▶ イノベイション バイオ カンパニー リミテッドの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-12-14
(54)【発明の名称】ＣＤ４７に特異的な抗体及びその使用
(51)【国際特許分類】
C07K 16/28 20060101AFI20231207BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20231207BHJP
C12N 15/62 20060101ALI20231207BHJP
C12N 15/12 20060101ALI20231207BHJP
C07K 14/725 20060101ALI20231207BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20231207BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20231207BHJP
C12P 21/08 20060101ALI20231207BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20231207BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20231207BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20231207BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20231207BHJP
A61K 35/17 20150101ALI20231207BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20231207BHJP
【ＦＩ】
C07K16/28
C12N15/13 ZNA
C12N15/62 Z
C12N15/12
C07K14/725
C07K19/00
C12N15/63 Z
C12P21/08
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
A61K39/395 N
A61K35/17
A61P35/00
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023534627
(86)(22)【出願日】2021-12-07
(85)【翻訳文提出日】2023-06-07
(86)【国際出願番号】 KR2021018467
(87)【国際公開番号】W WO2022124764
(87)【国際公開日】2022-06-16
(31)【優先権主張番号】10-2020-0169415
(32)【優先日】2020-12-07
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】521533463
【氏名又は名称】イノベイション バイオ カンパニー リミテッド
【氏名又は名称原語表記】ＩｎｎｏＢａｔｉｏｎ Ｂｉｏ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．
(74)【代理人】
【識別番号】100125450
【弁理士】
【氏名又は名称】河野 広明
(72)【発明者】
【氏名】キム、キテ
(72)【発明者】
【氏名】キム、スング
【テーマコード（参考）】
4B064
4B065
4C085
4C087
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B064AG27
4B064CA19
4B064CC24
4B064CE10
4B064DA01
4B065AA01X
4B065AA57X
4B065AA72X
4B065AA88X
4B065AA90X
4B065AB01
4B065BA02
4B065CA44
4B065CA46
4C085AA14
4C085AA16
4C085BB11
4C085BB31
4C085DD62
4C085EE01
4C087BB37
4C087BB65
4C087CA12
4C087NA14
4C087ZB26
4H045AA11
4H045AA20
4H045AA30
4H045CA40
4H045DA76
4H045EA20
4H045FA74
4H045GA21
(57)【要約】
本発明は、ＣＤ４７に特異的な抗体及びその使用に関し、より詳細には、ＣＤ４７に特異的に結合する抗体、該抗体を含むキメラ抗原受容体、及びそれらを含むＣＤ４７を発現する細胞によって媒介される疾患の予防又は治療のための医薬組成物に関する。
本発明では、ＣＤ４７により特異的に結合する抗体をスクリーニングして新規抗体７種（７Ｃ７、５Ｈ４、５Ａ４、４Ｅ１２、３Ｈ３、３Ａ５、１Ｅ７）を確立し、前記新規抗体がＣＤ４７抗原と特異的に結合することを確認した。
また、上記確立された抗体を用いてＣＤ４７を標的とするキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の製造が可能であることを確認したので、本発明のＣＤ４７に特異的な抗体及びこれを用いて製造したキメラ抗原受容体はＣＤ４７を発現する癌又は腫瘍の予防又は治療に適用することができる。
本発明では、ＣＤ４７により特異的に結合する抗体をスクリーニングして新規抗体７種（７Ｃ７、５Ｈ４、５Ａ４、４Ｅ１２、３Ｈ３、３Ａ５、１Ｅ７）を確立し、前記新規抗体がＣＤ４７抗原と特異的に結合することを確認した。
また、上記確立された抗体を用いてＣＤ４７を標的とするキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の製造が可能であることを確認したので、本発明のＣＤ４７に特異的な抗体及びこれを用いて製造したキメラ抗原受容体はＣＤ４７を発現する癌又は腫瘍の予防又は治療に適用することができる。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
（１）配列番号１のアミノ酸で表されるＣＤＲ１領域、配列番号２のアミノ酸で表されるＣＤＲ２領域及び配列番号３のアミノ酸で表されるＣＤＲ３領域を含む重鎖可変部位、及び配列番号４のアミノ酸で表されるＣＤＲ１領域、配列番号５のアミノ酸で表されるＣＤＲ２領域及び配列番号６のアミノ酸で表されるＣＤＲ３領域を含む軽鎖可変部位；（２）配列番号１１のアミノ酸で表されるＣＤＲ１領域、配列番号１２のアミノ酸で表されるＣＤＲ２領域及び配列番号１３のアミノ酸で表されるＣＤＲ３領域を含む重鎖可変部位、及び配列番号１４のアミノ酸で表されるＣＤＲ１領域、配列番号１５のアミノ酸で表されるＣＤＲ２領域と配列番号１６のアミノ酸で表されるＣＤＲ３領域とを含む軽鎖可変部位；
（３）配列番号２１のアミノ酸で表されるＣＤＲ１領域、配列番号２２のアミノ酸で表されるＣＤＲ２領域及び配列番号２３のアミノ酸で表されるＣＤＲ３領域を含む重鎖可変部位、及び配列番号２４のアミノ酸で表されるＣＤＲ１領域、配列番号２５のアミノ酸で表されるＣＤＲ２領域及び配列番号２６のアミノ酸で表されるＣＤＲ３領域を含む軽鎖可変部位；
（４）配列番号３１のアミノ酸で表されるＣＤＲ１領域、配列番号３２のアミノ酸で表されるＣＤＲ２領域及び配列番号３３のアミノ酸で表されるＣＤＲ３領域を含む重鎖可変部位、及び配列番号３４のアミノ酸で表されるＣＤＲ１領域、配列番号３５のアミノ酸で表されるＣＤＲ２領域及び配列番号３６のアミノ酸で表されるＣＤＲ３領域を含む軽鎖可変部位；
（５）配列番号４１のアミノ酸で表されるＣＤＲ１領域、配列番号４２のアミノ酸で表されるＣＤＲ２領域及び配列番号４３のアミノ酸で表されるＣＤＲ３領域を含む重鎖可変部位、及び配列番号４４のアミノ酸で表されるＣＤＲ１領域、配列番号４５のアミノ酸で表されるＣＤＲ２領域及び配列番号４６のアミノ酸で表されるＣＤＲ３領域を含む軽鎖可変部位；
（６）配列番号５１のアミノ酸で表されるＣＤＲ１領域、配列番号５２のアミノ酸で表されるＣＤＲ２領域及び配列番号５３のアミノ酸で表されるＣＤＲ３領域を含む重鎖可変部位、及び配列番号５４のアミノ酸で表されるＣＤＲ１領域、配列番号５５のアミノ酸で表されるＣＤＲ２領域及び配列番号５６のアミノ酸で示されるＣＤＲ３領域を含む軽鎖可変部位；又は
（７）配列番号６１のアミノ酸で表されるＣＤＲ１領域、配列番号６２のアミノ酸で表されるＣＤＲ２領域及び配列番号６３のアミノ酸で表されるＣＤＲ３領域を含む重鎖可変部位、及び配列番号６４のアミノ酸で表されるＣＤＲ１領域、配列番号６５のアミノ酸で表されるＣＤＲ２領域及び配列番号６６のアミノ酸で表されるＣＤＲ３領域を含む軽鎖可変部位；を含む
ＣＤ４７に特異的に結合する抗体又はその断片。
【請求項2】
前記（１）抗体が、配列番号７のアミノ酸で表される重鎖可変部位、及び配列番号８のアミノ酸で表される軽鎖可変部位、前記（２）抗体は、配列番号１７のアミノ酸で表される重鎖可変部位、及び配列番号１８のアミノ酸で表される軽鎖可変部位、
前記（３）抗体は、配列番号２７のアミノ酸で表される重鎖可変部位、及び配列番号２８のアミノ酸で表される軽鎖可変部位、
前記（４）抗体は、配列番号３７のアミノ酸で表される重鎖可変部位、及び配列番号３８のアミノ酸で表される軽鎖可変部位、
前記（５）抗体は、配列番号４７のアミノ酸で表される重鎖可変部位、及び配列番号４８のアミノ酸で表される軽鎖可変部位、
前記（６）抗体は、配列番号５７のアミノ酸で表される重鎖可変部位、及び配列番号５８のアミノ酸で表される軽鎖可変部位、又は
前記（７）抗体は、配列番号６７のアミノ酸で表される重鎖可変部位と、配列番号６８のアミノ酸で表される軽鎖可変部位、とからなることを特徴とする
ＣＤ４７に特異的に結合する抗体又はその断片。
【請求項3】
請求項１又は２に記載のＣＤ４７に特異的に結合する抗体又はその断片をコードするポリヌクレオチド。
【請求項4】
請求項１又は２に記載のＣＤ４７に特異的に結合する抗体又はその断片をコードするポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項5】
請求項４に記載のベクターで形質転換されたＣＤ４７に特異的に結合する抗体又はその断片を産生する組換え細胞。
【請求項6】
ＣＤ４７結合ドメイン；膜貫通ドメイン；
共同刺激ドメイン；及び
細胞内シグナル伝達ドメイン（ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｉｇｎａｌ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｄｏｍａｉｎ） ；を含むキメラ抗原受容体（ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ＣＡＲ）であって、
前記ＣＤ４７結合ドメインは、
（１）配列番号１のアミノ酸で表されるＣＤＲ１領域、配列番号２のアミノ酸で表されるＣＤＲ２領域及び配列番号３のアミノ酸で表されるＣＤＲ３領域を含む重鎖可変部位、及び配列番号４のアミノ酸で表されるＣＤＲ１領域、配列番号５のアミノ酸で示されるＣＤＲ２領域及び配列番号６のアミノ酸で示されるＣＤＲ３領域を含む軽鎖可変部位を含むＣＤ４７に特異的に結合する抗体又はその断片；
（２）配列番号１１のアミノ酸で表されるＣＤＲ１領域、配列番号１２のアミノ酸で表されるＣＤＲ２領域及び配列番号１３のアミノ酸で表されるＣＤＲ３領域を含む重鎖可変部位、及び配列番号１４のアミノ酸で表されるＣＤＲ１領域、配列番号１５のアミノ酸で表されるＣＤＲ２領域及び配列番号１６のアミノ酸で表されるＣＤＲ３領域を含む軽鎖可変部位を含むＣＤ４７に特異的に結合する抗体又はその断片；
（３）配列番号２１のアミノ酸で表されるＣＤＲ１領域、配列番号２２のアミノ酸で表されるＣＤＲ２領域及び配列番号２３のアミノ酸で表されるＣＤＲ３領域を含む重鎖可変部位、及び配列番号２４のアミノ酸で表されるＣＤＲ１領域、配列番号２５のアミノ酸で表されるＣＤＲ２領域及び配列番号２６のアミノ酸で表されるＣＤＲ３領域を含む軽鎖可変部位を含むＣＤ４７に特異的に結合する抗体又はその断片；
（４）配列番号３１のアミノ酸で表されるＣＤＲ１領域、配列番号３２のアミノ酸で表されるＣＤＲ２領域及び配列番号３３のアミノ酸で表されるＣＤＲ３領域を含む重鎖可変部位、及び配列番号３４のアミノ酸で表されるＣＤＲ１領域、配列番号３５のアミノ酸で表されるＣＤＲ２領域及び配列番号３６のアミノ酸で表されるＣＤＲ３領域を含む軽鎖可変部位を含むＣＤ４７に特異的に結合する抗体又はその断片；
（５）配列番号４１のアミノ酸で表されるＣＤＲ１領域、配列番号４２のアミノ酸で表されるＣＤＲ２領域及び配列番号４３のアミノ酸で表されるＣＤＲ３領域を含む重鎖可変部位、及び配列番号４４のアミノ酸で表されるＣＤＲ１領域、配列番号４５のアミノ酸で表されるＣＤＲ２領域及び配列番号４６のアミノ酸で表されるＣＤＲ３領域を含む軽鎖可変部位を含むＣＤ４７に特異的に結合する抗体又はその断片；
（６）配列番号５１のアミノ酸で表されるＣＤＲ１領域、配列番号５２のアミノ酸で表されるＣＤＲ２領域及び配列番号５３のアミノ酸で表されるＣＤＲ３領域を含む重鎖可変部位、及び配列番号５４のアミノ酸で表されるＣＤＲ１領域、配列番号５５のアミノ酸で表されるＣＤＲ２領域及び配列番号５６のアミノ酸で表されるＣＤＲ３領域を含む軽鎖可変部位を含むＣＤ４７に特異的に結合する抗体又はその断片；又は
