特表 2023-552003 ＲＮＡ合成のための組成物および方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-12-13

(54)【発明の名称】ＲＮＡ合成のための組成物および方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/10 20060101AFI20231206BHJP

   C12N 15/113 20100101ALI20231206BHJP

   C12P 19/34 20060101ALI20231206BHJP

   C12N 9/12 20060101ALI20231206BHJP

   C12M 1/40 20060101ALI20231206BHJP

   C40B 40/06 20060101ALI20231206BHJP

【ＦＩ】

C12N15/10 Z ZNA

C12N15/10 110Z

C12N15/113 100Z

C12P19/34 Z

C12N9/12

C12M1/40 A

C40B40/06

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023549149

(86)(22)【出願日】2021-10-22

(85)【翻訳文提出日】2023-06-21

(86)【国際出願番号】 IB2021000727

(87)【国際公開番号】W WO2022084748

(87)【国際公開日】2022-04-28

(31)【優先権主張番号】63/104,735

(32)【優先日】2020-10-23

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＲＩＴＯＮ

２．ＴＷＥＥＮ

３．Ｌｉｎｕｘ

(71)【出願人】

【識別番号】523151632

【氏名又は名称】スピンドル バイオテック インク．

(74)【代理人】

【識別番号】110003797

【氏名又は名称】弁理士法人清原国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】チュン，ライ，イム

(72)【発明者】

【氏名】ハッセー，ブレンダン

【テーマコード（参考）】

4B029

4B064

【Ｆターム（参考）】

4B029AA23

4B029BB20

4B029CC03

4B064AF27

4B064CA21

4B064CC24

(57)【要約】

非常に正確で純粋なＲＮＡ合成のための組成物、方法、デバイス、およびシステムが本明細書に提供される。さらに、本明細書に開示されるデバイス、組成物、および方法の使用によって生成されたＲＮＡを含む核酸ライブラリーが本明細書に提供される。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＲＮＡを合成するための方法であって、前記方法は、
表面上で固定されたＲＮＡポリメラーゼを提供する工程と、
毎時少なくとも５０ヌクレオチドの伸長速度で複数のＲＮＡを合成する工程であって、前記複数のＲＮＡのそれぞれはあらかじめ選択された配列を有しており、前記合成する工程は１つの伸長反応において一塩基ずつ伸長させることを含む、工程と
を含む、方法。

【請求項2】

前記複数のＲＮＡのそれぞれは、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記複数のＲＮＡのそれぞれは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ｐｉｗｉ相互作用ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）、ＲＮＡアプタマー、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、およびアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。

【請求項4】

前記合成する工程は、鋳型ＤＮＡを用いて行われる、請求項１に記載の方法。

【請求項5】

前記鋳型ＤＮＡは前記表面上で固定される、請求項４に記載の方法。

【請求項6】

前記鋳型ＤＮＡは、リンカー、ビオチン、またはストレプトアビジンによって前記表面上で固定される、請求項５に記載の方法。

【請求項7】

前記鋳型ＤＮＡは一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）を含む、請求項４に記載の方法。

【請求項8】

前記鋳型ＤＮＡは二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）を含む、請求項４に記載の方法。

【請求項9】

前記鋳型ＤＮＡは二次構造を含む、請求項４に記載の方法。

【請求項10】

前記二次構造はヘアピンを含む、請求項９に記載の方法。

【請求項11】

前記鋳型ＤＮＡはプロモーター配列を含む、請求項４に記載の方法。

【請求項12】

前記プロモーター配列は、トランケートされたプロモーター配列である、請求項１１に記載の方法。

【請求項13】

前記伸長速度は、毎時少なくとも５０ヌクレオチドである、請求項１に記載の方法。

【請求項14】

前記伸長速度は、毎秒少なくとも５０ヌクレオチドである、請求項１に記載の方法。

【請求項15】

前記ＲＮＡポリメラーゼは、ファージＲＮＡポリメラーゼ、細菌ＲＮＡポリメラーゼ、および真核生物ＲＮＡポリメラーゼからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。

【請求項16】

前記ＲＮＡポリメラーゼは、標準のＮ－ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＮＨＳ）官能基を用いて前記表面を活性化することによって前記表面上で固定される、請求項１に記載の方法。

【請求項17】

前記ＲＮＡポリメラーゼは、無水トリフルオロ酢酸（ＴＦＡＡ）官能基を用いて前記表面を活性化することによって前記表面上で固定される、請求項１に記載の方法。

【請求項18】

前記ＲＮＡポリメラーゼは、無水グルタルアルデヒド（ＧＡ）官能基を用いて前記表面を活性化することによって前記表面上で固定される、請求項１に記載の方法。

【請求項19】

前記表面は固体表面である、請求項１に記載の方法。

【請求項20】

前記固体表面は、磁気ビーズ、アガロースビーズ、溶融石英、ゾル－ゲル、シリカポリマー、シリカモノリス、セルロース、寒天、アクリルアミド、金ビーズ、またはゲルマトリックスを含む、請求項１９に記載の方法。

【請求項21】

前記複数のＲＮＡのそれぞれは、あらかじめ選択された同じ配列を有する、請求項１に記載の方法。

【請求項22】

前記複数のＲＮＡは、あらかじめ選択された異なる配列を含む少なくとも２つのＲＮＡを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項23】

前記複数のＲＮＡは、少なくとも１つの化学修飾されたｇＲＮＡを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項24】

ＲＮＡを合成するための方法であって、前記方法は、
融合ＲＮＡポリメラーゼ、またはその機能的断片あるいはバリアントを提供する工程と、
毎時少なくとも５０のヌクレオチドの伸速度で複数のＲＮＡを合成する工程であって、前記複数のＲＮＡのそれぞれはあらかじめ選択された配列を有しており、前記合成する工程は１つの伸長反応において一塩基ずつ伸長させることを含む、工程と
を含む、方法。

【請求項25】

前記融合ＲＮＡポリメラーゼは、ＲＮＡポリメラーゼ、またはその機能的断片あるいはバリアント、およびＤＮＡ結合タンパク質、またはその機能的断片あるいはバリアントを含み、前記ＲＮＡポリメラーゼおよびＤＮＡ結合タンパク質は異種である、請求項２４に記載の方法。

【請求項26】

前記融合ＲＮＡポリメラーゼはリンカーをさらに含む、請求項２４または２５に記載の方法。

【請求項27】

前記ＲＮＡポリメラーゼは、ファージＲＮＡポリメラーゼ、細菌ＲＮＡポリメラーゼ、および真核生物ＲＮＡポリメラーゼからなる群から選択される、請求項２５に記載の方法。

【請求項28】

前記ＤＮＡ結合タンパク質は、前記ＲＮＡポリメラーゼのＮ末端に融合される、請求項２５に記載の方法。

【請求項29】

前記ＤＮＡ結合タンパク質は、前記ＲＮＡポリメラーゼのＣ末端に融合される、請求項２５に記載の方法。

【請求項30】

前記複数のＲＮＡのそれぞれは、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む、請求項２４に記載の方法。

【請求項31】

前記複数のＲＮＡのそれぞれは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ｐｉｗｉ相互作用ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）、ＲＮＡアプタマー、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、およびアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）からなる群から選択される、請求項２４に記載の方法。

【請求項32】

前記合成する工程は、鋳型ＤＮＡを用いて行われる、請求項２４に記載の方法。

【請求項33】

前記鋳型ＤＮＡは一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）を含む、請求項３２に記載の方法。

【請求項34】

前記鋳型ＤＮＡは二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）を含む、請求項３２に記載の方法。

【請求項35】

前記鋳型ＤＮＡは二次構造を含む、請求項３２に記載の方法。

【請求項36】

前記二次構造はヘアピンを含む、請求項３５に記載の方法。

【請求項37】

前記鋳型ＤＮＡはプロモーター配列を含む、請求項３２に記載の方法。

【請求項38】

前記プロモーター配列は、トランケートされたプロモーター配列である、請求項３７に記載の方法。

【請求項39】

前記伸長速度は、毎時少なくとも５０ヌクレオチドである、請求項２４に記載の方法。

【請求項40】

前記伸長速度は、毎秒少なくとも５０ヌクレオチドである、請求項２４に記載の方法。

【請求項41】

前記複数のＲＮＡのそれぞれは、あらかじめ選択された同じ配列を有する、請求項２４に記載の方法。

【請求項42】

前記複数のＲＮＡは、あらかじめ選択された異なる配列を含む少なくとも２つのＲＮＡを含む、請求項２４に記載の方法。

【請求項43】

前記複数のＲＮＡは、少なくとも１つの化学修飾されたｇＲＮＡを含む、請求項２４に記載の方法。

【請求項44】

核酸ライブラリーであって、
複数の精製されたガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）および
トランケートされたＲＮＡポリメラーゼプロモーター領域をコードする少なくとも１つの一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）
を含む、核酸ライブラリー。

【請求項45】

前記精製されたｇＲＮＡのそれぞれは、少なくとも２０ヌクレオチド長の配列を含む、請求項４４に記載の核酸ライブラリー。

【請求項46】

前記精製されたｇＲＮＡのそれぞれは、少なくとも８０ヌクレオチド長の配列を含む、請求項４４に記載の核酸ライブラリー。

【請求項47】

前記複数の精製されたｇＲＮＡは、少なくとも１００，０００個の精製されたｇＲＮＡを含む、請求項４４に記載の核酸ライブラリー。

【請求項48】

前記トランケートされたＲＮＡポリメラーゼプロモーター領域は、配列番号３～６からなる群から選択される配列を含む、請求項４４に記載の核酸ライブラリー。

【請求項49】

前記複数の精製されたｇＲＮＡは、修飾されたヌクレオチドを含む、請求項４４に記載の核酸ライブラリー。

【請求項50】

核酸ライブラリーであって、
少なくとも２０ヌクレオチド長の複数の精製されたガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、および
２～１０ヌクレオチド長の少なくとも１つのオリゴヌクレオチド
を含む、核酸ライブラリー。

【請求項51】

前記複数の精製されたガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）は、少なくとも８０ヌクレオチド長を含む、請求項５０に記載の核酸ライブラリー。

【請求項52】

前記複数の精製されたｇＲＮＡは、少なくとも１００，０００個の精製されたｇＲＮＡを含む、請求項５０に記載の核酸ライブラリー。

【請求項53】

前記少なくとも１つのオリゴヌクレオチドは、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０ヌクレオチド長である、請求項５０に記載の核酸ライブラリー。

【請求項54】

前記少なくとも１つのオリゴヌクレオチドはＲＮＡを含む、請求項５０に記載の核酸ライブラリー。

【請求項55】

前記少なくとも１つのオリゴヌクレオチドは、精製されたガイドＲＮＡの５’末端の、または５’末端付近の２、３、４、５、６、７、８、９または１０個の連続するヌクレオチドに対して１００％同一である、請求項５０に記載の核酸ライブラリー。

【請求項56】

前記少なくとも１つのオリゴヌクレオチドは、精製されたガイドＲＮＡの３’末端の、または３’末端付近の２、３、４、５、６、７、８、９または１０個の連続するヌクレオチドに対して１００％同一である、請求項５０に記載の核酸ライブラリー。

【請求項57】

前記複数の精製されたｇＲＮＡは、少なくとも１つの化学修飾されたｇＲＮＡを含む、請求項５０に記載の核酸ライブラリー。

【請求項58】

少なくとも５０個のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む核酸ライブラリーを作製する方法であって、前記方法は、
ＲＮＡポリメラーゼを使用して少なくとも５０個のｇＲＮＡを合成する工程であって、前記少なくとも５０個のｇＲＮＡの少なくとも１つは標的遺伝子中の標的配列に相補的なスペーサー配列を含み、前記スペーサー配列の５’末端ヌクレオチドは前記標的配列の３’末端ヌクレオチドに相補的である、工程
を含む方法。

【請求項59】

前記少なくとも５０個のｇＲＮＡのそれぞれは、標的遺伝子中の標的配列に相補的なスペーサー配列を含み、前記スペーサー配列の５’末端ヌクレオチド、前記標的配列の３’末端ヌクレオチドに相補的である、請求項５８に記載の方法。

【請求項60】

前記ＲＮＡポリメラーゼは、ファージＲＮＡポリメラーゼ、細菌ＲＮＡポリメラーゼ、および真核生物ＲＮＡポリメラーゼからなる群から選択される、請求項５８に記載の方法。

【請求項61】

前記ＲＮＡポリメラーゼは、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼである、請求項６０に記載の方法。

【請求項62】

前記少なくとも５０個のｇＲＮＡのそれぞれは、前記標的配列の３’末端ヌクレオチドに相補的でない５’末端ヌクレオチドを含むｇＲＮＡと比較して、前記標的配列の編集効率の増強を示す、請求項５８に記載の方法。

【請求項63】

前記少なくとも５０個のｇＲＮＡのそれぞれは、前記標的配列の３’末端ヌクレオチドに相補的でない５’末端ヌクレオチドを含むｇＲＮＡと比較して、前記標的配列のオフターゲット編集の減少を示す、請求項５８に記載の方法。

【請求項64】

前記少なくとも５０個のｇＲＮＡは、５’末端グアニン（Ｇ）ヌクレオチドを欠くｇＲＮＡ配列を含み、前記ｇＲＮＡ配列は少なくとも４０ヌクレオチド長を含み、前記ｇＲＮＡ配列の５’末端の少なくとも３つの連続するヌクレオチドは、ゲノム中の前記標的配列の３’末端に対して１００％同一である、請求項５８に記載の方法。

【請求項65】

前記少なくとも５０個のｇＲＮＡは、５’末端Ｇヌクレオチドを含むｇＲＮＡ配列を含むｇＲＮＡと比較して、前記標的配列と対になる増強された５’末端を示し、前記５’末端Ｇヌクレオチドはプロトスペーサー配列中に存在しない、請求項６４に記載の方法。

【請求項66】

前記少なくとも５０個のｇＲＮＡのそれぞれは、スペーサー配列を含むｇＲＮＡ配列を含むｇＲＮＡと比較して、標的配列の編集効率の増強を示し、前記ｇＲＮＡ配列は、前記スペーサー配列の５’末端に１つ以上のＧヌクレオチドを含み、前記スペーサー配列の５’末端の前記１つ以上のＧヌクレオチドは、ゲノム中の前記標的配列の３’末端の１つ以上のヌクレオチドに相補的でない、請求項６４に記載の方法。

【請求項67】

前記少なくとも５０個のｇＲＮＡのそれぞれは、スペーサー配列を含むｇＲＮＡ配列を含むｇＲＮＡと比較して、オフターゲット編集の減少を示し、前記ｇＲＮＡ配列は、前記スペーサー配列の５’末端に１つ以上のＧヌクレオチドを含み、前記スペーサー配列の５’末端の前記１つ以上のＧヌクレオチドは、ゲノム中の前記標的配列の３’末端の１つ以上のヌクレオチドに相補的でない、請求項６４に記載の方法。

【請求項68】

前記少なくとも５０個のｇＲＮＡは、５’末端コドン中でグアニン（Ｇ）ヌクレオチドを欠くｇＲＮＡ配列を含み、前記ｇＲＮＡ配列は少なくとも４０ヌクレオチド長を含み、前記ｇＲＮＡ配列の５’末端の少なくとも３つの連続するヌクレオチドは、ゲノム中の前記標的配列の３’末端に対して１００％同一である、請求項５８に記載の方法。

【請求項69】

前記少なくとも５０個のｇＲＮＡのそれぞれは、５’末端コドン中にＧヌクレオチドを含むｇＲＮＡ配列を含むｇＲＮＡと比較して、前記標的配列と対になる増強された５’末端を示し、前記５’末端コドン中の前記Ｇヌクレオチドはプロトスペーサー配列の中に存在しない、請求項６８に記載の方法。

【請求項70】

前記少なくとも５０個のｇＲＮＡのそれぞれは、スペーサー配列を含むｇＲＮＡ配列を含むｇＲＮＡと比較して、標的配列の編集効率の増強を示し、前記ｇＲＮＡ配列は、前記スペーサー配列の５’末端に１つ以上のＧヌクレオチドを含み、前記スペーサー配列の５’末端の前記１つ以上のＧヌクレオチドは、ゲノム中の前記標的配列の３’末端の１つ以上のヌクレオチドに相補的でない、請求項６８に記載の方法。

【請求項71】

前記少なくとも５０個のｇＲＮＡのそれぞれは、スペーサー配列を含むｇＲＮＡ配列を含むｇＲＮＡと比較して、オフターゲット編集の減少を示し、前記ｇＲＮＡ配列は、前記スペーサー配列の５’末端に１つ以上のＧヌクレオチドを含み、前記スペーサー配列の５’末端の前記１つ以上のＧヌクレオチドは、ゲノム中の前記標的配列の３’末端の１つ以上のヌクレオチドに相補的でない、請求項６８に記載の方法。

【請求項72】

前記少なくとも５０個のｇＲＮＡは、少なくとも１００，０００個の精製されたｇＲＮＡを含む、請求項５８～７１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項73】

核酸ライブラリーであって、
５’末端グアニン（Ｇ）アナログを含むｇＲＮＡ配列を含む少なくとも５０個の精製されたガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）
を含む、核酸ライブラリー。

【請求項74】

前記少なくとも５０個の精製されたｇＲＮＡのそれぞれは、５’末端Ｇアナログを欠くｇＲＮＡ配列を含むｇＲＮＡと比較して、標的配列の編集効率の増強を示す、請求項７３に記載の核酸ライブラリー。

【請求項75】

前記少なくとも５０個の精製されたｇＲＮＡのそれぞれは、５’末端Ｇアナログを欠くｇＲＮＡ配列を含むｇＲＮＡと比較して、安定性の増強を示す、請求項７３に記載の核酸ライブラリー。

【請求項76】

前記少なくとも５０個の精製されたｇＲＮＡは、少なくとも１００，０００個の精製されたｇＲＮＡを含む、請求項７３～７５のいずれか一項に記載の核酸ライブラリー。

【請求項77】

核酸ライブラリーであって、前記核酸ライブラリーは、
少なくとも５０個のＲＮＡを含み、前記少なくとも５０個のＲＮＡのそれぞれは異なるガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）配列をコードし、前記少なくとも５０個のＲＮＡの少なくとも約９０％は、ライブラリー中の前記少なくとも５０個のＲＮＡについての平均頻度の１．５倍以内の量で前記核酸ライブラリー中にそれぞれ存在する、
核酸ライブラリー。

【請求項78】

前記少なくとも５０個のＲＮＡは、少なくとも１００、少なくとも５００、少なくとも１，０００、少なくとも５，０００、少なくとも１０，０００、少なくとも５０，０００、または少なくとも１００，０００個のＲＮＡを含み、前記少なくとも１００、少なくとも５００、少なくとも１，０００、少なくとも５，０００、少なくとも１０，０００、少なくとも５０，０００、または少なくとも１００，０００個のＲＮＡの少なくとも約９０％は、ライブラリー中の前記少なくとも１００、少なくとも５００、少なくとも１，０００、少なくとも５，０００、少なくとも１０，０００、少なくとも５０，０００、または少なくとも１００，０００個のＲＮＡについての平均頻度の１．５倍以内の量で前記核酸ライブラリー中にそれぞれ存在する、請求項７７に記載の核酸ライブラリー。

【請求項79】

前記異なるｇＲＮＡ配列は、少なくとも８０ヌクレオチド長を含む、請求項７７に記載の核酸ライブラリー。

【請求項80】

前記異なるｇＲＮＡ配列は、少なくとも１００個の異なるｇＲＮＡ配列を含む、請求項７７に記載の核酸ライブラリー。

【請求項81】

前記少なくとも５０個のＲＮＡの少なくとも約９５％は、ライブラリー中のＲＮＡのそれぞれについての平均頻度の１．５倍以内の量で前記核酸ライブラリー中にそれぞれ存在する、請求項７７に記載の核酸ライブラリー。

【請求項82】

前記少なくとも５０個のＲＮＡの少なくとも約９９％は、ライブラリー中のＲＮＡのそれぞれについての平均頻度の１．５倍以内の量で前記核酸ライブラリー中にそれぞれ存在する、請求項７７に記載の核酸ライブラリー。

【請求項83】

修飾されたポリペプチド組成物であって、前記修飾されたポリペプチド組成物は、
精製されたＲＮＡポリメラーゼ、またはその機能的断片あるいはバリアントと、
精製された核酸結合タンパク質、任意選択で、タンパク質を含有するジンクフィンガー、またはその機能的断片あるいはバリアントとを含み、
前記精製されたＲＮＡポリメラーゼおよび前記精製された核酸結合タンパク質は、異種であり、前記精製されたＲＮＡポリメラーゼおよび精製された核酸結合タンパク質は連結される、
組成物。

【請求項84】

前記精製されたＲＮＡポリメラーゼおよび精製された核酸結合タンパク質は、コンジュゲーションによって連結される、請求項８３に記載の修飾されたポリペプチド組成物。

【請求項85】

前記精製されたＲＮＡポリメラーゼおよび精製された核酸結合タンパク質は、融合によって連結される、請求項８３に記載の修飾されたポリペプチド組成物。

【請求項86】

前記精製された核酸結合タンパク質は、前記精製されたＲＮＡポリメラーゼのＮ末端に連結される、請求項８３に記載の修飾されたポリペプチド組成物。

【請求項87】

前記精製された核酸結合タンパク質は、前記精製されたＲＮＡポリメラーゼのＣ末端に連結される、請求項８３に記載の修飾されたポリペプチド組成物。

【請求項88】

前記精製されたＲＮＡポリメラーゼは、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼである、請求項８３に記載の修飾されたポリペプチド組成物。

【請求項89】

前記精製された核酸結合タンパク質は、ジンクフィンガードメイン、ロイシンジッパー、ヘリックスターンヘリックス（ＨＴＨ）モチーフ、ヘリックスループヘリックス（ＨＬＨ）モチーフ、ウィングドヘリックス（ＷＨ）、ウィングドＨＴＨ（ＷＨＴＨ）モチーフ、高移動度群（ＨＭＧ）ボックス、白色不透明レギュレーター３（Ｗｈｉｔｅ－Ｏｐａｑｕｅ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ３／Ｗｏｒ３）ドメイン、オリゴヌクレオチド／オリゴ糖結合（ＯＢ）フォールドドメイン、免疫グロブリンフォールド、Ｂ３ドメイン、転写アクチベーター様エフェクター（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ａｃｔｉｖａｔｏｒ－Ｌｉｋｅ Ｅｆｆｅｃｔｏｒ／ＴＡＬＥ）、ＴＡＬＥ様タンパク質、またはクラスター化され規則的に間隔が空いた短い回文構造の繰り返し（ＣＲＩＳＰＲ）関連Ｃａｓタンパク質を含む、請求項８３に記載の修飾されたポリペプチド組成物。

【請求項90】

前記精製された核酸結合タンパク質は、ジンクフィンガードメインを含む、請求項８９に記載の修飾されたポリペプチド組成物。

【請求項91】

組成物であって、前記組成物は、
融合ＲＮＡポリメラーゼ、またはその機能的断片あるいはバリアントとＤＮＡポリヌクレオチドとを含み、前記融合ＲＮＡポリメラーゼは、
（ｉ）ＲＮＡポリメラーゼ、またはその機能的断片あるいはバリアント、および
（ｉｉ）ＤＮＡ結合タンパク質、またはその機能的断片あるいはバリアントを含み、前記ＲＮＡポリメラーゼおよび前記ＤＮＡ結合タンパク質は異種である、
組成物。

【請求項92】

前記ＤＮＡポリヌクレオチドは、一本鎖ＤＮＡポリヌクレオチドである、請求項９１に記載の組成物。

【請求項93】

前記ＤＮＡポリヌクレオチドは３’の二次構造を含む、請求項９１または９２に記載の組成物。

【請求項94】

前記３’の二次構造はヘアピンを含む、請求項９３に記載の組成物。

【請求項95】

修飾されたポリペプチドであって、前記修飾されたポリペプチドは、
バリアントＴ７ ＲＮＡポリメラーゼまたはその機能的断片を含み、前記バリアントＴ７ ＲＮＡポリメラーゼは、Ｋ１７２Ｌ、Ｐ２６６Ｌ、Ｈ７７２Ｒ、Ｎ７４８Ｘ、Ｒ７５６Ｍ、Ｑ７５８Ｘ、およびＥ７７５Ｖからなる群から選択される少なくとも４つのバリエーションを含み、その位置は配列番号１とのアラインメントによって決定され、Ｘは野生型アミノ酸とは異なる任意のアミノ酸である、
修飾されたポリペプチド。

【請求項96】

修飾されたポリペプチドであって、前記修飾されたポリペプチドは、
バリアントＴ７ ＲＮＡポリメラーゼまたはその機能的断片を含み、前記バリアントＴ７ ＲＮＡポリメラーゼは、Ｋ１７２Ｌ、Ｐ２６６Ｌ、Ｈ７７２Ｒ、Ｎ７４８Ｘ、Ｒ７５６Ｍ、Ｑ７５８Ｘ、およびＥ７７５Ｖからなる群から選択される少なくとも１つのバリエーションを含み、その位置は配列番号１とのアラインメントによって決定され、Ｘは、野生型アミノ酸とは異なる任意のアミノ酸であり、前記修飾されたポリペプチドは表面上で固定される、
修飾されたポリペプチド。

【請求項97】

前記バリアントＴ７ ＲＮＡポリメラーゼまたはその機能的断片は、ＤＮＡ結合タンパク質に連結される、請求項９５または９６に記載の修飾されたポリペプチド。

【請求項98】

前記バリアントＴ７ ＲＮＡポリメラーゼまたはその機能的断片は、融合によって前記ＤＮＡ結合タンパク質に連結される、請求項９７に記載の修飾されたポリペプチド。

【請求項99】

前記バリアントＴ７ ＲＮＡポリメラーゼまたはその機能的断片は、コンジュゲーションによって前記ＤＮＡ結合タンパク質に連結される、請求項９７に記載の修飾されたポリペプチド。

【請求項100】

前記ＤＮＡ結合タンパク質は、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼのＮ末端に連結される、請求項９７に記載の修飾されたポリペプチド。

【請求項101】

前記ＤＮＡ結合タンパク質は、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼのＣ末端に連結される、請求項９７に記載の修飾されたポリペプチド。

【請求項102】

前記バリアントＴ７ ＲＮＡポリメラーゼまたはその機能的断片は、配列番号１に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含む、請求項９５または９６に記載の修飾されたポリペプチド。

【請求項103】

前記バリアントＴ７ ＲＮＡポリメラーゼまたはその機能的断片は、配列番号１に記載の配列を含むＴ７ ＲＮＡポリメラーゼと比較して、転写開始および／または伸長プロセス中の安定性の増加を示す、請求項９５または９６に記載の修飾されたポリペプチド。

【請求項104】

前記バリアントＴ７ ＲＮＡポリメラーゼまたはその機能的断片は、配列番号１に記載の配列を含むＴ７ ＲＮＡポリメラーゼと比較して、Ｔ７プロモーター配列に対する結合親和性の減少を示す、請求項９５または９６に記載の修飾されたポリペプチド。

【請求項105】

デバイスであって、前記デバイスは、
表面と、
Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、またはその機能的断片あるいはバリアントと、
ＤＮＡ鋳型であって、前記ＤＮＡ鋳型はトランケートされたＴ７プロモーター配列を含むＤＮＡ鋳型とを含み、
前記Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、その機能的断片またはバリアント、あるいはＤＮＡ鋳型は前記表面に連結される、
デバイス。

【請求項106】

前記表面に連結された核酸結合タンパク質、またはその機能的断片あるいはバリアントをさらに含む、請求項１０５に記載のデバイス。

【請求項107】

前記表面は固体表面である、請求項１０５または１０６に記載のデバイス。

【請求項108】

前記固体表面は、磁気ビーズ、アガロースビーズ、溶融石英、ゾル－ゲル、シリカポリマー、シリカモノリス、セルロース、寒天、アクリルアミド、または金ビーズを含む、請求項１０７に記載のデバイス。

【請求項109】

前記固体表面は、前記Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、前記ＤＮＡ鋳型、または前記核酸結合タンパク質のカプセル化あるいは取り込みのためのゲルマトリックスを含む、請求項１０７に記載のデバイス。

【請求項110】

前記核酸結合タンパク質はストレプトアビジンタグを含む、請求項１０６に記載のデバイス。

【請求項111】

前記Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼは固定される、請求項１０５に記載のデバイス。

【請求項112】

前記ＤＮＡ鋳型は固定される、請求項１０５に記載のデバイス。

【請求項113】

前記核酸結合タンパク質、またはその前記機能的断片あるいはバリアントは、ジンクフィンガードメイン、ロイシンジッパー、ヘリックスターンヘリックス（ＨＴＨ）モチーフ、ヘリックスループヘリックス（ＨＬＨ）モチーフ、ウィングドヘリックス（ＷＨ）、ウィングドＨＴＨ（ＷＨＴＨ）モチーフ、高移動度群（ＨＭＧ）ボックス、白色不透明レギュレーター３（Ｗｈｉｔｅ－Ｏｐａｑｕｅ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ３／Ｗｏｒ３）ドメイン、オリゴヌクレオチド／オリゴ糖結合（ＯＢ）フォールドドメイン、免疫グロブリンフォールド、Ｂ３ドメイン、転写アクチベーター様エフェクター（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ａｃｔｉｖａｔｏｒ－Ｌｉｋｅ Ｅｆｆｅｃｔｏｒ／ＴＡＬＥ）、ＴＡＬＥ様タンパク質、またはクラスター化され規則的に間隔が空いた短い回文構造の繰り返し（ＣＲＩＳＰＲ）関連Ｃａｓタンパク質を含む、請求項１０５に記載のデバイス。

