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特表2023-552441ＳＩＲＰ－αエンゲージャーによる自然免疫細胞のサイレンシング
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-12-15
(54)【発明の名称】ＳＩＲＰ－αエンゲージャーによる自然免疫細胞のサイレンシング
(51)【国際特許分類】
C12N 15/13 20060101AFI20231208BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20231208BHJP
C12N 5/0735 20100101ALI20231208BHJP
C12N 5/071 20100101ALI20231208BHJP
C12N 5/0783 20100101ALI20231208BHJP
C12N 5/077 20100101ALI20231208BHJP
C12N 5/0793 20100101ALI20231208BHJP
C12N 15/62 20060101ALI20231208BHJP
C12N 15/12 20060101ALI20231208BHJP
A61K 35/17 20150101ALI20231208BHJP
A61K 35/44 20150101ALI20231208BHJP
A61K 35/30 20150101ALI20231208BHJP
A61K 35/34 20150101ALI20231208BHJP
A61K 35/39 20150101ALI20231208BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20231208BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20231208BHJP
A61P 37/06 20060101ALI20231208BHJP
A61P 3/10 20060101ALI20231208BHJP
A61P 9/00 20060101ALI20231208BHJP
A61P 25/00 20060101ALI20231208BHJP
A61P 5/00 20060101ALI20231208BHJP
A61P 27/02 20060101ALI20231208BHJP
【ＦＩ】
C12N15/13
C12N5/10 ZNA
C12N5/0735
C12N5/071
C12N5/0783
C12N5/077
C12N5/0793
C12N15/62 Z
C12N15/12
A61K35/17
A61K35/44
A61K35/30
A61K35/34
A61K35/39
A61P43/00 105
A61P35/00
A61P37/06
A61P3/10
A61P9/00
A61P25/00
A61P5/00
A61P27/02
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023534278
(86)(22)【出願日】2021-12-06
(85)【翻訳文提出日】2023-07-27
(86)【国際出願番号】 US2021062008
(87)【国際公開番号】W WO2022125439
(87)【国際公開日】2022-06-16
(31)【優先権主張番号】63/122,465
(32)【優先日】2020-12-07
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＲＩＴＯＮ
(71)【出願人】
【識別番号】506115514
【氏名又は名称】ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア
【氏名又は名称原語表記】Ｔｈｅ Ｒｅｇｅｎｔｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ
(74)【代理人】
【識別番号】100147485
【弁理士】
【氏名又は名称】杉村 憲司
(74)【代理人】
【識別番号】230118913
【弁護士】
【氏名又は名称】杉村 光嗣
(74)【代理人】
【識別番号】100174001
【弁理士】
【氏名又は名称】結城 仁美
(72)【発明者】
【氏名】トビアス デュース
【テーマコード（参考）】
4B065
4C087
【Ｆターム（参考）】
4B065AA90X
4B065AA90Y
4B065AA94X
4B065AA94Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA24
4B065CA25
4B065CA44
4C087AA01
4C087AA02
4C087AA03
4C087BB37
4C087BB45
4C087BB47
4C087BB51
4C087BB56
4C087BB63
4C087BB65
4C087CA04
4C087CA12
4C087NA14
4C087ZA01
4C087ZA33
4C087ZA36
4C087ZB08
4C087ZB21
4C087ZB26
4C087ZC03
4C087ZC35
(57)【要約】
本発明は、非改変ＳＩＲＰα会合機能を有する親細胞と比較して、対象に移植された場合に自然免疫に抵抗する、増加したシグナル調節タンパク質アルファ（ＳＩＲＰα）会合機能を有する細胞（ＳＩＲＰαエンゲージャー細胞）を提供する。ＳＩＲＰαエンゲージャー細胞は、無傷のＣＤ４７細胞質シグナル伝達機能を欠いている。いくつかの実施形態では、ＳＩＲＰαエンゲージャー細胞は、低免疫細胞である。他の実施形態では、ＳＩＲＰαエンゲージャー細胞は、分化した体細胞である。他の実施形態では、ＳＩＲＰαエンゲージャー細胞は、低免疫多能性（ＨＩＰ）細胞である。さらなる実施形態では、ＨＩＰ細胞は、血液型Ｏ（ＨＩＰＯ）、Ｒｈ因子（Ｒｈ）陰性（ＨＩＰ－）、又は血液型Ｏ及びＲｈ－の両方（ＨＩＰＯ－）である。他の実施形態では、ＳＩＲＰαエンゲージャー細胞は、ＨＩＰ細胞、ＨＩＰ－細胞、又はＨＩＰＯ－細胞に由来するか、又は分化した細胞である。他の実施形態では、ＳＩＲＰαエンゲージャー細胞は、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）又は補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）から保護するために抗体Ｆｃ受容体を含む。他の実施形態では、ＳＩＲＰαエンゲージャー細胞は、細胞表面のＣＤ１６、ＣＤ３２、又はＣＤ６４の発現の上昇を介してＡＤＣＣ又はＣＤＣを回避する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
免疫細胞上のシグナル調節タンパク質アルファ（ＳＩＲＰα）タンパク質と会合するエンゲージャー分子を細胞表面上に含むＳＩＲＰ－αエンゲージャー細胞であって、前記会合により前記エンゲージャー細胞が前記免疫細胞によって死滅することが防止され、前記細胞表面分子が、機能性ＣＤ４７細胞内ドメインを欠いている、ＳＩＲＰ－αエンゲージャー細胞。
【請求項2】
前記エンゲージャー分子がタンパク質である、請求項１に記載のＳＩＲＰ－αエンゲージャー細胞。
【請求項3】
前記タンパク質が融合タンパク質である、請求項２に記載のＳＩＲＰ－αエンゲージャー細胞。
【請求項4】
前記融合タンパク質が、ＣＤ４７細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を含む、請求項３に記載のＳＩＲＰ－αエンゲージャー細胞。
【請求項5】
前記ＣＤ４７ ＥＣＤが、配列番号３と少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項４に記載のＳＩＲＰ－αエンゲージャー細胞。
【請求項6】
前記ＣＤ４７ ＥＣＤが配列番号３の配列を含む、請求項５に記載のＳＩＲＰ－αエンゲージャー細胞。
【請求項7】
前記エンゲージャー分子が、免疫グロブリンスーパーファミリードメインを含む、請求項１～５のいずれか一項に記載のＳＩＲＰ－αエンゲージャー細胞。
【請求項8】
前記免疫グロブリンスーパーファミリードメインが、配列番号４に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項７に記載のＳＩＲＰ－αエンゲージャー細胞。
【請求項9】
前記免疫グロブリンスーパーファミリードメインが配列番号４の配列を含む、請求項７に記載のＳＩＲＰ－αエンゲージャー細胞。
【請求項10】
前記エンゲージャー分子が、ＳＩＲＰαに結合する抗体Ｆａｂ又は単鎖可変断片（ｓｃＦＶ）を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載のＳＩＲＰ－αエンゲージャー細胞。
【請求項11】
前記Ｆａｂ又はｓｃＦＶが、その解離定数（Ｋｄ）によって測定される親和性でＳＩＲＰαに結合し、前記Ｋｄが、約１０－７～１０－１３Ｍである、請求項１０に記載のＳＩＲＰ－αエンゲージャー細胞。
【請求項12】
前記エンゲージャー分子が、ＳＩＲＰαに結合する１つ又は複数の抗体相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載のＳＩＲＰ－αエンゲージャー細胞。
【請求項13】
前記１つ又は複数のＣＤＲが、配列番号５～１２のいずれか１つに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項１２に記載のＳＩＲＰ－αエンゲージャー細胞。
【請求項14】
前記１つ又は複数のＣＤＲが、配列番号５～１２のいずれか１つの配列を含む、請求項１２に記載のＳＩＲＰ－αエンゲージャー細胞。
【請求項15】
前記１つ又は複数のＣＤＲが、配列番号５に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項１２に記載のＳＩＲＰ－αエンゲージャー細胞。
【請求項16】
前記１つ又は複数のＣＤＲが、配列番号５の配列を含む、請求項１２に記載のＳＩＲＰ－αエンゲージャー細胞。
【請求項17】
前記１つ又は複数のＣＤＲが、配列番号９に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項１２に記載のＳＩＲＰ－αエンゲージャー細胞。
【請求項18】
前記１つ又は複数のＣＤＲが、配列番号９の配列を含む、請求項１２に記載のＳＩＲＰ－αエンゲージャー細胞。
【請求項19】
前記エンゲージャー分子が、異種膜貫通ドメイン（ＴＭＤ）を含む融合タンパク質である、請求項１～１８のいずれか一項に記載のＳＩＲＰ－αエンゲージャー細胞。
【請求項20】
前記ＴＭＤが、単一のαヘリックス、複数のαヘリックス、又は丸まったβシートを含む、請求項１９に記載のＳＩＲＰ－αエンゲージャー細胞。
【請求項21】
前記異種ＴＭＤが、ＣＤ８５ｆ、ＣＤ３４９、ＣＤ２８４、ＣＤ２６１、ＣＤ１７２ｂ、ＣＤ２７７、ＣＤ１８６、ＣＤ１５６ｃ、ＣＤ３０４、ＣＤ２５４、ＣＤ２６３、ＣＤ２６７、ＣＤ３３７、ＣＤ１７０、ＣＤ２８３、ＣＤ１３３、ＣＤ３２７、ＣＤ２０５、ＣＤ２３２、ＣＤ２８２、ＣＤ１６ｂ、ＣＤ８５ｉ、ＣＤ８５ａ、ＣＤ８５ｃ、ＣＤ２７５、ＣＤ１０８、ＣＤ３５８、ＣＤ３３５、ＣＤ２１８ｂ、ＣＤ３５５、ＣＤ３３６、ＣＤ１６０、ＣＤ２５、ＣＤ４、ＣＤ８ａ、ＣＤ２３５ａ、ＣＤ２３３、ＣＤ２３０、ＣＤ９０、ＣＤ７４、ＣＤ３ｄ、ＣＤ３４０、ＣＤ２３６、ＣＤ６１、ＣＤ１８、ＣＤ５４、ＣＤ２９、ＣＤ１ａ、ＣＤ５、ＣＤ２２０、ＣＤ２、ＣＤ６６ｅ、ＣＤ５１、ＣＤ１４１、ＣＤ１１５、ＣＤ４２ｂ、ＣＤ２２１、ＣＤ２７１、ＣＤ５５、ＣＤ２４３、ＣＤ９８、ＣＤ１０、ＣＤ４１、ＣＤ１４、ＣＤ４５、ＣＤ２２８、ＣＤ１６ａ、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ１２６、ＣＤ６３、ＣＤ４８、ＣＤ７、ＣＤ１４０ｂ、ＣＤ３ｇ、ＣＤ１１７、ＣＤ２８、ＣＤ８ｂ、ＣＤ３７、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１０７ａ、ＣＤ３３１、ＣＤ２２２、ＣＤ２０、ＣＤ７９ａ、ＣＤ６４、ＣＤ３２、ＣＤ１４３、ＣＤ３２４、ＣＤ４２ｃ、ＣＤ１０７ｂ、ＣＤ５６、ＣＤ１０２、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ６６ａ、ＣＤ１４２、ＣＤ５９、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２１ａ、ＣＤ１２２、ＣＤ１３、ＣＤ１５５、ＣＤ１１９、ＣＤ１９、ＣＤ１１６、ＣＤ４６、ＣＤ１ｅ、ＣＤ１ｄ、ＣＤ２２７、ＣＤ４４、ＣＤ６２Ｐ、ＣＤ１０４、ＣＤ４３、ＣＤ１４０ａ、ＣＤ３１、ＣＤ１５２、ＣＤ３２６、ＣＤ６２Ｅ、ＣＤ３６、ＣＤ１２７、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ１０５、ＣＤ３５、ＣＤ２２３、ＣＤ１３８、ＣＤ３２５、ＣＤ５８、ＣＤ１０６、ＣＤ５３、ＣＤ１２０ａ、ＣＤ２２４、ＣＤ２１、ＣＤ３３、ＣＤ２２、ＣＤ１２０ｂ、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ３６３、ＣＤ７３、ＣＤ８８、ＣＤ２０４、ＣＤ３３２、ＣＤ９、ＣＤ２０３ａ、ＣＤ３３４、ＣＤ３３３、ＣＤ２０６、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ２３８、ＣＤ２５２、ＣＤ８９、ＣＤ１２４、ＣＤ１８１、ＣＤ１８２、ＣＤ２４、ＣＤ９５、ＣＤ４０、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ１５９ａ、ＣＤ１５９ｃ、ＣＤ３１４、ＣＤ２７、ＣＤ１２３、ＣＤ２６、ＣＤ８２、ＣＤ１２１ｂ、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ３０、ＣＤ１ｂ、ＣＤ１ｃ、ＣＤ１５４、ＣＤ６、ＣＤ５２、ＣＤ１３２、ＣＤ３２、ＣＤ６６ｂ、ＣＤ１７１、ＣＤ１９１、ＣＤ１９７、ＣＤ１８５、ＣＤ１３１、ＣＤ５０、ＣＤ７０、ＣＤ１５３、ＣＤ１４４、ＣＤ８０、ＣＤ３６２、ＣＤ６８、ＣＤ３６１、ＣＤ１４７、ＣＤ３０９、ＣＤ１３５、ＣＤ２９２、ＣＤ１０３、ＣＤ１３０、ＣＤ４２ｄ、ＣＤ６６ｄ、ＣＤ６６ｃ、ＣＤ９６、ＣＤ１１０、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ２００、ＣＤ１９２、ＣＤ２３１、ＣＤ８６、ＣＤ２１２、ＣＤ１１８、ＣＤ１４６、ＣＤ１３４、ＣＤ１５８ａ、ＣＤ１５８ｂ１、ＣＤ１５８ｂ２、ＣＤ１５８ｅ、ＣＤ１５８ｋ、ＣＤ１５８ｊ、ＣＤ１５８ｉ、ＣＤ１７８、ＣＤ２９５、ＣＤ１５１、ＣＤ９７、ＣＤ１８３、ＣＤ３９、ＣＤ２３９、ＣＤ１９３、ＣＤ１９４、ＣＤ１９５、ＣＤ１９６、ＣＤｗ１９８、ＣＤｗ１９９、ＣＤ２９６、ＣＤ２９８、ＣＤ４９ａ、ＣＤ３２２、ＣＤ８５ｇ、ＣＤ１８４、ＣＤ１７２ａ、ＣＤ１５６ａ、ＣＤ３３９、ＣＤ１５６ｂ、ＣＤ２１３ａ１、ＣＤ１２９、ＣＤ８３、ＣＤ１２５、ＣＤ２４１、ＣＤ２６９、ＣＤ２０２ｂ、ＣＤ８７、ＣＤ１６４、ＣＤ１３６、ＣＤ１３７、ＣＤ２４９、ＣＤ６９、ＣＤ９１、ＣＤｗ２１０ｂ、ＣＤ１６７ａ、ＣＤ３００ｃ、ＣＤ４７、ＣＤ１５７、ＣＤ３１７、ＣＤ１４８、ＣＤ１６１、ＣＤ２１５、ＣＤ１５０、ＣＤ１１ｄ、ＣＤ２１８ａ、ＣＤ２１０、ＣＤ１６６、ＣＤ１６２、ＣＤ２１３ａ２、ＣＤ２４２、ＣＤ１５８ｇ、ＣＤ１５８ｈ、ＣＤ２７９、ＣＤ１１１、ＣＤ２８１、ＣＤ２２６、ＣＤ２３４、ＣＤ１６７ｂ、ＣＤ３００ｅ、ＣＤ２７６、ＣＤ３０５、ＣＤ３００ｇ、ＣＤ３００ｄ、ＣＤ１０９、ＣＤ２７２、ＣＤ１６３、ＣＤ３０２、ＣＤ１５８ｆ１、ＣＤ８５ｈ、ＣＤ８５ｄ、ＣＤ１７７、ＣＤ１５８ｚ、ＣＤ１５８ｆ２、ＣＤ８５ｊ、ＣＤ３００ｆ、ＣＤ９２、ＣＤ３５１、ＣＤ１１２、ＣＤ１００、ＣＤ２７０、ＣＤ１０１、ＣＤ２９７、ＣＤ３１６、ＣＤ３５２、ＣＤ２１７、ＣＤ３０７ｂ、ＣＤ３０７ａ、ＣＤ３０７ｃ、ＣＤ３０７ｄ、ＣＤ３０７ｅ、ＣＤ１１４、ＣＤ１８０、ＣＤ１５８ｄ、ＣＤ２７３、ＣＤ２９０、ＣＤ２４４、ＣＤ１６９、ＣＤ２９９、ＣＤ３１８、ＣＤ３６０、ＣＤ２２９、ＣＤ２４８、ＣＤ３５４、ＣＤ３２０、ＣＤ９３、ＣＤ３１９、ＣＤ１１３、ＣＤ１６３ｂ、ＣＤ２８９、ＣＤ２８８、ＣＤ３２９、ＣＤ２７４、ＣＤ３５３、ＣＤ１７２ｇ、ＣＤ３１５、ＣＤ２８０、ＣＤ２６４、ＣＤ３００ａ、ＣＤ３１２、ＣＤ８４、ＣＤ３４４、ＣＤ３５０、ＣＤ２４６、ＣＤ２０１、ＣＤ３３８、ＣＤ２０８、ＣＤ２５７、ＣＤ３２８、ＣＤ２８６、ＣＤ３５７、ＣＤ２９４、ＣＤ３２１、ＣＤ２６５、ＣＤ２７８、ＩＴＧＡ７、ＩＴＧＡ８、ＩＴＧＡ９、ＩＴＧＡ１０、ＩＴＧＡ１１、ＣＤ５１、ＣＤ４１、ＣＤ２９、ＣＤ１８、ＣＤ６１、ＣＤ１０４、及びＰＤＧＦからなる群から選択される、請求項１９に記載のＳＩＲＰ－αエンゲージャー細胞。
【請求項22】
前記ＴＭＤが、配列番号１３、配列番号１４、又は配列番号２７に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む、請求項１９に記載のＳＩＲＰ－αエンゲージャー細胞。
【請求項23】
前記ＴＭＤが、配列番号１３、配列番号１４、又は配列番号２７の配列を含む、請求項１９に記載のＳＩＲＰ－αエンゲージャー細胞。
【請求項24】
前記エンゲージャー分子が、細胞内ドメイン（ＩＣＤ）を有さない、請求項１～２３のいずれか一項に記載のＳＩＲＰ－αエンゲージャー細胞。
【請求項25】
前記エンゲージャー分子が、ＣＤ１６、ＣＤ３２、ＣＤ６４、ＣＤ８、ＣＤ３、ＣＤ２８、又はＣＤ１３７に由来する細胞内ドメインを有する、請求項１～２３のいずれか一項に記載のＳＩＲＰ－αエンゲージャー細胞。
【請求項26】
前記エンゲージャー分子が、配列番号１５の配列における１つ又は複数の突然変異から生じる非機能性ＣＤ４７ ＩＣＤを含むＩＣＤを含む、請求項１に記載のＳＩＲＰ－αエンゲージャー細胞。
【請求項27】
前記エンゲージャー分子が、配列番号１５の配列における１つ又は複数の欠失又は挿入から生じる非機能性ＣＤ４７ ＩＣＤを含むＩＣＤを含む、請求項１に記載のＳＩＲＰ－αエンゲージャー細胞。
【請求項28】
前記エンゲージャー分子が、ＥＣＤ配列、ＴＭＤ配列、又はＩＣＤ配列を連結する１つ又は複数のリンカー又はヒンジ領域を有する、請求項２～２７のいずれか一項に記載のＳＩＲＰ－αエンゲージャー細胞。
【請求項29】
前記ＴＭＤが、７回膜貫通タンパク質（７ＴＭ）又は免疫グロブリン細胞表面タンパク質に由来する、請求項１９に記載のＳＩＲＰ－αエンゲージャー細胞。
【請求項30】
前記細胞表面タンパク質が、抗体、受容体、リガンド、又は接着タンパク質である、請求項２～２９のいずれか一項に記載のＳＩＲＰ－αエンゲージャー細胞。
【請求項31】
前記ＳＩＲＰαエンゲージャー細胞が、前記細胞表面に固定されたＣＤ４７融合タンパク質に由来する、請求項１～６のいずれか一項に記載のＳＩＲＰ－αエンゲージャー細胞。
【請求項32】
前記エンゲージャー分子が、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）由来のＣＤ６４相互作用ドメインを介してＣＤ６４と相互作用する、請求項１～１８のいずれか一項に記載のＳＩＲＰ－αエンゲージャー細胞。
【請求項33】
前記エンゲージャー分子が、配列番号２０又は配列番号２２に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するタンパク質を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載のＳＩＲＰ－αエンゲージャー細胞。
【請求項34】
前記エンゲージャー分子が、配列番号２０又は配列番号２２の配列を有するタンパク質を含む、請求項３３に記載のＳＩＲＰ－αエンゲージャー細胞。
【請求項35】
前記エンゲージャー分子が、配列番号２３又は配列番号２４に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するタンパク質を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載のＳＩＲＰ－αエンゲージャー細胞。
【請求項36】
前記エンゲージャー分子が、配列番号２３又は配列番号２４の配列を有するタンパク質を含む、請求項３５に記載のＳＩＲＰ－αエンゲージャー細胞。
【請求項37】
前記エンゲージャー分子が、配列番号２８に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するタンパク質を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載のＳＩＲＰ－αエンゲージャー細胞。
【請求項38】
前記エンゲージャー分子が、配列番号２８の配列を有するタンパク質を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載のＳＩＲＰ－αエンゲージャー細胞。
【請求項39】
ＨＬＡ－Ｉ又はＨＬＡ－ＩＩ発現の減少又は消失をさらに有する、請求項１～３８のいずれか一項に記載のＳＩＲＰ－αエンゲージャー細胞。
【請求項40】
前記細胞がＡＢＯ血液型Ｏである、請求項１～３９のいずれか一項に記載のＳＩＲＰ－αエンゲージャー細胞。
【請求項41】
Ｒｈ因子陰性（Ｒｈ－）である、請求項１～４０のいずれか一項に記載のＳＩＲＰ－αエンゲージャー細胞。
【請求項42】
Ａ１、Ａ２、及びＢからなる群から選択されるＡＢＯ血液型抗原の減少又は消失を有する、請求項１～４１のいずれか一項に記載のＳＩＲＰ－αエンゲージャー細胞。
【請求項43】
Ｒｈ Ｃ抗原、Ｒｈ Ｅ抗原、Ｋｅｌｌ Ｋ抗原（ＫＥＬ）、Ｄｕｆｆｙ（ＦＹ）Ｆｙａ抗原、Ｄｕｆｆｙ Ｆｙ３抗原、Ｋｉｄｄ（ＪＫ）Ｊｋｂ抗原、ＭＮＳ抗原Ｕ、及びＭＮＳ抗原Ｓからなる群から選択されるＲｈタンパク質抗原の発現の減少又は消失を有する、請求項１～４２のいずれか一項に記載のＳＩＲＰ－αエンゲージャー細胞。
【請求項44】
非改変親細胞と比較して低下している内因性主要組織適合遺伝子複合体クラスＩ（ＨＬＡ－Ｉ）機能、及び前記非改変親細胞と比較して低下している内因性主要組織適合遺伝子複合体クラスＩＩ（ＨＬＡ－ＩＩ）機能を含む低免疫原性（ＨＩ）細胞である、請求項１～４３のいずれか一項に記載のＳＩＲＰ－αエンゲージャー細胞。
【請求項45】
野生型幹細胞に対して、ＨＬＡ－Ｉヒト白血球抗原、ＨＬＡ－ＩＩヒト白血球抗原、ＣＤ６４、ＣＤ４７、ＣＤ３８、ＣＣＲ５、ＣＸＣＲ４、ＮＬＲＣ５、ＣＩＩＴＡ、Ｂ２Ｍ、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｇ、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４－Ｉｇ、ＣＤ４７、ＣＩ－ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ、ＩＬ－３５、ＲＦＸ－５、ＲＦＸＡＰ、ＲＦＸＡＮＫ、ＮＦＹ－Ａ、ＮＦＹ－Ｂ、ＮＦＹ－Ｃ、ＩＲＦ－１、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、４－１ＢＢ、ＣＤ２８、Ｂ７－１、Ｂ７－２、ＩＣＯＳ、ＣＤ２７、ＨＶＥＭ、ＳＬＡＭ、ＣＤ２２６、ＰＤ１、ＣＴＬ４、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ３、ＣＤ１６０、ＢＴＬＡ、ＣＤ２４４、ＣＤ３０、ＴＬＴ、ＶＩＳＴＡ、Ｂ７－Ｈ３、ＰＤ－Ｌ２、ＬＦＡ－１、ＣＤ２、ＣＤ５８、ＩＣＡＭ－３、ＴＣＲＡ、ＴＣＲＢ、ＦＯＸＰ３、ＨＥＬＩＯＳ、ＳＴ２、ＰＣＳＫ９、ＡＰＯＣ３、ＣＤ２００、ＦＡＳＬＧ、ＣＬＣ２１、ＭＦＧＥ８、ＳＥＲＰＩＮ Ｂ９、ＴＧＦβ、ＣＤ７３、ＣＤ３９、ＬＡＧ３、ＩＬ１Ｒ２、ＡＣＫＲ２、ＴＮＦＲＳＦ２２、ＴＮＦＲＳＦ２３、ＴＮＦＲＳ１０、ＤＡＤ１、及び／又はＩＦＮγＲ１ ｄ３９のうちの１つ又は複数の発現の調節を含み、ＡＢＯ血液型Ｏ又はＲｈ因子陰性（Ｒｈ－）である、請求項１～４４のいずれか一項に記載のＳＩＲＰ－αエンゲージャー細胞。
【請求項46】
前記細胞表面上の抗体Ｆｃ受容体の発現の上昇をさらに含み、前記Ｆｃ受容体が、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）又は補体媒介性細胞傷害（ＣＤＣ）を回避するのに役立つ、請求項１～４５のいずれか一項に記載のＳＩＲＰ－αエンゲージャー細胞。
【請求項47】
前記Ｆｃ受容体が、ＣＤ１６、ＣＤ３２、又はＣＤ６４である、請求項４６に記載のＳＩＲＰ－αエンゲージャー細胞。
【請求項48】
多能性である、請求項１～４７のいずれか一項に記載のＳＩＲＰ－αエンゲージャー細胞。
【請求項49】
低免疫多能性（ＨＩＰ）細胞である、請求項４８に記載のＳＩＲＰ－αエンゲージャー細胞。
【請求項50】
ＡＢＯ血液型Ｏ（ＨＩＰＯ）を有する低免疫多能性細胞である、請求項４９に記載のＳＩＲＰ－αエンゲージャー細胞。
【請求項51】
Ｒｈ因子陰性（ＨＩＰ－）である低免疫多能性細胞である、請求項４８に記載のＳＩＲＰ－αエンゲージャー細胞。
【請求項52】
ＡＢＯ血液型Ｏを有する低免疫多能性細胞であり、且つＲｈ因子陰性（ＨＩＰＯ－）である、請求項４８に記載のエンゲージャー細胞。
【請求項53】
多能性（ＰＳＣ）細胞、人工ＰＳＣ（ｉＰＳＣ）、又は胚性幹細胞（ＥＳＣ）である、請求項４８に記載のＳＩＲＰ－αエンゲージャー細胞。
【請求項54】
特定の組織型である、請求項１～４７のいずれか一項に記載のＳＩＲＰ－αエンゲージャー細胞。
【請求項55】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、内皮細胞、ドーパミン作動性ニューロン、心臓細胞、膵島細胞、又は網膜色素内皮細胞である、請求項５４に記載のＳＩＲＰ－αエンゲージャー細胞。
【請求項56】
前記ＣＡＲ細胞が、ＣＡＲ－Ｔ細胞又はＣＡＲ－ＮＫ細胞である、請求項５５に記載のＳＩＲＰ－αエンゲージャー細胞。
【請求項57】
多能性細胞から分化した細胞である、請求項１～４７又は５４～５６のいずれか一項に記載のＳＩＲＰ－αエンゲージャー細胞。
【請求項58】
請求項５４～５７のいずれか一項に記載のＳＩＲＰ－αエンゲージャー細胞及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項59】
請求項５４～５７のいずれか一項に記載のＳＩＲＰ－αエンゲージャー細胞及び薬学的に許容される担体を含む薬剤。
【請求項60】
対象の疾患を治療する方法であって、請求項５４～５７のいずれか一項に記載のＳＩＲＰ－αエンゲージャー細胞を前記対象に移植することを含む、方法。
【請求項61】
前記疾患が、１型糖尿病、心疾患、神経疾患、内分泌疾患、癌、失明、又は血管疾患である、請求項５４に記載の方法。
【請求項62】
対象の疾患を治療するための医薬組成物を調製するための、請求項５４～５７のいずれか一項に記載のＳＩＲＰ－αエンゲージャー細胞の使用。
【請求項63】
対象の疾患を治療するための、請求項５４～５７のいずれか一項に記載のＳＩＲＰ－αエンゲージャー細胞の使用。
【請求項64】
前記疾患が、１型糖尿病、心疾患、神経疾患、内分泌疾患、癌、失明、又は血管疾患である、請求項６２又は６３に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
Ｉ．関連出願の相互参照
本出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、２０２０年１２月７日に出願された米国仮特許出願第６３／１２２，４６５号の優先権を米国特許法第１１９条（ｅ）の下で主張する。
本出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、２０２０年１２月７日に出願された米国仮特許出願第６３／１２２，４６５号の優先権を米国特許法第１１９条（ｅ）の下で主張する。
【0002】
ＩＩ．発明の分野
本発明は、非改変ＳＩＲＰα会合機能（ｅｎｇａｇｅｍｅｎｔ ｆｕｎｃｔｉｏｎ）を有する親細胞と比較して、対象に移植された場合に自然免疫に抵抗する、増加したシグナル調節タンパク質アルファ（ＳＩＲＰα）会合機能を有する細胞（ＳＩＲＰαエンゲージャー細胞（ｅｎｇａｇｅｒ ｃｅｌｌ））を提供する。いくつかの実施形態では、ＳＩＲＰαエンゲージャー細胞は、低免疫細胞である。他の実施形態では、ＳＩＲＰαエンゲージャー細胞は、分化した体細胞である。他の実施形態では、ＳＩＲＰαエンゲージャー細胞は、低免疫多能性（ＨＩＰ）細胞である。さらなる実施形態では、ＨＩＰ細胞は、血液型Ｏ（ＨＩＰＯ）、Ｒｈ因子（Ｒｈ）陰性（ＨＩＰ－）、又はＯ型及びＲｈ－の両方（ＨＩＰＯ－）である。他の実施形態では、ＳＩＲＰαエンゲージャー細胞は、ＨＩＰ細胞、ＨＩＰ－細胞、又はＨＩＰＯ－細胞に由来するか、又はこれらから分化した細胞である。他の実施形態では、ＳＩＲＰαエンゲージャー細胞は、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）又は補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）から保護するために抗体Ｆｃ受容体を含む。
