脂質ナノ粒子を有する両親媒性脂質二重層（例えば、単一；単層、又は複数；多層）ミセル様脂質ナノ粒子によって封入され、固体脂質ナノ粒子は、脂質二重層を欠いている。

【0595】

ポリヌクレオチド
本明細書で使用される場合、「ポリヌクレオチド」という用語は、１つのヌクレオチドのホスホリル基と隣接ヌクレオチド中の糖のヒドロキシル基との間で一連のエステル結合（ｌｉｎａｋｇｅｓ）によって化学的に結合されたヌクレオチドの分子鎖を指す。一実施例において、ポリヌクレオチドは、ＤＮＡである。一実施例において、ポリヌクレオチドは、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡである。例えば、ｍＲＮＡは、従来ｍＲＮＡ（ｃＲＮＡ）又は自己複製ＲＮＡである。

【0596】

本明細書で使用される場合、「断片」という用語は、完全長ヌクレオチド配列又はポリペプチドの定義された活性を維持する、本明細書に開示される参照ヌクレオチド配列又はポリペプチドのヌクレオチド配列又はポリペプチドの一部分を指す。

【0597】

本明細書で使用される場合、「変異体」という用語は、非修飾配列と比較して、１つ以上の置換、挿入、欠失、及び／又は他の修飾を有するヌクレオチド配列を指す。本明細書に記載される任意の変異体が、コードされたタンパク質の同じ又は類似の発現を有することは、当業者には明らかであろう。例えば、変異体は、機能性変異体である。ヌクレオチド配列及び／又はポリペプチドに対する例示的な修飾は、当業者には明らかであるか、及び／又は本明細書に記載される。

【0598】

一実施例において、修飾は、ヌクレオチド配列のうちの１つ以上のヌクレオチドの化学修飾である。例えば、ポリヌクレオチドのうちの少なくとも１つの天然に存在するヌクレオチドは、化学修飾されたヌクレオチド（例えば、シュードウリジン（ψ）、及び１－メチルシュードウリジン（ｍ１ψ））により置き換えられる。

【0599】

一実施例において、修飾は、ヌクレオチド配列のＧ／Ｃ含有量を増加させることを含む。

【0600】

一実施例において、修飾は、ヌクレオチド配列のコドン最適化を含む。

【0601】

一実施例において、置換は、保存的置換である。当業者は、ポリペプチドに関する保存的置換が、ポリペプチド中のアミノ酸の、類似の生化学的特性（例えば、電荷、疎水性、及びサイズ）を有する異なるアミノ酸との置き換えを伴うことを理解するであろう。一実施例において、置換は、非保存的置換である。

【0602】

本明細書で使用される場合、「コードする（ｅｎｃｏｄｅ）」、「コードする（ｅｎｃｏｄｅｓ）」、又は「コードすること」という用語は、ポリペプチドへの翻訳を受けることができるポリヌクレオチドの領域を指す。

【0603】

本開示のポリヌクレオチドは、ＤＮＡ及びＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）を含む。

【0604】

デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）
一実施例において、ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ（例えば、ＤＮＡベクター）である。

【0605】

本開示のＤＮＡが、３’ＵＴＲの３’末端にエンドヌクレアーゼ制限部位を更に含むことは、当業者には明らかであろう。当業者は、エンドヌクレアーゼ制限部位が、ＤＮＡの残りの部分を破壊することなく、１つ以上のヌクレオチド配列（例えば、目的の抗原、その断片及び／又は変異体をコードする）の挿入を可能にすることを理解するであろう。

【0606】

本明細書で使用される場合、「制限エンドヌクレアーゼ部位」という用語は、制限エンドヌクレアーゼに結合するＤＮＡの配列を指す。典型的には、制限エンドヌクレアーゼ部位は、制限エンドヌクレアーゼによって認識及び切断される短い配列（例えば、およそ４～８塩基対）である。

【0607】

本明細書で使用される場合、「制限酵素」又は「制限エンドヌクレアーゼ」という用語は、細菌及びいくつかのウイルス中に天然に存在する酵素のクラスを指す。制限エンドヌクレアーゼは、制限エンドヌクレアーゼ部位内又はそれに隣接する特定の部位で二本鎖ＤＮＡに特異的に結合し、二本鎖ＤＮＡを切断する。例示的な制限エンドヌクレアーゼとしては、例えば、ＢｃｉＶＩ（Ｂｆｕｌ）、Ｂｃｕｌ（Ｓｐｅｌ）、ＥｃｏＲＩ、Ａａｔｌｌ、ＡｇｅＩ（ＢｓｈＴＩ）、Ａｐａｌ、ＢａｍＨＩ、ＢｇｌＩＩ、Ｂｌｐｌ（Ｂｐｕ１１０２Ｉ）、ＢｓｒＧＩ（Ｂｓｐ１４０７）、Ｃｌａｌ（Ｂｓｕ１５Ｉ）、ＥｃｏＲＩ、ＥｃｏＲＶ（Ｅｃｏ３２Ｉ）、Ｅａｍ１１０４Ｉ（ＥａｒＩ）、Ｈｉｎｄｌｌｌ、Ｋｐｎｌ、Ｍｌｕｌ、Ｎｃｏｌ、Ｎｄｅｌ、Ｎｈｅｌ、Ｎｏｔｌ、Ｎｓｉｌ、Ｍｐｈ１１０３Ｉ）、Ｐｓｔｌ、Ｐｖｕｌ、Ｐｖｕｌｌ、ＳａｃＩ、ＳａｌＩ、ＳｃａＩ、ＳｐｅＩ、Ｘｂａｌ、Ｘｈｏｌ、Ｓａｃｌｌ（Ｃｆｒ４２Ｉ）、及びＸｂａｌが挙げられる。

【0608】

一実施例において、本開示は、目的の第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、並びにＳＧプロモーター及びＩＲＥＳからなる群から選択される調節エレメントに作動可能に連結された目的の第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列を含む、転写可能ポリヌクレオチドを提供する。例えば、ポリヌクレオチドは、第１及び第２のヌクレオチド配列、並びに任意選択的に目的の１つ以上の抗原をコードする１つ以上のヌクレオチド配列を含むＤＮＡプラスミドである。

【0609】

一実施例において、ＤＮＡは、３’ＵＴＲの３’に位置する制限エンドヌクレアーゼ部位を含むヌクレオチド配列を含む。３’ＵＴＲの３’に位置する制限エンドヌクレアーゼ部位の存在は、線状化したＤＮＡの産生を可能にする。ＤＮＡの線状化は、ｍＲＮＡを産生するためのインビトロ転写ＤＮＡの定義された終結を確実にする。

【0610】

リボ核酸（ＲＮＡ）
一実施例において、ポリヌクレオチドは、５’から３’への順に、目的の第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、並びにＳＧプロモーター及びＩＲＥＳからなる群から選択される調節エレメントに作動可能に連結された目的の第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列を含むｍＲＮＡである。

【0611】

本開示のｍＲＮＡは、非複製ｍＲＮＡ（従来ｍＲＮＡ（ｃＲＮＡ）又は非増幅とも称される）及び自己複製ＲＮＡ（自己増幅ＲＮＡ又はｓａ－ｍＲＮＡとも称される）を包含する。

【0612】

従来（非複製）ＲＮＡ
本開示は、マルチシストロン性ｃＲＮＡを提供する。

【0613】

当業者は、本開示のｃＲＮＡが、５’から３’への順に、５’キャップ構造、５’－ＵＴＲ、その断片及び／又は変異体、目的の第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、目的の第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列、３’－ＵＴＲ及び３’テーリング配列（例えば、ポリアデニル化シグナル又は１つ以上のポリＡテール）を含むことを理解するであろう。本開示のｃＲＮＡは、目的の第１の抗原に作動可能に連結された翻訳内部リボソーム進入部位（例えば、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列又はＩＲＥＳ）を更に含み得る。

【0614】

自己複製ＲＮＡ
本開示は、マルチシストロン性自己複製ＲＮＡ（レプリコンとしても既知である）を提供する。

【0615】

当業者は、本開示の自己複製ＲＮＡが、ＲＮＡウイルスのゲノムＲＮＡに基づくことを理解するであろう。ＲＮＡは、陽性（＋）鎖であるべきであり、その結果、それは、介在する複製ステップ（例えば、逆転写）を必要とせずに、細胞への送達後に直接翻訳され得る。ＲＮＡの翻訳は、組み合わせて、レプリカーゼ複合体（すなわち、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ）を形成する非構造タンパク質（ＮＳＰ）の産生をもたらす。次いで、複合体は元のＲＮＡを増幅し、アンチセンス及びセンス転写物の両方を産生し、その後翻訳及び転写され得る複数の娘ＲＮＡの産生をもたらし、全体的なタンパク質発現を増強する。

【0616】

一実施例において、本開示の自己複製ＲＮＡは、ＲＮＡウイルスの非構造タンパク質、５’及び３’非翻訳領域（ＵＴＲ）、並びに天然サブゲノムプロモーターを含む。

【0617】

一実施例において、自己複製ＲＮＡは、ＲＮＡウイルスのうちの１つ以上の非構造タンパク質を含む。例えば、ＲＮＡは、ウイルスレプリカーゼ（又はウイルスポリメラーゼ）、ウイルスプロテアーゼ、ウイルスヘリカーゼ、及び他の非構造ウイルスタンパク質からなる群から選択される少なくとも１つ以上の遺伝子を含む。例えば、自己複製ＲＮＡは、ウイルスレプリカーゼ（又はウイルスポリメラーゼ）を含む。

【0618】

別の実施例において、自己複製ＲＮＡは、ＲＮＡウイルスの５’末端ＵＴＲ及び３’末端ＵＴＲを含む。５’及び３’ＵＴＲという用語が、５’及び３’保存配列エレメント（ＣＳＥ）という用語も包含することは、当業者には明らかであろう。一実施例において、自己複製ＲＮＡは、５’末端ＣＳＥ及び３’末端ＣＳＥを含む。

【0619】

本開示の自己複製ＲＮＡは、感染性ウイルス粒子の産生を誘導することはできない。例えば、本開示の自己複製ＲＮＡは、ウイルス粒子の産生に必要な構造タンパク質をコードするウイルス遺伝子を含まない。

【0620】

一実施例において、自己複製ＲＮＡは、アルファウイルスに由来するか、又はそれに基づく。好適なアルファウイルスは、当業者には明らかであるか、及び／又は本明細書に記載される。

【0621】

別の実施例において、自己複製ＲＮＡは、アルファウイルス、例えば、陽性鎖ＲＮＡウイルス以外のウイルスに由来するか、又はそれに基づく。本開示における使用に好適な、好適な陽性鎖ＲＮＡウイルスは、当業者には明らかであり、例えば、ピコルナウイルス、フラビウイルス、ルビウイルス、ペスチウイルス、ヘパシウイルス、カリシウイルス、又はコロナウイルスを含む。

【0622】

アルファウイルス
一実施例において、本開示の自己複製ＲＮＡは、アルファウイルスに由来する（又はそれに基づく）。

【0623】

アルファウイルスは、Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅファミリーにおける唯一の属であり、陽性センスの一本鎖ＲＮＡゲノムを有するエンベロープウイルスである。当業者は、アルファウイルスゲノムが、非構造及び構造の２つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含むことを理解するであろう。最初のＯＲＦは、ウイルスＲＮＡの転写及び複製に必要な４つの非構造タンパク質（ＮＳＰ１、ＮＳＰ２、ＮＳＰ３、及びＮＳＰ４）をコードする。２つ目は、３つの構造タンパク質：コアヌクレオカプシドタンパク質Ｃ、並びにヘテロ二量体として会合するエンベロープタンパク質Ｐ６２及びＥ１をコードする。ウイルス膜アンカー型表面糖タンパク質は、受容体認識及び膜融合を介する標的細胞への進入に関与する。

【0624】

一実施例において、本開示の自己複製ＲＮＡは、ウイルスレプリカーゼ（又はウイルスポリメラーゼ）を含む。例えば、ウイルスレプリカーゼは、アルファウイルスレプリカーゼ、例えば、アルファウイルスタンパク質ＮＳＰ４である。

【0625】

一実施例において、本開示の自己複製ＲＮＡは、１つ以上のアルファウイルス構造タンパク質（例えば、カプシド及び／又はエンベロープ糖タンパク質）をコードしない。例えば、自己複製ＲＮＡは、ＲＮＡ含有アルファウイルスビリオン（すなわち、感染性ウイルス粒子）を産生することができない。

【0626】

一実施例において、自己複製ＲＮＡは、天然アルファウイルスＳＧプロモーターを含む。例えば、天然アルファウイルスＳＧプロモーターは、最小ＳＧプロモーター（すなわち、転写の開始のために必要とされる最小配列）であり、配列番号１に記述されている配列を含む。

【0627】

当業者は、本開示における使用に好適なアルファウイルスを認識するであろう。例示的なアルファウイルスとしては、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥ；例えば、トリニダードロバ（Ｔｒｉｎｉｄａｄ ｄｏｎｋｅｙ）、ＴＣ８３ＣＲ）、セムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）、シンドビスウイルス（ＳＩＮ）、ロスリバーウイルス、西部ウマ脳炎ウイルス、東部ウマ脳炎ウイルス、チクングニヤウイルス、Ｓ．Ａ．ＡＲ８６ウイルス、エバーグレイズウイルス、ムカンボウイルス、バーマ森林ウイルス、ミッデルブルグウイルス、ピクスナウイルス、オニョンニョンウイルス、ゲタウイルス、サギヤマウイルス、ベバルウイルス、マヤロウイルス、ウナウイルス、アウラウイルス、ワタロアウイルス、バンバンキウイルス（Ｂａｎｂａｎｋｉ ｖｉｒｕｓ）、キジラガチウイルス（Ｋｙｚｙｌａｇａｃｈ ｖｉｒｕｓ）、ハイランドＪウイルス、フォートモーガンウイルス（Ｆｏｒｔ Ｍｏｒｇａｎ ｖｉｒｕｓ）、ヌドゥムウイルス、及びバギークリークウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。アルファウイルスという用語はまた、２つ以上のアルファウイルス由来のゲノム配列を含有するキメラアルファウイルス（例えば、Ｐｅｒｒｉ ｅｔ ａｌ，（２００３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７７（１９）：１０３９４－４０３により記載されるように）を含んでもよい。

【0628】

調節エレメント
本開示は、目的の第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、並びにＳＧプロモーター及びＩＲＥＳからなる群から選択される調節エレメントに作動可能に連結された目的の配列抗原をコードする第２のヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチドを提供する。

【0629】

本開示は、目的の第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、並びにＳＧプロモーター及びＩＲＥＳからなる群から選択される調節エレメントに作動可能に結合された目的の配列抗原をコードする第２のヌクレオチド配列を含む、ＲＮＡ（例えば、ｃＲＮＡ又は自己複製ＲＮＡ）を提供する。

【0630】

一実施例において、目的の第１の抗原は、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列、ＩＲＥＳ、ＳＧプロモーター、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される調節エレメントに作動可能に連結されている。

【0631】

本開示は、サブゲノム（ＳＧ）プロモーターに作動可能に連結された第１の抗原をコードする第１のヌクレオチド配列、並びにＳＧプロモーター及び内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）からなる群から選択されるプロモーターを調節エレメントに作動可能に連結された第２の抗原をコードする第２のヌクレオチド配列を含む、自己複製ＲＮＡを提供する。

【0632】

Ｋｏｚａｋコンセンサス配列
本明細書で使用される場合、「Ｋｏｚａｋコンセンサス配列」という用語は、リボソームによって認識される開始コドン（ｓｔａｒｔ ｃｏｄｏｎ）（翻訳開始コドン（ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｃｏｄｏｎ）とも称される）を含有することによって遺伝子の翻訳を容易にする真核生物遺伝子において同定されるヌクレオチド配列を指す。

【0633】

例示的なＫｏｚａｋコンセンサス配列は、当該技術分野で既知であるか、及び／又は本明細書に記載される。一実施例において、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列は、配列番号３８に記述されている。別の実施例において、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列は、配列番号３９に記述されている。一実施例において、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列は、ＡＣＣＡＴＧＧである。別の実施例において、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列は、ＡＣＣＡＴＧである。