【請求項114】

前記核酸結合タンパク質、またはその機能的断片あるいはバリアントは、配列特異的結合によって核酸に結合する、請求項１０６に記載のデバイス。

【請求項115】

前記核酸結合タンパク質、またはその機能的断片あるいはバリアントは、核酸上の１つ以上の化学修飾を通じて核酸に結合する、請求項１０６に記載のデバイス。

【請求項116】

前記１つ以上の化学修飾は、ビオチンまたはアビジンを含む、請求項１１５に記載のデバイス。

【請求項117】

前記ＤＮＡ結合タンパク質は、ジンクフィンガードメイン、ロイシンジッパー、ヘリックスターンヘリックス（ＨＴＨ）モチーフ、ヘリックスループヘリックス（ＨＬＨ）モチーフ、ウィングドヘリックス（ＷＨ）、ウィングドＨＴＨ（ＷＨＴＨ）モチーフ、高移動度群（ＨＭＧ）ボックス、白色不透明レギュレーター３（Ｗｈｉｔｅ－Ｏｐａｑｕｅ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ３／Ｗｏｒ３）ドメイン、オリゴヌクレオチド／オリゴ糖結合（ＯＢ）フォールドドメイン、免疫グロブリンフォールド、Ｂ３ドメイン、転写アクチベーター様エフェクター（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ａｃｔｉｖａｔｏｒ－Ｌｉｋｅ Ｅｆｆｅｃｔｏｒ／ＴＡＬＥ）、ＴＡＬＥ様タンパク質、またはクラスター化され規則的に間隔が空いた短い回文構造の繰り返し（ＣＲＩＳＰＲ）関連Ｃａｓタンパク質を含む、請求項１０５に記載のデバイス。

【請求項118】

前記ＤＮＡ鋳型は、配列番号７を含む配列を含む、請求項１０５に記載のデバイス。

【請求項119】

前記バリアントＴ７ ＲＮＡポリメラーゼまたはそのバリアントは、配列番号１に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含む、請求項１０５に記載のデバイス。

【請求項120】

圧電振動子、回転バルブ、ペルチェヒーター、電圧コントローラ、シリンジポンプ、紫外線ＬＥＤ、およびセンサーまたは真空ポンプをさらに含む、請求項１０５に記載のデバイス。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

相互参照
本出願は、２０２０年１０月２３日に出願された、米国仮特許出願第６３／１０４，７３５の利益を主張するものであり、その全体が参照により本明細書に援用される。

【背景技術】

【0002】

ＲＮＡ分子が細胞において重要かつ多様な役割を果たすことから、ＲＮＡに基づく療法は様々な疾患を処置するための魅力的な薬物分類である。対象の遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、またはマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、およびアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）などの非コードＲＮＡを送達することによって、遺伝子発現を調節するＲＮＡ療法は著しく進歩した。加えて、クラスター化され規則的に間隔が空いた短い回文構造の繰り返し（ＣＲＩＳＰＲ）－ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質系のためのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）は、ゲノム編集のために標的部位にＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系をガイドする際に必須の役割を果たす。プラスミドＤＮＡの代わりに合成ＲＮＡを使用することによって、ＲＮＡ分子の比較的短い半減期に起因して最小限のオフターゲット活性を用いた信頼できる手法が提供される。

【0003】

現在利用可能なＲＮＡ合成方法は、短鎖ＲＮＡ分子に対する化学合成、およびｉｎ ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）などの長鎖ＲＮＡ分子に対する酵素的合成を含む。化学合成は、純粋かつ高品質のＲＮＡ分子を提供し、広範な種類の位置特異的なカスタム修飾を提示する一方で、スケールアップに要する高額な費用および低速度の問題が生じる。ＩＶＴによってそれほど高価でない溶液は得られるが、これはエラー率が高く、多くの人手を要する傾向があり、配列編集が制限される。速く、正確で、自動化された、スケーラブルな、かつ費用対効果の高いＲＮＡ合成プラットフォームを開発するニーズがある。

【発明の概要】

【0004】

一態様では、ＲＮＡを合成するための方法が本明細書に提供され、上記方法は、表面上で固定されたＲＮＡポリメラーゼを提供する工程と、毎時少なくとも５０ヌクレオチドの伸長速度で複数のｇＲＮＡを合成する工程であって、ｇＲＮＡのそれぞれはあらかじめ選択された配列を有しており、合成する工程は１つの伸長反応において一塩基ずつ伸長させることを含む工程とを含む。別の態様では、ＲＮＡを合成するための方法が本明細書に提供され、上記方法は、融合ＲＮＡポリメラーゼ、またはその機能的断片あるいはバリアントを提供する工程と、毎時少なくとも５０ヌクレオチドの伸長速度で複数のｇＲＮＡを合成する工程であって、ｇＲＮＡのそれぞれはあらかじめ選択された配列を有しており、合成する工程は１つの伸長反応において一塩基ずつ伸長させることを含む工程とを含む。いくつかの実施形態では、伸長速度は毎分少なくとも５０ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、伸長速度は毎秒少なくとも５０ヌクレオチドである。

【0005】

別の態様では、複数の精製されたＲＮＡと、トランケートされたＲＮＡポリメラーゼプロモーター領域をコードする少なくとも１つの一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）とを含む核酸ライブラリーが本明細書に提供される。さらに、少なくとも８０ヌクレオチド長の複数の精製されたガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）および２～１０ヌクレオチド長の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含む核酸ライブラリーが本明細書に提供される。いくつかの態様では、少なくとも５０個のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む核酸ライブラリーを作製する方法が本明細書に提供され、上記方法は、ＲＮＡポリメラーゼを使用して少なくとも５０個のｇＲＮＡを合成する工程であって、少なくとも５０個のｇＲＮＡのうちの少なくとも１つは標的遺伝子中の標的配列に相補的なスペーサー配列を含み、スペーサー配列の５’末端ヌクレオチドは標的配列の３’末端ヌクレオチドに相補的である工程を含む。いくつかの態様では、５’末端グアニン（Ｇ）アナログを含むｇＲＮＡ配列を含む少なくとも５０個の精製されたガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む核酸ライブラリーが本明細書に提供される。

【0006】

いくつかの態様では、核酸ライブラリーが本明細書に提供され、核酸ライブラリーは少なくとも５０個のＲＮＡを含み、少なくとも５０個のＲＮＡのそれぞれは異なるガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）配列をコードし、少なくとも５０個のＲＮＡの少なくとも約９０％は、ライブラリー中の少なくとも５０個のＲＮＡについての平均頻度の１．５倍以内の量で核酸ライブラリー中にそれぞれ存在する。いくつかの実施形態では、少なくとも５０個のＲＮＡの少なくとも約９５％は、ライブラリー中の少なくとも５０個のＲＮＡについての平均頻度の１．５倍以内の量で核酸ライブラリー中にそれぞれ存在する。いくつかの実施形態では、少なくとも５０個のＲＮＡの少なくとも約９９％は、ライブラリー中の少なくとも５０個のＲＮＡについての平均頻度の１．５倍以内の量で核酸ライブラリー中にそれぞれ存在する。

【0007】

一態様では、修飾されたポリペプチド組成物が本明細書に提供され、修飾されたポリペプチド組成物は、精製されたＲＮＡポリメラーゼ、またはその機能的断片あるいはバリアントと、精製された核酸結合タンパク質、任意選択で、タンパク質を含有するジンクフィンガー、またはその機能的断片あるいはバリアントとを含み、精製されたＲＮＡポリメラーゼおよび核酸結合タンパク質は異種であり、精製されたＲＮＡポリメラーゼおよび精製された核酸結合タンパク質は連結される。別の態様では、融合ＲＮＡポリメラーゼ、またはその機能的断片あるいはバリアントとＤＮＡポリヌクレオチドとを含む組成物が本明細書に提供され、融合ＲＮＡポリメラーゼは、（ｉ）ＲＮＡポリメラーゼまたはその断片と、（ｉｉ）ＤＮＡ結合タンパク質とを含み、ＲＮＡポリメラーゼおよびＤＮＡ結合タンパク質は異種である。

【0008】

一態様では、修飾されたポリペプチドが本明細書に提供され、バリアントＴ７ ＲＮＡポリメラーゼまたはその機能的断片を含み、バリアントＴ７ ＲＮＡポリメラーゼは、Ｋ１７２Ｌ、Ｐ２６６Ｌ、Ｈ７７２Ｒ、Ｎ７４８Ｘ、Ｒ７５６Ｍ、Ｑ７５８Ｘ、およびＥ７７５Ｖからなる群から選択される少なくとも４つのバリエーションを含み、その位置は配列番号１とのアラインメントによって決定される。他の態様では、修飾されたポリペプチドが本明細書に提供され、バリアントＴ７ ＲＮＡポリメラーゼまたはその機能的断片を含み、バリアントＴ７ ＲＮＡポリメラーゼは、Ｋ１７２Ｌ、Ｐ２６６Ｌ、Ｈ７７２Ｒ、Ｎ７４８Ｘ、Ｒ７５６Ｍ、Ｑ７５８Ｘ、およびＥ７７５Ｖからなる群から選択される少なくとも１つのバリエーションを含み、その位置は配列番号１とのアラインメントによって決定され、修飾されたポリペプチドは表面上で固定される。

【0009】

一態様では、デバイスであって、表面と、表面に連結された核酸結合タンパク質、またはその機能的断片あるいはバリアントと、ＤＮＡ結合タンパク質に連結されたＴ７ ＲＮＡポリメラーゼまたはそのバリアントと、トランケートされたＴ７プロモーター配列を含むＤＮＡ鋳型とを含む、デバイスが本明細書に提供される。

【0010】

参照による援用
本明細書で言及されるすべての刊行物、特許、および特許出願は、あたかも個々の刊行物、特許、または特許出願がそれぞれ参照により本明細書に具体的かつ個別に援用されるのと同じ程度にまで、参照により本明細書に援用される。

【図面の簡単な説明】

【0011】

本開示の特徴は、特に添付の特許請求の範囲に明記される。本開示の特徴と利点についてのよりよい理解は、本開示の原則が用いられている例証的な実施形態を説明する以下の詳細な記載と添付の図面とを参照することによって得られる。

【0012】

【図1】マイクロ流体ポリヌクレオチド合成の例示的なワークフローの図を描く。

【図2】マイクロ流体ポリヌクレオチド合成の表面機能化の例示的なプロセスの図を描く。

【図3A】例示的なマイクロ流体ポリヌクレオチド合成の図を描く。

【図3B】例示的なマイクロ流体ポリヌクレオチド合成の図を描く。

【図4】ＲＮＡ転写（上部）のためのＤＮＡ鋳型およびその予測された第２のヘアピン構造（下部）の略図を描く。ＶはＲＮＡ転写のための鋳型、ＷはＤＮＡ融解部位、Ｘはポリメラーゼプロモーター配列Ｚに逆相補的でありＺとハイブリダイズする配列、ＹはＸとＺを接続するループ領域、およびＺはＸとハイブリダイズするポリメラーゼプロモーター配列を表す。

【図5】標的ＤＮＡ配列と一致しない付加的な５’グアニン（Ｇ）ヌクレオチドを含有している例示的なガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を描く。

【図6】完全に標的ＤＮＡ配列と一致する例示的なガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を描く。

【図7】コンピュータシステムを説明する。

【図8】コンピュータシステムの構造を説明するブロック図である。

【図9】複数のコンピュータシステム、複数の携帯電話、および個人用携帯情報端末、ならびにネットワーク接続ストレージ（ＮＡＳ）を組み込むように構成されたネットワークを説明する図である。

【図10】共有仮想アドレスメモリ空間を用いた、マルチプロセッサコンピュータシステムのブロック図である。

【図11】ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）の純度を比較するプロットを描く。各グラフは、マイクロ流体ポリヌクレオチド合成方法によって産生されたｇＲＮＡ（オレンジ色）、化学合成によって産生されたｇＲＮＡ（青色）、またはｉｎ ｖｉｔｒｏ転写によって産生されたｇＲＮＡ（緑色）を表す。Ｘ軸は溶出時間であり、Ｙ軸は規格化された蛍光単位である。

【図12】ｇＲＮＡの純度を比較するプロットを描く。各グラフは、マイクロ流体ポリヌクレオチド合成方法によって産生されたｇＲＮＡ（青色）、または３つの異なるｉｎ ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）キットによって産生されたｇＲＮＡ（緑色、赤色、紫色）を表す。Ｘ軸は実行時間（秒）であり、Ｙ軸は規格化された蛍光単位である。

【図13】ｇＲＮＡの純度を比較するプロットを描く。各グラフは、マイクロ流体ポリヌクレオチド合成方法によって産生された８つの異なるｇＲＮＡ試料を表す。Ｘ軸は実行時間（秒）であり、Ｙ軸は規格化された蛍光単位である。

【図14】様々な時点での、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９による標的ＤＮＡの切断についてのｉｎ ｖｉｔｒｏ切断アッセイのＤＮＡアガロースゲル電気泳動分析を描く。レーン１：ラダー、レーン２：ブランク、レーン３：０分で得られた、ヘアピンＤＮＡ鋳型を使用してｉｎ ｖｉｔｒｏ転写によって産生されたｇＲＮＡ、レーン４：５分で得られた、市販のｉｎ ｖｉｔｒｏ転写を行ったｇＲＮＡ１、レーン５：５分で得られた、市販の化学合成を行ったｇＲＮＡ２、レーン６：５分で得られた、ヘアピン一本鎖ＤＮＡ鋳型を使用してｉｎ ｖｉｔｒｏ転写によって産生されたｇＲＮＡである。

【図15A】挿入および／または欠失（インデル）のスペクトルおよびそれらの頻度を示すシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）の分解によるインデルのトラッキング（ＴＩＤＥ）分析を描く。Ｘ軸はインデルのスペクトルを示し、Ｙ軸は配列の割合（％）である。左上隅に編集の総合効率（％）が示され、右上隅に決定係数（ｒ２）が示される。

【図15B】インデルのスペクトルおよびそれらの頻度を示すｓｇＲＮＡの分解によるインデルのトラッキング（ＴＩＤＥ）分析を描く。Ｘ軸はインデルのスペクトルを示し、Ｙ軸は配列の割合（％）である。左上隅に編集の総合効率（％）が示され、右上隅に決定係数（ｒ^２）が示される。

【図16A】ＲＮＡポリメラーゼドメインおよびＤＮＡ結合ドメインを含有している市販の酵素ならびに融合酵素の酵素活性を比較するリボヌクレオチドの転写産物の実時間測定のプロットを描く。Ｘ軸は時間を示し、Ｙ軸は蛍光読取を相対蛍光単位（ＲＦＵ）で示す。

【図16B】リボヌクレオチドの転写産物の実時間測定のプロットを描く。Ｘ軸は時間を示し、Ｙ軸は蛍光読取を相対蛍光単位（ＲＦＵ）で示す。

【図17A】リボヌクレオチドの転写産物の実時間測定のプロットを描く。Ｘ軸は時間を示し、Ｙ軸は蛍光読取を相対蛍光単位（ＲＦＵ）で示す。

【図17B】トランケートされたプロモーターと従来のプロモーターとを比較するＲＮＡ収率の改善のプロットを描く。Ｘ軸はトランケートされたプロモーターの長さを示し、Ｙ軸は倍数改善を示す。

【発明を実施するための形態】

【0013】

迅速で、高効率的で、正確で、純粋なＲＮＡ産生ができるマイクロ流体ワークフローを使用して、ポリヌクレオチドを生成するための方法、組成物、およびデバイスが本明細書に提供される。本明細書に記載される方法、組成物、およびデバイスは、効率的なＲＮＡポリメラーゼ酵素、マイクロ流体力学、増強された動態、減少したオフターゲット効果を使用して、ポリヌクレオチドを合成する手段を提供する。いくつかの態様では、本明細書に記載される方法、組成物、およびデバイスは、ポリヌクレオチド合成のための単一ユニットのカートリッジベースの携帯可能なシステムを提供する。

【0014】

定義

【0015】

本明細書と添付の特許請求の範囲で使用されるとき、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、別段明示されない限り、複数の指示物を含む。用語「または」は、その内容がそれ以外のものを明確に指示していない限り、「および／または」を含む意味で一般に用いられていることにも留意されたい。本明細書で使用されるとき「および／または」、「そのあらゆる組合せ」という用語およびそれらの文法の当量は、交換可能に使用することができる。これらの用語は、どの組合せも具体的に企図されると伝えることができる。単に例示の目的のために、「Ａ、Ｂ、および／またはＣ」あるいは、「Ａ、Ｂ、Ｃ、またはそのあらゆる組合せ」という句は、「Ａ単独で、Ｂ単独で、Ｃ単独で、ＡおよびＢ、ＢおよびＣ、ＡおよびＣ、ならびにＡ、Ｂ、およびＣ」を意味することができる。用語「または」は、もし文脈が特に選言的な使用を具体的に言及していない限り、接続的にまたは選言的に使用することができる。

【0016】

「約（ａｂｏｕｔ）」または「およそ（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」という用語は、当業者によって決定されるような特定の値の許容可能な誤差範囲内であることを意味することができ、これは、その値がどのように測定または決定されるか、つまり、測定系の制限に部分的に依存している。例えば、「約」とは、当該技術分野での実践につき１または１を超える標準偏差を意味し得る。代替的に、「約」とは所定の値の最大２０％、最大１０％、最大５％、または最大１％の範囲内を意味し得る。代替的に、とりわけ生体系または生物学的プロセスに関して、この用語はある値の１桁以内、５倍以内、より好ましくは２倍以内を意味することがある。特定の値が本出願と特許請求の範囲に記載されている場合、特段の定めのない限り、特定の値の許容可能な誤差範囲内を意味する「約」との用語が仮定されなければならない。

【0017】

本開示全体にわたって、数値的特徴は範囲形式で示される。範囲形式での記載は単に利便性と簡潔さのためのものに過ぎず、任意の実施形態の範囲に対する確固たる限定として解釈されてはならないということを理解されたい。これに応じて、範囲の記載は、文脈で別段の定めのない限り、すべての可能性のある下位範囲と、下限の単位の小数第２位までのその範囲内の個々の数値を具体的に開示していると考えられなければならない。例えば、１～６などの範囲の記載は、１～３、１～４、１～５、２～４、２～６、３～６などの下位範囲と、例えば、１．１、２、２．３、５、および５．９のその範囲内の個々の数値を具体的に開示していると考えられなければならない。これは、範囲の広さにかかわらず適用される。これらの介在する範囲の上限および下限は、より小さな範囲内に独立して含まれてもよく、また、定められた範囲内のあらゆる具体的に除外された限界に従って、本発明内に包含される。定められた範囲が上限および下限の１つまたはその両方を含む場合、これらの含まれた上限および下限のいずれかまたは両方を除く範囲も、文脈から明確に指示されない限り、本発明内に包含される。

【0018】

本明細書および特許請求の範囲で使用されるとき、単語「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」（および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」と「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」などの「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」の語形）、「有している（ｈａｖｉｎｇ）」（および「有する（ｈａｖｅ）」と「有する（ｈａｓ）」などの「有している（ｈａｖｉｎｇ）」の語形）、「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」（および「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」と「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」などの「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」の語形）、または「含んでいる（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」（および「含む（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」と「含む（ｃｏｎｔａｉｎ）」などの「含んでいる（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」の語形）は、包括的または無制限であり、および追加の列挙されていない要素または方法工程を除外しない。本明細書で論じられるいかなる実施形態も、本開示の方法または組成物に関して実施することができ、逆もまた同様である。さらに、本開示の組成物は、本開示の方法を達成するために使用することができる。

【0019】

本明細書における「いくつかの実施形態」、「実施形態」、「一実施形態」または「他の実施形態」への言及は、実施形態と関連して記載される特定の特徴、構造または特性が、本発明の少なくともいくつかの実施形態に含まれるが、必ずしも本開示のすべての実施形態には含まれないことを意味する。本開示の理解を促すために、多くの用語や成句は以下のように定義される。

【0020】

本明細書で使用されるとき、「あらかじめ選択された配列（ｐｒｅｓｅｌｅｃｔｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）、「あらかじめ定められた配列（ｐｒｅｄｅｆｉｎｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」、または「あらかじめ決定された配列（ｐｒｅｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」という用語は、交換可能に使用される。用語は、ポリ核酸配列が、公知であり、ポリ核酸の合成または組立の前に選択されることを意味する。特に、本明細書に記載される本発明の様々な態様は、主に核酸分子の調製に関するものであり、ポリ核酸配列は、公知であり、核酸分子の合成または組立の前に選択される。

【0021】

ポリペプチドまたはタンパク質を記載するために使用された命名法は、各アミノ酸残基のアミノ基が左（アミノ－またはＮ末端）、およびカルボキシル基が右（カルボキシ－またはＣ末端）にある従来の実施に従っている。アミノ酸残基位置がポリペプチドまたはタンパク質中で参照される場合、それらはアミノからカルボキシルの方向へ番号を付けられ、１番目の位置は、その残基が一部分であり得るポリペプチドまたはタンパク質のアミノ末端にある残基である。本明細書に記載されるペプチドのアミノ酸配列は、標準の単一の文字シンボルを使用して通常指定される。（Ａはアラニン、Ｃはシステイン、Ｄはアスパラギン酸、Ｅはグルタミン酸、Ｆはフェニルアラニン、Ｇはグリシン、Ｈはヒスチジン、Ｉはイソロイシン、Ｋはリシン、Ｌはロイシン、Ｍはメチオニン、Ｎはアスパラギン、Ｐはプロリン、Ｑはグルタミン、Ｒはアルギニン、Ｓはセリン、Ｔはトレオニン、Ｖはバリン、Ｗはトリプトファン、およびＹはチロシンである）。

【0022】

この記載の特定の詳細は、様々な実施形態についての完全な理解を提供するために記載される。しかし、当業者はこれらの詳細がなくとも、本開示が実行され得ることが理解されよう。他の例では、実施形態の記載を不必要に不明瞭にしないように、周知の構造は詳細に描かれたり示されたりしていない。文脈が特別に必要としない限り、以下の明細書と請求項の全体にわたって、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という単語およびその変更形態（例えば、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」または「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」）は、開かれた包括的な意味で、すなわち、「限定されないが、～を含む」という意味で解釈されるものとする。さらに、本明細書で提供される見出しは、便宜上のものであり、本開示の範囲や意味を解釈するものではない。

【0023】

他に特段の定義のない限り、本明細書で使用される技術用語および科学用語はすべて、本開示が属する当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有している。本明細書に記載される方法および物質に類似したまたは同等の方法および物質は、本開示の実施または試験に使用され得るが、適切な方法および物質が以下に記載される。

【0024】

マイクロ流体ポリヌクレオチド合成、デバイス、およびシステム

【0025】

速く、純粋、かつ正確な方法でポリヌクレオチドを産生する方法、組成物、デバイス、およびシステムが本明細書に提供される。さらに、マイクロ流体力学、増強された動態、および減少したオフターゲット効果を用いて非常に正確で効率的なポリヌクレオチド合成ができる単一ユニットのカートリッジベースのシステムを使用して、ポリヌクレオチドを産生するためのデバイスおよびシステムが本明細書に提供される。オリゴヌクレオチド、オリゴ、およびポリヌクレオチドという用語は全体で同義であると定義される。本明細書に記載された核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）のライブラリーは、コードまたは非コードのＲＮＡ配列を集団的にコードする複数のポリヌクレオチドを含み得る。いくつかの例では、コード配列はメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を含み得る。いくつかの例では、非コードの配列は、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、ｐｉｗｉ相互作用ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）、ＲＮＡアプタマー、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、またはアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）を含み得る。いくつかの例では、核酸ライブラリーは複数のポリヌクレオチドを含み、各ポリヌクレオチドは異なる配列をコードし得る。

【0026】

マイクロ流体ワークフローを使用した、ポリヌクレオチドの産生のための方法、組成物、デバイス、およびシステムが本明細書に提供される。マイクロ流体力学は、キャピラリー浸透が大量輸送を向ける小規模（１０～１００μｍ）に幾何学的に抑制されるチャネルのネットワーク中で、μＬからｐＬへの範囲中で、流体を制御および操作する科学を利用する。マイクロ流体力学によって、試料および試薬の消費の減少、より短い実験時間、ならびに適用にかかる全体的なコストの削減を含む多くの利点が提示される。加えて、マイクロ流体力学によって、ポリヌクレオチド合成の自動化および小型化が可能になり、これにより合成の精密さと正確さを改善し、１つのマイクロ流体のチップまたはカートリッジ中の多数のチャンバを同時に作動することによって非常に迅速に合成を行うことができる。

【0027】

例示的なワークフローでは、本明細書に記載されたカートリッジ中のマイクロ流体ポリヌクレオチド合成は、表面の機能化、ＲＮＡ合成、およびＲＮＡ精製と品質管理の３つのステージを含み得る（図１）。ステージ１では、表面はマイクロ流体カートリッジ中で転写系をセットアップするために機能化される。表面は、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＮＨＳ）官能基、無水トリフルオロ酢酸（ＴＦＡＡ）官能基、またはグルタルアルデヒド（ＧＡ）官能基を含むが、これらに限定されない官能基を用いた表面の活性化により機能化され得る。例えば、ポリヌクレオチドの付着と合成を支持するために、標準Ｎ－ヒドロキシ－スクシンイミド（ＮＨＳ）官能基を用いて活性化される磁気ビーズまたはアガロースビーズなどの表面は、マイクロ流体カートリッジの各反応チャンバで提供される（図１および図２）。ＮＨＳ官能基（２０１）は、標的タンパク質、例えば、ストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐ）（２０２）などのＤＮＡ結合タンパク質またはその機能的断片上で第一級アミンと反応し得、安定したアミド結合を形成する（図２のステップ１）。その後、マイクロ流体ポリヌクレオチド合成に要する他の必要な要素（例えば、転写タンパク質）が添加される前に、ＮＨＳ反応はクエンチされることがある。この２段階反応により、ＮＨＳ反応化学から、ポリメラーゼを含む他の転写複合タンパク質が防御され得る。結果として生じる固定されたタンパク質は、ビーズ（２０３）に共有結合でコンジュゲートされ、ビーズ表面からの浸出に高い耐性を示し得る。各ビーズは、図２において１つの合成反応が発生し得る１つのチャンバを表すが、１つより多くのビーズが各チャンバで提供され得る。その後、転写複合体（２０４）が組み立てられる（図２のステップ２）。ポリメラーゼの例として、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ（２０５）が、任意選択で、ＤＮＡ結合タンパク質を融合パートナー１に連結し、かつポリメラーゼを融合パートナー２に連結するリンカーを用いて、安定した転写複合体（２０４）を形成するために、融合パートナー相互作用（２０６）（図２のステップ２において青色の三角形および紫色の三角形）を通じてＤＮＡ結合タンパク質またはその機能的断片（例えば、ｓｔｒｅｐ、もしくはジンクフィンガーアレイタンパク質）に添加され、結合する。その後、ＤＮＡ鋳型が、ＤＮＡ結合タンパク質またはその機能的断片に添加され、結合する（図２のステップ３）。例えば、ＤＮＡ鋳型は、図２に示されるようなｓｔｒｅｐとの相互作用のためにビオチン化（２０７）され得る。別の例では、ＤＮＡ鋳型は、ポリメラーゼと融合されたＤＮＡ結合タンパク質（例えば、ＺＦＡ）を通じてポリメラーゼとの相互作用のためのＤＮＡ結合標的配列（例えば、ジンクフィンガーアレイ（ＺＦＡ）結合配列）を含み得る。本明細書に記載されるようなＤＮＡ鋳型は、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）、部分的二本鎖ＤＮＡ、または一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）を含み得る。ＤＮＡ鋳型は、二次構造、例えばヘアピンを含むｓｓＤＮＡであり得る（図４）。本明細書に記載されるＤＮＡ鋳型は、ＲＮＡポリメラーゼが結合しＲＮＡ合成を開始するプロモーター領域を含み得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるプロモーター領域は、必須のプロモーター領域および／または非必須のプロモーター領域を含み得る。本明細書に記載されるＲＮＡポリメラーゼは、バクテリオファージＲＮＡポリメラーゼ、細菌ＲＮＡポリメラーゼ、または真核生物ＲＮＡポリメラーゼを含み得る。ファージＲＮＡポリメラーゼの非限定的な例として、Ｔ３ ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、ＫＰ３４ ＲＮＡポリメラーゼ、Ｎ４ ＲＮＡポリメラーゼ、およびＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼが挙げられる。例えば、ＲＮＡポリメラーゼは、図２に示されるようなＴ７ ＲＮＡポリメラーゼであり得る。本明細書に記載されるＲＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡ認識、ＤＮＡ結合親和性、ポリメラーゼ活性、またはポリメラーゼの安定性に影響し得る１つ以上のアミノ酸置換を含む野生型ＲＮＡポリメラーゼあるいはバリアントＲＮＡポリメラーゼを含み得る。本明細書に記載されるように、ＲＮＡポリメラーゼは、図２に示されるように、マイクロ流体ＲＮＡ合成のためのＤＮＡ鋳型を認識し結合することができるＲＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼまたはそのバリアント）および異種のＤＮＡ結合タンパク質またはドメイン（例えば、ｓｔｒｅｐまたはＺＦＡ）を含む融合タンパク質として提供され得る。いくつかの例では、ポリメラーゼは、カートリッジ中のバイオマトリックス中で乾燥され得る。この例では、ポリメラーゼは、カートリッジをマイクロ流体ポリヌクレオチド合成のために使用する前に再水和され得る。いくつかの例では、ポリメラーゼを含むカートリッジは、カートリッジ中のポリメラーゼを保存するためにドライアイス、氷、または室温中で輸送され得る。いくつかの例では、ＤＮＡ鋳型は、ビーズなどの表面に直接連結され得る。いくつかの例では、表面は、磁気ビーズ、アガロースビーズ、溶融石英、ゾル－ゲル、シリカポリマー、シリカモノリス、セルロース、寒天、アクリルアミド、金ビーズ、またはゲルマトリックスを含み得る。いくつかの例では、固体表面は、ＲＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡ鋳型、または核酸結合タンパク質のカプセル化あるいは取り込み（ｅｎｔｒａｐｍｅｎｔ）のためのゲルマトリックスを含むことがある。いくつかの例では、ＲＮＡポリメラーゼは、表面に連結されたＤＮＡ鋳型に結合し得る。

【0028】

ステージ２では、転写反応試薬（３０１）は、シリンジポンプによってマイクロ流体カートリッジに注入され、マイクロ流体ＲＮＡ合成用に各反応チャンバに固定されたＲＮＡポリメラーゼ（３０３）および固定されたＤＮＡ鋳型（３０４）を含む転写複合体（３０２）上に流される（図３Ａ）。転写反応試薬は、混合基、５’イニシエーターオリゴ、および３’ターミネーターオリゴを含むが、これらに限定されない。いくつかの例では、修飾された核酸塩基は、１つ以上の修飾を含むＲＮＡを合成するために使用され得る。例えば、混合基は、天然のヌクレオシド、ヌクレオシドアナログ、化学的に修飾された塩基、生物学的に修飾された塩基、インターカレートされた塩基、修飾された糖類、および／または修飾されたリン酸基を含み得る。マイクロ流体ＲＮＡ合成については、反応チャンバの温度を３７℃に維持するために熱電ペルチェ素子ヒーター（３０５）が利用され得る（図３Ｂ）。転写反応試薬が一方向へ各反応チャンバを通って流れるとともに、ＲＮＡは、産生され、流量によって制御されるため約数秒で反応チャンバから除去される（図３Ｂ）。