本発明は、非改変ＳＩＲＰα会合機能（ｅｎｇａｇｅｍｅｎｔ ｆｕｎｃｔｉｏｎ）を有する親細胞と比較して、対象に移植された場合に自然免疫に抵抗する、増加したシグナル調節タンパク質アルファ（ＳＩＲＰα）会合機能を有する細胞（ＳＩＲＰαエンゲージャー細胞（ｅｎｇａｇｅｒ ｃｅｌｌ））を提供する。いくつかの実施形態では、ＳＩＲＰαエンゲージャー細胞は、低免疫細胞である。他の実施形態では、ＳＩＲＰαエンゲージャー細胞は、分化した体細胞である。他の実施形態では、ＳＩＲＰαエンゲージャー細胞は、低免疫多能性（ＨＩＰ）細胞である。さらなる実施形態では、ＨＩＰ細胞は、血液型Ｏ（ＨＩＰＯ）、Ｒｈ因子（Ｒｈ）陰性（ＨＩＰ－）、又はＯ型及びＲｈ－の両方（ＨＩＰＯ－）である。他の実施形態では、ＳＩＲＰαエンゲージャー細胞は、ＨＩＰ細胞、ＨＩＰ－細胞、又はＨＩＰＯ－細胞に由来するか、又はこれらから分化した細胞である。他の実施形態では、ＳＩＲＰαエンゲージャー細胞は、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）又は補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）から保護するために抗体Ｆｃ受容体を含む。
【背景技術】
【0003】
ＩＩＩ．発明の背景
ナチュラルキラー細胞又はＮＫ細胞は、自然免疫系に重要な細胞傷害性リンパ球である。ＮＫ細胞が果たす役割は、脊椎動物の適応免疫応答における細胞傷害性Ｔ細胞の役割と類似している。ＮＫ細胞は、ウイルス感染細胞及び癌細胞に対して迅速な応答を提供する。典型的には、ＮＫ細胞は、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）をダウンレギュレートする標的細胞によって活性化され、これは、１つの主な抑制ＮＫ細胞シグナルである。ＮＫ細胞の活性化は、溶解又はアポトーシスをもたらすサイトカイン放出を引き起こす。ＮＫ細胞は、他の刺激性ＮＫ細胞シグナルをアップレギュレートして特定の細胞エピトープへの事前の曝露を必要とせずに、ストレスを受けた細胞を認識できるため独特である。これにより、ＮＫ細胞は、非常に迅速に応答する。ＮＫ細胞は、遊離抗体Ｆｃの結合が強力な刺激性ＮＫ細胞シグナルであるため、抗体を含む細胞にも迅速に応答することができる。ＮＫ細胞は、ＩＬ－２又はＩＬ－１５のような一部のサイトカイン曝露の他は、ＭＨＣクラス１の「自己」マーカーが欠落している細胞を死滅させるために強力な活性化を必要としない。ＭＨＣ Ｉマーカーがダウンレギュレートされているか又は欠落している有害な細胞を、Ｔリンパ球細胞などの他の免疫細胞によって検出も破壊もできないため、この役割は特に重要である。
ナチュラルキラー細胞又はＮＫ細胞は、自然免疫系に重要な細胞傷害性リンパ球である。ＮＫ細胞が果たす役割は、脊椎動物の適応免疫応答における細胞傷害性Ｔ細胞の役割と類似している。ＮＫ細胞は、ウイルス感染細胞及び癌細胞に対して迅速な応答を提供する。典型的には、ＮＫ細胞は、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）をダウンレギュレートする標的細胞によって活性化され、これは、１つの主な抑制ＮＫ細胞シグナルである。ＮＫ細胞の活性化は、溶解又はアポトーシスをもたらすサイトカイン放出を引き起こす。ＮＫ細胞は、他の刺激性ＮＫ細胞シグナルをアップレギュレートして特定の細胞エピトープへの事前の曝露を必要とせずに、ストレスを受けた細胞を認識できるため独特である。これにより、ＮＫ細胞は、非常に迅速に応答する。ＮＫ細胞は、遊離抗体Ｆｃの結合が強力な刺激性ＮＫ細胞シグナルであるため、抗体を含む細胞にも迅速に応答することができる。ＮＫ細胞は、ＩＬ－２又はＩＬ－１５のような一部のサイトカイン曝露の他は、ＭＨＣクラス１の「自己」マーカーが欠落している細胞を死滅させるために強力な活性化を必要としない。ＭＨＣ Ｉマーカーがダウンレギュレートされているか又は欠落している有害な細胞を、Ｔリンパ球細胞などの他の免疫細胞によって検出も破壊もできないため、この役割は特に重要である。
【0004】
ＮＫ細胞は、一般的なリンパ球前駆細胞を産生するＢ及びＴリンパ球から分化した大顆粒リンパ球である。ＮＫ細胞は、骨髄、リンパ節、脾臓、扁桃腺、及び胸腺で分化して成熟し、そこで循環に入る。
【0005】
ＳＩＲＰαは、シグナル調節タンパク質（ＳＩＲＰ）ファミリーのメンバーであり、免疫グロブリンスーパーファミリーにも属している。ＳＩＲＰファミリーのメンバーは、受容体チロシンキナーゼ結合シグナル伝達プロセスの負の調節に関与することが知られている受容体型膜貫通糖タンパク質である。ＳＩＲＰαは、チロシンキナーゼによってリン酸化され得る。ホスホチロシン残基は、ＳＨ２ドメインを含むチロシンホスファターゼ（ＰＴＰ）を動員し、それらの基質として機能する。ＳＩＲＰαは、様々な成長因子受容体によって媒介されるシグナル伝達に関与している。
【0006】
ＣＤ４７は、ＳＩＲＰαのリガンドである。ＣＤ４７は、腫瘍の種類を超えて広く過剰発現され得る「自己のマーカー」タンパク質である。ＣＤ４７は、癌免疫療法のための新規の強力なマクロファージ免疫チェックポイントとして浮上している。腫瘍細胞のＣＤ４７は、マクロファージの食作用を阻害する「私を食べるな」シグナルを送信する。ＣＤ４７は、血液癌及び固形腫瘍の単剤療法及び併用療法の両方としてのＣＤ４７阻害剤の機会と課題を提示する。これらの作用物質のいくつかは、現在臨床試験中である。
【0007】
ＣＤ４７の細胞質シグナル伝達は、その細胞内ドメイン（ＩＣＤ）を介して媒介され得るが、これまでのところ、ＣＤ４７細胞質尾部と直接相互作用するタンパク質はほとんど同定されていない（Ｌａｍｙ Ｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２７８：２３９１５－２１（２００３）；Ｗｕ Ａ．Ｌ．，．Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ．４：６１９－２５（１９９９））。そのような結合パートナーの１つであるユビキリン－１は、Ｇβγに結合し、それによってヘテロ三量体Ｇタンパク質をＣＤ４７に繋ぎ止める（Ｎ’Ｄｉａｙｅ Ｅ．Ｎ，．Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１６３：１１５７－６５（２００３））。これに関連して、ユビキリン－１は、Ｇｉ共役受容体ＣＸＣＲ４によってシグナル伝達される走化性を阻害する（Ｓｉｃｋ Ｅ．，Ｇｌｉａ．５９：３０８－１９（２０１１））。上記は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【0008】
ヒト初代ＮＫ細胞は、刺激によりＳＩＲＰαを発現し、ＣＤ４７に結合することが示された。これにより、ＣＤ４７発現細胞に対するヒト初代ＮＫ細胞の死滅効果が低下する（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０／３９２２０号明細書を参照されたい）。
【0009】
自己人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）は、理論的には、患者固有の細胞ベースの器官修復戦略のための無制限の細胞源を構成する。しかしながら、自己人工多能性幹細胞の作製には、技術的及び製造上の課題があり、この作製は、あらゆる急性治療法を概念的に妨げる長期のプロセスである。同種異系ｉＰＳＣベースの治療又は胚性幹細胞ベースの治療は、製造の観点からより容易であり、十分にスクリーニングされ、標準化された高品質の細胞産物の作製が可能である。多能性幹細胞は、３つの胚葉の任意の細胞型に分化できるため、幹細胞療法の応用可能性は広範囲に及ぶ。分化は、移植部位の器官環境で分化及び成熟し続ける前駆細胞を移植することによって、エクスビボ又はインビボで実施することができる。エクスビボ分化により、研究者又は臨床医は、手順を注意深く監視し、適切な細胞集団が移植前に確実に生成されるようにすることができる。しかしながら、そのような細胞産物は同種異系起源であるため、拒絶反応が起こり得る。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0010】
ＩＶ．発明の概要
本発明は、非改変ＳＩＲＰα会合機能を有する親細胞と比較して、対象に移植された場合に自然免疫に抵抗する、増加したシグナル調節タンパク質アルファ（ＳＩＲＰα）会合機能を有する細胞（ＳＩＲＰαエンゲージャー細胞）を提供する。いくつかの実施形態では、ＳＩＲＰαエンゲージャー細胞は、低免疫多能性（ＨＩＰ）細胞である。さらなる実施形態では、ＨＩＰ細胞は、血液型Ｏ（ＨＩＰＯ）、Ｒｈ因子（Ｒｈ）陰性（ＨＩＰ－）、又はＯ型及びＲｈ－の両方（ＨＩＰＯ－）である。他の実施形態では、ＳＩＲＰαエンゲージャー細胞は、ＨＩＰ細胞、ＨＩＰ－細胞、又はＨＩＰＯ－細胞に由来するか、又はこれらから分化した細胞である。
本発明は、非改変ＳＩＲＰα会合機能を有する親細胞と比較して、対象に移植された場合に自然免疫に抵抗する、増加したシグナル調節タンパク質アルファ（ＳＩＲＰα）会合機能を有する細胞（ＳＩＲＰαエンゲージャー細胞）を提供する。いくつかの実施形態では、ＳＩＲＰαエンゲージャー細胞は、低免疫多能性（ＨＩＰ）細胞である。さらなる実施形態では、ＨＩＰ細胞は、血液型Ｏ（ＨＩＰＯ）、Ｒｈ因子（Ｒｈ）陰性（ＨＩＰ－）、又はＯ型及びＲｈ－の両方（ＨＩＰＯ－）である。他の実施形態では、ＳＩＲＰαエンゲージャー細胞は、ＨＩＰ細胞、ＨＩＰ－細胞、又はＨＩＰＯ－細胞に由来するか、又はこれらから分化した細胞である。
【0011】
したがって、本発明は、免疫細胞上のシグナル調節タンパク質アルファ（ＳＩＲＰα）タンパク質と会合するエンゲージャー分子（ｅｎｇａｇｅｒ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）を細胞表面上に含むＳＩＲＰ－αエンゲージャー細胞を提供し、この会合が、エンゲージャー細胞が免疫細胞によって死滅するのを防止し、細胞表面分子は、機能性ＣＤ４７細胞内ドメインを欠いている。
【0012】
本発明のいくつかの態様では、エンゲージャー分子はタンパク質である。他の態様では、タンパク質は、融合タンパク質である。他の態様では、融合タンパク質は、ＣＤ４７細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を含む。他の態様では、ＣＤ４７ ＥＣＤは、配列番号３と少なくとも９０％の配列同一性を有する。好ましい態様では、ＣＤ４７ ＥＣＤは、配列番号３の配列を含む。
【0013】
本発明のいくつかの態様では、ＳＩＲＰ－αエンゲージャー細胞は、免疫グロブリンスーパーファミリードメインを含む。他の態様では、免疫グロブリンスーパーファミリードメインは、配列番号４に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する。好ましい態様では、免疫グロブリンスーパーファミリードメインは、配列番号４の配列を含む。
【0014】
本発明のいくつかの態様では、エンゲージャー分子は、ＳＩＲＰαに結合する抗体Ｆａｂ又は単鎖可変断片（ｓｃＦＶ）を含む。他の態様では、Ｆａｂ又はｓｃＦＶは、その解離定数（Ｋｄ）によって測定される親和性でＳＩＲＰαに結合し、Ｋｄは、約１０－７～１０－１３Ｍである。
【0015】
本発明のいくつかの態様では、エンゲージャー分子は、ＳＩＲＰαに結合する１つ又は複数の抗体相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。他の態様では、１つ又は複数のＣＤＲは、配列番号５～１２のいずれか１つに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する。好ましい態様では、１つ又は複数のＣＤＲは、配列番号５～１２のいずれか１つの配列を含む。他の態様では、１つ又は複数のＣＤＲは、配列番号５に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する。好ましい態様では、１つ又は複数のＣＤＲは、配列番号５の配列を含む。他の態様では、１つ又は複数のＣＤＲは、配列番号９に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する。好ましい態様では、１つ又は複数のＣＤＲは、配列番号９の配列を含む。
【0016】
本発明のいくつかの態様では、エンゲージャー分子は、異種膜貫通ドメイン（ＴＭＤ）を含む融合タンパク質である。他の態様では、ＴＭＤは、単一のαヘリックス、複数のαヘリックス、又は丸まったβシートを含む。他の態様では、異種ＴＭＤは、ＣＤ８５ｆ、ＣＤ３４９、ＣＤ２８４、ＣＤ２６１、ＣＤ１７２ｂ、ＣＤ２７７、ＣＤ１８６、ＣＤ１５６ｃ、ＣＤ３０４、ＣＤ２５４、ＣＤ２６３、ＣＤ２６７、ＣＤ３３７、ＣＤ１７０、ＣＤ２８３、ＣＤ１３３、ＣＤ３２７、ＣＤ２０５、ＣＤ２３２、ＣＤ２８２、ＣＤ１６ｂ、ＣＤ８５ｉ、ＣＤ８５ａ、ＣＤ８５ｃ、ＣＤ２７５、ＣＤ１０８、ＣＤ３５８、ＣＤ３３５、ＣＤ２１８ｂ、ＣＤ３５５、ＣＤ３３６、ＣＤ１６０、ＣＤ２５、ＣＤ４、ＣＤ８ａ、ＣＤ２３５ａ、ＣＤ２３３、ＣＤ２３０、ＣＤ９０、ＣＤ７４、ＣＤ３ｄ、ＣＤ３４０、ＣＤ２３６、ＣＤ６１、ＣＤ１８、ＣＤ５４、ＣＤ２９、ＣＤ１ａ、ＣＤ５、ＣＤ２２０、ＣＤ２、ＣＤ６６ｅ、ＣＤ５１、ＣＤ１４１、ＣＤ１１５、ＣＤ４２ｂ、ＣＤ２２１、ＣＤ２７１、ＣＤ５５、ＣＤ２４３、ＣＤ９８、ＣＤ１０、ＣＤ４１、ＣＤ１４、ＣＤ４５、ＣＤ２２８、ＣＤ１６ａ、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ１２６、ＣＤ６３、ＣＤ４８、ＣＤ７、ＣＤ１４０ｂ、ＣＤ３ｇ、ＣＤ１１７、ＣＤ２８、ＣＤ８ｂ、ＣＤ３７、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１０７ａ、ＣＤ３３１、ＣＤ２２２、ＣＤ２０、ＣＤ７９ａ、ＣＤ６４、ＣＤ３２、ＣＤ１４３、ＣＤ３２４、ＣＤ４２ｃ、ＣＤ１０７ｂ、ＣＤ５６、ＣＤ１０２、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ６６ａ、ＣＤ１４２、ＣＤ５９、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２１ａ、ＣＤ１２２、ＣＤ１３、ＣＤ１５５、ＣＤ１１９、ＣＤ１９、ＣＤ１１６、ＣＤ４６、ＣＤ１ｅ、ＣＤ１ｄ、ＣＤ２２７、ＣＤ４４、ＣＤ６２Ｐ、ＣＤ１０４、ＣＤ４３、ＣＤ１４０ａ、ＣＤ３１、ＣＤ１５２、ＣＤ３２６、ＣＤ６２Ｅ、ＣＤ３６、ＣＤ１２７、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ１０５、ＣＤ３５、ＣＤ２２３、ＣＤ１３８、ＣＤ３２５、ＣＤ５８、ＣＤ１０６、ＣＤ５３、ＣＤ１２０ａ、ＣＤ２２４、ＣＤ２１、ＣＤ３３、ＣＤ２２、ＣＤ１２０ｂ、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ３６３、ＣＤ７３、ＣＤ８８、ＣＤ２０４、ＣＤ３３２、ＣＤ９、ＣＤ２０３ａ、ＣＤ３３４、ＣＤ３３３、ＣＤ２０６、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ２３８、ＣＤ２５２、ＣＤ８９、ＣＤ１２４、ＣＤ１８１、ＣＤ１８２、ＣＤ２４、ＣＤ９５、ＣＤ４０、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ１５９ａ、ＣＤ１５９ｃ、ＣＤ３１４、ＣＤ２７、ＣＤ１２３、ＣＤ２６、ＣＤ８２、ＣＤ１２１ｂ、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ３０、ＣＤ１ｂ、ＣＤ１ｃ、ＣＤ１５４、ＣＤ６、ＣＤ５２、ＣＤ１３２、ＣＤ３２、ＣＤ６６ｂ、ＣＤ１７１、ＣＤ１９１、ＣＤ１９７、ＣＤ１８５、ＣＤ１３１、ＣＤ５０、ＣＤ７０、ＣＤ１５３、ＣＤ１４４、ＣＤ８０、ＣＤ３６２、ＣＤ６８、ＣＤ３６１、ＣＤ１４７、ＣＤ３０９、ＣＤ１３５、ＣＤ２９２、ＣＤ１０３、ＣＤ１３０、ＣＤ４２ｄ、ＣＤ６６ｄ、ＣＤ６６ｃ、ＣＤ９６、ＣＤ１１０、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ２００、ＣＤ１９２、ＣＤ２３１、ＣＤ８６、ＣＤ２１２、ＣＤ１１８、ＣＤ１４６、ＣＤ１３４、ＣＤ１５８ａ、ＣＤ１５８ｂ１、ＣＤ１５８ｂ２、ＣＤ１５８ｅ、ＣＤ１５８ｋ、ＣＤ１５８ｊ、ＣＤ１５８ｉ、ＣＤ１７８、ＣＤ２９５、ＣＤ１５１、ＣＤ９７、ＣＤ１８３、ＣＤ３９、ＣＤ２３９、ＣＤ１９３、ＣＤ１９４、ＣＤ１９５、ＣＤ１９６、ＣＤｗ１９８、ＣＤｗ１９９、ＣＤ２９６、ＣＤ２９８、ＣＤ４９ａ、ＣＤ３２２、ＣＤ８５ｇ、ＣＤ１８４、ＣＤ１７２ａ、ＣＤ１５６ａ、ＣＤ３３９、ＣＤ１５６ｂ、ＣＤ２１３ａ１、ＣＤ１２９、ＣＤ８３、ＣＤ１２５、ＣＤ２４１、ＣＤ２６９、ＣＤ２０２ｂ、ＣＤ８７、ＣＤ１６４、ＣＤ１３６、ＣＤ１３７、ＣＤ２４９、ＣＤ６９、ＣＤ９１、ＣＤｗ２１０ｂ、ＣＤ１６７ａ、ＣＤ３００ｃ、ＣＤ４７、ＣＤ１５７、ＣＤ３１７、ＣＤ１４８、ＣＤ１６１、ＣＤ２１５、ＣＤ１５０、ＣＤ１１ｄ、ＣＤ２１８ａ、ＣＤ２１０、ＣＤ１６６、ＣＤ１６２、ＣＤ２１３ａ２、ＣＤ２４２、ＣＤ１５８ｇ、ＣＤ１５８ｈ、ＣＤ２７９、ＣＤ１１１、ＣＤ２８１、ＣＤ２２６、ＣＤ２３４、ＣＤ１６７ｂ、ＣＤ３００ｅ、ＣＤ２７６、ＣＤ３０５、ＣＤ３００ｇ、ＣＤ３００ｄ、ＣＤ１０９、ＣＤ２７２、ＣＤ１６３、ＣＤ３０２、ＣＤ１５８ｆ１、ＣＤ８５ｈ、ＣＤ８５ｄ、ＣＤ１７７、ＣＤ１５８ｚ、ＣＤ１５８ｆ２、ＣＤ８５ｊ、ＣＤ３００ｆ、ＣＤ９２、ＣＤ３５１、ＣＤ１１２、ＣＤ１００、ＣＤ２７０、ＣＤ１０１、ＣＤ２９７、ＣＤ３１６、ＣＤ３５２、ＣＤ２１７、ＣＤ３０７ｂ、ＣＤ３０７ａ、ＣＤ３０７ｃ、ＣＤ３０７ｄ、ＣＤ３０７ｅ、ＣＤ１１４、ＣＤ１８０、ＣＤ１５８ｄ、ＣＤ２７３、ＣＤ２９０、ＣＤ２４４、ＣＤ１６９、ＣＤ２９９、ＣＤ３１８、ＣＤ３６０、ＣＤ２２９、ＣＤ２４８、ＣＤ３５４、ＣＤ３２０、ＣＤ９３、ＣＤ３１９、ＣＤ１１３、ＣＤ１６３ｂ、ＣＤ２８９、ＣＤ２８８、ＣＤ３２９、ＣＤ２７４、ＣＤ３５３、ＣＤ１７２ｇ、ＣＤ３１５、ＣＤ２８０、ＣＤ２６４、ＣＤ３００ａ、ＣＤ３１２、ＣＤ８４、ＣＤ３４４、ＣＤ３５０、ＣＤ２４６、ＣＤ２０１、ＣＤ３３８、ＣＤ２０８、ＣＤ２５７、ＣＤ３２８、ＣＤ２８６、ＣＤ３５７、ＣＤ２９４、ＣＤ３２１、ＣＤ２６５、ＣＤ２７８、ＩＴＧＡ７、ＩＴＧＡ８、ＩＴＧＡ９、ＩＴＧＡ１０、ＩＴＧＡ１１、ＣＤ５１、ＣＤ４１、ＣＤ２９、ＣＤ１８、ＣＤ６１、ＣＤ１０４、及びＰＤＧＦからなる群から選択される。
【0017】
他の態様では、ＴＭＤは、配列番号１３、配列番号１４、又は配列番号２７に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む。好ましい態様では、ＴＭＤは、配列番号１３、配列番号１４、又は配列番号２７の配列を含む。
【0018】
本発明のいくつかの態様では、エンゲージャー分子は、細胞内ドメイン（ＩＣＤ）を有さない。本発明の他の態様では、エンゲージャー分子は、ＣＤ１６、ＣＤ３２、ＣＤ６４、ＣＤ８、ＣＤ３、ＣＤ２８、又はＣＤ１３７に由来する細胞内ドメインを有する。本発明の他の態様では、エンゲージャー分子は、配列番号１５の配列における１つ又は複数の突然変異から生じる非機能性ＣＤ４７ＩＣＤを含むＩＣＤを含む。本発明の他の態様では、エンゲージャー分子は、配列番号１５の配列への１つ又は複数の欠失又は挿入から生じる非機能性ＣＤ４７ＩＣＤを含むＩＣＤを含む。
【0019】
本発明のいくつかの態様では、エンゲージャー分子は、ＥＣＤ配列、ＴＭＤ配列、又はＩＣＤ配列を連結する１つ又は複数のリンカー又はヒンジ領域を有する。
【0020】
本発明の他の態様では、ＴＭＤは、７回膜貫通タンパク質（７ＴＭ）又は免疫グロブリン細胞表面タンパク質に由来する。
【0021】
本発明のいくつかの態様では、細胞表面タンパク質は、抗体、受容体、リガンド、又は接着タンパク質である。他の態様では、ＳＩＲＰαエンゲージャー細胞は、細胞表面に固定されたＣＤ４７融合タンパク質に由来する。他の態様では、エンゲージャー分子は、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）由来のＣＤ６４相互作用ドメインを介してＣＤ６４と相互作用する。
【0022】
本発明のいくつかの態様では、エンゲージャー分子は、配列番号２０又は配列番号２２に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するタンパク質を含む。好ましい態様では、エンゲージャー分子は、配列番号２０又は配列番号２２の配列を有するタンパク質を含む。
【0023】
本発明のいくつかの態様では、エンゲージャー分子は、配列番号２３又は配列番号２４に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するタンパク質を含む。好ましい態様では、エンゲージャー分子は、配列番号２３又は配列番号２４の配列を有するタンパク質を含む。
【0024】
本発明のいくつかの態様では、エンゲージャー分子は、配列番号２８に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するタンパク質を含む。好ましい態様では、エンゲージャー分子は、配列番号２８の配列を有するタンパク質を含む。
【0025】
本発明のいくつかの態様では、本明細書に開示されるＳＩＲＰ－αエンゲージャー細胞は、ＨＬＡ－Ｉ又はＨＬＡ－ＩＩ発現の減少又は消失をさらに有する。他の態様では、細胞は、ＡＢＯ血液型Ｏである。他の態様では、細胞は、Ｒｈ因子陰性（Ｒｈ－）である。他の態様では、細胞は、Ａ１、Ａ２、及びＢからなる群から選択されるＡＢＯ血液型抗原の減少又は消失を有する。他の態様では、細胞は、Ｒｈ Ｃ抗原、Ｒｈ Ｅ抗原、Ｋｅｌｌ Ｋ抗原（ＫＥＬ）、Ｄｕｆｆｙ（ＦＹ）Ｆｙａ抗原、Ｄｕｆｆｙ Ｆｙ３抗原、Ｋｉｄｄ（ＪＫ）Ｊｋｂ抗原、ＭＮＳ抗原Ｕ、ＭＮＳ抗原Ｓからなる群から選択されるＲｈタンパク質抗原の発現の減少又は消失を有する。
【0026】
本発明のいくつかの態様では、本明細書に開示されるＳＩＲＰ－αエンゲージャー細胞は、非改変親細胞と比較して低下している内因性主要組織適合遺伝子複合体クラスＩ（ＨＬＡ－Ｉ）機能、及び非改変親細胞と比較して低下している内因性主要組織適合遺伝子複合体クラスＩＩ（ＨＬＡ－ＩＩ）機能を含む低免疫原性（ＨＩ）細胞である。
【0027】
本発明のいくつかの態様では、本明細書に記載のＳＩＲＰ－αエンゲージャー細胞は、野生型幹細胞に対して、ＨＬＡ－Ｉヒト白血球抗原、ＨＬＡ－ＩＩヒト白血球抗原、ＣＤ６４、ＣＤ４７、ＣＤ３８、ＣＣＲ５、ＣＸＣＲ４、ＮＬＲＣ５、ＣＩＩＴＡ、Ｂ２Ｍ、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｇ、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４－Ｉｇ、ＣＤ４７、ＣＩ－ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ、ＩＬ－３５、ＲＦＸ－５、ＲＦＸＡＰ、ＲＦＸＡＮＫ、ＮＦＹ－Ａ、ＮＦＹ－Ｂ、ＮＦＹ－Ｃ、ＩＲＦ－１、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、４－１ＢＢ、ＣＤ２８、Ｂ７－１、Ｂ７－２、ＩＣＯＳ、ＣＤ２７、ＨＶＥＭ、ＳＬＡＭ、ＣＤ２２６、ＰＤ１、ＣＴＬ４、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ３、ＣＤ１６０、ＢＴＬＡ、ＣＤ２４４、ＣＤ３０、ＴＬＴ、ＶＩＳＴＡ、Ｂ７－Ｈ３、ＰＤ－Ｌ２、ＬＦＡ－１、ＣＤ２、ＣＤ５８、ＩＣＡＭ－３、ＴＣＲＡ、ＴＣＲＢ、ＦＯＸＰ３、ＨＥＬＩＯＳ、ＳＴ２、ＰＣＳＫ９、ＡＰＯＣ３、ＣＤ２００、ＦＡＳＬＧ、ＣＬＣ２１、ＭＦＧＥ８、ＳＥＲＰＩＮ Ｂ９、ＴＧＦβ、ＣＤ７３、ＣＤ３９、ＬＡＧ３、ＩＬ１Ｒ２、ＡＣＫＲ２、ＴＮＦＲＳＦ２２、ＴＮＦＲＳＦ２３、ＴＮＦＲＳ１０、ＤＡＤ１、及び／又はＩＦＮγＲ１ ｄ３９のうちの１つ又は複数の発現が調節され、エンゲージャー細胞は、ＡＢＯ血液型Ｏ又はＲｈ因子陰性（Ｒｈ－）である。
【0028】
本発明のいくつかの態様では、本明細書に開示されるＳＩＲＰ－αエンゲージャー細胞は、細胞表面上の抗体Ｆｃ受容体の発現の増加をさらに有し、Ｆｃ受容体は、抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）又は補体媒介性細胞毒性（ＣＤＣ）を回避するのに役立つ。いくつかの態様では、Ｆｃ受容体は、ＣＤ１６、ＣＤ３２、又はＣＤ６４である。
【0029】
本発明のいくつかの態様では、本明細書に開示されるＳＩＲＰ－αエンゲージャー細胞は多能性である。他の態様では、ＳＩＲＰ－αエンゲージャー細胞は、低免疫多能性（ＨＩＰ）細胞である。他の態様では、ＳＩＲＰ－αエンゲージャー細胞は、ＡＢＯ血液型Ｏ（ＨＩＰＯ）を有する低免疫多能性細胞であるか、又はＲｈ因子陰性（ＨＩＰ－）である。好ましい態様では、本明細書に開示されるＳＩＲＰ－αエンゲージャー細胞は、ＡＢＯ血液型Ｏを有し、且つＲｈ因子陰性（ＨＩＰＯ－）である。他の態様では、本明細書に開示されるＳＩＲＰ－αエンゲージャー細胞は、多能性（ＰＳＣ）細胞、人工ＰＳＣ（ｉＰＳＣ）、又は胚性幹細胞（ＥＳＣ）である。
【0030】
本発明のいくつかの態様では、本明細書に開示されるＳＩＲＰ－αエンゲージャー細胞は、特定の組織型である。他の態様では、本細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、内皮細胞、ドーパミン作動性ニューロン、心臓細胞、膵島細胞、又は網膜色素内皮細胞である。好ましい態様では、ＣＡＲ細胞は、ＣＡＲ－Ｔ細胞又はＣＡＲ－ＮＫ細胞である。
【0031】
本発明のいくつかの態様では、本明細書に開示されるＳＩＲＰ－αエンゲージャー細胞は、多能性細胞から分化される。
【0032】
本発明は、本明細書に開示されるＳＩＲＰ－αエンゲージャー細胞及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。
【0033】
本発明は、本明細書に開示されるＳＩＲＰ－αエンゲージャー細胞及び薬学的に許容される担体を含む薬剤を提供する。
【0034】
本発明は、本明細書に開示されるＳＩＲＰ－αエンゲージャー細胞を対象に移植することを含む、対象の疾患を治療する方法を提供する。いくつかの実施形態では、この疾患は、１型糖尿病、心疾患、神経疾患、内分泌疾患、癌、失明、又は血管疾患である。
【0035】
本発明は、対象における疾患を治療するための医薬組成物を調製するための、本明細書に開示されるＳＩＲＰ－αエンゲージャー細胞の使用を提供する。
【0036】
本発明は、対象の疾患を治療するための、本明細書に開示されるＳＩＲＰ－αエンゲージャー細胞の使用を提供する。いくつかの態様では、疾患は、１型糖尿病、心疾患、神経疾患、内分泌疾患、癌、失明、又は血管疾患である。
Ｖ．図面の簡単な説明
Ｖ．図面の簡単な説明
【図面の簡単な説明】
【0037】
【図1】図１Ａ～図１Ｃは、Ｐ８１５に対するリダイレクト抗体依存性細胞傷害性アッセイを示す。図１Ａは、ＩＬ－２で７２時間刺激された初代ヒトＣＤ３－ＣＤ７＋ＣＤ５６＋ＮＫ細胞を示す。ＳＩＲＰα発現を、フローサイトメトリーによって評価した（２つの独立した実験の代表的なヒストグラム）。図１Ｂ及び図１Ｃでは、これらの刺激されたＣＤ３～ＣＤ７＋ＣＤ５６＋ＮＫ細胞を、ホタルルシフェラーゼ発現（ＦＬｕｃ＋）標的Ｐ８１５細胞に添加し、標的細胞の死滅を、生物発光イメージング（ＢＬＩ）によって評価した。標的細胞の死滅は、ＢＬＩシグナルの低下と相関する。場合によっては、ＮＫ細胞を、ＣＤ１６（図１Ｂ）又はＮＫＧ２Ｄ（図１Ｃ）に対する活性化抗体と一緒に添加した。活性化シグナルを相殺する抗ＳＩＲＰαの効果を、活性化抗体と同時に抗ＳＩＲＰαを投与することによって評価した。ＮＫ細胞上で発現されるが、活性化又は阻害経路を有していないＣＤ５６に対する抗体を対照として用いた（平均±標準偏差、群当たり３回の独立した実験、ボンフェローニの事後検定によるＡＮＯＶＡ）。抗ＳＩＲＰα抗体は、ＣＤ１６又はＮＫＧ２Ｄを介した活性化刺激を完全に排除しただけではなく、Ｐ８１５標的に対する細胞傷害性ＮＫ細胞機能を阻害した。
