(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-12-13
(54)【発明の名称】血管新生を同定又は予測に使用するためのマーカー
(51)【国際特許分類】
A61B 3/10 20060101AFI20231206BHJP
A61B 3/14 20060101ALI20231206BHJP
A61B 5/00 20060101ALI20231206BHJP
【ＦＩ】
A61B3/10 100
A61B3/14
A61B3/10 300
A61B5/00 B
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023534696
(86)(22)【出願日】2021-12-03
(85)【翻訳文提出日】2023-08-01
(86)【国際出願番号】 EP2021084119
(87)【国際公開番号】W WO2022117791
(87)【国際公開日】2022-06-09
(31)【優先権主張番号】2019109.4
(32)【優先日】2020-12-03
(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＷＩＮＤＯＷＳ
２．ＰＹＴＨＯＮ
(71)【出願人】
【識別番号】523209287
【氏名又は名称】ノヴァイ リミテッド
【氏名又は名称原語表記】ＮＯＶＡＩ ＬＴＤ
(74)【代理人】
【識別番号】100121728
【弁理士】
【氏名又は名称】井関 勝守
(74)【代理人】
【識別番号】100165803
【弁理士】
【氏名又は名称】金子 修平
(72)【発明者】
【氏名】コーデイロ，マリア フランチェスカ
(72)【発明者】
【氏名】マディソン，ジョン
【テーマコード（参考）】
4C117
4C316
【Ｆターム（参考）】
4C117XB01
4C117XB09
4C117XD06
4C117XD07
4C117XE05
4C117XE43
4C117XE44
4C117XE45
4C117XR07
4C117XR08
4C117XR10
4C316AA09
4C316AA10
4C316AB02
4C316AB11
4C316AB12
4C316AB16
(57)【要約】
本発明は、対象における血管新生を同定又は予測するのに使用するための標識された細胞ストレスマーカーを提供する。また、対象の血管新生を同定又は予測する方法であって、対象が標識された細胞ストレスマーカーを投与された方法も提供される。本方法は、（ａ）第１の撮像装置を用いて対象から画像を生成するステップと、（ｂ）画像内の標識された細胞ストレスマーカー陽性細胞を同定するステップとを含む。標識された細胞ストレスマーカー陽性細胞が画像内で同定された場合、血管新生が同定又は予測される。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
対象の血管新生を同定又は予測するための使用のための標識された細胞ストレスマーカー。
【請求項2】
前記細胞ストレスマーカーは、アネキシン又はその断片若しくは変異体である、請求項１に記載の使用のための標識された細胞ストレスマーカー。
【請求項3】
前記細胞ストレスマーカーは、アネキシン５、１１、２又は６である、請求項２に記載の使用のための標識された細胞ストレスマーカー。
【請求項4】
前記標識は、蛍光性である、請求項１～３のいずれか１項に記載の使用のための標識された細胞ストレスマーカー。
【請求項5】
前記蛍光標識は、赤外線スペクトルの波長を有する、請求項４に記載の使用のための標識された細胞ストレスマーカー。
【請求項6】
前記蛍光標識は、Ｄ－７７６である、請求項４又は５に記載の使用のための標識された細胞ストレスマーカー。
【請求項7】
前記血管新生は、生理的、治療的又は病的血管新生である、請求項１～６のいずれか１項に記載の使用のための標識された細胞ストレスマーカー。
【請求項8】
前記生理的血管新生は、前記対象による以前の運動に関連する、請求項７に記載の使用のための標識された細胞ストレスマーカー。
【請求項9】
前記治療的血管新生は、創傷治癒及び／又は組織工学的足場の統合に関連する、請求項７に記載の使用のための標識された細胞ストレスマーカー。
【請求項10】
前記病的血管新生は、疾患、疾患の段階、疾患の重症度に関連する又は疾患の発症を予測する、請求項７に記載の使用のための標識された細胞ストレスマーカー。
【請求項11】
前記病的血管新生は、疾患の発症を予測する、請求項１０に記載の使用のための標識された細胞ストレスマーカー。
【請求項12】
前記疾患は、癌、自己免疫疾患、心血管疾患、アレルギー疾患、鎌状赤血球疾患及び／又は眼疾患を含む、請求項１０又は１１に記載の使用のための標識された細胞ストレスマーカー。
【請求項13】
前記疾患は、眼疾患を含む、請求項１２に記載の使用のための標識された細胞ストレスマーカー。
【請求項14】
前記眼疾患は、加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）、任意でウェット型ＡＭＤを含む、請求項１３に記載の使用のための標識された細胞ストレスマーカー。
【請求項15】
対象の血管新生を同定又は予測する方法であって、前記対象は、標識された細胞ストレスマーカーを投与され、以下のステップを含む、方法：（ａ）第１の撮像装置を用いて、前記対象から画像を生成するステップ；
（ｂ）前記画像内の標識された細胞ストレスマーカー陽性細胞を同定するステップ；
前記標識された細胞ストレスマーカー陽性細胞が前記画像内に確認された場合、血管新生が同定又は予測される。
【請求項16】
前記細胞ストレスマーカーは、アネキシン又はその断片若しくは変異体である、請求項１５に記載の方法。
【請求項17】
前記細胞ストレスマーカーは、アネキシン５、１１、２又は６である、請求項１６に記載の方法。
【請求項18】
前記標識は、蛍光性である、請求項１５～１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項19】
前記蛍光標識は、赤外線スペクトルの波長を有する、請求項１８に記載の方法。
【請求項20】
前記蛍光標識は、Ｄ－７７６である、請求項１８又は１９に記載の方法。
【請求項21】
前記血管新生は、生理的、治療的又は病的血管新生である、請求項１５～２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項22】
前記生理的血管新生は、前記対象による以前の運動と関連する、請求項２１に記載の方法。
【請求項23】
前記治療的血管新生は、創傷治癒及び／又は組織工学的足場の統合に関連する、請求項２１に記載の方法。
【請求項24】
前記病的血管新生は、疾患、疾患の段階に関連する又は疾患の発症若しくは疾患の重症度を予測する、請求項２０に記載の方法。
【請求項25】
前記病的血管新生は、疾患の発症を予測する、請求項２４に記載の方法。
【請求項26】
前記疾患は、癌、自己免疫疾患、心血管疾患、アレルギー疾患、鎌状赤血球疾患及び／又は眼疾患を含む、請求項２４又は２５に記載の方法。
【請求項27】
前記疾患は、眼疾患を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項28】
前記眼疾患は、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、任意でウェット型ＡＭＤを含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項29】
同定された疾患、疾患の段階、疾患の重症度又は予測される疾患に適切な治療を投与することをさらに含む、請求項２４～２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項30】
前記標識された細胞ストレスマーカーは、静脈内、鼻腔内又は局所に投与された、請求項１５～２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項31】
前記標識された細胞ストレスマーカー陽性細胞を同定することは、前記画像内の前記標識された細胞ストレスマーカー陽性細胞の数を数えることを含む、請求項１５～３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項32】
前記標識された細胞ストレスマーカー陽性細胞の同定は、コンピュータで実施されている、請求項３１に記載の方法。
【請求項33】
前記対象における前記標識された細胞ストレスマーカー陽性細胞の位置を決定することをさらに含む、請求項３１又は３２に記載の方法。
【請求項34】
前記位置は、第２の撮像装置を用いて得られた別の画像を用いて決定されている、請求項３３に記載の方法。
【請求項35】
前記第２の撮像装置は、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）スキャナ、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）スキャナ、ポジトロン断層法（ＰＥＴ）スキャナ、偏光子、反射型イメージスキャナ、眼底カメラ及び／又はＯＣＴスキャナを含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項36】
前記第２の撮像装置は、ＯＣＴスキャナを含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項37】
前記第１の撮像装置は、共焦点スキャナレーザー顕微鏡、任意で共焦点走査型レーザー検眼鏡（ｃＳＬＯ）を含む、請求項１５～３６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項38】
眼ではない対象の身体部分におけるアポトーシスを同定するために使用する、標識されたアポトーシスマーカー。
【請求項39】
前記身体部分は、中枢神経系ではない、請求項３８に記載の標識されたアポトーシスマーカー。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、対象における血管新生を同定又は予測に使用するための標識された細胞ストレスマーカーに関するものである。本発明はまた、対象における血管新生を同定又は予測する方法に関する。
【背景技術】
【0002】
血管新生は、癌、アレルギー疾患、自己免疫疾患、及び加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、特にウェット型ＡＭＤなどの眼疾患に関連する重要な病態である。ウェット型ＡＭＤは視力低下の主な原因であり、英国では６５歳以上の方の２．５％が罹患している。これは、英国の８０歳以上の高齢者では６．３％に上る。
