特表 2023-552379 ＢＣＬ１１Ａの標的化のための組成物及び方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-12-15

(54)【発明の名称】ＢＣＬ１１Ａの標的化のための組成物及び方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/09 20060101AFI20231208BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20231208BHJP

   C12N 15/86 20060101ALI20231208BHJP

   C12N 15/864 20060101ALI20231208BHJP

   C12N 15/867 20060101ALI20231208BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20231208BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20231208BHJP

   A61P 7/00 20060101ALI20231208BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20231208BHJP

   A61K 35/76 20150101ALI20231208BHJP

   A61K 35/28 20150101ALI20231208BHJP

   A61K 35/545 20150101ALI20231208BHJP

   A61P 13/02 20060101ALI20231208BHJP

   A61P 9/12 20060101ALI20231208BHJP

   A61P 9/00 20060101ALI20231208BHJP

   A61P 29/02 20060101ALI20231208BHJP

   A61P 25/04 20060101ALI20231208BHJP

   A61P 11/00 20060101ALI20231208BHJP

   A61P 7/06 20060101ALI20231208BHJP

【ＦＩ】

C12N15/09 110

C12N15/63 Z ZNA

C12N15/86 Z

C12N15/864 100Z

C12N15/867 Z

C12N5/10

C12N1/19

A61P7/00

A61K48/00

A61K35/76

A61K35/28

A61K35/545

A61P13/02

A61P9/12

A61P9/00

A61P29/02

A61P25/04

A61P11/00

A61P7/06

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023533861

(86)(22)【出願日】2021-12-02

(85)【翻訳文提出日】2023-07-28

(86)【国際出願番号】 US2021061672

(87)【国際公開番号】W WO2022120094

(87)【国際公開日】2022-06-09

(31)【優先権主張番号】63/120,885

(32)【優先日】2020-12-03

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＲＩＴＯＮ

(71)【出願人】

【識別番号】521532813

【氏名又は名称】スクライブ・セラピューティクス・インコーポレイテッド

【氏名又は名称原語表記】ＳＣＲＩＢＥ ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣＳ ＩＮＣ．

(74)【代理人】

【識別番号】100145403

【弁理士】

【氏名又は名称】山尾 憲人

(74)【代理人】

【識別番号】100122301

【弁理士】

【氏名又は名称】冨田 憲史

(74)【代理人】

【識別番号】100157956

【弁理士】

【氏名又は名称】稲井 史生

(74)【代理人】

【識別番号】100170520

【弁理士】

【氏名又は名称】笹倉 真奈美

(74)【代理人】

【識別番号】100221545

【弁理士】

【氏名又は名称】白江 雄介

(72)【発明者】

【氏名】オークス，ベンジャミン

(72)【発明者】

【氏名】ヒギンズ，ショーン

(72)【発明者】

【氏名】デニー，サラ

(72)【発明者】

【氏名】スタール，ブレット ティ

(72)【発明者】

【氏名】コリン，イザベル

(72)【発明者】

【氏名】アディル，マルーフ

(72)【発明者】

【氏名】アーンズ，コール

【テーマコード（参考）】

4B065

4C084

4C087

【Ｆターム（参考）】

4B065AA90X

4B065AA90Y

4B065AB01

4B065AC20

4B065BA02

4B065CA44

4C084AA13

4C084NA14

4C084ZA08

4C084ZA36

4C084ZA51

4C084ZA55

4C084ZA59

4C084ZA81

4C087AA01

4C087AA02

4C087BB63

4C087BC83

4C087CA12

4C087NA14

4C087ZA08

4C087ZA36

4C087ZA51

4C087ZA55

4C087ZA59

4C087ZA81

(57)【要約】

本明細書において、クラス２ Ｖ型ＣＲＩＳＰＲポリペプチド、ガイド核酸（ｇＮＡ）、及び任意選択的にＢＣＬ１１Ａ遺伝子の改変に有用なドナー鋳型核酸を含むシステムが提供される。このシステムはまた、異常ヘモグロビン症関連疾患を有する対象における細胞の改変にも有用である。また、かかる対象においてＢＣＬ１１Ａ遺伝子を標的化するシステム又はかかるシステムをコードする核酸を投与することによって、異常ヘモグロビン症関連疾患を有する対象を治療する方法も提供される。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

クラス２ Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質及び第１のガイドリボ核酸（ｇＲＮＡ）を含むシステムであって、前記ｇＲＮＡが、ポリピリミジントラクト結合タンパク質１（ＢＣＬ１１Ａ）遺伝子を含む標的核酸配列に相補的な標的化配列を含む、システム。

【請求項2】

前記ｇＲＮＡが、
ａ．ＢＣＬ１１Ａイントロン、
ｂ．ＢＣＬ１１Ａエキソン、
ｃ．ＢＣＬ１１Ａイントロン－エキソン接合部、
ｄ．ＢＣＬ１１Ａ調節エレメント、及び
ｅ．遺伝子間領域、からなる群から選択される標的核酸配列に相補的な標的化配列を含む、請求項１に記載のシステム。

【請求項3】

前記ＢＣＬ１１Ａ遺伝子が、野生型配列を含む、請求項１又は請求項２に記載のシステム。

【請求項4】

前記ｇＲＮＡが、単一分子ｇＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）である、請求項１～３のいずれか一項に記載のシステム。

【請求項5】

前記ｇＲＮＡが、二種分子ｇＲＮＡ（ｄｇＲＮＡ）である、請求項１～４のいずれか一項に記載のシステム。

【請求項6】

前記ｇＲＮＡの前記標的化配列が、配列番号２７２～２１００及び２２８６～２６７８９からなる群から選択される配列、又はそれと少なくとも約６５％、少なくとも約７５％、少なくとも約８５％、若しくは少なくとも約９５％の同一性を有する配列を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載のシステム。

【請求項7】

前記ｇＲＮＡの前記標的化配列が、配列番号２７２～２１００及び２２８６～２６７８９からなる群から選択される配列を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載のシステム。

【請求項8】

前記標的化配列が、前記配列の３’末端から単一のヌクレオチドが除去されている、請求項７に記載のシステム。

【請求項9】

前記標的化配列が、前記配列の３’末端から２つのヌクレオチドが除去されている、請求項７に記載のシステム。

【請求項10】

前記標的化配列が、前記配列の３’末端から３つのヌクレオチドが除去されている、請求項７に記載のシステム。

【請求項11】

前記標的化配列が、前記配列の３’末端から４つのヌクレオチドが除去されている、請求項７に記載のシステム。

【請求項12】

前記標的化配列が、前記配列の３’末端から５つのヌクレオチドが除去されている、請求項７に記載のシステム。

【請求項13】

前記ｇＲＮＡの前記標的化配列が、ＢＣＬ１１Ａエキソンの配列に相補的である、請求項１～１２のいずれか一項に記載のシステム。

【請求項14】

前記ｇＲＮＡの前記標的化配列が、ＢＣＬ１１Ａエキソン１配列、ＢＣＬ１１Ａエキソン２配列、ＢＣＬ１１Ａエキソン３配列、ＢＣＬ１１Ａエキソン４配列、ＢＣＬ１１Ａエキソン５配列、ＢＣＬ１１Ａエキソン６配列、ＢＣＬ１１Ａエキソン７配列、ＢＣＬ１１Ａエキソン８配列、及びＢＣＬ１１Ａエキソン９配列からなる群から選択される配列に相補的である、請求項１３に記載のシステム。

【請求項15】

前記ｇＲＮＡの前記標的化配列が、ＢＣＬ１１Ａエキソン１配列、ＢＣＬ１１Ａエキソン２配列、及びＢＣＬ１１Ａエキソン３配列からなる群から選択される配列に相補的である、請求項１４に記載のシステム。

【請求項16】

前記ｇＲＮＡの前記標的化配列が、ＢＣＬ１１Ａ調節エレメントの配列に相補的である、請求項１～１２のいずれか一項に記載のシステム。

【請求項17】

前記ｇＲＮＡの前記標的化配列が、前記ＢＣＬ１１Ａ遺伝子のプロモーターの配列に相補的である、請求項１６に記載のシステム。

【請求項18】

前記ｇＲＮＡの前記標的化配列が、エンハンサー調節エレメントの配列に相補的である、請求項１６に記載のシステム。

【請求項19】

前記ｇＲＮＡの前記標的化配列が、前記ＢＣＬ１１Ａ遺伝子のＧＡＴＡ１赤血球特異的エンハンサー結合部位（ＧＡＴＡ１）を含む配列に相補的である、請求項１８に記載のシステム。

【請求項20】

前記ｇＲＮＡの前記標的化配列が、前記ＢＣＬ１１Ａ遺伝子の前記ＧＡＴＡ１結合部位の５’側にある配列に相補的である、請求項１６に記載のシステム。

【請求項21】

前記ｇＲＮＡの前記標的化配列が、ＵＧＧＡＧＣＣＵＧＵＧＡＵＡＡＡＡＧＣＡ（配列番号２２）の配列、又はそれと少なくとも９０％若しくは９５％の配列同一性を有する配列を含む、請求項１９又は請求項２０に記載のシステム。

【請求項22】

前記ｇＲＮＡの前記標的化配列が、ＵＧＧＡＧＣＣＵＧＵＧＡＵＡＡＡＡＧＣＡ（配列番号２２）の配列からなる、請求項１９に記載のシステム。

【請求項23】

前記ｇＲＮＡの前記標的化配列が、ＵＧＣＵＵＵＵＡＵＣＡＣＡＧＧＣＵＣＣＡ（配列番号２３）の配列、又はそれと少なくとも９０％若しくは９５％の配列同一性を有する配列を含む、請求項１８に記載のシステム。

【請求項24】

前記ｇＲＮＡの前記標的化配列が、ＵＧＣＵＵＵＵＡＵＣＡＣＡＧＧＣＵＣＣＡ（配列番号２３）の配列からなる、請求項１８に記載のシステム。

【請求項25】

前記ｇＲＮＡの前記標的化配列が、ＣＡＧＧＣＵＣＣＡＧＧＡＡＧＧＧＵＵＵＧ（配列番号２９４９）の配列、又はそれと少なくとも９０％若しくは９５％の配列同一性を有する配列を含む、請求項１９又は請求項２０に記載のシステム。

【請求項26】

前記ｇＲＮＡの前記標的化配列が、ＣＡＧＧＣＵＣＣＡＧＧＡＡＧＧＧＵＵＵＧ（配列番号２９４９）の配列からなる、請求項１９又は請求項２０に記載のシステム。

【請求項27】

前記ｇＲＮＡの前記標的化配列が、ＧＡＧＧＣＣＡＡＡＣＣＣＵＵＣＣＵＧＧＡ（配列番号２９４８）の配列、又はそれと少なくとも９０％若しくは９５％の配列同一性を有する配列を含む、請求項１９又は請求項２０に記載のシステム。

【請求項28】

前記ｇＲＮＡの前記標的化配列が、ＣＡＧＧＣＵＣＣＡＧＧＡＡＧＧＧＵＵＵＧ（配列番号２９４８）の配列からなる、請求項１９又は請求項２０に記載のシステム。

【請求項29】

前記ｇＲＮＡの前記標的化配列が、ＡＧＵＧＣＡＡＧＣＵＡＡＣＡＧＵＵＧＣＵ（配列番号１５７４７）の配列、又はそれと少なくとも９０％若しくは９５％の配列同一性を有する配列を含む、請求項１９又は請求項２０に記載のシステム。

【請求項30】

前記ｇＲＮＡの前記標的化配列が、ＡＧＵＧＣＡＡＧＣＵＡＡＣＡＧＵＵＧＣＵ（配列番号１５７４７）の配列からなる、請求項１９又は請求項２０に記載のシステム。

【請求項31】

前記ｇＲＮＡの前記標的化配列が、ＡＵＡＣＡＡＣＵＵＵＧＡＡＧＣＵＡＧＵＣ（配列番号１５７４８）の配列、又はそれと少なくとも９０％若しくは９５％の配列同一性を有する配列を含む、請求項１９又は請求項２０に記載のシステム。

【請求項32】

前記ｇＲＮＡの前記標的化配列が、ＡＵＡＣＡＡＣＵＵＵＧＡＡＧＣＵＡＧＵＣ（配列番号１５７４８）の配列からなる、請求項１９又は請求項２０に記載のシステム。

【請求項33】

第２のｇＲＮＡを更に含み、前記第２のｇＲＮＡが、前記第１のｇＲＮＡの前記ｇＲＮＡの前記標的化配列と比較して、前記ＢＣＬ１１Ａ標的核酸の異なる部分又は重複する部分に相補的な標的化配列を有する、請求項１～３２のいずれか一項に記載のシステム。

【請求項34】

前記第２のｇＲＮＡの前記標的化配列が、前記ＧＡＴＡ１結合部位配列の５’側又は３’側にある前記標的核酸の配列に相補的である、請求項３３に記載のシステム。

【請求項35】

前記第１のｇＲＮＡ及び前記第２のｇＲＮＡが、各々、前記ＢＣＬ１１Ａ遺伝子の前記プロモーター内の配列に相補的な標的化配列を有する、請求項３３に記載のシステム。

【請求項36】

前記第１のｇＲＮＡ又は前記第２のｇＲＮＡが、配列番号２２３８～２２８５、２６７９４～２６８３９、及び２７２１９～２７２６５からなる群から選択される配列、又はそれと少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％の配列同一性を有する配列を含む足場を有する、請求項１～３５のいずれか一項に記載のシステム。

【請求項37】

前記第１のｇＲＮＡ又は前記第２のｇＲＮＡが、配列番号２２３８～２２８５、２６７９４～２６８３９、及び２７２１９～２７２６５からなる群から選択される配列を含む足場を有する、請求項１～３６のいずれか一項に記載のシステム。

【請求項38】

前記第１のｇＲＮＡ又は前記第２のｇＲＮＡが、配列番号２２３８～２２８５、２６７９４～２６８３９、及び２７２１９～２７２６５からなる群から選択される配列からなる足場を有する、請求項１～３６のいずれか一項に記載のシステム。

【請求項39】

前記第１のｇＲＮＡ又は前記第２のｇＲＮＡが、配列番号２２３８又は配列番号２６８００の配列からなる足場を有する、請求項３８に記載のシステム。

【請求項40】

前記標的化配列が、前記ｇＲＮＡの前記足場の３’末端に連結されている、請求項３６～３９のいずれか一項に記載のシステム。

【請求項41】

前記クラス２ Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質が、配列番号５９、７２～９９、１０１～１４８、及び２６９０８～２７１５４からなる群から選択される配列、又はそれと少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、若しくは少なくとも約９５％、若しくは少なくとも約９５％、若しくは少なくとも約９６％、若しくは少なくとも約９７％、若しくは少なくとも約９８％、若しくは少なくとも約９９％の配列同一性を有する配列を含むＣａｓＸバリアントタンパク質である、請求項１～４０のいずれか一項に記載のシステム。

【請求項42】

前記クラス２ Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質が、配列番号５９、７２～９９、１０１～１４８、及び２６９０８～２７１５４からなる群から選択される配列を含むＣａｓＸバリアントタンパク質である、請求項４１に記載のシステム。

【請求項43】

前記ＣａｓＸバリアントタンパク質が、配列番号５９、７２～９９、１０１～１４８、及び２６９０８～２７１５４からなる群から選択される配列からなる、請求項４１に記載のシステム。

【請求項44】

前記ＣａｓＸバリアントタンパク質が、配列番号１２６、２７０４３、２７０４６、２７０５０からなる群から選択される配列からなる、請求項４２に記載のシステム。

【請求項45】

前記ＣａｓＸバリアントタンパク質が、配列番号１～３から選択される配列を有する参照ＣａｓＸタンパク質と比較して、少なくとも１つの改変を含む、請求項４１に記載のシステム。

【請求項46】

前記少なくとも１つの改変が、前記参照ＣａｓＸタンパク質と比較して、前記ＣａｓＸバリアントタンパク質のドメインにおける少なくとも１つのアミノ酸置換、欠失、又は置換を含む、請求項４５に記載のシステム。

【請求項47】

前記ドメインが、非標的鎖結合（ＮＴＳＢ）ドメイン、標的鎖装填（ＴＳＬ）ドメイン、ヘリックスＩドメイン、ヘリックスＩＩドメイン、オリゴヌクレオチド結合ドメイン（ＯＢＤ）、及びＲｕｖＣ ＤＮＡ切断ドメインからなる群から選択される、請求項４６に記載のシステム。

【請求項48】

前記ＣａｓＸバリアントタンパク質が、ＨＮＨドメインを含まない、請求項４１～４７のいずれか一項に記載のシステム。

【請求項49】

前記ＣａｓＸバリアントタンパク質が、１つ以上の核局在化シグナル（ＮＬＳ）を更に含む、請求項４１～４８のいずれか一項に記載のシステム。

【請求項50】

前記１つ以上のＮＬＳが、ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号１６８）、ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫ（配列番号１６９）、ＰＡＡＫＲＶＫＬＤ（配列番号１７０）、ＲＱＲＲＮＥＬＫＲＳＰ（配列番号１７１）、ＮＱＳＳＮＦＧＰＭＫＧＧＮＦＧＧＲＳＳＧＰＹＧＧＧＧＱＹＦＡＫＰＲＮＱＧＧＹ（配列番号１７２）、ＲＭＲＩＺＦＫＮＫＧＫＤＴＡＥＬＲＲＲＲＶＥＶＳＶＥＬＲＫＡＫＫＤＥＱＩＬＫＲＲＮＶ（配列番号１７３）、ＶＳＲＫＲＰＲＰ（配列番号１７４）、ＰＰＫＫＡＲＥＤ（配列番号１７５）、ＰＱＰＫＫＫＰＬ（配列番号１７６）、ＳＡＬＩＫＫＫＫＫＭＡＰ（配列番号１７７）、ＤＲＬＲＲ（配列番号１７８）、ＰＫＱＫＫＲＫ（配列番号１７９）、ＲＫＬＫＫＫＩＫＫＬ（配列番号１８０）、ＲＥＫＫＫＦＬＫＲＲ（配列番号１８１）、ＫＲＫＧＤＥＶＤＧＶＤＥＶＡＫＫＫＳＫＫ（配列番号１８２）、ＲＫＣＬＱＡＧＭＮＬＥＡＲＫＴＫＫ（配列番号１８３）、ＰＲＰＲＫＩＰＲ（配列番号１８４）、ＰＰＲＫＫＲＴＶＶ（配列番号１８５）、ＮＬＳＫＫＫＫＲＫＲＥＫ（配列番号１８６）、ＲＲＰＳＲＰＦＲＫＰ（配列番号１８７）、ＫＲＰＲＳＰＳＳ（配列番号１８８）、ＫＲＧＩＮＤＲＮＦＷＲＧＥＮＥＲＫＴＲ（配列番号１８９）、ＰＲＰＰＫＭＡＲＹＤＮ（配列番号１９０）、ＫＲＳＦＳＫＡＦ（配列番号１９１）、ＫＬＫＩＫＲＰＶＫ（配列番号１９２）、ＰＫＫＫＲＫＶＰＰＰＰＡＡＫＲＶＫＬＤ（配列番号１９３）、ＰＫＴＲＲＲＰＲＲＳＱＲＫＲＰＰＴ（配列番号２６７９２）、ＳＲＲＲＫＡＮＰＴＫＬＳＥＮＡＫＫＬＡＫＥＶＥＮ（配列番号１９４）、ＫＴＲＲＲＰＲＲＳＱＲＫＲＰＰＴ（配列番号１９５）、ＲＲＫＫＲＲＰＲＲＫＫＲＲ（配列番号１９６）、ＰＫＫＫＳＲＫＰＫＫＫＳＲＫ（配列番号１９７）、ＨＫＫＫＨＰＤＡＳＶＮＦＳＥＦＳＫ（配列番号１９８）、ＱＲＰＧＰＹＤＲＰＱＲＰＧＰＹＤＲＰ（配列番号１９９）、ＬＳＰＳＬＳＰＬＬＳＰＳＬＳＰＬ（配列番号２００）、ＲＧＫＧＧＫＧＬＧＫＧＧＡＫＲＨＲＫ（配列番号２０１）、ＰＫＲＧＲＧＲＰＫＲＧＲＧＲ（配列番号２０２）、ＰＫＫＫＲＫＶＰＰＰＰＡＡＫＲＶＫＬＤ（配列番号２０３）、ＰＫＫＫＲＫＶＰＰＰＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号２０４）、ＰＡＫＲＡＲＲＧＹＫＣ（配列番号２７１９９）、ＫＬＧＰＲＫＡＴＧＲＷ（配列番号２７２００）、ＰＲＲＫＲＥＥ（配列番号２７２０１）、ＰＹＲＧＲＫＥ（配列番号２７２０２）、ＰＬＲＫＲＰＲＲ（配列番号２７２０３）、ＰＬＲＫＲＰＲＲＧＳＰＬＲＫＲＰＲＲ（配列番号２７２０４）、ＰＡＡＫＲＶＫＬＤＧＧＫＲＴＡＤＧＳＥＦＥＳＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号２７２０５）、ＰＡＡＫＲＶＫＬＤＧＧＫＲＴＡＤＧＳＥＦＥＳＰＫＫＫＲＫＶＧＩＨＧＶＰＡＡ（配列番号２７２０６）、ＰＡＡＫＲＶＫＬＤＧＧＫＲＴＡＤＧＳＥＦＥＳＰＫＫＫＲＫＶＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡ（配列番号２０７）、ＰＡＡＫＲＶＫＬＤＧＧＫＲＴＡＤＧＳＥＦＥＳＰＫＫＫＲＫＶＰＧ（配列番号２７２０８）、ＫＲＫＧＳＰＥＲＧＥＲＫＲＨＷ（配列番号２７２０９）、ＫＲＴＡＤＳＱＨＳＴＰＰＫＴＫＲＫＶＥＦＥＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号２７２１０）、及びＰＫＫＫＲＫＶＧＧＳＫＲＴＡＤＳＱＨＳＴＰＰＫＴＫＲＫＶＥＦＥＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号２７２１１）からなる配列の群から選択され、前記１つ以上のＮＬＳが、リンカーペプチドを用いて、前記ＣＲＩＳＰＲタンパク質又は隣接するＮＬＳに連結され、前記リンカーペプチドが、ＲＳ、（Ｇ）ｎ（配列番号２７２１２）、（ＧＳ）ｎ（配列番号２７２１３）、（ＧＳＧＧＳ）ｎ（配列番号２１４）、（ＧＧＳＧＧＳ）ｎ（配列番号２１５）、（ＧＧＧＳ）ｎ（配列番号２１６）、ＧＧＳＧ（配列番号２１７）、ＧＧＳＧＧ（配列番号２１８）、ＧＳＧＳＧ（配列番号２１９）、ＧＳＧＧＧ（配列番号２２０）、ＧＧＧＳＧ（配列番号２２１）、ＧＳＳＳＧ（配列番号２２２）、ＧＰＧＰ（配列番号２２３）、ＧＧＰ、ＰＰＰ、ＰＰＡＰＰＡ（配列番号２２４）、ＰＰＰＧ（配列番号２７２１４）、ＰＰＰＧＰＰＰ（配列番号２２５）、ＰＰＰ（ＧＧＧＳ）ｎ（配列番号２７２１５）、（ＧＧＧＳ）ｎＰＰＰ（配列番号２７２１６）、ＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡ（配列番号２７２１７）、及びＴＰＰＫＴＫＲＫＶＥＦＥ（配列番号２７２１８）（式中、ｎは１～５である）からなる群から選択される、請求項４９に記載のシステム。

【請求項51】

前記１つ以上のＮＬＳが、前記ＣａｓＸバリアントタンパク質のＣ末端又はその近傍に位置する、請求項４９又は請求項５０に記載のシステム。

【請求項52】

前記１つ以上のＮＬＳが、前記ＣａｓＸバリアントタンパク質のＮ末端又はその近傍に位置する、請求項４９又は請求項５０に記載のシステム。

【請求項53】

前記ＣａｓＸバリアントタンパク質のＮ末端又はその近傍及びＣ末端又はその近傍に位置する１つ以上のＮＬＳを含む、請求項４９又は請求項５０に記載のシステム。

【請求項54】

前記ＣａｓＸバリアントが、ガイド核酸（ｇＲＮＡ）とリボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）を形成することができる、請求項４１～５３のいずれか一項に記載のシステム。

【請求項55】

前記ＣａｓＸバリアントタンパク質及び前記ｇＲＮＡバリアントのＲＮＰが、配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の参照ＣａｓＸタンパク質及び配列番号４～１６のいずれか１つの配列を含むｇＲＮＡのＲＮＰと比較して、少なくとも１つ以上の改善された特徴を示す、請求項５４に記載のシステム。

【請求項56】

前記改善された特徴が、前記ＣａｓＸバリアントのフォールディングの改善、ガイド核酸（ｇＲＮＡ）に対する結合親和性の改善、標的ＤＮＡに対する結合親和性の改善、標的ＤＮＡの編集において、ＡＴＣ、ＣＴＣ、ＧＴＣ、又はＴＴＣを含むより広範囲の１つ以上のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列を利用する能力の改善、前記標的ＤＮＡの巻き戻しの改善、編集活性の増加、編集効率の改善、編集特異性の改善、ヌクレアーゼ活性の増加、標的核酸配列の切断速度の改善、二本鎖切断のための標的鎖装填の増加、一本鎖ニッキングのための標的鎖装填の減少、オフターゲット切断の減少、非標的ＤＮＡ鎖の結合の改善、タンパク質安定性の改善、タンパク質溶解度の改善、リボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）の形成の改善、より高い百分率割合の切断コンピテントＲＮＰ、タンパク質：ｇＲＮＡ複合体（ＲＮＰ）の安定性の改善、タンパク質：ｇＲＮＡ複合体の溶解度の改善、タンパク質収量の改善、タンパク質発現の改善、及び融合体特徴の改善、からなる群の１つ以上から選択される、請求項５５に記載のシステム。

【請求項57】

前記ＣａｓＸバリアントタンパク質及び前記ｇＲＮＡバリアントの前記ＲＮＰの前記改善された特徴が、配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の前記参照ＣａｓＸタンパク質及び配列番号４～１６のいずれか１つの配列を含む前記ｇＲＮＡの前記ＲＮＰと比較して、少なくとも約１．１～約１００倍又はそれ以上改善されている、請求項５５又は請求項５６に記載のシステム。

【請求項58】

前記ＣａｓＸバリアントタンパク質の前記改善された特徴が、配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の前記参照ＣａｓＸタンパク質及び配列番号４～１６のいずれか１つの配列を含む前記ｇＲＮＡと比較して、少なくとも約１．１倍、少なくとも約２倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１００倍、又はそれ以上改善されている、請求項５５又は請求項５６に記載のシステム。

【請求項59】

前記ＣａｓＸバリアントタンパク質の前記改善された特徴が、配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の前記参照ＣａｓＸタンパク質及び配列番号４～１６のいずれか１つの配列を含む前記ｇＮＡと比較して、少なくとも約１．１倍、少なくとも約２倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１００倍、又はそれ以上改善されている、請求項５５又は請求項５６に記載のシステム。

【請求項60】

前記改善された特徴が、編集効率を含み、前記ＣａｓＸバリアントタンパク質及び前記ｇＲＮＡバリアントの前記ＲＮＰが、配列番号２の前記参照ＣａｓＸタンパク質及び配列番号４～１６のいずれか１つの前記ｇＲＮＡの前記ＲＮＰと比較して、編集効率の１．１～１００倍の改善を含む、請求項５５～５９のいずれか一項に記載のシステム。

【請求項61】

前記ＰＡＭ配列ＴＴＣ、ＡＴＣ、ＧＴＣ、又はＣＴＣのいずれか１つが、細胞アッセイシステムにおいて前記ｇＲＮＡの前記標的化配列と同一性を有するプロトスペーサーの前記非標的鎖に対して１ヌクレオチド５’側に位置する場合、前記ＣａｓＸバリアント及び前記ｇＲＮＡバリアントを含む前記ＲＮＰが、比較アッセイシステムにおける参照ＣａｓＸタンパク質及び参照ｇＲＮＡを含むＲＮＰの編集効率及び／又は結合と比較して、より高い編集効率及び／又は標的核酸配列の結合を示す、請求項５４～５９のいずれか一項に記載のシステム。

【請求項62】

前記ＰＡＭ配列が、ＴＴＣである、請求項６１に記載のシステム。

【請求項63】

前記ｇＲＮＡの前記標的化配列が、配列番号１７９０４～２６７８９からなる群から選択される配列を含む、請求項６２に記載のシステム。

【請求項64】

前記ＰＡＭ配列が、ＡＴＣである、請求項６１に記載のシステム。

【請求項65】

前記ｇＲＮＡの前記標的化配列が、配列番号２７２～２１００及び２２８６～５６２５からなる群から選択される配列を含む、請求項６４に記載のシステム。

【請求項66】

前記ＰＡＭ配列が、ＣＴＣである、請求項６１に記載のシステム。

【請求項67】

前記ｇＲＮＡの前記標的化配列が、配列番号５６２６～１３６１６からなる群から選択される配列を含む、請求項６６に記載のシステム。

【請求項68】

前記ＰＡＭ配列が、ＧＴＣである、請求項６１に記載のシステム。

【請求項69】

前記ｇＲＮＡの前記標的化配列が、配列番号１３６１７～１７９０３からなる群から選択される配列を含む、請求項６６に記載のシステム。

【請求項70】

前記１つ以上のＰＡＭ配列に対する増加した前記結合親和性が、配列番号１～３の前記参照ＣａｓＸタンパク質のいずれか１つの前記ＰＡＭ配列に対する前記結合親和性と比較して、少なくとも１．５倍大きい、請求項６１～６８のいずれか一項に記載のシステム。

【請求項71】

前記ＲＮＰが、前記参照ＣａｓＸタンパク質及び配列番号４～１６の前記ｇＲＮＡのＲＮＰと比較して、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、又は少なくとも２０％高い百分率割合の切断コンピテントＲＮＰを有する、請求項５４～７０のいずれか一項に記載のシステム。

【請求項72】

前記ＣａｓＸバリアントタンパク質が、ニッカーゼ活性を有するＲｕｖＣ ＤＮＡ切断ドメインを含む、請求項４１～７１のいずれか一項に記載のシステム。

【請求項73】

前記ＣａｓＸバリアントタンパク質が、二本鎖切断活性を有するＲｕｖＣ ＤＮＡ切断ドメインを含む、請求項４１～７１のいずれか一項に記載のシステム。

【請求項74】

前記ＣａｓＸタンパクが、触媒的に不活性なＣａｓＸ（ｄＣａｓＸ）タンパク質であり、前記ｄＣａｓＸ及び前記ｇＲＮＡが、前記ＢＣＬ１１Ａ標的核酸への結合能を保持している、請求項１～５４のいずれか一項に記載のシステム。

【請求項75】

前記ｄＣａｓＸが、残基：
ａ．配列番号１の前記ＣａｓＸタンパク質に対応するＤ６７２、Ｅ７６９、及び／若しくはＤ９３５、又は
ｂ．配列番号２の前記ＣａｓＸタンパク質に対応するＤ６５９、Ｅ７５６、及び／若しくはＤ９２２、に変異を含む、請求項７４に記載のシステム。

【請求項76】

前記変異が、前記残基のアラニンへの置換である、請求項７５に記載のシステム。

【請求項77】

ドナー鋳型核酸を更に含む、請求項１～７３のいずれか一項に記載のシステム。

【請求項78】

前記ドナー鋳型が、ＢＣＬ１１Ａエキソン、ＢＣＬ１１Ａイントロン、ＢＣＬ１１Ａイントロン－エキソン接合部、ＢＣＬ１１Ａ調節エレメント、及びＧＡＴＡ１結合部位配列からなる群から選択されるＢＣＬ１１Ａ遺伝子の少なくとも一部を含む核酸を含む、請求項７７に記載のシステム。

【請求項79】

前記ドナー鋳型の配列が、野生型ＢＣＬ１１Ａ遺伝子の対応する部分と比較して、１つ以上の変異を含む、請求項７８に記載のシステム。

【請求項80】

前記ドナー鋳型が、ＢＣＬ１１Ａエキソン１、ＢＣＬ１１Ａエキソン２、ＢＣＬ１１Ａエキソン３、ＢＣＬ１１Ａエキソン４、ＢＣＬ１１Ａエキソン５、ＢＣＬ１１Ａエキソン６、ＢＣＬ１１Ａエキソン７、ＢＣＬ１１Ａエキソン８、及びＢＣＬ１１Ａエキソン９からなる群から選択されるＢＣＬ１１Ａエキソンの少なくとも一部を含む核酸を含む、請求項７８又は請求項７９に記載のシステム。

【請求項81】

前記ドナー鋳型が、ＢＣＬ１１Ａエキソン１、ＢＣＬ１１Ａエキソン２、及びＢＣＬ１１Ａエキソン３からなる群から選択されるＢＣＬ１１Ａエキソンの少なくとも一部を含む核酸を含む、請求項８０に記載のシステム。

【請求項82】

前記ドナー鋳型のサイズが、１０～１５，０００ヌクレオチドの範囲である、請求項７７～８１のいずれか一項に記載のシステム。

【請求項83】

前記ドナー鋳型が、一本鎖ＤＮＡ鋳型又は一本鎖ＲＮＡ鋳型である、請求項７７～８２のいずれか一項に記載のシステム。

【請求項84】

前記ドナー鋳型が、二本鎖ＤＮＡ鋳型である、請求項７７～８２のいずれか一項に記載のシステム。

【請求項85】

前記ドナー鋳型が、前記クラス２ Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質によって導入される前記ＢＣＬ１１Ａ標的核酸における切断部位に隣接する配列に相補的である相同アームを、前記ドナー鋳型の５’末端及び３’末端又はその近傍に含む、請求項７７～８４のいずれか一項に記載のシステム。

【請求項86】

請求項７７～８５のいずれか一項に記載のドナー鋳型を含む、核酸。

【請求項87】

請求項４１～７６のいずれか一項に記載のＣａｓＸをコードする配列を含む、核酸。

【請求項88】

請求項１～４０のいずれか一項に記載のｇＲＮＡをコードする配列を含む、核酸。

【請求項89】

前記ＣａｓＸタンパク質をコードする前記配列が、真核細胞における発現のためにコドン最適化されている、請求項８７に記載の核酸。

【請求項90】

請求項１～４０のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ、請求項４１～７６のいずれか一項に記載のＣａｓＸタンパク質、又は請求項８６～８９のいずれか一項に記載の核酸を含む、ベクター。

【請求項91】

前記ベクターが、１つ以上のプロモーターを更に含む、請求項９０に記載のベクター。

【請求項92】

前記ベクターが、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ベクター、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）、ＣａｓＸ送達粒子（ＸＤＰ）、プラスミド、ミニサークル、ナノプラスミド、ＤＮＡベクター、及びＲＮＡベクターからなる群から選択される、請求項９０又は請求項９１に記載のベクター。

【請求項93】

前記ベクターが、ＡＡＶベクターである、請求項９２に記載のベクター。

【請求項94】

前記ＡＡＶベクターが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ－Ｒｈ７４、又はＡＡＶＲｈ１０から選択される、請求項９３に記載のベクター。

【請求項95】

前記ＡＡＶベクターが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ８、又はＡＡＶ９から選択される、請求項９４に記載のベクター。

【請求項96】

前記ＡＡＶベクターが、以下の成分：
ａ．５’ＩＴＲ、
ｂ．３’ＩＴＲ、及び
ｃ．導入遺伝子であって、第１のプロモーターに作動可能に連結された請求項８７に記載の核酸と、第２のプロモーターに作動可能に連結された請求項８８に記載の核酸と、を含む、導入遺伝子、を含む核酸を含む、請求項９４又は請求項９５に記載のベクター。

【請求項97】

前記核酸が、前記ＣａｓＸタンパク質をコードする前記配列の３’側にポリ（Ａ）配列を更に含む、請求項９６に記載のベクター。

【請求項98】

前記核酸が、１つ以上のエンハンサーエレメントを更に含む、請求項９６又は請求項９７に記載のベクター。

【請求項99】

単一のＡＡＶ粒子が、前記核酸を含有することができ、前記ＡＡＶ粒子が、標的細胞において標的核酸を形質導入し、効果的に改変するのに必要な全ての成分を有する、請求項９６～９８のいずれか一項に記載のベクター。

【請求項100】

前記ベクターが、レトロウイルスベクターである、請求項９２に記載のベクター。

【請求項101】

前記ベクターが、ｇａｇポリタンパク質の１つ以上の成分を含むＸＤＰである、請求項９２に記載のベクター。

【請求項102】

前記ｇａｇポリタンパク質の前記１つ以上の成分が、マトリックスタンパク質（ＭＡ）、ヌクレオカプシドタンパク質（ＮＣ）、カプシドタンパク質（ＣＡ）、ｐ１ペプチド、ｐ６ペプチド、Ｐ２Ａペプチド、Ｐ２Ｂペプチド、Ｐ１０ペプチド、ｐ１２ペプチド、ＰＰ２１／２４ペプチド、Ｐ１２／Ｐ３／Ｐ８ペプチド、及びＰ２０ペプチドからなる群から選択される、請求項１０１に記載のベクター。

【請求項103】

前記ＸＤＰが、前記ｇａｇポリタンパク質、前記ＣａｓＸバリアントタンパク質、及び前記ｇＲＮＡの前記１つ以上の成分を含む、請求項１０１又は請求項１０２に記載のベクター。

【請求項104】

前記ＣａｓＸバリアントタンパク質及び前記ｇＲＮＡが、ＲＮＰ中で一緒に会合している、請求項１０３に記載のベクター。

【請求項105】

前記ドナー鋳型を更に含む、請求項１０１～１０４のいずれか一項に記載のベクター。

【請求項106】

標的細胞への前記ＸＤＰの結合及び融合を提供する偽型ウイルスエンベロープ糖タンパク質又は抗体断片を更に含む、請求項１０１～１０４のいずれか一項に記載のベクター。

【請求項107】

前記標的細胞が、造血幹細胞（ＨＳＣ）、造血前駆細胞（ＨＰＣ）、ＣＤ３４＋細胞、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、胚性幹細胞（ＥＳ）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、骨髄系共通前駆細胞、前赤芽球細胞、及び赤芽球細胞からなる群から選択される、請求項１０６に記載のベクター。

【請求項108】

請求項９０～１０７のいずれか一項に記載のベクターを含む、宿主細胞。

【請求項109】

前記宿主細胞が、ベビーハムスター腎線維芽細胞（ＢＨＫ）細胞、ヒト胎児腎臓２９３（ＨＥＫ２９３）細胞、ヒト胎児腎臓２９３Ｔ（ＨＥＫ２９３Ｔ）細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ＹＯ骨髄腫細胞、Ｐ３Ｘ６３マウス骨髄腫細胞、ＰＥＲ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、ハイブリドーマ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＳＶ４０遺伝物質を有するＣＶ－１（サル）起源（ＣＯＳ）細胞、ＨｅＬａ、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、及び酵母細胞からなる群から選択される、請求項１０８に記載の宿主細胞。

【請求項110】

細胞集団においてＢＣＬ１１Ａ標的核酸配列を改変する方法であって、前記細胞集団に、
ａ．請求項１～８５のいずれか一項に記載のシステム、
ｂ．請求項８６～８９のいずれか一項に記載の核酸、
ｃ．請求項９０～１００のいずれか一項に記載のベクター、
ｄ．請求項１０１～１０７のいずれか一項に記載のＸＤＰ、又は
ｅ．（ａ）～（ｄ）のうちの２つ以上の組み合わせ、を導入することを含み、
前記第１のｇＲＮＡによって標的化される前記細胞の前記ＢＣＬ１１Ａ遺伝子の標的核酸配列が、前記前記ＣａｓＸバリアントタンパク質によって改変される、方法。

【請求項111】

前記改変することが、前記細胞集団の前記ＢＣＬ１１Ａ遺伝子の標的核酸配列に一本鎖切断を導入することを含む、請求項１１０に記載の方法。

【請求項112】

前記改変することが、前記細胞集団の前記ＢＣＬ１１Ａ遺伝子の標的核酸配列に二本鎖切断を導入することを含む、請求項１１０に記載の方法。

【請求項113】

第２のｇＲＮＡ又は前記第２のｇＲＮＡをコードする核酸を前記細胞集団に導入することを更に含み、前記第２のｇＲＮＡが、前記第１のｇＲＮＡと比較して、前記ＢＣＬ１１Ａ遺伝子の標的核酸の異なる部分又は重複する部分に相補的な標的化配列を有し、前記細胞集団の前記ＢＣＬ１１Ａ標的核酸における更なる切断をもたらす、請求項１１０～１１２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項114】

前記改変することが、前記細胞集団の前記ＢＣＬ１１Ａ遺伝子において１つ以上のヌクレオチドの挿入、欠失、置換、重複、又は逆位を導入することを含む、請求項１１０～１１３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項115】

前記標的核酸のＧＡＴＡ１結合部位配列が改変される、請求項１１０～１１４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項116】

前記方法が、前記細胞集団の前記ＢＣＬ１１Ａ遺伝子の標的核酸配列の前記切断部位への前記ドナー鋳型の挿入を含む、請求項１１０～１１３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項117】

前記ドナー鋳型の前記挿入が、相同組換え修復（ＨＤＲ）又は相同性非依存性標的化組み込み（ＨＩＴＩ）によって媒介される、請求項１１４に記載の方法。

【請求項118】

前記標的核酸の前記ＧＡＴＡ１結合部位配列が改変される、請求項１１６又は請求項１１７に記載の方法。

【請求項119】

前記ドナー鋳型の挿入が、前記細胞集団における前記ＢＣＬ１１Ａ遺伝子のノックダウン又はノックアウトをもたらす、請求項１１６～１１８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項120】

前記ＢＣＬ１１Ａタンパク質の発現が、前記ＢＣＬ１１Ａ遺伝子が改変されていない細胞と比較して、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、又は少なくとも約９０％減少するように、前記細胞集団の前記ＢＣＬ１１Ａ遺伝子が改変される、請求項１１０～１１９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項121】

前記改変された細胞の少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、又は少なくとも約９０％が検出可能なレベルのＢＣＬ１１Ａタンパク質を発現しないように、前記細胞集団の前記ＢＣＬ１１Ａ遺伝子が改変される、請求項１１０～１１９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項122】

前記細胞が、真核細胞である、請求項１１０～１２１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項123】

前記真核細胞が、げっ歯類細胞、マウス細胞、ラット細胞、及び非ヒト霊長類細胞からなる群から選択される、請求項１２２に記載の方法。

【請求項124】

前記真核細胞が、ヒト細胞である、請求項１２２に記載の方法。

【請求項125】

前記真核細胞が、造血幹細胞（ＨＳＣ）、造血前駆細胞（ＨＰＣ）、ＣＤ３４＋細胞、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、骨髄系共通前駆細胞、前赤芽球細胞、及び赤芽球細胞からなる群から選択される、請求項１２２～１２４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項126】

前記細胞集団の前記ＢＣＬ１１Ａ遺伝子の標的核酸配列の前記改変が、インビトロ又はエクスビボで起こる、請求項１１０～１２５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項127】

前記細胞集団の前記ＢＣＬ１１Ａ遺伝子の標的核酸配列の前記改変が、対象においてインビボで起こる、請求項１１０～１２５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項128】

前記対象が、げっ歯類、マウス、ラット、及び非ヒト霊長類からなる群から選択される、請求項１２７に記載の方法。

【請求項129】

前記対象が、ヒトである、請求項１２７に記載の方法。

【請求項130】

前記方法が、前記対象に治療有効用量の前記ＡＡＶベクターを投与することを含む、請求項１２７～１２９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項131】

前記ＡＡＶベクターが、少なくとも約１×１０^５ベクターゲノム／ｋｇ（ｖｇ／ｋｇ）、少なくとも約１×１０^６ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０^７ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０^８ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０^９ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０^１０ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０^１１ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０^１５ｖｇ／ｋｇ、又は少なくとも約１×１０^１６ｖｇ／ｋｇの用量で前記対象に投与される、請求項１３０に記載の方法。

【請求項132】

前記ＡＡＶベクターが、少なくとも約１×１０^５ｖｇ／ｋｇ～約１×１０^１６ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０^６ｖｇ／ｋｇ～約１×１０^１５ｖｇ／ｋｇ、又は少なくとも約１×１０^７ｖｇ／ｋｇ～約１×１０^１４ｖｇ／ｋｇの用量で前記対象に投与される、請求項１３０に記載の方法。

【請求項133】

前記方法が、治療有効用量のＸＤＰを前記対象に投与することを含む、請求項１２７～１２９のいずれか一項に記載に記載の方法。

【請求項134】

前記ＸＤＰが、少なくとも約１×１０^５粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０^６粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０^７粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０^８粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０^９粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０^１０粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０^１１粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０^１２粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０^１３粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０^１４粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０^１５粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０^１６粒子／ｋｇの用量で前記対象に投与される、請求項１３３に記載の方法。

【請求項135】

前記ＸＤＰが、少なくとも約１×１０^５粒子／ｋｇ～約１×１０^１６粒子／ｋｇ、又は少なくとも約１×１０^６粒子／ｋｇ～約１×１０^１５粒子／ｋｇ、又は少なくとも約１×１０^７粒子／ｋｇ～約１×１０^１４粒子／ｋｇの用量で前記対象に投与される、請求項１３３に記載の方法。

【請求項136】

前記ベクター又は前記ＸＤＰが、移植、局所注射、全身注入、又はそれらの組み合わせから選択される投与経路によって前記対象に投与される、請求項１２８～１３５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項137】

前記方法が、治療前の前記対象におけるヘモグロビンＦ（ＨｂＦ）のレベルと比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、又は少なくとも約５０％の前記対象の循環血液中のＨｂＦのレベルの増加をもたらす、請求項１２８～１３６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項138】

前記方法が、少なくとも０．０１：１．０、少なくとも０．０２５：１．０、少なくとも０．０５：１．０、少なくとも０．０７５：１．０、少なくとも０．１：１．０、少なくとも０．２：１．０、少なくとも０．３：１．０、少なくとも０．４：１．０、少なくとも０．５：１：０、少なくとも０．７５：１．０、少なくとも１．０：１．０、少なくとも１．２５：１．０、少なくとも１．５：１．０、又は少なくとも１．７５：１．０の前記対象の循環血液中のＨｂＦ対ヘモグロビンＳ（ＨｂＳ）の比をもたらす、実施形態１２８～１３７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項139】

前記方法が、前記対象の循環血液中の総ヘモグロビンの少なくとも約５％、又は少なくとも約１０％、又は少なくとも約２０％、又は少なくとも約３０％のＨｂＦレベルをもたらす、請求項１２８～１３８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項140】

前記細胞集団の前記ＢＣＬ１１Ａ遺伝子の標的核酸配列を、
ａ．前記第１のｇＲＮＡと比較して、前記ＢＣＬ１１Ａ標的核酸の異なる部分若しくは重複する部分を標的化する追加のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ及びｇＲＮＡ、
ｂ．（ａ）の前記追加のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ及び前記ｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチド、
ｃ．（ｂ）の前記ポリヌクレオチドを含むベクター、又は
ｄ．（ａ）の前記追加のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ及び前記ｇＲＮＡを含むＸＤＰ、と接触させることを更に含み、
前記接触させることが、前記第１のｇＲＮＡによって標的化される前記配列と比較して、前記配列における異なる位置で前記ＢＣＬ１１Ａ遺伝子の改変をもたらす、実施形態１１０～１３９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項141】

前記追加のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼが、請求項１～１４０のいずれか一項に記載のＣａｓＸタンパク質とは異なる配列を有するＣａｓＸタンパク質である、請求項１４０に記載の方法。

【請求項142】

前記追加のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼが、ＣａｓＸタンパク質ではない、請求項１４０に記載の方法。

【請求項143】

前記追加のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼが、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｃ、Ｃａｓ１２ｄ（ＣａｓＹ）、Ｃａｓ１２ｊ、Ｃａｓ１２ｋ、Ｃａｓ１３ａ、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃ、Ｃａｓ１３ｄ、Ｃａｓ１４、Ｃｐｆｌ、Ｃ２ｃｌ、Ｃｓｎ２、及びそれらの配列バリアントからなる群から選択される、請求項１４２に記載の方法。

【請求項144】

請求項１１０～１４３のいずれか一項に記載の方法によって改変された細胞集団であって、前記改変された細胞の少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％が検出可能なレベルのＢＣＬ１１Ａタンパク質を発現しないように、前記細胞が改変されている、細胞集団。

【請求項145】

ＢＣＬ１１Ａタンパク質の前記発現が、前記ＢＣＬ１１Ａ遺伝子が改変されていない細胞と比較して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％減少するように、前記細胞が改変されている、請求項１１０～１４３のいずれか一項に記載の方法によって改変された細胞集団。

【請求項146】

異常ヘモグロビン症の治療を必要とする対象においてそれを行う方法であって、治療有効量の請求項１４４又は請求項１４５に記載の細胞を前記対象に投与することを含む、方法。

【請求項147】

前記異常ヘモグロビン症が、鎌状赤血球症又はβサラセミアである、請求項１４６に記載の方法。

【請求項148】

前記細胞が、前記細胞を投与される前記対象に対して自己由来である、請求項１４６又は請求項１４７に記載の方法。

【請求項149】

前記細胞が、前記細胞を投与される前記対象に対して同種である、請求項１４６又は請求項１４７に記載の方法。

【請求項150】

前記細胞又はその子孫が、前記対象への前記改変された細胞の投与後、前記対象において、少なくとも１ヶ月間、２ヶ月間、３ヶ月間、４ヶ月間、５ヶ月間、６ヶ月間、７ヶ月間、８ヶ月間、９ヶ月間、１０ヶ月間、１１ヶ月間、１２ヶ月間、１３ヶ月間、１４ヶ月間、１５ヶ月間、１６ヶ月間、１７ヶ月間、１８ヶ月間、１９ヶ月間、２０ヶ月間、２１ヶ月間、２２ヶ月間、２３ヶ月間、２年間、３年間、４年間、又は５年間存続する、請求項１４６～１４９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項151】

前記方法が、治療前の前記対象におけるヘモグロビンＦ（ＨｂＦ）のレベルと比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、又は少なくとも約５０％の循環血液中のＨｂＦのレベルの増加をもたらす、請求項１４６～１５０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項152】

前記方法が、少なくとも０．０１：１．０、少なくとも０．０２５：１．０、少なくとも０．０５：１．０、少なくとも０．０７５：１．０、少なくとも０．１：１．０、少なくとも０．２：１．０、少なくとも０．３：１．０、少なくとも０．４：１．０、少なくとも０．５：１：０、少なくとも０．７５：１．０、少なくとも１．０：１．０、少なくとも１．２５：１．０、少なくとも１．５：１．０、又は少なくとも１．７５：１．０の前記対象におけるＨｂＦ対ヘモグロビンＳ（ＨｂＳ）の比をもたらす、実施形態１４６～１５０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項153】

前記方法が、前記対象における総循環ヘモグロビンの少なくとも約５％、又は少なくとも約１０％、又は少なくとも約２０％、又は少なくとも約３０％のＨｂＦレベルをもたらす、請求項１４６～１５０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項154】

前記対象が、げっ歯類、マウス、ラット、及び非ヒト霊長類からなる群から選択される、請求項１４６～１５３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項155】

前記対象が、ヒトである、請求項１４６～１５３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項156】

異常ヘモグロビン症の治療を必要とする対象においてそれを行う方法であって、前記対象の細胞においてＢＣＬ１１Ａ遺伝子を改変することを含み、前記改変することが、前記細胞を、治療有効用量の
ａ．請求項１～８５のいずれか一項に記載のシステム、
ｂ．請求項８６～８９のいずれか一項に記載の核酸、
ｃ．請求項９０～１００のいずれか一項に記載のベクター、
ｄ．請求項１０１～１０４のいずれか一項に記載のＸＤＰ、又は
ｅ．（ａ）～（ｄ）のうちの２つ以上の組み合わせ、と接触させることを含み、
前記第１のｇＲＮＡによって標的化される前記細胞の前記ＢＣＬ１１Ａ遺伝子が、前記ＣａｓＸタンパク質によって改変される、方法。

【請求項157】

前記異常ヘモグロビン症が、鎌状赤血球症又はβサラセミアである、請求項１５６に記載の方法。

【請求項158】

前記細胞が、造血幹細胞（ＨＳＣ）、造血前駆細胞（ＨＰＣ）、ＣＤ３４＋細胞、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、骨髄系共通前駆細胞、前赤芽球細胞、及び赤芽球細胞からなる群から選択される、請求項１５６又は請求項１５７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項159】

前記改変することが、前記細胞の前記ＢＣＬ１１Ａ遺伝子において一本鎖切断を導入することを含む、請求項１５６～１５８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項160】

前記改変することが、前記細胞の前記ＢＣＬ１１Ａ遺伝子において二本鎖切断を導入することを含む、請求項１５６～１５８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項161】

第２のｇＲＮＡ又は前記第２のｇＲＮＡをコードする核酸を前記対象の前記細胞に導入することを更に含み、前記第２のｇＲＮＡが、前記第１のｇＲＮＡと比較して、前記標的核酸の異なる部分又は重複する部分に相補的な標的化配列を有し、前記対象の前記細胞の前記ＢＣＬ１１Ａ標的核酸における更なる切断をもたらす、請求項１５６～１６０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項162】

前記改変することが、前記細胞の前記ＢＣＬ１１Ａ遺伝子において１つ以上のヌクレオチドの挿入、欠失、置換、重複、又は逆位を導入することを含む、請求項１５６～１６１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項163】

前記改変することが、前記対象の前記改変された細胞における前記ＢＣＬ１１Ａ遺伝子のノックダウン又はノックアウトをもたらす、請求項１６２記載の方法。

【請求項164】

前記改変された細胞による前記ＢＣＬ１１Ａタンパク質の発現が、改変されていない細胞と比較して、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、又は少なくとも約９０％減少するように、前記細胞の前記ＢＣＬ１１Ａ遺伝子が改変される、請求項１５６～１６３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項165】

前記改変された細胞の少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％が検出可能なレベルのＢＣＬ１１Ａタンパク質を発現しないように、前記対象の前記細胞の前記ＢＣＬ１１Ａ遺伝子が改変される、請求項１５６～１６３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項166】

前記方法が、治療前の前記対象におけるヘモグロビンＦ（ＨｂＦ）のレベルと比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、又は少なくとも約５０％の前記対象の循環血液中のＨｂＦのレベルの増加をもたらす、請求項１５６～１６５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項167】

前記方法が、少なくとも０．０１：１．０、少なくとも０．０２５：１．０、少なくとも０．０５：１．０、少なくとも０．０７５：１．０、少なくとも０．１：１．０、少なくとも０．２：１．０、少なくとも０．３：１．０、少なくとも０．４：１．０、少なくとも０．５：１：０、少なくとも０．７５：１．０、少なくとも１．０：１．０、少なくとも１．２５：１．０、少なくとも１．５：１．０、又は少なくとも１．７５：１．０の前記対象の循環血液中のＨｂＦ対ヘモグロビンＳ（ＨｂＳ）の比をもたらす、実施形態１３７～１４７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項168】

前記方法が、前記対象の循環血液中の総ヘモグロビンの少なくとも約５％、又は少なくとも約１０％、又は少なくとも約２０％、又は少なくとも約３０％のＨｂＦレベルをもたらす、請求項１５６～１６５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項169】

前記方法が、前記細胞の前記ＢＣＬ１１Ａ遺伝子の標的核酸配列の前記切断部位への前記ドナー鋳型の挿入を含む、請求項１５６～１６１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項170】

前記ドナー鋳型の前記挿入が、相同組換え修復（ＨＤＲ）又は相同性非依存性標的化組み込み（ＨＩＴＩ）によって媒介される、請求項１６８に記載の方法。

【請求項171】

前記ドナー鋳型の前記挿入が、前記対象の前記改変された細胞において前記ＢＣＬ１１Ａ遺伝子のノックダウン又はノックアウトをもたらす、請求項１６８又は請求項１７０に記載の方法。

【請求項172】

前記改変された細胞による前記ＢＣＬ１１Ａタンパク質の発現が、改変されていない細胞と比較して、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、又は少なくとも約９０％減少するように、前記細胞の前記ＢＣＬ１１Ａ遺伝子が改変される、請求項１６６～１７１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項173】

前記改変された細胞の少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％が検出可能なレベルのＢＣＬ１１Ａタンパク質を発現しないように、前記対象の前記細胞の前記ＢＣＬ１１Ａ遺伝子が改変される、請求項１６６～１７１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項174】

前記方法が、治療前の前記対象におけるヘモグロビンＦ（ＨｂＦ）のレベルと比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、又は少なくとも約５０％の前記対象の循環血液中のＨｂＦのレベルの増加をもたらす、請求項１６６～１７３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項175】

前記方法が、少なくとも０．０１：１．０、少なくとも０．０２５：１．０、少なくとも０．０５：１．０、少なくとも０．０７５：１．０、少なくとも０．１：１．０、少なくとも０．２：１．０、少なくとも０．３：１．０、少なくとも０．４：１．０、少なくとも０．５：１：０、少なくとも０．７５：１．０、少なくとも１．０：１．０、少なくとも１．２５：１．０、少なくとも１．５：１．０、又は少なくとも１．７５：１．０の前記対象の循環血液中のＨｂＦ対ヘモグロビンＳ（ＨｂＳ）の比をもたらす、請求項１６６～１７３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項176】

前記方法が、前記対象の循環血液中の総ヘモグロビンの少なくとも約５％、又は少なくとも約１０％、又は少なくとも約２０％、又は少なくとも約３０％のＨｂＦレベルをもたらす、請求項１６６～１７３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項177】

前記対象が、げっ歯類、マウス、ラット、及び非ヒト霊長類からなる群から選択される、請求項１５６～１７５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項178】

前記対象が、ヒトである、請求項１５６～１７５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項179】

前記ベクターが、ＡＡＶであり、少なくとも約１×１０^５ベクターゲノム／ｋｇ（ｖｇ／ｋｇ）、少なくとも約１×１０^６ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０^７ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０^８ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０^９ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０^１０ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０^１１ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０^１５ｖｇ／ｋｇ、又は少なくとも約１×１０^１６ｖｇ／ｋｇの用量で前記対象に投与される、請求項１５６～１７８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項180】

前記ベクターが、ＡＡＶであり、少なくとも約１×１０^５ｖｇ／ｋｇ～約１×１０^１６ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０^６ｖｇ／ｋｇ～約１×１０^１５ｖｇ／ｋｇ、又は少なくとも約１×１０^７ｖｇ／ｋｇ～約１×１０^１４ｖｇ／ｋｇの用量で前記対象に投与される、請求項１５６～１７８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項181】

前記ＸＤＰが、少なくとも約１×１０^５粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０^６粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０^７粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０^８粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０^９粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０^１０粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０^１１粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０^１２粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０^１３粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０^１４粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０^１５粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０^１６粒子／ｋｇの用量で前記対象に投与される、請求項１５６～１７８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項182】

前記ＸＤＰが、少なくとも約１×１０^５粒子／ｋｇ～約１×１０^１６粒子／ｋｇ、又は少なくとも約１×１０^６粒子／ｋｇ～約１×１０^１５粒子／ｋｇ、又は少なくとも約１×１０^７粒子／ｋｇ～約１×１０^１４粒子／ｋｇの用量で前記対象に投与される、請求項１５６～１７８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項183】

前記ベクター又は前記ＸＤＰが、実質内、静脈内、動脈内、腹腔内（intraperitoneal）、嚢内、皮下、筋肉内、腹腔内（intraabdominally）、又はそれらの組み合わせから選択される投与経路によって前記対象に投与され、前記投与方法が、注射、輸血、又は移植である、請求項１５６～１８２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項184】

前記方法が、前記対象における少なくとも１つの臨床的に関連するエンドポイントの改善をもたらす、請求項１５６～１８３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項185】

前記方法が、末端臓器疾患の発生、アルブミン尿、高血圧、衰弱状態、低張尿、拡張機能障害、機能的な運動能力、急性冠症候群、疼痛事象、疼痛重篤度、貧血症、溶血、組織低酸素症、臓器機能障害、異常なヘマトクリット値、小児死亡率、脳卒中の発生率、ベースラインと比較したヘモグロビンレベル、ＨｂＦレベル、肺塞栓症の発生率の低下、血管閉塞危機の発生率、赤血球中のヘモグロビンＳの濃度、入院率、肝臓鉄濃度、必要な輸血、及び生活の質スコアからなる群から選択される少なくとも１つの臨床的に関連するパラメータの改善をもたらす、請求項１８４に記載の方法。

【請求項186】

前記方法が、末端臓器疾患の発生、アルブミン尿、高血圧、衰弱状態、低張尿、拡張機能障害、機能的な運動能力、急性冠症候群、疼痛事象、疼痛重篤度、貧血症、溶血、組織低酸素症、臓器機能障害、異常なヘマトクリット値、小児死亡率、脳卒中の発生率、ベースラインと比較したヘモグロビンレベル、ＨｂＦレベル、肺塞栓症の発生率の低下、血管閉塞危機の発生率、赤血球中のヘモグロビンＳの濃度、入院率、肝臓鉄濃度、必要な輸血、及び生活の質スコアからなる群から選択される少なくとも２つの臨床的に関連するパラメータの改善をもたらす、請求項１８４に記載の方法。

【請求項187】

異常ヘモグロビン症を有する対象を治療するための方法であって、
ａ．対象から人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）又は造血幹細胞（ＨＳＣ）を単離することと、
ｂ．請求項１１０～１２６のいずれか一項に記載の方法によって、前記ｉＰＳＣ又は前記ＨＳＣの前記ＢＣＬ１１Ａ標的核酸を改変することと、
ｃ．前記改変されたｉＰＳＣ又はＨＳＣを造血前駆細胞に分化させることと、
ｄ．前記異常ヘモグロビン症を有する前記対象に前記造血前駆細胞を移植することと、を含み、
前記方法が、治療前の前記対象におけるヘモグロビンＦ（ＨｂＦ）のレベルと比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、又は少なくとも約５０％の前記対象の循環血液中のＨｂＦのレベルの増加をもたらす、方法。

【請求項188】

前記ｉＰＳＣ又は前記ＨＳＣが、自己由来であり、前記対象の骨髄又は末梢血から単離される、請求項１８７に記載の方法。

【請求項189】

前記ｉＰＳＣ又は前記ＨＳＣが、同種であり、異なる対象の骨髄又は末梢血から単離される、請求項１８７に記載の方法。

【請求項190】

前記移植することが、移植、局所注射、全身注入、又はそれらの組み合わせによって前記対象に前記造血前駆細胞を投与することを含む、請求項１８７～１８９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項191】

前記異常ヘモグロビン症が、鎌状赤血球症又はβサラセミアである、請求項１８７～１９０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項192】

ゲノム編集によって対象において胎児型ヘモグロビン（ＨｂＦ）を増加させる方法であって、
ａ．有効用量の請求項９０～１００のいずれか一項に記載のベクター又は請求項１０１～１０７のいずれか一項に記載のＸＤＰを前記対象に投与することであって、前記ベクター又は前記ＸＤＰが、前記対象の細胞に、ＣａｓＸ：ｇＲＮＡシステムを送達する、投与することと、
ｂ．前記対象の細胞の前記ＢＣＬ１１Ａ標的核酸が、前記第１のｇＲＮＡによって標的化される前記ＣａｓＸによって編集されることと、
ｃ．ＢＣＬ１１Ａタンパク質の発現が低減又は排除されるように、前記編集することが、前記標的核酸配列において１つ以上のヌクレオチドの挿入、欠失、置換、重複、又は逆位を導入することを含むことと、を含み、
前記方法が、治療前の前記対象におけるヘモグロビンＦ（ＨｂＦ）のレベルと比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、又は少なくとも約５０％の前記対象の循環血液中のＨｂＦのレベルの増加をもたらす、方法。

【請求項193】

前記方法が、少なくとも０．０１：１．０、少なくとも０．０２５：１．０、少なくとも０．０５：１．０、少なくとも０．０７５：１．０、少なくとも０．１：１．０、少なくとも０．２：１．０、少なくとも０．３：１．０、少なくとも０．４：１．０、少なくとも０．５：１：０、少なくとも０．７５：１．０、少なくとも１．０：１．０、少なくとも１．２５：１．０、少なくとも１．５：１．０、又は少なくとも１．７５：１．０の前記対象におけるＨｂＦ対ヘモグロビンＳ（ＨｂＳ）の比をもたらす、請求項１９２に記載の方法。

【請求項194】

前記方法が、前記対象における総循環ヘモグロビンの少なくとも約５％、又は少なくとも約１０％、又は少なくとも約２０％、又は少なくとも約３０％のＨｂＦレベルをもたらす、請求項１９２又は請求項１９３に記載の方法。

【請求項195】

前記細胞が、造血幹細胞（ＨＳＣ）、造血前駆細胞（ＨＰＣ）、ＣＤ３４＋細胞、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、骨髄系共通前駆細胞、前赤芽球細胞、及び赤芽球細胞からなる群から選択される、請求項１９２～１９４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項196】

前記ＢＣＬ１１Ａタンパク質の発現が、編集されていない細胞の標的核酸と比較して、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、又は少なくとも約９０％減少するように、前記細胞の前記標的核酸が編集されている、請求項１９２～１９５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項197】

前記対象が、マウス、ラット、ブタ、及び非ヒト霊長類からなる群から選択される、請求項１９２～１９６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項198】

前記対象が、ヒトである、請求項１９２～１９６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項199】

前記ベクターが、少なくとも約１×１０^５ベクターゲノム／ｋｇ（ｖｇ／ｋｇ）、少なくとも約１×１０^６ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０^７ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０^８ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０^９ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０^１０ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０^１１ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０^１５ｖｇ／ｋｇ、又は少なくとも約１×１０^１６ｖｇ／ｋｇの用量で投与される、請求項１９２～１９８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項200】

前記ＸＤＰが、少なくとも約１×１０^５粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０^６粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０^７粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０^８粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０^９粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０^１０粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０^１１粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０^１２粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０^１３粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０^１４粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０^１５粒子／ｋｇ、又は少なくとも約１×１０^１６粒子／ｋｇの用量で投与される、請求項１９２～１９８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項201】

前記ベクター又は前記ＸＤＰが、移植、局所注射、全身注入、又はそれらの組み合わせから選択される投与経路によって投与される、請求項１９２～２００のいずれか一項に記載の方法。

【請求項202】

異常ヘモグロビン症の前記治療のための医薬品として使用するための、請求項１～８５のいずれか一項に記載のシステム、請求項８６～８９のいずれか一項に記載の核酸、９０～９５のいずれか一項に記載のベクター、請求項１０１～１０４のいずれか一項に記載のＸＤＰ、請求項１０８若しくは請求項１０９に記載の宿主細胞、又は請求項１４４若しくは請求項１４５に記載の細胞集団。

【請求項203】

前記標的核酸配列が、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列の１ヌクレオチド３’側に位置する非標的鎖配列に相補的である、請求項１に記載のシステム。

【請求項204】

前記ＰＡＭ配列が、ＴＣモチーフを含む、請求項２０３に記載のシステム。

【請求項205】

前記ＰＡＭ配列が、ＡＴＣ、ＧＴＣ、ＣＴＣ、又はＴＴＣを含む、請求項２０４に記載のシステム。

【請求項206】

前記クラス２ Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質が、ＲｕｖＣドメインを含む、請求項２０３～２０５のいずれか一項に記載のシステム。

【請求項207】

前記ＲｕｖＣドメインが、前記標的核酸配列においてずれた二本鎖切断を生成する、請求項２０６に記載のシステム。

【請求項208】

前記クラス２ Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質が、ＨＮＨヌクレアーゼドメインを含まない、請求項２０３～２０７のいずれか一項に記載のシステム。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願に対する相互参照
本出願は、２０２０年１２月３日に出願された、米国仮特許出願第６３／１２００２３３，８８５号の優先権を主張し、その内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に援用される。

【0002】

配列表の参照による援用
本出願はＥＦＳ－Ｗｅｂを介して提出されたＡＳＣＩＩ形式の配列表を含み、その全体が参照により本明細書に援用される。当該ＡＳＣＩＩコピーは、２０２１年１２月１日に作成され、名前が、ＳＣＲＢ＿０３０＿０１ＷＯ＿ＳｅｑＬｉｓｔ＿ＳＴ２５．ｔｘｔであり、ファイルサイズが、８．７８ＭＢである。

【背景技術】

【0003】

胎児型ヘモグロビン（同様にヘモグロビンＦ、ＨｂＦ、又はα２γ２）は、ヒト胎児における主要な酸素キャリアタンパク質である。ＨｂＦは、ヘモグロビンの成人形態とは異なる組成を有し、成人形態よりも強く酸素に結合することを可能にし、発育中の胎児が母親の血流から酸素を回収することを可能にする。ＨｂＦは、２つの成体α－グロビンポリペプチドと２つの胎児β様γ－グロビンポリペプチドとの四量体である。妊娠中、複製されたγ－グロビン遺伝子は、β－グロビンクラスターにおいて転写される主な遺伝子を構成する。出生後、γ－グロビンは、成体β－グロビンによって置換され、このプロセスは、「胎児スイッチ（fetal switch）」と呼ばれ、ＢＣＬ１１Ａ（ＨｂＦサイレンシングの調節因子）の発現を伴うプロセスである（Ｓａｎｋａｒａｎ，Ｖ．Ｇ．，ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍａｎ Ｆｅｔａｌ Ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｉｓ Ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｂｙ ｔｈｅ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｓｔａｇｅ－Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ ＢＣＬ１１Ａ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２２（５９０９）：１８３９－１８４２（２００８）、Ｌｉｕ，Ｎ．，ｅｔ ａｌ．Ｄｉｒｅｃｔ Ｐｒｏｍｏｔｅｒ Ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ ｂｙ ＢＣＬ１１Ａ Ｃｏｎｔｒｏｌｓ ｔｈｅ Ｆｅｔａｌ ｔｏ Ａｄｕｌｔ Ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ Ｓｗｉｔｃｈ．Ｃｅｌｌ １７３（２）：４３０（２０１８））。健康な成人では、ヘモグロビンの組成は、ヘモグロビンＡ（約９７％）、ヘモグロビンＡ２（２．２～３．５％）、及びヘモグロビンＦ（＜１％）である（Ｔｈｏｍａｓ，Ｃ ａｎｄ Ｌｕｍｂ，Ａ．Ｂ．Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｈａｅｍｏｇｌｏｂｉｎ．Ｃｏｎｔｉｎｕｉｎｇ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ ｉｎ Ａｎａｅｓｔｈｅｓｉａ Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｃａｒｅ＆Ｐａｉｎ．１２（５）：２５１－２５６（２０１２））。

【0004】

異常ヘモグロビン症は、ほとんどの場合、常染色体共優性形質として遺伝する遺伝性単一遺伝子障害である。一般的な異常ヘモグロビン症としては、鎌状赤血球症並びにαサラセミア及びβサラセミアが挙げられる。異常ヘモグロビン症は、アフリカ、地中海沿岸、及び東南アジアの人々において最も一般的である。鎌状赤血球貧血を含むほとんどの異常ヘモグロビン症は、単にグロビンタンパク質自体の構造的異常である。鎌状赤血球貧血は、β－グロビン構造遺伝子ＨＢＢにおける点変異から生じ、異常ヘモグロビン（ＨｂＳ）の産生をもたらし、血液の酸素運搬能力の低下をもたらす。サラセミアは、対照的に、通常、正常なグロビンタンパク質の産生不足をもたらし、多くの場合、調節遺伝子における変異を介して、成体型ヘモグロビン（ＨｂＡ）の欠乏又は不在をもたらす。βサラセミアでは、β－グロビンが欠損しており、γ－グロビンの発現の増加は、この状態における貧血の病態生理の根底にあるα－グロビン鎖とβ－グロビン鎖の不均衡を減少させる（Ｌｉｕ，Ｎ．，ｅｔ ａｌ．Ｄｉｒｅｃｔ Ｐｒｏｍｏｔｅｒ Ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ ｂｙ ＢＣＬ１１Ａ Ｃｏｎｔｒｏｌｓ ｔｈｅ Ｆｅｔａｌ ｔｏ Ａｄｕｌｔ Ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ Ｓｗｉｔｃｈ．Ｃｅｌｌ １７３（２）：４３０（２０１８））。鎌状赤血球症及びサラセミアの両方が、貧血を引き起こし得る。

【0005】

Ｂ細胞リンパ腫／白血病１１Ａ（B-cell lymphoma/leukemia 11A、ＢＣＬ１１Ａ）は、ヒトにおいてＢＣＬ１１Ａ遺伝子によってコードされるタンパク質である。造血細胞の分化の間、この遺伝子は下方調節され、胎児型ヘモグロビン産生の抑制において役割を果たすことが見出されている。ＢＣＬ１１Ａは、γサブユニットをコードする遺伝子にそのプロモーター領域で結合することによる、ヘモグロビンＦ産生の主要なリプレッサータンパク質である（Ｓａｎｋａｒａｎ ＶＧ，ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍａｎ ｆｅｔａｌ ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｓ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｓｔａｇｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ ＢＣＬ１１Ａ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２２：１８３９（２００８））。増加したγ－グロビンは、β－グロビンの変異又は発現の減少によって引き起こされるβ－異常ヘモグロビン症、鎌状赤血球症、及びβサラセミアの臨床重症度をそれぞれ減少させるので、γ－グロビンの発現を残りの約１％の胎児型ヘモグロビンを超えて増加させるためのＢＣＬ１１Ａの遺伝子編集が、異常ヘモグロビン症を有する成人における魅力的な治療戦略として提案されている（Ｓｍｉｔｈ，Ｅ．Ｃ．，ｅｔ ａｌ．Ｓｔｒｉｃｔ ｉｎ ｖｉｖｏ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｂｃｌ１１ａ ｅｒｙｔｈｒｏｉｄ ｅｎｈａｎｃｅｒ．Ｂｌｏｏｄ １２８（１９）：２３３８（２０１６））。

【0006】

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの出現及びこれらの最小システムのプログラム可能な性質は、ゲノム操作及びエンジニアリングのための多用途技術としてのそれらの使用を容易にした。今日まで、異常ヘモグロビン症の治療のためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの使用は、エクスビボでの細胞の編集、それに続く、根底にある異常ヘモグロビン症に罹患している対象への移植に限定されてきた。したがって、これらの疾患を有する対象において、インビボで直接的なγ－グロビン遺伝子プロモーターの抑制を低減するために、ＢＣＬ１１Ａを調節する組成物及び方法が必要とされている。この必要性に対処するために、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子を標的化するための組成物及び方法が本明細書に提供される。

【発明の概要】

【0007】

本開示は、細胞においてＢＣＬ１１Ａ遺伝子を含む標的核酸を改変するために使用される、改変されたクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質及びガイド核酸の組成物に関する。クラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質及びガイド核酸は、標的細胞に受動的に侵入するように改変される。クラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質及びガイド核酸は、ＢＣＬ１１Ａ関連疾患の標的核酸を改変するための様々な方法において有用であり、この方法も提供される。

【0008】

一態様では、本開示は、β異常ヘモグロビン症関連疾患を有する対象においてＢＣＬ１１Ａ遺伝子産物の発現を低減又は排除するための、ＣａｓＸ：ガイド核酸システム（ＣａｓＸ：ｇＲＮＡシステム）及びＢＣＬ１１Ａ遺伝子をノックダウン又はノックアウトするために使用される方法に関する。

【0009】

いくつかの実施形態では、ＣａｓＸ：ｇＲＮＡシステムのｇＲＮＡは、ｇＲＮＡ、又はＲＮＡとＤＮＡとのキメラであり、単一分子ｇＲＮＡ又は二種分子ｇＲＮＡであり得る。他の実施形態では、ＣａｓＸ：ｇＲＮＡシステムのｇＲＮＡは、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子内の領域を含む標的核酸配列に相補的な標的化配列を有する。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡの標的化配列は、配列番号２７２～２１００及び２２８６～２６７８９、又はそれと少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、若しくは少なくとも約９５％の同一性を有する配列からなる群から選択される。ｇＲＮＡは、１５～２０個の連続したヌクレオチドを含む標的化配列を含むことができる。他の実施形態では、ｇＲＮＡの標的化配列は、２０ヌクレオチドからなる。他の実施形態では、標的化配列は、１９ヌクレオチドからなる。他の実施形態では、標的化配列は、１８ヌクレオチドからなる。他の実施形態では、標的化配列は、１７ヌクレオチドからなる。他の実施形態では、標的化配列は、１６ヌクレオチドからなる。他の実施形態では、標的化配列は、１５ヌクレオチドからなる。他の実施形態では、ｇＲＮＡの標的化配列は、配列番号２７２～２１００及び２２８６～２６７８９からなる群から選択される配列を有する。他の実施形態では、ｇＲＮＡの標的化配列は、配列番号２７２～２１００及び２２８６～２６７８９からなる群から選択される配列を有し、配列の３’末端から単一のヌクレオチドが除去されている。他の実施形態では、標的化配列は、１８ヌクレオチドからなり、配列番号２７２～２１００及び２２８６～２６７８９からなる群から選択される配列を有し、２つのヌクレオチドが配列の３’末端から除去されている。他の実施形態では、標的化配列は、１７ヌクレオチドからなり、配列番号２７２～２１００及び２２８６～２６７８９からなる群から選択される配列を有し、３つのヌクレオチドが配列の３’末端から除去されている。他の実施形態では、標的化配列は、１６ヌクレオチドからなり、配列番号２７２～２１００及び２２８６～２６７８９からなる群から選択される配列を有し、４つのヌクレオチドが配列の３’末端から除去されている。他の実施形態では、標的化配列は、１５ヌクレオチドからなり、配列番号２７２～２１００及び２２８６～２６７８９からなる群から選択される配列を有し、５つのヌクレオチドが配列の３’末端から除去されている。