【0634】

サブゲノムプロモーター
本開示における使用に好適なＳＧプロモーター（「ジャンクション領域」プロモーターとしても既知である）は、当業者には明らかであるか、及び／又は本明細書に記載される。

【0635】

一実施例において、ＳＧプロモーターは、アルファウイルスＳＧプロモーターに由来するか、又はそれに基づく。例えば、ＳＧプロモーターは、天然アルファウイルスＳＧプロモーターである。一実施例において、天然ＳＧプロモーターは、最小ＳＧプロモーターである。例えば、最小ＳＧプロモーターは、転写の開始のために必要とされる最小配列である。一実施例において、天然ＳＧプロモーターは、延長ＳＧプロモーターである。例えば、延長ＳＧプロモーターは、ＲＮＡウイルス（例えば、アルファウイルス）の非構造タンパク質（例えば、ＮＳＰ４）をコードする配列中に生じるヌクレオチドにより５’末端で延長された、最小ＳＧプロモーターである。一実施例において、延長ＳＧプロモーターは、アルファウイルスＮＳＰ４をコードする配列中に生じるヌクレオチドにより５’末端で延長された、最小ＳＧプロモーターである。

【0636】

一実施例において、本開示のポリヌクレオチドは、任意のアルファウイルス由来のＳＧプロモーターを含む。例えば、本開示のＲＮＡ（例えば、ｃＲＮＡ又は自己複製ＲＮＡ）は、任意のアルファウイルス由来のＳＧプロモーターを含む。

【0637】

一実施例において、自己複製ＲＮＡは、任意のアルファウイルス由来のＳＧプロモーターを含む。

【0638】

本開示のポリヌクレオチドは、目的の２つ以上の抗原をコードする２つ以上のヌクレオチド配列を含む。一実施例において、２つ以上のヌクレオチド配列は、各々、ＳＧプロモーターに作動可能に（ｏｐｅｒａｂｙ）連結されている。２つ以上のＳＧプロモーターが本開示のＲＮＡ中に存在する場合、プロモーターは、同じであっても異なっていてもよい。例えば、２つ以上のＳＧプロモーターは、同じアルファウイルスに由来する。別の実施例において、２つ以上のＳＧプロモーターは、異なるアルファウイルスに由来する。

【0639】

２つ以上のＳＧプロモーターが本開示の自己複製ＲＮＡ中に存在する場合、プロモーターは、同じであっても異なっていてもよい。例えば、２つ以上のＳＧプロモーターは、同じアルファウイルスに由来する。別の実施例において、２つ以上のＳＧプロモーターは、異なるアルファウイルスに由来する。

【0640】

内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）
本開示における使用に好適なＩＲＥＳは、当業者には明らかであるか、及び／又は本明細書に記載される。

【0641】

一実施例において、ＩＲＥＳは、脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）に由来する。例えば、ＩＲＥＳは、ＥＭＣＶ由来の野生型ＩＲＥＳである。

【0642】

一実施例において、ＩＲＥＳは、線維芽細胞成長因子１Ａ（ＦＧＦ１Ａ）ＩＲＥＳに由来する。

【0643】

加えて、天然に存在するＩＲＥＳエレメントの機能を模倣するために、当該技術分野で既知の方法に従って設計され得る合成ＩＲＥＳエレメントが記載されている（Ｃｈａｐｐｅｌｌ，ＳＡ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（２０００）９７（４）：１５３６－４１を参照されたい）。

【0644】

５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）
本開示は、５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）を含む第１のヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチドを提供する。

【0645】

本明細書で使用される場合、「５’非翻訳領域」又は「５’－ＵＴＲ」という用語は、翻訳開始配列（ＡＵＧ）の５’末端に位置するｍＲＮＡの非コード領域を指す。

【0646】

例示的な５’－ＵＴＲとしては、例えば、ハプトグロビン（ＨＰ）、フィブリノーゲンベータ鎖（ＦＧＢ）、ハプトグロビン関連タンパク質（ＨＰＲ）、アルブミン（ＡＬＢ）、補体成分３（Ｃ３）、フィブリノーゲンアルファ鎖（ＦＧＡ）、アルファ６コラーゲン（Ｃｏｌ６Ａ）、アルファ－１－アンチトリプシン（ＳＥＲＰＩＮＡ１）、アルファ－１－アンチキモトリプシン（ＳＥＲＰＩＮＡ３）の５’－ＵＴＲ その断片及び／又は変異体が挙げられる。

【0647】

一実施例において、５’ＵＴＲは、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）又はその修飾された形態の５’ＵＴＲである。例えば、５’ＵＴＲは、配列番号４５に記述されている配列を含む。

【0648】

一実施例において、５’ＵＴＲは、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位、ＡＵリッチエレメント（ＡＲＥ）、ＧＣリッチエレメント、ステムループ、及びこれらの組み合わせを含む。

【0649】

マイクロＲＮＡ結合部位
本明細書で使用される場合、「マイクロＲＮＡ結合部位」という用語は、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）と相互作用し、会合し、又は結合するためにｍｉＲＮＡの全て又は１つの領域に十分な相補性を有するポリクレオチド内（例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡ転写物内）の配列を指す。

【0650】

本明細書で使用される場合、「マイクロＲＮＡ」又は「ｍｉＲＮＡ」という用語は、ポリヌクレオチドの５’－ＵＴＲに結合し、（例えば、翻訳を阻害することによって）遺伝子発現を下方調節する１９～２５個のヌクレオチド長の非コードＲＮＡを指す。本開示の５’ＵＴＲにおけるマイクロＲＮＡ結合部位の存在は、５’－ＵＴＲの翻訳を阻害するように機能し得る。

【0651】

本開示における使用に好適なｍｉＲＮＡ結合部位は、当業者には明らかであるか、及び／又は本明細書に記載される。

【0652】

一実施例において、ｍｉＲＮＡ結合部位は、組織特異的マイクロＲＮＡ又は生物学的プロセスを調節するもののための結合部位を含む。例えば、肝臓（ｍｉＲ－１２２）、筋肉（ｍｉＲ－１３３、ｍｉＲ－２０６、ｍｉＲ－２０８）、内皮細胞（ｍｉＲ－１７－９２、ｍｉＲ－１２６）、骨髄細胞（ｍｉＲ－１４２－３ｐ、ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｍｉＲ－１６、ｍｉＲ－２１、ｍｉＲ－２２３、ｍｉＲ－２４、ｍｉＲ－２７）、脂肪組織（ｌｅｔ－７、ｍｉＲ－３０ｃ）、心臓（ｍｉＲ－ｉｄ、ｍｉＲ－１４９）、腎臓（ｍｉＲ－１９２、ｍｉＲ－１９４、ｍｉＲ－２０４）、及び肺上皮細胞（ｌｅｔ－７、ｍｉＲ－１３３、ｍｉＲ－１２６）のｍｉＲＮＡ。例えば、血管新生（ｍｉＲ－１３２）などの生物学的プロセスを調節するマイクロＲＮＡ。更なる例示的なｍｉＲＮＡ及びｍｉＲＮＡ結合部位は、米国特許出願第１４／０４３，９２７号に開示されている。

【0653】

ＡＵリッチエレメント（ＡＲＥ）
本明細書で使用される場合、「ＡＵリッチエレメント（ＡＵ ｒｉｃｈ ｅｌｅｍｅｎｔ）（ＡＲＥ）」又は「ＡＵリッチエレメント（ＡＵ ｒｉｃｈ ｅｌｅｍｅｎｔｓ）（ＡＲＥｓ）」という用語は、アデオニシン（Ａ）及びウリジン（Ｕ）の伸長を含むヌクレオチド配列の領域を指す。例示的なＡＲＥとしては、例えば、細胞質ｍｙｃ（ｃ－ｍｙｃ）、筋芽細胞決定タンパク質１（ｍｙｏＤ）、ｃ－Ｊｕｎ、Ｍｙｏｇｅｎｉｎ、顆粒球－マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、及び腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ－α）、又はこれらの組み合わせ由来のＡＲＥが挙げられる。

【0654】

一実施例において、ＡＲＥは、ヒト抗原Ｒ又は「ＨｕＲ」（Ｅｌａｖｌ１としても既知である）特異的結合部位を含む。ＨｕＲは、ｍＲＮＡの安定性を増加させるＡＲＥに結合することが既知である。

【0655】

ＧＣリッチエレメント
本明細書で使用される場合、「ＧＣリッチエレメント」という用語は、アデニン（Ａ）及びチミン（Ｔ）／ウラシル（Ｕ）と比較して、多量のグアニン（Ｇ）及び／又はシトシン（Ｃ）を有するヌクレオチド配列を指す。ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）中のＧＣリッチエレメントの存在は、ｍＲＮＡを安定化させることができる。

【0656】

一実施例において、ＧＣリッチエレメントは、３個、又は４個、又は５個、又は６個、又は７個、又は８個、又は９個、又は１０個、又は１１個、又は１２個、又は１３個、又は１４個、又は１５個、又は１６個、又は１７個、又は１８個、又は１９個、又は２０個、又は２１個、又は２２個、又は２３個、又は２４個、又は２５個、又は２６個、又は２７個、又は２８個、又は２９個、又は３０個のヌクレオチド長の配列を含む。

【0657】

一実施例において、ＧＣリッチエレメントは、３０％～４０％、又は４０％～５０％、又は５０％～６０％、又は６０％～７０％のシトシンを含む。例えば、ＧＣリッチエレメントは、３０％～４０％のシトシンを含む。例えば、ＧＣリッチエレメントは、４０％～５０％のシトシンを含む。例えば、ＧＣリッチエレメントは、５０％～６０％のシトシンを含む。例えば、ＧＣリッチエレメントは、６０％～７０％のシトシンを含む。

【0658】

一実施例において、ＧＣリッチエレメントは、３０％、又は４０％、又は５０％、又は６０％、又は７０％のシトシンを含む。例えば、ＧＣリッチエレメントは、３０％のシトシンを含む。例えば、ＧＣリッチエレメントは、４０％のシトシンを含む。例えば、ＧＣリッチエレメントは、５０％シトシンを含む。例えば、ＧＣリッチエレメントは、６０％のシトシンを含む。例えば、ＧＣリッチエレメントは、６０％のシトシンを含む。例えば、ＧＣリッチエレメントは、７０％のシトシンを含む。

【0659】

一実施例において、ＧＣリッチエレメントは、少なくとも５０％のシトシンである。

【0660】

一実施例において、ＧＣリッチエレメントは、少なくとも６０％のシトシンである。

【0661】

一実施例において、ＧＣリッチエレメントは、少なくとも７０％のシトシンである。

【0662】

一実施例において、ＧＣリッチエレメントは、ヌクレオチド配列ＣＣＣＣＧＧＣＧＣＣを含む。別の実施例において、ＧＣリッチエレメントは、ヌクレオチド配列ＣＣＣＣＧＧＣを含む。更なる実施例において、ＧＣリッチエレメントは、ヌクレオチド配列ＧＣＧＣＣＣＣＧＣＧＧＣＧＣＣＣＣＧＣＧを含む。

【0663】

一実施例において、ＧＣリッチエレメントは、配列番号４１～４３に記述されているヌクレオチド配列を含む。一実施例において、ＧＣリッチエレメントは、配列番号４１に記述されているヌクレオチド配列を含む。別の実施例において、ＧＣリッチエレメントは、配列番号４２に記述されているヌクレオチド配列を含む。更なる実施例において、ＧＣリッチエレメントは、配列番号４３に記述されているヌクレオチド配列を含む。

【0664】

ステムループ
本明細書で使用される場合、「ステムループ」という用語は、ステムループを形成するために、２つの隣接する完全に又は部分的に逆相補的な配列の分子内塩基対合を含むヌクレオチド配列を指す。ステムループは、一本鎖ＤＮＡにおいて、又はより一般的にはＲＮＡにおいて生じ得る。ステムループはまた、通常、連続する配列内のステム及び末端ループからなるヘアピン又はヘアピンループと称され得、ここで、ステムは、ループをステムループ構造に構築する短い配列によって分離された２つの隣接する完全に又は部分的に逆相補的な配列によって形成される。

【0665】

対合したステムループの安定性は、長さ、それが含有するミスマッチ又はバルジの数、及び対合した領域のヌクレオチド組成物によって決定される。

【0666】

一実施例において、ステムループのループは、３～１０個のヌクレオチド長である。例えば、ステムループのループは、３～８個、又は３～７個、又は３～６個、又は４～５個のヌクレオチド長である。

【0667】

一実施例において、ステムループのループは、４個のヌクレオチド長である。

【0668】

一実施例において、ステムループは、ヒストンステムループである。例えば、ヒストンステムループは、配列番号４４に設定されたヌクレオチド配列を含むか又はそれからなる。

【0669】

３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）
本開示は、３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）を含むポリヌクレオチドを提供する。

【0670】

本明細書で使用される場合、「３’－ＵＴＲ」という用語は、翻訳終結コドン（すなわち、停止コドン）の３’末端に位置するｍＲＮＡの領域を指す。

【0671】

例示的な３’－ＵＴＲとしては、例えば、アラキドン酸５－リポキシゲナーゼ（ＡＬＯＸ５）、アルファＩコラーゲン（ＣＯＬ１Ａ１）、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）遺伝子、スプリットのアミノ末端エンハンサー（ＡＥＳ）、ヒトミトコンドリア１２Ｓ ｒＲＮＡ（ｍｔＲＮＲ１）の３’－ＵＴＲ、その断片及び／又は変異体が挙げられる。

【0672】

一実施例において、３’ＵＴＲは、シンドビスウイルス（ＳＩＮＶ）又はその修飾された形態の３’ＵＴＲである。例えば、３’ＵＴＲは、配列番号４６に記述されている配列を含む。

【0673】

一実施例において、３’－ＵＴＲは、アルブミン遺伝子の３’－ＵＴＲに由来するヌクレオチド配列を含むか又はそれからなる。一実施例において、３’－ＵＴＲは、脊椎動物のα－グロビン遺伝子の３’－ＵＴＲに由来するヌクレオチド配列を含むか又はそれからなる。例えば、３’－ＵＴＲは、哺乳動物のα－グロビン遺伝子の３’－ＵＴＲに由来するヌクレオチド配列を含むか又はそれからなる。例えば、３’－ＵＴＲは、ヒトのα－グロビン遺伝子の３’－ＵＴＲに由来するヌクレオチド配列を含むか又はそれからなる。

【0674】

一実施例において、本開示の３’－ＵＴＲは、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位、ＡＵリッチエレメント（ＡＲＥ）、ＧＣリッチエレメント、三重らせん体、ステムループ、１つ以上の停止コドン、又はこれらの組み合わせを更に含む。

【0675】

停止コドン
本明細書で使用される場合、「停止コドン」という用語は、リボソームによるタンパク質合成の停止をシグナル伝達するｍＲＮＡ内のトリヌクレオチド配列を指す。

【0676】

一実施例において、本開示のポリヌクレオチドは、３’－ＵＴＲの５’末端に少なくとも１つの停止コドンを含む。例えば、停止コドンは、ＵＡＧ、ＵＡＡ、及びＵＧＡから選択される。

【0677】

一実施例において、ポリヌクレオチドは、配列ＵＧＡＵＧＡを含む２つの連続する停止コドンを含む。

【0678】

一実施例において、ポリヌクレオチドは、配列ＵＡＡＵＡＧを含む２つの連続する停止コドンを含む。

【0679】

３’テーリング配列
本開示のポリヌクレオチドは、３’ＵＴＲの３’末端に位置する１つ以上の３’テーリング配列を含む。

【0680】

本明細書に記載されるように、「３’テーリング配列（３’ｔａｉｌｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」又は「３’テーリング配列（３’ｔａｉｌｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）」という用語は、ｍＲＮＡの３’末端に位置するｍＲＮＡ又はヌクレオチド配列（例えば、ポリＡ配列）の３’末端への非コードヌクレオチドの付加を誘導するヌクレオチド配列（例えば、ポリアデニル化シグナル）を指す。当業者は、ｍＲＮＡ中の３’テーリング配列及び／又は３’テーリング配列の産物が、ｍＲＮＡを安定化させる、及び／又はｍＲＮＡの分解を予防するように機能することを理解するであろう。