【0003】
現在、ウェット型ＡＭＤの診断には、網膜を撮影して異常な血管の発生を評価することが必要である。しかしながら、ウェット型ＡＭＤは無症状で急速に進行するため、診断や治療が遅すぎて効果が得られないことも少なくない。これは、重大な疾病につながり得る。
【0004】
ウェット型ＡＭＤを発症するリスクのある対象を特定し、早期に治療が行われ得るようにする必要がある。本発明は、このような問題やその他の問題に対処しようとするものである。
【発明の概要】
【0005】
本発明の第１の様態によれば、対象における血管新生を同定又は予測に使用するための標識された細胞ストレスマーカーが提供される。
【0006】
本明細書で使用する場合、「細胞ストレスマーカー」という用語は、細胞ストレスを受けている細胞を同定するマーカーを指す。したがって、マーカーは、ストレスを受けた細胞に特異的に結合する化合物又は分子として知られていてもよい。細胞ストレスは、最終的にアポトーシスを受けている細胞を予測するものであってもよい。いくつかの実施形態では、細胞ストレスマーカーは、アポトーシス細胞を標識することもできる（すなわち、マーカーは、アポトーシス細胞だけでなく、細胞ストレスを受けている細胞を標識することができる）。したがって、実施形態では、細胞ストレスマーカーは、本明細書において「アポトーシスマーカー」と称されてもよい。
【0007】
本明細書で使用する場合、「アポトーシスマーカー」という用語は、アポトーシスを起こしている細胞を生細胞と区別することができるマーカーを指す。このマーカーはまた、アポトーシス細胞を壊死細胞から区別することができてもよい。したがって、マーカーは、アポトーシス細胞に特異的に結合する化合物又は分子として知られてもよい。
【0008】
細胞ストレスマーカーは、ストレスを受けた細胞膜を同定するマーカーを含む又はからなってもよい。
【0009】
「血管新生」という用語は、既存の血管系から新しい血管が成長することを指す、当該技術分野で既知の用語である。有利なことに、本発明者らは、標識された細胞ストレスマーカーを用いて、ストレスを受けた細胞を単一細胞レベルで同定し、血管新生を予測又は同定し得ることを発見した。いくつかの実施形態では、血管新生は、初期段階の血管新生である。血管新生を初期段階で同定する、又は血管新生の発生を予測することにより、初期段階で血管新生の抑制又は促進を臨床的に目標とし、対象にとって最大の効果を保証し得る。
【0010】
「血管新生を予測する」とは、例えば血管新生が起こる前に、血管新生の発生を予測することを指すと理解されてもよい。これにより、予期せぬ初期段階での臨床介入が可能となる。その結果、例えばウェット型ＡＭＤにおける視力低下などの症状の急速な進行を防ぐ。
【0011】
細胞ストレスマーカーが血管新生を同定又は予測し得ることは全く予想外であった。なぜなら、血管新生は、細胞ストレス及び／又はアポトーシスではなく、新しい細胞の増殖に関係するからである。
【0012】
いくつかの実施形態では、細胞ストレスマーカーは、アネキシン又はその断片又は変異体である。タンパク質のアネキシンファミリーは、アポトーシスマーカーとして知られている。アネキシンは、陽イオンの存在下で細胞膜に可逆的に結合するタンパク質である。本発明で有用なアネキシンは、天然であってもよいし、組換えであってもよい。
【0013】
「断片」とは、アネキシン全体の機能活性を実質的に保持するアネキシンの切断バージョンを指すと理解されるであろう。「実質的に保持する」とは、アネキシン全体の少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の機能活性を指すと理解されるであろう。アネキシンの変異体は、野生型アネキシンに対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有するように、野生型アネキシンと異なるアミノ酸配列を有するタンパク質を指すと理解されるであろう。アネキシンの変異体は、野生型アネキシンの機能活性を実質的に保持することになる。
【0014】
アネキシンは、アネキシン５、１１、２又は６であってもよい。いくつかの実施形態では、アネキシンはアネキシン５である。別の実施形態では、アネキシンはアネキシン１２８である（Ｔａｉｔら、２００５）。アネキシン１２８は、アネキシン５の変異体であり、２つの単一アミノ酸変異によって野生型アネキシン５とは異なる。アネキシン１２８には、Ｎ末端に露出したチオール基が含まれており、蛍光標識などの分子タグの結合効率が向上する。
【0015】
理論にとらわれることなく、本発明者らは、アネキシンが結合可能なホスファチジルセリンがストレスを受けた内皮細胞で露出されると考えている。したがって、例えばアネキシンの結合によるホスファチジルセリンの同定は、細胞ストレスを示し得る。本発明者らは、驚くべきことに、細胞膜上のホスファチジルセリンの露出が初期段階の血管新生のその後の進行を示し得ることを発見した。
【0016】
例えば、シナプトタグミン－ＩのＣ２Ａドメイン、デュラマイシン、ＷＣ－１１－８９などの非ペプチド系イサチンスルホンアミド類似体及びＮＳＴ－７３２、ＤＤＣ並びにＭＬ－１０（Ｓａｉｎｔ Ｈｕｂｅｒｔら、２００９）などのＡｐｏＳｅｎｓｅを含む他のアポトーシスマーカーが当該技術分野で知られている。このようなアポトーシスマーカーは、本発明の細胞ストレスマーカーとして使用するのに適している。
【0017】
細胞ストレスマーカーの標識は、可視であってもよい。例示的な可視標識としては、量子ドット、ナノスフェア及び／又はナノロッドを含んでもよいが、必ずしもこれらに限定されない。他の可視標識は、当業者に既知であろう。
【0018】
標識は、蛍光性であってもよい。蛍光標識は、励起に応答して光を放出する化合物又は分子（蛍光色素分子など）を指し、光毒性の影響を避けるために露光安全基準を遵守しながら、信号対雑音比が向上し、それによって画像解像度及び感度が向上するため、使用するために選択され得る。蛍光標識は、投与時にほとんど又は全く炎症を引き起こさないことが好ましい。蛍光標識は、赤外又は近赤外スペクトルの波長を有してもよい。蛍光標識は、約４００ｎｍ～約１０００ｎｍ、好ましくは約５００ｎｍ～約９００ｎｍ、より好ましくは約７００ｎｍ～約９００ｎｍの発光波長を有してもよい。
【0019】
好適な蛍光標識としては、フルオレセインナトリウム、インドシアニングリーン（ＩＣＧ）、クルクミン、ＩＲＤｙｅ７００、Ｄｙ－７７６（これ以外の場合はＤ－７７６と呼ぶことがある）、Ｄｙ－４８８及びＤｙ－７８１の１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、蛍光標識はＤ－７７６である。
【0020】
標識された細胞ストレスマーカーは、標識、例えば蛍光標識をマーカー化合物に結合させるための標準的な技術を用いて調製されてもよい。このような標識は、Ｄｙｏｍｉｃｓのような周知の供給源から入手してもよい。標識とマーカーを結合させるための適切な技術は、当該技術分野で知られており、標識の製造業者によって提供されてもよい。
【0021】
血管新生（任意に初期段階の血管新生）は、正常な成長及び発達と同様に、疾患などの病的な状態に関連し得ることが理解されるであろう。したがって、血管新生は、生理的、治療的又は病的血管新生であってもよい。本発明の文脈では、生理的血管新生は、対象における正常な成長及び治癒に関連する血管新生を指すと理解されるであろう。例えば、血管新生は、運動、特に高地での持久運動、例えば山登りによって誘発されることが以前から示されている。したがって、生理的血管新生は、対象による以前の運動と関連する可能性がある。治療的血管新生は、創傷治癒及び／又は組織工学的足場の統合に関連する可能性がある。
【0022】
いくつかの実施形態では、血管新生は、病的血管新生である。病的血管新生とは、疾患に関連する又は関与する血管新生であると理解されるであろう。病的血管新生は、疾患、疾患の段階、疾患の重症度及び／又は疾患発症の予測に関連してもよい。
【0023】
細胞ストレスマーカーは、病的血管新生の同定又は予測に使用するためのものであってもよい。細胞ストレスマーカーによる病的血管新生の同定又は予測は、特定の疾患、疾患の段階及び／又は疾患の重症度を予測又は同定してもよい。有利には、特定の疾患、疾患の段階及び／又は疾患の重症度を予測する能力、又は特定の疾患を初期段階で同定する能力は、最も適した治療コースを選択、投与及び任意にモニターすることを可能にする。
【0024】
疾患の文脈において、本明細書で使用される「予測する」という用語は、疾患、疾患の段階及び／又は疾患の重症度の進行、発症前、又は対象が無症状であり、かつ／若しくは疾患が他の方法では特定されないような疾患の初期段階において予測することを指すと理解されてもよい。初期段階の血管新生が同定される実施形態では、これは、初期段階で疾患を同定するために使用されてもよい。例えば、初期段階の血管新生は、対象に疾患の他の症状がない場合、又は対象が疾患の限定的又は軽微な症状しか有していない場合であって、他の方法では診断が困難又は不可能な疾患の初期段階にあるような場合に同定されてもよい。これは、臨床医が初期段階で治療法を選択し投与することを可能にし、それによって病気の不必要な進行を潜在的に回避するのに有用である。
【0025】
疾患は、血管新生に関連する任意の疾患を含んでいてもよい。例えば、疾患は、抗ＶＥＧＦが治療として投与され得る任意の疾患を含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、疾患は、癌、自己免疫疾患、心血管疾患、アレルギー疾患、鎌状赤血球症及び／又は眼疾患を含む。いくつかの疾患は、例えば、眼疾患及び自己免疫疾患（糖尿病性網膜症など）であってもよいことが理解されるであろう。
【0026】
いくつかの実施形態では、血管新生は、心血管疾患と関連している。他の実施形態では、血管新生は、心血管疾患の効果的な治療（すなわち、治療的血管新生）と関連している。血管新生に関連する心血管疾患の例は、静脈閉塞、例えば、脳卒中を含む。
【0027】
様々な自己免疫疾患は、当業者によく知られている。それらには、サルコイドーシス、関節リウマチ、多発性硬化症（ＭＳ）、乾癬、糖尿病（特にＩ型糖尿病）、潰瘍性大腸炎、全身性エリテマトーデス（ループス）、ギランバレー症候群、慢性炎症性脱髄性多発神経障害、バセドウ病、橋本甲状腺炎、重症筋無力症、自己免疫性脳炎、視神経脊髄炎及び抗ミエリンオリゴデンドロサイト糖蛋白抗体病（ＭＯＧ）が含まれるが、これらに限定されない。
【0028】