【0010】

いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、配列番号２２３８～２２８５、２６７９４～２６８３９、及び２７２１９～２７２６５の配列からなる群から選択される配列、若しくは表３に示される配列、又はそれと少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％の配列同一性を有する配列を含む足場（ｓｃａｆｆｏｌｄ）を有する。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、配列番号２２３８～２２８５、２６７９４～２６８３９、及び２７２１９～２７２６５の配列からなる群から選択される配列を含む足場を有する。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、配列番号２１０１～２２８５、２６７９４～２６８３９、及び２７２１９～２７２６５の配列からなる群から選択される配列を含む足場を有する。

【0011】

いくつかの実施形態では、ＣａｓＸ：ｇＲＮＡシステムは、配列番号３６～９９、１０１～１４８、２６９０８～２７１５４からなる群から選択される配列、又はそれと少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、若しくは少なくとも約９０％、若しくは少なくとも約９５％、若しくは少なくとも約９６％、若しくは少なくとも約９７％、若しくは少なくとも約９８％、若しくは少なくとも約９９％の配列同一性を有する配列を有するＣａｓＸバリアント配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸ：ｇＲＮＡシステムは、配列番号３６～９９、１０１～１４８、２６９０８～２７１５４からなる群から選択される配列を有するＣａｓＸバリアント配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸ：ｇＲＮＡシステムは、配列番号５９、７２～９９、１０１～１４８、及び２６９０８～２７１５４からなる群から選択される配列、若しくは表４に示される配列、又はそれと少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、若しくは少なくとも約９０％、若しくは少なくとも約９５％、若しくは少なくとも約９６％、若しくは少なくとも約９７％、若しくは少なくとも約９８％、若しくは少なくとも約９９％の配列同一性を有する配列を有するＣａｓＸバリアント配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸ：ｇＲＮＡシステムは、配列番号５９、７２～９９、１０１～１４８、及び２６９０８～２７１５４からなる群から選択される配列を有するＣａｓＸバリアント配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸ：ｇＲＮＡシステムは、配列番号１３２～１４８及び２６９０８～２７１５４からなる群から選択される配列、又はそれと少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、若しくは少なくとも約９０％、若しくは少なくとも約９５％、若しくは少なくとも約９６％、若しくは少なくとも約９７％、若しくは少なくとも約９８％、若しくは少なくとも約９９％の配列同一性を有する配列を有するＣａｓＸバリアント配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸ：ｇＲＮＡシステムは、配列番号１３２～１４８及び２６９０８～２７１５４からなる群から選択される配列を有するＣａｓＸバリアント配列を含む。これらの実施形態では、ＣａｓＸバリアントは、配列番号１～３の参照ＣａｓＸタンパク質のうちのいずれか１つと比較して、１つ以上の改善された特徴を示す。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、ＴＴＣ、ＡＴＣ、ＧＴＣ、及びＣＴＣからなる群から選択されるプロトスペーサー隣接モチーフ（protospacer adjacent motif、ＰＡＭ）配列に対する結合親和性を有する。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、ＴＴＣ、ＡＴＣ、ＧＴＣ、及びＣＴＣからなる群から選択されるＰＡＭ配列に対する配列番号１～３の参照ＣａｓＸタンパク質のうちのいずれか１つの結合親和性と比較して、少なくとも１．５倍大きいＰＡＭ配列に対する結合親和性を有する。

【0012】

ＣａｓＸ：ｇＲＮＡシステムの他の実施形態では、ＣａｓＸ分子及びｇＲＮＡ分子は、リボ核タンパク質複合体（ribonuclear protein、ＲＮＰ）において一緒に会合している。特定の実施形態では、ＣａｓＸバリアント及びｇＲＮＡバリアントを含むＲＮＰは、ＰＡＭ配列ＴＴＣ、ＡＴＣ、ＧＴＣ、又はＣＴＣのうちのいずれか１つが、細胞アッセイシステムにおいてｇＲＮＡの標的化配列と同一性を有する非標的鎖配列に対して１ヌクレオチド５’側に位置する場合、比較可能なアッセイシステムにおける参照ＣａｓＸタンパク質及び参照ｇＲＮＡを含むＲＮＰの編集効率及び／又は結合と比較して、より高い標的ＤＮＡにおける標的配列の編集効率及び／又は結合を示す。

【0013】

いくつかの実施形態では、ＣａｓＸ：ｇＲＮＡシステムは、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子の少なくとも一部を含み、野生型配列と比較して、少なくとも１～約５つの変異を有する核酸を含むドナー鋳型を更に含み、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子部分が、ＢＣＬ１１Ａエキソン、ＢＣＬ１１Ａイントロン、ＢＣＬ１１Ａイントロン－エキソン接合部、ＢＣＬ１１Ａ調節エレメント、又はそれらの組み合わせからなる群から選択され、ドナー鋳型が、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子をノックダウン又はノックアウトするために使用される。場合によっては、ドナー配列は、一本鎖ＤＮＡ鋳型又は一本鎖ＲＮＡ鋳型である。他の場合では、ドナー鋳型は、二本鎖ＤＮＡ鋳型である。

【0014】

他の実施形態では、本開示は、本明細書に記載の実施形態のいずれかのＣａｓＸ：ｇＲＮＡシステムをコードする核酸、並びに核酸を含むベクターに関する。いくつかの実施形態では、ベクターは、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（adeno-associated viral、ＡＡＶ）ベクター、単純ヘルペスウイルス（herpes simplex virus、ＨＳＶ）ベクター、プラスミド、ミニサークル、ナノプラスミド、及びＲＮＡベクターからなる群から選択される。他の実施形態では、ベクターは、本明細書に記載の実施形態のいずれかのＣａｓＸ及びｇＲＮＡのＲＮＰ、並びに任意選択的に、ドナー鋳型核酸及び標的化部分（例えば、ウイルス由来糖タンパク質）を含む、ＣａｓＸ送達粒子（CasX delivery particle、ＸＤＰ）である。

【0015】

他の実施形態では、本開示は、細胞集団のＢＣＬ１１Ａ標的核酸配列を改変する方法を提供し、当該方法は、細胞に、ａ）本明細書に開示される実施形態のいずれかのＣａｓＸ：ｇＲＮＡシステム、ｂ）本明細書に開示される実施形態のいずれかの核酸、ｃ）本明細書に開示される実施形態のいずれかのベクター、ｄ）本明細書に開示される実施形態のいずれかのＸＤＰ、又はｅ）前述の組み合わせ、を導入することを含む。本方法のいくつかの実施形態では、改変することは、野生型配列と比較して、標的核酸配列において１つ以上のヌクレオチドの挿入、欠失、置換、重複、又は逆位を導入することを含む。標的ＢＣＬ１１Ａ遺伝子は、調節エレメントとしてＧＡＴＡ１赤血球特異的エンハンサー結合部位（ＧＡＴＡ１）を含む。いくつかの実施形態では、改変する方法は、ＧＡＴＡ１配列の改変を含み、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子が、改変によってノックダウン又はノックアウトされる。場合によっては、本方法は、標的核酸を本明細書に開示される実施形態のいずれかのドナー鋳型核酸と接触させることを更に含む。本方法のいくつかの実施形態では、ドナー鋳型は、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子の少なくとも一部を含むが、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子をノックアウト又はノックダウンするための１つ以上の変異を有する核酸を含む。場合によっては、標的核酸配列の改変は、インビトロ又はエクスビボで起こる。場合によっては、標的核酸配列の改変はインビボで起こる。いくつかの実施形態では、細胞は、げっ歯類細胞、マウス細胞、ラット細胞、霊長類細胞、及び非ヒト霊長類細胞からなる群から選択される真核細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、ヒト細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、造血幹細胞（hematopoietic stem cell、ＨＳＣ）、造血前駆細胞（hematopoietic progenitor cell、ＨＰＣ）、ＣＤ３４＋幹細胞、間葉系幹細胞（mesenchymal stem cell、ＭＳＣ）、人工多能性幹細胞（induced pluripotent stem cell、ｉＰＳＣ）、骨髄系共通前駆細胞、前赤芽球細胞、及び赤芽球細胞からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、細胞は、β異常ヘモグロビン症関連疾患を有する対象に由来する自己細胞である。他の実施形態では、細胞は、同種であるが、治療される対象と同じ種である。

【0016】

他の実施形態では、本開示は、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子の標的核酸配列を改変する方法を提供し、標的細胞集団が、ＣａｓＸタンパク質、及びＢＣＬ１１Ａ遺伝子に相補的な標的化配列を含む１つ以上のｇＲＮＡをコードし、任意選択的に、ドナー鋳型を更に含む、ベクターを使用して接触される。場合によっては、ベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ－Ｒｈ７４、又はＡＡＶＲｈ１０から選択されるアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである。他の場合では、ベクターはレンチウイルスベクターである。他の実施形態では、本開示は、ベクターを使用して標的細胞を接触させる方法であって、ベクターが、本明細書に記載の実施形態のいずれかのＣａｓＸ及びｇＲＮＡのＲＮＰと、任意選択的にドナー鋳型核酸とを含むＣａｓＸ送達粒子（ＸＤＰ）である、方法を提供する。本方法のいくつかの実施形態では、ベクターは、治療有効用量で対象に投与される。対象は、マウス、ラット、ブタ、非ヒト霊長類、又はヒトであり得る。用量は、移植、局所注射、全身注入、又はそれらの組み合わせから選択される投与経路によって投与することができる。

【0017】

他の実施形態では、本開示は、β異常ヘモグロビン症関連疾患の治療を必要とする対象において、それを行う方法を提供し、対象の細胞においてＢＣＬ１１Ａ遺伝子をコードする遺伝子を改変することを含み、改変することが、当該細胞を、ａ）本明細書に開示される実施形態のいずれかのＣａｓＸ：ｇＲＮＡシステム、ｂ）本明細書に開示される実施形態のいずれかの核酸、ｃ）本明細書に開示される実施形態のいずれかのベクター、ｄ）本明細書に開示される実施形態のいずれかのＸＤＰ、又はｅ）前述の組み合わせ、のいずれかと接触させることを含む。いくつかの実施形態では、β異常ヘモグロビン症関連疾患は、鎌状赤血球貧血又はβサラセミアである。場合によっては、β異常ヘモグロビン症関連疾患を有する対象を治療する方法は、少なくとも１つの臨床的に関連するパラメータの改善をもたらす。他の場合では、β異常ヘモグロビン症関連疾患を有する対象を治療する方法は、少なくとも２つの臨床的に関連するパラメータの改善をもたらす。

【0018】

他の実施形態では、本開示は、β異常ヘモグロビン症関連疾患の治療を必要とする対象においてそれを行うための、本明細書に記載のＣａｓＸ：ｇＲＮＡシステム、核酸、ベクター、又はＸＤＰの使用を提供する。いくつかの実施形態では、使用は、対象の細胞においてＢＣＬ１１Ａ遺伝子をコードする遺伝子を改変することを含み、改変することが、当該細胞を、ａ）本明細書に開示される実施形態のいずれかのＣａｓＸ：ｇＲＮＡシステム、ｂ）本明細書に開示される実施形態のいずれかの核酸、ｃ）本明細書に開示される実施形態のいずれかのベクター、ｄ）本明細書に開示される実施形態のいずれかのＸＤＰ、又はｅ）前述の組み合わせ、のいずれかと接触させることを含む。

【0019】

参照による援用
本明細書で言及される全ての刊行物、特許、及び特許出願は、各個々の刊行物、特許、又は特許出願が、参照により援用されることが具体的かつ個別に示されているかのように、参照により本明細書に援用される。ＣａｓＸバリアント及びｇＲＮＡバリアントを開示する、２０２０年１２月３日に出願された米国仮出願第６３／１２１，１９６号、２０２１年３月１７日に出願された同第６３／１６２，３４６号、及び２０２１年６月９日に出願された同第６３／２０８，８５５号の内容は、それらの全体が参照により本明細書に援用される。２０２０年１２月１０日に公開された国際出願公開第２０２０／２４７８８２号、２０２０年１２月１０日に公開された同第２０２０／２４７８８３号、及び２０２１年６月１０日に公開された同第２０２１／１１３７７２号の内容は、それらの全体が参照により本明細書に援用される。

【図面の簡単な説明】

【0020】

添付の特許請求の範囲に本開示の新規の特徴を詳細に示す。本開示の原理を利用する例示的な実施形態について示す以下の詳細な説明、並びに添付の図面を参照することによって、本開示の特徴及び利点がより良く理解されるであろう。

【図1】実施例８に記載されるように、ｓｇＲＮＡ１７４（配列番号２２３８）並びにＣａｓＸバリアント１１９（配列番号５９）、４５７（配列番号１０１）、４８８（配列番号１２３）、及び４９１（配列番号１２６）によって形成されたＲＮＰの活性画分を定量化するためのアッセイの結果のグラフである。等モル量のＲＮＰ及び標的を共インキュベートし、切断された標的の量を、示された時点で決定した。３回の独立した反復の平均値及び標準偏差を、各時点について示す。組み合わせた複製物の二相適合を示す。「２」は、配列番号２の参照ＣａｓＸタンパク質を指す。

【図2】実施例８に記載されるように、ＣａｓＸ２（配列番号２の参照ＣａｓＸタンパク質）及び改変ｓｇＲＮＡによって形成されたＲＮＰの活性画分の定量化を示す。等モル量のＲＮＰ及び標的を共インキュベートし、切断された標的の量を、示された時点で決定した。３回の独立した反復の平均値及び標準偏差を、各時点について示す。組み合わせた複製物の二相適合を示す。

【図3】実施例８に記載されるように、ガイド制限条件下でＣａｓＸ ４９１及び改変ｓｇＲＮＡによって形成されたＲＮＰの活性画分の定量化を示す。等モル量のＲＮＰ及び標的を共インキュベートし、切断された標的の量を、示された時点で決定した。データの二相適合を示す。

【図4】実施例８に記載されるように、ｓｇＲＮＡ１７４及びＣａｓＸバリアントによって形成されたＲＮＰの切断速度の定量化を示す。標的ＤＮＡを、２０倍過剰の示されたＲＮＰとインキュベートし、切断された標的の量を、示された時点で決定した。単一の反復が示される４８８及び４９１を除いて、３回の独立した反復の平均値及び標準偏差を、各時点について示す。組み合わせた反復の単相適合を示す。

【図5】実施例８に記載されるように、ＣａｓＸ２及び示されたｓｇＲＮＡバリアントによって形成されたＲＮＰの切断速度の定量化を示す。標的ＤＮＡを、２０倍過剰の示されたＲＮＰとインキュベートし、切断された標的の量を、示された時点で決定した。３回の独立した反復の平均値及び標準偏差を、各時点について示す。組み合わせた反復の単相適合を示す。

【図6】実施例８に記載されるように、ＣａｓＸ２及びｓｇＲＮＡバリアントによって形成されたＲＮＰの初速度の定量化を示す。先の切断実験の最初の２つの時点を線形モデルに適合して、切断初速度を決定した。

【図7】実施例８に記載されるように、ＣａｓＸ４９１及びｓｇＲＮＡバリアントによって形成されたＲＮＰの切断速度の定量化を示す。標的ＤＮＡを、２０倍過剰の示されたＲＮＰと１０℃でインキュベートし、切断された標的の量を、示された時点で決定した。時点の単相適合を示す。

【図8】実施例８に記載されるように、等モル量の示されたＲＮＰ及び相補標的を使用して、ｇＲＮＡ ２と複合体化した参照ＣａｓＸ ２のＲＮＰと比較した、ｇＲＮＡバリアント１７４と複合体化したＣａｓＸバリアント５１５（配列番号１３３）及び５２６（配列番号１４３）のＲＮＰのコンピテント画分の定量化を示す。各時間経過又は組み合わせた複製のセットについての二相適合を示す。

【図9】実施例８に記載されるように、２０倍過剰の示されたＲＮＰを使用して、ｇＲＮＡ ２と複合体化した参照ＣａｓＸ ２のＲＮＰと比較した、ｇＲＮＡバリアント１７４と複合体化したＣａｓＸバリアント５１５及び５２６のＲＮＰの切断速度の定量化を示す。

【図10A】実施例５に記載されるように、ＴＴＣ ＰＡＭに対するＣａｓＸバリアントの切断速度の定量化を示す。同一のスペーサー及び示されたＰＡＭ配列を有する標的ＤＮＡ基質を、２０倍過剰の示されたＲＮＰと３７℃でインキュベートし、切断された標的の量を、示された時点で決定した。単一反復の単相適合を示す。

【図10B】実施例５に記載されるように、ＣＴＣ ＰＡＭに対するＣａｓＸバリアントの切断速度の定量化を示す。同一のスペーサー及び示されたＰＡＭ配列を有する標的ＤＮＡ基質を、２０倍過剰の示されたＲＮＰと３７℃でインキュベートし、切断された標的の量を、示された時点で決定した。単一反復の単相適合を示す。

【図10C】実施例５に記載されるように、ＧＴＣ ＰＡＭに対するＣａｓＸバリアントの切断速度の定量化を示す。同一のスペーサー及び示されたＰＡＭ配列を有する標的ＤＮＡ基質を、２０倍過剰の示されたＲＮＰと３７℃でインキュベートし、切断された標的の量を、示された時点で決定した。単一反復の単相適合を示す。

【図10D】実施例５に記載されるように、ＡＴＣ ＰＡＭに対するＣａｓＸバリアントの切断速度の定量化を示す。同一のスペーサー及び示されたＰＡＭ配列を有する標的ＤＮＡ基質を、２０倍過剰の示されたＲＮＰと３７℃でインキュベートし、切断された標的の量を、示された時点で決定した。単一反復の単相適合を示す。

【図11A】実施例５に記載されるように、ＮＴＣ ＰＡＭに対するＣａｓＸバリアント４９１及びガイド１７４のＲＮＰの切断速度の定量化を示す。時点を、１０分間にわたって取得し、切断された画分を各標的及び時点についてグラフ化したが、明確にするために、時間経過の最初の２分間のみを示す。

【図11B】実施例５に記載されるように、ＮＴＴ ＰＡＭに対するＣａｓＸバリアント４９１及びガイド１７４のＲＮＰの切断速度の定量化を示す。時点を、１０分間にわたって取得し、切断された画分を、各標的及び時点についてグラフ化した。

【図12A】実施例９に記載されるように、１８、１９、又は２０ヌクレオチド長のスペーサーを使用して、ｓｇＲＮＡ１７４及びＣａｓＸバリアント５１５によって形成されたＲＮＰによる切断の定量化を示す。標的ＤＮＡを、２０倍過剰の示されたＲＮＰとインキュベートし、切断された標的の量を、示された時点で決定した。３回の独立した反復の平均値及び標準偏差を、各時点について示す。組み合わせた反復の単相適合を示す。

【図12B】実施例９に記載されるように、１８、１９、又は２０ヌクレオチド長のスペーサーを使用して、ｓｇＲＮＡ１７４及びＣａｓＸバリアント５２６によって形成されたＲＮＰによる切断の定量化を示す。標的ＤＮＡを、２０倍過剰の示されたＲＮＰとインキュベートし、切断された標的の量を、示された時点で決定した。３回の独立した反復の平均値及び標準偏差を、各時点について示す。組み合わせた反復の単相適合を示す。

【図13】アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）におけるパッケージングのためのＣａｓＸタンパク質及び足場ＤＮＡ配列の例を示す概略図である。ＣａｓＸをコードするＤＮＡ及びそのプロモーター、並びに足場をコードするＤＮＡ及びそのプロモーターから構成される、ＡＡＶ逆位末端反復（inverted terminal repeat、ＩＴＲ）間のＤＮＡセグメントは、ＡＡＶ産生中にＡＡＶカプシド内にパッケージングされる。

【図14】Ａｉ９－ｔｄｔｏｍａｔｏトランスジェニックマウスから単離されたマウス神経前駆細胞（mouse neural progenitor cell、ｍＮＰＣ）におけるｇＲＮＡ足場２２９～２３７（対応する配列及び配列番号については表３を参照）と足場１７４を比較する編集アッセイの結果を示す。細胞を、ＣａｓＸ ４９１、足場、及びｍＲＨＯを標的化するスペーサー１１．３０（５’ＡＡＧＧＧＧＣＵＣＣＧＣＡＣＣＡＣＧＣＣ３’、配列番号２７１９７）をコードする示された用量のｐ５９プラスミドでヌクレオフェクトした。ｍＲＨＯ遺伝子座での編集を、トランスフェクションの５日後にＮＧＳによって評価し、足場２３０、２３１、２３４、及び２３５を有する構築物による編集が、両方の用量で足場１７４を有する構築物と比較して、より大きな編集を実証したことを示す。

【図15】ｍＮＰＣ細胞においてｇＲＮＡ足場２２９～２３７と足場１７４を比較する編集アッセイの結果を示す。細胞を、ｔｄＴｏｍａｔｏ蛍光タンパクの発現を防止する反復エレメントを標的化する、ＣａｓＸ ４９１、足場、及びスペーサー１２．７（５’ＣＵＧＣＡＵＵＣＵＡＧＵＵＧＵＧＧＵＵＵ ３’、配列番号２７１９８）をコードする示された用量のｐ５９プラスミドでヌクレオフェクトした。トランスフェクションの５日後、編集を、ＦＡＣＳによって評価して、ｔｄＴｏｍａｔｏ陽性細胞の割合を定量化した。足場２３１～２３５をヌクレオフェクトした細胞は、足場１７４を有する構築物と比較して、高用量では約３５％より大きい編集を示し、低用量では約２５％より大きい編集を示した。

【図16】カスタムＨＥＫ２９３細胞株ＰＡＳＳ＿Ｖ１．０１におけるＣａｓＸヌクレアーゼ２、１１９、４９１、５１５、５２７、５２８、５２９、５３０、及び５３１（対応する配列及び配列番号については表４を参照）を比較する編集アッセイの結果を示す。細胞を、示されたＣａｓＸタンパク質をコードする２μｇのｐ６７プラスミドでリポフェクトした。５日後、細胞のゲノムＤＮＡを抽出した。ＰＣＲ増幅及び次世代配列決定を実施して、カスタム設計されたオンターゲット編集部位で編集された細胞の画分を単離及び定量化した。各試料について、以下のＰＡＭ配列からなる標的部位（個々の点）で編集を評価した：４８個のＴＴＣ、１４個のＡＴＣ、２２個のＣＴＣ、１１個のＧＴＣの個々の部位、及び編集の割合（％）を、ビヒクル対照に対して正規化した。任意のヌクレアーゼでリポフェクトされた細胞は、ＣａｓＸ ５２８を除く野生型ヌクレアーゼＣａｓＸ ２のものよりも高い、ＴＴＣ ＰＡＭ標的部位（水平バー）での平均編集を示した。また、４つの異なるＰＡＭ配列に対する任意の所与のヌクレアーゼの相対優先度が、バイオリンプロットで表されている。特に、ＣａｓＸヌクレアーゼ５２７、５２８、及び５２９は、野生型ヌクレアーゼＣａｓＸ ２のものとは実質的に異なるＰＡＭ優先度を示す。

【図17】カスタムＨＥＫ２９３細胞株ＰＡＳＳ＿Ｖ１．０１において、改良型ＣａｓＸヌクレアーゼ４９１と改良型ヌクレアーゼ５３２及び５３３を比較する編集アッセイの結果を示す。細胞を、示されたＣａｓＸタンパク質及びピューロマイシン耐性遺伝子をコードする２μｇのｐ６７プラスミドで二連でリポフェクトし、ピューロマイシン選択下で増殖させた。３日後、細胞のゲノムＤＮＡを抽出した。ＰＣＲ増幅及び次世代配列決定を実施して、カスタム設計されたオンターゲット編集部位で編集された細胞の画分を単離及び定量化した。各試料について、以下のＰＡＭ配列からなる標的部位で編集を評価した：４８個のＴＴＣ、１４個のＡＴＣ、２２個のＣＴＣ、１１個のＧＴＣの個々の部位、及び編集の割合を、ビヒクル対照に対して正規化した。ＣａｓＸ ５３２又は５３３でリポフェクトされた細胞は、ＴＴＣ ＰＡＭ標的部位におけるＣａｓＸ ５３３を除いて、ＰＡＭ配列の各々においてＣａｓ ４９１よりも高い平均編集を示した。エラーバーは、ｎ＝２の生物学的試料についての平均値の標準誤差を表す。

【図18】実施例１３に記載されるように、Ｃａｓ９システムと比較した、足場１７４を有するＣａｓＸタンパク質バリアント４３８によるＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＢＣＬ１１Ａ赤血球エンハンサー遺伝子座の編集の結果を示す。

【図19】実施例１４に記載されるように、足場１７４を有するＣａｓＸタンパク質バリアント１１９と比較した、足場１７４を有するＣａｓＸタンパク質バリアント４９１によるＫ５６２細胞におけるＢＣＬ１１Ａ赤血球エンハンサー遺伝子座のＧＡＴＡ１結合領域での編集の結果を示す。

【図20】実施例１４に記載されるように、様々な用量のＸＤＰによって送達された足場１７４を有するＣａｓＸタンパク質バリアント４９１による、Ｋ５６２細胞におけるＢＣＬ１１Ａ赤血球エンハンサー遺伝子座のＧＡＴＡ１結合領域での編集の結果を示す。

【図21】実施例１５に記載されるように、足場１７４を有するＣａｓＸタンパク質バリアント１１９と比較した、足場１７４を有するＣａｓＸタンパク質バリアント４９１による、ＨＳＣ細胞におけるＢＣＬ１１Ａ赤血球エンハンサー遺伝子座のＧＡＴＡ１結合領域での編集の結果を示す。

【図22】実施例１５に記載されるように、様々な用量のＸＤＰによって送達された足場１７４を有するＣａｓＸタンパク質バリアント４９１による、ＨＳＣ細胞におけるＢＣＬ１１Ａ赤血球エンハンサー遺伝子座のＧＡＴＡ１結合領域での編集の結果を示す。

【図23】標的核酸におけるＧＡＴＡ１結合部位配列に対するスペーサー２１．１（配列番号２２）の配置を示す概略図である。上の鎖：配列番号２６７９０、下の鎖：配列番号２６７９１。

【発明を実施するための形態】

【0021】

例示的な実施形態が本明細書に示され、説明されてきたが、かかる実施形態は、単なる例として提供されることが当業者には明らかであろう。当業者であれば、本明細書で特許請求される本発明から逸脱することなく、多数の変形、変更、及び置換を想起するであろう。本開示の実施形態を実施する際に、本明細書に記載の実施形態に対する様々な代替形態を用いることができることを理解されたい。特許請求の範囲が本発明の範囲を定義し、これらの特許請求の範囲内の方法及び構造並びにそれらの均等物がそれによって包含されることが意図される。

【0022】

別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されているものと同様又は同等の任意の方法及び材料を本実施形態の実施又は試験において使用することができるが、好適な方法及び材料を以下に記載する。矛盾する場合、定義を含む本特許明細書が優先される。加えて、材料、方法、及び実施例は、例示にすぎず、限定することを意図するものではない。当業者であれば、本発明から逸脱することなく、多数の変形、変更、及び置換を想起するであろう。

【0023】

定義
「ポリヌクレオチド」及び「核酸」という用語は、本明細書において互換的に使用され、リボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドのいずれかである、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。したがって、「ポリヌクレオチド」及び「核酸」という用語は、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、多重鎖ＤＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、多重鎖ＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッド、並びにプリン及びピリミジン塩基又は他の天然の、化学的若しくは生化学的に改変された、非天然の、若しくは誘導体化されたヌクレオチド塩基を含むポリマーを包含する。

【0024】

「ハイブリダイズ可能」又は「相補的」は、互換的に使用され、核酸（例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡ）が、温度及び溶液のイオン強度の適切なインビトロ及び／又はインビボ条件下で、配列特異的な逆平行様式で、別の核酸に非共有結合する（すなわち、ワトソン－クリック塩基対及び／又はＧ／Ｕ塩基対を形成する）、「アニールする」又は「ハイブリダイズする」（すなわち、核酸が相補的な核酸に特異的に結合する）ことを可能にするヌクレオチドの配列を含むことを意味する。ポリヌクレオチドの配列は、特異的にハイブリダイズ可能であるために、その標的核酸の配列と１００％相補的である必要はないことが理解される。それは、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、又は少なくとも約９０％、又は少なくとも約９５％の配列同一性を有し、それでもなお標的核酸にハイブリダイズすることができる。更に、ポリヌクレオチドは、介在又は隣接するセグメントがハイブリダイゼーション事象に関与することなく、１つ以上のセグメントにわたってハイブリダイズすることができる（例えば、ループ構造又はヘアピン構造、「バルジ」、「バブル」など）。

【0025】

本開示の目的のための「遺伝子」は、遺伝子産物（例えば、タンパク質、ＲＮＡ）をコードするＤＮＡ領域、並びに遺伝子産物の産生を調節する全てのＤＮＡ領域を含む（かかる調節エレメント配列がコード配列及び／又は転写配列に隣接しているか否かにかかわらない）。したがって、遺伝子は、調節配列を含み得、これには、プロモーター配列、ターミネーター、翻訳調節配列（例えば、リボソーム結合部位及び内部リボソーム進入部位）、エンハンサー、サイレンサー、インスレーター、境界エレメント、複製起点、マトリックス付着部位、及び遺伝子座制御領域が含まれるが、必ずしもこれらに限定されない。コード配列は、転写又は転写及び翻訳の際に遺伝子産物をコードする。本開示のコード配列は、オープンリーディングフレームの断片を含んでもよく、全長を含む必要はない。遺伝子は、転写される鎖（例えば、コード配列を含む鎖）、並びに相補鎖の両方を含み得る。

【0026】

「下流」という用語は、参照ヌクレオチド配列の３’側に位置するヌクレオチド配列を指す。特定の実施形態では、下流ヌクレオチド配列は、転写の開始点に続く配列に関する。例えば、遺伝子の翻訳開始コドンは、転写開始部位の下流に位置する。

【0027】

「上流」という用語は、参照ヌクレオチド配列の５’側に位置するヌクレオチド配列を指す。特定の実施形態では、上流ヌクレオチド配列は、コード領域又は転写開始点の５’側に位置する配列に関する。例えば、ほとんどのプロモーターは、転写開始部位の上流に位置する。

【0028】

ポリヌクレオチド又はアミノ酸配列に関して「に隣接する」という用語は、ポリヌクレオチド又はポリペプチドにおいて互いに隣にある又は隣接する配列を指す。当業者は、２つの配列が互いに隣接していると考えることができ、それでも限定された量の介在配列、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個のヌクレオチド又はアミノ酸を包含することを理解するであろう。

【0029】

「調節エレメント」という用語は、本明細書において「調節配列」という用語と互換的に使用され、プロモーター、エンハンサー、及び他の発現調節エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル及びポリＵ配列などの転写終結シグナル）を含むことが意図される。例示的な調節エレメントとしては、転写プロモーター（例えば、ＣＭＶ、ＣＭＶ＋イントロンＡ、ＳＶ４０、ＲＳＶ、ＨＩＶ－Ｌｔｒ、伸長因子１α（elongation factor 1 alpha、ＥＦ１α）、ＭＭＬＶ－ｌｔｒ、内部リボソーム進入部位（internal ribosome entry site、ＩＲＥＳ）又はＰ２Ａペプチド（単一の転写物から複数の遺伝子の翻訳を可能にする）、メタロチオネイン、転写エンハンサーエレメント、転写終結シグナル、ポリアデニル化配列、翻訳開始の最適化のための配列、及び翻訳終結配列が挙げられるが、これらに限定されない。適切な調節エレメントの選択は、発現されるコードされた成分（例えば、タンパク質若しくはＲＮＡ）に依存するか、又は核酸が異なるポリメラーゼを必要とする複数の成分を含むか若しくは融合タンパク質として発現するように意図されていないかに依存することが理解される。

【0030】

「プロモーター」という用語は、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位、転写開始部位、ＴＡＴＡボックス、及び／又はＢ認識エレメントを含み、関連する転写可能なポリヌクレオチド配列及び／又は遺伝子（若しくは導入遺伝子）の転写及び発現を補助若しくは促進する、ＤＮＡ配列を指す。プロモーターは、合成的に産生され得るか、又は既知の若しくは天然に存在するプロモーター配列若しくは別のプロモーター配列に由来し得る。プロモーターは、転写される遺伝子に対して近位又は遠位であり得る。プロモーターはまた、特定の特性を付与するための２つ以上の異種配列の組み合わせを含むキメラプロモーターを含み得る。本開示のプロモーターは、組成が類似しているが、既知の又は本明細書に提供される他のプロモーター配列と同一ではないプロモーター配列のバリアントを含み得る。プロモーターは、プロモーター（例えば、構成的、発生的、組織特異的、誘導性など）に作動可能に連結された関連するコード配列若しくは転写可能配列又は遺伝子の発現パターンに関する基準に従って分類され得る。

【0031】

「エンハンサー」という用語は、転写因子と呼ばれる特定のタンパク質が結合した場合に、関連する遺伝子の発現を調節する、調節エレメントＤＮＡ配列を指す。エンハンサーは、遺伝子のイントロン、又は遺伝子のコード配列の５’若しくは３’に位置し得る。エンハンサーは、遺伝子の近位（すなわち、プロモーターの数十若しくは数百塩基対（base pair、ｂｐ）内）にあってもよく、又は遺伝子の遠位（すなわち、プロモーターから数千ｂｐ、数十万ｂｐ、若しくは更に数百万ｂｐ離れている）に位置してもよい。単一の遺伝子は、２つ以上のエンハンサーによって調節されてもよく、これらの全ては、本開示の範囲内であると想定される。

【0032】

本明細書で使用される場合、「転写後調節エレメント（post-transcriptional regulatory element、ＰＲＥ）」（例えば、肝炎ＰＲＥ）とは、転写された場合、それに作動可能に連結された関連遺伝子の発現を増強又は促進する転写後活性を示し得る三次構造を生成するＤＮＡ配列をいう。

【0033】

「ＧＡＴＡ結合部位」という用語は、転写因子のＧＡＴＡファミリーのＤＮＡ結合部位を指す。ＧＡＴＡ転写因子は、典型的には、コンセンサス配列ＷＧＡＴＡＲ（式中、Ｗ＝Ａ又はＴ、及びＲ＝Ａ又はＧ）に一致する標的部位を認識する。

【0034】

本明細書で使用される場合、「組換え」とは、特定の核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）が、クローニングステップ、制限ステップ、及び／又は連結ステップの様々な組み合わせの産物であり、その結果、天然のシステムで見出される内因性核酸から識別可能な構造的なコード配列又は非コード配列を有する構築物が得られることを意味する。一般に、構造コード配列をコードするＤＮＡ配列は、ｃＤＮＡ断片と短いオリゴヌクレオチドリンカー、又は一連の合成オリゴヌクレオチドから組み立てることができ、細胞又は無細胞転写及び翻訳システムに含まれる組換え転写単位から発現され得る合成核酸を提供する。かかる配列は、典型的には、真核生物遺伝子に存在する内部非翻訳配列又はイントロンによって中断されないオープンリーディングフレームの形態で提供され得る。関連配列を含むゲノムＤＮＡはまた、組換え遺伝子又は転写単位の形成において使用され得る。非翻訳ＤＮＡの配列は、オープンリーディングフレームから５’又は３’に存在し得、ここで、かかる配列は、コード領域の操作又は発現を妨害せず、実際に、様々な機構によって所望の産物の産生を調節するように作用し得る（上記の「エンハンサー」及び「プロモーター」を参照）。

【0035】

「組換えポリヌクレオチド」又は「組換え核酸」という用語は、天然に存在しないもの、例えば、ヒトの介入を介して、そうでなければ分離された配列の２つのセグメントの人工的な組み合わせによって作製されるものを指す。この人工的な組み合わせは、多くの場合、化学合成手段、又は核酸の単離されたセグメントの人工的操作（例えば、遺伝子操作技術）のいずれかによって達成される。これは、典型的には、配列認識部位を導入又は除去しながら、コドンを、同じアミノ酸又は保存的アミノ酸をコードする縮重コドン（redundant codon）で置換するように行うことができる。代替的には、所望の機能の核酸セグメントを一緒に連結して、所望の機能の組み合わせを生成するように行われる。この人工的な組み合わせは、多くの場合、化学合成手段、又は核酸の単離されたセグメントの人工的操作（例えば、遺伝子操作技術）のいずれかによって達成される。

【0036】

同様に、「組換えポリペプチド」又は「組換えタンパク質」という用語は、天然に存在しないポリペプチド又はタンパク質、例えば、ヒトの介入を介して、そうでなければ分離されたアミノ配列の２つのセグメントの人工的な組み合わせによって作製されるものを指す。したがって、例えば、異種アミノ酸配列を含むタンパク質は組換え体である。

【0037】

本明細書で使用される場合、「接触する」という用語は、２つ以上の実体間に物理的接続を確立することを意味する。例えば、標的核酸配列をガイド核酸と接触させることは、標的核酸配列及びガイド核酸が、物理的接続を共有するようになされることを意味する（例えば、それらの配列が配列類似性を共有する場合、ハイブリダイズすることができる）。

【0038】

「解離定数」又は「Ｋ_ｄ」は、互換的に使用され、リガンド「Ｌ」とタンパク質「Ｐ」との間の親和性を意味する（すなわち、リガンドが特定のタンパク質にどの程度強く結合するかである）。それは、式Ｋ_ｄ＝［Ｌ］［Ｐ］／［ＬＰ］を用いて計算することができ、式中、［Ｐ］、［Ｌ］、及び［ＬＰ］は、それぞれ、タンパク質、リガンド、及び複合体のモル濃度を表す。

【0039】

本開示は、標的核酸配列を編集するために有用な組成物及び方法を提供する。本明細書で使用される場合、「編集」は、「改変」と互換的に使用され、切断、ニッキング、欠失、ノックイン、ノックアウトなどを含むが、これらに限定されない。

【0040】

「ノックアウト」という用語は、遺伝子又は遺伝子の発現の排除を指す。例えば、遺伝子は、リーディングフレームの破壊をもたらすヌクレオチド配列の欠失又は付加のいずれかによってノックアウトされ得る。別の例として、遺伝子は、遺伝子の一部を無関係な配列で置換することによってノックアウトされ得る。本明細書で使用される「ノックダウン」という用語は、遺伝子又はその遺伝子産物の発現の低減を指す。遺伝子ノックダウンの結果として、タンパク質活性若しくは機能が減弱され得るか、又はタンパク質レベルが低減若しくは排除され得る。

【0041】

本明細書で使用される場合、「相同組換え修復」（homology-directed repair、ＨＤＲ）とは、細胞における二本鎖切断の修復中に起こるＤＮＡ修復の形態を指す。このプロセスは、ヌクレオチド配列の相同性を必要とし、ドナー鋳型を使用して標的ＤＮＡを修復又はノックアウトし、ドナー（例えば、ドナー鋳型など）から標的への遺伝情報の伝達をもたらす。相同組換え修復は、ドナー鋳型が標的ＤＮＡ配列と異なり、ドナー鋳型の配列の一部又は全部が正しいゲノム遺伝子座で標的ＤＮＡに組み込まれる場合、挿入、欠失、又は変異による標的核酸配列の配列の改変をもたらすことができる。

【0042】

本明細書で使用される場合、「非相同末端結合」（non-homologous end joining、ＮＨＥＪ）は、（修復を誘導するために相同配列を必要とする相同組換え修復とは対照的に）相同鋳型を必要とせずに、切断末端を互いに直接ライゲーションすることによる、ＤＮＡにおける二本鎖切断の修復を指す。ＮＨＥＪは、多くの場合、インデル（二本鎖切断部位付近のヌクレオチド配列の喪失（欠失）又は挿入）をもたらす。

【0043】

本明細書で使用される場合、「マイクロホモロジー媒介末端結合」（micro-homology mediated end joining、ＭＭＥＪ）は、（修復を誘導するために相同配列を必要とする相同組換え修復とは対照的に）相同鋳型を必要とせずに、切断部位に隣接する欠失と常に関連する、変異原性二本鎖切断（double strand break、ＤＳＢ）修復機構を指す。ＭＭＥＪは、多くの場合、二本鎖切断部位付近のヌクレオチド配列の喪失（欠失）をもたらす。

【0044】

ポリヌクレオチド又はポリペプチド（若しくはタンパク質）は、別のポリヌクレオチド又はポリペプチドと特定のパーセント「配列類似性」又は「配列同一性」を有し、これは、２つの配列を比較した場合（整列させた場合）、同じ相対位置にある同じ塩基又はアミノ酸の百分率割合を意味する。配列類似性（パーセント類似性、パーセント同一性、又は相同性とも称される）は、いくつかの異なる様式で決定することができる。配列類似性を決定するために、配列は、ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴのワールドワイドウェブ上で利用可能なＢＬＡＳＴを含む、当該技術分野で既知の方法及びコンピュータプログラムを使用して整列することができる。核酸内の核酸配列の特定のストレッチ間のパーセント相補性は、任意の便利な方法を使用して決定することができる。例示的な方法としては、ＢＬＡＳＴプログラム（基本的局所整列検索ツール）及びＰｏｗｅｒＢＬＡＳＴプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９０，２１５，４０３－４１０、Ｚｈａｎｇ ａｎｄ Ｍａｄｄｅｎ，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．，１９９７，７，６４９－６５６）が挙げられる（又はＧａｐプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ ８ ｆｏｒ Ｕｎｉｘ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐａｒｋ，Ｍａｄｉｓｏｎ Ｗｉｓ．）を使用することによって、例えば、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎのアルゴリズム（Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．，１９８１，２，４８２－４８９）を使用するデフォルト設定を使用して）。

【0045】

「ポリペプチド」及び「タンパク質」という用語は、本明細書で互換的に使用され、任意の長さのアミノ酸のポリマー形態を指し、これは、コードアミノ酸及び非コードアミノ酸、化学的又は生化学的に改変又は誘導体化されたアミノ酸、並びに改変されたペプチド骨格を有するポリペプチドを含み得る。この用語は、融合タンパク質（異種アミノ酸配列を有する融合タンパク質を含むが、これに限定されない）を含む。

【0046】

「ベクター」又は「発現ベクター」は、プラスミド、ファージ、ウイルス、ウイルス様粒子、又はコスミドなどのレプリコンであり、これに別のＤＮＡセグメント（すなわち、「インサート」）を結合させて、細胞において結合されたセグメントの複製又は発現をもたらすことができる。

【0047】

本明細書で使用される「天然に存在する」又は「未改変」又は「野生型」という用語は、核酸、ポリペプチド、細胞、又は生物に適用される場合、天然に見出される核酸、ポリペプチド、細胞、又は生物を指す。

【0048】

本明細書で使用される場合、「変異」とは、野生型若しくは参照アミノ酸配列と比較して、又は野生型若しくは参照ヌクレオチド配列と比較して、１つ以上のアミノ酸又はヌクレオチドの挿入、欠失、置換、重複、又は逆位を指す。

【0049】

本明細書で使用される場合、「単離された」という用語は、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、又は細胞が天然に存在する環境とは異なる環境にあるポリヌクレオチド、ポリペプチド、又は細胞を表すことを意味する。単離された遺伝子改変宿主細胞は、遺伝子改変宿主細胞の混合集団中に存在してもよい。

【0050】

本明細書で使用される「宿主細胞」とは、真核細胞、原核細胞、又は単細胞実体として培養された多細胞生物由来の細胞（例えば、細胞株）を意味し、真核細胞又は原核細胞は、核酸（例えば、発現ベクター）のレシピエントとして使用され、核酸によって遺伝子改変された元の細胞の子孫を含む。単一細胞の子孫は、天然の、偶発的な、又は意図的な変異に起因して、形態において、又はゲノム若しくは全ＤＮＡの相補体において、元の親と必ずしも完全に同一でなくてもよいことが理解される。「組換え宿主細胞」（「遺伝子改変宿主細胞」とも称される）は、異種核酸（例えば、発現ベクター）が導入された宿主細胞である。

【0051】

「保存的アミノ酸置換」という用語は、タンパク質における、類似の側鎖を有するアミノ酸残基の互換性を指す。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸の群は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、及びイソロイシンからなり、脂肪族ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸の群は、セリン及びスレオニンからなり、アミド含有側鎖を有するアミノ酸の群は、アスパラギン及びグルタミンからなり、芳香族側鎖を有するアミノ酸の群は、フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファンからなり、塩基性側鎖を有するアミノ酸の群は、リジン、アルギニン、及びヒスチジンからなり、硫黄含有側鎖を有するアミノ酸の群は、システイン及びメチオニンからなる。例示的な保存的アミノ酸置換群は、バリン－ロイシン－イソロイシン、フェニルアラニン－チロシン、リジン－アルギニン、アラニン－バリン、及びアスパラギン－グルタミンである。

【0052】

本明細書で使用される場合、「治療」又は「治療すること」は、本明細書で互換的に使用され、治療的利益及び／又は予防的利益を含むがこれらに限定されない有益な結果若しくは所望の結果を得るためのアプローチを指す。治療的利益とは、治療される基礎となる障害又は疾患の根絶又は改善を意味する。治療的利益はまた、対象が依然として基礎疾患に罹患している可能性があるにもかかわらず、対象において改善が観察されるような、基礎疾患に関連する１つ以上の症状の根絶若しくは改善、あるいは１つ以上の臨床パラメータの改善により達成することができる。

【0053】

「治療有効量」及び「治療有効用量」という用語は、本明細書で使用される場合、対象（例えば、ヒト又は実験動物）に単回用量又は反復用量で投与した場合、疾患状態又は病態の任意の症状、態様、測定されたパラメータ、又は特徴に対して任意の検出可能な有益な効果を有することができる、単独での又は組成物の一部としての薬物又は生物製剤の量を指す。かかる効果は、有益であるために絶対的である必要はない。

【0054】

本明細書で使用される場合、「投与すること」とは、本開示の組成物の投与量を対象に与える方法を意味する。

【0055】

本明細書で使用される場合、「対象」は、哺乳動物である。哺乳動物としては、家畜、霊長類、非ヒト霊長類、ヒト、イヌ、ブタ（porcine）（ブタ（pig））、ウサギ、マウス、ラット、及び他のげっ歯類が挙げられるが、これらに限定されない。

【0056】

本明細書で言及される全ての刊行物、特許、及び特許出願は、各個々の刊行物、特許、又は特許出願が、参照により援用されることが具体的かつ個別に示されているかのように、参照により本明細書に援用される。

【0057】

Ｉ．一般的な方法
本発明の実施は、別段の指示がない限り、免疫学、生化学、化学、分子生物学、微生物学、細胞生物学、ゲノミクス、及び組換えＤＮＡの従来の技術を使用し、これらは、かかる標準的な教科書Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ Ｅｄ．（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ ２００１）、Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，４ｔｈ Ｅｄ．（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ １９９９）、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ（Ｂｏｌｌａｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ １９９６）、Ｎｏｎｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（Ｗａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９９９）、Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ（Ｋａｐｌｉｆｔ＆Ｌｏｅｗｙ ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９９５）、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍａｎｕａｌ（Ｉ．Ｌｅｆｋｏｖｉｔｓ ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９９７）、及びＣｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｄｏｙｌｅ＆Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ １９９８）に見出すことができる（それらの開示は、参照により本明細書に援用される）。

【0058】

値の範囲が提供される場合、終点が含まれること、及びその範囲の上限と下限との間の各介在値が、文脈が別途明確に指示しない限り、下限の単位の１０分の１まで、その記載された範囲内の任意の他の記載された値又は介在値が包含されることが理解される。これらのより小さい範囲の上限及び下限は、独立して、より小さい範囲に含まれてもよく、また、記載された範囲内の任意の具体的に除外された限界に従って包含される。記載された範囲が限界の一方又は両方を含む場合、それらの含まれる限界のいずれか又は両方を除外する範囲も含まれる。

【0059】

別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されているものと同じ意味を有する。本明細書で言及される全ての刊行物は、刊行物が引用される方法及び／又は材料を開示及び記載するために、参照により本明細書に援用される。

【0060】

本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形である「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」には、文脈上明らかに別段の指示がない限り、その複数の指示対象が含まれることに留意されたい。

【0061】

明確にするために、別個の実施形態の文脈で説明される本開示の特定の特徴は、単一の実施形態で組み合わせて提供されてもよいことが理解されるであろう。他の場合では、簡潔にするために、単一の実施形態の文脈で説明される本開示の様々な特徴は、別個に又は任意の好適な部分的な組み合わせで提供されてもよい。本開示に関連する実施形態の全ての組み合わせは、本開示によって具体的に包含され、あたかもありとあらゆる組み合わせが個別にかつ明示的に開示されているかのように本明細書に開示されることが意図される。加えて、様々な実施形態及びその要素の全ての部分的な組み合わせもまた、本開示によって具体的に包含され、ありとあらゆるかかる部分的な組み合わせが本明細書に個別にかつ明示的に開示されているかのように本明細書に開示される。

【0062】

ＩＩ．ＢＣＬ１１Ａ遺伝子の遺伝子編集のためのシステム
第１の態様では、本開示は、システムを提供し、当該システムは、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子産物の発現を低減又は排除するために、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子を改変又は編集するのに使用するための、クラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼタンパク質と、１つ以上のガイド核酸（guide nucleic acid、ｇＲＮＡ）と、を含む。例示的なクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼタンパク質及びガイド核酸システムとしては、ＣａｓＸ：ｇＲＮＡシステムが挙げられる。ＣａｓＸ：ｇＲＮＡシステムは、真核細胞においてＢＣＬ１１Ａ遺伝子を改変するように特別に設計されている。場合によっては、ＣａｓＸ：ｇＲＮＡシステムは、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子をノックダウン又はノックアウトするように設計される。一般に、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子の任意の部分は、本明細書に提供されるプログラム可能な組成物及び方法を使用して標的化され得る。いくつかの実施形態では、改変されるＢＣＬ１１Ａ遺伝子は、野生型配列であり、改変される部分は、ＢＣＬ１１Ａイントロン、ＢＣＬ１１Ａエキソン、ＢＣＬ１１Ａイントロン－エキソン接合部、ＢＣＬ１１Ａ調節エレメント、及び遺伝子間領域からなる群から選択されるか、又は改変は、１つ以上のエキソンの欠失若しくは変異である。

【0063】

本明細書で使用される場合、本開示のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼタンパク質及び１つ以上のｇＲＮＡ、並びに本開示のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼタンパク質及びｇＲＮＡをコードする核酸、並びに本開示の核酸又はＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼタンパク質及び１つ以上のｇＲＮＡを含むベクターを含むシステムなどの「システム」は、用語「組成物」と互換的に使用される。

【0064】

ヒトＢＣＬ１１Ａ遺伝子（ＨＧＮＣ：１３２２１）は、以下の配列を有するタンパク質（Ｑ９Ｈ１６５）をコードする。
ＭＳＲＲＫＱＧＫＰＱＨＬＳＫＲＥＦＳＰＥＰＬＥＡＩＬＴＤＤＥＰＤＨＧＰＬＧＡＰＥＧＤＨＤＬＬＴＣＧＱＣＱＭＮＦＰＬＧＤＩＬＩＦＩＥＨＫＲＫＱＣＮＧＳＬＣＬＥＫＡＶＤＫＰＰＳＰＳＰＩＥＭＫＫＡＳＮＰＶＥＶＧＩＱＶＴＰＥＤＤＤＣＬＳＴＳＳＲＧＩＣＰＫＱＥＨＩＡＤＫＬＬＨＷＲＧＬＳＳＰＲＳＡＨＧＡＬＩＰＴＰＧＭＳＡＥＹＡＰＱＧＩＣＫＤＥＰＳＳＹＴＣＴＴＣＫＱＰＦＴＳＡＷＦＬＬＱＨＡＱＮＴＨＧＬＲＩＹＬＥＳＥＨＧＳＰＬＴＰＲＶＧＩＰＳＧＬＧＡＥＣＰＳＱＰＰＬＨＧＩＨＩＡＤＮＮＰＦＮＬＬＲＩＰＧＳＶＳＲＥＡＳＧＬＡＥＧＲＦＰＰＴＰＰＬＦＳＰＰＰＲＨＨＬＤＰＨＲＩＥＲＬＧＡＥＥＭＡＬＡＴＨＨＰＳＡＦＤＲＶＬＲＬＮＰＭＡＭＥＰＰＡＭＤＦＳＲＲＬＲＥＬＡＧＮＴＳＳＰＰＬＳＰＧＲＰＳＰＭＱＲＬＬＱＰＦＱＰＧＳＫＰＰＦＬＡＴＰＰＬＰＰＬＱＳＡＰＰＰＳＱＰＰＶＫＳＫＳＣＥＦＣＧＫＴＦＫＦＱＳＮＬＶＶＨＲＲＳＨＴＧＥＫＰＹＫＣＮＬＣＤＨＡＣＴＱＡＳＫＬＫＲＨＭＫＴＨＭＨＫＳＳＰＭＴＶＫＳＤＤＧＬＳＴＡＳＳＰＥＰＧＴＳＤＬＶＧＳＡＳＳＡＬＫＳＶＶＡＫＦＫＳＥＮＤＰＮＬＩＰＥＮＧＤＥＥＥＥＥＤＤＥＥＥＥＥＥＥＥＥＥＥＥＥＬＴＥＳＥＲＶＤＹＧＦＧＬＳＬＥＡＡＲＨＨＥＮＳＳＲＧＡＶＶＧＶＧＤＥＳＲＡＬＰＤＶＭＱＧＭＶＬＳＳＭＱＨＦＳＥＡＦＨＱＶＬＧＥＫＨＫＲＧＨＬＡＥＡＥＧＨＲＤＴＣＤＥＤＳＶＡＧＥＳＤＲＩＤＤＧＴＶＮＧＲＧＣＳＰＧＥＳＡＳＧＧＬＳＫＫＬＬＬＧＳＰＳＳＬＳＰＦＳＫＲＩＫＬＥＫＥＦＤＬＰＰＡＡＭＰＮＴＥＮＶＹＳＱＷＬＡＧＹＡＡＳＲＱＬＫＤＰＦＬＳＦＧＤＳＲＱＳＰＦＡＳＳＳＥＨＳＳＥＮＧＳＬＲＦＳＴＰＰＧＥＬＤＧＧＩＳＧＲＳＧＴＧＳＧＧＳＴＰＨＩＳＧＰＧＰＧＲＰＳＳＫＥＧＲＲＳＤＴＣＥＹＣＧＫＶＦＫＮＣＳＮＬＴＶＨＲＲＳＨＴＧＥＲＰＹＫＣＥＬＣＮＹＡＣＡＱＳＳＫＬＴＲＨＭＫＴＨＧＱＶＧＫＤＶＹＫＣＥＩＣＫＭＰＦＳＶＹＳＴＬＥＫＨＭＫＫＷＨＳＤＲＶＬＮＮＤＩＫＴＥ（配列番号１００）。ＢＣＬ１１Ａ遺伝子は、第２染色体上のヒトゲノムのｃｈｒ２ ６０４５０５２０－６０５５４４６７（ＧＲＣｈ３８／ｈｇ３８ Ｅｎｓｅｍｂｌ １００）にわたる配列として定義される。

【0065】

いくつかの実施形態では、本開示は、対象において、インビトロ、エクスビボ、又はインビボのいずれかで、真核細胞におけるＢＣＬ１１Ａ遺伝子を改変するように特別に設計されたシステムを提供する。一般に、ＢＣＬ１１Ａ標的核酸の任意の部分は、本明細書に提供されるプログラム可能な組成物及び方法を使用して標的化され得る。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、クラス２、Ｖ型ヌクレアーゼである。クラス２ Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムのメンバーには相違点があるが、それらは、それらをＣａｓ９システムと区別するいくつかの共通の特徴を共有する。まず、Ｖ型ヌクレアーゼは、ＲｕｖＣドメインを含むがＨＮＨドメインを含まないＲＮＡ誘導型の単一エフェクターを有し、非標的鎖上の標的領域の５’上流のＴ－リッチＰＡＭを認識する。これは、標的配列の３’側でＧ－リッチＰＡＭに依存するＣａｓ９システムとは異なる。Ｖ型ヌクレアーゼは、ＰＡＭに近い近位部位に平滑末端を生成するＣａｓ９とは異なり、ＰＡＭ配列に対して遠位にずれた二本鎖切断を生成する。加えて、Ｖ型ヌクレアーゼは、標的ｄｓＤＮＡ又はシスで結合するｓｓＤＮＡによって活性化されると、ｓｓＤＮＡをトランスで分解する。いくつかの実施形態では、本開示は、Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｃ、Ｃａｓ１２ｄ（ＣａｓＹ）、Ｃａｓ１２ｊ、Ｃａｓ１２ｋ、ＣａｓＺ、及びＣａｓＸからなる群から選択されるクラス２、Ｖ型ヌクレアーゼを提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、ＣａｓＸ：ｇＲＮＡシステムとして、１つ以上のＣａｓＸタンパク質と、１つ以上のガイド核酸（ｇＲＮＡ）と、を含むシステムを提供する。他の実施形態では、本開示のＣａｓＸ：ｇＲＮＡシステムは、１つ以上のＣａｓＸタンパク質と、１つ以上のガイド核酸（ｇＲＮＡ）と、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子の一部をコードする核酸を含む１つ以上のドナー鋳型核酸と、を含み、ドナー鋳型核酸が、ＢＣＬ１１Ａタンパク質をコードするゲノム核酸配列と比較して、１つ以上のヌクレオチドの欠失、挿入、又は変異を含む。これらの成分の各々及びＢＣＬ１１Ａ遺伝子の編集におけるそれらの使用は、以下で本明細書に記載される。

【0066】

いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載の実施形態のいずれかのＣａｓＸ及びｇＲＮＡの遺伝子編集ペアを提供し、これは、遺伝子編集のためにそれらを使用する前に一緒に結合することができ、したがって、リボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）として「前複合体化（pre-complexed）」している。前複合体化したＲＮＰの使用は、標的核酸配列の編集のための細胞又は標的核酸配列へのシステム成分の送達において利点を付与する。

【0067】

いくつかの実施形態では、機能的ＲＮＰは、電気泳動又は化学的手段によって、エクスビボで細胞に送達され得る。他の実施形態では、機能的ＲＮＰは、それらの機能的形態でベクターによってエクスビボ又はインビボのいずれかで送達され得る。いくつかの実施形態では、ＲＮＰは、ＣａｓＸ送達粒子（ＸＤＰ）を使用して、対象にインビボで送達され得る。ｇＲＮＡは、標的核酸配列の配列に相補的なヌクレオチド配列を有する標的化配列（又は「スペーサー」）を含むことによって、複合体に標的特異性を提供することができる。一方、前複合体化したＣａｓＸ：ｇＲＮＡのＣａｓＸバリアントタンパク質は、ｇＲＮＡとのその会合によって標的核酸配列内の標的部位に誘導される（例えば、標的部位で安定化される）、標的配列の切断又はニッキングなどの部位特異的活性を提供する。

【0068】

システムは、異常ヘモグロビン症の疾患（例えば、鎌状赤血球貧血又はβサラセミア）を有する対象の治療において有用である。ＣａｓＸ：ｇＲＮＡシステムの成分、それらの機能、及び細胞における標的核酸の編集におけるそれらの使用の各々は、以下で更に詳しく説明される。

【0069】

ＩＩＩ．遺伝子編集のためのシステムのガイド核酸
別の態様では、本開示は、特別に設計されたガイドリボ核酸（ｇＲＮＡ）に関し、当該ｇＲＮＡは、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子の標的核酸配列に相補的な（したがって、それとハイブリダイズすることができる）標的化配列を含み、これは、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと複合体化した場合、細胞におけるＢＣＬ１１Ａ標的核酸のゲノム編集において有用である。いくつかの実施形態では、複数のｇＲＮＡが、標的核酸の改変のためにシステムにおいて送達されることが想定される。例えば、遺伝子内の２つの異なる部位又は重複する部位で結合及び切断するために、各々がＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと複合体化する場合、標的核酸配列の異なる領域又は重複する領域に対する標的化配列を有する一対のｇＲＮＡを使用することができ、次いで、遺伝子は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）、相同組換え修復（ＨＤＲ）、相同性非依存性標的化組み込み（homology-independent targeted integration、ＨＩＴＩ）、マイクロホモロジー媒介末端結合（micro-homology mediated end joining、ＭＭＥＪ）、一本鎖アニーリング（single strand annealing、ＳＳＡ）、又は塩基除去修復（base excision repair、ＢＥＲ）によって編集される。

【0070】

いくつかの実施形態では、本開示は、ＣａｓＸ：ｇＲＮＡシステムにおいて利用されるｇＲＮＡを提供し、これは、真核細胞におけるＢＣＬ１１Ａ遺伝子のゲノム編集において有用である。特定の実施形態では、システムのｇＲＮＡは、ＣａｓＸヌクレアーゼと複合体を形成することができる。本開示は、特別に設計されたｇＲＮＡを提供し、ｇＲＮＡの標的化配列（又はスペーサー、以下でより詳細に記載される）は、遺伝子編集ＣａｓＸ：ｇＲＮＡシステムの成分として使用される場合、標的核酸配列に相補的である（したがって、それとハイブリダイズすることができる）。表１に、本実施形態のｇＲＮＡで利用することができるＢＣＬ１１Ａ標的核酸に対する標的化配列の代表的であるが非限定的な例の配列番号を提示し、以下でより詳細に記載される。

【0071】

ａ．参照ｇＲＮＡ及びｇＲＮＡバリアント
本明細書で使用される場合、「参照ｇＲＮＡ」は、天然に存在するｇＲＮＡの野生型配列を含むＣＲＩＳＰＲガイド核酸を指す。いくつかの実施形態では、本開示の参照ｇＲＮＡは、参照ｇＲＮＡと比較して増強された又は異なる特性を有する１つ以上のｇＲＮＡバリアントを生成するために、１つ以上の変異誘発方法（例えば、網羅的変異進化（Deep Mutational Evolution、ＤＭＥ）、網羅的変異スキャニング（deep mutational scanning、ＤＭＳ）、エラープローンＰＣＲ、カセット変異誘発、ランダム変異誘発、付着伸長ＰＣＲ、遺伝子シャッフリング、又はドメインスワッピングを含み得る、本明細書に記載される変異誘発方法）に供され得る。ｇＲＮＡバリアントはまた、例えば、５’末端若しくは３’末端のいずれかに融合された又は内部に挿入された、１つ以上の外因性配列を含むバリアントも含む。参照ｇＲＮＡの活性は、それに対してｇＲＮＡバリアントの活性が比較されるベンチマークとして使用されてもよく、それによって、ｇＲＮＡバリアントの機能又は他の特徴の改善が測定される。他の実施形態では、参照ｇＲＮＡは、ｇＲＮＡバリアント（例えば、合理的に設計されたバリアント）を産生するために、１つ以上の意図的な特異的に標的化された変異に供され得る。

【0072】

本開示のｇＲＮＡは、２つのセグメントである標的化配列及びタンパク質結合セグメントを含む。ｇＲＮＡの標的化セグメントは、以下でより詳細に記載される標的核酸配列（例えば、標的ｓｓＲＮＡ、標的ｓｓＤＮＡ、二本鎖標的ＤＮＡの鎖など）内の特定の配列（標的部位）に相補的である（したがって、それとハイブリダイズする）ヌクレオチド配列（互換的に、ガイド配列、スペーサー、ターゲッター、又は標的化配列と称される）を含む。ｇＲＮＡの標的化配列は、標的核酸配列（コード配列、コード配列の相補体、非コード配列を含む）及び調節エレメントに結合することができる。タンパク質結合セグメント（又は「アクチベーター」若しくは「タンパク質結合配列」）は、ＲＮＰを形成する複合体として、ＣａｓＸタンパク質と相互作用（例えば、結合）する（以下でより詳細に記載される）。代替的には、タンパク質結合セグメントは、本明細書で「足場（scaffold）」と呼ばれ、これは、いくつかの領域から構成される（以下でより詳細に記載される）。

【0073】

デュアルガイドＲＮＡ（ｄｇＲＮＡ）の場合、ターゲッター部分及びアクチベーター部分は各々、二重鎖形成セグメントを有し、ターゲッターの二重鎖形成セグメント及びアクチベーターの二重鎖形成セグメントは、互いに相補性を有し、互いにハイブリダイズして二本鎖の二重鎖（ｇＲＮＡについてはｄｓＲＮＡ二重鎖）を形成する。ｇＲＮＡがｇＲＮＡである場合、「ターゲッター」又は「ターゲッターＲＮＡ」という用語は、本明細書において、ＣａｓＸデュアルガイドＲＮＡの（したがって、「アクチベーター」及び「ターゲッター」が、例えば、介在ヌクレオチドによって一緒に連結されている場合、ＣａｓＸシングルガイドＲＮＡの）ｃｒＲＮＡ様分子（ｃｒＲＮＡ：「ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ」）を指すために使用される。ｃｒＲＮＡは、ｔｒａｃｒＲＮＡとアニーリングする５’領域、続いて、標的化配列のヌクレオチドを有する。したがって、例えば、ガイドＲＮＡ（ｄｇＲＮＡ又はｓｇＲＮＡ）は、ガイド配列と、ｃｒＲＮＡの二重鎖形成セグメント（ｃｒＲＮＡリピートとも称され得る）と、を含む。対応するｔｒａｃｒＲＮＡ様分子（アクチベーター）はまた、ガイドＲＮＡのタンパク質結合セグメントのｄｓＲＮＡ二重鎖の他の半分を形成するヌクレオチドの二重鎖形成ストレッチも含む。したがって、ターゲッター及びアクチベーターは、対応する対としてハイブリダイズして、デュアルガイドＮＡ（本明細書において「デュアルガイドＮＡ」、「二種分子ｇＲＮＡ」、「ｄｇＲＮＡ」、「二種分子ガイドＮＡ」、又は「２分子ガイドＮＡ」と呼ばれる）を形成する。ＣａｓＸタンパク質による標的核酸配列（例えば、ゲノムＤＮＡ）の部位特異的結合及び／又は切断は、ｇＲＮＡの標的化配列と標的核酸配列との間の塩基対形成の相補性によって決定される１つ以上の位置（例えば、標的核酸の配列）で起こり得る。したがって、例えば、本開示のｇＲＮＡは、ＴＣ ＰＡＭモチーフ（又はＡＴＣ、ＣＴＣ、ＧＴＣ、若しくはＴＴＣなどのＰＡＭ配列）に相補的な配列に隣接する標的核酸に相補的な配列を有し、したがって、標的核酸とハイブリダイズすることができる。ガイド配列の標的化配列は標的核酸配列の配列とハイブリダイズするので、ＰＡＭ配列の位置が考慮される限り、特定の標的核酸配列とハイブリダイズするように、使用者によってターゲッターが改変され得る。したがって、場合によっては、ターゲッターの配列は、天然に存在しない配列であり得る。他の場合では、ターゲッターの配列は、編集される遺伝子に由来する天然に存在する配列であり得る。他の実施形態では、ｇＲＮＡのアクチベーター及びターゲッターは、（互いにハイブリダイズするのではなく）互いに共有結合しており、単一分子（本明細書において、「単一分子ｇＲＮＡ」、「１分子ガイドＮＡ」、「シングルガイドＮＡ」、「シングルガイドＲＮＡ」、「単一分子ガイドＲＮＡ」、「１分子ガイドＲＮＡ」、又は「ｓｇＲＮＡ」と称される）を含む。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、「アクチベーター」又は「ターゲッター」を含み、したがって、それぞれ「アクチベーターＲＮＡ」及び「ターゲッターＲＮＡ」であり得る。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、リボ核酸分子（「ｇＲＮＡ」）であり、他の実施形態では、ｇＲＮＡは、キメラであり、ＤＮＡ及びＲＮＡの両方を含む。本明細書で使用される場合、ｇＲＮＡという用語は、天然に存在する分子、並びに配列バリアントを包含する。

【0074】

まとめると、本開示の構築されたｇＲＮＡは、４つの別個の領域又はドメイン：ＲＮＡ三重鎖、足場ステム、伸長ステム、及び標的化配列（本開示の実施形態では標的核酸に特異的であり、ｇＲＮＡの３’末端に位置する）を含む。ＲＮＡ三重鎖、足場ステム、及び伸長ステムは、合わせて、ｇＲＮＡの「足場」と称される。

【0075】

ｂ．ＲＮＡ三重鎖
本明細書に提供されるガイドＮＡ（参照ｓｇＲＮＡを含む）のいくつかの実施形態では、ＲＮＡ三重鎖が存在し、ＲＮＡ三重鎖が、２つの介在ステムループ（足場ステムループ及び伸長ステムループ）の後にＡＡＡＧで終わるＵＵＵ－ｎＸ（約４～１５）－ＵＵＵ（配列番号２２６）ステムループの配列を含み、三重鎖を越えて二重鎖シュードノットへと伸長してもよいシュードノットを形成する。三重鎖のＵＵ－ＵＵＵ－ＡＡＡ配列は、標的化配列、足場ステム、及び伸長ステムの間のネクサスとして形成される。例示的なＣａｓＸ ｓｇＲＮＡでは、ＵＵＵ－ループ－ＵＵＵ領域が最初にコードされ、次いで、足場ステムループがコードされ、次いで、テトラループによって連結された伸長ステムループがコードされ、次いで、ＡＡＡＧが三重鎖を閉じてから標的化配列になる。

【0076】

ｃ．足場ステムループ
本開示のｓｇＲＮＡのいくつかの実施形態では、三重鎖領域の後に足場ステムループが続く。足場ステムループは、ＣａｓＸタンパク質（例えば、参照又はＣａｓＸバリアントタンパク質）が結合するｇＲＮＡの領域である。いくつかの実施形態では、足場ステムループは、かなり短く安定なステムループである。場合によっては、足場ステムループは、多くの変化を許容せず、何らかの形態のＲＮＡバブルを必要とする。いくつかの実施形態では、足場ステムは、ＣａｓＸ ｓｇＲＮＡの機能に必要である。これは、おそらく、重要なステムループであるＣａｓ９のネクサスステムに類似しているが、ＣａｓＸ ｓｇＲＮＡの足場ステムは、いくつかの実施形態では、必要なバルジ（ＲＮＡバブル）を有し、これは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムで見出される多くの他のステムループとは異なる。いくつかの実施形態では、このバルジの存在は、異なるＣａｓＸタンパク質と相互作用するｓｇＲＮＡにわたって保存されている。ｇＲＮＡの足場ステムループ配列の例示的な配列は、配列ＣＣＡＧＣＧＡＣＵＡＵＧＵＣＧＵＡＵＧＧ（配列番号２０）を含む。

【0077】

ｄ．伸長ステムループ
本開示のＣａｓＸ ｓｇＲＮＡのいくつかの実施形態では、足場ステムループの後に伸長ステムループが続く。いくつかの実施形態では、伸長ステムは、主にＣａｓＸタンパク質が結合していない合成ｔｒａｃｒＲＮＡ及びｃｒＲＮＡ融合体を含む。いくつかの実施形態では、伸長ステムループは、高度に可鍛性であり得る。いくつかの実施形態では、シングルガイドｇＲＮＡは、伸長ステムループ中のｔｒａｃｒＲＮＡとｃｒＲＮＡとの間にＧＡＡＡテトラループリンカー又はＧＡＧＡＡＡリンカーを用いて作製される。場合によっては、ＣａｓＸ ｓｇＲＮＡのターゲッター及びアクチベーターは、介在ヌクレオチドによって互いに連結され、リンカーは、３～２０ヌクレオチドの長さを有し得る。本開示のＣａｓＸ ｓｇＲＮＡのいくつかの実施形態では、伸長ステムは、リボ核タンパク質複合体中のＣａｓＸタンパク質の外側に位置する大きな３２ｂｐのループである。ｓｇＲＮＡの伸長ステムループ配列の例示的な配列は、配列ＧＣＧＣＵＵＡＵＵＵＡＵＣＧＧＡＧＡＧＡＡＡＵＣＣＧＡＵＡＡＡＵＡＡＧＡＡＧＣ（配列番号２１）を含む。いくつかの実施形態では、伸長ステムループは、ＧＡＧＡＡＡスペーサー配列を含む。

【0078】

ｅ．標的化配列
本開示のｇＲＮＡのいくつかの実施形態では、伸長ステムループの後に、三重鎖の一部を形成する領域が続き、次いで、ｇＲＮＡの３’末端に標的化配列（又は「スペーサー」）が続く。標的化配列は、ＣａｓＸリボ核タンパク質ホロ複合体を、改変される遺伝子の標的核酸配列の特定の領域に標的化する。したがって、例えば、本開示のｇＲＮＡ標的化配列は、ＴＣ ＰＡＭモチーフ又はＰＡＭ配列ＴＴＣ、ＡＴＣ、ＧＴＣ、若しくはＣＴＣのうちのいずれか１つが、標的配列に相補的な非標的鎖配列に対して１ヌクレオチド５’側に位置する場合、ＲＮＰの成分として、真核細胞の核酸（例えば、真核生物の染色体、染色体配列、真核生物のＲＮＡなど）におけるＢＣＬ１１Ａ遺伝子の一部に相補的な（したがって、それにハイブリダイズすることができる）配列を有する。ｇＲＮＡの標的化配列は、ＰＡＭ配列の位置が考慮される限り、ｇＲＮＡが任意の所望の標的核酸配列の所望の配列を標的化することができるように改変することができる。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ足場は、標的配列の５’側にあり、標的化配列が、ｇＲＮＡの３’末端にある。いくつかの実施形態では、ＲＮＰのヌクレアーゼによって認識されるＰＡＭモチーフ配列は、ＴＣである。他の実施形態では、ＲＮＰのヌクレアーゼによって認識されるＰＡＭ配列は、ＮＴＣである。

【0079】

いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡの標的化配列は、ＢＣＬ１１Ａタンパク質をコードする遺伝子の一部に特異的である。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡの標的化配列は、ＢＣＬ１１Ａのエキソンに特異的である。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡの標的化配列は、ＢＣＬ１１Ａのイントロンに特異的である。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡの標的化配列は、ＢＣＬ１１Ａのイントロン－エキソン接合部に特異的である。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡの標的化配列は、ＢＣＬ１１Ａの調節エレメント、ＢＣＬ１１Ａのコード領域、ＢＣＬ１１Ａの非コード領域、又はこれらの組み合わせ（例えば、２つの領域の共通部分）とハイブリダイズする配列を有する。いくつかの実施形態では、調節エレメントは、ＧＡＴＡ結合配列を含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡの標的化配列は、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子又はその相補体の１つ以上の一塩基多型（single nucleotide polymorphism、ＳＮＰ）を含む配列に相補的である。ＢＣＬ１１Ａのコード配列内又はＢＣＬ１１Ａの非コード配列内にあるＳＮＰは、両方とも本開示の範囲内である。他の実施形態では、ｇＲＮＡの標的化配列は、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子の遺伝子間領域の配列に相補的であるか、又はＢＣＬ１１Ａ遺伝子の遺伝子間領域に相補的な配列である。

【0080】

いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡの標的化配列は、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子産物の発現を調節する調節エレメントに特異的であるように設計される。かかる調節エレメントとしては、プロモーター領域、エンハンサー領域、遺伝子間領域、５’非翻訳領域（5’untranslated region、５’ＵＴＲ）、３’非翻訳領域（3’untranslated region、３’ＵＴＲ）、保存されたエレメント、及びシス調節エレメントを含む領域が挙げられるが、これらに限定されない。プロモーター領域は、コード配列の開始点から５ｋｂ以内のヌクレオチドを包含することが意図され、又は遺伝子エンハンサーエレメント若しくは保存されたエレメントの場合、標的核酸の遺伝子のコード配列から数千塩基対（ｂｐ）、数十万ｂｐ、又は数百万ｂｐ離れていてもよい。特定の実施形態では、ｇＲＮＡの標的化配列は、ＢＣＬ１１Ａの調節エレメントに相補的な配列とハイブリダイズする。一実施形態では、ｇＲＮＡの標的化配列は、ＵＧＧＡＧＣＣＵＧＵＧＡＵＡＡＡＡＧＣＡ（配列番号２２）であり、これは、ＢＣＬ１１Ａ ＧＡＴＡ１赤血球系特異的エンハンサー結合部位配列とハイブリダイズするか、又はそれと少なくとも９０％若しくは少なくとも９５％の配列同一性を有する（図２３を参照）。別の実施形態では、ｇＲＮＡの標的化配列は、ＵＧＣＵＵＵＵＡＵＣＡＣＡＧＧＣＵＣＣＡ（配列番号２３）であるか、又はそれと少なくとも９０％若しくは少なくとも９５％の配列同一性を有する。別の実施形態では、ｇＲＮＡの標的化配列は、ＵＧＣＵＵＵＵＡＵＣＡＣＡＧＧＣＵＣＣＡ（配列番号２３）であるか、又はそれと少なくとも９０％若しくは少なくとも９５％の配列同一性を有する。他の実施形態では、ｇＲＮＡの標的化配列は、ＣＡＧＧＣＵＣＣＡＧＧＡＡＧＧＧＵＵＵＧ（配列番号２９４９）、ＧＡＧＧＣＣＡＡＡＣＣＣＵＵＣＣＵＧＧＡ（配列番号２９４８）、ＡＧＵＧＣＡＡＧＣＵＡＡＣＡＧＵＵＧＣＵ（配列番号１５７４７）、及びＡＵＡＣＡＡＣＵＵＵＧＡＡＧＣＵＡＧＵＣ（配列番号１５７４８）からなる群から選択される。

【0081】

出生後に成熟している対象において、ＧＡＴＡ１の結合は、ＢＣＬ１１Ａの発現を増強し、これが次に、ヘモグロビンγに有利に、ヘモグロビンＦ（ＨｂＦ）の発現を抑制する。しかし、特定の異常ヘモグロビン症を有する対象においてＢＣＬ１１Ａの発現を抑制すると、ＨｂＦの発現が再開することが実証されており、さもなければ欠陥のあるヘモグロビンを、対象において補償することができる。