【図2】図２は、ＳＩＲＰαエンゲージャー機能の原理を示す。標的細胞表面に結合した抗ＳＩＲＰα抗体（ＳＩＲＰαエンゲージャー）は、ＮＫ細胞によるＨＬＡ欠損標的細胞の死滅を阻害した。ＣＤ６４を発現するＦＬｕｃ＋ヒトＢ２Ｍ－／－ＣＩＩＴＡ－／－ｉＰＳＣ由来内皮細胞（ｉＥＣ）を、ＣＤ６４によって捕捉されて結合した、細胞表面を覆った抗ＳＩＲＰα抗体と共にインキュベートした。これらの細胞、及び対照Ｂ２Ｍ－／－ＣＩＩＴＡ－／－ｉＰＳＣ由来ＥＣを、ＩＬ－２で７２時間刺激されたＣＤ３－ＣＤ７＋ＣＤ５６＋ＮＫ細胞と共にインキュベートした。標的細胞の死滅を、ＢＬＩ（平均±標準偏差、群当たり３回の独立した実験、スチューデントのｔ検定）によって評価した。Ｂ２Ｍ－／－ＣＩＩＴＡ－／－ＣＤ６４トランスジェニック（ｔｇ）ｉＥＣ上の捕捉された抗ＳＩＲＰα抗体は、ＮＫ細胞ＳＩＲＰαに会合して、細胞傷害性ＮＫ細胞応答を阻害した。
【図3】ＳＩＲＰαエンゲージャーは、エンジニアリングされた細胞上で発現される合成融合タンパク質である。この融合タンパク質は、細胞外ドメイン（ＥＣＤ）と膜貫通ドメイン（ＴＭＤ）から構成され、細胞内ドメイン（ＩＣＤ）を含んでも含まなくてもよい。これらのドメインは、直接又はリンカーを介して互いに連結されていてもよい。ＳＩＲＰαエンゲージャー融合タンパク質のＥＣＤは、アゴニスト様式で免疫細胞上のＳＩＲＰαと会合し、これにより、免疫細胞エフェクター機能の関連阻害を伴うＳＩＲＰαシグナル伝達が引き起こされる。ＴＭＤは、タンパク質を細胞膜に固定する。任意選択のＩＣＤは、そのようなシグナル伝達がエンジニアリングされた細胞の機能にとって有益である場合、エンジニアリングされた細胞内にシグナル伝達を提供し得る。
【図4】ＣＤ４７－ＣＤ６４ハイブリッドタンパク質を発現するＦＬｕｃ＋Ｂ２Ｍ－／－ＣＩＩＴＡ－／－ｉＥＣ細胞は、ＩＬ－２で７２時間刺激された初代ヒトＮＫ細胞による死滅から保護された。保護は、ＦＬｕｃ＋Ｂ２Ｍ－／－ＣＩＩＴＡ－／－ｉＥＣ細胞と比較した場合、ＢＬＩシグナルの小さい低下として記録された。ＣＤ４７－ＣＤ６４ハイブリッドペプチドの発現は、ある程度の免疫防御をもたらした。
【図5】合成抗ＳＩＲＰα－ＣＤ６４融合タンパク質（抗体融合体１）を発現するＦＬｕｃ＋Ｂ２Ｍ－／－ＣＩＩＴＡ－／－ｉＥＣ細胞は、ＩＬ－２で７２時間刺激された初代ヒトＮＫ細胞による死滅から保護された。保護は、ＦＬｕｃ＋Ｂ２Ｍ－／－ＣＩＩＴＡ－／－ｉＥＣ細胞と比較した場合、ＢＬＩシグナルの小さい低下として記録された。抗体融合体１タンパク質は、ＮＫ細胞死滅に対してある程度の免疫防御をもたらした。
【図6】合成抗ＳＩＲＰα－ＣＤ６４融合タンパク質（抗体融合体２）を発現するＦＬｕｃ＋Ｂ２Ｍ－／－ＣＩＩＴＡ－／－ｉＥＣ細胞は、ＩＬ－２で７２時間刺激された初代ヒトＮＫ細胞による死滅から保護された。保護は、ＦＬｕｃ＋Ｂ２Ｍ－／－ＣＩＩＴＡ－／－ｉＥＣ細胞と比較した場合、ＢＬＩシグナルの小さい低下として記録された。抗体融合体２タンパク質は、ＮＫ細胞死滅に対してある程度の免疫防御をもたらした。
【図7】ＦＬｕｃ＋Ｂ２Ｍ－／－ＣＩＩＴＡ－／－ｉＥＣ細胞に、トラスツズマブ構造配列を介してＣＤ６４ ＴＭＤに融合された抗ＳＩＲＰα抗体の重鎖及び軽鎖の導入遺伝子を有する２つのレンチウイルスを形質導入した。この抗ＳＩＲＰα－Ｔｒａｓ－ＣＤ６４融合タンパク質の発現は、ＩＬ－２で７２時間刺激された初代ヒトＮＫ細胞に対する防御を示した。保護は、ＦＬｕｃ＋Ｂ２Ｍ－／－ＣＩＩＴＡ－／－ｉＥＣ細胞と比較した場合、ＢＬＩシグナルの小さい低下として記録された。
【図8】ＦＬｕｃ＋Ｂ２Ｍ－／－ＣＩＩＴＡ－／－ｉＥＣ細胞に形質導入して、より小さな抗ＳＩＲＰα－ｓｃＦｖ－ＣＤ８－ＰＤＧＦ融合タンパク質を発現させた。この抗ＳＩＲＰα－ｓｃＦｖ－ＣＤ８－ＰＤＧＦ融合タンパク質の発現は、ＩＬ－２で７２時間刺激された初代ヒトＮＫ細胞に対する防御を示した。保護は、ＦＬｕｃ＋Ｂ２Ｍ－／－ＣＩＩＴＡ－／－ｉＥＣ細胞と比較した場合、ＢＬＩシグナルの小さい低下として記録された。
【発明を実施するための形態】
【0038】
ＶＩ．発明の詳細な説明
本発明は、非改変ＳＩＲＰα会合機能を有する親細胞と比較して、対象に移植されると自然免疫に抵抗する、増加したシグナル調節タンパク質アルファ（ＳＩＲＰα）会合機能を有する細胞（ＳＩＲＰαエンゲージャー細胞）を提供する。いくつかの実施形態では、ＳＩＲＰαエンゲージャー細胞は、低免疫細胞である。他の実施形態では、ＳＩＲＰαエンゲージャー細胞は、分化した体細胞である。他の実施形態では、ＳＩＲＰαエンゲージャー細胞は、低免疫多能性（ＨＩＰ）細胞である。さらなる実施形態では、ＨＩＰ細胞は、血液型Ｏ（ＨＩＰＯ）、Ｒｈ因子（Ｒｈ）陰性（ＨＩＰ－）、又は血液型Ｏ及びＲｈ－の両方（ＨＩＰＯ－）である。他の実施形態では、ＳＩＲＰαエンゲージャー細胞は、ＨＩＰ細胞、ＨＩＰ－細胞、又はＨＩＰＯ－細胞に由来するか、又はこれらから分化した細胞である。他の実施形態では、ＳＩＲＰαエンゲージャー細胞は、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）又は補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）から保護するために抗体Ｆｃ受容体を含む。
本発明は、非改変ＳＩＲＰα会合機能を有する親細胞と比較して、対象に移植されると自然免疫に抵抗する、増加したシグナル調節タンパク質アルファ（ＳＩＲＰα）会合機能を有する細胞（ＳＩＲＰαエンゲージャー細胞）を提供する。いくつかの実施形態では、ＳＩＲＰαエンゲージャー細胞は、低免疫細胞である。他の実施形態では、ＳＩＲＰαエンゲージャー細胞は、分化した体細胞である。他の実施形態では、ＳＩＲＰαエンゲージャー細胞は、低免疫多能性（ＨＩＰ）細胞である。さらなる実施形態では、ＨＩＰ細胞は、血液型Ｏ（ＨＩＰＯ）、Ｒｈ因子（Ｒｈ）陰性（ＨＩＰ－）、又は血液型Ｏ及びＲｈ－の両方（ＨＩＰＯ－）である。他の実施形態では、ＳＩＲＰαエンゲージャー細胞は、ＨＩＰ細胞、ＨＩＰ－細胞、又はＨＩＰＯ－細胞に由来するか、又はこれらから分化した細胞である。他の実施形態では、ＳＩＲＰαエンゲージャー細胞は、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）又は補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）から保護するために抗体Ｆｃ受容体を含む。
【0039】
他の実施形態では、ＳＩＲＰαエンゲージャー細胞は、前述の細胞に由来するか、又はこれらから分化した細胞である。例として、分化したＳＩＲＰαエンゲージャー細胞は、内皮細胞、心筋細胞、肝細胞、ドーパミン作動性ニューロン、膵島細胞、網膜色素内皮細胞、及び移植及び医学療法に使用される他の細胞型であり得る。これらには、ＣＡＲ－Ｔ細胞、ＮＫ細胞、及びＣＡＲ－ＮＫ細胞などのキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）細胞が含まれる。
【0040】
本明細書で使用される「対象」又は「患者」という用語は、家畜、動物園の動物、又はヒトなどの任意の動物を指す。「対象」又は「患者」は、イヌ、ネコ、トリ、家畜、又はヒトのような哺乳動物であり得る。「対象」及び「患者」の具体例には、限定されるものではないが、肝臓、心臓、肺、腎臓、膵臓、脳、神経組織、血液、骨、及び骨髄などに関連する疾患又は障害を有する個体（特にヒト）が含まれる。
【0041】
哺乳動物細胞は、ヒト又は非ヒト哺乳動物に由来し得る。例示的な非ヒト哺乳動物には、限定されるものではないが、マウス、ラット、ネコ、イヌ、ウサギ、モルモット、ハムスター、ヒツジ、ブタ、ウマ、ウシ、及び非ヒト霊長類（例えば、チンパンジー、マカク、及び類人猿）が含まれる。
【0042】
本明細書における「低免疫原性」細胞又は「ＨＩ」細胞は、同種異系の宿主に移入されたときに免疫学的拒絶反応の低下をもたらす細胞を意味する。好ましい実施形態では、ＨＩ細胞は、免疫応答を引き起こさない。したがって、「低免疫原性」は、免疫工学の前の親（即ち、「ｗｔ」）細胞の免疫応答と比較すると、免疫応答が有意に低下又は消失していることを意味する。
【0043】
本明細書における「低免疫原性細胞Ｏ－」、「低免疫原性ＯＲｈ－」細胞、又は「ＨＩＯ－」細胞は、ＡＢＯ血液型Ｏ及びＲｈ因子Ｒｈ－でもあるＨＩ細胞を意味する。ＨＩＯ－細胞は、Ｏ－細胞から生成するか、Ｏ－になるように酵素的に改変するか、又はＯ－になるように遺伝子学的にエンジニアリングすることができる。
【0044】
本明細書の「ＨＬＡ」又は「ヒト白血球抗原」複合体は、ヒトにおける主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）タンパク質をコードする遺伝子複合体を意味する。ＨＬＡ複合体を構成するこれらの細胞表面タンパク質は、抗原に対する免疫応答の調節に関与している。ヒトには、クラスＩ及びクラスＩＩの２つのＭＨＣ、「ＨＬＡ－Ｉ」及び「ＨＬＡ－ＩＩ」が存在する。ＨＬＡ－Ｉには、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、及びＨＬＡ－Ｃの３つのタンパク質が含まれ、これらは、細胞内からペプチドを提示し、ＨＬＡ－Ｉ複合体によって提示される抗原は、キラーＴ細胞（ＣＤ８＋Ｔ－細胞又は細胞傷害性Ｔ細胞としても知られている）を引き付ける。ＨＬＡ－Ｉタンパク質は、β－２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）と関連している。ＨＬＡ－ＩＩには、ＨＬＡ－ＤＰ、ＨＬＡ－ＤＭ、ＨＬＡ－ＤＯＢ、ＨＬＡ－ＤＱ、及びＨＬＡ－ＤＲの５つのタンパク質が含まれ、これらは、細胞外からＴリンパ球に抗原を提示する。ＨＬＡ－ＩＩは、ＣＤ４＋細胞（Ｔヘルパー細胞としても知られている）を刺激する。「ＭＨＣ」又は「ＨＬＡ」のいずれかの使用は、遺伝子がヒト（ＨＬＡ）又は非ヒト（ＭＨＣ）のどちらに由来するかによって決まるため、限定を意味するものではないことを理解されたい。したがって、「ＭＨＣ」又は「ＨＬＡ」は、哺乳動物細胞に関連するため、これらの用語は、本明細書では互換的に使用することができる。
【0045】
本明細書における「遺伝子ノックアウト」とは、特定の遺伝子を、それが存在する宿主細胞において不活性にして、目的のタンパク質が産生されないようにするか、又は目的のタンパク質を不活性形態にするプロセスを指す。当業者によって理解され、以下でさらに説明されるように、遺伝子ノックアウトは、核酸配列を遺伝子から除去すること、又は配列を他の配列で阻害すること、リーディングフレームを変更すること、又は核酸の調節成分を変更することを含む、いくつかの方法で達成することができる。例えば、目的の遺伝子のコード領域の全部又は一部を除去するか又は「ナンセンス」配列で置換することができる、プロモーターなどの調節配列の全部又は一部を除去するか又は置換することができる、翻訳開始配列を除去するか又は置換することができるなど。
【0046】
本明細書における「遺伝子ノックイン」とは、宿主細胞に遺伝的機能を追加するプロセスを意味する。これにより、コードされたタンパク質のレベルが上昇する。当業者には理解されるように、遺伝子ノックインは、遺伝子の１つ又は複数の追加のコピーを宿主細胞に加えること、又はタンパク質の発現を増加させる内因性遺伝子の調節成分を変更することを含むいくつかの方法で達成することができる。遺伝子ノックインは、プロモーターを改変すること、異なるプロモーターを加えること、エンハンサーを加えること、又は他の遺伝子発現配列を改変することによって達成してもよい。「β－２ミクログロブリン」又は「β２Ｍ」又は「Ｂ２Ｍ」タンパク質は、以下に示すアミノ酸及び核酸配列を有するヒトβ２Ｍタンパク質を指し；ヒト遺伝子は、ＲｅｆＳｅｑアクセッション番号ＮＭ＿００４０４８．４を有する。
【0047】
「ＣＤ４７タンパク質」タンパク質は、以下に示されるアミノ酸及び核酸配列を有するヒトＣＤ４７タンパク質を指し；ヒト遺伝子は、ＲｅｆＳｅｑアクセッション番号ＮＭ＿００１７７７．４を有する。
【0048】
エンジニアリングされた細胞上でのＣＤ４７の発現は、自然免疫細胞の死滅及び食作用に対する保護を提供することが示されている（Ｄｅｕｓｅ Ｔ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１９ Ｍａｒ；３７：２５２－２５８）。しかしながら、そのリガンドＳＩＲＰαの連結により、ＣＤ４７は、エンジニアリングされた細胞内で、その生理機能の不所望の混乱が生じ得る下流のシグナル伝達を開始し得る。免疫細胞の死滅に対する防御のみを達成するために、本発明のいくつかの態様は、エンジニアリングされた細胞において細胞外ＳＩＲＰαエンゲージャー機能を細胞内シグナル伝達から分離する。他の態様では、本発明は、エンジニアリングされた細胞においてアゴニストＳＩＲＰα結合活性を有するが、不所望の細胞内シグナル伝達を欠くＳＩＲＰαエンゲージャー融合タンパク質を提供する。他の態様は、ＣＤ４７ ＥＣＤを含むＳＩＲＰαエンゲージャー融合タンパク質を提供する。
【0049】
本発明は、エンジニアリングされた細胞上で発現され、ＳＩＲＰαシグナル伝達を活性化するアゴニスト様式で免疫細胞上のＳＩＲＰαに結合するように設計されたＳＩＲＰαエンゲージャー融合タンパク質を提供する。エフェクター免疫細胞は、ＳＩＲＰαを発現する任意の免疫細胞であり得、骨髄系（例えば、単球、マクロファージ、又は多形核細胞）並びにリンパ系（例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、又はＮＫ細胞）に由来し得る。
【0050】
本明細書で提供される融合タンパク質は、細胞外ドメイン（ＥＣＤ）及び膜貫通ドメイン（ＴＭＤ）を含み、細胞内ドメイン（ＩＣＤ）を含んでも含まなくてもよい。融合タンパク質は、典型的には、ＩＣＤを含まず、ＥＣＤ及びＴＭＤのみを含む。
【0051】
いくつかの態様では、ＥＣＤは、ＣＤ４７ ＥＣＤ、ＣＤ４７免疫グロブリンスーパーファミリー（ＩｇＳＦ）ドメイン、アゴニスト抗ＳＩＲＰα抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）、又はアゴニスト抗ＳＩＲＰα抗体の単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む。ＥＣＤ上の目的の領域は、少なくとも１つのＣＤＲ配列を含み、ＣＤＲは、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、又はそれ以上のアミノ酸であり得る。別法では、目的のＥＣＤは、２つ以上の抗体可変領域（例えば、配列番号５及び９を参照）を含む。抗ＳＩＲＰα抗体のＣＤＲは、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１６／２０５０４２号パンフレットに開示されている。
【0052】
本発明の特定の態様は、以下の例示的な配列を提供する。
【0053】
【表1】
【0054】
本発明のいくつかの態様では、ＥＣＤは、１つ、２つ、又は３つの抗ＳＩＲＰα－ＣＤＲを含む。好ましい態様では、ＥＣＤは、配列番号６～８又は１０～１２のうちの１つ又は複数を含む。
【0055】
いくつかの態様では、最適化された結合が得られるようにより好ましい結合のオンレート、より好ましい結合のオフレート、又はその両方を達成するべく結合を修飾するために、配列の１つ又は複数の残基が改変される。
【0056】
他の態様では、ＥＣＤは、ＴＭＤを有する配列を連結するか、又は互いに配列を連結するリンカー領域又はヒンジを含む。他の態様では、修飾は、これらの修飾が融合タンパク質とＳＩＲＰαとの結合親和性がなくならない限り、リンカー領域又はヒンジ領域の１つ又は複数内で行われる。
【0057】
いくつかの態様では、ＥＣＤは、配列番号５又は配列番号９のいずれか１つに示される少なくとも約１０個のアミノ酸、少なくとも約１５個のアミノ酸、少なくとも約２０個のアミノ酸、少なくとも約２５個のアミノ酸、少なくとも約３０個のアミノ酸、提供される完全な領域までの連続した配列を有する。ＥＣＤはまた、配列番号５又は９のいずれか１つに示されるアミノ酸配列と比較して、最大１個、２個、３個、４個、５個、６個、又はそれ以上のアミノ酸が異なる配列を含む。他の実施形態では、ＥＣＤは、配列番号５又は９のいずれか１つに示されるアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、又は約９９％の配列同一性を有する。
【0058】
一般に、ＳＩＲＰαエンゲージャー融合タンパク質の膜貫通ドメイン（ＴＭＤ）は、特定のＴＭＤ配列に限定されない。好ましくは、ＴＭＤは、融合タンパク質を発現する細胞（例えば、内皮細胞、心筋細胞、膵臓ベータ細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、又は造血細胞など）の膜における融合タンパク質の安定した固定を可能にする。さらに、ＴＭＤは、ＥＣＤのＳＩＲＰαへの結合を可能にする。いくつかの態様では、融合タンパク質は、ＩＣＤを含み、ＳＩＲＰαへの結合により、ＩＣＤを介したシグナル伝達が可能になる。これは、このようなシグナル伝達がこの細胞の固有の機能を強化する場合、エンジニアリングされた細胞にとって有益である可能性がある。機能の強化は、例えば、インテグリンの活性化による接着の強化によって達成することができる。他の態様では、融合タンパク質は、ＩＣＤを含むのではなく、ＴＭＤの後ろで切断されている。後者の場合、融合タンパク質のＳＩＲＰαへの結合により、エンジニアリングされた細胞内で細胞内シグナル伝達が生じない。
【0059】
ＴＭＤは、単一のαヘリックスとして、複数のαヘリックスとして、又は丸まったβシートとして細胞膜脂質二重層を横断して延びる。これらの「１回貫通」及び「複数回貫通」タンパク質のいくつかは、サイトゾル脂質単層に挿入された共有結合した脂肪酸鎖を有する。他の膜タンパク質は、膜の片面のみで露出される。これらのいくつかは、ヘリックスの疎水性面を通って脂質二重層のサイトゾル単層に分割される両親媒性αヘリックスによってサイトゾル表面に固定される。その他は、サイトゾル単層では共有結合した脂質鎖（脂肪酸鎖又はプレニル基のいずれか）によってのみ二重層に結合するか、又は非サイトゾル単層ではオリゴ糖リンカーを介してホスファチジルイノシトールに結合する（Ａｌｂｅｒｔｓ Ｂ，Ｊｏｈｎｓｏｎ Ａ，Ｌｅｗｉｓ Ｊ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ．４ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｇａｒｌａｎｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ；ＩＳＢＮ－１０：０－８１５３－３２１８－１（２００２））。
【0060】
いくつかの態様では、融合タンパク質の例示的なＴＭＤは、ＣＤ１６、ＣＤ８、ＣＤ３３５、ＣＤ２５、ＣＤ１ａ、ＣＤ２２０、ＣＤ４５、ＣＤ１１ａ～ｄ、ＣＤ６４、ＣＤ３２、ＣＤ６２、ＣＤ４０、ＣＤ４９ａ～ｆ、ＣＤ４７、ＣＤ３２、ＣＤ６８、ＣＤ８５、ＣＤ３００、ＣＤ３４４、ＣＤ３５０、ＣＤ５４、ＣＤ５６、ＣＤ１３７、ＩＴＧＡ７、ＩＴＧＡ８、ＩＴＧＡ９、ＩＴＧＡ１０、ＩＴＧＡ１１、ＣＤ５１、ＣＤ４１、ＣＤ２９、ＣＤ１８、ＣＤ６１、又はＣＤ１０４に由来する。他の態様では、融合タンパク質のＴＭＤは、ＣＤ４７（配列番号１３）、又はＣＤ６４（配列番号１４）、又はＰＤＧＦ（配列番号２７）に由来する。
【0061】
他の態様では、ＳＩＲＰαエンゲージャー融合タンパク質は、エンジニアリングされた細胞におけるシグナル伝達を回避するための細胞内ドメイン（ＩＣＤ）を有さない。しかしながら、有益であると考えられる場合、融合タンパク質のＩＣＤは、ＣＤ１６、ＣＤ３２、ＣＤ６４、ＣＤ８、ＣＤ３、ＣＤ２８、又はＣＤ１３７由来のＩＣＤであり得る。
【0062】
「ＣＩＩＴＡタンパク質」タンパク質は、以下に示すアミノ酸配列及び核酸配列を有するヒトＣＩＩＴＡタンパク質を指し；ヒト遺伝子は、ＲｅｆＳｅｑアクセッション番号ＮＭ＿０００２４６．４を有する。
【0063】
細胞の文脈における「野生型」とは、自然界に見られる細胞を意味する。しかしながら、本明細書で使用されるナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の文脈において、野生型とは、細胞が、死をもたらす核酸変化を含み得るが、低免疫原性を達成するために本発明の遺伝子編集手順を受けていないことも意味する。
【0064】
本明細書における「同系」とは、免疫学的適合性が存在する宿主生物及び細胞移植の遺伝的類似性又は同一性を意味し、例えば、免疫応答が生じない。
【0065】
本明細書における「同種異系」とは、免疫応答が生じる宿主生物及び細胞移植の遺伝的非類似性を指す。
【0066】
本明細書における「Ｂ２Ｍ－／－」とは、２倍体細胞が両方の染色体でＢ２Ｍ遺伝子を不活性化していることを意味する。本明細書に記載されるように、これは、様々な方法で行うことができる。
【0067】
本明細書における「ＣＩＩＴＡ－／－」とは、２倍体細胞が両方の染色体でＣＩＩＴＡ遺伝子を不活性化していることを意味する。本明細書に記載されるように、これは、様々な方法で行うことができる。
【0068】
本明細書の「ＣＤ４７ｔｇ」、「ＣＤ４７導入遺伝子」、又は「ＣＤ４７＋」は、場合によってはＣＤ４７遺伝子の少なくとも１つの追加コピーを有することにより、宿主細胞がＣＤ４７を発現することを意味する。
【0069】
２つ以上の核酸又はポリペプチド配列の文脈におけるパーセント「同一性」という用語は、以下に記載される配列比較アルゴリズムの１つ（例えば、ＢＬＡＳＴＰ及びＢＬＡＳＴＮ又は当業者が利用可能な他のアルゴリズム）を使用して又は目視検査によって測定される、最大限一致するように整列されて比較した際に同一であるヌクレオチド又はアミノ酸残基の特定のパーセンテージを有する２つ以上の配列又は部分配列を指す。用途に応じて、パーセント「同一性」は、比較される配列の領域にわたって、例えば機能的ドメインにわたって存在し得る、或いは比較される２つの配列の全長にわたって存在し得る。配列の比較では、典型的には、１つの配列が、試験配列が比較される参照配列としての役割を果たす。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験配列及び参照配列がコンピューターに入力され、必要に応じてサブ配列座標が指定され、配列アルゴリズムのプログラムパラメーターが指定される。次いで、配列比較アルゴリズムは、指定されたプログラムパラメーターに基づいて、参照配列に対する試験配列のパーセント配列同一性を計算する。
【0070】
比較のための配列の最適なアラインメントは、例えば、Ｓｍｉｔｈ ＆ Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所相同性アルゴリズムによって、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ＆ Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性アラインメントアルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ ＆ Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４（１９８８）の類似性検索方法によって、これらのアルゴリズム（ＧＡＰ，ＢＥＳＴＦＩＴ，ＦＡＳＴＡ，ａｎｄ ＴＦＡＳＴＡ ｉｎ ｔｈｅ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）のコンピューター化された実施によって、又は目視検査（一般的に、以下のＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．を参照されたい）によって行うことができる。
【0071】
パーセント配列同一性及び配列類似性を決定するのに適したアルゴリズムの一例は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０（１９９０）に記載されているＢＬＡＳＴアルゴリズムである。ＢＬＡＳＴ分析を行うためのソフトウェアは、全米バイオテクノロジー情報センター（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）が一般公開している。
【0072】
「阻害剤」、「活性化因子」、及び「モジュレーター」は、生物学的に関連する分子の機能又は発現に影響を与える。「モジュレーター」という用語は、阻害剤と活性化因子の両方を含む。モジュレーターは、標的分子の発現又は活性についてのインビトロ及びインビボアッセイを使用して同定することができる。
【0073】
「阻害剤」は、例えば、発現を阻害するか、又は標的分子又はタンパク質に結合する作用物質である。阻害剤は、刺激を部分的又は完全にブロックするか、又はプロテアーゼ阻害剤活性を有し得る。阻害剤は、記載される標的タンパク質の不活性化、脱感作、又は活性のダウンレギュレーションを含め、活性化を低下させる、減少させる、防止する、又は遅延させ得る。モジュレーターは、標的分子又はタンパク質のアンタゴニストであり得る。
【0074】
「活性化因子」は、例えば、標的分子又はタンパク質の機能若しくは発現を誘導又は活性化する作用物質である。活性化因子は結合して、標的分子の活性を刺激する、高める、広げる、活性化する、又は促進することができる。活性化因子は、標的分子又はタンパク質のアゴニストであり得る。
【0075】
「相同体」は、ヌクレオチド配列、ペプチド配列、機能的又は構造的レベルで参照分子に類似している生物活性分子である。相同体は、参照配列と特定のパーセント同一性を共有する配列誘導体を含み得る。したがって、一実施形態では、相同配列又は誘導体配列は、少なくとも７０パーセントの配列同一性を共有する。特定の実施形態では、相同配列又は誘導体配列は、少なくとも８０又は８５パーセントの配列同一性を共有する。特定の実施形態では、相同配列又は誘導体配列は、少なくとも９０パーセントの配列同一性を共有する。特定の実施形態では、相同又は派生配列は、少なくとも９５パーセントの配列同一性を共有する。より具体的な実施形態では、相同配列又は誘導体配列は、少なくとも５０、５５、６０、６５、７０、７５、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９パーセントの配列同一性を共有する。相同核酸配列又は誘導体核酸配列はまた、高ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件下で参照核酸配列と結合を維持できるそれらの能力によって定義することができる。参照分子と構造的又は機能的類似性を有する相同体は、参照分子の化学的誘導体であり得る。構造的及び機能的相同体並びに誘導体を検出する、生成する、及びスクリーニングする方法は当技術分野で公知である。
【0076】
「ハイブリダイゼーション」は、一般に、相補鎖がそれらの融解温度より低い環境に存在するときに、変性したＤＮＡが再アニーリングする能力に依存する。プローブとハイブリダイズ可能な配列との間の所望の相同性の度合いが高いほど、使用できる相対温度が高くなる。結果として、より高い相対温度は反応条件をよりストリンジェントにする傾向がある一方、より低い温度はそれほどストリンジェントではないことになる。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーのさらなる詳細及び説明については、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ（１９９５）を参照されたい。
【0077】
ハイブリダイゼーション反応の「ストリンジェンシー」は、当業者によって容易に決定可能であり、一般に、プローブ長、洗浄温度、及び塩濃度に依存する経験的計算である。一般に、プローブが長いほど適切なアニーリングの温度を高くする必要があるが、プローブが短いほど必要な温度が低くなる。
【0078】