【0681】

本明細書で使用される場合、本開示のポリＡ又はポリＣ配列に関して、「中断リンカー」という用語は、ポリＡ又はポリＣ配列中の連続するアデノシン又はシトシンヌクレオチドの伸長に連結され、中断される単一ヌクレオチド又はヌクレオチド配列を指す。例えば、ポリＡ配列中の中断リンカーは、アデノシンヌクレオチド以外のヌクレオチドからなるか、又はそれを含む単一ヌクレオチド又はヌクレオチド配列である。例えば、ポリＣ配列中の中断リンカーは、シトシンヌクレオチド以外のヌクレオチドからなるか、又はそれを含む単一ヌクレオチド又はヌクレオチド配列である。

【0682】

一実施例において、１つ以上の３’テーリング配列は、ポリＡ配列、ポリアデニル化シグナル、Ｇ四重鎖、ポリＣ配列、ステムループ、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される。

【0683】

ポリＡ配列
本明細書で使用される場合、「ポリＡ配列」という用語は、ｍＲＮＡの３’末端に位置するアデニン（Ａ）のヌクレオチド配列を指す。本開示の文脈において、ポリＡ配列は、ｍＲＮＡ又はＤＮＡ（例えば、ベクターの転写によってｍＲＮＡを生成するためのテンプレートとして機能するＤＮＡプラスミド）内に位置し得る。

【0684】

本開示における使用に好適なポリＡ配列は、当業者には明らかであるか、及び／又は本明細書に記載される。一実施例において、ポリＡ配列は、任意の長さ（例えば、１０～３００）の連続する（すなわち、次から次へ）アデノシンヌクレオチドを含む。一実施例において、ポリＡ配列は、１つ以上の中断リンカーによって分離される連続するアデノシンヌクレオチドを含む。一実施例において、ポリＡ配列は、中断リンカーを含まない連続するアデノシンヌクレオチドを含む。

【0685】

ポリアデニル化シグナル
本明細書で使用される場合、「ポリアデニル化シグナル」という用語は、ポリアデニル化を誘導するヌクレオチド配列を指す。ポリアデニル化は、典型的には、ＲＮＡへのポリＡ配列の付加（例えば、成熟ｍＲＮＡを生成するための未熟ｍＲＮＡへの付加）であると理解される。ポリアデニル化シグナルは、ポリアデニル化されるポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）の３’末端におけるヌクレオチド配列内に位置し得る。

【0686】

本開示における使用に好適なポリアデニル化シグナルは、当業者には明らかであるか、及び／又は本明細書に記載される。

【0687】

一実施例において、ポリアデニル化シグナルは、アデニン及びウラシル／チミジンヌクレオチドからなる六量体を含む。一実施例において、六量体配列は、ＡＡＵＡＡＡを含むか又はそれからなる。

【0688】

一実施例において、３’テーリング配列は、ポリアデニル化シグナルを含むが、ポリＡ配列を含まない。

【0689】

Ｇ四重鎖
本明細書で使用される場合、「Ｇ四重鎖」又は「Ｇ４」という用語は、四本鎖二次構造を形成するグアニン残基が豊富なヌクレオチド配列を指す。例えば、Ｇ四重鎖は、ＤＮＡ及びＲＮＡの両方におけるＧリッチ配列によって形成される４つのグアニンヌクレオチドの環状水素結合アレイである。

【0690】

一実施例において、３’テーリング配列は、ポリＡ配列及びＧ四重鎖を含む。例えば、３’テーリング配列は、ポリＡ－Ｇカルテットを産生するためにＧ四重鎖に連結されたポリＡ配列を含む。

【0691】

ポリＣ配列
本明細書で使用される場合、「ポリＣ配列」という用語は、ｍＲＮＡの３’末端に位置するシトシン（Ｃ）のヌクレオチド配列を指す。本開示の文脈において、ポリＣ配列は、ｍＲＮＡ又はＤＮＡ（例えば、ベクターの転写によってｍＲＮＡを生成するためのテンプレートとして機能するＤＮＡプラスミド）内に位置し得る。

【0692】

本開示における使用に好適なポリＣ配列は、当業者には明らかであるか、及び／又は本明細書に記載される。

【0693】

一実施例において、１つ以上の３’テーリング配列は、各々１０～３００個の連続するシトシンヌクレオチドを含む、１つ以上のポリＣ配列を含む。例えば、１つ以上のポリＣ配列は、各々、１０～２０、又は２０～３０、又は３０～４０、又は４０～５０、又は５０～６０、又は６０～７０、又は７０～８０、又は８０～９０、又は９０～１００、又は１００～１２５、又は１２５～１５０、又は１５０～１７５、又は１７５～２００、又は２００～２２５、又は２２５～２５０、又は２５０～２７５、又は２７５～３００個の連続するシトシンヌクレオチドを含む。例えば、１つ以上のポリＣ配列は、各々、１０個、又は２０個、又は３０個、又は４０個、又は５０個、又は６０個、又は７０個、又は８０個、又は９０個、又は１００個、又は１２５個、又は１５０個、又は１７５個、又は２００個、又は２２５個、又は２５０個、又は２７５個、又は３００個の連続するシトシンヌクレオチドを含む。

【0694】

一実施例において、１つ以上のポリＣ配列は、中断リンカーによって分離される。例えば、１つ以上の３’テーリング配列を含む第４のヌクレオチド配列は、５’から３’への順に、連続するシトシンヌクレオチド、中断リンカー、及び更なる連続するシトシンヌクレオチドを含む。

【0695】

一実施例において、中断リンカーは、１０～５０、又は５０～１００、又は１００～１５０個のヌクレオチド長である。例えば、中断リンカーは、１個、又は２個、又は３個、又は４個、又は５個、又は６個、又は７個、又は８個、又は９個、又は１０個、又は１１個、又は１２個、又は１３個、又は１４個、又は１５個、又は１６個、又は１７個、又は１８個、又は１９個、又は２０個、又は２５個、又は３０個、又は３５個、又は４０個、又は４５個、又は５０個、又は５５個、又は６０個、又は６５個、又は７０個、又は７５個、又は８０個、又は８５個、又は９０個、又は９５個、又は１００個、又は１１０個、又は１２０個、又は１３０個、又は１４０個、又は１５０個のヌクレオチド長である。

【0696】

５’キャップ構造
一実施例において、本開示は、５’末端キャップ構造を含むｍＲＮＡを提供する。

【0697】

本明細書で使用される場合、「５’キャップ構造」という用語は、核外移行に関与するｍＲＮＡの５’末端での構造を指し、ｍＲＮＡキャップ結合タンパク質（ＣＢＰ）に結合する。５’キャップ構造は、ポリ（Ａ）結合タンパク質とのＣＢＰの会合を通してｍＲＮＡを安定化させて成熟ｍＲＮＡを形成することが既知である。したがって、本開示のｍＲＮＡ中の５’キャップ構造の存在は、５’キャップを含まないｍＲＮＡと比較して、ｍＲＮＡの安定性を更に増加させ得る。

【0698】

例示的な５’キャップ構造としては、例えば、抗逆キャップ類似体（ＡＲＣＡ）、Ｎ７，２’－０－ジメチル－グアノシン（ｍＣＡＰ）、イノシン、Ｎ１－メチル－グアノシン、２’フルオロ－グアノシン、７－デアザ－グアノシン、８－オキソ－グアノシン、２－アミノ－グアノシン、ＬＮＡ－グアノシン、２－アジド－グアノシン、Ｎ６，２’－Ｏ－ジメチルアデノシン、７－メチルグアノシン（ｍ７Ｇ）、キャップ１、及びキャップ２が挙げられる。

【0699】

典型的には、内因性ｍＲＮＡは、ｍＲＮＡの５’末端ヌクレオチドに付着した（５）’－ｐｐｐ－（５）’－トリホスフェート結合を通してグアノシンによりキャッピングされた５’である。次いで、グアノシンキャップは、７ｍＧ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｎ，ｐＮ２ｐ（キャップ０構造）を生成する７－メチルグアノシン（ｍ７Ｇ）にメチル化され得、Ｎは、ｍＲＮＡの第１及び第２の５’末端ヌクレオチドを表す。キャップ０構造は、更に２’－Ｏ－メチル化されて、７ｍＧ（５’）ｐｐｐ（５’）ＮｌｍｐＮｐ（キャップ１）、及び／又は７ｍＧ（５’）－ｐｐｐ（５’）ＮｌｍｐＮ２ｍｐ（キャップ２）を産生し得る。

【0700】

一実施例において、本開示のポリヌクレオチドは、内因性キャップを含む。

【0701】

本明細書で使用される場合、「内因性キャップ」という用語は、細胞内で合成された５’キャップを指す。例えば、内因性キャップは、天然５’キャップ又は野生型５’キャップである。例えば、内因性キャップは、キャップ０、キャップ１、又はキャップ２構造である。

【0702】

一実施例において、本開示のポリヌクレオチドは、内因性キャップのアナログ（キャップアナログとも称される）を含む。

【0703】

本明細書で使用される場合、内因性キャップ又は「キャップアナログ」の文脈における「その類似体」という用語は、合成５’キャップを指す。キャップアナログを使用して、インビトロ転写反応において５’キャッピングされたｍＲＮＡを産生することができる。キャップアナログは、化学的に（すなわち、非酵素的に）、若しくは酵素的に合成され、かつ／又はヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡの５’末端ヌクレオチド）に連結され得る。例示的なキャップアナログは、市販されており、例えば、３”－Ｏ－Ｍｅ－ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ、Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ａ、Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ａ、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）を含む。一実施例において、キャップアナログは、Ｎ７，３’－Ｏ－ジメチル－グアノシン－５’－トリホスフェート－５’－グアノシン（すなわち、抗逆キャップ類似体（ＡＲＣＡ））である。

【0704】

一実施例において、５’キャップ構造は、非加水分解性キャップ構造である。非加水分解性キャップ構造は、ｍＲＮＡの脱キャッピングを防止し、ｍＲＮＡの半減期を増加させることができる。

【0705】

一実施例において、非加水分解性キャップ構造は、α－チオ－グアノシンヌクレオチド、α－メチル－ホスホネート、セレノ－ホスフェート、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される修飾されたヌクレオチドを含む。一実施例において、修飾されたヌクレオチドは、α－ホスホロチオエート結合を介してｍＲＮＡの５’末端に連結される。修飾されたヌクレオチドをｍＲＮＡの５’末端に連結する方法は、当業者には明らかであろう。例えば、Ｖａｃｃｉｎｉａ Ｃａｐｐｉｎｇ Ｅｎｚｙｍｅ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用する。

【0706】

修飾
一実施例において、本開示のポリヌクレオチドは、１つ以上の修飾を含む。典型的には、修飾は、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）に導入されて、ポリヌクレオチドの翻訳効率及び／又は安定性を増加させる。ポリヌクレオチドへの好適な修飾は、当業者には明らかであるか、及び／又は本明細書に記載される。

【0707】

一実施例において、５’－ＵＴＲ及び／又はその断片を含む第１のヌクレオチド配列は、修飾される。５’－ＵＴＲ及び／又はその断片を含む第１のヌクレオチド配列の修飾は、５’－ＵＴＲ及び／又はその断片の変異体をもたらす。

【0708】

一実施例において、ポリヌクレオチドの１つ以上のヌクレオチド配列は、コドン最適化される。コドン最適化の方法は、当業者には明らかであるか、及び／又は本明細書に記載される。例えば、ポリヌクレオチドのコドン最適化のためのツールとしては、例えば、ＧｅｎｅＡｒｔ ＧｅｎｅＯｐｔｉｍｉｚｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ（登録商標））、又はＧｅｎＳｍａｒｔ（登録商標）（ＧｅｎｅＳｃｒｉｐｔ（登録商標））が挙げられる。

【0709】

一実施例において、ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド中のグアニン（Ｇ）及び／又はシトシン（Ｃ）の量を増加させるように修飾される。ポリヌクレオチド中のＧ／Ｃの量（すなわち、Ｇ／Ｃ含有量）は、ポリヌクレオチドの安定性に影響を及ぼし得る。したがって、増加した量のＧ／Ｃヌクレオチドを含むポリヌクレオチドは、大量のアデニン（Ａ）及びチミン（Ｔ）又はウラシル（Ｕ）ヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドよりも機能的に安定であり得る。Ｇ／Ｃ含有量は、Ａ又はＴヌクレオチドをＧ又はＣヌクレオチドにより置換することによって増加する。

【0710】

一実施例において、Ｇ／Ｃ含有量は、目的の第１及び／又は第２の抗原をコードする第１及び／又は第２のヌクレオチド配列において増加する。一実施例において、Ｇ／Ｃ含有量は、目的の第１及び／若しくは第２の抗原をコードする第１及び／若しくは第２のヌクレオチド配列、並びに／又は目的の１つ以上の抗原をコードする１つ以上の追加のヌクレオチド配列において増加する。第１及び若しくは第２のヌクレオチド配列、並びに／又は１つ以上のヌクレオチド配列における修飾は、（ｍＲＮＡ安定性の観点から）ヌクレオチドのより好ましくない組み合わせを含有するコドンを、同じアミノ酸をコードする、又は同様の化学のアミノ酸をコードする代替コドンにより置換する能力（例えば、保存されたアミノ酸置換）を利用する。例えば、Ｇ／Ｃ含有量は、Ａ又はＴヌクレオチドを含有するコドンを、同じアミノ酸をコードするＧ又はＣヌクレオチドを含有するコドンにより置換することによって増加する。例えば、Ｇ／Ｃ含有量は、Ａ又はＴヌクレオチドを含有するコドンを、同様の化学のアミノ酸をコードするＧ又はＣヌクレオチドを含有するコドンにより置換することによって増加する。

【0711】

一実施例において、Ｇ／Ｃ含有量は、目的の抗原をコードしないポリヌクレオチドのうちの１つ以上のヌクレオチド配列において増加する。例えば、Ｇ／Ｃ含有量は、５’－ＵＴＲ、その断片及び／又は変異体において増加する。例えば、Ｇ／Ｃ含有量は、３’－ＵＴＲ、その断片及び／又は変異体において増加する。

【0712】

一実施例において、ポリヌクレオチドは、少なくとも１つの化学修飾されたヌクレオチドを含む。

【0713】

本明細書で使用される場合、ヌクレオチドの文脈における「化学修飾」又は「化学修飾された」という用語は、天然に存在するヌクレオチドと比較して、個々の又はいくつかの原子又は原子基の置き換え、挿入、又は除去によって修飾される天然に存在するヌクレオチド（すなわち、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｕ）を指す。一実施例において、ポリヌクレオチドの少なくとも１つの天然に存在するヌクレオチドは、化学修飾されたヌクレオチドにより置き換えられる。一実施例において、ポリヌクレオチドの天然に存在するヌクレオチドのうちの少なくとも１０％、又は２０％、又は３０％、又は４０％、又は５０％、又は６０％、又は７０％、又は８０％、又は９０％、又は１００％は、化学修飾されたヌクレオチドにより置き換えられる。本開示における使用に好適な化学修飾されたヌクレオチドは、当業者には明らかであるか、及び／又は本明細書に記載される。例示的な化学修飾されたヌクレオチドとしては、例えば、Ｎ６，２’－Ｏ－ジメチル－アデノシン（ｍ６Ａｍ）、５－メチルウリジン（ｍ５Ｕ）、Ｎ４－アセチルシチジン（ａｃ４Ｃ）、２－チオシチジン（ｓ２Ｃ）、２－チオウリジン（ｓ２Ｕ）、５－メチルシチジン（ｍ５Ｃ）、Ｎ６－メチルアデノシン（ｍ６ａ）、シュードウリジン（ψ）、及び１－メチルシュードウリジン（ｍ１ψ）が挙げられる。

【0714】

抗原
本開示のポリヌクレオチドは、目的の第１及び第２の抗原（例えば、病原性抗原）をコードする第１及び第２のヌクレオチド配列を含む。例えば、目的の抗原は、対象において免疫応答を誘導することができる抗原ポリペプチド、その断片及び／又は変異体である。

【0715】

本開示のｃＲＮＡは、目的の第１及び第２の抗原（例えば、病原性抗原）をコードする第１及び第２のヌクレオチド配列を含む。例えば、目的の抗原は、対象において免疫応答を誘導することができる抗原ポリペプチド、その断片及び／又は変異体である。