【0082】

いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡの標的化配列は、１４～３５個の連続したヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、標的化配列は、１４、１５、１６、１８、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、又は３５個の連続したヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、標的化配列は、２０個の連続したヌクレオチドからなる。いくつかの実施形態では、標的化配列は、１９個の連続したヌクレオチドからなる。いくつかの実施形態では、標的化配列は、１８個の連続したヌクレオチドからなる。いくつかの実施形態では、標的化配列は、１７個の連続したヌクレオチドからなる。いくつかの実施形態では、標的化配列は、１６個の連続したヌクレオチドからなる。いくつかの実施形態では、標的化配列は、１５個の連続したヌクレオチドからなる。いくつかの実施形態では、標的化配列は、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、又は３５個の連続したヌクレオチドを有し、標的化配列は、標的核酸配列に対して０～５、０～４、０～３、又は０～２個のミスマッチを含むことができ、標的化配列を含むｇＲＮＡを含むＲＮＰが標的核酸に対して相補的な結合を形成することができるように十分な結合特異性を保持することができる。

【0083】

本開示のｇＲＮＡにおける使用のために企図される標的核酸配列に対する標的化配列の代表的であるが非限定的な例は、配列番号２７２～２１００及び２２８６～２６７８９として提示される（表１を参照）。いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号２７２～２１００又は２２８６～５６２５の配列と少なくとも５０％同一、少なくとも５５％同一、少なくとも６０％同一、少なくとも６５％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、又は１００％同一である配列を含むＡＴＣ ＰＡＭの標的化配列を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号２７２～２１００又は２２８６～５６２５の配列を含むＡＴＣ ＰＡＭの標的化配列を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号５６２６～１３６１６の配列と少なくとも５０％同一、少なくとも５５％同一、少なくとも６０％同一、少なくとも６５％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、又は１００％同一である配列を含むＣＴＣ ＰＡＭの標的化配列を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号５６２６～１３６１６の配列を含むＣＴＣ ＰＡＭの標的化配列を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号１３６１７～１７９０３の配列と少なくとも５０％同一、少なくとも５５％同一、少なくとも６０％同一、少なくとも６５％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、又は１００％同一である配列を含むＧＴＣ ＰＡＭの標的化配列を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号１３６１７～１７９０３の配列を含むＧＴＣ ＰＡＭの標的化配列を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号１７９０４～２６７８９の配列と少なくとも５０％同一、少なくとも５５％同一、少なくとも６０％同一、少なくとも６５％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、又は１００％同一である配列を含むＴＴＣ ＰＡＭの標的化配列を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号１７９０４～２６７８９の配列を含むＴＴＣ ＰＡＭに対する標的化配列を提供する。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡの本開示のｇＲＮＡにおける使用のために企図される標的化配列は、配列の３’末端から単一のヌクレオチドが除去された配列番号２７２～２１００又は２２８６～２６７８９の配列を含む。他の実施形態では、ｇＲＮＡの標的化配列は、配列の３’末端から２つのヌクレオチドが除去された配列番号２７２～２１００又は２２８６～２６７８９の配列を含む。他の実施形態では、ｇＲＮＡの標的化配列は、配列の３’末端から３つのヌクレオチドが除去された配列番号２７２～２１００又は２２８６～２６７８９の配列を含む。他の実施形態では、ｇＲＮＡの標的化配列は、配列の３’末端から４つのヌクレオチドが除去された配列番号２７２～２１００又は２２８６～２６７８９の配列を含む。他の実施形態では、ｇＲＮＡの標的化配列は、配列の３’末端から５つのヌクレオチドが除去された配列番号２７２～２１００又は２２８６～２６７８９の配列を含む。段落の前述の実施形態では、チミン（Ｔ）ヌクレオチドは、ｇＲＮＡ標的化配列がｇＤＮＡ若しくはｇＲＮＡ、又はＲＮＡ及びＤＮＡのキメラであり得るように、又はスペーサーのコード配列が発現ベクターに組み込まれる場合に、標的化配列のいずれかにおいてウラシル（Ｕ）ヌクレオチドの１つ以上又は全てを置換することができる。いくつかの実施形態では、配列番号２７２～２１００又は２２８６～２６７８９の標的化配列は、ウラシルヌクレオチドに置換される少なくとも１、２、３、４、５、若しくは６個、又はそれ以上のチミンヌクレオチドを有する。

【0084】

【表1】

【0085】

いくつかの実施形態では、ＣａｓＸ：ｇＲＮＡシステムは、第１のｇＲＮＡを含み、第２（及び任意選択的に、第３、第４、第５、又はそれ以上）のｇＲＮＡを更に含み、第２のｇＲＮＡ又は追加のｇＲＮＡが、第１のｇＲＮＡの標的化配列と比較して、標的核酸配列の異なる部分又は重複する部分に相補的な標的化配列を有し、その結果、標的核酸において複数の点が標的化され、例えば、ＣａｓＸによって標的核酸において複数の切断が導入される。そのような場合、第２の又は追加のｇＲＮＡは、ＣａｓＸタンパク質の追加のコピーと複合体化されることが理解されるであろう。ｇＲＮＡの標的化配列の選択によって、標的核酸内の特定の位置を囲む標的核酸配列の規定された領域を、本明細書に記載のＣａｓＸ：ｇＲＮＡシステムを使用して改変又は編集することができ、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子の変異を含むドナー鋳型の挿入を容易にすることを含む。特定の実施形態では、第２のｇＲＮＡは、ＧＡＴＡ１結合部位が破壊されるように、５’又は３’側でＧＡＴＡ１結合部位に隣接する配列に相補的な標的化配列を含み得る。

【0086】

ｆ．ｇＲＮＡ足場
標的化配列ドメインを除いて、ｇＲＮＡの残りの成分は、本明細書において足場と称される。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ足場は、参照ｇＲＮＡとして以下に記載される天然に存在する配列に由来する。他の実施形態では、ｇＲＮＡ足場は、参照ｇＲＮＡのバリアントであり、変異、挿入、欠失、又はドメイン置換が導入されて、ｇＲＮＡに望ましい若しくは改善された特性を付与する。

【0087】

ポリヌクレオチド又はアミノ酸配列に関して「に隣接する」という用語は、ポリヌクレオチド又はポリペプチドにおいて互いに隣にある又は隣接する配列を指す。当業者は、２つの配列が互いに隣接していると考えることができ、それでも限定された量の介在配列、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個のヌクレオチド又はアミノ酸を包含することを理解するであろう。

【0088】

表２は、参照ｇＲＮＡ ｔｒａｃｒの配列及び足場配列を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、ｇＲＮＡ配列を提供し、ｇＲＮＡが、表２に示される配列番号４～１６の配列、又は表２の配列番号４～１６のうちのいずれか１つの配列を有する参照ｇＲＮＡ配列と比較して少なくとも１つのヌクレオチド改変を有する配列を含む足場を有する。ベクターがｇＲＮＡの配列をコードするＤＮＡを含むか又はｇＲＮＡがＲＮＡ及びＤＮＡのキメラである実施形態では、チミン（Ｔ）塩基が、本明細書に記載のｇＲＮＡ配列の実施形態のいずれかのウラシル（Ｕ）塩基に置換され得ることが理解されるであろう。

【0089】

【表2】

【0090】

ｇ．ｇＲＮＡバリアント
別の態様では、本開示は、参照ｇＲＮＡ足場と比較して１つ以上の改変を含むガイド核酸バリアント（本明細書において、代替的に「ｇＲＮＡバリアント」又は「ｇＲＮＡバリアント」と称される）に関する。本明細書で使用される場合、「足場」とは、標的化配列を除いて、ｇＲＮＡの機能に必要なｇＲＮＡの全ての部分を指す。

【0091】

いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡバリアントは、本開示の参照ｇＲＮＡ配列と比較して、１つ以上のヌクレオチド置換、挿入、欠失、又はスワップ若しくは置換された領域を含む。いくつかの実施形態では、変異は、ｇＲＮＡバリアントを生成するために、参照ｇＲＮＡ足場の任意の領域において生じ得る。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡバリアント配列の足場は、配列番号４又は配列番号５の配列と少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、又は少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％の同一性を有する。

【0092】

いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡバリアントは、参照ｇＲＮＡと比較して、特徴を改善する参照ｇＲＮＡの１つ以上の領域内に１つ以上のヌクレオチド変化を含む。例示的な領域としては、ＲＮＡ三重鎖、シュードノット、足場ステムループ、及び伸長ステムループが挙げられる。場合によっては、バリアント足場ステムは、バブルを更に含む。他の場合では、バリアント足場は、三重鎖ループ領域を更に含む。更に他の場合では、バリアント足場は、５’非構造化領域を更に含む。一実施形態では、ｇＲＮＡバリアント足場は、配列番号１４と少なくとも６０％の配列同一性を有する足場ステムループを含む。別の実施形態では、ｇＲＮＡバリアントは、ＣＣＡＧＣＧＡＣＵＡＵＧＵＣＧＵＡＧＵＧＧ（配列番号２５）の配列を有する足場ステムループを含む。別の実施形態では、本開示は、配列番号５に対して、Ｃ１８Ｇ置換、Ｇ５５挿入、Ｕ１欠失、並びに改変された伸長ステムループ（元の６ｎｔループ及びループに対して最も近位の（ｍｏｓｔ－ｌｏｏｐ－ｐｒｏｘｉｍａｌ）１３塩基対（合計３２ヌクレオチド）が、Ｕｖｓｘヘアピン（４ｎｔループ及びループに対して最も近位の５塩基対；合計１４ヌクレオチド）に置換され、伸長ステムのループに対して遠位の（ｌｏｏｐ－ｄｉｓｔａｌ）塩基が、Ａ９９欠失及びＧ６４Ｕ置換によって新しいＵｖｓｘヘアピンに隣接する完全に塩基対合したステムに変換された）を提供する。前述の実施形態では、ｇＲＮＡ足場は、配列ＡＣＵＧＧＣＧＣＵＵＵＵＡＵＣＵＧＡＵＵＡＣＵＵＵＧＡＧＡＧＣＣＡＵＣＡＣＣＡＧＣＧＡＣＵＡＵＧＵＣＧＵＡＧＵＧＧＧＵＡＡＡＧＣＵＣＣＣＵＣＵＵＣＧＧＡＧＧＧＡＧＣＡＵＣＡＡＡＧ（配列番号２２３８）を含む。

【0093】

１つ以上の改善された機能若しくは特徴を有するか、又はバリアントｇＲＮＡを本明細書に記載の参照ｇＲＮＡと比較した場合に１つ以上の新たな機能を追加する、全てのｇＲＮＡバリアントが、本開示の範囲内であると想定される。かかるｇＲＮＡバリアントの代表例は、ガイド１７４（配列番号２２３８）であり、その設計（及び設計の根拠）は、実施例に記載されている。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡバリアントは、ｇＲＮＡバリアントを含むＲＮＰに新たな機能を追加する。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡバリアントは、以下から選択される改善された特徴を有する：安定性の改善、溶解度の改善、ｇＲＮＡの転写の改善、ヌクレアーゼ活性に対する耐性の改善、ｇＲＮＡのフォールディング率の増加、フォールディング中の副生成物形成の減少、生産的なフォールディングの増加、ＣａｓＸタンパク質に対する結合親和性の改善、ＣａｓＸタンパク質と複合体化した場合の標的ＤＮＡに対する結合親和性の改善、ＣａｓＸタンパク質と複合体化した場合の遺伝子編集の改善、ＣａｓＸタンパク質と複合体化した場合の編集の特異性の改善、及びＣａｓＸタンパク質と複合体化した場合の標的ＤＮＡの編集におけるＡＴＣ、ＣＴＣ、ＧＴＣ、若しくはＴＴＣを含む１つ以上のより広範囲のＰＡＭ配列を利用する能力の改善、又はそれらの任意の組み合わせ。場合によっては、ｇＲＮＡバリアントの改善された特徴のうちの１つ以上は、配列番号４又は配列番号５の参照ｇＲＮＡと比較して、少なくとも約１．１～約１００，０００倍改善されている。他の場合では、ｇＲＮＡバリアントの１つ以上の改善された特徴は、配列番号４又は配列番号５の参照ｇＲＮＡと比較して、少なくとも約１．１倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約１０００倍、少なくとも約１０，０００倍、少なくとも約１００，０００倍、又はそれ以上改善されている。他の場合では、ｇＲＮＡバリアントの改善された特徴のうちの１つ以上は、配列番号４又は配列番号５の参照ｇＲＮＡと比較して、約１．１～１００，００倍、約１．１～１０，００倍、約１．１～１，０００倍、約１．１～５００倍、約１．１～１００倍、約１．１～５０倍、約１．１～２０倍、約１０～１００，００倍、約１０～１０，００倍、約１０～１，０００倍、約１０～５００倍、約１０～１００倍、約１０～５０倍、約１０～２０倍、約２～７０倍、約２～５０倍、約２～３０倍、約２～２０倍、約２～１０倍、約５～５０倍、約５～３０倍、約５～１０倍、約１００～１００，００倍、約１００～１０，００倍、約１００～１，０００倍、約１００～５００倍、約５００～１００，００倍、約５００～１０，００倍、約５００～１，０００倍、約５００～７５０倍、約１，０００～１００，００倍、約１０，０００～１００，００倍、約２０～５００倍、約２０～２５０倍、約２０～２００倍、約２０～１００倍、約２０～５０倍、約５０～１０，０００倍、約５０～１，０００倍、約５０～５００倍、約５０～２００倍、又は約５０～１００倍改善されている。他の場合では、ｇＲＮＡバリアントの１つ以上の改善された特徴は、配列番号４又は配列番号５の参照ｇＲＮＡと比較して、約１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１３倍、１４倍、１５倍、１６倍、１７倍、１８倍、１９倍、２０倍、２５倍、３０倍、４０倍、４５倍、５０倍、５５倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、１１０倍、１２０倍、１３０倍、１４０倍、１５０倍、１６０倍、１７０倍、１８０倍、１９０倍、２００倍、２１０倍、２２０倍、２３０倍、２４０倍、２５０倍、２６０倍、２７０倍、２８０倍、２９０倍、３００倍、３１０倍、３２０倍、３３０倍、３４０倍、３５０倍、３６０倍、３７０倍、３８０倍、３９０倍、４００倍、４２５倍、４５０倍、４７５倍、又は５００倍改善されている。

【0094】

いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡバリアントは、本開示のｇＲＮＡバリアントを生成するために、参照ｇＲＮＡを１つ以上の変異誘発方法、例えば、以下で本明細書に記載される変異誘発方法に供することによって作製することができ、これには、網羅的変異進化（ＤＭＥ）、網羅的変異スキャニング（ＤＭＳ）、エラープローンＰＣＲ、カセット変異誘発、ランダム変異誘発、付着伸長ＰＣＲ、遺伝子シャッフリング、又はドメインスワッピングが含まれ得る。参照ｇＲＮＡの活性は、それに対してｇＲＮＡバリアントの活性が比較されるベンチマークとして使用されてもよく、それによって、参照ｇＲＮＡと比較して、ｇＲＮＡバリアントの機能の改善が測定される。他の実施形態では、参照ｇＲＮＡは、ｇＲＮＡバリアント（例えば、合理的に設計されたバリアント）を産生するために、１つ以上の意図的に標的化された変異、置換、又はドメインスワップに供され得る。かかる方法によって産生される例示的なｇＲＮＡバリアントは、実施例に記載されており、ｇＲＮＡ足場の代表的な配列は、表３に提示されている。

【0095】

いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡバリアントは、参照ガイド核酸足場配列と比較して、１つ以上の改変を含み、１つ以上の改変が、以下から選択される：ｇＲＮＡバリアントの領域における少なくとも１つのヌクレオチド置換、ｇＲＮＡバリアントの領域における少なくとも１つのヌクレオチド欠失、ｇＲＮＡバリアントの領域における少なくとも１つのヌクレオチド挿入、ｇＲＮＡバリアントの領域の全部若しくは一部の置換、ｇＲＮＡバリアントの領域の全部若しくは一部の欠失、又は上記の任意の組み合わせ。場合によっては、改変は、ｇＲＮＡバリアントの１つ以上の領域における１～１５個の連続した又は連続していないヌクレオチドの置換である。他の場合では、改変は、ｇＲＮＡバリアントの１つ以上の領域における１～１０個の連続した又は連続していないヌクレオチドの欠失である。他の場合では、改変は、ｇＲＮＡバリアントの１つ以上の領域における１～１０個の連続した又は連続していないヌクレオチドの挿入である。他の場合では、改変は、足場ステムループ又は伸長ステムループの、近位の５’末端及び３’末端を有する異種ＲＮＡ源由来のＲＮＡステムループ配列による置換である。場合によっては、本開示のｇＲＮＡバリアントは、１つの領域に２つ以上の改変を含む。他の場合では、本開示のｇＲＮＡバリアントは、２つ以上の領域に改変を含む。他の場合では、ｇＲＮＡバリアントは、この段落に記載されている前述の改変の任意の組み合わせを含む。

【0096】

いくつかの実施形態では、＋１ヌクレオチドがＧである場合、Ｕ６プロモーターからの転写がより効率的であり、開始部位に関してより一貫性があるので、インビボでの発現のために、５’ＧがｇＲＮＡバリアント配列に付加される。他の実施形態では、Ｔ７ポリメラーゼが＋１位のＧ及び＋２位のプリンを強く好むので、インビトロでの転写で生産効率を増加させるために、２つの５’ＧがｇＲＮＡバリアント配列に付加される。場合によっては、５’Ｇ塩基が、表２の参照足場に付加される。他の場合では、５’Ｇ塩基が、表３の配列番号２２３８～２２８５、２６７９４～２６８３９、及び２７２１９～２７２６のバリアント足場に付加される。

【0097】

表３は、本開示の例示的なｇＲＮＡバリアント足場配列を提供する。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡバリアント足場は、表３の配列番号２２３８～２２８５、２６７９４～２６８３９、及び２７２１９～２７２６５に列挙される配列のうちのいずれか１つ、又はそれと少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡバリアント足場は、配列番号２２３８～２２８５、２６７９４～２６８３９、及び２７２１９～２７２６５のうちのいずれか１つを含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡバリアント足場は、配列番号２２８１～２２８５、２６７９４～２６８３９、及び２７２１９～２７２６５のうちのいずれか１つ、又はそれと少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡバリアント足場は、配列番号２２８１～２２８５、２６７９４～２６８３９、及び２７２１９～２７２６５のうちのいずれか１つを含む。ベクターがｇＲＮＡの配列をコードするＤＮＡを含むか又はｇＲＮＡがＲＮＡ及びＤＮＡのキメラである実施形態では、チミン（Ｔ）塩基が、本明細書に記載のｇＲＮＡ配列の実施形態のいずれかのウラシル（Ｕ）塩基に置換され得ることが理解されるであろう。

【0098】

【表3-1】

【0099】

【表3-2】

【0100】

【表3-3】

【0101】

【表3-4】

【0102】

【表3-5】

【0103】

【表3-6】

【0104】

【表3-7】

【0105】

【表3-8】

【0106】

【表3-9】

【0107】

【表3-10】

【0108】

【表3-11】

【0109】

いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡバリアントは、表３の配列番号２２３８、配列番号２２３９、配列番号２２４０、配列番号２２４１、配列番号２２４３、配列番号２２５６、配列番号２２７４、配列番号２２７５、配列番号２２７９、配列番号２２８１、配列番号２２８５、配列番号２６７９７、又は配列番号２６８００の配列に対する１つ以上の追加の変化を含む。

【0110】

本開示のｇＲＮＡバリアントのいくつかの実施形態では、ｇＲＮＡバリアントは、少なくとも１つの改変を含み、配列番号５の参照ガイド足場と比較した少なくとも１つの改変が、以下のうちの１つ以上から選択される：（ａ）三重鎖ループにおけるＣ１８Ｇ置換、（ｂ）ステムバブルにおけるＧ５５挿入、（ｃ）Ｕ１欠失、（ｄ）（ｉ）６ｎｔループ及びループに対して近位の１３塩基対がＵｖｓｘヘアピンによって置換されており、（ｉｉ）Ａ９９の欠失及びＧ６５Ｕの置換により、ループに対して遠位の塩基が完全に塩基対合している、伸長ステムループの改変。上記の例示的な実施形態では、ｇＲＮＡバリアントは、配列番号２２３８、２２４１、２２４４、２２４８、２２４９、２２５６、２２５９～２２８５、２６７９７、又は２６８００のうちのいずれか１つの配列を含む。

【0111】

いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡバリアントは、長い非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）を有する外因性ステムループを含む。本明細書で使用されるｌｎｃＲＮＡは、長さが約２００ｂｐよりも長い非コードＲＮＡを指す。いくつかの実施形態では、外因性ステムループの５’末端及び３’末端は、塩基対合している（すなわち、二重鎖ＲＮＡの領域を形成するように相互作用する）。いくつかの実施形態では、外因性ステムループの５’末端及び３’末端は、塩基対合しており、外因性ステムループの５’末端と３’末端との間の１つ以上の領域は、塩基対合していない。

【0112】

いくつかの実施形態では、本開示は、参照ｇＲＮＡと比較して、ヌクレオチドの改変を有するｇＲＮＡバリアントを提供し、（ａ）ｇＲＮＡバリアントの１つ以上の領域における１～１５個の連続した若しくは連続していないヌクレオチドの置換、（ｂ）ｇＲＮＡバリアントの１つ以上の領域における１～１０個の連続した若しくは連続していないヌクレオチドの欠失、（ｃ）ｇＲＮＡバリアントの１つ以上の領域における１～１０個の連続した若しくは連続していないヌクレオチドの挿入、（ｄ）足場ステムループ若しくは伸長ステムループの、近位の５’末端及び３’末端を有する異種ＲＮＡ源由来のＲＮＡステムループ配列による置換、又は（ａ）～（ｄ）の任意の組み合わせ、を有する。本明細書に記載の置換、挿入及び欠失のうちのいずれかを組み合わせて、本開示のｇＮＡバリアントを生成することができる。例えば、ｇＮＡバリアントは、参照ｇＲＮＡと比較して、少なくとも１つの置換及び少なくとも１つの欠失、参照ｇＲＮＡと比較して、少なくとも１つの置換及び少なくとも１つの挿入、参照ｇＲＮＡと比較して、少なくとも１つの挿入及び少なくとも１つの欠失、又は参照ｇＲＮＡと比較して少なくとも１つの置換、１つの挿入、及び１つの欠失、を含み得る。

【0113】

いくつかの実施形態では、本開示のｓｇＲＮＡバリアントは、以前に生成されたバリアントに対する１つ以上の追加の変化を含み、以前に生成されたバリアント自体が、改変される配列として機能する。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡバリアントは、配列番号２２３８、配列番号２２３９、配列番号２２４０、配列番号２２４１、配列番号２２４１、配列番号２２７４、配列番号２２７５、配列番号２２７９、又は配列番号２２８５、配列番号２６７９７、又は配列番号２６８００の配列に対する１つ以上の更なる変化を含む。

【0114】

例示的な実施形態では、ｇＲＮＡバリアントは、ｇＲＮＡ足場バリアント１７４（配列番号２２３８）に対する１つ以上の改変を含み、得られたｇＲＮＡバリアントは、同等の条件下でインビトロ又はインビボアッセイにおいて評価した場合、親１７４と比較して機能的改善を示す。

【0115】

例示的な実施形態では、ｇＲＮＡバリアントは、ｇＲＮＡ足場バリアント１７５（配列番号２２３９）に対する１つ以上の改変を含み、得られたｇＲＮＡバリアントは、同等の条件下でインビトロ又はインビボアッセイにおいて評価した場合、親１７４と比較して機能的改善を示す。

【0116】

例示的な実施形態では、ｇＲＮＡバリアントは、ｇＲＮＡ足場バリアント２１５（配列番号２２７５）に対する１つ以上の改変を含み、得られたｇＲＮＡバリアントは、同等の条件下でインビトロ又はインビボアッセイにおいて評価した場合、親２１５と比較して機能的改善を示す。

【0117】

例示的な実施形態では、ｇＲＮＡバリアントは、ｇＲＮＡ足場バリアント２２１（配列番号２２８１）に対する１つ以上の改変を含み、得られたｇＲＮＡバリアントは、同等の条件下でインビトロ又はインビボアッセイにおいて評価した場合、親２２１と比較して機能的改善を示す。

【0118】

例示的な実施形態では、ｇＲＮＡバリアントは、ｇＲＮＡ足場バリアント２２５（配列番号２２８５）に対する１つ以上の改変を含み、得られたｇＲＮＡバリアントは、同等の条件下でインビトロ又はインビボアッセイにおいて評価した場合、親２２５と比較して機能的改善を示す。

【0119】

例示的な実施形態では、ｇＲＮＡバリアントは、ｇＲＮＡ足場バリアント２３５（配列番号２６８００）に対する１つ以上の改変を含み、得られたｇＲＮＡバリアントは、同等の条件下でインビトロ又はインビボアッセイにおいて評価した場合、親２２５と比較して機能的改善を示す。

【0120】

いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡバリアントは、外因性伸長ステムループを含み、参照ｇＲＮＡとのかかる差異は、以下の通りである。いくつかの実施形態では、外因性伸長ステムループは、本明細書に開示される参照ステムループ領域（例えば、配列番号１５）とほとんど又は全く同一性を有しない。いくつかの実施形態では、外因性ステムループは、少なくとも１０ｂｐ、少なくとも２０ｂｐ、少なくとも３０ｂｐ、少なくとも４０ｂｐ、少なくとも５０ｂｐ、少なくとも６０ｂｐ、少なくとも７０ｂｐ、少なくとも８０ｂｐ、少なくとも９０ｂｐ、少なくとも１００ｂｐ、少なくとも２００ｂｐ、少なくとも３００ｂｐ、少なくとも４００ｂｐ、少なくとも５００ｂｐ、少なくとも６００ｂｐ、少なくとも７００ｂｐ、少なくとも８００ｂｐ、少なくとも９００ｂｐ、少なくとも１，０００ｂｐ、少なくとも２，０００ｂｐ、少なくとも３，０００ｂｐ、少なくとも４，０００ｂｐ、少なくとも５，０００ｂｐ、少なくとも６，０００ｂｐ、少なくとも７，０００ｂｐ、少なくとも８，０００ｂｐ、少なくとも９，０００ｂｐ、少なくとも１０，０００ｂｐ、少なくとも１２，０００ｂｐ、少なくとも１５，０００ｂｐ、又は少なくとも２０，０００ｂｐである。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡバリアントは、少なくとも１０、少なくとも１００、少なくとも５００、少なくとも１０００、又は少なくとも１０，０００ヌクレオチドを含む伸長ステムループ領域を含む。いくつかの実施形態では、異種ステムループは、ｇＲＮＡの安定性を増加させる。いくつかの実施形態では、異種ＲＮＡステムループは、タンパク質、ＲＮＡ構造、ＤＮＡ配列、又は小分子に結合することができる。いくつかの実施形態では、ステムループを置換する外因性ステムループ領域は、ＲＮＡステムループ又はヘアピンを含み、得られるｇＲＮＡは、安定性が増加しており、ループの選択に応じて、特定の細胞タンパク質又はＲＮＡと相互作用することができる。かかる外因性伸長ステムループは、例えば、熱安定性ＲＮＡ、例えば、ＭＳ２ヘアピン（ＡＣＡＵＧＡＧＧＡＵＣＡＣＣＣＡＵＧＵ（配列番号２７））、Ｑβヘアピン（ＵＧＣＡＵＧＵＣＵＡＡＧＡＣＡＧＣＡ（配列番号２８））、Ｕ１ヘアピンＩＩ（ＡＡＵＣＣＡＵＵＧＣＡＣＵＣＣＧＧＡＵＵ（配列番号２９））、Ｕｖｓｘ（ＣＣＵＣＵＵＣＧＧＡＧＧ（配列番号３０））、ＰＰ７ヘアピン（ＡＧＧＡＧＵＵＵＣＵＡＵＧＧＡＡＡＣＣＣＵ（配列番号３１））、ファージ複製ループ（ＡＧＧＵＧＧＧＡＣＧＡＣＣＵＣＵＣＧＧＵＣＧＵＣＣＵＡＵＣＵ（配列番号３２））、キッシングループ＿ａ（ＵＧＣＵＣＧＣＵＣＣＧＵＵＣＧＡＧＣＡ（配列番号３３））、キッシングループ＿ｂ１（ＵＧＣＵＣＧＡＣＧＣＧＵＣＣＵＣＧＡＧＣＡ（配列番号３４））、キッシングループ＿ｂ２（ＵＧＣＵＣＧＵＵＵＧＣＧＧＣＵＡＣＧＡＧＣＡ（配列番号３５））、Ｇ三重鎖Ｍ３ｑ（ＡＧＧＧＡＧＧＧＡＧＧＧＡＧＡＧＧ（配列番号１４９））、Ｇ四重鎖テロメアバスケット（ＧＧＵＵＡＧＧＧＵＵＡＧＧＧＵＵＡＧＧ（配列番号１５０））、サルシン－リシンループ（ＣＵＧＣＵＣＡＧＵＡＣＧＡＧＡＧＧＡＡＣＣＧＣＡＧ（配列番号１５１））、又はシュードノット（ＵＡＣＡＣＵＧＧＧＡＵＣＧＣＵＧＡＡＵＵＡＧＡＧＡＵＣＧＧＣＧＵＣＣＵＵＵＣＡＵＵＣＵＡＵＡＵＡＣＵＵＵＧＧＡＧＵＵＵＵＡＡＡＡＵＧＵＣＵＣＵＡＡＧＵＡＣＡ（配列番号１５２））を含み得る。いくつかの実施形態では、前述のヘアピン配列のうちの１つは、ステムループに組み込まれて、ｇＲＮＡ（及びＲＮＰ複合体中の関連するＣａｓＸ）の出芽ＸＤＰへの組み込みを輸送するのを助ける（以下でより詳細に記載される）。

【0121】

ｇＲＮＡバリアントの実施形態では、ｇＲＮＡバリアントは、ｇＲＮＡの３’末端に位置し、ＤＭＰＫ配列に特異的な標的核酸とハイブリダイズすることができるスペーサー（又は標的化配列）（上でより詳細に記載されている）を更に含み、スペーサーが、少なくとも１４～約３５ヌクレオチドを含み、標的ＤＮＡに相補的である配列を用いて設計される。いくつかの実施形態では、コードされたｇＲＮＡバリアントは、標的ＤＮＡに相補的な少なくとも１０～２０ヌクレオチドの標的化配列を含む。いくつかの実施形態では、標的化配列は、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、又は３５ヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、コードされたｇＲＮＡバリアントは、２０ヌクレオチドを有する標的化配列を含む。いくつかの実施形態では、標的化配列は、２５ヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、標的化配列は、２４ヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、標的化配列は、２３ヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、標的化配列は、２２ヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、標的化配列は、２１ヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、標的化配列は、２０ヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、標的化配列は、１９ヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、標的化配列は、１８ヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、標的化配列は、１７ヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、標的化配列は、１６ヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、標的化配列は、１５ヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、標的化配列は、１４ヌクレオチドを有する。

【0122】

ｈ．ＣａｓＸタンパク質との複合体形成
いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡバリアントは、発現時、表４の配列（配列番号３６～９９、１０１～１４８、及び２６９０８～２７１５４）のうちのいずれか１つ、又はそれと少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、若しくは少なくとも約９９％の同一性を有する配列を含むＣａｓＸバリアントタンパク質とＲＮＰとして複合体化される。いくつかの実施形態では、発現時に、ｇＲＮＡバリアントは、配列番号５９、７２～９９、１０１～１４８、若しくは２６９０８～２７１５４のうちのいずれか１つ、又はそれと少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、若しくは少なくとも約９９％の同一性を有する配列を含むＣａｓＸバリアントタンパク質とＲＮＰとして複合体化される。いくつかの実施形態では、発現時に、ｇＲＮＡバリアントは、配列番号１３２～１４８若しくは２６９０８～２７１５４のうちのいずれか１つ、又はそれと少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、若しくは少なくとも約９９％の同一性を有する配列を含むＣａｓＸバリアントタンパク質とＲＮＰとして複合体化される。

【0123】

いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡバリアントは、参照ｇＲＮＡと比較した場合、ＣａｓＸタンパク質（例えば、参照ＣａｓＸ又はＣａｓＸバリアントタンパク質）と複合体を形成する改善された能力を有する。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡバリアントは、参照ｇＲＮＡと比較した場合、ＣａｓＸタンパク質（例えば、参照タンパク質又はバリアントタンパク質）に対する改善された親和性を有し、それによって、実施例に記載されるように、ＣａｓＸタンパク質とリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を形成するその能力を改善する。リボ核タンパク質複合体の形成を改善することは、いくつかの実施形態では、機能的なＲＮＰが構築される効率を改善することができる。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡバリアント及びその標的化配列を含むＲＮＰの９０％超、９３％超、９５％超、９６％超、９７％超、９８％超又は９９％超が、標的核酸の遺伝子編集に適格である。

【0124】

ＣａｓＸタンパク質と複合体を形成するｇＲＮＡバリアントの能力を改善することができる例示的なヌクレオチド変化は、いくつかの実施形態では、足場ステムを熱安定性ステムループで置換することを含み得る。いかなる理論にも拘束されることを望むものではないが、足場ステムを熱安定性ステムループで置換することによって、ｇＲＮＡバリアントとＣａｓＸタンパク質との全体的な結合安定性を増加させることができる。代替的に、又は追加的に、ステムループの大部分を除去することによって、ｇＲＮＡバリアントのフォールディング動態が変化し、例えば、ｇＲＮＡバリアントがそれ自体で「もつれ」得る程度を減少させることによって、機能的にフォールディングされたｇＲＮＡがより容易にかつ迅速に形成され得る。いくつかの実施形態では、足場ステムループ配列の選択は、ｇＲＮＡのために利用される異なる標的化配列によって変化し得る。いくつかの実施形態では、足場配列は、標的化配列、したがって、標的配列に合わせて調整することができる。実施例のアッセイを含む生化学的アッセイを使用して、ＲＮＰを形成するためのｇＲＮＡバリアントに対するＣａｓＸタンパク質の結合親和性を評価することができる。例えば、当業者は、追加の非標識「コールド競合（cold competitor）」ｇＲＮＡの濃度の増加に対する応答として、固定化ＣａｓＸタンパク質に結合している蛍光タグ付きｇＲＮＡの量の変化を測定することができる。代替的に、又は追加的に、異なる量の蛍光標識されたｇＲＮＡが固定化ＣａｓＸタンパク質上を流れる際に、蛍光シグナルがどのように変化するのかを監視又は観察することができる。代替的に、ＲＮＰを形成する能力は、規定された標的核酸配列に対するインビトロ切断アッセイを使用して評価され得る。

【0125】

ＩＶ．標的核酸を改変するためのタンパク質
本開示は、真核細胞のゲノム編集において有用であるＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを含むシステムを提供する。いくつかの実施形態では、ゲノム編集システムにおいて使用されるＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、クラス２、Ｖ型ヌクレアーゼである。クラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムのメンバーには相違点があるが、それらは、それらをＣａｓ９システムと区別するいくつかの共通の特徴を共有する。まず、クラス２、Ｖ型ヌクレアーゼは、単一のＲＮＡ誘導ＲｕｖＣドメイン含有エフェクターを有するが、ＨＮＨドメインを有さず、非標的鎖上の標的領域の５’上流のＴ－リッチＰＡＭを認識し、これは、標的配列の３’側でＧ－リッチＰＡＭに依存するＣａｓ９システムとは異なる。Ｖ型ヌクレアーゼは、ＰＡＭに近い近位部位に平滑末端を生成するＣａｓ９とは異なり、ＰＡＭ配列に対して遠位にずれた二本鎖切断を生成する。加えて、Ｖ型ヌクレアーゼは、シスで結合する標的ｄｓＤＮＡ又はｓｓＤＮＡによって活性化された場合、トランスでｓｓＤＮＡを分解する。いくつかの実施形態では、本実施形態のＶ型ヌクレアーゼは、５’－ＴＣ ＰＡＭモチーフを認識し、ＲｕｖＣドメインによってのみ切断される付着末端を生成する。いくつかの実施形態では、Ｖ型ヌクレアーゼは、Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｃ、Ｃａｓ１２ｄ（ＣａｓＹ）、Ｃａｓ１２ｊ、Ｃａｓ１２ｋ、ＣａｓＺ、及びＣａｓＸからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、本開示は、ＣａｓＸタンパク質と、１つ以上のｇＲＮＡ酸とを含むシステム（ＣａｓＸ：ｇＲＮＡシステム）を提供し、ｇＲＮＡ酸は、真核細胞において標的核酸配列を改変するように特別に設計されている。

【0126】

本明細書で使用される「ＣａｓＸタンパク質」という用語は、タンパク質のファミリーを指し、全ての天然に存在するＣａｓＸタンパク質、天然に存在するＣａｓＸタンパク質と少なくとも５０％の同一性を共有するタンパク質、並びに天然に存在する参照ＣａｓＸタンパク質と比較して１つ以上の改善された特徴を有するＣａｓＸバリアントを包含する。

【0127】

本開示のＣａｓＸタンパク質は、以下のドメインのうちの少なくとも１つを含む：非標的鎖結合（non-target strand binding、ＮＴＳＢ）ドメイン、標的鎖負荷（target strand loading、ＴＳＬ）ドメイン、ヘリックスＩドメイン、ヘリックスＩＩドメイン、オリゴヌクレオチド結合ドメイン（oligonucleotide binding domain、ＯＢＤ）、及びＲｕｖＣ ＤＮＡ切断ドメイン。

【0128】

いくつかの実施形態では、ＣａｓＸタンパク質は、標的核酸配列内の配列にハイブリダイズする関連するｇＲＮＡによって標的化される特定の配列において標的核酸に結合する及び／又はそれを改変する（例えば、ニックを入れる、二本鎖切断を触媒する、メチル化する、脱メチル化するなど）ことができる。

【0129】

ａ．参照ＣａｓＸタンパク質
本開示は、天然に存在するＣａｓＸタンパク質（本明細書において「参照ＣａｓＸタンパク質」と称される）を提供し、これはその後、本開示のＣａｓＸバリアントを作製するために改変された。例えば、参照ＣａｓＸタンパク質は、Ｄｅｌｔａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｔｅｓ、又はＣａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｓｕｎｇｂａｃｔｅｒｉａ種などの天然に存在する原核生物から単離することができる。参照ＣａｓＸタンパク質（互換的に、本明細書において参照ＣａｓＸポリペプチドと称される）は、ガイドＲＮＡと相互作用してリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を形成するタンパク質のＣａｓＸ（互換的に、Ｃａｓ１２ｅと称される）ファミリーに属するＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼである。

【0130】

場合によっては、参照ＣａｓＸタンパク質は、Ｄｅｌｔａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒから単離されるか又はそれに由来し、以下の配列を有する：

【0131】

【表4】

【0132】

場合によっては、参照ＣａｓＸタンパク質は、Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｔｅｓから単離されるか又はそれに由来し、以下の配列を有する：

【0133】

【表5】

【0134】

場合によっては、参照ＣａｓＸタンパクは、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｓｕｎｇｂａｃｔｅｒｉａから単離されるか又はそれに由来し、以下の配列を有する：

【0135】

【表6】

【0136】

ｂ．ＣａｓＸバリアントタンパク質
本開示は、参照ＣａｓＸタンパク質のバリアント（互換的に、本明細書において「ＣａｓＸバリアント」又は「ＣａｓＸバリアントタンパク質」と称される）を提供し、ＣａｓＸバリアントは、参照ＣａｓＸタンパク質と比較して少なくとも１つのドメインに少なくとも１つの改変を含み、配列番号１～３の配列を含むが、これらに限定されない。

【0137】

本開示のＣａｓＸバリアントは、参照ＣａｓＸタンパク質と比較して、１つ以上の改善された特徴を有する。ＣａｓＸバリアントの実施形態の例示的な改善された特徴としては、バリアントのフォールディングの改善、ｇＲＮＡに対する結合親和性の改善、標的核酸に対する結合親和性の改善、標的ＤＮＡの編集及び／又は結合においてより広範囲のＰＡＭ配列を利用する能力の改善、標的ＤＮＡの巻き戻しの改善、編集活性の増加、編集効率の改善、編集特異性の改善、効率的に編集され得る真核生物ゲノムの百分率割合の増加、ヌクレアーゼ活性の増加、二本鎖切断のための標的鎖装填（target strand loading）の増加、一本鎖ニッキングのための標的鎖装填の減少、オフターゲット切断の減少、ＤＮＡの非標的鎖の結合の改善、タンパク質安定性の改善、タンパク質：ｇＲＮＡ（ＲＮＰ）複合体の安定性の改善、タンパク質溶解度の改善、タンパク質：ｇＲＮＡ（ＲＮＰ）複合体の溶解度性の改善、タンパク質収量の改善、タンパク質発現の改善、及び融合体特徴の改善が挙げられるが、これらに限定されない（以下でより詳細に説明される）。例示的な改善された特徴は、国際公開第２０２０／２４７８８２号（Ａ１）及び国際公開第２０２０／２４７８８３号に記載されている（参照により本明細書に援用される）。前述の実施形態では、ＣａｓＸバリアントの改善された特徴のうちの１つ以上は、比較可能な様式でアッセイした場合、配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の参照ＣａｓＸタンパク質と比較して、少なくとも約１．１～約１００，０００倍改善されている。他の実施形態では、改善は、比較可能な様式でアッセイした場合、配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の参照ＣａｓＸタンパク質と比較して、少なくとも約１．１倍、少なくとも約２倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約５００倍、少なくとも約１０００倍、少なくとも約５０００倍、少なくとも約１０，０００倍、又は少なくとも約１００，０００倍である。他の場合では、ＣａｓＸバリアント及びｇＲＮＡバリアントのＲＮＰの１つ以上の改善された特徴は、配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の参照ＣａｓＸタンパク質及び表２のｇＲＮＡのＲＮＰと比較して、少なくとも約１．１、少なくとも約１０、少なくとも約１００、少なくとも約１０００、少なくとも約１０，０００、少なくとも約１００，０００倍、又はそれ以上改善されている。他の場合では、ＣａｓＸバリアント及びｇＲＮＡバリアントのＲＮＰの改善された特徴のうちの１つ以上は、比較可能な様式でアッセイした場合、配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の参照ＣａｓＸタンパク質及び表２のｇＲＮＡのＲＮＰと比較して、約１．１～１００，００倍、約１．１～１０，００倍、約１．１～１，０００倍、約１．１～５００倍、約１．１～１００倍、約１．１～５０倍、約１．１～２０倍、約１０～１００，００倍、約１０～１０，００倍、約１０～１，０００倍、約１０～５００倍、約１０～１００倍、約１０～５０倍、約１０～２０倍、約２～７０倍、約２～５０倍、約２～３０倍、約２～２０倍、約２～１０倍、約５～５０倍、約５～３０倍、約５～１０倍、約１００～１００，００倍、約１００～１０，００倍、約１００～１，０００倍、約１００～５００倍、約５００～１００，００倍、約５００～１０，００倍、約５００～１，０００倍、約５００～７５０倍、約１，０００～１００，００倍、約１０，０００～１００，００倍、約２０～５００倍、約２０～２５０倍、約２０～２００倍、約２０～１００倍、約２０～５０倍、約５０～１０，０００倍、約５０～１，０００倍、約５０～５００倍、約５０～２００倍、又は約５０～１００倍改善されている。他の場合では、ＣａｓＸバリアント及びｇＲＮＡバリアントのＲＮＰの１つ以上の改善された特徴は、比較可能な様式でアッセイした場合、配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の参照ＣａｓＸタンパク質及び表２のｇＲＮＡのＲＮＰと比較して、約１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１３倍、１４倍、１５倍、１６倍、１７倍、１８倍、１９倍、２０倍、２５倍、３０倍、４０倍、４５倍、５０倍、５５倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、１１０倍、１２０倍、１３０倍、１４０倍、１５０倍、１６０倍、１７０倍、１８０倍、１９０倍、２００倍、２１０倍、２２０倍、２３０倍、２４０倍、２５０倍、２６０倍、２７０倍、２８０倍、２９０倍、３００倍、３１０倍、３２０倍、３３０倍、３４０倍、３５０倍、３６０倍、３７０倍、３８０倍、３９０倍、４００倍、４２５倍、４５０倍、４７５倍、又は５００倍改善されている。

【0138】

ＣａｓＸバリアントという用語は、融合タンパク質であるバリアントを含む。すなわち、ＣａｓＸは、異種配列に「融合」されている。これは、ＣａｓＸバリアント配列、及び異種タンパク質若しくはそのドメインへのＣａｓＸのＮ末端融合、Ｃ末端融合、又は内部融合を含むＣａｓＸバリアントを含む。

【0139】

いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントは、ＮＴＳＢドメインに少なくとも１つの改変を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントは、ＴＳＬドメインに少なくとも１つの改変を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントは、ヘリックスＩドメインに少なくとも１つの改変を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントは、ヘリックスＩＩドメインに少なくとも１つの改変を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントは、ＯＢＤドメインに少なくとも１つの改変を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントは、ＲｕｖＣ ＤＮＡ切断ドメインに少なくとも１つの改変を含む。いくつかの実施形態では、ＲｕｖＣ ＤＮＡ切断ドメインにおける少なくとも１つの改変は、配列番号２のアミノ酸Ｋ６８２、Ｇ６９５、Ａ７０８、Ｖ７１１、Ｄ７３２、Ａ７３９、Ｄ７３３、Ｌ７４２、Ｖ７４７、Ｆ７５５、Ｍ７７１、Ｍ７７９、Ｗ７８２、Ａ７８８、Ｇ７９１、Ｌ７９２、Ｐ７９３、Ｙ７９７、Ｍ７９９、Ｑ８０４、Ｓ８１９、若しくはＹ８５７のうちの１つ以上のアミノ酸置換、又はアミノ酸Ｐ７９３の欠失を含む。

【0140】

いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、配列番号１～３の配列を含む参照ＣａｓＸタンパク質の少なくとも１つのドメインにおいて、少なくとも２つのドメインの各々において、少なくとも３つのドメインの各々において、少なくとも４つのドメインの各々において、又は少なくとも５つのドメインの各々において、少なくとも１つの改変を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、参照ＣａｓＸタンパク質の少なくとも１つのドメインにおいて２つ以上の改変を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、参照ＣａｓＸタンパク質の少なくとも１つのドメインにおいて少なくとも２つの改変、参照ＣａｓＸタンパク質の少なくとも１つのドメインにおいて少なくとも３つの改変、又は参照ＣａｓＸタンパク質の少なくとも１つのドメインにおいて少なくとも４つの改変を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントは、参照ＣａｓＸと比較して２つ以上の改変を含み、各改変は、独立して、ＮＴＳＢＤ、ＴＳＬＤ、ヘリックスＩドメイン、ヘリックスＩＩドメイン、ＯＢＤ、及びＲｕｖＣ ＤＮＡ切断ドメインからなる群から選択されるドメインにおいて行われる。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質の少なくとも１つの改変は、配列番号１～３の参照ＣａｓＸタンパク質の１つのドメインの少なくとも一部の欠失を含む。いくつかの実施形態では、欠失は、ＮＴＳＢＤ、ＴＳＬＤ、ヘリックスＩドメイン、ヘリックスＩＩドメイン、ＯＢＤ、又はＲｕｖＣ ＤＮＡ切断ドメインにある。他の実施形態では、本開示は、別のＣａｓＸバリアントと比較して少なくとも１つの改変を含むＣａｓＸバリアントを提供する。例えば、ＣａｓＸバリアント５１５は、ＣａｓＸバリアント４９１のバリアントである。本明細書に記載の参照ＣａｓＸタンパク質（又はそれが由来するバリアント）と比較した場合、ＣａｓＸバリアントタンパク質の１つ以上の機能又は特徴を改善する全てのバリアントは、本開示の範囲内であると想定される。

【0141】

いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントの改変は、参照ＣａｓＸの１つ以上のアミノ酸における変異である。他の実施形態では、改変は、参照ＣａｓＸの１つ以上のドメインの、異なるＣａｓＸ由来の１つ以上のドメインによる置換である。いくつかの実施形態では、挿入は、異なるＣａｓＸタンパク質由来のドメインの一部又は全部の挿入を含む。変異は、参照ＣａｓＸタンパク質の任意の１つ以上のドメインにおいて生じ得、例えば、参照ＣａｓＸタンパク質の任意のドメインにおける１つ以上のドメインの一部若しくは全部の欠失、又は１つ以上のアミノ酸の置換、欠失、若しくは挿入を含み得る。ＣａｓＸタンパク質のドメインは、非標的鎖結合（ＮＴＳＢ）ドメイン、標的鎖装填（ＴＳＬ）ドメイン、ヘリックスＩドメイン、ヘリックスＩＩドメイン、オリゴヌクレオチド結合ドメイン（ＯＢＤ）、及びＲｕｖＣ ＤＮＡ切断ドメインを含む。ＣａｓＸタンパク質の改善された特徴をもたらす参照ＣａｓＸタンパク質のアミノ酸配列における任意の変化は、本開示のＣａｓＸバリアントタンパク質とみなされる。例えば、ＣａｓＸバリアントは、参照ＣａｓＸタンパク質配列と比較して、１つ以上のアミノ酸置換、挿入、欠失、若しくはスワップされたドメイン、又はそれらの任意の組み合わせを含み得る。

【0142】

本開示のＣａｓＸバリアントタンパク質を生成するための好適な変異誘発法には、例えば、網羅的変異進化（ＤＭＥ）、網羅的変異スキャニング（ＤＭＳ）、エラープローンＰＣＲ、カセット変異誘発、ランダム変異誘発、付着伸長ＰＣＲ、遺伝子シャッフリング、又はドメインスワッピングが含まれ得る。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントは、例えば、参照ＣａｓＸにおける１つ以上の所望の変異を選択することによって設計される。特定の実施形態では、参照ＣａｓＸタンパク質の活性は、それに対して１つ以上のＣａｓＸバリアントの活性が比較されるベンチマークとして使用され、それによって、ＣａｓＸバリアントの機能の改善が測定される。

【0143】

本明細書に記載のＣａｓＸバリアントのいくつかの実施形態では、少なくとも１つの改変は、以下を含む：（ａ）配列番号１、配列番号２、配列番号３、ＣａｓＸバリアント４９１、若しくはＣａｓＸバリアント５１５の参照ＣａｓＸと比較した、ＣａｓＸバリアントにおける１～１００個の連続した若しくは連続していないアミノ酸の置換、（ｂ）参照ＣａｓＸ若しくはそれが由来するバリアントと比較した、ＣａｓＸバリアントにおける１～１００個の連続した若しくは連続していないアミノ酸の欠失、（ｃ）参照ＣａｓＸ若しくはそれが由来するバリアントと比較した、ＣａｓＸにおける１～１００個の連続した若しくは連続していないアミノ酸の挿入、又は（ｄ）（ａ）～（ｃ）の任意の組み合わせ。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの改変は、以下を含む：（ａ）配列番号１、配列番号２、配列番号３、ＣａｓＸ ４９１、又はＣａｓＸ ５１５の参照ＣａｓＸと比較した、ＣａｓＸバリアントにおける５～１０個の連続した又は連続していないアミノ酸の置換、（ｂ）参照ＣａｓＸ又はそれが由来するバリアントと比較した、ＣａｓＸバリアントにおける１～５個の連続した又は連続していないアミノ酸の欠失、（ｃ）参照ＣａｓＸ又はそれが由来するバリアントと比較した、ＣａｓＸにおける１～５個の連続した又は連続していないアミノ酸の挿入、又は（ｄ）（ａ）～（ｃ）の任意の組み合わせ。

【0144】

いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、ＣａｓＸ ４９１（表４を参照）、又はＣａｓＸ ５１５（表４を参照）の配列と比較して、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、又は少なくとも１００個の改変を有する配列を含むか又はそれからなる。これらの改変は、アミノ酸の挿入、欠失、置換、又はそれらの任意の組み合わせであり得る。改変は、ＣａｓＸバリアントの１つのドメイン、又はいずれかのドメイン、又はドメインのいずれかの組み合わせにあり得る。本明細書に記載の置換において、任意のアミノ酸は、任意の他のアミノ酸と置換され得る。置換は、保存的置換であり得る（例えば、塩基性アミノ酸が別の塩基性アミノ酸に置換される）。置換は、非保存的置換であってもよい（例えば、塩基性アミノ酸が酸性アミノ酸に置換されるか、又はその逆も同様である）。例えば、参照ＣａｓＸタンパク質におけるプロリンを、アルギニン、ヒスチジン、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、スレオニン、アスパラギン、グルタミン、システイン、グリシン、アラニン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、又はバリンのうちのいずれかに置換して、本開示のＣａｓＸバリアントタンパク質を生成することができる。

【0145】

本明細書に記載の実施形態の置換、挿入、及び欠失の任意の順列を組み合わせて、本開示のＣａｓＸバリアントタンパク質を生成することができる。例えば、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、参照ＣａｓＸタンパク質配列と比較して、少なくとも１つの置換及び少なくとも１つの欠失、参照ＣａｓＸタンパク質配列と比較して、少なくとも１つの置換及び少なくとも１つの挿入、参照ＣａｓＸタンパク質配列と比較して、少なくとも１つの挿入及び少なくとも１つの欠失、又は参照ＣａｓＸタンパク質配列と比較して、少なくとも１つの置換、１つの挿入、及び１つの欠失を含むことができる。

【0146】

いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントは、配列番号２の参照ＣａｓＸ配列と比較して、以下のうちの１つ以上から選択される少なくとも１つの改変を含む：（ａ）Ｌ３７９Ｒのアミノ酸置換、（ｂ）Ａ７０８Ｋのアミノ酸置換、（ｃ）Ｔ６２０Ｐのアミノ酸置換、（ｄ）Ｅ３８５Ｐのアミノ酸置換、（ｅ）Ｙ８５７Ｒのアミノ酸置換、（ｆ）Ｉ６５８Ｖのアミノ酸置換、（ｇ）Ｆ３９９Ｌのアミノ酸置換、（ｈ）Ｑ２５２Ｋのアミノ酸置換、（ｉ）Ｌ４０４Ｋのアミノ酸置換、及び（ｊ）Ｐ７９３のアミノ酸欠失。

【0147】

いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、４００～２０００アミノ酸、５００～１５００アミノ酸、７００～１２００アミノ酸、８００～１１００アミノ酸、又は９００～１０００アミノ酸を含む。

【0148】

いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、表４に示される配列番号５９、７２～９９、１０１～１４８、及び２６９０８～２７１５４の配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、表４に示される配列番号５９、７２～９９、１０１～１４８、及び２６９０８～２７１５４の配列からなる。他の実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、表４に示される配列番号５９、７２～９９、１０１～１４８、又は２６９０８～２７１５４の配列と少なくとも６０％同一、少なくとも６５％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８１％同一、少なくとも８２％同一、少なくとも８３％同一、少なくとも８４％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも８６％同一、少なくとも８６％同一、少なくとも８７％同一、少なくとも８８％同一、少なくとも８９％同一、少なくとも８９％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、少なくとも９９．５％同一の配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、配列番号５３６～９９、１０１～１４８、又は２６９０８～２７１５４の配列を含むか、又はそれからなる。他の実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、配列番号３６～９９、１０１～１４８、又は２６９０８～２７１５４の配列と少なくとも６０％同一、少なくとも６５％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８１％同一、少なくとも８２％同一、少なくとも８３％同一、少なくとも８４％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも８６％同一、少なくとも８６％同一、少なくとも８７％同一、少なくとも８８％同一、少なくとも８９％同一、少なくとも８９％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、少なくとも９９．５％同一の配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、配列番号１３２～１４８又は２６９０８～２７１５４の配列を含むか、又はそれからなる。他の実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、配列番号１３２～１４８又は２６９０８～２７１５４の配列と少なくとも６０％同一、少なくとも６５％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８１％同一、少なくとも８２％同一、少なくとも８３％同一、少なくとも８４％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも８６％同一、少なくとも８６％同一、少なくとも８７％同一、少なくとも８８％同一、少なくとも８９％同一、少なくとも８９％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、少なくとも９９．５％同一の配列を含む。

【0149】

【表7-1】

【0150】

【表7-2】

【0151】

【表7-3】

【0152】

【表7-4】

【0153】

【表7-5】

【0154】

【表7-6】

【0155】

【表7-7】

【0156】

ｃ．複数の供給源のタンパク質由来のドメインを有するＣａｓＸバリアントタンパク質
特定の実施形態では、本開示は、２つ以上の異なるＣａｓＸタンパク質（例えば、２つ以上の天然に存在するＣａｓＸタンパク質又は本明細書に記載される２つ以上のＣａｓＸバリアントタンパク質配列）由来のタンパク質ドメインを含むキメラＣａｓＸタンパク質を提供する。本明細書で使用される場合、「キメラＣａｓＸタンパク質」とは、異なる供給源（例えば、２つの天然に存在するタンパク質）から単離又は誘導された少なくとも２つのドメインを含むＣａｓＸを指し、これは、いくつかの実施形態では、異なる種から単離され得る。例えば、いくつかの実施形態では、キメラＣａｓＸタンパク質は、第１のＣａｓＸタンパク質由来の第１のドメインと、第２の異なるＣａｓＸタンパク質由来の第２のドメインと、を含む。いくつかの実施形態では、第１のドメインは、ＮＴＳＢ、ＴＳＬ、ヘリックスＩ、ヘリックスＩＩ、ＯＢＤ、及びＲｕｖＣドメインからなる群から選択され得る。いくつかの実施形態では、第２のドメインは、ＮＴＳＢ、ＴＳＬ、ヘリックスＩ、ヘリックスＩＩ、ＯＢＤ、及びＲｕｖＣドメインからなる群から選択され、第２のドメインは、前述の第１のドメインとは異なる。ヘリックスＩ、ＲｕｖＣ、及びＯＢＤなどの分割又は非連続ドメインの場合、非連続ドメインの一部を任意の他の供給源由来の対応する部分で置換することができる。例えば、配列番号２におけるヘリックスＩ－Ｉドメイン（時折、ヘリックスＩ－ａと称される）は、配列番号１由来の対応するヘリックスＩ－Ｉ配列などで置換され得る。表５に、参照ＣａｓＸタンパク質由来のドメイン配列及びそれらの座標を示す。キメラＣａｓＸタンパク質の代表的な例としては、ＣａｓＸ ４７２－４８３、４８５－４９１及び５１５のバリアントが挙げられ、表４に、その配列を示す。

【0157】

【表8】

^＊ＯＢＤａ及びｂ、ヘリックスＩａ及びｂ、並びにＲｕｖＣａ及びｂはまた、本明細書において、ＯＢＤＩ及びＩＩ、ヘリックスＩ－Ｉ及びＩ－ＩＩ、並びにＲｕｖＣＩ及びＩＩとも称される。

【0158】

ｄ．ｇＲＮＡに対するタンパク質親和性
いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、参照ＣａｓＸタンパク質と比較して、ｇＲＮＡに対する改善された親和性を有し、リボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）の形成をもたらす。ｇＲＮＡに対するＣａｓＸバリアントタンパク質の親和性の増加は、例えば、ＲＮＰ複合体の生成についてより低いＫ_ｄをもたらし得、これは、場合によっては、より安定なリボ核タンパク質複合体の形成をもたらし得る。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡに対するＣａｓＸバリアントタンパク質の親和性の増加は、ヒト細胞に送達された場合、リボ核タンパク質複合体の安定性の増加をもたらす。この安定性の増加は、対象の細胞における複合体の機能及び有用性に影響を及ぼし得、並びに対象に送達された場合、血液における改善された薬物動態学特性をもたらし得る。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質の親和性の増加、及び得られるリボ核タンパク質複合体の安定性の増加は、所望の活性、例えば、インビボ又はインビトロでの遺伝子編集を依然として有しながら、対象又は細胞に送達されるＣａｓＸバリアントタンパク質の用量がより低くなる。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質のｇＲＮＡに対するより高い親和性（より強い結合）は、ＣａｓＸバリアントタンパク質及びｇＲＮＡの両方がＲＮＰ複合体中に残っている場合、より多くの編集事象を可能にする。編集事象の増加は、本明細書に記載のｔｄＴｏｍ編集アッセイなどの編集アッセイを使用して評価することができる。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡに対するＣａｓＸバリアントタンパク質のＫ_ｄは、参照ＣａｓＸタンパク質と比較して、少なくとも約１．１、少なくとも約１．２、少なくとも約１．３、少なくとも約１．４、少なくとも約１．５、少なくとも約１．６、少なくとも約１．７、少なくとも約１．８、少なくとも約１．９、少なくとも約２、少なくとも約３、少なくとも約４、少なくとも約５、少なくとも約６、少なくとも約７、少なくとも約８、少なくとも約９、少なくとも約１０、少なくとも約１５、少なくとも約２０、少なくとも約２５、少なくとも約３０、少なくとも約３５、少なくとも約４０、少なくとも約４５、少なくとも約５０、少なくとも約６０、少なくとも約７０、少なくとも約８０、少なくとも約９０、又は少なくとも約１００倍増加する。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントは、配列番号２の参照ＣａｓＸタンパク質と比較して、ｇＲＮＡに対して約１．１～約１０倍増加した結合親和性を有する。

【0159】

いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡに対するＣａｓＸバリアントタンパク質の親和性の増加は、哺乳動物細胞に送達された場合（対象へのインビボ送達を含む）、リボ核タンパク質複合体の安定性の増加をもたらす。この安定性の増加は、対象の細胞における複合体の機能及び有用性に影響を及ぼし得、並びに対象に送達された場合、血液における改善された薬物動態学特性をもたらし得る。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質の親和性の増加、及び得られるリボ核タンパク質複合体の安定性の増加は、所望の活性（例えば、インビボ又はインビトロ遺伝子編集）を依然として有しながら、対象又は細胞に送達されるＣａｓＸバリアントタンパク質の用量がより低くなる。ＲＮＰを形成し、それらを安定な形態に保つ能力の増加は、アッセイ（例えば、本明細書の実施例に記載のインビトロ切断アッセイ）を使用して評価することができる。いくつかの実施形態では、本開示のＣａｓＸバリアントを含むＲＮＰは、ＲＮＰとして複合体化した場合、配列番号１～３の参照ＣａｓＸを含むＲＮＰと比較して、少なくとも２倍、少なくとも５倍、又は少なくとも１０倍高いｋ_切断速度を達成することができる。

【0160】

いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質のｇＲＮＡに対するより高い親和性（より強い結合）は、ＣａｓＸバリアントタンパク質及びｇＲＮＡの両方がＲＮＰ複合体中に残っている場合、より多くの編集事象を可能にする。編集事象の増加は、本明細書に記載のアッセイなどの編集アッセイを使用して評価することができる。

【0161】

理論に束縛されることを望むものではないが、いくつかの実施形態では、ヘリックスＩドメインにおけるアミノ酸変化は、ＣａｓＸバリアントタンパク質とｇＲＮＡ標的化配列との結合親和性を増加させることができ、ヘリックスＩＩドメインにおける変化は、ＣａｓＸバリアントタンパク質とｇＲＮＡ足場ステムループとの結合親和性を増加させることができ、オリゴヌクレオチド結合ドメイン（ＯＢＤ）における変化は、ＣａｓＸバリアントタンパク質とｇＲＮＡ三重鎖との結合親和性を増加させる。

【0162】

ｇＲＮＡに対するＣａｓＸタンパク質の結合親和性を測定する方法は、精製されたＣａｓＸタンパク質及びｇＲＮＡを使用するインビトロの方法を含む。参照ＣａｓＸ及びバリアントタンパク質に対する結合親和性は、ｇＲＮＡ又はＣａｓＸタンパク質がフルオロフォアでタグ付けされている場合、蛍光偏光によって測定することができる。代替的に、又は追加的に、結合親和性は、バイオレイヤー干渉法、電気泳動移動度シフトアッセイ（electrophoretic mobility shift assay、ＥＭＳＡ）、又は膜結合によって測定することができる。参照ｇＲＮＡ及びそのバリアントなどの特定のｇＲＮＡに対する、参照ＣａｓＸ及び本開示のバリアントタンパク質などのＲＮＡ結合タンパク質の絶対親和性を定量化するための更なる標準的な技術としては、等温熱量測定（isothermal calorimetry、ＩＴＣ）及び表面プラズモン共鳴（surface plasmon resonance、ＳＰＲ）、並びに実施例の方法が挙げられるが、これらに限定されない。

【0163】

ｅ．標的核酸に対する親和性
いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、標的核酸配列に対する参照ＣａｓＸタンパク質の親和性と比較して、標的核酸配列に対する改善された結合親和性を有する。いくつかの実施形態では、標的核酸分子に対する本開示のＣａｓＸバリアントタンパク質の親和性は、参照ＣａｓＸタンパク質と比較して、少なくとも約１．１、少なくとも約１．２、少なくとも約１．３、少なくとも約１．４、少なくとも約１．５、少なくとも約１．６、少なくとも約１．７、少なくとも約１．８、少なくとも約１．９、少なくとも約２、少なくとも約３、少なくとも約４、少なくとも約５、少なくとも約６、少なくとも約７、少なくとも約８、少なくとも約９、少なくとも約１０、少なくとも約１５、少なくとも約２０、少なくとも約２５、少なくとも約３０、少なくとも約３５、少なくとも約４０、少なくとも約４５、少なくとも約５０、少なくとも約６０、少なくとも約７０、少なくとも約８０、少なくとも約９０、又は少なくとも約１００倍増加する。

【0164】

それらの標的核酸に対してより高い親和性を有するＣａｓＸバリアントは、いくつかの実施形態では、標的核酸に対して増加した親和性を有しない参照ＣａｓＸタンパク質よりも迅速に標的核酸配列を切断することができる。いくつかの実施形態では、標的核酸配列に対する親和性の改善は、標的核酸配列に対する親和性の改善、より広範囲のＰＡＭ配列に対する結合親和性の改善、標的核酸配列についてＤＮＡを検索する能力の改善、又はそれらの任意の組み合わせを含み、標的核酸を改変する能力の増加をもたらす。いくつかの実施形態では、改善された標的核酸親和性を有するＣａｓＸバリアントタンパク質は、ＴＴＣ、ＡＴＣ、ＧＴＣ、及びＣＴＣからなる群から選択されるＰＡＭ配列に対する結合親和性を含む、配列番号２の参照ＣａｓＸタンパク質によって認識される正準ＴＴＣ ＰＡＭ以外の特定のＰＡＭ配列に対する増加した親和性を有する。ＤＮＡに対するより高い全体的な親和性はまた、いくつかの実施形態では、ＣａｓＸタンパク質が結合及び巻き戻しステップを効果的に開始及び終了することができる頻度を増加させることができ、それによって、標的鎖侵入及びＲループ形成、並びに最終的に標的核酸配列の切断を促進する。

【0165】

いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、標的核酸の非標的鎖に対する改善された結合親和性を有する。本明細書で使用される場合、「非標的鎖」という用語は、ｇＲＮＡにおける標的化配列とワトソン及びクリック塩基対を形成せず、標的ＤＮＡ鎖に相補的であるＤＮＡ標的核酸配列の鎖を指す。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の参照タンパク質と比較して、標的核酸の非標的鎖に対して約１．１～約１００倍増加した結合親和性を有する。

【0166】

標的核酸分子に対するＣａｓＸバリアントタンパク質の親和性を測定する方法は、電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）、膜結合、等温熱量測定（ＩＴＣ）、及び表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、蛍光偏光、及びバイオレイヤー干渉法（biolayer interferometry、ＢＬＩ）を含み得る。標的に対するＣａｓＸタンパク質の親和性を測定する更なる方法としては、経時的にＤＮＡ切断事象を測定するインビトロ生化学的アッセイ（例えば、実施例に記載されるように、ｋ_切断速度の決定）が挙げられる。

【0167】

ｆ．標的部位に対する改善された特異性
いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、参照ＣａｓＸタンパク質と比較して、標的核酸配列に対する改善された特異性を有する。本明細書で使用される場合、「特異性」（互換的に「標的特異性」と称される）は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムリボ核タンパク質複合体が、標的核酸配列に類似するが同一ではないオフターゲット配列を切断する程度を指す。例えば、より高い程度の特異性を有するＣａｓＸバリアントＲＮＰは、参照ＣａｓＸタンパク質と比較して、配列のオフターゲット切断の低減を示す。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムタンパク質の特異性、及び潜在的に有害なオフターゲット効果の低減は、哺乳動物対象における使用のための許容される治療指数を達成するために極めて重要であり得る。

【0168】

いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパクは、配列番号１～３の参照ＣａｓＸタンパクと比較して、ｇＲＮＡの標的化配列に相補的である標的配列内の標的部位に対して改善された特異性を有する。理論に束縛されることを望むものではないが、標的核酸鎖に対するＣａｓＸバリアントタンパク質の特異性を増加させるヘリックスＩ及びＩＩドメインにおけるアミノ酸変化は、標的核酸全体に対するＣａｓＸバリアントタンパク質の特異性を増加させることができる可能性がある。いくつかの実施形態では、標的核酸に対するＣａｓＸバリアントタンパク質の特異性を増加させるアミノ酸変化はまた、ＤＮＡに対するＣａｓＸバリアントタンパク質の親和性の減少をもたらし得る。

【0169】

ＣａｓＸタンパク質（例えば、バリアント又は参照）の標的特異性を試験する方法は、ガイド及び配列決定による切断効果のインビトロ報告のための環状化（Circularization for In vitro Reporting of Cleavage Effects by Sequencing）（ＣＩＲＣＬＥ－ｓｅｑ）、又は同様の方法を含み得る。簡潔に、ＣＩＲＣＬＥ－ｓｅｑ技術では、ゲノムＤＮＡを剪断し、ステム・ループアダプターのライゲーションによって環状化し、ステム・ループ領域にニックを入れて、４ヌクレオチドのパリンドロームオーバーハングを露出させる。これに続いて、残りの直鎖ＤＮＡの分子内ライゲーション及び分解が行われる。続いて、ＣａｓＸ切断部位を含む環状ＤＮＡ分子をＣａｓＸで線状化し、アダプターアダプターを、露出した末端にライゲーションした後、ハイスループット配列決定を行って、オフターゲット部位についての情報を含むペアエンドリードを生成する。オフターゲット事象（したがって、ＣａｓＸタンパク質の特異性）を検出するために使用することができる更なるアッセイとしては、それらの選択されたオフターゲット部位で形成されたインデル（挿入及び欠失）を検出及び定量化するために使用されるアッセイ（例えば、ミスマッチ検出ヌクレアーゼアッセイ及び次世代シーケンシング（next generation sequencing、ＮＧＳ））が挙げられる。例示的なミスマッチ検出アッセイとしては、ヌクレアーゼアッセイが挙げられ、これは、ＣａｓＸ及びｓｇＲＮＡで処理した細胞由来のゲノムＤＮＡをＰＣＲ増幅し、変性させ、再ハイブリダイズして、１つの野生型鎖と１つのインデルを有する鎖とを含むヘテロ二重鎖ＤＮＡを形成する。ミスマッチは、ミスマッチ検出ヌクレアーゼ（例えば、Ｓｕｒｖｅｙｏｒヌクレアーゼ又はＴ７エンドヌクレアーゼＩ）によって認識及び切断される。

【0170】

ｇ．プロトスペーサー及びＰＡＭ配列
本明細書において、プロトスペーサーは、ガイドＲＮＡの標的化配列に相補的なＤＮＡ配列及びその配列に相補的なＤＮＡとして定義され、それぞれ標的鎖及び非標的鎖と呼ばれる。本明細書で使用される場合、ＰＡＭは、標的核酸の標的鎖における標的核酸配列に相補的である非標的鎖における配列の１ヌクレオチド５’側に位置するヌクレオチド配列であり、ｇＲＮＡの標的化配列と併せて、プロトスペーサー鎖の潜在的な切断のためにＣａｓＸの配向及び配置を助ける。
ＰＡＭ配列は縮重していてもよく、特定のＲＮＰ構築物は、異なる切断効率を支持する異なる好ましい許容されるＰＡＭ配列を有していてもよい。慣例に従って、別段の記載がない限り、本開示は、ＰＡＭ及びプロトスペーサー配列の両方、並びに非標的鎖の配向に従ったそれらの方向性について言及する。これは、標的鎖ではなく非標的鎖のＰＡＭ配列が切断の決定因子であるか、又は標的認識に機構的に関与することを意味するものではない。例えば、ＴＴＣ ＰＡＭに言及する場合、実際には、標的切断に必要な相補的なＧＡＡ配列であってもよく、又は両方の鎖からのヌクレオチドの何らかの組み合わせであってもよい。本明細書に開示されるＣａｓＸタンパク質の場合、ＰＡＭは、プロトスペーサーの５’側に位置し、単一のヌクレオチドがＰＡＭをプロトスペーサーの第１のヌクレオチドから分離する。したがって、参照ＣａｓＸの場合、ＴＴＣ ＰＡＭは、式５’－．．．ＮＮＴＴＣＮ（プロトスペーサー）ＮＮＮＮＮＮ．．．３’（式中、「Ｎ」は、任意のＤＮＡヌクレオチドであり、「（プロトスペーサー）」は、ガイドＲＮＡの標的化配列と同一性を有するＤＮＡ配列である）に従う配列を意味すると理解されるべきである。拡張されたＰＡＭ認識を有するＣａｓＸバリアントの場合、ＴＴＣ、ＣＴＣ、ＧＴＣ、又はＡＴＣ ＰＡＭは、以下の式に従う配列を意味すると理解されるべきである：５’－．．．ＮＮＴＴＣＮ（プロトスペーサー）ＮＮＮＮＮＮ．．．３’、
５’－．．．ＮＮＣＴＣＮ（プロトスペーサー）ＮＮＮＮＮＮ．．．３’、
５’－．．．ＮＮＧＴＣＮ（プロトスペーサー）ＮＮＮＮＮＮ．．．３’、又は
５’－．．．ＮＮＡＴＣＮ（プロトスペーサー）ＮＮＮＮＮＮ．．．３’。

【0171】

代替的に、ＴＣ ＰＡＭは、式：５’－．．．ＮＮＮＴＣＮ（プロトスペーサー）ＮＮＮＮＮＮ．．．３’に従う配列を意味すると理解されるべきである。追加的に、本開示のＣａｓＸバリアントタンパク質は、参照ＣａｓＸタンパク質及び参照ｇＲＮＡのＲＮＰと比較して、ＴＴＣ、ＡＴＣ、ＧＴＣ、又はＣＴＣ（５’から３’の配向で）から選択されるＰＡＭ配列を含むＰＡＭ ＴＣモチーフを利用して、ＲＮＰとしてｇＲＮＡと複合体化した場合、標的ＤＮＡを効率的に編集及び／又はそれに結合する増強された能力を有する。前述において、ＰＡＭ配列は、比較可能なアッセイシステムにおける参照ＣａｓＸタンパク質及び参照ｇＲＮＡを含むＲＮＰの編集効率及び／又は結合と比較して、アッセイシステムにおけるｇＲＮＡの標的化配列と同一性を有するプロトスペーサーの非標的鎖に対して少なくとも１ヌクレオチド５’側に位置する。一実施形態では、ＣａｓＸバリアント及びｇＲＮＡバリアントのＲＮＰは、比較可能なアッセイシステムにおける参照ＣａｓＸタンパク質及び参照ｇＲＮＡを含むＲＮＰと比較して、より高い編集効率及び／又は標的ＤＮＡにおける標的配列の結合を示し、ここで、標的ＤＮＡのＰＡＭ配列はＴＴＣである。別の実施形態では、ＣａｓＸバリアント及びｇＲＮＡバリアントのＲＮＰは、比較可能なアッセイシステムにおける参照ＣａｓＸタンパク質及び参照ｇＲＮＡを含むＲＮＰと比較して、より高い編集効率及び／又は標的ＤＮＡにおける標的配列の結合を示し、ここで、標的ＤＮＡのＰＡＭ配列はＡＴＣである。別の実施形態では、ＣａｓＸバリアント及びｇＲＮＡバリアントのＲＮＰは、比較可能なアッセイシステムにおける参照ＣａｓＸタンパク質及び参照ｇＲＮＡを含むＲＮＰと比較して、より高い編集効率及び／又は標的ＤＮＡにおける標的配列の結合を示し、ここで、標的ＤＮＡのＰＡＭ配列はＣＴＣである。別の実施形態では、ＣａｓＸバリアント及びｇＲＮＡバリアントのＲＮＰは、比較可能なアッセイシステムにおける参照ＣａｓＸタンパク質及び参照ｇＲＮＡを含むＲＮＰと比較して、より高い編集効率及び／又は標的ＤＮＡにおける標的配列の結合を示し、ここで、標的ＤＮＡのＰＡＭ配列はＧＴＣである。前述の実施形態では、１つ以上のＰＡＭ配列に対する増大した編集効率及び／又は結合親和性は、ＰＡＭ配列についての配列番号１～３のうちのいずれか１つのＣａｓＸタンパク質及び表２のｇＲＮＡのＲＮＰの編集効率及び／又は結合親和性と比較して、少なくとも１．５倍以上大きい。改善された編集を実証する例示的なアッセイは、本明細書の実施例に記載されている。

【0172】

ｈ．ＤＮＡの巻き戻し
いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、参照ＣａｓＸタンパク質と比較して、改善されたＤＮＡ巻き戻し能力を有する。不十分なｄｓＤＮＡ巻き戻しは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムタンパク質ＡｎａＣａｓ９又はＣａｓ１４のＤＮＡを切断する能力を損なうか又は妨げることが以前に示されている。したがって、いかなる理論にも束縛されることを望むものではないが、本開示のいくつかのＣａｓＸバリアントタンパク質によるＤＮＡ切断活性の増加は、少なくとも部分的に、標的部位でｄｓＤＮＡを見つけて巻き戻す能力の増加に起因する可能性が高い。

【0173】

理論に束縛されることを望むものではないが、ＮＴＳＢドメインにおけるアミノ酸変化は、ＤＮＡ巻き戻し特徴が増加したＣａｓＸバリアントタンパク質を産生することができると考えられる。代替的に、又は追加的に、ＯＢＤ又はＰＡＭと相互作用するヘリックスドメイン領域におけるアミノ酸変化はまた、ＤＮＡ巻き戻し特徴が増加したＣａｓＸバリアントタンパク質を生成することができる。