（７）配列番号６１のアミノ酸で表されるＣＤＲ１領域、配列番号６２のアミノ酸で表されるＣＤＲ２領域及び配列番号６３のアミノ酸で表されるＣＤＲ３領域を含む重鎖可変部位、及び配列番号６４のアミノ酸で表されるＣＤＲ１領域、配列番号６５のアミノ酸で表されるＣＤＲ２領域及び配列番号６６のアミノ酸で表されるＣＤＲ３領域を含む軽鎖可変部位を含むＣＤ４７に特異的に結合する抗体又はその断片；であることを特徴とする、
キメラ抗原受容体。
【請求項7】
前記膜貫通ドメインが、ＣＤ８α、ＣＤ４、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１５２及びＰＤ１からなる群から選択されるタンパク質であって、共刺激ドメインは、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＯＸ－４０及びＩＣＯＳからなる群から選択されるタンパク質であって、
シグナル伝達ドメインはＣＤ３ζであることを特徴とする
請求項６に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項8】
前記ＣＤ４７結合ドメインのＣ末端と膜貫通ドメインのＮ末端との間にヒンジ領域がさらに含まれる、請求項６に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項9】
請求項６～８のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするポリヌクレオチド。
【請求項10】
請求項６～８のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項11】
請求項６～８のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするポリヌクレオチド、又は前記ポリヌクレオチドを含むベクターを含む免疫エフェクター細胞。
【請求項12】
請求項１又は２に記載のＣＤ４７に特異的に結合する抗体又はその断片；又は請求項１１に記載の免疫エフェクター細胞を含む
ＣＤ４７を発現する癌又は腫瘍の予防又は治療用医薬組成物。
【請求項13】
前記癌又は腫瘍が、血液癌、卵巣癌、結腸癌、乳癌、肺癌、骨髄腫、神経芽細胞誘発性ＣＮＳ腫瘍、単球白血病、Ｂ細胞誘導白血病、Ｔ細胞誘導白血病、 Ｂ細胞誘導リンパ腫、Ｔ細胞誘導リンパ腫、及び肥満細胞誘導腫瘍からなる群から選択されることを特徴とする，請求項１２に記載のＣＤ４７を発現する癌又は腫瘍の予防又は治療用医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ＣＤ４７に特異的な抗体及びその使用に関し、より詳細には、ＣＤ４７に特異的に結合する抗体、該抗体を含むキメラ抗原受容体、及びそれらを含むＣＤ４７を発現する細胞によって媒介される疾患の予防又は治療のための医薬組成物に関する。
【背景技術】
【0002】
ＣＤ４７はインテグリン結合タンパク質（ＩＡＰ）とも呼ばれ、細胞表面で広く発現される膜貫通糖タンパク質であって、免疫グロブリン相科（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ）に属する。
【0003】
ＣＤ４７は細胞表面の非常に重要なマーカーであって、分子量は４７～５５ｋＤであって、構造は１つのアミノ末端細胞外可変領域、１つの３～５個の高疎水性膜貫通断片からなる膜貫通領域と１つの親水性カルボキシ末端細胞質尾部（ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ｔａｉｌ）を含む。これは、インテグリン、ＳＩＲＰα（シグナル調節タンパク質α）、ＳＩＲＰγ及びトロンボスポンジンなどの様々なリガンドと相互作用する。
【0004】
ＳＩＲＰαは、主にマクロファージ、顆粒細胞、骨髄系樹状細胞（ＤＣｓ）、肥満細胞、及び造血幹細胞（ＨＳＣｓ）を含む、それらの前駆体を含む骨髄細胞で発現される。ＳＩＲＰαはマクロファージによる宿主細胞の食菌作用を抑制し、宿主標的細胞上で発現されるＣＤ４７によるマクロファージ上のＳＩＲＰαのライゲーションはＳＨＰ－１によって媒介される抑制シグナルを生成し、食菌作用を陰性的で調整する。
【0005】
先天的な免疫系では、ＣＤ４７は骨髄細胞で発現されるＳＩＲＰαとの結合を介して機能し、生理学的条件下でのＣＤ４７の広範な発現の作用は、健康な細胞が先天的免疫系によって除去されるのを防ぐ。
【0006】
しかし、腫瘍細胞はＣＤ４７の過剰発現による免疫監視を効果的に回避することができる。近年、ＣＤ４７及びＣＤ４７－ＳＩＲＰαシグナル伝達系は腫瘍治療における潜在的な薬物標的として最も注目されている。既存の研究によれば、ＣＤ４７の発現は、ほとんどのヒト癌（例えば、ＮＨＬ、ＡＭＬ、乳癌、結腸癌、膠芽腫、神経膠腫、卵巣癌、膀胱癌及び前立腺癌）で上昇調節され、上昇したＣＤ４７の発現レベルは侵襲性疾患と低い生存率と関連していることが証明された。スタンフォード大学のＷｅｉｓｓｍａｎは、様々な固形腫瘍のうちＣＤ４７の発現レベルを体系的に研究し、その結果、すべてのヒト固形腫瘍細胞においてＣＤ４７は過剰発現を示し、平均発現レベルは対応する正常細胞の３．３倍程度であることを見出した。さらに、固形腫瘍患者のＣＤ４７ｍＲＮＡのレベルは予後指数と 相関関係を示すことがわかった（Ｍａｒｋ Ｐ Ｃｈａｏ ｅｔ ａｌ．， Ｆｒｏｎｔ Ｏｎｃｏｌ．， ９：１３８０， ２０２０）。
【0007】
抗ＣＤ４７抗体の腫瘍の治療は様々なメカニズムと関連している。まず、抗ＣＤ４７抗体は、腫瘍細胞上のＣＤ４７とマクロファージ上のＳＩＲＰαの結合を遮断し、腫瘍細胞が貪食されるようにする。さらに、抗ＣＤ４７抗体は、ＮＫ細胞が関与する腫瘍細胞の細胞毒性を誘導することができ、死を直接誘導して腫瘍細胞を除去することができる。最後に、抗ＣＤ４７抗体はＣＤ８＋Ｔ細胞を活性化し、獲得性Ｔ細胞の免疫反応を引き起こし、腫瘍細胞をさらに死滅させることができる。
【0008】
このようなＣＤ４７を発現する腫瘍細胞又はＣＤ４７過剰発現に関連する疾患などの治療又は診断のためにＣＤ４７に特異的な抗体の開発が行われており、国際公開特許ＷＯ２０１８－０７５８５７号、国際公開特許ＷＯ２０１７－１２１７７１号及び国際公開特許ＷＯ２０１３－１１９７１４号は、様々な抗ＣＤ４７抗体について開示されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0009】
本発明では、ＣＤ４７により特異的に結合する抗体を開発するために、ＣＤ４７に結合する抗体をスクリーニングして新規抗体７種（７Ｃ７、５Ｈ４、５Ａ４、４Ｅ１２、３Ｈ３、３Ａ５、１Ｅ７）を確立し、本発明で選択した７種の抗体はＣＤ４７抗原と特異的に結合することを確認した。また、本発明のＣＤ４７特異的抗体を用いてＣＤ４７を標的とするキメラ抗原受容体の製造が可能であることを確認し、本発明を完成した。
【0010】
したがって、本発明の目的は、ＣＤ４７に特異的に結合する抗体を提供することである。
【0011】
本発明の他の目的は、前記抗体をコードするポリヌクレオチド、前記抗体を発現するベクター、前記ベクターで形質転換された組換え細胞を提供することにある。
【0012】
本発明の別の目的は、前記抗体を含むキメラ抗原受容体、ＣＤ４７を標的とするキメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチド、それを含むベクター、及び前記ポリヌクレオチド又はベクターを含むキメラ抗原受容体を発現する免疫エフェクター細胞を提供することにある。
【0013】
本発明の別の目的は、前記抗体又はＣＤ４７を標的とするキメラ抗原受容体を発現する免疫エフェクター細胞を含む、ＣＤ４７を発現する細胞によって媒介される疾患の予防又は治療用医薬組成物を提供することである。
【0014】
本発明の他の目的は、前記抗体を含むＣＤ４７を発現する細胞によって媒介される疾患の診断又はモニタリング組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0015】
上記の目的を達成するために、
本発明は、
（１）配列番号１のアミノ酸で表されるＣＤＲ１領域、配列番号２のアミノ酸で表されるＣＤＲ２領域及び配列番号３のアミノ酸で表されるＣＤＲ３領域を含む重鎖可変部位、及び配列番号４のアミノ酸で表されるＣＤＲ１領域、配列番号５のアミノ酸で表されるＣＤＲ２領域及び配列番号６のアミノ酸で表されるＣＤＲ３領域を含む軽鎖可変部位；
（２）配列番号１１のアミノ酸で表されるＣＤＲ１領域、配列番号１２のアミノ酸で表されるＣＤＲ２領域及び配列番号１３のアミノ酸で表されるＣＤＲ３領域を含む重鎖可変部位、及び配列番号１４のアミノ酸で表されるＣＤＲ１領域、配列番号１５のアミノ酸で表されるＣＤＲ２領域と配列番号１６のアミノ酸で表されるＣＤＲ３領域とを含む軽鎖可変部位；
（３）配列番号２１のアミノ酸で表されるＣＤＲ１領域、配列番号２２のアミノ酸で表されるＣＤＲ２領域及び配列番号２３のアミノ酸で表されるＣＤＲ３領域を含む重鎖可変部位、及び配列番号２４のアミノ酸で表されるＣＤＲ１領域、配列番号２５のアミノ酸で表されるＣＤＲ２領域及び配列番号２６のアミノ酸で表されるＣＤＲ３領域を含む軽鎖可変部位；
（４）配列番号３１のアミノ酸で表されるＣＤＲ１領域、配列番号３２のアミノ酸で表されるＣＤＲ２領域及び配列番号３３のアミノ酸で表されるＣＤＲ３領域を含む重鎖可変部位、及び配列番号３４のアミノ酸で表されるＣＤＲ１領域、配列番号３５のアミノ酸で表されるＣＤＲ２領域及び配列番号３６のアミノ酸で表されるＣＤＲ３領域を含む軽鎖可変部位；
（５）配列番号４１のアミノ酸で表されるＣＤＲ１領域、配列番号４２のアミノ酸で表されるＣＤＲ２領域及び配列番号４３のアミノ酸で表されるＣＤＲ３領域を含む重鎖可変部位、及び配列番号４４のアミノ酸で表されるＣＤＲ１領域、配列番号４５のアミノ酸で表されるＣＤＲ２領域及び配列番号４６のアミノ酸で表されるＣＤＲ３領域を含む軽鎖可変部位；
（６）配列番号５１のアミノ酸で表されるＣＤＲ１領域、配列番号５２のアミノ酸で表されるＣＤＲ２領域及び配列番号５３のアミノ酸で表されるＣＤＲ３領域を含む重鎖可変部位、及び配列番号５４のアミノ酸で表されるＣＤＲ１領域、配列番号５５のアミノ酸で表されるＣＤＲ２領域及び配列番号５６のアミノ酸で示されるＣＤＲ３領域を含む軽鎖可変部位；又は
（７）配列番号６１のアミノ酸で表されるＣＤＲ１領域、配列番号６２のアミノ酸で表されるＣＤＲ２領域及び配列番号６３のアミノ酸で表されるＣＤＲ３領域を含む重鎖可変部位、及び配列番号６４のアミノ酸で表されるＣＤＲ１領域、配列番号６５のアミノ酸で表されるＣＤＲ２領域及び配列番号６６のアミノ酸で表されるＣＤＲ３領域を含む軽鎖可変部位；を含むＣＤ４７に特異的に結合する抗体又はその断片を提供する。
本発明は、
（１）配列番号１のアミノ酸で表されるＣＤＲ１領域、配列番号２のアミノ酸で表されるＣＤＲ２領域及び配列番号３のアミノ酸で表されるＣＤＲ３領域を含む重鎖可変部位、及び配列番号４のアミノ酸で表されるＣＤＲ１領域、配列番号５のアミノ酸で表されるＣＤＲ２領域及び配列番号６のアミノ酸で表されるＣＤＲ３領域を含む軽鎖可変部位；
（２）配列番号１１のアミノ酸で表されるＣＤＲ１領域、配列番号１２のアミノ酸で表されるＣＤＲ２領域及び配列番号１３のアミノ酸で表されるＣＤＲ３領域を含む重鎖可変部位、及び配列番号１４のアミノ酸で表されるＣＤＲ１領域、配列番号１５のアミノ酸で表されるＣＤＲ２領域と配列番号１６のアミノ酸で表されるＣＤＲ３領域とを含む軽鎖可変部位；
（３）配列番号２１のアミノ酸で表されるＣＤＲ１領域、配列番号２２のアミノ酸で表されるＣＤＲ２領域及び配列番号２３のアミノ酸で表されるＣＤＲ３領域を含む重鎖可変部位、及び配列番号２４のアミノ酸で表されるＣＤＲ１領域、配列番号２５のアミノ酸で表されるＣＤＲ２領域及び配列番号２６のアミノ酸で表されるＣＤＲ３領域を含む軽鎖可変部位；
（４）配列番号３１のアミノ酸で表されるＣＤＲ１領域、配列番号３２のアミノ酸で表されるＣＤＲ２領域及び配列番号３３のアミノ酸で表されるＣＤＲ３領域を含む重鎖可変部位、及び配列番号３４のアミノ酸で表されるＣＤＲ１領域、配列番号３５のアミノ酸で表されるＣＤＲ２領域及び配列番号３６のアミノ酸で表されるＣＤＲ３領域を含む軽鎖可変部位；
（５）配列番号４１のアミノ酸で表されるＣＤＲ１領域、配列番号４２のアミノ酸で表されるＣＤＲ２領域及び配列番号４３のアミノ酸で表されるＣＤＲ３領域を含む重鎖可変部位、及び配列番号４４のアミノ酸で表されるＣＤＲ１領域、配列番号４５のアミノ酸で表されるＣＤＲ２領域及び配列番号４６のアミノ酸で表されるＣＤＲ３領域を含む軽鎖可変部位；
（６）配列番号５１のアミノ酸で表されるＣＤＲ１領域、配列番号５２のアミノ酸で表されるＣＤＲ２領域及び配列番号５３のアミノ酸で表されるＣＤＲ３領域を含む重鎖可変部位、及び配列番号５４のアミノ酸で表されるＣＤＲ１領域、配列番号５５のアミノ酸で表されるＣＤＲ２領域及び配列番号５６のアミノ酸で示されるＣＤＲ３領域を含む軽鎖可変部位；又は
（７）配列番号６１のアミノ酸で表されるＣＤＲ１領域、配列番号６２のアミノ酸で表されるＣＤＲ２領域及び配列番号６３のアミノ酸で表されるＣＤＲ３領域を含む重鎖可変部位、及び配列番号６４のアミノ酸で表されるＣＤＲ１領域、配列番号６５のアミノ酸で表されるＣＤＲ２領域及び配列番号６６のアミノ酸で表されるＣＤＲ３領域を含む軽鎖可変部位；を含むＣＤ４７に特異的に結合する抗体又はその断片を提供する。
【0016】
本発明の好ましい一実施形態では、前記抗体はモノクローナル抗体、好ましくはｓｃＦｖ（Ｓｉｎｇｌｅ－ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ）であり得る。