本明細書で定義される「ストリンジェントな条件」又は「高ストリンジェンシー条件」は、以下によって確認することができる：（１）低イオン強度及び高温、例えば、５０℃の０．０１５Ｍ塩化ナトリウム／０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム／０．１％ドデシル硫酸ナトリウムを洗浄に使用する；（２）ハイブリダイゼーション中に、ホルムアミドなどの変性剤、例えば、４２℃の５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミドと０．１％ウシ血清アルブミン／０．１％フィコール／０．１％ポリビニルピロリドン／５０Ｍｍリン酸ナトリウム緩衝液（Ｐｈ６．５）と７５０Ｍｍ塩化ナトリウム、７５Ｍｍクエン酸ナトリウムを使用する；又は（３）４２℃の５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（０．７５Ｍ ＮａＣｌ、０．０７５Ｍクエン酸ナトリウム）、５０Ｍｍリン酸ナトリウム（Ｐｈ６．８）、０．１％ピロリン酸ナトリウム、５×デンハルト溶液、超音波処理したサケ精子ＤＮＡ（５０μｌ／ｍｌ）、０．１％ＳＤＳ、及び１０％硫酸デキストランを使用する溶液での一晩のハイブリダイゼーション、０．２×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸塩ナトリウム）で４２℃での１０分間の洗浄、これに続く５５℃のＥＤＴＡを含む０．１×ＳＳＣからなる１０分間の高ストリンジェンシー洗浄。
【0079】
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」又は「治療効果のある担体」は、水性又は非水性（固体）、例えばアルコール性又は油性、又はそれらの混合物であり、且つ界面活性剤、皮膚軟化剤、潤滑剤、安定剤、染料、香料、防腐剤、ｐＨ調整のための酸又は塩基、溶媒、乳化剤、ゲル化剤、保湿剤、安定剤、湿潤剤、徐放剤、保水剤、又は特定の形態の医薬組成物に一般的に含まれる他の成分を含み得る。薬学的に許容される担体は、当技術分野で周知であり、例えば、水若しくは生理学的緩衝食塩水などの水溶液、又はグリコール、グリセロールなどの他の溶媒若しくはビヒクル、及びオリーブ油などの油を含む。薬学的に許容される担体は、例えば、特定の阻害剤、例えば、グルコース、スクロース、若しくはデキストランなどの炭水化物、アスコルビン酸若しくはグルタチオンなどの抗酸化剤、キレート剤、低分子量タンパク質、又は他の安定剤若しくは賦形剤を安定させる、或いはこれらの吸収性を高めるように作用する生理学的に許容可能な化合物を含み得る。
【0080】
医薬組成物は、滅菌注射用製剤、例えば、滅菌注射用水性懸濁液又は油性懸濁液の形態であってもよい。この懸濁液は、適切な分散剤又は湿潤剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ ８０など）及び懸濁剤を使用して、当技術分野で周知の技術にしたがって調製することができる。滅菌注射用製剤はまた、非毒性の非経口的に許容可能な希釈剤又は溶媒中、例えば１，３－ブタンジオール中の溶液のような、滅菌注射用溶液又は懸濁液溶液であり得る。使用できる許容可能なビヒクル及び溶媒の中には、マンニトール、水、リンゲル液、及び等張塩化ナトリウム溶液がある。加えて、滅菌した固定油が、溶媒又は懸濁媒体として従来使用されている。この目的のために、合成モノグリセリド又は合成ジグリセリドを含む、無刺激性固定油を使用することができる。オレイン酸及びそのグリセリド誘導体などの脂肪酸は、特にポリオキシエチル化型であるオリーブ油又はヒマシ油などの薬学的に許容される天然油と同様に、注射剤の調製に有用である。これらの油剤又は油懸濁液には、Ｐｈ．Ｈｅｌｖ又は類似のアルコールなどの長鎖アルコールの希釈剤又は分散剤も含まれ得る。
【0081】
本明細書全体で与えられるすべての最大数値制限には、あたかもそのようなより低い数値制限が本明細書に明示的に記載されているかのように、すべてのより低い数値制限が含まれることが意図される。本明細書全体で与えられるすべての最小数値制限には、あたかもそのようなより高い数値制限が本明細書に明示的に記載されているかのように、すべてのより高い数値制限が含まれる。本明細書全体で与えられるすべての数値範囲には、あたかもそのようなより狭い数値範囲がすべて本明細書に明示的に記載されているかのように、そのようなより広い数値範囲内にあるすべてのより狭い数値範囲が含まれる。
【0082】
本明細書で使用される「修飾」という用語は、修飾された分子を親分子と物理的に区別する変化を指す。いくつかの実施形態では、ＳＩＲＰα、ＣＤ４７、ＣＤ３１６、ＣＤ３２、ＣＤ６４、ＨＳＶｔｋ、ＥＣ－ＣＤ、又はｉＣａｓｐ９変異体ポリペプチドにおけるアミノ酸の挿入、欠失、置換、又は他のタイプのアミノ酸の変化は、本明細書に記載される当技術分野で公知の方法にしたがって調製される。このような修飾は、これらを、本明細書に記載の方法にしたがって修飾されていない対応する親、例えば、野生型タンパク質、天然に存在する変異体タンパク質、又はそのような変異体ポリペプチドの修飾を含まない別のエンジニアリングされたタンパク質と区別する。別の実施形態では、変異体ポリペプチドは、その機能を非修飾ポリペプチドと区別する１つ又は複数の修飾を含む。例えば、変異体ポリペプチドのアミノ酸変化は、その受容体結合プロファイルに影響を与える。他の実施形態では、変異体ポリペプチドは、置換、欠失、又は挿入修飾、又はそれらの組み合わせを含む。別の実施形態では、変異体ポリペプチドは、非修飾ポリペプチドの親和性と比較して、受容体に対するその親和性を高める１つ又は複数の修飾を含む。
【0083】
一実施形態では、変異体ポリペプチドは、対応する天然又は親配列と比較して、１つ又は複数の置換、挿入、又は欠失を含む。特定の実施形態では、変異体ポリペプチドは、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１～４０、４１～５０、又は５１以上の修飾を含む。
【0084】
本明細書における「エピソームベクター」とは、細胞の細胞質内に自律的に存在して複製することができる遺伝子ベクターを意味し；例えば、エピソームベクターは、宿主細胞のゲノムＤＮＡに組み込まれない。いくつかのエピソームベクターが当技術分野で公知であり、以下に記載される。
【0085】
遺伝子の文脈における「ノックアウト」とは、ノックアウトされた宿主細胞が遺伝子の機能的タンパク質産物を産生しないことを意味する。本明細書で概説されるように、ノックアウトは、コード配列の全部又は一部を除去すること、機能性タンパク質が産生されないようにフレームシフト突然変異を導入すること（切断又はナンセンス配列のいずれか）、遺伝子が転写されないように調節成分（例えば、プロモーター）を除去又は変更すること、ｍＲＮＡへの結合による翻訳を防止することなどによって様々な方法でもたらすことができる。一般的に、ノックアウトは、細胞の子孫も永久にノックアウトを有するように、ゲノムＤＮＡレベルで達成される。
【0086】
遺伝子の文脈における「ノックイン」とは、ノックインされた宿主細胞が、より多くの機能的なタンパク質が細胞内で活性であることを意味する。本明細書に概説されるように、ノックインは、様々な方法で、通常は、タンパク質をコードする導入遺伝子（ｔｇ）の少なくとも１つのコピーを細胞に導入することによって行うことができるが、これは、例えば内因性遺伝子に構成的プロモーターを加えることによって、調節成分を置き換えることによっても行うことができる。一般に、ノックイン技術は、導入遺伝子の追加のコピーの宿主細胞への組み込みをもたらす。
【0087】
ＶＩＩ．本発明の細胞
本発明は、低免疫細胞であるＳＩＲＰαエンゲージャー細胞を提供する。他の実施形態では、ＳＩＲＰαエンゲージャー細胞は、分化した体細胞である。他の実施形態では、ＳＩＲＰαエンゲージャー細胞は、低免疫多能性（ＨＩＰ）細胞である。さらなる実施形態では、ＨＩＰ細胞は、血液型Ｏ（ＨＩＰＯ）、Ｒｈ因子（Ｒｈ）陰性（ＨＩＰ－）、又はＯ型及びＲｈ－（ＨＩＰＯ－）の両方である。他の実施形態では、ＳＩＲＰαエンゲージャー細胞は、ＨＩＰ細胞、ＨＩＰ－細胞、又はＨＩＰＯ－細胞から誘導又は分化された細胞である。他の実施形態では、ＳＩＲＰαエンゲージャー細胞は、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）又は補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）から保護するために抗体Ｆｃ受容体を含む。
本発明は、低免疫細胞であるＳＩＲＰαエンゲージャー細胞を提供する。他の実施形態では、ＳＩＲＰαエンゲージャー細胞は、分化した体細胞である。他の実施形態では、ＳＩＲＰαエンゲージャー細胞は、低免疫多能性（ＨＩＰ）細胞である。さらなる実施形態では、ＨＩＰ細胞は、血液型Ｏ（ＨＩＰＯ）、Ｒｈ因子（Ｒｈ）陰性（ＨＩＰ－）、又はＯ型及びＲｈ－（ＨＩＰＯ－）の両方である。他の実施形態では、ＳＩＲＰαエンゲージャー細胞は、ＨＩＰ細胞、ＨＩＰ－細胞、又はＨＩＰＯ－細胞から誘導又は分化された細胞である。他の実施形態では、ＳＩＲＰαエンゲージャー細胞は、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）又は補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）から保護するために抗体Ｆｃ受容体を含む。
【0088】
本発明は、ＳＩＲＰαエンゲージャー細胞を作製するための組成物及び方法を提供する。いくつかの態様では、細胞は、低免疫細胞である。他の態様では、細胞は、分化した体細胞である。他の態様では、細胞は、ＨＩＰ細胞、ＨＩＰ－細胞、ＨＩＰＯ－細胞などの多能性細胞である。他の態様では、ＳＩＲＰαエンゲージャー細胞は、移植及び／又は分化に適した多能性（ＰＳＣ）細胞である。ＰＳＣ細胞には、人工ＰＳＣ（ｉＰＳＣ）又は胚性幹細胞（ＥＳＣ）が含まれる。他の態様では、細胞は、特定の組織型であり、前述のＳＩＲＰαエンゲージャー細胞から分化した細胞である。例として、分化したＳＩＲＰαエンゲージャー細胞は、内皮細胞、心筋細胞、肝細胞、ドーパミン作動性ニューロン、膵島細胞、網膜色素内皮細胞、及び移植及び医学療法に使用される他の細胞型であり得る。これらには、ＣＡＲ－Ｔ細胞、ＣＡＲ－ＮＫ細胞、及びその他のエンジニアリングされた細胞集団などのキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）細胞が含まれることになる。参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１８／１３２７８３号パンフレット、同第２０２０／０１８６２０号パンフレット、同第２０２０／０１８６１５号パンフレット、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０２０／０３２２７２号明細書、及び米国特許出願第１６／８７０，９５９号明細書、及び同第１６／８７０，９６０号明細書を参照されたい。
【0089】
本発明は、ＮＫ細胞表面上のＳＩＲＰαと相互作用し、細胞死滅及び自然免疫を防止するＳＩＲＰαエンゲージャータンパク質を有するＳＩＲＰαエンゲージャー細胞を提供する。いくつかの実施形態では、ＳＩＲＰαエンゲージャータンパク質は、ＳＩＲＰαエンゲージャー細胞の表面に繋がれた抗ＳＩＲＰα抗体である。いくつかの実施形態では、抗ＳＩＲＰα抗体は、その断片の結晶化可能（Ｆｃ）部分を介して細胞表面ＣＤに繋がれている。他の実施形態では、抗ＳＩＲＰα抗体（ｓｃＦｖ）の抗原結合部分は、膜貫通ドメイン（ＴＭＤ）を介して細胞表面に結合される。好ましい実施形態では、ＴＭＤは、１つ又は複数のαヘリックスを含む。他の好ましい実施形態では、ＴＭＤは、７回膜貫通タンパク質（７ＴＭ）に由来する。他の好ましい実施形態では、ＴＭＤは、免疫グロブリン細胞表面タンパク質に由来する。より好ましい実施形態では、免疫グロブリン細胞表面タンパク質は、抗体、受容体、リガンド、又は接着タンパク質である。いくつかの実施形態では、ＳＩＲＰαエンゲージャー細胞は、細胞表面に固定されたＣＤ４７融合タンパク質から生じる。
【0090】
ＳＩＲＰαエンゲージャータンパク質の発現は、当業者には理解されるように、「ノックイン」技術又はトランスジェニック技術を使用するいくつかの方法で達成することができる。場合によっては、ＳＩＲＰαエンゲージャータンパク質の発現は、１つ又は複数の導入遺伝子に起因する。
【0091】
したがって、いくつかの実施形態では、ＳＩＲＰαエンゲージャータンパク質発現遺伝子の１つ又は複数のコピーが、誘導性プロモーター又は構成的プロモーター（後者が好ましい）の制御下でＳＩＲＰαエンゲージャー細胞に加えられる。いくつかの実施形態では、レンチウイルス構築物は、本明細書に記載されるように、又は当技術分野で公知であるように使用される。遺伝子は、当技術分野で公知であるように、適切なプロモーターの制御下で宿主細胞のゲノムに組み込むことができる。
【0092】
いくつかの実施形態では、遺伝子の発現は、内因性遺伝子座の調節配列を改変することによって、例えば、内因性プロモーターを構成的プロモーター又は異なる誘導性プロモーターと交換することによって増加させることができる。これは通常、ＣＲＩＳＰＲなどの既知の技術を使用して行うことができる。
【0093】
改変されたら、十分なＳＩＲＰαエンゲージャータンパク質発現の存在を、実施例に記載されるような公知の技術、例えば、適切な抗体を使用するウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡアッセイ、又はＦＡＣＳアッセイを使用してアッセイすることができる。一般に、この文脈における「十分」とは、ＮＫ細胞の死滅を抑制する細胞表面上のＳＩＲＰαエンゲージャータンパク質発現の増加を意味する。
【0094】
抗体であるポリペプチドも本発明の範囲内である。抗体という用語は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ヒト化抗体、抗体断片（例えば、Ｆｃドメイン）、Ｆａｂ断片、一本鎖抗体、二重特異性抗体又は多重特異性抗体、ラマ抗体、ナノボディ、ダイアボディ、アフィボディ、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ、及びｓｃＦｖ－Ｆｃなどを含むことを意味する。この用語には、Ｉｇキメラなどの抗体融合タンパク質も含まれる。好ましい抗体には、ヒト化又は完全ヒトモノクローナル抗体又はその断片が含まれる。
【0095】
「抗体」及び「免疫グロブリン」という用語には、モノクローナル抗体（例えば、完全長又は無傷のモノクローナル抗体）、ポリクローナル抗体、一価抗体、多価抗体、多重特異性抗体（例えば、所望の生物学的活性を示すのであれば二重特異性抗体）が含まれ得、特定の抗体断片（本明細書でより詳細に説明する）も含まれ得る。抗体は、キメラ抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、及び／又は親和性成熟抗体であり得る。
【0096】
「完全長抗体」、「無傷の抗体」、及び「全抗体」という用語は、以下に定義する抗体断片ではなく、実質的に無傷の形態の抗体を指すために本明細書では互換的に使用される。この用語は、特に、Ｆｃ領域を含む重鎖を有する抗体を指す。「抗体断片」は、無傷の抗体の一部を含み、好ましくはその抗原結合領域を含む。抗体断片の例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖ断片；ダイアボディ；直鎖状抗体；一本鎖抗体分子；及び抗体断片から形成される多重特異性抗体が含まれる。本明細書で使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を指す、即ち、集団を構成する個々の抗体は、少量存在し得る潜在的な突然変異、例えば天然に存在する突然変異を除いて同一である。したがって、修飾語「モノクローナル」は、個別の抗体の混合物ではないという抗体の性質を示す。
【0097】
特定の実施形態では、そのようなモノクローナル抗体は、典型的には、標的に結合するポリペプチド配列を含む抗体を含み、この標的結合ポリペプチド配列は、複数のポリペプチド配列からの１つの標的結合ポリペプチド配列の選択を含むプロセスによって得られた。例えば、選択プロセスは、ハイブリドーマクローン、ファージクローン、又は組換えＤＮＡクローンのプールなどの複数のクローンからのユニークなクローンの選択であり得る。選択される標的結合配列は、例えば、標的に対する親和性を改善するため、標的結合配列をヒト化するため、細胞培養におけるその産生を改善するため、インビボでの免疫原性を低下させるため、多重特異性抗体を作製するなどのためにさらに改変され得ること、並びに改変された標的結合配列を含む抗体も本発明のモノクローナル抗体であることを理解されたい。異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を通常は含むポリクローナル抗体製剤とは対照的に、モノクローナル抗体製剤の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。モノクローナル抗体製剤は、その特異性に加えて、典型的には他の免疫グロブリンによって汚染されていないという点でも有利である。
【0098】
抗原に特異的に結合する抗体は、その抗原に対して高い親和性を有する。抗体親和性は、解離定数（Ｋｄ）によって測定することができる。特定の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、約１００ｎＭ以下、約１０ｎＭ以下、約１ｎＭ以下、約０．１ｎＭ以下、約０．０１ｎＭ以下、又は約０．００１ｎＭ以下（例えば、１０－７Ｍ未満、１０－７Ｍ～１０－１３Ｍ、１０－８Ｍ～１０－１３Ｍ、又は１０－９Ｍ～１０－１３Ｍ）の解離定数（Ｋｄ）を有する。
【0099】
一実施形態では、Ｋｄは、以下のアッセイによって記載されるように、目的の抗体のＦａｂ型及びその抗原を用いて実施される放射性標識抗原結合アッセイ（ＲＩＡ）によって測定される。抗原に対するＦａｂの溶液結合親和性は、非標識抗原の滴定系列の存在下で、最小濃度の（１２５Ｉ）標識抗原でＦａｂを平衡化し、次いで、抗Ｆａｂ抗体でコーティングしたプレートで結合した抗原を捕捉することによって測定される（例えば、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９３：８６５－８８１（１９９９）を参照）。アッセイの条件を確立するために、ＭＩＣＲＯＴＩＴＥＲ（登録商標）マルチウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、５０ｍＭ炭酸ナトリウム（ｐＨ９．６）中の５μｇ／ｍｌの捕捉抗Ｆａｂ抗体（Ｃａｐｐｅｌ Ｌａｂｓ）で一晩コーティングし、その後、ブロックする。ＰＢＳ中の２％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミンで、室温（約２３℃）で２～５時間処理する。非吸着性プレート（Ｎｕｎｃ＃２６９６２０）において、１００μＭ又は２６μＭ［１２５Ｉ］の抗原を目的のＦａｂの段階希釈液と混合する（例えば、Ｐｒｅｓｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５７：４５９３－４５９９（１９９７）での抗ＶＥＧＦ抗体であるＦａｂ－１２の評価と一致する）。次いで、目的のＦａｂを一晩インキュベートする；しかしながら、インキュベーションは、確実に平衡に達するようにより長い期間（例えば、約６５時間）継続してもよい。その後、混合物を捕捉プレートに移し、室温で（例えば、１時間）インキュベートする。次いで、溶液を除去し、プレートをＰＢＳ中の０．１％ポリソルベート２０（ＴＷＥＥＮ－２０（登録商標））で８回洗浄する。プレートが乾燥したら、１５０μｌ／ウェルのシンチラント（ＭＩＣＲＯＳＣＩＮＴ－２０（商標）；Ｐａｃｋａｒｄ）を添加し、プレートをＴＯＰＣＯＵＮＴ（商標）ガンマカウンター（Ｐａｃｋａｒｄ）で１０分間カウントする。競合結合アッセイで使用するために、最大結合の２０％以下をもたらす各Ｆａｂの濃度が選択される。
【0100】
別の実施形態によると、Ｋｄは、約１０応答単位（ＲＵ）で、例えば固定化抗原ＣＭ５チップを用いて、２５℃で、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）－２０００又はＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）－３０００（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）を使用する表面プラズモン共鳴アッセイを使用して測定される。簡単に説明すると、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ（ＣＭ５、ＢＩＡＣＯＲＥ，Ｉｎｃ．）を、供給者の指示にしたがってＮ－エチル－Ｎ’－（３－ジメチルアミノプロピル）－カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）、及びＮ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）で活性化する。抗原を１０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．８で５μｇ／ｍｌ（約０．２μＭ）に希釈してから、５μｌ／分の流速で注入して、共役タンパク質の約１０応答単位（ＲＵ）を達成する。抗原の注入後、１Ｍエタノールアミンを注入して未反応基をブロックする。反応速度測定では、Ｆａｂの２倍段階希釈（０．７８ｎＭ～５００ｎＭ）を、約２５μｌ／分の流量、２５℃で、０．０５％ポリソルベート２０（ＴＷＥＥＮ－２０（商標））界面活性剤を含むＰＢＳ（ＰＢＳＴ）に入れて注入する。会合速度（Ｋｏｎ）と解離速度（Ｋｏｆｆ）は、会合センサーグラムと解離センサーグラムを同時にフィッティングすることによって、単純な１対１ラングミュア結合モデル（ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）評価ソフトウェアバージョン３．２）を使用して計算される。平衡解離定数（Ｋｄ）は、ｋｏｆｆ／ｋｏｎの比として計算される。例えば、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９３：８６５－８８１（１９９９）を参照されたい。オンレートが、上記の表面プラズモン共鳴アッセイによって１０６ Ｍ－１ ｓ－１を超える場合、オンレートは、ストップフローを備えた分光計（Ａｖｉｖ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）又は撹拌キュベットを備えた８０００シリーズＳＬＭ－ＡＭＩＮＣＯ（商標）分光光度計（ＴｈｅｒｍｏＳｐｅｃｔｒｏｎｉｃ）などの分光計で測定した増加する濃度の抗原の存在下、ＰＢＳ、ｐＨ７．２中の２５℃の２０ｎＭ抗抗原抗体（Ｆａｂ形態）での蛍光発光強度（励起＝２９５ｎｍ；発光＝３４０ｎｍ、１６ｎｍのバンドパス）の増加又は減少を測定する蛍光消光技術を使用して決定することができる。当業者であれば理解されるように、上記のアミンカップリング法（ＣＭ５チップ）の代わりに、チップ表面への標的抗原の他のカップリング化学（例えば、ストレプトアビジン／ビオチン、疎水性相互作用、又はジスルフィド化学）も容易に利用可能である。
【0101】
「モノクローナル」という修飾語は、実質的に均質な抗体集団から得られる抗体の性質を示し、特定の方法による抗体の産生を必要とするものとして解釈されるべきではない。例えば、本発明にしたがって使用されるモノクローナル抗体は、例えば、ハイブリドーマ法（例えば、Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ， ２５６：４９５（１９７５）；Ｈａｒｌｏｗ ｅｔ ａｌ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，２ｎｄ ｅｄ．１９８８）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，ｉｎ：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｔ－Ｃｅｌｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ ｐｐ．５６３－６８１ （Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８１））、組換え体ＤＮＡ法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号明細書を参照）、ファージディスプレイ技術（例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４－６２８ （１９９１）；Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１－５９７（１９９２）；Ｓｉｄｈｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３８（２）：２９９－３１０（２００４）；Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４０（５）：１０７３－１０９３（２００４）；Ｆｅｌｌｏｕｓｅ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０１（３４）：１２４６７－１２４７２（２００４）；ａｎｄ Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２８４（１－２）：１１９－１３２（２００４）を参照）、及びヒト免疫グロブリン遺伝子座又はヒト免疫グロブリン配列をコードする遺伝子の一部又は全部を有する動物においてヒト又はヒト様抗体を産生するための技術（例えば、国際公開第９８／２４８９３号パンフレット；同第９６／３４０９６号パンフレット；同第９６／３３７３５号パンフレット；同第９１／１０７４１号パンフレット；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：２５５１（１９９３）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３６２：２５５－２５８（１９９３）；Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｙｅａｒ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．７：３３（１９９３）；Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏｓ．５，５４５，８０７；５，５４５，８０６；５，５６９，８２５；５，６２５，１２６；５，６３３，４２５；５，６６１，０１６；Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ．Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：７７９－７８３（１９９２）；Ｌｏｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３６８：８５６－８５９（１９９４）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ ３６８：８１２－８１３（１９９４）；Ｆｉｓｈｗｉｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：８４５－８５１（１９９６）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：８２６（１９９６）ａｎｄ Ｌｏｎｂｅｒｇ ａｎｄ Ｈｕｓｚａｒ，Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３： ６５－９３（１９９５）を参照）を含む様々な技術によって作製することができる。上記の特許、刊行物、及び参考文献は、参照によりその全体が組み込まれる。
【0102】