【0174】

ＣａｓＸタンパク質（例えば、バリアント又は参照）がＤＮＡを巻き戻す能力を測定する方法としては、蛍光偏光又はバイオレイヤー干渉法におけるｄｓＤＮＡ標的のオン速度の増加を観察するインビトロアッセイが挙げられるが、これらに限定されない。

【0175】

ｉ．触媒活性
本明細書に開示されるＣａｓＸ：ＲＮＡシステムのリボ核タンパク質複合体ｇは、標的核酸配列に結合し、標的核酸配列を切断するＣａｓＸバリアントを含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、参照ＣａｓＸタンパク質と比較して、改善された触媒活性を有する。理論に束縛されることを望むものではないが、場合によっては、標的鎖の切断が、ｄｓＤＮＡ切断の生成におけるＣａｓ１２様分子の制限因子であり得ると考えられる。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、ＤＮＡの標的鎖の屈曲及びこの鎖の切断を改善し、ＣａｓＸリボ核タンパク質複合体によるｄｓＤＮＡ切断の全体的な効率の改善をもたらす。

【0176】

いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、参照ＣａｓＸタンパク質と比較して、増加したヌクレアーゼ活性を有する。ヌクレアーゼ活性が増加したバリアントは、例えば、ＲｕｖＣヌクレアーゼドメインにおけるアミノ酸変化を介して生成することができる。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントは、ニッカーゼ活性を有するＲｕｖＣヌクレアーゼドメインを含む。前述において、ＣａｓＸ：ｇＲＮＡシステムのＣａｓＸニッカーゼは、非標的鎖におけるＰＡＭ部位の３’側の１０～１８ヌクレオチド内に一本鎖切断を生成する。他の実施形態では、ＣａｓＸバリアントは、二本鎖切断活性を有するＲｕｖＣヌクレアーゼドメインを含む。前述において、ＣａｓＸ：ｇＲＮＡシステムのＣａｓＸは、標的鎖上のＰＡＭ部位の５’側１８～２６ヌクレオチド及び非標的鎖上の３’側１０～１８ヌクレオチド内に二本鎖切断を生成する。ヌクレアーゼ活性は、実施例の方法を含む様々な方法によってアッセイすることができる。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントは、参照ＣａｓＸと比較して、少なくとも２倍、又は少なくとも３倍、又は少なくとも４倍、又は少なくとも５倍、又は少なくとも６倍、又は少なくとも７倍、又は少なくとも８倍、又は少なくとも９倍、又は少なくとも１０倍大きいｋ_切断定数を有する。

【0177】

いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、ｇＲＮＡを有するＲＮＰを形成する改善された特徴を有し、実施例に記載されるように、配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の参照ＣａｓＸタンパク質及びｇＲＮＡのＲＮＰと比較して、より高い百分率割合の切断コンピテントＲＮＰをもたらす。切断コンピテント（cleavage competent）とは、形成されるＲＮＰが標的核酸を切断する能力を有することを意味する。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアント及びｇＲＮＡのＲＮＰは、配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の参照ＣａｓＸタンパク質及び表２のｇＲＮＡのＲＮＰと比較して、少なくとも２倍、又は少なくとも３倍、又は少なくとも４倍、又は少なくとも５倍、又は少なくとも１０倍の切断速度を示す。前述の実施形態では、改善されたコンピテンシー率は、実施例に記載されているようなインビトロアッセイにおいて実証することができる。

【0178】

いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、参照ＣａｓＸと比較して、二本鎖切断のための増加した標的鎖装填を有する。増加した標的鎖装填活性を有するバリアントは、例えば、ＴＬＳドメインにおけるアミノ酸変化を介して生成され得る。理論に束縛されることを望むものではないが、ＴＳＬドメインにおけるアミノ酸変化は、改善された触媒活性を有するＣａｓＸバリアントタンパク質をもたらし得る。代替的に、又は追加的に、ＲＮＡ：ＤＮＡ二重鎖の結合チャネルの周囲のアミノ酸変化はまた、ＣａｓＸバリアントタンパク質の触媒活性も改善することができる。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、参照ＣａｓＸタンパク質と比較して、増加した付随的な切断活性を有する。本明細書で使用される場合、「付随的な切断活性」とは、標的核酸配列の認識及び切断に続く、核酸の更なる非標的化切断をいう。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、参照ＣａｓＸタンパク質と比較して、減少した付随的な切断活性を有する。

【0179】

いくつかの実施形態、例えば、標的核酸配列の切断が所望の結果ではない適用を包含する実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質の触媒活性を改善することは、ＣａｓＸバリアントタンパク質の触媒活性を変化、低下、又は消失させることを含む。いくつかの実施形態では、ｄＣａｓＸバリアントタンパクを含むリボ核タンパク質複合体は、標的核酸配列に結合し、標的核酸を切断しない。

【0180】

いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質を含むＣａｓＸリボ核タンパク質複合体は、標的ＤＮＡに結合するが、標的ＤＮＡにおいて一本鎖ニックを生成する。いくつかの実施形態、特に、ＣａｓＸタンパク質がニッカーゼである実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、一本鎖ニッキングのための標的鎖装填が減少している。標的鎖装填が減少したバリアントは、例えば、ＴＳＬドメインにおけるアミノ酸変化を介して生成され得る。

【0181】

ＣａｓＸタンパク質の触媒活性を特徴付けるための例示的な方法としては、以下の実施例の方法を含むインビトロ切断アッセイが挙げられ得るが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、アガロースゲル上でのＤＮＡ産物の電気泳動は、鎖切断の動態を調べることができる。

【0182】

ｊ．ＣａｓＸ融合タンパク質
いくつかの実施形態では、本開示は、ＣａｓＸに融合した異種タンパク質を含むＣａｓＸタンパク質を提供する。場合によっては、ＣａｓＸは、参照ＣａｓＸタンパク質である。他の場合では、ＣａｓＸは、本明細書に記載の実施形態のいずれかのＣａｓＸバリアントである。

【0183】

いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、目的の異なる活性を有する１つ以上のタンパク質又はそのドメインに融合された表４の配列の配列番号５９、７２～９９、１０１～１４８、及び２６９０８～２７１５４のうちのいずれか１つを含み、融合タンパク質をもたらす。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、１つ以上のタンパク質又はそのドメインに融合された配列番号３６～９９、１０１～１４８、２６９０８～２７１５４のうちのいずれか１つを含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、１つ以上のタンパク質又はそのドメインに融合された配列番号１３２～１４８、２６９０８～２７１５のいずれか１つを含む。例えば、いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、転写を阻害する、標的核酸配列を改変する、又は核酸に関連するポリペプチドを改変する（例えば、ヒストン改変）タンパク質（又はそのドメイン）に融合される。

【0184】

いくつかの実施形態では、異種ポリペプチド（又はシステイン残基若しくは非天然アミノ酸などの異種アミノ酸）をＣａｓＸタンパク質内の１つ以上の位置に挿入して、ＣａｓＸ融合タンパク質を生成することができる。他の実施形態では、システイン残基をＣａｓＸタンパク質内の１つ以上の位置に挿入し、続いて、以下に記載する異種ポリペプチドをコンジュゲートすることができる。いくつかの代替的な実施形態では、異種ポリペプチド又は異種アミノ酸は、ＣａｓＸバリアントタンパク質のＮ末端又はＣ末端に付加され得る。他の実施形態では、異種ポリペプチド又は異種アミノ酸は、ＣａｓＸタンパク質の配列内に内部挿入され得る。

【0185】

いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアント融合タンパク質は、ＲＮＡ誘導型の配列特異的な標的核酸結合及び切断活性を保持する。場合によっては、ＣａｓＸバリアント融合タンパク質は、異種タンパク質の挿入を有しない対応するＣａｓＸバリアントタンパク質の活性（例えば、切断活性及び／又は結合活性）の５０％以上を有する（保持する）。場合によっては、ＣａｓＸバリアント融合タンパク質は、異種タンパク質の挿入を有しない対応するＣａｓＸタンパク質の活性（例えば、切断活性及び／又は結合活性）の少なくとも約６０％、又は少なくとも約７０％以上、少なくとも約８０％、又は少なくとも約９０％、又は少なくとも約９２％、又は少なくとも約９５％、又は少なくとも約９８％、又は少なくとも約１００％を保持する。

【0186】

場合によっては、ＣａｓＸバリアント融合タンパク質は、挿入された異種アミノ酸又は異種ポリペプチドを有しないＣａｓＸタンパク質の活性と比較して、標的核酸の結合活性を保持する（有する）。場合によっては、ＣａｓＸバリアント融合タンパク質は、異種タンパク質の挿入を有しない対応するＣａｓＸタンパク質の結合活性の少なくとも約６０％、又は少なくとも約７０％以上、少なくとも約８０％、又は少なくとも約９０％、又は少なくとも約９２％、又は少なくとも約９５％、又は少なくとも約９８％、又は少なくとも約１００％を保持する。

【0187】

場合によっては、ＣａｓＸバリアント融合タンパク質は、挿入された異種アミノ酸又は異種ポリペプチドを有しない親ＣａｓＸタンパク質の活性と比較して、標的核酸の結合活性及び／又は切断活性を保持する（有する）。例えば、場合によっては、ＣａｓＸバリアント融合タンパク質は、対応する親ＣａｓＸタンパク質（挿入を有しないＣａｓＸタンパク質）の結合活性及び／又は切断活性の５０％以上を有する（保持する）。例えば、場合によっては、ＣａｓＸバリアント融合タンパク質は、対応するＣａｓＸ親タンパク質（挿入を有しないＣａｓＸタンパク質）の結合活性及び／又は切断活性の６０％以上（７０％以上、８０％以上、９０％以上、９２％以上、９５％以上、９８％以上、又は１００％）を有する（保持する）。ＣａｓＸタンパク質及び／又はＣａｓＸ融合タンパク質の切断活性及び／又は結合活性を測定する方法は、当業者に既知であり、任意の便利な方法を使用することができる。

【0188】

様々な異種ポリペプチドが、本開示の参照ＣａｓＸ又はＣａｓＸバリアント融合タンパク質に含めるのに好適である。場合によっては、融合パートナーは、標的ＤＮＡの転写を調節する（例えば、転写を阻害する、転写を増加させる）ことができる。例えば、場合によっては、融合パートナーは、転写を抑制するタンパク質（又はタンパク質由来のドメイン）（例えば、転写リプレッサー、転写抑制タンパク質の動員、メチル化などの標的ＤＮＡの改変、ＤＮＡモディファイヤーの動員、標的ＤＮＡに会合するヒストンの調節、ヒストンのアセチル化及び／又はメチル化を改変するものなどのヒストンモディファイヤーの動員などを介して機能するタンパク質）である。

【0189】

場合によっては、融合パートナーは、転写を増加させるタンパク質（又はタンパク質由来のドメイン）（例えば、転写アクチベーター、転写アクチベータータンパク質の動員、脱メチル化などの標的ＤＮＡの改変、ＤＮＡモディファイヤーの動員、標的ＤＮＡに会合するヒストンの調節、ヒストンのアセチル化及び／又はメチル化を改変するものなどのヒストンモディファイヤーの動員などを介して作用するタンパク質）である。場合によっては、融合パートナーは、標的核酸配列を改変する酵素活性、例えば、ヌクレアーゼ活性、メチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、ＤＮＡ修復活性、ＤＮＡ損傷活性、脱アミノ化活性、ジスムターゼ活性、アルキル化活性、脱プリン化活性、酸化活性、ピリミジン二量体形成活性、インテグラーゼ活性、トランスポザーゼ活性、リコンビナーゼ活性、ポリメラーゼ活性、リガーゼ活性、ヘリカーゼ活性、フォトリアーゼ活性、又はグリコシラーゼ活性を有する。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントは、配列番号３６～９９、１０１～１４８、若しくは２６９０８～２７１５４のうちのいずれか１つ、又は配列番号５９、７２～９９、１０１～１４８、若しくは２６９０８～２７１５４のうちのいずれか１つ、又は配列番号１３２～１４８若しくは２６９０８～２７１５４のうちのいずれか１つと、メチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、デアセチラーゼ活性、キナーゼ活性、ホスファターゼ活性、ユビキチンリガーゼ活性、脱ユビキチン化活性、アデニル化活性、脱アデニル化活性、ＳＵＭＯ化活性、脱ＳＵＭＯ化活性、リボシル化活性、脱リボシル化活性、ミリストイル化活性、又は脱ミリストイル化活性を有するポリペプチドと、を含む。

【0190】

いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントは、配列番号３６～９９、１０１～１４８、及び２６９０８～２７１５４のうちのいずれか１つ、又は配列番号５９、７２～９９、１０１～１４８、若しくは２６９０８～２７１５４のうちのいずれか１つ、又は配列番号１３２～１４８若しくは２６９０８～２７１５４のうちのいずれか１つと、標的核酸に関連するポリペプチド（例えば、ヒストン）を改変する酵素活性（例えば、メチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、デアセチラーゼ活性、キナーゼ活性、ホスファターゼ活性、ユビキチンリガーゼ活性、脱ユビキチン化活性、アデニル化活性、脱アデニル化活性、ＳＵＭＯ化活性、脱ＳＵＭＯ化活性、リボシル化活性、脱リボシル化活性、ミリストイル化活性、又は脱ミリストイル化活性）を有する融合パートナーと、を含む。転写を増加させるための融合パートナーとして使用することができるタンパク質（又はその断片）の例としては、転写アクチベーター（例えば、ＶＰ１６、ＶＰ６４、ＶＰ４８、ＶＰ１６０、ｐ６５サブドメイン（例えば、ＮＦｋＢ由来）、及び（例えば、植物における活性の）ＥＤＬＬの活性化ドメイン及び／又はＴＡＬ活性化ドメイン）；ヒストンリジンメチルトランスフェラーゼ（例えば、ＳＥＴ１Ａ、ＳＥＴ１Ｂ、ＭＬＬ１～５、ＡＳＨ１、ＳＹＭＤ２、ＮＳＤ１など）；ヒストンリジンデメチラーゼ（例えば、ＪＨＤＭ２ａ／ｂ、ＵＴＸ、ＪＭＪＤ３など）；ヒストンアセチルトランスフェラーゼ（例えば、ＧＣＮ５、ＰＣＡＦ、ＣＢＰ、ｐ３００、ＴＡＦ１、ＴＩＰ６０／ＰＬＩＰ、ＭＯＺ／ＭＹＳＴ３、ＭＯＲＦ／ＭＹＳＴ４、ＳＲＣ１、ＡＣＴＲ、Ｐ１６０、ＣＬＯＣＫなど）；並びにＤＮＡデメチラーゼ（例えば、Ｔｅｎ－Ｅｌｅｖｅｎ Ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ（ＴＥＴ）ジオキシゲナーゼ１（ＴＥＴ１ＣＤ）、ＴＥＴ１、ＤＭＥ、ＤＭＬ１、ＤＭＬ２、ＲＯＳ１など）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0191】

転写を減少させるための融合パートナーとして使用され得るタンパク質（又はその断片）の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：転写リプレッサー（例えば、Ｋｒｕｐｐｅｌ関連ボックス（ＫＲＡＢ又はＳＫＤ））；ＫＯＸ１抑制ドメイン；Ｍａｄ ｍＳＩＮ３相互作用ドメイン（ＳＩＤ）；ＥＲＦリプレッサードメイン（ＥＲＦ ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ ｄｏｍａｉｎ、ＥＲＤ）、（例えば、植物における抑制の）ＳＲＤＸ抑制ドメインなど；ヒストンリジンメチルトランスフェラーゼ（例えば、Ｐｒ－ＳＥＴ７／８、ＳＵＶ４－２０Ｈ１、ＲＩＺ１など）；ヒストンリジンデメチラーゼ（例えば、ＪＭＪＤ２Ａ／ＪＨＤＭ３Ａ、ＪＭＪＤ２Ｂ、ＪＭＪＤ２Ｃ／ＧＡＳＣ１、ＪＭＪＤ２Ｄ、ＪＡＲＩＤ１Ａ／ＲＢＰ２、ＪＡＲＩＤ１Ｂ／ＰＬＵ－１、ＪＡＲＩＤ１Ｃ／ＳＭＣＸ、ＪＡＲＩＤ１Ｄ／ＳＭＣＹなど）；ヒストンリジンデアセチラーゼ（例えば、ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２、ＨＤＡＣ３、ＨＤＡＣ８、ＨＤＡＣ４、ＨＤＡＣ５、ＨＤＡＣ７、ＨＤＡＣ９、ＳＩＲＴ１、ＳＩＲＴ２、ＨＤＡＣ１１など）；ＤＮＡメチラーゼ（例えば、ＨｈａＩ ＤＮＡ ｍ５ｃ－メチルトランスフェラーゼ（Ｍ．ＨｈａＩ）、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ１（ＤＮＭＴ１）、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ３ａ（ＤＮＭＴ３ａ）、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ３ｂ（ＤＮＭＴ３ｂ）、ＭＥＴＩ、ＤＲＭ３（植物）、ＺＭＥＴ２、ＣＭＴ１、ＣＭＴ２（植物）など）；及び末梢動員エレメント（例えば、Ｌａｍｉｎ Ａ、Ｌａｍｉｎ Ｂなど）。

【0192】

場合によっては、ＣａｓＸバリアントに対する融合パートナーは、標的核酸配列（例えば、ｓｓＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｓｓＤＮＡ、ｄｓＤＮＡ）を改変する酵素活性を有する。融合パートナーによって提供され得る酵素活性の例としては、ヌクレアーゼ活性（例えば、制限酵素（例えば、ＦｏｋＩヌクレアーゼ）によって提供されるもの）、メチルトランスフェラーゼ活性（例えば、メチルトランスフェラーゼ（例えば、ＨｈａＩ ＤＮＡ ｍ５ｃ－メチルトランスフェラーゼ（Ｍ．Ｈｈａｌ）、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ１（ＤＮＭＴ１）、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ３ａ（ＤＮＭＴ３ａ）、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ３ｂ（ＤＮＭＴ３ｂ）、ＭＥＴＩ、ＤＲＭ３（植物）、ＺＭＥＴ２、ＣＭＴ１、ＣＭＴ２（植物）などによって提供されるもの）、デメチラーゼ活性（例えば、デメチラーゼ（例えば、Ｔｅｎ－Ｅｌｅｖｅｎ Ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ（ＴＥＴ）ジオキシゲナーゼ１（ＴＥＴ１ ＣＤ）、ＴＥＴ１、ＤＭＥ、ＤＭＬ１、ＤＭＬ２、ＲＯＳ１など）によって提供されるもの）、ＤＮＡ修復活性、ＤＮＡ損傷活性、脱アミノ化活性（例えば、デアミナーゼ（例えば、シトシンデアミナーゼ酵素、例えば、ラットＡＰＯＢＥＣ１などのＡＰＯＢＥＣタンパク質）によって提供されるもの）、ジスムターゼ活性、アルキル化活性、脱プリン化活性、酸化活性、ピリミジン二量体形成活性、インテグラーゼ活性（例えば、インテグラーゼ及び／又はリゾルバーゼ（例えば、Ｇｉｎインベルターゼ（例えば、ＧｉｎインベルターゼＧｉｎＨ１０６Ｙの高活性変異体））、ヒト免疫不全ウイルス１型インテグラーゼ（ＩＮ）、Ｔｎ３リゾルバーゼなどによって提供されるもの）、トランスポザーゼ活性、リコンビナーゼ活性（例えば、リコンビナーゼ（例えば、Ｇｉｎリコンビナーゼの触媒ドメイン）によって提供されるもの）、ポリメラーゼ活性、リガーゼ活性、ヘリカーゼ活性、フォトリアーゼ活性、及びグリコシラーゼ活性が挙げられるが、これらに限定されない。

【0193】

場合によっては、本開示のＣａｓＸバリアントタンパク質は、転写を増加させるためのドメイン（例えば、ＶＰ１６ドメイン、ＶＰ６４ドメイン）、転写を減少させるためのドメイン（例えば、ＫＲＡＢドメイン（例えば、Ｋｏｘ１タンパク質由来））、ヒストンアセチルトランスフェラーゼのコア触媒ドメイン（例えば、ヒストンアセチルトランスフェラーゼｐ３００）、検出可能なシグナルを提供するタンパク質／ドメイン（例えば、ＧＦＰなどの蛍光タンパク質）、ヌクレアーゼドメイン（例えば、ＦｏｋＩヌクレアーゼ）、又は塩基エディター（例えば、ＡＰＯＢＥＣ１などのシチジンデアミナーゼ）から選択されるポリペプチドに融合される。

【0194】

いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントは、配列番号３６～９９、１０１～１４８、若しくは２６９０８～２７１５４のうちのいずれか１つ、又は配列番号５９、７２～９９、１０１～１４８、若しくは２６９０８～２７１５４のうちのいずれか１つ、又は配列番号１３２～１４８若しくは２６９０８～２７１５４のうちのいずれか１つと、標的核酸に関連するタンパク質（例えば、ｓｓＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｓｓＤＮＡ、ｄｓＤＮＡ）を改変する酵素活性を有する融合パートナー（例えば、ヒストン、ＲＮＡ結合タンパク質、ＤＮＡ結合タンパク質など）と、を含む。融合パートナーによって提供され得る酵素活性（標的核酸に関連するタンパク質を改変する）の例としては、ヒストンメチルトランスフェラーゼ活性（例えば、メチルトランスフェラーゼ（histone methyltransferase、ＨＭＴ）（例えば、斑入り３－９ホモログ１のサプレッサー（ＳＵＶ３９Ｈ１、ＫＭＴ１Ａとしても知られる）、真性染色質ヒストンリジンメチルトランスフェラーゼ２（Ｇ９Ａ、ＫＭＴ１Ｃ及びＥＨＭＴ２としても知られる）、ＳＵＶ３９Ｈ２、ＥＳＥＴ／ＳＥＴＤＢ １など、ＳＥＴ１Ａ、ＳＥＴ１Ｂ、ＭＬＬ１～５、ＡＳＨ１、ＳＹＭＤ２、ＮＳＤ１、ＤＯＴ１Ｌ、Ｐｒ－ＳＥＴ７／８、ＳＵＶ４－２０Ｈ１、ＥＺＨ２、ＲＩＺ１）によって提供されるもの）、デメチラーゼ活性（例えば、ヒストンデメチラーゼ（例えば、リジンデメチラーゼ１Ａ（ＫＤＭ１Ａ、ＬＳＤ１としても知られる）、ＪＨＤＭ２ａ／ｂ、ＪＭＪＤ２Ａ／ＪＨＤＭ３Ａ、ＪＭＪＤ２Ｂ、ＪＭＪＤ２Ｃ／ＧＡＳＣ１、ＪＭＪＤ２Ｄ、ＪＡＲＩＤ１Ａ／ＲＢＰ２、ＪＡＲＩＤ１Ｂ／ＰＬＵ－１、ＪＡＲＩＤ１Ｃ／ＳＭＣＸ、ＪＡＲＩＤ１Ｄ／ＳＭＣＹ、ＵＴＸ、ＪＭＪＤ３など）によって提供されるもの）、アセチルトランスフェラーゼ活性（例えば、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ（例えば、ヒトアセチルトランスフェラーゼｐ３００の触媒コア／断片、ＧＣＮ５、ＰＣＡＦ、ＣＢＰ、ＴＡＦ１、ＴＩＰ６０／ＰＬＩＰ、ＭＯＺ／ＭＹＳＴ３、ＭＯＲＦ／ＭＹＳＴ４、ＨＢ０１／ＭＹＳＴ２、ＨＭＯＦ／ＭＹＳＴ１、ＳＲＣ１、ＡＣＴＲ、Ｐ１６０、ＣＬＯＣＫなど）によって提供されるもの）、デアセチラーゼ活性（例えば、ヒストンデアセチラーゼ（例えば、ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２、ＨＤＡＣ３、ＨＤＡＣ８、ＨＤＡＣ４、ＨＤＡＣ５、ＨＤＡＣ７、ＨＤＡＣ９、ＳＩＲＴ１、ＳＩＲＴ２、ＨＤＡＣ１１など）によって提供されるもの）、キナーゼ活性、ホスファターゼ活性、ユビキチンリガーゼ活性、脱ユビキチン化活性、アデニル化活性、脱アデニル化活性、ＳＵＭＯ化活性、脱ＳＵＭＯ化活性、リボシル化活性、脱リボシル化活性、ミリストイル化活性、及び脱ミリストイル化活性が挙げられるが、これらに限定されない。

【0195】

ＣａｓＸバリアントのための好適な融合パートナーの更なる例は、（ｉ）ジヒドロ葉酸レダクターゼ（dihydrofolate reductase、ＤＨＦＲ）不安定化ドメイン（例えば、化学的に制御可能な対象のＲＮＡ誘導型ポリペプチド又は条件的に活性なＲＮＡ誘導型ポリペプチドを生成するため）、及び（ｉｉ）葉緑体移行ペプチド、を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントは、配列番号３６～９９、１０１～１４８、若しくは２６９０８～２７１５４のうちのいずれか１つ、又は配列番号５９、７２～９９、１０１～１４８、若しくは２６９０８～２７１５４のうちのいずれか１つ、又は配列番号１３２～１４８若しくは２６９０８～２７１５４のうちのいずれか１つ、又は表４の配列と、葉緑体移行ペプチド（ＭＡＳＭＩＳＳＳＡＶＴＴＶＳＲＡＳＲＧＱＳＡＡＭＡＰＦＧＧＬＫＳＭＴＧＦＰＶＲＫＶＮＴＤＩＴＳＩＴＳＮＧＧＲ ＶＫＣＭＱＶＷＰＰＩＧＫＫＫＦＥＴＬＳＹＬＰＰＬＴＲＤＳＲＡ（配列番号１５４）；ＭＡＳＭＩＳＳＳＡＶＴＴＶＳＲＡＳＲＧＱＳＡＡＭＡＰＦＧＧＬＫＳＭＴＧＦＰＶＲＫＶＮＴＤＩＴＳＩＴＳＮＧＧＲＶＫＳ（配列番号１５５）；ＭＡＳＳＭＬＳＳＡＴＭＶＡＳＰＡＱＡＴＭＶＡＰＦＮＧＬＫＳＳＡＡＦＰＡＴＲＫＡＮＮＤＩＴＳＩＴＳＮＧＧＲＶＮＣＭＱＶ ＷＰＰＩＥＫＫＫＦＥＴＬＳＹＬＰＤＬＴＤＳＧＧＲＶＮＣ（配列番号１５６）；ＭＡＱＶＳＲＩＣＮＧＶＱＮＰＳＬＩＳＮＬＳＫＳＳＱＲＫＳＰＬＳＶＳＬＫＴＱＱＨＰＲＡＹＰＩＳＳＳＷＧＬＫＫＳＧＭＴＬＩＧ ＳＥＬＲＰＬＫＶＭＳＳＶＳＴＡＣ（配列番号１５７）；ＭＡＱＶＳＲＩＣＮＧＶＷＮＰＳＬＩＳＮＬＳＫＳＳＱＲＫＳＰＬＳＶＳＬＫＴＱＱＨＰＲＡＹＰＩＳＳＳＷＧＬＫＫＳＧＭＴＬＩＧ ＳＥＬＲＰＬＫＶＭＳＳＶＳＴＡＣ（配列番号１５８）；ＭＡＱＩＮＮＭＡＱＧＩＱＴＬＮＰＮＳＮＦＨＫＰＱＶＰＫＳＳＳＦＬＶＦＧＳＫＫＬＫＮＳＡＮＳＭＬＶＬＫＫＤＳＩＦＭＱＬＦ ＣＳＦＲＩＳＡＳＶＡＴＡＣ（配列番号１５９）；ＭＡＡＬＶＴＳＱＬＡＴＳＧＴＶＬＳＶＴＤＲＦＲＲＰＧＦＱＧＬＲＰＲＮＰＡＤＡＡＬＧＭＲＴＶＧＡＳＡＡＰＫＱＳＲＫＰＨ ＲＦＤＲＲＣＬＳＭＶＶ（配列番号１６０）；ＭＡＡＬＴＴＳＱＬＡＴＳＡＴＧＦＧＩＡＤＲＳＡＰＳＳＬＬＲＨＧＦＱＧＬＫＰＲＳＰＡＧＧＤＡＴＳＬＳＶＴＴＳＡＲＡＴＰＫＱ ＱＲＳＶＱＲＧＳＲＲＦＰＳＶＶＶＣ（配列番号１６１）；ＭＡＳＳＶＬＳＳＡＡＶＡＴＲＳＮＶＡＱＡＮＭＶＡＰＦＴＧＬＫＳＡＡＳＦＰＶＳＲＫＱＮＬＤＩＴＳＩＡＳＮＧＧＲＶＱＣ（配列番号１６２）；ＭＥＳＬＡＡＴＳＶＦＡＰＳＲＶＡＶＰＡＡＲＡＬＶＲＡＧＴＶＶＰＴＲＲＴＳＳＴＳＧＴＳＧＶＫＣＳＡＡＶＴＰＱＡＳＰＶＩＳ ＲＳＡＡＡＡ（配列番号１６３）；及びＭＧＡＡＡＴＳＭＱＳＬＫＦＳＮＲＬＶＰＰＳＲＲＬＳＰＶＰＮＮＶＴＣＮＮＬＰＫＳＡＡＰＶＲＴＶＫＣＣＡＳＳＷＮＳＴＩＮＧＡＡＡＴＴＮＧＡＳＡＡＳＳ（配列番号１６４）が含まれるが、これらに限定されない）と、を含む。

【0196】

場合によっては、本開示のＣａｓＸバリアントタンパク質は、エンドソームエスケープペプチドを含んでもよい。場合によっては、エンドソーム脱出ポリペプチドは、アミノ酸配列ＧＬＦＸＡＬＬＸＬＬＸＳＬＷＸＬＬＬＸＡ（配列番号１６５）を含み、各Ｘは、独立して、リジン、ヒスチジン、及びアルギニンから選択される。場合によっては、エンドソーム脱出ポリペプチドは、アミノ酸配列ＧＬＦＨＡＬＬＨＬＬＨＳＬＷＨＬＬＬＨＡ（配列番号１６６）又はＨＨＨＨＨＨＨＨＨ（配列番号１６７）を含む。

【0197】

ｓｓＲＮＡ標的核酸配列を標的化する場合、ＣａｓＸバリアントタンパク質とともに使用するための融合パートナーの非限定的な例としては（限定されないが）、スプライシング因子（例えば、ＲＳドメイン）；タンパク質翻訳成分（例えば、翻訳開始、伸長、及び／又は終結因子；例えば、ｅＩＦ４Ｇ）；ＲＮＡメチラーゼ；ＲＮＡ編集酵素（例えば、ＲＮＡデアミナーゼ（例えば、ＲＮＡに作用するアデノシンデアミナーゼ（adenosine deaminase acting on RNA、ＡＤＡＲ））、ＡからＩ及び／又はＣからＵの編集酵素を含む）；ヘリカーゼ；ＲＮＡ結合タンパク質などが挙げられる。異種ポリペプチドは、タンパク質全体を含み得るか、又は場合によっては、タンパク質の断片（例えば、機能的ドメイン）を含み得ることが理解される。

【0198】

いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントは、配列番号３６～９９、１０１～１４８、若しくは２６９０８～２７１５４のうちのいずれか１つ、又は配列番号５９、７２～９９、１０１～１４８、若しくは２６９０８～２７１５４のうちのいずれか１つ、又は配列番号１３２～１４８若しくは２６９０８～２７１５４のうちのいずれか１つと、ｓｓＲＮＡと相互作用することができる任意のドメインの融合パートナーと、を含む（本開示の目的のために、分子内及び／又は分子間二次構造を含む、例えば、二本鎖ＲＮＡ二重鎖、例えば、ヘアピン、ステムループなどが含まれる）。一過的又は不可逆的、直接的又は間接的にかかわらず、以下を含む群から選択されるエフェクタードメインが挙げられるが、これに限定されない：エンドヌクレアーゼ（例えば、ＲＮａｓｅ ＩＩＩ、ＣＲＲ２２ ＤＹＷドメイン、Ｄｉｃｅｒ、並びにＳＭＧ５及びＳＭＧ６などのタンパク質由来のＰＩＮ（ＰｉｌＴ Ｎ末端）ドメイン）；ＲＮＡ切断の刺激に関与するタンパク質及びタンパク質ドメイン（例えば、ＣＰＳＦ、ＣｓｔＦ、ＣＦＩｍ、及びＣＦＩＩｍ）；エキソヌクレアーゼ（例えば、ＸＲＮ－１又はエキソヌクレアーゼＴ）；デアデニラーゼ（例えば、ＨＮＴ３）；ナンセンス媒介ＲＮＡ分解に関与するタンパク質及びタンパク質ドメイン（例えば、ＵＰＦ１、ＵＰＦ２、ＵＰＦ３、ＵＰＦ３ｂ、ＲＮＰＳＩ、Ｙ１４、ＤＥＫ、ＲＥＦ２、及びＳＲｍ１６０）；ＲＮＡの安定化に関与するタンパク質及びタンパク質ドメイン（例えば、ＰＡＢＰ）；翻訳の抑制に関与するタンパク質及びタンパク質ドメイン（例えば、Ａｇｏ２及びＡｇｏ４）；翻訳の刺激に関与するタンパク質及びタンパク質ドメイン（例えば、Ｓｔａｕｆｅｎ）；翻訳の調節に関与する（例えば、翻訳を調節することができる）タンパク質及びタンパク質ドメイン（例えば、翻訳因子（例えば、開始因子、伸長因子、終結因子など、例えば、ｅＩＦ４Ｇ））；ＲＮＡのポリアデニル化に関与するタンパク質及びタンパク質ドメイン（例えば、ＰＡＰ１、ＧＬＤ－２、及びＳｔａｒ－ＰＡＰ）；ＲＮＡのポリウリジニル化に関与するタンパク及びタンパクドメイン（例えば、ＣＩＤｌ及び末端ウリジル酸トランスフェラーゼ）；ＲＮＡ局在化に関与するタンパク質及びタンパク質ドメイン（例えば、ＩＭＰ１、ＺＢＰ１、Ｓｈｅ２ｐ、Ｓｈｅ３ｐ、及びＢｉｃａｕｄａｌ－Ｄ由来）；ＲＮＡの核内保持に関与するタンパク質及びタンパク質ドメイン（例えば、Ｒｒｐ６）；ＲＮＡの核外輸送に関与するタンパク質及びタンパク質ドメイン（例えば、ＴＡＰ、ＮＸＦ１、ＴＨＯ、ＴＲＥＸ、ＲＥＦ、及びＡｌｙ）；ＲＮＡスプライシングの抑制に関与するタンパク質及びタンパク質ドメイン（例えば、ＰＴＢ、Ｓａｍ６８、及びｈｎＲＮＰ Ａｌ）；ＲＮＡスプライシングの刺激に関与するタンパク質及びタンパク質ドメイン（例えば、セリン／アルギニンリッチ（ＳＲ）ドメイン）；転写効率の低下に関与するタンパク質及びタンパク質ドメイン（例えば、ＦＵＳ（ＴＬＳ））；転写の刺激に関与するタンパク質及びタンパク質ドメイン（例えば、ＣＤＫ７及びＨＩＶ Ｔａｔ）。代替的に、エフェクタードメインは、以下を含む群から選択することができる：エンドヌクレアーゼ；ＲＮＡ切断を刺激することができるタンパク質及びタンパク質ドメイン；エキソヌクレアーゼ；デアデニラーゼ；ナンセンス媒介ＲＮＡ分解活性を有するタンパク質及びタンパク質ドメイン；ＲＮＡを安定化することができるタンパク質及びタンパク質ドメイン；翻訳を抑制することができるタンパク質及びタンパク質ドメイン；翻訳を刺激することができるタンパク質及びタンパク質ドメイン；翻訳を調節することができるタンパク質及びタンパク質ドメイン（例えば、翻訳因子（例えば、開始因子、伸長因子、終結因子など、例えば、ｅＩＦ４Ｇ））；ＲＮＡをポリアデニル化することができるタンパク質及びタンパク質ドメイン；ＲＮＡをポリウリジニル化することができるタンパク及びタンパクドメイン；ＲＮＡ局在化活性を有するタンパク質及びタンパク質ドメイン；ＲＮＡを核内保持することができるタンパク質及びタンパク質ドメイン；ＲＮＡ核外輸送活性を有するタンパク質及びタンパク質ドメイン；ＲＮＡスプライシングを抑制することができるタンパク質及びタンパク質ドメイン；ＲＮＡスプライシングを刺激することができるタンパク質及びタンパク質ドメイン；転写効率を低下させることができるタンパク質及びタンパク質ドメイン；並びに転写を刺激することができるタンパク質及びタンパク質ドメイン。別の好適な異種ポリペプチドは、ＰＵＦ ＲＮＡ結合ドメインであり、これは、国際公開第２０１２／０６８６２７号（その全体が参照により本明細書に援用される）により詳細に記載されている。

【0199】

ＣａｓＸバリアントとの融合パートナーとして（全体又はその断片で）使用することができるいくつかのＲＮＡスプライシング因子は、別個の配列特異的なＲＮＡ結合モジュール及びスプライシングエフェクタードメインを有するモジュール構成を有する。例えば、セリン／アルギニンリッチ（serine/arginine-rich、ＳＲ）タンパク質ファミリーのメンバーは、プレｍＲＮＡにおけるエキソンスプライシングエンハンサー（exonic splicing enhancer、ＥＳＥ）に結合するＮ末端ＲＮＡ認識モチーフ（RNA recognition motif、ＲＲＭ）及びエキソン封入を促進するＣ末端ＲＳドメインを含む。別の例として、ｈｎＲＮＰタンパク質ｈｎＲＮＰ Ａｌは、そのＲＲＭドメインを介してエキソンスプライシングサイレンサー（exonic splicing silencer、ＥＳＳ）に結合し、Ｃ末端グリシンリッチドメインを介してエキソン封入を阻害する。いくつかのスプライシング因子は、２つの選択的部位の間の調節配列に結合することによって、スプライス部位（splice site、ｓｓ）の選択的使用を調節することができる。例えば、ＡＳＦ／ＳＦ２は、ＥＳＥを認識し、イントロン近位部位の使用を促進することができるが、ｈｎＲＮＰＡｌは、ＥＳＳに結合し、スプライシングをイントロン遠位部位の使用にシフトさせることができる。かかる因子の１つの適用は、内因性遺伝子（特に、疾患関連遺伝子）の選択的スプライシングを調節するＥＳＦを作製することである。例えば、Ｂｃｌ－ｘプレｍＲＮＡは、反対の機能のタンパク質をコードする２つの選択的５’スプライス部位を有する２つのスプライシングアイソフォームを産生する。長いスプライシングアイソフォームのＢｃｌ－ｘＬは、長寿命の有糸分裂後細胞において発現される強力なアポトーシス阻害剤であり、多くのがん細胞において上方制御され、アポトーシスシグナルから細胞を保護する。短いアイソフォームのＢｃｌ－ｘＳは、アポトーシス促進性アイソフォームであり、高い代謝率を有する細胞（例えば、発生中のリンパ球）において高レベルで発現される。２つのＢｃｌ－ｘスプライシングアイソフォームの比は、コアエキソン領域又はエキソン伸長領域（すなわち、２つの選択的５’スプライス部位間）のいずれかに位置する複数のｃｃエレメントによって調節される。更なる例については、国際公開第２０１０／０７５３０３号を参照されたい（その全体が参照により本明細書に援用される）。

【0200】

ＣａｓＸバリアントとともに使用するための更なる好適な融合パートナーとしては、境界エレメント（例えば、ＣＴＣＦ）であるタンパク質（又はその断片）、末梢動員を提供するタンパク質及びその断片（例えば、ラミンＡ、ラミンＢなど）、並びにタンパク質ドッキングエレメント（例：ＦＫＢＰ／ＦＲＢ、Ｐｉｌｌ／Ａｂｙｌなど）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0201】

場合によっては、ＣａｓＸバリアントとともに使用するための異種ポリペプチド（融合パートナー）は、細胞内局在化を提供する。すなわち、異種ポリペプチドは、細胞内局在化配列（例えば、核への標的化のための核局在化シグナル（nuclear localization signal、ＮＬＳ）、融合タンパク質を核外に保持するための配列（例えば、核外輸送配列（nuclear export sequence、ＮＥＳ））、融合タンパク質を細胞質に保持するための配列、ミトコンドリアへの標的化のためのミトコンドリア局在化シグナル、葉緑体への標的化のための葉緑体局在化シグナル、ＥＲ保持シグナルなど）を含む。いくつかの実施形態では、対象のＲＮＡガイドポリペプチド若しくは条件的活性型ＲＮＡガイドポリペプチド及び／又は対象のＣａｓＸ融合タンパク質は、タンパク質が核を標的化しないように、ＮＬＳを含まない（これは、例えば、標的核酸配列が細胞質ゾルに存在するＲＮＡである場合に有利であり得る）。いくつかの実施形態では、融合パートナーは、追跡及び／又は精製を容易にするためのタグを提供することができる（すなわち、異種ポリペプチドが検出可能な標識である）（例えば、蛍光タンパク質、例えば、緑色蛍光タンパク質（green fluorescent protein、ＧＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（yellow fluorescent protein、ＹＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（red fluorescent protein、ＲＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（cyan fluorescent protein、ＣＦＰ）、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｔｄＴｏｍａｔｏなど；ヒスチジンタグ、例えば、６×Ｈｉｓタグ；赤血球凝集素（ＨＡ）タグ；ＦＬＡＧタグ；Ｍｙｃタグなど）。

【0202】

場合によっては、ＣａｓＸバリアントとともに使用するのに好適なＮＬＳの非限定的な例としては、以下に由来する配列と少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、若しくは少なくとも約９５％の同一性を有するか、又はそれと同一である配列が挙げられる：アミノ酸配列ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号１６８）を有するＳＶ４０ウイルスラージＴ抗原のＮＬＳ；ヌクレオプラスミン由来のＮＬＳ（例えば、配列ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫ（配列番号１６９）を有するヌクレオプラスミン二分ＮＬＳ）；アミノ酸配列ＰＡＡＫＲＶＫＬＤ（配列番号１７０）又はＲＱＲＲＮＥＬＫＲＳＰ（配列番号１７１）を有するｃ－ｍｙｃ ＮＬＳ；配列ＮＱＳＳＮＦＧＰＭＫＧＧＮＦＧＧＲＳＳＧＰＹＧＧＧＧＱＹＦＡＫＰＲＮＱＧＧＹ（配列番号１７２）を有するｈＲＮＰＡｌ Ｍ９ ＮＬＳ；インポーチンアルファ由来のＩＢＢドメインの配列ＲＭＲＩＺＦＫＮＫＧＫＤＴＡＥＬＲＲＲＲＶＥＶＳＶＥＬＲＫＡＫＫＤＥＱＩＬＫＲＲＮＶ（配列番号１７３）；筋腫Ｔタンパク質の配列ＶＳＲＫＲＰＲＰ（配列番号１７４）及びＰＰＫＫＡＲＥＤ（配列番号１７５）；ヒトｐ５３の配列ＰＱＰＫＫＫＰＬ（配列番号１７６）；マウスｃ－ａｂｌ ＩＶの配列ＳＡＬＩＫＫＫＫＫＭＡＰ（配列番号１７７）；インフルエンザウイルスＮＳ１の配列ＤＲＬＲＲ（配列番号１７８）及びＰＫＱＫＫＲＫ（配列番号１７９）；ヘルペスウイルスδ抗原の配列ＲＫＬＫＫＫＩＫＫＬ（配列番号１８０）；マウスＭｘｌタンパク質の配列ＲＥＫＫＫＦＬＫＲＲ（配列番号１８１）；ヒトポリ（ＡＤＰ－リボース）ポリメラーゼの配列ＫＲＫＧＤＥＶＤＧＶＤＥＶＡＫＫＫＳＫＫ（配列番号１８２）；ステロイドホルモン受容体（ヒト）グルココルチコイドの配列ＲＫＣＬＱＡＧＭＮＬＥＡＲＫＴＫＫ（配列番号１８３）；ボルナ病ウイルスＰタンパク質（ＢＤＶ－Ｐ１）の配列ＰＲＰＲＫＩＰＲ（配列番号１８４）；Ｃ型肝炎ウイルス非構造タンパク質（ＨＣＶ－ＮＳ５Ａ）の配列ＰＰＲＫＫＲＴＶＶ（配列番号１８５）；ＬＥＦ１の配列ＮＬＳＫＫＫＫＲＫＲＥＫ（配列番号１８６）；ＯＲＦ５７ ｓｉｍｉｒａｅの配列ＲＲＰＳＲＰＦＲＫＰ（配列番号１８７）；ＥＢＶ ＬＡＮＡの配列ＫＲＰＲＳＰＳＳ（配列番号１８８）；インフルエンザＡタンパク質の配列ＫＲＧＩＮＤＲＮＦＷＲＧＥＮＥＲＫＴＲ（配列番号１８９）；ヒトＲＮＡヘリカーゼＡ（ＲＨＡ）の配列ＰＲＰＰＫＭＡＲＹＤＮ（配列番号１９０）；核小体ＲＮＡヘリカーゼＩＩの配列ＫＲＳＦＳＫＡＦ（配列番号１９１）；ＴＵＳ－タンパク質の配列ＫＬＫＩＫＲＰＶＫ（配列番号１９２）；インポーチンαに関連する配列ＰＫＫＫＲＫＶＰＰＰＰＡＡＫＲＶＫＬＤ（配列番号１９３）；ＨＴＬＶ－１のＲｅｘタンパク質由来の配列ＰＫＴＲＲＲＰＲＲＳＱＲＫＲＰＰＴ（配列番号２６７９２）；Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓのＥＧＬ－１３タンパク由来の配列ＳＲＲＲＫＡＮＰＴＫＬＳＥＮＡＫＫＬＡＫＥＶＥＮ（配列番号１９４）；並びに配列ＫＴＲＲＲＰＲＲＳＱＲＫＲＰＰＴ（配列番号１９５）、ＲＲＫＫＲＲＰＲＲＫＫＲＲ（配列番号１９６）、ＰＫＫＫＳＲＫＰＫＫＫＳＲＫ（配列番号１９７）、ＨＫＫＫＨＰＤＡＳＶＮＦＳＥＦＳＫ（配列番号１９８）、ＱＲＰＧＰＹＤＲＰＱＲＰＧＰＹＤＲＰ（配列番号１９９）、ＬＳＰＳＬＳＰＬＬＳＰＳＬＳＰＬ（配列番号２００）、ＲＧＫＧＧＫＧＬＧＫＧＧＡＫＲＨＲＫ（配列番号２０１）、ＰＫＲＧＲＧＲＰＫＲＧＲＧＲ（配列番号２０２）、ＰＫＫＫＲＫＶＰＰＰＰＡＡＫＲＶＫＬＤ（配列番号２０３）、ＰＫＫＫＲＫＶＰＰＰＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号２０４）、ＰＡＫＲＡＲＲＧＹＫＣ（配列番号２７１９９）、ＫＬＧＰＲＫＡＴＧＲＷ（配列番号２７２００）、ＰＲＲＫＲＥＥ（配列番号２７２０１）、ＰＹＲＧＲＫＥ（配列番号２７２０２）、ＰＬＲＫＲＰＲＲ（配列番号２７２０３）、ＰＬＲＫＲＰＲＲＧＳＰＬＲＫＲＰＲＲ（配列番号２７２０４）、ＰＡＡＫＲＶＫＬＤＧＧＫＲＴＡＤＧＳＥＦＥＳＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号２７２０５）、ＰＡＡＫＲＶＫＬＤＧＧＫＲＴＡＤＧＳＥＦＥＳＰＫＫＫＲＫＶＧＩＨＧＶＰＡＡ（配列番号２７２０６）、ＰＡＡＫＲＶＫＬＤＧＧＫＲＴＡＤＧＳＥＦＥＳＰＫＫＫＲＫＶＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡ（配列番号２０７）、ＰＡＡＫＲＶＫＬＤＧＧＫＲＴＡＤＧＳＥＦＥＳＰＫＫＫＲＫＶＰＧ（配列番号２７２０８）、ＫＲＫＧＳＰＥＲＧＥＲＫＲＨＷ（配列番号２７２０９）、ＫＲＴＡＤＳＱＨＳＴＰＰＫＴＫＲＫＶＥＦＥＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号２７２１０）、及びＰＫＫＫＲＫＶＧＧＳＫＲＴＡＤＳＱＨＳＴＰＰＫＴＫＲＫＶＥＦＥＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号２７２１１）。いくつかの実施形態では、１つ以上のＮＬＳは、リンカーペプチドを用いて、ＣＲＩＳＰＲタンパク質又は隣接するＮＬＳに連結され、リンカーペプチドが、ＲＳ、（Ｇ）ｎ（配列番号２７２１２）、（ＧＳ）ｎ（配列番号２７２１３）、（ＧＳＧＧＳ）ｎ（配列番号２１４）、（ＧＧＳＧＧＳ）ｎ（配列番号２１５）、（ＧＧＧＳ）ｎ（配列番号２１６）、ＧＧＳＧ（配列番号２１７）、ＧＧＳＧＧ（配列番号２１８）、ＧＳＧＳＧ（配列番号２１９）、ＧＳＧＧＧ（配列番号２２０）、ＧＧＧＳＧ（配列番号２２１）、ＧＳＳＳＧ（配列番号２２２）、ＧＰＧＰ（配列番号２２３）、ＧＧＰ、ＰＰＰ、ＰＰＡＰＰＡ（配列番号２２４）、ＰＰＰＧ（配列番号２７２１４）、ＰＰＰＧＰＰＰ（配列番号２２５）、ＰＰＰ（ＧＧＧＳ）ｎ（配列番号２７２１５）、（ＧＧＧＳ）ｎＰＰＰ（配列番号２７２１６）、ＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡ（配列番号２７２１７）、及びＴＰＰＫＴＫＲＫＶＥＦＥ（配列番号２７２１８）（式中、ｎは１～５である）からなる群から選択される。一般に、ＮＬＳ（又は複数のＮＬＳ）は、真核細胞の核におけるＣａｓＸバリアント融合タンパク質の蓄積を駆動するのに十分強力なものである。核における蓄積の検出は、任意の好適な技術によって実施され得る。例えば、検出可能なマーカーは、細胞内の位置が可視化され得るように、ＣａｓＸバリアント融合タンパク質に融合され得る。細胞核はまた、細胞から単離され得、次いで、その内容物が、タンパク質を検出するための任意の好適なプロセス（例えば、免疫組織化学、ウェスタンブロット、又は酵素活性アッセイ）によって分析され得る。核における蓄積はまた、間接的に決定され得る。

【0203】

一般に、ＮＬＳ（又は複数のＮＬＳ）は、真核細胞の核において発現されたＣａｓＸバリアント融合タンパク質の蓄積を駆動するのに十分強力なものである。核における蓄積の検出は、任意の好適な技術によって実施され得る。例えば、検出可能なマーカーは、細胞内の位置が可視化され得るように、ＣａｓＸバリアント融合タンパク質に融合され得る。細胞核はまた、細胞から単離され得、次いで、その内容物が、タンパク質を検出するための任意の好適なプロセス（例えば、免疫組織化学、ウェスタンブロット、又は酵素活性アッセイ）によって分析され得る。核における蓄積はまた、間接的に決定され得る。

【0204】

場合によっては、ＣａｓＸバリアント融合タンパク質は、「タンパク質形質導入ドメイン」又はＰＴＤ（ＣＰＰ細胞透過ペプチドとしても知られる）を含み、これは、脂質二重層、ミセル、細胞膜、細胞小器官膜、又は小胞膜の横断を促進するタンパク質、ポリヌクレオチド、炭水化物、又は有機若しくは無機化合物を指す。別の分子（これは、小さな極性分子から大きな高分子及び／又はナノ粒子の範囲であり得る）に結合したＰＴＤは、分子が膜を横断すること、例えば、細胞外空間から細胞内空間へ、又はサイトゾルから細胞小器官内へ移行することを容易にする。いくつかの実施形態では、ＰＴＤは、ＣａｓＸバリアント融合タンパク質のアミノ末端に共有結合される。いくつかの実施形態では、ＰＴＤは、ＣａｓＸバリアント融合タンパク質のカルボキシル末端に共有結合される。場合によっては、ＰＴＤは、好適な挿入部位でＣａｓＸバリアント融合タンパク質の配列の内部に挿入される。場合によっては、ＣａｓＸバリアント融合タンパク質は、１つ以上のＰＴＤ（例えば、２つ以上、３つ以上、４つ以上のＰＴＤ）を含む（にコンジュゲートされている、融合されている）。場合によっては、ＰＴＤは、１つ以上の核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含む。ＰＴＤの例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号２０５）、ＲＫＫＲＲＱＲＲ（配列番号２０６）を含むＨＩＶ ＴＡＴのペプチド形質導入ドメイン；ＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡ（配列番号２０７）；ＴＨＲＬＰＲＲＲＲＲＲ（配列番号２０８）；及びＧＧＲＲＡＲＲＲＲＲＲ（配列番号２０９）；細胞への侵入を指示するのに十分な数のアルギニン残基（例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１０～５０個のアルギニン残基を含むポリアルギニン配列（配列番号２６７９３）；ＶＰ２２ドメイン（Ｚｅｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．９（６）：４８９－９６）；Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａアンテナペディアタンパク形質導入ドメイン（Ｎｏｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｄｉａｂｅｔｅｓ ５２（７）：１７３２－１７３７）；短縮型ヒトカルシトニンペプチド（Ｔｒｅｈｉｎ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２１：１２４８－１２５６）；ポリリジン（Ｗｅｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９７：１３００３－１３００８）；ＲＲＱＲＲＴＳＫＬＭＫＲ（配列番号２１０）；トランスポータンＧＷＴＬＮＳＡＧＹＬＬＧＫＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬ（配列番号２１１）；ＫＡＬＡＷＥＡＫＬＡＫＡＬＡＫＡＬＡＫＨＬＡＫＡＬＡＫＡＬＫＣＥＡ（配列番号２１２）；並びにＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ（配列番号２１３）。いくつかの実施形態では、ＰＴＤは、活性化可能ＣＰＰ（ＡＣＰＰ）である（Ａｇｕｉｌｅｒａ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｉｎｔｅｇｒ Ｂｉｏｌ（Ｃａｍｂ）Ｊｕｎｅ；１（５－６）：３７１－３８１）。ＡＣＰＰは、一致するポリアニオン（例えば、Ｇｌｕ９又は「Ｅ９」）に切断コンピテントリンカーを介して連結されたポリカチオン性ＣＰＰ（例えば、Ａｒｇ９又は「Ｒ９」）を含み、これは、正味電荷をほぼ０に減少させ、それによって、細胞への接着及び取り込みを阻害する。リンカーが切断されると、ポリアニオンが放出され、ポリアルギニン及びその固有の接着性を局所的にアンマスクし、したがって、ＡＣＰＰを「活性化」して膜を通過させる。

【0205】

いくつかの実施形態では、システムにおいて使用するためのＣａｓＸバリアント融合タンパク質は、リンカーポリペプチド（例えば、１つ以上のリンカーポリペプチド）を介して内部に挿入された異種アミノ酸又は異種ポリペプチド（異種アミノ酸配列）に連結されたＣａｓＸタンパク質を含むことができる。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアント融合タンパク質は、Ｃ末端及び／又はＮ末端において、リンカーポリペプチド（例えば、１つ以上のリンカーポリペプチド）を介して異種ポリペプチド（融合パートナー）に連結され得る。リンカーポリペプチドは、様々なアミノ酸配列のいずれかを有し得る。タンパク質は、一般的に柔軟な性質のスペーサーペプチドによって連結され得るが、他の化学結合は除外されない。好適なリンカーには、４アミノ酸～４０アミノ酸長、又は４アミノ酸～２５アミノ酸長のポリペプチドが含まれる。これらのリンカーは、一般に、合成のリンカーをコードするオリゴヌクレオチドを使用してタンパク質をカップリングすることによって生成される。ある程度の柔軟性を有するペプチドリンカーを使用することができる。連結ペプチドは、好ましいリンカーが一般的に柔軟なペプチドをもたらす配列を有するであろうことを考慮して、実質的に任意のアミノ酸配列を有し得る。グリシン及びアラニンなどの小アミノ酸の使用は、柔軟なペプチドの生成において有用である。かかる配列の生成は、当業者にとって日常的である。様々な異なるリンカーが市販されており、使用に好適であると考えられる。例示的なリンカーポリペプチドとしては、ＲＳ、（Ｇ）ｎ（配列番号２７２１２）、（ＧＳ）ｎ（配列番号２７２１３）、（ＧＳＧＧＳ）ｎ（配列番号２１４）、（ＧＧＳＧＧＳ）ｎ（配列番号２１５）、（ＧＧＧＳ）ｎ（配列番号２１６）、（式中、ｎは１～５の整数である）ＧＧＳＧ（配列番号２１７）、ＧＧＳＧＧ（配列番号２１８）、ＧＳＧＳＧ（配列番号２１９）、ＧＳＧＧＧ（配列番号２２０）、ＧＧＧＳＧ（配列番号２２１）、ＧＳＳＳＧ（配列番号２２２）、ＧＰＧＰ（配列番号２２３）、ＧＧＰ、ＰＰＰ、ＰＰＡＰＰＡ（配列番号２２４）、ＰＰＰＧ（配列番号２７２１４）、ＰＰＰＧＰＰＰ（配列番号２２５）、ＰＰＰ（ＧＧＧＳ）ｎ（配列番号２７２１５）、（ＧＧＧＳ）ｎＰＰＰ（配列番号２７２１６）、ＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡ（配列番号２７２１７）、及びＴＰＰＫＴＫＲＫＶＥＦＥ（配列番号２７２１８）（式中、ｎは１～５である）からなる群から選択されるペプチドが挙げられる。当業者であれば、上記の任意のエレメントにコンジュゲートされたペプチドの設計は、リンカーが柔軟なリンカー並びにあまり柔軟ではない構造を付与する１つ以上の部分を含むことができるように、全て又は部分的に柔軟なリンカーを含むことができることを認識するであろう。

【0206】

Ｖ．ＢＣＬ１１Ａ遺伝子の改変のためのシステム及び方法
本明細書に提供されるＣＲＩＳＰＲタンパク質、ガイド核酸、及びそれらのバリアントは、治療剤、診断剤として、及び研究のためを含む様々な用途に有用である。いくつかの実施形態では、遺伝子編集のための本開示の方法を実施するために、プログラム可能なＣａｓＸ：ｇＲＮＡシステムが本明細書において提供される。本明細書に提供されるシステムのプログラム可能な性質は、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子標的核酸中の所定の目的の１つ以上の領域において所望の改変を達成するための正確な標的化を可能にする。本明細書に提供されるシステムを使用して細胞における標的核酸配列を改変するために、様々な戦略及び方法を使用することができる。本明細書で使用される場合、「改変」としては、切断、ニッキング、編集、欠失、ノックアウト、ノックダウン、変異誘発、修復、エキソンスキッピングなどが挙げられるが、これらに限定されない。利用されるシステム成分に応じて、編集事象は、切断事象と、それに続く、例えば、フレームシフト変異を生成し得る不正確な非相同ＤＮＡ末端結合（ＮＨＥＪ）修復経路を利用することによる、ランダム挿入若しくは欠失（インデル）又は他の変異（例えば、１つ以上のヌクレオチドの置換、重複、若しくは逆位）の導入であり得る。代替的に、編集事象は、切断事象、それに続く、標的核酸配列の改変をもたらす相同組換え修復（ＨＤＲ）、相同性非依存性標的化組み込み（ＨＩＴＩ）、マイクロホモロジー媒介末端結合（ＭＭＥＪ）、一本鎖アニーリング（ＳＳＡ）又は塩基除去修復（ＢＥＲ）であり得る。

【0207】

本方法のいくつかの実施形態では、改変されるＢＣＬ１１Ａ遺伝子は、配列番号１００の配列の全部若しくは一部をコードするポリヌクレオチドに対応する配列を含むか、又は第２染色体上のヒトゲノムのｃｈｒ２ ６０４５０５２０－６０５５４４６７（ＧＲＣｈ３８／ｈｇ３８ Ｅｎｓｅｍｂｌ １００）の全部若しくは一部にわたるポリヌクレオチド配列を含む。本方法の他の実施形態では、改変される標的核酸配列は、ＢＣＬ１１Ａタンパク質をコードするＢＣＬ１１Ａ遺伝子の領域、ＢＣＬ１１Ａ調節エレメント、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子の非コード領域、又はそれらの重複部分を含む。本方法の特定の実施形態では、改変される標的核酸配列は、ＧＡＴＡ１結合モチーフ配列又はその相補体を含む。

【0208】

いくつかの実施形態では、本開示は、細胞においてＢＣＬ１１Ａ標的核酸を改変する方法を提供し、クラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲシステムを細胞に導入することを含む方法を提供する。本方法のいくつかの実施形態では、改変される細胞は、当該細胞を投与される対象に対して自己由来である。他の実施形態では、改変される細胞は、当該細胞を投与される対象に対して同種である。したがって、本明細書に記載のシステム及び方法は、変異がβ－グロビン遺伝子に存在し、疾患（例えば、鎌状赤血球症並びにαサラセミア及びβサラセミアを含む異常ヘモグロビン症）に関連する様々な細胞を操作するために使用され得る。したがって、このアプローチは、限定されないが鎌状赤血球症並びにα－及びβサラセミアなどの異常ヘモグロビン症関連疾患を有する対象における適用のために細胞を改変するのに使用することができる。

【0209】

いくつかの実施形態では、本開示は、細胞におけるＢＣＬ１１Ａ標的核酸を改変する方法を提供し、本方法は、細胞に、ｉ）本明細書に記載の実施形態のいずれか１つに記載のＣａｓＸ及びｇＲＮＡを含むＣａｓＸ：ｇＲＮＡシステム、ｉｉ）本明細書に記載の実施形態のいずれか１つに記載のＣａｓＸ、ｇＲＮＡ、及びドナー鋳型を含むＣａｓＸ：ｇＲＮＡシステム、ｉｉｉ）ＣａｓＸ及びｇＲＮＡをコードし、任意選択的に、ドナー鋳型を含む核酸、ｉｖ）上記の（ｉｉｉ）の核酸を含むベクター、ｖ）本明細書に記載の実施形態のいずれか１つに記載のＣａｓＸ：ｇＲＮＡシステムを含むＸＤＰ、又はｖｉ）（ｉ）～（ｖ）のうちの２つ以上の組み合わせ、を導入することを含み、細胞の標的核酸配列が、ＣａｓＸタンパク質及び任意選択的にドナー鋳型によって改変される。いくつかの実施形態では、ベクターはＡＡＶベクターである。いくつかの実施形態では、本開示は、細胞におけるＢＣＬ１１Ａ遺伝子を改変する方法において使用するためのＣａｓＸ：ｇＲＮＡシステムを提供し、本方法は、配列番号３６～９９、１０１～１４８、及び２６９０８～２７１５４からなる群から選択されるＣａｓＸバリアント、若しくは配列番号５９、７２～９９、１０１～１４８、及び２６９０８～２７１５４からなる群から選択されるＣａｓＸバリアント、若しくは配列番号１３２～１４８及び２６９０８～２７１５４からなる群から選択されるＣａｓＸバリアント、又はそれと少なくとも６０％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８１％同一、少なくとも８２％同一、少なくとも８３％同一、少なくとも８４％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも８６％同一、少なくとも８６％同一、少なくとも８７％同一、少なくとも８８％同一、少なくとも８９％同一、少なくとも８９％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、若しくは少なくとも９９．５％同一のバリアント配列を含み、ｇＲＮＡ足場が、表３に示される配列番号２１０１～２２８５、２６７９４～２６８３９、及び２７２１９～２７２６５からなる群から選択される配列、若しくは配列番号２２８１～２２８５、２６７９４～２６８３９、及び２７２１９～２７２６５からなる群から選択される配列、又はそれと少なくとも６５％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８１％同一、少なくとも８２％同一、少なくとも８３％同一、少なくとも８４％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも８６％同一、少なくとも８６％同一、少なくとも８７％同一、少なくとも８８％同一、少なくとも８９％同一、少なくとも８９％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、少なくとも９９．５％同一の配列を含み、ｇＲＮＡが、配列番号２７２～２１００若しくは２２８６～２６７８９からなる群から選択される標的化配列、又はそれと少なくとも６５％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、若しくは少なくとも９５％同一の配列を含み、かつ１５～２０ヌクレオチドを有する。特定の実施形態では、ｇＲＮＡの標的化配列は、ＧＡＴＡ１結合モチーフ配列内の配列、又はＧＡＴＡ１結合モチーフ配列の５’側若しくは３’側にある配列と相補的であり、したがって、それとハイブリダイズすることができる。一実施形態では、ｇＲＮＡの標的化配列は、ＢＣＬ１１Ａ ＧＡＴＡ１赤血球特異的エンハンサー結合部位配列とハイブリダイズするＵＧＧＡＧＣＣＵＧＵＧＡＵＡＡＡＡＧＣＡ（配列番号２２）であるか、又はそれと少なくとも９０％若しくは少なくとも９５％の配列同一性を有する配列である。別の実施形態では、ｇＲＮＡの標的化配列はＵＧＣＵＵＵＵＡＵＣＡＣＡＧＧＣＵＣＣＡ（配列番号２３）であり、これは、ＢＣＬ１１Ａ ＧＡＴＡ１赤血球特異的エンハンサー結合部位配列の逆相補体に相補的な配列とハイブリダイズするか、又はそれと少なくとも９０％若しくは少なくとも９５％の配列同一性を有する配列である。別の特定の実施形態では、ｇＲＮＡの標的化配列は、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子のプロモーター内の配列に相補的であり、したがって、それとハイブリダイズすることができる。本方法の一実施形態では、ＣａｓＸ及びｇＲＮＡは、リボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）において一緒に会合している。細胞におけるＢＣＬ１１Ａ標的核酸配列を改変する方法のいくつかの実施形態では、改変は、標的核酸配列において一本鎖切断を導入することを含む。本方法の他の実施形態では、改変は、標的核酸配列において二本鎖切断を導入することを含む。本方法のいくつかの実施形態では、改変することは、標的核酸配列において１つ以上のヌクレオチドの挿入、欠失、置換、重複、又は逆位を導入することを含む。本明細書に記載されるように、標的核酸の二本鎖切断を導入するＣａｓＸバリアントは、標的鎖上のＰＡＭ部位の５’側の１８～２６ヌクレオチド内及び非標的鎖上の３’側の１０～１８ヌクレオチド内に二本鎖切断を生成する。したがって、いくつかの実施形態では、本方法によって得られる改変は、非相同ＤＮＡ末端結合（ＮＨＥＪ）修復機構によって、それらの領域における１つ以上のヌクレオチドのランダムな挿入、又は欠失（インデル）、又は置換、重複、又は逆位をもたらし得る。

【0210】

細胞におけるＢＣＬ１１Ａ標的核酸配列を改変する方法の他の実施形態では、本方法は、標的核酸配列をＢＣＬ１１Ａ遺伝子の異なる部分又は重複する部分を標的化する第１及び第２の又は複数のｇＲＮＡ（例えば、第２のｇＲＮＡの標的化配列が、ＧＡＴＡ１結合部位の５’側又は３’側にある配列と相補的である）を有するＣａｓＸ：ｇＲＮＡシステムと接触させることを含み、ＣａｓＸタンパク質が、標的核酸に複数の切断を導入し、本明細書に記載されるように、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子産物の対応する発現の調節若しくは機能の改変を伴う、標的核酸における永続的なインデル若しくは変異又はＧＡＴＡ１結合モチーフ配列の切除をもたらし、それによって、編集された細胞を生成する。前述のいくつかの場合では、複数のｇＲＮＡは、ＧＡＴＡ１結合モチーフ配列の一部又は全部が、２つのｇＲＮＡによって標的化される二重切断部位間の標的遺伝子から切除されるように、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子のＧＡＴＡ１結合モチーフ配列に対して５’側及び３’側の位置を標的化する。本方法の前述の実施形態はまた、コード核酸、コード酸を含むベクター、又はＣａｓＸ：ｇＲＮＡシステム成分を含むＸＤＰの使用によって達成され得ることが理解されるであろう。

【0211】

いくつかの実施形態では、本開示の方法は、ＰＡＭ部位の３’側の１８～２４ヌクレオチド内に部位特異的な二本鎖切断（double strand break、ＤＳＢ）又は一本鎖切断（single strand break、ＳＳＢ）（例えば、ＣａｓＸタンパク質が、標的核酸の一方の鎖のみを切断することができるニッカーゼである場合）を生成するＣａｓＸタンパク質及びｇＲＮＡ対を提供し、これは次いで、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）、相同組換え修復（ＨＤＲ）、相同性非依存性標的化組み込み（ＨＩＴＩ）、マイクロホモロジー媒介末端結合（ＭＭＥＪ）、一本鎖アニーリング（ＳＳＡ）、又は塩基除去修復（ＢＥＲ）のいずれかによって修復され得、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子の改変が、野生型配列と比較して、１つ以上のヌクレオチドの挿入、欠失、逆位、又は重複の変異を導入し、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子産物の対応する発現の調節又は機能の改変を伴い、それによって、編集された細胞が生成される。

【0212】

場合によっては、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子を改変する方法において使用するためのＣａｓＸ：ｇＲＮＡシステムは、本明細書に開示される実施形態のいずれかのドナー鋳型核酸を更に含み、ドナー鋳型が、宿主細胞の相同組換え修復（ＨＤＲ）又は相同性非依存性標的化組み込み（ＨＩＴＩ）修復機構によって挿入され得る。したがって、場合によっては、本明細書に提供される方法は、ドナー鋳型を（インビトロで細胞内に又はインビボで細胞内に）導入することによって、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子をドナー鋳型と接触させることを含み、ドナー鋳型、ドナー鋳型の一部、ドナー鋳型のコピー、又はドナー鋳型のコピーの一部は、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子に組み込まれて、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子の一部を置換する。ドナー鋳型は、短い一本鎖若しくは二本鎖オリゴヌクレオチド、又は長い一本鎖若しくは二本鎖オリゴヌクレオチドであり得る。いくつかの実施形態では、ドナー鋳型は、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子の少なくとも一部を含み、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子の部分が、ＢＣＬ１１Ａエキソン、ＢＣＬ１１Ａイントロン、ＢＣＬ１１Ａイントロン－エキソン接合部、ＢＣＬ１１Ａ調節エレメント、又はそれらの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、本開示は、ＢＣＬ１１Ａ標的配列における転写アクチベーターＧＡＴＡ１結合部位を標的化又は破壊する際に使用するためのドナー鋳型を提供し、ドナー鋳型が、標的ＤＮＡ領域と２つの隣接配列との間の修復機構が、ＨＤＲによる挿入を容易にするための標的領域でのドナー鋳型の挿入をもたらすように、切断部位の５’側及び３’側に対する２つの相同性領域（「相同アーム」）に隣接する、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子におけるＧＡＴＡ１部位内又はその付近のＤＮＡの領域に対して非相同である配列を含む。ドナー鋳型は、ゲノム配列に関して１つ以上の単一塩基変化、挿入、欠失、逆位又は再編成を含んでもよいが、ＢＣＬ１１Ａタンパク質が発現されない（ノックアウト）又はより低いレベルで発現される（ノックダウン）ようなフレームシフト又は他の変異をもたらすことができる、標的核酸へのその組み込みを支持するための標的核酸配列との十分な相同性が存在しなければならない。ＨＩＴＩによって挿入される外因性ドナー鋳型は、任意の長さ、例えば、１０～５０ヌクレオチド長の比較的短い配列、又は約５０～１０００ヌクレオチド長のより長い配列であり得る。相同性の欠如は、例えば、２０～５０％以下の配列同一性を有すること、及び／又は低い厳密性での特異的なハイブリダイゼーションを欠くことであり得る。他の場合では、相同性の欠如は、５、６、７、８、又は９ｂｐ以下の同一性を有するという基準を更に含み得る。いくつかの実施形態では、ドナー鋳型ポリヌクレオチドは、少なくとも約１０、少なくとも約５０、少なくとも約１００、又は少なくとも約２００、又は少なくとも約３００、又は少なくとも約４００、又は少なくとも約５００、又は少なくとも約６００、又は少なくとも約７００、又は少なくとも約８００、又は少なくとも約９００、又は少なくとも約１０００、又は少なくとも約１０，０００、又は少なくとも約１５，０００ヌクレオチドを含む。他の実施形態では、ドナー鋳型は、少なくとも約１０～約１５，０００ヌクレオチド、又は少なくとも約１００～約１０，０００ヌクレオチド、又は少なくとも約４００～約８，０００ヌクレオチド、又は少なくとも約６００～約５０００ヌクレオチド、又は少なくとも約１０００～約２０００ヌクレオチドを含む。ドナー鋳型配列は、ゲノム配列と比較して、特定の配列の差異、例えば、制限部位、ヌクレオチド多型、選択マーカー（例えば、薬剤耐性遺伝子、蛍光タンパク質、酵素など）などを含み得、これらは、切断部位でのドナー核酸の挿入の成功を評価するために使用され得るか、又は場合によっては、他の目的のために（例えば、標的ゲノム遺伝子座における発現を示すために）使用され得る。代替的に、これらの配列の差異は、マーカー配列の除去のために後で活性化され得る、隣接する組換え配列（例えば、ＦＬＰ配列、ｌｏｘＰ配列など）を含み得る。

【0213】

標的核酸に対する切断又は任意の所望の改変を誘導するために、細胞のＢＣＬ１１Ａ標的核酸をインビトロ又はエクスビボで改変する方法のいくつかの実施形態では、本開示のｇＲＮＡ及び／又はＣａｓＸタンパク質、並びに任意選択的にドナー鋳型配列は、核酸又はポリペプチド、複合体化ＲＮＰ、ベクター、又はＸＤＰとして導入されるかどうかにかかわらず、約３０分～約２４時間、又は少なくとも約１時間、１．５時間、２時間、２．５時間、３時間、３．５時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、１２時間、１６時間、１８時間、２０時間、又は約３０分～約２４時間の任意の他の期間、細胞に提供され、これは、約毎日～約４日毎の頻度、例えば、１．５日毎、２日毎、３日毎、又は約毎日～約４日毎の任意の他の頻度で繰り返され得る。薬剤は、対象細胞に、１回以上、例えば、１回、２回、３回、又は３回超提供され得、細胞は、各接触事象後に一定の時間（例えば、３０分～約２４時間）、薬剤とインキュベートされ得る。インビトロベースの方法の場合、ＣａｓＸ及びｇＲＮＡ（及び任意選択的にドナー鋳型）とのインキュベーション期間後、培地を新鮮な培地と交換し、細胞を更に培養する。

【0214】

細胞におけるＢＣＬ１１Ａ標的核酸を改変する方法のいくつかの実施形態では、本方法は、細胞の標的核酸配列を、ａ）第１のｇＲＮＡと比較してＢＣＬ１１Ａ標的核酸の異なる部分又は重複する部分を標的化する追加のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ及びｇＲＮＡ、ｂ）（ａ）の追加のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ及びｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチド、ｃ）（ｂ）のポリヌクレオチドを含むベクター、又はｄ）追加のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ及び（ａ）のｇＲＮＡを含むＸＤＰ、と接触させることを更に含み、接触が、第１のｇＲＮＡと比較して配列における異なる位置で、ＢＣＬ１１Ａ標的核酸の改変をもたらす。場合によっては、追加のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、前述の請求項のいずれかのＣａｓＸタンパク質とは異なる配列を有するＣａｓＸタンパク質である。他の場合では、追加のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、ＣａｓＸタンパク質ではなく、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｃ、Ｃａｓ１２ｄ（ＣａｓＹ）、Ｃａｓ１２ｊ、Ｃａｓ１２ｋ、Ｃａｓ１３ａ、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃ、Ｃａｓ１３ｄ、ＣａｓＹ、Ｃａｓ１４、Ｃｐｆｌ、Ｃ２ｃｌ、Ｃｓｎ２、Ｃａｓ Ｐｈｉ、及びそれらの配列バリアントからなる群から選択される。

【0215】

改変がＢＣＬ１１Ａ遺伝子のノックダウンをもたらす場合では、ＢＣＬ１１Ａタンパク質の発現は、改変されていない細胞と比較して、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、又は少なくとも約９０％減少する。改変がＢＣＬ１１Ａ遺伝子のノックアウトをもたらす他の場合では、細胞集団の標的核酸は、ＢＣＬ１１Ａタンパク質の発現が検出できないように改変される。ＢＣＬ１１Ａタンパク質の発現は、フローサイトメトリー、ＥＬＩＳＡ、細胞ベースのアッセイ、ウェスタンブロット、ｑＲＴ－ＰＣＲ、若しくは当該技術分野で既知の他の方法によって、又は実施例に記載されるように測定することができる。

【0216】

いくつかの実施形態では、本開示は、インビボで対象における細胞集団のＢＣＬ１１Ａ標的核酸を改変する方法を提供する。いくつかの実施形態では、標的核酸配列の改変は、エクスビボで真核細胞において行われ、真核細胞が、造血幹細胞（ＨＳＣ）、造血前駆細胞（ＨＰＣ）、ＣＤ３４＋細胞、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、骨髄系共通前駆細胞、前赤芽球細胞、及び赤芽球細胞からなる群から選択される。前述の実施形態では、改変された細胞集団は、対象における治療の方法において利用され得、改変された細胞が、それを必要とする対象に投与され、対象が、マウス、ラット、ブタ、非ヒト霊長類、及びヒトからなる群から選択される。場合によっては、エクスビボ細胞は自己由来であり、対象の骨髄又は末梢血から単離される。他の場合では、エクスビボ細胞は同種であり、異なる対象の骨髄又は末梢血から単離される。治療方法では、改変細胞は、実質内、静脈内、動脈内、筋内、表皮下、関節腔内、心臓内、心膜内、硝子体内、被膜下から選択される投与経路によって、又は皮下注射によって対象に投与することができ、移植、局所注射、全身注入、又はそれらの組み合わせによって対象に移植することができる。前述の実施形態では、本方法は、少なくとも約１ヶ月間、少なくとも約２ヶ月間、少なくとも約３ヶ月間、少なくとも約４ヶ月間、少なくとも約６ヶ月間、少なくとも約７ヶ月間、少なくとも約８ヶ月間、少なくとも約９ヶ月間、少なくとも約１０ヶ月間、少なくとも約１１ヶ月間、少なくとも約１２ヶ月間、少なくとも約１８ヶ月間、少なくとも約２年間、少なくとも約３年間、少なくとも約４年間、又は少なくとも約５年間、改変細胞又はその子孫の存続をもたらす。