【0017】
本発明の好ましい別の実施形態において、前記（１）抗体は、配列番号７のアミノ酸で表される重鎖可変部位、及び配列番号８のアミノ酸で表される軽鎖可変部位であって、
前記（２）抗体は、配列番号１７のアミノ酸で表される重鎖可変部位、及び配列番号１８のアミノ酸で表される軽鎖可変部位であって、
前記（３）抗体は、配列番号２７のアミノ酸で表される重鎖可変部位、及び配列番号２８のアミノ酸で表される軽鎖可変部位であって、
前記（４）抗体は、配列番号３７のアミノ酸で表される重鎖可変部位、及び配列番号３８のアミノ酸で表される軽鎖可変部位であって、
前記（５）抗体は、配列番号４７のアミノ酸で表される重鎖可変部位、及び配列番号４８のアミノ酸で表される軽鎖可変部位であって、
前記（６）抗体は、配列番号５７のアミノ酸で表される重鎖可変部位、及び配列番号５８のアミノ酸で表される軽鎖可変部位であって、
前記（７）抗体は、配列番号６７のアミノ酸で表される重鎖可変部位と、配列番号６８のアミノ酸で表される軽鎖可変部位から構成され得る。
前記（２）抗体は、配列番号１７のアミノ酸で表される重鎖可変部位、及び配列番号１８のアミノ酸で表される軽鎖可変部位であって、
前記（３）抗体は、配列番号２７のアミノ酸で表される重鎖可変部位、及び配列番号２８のアミノ酸で表される軽鎖可変部位であって、
前記（４）抗体は、配列番号３７のアミノ酸で表される重鎖可変部位、及び配列番号３８のアミノ酸で表される軽鎖可変部位であって、
前記（５）抗体は、配列番号４７のアミノ酸で表される重鎖可変部位、及び配列番号４８のアミノ酸で表される軽鎖可変部位であって、
前記（６）抗体は、配列番号５７のアミノ酸で表される重鎖可変部位、及び配列番号５８のアミノ酸で表される軽鎖可変部位であって、
前記（７）抗体は、配列番号６７のアミノ酸で表される重鎖可変部位と、配列番号６８のアミノ酸で表される軽鎖可変部位から構成され得る。
【0018】
本発明の別の好ましい実施形態では、前記抗体は、ＣＤ４７がシグナル調節タンパク質α（ＳＩＲＰα）と相互作用するのを防止するか、又はＣＤ４７発現細胞に対するマクロファージ媒介性食作用を促進することができる。
【0019】
他の目的を達成するために、本発明は、前記ＣＤ４７に特異的に結合する抗体をコードするポリヌクレオチドを提供する。
【0020】
さらに、本発明は、前記ＣＤ４７に特異的に結合する抗体をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。
【0021】
さらに、本発明は、前記ベクターで形質転換されたＣＤ４７に特異的に結合する抗体又はその断片を産生する組換え細胞を提供する。
【0022】
さらに、他の目的を達成するために、本発明はＣＤ４７結合ドメイン；膜貫通ドメイン（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｄｏｍａｉｎ）；共同刺激ドメイン（ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ ｄｏｍａｉｎ）；及び細胞内シグナル伝達ドメイン（ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｉｇｎａｌ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｄｏｍａｉｎ）；を含むキメラ抗原受容体を提供する。
【0023】
前記ＣＤ４７結合ドメインは、本発明のＣＤ４７に特異的に結合することができる抗体又はその断片で選択することができる。
【0024】
本発明の好ましい一実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ８α、ＣＤ４、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１５２及びＰＤ１からなる群から選択されるタンパク質に由来し得る。
【0025】
本発明の別の好ましい一実施形態では、共刺激ドメインは、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＯＸ－４０及びＩＣＯＳからなる群から選択されるタンパク質由来であって得、シグナル伝達ドメインはＣＤ３ζ由来であり得る。
【0026】
本発明の別の好ましい一実施形態では、前記ＣＤ４７結合ドメインのＣ末端と膜経由ドメインのＮ末端との間に位置するヒンジ領域をさらに含み、ヒンジ部位はＣＤ８α由来であり得る。
【0027】
他の目的を達成するために、本発明は前記キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするポリヌクレオチドを提供する。
【0028】
さらに、本発明は、前記キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。
【0029】
本発明の好ましい一実施形態では、前記ベクターはプラスミド（ｐｌａｓｍｉｄ）、レトロウイルス（ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ）ベクター、又はレンチウイルス（ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ）ベクターであり得る。
【0030】
また、本発明は、前記キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするポリヌクレオチド又はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするポリヌクレオチドを含み、前記キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する免疫エフェクター細胞を提供する。
【0031】
本発明の好ましい一実施形態では、 前記免疫エフェクター細胞はＴ細胞であり得る。
【0032】
別の目的を達成するために、本発明は、ＣＤ４７を標的とするキメラ抗原受容体を発現する免疫エフェクター細胞；あるいは、ＣＤ４７に特異的に結合する抗体又はその断片；を含むＣＤ４７を発現する癌又は腫瘍の予防又は治療用医薬組成物を提供する。
【0033】
本発明において、前記癌又は腫瘍は、血液癌、卵巣癌、結腸癌、乳癌、肺癌、骨髄腫、神経芽細胞誘導ＣＮＳ腫瘍、単核球白血病、Ｂ細胞誘導白血病、Ｔ細胞誘導白血病、Ｂ細胞誘導リンパ腫、Ｔ細胞誘導リンパ腫、及び肥満細胞誘導腫瘍からなる群から選択することができる。
【発明の効果】
【0034】
本発明では、ＣＤ４７により特異的に結合する抗体をスクリーニングして新規抗体７種（７Ｃ７、５Ｈ４、５Ａ４、４Ｅ１２、３Ｈ３、３Ａ５、１Ｅ７）を確立し、前記新規抗体がＣＤ４７抗原と特異的に結合することを確認した。
【0035】
また、上記確立された抗体を用いてＣＤ４７を標的とするキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の製造が可能であることを確認したので、本発明のＣＤ４７に特異的な抗体、及びこれを用いて製造したキメラ抗原受容体はＣＤ４７を発現する癌又は腫瘍の予防又は治療に適用することができる。
【図面の簡単な説明】
【0036】
図１は、本発明で選択した７Ｃ７、５Ｈ４、５Ａ４、４Ｅ１２、３Ｈ３、３Ａ５及び１Ｅ７抗体のＣＤ４７発現腫瘍細胞（ＭＣＦ－７）に対する結合力をフローサイトメーターで確認したデータである。
図２は、ＣＤ４７を標的とするキメラ抗原受容体（ＣＤ４７－ＣＡＲ）を発現するレンチウイルスを用いたＣＤ４７－ＣＡＲ発現細胞の製造方法を示す模式図である。
図３は、ＨＥＫ２９３細胞株にＣＤ４７－ＣＡＲ発現レンチウイルスベクターを形質転換させた後、形質転換されたＨＥＫ２９３細胞のＣＤ４７ペプチドに対する結合能を確認する方法を示す模式図である。
図４は、ＣＤ４７－ＣＡＲを発現するレンチウイルスで形質転換されたＨＥＫ２９３ＦＴ細胞におけるＣＤ４７－ＣＡＲ発現程度（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）及びＣＤ４７に対する結合能（ｂｉｎｄｉｎｇ）を確認したデータである。
図２は、ＣＤ４７を標的とするキメラ抗原受容体（ＣＤ４７－ＣＡＲ）を発現するレンチウイルスを用いたＣＤ４７－ＣＡＲ発現細胞の製造方法を示す模式図である。
図３は、ＨＥＫ２９３細胞株にＣＤ４７－ＣＡＲ発現レンチウイルスベクターを形質転換させた後、形質転換されたＨＥＫ２９３細胞のＣＤ４７ペプチドに対する結合能を確認する方法を示す模式図である。
図４は、ＣＤ４７－ＣＡＲを発現するレンチウイルスで形質転換されたＨＥＫ２９３ＦＴ細胞におけるＣＤ４７－ＣＡＲ発現程度（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）及びＣＤ４７に対する結合能（ｂｉｎｄｉｎｇ）を確認したデータである。
【発明を実施するための形態】
【0037】
以下、本発明を詳細に説明する。
【0038】
ＣＤ４７に特異的に結合する抗体
本発明は、一態様において、ＣＤ４７に特異的に結合する抗体又はその断片であって、
本発明は、一態様において、ＣＤ４７に特異的に結合する抗体又はその断片であって、
【0039】
（１）配列番号１のアミノ酸で表されるＣＤＲ１領域、配列番号２のアミノ酸で表されるＣＤＲ２領域及び配列番号３のアミノ酸で表されるＣＤＲ３領域を含む重鎖可変部位、及び配列番号４のアミノ酸で表されるＣＤＲ１領域、配列番号５のアミノ酸で表されるＣＤＲ２領域及び配列番号６のアミノ酸で表されるＣＤＲ３領域を含む軽鎖可変部位を含むＣＤ４７に特異的に結合する抗体又はその断片；
（２）配列番号１１のアミノ酸で表されるＣＤＲ１領域、配列番号１２のアミノ酸で表されるＣＤＲ２領域及び配列番号１３のアミノ酸で表されるＣＤＲ３領域を含む重鎖可変部位、及び配列番号１４のアミノ酸で表されるＣＤＲ１領域、配列番号１５のアミノ酸で表されるＣＤＲ２領域及び配列番号１６のアミノ酸で表されるＣＤＲ３領域を含む軽鎖可変部位を含むＣＤ４７に特異的に結合する抗体又はその断片；
（３）配列番号２１のアミノ酸で表されるＣＤＲ１領域、配列番号２２のアミノ酸で表されるＣＤＲ２領域及び配列番号２３のアミノ酸で表されるＣＤＲ３領域を含む重鎖可変部位、及び配列番号２４のアミノ酸で表されるＣＤＲ１領域、配列番号２５のアミノ酸で表されるＣＤＲ２領域及び配列番号２６のアミノ酸で表されるＣＤＲ３領域を含む軽鎖可変部位を含むＣＤ４７に特異的に結合する抗体又はその断片；
（４）配列番号３１のアミノ酸で表されるＣＤＲ１領域、配列番号３２のアミノ酸で表されるＣＤＲ２領域及び配列番号３３のアミノ酸で表されるＣＤＲ３領域を含む重鎖可変部位、及び配列番号３４のアミノ酸で表されるＣＤＲ１領域、配列番号３５のアミノ酸で表されるＣＤＲ２領域及び配列番号３６のアミノ酸で示されるＣＤＲ３領域を含む軽鎖可変部位を含むＣＤ４７に特異的に結合する抗体又はその断片；
（５）配列番号４１のアミノ酸で表されるＣＤＲ１領域、配列番号４２のアミノ酸で表されるＣＤＲ２領域及び配列番号４３のアミノ酸で表されるＣＤＲ３領域を含む重鎖可変部位、及び配列番号４４のアミノ酸で表されるＣＤＲ１領域、配列番号４５のアミノ酸で表されるＣＤＲ２領域及び配列番号４６のアミノ酸で表されるＣＤＲ３領域を含む軽鎖可変部位を含むＣＤ４７に特異的に結合する抗体又はその断片；
（６）配列番号５１のアミノ酸で表されるＣＤＲ１領域、配列番号５２のアミノ酸で表されるＣＤＲ２領域及び配列番号５３のアミノ酸で表されるＣＤＲ３領域を含む重鎖可変部位、及び配列番号５４のアミノ酸で表されるＣＤＲ１領域、配列番号５５のアミノ酸で表されるＣＤＲ２領域及び配列番号５６のアミノ酸で表されるＣＤＲ３領域を含む軽鎖可変部位を含むＣＤ４７に特異的に結合する抗体又はその断片；又は
（７）配列番号６１のアミノ酸で表されるＣＤＲ１領域、配列番号６２のアミノ酸で表されるＣＤＲ２領域及び配列番号６３のアミノ酸で表されるＣＤＲ３領域を含む重鎖可変部位、及び配列番号６４のアミノ酸で表されるＣＤＲ１領域、配列番号６５のアミノ酸で表されるＣＤＲ２領域及び配列番号６６のアミノ酸で表されるＣＤＲ３領域を含む軽鎖可変部位を含むＣＤ４７に特異的に結合する抗体又はその断片；に関する。
（２）配列番号１１のアミノ酸で表されるＣＤＲ１領域、配列番号１２のアミノ酸で表されるＣＤＲ２領域及び配列番号１３のアミノ酸で表されるＣＤＲ３領域を含む重鎖可変部位、及び配列番号１４のアミノ酸で表されるＣＤＲ１領域、配列番号１５のアミノ酸で表されるＣＤＲ２領域及び配列番号１６のアミノ酸で表されるＣＤＲ３領域を含む軽鎖可変部位を含むＣＤ４７に特異的に結合する抗体又はその断片；
（３）配列番号２１のアミノ酸で表されるＣＤＲ１領域、配列番号２２のアミノ酸で表されるＣＤＲ２領域及び配列番号２３のアミノ酸で表されるＣＤＲ３領域を含む重鎖可変部位、及び配列番号２４のアミノ酸で表されるＣＤＲ１領域、配列番号２５のアミノ酸で表されるＣＤＲ２領域及び配列番号２６のアミノ酸で表されるＣＤＲ３領域を含む軽鎖可変部位を含むＣＤ４７に特異的に結合する抗体又はその断片；
（４）配列番号３１のアミノ酸で表されるＣＤＲ１領域、配列番号３２のアミノ酸で表されるＣＤＲ２領域及び配列番号３３のアミノ酸で表されるＣＤＲ３領域を含む重鎖可変部位、及び配列番号３４のアミノ酸で表されるＣＤＲ１領域、配列番号３５のアミノ酸で表されるＣＤＲ２領域及び配列番号３６のアミノ酸で示されるＣＤＲ３領域を含む軽鎖可変部位を含むＣＤ４７に特異的に結合する抗体又はその断片；