非ヒト（例えば、マウス）抗体の「ヒト化」形態は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小限の配列を含むキメラ抗体である。一実施形態では、ヒト化抗体は、レシピエントの超可変領域に由来する残基が、所望の特異性、親和性、及び／又は能力を有する、マウス、ラット、ウサギ、又は非ヒト霊長類などの非ヒト種（ドナー抗体）の超可変領域に由来する残基によって置換されているヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。場合によっては、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域（ＦＲ）残基が、対応する非ヒト残基に置き換えられる。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体又はドナー抗体には見られない残基を含み得る。これらの修飾は、抗体の性能をさらに改良するために行うことができる。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的にすべてを含むことになり、超可変ループのすべて又は実質的にすべてが、非ヒト免疫グロブリンの超可変ループに一致し、ＦＲのすべて又は実質的にすべてが、ヒト免疫グロブリン配列のＦＲである。ヒト化抗体は、任意選択により、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、典型的にはヒト免疫グロブリンの定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部も含むことになる。さらなる詳細については、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２－５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３－３２９（１９８８）；ａｎｄ Ｐｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３－５９６（１９９２）を参照されたい。以下の総説及びそこで引用されている参考文献も参照されたい：Ｖａｓｗａｎｉ ａｎｄ Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ａｎｎ．Ａｌｌｅｒｇｙ，Ａｓｔｈｍａ＆Ｉｍｍｕｎｏｌ．１：１０５－１１５（１９９８）；Ｈａｒｒｉｓ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ ２３：１０３５－１０３８（１９９５）；Ｈｕｒｌｅ ａｎｄ Ｇｒｏｓｓ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．５：４２８－４３３（１９９４）。前述の参考文献は、参照によりその全体が組み込まれる。
【0103】
「ヒト抗体」は、ヒトによって産生される抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を含む抗体、及び／又は本明細書に開示されるヒト抗体を作製するための技術のいずれかを使用して作製された抗体である。このような技術には、ファージディスプレイライブラリーなどのヒト由来のコンビナトリアルライブラリーのスクリーニング（例えば、Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ，２２２：５８１－５９７（１９９１）ａｎｄ Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９：４１３３－４１３７（１９９１）を参照）；ヒトモノクローナル抗体の産生のためのヒト骨髄腫細胞株及びマウス－ヒトヘテロ骨髄腫細胞株の使用（例えば、Ｋｏｚｂｏｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１３３：３００１（１９８４）；Ｂｒｏｄｅｕｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ．５５－９３（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８７）；ａｎｄ Ｂｏｅｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１４７：８６（１９９１）を参照）；並びに内因性免疫グロブリン産生の非存在下で、ヒト抗体の完全なレパートリーを産生することができるトランスジェニック動物（例えば、マウス）におけるモノクローナル抗体の作製（例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ，９０：２５５１（１９９３）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３６２：２５５（１９９３）；Ｂｒｕｇｇｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｙｅａｒ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，７：３３（１９９３）を参照）が含まれる。ヒト抗体のこの定義は、非ヒト動物由来の抗原結合残基を含むヒト化抗体を特に除外する。
【0104】
Ａ．遺伝子変更の方法
本発明は、ＳＩＲＰαエンゲージャー細胞を作製するために細胞内又は無細胞条件で核酸配列を改変する方法を含む。例示的な技術には、相同組換え、ノックイン、ＺＦＮ（ジンクフィンガーヌクレアーゼ）、ＴＡＬＥＮ（転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ）、ＣＲＩＳＰＲ（クラスター化された規則的に間隔を空けた短いパリンドロームリピート）／Ｃａｓ９、及び他の部位特異的ヌクレアーゼ技術が含まれる。これらの技術により、目的の遺伝子座部位での二本鎖ＤＮＡの切断が可能になる。これらの制御された二本鎖切断は、特定の遺伝子座部位での相同組換えを促進する。このプロセスは、染色体などの核酸分子の特定の配列を、その配列を認識して結合し、核酸分子に二本鎖切断を誘導するエンドヌクレアーゼで標的化することに重点を置いている。二本鎖切断は、エラーが発生しやすい非相同末端結合（ＮＨＥＪ）又は相同組換え（ＨＲ）のいずれかによって修復される。
本発明は、ＳＩＲＰαエンゲージャー細胞を作製するために細胞内又は無細胞条件で核酸配列を改変する方法を含む。例示的な技術には、相同組換え、ノックイン、ＺＦＮ（ジンクフィンガーヌクレアーゼ）、ＴＡＬＥＮ（転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ）、ＣＲＩＳＰＲ（クラスター化された規則的に間隔を空けた短いパリンドロームリピート）／Ｃａｓ９、及び他の部位特異的ヌクレアーゼ技術が含まれる。これらの技術により、目的の遺伝子座部位での二本鎖ＤＮＡの切断が可能になる。これらの制御された二本鎖切断は、特定の遺伝子座部位での相同組換えを促進する。このプロセスは、染色体などの核酸分子の特定の配列を、その配列を認識して結合し、核酸分子に二本鎖切断を誘導するエンドヌクレアーゼで標的化することに重点を置いている。二本鎖切断は、エラーが発生しやすい非相同末端結合（ＮＨＥＪ）又は相同組換え（ＨＲ）のいずれかによって修復される。
【0105】
当業者には理解されるように、いくつかの異なる技術を使用して、本発明の修飾細胞をエンジニアリングすること、及び本明細書に概説されるようにＮＫ細胞をエンジニアリングして低免疫原性になるようにすることができる。
【0106】
一般に、これらの技術は、個別に又は組み合わせて使用することができる。例えば、ＳＩＲＰαエンゲージャー細胞の作製では、ＣＲＩＳＰＲを使用して、抗ＳＩＲＰα免疫グロブリンなどのＳＩＲＰαエンゲージャータンパク質を発現させることができる。別の例では、ウイルス技術（例えば、レンチウイルス）を使用して、ＳＩＲＰαエンゲージャータンパク質を発現させる。
【0107】
ａ．ＣＲＩＳＰＲ技術
一実施形態では、細胞は、当技術分野で知られているように、クラスター化された規則的に間隔を空けた短いパリンドロームリピート／Ｃａｓ（「ＣＲＩＳＰＲ」）技術を使用して操作される。ＣＲＩＳＰＲを使用して、ＳＩＲＰαエンゲージャー細胞を作製することができる。ＣＲＩＳＰＲに基づく多数の技術が存在する。例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｄｏｕｄｎａ ａｎｄ Ｃｈａｒｐｅｎｔｉｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１２５８０９６を参照されたい。ＣＲＩＳＰＲ技術及びキットは市販されている。
一実施形態では、細胞は、当技術分野で知られているように、クラスター化された規則的に間隔を空けた短いパリンドロームリピート／Ｃａｓ（「ＣＲＩＳＰＲ」）技術を使用して操作される。ＣＲＩＳＰＲを使用して、ＳＩＲＰαエンゲージャー細胞を作製することができる。ＣＲＩＳＰＲに基づく多数の技術が存在する。例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｄｏｕｄｎａ ａｎｄ Ｃｈａｒｐｅｎｔｉｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１２５８０９６を参照されたい。ＣＲＩＳＰＲ技術及びキットは市販されている。
【0108】
ｂ．ＴＡＬＥＮ技術
いくつかの実施形態では、本発明の細胞は、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）方法を使用して作製される。ＴＡＬＥＮは、実質的に任意の所望のＤＮＡ配列に結合して切断するようにエンジニアリングすることができるヌクレアーゼと組み合わせられた制限酵素である。ＴＡＬＥＮキットは市販されている。
いくつかの実施形態では、本発明の細胞は、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）方法を使用して作製される。ＴＡＬＥＮは、実質的に任意の所望のＤＮＡ配列に結合して切断するようにエンジニアリングすることができるヌクレアーゼと組み合わせられた制限酵素である。ＴＡＬＥＮキットは市販されている。
【0109】
ｃ．ジンクフィンガー技術
一実施形態では、細胞は、Ｚｎフィンガーヌクレアーゼ技術を使用して操作される。Ｚｎフィンガーヌクレアーゼは、ジンクフィンガーのＤＮＡ結合ドメインをＤＮＡ切断ドメインに融合させることによって生成される人工的な制限酵素である。ジンクフィンガードメインは、特定の所望のＤＮＡ配列を標的にするようにエンジニアリングすることができ、これにより、ジンクフィンガーヌクレアーゼが複雑なゲノム内の固有の配列を標的にすることができる。内因性ＤＮＡ修復機構を利用することにより、これらの試薬を使用して、ＣＲＩＳＰＲ及びＴＡＬＥＮＳと同様に、高等生物のゲノムを正確に変更することができる。
一実施形態では、細胞は、Ｚｎフィンガーヌクレアーゼ技術を使用して操作される。Ｚｎフィンガーヌクレアーゼは、ジンクフィンガーのＤＮＡ結合ドメインをＤＮＡ切断ドメインに融合させることによって生成される人工的な制限酵素である。ジンクフィンガードメインは、特定の所望のＤＮＡ配列を標的にするようにエンジニアリングすることができ、これにより、ジンクフィンガーヌクレアーゼが複雑なゲノム内の固有の配列を標的にすることができる。内因性ＤＮＡ修復機構を利用することにより、これらの試薬を使用して、ＣＲＩＳＰＲ及びＴＡＬＥＮＳと同様に、高等生物のゲノムを正確に変更することができる。
【0110】
ｄ．ウイルスベースの技術
限定されるものではないが、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、及びセンダイウイルスベクターの使用を含む、本発明のＳＩＲＰαエンゲージャー細胞のいくつかの実施形態を形成するために使用することができる多種多様なウイルス技術が存在する。細胞の作製に使用されるエピソームベクターが以下に説明される。
限定されるものではないが、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、及びセンダイウイルスベクターの使用を含む、本発明のＳＩＲＰαエンゲージャー細胞のいくつかの実施形態を形成するために使用することができる多種多様なウイルス技術が存在する。細胞の作製に使用されるエピソームベクターが以下に説明される。
【0111】
これらのすべての技術では、周知の組換え技術を使用して、本明細書に概説される組換え核酸が作製される。特定の実施形態では、ＳＩＲＰαエンゲージャータンパク質、例えば、抗ＳＩＲＰα免疫グロブリンをコードする組換え核酸は、発現構築物中の１つ又は複数の調節ヌクレオチド配列に動作可能に連結することができる。調節ヌクレオチド配列は、一般に、処置される宿主細胞及び対象に適切である。様々な宿主細胞に関して、多くの種類の適切な発現ベクター及び適切な調節配列が当技術分野で公知である。典型的には、１つ以上の調節ヌクレオチド配列は、限定されるものではないが、プロモーター配列、リーダー又はシグナル配列、リボソーム結合部位、転写開始及び終結配列、翻訳開始及び終結配列、並びにエンハンサー又はアクチベーター配列を含み得る。当技術分野で公知である構成的又は誘導性プロモーターもまた企図される。プロモーターは、天然に存在するプロモーター、又は複数のプロモーターの要素を組み合わせたハイブリッドプロモーターのいずれかであり得る。発現構築物は、プラスミドなどのエピソーム上の細胞に存在し得るか、又は発現構築物は、染色体に挿入され得る。特定の実施形態では、発現ベクターは、形質転換された宿主細胞の選択を可能にするための選択可能なマーカー遺伝子を含む。特定の実施形態は、少なくとも１つの調節配列に動作可能に連結された変異体ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターを含む。本明細書で使用するための調節配列には、プロモーター、エンハンサー、及び他の発現制御要素が含まれる。特定の実施形態では、発現ベクターは、形質転換される宿主細胞の選択、発現されることが望まれる特定の変異体ポリペプチド、ベクターのコピー数、そのコピー数を制御する能力、又は抗生物質マーカーなどのベクターによってコードされるその他のタンパク質の発現のために設計される。
【0112】
適切な哺乳類プロモーターの例には、例えば、以下の遺伝子由来のプロモーター：ハムスターのユビキチン／Ｓ２７ａプロモーター（国際公開第９７／１５６６４号パンフレット）、サル空胞ウイルス４０（ＳＶ４０）初期プロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター、マウスメタロチオネイン－Ｉプロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）のロングターミナルリピート領域、マウス乳腺腫瘍ウイルスプロモーター（ＭＭＴＶ）、モロニーマウス白血病ウイルスのロングターミナルリピート領域、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の初期プロモーター、真核生物の翻訳伸長因子１α（ＥＦ‐１α）、及びＣＭＶ初期エンハンサー（ＣＡＧ）と結合したニワトリβ－アクチンプロモーターの遺伝子由来のプロモーターが含まれる。他の異種哺乳動物プロモーターの例は、アクチン、免疫グロブリン又は熱ショックプロモーター（複数可）である。
【0113】
追加の実施形態では、哺乳動物宿主細胞で使用するためのプロモーターは、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス（１９８９年７月５日に公開された英国特許第２，２１１，５０４号明細書）、ウシ乳頭腫ウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、及びシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）などのウイルスのゲノムから得ることができる。さらなる実施形態では、異種哺乳動物プロモーターが使用される。例には、アクチンプロモーター、免疫グロブリンプロモーター、及び熱ショックプロモーターが含まれる。ＳＶ４０の初期及び後期プロモーターは、ＳＶ４０ウイルスの複製起点も含むＳＶ４０制限断片として好都合に得られる。Ｆｉｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ２７３：１１３－１２０（１９７８）。ヒトサイトメガロウイルスの前初期プロモーターは、ＨｉｎｄＩＩＩＥ制限断片として好都合に得られる。Ｇｒｅｅｎａｗａｙ，Ｐ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ １８：３５５－３６０（１９８２）。前述の参考文献は、その全体が参照により組み込まれる。
【0114】
いくつかの実施形態では、ＳＩＲＰαエンゲージャー細胞は幹細胞に由来する。
【0115】
「多能性細胞」という用語は、未分化状態のままで自己複製及び増殖することができ、適切な条件下で、特殊な細胞型に分化するように誘導することができる細胞を指す。本明細書で使用される「多能性細胞」という用語は、胚性幹細胞（ＥＳＣ）、及び胎児、羊膜、又は体性幹細胞を含む他のタイプの幹細胞を包含する。例示的なヒト幹細胞株には、Ｈ９ヒト胚性幹細胞株が含まれる。追加の例示的な幹細胞株には、国立衛生研究所のヒト胚性幹細胞登録（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ Ｈｕｍａｎ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｇｉｓｔｒｙ）及びハワード・ヒューズ医学研究所のＨＵＥＳコレクション（Ｈｏｗａｒｄ Ｈｕｇｈｅｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ＨＵＥＳ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）を通じて入手可能なものが含まれる（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｃｏｗａｎ，Ｃ．Ａ．ｅｔ．ａｌ，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊ．Ｍｅｄ．３５０：１３．（２００４）に記載されている）。
【0116】
本明細書で使用される「多能性幹細胞」は、３つの胚葉：内胚葉（例えば、胃結合、胃腸管、肺など）、中胚葉（例えば、筋肉、骨、血液、泌尿生殖器組織など）、又は外胚葉（例えば、表皮組織及び神経系組織）のいずれかに分化する可能性がある。本明細書で使用される「多能性幹細胞」という用語もまた、非多能性細胞に由来する多能性幹細胞の一種である「人工多能性幹細胞」又は「ｉＰＳＣ」を包含する。親細胞の例には、様々な手段によって多能性未分化表現型を誘導するように再プログラムされた体細胞が含まれる。このような「ｉＰＳ」又は「ｉＰＳＣ」細胞は、特定の調節遺伝子の発現を誘導することによって、又は特定のタンパク質を外部から加えることによって作製することができる。ｉＰＳ細胞を誘導するための方法は、当技術分野で公知であり、以下でさらに説明される。（例えば、それぞれ参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２７（１１）：２６６７－７４（２００９）；Ｈｕａｎｇｆｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２６（７）：７９５（２００８）；Ｗｏｌｔｊｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４５８（７２３９）：７６６－７７０（２００９）；及びＺｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ８：３８１－３８４（２００９）を参照されたい）。人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）の作製が以下に概説される。本明細書で使用される「ｈｉＰＳＣ」は、ヒト人工多能性幹細胞であり、「ｍｉＰＳＣ」は、マウス人工多能性幹細胞である。
【0117】
「多能性幹細胞の特徴」とは、多能性幹細胞を他の細胞と区別する細胞の特徴を指す。適切な条件下で、３つの胚葉（内胚葉、中胚葉、外胚葉）のすべてからの細胞系統に関連する特徴をまとめて示す細胞型に分化し得る子孫を生み出す能力は、多能性幹細胞の特徴である。特定の組み合わせの分子マーカーの発現又は非発現も、多能性幹細胞の特徴である。例えば、ヒト多能性幹細胞は、以下の非限定的リスト：ＳＳＥＡ－３、ＳＳＥＡ－４、ＴＲＡ－１－６０、ＴＲＡ－１－８１、ＴＲＡ－２－４９／６Ｅ、ＡＬＰ、Ｓｏｘ２、Ｅ－カドヘリン、ＵＴＦ－１、Ｏｃｔ４、Ｒｅｘｌ、及びＮａｎｏｇのマーカーの少なくともいくつか、いくつかの実施形態ではすべてを発現する。多能性幹細胞に関連する細胞形態もまた、多能性幹細胞の特徴である。本明細書に記載されるように、細胞は、内胚葉前駆細胞及び／又は肝細胞に再プログラムされるために多能性を通過する必要はない。
【0118】
Ｂ．低免疫原性ＳＩＲＰαエンゲージャー細胞の作製
ＨＩ細胞の作製は、わずか３つの遺伝子変化で行われ、細胞活性の阻害は最小限に抑えられるが、細胞に免疫サイレンシングを与える。この技術は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１８／１３２７８３号パンフレット、同第２０２０／０１８６２０号パンフレット、同第２０２０／０１８６１５号パンフレット、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０２０／０３２２７２号明細書、及び米国特許出願第１６／８７０，９５９号明細書、及び同第１６／８７０，９６０号明細書に開示されている。これらの技術については、以下で簡単に説明する。
ＨＩ細胞の作製は、わずか３つの遺伝子変化で行われ、細胞活性の阻害は最小限に抑えられるが、細胞に免疫サイレンシングを与える。この技術は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１８／１３２７８３号パンフレット、同第２０２０／０１８６２０号パンフレット、同第２０２０／０１８６１５号パンフレット、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０２０／０３２２７２号明細書、及び米国特許出願第１６／８７０，９５９号明細書、及び同第１６／８７０，９６０号明細書に開示されている。これらの技術については、以下で簡単に説明する。
【0119】
本明細書で論じられるように、一実施形態は、ＭＨＣ Ｉ及びＩＩ（細胞がヒトである場合にはＨＬＡ Ｉ及びＩＩ）のタンパク質活性の減少又は消失を利用する。これは、その構成要素をコードする遺伝子を変更することによって行うことができる。一実施形態では、遺伝子のコード領域又は調節配列は、ＣＲＩＳＰＲを使用して中断される。別の実施形態では、遺伝子翻訳は、干渉ＲＮＡ技術を使用して低減される。別の実施形態は、マクロファージの食作用に対する感受性を調節する遺伝子の変化である。これは、ウイルス技術を使用する遺伝子の「ノックイン」であり得る。
【0120】
１．ＨＬＡ－Ｉの減少
本発明のＨＩ ＳＩＲＰαエンゲージャー細胞は、ＭＨＣ Ｉ（細胞がヒト細胞に由来する場合はＨＬＡ Ｉ）機能の低下を含む。
本発明のＨＩ ＳＩＲＰαエンゲージャー細胞は、ＭＨＣ Ｉ（細胞がヒト細胞に由来する場合はＨＬＡ Ｉ）機能の低下を含む。
【0121】
当業者には理解されるように、機能の低下は、遺伝子からの核酸配列の除去、他の配列による配列の阻害、又は核酸の調節成分の変更を含む、いくつかの方法で達成することができる。例えば、目的の遺伝子のコード領域の全部又は一部を除去するか、又は「ナンセンス」配列で置き換えることができる、フレームシフト突然変異を生じさせることができる、プロモーターなどの調節配列の全部又は一部を除去又は置換することができる、翻訳開始配列を除去又は置換することができるなど。
【0122】
当業者には理解されるように、ＳＩＲＰαエンゲージャー細胞におけるＭＨＣ Ｉ機能（細胞がヒト細胞に由来する場合はＨＬＡ Ｉ）の低下の成功は、当技術分野で公知の技術及び以下で説明される技術；例えば、ＨＬＡ複合体に結合する標識抗体を使用する；例えば、ヒト主要組織適合遺伝子ＨＬＡクラスＩ抗原のアルファ鎖に結合する市販のＨＬＡ－Ａ、Ｂ、Ｃ抗体を使用するＦＡＣＳ技術を使用して測定することができる。
【0123】
ａ．Ｂ２Ｍの改変
一実施形態では、本明細書に開示されるように、ＨＬＡ－１活性の低下は、ＨＩ ＳＩＲＰαエンゲージャー細胞におけるβ－２ミクログロブリン遺伝子の発現を妨害することによってなされる。この改変は、本明細書では一般に遺伝子「ノックアウト」と呼ばれ、本発明の細胞では、宿主細胞の両方の対立遺伝子に対して行われる。一般に、両方の妨害を行うための技術は同じである。
一実施形態では、本明細書に開示されるように、ＨＬＡ－１活性の低下は、ＨＩ ＳＩＲＰαエンゲージャー細胞におけるβ－２ミクログロブリン遺伝子の発現を妨害することによってなされる。この改変は、本明細書では一般に遺伝子「ノックアウト」と呼ばれ、本発明の細胞では、宿主細胞の両方の対立遺伝子に対して行われる。一般に、両方の妨害を行うための技術は同じである。
【0124】
特に有用な実施形態は、遺伝子を破壊するためにＣＲＩＳＰＲ技術を使用する。別の実施形態は、ＣＲＩＳＰＲベースのエピゲノム編集によるプログラム可能な転写記憶を使用する（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｎｕｎｅｚ ＪＫ，Ｃｅｌｌ．１８４：２５０３－２５１９（２０２１））。場合によっては、ＣＲＩＳＰＲ技術を使用して、遺伝子のコード領域に小さな欠失／挿入を導入し、機能性タンパク質が生成されないようにする。多くの場合、フレームシフト突然変異の結果として停止コドンが生成され、切断された非機能性タンパク質が作製されることになる。
【0125】
したがって、有用な技術は、マウスのＢ２Ｍ遺伝子又はヒトのＢ２Ｍ遺伝子のコード配列を標的とするように設計されたＣＲＩＳＰＲ配列を使用することである。遺伝子編集後、トランスフェクトされたＳＩＲＰαエンゲージャー細胞培養物は、単一細胞に解離する。単一細胞は、フルサイズのコロニーに拡大され、且つＣＲＩＳＰＲ切断部位からの異常な配列の存在をスクリーニングすることによってＣＲＩＳＰＲ編集について試験される。両方の対立遺伝子が欠失しているクローンが選択される。そのようなクローンは、ＰＣＲによって実証されたようにＢ２Ｍを発現せず、ＦＡＣＳ分析によって実証されたようにＨＬＡ－Ｉを発現しなかった。
【0126】
Ｂ２Ｍ遺伝子が不活性化されているかどうかを試験するためのアッセイは公知であり、本明細書に記載されている。一実施形態では、アッセイは、Ｂ２Ｍタンパク質に対する抗体でプローブされた細胞溶解物のウエスタンブロットである。別の実施形態では、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ｒｔ－ＰＣＲ）により、不活性化する変更の存在を確認する。
【0127】
加えて、細胞を試験して、ＨＬＡ Ｉ複合体が細胞表面で発現されていないことを確認することができる。これは、上記のように、１つ又は複数のＨＬＡ細胞表面成分に対する抗体を使用するＦＡＣＳ分析によってアッセイすることができる。
【0128】
２．ＨＬＡ－ＩＩの減少
いくつかの実施形態では、ＨＬＡ Ｉの減少に加えて、本発明のＨＩ ＳＩＲＰαエンゲージャー細胞は、ＭＨＣ ＩＩ機能（ヒト由来細胞からのＨＬＡ ＩＩ）も欠如し得る。
いくつかの実施形態では、ＨＬＡ Ｉの減少に加えて、本発明のＨＩ ＳＩＲＰαエンゲージャー細胞は、ＭＨＣ ＩＩ機能（ヒト由来細胞からのＨＬＡ ＩＩ）も欠如し得る。
【0129】
当業者には理解されるように、機能の低下は、遺伝子からの核酸配列の除去、遺伝子への核酸配列の追加、リーディングフレームの破壊、他の配列による配列の阻害、又は核酸の調節成分の変更を含む、いくつかの方法で達成することができる。一実施形態では、目的の遺伝子のコード領域の全部又は一部が、除去されるか、又は「ナンセンス」配列で置換され得る。別の実施形態では、プロモーターなどの調節配列が除去又は置換され得る、翻訳開始配列が除去又は置換され得るなど。
【0130】
