(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-12-18
(54)【発明の名称】新規ポリマー及びその使用
(51)【国際特許分類】
C08G 63/685 20060101AFI20231211BHJP
A61K 47/34 20170101ALI20231211BHJP
A61P 27/02 20060101ALI20231211BHJP
A61K 9/06 20060101ALI20231211BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20231211BHJP
【ＦＩ】
C08G63/685
A61K47/34
A61P27/02
A61K9/06
A61K39/395 M
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023535322
(86)(22)【出願日】2021-12-09
(85)【翻訳文提出日】2023-08-03
(86)【国際出願番号】 EP2021085026
(87)【国際公開番号】W WO2022122937
(87)【国際公開日】2022-06-16
(31)【優先権主張番号】20306555.2
(32)【優先日】2020-12-11
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(31)【優先権主張番号】21199651.7
(32)【優先日】2021-09-29
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＥＦＬＯＮ
(71)【出願人】
【識別番号】591003013
【氏名又は名称】エフ． ホフマン－ラ ロシュ アーゲー
【氏名又は名称原語表記】Ｆ． ＨＯＦＦＭＡＮＮ－ＬＡ ＲＯＣＨＥ ＡＫＴＩＥＮＧＥＳＥＬＬＳＣＨＡＦＴ
(74)【代理人】
【識別番号】100102978
【弁理士】
【氏名又は名称】清水 初志
(74)【代理人】
【識別番号】100205707
【弁理士】
【氏名又は名称】小寺 秀紀
(74)【代理人】
【識別番号】100160923
【弁理士】
【氏名又は名称】山口 裕孝
(74)【代理人】
【識別番号】100119507
【弁理士】
【氏名又は名称】刑部 俊
(74)【代理人】
【識別番号】100142929
【弁理士】
【氏名又は名称】井上 隆一
(74)【代理人】
【識別番号】100148699
【弁理士】
【氏名又は名称】佐藤 利光
(74)【代理人】
【識別番号】100188433
【弁理士】
【氏名又は名称】梅村 幸輔
(74)【代理人】
【識別番号】100128048
【弁理士】
【氏名又は名称】新見 浩一
(74)【代理人】
【識別番号】100129506
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 智彦
(74)【代理人】
【識別番号】100114340
【弁理士】
【氏名又は名称】大関 雅人
(74)【代理人】
【識別番号】100214396
【弁理士】
【氏名又は名称】塩田 真紀
(74)【代理人】
【識別番号】100121072
【弁理士】
【氏名又は名称】川本 和弥
(74)【代理人】
【識別番号】100221741
【弁理士】
【氏名又は名称】酒井 直子
(74)【代理人】
【識別番号】100114926