いくつかの実施形態では、自己免疫疾患は、中枢神経系（ＣＮＳ）自己免疫疾患である。例示的なＣＮＳ自己免疫疾患には、神経サルコイドーシス、ＭＳ、視神経脊髄炎及び抗ミエリンオリゴデンドロサイト糖蛋白抗体病（ＭＯＧ）が含まれるが、これらに限定されない。
【0029】
アレルギー疾患は、鼻炎、喘息及び／又は花粉症を含む又はからなってもよい。典型的には、アレルギー疾患は、慢性アレルギー疾患である。慢性アレルギー疾患は、血管新生と関連し得ることがわかっている。「慢性アレルギー疾患」とは、長期的かつ再発するアレルギー疾患を指すと理解されるであろう。長期的とは、少なくとも６ヶ月、少なくとも１年、少なくとも２年、少なくとも５年、少なくとも１０年又は少なくとも２０年持続する及び／又は再発する状態を指してもよい。
【0030】
いくつかの実施形態では、疾患は、眼疾患を含む。眼疾患には、網膜静脈閉塞症、糖尿病性網膜症、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、視神経炎及び眼血管疾患が含まれるが、必ずしもこれらに限定されない。いくつかの実施形態では、眼疾患は、眼神経変性疾患を含む。「眼神経変性疾患」という用語は、当業者にはよく知られており、眼神経細胞の徐々に進行して失われることによって起こる疾患を指す。それらには、ＡＭＤ、視神経炎及び糖尿病性網膜症が含まれるが、これらに限定されない。神経変性疾患には、例えば、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病及びフリードライヒ失調症が含まれる。
【0031】
いくつかの実施形態では、眼疾患は、糖尿病性網膜若しくはＡＭＤを含む又はからなる。
【0032】
いくつかの実施形態では、眼疾患は、ＡＭＤを含む又はからなる。任意で、眼疾患はウェット型ＡＭＤを含む又はからなる。本発明者らは、驚くべきことに、標識された細胞ストレスマーカーを用いて対象における血管新生を同定又は予測し得、血管新生の同定又は予測がウェット型ＡＭＤの予測マーカーであることを発見した。これにより、臨床医は対象がウェット型ＡＭＤを発症するかどうかを予測し得る。ウェット型ＡＭＤの症状は非常に早く進行し、永久的な視力喪失につながり得る。したがって、そのような予測は、臨床医が初期段階で対象に治療を施すことを可能にし、それによって視力の喪失を軽減し、いくつかの実施形態では視力の喪失を回避するのに特に有益である。
【0033】
いくつかの実施形態では、対象は哺乳類である。例えば、対象は、ラット、マウス、ヒト、ウサギ、ウマ、イヌ、ネコ、ウシ又はヒツジであってよい。いくつかの実施形態では、対象は、マウス、ラット、ヒト及びウサギから選択される。いくつかの実施形態では、対象はヒトである。
【0034】
本発明の第２の様態によれば、対象における血管新生を同定又は予測するための、標識された細胞ストレスマーカーの使用が提供される。血管新生は、生理的血管新生又は治療的血管新生であってもよく、好ましくは、本明細書に記載されるような生理的血管新生である。
【0035】
本発明の第３の様態によれば、以下のステップを含む、対象における血管新生を同定又は予測する方法であって、前記対象は標識された細胞ストレスマーカーを投与される、方法が提供される：
（ａ）第１の撮像装置を用いて、前記対象から第１の画像を生成するステップ；
（ｂ）前記画像内の標識された細胞ストレスマーカー陽性細胞を同定するステップ；
ここで、標識された細胞ストレスマーカー陽性細胞が前記画像内で同定された場合、血管新生が同定又は予測される。
（ａ）第１の撮像装置を用いて、前記対象から第１の画像を生成するステップ；
（ｂ）前記画像内の標識された細胞ストレスマーカー陽性細胞を同定するステップ；
ここで、標識された細胞ストレスマーカー陽性細胞が前記画像内で同定された場合、血管新生が同定又は予測される。
【0036】
本発明の更なる様態では、以下のステップを含む、対象における血管新生を同定又は予測する方法が提供される：
（ａ）標識された細胞ストレスマーカーを対象に投与するステップ；
（ｂ）撮像装置を用いて、前記対象から画像を生成するステップ；
（ｃ）前記画像内の標識された細胞ストレスマーカー陽性細胞を同定するステップ；
ここで、標識された細胞ストレスマーカー陽性細胞が前記画像内で同定された場合、血管新生が同定又は予測される。
（ａ）標識された細胞ストレスマーカーを対象に投与するステップ；
（ｂ）撮像装置を用いて、前記対象から画像を生成するステップ；
（ｃ）前記画像内の標識された細胞ストレスマーカー陽性細胞を同定するステップ；
ここで、標識された細胞ストレスマーカー陽性細胞が前記画像内で同定された場合、血管新生が同定又は予測される。
【0037】
本発明者らは、標識された細胞ストレスマーカーを用いて、単一細胞レベルで細胞ストレスを標識化し得ることを発見した。単一細胞レベルでの細胞ストレスの同定は、有利には、その後の血管新生の発生を予測し、及び／又は血管新生の初期段階での検出を可能にし、それによって、他の又は更なる症状が発生する前に、疾患の予測又は同定を可能にする。
【0038】
標識された細胞ストレスマーカーの投与は、静脈内、鼻腔内、局所又は硝子体内であってもよい。局所とは、対象の表面、例えば、皮膚又は眼の表面への適用を指すと理解されるであろう。いくつかの実施形態では、標識された細胞ストレスマーカーは静脈内に投与される。他の実施形態では、標識された細胞ストレスマーカーは硝子体内に投与される。
【0039】
いくつかの実施形態では、本方法は、血管新生又は予測される血管新生に基づいて特定される疾患、疾患の段階、疾患の重症度又は予測される疾患に対して適切な治療法を施すことをさらに含む。適切な治療は、抗血管新生薬（すなわち、血管新生を抑制する治療）、例えば抗ＶＥＧＦ化合物を含む又はからなってもよい。例示的な抗血管新生薬としては、アキシチニブ、ベバシズマブ、ラニビズマブ、カボザンチニブ、エベロリムス、レナリドミド、パゾパニブ、ラムシルマブ、レゴラフェニブ、ソラフェニブ、スニチニブ、サロミド、バンデタニブ及びアフリベルセプトを含んでもよいが、必ずしもそれらに限定されるわけではない。適切な治療薬の投与は、静脈内、鼻腔内、局所又は硝子体内であってもよい。
【0040】
いくつかの実施形態では、標識された細胞ストレスマーカー陽性細胞を同定することは、画像内の標識された細胞ストレスマーカー陽性細胞の数を数えることを含む。有利には、このステップは繰り返す必要がない。言い換えれば、本発明者らは驚くべきことに、血管新生を同定する又はその後の発生を予測するために必要な同定ステップが１回だけであることを発見したため、標識された細胞ストレスマーカー陽性細胞を同定するステップは、１回だけ行う必要がある。したがって、本発明の方法は、特に迅速、正確かつ費用対効果に優れている。
【0041】
いくつかの実施形態では、標識された細胞ストレスマーカー陽性細胞を同定することは、対象における標識された細胞ストレスマーカー陽性細胞の位置を決定することを含む。これは、画像内に示される標識された細胞ストレスマーカー陽性細胞の解剖学的位置を決定することを含んでもよい。上述したように、本発明の細胞ストレスマーカーは、ストレスを受けている細胞とアポトーシス細胞の両方を標識してもよい。したがって、アポトーシス細胞とストレスを受けた細胞とを区別することが望ましくてもよい。本発明者らは、これを達成する方法の一つとして、標識された細胞の位置を調べ、血管新生が起こりそうな場所、例えば血管の近くにあるか、又は血管新生が起こりそうにない場所、例えば網膜の光受容層にあるかを検討することを確認した。したがって、本発明の方法は、細胞ストレスマーカー陽性細胞の位置を決定するステップをさらに含んでもよく、その位置はその細胞が血管新生に関与しているかアポトーシスであるかを示している。これにより、医者はアポトーシス陽性細胞からの偽陽性を減らすことができるため、血管新生の同定及び／又は予測が特に正確になることを保証する。細胞ストレスマーカー陽性細胞の位置を決定するステップは、血管などの解剖学的構造又は組織タイプに対する細胞の位置を特定することを含んでもよい。
【0042】
位置を決定するステップは、生成された第１の画像上の細胞の位置を特定することを含んでもよい。又は、第２の画像、特に異なる様態から細胞を示す画像、又は第１の画像では見えない組織若しくは他の構造を示す画像内で細胞の位置を特定することを含んでもよい。任意で、本方法は、複数の平面における標識された細胞ストレスマーカー陽性細胞の位置を決定することを含む。例えば、標識された細胞ストレスマーカー陽性細胞の位置は、例えば２Ｄ画像において、ｘ軸及びｙ軸にわたって決定されてもよい。標識された細胞ストレスマーカー陽性細胞の位置は、ｘ軸、ｙ軸及びｚ軸にわたって決定されてもよい。いくつかの実施形態では、細胞の位置は、複数の画像から特定されてもよい。例えば、細胞の位置は、少なくとも第２及び第３の画像を用いて特定されてもよい。複数の画像の各々は、類似又は同一の基準フレームを用いて撮影され、複数の画像が得られた後、それらを重ね合わせてｘ、ｙ及びｚ軸を形成し得る。言い換えれば、３Ｄ画像を形成することである。３Ｄ画像は、細胞の位置を特定するために使用され得る。
【0043】
本方法は、例えば、同じ又は異なる撮像装置を用いて対象の第２の画像を生成するステップと、任意に、その画像を第１の画像と比較するステップとを含んでもよい。本方法が１つ以上の画像を比較することを含む場合、一方の画像を他方の画像に重ねて表示することが好ましい。本方法は、そのようにするステップを含んでいてもよい。また、各画像に示された細胞ストレスマーカー陽性細胞を正しく一致させるために、画像登録、すなわち画像を位置合わせするステップを含んでもよい。
【0044】
本方法が２つ以上の画像の使用を含む場合、それらの画像は、同じ又は異なる撮像装置を用いて得られてもよい。例えば、第１の撮像装置は、共焦点スキャナレーザー顕微鏡を含む又はからなってもよい。共焦点スキャナレーザー顕微鏡の一例としては、共焦点走査型レーザー検眼鏡（ｃＳＬＯ）がある。
【0045】
いくつかの実施形態では、複数の画像を取得するために、第１及び第２の撮像装置が使用される。第２の撮像装置は、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）スキャナ、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）スキャナ、ポジトロン断層法（ＰＥＴ）スキャナ、偏光子、反射型イメージスキャナ、眼底カメラ及び／又はＯＣＴスキャナを含む又はからなってもよい。好ましくは、第２の撮像装置は、第１の撮像装置と異なる装置である。
【0046】