【0716】

本開示の自己複製ＲＮＡは、抗原（例えば、病原性抗原）をコードする異種配列（例えば、第１及び第２のヌクレオチド配列）を含む。例えば、抗原は、対象において免疫応答を誘導することができる。

【0717】

本明細書に記載されるポリヌクレオチドにおける使用に好適な抗原性ポリペプチド、その断片及び／又は変異体は、当業者には明らかであり、例えば、任意の病原体に由来するタンパク質及びペプチドが挙げられる。例えば、抗原は、ウイルス、細菌、真菌、又は原生動物である。

【0718】

本明細書に記載される自己複製ＲＮＡにおける使用に好適な抗原は、当業者には明らかであり、例えば、任意の病原体に由来するタンパク質及びペプチドが挙げられる。例えば、抗原は、ウイルス、細菌、真菌、又は原生動物である。

【0719】

ウイルス抗原
一実施例において、本開示の抗原は、ウイルス抗原である。

【0720】

ポリヌクレオチド、ｃＲＮＡ、又は自己複製ＲＮＡによってコードされ得るウイルス抗原は、当業者には明らかであり、例えば、オルトミクソウイルス（例えば、インフルエンザＡ、Ｂ及びＣ）、パラミクソウイルス科ウイルス（ニューモウイルス（例えば、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、ウシ呼吸器合胞体ウイルス、マウスの肺炎ウイルス、及びシチメンチョウ鼻気管支炎ウイルス）、パラミクソウイルス１～４型（ＰＩＶ）、ムンプス、センダイウイルス、シミアンウイルス５））、ウシパラインフルエンザウイルス、ニパウイルス、ヘニパウイルス、及びニューカッスル病ウイルス）、ポックスウイルス科（例えば、大痘瘡及び小痘瘡を含むが、これらに限定されない、真正痘瘡、メタニューモウイルス、例えば、ヒトメタニューモウイルス（ｈＭＰＶ）、及びトリメタニューモウイルス（ａＭＰＶ））、麻疹ウイルス属（例えば、麻疹）、ピコルナウイルス（例えば、エンテロウイルス、ライノウイルス、ヘパルナウイルス、パレコウイルス、カルジオウイルス、及びアフトウイルス）、エンテロウイルス（Ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓｅｓｅｓ）（例えば、ポリオウイルス１型、２型、又は３型、コクサッキーＡウイルス１～２２型及び２４型、コクサッキーＢウイルス１～６型、エコーウイルス（ＥＣＨＯ）ウイルス１～９型、１１～２７型、及び２９～３４型、並びにエンテロウイルス６８～７１）、バンヤウイルス（例えば、カリフォルニア脳炎ウイルス）、フレボウイルス（例えば、リフトバレー熱ウイルス）、ナイロウイルス（例えば、クリミア－コンゴ出血性熱ウイルス）、ヘパルナウイルス（例えば、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ））、トガウイルス（例えば、ルビウイルス、アルファウイルス、又はアルテリウイルス）、フラビウイルス（例えば、ダニ媒介脳炎（ＴＢＥ）ウイルス、デング熱（１型、２型、３型、若しくは４型）ウイルス、黄熱病ウイルス、日本脳炎ウイルス、キャサヌール森林ウイルス、西ナイル脳炎ウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、ロシア春夏脳炎ウイルス、ポーワッサン脳炎ウイルス）、ペスチウイルス（例えば、ウシウイルス性下痢（ＢＶＤＶ）、古典的ブタ熱（ＣＳＦＶ）、又はボーダー病（ＢＤＶ））、ヘパドナウイルス（例えば、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス）、ラブドウイルス（例えば、リッサウイルス（狂犬病ウイルス）、及びベシクロウイルス（ＶＳＶ））、カリシウイルス科（例えば、ノーウォークウイルス、及びノーウォーク様ウイルス（例えば、ハワイウイルス及びスノーマウンテンウイルス）、コロナウイルス（例えば、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）、ＳＡＲＳコロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）、中東呼吸器症候群（ＭＥＲＳ）コロナウイルス（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）、トリ感染性気管支炎（ＩＢＶ）、マウス肝炎ウイルス（ＭＨＶ）、及びブタ伝染性胃腸炎ウイルス（ＴＧＥＶ））、レトロウイルス（例えば、オンコウイルス、レンチウイルス、又はスプマウイルス）、レオウイルス（例えば、オルトレオウイルス、ロタウイルス、オルビウイルス、又はコルチウイルス）、パルボウイルス（例えば、パルボウイルスＢ１９）、デルタ肝炎ウイルス（ＨＤＶ）、Ｅ型肝炎ウイルス（ＨＥＶ）、ヒトヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、水痘－帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、エプスタイン－バーウイルス（ＥＢＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヒトヘルペスウイルス６（ＨＨＶ６）、ヒトヘルペスウイルス７（ＨＨＶ７）、及びヒトヘルペスウイルス８（ＨＨＶ８））、パポバウイルス（例えば、パピローマウイルス及びポリオーマウイルス）、アデノウイルス（Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｅｓｓ）、並びにアレナウイルス由来のタンパク質及びペプチドが挙げられる。

【0721】

一実施例において、本開示の第１及び／又は第２の抗原は、呼吸器ウイルス由来のウイルス抗原である。自己複製ＲＮＡによってコードされ得る呼吸器ウイルス抗原は、当業者には明らかであり、例えば、オルトミクソウイルス（例えば、インフルエンザＡ、Ｂ及びＣ）、パラミクソウイルス科ウイルス（ニューモウイルス（例えば、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、ウシ呼吸器合胞体ウイルス、マウスの肺炎ウイルス、及びシチメンチョウ鼻気管支炎ウイルス）、パラミクソウイルス（ＰＩＶ）、並びにメタニューモウイルス、例えば、ヒトメタニューモウイルス（ｈＭＰＶ）、及びトリメタニューモウイルス（ａＭＰＶ））、ピコルナウイルス（例えば、ライノウイルス）、及びコロナウイルス（例えば、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）、ＳＡＲＳコロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）、中東呼吸器症候群（ＭＥＲＳ）コロナウイルス（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）、トリ感染性気管支炎（ＩＢＶ）、マウス肝炎ウイルス（ＭＨＶ））由来のタンパク質及びペプチドが挙げられる。

【0722】

一実施例において、本開示の第１及び／又は第２の抗原は、インフルエンザウイルス由来のウイルス抗原である。

【0723】

別の実施例において、本開示の第１及び／又は第２の抗原は、コロナウイルス由来のウイルス抗原である。

【0724】

細菌抗原
一実施例において、本開示の抗原は、細菌抗原である。

【0725】

ポリヌクレオチド、ｃＲＮＡ、又は自己複製ＲＮＡによってコードされ得る細菌抗原は、当業者には明らかであり、例えば、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｐ．（例えば、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｍａｌｌｅｉ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ、及びＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｐａｃｉａ）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ（破傷風）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍｓ、Ｃｏｒｎｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ（ジフテリア）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ、Ｃｏｘｉｅｌｌａ ｂｕｒｎｅｔｉｉ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ ｓｐ．（Ｂ．ａｂｏｒｔｕｓ、Ｂ．ｃａｎｉｓ、Ｂ．ｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓ、Ｂ．ｎｅｏｔｏｍａｅ、Ｂ．ｏｖｉｓ、Ｂ．ｓｕｉｓ、及びＢ．ｐｉｎｎｉｐｅｄｉａｅ）、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｓｐ．（例えば、Ｆ．ｎｏｖｉｃｉｄａ、Ｆ．ｐｈｉｌｏｍｉｒａｇｉａ、及びＦ．ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｎｅｉｓｅｒｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌｉｄｕｍ（梅毒）、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｄｕｃｒｅｙｉ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ（炭疽）、Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ（ペスト）、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ（腸チフス）、Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｓｐ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｓｐ由来のタンパク質及びペプチドが挙げられる。

【0726】

真菌抗原
一実施例において、本開示の抗原は、真菌抗原である。

【0727】

ポリヌクレオチド、ｃＲＮＡ、又は自己複製ＲＮＡによってコードされ得る真菌抗原は、当業者には明らかであり、例えば、Ｄｅｒｍａｔｏｐｈｙｔｅｓ（Ｅｐｉｄｅｒｍｏｐｈｙｔｏｎ ｆｌｏｃｃｕｓｕｍ、Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ ａｕｄｏｕｉｎｉ、Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ ｃａｎｉｓ、Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ ｄｉｓｔｏｒｔｕｍ、Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ ｅｑｕｉｎｕｍ、Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ ｇｙｐｓｕｍ、Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ ｎａｎｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｃｏｎｃｅｎｔｒｉｃｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｅｑｕｉｎｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｇａｌｌｉｎａｅ、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｇｙｐｓｅｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｍｅｇｎｉｎｉ、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｍｅｎｔａｇｒｏｐｈｙｔｅｓ、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｑｕｉｎｃｋｅａｎｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｒｕｂｒｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｓｃｈｏｅｎｌｅｉｎｉ、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｔｏｎｓｕｒａｎｓ、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｖｅｒｒｕｃｏｓｕｍ、Ｔ ｖｅｒｒｕｃｏｓｕｍ ｖａｒ．ａｌｂｕｍ、ｖａｒ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｓ、ｖａｒ．ｏｃｈｒａｃｅｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｖｉｏｌａｃｅｕｍ、及び／又はＴｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｆａｖｉｆｏｒｍｅを含む）、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｙｄｏｗｉ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｌａｖａｔｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｇｌａｕｃｕｓ、Ｂｌａｓｔｏｓｃｈｉｚｏｍｙｃｅｓ ｃａｐｉｔａｔｕｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ｅｎｏｌａｓｅ、Ｃａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ｇｌａｂｒａｔａ、Ｃａｎｄｉｄａ ｋｒｕｓｅｉ、Ｃａｎｄｉｄａ ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ｓｔｅｌｌａｔｏｉｄｅａ、Ｃａｎｄｉｄａ ｋｕｓｅｉ、Ｃａｎｄｉｄａ ｐａｒａｋｗｓｅｉ、Ｃａｎｄｉｄａ ｌｕｓｉｔａｎｉａｅ、Ｃａｎｄｉｄａ ｐｓｅｕｄｏｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉ、Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ ｃａｒｒｉｏｎｉｉ、Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｉｍｍｉｔｉｓ、Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ ｄｅｒｍａｔｉｄｉｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ、Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ ｃｌａｖａｔｕｍ、Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｉｄｉａ、Ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｏｚｏｏｎ ｓｐｐ．、Ｓｅｐｔａｔａ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ、及びＥｎｔｅｒｏｃｙｔｏｚｏｏｎ ｂｉｅｎｅｕｓｉ由来のタンパク質及びペプチドが挙げられる。

【0728】

プロタゾアン抗原
一実施例において、本開示の抗原は、プロタゾアン抗原である。

【0729】

ポリヌクレオチド、ｃＲＮＡ、又は自己複製ＲＮＡによってコードされ得るプロタゾアン抗原は、当業者には明らかであり、例えば、Ｅｎｔａｍｏｅｂａ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ、Ｇｉａｒｄｉａ ｌａｍｂｌｉ、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ、Ｃｙｃｌｏｓｐｏｒａ ｃａｙａｔａｎｅｎｓｉｓ、及びＴｏｘｏｐｌａｓｍａ由来のタンパク質及びペプチドが挙げられる。

【0730】

産生方法
本開示のポリヌクレオチド、ｃＲＮＡ、及び／又は自己複製ＲＮＡの産生のための好適な方法は、当業者には明らかであるか、及び／又は本明細書に記載される。

【0731】

一実施例において、ポリヌクレオチドは、ＤＮＡである。例えば、ポリヌクレオチドは、プラスミドＤＮＡである。

【0732】

一実施例において、ｃＲＮＡは、プラスミドＤＮＡを使用して産生される。一実施例において、自己複製ＲＮＡは、プラスミドＤＮＡを使用して産生される。当業者は、プラスミドＤＮＡが比較的安定であることを理解するであろう。簡潔に述べると、コンピテント細菌細胞（例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）細胞は、本開示の自己複製ＲＮＡをコードするＤＮＡプラスミドにより形質転換される。個々の細菌コロニーを単離し、得られるプラスミドＤＮＡをＥ．ｃｏｌｉ培養物中で増幅する。

【0733】

一実施例において、プラスミドＤＮＡは、発酵後に単離される。例えば、プラスミドＤＮＡは、市販のキット（例えば、Ｍａｘｉｐｒｅｐ ＤＮＡキット）、又は当業者に既知の他の日常的な方法を使用して単離される。単離後、プラスミドＤＮＡは、制限消化によって（すなわち、制限酵素を使用して）線状化される。制限酵素は、例えば、フェノール／クロロホルム抽出及びエタノール沈殿を含む、当該技術分野で既知の方法を使用して除去される。

【0734】

一実施例において、ｍＲＮＡは、ＲＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ）を使用して、線状化ＤＮＡテンプレートからのインビトロ転写によって作製される。インビトロ転写の後、ＤＮＡテンプレートは、ＤＮａｓｅ消化によって除去される。当業者は、合成ｍＲＮＡキャッピングが、ｍＲＮＡ処理を修正し、ｍＲＮＡの安定化に寄与するために行われることを理解するであろう。一実施例において、ｍＲＮＡは、酵素的に５’キャッピングされる。例えば、５’キャップは、キャップ０構造又はキャップ１構造である。一実施例において、５’キャップは、キャップ０構造であり、例えば、５’キャップ（すなわち、キャップ０）は、５’－５’トリホスフェート架橋を介してｍＲＮＡの残部に接続された反転７－メチルグアノシンからなる。一実施例において、５’キャップは、キャップ１構造であり、例えば、５’キャップ（すなわち、キャップ１）は、開始ヌクレオチドの２’Ｏ位置の追加のメチル化を有するキャップ０からなる。

【0735】

一実施例において、ｍＲＮＡは、精製される。ｍＲＮＡを精製するための様々な方法は、当業者には明らかであろう。例えば、ｍＲＮＡは、塩化リチウム（ＬｉＣｌ）沈殿を使用して精製される。別の実施例において、ｍＲＮＡは、タンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）を使用して精製される。精製後、ｍＲＮＡは、例えば、ヌクレアーゼを含まない水中に再懸濁される。

【0736】

組成物
本開示は、本開示のポリヌクレオチドを含む免疫原性組成物を提供する。

【0737】

本開示はまた、本開示のｃＲＮＡを含む免疫原性組成物を提供する。

【0738】

本開示は、本開示の自己複製ＲＮＡを含む免疫原性組成物を更に提供する。

【0739】

本開示はまた、本開示の免疫原性組成物、及び薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物を提供する。

【0740】

本開示のポリヌクレオチド、ｃＲＮＡ、及び／又は自己複製ＲＮＡは、裸のＲＮＡとして、又は細胞への進入を容易にする脂質、ポリマー、若しくは他の送達系と組み合わせて存在し得ることが、当業者には明らかであるか、及び／又は本明細書に記載される。

【0741】

送達系
一実施例において、本開示の薬学的組成物は、ＬＮＰ、高分子微粒子、及び水中油型エマルションを更に含む。例えば、ポリヌクレオチド、ｃＲＮＡ、及び／又は自己複製ＲＮＡは、ＬＮＰ、高分子微粒子、又は水中油型エマルション中に封入されているか、それに結合されているか、又はそれに吸着されている。

【0742】

脂質ナノ粒子
一実施例において、本開示の薬学的組成物は、ＬＮＰを更に含む。

【0743】

「脂質ナノ粒子」又は「ＬＮＰ」という用語は、リポソーム又は小胞を含むが、これらに限定されない、任意の脂質組成物を指し、水性体積は、非水性コア及び固体脂質ナノ粒子を有する両親媒性脂質二重層（例えば、単一；単層、又は複数；多層）ミセル様脂質ナノ粒子によって封入され、固体脂質ナノ粒子は、脂質二重層を欠いていることが明らかであろう。

【0744】

本開示における使用に好適な脂質ナノ粒子は、当業者には明らかであるか、及び／又は本明細書に記載される。脂質は、アニオン性、カチオン性、又は両性イオン性親水性先端基を有し得る。