【0217】

標的核酸配列を改変する方法のいくつかの実施形態では、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子を改変することは、ＣａｓＸ：ｇＲＮＡ複合体を標的核酸配列と結合させ、ＲＮＰとして細胞に導入することを含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸは、ｇＲＮＡ及び標的核酸配列に結合する能力を保持している触媒的に不活性なＣａｓＸ（ｄＣａｓＸ）タンパク質である。例えば、標的核酸配列は、ＧＡＴＡ１結合モチーフ配列に相補的な配列を含むＢＣＬ１１Ａ配列を含み、ｄＣａｓＸ：ｇＲＮＡ複合体の標的配列への結合が、ＢＣＬ１１Ａアレルの転写を妨害又は抑制する。いくつかの実施形態では、ｄＣａｓＸは、配列番号１のＣａｓＸタンパクに対応する残基Ｄ６７２、Ｅ７６９、及び／若しくはＤ９３５、又は配列番号２のＣａｓＸタンパクに対応するＤ６５９、Ｅ７５６、及び／若しくはＤ９２２に変異を含む。前述のいくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質における変異は、残基のアラニン又はグリシンの置換であり、本明細書に記載のバリアントのいずれかに利用することができる。

【0218】

システム実施形態の成分又は成分をコードする核酸を含む組換え発現ベクターを標的細胞に導入することは、インビボ、インビトロ又はエクスビボで行うことができる。本方法のいくつかの実施形態では、ベクターは、標的宿主細胞に直接提供され得る。核酸（例えば、ドナーポリヌクレオチド配列を含む核酸、ＣａｓＸタンパク質及び／若しくはｇＲＮＡをコードする１つ以上の核酸（ＤＮＡ若しくはＲＮＡ）、又はそれを含むベクター）を細胞に導入する方法は、当該技術分野で既知であり、任意の便利な方法を使用して、核酸（例えば、発現構築物）を細胞に導入することができる。好適な方法としては、例えば、ウイルス感染、トランスフェクション、リポフェクション、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）媒介性トランスフェクション、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介性トランスフェクション、リポソーム媒介性トランスフェクション、パーティクルガン技術、ヌクレオフェクション、エレクトロポレーション、ドナーＤＮＡに融合された若しくはそれを動員する細胞透過性ＣａｓＸタンパク質による直接添加、細胞圧搾、リン酸カルシウム沈殿、直接マイクロインジェクション、ナノ粒子媒介性核酸送達などが挙げられる。核酸は、ＱｉａｇｅｎからのＴｒａｎｓＭｅｓｓｅｎｇｅｒ（登録商標）試薬、ＳｔｅｍｇｅｎｔからのＳｔｅｍｆｅｃｔ（商標）ＲＮＡトランスフェクションキット、及びＭｉｒｕｓ Ｂｉｏ ＬＬＣからのＴｒａｎｓＩＴ（登録商標）－ｍＲＮＡトランスフェクションキット、Ｌｏｎｚａヌクレオフェクション、Ｍａｘａｇｅｎエレクトロポレーションなどの使用などの、十分に開発された市販のトランスフェクション技術を使用して細胞に導入され得る。インビトロ条件下で本開示のＣａｓＸ：ｇＲＮＡシステム（及び任意選択的にドナー配列）をコードする配列を含む組換え発現ベクターを細胞に導入することで、任意の好適な培養培地中で、細胞の生存を促進する任意の好適な培養条件下で行うことができる。例えば、細胞は、ベクターが細胞によって取り込まれるように、対象核酸を含むベクター（例えば、ドナー鋳型配列並びにＣａｓＸ及びｇＲＮＡをコードする核酸を有する組換え発現ベクター）と接触させることができる。ｇＲＮＡ及び／又はＣａｓＸタンパク質をコードする核酸を標的宿主細胞に提供するために使用されるベクターは、目的の核酸の発現（すなわち、転写活性化）を駆動するための好適なプロモーターを含むことができる。場合によっては、目的のコード核酸は、プロモーターに作動可能に連結される。これは、遍在的に作用するプロモーター（例えば、ＣＭＶ－β－アクチンプロモーター）又は誘導性プロモーター（例えば、特定の細胞集団において活性であるか、又はテトラサイクリン若しくはカナマイシンのような薬物の存在に応答するプロモーター）を含み得る。転写活性化によって、転写が、ベクターを含む標的宿主細胞における基底レベルを超えて、少なくとも約１０倍、少なくとも約１００倍、より通常には少なくとも約１０００倍増加することが意図される。加えて、ｇＲＮＡ及び／又はＣａｓＸタンパク質をコードする核酸を細胞に提供するために使用されるベクターは、ＣａｓＸタンパク質及び／又はｇＲＮＡを取り込んだ細胞を同定するために、標的細胞における選択可能マーカーをコードする核酸配列を含み得る。

【0219】

ウイルスベクターの送達の場合、細胞を、対象ウイルス発現ベクター、並びにＣａｓＸ及びｇＲＮＡをコードする核酸、並びに任意選択的にドナー鋳型を含むウイルス粒子と接触させることができる。いくつかの実施形態では、ベクターはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターであり、ＡＡＶが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ４４．９、ＡＡＶ－Ｒｈ７４、又はＡＡＶＲｈ１０から選択される。他の場合では、ＡＡＶは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、及びＡＡＶ９から選択され、これは、筋肉の形質導入に効率的である（Ｇｒｕｎｔｍａｎ ＡＭ，ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｉｎ ｓｋｅｌｅｔａｌ ａｎｄ ｃａｒｄｉａｃ ｍｕｓｃｌｅ ｕｓｉｎｇ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ．Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔｏｃ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１４（１４Ｄ）：３（２０１３））。ＡＡＶベクターの実施形態は、以下でより詳細に記載される。他の実施形態では、ベクターは、レンチウイルスベクターである。レトロウイルス（例えば、レンチウイルス）は、本開示の方法における使用に好適であり得る。一般的に使用されるレトロウイルスベクターは、「欠陥」があり、例えば、増殖性感染に必要なウイルスタンパク質を産生することができない。むしろ、ベクターの複製は、パッケージング細胞株における増殖を必要とする。目的の核酸を含むウイルス粒子を生成するために、核酸を含むレトロウイルス核酸は、パッケージング細胞株によってウイルスカプシドにパッケージングされる。異なるパッケージング細胞株は、カプシドに組み込まれる異なるエンベロープタンパク（エコトロピック、アンホトロピック、又はゼノトロピック）を提供し、このエンベロープタンパクは、細胞に対するウイルス粒子の特異性又はトロピズムを決定する（マウス及びラットに対してエコトロピック；ヒト、イヌ、及びマウスを含むほとんどの哺乳動物細胞型に対してアンホトロピック；マウス細胞を除くほとんどの哺乳動物細胞型に対してゼノトロピック）。適切なパッケージング細胞株は、パッケージングされたウイルス粒子によって確実に細胞が標的化されるように使用され得る。対象ベクター発現ベクターをパッケージング細胞株に導入する方法、及びパッケージング株によって生成されるウイルス粒子を収集する方法は、当該技術分野で周知であり、これには、米国特許第５，１７３，４１４号、Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３２５１－３２６０（１９８５）、Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：２０７２－２０８１（１９８４）、Ｈｅｒｍｏｎａｔ＆Ｍｕｚｙｃｚｋａ，ＰＮＡＳ ８１：６４６６－６４７０（１９８４）、及びＳａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：０３８２２－３８２８（１９８９）が含まれる。核酸はまた、直接マイクロインジェクション（例えば、ＲＮＡの注入）によって導入することもできる。

【0220】

ＢＣＬ１１Ａ遺伝子を改変する方法の他の実施形態では、本方法は、対象の細胞へのＲＮＰの標的化送達のために、ＣａｓＸ送達粒子（ＸＤＰ）を利用する。ＸＤＰは、ウイルスに非常に似ているが、ウイルス性遺伝物質を含まず、したがって、非感染性である粒子である。いくつかの実施形態では、ＸＤＰは、ＲＮＰとして複合体化されたＣａｓＸ及びｇＲＮＡ、並びに任意選択的に、ＨＤＲ又はＨＩＴＩ機構を介した挿入によってＢＣＬ１１Ａ遺伝子又はその遺伝子の一部をノックダウン又はノックアウトするためのＢＣＬ１１Ａ遺伝子の全部又は一部を含むドナー鋳型を含む。ＸＤＰの実施形態は、以下でより詳細に記載される。

【0221】

ＶＩ．ポリヌクレオチド及びベクター
別の態様では、本開示は、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子の編集において有用であるクラス２、Ｖ型ヌクレアーゼ及びｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチドに関する。いくつかの実施形態では、本開示は、ＣａｓＸタンパク質をコードするポリヌクレオチド及び本明細書に記載の実施形態のＣａｓＸ：ｇＲＮＡシステムのｇＲＮＡのポリヌクレオチドを提供する。追加の実施形態では、本開示は、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子の一部又は全部をコードするドナー鋳型ポリヌクレオチドを提供する。場合によっては、ドナー鋳型は、標的核酸への挿入時にＢＣＬ１１Ａ遺伝子をノックダウン又はノックアウトするための変異又は異種配列を含む。また更なる実施形態では、本開示は、本明細書に記載のＣａｓＸタンパク質及びＣａｓＸ ｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチド、並びに実施形態のドナー鋳型を含むベクターを提供する。

【0222】

いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載の実施形態のいずれかのＣａｓＸバリアントをコードするポリヌクレオチド配列を提供し、表４に記載される配列番号５９、７２～９９、１０１～１４８、及び２６９０８～２７１５４のＣａｓＸタンパク質バリアント、又は表４の配列番号５９、７２～９９、１０１～１４８、及び２６９０８～２７１５４の配列と少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、若しくは少なくとも約９９％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載の実施形態のいずれかのＣａｓＸバリアントをコードするポリヌクレオチド配列を提供し、表４に記載される配列番号３６～９９、１０１～１４８、及び２６９０８～２７１５４のＣａｓＸタンパク質バリアント、又は表４の配列番号３６～９９、１０１～１４８、及び２６９０８～２７１５４の配列と少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、若しくは少なくとも約９９％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載の実施形態のいずれかのｇＲＮＡ配列をコードする単離されたポリヌクレオチド配列を提供し、表２及び表３の配列番号４～１６、２２３８～２２８５、２６７９４～２６８３９、又は２７２１９～２７２６５の配列とともに、配列番号２７２～２１００又は２２８６～２６７８９の標的化配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載の実施形態のいずれかのｇＲＮＡ配列をコードする単離されたポリヌクレオチド配列を提供し、配列番号２１０１～２２８５、２６７９４～２６８３９、及び２７２１９～２７２６５の配列とともに、配列番号２７２～２１００又は２２８６～２６７８９の標的化配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載の実施形態のいずれかのｇＲＮＡ配列をコードする単離されたポリヌクレオチド配列を提供し、配列番号２２８１～２２８５、２６７９４～２６８３９、及び２７２１９～２７２６５の配列とともに、配列番号２７２～２１００又は２２８６～２６７８９の標的化配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸタンパク質をコードする配列は、真核細胞における発現のためにコドン最適化される。

【0223】

いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号４～１６、２２３８～２２８５、２６７９４～２６８３９、若しくは２７２１９～２７２６５のｇＲＮＡ足場配列、又は表２若しくは表３に示されるｇＲＮＡ足場配列、あるいはそれと少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％の配列同一性を有する配列をコードするポリヌクレオチドを提供する。他の実施形態では、本開示は、表１の標的化配列ポリヌクレオチド、又は配列番号２７２～２１００若しくは２２８６～２６７８９の配列と少なくとも約６５％、少なくとも約７５％、少なくとも約８５％、若しくは少なくとも約９５％の同一性を有する配列を提供する。いくつかの実施形態では、標的化配列ポリヌクレオチドは、次に、ｇＲＮＡ足場配列の３’末端に（ｓｇＲＮＡ又はｄｇＲＮＡのいずれかとして）連結される。他の実施形態では、本開示は、配列番号２７２～２１００又は２２８６～２６７８９の配列と比較して１つ以上の一塩基多型（ＳＮＰ）を有する標的化配列ポリヌクレオチドを含むｇＲＮＡを提供する。

【0224】

他の実施形態では、本開示は、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子に相補的であり、したがって、それとハイブリダイズすることができる標的化配列を含むｇＲＮＡをコードする単離されたポリヌクレオチド配列を提供する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、ＢＣＬ１１Ａエキソンとハイブリダイズする標的化配列を含むｇＲＮＡをコードする。他の実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、ＢＣＬ１１Ａイントロンとハイブリダイズする標的化配列を含むｇＲＮＡをコードする。他の実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、ＢＣＬ１１Ａイントロン－エキソン接合部とハイブリダイズする標的化配列を含むｇＲＮＡをコードする。他の実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子の遺伝子間領域とハイブリダイズする標的化配列を含むｇＲＮＡをコードする。他の実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、ＢＣＬ１１Ａ調節エレメントとハイブリダイズする標的化配列を含むｇＲＮＡをコードする。場合によっては、ＢＣＬ１１Ａ調節エレメントは、ＢＣＬ１１Ａプロモーター又はエンハンサーである。場合によっては、ＢＣＬ１１Ａ調節エレメントは、ＢＣＬ１１Ａ転写開始部位の５’側、ＢＣＬ１１Ａ転写開始の３’側、又はＢＣＬ１１Ａイントロン中に位置する。他の実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、ＧＡＴＡ１結合モチーフ配列の５’側に位置する配列とハイブリダイズする標的化配列を含むｇＲＮＡをコードする。他の実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、ＧＡＴＡ１結合モチーフ配列と重複する配列とハイブリダイズする標的化配列を含むｇＲＮＡをコードする。前述の特定の実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、配列番号２２を有する標的化配列を含むｇＲＮＡをコードする。場合によっては、ＢＣＬ１１Ａ調節エレメントは、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子のイントロン中にある。他の場合では、ＢＣＬ１１Ａ調節エレメントは、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子の５’ＵＴＲを含む。更に他の場合では、ＢＣＬ１１Ａ調節エレメントは、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子の３’ＵＴＲを含む。

【0225】

他の実施形態では、本開示はドナー鋳型核酸を提供し、ドナー鋳型が、ＢＣＬ１１Ａ標的核酸配列と相同性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ＢＣＬ１１Ａドナー鋳型は、ＣａｓＸ：ｇＲＮＡシステムと併せて遺伝子編集を目的とし、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子の少なくとも一部を含む。他の実施形態では、ＢＣＬ１１Ａドナー配列は、ＢＣＬ１１Ａエキソンの少なくとも一部をコードする配列を含む。他の実施形態では、ＢＣＬ１１Ａドナー鋳型は、ＢＣＬ１１Ａイントロンの少なくとも一部をコードする配列を有する。他の実施形態では、ＢＣＬ１１Ａドナー鋳型は、ＢＣＬ１１Ａイントロン－エキソン接合部の少なくとも一部をコードする配列を有する。他の実施形態では、ＢＣＬ１１Ａドナー鋳型は、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子の遺伝子間領域の少なくとも一部をコードする配列を有する。他の実施形態では、ＢＣＬ１１Ａドナー鋳型は、ＢＣＬ１１Ａ調節エレメントの少なくとも一部をコードする配列を有する。場合によっては、ＢＣＬ１１Ａドナー鋳型は、配列番号１００の少なくとも一部をコードする野生型配列である。他の場合では、ＢＣＬ１１Ａドナー鋳型配列は、野生型ＢＣＬ１１Ａ遺伝子と比較して、１つ以上の変異を含む。特定の実施形態では、ドナー鋳型は、ＧＡＴＡ１結合モチーフ配列の一部又は全部をコードするが、野生型配列と比較して少なくとも１～５個の変異を有する配列を有する。前述の実施形態では、ドナー鋳型は、少なくとも１０ヌクレオチド、少なくとも１００ヌクレオチド、少なくとも２００ヌクレオチド、少なくとも３００ヌクレオチド、少なくとも４００ヌクレオチド、少なくとも５００ヌクレオチド、少なくとも６００ヌクレオチド、少なくとも７００ヌクレオチド、少なくとも８００ヌクレオチド、少なくとも９００ヌクレオチド、少なくとも１，０００ヌクレオチド、少なくとも２，０００ヌクレオチド、少なくとも３，０００ヌクレオチド、少なくとも４，０００ヌクレオチド、少なくとも５，０００ヌクレオチド、少なくとも６，０００ヌクレオチド、少なくとも７，０００ヌクレオチド、少なくとも８，０００ヌクレオチド、少なくとも９，０００ヌクレオチド、少なくとも１０，０００ヌクレオチド、少なくとも１２，０００ヌクレオチド、又は少なくとも１５，０００ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ドナー鋳型は、少なくとも約１０～約１５，０００ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ドナー鋳型は、一本鎖ＤＮＡ鋳型である。他の実施形態では、ドナー鋳型は、一本鎖ＲＮＡ鋳型である。他の実施形態では、ドナー鋳型は、二本鎖ＤＮＡ鋳型である。いくつかの実施形態では、ドナー鋳型は、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子を編集するための系において裸の核酸として提供することができ、ベクターに組み込む必要はない。他の実施形態では、ドナー鋳型をベクターに組み込んで（例えば、ウイルスベクターで）、細胞へのその送達を容易にすることができる。

【0226】

他の態様では、本開示は、本明細書に記載の実施形態のいずれかのＣａｓＸバリアント又はｇＲＮＡ（その相同バリアントを含む）をコードするポリヌクレオチド配列を産生するための方法、並びにポリヌクレオチド配列によって発現されるタンパク質又は転写されるＲＮＡを発現させるための方法に関する。一般に、本方法は、本明細書に記載の実施形態のいずれかのＣａｓＸバリアント又はｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチド配列を産生することと、コード遺伝子を宿主細胞に適した発現ベクターに組み込むことと、を含む。分子生物学における標準的な組換え技術を使用して、本開示のポリヌクレオチド及び発現ベクターを作製することができる。本明細書に記載の実施形態のいずれかのコードされた参照ＣａｓＸ、ＣａｓＸバリアント、又はｇＲＮＡの産生のために、本方法は、適切な宿主細胞をコードポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換することと、得られる本明細書に記載の実施形態のいずれかの参照ＣａｓＸ、ＣａｓＸバリアント、又はｇＲＮＡが形質転換された宿主細胞において発現又は転写されることを引き起こすか又は可能にする条件下で宿主細胞を培養し、それによって、ＣａｓＸバリアント又はｇＲＮＡを産生することと、を含み、それは、本明細書に記載される方法によって、又は当該技術分野で既知の標準的な精製方法によって、又は実施例に記載されるように回収される。

【0227】

本開示によれば、本明細書に記載の実施形態のいずれかのＣａｓＸバリアント又はｇＲＮＡ（又はそれらの相補体）をコードする核酸配列を使用して、適切な宿主細胞における発現を指示する組換えＤＮＡ分子を生成する。いくつかのクローニング戦略が本開示を実施するのに好適であり、その多くは、本開示の組成物をコードする遺伝子又はその相補体を含む構築物を生成するために使用される。いくつかの実施形態では、クローニング戦略を使用して、組成物の発現のために宿主細胞を形質転換するために使用される、ＣａｓＸバリアント又はｇＲＮＡをコードするヌクレオチドを含む構築物をコードする遺伝子を生成する。

【0228】

いくつかのアプローチでは、まず、ＣａｓＸバリアント又はｇＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を含む構築物が調製される。かかる構築物の調製のための例示的な方法は、実施例に記載されている。次いで、構築物を使用して、宿主細胞（例えば、ＣａｓＸ又はｇＲＮＡの場合、タンパク質構築物の発現及び回収のための原核宿主細胞又は真核宿主細胞）を形質転換するのに好適な発現ベクターを生成する。所望であれば、宿主細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉである。他の実施形態では、宿主細胞は、真核細胞である。真核宿主細胞は、ベビーハムスター腎線維芽細胞（Baby Hamster Kidney、ＢＨＫ）細胞、ヒト胎児腎臓２９３（ＨＥＫ２９３）、ヒト胎児腎臓２９３Ｔ（ＨＥＫ２９３Ｔ）、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ＹＯ骨髄腫細胞、Ｐ３Ｘ６３マウス骨髄腫細胞、ＰＥＲ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、ハイブリドーマ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＳＶ４０遺伝物質を有するＣＶ－１（サル）起源（ＣＯＳ）細胞、ＨｅＬａ、チャイニーズハムスター卵巣（Chinese hamster ovary、ＣＨＯ）、若しくは酵母細胞、又は組換え産物の産生に好適な当該技術分野で既知の他の真核細胞から選択することができる。発現ベクターの生成、宿主細胞の形質転換、並びにＣａｓＸバリアント又はｇＲＮＡの発現及び回収のための例示的な方法は、実施例に記載されている。

【0229】

ＣａｓＸバリアント又はｇＲＮＡ構築物をコードする遺伝子は、完全に合成的に、又は実施例でより詳細に記載される方法を含む、制限酵素媒介クローニング、ＰＣＲ、及び重複伸長などの酵素プロセスと組み合わせた合成によって、１つ以上のステップで作製することができる。本明細書に開示される方法は、例えば、所望の配列の様々な成分（例えば、ＣａｓＸ及びｇＲＮＡ）遺伝子をコードするポリヌクレオチドの配列をライゲーションするために使用することができる。ポリペプチド組成物をコードする遺伝子は、遺伝子合成の標準的な技術を使用して、オリゴヌクレオチドから構築される。

【0230】

いくつかの実施形態では、ＣａｓＸタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、意図された宿主細胞のためにコドン最適化される。このタイプの最適化は、同じＣａｓＸタンパク質をコードしながら、意図された宿主生物又は細胞のコドン選好性を模倣するために、コードヌクレオチド配列の変異を伴い得る。したがって、コドンを変化させることはできるが、コードされるタンパク質又はｇＲＮＡは変化しないままである。例えば、ＣａｓＸタンパク質の意図された標的細胞がヒト細胞である場合、ヒトコドン最適化ＣａｓＸコードヌクレオチド配列を使用することができる。別の非限定的な例として、意図された宿主細胞がマウス細胞である場合、マウスコドン最適化ＣａｓＸコードヌクレオチド配列を生成することができる。遺伝子設計は、参照ＣａｓＸ又はＣａｓＸバリアントの産生において利用される宿主細胞に適切なコドン使用頻度及びアミノ酸組成を最適化するアルゴリズムを使用して行うことができる。本開示の１つの方法において、構築物の成分をコードするポリヌクレオチドのライブラリが作製され、次いで、上記のように構築される。次いで、本明細書に記載されるように、得られた遺伝子を組み立て、得られた遺伝子を使用して宿主細胞を形質転換し、その特性を評価するために、ＣａｓＸバリアント又はｇＲＮＡ組成物を産生及び回収する。

【0231】

本開示は、宿主細胞と適合し、宿主細胞によって認識され、ポリペプチドの制御された発現又はＲＮＡの転写のためにポリペプチドをコードする遺伝子に作動可能に連結されている複製配列及び制御配列を含むプラスミド発現ベクターの使用を提供する。様々な細菌、酵母、及びウイルスについてのかかるベクター配列はよく知られている。使用され得る有用な発現ベクターには、例えば、染色体、非染色体、及び合成ＤＮＡ配列のセグメントが含まれる。「発現ベクター」とは、好適な宿主においてポリペプチドをコードするＤＮＡの発現をもたらすことができる好適な制御配列に作動可能に連結されているＤＮＡ配列を含むＤＮＡ構築物を指す。必要条件は、選択された宿主細胞において、ベクターが複製可能かつ生存可能であることである。低コピー数ベクター又は高コピー数ベクターを、所望に応じて使用することができる。ベクターの制御配列は、転写をもたらすプロモーター、かかる転写を制御する任意選択的なオペレーター配列、好適なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、並びに転写及び翻訳の終結を制御する配列を含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡをコードするヌクレオチド配列は、制御エレメント（例えば、プロモーターなどの転写制御エレメント）に作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、制御エレメント（例えば、プロモーターなどの転写制御エレメント）に作動可能に連結される。他の場合では、ＣａｓＸ及びｇＲＮＡをコードするヌクレオチドは連結され、単一の制御エレメントに作動可能に連結される。プロモーターは、選択された宿主細胞において転写活性を示す任意のＤＮＡ配列であってもよく、宿主細胞に対して同種又は異種のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子に由来してもよい。例示的な調節エレメントとしては、転写プロモーター、転写エンハンサーエレメント、転写終結シグナル、単一の転写物から複数の遺伝子の翻訳を可能にする内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）又はＰ２Ａペプチド、下流の転写終結を促進するポリアデニル化配列、翻訳の開始の最適化のための配列、及び翻訳終結配列が挙げられる。場合によっては、プロモーターは、構成的に活性なプロモーターである。場合によっては、プロモーターは、調節可能なプロモーターである。場合によっては、プロモーターは、誘導性プロモーターである。場合によっては、プロモーターは、組織特異的プロモーターである。場合によっては、プロモーターは、細胞型特異的プロモーターである。場合によっては、転写制御エレメント（例えば、プロモーター）は、標的化細胞型又は標的化細胞集団において機能的である。例えば、場合によっては、転写制御エレメントは、真核細胞（例えば、ウイルス又はＸＤＰベクターのためのパッケージング細胞、造血幹細胞（ＨＳＣ）、造血前駆細胞（ＨＰＣ）、ＣＤ３４＋細胞、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、胚性幹細胞（ＥＳ）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、骨髄系共通前駆細胞、前赤芽球細胞、及び赤芽球細胞）において機能的であり得る。

【0232】

ｐｏｌ ＩＩプロモーターの非限定的な例としては、ＥＦ－１α、ＥＦ－１αコアプロモーター、Ｊｅｎｓ Ｔｏｒｎｏｅ（ＪｅＴ）、サイトメガロウイルス（cytomegalovirus、ＣＭＶ）由来のプロモーター、ＣＭＶ最初期（CMV immediate early、ＣＭＶＩＥ）、ＣＭＶエンハンサー、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）チミジンキナーゼ、初期及び後期サルウイルス４０（simian virus 40、ＳＶ４０）、ＳＶ４０エンハンサー、レトロウイルス由来の長鎖末端反復（long terminal repeat、ＬＴＲ）、マウスメタロチオネイン－Ｉ、アデノウイルス主要後期プロモーター（adenovirus major late promoter、Ａｄ ＭＬＰ）、ＣＭＶプロモーター全長プロモーター、最小ＣＭＶプロモーター、ニワトリ

【0233】

【化1】

（ＣＢＡ）、ＣＢＡハイブリッド（CBA hybrid、ＣＢｈ）、サイトメガロウイルスエンハンサーを有するニワトリ

【0234】

【化2】

（ＣＢ７）、ニワトリβ－アクチンプロモーター及びウサギβ－グロビンスプライスアクセプター部位融合体（ＣＡＧ）、ラウス肉腫ウイルス（rous sarcoma virus、ＲＳＶ）プロモーター、ＨＩＶ－Ｌｔｒプロモーター、ｈＰＧＫプロモーター、ＨＳＶ ＴＫプロモーター、７ＳＫプロモーター、Ｍｉｎｉ－ＴＫプロモーター、ニューロン特異的発現を付与するヒトシナプシンＩ（ＳＹＮ）プロモーター、β－アクチンプロモーター、スーパーコアプロモーター１（super core promoter 1、ＳＣＰ１）、ニューロンにおける選択的発現のためのＭｅｃｐ２プロモーター、最小ＩＬ－２プロモーター、ラウス肉腫ウイルスエンハンサー／プロモーター（単一）、脾臓病巣形成ウイルス長鎖末端反復（ＬＴＲ）プロモーター、ＴＢＧプロモーター、ヒトチロキシン結合グロブリン遺伝子由来のプロモーター（肝臓特異的）、ＰＧＫプロモーター、ヒトユビキチンＣプロモーター（ubiquitin C、ＵＢＣ）、ＵＣＯＥプロモーター（ＨＮＲＰＡ２Ｂ１－ＣＢＸ３のプロモーター）、合成ＣＡＧプロモーター、ヒストンＨ２プロモーター、ヒストンＨ３プロモーター、Ｕ１ａ１核内低分子ＲＮＡプロモーター（２２６ｎｔ）、Ｕ１ａ１核内低分子ＲＮＡプロモーター（２２６ｎｔ）、Ｕ１ｂ２核内低分子ＲＮＡプロモーター（２４６ｎｔ）２６、ＧＵＳＢプロモーター、ＣＢｈプロモーター、ロドプシン（rhodopsin、Rho）プロモーター、サイレンシングプローン脾臓病巣形成ウイルス（spleen focus forming virus、ＳＦＦＶ）プロモーター、ヒトＨ１プロモーター（Ｈ１）、ＰＯＬ１プロモーター、ＴＴＲ最小エンハンサー／プロモーター、ｂ－キネシンプロモーター、マウス乳がんウイルス長鎖末端反復（ＬＴＲ）プロモーター、ヒト真核生物翻訳開始因子４Ａ（eukaryotic initiation factor 4A、ＥＩＦ４Ａ１）プロモーター、ＲＯＳＡ２６プロモーター、グリセルアルデヒド３－リン酸デヒドロゲナーゼ（glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase、ＧＡＰＤＨ）プロモーター、ｔＲＮＡプロモーター、並びに前述の短縮型バージョン及び配列バリアントが挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、ｐｏｌ ＩＩプロモーターは、ＥＦ－１αであり、プロモーターが、トランスフェクション効率、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの導入遺伝子の転写又は発現、発現陽性クローンの割合、及び長期培養におけるエピソームベクターのコピー数を増強する。

【0235】

ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターの非限定的な例としては、Ｕ６、ミニＵ６、Ｕ６短縮型プロモーター、７ＳＫ、及びＨ１バリアント、ＢｉＨ１（双方向性Ｈ１プロモーター）、ＢｉＵ６、Ｂｉ７ＳＫ、ＢｉＨ１（双方向性Ｕ６、７ＳＫ、及びＨ１プロモーター）、ゴリラＵ６、アカゲザルＵ６、ヒト７ＳＫ、ヒトＨ１プロモーター、及びそれらの配列バリアントが挙げられるが、これらに限定されない。前述の実施形態では、ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターは、ｇＲＮＡの転写を増強する。

【0236】

適切なベクター及びプロモーターの選択は、発現の制御に関連するので（例えば、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子を改変するための）、十分に当業者のレベルの範囲内である。発現ベクターはまた、翻訳開始のためのリボソーム結合部位及び転写ターミネーターを含み得る。発現ベクターはまた、発現を増幅するための適切な配列を含み得る。発現ベクターはまた、ＣａｓＸタンパク質に融合され得るタンパク質タグ（例えば、６×Ｈｉｓタグ、赤血球凝集素タグ、蛍光タンパク質など）をコードするヌクレオチド配列を含み、したがって、精製又は検出のために使用されるキメラＣａｓＸタンパク質を得ることができる。

【0237】

本開示の組換え発現ベクターはまた、本開示のＣａｓＸタンパク質及びｇＲＮＡの強力な発現を促進するエレメントを含むことができる。例えば、組換え発現ベクターは、１つ以上のポリアデニル化シグナル（ポリ（Ａ））、イントロン配列、又は転写後調節エレメント（例えば、ウッドチャック肝炎転写後調節エレメント（woodchuck hepatitis post-transcriptional regulatory element、ＷＰＲＥ））を含むことができる。例示的なポリ（Ａ）配列としては、ｈＧＨポリ（Ａ）シグナル（短鎖）、ＨＳＶ ＴＫポリ（Ａ）シグナル、合成ポリアデニル化シグナル、ＳＶ４０ポリ（Ａ）シグナル、β－グロビンポリ（Ａ）シグナルなどが挙げられる。当業者は、本明細書に記載の組換え発現ベクターに含まれる好適なエレメントを選択することができるであろう。

【0238】

いくつかの実施形態では、以下のうちの１つ以上を含む１つ以上の組換え発現ベクターが本明細書に提供される：（ｉ）ドナー鋳型が標的核酸（例えば、標的ゲノム）の標的ＢＣＬ１１Ａ遺伝子座の配列と相同性を有するヌクレオチド配列を含む、ドナー鋳型核酸のヌクレオチド配列、（ｉｉ）真核細胞などの標的細胞において作動可能であるプロモーターに作動可能に連結された標的ゲノムのＢＣＬ１１Ａ遺伝子座の標的配列にハイブリダイズする（例えば、シングル又はデュアルガイドＲＮＡとして構成される）、ｇＲＮＡをコードするヌクレオチド配列、及び（ｉｉｉ）真核細胞などの標的細胞において作動可能であるプロモーターに作動可能に連結された、ＣａｓＸタンパク質をコードするヌクレオチド配列。いくつかの実施形態では、ドナー鋳型、ｇＲＮＡ、及びＣａｓＸタンパク質をコードする配列は、異なる組換え発現ベクター中にあり、他の実施形態では、１つ以上の（ドナー鋳型、ＣａｓＸ、及びｇＲＮＡの）ポリヌクレオチド配列は、同じ組換え発現ベクター中にある。他の場合では、ＣａｓＸ及びｇＲＮＡが、ＲＮＰとして標的細胞に送達され（例えば、エレクトロポレーション又は化学的手段によって）、ドナー鋳型が、ベクターによって送達される。

【0239】

ポリヌクレオチド配列は、様々な手順によってベクターに挿入される。一般に、ＤＮＡは、当該技術分野で既知の技術を使用して、適切な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入される。ベクター成分としては、一般に、シグナル配列、複製起点、１つ以上のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、及び転写終結配列のうちの１つ以上が挙げられるが、これらに限定されない。これらの成分のうちの１つ以上を含む好適なベクターの構築は、当業者に既知の標準的なライゲーション技術を使用する。かかる技術は、当該技術分野で周知であり、科学文献及び特許文献に詳細に記載されている。様々なベクターが公的に入手可能である。ベクターは、例えば、組換えＤＮＡ手順に都合よく供され得るプラスミド、コスミド、ウイルス粒子、又はファージの形態であり得、ベクターの選択は、しばしば、ベクターが導入される宿主細胞に依存する。したがって、ベクターは、自律複製ベクター、すなわち、染色体外実体として存在し、その複製が染色体複製とは独立しているベクター（例えば、プラスミド）であってもよい。代替的に、ベクターは、宿主細胞に導入された場合、宿主細胞ゲノムに組み込まれ、それが組み込まれた染色体と一緒に複製されるものであってもよい。好適な宿主細胞に導入されると、抗原プロセシング、抗原提示、抗原認識、及び／又は抗原応答に関与するタンパク質の発現は、当該技術分野で既知の任意の核酸アッセイ又はタンパク質アッセイを使用して決定され得る。例えば、参照ＣａｓＸ又はＣａｓＸバリアントの転写されたｍＲＮＡの存在は、ポリヌクレオチドの任意の領域に相補的なプローブを使用して、従来のハイブリダイゼーションアッセイ（例えば、ノーザンブロット分析）、増幅手順（例えば、ＲＴ－ＰＣＲ）、ＳＡＧＥ（米国特許第５，６９５，９３７号）、及びアレイベース技術（例えば、米国特許第５，４０５，７８３号、同第５，４１２，０８７号、及び同第５，４４５，９３４号を参照）によって検出及び／又は定量化され得る。

【0240】

ポリヌクレオチド及び組換え発現ベクターは、様々な方法によって標的宿主細胞に送達することができる。かかる方法としては、ウイルス感染、トランスフェクション、リポフェクション、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）媒介性トランスフェクション、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介性トランスフェクション、マイクロインジェクション、リポソーム媒介性トランスフェクション、パーティクルガン技術、ヌクレオフェクション、ドナーＤＮＡに融合された若しくはそれを動員する細胞透過性ＣａｓＸタンパク質による直接添加、細胞圧搾、リン酸カルシウム沈殿、直接マイクロインジェクション、ナノ粒子媒介性核酸送達、並びにＱｉａｇｅｎから市販されているＴｒａｎｓＭｅｓｓｅｎｇｅｒ（登録商標）試薬、ＳｔｅｍｇｅｎｔからのＳｔｅｍｆｅｃｔＴＭ ＲＮＡトランスフェクションキット、及びＭｉｒｕｓ Ｂｉｏ ＬＬＣからのＴｒａｎｓＩＴ（登録商標）－ｍＲＮＡトランスフェクションキット、Ｌｏｎｚａヌクレオフェクション、Ｍａｘａｇｅｎエレクトロポレーションなどを使用することが挙げられるが、これらに限定されない。

【0241】

組換え発現ベクター配列は、その後のエクスビボ、インビトロ、又はインビボでの細胞の感染及び形質転換のために、ウイルス又はウイルス様粒子（本明細書では「粒子」又は「ビリオン」とも称される）にパッケージングされ得る。かかる粒子又はビリオンは、典型的には、ベクターゲノムをカプシド化又はパッケージングするタンパク質を含む。好適な発現ベクターとしては、以下に基づくウイルス発現ベクターが挙げられ得る：ワクシニアウイルス；ポリオウイルス；アデノウイルス；レトロウイルスベクター（例えば、マウス白血病ウイルス）、脾臓壊死ウイルス、並びにレトロウイルス（例えば、ラウス肉腫ウイルス、ハーベイ肉腫ウイルス、トリ白血病ウイルス、レンチウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルス、及び乳がんウイルス）に由来するベクターなど。いくつかの実施形態では、本開示の組換え発現ベクターは、組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである。いくつかの実施形態では、本開示の組換え発現ベクターは、組換えレンチウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、本開示の組換え発現ベクターは、組換えレトロウイルスベクターである。

【0242】

いくつかの実施形態では、本開示の組換え発現ベクターは、組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである。いくつかの実施形態では、本開示の組換え発現ベクターは、組換えレンチウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、本開示の組換え発現ベクターは、組換えレトロウイルスベクターである。

【0243】

ＡＡＶは、対象に投与するために調製される細胞のためにインビボ又はエクスビボのいずれかで、真核細胞などの細胞への送達のためにウイルスベクターを用いる状況において、ヒト疾患を治療するのに有用である小さな（２０ｎｍ）非病原性ウイルスである。構築物（例えば、本明細書に記載される実施形態のＣａｓＸタンパク質及び／又はＣａｓＸ ｇＲＮＡのいずれかをコードする構築物）が生成され、ＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）配列に隣接し、それによって、ＡＡＶベクターのＡＡＶウイルス粒子へのパッケージングが可能になる。

【0244】

「ＡＡＶ」ベクターは、天然に存在する野生型ウイルス自体又はその誘導体を指し得る。この用語は、別途必要とされる場合を除いて、全てのサブタイプ、血清型、及び偽型、並びに天然に存在する形態及び組換え形態の両方を包含する。本明細書で使用される場合、「血清型」という用語は、規定の抗血清とのカプシドタンパク質の反応性に基づいて他のＡＡＶによって同定されかつそれと区別されるＡＡＶを指す。例えば、霊長類ＡＡＶの多くの既知の血清型が存在する。いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ４４．９、ＡＡＶ－Ｒｈ７４（アカゲザル由来ＡＡＶ）、及びＡＡＶＲｈ１０、並びにこれらの血清型の改変カプシドから選択される。例えば、血清型ＡＡＶ－２は、ＡＡＶ－２のｃａｐ遺伝子からコードされるカプシドタンパク質と、同じＡＡＶ－２血清型由来の５’及び３’ＩＴＲ配列を含むゲノムと、を含むＡＡＶを指すために使用される。偽型ＡＡＶは、１つの血清型由来のカプシドタンパク質と、第２の血清型の５’－３’ＩＴＲを含むウイルスゲノムと、を含むＡＡＶを指す。偽型ｒＡＡＶは、カプシド血清型の細胞表面結合特性と、ＩＴＲ血清型と一致する遺伝的特性と、を有することが予想される。偽型組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）は、当該技術分野で記載される標準的な技術を使用して産生される。本明細書で使用される場合、例えば、ｒＡＡＶ１は、同じ血清型由来のカプシドタンパク質及び５’－３’ＩＴＲの両方を有するＡＡＶを指すために使用され得るか、又はそれは、血清型１由来のカプシドタンパク質及び異なるＡＡＶ血清型（例えば、ＡＡＶ血清型２）由来の５’－３’ＩＴＲを有するＡＡＶを指し得る。本明細書に例示される各実施例について、ベクター設計及び産生の記載は、カプシド及び５’－３’ＩＴＲ配列の血清型を記載する。

【0245】

「ＡＡＶウイルス」又は「ＡＡＶウイルス粒子」は、少なくとも１つのＡＡＶカプシドタンパク質（好ましくは野生型ＡＡＶのカプシドタンパク質の全てによるもの）と、カプシド化されたポリヌクレオチドと、から構成されるウイルス粒子を指す。粒子が異種ポリヌクレオチド（すなわち、哺乳動物細胞に送達される野生型ＡＡＶゲノム以外のポリヌクレオチド）を更に含む場合、それは、典型的には「ｒＡＡＶ」と称される。例示的な異種ポリヌクレオチドは、本明細書に記載の実施形態のいずれかのＣａｓＸタンパク質及び／又はｓｇＲＮＡ、並びに任意選択的にドナー鋳型を含むポリヌクレオチドである。

【0246】

「アデノ随伴ウイルス逆位末端反復」又は「ＡＡＶ ＩＴＲ」とは、ＡＡＶゲノムの各末端に見出される当該技術分野で認識される領域を意味し、これは、ＤＮＡの複製起点として及びウイルスのパッケージングシグナルとして、シスで一緒に機能する。ＡＡＶ ＩＴＲは、ＡＡＶ ｒｅｐコード領域とともに、哺乳動物細胞ゲノムからの効率的な切除及び救出、並びに哺乳動物細胞ゲノムへの２つの隣接ＩＴＲ間に挿入されたヌクレオチド配列の組み込みを提供する。ＡＡＶ ＩＴＲ領域のヌクレオチド配列は既知である。例えば、Ｋｏｔｉｎ，Ｒ．Ｍ．（１９９４）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：７９３－８０１；Ｂｅｒｎｓ，Ｋ．Ｉ．「Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ」ｉｎ Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２^ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，（Ｂ．Ｎ．Ｆｉｅｌｄｓ ａｎｄ Ｄ．Ｍ．Ｋｎｉｐｅ，ｅｄｓ．）を参照されたい。本明細書で使用される場合、ＡＡＶ ＩＴＲは、示された野生型ヌクレオチド配列を有する必要はないが、例えば、ヌクレオチドの挿入、欠失、又は置換によって改変され得る。追加的に、ＡＡＶ ＩＴＲは、いくつかのＡＡＶ血清型（ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ－Ｒｈ７４、及びＡＡＶＲｈ１０が挙げられるが、これらに限定されない）、並びにこれらの血清型の改変カプシドのうちのいずれかに由来し得る。更に、ＡＡＶベクターにおける選択されたヌクレオチド配列に隣接する５’及び３’ＩＴＲは、それらが意図されるように機能する（すなわち、宿主細胞ゲノム又はベクターからの目的の配列の切除及び救出を可能にし、かつＡＡＶ Ｒｅｐ遺伝子産物が細胞に存在する場合、レシピエント細胞のゲノムへの異種配列の組み込みを可能にする）限り、必ずしも同一である必要はないか、又は同じＡＡＶ血清型若しくは分離株に由来する必要はない。宿主細胞への異種配列の組み込みのためのＡＡＶ血清型の使用は、当該技術分野において既知である（例えば、参照により本明細書に援用される、国際公開第２０１８／１９５５５５号（Ａ１）及び米国特許出願公開第組み込２０１８／０２５８４２４号（Ａ１）を参照）。

【0247】

「ＡＡＶ ｒｅｐコード領域」とは、複製タンパク質であるＲｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２、及びＲｅｐ４０をコードするＡＡＶゲノムの領域を意味する。これらのＲｅｐ発現産物は、ＡＡＶのＤＮＡ複製起点の認識、結合、及びニッキング、ＤＮＡヘリカーゼ活性、並びにＡＡＶ（又は他の異種）プロモーターからの転写の調節を含む多くの機能を有することが示されている。Ｒｅｐ発現産物は、まとめて、ＡＡＶゲノムを複製するために必要とされる。「ＡＡＶ ｃａｐコード領域」とは、カプシドタンパク質であるＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３、又はそれらの機能的ホモログをコードするＡＡＶゲノムの領域を意味する。これらのＣａｐ発現産物は、まとめて、ウイルスゲノムをパッケージングするために必要とされるパッケージング機能を供給する。

【0248】

いくつかの実施形態では、ＣａｓＸ及びｇＲＮＡ、並びに任意でＤＭＰＫドナー鋳型ヌクレオチドのコード配列を宿主細胞に送達するために利用されるＡＡＶカプシドは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ４４．９、ＡＡＶ－Ｒｈ７４（アカゲザル由来ＡＡＶ）、及びＡＡＶＲｈ１０を含むがこれらに限定されないいくつかのＡＡＶ血清型のいずれかに由来することができ、ＡＡＶ ＩＴＲはＡＡＶ血清型２に由来する。特定の実施形態では、ＡＡＶ１、ＡＡＶ７、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、又はＡＡＶ９は、ＣａｓＸ、ｇＲＮＡ、及び任意選択的にドナー鋳型ヌクレオチドの宿主筋細胞への送達のために利用される。

【0249】

ｒＡＡＶウイルス粒子を産生するために、ＡＡＶ発現ベクターは、既知の技術（例えば、トランスフェクション）を使用して好適な宿主細胞に導入される。パッケージング細胞は、典型的には、ウイルス粒子を形成するために使用される。かかる細胞には、アデノウイルスをパッケージングするＨＥＫ２９３細胞（及び当該技術分野で既知の他の細胞）が含まれる。多くのトランスフェクション技術が当該技術分野で一般的に既知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照されたい。特に好適なトランスフェクション方法としては、リン酸カルシウム共沈殿、培養細胞への直接マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、リポソーム媒介性遺伝子導入、脂質媒介性形質導入、及び高速微粒子銃を使用する核酸送達が挙げられる。

【0250】

本開示のｒＡＡＶ構築物の利点では、より小さいサイズのＣＲＩＳＰＲ Ｖ型ヌクレアーゼ（例えば、本実施形態のＣａｓＸ）は、単一のｒＡＡＶ粒子が、全ての必要な編集及び補助的発現成分を、標的細胞の標的核酸を効果的に改変することができるＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ及びｇＲＮＡの発現をもたらす形態で標的細胞に送達及び形質導入することができるように、これら成分を導入遺伝子に含めることを可能にする。このような構築物の代表的な概略図を、図１３に示す。これは、Ｃａｓ９などの他のＣＲＩＳＰＲシステムとは著しく対照的であり、典型的には、二粒子システムを用いて、必要な編集成分を標的細胞に送達する。したがって、ｒＡＡＶシステムのいくつかの実施形態では、本開示は、ｉ）ＩＴＲ、ＣａｓＸバリアントをコードする配列、１つ以上のｇＲＮＡをコードする配列、ＣａｓＸに作動可能に連結された第１のプロモーター及びｇＲＮＡに作動可能に連結された第２のプロモーター、並びに任意選択的に１つ以上のエンハンサーエレメントを含む、第１のプラスミド、ｉｉ）ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子を含む、第２のプラスミド、並びにｉｉｉ）ヘルパー遺伝子を含む、第３のプラスミド、を提供し、適切なパッケージング細胞のトランスフェクション時、細胞が、ＣａｓＸヌクレアーゼを発現することができる配列及び標的細胞の標的核酸を編集する能力を有するｇＲＮＡを単一粒子で標的細胞に送達する能力を有するｒＡＡＶを産生することができる。ｒＡＡＶシステムのいくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲタンパク質をコードする配列及び少なくとも第１のｇＲＮＡをコードする配列は、約３１００未満、約３０９０未満、約３０８０未満、約３０７０未満、約３０６０未満、約３０５０未満、又は約３０４０未満のヌクレオチド長であり、それにより、第１のプロモーター及び第２のプロモーター並びに任意選択的に１つ以上のエンハンサーエレメントをコードする配列が、合わせて、少なくとも約１３００、少なくとも約１３５０、少なくとも約１３６０、少なくとも約１３７０、少なくとも約１３８０、少なくとも約１３９０、少なくとも約１４００、少なくとも約１５００、少なくとも約１６００ヌクレオチド、少なくとも１６５０、少なくとも約１７００、少なくとも約１７５０、少なくとも約１８００、少なくとも約１８５０、又は少なくとも約１９００ヌクレオチド長を有することができる。ｒＡＡＶシステムのいくつかの実施形態では、第１及のプロモーター及び少なくとも１つのアクセサリエレメントをコードする配列は、合わせて、少なくとも約１３００、少なくとも約１３５０、少なくとも約１３６０、少なくとも約１３７０、少なくとも約１３８０、少なくとも約１３９０、少なくとも約１４００、少なくとも約１５００、少なくとも約１６００ヌクレオチド、少なくとも１６５０、少なくとも約１７００、少なくとも約１７５０、少なくとも約１８００、少なくとも約１８５０、又は少なくとも約１９００超のヌクレオチド長を有する。ｒＡＡＶシステムのいくつかの実施形態では、第１及び第２のプロモーター並びに少なくとも１つのアクセサリエレメントをコードする配列は、合わせて、少なくとも約１３００、少なくとも約１３５０、少なくとも約１３６０、少なくとも約１３７０、少なくとも約１３８０、少なくとも約１３９０、少なくとも約１４００、少なくとも約１５００、少なくとも約１６００ヌクレオチド、少なくとも１６５０、少なくとも約１７００、少なくとも約１７５０、少なくとも約１８００、少なくとも約１８５０、又は少なくとも約１９００超のヌクレオチド長を有する。

【0251】

いくつかの実施形態では、上記のＡＡＶ発現ベクターでトランスフェクトされた宿主細胞は、ＡＡＶ ＩＴＲに隣接するヌクレオチド配列を複製及びカプシド化してｒＡＡＶウイルス粒子を産生するために、ＡＡＶヘルパー機能を提供することができるようにされる。ＡＡＶヘルパー機能は、一般に、ＡＡＶ由来コード配列であり、これが発現してＡＡＶ遺伝子産物を提供し、それは次に、生産的なＡＡＶ複製のためにトランスで機能することができる。ＡＡＶヘルパー機能は、本明細書において、ＡＡＶ発現ベクターに欠けている必要なＡＡＶ機能を補完するために使用される。したがって、ＡＡＶヘルパー機能は、ｒｅｐ及びｃａｐのコード領域をコードする主要なＡＡＶ ＯＲＦ（オープンリーディングフレーム）の一方又は両方、又はその機能的ホモログを含む。アクセサリ機能は、当業者に既知の方法を使用して宿主細胞に導入され、次いで、宿主細胞で発現され得る。通常、アクセサリ機能は、無関係なヘルパーウイルスによる宿主細胞の感染によって提供される。いくつかの実施形態では、アクセサリ機能は、アクセサリ機能ベクターを使用して提供される。利用される宿主／ベクター系に依存して、構成的プロモーター及び誘導性プロモーター、転写エンハンサーエレメント、転写ターミネーターなどを含むいくつかの好適な転写及び翻訳制御エレメントのいずれかが、発現ベクターにおいて使用され得る。いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に開示される実施形態のＡＡＶベクターを含む宿主細胞を提供する。

【0252】

他の実施形態では、好適なベクターは、ウイルス様粒子（virus-like particle、ＶＬＰ）を含み得る。ウイルス様粒子（ＶＬＰ）は、ウイルスに非常に似ているが、ウイルス性遺伝物質を含まず、したがって、非感染性である粒子である。いくつかの実施形態では、ＶＬＰは、１つ以上のウイルス構造タンパク質とともにパッケージングされた、目的の導入遺伝子（例えば、実施形態のＣａｓＸタンパク質及び／又はｇＲＮＡのいずれか）をコードするポリヌクレオチド、並びに任意選択的に本明細書に記載のドナー鋳型ポリヌクレオチドを含む。他の実施形態では、本開示は、インビトロで産生されたＸＤＰを提供し、ＣａｓＸ：ｇＲＮＡ ＲＮＰ複合体と、任意選択的に、ドナー鋳型と、を含む。異なるウイルス由来の構造タンパク質の組み合わせを使用して、ＸＤＰｓを作製することができる。それには、パルボウイルス科（例えば、アデノ随伴ウイルス）、レトロウイルス科（例えば、アルファレトロウイルス、ベータレトロウイルス、ガンマレトロウイルス、デルタレトロウイルス、イプシロンレトロウイルス、又はレンチウイルス）、フラビウイルス科（例えば、Ｃ型肝炎ウイルス）、パラミクソウイルス科（例えば、Ｎｉｐａｈ）、及びバクテリオファージ（例えば、Ｑβ、ＡＰ２０５）を含むウイルス科由来の成分が含まれる。いくつかの実施形態では、本開示は、レトロウイルス（レンチウイルス（ＨＩＶなど）及びアルファレトロウイルス、ベータレトロウイルス、ガンマレトロウイルス、デルタレトロウイルス、イプシロンレトロウイルスを含む）の成分を使用して設計されたＸＤＰシステムを提供し、様々な成分をコードするポリヌクレオチドを含む個々のプラスミドが、パッケージング細胞に導入され、これが次に、ＸＤＰを産生する。いくつかの実施形態、本開示は、ｉ）プロテアーゼ、ｉｉ）プロテアーゼ切断部位、ｉｉｉ）以下から選択されるｇａｇポリタンパク質の１つ以上の成分：マトリックスタンパク質（matrix protein、ＭＡ）、ヌクレオカプシドタンパク質（nucleocapsid protein、ＮＣ）、カプシドタンパク質（capsid protein、ＣＡ）、ｐ１ペプチド、ｐ６ペプチド、Ｐ２Ａペプチド、Ｐ２Ｂペプチド、Ｐ１０ペプチド、ｐ１２ペプチド、ＰＰ２１／２４ペプチド、Ｐ１２／Ｐ３／Ｐ８ペプチド、及びＰ２０ペプチド、ｖ）ＣａｓＸ、ｖｉ）ｇＲＮＡ、並びにｖｉ）標的化糖タンパク質又は抗体断片、のうちの１つ以上の成分を含むＸＤＰを提供し、得られたＸＤＰ粒子が、ＣａｓＸ：ｇＲＮＡ ＲＮＰをカプシド化する。Ｇａｇ、ＣａｓＸ、及びｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチドは、宿主細胞の核から出芽ＸＤＰへの成分の輸送を補助するように設計された対の成分を更に含み得る。かかる輸送成分の非限定的な例としては、ＭＳ２ヘアピン、ＰＰ７ヘアピン、Ｑβヘアピン、並びにそれぞれＭＳ２コートタンパク質、ＰＰ７コートタンパク質、Ｑβコートタンパク質に対する結合親和性を有するＵ１ヘアピンＩＩ及びＵ１Ａシグナル認識粒子が挙げられる。他の実施形態では、ｇＲＮＡは、Ｒｅｖ応答エレメント（Rev response element、ＲＲＥ）又はＲｅｖに対する結合親和性を有するその部分を含むことができ、これはＧａｇポリタンパク質に連結することができる。他の実施形態では、ｇＲＮＡは、１つ以上のＲＲＥと、１つ以上のＭＳ２ヘアピン配列と、を含むことができる。他の実施形態では、ｇＲＮＡは、Ｒｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）又はＲｅｖに対する結合親和性を有するその部分を含むことができ、これはＧａｇポリタンパク質に連結することができる。ＲＲＥは、Ｒｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）のステムＩＩＢ、ＲＲＥのステムＩＩ～Ｖ、ＲＲＥのステムＩＩ、ステムＩＩＢのＲｅｖ結合エレメント（Rev-binding element、ＲＢＥ）、及び全長ＲＲＥからなる群から選択され得る。前述の実施形態では、成分には、ＵＧＧＧＣＧＣＡＧＣＧＵＣＡＡＵＧＡＣＧＣＵＧＡＣＧＧＵＡＣＡ（ステムＩＩＢ；配列番号２７２６６）、ＧＣＡＣＵＡＵＧＧＧＣＧＣＡＧＣＧＵＣＡＡＵＧＡＣＧＣＵＧＡＣＧＧＵＡＣＡＧＧＣＣＡＧＡＣＡＡＵＵＡＵＵＧＵＣＵＧＧＵＡＵＡＧＵＧＣ（ステムＩＩ；配列番号２７２６７）、ＧＣＵＧＡＣＧＧＵＡＣＡＧＧＣ（ＲＢＥ、配列番号２７２６８）、ＣＡＧＧＡＡＧＣＡＣＵＡＵＧＧＧＣＧＣＡＧＣＧＵＣＡＡＵＧＡＣＧＣＵＧＡＣＧＧＵＡＣＡＧＧＣＣＡＧＡＣＡＡＵＵＡＵＵＧＵＣＵＧＧＵＡＵＡＧＵＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＡＡＣＡＡＵＵＵＧＣＵＧＡＧＧＧＣＵＡＵＵＧＡＧＧＣＧＣＡＡＣＡＧＣＡＵＣＵＧＵＵＧＣＡＡＣＵＣＡＣＡＧＵＣＵＧＧＧＧＣＡＵＣＡＡＧＣＡＧＣＵＣＣＡＧＧＣＡＡＧＡＡＵＣＣＵＧ（ステムＩＩ－Ｖ；配列番号２７２６９）、及びＡＧＧＡＧＣＵＵＵＧＵＵＣＣＵＵＧＧＧＵＵＣＵＵＧＧＧＡＧＣＡＧＣＡＧＧＡＡＧＣＡＣＵＡＵＧＧＧＣＧＣＡＧＣＧＵＣＡＡＵＧＡＣＧＣＵＧＡＣＧＧＵＡＣＡＧＧＣＣＡＧＡＣＡＡＵＵＡＵＵＧＵＣＵＧＧＵＡＵＡＧＵＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＡＡＣＡＡＵＵＵＧＣＵＧＡＧＧＧＣＵＡＵＵＧＡＧＧＣＧＣＡＡＣＡＧＣＡＵＣＵＧＵＵＧＣＡＡＣＵＣＡＣＡＧＵＣＵＧＧＧＧＣＡＵＣＡＡＧＣＡＧＣＵＣＣＡＧＧＣＡＡＧＡＡＵＣＣＵＧＧＣＵＧＵＧＧＡＡＡＧＡＵＡＣＣＵＡＡＡＧＧＡＵＣＡＡＣＡＧＣＵＣＣＵ（全長ＲＲＥ；配列番号２７２７０）の配列が含まれる。他の実施形態では、ｇＲＮＡは、１つ以上のＲＲＥと、１つ以上のＭＳ２ヘアピン配列と、を含むことができる。特定の実施形態では、ｇＲＮＡは、ＭＳ２コートタンパク質に対する結合親和性を増加させ、それによって、出芽ＸＤＰへのｇＲＮＡ及び関連するＣａｓＸの組み込みを増強するように最適化されたＭＳ２ヘアピンバリアントを含む。ＭＳ２ヘアピンバリアントを含むｇＲＮＡバリアントには、ｇＲＮＡバリアント２７５～３１５及び３１７～３２０（配列番号２７２２～２７２６４）が含まれる。

【0253】

表面上の標的化糖タンパク質又は抗体断片は、標的細胞へのＸＤＰのトロピズムを提供し、標的細胞への投与及び侵入の際、ＲＮＰ分子が、細胞の核内に自由に輸送される。エンベロープ糖タンパク質は、ＸＤＰにトロピズムを付与することが当該技術分野で既知である任意の以下のエンベロープウイルスに由来し得る：限定するものではないが、アルゼンチン出血熱ウイルス、オーストラリアコウモリウイルス、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体病ウイルス、トリ白血病ウイルス、ヒヒ内在性ウイルス、ボリビア出血熱ウイルス、ボルナ病ウイルス、ブレダウイルス、ブニヤムウェラウイルス、チャンディプラウイルス、チクングニアウイルス、クリミア・コンゴ出血熱ウイルス、デング熱ウイルス、ドゥベンヘイグウィルス、東部ウマ脳炎ウイルス、エボラ出血熱ウイルス、エボラ・ザイールウイルス、腸管アデノウイルス、エフェメロウイルス、エプスタイン・バーウイルス（Epstein-Bar viru、ＥＢＶ）、ヨーロッパコウモリウイルス１、ヨーロッパコウモリウイルス２、Ｆｕｇ合成ｇＰ融合体、テナガザル白血病ウイルス、ハンタウイルス、ヘンドラウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、Ｄ型肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、Ｇ型肝炎ウイルス（ＧＢウイルスＣ）、単純ヘルペスウイルス１型、単純ヘルペスウイルス２型、ヒトサイトメガロウイルス（human cytomegalovirus、ＨＨＶ５）、ヒト泡沫状ウイルス、ヒトヘルペスウイルス（human herpesvirus、ＨＨＶ）、ヒトヘルペスウイルス７型、ヒトヘルペスウイルス６型、ヒトヘルペスウイルス８型、ヒト免疫不全ウイルス１型（human immunodeficiency virus 1、ＨＩＶ－１）、ヒトメタニューモウイルス、ヒトＴリンパ球向性ウイルス１、インフルエンザＡ型ウイルス、インフルエンザＢ型ウイルス、インフルエンザＣ型ウイルス、日本脳炎ウイルス、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス（Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus、ＨＨＶ８）、キャサヌール森林病ウイルス、ラクロスウイルス、ラゴスコウモリウイルス、ラッサ熱ウイルス、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（lymphocytic choriomeningitis virus、ＬＣＭＶ）、マチュポウイルス、マールブルグ出血熱ウイルス、麻疹ウイルス、中東呼吸器症候群関連コロナウイルス、モコラウイルス、モロニーマウス白血病ウイルス、サル痘、マウス乳がんウイルス、おたふく風邪ウイルス、マウスガンマヘルペスウイルス、ニューカッスル病ウイルス、ニパウイルス、ニパウイルス、ノーウォークウイルス、オムスク出血熱ウイルス、パピローマウイルス、パルボウイルス、仮性狂犬病ウイルス、クアランフィルウイルス、狂犬病ウイルス、ＲＤ１１４ネコ内在性レトロウイルス、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、リフトバレー熱ウイルス、ロスリバーウイルス、ｒロタウイルス、ラウス肉腫ウイルス、風疹ウイルス、サビア関連出血熱ウイルス、ＳＡＲＳ関連コロナウイルス（SARS-associated coronavirus、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）、センダイウイルス、タカリベウイルス、ソゴトウイルス、ダニ媒介性脳炎原因ウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス（varicella zoster virus、ＨＨＶ３）、水痘帯状疱疹ウイルス（ＨＨＶ３）、大痘瘡ウイルス、小痘瘡ウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、ベネズエラ出血熱ウイルス、水疱性口内炎ウイルス（vesicular stomatitis virus、ＶＳＶ）、ＶＳＶ－Ｇ、ベシクロウイルス、西ナイルウイルス、西部ウマ脳炎ウイルス、及びジカウイルス。

【0254】

他の実施形態では、本開示は、前述のＸＤＰを提供し、ｐｏｌポリタンパク質の１つ以上の成分（例えば、プロテアーゼ）、及び任意選択的に、第２のＣａｓＸ又はドナー鋳型を更に含む。本開示は、コード化された成分のいくつかの複製を含む、コード化された成分の配置の複数の構成を企図する。前述のことは、分裂細胞及び非分裂細胞へのウイルス形質導入が効率的であり、ＸＤＰが、さもなければ外来タンパク質を検出する対象の免疫監視機構を回避する強力で短寿命のＲＮＰを送達するという点で、当該技術分野における他のベクターに対する利点を提供する。非限定的な例示的なＸＤＰ系は、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０／６３４８８号及び国際公開第２０２１／１１３７７２号（Ａ１）に記載されている（参照により本明細書に援用される）。いくつかの実施形態では、本開示は、前述のＸＤＰの実施形態のいずれかをコードするポリヌクレオチド又はベクターを含む宿主細胞を提供する。

【0255】

本明細書に記載の実施形態のいずれかのＣａｓＸ：ｇＲＮＡ ＲＮＰを含むＸＤＰを生成及び回収する際、ＸＤＰは、以下でより詳細に記載されるように、かかるＸＤＰの投与によって対象の標的細胞を編集するための方法において使用され得る。

【0256】

ＶＩＩ．細胞
別の態様では、本明細書に記載のシステム又は方法のいずれかの実施形態によってエクスビボで改変されたＢＣＬ１１Ａ遺伝子を含む細胞集団が本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、このように遺伝子改変された細胞は、遺伝子療法などの目的のために対象に投与され得る。例えば、鎌状赤血球症又はβサラセミアなどの異常ヘモグロビン症関連疾患の治療方法において、投与は、対象におけるγ－グロビンの発現の増加及び胎児型ヘモグロビン（fetal hemoglobin、ＨｂＦ）の増加をもたらす。他の実施形態では、本開示は、異常ヘモグロビン症関連疾患の治療における医薬品として使用するための改変細胞の組成物を提供する。

【0257】

クラス２、Ｖ型Ｃａｓヌクレアーゼ及びＢＣＬ１１Ａ標的核酸を標的化する１つ以上のガイドによるＢＣＬ１１Ａ遺伝子のエクスビボ改変に好適な本開示の細胞は、造血前駆細胞（ＨＰＣ）、造血幹細胞（ＨＳＣ）、ＣＤ３４＋細胞、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、骨髄系共通前駆細胞、前赤芽球細胞、又は赤芽球細胞であり得る。いくつかの実施形態では、改変される細胞集団は、動物細胞である。例えば、げっ歯類、ラット、マウス、ウサギ、イヌ細胞、又は非ヒト霊長類細胞（例えば、カニクイザル細胞）に由来する。いくつかの実施形態では、細胞は、ヒト細胞である。場合によっては、改変される細胞は、細胞を投与される対象に対して自己由来である。他の場合では、細胞は、細胞を投与される対象に対して同種である。場合によっては、エクスビボ細胞は、対象の骨髄又は末梢血から単離される。

【0258】

いくつかの実施形態では、本開示は、各細胞集団に、ｉ）本明細書に記載の実施形態のいずれか１つのＣａｓＸ及びｇＲＮＡを含むＣａｓＸ：ｇＲＮＡシステム、ｉｉ）本明細書に記載の実施形態のいずれか１つのＣａｓＸ、ｇＲＮＡ、及びドナー鋳型を含むＣａｓＸ：ｇＲＮＡシステム、ｉｉｉ）ＣａｓＸ及びｇＲＮＡをコードし、任意選択的にドナー鋳型を含む核酸、ｉｖ）本明細書に記載の実施形態のいずれかのＡＡＶであり得る、上記の（ｉｉｉ）の核酸を含むベクター、ｖ）本明細書に記載の実施形態のいずれか１つのＣａｓＸ：ｇＲＮＡシステムを含むＸＤＰ、又はｖｉ）（ｉ）～（ｖ）のうちの２つ以上の組み合わせ、を導入する方法及びそれによって改変された細胞集団を提供し、ｇＲＮＡによって標的化される細胞のＢＣＬ１１Ａ標的核酸配列が、ＣａｓＸタンパク質及び任意選択的にドナー鋳型によって改変される。いくつかの実施形態では、本方法は、第２のｇＲＮＡ又は第２のｇＲＮＡをコードする核酸を投与することを更に含み、第２のｇＲＮＡが、第１のｇＲＮＡと比較して、標的核酸配列の異なる部分又は重複する部分に相補的な標的化配列を有する。場合によっては、ＣａｓＸ及びｇＲＮＡは、ＲＮＰ（その実施形態は、本明細書において上に記載されている）及び任意選択的にドナー鋳型として、細胞集団に送達される。いくつかの実施形態では、本開示は、改変された細胞の少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％が検出可能なレベルのＢＣＬ１１Ａタンパク質を発現しないように細胞が改変されている、前述の方法によって改変された細胞集団を提供する。他の実施形態では、本開示は、ＢＣＬ１１Ａタンパク質の発現が、改変されていない細胞と比較して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％減少するように、細胞が改変されている細胞集団を提供する。更に他の実施形態では、本開示は、ＢＣＬ１１Ａタンパク質の発現が、改変された細胞集団において検出され得ない、細胞集団を提供する。改変の効果は、ウェスタンブロット、フローサイトメトリー、ＥＬＩＳＡ、細胞ベースのアッセイ、ｑＲＴ－ＰＣＲ、電気化学発光アッセイによって評価され得、センス転写物は、ＲＮＡ蛍光インサイツハイブリダイゼーション（fluorescence in situ hybridization、ＦＩＳＨ）アッセイ、又は当該技術分野で既知の他の方法、又は実施例に記載されている他の方法によって分析され得る。

【0259】

いくつかの実施形態では、本開示は、インビトロ又はエクスビボの方法によって細胞集団においてＢＣＬ１１Ａ標的核酸を改変する方法を提供する。本方法は、当業者に既知の任意の数の技術を使用して、対象から細胞を得ることができることを提供する（例えば、骨髄の生検又は末梢血の試料を得ることによって）。所望の細胞を、試料の残りから分離し、洗浄して、流体及びデブリを除去し、任意選択的に、その後の処理ステップのために適切な緩衝液又は培地に入れてもよい。本方法は、以下のうちの１つ以上のステップを含み得る：ｉ）標的核酸を編集するためのＣａｓＸ：ｇＲＮＡシステム成分を細胞に導入するステップ、ｉｉ）ＣａｓＸ：ｇＲＮＡシステム成分を細胞にコードする核酸又はベクターを細胞に導入するステップ、ｉｉｉ）細胞を、それらの増殖に好適な条件下で、好適な培地で増殖させるステップ、及びｉｖ）細胞を、その後の対象への投与のために凍結保存するステップ。したがって、本明細書に記載のＣａｓＸ：ｇＲＮＡシステム及び方法を使用して、異常ヘモグロビン症に関連する様々な細胞を改変して、ＢＣＬ１１Ａタンパク質の発現が低減又は排除され、かつＨｂＦが増加している細胞集団を産生することができる。したがって、このアプローチは、とりわけ鎌状赤血球貧血又はβサラセミアなどの異常ヘモグロビン症を有する対象における治療方法に使用することができる。場合によっては、細胞を、ｇＲＮＡがガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）である、ＣａｓＸ及びｇＲＮＡと接触させる。他の場合では、細胞を、ｇＲＮＡがＤＮＡ及びＲＮＡを含むキメラである、ＣａｓＸ及びｇＲＮＡと接触させる。本明細書に記載されるように、任意の組み合わせ（ｓｇＲＮＡ又はｄｇＲＮＡとして構成され得る足場及び標的化配列の組み合わせ）の実施形態では、当該ｇＲＮＡ分子の各々は、改変される細胞への組み込みのために、本明細書に記載の実施形態のＣａｓＸを有するＲＮＰとして提供され得る。一実施形態では、細胞の標的核酸は、細胞を、ＣａｓＸタンパク質、ＢＣＬ１１Ａ標的核酸に相補的な標的化配列を含むガイド核酸（ｇＲＮＡ）、及びドナー鋳型と接触させることによって、改変され、ＢＣＬ１１Ａタンパク質が発現されないか又は減少したレベルで発現されるように、ドナー鋳型が、細胞の標的核酸配列の一部に挿入されるか又はそれを置換する。他の場合では、ベクターにおけるＣａｓＸ及びｇＲＮＡが、細胞集団に送達され（その実施形態は、本明細書において上に記載されている）、標的核酸は、ＢＣＬ１１Ａタンパク質が発現されないか又は減少したレベルで発現されるように改変される。

【0260】

いくつかの実施形態では、細胞集団が、表４の配列又はそれと少なくとも６５％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８１％同一、少なくとも８２％同一、少なくとも８３％同一、少なくとも８４％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも８６％同一、少なくとも８６％同一、少なくとも８７％同一、少なくとも８８％同一、少なくとも８９％同一、少なくとも８９％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、若しくは少なくとも９９．５％同一の配列を含むＣａｓＸバリアントと接触され、ｇＲＮＡ足場が、表３の配列又はそれと少なくとも６５％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８１％同一、少なくとも８２％同一、少なくとも８３％同一、少なくとも８４％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも８６％同一、少なくとも８６％同一、少なくとも８７％同一、少なくとも８８％同一、少なくとも８９％同一、少なくとも８９％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、少なくとも９９．５％同一の配列を含み、ｇＲＮＡが、表１の配列番号２７２～２１００及び２２８６～２６７８９からなる群から選択される標的化配列又はそれと少なくとも６５％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、若しくは少なくとも９５％同一の配列を含み、かつ１５～２０個のアミノ酸を有する。他の場合では、ＣａｓＸ及び１つ以上のｇＲＮＡは、ベクターを使用して、コードポリヌクレオチドとして細胞集団に導入される（その実施形態は、本明細書に記載されている）。ＣａｓＸ：ｇＲＮＡシステム成分を使用して細胞を改変する更なる方法には、ウイルス感染、トランスフェクション、コンジュゲーション、プロトプラスト融合、パーティクルガン技術、リン酸カルシウム沈殿、直接マイクロインジェクションなどが含まれる。方法の選択は、一般に、形質転換される細胞型及び形質転換が行われる環境（例えば、インビトロ、エクスビボ、又はインビボ）に依存する。これらの方法の一般的な考察は、Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ，Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，３ｒｄ ｅｄ．，Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，１９９５に見出すことができる。

【0261】

ＣａｓＸ及びｇＲＮＡによる標的核酸とのハイブリダイゼーションの際、ＣａｓＸは、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子内に１つ以上の一本鎖切断又は二本鎖切断を導入し、これが、標的核酸における永続的なインデル（欠失若しくは挿入）又は他の変異（例えば、置換、重複、若しくは逆位）などの標的核酸の改変をもたらし、宿主細胞の修復機構と関連して、機能的なＢＣＬ１１Ａタンパク質の発現の対応する低減又は排除をもたらし、それによって、改変された細胞集団が作製される。本明細書に記載されるように、標的核酸の二本鎖切断を導入するＣａｓＸバリアントは、標的鎖上のＰＡＭ部位の５’側の１８～２６ヌクレオチド内及び非標的鎖上の３’側の１０～１８ヌクレオチド内に二本鎖切断を生成する。したがって、いくつかの実施形態では、本方法によって得られる改変は、非相同ＤＮＡ末端結合（ＮＨＥＪ）修復機構によって、それらの領域における１つ以上のヌクレオチドのランダムな挿入、又は欠失（インデル）、又は置換、重複、又は逆位をもたらし得る。

【0262】

細胞集団を改変する方法のいくつかの実施形態では、第１のｇＲＮＡは、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子のエキソンのうちのいずれか１つに近位の又はその中の配列に相補的な標的化配列を含む。一実施形態では、第１のｇＲＮＡは、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子の調節エレメントのうちのいずれか１つに近位の又はその中の又はそれに隣接する配列に相補的な標的化配列を含む。特定の実施形態では、第１のｇＲＮＡは、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子のＧＡＴＡ１結合モチーフ配列内の又は５’側に隣接する配列に相補的な標的化配列を含む。特定の実施形態では、標的化配列は配列番号２２である。前述により、標的核酸配列の破壊は、機能的なＢＣＬ１１Ａタンパク質の発現が改変された細胞集団において低減又は排除されるように、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子の改変をもたらす。

【0263】

本方法のいくつかの実施形態では、細胞集団の標的核酸は、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子の異なる部分又は重複する部分を標的化する複数の（例えば、２つ、３つ、４つ、又はそれ以上）ｇＲＮＡを使用して改変され、ＣａｓＸタンパク質は、標的核酸配列に複数の切断を導入して、永続的なインデル（欠失若しくは挿入）又は他の変異（例えば、１つ以上のヌクレオチドの置換、重複、若しくは逆位）をもたらし、それにより、改変された細胞集団において、機能的なＢＣＬ１１Ａタンパク質の発現が低減又は排除される。

【0264】

他の実施形態では、本開示は、細胞を、本明細書に記載の実施形態のいずれかのＣａｓＸタンパク質、標的化配列を含む１つ以上のｇＲＮＡ、及びドナー鋳型と接触させることによって、改変された細胞集団を提供し、ドナー鋳型が、ヌクレアーゼによって導入された切断部位に挿入され、改変されるＢＣＬ１１Ａ遺伝子の標的核酸配列の全て又は一部を置換する。前述の一実施形態では、ドナー鋳型は、ＢＣＬ１１Ａエキソンの少なくとも一部を含み、１つ以上の変異及び細胞の改変が、遺伝子の改変をもたらし、それにより、改変された細胞集団において、機能的なＢＣＬ１１Ａタンパク質の発現が低減又は排除される。前述の別の実施形態では、ドナー鋳型は、ＧＡＴＡ１結合モチーフ配列の中の又は５’側に隣接する配列を含むが、野生型配列と比較して１つ以上の変異を有し、細胞の改変が、改変された細胞集団において、機能的なＢＣＬ１１Ａタンパク質の発現の低減又は排除をもたらす。このような場合、ドナー鋳型による置換は、置換される標的核酸の特定の部分でヌクレアーゼによって導入される切断部位の位置よりも５’方向及び３’方向に大きく、その挿入を容易にするために、ヌクレアーゼによって導入される切断部位の５’側及び３’側にある相同アームを更に含むことが理解される。場合によっては、ドナー鋳型は、一本鎖ＤＮＡ鋳型又は一本鎖ＲＮＡ鋳型である。他の場合では、ドナー鋳型は、二本鎖ＤＮＡ鋳型である。標的領域でのドナー鋳型の挿入は、相同組換え修復（ＨＤＲ、上記のとおり）又は相同性非依存性標的化組み込み（ＨＩＴＩ）によって媒介され得る。ＨＩＴＩによって挿入される外因性配列は、任意の長さ、例えば、１０～５０ヌクレオチド長の比較的短い配列、又は約５０～１０００ヌクレオチド長のより長い配列であり得る。ドナー鋳型配列は、ゲノム配列と比較して、特定の配列の差異、例えば、制限部位、ヌクレオチド多型、バーコード、選択マーカー（例えば、薬剤耐性遺伝子、蛍光タンパク質、酵素など）などを含み得、これらは、切断部位でのドナー核酸の挿入の成功を評価するために使用され得るか、又は場合によっては、他の目的のために（例えば、標的ゲノム遺伝子座における発現を示すために）使用され得る。代替的に、これらの配列の差異は、マーカー配列の除去のために後で活性化され得る、隣接する組換え配列（例えば、ＦＬＰ配列、ｌｏｘＰ配列など）を含み得る。