いくつかの実施形態では、第２の撮像装置は、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）スキャナ、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）スキャナ、ポジトロン断層法（ＰＥＴ）スキャナ及び／又はＯＣＴスキャナを含む又はからなる。
【0047】
いくつかの実施形態では、第２の撮像装置は、ＯＣＴスキャナを含む又はからなる。
【0048】
いくつかの実施形態では、複数の画像を取得するために、第１、第２及び第３の撮像装置が使用される。第３の撮像装置は、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）スキャナ、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）スキャナ、ポジトロン断層法（ＰＥＴ）スキャナ、偏光子、反射型イメージスキャナ、眼底カメラ及び／又はＯＣＴスキャナを含む又からなってもよい。好ましくは、第３の撮像装置は、第１及び第２の撮像装置と異なる装置である。
【0049】
第１の撮像装置は、２Ｄ又は３Ｄ画像を取得するために使用されてもよい。任意に、第１の撮像装置は、２Ｄ画像を取得するために使用される。第２の撮像装置は、２Ｄ又は３Ｄ画像を取得するために使用されてもよい。第２の撮像装置は、３Ｄ画像を取得するために使用されてもよい。いくつかの実施形態では、第２又は第３の撮像装置は、マスク画像を提供するために使用される。マスク画像とは、「背景」画像、すなわち、細胞の位置を特定するために使用される画像の背景値を設定するために使用され得る画像を指すと理解されるであろう。
【0050】
いくつかの実施形態では、第３の撮像装置は、反射型イメージスキャナを含む又はからなる。
【0051】
一実施形態では、本方法は、１つ以上の血管の位置を決定することを含む。血管の位置の決定は、当該技術分野で知られている方法である血管造影法によって行われてもよい。例えば、血管の位置は、フルオレセイン血管造影（ＦＡ）、インドシアニングリーン血管造影（ＩＣＧＡ）及び／又は光干渉断層撮影（ＯＣＴ）、任意に光干渉断層血管撮影（ＯＣＴＡ）を用いて決定されてもよい。
【0052】
いくつかの実施形態では、画像内の標識された細胞ストレスマーカー陽性細胞の位置を決定することは、血管の位置に対する前記細胞の位置を決定することを含んでもよい。例えば、標識された細胞ストレスマーカー陽性細胞が血管に隣接している又は血管上にあると同定される場合、これはアポトーシスではなく細胞ストレスを同定するために使用されてもよい。これは、初期段階の血管新生又は予測されるその後の血管新生の肯定的な指標として用いてもよい。
【0053】
例えば、血管新生の同定又は予測が、対象が眼神経変性疾患を発症する可能性があるかどうかを予測するために使用される実施形態では、標識された細胞ストレスマーカー陽性細胞の位置の決定（任意に、血管の位置に対する位置を決定することをさらに含む）は、対象が緑内障ではなく、ウェット型ＡＭＤを発症するかどうかを予測するために使用されてもよい。これは、ウェット型ＡＭＤが細胞ストレスに代表されるのに対し、緑内障はアポトーシスに関連しているためである。ウェット型ＡＭＤと緑内障はいずれも深刻で進行が早く、異なる治療が必要な眼疾患であるため、これは特に有益である。症状が出る前又は病気の初期段階で２つの疾患を区別することができれば、不必要な視力喪失を避けるために、正しい治療法を選択して実施され得る。
【0054】
標識された細胞ストレスマーカー陽性細胞の同定、及び任意で画像内の標識された細胞ストレスマーカー陽性細胞の位置は、コンピュータで実施されてもよい。これは、人工ニューラルネットワークなどの識別モデルを訓練する際に使用するための訓練データを生成することを含んでもよい。人工ニューラルネットワークは、畳み込みニューラルネットワーク（ＣＮＮ）を含んでもよい。訓練データは、例えば、ウェット型ＡＭＤなどの疾患を有する（又は有さない）ことが既に知られている対象から、標識された細胞ストレスマーカー陽性細胞を含む又は含まないものとして手動で分類された対照データを含んでもよい。
【0055】
いくつかの実施形態では、識別モデルは、訓練データを用いて訓練されてもよい。これは、識別モデルの訓練に使用するための訓練データを生成するステップに加えて、又はその代わりであってもよい。一旦訓練されると、識別モデルは手動で検証されてもよい。
【0056】
訓練された識別モデル（例えば、畳み込みニューラルネットワークなど）を用いて、標識された細胞ストレスマーカー陽性細胞及び任意で標識された細胞ストレスマーカー陽性細胞の位置を識別してもよい。
【0057】
又は、標識された細胞ストレスマーカー陽性細胞の同定、及び任意で画像内の標識された細胞ストレスマーカー陽性細胞の位置は、手動で行ってもよい。
【0058】
いくつかの実施形態では、画像内の少なくとも５個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも３０個又は少なくとも４０個の標識された細胞ストレスマーカー陽性細胞の同定は、対象が疾患を発症することを予測する。いくつかの実施形態では、画像内の５個以上、１０個以上、１５個以上、２０個以上、３０個以上又は４０個以上の標識された細胞ストレスマーカー陽性細胞の同定は、対象が疾患を発症することを予測する。例えば、対象の眼の画像における少なくとも５個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも３０個又は少なくとも４０個の標識された細胞ストレスマーカー陽性細胞の同定は、対象がウェット型ＡＭＤを発症することを予測してもよい。いくつかの実施形態では、対象の眼の画像における少なくとも５個、任意で５個以上の標識された細胞ストレスマーカー陽性細胞の同定は、対象がウェット型ＡＭＤを発症することを予測する。
【0059】
有利なことに、本発明者らは、同定される標識された細胞ストレスマーカー陽性細胞の数の増加が、その後発症する疾患の重症度と相関すること、すなわち、画像内で同定される標識された細胞ストレスマーカー陽性細胞の数が多いほど、その後に発症する疾患の重症度が高くなることも発見した。したがって、いくつかの実施形態では、画像内の少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも３０個又は少なくとも４０個の標識された細胞ストレスマーカー陽性細胞の同定は、対象の疾患の重症度が増加することを予測する。これは、有利なことに、対象がより高用量の治療、より定期的な治療の投与又は全く別の治療を必要とするかどうかを決定するために使用され得る。
【0060】
いくつかの実施形態では、画像を生成するステップは、第２、第３、第４、第５又はそれ以上の追加の画像を取得するために繰り返される。画像は、対象の同じ領域、例えば対象の同じ眼の１つ以上の先行画像と比較されてもよい。画像の生成の繰り返しは、毎月、２ヶ月ごと、６ヶ月ごと、毎年又は隔年（２年に１回）であってもよい。本方法は、１つ、２つ、３つ、４つ又はそれ以上の先行画像の上に画像を重ねることを含んでもよい。対象の同じ領域の画像を経時的に比較することは、疾患の進行を監視するために使用されてもよい。又は、適切な治療が行われた実施形態では、対象の同じ領域の画像を経時的に比較することは、投与された治療の有効性を監視するために使用されてもよい。例えば、最初の画像を生成した後、対象に適切な治療を施してもよい。その後に得られる画像は、前記治療の有効性を監視するために使用され得る。
【0061】
いくつかの実施形態では、本方法は、対象が特定の疾患を発症する可能性を診断又は予測しようとするために、別の方法が既に実施されている対象に対して実施されてもよい。したがって、本方法は、別の（第１の）方法の精度を試験及び／又は改善し、第１の方法による偽陰性を確実に特定するための「第２の意見」として使用され得る。
【0062】
本発明の別の様態によれば、眼ではない対象の身体部分におけるアポトーシスを同定するのに使用する標識アポトーシスマーカーが提供される。一実施形態において、身体部分は、中枢神経系の一部ではない。身体部分は、四肢（例えば、腕又は脚）、肝臓、脾臓、心臓、１つ以上の肺、胃、小腸、大腸、腎臓、皮膚若しくは膀胱の全部又は一部であってもよい。
【0063】
本明細書の説明及び特許請求の範囲を通じて、単語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」及び「含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）」並びに単語の変形、例えば「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」は、「含むが限定されない」を意味し、他の成分、整数又はステップを除外しない。また、単数形は、文脈上別段の定めがない限り、複数形を包含する：特に、不定冠詞が使用されている場合、文脈上別段の定めがない限り、本明細書は単数だけでなく複数も想定していると理解される。
【0064】
本発明の各様態の好ましい特徴は、他の様態のいずれかに関連して説明される通りであってもよい。本出願の範囲内において、前の段落、特許請求の範囲及び／又は以下の説明及び図面に記載された様々な様態、実施形態、実施例及び代替案、特にその個々の特徴は、独立して又は任意の組み合わせで取り得ることが明示的に意図されている。すなわち、すべての実施形態及び／又は任意の実施形態の特徴は、そのような特徴が互換性のないものでない限り、任意の方法及び／又は組み合わせで組み合わせ得る。
【0065】
次に、本発明の１つ又は複数の実施形態が、添付の図面を参照して、例示的にのみ説明される。
【図面の簡単な説明】
【0066】