【0745】

一実施例において、脂質ナノ粒子は、ＰＥＧ脂質、ステロール構造脂質、及び／又は中性脂質を含む。一実施例において、脂質ナノ粒子は、カチオン性脂質を更に含む。一実施例において、脂質ナノ粒子は、カチオン性脂質を含まない。

【0746】

一実施例において、ＬＮＰは、ＰＥＧ脂質を含む。例えば、ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ－ｃ－ＤＭＧ、ＰＥＧ－ＤＭＧ、ＰＥＧ－ＤＬＰＥ、ＰＥＧ－ＤＭＰＥ、ＰＥＧ－ＤＰＰＣ、ＰＥＧ－ＤＳＰＥ脂質、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される。

【0747】

一実施例において、ＬＮＰは、構造脂質を含む。例えば、構造脂質は、コレステロール フェコステロール、シトステロール、カンペステロール、スティグマステロール、ブラシカステロール、エルゴステロール、トマチジン、トマチン、ウルソル酸、及びアルファ－トコフェロール、並びにこれらの組み合わせからなる群から選択される。

【0748】

一実施例において、ＬＮＰは、中性脂質を含む。本開示に使用するための例示的なリン脂質（アニオン性又は両性イオン性）としては、例えば、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、及びホスファチジルグリセロールが挙げられる。例えば、中性脂質は、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２－ジリノレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＬＰＣ）、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－ホスホコリン（ＤＭＰＣ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、１，２－ジウンデカノイル－ｓｎ－グリセロ－ホスホコリン（ＤＵＰＣ）、１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＰＯＰＣ）、１，２－ジ－Ｏ－オクタデセニル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１８：０ ジエーテル ＰＣ）、１－オレオイル－２－コレステリルヘミスクシノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＯＣｈｅｍｓＰＣ）、１－ヘキサデシル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（Ｃ１６ Ｌｙｓｏ ＰＣ）、１，２－ジリノレノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン、１，２－ジアラキドノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン、１，２－ジドコサヘキサエノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン、１，２－ジフィタノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＭＥ １６．０ ＰＥ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、１，２－ジリノレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、１，２－ジリノレノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、１，２－ジアラキドノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、１，２－ジドコサヘキサエノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホ－ｒａｃ－（１－グリセロール）ナトリウム塩（ＤＯＰＧ）、及びスフィンゴミエリン、並びにこれらの組み合わせからなる群から選択される。

【0749】

一実施例において、ＬＮＰは、カチオン性脂質を含む。例示的なカチオン性脂質としては、ジオレオイルトリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）、ｌ，２－ジステアリルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－アミノプロパン（ＤＳＤＭＡ）、１，２－ジオレイルオキシ－Ｎ，Ｎジメチル－３－アミノプロパン（ＤＯＤＭＡ）、１，２－ジリノレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－アミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、１，２－ジリノレニルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－アミノプロパン（ＤＬｅｎＤＭＡ）、２，５－ビス（（９ｚ，１２ｚ）－オクタデカ－９，１２，ジエン－１－イルオキシル）ベンジル－４－（ジメチルアミノ）ブツノエート（ＬＫＹ７５０）が挙げられるが、これらに限定されない。一実施例において、リン脂質は、２，５－ビス（（９ｚ，１２ｚ）－オクタデカ－９，１２，ジエン－１－イルオキシル）ベンジル－４－（ジメチルアミノ）ブツノエート（ＬＫＹ７５０）である。例示的な両性イオン性脂質としては、アシル両性イオン性脂質及びエーテル両性イオン性脂質、例えば、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、及びドデシルホスホコリンが挙げられるが、これらに限定されない。脂質は、飽和又は不飽和であり得る。

【0750】

高分子微粒子
一実施例において、本開示の薬学的組成物は、高分子微粒子を更に含む。

【0751】

当業者は、様々なポリマーが、本開示のポリヌクレオチド、ｃＲＮＡ、及び／又は自己複製ＲＮＡを封入又は吸着するために微粒子を形成し得ることを認識するであろう。実質的に非毒性のポリマーの使用は、粒子が安全であることを意味し、生分解性ポリマーの使用は、粒子が長期持続性を回避するために送達後に代謝され得ることを意味することが明らかであろう。有用なポリマーはまた、薬学的グレードの製剤の調製を支援するために滅菌可能である。

【0752】

例示的な非毒性及び生分解性ポリマーとしては、ポリ（α－ヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシ酪酸、ポリラクトン（ポリカプロラクトンを含む）、ポリジオキサノン、ポリバレロラクトン、ポリオルトエステル、ポリ無水物、ポリシアノアクリレート、チロシン由来ポリカーボネート、ポリビニルピロリジノン、又はポリエステル－アミド、及びこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。

【0753】

水中油型カチオン性エマルション
一実施例において、本開示の薬学的組成物は、水中油型カチオン性エマルションを更に含む。

【0754】

水中油型エマルションに使用するための好適な油は、当業者には明らかであるか、及び／又は本明細書に記載される。例えば、エマルションは、例えば、動物（例えば、魚）又は植物供給元（例えば、ナッツ、種子、穀物）に由来する１つ以上の油を含む。当業者は、生体適合性及び生分解性油が優先的に使用されることを認識するであろう。例示的な動物油（すなわち、魚油）としては、タラ肝油、サメ肝油、及びクジラ油が挙げられる。例示的な植物油としては、ピーナッツ油、ココナッツ油、オリーブ油、大豆油、ホホバ油、サフラワー油、綿実油、ヒマワリ種子油、ゴマ種子油、トウモロコシ油が挙げられる。

【0755】

油に加えて、水中油型エマルションはまた、エマルションの形成及び安定化を容易にするカチオン性脂質を含む。好適なカチオン性脂質は、当業者には明らかであるか、及び／又は本明細書に記載される。例示的なカチオン性脂質としては、限定されないが、１，２－ジオレオイルオキシ－３－（トリメチルアンモニオ）プロパン（ＤＯＴＡＰ）、３’－［Ｎ－（Ｎ’，Ｎ’－ジメチルアミノエタン）－カルバモイル］コレステロール（ＤＣコレステロール）、ジメチルジオクタデシル－アンモニウム（ＤＤＡ）、１，２－ジミリストイル－３－トリメチル－アンモニウムプロパン（ＤＭＴＡＰ）、ジパルミトイル［Ｃ１６：０］トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＰＴＡＰ）、及びジステアロイルトリメチルアンモニウムプロパン（ＤＳＴＡＰ）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0756】

いくつかの実施例において、水中油型エマルションはまた、非イオン性界面活性剤及び／又は両性イオン性界面活性剤を含む。当業者は、本開示における使用に好適な界面活性剤を認識するであろう。例示的な界面活性剤としては、ポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤（例えば、ポリソルベート２０及びポリソルベート８０）、並びにエチレンオキシド（ＥＯ）、プロピレンオキシド（ＰＯ）、及び／又はブチレンオキシド（ＢＯ）のコポリマーが挙げられるが、これらに限定されない。

【0757】

薬学的に許容される担体
好適には、本開示のｃＲＮＡ及び／又は自己複製ＲＮＡを対象に投与するための組成物又は方法において、ｃＲＮＡ及び／又は自己複製ＲＮＡは、当該技術分野で理解されるように、薬学的に許容される担体と組み合わされる。したがって、本開示の一実施例は、薬学的に許容される担体と組み合わせた本開示の自己複製ＲＮＡ（及び任意の送達系）を含む組成物（例えば、薬学的組成物）を提供する。本開示の別の実施例は、薬学的に許容される担体と組み合わせた本開示のｃＲＮＡ（及び任意の送達系）を含む組成物（例えば、薬学的組成物）を提供する。

【0758】

一般論において、「担体」は、任意の対象、例えば、ヒトに安全に投与され得る、固体又は液体充填剤、結合剤、希釈剤、封入化物質、乳化剤、湿潤剤、溶媒、懸濁剤、コーティング又は潤滑剤を意味する。特定の投与の経路に応じて、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．Ｎ．Ｊ．ＵＳＡ，１９９１）に記載されるように、当該技術分野で既知の種々の許容される担体が使用され得る。

【0759】

本開示のｃＲＮＡ及び／又は自己複製ＲＮＡは、予防的又は治療的治療のために、非経口、局所、経口、又は局所投与、筋肉内投与、エアロゾル投与、若しくは経皮投与に有用である。一実施例において、自己複製ＲＮＡは、非経口的に、例えば、筋肉内に、皮下に、又は静脈内に投与される。例えば、自己複製ＲＮＡは、筋肉内に投与される。別の実施例において、ｃＲＮＡは、非経口的に、例えば、筋肉内に、皮下に、又は静脈内に投与される。例えば、ｃＲＮＡは、筋肉内に投与される。

【0760】

投与されるｃＲＮＡ及び／又は自己複製ＲＮＡの製剤は、選択される投与及び製剤（例えば、溶液、エマルション、カプセル）の経路に応じて変化する。投与されるｃＲＮＡ及び／又は自己複製ＲＮＡを含む適切な薬学的組成物は、生理学的に許容される担体中で調製され得る。溶液又はエマルションについて、好適な担体としては、例えば、生理食塩水及び緩衝媒体を含む、水性又はアルコール性／水性溶液、エマルション又は懸濁液が挙げられる。非経口ビヒクルは、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロース及び塩化ナトリウム、乳酸リンゲル又は固定油を含み得る。当業者には、水、緩衝水、緩衝生理食塩水、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール）、デキストロース溶液及びグリシンを含む、種々の適切な水性担体が既知である。静脈内ビヒクルは、様々な添加剤、防腐剤、又は流体、栄養素又は電解質補充剤を含み得る（一般に、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，１６ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｍａｃｋ，Ｅｄ．１９８０を参照されたい）。組成物は、ｐＨ調整剤及び緩衝剤並びに毒性調整剤、例えば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、及び乳酸ナトリウムなどの生理学的条件を近似するために、必要に応じて、薬学的に許容される補助物質を任意選択的に含有し得る。ｃＲＮＡ及び／又は自己複製ＲＮＡは、液相段階において貯蔵することができるか、又は貯蔵のために凍結乾燥させることができ、当該技術分野で既知の凍結乾燥及び再構築技術に従って使用する前に好適な担体中で再構築することができる。

【0761】

選択された培地中の活性成分の最適な濃度は、当業者に既知の手順に従って経験的に決定することができ、所望の最終的な薬学的製剤に依存する。

【0762】

製剤時に、本開示の組成物は、投薬製剤に適合する様式で、及び治療的／予防的に有効であるように、そのような量で投与される。本開示のｃＲＮＡ及び／又は自己複製ＲＮＡの投与のための投与量範囲は、所望の効果をもたらすのに十分な大きさのものである。例えば、組成物は、有効量の自己複製ＲＮＡを含む。一実施例において、組成物は、治療有効量の自己複製ＲＮＡを含む。別の実施例において、組成物は、予防的有効量の自己複製ＲＮＡを含む。一実施例において、組成物は、有効量のｃＲＮＡを含む。一実施例において、組成物は、治療有効量のｃＲＮＡを含む。別の実施例において、組成物は、予防的有効量のｃＲＮＡを含む。

【0763】

投与量は、有害な副作用を引き起こすほど大きくあるべきではない。一般に、投与量は、患者における年齢、状態、性別、及び疾患の程度によって変化し、当業者によって決定され得る。投与量は、任意の合併症の場合に個々の医師によって調整され得る。

【0764】

投与量は、１日又は数日間にわたる、毎日の１つ以上の用量投与において、約０．１ｍｇ／ｋｇ～約３００ｍｇ／ｋｇ、例えば、約０．２ｍｇ／ｋｇ～約２００ｍｇ／ｋｇ、例えば、約０．５ｍｇ／ｋｇ～約２０ｍｇ／ｋｇで変化し得る。

【0765】

いくつかの実施例において、ｃＲＮＡ及び／又は自己複製ＲＮＡは、後続の（維持用量）よりも高い初期（又は負荷）用量で投与される。例えば、ｃＲＮＡ及び／又は自己複製ＲＮＡは、約１０ｍｇ／ｋｇ～約３０ｍｇ／ｋｇの初期用量で投与される。次いで、ｃＲＮＡ及び／又は自己複製ＲＮＡは、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇの維持用量で投与される。維持用量は、７～３５日ごと、例えば、７日又は１４日又は２８日ごとに投与されてもよい。

【0766】

いくつかの実施例では、ｃＲＮＡ及び／又は自己複製ＲＮＡが、後続の用量で使用されるよりも低い用量で初期に投与される用量漸増レジームが使用される。この投与量レジームは、対象が初期に有害事象に苦しんでいる場合に有用である。

【0767】

治療に適切に応答していない対象の場合、１週間に複数用量を投与してもよい。代替的に、又は加えて、増加する用量が投与されてもよい。

【0768】

対象は、本開示のｃＲＮＡ及び／又は自己複製ＲＮＡにより再治療されてもよい。対象は、結合タンパク質の少なくとも約２回の曝露、例えば、約２～６０回の曝露、及びより具体的には、約２～４０回の曝露、最も具体的には、約２～２０回の曝露などの、２回以上の曝露又は用量のセットを与えられることによって、ｃＲＮＡ及び／又は自己複製ＲＮＡにより再治療されてもよい。

【0769】

一実施例において、任意の再治療は、疾患の徴候又は症状が再発するときに与えられてもよい。

【0770】

別の実施例において、任意の再治療は、定義された間隔で与えられてもよい。例えば、後続の曝露は、様々な間隔、例えば、約２４～２８週間又は４８～５６週間以上などで投与されてもよい。例えば、そのような曝露は、約２４～２６週間又は約３８～４２週間、又は約５０～５４週間の各々の間隔で投与される。

【0771】

治療に適切に応答していない対象の場合、１週間に複数用量を投与してもよい。代替的に、又は加えて、増加する用量が投与されてもよい。

【0772】

別の実施例において、有害反応を経験している対象について、初期（又は負荷）用量は、１週間に多数の日にわたって、又は多数の連続する日にわたって分割されてもよい。

【0773】

本開示の方法によるｃＲＮＡ及び／又は自己複製ＲＮＡの投与は、例えば、レシピエントの生理学的状態、投与の目的が治療的であるか又は予防的であるか、及び熟練実務者に既知の他の因子に応じて、連続的又は断続的であり得る。ｃＲＮＡ及び／又は自己複製ＲＮＡの投与は、事前に選択された期間にわたって本質的に連続的であってもよく、又は例えば、状態の発症中若しくは発症後のいずれかで、一連の間隔をあけた用量であってもよい。

【0774】

スクリーニングアッセイ
本開示のｃＲＮＡ及び／又は自己複製ＲＮＡを選択するための好適な方法は、当業者に利用可能である。アッセイは、例えば、血清学及び免疫応答を含む、ＲＮＡの効率及び有効性を評価するために実施されてもよい。

【0775】

抗原発現
一実施例において、自己複製ＲＮＡは、目的の（少なくとも）第１及び第２の遺伝子の発現について評価される。別の実施例において、ｃＲＮＡは、目的の（少なくとも）第１及び第２の遺伝子の発現について評価される。

【0776】

例えば、抗原発現は、目的の遺伝子に対する抗体を使用して検出される。一実施例において、抗原発現に対して陽性である細胞の数は、例えば、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）によって測定される。別の実施例において、平均蛍光強度（ＭＦＩ）は、例えば、ＦＡＣＳを使用して決定される。更なる実施例において、ＲＮＡの単位質量当たりの特定の効力値、又は成功したトランスフェクションの確率が計算される。

【0777】

マイクロ中和アッセイ
一実施例において、自己複製ＲＮＡ（裸及び／又は製剤化）は、抗体応答について評価される。一実施例において、ｃＲＮＡ（裸及び／又は製剤化）は、抗体応答について評価される。例えば、ｃＲＮＡ及び／又は自己複製ＲＮＡは、マイクロ中和アッセイを使用して評価される。マイクロ中和アッセイを行う方法は、当業者には明らかであろう。一実施例において、マイクロ中和アッセイは、短い形態のアッセイである。一実施例では、ウイルス蛍光焦点ベースのマイクロ中和アッセイが行われる。別の実施例において、マイクロ中和アッセイは、長い形態のアッセイである。