（５）配列番号４１のアミノ酸で表されるＣＤＲ１領域、配列番号４２のアミノ酸で表されるＣＤＲ２領域及び配列番号４３のアミノ酸で表されるＣＤＲ３領域を含む重鎖可変部位、及び配列番号４４のアミノ酸で表されるＣＤＲ１領域、配列番号４５のアミノ酸で表されるＣＤＲ２領域及び配列番号４６のアミノ酸で表されるＣＤＲ３領域を含む軽鎖可変部位を含むＣＤ４７に特異的に結合する抗体又はその断片；
（６）配列番号５１のアミノ酸で表されるＣＤＲ１領域、配列番号５２のアミノ酸で表されるＣＤＲ２領域及び配列番号５３のアミノ酸で表されるＣＤＲ３領域を含む重鎖可変部位、及び配列番号５４のアミノ酸で表されるＣＤＲ１領域、配列番号５５のアミノ酸で表されるＣＤＲ２領域及び配列番号５６のアミノ酸で表されるＣＤＲ３領域を含む軽鎖可変部位を含むＣＤ４７に特異的に結合する抗体又はその断片；又は
（７）配列番号６１のアミノ酸で表されるＣＤＲ１領域、配列番号６２のアミノ酸で表されるＣＤＲ２領域及び配列番号６３のアミノ酸で表されるＣＤＲ３領域を含む重鎖可変部位、及び配列番号６４のアミノ酸で表されるＣＤＲ１領域、配列番号６５のアミノ酸で表されるＣＤＲ２領域及び配列番号６６のアミノ酸で表されるＣＤＲ３領域を含む軽鎖可変部位を含むＣＤ４７に特異的に結合する抗体又はその断片；に関する。
【0040】
本発明において、前記抗体は、ＣＤ４７がシグナル調節タンパク質α（ＳＩＲＰα）と相互作用するのを防止するか、又はＣＤ４７発現細胞に対するマクロファージ媒介食作用を促進することができる。
【0041】
本発明において、前記抗体はモノクローナル抗体であり得る。本発明において、用語「モノクローナル抗体」は単一抗体形成細胞が産生する抗体であり、一次構造（アミノ酸配列）が均一な特徴がある。ただ一つの抗原決定基のみを認識し、一般にがん細胞と抗体産生細胞を融合したハイブリドーマ細胞を培養して産生される。
【0042】
本発明の抗体は、抗原結合に核心的な部分であるＣＤＲ部位を除く残りの部分をヒトによって産生された抗体と対応するアミノ酸配列となるようにし、よりヒト抗体との類似性が増加したヒト化抗体で製造することができる。抗体（ｎｏｎ－ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ）をヒト化する最も一般的な方法としては、動物抗体のＣＤＲ部位をヒト抗体に移植するＣＤＲ－グラフト法（ＣＤＲ－ｇｒａｆｔｉｎｇ）方法があり、これに限定されず、当技術分野で公知の方法を利用してヒト化抗体を作製することができる。
【0043】
本発明において、用語「ＣＤＲ」、すなわち「相補性決定領域」は、重鎖ポリペプチド及び軽鎖ポリペプチドの両方の可変領域内に見られる非近接（ｎｏｎ－ｃｏｎｔｉｇｕｏｕｓ）抗原結合部位を意味する。
【0044】
本発明において、用語「抗体」は、２つの全長の軽鎖及び２つの全長の重鎖を有する完全な形態だけでなく、抗体分子の断片も使用することができる。抗体分子の断片とは、少なくともペプチドタグ（エピトープ）結合機能を保持している断片を意味し、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）２、単一ドメイン（ｓｉｎｇｌｅ ｄｏｍａｉｎ）などを含む。
【0045】
抗体断片のうち、Ｆａｂは、軽鎖及び重鎖の可変領域と軽鎖の定常領域及び重鎖の最初の定常領域（ＣＨ１）とを有する構造であり、１つの抗原結合部位を有する。
【0046】
Ｆａｂ’は、重鎖ＣＨ１ドメインのＣ末端に１つ以上のシステイン残基を含むヒンジ領域を有するという点で、Ｆａｂとは異なる。Ｆ（ａｂ’）２抗体は、Ｆａｂ’のヒンジ部位のシステイン残基がジスルフィド結合を形成しながら生成される。Ｆｖは、重鎖可変部位及び軽鎖可変部位のみを有する最小の抗体断片で、Ｆｖ断片を生成する組換え技術は、国際公開特許ＷＯ ８８／１０６４９、ＷＯ ８８／１０６６３０、ＷＯ ８８／０７０８５、ＷＯ ８８／０７０８６及びＷＯ ８８／０９３４４に開示されている。二重鎖Ｆｖ（ｄｓＦｖ）はジスルフィド結合で重鎖可変部位と軽鎖可変部位が連結されており、短鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）は一般にペプチドリンカーを介して重鎖の可変領域と軽鎖の可変領域が共有結合で連結されている。このような抗体断片は、タンパク質加水分解酵素を用いて得ることができ（例えば、全抗体をパパインに制限切断するとＦａｂを得ることができ、ペプシンで切断するとＦ（ａｂ’）２断片を得ることができる）、好ましい。遺伝子組み換え技術によって作製することができます。
【0047】
本発明のＣＤ４７に特異的に結合するモノクローナル抗体は、ＣＤ４７タンパク質の全部又は一部のペプチドを免疫原（又は抗原）として利用して調製することができる。より具体的には、まず免疫原としてＣＤ４７、ＣＤ４７タンパク質を含む融合タンパク質、又はＣＤ４７タンパク質を含むキャリアを必要に応じて免疫増強剤であるアジュバント（例えば、Ｆｒｅｕｎｄ ａｄｊｕｖａｎｔ）と共に、ヒト以外の哺乳動物の皮下、筋肉、静脈、足凸、又は腹腔内に１回以上の注射により免疫感作をさせる。ヒト以外の哺乳動物は、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ニワトリ、ウサギ、ネコ、イヌ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、ロバ、ウマ又はウシ（ヒト抗体を産生するトランスジェニックマウスなどの他の動物由来の抗体を産生するように操作されたトランスジェニック動物を含む）であり、より好ましくはマウス、ラット、ハムスター、モルモット、鶏やウサギである。最初の免疫から約１～２１日ごとに１～４回免疫を行い、最終免疫から約１～１０日後に免疫感作された哺乳動物から抗体産生する細胞を得ることができる。免疫をさせる回収及び時間的間隔は、使用する免疫原の特徴等により適宜変更することができる。
【0048】
モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ（ｈｙｂｒｉｄｏｍａ）の製造は、ケイラ及びミルシュタインなどの方法（Ｎａｔｕｒｅ、１９７５、Ｖｏｌ。２５６、ｐ．４９５－４９７）及びそれに準ずる方法に従って行うことができる。上記のように免疫感作されたヒトを除く動物から採取した脾臓、リンパ節、骨髄又は扁桃からなる群から選択されるいずれか、好ましくは脾臓に含まれる抗体産生する細胞と自己抗体産生能力のない哺乳動物由来の骨髄腫細胞（ｍｙｅｌｏｍａ ｃｅｌｌｓ）を細胞融合させることによりハイブリドーマ（ｈｙｂｒｉｄｏｍａ）を製造することができる。哺乳動物は、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ニワトリ、ウサギ又はヒトであり得、好ましくはマウス、ラット、ニワトリ又はヒトであり得る。
【0049】
細胞融合は、例えば、ポリエチレングリコールやセンダイウイルスを含む融合促進剤や電気パルスによる方法が用いられ、例えば、融合促進剤を含む融合培地に抗体産生細胞と無限増殖可能な哺乳類由来の細胞を約１：１～１：１０の割合で浮遊させ、この状態で、約３０～４０℃で約１～５分間インキュベートする。融合培地には、例えば、ＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ１６４０培地及びイスコブ修飾ダルベッコ培地（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ）を含む通常の一般的なものを用いるとよく、ウシ血清などの血清流は除いておくことが好ましい。
【0050】
前記モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマクローンをスクリーニングする方法は、まず、上記のように取得した融合細胞をＨＡＴ培地などの選択用培地に移し、約３０～４０℃で約３日～３週間培養して、ハイブリドーマ以外の細胞を死滅させる。続いて、マイクロタイタープレート（ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ ｐｌａｔｅ）等でハイブリドーマを培養した後、上述したヒトを除く動物の免疫反応に用いた免疫原と培養上清との反応性が増加した部分をＲＩＡ（ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ ｓｕｂｓｔａｎｃｅ－ｍａｒｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏ ａｎｔｉｂｏｄｙ）又はＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ－Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ）などのイムノアッセイ方法を用いて見つける方法によって行うことができる。そして、上記で見つけたモノクローナル抗体を産生するクローンは、前記免疫原に対して特異的な結合力を示す。
【0051】
本発明のモノクローナル抗体は、このようなハイブリドーマを生体内外で培養することにより得ることができる。培養には、哺乳動物由来の細胞を培養するための通常の方法が用いられ、培養物などからモノクローナル抗体を採取するためには、抗体一般を精製するためのこの分野における通常の方法が用いられる。それぞれの方法としては、例えば、塩析、透析、濾過、濃縮、遠心分離、分別沈殿、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、ゲル電気泳動等電点電気泳動などが挙げられ、これらは必要に応じて組み合わせて適用される。精製したモノクローナル抗体は、その後、濃縮、乾燥し、用途に応じて液相又は固相とする。
【0052】
本発明の具体的な一実施形態では、ＣＤ４７に特異的に結合する抗体を製造するために、ＣＤ４７タンパク質を産生するハイブリドーマを調製及びスクリーニングし、ＣＤ４７に特異的に結合する抗体（ｓｃＦｖ）７種を選択し、これをそれぞれ７Ｃ７、５Ｈ４、５Ａ４、４Ｅ１２、３Ｈ３、３Ａ５及び１Ｅ７と命名した。
【0053】
（１）前記７Ｃ７抗体は、配列番号１のアミノ酸で表されるＣＤＲ１領域（ＧＹＴＦＴＳＹＶ）、配列番号２のアミノ酸で表されるＣＤＲ２領域（ＩＮＰＹＮＤＧＴ）及び配列番号３のアミノ酸で表されるＣＤＲ３領域（ＡＲＧＲＮＲＹＤＳＷＦＡＹ）を含む重鎖可変部位、及び配列番号４のアミノ酸で表されるＣＤＲ１領域（ＱＤＩＳＮＹ）、配列番号５のアミノ酸で表されるＣＤＲ２領域（ＹＴＳ）及び配列番号６のアミノ酸で表されるＣＤＲ３領域（ＱＱＧＮＴＬＰＷＴ）を含む軽鎖可変部位からなることを確認した。
【0054】
具体的には、７Ｃ７抗体は、配列番号７のアミノ酸で表される重鎖可変部位と配列番号８のアミノ酸で表される軽鎖可変部位から構成され、前記重鎖可変部位は配列番号９の塩基配列であって、軽鎖可変部位は、配列番号１０の塩基配列でコードされることを確認した。
【0055】
（２）前記５Ｈ４抗体は、配列番号１１のアミノ酸で表されるＣＤＲ１領域（ＧＹＴＦＴＮＹＷ）、配列番号１２のアミノ酸で表されるＣＤＲ２領域（ＩＤＰＳＮＳＡＴ）及び配列番号１３のアミノ酸で表されるＣＤＲ３領域（ＡＲＧＧＦＡＦＤＳ）を含む重鎖可変部位、及び配列番号１４のアミノ酸で表されるＣＤＲ１領域（ＱＳＬＶＨＳＮＧＮＴＹ）、配列番号１５のアミノ酸で表されるＣＤＲ２領域（ＫＶＳ）及び配列番号１６のアミノ酸で表されるＣＤＲ３領域（ＳＱＳＴＨＶＰＷＴ）を含む軽鎖可変部位からなることを確認した。
【0056】
具体的には、５Ｈ４抗体は、配列番号１７のアミノ酸で表される重鎖可変部位と配列番号１８のアミノ酸で表される軽鎖可変部位から構成され、前記重鎖可変部位は配列番号１９の塩基配列であって、軽鎖可変部位は、配列番号２０の塩基配列でコードされることを確認した。
【0057】
（３）前記５Ａ４抗体は、配列番号２１のアミノ酸で表されるＣＤＲ１領域（ＧＹＴＦＴＮＹＷ）、配列番号２２のアミノ酸で表されるＣＤＲ２領域（ＩＤＰＳＤＳＹＴ）及び配列番号２３のアミノ酸で表されるＣＤＲ３領域（ＴＲＧＧＫＲＡＭＤＹ）を含む重鎖可変部位、及び配列番号２４のアミノ酸で表されるＣＤＲ１領域（ＱＳＬＶＨＳＮＧＮＴＹ）、配列番号２５のアミノ酸で表されるＣＤＲ２領域（ＫＶＳ）及び配列番号２６のアミノ酸で表されるＣＤＲ３領域（ＳＱＳＴＨＶＰＦＴ）を含む軽鎖可変部位からなることを確認した。
【0058】
具体的には、５Ａ４抗体は、配列番号２７のアミノ酸で表される重鎖可変部位と配列番号２８のアミノ酸で表される軽鎖可変部位から構成され、前記重鎖可変部位は配列番号２９の塩基配列であって、軽鎖可変部位は、配列番号３０の塩基配列でコードされることを確認した。
【0059】
（４）前記４Ｅ１２抗体は、配列番号３１のアミノ酸で表されるＣＤＲ１領域（ＧＹＴＦＴＮＹＧ）、配列番号３２のアミノ酸で表されるＣＤＲ２領域（ＩＮＴＹＴＧＥＰ）及び配列番号３３のアミノ酸で表されるＣＤＲ３領域（ＡＲＧＧＧＲＧＡＭＤＹ）を含む重鎖可変部位、及び配列番号３４のアミノ酸で表されるＣＤＲ１領域（ＱＳＩＶＨＳＮＧＮＴＹ）、配列番号３５のアミノ酸で表されるＣＤＲ２領域（ＫＶＳ）及び配列番号３６のアミノ酸で表されるＣＤＲ３領域（ＦＱＧＳＨＶＰＦＴ）を含む軽鎖可変部位からなることを確認した。
【0060】
具体的には、４Ｅ１２抗体は、配列番号３７のアミノ酸で表される重鎖可変部位と配列番号３８のアミノ酸で表される軽鎖可変部位から構成され、前記重鎖可変部位は配列番号３９の塩基配列であって、軽鎖可変部位は配列番号４０の塩基配列でコードされることを確認した。