【0265】

細胞集団を改変する方法のいくつかの実施形態では、本方法は、細胞集団のＢＣＬ１１Ａ遺伝子の標的核酸配列を、ｉ）第１のｇＲＮＡと比較してＢＣＬ１１Ａ標的核酸の異なる部分又は重複する部分を標的化する追加のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ及びｇＲＮＡ、ｉｉ）（ｉ）の追加のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ及びｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチド、ｉｉｉ）（ｉｉ）のポリヌクレオチドを含むベクター、又はｉｖ）（ｉ）の追加のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ及びｇＲＮＡを含むＸＤＰ、と接触させることを更に含み、接触が、第１のｇＲＮＡによって標的化される配列と比較して配列における異なる位置で、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子の改変をもたらす。前述の一実施形態では、追加のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、前述の実施形態のＣａｓＸタンパク質とは異なる配列を有するＣａｓＸタンパク質である。前述の別の実施形態では、追加のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、ＣａｓＸタンパク質ではなく、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｃ、Ｃａｓ１２ｄ（ＣａｓＹ）、Ｃａｓ１２ｊ、Ｃａｓｋ、Ｃａｓ１３ａ、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃ、Ｃａｓ１３ｄ、Ｃａｓ１４、Ｃｐｆｌ、Ｃ２ｃｌ、Ｃｓｎ２、及びそれらの配列バリアントからなる群から選択される。

【0266】

他の実施形態では、本開示は、対象の細胞集団におけるＢＣＬ１１Ａ標的核酸を、インビボで改変する方法を提供する。インビボでの改変の方法の一実施形態では、本方法は、本明細書に記載の実施形態のベクターを、治療有効用量で対象に投与することを含む。いくつかの実施形態では、ベクターは、少なくとも約１×１０^５ベクターゲノム（ｖｇ／ｋｇ）、少なくとも約１×１０^６ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０^７ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０^８ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０^９ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０^１０ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０^１１ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０^１５ｖｇ／ｋｇ、又は少なくとも約１×１０^１６ｖｇ／ｋｇの用量で対象に投与される。他の実施形態では、ベクターは、少なくとも約１×１０^５ｖｇ／ｋｇ～少なくとも約１×１０^１６ｖｇ／ｋｇ、又は少なくとも約１×１０^６ｖｇ／ｋｇ～約１×１０^１５ｖｇ／ｋｇ、又は少なくとも約１×１０^７ｖｇ／ｋｇ～約１×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、又は少なくとも約１×１０^８ｖｇ／ｋｇ～約１×１０^１４ｖｇ／ｋｇの用量で対象に投与される。インビボでの改変の方法の別の実施形態では、本方法は、対象に、治療有効用量のＸＤＰを投与すること含み、ＸＤＰが、ＲＮＰ中で複合体化されたＣａｓＸ及びｇＲＮＡ、並びに任意選択的にドナー鋳型を含み（上により詳細に記載されている）、ＸＤＰが、標的細胞に対するトロピズムを有し、本明細書に記載されるように、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子の編集のためにＲＮＰを送達することができる。前述の編集方法で利用されるＸＤＰの実施形態が、本明細書に記載される。一実施形態では、ＸＤＰは、少なくとも約１×１０^５粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０^６粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０^７粒子／ｋｇ少なくとも約１×１０^８粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０^９粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０^１０粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０^１１粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０^１２粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０^１３粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０^１４粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０^１５粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０^１６粒子／ｋｇ、又は少なくとも約１×１０^６粒子／ｋｇ～約１×１０^１５粒子／ｋｇ、又は少なくとも約１×１０^７粒子／ｋｇ～約１×１０^１４粒子／ｋｇの用量で対象に投与される。本段落の前述の実施形態では、ベクター又はＸＤＰは、実質内、静脈内、動脈内、腹腔内（intraperitoneal）、嚢内、皮下、筋肉内、腹腔内（intraabdominally）、又はそれらの組み合わせから選択される投与経路によって対象に投与され、投与方法が、注射、輸血、又は移植である。

【0267】

ＶＩＩＩ．治療方法
別の態様では、本開示は、鎌状赤血球症又はβサラセミアを含むがこれらに限定されない異常ヘモグロビン症関連疾患の治療を必要とする対象においてそれを行う方法に関し、対象の標的細胞におけるＢＣＬ１１Ａ遺伝子を改変することによるＢＣＬ１１Ａタンパク質の発現の抑制又は排除が、対象が依然として基礎疾患に罹患している可能性があるにもかかわらず、疾患の徴候、症状、又は影響を改善する。

【0268】

いくつかの治療戦略が、異常ヘモグロビン症関連疾患を有する対象の治療方法における使用のための組成物を設計するために使用されている。いくつかの実施形態では、本方法は、異常ヘモグロビン症（例えば、鎌状赤血球貧血又はβサラセミア）を有する対象に、治療有効用量の本明細書に開示されるクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ及びガイドＲＮＡを投与することを含む。いくつかの実施形態では、治療方法は、対象に、治療有効用量のｉ）第１のＣａｓＸタンパク質と、標的核酸に相補的な標的化配列を有する第１のｇＲＮＡと、を含むＣａｓＸ：ｇＲＮＡシステム、ｉｉ）第１のＣａｓＸタンパク質と、標的核酸に相補的な標的化配列を有する第１のｇＲＮＡと、ドナー鋳型と、を含むＣａｓＸ：ｇＲＮＡシステム、ｉｉｉ）（ｉ）若しくは（ｉｉ）のＣａｓＸ：ｇＲＮＡシステムをコードする核酸、ｉｖ）本明細書に記載の実施形態のいずれかのＡＡＶであり得る、（ｉｉｉ）の核酸を含むベクター、ｖ）（ｉ）若しくは（ｉｉ）のＣａｓＸ：ｇＲＮＡシステムを含むＸＤＰ、又はｖｉ）（ｉ）～（ｖ）のうちの２つ以上の組み合せ、を投与することを含み、１）第１のｇＲＮＡによって標的化される対象の細胞のＢＣＬ１１Ａ遺伝子が、ＣａｓＸタンパク質及び任意選択的にドナー鋳型によって改変され（例えば、ノックダウン又はノックアウトされ）、２）対象においてヘモグロビンＦ（ＨｂＦ）の産生の増加が生じる。いくつかの実施形態では、治療方法は、第２のｇＲＮＡ又は第２のｇＲＮＡをコードする核酸を投与することを更に含み、第２のｇＲＮＡが、第１のｇＲＮＡと比較して、標的核酸配列の異なる部分又は重複する部分に相補的な標的化配列を有する。場合によっては、改変のために標的化される細胞は、造血幹細胞（ＨＳＣ）、造血前駆細胞（ＨＰＣ）、ＣＤ３４＋細胞、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、骨髄系共通前駆細胞、前赤芽球細胞、及び赤芽球細胞からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、治療される対象は、げっ歯類、マウス、ラット、及び非ヒト霊長類からなる群から選択される。別の実施形態では、対象は、ヒトである。

【0269】

治療方法のいくつかの実施形態では、ベクターは、ＣａｓＸ：ｇＲＮＡシステムをコードするＡＡＶベクターであり、少なくとも約１×１０^５ベクターゲノム（ｖｇ／ｋｇ）、少なくとも約１×１０^６ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０^７ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０^８ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０^９ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０^１０ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０^１１ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０^１５ｖｇ／ｋｇ、又は少なくとも約１×１０^１６ｖｇ／ｋｇの用量で対象に投与される。本方法の他の実施形態では、ＡＡＶベクターは、少なくとも約１×１０^５ｖｇ／ｋｇ～約１×１０^１６ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０^６ｖｇ／ｋｇ～約１×１０^１５ｖｇ／ｋｇ、又は少なくとも約１×１０^７ｖｇ／ｋｇ～約１×１０^１４ｖｇ／ｋｇの用量で対象に投与される。他の実施形態では、治療方法は、対象に、治療有効用量の、ＣａｓＸ：ｇＲＮＡシステムを含むＸＤＰを投与することを含む。一実施形態では、ＸＤＰは、少なくとも約１×１０^５粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０^６粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０^７粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０^８粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０^９粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０^１０粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０^１１粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０^１２粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０^１３粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０^１４粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０^１５粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０^１６粒子／ｋｇの用量で対象に投与される。別の実施形態では、ＸＤＰは、少なくとも約１×１０^５粒子／ｋｇ～約１×１０^１６粒子／ｋｇ、又は少なくとも約１×１０^６粒子／ｋｇ～約１×１０^１５粒子／ｋｇ、又は少なくとも約１×１０^７粒子／ｋｇ～約１×１０^１４粒子／ｋｇの用量で対象に投与される。本段落の前述の実施形態では、ベクター又はＸＤＰは、実質内、静脈内、動脈内、腹腔内（intraperitoneal）、嚢内、皮下、筋肉内、腹腔内（intraabdominally）、又はそれらの組み合わせから選択される投与経路によって対象に投与され、投与方法が、注射、輸血、又は移植である。投与は、１回、２回であり得るか、又は毎週、２週間毎、毎月、四半期毎、若しくは６ヶ月毎のレジメンスケジュールを使用して、複数回投与され得る。

【0270】

いくつかの実施形態では、治療方法は、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子の異なる又は重複する領域を標的化するＣａｓＸ及び複数のｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを対象に投与することを含み、投与が、対象の細胞内で対象標的核酸配列をベクターの発現産物と接触させることをもたらし、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子が、対象の細胞において改変される。治療方法の他の実施形態では、本方法は、ＣａｓＸタンパク質及びｇＲＮＡをコードし、ドナー鋳型を更に含むベクターを、対象に投与することを含み、当該投与が、ＣａｓＸタンパク質による切断及びドナー鋳型の標的核酸への挿入によって、対象の細胞の標的核酸配列の改変をもたらす。他の実施形態では、本方法は、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子の異なる又は重複する配列を標的化するＣａｓＸ及び複数のｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを含む第１のベクターと、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子の少なくとも一部又は全体をコードするドナー鋳型ポリヌクレオチドを含む第２のベクターとを、対象に投与することを含み、ベクターの投与が、対象の細胞内の対象標的核酸配列をＣａｓＸ及びｇＲＮＡベクターの発現産物並びにドナー鋳型と接触させることをもたらし、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子が、本明細書に記載されるように、対象の細胞において改変される。治療方法のいくつかの実施形態では、対象に投与されるベクターは、本明細書に記載されるＡＡＶベクターである。前述において、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ－Ｒｈ７４、又はＡＡＶＲｈ１０から選択される。治療方法のいくつかの実施形態では、対象に投与されるベクターは、ＣａｓＸ：ｇＲＮＡシステムのＲＮＰを含む、本明細書に記載のＸＤＰである。

【0271】

本方法のいくつかの実施形態では、改変することは、細胞集団のＢＣＬ１１Ａ遺伝子において一本鎖切断を導入することを含む。他の場合では、改変することは、細胞集団のＢＣＬ１１Ａ遺伝子において二本鎖切断を導入することを含む。いくつかの実施形態では、改変することは、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子における１つ以上のヌクレオチドの挿入、欠失、置換、重複、又は逆位などの、ＢＣＬ１１Ａ標的核酸における１つ以上の変異を導入し、対象の細胞におけるＢＣＬ１１Ａタンパク質の発現が、改変されていない細胞と比較して、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、又は少なくとも約９０％減少する。場合によっては、対象の細胞のＢＣＬ１１Ａ遺伝子は、改変された細胞の少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％が検出可能なレベルのＢＣＬ１１Ａタンパク質を発現しないように改変される。治療方法の他の場合では、改変することは、治療前の対象におけるＨｂＦのレベルと比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、又は少なくとも約５０％の対象の循環血液中のＨｂＦの産生の増加をもたらす。他の実施形態では、本方法は、少なくとも０．０１：１．０、少なくとも０．０２５：１．０、少なくとも０．０５：１．０、少なくとも０．０７５：１．０、少なくとも０．１：１．０、少なくとも０．２：１．０、少なくとも０．３：１．０、少なくとも０．４：１．０、少なくとも０．５：１：０、少なくとも０．７５：１．０、少なくとも１．０：１．０、少なくとも１．２５：１．０、少なくとも１．５：１．０、又は少なくとも１．７５：１．０の対象の循環血液中のＨｂＦ対ヘモグロビンＳ（ＨｂＳ）の比をもたらす。他の実施形態では、本方法は、対象の循環血液中の総ヘモグロビンの少なくとも約５％、又は少なくとも約１０％、又は少なくとも約２０％、又は少なくとも約３０％のＨｂＦレベルをもたらす。前述の実施形態では、対象は、マウス、ラット、ブタ、非ヒト霊長類、及びヒトからなる群から選択される。治療の有効性を決定するための分析のために治療された対象から試料（例えば、体液又は組織）を得る方法、及び分析を可能にするための試料の調製方法は、当業者に周知である。ＲＮＡレベル及びタンパク質レベルの分析のための方法は、上で考察されており、当業者に周知である。治療の効果はまた、当該技術分野で既知の日常的な臨床方法によって、本発明の１つ以上の化合物と接触させた動物から採取された前述の体液、組織、又は器官における標的遺伝子の発現に関連するバイオマーカーを測定することによって評価することができる。異常ヘモグロビン症疾患のバイオマーカーとしては、循環血液中の鎌状赤血球の百分率割合、ＢＣＬ１１Ａレベル、ＢＣＬ１１Ａ ＲＮＡ、ヘモグロビンＳレベル、ヘモグロビン－ガンマレベル、及びヘモグロビンＦレベルが挙げられるが、これらに限定されない。

【0272】

場合によっては、対象における異常ヘモグロビン症を治療する方法は、治療有効用量の追加のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、又は追加のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを投与することを更に含む。一実施形態では、追加のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、第１のＣａｓＸとは異なる配列を有するＣａｓＸタンパク質である。別の実施形態では、追加のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、ＣａｓＸタンパク質（すなわち、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｃ、Ｃａｓ１２ｄ（ＣａｓＹ）、Ｃａｓ１２ｊ、Ｃａｓ１２ｋ、Ｃａｓ１３ａ、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃ、Ｃａｓ１３ｄ、Ｃａｓ１４、Ｃｐｆｌ、Ｃ２ｃｌ、Ｃｓｎ２である）又はその配列バリアントではない。いくつかの実施形態では、対象における異常ヘモグロビン症を治療する方法は、化学療法剤を投与することを更に含む。

【0273】

他の実施形態では、本開示は、異常ヘモグロビン症関連疾患の治療を必要とする対象において、以下を含む本明細書に記載の実施形態のＣａｓＸ：ｇＲＮＡシステム組成物によってインビトロ又はエクスビボで改変された治療的有効量の細胞集団を対象に投与することによって、それを行う方法を提供する：ｉ）第１のＣａｓＸタンパク質と、標的核酸に相補的な標的化配列を有する第１のｇＲＮＡと、を含むＣａｓＸ：ｇＲＮＡシステム、ｉｉ）第１のＣａｓＸタンパク質と、標的核酸に相補的な標的化配列を有する第１のｇＲＮＡと、ドナー鋳型と、を含むＣａｓＸ：ｇＲＮＡシステム、ｉｉｉ）（ｉ）若しくは（ｉｉ）のＣａｓＸ：ｇＲＮＡシステムをコードする核酸、ｉｖ）本明細書に記載の実施形態のいずれかのＡＡＶであり得る、（ｉｉｉ）の核酸を含むベクター、ｖ）（ｉ）若しくは（ｉｉ）のＣａｓＸ：ｇＲＮＡシステムを含むＸＤＰ、又はｖｉ）（ｉ）～（ｖ）のうちの２つ以上の組み合わせ。一実施形態では、治療方法は、ｉ）対象から人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）又は造血幹細胞（ＨＳＣ）を単離することと、ｉｉ）本明細書に記載の実施形態のいずれかの方法によって、ｉＰＳＣ又はＨＳＣのＢＣＬ１１Ａ標的核酸を改変することと、ｉｉｉ）改変されたｉＰＳＣ又はＨＳＣを造血前駆細胞に分化させることと、ｉｖ）造血前駆細胞を、異常ヘモグロビン症を有する対象に移植することと、を含み、本方法が、治療前の対象におけるヘモグロビンＦ（ＨｂＦ）のレベルと比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、又は少なくとも約５０％の対象の循環血液中のＨｂＦのレベルの増加をもたらす。場合によっては、細胞は、細胞が投与される対象に対して自己由来であり、対象の骨髄又は末梢血から単離される。他の場合では、細胞は、細胞を投与される対象に対して同種であり、異なる対象の骨髄又は末梢血から単離される。改変された細胞は、移植、局所注射、全身注入、又はそれらの組み合わせによって対象に移植することができる。対象への投与のために細胞を改変する方法は、本明細書に記載されているが、簡潔には、改変することは、細胞を、ｉ）第１のＣａｓＸタンパク質と、標的核酸に相補的な標的化配列を有する第１のｇＲＮＡと、を含むＣａｓＸ：ｇＲＮＡシステム、ｉｉ）第１のＣａｓＸタンパク質と、標的核酸に相補的な標的化配列を有する第１のｇＲＮＡと、ドナー鋳型と、を含むＣａｓＸ：ｇＲＮＡシステム、ｉｉｉ）（ｉ）若しくは（ｉｉ）のＣａｓＸ：ｇＲＮＡシステムをコードする核酸、ｉｖ）本明細書に記載の実施形態のいずれかのＡＡＶであり得る、（ｉｉｉ）の核酸を含むベクター、ｖ）（ｉ）若しくは（ｉｉ）のＣａｓＸ：ｇＲＮＡシステムを含むＸＤＰ、又はｖｉ）（ｉ）～（ｖ）のうちの２つ以上の組み合わせ、と接触させることを含み、ＢＣＬ１１Ａタンパク質の発現が低減されるか、又は細胞が検出可能なレベルのＢＣＬ１１Ａタンパク質を発現しない。いくつかの実施形態では、本方法は、第２のｇＲＮＡ又は第２のｇＲＮＡをコードする核酸を投与することを更に含み、第２のｇＲＮＡが、第１のｇＲＮＡと比較して、標的核酸配列の異なる部分又は重複する部分に相補的な標的化配列を有する。場合によっては、ＲＮＰとしてのＣａｓＸ及びｇＲＮＡ（その実施形態は、本明細書において上に記載されている）、並びに任意選択的にドナー鋳型が、細胞集団に送達され、標的核酸は、ＢＣＬ１１Ａタンパク質が発現されないか又は減少したレベルで発現されるように改変される。他の場合では、ベクターにおけるＣａｓＸ及びｇＲＮＡが、細胞集団に送達され（その実施形態は、本明細書において上に記載されている）、標的核酸は、ＢＣＬ１１Ａタンパク質が発現されないか又は減少したレベルで発現されるように改変される。いくつかの実施形態では、組成物の投与によって改変される細胞集団は、げっ歯類細胞、マウス細胞、ラット細胞、及び非ヒト霊長類細胞からなる群から選択される真核細胞である。いくつかの実施形態では、真核細胞は、ヒト細胞である。いくつかの実施形態、真核細胞は、造血幹細胞（ＨＳＣ）、造血前駆細胞（ＨＰＣ）、ＣＤ３４＋細胞、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、骨髄系共通前駆細胞、前赤芽球細胞、及び赤芽球細胞からなる群から選択される。本方法のいくつかの実施形態では、対象に投与された細胞又はその子孫は、対象への投与後、対象において、少なくとも１ヶ月間、２ヶ月間、３ヶ月間、４ヶ月間、５ヶ月間、６ヶ月間、７ヶ月間、８ヶ月間、９ヶ月間、１０ヶ月間、１１ヶ月間、１２ヶ月間、１３ヶ月間、１４ヶ月間、１５ヶ月間、１６ヶ月間、１７ヶ月間、１８ヶ月間、１９ヶ月間、２０ヶ月間、２１ヶ月間、２２ヶ月間、２３ヶ月間、２年間、３年間、４年間、又は５年間存続する。いくつかの実施形態では、本開示の治療方法は、治療前の対象におけるヘモグロビンＦ（ＨｂＦ）のレベルと比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、又は少なくとも約５０％の循環血液中のＨｂＦのレベルの増加をもたらす。他の実施形態では、本方法は、少なくとも０．０１：１．０、少なくとも０．０２５：１．０、少なくとも０．０５：１．０、少なくとも０．０７５：１．０、少なくとも０．１：１．０、少なくとも０．２：１．０、少なくとも０．３：１．０、少なくとも０．４：１．０、少なくとも０．５：１：０、少なくとも０．７５：１．０、少なくとも１．０：１．０、少なくとも１．２５：１．０、少なくとも１．５：１．０、又は少なくとも１．７５：１．０の対象におけるＨｂＦ対ヘモグロビンＳ（ＨｂＳ）の比をもたらす。他の実施形態では、本方法は、対象における総循環ヘモグロビンの少なくとも約５％、又は少なくとも約１０％、又は少なくとも約２０％、又は少なくとも約３０％のＨｂＦレベルをもたらす。

【0274】

他の実施形態では、本開示は、ゲノム編集によって異常ヘモグロビン症を有する対象において胎児型ヘモグロビン（ＨｂＦ）を増加させる方法を提供し、ｉ）対象に有効用量の本明細書に記載の実施形態のベクター又はＸＤＰを投与することを含み、ベクター又はＸＤＰが、対象の細胞に、ＣａｓＸ：ｇＲＮＡシステムを送達し、ｉｉ）対象の細胞のＢＣＬ１１Ａ標的核酸が、第１のｇＲＮＡにより標的化されるＣａｓＸによって編集され、ｉｉｉ）編集が、ＢＣＬ１１Ａタンパク質の発現が低減又は排除されるように、標的核酸配列において１つ以上のヌクレオチドの挿入、欠失、置換、重複、又は逆位を導入することを含み、本方法が、治療前の対象におけるヘモグロビンＦ（ＨｂＦ）のレベルと比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、又は少なくとも約５０％の対象の循環血液中のＨｂＦのレベルの増加をもたらす。前述において、細胞は、造血幹細胞（ＨＳＣ）、造血前駆細胞（ＨＰＣ）、ＣＤ３４＋細胞、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、骨髄系共通前駆細胞、前赤芽球細胞、及び赤芽球細胞からなる群から選択される。本方法の一実施形態では、細胞の標的核酸は、ＢＣＬ１１Ａタンパク質の発現が、編集されていない細胞の標的核酸と比較して、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、又は少なくとも約９０％減少するように編集されている。場合によっては、対象は、マウス、ラット、ブタ、及び非ヒト霊長類からなる群から選択される。他の場合では、対象は、ヒトである。

【0275】

対象における異常ヘモグロビン症を治療する方法のいくつかの実施形態では、本方法は、末端臓器疾患の発生、アルブミン尿、高血圧、衰弱状態、低張尿、拡張機能障害、機能的な運動能力、急性冠症候群、疼痛事象、疼痛重篤度、貧血症、溶血、組織低酸素症、臓器機能障害、異常なヘマトクリット値、小児死亡率、脳卒中の発生率、ベースラインと比較したヘモグロビンレベル、ＨｂＦレベル、肺塞栓症の発生率の低下、血管閉塞危機の発生率、赤血球中のヘモグロビンＳの濃度、入院率、肝臓鉄濃度、必要な輸血、及び生活の質スコアからなる群から選択される少なくとも１つの臨床的に関連するパラメータの改善をもたらす。対象における異常ヘモグロビン症を治療する方法の他の実施形態では、本方法は、末端臓器疾患の発生、アルブミン尿、高血圧、衰弱状態、低張尿、拡張機能障害、機能的な運動能力、急性冠症候群、疼痛事象、疼痛重篤度、貧血症、溶血、組織低酸素症、臓器機能障害、異常なヘマトクリット値、小児死亡率、脳卒中の発生率、ベースラインと比較したヘモグロビンレベル、ＨｂＦレベル、肺塞栓症の発生率の低下、血管閉塞危機の発生率、赤血球中のヘモグロビンＳの濃度、入院率、肝臓鉄濃度、必要な輸血、及び生活の質スコアからなる群から選択される少なくとも２つの臨床的に関連するパラメータの改善をもたらす。

【0276】

いくつかの実施形態では、治療方法は、ＣａｓＸタンパク質及びｇＲＮＡを含むリポソーム又は脂質ナノ粒子を対象に投与することを含む。いくつかの実施形態では、リポソーム又は脂質ナノ粒子は、本明細書に記載の実施形態のいずれかのドナー鋳型を更に含む。

【0277】

いくつかの実施形態では、本開示は、異常ヘモグロビン症関連疾患を有する対象の治療方法を提供し、本方法は、本明細書に開示される実施形態のいずれかのＣａｓＸ：ｇＲＮＡ組成物、又はベクター、又はＣａｓＸ：ｇＲＮＡ組成物のＲＮＰを含むＸＤＰを、治療有効用量を使用して、１回以上の連続した用量を含む治療レジメンに従って、対象に投与することを含む。治療レジメンのいくつかの実施形態では、治療有効用量の組成物又はベクターは、単回用量として投与される。治療レジメンの他の実施形態では、治療有効用量は、少なくとも２週間、又は少なくとも１ヶ月間、又は少なくとも２ヶ月間、又は少なくとも３ヶ月間、又は少なくとも４ヶ月間、又は少なくとも５ヶ月間、又は少なくとも６ヶ月間の期間にわたって、２回以上の用量として対象に投与される。治療レジメンのいくつかの実施形態では、有効用量は、移植、局所注射、全身注入、又はそれらの組み合わせからなる群から選択される経路によって投与される。

【0278】

いくつかの実施形態では、治療方法は、化学療法剤を投与することを更に含み、薬剤は、ヒドロキシ尿素、Ｌ－グルタミン経口粉末、ボクセロトール、及び鎮痛剤を含むがこれらに限定されない、異常ヘモグロビン症関連疾患に関連する徴候又は症状を改善するのに有効である。

【0279】

いくつかの実施形態では、本開示は、鎌状赤血球症又はβサラセミアを含む異常ヘモグロビン症の治療のための医薬品として使用するためのＣａｓＸ：ｇＲＮＡ組成物、ＣａｓＸ：ｇＲＮＡ組成物をコードする核酸、核酸を含むベクター、又はＣａｓＸ：ｇＲＮＡのＲＮＰを含むＸＤＰを提供する。

【0280】

ＸＩＶ．キット及び組成物
他の実施形態では、ＣａｓＸタンパク質、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子に特異的な標的化配列を含む本開示の実施形態のいずれかの１つ又は複数のｇＲＮＡ、及び好適な容器（例えば、チューブ、バイアル、又はプレート）を含むキットが本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、キットは、緩衝液、ヌクレアーゼ阻害剤、プロテアーゼ阻害剤、リポソーム、治療剤、標識、標識可視化試薬、又は前述の任意の組み合わせを更に含む。いくつかの実施形態では、キットは、薬学的に許容される担体、希釈剤、又は賦形剤を更に含む。いくつかの実施形態では、キットは、遺伝子改変適用のための適切な対照組成物、及び使用説明書を含む。いくつかの実施形態では、キットは、ベクターを含み、ベクターは、本開示のＣａｓＸタンパク質をコードする配列、本開示のｇＲＮＡ、任意選択的にドナー鋳型、又はそれらの組み合わせを含む。

【0281】

本開示のキットの他の実施形態では、キットは、対象の単離された細胞におけるＢＣＬ１１Ａ標的核酸を改変することによる、対象における異常ヘモグロビン症の治療のための組成物を含み、改変することが、細胞の標的核酸配列を、本明細書に開示される実施形態のｉ）ＣａｓＸ：ｇＲＮＡシステム、ｉｉ）ＣａｓＸ：ｇＲＮＡシステムの成分をコードする核酸、ｉｉｉ）核酸を含むベクター、ｉｖ）ＣａｓＸタンパク質及びガイド核酸（ｇＲＮＡ）を含むＸＤＰ、又はｖ）（ｉ）～（ｉｖ）のいずれかの組み合わせ、と接触させることを含み、ｉ）当該接触させることが、ＣａｓＸタンパク質によるＢＣＬ１１Ａ標的核酸配列の改変、ｉｉ）ＢＣＬ１１Ａタンパク質の発現の減少、及びｉｉｉ）細胞の成熟時のヘモグロビンＦ（ＨｂＦ）の産生の増加、をもたらす。場合によっては、細胞は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である。他の場合では、細胞は、造血幹細胞（ＨＳＣ）である。一実施形態では、組成物の使用は、成熟細胞によるＢＣＬ１１Ａタンパク質の発現の減少をもたらし、改変されていない標的核酸と比較して、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、又は少なくとも約９０％減少する。別の実施形態では、成熟細胞によるＢＣＬ１１Ａタンパク質の発現は検出できない。

【0282】

いくつかの実施形態では、キットは、本明細書に記載のＣａｓＸ：ｇＲＮＡシステムを使用して編集された複数の細胞を含む。

【0283】

本明細書は、多数の例示的な構成、方法、パラメータなどを記載する。しかしながら、かかる説明は、本開示の範囲に対する限定として意図されるものではなく、代わりに例示的な実施形態の説明として提供されることを認識されたい。

【0284】

列挙された実施形態
本発明は、以下に列挙された例示的な実施形態を参照することによって定義され得る。

【0285】

セットＩ
実施形態１．クラス２ Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質及び第１のガイド核酸（guide nucleic acid、ｇＮＡ）を含む組成物であって、ｇＮＡが、ポリピリミジントラクト結合タンパク質１（ＢＣＬ１１Ａ）遺伝子標的核酸配列に相補的な標的化配列を含む、組成物。

【0286】

実施形態２．ｇＮＡが、
ａ．ＢＣＬ１１Ａイントロン、
ｂ．ＢＣＬ１１Ａエキソン、
ｃ．ＢＣＬ１１Ａイントロン－エキソン接合部、
ｄ．ＢＣＬ１１Ａ調節エレメント、及び
ｅ．遺伝子間領域、からなる群から選択される標的核酸配列に相補的な標的化配列を含む、実施形態１に記載の組成物。

【0287】

実施形態３．ＢＣＬ１１Ａ遺伝子が、野生型配列を含む、実施形態１に記載の組成物。

【0288】

実施形態４．ｇＮＡが、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）である、実施形態１～３のいずれか１つに記載の組成物。

【0289】

実施形態５．ｇＮＡが、ガイドＤＮＡ（ｇＤＮＡ）である、実施形態１～３のいずれか１つに記載の組成物。

【0290】

実施形態６．ｇＮＡが、ＤＮＡ及びＲＮＡを含むキメラである、実施形態１～３のいずれか１つに記載の組成物。

【0291】

実施形態ｇＮＡが、単一分子ｇＮＡ（ｓｉｎｇｌｅ－ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｇＮＡ、ｓｇｎＡ）である、実施形態１～６のいずれか１つに記載の組成物。

【0292】

実施形態８．ｇＮＡが、二種分子ｇＮＡ（ｄｕａｌ－ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｇＮＡ、ｄｇＮａ）である、実施形態１～６のいずれか１つに記載の組成物。

【0293】

実施形態９．ｇＮＡの標的化配列が、配列番号２７２～２１００及び２２８６～２６７８９からなる群から選択される配列、又はそれと少なくとも約６５％、少なくとも約７５％、少なくとも約８５％、若しくは少なくとも約９５％の同一性を有する配列を含む、実施形態１～８のいずれか１つに記載の組成物。

【0294】

実施形態１０．ｇＮＡの標的化配列が、配列番号２７２～２１００及び２２８６～２６７８９からなる群から選択される配列を含む、実施形態１～８のいずれか１つに記載の組成物。

【0295】

実施形態１１．ｇＮＡの標的化配列が、配列の３’末端から単一のヌクレオチドが除去された配列番号２７２～２１００及び２２８６～２６７８９の配列を含む、実施形態１～８のいずれか１つに記載の組成物。

【0296】

実施形態１２．ｇＮＡの標的化配列が、配列の３’末端から２つのヌクレオチドが除去された配列番号２７２～２１００及び２２８６～２６７８９の配列を含む、実施形態１～８のいずれか１つに記載の組成物。

【0297】

実施形態１３．ｇＮＡの標的化配列が、配列の３’末端から３つのヌクレオチドが除去された配列番号２７２～２１００及び２２８６～２６７８９の配列を含む、実施形態１～８のいずれか１つに記載の組成物。

【0298】

実施形態１４．ｇＮＡの標的化配列が、配列の３’末端から４つのヌクレオチドが除去された配列番号２７２～２１００及び２２８６～２６７８９の配列を含む、実施形態１～８のいずれか１つに記載の組成物。

【0299】

実施形態１５．ｇＮＡの標的化配列が、配列の３’末端から５つのヌクレオチドが除去された配列番号２７２～２１００及び２２８６～２６７８９の配列を含む、実施形態１～８のいずれか１つに記載の組成物。

【0300】

実施形態１６．ｇＮＡの標的化配列が、ＢＣＬ１１Ａエキソンの配列に相補的である、実施形態１～１５のいずれか１つに記載の組成物。

【0301】

実施形態１７．ｇＮＡの標的化配列が、ＢＣＬ１１Ａエキソン１配列、ＢＣＬ１１Ａエキソン２配列、ＢＣＬ１１Ａエキソン３配列、ＢＣＬ１１Ａエキソン４配列、ＢＣＬ１１Ａエキソン５配列、ＢＣＬ１１Ａエキソン６配列、ＢＣＬ１１Ａエキソン７配列、ＢＣＬ１１Ａエキソン８配列、及びＢＣＬ１１Ａエキソン９配列からなる群から選択される配列に相補的である、実施形態１６に記載の組成物。

【0302】

実施形態１８．ｇＮＡの標的化配列が、ＢＣＬ１１Ａエキソン１配列、ＢＣＬ１１Ａエキソン２配列、及びＢＣＬ１１Ａエキソン３配列からなる群から選択される配列に相補的である、実施形態１７に記載の組成物。

【0303】

実施形態１９．ｇＮＡの標的化配列が、ＢＣＬ１１Ａ調節エレメントの配列に相補的である、実施形態１～１５のいずれか１つに記載の組成物。

【0304】

実施形態２０．ｇＮＡの標的化配列が、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子のプロモーターの配列に相補的である、実施形態１９に記載の組成物。

【0305】

実施形態２１．ｇＮＡの標的化配列が、エンハンサー調節エレメントの配列に相補的である、実施形態１９に記載の組成物。

【0306】

実施形態２２．ｇＮＡの標的化配列が、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子のＧＡＴＡ１赤血球特異的エンハンサー結合部位（ＧＡＴＡ１）を含む配列に相補的である、実施形態２１に記載の組成物。

【0307】

実施形態２３．ｇＮＡの標的化配列が、配列ＵＧＧＡＧＣＣＵＧＵＧＡＵＡＡＡＡＧＣＡ（配列番号２２）、又はそれと少なくとも９０％若しくは９５％の配列同一性を有する配列を有する、実施形態２２に記載の組成物。

【0308】

実施形態２４．ｇＮＡの標的化配列が、配列ＵＧＧＡＧＣＣＵＧＵＧＡＵＡＡＡＡＧＣＡ（配列番号２２）からなる、実施形態２２に記載の組成物。

【0309】

実施形態２５．ｇＮＡの標的化配列が、配列ＵＧＣＵＵＵＵＡＵＣＡＣＡＧＧＣＵＣＣＡ（配列番号２３）、又はそれと少なくとも９０％若しくは９５％の配列同一性を有する配列を有する、実施形態２１に記載の組成物。

【0310】

実施形態２６．ｇＮＡの標的化配列が、配列ＵＧＣＵＵＵＵＡＵＣＡＣＡＧＧＣＵＣＣＡ（配列番号２３）からなる、実施形態２１に記載の組成物。

【0311】

実施形態２７．第２のｇＮＡを更に含み、第２のｇＮＡが、第１のｇＮＡのｇＮＡの標的化配列と比較して、ＢＣＬ１１Ａ標的核酸の異なる部分又は重複する部分に相補的な標的化配列を有する、実施形態１～２６のいずれか１つに記載の組成物。

【0312】

実施形態２８．第２のｇＮＡの標的化配列が、ＧＡＴＡ１結合部位配列の５’側又は３’側にある標的核酸の配列に相補的である、実施形態２７に記載の組成物。

【0313】

実施形態２９．第２のｇＮＡが、第１のｇＮＡによって標的化される同じエキソンに相補的な標的化配列を有する、実施形態２７に記載の組成物。

【0314】

実施形態３０．第１のｇＮＡ又は第２のｇＮＡが、表１及び表２に示される配列番号４～１６及び２１０１～２２８５からなる群から選択される配列と少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％の配列同一性を有する配列を含む足場を有する、実施形態１～２９のいずれか１つに記載の組成物。

【0315】

実施形態３１．第１のｇＮＡ又は第２のｇＮＡが、配列番号２１０１～２２８５からなる群から選択される配列を含む足場を有する、実施形態１～３０のいずれか１つに記載の組成物。

【0316】

実施形態３２．第１のｇＮＡ又は第２のｇＮＡが、配列番号２１０１～２２８５からなる群から選択される配列からなる足場を有する、実施形態１～３０のいずれか１つに記載の組成物。

【0317】

実施形態３３．第１のｇＮＡ又は第２のｇＮＡの足場が、配列番号４～１６からなる群から選択される参照ｇＮＡ配列と比較して、少なくとも１つの改変を有する配列を含む、実施形態１～３０のいずれか１つに記載の組成物。

【0318】

実施形態３４．参照ｇＮＡの少なくとも１つの改変が、参照ｇＮＡ配列のヌクレオチドの少なくとも１つの置換、欠失、又は置換を含む、実施形態３３に記載の組成物。

【0319】

実施形態３５．第１のｇＮＡのバリアント又は第２のｇＮＡのバリアントが、ＵＧＧＡＧＣＣＵＧＵＧＡＵＡＡＡＡＧＣＡ（配列番号２２）の標的化配列を含む、実施形態１～３４のいずれか１つに記載の組成物。

【0320】

実施形態３６．第１のｇＮＡ又は第２のｇＮＡが、化学的に改変されている、実施形態１～３５のいずれか１つに記載の組成物。

【0321】

実施形態３７．クラス２ Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質が、配列番号１～３のいずれか１つの配列を有する参照ＣａｓＸタンパク質、表４に示される配列番号３６～９９若しくは１０１～１４８の配列、又はそれと少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、若しくは少なくとも約９５％、若しくは少なくとも約９５％、若しくは少なくとも約９６％、若しくは少なくとも約９７％、若しくは少なくとも約９８％、若しくは少なくとも約９９％の配列同一性を有する配列を有するＣａｓＸバリアントタンパク質である、実施形態１～３６のいずれか１つに記載の組成物。

【0322】

実施形態３８．クラス２ Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質が、配列番号３６～９９又は１０１～１４８の配列を有するＣａｓＸバリアントタンパク質である、実施形態３７に記載の組成物。

【0323】

実施形態３９．ＣａｓＸバリアントタンパク質が、配列番号３６～９９又は１０１～１４８の配列からなる、実施形態３７に記載の組成物。

【0324】

実施形態４０．ＣａｓＸバリアントタンパク質が、配列番号１～３から選択される配列を有する参照ＣａｓＸタンパク質と比較して、少なくとも１つの改変を含む、実施形態３７に記載の組成物。

【0325】

実施形態４１．少なくとも１つの改変が、参照ＣａｓＸタンパク質と比較して、ＣａｓＸバリアントタンパク質のドメインにおける少なくとも１つのアミノ酸置換、欠失、又は置換を含む、実施形態４０に記載の組成物。

【0326】

実施形態４２．ドメインが、非標的鎖結合（ＮＴＳＢ）ドメイン、標的鎖装填（ＴＳＬ）ドメイン、ヘリックスＩドメイン、ヘリックスＩＩドメイン、オリゴヌクレオチド結合ドメイン（ＯＢＤ）、及びＲｕｖＣ ＤＮＡ切断ドメインからなる群から選択される、実施形態４１に記載の組成物。

【0327】

実施形態４３．ＣａｓＸタンパク質が、１つ以上の核局在化シグナル（ＮＬＳ）を更に含む、実施形態３７～４２のいずれか１つに記載の組成物。

【0328】

実施形態４４．１つ以上のＮＬＳが、ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号１６８）、ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫ（配列番号１６９）、ＰＡＡＫＲＶＫＬＤ（配列番号１７０）、ＲＱＲＲＮＥＬＫＲＳＰ（配列番号１７１）、ＮＱＳＳＮＦＧＰＭＫＧＧＮＦＧＧＲＳＳＧＰＹＧＧＧＧＱＹＦＡＫＰＲＮＱＧＧＹ（配列番号１７２）、ＲＭＲＩＺＦＫＮＫＧＫＤＴＡＥＬＲＲＲＲＶＥＶＳＶＥＬＲＫＡＫＫＤＥＱＩＬＫＲＲＮＶ（配列番号１７３）、ＶＳＲＫＲＰＲＰ（配列番号１７４）、ＰＰＫＫＡＲＥＤ（配列番号１７５）、ＰＱＰＫＫＫＰＬ（配列番号１７６）、ＳＡＬＩＫＫＫＫＫＭＡＰ（配列番号１７７）、ＤＲＬＲＲ（配列番号１７８）、ＰＫＱＫＫＲＫ（配列番号１７９）、ＲＫＬＫＫＫＩＫＫＬ（配列番号１８０）、ＲＥＫＫＫＦＬＫＲＲ（配列番号１８１）、ＫＲＫＧＤＥＶＤＧＶＤＥＶＡＫＫＫＳＫＫ（配列番号１８２）、ＲＫＣＬＱＡＧＭＮＬＥＡＲＫＴＫＫ（配列番号１８３）、ＰＲＰＲＫＩＰＲ（配列番号１８４）、ＰＰＲＫＫＲＴＶＶ（配列番号１８５）、ＮＬＳＫＫＫＫＲＫＲＥＫ（配列番号１８６）、ＲＲＰＳＲＰＦＲＫＰ（配列番号１８７）、ＫＲＰＲＳＰＳＳ（配列番号１８８）、ＫＲＧＩＮＤＲＮＦＷＲＧＥＮＥＲＫＴＲ（配列番号１８９）、ＰＲＰＰＫＭＡＲＹＤＮ（配列番号１９０）、ＫＲＳＦＳＫＡＦ（配列番号１９１）、ＫＬＫＩＫＲＰＶＫ（配列番号１９２）、ＰＫＴＲＲＲＰＲＲＳＱＲＫＲＰＰＴ（配列番号２６７９２）、ＲＲＫＫＲＲＰＲＲＫＫＲＲ（配列番号１９６）、ＰＫＫＫＳＲＫＰＫＫＫＳＲＫ（配列番号１９７）、ＨＫＫＫＨＰＤＡＳＶＮＦＳＥＦＳＫ（配列番号１９８）、ＱＲＰＧＰＹＤＲＰＱＲＰＧＰＹＤＲＰ（配列番号１９９）、ＬＳＰＳＬＳＰＬＬＳＰＳＬＳＰＬ（配列番号２００）、ＲＧＫＧＧＫＧＬＧＫＧＧＡＫＲＨＲＫ（配列番号２０１）、ＰＫＲＧＲＧＲＰＫＲＧＲＧＲ（配列番号２０２）、ＭＳＲＲＲＫＡＮＰＴＫＬＳＥＮＡＫＫＬＡＫＥＶＥＮ（配列番号１９４）、ＰＫＫＫＲＫＶＰＰＰＰＡＡＫＲＶＫＬＤ（配列番号１９３）、及びＰＫＫＫＲＫＶＰＰＰＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号２０４）からなる配列の群から選択される、実施形態４３に記載の組成物。

【0329】

実施形態４５．１つ以上のＮＬＳが、ＣａｓＸタンパク質のＣ末端又はその近傍で発現される、実施形態４３又は実施形態４４に記載の組成物。

【0330】

実施形態４６．１つ以上のＮＬＳが、ＣａｓＸタンパク質のＮ末端又はその近傍で発現される、実施形態４３又は実施形態４４に記載の組成物。

【0331】

実施形態４７．ＣａｓＸタンパク質のＮ末端又はその近傍及びＣ末端又はその近傍に位置する１つ以上のＮＬＳを含む、実施形態４３又は実施形態４４に記載の組成物。

【0332】

実施形態４８．ＣａｓＸバリアントが、ガイド核酸（ｇＮＡ）とリボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）を形成することができる、実施形態３７～４７のいずれか１つに記載の組成物。

【0333】

実施形態４９．ＣａｓＸバリアントタンパク質及びｇＮＡバリアントのＲＮＰが、配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の参照ＣａｓＸタンパク質及び配列番号４～１６の配列を含むｇＮＡのＲＮＰと比較して、少なくとも１つ以上の改善された特徴を示す、実施形態４８に記載の組成物。

【0334】

実施形態５０．改善された特徴が、ＣａｓＸバリアントのフォールディングの改善、ガイド核酸（ｇＮＡ）に対する結合親和性の改善、標的ＤＮＡに対する結合親和性の改善、標的ＤＮＡの編集において、ＡＴＣ、ＣＴＣ、ＧＴＣ、又はＴＴＣを含む１つ以上のより広範囲のＰＡＭ配列を利用する能力の改善、当該標的ＤＮＡの巻き戻しの改善、編集活性の増加、編集効率の改善、編集特異性の改善、ヌクレアーゼ活性の増加、二本鎖切断のための標的鎖装填の増加、一本鎖ニッキングのための標的鎖装填の減少、オフターゲット切断の減少、非標的ＤＮＡ鎖の結合の改善、タンパク質安定性の改善、タンパク質溶解度の改善、タンパク質：ｇＮＡ複合体（ＲＮＰ）の安定性の改善、タンパク質：ｇＮＡ複合体の溶解度の改善、タンパク質収量の改善、タンパク質発現の改善、及び融合体特徴の改善、からなる群の１つ以上から選択される、実施形態４９に記載の組成物。

【0335】

実施形態５１．ＣａｓＸバリアントタンパク質及びｇＮＡバリアントのＲＮＰの改善された特徴が、配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の参照ＣａｓＸタンパク質及び配列番号４～１６の配列を含むｇＮＡのＲＮＰと比較して、少なくとも約１．１～約１００倍又はそれ以上改善されている、実施形態４９又は実施形態５０に記載の組成物。

【0336】

実施形態５２．ＣａｓＸバリアントタンパク質の改善された特徴が、配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の参照ＣａｓＸタンパク質及び配列番号４～１６の配列を含むｇＮＡと比較して、少なくとも約１．１倍、少なくとも約２倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１００倍、又はそれ以上改善されている、実施形態４９又は実施形態５０に記載の組成物。

【0337】

実施形態５３．改善された特徴が、編集効率を含み、ＣａｓＸバリアントタンパク質及びｇＮＡバリアントのＲＮＰが、配列番号２の参照ＣａｓＸタンパク質及び配列番号４～１６のｇＮＡのＲＮＰと比較して、編集効率の１．１～１００倍の改善を含む、実施形態４９～５２のいずれか１つに記載の組成物。

【0338】

実施形態５４．ＰＡＭ配列ＴＴＣ、ＡＴＣ、ＧＴＣ、又はＣＴＣのいずれか１つが、細胞アッセイシステムにおいてｇＮＡの標的化配列と同一性を有するプロトスペーサーの非標的鎖に対して１ヌクレオチド５’側に位置する場合、ＣａｓＸバリアント及びｇＮＡバリアントを含むＲＮＰが、比較アッセイシステムにおける参照ＣａｓＸタンパク質及び参照ｇＮＡを含むＲＮＰの編集効率及び／又は結合と比較して、標的ＤＮＡにおけるより高い編集効率及び／又は標的配列の結合を示す、実施形態４８～５３のいずれか１つに記載の組成物。

【0339】

実施形態５５．ＰＡＭ配列が、ＴＴＣである、実施形態５４に記載の組成物。

【0340】

実施形態５６．ＰＡＭ配列が、ＡＴＣである、実施形態５４に記載の組成物。

【0341】

実施形態５７．ＰＡＭ配列が、ＣＴＣである、実施形態５４に記載の組成物。

【0342】

実施形態５８．ＰＡＭ配列が、ＧＴＣである、実施形態５４に記載の組成物。

【0343】

実施形態５９．１つ以上のＰＡＭ配列に対する増加した結合親和性が、配列番号１～３のＣａｓＸタンパク質のいずれか１つのＰＡＭ配列に対する結合親和性と比較して、少なくとも１．５倍大きい、実施形態５４～５８のいずれか１つに記載の組成物。

【0344】

実施形態６０．ＲＮＰが、参照ＣａｓＸ及び配列番号４～１６のｇＮＡのＲＮＰと比較して、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、又は少なくとも２０％高い百分率割合の切断コンピテントＲＮＰを有する、実施形態４８～５９のいずれか１つに記載の組成物。

【0345】

実施形態６１．ＣａｓＸバリアントタンパク質が、ニッカーゼ活性を有するＲｕｖＣ ＤＮＡ切断ドメインを含む、実施形態３７～６０のいずれか１つに記載の組成物。

【0346】

実施形態６２．ＣａｓＸバリアントタンパク質が、二本鎖切断活性を有するＲｕｖＣ ＤＮＡ切断ドメインを含む、実施形態３７～６０のいずれか１つに記載の組成物。

【0347】

実施形態６３．ＣａｓＸタンパクが、触媒的に不活性なＣａｓＸ（ｄＣａｓＸ）タンパク質であり、ｄＣａｓＸ及びｇＮＡが、ＢＣＬ１１Ａ標的核酸への結合能を保持している、実施形態１～４８のいずれか１つに記載の組成物。

【0348】

実施形態６４．ｄＣａｓＸが、残基：
ａ．配列番号１のＣａｓＸタンパク質に対応するＤ６７２、Ｅ７６９、及び／若しくはＤ９３５、又は
ｂ．配列番号２のＣａｓＸタンパク質に対応するＤ６５９、Ｅ７５６、及び／若しくはＤ９２２、に変異を含む、実施形態６３に記載の組成物。

【0349】

実施形態６５．変異が、残基のアラニンへの置換である、実施形態６４に記載の組成物。

【0350】

実施形態６６．ドナー鋳型核酸を更に含む、実施形態１～６２のいずれか１つに記載の組成物。

【0351】

実施形態６７．ドナー鋳型が、ＢＣＬ１１Ａエキソン、ＢＣＬ１１Ａイントロン、ＢＣＬ１１Ａイントロン－エキソン接合部、ＢＣＬ１１Ａ調節エレメント、及びＧＡＴＡ１結合部位配列からなる群から選択されるＢＣＬ１１Ａ遺伝子の少なくとも一部を含む核酸を含む、実施形態６６に記載の組成物。

【0352】

実施形態６８．ドナー鋳型の配列が、野生型ＢＣＬ１１Ａ遺伝子の対応する部分と比較して、１つ以上の変異を含む、実施形態６７に記載の組成物。

【0353】

実施形態６９．ドナー鋳型が、ＢＣＬ１１Ａエキソン１、ＢＣＬ１１Ａエキソン２、ＢＣＬ１１Ａエキソン３、ＢＣＬ１１Ａエキソン４、ＢＣＬ１１Ａエキソン５、ＢＣＬ１１Ａエキソン６、ＢＣＬ１１Ａエキソン７、ＢＣＬ１１Ａエキソン８、及びＢＣＬ１１Ａエキソン９からなる群から選択されるＢＣＬ１１Ａエキソンの少なくとも一部を含む核酸を含む、実施形態６７又は実施形態６８に記載の組成物。

【0354】

実施形態７０．ドナー鋳型が、ＢＣＬ１１Ａエキソン１、ＢＣＬ１１Ａエキソン２、及びＢＣＬ１１Ａエキソン３からなる群から選択されるＢＣＬ１１Ａエキソンの少なくとも一部を含む核酸を含む、実施形態６９に記載の組成物。

【0355】

実施形態７１．ドナー鋳型のサイズが、１０～１５，０００ヌクレオチドの範囲である、実施形態６６～７０のいずれか１つに記載の組成物。

【0356】

実施形態７２．ドナー鋳型が、一本鎖ＤＮＡ鋳型又は一本鎖ＲＮＡ鋳型である、実施形態６６～７１のいずれか１つに記載の組成物。

【0357】

実施形態７３．ドナー鋳型が、二本鎖ＤＮＡ鋳型である、実施形態６６～７１のいずれか１つに記載の組成物。

【0358】

実施形態７４．ドナー鋳型が、クラス２ Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質によって導入されるＢＣＬ１１Ａ標的核酸における切断部位に隣接する配列に相補的である相同アームを、ドナー鋳型の５’末端及び３’末端又はその近傍に含む、実施形態６６～７３のいずれか１つに記載の組成物。

【0359】

実施形態７５．実施形態６６～７４のいずれか１つに記載のドナー鋳型を含む、核酸。

【0360】

実施形態７６．実施形態３７～６５のいずれか１つに記載のＣａｓＸをコードする配列を含む、核酸。

【0361】

実施形態７７．実施形態１～３６のいずれか１つに記載のｇＮＡをコードする配列を含む、核酸。

【0362】

実施形態７８．ＣａｓＸタンパク質をコードする配列が、真核細胞における発現のためにコドン最適化されている、実施形態７６に記載の核酸。

【0363】

実施形態７９．実施形態１～３６のいずれか１つに記載のｇＮＡ、実施形態３７～６５のいずれか１つに記載のＣａｓＸタンパク質、又は実施形態７５～７８のいずれか１つに記載の核酸を含む、ベクター。

【0364】

実施形態プロモーターを更に含む、実施形態７９に記載のベクター。

【0365】

実施形態８１．ベクターが、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ベクター、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）、プラスミド、ミニサークル、ナノプラスミド、ＤＮＡベクター、及びＲＮＡベクターからなる群から選択される、実施形態７９又は８実施形態０に記載のベクター。

【0366】

実施形態８２．ベクターが、ＡＡＶベクターである、実施形態８１に記載のベクター。

【0367】

実施形態８３．ＡＡＶベクターが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ－Ｒｈ７４、又はＡＡＶＲｈ１０から選択される、実施形態８２に記載のベクター。

【0368】

実施形態８４．ベクターが、レトロウイルスベクターである、実施形態８１に記載のベクター。

【0369】

実施形態８５．ベクターが、ｇａｇポリタンパク質の１つ以上の成分を含むＶＬＰである、実施形態８１に記載のベクター。

【0370】

実施形態８６．ｇａｇポリタンパク質の１つ以上の成分が、マトリックスタンパク質（ＭＡ）、ヌクレオカプシドタンパク質（ＮＣ）、カプシドタンパク質（ＣＡ）、及びｐ１～ｐ６タンパク質からなる群から選択される、実施形態８５に記載のベクター。

【0371】

実施形態８７．ＣａｓＸタンパク質及びｇＮＡを含む、実施形態８５又は実施形態８６に記載のベクター。

【0372】

実施形態８８．ＣａｓＸタンパク質及びｇＮＡが、ＲＮＰ中で一緒に会合している、実施形態８７に記載のベクター。

【0373】

実施形態８９．標的細胞へのＶＬＰの結合及び融合を提供する偽型ウイルスエンベロープ糖タンパク質又は抗体断片を更に含む、実施形態８５～８８のいずれか１つに記載のＶＬＰ。

【0374】

実施形態９０．標的細胞が、造血幹細胞（ＨＳＣ）、造血前駆細胞（ＨＰＣ）、ＣＤ３４＋細胞、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、胚性幹細胞（ＥＳ）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、骨髄系共通前駆細胞、前赤芽球細胞、及び赤芽球細胞からなる群から選択される、実施形態８９の実施形態に記載のＶＬＰ。

【0375】

実施形態９１．ドナー鋳型を更に含む、実施形態８５～９０のいずれか１つに記載のベクター。

【0376】

実施形態９２．実施形態７９～９１のいずれか１つに記載のベクターを含む、宿主細胞。

【0377】

実施形態９３．宿主細胞が、ＢＨＫ、ＨＥＫ２９３、ＨＥＫ２９３Ｔ、ＮＳ０、ＳＰ２／０、ＹＯ骨髄腫細胞、Ｐ３Ｘ６３マウス骨髄腫細胞、ＰＥＲ、ＰＥＲ．Ｃ６、ＮＩＨ３Ｔ３、ＣＯＳ、ＨｅＬａ、ＣＨＯ、及び酵母細胞からなる群から選択される、実施形態９２の宿主細胞。

【0378】

実施形態９４．細胞集団においてＢＣＬ１１Ａ標的核酸配列を改変する方法であって、細胞集団に、
ａ．実施形態１～７４のいずれか１つに記載の組成物、
ｂ．実施形態７５～７８のいずれか１つに記載の核酸、
ｃ．実施形態７９～８４のいずれか１つに記載のベクター、
ｄ．実施形態８５～９１のいずれか１つに記載のＶＬＰ、又は
ｅ．（ａ）～（ｄ）のうちの２つ以上の組み合わせ、を導入することを含み、
第１のｇＮＡによって標的化される細胞のＢＣＬ１１Ａ遺伝子の標的核酸配列が、ＣａｓＸタンパク質によって改変される、方法。

【0379】

実施形態９５．改変することが、細胞集団のＢＣＬ１１Ａ遺伝子の標的核酸配列に一本鎖切断を導入することを含む、実施形態９４に記載の方法。

【0380】

実施形態９６．改変することが、細胞集団のＢＣＬ１１Ａ遺伝子の標的核酸配列に二本鎖切断を導入することを含む、実施形態９４に記載の方法。

【0381】

実施形態９７．第２のｇＮＡ又は第２のｇＮＡをコードする核酸を細胞集団に導入することを更に含み、第２のｇＮＡが、第１のｇＮＡと比較して、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子の標的核酸の異なる部分又は重複する部分に相補的な標的化配列を有し、細胞集団のＢＣＬ１１Ａ標的核酸における更なる切断をもたらす、実施形態９４～９６のいずれか１つに記載の方法。

【0382】

実施形態９８．改変することが、細胞集団のＢＣＬ１１Ａ遺伝子において１つ以上のヌクレオチドの挿入、欠失、置換、重複、又は逆位を導入することを含む、実施形態９４～９７のいずれか１つに記載の方法。

【0383】

実施形態９９．標的核酸のＧＡＴＡ１結合部位配列が改変される、実施形態９４～９８に記載の方法。

【0384】

実施形態１００．方法が、細胞集団のＢＣＬ１１Ａ遺伝子の標的核酸配列の切断部位へのドナー鋳型の挿入を含む、実施形態９４～９７のいずれか１つに記載の方法。

【0385】

実施形態１０１．ドナー鋳型の挿入が、相同組換え修復（ＨＤＲ）又は相同性非依存性標的化組み込み（ＨＩＴＩ）によって媒介される、実施形態９８に記載の方法。

【0386】

実施形態１０２．標的核酸のＧＡＴＡ１結合部位配列が改変される、実施形態１００又は実施形態１０１に記載の方法。

【0387】

実施形態１０３．ドナー鋳型の挿入が、細胞集団におけるＢＣＬ１１Ａ遺伝子のノックダウン又はノックアウトをもたらす、実施形態１００～１０２のいずれか１つに記載の方法。

【0388】

実施形態１０４．ＢＣＬ１１Ａタンパク質の発現が、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子が改変されていない細胞と比較して、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、又は少なくとも約９０％減少するように、細胞集団のＢＣＬ１１Ａ遺伝子が改変される、実施形態９４～１０３のいずれか１つに記載の方法。

【0389】

実施形態１０５．細胞の少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、又は少なくとも約９０％が検出可能なレベルのＢＣＬ１１Ａタンパク質を発現しないように、細胞集団のＢＣＬ１１Ａ遺伝子が改変される、実施形態９４～１０３のいずれか１つに記載の方法。

【0390】

実施形態１０６．細胞が、真核細胞である、実施形態９４～１０５のいずれか１つに記載の方法。

【0391】

実施形態１０７．真核細胞が、げっ歯類細胞、マウス細胞、ラット細胞、及び非ヒト霊長類細胞からなる群から選択される、実施形態１０６に記載の方法。

【0392】

実施形態１０８．真核細胞が、ヒト細胞である、実施形態１０６に記載の方法。

【0393】

実施形態１０９．真核細胞が、造血幹細胞（ＨＳＣ）、造血前駆細胞（ＨＰＣ）、ＣＤ３４＋細胞、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、骨髄系共通前駆細胞、前赤芽球細胞、及び赤芽球細胞からなる群から選択される、実施形態１０６～１０８のいずれか１つに記載の方法。

【0394】

実施形態１１０．細胞集団のＢＣＬ１１Ａ遺伝子の標的核酸配列の改変が、インビトロ又はエクスビボで起こる、実施形態９４～１０９のいずれか１つに記載の方法。

【0395】

実施形態１１１．細胞集団のＢＣＬ１１Ａ遺伝子の標的核酸配列の改変が、対象においてインビボで起こる、実施形態９４～１０９のいずれか１つに記載の方法。

【0396】

実施形態１１２．対象が、げっ歯類、マウス、ラット、及び非ヒト霊長類からなる群から選択される、実施形態１１１に記載の方法。

【0397】

実施形態１１３．対象が、ヒトである、実施形態１１１に記載の方法。

【0398】

実施形態１１４．方法が、対象に治療有効用量のＡＡＶベクターを投与することを含む、実施形態１１１～１１３のいずれか１つに記載の方法。

【0399】

実施形態１１５．ＡＡＶベクターが、少なくとも約１×１０^５ベクターゲノム／ｋｇ（ｖｇ／ｋｇ）、少なくとも約１×１０^６ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０^７ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０^８ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０^９ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０^１０ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０^１１ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０^１５ｖｇ／ｋｇ、又は少なくとも約１×１０^１６ｖｇ／ｋｇの用量で対象に投与される、実施形態１１４に記載の方法。

【0400】

実施形態１１６．ＡＡＶベクターが、少なくとも約１×１０^５ｖｇ／ｋｇ～約１×１０^１６ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０^６ｖｇ／ｋｇ～約１×１０^１５ｖｇ／ｋｇ、又は少なくとも約１×１０^７ｖｇ／ｋｇ～約１×１０^１４ｖｇ／ｋｇの用量で対象に投与される、実施形態１１４に記載の方法。

【0401】

実施形態１１７．方法が、治療有効用量のＶＬＰを対象に投与することを含む、実施形態１１１～１１３のいずれか１つに記載に記載の方法。

【0402】

実施形態１１８．ＶＬＰが、少なくとも約１×１０^５粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０^６粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０^７粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０^８粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０^９粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０^１０粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０^１１粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０^１２粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０^１３粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０^１４粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０^１５粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０^１６粒子／ｋｇの用量で対象に投与される、実施形態１１７に記載の方法。

【0403】

実施形態１１９．ＶＬＰが、少なくとも約１×１０^５粒子／ｋｇ～約１×１０^１６粒子／ｋｇ、又は少なくとも約１×１０^６粒子／ｋｇ～約１×１０^１５粒子／ｋｇ、又は少なくとも約１×１０^７粒子／ｋｇ～約１×１０^１４粒子／ｋｇの用量で対象に投与される、実施形態１１７に記載の方法。

【0404】

実施形態１２０．ベクター又はＶＬＰが、移植、局所注射、全身注入、又はそれらの組み合わせから選択される投与経路によって対象に投与される、実施形態１１２～１１９のいずれか１つに記載の方法。

【0405】

実施形態１２１．細胞集団のＢＣＬ１１Ａ遺伝子の標的核酸配列を、
ａ．第１のｇＮＡと比較して、ＢＣＬ１１Ａ標的核酸の異なる部分若しくは重複する部分を標的化する追加のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ及びｇＮＡ、
ｂ．（ａ）の追加のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ及びｇＮＡをコードするポリヌクレオチド、
ｃ．（ｂ）のポリヌクレオチドを含むベクター、又は
ｄ．（ａ）の追加のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ及びｇＮＡを含むＶＬＰ、と接触させることを更に含み、
接触させることが、第１のｇＮＡによって標的化される配列と比較して、配列における異なる位置でＢＣＬ１１Ａ遺伝子の改変をもたらす、実施形態９４～１２０のいずれか１つに記載の方法。

【0406】

実施形態１２２．追加のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼが、実施形態１～１２１のいずれか１つに記載のＣａｓＸタンパク質とは異なる配列を有するＣａｓＸタンパク質である、実施形態１２１に記載の方法。

【0407】

実施形態１２３．追加のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼが、ＣａｓＸタンパク質ではない、実施形態１２１に記載の方法。

【0408】

実施形態１２４．追加のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼが、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｃ、Ｃａｓ１２ｄ（ＣａｓＹ）、Ｃａｓ１２Ｊ、Ｃａｓ１３ａ、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃ、Ｃａｓ１３ｄ、ＣａｓＸ、ＣａｓＹ、Ｃａｓ１４、Ｃｐｆｌ、Ｃ２ｃｌ、Ｃｓｎ２、及びそれらの配列バリアントからなる群から選択される、実施形態１２３に記載の方法。

【0409】

実施形態１２５．実施形態９４～１２４のいずれか１つに記載の方法によって改変された細胞集団であって、改変された細胞の少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％が検出可能なレベルのＢＣＬ１１Ａタンパク質を発現しないように、細胞が改変されている、細胞集団。

【0410】

実施形態１２６．ＢＣＬ１１Ａタンパク質の発現が、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子が改変されていない細胞と比較して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％減少するように、細胞が改変されている、実施形態９４～１２４のいずれか１つに記載の方法によって改変された細胞集団。

【0411】

実施形態１２７．異常ヘモグロビン症の治療を必要とする対象においてそれを行う方法であって、治療有効量の実施形態１２５又は実施形態１２６に記載の細胞を対象に投与することを含む、方法。

【0412】

実施形態１２８．異常ヘモグロビン症が、鎌状赤血球症又はβサラセミアである、実施形態１２７に記載の方法。

【0413】

実施形態１２９．細胞が、細胞を投与される対象に対して自己由来である、実施形態１２７又は実施形態１２８のいずれか１つに記載の方法。

【0414】

実施形態１３０．細胞が、細胞を投与される対象に対して同種である、実施形態１２７又は実施形態１２８のいずれか１つに記載の方法。

【0415】

実施形態１３１．細胞又はその子孫が、対象への改変された細胞の投与後、対象において、少なくとも１ヶ月間、２ヶ月間、３ヶ月間、４ヶ月間、５ヶ月間、６ヶ月間、７ヶ月間、８ヶ月間、９ヶ月間、１０ヶ月間、１１ヶ月間、１２ヶ月間、１３ヶ月間、１４ヶ月間、１５ヶ月間、１６ヶ月間、１７ヶ月間、１８ヶ月間、１９ヶ月間、２０ヶ月間、２１ヶ月間、２２ヶ月間、２３ヶ月間、２年間、３年間、４年間、又は５年間存続する、実施形態１２７～１３０のいずれか１つに記載の方法。

【0416】

実施形態１３２．方法が、治療前の対象におけるヘモグロビンＦ（ＨｂＦ）のレベルと比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、又は少なくとも約５０％の循環血液中のＨｂＦのレベルの増加をもたらす、実施形態１２７～１３１のいずれか１つに記載の方法。

【0417】

実施形態１３３．方法が、少なくとも０．０１：１．０、少なくとも０．０２５：１．０、少なくとも０．０５：１．０、少なくとも０．０７５：１．０、少なくとも０．１：１．０、少なくとも０．２：１．０、少なくとも０．３：１．０、少なくとも０．４：１．０、少なくとも０．５：１：０、少なくとも０．７５：１．０、少なくとも１．０：１．０、少なくとも１．２５：１．０、少なくとも１．５：１．０、又は少なくとも１．７５：１．０の対象におけるＨｂＦ対ヘモグロビンＳ（ＨｂＳ）の比をもたらす、実施形態１２７～１３１のいずれか１つに記載の方法。

【0418】

実施形態１３４．方法が、対象における総循環ヘモグロビンの少なくとも約５％、又は少なくとも約１０％、又は少なくとも約２０％、又は少なくとも約３０％のＨｂＦレベルをもたらす、実施形態１２７～１３１のいずれか１つに記載の方法。

【0419】

実施形態１３５．対象が、げっ歯類、マウス、ラット、及び非ヒト霊長類からなる群から選択される、実施形態１２７～１３４のいずれか１つに記載の方法。

【0420】

実施形態１３６．対象が、ヒトである、実施形態１２７～１３４のいずれか１つに記載の方法。

【0421】

実施形態１３７．異常ヘモグロビン症の治療を必要とする対象においてそれを行う方法であって、対象の細胞においてＢＣＬ１１Ａ遺伝子を改変することを含み、改変することが、当該細胞を、治療有効用量の
ａ．実施形態１～７４のいずれか１つに記載の組成物、
ｂ．実施形態７５～７８のいずれか１つに記載の核酸、
ｃ．実施形態７９～８４のいずれか１つに記載のベクター、
ｄ．実施形態８５～８８のいずれか１つに記載のＶＬＰ、又は
ｅ．（ａ）～（ｄ）のうちの２つ以上の組み合わせ、と接触させることを含み、
第１のｇＮＡによって標的化される細胞のＢＣＬ１１Ａ遺伝子が、ＣａｓＸタンパク質によって改変される、方法。

【0422】

実施形態１３８．異常ヘモグロビン症が、鎌状赤血球症又はβサラセミアである、実施形態１３７に記載の方法。

【0423】

実施形態１３９．細胞が、造血幹細胞（ＨＳＣ）、造血前駆細胞（ＨＰＣ）、ＣＤ３４＋細胞、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、骨髄系共通前駆細胞、前赤芽球細胞、及び赤芽球細胞からなる群から選択される、実施形態１３７又は実施形態１３８のいずれか１つに記載の方法。

【0424】

実施形態１４０．改変することが、細胞のＢＣＬ１１Ａ遺伝子において一本鎖切断を導入することを含む、実施形態１３７～１３９のいずれか１つに記載の方法。

【0425】

実施形態１４１．改変することが、細胞のＢＣＬ１１Ａ遺伝子において二本鎖切断を導入することを含む、実施形態１３７～１３９のいずれか１つに記載の方法。

【0426】

実施形態１４２．第２のｇＮＡ又は第２のｇＮＡをコードする核酸を対象の細胞に導入することを更に含み、第２のｇＮＡが、第１のｇＮＡと比較して、標的核酸の異なる部分又は重複する部分に相補的な標的化配列を有し、対象の細胞のＢＣＬ１１Ａ標的核酸における更なる切断をもたらす、実施形態１３７～１４１のいずれか１つに記載の方法。

【0427】

実施形態１４３．改変することが、細胞のＢＣＬ１１Ａ遺伝子において１つ以上のヌクレオチドの挿入、欠失、置換、重複、又は逆位を導入することを含む、実施形態１３７～１４２のいずれか１つに記載の方法。

【0428】

実施形態１４４．改変することが、対象の改変された細胞におけるＢＣＬ１１Ａ遺伝子のノックダウン又はノックアウトをもたらす、実施形態１４３記載の方法。

【0429】

実施形態１４５．改変された細胞によるＢＣＬ１１Ａタンパク質の発現が、改変されていない細胞と比較して、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、又は少なくとも約９０％減少するように、細胞のＢＣＬ１１Ａ遺伝子が改変される、実施形態１３７～１４４のいずれか１つに記載の方法。

【0430】

実施形態１４６．改変された細胞の少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％が検出可能なレベルのＢＣＬ１１Ａタンパク質を発現しないように、対象の細胞のＢＣＬ１１Ａ遺伝子が改変される、実施形態１３７～１４４のいずれか１つに記載の方法。

【0431】

実施形態１４７．方法が、治療前の対象におけるヘモグロビンＦ（ＨｂＦ）のレベルと比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、又は少なくとも約５０％の対象の循環血液中のＨｂＦのレベルの増加をもたらす、実施形態１３７～１４６のいずれか１つに記載の方法。

【0432】

実施形態１４８．方法が、少なくとも０．０１：１．０、少なくとも０．０２５：１．０、少なくとも０．０５：１．０、少なくとも０．０７５：１．０、少なくとも０．１：１．０、少なくとも０．２：１．０、少なくとも０．３：１．０、少なくとも０．４：１．０、少なくとも０．５：１：０、少なくとも０．７５：１．０、少なくとも１．０：１．０、少なくとも１．２５：１．０、少なくとも１．５：１．０、又は少なくとも１．７５：１．０の対象の循環血液中のＨｂＦ対ヘモグロビンＳ（ＨｂＳ）の比をもたらす、実施形態１３７～１４７のいずれか１つに記載の方法。

【0433】

実施形態１４９．方法が、対象の循環血液中の総ヘモグロビンの少なくとも約５％、又は少なくとも約１０％、又は少なくとも約２０％、又は少なくとも約３０％のＨｂＦレベルをもたらす、実施形態１３７～１４６のいずれか１つに記載の方法。

【0434】

実施形態１５０．方法が、細胞のＢＣＬ１１Ａ遺伝子の標的核酸配列の切断部位へのドナー鋳型の挿入を含む、実施形態１３７～１４２のいずれか１つに記載の方法。

【0435】

実施形態１５１．ドナー鋳型の挿入が、相同組換え修復（ＨＤＲ）又は相同性非依存性標的化組み込み（ＨＩＴＩ）によって媒介される、実施形態１４９に記載の方法。

【0436】

実施形態１５２．ドナー鋳型の挿入が、対象の改変された細胞においてＢＣＬ１１Ａ遺伝子のノックダウン又はノックアウトをもたらす、実施形態１４９又は実施形態１５１に記載の方法。

【0437】

実施形態１５３．改変された細胞によるＢＣＬ１１Ａタンパク質の発現が、改変されていない細胞と比較して、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、又は少なくとも約９０％減少するように、細胞のＢＣＬ１１Ａ遺伝子が改変される、実施形態１４７～１５２のいずれか１つに記載の方法。

【0438】

実施形態１５４．改変された細胞の少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％が検出可能なレベルのＢＣＬ１１Ａタンパク質を発現しないように、対象の細胞のＢＣＬ１１Ａ遺伝子が改変される、実施形態１４７～１５２のいずれか１つに記載の方法。

【0439】

実施形態１５５．方法が、治療前の対象におけるヘモグロビンＦ（ＨｂＦ）のレベルと比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、又は少なくとも約５０％の対象の循環血液中のＨｂＦのレベルの増加をもたらす、実施形態１４７～１５４のいずれか１つに記載の方法。

【0440】

実施形態１５６．方法が、少なくとも０．０１：１．０、少なくとも０．０２５：１．０、少なくとも０．０５：１．０、少なくとも０．０７５：１．０、少なくとも０．１：１．０、少なくとも０．２：１．０、少なくとも０．３：１．０、少なくとも０．４：１．０、少なくとも０．５：１：０、少なくとも０．７５：１．０、少なくとも１．０：１．０、少なくとも１．２５：１．０、少なくとも１．５：１．０、又は少なくとも１．７５：１．０の対象の循環血液中のＨｂＦ対ヘモグロビンＳ（ＨｂＳ）の比をもたらす、実施形態１４７～１５４のいずれか１つに記載の方法。

【0441】

実施形態１５７．方法が、対象の循環血液中の総ヘモグロビンの少なくとも約５％、又は少なくとも約１０％、又は少なくとも約２０％、又は少なくとも約３０％のＨｂＦレベルをもたらす、実施形態１４７～１５４のいずれか１つに記載の方法。

【0442】

実施形態１５８．対象が、げっ歯類、マウス、ラット、及び非ヒト霊長類からなる群から選択される、実施形態１３７～１５６のいずれか１つに記載の方法。

【0443】

実施形態１５９．対象が、ヒトである、実施形態１３７～１５６のいずれか１つに記載の方法。

【0444】

実施形態１６０．ベクターが、ＡＡＶであり、少なくとも約１×１０^５ベクターゲノム／ｋｇ（ｖｇ／ｋｇ）、少なくとも約１×１０^６ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０^７ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０^８ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０^９ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０^１０ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０^１１ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０^１５ｖｇ／ｋｇ、又は少なくとも約１×１０^１６ｖｇ／ｋｇの用量で対象に投与される、実施形態１３７～１５９のいずれか１つに記載の方法。

【0445】

実施形態１６１．ベクターが、ＡＡＶであり、少なくとも約１×１０^５ｖｇ／ｋｇ～約１×１０^１６ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０^６ｖｇ／ｋｇ～約１×１０^１５ｖｇ／ｋｇ、又は少なくとも約１×１０^７ｖｇ／ｋｇ～約１×１０^１４ｖｇ／ｋｇの用量で対象に投与される、実施形態１３７～１５９のいずれか１つに記載の方法。

【0446】

実施形態１６２．ＶＬＰが、少なくとも約１×１０^５粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０^６粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０^７粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０^８粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０^９粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０^１０粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０^１１粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０^１２粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０^１３粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０^１４粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０^１５粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０^１６粒子／ｋｇの用量で対象に投与される、実施形態１３７～１５９のいずれか１つに記載の方法。

【0447】

実施形態１６３．ＶＬＰが、少なくとも約１×１０^５粒子／ｋｇ～約１×１０^１６粒子／ｋｇ、又は少なくとも約１×１０^６粒子／ｋｇ～約１×１０^１５粒子／ｋｇ、又は少なくとも約１×１０^７粒子／ｋｇ～約１×１０^１４粒子／ｋｇの用量で対象に投与される、実施形態１３７～１５９のいずれか１つに記載の方法。

【0448】

実施形態１６４．ベクター又はＶＬＰが、移植、局所注射、全身注入、又はそれらの組み合わせから選択される投与経路によって対象に投与される、実施形態１３７～１６３のいずれか１つに記載の方法。