【弁理士】
【氏名又は名称】枝松 義恵
(72)【発明者】
【氏名】バフオン フロリアン
(72)【発明者】
【氏名】クダーヌ ジャン
(72)【発明者】
【氏名】ダルコス ビンセント
(72)【発明者】
【氏名】ノッテレ ベンジャミン
(72)【発明者】
【氏名】パテル スラーブ プラヴァンチャンドラ
(72)【発明者】
【氏名】シュバッハ グレゴワール
【テーマコード（参考）】
4C076
4C085
4J029
【Ｆターム（参考）】
4C076AA94
4C076BB11
4C076BB24
4C076CC10
4C076EE24A
4C076EE25A
4C076EE49A
4C076EE50
4C076FF32
4C085AA14
4J029AB01
4J029AC03
4J029AC05
4J029AD01
4J029AE06
4J029AE18
4J029EG09
4J029KH01
(57)【要約】
眼の障害又は眼疾患の治療のための、ポリ（ε－カプロラクトン）（ＰＣＬ）とポリドーパミン（ＰＤＡ）との新規共重合体（任意選択的にＰＥＧ鎖をさらに含む）、それらを製造するための方法、並びに薬学的調製物、とりわけインプラント又はｉｎ ｓｉｔｕゲル化デポーにおけるそれらの使用が、本明細書に開示される。
【選択図】図６
【選択図】図６
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ポリ（ε－カプロラクトン）（ＰＣＬ）及びポリドーパミン（ＰＤＡ）からなる、共重合体。
【請求項2】
ポリ（ε－カプロラクトン）（ＰＣＬ）及びポリドーパミン（ＰＤＡ）からなる前記共重合体が、グラフト共重合体（ＰＣＬ－ｇ－ＰＤＡ）である、請求項１に記載の共重合体。
【請求項3】
前記ＰＣＬ－ｇ－ＰＤＡ共重合体が、１０００ｇ／モル～２０００００ｇ／モルの範囲の分子量のＰＣＬを含む、請求項１又は２に記載のＰＣＬ－ｇ－ＰＤＡ共重合体。
【請求項4】
前記ＰＣＬ－ｇ－ＰＤＡ共重合体が、１０００ｇ／モル～２０００００ｇ／モルの分子量を有するＰＣＬ骨格と、０．１～５０重量％の質量含有量を有するＰＤＡの分岐とを含む、請求項１～３のいずれか一項に記載のＰＣＬ－ｇ－ＰＤＡ共重合体。
【請求項5】
０．１～５０モル％の範囲のハロゲン化ＰＣＬ単位のモル百分率を有するＰＣＬが、ＰＤＡ前駆体と反応することを特徴とする、請求項１～４のいずれか一項に記載のＰＣＬ－ｇ－ＰＤＡ共重合体を製造するための方法。
【請求項6】
特に活性成分の徐放のための担体として、薬学的調製物に使用するための、請求項１～４のいずれか一項に記載のＰＣＬ－ｇ－ＰＤＡ共重合体。
【請求項7】
薬学的調製物が硝子体内インプラントである、請求項６に記載の使用のためのＰＣＬ－ｇ－ＰＤＡ共重合体。
【請求項8】
薬学的有効成分が小分子であり、薬学的調製物中又は硝子体内インプラント中に１０重量％以上の量で存在する、請求項６又は７に記載の使用のためのＰＣＬ－ｇ－ＰＤＡ共重合体。
【請求項9】
眼疾患又は眼の障害の治療に使用するための、請求項１～４のいずれか一項に記載のＰＣＬ－ｇ－ＰＤＡ共重合体。
【請求項10】
２つのＰＣＬ－ｇ－ＰＤＡ鎖がＰＥＧ鎖に結合して、（ＰＣＬ－ｇ－ＰＤＡ）－ｂ－ＰＥＧ－ｂ－（ＰＣＬ－ｇ－ＰＤＡ）型のポリマーを形成する、請求項１～４のいずれか一項に記載のＰＣＬ－ｇ－ＰＤＡ共重合体。
【請求項11】