【0061】
（５）前記３Ｈ３抗体は、配列番号４１のアミノ酸で表されるＣＤＲ１領域（ＧＹＴＦＴＮＹＷ）、配列番号４２のアミノ酸で表されるＣＤＲ２領域（ＩＤＰＳＮＳＥＴ）及び配列番号４３のアミノ酸で表されるＣＤＲ３領域（ＡＲＧＧＦＡＦＤＳ）を含む重鎖可変部位、及び配列番号４４のアミノ酸で表されるＣＤＲ１領域（ＱＳＬＶＨＮＮＧＮＴＹ）、配列番号４５のアミノ酸で表されるＣＤＲ２領域（ＫＶＳ）及び配列番号４６のアミノ酸で表されるＣＤＲ３領域（ＳＱＳＴＨＶＰＷＴ）を含む軽鎖可変部位からなることを確認した。
【0062】
具体的には、３Ｈ３抗体は、配列番号４７のアミノ酸で表される重鎖可変部位と配列番号４８のアミノ酸で表される軽鎖可変部位から構成され、前記重鎖可変部位は配列番号４９の塩基配列であって、軽鎖可変部位は配列番号５０の塩基配列でコードされることを確認した。
【0063】
（６）前記３Ａ５抗体は、配列番号５１のアミノ酸で表されるＣＤＲ１領域（ＧＹＴＦＴＳＹＷ）、配列番号５２のアミノ酸で表されるＣＤＲ２領域（ＩＤＰＳＤＳＹＴ）及び配列番号５３のアミノ酸で表されるＣＤＲ３領域（ＡＲＧＧＫＲＡＭＤＹ）を含む重鎖可変部位、及び配列番号５４のアミノ酸で表されるＣＤＲ１領域（ＱＳＬＶＨＳＮＧＮＴＹ）、配列番号５５のアミノ酸で表されるＣＤＲ２領域（ＫＶＳ）及び配列番号５６のアミノ酸で表されるＣＤＲ３領域（ＳＱＳＴＨＶＰＦＴ）を含む軽鎖可変部位からなることを確認した。
【0064】
具体的には、３Ａ５抗体は、配列番号５７のアミノ酸で表される重鎖可変部位と配列番号５８のアミノ酸で表される軽鎖可変部位から構成され、前記重鎖可変部位は配列番号５９の塩基配列であって、軽鎖可変部位は、配列番号６０の塩基配列でコードされることを確認した。
【0065】
（７）前記１Ｅ７抗体は、配列番号６１のアミノ酸で表されるＣＤＲ１領域（ＧＹＩＦＴＳＹＶ）、配列番号６２のアミノ酸で表されるＣＤＲ２領域（ＩＮＰＹＮＤＧＴ）及び配列番号６３のアミノ酸で表されるＣＤＲ３領域（ＡＲＧＧＦＴＴＤＹ）を含む重鎖可変部位、及び配列番号６４のアミノ酸で表されるＣＤＲ１領域（ＱＳＬＶＨＳＮＧＮＴＹ）、配列番号６５のアミノ酸で表されるＣＤＲ２領域（ＫＶＳ）及び配列番号６６のアミノ酸で表されるＣＤＲ３領域（ＳＱＳＴＨＶＰＹＴ）を含む軽鎖可変部位からなることを確認した。
【0066】
具体的には、１Ｅ７抗体は、配列番号６７のアミノ酸で表される重鎖可変部位と配列番号６８のアミノ酸で表される軽鎖可変部位から構成され、前記重鎖可変部位は配列番号６９の塩基配列であって、軽鎖可変部位は配列番号７０の塩基配列でコードされることを確認した。
【0067】
本発明のＣＤ４７に特異的な抗体は、好ましくはｓｃＦｖ（単一鎖可変フラグメント）であって、重鎖可変部位及び軽鎖可変部位がリンカーに連結され得るように遺伝子組換え技術を介して作製することができる。リンカーは、好ましくは、配列番号７１のアミノ酸配列又は配列番号７２の塩基配列で表すことができるが、これらに限定されない。
【0068】
軽鎖可変部位－リンカー－重鎖可変部位で連結された場合、７Ｃ７抗体は配列番号７３のアミノ酸配列又は配列番号７４の塩基配列で、５Ｈ４抗体は配列番号７５のアミノ酸配列又は配列番号７６の塩基配列で、５Ａ４抗体は配列番号７７のアミノ酸配列又は配列番号７８の塩基配列であって、４Ｅ１２抗体は配列番号７９のアミノ酸配列又は配列番号８０の塩基配列で、３Ｈ３抗体は配列番号８１のアミノ酸配列又は配列番号８２の塩基配列で、３Ａ５抗体は配列番号８３のアミノ酸配列又は配列番号８４の塩基配列で、１Ｅ７抗体は配列番号８５のアミノ酸配列又は配列番号８６の塩基配列で表すことができる。
【0069】
本発明は、別の観点から、前記ＣＤ４７に特異的に結合する抗体をコードするポリヌクレオチドに関する。
【0070】
本発明において、「ポリヌクレオチド」という用語は、一般に、任意の長さに単離された核酸分子（ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチド、又はその類似体を指す。いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、
（１）ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅などのインビトロ増幅；
（２）クローニング及び組換え；
（３）切断及びゲル電気泳動分離などの精製；
（４）化学合成などの合成；によって製造することができ、好ましくは単離されたポリヌクレオチドは組換えＤＮＡ技術によって製造される。
本発明において、抗体又はその抗原結合断片をコードするための核酸は、合成オリゴヌクレオチドの制限断片操作（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｏｐｅｒａｔｉｏｎ）又はＳＯＥ ＰＣＲの適用を含むがこれらに限定されず、当技術分野で公知の様々な方法により、製造することができる。
（１）ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅などのインビトロ増幅；
（２）クローニング及び組換え；
（３）切断及びゲル電気泳動分離などの精製；
（４）化学合成などの合成；によって製造することができ、好ましくは単離されたポリヌクレオチドは組換えＤＮＡ技術によって製造される。
本発明において、抗体又はその抗原結合断片をコードするための核酸は、合成オリゴヌクレオチドの制限断片操作（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｏｐｅｒａｔｉｏｎ）又はＳＯＥ ＰＣＲの適用を含むがこれらに限定されず、当技術分野で公知の様々な方法により、製造することができる。
【0071】
本発明は、別の観点から、前記ＣＤ４７に特異的に結合する抗体をコードするポリヌクレオチドを含むベクター、及び前記ベクターで形質転換された組換え細胞に関する。
【0072】
本発明において、「ベクター」という用語は、適切な宿主細胞内で目的遺伝子が発現できるように、プロモーターなどの必須の調節要素を含む遺伝子調製物である。ベクターは、プラスミド、レトロウイルスベクター及びレンチウイルスベクターのうちの１つ以上から選択することができる。適切な宿主に形質転換されると、ベクターは宿主ゲノムとは無関係に複製及び機能することができ、又は場合によってはゲノム自体に組み込むことができる。
【0073】
さらに、ベクターは、コード領域が適切な宿主において正確に発現されることを可能にする発現制御要素を含み得る。そのような調節要素は当業者に周知であり、例えば、プロモーター、リボソーム結合部位、エンハンサー、及び遺伝子転写又はｍＲＮＡ翻訳を調節するための他の調節要素を含み得る。発現制御配列の特定の構造は、種又は細胞型の機能に応じて変わり得るが、通常、ＴＡＴＡボックス、キャップ配列、ＣＡＡＴ配列などの転写開始及び翻訳開始にそれぞれ関与する５’非－転写配列、及び５’又は３’非翻訳配列を含む。例えば、５’非転写発現制御配列は、機能的に連結された核酸を転写及び制御するためのプロモーター配列を含み得るプロモーター領域を含み得る。
【0074】
本発明において、用語「プロモーター」は、転写を指示するのに十分な最小配列を意味する。さらに、細胞型特異的又は外部のシグナル又は制裁によって誘導される調節可能なプロモーター依存性遺伝子を発現させるのに十分なプロモーター構成を含めることができ、そのような構成は遺伝子の５’又は３’部分に配置することができる。保存的プロモーターと誘導的プロモーターの両方が含まれる。プロモーター配列は、原核生物、真核生物又はウイルスに由来し得る。
【0075】
本発明において、「形質転換体」という用語は、１つ以上の目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを有するベクターが宿主細胞に導入されて形質転換された細胞を意味し、発現ベクターを宿主細胞に導入して形質転換体を製造する方法としては文献（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｊ．、 ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２版）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１．７４、１９８９）に記載のリン酸カルシウム法又は塩化カンシウム／塩化ルビジウム法、エレクトロポレーション法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、電気注入法（ｅｌｅｃｔｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、ＰＥＧなどの化学的処理方法、遺伝子銃（ｇｅｎｅ ｇｕｎ）などを用いる方法などがある。
【0076】
前記ベクターが発現される形質転換体を栄養培地で培養すると、抗体タンパク質を大量に製造、分離可能である。培地と培養条件は、宿主細胞によって慣用されるものを適宜選択して用いることができる。培養時の細胞の生育とタンパク質の大量生産に適するように、温度、培地のｐＨ、培養時間などの条件を適切に調節しなければならない。
【0077】
本発明によるベクターは、抗体の産生のために宿主細胞、好ましくは哺乳動物細胞に形質転換することができる。完全なグリコシル化タンパク質を発現できる適切な宿主細胞株の数は当分野で開発されており、ＣＯＳ－１（例えば、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５０）、ＣＯＳ－７（例えば、ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１６５１）、ＨＥＫ２９３ 、ＢＨＫ２１（例えば、ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１０）、ＣＨＯ（例えば、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６１０）及びＢＳＣ－１（例えば、ＡＴＣＣ ＣＲＬ－２６）細胞株、Ｃｏｓ－７細胞、ＣＨＯ細胞、ｈｅｐ Ｇ２細胞、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８６５３、ＳＰ２／０－Ａｇｌ４、２９３細胞、ＨｅＬａ細胞などを含み、これらの細胞は、例えば、ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、米国）から容易に利用可能である。
【0078】
ＣＤ４７を標的とするキメラ抗原受容体
本発明は、他の観点から、
ＣＤ４７結合ドメイン；
膜貫通ドメイン；
共同刺激ドメイン；及び
細胞内シグナル伝達ドメイン（ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｉｇｎａｌ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｄｏｍａｉｎ）を含むキメラ抗原受容体（ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ＣＡＲ）で、
前記ＣＤ４７結合ドメインは、
（１）配列番号１のアミノ酸で表されるＣＤＲ１領域、配列番号２のアミノ酸で表されるＣＤＲ２領域及び配列番号３のアミノ酸で表されるＣＤＲ３領域を含む重鎖可変部位、及び配列番号４のアミノ酸で表されるＣＤＲ１領域、配列番号５のアミノ酸で示されるＣＤＲ２領域及び配列番号６のアミノ酸で示されるＣＤＲ３領域を含む軽鎖可変部位を含むＣＤ４７に特異的に結合する抗体又はその断片；
（２）配列番号１１のアミノ酸で表されるＣＤＲ１領域、配列番号１２のアミノ酸で表されるＣＤＲ２領域及び配列番号１３のアミノ酸で表されるＣＤＲ３領域を含む重鎖可変部位、及び配列番号１４のアミノ酸で表されるＣＤＲ１領域、配列番号１５のアミノ酸で表されるＣＤＲ２領域及び配列番号１６のアミノ酸で表されるＣＤＲ３領域を含む軽鎖可変部位を含むＣＤ４７に特異的に結合する抗体又はその断片；
（３）配列番号２１のアミノ酸で表されるＣＤＲ１領域、配列番号２２のアミノ酸で表されるＣＤＲ２領域及び配列番号２３のアミノ酸で表されるＣＤＲ３領域を含む重鎖可変部位、及び配列番号２４のアミノ酸で表されるＣＤＲ１領域、配列番号２５のアミノ酸で表されるＣＤＲ２領域及び配列番号２６のアミノ酸で表されるＣＤＲ３領域を含む軽鎖可変部位を含むＣＤ４７に特異的に結合する抗体又はその断片；
（４）配列番号３１のアミノ酸で表されるＣＤＲ１領域、配列番号３２のアミノ酸で表されるＣＤＲ２領域及び配列番号３３のアミノ酸で表されるＣＤＲ３領域を含む重鎖可変部位、及び配列番号３４のアミノ酸で表されるＣＤＲ１領域、配列番号３５のアミノ酸で表されるＣＤＲ２領域及び配列番号３６のアミノ酸で示されるＣＤＲ３領域を含む軽鎖可変部位を含むＣＤ４７に特異的に結合する抗体又はその断片；
（５）配列番号４１のアミノ酸で表されるＣＤＲ１領域、配列番号４２のアミノ酸で表されるＣＤＲ２領域及び配列番号４３のアミノ酸で表されるＣＤＲ３領域を含む重鎖可変部位、及び配列番号４４のアミノ酸で表されるＣＤＲ１領域、配列番号４５のアミノ酸で表されるＣＤＲ２領域及び配列番号４６のアミノ酸で表されるＣＤＲ３領域を含む軽鎖可変部位を含むＣＤ４７に特異的に結合する抗体又はその断片；