【図1】ＤＡＲＣ ＣＮＮシステムがＯＣＴにおいて新たな網膜下液（ウェット型ＡＭＤ）を予測することを示す。位置合わせアプリケーション：各眼について、反射型ＯＣＴローカリゼーションマップ（Ａ）は、共焦点走査型レーザー検眼鏡（ｃＳＬＯ）で撮影したベースラインの自家蛍光画像（Ｂ）及びＯＣＴスキャン（Ｃ）に、を位置合わせされ、連続スキャンでＯＣＴ領域を定義する自動ランドマーク（塗りつぶされた白丸）とフィデューシャルマーカー（黄色と青色の十字、Ａ、Ｂ）を手動で配置する特注アプリケーションを使用した。ＤＡＲＣ画像（Ｄ）は、Ａｎｘ７７６をｃＳＬＯで静注した２４０分後に撮影され、ベースラインの自家蛍光画像（Ｂ）と自動的に位置合わせされ、ＯＣＴ画像（Ａ、Ｃ）とも位置合わせされている。ＤＡＲＣ画像に対応する点は、シアン色の垂直線を用いてＯＣＴスキャン（Ｃ）内で特定し得、その垂直位置におけるＯＣＴ画像内のすべての断面構造を同定することができる。したがって、この例では、ベースライン時に、シアン色で囲まれた黄色のＤＡＲＣスポット（Ｄ）の位置は、ベースラインＯＣＴスキャン（Ｃ）のすべての網膜層におけるｘ，ｙ座標で記録され得る。これはすべてのＤＡＲＣスポットに対して行われ得、対応する点はすべての経過観察ＯＣＴスキャンに配置される。ＤＡＲＣスポットの位置特定：ＤＡＲＣスポットは、既に説明したＣＮＮ支援アルゴリズム（Ｌｉｎｄｅｋｌｅｉｖら（２０１３））を使用して自動的に検出される。シアン色で囲まれた黄色のＤＡＲＣスポット（Ｄ）は、ベースライン（Ｃ）上に位置し、３６ヶ月後の経過観察ＯＣＴスキャン（Ｅ）に位置合わせされている。新しい網膜下液（ＳＲＦ）の存在はＳＲＦ ＣＮＮによって自動的に同定され、３６ヶ月後の注釈付き画像に輪郭が描かれている（紫色の領域、Ｆ）。これは、シアン色で囲まれた黄色のＤＡＲＣスポット（Ｄ）が３６ヶ月後の新しいＳＲＦを予測することを示している（Ｅ、Ｆ）。ユニークなＤＡＲＣスポット予測：ベースライン時に観察された個々のＤＡＲＣスポットは、経過観察時に実行された一連のＯＣＴスキャンとの関連で評価され得る。ＳＲＦ（Ｄ）に関連するユニークなＤＡＲＣスポットは、異なる時点を表す異なる色で囲まれている：１２～１８ヶ月（赤色、Ｄ、Ｇ）、１８～２４ヶ月（薄緑色、Ｄ、Ｌ）、２４～３０ヶ月（紫色、Ｄ、Ｑ）、３０～３６ヶ月（黄色、Ｄ）。これらは、経過観察時のＯＣＴスキャン（Ｈ、Ｍ、Ｒ）とベースライン時（Ｊ、Ｏ、Ｔ）に対応するＯＣＴスキャンで示されており、ＳＲＦ ＣＮＮは、ベースライン時（Ｋ、Ｐ、Ｕ）と比較して、新たに形成されたＳＲＦ領域（Ｉ、Ｎ、Ｓ）を同じ色分けで注釈付きで示している。各ＯＣＴスキャンのシアン色の線は、示されたＤＡＲＣスポット（白色矢印；Ｇ、Ｌ、Ｑ）を通る垂直断面を強調している。
【図2】ＣＮＮ ＤＡＲＣカウント＞５が、３６ヶ月以上のＯＣＴにおいてＳＲＦ（ウェット型ＡＭＤ）の発症リスクと関連していることを示す。（Ａ）ＣＮＮ ＤＡＲＣカウント＞５（赤色）又は≦５（青色）でグループ分けし、３６ヶ月間にＳＲＦを発症しなかった（ウェット型ＡＭＤを発症しなかった）眼の割合を示すプロットである。ＣＮＮ ＤＡＲＣカウント＞５の眼は、ＣＮＮ ＤＡＲＣカウント≦５の眼に比べ、ＳＲＦの発症レベルが有意に高い（ウィルコクソン順位、ｐ＝０．０１５６）。（Ｂ）ベースライン診断別の転換眼の内訳を示す表である。新たなＳＲＦを発症した７眼はすべてＣＮＮ ＤＡＲＣカウント＞５であり、ベースライン時に活動性の脈絡膜新生血管（ＣＮＶ）を有していた１７眼（ｎ＝１０）又は経過観察中に転換した１７眼（ｎ＝７）のうち１６眼はＣＮＮ ＤＡＲＣカウント＞５であった。
【図3】ＣＮＮ ＤＡＲＣカウントが、ＳＲＦの蓄積領域が大きい眼で有意に増加したことを示す。ＯＣＴ上のＳＲＦを覆うユニークなＤＡＲＣスポットのデータ分布と、各時点におけるＯＣＴ上のＳＲＦ蓄積総面積を示すバイオリンプロットである。ＯＣＴ上でＣＮＶ病変を検出するために、Ｔｈｅ Ｒｅｔｉｎａｌ ＯＣＴ Ｆｌｕｉｄ Ｃｈａｌｌｅｎｇｅ（ＲＥＴＯＵＣＨ）のデータを用いて訓練したＣＮＮを用いてＳＲＦの領域を特定した。６ヶ月間隔でのＯＣＴスキャンの回数や眼間のばらつきを考慮し、間隔ごとにＳＲＦの平均面積を計算した。眼は３０００μｍの閾値を用いて「高ＳＲＦ」と「低ＳＲＦ」に分けられた。すべての時点で、すべての眼でＤＡＲＣカウントが５以上であることが、ＳＲＦの大量蓄積と関連している。ｐ値はすべてマン・ホイットニーの有意水準を示す。横線は中央値と四分位範囲、最小値と最大値を示す。
【図4】ウサギの血管新生モデルにおいて、ＤＡＲＣが内皮活性の最も早い変化を同定していることを示す。ウサギ３匹の左眼のみにヒトＶＥＧＦ（ｈＶＥＧＦ１６５－Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ，Ｌｏｎｄｏｎ ＵＫ）を５０μｌ中１μｇを硝子体内投与し、血管新生モデルを作成した。２日後と４日後にＡＮＸ７７６（０．２ｍｇ）と１％フルオレセインナトリウムを静脈内投与した。ウサギの両眼をｃＳＬＯのＩＣＧＡ及びＦＦＡ設定を用いて撮影した。ＤＡＲＣスポット（ＡＮＸ７７６陽性標識の白点として識別される）は、未処置の右眼（Ｄ－Ｆ）と比較して、ｈＶＥＧＦを処置した左眼（Ａ－Ｃ）ではっきりと見える。ＤＡＲＣカウントは３人のマスクされた手動観察者によって得られた。（Ｇ）個々の点は、左右の眼を別々に手動で観察したものである。すべてのｈＶＥＧＦ眼は、未処置の対側眼と比較してＤＡＲＣ染色が陽性であった。治療眼と対照眼のＤＡＲＣカウントには有意差（ｐ＝０．０２０３）があった。挿入図（Ａ－Ｆ）は、ｈＶＥＧＦ投与４日後のフルオレセイン血管造影を示す。すべての治療眼は対照（挿入図Ｄ－Ｆ）と比較して４日後にフルオレセイン漏出を示した（挿入図Ａ－Ｃ）。ラニビズマブ局所投与は、血管新生ＤＡＲＣ標識を減少させた（Ｈ－Ｊ）。Ａ－Ｆでは治療眼と対照眼との間でＤＡＲＣカウントに有意差があったが、ラニビズマブ治療によりこの有意差は消失した（Ｎ）。ラニビズマブ局所投与により、ＤＡＲＣカウントはビヒクル対照と比較して有意に減少した（Ｏ、ｐ＝０．０２６２）。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【0067】
背景
加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）は、先進国における失明原因の第１位であり、その発症率は高齢化人口の増加とともに上昇すると予測されている。ＡＭＤには２つの病型があり、脈絡膜新生血管（ＣＮＶ）がある（ウェット型）又はない（ドライ型）によって分類され、漏出した血管から網膜下液又は網膜内液（それぞれＳＲＦ又はＩＲＦ）が形成されることが特徴である。光干渉断層撮影（ＯＣＴ）は現在、ＡＭＤの管理、特に抗血管内皮増殖因子（抗ＶＥＧＦ）を標的とした治療を評価する際のゴールドスタンダードと考えられている。
加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）は、先進国における失明原因の第１位であり、その発症率は高齢化人口の増加とともに上昇すると予測されている。ＡＭＤには２つの病型があり、脈絡膜新生血管（ＣＮＶ）がある（ウェット型）又はない（ドライ型）によって分類され、漏出した血管から網膜下液又は網膜内液（それぞれＳＲＦ又はＩＲＦ）が形成されることが特徴である。光干渉断層撮影（ＯＣＴ）は現在、ＡＭＤの管理、特に抗血管内皮増殖因子（抗ＶＥＧＦ）を標的とした治療を評価する際のゴールドスタンダードと考えられている。
【0068】
アポトーシス網膜細胞の検出（ＤＡＲＣ）は、網膜の細胞死速度をモニターする技術で、緑内障診断のための第Ｉ相臨床試験を最近完了した（Ｃｏｒｄｅｉｒｏら、２０１７）。この技術は現在、Ａｎｘ７７６と呼ばれる新規蛍光剤を静脈内投与するもので、内因性タンパク質アネキシンＡ５を改変し、近赤色蛍光体Ｄｙ－７７６と結合させたものである。Ａｎｘ７７６陽性標識細胞は、一般的に使用されている共焦点走査型レーザー検眼鏡（ｃＳＬＯ）のＩＣＧＡ設定を用いて、網膜上の「白点」として可視化される。ＤＡＲＣは、眼のユニークな光学特性を利用し、蛍光標識されたヒトアネックスＶ誘導体を用いて、患者の単一神経細胞のアポトーシスを直接観察することを可能にした。ＤＡＲＣを、疾患、特にウェット型ＡＭＤの発症を予測する（つまり、十分な症状がないために診断がつかないうちに）技術として研究することにした。
【0069】
材料と方法
Ｄ７７６とアネキシン５の結合
組換え細菌発現アネキシン５（等張緩衝液１ｍｌに５ｍｇ）を「標識緩衝液」に対して３時間かけて透析し、２回の交換を行った（各回２５０ｍｌ）。標識緩衝液は、炭酸水素ナトリウム２１ｇ（２５０ｍｍｏｌ）を蒸留水４００ｍｌに溶解して調製した。アジ化ナトリウム１ｇ（０．２％）を加えた。ｐＨは、水酸化ナトリウムの濃厚水溶液でｐＨ９．０に調整した。使用前に、濃縮原液１部に対して水９部を加えて緩衝液を希釈した（ｖ／ｖ）。その後、アネキシン５タンパク質は標識反応の準備が整った。色素とタンパク質の比率は、各標識反応において一定に保たれた。したがって、１ｍｇのアネキシン５を標識するために０．５ｍｇのＤ７７６－ＮＨＳ－エステルを使用した。これにより、色素とアネキシン５タンパク質のモル比は約５００となる。ＮＨＳ－エステルをボルテックスでジメチルホルムアミドに溶解し、標識緩衝液中のアネキシン５タンパク質に色素を加えて反応を開始した。標識反応におけるアネキシン５の最終濃度は５ｍｇ／ｍｌであった。エッペンドルフチューブをシェーカーに入れ、２時間かけてラベリングを行った。
Ｄ７７６とアネキシン５の結合
組換え細菌発現アネキシン５（等張緩衝液１ｍｌに５ｍｇ）を「標識緩衝液」に対して３時間かけて透析し、２回の交換を行った（各回２５０ｍｌ）。標識緩衝液は、炭酸水素ナトリウム２１ｇ（２５０ｍｍｏｌ）を蒸留水４００ｍｌに溶解して調製した。アジ化ナトリウム１ｇ（０．２％）を加えた。ｐＨは、水酸化ナトリウムの濃厚水溶液でｐＨ９．０に調整した。使用前に、濃縮原液１部に対して水９部を加えて緩衝液を希釈した（ｖ／ｖ）。その後、アネキシン５タンパク質は標識反応の準備が整った。色素とタンパク質の比率は、各標識反応において一定に保たれた。したがって、１ｍｇのアネキシン５を標識するために０．５ｍｇのＤ７７６－ＮＨＳ－エステルを使用した。これにより、色素とアネキシン５タンパク質のモル比は約５００となる。ＮＨＳ－エステルをボルテックスでジメチルホルムアミドに溶解し、標識緩衝液中のアネキシン５タンパク質に色素を加えて反応を開始した。標識反応におけるアネキシン５の最終濃度は５ｍｇ／ｍｌであった。エッペンドルフチューブをシェーカーに入れ、２時間かけてラベリングを行った。
【0070】
反応終了後、着色した標識溶液を５又は１０ｍｌのＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－２５カラムに注意深くピペッティングし、ゲルに浸透させた。次に、１００ｍＭのＰＢＳ－緩衝液ｐＨ７．４をゆっくりとカラムに滴下し、コンジュゲートを溶出した。標識タンパク質は比較的シャープなバンドとして前方に流れ、遊離色素はゆっくりと後方に流れる。結合したアネキシン５がカラムの底に到達すると、エッペンドルフチューブに回収され、すぐに使用できる。
【0071】
臨床試験デザイン
ＤＡＲＣの単施設非盲検第２相臨床試験は、Ｔｈｅ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｅｙｅ Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｉｍｐｅｒｉａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＮＨＳ Ｔｒｕｓｔで実施された。すべての対象に、２０１７年２月１５日～２０１７年６月３０日の間に、蛍光アネキシン５（ＡＮＸ７７６、０．４ｍｇ）を単回静脈注射した。本試験には、既にＷｅｓｔｅｒｎ Ｅｙｅ Ｈｏｓｐｉｔａｌの網膜内科で治療を受けているＡＭＤ対象を募集し、ブレント研究倫理委員会の承認を得た後、ヘルシンキ宣言に従ってインフォームド・コンセントを得た。（ＩＳＲＣＴＮ１０７５１８５９）。すべての参加者は、ベースライン時に１回だけＤＡＲＣを行い、ＤＡＲＣ後最長３６ヶ月まで、標準治療に従って経過観察のたびに光干渉断層撮影（ＯＣＴ）スキャンを記録した。