【0029】

ステージ３では、新たに合成されたポリヌクレオチド（例えばＲＮＡ）はマイクロピラーアレイおよび／または等速電気泳動（ＩＴＰ）精製プロセスあるいは当業者に知られている任意の既知の精製方法を使用して、抽出かつ精製され、その後、ＵＶ ＬＥＤおよびＵＶ検出器を使用して、ＵＶが分光学的に定量化される（図１）。ＩＴＰは、強力な電場勾配を生成し、それらの電気泳動移動度に基づいた荷電種の選択的な集束および分離を可能にする、強固な電気泳動分離および予備濃縮技術である。ＩＴＰ電解液の化学作用は、標的サイズ範囲内のＲＮＡを精製するために制御され得る。代替的に、電荷とサイズに基づいて、電界における異なる移行速度によって荷電種が分離される分離技術である、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）が精製に使用され得る。完成したポリヌクレオチド産物は保存され、核酸ライブラリーが合成され得る。合成されたポリヌクレオチドはマイクロピラーアレイを使用しても精製され得る。マイクロピラーのアレイによって、合成されたポリヌクレオチドを捕捉するまたは閉じ込めることができる一方で、マイクロ流体ポリヌクレオチド合成の他の成分は洗浄緩衝液中のマイクロピラーを通って継続的に流れている。マイクロピラー中で捕捉されたまたは閉じ込められたポリヌクレオチドは、溶出緩衝液を使用して抽出され得る。

【0030】

本明細書に記載されるマイクロ流体ポリヌクレオチド合成の方法、組成物、および／またはデバイスを使用して合成されたポリヌクレオチドを保存する方法が、本明細書に提供される。合成されたポリヌクレオチドは、合成直後に使用されるか、または後の使用のために保存され得る。いくつかの実施形態では、合成されたポリヌクレオチドは、冷蔵庫または冷凍庫に保存され得る。例えば、合成されたポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド保存に適していると知られる任意の温度で保存され得る。いくつかの実施形態では、合成されたポリヌクレオチドは、４℃、－２０℃、または－８０℃で保存され得る。いくつかの実施形態では、合成されたポリヌクレオチドは、真空ポンプを使用して、バイオマトリックス中で乾燥され得る。この実施形態では、乾燥したポリヌクレオチド産物は、使用の前に再水和され得る。

【0031】

いくつかの実施形態では、マイクロ流体ポリヌクレオチド合成用のデバイスは、圧電振動子、回転バルブ、ペルチェヒーター、電圧コントローラ、シリンジポンプ、ＵＶ ＬＥＤおよびセンサー、または真空ポンプをさらに含む。いくつかの実施形態では、圧電振動子は、転写反応試薬などのマイクロ流体ポリヌクレオチド合成用の混合成分を改良するために使用され得る。いくつかの実施形態では、１つ以上の回転バルブは、イニシエーターオリゴを選択するために使用され得る。いくつかの実施形態では、ペルチェヒーターは、マイクロ流体ポリヌクレオチド合成のための最適温度を維持するために使用され得る。いくつかの実施形態では、電圧コントローラは、ＩＴＰ精製のための電圧を印加するために使用され得る。いくつかの実施形態では、ＵＶ ＬＥＤおよびセンサーは、合成されたポリヌクレオチドを検出し、定量化するために使用され得る。いくつかの実施形態では、真空ポンプは、合成されたポリヌクレオチドを乾燥するために使用され得る。

【0032】

ＲＮＡの迅速な合成を可能にする、ＲＮＡを合成するための組成物、方法、デバイス、およびシステムが本明細書に提供される。毎時少なくとも５０ヌクレオチドの伸長速度で複数のＲＮＡを合成する方法が本明細書に提供される。さらに、あらかじめ選択された配列を有するＲＮＡを合成するための組成物、方法、デバイス、および系が本明細書に提供される。さらに、ＲＮＡを合成するための組成物、方法、デバイス、および系が本明細書に提供され、合成は１つの伸長反応において一塩基ずつ伸長させることを含む。本明細書に記載されるようなＲＮＡとしては、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ｐｉｗｉ相互作用ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）、ＲＮＡアプタマー、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、またはアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）が挙げられ得る。

【0033】

毎時少なくとも５０ヌクレオチドの伸長速度で複数のＲＮＡを合成するための組成物、方法、デバイス、およびシステムが本明細書に提供される。例えば、伸長速度は、毎時少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２１００、２２００、２３００、２４００、２５００、２６００、２７００、２８００、２９００、３０００、３１００、３２００、３３００、３４００、３５００、３６００、３７００、３８００、３９００、または４０００ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、伸長速度は、毎分少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２１００、２２００、２３００、２４００、２５００、２６００、２７００、２８００、２９００、３０００、３１００、３２００、３３００、３４００、３５００、３６００、３７００、３８００、３９００、または４０００ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、伸長速度は、毎分少なくとも５０ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、伸長速度は、毎分少なくとも３０００ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、伸長速度は、毎秒少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、伸長速度は、毎秒少なくとも５０ヌクレオチドである。

【0034】

改良された酵素反応動力学および正確さなどのポリヌクレオチド合成のための技術的な利点を用いたマイクロ流体ポリヌクレオチド合成のための複数の特徴を有する表面を有する、デバイスが本明細書に提供される。本明細書に提供されるデバイスは、プログラム可能な流体操作のための空圧かつ蠕動のポンプシステムを含み得る。蠕動ポンプシステムは連続的に作動するか、あるいは少量の流体を運ぶことがある。いくつかの例では、循環する流量を最小限に抑えることが所望される。いくつかの例では、蠕動ポンプシステムはマイクロポンプ構造をマイクロ流体回路に取り入れ得る。マイクロ流体カートリッジ、流入口、流出口、薄膜、空圧マイクロバルブ、空圧マイクロポンプ、または空圧マイクロバルブおよび空圧マイクロポンプ用の１つ以上の孔を含むデバイスが本明細書に提供される。本明細書に記載されたデバイス中のチャネルおよび孔は、レーザーアブレーション技術によって作られ得る。

【0035】

フローセルまたはチャンバを含むマイクロ流体カートリッジを含むデバイスがさらに本明細書に提供される。本明細書に記載されたマイクロ流体カートリッジは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、または少なくとも１０個のフローセルあるいはチャンバを含み得る。いくつかの例では、マイクロ流体カートリッジは、少なくとも３つのフローセルまたはチャンバを含み得る。いくつかの例では、マイクロ流体カートリッジは、反応チャンバ、収集チャンバ、またはＩＴＰチャンバを含み得る。いくつかの実施形態では、マイクロ流体カートリッジは、反応チャンバ、収集チャンバ、およびＩＴＰチャンバを含む。本明細書に記載された反応チャンバおよび収集チャンバは、ガラスウェハまたはシリコンウェハを利用し得る。いくつかの例では、反応チャンバおよび収集チャンバはガラスウェハおよびシリコンウェハを利用し得る。本明細書に記載されるようなＩＴＰチャンバは、ガラスウェハを利用し得る。いくつかの例では、ＩＴＰチャンバはＩＴＰのために印加された電圧によってのみガラスウェハを利用し得る。

【0036】

本明細書に記載されるように、シリコンウェハは、２５～４５０ｍｍの直径を有し得る。例えば、シリコンウェハは、２５、３０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、または４５０ｍｍの直径を有し得る。いくつかの実施形態では、シリコンウェハは２００ｍｍの直径を有し得る。本明細書に記載されるように、シリコンウェハは、１００μｍ～１５ｍｍの厚さまたは高さを有し得る。例えば、シリコンウェハは、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、または１，０００μｍの厚さまたは高さを有し得る。いくつかの実施形態では、シリコンウェハは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５ｍｍの厚さまたは高さを有し得る。

【0037】

本明細書に記載されるように、ガラスウェハは２５～４５０ｍｍの直径を有し得る。例えば、ガラスウェハは、２５、３０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、または４５０ｍｍの直径を有し得る。いくつかの実施形態では、ガラスウェハは２００ｍｍの直径を有し得る。本明細書に記載されるように、ガラスウェハは、０．１～１．３ｍｍの厚さまたは高さを有し得る。例えば、ガラスウェハは、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、または１．３ｍｍの厚さまたは高さを有し得る。

【0038】

本明細書に記載されるように、シリコンウェハまたはガラスウェハは、１つ以上のダイを含み得る。いくつかの例では、１つ以上のダイのそれぞれは、０．５～７０ｍｍの幅を有する。例えば、１つ以上のダイのそれぞれは、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０ｍｍの幅を有し得る。いくつかの実施形態では、１つ以上のダイのそれぞれは、２５ｍｍの幅を有する。いくつかの例では、１つ以上のダイのそれぞれは、０．５～７０ｍｍの高さを有する。例えば、１つ以上のダイのそれぞれは、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０ｍｍの高さを有し得る。いくつかの実施形態では、１つ以上のダイのそれぞれは、３７ｍｍの高さを有する。いくつかの実施形態では、１つ以上のダイのそれぞれは、７５ｍｍの高さを有する。いくつかの例では、シリコンウェハまたはガラスウェハは、１つのウェハ当たりのダイ（ＤＰＷ）の数が１～３０であり得る。例えば、ＤＰＷの数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、または１０００であり得る。いくつかの実施形態では、ＤＰＷの数は８である。いくつかの実施形態では、ＤＰＷの数は２０である。

【0039】

複数のマイクロチャンバを含むデバイスが本明細書に提供され、チャンバの高さまたは深さは１００ｎｍ～１００μｍである。例えば、チャンバの高さまたは深さは、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、または１，０００ｎｍであり得る。例えば、チャンバの高さまたは深さは、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００μｍであり得る。複数のマイクロチャンバを含むデバイスがさらに本明細書に提供され、チャンバの幅は１００ｎｍ～１００μｍである。例えば、チャンバの幅は、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、または１，０００ｎｍであり得る。例えば、チャンバの幅は、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００μｍであり得る。

【0040】

１つ以上の反応チャンバを含むデバイスが本明細書に提供され、各反応チャンバは１つのＤＮＡ鋳型を含む。ＤＮＡ鋳型は、マイクロ流体カートリッジの組立後に反応チャンバに添加され得る。いくつかの例では、マイクロ流体カートリッジは２つ以上の反応チャンバを含み得、２つ以上の反応チャンバのそれぞれは同じＤＮＡ鋳型を含むため、同じＲＮＡ配列を有する複数のＲＮＡ（例えば、ｇＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍＲＮＡなど）を産生する。いくつかの例では、マイクロ流体カートリッジは２つ以上の反応チャンバを含み、２つ以上の反応チャンバのそれぞれは異なるＤＮＡ鋳型を含むため、２つ以上のＲＮＡの群を複数産生し、２つ以上のＲＮＡの群のそれぞれは、異なるＲＮＡ配列を含む。例えば、マイクロ流体カートリッジは３つの反応チャンバを含み得、３つの反応チャンバのそれぞれは異なるＤＮＡ鋳型を含むため、３つの様々な配列を有する複数のＲＮＡを産生する。

【0041】

マイクロ流体ポリヌクレオチド合成のためのデバイスが本明細書に提供され、流体はマイクロ流体ポリヌクレオチド合成のための本明細書に記載されたデバイスの入口から出口へ流れ得る。入口から出口へ流体が流れるため、本明細書において様々な流量が、合成されたポリヌクレオチドのマイクロ流体ポリヌクレオチドの合成または精製用の転写反応試薬に使用される。いくつかの例では、流量は、約０．００１～１０００ｎＬ／秒（ｎＬ／ｓ）である。いくつかの例では、流量は、約０．００１、０．００５、０．０１、０．０５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、５、１０、１５、２０、５０、７５、１００、１２５、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、５００、８００、または約１０００ｎＬ／秒（ｎＬ／ｓ）である。いくつかの例では、流量は、少なくとも０．００１、０．００５、０．０１、０．０５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、５、１０、１５、２０、５０、７５、１００、１２５、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、５００、または少なくとも８００ｎＬ／秒（ｎＬ／ｓ）である。いくつかの例では、流量は、０．００５、０．０１、０．０５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、５、１０、１５、２０、５０、７５、１００、１２５、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、５００、８００以下、または１０００ｎＬ／秒（ｎＬ／ｓ）以下である。いくつかの例では、流量は、約１、５、１０、１５、２０、５０、７５、１００、１２５、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、または約５００μＬ／秒（μＬ／ｓ）である。いくつかの例では、流量は、少なくとも１、５、１０、１５、２０、５０、７５、１００、１２５、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、または少なくとも５００μＬ／ｓである。いくつかの例では、流量は、５、１０、１５、２０、５０、７５、１００、１２５、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００以下、または５００μＬ／ｓ以下である。いくつかの例では、流量は、約１～５００μＬ／ｓ、約５～５００μＬ／ｓ、約１０～４００μＬ／ｓ、約２０～３００μＬ／ｓ、約５０～５００μＬ／ｓ、約５０～４００μＬ／ｓ、約５０～３００μＬ／ｓ、約７５～３００μＬ／ｓ、約１００～４００μＬ／ｓ、約２００～５００μＬ／ｓ、または約４０～３５０μＬ／ｓである。いくつかの例では、流量は約４０～３５０μＬ／ｓである。いくつかの例では、流量は約７５～２５０μＬ／ｓである。いくつかの例では、流量は約５０～４００μＬ／ｓである。

【0042】

マイクロ流体ポリヌクレオチド合成のためのデバイスが本明細書に提供され、デバイスは１μｍ～１ｃｍの幅、高さ、または直径を有するチャネルを含み得る。例えば、マイクロ流体ポリヌクレオチド合成デバイス上のチャネルは、少なくとも１、５、１０、１５、２０、５０、７５、１００、１２５、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、または少なくとも９５０μｍの幅、高さ、あるいは直径を有し得る。例えば、マイクロ流体ポリヌクレオチド合成デバイス上のチャネルは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、６６０、６７０、６８０、６９０、７００、７１０、７２０、７３０、７４０、７５０、７６０、７７０、７８０、７９０、８００、８１０、８２０、８３０、８４０、８５０、８６０、８７０、８８０、８９０、９００、９１０、９２０、９３０、９４０、９５０、９６０、９７０、９８０、９９０、または１０００ｍｍの幅、高さ、あるいは直径を有し得る。いくつかの実施形態では、マイクロ流体ポリヌクレオチド合成デバイス上のチャネルは、約１μＬ～１００ｍＬの全容量を有し得る。例えば、マイクロ流体ポリヌクレオチド合成デバイス上のチャネルは、少なくとも約１、５、１０、１５、２０、５０、７５、１００、１２５、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、または少なくとも約９５０μＬの全容量を有し得る。いくつかの実施形態では、マイクロ流体ポリヌクレオチド合成機器上のチャネルは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００ｍＬの全容量を有し得る。

【0043】

マイクロ流体ポリヌクレオチド合成のためのデバイスが本明細書に提供され、合成されたポリヌクレオチドは、ＩＴＰ精製プロセスを使用して精製され得る。ＩＴＰ精製プロセスに使用される電圧は、ＩＴＰ精製プロセスに使用されるカラムまたはチャネルの長さに依存し得る。例えば、電圧は１０～５００Ｖであり得る。例えば、電圧は、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、または５００Ｖであり得る。

【0044】

マイクロ流体ポリヌクレオチド合成のためのデバイスが本明細書に提供され、合成されたポリヌクレオチドは、マイクロピラーのアレイを使用して精製され得る。マイクロピラーは、直径０．１～１０．０μｍであり得る。例えば、マイクロピラーは、直径０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、７．０、８．０、９．０、９．５、または１０．０μｍであり得る。いくつかの実施形態では、マイクロピラーの高さは１０～５０μｍであり得る。例えば、マイクロピラーの高さは、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０μｍであり得る。いくつかの実施形態では、マイクロピラーのアレイは、１００～１５００ｎｍ間隔のマイクロピラーを含み得る。例えば、マイクロピラーは、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１０５０、１１００、１１５０、１２００、１２５０、１３００、１３５０、１４００、１４５０、または１５００ｎｍ間隔であり得る。

【0045】

マイクロ流体ポリヌクレオチド合成のためのデバイスが本明細書に提供され、マイクロ流体ポリヌクレオチド合成の界面化学および流体力学によって、酵素反応動力学を増加、純度を増強でき、５’末端、３’末端、および内部化学修飾を含むＲＮＡ修飾が可能になる。統合されたＲＮＡ精製および品質管理を可能にするマイクロ流体ポリヌクレオチド合成のためのデバイスが本明細書に提供され、これにより生産コストを下げることができる。

【0046】

ＤＮＡ鋳型

【0047】

ＤＮＡ鋳型を使用してポリヌクレオチドを産生するための方法、組成物、デバイス、およびシステムが本明細書に提供される。本明細書に記載されるＤＮＡ鋳型は、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）、部分二本鎖ＤＮＡ、または一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）であり得る。ＤＮＡ鋳型としては、クローニング、例えば、プラスミドベクター、ＰＣＲ産物、オリゴヌクレオチド、例えば、共にアニーリングされた２つの相補的なオリゴヌクレオチド、または第１の鎖および第２の鎖の合成によりＲＮＡ前駆体から生成された相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）鋳型によって操作された、線形化されたプラスミド構築物が挙げられ得るが、これに限定されない。ＤＮＡ鋳型は、ＲＮＡポリメラーゼがＲＮＡ合成に結合およびＲＮＡ合成を開始するプロモーター領域を含み得る。例えば、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼは、転写を開始するためにｄｓＤＮＡプロモーターを必要とする。二本鎖鋳型の巻戻プロセスが必要ではないため、ｓｓＤＮＡは必要とするエネルギーが少なく、鋳型から分離する可能性が低く、より速い開始が可能になり、伸長にはｄｓＤＮＡ鋳型を必要としないため、転写にはｄｓＤＮＡ鋳型よりもｓｓＤＮＡ鋳型が望ましい。本明細書に記載されるｓｓＤＮＡ鋳型は、ＲＮＡポリメラーゼによる認識のための部分二本鎖プロモーター領域を作るために二次構造を含み得る。二次構造の例としては、ステム、シュードノット、ヘアピンループ、内部ループ、マルチ分岐ループ、およびバルジループが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるプロモーター領域は、必須のプロモーター領域および／または非必須のプロモーター領域を含み得る。例示的なｓｓＤＮＡ鋳型は、図４に示され、５’から３’の方向に、ＲＮＡ転写のための鋳型配列（４０１）、ＤＮＡ融解領域（４０２）、プロモーター配列（４０３）、（４０３）と（４０５）とを接続するループ（４０４）、およびプロモーター配列の逆相補的な対応物（４０５）を含む。（４０５）が（４０３）にハイブリダイズすると、ｓｓＤＮＡ鋳型は、二次構造、例えばヘアピンを形成し、ＲＮＡポリメラーゼによって認識され得る部分二本鎖領域が生じる。いくつかの実施形態では、二次構造はヘアピンを含む。いくつかの実施形態では、ヘアピン構造の例示的な配列は、配列番号７を含む配列を含み得る。

【0048】

本明細書に記載されるように、プロモーター配列を含む、マイクロ流体ポリヌクレオチド合成のためのＤＮＡ鋳型が本明細書に提供される。本明細書に記載されるＤＮＡ鋳型は、ＲＮＡ合成のために選択されたＲＮＡポリメラーゼに対応するプロモーター配列を含み得る。例えば、ＤＮＡ鋳型は、ＲＮＡ合成のためのＲＮＡポリメラーゼの選択に応じて、ファージプロモーター配列、例えばＴ３プロモーター配列、Ｔ７プロモーター配列、ＫＰ３４プロモーター配列、Ｎ４プロモーター配列、またはＳＰ６プロモーター配列を含み得る。Ｔ７プロモーター配列を含むＤＮＡ鋳型が本明細書に提供される。本明細書に提供されるＤＮＡ鋳型は、必須のＴ７プロモーターおよび／または非必須のＴ７プロモーターを含み得る。いくつかの実施形態では、Ｔ７プロモーター配列は必須のＴ７プロモーター配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｔ７プロモーター配列は非必須のＴ７プロモーター配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｔ７プロモーター配列は必須のＴ７プロモーター配列および非必須のＴ７プロモーター配列を含む。いくつかの実施形態では、必須のＴ７プロモーター配列は、配列番号１５を含む配列を含む。いくつかの実施形態では、非必須のＴ７プロモーター配列は、配列番号１６を含む配列を含む。トランケートされたプロモーター配列を含むＤＮＡ鋳型が、さらに本明細書に提供される。いくつかの例では、本明細書に記載されるＤＮＡ鋳型は、トランケートされたＴ７プロモーター配列を含み得る。一例では、トランケーションはＴ７プロモーター配列の５’末端上であり得る。別の例では、トランケーションはＴ７プロモーター配列の３’末端上であり得る。いくつかの実施形態では、Ｔ７プロモーター配列は、配列番号３を含む配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｔ７プロモーター配列は、配列番号４を含む配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｔ７プロモーター配列は、配列番号５を含む配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｔ７プロモーター配列は、配列番号６を含む配列を含む。いくつかの実施形態では、トランケーションは非必須のＴ７プロモーター配列中であり得る。

【0049】

ＤＮＡ結合タンパク質またはＤＮＡ結合ドメインによって認識されるＤＮＡ結合標的配列をさらに含む、マイクロ流体ポリヌクレオチド合成のためのＤＮＡ鋳型が本明細書に提供される。いくつかの例では、ＤＮＡ結合タンパク質またはＤＮＡ結合ドメインによって認識されるＤＮＡ結合標的配列は、ジンクフィンガーアレイ（ＺＦＡ）結合配列を含み得る。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ鋳型は、ＺＦＡ結合配列の１つ以上のコピーを含み得る。例えば、ＤＮＡ鋳型は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０、あるいはそれ以上のＺＦＡ結合配列のコピーを含み得る。本明細書に記載されるように、ＤＮＡ鋳型は、ＺＦＡ結合配列の１つ以上のコピーを含み得、ＺＦＡ結合配列の１つ以上のコピーは、ＺＦＡ結合配列の１つ以上のコピーのそれぞれの間のヌクレオチドリンカーまたは挿入物と直列に配置することができる（例えば、５’－ＺＦＡ－ヌクレオチドリンカー－ＺＦＡ－ヌクレオチドリンカー－…－３’）。いくつかの例では、ヌクレオチドリンカーまたは挿入物は、２～３０ヌクレオチド長を含み得る。例えば、ヌクレオチドリンカーまたは挿入物は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０ヌクレオチド長を含み得る。いくつかの実施形態では、ヌクレオチドリンカーまたは挿入物は、８、９、または１０ヌクレオチド長を含む。プロモーター配列の上流または５’からプロモーター配列に１つ以上のＺＦＡ結合配列のコピーを含むＤＮＡの鋳型が、本明細書に提供される（例えば、５’－（ＺＦＡ－ヌクレオチドリンカー）_ｎ－プロモーター配列－３’であって、ｎは１～１０の整数である）。いくつかの実施形態では、プロモーター配列は、トランケートされたプロモーター配列である。

【0050】

１つ以上のＤＮＡ結合標的配列（例えば、ＺＦＡ結合配列の１つ以上のコピー）およびトランケートされたプロモーター配列を含む、プログラム可能なＲＮＡ合成のためのＤＮＡ鋳型が本明細書に提供される。本明細書に記載されるＤＮＡ鋳型は、ＤＮＡ結合ドメイン（例えば、ＺＦＡ）およびＲＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ）を含む融合タンパク質を利用するプログラム可能なＲＮＡ合成系の中で使用することができる。この系では、結合親和性はＲＮＡ転写に重要な要素であり、ＤＮＡ鋳型に融合タンパク質の結合親和性を適合させるために、ＺＦＡ結合配列などのＤＮＡ結合標的配列のコピーを操作することによりＲＮＡ合成をプログラムできる。

【0051】

本明細書に記載されるように、ＤＮＡ鋳型は様々な長さであり得る。例えば、ＤＮＡ鋳型は、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも１５０、少なくとも２００、または少なくとも３００ヌクレオチド長を含み得る。いくつかの例では、ＤＮＡ鋳型は、最大７０、最大８０、最大９０、最大１００、最大１２０、最大１４０、最大１６０、最大１８０、または最大２００ヌクレオチド長を含む。いくつかの例では、ＤＮＡ鋳型は、約４０、約５０、約６０、約７０、約８０、約９０、約１００、約１２０、約１４０、約１６０、約１８０、約２００、約２５０、または約３００ヌクレオチド長を含む。いくつかの例では、ＤＮＡ鋳型は少なくとも６０ヌクレオチド長を含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ鋳型は少なくとも１２０ヌクレオチド長を含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ鋳型は最大８０ヌクレオチド長を含む。

【0052】

本明細書に記載されるようなＤＮＡ鋳型は、コードＲＮＡまたは非コードＲＮＡを合成するための配列を含み得る。コードＲＮＡの非限定的な例としてはｍＲＮＡが挙げられ、非コードＲＮＡの非限定的な例としてはｇＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、およびＡＳＯが挙げられる。例えば、ＤＮＡ鋳型は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９を介した遺伝子編集のために疾患または疾病に含まれる特定の遺伝子を標的化するのに使用できるｇＲＮＡを合成するための配列を含み得る。いくつかの例では、標的遺伝子は、癌に含まれる遺伝子、例えば、急性リンパ性癌、急性骨髄性白血病、胞巣状横紋筋肉腫、膀胱癌、骨癌、脳癌、乳癌、肛門、肛門管、直腸の癌、眼の癌、肝内胆管の癌、関節の癌、首、胆嚢、または胸膜の癌、鼻、鼻腔、または中耳の癌、口腔癌、外陰癌、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性癌、結腸癌、食道癌、子宮頚癌、線維肉腫、胃腸カルチノイド腫瘍、ホジキンリンパ腫、下咽頭癌、腎癌、喉頭癌、白血病、液性腫瘍、肝臓癌、肺癌、リンパ腫、悪性中皮腫、肥満細胞腫、黒色腫、多発性骨髄腫、鼻咽腔癌、非ホジキンリンパ腫、卵巣癌、膵臓癌、腹膜、網、および腸間膜の癌、咽頭癌、前立腺癌、直腸癌、腎癌、皮膚癌、小腸癌、軟組織癌、固形腫瘍、胃癌、精巣癌、甲状腺癌、尿管癌、および／あるいは膀胱癌に含まれる遺伝子を含み得る。いくつかの例では、標的遺伝子はＭＡＧＥ－１、ＭＡＧＥ－２、ＭＡＧＥ－３、ＣＥＡ、チロシナーゼ、ミッドカイン、ＢＡＧＥ、ＣＡＳＰ－８、β－カテニン、ＣＡ－１２５、ＣＤＫ－１、ＥＳＯ－１、ｇｐ７５、ｇｐｌＯＯ、ＭＡＲＴ－１、ＭＵＣ－１、ＭＵＭ－１、ｐ５３、ＰＡＰ、ＰＳＡ、ＰＳＭＡ、ｒａｓ、ｔｒｐ－１、ＨＥＲ－２、ＴＲＰ－１、ＴＲＰ－２、ＩＬ１３Ｒａｌｐｈａ、ＩＬ１３Ｒａｌｐｈａ２、ＡＩＭ－２、ＡＩＭ－３、ＮＹ－ＥＳＯ－１、Ｃ９ｏｒｆｌｌ２、ＳＡＲＴ１、ＳＡＲＴ２、ＳＡＲＴ３、ＢＲＡＰ、ＲＴＮ４、ＧＬＥＡ２、Ｔ ＫＳ２、ＫＩＡＡ０３７６、ＩＮＧ４、ＨＳＰＨ１、Ｃ１３ｏｒｆ２４、ＲＥＩＣ、ＲＢＰＳＵＨ、Ｃ６ｏｒｆｌ５３、ＫＴＲ、ＮＳＥＰ１、Ｕ２ＡＦ１Ｌ、ＣＹ Ｌ２、ＴＰＲ、ＳＯＸ２、ＧＯＬＧＡ、ＢＭＩ１、ＣＯＸ－２、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＺＨ２、ＬＩＣＡＭ、Ｌｉｖｉｎ、ＭＲＰ－３、ネスチン、ＯＬＩＧ２、ＡＲＴ１、ＡＲＴ４、Ｂ－サイクリン、Ｇｌｉｌ、Ｃａｖ－１、カテプシンＢ、ＣＤ７４、ｅ－カドヘリン、ＥｐｈＡ２／Ｅｃｋ、Ｆｒａ－ｌ／Ｆｏｓｌｌ、ＧＡＧＥ－１、ガングリオシド／ＧＤ２、ＧｎＴ－Ｖ、β１，６－Ν、Ｋｉ６７、Ｋｕ７０／８０、ＰＲＯＸ１、ＰＳＣＡ、ＳＯＸ１０、ＳＯＸ１１、サバイビン、ＵＰＡＲ、メソテリン、ＷＴ－１、ＲＥＴ、ＥＲＢＢ２またはＨＥＲ２、ＰＤＧＦ－Ｒβ、ＳＲＣ、ＰＲＡＤ１／サイクリンＤ１、Ｃ－Ｍｙｃ、ＢＣＬ２、ＡＢＬ、ＭＤＭ２、ｐ１１０α、Ｂ－ＲＡＦ、ＩＤＨ１、ＩＤＨ２、ＪＡＫ２、ＫＩＴ、ＭＥＴ、ＦＬＴ－３、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ、ＳＫＹ、ｐ５３、ＲＢ、ＢＣＬ２、ＳＷＩ／ＳＮＦ、ＲＡＰ１Ａ、ＤＣＣ、Ｋ－ＲＥＶ、ＷＴ１、ＴＢＲ－１１、ＩＮＫ４Ａ／ＡＲＦ、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ４／ＤＰＣ４、ｅ－カドヘリン、ＡＰＣ、ＶＨＬ、ＰＴＥＮ／ＭＭＡＣ１、ＮＦ１、ＮＦ２、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＭＳＨ２、ＭＬＨ１、ＰＭＳ１、ＰＭＳ２、ＲＥＩＣ、ＳＤＨＢ、ＳＤＨＤ、および／あるいはＧＰ４３／Ｍｅｒｌｉｎを含み得る。いくつかの例では、標的遺伝子は、免疫障害に含まれる遺伝子、例えば、ＰＴＰＮ２２、ＴＲＡＦ１－Ｃ５、ＰＡＤＩ４、ＳＴＡＴ４、ＴＮＦ、ＩＬ－１、ＩＬ－６、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＯＰＮ、ＰＲＦ１、ＩＦＩＨ１、ＴＲＡＦ３ＩＰ２、ＩＬ１２Ａ、ＩＬ１２ＲＢ２、ＡＩＲＥ、Ｆａｓ、ＦａｓＬ、カスパーゼ１０、カスパーゼ８、ＰＲＫＣＤ、ＮＲＡＳ、ＣＴＬＡ－４、ＦＯＸＰ３、ＬＲＢＡ、ＨＬＡ－ＤＱ８、ＩＮＳ、ＩＬ２ＲＡ、ＳＨ２Ｂ３、ＥＲＢＢ３、ＰＴＰＮ２、ＣＬＥＣ１６Ａ、ＩＬ１８ＲＡＰ、ＣＴＳＨ、ＣＤ２２６、ＩＬ２ＲＡ、ＰＲＫＣＱ、ＩＬ２、ＢＡＣＨ２、ＵＢＡＳＨ３Ａ、ＲＧＳ１、ＩＬ１７ＲＡ、ＣＩＱＴＮＦ６、ＴＮＦＡＩＰ３、ＴＹＫ２、および／またはＴＡＧＡＰを含み得る。いくつかの例では、標的遺伝子は、ノックダウン、ノックアウト、修飾、または編集を行う必要のある遺伝子を含み得る。いくつかの例では、標的遺伝子は、例えばアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションなど、転写的に調節する必要のある遺伝子を含み得る。