（６）配列番号５１のアミノ酸で表されるＣＤＲ１領域、配列番号５２のアミノ酸で表されるＣＤＲ２領域及び配列番号５３のアミノ酸で表されるＣＤＲ３領域を含む重鎖可変部位、及び配列番号５４のアミノ酸で表されるＣＤＲ１領域、配列番号５５のアミノ酸で表されるＣＤＲ２領域及び配列番号５６のアミノ酸で表されるＣＤＲ３領域を含む軽鎖可変部位を含むＣＤ４７に特異的に結合する抗体又はその断片；又は
（７）配列番号６１のアミノ酸で表されるＣＤＲ１領域、配列番号６２のアミノ酸で表されるＣＤＲ２領域及び配列番号６３のアミノ酸で表されるＣＤＲ３領域を含む重鎖可変部位、及び配列番号６４のアミノ酸で表されるＣＤＲ１領域、配列番号６５のアミノ酸で表されるＣＤＲ２領域及び配列番号６６のアミノ酸で表されるＣＤＲ３領域を含む軽鎖可変部位を含むＣＤ４７に特異的に結合する抗体又はその断片；である。
本発明は、他の観点から、
ＣＤ４７結合ドメイン；
膜貫通ドメイン；
共同刺激ドメイン；及び
細胞内シグナル伝達ドメイン（ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｉｇｎａｌ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｄｏｍａｉｎ）を含むキメラ抗原受容体（ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ＣＡＲ）で、
前記ＣＤ４７結合ドメインは、
（１）配列番号１のアミノ酸で表されるＣＤＲ１領域、配列番号２のアミノ酸で表されるＣＤＲ２領域及び配列番号３のアミノ酸で表されるＣＤＲ３領域を含む重鎖可変部位、及び配列番号４のアミノ酸で表されるＣＤＲ１領域、配列番号５のアミノ酸で示されるＣＤＲ２領域及び配列番号６のアミノ酸で示されるＣＤＲ３領域を含む軽鎖可変部位を含むＣＤ４７に特異的に結合する抗体又はその断片；
（２）配列番号１１のアミノ酸で表されるＣＤＲ１領域、配列番号１２のアミノ酸で表されるＣＤＲ２領域及び配列番号１３のアミノ酸で表されるＣＤＲ３領域を含む重鎖可変部位、及び配列番号１４のアミノ酸で表されるＣＤＲ１領域、配列番号１５のアミノ酸で表されるＣＤＲ２領域及び配列番号１６のアミノ酸で表されるＣＤＲ３領域を含む軽鎖可変部位を含むＣＤ４７に特異的に結合する抗体又はその断片；
（３）配列番号２１のアミノ酸で表されるＣＤＲ１領域、配列番号２２のアミノ酸で表されるＣＤＲ２領域及び配列番号２３のアミノ酸で表されるＣＤＲ３領域を含む重鎖可変部位、及び配列番号２４のアミノ酸で表されるＣＤＲ１領域、配列番号２５のアミノ酸で表されるＣＤＲ２領域及び配列番号２６のアミノ酸で表されるＣＤＲ３領域を含む軽鎖可変部位を含むＣＤ４７に特異的に結合する抗体又はその断片；
（４）配列番号３１のアミノ酸で表されるＣＤＲ１領域、配列番号３２のアミノ酸で表されるＣＤＲ２領域及び配列番号３３のアミノ酸で表されるＣＤＲ３領域を含む重鎖可変部位、及び配列番号３４のアミノ酸で表されるＣＤＲ１領域、配列番号３５のアミノ酸で表されるＣＤＲ２領域及び配列番号３６のアミノ酸で示されるＣＤＲ３領域を含む軽鎖可変部位を含むＣＤ４７に特異的に結合する抗体又はその断片；
（５）配列番号４１のアミノ酸で表されるＣＤＲ１領域、配列番号４２のアミノ酸で表されるＣＤＲ２領域及び配列番号４３のアミノ酸で表されるＣＤＲ３領域を含む重鎖可変部位、及び配列番号４４のアミノ酸で表されるＣＤＲ１領域、配列番号４５のアミノ酸で表されるＣＤＲ２領域及び配列番号４６のアミノ酸で表されるＣＤＲ３領域を含む軽鎖可変部位を含むＣＤ４７に特異的に結合する抗体又はその断片；
（６）配列番号５１のアミノ酸で表されるＣＤＲ１領域、配列番号５２のアミノ酸で表されるＣＤＲ２領域及び配列番号５３のアミノ酸で表されるＣＤＲ３領域を含む重鎖可変部位、及び配列番号５４のアミノ酸で表されるＣＤＲ１領域、配列番号５５のアミノ酸で表されるＣＤＲ２領域及び配列番号５６のアミノ酸で表されるＣＤＲ３領域を含む軽鎖可変部位を含むＣＤ４７に特異的に結合する抗体又はその断片；又は
（７）配列番号６１のアミノ酸で表されるＣＤＲ１領域、配列番号６２のアミノ酸で表されるＣＤＲ２領域及び配列番号６３のアミノ酸で表されるＣＤＲ３領域を含む重鎖可変部位、及び配列番号６４のアミノ酸で表されるＣＤＲ１領域、配列番号６５のアミノ酸で表されるＣＤＲ２領域及び配列番号６６のアミノ酸で表されるＣＤＲ３領域を含む軽鎖可変部位を含むＣＤ４７に特異的に結合する抗体又はその断片；である。
【0079】
本発明において、用語「キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）」は、一般に、抗原及び１つ以上の細胞内ドメインと結合する能力を有する細胞外ドメインを含む融合タンパク質を指す。ＣＡＲはキメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲ－Ｔ）の重要な部分であり、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、共刺激ドメイン、及び細胞内シグナル伝達ドメインを含み得る。ＣＡＲは、抗体の抗原（例えばＣＤ４７）特異性に基づいてＴ細胞受容体－活性化細胞内ドメインと組み合わせることができる。遺伝子改変されたＣＡＲ発現Ｔ細胞は、標的抗原発現悪性細胞を特異的に同定し除去することができる。
【0080】
本発明において、「ＣＤ４７結合ドメイン」という用語は、一般にＣＤ４７タンパク質に特異的に結合することができるドメインを指す。例えば、ＣＤ４７結合ドメインは、Ｂ細胞で発現されたヒトＣＤ４７ポリペプチド又はその断片に特異的に結合することができる抗ＣＤ４７抗体又はその断片を含み得る。
【0081】
本発明において、用語「結合ドメイン」は、「細胞外ドメイン」、「細胞外結合ドメイン」、「抗原特異的結合ドメイン」及び「細胞外抗原特異的結合ドメイン」は互換的に使用することができ、標的抗原（例えばＣＤ４７）に特異的に結合する能力を有するＣＡＲドメイン又は断片をという。
【0082】
本発明において、前記抗ＣＤ４７抗体又はその断片は、上述の抗ＣＤ４７抗体であり、モノクローナル抗体（モノクローナル抗体）、好ましくはｓｃＦｖ（ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ）である。具体的には、本発明のＣＤ４７に特異的な７Ｃ７、５Ｈ４、５Ａ４、４Ｅ１２、３Ｈ３、３Ａ５及び１Ｅ７抗体を用いて製造することができる。
【0083】
本発明において、ＣＤ４７結合ドメインのＮ末端にシグナルペプチドをさらに含むことができ、前記「シグナルペプチド」は一般にタンパク質送達を誘導するためのペプチド鎖を指す。シグナルペプチドは、５～３０のアミノ酸長を有する短いペプチドであり得、本発明では、好ましくは配列番号９４のアミノ酸配列を使用した。
【0084】
本発明において、ＣＤ４７結合ドメインのＣ末端と膜貫通ドメインのＮ末端との間に位置するヒンジ領域をさらに含むことができ、ヒンジ部位はＣＤ８α由来であり、好ましくは配列番号９５のアミノ酸配列で表すことができる。
【0085】
前記「ヒンジ領域」は、一般に、抗原結合領域と免疫細胞Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）結合領域との間の結合領域を指す。
【0086】
本発明において、「膜貫通ドメイン」とは、一般に細胞膜を通過し、細胞内シグナル伝達ドメインに連結されてシグナル伝達の役割を果たすＣＡＲのドメインを指す。膜貫通ドメインは、ＣＤ８α、ＣＤ４、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１５２及びＰＤ１からなる群から選択されるタンパク質に由来し得、好ましくは配列番号９６のアミノ酸配列で表され得る。
【0087】
本発明において、「共刺激ドメイン」とは、一般に、リンパ球の抗原に対する効果的な反応に必要な細胞表面分子である免疫刺激分子を提供することができる細胞内ドメインを指す。上記の共刺激ドメインは、ＣＤ２８の共刺激ドメインを含み、ＯＸ４０及び４－１ＢＢの共刺激ドメインなどのＴＮＦ受容体ファミリーの共刺激ドメインを含むことができ、好ましくは配列番号９７のアミノ酸配列で表される４－１ＢＢであり得る。
【0088】
本発明において、「細胞内シグナル伝達ドメイン」とは、一般に、細胞内に位置し、シグナルを伝達することができるドメインを指す。本発明において、細胞内シグナル伝達ドメインはキメラ抗原受容体の細胞内シグナル伝達ドメインである。例えば、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζ細胞内ドメイン、ＣＤ２８細胞内ドメイン、ＣＤ２８細胞内ドメイン、４－１ＢＢ細胞内ドメイン、及びＯＸ４０細胞内ドメインから選択することができ、好ましくは配列番号９８のアミノ酸配列で表されるＣＤ３ζであり得る。
【0089】
本発明のＣＤ４７を標的とするキメラ抗原受容体（ＣＤ４７－ＣＡＲ）は、好ましくは、図２に示す模式図のように調製することができる。
【0090】
キメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチド及びキメラ抗原受容体発現ベクター
本発明はさらに別の観点から、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするポリヌクレオチドに関する。
本発明はさらに別の観点から、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするポリヌクレオチドに関する。
【0091】
本発明において、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするポリヌクレオチドは、ＣＤ４７結合ドメインをコードするポリヌクレオチド；膜貫通ドメインをコードするポリヌクレオチド；共刺激ドメインをコーティングするポリヌクレオチド；細胞内シグナル伝達ドメインをコードするポリヌクレオチド；を含み得る。
【0092】
前記ＣＤ４７結合ドメインをコードするポリヌクレオチドは、本発明のＣＤ４７に特異的な７Ｃ７、５Ｈ４、５Ａ４、４Ｅ１２、３Ｈ３、３Ａ５及び１Ｅ７抗体をコードするポリヌクレオチドであってもよく、軽鎖可変部位及び重鎖可変部位がリンカーで連結されたｓｃＦｖの形態で、具体的な塩基配列は上記の通りである。
【0093】
好ましくは、本発明のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするポリヌクレオチドは、
配列番号８８の塩基配列で表されるシグナルペプチド；
配列番号７４の塩基配列で表される７Ｃ７抗体、配列番号７６の塩基配列で表される５Ｈ４抗体、配列番号７８の塩基配列で表される５Ａ４抗体、配列番号８０の塩基配列で表される４Ｅ１２抗体、配列番号８２の塩基配列で表される３Ｈ３抗体、配列番号８４の塩基配列で表される３Ａ５抗体、又は配列番号８６の塩基配列で表される１Ｅ７抗体；
配列番号９０の塩基配列で表される膜貫通ドメイン；
配列番号９１の塩基配列で表される４－１ＢＢ（共刺激ドメイン）；及び
配列番号９２の塩基配列で表されるＣＤ３ζ（細胞内シグナル伝達ドメイン）；から構成することができる。
配列番号８８の塩基配列で表されるシグナルペプチド；
配列番号７４の塩基配列で表される７Ｃ７抗体、配列番号７６の塩基配列で表される５Ｈ４抗体、配列番号７８の塩基配列で表される５Ａ４抗体、配列番号８０の塩基配列で表される４Ｅ１２抗体、配列番号８２の塩基配列で表される３Ｈ３抗体、配列番号８４の塩基配列で表される３Ａ５抗体、又は配列番号８６の塩基配列で表される１Ｅ７抗体；
配列番号９０の塩基配列で表される膜貫通ドメイン；
配列番号９１の塩基配列で表される４－１ＢＢ（共刺激ドメイン）；及び
配列番号９２の塩基配列で表されるＣＤ３ζ（細胞内シグナル伝達ドメイン）；から構成することができる。
【0094】
また、ＣＤ４７結合ドメインをコードするポリヌクレオチドと膜貫通ドメインとの間に、ヒンジ部位をコードするポリヌクレオチドをさらに含むことができ、好ましくは配列番号８９の塩基配列で表されるＣＤ８ヒンジ部位を含むことができる。
【0095】
本発明はさらに別の観点から、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするポリヌクレオチドを含むベクターに関する。
【0096】
本発明の特定の実施形態では、ベクターは組換えウイルスベクターであり、好ましくはレンチウイルスベクターであり、作動可能に連結されたＥＦ１αプロモーター；シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチド；ＣＤ４７結合ドメインをコードするポリヌクレオチド；膜貫通ドメインをコードするポリヌクレオチド；細胞内シグナル伝達ドメインをコードするポリヌクレオチド；を含み、タンパク質の発現を増加させるためにＷＰＲＥ（ｗｏｏｄｃｈｕｃｋ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ ｐｏｓｔ－ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｅｌｅｍｅｎｔ）をさらに含み得る（図２）。
【0097】
前記ＥＦ１αプロモーターは配列番号８７の塩基配列で表され、必要に応じて前記配列番号８７の塩基配列と９０％以上、９３％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上同じ配列を含み得る。
【0098】