ＰＥＧ鎖が最大２００００ｇ／モルの分子量を有し、２つのＰＣＬ－ｇ－ＰＤＡ鎖の両方が同じ分子量を有する、請求項１０に記載のポリマー。
【請求項12】
式（ＩＩ）のポリマー：ｐは３～３９７であり、
ｒは１～１７０であり、
ｍは１～１７０である］。
【請求項13】
薬学的調製物における使用のための、請求項１０～１２のいずれか一項に記載のポリマー。
【請求項14】
前記薬学的調製物が、眼内注射時に、薬学的有効成分を徐放するためのｉｎ ｓｉｔｕゲル化デポーを形成する、請求項１３に記載の使用のためのポリマー。
【請求項15】
前記薬学的有効成分が抗体である、請求項１４に記載の使用のためのポリマー。
【請求項16】
本明細書に実質的に記載されている、新規ポリマー、方法、及び使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、概して、薬学的に許容される担体として使用するため、特に眼に適用するためのポリマーの分野に関する。
【背景技術】
【0002】
世界中で約３，９００万人が盲目であり、２億４，６００万人に視覚障害があると推定されている。そのほとんどが５０歳以上の人々である。部分的視力喪失及び完全な視力喪失の主な原因は、それぞれ未矯正の屈折異常と白内障にある１。主な視覚の後眼部障害は、加齢黄斑変性症、糖尿病性網膜症、及びブドウ膜炎である。コルチコイドなどの薬物はこれらの障害を治療する。一部の薬物は、長期間にわたって送達されるように、埋め込み可能なポリマーデバイスにロードされている２。生分解性ポリマー系では、薬物の放出は、拡散とポリマーの分解によって統制される。例えば、Ｏｚｕｒｄｅｘ（登録商標）は、糖尿病性黄斑浮腫非感染性ブドウ膜炎の治療のためにＦＤＡによって承認された最初の生分解性の硝子体内インプラントである。デキサメタゾンは、Ｎｏｖａｄｕｒ（登録商標）の技術に基づいてポリ（乳酸－ｃｏ－グリコール酸）（ＰＬＧＡ）マトリクスにロードされている。該薬物は最初の２か月間にわたり急速に放出され、その後、４か月間にわたってゆっくりと放出される。しかしながら、ＰＬＧＡの分解は、眼組織の炎症の２つの考えられる要因である、インプラントの断片化と、酸部分の放出とを生じさせる。例えば、ＤＭＥ中のフルオシノロンアセトニドの３６か月間の薬物放出のためのＩｌｕｖｉｅｎ（登録商標）硝子体内マイクロインプラントなど、幾つかの非生分解性のポリマーが当技術分野で知られている。したがって、安定性、忍容性、及び放出プロファイルが改善された新規ポリマーを開発することが依然として必要とされている。
【発明の概要】
【0003】
一実施形態では、本発明は、ポリ（ε－カプロラクトン）（ＰＣＬ）とポリドーパミン（ＰＤＡ）とからなる新規共重合体を提供する。
【0004】
一実施形態では、ポリ（ε－カプロラクトン）（ＰＣＬ）とポリドーパミン（ＰＤＡ）とからなる新規共重合体は、グラフト共重合体（ＰＣＬ－ｇ－ＰＤＡ）である。
【0005】
一実施形態では、本発明は、本明細書に開示されるグラフト共重合体を製造するための方法を提供する。
【0006】
別の実施形態では、本発明は、薬学的調製物における、特に活性成分の徐放のための担体として使用するための、新規ＰＣＬ－ｇ－ＰＤＡ共重合体を提供する。
【0007】
一実施形態では、活性成分は小分子である。
【0008】
別の実施形態では、本発明は、眼疾患又は眼の障害の治療に使用するための、新規ＰＣＬ－ｇ－ＰＤＡ共重合体を提供する。
【0009】