【0053】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるＤＮＡ鋳型を使用して転写されたＲＮＡの量は、従来のＤＮＡ鋳型、すなわち本明細書に記載される特徴のないＤＮＡ鋳型を使用して転写されたＲＮＡの量と比較して、増加し得る。例えば、本明細書に記載されるＤＮＡ鋳型を使用して転写されたＲＮＡの量は、従来のＤＮＡ鋳型、すなわち本明細書に記載される特徴のないＤＮＡ鋳型を使用して転写されたＲＮＡの量と比較して、少なくとも１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２．０倍、２．１倍、２．２倍、２．３倍、２．４倍、２．５倍、２．６倍、２．７倍、２．８倍、２．９倍、３．０倍、３．１倍、３．２倍、３．３倍、３．４倍、３．５倍、４．０倍、４．５倍、５．０倍、５．５倍、６．０倍、７．０倍、８．０倍、９．０倍、９．５倍、１０．０倍、１０．５倍、１１．０倍、１１．５倍、１２．０倍、１２．５倍、１３．０倍、１４．５倍、１５．０倍、１５．５倍、１６．０倍、１６．５倍、１７．０倍、１７．５倍、１８．０倍、１８．５倍、１９．０倍、１９．５倍、２０倍、２１倍、２２倍、２３倍、２４倍、２５倍、２６倍、２７倍、２８倍、２９倍、３０倍、３１倍、３２倍、３３倍、３４倍、３５倍、３６倍、３７倍、３８倍、３９倍、４０倍、４１倍、４２倍、４３倍、４４倍、４５倍、４６倍、４７倍、４８倍、４９倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、１１０倍、１２０倍、１３０倍、１４０倍、１５０倍、１６０倍、１７０倍、１８０倍、１９０倍、２００倍、２１０倍、２２０倍、２３０倍、２４０倍、２５０倍、２６０倍、２７０倍、２８０倍、２９０倍、３００倍、３１０倍、３２０倍、３３０倍、３４０倍、３５０倍、３６０倍、３７０倍、３８０倍、３９０倍、４００倍、４１０倍、４２０倍、４３０倍、４４０倍、４５０倍、４６０倍、４７０倍、４８０倍、４９０倍、５００倍、６１０倍、６２０倍、６３０倍、６４０倍、６５０倍、６６０倍、６７０倍、６８０倍、６９０倍、７００倍、７１０倍、７２０倍、７３０倍、７４０倍、７５０倍、７６０倍、７７０倍、７８０倍、７９０倍、８００倍、８１０倍、８２０倍、８３０倍、８４０倍、８５０倍、８６０倍、８７０倍、８８０倍、８９０倍、９００倍、９１０倍、９２０倍、９３０倍、９４０倍、９５０倍、９６０倍、９７０倍、９８０倍、９９０倍、１０００倍、１１００倍、１２００倍、１３００倍、１４００倍、１５００倍、１６００倍、１７００倍、１８００倍、１９００倍、２０００倍、２１００倍、２２００倍、２３００倍、２４００倍、２５００倍、２６００倍、２７００倍、２８００倍、２９００倍、３０００倍、３１００倍、３２００倍、３３００倍、３４００倍、３５００倍、３６００倍、３７００倍、３８００倍、３９００倍、４０００倍、４１００倍、４２００倍、４３００倍、４４００倍、４５００倍、４６００倍、４７００倍、４８００倍、４９００倍、５０００倍、５１００倍、５２００倍、５３００倍、５４００倍、５５００倍、５６００倍、５７００倍、５８００倍、５９００倍、６０００倍、６１００倍、６２００倍、６３００倍、６４００倍、６５００倍、６６００倍、６７００倍、６８００倍、６９００倍、７０００倍、７１００倍、７２００倍、７３００倍、７４００倍、７５００倍、７６００倍、７７００倍、７８００倍、７９００倍、８０００倍、８１００倍、８２００倍、８３００倍、８４００倍、８５００倍、８６００倍、８７００倍、８８００倍、８９００倍、９０００倍、９１００倍、９２００倍、９３００倍、９４００倍、９５００倍、９６００倍、９７００倍、９８００倍、９９００倍、または少なくとも１００００倍、増加し得る。

【0054】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるＤＮＡ鋳型を使用したＲＮＡ合成に要するＤＮＡ鋳型の量は、従来のＤＮＡ鋳型、すなわち本明細書に記載される特徴のないＤＮＡ鋳型を使用したＲＮＡ合成に要するＤＮＡ鋳型の量より少なくてよい。例えば、本明細書に記載されるＤＮＡ鋳型使用したＲＮＡ合成に要するＤＮＡ鋳型の量は、従来のＤＮＡ鋳型、すなわち本明細書に記載される特徴のないＤＮＡ鋳型を使用したＲＮＡ合成に要するＤＮＡ鋳型の量より、少なくとも１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２．０倍、２．１倍、２．２倍、２．３倍、２．４倍、２．５倍、２．６倍、２．７倍、２．８倍、２．９倍、３．０倍、３．１倍、３．２倍、３．３倍、３．４倍、３．５倍、４．０倍、４．５倍、５．０倍、５．５倍、６．０倍、６．５倍、７．０倍、８．０倍、９．０倍、９．５倍、または少なくとも１０倍少なくてよい。

【0055】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるＤＮＡ鋳型を使用したＲＮＡ合成に要するヌクレオシド三リン酸（ＮＴＰ）の量は、従来のＤＮＡ鋳型、すなわち本明細書に記載される特徴のないＤＮＡ鋳型を使用したＲＮＡ合成に要するＮＴＰの量より少なくてよい。例えば、本明細書に記載されるＤＮＡ鋳型使用したＲＮＡ合成に要するヌクレオシド三リン酸（ＮＴＰ）の量は、従来のＤＮＡ鋳型、すなわち本明細書に記載される特徴のないＤＮＡ鋳型を使用したＲＮＡ合成に要するＮＴＰの量より、少なくとも１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２．０倍、２．１倍、２．２倍、２．３倍、２．４倍、２．５倍、２．６倍、２．７倍、２．８倍、２．９倍、３．０倍、３．１倍、３．２倍、３．３倍、３．４倍、３．５倍、４．０倍、４．５倍、５．０倍、５．５倍、６．０倍、６．５倍、７．０倍、８．０倍、９．０倍、９．５倍、または少なくとも１０倍少なくてよい。

【0056】

ＲＮＡポリメラーゼ

【0057】

マイクロ流体ＲＮＡ合成のためのＲＮＡポリメラーゼが本明細書に提供される。例えば、ＲＮＡポリメラーゼは、ファージＲＮＡポリメラーゼ、細菌ＲＮＡポリメラーゼ、または真核生物ＲＮＡポリメラーゼを含み得る。いくつかの例では、細菌ＲＮＡポリメラーゼは、大腸菌を含むがこれに限定されない任意の細菌種のＲＮＡポリメラーゼを含み得る。いくつかの例では、真核生物ＲＮＡポリメラーゼは、あらゆる真核生物のＲＮＡポリメラーゼＩ、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ、ＲＮＡポリメラーゼＩＶ、またはＲＮＡポリメラーゼＶを含み得る。ファージＲＮＡポリメラーゼの非限定的な例として、Ｔ３ ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、ＫＰ３４ ＲＮＡポリメラーゼ、Ｎ４ ＲＮＡポリメラーゼ、およびＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼが挙げられる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるマイクロ流体ＲＮＡ合成に使用されるＲＮＡポリメラーゼは、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼである。いくつかの実施形態では、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼは、配列番号１を含む配列を含む。

【0058】

アミノ酸配列における１つ以上のバリエーションまたは置換、例えば、安定性、ＤＮＡ認識、ＤＮＡ結合親和性、および／またはＲＮＡポリメラーゼ活性などの酵素活性に関連するバリエーションを含むＲＮＡポリメラーゼがさらに本明細書に提供される。いくつかの例では、１つ以上のバリエーションは、１つ以上のバリエーションのないＲＮＡポリメラーゼと比較して、転写開始および／または伸長プロセスの間にバリアントＲＮＡポリメラーゼの安定性を増強し得る。いくつかの例では、１つ以上のバリエーションは、１つ以上のバリエーションのないＲＮＡポリメラーゼと比較して、ＲＮＡポリメラーゼのＤＮＡ認識能力を増強し得る。いくつかの例では、１つ以上のバリエーションは、１つ以上のバリエーションのないＲＮＡポリメラーゼと比較して、ＲＮＡポリメラーゼのＤＮＡ結合親和性を増強し得る。いくつかの例では、１つ以上のバリエーションは、１つ以上のバリエーションのないＲＮＡポリメラーゼと比較して、ＲＮＡポリメラーゼのＤＮＡ結合親和性を低減し得る。いくつかの例では、１つ以上のバリエーションは、１つ以上のバリエーションのないＲＮＡポリメラーゼと比較して、ＲＮＡポリメラーゼ活性を増強し得る。

【0059】

マイクロ流体ＲＮＡ合成のためのＴ７ ＲＮＡポリメラーゼバリアントが、本明細書に提供される。Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼにおけるバリエーションまたはアミノ酸置換の非限定的な例として、Ｉ４Ｍ、Ｉ１１９Ｖ、Ｎ１６５Ｓ、Ｋ１７２Ｌ、Ｇ１７５Ｒ、Ｅ２２２Ｋ、Ｇ２２５Ｓ、Ｑ２３９Ｋ、Ｑ２３９Ｒ、Ｑ２３９Ｌ、Ａ２５５Ｔ、Ｐ２６６Ｌ、Ｋ３３３Ｎ、Ｄ３６６Ｎ、Ｆ４００Ｌ、Ｖ４２６Ｌ、Ｖ４２６Ｉ、Ｖ４２６Ｆ、Ｓ４３０Ｐ、Ｎ４３３Ｔ、Ｇ５４２Ｖ、Ｖ５７４Ａ、Ｅ５９３Ｇ、Ｖ６２５Ｌ、Ｓ６３３Ｖ、Ｓ６３３Ｍ、Ｓ６３３Ｐ、Ｙ６３９Ｆ、Ｙ６３９Ｌ、Ｙ６３９Ｖ、Ｅ６４３Ｋ、Ｖ６５０Ｌ、Ｔ６５４Ｌ、Ｓ６６１Ｇ、Ｇ６７５Ｒ、Ｖ６８５Ａ、Ａ７０２Ｖ、Ｒ７５６Ｃ、Ｑ７５８Ｋ、Ｑ７５８Ｒ、Ｖ７８３Ｉ、Ｖ７９５Ｉ、Ｈ７７２Ｒ、Ｎ７４８Ｘ、Ｒ７５６Ｍ、Ｑ７５８Ｘ、Ｅ７７５Ｋ、Ｅ７７５Ｖ、Ｈ７８４Ａ、Ｈ７８４Ｇ、Ｈ７８４Ｓ、Ｆ８４９Ｉ、およびＦ８８０Ｙが挙げられ、その位置は配列番号１とのアラインメントによって決定され、Ｘは野生型アミノ酸とは異なる任意のアミノ酸である。マイクロ流体ＲＮＡ合成のためのＴ７ ＲＮＡポリメラーゼバリアントが本明細書に提供され、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼバリアントは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、４０、または少なくとも４１個のアミノ酸バリエーションまたはアミノ酸置換を含む。例えば、本明細書に記載されるＴ７ ＲＮＡポリメラーゼバリアントは、ＤＮＡ認識または結合ドメイン（例えば、ＡＴ－認識ループ）において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、４０、または少なくとも４１個のバリエーションまたはアミノ酸置換を含み得る。例えば、本明細書に記載されるＴ７ ＲＮＡポリメラーゼバリアントは、ＲＮＡポリメラーゼドメイン（例えば、サムサブドメイン、パームドメイン、またはフィンガーサブドメイン）において少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、４０、または少なくとも４１個のバリエーションあるいはアミノ酸置換を含み得る。例えば、本明細書に記載されるＴ７ ＲＮＡポリメラーゼバリアントは、特異性ループにおいて少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、４０、または少なくとも４１個のバリエーションまたはアミノ酸置換を含み得る。

【0060】

少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、または少なくとも４つ、あるいはそれ以上の本明細書に記載されるパリエーション、例えば、Ｋ１７２Ｌ、Ｐ２６６Ｌ、Ｈ７７２Ｒ、Ｎ７４８Ｘ、Ｒ７５６Ｍ、Ｑ７５８Ｘ、およびＥ７７５Ｖを含むＴ７ ＲＮＡポリメラーゼバリアントが、本明細書に提供され、その位置は配列番号１とのアラインメントによって決定され、Ｘは野生型アミノ酸とは異なる任意のアミノ酸である。また、Ｋ１７２Ｌ、Ｐ２６６Ｌ、Ｈ７７２Ｒ、Ｎ７４８Ｘ、Ｒ７５６Ｍ、Ｑ７５８Ｘ、およびＥ７７５Ｖからなる群から選択される少なくとも１つのバリエーションを含むＴ７ ＲＮＡポリメラーゼバリアントが本明細書に提供され、その位置は配列番号１とのアラインメントによって決定され、Ｘは野生型アミノ酸とは異なる任意のアミノ酸である。Ｋ１７２Ｌ、Ｐ２６６Ｌ、Ｈ７７２Ｒ、Ｎ７４８Ｘ、Ｒ７５６Ｍ、Ｑ７５８Ｘ、およびＥ７７５Ｖからなる群から選択される少なくとも４つのバリエーションを含むＴ７ ＲＮＡポリメラーゼバリアントがさらに本明細書に提供され、その位置は配列番号１とのアラインメントによって決定され、Ｘは野生型アミノ酸とは異なる任意のアミノ酸である。いくつかの例では、バリアントＴ７ ＲＮＡポリメラーゼまたはその機能的断片は、配列番号１に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つまたは少なくとも４つの本明細書に記載されるバリエーションを含むバリアントＴ７ ＲＮＡポリメラーゼは、少なくとも１つのバリエーションのないＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ、例えば、配列番号１に記載の配列を含むＴ７ ＲＮＡポリメラーゼと比較して、転写開始および／または伸長プロセスの間に安定性の増加を示し得る。いくつかの実施形態では、少なくとも１つまたは少なくとも４つの本明細書に記載されるバリエーションを含むバリアントＴ７ ＲＮＡポリメラーゼは、少なくとも１つのバリエーションのないＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ、例えば、配列番号１に記載の配列を含むＴ７ ＲＮＡポリメラーゼと比較して、転写開始および／または伸長プロセスの間にＤＮＡ結合親和性、例えば、Ｔ７プロモーター配列に対する結合親和性の減少を示し得る。

【0061】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるＲＮＡポリメラーゼ（例えば、修飾されたＲＮＡポリメラーゼ）を使用して転写されたＲＮＡの量は、従来のＲＮＡポリメラーゼ、すなわち本明細書に記載される特徴または修飾のないＲＮＡポリメラーゼを使用して転写されたＲＮＡの量と比較して、増加し得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるＲＮＡポリメラーゼ（例えば、修飾されたＲＮＡポリメラーゼ）を使用して転写されたＲＮＡの量は、従来のＲＮＡポリメラーゼ、すなわち本明細書に記載される特徴または修飾のないＲＮＡポリメラーゼを使用して転写されたＲＮＡの量と比較して、少なくとも１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２．０倍、２．１倍、２．２倍、２．３倍、２．４倍、２．５倍、２．６倍、２．７倍、２．８倍、２．９倍、３．０倍、３．１倍、３．２倍、３．３倍、３．４倍、３．５倍、４．０倍、４．５倍、５．０倍、５．５倍、６．０倍、７．０倍、８．０倍、９．０倍、９．５倍、１０．０倍、１０．５倍、１１．０倍、１１．５倍、１２．０倍、１２．５倍、１３．０倍、１４．５倍、１５．０倍、１５．５倍、１６．０倍、１６．５倍、１７．０倍、１７．５倍、１８．０倍、１８．５倍、１９．０倍、１９．５倍、２０倍、２１倍、２２倍、２３倍、２４倍、２５倍、２６倍、２７倍、２８倍、２９倍、３０倍、３１倍、３２倍、３３倍、３４倍、３５倍、３６倍、３７倍、３８倍、３９倍、４０倍、４１倍、４２倍、４３倍、４４倍、４５倍、４６倍、４７倍、４８倍、４９倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、１１０倍、１２０倍、１３０倍、１４０倍、１５０倍、１６０倍、１７０倍、１８０倍、１９０倍、２００倍、２１０倍、２２０倍、２３０倍、２４０倍、２５０倍、２６０倍、２７０倍、２８０倍、２９０倍、３００倍、３１０倍、３２０倍、３３０倍、３４０倍、３５０倍、３６０倍、３７０倍、３８０倍、３９０倍、４００倍、４１０倍、４２０倍、４３０倍、４４０倍、４５０倍、４６０倍、４７０倍、４８０倍、４９０倍、５００倍、６１０倍、６２０倍、６３０倍、６４０倍、６５０倍、６６０倍、６７０倍、６８０倍、６９０倍、７００倍、７１０倍、７２０倍、７３０倍、７４０倍、７５０倍、７６０倍、７７０倍、７８０倍、７９０倍、８００倍、８１０倍、８２０倍、８３０倍、８４０倍、８５０倍、８６０倍、８７０倍、８８０倍、８９０倍、９００倍、９１０倍、９２０倍、９３０倍、９４０倍、９５０倍、９６０倍、９７０倍、９８０倍、９９０倍、１０００倍、１１００倍、１２００倍、１３００倍、１４００倍、１５００倍、１６００倍、１７００倍、１８００倍、１９００倍、２０００倍、２１００倍、２２００倍、２３００倍、２４００倍、２５００倍、２６００倍、２７００倍、２８００倍、２９００倍、３０００倍、３１００倍、３２００倍、３３００倍、３４００倍、３５００倍、３６００倍、３７００倍、３８００倍、３９００倍、４０００倍、４１００倍、４２００倍、４３００倍、４４００倍、４５００倍、４６００倍、４７００倍、４８００倍、４９００倍、５０００倍、５１００倍、５２００倍、５３００倍、５４００倍、５５００倍、５６００倍、５７００倍、５８００倍、５９００倍、６０００倍、６１００倍、６２００倍、６３００倍、６４００倍、６５００倍、６６００倍、６７００倍、６８００倍、６９００倍、７０００倍、７１００倍、７２００倍、７３００倍、７４００倍、７５００倍、７６００倍、７７００倍、７８００倍、７９００倍、８０００倍、８１００倍、８２００倍、８３００倍、８４００倍、８５００倍、８６００倍、８７００倍、８８００倍、８９００倍、９０００倍、９１００倍、９２００倍、９３００倍、９４００倍、９５００倍、９６００倍、９７００倍、９８００倍、９９００倍、または少なくとも１００００倍増加し得る。

【0062】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるＲＮＡポリメラーゼ（例えば、修飾されたＲＮＡポリメラーゼ）を使用したＲＮＡ合成に要するＤＮＡ鋳型の量は、従来のＲＮＡポリメラーゼ、すなわち本明細書に記載される特徴または修飾のないＲＮＡポリメラーゼを使用したＲＮＡの合成に要するＤＮＡ鋳型の量より少なくてよい。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるＲＮＡポリメラーゼ（例えば、修飾されたＲＮＡポリメラーゼ）を使用したＲＮＡ合成に要するＤＮＡ鋳型の量は、従来のＲＮＡポリメラーゼ、すなわち本明細書に記載される特徴または修飾のないＲＮＡポリメラーゼを使用したＲＮＡ合成に要するＤＮＡ鋳型の量より、少なくとも１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２．０倍、２．１倍、２．２倍、２．３倍、２．４倍、２．５倍、２．６倍、２．７倍、２．８倍、２．９倍、３．０倍、３．１倍、３．２倍、３．３倍、３．４倍、３．５倍、４．０倍、４．５倍、５．０倍、５．５倍、６．０倍、７．０倍、８．０倍、９．０倍、９．５倍、または少なくとも１０．０倍少なくてよい。

【0063】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるＲＮＡポリメラーゼ（例えば、修飾されたＲＮＡポリメラーゼ）を使用したＲＮＡ合成に要するヌクレオシド三リン酸（ＮＴＰ）の量は、従来のＲＮＡポリメラーゼ、すなわち本明細書に記載される特徴または修飾のないＲＮＡポリメラーゼを使用したＲＮＡの合成に要するＮＴＰの量より少なくてよい。例えば、本明細書に記載されるＲＮＡポリメラーゼ（例えば、修飾されたＲＮＡポリメラーゼ）を使用したＲＮＡ合成に要すヌクレオシド三リン酸（ＮＴＰ）の量は、従来のＲＮＡポリメラーゼ、すなわち本明細書に記載される特徴または修飾のないＲＮＡポリメラーゼを使用したＲＮＡ合成に要するＮＴＰの量より、少なくとも１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２．０倍、２．１倍、２．２倍、２．３倍、２．４倍、２．５倍、２．６倍、２．７倍、２．８倍、２．９倍、３．０倍、３．１倍、３．２倍、３．３倍、３．４倍、３．５倍、４．０倍、４．５倍、５．０倍、５．５倍、６．０倍、７．０倍、８．０倍、９．０倍、９．５倍、または少なくとも１０．０倍少なくてよい。

【0064】

融合タンパク質

【0065】

本明細書に記載されるＲＮＡ合成で使用するためのＲＮＡポリメラーゼまたはその機能的断片およびＤＮＡ結合ドメインを含む、融合タンパク質が本明細書に提供され、ＲＮＡポリメラーゼまたはその機能的断片およびＤＮＡ結合ドメインは、異種である。本明細書で使用されるとき、融合タンパク質または融合ポリペプチドは、本明細書に記載されるＲＮＡポリメラーゼ、例えば、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼもしくはそのバリアント、およびＲＮＡ合成のためのＤＮＡ鋳型を認識し結合できる異種のＤＮＡ結合ドメインを含み得る。

【0066】

例示的なＤＮＡ結合ドメインとして、ジンクフィンガードメイン、ロイシンジッパー、ヘリックスターンヘリックス（ＨＴＨ）モチーフ、ヘリックスループヘリックス（ＨＬＨ）モチーフ、ウィングドヘリックス（ＷＨ）、ウィングドＨＴＨ（ＷＨＴＨ）モチーフ、高移動度群（ＨＭＧ）ボックス、白色不透明レギュレーター３（Ｗｈｉｔｅ－Ｏｐａｑｕｅ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ３／Ｗｏｒ３）ドメイン、オリゴヌクレオチド／オリゴ糖結合（ＯＢ）フォールドドメイン、免疫グロブリンフォールド、Ｂ３ドメイン、転写アクチベーター様エフェクター（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ａｃｔｉｖａｔｏｒ－Ｌｉｋｅ Ｅｆｆｅｃｔｏｒ／ＴＡＬＥ）、ＴＡＬＥ様タンパク質、およびクラスター化され規則的に間隔が空いた短い回文構造の繰り返し（ＣＲＩＳＰＲ）関連（Ｃａｓ）タンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの例では、ＤＮＡ結合ドメインはアビジンを含む。アビジンの非限定的な例として、ストレプトアビジン、リザビジン（ｒｈｉｚａｖｉｄｉｎ）、およびＥｘｔｒａｖｉｄｉｎ、ＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎ、ＮｅｕｔｒａＬｉｔｅなどのニュートラアビジンが挙げられる。いくつかの例では、本明細書に使用されるＤＮＡ結合ドメインは変異またはバリエーションを含まないことがある。いくつかの例では、ＤＮＡ結合ドメインは変異またはバリエーションを含み得る。いくつかの例では、ＤＮＡ結合ドメインはＤＮＡメチルトランスフェラーゼを含む。いくつかの例では、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼは、エジプトヘモフィルスのＨａｅＩＩＩメチルトランスフェラーゼ（ＨａｅＩＩＩＭ）である。いくつかの実施形態では、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼは、５－ブロモ－シチジン、５－ヨード－シチジン、５－フルオロ－シチジン、５－ブロモ－デオキシウラシル、５－ヨード－デオキシウラシル、または５－フルオロ－デオキシウラシルを含むが、これらに限定されない修飾塩基の存在下で、ＤＮＡ、例えばＤＮＡ鋳型に共有結合で結合し得る。いくつかの例では、ＤＮＡ結合ドメインはジンクフィンガードメインである。いくつかの実施形態では、ジンクフィンガードメインはジンクフィンガーアレイ（ＺＦＡ）を含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、配列番号８を含む配列を含む。いくつかの例では、ＤＮＡ結合ドメインはロイシンジッパーである。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインはストレプトアビジンである。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインはモノマーストレプトアビジンである。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインはリザビジンである。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、配列番号９を含む配列を含む。

【0067】

ＤＮＡ結合ドメインに連結されたＲＮＡポリメラーゼまたはその機能的断片が、本明細書に提供される。ＤＮＡ結合ドメインを有する例示的なＲＮＡポリメラーゼ融合タンパク質の一般的な構造は、以下の構造：ＮＨ２－［ＤＮＡ結合ドメイン］－［リンカー］－［ＲＮＡポリメラーゼ］－ＣＯＯＨを含み得、ＮＨ２は融合タンパク質のＮ末端であり、ＣＯＯＨは融合タンパク質のＣ末端である。いくつかの例では、ＲＮＡポリメラーゼまたはその機能的断片は、ＤＮＡ結合ドメインに共有結合される。例えば、ＲＮＡポリメラーゼまたはその機能的断片は、リンカーを介してＤＮＡ結合ドメインに連結されることがある。リンカーの非限定的な例として、ペプチドリンカー、非ペプチドリンカー、ヌクレオチドリンカー、化学リンカー、およびフレキシブルリンカーが挙げられる。いくつかの実施形態では、リンカーはペプチドリンカーである。いくつかの実施形態では、リンカーは非ペプチドリンカーである。いくつかの実施形態では、リンカーは、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、または少なくとも４０個のアミノ酸残基長を含む。いくつかの実施形態では、リンカーは、アミノ酸配列ＳＧＧＳを含む。いくつかの実施形態では、リンカーは、（ＳＧＧＳ）_ｎ、（ＧＧＧＳ）_ｎ、（ＧＧＧＧＳ）_ｎ、（Ｇ）_ｎ、（ＥＡＡＡＫ）_ｎ、（ＧＧＳ）_ｎ、ＧＳ（ＧＧＧＳ）_ｎ、ＧＳ（ＧＧＧＧＳ）_ｎ、または（ＸＰ）_ｎモチーフ、あるいはこれらのいずれかの組合せを含み、ｎは、独立して１～３０の整数であり、Ｘは任意のアミノ酸である。いくつかの実施形態では、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５である。ペプチドリンカーは、フレキシブルリンカーまたはリジッドリンカーであり得る。いくつかの実施形態では、リンカーは複数のプロリン残留物を含み、長さは５～２１、５～１４の、５～９、５～７アミノ酸であり、例えば、ＰＡＰＡＰ、ＰＡＰＡＰＡ、ＰＡＰＡＰＡＰ、ＰＡＰＡＰＡＰＡ、Ｐ（ＡＰ）_ｎであり、ｎは１～１０の整数である。そのようなプロリンリッチリンカーも「リジッド」リンカーと名付けられる。いくつかの実施形態では、リンカーはＧＳ（ＧＧＧＧＳ）_ｎを含み、ｎは１～１０の整数である。いくつかの実施形態では、リンカーは、配列番号１０、配列番号１１、または配列番号１２を含む配列を含む。いくつかの実施形態では、リンカーはＸＴＥＮリンカーを含む。いくつかの実施形態では、リンカーは、配列番号１３を含む配列を含む。

【0068】

ＤＮＡ結合タンパク質によって認識されたＤＮＡ結合標的配列に隣接して配置されると、動員依存性活性を示すトランケートされたＲＮＡプロモーター（例えば、Ｔ７プロモーター）を含むＤＮＡ鋳型と共に、野生型またはバリアントＲＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ）に融合または架橋されたカスタマイズ可能なＤＮＡ結合タンパク質（例えば、ＺＦＡ）を含む、プログラム可能なＲＮＡ合成系が本明細書に提供される。融合タンパク質のＲＮＡ転写活性は、開始および／または伸長の間にＤＮＡ鋳型またはＤＮＡ鋳型上の融合タンパク質の安定性に融合タンパク質の結合親和性を方向付けることにより、プログラムすることができる。例えば、融合タンパク質とＤＮＡ鋳型との間の結合親和性は、ＤＮＡ結合ドメイン、ＲＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡ結合タンパク質によって認識されたＤＮＡ鋳型中のＤＮＡ結合標的配列、および／またはトランケートされたプロモーター配列などの系中の任意の要素を修飾することより調節できる。例えば、ＺＦＡと結合したトランケートされたＴ７プロモーターに対して減少した結合親和性を有するバリアントＴ７ ＲＮＡポリメラーゼは、１つ以上のＺＦＡ結合配列のコピーおよびトランケートされたＴ７プロモーターを含むＤＮＡ鋳型を有する系の中で使用することができ、融合タンパク質の結合親和は、ＤＮＡ鋳型中のＺＦＡ結合配列のコピーの数に依存し得る。