さらに、プロモーターは、ＣＤ４７結合ドメインである抗ＣＤ４７抗体（ｓｃＦｖ）の発現を誘導するように作動可能に連結されている。
【0099】
本発明の具体的な一実施形態では、図２及び図３に示すように、ＣＤ４７－ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドが挿入されたレンチウイルスベクターを作製し、図４に示すように、抗ＣＤ４７ ＣＡＲは正常に発現してＣＤ４７ペプチドと結合することを確認した。
【0100】
宿主細胞にポリヌクレオチドを導入するための生物学的方法は、ＤＮＡ及びＲＮＡベクターの使用を含む。ウイルスベクター、特にレトロウイルスベクターは、哺乳動物、例えばヒト細胞に遺伝子を挿入するために最も広く使用されている方法となっている。他のウイルスベクターは、レンチウイルス、ポックスウイルス、単純ヘルペスウイルス、アデノウイルス及びアデノ関連ウイルスなどに由来し得る。
【0101】
宿主細胞にポリヌクレオチドを導入するための化学的手段は、コロイド分散系、例えば、高分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズ、及び水中油型エマルジョン、ミセル、混合ミセル、及びリポソームを含む脂質ベースシステムを含みます。インビトロ及びインビボで送達ビヒクルとして使用するための例示的なコロイド系は、リポソーム（例えば、人工膜小胞）である。核酸の最新技術の標的化送達、例えば、標的化ナノ粒子又は他の適切なマイクロメータ未満の送達システムを用いたポリヌクレオチドの送達のための他の方法が利用可能である。
【0102】
非ウイルス送達システムが使用される場合、例示的な送達ビヒクルはリポソームである。脂質製剤の使用は、宿主細胞への核酸の導入（インビトロ又はインビボ）のために企図される。別の態様では、核酸は脂質と会合することができる。脂質と会合した核酸は、リポソームの水性内部にカプセル化されるか、リポソームの脂質二重層に点在するか、リポソームとオリゴヌクレオチドの両方と会合した連結分子を介してリポソームに結合するか、リポソーム内に捕捉されるか、リポソームと複合体化されるか、脂質含有溶液中に分散させるか、脂質と混合するか、脂質と組み合わせるか、脂質中に懸濁液として含有するか、ミセルと共に含有又は複合体化するか、又は脂質とは異なり会合することができる。脂質、脂質／ＤＮＡ又は脂質／発現ベクター会合組成物は、溶液中の任意の特定の構造に限定されない。
【0103】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）発現免疫エフェクター細胞
本発明はさらに別の観点から、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするポリヌクレオチド又はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを含み、前記キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する免疫エフェクター細胞に関する。
本発明はさらに別の観点から、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするポリヌクレオチド又はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを含み、前記キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する免疫エフェクター細胞に関する。
【0104】
本発明において、免疫エフェクター細胞は哺乳動物由来細胞であり得、好ましくはＴ細胞又は自然殺害（ＮＫ）細胞であり得る。
【0105】
本発明において、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する免疫エフェクター細胞は、本発明のＣＡＲベクターを免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞又はＮＫ細胞に導入することにより製造することができる。
【0106】
具体的には、ＣＡＲベクターは、エレクトロポレーション、リポフェクタミン２０００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎなどの当技術分野で公知の方法によって細胞に導入することができる。例えば、免疫エフェクター細胞をレンチウイルスベクターでトランスフェクトして、ＣＡＲ分子を運ぶウイルスゲノムを宿主ゲノムに組み込むことによって標的遺伝子の長期的かつ安定した発現を確実にすることができる。他の例では、転移因子を用いてＣＡＲ輸送プラスミド及び転移酵素輸送プラスミドを標的細胞に導入することができる。他の例では、ＣＡＲ分子を遺伝子編集方法（例えば、ＣＲＩＳＰＲ ／ Ｃａｓ９）によってゲノムに添加することができる。
【0107】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する免疫エフェクター細胞を調製するための免疫エフェクター細胞は、対象から得ることができ、「対象」は免疫応答を引き出すことができる生きている生物（例えば哺乳動物）を含む。対象の例には、ヒト、イヌ、ネコ、マウス、ラット、及びそれらのトランスジェニック種が含まれる。
【0108】
Ｔ細胞は、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位からの組織、腹水、胸膜滲出、脾臓組織、及び腫瘍を含む多数の供給源から得ることができる。
【0109】
前記Ｔ細胞は、当業者に知られている多くの技術、例えばＦｉｃｏｌｌ（商標）単離を用いて対象から収集された血液単位から得ることができる。血液からの細胞は単離輸出によって得られ、単離輸出産物は典型的にはＴ細胞、単球、顆粒球、Ｂ細胞を含むリンパ球、他の有核白血球、赤血球、及び血小板を含む。
【0110】
分離エクスポートによって収集された細胞は、血漿画分を除去し、細胞をその後の処理工程のために適切な緩衝液又は培地に入れるために洗浄することができる。
【0111】
Ｔ細胞は、赤血球を溶解し、例えばパーコール（ＰＥＲＣＯＬＬ）ＴＭ勾配による遠心分離によって又は逆流遠心分離によって単球を枯渇させることによって末梢血リンパ球から単離される。
【0112】
ＣＤ４７発現によって媒介される疾患の予防又は治療用組成物
本発明は、別の観点から、ＣＤ４７に特異的に結合する抗体、又はＣＤ４７を標的とするキメラ抗原受容体を発現する免疫エフェクター細胞を含む、ＣＤ４７を発現する癌又は腫瘍の予防又は治療用医薬組成物に関する。
本発明は、別の観点から、ＣＤ４７に特異的に結合する抗体、又はＣＤ４７を標的とするキメラ抗原受容体を発現する免疫エフェクター細胞を含む、ＣＤ４７を発現する癌又は腫瘍の予防又は治療用医薬組成物に関する。
【0113】
本発明において、ＣＤ４７を発現する癌又は腫瘍は、血液癌、卵巣癌、結腸癌、乳癌、肺癌、骨髄腫、神経芽細胞誘発ＣＮＳ腫瘍、単球白血病、Ｂ細胞誘導白血病、Ｔ細胞誘導白血病、Ｂ細胞由来リンパ腫、Ｔ細胞誘導リンパ腫、及び肥満細胞誘導腫瘍からなる群から選択することができる。
【0114】
本発明において、組成物は、ＣＤ４７を発現する細胞によって媒介される疾患の治療剤を含み得、治療剤は、ＣＤ４７に特異的に結合する抗体の重鎖及び／又は軽鎖に共有結合した状態で存在する。あるいは、本発明のＣＤ４７に特異的な抗体又はＣＤ４７－ＣＡＲ－Ｔ細胞と併用投与することができる。
【0115】
治療薬は、低分子薬物、ペプチド薬物、毒素（例えば細胞毒素）などを含む。
【0116】
さらに、治療薬は抗癌剤であり得る。抗癌剤は、癌細胞の増殖を減少させ、細胞傷害性薬剤及び細胞増殖抑制剤を組み合わせた非ペプチド性（すなわち、非タンパク質系）化合物を含む。抗癌剤の非限定的な例には、アルキル化剤、ニトロソ要素、抗代謝物質、抗腫瘍抗生物質、植物（ビンカ）アルカロイド及びステロイドホルモンが含まれる。ペプチド性化合物も使用することができる。
【0117】
前記医薬組成物中のＣＤ４７に特異的に結合する抗体又はＣＤ４７を標的とするキメラ抗原受容体を発現する免疫エフェクター細胞は、治療又は診断用組成物内で唯一の活性成分であるか、又は例えば抗Ｔ細胞、抗ＩＦＮγ又は抗ＬＰＳ抗体などの他の抗体成分、又はキサンチンなどの非抗体成分を含む他の活性成分と共に使用可能である。
【0118】
医薬組成物は、治療的有効量の本発明の抗体を含むことが好ましい。本明細書で使用される「治療的有効量」という用語は、標的疾患又は状態を治療、改善、又は予防するのに必要な治療薬の量を意味し、又は検出可能な程度の治療又は予防効果を示すために必要な治療薬の量を意味する。いくつかの抗体について、治療的有効投与量は、細胞培養アッセイ又は通常げっ歯類、ウサギ、イヌ、ブタ、又は霊長類などの動物モデルによって最初に決定することができる。動物モデルはまた、適切な濃度範囲及び投与ルートを決定するために使用することができる。そのような情報は、ヒトの投与に有用な投与量及び根を決定するために使用することができる。
【0119】
ヒト患者の正確な有効量は、疾患状態の重症度、患者の一般的な健康状態、患者の年齢、体重及び性別、食事、投与時間、投与頻度、薬剤組成、反応感度及び治療に対する耐性／反応に依存する。前記量は従来の実験によって決定することができ、臨床医の判断の範囲内である。一般に、有効用量は０．０１～５０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．１～２０ｍｇ／ｋｇ、さらに好ましくは約１５ｍｇ／ｋｇである。
【0120】
組成物は患者に個別に投与することができ、又は他の薬剤、薬剤又はホルモンと組み合わせて投与することができる。
【0121】
本発明の抗体が投与される投与量は、治療される状態の性質、悪性リンパ腫又は白血病のグレード、及び抗体が疾患予防レベルで使用されるか、又は存在する状態を治療するために使用されるかによって異なる。
【0122】
投与頻度は、抗体分子の半減期、薬効の持続性に依存する。抗体分子が短い半減期（例えば、２～１０時間）を有する場合、１日当たり１回以上の用量を提供する必要がある。あるいは、抗体分子が長い半減期（例えば、２～１５日）を有する場合、１日に１回、１週間に１回、又は毎月又は２ヶ月あたり１回の用量を提供する必要がある。
【0123】
さらに、医薬組成物は、抗体の投与のために薬学的に許容される担体を含有してもよい。担体は、それ自体が組成物を投与される個体に有害な抗体の産生を引き起こすべきではなく、毒性がないべきである。適切な担体は、タンパク質、ポリペプチド、リポオソーム、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、アミノ酸ポリマー、アミノ酸コポリマー及び不活性ウイルス粒子などの徐々に新陳代謝される高分子であり得る。
【0124】
薬学的に許容される塩は、例えば、塩化水素酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩及び硫酸塩などのミネラル酸塩、又は酢酸、プロピオン酸、マロン酸及び安息香酸などの有機酸の塩を使用することができる。
【0125】
治療組成物中の薬学的に許容される担体はさらに、水、生理食塩水、グリセロール及びエタノールなどの液体を含み得る。さらに、湿潤剤、乳化剤又はｐＨ緩衝物質などの補助物質がそのような組成物中に存在し得る。担体は、患者による医薬組成物の摂取のために、錠剤、丸薬、糖衣錠、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、及び懸濁剤として製剤化することができる。
【0126】
投与のための好ましい形態は、例えば注射又は注入（例えば、喪失注射又は連続注入）による非経口投与に適した形態を含む。生成物が注入又は注射用である場合、油又は水溶性賦形剤中の懸濁剤、溶液又はエマルジョンの形態をとることができ、これは懸濁剤、保存剤、安定剤及び／又は分散剤などの処方剤を含み得る。あるいは、抗体分子は無水形態であってもよく、使用前に適切な滅菌液で再構成されてもよい。
【0127】
一旦製剤化されると、本発明の組成物は患者に直接投与することができる。治療を受ける患者は動物であり得る。しかしながら、組成物はヒト患者の投与のために適合することが好ましい。
【0128】
本発明の医薬組成物は制限はないが、経口、静脈、筋肉内、動脈内、骨髄内、脊椎腔内、心室内、経皮、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、腸内、局所、舌下、膣内又は直腸経路を含む経路によって投与することができる。典型的には、治療用組成物は液体溶液又は懸濁液として注射可能な材料として調製することができる。また、注入前に液体賦形剤内容液又は懸濁液に適した固体形態を製造することができる。
【0129】
組成物の直接送達は、一般に、注射、皮下注射、腹腔内注射、静脈内注射、筋肉内注射によって行うことができ、又は組織の間質空間に送達することができる。さらに、組成物は創傷部位で投与することができる。用量処理は、単回投与スケジュール又は複数回投与スケジュールであり得る。
【0130】
ＣＤ４７を発現する細胞によって媒介される疾患の診断又はモニタリング
本発明はさらに別の観点から、ＣＤ４７に特異的に結合する抗体を含む、ＣＤ４７を発現する細胞によって媒介される疾患の診断又は監視用組成物に関する。
本発明はさらに別の観点から、ＣＤ４７に特異的に結合する抗体を含む、ＣＤ４７を発現する細胞によって媒介される疾患の診断又は監視用組成物に関する。