ＳＩＲＰαエンゲージャー細胞又はその誘導体におけるＭＨＣ ＩＩ（ＨＬＡ ＩＩ）機能の正常な低下は、例えば、タンパク質に対する抗体を使用するウエスタンブロッティング、ＦＡＣＳ技術、ｒｔ－ＰＣＲ技術などの当技術分野で公知の技術を使用して測定することができる。
【0131】
ａ．ＣＩＩＴＡの改変
一実施形態では、本明細書に示されるように、ＨＬＡ－ＩＩ活性の低下は、ＳＩＲＰαエンゲージャー細胞におけるＣＩＩＴＡ遺伝子の発現を妨害することによって行われる。この改変は一般に、本明細書では遺伝子「ノックアウト」と呼ばれ、本発明のＳＩＲＰαエンゲージャー細胞では、宿主細胞の両方の対立遺伝子に対して行われる。
一実施形態では、本明細書に示されるように、ＨＬＡ－ＩＩ活性の低下は、ＳＩＲＰαエンゲージャー細胞におけるＣＩＩＴＡ遺伝子の発現を妨害することによって行われる。この改変は一般に、本明細書では遺伝子「ノックアウト」と呼ばれ、本発明のＳＩＲＰαエンゲージャー細胞では、宿主細胞の両方の対立遺伝子に対して行われる。
【0132】
ＣＩＩＴＡ遺伝子が不活性化されているかどうかを試験するためのアッセイは公知であり、本明細書に記載されている。一実施形態では、アッセイは、ＣＩＩＴＡタンパク質に対する抗体でプローブされた細胞溶解物のウエスタンブロットである。別の実施形態では、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ｒｔ－ＰＣＲ）により、不活性化する変更の存在を確認する。
【0133】
加えて、細胞を試験して、ＨＬＡ ＩＩ複合体が細胞表面で発現されていないことを確認することができる。この場合も、このアッセイは、当技術分野で知られているように行われる。例示的な分析には、以下に概説されるように、ヒトＨＬＡクラスＩＩ ＨＬＡ－ＤＲ、ＤＰ、及びほとんどのＤＱ抗原に結合する市販の抗体を使用するウエスタンブロット又はＦＡＣＳ分析が含まれる。
【0134】
特に有用な実施形態は、ＣＲＩＳＰＲ技術を使用してＣＩＩＴＡ遺伝子を切断する。ＣＲＩＳＰＲは、すべてのＭＨＣ ＩＩ分子に不可欠な転写因子であるＣＩＩＴＡ遺伝子のコード配列を標的とするように設計されている。遺伝子編集後、トランスフェクトされた細胞培養物は、単一細胞に解離される。単一細胞は、フルサイズのコロニーに拡大され、ＣＲＩＳＰＲ切断部位からの異常な配列の存在をスクリーニングすることによってＣＲＩＳＰＲ編集の成功が試験される。ＣＩＩＴＡを発現しない欠失を持つクローンは、ＰＣＲによって決定され、ＦＡＣＳ分析によってＭＨＣ ＩＩ／ＨＬＡ－ＩＩを発現しないことが示され得る。別の実施形態は、ＣＲＩＳＰＲベースのエピゲノム編集によるプログラム可能な転写記憶を使用する。
【0135】
３．血液型Ｏ Ｒｈ陰性細胞
血液製剤は、人体内のあらゆる赤血球の表面上の抗原の有無に応じて、異なる型に分類することができる（ＡＢＯ血液型）。Ａ抗原、Ｂ抗原、ＡＢ抗原、及びＡ１抗原は、赤血球の糖タンパク質上のオリゴ糖の配列によって決定される。血液型抗原群の遺伝子は、抗原タンパク質を産生させるための指示を提供する。血液型抗原タンパク質は、赤血球の細胞膜内で様々な機能を果たす。これらのタンパク質の機能には、他のタンパク質や分子の細胞内外への輸送、細胞構造の維持、他の細胞や分子への付着、及び化学反応への参加が含まれる。
血液製剤は、人体内のあらゆる赤血球の表面上の抗原の有無に応じて、異なる型に分類することができる（ＡＢＯ血液型）。Ａ抗原、Ｂ抗原、ＡＢ抗原、及びＡ１抗原は、赤血球の糖タンパク質上のオリゴ糖の配列によって決定される。血液型抗原群の遺伝子は、抗原タンパク質を産生させるための指示を提供する。血液型抗原タンパク質は、赤血球の細胞膜内で様々な機能を果たす。これらのタンパク質の機能には、他のタンパク質や分子の細胞内外への輸送、細胞構造の維持、他の細胞や分子への付着、及び化学反応への参加が含まれる。
【0136】
Ｒｈ因子（Ｒｈ）血液型は、ＡＢＯ血液型系に次いで２番目に重要な血液型系である。Ｒｈ血液型系は、４９の定義された血液型抗原で構成されており、その中で５つの抗原、Ｄ、Ｃ、ｃ、Ｅ、及びｅが最も重要である。個人のＲｈ（Ｄ）状態は通常、ＡＢＯ型の後に陽性又は陰性の接尾辞を付けて記述される。「Ｒｈ因子」、「Ｒｈ陽性」、及び「Ｒｈ陰性」という用語は、Ｒｈ（Ｄ）抗原のみを指す。Ｒｈ抗原に対する抗体は、溶血性輸血反応に関与する可能性があり、Ｒｈ（Ｄ）及びＲｈ（ｃ）抗原に対する抗体は、胎児及び新生児の溶血性疾患の重大なリスクをもたらす。ＡＢＯ抗体は、どのヒトでも若年期に発生する。しかしながら、Ｒｈ－ヒトのＲｈ抗体は、その人が感作されている場合にのみ生じる。これは、ｒｈ＋新生児の出産によって、又はＲｈ＋の輸血を受けることによって起こる。
【0137】
本発明は、移植及び／又は分化に適した多能性（ＰＳＣＯ－）細胞のＡＢＯ血液型Ｏ及び／又はＲｈ因子陰性（Ｏ－）集団を有するＳＩＲＰαエンゲージャー細胞を提供する。ＰＳＣＯ－細胞には、人工ｉＰＳＣ（ｉＰＳＣＯ－）、胚性ＥＳＣ（ＥＳＣＯ－）、及びこれらの細胞から分化した細胞（Ｏ－内皮細胞、Ｏ－心筋細胞、Ｏ－肝細胞、Ｏ－ドーパミン作動性ニューロン、Ｏ－膵島細胞、Ｏ－網膜色素内皮細胞、及び移植及び内科的治療に使用されるその他のＯ－細胞型を含む）が含まれる。これらには、ＣＡＲ－Ｔ細胞、ＣＡＲ－ＮＫ細胞などのＯ－キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）細胞、及びその他のエンジニアリングされた細胞集団が含まれることになる。いくつかの実施形態では、細胞は、造血幹細胞ではない。本発明は、特定の組織及び器官を生成又は再生するための、一般に許容される「市販の」ＥＳＣＯ－及びＰＳＣＯ－及びそれらの誘導体をさらに提供する。
【0138】
本発明の別の態様は、移植のためのＰＳＣＯ－細胞、ｉＰＳＣＯ－細胞、ＥＳＣＯ－細胞、及び他のＯ－細胞の集団を作製する方法を提供する。本発明はまた、多能性細胞又は分化した細胞の移植から恩恵を受ける、疾患、障害、及び症状を治療する方法も提供する。
【0139】
本発明のいくつかの実施形態では、ＡＢＯ血液型Ｏは、ＡＢＯ血液型タンパク質発現の低下によって生じる。他の態様では、ＡＢＯ血液型は、内因性Ｏ型である。本発明のいくつかの態様では、ＨＩＰＯ－細胞は、ＡＢＯ遺伝子のヒトエクソン７の破壊に起因するＡＢＯ血液型Ｏを有する。いくつかの実施形態では、ＡＢＯ遺伝子のエクソン７の両方の対立遺伝子が破壊される。いくつかの実施形態では、ＡＢＯ遺伝子のエクソン７の両方の対立遺伝子の破壊は、両方の対立遺伝子を破壊するクラスター化された規則的に間隔があいた短いパリンドロームリピート（ＣＲＩＳＰＲ）／Ｃａｓ９反応から生じる。別の実施形態は、この遺伝子を不活性化するために、ＣＲＩＳＰＲベースのエピゲノム編集によるプログラム可能な転写記憶を使用する。
【0140】
他の態様では、ＡＢＯ血液型Ｏは、細胞表面上のＡＢＯ遺伝子産物の酵素修飾によって生じる。好ましい態様では、酵素修飾により、ＡＢＯ遺伝子産物から炭水化物を除去する。別の好ましい態様では、酵素修飾により、ＡＢＯ Ａ１抗原、Ａ２抗原、又はＢ抗原から炭水化物を除去する。
【0141】
本発明のいくつかの実施形態では、Ｒｈ血液型は、内因性Ｒｈ－型である。別の態様では、Ｒｈ－血液型は、Ｒｈタンパク質発現の減少又は排除によって生じる。別の態様では、Ｒｈ－型は、Ｒｈ Ｃ抗原、Ｒｈ Ｅ抗原、Ｋｅｌｌ Ｋ抗原（ＫＥＬ）、Ｄｕｆｆｙ（ＦＹ）Ｆｙａ抗原、Ｄｕｆｆｙ Ｆｙ３抗原、Ｋｉｄｄ（ＪＫ）Ｊｋｂ抗原、又は／及び又はＫｉｄｄ ＳＬＣ１４Ａ１をコードする遺伝子の破壊によって生じる。いくつかの実施形態では、破壊は、Ｒｈ Ｃ抗原、Ｒｈ Ｅ抗原、Ｋｅｌｌ Ｋ抗原（ＫＥＬ）、Ｄｕｆｆｙ（ＦＹ）Ｆｙａ抗原、Ｄｕｆｆｙ Ｆｙ３抗原、Ｋｉｄｄ（ＪＫ）Ｊｋｂ抗原、又は／及び又はＫｉｄｄ ＳＬＣ１４Ａ１をコードする遺伝子の両方の対立遺伝子を破壊するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に反応よって生じる。
【0142】
本発明のいくつかの実施形態では、本発明のＯ－細胞（例えば、ＰＳＣＯ－細胞、ｉＰＳＣＯ－細胞、ＥＳＣＯ－細胞、及びそれらに由来する細胞）は、哺乳類起源、例えば、ヒト、ウシ、ブタ、ニワトリ、七面鳥、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ロバ、ラバ、アヒル、ガチョウ、バッファロー、ラクダ、ヤク、ラマ、アルパカ、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ハムスター、又はモルモット起源である。
【0143】
特定の実施形態では、本発明は、宿主同種異系免疫系による拒絶を回避し、血液抗原型拒絶を回避する、ＡＢＯ血液型Ｏ Ｒｈ因子陰性（ＨＩＰＯ－）細胞を含む低免疫ＳＩＲＰαエンゲージャー細胞を提供する。いくつかの実施形態では、ＨＩＰＯ－細胞は、ＨＬＡ－Ｉ及びＨＬＡ－ＩＩの発現を低減又は排除し、マクロファージ貪食に対する多能性細胞の感受性を低下させる内因性タンパク質の発現を増加させ、普遍的な血液型Ｏ Ｒｈ－（「Ｏ－」）血液型を含むようにエンジニアリングされる。普遍的な血液型は、ＡＢＯ血液型Ａ及びＢ抗原並びにＲｈ因子発現を除去することによって、又はＯ－細胞株で開始することによって達成することができる。これらの新規なＨＩＰＯ－細胞は、抗原提示能力の低下、自然免疫クリアランスからの保護、及び血液型拒絶の欠如を有するため、宿主免疫拒絶を回避する。
【0144】
４．自殺遺伝子
いくつかの実施形態では、本発明は、「自殺遺伝子」又は「自殺スイッチ」を含むＨＩ ＳＩＲＰαエンゲージャー細胞を提供する。これらは、細胞が望ましくない形で成長及び分裂した場合に細胞死を引き起こすことができる「安全スイッチ」として機能するように組み込まれる。「自殺遺伝子」除去アプローチでは、特定の化合物によって活性化された場合にのみ細胞死をもたらすタンパク質をコードする遺伝子導入ベクターに自殺遺伝子を含める。自殺遺伝子は、無毒の化合物を猛毒代謝物に選択的に変換する酵素をコードし得る。その結果、酵素を発現している細胞が特異的に除去される。いくつかの実施形態では、自殺遺伝子は、ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ－ｔｋ）遺伝子であり、トリガーはガンシクロビルである。他の実施形態では、自殺遺伝子は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）シトシンデアミナーゼ（ＥＣ－ＣＤ）遺伝子であり、トリガーは、５－フルオロシトシン（５－ＦＣ）である（両方とも参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｂａｒｅｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒａｐ．２０（１０）：１９３２－１９４３（２０１２）、Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．８：７３－８（１９９８））。
いくつかの実施形態では、本発明は、「自殺遺伝子」又は「自殺スイッチ」を含むＨＩ ＳＩＲＰαエンゲージャー細胞を提供する。これらは、細胞が望ましくない形で成長及び分裂した場合に細胞死を引き起こすことができる「安全スイッチ」として機能するように組み込まれる。「自殺遺伝子」除去アプローチでは、特定の化合物によって活性化された場合にのみ細胞死をもたらすタンパク質をコードする遺伝子導入ベクターに自殺遺伝子を含める。自殺遺伝子は、無毒の化合物を猛毒代謝物に選択的に変換する酵素をコードし得る。その結果、酵素を発現している細胞が特異的に除去される。いくつかの実施形態では、自殺遺伝子は、ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ－ｔｋ）遺伝子であり、トリガーはガンシクロビルである。他の実施形態では、自殺遺伝子は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）シトシンデアミナーゼ（ＥＣ－ＣＤ）遺伝子であり、トリガーは、５－フルオロシトシン（５－ＦＣ）である（両方とも参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｂａｒｅｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒａｐ．２０（１０）：１９３２－１９４３（２０１２）、Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．８：７３－８（１９９８））。
【0145】
他の実施形態では、自殺遺伝子は、誘導性カスパーゼタンパク質である。誘導性カスパーゼタンパク質は、アポトーシスを誘導することができるカスパーゼタンパク質の少なくとも一部を含む。好ましい実施形態では、誘導性カスパーゼタンパク質はｉＣａｓｐ９である。ｉＣａｓｐ９は、一連のアミノ酸を介してヒトカスパーゼ９をコードする遺伝子に接続された、Ｆ３６Ｖ突然変異を有するヒトＦＫ５０６結合タンパク質であるＦＫＢＰ１２の配列を含む。ＦＫＢＰ１２－Ｆ３６Ｖは、小分子二量体化剤であるＡＰ１９０３に高い親和性で結合する。したがって、本発明におけるｉＣａｓｐ９の自殺機能は、二量体化の化学的誘導物質（ＣＩＤ）の投与によって引き起こされる。いくつかの実施形態では、ＣＩＤは、小分子薬物ＡＰ１９０３である。二量体化は、アポトーシスの迅速な誘導を引き起こす。（それぞれ参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１１１４６８６２号パンフレット；Ｓｔａｓｉ ｅｔ ａｌ，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ ３６５；１８（２０１１）；Ｔｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｌ．Ｂｌｏｏｄ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．１３：９１３－９２４（２００７）を参照されたい）。
【0146】
５．Ｆｃ隔離（Ｆｃ ｓｅｑｕｅｓｔｒａｔｉｏｎ）
抗体がそのＦａｂ領域を介して保護されていない細胞に結合すると、Ｆｃが、ＮＫ細胞（主にＣＤ１６受容体を介して）、マクロファージ（主にＣＤ１６、ＣＤ３２、又はＣＤ６４を介して）、Ｂ細胞（主にＣＤ３２を介して）、又は顆粒球（主にＣＤ１６、ＣＤ３２、又はＣＤ６４を介して）によって結合され得る。これらは、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を媒介し得る。補体がＦｃに結合すると、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を引き起こし得る。
抗体がそのＦａｂ領域を介して保護されていない細胞に結合すると、Ｆｃが、ＮＫ細胞（主にＣＤ１６受容体を介して）、マクロファージ（主にＣＤ１６、ＣＤ３２、又はＣＤ６４を介して）、Ｂ細胞（主にＣＤ３２を介して）、又は顆粒球（主にＣＤ１６、ＣＤ３２、又はＣＤ６４を介して）によって結合され得る。これらは、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を媒介し得る。補体がＦｃに結合すると、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を引き起こし得る。
【0147】
いくつかの実施形態では、本発明のＳＩＲＰαエンゲージャー細胞は、ＩｇＧのＦｃ部分を認識する受容体を高レベルで含む。ＩｇＧのＦｃ部分を認識する受容体は、４つの異なるクラス：ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）、ＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）、及びＦｃγＲＩＶに分類される。これにより、細胞移植レシピエントの免疫系が同種異系物質を拒絶する傾向が減少する。上昇したレベルのＣＤ１６、ＣＤ３２、又はＣＤ６４を発現する細胞は、ＡＤＣＣ又はＣＤＣを回避する。Ｆｃ隔離は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第２０２１０７６４２７号パンフレットに開示されている。
【0148】
６．ＨＩ表現型のアッセイ
ＨＩ細胞が作製されたら、ＨＩ細胞は、本明細書に一般的に記載されるようにそれらの低免疫原性についてアッセイすることができる。
ＨＩ細胞が作製されたら、ＨＩ細胞は、本明細書に一般的に記載されるようにそれらの低免疫原性についてアッセイすることができる。
【0149】
例えば、低免疫原性は、いくつかの技術を使用してアッセイされる。１つの例示的な技術は、同種異系宿主への移植、及びＨＩ ＳＩＲＰαエンゲージャー細胞の生存についてのモニタリングを含む。細胞を形質導入してルシフェラーゼを発現させることができ、次いで生物発光イメージングを使用して追跡することができる。同様に、ＨＩ ＳＩＲＰαエンゲージャー細胞に対する宿主動物のＴ細胞又はＢ細胞の応答を試験して、宿主動物で免疫応答が引き起こされないことを確認する。Ｔ細胞の機能が、Ｅｌｉｓｐｏｔ、Ｅｌｉｓａ、ＦＡＣＳ、ＰＣＲ、又はマスサイトメトリー（ＣＹＴＯＦ）によって評価される。Ｂ細胞応答又は抗体応答が、ＦＡＣＳ又はｌｕｍｉｎｅｘを使用して評価される。加えて、又は代わりに、細胞を、自然免疫応答、例えばＮＫ細胞による死滅を回避するそれらの能力についてアッセイすることができる。ＮＫ細胞の細胞溶解性活性は、当技術分野で公知の技術を使用してインビトロ又はインビボで評価される。
【0150】
Ｃ．低免疫（ＨＩ）Ｏ－ＳＩＲＰαエンゲージャー細胞の作製
本発明のいくつかの態様では、プロセスが血液型Ｏを有するＮＫ細胞で開始されるため、上記のように作製されたＳＩＲＰαエンゲージャー細胞は、すでにＡＢＯ血液型Ｏ及びＲｈ因子陰性（－）細胞である。
本発明のいくつかの態様では、プロセスが血液型Ｏを有するＮＫ細胞で開始されるため、上記のように作製されたＳＩＲＰαエンゲージャー細胞は、すでにＡＢＯ血液型Ｏ及びＲｈ因子陰性（－）細胞である。
【0151】
本発明の他の態様は、Ａ及びＢ抗原の酵素的変換を含む。好ましい態様では、Ｂ抗原は、酵素を使用してＯに変換される。好ましい態様では、酵素は、α－ガラクトシダーゼである。この酵素は、Ｂ抗原の末端ガラクトース残基を除去する。本発明の他の態様は、Ａ抗原のＯへの酵素的変換を含む。好ましい態様では、Ａ抗原は、α－Ｎ－アセチルガラクトサミニダーゼを使用してＯに変換される。酵素変換については、例えば、それぞれ参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｏｌｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ Ｃｌｉｎｉｑｕｅ ｅｔ Ｂｉｏｌｏｇｉｑｕｅ １１：３３－３９（２００４）；米国特許第４，４２７，７７７号明細書、同第５，６０６，０４２号明細書、同第５，６３３，１３０号明細書、同第５，７３１，４２６号明細書、同第６，１８４，０１７号明細書、同第４，６０９，６２７号明細書、及び同第５，６０６，０４２号明細書；及び国際公開第９９２３２１０号パンフレットで論じられている。
【0152】
本発明の他の実施形態は、ＡＢＯ遺伝子エキソン７をノックアウトするか、又はＳＬＣ１４Ａ１（ＪＫ）遺伝子をサイレンシングすることによって細胞を遺伝子学的にエンジニアリングすることを含む。本発明の他の実施形態は、Ｒｈ血液型（ＲＨ）のＣ及びＥ抗原、ケル式血液型（ＫＥＬ）のＫ、ダッフィ式血液型（ＦＹ）のＦｙａ及びＦｙ３、キッド式血液型（ＪＫ）のＪｋｂ、又はＭＮＳ血液型のＵ及びＳのノックアウトを含む。ＣＲＩＳＰＲ、ｔａｌｅｎ、又は相同組換えなどの当技術分野で公知である、又は本明細書に記載される任意のノックアウト方法を使用することができる。
【0153】
低免疫ＡＢＯ血液型Ｏ Ｒｈ因子（－）細胞を作製するための技術は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国仮特許出願第６２／８４６，３９９号明細書に記載されている。
【0154】
Ｄ．本発明の実施形態
本発明のＳＩＲＰαエンゲージャー細胞又はその誘導体は、例えば、１型糖尿病、心疾患、神経疾患、癌、失明、血管疾患、及び再生薬物療法に応答する他の疾患／障害を治療するために使用することができる。特に、本発明は、任意の細胞型への分化のためにＳＩＲＰαエンゲージャー細胞を使用することを企図する。したがって、ヒト患者などの同種異系宿主に移植された場合、多能性を示すが宿主の自然免疫応答をもたらさない、ｉＰＳＣ、ＥＳＣ、ＨＩＰ、ｉＰＳＣＯ、ＥＳＣＯ、ＨＩＰＯ、ｉＰＳＣＯ－、ＥＳＣＯ－、及びＨＩＰＯ－ＳＩＲＰαエンゲージャー細胞又はその誘導体若しくは分化した細胞が本明細書で提供される。
本発明のＳＩＲＰαエンゲージャー細胞又はその誘導体は、例えば、１型糖尿病、心疾患、神経疾患、癌、失明、血管疾患、及び再生薬物療法に応答する他の疾患／障害を治療するために使用することができる。特に、本発明は、任意の細胞型への分化のためにＳＩＲＰαエンゲージャー細胞を使用することを企図する。したがって、ヒト患者などの同種異系宿主に移植された場合、多能性を示すが宿主の自然免疫応答をもたらさない、ｉＰＳＣ、ＥＳＣ、ＨＩＰ、ｉＰＳＣＯ、ＥＳＣＯ、ＨＩＰＯ、ｉＰＳＣＯ－、ＥＳＣＯ－、及びＨＩＰＯ－ＳＩＲＰαエンゲージャー細胞又はその誘導体若しくは分化した細胞が本明細書で提供される。
【0155】
一態様では、本発明は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸を含むＳＩＲＰαエンゲージャー細胞又はその誘導体を提供し、内因性β－２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子活性及び内因性クラスＩＩトランス活性化因子（ＣＩＩＴＡ）遺伝子活性が除去され、ＳＩＲＰαエンゲージャー分子が細胞表面に提示されている。ＣＡＲは、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内シグナル伝達ドメインを含み得る。いくつかの実施形態では、細胞外ドメインは、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３８、ＣＤ１２３、ＣＳ１、ＣＤ１７１、ＢＣＭＡ、ＭＵＣ１６、ＲＯＲ１、及びＷＴ１からなる群から選択される抗原に結合する。特定の実施形態では、細胞外ドメインは、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ８α、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＬＡＧ－３、及びＢＴＬＡを含む。特定の実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζ、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＬＡＧ－３、及びＢＴＬＡを含む。
【0156】
特定の実施形態では、ＣＡＲは、抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖドメイン、ＣＤ２８膜貫通ドメイン、及びＣＤ３ζシグナル伝達細胞内ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖドメイン、ＣＤ２８膜貫通ドメイン、４－１ＢＢシグナル伝達細胞内ドメイン、及びＣＤ３ζシグナル伝達細胞内ドメインを含む。
【0157】
本発明の別の態様では、本明細書に記載の多能性細胞のいずれか１つのインビトロ分化によって産生される、単離されたＳＩＲＰαエンゲージャーＣＡＲ－Ｔ細胞又は低免疫ＣＡＲ－Ｔ細胞が提供される。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ－Ｔ細胞は、細胞傷害性ＨＩＰＯ－ＣＡＲ－Ｔ細胞である。
【0158】
いくつかの態様では、本発明は、ＳＩＲＰαエンゲージャーＮＫ細胞又はＣＡＲ－ＮＫ細胞を提供する。
【0159】
様々な実施形態では、インビトロ分化は、ｂＦＧＦ、ＥＰＯ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＧＦ、ＩＬ－３、ＩＬ－６、ＩＬ－１５、ＧＭ－ＣＳＦ、ＳＣＦ、及びＶＥＧＦからなる群から選択される１つ又は複数の成長因子又はサイトカインを含む培養培地でＣＡＲ構築物を有するＳＩＲＰαエンゲージャー細胞又はその誘導体を培養することを含む。いくつかの実施形態では、培養培地は、ＢＭＰ活性化因子、ＧＳＫ３阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤、及びＮＯＴＣＨ活性化因子からなる群から選択される１つ又は複数の成長因子又はサイトカインをさらに含む。
【0160】
特定の実施形態では、単離されたＳＩＲＰαエンゲージャーＣＡＲ－Ｔ細胞又はＣＡＲ－ＮＫ細胞は、ＣＡＲ－Ｔ構築物を有するｉＰＳＣ、ＥＳＣ、ＨＩＰ、ｉＰＳＣＯ、ＥＳＣＯ、ＨＩＰＯ、ｉＰＳＣＯ－、ＥＳＣＯ－、又はＨＩＰＯ－ＳＩＲＰαエンゲージャー細胞のいずれか１つのインビトロ分化によって産生される。他の実施形態では、これらの細胞は、癌を治療するために使用される。
【0161】
本発明の別の態様では、治療有効量の、本明細書に記載の単離されたＳＩＲＰαエンゲージャーＣＡＲ－Ｔ ＣＡＲ－ＮＫ細胞のいずれかを含む組成物を投与することによって癌患者を治療する方法が提供される。いくつかの実施形態では、組成物は、治療効果のある担体をさらに含む。
【0162】
いくつかの実施形態では、投与ステップは、静脈内投与、皮下投与、節内投与、腫瘍内投与、くも膜下腔内投与、胸膜腔内投与、及び腹腔内投与を含む。特定の場合には、投与は、ボーラス投与又は連続灌流による投与をさらに含む。
【0163】
いくつかの実施形態では、癌は、白血病、リンパ腫、及び骨髄腫からなる群から選択される血液癌である。様々な実施形態では、癌は、固形腫瘍癌又は液性腫瘍癌である。
【0164】
別の態様では、本発明は、本明細書に記載の単離されたＳＩＲＰαエンゲージャーＣＡＲ－Ｔ ＣＡＲ－ＮＫ細胞のいずれか１つを作製する方法を提供する。この方法は、本発明のｉＰＳＣ、ＥＳＣ、ＨＩＰ、ｉＰＳＣＯ、ＥＳＣＯ、ＨＩＰＯ、ｉＰＳＣＯ－、ＥＳＣＯ－、又はＨＩＰＯ－ＳＩＲＰαエンゲージャー細胞のいずれか１つをインビトロで分化させることを含む。インビトロ分化は、ｂＦＧＦ、ＥＰＯ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＧＦ、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、ＧＭ－ＣＳＦ、ＳＣＦ、及びＶＥＧＦからなる群から選択される１つ又は複数の成長因子又はサイトカインを含む培養培地で細胞を培養することを含み得る。いくつかの実施形態では、培養培地は、ＢＭＰ活性化因子、ＧＳＫ３阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤、及びＮＯＴＣＨ活性化因子からなる群から選択される１つ又は複数の成長因子又はサイトカインをさらに含む。
【0165】
いくつかの実施形態では、インビトロ分化は、ｉＰＳＣ、ＥＳＣ、ＨＩＰ、ｉＰＳＣＯ、ＥＳＣＯ、ＨＩＰＯ、ｉＰＳＣＯ－、ＥＳＣＯ－、又はＨＩＰＯ－ＳＩＲＰαエンゲージャー細胞をフィーダー細胞上で培養することを含む。様々な実施形態では、インビトロ分化は、模擬微小重力状態で培養することを含む。特定の場合には、模擬微小重力状態での培養は少なくとも７２時間である。
【0166】
いくつかの態様では、ｉＰＳＣ、ＥＳＣ、ＨＩＰ、ｉＰＳＣＯ、ＥＳＣＯ、ＨＩＰＯ、ｉＰＳＣＯ－、ＥＳＣＯ－、又はＨＩＰＯ－ＳＩＲＰαエンゲージャー細胞から分化した、単離されエンジニアリングされた低免疫心臓細胞（低免疫原性心臓細胞）、例えば心筋細胞が本明細書で提供される。
【0167】
心筋細胞は、ＡＢＯ血液型抗原を欠いていると以前は考えられていた。ＡＢＯ血液型Ｂのヒト胚性幹細胞株が心筋細胞様細胞に分化するとＢ抗原が消失することが観察され、これらの抗原の消失がヒト胚発生の初期に起こり得ることが示唆された。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｍｏｌｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．８６（１０）：１４０７－１３（２００８）を参照されたい。他の研究では、ヒト人工多能性幹細胞の心筋細胞様細胞への分化により、これらの細胞におけるＡＢＯ血液型Ａ抗原の進行性の喪失が引き起こされることも報告された。例えば、Ｓａｌｊｏ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ．１３０７２：１－１４（２０１７）を参照されたい。しかしながら、驚くべきことに、本発明者らは、心筋細胞が、不適合レシピエントに対してそのような細胞の拒絶反応を引き起こし得るＡＢＯ血液型抗原を発現することを見出した。