【0069】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される融合タンパク質（例えば、ＲＮＡポリメラーゼまたはその機能的断片およびＤＮＡ結合ドメインを含む融合タンパク質）を使用して転写されたＲＮＡの量は、従来のＲＮＡポリメラーゼ、すなわち本明細書に記載される特徴または修飾のないＲＮＡポリメラーゼを使用して転写されたＲＮＡの量と比較して、増加し得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される融合タンパク質（例えば、ＲＮＡポリメラーゼまたはその機能的断片およびＤＮＡ結合ドメインを含む融合タンパク質）を使用して転写されたＲＮＡの量は、従来のＲＮＡポリメラーゼ、すなわち本明細書に記載される特徴または修飾のないＲＮＡポリメラーゼを使用して転写されたＲＮＡの量と比較して、少なくとも１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２．０倍、２．１倍、２．２倍、２．３倍、２．４倍、２．５倍、２．６倍、２．７倍、２．８倍、２．９倍、３．０倍、３．１倍、３．２倍、３．３倍、３．４倍、３．５倍、４．０倍、４．５倍、５．０倍、５．５倍、６．０倍、７．０倍、８．０倍、９．０倍、９．５倍、１０．０倍、１０．５倍、１１．０倍、１１．５倍、１２．０倍、１２．５倍、１３．０倍、１４．５倍、１５．０倍、１５．５倍、１６．０倍、１６．５倍、１７．０倍、１７．５倍、１８．０倍、１８．５倍、１９．０倍、１９．５倍、２０倍、２１倍、２２倍、２３倍、２４倍、２５倍、２６倍、２７倍、２８倍、２９倍、３０倍、３１倍、３２倍、３３倍、３４倍、３５倍、３６倍、３７倍、３８倍、３９倍、４０倍、４１倍、４２倍、４３倍、４４倍、４５倍、４６倍、４７倍、４８倍、４９倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、１１０倍、１２０倍、１３０倍、１４０倍、１５０倍、１６０倍、１７０倍、１８０倍、１９０倍、２００倍、２１０倍、２２０倍、２３０倍、２４０倍、２５０倍、２６０倍、２７０倍、２８０倍、２９０倍、３００倍、３１０倍、３２０倍、３３０倍、３４０倍、３５０倍、３６０倍、３７０倍、３８０倍、３９０倍、４００倍、４１０倍、４２０倍、４３０倍、４４０倍、４５０倍、４６０倍、４７０倍、４８０倍、４９０倍、５００倍、６１０倍、６２０倍、６３０倍、６４０倍、６５０倍、６６０倍、６７０倍、６８０倍、６９０倍、７００倍、７１０倍、７２０倍、７３０倍、７４０倍、７５０倍、７６０倍、７７０倍、７８０倍、７９０倍、８００倍、８１０倍、８２０倍、８３０倍、８４０倍、８５０倍、８６０倍、８７０倍、８８０倍、８９０倍、９００倍、９１０倍、９２０倍、９３０倍、９４０倍、９５０倍、９６０倍、９７０倍、９８０倍、９９０倍、１０００倍、１１００倍、１２００倍、１３００倍、１４００倍、１５００倍、１６００倍、１７００倍、１８００倍、１９００倍、２０００倍、２１００倍、２２００倍、２３００倍、２４００倍、２５００倍、２６００倍、２７００倍、２８００倍、２９００倍、３０００倍、３１００倍、３２００倍、３３００倍、３４００倍、３５００倍、３６００倍、３７００倍、３８００倍、３９００倍、４０００倍、４１００倍、４２００倍、４３００倍、４４００倍、４５００倍、４６００倍、４７００倍、４８００倍、４９００倍、５０００倍、５１００倍、５２００倍、５３００倍、５４００倍、５５００倍、５６００倍、５７００倍、５８００倍、５９００倍、６０００倍、６１００倍、６２００倍、６３００倍、６４００倍、６５００倍、６６００倍、６７００倍、６８００倍、６９００倍、７０００倍、７１００倍、７２００倍、７３００倍、７４００倍、７５００倍、７６００倍、７７００倍、７８００倍、７９００倍、８０００倍、８１００倍、８２００倍、８３００倍、８４００倍、８５００倍、８６００倍、８７００倍、８８００倍、８９００倍、９０００倍、９１００倍、９２００倍、９３００倍、９４００倍、９５００倍、９６００倍、９７００倍、９８００倍、９９００倍、または少なくとも１００００倍増加し得る。

【0070】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される融合タンパク質（例えば、ＲＮＡポリメラーゼまたはその機能的断片およびＤＮＡ結合ドメインを含む融合タンパク質）を使用したＲＮＡ合成に要するＤＮＡ鋳型の量は、従来のＲＮＡポリメラーゼ、すなわち本明細書に記載される特徴または修飾のないＲＮＡポリメラーゼを使用したＲＮＡ合成に要するＤＮＡ鋳型の量より、少なくてよい。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される融合タンパク質（例えば、ＲＮＡポリメラーゼまたはその機能的断片およびＤＮＡ結合ドメインを含む融合タンパク質）を使用したＲＮＡ合成に要するＤＮＡ鋳型の量は、従来のＲＮＡポリメラーゼ、すなわち本明細書に記載される特徴または修飾のないＲＮＡポリメラーゼを使用したＲＮＡ合成に要するＤＮＡ鋳型の量より、少なくとも１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２．０倍、２．１倍、２．２倍、２．３倍、２．４倍、２．５倍、２．６倍、２．７倍、２．８倍、２．９倍、３．０倍、３．１倍、３．２倍、３．３倍、３．４倍、３．５倍、４．０倍、４．５倍、５．０倍、５．５倍、６．０倍、７．０倍、８．０倍、９．０倍、９．５倍、または少なくとも１０．０倍少なくてよい。

【0071】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される融合タンパク質（例えば、ＲＮＡポリメラーゼまたはその機能的断片およびＤＮＡ結合ドメインを含む融合タンパク質）を使用したＲＮＡ合成に要するヌクレオシド三リン酸（ＮＴＰ）の量は、従来のＲＮＡポリメラーゼ、すなわち本明細書に記載される特徴または修飾のないＲＮＡポリメラーゼを使用したＲＮＡ合成に要するＮＴＰの量より、少なくてよい。例えば、本明細書に記載される融合タンパク質（例えば、ＲＮＡポリメラーゼまたはその機能的断片およびＤＮＡ結合ドメインを含む融合タンパク質）を使用したＲＮＡ合成に要するヌクレオシド三リン酸（ＮＴＰ）の量は、従来のＲＮＡポリメラーゼ、すなわち本明細書に記載される特徴または修飾のないＲＮＡポリメラーゼを使用したＲＮＡ合成に要するＮＴＰの量より、少なくとも１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２．０倍、２．１倍、２．２倍、２．３倍、２．４倍、２．５倍、２．６倍、２．７倍、２．８倍、２．９倍、３．０倍、３．１倍、３．２倍、３．３倍、３．４倍、３．５倍、４．０倍、４．５倍、５．０倍、５．５倍、６．０倍、７．０倍、８．０倍、９．０倍、９．５倍、または少なくとも１０．０倍少なくてよい。

【0072】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるプロモーター（例えば、本明細書に記載されるＤＮＡ結合標的配列を有するＤＮＡ鋳型中のプロモーター）への、本明細書に記載される融合タンパク質（例えば、ＲＮＡポリメラーゼまたはその機能的断片およびＤＮＡ結合ドメインを含む融合タンパク質）の結合は、本明細書に記載される特徴もしくは修飾のない従来のプロモーターまたはＤＮＡ鋳型（例えば、ＤＮＡ結合ドメインのないプロモーターまたはＤＮＡ鋳型）への、本明細書に記載される融合タンパク質（例えば、ＲＮＡポリメラーゼまたはその機能的断片およびＤＮＡ結合ドメインを含む融合タンパク質）の結合より、強力な場合がある。例えば、本明細書に記載されるプロモーター（例えば、本明細書に記載されるＤＮＡ結合標的配列を有するＤＮＡ鋳型中のプロモーター）への、本明細書に記載される融合タンパク質（例えば、ＲＮＡポリメラーゼまたはその機能的断片およびＤＮＡ結合ドメインを含む融合タンパク質）の結合は、本明細書に記載される特徴もしくは修飾のない従来のプロモーターまたはＤＮＡ鋳型（例えば、ＤＮＡ結合ドメインのないプロモーターまたはＤＮＡ鋳型）への、本明細書に記載される融合タンパク質（例えば、ＲＮＡポリメラーゼまたはその機能的断片およびＤＮＡ結合ドメインを含む融合タンパク質）の結合より、少なくとも１００倍、２００倍、３００倍、４００倍、５００倍、６００倍、７００倍、８００倍、９００倍、１０００倍、１１００倍、１２００倍、１３００倍、１４００倍、１５００倍、１６００倍、１７００倍、１８００倍、１９００倍、２０００倍、２１００倍、２２００倍、２３００倍、２４００倍、２５００倍、２６００倍、２７００倍、２８００倍、２９００倍、３０００倍、３１００倍、３２００倍、３３００倍、３４００倍、３５００倍、３６００倍、３７００倍、３８００倍、３９００倍、４０００倍、４１００倍、４２００倍、４３００倍、４４００倍、４５００倍、４６００倍、４７００倍、４８００倍、４９００倍、５０００倍、５１００倍、５２００倍、５３００倍、５４００倍、５５００倍、５６００倍、５７００倍、５８００倍、５９００倍、６０００倍、６１００倍、６２００倍、６３００倍、６４００倍、６５００倍、６６００倍、６７００倍、６８００倍、６９００倍、７０００倍、７１００倍、７２００倍、７３００倍、７４００倍、７５００倍、７６００倍、７７００倍、７８００倍、７９００倍、８０００倍、８１００倍、８２００倍、８３００倍、８４００倍、８５００倍、８６００倍、８７００倍、８８００倍、８９００倍、９０００倍、９１００倍、９２００倍、９３００倍、９４００倍、９５００倍、９６００倍、９７００倍、９８００倍、９９００倍、または少なくとも１００００倍強力な場合がある。

【0073】

合成されたＲＮＡ

【0074】

本明細書に記載されるマイクロ流体ポリヌクレオチド合成のための組成物、方法、デバイス、およびシステムによって合成されたＲＮＡが本明細書に提供される。本明細書に提供される合成されたＲＮＡは、コードＲＮＡまたは非コードＲＮＡを含む。一例では、コードＲＮＡはメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を含み得る。別の例では、非コードＲＮＡは、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、ｐｉｗｉ相互作用ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）、ＲＮＡアプタマー、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、またはアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）を含み得る。

【0075】

本明細書に記載されるマイクロ流体ポリヌクレオチド合成方法によって合成されたｇＲＮＡが、本明細書に提供される。ｇＲＮＡは、遺伝子スクリーニング、標的化された転写調節、標的化されたノックイン、ならびに塩基編集、エピジェネティック編集、および相同組換えを介したヌクレオチド配列挿入のための二本鎖切断（ＤＳＢ）の導入を含む標的化されたゲノム編集のために標的配列にＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系をガイドする際に使用され得る。ゲノム編集は、遺伝子発現を変更するために、既存のＤＮＡ配列を添加すること、除去すること、置き換えること、または修飾すること、および染色体再配列を誘導することまたは転写調節因子を修飾すること（例えば、遺伝子のプロモーター配列のメチル化／脱メチル反応）を含むが、これらに限定されないＤＮＡ配列の標的化された修飾を指し得る。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系には、ゲノム中の標的ＤＮＡ部位へＣａｓタンパク質を位置付けることができるガイド系が必要とされる。いくつかの例では、ガイド系は、Ｃａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９）によって認識された、標的ＤＮＡ部位およびトランス活性化型ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）スキャフォールドに相補的な１７～２０個のヌクレオチド配列を有するｃｒｉｓｐｒ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）を含む。標的ＤＮＡ部位に相補的な１７～２０ヌクレオチド配列はスペーサーと呼ばれるが、１７～２０個のヌクレオチド標的ＤＮＡ配列はプロトスペーサーと呼ばれる。ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡは２つの別個のＲＮＡ分子として自然に存在しているが、単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡまたはｇＲＮＡ）は、１つの単一ＲＮＡ分子へｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡの要素を組み合わせて融合するように操作され得る。したがって、一実施形態では、ｇＲＮＡは２つ以上のＲＮＡ、例えば、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを含む。別の実施形態では、ｇＲＮＡは、ゲノム標的化のためのスペーサー配列およびＣａｓタンパク質結合のためのスキャフォールド配列を含むｓｇＲＮＡを含む。いくつかの例では、ガイド系は自然にｓｇＲＮＡを含む。例えば、Ｃａｓ１２ａ／Ｃｐｆ１は、ｔｒａｃｒＲＮＡを欠き、かつＣａｓ１２ａ／Ｃｐｆ１結合のためのスペーサー配列およびスキャフォールドを含有しているｃｒＲＮＡのみを含む、ガイド系を利用する。スペーサー配列はゲノム中の標的部位に応じて変動し得るが、Ｃａｓタンパク質結合のためのスキャフォールド配列はすべてのｇＲＮＡに対して同一であり得る。

【0076】

本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は、様々なＣＲＩＳＰＲ酵素を含み得る。例えば、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１２ａ／Ｃｐｆｌ、Ｃａｓ１２ｂ／Ｃ２ｃｌ、Ｃａｓ１２ｃ／Ｃ２ｃ３、Ｃａｓ１２ｄ／ＣａｓＹ、Ｃａｓ１２ｅ／ＣａｓＸ、Ｃａｓ１２ｇ、Ｃａｓ１２ｈ、またはＣａｓ１２ｉを含み得る。Ｃａｓ酵素の非限定的な例として、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ５ｔ、Ｃａｓ５ｈ、Ｃａｓ５ａ、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ８ａ、Ｃａｓ８ｂ、Ｃａｓ８ｃ、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１またはＣｓｘ１２としても知られる）、Ｃａｓ１０、Ｃａｓ１０ｄ、Ｃａｓ１２ａ／Ｃｐｆｌ、Ｃａｓ１２ｂ／Ｃ２ｃｌ、Ｃａｓ１２ｃ／Ｃ２ｃ３、Ｃａｓ１２ｄ／ＣａｓＹ、Ｃａｓ１２ｅ／ＣａｓＸ、Ｃａｓ１２ｆ／Ｃａｓ１４／Ｃ２ｃ１０、Ｃａｓ１２ｇ、Ｃａｓ１２ｈ、Ｃａｓ１２ｉ、Ｃａｓ１２ｋ／Ｃ２ｃ５、Ｃａｓ１３ａ／Ｃ２ｃ２、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃ、Ｃａｓ１３ｄ、Ｃ２ｃ４、Ｃ２ｃ８、Ｃ２ｃ９、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｙ４、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｅ３、Ｃｓｅ４、Ｃｓｅ５ｅ、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ１、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ１、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１Ｓ、Ｃｓｘ１１、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、ＣｓＯ、Ｃｓｆ４、Ｃｓｄ１、Ｃｓｄ２、Ｃｓｔ１、Ｃｓｔ２、Ｃｓｈ１、Ｃｓｈ２、Ｃｓａ１、Ｃｓａ２、Ｃｓａ３、Ｃｓａ４、Ｃｓａ５、ＧＳＵ００５４、タイプＩＩのＣａｓエフェクタータンパク質、タイプＶのＣａｓエフェクタータンパク質、タイプＶＩのＣａｓエフェクタータンパク質、ＣＡＲＦ、ＤｉｎＧ、それらのホモログ、あるいはｄＣａｓ９（エンドヌクレアーゼ－不活性型Ｃａｓ９）およびｎＣａｓ９（不活性のＤＮＡ切断ドメインを有するＣａｓ９ニッカーゼ）などの修飾もしくは操作されたその変形が挙げられるが、これらに限定されない。場合によっては、本明細書に記載される組成物、方法、デバイス、およびシステムは、化膿連鎖球菌のＣａｓ９ヌクレアーゼを使用してもよく、そのアミノ酸配列と構造は当業者に周知である。

【0077】

Ｃａｓタンパク質をその標的ＤＮＡ配列（すなわち、標的ｄｓＤＮＡ）に結合することは、Ｃａｓタンパク質により標的とされ得るゲノム中の領域を制限する、非標的ＤＮＡ鎖上にプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）、すなわちプロトスペーサーに隣接した短鎖配列の存在を必要とする。様々な細菌種のＣａｓタンパク質は、様々なＰＡＭ配列を認識し、ＰＡＭ配列の上流の３～４のヌクレオチド（例えば、Ｃａｓ９）または下流の１８～２３のヌクレオチド（例えば、Ｃａｓ１２ａ／Ｃｐｆ１）を切断する。例えば、化膿連鎖球菌のＣａｓ９は、ＰＡＭ配列５’－ＮＧＧ－３’（「Ｎ」は、あらゆるヌクレオチドであり得る）を認識し、ＰＡＭ配列の上流の３つのヌクレオチドを切断する。別の例では、黄色ブドウ球菌のＣａｓ９は、ＰＡＭ配列５’－ＮＮＧＲＲＮ－３’（「Ｎ」は、あらゆるヌクレオチドであり得る）を認識し、ＰＡＭ配列の上流の４つのヌクレオチドを切断する。ＰＡＭ配列はＣａｓを介した切断には不可欠であるが、いくつかの例では、ｇＲＮＡ配列はＰＡＭ配列を含まない。

【0078】

ゲノム中の標的部位の配列に相補的なスペーサーを含む標的配列を含むｇＲＮＡが本明細書に提供される。本明細書に記載されるように、スペーサーは、約１０～約２５ヌクレオチド長を含み得る。例えば、ゲノム中の標的部位配列に相補的なスペーサー配列は、約１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２７、２８、３０、またはそれより上のヌクレオチド長であり得る。本明細書に記載されるように、標的部位は、ＰＡＭの第１のヌクレオチドのすぐ上流または５’の約２０ヌクレオチドの配列を含み得る。

【0079】

ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）によって現在生産されている市販のｇＲＮＡは、典型的にｇＲＮＡ配列の５’末端に１～３つの付加的なグアニン（Ｇ）を含む（図５）。最小化されたＴ７プロモーターを有するＴ７ ＲＮＡポリメラーゼは、ｇＲＮＡのＩＶＴに一般的に使用される。転写開始の最小規格は＋１の位置に１つのＧであるが、自然発生の転写開始配列はｇＲＮＡの５’末端から＋１、＋２、＋３の位置に最大３つのＧを有し得る。ＩＶＴで合成されたｇＲＮＡ中のそのような付加的なＧは、スペーサー配列の５’末端で余剰のＧをもたらすことがあり、例えば、Ｃａｓ９ｇＲＮＡでは、ｇＲＮＡとその標的配列との間に不対オーバーハングまたはミスマッチを引き起こす。この誤対合によって、標的化されたゲノム編集の効率が減少し得る（図５）。標的部位ＤＮＡ配列との５’末端対合を改良するために、スペーサーの５’末端にミスマッチのヌクレオチド含まないｇＲＮＡが本明細書に提供される。スペーサーの５’末端に付加的な１つ以上のＧがないｇＲＮＡは、オフターゲット効果の減少によって非常に正確なゲノム編集を支持することができる（図６）。ｇＲＮＡであって、ｇＲＮＡ配列の５’末端の少なくとも１つ、少なくとも２つ、または少なくとも３つの連続するヌクレオチドが、ゲノム中の標的配列の３’末端に対して１００％同一であるｇＲＮＡが、本明細書に提供される。本明細書に記載される組成物、方法、デバイス、およびシステムによって合成されたｇＲＮＡは、プロトスペーサー配列中に存在しないかまたは標的配列の３’末端に相補的でない付加的な５’末端Ｇヌクレオチドを含むｇＲＮＡと比較して改良または増強された、標的遺伝子中の標的配列との相補的塩基対を介した標的配列との対合を示す。

【0080】

ｇＲＮＡがＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系（例えば、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１２ａ／Ｃｐｆ１など）を有する複合体中の標的配列と接触した場合に標的配列の編集効率の増強を示すｇＲＮＡが本明細書に提供される。例えば、本明細書に提供されるｇＲＮＡ（例えば、５’末端に１つ以上の付加的なＧヌクレオチドを含まないｇＲＮＡ、または５’末端コドン中にＧヌクレオチドを含まないｇＲＮＡ）は、１つ以上の付加的な５’末端Ｇヌクレオチドを含むｇＲＮＡと比較して、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系を有する複合体中にある場合に標的配列の編集効率の増強を示すことができ、１つ以上の付加的な５’末端Ｇヌクレオチドは、プロトスペーサー配列中に存在しないか、またはゲノム中の標的配列の３’末端の１つ以上のヌクレオチドに相補的ではない。本明細書で使用されるとき、用語「コドン」は概して３つの連続するヌクレオチドを指し、アミノ酸をコードする、またはコードしない場合がある。本明細書で使用されるとき、「編集の効率」または「編集効率」は、標的ＤＮＡ配列を修飾するｇＲＮＡ指向性エフェクタータンパク質（例えば、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質）の能力を指し得る。標的配列の修飾の非限定的な例として、二本鎖切断を導入すること、核酸塩基を修飾すること、染色体再配列を誘導すること、および遺伝子のプロモーター配列のメチル化／脱メチル反応を修飾することが挙げられ得る。標的配列は、ゲノム中の遺伝子またはプロモーター領域に位置付けられてよい。エフェクタータンパク質は、ｇＲＮＡ指向性ヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ９または本明細書に記載された他のあらゆるＣａｓタンパク質などのＣａｓタンパク質であってよい。編集効率は、当業者に周知のあらゆる方法の使用によって測定することができる。例えば、ゲノム編集の効率または編集効率は、分解によるインデルのトラッキング（ＴＩＤＥ）分析、ｓｕｒｖｅｙｏｒヌクレアーゼアッセイ、接合部のＰＣＲ、ドロップレットデジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）、変性高速液体クロマトグラフィー（ＤＨＰＬＣ）、ＰＣＲ一本鎖構造多型（ＳＳＣＰ）、高解像度融解曲線（ＨＲＭ）、制限酵素消化が抑制されたＰＣＲ（ＲＥ－ＰＣＲ）、操作されたヌクレアーゼ誘導性転座（ＥＮＩＴ）、制限酵素消化、サンガーＤＮＡシーケンシング、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）などのディープシーケンシング、またはそれらのあらゆる組合せを使用することにより測定することができる。本明細書で使用されるとき、用語「インデル」は、核酸内のヌクレオチド塩基の挿入または欠失を指す。いくつかの実施形態では、ゲノム編集、例えば、二本鎖切断の生成の効率は、３つのステップによる方法であるＴＩＤＥ分析によって測定することができ、それによってヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）により標的化された領域は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系およびｇＲＮＡでトランスフェクトされた細胞から単離されたＤＮＡからＰＣＲ増幅される。標的部位の周囲で生成された５００～１５００ｂｐのアンプリコンは、従来のサンガーＤＮＡシーケンシング、続いてウェブベースのＴＩＤＥソフトウェアを使用した分析にかけられる。ヌクレアーゼによって行われたいかなる配列修飾も、異常な塩基シグナルで配列のグラフ中に視覚化される。また、ソフトウェアは切断部位の正確な局在化、および各インデルの推定された統計的有意性を提供する。いくつかの実施形態では、編集効率、例えば意図した標的部位中でＤＮＡ切断を生成する効率は、少なくとも３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％である。

【0081】

ｇＲＮＡが、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系（例えば、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１２ａ／Ｃｐｆ１など）を有する複合体中の標的配列と接触した場合に、オフターゲット編集（例えば、非標的配列の編集）の減少を示すｇＲＮＡが、さらに本明細書に提供される。例えば、本明細書に提供されるｇＲＮＡ（例えば、５’末端に１つ以上の付加的なＧヌクレオチドを含まないｇＲＮＡ、または５’末端コドン中にＧヌクレオチドを含まないｇＲＮＡ）は、１つ以上の付加的な５’末端Ｇヌクレオチドを含むｇＲＮＡと比較して、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系を有する複合体中にある場合に標的配列のオフターゲット編集の減少を示すことができ、１つ以上の付加的な５’末端Ｇヌクレオチドは、プロトスペーサー配列中に存在しないか、またはゲノム中の標的配列の３’末端の１つ以上のヌクレオチドに相補的ではない。いくつかの実施形態では、オフターゲット編集は、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％減少し得る。

【0082】

二次構造を含むｇＲＮＡが本明細書に提供される。例えば、Ｃａｓタンパク質によって認識されたｇＲＮＡのスキャフォールド部位は、ステム、ヘアピン、および／またはループなどの二次構造を形成し得る。本明細書に記載されるステムまたはヘアピンは、約３～１０ヌクレオチド長であり得る。ループは約６～２０ヌクレオチド長であり得る。ステムは、１つ以上の１～１０ヌクレオチド長の膨らみ部を含み得る。

【0083】

１つ以上のミスマッチのヌクレオチドを含む標的配列を含むｇＲＮＡがさらに本明細書に提供され、すなわち、スペーサー配列は、ゲノム中の標的部位配列に相補的でない１つ以上のヌクレオチドを含み得る。本明細書に記載されるスペーサーは、様々な数のミスマッチ、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５個のミスマッチを有し得る。いくつかの実施形態では、スペーサーは、最大１、２、３、４、または５つのミスマッチを含む。いくつかの実施形態では、スペーサーは、標的部位のプロトスペーサー配列と比較していずれのミスマッチも含まず、すなわち、スペーサーは１００％で標的配列とハイブリダイズする。本明細書に記載されるスペーサーは、少なくとも１つ～少なくとも５つのミスマッチのヌクレオチドを含み得る。例えば、スペーサーは、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、または少なくとも５つのミスマッチのヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施形態では、スペーサーは、最大３つ、最大４つ、最大５つ、最大６つ、または最大７つのミスマッチのヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施形態では、１つ以上のミスマッチのヌクレオチドは、スペーサー配列の５’末端に位置付けられてよい。いくつかの実施形態では、１つ以上のミスマッチのヌクレオチドは、スペーサー配列の３’末端に位置付けられてよい。いくつかの実施形態では、１つ以上のミスマッチのヌクレオチドは、スペーサー配列内部に位置付けられてよい。

【0084】

配列伸長を含むｇＲＮＡが本明細書に提供される。配列伸長は５’末端または３’末端上にあり得る、あるいは内部に添加され得る。例えば、ｇＲＮＡ Ｃａｓ１２ａ／Ｃｐｆ１（例えば、ｃｒＲＮＡ）の５’末端は、２～５９ヌクレオチドによって伸長することができる。Ｃａｓ１２ａ／Ｃｐｆ１ ｇＲＮＡの５’末端の伸長は、５’末端上のＣａｓ１２ａ／Ｃｐｆ１結合のためのスキャフォールド配列および３’末端上の標的配列を含み、伸長によってｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏでＣａｓ１２ａ／Ｃｐｆ１の編集効率ならびに送達を増加することができる。さらに、化学修飾に対するｇＲＮＡの耐性を増加させることができ、ｇＲＮＡの安定性の増強をもたらす。別の例では、ステムループ構造のステム領域を伸長するための２～１０ヌクレオチドの内部伸長を含むＣａｓ９のｇＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９を介したゲノム編集における遺伝子ノックアウト効率を増加させることができる。いくつかの例では、ｇＲＮＡは、２つ以上のｃｒＲＮＡ配列およびｔｒａｃｒＲＮＡ配列を含み得、ゲノム中の２つ以上の明確な領域で、２つ以上のＣａｓタンパク質および標的ＤＮＡ部位を結合し得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されたｇＲＮＡは、５’配列伸長を含み得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されたｇＲＮＡは、３’配列伸長を含み得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されたｇＲＮＡは、内部配列伸長を含み得る。いくつかの実施形態では、配列伸長は、少なくとも約１～少なくとも７０ヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施形態では、配列伸長は、少なくとも１、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、または少なくとも７０ヌクレオチドを含み得る。

【0085】

ヌクレオチドアナログ、例えば、グアニン（Ｇ）アナログを含むｇＲＮＡが本明細書に提供される。ヌクレオチドアナログは、リン酸骨格、糖、および／または核酸塩基の変質を含む。ヌクレオチドアナログの非限定的な例として、２－アミノアデノシン、２－チオチミジン、イノシン、ピロロ－ピリミジン、３－メチルアデノシン、５－メチルシチジン、２－アミノアデノシン、Ｃ５－ブロモウリジン、Ｃ５－フルオロウリジン、Ｃ５－ヨードウリジン、Ｃ５－プロピニル－ウリジン、Ｃ５－プロピニル－シチジン、Ｃ５－メチルシチジン、２－アミノアデノシン、７－デアザアデノシン、７－デアザグアノシン、８－オキソアデノシン、８－オキソグアノシン、Ｏ（６）－メチルグアニン、２－チオシチジン、２’－フルオロリボース、リボース、２’－デオキシリボース、アラビノース、ヘキソース、ホスホロチオエート結合、５’－Ｎ－ホスホラミダイト結合、インターカレート塩基、および／または化学的に修飾された塩基が挙げられる。５’末端Ｇアナログを欠いたｇＲＮＡと比較して、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系を有する複合体中にある場合に標的配列の編集効率の増強を示し得る５’末端Ｇアナログを含むｇＲＮＡが、本明細書に提供される。