別の実施形態では、本発明は、硝子体内インプラントとして使用するための、新規ＰＣＬ－ｇ－ＰＤＡ共重合体を提供する。
【0010】
別の実施形態では、本発明は、２つのＰＣＬ－ｇ－ＰＤＡ鎖がＰＥＧ鎖に結合して、（ＰＣＬ－ｇ－ＰＤＡ）－ｂ－ＰＥＧ－ｂ－（ＰＣＬ－ｇ－ＰＤＡ）型のポリマーを形成する、新規ＰＣＬ－ｇ－ＰＤＡを提供する。
【0011】
別の実施形態では、本発明は、ＰＥＧ鎖が本明細書に定義される分子量を有し、ＰＣＬ－ｇ－ＰＤＡ鎖の両方が同じ分子量を有する、（ＰＣＬ－ｇ－ＰＤＡ）－ｂ－ＰＥＧ－ｂ－（ＰＣＬ－ｇ－ＰＤＡ）型のポリマーを提供する。
【0012】
別の実施形態では、本発明は、薬学的調製物において使用するための、好ましくは眼内注射時に薬学的有効成分を徐放するためにｉｎ ｓｉｔｕゲル化デポーを形成する薬学的調製物において使用するための、（ＰＣＬ－ｇ－ＰＤＡ）－ｂ－ＰＥＧ－ｂ－（ＰＣＬ－ｇ－ＰＤＡ）型のポリマーを提供し、ここで前記薬学的有効成分は抗体である。
【図面の簡単な説明】
【0013】
【図1】ヨウ素化ＰＣＬ（ＰＣＬ－Ｉ）のＣＤＣＬ３中での１Ｈ ＮＭＲスペクトル。
【図2】λ２９０ｎｍにおけるＲＩ検出及びＵＶ検出を使用した、ヨウ素化ＰＣＬのＴＨＦ中でのサイズ排除クロマトグラフィー。
【図3】ＰＣＬ－ｇ－ＰＤＡのＤＭＳＯ－ｄ６中での１Ｈ ＮＭＲ。
【図4】精製後のＰＣＬ－ｇ－ＰＤＡのＤＭＳＯ－ｄ６中でのＤＯＳＹ ＮＭＲ。
【図5】初期の市販のＰＣＬ、ＰＣＬ－ｇ－ＰＤＡ共重合体、及びオリゴＰＤＡのλ＝３５０ｎｍにおけるＵＶ検出を使用した、ＤＭＳＯ中でのサイズ排除クロマトグラフィー。
【図6】窒素雰囲気下、２０℃／分で３０℃から７００℃までのＰＣＬ－ｇ－ＰＤＡの熱重量分析（ＴＧＡ）。
【図7】ＰＣＬ－ｇ－ＰＤＡの示差走査熱量測定（ＤＳＣ）サーモグラム：１０℃／分で－８０℃から１５０℃までの第１の加熱ランプ、１０℃／分で１５０℃から－８０℃までの冷却ランプ。
【図8】膜キャスティングによって調製し、１３０℃、４トンで１５分間加圧した、３０重量％のＤＥＸを含むＰＣＬ－ｇ－ＰＤＡ（１つのステープルは１．２ｃｍに等しく、膜の厚さは約５００μｍである）。
【図9A】インプラント組成の関数としてのＰＣＬ及びＰＣＬ－ｇ－ＰＤＡインプラントからのデキサメタゾン（ＤＥＸ３０）の累積放出。データは、ＨＰＣＬによる測定から得られた結果の平均として表される（平均±ＳＤ；ｎ＝３）。ＰＤＡ含有量は、ＴＧＡによって、５重量％と推定される。
【図9B】インプラント組成の関数としてのＰＣＬ及びＰＣＬ－ｇ－ＰＤＡインプラントからのシプロフロキサシン塩酸塩（ＣＩＰ３０）の累積放出。データは、ＨＰＣＬによる測定から得られた結果の平均として表される（平均±ＳＤ；ｎ＝３）。ＰＤＡ含有量は、ＴＧＡによって、５重量％と推定される。
【図10】ＰＣＬ－ｇ－ＰＤＡ膜とともに２４時間インキュベートした後のＬ９２９細胞の生存率。パーセンテージはＰｒｅｓｔｏＢｌｕｅ試験後の蛍光強度から得た。
【図11】ＰＣＬ又はＰＣＬ－ｇ－ＰＤＡ膜とともに４８時間インキュベートした後のヒト網膜上皮細胞株ＡＲＰＥ－１９（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ－２３０２）の生存率。
【図12】標準条件（ＰＢＳ、３７℃、ｐＨ＝７．４）での分解研究中のＰＣＬ－ｇ－ＰＤＡの残留質量。
【図13】標準条件（ＰＢＳ、３７℃、ｐＨ＝７．４）での分解研究中のＰＣＬ－ｇ－ＰＤＡの残留分子量。