【0131】
ＣＤ４７に特異的に結合する抗体は直接的又は間接的に標識することができる。間接的標識は、検出可能な標識を含む二次抗体を含み、二次抗体がＣＤ４７に特異的に結合する抗体に結合する。他の間接的標識はビオチンを含み、ビオチン化ＣＤ４７に特異的に結合する抗体は検出可能標識を含むアビジン又はストレプトアビジンを使用して検出することができる。
【0132】
適切な検出可能標識は、分光分析的、光化学的、生化学的、免疫化学的、電気的、光学的又は化学的手段によって検出可能なすべての組成物を含む。適切な標識は、非限定的に、磁石ビーズ、蛍光染料（例えば、フルオレセインイソチオシアン酸塩、テキサスレッド、ローダミン、緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質など）、放射性標識（例えば、たとえば、３Ｈ、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、又は３２Ｐ）、酵素（例えば、マスタード無過酸化酵素、アルカリンホスファターゼ、ルシフェラーゼ及び酵素結合免疫吸着検査（ＥＬＩＳＡ）に一般的に使用されるもの）及びコロイド状の金又は着色ガラス又はプラスチック（例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックスなど）ビーズなどの表色系標識が含まれる。
【0133】
さらに、診断又は監視のために、抗体は蛍光タンパク質で標識することができ、造影剤又は放射線同位体を含み得る。
【0134】
本発明のＣＤ４７に特異的に結合する抗体を診断キットに用いる場合、抗体は支持体に固定されており、支持体はマイクロプレート、マイクロアレイ、チップ、ガラス、ビーズ又は粒子、又は膜であり得る。
【0135】
以下、本発明の理解を助けるために好ましい実施例を提示する。しかしながら、以下の実施例は本発明をより容易に理解するために提供されるものであり、以下の実施例によって本発明の内容が限定されるものではない。
【0136】
実施例１：ＣＤ４７に特異的に結合する抗体の調製及び選択
ＣＤ４７ペプチド特異的抗体を選択するために、ＣＤ４７に結合する抗体を産生するハイブリドーマを調製して抗体を選択した。
ＣＤ４７ペプチド特異的抗体を選択するために、ＣＤ４７に結合する抗体を産生するハイブリドーマを調製して抗体を選択した。
【0137】
まず、ＣＤ４７タンパク質（Ａｃｒｏｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ｃａｔ＃ＣＤ７－ＨＡ２Ｅ９）を免疫して脾臓細胞を摘出し、マウス骨髄症細胞と細胞融合を通じてハイブリドーマ細胞を作製した。
【0138】
細胞融合に用いるマウス骨髄腫細胞は、ＨＧＰＲＴ（ＨｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅＧｕａｎｉｄｉｎｅ－Ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌ－Ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）を有していないため、ＨＡＴ培地では生存できないが、ハイブリドーマは脾臓細胞と融合することによりＨＡＴ培地で生存できる。これを用いるとハイブリドーマのみを増殖させることができるので、通常ハイブリドーマを確立するまでＨＡＴ培地で増殖させた。
【0139】
増殖したハイブリドーマの中でＣＤ４７と結合する抗体を産生するハイブリドーマを選択するために限界希釈法を用いた。まず、９６ウェル当たり１細胞以下となるようにした後、１つの細胞から増殖したクローンで得られた抗体がＣＤ４７と結合するかをＥＬＩＳＡで確認し、ＣＤ４７と結合するクローンを選別した。この過程を３回繰り返してＣＤ４７と結合する抗体を産生するハイブリドーマを選別した。このようにしてＣＤ４７に結合する７種の抗体を得た。
【0140】
上記７種の抗体はそれぞれ７Ｃ７、５Ｈ４、５Ａ４、４Ｅ１２、３Ｈ３、３Ａ５及び１Ｅ７と命名し、それらの塩基配列とアミノ酸配列を分析した。配列分析結果による各抗体の重鎖可変部位、及び軽鎖可変部位の配列情報を下記表１～表７に示し、下記表１～７で下線を付した部分は相補的決定部位を意味する。
【0141】
【表1】
【0142】
【表2】
【0143】
【表3】
【0144】
【表4】
【0145】
【表5】
【0146】
【表6】
【0147】
【表7】
【0148】
実施例２：選択された抗体のＣＤ４７に対する特異性の確認 － ＥＬＩＳＡ分析
本発明では、上記実施例１で確立した７Ｃ７、５Ｈ４、５Ａ４、４Ｅ１２、３Ｈ３、３Ａ５及び１Ｅ７抗体のＣＤ４７に対する特異性を確認するために、ＥＬＩＳＡ分析を行った。
本発明では、上記実施例１で確立した７Ｃ７、５Ｈ４、５Ａ４、４Ｅ１２、３Ｈ３、３Ａ５及び１Ｅ７抗体のＣＤ４７に対する特異性を確認するために、ＥＬＩＳＡ分析を行った。
【0149】
まず、ＣＤ４７ペプチドをコードするために、ＣＤ４７タンパク質（Ａｃｒｏｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ｃａｔ＃ＣＤ７－ＨＡ２Ｅ９）を１００ｎｇ／ウェルになるように９６ウェルプレートに分注し、４℃で一晩反応させた。次いで、３％ＢＳＡを含む１×ＰＢＳＴを処理した後、室温で３０分間ブロッキングした。
【0150】
７Ｃ７、５Ｈ４、５Ａ４、４Ｅ１２、３Ｈ３、３Ａ５及び１Ｅ７抗体産生する各クローンのハイブリドーマ細胞培養液３μｌを各ウェルに処理した後、常温で２時間反応させた後、１×ＰＢＳＴで３回洗浄した。二次抗体（ａｎｔｉ－ＨＲＰ、１：１０，０００）を処理して室温で３０分間反応させた後、１×ＰＢＳＴで３回洗浄した後、発色のためにＴＭＢを処理して室温で５分間反応させた。最後に１Ｎ Ｈ２ＳＯ４の停止液（ｓｔｏｐ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を処理して反応を終了させた後、４５０ｎｍで吸光度を測定した。
【0151】
【表8】
【0152】
【表9】
【0153】
その結果、表９に示すように、本発明で選択した抗体が全てＣＤ４７に特異的に結合することを確認した。
【0154】
実施例３：選択された抗体のＣＤ４７に対する特異性の確認 － フローサイトメトリー
本発明では、上記実施例１で確立した７Ｃ７、５Ｈ４、５Ａ４、４Ｅ１２、３Ｈ３、３Ａ５及び１Ｅ７抗体のＣＤ４７に対する特異性を確認するためにフローサイトメトリーを行った。
本発明では、上記実施例１で確立した７Ｃ７、５Ｈ４、５Ａ４、４Ｅ１２、３Ｈ３、３Ａ５及び１Ｅ７抗体のＣＤ４７に対する特異性を確認するためにフローサイトメトリーを行った。
【0155】
まず、ＣＤ４７を発現する乳がん細胞株ＭＣＦ－７ １×１０７個と７Ｃ７、５Ｈ４、５Ａ４、４Ｅ１２、３Ｈ３、３Ａ５及び１Ｅ７抗体１μｇそれぞれを３０分間反応させた後、二次抗体で表面（ｓｕｒｆａｃｅ）を染色その後、フローサイトメーターで測定した。
【0156】
陽性対照（ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ）でＣＤ４７抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ＰＥ ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＣＤ４７， ｃａｔ＃ ３２３１０８， ５μｌ）を、二次抗体としてＰＥ－コンジュゲーションされた抗マウスＩｇＧ抗体（ＰＥ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｇｏａｔ ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ； Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ Ｉｎｃ．， ｃａｔ＃ ４０５３０７， 米国、５μｌ）を使用した。
【0157】
【表10】
【0158】
その結果、図１及び表１０に示すように、７Ｃ７、５Ｈ４、５Ａ４、４Ｅ１２、３Ｈ３、３Ａ５及び１Ｅ７抗体ともにＣＤ４７を発現する細胞と特異的に結合することを確認した。
【0159】
本発明で選択した抗体はＣＤ４７を発現する細胞を特異的に認識したので、ＣＤ４７を発現する癌又は腫瘍細胞の免疫回避を抑制して免疫細胞／マクロファージによる細胞毒性又は死滅を効果的に誘導することができる。したがって、本発明の抗ＣＤ４７抗体は、ＣＤ４７を発現する癌又は腫瘍の予防又は治療用組成物として有用に利用することができる。
【0160】
実施例４：ＣＤ４７を標的とするキメラ抗原受容体（ＣＤ４７－ＣＡＲ）発現ベクターの作製
本発明では、上記実施例１で製造したＣＤ４７抗体を用いて、ＣＤ４７を標的とするキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するレンチウイルスベクター（ＣＤ４７－ＣＡＲレンチウイルス）を製造した。
本発明では、上記実施例１で製造したＣＤ４７抗体を用いて、ＣＤ４７を標的とするキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するレンチウイルスベクター（ＣＤ４７－ＣＡＲレンチウイルス）を製造した。
【0161】
図２の模式図に示すように、ＥＦ１αプロモーター（配列番号８７）；
シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチド（配列番号８８）；
ＣＤ４７結合ドメインをコードするポリヌクレオチド（配列番号７４の塩基配列で表される７Ｃ７抗体、配列番号７６の塩基配列で表される５Ｈ４抗体、配列番号７８の塩基配列で表される５Ａ４抗体、配列番号８０の塩基配列で表される４Ｅ１２抗体、配列番号８２の塩基配列で表される３Ｈ３抗体、配列番号８４の塩基配列で表される３Ａ５抗体、又は配列番号８６の塩基配列で表される１Ｅ７抗体）；
ＣＤ８ヒンジ部位をコードするポリヌクレオチド（配列番号８９）；
膜貫通ドメインをコードするポリヌクレオチド（配列番号９０）；
４－１ＢＢ（共同刺激ドメイン）をコードするポリヌクレオチド（配列番号９１）；
ＣＤ３ζ細胞内のシグナル伝達ドメイン）をコードするポリヌクレオチド（配列番号９２）；とＷＰＲＥをコードするポリヌクレオチド（配列番号９３）；からなるＣＡＲ ＤＮＡをｉｎ ｖｉｔｒｏで合成し、第３世代レンチウイルスベクターに挿入した。
シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチド（配列番号８８）；
ＣＤ４７結合ドメインをコードするポリヌクレオチド（配列番号７４の塩基配列で表される７Ｃ７抗体、配列番号７６の塩基配列で表される５Ｈ４抗体、配列番号７８の塩基配列で表される５Ａ４抗体、配列番号８０の塩基配列で表される４Ｅ１２抗体、配列番号８２の塩基配列で表される３Ｈ３抗体、配列番号８４の塩基配列で表される３Ａ５抗体、又は配列番号８６の塩基配列で表される１Ｅ７抗体）；
ＣＤ８ヒンジ部位をコードするポリヌクレオチド（配列番号８９）；
膜貫通ドメインをコードするポリヌクレオチド（配列番号９０）；
４－１ＢＢ（共同刺激ドメイン）をコードするポリヌクレオチド（配列番号９１）；
ＣＤ３ζ細胞内のシグナル伝達ドメイン）をコードするポリヌクレオチド（配列番号９２）；とＷＰＲＥをコードするポリヌクレオチド（配列番号９３）；からなるＣＡＲ ＤＮＡをｉｎ ｖｉｔｒｏで合成し、第３世代レンチウイルスベクターに挿入した。
【0162】
レンチウイルスベクターＤＮＡ（０．５μｇ）をＨＥＫ２９３ＦＴ細胞（５×１０５ｃｅｌｌｓ／５００μｌ）に送達し、ＣＤ４７－ＣＡＲ遺伝子を発現する２９３ＨＥＫ細胞を作製した。２９３ＨＥＫ細胞に遺伝子を送達するために、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ３０００トランスフェクションキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ｃａｔ＃Ｌ３０００－０１５）を使用し、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ（ｇｉｂｃｏ、ｃａｔ＃５１９８５－０３４）培地で４時間インキュベートした。
【0163】
レンチウイルスベクターＤＮＡで形質転換されたＨＥＫ２９３ＦＴでＣＤ４７特異的ＣＡＲが正常に発現され、ＣＤ４７ペプチドと結合するかフローサイトメトリー法により確認した結果（図３）、図４に示すように、ＣＤ４７－ＣＡＲは、正常に発現し、ＣＤ４７ペプチドと結合することを確認した。したがって、抗ＣＤ４７抗体である５Ａ４、４Ｅ１２、３Ｈ３、３Ａ５又は１Ｅ７は、ＣＤ４７を標的とするＣＡＲ－Ｔ細胞の製造に利用することができる。
【産業上の利用可能性】
【0164】
本発明で選択したＣＤ４７に特異的な抗体７種（７Ｃ７、５Ｈ４、５Ａ４、４Ｅ１２、３Ｈ３、３Ａ５、１Ｅ７）はＣＤ４７抗原と特異的に結合し、上記確立された抗体を用いてＣＤ４７を標的とするキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の調製が可能であることが確認されたので、本発明のＣＤ４７に特異的な抗体及びそれを用いて製造したキメラ抗原受容体は、ＣＤ４７を発現する癌又は腫瘍の予防又は治療に適用することができる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【配列表】
【国際調査報告】