【0086】

１０～１００ヌクレオチド長を含むＲＮＡがさらに本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、合成されたＲＮＡは、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００ヌクレオチド長を含む。いくつかの実施形態では、合成されたＲＮＡは、１０～２０ヌクレオチド、１０～３０ヌクレオチド、１０～４０ヌクレオチド、１０～５０ヌクレオチド、１０～６０ヌクレオチド、１０～７０ヌクレオチド、１０～８０ヌクレオチド、１０～９０ヌクレオチド、１０～１００ヌクレオチド、２０～３０ヌクレオチド、２０～４０ヌクレオチド、２０～５０ヌクレオチド、２０～６０ヌクレオチド、２０～７０ヌクレオチド、２０～８０ヌクレオチド、２０～９０ヌクレオチド、２０～１００ヌクレオチド、３０～４０ヌクレオチド、３０～５０ヌクレオチド、３０～６０ヌクレオチド、３０～７０ヌクレオチド、３０～８０ヌクレオチド、３０～９０ヌクレオチド、３０～１００ヌクレオチド、４０～５０ヌクレオチド、４０～６０ヌクレオチド、４０～７０ヌクレオチド、４０～８０ヌクレオチド、４０～９０ヌクレオチド、４０～１００ヌクレオチド、５０～６０ヌクレオチド、５０～７０ヌクレオチド、５０～８０ヌクレオチド、５０～９０ヌクレオチド、５０～１００ヌクレオチド、６０～７０ヌクレオチド、６０～８０ヌクレオチド、６０～９０ヌクレオチド、６０～１００ヌクレオチド、７０～８０ヌクレオチド、７０～９０ヌクレオチド、７０～１００ヌクレオチド、８０～９０ヌクレオチド、８０～１００ヌクレオチド、または９０～１００ヌクレオチド長を含む。いくつかの実施形態では、合成されたＲＮＡは、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、または少なくとも９０ヌクレオチド長を含む。いくつかの実施形態では、合成されたＲＮＡは、最大２０、最大３０、最大４０、最大５０、最大６０、最大７０、最大８０、最大９０、または最大１００ヌクレオチド長を含む。いくつかの実施形態では、合成されたＲＮＡは少なくとも２０ヌクレオチド長を含む。いくつかの実施形態では、合成されたＲＮＡは少なくとも８０ヌクレオチド長を含む。いくつかの実施形態では、合成されたＲＮＡは最大３０ヌクレオチド長を含む。

【0087】

合成されたＲＮＡは、本明細書に記載されるように、１つ以上の修飾を含み得る。例えば、合成されたＲＮＡは、合成ヌクレオチド、合成ヌクレオチドアナログ、ヌクレオチド誘導体、および／または修飾ヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施形態では、１つ以上の修飾は、合成されたＲＮＡの安定性を増加させることができる。いくつかの実施形態では、１つ以上の修飾は、合成されたＲＮＡの生物学的活性を増強することができる。いくつかの実施形態では、ホスホロチオエート（ＰＳ）結合代用物を使用したヌクレオチド間の結合の修飾は、ＲＮＡのエキソヌクレアーゼを介した分解を阻害するために導入され得る。いくつかの実施形態では、１つ以上の修飾は、合成されたＲＮＡの任意の位置で起こり得る。合成されたＲＮＡは、本明細書に記載されるように、天然のヌクレオシド（例えば、アデノシン、グアノシン、シチジン、およびウリジン）、ヌクレオシドアナログ（例えば、２－アミノアデノシン、２－チオチミジン、イノシン、ピロロ－ピリミジン、３－メチルアデノシン、５－メチルシチジン、２－アミノアデノシン、Ｃ５－ブロモウリジン、Ｃ５－フルオロウリジン、Ｃ５－ヨードウリジン、Ｃ５－プロピニル－ウリジン、Ｃ５－プロピニル－シチジン、Ｃ５－メチルシチジン、２－アミノアデノシン、７－デアザアデノシン、７－デアザグアノシン、８－オキソアデノシン、８－オキソグアノシン、Ｏ（６）－メチルグアニン、および２－チオシチジン）、化学的に修飾された塩基、生物学的に修飾された塩基（例えば、メチル化された塩基）、インターカレートされた塩基、修飾された糖（例えば、２’－フルオロリボース、リボース、２’－デオキシリボース、アラビノース、およびヘキソース）、および／または修飾されたリン酸基（例えば、ホスホロチオエート結合および５’－Ｎ－ホスホラミダイト結合）を含み得る。

【0088】

化学修飾を含むＲＮＡが本明細書に提供される。本明細書に記載されるような化学修飾は、５’三リン酸、５’二リン酸、５’一リン酸、および５’ヒドロキシルからなる群から選択される１つ以上の５’修飾を含み得る。別の実施形態では、化学修飾は、２’－Ｏメチル化（２’ＯＭｅ）、２’－Ｏ－メトキシ－エチル（２’－ＭＯＥ）、２’－フルオロ（２’Ｆ）、２－デオキシ－２’－チオ、および２’－アジドからなる群から選択される１つ以上のリボース修飾を含む。いくつかの実施形態では、化学的修飾は、ホスホロチオエート、メチルホスホナート、ホスホノカルボキシラート、ホスホノチオカルボキシラート、ボラノホスホネート、アルキルホスホナート、およびアルキルホスホナートからなる群から選択される１つ以上のヌクレオチド間の結合修飾を含む。

【0089】

化学修飾は、２，６－ジアミノプリン、２－アミノプリン、イノシン、２－アミノアデノシン、Ｎ６－メチルアデノシン、Ｎ６、２’－Ｏ－ジメチルアデノシン、Ｎ１－メチルアデノシン、２－アミノ－６－クロロプリンリボシド、５－メチルシチジン、５－ヒドロキシメチルシチジン、８－オキソ－７，８－ジヒドログアノシン、プソイドウリジン、Ｎ４－アセチルシチジン、５－ブロモ－ウリジン、５－メチルウリジン、および５－ニトロインドールからなる群から選択される１つ以上の複素環式修飾を含む修飾ヌクレオチドをさらに含む。いくつかの実施形態では、化学修飾は、ＧｐｐｐＧ、７－メチルグアニレート（ｍ７ＧｐｐｐＧ）、ｍ２，２，７ＧｐｐｐＧ、およびｍ７－３’－ＯＧｐｐｐＧ（ＡＲＣＡ）からなる群から選択される１つ以上の５’キャップ修飾を含む修飾ヌクレオチドを含むが、これらに限定されない。

【0090】

いくつかの例では、化学修飾は、付着化学（例えば、ビオチン）、色素、細胞標的化部分、活性化学、およびアミノ修飾剤からなる群から選択される１つ以上の５’キャップ修飾を含む修飾ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、付着化学はビオチンを含み得る。いくつかの実施形態では、色素はフルオレセインを含む。いくつかの実施形態では、細胞標的化部分はジゴキシゲニンを含む。いくつかの実施形態では、活性化学は、アジド、アクリダイト（ａｃｒｙｄｉｔｅ）、チオール、またはアルキンを含む。いくつかの実施形態では、アミノ修飾剤はアミノアリルを含む。

【0091】

核酸ライブラリー

【0092】

本明細書に記載されるマイクロ流体ポリヌクレオチド合成を使用して合成された、精製されたＲＮＡを含む、核酸ライブラリーが本明細書に提供される。本明細書に提供される核酸ライブラリーは、高純度かつ均一のＲＮＡ分子を含む。精製されたＲＮＡは、本明細書に記載されるように、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ｐｉｗｉ相互作用ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）、ＲＮＡアプタマー、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、またはアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）を含み得る。本明細書に記載されるように、ＲＮＡの純度は、等速電気泳動（ＩＴＰ）、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）、および／またはマイクロチップベースＣＥと結合したＩＴＰを含むが、これらに限定されない方法を使用して測定および分析できる。ＤＮＡ鋳型によってコードされたあらかじめ決定されたＲＮＡ配列と比較して、非常に正確な配列を有するＲＮＡを含む核酸ライブラリーがさらに本明細書に提供される。いくつかの例では、各ＲＮＡが少なくとも２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００ヌクレオチドを含む核酸ライブラリーについて、完全長の配列の割合は、少なくとも４０％、４５％、５０％、５２％、５５％、５８％、６０％、６２％、６５％、６８％、７０％、７２％、７５％、７８％、８０％、８２％、８５％、８８％、９０％、または９５％である。いくつかの例では、核酸ライブラリー中の少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、またはそれ以上のＲＮＡは、配列中のエラー、例えば、ヌクレオチド変化を有していない。いくつかの例では、核酸ライブラリー中の少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、またはそれ以上のＲＮＡは、配列中の挿入または欠失（インデル）を有している。いくつかの例では、本明細書に記載された核酸ライブラリーは、ＤＮＡ鋳型によってコードされたあらかじめ決定されたＲＮＡ配列と比較して、１：１００、１：５００、１：１０００、１：１５００、１：２０００、１：３０００、１：５０００、１：１０，０００未満、またはそれ以下のエラー率を有する。

【0093】

本明細書に記載された核酸ライブラリーは、ＲＮＡ種表現の尺度である、均一性の点から測定され得る。均一性は、クラスター当たりおよびデバイスベース当たりの両方で測定され得る。いくつかの例では、９９％のＲＮＡは、約０．０５、０．１、０．２、０．５、０．７、１、１．２、１．５、１．７倍以内、または平均存在量の約２倍以内の存在量を有する。いくつかの例では、９７％のポリヌクレオチドは、約０．０５、０．１、０．２、０．５、０．７、１、１．２、１．５、１．７倍以内、または平均存在量の約２倍以内の存在量を有する。いくつかの例では、６０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、または９９％の配列は、平均の２倍以内の存在量を有している。いくつかの例では、６０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、または９９％の配列は、平均の１．５倍以内の存在量を有している。いくつかの例では、６０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、または９９％の配列は、平均の１倍以内の存在量を有している。

【0094】

マイクロ流体ポリヌクレオチド合成後に高い均一性を有するＲＮＡ分子を含む核酸ライブラリーが本明細書に提供される。例えば、本明細書に記載される核酸ライブラリー中のＲＮＡの少なくとも約６０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、または９９％は、全ライブラリーについての平均頻度の１．５倍以内で表され得る。いくつかの実施形態では、核酸ライブラリーは少なくとも５０個のＲＮＡを含み、少なくとも５０個のＲＮＡのそれぞれは異なるガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）配列をコードし、少なくとも５０個のＲＮＡの少なくとも約９０％は、ライブラリー中の少なくとも５０個のＲＮＡについての平均頻度の１．５倍以内の量で核酸ライブラリー中にそれぞれ存在する、核酸ライブラリーが本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、核酸ライブラリーは少なくとも５０個のＲＮＡを含み、少なくとも５０個のＲＮＡのそれぞれは異なるガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）配列をコードし、少なくとも５０個のＲＮＡの少なくとも約９５％は、ライブラリー中の少なくとも５０個のＲＮＡについての平均頻度の１．５倍以内の量で核酸ライブラリー中にそれぞれ存在する。いくつかの実施形態では、核酸ライブラリーは少なくとも５０個のＲＮＡを含み、少なくとも５０個のＲＮＡのそれぞれは異なるガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）配列をコードし、少なくとも５０個のＲＮＡの少なくとも約９９％は、ライブラリー中の少なくとも５０個のＲＮＡについての平均頻度の１．５倍以内の量で核酸ライブラリー中にそれぞれ存在する。

【0095】

少なくとも１００，０００の個の精製されたＲＮＡを含む核酸ライブラリーが本明細書に提供される。例えば、核酸ライブラリーは、少なくとも１００，０００、１５０，０００、２００，０００、２５０，０００、３００，０００、３５０，０００、４００，０００、４５０，０００、５００，０００、５５０，０００、６００，０００、６５０，０００、７００，０００、７５０，０００、８００，０００、８５０，０００、９００，０００、９５０，０００、または１０００，０００個の精製されたＲＮＡを含み得る。いくつかの例では、精製されたＲＮＡはＲＮＡ配列を含み、ＲＮＡ配列のそれぞれは、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、または少なくとも１００ヌクレオチド長を含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ配列のそれぞれは、１０～２０ヌクレオチド、１０～３０ヌクレオチド、１０～４０ヌクレオチド、１０～５０ヌクレオチド、１０～６０ヌクレオチド、１０～７０ヌクレオチド、１０～８０ヌクレオチド、１０～９０ヌクレオチド、１０～１００ヌクレオチド、２０～３０ヌクレオチド、２０～４０ヌクレオチド、２０～５０ヌクレオチド、２０～６０ヌクレオチド、２０～７０ヌクレオチド、２０～８０ヌクレオチド、２０～９０ヌクレオチド、２０～１００ヌクレオチド、３０～４０ヌクレオチド、３０～５０ヌクレオチド、３０～６０ヌクレオチド、３０～７０ヌクレオチド、３０～８０ヌクレオチド、３０～９０ヌクレオチド、３０～１００ヌクレオチド、４０～５０ヌクレオチド、４０～６０ヌクレオチド、４０～７０ヌクレオチド、４０～８０ヌクレオチド、４０～９０ヌクレオチド、４０～１００ヌクレオチド、５０～６０ヌクレオチド、５０～７０ヌクレオチド、５０～８０ヌクレオチド、５０～９０ヌクレオチド、５０～１００ヌクレオチド、６０～７０ヌクレオチド、６０～８０ヌクレオチド、６０～９０ヌクレオチド、６０～１００ヌクレオチド、７０～８０ヌクレオチド、７０～９０ヌクレオチド、７０～１００ヌクレオチド、８０～９０ヌクレオチド、８０～１００ヌクレオチド、または９０～１００ヌクレオチド長を含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ配列のそれぞれは、最大２０、最大３０、最大４０、最大５０、最大６０、最大７０、最大８０、最大９０、または最大１００ヌクレオチド長を含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡのそれぞれは、少なくとも２０ヌクレオチド長を含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡのそれぞれは、少なくとも８０ヌクレオチド長を含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡのそれぞれは、最大３０ヌクレオチド長を含む。

【0096】

複数のＲＮＡを含む核酸ライブラリーがさらに本明細書に提供され、ＲＮＡのそれぞれは、同じＲＮＡ（例えば、ｇＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ＲＮＡアプタマー、またはＡＳＯ）配列を含む。いくつかの例では、核酸ライブラリーは、ＲＮＡの２つ以上の群を含み、ＲＮＡの２つ以上の群のそれぞれは、異なるＲＮＡ配列を含み、ＲＮＡの２つ以上の群またはそのそれぞれは、複数のＲＮＡを含む。いくつかの例では、核酸ライブラリーは、それぞれは異なるＲＮＡ配列を含む少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも３００、少なくとも４００、または少なくとも５００個の異なるＲＮＡの群を含む。いくつかの実施形態では、核酸ライブラリーは、それぞれ異なるＲＮＡ配列を含む少なくとも２００個のＲＮＡの群を含む。例えば、核酸ライブラリーは、２００個のＲＮＡの群を含み得、２００個のＲＮＡの群のそれぞれは複数のＲＮＡ分子を含み、また２００個のＲＮＡの群のそれぞれは異なるＲＮＡ配列を含み、したがって、核酸ライブラリーは、２００個の異なるＲＮＡ配列を有する複数のＲＮＡを含み得る。

【0097】

本明細書に記載される核酸ライブラリーは、付加的な成分をさらに含み得る。付加的な成分は、本明細書に記載されるマイクロ流体ポリヌクレオチド合成に含まれるあらゆる要素、例えば、ＮＨＳエステル反応産物、解離した転写複合体もしくは断片、転写反応成分、ヌクレオチド因子、ＩＴＰおよび／もしくはＣＥ緩衝液、マイクロ流体コーティングポリマー、ならびにＵＶ補助剤（ＵＶ ａｄｊｕｎｃｔｓ）を含み得る。例えば、核酸ライブラリーは、マイクロ流体ポリヌクレオチド合成に使用される鋳型としてトランケートされたＲＮＡポリメラーゼプロモーターをコードする少なくとも１つの一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）を含み得る。付加的な成分は、ＲＮＡポリメラーゼ、またはその機能的断片あるいはバリアント、ＲＮＡポリメラーゼ、またはその機能的断片あるいはバリアントおよびＤＮＡ結合タンパク質、またはその機能的断片あるいはバリアントを含む融合タンパク質、複数のオリゴヌクレオチド、複数の単一ヌクレオチド、Ｔｒｉｓ－ＨＣＬ、ＭｇＣｌ２、Ｍｎ２＋、スペルミジン、ジチオトレイトール、ＤＮＡ鋳型、ＮａＣｌ、ベータメルカプトエタノール（β－ＭＥ）、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、グリセロール、ピロホスファターゼ、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、Ｔｗｅｅｎ－２０、グルタミン酸カリウム、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）８０００、ならびに酢酸塩を含み得るが、これらに限定されない。

【0098】

少なくとも１つのオリゴヌクレオチドをさらに含む核酸ライブラリーが本明細書に提供される。例えば、オリゴヌクレオチドは、イニシエーターオリゴまたはターミネーターオリゴなどのＲＮＡプライマーであり得る。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドは、２～１０ヌクレオチド長を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドは、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０ヌクレオチド長を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドはＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドはＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドは、精製されたＲＮＡ、例えば、ｇＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはｍＲＮＡの５’末端の、もしくは５’末端付近の２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の連続するヌクレオチドに対して８０％、８５％、９０％、９５％、あるいは１００％同一である。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドは、精製されたＲＮＡ、例えば、ｇＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはｍＲＮＡの３’末端の、もしくは３’末端付近の２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の連続するヌクレオチドに対して８０％、８５％、９０％、９５％、あるいは１００％同一である。好ましい実施形態では、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドは、精製されたｇＲＮＡの５’末端の、または５’末端付近の２、３、４、５、６、７、８、９または１０個の連続するヌクレオチドに対して１００％同一である。別の実施形態では、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドは、精製されたｇＲＮＡの３’末端の、または３’末端付近の２、３、４、５、６、７、８、９または１０個の連続するヌクレオチドに対して１００％同一である。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドは、本明細書に記載される化学修飾（例えば、段落［０１０７］～［０１１０］を参照）を含み得る。イニシエーターオリゴの非限定的な例として、ＡｐＡ、ＡｐＵ、ＡｐＧ、ＡｐＣ、ＵｐＡ、ＵｐＵ、ＵｐＧ、ＵｐＣ、ＧｐＡ、ＧｐＵ、ＧｐＧ、ＧｐＣ、ＣｐＡ、ＣｐＵ、ＣｐＧ、ＣｐＣが挙げられ、ｐはリン酸ジエステル結合および残りの５’リン酸基を示す。

【0099】

本明細書に記載される付加的な成分を含む核酸ライブラリーが本明細書に提供され、付加的な成分は、１０ｐＭ、９ｐＭ、８ｐＭ、７ｐＭ、６ｐＭ、５ｐＭ、４ｐＭ、３ｐＭ、２ｐＭ、１ｐＭ、０．５ｐＭ、０．１ｐＭ、０．０５ｐＭ未満、または０．０１ｐＭ未満の量で核酸ライブラリー中に存在し得る。本明細書に記載される付加的な成分を含む核酸ライブラリーがさらに本明細書に提供され、付加的な成分は、少なくとも０．０１ｐＭ、０．０５ｐＭ、０．１ｐＭ、０．５ｐＭ、１ｐＭ、２ｐＭ、３ｐＭ、４ｐＭ、５ｐＭ、６ｐＭ、７ｐＭ、８ｐＭ、９ｐＭ、または少なくとも１０ｐＭの量で核酸ライブラリー中に存在し得る。本明細書に記載される付加的な成分を含む核酸ライブラリーがさらに本明細書に提供され、付加的な成分は、最大２０ｐＭ、１５ｐＭ、１０ｐＭ、９ｐＭ、８ｐＭ、７ｐＭ、６ｐＭ、５ｐＭ、４ｐＭ、３ｐＭ、２ｐＭ、１ｐＭ、０．５ｐＭ、０．１ｐＭ、０．０５ｐＭ、または最大０．０１ｐＭの量で核酸ライブラリー中に存在し得る。例えば、複数の精製されたＲＮＡを含む核酸ライブラリーは、少なくとも１ｐＭのマイクロ流体コーティングポリマーをさらに含み得る。いくつかの実施形態では、少なくとも１ｐＭのマイクロ流体コーティングポリマーは、最大１０ｐＭのマイクロ流体コーティングポリマーを含む。例えば、複数の精製されたＲＮＡを含む核酸ライブラリーは、少なくとも１ｐＭのＵＶ補助剤をさらに含み得る。いくつかの実施形態では、少なくとも１ｐＭのＵＶ補助剤は、最大１０ｐＭのＵＶ補助剤を含む。

【0100】

コンピュータシステム

【0101】

本明細書に記載の任意のシステムは、コンピュータに操作可能に連結され得、コンピュータを介して局所的にまたは遠隔で自動操作され得る。様々な例では、本発明の方法およびシステムは、コンピュータシステム上のソフトウェアプログラム、およびその使用をさらに含んでもよい。したがって、材料堆積装置の動作、分配行為、ならびに減圧の作動を編成および同期するなど、機能の分配／減圧／再充填の同期のためのコンピュータ制御は、本発明の範囲内にある。コンピュータシステムは、表面の指定された領域に正しい試薬を送達するために、ユーザーに指定された鋳型配列と材料堆積デバイスの位置との間に干渉するようにプログラムされる。

【0102】

図７に例示されるコンピュータシステム（７００）は、媒体（７１１）、および／または固定された媒体（７１２）を有するサーバー（７０９）に任意選択で接続され得るネットワークポート（７０５）から命令を読み出すことができる論理装置として理解され得る。図７に示されるものなどのシステムは、ＣＰＵ（７０１）、ディスクドライブ（７０３）、キーボード（７１５）および／またはマウス（７１６）などの任意選択の入力デバイス、ならびに任意選択のモニター（７０７）を含み得る。データ通信は指示された通信媒体を介して局所位置または遠隔位置のサーバーまで達成され得る。通信媒体は、データを送信および／または受信する任意の手段を含むことができる。例えば、通信媒体は、ネットワーク接続、無線接続、またはインターネット接続であり得る。そのような接続は、ワールド・ワイド・ウェブ（Ｗｏｒｌｄ Ｗｉｄｅ Ｗｅｂ）上での通信を提供することができる。本開示に関するデータは、図７に例示されるように当事者（７２２）による受領および／または検討のためにそのようなネットワークまたは接続によって伝達され得ることが想定される。

【0103】

図８に示されるように、本発明の例に関連して使用され得るコンピューターシステム（８００）の第１の例となるアーキテクチャを例示するブロック図が本明細書に提供される。図８に表されるように、例示的なコンピュータシステムは、命令を処理するためのプロセッサ（８０２）を含んでもよい。プロセッサの非限定的な例として、Ｉｎｔｅｌ Ｘｅｏｎ（商標）プロセッサ、ＡＭＤ Ｏｐｔｅｒｏｎ（商標）プロセッサ、Ｓａｍｓｕｎｇ ８－ｂｉｔ ＲＩＳＣ ＡＲＭ １１７６ＪＺ（Ｆ）－Ｓ ｖ１．０（商標）プロセッサ、ＡＲＭ Ｃｏｒｔｅｘ－Ａ８ Ｓａｍｓｕｎｇ Ｓ５ＰＣ１００（商標）プロセッサ、ＡＲＭ Ｃｏｒｔｅｘ－Ａ８ Ａｐｐｌｅ Ａ４（商標）プロセッサ、Ｍａｒｖｅｌｌ ＰＸＡ ９３０（商標）プロセッサ、または機能的に同等なプロセッサが挙げられる。実行の複数のスレッドが並列処理に使用可能である。いくつかの例では、複数のプロセッサ、または複数のコアを持つプロセッサも、単一のコンピュータシステム中であろうと、クラスターの中であろうと、または、複数のコンピュータ、携帯電話、および／または個人用携帯情報端末デバイスを含むネットワーク上のシステムにわたって分布されていても、使用可能である。

【0104】

図８に例示されるように、高速キャッシュ（８０４）は、プロセッサ（８０２）に接続するか、または組み込まれることで、プロセッサ（８０２）により近年使用されてきたまたは頻繁に使用されている命令またはデータのための高速メモリを提供することができる。プロセッサ（８０２）は、プロセッサバス（８０８）によりノースブリッジ（８０６）に接続される。ノースブリッジ（８０６）は、メモリバス（８１２）によりランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）（８１０）に接続され、プロセッサ（８０２）によりＲＡＭ（８１０）へのアクセスを管理する。ノースブリッジ（８０６）は、チップセットバス（８１６）によりサウスブリッジ（８８）にも接続される。サウスブリッジ（８１４）は次に、ペリフェラルバス（８１８）に接続される。ペリフェラルバスは、例えば、ＰＣＩ、ＰＣＩ－Ｘ、ＰＣＩ Ｅｘｐｒｅｓｓ、または他のペリフェラルバスであってもよい。ノースブリッジおよびサウスブリッジはしばしば、プロセッサチップセットと称され、ペリフェラルバス（８１８）上でプロセッサと、ＲＡＭと、周辺コンポーネントとの間のデータ転送を管理する。いくつかの代替的なアーキテクチャでは、ノースブリッジの機能性は、別のノースブリッジチップを使用する代わりにプロセッサに組み込まれ得る。いくつかの例では、システム（８００）は、ペリフェラルバス（８１８）に取り付けられたアクセラレータカード（８２２）を含むことができる。アクセラレータは、フィールドプログラマブルゲートアレイ（ＦＰＧＡ）、または特定の処理を促進するための他のハードウェアを含んでもよい。例えば、アクセラレータは、適応データの再構成のために、または拡張された設定処理に使用される代数式を評価するために使用され得る。

【0105】

ソフトウェアとデータは、外部ストレージ（８２４）に記憶され、プロセッサにより使用されるＲＡＭ（８１０）および／またはキャッシュ（８０４）へとロードすることができる。システム（８００）は、システムリソースの管理のためのオペレーティングシステムを含み、オペレーティングシステムの非限定的な例として、Ｌｉｎｕｘ、Ｗｉｎｄｏｗｓ（商標）、ＭＡＣＯＳ（商標）、ＢｌａｃｋＢｅｒｒｙ ＯＳ（商標）、ｉＯＳ（商標）、及び他の機能的に同等なＯＳ、同様に、本発明の例に従ってデータの記憶と最適化を管理するためのオペレーティングシステム上で実行するアプリケーションソフトウェアが挙げられる。この例では、システム（８００）は、ネットワーク接続ストレージ（ＮＡＳ）などの外部記憶装置、および分散並列処理に使用することができる他のコンピュータシステムにネットワークインターフェースを提供するために、周辺バスに接続されるネットワークインターフェースカード（ＮＩＣ）（８２０）および（８２１）をさらに含む。

【0106】

図９に示されるように、複数のコンピュータシステム（９０２ａ）および（９０２ｂ）、複数の携帯電話および個人用携帯情報端末（９０２ｃ）、ならびにネットワーク接続ストレージ（ＮＡＳ）（９０４ａ）および（９０４ｂ）を備えたネットワーク（９００）を示す略図が本明細書に提供される。例では、システム（９０２ａ）、（９０２ｂ）、および（９０２ｃ）は、データ記憶を管理し、ネットワーク接続ストレージ（ＮＡＳ）（９０４ａ）および（９０４ｂ）に記憶されたデータに対するデータアクセスを最適化することができる。数学モデルがこのデータに対して使用可能であり、コンピュータシステム（９０２ａ）および（９０２ｂ）、ならびに携帯電話および個人用携帯情報端末システム（９０２ｃ）にわたって分散並列処理を使用して評価可能である。コンピュータシステム（９０２ａ）および（９０２ｂ）、ならびに携帯電話および個人用携帯情報端末システム（９０２ｃ）は、ネットワーク接続ストレージ（ＮＡＳ）（９０４ａ）および（９０４ｂ）に記憶されたデータの適応データ再構築に対して並列処理を提供することもできる。図９は一例のみを示しており、様々な他のコンピュータのアーキテクチャおよびシステムは、本発明の様々な例と共に使用され得る。例えば、ブレードサーバーは並列処理を提供するために使用することができる。プロセッサブレードは、並列処理を提供するためにバックプレーンを介して接続可能である。ストレージも、バックプレーンに接続することができるか、または別のネットワークインターフェースを介してネットワーク接続ストレージ（ＮＡＳ）として接続可能である。

【0107】

いくつかの例では、プロセッサは、別のメモリ空間を維持し、ネットワークインターフェース、バックプレーン、または他のプロセッサによる並列処理のための他のコネクターを介してデータを伝達することができる。他の例では、プロセッサのいくつかまたはすべてが、共有仮想アドレスメモリ空間を使用することができる。

【0108】

実施形態の一例による、図１０に例示されるような共有の仮想アドレスメモリ空間を使用した、マルチプロセッサコンピュータシステム（１０００）のブロック図が本明細書に提供される。上記システムは、共有メモリサブシステム（１００４）にアクセス可能な複数のプロセッサ（１００２ａ～１００２ｆ）を含むプロセッサ（１００２）を含む。上記システムは、メモリサブシステム（１００４）に複数のプログラム可能なハードウェアメモリアルゴリズムプロセッサ（ＭＡＰ）（１００６ａ～１００６ｆ）を組み込む。各ＭＡＰ（１００６ａ～１００６ｆ）は、メモリ（１００８ａ～１００８ｆ）および１つ以上のフィールドプログラマブルゲートアレイ（ＦＰＧＡ）（１０１０ａ～１０１０ｆ）を含み得る。ＭＡＰは構成可能な機能ユニットを提供し、特定のアルゴリズムまたはアルゴリズムの一部は、それぞれのプロセッサと密接に協働して処理するためのＦＰＧＡ（１０１０ａ～１０１０ｆ）に提供され得る。例えば、ＭＡＰは、データモデルに関する代数式を評価し、かつ例における適応データの再構築を行なうために使用することができる。この例では、各ＭＡＰは、このような目的のためにプロセッサすべてによって世界中からアクセス可能である。１つの構成では、各ＭＡＰは、関連するメモリ（１００８ａ～１００８ｆ）にアクセスするためにダイレクトメモリアクセス（ＤＭＡ）を使用することができ、それにより、それぞれのマイクロプロセッサ（１００２ａ～１００２ｆ）から独立して、かつこれらから非同期的に、タスクを実行することができる。この構成では、ＭＡＰは、アルゴリズムのパイプライン処理（ｐｉｐｅｌｉｎｉｎｇ）および並列実行のために別のＭＡＰに直接結果を供給することができる。