【図14】標準条件（ＰＢＳ、３７℃、ｐＨ＝７．４）で１１０日間浸漬した後のＰＣＬ－ｇ－ＰＤＡインプラントの写真。
【図15】標準条件（ＰＢＳ、３７℃、ｐＨ＝７．４）での分解研究中のＰＣＬ－ｇ－ＰＤＡの膨潤度。
【図16】標準条件（ＰＢＳ、３７℃、ｐＨ＝７．４）でのＰＣＬ－ｇ－ＰＤＡインプラントの分解研究中の分解媒体のｐＨ。
【図17】加速条件（ＨＣｌ（２Ｍ）、３７℃、ｐＨ＝１）での分解研究中のＰＣＬ－ｇ－ＰＤＡの残留質量。
【図18】加速条件（ＨＣｌ（２Ｍ）、３７℃、ｐＨ＝１）での分解研究中のＰＣＬ－ｇ－ＰＤＡの残留分子量。
【図19】加速条件（ＨＣｌ（２Ｍ）、３７℃、ｐＨ＝１）に６０日間浸漬した後のＰＣＬ－ｇ－ＰＤＡインプラントの写真。
【図20】Ｔ－ＰＤＡのＤＭＳＯ－ｄ６中での１Ｈ ＮＭＲ。
【図21】Ｔ－ＰＤＡのＤＭＳＯ－ｄ６中でのＤＯＳＹ ＮＭＲ。
【図22A】ＨＢＳ：ＰＥＧ４００＝１：１のＴ－ＨＤで構成される製剤中のｍＡｂの安定性研究中の２８０ｎｍでのサイズ排除クロマトグラフィー。
【図22B】ＨＢＳ：ＰＥＧ４００＝１：１のＴ／Ｔ－ＰＤＡ－ＨＤ（２：１）で構成される製剤中のｍＡｂの安定性研究中の２８０ｎｍでのサイズ排除クロマトグラフィー。
【図22C】ＨＢＳ：ＰＥＧ４００＝１：１のＴ－ＰＤＡ－ＨＤで構成される製剤中のｍＡｂの安定性研究中の２８０ｎｍでのサイズ排除クロマトグラフィー。
【図23A】製剤Ｔ－ＨＤについてのｉｎ－ｓｉｔｕデポーの３０日間における、外観の形成及び発展。
【図23B】製剤Ｔ／Ｔ－ＰＤＡ－ＨＤ（２：１）についてのｉｎ－ｓｉｔｕデポーの３０日間における、外観の形成及び発展。
【図23C】製剤Ｔ－ＰＤＡ－ＨＤについてのｉｎ－ｓｉｔｕデポーの３０日間における、外観の形成及び発展。
【発明を実施するための形態】
【0014】
発明の詳細な説明
ほとんどの眼疾患は、目が適切に機能する能力を妨げるか、及び／又は視覚の明瞭さに悪影響を及ぼす状態又は障害であり、重大な公衆衛生上の問題である。硝子体内（ＩＶＴ）投与（医療デバイスの埋め込み、又は懸濁液、溶液、若しくはインプラントの注入を含む）は、日常的な方法であり、網膜にＡＰＩを送達するのに最も効率的な方法である。ＩＶＴ投与の主な課題は、患者の治療に対するコンプライアンス及びアドヒアランスを改善するための注射頻度の減少、製剤の眼への忍容性、及び生物学的製剤の安定性である。現時点では、すべての仕様を満たすことは依然として困難であり、ポリマー技術に基づいた製剤は限界があり、最近のものであるが、これらの問題を解決できる可能性がある。科学者らは、患者の健康を増進し、眼疾患を効率的に治療するための治療レベルに到達するために、最小限の外科手術でＡＰＩの長期間の持続的送達をもたらす、生体適合性の、（生）分解性である又は（生）分解性ではない、製剤の開発に注力している。
ほとんどの眼疾患は、目が適切に機能する能力を妨げるか、及び／又は視覚の明瞭さに悪影響を及ぼす状態又は障害であり、重大な公衆衛生上の問題である。硝子体内（ＩＶＴ）投与（医療デバイスの埋め込み、又は懸濁液、溶液、若しくはインプラントの注入を含む）は、日常的な方法であり、網膜にＡＰＩを送達するのに最も効率的な方法である。ＩＶＴ投与の主な課題は、患者の治療に対するコンプライアンス及びアドヒアランスを改善するための注射頻度の減少、製剤の眼への忍容性、及び生物学的製剤の安定性である。現時点では、すべての仕様を満たすことは依然として困難であり、ポリマー技術に基づいた製剤は限界があり、最近のものであるが、これらの問題を解決できる可能性がある。科学者らは、患者の健康を増進し、眼疾患を効率的に治療するための治療レベルに到達するために、最小限の外科手術でＡＰＩの長期間の持続的送達をもたらす、生体適合性の、（生）分解性である又は（生）分解性ではない、製剤の開発に注力している。