【0168】
したがって、いくつかの態様では、心臓の状態又は疾患に苦しんでいる患者を治療する方法が本明細書で提供される。この方法は、本明細書に記載のように、ｉＰＳＣ、ＥＳＣ、ＨＩＰ、ｉＰＳＣＯ、ＥＳＣＯ、ＨＩＰＯ、ｉＰＳＣＯ－、ＥＳＣＯ－、又はＨＩＰＯ－ＳＩＲＰαエンゲージャー細胞に由来する、治療有効量の、単離されたＳＩＲＰαエンゲージャー心臓細胞のいずれか１つの集団を含む組成物を投与することを含む。いくつかの実施形態では、組成物は、治療効果のある担体をさらに含む。
【0169】
いくつかの実施形態では、投与は、患者の心臓組織への移植、静脈内注射、動脈内注射、冠動脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、心筋内注射、経心内膜注射、経心外膜注射、又は注入を含む。
【0170】
いくつかの実施形態では、心臓の状態又は疾患は、小児心筋症、加齢性心筋症、拡張型心筋症、肥大型心筋症、拘束型心筋症、慢性虚血性心筋症、周産期心筋症、炎症性心筋症、他の心筋症、心筋炎、心筋虚血性再灌流傷害、心室機能不全、心不全、うっ血性心不全、冠状動脈疾患、末期心臓病、アテローム性動脈硬化症、虚血、高血圧、再狭窄、狭心症、リウマチ性心疾患、動脈炎、又は心血管疾患からなる群から選択される。
【0171】
いくつかの態様では、インビトロ分化によってＳＩＲＰαエンゲージャー細胞の集団から心臓細胞の集団を作製する方法が本明細書に提供され、内因性β－２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子活性及び内因性クラスＩＩトランス活性化因子（ＣＩＩＴＡ）遺伝子活性が除去され、ＳＩＲＰαエンゲージャー分子が細胞表面に提示されている。この方法は：（ａ）ＧＳＫ阻害剤を含む培養培地でＳＩＲＰαエンゲージャー細胞の集団を培養すること、（ｂ）ＷＮＴアンタゴニストを含む培養培地でＳＩＲＰαエンゲージャー細胞の集団を培養して、前心臓細胞（ｐｒｅ－ｃａｒｄｉａｃ ｃｅｌｌ）の集団を作製すること；並びに（ｃ）インスリンを含む培養培地で前心臓細胞の集団を培養して、Ｏ－低免疫心臓細胞の集団を作製することを含む。いくつかの実施形態では、ＧＳＫ阻害剤は、ＣＨＩＲ－９９０２１、その誘導体、又はその変異体である。場合によっては、ＧＳＫ阻害剤は、約２μＭ～約１０μＭの範囲の濃度である。いくつかの実施形態では、ＷＮＴアンタゴニストは、ＩＷＲ１、その誘導体、又はその変異体である。場合によっては、ＷＮＴアンタゴニストは、約２μＭ～約１０μＭの範囲の濃度である。
【0172】
いくつかの態様では、ｉＰＳＣ、ＥＳＣ、ＨＩＰ、ｉＰＳＣＯ、ＥＳＣＯ、ＨＩＰＯ、ｉＰＳＣＯ－、ＥＳＣＯ－、又はＨＩＰＯ－ＳＩＲＰαエンゲージャー細胞から分化した、単離されエンジニアリングされたＳＩＲＰαエンゲージャー内皮細胞が本明細書で提供される。他の態様では、単離されエンジニアリングされたＯ－又はＯ－低免疫内皮細胞は、毛細血管内皮細胞、血管内皮細胞、大動脈内皮細胞、脳内皮細胞、及び腎内皮細胞からなる群から選択される。
【0173】
いくつかの態様では、血管の状態又は疾患に苦しんでいる患者を治療する方法が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、この方法は、治療有効量の、単離されエンジニアリングされたＳＩＲＰαエンゲージャー内皮細胞の集団を含む組成物を投与することを含む。
【0174】
いくつかの実施形態では、この方法は、治療有効量の、本明細書に記載の単離されエンジニアリングされたＳＩＲＰαエンゲージャー内皮細胞のいずれか１つの集団を含む組成物を投与することを含む。いくつかの実施形態では、組成物は、治療効果のある担体をさらに含む。いくつかの実施形態では、投与は、患者の心臓組織への移植、静脈内注射、動脈内注射、冠動脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、心筋内注射、経心内膜注射、経心外膜注射、又は注入を含む。
【0175】
いくつかの実施形態では、血管の状態又は疾患は、血管損傷、心血管疾患、血管疾患、虚血性疾患、心筋梗塞、うっ血性心不全、高血圧、虚血性組織損傷、四肢虚血、脳卒中、神経障害、及び脳血管疾患からなる群から選択される。
【0176】
いくつかの態様では、インビトロ分化による、ｉＰＳＣ、ＥＳＣ、ＨＩＰ、ｉＰＳＣＯ、ＥＳＣＯ、ＨＩＰＯ、ｉＰＳＣＯ－、ＥＳＣＯ－、又はＨＩＰＯ－ＳＩＲＰαエンゲージャー細胞の集団からＳＩＲＰαエンゲージャー内皮細胞の集団を作製する方法が本明細書で提供され、内因性β－２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子活性及び内因性クラスＩＩトランス活性化因子（ＣＩＩＴＡ）遺伝子活性が除去され、ＳＩＲＰαエンゲージャー分子が細胞表面に提示される。この方法は：（ａ）ＧＳＫ阻害剤を含む第１の培養培地で細胞を培養することと、（ｂ）ＶＥＧＦ及びｂＦＧＦを含む第２の培養培地で細胞の集団を培養して、前内皮細胞（ｐｒｅ－ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ）の集団を作製すること；並びに（ｃ）ＲＯＣＫ阻害剤及びＡＬＫ阻害剤を含む第３の培養培地で前内皮細胞の集団を培養して、低免疫内皮細胞の集団を作製することを含む。
【0177】
いくつかの実施形態では、ＧＳＫ阻害剤は、ＣＨＩＲ－９９０２１、その誘導体、又はその変異体である。場合によっては、ＧＳＫ阻害剤は、約１μＭ～約１０μＭの範囲の濃度である。いくつかの実施形態では、ＲＯＣＫ阻害剤は、Ｙ－２７６３２、その誘導体、又はその変異体である。場合によっては、ＲＯＣＫ阻害剤は、約１μＭ～約２０μＭの範囲の濃度である。いくつかの実施形態では、ＡＬＫ阻害剤は、ＳＢ－４３１５４２、その誘導体、又はその変異体である。場合によっては、ＡＬＫ阻害剤は、約０．５μＭ～約１０μＭの範囲の濃度である。
【0178】
いくつかの実施形態では、第１の培養培地は、２μＭ～約１０μＭのＣＨＩＲ－９９０２１を含む。いくつかの実施形態では、第２の培養培地は、５０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ及び１０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦを含む。他の実施形態では、第２の培養培地は、Ｙ－２７６３２及びＳＢ－４３１５４２をさらに含む。様々な実施形態では、第３の培養培地は、１０μＭのＹ－２７６３２及び１μＭのＳＢ－４３１５４２を含む。特定の実施形態では、第３の培養培地は、ＶＥＧＦ及びｂＦＧＦをさらに含む。特定の場合には、第１の培養培地及び／又は第２の培地にはインスリンが存在しない。
【0179】
いくつかの態様では、ＳＩＲＰαエンゲージャー細胞から分化した、単離されエンジニアリングされたＳＩＲＰαエンゲージャードーパミン作動性ニューロン（ＤＮ）が本明細書に提供され、内因性β－２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子活性及び内因性クラスＩＩトランス活性化因子（ＣＩＩＴＡ）遺伝子活性が除去され、ＳＩＲＰαエンゲージャー分子が細胞表面に提示され、ニューロンは、血液型Ｏ及びＲｈ－である。
【0180】
いくつかの実施形態では、単離されたＳＩＲＰαエンゲージャードーパミン作動性ニューロンは、神経幹細胞、神経前駆細胞、未成熟ドーパミン作動性ニューロン、及び成熟ドーパミン作動性ニューロンからなる群から選択される。
【0181】
いくつかの態様では、神経変性疾患又は神経変性状態に苦しんでいる患者を治療する方法が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、この方法は、治療有効量の、単離されたＳＩＲＰαエンゲージャードーパミン作動性ニューロンのいずれか１つの集団を含む組成物を投与することを含む。いくつかの実施形態では、組成物は、治療効果のある担体をさらに含む。いくつかの実施形態では、単離された低免疫ドーパミン作動性ニューロンの集団は生分解性足場上にある。いくつかの実施形態では、投与は、移植又は注射を含み得る。いくつかの実施形態では、神経変性疾患又は状態は、パーキンソン病、ハンチントン病、及び多発性硬化症からなる群から選択される。
【0182】
いくつかの態様では、インビトロ分化によってＳＩＲＰαエンゲージャー細胞の集団からＳＩＲＰαエンゲージャードーパミン作動性ニューロンの集団を作製する方法が本明細書に提供され、内因性β－２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子活性及び内因性クラスＩＩトランス活性化因子（ＣＩＩＴＡ）遺伝子活性が除去され、ＳＩＲＰαエンゲージャー分子が細胞表面に提示され、血液型はＯ及びＲｈ－である。いくつかの実施形態では、この方法は、（ａ）未成熟ドーパミン作動性ニューロンの集団を作製するために、ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）、ＢＤＮＦ、ＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＦＧＦ８、ＷＮＴ１、レチノイン酸、ＧＳＫ３β阻害剤、ＡＬＫ阻害剤、及びＲＯＣＫ阻害剤からなる群から選択される１つ又は複数の因子を含む第１の培養培地で細胞の集団を培養すること；並びに（ｂ）未成熟ドーパミン作動性ニューロンの集団を、第１の培養培地とは異なる第２の培養培地で培養して、ドーパミン作動性ニューロンの集団を作製することを含む。
【0183】
いくつかの実施形態では、ＧＳＫβ阻害剤は、ＣＨＩＲ－９９０２１、その誘導体、又はその変異体である。場合によっては、ＧＳＫβ阻害剤は、約２μＭ～約１０μＭの範囲の濃度である。いくつかの実施形態では、ＡＬＫ阻害剤は、ＳＢ－４３１５４２、その誘導体、又はその変異体である。場合によっては、ＡＬＫ阻害剤は、約１μＭ～約１０μＭの範囲の濃度である。いくつかの実施形態では、第１の培養培地及び／又は第２の培養培地には動物血清が存在しない。
【0184】
いくつかの実施形態では、この方法は、非ドーパミン作動性ニューロンから低免疫ドーパミン作動性ニューロンの集団を単離することも含む。いくつかの実施形態では、この方法は、単離された低免疫ドーパミン作動性ニューロンの集団を凍結保存することをさらに含む。
【0185】
いくつかの態様では、ＳＩＲＰαエンゲージャー細胞から分化した、単離されたＳＩＲＰαエンゲージャー低免疫膵島細胞が本明細書で提供され、内因性β－２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子活性及び内因性クラスＩＩトランス活性化因子（ＣＩＩＴＡ）遺伝子活性が除去され、ＳＩＲＰαエンゲージャー分子が細胞表面に提示され、血液型はＯ及びＲｈ－である。
【0186】
いくつかの実施形態では、単離されたＳＩＲＰαエンゲージャー膵島細胞は、膵島前駆細胞、未成熟膵島細胞、及び成熟膵島細胞からなる群から選択される。
【0187】
いくつかの態様では、糖尿病に苦しんでいる患者を治療する方法が本明細書で提供される。この方法は、治療有効量の、本明細書に記載の単離されたＳＩＲＰαエンゲージャー膵島細胞のいずれか１つの集団を含む組成物を投与することを含む。いくつかの実施形態では、組成物は、治療効果のある担体をさらに含む。いくつかの実施形態では、単離された低免疫膵島細胞の集団は生分解性足場上にある。場合によっては、投与は、移植又は注射を含む。
【0188】
いくつかの態様では、インビトロ分化によってＨＩＰＯ－細胞の集団からＳＩＲＰαエンゲージャー膵島細胞の集団を作製する方法が本明細書に提供され、内因性β－２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子活性及び内因性クラスＩＩトランス活性化因子（ＣＩＩＴＡ）遺伝子活性が除去され、ＳＩＲＰαエンゲージャー分子が細胞表面に提示され、ＨＩＰＯ－細胞では血液型はＯ及びＲｈ－である。この方法は：（ａ）インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、形質転換成長因子（ＴＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ＥＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）、及び血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、形質転換成長因子－β（ＴＧＦβ）スーパーファミリー、骨形成タンパク質－２（ＢＭＰ２）、骨形成タンパク質－７（ＢＭＰ７）、ＧＳＫ３β阻害剤、ＡＬＫ阻害剤、ＢＭＰ１型受容体阻害剤、及びレチノイン酸からなる群から選択される１つ又は複数の因子を含む第１の培養培地でＳＩＲＰαエンゲージャー細胞の集団を培養して未成熟膵島細胞の集団を作製すること；並びに（ｂ）第１の培養培地とは異なる第２の培養培地で未成熟膵島細胞の集団を培養して、低免疫膵島細胞の集団を作製することを含む。
【0189】
いくつかの実施形態では、ＧＳＫ阻害剤は、ＣＨＩＲ－９９０２１、その誘導体、又はその変異体である。場合によっては、ＧＳＫ阻害剤は、約２μＭ～約１０μＭの範囲の濃度である。いくつかの実施形態では、ＡＬＫ阻害剤は、ＳＢ－４３１５４２、その誘導体、又はその変異体である。場合によっては、ＡＬＫ阻害剤は、約１μＭ～約１０μＭの範囲の濃度である。いくつかの実施形態では、第１の培養培地及び／又は第２の培養培地には動物血清が存在しない。
【0190】
いくつかの実施形態では、この方法は、非膵島細胞からＳＩＲＰαエンゲージャー膵島細胞の集団を単離することも含む。いくつかの実施形態では、この方法は、低免疫膵島細胞の単離された集団を凍結保存することをさらに含む。
【0191】
いくつかの態様では、ＳＩＲＰαエンゲージャー細胞から分化した、単離されエンジニアリングされたＳＩＲＰαエンゲージャー網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞が本明細書に提供され、内因性β－２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子活性及び内因性クラスＩＩトランス活性化因子（ＣＩＩＴＡ）遺伝子活性が除去され、ＳＩＲＰαエンゲージャー分子が細胞表面に提示され、血液型はＯ及びＲｈ－である。
【0192】
いくつかの実施形態では、単離されたＳＩＲＰαエンゲージャー細胞ＲＰＥ細胞は、ＲＰＥ前駆細胞、未成熟ＲＰＥ細胞、成熟ＲＰＥ細胞、及び機能性ＲＰＥ細胞からなる群から選択される。
【0193】
いくつかの態様では、眼症状に苦しんでいる患者を治療する方法が本明細書で提供される。この方法は、治療有効量の、本明細書に記載の単離されたＳＩＲＰαエンゲージャー細胞ＲＰＥ細胞の集団のいずれか１つの集団を含む組成物を投与することを含む。いくつかの実施形態では、組成物は、治療効果のある担体をさらに含む。いくつかの実施形態では、単離された低免疫ＲＰＥ細胞の集団は生分解性足場上にある。いくつかの実施形態では、投与は、患者の網膜への移植又は注射を含む。いくつかの実施形態では、眼症状は、湿性黄斑変性、乾性黄斑変性、若年性黄斑変性、レーバー先天性黒内障、網膜色素変性症、及び網膜剥離からなる群から選択される。
【0194】
いくつかの態様では、インビトロ分化によってＳＩＲＰαエンゲージャー細胞の集団からＳＩＲＰαエンゲージャー網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞の集団を作製する方法が本明細書に提供され、内因性β－２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子活性及び内因性クラスＩＩトランス活性化因子（ＣＩＩＴＡ）遺伝子活性が除去され、ＳＩＲＰαエンゲージャー分子が細胞表面に提示される。この方法は：（ａ）アクチビンＡ、ｂＦＧＦ、ＢＭＰ４／７、ＤＫＫ１、ＩＧＦ１、ノギン、ＢＭＰ阻害剤、ＡＬＫ阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤、及びＶＥＧＦＲ阻害剤からなる群から選択されるいずれか１つの因子を含む第１の培養培地でＳＩＲＰαエンゲージャーの集団を培養してｐｒｅ－ＲＰＥ細胞の集団を作製すること；並びに（ｂ）第１の培養培地とは異なる第２の培養培地でｐｒｅ－ＲＰＥ細胞の集団を培養して、低免疫ＲＰＥ細胞の集団を作製することを含む。
【0195】
いくつかの実施形態では、ＡＬＫ阻害剤は、ＳＢ－４３１５４２、その誘導体、又はその変異体である。場合によっては、ＡＬＫ阻害剤は、約２μＭ～約１０μＭの範囲の濃度である。いくつかの実施形態では、ＲＯＣＫ阻害剤は、Ｙ－２７６３２、その誘導体、又はその変異体である。場合によっては、ＲＯＣＫ阻害剤は、約１μＭ～約１０μＭの範囲の濃度である。
【0196】
いくつかの実施形態では、第１の培養培地及び／又は第２の培養培地には動物血清が存在しない。
【0197】
いくつかの実施形態では、この方法は、非ＲＰＥ細胞からＳＩＲＰαエンゲージャーＲＰＥ細胞の集団を単離することをさらに含む。いくつかの実施形態では、この方法は、低免疫ＲＰＥ細胞の単離された集団を凍結保存することをさらに含む。
【0198】
Ｅ．ＨＩ ＳＩＲＰαエンゲージャー細胞の移植
当業者には理解されるように、ＨＩ ＳＩＲＰαエンゲージャー細胞は、当技術分野で公知である技術を使用して移植される。一般に、本発明のＨＩ ＳＩＲＰαエンゲージャー細胞は、患者の特定の位置における静脈内に又は注射によって移植される。特定の部位に移植される場合、細胞をゲルマトリックス中に懸濁して細胞が定着する間の分散を防止することができる。
当業者には理解されるように、ＨＩ ＳＩＲＰαエンゲージャー細胞は、当技術分野で公知である技術を使用して移植される。一般に、本発明のＨＩ ＳＩＲＰαエンゲージャー細胞は、患者の特定の位置における静脈内に又は注射によって移植される。特定の部位に移植される場合、細胞をゲルマトリックス中に懸濁して細胞が定着する間の分散を防止することができる。
【0199】
本明細書に記載の本発明をより完全に理解できるようにするために、以下の実施例を説明する。これらの実施例は、説明のみを目的としており、いかなる形でも本発明を限定するものとして解釈されるべきではないことを理解されたい。
【実施例】
【0200】
ＶＩＩＩ．実施例
実施例１：ＳＩＲＰαの会合は自然免疫細胞をサイレンシングする
ＮＫ細胞における阻害ＳＩＲＰα経路を、ＮＫ細胞阻害についてのＣＤ４７非依存性アッセイを使用して分析した。ＳＩＲＰαは、ＮＫ細胞に対する強力な抑制性受容体であることが判明した。
実施例１：ＳＩＲＰαの会合は自然免疫細胞をサイレンシングする
ＮＫ細胞における阻害ＳＩＲＰα経路を、ＮＫ細胞阻害についてのＣＤ４７非依存性アッセイを使用して分析した。ＳＩＲＰαは、ＮＫ細胞に対する強力な抑制性受容体であることが判明した。
【0201】
ＮＫ細胞におけるＳＩＲＰαの機能的役割を、ＦｃＲ＋Ｐ８１５マウス肥満細胞腫細胞株に対する抗体依存性細胞傷害性アッセイで評価した（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｇａｊｅｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔｏｃ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｃｈａｐｔｅｒ ２０（２００１），ｄｏｉ：１０．１００２／０４７１１４２７３５．ｉｍ２００４ｓ４３）。ＮＫ細胞又はＴ細胞上の活性化又は抑制性受容体に対するアゴニスト抗体を使用して、Ｐ８１５マウス肥満細胞腫細胞株上のＦｃ受容体に会合させた。これらはそれぞれ、この標的細胞株の死滅を増加又は減少させた。同様に、ＣＤ１６に対する抗体は、細胞溶解性ＮＫ細胞活性を開始したが、ＣＤ５６のような他の膜分子に対する対照抗体はそうではなかった。参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｌａｎｉｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ １５５：１４５－１５４（１９９７）；Ｌａｎｉｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １４１：３４７８－３４８５（１９８８）；Ｓｉｌｉｃｉａｎｏ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ３１７：４２８－４３０（１９８５）を参照されたい。
【0202】
ＳＩＲＰαに対するアゴニスト抗体は、高い特異性でＳＩＲＰα誘導性ＮＫ細胞阻害を引き起こしたため、ＣＤ４７と別の未知の受容体との間の相互作用がＮＫ細胞阻害に寄与する可能性が排除される。ＦＬｕｃ＋Ｐ８１５細胞の標的細胞死滅を、４時間にわたるその生物発光イメージング（ＢＬＩシグナル）の低下によって評価した。初代ヒトＣＤ３－ＣＤ７＋ＣＤ５６＋ＮＫ細胞を、ＩＬ－２で７２時間刺激して、その死滅応答を活性化した。ＩＬ－２は、活性化ＮＫ細胞シグナルを提供し、またＳＩＲＰαの表面発現を増加させる。図１Ａは、強力なＳＩＲＰα発現の代表的なフローサイトメトリーヒストグラムを示す。Ｐ８１５の約５０％が、ＩＬ－２刺激ＣＤ３－ＣＤ７＋ＣＤ５６＋ＮＫ細胞によって死滅した（図１Ｂ及び図１Ｃの左のバー）。ＮＫ細胞の死滅は、ＣＤ１６が抗ＣＤ１６（図１Ｂ）によって架橋されると、架橋ＮＫＧ２Ｄ（図１Ｃ）による程度よりも低いがさらに増加した。ＣＤ１６及びＮＫＧ２Ｄの両方が、ＮＫ細胞に強力な活性化経路を提供する。ＳＩＲＰαの同時会合は、Ｐ８１５溶解を阻害し、両方の刺激シグナルを相殺した。ＣＤ５６は、活性化又は阻害機能が欠如しているＮＫ細胞表面タンパク質である。このアッセイでは、ＣＤ５６の抗体との架橋は、ＮＫ細胞の細胞毒性に影響を与えなかった。したがって、ＮＫ細胞ＳＩＲＰαの阻害特性は、ＣＤ４７非依存的に確認された。したがって、ＳＩＲＰαに対して高度に特異的な抗体は、ＣＤ４７を使用せずにこの阻害経路を誘発し、したがって、ＳＩＲＰαの会合が、対象への移植時の標的細胞のＮＫ細胞死滅及び自然免疫を回避するのに十分であることを示している。
【0203】
実施例２：標的細胞に結合したＳＩＲＰαエンゲージャーはＮＫ細胞を阻害する
初代ヒトＣＤ３－ＣＤ７＋ＣＤ５６＋ＮＫ細胞をＩＬ－２で７２時間刺激して、Ｂ２Ｍ－／－ＣＩＩＴＡ－／－ｉＰＳＣ由来内皮細胞（ｉＥＣ）に対する効果的な死滅応答を活性化させた。刺激されたＣＤ３－ＣＤ７＋ＣＤ５６＋ＮＫ細胞をＦＬｕｃ＋Ｂ２Ｍ－／－ＣＩＩＴＡ－／－ｉＥＣと共にインキュベートすると、そのＢＬＩシグナルの低下によって示されるように、標的細胞の約９０％が４時間以内に急速に死滅した。ＣＤ６４は、ＩｇＧ Ｆｃに対する高親和性受容体であり、ＣＤ６４は、ＣＤ６４に結合することによって遊離ＩｇＧを捕捉する。ＣＤ６４は、レンチウイルストランスフェクションを使用してＢ２Ｍ－／－ＣＩＩＴＡ－／－ｉＥＣ上で発現させた。アゴニスト抗ＳＩＲＰα ＩｇＧ１抗体を、ＣＤ６４を発現する標的細胞と共にインキュベートした。ＩｇＧ１は、アンカーとしてそのＦｃ断片を介してＣＤ６４に結合した。抗体Ｆａｂ断片は、遊離しており、免疫エフェクター細胞上のＳＩＲＰαのそのエピトープと会合する準備ができていた。このような細胞は、「ＳＩＲＰαエンゲージャー細胞」である。ＩＬ－２活性化ＮＫ細胞と共にインキュベートすると、ＳＩＲＰαエンゲージャーが、標的細胞の死滅を防止した（図２）。抗ＳＩＲＰα ＩｇＧ１抗体が、エンジニアリングされた標的細胞のＡＤＣＣを媒介するのを防止するために、ＮＫ細胞上のＣＤ１６を、抗ＣＤ１６Ｆａｂを使用してブロックした。
初代ヒトＣＤ３－ＣＤ７＋ＣＤ５６＋ＮＫ細胞をＩＬ－２で７２時間刺激して、Ｂ２Ｍ－／－ＣＩＩＴＡ－／－ｉＰＳＣ由来内皮細胞（ｉＥＣ）に対する効果的な死滅応答を活性化させた。刺激されたＣＤ３－ＣＤ７＋ＣＤ５６＋ＮＫ細胞をＦＬｕｃ＋Ｂ２Ｍ－／－ＣＩＩＴＡ－／－ｉＥＣと共にインキュベートすると、そのＢＬＩシグナルの低下によって示されるように、標的細胞の約９０％が４時間以内に急速に死滅した。ＣＤ６４は、ＩｇＧ Ｆｃに対する高親和性受容体であり、ＣＤ６４は、ＣＤ６４に結合することによって遊離ＩｇＧを捕捉する。ＣＤ６４は、レンチウイルストランスフェクションを使用してＢ２Ｍ－／－ＣＩＩＴＡ－／－ｉＥＣ上で発現させた。アゴニスト抗ＳＩＲＰα ＩｇＧ１抗体を、ＣＤ６４を発現する標的細胞と共にインキュベートした。ＩｇＧ１は、アンカーとしてそのＦｃ断片を介してＣＤ６４に結合した。抗体Ｆａｂ断片は、遊離しており、免疫エフェクター細胞上のＳＩＲＰαのそのエピトープと会合する準備ができていた。このような細胞は、「ＳＩＲＰαエンゲージャー細胞」である。ＩＬ－２活性化ＮＫ細胞と共にインキュベートすると、ＳＩＲＰαエンゲージャーが、標的細胞の死滅を防止した（図２）。抗ＳＩＲＰα ＩｇＧ１抗体が、エンジニアリングされた標的細胞のＡＤＣＣを媒介するのを防止するために、ＮＫ細胞上のＣＤ１６を、抗ＣＤ１６Ｆａｂを使用してブロックした。
【0204】
方法：
ＮＫ細胞培養。ヒト初代ＮＫ細胞を、Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ （７００３６，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｃａｎａｄａ）から購入し、アッセイを行う前にＲＰＭＩ－１６４０と１０％ＦＣＳ ｈｉ及び１％ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ中で培養した。ＣＤ３－ＣＤ７＋ＣＤ５６＋初代ヒトＮＫ細胞をＦＡＣＳＡｒｉａ Ｆｕｓｉｏｎで選別した。
ＮＫ細胞培養。ヒト初代ＮＫ細胞を、Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ （７００３６，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｃａｎａｄａ）から購入し、アッセイを行う前にＲＰＭＩ－１６４０と１０％ＦＣＳ ｈｉ及び１％ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ中で培養した。ＣＤ３－ＣＤ７＋ＣＤ５６＋初代ヒトＮＫ細胞をＦＡＣＳＡｒｉａ Ｆｕｓｉｏｎで選別した。
【0205】
Ｐ８１５ ＢＬＩ死滅アッセイ。Ｆｌｕｃ＋Ｐ８１５細胞をカウントし、９６ウェル当たり１×１０３個の細胞数の濃度でプレーティングし、１０：１のＥ：Ｔ比でＣＤ３－ＣＤ７＋ＣＤ５６＋初代ヒトＮＫ細胞と混合した。すべてのＮＫ細胞を、１μｇ／ｍＬ濃度のヒトＩＬ－２（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ （Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））と共に７２時間プレインキュベートした。ＢＬＩ死滅アッセイで４時間後、ルシフェラーゼの発現を、Ｄ－ルシフェリン（Ｐｒｏｍｅｇａ （Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ））を添加することによって検出した。対照として、標的細胞を、未処理のままか、又は細胞特異的培地中の２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００で処理した。いくつかの条件では、標的細胞を、抗ＣＤ１６抗体（クローン３Ｇ８、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ （Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、マウスＩｇＧ１、κ、１０μｇ／ｍｌ）、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体（クローン１４９８１０、マウスＩｇＧ１、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＩ）、１０μｇ／ｍｌ）、抗ＳＩＲＰα（クローン２Ｈ７Ｅ２、マウスＩｇＧ１、抗体－オンライン（Ａａｃｈｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、１０μｇ／ｍｌ）、又は抗ＣＤ５６（クローンＮＣＡＭ１／７８４、マウスＩｇＧ１、Ａｂｅａｍ （Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）、１０μｇ／ｍｌ）で処理した。シグナルを、Ａｍｉ ＨＴ（Ｓｐｅｃｔｒａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｍａｇｉｎｇ（Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ））を使用してｐ／ｓ／ｃｍ２／ｓｒで定量化した。