ＤＡＲＣの単施設非盲検第２相臨床試験は、Ｔｈｅ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｅｙｅ Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｉｍｐｅｒｉａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＮＨＳ Ｔｒｕｓｔで実施された。すべての対象に、２０１７年２月１５日～２０１７年６月３０日の間に、蛍光アネキシン５（ＡＮＸ７７６、０．４ｍｇ）を単回静脈注射した。本試験には、既にＷｅｓｔｅｒｎ Ｅｙｅ Ｈｏｓｐｉｔａｌの網膜内科で治療を受けているＡＭＤ対象を募集し、ブレント研究倫理委員会の承認を得た後、ヘルシンキ宣言に従ってインフォームド・コンセントを得た。（ＩＳＲＣＴＮ１０７５１８５９）。すべての参加者は、ベースライン時に１回だけＤＡＲＣを行い、ＤＡＲＣ後最長３６ヶ月まで、標準治療に従って経過観察のたびに光干渉断層撮影（ＯＣＴ）スキャンを記録した。
【0072】
患者は、表１に示した包含基準及び除外基準に従って適格である場合に、本試験に参加するものとみなされた。具体的には、ＡＭＤコホートに含めるためには、ＣＮＶ（ウェット型ＡＭＤ）、「初期ＡＭＤ」（ドルーゼン、網膜色素上皮（ＲＰＥ）色素変化）又は「後期ＡＭＤ」（ＲＰＥの地理的萎縮（ドライ型ＡＭＤ））に一致する変化を示すことが必要だった。さらに、脈絡膜新生血管（ＣＮＶＭ）のリスクを高める眼疾患の存在、クロロキン、ヒドロキシクロロキン、クロルプロマジン、チオリダジン、硫酸キニーネ、クロファジミン、シスプラチン、カルムスチン、（ＢＣＮＵ）、ディフェロキサミン、アミオダロン、イソレチノイン、金の現在又は過去３０日以上の使用は除外した。眼は、臨床検査及び網膜画像所見に基づいて、ベースライン時に活動性ＣＮＶ、ＣＮＶ既往、初期ＡＭＤ、後期ＡＭＤに分けられた。
【0073】
１９人のＡＭＤ対象のうち、３１眼が分析され、ベースラインと２４０分の時点の画像が評価された。
【0074】
ＤＡＲＣの画像取得と試験の盲検化
網膜画像は、Ｎｏｒｍａｎｄｏら（２０２０）に既に記載されたように、ｃＳＬＯ（ＨＲＡ＋ＯＣＴ Ｓｐｅｃｔｒａｌｉｓ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ＧｍｂＨ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて取得した。高解像度ＩＣＧＡモードの蛍光設定（ダイオードレーザー７８６ｎｍ励起；８００ｎｍバリアフィルター付き光検出器）を用い、瞳孔拡張（１％トロピカミドと２．５％フェニレフリン）後にベースライン赤外自家蛍光画像を取得した。すべての参加者は、ベースライン時に１回だけＤＡＲＣを実施した。各患者はＡＮＸ７７６を静脈注射（単回投与量０．４ｍｇ）され、１５分、１２０分、２４０分にＡＮＸ７７６注射中及び注射後の画像が撮影され、各時点で１００フレームの平均画像を記録した。すべての画像は解析を行う前に匿名化され、本試験では２４０分の画像のみを解析した。
網膜画像は、Ｎｏｒｍａｎｄｏら（２０２０）に既に記載されたように、ｃＳＬＯ（ＨＲＡ＋ＯＣＴ Ｓｐｅｃｔｒａｌｉｓ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ＧｍｂＨ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて取得した。高解像度ＩＣＧＡモードの蛍光設定（ダイオードレーザー７８６ｎｍ励起；８００ｎｍバリアフィルター付き光検出器）を用い、瞳孔拡張（１％トロピカミドと２．５％フェニレフリン）後にベースライン赤外自家蛍光画像を取得した。すべての参加者は、ベースライン時に１回だけＤＡＲＣを実施した。各患者はＡＮＸ７７６を静脈注射（単回投与量０．４ｍｇ）され、１５分、１２０分、２４０分にＡＮＸ７７６注射中及び注射後の画像が撮影され、各時点で１００フレームの平均画像を記録した。すべての画像は解析を行う前に匿名化され、本試験では２４０分の画像のみを解析した。
【0075】
また、確立された網膜血管新生モデルを用いてＤＡＲＣを評価するため、３匹のニュージーランド白ウサギを用いたパイロット試験も実施された。すべての実験は、ＡＲＶＯ Ｓｔａｔｅｍｅｎｔ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｕｓｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌｓ ｉｎ Ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ ａｎｄ Ｖｉｓｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈに従い、英国内務省の承認を得たプロトコルで設計及び実施された。簡単に説明すると、２．５ｋｇのウサギを、それぞれ５０ｍｇ／ｋｇの塩酸ケタミン及び１０ｍｇ／ｋｇのキシラジンの筋肉注射で麻酔した。瞳孔は２．５％フェニレフリンと１％トロピカミドで拡張した。０．１％ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ ＵＫ）に溶解した１μｇのヒトＶＥＧＦ１６５（Ｓｉｇｍａ ＵＫ）を含む５０μｌを、各動物の左眼のみに硝子体内注射した。４８時間後、全身麻酔下で、ウサギはＡｎｘ７７６（０．２ｍｇ）と１％フルオレセインナトリウムを静脈内投与され、ＨＲＡ－Ｓｐｅｃｔｒａｌｉｓの高解像度ＩＣＧＡ及びＦＦＡモードを用いて、４０分後にＤＡＲＣ及び４４８イメージングを行った。マスクされた３人の観察者がＤＡＲＣ画像のマニュアルカウントを行った。抗血管新生実験では、３匹のウサギにラニビズマブ点眼薬を投与した。３匹のウサギはビヒクル対照とした。
【0076】
ＯＣＴスキャンの取得
ＯＣＴスキャンは、ＤＡＲＣ後最大３６ヶ月まで、標準治療に従って各患者の経過観察診察ごとに記録された。ＤＡＲＣ画像とＯＣＴスキャンは、事後解析で評価された。
ＯＣＴスキャンは、ＤＡＲＣ後最大３６ヶ月まで、標準治療に従って各患者の経過観察診察ごとに記録された。ＤＡＲＣ画像とＯＣＴスキャンは、事後解析で評価された。
【0077】
ＤＡＲＣスポット検出
スポット検出の完全な方法については、Ｎｏｒｍａｎｄｏら（２０２０）に記載されている。簡単に説明すると、テンプレートマッチングを用いて識別され、５人の観察者が手動で分類した対照データセットからスポットを分類するために、中央ニューラルネットワーク（ＣＮＮ）を訓練することを含んだ。ＣＮＮの訓練には、５人の観察者のうち２人の一致が用いられ、その精度は９７％、感度は９１．１％、特異度は９７．１％であることが判明した。
スポット検出の完全な方法については、Ｎｏｒｍａｎｄｏら（２０２０）に記載されている。簡単に説明すると、テンプレートマッチングを用いて識別され、５人の観察者が手動で分類した対照データセットからスポットを分類するために、中央ニューラルネットワーク（ＣＮＮ）を訓練することを含んだ。ＣＮＮの訓練には、５人の観察者のうち２人の一致が用いられ、その精度は９７％、感度は９１．１％、特異度は９７．１％であることが判明した。
【0078】
報告されたＣＮＮモデルと重みは、本作業でも変更なく使用されている。
【0079】
ＣＬＳＯとＯＣＴの位置合わせ
各眼のＤＡＲＣ画像は、対応する一連のＯＣＴスキャンと位置合わせされ、その後の経過観察時に対応するＯＣＴスキャン上でＤＡＲＣスポットの位置を特定できるようにした。この位置合わせにより、ＣＬＳＯ画像で特定されたＤＡＲＣスポットの位置と、ＯＣＴ画像内の網膜下液（ＳＲＦ）の位置を照合することも可能となった。ＤＡＲＣのＣＬＳＯ画像をＯＣＴ画像に登録するために、ベースラインの自家蛍光画像とＤＡＲＣ画像（２４０分）を、アフィン変換の後に非剛体Ｂスプライン変換を用いて自動的に位置合わせをした。これは、ＳｉｍｐｌｅＩＴＫ（ＮｕｍＦＯＣＵＳ，ＵＳ）内の多重解像度位置合わせ法と勾配降下最適化法を用いて完了した。次に、ＣＬＳＯの自家蛍光とＯＣＴ反射率画像上にフィデューシャルマーカー（白点、図１）を手動で配置し、アフィン変換を計算して適用することにより、連続したＳｐｅｃｔｒａｌｉｓ ＯＣＴスキャンの反射率画像を、登録されたＤＡＲＣ画像と位置合わせした。すべての画像の位置合わせが完了すると、２４０分のＤＡＲＣ画像上の位置を選択し、対応するＯＣＴ画像スライスで同じ位置を特定し得た。
各眼のＤＡＲＣ画像は、対応する一連のＯＣＴスキャンと位置合わせされ、その後の経過観察時に対応するＯＣＴスキャン上でＤＡＲＣスポットの位置を特定できるようにした。この位置合わせにより、ＣＬＳＯ画像で特定されたＤＡＲＣスポットの位置と、ＯＣＴ画像内の網膜下液（ＳＲＦ）の位置を照合することも可能となった。ＤＡＲＣのＣＬＳＯ画像をＯＣＴ画像に登録するために、ベースラインの自家蛍光画像とＤＡＲＣ画像（２４０分）を、アフィン変換の後に非剛体Ｂスプライン変換を用いて自動的に位置合わせをした。これは、ＳｉｍｐｌｅＩＴＫ（ＮｕｍＦＯＣＵＳ，ＵＳ）内の多重解像度位置合わせ法と勾配降下最適化法を用いて完了した。次に、ＣＬＳＯの自家蛍光とＯＣＴ反射率画像上にフィデューシャルマーカー（白点、図１）を手動で配置し、アフィン変換を計算して適用することにより、連続したＳｐｅｃｔｒａｌｉｓ ＯＣＴスキャンの反射率画像を、登録されたＤＡＲＣ画像と位置合わせした。すべての画像の位置合わせが完了すると、２４０分のＤＡＲＣ画像上の位置を選択し、対応するＯＣＴ画像スライスで同じ位置を特定し得た。
【0080】
ＣＮＮによるＳＲＦの特定
ＯＣＴ上で脈絡膜新生血管（ＣＮＶ）病変を検出するために、ＳＲＦの領域を特定するためにＣＮＮを使用した。ＣＮＮは、Ｂｏｇｕｎｏｖｉら（２０１９）に記載されているＴｈｅ Ｒｅｔｉｎａｌ ＯＣＴ Ｆｌｕｉｄ Ｃｈａｌｌｅｎｇｅ（ＲＥＴＯＵＣＨ）のデータを用いて訓練された。
ＯＣＴ上で脈絡膜新生血管（ＣＮＶ）病変を検出するために、ＳＲＦの領域を特定するためにＣＮＮを使用した。ＣＮＮは、Ｂｏｇｕｎｏｖｉら（２０１９）に記載されているＴｈｅ Ｒｅｔｉｎａｌ ＯＣＴ Ｆｌｕｉｄ Ｃｈａｌｌｅｎｇｅ（ＲＥＴＯＵＣＨ）のデータを用いて訓練された。