【0778】

赤血球凝集阻害（ＨＡＩ）アッセイ
一実施例において、自己複製ＲＮＡ（裸及び／又は製剤化）は、抗体応答について評価される。一実施例において、ｃＲＮＡ（裸及び／又は製剤化）は、抗体応答について評価される。例えば、ｃＲＮＡ及び／又は自己複製ＲＮＡは、赤血球凝集阻害（ＨＡＩ）アッセイを使用して評価される。ＨＡＩアッセイを行う方法は、当業者には明らかであるか、及び／又は例えば、ＷＨＯ（２０１１）Ｍａｎｕａｌ ｆｏｒ ｔｈｅ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ ｏｆ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ：ＷＨＯ Ｐｒｅｓｓ，Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎに記載される。

【0779】

抗原特異的Ｔ細胞応答
一実施例において、自己複製ＲＮＡは、抗原特異的Ｔ細胞応答を誘導するその能力について評価される。一実施例において、ｃＲＮＡは、抗原特異的Ｔ細胞応答を誘導するその能力について評価される。抗原特異的Ｔ細胞応答の誘導を評価する方法は、当業者には明らかであるか、及び／又は本明細書に記載される。

【0780】

例えば、抗原特異的Ｔ細胞検出は、脾臓培養物上で行われる。簡潔に述べると、脾細胞培養物はＴ細胞培地中で確立され、細胞培養物は抗原性ペプチドにより刺激されるか、又は非刺激されるかのいずれかである。一実施例において、抗原特異的Ｔ細胞応答は、フローサイトメトリーを使用して決定される。

【0781】

中和アッセイ
本開示の自己複製ＲＮＡは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質ＲＢＤに結合し、Ｓタンパク質ＲＢＤのＡＣＥ２への結合を中和するそれらの能力についてインビトロでスクリーニングしてもよい。好適なアッセイは、当業者に明らかであり、例えば、Ｖｅｒｏマイクロ中和アッセイ、ｓＶＮＴアッセイ、又はプスエドウイルス中和アッセイ（例えば、ＨＥＫ－２９３Ｔ細胞又はＨｅＬａ－ＡＣＥ２細胞を使用する）が挙げられる。

【0782】

一実施例において、中和アッセイは、Ｖｅｒｏマイクロ中和アッセイである。簡潔に述べると、ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２野生型ウイルスは、Ｖｅｒｏ細胞（すなわち、アフリカミドリザルから抽出された腎臓上皮細胞から単離されたＶｅｒｏ系統）において継代される。試験タンパク質の連続２倍希釈物を、１００ ＴＣＩＤ_５０（すなわち、組織培養感染性用量の中央値）のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２とともに１時間インキュベートし、残留ウイルス感染力をＶｅｒｏ細胞において評価する；ウイルス細胞変性効果は、例えば、５日目に読み取られる。中和抗体力価は、前述のようにＲｅｅｄ／Ｍｕｅｎｃｈ法を使用して計算する（Ｈｏｕｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１６；Ｓｕｂｂａｒａｏ ｅｔ ａｌ ２００４）。

【0783】

一実施例において、中和アッセイは、代理中和試験（ｓＶＮＴ）である。簡潔に述べると、プレートのウェルは、炭酸塩－重炭酸塩コーティング緩衝液（例えば、ｐＨ９．６）中のｈＡＣＥ２タンパク質によりコーティングされる。試験タンパク質とともに予めインキュベートされたＨＲＰにコンジュゲートしたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２及びＨＲＰにコンジュゲートしたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－ＲＢＤは、異なる濃度でｈＡＣＥ２に添加され、例えば、室温で１時間インキュベートされる。非結合ＨＲＰにコンジュゲートした抗原は、洗浄によって除去される。比色シグナルは、発色基質、例えば、３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）とのＨＲＰの酵素反応上で発現させる。一実施例において、４５０ｎｍ及び５７０ｎｍにおける吸光度読み取り値を取得する。

【0784】

一実施例において、中和は、プスエドウイルス中和アッセイである。簡潔に述べると、ＳＡＲＳ－２－スパイクタンパク質により疑似化されたＨＩＶレポーターウイルスは、ＳＡＲＳ－２－ＣＯＶ－２スパイクプラスミドを、ウイルス骨格プラスミド（例えば、ｐＤＲ－ＮＬ Δｅｎｖ ＦＬＵＣ）とともに、例えば、ＨＥＫ－２９３Ｔ細胞に共トランスフェクションすることによって産生される。疑似ウイルスは、トランスフェクション後に採取され、濾過によって明らかにされる。相対ルシフェラーゼ単位感染性用量（ＲＬＵ）として報告されるウイルスストック力価は、ウイルス感染についての読み出しとしてルシフェラーゼ活性を測定するＨｅｌａ－ｈＡＣＥ２細胞における希釈感染を制限することによって計算する。

【0785】

治療又は予防の方法
本開示は、本開示の免疫原性組成物又は薬学的組成物をワクチンとして使用する方法を提供する。

【0786】

本開示はまた、本開示の免疫原性組成物又は薬学的組成物を投与することを含む、対象における疾患又は状態の治療又は予防の方法を提供する。例えば、疾患又は状態は、インフルエンザ又はＣＯＶＩＤ－１９などの呼吸器ウイルス感染である。一実施例において、疾患又は状態は、ＡＲＤＳである。

【0787】

インフルエンザ
「インフルエンザ（ｔｈｅ ｆｌｕ）」としても既知であるインフルエンザは、インフルエンザウイルスによって引き起こされる感染性疾患である。症状は軽度から重度であり得、最も一般的な症状としては、高熱、鼻水、のどの痛み、筋肉及び関節の痛み、頭痛、咳、及び疲労感が挙げられる。症状は、典型的には、ウイルスに曝露してから２日後に始まり、ほとんどの症状は１週間未満続く。インフルエンザの合併症は、ウイルス性肺炎、二次性細菌性肺炎、副鼻腔感染、及び喘息又は心不全などの以前の健康問題の悪化を含み得る。ウイルス性肺炎は、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）にもつながる可能性がある。

【0788】

現在、Ａ、Ｂ、Ｃ、及びＤの４つのインフルエンザウイルスが存在することは、当業者には明らかであろう。インフルエンザＡウイルスは、ヒト、動物、及び鳥に感染する最も一般的なインフルエンザウイルスであり、一方、インフルエンザＢウイルス感染は、主にヒトに発生する。インフルエンザＣウイルスの感染は、ヒト又は哺乳動物に任意の重度の症状を引き起こさず、インフルエンザＤは、これまでに、ブタ及びウシのみに感染している。

【0789】

したがって、本開示のいくつかの実施例において、対象は、インフルエンザウイルス感染を有する。一実施例において、対象は、インフルエンザを有する。特に、インフルエンザは、ＡＲＤＳと関連している。一実施例において、本開示の方法は、インフルエンザウイルス感染に罹患している対象におけるＡＲＤＳを治療又は予防するために使用され得る。一実施例において、本開示の方法は、インフルエンザに罹患している対象におけるＡＲＤＳを治療又は予防するために使用され得る。

【0790】

コロナウイルス病２０１９（ＣＯＶＩＤ－１９）
本開示は、例えば、ＣＯＶＩＤ－１９を治療又は予防する方法を提供する。

【0791】

本開示はまた、例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を治療又は予防する方法を提供する。本開示のいくつかの実施例において、対象は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を有するが、臨床的にＣＯＶＩＤ－１９と診断されていない。

【0792】

ＣＯＶＩＤ－１９は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２によって引き起こされる感染性疾患である。ＣＯＶＩＤ－１９は、中華人民共和国湖北省武漢市において２０１９年１２月に初めて特定され、現在進行中のパンデミックをもたらしている。一般的な症状としては、発熱、咳、倦怠、息切れ、並びに嗅覚及び味覚の喪失が挙げられる。症例の大部分は軽度の症状をもたらすが、一部はＡＲＤＳに進行する。曝露から症状の発生までの時間は、典型的には、約５日であるが、２～１４日の範囲であり得る。現在、ＣＯＶＩＤ－１９に対するワクチンはなく、特定の抗ウイルス治療もなく、管理には症状の治療、支持療法、隔離、及び実験的措置を伴う。

【0793】

したがって、いくつかの実施例において、対象は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を有する。一実施例において、対象は、ＣＯＶＩＤ－１９、例えば、重度のＣＯＶＩＤ－１９を有する。特に、重度のＣＯＶＩＤ－１９は、しばしばＡＲＤＳをもたらす。本開示の方法は、重度のＣＯＶＩＤ－１９に罹患している対象におけるＡＲＤＳを治療又は予防するために使用され得る。

【0794】

急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）
本開示は、例えば、対象におけるＡＲＤＳを治療又は予防する方法を提供する。

【0795】

ＡＲＤＳは、両側肺浸潤、重度の低酸素血症、及び肺胞毛細血管膜バリアの破壊（すなわち、肺血管漏出）によって特徴付けられる生命を脅かす状態であり、非心原性肺水腫を引き起こす。現在、効果的な薬理学的療法は存在しない。

【0796】

インフルエンザ及びコロナウイルス感染を含む感染性病因は、ＡＲＤＳの主な原因である。したがって、本開示の一実施例において、ＡＲＤＳは、インフルエンザ又はコロナウイルス感染と関連している。例えば、ＡＲＤＳは、インフルエンザと関連している。別の実施例において、ＡＲＤＳは、ＳＡＲＳ－ＣＯＶ感染などのコロナウイルス感染と関連している。一実施例において、ＡＲＤＳは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染と関連している。

【0797】

ＡＲＤＳは、Ｂｅｒｌｉｎ定義に従って分類され、
（１）臨床侵襲又は呼吸器症状の発生の１週間以内の症状、
（２）ＰａＯ２が動脈血中の酸素の分圧であり、ＦｉＯ２が吸入された酸素の割合である、連続気道陽圧（ＣＰＡＰ）又は呼気終末陽圧（ＰＥＥＰ）の少なくとも５ｃｍにおける３００ｍｍＨｇ以下のＰａＯ２／ＦｉＯ２比によって決定される場合の急性低酸素性呼吸器不全、
（３）浸出、凝固、又は無気肺によって完全に説明されていない肺Ｘ線写真上の両側性混濁、及び
（４）心不全又は体液過剰によって完全に説明されていない水腫／呼吸器不全を含む。

【0798】

一実施例において、対象は、ＡＲＤＳを有するか、又はＡＲＤＳに罹患している（すなわち、対象は、ＡＲＤＳのＢｅｒｌｉｎ定義を満たす）。例えば、対象は、治療を必要としている（すなわち、それを必要としている）。

【0799】

一実施例において、対象は、ＡＲＤＳと関連する症状を有するか、又は症状に罹患している。ＡＲＤＳと関連する症状及びＡＲＤＳを発症するリスクにある対象を同定する方法は、当業者には明らかであるか、及び／又は本明細書に記載される。例えば、対象は、以下の症状のうちの１つ以上又は全てを有する。
ａ）１分当たり３０回超の呼吸の呼吸器頻度、
ｂ）室内空気における９３％以下の酸素飽和度（ＳｐＯ_２）、
ｃ）３００ｍｍＨｇ未満の吸入された酸素の割合に対する酸素の動脈分圧の比（ＰａＯ_２／ＦｉＯ_２）、
ｄ）２１８未満のＳｐＯ_２／ＦｉＯ_２比、及び
ｅ）５０％超の量におけるＸ線写真による肺浸潤。

【0800】

現在、ＡＲＤＳは軽度、中等度、又は重度のように分類され、関連する死亡率が増加している。ＡＲＤＳの重症度は、Ｂｅｒｌｉｎ定義に従って以下のように分類することができる。
（ｉ）軽度のＡＲＤＳ：少なくとも５ｃｍのＣＰＡＰ又はＰＥＥＰにおける２００～３００ｍｍＨｇのＰａＯ_２／ＦｉＯ_２、
（ｉｉ）中等度のＡＲＤＳ：少なくとも５ｃｍのＰＥＥＰにおける１００～２００ｍｍＨｇのＰａＯ_２／ＦｉＯ_２、及び
（ｉｉｉ）重度のＡＲＤＳ：少なくとも５ｃｍのＰＥＥＰにおける１００ｍｍＨｇ以下のＰａＯ_２／ＦｉＯ_２。

【0801】

一実施例において、ＡＲＤＳは、軽度のＡＲＤＳである。別の実施例において、ＡＲＤＳは、中等度のＡＲＤＳである。更なる実施例において、ＡＲＤＳは、重度のＡＲＤＳである。

【0802】

本開示の方法は、既存のＡＲＤＳの治療に加えて、ＡＲＤＳの発生を予防するために使用され得る。したがって、一実施例において、対象は、ＡＲＤＳを有しない。

【0803】

キット
本開示の別の実施例は、上記のような疾患又は障害の治療又は予防に有用な本開示の自己複製ＲＮＡを含むキットを提供する。

【0804】

本開示の別の実施例は、上記のような疾患又は障害の治療又は予防に有用な本開示のｃＲＮＡを含むキットを提供する。

【0805】

一実施例において、キットは、（ａ）任意選択的に、送達系及び／又は薬学的に許容される担体若しくは希釈剤中に自己複製ＲＮＡを含む容器、並びに（ｂ）対象における疾患又は障害（例えば、インフルエンザ、ＣＯＶＩＤ－１９又はＡＲＤＳ）を治療又は予防するための使用説明書を有する添付文書を含む。

【0806】

一実施例において、キットは、（ａ）任意選択的に、送達系及び／又は薬学的に許容される担体若しくは希釈剤中にｃＲＮＡを含む容器、並びに（ｂ）対象における疾患又は障害（例えば、インフルエンザ、ＣＯＶＩＤ－１９又はＡＲＤＳ）を治療又は予防するための使用説明書を有する添付文書を含む。

【0807】

本開示のこの実施例によれば、添付文書は容器の上にあるか、又は容器と関連している。好適な容器としては、例えば、ボトル、バイアル、注射器などが挙げられる。容器は、ガラス又はプラスチックなどの種々の材料から形成され得る。容器は、本開示の疾患又は障害に効果的であり、滅菌アクセスポートを有し得る組成物を保持又は含有する（例えば、容器は、皮下注射針によって貫通可能なストッパーを有する静脈内溶液バッグ又はバイアルであり得る）。組成物中の少なくとも１つの活性剤は、自己複製ＲＮＡ及び／又はｃＲＮＡである。ラベル又は添付文書は、組成物が、治療に適格である対象、例えば、インフルエンザ、インフルエンザウイルス感染、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染、ＣＯＶＩＤ－１９、及び／又はＡＲＤＳを発症しているか又は発症する素因がある対象を治療するために使用され、投薬量及び治療の間隔、並びに任意の他の医薬に関する特定のガイダンスが提供されることを示す。キットは、薬学的に許容される希釈剤緩衝液、例えば、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル溶液、及び／又はデキストロース溶液を含む追加の容器を更に含み得る。キットは、他の緩衝液、希釈剤、フィルタ、針、及び注射器を含む、商業的及び使用者の観点から望ましい他の材料を更に含み得る。

【0808】

本開示は、以下の非限定的な実施例を含む。

【実施例】

【0809】

実施例１：自己複製ＲＮＡの生成
自己複製ＲＮＡをコードするＤＮＡテンプレートを、ＤＮＡプラスミドにより形質転換したコンピテントＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ細胞内で産生した。個々の細菌コロニーを単離し、得られるプラスミドＤＮＡをＥ．ｃｏｌｉ培養物中で増幅した。発酵後、プラスミドＤＮＡをＭａｘｉｐｒｅｐ ＤＮＡキットを使用して単離し、制限消化によって線状化した。次いで、フェノール／クロロホルム抽出及びエタノール沈殿を使用して、制限酵素を除去した。

【0810】

ｍＲＮＡを、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを使用して、線状化ＤＮＡテンプレートからのインビトロ転写によって作製した。続いて、ＤＮａｓｅ消化によってＤＮＡテンプレートを除去した。キャップ０を用いて酵素キャッピングを行い、機能性ｍＲＮＡを提供した。得られるｍＲＮＡを精製し、ヌクレアーゼを含まない水に再懸濁した。