【0206】
ホタルルシフェラーゼを発現させるためのヒトｉＰＳＣの培養及び形質導入。ヒトＢ２Ｍ－／－ＣＩＩＴＡ－／－ｉＰＳＣを、希釈したフィーダーフリーマトリゲル（ｈＥＳＣ認定、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）でコーティングした１０ｃｍ皿のＥｓｓｅｎｔｉａｌ ８ Ｆｌｅｘ培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）中で培養した。培地を２４時間ごとに交換し、Ｖｅｒｓｅｎｅ（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を１：６の比率で細胞継代に使用した。ルシフェラーゼ形質導入では、１×１０５個のｉＰＳＣを１つの６ウェルプレートにプレーティングし、３７℃、５％ＣＯ２で一晩インキュベートした。翌日、培地を交換し、再エンジニアリングしたＥＦ１ａプロモーター（Ｇｅｎ Ｔａｒｇｅｔ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）下でルシフェラーゼＩＩ遺伝子を発現するＦｌｕｃレンチウイルス粒子の１つのバイアルを１．５ｍｌの培地に添加した。３６時間後、１ｍｌの細胞培地を添加した。２４時間後、完全培地を交換した。２日後、Ｄ－ルシフェリン（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を添加することによってルシフェラーゼの発現を確認した。シグナルを、ｐ／ｓ／ｃｍ２／ｓｒで定量化した。
【0207】
ＣＤ６４を発現するＢ２Ｍ－／－ＣＩＩＴＡ－／－ｉＥＣの作製。Ｆｌｕｃ＋Ｂ２Ｍ－／－ＣＩＩＴＡ－／－ｉＥＣを、以下のようにＦＬｕｃ＋Ｂ２Ｍ－／－ＣＩＩＴＡ－／－ｉＰＳＣと区別した。分化プロトコルを、６０％のｉＰＳＣコンフルエンシーで開始した。培地を、２％Ｂ－２７マイナスインスリン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ｃａｔ ｎｏ Ａ１８９５６０１）及び５μＭ ＣＨＩＲ－９９０２１（Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ，Ｍｕｎｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ，ｃａｔ ｎｏ ＣＴ９９０２１）を含むＲＰＭＩ－１６４０（Ｇｉｂｃｏ，ｃａｔ ｎｏ １１－８７５－１０１）に交換した。２日目に、培地を還元培地：２％Ｂ－２７マイナスインスリン（Ｇｉｂｃｏ）及び２μＭ ＣＨＩＲ－９９０２１（Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ）を含むＲＰＭＩ－１６４０に交換した。培養の４日目から７日目まで、細胞を、ＲＰＭＩ－１６４０ＥＣ培地、即ち、ＲＰＭＩ－１６４０ＥＣ培地、２％Ｂ－２７マイナスインスリンと５０ｎｇ／ｍｌヒト血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ，ｃａｔ ｎｏ ２９３－ＶＥ－０１０）、１０ｎｇ／ｍｌヒト線維芽細胞成長因子（塩基性）（ＦＧＦｂ；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ｃａｔ ｎｏ ２３３－ＦＢ－０１０）、１０μＭ Ｙ－２７６３２（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ｃａｔ ｎｏ Ｙ０５０３）、及び１μＭ ＳＢ ４３１５４２（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ｃａｔ ｎｏ Ｓ４３１７）を含むＲＰＭＩ－１６４０に曝露した。内皮細胞クラスターを、７日目から確認でき、細胞を、内皮細胞基礎培地２（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ ｃａｔ ｎｏ Ｃ－２２０１０）とサプリメント、１０％ＦＣＳ ｈｉ（Ｇｉｂｃｏ，ｃａｔ ｎｏ １６－１４０－０７１）、１％ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ、２５ｎｇ／ｍｌ ＶＥＧＦ、２ｎｇ／ｍｌ ＦＧＦｂ、１０μＭ Ｙ－２７６３２、及び１μＭ ＳＢ４３１５４２で維持した。分化プロトコルは、分化プロセス中に未分化細胞が剥離した１４日後に完了した。ＴｒｙｐＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｇｉｂｃｏ，ｃａｔ ｎｏ １２６０５０１０）を使用して、３～４日ごとに１：３で細胞を継代した。次いで、Ｂ２Ｍ－／－ＣＩＩＴＡ－／－ｉＰＳＣ由来上皮細胞に、ＣＤ６４を発現するレンチウイルスベクターで形質導入した。プレコート１２ウェルプレートにおいて、１．５×１０５個のヒトＢ２Ｍ－／－ＣＩＩＴＡ－／－ｉＥＣを細胞特異的培地にプレーティングし、３７℃、５％ＣＯ２で一晩インキュベートした。翌日、細胞を、感染多重度４で、ヒトＣＤ６４の導入遺伝子を有するレンチウイルス粒子（ＮＭ＿０００５６６，Ｏｒｉｇｅｎｅ，ｃａｔａｌｏｇ ｎｏ．ＲＣ２０７４８７Ｌ２Ｖ）と共に一晩インキュベートした。ポリブレン（８μｇ／ｍｌ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）を培地に添加し、プレートを８００ｇで３０分間遠心分離してから、一晩インキュベートした。細胞集団を、ＢＶ４２１標識抗ヒトＣＤ６４抗体（クローン１０．１，ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ，ｃａｔａｌｏｇ ｎｏ．３０５００２）を使用してＦＡＣＳＡｒｉａ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で選別した。
【0208】
抗ＳＩＲＰα抗体を使用した場合のｉＥＣ ＢＬＩ死滅アッセイ。Ｆｌｕｃ＋Ｂ２Ｍ－／－ＣＩＩＴＡ－／－ｉＥＣ及びＢ２Ｍ－／－ＣＩＩＴＡ－／－ＣＤ６４導入遺伝子（ｔｇ）ｉＥＣをカウントし、９６ウェルプレート当たり１×１０３個の細胞数の濃度でプレーティングした。Ｂ２Ｍ－／－ＣＩＩＴＡ－／－ＣＤ６４ ｔｇ ｉＥＣを、抗ＳＩＩＲＰａ抗体（クローンＰ３６２， ヒトＩｇＧ１，Ｃｒｅａｔｉｖｅ Ｂｉｏｌａｂｓ，１０μｇ／ｍｌ）と共に３０分間インキュベートした。並行して、ＣＤ３－ＣＤ７＋ＣＤ５６＋初代ヒトＮＫ細胞を、１μｇ／ｍＬの濃度のヒトＩＬ－２（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と共に７２時間プレインキュベートした。次いで、それらを抗ＣＤ１６ Ｆａｂ（クローン３Ｇ８，１０μｇ／ｍｌ，Ａｎｃｅｌｌ，Ｂａｙｐｏｒｔ，ＭＮ）と共にインキュベートして、ＣＤ１６をブロックし、その後のＡＤＣＣを防止した。次いで、すべての標的細胞を、ＣＤ３－ＣＤ７＋ＣＤ５６＋初代ヒトＮＫ細胞と１０：１のＥ：Ｔ比で混合した。ＢＬＩ死滅アッセイで４時間後、ルシフェラーゼの発現を、Ｄ－ルシフェリン（Ｐｒｏｍｅｇａ，ｃａｔ ｎｏ Ｐ１０４１）を添加することによって検出した。対照として、標的細胞を、未処理のままか、又は細胞特異的培地中の２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００で処理した。シグナルを、Ａｍｉ ＨＴ（Ｓｐｅｃｔｒａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｍａｇｉｎｇ）を使用してｐ／ｓ／ｃｍ２／ｓｒで定量化した。
【0209】
実施例３：合成ＳＩＲＰαエンゲージャー融合タンパク質を発現するＢ２Ｍ－／－ＣＩＩＴＡ－／－ｉＥＣの作製
Ｂ２Ｍ－／－ＣＩＩＴＡ－／－ｉＥＣに、以下を発現するレンチウイルスベクターで形質導入した：
・ＣＤ４７－ＣＤ６４ ＳＩＲＰαエンゲージャーハイブリッドタンパク質：ＣＤ４７細胞外ドメイン（ＥＣＤ）をＣＤ６４膜貫通ドメイン（ＴＭＤ）と融合した。（配列番号：１６、ＣＤ４７－ＣＤ６４ハイブリッド）
・抗ＳＩＲＰα－ＣＤ６４エンゲージャー融合タンパク質：３つの抗ＳＩＲＰα ＣＤＲをＣＤ６４ ＴＭＤと融合した（配列番号１７、抗体融合体１）
・抗ＳＩＲＰα－ＣＤ６４エンゲージャー融合タンパク質：３つの抗ＳＩＲＰα ＣＤＲをＣＤ６４ ＴＭＤと融合した（配列番号１８、抗体融合体２）
Ｂ２Ｍ－／－ＣＩＩＴＡ－／－ｉＥＣに、以下を発現するレンチウイルスベクターで形質導入した：
・ＣＤ４７－ＣＤ６４ ＳＩＲＰαエンゲージャーハイブリッドタンパク質：ＣＤ４７細胞外ドメイン（ＥＣＤ）をＣＤ６４膜貫通ドメイン（ＴＭＤ）と融合した。（配列番号：１６、ＣＤ４７－ＣＤ６４ハイブリッド）
・抗ＳＩＲＰα－ＣＤ６４エンゲージャー融合タンパク質：３つの抗ＳＩＲＰα ＣＤＲをＣＤ６４ ＴＭＤと融合した（配列番号１７、抗体融合体１）
・抗ＳＩＲＰα－ＣＤ６４エンゲージャー融合タンパク質：３つの抗ＳＩＲＰα ＣＤＲをＣＤ６４ ＴＭＤと融合した（配列番号１８、抗体融合体２）
【0210】
ハイブリッド配列及び融合配列を有するレンチウイルスを、ＧｅｎＴａｒｇｅｔ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡに特別注文した。プレコート１２ウェルプレートにおいて、１．５×１０５個のヒトＢ２Ｍ－／－ＣＩＩＴＡ－／－ｉＥＣを細胞特異的培地にプレーティングし、次いで、３７℃、５％ＣＯ２で一晩インキュベートした。翌日、細胞を、感染多重度４で、ＳＩＲＰαエンゲージャー融合タンパク質の配列の１つを有するレンチウイルス粒子と共にインキュベートした。翌日、ポリブレン（８μｇ／ｍｌ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を培地に添加し、プレートを８００ｇで３０分間遠心分離してから、一晩インキュベートした。細胞集団を、レンチウイルスベクターに含まれるＲＦＰタグを使用してＦＡＣＳＡｒｉａ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で選別した。
【0211】
実施例４：合成ＳＩＲＰαエンゲージャー融合タンパク質を発現するｉＥＣのＢＬＩ死滅アッセイ
ＣＤ４７－ＣＤ６４ハイブリッドタンパク質、抗体融合体１タンパク質、又は抗体融合２タンパク質のいずれかを発現するＦｌｕｃ＋Ｂ２Ｍ－／－ＣＩＩＴＡ－／－ｉＥＣ及びＢ２Ｍ－／－ＣＩＩＴＡ－／－ｉＥＣをカウントし、９６ウェルプレート当たり１×１０３個の細胞数の濃度でプレーティングした。並行して、初代ヒトＮＫ細胞を、１μｇ／ｍＬの濃度のヒトＩＬ－２（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と共に７２時間プレインキュベートした。次いで、すべての標的細胞を１０：１のＥ：Ｔ比で初代ヒトＮＫ細胞と混合した。ＢＬＩ死滅アッセイで４時間後、Ｄ－ルシフェリン（Ｐｒｏｍｅｇａ，ｃａｔ ｎｏ Ｐ１０４１）を添加することによってルシフェラーゼの発現を検出した。対照として、標的細胞を、未処理のままか、又は細胞特異的培地中の２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００で処理した。シグナルを、Ａｍｉ ＨＴ（Ｓｐｅｃｔｒａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｍａｇｉｎｇ）を使用してｐ／ｓ／ｃｍ２／ｓｒで定量化した。
ＣＤ４７－ＣＤ６４ハイブリッドタンパク質、抗体融合体１タンパク質、又は抗体融合２タンパク質のいずれかを発現するＦｌｕｃ＋Ｂ２Ｍ－／－ＣＩＩＴＡ－／－ｉＥＣ及びＢ２Ｍ－／－ＣＩＩＴＡ－／－ｉＥＣをカウントし、９６ウェルプレート当たり１×１０３個の細胞数の濃度でプレーティングした。並行して、初代ヒトＮＫ細胞を、１μｇ／ｍＬの濃度のヒトＩＬ－２（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と共に７２時間プレインキュベートした。次いで、すべての標的細胞を１０：１のＥ：Ｔ比で初代ヒトＮＫ細胞と混合した。ＢＬＩ死滅アッセイで４時間後、Ｄ－ルシフェリン（Ｐｒｏｍｅｇａ，ｃａｔ ｎｏ Ｐ１０４１）を添加することによってルシフェラーゼの発現を検出した。対照として、標的細胞を、未処理のままか、又は細胞特異的培地中の２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００で処理した。シグナルを、Ａｍｉ ＨＴ（Ｓｐｅｃｔｒａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｍａｇｉｎｇ）を使用してｐ／ｓ／ｃｍ２／ｓｒで定量化した。
【0212】
次いで、ＮＫ細胞をＦＬｕｃ＋Ｂ２Ｍ－／－ＣＩＩＴＡ－／－ｉＥＣと共にインキュベートすると、その生物発光イメージング（ＢＬＩ）シグナルの低下によって示されるように、標的細胞の約８５％が４時間以内に急速に死滅した。ＦＬｕｃ＋Ｂ２Ｍ－／－ＣＩＩＴＡ－／－ＣＤ４７－ＣＤ６４ハイブリッドペプチドを発現するｉＥＣは、このような強力な死滅から保護され、ＢＬＩシグナルの有意に小さい低下が観察された。ＣＤ４７－ＣＤ６４ハイブリッドペプチドの発現により免疫防御がもたらされた（図４）。
【0213】
初代ヒトＮＫ細胞を、ＩＬ－２で７２時間刺激した。次いで、ＮＫ細胞を、ＦＬｕｃ＋Ｂ２Ｍ－／－ＣＩＩＴＡ－／－ｉＥＣと共にインキュベートすると、そのＢＬＩシグナルの低下によって示されるように、標的細胞の約８５％が４時間以内に急速に死滅した。しかしながら、合成抗ＳＩＲＰα－ＣＤ６４融合タンパク質（抗体融合体１又は融合体２）を発現するＦＬｕｃ＋Ｂ２Ｍ－／－ＣＩＩＴＡ－／－ｉＥＣの死滅は有意に減少した。抗ＳＩＲＰα－ＣＤ６４融合タンパク質は、ＮＫ細胞死滅に対する免疫防御をもたらした（図５及び図６）。
【0214】
実施例５：ＳＩＲＰａエンゲージャー機能を有する膜結合抗ＳＩＲＰα－Ｔｒａｓ－ＣＤ６４融合タンパク質を発現するＢ２Ｍ－／－ＣＩＩＴＡ－／－ｉＥＣの作製
抗ＳＩＲＰα－Ｔｒａｓ－ＣＤ６４融合タンパク質重鎖を有するレンチウイルスと抗ＳＩＲＰα－Ｔｒａｓ軽鎖を有するレンチウイルスの２つを、ＧｅｎＴａｒｇｅｔ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡに特別注文した。融合タンパク質の良好な発現効率を達成するために、重鎖と軽鎖は別々にパッケージ化した。プレコート１２ウェルプレートにおいて、１．５×１０５個のヒトＢ２Ｍ－／－ＣＩＩＴＡ－／－ｉＥＣを、細胞特異的培地にプレーティングし、３７℃、５％ＣＯ２で一晩インキュベートした。翌日、細胞を、それぞれ感染多重度４で、両方のレンチウイルス粒子と共にインキュベートした。翌日、ポリブレン（８μｇ／ｍｌ， Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を培地に添加し、プレートを８００ｇで３０分間遠心分離してから、一晩インキュベートした。細胞集団を、レンチウイルスベクターに含まれるＲＦＰタグを使用してＦＡＣＳＡｒｉａ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で選別した。
抗ＳＩＲＰα－Ｔｒａｓ－ＣＤ６４融合タンパク質重鎖を有するレンチウイルスと抗ＳＩＲＰα－Ｔｒａｓ軽鎖を有するレンチウイルスの２つを、ＧｅｎＴａｒｇｅｔ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡに特別注文した。融合タンパク質の良好な発現効率を達成するために、重鎖と軽鎖は別々にパッケージ化した。プレコート１２ウェルプレートにおいて、１．５×１０５個のヒトＢ２Ｍ－／－ＣＩＩＴＡ－／－ｉＥＣを、細胞特異的培地にプレーティングし、３７℃、５％ＣＯ２で一晩インキュベートした。翌日、細胞を、それぞれ感染多重度４で、両方のレンチウイルス粒子と共にインキュベートした。翌日、ポリブレン（８μｇ／ｍｌ， Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を培地に添加し、プレートを８００ｇで３０分間遠心分離してから、一晩インキュベートした。細胞集団を、レンチウイルスベクターに含まれるＲＦＰタグを使用してＦＡＣＳＡｒｉａ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で選別した。
【0215】
実施例４に概説したように、ＢＬＩ死滅アッセイを実施した。初代ヒトＮＫ細胞をＩＬ－２で７２時間刺激した。次いで、ＮＫ細胞をＦＬｕｃ＋Ｂ２Ｍ－／－ＣＩＩＴＡ－／－ｉＥＣとインキュベートすると、そのＢＬＩシグナルの低下によって示されるように、標的細胞の約８５％が４時間以内に急速に死滅した。抗ＳＩＲＰα－Ｔｒａｓ－ＣＤ６４融合タンパク質を発現するＦＬｕｃ＋Ｂ２Ｍ－／－ＣＩＩＴＡ－／－ｉＥＣの死滅は有意に減少した。これは、膜結合抗ＳＩＲＰα－Ｔｒａｓ－ＣＤ６４融合タンパク質が、エンジニアリングされた細胞をＮＫ細胞死滅から保護するのに有効であることを示した（図７）。
【0216】
実施例６：ＳＩＲＰαエンゲージャー機能を有する膜結合抗ＳＩＲＰα－ｓｃＦｖ－ＣＤ８ａ－ＰＤＧＦ融合タンパク質を発現するＢ２Ｍ－／－ＣＩＩＴＡ－／－ｉＥＣの作製
より小さいｓｃＦｖベースの融合タンパク質（より小さいＳＩＲＰαエンゲージャー分子）を、ＩＬ－２シグナルペプチドを使用して設計した。重鎖ＣＤＲを、ＣＤ８ａヒンジペプチド及びＰＤＧＦ ＴＭＤに融合した（ＧＧＧＧＳ）３リンカーを介して軽鎖ＣＤＲに連結した。導入遺伝子を、ＧｅｎＴａｒｇｅｔ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡによってレンチウイルスにパッケージ化した。実施例３に概説したように形質導入を実施した。
より小さいｓｃＦｖベースの融合タンパク質（より小さいＳＩＲＰαエンゲージャー分子）を、ＩＬ－２シグナルペプチドを使用して設計した。重鎖ＣＤＲを、ＣＤ８ａヒンジペプチド及びＰＤＧＦ ＴＭＤに融合した（ＧＧＧＧＳ）３リンカーを介して軽鎖ＣＤＲに連結した。導入遺伝子を、ＧｅｎＴａｒｇｅｔ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡによってレンチウイルスにパッケージ化した。実施例３に概説したように形質導入を実施した。
【0217】
ＢＬＩ死滅アッセイを、実施例４に記載したように実施した。初代ヒトＮＫ細胞を、ＩＬ－２で７２時間刺激した。次いで、ＮＫ細胞をＦＬｕｃ＋Ｂ２Ｍ－／－ＣＩＩＴＡ－／－ｉＥＣと共にインキュベートすると、標的細胞の約８５％が４時間以内に急速に死滅した。抗ＳＩＲＰα－ｓｃＦｖ－ＣＤ８ａ－ＰＤＧＦ融合タンパク質を発現するＦＬｕｃ＋Ｂ２Ｍ－／－ＣＩＩＴＡ－／－ｉＥＣの死滅は有意に減少し、膜結合抗ＳＩＲＰα－ｓｃＦｖ－ＣＤ８ａ－ＰＤＧＦ融合タンパク質が、エンジニアリングされた細胞をＮＫ細胞死滅から保護するのに有効であることが示された。（図８）。
【0218】
例示的な配列：
配列番号１－ヒトＳＩＲＰα
＞ＮＰ＿００１３１７６５７．１ チロシン－プロテインホスファターゼ非受容体型基質１アイソフォーム２前駆体［ヒト］
配列番号２－ヒトＣＤ４７
＞ＮＰ＿００１７６８．１ 白血球表面抗原ＣＤ４７アイソフォーム１前駆体［ヒト］
配列番号３：ＣＤ４７細胞外ドメイン（ＥＣＤ）
ＱＬＬＦＮＫＴＫＳＶＥＦＴＦＣＮＤＴＶＶＩＰＣＦＶＴＮＭＥＡＱＮＴＴＥＶＹＶＫＷＫＦＫＧＲＤＩＹＴＦＤＧＡＬＮＫＳＴＶＰＴＤＦＳＳＡＫＩＥＶＳＱＬＬＫＧＤＡＳＬＫＭＤＫＳＤＡＶＳＨＴＧＮＹＴＣＥＶＴＥＬＴＲＥＧＥＴＩＩＥＬＫＹＲＶＶＳＷＦＳＰＮＥ
配列番号４：ＣＤ４７免疫グロブリンスーパーファミリードメイン
ＱＬＬＦＮＫＴＫＳＶＥＦＴＦＣＮＤＴＶＶＩＰＣＦＶＴＮＭＥＡＱＮＴＴＥＶＹＶＫＷＫＦＫＧＲＤＩＹＴＦＤＧＡＬＮＫＳＴＶＰＴＤＦＳＳＡＫＩＥＶＳＱＬＬＫＧＤＡＳＬＫＭＤＫＳＤＡＶＳＨＴＧＮＹＴＣＥＶＴＥＬＴＲＥＧＥＴＩＩＥＬＫＹＲＶＶ
配列番号５：抗ＳＩＲＰα ＣＤＲ（配列番号６～８を含む）
ＱＶＱＬＶＥＳＥＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＥＭＮＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＹＩＳＳＳＧＳＴＩＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＥＡＫＧＹＹＹＧＭＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ
配列番号６：抗ＳＩＲＰα ＣＤＲ
ＦＴＦＳＳＹＥＭＮ
配列番号７：抗ＳＩＲＰα ＣＤＲ
ＷＶＳＹＩＳＳＳＧＳＴＩＹＹ
配列番号８：抗ＳＩＲＰα ＣＤＲ
ＲＥＡＫＧＹＹＹＧＭＤＶ
配列番号９：抗ＳＩＲＰα ＣＤＲ（配列番号１０～１２を含む）
ＱＰＶＬＴＱＳＰＳＶＳＶＳＰＧＱＴＡＳＩＴＣＳＧＤＫＬＧＤＴＹＡＣＷＹＱＱＫＰＧＱＳＰＶＬＶＩＹＱＤＴＫＲＰＳＧＩＰＥＲＦＳＧＳＮＳＧＮＴＡＴＬＴＩＳＧＴＱＡＭＤＥＡＤＹＹＣＱＡＷＤＳＳＴＶＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬ
配列番号１０：抗ＳＩＲＰα ＣＤＲ
ＫＬＧＤＴＹＡＣ
配列番号１１：抗ＳＩＲＰα ＣＤＲ
ＬＶＩＹＱＤＴＫＲＰＳ
配列番号１２：抗ＳＩＲＰα ＣＤＲ
ＱＡＷＤＳＳＴＶ
配列番号１３：ＣＤ４７膜貫通ドメイン（ＴＭＤ）
配列番号１４：ＣＤ６４膜貫通ドメイン（ＴＭＤ）
ＶＬＦＹＬＡＶＧＩＭＦＬＶＮＴＶＬＷＶＴＩ
配列番号１５：ＣＤ４７細胞内ドメイン（ＩＣＤ）
ＫＦＶＡＳＮＱＫＴＩＱＰＰＲＫＡＶＥＥＰＬＮＡＦＫＥＳＫＧＭＭＮＤＥ
配列番号１６：ＣＤ６４ ＴＭＤと融合したＣＤ４７ ＥＣＤ
配列番号１７：ＣＤ６４ ＴＭＤと融合した３つの抗ＳＩＲＰα ＣＤＲ（抗体融合体１）
配列番号１８：ＣＤ６４ ＴＭＤと融合した３つの抗ＳＩＲＰα ＣＤＲ（抗体融合体２）
ＱＰＶＬＴＱＳＰＳＶＳＶＳＰＧＱＴＡＳＩＴＣＳＧＤＫＬＧＤＴＹＡＣＷＹＱＱＫＰＧＱＳＰＶＬＶＩＹＱＤＴＫＲＰＳＧＩＰＥＲＦＳＧＳＮＳＧＮＴＡＴＬＴＩＳＧＴＱＡＭＤＥＡＤＹＹＣＱＡＷＤＳＳＴＶＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬＶＬＦＹＬＡＶＧＩＭＦＬＶＮＴＶＬＷＶＴＩ
配列番号１９：ＣＤ８ａシグナルペプチド
ＭＡＬＰＶＴＡＬＬＬＰＬＡＬＬＬＨＡＡＲＰ
配列番号２０：トラスツズマブ重鎖
配列番号２１：Ｌ１シグナルペプチド
ＭＤＭＲＶＰＡＱＬＬＧＬＬＬＬＷＬＳＧＡＲＣ
配列番号２２：トラスツズマブ軽鎖
ＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
配列番号２３：抗ＳＩＲＰα－Ｔｒａｓ－ＣＤ６４融合タンパク質重鎖
配列番号２４：抗ＳＩＲＰα－Ｔｒａｓ軽鎖
配列番号２５：ＩＬ－２シグナルペプチド
ＭＹＲＭＱＬＬＳＣＩＡＬＳＬＡＬＶＴＮＳ
配列番号２６：ＣＤ８ａヒンジ
ＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴＬＹＣ
配列番号２７：ＰＤＧＦ膜貫通ドメイン（ＴＭＤ）
ＡＡＶＬＶＬＬＶＩＶＩＩＳＬＩＶＬＶＶＩＷ
配列番号２８：抗ＳＩＲＰα－ｓｃＦｖ－ＣＤ８ａ－ＰＤＧＦ融合タンパク質
配列番号１－ヒトＳＩＲＰα
＞ＮＰ＿００１３１７６５７．１ チロシン－プロテインホスファターゼ非受容体型基質１アイソフォーム２前駆体［ヒト］
【化1】
＞ＮＰ＿００１７６８．１ 白血球表面抗原ＣＤ４７アイソフォーム１前駆体［ヒト］
【化2】
ＱＬＬＦＮＫＴＫＳＶＥＦＴＦＣＮＤＴＶＶＩＰＣＦＶＴＮＭＥＡＱＮＴＴＥＶＹＶＫＷＫＦＫＧＲＤＩＹＴＦＤＧＡＬＮＫＳＴＶＰＴＤＦＳＳＡＫＩＥＶＳＱＬＬＫＧＤＡＳＬＫＭＤＫＳＤＡＶＳＨＴＧＮＹＴＣＥＶＴＥＬＴＲＥＧＥＴＩＩＥＬＫＹＲＶＶＳＷＦＳＰＮＥ
配列番号４：ＣＤ４７免疫グロブリンスーパーファミリードメイン
ＱＬＬＦＮＫＴＫＳＶＥＦＴＦＣＮＤＴＶＶＩＰＣＦＶＴＮＭＥＡＱＮＴＴＥＶＹＶＫＷＫＦＫＧＲＤＩＹＴＦＤＧＡＬＮＫＳＴＶＰＴＤＦＳＳＡＫＩＥＶＳＱＬＬＫＧＤＡＳＬＫＭＤＫＳＤＡＶＳＨＴＧＮＹＴＣＥＶＴＥＬＴＲＥＧＥＴＩＩＥＬＫＹＲＶＶ
配列番号５：抗ＳＩＲＰα ＣＤＲ（配列番号６～８を含む）
ＱＶＱＬＶＥＳＥＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＥＭＮＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＹＩＳＳＳＧＳＴＩＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＥＡＫＧＹＹＹＧＭＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ
配列番号６：抗ＳＩＲＰα ＣＤＲ
ＦＴＦＳＳＹＥＭＮ
配列番号７：抗ＳＩＲＰα ＣＤＲ
ＷＶＳＹＩＳＳＳＧＳＴＩＹＹ
配列番号８：抗ＳＩＲＰα ＣＤＲ
ＲＥＡＫＧＹＹＹＧＭＤＶ
配列番号９：抗ＳＩＲＰα ＣＤＲ（配列番号１０～１２を含む）
ＱＰＶＬＴＱＳＰＳＶＳＶＳＰＧＱＴＡＳＩＴＣＳＧＤＫＬＧＤＴＹＡＣＷＹＱＱＫＰＧＱＳＰＶＬＶＩＹＱＤＴＫＲＰＳＧＩＰＥＲＦＳＧＳＮＳＧＮＴＡＴＬＴＩＳＧＴＱＡＭＤＥＡＤＹＹＣＱＡＷＤＳＳＴＶＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬ
配列番号１０：抗ＳＩＲＰα ＣＤＲ
ＫＬＧＤＴＹＡＣ
配列番号１１：抗ＳＩＲＰα ＣＤＲ
ＬＶＩＹＱＤＴＫＲＰＳ
配列番号１２：抗ＳＩＲＰα ＣＤＲ
ＱＡＷＤＳＳＴＶ
配列番号１３：ＣＤ４７膜貫通ドメイン（ＴＭＤ）
【化3】
ＶＬＦＹＬＡＶＧＩＭＦＬＶＮＴＶＬＷＶＴＩ
配列番号１５：ＣＤ４７細胞内ドメイン（ＩＣＤ）
ＫＦＶＡＳＮＱＫＴＩＱＰＰＲＫＡＶＥＥＰＬＮＡＦＫＥＳＫＧＭＭＮＤＥ
配列番号１６：ＣＤ６４ ＴＭＤと融合したＣＤ４７ ＥＣＤ
【化4】
【化5】
ＱＰＶＬＴＱＳＰＳＶＳＶＳＰＧＱＴＡＳＩＴＣＳＧＤＫＬＧＤＴＹＡＣＷＹＱＱＫＰＧＱＳＰＶＬＶＩＹＱＤＴＫＲＰＳＧＩＰＥＲＦＳＧＳＮＳＧＮＴＡＴＬＴＩＳＧＴＱＡＭＤＥＡＤＹＹＣＱＡＷＤＳＳＴＶＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬＶＬＦＹＬＡＶＧＩＭＦＬＶＮＴＶＬＷＶＴＩ
配列番号１９：ＣＤ８ａシグナルペプチド
ＭＡＬＰＶＴＡＬＬＬＰＬＡＬＬＬＨＡＡＲＰ
配列番号２０：トラスツズマブ重鎖
【化6】
ＭＤＭＲＶＰＡＱＬＬＧＬＬＬＬＷＬＳＧＡＲＣ
配列番号２２：トラスツズマブ軽鎖
ＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
配列番号２３：抗ＳＩＲＰα－Ｔｒａｓ－ＣＤ６４融合タンパク質重鎖
【化7】
【化8】
ＭＹＲＭＱＬＬＳＣＩＡＬＳＬＡＬＶＴＮＳ
配列番号２６：ＣＤ８ａヒンジ
ＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴＬＹＣ
配列番号２７：ＰＤＧＦ膜貫通ドメイン（ＴＭＤ）
ＡＡＶＬＶＬＬＶＩＶＩＩＳＬＩＶＬＶＶＩＷ
配列番号２８：抗ＳＩＲＰα－ｓｃＦｖ－ＣＤ８ａ－ＰＤＧＦ融合タンパク質
【化9】
【0219】
本明細書で開示又は参照されたすべての刊行物及び特許文献は、参照によりその全体が組み込まれる。前述の説明は、例示及び説明の目的でのみ提示されている。この説明は、開示された正確な形に本発明を限定することを意図するものではない。本発明の範囲は、本明細書に添付される特許請求の範囲によって規定されることが意図されている。
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【配列表】
【国際調査報告】