【0449】

実施形態１６５．方法が、対象における少なくとも１つの臨床的に関連するエンドポイントの改善をもたらす、実施形態１３７～１６４のいずれか１つに記載の方法。

【0450】

実施形態１６６．方法が、末端臓器疾患の発生、アルブミン尿、高血圧、衰弱状態、低張尿、拡張機能障害、機能的な運動能力、急性冠症候群、疼痛事象、疼痛重篤度、貧血症、溶血、組織低酸素症、臓器機能障害、異常なヘマトクリット値、小児死亡率、脳卒中の発生率、ベースラインと比較したヘモグロビンレベル、ＨｂＦレベル、肺塞栓症の発生率の低下、血管閉塞危機の発生率、赤血球中のヘモグロビンＳの濃度、入院率、肝臓鉄濃度、必要な輸血、及び生活の質スコアからなる群から選択される少なくとも１つの臨床的に関連するパラメータの改善をもたらす、実施形態１６５に記載の方法。

【0451】

実施形態１６７．方法が、末端臓器疾患の発生、アルブミン尿、高血圧、衰弱状態、低張尿、拡張機能障害、機能的な運動能力、急性冠症候群、疼痛事象、疼痛重篤度、貧血症、溶血、組織低酸素症、臓器機能障害、異常なヘマトクリット値、小児死亡率、脳卒中の発生率、ベースラインと比較したヘモグロビンレベル、ＨｂＦレベル、肺塞栓症の発生率の低下、血管閉塞危機の発生率、赤血球中のヘモグロビンＳの濃度、入院率、肝臓鉄濃度、必要な輸血、及び生活の質スコアからなる群から選択される少なくとも２つの臨床的に関連するパラメータの改善をもたらす、実施形態１６５に記載の方法。

【0452】

実施形態１６８．異常ヘモグロビン症を有する対象を治療するための方法であって、
ａ．対象から人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）又は造血幹細胞（ＨＳＣ）を単離することと、
ｂ．実施形態９４～１１０のいずれか１つに記載の方法によって、ｉＰＳＣ又はＨＳＣのＢＣＬ１１Ａ標的核酸を改変することと、
ｃ．改変されたｉＰＳＣ又はＨＳＣを造血前駆細胞に分化させることと、
ｄ．異常ヘモグロビン症を有する対象に造血前駆細胞を移植することと、を含み、
方法が、治療前の対象におけるヘモグロビンＦ（ＨｂＦ）のレベルと比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、又は少なくとも約５０％の対象の循環血液中のＨｂＦのレベルの増加をもたらす、方法。

【0453】

実施形態１６９．ｉＰＳＣ又はＨＳＣが、自己由来であり、対象の骨髄又は末梢血から単離される、実施形態１６８に記載の方法。

【0454】

実施形態１７０．ｉＰＳＣ又はＨＳＣが、同種であり、異なる対象の骨髄又は末梢血から単離される、実施形態１６８に記載の方法。

【0455】

実施形態１７１．移植することが、移植、局所注射、全身注入、又はそれらの組み合わせによって対象に造血前駆細胞を投与することを含む、実施形態１６８～１７０のいずれか１つに記載の方法。

【0456】

実施形態１７２．異常ヘモグロビン症が、鎌状赤血球症又はβサラセミアである、実施形態１６８～１７１のいずれか１つに記載の方法。

【0457】

実施形態１７３．ゲノム編集によって対象において胎児型ヘモグロビン（ＨｂＦ）を増加させる方法であって、ａ．有効用量の、実施形態７９～８４のいずれか１つに記載のベクター又は実施形態８５～９０のいずれか１つに記載のＶＬＰを対象に投与することであって、ベクター又はＶＬＰが、対象の細胞にＣａｓＸ：ｇＮＡシステムを送達する、投与することと、
ｂ．対象の細胞のＢＣＬ１１Ａ標的核酸が、第１のｇＮＡによって標的化されたＣａｓＸによって編集されることと、
ｃ．ＢＣＬ１１Ａタンパク質の発現が低減又は排除されるように、編集することが、標的核酸配列において１つ以上のヌクレオチドの挿入、欠失、置換、重複、又は逆位を導入することを含むことと、を含み、
方法が、治療前の対象におけるヘモグロビンＦ（ＨｂＦ）のレベルと比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、又は少なくとも約５０％の対象の循環血液中のＨｂＦのレベルの増加をもたらす、方法。

【0458】

実施形態１７４．細胞が、造血幹細胞（ＨＳＣ）、造血前駆細胞（ＨＰＣ）、ＣＤ３４＋細胞、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、骨髄系共通前駆細胞、前赤芽球細胞、及び赤芽球細胞からなる群から選択される、実施形態１７３に記載の方法。

【0459】

実施形態１７５．ＢＣＬ１１Ａタンパク質の発現が、編集されていない細胞の標的核酸と比較して、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、又は少なくとも約９０％減少するように、細胞の標的核酸が編集されている、実施形態１７３又は実施形態１７４に記載の方法。

【0460】

実施形態１７６．対象が、マウス、ラット、ブタ、及び非ヒト霊長類からなる群から選択される、実施形態１７３～１７５のいずれか１つに記載の方法。

【0461】

実施形態１７７．対象が、ヒトである、実施形態１７３～１７５のいずれか１つに記載の方法。

【0462】

実施形態１７８．ベクターが、少なくとも約１×１０５ベクターゲノム／ｋｇ（ｖｇ／ｋｇ）、少なくとも約１×１０^６ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０^７ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０^８ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０^９ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０^１０ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０^１１ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０^１５ｖｇ／ｋｇ、又は少なくとも約１×１０^１６ｖｇ／ｋｇの用量で投与される、実施形態１７３～１７７のいずれか１つに記載の方法。

【0463】

実施形態１７９．ＶＬＰが、少なくとも約１×１０^５粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０^６粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０^７粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０^８粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０^９粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０^１０粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０^１１粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０^１２粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０^１３粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０^１４粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０^１５粒子／ｋｇ、又は少なくとも約１×１０^１６粒子／ｋｇの用量で投与される、実施形態１７３～１７７のいずれか１つに記載の方法。

【0464】

実施形態１８０．ベクター又はＶＬＰが、移植、局所注射、全身注入、又はそれらの組み合わせから選択される投与経路によって投与される、実施形態１７３～１７９のいずれか１つに記載の方法。

【0465】

実施形態１８１．異常ヘモグロビン症の治療のための医薬品として使用するための、実施形態１～７４のいずれか１つに記載の組成物、実施形態７５～７８のいずれか１つに記載の核酸、７９～８４のいずれか１つに記載のベクター、実施形態８５～８８のいずれか１つに記載のＶＬＰ、実施形態９２若しくは実施形態９３に記載の宿主細胞、又は実施形態１２５若しくは実施形態１２６に記載の細胞集団。

【0466】

実施形態１８２．標的核酸配列が、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列の１ヌクレオチド３’側に位置する非標的鎖配列に相補的である、実施形態１に記載の組成物。

【0467】

実施形態１８３．ＰＡＭ配列が、ＴＣモチーフを含む、実施形態１８２に記載の組成物。

【0468】

実施形態１８４．ＰＡＭ配列が、ＡＴＣ、ＧＴＣ、ＣＴＣ、又はＴＴＣを含む、実施形態１８３に記載の組成物。

【0469】

実施形態１８５．クラス２ Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質が、ＲｕｖＣドメインを含む、実施形態１８２～１８４のいずれか１つに記載の組成物。

【0470】

実施形態１８６．ＲｕｖＣドメインが、標的核酸配列においてずれた二本鎖切断を生成する、実施形態１８５に記載の組成物。

【0471】

実施形態１８７．クラス２ Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質が、ＨＮＨヌクレアーゼドメインを含まない、実施形態１８２～１８６のいずれか１つに記載の組成物。

【0472】

セットＩＩ
実施形態１．クラス２ Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質及び第１のガイドリボ核酸（ｇＲＮＡ）を含むシステムであって、ｇＲＮＡが、ポリピリミジントラクト結合タンパク質１（ＢＣＬ１１Ａ）遺伝子を含む標的核酸配列に相補的な標的化配列を含む、システム。

【0473】

実施形態２．ｇＲＮＡが、
ａ．ＢＣＬ１１Ａイントロン、
ｂ．ＢＣＬ１１Ａエキソン、
ｃ．ＢＣＬ１１Ａイントロン－エキソン接合部、
ｄ．ＢＣＬ１１Ａ調節エレメント、及び
ｅ．遺伝子間領域、からなる群から選択される標的核酸配列に相補的な標的化配列を含む、実施形態１に記載のシステム。

【0474】

実施形態３．ＢＣＬ１１Ａ遺伝子が、野生型配列を含む、実施形態１又は実施形態２に記載のシステム。

【0475】

実施形態４．ｇＲＮＡが、単一分子ｇＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）である、実施形態１～３のいずれか１つに記載のシステム。

【0476】

実施形態５．ｇＲＮＡが、二種分子ｇＲＮＡ（ｄｇＲＮＡ）である、実施形態１～４のいずれか１つに記載のシステム。

【0477】

実施形態６．ｇＲＮＡの標的化配列が、配列番号２７２～２１００及び２２８６～２６７８９からなる群から選択される配列、又はそれと少なくとも約６５％、少なくとも約７５％、少なくとも約８５％、若しくは少なくとも約９５％の同一性を有する配列を含む、実施形態１～５のいずれか１つに記載のシステム。

【0478】

実施形態７．ｇＲＮＡの標的化配列が、配列番号２７２～２１００及び２２８６～２６７８９からなる群から選択される配列を含む、実施形態１～５のいずれか１つに記載のシステム。

【0479】

実施形態８．標的化配列が、配列の３’末端から単一のヌクレオチドが除去されている、実施形態７に記載のシステム。

【0480】

実施形態９．標的化配列が、配列の３’末端から２つのヌクレオチドが除去されている、実施形態７に記載のシステム。

【0481】

実施形態１０．標的化配列が、配列の３’末端から３つのヌクレオチドが除去されている、実施形態７に記載のシステム。

【0482】

実施形態１１．標的化配列が、配列の３’末端から４つのヌクレオチドが除去されている、実施形態７に記載のシステム。

【0483】

実施形態１２．標的化配列が、配列の３’末端から５つのヌクレオチドが除去されている、実施形態７に記載のシステム。

【0484】

実施形態１３．ｇＲＮＡの標的化配列が、ＢＣＬ１１Ａエキソンの配列に相補的である、実施形態１～１２のいずれか１つに記載のシステム。

【0485】

実施形態１４．ｇＲＮＡの標的化配列が、ＢＣＬ１１Ａエキソン１配列、ＢＣＬ１１Ａエキソン２配列、ＢＣＬ１１Ａエキソン３配列、ＢＣＬ１１Ａエキソン４配列、ＢＣＬ１１Ａエキソン５配列、ＢＣＬ１１Ａエキソン６配列、ＢＣＬ１１Ａエキソン７配列、ＢＣＬ１１Ａエキソン８配列、及びＢＣＬ１１Ａエキソン９配列からなる群から選択される配列に相補的である、実施形態１３に記載のシステム。

【0486】

実施形態１５．ｇＲＮＡの標的化配列が、ＢＣＬ１１Ａエキソン１配列、ＢＣＬ１１Ａエキソン２配列、及びＢＣＬ１１Ａエキソン３配列からなる群から選択される配列に相補的である、実施形態１４に記載のシステム。

【0487】

実施形態１６．ｇＲＮＡの標的化配列が、ＢＣＬ１１Ａ調節エレメントの配列に相補的である、実施形態１～１２のいずれか１つに記載のシステム。

【0488】

実施形態１７．ｇＲＮＡの標的化配列が、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子のプロモーターの配列に相補的である、実施形態１６に記載のシステム。

【0489】

実施形態１８．ｇＲＮＡの標的化配列が、エンハンサー調節エレメントの配列に相補的である、実施形態１６に記載のシステム。

【0490】

実施形態１９．ｇＲＮＡの標的化配列が、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子のＧＡＴＡ１赤血球特異的エンハンサー結合部位（ＧＡＴＡ１）を含む配列に相補的である、実施形態１８に記載のシステム。

【0491】

実施形態２０．ｇＲＮＡの標的化配列が、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子のＧＡＴＡ１結合部位の５’側にある配列に相補的である、実施形態１６に記載のシステム。

【0492】

実施形態２１．ｇＲＮＡの標的化配列が、ＵＧＧＡＧＣＣＵＧＵＧＡＵＡＡＡＡＧＣＡ（配列番号２２）の配列、又はそれと少なくとも９０％若しくは９５％の配列同一性を有する配列を含む、実施形態１９又は実施形態２０に記載のシステム。

【0493】

実施形態２２．ｇＲＮＡの標的化配列が、ＵＧＧＡＧＣＣＵＧＵＧＡＵＡＡＡＡＧＣＡ（配列番号２２）の配列からなる、実施形態１９に記載のシステム。

【0494】

実施形態２３．ｇＲＮＡの標的化配列が、ＵＧＣＵＵＵＵＡＵＣＡＣＡＧＧＣＵＣＣＡ（配列番号２３）の配列、又はそれと少なくとも９０％若しくは９５％の配列同一性を有する配列を含む、実施形態１８に記載のシステム。

【0495】

実施形態２４．ｇＲＮＡの標的化配列が、ＵＧＣＵＵＵＵＡＵＣＡＣＡＧＧＣＵＣＣＡ（配列番号２３）の配列からなる、実施形態１８に記載のシステム。

【0496】

実施形態２５．ｇＲＮＡの標的化配列が、ＣＡＧＧＣＵＣＣＡＧＧＡＡＧＧＧＵＵＵＧ（配列番号２９４９）の配列、又はそれと少なくとも９０％若しくは９５％の配列同一性を有する配列を含む、実施形態１９又は実施形態２０に記載のシステム。

【0497】

実施形態２６．ｇＲＮＡの標的化配列が、ＣＡＧＧＣＵＣＣＡＧＧＡＡＧＧＧＵＵＵＧ（配列番号２９４９）の配列からなる、実施形態１９又は実施形態２０に記載のシステム。

【0498】

実施形態２７．ｇＲＮＡの標的化配列が、ＧＡＧＧＣＣＡＡＡＣＣＣＵＵＣＣＵＧＧＡ（配列番号２９４８）の配列、又はそれと少なくとも９０％若しくは９５％の配列同一性を有する配列を含む、実施形態１９又は実施形態２０に記載のシステム。

【0499】

実施形態２８．ｇＲＮＡの標的化配列が、ＣＡＧＧＣＵＣＣＡＧＧＡＡＧＧＧＵＵＵＧ（配列番号２９４８）の配列からなる、実施形態１９又は実施形態２０に記載のシステム。

【0500】

実施形態２９．ｇＲＮＡの標的化配列が、ＡＧＵＧＣＡＡＧＣＵＡＡＣＡＧＵＵＧＣＵ（配列番号１５７４７）の配列、又はそれと少なくとも９０％若しくは９５％の配列同一性を有する配列を含む、実施形態１９又は実施形態２０に記載のシステム。

【0501】

実施形態３０．ｇＲＮＡの標的化配列が、ＡＧＵＧＣＡＡＧＣＵＡＡＣＡＧＵＵＧＣＵ（配列番号１５７４７）の配列からなる、実施形態１９又は実施形態２０に記載のシステム。

【0502】

実施形態３１．ｇＲＮＡの標的化配列が、ＡＵＡＣＡＡＣＵＵＵＧＡＡＧＣＵＡＧＵＣ（配列番号１５７４８）の配列、又はそれと少なくとも９０％若しくは９５％の配列同一性を有する配列を含む、実施形態１９又は実施形態２０に記載のシステム。

【0503】

実施形態３２．ｇＲＮＡの標的化配列が、ＡＵＡＣＡＡＣＵＵＵＧＡＡＧＣＵＡＧＵＣ（配列番号１５７４８）の配列からなる、実施形態１９又は実施形態２０に記載のシステム。

【0504】

実施形態３３．第２のｇＲＮＡを更に含み、第２のｇＲＮＡが、第１のｇＲＮＡのｇＲＮＡの標的化配列と比較して、ＢＣＬ１１Ａ標的核酸の異なる部分又は重複する部分に相補的な標的化配列を有する、実施形態１～３２のいずれか１つに記載のシステム。

【0505】

実施形態３４．第２のｇＲＮＡの標的化配列が、ＧＡＴＡ１結合部位配列の５’側又は３’側にある標的核酸の配列に相補的である、実施形態３３に記載のシステム。

【0506】

実施形態３５．第１のｇＲＮＡ及び第２のｇＲＮＡが、各々、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子のプロモーター内の配列に相補的な標的化配列を有する、実施形態３３に記載のシステム。

【0507】

実施形態３６．第１のｇＲＮＡ又は第２のｇＲＮＡが、配列番号２２３８～２２８５、２６７９４～２６８３９、及び２７２１９～２７２６５からなる群から選択される配列、又はそれと少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％の配列同一性を有する配列を含む足場を有する、実施形態１～３５のいずれか１つに記載のシステム。

【0508】

実施形態３７．第１のｇＲＮＡ又は第２のｇＲＮＡが、配列番号２２３８～２２８５、２６７９４～２６８３９、及び２７２１９～２７２６５からなる群から選択される配列を含む足場を有する、実施形態１～３６のいずれか１つに記載のシステム。

【0509】

実施形態３８．第１のｇＲＮＡ又は第２のｇＲＮＡが、配列番号２２３８～２２８５、２６７９４～２６８３９、及び２７２１９～２７２６５からなる群から選択される配列からなる足場を有する、実施形態１～３６のいずれか１つに記載のシステム。

【0510】

実施形態３９．第１のｇＲＮＡ又は第２のｇＲＮＡが、配列番号２２３８又は配列番号２６８００の配列からなる足場を有する、実施形態３８に記載のシステム。

【0511】

実施形態４０．標的化配列が、ｇＲＮＡの足場の３’末端に連結されている、実施形態３６～３９のいずれか１つに記載のシステム。

【0512】

実施形態４１．クラス２ Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質が、配列番号５９、７２～９９、１０１～１４８、及び２６９０８～２７１５４からなる群から選択される配列、又はそれと少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、若しくは少なくとも約９５％、若しくは少なくとも約９５％、若しくは少なくとも約９６％、若しくは少なくとも約９７％、若しくは少なくとも約９８％、若しくは少なくとも約９９％の配列同一性を有する配列を含むＣａｓＸバリアントタンパク質である、実施形態１～４０のいずれか１つに記載のシステム。

【0513】

実施形態４２．クラス２ Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質が、配列番号５９、７２～９９、１０１～１４８、及び２６９０８～２７１５４からなる群から選択される配列を含むＣａｓＸバリアントタンパク質である、実施形態４１に記載のシステム。

【0514】

実施形態４３．ＣａｓＸバリアントタンパク質が、配列番号５９、７２～９９、１０１～１４８、及び２６９０８～２７１５４からなる群から選択される配列からなる、実施形態４１に記載のシステム。

【0515】

実施形態４４．ＣａｓＸバリアントタンパク質が、配列番号１２６、２７０４３、２７０４６、２７０５０からなる群から選択される配列からなる、実施形態４２に記載のシステム。

【0516】

実施形態４５．ＣａｓＸバリアントタンパク質が、配列番号１～３から選択される配列を有する参照ＣａｓＸタンパク質と比較して、少なくとも１つの改変を含む、実施形態４１に記載のシステム。

【0517】

実施形態４６．少なくとも１つの改変が、参照ＣａｓＸタンパク質と比較して、ＣａｓＸバリアントタンパク質のドメインにおける少なくとも１つのアミノ酸置換、欠失、又は置換を含む、実施形態４５に記載のシステム。

【0518】

実施形態４７．ドメインが、非標的鎖結合（ＮＴＳＢ）ドメイン、標的鎖装填（ＴＳＬ）ドメイン、ヘリックスＩドメイン、ヘリックスＩＩドメイン、オリゴヌクレオチド結合ドメイン（ＯＢＤ）、及びＲｕｖＣ ＤＮＡ切断ドメインからなる群から選択される、実施形態４６に記載のシステム。

【0519】

実施形態４８．ＣａｓＸバリアントタンパク質が、ＨＮＨドメインを含まない、実施形態４１～４７のいずれか１つに記載のシステム。

【0520】

実施形態４９．ＣａｓＸバリアントタンパク質が、１つ以上の核局在化シグナル（ＮＬＳ）を更に含む、実施形態４１～４８のいずれか１つに記載のシステム。

【0521】

実施形態５０．１つ以上のＮＬＳが、ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号１６８）、ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫ（配列番号１６９）、ＰＡＡＫＲＶＫＬＤ（配列番号１７０）、ＲＱＲＲＮＥＬＫＲＳＰ（配列番号１７１）、ＮＱＳＳＮＦＧＰＭＫＧＧＮＦＧＧＲＳＳＧＰＹＧＧＧＧＱＹＦＡＫＰＲＮＱＧＧＹ（配列番号１７２）、ＲＭＲＩＺＦＫＮＫＧＫＤＴＡＥＬＲＲＲＲＶＥＶＳＶＥＬＲＫＡＫＫＤＥＱＩＬＫＲＲＮＶ（配列番号１７３）、ＶＳＲＫＲＰＲＰ（配列番号１７４）、ＰＰＫＫＡＲＥＤ（配列番号１７５）、ＰＱＰＫＫＫＰＬ（配列番号１７６）、ＳＡＬＩＫＫＫＫＫＭＡＰ（配列番号１７７）、ＤＲＬＲＲ（配列番号１７８）、ＰＫＱＫＫＲＫ（配列番号１７９）、ＲＫＬＫＫＫＩＫＫＬ（配列番号１８０）、ＲＥＫＫＫＦＬＫＲＲ（配列番号１８１）、ＫＲＫＧＤＥＶＤＧＶＤＥＶＡＫＫＫＳＫＫ（配列番号１８２）、ＲＫＣＬＱＡＧＭＮＬＥＡＲＫＴＫＫ（配列番号１８３）、ＰＲＰＲＫＩＰＲ（配列番号１８４）、ＰＰＲＫＫＲＴＶＶ（配列番号１８５）、ＮＬＳＫＫＫＫＲＫＲＥＫ（配列番号１８６）、ＲＲＰＳＲＰＦＲＫＰ（配列番号１８７）、ＫＲＰＲＳＰＳＳ（配列番号１８８）、ＫＲＧＩＮＤＲＮＦＷＲＧＥＮＥＲＫＴＲ（配列番号１８９）、ＰＲＰＰＫＭＡＲＹＤＮ（配列番号１９０）、ＫＲＳＦＳＫＡＦ（配列番号１９１）、ＫＬＫＩＫＲＰＶＫ（配列番号１９２）、ＰＫＫＫＲＫＶＰＰＰＰＡＡＫＲＶＫＬＤ（配列番号１９３）、ＰＫＴＲＲＲＰＲＲＳＱＲＫＲＰＰＴ（配列番号２６７９２）、ＳＲＲＲＫＡＮＰＴＫＬＳＥＮＡＫＫＬＡＫＥＶＥＮ（配列番号１９４）、ＫＴＲＲＲＰＲＲＳＱＲＫＲＰＰＴ（配列番号１９５）、ＲＲＫＫＲＲＰＲＲＫＫＲＲ（配列番号１９６）、ＰＫＫＫＳＲＫＰＫＫＫＳＲＫ（配列番号１９７）、ＨＫＫＫＨＰＤＡＳＶＮＦＳＥＦＳＫ（配列番号１９８）、ＱＲＰＧＰＹＤＲＰＱＲＰＧＰＹＤＲＰ（配列番号１９９）、ＬＳＰＳＬＳＰＬＬＳＰＳＬＳＰＬ（配列番号２００）、ＲＧＫＧＧＫＧＬＧＫＧＧＡＫＲＨＲＫ（配列番号２０１）、ＰＫＲＧＲＧＲＰＫＲＧＲＧＲ（配列番号２０２）、ＰＫＫＫＲＫＶＰＰＰＰＡＡＫＲＶＫＬＤ（配列番号２０３）、ＰＫＫＫＲＫＶＰＰＰＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号２０４）、ＰＡＫＲＡＲＲＧＹＫＣ（配列番号２７１９９）、ＫＬＧＰＲＫＡＴＧＲＷ（配列番号２７２００）、ＰＲＲＫＲＥＥ（配列番号２７２０１）、ＰＹＲＧＲＫＥ（配列番号２７２０２）、ＰＬＲＫＲＰＲＲ（配列番号２７２０３）、ＰＬＲＫＲＰＲＲＧＳＰＬＲＫＲＰＲＲ（配列番号２７２０４）、ＰＡＡＫＲＶＫＬＤＧＧＫＲＴＡＤＧＳＥＦＥＳＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号２７２０５）、ＰＡＡＫＲＶＫＬＤＧＧＫＲＴＡＤＧＳＥＦＥＳＰＫＫＫＲＫＶＧＩＨＧＶＰＡＡ（配列番号２７２０６）、ＰＡＡＫＲＶＫＬＤＧＧＫＲＴＡＤＧＳＥＦＥＳＰＫＫＫＲＫＶＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡ（配列番号２０７）、ＰＡＡＫＲＶＫＬＤＧＧＫＲＴＡＤＧＳＥＦＥＳＰＫＫＫＲＫＶＰＧ（配列番号２７２０８）、ＫＲＫＧＳＰＥＲＧＥＲＫＲＨＷ（配列番号２７２０９）、ＫＲＴＡＤＳＱＨＳＴＰＰＫＴＫＲＫＶＥＦＥＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号２７２１０）、及びＰＫＫＫＲＫＶＧＧＳＫＲＴＡＤＳＱＨＳＴＰＰＫＴＫＲＫＶＥＦＥＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号２７２１１）からなる配列の群から選択され、１つ以上のＮＬＳが、リンカーペプチドを用いて、ＣＲＩＳＰＲタンパク質又は隣接するＮＬＳに連結され、リンカーペプチドが、ＲＳ、（Ｇ）ｎ（配列番号２７２１２）、（ＧＳ）ｎ（配列番号２７２１３）、（ＧＳＧＧＳ）ｎ（配列番号２１４）、（ＧＧＳＧＧＳ）ｎ（配列番号２１５）、（ＧＧＧＳ）ｎ（配列番号２１６）、ＧＧＳＧ（配列番号２１７）、ＧＧＳＧＧ（配列番号２１８）、ＧＳＧＳＧ（配列番号２１９）、ＧＳＧＧＧ（配列番号２２０）、ＧＧＧＳＧ（配列番号２２１）、ＧＳＳＳＧ（配列番号２２２）、ＧＰＧＰ（配列番号２２３）、ＧＧＰ、ＰＰＰ、ＰＰＡＰＰＡ（配列番号２２４）、ＰＰＰＧ（配列番号２７２１４）、ＰＰＰＧＰＰＰ（配列番号２２５）、ＰＰＰ（ＧＧＧＳ）ｎ（配列番号２７２１５）、（ＧＧＧＳ）ｎＰＰＰ（配列番号２７２１６）、ＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡ（配列番号２７２１７）、及びＴＰＰＫＴＫＲＫＶＥＦＥ（配列番号２７２１８）（式中、ｎは１～５である）からなる群から選択される、実施形態４９に記載のシステム。

【0522】

実施形態５１．１つ以上のＮＬＳが、ＣａｓＸバリアントタンパク質のＣ末端又はその近傍に位置する、実施形態４９又は実施形態５０に記載のシステム。

【0523】

実施形態５２．１つ以上のＮＬＳが、ＣａｓＸバリアントタンパク質のＮ末端又はその近傍に位置する、実施形態４９又は実施形態５０に記載のシステム。

【0524】

実施形態５３．ＣａｓＸバリアントタンパク質のＮ末端又はその近傍及びＣ末端又はその近傍に位置する１つ以上のＮＬＳを含む、実施形態４９又は実施形態５０に記載のシステム。

【0525】

実施形態５４．ＣａｓＸバリアントが、ガイド核酸（ｇＲＮＡ）とリボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）を形成することができる、実施形態４１～５３のいずれか１つに記載のシステム。

【0526】

実施形態５５．ＣａｓＸバリアントタンパク質及びｇＲＮＡバリアントのＲＮＰが、配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の参照ＣａｓＸタンパク質及び配列番号４～１６のいずれか１つの配列を含むｇＲＮＡのＲＮＰと比較して、少なくとも１つ以上の改善された特徴を示す、実施形態５４に記載のシステム。

【0527】

実施形態５６．改善された特徴が、ＣａｓＸバリアントのフォールディングの改善、ガイド核酸（ｇＲＮＡ）に対する結合親和性の改善、標的ＤＮＡに対する結合親和性の改善、標的ＤＮＡの編集において、ＡＴＣ、ＣＴＣ、ＧＴＣ、又はＴＴＣを含むより広範囲の１つ以上のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列を利用する能力の改善、標的ＤＮＡの巻き戻しの改善、編集活性の増加、編集効率の改善、編集特異性の改善、ヌクレアーゼ活性の増加、標的核酸配列の切断速度の改善、二本鎖切断のための標的鎖装填の増加、一本鎖ニッキングのための標的鎖装填の減少、オフターゲット切断の減少、非標的ＤＮＡ鎖の結合の改善、タンパク質安定性の改善、タンパク質溶解度の改善、リボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）の形成の改善、より高い百分率割合の切断コンピテントＲＮＰ、タンパク質：ｇＲＮＡ複合体（ＲＮＰ）の安定性の改善、タンパク質：ｇＲＮＡ複合体の溶解度の改善、タンパク質収量の改善、タンパク質発現の改善、及び融合体特徴の改善、からなる群の１つ以上から選択される、実施形態５５に記載のシステム。

【0528】

実施形態５７．ＣａｓＸバリアントタンパク質及びｇＲＮＡバリアントのＲＮＰの改善された特徴が、配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の参照ＣａｓＸタンパク質及び配列番号４～１６のいずれか１つの配列を含むｇＲＮＡのＲＮＰと比較して、少なくとも約１．１～約１００倍又はそれ以上改善されている、実施形態５５又は実施形態５６に記載のシステム。

【0529】

実施形態５８．ＣａｓＸバリアントタンパク質の改善された特徴が、配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の参照ＣａｓＸタンパク質及び配列番号４～１６のいずれか１つの配列を含むｇＲＮＡと比較して、少なくとも約１．１倍、少なくとも約２倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１００倍、又はそれ以上である、実施形態５５又は実施形態５６に記載のシステム。

【0530】

実施形態５９．ＣａｓＸバリアントタンパク質の改善された特徴が、配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の参照ＣａｓＸタンパク質及び配列番号４～１６のいずれか１つの配列を含むｇＮＡと比較して、少なくとも約１．１倍、少なくとも約２倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１００倍、又はそれ以上改善されている、実施形態５５又は実施形態５６に記載のシステム。

【0531】

実施形態６０．改善された特徴が、編集効率を含み、ＣａｓＸバリアントタンパク質及びｇＲＮＡバリアントのＲＮＰが、配列番号２の参照ＣａｓＸタンパク質及び配列番号４～１６のいずれか１つのｇＲＮＡのＲＮＰと比較して、編集効率の１．１～１００倍の改善を含む、実施形態５５～５９のいずれか１つに記載のシステム。

【0532】

実施形態６１．ＰＡＭ配列ＴＴＣ、ＡＴＣ、ＧＴＣ、又はＣＴＣのいずれか１つが、細胞アッセイシステムにおいてｇＲＮＡの標的化配列と同一性を有するプロトスペーサーの非標的鎖に対して１ヌクレオチド５’側に位置する場合、ＣａｓＸバリアント及びｇＲＮＡバリアントを含むＲＮＰが、比較アッセイシステムにおける参照ＣａｓＸタンパク質及び参照ｇＲＮＡを含むＲＮＰの編集効率及び／又は結合と比較して、より高い編集効率及び／又は標的核酸配列の結合を示す、実施形態５４～５９のいずれか１つに記載のシステム。

【0533】

実施形態６２．ＰＡＭ配列が、ＴＴＣである、実施形態６１に記載のシステム。

【0534】

実施形態６３．ｇＲＮＡの標的化配列が、配列番号１７９０４～２６７８９からなる群から選択される配列を含む、実施形態６２に記載のシステム。

【0535】

実施形態６４．ＰＡＭ配列が、ＡＴＣである、実施形態６１に記載のシステム。

【0536】

実施形態６５．ｇＲＮＡの標的化配列が、配列番号２７２～２１００及び２２８６～５６２５からなる群から選択される配列を含む、実施形態６４に記載のシステム。

【0537】

実施形態６６．ＰＡＭ配列が、ＣＴＣである、実施形態６１に記載のシステム。

【0538】

実施形態６７．ｇＲＮＡの標的化配列が、配列番号５６２６～１３６１６からなる群から選択される配列を含む、実施形態６６に記載のシステム。

【0539】

実施形態６８．ＰＡＭ配列が、ＧＴＣである、実施形態６１に記載のシステム。

【0540】

実施形態６９．ｇＲＮＡの標的化配列が、配列番号１３６１７～１７９０３からなる群から選択される配列を含む、実施形態６６に記載のシステム。

【0541】

実施形態７０．１つ以上のＰＡＭ配列に対する増加した結合親和性が、配列番号１～３の参照ＣａｓＸタンパク質のいずれか１つのＰＡＭ配列に対する結合親和性と比較して、少なくとも１．５倍大きい、実施形態６１～６８のいずれか１つに記載のシステム。

【0542】

実施形態７１．ＲＮＰが、参照ＣａｓＸタンパク質及び配列番号４～１６のｇＲＮＡのＲＮＰと比較して、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、又は少なくとも２０％高い百分率割合の切断コンピテントＲＮＰを有する、実施形態５４～７０のいずれか１つに記載のシステム。

【0543】

実施形態７２．ＣａｓＸバリアントタンパク質が、ニッカーゼ活性を有するＲｕｖＣ ＤＮＡ切断ドメインを含む、実施形態４１～７１のいずれか１つに記載のシステム。

【0544】

実施形態７３．ＣａｓＸバリアントタンパク質が、二本鎖切断活性を有するＲｕｖＣ ＤＮＡ切断ドメインを含む、実施形態４１～７１のいずれか１つに記載のシステム。

【0545】

実施形態７４．ＣａｓＸタンパクが、触媒的に不活性なＣａｓＸ（ｄＣａｓＸ）タンパク質であり、ｄＣａｓＸ及びｇＲＮＡが、ＢＣＬ１１Ａ標的核酸への結合能を保持している、実施形態１～５４のいずれか１つに記載のシステム。

【0546】

実施形態７５．ｄＣａｓＸが、残基：
ａ．配列番号１のＣａｓＸタンパク質に対応するＤ６７２、Ｅ７６９、及び／若しくはＤ９３５、又は
ｂ．配列番号２のＣａｓＸタンパク質に対応するＤ６５９、Ｅ７５６、及び／若しくはＤ９２２、に変異を含む、実施形態７４に記載の組成物。

【0547】

実施形態７６．変異が、残基のアラニンへの置換である、実施形態７５に記載のシステム。

【0548】

実施形態７７．ドナー鋳型核酸を更に含む、実施形態１～７３のいずれか１つに記載のシステム。

【0549】

実施形態７８．ドナー鋳型が、ＢＣＬ１１Ａエキソン、ＢＣＬ１１Ａイントロン、ＢＣＬ１１Ａイントロン－エキソン接合部、ＢＣＬ１１Ａ調節エレメント、及びＧＡＴＡ１結合部位配列からなる群から選択されるＢＣＬ１１Ａ遺伝子の少なくとも一部を含む核酸を含む、実施形態７７に記載のシステム。

【0550】

実施形態７９．ドナー鋳型の配列が、野生型ＢＣＬ１１Ａ遺伝子の対応する部分と比較して、１つ以上の変異を含む、実施形態７８に記載のシステム。

【0551】

実施形態８０．ドナー鋳型が、ＢＣＬ１１Ａエキソン１、ＢＣＬ１１Ａエキソン２、ＢＣＬ１１Ａエキソン３、ＢＣＬ１１Ａエキソン４、ＢＣＬ１１Ａエキソン５、ＢＣＬ１１Ａエキソン６、ＢＣＬ１１Ａエキソン７、ＢＣＬ１１Ａエキソン８、及びＢＣＬ１１Ａエキソン９からなる群から選択されるＢＣＬ１１Ａエキソンの少なくとも一部を含む核酸を含む、実施形態７８又は実施形態７９に記載のシステム。

【0552】

実施形態８１．ドナー鋳型が、ＢＣＬ１１Ａエキソン１、ＢＣＬ１１Ａエキソン２、及びＢＣＬ１１Ａエキソン３からなる群から選択されるＢＣＬ１１Ａエキソンの少なくとも一部を含む核酸を含む、実施形態８０に記載のシステム。

【0553】

実施形態８２．ドナー鋳型のサイズが、１０～１５，０００ヌクレオチドの範囲である、実施形態７７～８１のいずれか１つに記載のシステム。

【0554】

実施形態８３．ドナー鋳型が、一本鎖ＤＮＡ鋳型又は一本鎖ＲＮＡ鋳型である、実施形態７７～８２のいずれか１つに記載のシステム。

【0555】

実施形態８４．ドナー鋳型が、二本鎖ＤＮＡ鋳型である、実施形態７７～８２のいずれか１つに記載のシステム。

【0556】

実施形態８５．ドナー鋳型が、クラス２ Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質によって導入されるＢＣＬ１１Ａ標的核酸における切断部位に隣接する配列に相補的である相同アームを、ドナー鋳型の５’末端及び３’末端又はその近傍に含む、実施形態７７～８４のいずれか１つに記載のシステム。

【0557】

実施形態８６．実施形態７７～８５のいずれか１つに記載のドナー鋳型を含む、核酸。

【0558】

実施形態８７．実施形態４１～７６のいずれか１つに記載のＣａｓＸをコードする配列を含む、核酸。

【0559】

実施形態８８．実施形態１～３９のいずれか１つに記載のｇＲＮＡをコードする配列を含む、核酸。

【0560】

実施形態８９．ＣａｓＸタンパク質をコードする配列が、真核細胞における発現のためにコドン最適化されている、実施形態８７に記載の核酸。

【0561】

実施形態実施形態１～３９のいずれか１つに記載のｇＲＮＡ、実施形態４１～７６のいずれか１つに記載のＣａｓＸタンパク質、又は実施形態８６～８９のいずれか１つに記載の核酸を含む、ベクター。

【0562】

実施形態９１．ベクターが、１つ以上のプロモーターを更に含む、実施形態９０に記載のベクター。

【0563】

実施形態９２．ベクターが、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ベクター、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）、ＣａｓＸ送達粒子（ＸＤＰ）、プラスミド、ミニサークル、ナノプラスミド、ＤＮＡベクター、及びＲＮＡベクターからなる群から選択される、実施形態９０又は実施形態９１に記載のベクター。

【0564】

実施形態９３．ベクターが、ＡＡＶベクターである、実施形態９２に記載のベクター。

【0565】

実施形態９４．ＡＡＶベクターが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ－Ｒｈ７４、又はＡＡＶＲｈ１０から選択される、実施形態９３に記載のベクター。

【0566】

実施形態９５．ＡＡＶベクターが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ８、又はＡＡＶ９から選択される、実施形態９４に記載のベクター。

【0567】

実施形態９６．ＡＡＶベクターが、以下の成分：
ａ．５’ＩＴＲ、
ｂ．３’ＩＴＲ、及び
ｃ．導入遺伝子であって、第１のプロモーターに作動可能に連結された実施形態８７に記載の核酸と、第２のプロモーターに作動可能に連結された実施形態８８に記載の核酸と、を含む、導入遺伝子、を含む核酸を含む、実施形態９４又は実施形態９５に記載のベクター。

【0568】

実施形態９７．核酸が、ＣａｓＸタンパク質をコードする配列の３’側にポリ（Ａ）配列を更に含む、実施形態９６に記載のベクター。

【0569】

実施形態９８．核酸が、１つ以上のエンハンサーエレメントを更に含む、実施形態９６又は実施形態９７に記載のベクター。

【0570】

実施形態９９．単一のＡＡＶ粒子が、核酸を含有することができ、ＡＡＶ粒子が、標的細胞において標的核酸を形質導入し、効果的に改変するのに必要な全ての成分を有する、実施形態９６～９８のいずれか１つに記載のベクター。

【0571】

実施形態１００．ベクターが、レトロウイルスベクターである、実施形態９２に記載のベクター。

【0572】

実施形態１０１．ベクターが、ｇａｇポリタンパク質の１つ以上の成分を含むＸＤＰである、実施形態９２に記載のベクター。

【0573】

実施形態１０２．ｇａｇポリタンパク質の１つ以上の成分が、マトリックスタンパク質（ＭＡ）、ヌクレオカプシドタンパク質（ＮＣ）、カプシドタンパク質（ＣＡ）、ｐ１ペプチド、ｐ６ペプチド、Ｐ２Ａペプチド、Ｐ２Ｂペプチド、Ｐ１０ペプチド、ｐ１２ペプチド、ＰＰ２１／２４ペプチド、Ｐ１２／Ｐ３／Ｐ８ペプチド、及びＰ２０ペプチドからなる群から選択される、実施形態１０１に記載のベクター。

【0574】

実施形態１０３．ＸＤＰが、ｇａｇポリタンパク質、ＣａｓＸタンパク質、及びｇＲＮＡの１つ以上の成分を含む、実施形態１０１又は実施形態１０２に記載のベクター。

【0575】

実施形態１０４．ＣａｓＸタンパク質及びｇＲＮＡが、ＲＮＰ中で一緒に会合している、実施形態１０３に記載のベクター。

【0576】

実施形態１０５．ドナー鋳型を更に含む、実施形態１０１～１０４のいずれか１つに記載のベクター。

【0577】

実施形態１０６．標的細胞へのＸＤＰの結合及び融合を提供する偽型ウイルスエンベロープ糖タンパク質又は抗体断片を更に含む、実施形態１０１～１０４のいずれか１つに記載のベクター。

【0578】

実施形態１０７．実施形態の実施形態に記載のベクターであって、標的細胞が、造血幹細胞（ＨＳＣ）、造血前駆細胞（ＨＰＣ）、ＣＤ３４＋細胞、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、胚性幹細胞（ＥＳ）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、骨髄系共通前駆細胞、前赤芽球細胞、及び赤芽球細胞からなる群から選択される、ベクター。

【0579】

実施形態１０８．実施形態９０～１０７のいずれか１つに記載のベクターを含む、宿主細胞。

【0580】

実施形態１０９．宿主細胞が、ＢＨＫ、ＨＥＫ２９３、ＨＥＫ２９３Ｔ、ＮＳ０、ＳＰ２／０、ＹＯ骨髄腫細胞、Ｐ３Ｘ６３マウス骨髄腫細胞、ＰＥＲ、ＰＥＲ．Ｃ６、ＮＩＨ３Ｔ３、ＣＯＳ、ＨｅＬａ、ＣＨＯ、及び酵母細胞からなる群から選択される、実施形態１０８に記載の宿主細胞。

【0581】

実施形態１１０．細胞集団においてＢＣＬ１１Ａ標的核酸配列を改変する方法であって、細胞集団に、
ａ．実施形態１～８５のいずれか１つに記載のシステム、
ｂ．実施形態８６～８９のいずれか１つに記載の核酸、
ｃ．実施形態９０～９５のいずれか１つに記載のベクター、
ｄ．実施形態１０１～１０７のいずれか１つに記載のＸＤＰ、又は
ｅ．（ａ）～（ｄ）のうちの２つ以上の組み合わせ、を導入することを含み、
第１のｇＲＮＡによって標的化される細胞のＢＣＬ１１Ａ遺伝子の標的核酸配列が、ＣａｓＸバリアントタンパク質によって改変される、方法。

【0582】

実施形態１１１．改変することが、細胞集団のＢＣＬ１１Ａ遺伝子の標的核酸配列に一本鎖切断を導入することを含む、実施形態１１０に記載の方法。

【0583】

実施形態１１２．改変することが、細胞集団のＢＣＬ１１Ａ遺伝子の標的核酸配列に二本鎖切断を導入することを含む、実施形態１１０に記載の方法。

【0584】

実施形態１１３．第２のｇＲＮＡ又は第２のｇＲＮＡをコードする核酸を細胞集団に導入することを更に含み、第２のｇＲＮＡが、第１のｇＲＮＡと比較して、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子の標的核酸の異なる部分又は重複する部分に相補的な標的化配列を有し、細胞集団のＢＣＬ１１Ａ標的核酸における更なる切断をもたらす、実施形態１１０～１１２のいずれか１つに記載の方法。

【0585】

実施形態１１４．改変することが、細胞集団のＢＣＬ１１Ａ遺伝子において１つ以上のヌクレオチドの挿入、欠失、置換、重複、又は逆位を導入することを含む、実施形態１１０～１１３のいずれか１つに記載の方法。

【0586】

実施形態１１５．標的核酸のＧＡＴＡ１結合部位配列が改変される、実施形態１１０～１１４のいずれか１つに記載の方法。

【0587】

実施形態１１６．方法が、細胞集団のＢＣＬ１１Ａ遺伝子の標的核酸配列の切断部位へのドナー鋳型の挿入を含む、実施形態１１０～１１３のいずれか１つに記載の方法。

【0588】

実施形態１１７．ドナー鋳型の挿入が、相同組換え修復（ＨＤＲ）又は相同性非依存性標的化組み込み（ＨＩＴＩ）によって媒介される、実施形態１１４に記載の方法。

【0589】

実施形態１１８．標的核酸のＧＡＴＡ１結合部位配列が改変される、実施形態１１６又は実施形態１１７に記載の方法。

【0590】

実施形態１１９．ドナー鋳型の挿入が、細胞集団におけるＢＣＬ１１Ａ遺伝子のノックダウン又はノックアウトをもたらす、実施形態１１６～１１８のいずれか１つに記載の方法。

【0591】

実施形態１２０．ＢＣＬ１１Ａタンパク質の発現が、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子が改変されていない細胞と比較して、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、又は少なくとも約９０％減少するように、細胞集団のＢＣＬ１１Ａ遺伝子が改変される、実施形態１１０～１１９のいずれか１つに記載の方法。

【0592】

実施形態１２１．改変された細胞の少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、又は少なくとも約９０％が検出可能なレベルのＢＣＬ１１Ａタンパク質を発現しないように、細胞集団のＢＣＬ１１Ａ遺伝子が改変される、実施形態１１０～１１９のいずれか１つに記載の方法。

【0593】

実施形態１２２．細胞が、真核細胞である、実施形態１１０～１２１のいずれか１つに記載の方法。

【0594】

実施形態１２３．真核細胞が、げっ歯類細胞、マウス細胞、ラット細胞、及び非ヒト霊長類細胞からなる群から選択される、実施形態１２２に記載の方法。

【0595】

実施形態１２４．真核細胞が、ヒト細胞である、実施形態１２２に記載の方法。

【0596】

実施形態１２５．真核細胞が、造血幹細胞（ＨＳＣ）、造血前駆細胞（ＨＰＣ）、ＣＤ３４＋細胞、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、骨髄系共通前駆細胞、前赤芽球細胞、及び赤芽球細胞からなる群から選択される、実施形態１２２～１２４のいずれか１つに記載の方法。

【0597】

実施形態１２６．細胞集団のＢＣＬ１１Ａ遺伝子の標的核酸配列の改変が、インビトロ又はエクスビボで起こる、実施形態１１０～１２５のいずれか１つに記載の方法。

【0598】

実施形態１２７．細胞集団のＢＣＬ１１Ａ遺伝子の標的核酸配列の改変が、対象においてインビボで起こる、実施形態１１０～１２５のいずれか１つに記載の方法。

【0599】

実施形態１２８．対象が、げっ歯類、マウス、ラット、及び非ヒト霊長類からなる群から選択される、実施形態１２７に記載の方法。

【0600】

実施形態１２９．対象が、ヒトである、実施形態１２７に記載の方法。

【0601】

実施形態１３０．方法が、対象に治療有効用量のＡＡＶベクターを投与することを含む、実施形態１２７～１２９のいずれか１つに記載の方法。

【0602】

実施形態１３１．ＡＡＶベクターが、少なくとも約１×１０^５ベクターゲノム／ｋｇ（ｖｇ／ｋｇ）、少なくとも約１×１０^６ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０^７ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０^８ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０^９ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０^１０ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０^１１ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０^１５ｖｇ／ｋｇ、又は少なくとも約１×１０^１６ｖｇ／ｋｇの用量で対象に投与される、実施形態１３０に記載の方法。

【0603】

実施形態１３２．ＡＡＶベクターが、少なくとも約１×１０^５ｖｇ／ｋｇ～約１×１０^１６ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０^６ｖｇ／ｋｇ～約１×１０^１５ｖｇ／ｋｇ、又は少なくとも約１×１０^７ｖｇ／ｋｇ～約１×１０^１４ｖｇ／ｋｇの用量で対象に投与される、実施形態１３０に記載の方法。

【0604】

実施形態１３３．方法が、治療有効用量のＸＤＰを対象に投与することを含む、実施形態１２７～１２９のいずれか１つに記載に記載の方法。

【0605】

実施形態１３４．ＸＤＰが、少なくとも約１×１０^５粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０^６粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０^７粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０^８粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０^９粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０^１０粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０^１１粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０^１２粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０^１３粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０^１４粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０^１５粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０^１６粒子／ｋｇの用量で対象に投与される、実施形態１３３に記載の方法。

【0606】

実施形態１３５．ＸＤＰが、少なくとも約１×１０^５粒子／ｋｇ～約１×１０^１６粒子／ｋｇ、又は少なくとも約１×１０^６粒子／ｋｇ～約１×１０^１５粒子／ｋｇ、又は少なくとも約１×１０^７粒子／ｋｇ～約１×１０^１４粒子／ｋｇの用量で対象に投与される、実施形態１３３に記載の方法。

【0607】

実施形態１３６．ベクター又はＸＤＰが、移植、局所注射、全身注入、又はそれらの組み合わせから選択される投与経路によって対象に投与される、実施形態１２８～１３５のいずれか１つに記載の方法。

【0608】

実施形態１３７．方法が、治療前の対象におけるヘモグロビンＦ（ＨｂＦ）のレベルと比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、又は少なくとも約５０％の対象の循環血液中のＨｂＦのレベルの増加をもたらす、実施形態１２８～１３６のいずれか１つに記載の方法。

【0609】

実施形態１３８．方法が、少なくとも０．０１：１．０、少なくとも０．０２５：１．０、少なくとも０．０５：１．０、少なくとも０．０７５：１．０、少なくとも０．１：１．０、少なくとも０．２：１．０、少なくとも０．３：１．０、少なくとも０．４：１．０、少なくとも０．５：１：０、少なくとも０．７５：１．０、少なくとも１．０：１．０、少なくとも１．２５：１．０、少なくとも１．５：１．０、又は少なくとも１．７５：１．０の対象の循環血液中のＨｂＦ対ヘモグロビンＳ（ＨｂＳ）の比をもたらす、実施形態１２８～１３７のいずれか１つに記載の方法。

【0610】

実施形態１３９．方法が、対象の循環血液中の総ヘモグロビンの少なくとも約５％、又は少なくとも約１０％、又は少なくとも約２０％、又は少なくとも約３０％のＨｂＦレベルをもたらす、実施形態１２８～１３８のいずれか１つに記載の方法。

【0611】

実施形態１４０．細胞集団のＢＣＬ１１Ａ遺伝子の標的核酸配列を、
ａ．第１のｇＲＮＡと比較して、ＢＣＬ１１Ａ標的核酸の異なる部分若しくは重複する部分を標的化する追加のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ及びｇＲＮＡ、
ｂ．（ａ）の追加のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ及びｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチド、
ｃ．（ｂ）のポリヌクレオチドを含むベクター、又は
ｄ．（ａ）の追加のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ及びｇＲＮＡを含むＸＤＰ、と接触させることを更に含み、
接触させることが、第１のｇＲＮＡによって標的化される配列と比較して、配列における異なる位置でＢＣＬ１１Ａ遺伝子の改変をもたらす、実施形態１１０～１３９のいずれか１つに記載の方法。

【0612】

実施形態１４１．追加のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼが、実施形態１～１４０のいずれか１つに記載のＣａｓＸタンパク質とは異なる配列を有するＣａｓＸタンパク質である、実施形態１４０に記載の方法。

【0613】

実施形態１４２．追加のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼが、ＣａｓＸタンパク質ではない、実施形態１４０に記載の方法。

【0614】

実施形態１４３．追加のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼが、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｃ、Ｃａｓ１２ｄ（ＣａｓＹ）、Ｃａｓ１２ｊ、Ｃａｓ１２ｋ、Ｃａｓ１３ａ、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃ、Ｃａｓ１３ｄ、Ｃａｓ１４、Ｃｐｆｌ、Ｃ２ｃｌ、Ｃｓｎ２、及びそれらの配列バリアントからなる群から選択される、実施形態１４２に記載の方法。

【0615】

実施形態１４４．実施形態１１０～１４３のいずれか１つに記載の方法によって改変された細胞集団であって、改変された細胞の少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％が検出可能なレベルのＢＣＬ１１Ａタンパク質を発現しないように、細胞が改変されている、細胞集団。

【0616】

実施形態１４５．ＢＣＬ１１Ａタンパク質の発現が、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子が改変されていない細胞と比較して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％減少するように、細胞が改変されている、実施形態１１０～１４３のいずれか１つに記載の方法によって改変された細胞集団。

【0617】

実施形態１４６．異常ヘモグロビン症の治療を必要とする対象においてそれを行う方法であって、治療有効量の実施形態１４４又は実施形態１４５に記載の細胞を対象に投与することを含む、方法。

【0618】

実施形態１４７．異常ヘモグロビン症が、鎌状赤血球症又はβサラセミアである、実施形態１４６に記載の方法。

【0619】

実施形態１４８．細胞が、細胞を投与される対象に対して自己由来である、実施形態１４６又は実施形態１４７に記載の方法。

【0620】

実施形態１４９．細胞が、細胞を投与される対象に対して同種である、実施形態１４６又は実施形態１４７に記載の方法。

【0621】

実施形態１５０．細胞又はその子孫が、対象への改変された細胞の投与後、対象において、少なくとも１ヶ月間、２ヶ月間、３ヶ月間、４ヶ月間、５ヶ月間、６ヶ月間、７ヶ月間、８ヶ月間、９ヶ月間、１０ヶ月間、１１ヶ月間、１２ヶ月間、１３ヶ月間、１４ヶ月間、１５ヶ月間、１６ヶ月間、１７ヶ月間、１８ヶ月間、１９ヶ月間、２０ヶ月間、２１ヶ月間、２２ヶ月間、２３ヶ月間、２年間、３年間、４年間、又は５年間存続する、実施形態１４６～１４９のいずれか１つに記載の方法。

【0622】

実施形態１５１．方法が、治療前の対象におけるヘモグロビンＦ（ＨｂＦ）のレベルと比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、又は少なくとも約５０％の循環血液中のＨｂＦのレベルの増加をもたらす、実施形態１４６～１５０のいずれか１つに記載の方法。

【0623】

実施形態１５２．方法が、少なくとも０．０１：１．０、少なくとも０．０２５：１．０、少なくとも０．０５：１．０、少なくとも０．０７５：１．０、少なくとも０．１：１．０、少なくとも０．２：１．０、少なくとも０．３：１．０、少なくとも０．４：１．０、少なくとも０．５：１：０、少なくとも０．７５：１．０、少なくとも１．０：１．０、少なくとも１．２５：１．０、少なくとも１．５：１．０、又は少なくとも１．７５：１．０の対象におけるＨｂＦ対ヘモグロビンＳ（ＨｂＳ）の比をもたらす、実施形態１４６～１５０のいずれか１つに記載の方法。

【0624】

実施形態１５３．方法が、対象における総循環ヘモグロビンの少なくとも約５％、又は少なくとも約１０％、又は少なくとも約２０％、又は少なくとも約３０％のＨｂＦレベルをもたらす、実施形態１４６～１５０のいずれか１つに記載の方法。

【0625】

実施形態１５４．対象が、げっ歯類、マウス、ラット、及び非ヒト霊長類からなる群から選択される、実施形態１４６～１５３のいずれか１つに記載の方法。

【0626】

実施形態１５５．対象が、ヒトである、実施形態１４６～１５３のいずれか１つに記載の方法。

【0627】

実施形態１５６．異常ヘモグロビン症の治療を必要とする対象においてそれを行う方法であって、対象の細胞においてＢＣＬ１１Ａ遺伝子を改変することを含み、改変することが、当該細胞を、治療有効用量の
ａ．実施形態１～８５のいずれか１つに記載のシステム、
ｂ．実施形態８６～８９のいずれか１つに記載の核酸、
ｃ．実施形態９０～９５のいずれか１つに記載のベクター、
ｄ．実施形態１０１～１０４のいずれか１つに記載のＸＤＰ、又は
ｅ．（ａ）～（ｄ）のうちの２つ以上の組み合わせ、と接触させることを含み、
第１のｇＲＮＡによって標的化される細胞のＢＣＬ１１Ａ遺伝子が、ＣａｓＸタンパク質によって改変される、方法。

【0628】

実施形態１５７．異常ヘモグロビン症が、鎌状赤血球症又はβサラセミアである、実施形態１５６に記載の方法。

【0629】

実施形態１５８．細胞が、造血幹細胞（ＨＳＣ）、造血前駆細胞（ＨＰＣ）、ＣＤ３４＋細胞、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、骨髄系共通前駆細胞、前赤芽球細胞、及び赤芽球細胞からなる群から選択される、実施形態１５６又は実施形態１５７のいずれか１つに記載の方法。

【0630】

実施形態１５９．改変することが、細胞のＢＣＬ１１Ａ遺伝子において一本鎖切断を導入することを含む、実施形態１５６～１５８のいずれか１つに記載の方法。

【0631】

実施形態１６０．改変することが、細胞のＢＣＬ１１Ａ遺伝子において二本鎖切断を導入することを含む、実施形態１５６～１５８のいずれか１つに記載の方法。

【0632】

実施形態１６１．第２のｇＲＮＡ又は第２のｇＲＮＡをコードする核酸を対象の細胞に導入することを更に含み、第２のｇＲＮＡが、第１のｇＲＮＡと比較して、標的核酸の異なる部分又は重複する部分に相補的な標的化配列を有し、対象の細胞のＢＣＬ１１Ａ標的核酸における更なる切断をもたらす、実施形態１５６～１６０のいずれか１つに記載の方法。

【0633】

実施形態１６２．改変することが、細胞のＢＣＬ１１Ａ遺伝子において１つ以上のヌクレオチドの挿入、欠失、置換、重複、又は逆位を導入することを含む、実施形態１５６～１６１のいずれか１つに記載の方法。

【0634】

実施形態１６３．改変することが、対象の改変された細胞におけるＢＣＬ１１Ａ遺伝子のノックダウン又はノックアウトをもたらす、実施形態１６２記載の方法。

【0635】

実施形態１６４．改変された細胞によるＢＣＬ１１Ａタンパク質の発現が、改変されていない細胞と比較して、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、又は少なくとも約９０％減少するように、細胞のＢＣＬ１１Ａ遺伝子が改変される、実施形態１５６～１６３のいずれか１つに記載の方法。

【0636】

実施形態１６５．改変された細胞の少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％が検出可能なレベルのＢＣＬ１１Ａタンパク質を発現しないように、対象の細胞のＢＣＬ１１Ａ遺伝子が改変される、実施形態１５６～１６３のいずれか１つに記載の方法。

【0637】

実施形態１６６．方法が、治療前の対象におけるヘモグロビンＦ（ＨｂＦ）のレベルと比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、又は少なくとも約５０％の対象の循環血液中のＨｂＦのレベルの増加をもたらす、実施形態１５６～１６５のいずれか１つに記載の方法。

【0638】

実施形態１６７．方法が、少なくとも０．０１：１．０、少なくとも０．０２５：１．０、少なくとも０．０５：１．０、少なくとも０．０７５：１．０、少なくとも０．１：１．０、少なくとも０．２：１．０、少なくとも０．３：１．０、少なくとも０．４：１．０、少なくとも０．５：１：０、少なくとも０．７５：１．０、少なくとも１．０：１．０、少なくとも１．２５：１．０、少なくとも１．５：１．０、又は少なくとも１．７５：１．０の対象の循環血液中のＨｂＦ対ヘモグロビンＳ（ＨｂＳ）の比をもたらす、実施形態１４７～１５４のいずれか１つに記載の方法。

【0639】

実施形態１６８．方法が、対象の循環血液中の総ヘモグロビンの少なくとも約５％、又は少なくとも約１０％、又は少なくとも約２０％、又は少なくとも約３０％のＨｂＦレベルをもたらす、実施形態１５６～１６５のいずれか１つに記載の方法。

【0640】

実施形態１６９．方法が、細胞のＢＣＬ１１Ａ遺伝子の標的核酸配列の切断部位へのドナー鋳型の挿入を含む、実施形態１５６～１６１のいずれか１つに記載の方法。

【0641】

実施形態１７０．ドナー鋳型の挿入が、相同組換え修復（ＨＤＲ）又は相同性非依存性標的化組み込み（ＨＩＴＩ）によって媒介される、実施形態１６８に記載の方法。

【0642】

実施形態１７１．ドナー鋳型の挿入が、対象の改変された細胞においてＢＣＬ１１Ａ遺伝子のノックダウン又はノックアウトをもたらす、実施形態１６８又は実施形態１７０に記載の方法。

【0643】

実施形態１７２．改変された細胞によるＢＣＬ１１Ａタンパク質の発現が、改変されていない細胞と比較して、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、又は少なくとも約９０％減少するように、細胞のＢＣＬ１１Ａ遺伝子が改変される、実施形態１６６～１７１のいずれか１つに記載の方法。

【0644】

実施形態１７３．改変された細胞の少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％が検出可能なレベルのＢＣＬ１１Ａタンパク質を発現しないように、対象の細胞のＢＣＬ１１Ａ遺伝子が改変される、実施形態１６６～１７１のいずれか１つに記載の方法。

【0645】

実施形態１７４．方法が、治療前の対象におけるヘモグロビンＦ（ＨｂＦ）のレベルと比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、又は少なくとも約５０％の対象の循環血液中のＨｂＦのレベルの増加をもたらす、実施形態１６６～１７３のいずれか１つに記載の方法。

【0646】

実施形態１７５．方法が、少なくとも０．０１：１．０、少なくとも０．０２５：１．０、少なくとも０．０５：１．０、少なくとも０．０７５：１．０、少なくとも０．１：１．０、少なくとも０．２：１．０、少なくとも０．３：１．０、少なくとも０．４：１．０、少なくとも０．５：１：０、少なくとも０．７５：１．０、少なくとも１．０：１．０、少なくとも１．２５：１．０、少なくとも１．５：１．０、又は少なくとも１．７５：１．０の対象の循環血液中のＨｂＦ対ヘモグロビンＳ（ＨｂＳ）の比をもたらす、実施形態１６６～１７３のいずれか１つに記載の方法。

【0647】

実施形態１７６．方法が、対象の循環血液中の総ヘモグロビンの少なくとも約５％、又は少なくとも約１０％、又は少なくとも約２０％、又は少なくとも約３０％のＨｂＦレベルをもたらす、実施形態１６６～１７３のいずれか１つに記載の方法。

【0648】

実施形態１７７．対象が、げっ歯類、マウス、ラット、及び非ヒト霊長類からなる群から選択される、実施形態１５６～１７５のいずれか１つに記載の方法。

【0649】

実施形態１７８．対象が、ヒトである、実施形態１５６～１７５のいずれか１つに記載の方法。

【0650】

実施形態１７９．ベクターが、ＡＡＶであり、少なくとも約１×１０^５ベクターゲノム／ｋｇ（ｖｇ／ｋｇ）、少なくとも約１×１０^６ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０^７ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０^８ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０^９ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０^１０ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０^１１ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０^１５ｖｇ／ｋｇ、又は少なくとも約１×１０^１６ｖｇ／ｋｇの用量で対象に投与される、実施形態１５６～１７８のいずれか１つに記載の方法。

【0651】

実施形態１８０．ベクターが、ＡＡＶであり、少なくとも約１×１０^５ｖｇ／ｋｇ～約１×１０^１６ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０^６ｖｇ／ｋｇ～約１×１０^１５ｖｇ／ｋｇ、又は少なくとも約１×１０^７ｖｇ／ｋｇ～約１×１０^１４ｖｇ／ｋｇの用量で対象に投与される、実施形態１５６～１７８のいずれか１つに記載の方法。

【0652】

実施形態１８１．ＸＤＰが、少なくとも約１×１０５粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０^６粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０^７粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０^８粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０^９粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０^１０粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０^１１粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０^１２粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０^１３粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０^１４粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０^１５粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０^１６粒子／ｋｇの用量で対象に投与される、実施形態１５６～１７８のいずれか１つに記載の方法。

【0653】

実施形態１８２．ＸＤＰが、少なくとも約１×１０^５粒子／ｋｇ～約１×１０^１６粒子／ｋｇ、又は少なくとも約１×１０^６粒子／ｋｇ～約１×１０^１５粒子／ｋｇ、又は少なくとも約１×１０^７粒子／ｋｇ～約１×１０^１４粒子／ｋｇの用量で対象に投与される、実施形態１５６～１７８のいずれか１つに記載の方法。

【0654】

実施形態１８３．ベクター又はＸＤＰが、実質内、静脈内、動脈内、腹腔内（intraperitoneal）、嚢内、皮下、筋肉内、腹腔内（intraabdominally）、又はそれらの組み合わせから選択される投与経路によって対象に投与され、投与方法が、注射、輸血、又は移植である、実施形態１５６～１８２のいずれか１つに記載の方法。

【0655】

実施形態１８４．方法が、対象における少なくとも１つの臨床的に関連するエンドポイントの改善をもたらす、実施形態１５６～１８３のいずれか１つに記載の方法。

【0656】

実施形態１８５．方法が、末端臓器疾患の発生、アルブミン尿、高血圧、衰弱状態、低張尿、拡張機能障害、機能的な運動能力、急性冠症候群、疼痛事象、疼痛重篤度、貧血症、溶血、組織低酸素症、臓器機能障害、異常なヘマトクリット値、小児死亡率、脳卒中の発生率、ベースラインと比較したヘモグロビンレベル、ＨｂＦレベル、肺塞栓症の発生率の低下、血管閉塞危機の発生率、赤血球中のヘモグロビンＳの濃度、入院率、肝臓鉄濃度、必要な輸血、及び生活の質スコアからなる群から選択される少なくとも１つの臨床的に関連するパラメータの改善をもたらす、実施形態１８４に記載の方法。

【0657】

実施形態１８６．方法が、末端臓器疾患の発生、アルブミン尿、高血圧、衰弱状態、低張尿、拡張機能障害、機能的な運動能力、急性冠症候群、疼痛事象、疼痛重篤度、貧血症、溶血、組織低酸素症、臓器機能障害、異常なヘマトクリット値、小児死亡率、脳卒中の発生率、ベースラインと比較したヘモグロビンレベル、ＨｂＦレベル、肺塞栓症の発生率の低下、血管閉塞危機の発生率、赤血球中のヘモグロビンＳの濃度、入院率、肝臓鉄濃度、必要な輸血、及び生活の質スコアからなる群から選択される少なくとも２つの臨床的に関連するパラメータの改善をもたらす、実施形態１８４に記載の方法。

【0658】

実施形態１８７．異常ヘモグロビン症を有する対象を治療するための方法であって、
ａ．対象から人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）又は造血幹細胞（ＨＳＣ）を単離することと、
ｂ．実施形態１１０～１２６のいずれか１つに記載の方法によって、ｉＰＳＣ又はＨＳＣのＢＣＬ１１Ａ標的核酸を改変することと、
ｃ．改変されたｉＰＳＣ又はＨＳＣを造血前駆細胞に分化させることと、
ｄ．異常ヘモグロビン症を有する対象に造血前駆細胞を移植することと、を含み、
方法が、治療前の対象におけるヘモグロビンＦ（ＨｂＦ）のレベルと比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、又は少なくとも約５０％の対象の循環血液中のＨｂＦのレベルの増加をもたらす、方法。

【0659】

実施形態１８８．ｉＰＳＣ又はＨＳＣが、自己由来であり、対象の骨髄又は末梢血から単離される、実施形態１８７に記載の方法。

【0660】

実施形態１８９．ｉＰＳＣ又はＨＳＣが、同種であり、異なる対象の骨髄又は末梢血から単離される、実施形態１８７に記載の方法。

【0661】

実施形態１９０．移植することが、移植、局所注射、全身注入、又はそれらの組み合わせによって対象に造血前駆細胞を投与することを含む、実施形態１８７～１８９のいずれか１つに記載の方法。

【0662】

実施形態１９１．異常ヘモグロビン症が、鎌状赤血球症又はβサラセミアである、実施形態１８７～１９０のいずれか１つに記載の方法。

【0663】

実施形態１９２．ゲノム編集によって対象において胎児型ヘモグロビン（ＨｂＦ）を増加させる方法であって、
ａ．有効用量の実施形態９０～９５のいずれか１つに記載のベクター又は実施形態１０１～１０７のいずれか１つに記載のＸＤＰを対象に投与することであって、ベクター又はＸＤＰが、対象の細胞に、ＣａｓＸ：ｇＲＮＡシステムを送達する、投与することと、
ｂ．対象の細胞のＢＣＬ１１Ａ標的核酸が、第１のｇＲＮＡによって標的化されるＣａｓＸによって編集されることと、
ｃ．ＢＣＬ１１Ａタンパク質の発現が低減又は排除されるように、編集することが、標的核酸配列において１つ以上のヌクレオチドの挿入、欠失、置換、重複、又は逆位を導入することを含むことと、を含み、
方法が、治療前の対象におけるヘモグロビンＦ（ＨｂＦ）のレベルと比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、又は少なくとも約５０％の対象の循環血液中のＨｂＦのレベルの増加をもたらす、方法。

【0664】

実施形態１９３．方法が、少なくとも０．０１：１．０、少なくとも０．０２５：１．０、少なくとも０．０５：１．０、少なくとも０．０７５：１．０、少なくとも０．１：１．０、少なくとも０．２：１．０、少なくとも０．３：１．０、少なくとも０．４：１．０、少なくとも０．５：１：０、少なくとも０．７５：１．０、少なくとも１．０：１．０、少なくとも１．２５：１．０、少なくとも１．５：１．０、又は少なくとも１．７５：１．０の対象におけるＨｂＦ対ヘモグロビンＳ（ＨｂＳ）の比をもたらす、実施形態１９２に記載の方法。

【0665】

実施形態１９４．方法が、対象における総循環ヘモグロビンの少なくとも約５％、又は少なくとも約１０％、又は少なくとも約２０％、又は少なくとも約３０％のＨｂＦレベルをもたらす、実施形態１９２又は実施形態１９３に記載の方法。

【0666】

実施形態１９５．細胞が、造血幹細胞（ＨＳＣ）、造血前駆細胞（ＨＰＣ）、ＣＤ３４＋細胞、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、骨髄系共通前駆細胞、前赤芽球細胞、及び赤芽球細胞からなる群から選択される、実施形態１９２～１９４のいずれか１つに記載の方法。

【0667】

実施形態１９６．ＢＣＬ１１Ａタンパク質の発現が、編集されていない細胞の標的核酸と比較して、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、又は少なくとも約９０％減少するように、細胞の標的核酸が編集されている、実施形態１９２～１９５のいずれか１つに記載の方法。

【0668】

実施形態１９７．対象が、マウス、ラット、ブタ、及び非ヒト霊長類からなる群から選択される、実施形態１９２～１９６のいずれか１つに記載の方法。

【0669】

実施形態１９８．対象が、ヒトである、実施形態１９２～１９６のいずれか１つに記載の方法。

【0670】

実施形態１９９．ベクターが、少なくとも約１×１０５ベクターゲノム／ｋｇ（ｖｇ／ｋｇ）、少なくとも約１×１０６ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０７ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０８ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０９ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０１０ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０１１ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０１２ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０１３ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０１４ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０１５ｖｇ／ｋｇ、又は少なくとも約１×１０１６ｖｇ／ｋｇの用量で投与される、実施形態１９２～１９８のいずれか１つに記載の方法。

【0671】

実施形態２００．ＸＤＰが、少なくとも約１×１０^５粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０^６粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０^７粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０^８粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０^９粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０^１０粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０^１１粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０^１２粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０^１３粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０^１４粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０^１５粒子／ｋｇ、又は少なくとも約１×１０^１６粒子／ｋｇの用量で投与される、実施形態１９２～１９８のいずれか１つに記載の方法。

【0672】

実施形態２０１．ベクター又はＸＤＰが、移植、局所注射、全身注入、又はそれらの組み合わせから選択される投与経路によって投与される、実施形態１９２～２００のいずれか１つに記載の方法。

【0673】

実施形態２０２．異常ヘモグロビン症の治療のための医薬品として使用するための、実施形態１～８５のいずれか１つに記載のシステム、実施形態８６～８９のいずれか１つに記載の核酸、９０～９５のいずれか１つに記載のベクター、実施形態１０１～１０４のいずれか１つに記載のＸＤＰ、実施形態１０８若しくは実施形態１０９に記載の宿主細胞、又は実施形態１４４若しくは実施形態１４５に記載の細胞集団。

【0674】

実施形態２０３．標的核酸配列が、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列の１ヌクレオチド３’側に位置する非標的鎖配列に相補的である、実施形態１に記載のシステム。

【0675】

実施形態２０４．ＰＡＭ配列が、ＴＣモチーフを含む、実施形態２０３に記載のシステム。

【0676】

実施形態２０５．ＰＡＭ配列が、ＡＴＣ、ＧＴＣ、ＣＴＣ、又はＴＴＣを含む、実施形態２０４に記載のシステム。

【0677】

実施形態２０６．クラス２ Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質が、ＲｕｖＣドメインを含む、実施形態２０３～２０５のいずれか１つに記載のシステム。

【0678】

実施形態２０７．ＲｕｖＣドメインが、標的核酸配列においてずれた二本鎖切断を生成する、実施形態２０６に記載のシステム。

【0679】

実施形態２０８．クラス２ Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質が、ＨＮＨヌクレアーゼドメインを含まない、実施形態２０３～２０７のいずれか１つに記載のシステム。

【実施例】

【0680】

実施例１：ＣａｓＸバリアント構築物の生成
ＣａｓＸ ４８８構築物（表６の配列）を生成するために、コドン最適化ＣａｓＸ １１９構築物（Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｔｅｓ ＣａｓＸ配列番号２をコードし、アミノ酸置換及び欠失を有する、ＣａｓＸ Ｓｔｘ２構築物に基づく）を、標準的なクローニング方法を使用して目的のプラスミド（ｐＳｔＸ）にクローニングした。ＣａｓＸ ４９１構築物（表６の配列）を生成するために、コドン最適化ＣａｓＸ ４８４構築物（Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｔｅｓ ＣａｓＸ配列番号２をコードし、特定のアミノ酸の置換及び欠失を有し、ＮＬＳに融合され、ガイド配列及び非標的化配列に連結された、ＣａｓＸ Ｓｔｘ２構築物に基づく）を、標準的なクローニング方法を使用して目的のプラスミド（ｐＳｔＸ）にクローニングした。標準的なクローニング方法を使用して、構築物ＣａｓＸ １（ＣａｓＸ配列番号１）を目的のベクターにクローニングした。ＣａｓＸ ４８８を構築するために、ＣａｓＸ １１９構築物ＤＮＡを、適切なユニバーサルプライマーを使用して、製造業者のプロトコルに従ってＱ５ ＤＮＡポリメラーゼを使用して、２つの反応でＰＣＲ増幅した。ＣａｓＸ ４９１を構築するために、コドン最適化ＣａｓＸ ４８４構築物ＤＮＡを、適切なプライマーを使用して、製造業者のプロトコルに従ってＱ５ ＤＮＡポリメラーゼを使用して、２つの反応でＰＣＲ増幅した。ＣａｓＸ １構築物を、適切なユニバーサルプライマーを使用して、製造業者のプロトコルに従ってＱ５ ＤＮＡポリメラーゼを使用して、２つの反応でＰＣＲ増幅した。各ＰＣＲ産物を、製造業者のプロトコルに従ってＺｙｍｏｃｌｅａｎゲルＤＮＡ回収キットを使用して、１％アガロースゲル（Ｇｏｌｄ Ｂｉｏ カタログ番号Ａ－２０１－５００）からのゲル抽出によって精製した。次いで、製造業者のプロトコルに従って、Ｇｉｂｓｏｎアセンブリ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ カタログ番号Ｅ２６２１Ｓ）を使用して、対応する断片をつなぎ合わせた。ｐＳｔｘ１において構築された産物を、化学的にコンピテントなＴｕｒｂｏコンピテントＥ．ｃｏｌｉ細菌細胞に形質転換し、カナマイシンを含有するＬＢ寒天プレート上にプレーティングした。個々のコロニーを採取し、製造業者のプロトコルに従ってＱｉａｇｅｎスピンミニプレップキットを使用してミニプレップした。得られたプラスミドを、サンガー配列決定を使用して配列決定して、正しい構築を確認した。次いで、正しいクローンを、制限酵素クローニングを使用して、哺乳動物発現ベクターｐＳｔｘ３４にサブクローニングした。ｐＳｔｘ１におけるｐＳｔｘ３４骨格、並びにＣａｓＸ ４８８及び４９１クローンを、それぞれＸｂａＩ及びＢａｍＨＩで消化した。消化した骨格及びそれぞれの挿入断片を、製造業者のプロトコルに従ってＺｙｍｏｃｌｅａｎゲルＤＮＡ回収キットを使用して、１％アガロースゲル（Ｇｏｌｄ Ｂｉｏカタログ番号Ａ－２０１－５００）からのゲル抽出によって精製した。次いで、製造業者のプロトコルに従ってＴ４リガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓカタログ番号Ｍ０２０２Ｌ）を使用して、きれいな骨格及びインサートを一緒にライゲーションした。ライゲーション産物を、化学的にコンピテントなＴｕｒｂｏコンピテントＥ．ｃｏｌｉ細菌細胞に形質転換し、カルベニシリンを含有するＬＢ寒天プレート上にプレーティングした。個々のコロニーを採取し、製造業者のプロトコルに従ってＱｉａｇｅｎスピンミニプレップキットを使用してミニプレップした。得られたプラスミドを、サンガー配列決定を使用して配列決定して、正しい構築を確認した。