【0811】

自己複製ＲＮＡ（図１Ａ）を、Ａ／シチメンチョウ／Ｔｕｒｋｅｙ／１／２００５由来のＨＡ及びＮＡサブタイプ、Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／２００９由来のＮＳ１及びＮＰ、並びにＰＲ８Ｘ由来のＭ１及びＭ２を使用して調製した。以下の構築物を調製した。
●ＮＳＰ１－４．ＳＧＰ．Ｈ５．ＳＧＰ．Ｎ１（Ｆ５４８）
●ＮＳＰ１－４．ＳＧＰ．Ｎ１．ＳＧＰ．Ｈ５（Ｆ５４９）
●ＮＳＰ１－４．ＳＧＰ．Ｈ５．ＩＲＥＳ．Ｎ１（Ｆ５５６）
●ＮＳＰ１－４．ＳＧＰ．Ｎ１．ＩＲＥＳ．Ｈ５（Ｆ５５７）
●ＮＳＰ１－４．ＳＧＰ．Ｈ５．ＳＧＰｖ２．Ｎ１（Ｆ６０２）
●ＮＳＰ１－４．ＳＧＰ．Ｈ５．ＳＧＰｖ３．Ｎ１（Ｆ６１６）
●ＮＳＰ１－４．ＳＧＰ．Ｈ５．ＳＧＰｖ４．Ｎ１（Ｆ６１７）
●ＮＳＰ１－４．ＳＧＰ．Ｈ５．ＳＧＰ．Ｎ１．ＳＧＰ．Ｍ１（Ｆ５５４）
●ＮＳＰ１－４．ＳＧＰ．Ｈ５．ＳＧＰ．ＮＳ１（Ｆ５６８）
●ＮＳＰ１－４．ＳＧＰ．ＮＳ１．ＳＧＰ．ＨＡ（Ｆ５６９）
●ＮＳＰ１－４．ＳＧＰ．Ｈ５．ＳＧＰ．Ｍ１（Ｆ５７６）
●ＮＳＰ１－４．ＳＧＰ．Ｍ１．ＳＧＰｖ２．ＮＰ（Ｆ６２０）
●ＮＳＰ１－４．ＳＧＰ．Ｍ１．ＳＧＰ．Ｎ１．ＳＧＰ．Ｈ５（Ｆ５８４）
●ＮＳＰ１－４．ＳＧＰ．Ｍ１．ＳＧＰ．Ｍ２．ＳＧＰ．Ｎ１．ＳＧＰ．Ｈ５（Ｆ５９０）

【0812】

ＳＧＰｖ２、ｖ３、及びｖ４を、それぞれ１２個、３１個、及び５２個の塩基により５’で延長した。図１Ｂ及び１Ｃは、上記構築物における５’キャップ駆動抗原発現を示す。

【0813】

実施例２：自己複製ＲＮＡのインビトロ特徴付け
実施例１において産生された自己複製ＲＮＡを、目的の第１及び第２の遺伝子の発現について評価した。

【0814】

非製剤化（裸）又はＬＮＰ製剤化自己増幅ｍＲＮＡ構築物の２倍連続希釈物を、Ｂａｂｙ Ｈａｍｓｔｅｒ Ｋｉｄｎｅｙ（ＢＨＫ）細胞株にエレクトロポレーションするか、又はトランスフェクトした。１７～１９時間後、細胞を採取し、抗ＨＡ、抗ＮＡ、抗ＮＳ１、抗ＮＰ、又は抗Ｍ１抗体を使用して、ＨＡ、ＮＡ、ＮＳ１、ＮＰ、又はＭ１抗原発現のいずれかについて染色した。抗原発現に陽性である細胞の数及び平均蛍光強度（ＭＦＩ）を、ＦＡＣＳによって測定した。データを分析して、特定の効力値（ＲＮＡの質量の単位当たりの成功したトランスフェクションの確率）を計算し、非製剤化ＲＮＡ及びＬＮＰのＭＦＩをそれぞれ図２及び図３に示す。

【0815】

非製剤化ＲＮＡ及びＬＮＰのインビトロ活性及び効力を、抗原共発現に基づいてＦＡＣｓによって決定し、以下の表１に示す。

【表1】

【0816】

抗体応答
抗体応答を評価するために、試験終了時（すなわち、第１のワクチン用量から４２日後又は最後の第２のワクチン用量から２１日後）に血清を収集し、マイクロ中和アッセイ（図４）及び赤血球凝集阻害アッセイ（図５）によって試験した。

【0817】

全ての血清学的アッセイについて、血清を、受容体破壊酵素（ＲＤＥ）としても既知であるビブリオコレラ（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）ノイラミニダーゼ（Ｄｅｎｋａ Ｓｅｉｋｅｎ Ｃｏ．Ｌｔｄ．、Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）により同じ様式で処理し、ＰＢＳにより１：１０の開始希釈に希釈した。Ｈ５Ｎ１ウイルスに対するヒツジ血清（ＦＤＡ／ＣＢＥＲ Ｋｅｎｓｉｎｇｔｏｎ ｌｏｔ ｎｕ．Ｈ５－Ａｇ－１１１５）を、陽性対照血清３アッセイとして使用した。

【0818】

マイクロ中和アッセイ
マイクロ中和アッセイの短い形態及び長い形態を、適格な哺乳動物細胞株（独自の３３０１６－ＰＦ Ｍａｄｉｎ－Ｄａｒｂｙ Ｃａｎｉｎｅ Ｋｉｄｎｅｙ（ＭＤＣＫ））において行った。

【0819】

マイクロ中和アッセイの短い形態（ＭＮアッセイＳＦ）
ウイルス蛍光焦点ベースのマイクロ中和（ＦＦＡ ＭＮ）アッセイを、社内で開発されたプロトコルを使用して行った。ＲＤＥ処理された試験マウス試料及び陽性対照血清を熱失活させ、ＰＢＳにより１：４０の開始希釈に希釈し、Ｕ－Ｂｏｔｔｏｍ ９６ウェルプレート（ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ）を使用して中和培地（１％のＢＳＡ（Ｒｏｃｋｌａｎｄ、ＢＳＡ－３０）、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、及び１００ｕｇ／ｍＬのストレプトマイシン（ＧＩＢＣＯ）を補充した最小必須培地Ｄ－ＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ）から構成された）中で４倍連続希釈した。Ａ／シチメンチョウ／Ｔｕｒｋｅｙ／１／２００５（Ｈ５Ｎ１）ウイルスを、中和培地中で約１，０００～１，５００蛍光焦点形成単位（ＦＦＵ）／ウェル（２０，０００～３０，０００ＦＦＵ／ｍＬ）に希釈し、希釈血清に対して１：１の比で添加した。

【0820】

３７℃、５％のＣＯ_２での２時間のインキュベーション後、ＭＤＣＫ ３３０１６－ＰＦ細胞を含有するプレート（ハーフエリア９６ウェルプレート、Ｃｏｒｎｉｎｇ）を、この混合物により接種し、３７℃で、５％のＣＯ_２により１６～１８時間、一晩インキュベートした。ＭＤＣＫ ３３０１６－ＰＦ細胞は、細胞成長培地（１０％のＨｙＣｌｏｎｅウシ胎仔血清－ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、及び１００ｕｇ／ｍＬのストレプトマイシンを補充したＤ－ＭＥＭから構成された）中で６～８時間早く３．０Ｅ４／ウェル（３．０Ｅ６／プレート）として播種されていた。一晩のインキュベーションの後、及び免疫染色の前に、細胞をアセトン及びメタノールの冷混合物により固定した。

【0821】

０．０５％のｔｗｅｅｎ－２０（Ｓｉｇｍａ）及び２％のＢＳＡ（Ｆｒａｃｔｉｏｎ Ｖ，Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，２９６０，１１９４Ｃ１７５）を含有するＰＢＳ緩衝液中で希釈した、インフルエンザＡウイルス（クローンＡ１、Ａ３ブレンド、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅカタログ番号ＭＡＢ８２５１）及びＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）Ａｂ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号Ａ１１００１）のヌクレオタンパク質（ＮＰ）に特異的なモノクローナル抗体の室温での別個の１時間のインキュベーションを使用して、ウイルスを視覚化した。ＮＰウイルスタンパク質を、４８２及び５３６ｎｍの励起及び発光波長を有するフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）フルオレセンスフィルタセットを使用して、ＣＴＬ Ｉｍｍｕｎｏｓｐｏｔアナライザー（Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｉｍｉｔｅｄ、Ｓｈａｋｅｒ Ｈｅｉｇｈｔｓ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ）によって定量化した。蛍光焦点を、カスタム解析モジュールを使用して、ソフトウェアＩｍｍｕｎｏｓｐｏｔ７．０．１２．１プロフェッショナルアナライザーＤＣの使用により列挙した。データをこのソフトウェアにより逐次的にＥｘｃｅｌデータ解析スプレッドシートに記録し、次いで、６０％焦点低減エンドポイントを、ウイルス対照ウェルの平均焦点カウントから（各プレートについて）計算し、６０％焦点低減中和力価を、６０％エンドポイントの直上及び直下のウェル間の線形補間によって（各試料について）計算した。

【0822】

マイクロ中和アッセイの長い形態（ＭＮアッセイＬＦ）
ＭＮアッセイＬＦを、社内で開発されたプロトコルを使用して行った。ＲＤＥ処理された試験マウス試料及び陽性対照血清を熱失活させ、ＰＢＳにより１：４０の開始希釈に希釈し、Ｕ－Ｂｏｔｔｏｍ ９６ウェルプレート（ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ）を使用して、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、１００ｕｇ／ｍＬのストレプトマイシン（ＧＩＢＣＯ）、及び０．３３ｕｇ／ｍＬのＴＰＣＫ－トリプシン（ＴＰＣＫ処理、トシルフェニルアラニルクロロメチルケトン、Ｓｉｇｍａ）を補充した、中和培地（３０％使用済み成長培地（Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）から構成された、及び７０％の感染培地（タンパク質を含まない培地－３３０１６ ＭＤＣＫ ＰＦＭ；ＧＩＢＣＯ）中で２倍連続希釈した。Ａ／シチメンチョウ／Ｔｕｒｋｅｙ／１／２００５（Ｈ５Ｎ１）ウイルスを、中和培地中でウェル当たり１００ＴＣＩＤ（組織培養感染性用量）に希釈し、希釈した血清に対して１：１の比で添加した。連続的に事前に希釈した血清試料をウイルスとともにインキュベートし、３７℃、５％のＣＯ２で１時間反応させる。接種ステップにおいて、（抗生物質を含まない細胞成長培地（Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で前日に３．０Ｅ４／ウェル（３．０Ｅ６／プレート）として播種されていた）ＭＤＣＫ ３３０１６－ＰＦ細胞を含有するプレート（細胞培養９６ウェルプレート、Ｃｏｓｔａｒ）を、無菌ＰＢＳにより洗浄し、次いで、この混合物と感染させ、３７℃で５％のＣＯ_２により１時間インキュベートした。抗体／ウイルス混合物の吸引によって感染を停止させ、滅菌ＰＢＳにより洗浄した細胞を、２倍の連続希釈抗体を含有する中和培地（１００ｕｌ／ウェル）により接種し、次いで、３７℃で５％のＣＯ_２により５日間インキュベートした。最終の「読み出し」ステップにおいて、ウイルスの検出を、０．５％のシチメンチョウ赤血球（Ｌａｍｐｉｒｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用して、ウイルスのＨＡ定量化によって行った。感染力の不在は、陽性中和反応を構成し、血清試料中のウイルス特異的抗体の存在を示す。

【0823】

赤血球凝集阻害（ＨＡＩ）アッセイ
ＨＡＩアッセイを、前述のように行った（ＷＨＯ（２０１１）Ｍａｎｕａｌ ｆｏｒ ｔｈｅ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ ｏｆ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ：ＷＨＯ Ｐｒｅｓｓ，Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ、２０ Ａｖｅｎｕｅ Ａｐｐｉａ，１２１１ Ｇｅｎｅｖａ ２７，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）。簡潔に述べると、ＲＤＥ処理された試験マウス試料及び陽性対照血清を熱失活させ、ＰＢＳにより１：１０の開始希釈に希釈し、２倍の連続希釈試料（２５μｌ）を、Ａ／シチメンチョウ／Ｔｕｒｋｅｙ／１／２００５（Ｈ５Ｎ１）の等容量のウイルス（４つの赤血球凝集単位［ＨＡＵ］）とともに室温（ＲＴ）で３０分間インキュベートした。次いで、等容量の０．５％のシチメンチョウ赤血球（Ｌａｍｐｉｒｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を添加し、室温で３０分間インキュベートした。ＨＡＩ力価は、赤血球凝集を阻害する試料の最も高い希釈の逆数として表された。

【0824】

実施例３：自己複製ＲＮＡは、細胞媒介性免疫応答を誘導する。
自己複製ＲＮＡを、抗原特異的Ｔ細胞応答を誘導するそれらの能力について評価した。

【0825】

抗原特異的Ｔ細胞検出を、脾臓培養物上で行った。簡潔に述べると、脾細胞を解離溶液（ａｕｔｏＭＡＣＳリンス溶液とのＭＡＣＳ ＢＳＡストック１：２０）中で解離し、４Ｅ７細胞／ｍｌで濃縮した。簡潔に述べると、脾細胞培養物を、ＲＰＭＩ、ＮＥＡＡ、ペン／ストレップ、及びβＭＥを含有する）Ｔ細胞培地中の９６ウェルプレートに確立し、３７℃／５％のＣＯ_２で培養した。抗ＣＤ２８（クローン３７．５１；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ＃５５３２９４）及び抗ＣＤ１０７ａ（クローン＃１Ｄ４Ｂ；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ＃１２１６１８）を各ウェルに添加した。細胞培養物は、刺激されたか、又は非刺激されたかのいずれかであった。培養物ＮＡペプチド混合物（ＪＰＴ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＧｍｂＨ；ＰＭ－ＩＮＦＡ－ＮＡＴｕｒ）を刺激するために、ＨＡペプチド混合物（ＪＰＴ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＧｍｂＨ；ＰＭ－ＩＮＦＡ－ＨＡＩｎｄｏ）を添加した。２時間の刺激後、Ｇｏｌｇｉ Ｐｌｕｇ（ブレフェルジンＡ；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ＃５５５０２９を伴う）を各ウェルに添加した。細胞を３７℃で合計６時間インキュベートした後、細胞を４℃に移し、一晩貯蔵した。

【0826】

抗原特異的Ｔ細胞応答を、フローサイトメトリーを使用して決定した。簡潔に述べると、Ｆｃブロック混合物（クローン２．４Ｇ２；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ＃５５３１４２）を各ウェルに添加し、続いて、細胞外染色（Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ染色緩衝液プラス（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ＃５６６３８５）、ＩＣＯＳ ＢＶ７１１（クローンＣ３９８．４Ａ；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ＃３１３５４８）、ＣＤ４４ ＢＵＶ３９５（クローンＩＭ７；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ＃７４０２１５）、ＣＤ３ ＢＶ７８６（クローン１４５－２Ｃ１１；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ＃５６４３７９）、ＣＤ４ ＡＰＣ－Ｈ７（クローンＧＫ１．５、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ＃５６０１８１）、ＣＤ８ ＡＦ７００（クローン５３－６．７、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ＃５５７９５９）、及び染色緩衝液を含む）を添加した。製造業者のプロトコルに従って、細胞をＵｌｔｒａＣｏｍｐ ｅＢｅａｄｓ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ＃０１－２２２－４２）を用いて染色し、光から保護して、４℃で３０分間インキュベートした。細胞を染色緩衝液により洗浄し、遠心分離し、染色緩衝液中に再懸濁し、データをフローサイトメーターを使用して取得した。

【0827】

抗原特異的ＣＤ４及びＣＤ８ Ｔ細胞応答を図６に示す。

【0828】

実施例４：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２への自己複製ＲＮＡ
自己複製ＲＮＡをコードするＤＮＡテンプレートを、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株２０１９－ｎＣｏＶ／ＵＳＡ－ＷＡ１／２０２０からのスパイク（Ｓ）及びヌクレオカプシド（Ｎ）抗原を使用して、上記の実施例１に記載されるように産生した。以下の構築物を調製した。
●ＮＳＰ１－４．ＳＧＰ．Ｓ（ＲＲＡＲ→ＱＱＡＡ）．ＳＧＰｖ２．Ｎ（Ｃｏ１８）
●ＮＳＰ１－４．ＳＧＰ．Ｓ（ＲＲＡＲ→ＱＱＡＡ）．ＳＧＰｖ３．Ｎ（Ｃｏ１９）