【0109】

上記のコンピューターアーのキテクチャーおよびシステムは、単に例であり、一般的なプロセッサ、コプロセッサ、ＦＰＧＡおよび他のプログラマブルロジックデバイス、システムオンチップ（ＳＯＣ）、特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）、ならびに他の処理素子および論理素子のあらゆる組合せを使用したシステムを含む、様々な他のコンピュータ、携帯電話、パーソナルデータアシスタントのアーキテクチャおよびシステムが、例に関連して使用され得る。いくつかの例では、コンピュータシステムのすべてまたは一部は、ソフトウェアまたはハードウェアに実装することができる。様々なデータ記憶媒体が、ランダムアクセスメモリ、ハードドライブ、フラッシュメモリ、テープドライブ、ディスクアレイ、ネットワーク接続ストレージ（ＮＡＳ）、および他のローカルまたは分散データ記憶装置およびシステムを含む例と共に使用することができる。

【0110】

例では、コンピュータシステムは、上記のまたは他のコンピュータのアーキテクチャおよびシステムのいずれかで実行されるソフトウェアモジュールを使用して実施され得る。他の例では、システムの機能は、ファームウェア、図１０で参照されるようなフィールドプログラマブルゲートアレイ（ＦＰＧＡ）などのプログラマブルロジックデバイス、システムオンチップ（ＳＯＣ）、特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）、または他の処理要素および論理素子において部分的または完全に実装することができる。例えば、セットプロセッサおよびオプティマイザは、図７に例示されるアクセラレータカード（７２２）などのハードウェアアクセラレータカードの使用によってハードウェアアクセラレーションで実施され得る。

【0111】

他の実施形態

【0112】

いくつかの態様では、ＲＮＡを合成するための方法が本明細書に提供され、上記方法は、表面上で固定されたＲＮＡポリメラーゼを提供する工程と、毎時少なくとも５０ヌクレオチドの伸長速度で複数のＲＮＡを合成する工程であって、複数のＲＮＡのそれぞれはあらかじめ選択された配列を有しており、合成する工程は１つの伸長反応において一塩基ずつ伸長させることを含む、工程とを含む。いくつかの実施形態では、複数のＲＮＡのそれぞれは、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む。いくつかの実施形態では、複数のＲＮＡのそれぞれは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ｐｉｗｉ相互作用ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）、ＲＮＡアプタマー、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、およびアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、合成は鋳型ＤＮＡを用いて実行される。いくつかの実施形態では、鋳型ＤＮＡは表面上で固定される。いくつかの実施形態では、鋳型ＤＮＡは、リンカー、ビオチンまたはストレプトアビジンによって表面上で固定される。いくつかの実施形態では、鋳型ＤＮＡは一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）を含む。いくつかの実施形態では、鋳型ＤＮＡは二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）を含む。いくつかの実施形態では、鋳型ＤＮＡは二次構造を含む。いくつかの実施形態では、二次構造はヘアピンを含む。いくつかの実施形態では、鋳型ＤＮＡはプロモーター配列を含む。いくつかの実施形態では、プロモーター配列は、トランケートされたプロモーター配列である。いくつかの実施形態では、伸長速度は毎分少なくとも５０ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、伸長速度は毎秒少なくとも５０ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼは、ファージＲＮＡポリメラーゼ、細菌ＲＮＡポリメラーゼ、および真核生物ＲＮＡポリメラーゼからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼは、標準のＮ－ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＮＨＳ）官能基を用いて表面を活性化することによって表面上で固定される。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼは無水トリフルオロ酢酸（ＴＦＡＡ）官能基を用いて表面を活性化することによって表面上で固定される。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼはグルタルアルデヒド（ＧＡ）官能基を用いて表面を活性化することによって表面上で固定される。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼは、リンカー、ビオチンまたはストレプトアビジンによって表面上で固定される。いくつかの実施形態では、表面は固体表面である。いくつかの実施形態では、表面は、磁気ビーズ、アガロースビーズ、溶融石英、ゾル－ゲル、シリカポリマー、シリカモノリス、セルロース、寒天、アクリルアミド、金ビーズ、またはゲルマトリックスを含む。いくつかの実施形態では、複数のＲＮＡのそれぞれは、あらかじめ選択された同じ配列を有する。いくつかの実施形態では、複数のＲＮＡは、あらかじめ選択された異なる配列を含む少なくとも２つのＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、複数のＲＮＡは、少なくとも１つの化学修飾されたｇＲＮＡを含む。

【0113】

いくつかの態様では、ＲＮＡを合成するための方法が本明細書に提供され、上記方法は、融合ＲＮＡポリメラーゼ、またはその機能的断片あるいはバリアントを提供する工程と、毎時少なくとも５０ヌクレオチドの伸長速度で複数のＲＮＡを合成する工程であって、複数のＲＮＡのそれぞれはあらかじめ選択された配列を有しており、合成する工程は１つの伸長反応において一塩基ずつ伸長させることを含む工程とを含む。いくつかの実施形態では、融合ＲＮＡポリメラーゼは、ＲＮＡポリメラーゼ、またはその機能的断片あるいはバリアント、ならびにＤＮＡ結合タンパク質、またはその機能的断片あるいはバリアントを含み、ＲＮＡポリメラーゼおよびＤＮＡ結合タンパク質は異種である。いくつかの実施形態では、融合ＲＮＡポリメラーゼはリンカーをさらに含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼは、ファージＲＮＡポリメラーゼ、細菌ＲＮＡポリメラーゼ、および真核生物ＲＮＡポリメラーゼからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ結合タンパク質は、ＲＮＡポリメラーゼのＮ末端に融合される。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ結合タンパク質は、ＲＮＡポリメラーゼのＣ末端に融合される。いくつかの実施形態では、複数のＲＮＡのそれぞれは、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む。いくつかの実施形態では、複数のＲＮＡのそれぞれは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ｐｉｗｉ相互作用ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）、ＲＮＡアプタマー、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、およびアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、合成する工程は鋳型ＤＮＡを用いて実行される。いくつかの実施形態では、鋳型ＤＮＡは一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）を含む。いくつかの実施形態では、鋳型ＤＮＡは二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）を含む。いくつかの実施形態では、鋳型ＤＮＡは二次構造を含む。いくつかの実施形態では、二次構造はヘアピンを含む。いくつかの実施形態では、鋳型ＤＮＡはプロモーター配列を含む。いくつかの実施形態では、プロモーター配列は、トランケートされたプロモーター配列である。いくつかの実施形態では、伸長速度は毎分少なくとも５０ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、伸長速度は毎秒少なくとも５０ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、複数のＲＮＡのそれぞれは、同じあらかじめ選択された配列を有する。いくつかの実施形態では、複数のＲＮＡは、異なるあらかじめ選択された配列を含む少なくとも２つのＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、複数のＲＮＡは、少なくとも１つの化学修飾されたｇＲＮＡを含む。

【0114】

いくつかの態様では、複数の精製されたガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と、トランケートされたＲＮＡポリメラーゼプロモーター領域をコードする少なくとも１つの一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）分子とを含む核酸ライブラリーが本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、精製されたｇＲＮＡのそれぞれは、少なくとも２０ヌクレオチド長の配列を含む。いくつかの実施形態では、精製されたｇＲＮＡのそれぞれは、少なくとも８０ヌクレオチド長の配列を含む。いくつかの実施形態では、複数の精製されたｇＲＮＡは、少なくとも１００，０００個の精製されたｇＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、トランケートされたＲＮＡポリメラーゼプロモーター領域は、配列番号３～６からなる群から選択された配列を含む。いくつかの実施形態では、複数の精製されたｇＲＮＡは、修飾されたヌクレオチドを含む。

【0115】

いくつかの態様では、少なくとも２０ヌクレオチド長の複数の精製されたガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、および２～１０ヌクレオチド長の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含む核酸ライブラリーが本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、複数の精製されたガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）は、少なくとも８０ヌクレオチド長を含む。いくつかの実施形態では、複数の精製されたｇＲＮＡは、少なくとも１００，０００個の精製されたｇＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのオリゴヌクレオチド長は、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドはＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドは、精製されたガイドＲＮＡの５’末端の、または５’末端付近の２、３、４、５、６、７、８、９または１０個の連続するヌクレオチドに対して１００％同一である。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドは、精製されたガイドＲＮＡの３’末端の、または３’末端付近の２、３、４、５、６、７、８、９または１０個の連続するヌクレオチドに対して１００％同一である。

【0116】

いくつかの実施形態では、複数の精製されたｇＲＮＡは、少なくとも１つの化学修飾されたｇＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、化学修飾は、５’三リン酸、５’二リン酸、５’一リン酸、および５’ヒドロキシルからなる群から選択される１つ以上の５’修飾を含む。いくつかの実施形態では、化学修飾は、２’－Ｏ－メチル化（２’ＯＭｅ）、２’－Ｏ－メトキシ－エチル（２’－ＭＯＥ）、２’－フルオロ（２’Ｆ）、２－デオキシ－２’－チオ、および２’－アジドからなる群から選択される１つ以上のリボース修飾を含む。いくつかの実施形態では、化学修飾は、ホスホロチオエート、メチルホスホナート、ホスホノカルボキシラート、ホスホノチオカルボキシラート、ボラノホスホネート、アルキルホスホナート、およびアルキルホスホナートからなる群から選択される１つ以上のヌクレオチド間結合修飾を含む。いくつかの実施形態では、化学修飾は、２，６－ジアミノプリン、２－アミノプリン、イノシン、２－アミノアデノシン、Ｎ６－メチルアデノシン、Ｎ６、２’－Ｏ－ジメチルアデノシン、Ｎ１－メチルアデノシン、２－アミノ－６－クロロプリンリボシド、５－メチルシチジン、５－ヒドロキシメチルシチジン、８－オキソ－７，８－ジヒドログアノシン、プソイドウリジン、Ｎ４－アセチルシチジン、５－ブロモ－ウリジン、５－メチルウリジン、および５－ニトロインドールからなる群から選択される１つ以上の複素環式修飾を含む修飾ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、化学修飾は、ＧｐｐｐＧ、７－メチルグアニレート（ｍ７ＧｐｐｐＧ）、ｍ２，２，７ＧｐｐｐＧ、およびｍ７－３’－ＯＧｐｐｐＧ（ＡＲＣＡ）からなる群から選択される１つ以上の５’キャップ修飾を含む修飾ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、化学修飾は、付着化学、色素、細胞標的化部分、活性化学、およびアミノ修飾剤からなる群から選択される１つ以上の５’キャップ修飾を含む修飾ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、付着化学はビオチンを含む。いくつかの実施形態では、色素はフルオレセインを含む。いくつかの実施形態では、細胞標的化部分はジゴキシゲニンを含む。いくつかの実施形態では、活性化学は、アジド、アクリダイト（ａｃｒｙｄｉｔｅ）、チオール、またはアルキンを含む。いくつかの実施形態では、アミノ修飾剤はアミノアリルを含む。

【0117】

いくつかの態様では、少なくとも５０個のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む核酸ライブラリーを作製する方法が本明細書に提供され、上記方法は、ＲＮＡポリメラーゼを使用して少なくとも５０個のｇＲＮＡを合成する工程を含み、少なくとも５０個のｇＲＮＡのうちの少なくとも１つは標的遺伝子中の標的配列に相補的なスペーサー配列を含み、スペーサー配列の５’末端ヌクレオチドは標的配列の３’末端ヌクレオチドに相補的である。いくつかの実施形態では、少なくとも５０個のｇＲＮＡのそれぞれは、標的遺伝子中の標的配列に相補的なスペーサー配列を含み、スペーサー配列の５’末端ヌクレオチドは、標的配列の３’末端ヌクレオチドに相補的である。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼは、ファージＲＮＡポリメラーゼ、細菌ＲＮＡポリメラーゼ、および真核生物ＲＮＡポリメラーゼからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼは、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼである。いくつかの実施形態では、少なくとも５０個のｇＲＮＡのそれぞれは、標的配列の３’末端ヌクレオチドに相補的でない５’末端ヌクレオチドを含むｇＲＮＡと比較して、標的配列の編集効率の増強を示す。いくつかの実施形態では、少なくとも５０個のｇＲＮＡのそれぞれは、標的配列の３’末端ヌクレオチドに相補的でない５’末端ヌクレオチドを含むｇＲＮＡと比較して、オフターゲット編集の減少を示す。いくつかの実施形態では、少なくとも５０個のｇＲＮＡは、５’末端グアニン（Ｇ）ヌクレオチドを欠くｇＲＮＡ配列を含み、ｇＲＮＡ配列は少なくとも４０ヌクレオチド長を含み、ｇＲＮＡ配列の５’末端の少なくとも３つの連続するヌクレオチドは、ゲノム中の標的配列の３’末端に対して１００％同一である。いくつかの実施形態では、少なくとも５０個のｇＲＮＡのそれぞれは、５’末端Ｇヌクレオチドを含むｇＲＮＡ配列を含むｇＲＮＡと比較して、標的配列と対になる増強された５’末端を示し、５’末端Ｇヌクレオチドはプロトスペーサー配列中に存在しない。いくつかの実施形態では、少なくとも５０個のｇＲＮＡのそれぞれは、スペーサー配列を含むｇＲＮＡ配列を含むｇＲＮＡと比較して、標的配列の編集効率の増強を示し、ｇＲＮＡ配列は、スペーサー配列の５’末端に１つ以上のＧヌクレオチドを含み、スペーサー配列の５’末端の１つ以上のＧヌクレオチドは、ゲノム中の標的配列の３’末端の１つ以上のヌクレオチドに相補的でない。いくつかの実施形態では、少なくとも５０個のｇＲＮＡのそれぞれは、スペーサー配列を含むｇＲＮＡ配列を含むｇＲＮＡと比較して、オフターゲット編集の減少を示し、ｇＲＮＡ配列は、スペーサー配列の５’末端に１つ以上のＧヌクレオチドを含み、スペーサー配列の５’末端の１つ以上のＧヌクレオチドは、ゲノム中の標的配列の３’末端の１つ以上のヌクレオチドに相補的でない。いくつかの実施形態では、少なくとも５０個のｇＲＮＡは、５’末端コドン中でグアニン（Ｇ）ヌクレオチドを欠くｇＲＮＡ配列を含み、ｇＲＮＡ配列は少なくとも４０ヌクレオチド長を含み、ｇＲＮＡ配列の５’末端の少なくとも３つの連続するヌクレオチドは、ゲノム中の標的配列の３’末端に対して１００％同一である。いくつかの実施形態では、少なくとも５０個のｇＲＮＡは、５’末端コドン中にグアニン（Ｇ）ヌクレオチドを含むｇＲＮＡ配列を含むｇＲＮＡと比較して、標的配列と対になる増強された５’末端を示し、５’末端コドン中のＧヌクレオチドはプロトスペーサー配列中に存在しない。いくつかの実施形態では、少なくとも５０個のｇＲＮＡのそれぞれは、スペーサー配列を含むｇＲＮＡ配列を含むｇＲＮＡと比較して、標的配列の編集効率の増強を示し、ｇＲＮＡ配列は、スペーサー配列の５’末端に１つ以上のＧヌクレオチドを含み、スペーサー配列の５’末端の１つ以上のＧヌクレオチドは、ゲノム中の標的配列の３’末端の１つ以上のヌクレオチドに相補的でない。いくつかの実施形態では、少なくとも５０個のｇＲＮＡのそれぞれは、スペーサー配列を含むｇＲＮＡ配列を含むｇＲＮＡと比較して、オフターゲット編集の減少を示し、ｇＲＮＡ配列は、スペーサー配列の５’末端に１つ以上のＧヌクレオチドを含み、スペーサー配列の５’末端の１つ以上のＧヌクレオチドは、ゲノム中の標的配列の３’末端の１つ以上のヌクレオチドに相補的でない。いくつかの実施形態では、少なくとも５０個のｇＲＮＡは、少なくとも１００，０００個の精製されたｇＲＮＡを含む。

【0118】

いくつかの態様では、少なくとも５０個の精製されたｇＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む核酸ライブラリーが本明細書に提供され、少なくとも５０個の精製されたｇＲＮＡは、５’末端グアニン（Ｇ）アナログを含むｇＲＮＡ配列を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも５０個の精製されたｇＲＮＡのそれぞれは、５’末端Ｇアナログを欠くｇＲＮＡ配列を含むｇＲＮＡと比較して、標的配列の編集効率の増強を示す。いくつかの実施形態では、少なくとも５０個の精製されたｇＲＮＡのそれぞれは、５’末端Ｇアナログを欠くｇＲＮＡ配列を含むｇＲＮＡと比較して、安定性の増強を示す。いくつかの実施形態では、少なくとも５０個の精製されたｇＲＮＡは、少なくとも１００，０００個の精製されたｇＲＮＡを含む。

【0119】

いくつかの態様では、核酸ライブラリーであって、核酸ライブラリーは少なくとも５０個のＲＮＡを含み、少なくとも５０個のＲＮＡのそれぞれは異なるガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）配列をコードし、少なくとも５０個のＲＮＡの少なくとも約９０％は、ライブラリー中の少なくとも５０個のＲＮＡについての平均頻度の１．５倍以内の量で核酸ライブラリー中にそれぞれ存在する、核酸ライブラリーが本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、核酸ライブラリーは、少なくとも１００、少なくとも５００、少なくとも１，０００、少なくとも５，０００、少なくとも１０，０００、少なくとも５０，０００、または少なくとも１００，０００個のＲＮＡを含み、少なくとも１００、少なくとも５００、少なくとも１，０００、少なくとも５，０００、少なくとも１０，０００、少なくとも５０，０００、または少なくとも１００，０００個のＲＮＡの少なくとも約９０％は、ライブラリー中の少なくとも１００、少なくとも５００、少なくとも１，０００、少なくとも５，０００、少なくとも１０，０００、少なくとも５０，０００、または少なくとも１００，０００個のＲＮＡについての平均頻度の１．５倍以内の量で核酸ライブラリー中にそれぞれ存在する。いくつかの実施形態では、異なるｇＲＮＡ配列は少なくとも８０ヌクレオチド長を含む。いくつかの実施形態では、異なるｇＲＮＡ配列は少なくとも１００個の異なるｇＲＮＡ配列を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも５０個のＲＮＡの少なくとも約９５％は、ライブラリー中のＲＮＡのそれぞれについての平均頻度の１．５倍以内の量で核酸ライブラリー中にそれぞれ存在する。いくつかの実施形態では、少なくとも５０個のＲＮＡの少なくとも約９９％は、ライブラリー中のＲＮＡのそれぞれについての平均頻度の１．５倍以内の量で核酸ライブラリー中にそれぞれ存在する。

【0120】

いくつかの態様では、修飾されたポリペプチド組成物が本明細書に提供され、修飾されたポリペプチド組成物は、精製されたＲＮＡポリメラーゼ、またはその機能的断片あるいはバリアントと、精製された核酸結合タンパク質、任意選択で、タンパク質を含有するジンクフィンガー、またはその機能的断片あるいはバリアントとを含み、精製されたＲＮＡポリメラーゼおよび精製された核酸結合タンパク質は異種であり、精製されたＲＮＡポリメラーゼおよび精製された核酸結合タンパク質は連結される。いくつかの実施形態では、精製されたＲＮＡポリメラーゼおよび精製された核酸結合タンパク質は、コンジュゲーションによって連結される。いくつかの実施形態では、精製されたＲＮＡポリメラーゼおよび精製された核酸結合タンパク質は、融合によって連結される。いくつかの実施形態では、精製された核酸結合タンパク質は、精製されたＲＮＡポリメラーゼのＮ末端に連結される。いくつかの実施形態では、精製された核酸結合タンパク質は、精製されたＲＮＡポリメラーゼのＣ末端に連結される。いくつかの実施形態では、精製されたＲＮＡポリメラーゼは、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼである。いくつかの実施形態では、精製された核酸結合タンパク質は、ジンクフィンガードメイン、ロイシンジッパー、ヘリックスターンヘリックス（ＨＴＨ）モチーフ、ヘリックスループヘリックス（ＨＬＨ）モチーフ、ウィングドヘリックス（ＷＨ）、ウィングドＨＴＨ（ＷＨＴＨ）モチーフ、高移動度群（ＨＭＧ）ボックス、白色不透明レギュレーター３（Ｗｈｉｔｅ－Ｏｐａｑｕｅ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ３／Ｗｏｒ３）ドメイン、オリゴヌクレオチド／オリゴ糖結合（ＯＢ）フォールドドメイン、免疫グロブリンフォールド、Ｂ３ドメイン、転写アクチベーター様エフェクター（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ａｃｔｉｖａｔｏｒ－Ｌｉｋｅ Ｅｆｆｅｃｔｏｒ／ＴＡＬＥ）、ＴＡＬＥ様タンパク質、またはクラスター化され規則的に間隔が空いた短い回文構造の繰り返し（ＣＲＩＳＰＲ）関連Ｃａｓタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、精製された核酸結合タンパク質は、ジンクフィンガードメインを含む。

【0121】

いくつかの態様では、融合ＲＮＡポリメラーゼ、またはその機能的断片あるいはバリアントと、ＤＮＡポリヌクレオチドとを含む組成物であって、融合ＲＮＡポリメラーゼは、（ｉ）ＲＮＡポリメラーゼ、またはその機能的断片あるいはバリアントと、（ｉｉ）ＤＮＡ結合タンパク質、またはその機能的断片あるいはバリアントとを含み、ＲＮＡポリメラーゼおよびＤＮＡ結合タンパク質は異種である、組成物が本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリヌクレオチドは一本鎖ＤＮＡポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリヌクレオチドは３’二次構造を含む。いくつかの実施形態では、３’二次構造はヘアピンを含む。

【0122】

いくつかの態様では、修飾されたポリペプチドが本明細書に提供され、バリアントＴ７ ＲＮＡポリメラーゼまたはその機能的断片を含み、バリアントＴ７ ＲＮＡポリメラーゼは、Ｋ１７２Ｌ、Ｐ２６６Ｌ、Ｈ７７２Ｒ、Ｎ７４８Ｘ、Ｒ７５６Ｍ、Ｑ７５８Ｘ、およびＥ７７５Ｖからなる群から選択される少なくとも４つのバリエーションを含み、その位置は配列番号１とのアラインメントによって決定され、Ｘは野生型アミノ酸とは異なる任意のアミノ酸である。いくつかの態様では、バリアントＴ７ ＲＮＡポリメラーゼまたはその機能的断片を含む修飾されたポリペプチドが本明細書に提供され、バリアントＴ７ ＲＮＡポリメラーゼは、Ｋ１７２Ｌ、Ｐ２６６Ｌ、Ｈ７７２Ｒ、Ｎ７４８Ｘ、Ｒ７５６Ｍ、Ｑ７５８Ｘ、およびＥ７７５Ｖからなる群から選択される少なくとも１つのバリエーションを含み、その位置は配列番号１とのアラインメントによって決定され、Ｘは野生型アミノ酸とは異なる任意のアミノ酸であり、修飾されたポリペプチドは表面上で固定される。

【0123】

いくつかの実施形態では、バリアントＴ７ ＲＮＡポリメラーゼまたはその機能断片は、ＤＮＡ結合タンパク質に連結される。いくつかの実施形態では、バリアントＴ７ ＲＮＡポリメラーゼまたはその機能断片は、融合によってＤＮＡ結合タンパク質に連結される。いくつかの実施形態では、バリアントＴ７ ＲＮＡポリメラーゼまたはその機能断片は、コンジュゲーションによってＤＮＡ結合タンパク質に連結される。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ結合タンパク質は、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼのＮ末端に連結される。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ結合タンパク質は、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼのＣ末端に連結される。いくつかの実施形態では、バリアントＴ７ ＲＮＡポリメラーゼまたはその機能的断片は、配列番号１に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、バリアントＴ７ ＲＮＡポリメラーゼまたはその機能的断片は、配列番号１に記載の配列を含むＴ７ ＲＮＡポリメラーゼと比較して、転写開始および／または伸長プロセス中に増加した安定性を示す。いくつかの実施形態では、バリアントＴ７ ＲＮＡポリメラーゼまたはその機能的断片は、配列番号１に記載の配列を含むＴ７ ＲＮＡポリメラーゼと比較して、Ｔ７プロモーター配列に対する結合親和性の減少を示す。

【0124】

いくつかの態様では、デバイスが本明細書に提供され、表面と、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、またはその機能的断片あるいはバリアントと、ＤＮＡ鋳型であって、ＤＮＡ鋳型はトランケーションされたＴ７プロモーター配列を含むＤＮＡ鋳型とを含み、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、機能的断片またはそのバリアント、あるいはＤＮＡ鋳型は表面に連結される。いくつかの実施形態では、デバイスは、表面に連結された核酸結合タンパク質、またはその機能的断片あるいはバリアントをさらに含む。いくつかの実施形態では、表面は固体表面である。いくつかの実施形態では、表面は、磁気ビーズ、アガロースビーズ、溶融石英、ゾル－ゲル、シリカポリマー、シリカモノリス、セルロース、寒天、アクリルアミド、または金ビーズを含む。いくつかの実施形態では、固体表面は、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡ鋳型、または核酸結合タンパク質のカプセル化あるいは取り込みのためのゲルマトリックスを含む。いくつかの実施形態では、核酸結合タンパク質は、ストレプトアビジンタグを含む。いくつかの実施形態では、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼは固定される。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ鋳型は固定される。いくつかの実施形態では、核酸結合タンパク質、またはその機能的断片あるいはバリアントは、ジンクフィンガードメイン、ロイシンジッパー、ヘリックスターンヘリックス（ＨＴＨ）モチーフ、ヘリックスループヘリックス（ＨＬＨ）モチーフ、ウィングドヘリックス（ＷＨ）、ウィングドＨＴＨ（ＷＨＴＨ）モチーフ、高移動度群（ＨＭＧ）ボックス、白色不透明レギュレーター３（Ｗｈｉｔｅ－Ｏｐａｑｕｅ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ３／Ｗｏｒ３）ドメイン、オリゴヌクレオチド／オリゴ糖結合（ＯＢ）フォールドドメイン、免疫グロブリンフォールド、Ｂ３ドメイン、転写アクチベーター様エフェクター（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ａｃｔｉｖａｔｏｒ－Ｌｉｋｅ Ｅｆｆｅｃｔｏｒ／ＴＡＬＥ）、ＴＡＬＥ様タンパク質、またはクラスター化され規則的に間隔が空いた短い回文構造の繰り返し（ＣＲＩＳＰＲ）関連Ｃａｓタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、核酸結合タンパク質、またはその機能的断片あるいはバリアントは、配列特異的結合によって核酸に結合する。いくつかの実施形態では、核酸結合タンパク質、またはその機能的断片あるいはバリアントは、核酸上の１つ以上の化学修飾を通じて核酸に結合する。いくつかの実施形態では、１つ以上の化学修飾は、ビオチンまたはアビジンを含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ結合タンパク質は、ジンクフィンガードメイン、ロイシンジッパー、ヘリックスターンヘリックス（ＨＴＨ）モチーフ、ヘリックスループヘリックス（ＨＬＨ）モチーフ、ウィングドヘリックス（ＷＨ）、ウィングドＨＴＨ（ＷＨＴＨ）モチーフ、高移動度群（ＨＭＧ）ボックス、白色不透明レギュレーター３（Ｗｈｉｔｅ－Ｏｐａｑｕｅ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ３／Ｗｏｒ３）ドメイン、オリゴヌクレオチド／オリゴ糖結合（ＯＢ）フォールドドメイン、免疫グロブリンフォールド、Ｂ３ドメイン、転写アクチベーター様エフェクター（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ａｃｔｉｖａｔｏｒ－Ｌｉｋｅ Ｅｆｆｅｃｔｏｒ／ＴＡＬＥ）、ＴＡＬＥ様タンパク質、またはクラスター化され規則的に間隔が空いた短い回文構造の繰り返し（ＣＲＩＳＰＲ）関連Ｃａｓタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ鋳型は、配列番号７を含む配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼまたはそのバリアントは、配列番号１に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、デバイスは、圧電振動子、回転バルブ、ペルチェヒーター、電圧コントローラ、シリンジポンプ、ＵＶ ＬＥＤ、およびセンサーまたは真空ポンプをさらに含む。

【0125】

配列

【0126】

配列番号１（ＷＴ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼタンパク質配列）
ＭＮＴＩＮＩＡＫＮＤＦＳＤＩＥＬＡＡＩＰＦＮＴＬＡＤＨＹＧＥＲＬＡＲＥＱＬＡＬＥＨＥＳＹＥＭＧＥＡＲＦＲＫＭＦＥＲＱＬＫＡＧＥＶＡＤＮＡＡＡＫＰＬＩＴＴＬＬＰＫＭＩＡＲＩＮＤＷＦＥＥＶＫＡＫＲＧＫＲＰＴＡＦＱＦＬＱＥＩＫＰＥＡＶＡＹＩＴＩＫＴＴＬＡＣＬＴＳＡＤＮＴＴＶＱＡＶＡＳＡＩＧＲＡＩＥＤＥＡＲＦＧＲＩＲＤＬＥＡＫＨＦＫＫＮＶＥＥＱＬＮＫＲＶＧＨＶＹＫＫＡＦＭＱＶＶＥＡＤＭＬＳＫＧＬＬＧＧＥＡＷＳＳＷＨＫＥＤＳＩＨＶＧＶＲＣＩＥＭＬＩＥＳＴＧＭＶＳＬＨＲＱＮＡＧＶＶＧＱＤＳＥＴＩＥＬＡＰＥＹＡＥＡＩＡＴＲＡＧＡＬＡＧＩＳＰＭＦＱＰＣＶＶＰＰＫＰＷＴＧＩＴＧＧＧＹＷＡＮＧＲＲＰＬＡＬＶＲＴＨＳＫＫＡＬＭＲＹＥＤＶＹＭＰＥＶＹＫＡＩＮＩＡＱＮＴＡＷＫＩＮＫＫＶＬＡＶＡＮＶＩＴＫＷＫＨＣＰＶＥＤＩＰＡＩＥＲＥＥＬＰＭＫＰＥＤＩＤＭＮＰＥＡＬＴＡＷＫＲＡＡＡＡＶＹＲＫＤＫＡＲＫＳＲＲＩＳＬＥＦＭＬＥＱＡＮＫＦＡＮＨＫＡＩＷＦＰＹＮＭＤＷＲＧＲＶＹＡＶＳＭＦＮＰＱＧＮＤＭＴＫＧＬＬＴＬＡＫＧＫＰＩＧＫＥＧＹＹＷＬＫＩＨＧＡＮＣＡＧＶＤＫＶＰＦＰＥＲＩＫＦＩＥＥＮＨＥＮＩＭＡＣＡＫＳＰＬＥＮＴＷＷＡＥＱＤＳＰＦＣＦＬＡＦＣＦＥＹＡＧＶＱＨＨＧＬＳＹＮＣＳＬＰＬＡＦＤＧＳＣＳＧＩＱＨＦＳＡＭＬＲＤＥＶＧＧＲＡＶＮＬＬＰＳＥＴＶＱＤＩＹＧＩＶＡＫＫＶＮＥＩＬＱＡＤＡＩＮＧＴＤＮＥＶＶＴＶＴＤＥＮＴＧＥＩＳＥＫＶＫＬＧＴＫＡＬＡＧＱＷＬＡＹＧＶＴＲＳＶＴＫＲＳＶＭＴＬＡＹＧＳＫＥＦＧＦＲＱＱＶＬＥＤＴＩＱＰＡＩＤＳＧＫＧＬＭＦＴＱＰＮＱＡＡＧＹＭＡＫＬＩＷＥＳＶＳＶＴＶＶＡＡＶＥＡＭＮＷＬＫＳＡＡＫＬＬＡＡＥＶＫＤＫＫＴＧＥＩＬＲＫＲＣＡＶＨＷＶＴＰＤＧＦＰＶＷＱＥＹＫＫＰＩＱＴＲＬＮＬＭＦＬＧＱＦＲＬＱＰＴＩＮＴＮＫＤＳＥＩＤＡＨＫＱＥＳＧＩＡＰＮＦＶＨＳＱＤＧＳＨＬＲＫＴＶＶＷＡＨＥＫＹＧＩＥＳＦＡＬＩＨＤＳＦＧＴＩＰＡＤＡＡＮＬＦＫＡＶＲＥＴＭＶＤＴＹＥＳＣＤＶＬＡＤＦＹＤＱＦＡＤＱＬＨＥＳＱＬＤＫＭＰＡＬＰＡＫＧＮＬＮＬＲＤＩＬＥＳＤＦＡＦＡ