【0681】

ＣａｓＸ ５１５（表６の配列）を構築するために、ＣａｓＸ ４９１構築物ＤＮＡを、適切なプライマーを使用して、製造業者のプロトコルに従ってＱ５ ＤＮＡポリメラーゼを使用して、２つの反応でＰＣＲ増幅した。ＣａｓＸ ５２７（表６の配列）を構築するために、ＣａｓＸ ４９１構築物ＤＮＡを、適切なプライマーを使用して、製造業者のプロトコルに従ってＱ５ ＤＮＡポリメラーゼを使用して、２つの反応でＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ産物を、製造業者のプロトコルに従ってＺｙｍｏｃｌｅａｎゲルＤＮＡ回収キットを使用して、１％アガロースゲルからのゲル抽出によって精製した。ｐＳｔＸ骨格を、プラスミドｐＳｔｘ５６における２部位間のＤＮＡの２９３１塩基対断片を除去するために、ＸｂａＩ及びＳｐｅＩを使用して消化した。消化した骨格断片を、製造業者のプロトコルに従ってＺｙｍｏｃｌｅａｎゲルＤＮＡ回収キットを使用して、１％アガロースゲルからのゲル抽出によって精製した。次いで、製造業者のプロトコルに従ってＧｉｂｓｏｎアセンブリ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓカタログ番号Ｅ２６２１Ｓ）を使用して、挿入断片及び骨格断片をつなぎ合わせた。ｐＳｔｘ５６において構築された産物を、化学的にコンピテントなＴｕｒｂｏコンピテントＥ．ｃｏｌｉ細菌細胞に形質転換し、カナマイシンを含むＬＢ寒天プレート上にプレーティングした。個々のコロニーを採取し、製造業者のプロトコルに従ってＱｉａｇｅｎスピンミニプレップキットを使用してミニプレップした。得られたプラスミドを、サンガー配列決定を使用して配列決定して、正しい構築を確認した。ｐＳｔＸ３４は、タンパク質マーカー並びにピューロマイシン及びカルベニシリンの両方の選択マーカーのためのＥＦ－１αプロモーターを含む。ｐＳｔＸ５６は、タンパク質マーカー並びにピューロマイシン及びカルベニシリンの両方の選択マーカーのためのＥＦ－１αプロモーターを含む。目的の遺伝子を標的化する標的化配列をコードする配列を、ＣａｓＸ ＰＡＭの位置に基づいて設計した。標的配列及びこの配列の逆相補体からなる、一本鎖ＤＮＡ（single-stranded DNA、ｓｓＤＮＡ）オリゴ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）としての標的配列ＤＮＡを注文した。これらの２つのオリゴを、一緒にアニールし、プラスミドのためのＴ４ ＤＮＡリガーゼ及び適切な制限酵素を使用して、Ｇｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅアセンブリによって、個々に又はバルクで、ｐＳｔＸにクローニングした。Ｇｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅ産物を、ＮＥＢ ＴｕｒｂｏコンピテントＥ．ｃｏｌｉ（ＮＥＢカタログ番号Ｃ２９８４Ｉ）などの化学的又は電気的にコンピテントな細胞に形質転換し、適切な抗生物質を含有するＬＢ寒天プレートにプレーティングした。個々のコロニーを採取し、製造業者のプロトコルに従ってＱｉａｐｒｅｐスピンミニプレップキットを使用してミニプレップした。得られたプラスミドを、サンガー配列決定を使用して配列決定して、正しいライゲーションを確認した。

【0682】

ＣａｓＸ ５３５－５３７（表６の配列）を構築するために、ＣａｓＸ ５１５構築物ＤＮＡを、製造業者のプロトコルに従ってＱ５ ＤＮＡポリメラーゼを使用して、各構築物について２つの反応でＰＣＲ増幅した。ＣａｓＸ ５３５については、適切なプライマーを増幅に使用した。ＣａｓＸ ５３６については、適切なプライマーを使用した。ＣａｓＸ ５３７については、適切なプライマーを使用した。ＰＣＲ産物を、製造業者のプロトコルに従ってＺｙｍｏｃｌｅａｎゲルＤＮＡ回収キットを使用して、１％アガロースゲルからのゲル抽出によって精製した。ｐＳｔＸ骨格を、プラスミドｐＳｔｘ５６における２部位間のＤＮＡの２９３１塩基対断片を除去するために、ＸｂａＩ及びＳｐｅＩを使用して消化した。消化した骨格断片を、製造業者のプロトコルに従ってＺｙｍｏｃｌｅａｎゲルＤＮＡ回収キットを使用して、１％アガロースゲルからのゲル抽出によって精製した。次いで、製造業者のプロトコルに従ってＧｉｂｓｏｎアセンブリを使用して、挿入断片及び骨格断片をつなぎ合わせた。ｐＳｔｘ５６において構築された産物を、化学的にコンピテントなＴｕｒｂｏコンピテントＥ．ｃｏｌｉ細菌細胞に形質転換し、カナマイシンを含有するＬＢ寒天プレート上にプレーティングした。個々のコロニーを採取し、製造業者のプロトコルに従ってＱｉａｇｅｎスピンミニプレップキットを使用してミニプレップした。得られたプラスミドを、サンガー配列決定を使用して配列決定して、正しい構築を確認した。ｐＳｔＸ３４は、タンパク質マーカー並びにピューロマイシン及びカルベニシリンの両方の選択マーカーのためのＥＦ－１αプロモーターを含む。ｐＳｔＸ５６は、タンパク質マーカー並びにピューロマイシン及びカルベニシリンの両方の選択マーカーのためのＥＦ－１αプロモーターを含む。目的の遺伝子を標的化する標的化配列をコードする配列を、ＣａｓＸ ＰＡＭの位置に基づいて設計した。標的配列及びこの配列の逆相補体からなる、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）オリゴ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）としての標的配列ＤＮＡを注文した。これらの２つのオリゴを、一緒にアニールし、プラスミドのためのＴ４ ＤＮＡリガーゼ及び適切な制限酵素を使用して、Ｇｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅアセンブリによって、個々に又はバルクで、ｐＳｔＸにクローニングした。Ｇｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅ産物を、ＮＥＢ ＴｕｒｂｏコンピテントＥ．ｃｏｌｉなどの化学的又は電気的にコンピテントな細胞に形質転換し、適切な抗生物質を含有するＬＢ寒天プレートにプレーティングした。個々のコロニーを採取し、製造業者のプロトコルに従ってＱｉａｐｒｅｐスピンミニプレップキットを使用してミニプレップした。得られたプラスミドを、サンガー配列決定を使用して配列決定して、正しいライゲーションを確認した。

【0683】

全てのその後のＣａｓＸバリアント、例えば、ＣａｓＸ ５４４及びＣａｓＸ ６６０～６６４、６６８、６７０、６７２、６７６、及び６７７を、変異特異的内部プライマー並びにユニバーサルフォワード及びリバースプライマー（設計された変異特異的プライマー並びに使用されたＣａｓＸ基本構築物がそれらの間の違いであった）を用いるＧｉｂｓｏｎアセンブリを使用して、上記と同じ方法論を使用してクローニングした。ＳａＣａｓ９及びＳｐｙＣａｓ９対照プラスミドを、ｐＳｔＸのタンパク質及びガイド領域をそれぞれのタンパク質及びガイドに交換して、上記のｐＳｔＸプラスミドと同様に調製した。ＳａＣａｓ９及びＳｐｙＣａｓ９の標的化配列は、文献から得たか、又は確立された方法に従って合理的に設計した。

【0684】

ＣａｓＸ構築物の発現及び回収を、標準的な方法論を使用して実施し、以下のように要約する。

【0685】

精製：
凍結試料を、磁気撹拌しながら４℃で一晩解凍した。得られた溶解物の粘度を音波処理によって低下させ、ＮａｎｏＤｅＢＥＥ（ＢＥＥ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を使用して、２０，０００ＰＳＩで２回通してホモジナイズすることによって溶解を完了させた。溶解物を、５０，０００×ｇ、４℃で３０分間の遠心分離によって清澄化し、上清を回収した。清澄化した上清を、ＡＫＴＡ Ｐｕｒｅ ＦＰＬＣ（Ｃｙｔｉｖａ）を使用して、ヘパリン６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗカラム（Ｃｙｔｉｖａ）に適用した。カラムを、５カラム体積（ＣＶ）のヘパリン緩衝液Ａ（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＮａＯＨ、２５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．５ｍＭ ＴＣＥＰ、１０％グリセロール、ｐＨ８）で洗浄し、次いで、３ＣＶのヘパリン緩衝液Ｂ（ＮａＣｌ濃度を５００ｍＭに調整した緩衝液Ａ）で洗浄した。タンパク質を、１．７５ＣＶのヘパリン緩衝液Ｃ（ＮａＣｌ濃度を１Ｍに調整した緩衝液Ａ）で溶出した。溶出液を、ＦＰＬＣを使用して、ＳｔｒｅｐＴａｃｔｉｎ ＨＰカラム（Ｃｙｔｉｖａ）に適用した。カラムを、１０ ＣＶのＳｔｒｅｐ緩衝液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＮａＯＨ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．５ｍＭ ＴＣＥＰ、１０％グリセロール、ｐＨ８）で洗浄した。タンパク質を、２．５ｍＭデスチオビオチンを添加した１．６５ＣＶのＳｔｒｅｐ緩衝液を使用して、カラムから溶出した。ＣａｓＸ含有画分をプールし、５０ｋＤａカットオフの遠心濃縮器（Ａｍｉｃｏｎ）を使用して４℃で濃縮し、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ｐｇカラム（Ｃｙｔｉｖａ）でのサイズ排除クロマトグラフィーによって精製した。カラムを、ＳＥＣ緩衝液（２５ｍＭ リン酸ナトリウム、３００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＴＣＥＰ、１０％グリセロール、ｐＨ７．２５）で平衡化し、ＦＰＬＣによって操作した。適切な分子量で溶出したＣａｓＸ含有画分をプールし、５０ｋＤａカットオフ遠心濃縮器を使用して４℃で濃縮し、アリコートし、液体窒素中で急速凍結した後、－８０℃で保存した。

【0686】

ＣａｓＸバリアント４８８：平均収量は、コロイドクーマシー染色によって評価して、９８．８％純度で、培養物１リットル当たり２．７ｍｇの精製ＣａｓＸタンパク質であった。

【0687】

ＣａｓＸバリアント４９１：平均収量は、コロイドクーマシー染色によって評価して、９９．４％純度で、培養物１リットル当たり１２．４ｍｇの精製ＣａｓＸタンパク質であった。

【0688】

ＣａｓＸバリアント５１５：平均収量は、コロイドクーマシー染色によって評価して、純度９０％で培養物１リットル当たり７．８ｍｇの精製ＣａｓＸタンパク質であった。

【0689】

ＣａｓＸバリアント５２６：平均収量は、９３％純度で、培養物１リットル当たり１３．７９ｍｇであった。純度は、コロイドクーマシー染色によって評価した。

【0690】

【表9】

【0691】

実施例２：ＲＮＡガイドの生成
ＲＮＡシングルガイド及び標的化配列を生成するために、Ｑ５ポリメラーゼ、各骨格に対する鋳型プライマー、並びにＴ７プロモーター及び標的化配列を有する増幅プライマーを用いてＰＣＲを行うことによって、インビトロ転写のための鋳型を生成した。Ｔ７プロモーターに対するＤＮＡプライマー配列、ガイド及び標的化配列のためのガイド及び標的化配列を、以下の表７に示す。ｓｇ１、ｓｇ２、ｓｇ３２、ｓｇ６４、ｓｇ１７４、及びｓｇ２３５は、それぞれ配列番号４、５、２１０４、２１０６、２２３８、及び２６８００に対応するが、但し、ｓｇ２、ｓｇ３２、及びｓｇ６４は、転写効率を増加させるために追加の５’Ｇで改変した（表７の配列を表３と比較されたい）。７．３７標的化配列は、β２－ミクログロブリン（beta2-microglobulin、Ｂ２Ｍ）を標的化する。ＰＣＲ増幅後、鋳型をきれいにし、フェノール－クロロホルム－イソアミルアルコール抽出によって単離し、続いて、エタノール沈殿を行った。

【0692】

インビトロ転写を、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０、３０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、０．０１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、２ｍＭスペルミジン、２０ｍＭ ＤＴＴ、５ｍＭ ＮＴＰ、０．５μＭ鋳型、及び１００μｇ／ｍＬ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを含有する緩衝液中で行った。反応物を、３７℃で一晩インキュベートした。１ｍＬの転写容量当たり２０単位のＤＮａｓｅ Ｉ（Ｐｒｏｍｅｇａ ＃Ｍ６１０１）を添加し、１時間インキュベートした。ＲＮＡ産物を、変性ＰＡＧＥによって精製し、エタノール沈殿し、１×リン酸緩衝生理食塩水に再懸濁した。ｓｇＲＮＡをフォールディングするために、試料を、５分間７０℃に加熱し、次いで、室温に冷却した。反応物に最終濃度が１ｍＭになるようにＭｇＣｌ_２を補充し、５分間５０℃に加熱し、次いで、室温に冷却した。最終ＲＮＡガイド産物を、－８０℃で保存した。

【0693】

【表10】

【0694】

実施例３：ガイドＲＮＡに対する結合親和性の評価
精製された野生型及び改良型ＣａｓＸを、塩化マグネシウム並びに非特異的結合及び凝集を防止するためのヘパリンを含有する低塩緩衝液中で、３’側にＣｙ７．５部分を含有する合成シングルガイドＲＮＡとインキュベートする。ｓｇＲＮＡは、１０ｐＭの濃度で維持し、タンパク質は、別個の結合反応で、１ｐＭから１００μＭまで滴定する。反応を平衡に到達させた後、試料を、それぞれタンパク質及び核酸に結合するニトロセルロース膜及び正に荷電したナイロン膜を用いた真空マニホールド膜結合アッセイにかける。膜を画像化して、ガイドＲＮＡを同定し、結合ＲＮＡ対非結合ＲＮＡの割合を、各タンパク質濃度についてニトロセルロース膜対ナイロン膜上の蛍光量によって決定して、タンパク質－ｓｇＲＮＡ複合体の解離定数を計算する。実験はまた、これらの変異が野生型及び変異体タンパク質に対するガイドの親和性にも影響を及ぼすかどうかを判定するために、ｓｇＲＮＡの改良型バリアントを用いて実施される。本発明者らはまた、電気移動度シフトアッセイを実施して、膜結合アッセイと定性的に比較し、凝集ではなく可溶性結合が、タンパク質－ＲＮＡ会合への主要な寄与因子であることを確認する。

【0695】

実施例４：標的ＤＮＡに対する結合親和性の評価
精製された野生型及び改良ＣａｓＸは、標的核酸に相補的な標的化配列を有するシングルガイドＲＮＡと複合体化する。ＲＮＰ複合体を、塩化マグネシウム並びに非特異的結合及び凝集を防止するためのヘパリンを含有する低塩緩衝液中で、ＰＡＭ及び標的鎖上の５’側にＣｙ７．５部分を有する適切な標的核酸配列を含有する二本鎖標的ＤＮＡとインキュベートする。標的ＤＮＡは、１ｎＭの濃度で維持し、一方、ＲＮＰは、別個の結合反応で、１ｐＭから１００μＭまで滴定する。反応を平衡に到達させた後、試料を、未変性５％ポリアクリルアミドゲル上で泳動して、結合及び非結合標的ＤＮＡを分離する。ゲルを画像化して、標的ＤＮＡの移動度シフトを同定し、結合対非結合ＤＮＡの割合を、各タンパク質濃度について計算して、ＲＮＰ－標的ＤＮＡ三元複合体の解離定数を決定する。

【0696】

実施例５：インビトロでの差次的ＰＡＭ認識の評価
１．参照バリアント及びＣａｓＸバリアントの比較
本質的に実施例８に記載されるように、インビトロ切断アッセイを、ｓｇ１７４．７．３７と複合体化したＣａｓＸ２、ＣａｓＸ１１９、及びＣａｓＸ４３８を使用して実施した。７．３７スペーサー及びＴＴＣ、ＣＴＣ、ＧＴＣ、又はＡＴＣ ＰＡＭのいずれかを有する蛍光標識されたｄｓＤＮＡ標的を使用した（配列は表８）。０．２５、０．５、１、２、５、１０、３０、及び６０分の時点をとった。ゲルをＣｙｔｉｖａ Ｔｙｐｈｏｏｎで画像化し、ＩＱＴＬ ８．２ソフトウェアを使用して定量化した。各標的上の各ＣａｓＸ：ｓｇＲＮＡ複合体について、非標的鎖切断の見かけの一次速度定数（ｋ切断）を決定した。非ＴＴＣ ＰＡＭを有する標的についての速度定数を、ＴＴＣ ＰＡＭ標的と比較して、各ＰＡＭについての相対優先度が所与のタンパク質バリアントにおいて変化したかどうかを決定した。

【0697】

全てのバリアントについて、ＴＴＣ標的が最も高い切断速度を支持し、続いてＡＴＣ標的、次いでＣＴＣ標的、最後にＧＴＣ標的であった（図１０Ａ～図１０Ｄ、表９）。ＣａｓＸバリアント及びＮＴＣ ＰＡＭの各組み合わせについての切断速度ｋ_切断を示す。全ての非ＮＴＣ ＰＡＭについて、そのバリアントのＴＴＣ速度と比較した相対切断速度を括弧内に示す。全ての非ＴＴＣ ＰＡＭは、切断速度の大幅な減少（全てについて＞１０倍）を示した。特定のバリアントについての所与の非ＴＴＣ ＰＡＭの切断速度とＴＴＣ ＰＡＭの切断速度との間の比は、全てのバリアントにわたって概して一貫したままであった。ＣＴＣ標的は、ＴＴＣ標的の３．５～４．３％の速さで切断を支持し、ＧＴＣ標的は、１．０～１．４％の速さで切断を支持し、ＡＴＣ標的は、６．５～８．３％の速さで切断を支持した。例外は４９１であり、ここでは、ＴＴＣ ＰＡＭでの切断速度が速すぎて正確な測定ができず、これは、ＴＴＣと非ＴＴＣ ＰＡＭとの間の見かけの差を人為的に減少させる。測定可能な範囲内に入るＧＴＣ、ＣＴＣ、及びＡＴＣ ＰＡＭに対する４９１の相対速度を比較すると、非ＴＴＣ ＰＡＭ間で比較した場合、他のバリアントのものと同等の比が得られ、これは、タンデムで増加する速度と一致する。全体として、バリアント間の差異は、様々なＮＴＣ ＰＡＭに対する相対優先度が変化していることを示唆するほど大きくはない。しかしながら、バリアントの基底切断速度がより高いため、ＡＴＣ又はＣＴＣ ＰＡＭを有する標的が１０分以内にほぼ完全に切断され、見かけのｋ_切断は、ＴＴＣ ＰＡＭ上のＣａｓＸ２のｋ_切断と同等か、又はそれよりも大きい（表９）。この切断速度の増加は、ヒト細胞における有効なゲノム編集に必要な閾値を超えている可能性があり、これらのバリアントに対するＰＡＭの柔軟性が明らかに増加していることを説明する。

【0698】

【表11】

^＊各々のＰＡＭ配列は太字である。ＴＳ－標的鎖。ＮＴＳ－非標的鎖。

【0699】

【表12】

【0700】

２．単一ＣａｓＸバリアントを使用したＰＡＭ認識の比較
材料及び方法
７．３７スペーサー及びＴＴＣ、ＣＴＣ、ＧＴＣ、ＡＴＣ、ＴＴＴ、ＣＴＴ、ＧＴＴ、又はＡＴＴ ＰＡＭのいずれかを有する蛍光標識されたｄｓＤＮＡ標的を使用した（配列は表１０）。５’アミノ改変を有するオリゴを注文し、標的鎖オリゴについてはＣｙ７．５ ＮＨＳエステルで標識し、非標的鎖オリゴについてはＣｙ５．５ ＮＨＳエステルで標識した。オリゴを１：１の比で１×切断緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＴＣＥＰ、５％グリセロール、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２）中で混合し、１０分間９５℃に加熱し、溶液を室温に冷却することによって、ｄｓＤＮＡ標的を形成した。

【0701】

ＣａｓＸバリアント４９１を、ｓｇ１７４．７．３７と複合体化した。ガイドを１×切断緩衝液で１．５μＭの最終濃度に希釈し、次いで、タンパク質を１μＭの最終濃度に添加した。ＲＮＰを３７℃で１０分間インキュベートし、次いで、氷上に置いた。

【0702】

切断アッセイは、ＲＮＰを切断緩衝液で２００ｎＭの最終濃度に希釈し、ｄｓＤＮＡ標的を１０ｎＭの最終濃度に添加することによって行った。０．２５、０．５、１、２、５、及び１０分の時点をとり、等量の９５％ホルムアミド及び２０ｍＭ ＥＤＴＡを添加することによってクエンチした。切断産物を、１０％尿素－ＰＡＧＥゲル上で泳動することによって分離した。ゲルをＡｍｅｒｓｈａｍ Ｔｙｐｈｏｏｎで画像化し、ＩＱＴＬ ８．２ソフトウェアを使用して定量化した。非標的鎖切断の見かけの一次速度定数（ｋ切断）を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを使用して各標的について決定した。

【0703】

結果：
様々なＰＡＭに対する４９１．１７４ ＲＮＰの相対切断速度を調べた。細胞における標的及び潜在的なオフターゲットの切断効率の予測を助けることに加えて、これらのデータにより、合成標的の切断速度を調整することが可能になる。自己標的化を可能にするために新しいプロトスペーサーをベクター内に加えることができる自己制限ＡＡＶベクターの場合、本発明者らは、ＰＡＭを変化させることによってエピソームの切断速度を上下に調節することができると推論した。

【0704】

本発明者らは、ＰＡＭを除いて配列が同一である様々なｄｓＤＮＡ基質に対するＲＮＰの切断速度を試験した。この実験設定は、ＰＡＭ認識をスペーサー配列及びゲノムの状況から生じる効果で複雑にするのではなく、ＰＡＭ自体の効果の単離を可能にするはずである。全てのＮＴＣ及びＮＴＴ ＰＡＭを試験した。予想通り、ＲＮＰは、ＴＴＣ ＰＡＭを有する標的を最も迅速に切断し、第１の時点までに本質的に全てを生成物に変換した（図１１Ａ）。ＣＴＣは、およそ半分の速さで切断されたが、ＴＴＣの急速な切断により、より幅広い切断速度を捕捉するように最適化されたこれらのアッセイ条件下で、正確なｋ切断を決定することが困難になる（図１１Ａ、表１１）。ＧＴＣ標的は、ＮＴＣ ＰＡＭの中で最もゆっくりと切断され、切断速度はＴＴＣ標的よりもおよそ６倍遅かった。全てのＮＴＴ ＰＡＭは、全てのＮＴＣ ＰＡＭよりもゆっくりと切断され、ＴＴＴが最も効率的に切断され、ＧＴＴがそれに続いた（図１１Ｂ、表１１）。全てのＮＴＣ ＰＡＭと比較して低いＧＴＣの切断速度と比較した、全てのＮＴＴ ＰＡＭ間のＧＴＴ切断の相対的な効率は、個々のＰＡＭヌクレオチドの認識が状況依存的であり、ＰＡＭにおけるある位置でのヌクレオチド同一性が、他の位置での配列優先度に影響を及ぼすことを実証する。

【0705】

ここで試験したＰＡＭ配列は、同じスペーサー配列で切断活性を依然として維持しながら、３桁にわたる切断速度を生じる。これらのデータは、所与の合成標的における切断速度が、関連するＰＡＭを変化させることによって容易に改変され得、自己切断活性の調節を可能にして、ＡＡＶエピソームの切断及び排除の前にゲノム標的の効率的な標的化を可能にすることを実証する。

【0706】

【表13】

^＊各ｄｓＤＮＡ基質を生成するために使用したＤＮＡ配列を示す。各々のＰＡＭ配列は太字である。ＴＳ－標的鎖。ＮＴＳ－非標的鎖。

【0707】

【表14】

^＊ＴＴＣ切断の速度は、このアッセイの分解能を超えるので、得られたｋ_切断は、下限として解釈されるべきである。

【0708】

実施例６：二本鎖切断についてのヌクレアーゼ活性の評価
精製された野生型及び操作されたＣａｓＸバリアントは、固定されたＨＲＳ標的化配列を有するシングルガイドＲＮＡと複合体化する。ＲＮＰ複合体を、１００ｎＭの最終濃度でＭｇＣｌ２を含む緩衝液に添加し、１０ｎＭの濃度で標的鎖又は非標的鎖のいずれかの５’側にＣｙ７．５標識を有する二本鎖標的ＤＮＡとインキュベートする。反応物のアリコートを決まった時間に採取し、等量の５０ｍＭ ＥＤＴＡ及び９５％ホルムアミドの添加によってクエンチする。試料を、変性ポリアクリルアミドゲル上で泳動して、切断されたＤＮＡ基質と切断されていないＤＮＡ基質とを分離する。結果を可視化し、野生型及び操作されたバリアントによる標的及び非標的鎖の切断速度を決定する。標的結合に対する変化と核酸分解反応自体の触媒速度との間をより明確に区別するために、タンパク質濃度を１０ｎＭ～１ｕＭの範囲にわたって滴定し、切断速度を各濃度で決定して、偽ミカエリス－メンテン適合を生成し、ｋｃａｔ^＊及びＫＭ^＊を決定する。ＫＭ^＊の変化は変化した結合を示し、ｋｃａｔ^＊の変化は変化した触媒を示す。

【0709】

実施例７：ＰＡＳＳアッセイによる異なるＰＡＭ配列特異性のＣａｓＸタンパク質バリアントの同定
ＣａｓＸタンパク質２（配列番号２）、４９１（配列番号１２６）、５１５（配列番号１３３）、５３３（配列番号２６９０９）、５３５（配列番号２６９１１）、６６８（配列番号２７０４３）、及び６７２（配列番号２７０４６）のＰＡＭ配列特異性を同定するために実験を行った。これを達成するために、ＨＥＫ２９３細胞株であるＰＡＳＳ＿Ｖ１．０１又はＰＡＳＳ＿Ｖ１．０２を、少なくとも２回の反復実験で、上記のＣａｓＸタンパク質で処理し、次世代配列決定（ＮＧＳ）を実施して、意図された標的部位で様々なスペーサーを使用して、編集の割合（％）を計算した。

【0710】

材料及び方法：ＰＡＳＳシステムを使用してクローンタンパク質バリアントをアッセイするために、多重化プールアプローチをとった。簡潔には、２つのプールされたＨＥＫ２９３細胞株を生成し、ＰＡＳＳ＿Ｖ１．０１及びＰＡＳＳ＿Ｖ１．０２と名付けた。プール内の各細胞は、特定の標的部位と対になったゲノムに組み込まれたシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を含んでいた。タンパク質発現構築物のトランスフェクション後、特定のスペーサーによる特定の標的での編集を、ＮＧＳによって定量化することができた。各ガイド－標的対は、ＣａｓＸ－ガイドＲＮＰ複合体の活性、特異性、及び標的化能に関するデータを提供するように設計された。

【0711】

対のスペーサー－標的配列は、Ｔｗｉｓｔ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓによって合成され、等モルプールのオリゴヌクレオチドとして入手した。このプールを、ＰＣＲによって増幅し、Ｇｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅクローニングによってクローニングして、ｐ７７と名付けられたプラスミドの最終ライブラリを生成した。各プラスミドは、ＧＦＰ発現エレメントとともに、ｓｇＲＮＡ発現エレメント及び標的部位を含んでいた。ｓｇＲＮＡ発現エレメントは、ｇＲＮＡ足場１７４（配列番号２２３８）の転写を駆動するＵ６プロモーター、続いて、ガイド及びＣａｓＸバリアントのＲＮＰを意図された標的部位に標的化するスペーサー配列とからなった。２５０個の可能な固有の、対のスペーサー－標的合成配列を設計及び合成した。次いで、レンチウイルスのプールを、製造業者の説明書に従ってＬｅｎｔｉＸ産生システム（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ ＵＳＡ，Ｉｎｃ）を使用して、このプラスミドライブラリから産生した。次いで、得られたウイルス調製物を、ｑＰＣＲによって定量化し、単一コピーの組み込みを生成するように、低い感染多重度で標準ＨＥＫ２９３細胞株に形質導入した。次いで、得られた細胞株を、蛍光活性化細胞選別（fluorescence-activated cell sorting、ＦＡＣＳ）によって精製して、ＰＡＳＳ＿Ｖ１．０１又はＰＡＳＳ＿Ｖ１．０２の産生を完了した。次いで、細胞株を、６ウェルプレート形式で播種し、２連で、水で処理するか、又は２μｇのプラスミドｐ６７でトランスフェクトし、製造業者の説明書に従ってＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅトランスフェクション試薬（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）によって送達した。プラスミドｐ６７は、ＳＶ４０核局在化配列でタグ付けされたＣａｓＸタンパク質の発現を駆動するＥＦ－１αプロモーターを含む。２日後、処理した細胞を回収し、溶解させ、ゲノムＤＮＡ単離キット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用して、ゲノムＤＮＡを抽出した。次いで、ゲノムＤＮＡをカスタムプライマーを用いてＰＣＲ増幅して、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＮＧＳと適合性のアンプリコンを生成し、ＮｅｘｔＳｅｑ機器で配列決定した。試料リードを逆多重化し、品質についてフィルタリングした。次いで、編集結果メトリック（インデルを有するリードの割合）を、処理された試料にわたって、各スペーサー－標的合成配列について定量化した。

【0712】

ＣａｓＸタンパク質に対するＰＡＭ配列特異性を評価するために、４つの異なるＰＡＭ配列に対する編集結果メトリックを分類した。ＴＴＣ ＰＡＭ標的部位について、４８個の異なるスペーサー－標的対を定量化した（ＡＴＣ ＰＡＭ、ＣＴＣ ＰＡＭ、及びＧＴＣ ＰＡＭ標的部位について、１４、２２、及び１１個の個々の標的部位をそれぞれ定量化した）。いくつかのＣａｓＸタンパク質については、反復実験を数ヶ月間にわたって数十回繰り返した。これらの実験の各々について、平均編集効率を上記のスペーサーの各々について計算した。次いで、ＰＡＭ配列の４つのカテゴリにわたる平均編集効率を、これらの測定値の標準偏差とともに、全てのかかる実験から計算した。

【0713】

結果
表１２は、ＰＡＭカテゴリにわたる平均編集効率及びＣａｓＸタンパク質バリアントにわたる平均編集効率を、これらの測定値の標準偏差とともに列挙する。各カテゴリの測定回数も示されている。これらのデータは、操作されたＣａｓＸバリアント４９１及び５１５が、正準ＰＡＭ配列ＴＴＣに特異的である一方、ＣａｓＸの他の操作されたバリアントが、試験したＰＡＭ配列において多かれ少なかれ効率的に機能したことを示す。特に、ＣａｓＸ ４９１についてのＰＡＭ優先度の平均順位は、ＣａｓＸ ５１５についてＴＴＣ＞＞ＡＴＣ＞ＣＴＣ＞ＧＴＣ、又はＴＴＣ＞＞ＡＴＣ＞ＧＴＣ＞ＣＴＣであるが、野生型ＣａｓＸ ２は、ＴＴＣ＞＞ＧＴＣ＞ＣＴＣ＞ＡＴＣの平均順位を示す。より低い編集のＰＡＭ配列については、これらの平均測定値の誤差が大きいことに留意されたい。対照的に、ＣａｓＸバリアント５３５、６６８、及び６７２は、ＴＴＣ＞ＣＴＣ＞ＡＴＣ＞ＧＴＣの順位で、かなり広いＰＡＭ認識を有する。最後に、ＣａｓＸ ５３３は、ＷＴ ＣａｓＸと比較して、完全に並べ替えられた順位ＡＴＣ＞ＣＴＣ＞＞ＧＴＣ＞ＴＴＣを示す。これらのデータを使用して、目的の標的ＤＮＡ配列に対して最大限に活性な治療用ＣａｓＸ分子を操作することができる。

【0714】

実験の条件下で、配列ＴＴＣ、ＡＴＣ、ＣＴＣ、又はＧＴＣのＰＡＭに関連する標的ＤＮＡ配列でのヒト細胞における二本鎖ＤＮＡ切断について改良されたＣａｓＸタンパク質のセットが同定された。これは、ＣａｓＸバリアントが、非正準ＰＡＭ（すなわち、ＡＴＣ、ＣＴＣ、及びＧＴＣ）について、ＣａｓＸ ４９１と比較して、ＰＡＭ特異性の範囲が変化したことを支持している。

【0715】

【表15】

【0716】

実施例８：ＣａｓＸ：ｇＲＮＡインビトロ切断アッセイ
１．ＲＮＰの構築
精製された野生型及びＣａｓＸのＲＮＰ及びシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を、実験の直前に調製するか、又は調製して後で使用するために液体窒素中で瞬間凍結し、－８０℃で保存した。ＲＮＰ複合体を調製するために、ＣａｓＸタンパク質をｓｇＲＮＡと１：１．２のモル比でインキュベートした。簡潔には、ｓｇＲＮＡを、緩衝液＃１（２５ｍＭ ＮａＰｉ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２００ｍＭトレハロース、１ｍＭ ＭｇＣｌ２）に添加し、次いで、ＣａｓＸをｓｇＲＮＡ溶液にゆっくりとかき混ぜながら添加し、３７℃で１０分間インキュベートして、ＲＮＰ複合体を形成する。ＲＮＰ複合体を、使用前に２００μＬの緩衝液＃１で予め湿らせた０．２２μｍのＣｏｓｔａｒ ８１６０フィルターを通して濾過した。必要に応じて、ＲＮＰ試料を、０．５ｍＬ Ｕｌｔｒａ １００－Ｋｄカットオフフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ パーツ番号ＵＦＣ５１００９６）を用いて、所望の容量が得られるまで濃縮した。コンピテントＲＮＰの形成を以下に記載するように評価した。

【0717】

２．野生型参照ＣａｓＸと比較したタンパク質バリアントの切断コンピテント画分の決定
参照ＣａｓＸと比較して活性ＲＮＰを形成するＣａｓＸバリアントの能力を、インビトロ切断アッセイを使用して決定した。切断アッセイのためのβ－２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）７．３７標的を以下のように生成した。５’蛍光標識（それぞれ、ＬＩ－ＣＯＲ ＩＲＤｙｅ ７００及び８００）を有する配列ＴＧＡＡＧＣＴＧＡＣＡＧＣＡＴＴＣＧＧＧＣＣＧＡＧＡＴＧＴＣＴＣＧＣＴＣＣＧＴＧＧＣＣＴＴＡＧＣＴＧＴＧＣＴＣＧＣＧＣＴ（非標的鎖、ＮＴＳ（配列番号２７１７７））及びＡＧＣＧＣＧＡＧＣＡＣＡＧＣＴＡＡＧＧＣＣＡＣＧＧＡＧＣＧＡＧＡＣＡＴＣＴＣＧＧＣＣＣＧＡＡＴＧＣＴＧＴＣＡＧＣＴＴＣＡ（標的鎖、ＴＳ（配列番号２７１７６））を有するＤＮＡオリゴを購入した。オリゴを１：１の比で１×切断緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＴＣＥＰ、５％グリセロール、１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２）中で混合し、９５℃に１０分間加熱し、溶液を室温に冷却することによって、ｄｓＤＮＡ標的を形成させた。

【0718】

ａｓＸ ＲＮＰを、ＣａｓＸを
、１×切断緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＴＣＥＰ、５％グリセロール、１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２）中で、最終濃度が１μＭの示されたＣａｓＸ及びガイド（グラフを参照されたい）（特に明記しない限り、１．５倍過剰の示されたガイド）を用いて、３７℃で１０分間再構成した後、使用するまで氷に移した。７．３７標的を、７．３７標的に相補的なスペーサーを有するｓｇＲＮＡとともに使用した。

【0719】

切断反応物を、１００ｎＭの最終ＲＮＰ濃度及び１００ｎＭの最終標的濃度で調製した。反応を３７℃で行い、７．３７標的ＤＮＡを添加することによって反応を開始した。アリコートを、５、１０、３０、６０、及び１２０分で採取し、９５％ホルムアミド、２０ｍＭ ＥＤＴＡに添加することによってクエンチした。試料を、９５℃で１０分間加熱することによって変性させ、１０％尿素－ＰＡＧＥゲル上で泳動した。ゲルを、ＬＩ－ＣＯＲ Ｏｄｙｓｓｅｙ ＣＬｘで画像化し、ＬＩ－ＣＯＲ Ｉｍａｇｅ Ｓｔｕｄｉｏソフトウェアを使用して定量化するか、又はＣｙｔｉｖａ Ｔｙｐｈｏｏｎで画像化し、Ｃｙｔｉｖａ ＩＱＴＬソフトウェアを使用して定量化した。得られたデータをプロットし、Ｐｒｉｓｍを使用して分析した。本発明者らは、化学量論量未満の酵素が、延長された時間スケール下であっても化学量論量を超える量の標的を切断することができず、代わりに、存在する酵素の量に比例するプラトーに近づくという観察によって示されるように、ＣａｓＸが、アッセイ条件下で、本質的に単一代謝回転酵素として作用すると仮定した。したがって、等モル量のＲＮＰによって長い時間スケールにわたって切断された標的の画分は、ＲＮＰのどの画分が適切に形成され、切断に対して活性であるかを示す。切断反応がこの濃度レジーム下で単相性から明らかに逸脱するので、切断トレースを二相性速度モデルに適合させ、３つの独立した反復の各々についてプラトーを決定した。平均値及び標準偏差を計算して、活性画分を決定した（表１３）。

【0720】

図１に示されるように、ＣａｓＸ２＋ガイド１７４＋７．３７スペーサー、ＣａｓＸ１１９＋ガイド１７４＋７．３７スペーサー、ＣａｓＸ４５７＋ガイド１７４＋７．３７スペーサー、ＣａｓＸ４８８＋ガイド１７４＋７．３７スペーサー、及びＣａｓＸ４９１＋ガイド１７４＋７．３７スペーサーについて形成されたＲＮＰについて、見かけの活性（コンピテント）画分を決定した。表１３に、決定した活性画分を示す。全てのＣａｓＸバリアントは、野生型ＣａｓＸ２よりも高い活性画分を有し、これは、操作されたＣａｓＸバリアントが、野生型ＣａｓＸと比較して、試験条件下で同一のガイドを有する有意により活性で安定なＲＮＰを形成することを示している。これは、ｓｇＲＮＡに対する親和性の増加、ｓｇＲＮＡの存在下での安定性若しくは溶解度の増加、又は操作されたＣａｓＸ：ｓｇＲＮＡ複合体の切断コンピテント立体構造の安定性の増加に起因する可能性がある。ＲＮＰの溶解度の増加は、ＣａｓＸ２と比較して、ＣａｓＸ４５７、ＣａｓＸ４８８、又はＣａｓＸ４９１がｓｇＲＮＡに添加された場合、形成される観察された沈殿物の顕著な減少によって示された。

【0721】

３．インビトロ切断アッセイ－参照シングルガイドと比較したシングルガイドバリアントについての切断コンピテント画分の決定
図２及び表１０に示されるように、ＣａｓＸ２．２．７．３７、ＣａｓＸ２．３２．７．３７、ＣａｓＸ２．６４．７．３７、及びＣａｓＸ２．１７４．７．３７についても同じプロトコルを使用して切断コンピテント画分を決定したところ、１６±３％、１３±３％、５±２％、及び２２±５％であった。

【0722】

ガイドの第２のセットを異なる条件下で試験して、ＲＮＰの形成に対するガイドの寄与をより良好に単離した。７．３７スペーサーを有するガイド１７４、１７５、１８５、１８６、１９６、２１４、及び２１５を、以前のように過剰なガイドではなく、ガイドについて１μＭ及びタンパク質について１．５μＭの最終濃度でＣａｓＸ ４９１と混合した。図３及び表１０に、その結果を示す。これらのガイド制限条件下で、これらのガイドの多くは、１７４を上回る更なる改善を示し、１７４の場合の８０±９％と比較して、１８５及び１９６は、それぞれ９１±４％及び９１±１％のコンピテント画分を達成した。

【0723】

これらのデータは、ＣａｓＸバリアント及びｓｇＲＮＡバリアントの両方が、野生型ＣａｓＸ及び野生型ｓｇＲＮＡと比較して、ガイドＲＮＡを有するより高度の活性ＲＮＰを形成できることを示す。野生型参照ＣａｓＸと比較したＣａｓＸバリアント１１９、４５７、４８８、及び４９１の見かけの切断速度を、標的７．３７の切断についてのインビトロ蛍光アッセイを使用して決定した。

【0724】

４．インビトロ切断アッセイ－野生型参照ＣａｓＸと比較したＣａｓＸバリアントのｋ_切断の決定
ＣａｓＸ ＲＮＰを、１×切断緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＴＣＥＰ、５％グリセロール、１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２）中で、最終濃度が１μＭの示されたＣａｓＸ（図４を参照）及び１．５倍過剰の示されたガイドを用いて、３７℃で１０分間再構成した後、使用するまで氷に移した。切断反応を、２００ｎＭの最終ＲＮＰ濃度及び１０ｎＭの最終標的濃度で設定した。反応を、特に断りのない限り、３７℃で行い、標的ＤＮＡを添加することによって反応を開始した。アリコートを、０．２５、０．５、１、２、５、及び１０分で採取し、９５％ホルムアミド、２０ｍＭ ＥＤＴＡに添加することによってクエンチした。試料を、９５℃で１０分間加熱することによって変性させ、１０％尿素－ＰＡＧＥゲル上で泳動した。ゲルを、ＬＩ－ＣＯＲ Ｏｄｙｓｓｅｙ ＣＬｘで画像化し、ＬＩ－ＣＯＲ Ｉｍａｇｅ Ｓｔｕｄｉｏソフトウェアを使用して定量化するか、又はＣｙｔｉｖａ Ｔｙｐｈｏｏｎで画像化し、Ｃｙｔｉｖａ ＩＱＴＬソフトウェアを使用して定量化した。得られたデータをプロットし、Ｐｒｉｓｍを使用して分析し、各ＣａｓＸ：ｓｇＲＮＡの組み合わせの個別の反復について、非標的鎖切断の見かけの一次速度定数（ｋ切断）を決定した。表１０に、独立した適合による３回の反復の平均値及び標準偏差を示し、図５に、切断トレースを示す。

【0725】

見かけの切断速度定数を、野生型ＣａｓＸ２、並びに各アッセイで利用したガイド１７４及びスペーサー７．３７を有するＣａｓＸバリアント１１９、４５７、４８８、及び４９１について決定した（表１０及び図４を参照）。全てのＣａｓＸバリアントは、野生型ＣａｓＸ２と比較して、改善された切断速度を有した。ＣａｓＸ ４５７は、上で決定されたように、より高いコンピテント画分を有するにもかかわらず、１１９よりもゆっくりと切断した。ＣａｓＸ４８８及びＣａｓＸ４９１は、かなりの差で最も高い切断速度を有した。標的は最初の時点でほぼ完全に切断され、真の切断速度はこのアッセイの分解能を超えるので、報告されたｋ_切断は下限として解釈されるべきである。

【0726】

これらのデータは、ＣａｓＸバリアントがより高いレベルの活性を有し、ｋ_切断速度が、野生型ＣａｓＸ２と比較して少なくとも３０倍高くなることを示す。

【0727】

５．インビトロ切断アッセイ：野生型ガイドとガイドバリアントとの比較
また、野生型参照ＣａｓＸ２及び参照ガイド２を用いて切断アッセイを実施し、ガイドバリアント３２、６４、及び１７４と比較して、バリアントが切断を改善したかどうかを決定した。実験は上記のように実施した。得られたＲＮＰの多くは、試験した時間内に標的の完全な切断に近づかなかったので、本発明者らは、一次速度定数ではなく初期反応速度（Ｖ_０）を決定した。最初の２つの時点（１５秒及び３０秒）を、各ＣａｓＸ：ｓｇＲＮＡの組み合わせ及び反復について線形適合した。３回の反復について、傾きの平均値及び標準偏差を決定した。

【0728】

アッセイ条件下で、ガイド２、３２、６４、及び１７４を有するＣａｓＸ２のＶ_０は、２０．４±１．４ｎＭ／分、１８．４±２．４ｎＭ／分、７．８±１．８ｎＭ／分、及び４９．３±１．４ｎＭ／分であった。（表１３、並びに図５及び図６を参照）。ガイド１７４は、得られたＲＮＰの切断速度の大幅な改善（２に対して約２．５倍、図６を参照のこと）を示したが、ガイド３２及び６４は、ガイド２と同様の又はそれよりも劣る機能を示した。注目すべきことに、ガイド６４は、ガイド２のものよりも低い切断速度を支持するが、インビボでは、はるかに良好に機能する（データは示さず）。ガイド６４を生成するためのいくつかの配列の改変は、三重鎖形成に関与するヌクレオチドを犠牲にして、インビボで転写を改善する可能性が高い。ガイド６４の改善された発現は、インビボでのその改善された活性を説明する可能性が高く、一方、その減少した安定性は、インビトロで不適切なフォールディングを導く可能性がある。

【0729】

スペーサー７．３７を有するガイド１７４、１７５、１８５、１８６、１９６、２１４、及び２１５、並びにＣａｓＸ ４９１を用いて更なる実験を実施して、相対切断速度を決定した。本発明者らのアッセイで測定可能な範囲まで切断速度を減少させるために、切断反応物を１０℃でインキュベートした。結果を図７及び表１３に示す。これらの条件下では、２１５は、１７４よりも速い切断速度を支持する唯一のガイドであった。１９６は、ガイド制限条件下でＲＮＰの最も高い活性画分を示し、１７４と本質的に同じ動態を有し、異なるバリアントが異なる特徴の改善をもたらすことを再度強調した。

【0730】

これらのデータは、アッセイの条件下で、ガイドバリアントをＣａｓＸとともに使用すると、その大部分が、野生型ガイドを有するものよりも高いレベルの活性を有するＲＮＰをもたらし、約２倍～６倍超の範囲の切断初速度の改善を伴うことを支持する。表１３の番号は、左から右に、ＲＮＰ構築物のＣａｓＸバリアント、ｓｇＲＮＡ足場、及びスペーサー配列を示す。以下の表で、ＲＮＰ構築物名は、左から右に、ＣａｓＸタンパク質バリアント、ガイド足場、及びスペーサーが示されている。

【0731】

６．インビトロ切断アッセイ：参照２．２に対する５１５．１７４及び５２６．１７４の切断速度及びコンピテント画分の比較。
本発明者らは、操作されたシングルガイドバリアント１７４と複合体化した操作されたタンパク質ＣａｓＸバリアント５１５及び５２６を、参照野生型タンパク質２（配列番号２）及び最小限に操作されたガイドバリアント２（配列番号５）と比較したいと考えた。１．５倍過剰のガイドを用いて、上記のようにＲＮＰ複合体を構築した。ｋ_切断及びコンピテント画分を決定するための切断アッセイを上記のように実施し（両方とも３７℃で実施）、異なる時点を使用して、反応がほぼ完了するのに必要な時間が有意に異なるため、野生型対操作されたＲＮＰについてのコンピテント画分を決定した。

【0732】

得られたデータは、タンパク質及びガイドの両方を操作することによって、ＲＮＰの活性が劇的に改善したことを明らかに実証する。５１５．１７４及び５２６．１７４のＲＮＰは、２．２の１６％と比較して、それぞれ７６％及び９１％のコンピテント画分を有した（図８、表１３）。動態アッセイにおいて、５１５．１７４及び５２６．１７４の両方は、第１の時点までに本質的に全ての標的ＤＮＡを切断し、アッセイの分解能を超え、それぞれ１７．１０及び１９．８７分^－１の推定切断速度をもたらした（図９、表１３）。対照的に、２．２のＲＮＰは、最後の１０分の時点までに平均６０％未満の標的ＤＮＡを切断し、操作されたＲＮＰよりもほぼ２桁低い推定ｋ_切断を有する。タンパク質及びガイドに対して行われた改変は、より安定であり、活性粒子を形成する可能性がより高く、粒子毎にはるかに効率的にＤＮＡを切断するＲＮＰをもたらした。

【0733】

【表16】

^＊平均値及び標準偏差
^＊＊速度がアッセイの分解能を超えている

【0734】

実施例９：インビトロでの切断動態に対するスペーサー長の効果の試験
様々な長さのスペーサーを有する２つのＣａｓＸバリアント及びガイドＲＮＡのリボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）を、インビトロでの切断活性について試験して、どのスペーサー長が標的核酸の最も効率的な切断を支持するか、及びスペーサー長の優先度がタンパク質によって変化するかどうかを決定した。

【0735】

方法：
様々な長さのスペーサーを有するＣａｓＸ及びガイドＲＮＡのリボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）を、インビトロでの切断活性について試験して、どのスペーサー長が標的核酸の最も効率的な切断を支持するかを決定した。

【0736】

ＣａｓＸバリアント５１５及び５２６を上記のように精製した。足場１７４（配列番号２２３８）を有するガイドを、インビトロ転写（in vitro transcription、ＩＶＴ）によって調製した。ＩＶＴ鋳型は、推奨プロトコルに従ってＱ５ポリメラーゼ（ＮＥＢ Ｍ０４９１）、各足場骨格の鋳型オリゴを使用して、またＴ７プロモーター及び７．３７スペーサーを有する２０ヌクレオチドの増幅プライマー又は３’末端から短縮された１８若しくは１９ヌクレオチドの増幅プライマー（ＧＧＣＣＧＡＧＡＴＧＴＣＴＣＧＣＴＣＣＧ；ｔｄＴｏｍａｔｏを標的化（配列番号２７１９２））を使用して、ＰＣＲによって生成した。表１４に、スペーサー配列並びに各鋳型を生成するために使用したオリゴヌクレオチドを示す。次いで、得られた鋳型は、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを使用して、標準的なプロトコルに従ってＲＮＡガイドを生成した。変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動を使用してガイドを精製し、使用前にリフォールディングした。

【0737】

ＣａｓＸ ＲＮＰを、ＣａｓＸを１μＭになるように１×切断緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＴＣＥＰ、５％グリセロール、１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２）に希釈し、ｓｇＲＮＡを１．２μＭになるように添加し、３７℃で１０分間インキュベートすることによって再構成した後、使用するまで氷に移した。蛍光標識された７．３７標的ＤＮＡを、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから個々のオリゴヌクレオチドとして購入し（配列の詳細は表１４）、ｄｓＤＮＡ標的を、１×切断緩衝液中の２つの相補鎖の等モル混合物を加熱し、室温までゆっくりと冷却することによって調製した。

【0738】

ＲＮＰを、最終濃度が２００ｎＭになるように切断緩衝液に希釈し、振盪せずに１０℃でインキュベートした。７．３７標的ＤＮＡを、最終濃度が１０ｎＭになるように添加することによって、切断反応を開始した。０．２５、０．５、１、２、５、１０、及び３０分の時点をとった。等量の９５％ホルムアミド、２０ｍＭ ＥＤＴＡを添加することによって、時点をクエンチした。試料を、９５℃で１０分間加熱することによって変性させ、１０％尿素－ＰＡＧＥゲル上で泳動した。ゲルをＡｍｅｒｓｈａｍ Ｔｙｐｈｏｏｎで画像化し、ＩＱＴＬソフトウェアで分析した。得られたデータをプロットし、Ｐｒｉｓｍを使用して分析した。非標的鎖の切断を単一の指数関数に適合させて、見かけの一次速度定数（ｋ_切断）を決定した。

【0739】

結果：
１８、１９、又は２０ヌクレオチドのスペーサーを有するｓｇＲＮＡと複合体化したＣａｓＸバリアント５１５及び５２６の切断速度を比較して、どのスペーサー長が各タンパク質バリアントについて最も効率的な切断をもたらすかを決定した。インビトロ転写されたｓｇＲＮＡを用いて実施した他の実験と一致して、１８ｎｔスペーサーガイドは、両方のタンパク質バリアントについて最も良好に機能した（図１２Ａ及び図１２Ｂ、表１４）。１８ｎｔスペーサーは、タンパク質５１５の場合、２０ｎｔスペーサーよりも１．４倍速く、タンパク質５２６の場合、２０ｎｔスペーサーよりも３倍速かった。１９ｎｔスペーサーは、両方のタンパク質に対して中間の活性を有したが、ここでも、差異はバリアント５２６に対してより顕著であった。一般に、２０ｎｔよりも短いスペーサーは、様々なタンパク質、スペーサー、及び送達方法にわたって増加した活性を有することが観察されているが、改善の程度及び最適なスペーサー長は異なっている。これらのデータは、配列が非常に類似している（２残基のみが異なる）２つの操作されたタンパク質が、方向は類似しているが程度が大幅に異なるスペーサー長の結果として、活性の変化を有し得ることを示す。

【0740】

【表17】

【0741】

【表18】

【0742】

実施例１０：ガイドＲＮＡに対する結合親和性の評価
精製された野生型及び改良型ＣａｓＸを、塩化マグネシウム並びに非特異的結合及び凝集を防止するためのヘパリンを含有する低塩緩衝液中で、３’側にＣｙ７．５部分を含有する合成シングルガイドＲＮＡとインキュベートする。ｓｇＲＮＡは、１０ｐＭの濃度で維持し、タンパク質は、別個の結合反応で、１ｐＭから１００μＭまで滴定する。反応を平衡に到達させた後、試料を、それぞれタンパク質及び核酸に結合するニトロセルロース膜及び正に荷電したナイロン膜を用いた真空マニホールド膜結合アッセイにかける。膜を画像化して、ガイドＲＮＡを同定し、結合ＲＮＡ対非結合ＲＮＡの割合を、各タンパク質濃度についてニトロセルロース膜対ナイロン膜上の蛍光量によって決定して、タンパク質－ｓｇＲＮＡ複合体の解離定数を計算する。実験はまた、これらの変異が野生型及び変異体タンパク質に対するガイドの親和性にも影響を及ぼすかどうかを判定するために、ｓｇＲＮＡの改良型バリアントを用いて実施される。本発明者らはまた、電気移動度シフトアッセイを実施して、膜結合アッセイと定性的に比較し、凝集ではなく可溶性結合が、タンパク質－ＲＮＡ会合への主要な寄与因子であることを確認する。

【0743】

実施例１１：標的ＤＮＡに対する結合親和性の評価
精製された野生型及び改良ＣａｓＸは、標的核酸に相補的な標的化配列を有するシングルガイドＲＮＡと複合体化する。ＲＮＰ複合体を、塩化マグネシウム並びに非特異的結合及び凝集を防止するためのヘパリンを含有する低塩緩衝液中で、ＰＡＭ及び標的鎖上の５’側にＣｙ７．５標識を有する適切な標的核酸配列を含有する二本鎖標的ＤＮＡとインキュベートする。標的ＤＮＡは、１ｎＭの濃度で維持し、一方、ＲＮＰは、別個の結合反応で、１ｐＭから１００μＭまで滴定する。反応を平衡に到達させた後、試料を、未変性５％ポリアクリルアミドゲル上で泳動して、結合及び非結合標的ＤＮＡを分離する。ゲルを画像化して、標的ＤＮＡの移動度シフトを同定し、結合対非結合ＤＮＡの割合を、各タンパク質濃度について計算して、ＲＮＰ－標的ＤＮＡ三元複合体の解離定数を決定する。実験は、参照ＣａｓＸ及び参照ｇＲＮＡを含むＲＮＰと比較して、ＣａｓＸバリアント及びｇＲＮＡバリアントを含むＲＮＰの改善された結合親和性を実証すると予想される。

【0744】

実施例１２：ＲＮＰ産生のためのＣａｓＸバリアントの改善された発現及び溶解度特徴の評価
野生型及び改変型ＣａｓＸバリアントを、同一条件下で、ＢＬ２１（ＤＥ３）Ｅ．ｃｏｌｉで発現させる。全てのタンパク質は、ＩＰＴＧ誘導性Ｔ７プロモーターの制御下にある。細胞を、ＴＢ培地で、３７℃で０．６のＯＤまで増殖させ、その時点で増殖温度を１６℃に低下させ、０．５ｍＭのＩＰＴＧを添加することによって発現を誘導する。発現の１８時間後、細胞を回収する。可溶性タンパク質画分を抽出し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル上で分析する。可溶性ＣａｓＸの発現の相対レベルを、クーマシー染色によって同定する。タンパク質を上記のプロトコルに従って並行して精製し、純粋なタンパク質の最終収量を比較する。精製されたタンパク質の溶解度を決定するために、タンパク質が沈殿し始めるまで、構築物を保存緩衝液中で濃縮する。沈殿したタンパク質を遠心分離によって除去し、可溶性タンパク質の最終濃度を測定して、各バリアントの最大溶解度を決定する。最後に、ＣａｓＸバリアントを、シングルガイドＲＮＡと複合体化し、沈殿が始まるまで濃縮する。沈殿したＲＮＰを遠心分離によって除去し、可溶性ＲＮＰの最終濃度を測定して、ガイドＲＮＡに結合した場合の各バリアントの最大溶解度を決定する。

【0745】

実施例１３：ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＢＣＬ１１Ａ赤血球エンハンサー遺伝子座におけるＧＡＴＡ１結合領域の編集
ＣａｓＸバリアント４３８及びガイドバリアント１７４、並びにＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるヒトＢＣＬ１１Ａ赤血球エンハンサー遺伝子座のＧＡＴＡ１結合領域を標的化するスペーサーを使用して、ＢＣＬ１１Ａ赤血球エンハンサー遺伝子座においてＧＡＴＡ１結合領域を編集するＣａｓＸの能力を実証するために実験を行った。

【0746】

ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、線維芽細胞（ＦＢ）培地で、３７℃、５％ＣＯ２で維持した。線維芽細胞（Fibroblast、ＦＢ）培地は、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ；Ｓｅｒａｄｉｇｍ，＃１５００－５００）、並びに１００単位／ｍＬのペニシリン及び１００ｍｇ／ｍＬのストレプトマイシン（１００ｘ－Ｐｅｎ－Ｓｔｒｅｐ；ＧＩＢＣＯ ＃１５１４０－１２２）が補充された、ピルビン酸ナトリウム（１００×、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ ＃１１３６００７０）、非必須アミノ酸（１００×、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ ＃１１１４００５０）、ＨＥＰＥＳ緩衝液（１００×、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ ＃１５６３００８０）、及び２－メルカプトエタノール（１０００×、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ ＃２１９８５０２３）を更に含み得る、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ；Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｅｌｌｇｒｏ、＃１０－０１３－ＣＶ）からなる。

【0747】

この実験の場合、１００μＬのＦＢ培地中のＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、９６ウェルプレートに２０～４０，０００個／ウェルで播種し、５％ＣＯ２を含む３７℃インキュベーターで培養した。翌日、細胞を、約７５％コンフルエンスでトランスフェクトした。ＣａｓＸ及びガイドの構築物（配列については表１６を参照）を、反復として構築物当たり３ウェルを使用して、製造業者のプロトコルに従ってＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ３０００を使用して、ウェル当たり１００～５００ｎｇでＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。陰性対照として、非標的プラスミドを使用した。ベンチマーク対照として、同じ領域を標的化するＳｐｙＣａｓ９及びガイドの構築物を使用した。０．３～３μｇ／ｍＬのピューロマイシンによる２４～４８時間のトランスフェクションが上手くいった細胞を選択し、その後、ＦＢ培地中で回収した。続いて、実験からの各試料の細胞を溶解させ、製造業者のプロトコル及び標準的な手順に従ってゲノムを抽出した。各実験試料からの細胞における編集を、ＮＧＳ分析を使用してアッセイした。簡潔には、ゲノムＤＮＡを、目的の標的ゲノム位置に特異的なプライマーを用いて、ＰＣＲによって増幅して、標的アンプリコンを形成した。これらのプライマーは、Ｉｌｌｕｍｉｎａリード及び２つの配列を導入するために５’末端に追加の配列を含む。更に、それらは、固有分子識別子（unique molecular identifier、ＵＭＩ）として機能する１６ｎｔランダム配列を含む。Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ａｎａｌｙｚｅｒ ＤＮＡ分析キット（Ａｇｉｌｅｎｔ、ｄｓＤＮＡ ３５～１５００ｂｐ）を使用して、アンプリコンの品質及び定量化を評価した。アンプリコンを、製造業者の説明書に従ってＩｌｌｕｍｉｎａ Ｍｉｓｅｑで配列決定した。配列決定からの生のｆａｓｔｑファイルを以下のように処理した。（１）プログラムｃｕｔａｄａｐｔ（ｖ．２．１）を使用して、品質及びアダプター配列について配列をトリミングした。（２）プログラムｆｌａｓｈ２（ｖ２．２．００）を使用して、リード１及びリード２の配列を単一の挿入配列に重ね合わせた。（３）コンセンサス挿入配列を、予想されるアンプリコン配列及びスペーサー配列とともに、プログラムＣＲＩＳＰＲｅｓｓｏ２（ｖ ２．０．２９）を実行した。このプログラムは、スペーサーの３’末端周辺のウィンドウ（スペーサーの３’末端から－３ｂｐを中心とする３０ｂｐウィンドウ）において改変されたリードの割合（％）を定量化する。ＣａｓＸ分子の活性を、このウィンドウ内のどこかに挿入及び／又は欠失を含むリードの割合の合計として定量化した。

【0748】

【表19】

【0749】

結果：図１８のグラフは、トランスフェクションの５日後のＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＢＣＬ１１Ａ赤血球エンハンサー遺伝子座でのＧＡＴＡ１結合領域のＣａｓＸ媒介編集のＮＧＳ分析の結果を示す。各データポイントは、個々の処理条件によって生成された編集結果のＮＧＳリードの平均測定値である。結果は、ＣａｓＸ及びガイドが９０％の平均編集レベルでＢＣＬ１１Ａ赤血球エンハンサー遺伝子座を編集することができた一方で、ＳｐｙＣａｓ９構築物が８０％の平均編集レベルを示したことを示す。非標的スペーサーを有する構築物は、編集をもたらさなかった（データは示さず）。本実施例は、適切なガイドを有するＣａｓＸが、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞においてＢＣＬ１１Ａ赤血球エンハンサー遺伝子座を編集することができたことを実証する。ＣａｓＸバリアント６６８、６７２、６７６、及びｇＲＮＡ ２３５を用いた実験は、同様の条件下で行われ、同様の編集効率をもたらすことが予想される。

【0750】

実施例１４：Ｋ５６２細胞におけるＢＣＬ１１Ａ赤血球エンハンサー遺伝子座におけるＧＡＴＡ１結合領域の編集
Ｋ５６２細胞において、ＣａｓＸバリアント１１９及び４９１、足場バリアント１７４、並びにヒトＢＣＬ１１Ａ赤血球エンハンサー遺伝子座のＧＡＴＡ１結合領域を標的化するスペーサーを使用して、ＣａｓＸがＢＣＬ１１Ａ赤血球エンハンサー遺伝子座を編集できることを実証するために実験を行った。

【0751】

Ｋ５６２細胞を、培地で、３７℃、５％ＣＯ２で維持した。培地は、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ；Ｓｅｒａｄｉｇｍ、＃１５００－５００）、並びに１００単位／ｍＬのペニシリン及び１００ｍｇ／ｍＬのストレプトマイシン（１００ｘ－Ｐｅｎ－Ｓｔｒｅｐ；ＧＩＢＣＯ ＃１５１４０－１２２）が補充された、ピルビン酸ナトリウム（１００×、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ ＃１１３６００７０）及びＨＥＰＥＳ緩衝液（１００×、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ ＃１５６３００８０）を更に含み得る、ＲＰＭＩ（ＲＰＭＩ；Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、＃１１８７５１１９）からなる。

【0752】

この実験では、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子座のＧＡＴＡ１結合領域を標的化するＣａｓＸ及びガイドを、２つの異なる送達様式であるＲＮＰ及びＸＤＰｓ（ＸＤＰにパッケージングされたＲＮＰ）を使用して、Ｋ５６２細胞に導入した。第１の実験群では、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子座のＧＡＴＡ１結合領域を標的化するＣａｓＸ ＲＮＰ（スペーサー配列については表を参照）を、標準的な方法を使用して製剤化した。簡潔には、各ＣａｓＸ ＲＮＰ（配列については表を参照）を、製造業者のプロトコルに従ってＬｏｎｚａ ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒキットを使用して、反復として構築物当たり３ウェルを使用して、条件当たり１０～１００ｐｍｏｌで、１００，０００～５００，０００個のＫ５６２細胞に形質導入した。細胞を、補充ＲＰＭＩ培地で、３７℃、５％ＣＯ２で培養した。

【0753】

第２の実験群では、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子座のＧＡＴＡ１結合領域を標的化するＣａｓＸがカプセル化されたＸＤＰｓを、以下に記載するように製剤化した。簡潔には、４つの構造プラスミド：ｐＸＤＰ１７、ｐＳＧ００１０、ｐＧＰ２、及びｐＸＤＰ３を使用して、ＸＤＰを産生した。プラスミドｐＸＤＰ１７は、ＨＩＶ－１のｇａｇ配列、続いてＣａｓＸバージョン４９１を発現する。ｐＳＧ００１０は、Ｕ６プロモーターの下で発現される、ＢＣ１１Ａを標的化するスペーサー２１．１（配列については以下を参照）を有する足場１７４である。ｐＧＰ２は、ＶＳＶ－Ｇ標的化部分を発現する。ｐＸＤＰ３は、ＣａｓＸ分子が結合していないＨＩＶ－１のｇａｇポリプロテインを発現する。ＸＤＰｓを産生するために、ＴａｋａｒａからのＬｅｎｔｉＸ細胞を継代し、プラスミドＤＮＡのトランスフェクションの２４時間前に播種した。８９μｇのｐＳＧ００１０プラスミド、３６６μｇのｐＸＤＰ００１７プラスミド、３０μｇのｐＸＤＰ０００３プラスミド、及び１．７μｇのｐＧＰ２プラスミドを、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ及びＰＥＩと混合し、次いで、細胞培養物に添加した。トランスフェクションの１６時間後、培地をＯｐｔｉ－ＭＥＭに交換した。トランスフェクションの５４時間後、培地を回収し、遠心分離によって濃縮した。ＸＤＰを、１５０ｍＭ ＮａＣｌ緩衝液１に再懸濁し、－１５０℃で凍結した。実験当日、ＸＤＰを氷上で解凍し、直ちに細胞に使用した。

【0754】

Ｋ５６２細胞を、９６ウェルプレートに３０～５０，０００個／ウェルで播種し、様々なＭＯＩのＸＤＰで形質導入し、補充ＲＰＭＩ培地で、３７℃、５％ＣＯ２で培養した。

【0755】

４日後、ＲＮＰ又はＸＤＰで形質導入した試料からの各実験試料由来の細胞における編集を、ＮＧＳ分析を使用してアッセイした。簡潔には、ゲノムＤＮＡを、目的の標的ゲノム位置に特異的なプライマーを用いて、ＰＣＲによって増幅して、標的アンプリコンを形成した。これらのプライマーは、Ｉｌｌｕｍｉｎａリード及び２つの配列を導入するために５’末端に追加の配列を含む。更に、それらは、固有分子識別子（ＵＭＩ）として機能する１６ｎｔランダム配列を含む。Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ａｎａｌｙｚｅｒ ＤＮＡ分析キット（Ａｇｉｌｅｎｔ，ｄｓＤＮＡ ３５～１５００ｂｐ）を使用して、アンプリコンの品質及び定量化を評価した。アンプリコンを、製造業者の説明書に従ってＩｌｌｕｍｉｎａ Ｍｉｓｅｑで配列決定した。配列決定からの生のｆａｓｔｑファイルを以下のように処理した。（１）プログラムｃｕｔａｄａｐｔ（ｖ．２．１）を使用して、品質及びアダプター配列について配列をトリミングした。（２）プログラムｆｌａｓｈ２（ｖ２．２．００）を使用して、リード１及びリード２の配列を単一の挿入配列に重ね合わせた。（３）コンセンサス挿入配列を、予想されるアンプリコン配列及びスペーサー配列とともに、プログラムＣＲＩＳＰＲｅｓｓｏ２（ｖ ２．０．２９）を実行した。このプログラムは、スペーサーの３’末端周辺のウィンドウ（スペーサーの３’末端から－３ｂｐを中心とする３０ｂｐウィンドウ）において改変されたリードの割合（％）を定量化する。ＣａｓＸ分子の活性を、このウィンドウ内のどこかに挿入及び／又は欠失を含むリードの割合の合計として定量化した。

【0756】

結果：図１９のグラフは、ＲＮＰ形質導入の４日後のＫ５６２細胞におけるＢＣＬ１１Ａ赤血球エンハンサー遺伝子座でのＧＡＴＡ１結合領域のＣａｓＸ媒介編集のＮＧＳ分析の結果を示す。各データポイントは、個々の処理条件によって生成された編集結果のＮＧＳリードの平均測定値である。結果は、ＣａｓＸ及びガイドが、用量依存的な様式でＢＣＬ１１Ａ赤血球エンハンサー遺伝子座を編集することができることを示し、ＣａｓＸバリアント４９１は、ＣａｓＸバリアント１１９と比較して、一貫してより高いレベルの編集を示す。本実施例は、アッセイの条件下で、適切なガイドを有するＣａｓＸが、Ｋ５６２細胞においてＢＣＬ１１Ａ赤血球エンハンサー遺伝子座を編集することができることを実証する。

【0757】

図２０のグラフは、ＸＤＰ形質導入の４日後のＫ５６２細胞におけるＢＣＬ１１Ａ赤血球エンハンサー遺伝子座でのＧＡＴＡ１結合領域のＣａｓＸ媒介編集のＮＧＳ分析の結果を示す。各データポイントは、個々の処理条件によって生成された編集結果のＮＧＳリードの平均測定値である。結果は、ＣａｓＸ及びガイドが用量依存的にＢＣＬ１１Ａ赤血球エンハンサー遺伝子座を編集することができたことを示す。本実施例は、適切なガイドを有するＣａｓＸが、Ｋ５６２細胞においてＢＣＬ１１Ａ赤血球エンハンサー遺伝子座を編集することができたことを実証する。ＣａｓＸバリアント６６８、６７２、６７６、及びｇＲＮＡ ２３５を用いた実験は、同様の条件下で行われ、同様の編集効率をもたらすことが予想される。

【0758】

実施例１５：造血幹細胞におけるＢＣＬ１１Ａ赤血球エンハンサー遺伝子座におけるＧＡＴＡ１結合領域の編集
ＣＤ３４＋造血幹細胞（ＨＳＣ）において、ＣａｓＸバリアント１１９及び４９１、足場バリアント１７４、並びにヒトＢＣＬ１１Ａ赤血球エンハンサー遺伝子座のＧＡＴＡ１結合領域を標的化するスペーサーを使用して、ＣａｓＸがＢＣＬ１１Ａ赤血球エンハンサー遺伝子座を編集できることを実証するために実験を行った。

【0759】

ＨＳＣを、ＣＣ１００（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ＃２６９７）を補充したＳｔｅｍＳｐａｎ ＳＦＥＭ ＩＩ培地（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ＃９６０５）で培養し、３７℃、５％ＣＯ２で維持した。この実験では、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子座のＧＡＴＡ１結合領域を標的化するＣａｓＸ及びガイドを、２つの異なる送達様式であるＲＮＰ及びＸＤＰを使用してＨＳＣに導入した。第１の実験群では、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子座のＧＡＴＡ１結合領域を標的化するＣａｓＸ ＲＮＰ（スペーサー配列については表を参照）を、標準的な方法を使用して製剤化した。各ＣａｓＸ ＲＮＰ（配列については表を参照）を、製造業者のプロトコルに従ってＬｏｎｚａ ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒキットを使用して、反復として構築物当たり３ウェルを使用して、条件当たり１０～１００ｐｍｏｌで、１００，０００～５００，０００個のＨＳＣに形質導入した。細胞を、補充ＳＦＥＭ ＩＩ培地で、３７℃、５％ＣＯ２で培養した。

【0760】

第２の実験群では、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子座のＧＡＴＡ１結合領域を標的化するＣａｓＸがカプセル化されたＸＤＰｓを、以下に記載するように製剤化した。簡潔には、４つの構造プラスミド：ｐＸＤＰ１７、ｐＳＧ００１０、ｐＧＰ２、及びｐＸＤＰ３を使用して、ＸＤＰを産生した。プラスミドｐＸＤＰ１７は、ＨＩＶ－１のｇａｇ配列、続いてＣａｓＸバージョン４９１を発現する。ｐＳＧ００１０は、Ｕ６プロモーターの下で発現される、ＢＣ１１Ａを標的化するスペーサー２１．１（配列については以下を参照）を有する足場１７４である。ｐＧＰ２は、ＶＳＶ－Ｇ標的化部分を発現する。ｐＸＤＰ３は、ＣａｓＸ分子が結合していないＨＩＶ－１のｇａｇポリプロテインを発現する。ＸＤＰｓを産生するために、ＴａｋａｒａからのＬｅｎｔｉＸ細胞を継代し、プラスミドＤＮＡのトランスフェクションの２４時間前に播種した。８９μｇのｐＳＧ００１０プラスミド、３６６μｇのｐＸＤＰ００１７プラスミド、３０μｇのｐＸＤＰ０００３プラスミド、及び１．７μｇのｐＧＰ２プラスミドを、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ及びＰＥＩと混合し、次いで、細胞培養物に添加した。トランスフェクションの１６時間後、培地をＯｐｔｉ－ＭＥＭに交換した。トランスフェクションの５４時間後、培地を回収し、遠心分離によって濃縮した。ＸＤＰを、１５０ｍＭ ＮａＣｌ緩衝液１に再懸濁し、－１５０℃で凍結した。実験当日、ＸＤＰを氷上で解凍し、直ちに細胞に使用した。

【0761】

ＨＳＣを、９６ウェルプレートに３０，０００～５０，０００個／ウェルで播種し、様々なＭＯＩのＸＤＰで形質導入し、補充ＳＦＥＭ ＩＩ培地で、３７℃、５％ＣＯ２で培養した。４日後、ＲＮＰ又はＸＤＰで形質導入した試料からの各実験条件からの細胞における編集を、ＮＧＳ分析を使用してアッセイした。簡潔には、実験からの各試料の細胞を溶解させ、製造業者のプロトコル及び標準的な手順に従ってゲノムを抽出した。各実験試料からの細胞における編集を、ＮＧＳ分析を使用してアッセイした。簡潔には、ゲノムＤＮＡを、目的の標的ゲノム位置に特異的なプライマーを用いて、ＰＣＲによって増幅して、標的アンプリコンを形成した。これらのプライマーは、Ｉｌｌｕｍｉｎａリード及び２つの配列を導入するために５’末端に追加の配列を含む。更に、それらは、固有分子識別子（ＵＭＩ）として機能する１６ｎｔランダム配列を含む。Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ａｎａｌｙｚｅｒ ＤＮＡ分析キット（Ａｇｉｌｅｎｔ，ｄｓＤＮＡ ３５～１５００ｂｐ）を使用して、アンプリコンの品質及び定量化を評価した。アンプリコンを、製造業者の説明書に従ってＩｌｌｕｍｉｎａ Ｍｉｓｅｑで配列決定した。配列決定からの生のｆａｓｔｑファイルを以下のように処理した。（１）プログラムｃｕｔａｄａｐｔ（ｖ．２．１）を使用して、品質及びアダプター配列について配列をトリミングした。（２）プログラムｆｌａｓｈ２（ｖ２．２．００）を使用して、リード１及びリード２の配列を単一の挿入配列に重ね合わせた。（３）コンセンサス挿入配列を、予想されるアンプリコン配列及びスペーサー配列とともに、プログラムＣＲＩＳＰＲｅｓｓｏ２（ｖ ２．０．２９）を実行した。このプログラムは、スペーサーの３’末端周辺のウィンドウ（スペーサーの３’末端から－３ｂｐを中心とする３０ｂｐウィンドウ）において改変されたリードの割合（％）を定量化する。ＣａｓＸ分子の活性を、このウィンドウ内のどこかに挿入及び／又は欠失を含むリードの割合の合計として定量化した。

【0762】

結果：図２１のグラフは、ＲＮＰ形質導入の４日後のＨＳＣにおけるＢＣＬ１１Ａ赤血球エンハンサー遺伝子座でのＧＡＴＡ１結合領域のＣａｓＸ媒介編集のＮＧＳ分析の結果を示す。各データポイントは、個々の処理条件によって生成された編集結果のＮＧＳリードの平均測定値である。結果は、ＣａｓＸ及びガイドが、用量依存的な様式でＢＣＬ１１Ａ赤血球エンハンサー遺伝子座を編集することができることを示し、ＣａｓＸバリアント４９１は、ＣａｓＸバリアント１１９と比較して、一貫してより高いレベルの編集を示す。本実施例は、アッセイの条件下で、適切なガイドを有するＣａｓＸが、ＨＳＣにおいてＢＣＬ１１Ａ赤血球エンハンサー遺伝子座を編集することができることを実証する。図２２のグラフは、ＸＤＰ形質導入の４日後のＨＳＣにおけるＢＣＬ１１Ａ赤血球エンハンサー遺伝子座でのＧＡＴＡ１結合領域のＣａｓＸ媒介編集のＮＧＳ分析の結果を示す。各データポイントは、個々の処理条件によって生成された編集結果のＮＧＳリードの平均測定値である。結果は、ＣａｓＸ及びガイドが用量依存的にＢＣＬ１１Ａ赤血球エンハンサー遺伝子座を編集することができたことを示す。本実施例は、適切なガイドを有するＣａｓＸが、ＨＳＣにおいてＢＣＬ１１Ａ赤血球エンハンサー遺伝子座を編集することができたことを実証する。ＣａｓＸバリアント６６８、６７２、６７６、及びｇＲＮＡ ２３５を用いた実験は、同様の条件下で行われ、同様の編集効率をもたらすことが予想される。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10A】

【図10B】

【図10C】

【図10D】

【図11A】

【図11B】

【図12A】

【図12B】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【配列表】

2023552379000001.app

【国際調査報告】