【0081】
Ｒｏｎｎｅｂｅｒｇｅｒら、２０１５によって記述されたカスタムＵＮＥＴが適応された。従来のＵＮＥＴのための一般的な訓練メカニズムは以前に実装されており、これは、網膜内液（ＩＲＦ）、網膜下液（ＳＲＦ）、色素上皮剥離（ＰＥＤ）領域が複数の観察者によって手動で注釈が付けられた、Ｂｏｇｕｎｏｖｉら（２０１９）に記載されているＴｈｅ Ｒｅｔｉｎａｌ ＯＣＴ Ｆｌｕｉｄ Ｃｈａｌｌｅｎｇｅ（ＲＥＴＯＵＣＨ）のデータを用いて訓練された。
【0082】
各ＯＣＴスキャン画像の３チャンネルラベルマスクは、各注釈タイプが３チャンネルＲＧＢ画像の別々のチャンネルで表現されるように作成された。モデルは、８ＧｂのＮＶＩＤＩＡ ＧＴＸ １０８０グラフィックカードを搭載したＷｉｎｄｏｗｓ ＰＣで、画像サイズ５１２×５１２、３２フィルター、ドロップアウト０．２の固定で、水平反転のみをランダムに増強したＵＮＥＴを用いて１００エポック訓練した。訓練データセットは、トレーニング用に約２／３（Ｎ＝４，６２４）、検証用に約１／３（Ｎ＝２，３１２）に分けられ、各ＳＲＦスキャン画像の画像サイズは４９７×４９５ピクセルであった。
【0083】
モデルの訓練が完了した後、１／３検証セットでモデルをテストした。訓練したネットワークから得られたＤＩＣＥ係数（Ｎｏｒｍａｎｄｏら、２０２０に記載）を比較すると、ＳＲＦはＲＥＴＯＵＣＨで報告された最高のシステムと比較し、ＳｐｅｃｔｒａｌｉｓのＤＩＣＥ係数スコアが０．７５であったのに対し、０．８３であった。報告された結果は、Ｃｉｒｒｕｓ、Ｓｐｅｃｔｒａｌｉｓ及びＴｏｐｃｏｎを組み合わせたチャレンジデータセットでのものであり、訓練データセットのパーティションサブセットでの結果と直接比較し得ない。
【0084】
ＲＥＴＯＵＣＨデータセットを用いて得られた結果が我々のＤＡＲＣ研究を代表するものであることを確認するため、７３５枚の匿名化されたＯＣＴ画像は、ＶＧＧ Ｉｍａｇｅ Ａｎｎｏｔａｔｏｒ（ＶＩＡ），Ｖｉｓｕａｌ Ｇｅｏｍｅｔｒｙ Ｇｒｏｕｐ， Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ａｎｄ ｈｔｔｐｓ：／／ｇｉｔｌａｂ．ｃｏｍ／ｖｇｇ／ｖｉａ／ｂｌｏｂ／ｍａｓｔｅｒ／Ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｏｒｓ．ｍｄを用いて上級網膜専門医が手動で注釈を付けた。ＤＩＣＥ係数は、前述のＳＲＦ ＣＮＮを用いて計算され、０．８４であった。次に、３１眼のデータセットから２０，６３０枚のＯＣＴ画像にＳＲＦ ＣＮＮを適用した。
【0085】
ＤＡＲＣスポットは、ＯＣＴスキャン面の正常位置に任意のＳＲＦが確認された場合、ＳＲＦの領域と交差するとした。
【0086】
ＳＲＦ蓄積の算出
６ヶ月間隔でＳＲＦの有無で眼を分類した。６ヶ月間隔でのＯＣＴスキャンの回数や眼間のばらつきを考慮し、間隔ごとにＳＲＦの平均面積を算出した。新規のＳＲＦは、ＯＣＴでＳＲＦを認め、その前の期間にＳＲＦ陰性と分類された眼と定義した。
６ヶ月間隔でＳＲＦの有無で眼を分類した。６ヶ月間隔でのＯＣＴスキャンの回数や眼間のばらつきを考慮し、間隔ごとにＳＲＦの平均面積を算出した。新規のＳＲＦは、ＯＣＴでＳＲＦを認め、その前の期間にＳＲＦ陰性と分類された眼と定義した。
【0087】
各眼の６ヶ月間のＳＲＦ量は、眼全体の特定の時点におけるすべてのＯＣＴスキャンで検出されたＳＲＦピクセルの正規化された合計とされた。蓄積されたＳＲＦは、ＯＣＴスキャンごとのＳＲＦ量を、６ヶ月間のＯＣＴスキャン数で平均した値である。
【0088】
統計解析
統計解析は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（バージョン８．０１）、Ｓｋｌｅａｒｎ（バージョン０．０）、ＳＰＳＳ（ＩＢＭ ＳＰＳＳ バージョン２５）及びＰｙｔｈｏｎ（バージョン３．６）を用いて行われた。ＳＲＦのＣＮＮテスト用に生成された精度、再現率、Ｆ１スコア、曲線下面積（ＡＵＣ）を用いて、精度－再現率曲線を構築した。ＳＲＦの臨床的定義とＣＮＮ定義の一致は、カッパ統計で評価した。ＣＮＮのＤＡＲＣカウントが５を上回った眼と５を下回った眼を比較し、ＳＲＦが残存している眼を基準にグラフを作成し、各時点のウィルコクソン順位ペアと単純線形回帰統計を使って比較した。ＳＲＦを覆うＤＡＲＣスポットのみを用いて、新たなＳＲＦを有する眼の予測率を評価するために混同行列を構築し、そこから陽性予測値（ＰＰＶ）、特異度、感度を算出した。スピアマンの相関係数を用いて、ＯＣＴ上のＳＲＦを覆うユニークなＤＡＲＣスポットと、各時点におけるＯＣＴ上のＳＲＦ集積総面積との相関を求めた（ｐ＜０．０５）。各ＯＣＴ時点におけるＳＲＦを覆うＤＡＲＣスポットの評価は、バイオリンプロットを用いて行い、ＳＲＦ蓄積の少ない領域と多い領域にグループを分けた。ＳＲＦが多いグループと少ないグループは、マン・ホイットニー検定を用いて比較した。手動ＤＡＲＣカウントは、ウサギのヒトＶＥＧＦ処置した左眼と未処置の右眼を比較するペアのｔ検定を用いて解析した。
統計解析は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（バージョン８．０１）、Ｓｋｌｅａｒｎ（バージョン０．０）、ＳＰＳＳ（ＩＢＭ ＳＰＳＳ バージョン２５）及びＰｙｔｈｏｎ（バージョン３．６）を用いて行われた。ＳＲＦのＣＮＮテスト用に生成された精度、再現率、Ｆ１スコア、曲線下面積（ＡＵＣ）を用いて、精度－再現率曲線を構築した。ＳＲＦの臨床的定義とＣＮＮ定義の一致は、カッパ統計で評価した。ＣＮＮのＤＡＲＣカウントが５を上回った眼と５を下回った眼を比較し、ＳＲＦが残存している眼を基準にグラフを作成し、各時点のウィルコクソン順位ペアと単純線形回帰統計を使って比較した。ＳＲＦを覆うＤＡＲＣスポットのみを用いて、新たなＳＲＦを有する眼の予測率を評価するために混同行列を構築し、そこから陽性予測値（ＰＰＶ）、特異度、感度を算出した。スピアマンの相関係数を用いて、ＯＣＴ上のＳＲＦを覆うユニークなＤＡＲＣスポットと、各時点におけるＯＣＴ上のＳＲＦ集積総面積との相関を求めた（ｐ＜０．０５）。各ＯＣＴ時点におけるＳＲＦを覆うＤＡＲＣスポットの評価は、バイオリンプロットを用いて行い、ＳＲＦ蓄積の少ない領域と多い領域にグループを分けた。ＳＲＦが多いグループと少ないグループは、マン・ホイットニー検定を用いて比較した。手動ＤＡＲＣカウントは、ウサギのヒトＶＥＧＦ処置した左眼と未処置の右眼を比較するペアのｔ検定を用いて解析した。
【0089】
実施例１：ＤＡＲＣは３６ヶ月後のＯＣＴで新たな網膜下液（ウェット型ＡＭＤ）を予測する
ＤＡＲＣを疾患、特にウェット型ＡＭＤの発症の予測技術（すなわち、十分な症状がないために診断が下される前）として調査することにした。
ＤＡＲＣを疾患、特にウェット型ＡＭＤの発症の予測技術（すなわち、十分な症状がないために診断が下される前）として調査することにした。
【0090】
ロンドンのＩＣＮＨＴにあるＷｅｓｔｅｒｎ Ｅｙｅ Ｈｏｓｐｉｔａｌで行われた第２相ＤＡＲＣ臨床試験に参加した１９名のＡＭＤ患者コホートからのＤＡＲＣ結果の事後解析が行われた。患者は、ＤＡＲＣ実施後、最長３６ヶ月間、ＯＣＴスキャンで定期的に経過観察された。患者のデモグラフィックを表２及び表３に示す。ＤＡＲＣで評価された３１眼のうち、ＤＡＲＣ実施後３６ヶ月までＯＣＴスキャンで定期的に経過観察された２９眼のＯＣＴ経過観察が可能であった。６ヶ月ごとのＯＣＴスキャンの平均回数は、３０～３６ヶ月で１．７０回、１２～１８ヶ月で２．５９回であった。患者が標準治療に従って治療を続けた結果、抗ＶＥＧＦ硝子体内注射の平均回数は、３０～３６ヶ月で２．０回、０～６ヶ月で３．６１回と変動した。
【0091】
各時点での解析は、ベースラインからのＤＡＲＣスポットが、図１に示すようにＯＣＴ上の新しいＳＲＦとＣＮＮによって検出された任意の領域と交差することによって、ウェット型ＡＭＤの発生を予測するかどうかを確認するために行われた。ＳＲＦ ＣＮＮを用いて新しいＳＲＦを定義し、各時点で眼を新しいウェット型ＡＭＤグループとウェット型ＡＭＤなしグループに分けた。
【0092】
各時期における新規ＳＲＦの発生率は表４の通りであり、ＯＣＴ ＣＮＮ ＳＲＦの定義のみを用いた場合、６ヶ月、１２ヶ月、１８ヶ月、２４ヶ月、３０ヶ月、３６ヶ月における転換率は、それぞれ７．４、１１．５、２６．１、２９．２、３３．３％である。眼は、初めて新しいＳＲＦを示した場合のみ「転換」と分類された。ＣＮＮ ＤＡＲＣカウントは、ＳＲＦ形成に関連した１眼を除くすべての眼で５以上であった。
【0093】
ベースラインＯＣＴのＳＲＦを覆う自家蛍光スポットとＤＡＲＣスポットの両方が、更なる解析から除外され、そこでは、繰り返し数えることを避けるために、新しいＳＲＦを覆う個々のＤＡＲＣスポットの最初の出現（「ユニークなＤＡＲＣスポット」と呼ばれる）のみが含まれた。特定の時点において、ある眼がＯＣＴ上で新しいＳＲＦを覆うユニークなＤＡＲＣスポットを示した場合、それは真陽性；ＳＲＦはあるがユニークなＤＡＲＣスポットがない眼は偽陰性；ＳＲＦはないがユニークなＤＡＲＣスポットがある眼は偽陽性；ＳＲＦもＤＡＲＣスポットもない眼は真陰性と分類された。ベースライン後６ヶ月から３６ヶ月までの６ヶ月ごとの経過観察期間について、混同行列（各混乱行列は、各時間間隔における眼によるＤＡＲＣ ＣＮＮの予測判定を決定する）を構築した。表４は、混同行列の結果をまとめたもので、ユニークなＤＡＲＣスポットが新たなＳＲＦ活性を有する眼を予測する能力を示している。したがって、６ヶ月の時点で、このシステムは、特異度９０％、感度８３％、ＰＰＶ７１％、ＮＰＶ９５％を有していた。ＤＡＲＣ ＤＬシステムのＰＰＶは、すべての時点で７０％以上であり、３０ヶ月で８６％のピークに達した。特異度は７９～９０％で、感度は８０％以上である。
【0094】
図２Ａは、各６ヶ月の時点でＳＲＦが残存していない（ウェット型ＡＭＤを発症していない）眼の割合を、ＣＮＮ ＤＡＲＣカウントの閾値５でグループ分けしたものである。グループ間の比較では、ＣＮＮ ＤＡＲＣカウント＞５の眼は、ＣＮＮ ＤＡＲＣカウント≦５の眼と比較して、ＳＲＦを発症するレベルが有意に高いことが示された（ウィルコクソン順位、ｐ＝０．０１５６）。また、同じデータの線形回帰も行われ、回帰推定値の傾きは統計的に有意に異なっていた（ｐ＜０．０００１、Ｒ２＝０．９２ ＤＡＲＣ ＣＮＮ＞５対Ｒ２＝１．０ ＤＡＲＣカウント≦５）。これは「時間＊グループ」効果、つまり時間の経過がＣＮＮ ＤＡＲＣカウント＞５グループとＣＮＮ ＤＡＲＣカウント≦５グループに与える影響とは有意に異なることを示している。適合線とデータポイントを観察すると、ハザードが大きいのは最初の１６ヶ月で、その後のハザードは比較的平坦であるのに対し、ＣＮＮ ＤＡＲＣカウント≦５はＳＲＦが残存していない生存期間の延長と有意に関連している。