【0127】

配列番号２（ＷＴ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼＤＮＡ配列）
ＡＴＧＡＡＣＡＣＧＡＴＴＡＡＣＡＴＣＧＣＴＡＡＧＡＡＣＧＡＣＴＴＣＴＣＴＧＡＣＡＴＣＧＡＡＣＴＧＧＣＴＧＣＴＡＴＣＣＣＧＴＴＣＡＡＣＡＣＴＣＴＧＧＣＴＧＡＣＣＡＴＴＡＣＧＧＴＧＡＧＣＧＴＴＴＡＧＣＴＣＧＣＧＡＡＣＡＧＴＴＧＧＣＣＣＴＴＧＡＧＣＡＴＧＡＧＴＣＴＴＡＣＧＡＧＡＴＧＧＧＴＧＡＡＧＣＡＣＧＣＴＴＣＣＧＣＡＡＧＡＴＧＴＴＴＧＡＧＣＧＴＣＡＡＣＴＴＡＡＡＧＣＴＧＧＴＧＡＧＧＴＴＧＣＧＧＡＴＡＡＣＧＣＴＧＣＣＧＣＣＡＡＧＣＣＴＣＴＣＡＴＣＡＣＴＡＣＣＣＴＡＣＴＣＣＣＴＡＡＧＡＴＧＡＴＴＧＣＡＣＧＣＡＴＣＡＡＣＧＡＣＴＧＧＴＴＴＧＡＧＧＡＡＧＴＧＡＡＡＧＣＴＡＡＧＣＧＣＧＧＣＡＡＧＣＧＣＣＣＧＡＣＡＧＣＣＴＴＣＣＡＧＴＴＣＣＴＧＣＡＡＧＡＡＡＴＣＡＡＧＣＣＧＧＡＡＧＣＣＧＴＡＧＣＧＴＡＣＡＴＣＡＣＣＡＴＴＡＡＧＡＣＣＡＣＴＣＴＧＧＣＴＴＧＣＣＴＡＡＣＣＡＧＴＧＣＴＧＡＣＡＡＴＡＣＡＡＣＣＧＴＴＣＡＧＧＣＴＧＴＡＧＣＡＡＧＣＧＣＡＡＴＣＧＧＴＣＧＧＧＣＣＡＴＴＧＡＧＧＡＣＧＡＧＧＣＴＣＧＣＴＴＣＧＧＴＣＧＴＡＴＣＣＧＴＧＡＣＣＴＴＧＡＡＧＣＴＡＡＧＣＡＣＴＴＣＡＡＧＡＡＡＡＡＣＧＴＴＧＡＧＧＡＡＣＡＡＣＴＣＡＡＣＡＡＧＣＧＣＧＴＡＧＧＧＣＡＣＧＴＣＴＡＣＡＡＧＡＡＡＧＣＡＴＴＴＡＴＧＣＡＡＧＴＴＧＴＣＧＡＧＧＣＴＧＡＣＡＴＧＣＴＣＴＣＴＡＡＧＧＧＴＣＴＡＣＴＣＧＧＴＧＧＣＧＡＧＧＣＧＴＧＧＴＣＴＴＣＧＴＧＧＣＡＴＡＡＧＧＡＡＧＡＣＴＣＴＡＴＴＣＡＴＧＴＡＧＧＡＧＴＡＣＧＣＴＧＣＡＴＣＧＡＧＡＴＧＣＴＣＡＴＴＧＡＧＴＣＡＡＣＣＧＧＡＡＴＧＧＴＴＡＧＣＴＴＡＣＡＣＣＧＣＣＡＡＡＡＴＧＣＴＧＧＣＧＴＡＧＴＡＧＧＴＣＡＡＧＡＣＴＣＴＧＡＧＡＣＴＡＴＣＧＡＡＣＴＣＧＣＡＣＣＴＧＡＡＴＡＣＧＣＴＧＡＧＧＣＴＡＴＣＧＣＡＡＣＣＣＧＴＧＣＡＧＧＴＧＣＧＣＴＧＧＣＴＧＧＣＡＴＣＴＣＴＣＣＧＡＴＧＴＴＣＣＡＡＣＣＴＴＧＣＧＴＡＧＴＴＣＣＴＣＣＴＡＡＧＣＣＧＴＧＧＡＣＴＧＧＣＡＴＴＡＣＴＧＧＴＧＧＴＧＧＣＴＡＴＴＧＧＧＣＴＡＡＣＧＧＴＣＧＴＣＧＴＣＣＴＣＴＧＧＣＧＣＴＧＧＴＧＣＧＴＡＣＴＣＡＣＡＧＴＡＡＧＡＡＡＧＣＡＣＴＧＡＴＧＣＧＣＴＡＣＧＡＡＧＡＣＧＴＴＴＡＣＡＴＧＣＣＴＧＡＧＧＴＧＴＡＣＡＡＡＧＣＧＡＴＴＡＡＣＡＴＴＧＣＧＣＡＡＡＡＣＡＣＣＧＣＡＴＧＧＡＡＡＡＴＣＡＡＣＡＡＧＡＡＡＧＴＣＣＴＡＧＣＧＧＴＣＧＣＣＡＡＣＧＴＡＡＴＣＡＣＣＡＡＧＴＧＧＡＡＧＣＡＴＴＧＴＣＣＧＧＴＣＧＡＧＧＡＣＡＴＣＣＣＴＧＣＧＡＴＴＧＡＧＣＧＴＧＡＡＧＡＡＣＴＣＣＣＧＡＴＧＡＡＡＣＣＧＧＡＡＧＡＣＡＴＣＧＡＣＡＴＧＡＡＴＣＣＴＧＡＧＧＣＴＣＴＣＡＣＣＧＣＧＴＧＧＡＡＡＣＧＴＧＣＴＧＣＣＧＣＴＧＣＴＧＴＧＴＡＣＣＧＣＡＡＧＧＡＣＡＡＧＧＣＴＣＧＣＡＡＧＴＣＴＣＧＣＣＧＴＡＴＣＡＧＣＣＴＴＧＡＧＴＴＣＡＴＧＣＴＴＧＡＧＣＡＡＧＣＣＡＡＴＡＡＧＴＴＴＧＣＴＡＡＣＣＡＴＡＡＧＧＣＣＡＴＣＴＧＧＴＴＣＣＣＴＴＡＣＡＡＣＡＴＧＧＡＣＴＧＧＣＧＣＧＧＴＣＧＴＧＴＴＴＡＣＧＣＴＧＴＧＴＣＡＡＴＧＴＴＣＡＡＣＣＣＧＣＡＡＧＧＴＡＡＣＧＡＴＡＴＧＡＣＣＡＡＡＧＧＡＣＴＧＣＴＴＡＣＧＣＴＧＧＣＧＡＡＡＧＧＴＡＡＡＣＣＡＡＴＣＧＧＴＡＡＧＧＡＡＧＧＴＴＡＣＴＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＡＡＴＣＣＡＣＧＧＴＧＣＡＡＡＣＴＧＴＧＣＧＧＧＴＧＴＣＧＡＴＡＡＧＧＴＴＣＣＧＴＴＣＣＣＴＧＡＧＣＧＣＡＴＣＡＡＧＴＴＣＡＴＴＧＡＧＧＡＡＡＡＣＣＡＣＧＡＧＡＡＣＡＴＣＡＴＧＧＣＴＴＧＣＧＣＴＡＡＧＴＣＴＣＣＡＣＴＧＧＡＧＡＡＣＡＣＴＴＧＧＴＧＧＧＣＴＧＡＧＣＡＡＧＡＴＴＣＴＣＣＧＴＴＣＴＧＣＴＴＣＣＴＴＧＣＧＴＴＣＴＧＣＴＴＴＧＡＧＴＡＣＧＣＴＧＧＧＧＴＡＣＡＧＣＡＣＣＡＣＧＧＣＣＴＧＡＧＣＴＡＴＡＡＣＴＧＣＴＣＣＣＴＴＣＣＧＣＴＧＧＣＧＴＴＴＧＡＣＧＧＧＴＣＴＴＧＣＴＣＴＧＧＣＡＴＣＣＡＧＣＡＣＴＴＣＴＣＣＧＣＧＡＴＧＣＴＣＣＧＡＧＡＴＧＡＧＧＴＡＧＧＴＧＧＴＣＧＣＧＣＧＧＴＴＡＡＣＴＴＧＣＴＴＣＣＴＡＧＴＧＡＡＡＣＣＧＴＴＣＡＧＧＡＣＡＴＣＴＡＣＧＧＧＡＴＴＧＴＴＧＣＴＡＡＧＡＡＡＧＴＣＡＡＣＧＡＧＡＴＴＣＴＡＣＡＡＧＣＡＧＡＣＧＣＡＡＴＣＡＡＴＧＧＧＡＣＣＧＡＴＡＡＣＧＡＡＧＴＡＧＴＴＡＣＣＧＴＧＡＣＣＧＡＴＧＡＧＡＡＣＡＣＴＧＧＴＧＡＡＡＴＣＴＣＴＧＡＧＡＡＡＧＴＣＡＡＧＣＴＧＧＧＣＡＣＴＡＡＧＧＣＡＣＴＧＧＣＴＧＧＴＣＡＡＴＧＧＣＴＧＧＣＴＴＡＣＧＧＴＧＴＴＡＣＴＣＧＣＡＧＴＧＴＧＡＣＴＡＡＧＣＧＴＴＣＡＧＴＣＡＴＧＡＣＧＣＴＧＧＣＴＴＡＣＧＧＧＴＣＣＡＡＡＧＡＧＴＴＣＧＧＣＴＴＣＣＧＴＣＡＡＣＡＡＧＴＧＣＴＧＧＡＡＧＡＴＡＣＣＡＴＴＣＡＧＣＣＡＧＣＴＡＴＴＧＡＴＴＣＣＧＧＣＡＡＧＧＧＴＣＴＧＡＴＧＴＴＣＡＣＴＣＡＧＣＣＧＡＡＴＣＡＧＧＣＴＧＣＴＧＧＡＴＡＣＡＴＧＧＣＴＡＡＧＣＴＧＡＴＴＴＧＧＧＡＡＴＣＴＧＴＧＡＧＣＧＴＧＡＣＧＧＴＧＧＴＡＧＣＴＧＣＧＧＴＴＧＡＡＧＣＡＡＴＧＡＡＣＴＧＧＣＴＴＡＡＧＴＣＴＧＣＴＧＣＴＡＡＧＣＴＧＣＴＧＧＣＴＧＣＴＧＡＧＧＴＣＡＡＡＧＡＴＡＡＧＡＡＧＡＣＴＧＧＡＧＡＧＡＴＴＣＴＴＣＧＣＡＡＧＣＧＴＴＧＣＧＣＴＧＴＧＣＡＴＴＧＧＧＴＡＡＣＴＣＣＴＧＡＴＧＧＴＴＴＣＣＣＴＧＴＧＴＧＧＣＡＧＧＡＡＴＡＣＡＡＧＡＡＧＣＣＴＡＴＴＣＡＧＡＣＧＣＧＣＴＴＧＡＡＣＣＴＧＡＴＧＴＴＣＣＴＣＧＧＴＣＡＧＴＴＣＣＧＣＴＴＡＣＡＧＣＣＴＡＣＣＡＴＴＡＡＣＡＣＣＡＡＣＡＡＡＧＡＴＡＧＣＧＡＧＡＴＴＧＡＴＧＣＡＣＡＣＡＡＡＣＡＧＧＡＧＴＣＴＧＧＴＡＴＣＧＣＴＣＣＴＡＡＣＴＴＴＧＴＡＣＡＣＡＧＣＣＡＡＧＡＣＧＧＴＡＧＣＣＡＣＣＴＴＣＧＴＡＡＧＡＣＴＧＴＡＧＴＧＴＧＧＧＣＡＣＡＣＧＡＧＡＡＧＴＡＣＧＧＡＡＴＣＧＡＡＴＣＴＴＴＴＧＣＡＣＴＧＡＴＴＣＡＣＧＡＣＴＣＣＴＴＣＧＧＴＡＣＣＡＴＴＣＣＧＧＣＴＧＡＣＧＣＴＧＣＧＡＡＣＣＴＧＴＴＣＡＡＡＧＣＡＧＴＧＣＧＣＧＡＡＡＣＴＡＴＧＧＴＴＧＡＣＡＣＡＴＡＴＧＡＧＴＣＴＴＧＴＧＡＴＧＴＡＣＴＧＧＣＴＧＡＴＴＴＣＴＡＣＧＡＣＣＡＧＴＴＣＧＣＴＧＡＣＣＡＧＴＴＧＣＡＣＧＡＧＴＣＴＣＡＡＴＴＧＧＡＣＡＡＡＡＴＧＣＣＡＧＣＡＣＴＴＣＣＧＧＣＴＡＡＡＧＧＴＡＡＣＴＴＧＡＡＣＣＴＣＣＧＴＧＡＣＡＴＣＴＴＡＧＡＧＴＣＧＧＡＣＴＴＣＧＣＧＴＴＣＧＣＧ

【0128】

配列番号３（Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列）
ＴＴＡＡＡＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＴＡＴＡ

【0129】

配列番号４（トランケートされたＴ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列）
ＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡ

【0130】

配列番号５（トランケートされたＴ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列）
ＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡ

【0131】

配列番号６（トランケートされたＴ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列）
ＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡ

【0132】

配列番号７（ヘアピン、完全長（５’－３’）鋳型）
ＴＡＴＡＧＴＧＡＧＴＣＧＴＡＴＴＡＡＴＴＴＡＣＡＡＣＡＡＡＡＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡ

【0133】

配列番号８（ＺＦＡ）
ＮＬＩＳＬＦＳＧＡＧＧＬＤＬＧＦＱＫＡＧＦＲＩＩＣＡＮＥＹＤＫＳＩＷＫＴＹＥＳＮＨＳＡＫＬＩＫＧＤＩＳＫＩＳＳＤＥＦＰＫＣＤＧＩＩＧＧＰＰＣＱＳＷＳＥＧＧＳＬＲＧＩＤＤＰＲＧＫＬＦＹＥＹＩＲＩＬＫＱＫＫＰＩＦＦＬＡＥＮＶＫＧＭＭＡＱＲＨＮＫＡＶＱＥＦＩＱＥＦＤＮＡＧＹＤＶＨＩＩＬＬＮＡＮＤＹＧＶＡＱＤＲＫＲＶＦＹＩＧＦＲＫＥＬＮＩＮＹＬＰＰＩＰＨＬＩＫＰＴＦＫＤＶＩＷＤＬＫＤＮＰＩＰＡＬＤＫＮＫＴＮＧＮＫＣＩＹＰＮＨＥＹＦＩＧＳＹＳＴＩＦＭＳＲＮＲＶＲＱＷＮＥＰＡＦＴＶＱＡＳＧＲＱＣＱＬＨＰＱＡＰＶＭＬＫＶＳＫＮＬＮＫＦＶＥＧＫＥＨＬＹＲＲＬＴＶＲＥＣＡＲＶＱＧＦＰＤＤＦＩＦＨＹＥＳＬＮＤＧＹＫＭＩＧＮＡＶＰＶＮＬＡ、ＹＥＩＡＫＴＩＫＳＡＬＥＩＣＫＧＮ

【0134】

配列番号９（リザビジン、単量体ストレプトアビジン）
ＦＤＡＳＮＦＫＤＦＳＳＩＡＳＡＳＳＳＷＱＮＱＨＧＳＴＭＩＩＱＶＤＳＦＧＮＶＳＧＱＹＶＮＲＡＥＧＴＧＣＱＮＳＰＹＰＬＴＧＲＶＮＧＴＦＩＤＦＳＶＫＷＮＮＳＴＥＮＣＮＳＮＴＱＷＴＧＹＡＱＶＮＧＮＮＴＥＩＶＴＲＷＮＬＫＹＥＧＧＳＧＰＡＩＷＱＧＱＤＴＦＱＹＶＰＴＴＥ

【0135】

配列番号１０（リンカー１）
ＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ

【0136】

配列番号１１（リンカー２）
ＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ

【0137】

配列番号１２（リンカー３）
ＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ

【0138】

配列番号１３（ＸＴＥＮリンカー）
ＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳ

【実施例】

【0139】

これらの実施例は例示目的のために提供されるにすぎず、特許請求の範囲を限定するものではない。

【0140】

実施例１：キャピラリー電気泳動を使用したＲＮＡ精製

【0141】

ヘアピン一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）鋳型を使用して、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写によってｇＲＮＡを産生し、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）を使用して、純度を評価した。標準プロトコル（小分子ＲＮＡアッセイ・ユーザガイド、２０２０年、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）に従って、マイクロ流体ＬａｂＣｈｉｐ（登録商標）キャピラリー電気泳動技術（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用した。ＣＥ分析を使用して、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写されたｇＲＮＡ（緑色）、化学的に合成されたｇＲＮＡ（青色）、およびマイクロ流体ポリヌクレオチド合成方法を使用して合成されたｇＲＮＡ（オレンジ）の品質を比較した（図１１を参照）。ピーク振幅は名目上の有意性を表し、および容易に分離された単一のピーク、わずかなピークブロードニングを有するピークはｇＲＮＡの純度（図１１、オレンジ色）を示す。より広いスペクトルテールまたは複数のピークは、ｇＲＮＡの不純物（例えば、様々なサイズの複数のｇＲＮＡ産物）および低品質のｇＲＮＡ（図１１、緑色および青色）を示す。様々なｉｎ ｖｉｔｒｏ転写方法によって合成されたｇＲＮＡ（緑色、赤色、および紫色）の品質と、マイクロ流体ポリヌクレオチド合成方法を使用して合成されたｇＲＮＡ（青色）の品質を比較したＣＥ分析の結果が、図１２に示される。加えて、ＣＥ分析を使用して、８つの異なるｇＲＮＡ試料の品質を比較する（表１および図１３）ことにより、高純度を再現できることを実証した。表１から分かるように、例えば、ＣＥによって分析された約１００ヌクレオチド長のｇＲＮＡは１００％の純度を有する。

【0142】

【表1】

【0143】

実施例２：ｇＲＮＡ編集効率

【0144】

切断アッセイ

【0145】

ｉｎ ｖｉｔｒｏ切断アッセイを実行して、別々に供給されたｇＲＮＡを使用して、標的配列を含むＤＮＡ基質に対する化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９のヌクレアーゼ活性を比較した。反応混合物を、ヌクレアーゼフリー水、緩衝液、３００ｎＭのｇＲＮＡ、および１μＭのＣａｓ９を混合することによって調製した。３０ｎＭの基質ＤＮＡを反応混合物に添加し、その後、混合し、微量遠心機中でパルス回転させた。試料を０分間取り出し（図１４、レーン３）、残りの反応混合物を３７℃で５分間インキュベートした（図１４、レーン４～６）。１μｌのプロテイナーゼＫを各試料に添加し、徹底的に混合した。微量遠心機中で試料をパルス回転させ、フラグメント解析に移る前に室温で１０分間インキュベートした。図１４に示されるように、１ｋｂの標的ＤＮＡ配列を、市販のｉｎ ｖｉｔｒｏ転写されたｇＲＮＡまたは化学的に合成されたｇＲＮＡ（それぞれレーン４および５）、およびヘアピンｓｓＤＮＡ鋳型を使用してｉｎ ｖｉｔｒｏ合成されたｇＲＮＡ（レーン６）を有するＣａｓ９によって２つの小さな（約５００ｂｐ）断片へ切断した。

【0146】

ｉｎ ｖｉｖｏヌクレアーゼ活性

【0147】

標準プロトコル（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社のユーザガイド、Ａｌｔ－Ｒ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９系：哺乳動物細胞へのＣＲＩＳＰＲリボ核タンパク複合体のカチオン性脂質送達、バージョン４、２０１８年、およびＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社のユーザガイド、Ａｌｔ－Ｒ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９系：Ａｍａｘａ（登録商標）Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（登録商標）システムを使用したＨＥＫ－２９３細胞へのリボ核タンパク複合体の送達、バージョン３．１、２０１９年）に従ってｉｎ ｖｉｖｏ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９を介したヌクレアーゼアッセイを実施し、２つの異なるシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を使用して、標的ＤＮＡに対するＣａｓ９ヌクレアーゼ活性のｇＲＮＡの有効性を測定した。簡潔に言えば、ＨＥＫ－２９３細胞を新たに解凍し、培養密度を９０％以下で維持しながら、エレクトロポレーションの前に最低２～３日間で継代培養した。Ｃａｓ９およびｓｇＲＮＡをＰＢＳ中で希釈し、リボ核タンパク（ＲＮＰ）複合体形成のために室温で１０～２０分間インキュベートした。ＲＮＰ複合体を、ＨＥＫ－２９３細胞にエレクトロポレーションした。有効性および変異スペクトルを、分解によるインデル（挿入および欠失）のトラッキング（ＴＩＤＥ）分析を使用して分析し、これにより細胞の標的化された集団中の優勢なタイプのインデルを同時に同定しながら、編集有効性を定量化した。ＴＩＤＥ分析は、標準分子生物学試薬をＰＣＲ反応１に使用した単純な３つのステップを含んでいる。１：１組の標準のＰＣＲ反応、２：１組の標準のキャピラリー（「サンガー」）シーケンシング反応、および３：ＴＩＤＥウェブツールを使用した、結果として生じる２つの生のシーケンシングファイルの分析。ＴＩＤＥウェブツールは、アルゴリズムを使用して、配列トレースからのインデルのスペクトルを正確に再構成し、検出されたインデルおよびその頻度の同一性を報告する。図１５Ａおよび図１５Ｂ（左上隅）に示されるように、試験したｓｇＲＮＡの両方は、８０％より高い編集効率を示した。

【0148】

実施例３：ＲＮＡ合成のマイクロ流体力学インテグレーション

【0149】

マイクロ流体カートリッジは、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）の合成および精製を実行するように設計される。各マイクロ流体カートリッジは複数の反応チャンバを含有し、各反応チャンバは同じ配列または異なる配列を有するｇＲＮＡを産生することができる。ＤＮＡ鋳型およびＲＮＡポリメラーゼ酵素を含む転写複合体を、界面化学を使用して、反応チャンバの内部のビーズなどの表面上で固定する。ＲＮＡの付着と合成を支持するために、各反応チャンバの表面（例えば、磁気ビーズなどのビーズ）を、標準のＮ－ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＮＨＳ）反応化学を使用して機能化する。ＤＮＡ結合タンパク質（例えば、ｓｔｒｅｐなど）を添加し、その後ＮＨＳ反応をクエンチさせた。Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを添加して、ＤＮＡ結合タンパク質を結合し、安定した複合体を形成する。ＤＮＡ鋳型を添加して、ＤＮＡ結合タンパク質に結合させることによって複合体に結合させる。

【0150】

空圧かつ蠕動のポンプシステムは、プログラム可能な流体操作に利用され得る。流入口を通じて、混合基および他の転写試薬を反応チャンバへ導入する。酵素が反応を触媒し、高純度ＲＮＡ産物が産生される。

【0151】

実施例４：ＲＮＡ合成

【0152】

一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）などのＤＮＡ鋳型を、マイクロ流体カートリッジの各反応チャンバに添加する。混合したＲＮＡ塩基を含む転写反応試薬、ならびに任意選択でイニシエーターオリゴヌクレオチドおよび／またはターミネーターオリゴヌクレオチドを、その後流入口を通じて反応チャンバに注入し、表面上で固定された転写複合体上に流した。熱電ペルチェ素子ヒーターを利用して、反応チャンバの温度を３７℃で維持する。ＲＮＡが産生されると、流量により制御されるため約数秒で反応チャンバから除去される。

【0153】

実施例５：等速電気泳動を使用したＲＮＡ精製

【0154】

Ｈａｎ ｅｔ ａｌ．（Ｌａｂ Ｃｈｉｐ、２０１９年、１９、２７４１～２７４９）によれば、等速電気泳動（ＩＴＰ）をＲＮＡ精製に使用することができる。ＩＴＰは、強力な電場勾配を生成し、それらの電気泳動移動度に基づいた荷電種の選択的な集束および分離を可能にする、強固な電気泳動の分離および予備濃縮技術である。ＩＴＰ電解液の化学作用は、標的サイズ範囲内のＲＮＡを精製するために制御され得る。

【0155】

実施例６：融合酵素および酵素結合ドメインを有するプロモーターによるＲＮＡ生成

【0156】

ＤＮＡ転写されたＲＮＡ産物およびＢｒｏｃｃｏｌｉ－ＤＦＨＢＩ－１Ｔなどのその蛍光性アプタマーの複合体形成に基づいて、Ｔ７ ＲＮＡ重合活性アッセイを発展させた。蛍光定量的な性質に起因して、このアッセイによって実時間方式でＲＮＡ転写産物の測定が可能になる。等しいモル量の鋳型鎖および非鋳型鎖をサーモサイクラー中で、９４℃で２分間、混合かつ加熱してから、混合物を冷却するアニーリングプロトコルを使用して、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）基質を産生した。Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ酵素を、１００μＭのＤＦＨＢＩ－１Ｔ、４００ｎＭのｄｓＤＮＡ Ｂｒｏｃｃｏｌｉ鋳型（蛍光用）、４ｍＭのＮＴＰ、０．１Ｕの無機ピロホスファターゼ、および１倍の転写緩衝液を含有している２０μｌの反応混合物に添加することによって、連続的なアッセイを開始した。反応混合物を、３７℃で最大１時間インキュベートしながら、Ｃｙｔａｔｉｏｎ５イメージングリーダー（Ｂｉｏｔｅｋ）を使用して、酵素活性を、蛍光読取（４６９ｎｍの励起波長および５０１ｎｍの発光波長）によって３７℃で測定した。市販のＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを、ＲＮＡポリメラーゼおよび本明細書に記載されたＤＮＡ結合ドメイン（例えば、リザビジン）を含有している融合酵素と置き換えて、ＲＮＡ産生活動を比較した（図１６Ａ）。加えて、酵素結合ドメインを有するプロモーター構造を試験して、ＲＮＡ産生活性を、酵素結合ドメインのない従来のプロモーターと比較した（図１６Ｂ）。

【0157】

実施例７：市販のＲＮＡポリメラーゼと比較してより強力なプロモーター結合

【0158】

Ｔ７プロモーター配列がどのようにＲＮＡ重合活性に影響するかを調べるために、一連のＢｒｏｃｃｏｌｉ ｄｓＤＮＡ基質を、非必須のプロモーター領域の０～１０の上流配列欠失により合成した。Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ酵素に結合する付加的な基質が、ＲＮＡ合成を促進すると同様にプロモーターの相乗効果を生むかどうかさらに分析するために、各対中の非鋳型鎖の５’のビオチンとコンジュゲートしたＤＮＡ基質を調製した。ＲＮＡポリメラーゼおよび本明細書に記載されたＤＮＡ結合ドメイン（例えば、リザビジン）を含有している融合酵素を、１００μＭのＤＦＨＢＩ－１Ｔ、４００ｎＭのトランケートされたｄｓＤＮＡＢｒｏｃｃｏｌｉ鋳型、４ｍＭのＮＴＰ、０．１Ｕの無機ピロホスファターゼ、および１倍の転写緩衝液を含有している２０μｌの反応混合物に添加することによって、リアルタイムＲＮＡ重合アッセイを開始した。反応混合物を、３７℃で最大１時間インキュベートして、酵素活性を、実施例６に記載されたものと同じ方法によって測定した。Ｂｒｏｃｃｏｌｉ、必須のＴ７プロモーター、および非必須のＴ７プロモーターの配列は、以下に示される。

【0159】

配列番号１４（Ｂｒｏｃｃｏｌｉ配列）
ＧＡＧＣＣＣＡＣＡＣＴＣＴＡＣＴＣＧＡＣＡＧＡＴＡＣＧＡＡＴＡＴＣＴＧＧＡＣＣＣＧＡＣＣＧＴＣＴＣ

【0160】

配列番号１５（必須のＴ７プロモーター）
ＴＡＴＡＧＴＧＡＧＴＣ

【0161】

配列番号１６（非必須のＴ７プロモーター）
ＧＴＡＴＴＡＡＴＴＴ

【0162】

ＤＮＡ鋳型の配列は、表２に示される。結果は、図１７Ａ～１７Ｂに示される。

【0163】

【表2】

【0164】

本明細書に記載される実施例と実施形態は説明目的のためのものに過ぎず、当業者に示唆される様々な変形または変化は、本明細書の精神と範囲、および添付の特許請求の範囲内に含まれるものとする。

【図1】

【図2】

【図3A】

【図3B】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15A】

【図15B】

【図16A】

【図16B】

【図17A】

【図17B】

【配列表】

2023552003000001.app

【国際調査報告】