【0829】

非製剤化ＲＮＡ及びＬＮＰのインビトロ活性及び効力を、Ｓ及びＮ共発現に基づいてＦＡＣｓによって決定し、以下の表２に示す。

【表2】

【0830】

抗体応答
抗体応答を評価するために、試験終了時（すなわち、第１のワクチン用量から４２日後又は最後の第２のワクチン用量から２１日後）に血清を収集し、上記のような実施例２におけるマイクロ中和アッセイによって試験した。結果を図７Ａに示す。

【0831】

ＡＣＥ２結合の阻害も評価した。結果を図７Ｂに示す。

【0832】

Ｎタンパク質に特異的な抗体も、ＥＬＩＳＡによって評価した（表３）。

【表3】

【0833】

ＩｇＧサブクラス
生成された免疫応答の型、すなわち、Ｔｈ１対Ｔｈ２型応答を特徴付けるために、Ｓ特異的ＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａ ＩｇＧサブクラスをＥＬＩＳＡによって評価した。加えて、ＩｇＧ１／ＩｇＧ２ａ抗体の比を評価した。ＩｇＧ１とＩｇＧ２ａ応答との間で少しの差異が観察された（表４）。

【表4】

【0834】

細胞媒介性免疫応答
自己複製ＲＮＡを、上記の実施例３に記載されるように、抗原特異的Ｔ細胞応答を誘導するそれらの能力について評価した。培養物Ｎペプチド混合物（ＣｏＶ－２完全長Ｎタンパク質のアミノ酸残基１～４１９にまたがる）を刺激するために、Ｓペプチド混合物１（ＣｏＶ－２完全長Ｓタンパク質のアミノ酸残基１～６４３にまたがる）、Ｓペプチド混合物２（ＣｏＶ－２完全長Ｓタンパク質のアミノ酸残基６３３～１２７３にまたがる）、ＣｏＶ－１ Ｓペプチド（ＣＹＧＶＳＡＴＫＬ）又はＣｏＶ－２ Ｓペプチド（ＣＹＧＶＳＰＴＫＬ）を添加した。

【0835】

抗原特異的Ｔ細胞応答を、上記のようなフローサイトメトリーを使用して決定した。

【0836】

抗原特異的ＣＤ４及びＣＤ８ Ｔ細胞応答を図８に示す。

【0837】

ｓａ－ｍＲＮＡワクチンによって誘発されたＣＤ４ Ｔ細胞は、ほとんどがＴｈ０（ＩＬ２＋及び／又はＴＮＦａ＋、ＩＦＮｇ－、ＩＬ５－、ＩＬ１３－）、及びＴｈ１（ＩＦＮｇ＋、ＩＬ５－、ＩＬ１３－）であり、Ｔｈ２（ＩＬ５＋及び／又はＩＬ１３＋、ＩＦＮｇ－）はほとんど又は全くなかった（図９）。同様の頻度のＳ１及びＳ２反応性ＣＤ４ Ｔ細胞が見出された；しかしながら、ＣＤ８ Ｔ細胞の場合、Ｓ１反応性Ｔ細胞は、Ｓ２反応性Ｔ細胞よりも優位であり、広範なサイトカイン表現型、三重、二重及び単一サイトカイン産生ＣＤ８＋Ｔ細胞を有した。

【0838】

実施例５：自己複製ＲＮＡによる免疫化の保護効果
免疫化の保護効果を評価するために、ハムスターを、１日目及び２２日目に、３μｇのＲＮＡ／ハムスター又は０．３μｇのＲＮＡ／ハムスターの用量でＣｏ１８により免疫化した。全ての動物を、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＵＳウイルスによる２回目の免疫化の２８日後に鼻腔内に挑戦し、４日後に肺及び鼻甲介において測定された感染性ウイルスについて肺及び鼻甲介を収集したときに屠殺した。

【0839】

ハムスターでは、３．０及び０．３μｇの用量は、それぞれ４２２及び１９０のように中和力価ＧＭＴを上昇させた。

【0840】

ウイルス感染からの肺の保護を評価するために、Ｃｏ１８により免疫化したハムスター及びＰＢＳにより免疫化した対照ハムスターについて、肺からの平均ウイルス回収を比較した。対照ハムスターからのウイルス力価は５，０１１，８７２ ＴＣＩＤ５０／グラムであったが、ワクチンで免疫化したハムスターからの平均ウイルス回収は、アッセイの定量限界を下回る、＜２０ ＴＣＩＤ５０／グラムであり、研究に含まれる全てのワクチンにより下気道の完全な保護を示した。

【0841】

上気道の保護を評価するために、対照ハムスターからの平均ウイルス回収の１２０，２２６，４４３ ＴＣＩＤ５０／グラムを用いて、鼻甲介からのウイルス回収を測定した。ウイルス力価を、それぞれ３．０及び０．３μｇの用量でＣｏ１８により免疫化したハムスターについて、５×１０^３～１０^４倍に低減させて１４，４５４及び２１，８７８ ＴＣＩＤ５０／グラムにした。これらの結果は、ｓａ－ｍＲＮＡ Ｓ－Ｎが上気道におけるウイルス感染を著しく低減させることを示した。

【0842】

実施例６：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２への自己複製ＲＮＡによる二重投薬
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ及びＮ抗原は、免疫学的に交差反応性ではない。前臨床動物モデルにおける抗体免疫応答を評価するために、雌ＢＡＬＢ／ｃマウスを、０日目に１μｇの用量により、２１日目に第２の用量により免疫化した。動物を４２日目に屠殺し、血清を得て、中和抗体、並びにＳタンパク質のＡＣＥ２受容体への結合を阻害する（ｉｎｈｂｉｔｉｎｇ）抗体を試験した。

【0843】

この研究では、単シストロン性構築物Ｃｏ６（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｎタンパク質への抗原を含む）及びＣｏ１６（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質への抗原を含む）も使用した。

【0844】

以下の１回目～２回目の用量の組み合わせを評価した。
●ＰＢＳ－Ｃｏ１８
●Ｃｏ６－Ｃｏ１８
●Ｃｏ１６－Ｃｏ１８
●Ｃｏ１８－Ｃｏ１８

【0845】

Ｓ及びＮタンパク質抗体
Ｓ及びＮタンパク質に特異的な抗体を、４２日目にＥＬＩＳＡによって評価した。結果を表５に示す。

【表5】

【0846】

相同プライム／ブースト（すなわち、Ｃｏ１８－Ｃｏ１８）は、抗Ｓ応答に関して異種プライムブーストよりも効果的であったが、しかしながら、異種プライムブースト（すなわち、Ｃｏ１８－Ｃｏ６）は、抗Ｎ応答に関して相同プライムブーストよりも効果的であった。

【0847】

ブーストの不在下において、抗Ｓ抗体は、２１日目から４２日目まで増加した（データは示されていない）。

【0848】

ＡＣＥ２結合の阻害
ＡＣＥ２結合の阻害も評価した。結果を表６に示す。

【表6】

【0849】

マイクロ中和アッセイ
ＷＴウイルス中和も評価した。結果を表７に示す。

【表7-1】

【0850】

細胞媒介性免疫応答
抗原特異的Ｔ細胞応答も評価した。ＣＤ４及びＣＤ８ Ｔ細胞応答は、相同抗原及び異種抗原の両方を用いるワクチン接種後に観察された。

【0851】

実施例７：バイシストロン性自己複製ＲＮＡワクチンは、免疫応答を誘導する
インフルエンザに対するバイシストロン性構築物を、上記の実施例１に記載されるように生成した。以下の構築物を生成した。
●ＮＳＰ１－４．ＳＧＰ．Ｈ５．ＳＧＰｖ２．Ｎ１（Ｆ６０２）
●ＮＳＰ１－４．ＳＧＰ．Ｍ１．ＳＧＰｖ２．ＮＰ（Ｆ６２０）

【0852】

ワクチンのインビトロ活性及び効力を表７に示す。バイシストロン性活性及び効力値は、Ｆ６２０についてのＭ１及びＮＰ共発現、並びにＦ６０２についてのＨ５及びＮ１共発現に基づく。

【表7-2】

【0853】

ワクチン製剤を、表８に示すように特徴付けた（ｃｈａｒａｃｔｉｓｅｄ）。

【表8】

【0854】

前臨床動物モデルにおける抗体免疫応答を評価するために、マウスを、０日目に０．１μｇ又は０．００１μｇの用量により、２１日目に第２の用量により免疫化した。以下の１回目～２回目の用量の組み合わせを評価した。

【表D】

【0855】

抗体応答を評価するために、試験終了時（すなわち、第１のワクチン用量から４２日後又は最後の第２のワクチン用量から２１日後）に血清を収集し、上記のような実施例２におけるマイクロ中和アッセイによって試験した。全ての構築物は、ウイルス特異的抗体を誘導した。

【0856】

全ての構築物は、ＥＬＩＳＡによって評価した場合、Ｎタンパク質に特異的な抗体を生成した。

【0857】

抗原特異的Ｔ細胞応答も評価した。ワクチン接種後にＮＰ及びＭ１ ＣＤ４及びＮＰ ＣＤ８ Ｔ細胞特異的応答が観察された。Ｍ１ ＣＤ８特異的Ｔ細胞応答は限定的であった。

【0858】

実施例８：ＳＧＰ及びＩＲＥＳによる目的の第２の抗原の調節
目的の抗原が挿入されたｓｐｇｖ２プロモーター又はＩＲＥＳエレメントによって調節されたときに、抗原特異的Ｔ細胞を評価した。

【0859】

以下の構築物を評価した。
●ＮＳＰ１－４．ＳＧＰ．Ｈ５．ＩＲＥＳ．Ｎ１（Ｆ５５６）
●ＮＳＰ１－４．ＳＧＰ．Ｎ１．ＩＲＥＳ．Ｈ５（Ｆ５５７）
●ＮＳＰ１－４．ＳＧＰ．Ｈ５．ＳＧＰｖ２．Ｎ１（Ｆ６０２）
●ＮＳＰ１－４．ＳＧＰ．Ｎ１．ＳＧＰｖ２．Ｈ５（Ｆ６３２）

【0860】

これらの構築物を、天然ＳＧＰの制御下の単シストロン性Ｎ１及びＨ５構築物と比較した。

【0861】

簡潔に述べると、ＢＡＬＢ／ｃマウスを、２回（０日目及び２１日目）ワクチン接種し、４２日目（２回目のワクチン接種後３週間）に安楽死させた。脾臓を、インビトロ抗原刺激／細胞内サイトカイン免疫蛍光フローサイトメトリーアッセイを使用して、抗原特異的ＣＤ４及びＣＤ８ Ｔ細胞について収集、プール、及びアッセイした。サイトカイン（ＩＬ－２、ＩＦＮ－ｇ、ＴＮＦ－ａ、ＩＬ－５、ＩＬ－１３のうちの１つ以上）を産生するＣＤ４又はＣＤ８ Ｔ細胞％を定量化した。

【0862】

表９及び表１０に示すように、Ｈ５特異的ＣＤ８及びＣＤ４ Ｔ細胞が、それぞれ、両方の用量で、及び両方の調節エレメントにより観察された。０．０１ｍｃｇのＲＮＡは、その最大のＨ５特異的ＣＤ４の頻度を誘導するのに十分であるように見えた。

【表9】

【表10】

【0863】

表１１及び表１２に示すように、Ｎ１特異的ＣＤ８及びＣＤ４ Ｔ細胞が、それぞれ、両方の用量で、及び両方の調節エレメントにより観察された。

【表11】

【表12】

【0864】

要約すると、ｓｇｐｖ２構築物（Ｆ６０２及びＦ６３２）並びにＩＲＥＳ構築物（Ｆ５５６及びＦ５５７）の両方について、より高い頻度の抗原特異的Ｔ細胞が、目的の抗原により観察され、挿入されたｓｐｇｖ２プロモーター又はＩＲＥＳエレメントによって調節された。

【0865】

実施例９：バイシストロン性構築物中の遺伝子順序は、抗原特異的ＣＤ４ Ｔ細胞の頻度にほとんど又は全く影響を及ぼさない
ＳＧＰｖ２を使用するバイシストロン性構築物における免疫応答に対する遺伝子順序の影響を評価した。

【0866】

簡潔に述べると、以下の構築物を、前述のように調製した。
●ＮＳＰ１－４．ＳＧＰ．Ｈ５．ＳＧＰｖ２．Ｎ１（Ｆ６０２）
●ＮＳＰ１－４．ＳＧＰ．Ｎ１．ＳＧＰｖ２．Ｈ５（Ｆ６３２）
●ＮＳＰ１－４．ＳＧＰ．Ｈ３．ＳＧＰｖ２．Ｎ２（Ｆ６２９）
●ＮＳＰ１－４．ＳＧＰ．Ｎ２．ＳＧＰｖ２．Ｈ３（Ｆ７０３）
●ＮＳＰ１－４．ＳＧＰ．Ｈｙａｍ．ＳＧＰｖ２．Ｎｙａｍ（Ｆ６３１）
●ＮＳＰ１－４．ＳＧＰ．Ｎｙａｍ．ＳＧＰｖ２．Ｈｙａｍ（Ｆ６９５）

【0867】

Ｈ５及びＮ１抗原は、Ａ／シチメンチョウ／Ｔｕｒｋｅｙ／０１／２００５に由来した。Ｈ３及びＮ２抗原は、Ａ／Ｄｅｌａｗａｒｅ／３９／２０１９に由来した。Ｈｙａｍ及びＮｙａｍ［Ｂ／Ｙａｍａｇａｔａ］は、Ｂ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／ＩＮＦＴＴ １６ ０６１０／１６（Ｂｙ）に由来した。

【0868】

これらの構築物を、天然ＳＧＰの制御下の単シストロン性Ｎ１及びＨ５構築物と比較した。

【0869】

簡潔に述べると、ＢＡＬＢ／ｃマウスを、２回（０日目及び２１日目）ワクチン接種し、４２日目（２回目のワクチン接種後３週間）に安楽死させた。脾臓を、インビトロ抗原刺激／細胞内サイトカイン免疫蛍光フローサイトメトリーアッセイを使用して、抗原特異的ＣＤ４及びＣＤ８ Ｔ細胞について収集、プール、及びアッセイした。サイトカイン（ＩＬ－２、ＩＦＮ－ｇ、ＴＮＦ－ａ、ＩＬ－５、ＩＬ－１３のうちの１つ以上）を産生するＣＤ４又はＣＤ８ Ｔ細胞％を定量化した。中和（Ｎｅｕｒａｌｉｓａｔｉｏｎ）及び抗原特異的ＥＬＩＳＡも行った。

【0870】

図１０Ａに示すように、ｓａ－ｍＲＮＡによる免疫化は、主にＴｈ０又はＴｈ１応答を誘導した。混合された応答は、ほとんど又は全くなかった。免疫化は、相同抗原に対する応答を誘導したが、異種抗原に対する応答を誘導しなかった。両方の用量（すなわち、１μｇ及び０．０１μｇ）が、同様のＣＤ４応答を誘導した。

【0871】

図１０Ｂに示すように、ｓａ－ｍＲＮＡベクターは、Ｈ３Ｎ２を除いて、マッチした抗原に対するＣＤ８応答を誘導した。

【0872】

図１０Ｃ及びＤに示すように、ＮＡ－ＨＡ遺伝子の順序は、Ｈ５に対するより高い頻度のＣＤ４応答、並びにＨ５、Ｎ１、及びＢ／Ｙａｍａｇａｔａに対するより高い頻度のＣＤ８応答をもたらした。

【0873】

抗ＨＡ ＩｇＧ ＥＬＩＳＡ、赤血球凝集阻害（ＨＡＩ）アッセイ、疑似ウイルスマイクロ中和アッセイ、及び抗ＮＡ阻害アッセイにおいて、全ての構築物における血清学も評価した。全ての構築物は、全てのアッセイにおいて血清抗体応答を誘導した。

【図1】

【図2-1】

【図2-2】

【図2-3】

【図3-1】

【図3-2】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10-1】

【図10-2】

【配列表】

2023551982000001.app

【国際調査報告】