【0095】
ベースライン診断による転換眼の内訳を図２Ｂに示す。新たなＳＲＦを発症した７つの眼はすべてＣＮＮ ＤＡＲＣカウント＞５であった。ベースライン時に活動性ＣＮＶ（ｎ＝１０）を有していた又は経過観察で転換した１７眼（ｎ＝７）のうち１６眼は、ＣＮＮ ＤＡＲＣカウント＞５であった。
【0096】
このことは、ＤＡＲＣがウェット型ＡＭＤの発症を予測し、早期診断につなげ得ることを示している。
【0097】
実施例２：ＤＡＲＣは他の予測方法と比較して予測精度が向上する
次に、実施例１のＤＡＲＣ＋ＯＣＴモデルの結果を、Ｙｉｍら（２０２０）の報告結果と比較した。Ｙｉｍは、ＯＣＴを用いたディープラーニング（ＤＬ）の使用により、ＯＣＴの特徴を解析することで、６ヶ月後の脈絡膜新生血管（ＣＮＶ）又はウェット型ＡＭＤの発症を予測することを改善することを説明した。しかしながら、予測値は低く、すなわち、感度８０％で特異度５５％、特異度９０％で感度３４％、陽性予測値（ＰＰＶ）はそれぞれ７．３％と１３．２％と報告された。
次に、実施例１のＤＡＲＣ＋ＯＣＴモデルの結果を、Ｙｉｍら（２０２０）の報告結果と比較した。Ｙｉｍは、ＯＣＴを用いたディープラーニング（ＤＬ）の使用により、ＯＣＴの特徴を解析することで、６ヶ月後の脈絡膜新生血管（ＣＮＶ）又はウェット型ＡＭＤの発症を予測することを改善することを説明した。しかしながら、予測値は低く、すなわち、感度８０％で特異度５５％、特異度９０％で感度３４％、陽性予測値（ＰＰＶ）はそれぞれ７．３％と１３．２％と報告された。
【0098】
表５は、実施例１のＤＡＲＣ ＤＬモデルによる結果と、Ｙｉｍら（２０２０）の報告結果との比較を示している。ＤＡＲＣ ＤＬシステムのＰＰＶははるかに大きく、６ヶ月で１００％であるの対し、Ｙｉｍシステムは７％又は１３％である。これは、ＤＡＲＣ ＤＬが一貫して特異度、感度ともに高く、６ヶ月で１００％と５０％、３６ヶ月で９５％と８３％であったことからもわかる。実施例１の転換率は、６ヶ月後のＹｉｍらの転換率と同様であり、それぞれ１４．８％と１３．５％である。これは、サンプルサイズの違いにもかかわらずである。
【0099】
実施例３：ＤＡＲＣカウントの増加は、観察されたＳＲＦ蓄積の大きさと相関する
ＤＡＲＣ ＤＬシステムは、単一細胞の活性を評価できるため、Ｙｉｍシステムよりも性能が優れているという仮説を立てた。このことをさらに調べるために、各時点における各眼のＳＲＦ蓄積の大きさとＤＡＲＣカウントの関係を評価した。眼は、各時点で２０００ピクセルの閾値を用いて「高ＳＲＦ」と「低ＳＲＦ」に分けられた。図３は、各時点でＳＲＦが大きく蓄積している眼では、ＳＲＦを覆うＤＡＲＣカウントが有意に（６ヶ月、１２ヶ月、１８ヶ月、２４ヶ月、３０ヶ月及び３６ヶ月でそれぞれｐ＝０．００２、＜０．０００１、０．００１９、０．００１６、０．００２６及び０．０１１８）増加することを示している。したがって、ＳＲＦが大きいほどＤＡＲＣカウントは多くなり、ＳＲＦ蓄積が多いほどＤＡＲＣカウントが５を超えるユニークな眼であることがわかった。実際、各時点でＳＲＦを覆うＤＡＲＣスポットは、６ヶ月（スピアマンのｒ＝０．６５、ｐ＝０．０００１）、１２ヶ月（ｒ＝０．７２、ｐ＜０．０００１）、１８ヶ月（ｒ＝０．６０、ｐ＝０．０００６）、２４ヶ月（ｒ＝０．５７、ｐ＝０．００１２）、３０ヶ月（ｒ＝０．６７、ｐ＜０．０００１）及び３６ヶ月（ｒ＝０．５９、ｐ＝０．０００８）でのＯＣＴ ＳＲＦ面積と正の相関があった。これは、図１に示されるように、ＳＲＦの新しい領域を予測する単一のＤＡＲＣスポットによって裏付けられている。
ＤＡＲＣ ＤＬシステムは、単一細胞の活性を評価できるため、Ｙｉｍシステムよりも性能が優れているという仮説を立てた。このことをさらに調べるために、各時点における各眼のＳＲＦ蓄積の大きさとＤＡＲＣカウントの関係を評価した。眼は、各時点で２０００ピクセルの閾値を用いて「高ＳＲＦ」と「低ＳＲＦ」に分けられた。図３は、各時点でＳＲＦが大きく蓄積している眼では、ＳＲＦを覆うＤＡＲＣカウントが有意に（６ヶ月、１２ヶ月、１８ヶ月、２４ヶ月、３０ヶ月及び３６ヶ月でそれぞれｐ＝０．００２、＜０．０００１、０．００１９、０．００１６、０．００２６及び０．０１１８）増加することを示している。したがって、ＳＲＦが大きいほどＤＡＲＣカウントは多くなり、ＳＲＦ蓄積が多いほどＤＡＲＣカウントが５を超えるユニークな眼であることがわかった。実際、各時点でＳＲＦを覆うＤＡＲＣスポットは、６ヶ月（スピアマンのｒ＝０．６５、ｐ＝０．０００１）、１２ヶ月（ｒ＝０．７２、ｐ＜０．０００１）、１８ヶ月（ｒ＝０．６０、ｐ＝０．０００６）、２４ヶ月（ｒ＝０．５７、ｐ＝０．００１２）、３０ヶ月（ｒ＝０．６７、ｐ＜０．０００１）及び３６ヶ月（ｒ＝０．５９、ｐ＝０．０００８）でのＯＣＴ ＳＲＦ面積と正の相関があった。これは、図１に示されるように、ＳＲＦの新しい領域を予測する単一のＤＡＲＣスポットによって裏付けられている。
【0100】
このことから、ＤＡＲＣカウントが多いほど、発症するウェット型ＡＭＤの重症度が高いことが確認された。
【0101】
実施例４：ＤＡＲＣによるウサギの初期段階の血管新生を同定する
ウサギの血管新生モデルは、ヒトＶＥＧＦ（ｈＶＥＧＦ１６５－Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ， Ｌｏｎｄｏｎ ＵＫ）を５０μｌ中１μｇを硝子体内投与することで作成した。４８時間後にＡＮＸ７７６（０．２ｍｇ）を静脈内投与し、ウサギをｃＳＬＯのＩＣＧＡ設定で撮影した。
ウサギの血管新生モデルは、ヒトＶＥＧＦ（ｈＶＥＧＦ１６５－Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ， Ｌｏｎｄｏｎ ＵＫ）を５０μｌ中１μｇを硝子体内投与することで作成した。４８時間後にＡＮＸ７７６（０．２ｍｇ）を静脈内投与し、ウサギをｃＳＬＯのＩＣＧＡ設定で撮影した。
【0102】
ｈＶＥＧＦを投与したすべてのウサギの眼は、投与２日後に未処置の対側眼と比較してＤＡＲＣ陽性染色が確認された。図４は、各動物の両眼を撮影したＤＡＲＣ画像で、左眼（Ａ－Ｃ）のｈＶＥＧＦ処置した眼では、未処置の右眼（Ｄ－Ｆ）と比較してＤＡＲＣスポットがはっきりと確認でき、処置した眼では有意な増加（ｐ＝０．０２０３、Ｇ）を示した。すべての処置した眼は、対照（挿入図Ｄ－Ｆ）と比較して挿入図Ａ－Ｃに示すように、４日目にフルオレセイン漏出を示すようになった。
【0103】
このことから、初期段階の血管新生に対するＤＡＲＣの予測及び同定価値がさらに確認さた。
【0104】
実施例５：ＤＡＲＣは抗血管新生治療の有効性をモニターするために使用され得る
実施例４に記載した血管新生のウサギモデルを、抗血管新生治療薬ラニビズマブで局所治療した。血管新生ＤＡＲＣ標識は、ラニビズマブ局所投与によって減少した（図４Ｈ－Ｊ）。ラニビズマブ局所投与により、ＤＡＲＣカウントはビヒクル対照と比較して有意に減少した（図４Ｏ、ｐ＝０．０２６２）。
実施例４に記載した血管新生のウサギモデルを、抗血管新生治療薬ラニビズマブで局所治療した。血管新生ＤＡＲＣ標識は、ラニビズマブ局所投与によって減少した（図４Ｈ－Ｊ）。ラニビズマブ局所投与により、ＤＡＲＣカウントはビヒクル対照と比較して有意に減少した（図４Ｏ、ｐ＝０．０２６２）。
【0105】
ラニビズマブによる局所治療の有効性の確認を図５に示す。ｈＶＥＧＦで治療したすべての対照ウサギの眼は、ラニビズマブの眼（Ｇ－Ｉ）と比較して４日目にフルオレセイン漏出があった（図５Ａ－Ｃ）。画像は、１％フルオレセインナトリウム投与後８分（Ｄ－Ｆ）及び２０分（Ａ－Ｃ、Ｇ－Ｉ）に収集した。この図から、ラニビズマブ局所投与によりｉｎ ｖｉｖｏでの血管漏出が減少したことが確認された。このことから、ＤＡＲＣによる治療効果のモニタリングが可能であることが確認された。
【0106】
【表1】
【0107】
【表2】
【0108】
【表3】
【0109】
【表4】
【0110】
【表5】
【0111】
参考文献
Bogunovi, H. et al. RETOUCH - The Retinal OCT Fluid Detection and Segmentation Benchmark and Challenge. XX, (2019).
Cordeiro, M.F. et al. Real-time imaging of single neuronal cell apoptosis in patients with glaucoma. Brain, 274, 61 (2017).
Normando, E. M. et al. A CNN-aided method to predict glaucoma progression using DARC (Detection of Apoptosing Retinal Cells). Expert Rev. Mol. Diagn. 00, 1－12 (2020).
Lindekleiv, H, Erke MG. Projected prevalence of age-related macular degeneration in Scandinavia 2021-2040. Acta Ophthalmol. 91 (4):307-311 (2013).
Ronneberger, O., Fischer, P. & Brox, T. U-Net: Convolutional Networks for Biomedical Image Segmentation. 1－8 (2015).
Saint-Hubert et al. Molecular imaging of cell death. Methods. 48(2), 178-87 (2009).
Tait et al. Structural requirements for in vivo detection of cell death with 99mTc-annexin V. J Nucl Med. 46(5), 807-815 (2005).
Yim, J. et al. Predicting conversion to wet age-related macular degeneration using deep learning. Nat. Med (2020). Doi:https://doi.org/10.1038/s41591-020-0867-7
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【図1】
【図2】
【図3】
【図4-1】
【図4-2】
【図4-3】
【図5】
【国際調査報告】