【0015】
本発明の目的は、優先的な薬物－ＰＤＡ相互作用により忍容性が改善され、（小分子又は大分子の）優れた徐放特性を備えた、眼科用の新規共重合体の設計におけるＰＤＡユニットの組み込みの利点を評価することである。医療提供用途及び／又は薬物送達用途に用いられるポリマーの中でも、分解性の合成ベースの製剤は、興味深い、有望な特性を示す。特に、ＰＣＬは、生分解性であり、ゆっくりと分解し、機能化することができ、医療目的（だが、まだ眼科用ではない）でＦＤＡによって承認されている。また、ＰＥＧは、（その分子量に応じて）生体除去可能であり、眼科用途としてＦＤＡによって承認されており、ＰＣＬと組み合わせて調整可能なゲル化特性を提供する。
【0016】
本発明者らは、２つの戦略、１つは小分子の送達のための固体製剤（第Ｉ章）、もう１つは生物製剤の送達のためのｉｎ ｓｉｔｕゲル化システム（第ＩＩ章）を開発した。
【0017】
第Ｉ章：ＰＣＬ－ｇ－ＰＤＡ固体インプラント
固体インプラントの手法は、疎水性のグラフト化された共重合体であるＰＣＬ－ｇ－ＰＤＡを提供する。共重合体は２段階のプロセスで合成した。最初に、ＰＣＬ（Ｍｎ＝１９００００ｇ／モル）を、求電子置換を介してヨウ素で後官能化して、ヨウ素化ＰＣＬ（ＰＣＬ－Ｉ）を得た。次に、ＰＣＬ－Ｉを、ＡＴＲＰ様の酸化条件下及び塩基性条件下でＰＤＡにより官能化して、約３～５重量％のグラフト化されたＰＤＡを含有する、ＰＣＬ－ｇ－ＰＤＡ共重合体を得た。ｉｎ ｖｉｔｒｏでの細胞障害性アッセイは、インプラントＰＣＬ－ｇ－ＰＤＡがマウス線維芽細胞及び網膜細胞に対して非細胞毒性であることを示した。さらに、インプラントは生理的条件下では１１０日を超えても分解されなかったが、加速条件下では分解され、ＰＣＬ－ｇ－ＰＤＡインプラントがゆっくり分解する能力があることを証明した。Ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、ＰＣＬ－ｇ－ＰＤＡインプラントは、１５５日間、非水溶性デキサメタゾン（ＤＬ＝３０％ｗ／ｗ）の持続的な一定かつ完全な放出（ゼロ次速度論）を示した。対照的に、ＰＣＬ－ｇ－ＰＤＡインプラントはバースト効果を示し、続いて、水溶性シプロフロキサシン塩酸塩（ＤＬ＝３０％ｗ／ｗ）の１２５日間の徐放を示し、５００日後には完全に放出されると推定される。すべての場合において、ＰＣＬ－ｇ－ＰＤＡインプラントの放出の速度論はＰＣＬインプラントと比較して遅く、したがって、グラフト化されたＰＤＡの量が少ない場合でも、ＰＤＡがインプラント内に薬物を保持する能力があることを示した。さらには、ＰＣＬ及びＰＣＬ－ｇ－ＰＤＡインプラントは、市販のＰＬＧＡベースのインプラント（Ｏｚｕｒｄｅｘ（商標））と比較して、デキサメタゾンの放出時間が長いことが示された。
固体インプラントの手法は、疎水性のグラフト化された共重合体であるＰＣＬ－ｇ－ＰＤＡを提供する。共重合体は２段階のプロセスで合成した。最初に、ＰＣＬ（Ｍｎ＝１９００００ｇ／モル）を、求電子置換を介してヨウ素で後官能化して、ヨウ素化ＰＣＬ（ＰＣＬ－Ｉ）を得た。次に、ＰＣＬ－Ｉを、ＡＴＲＰ様の酸化条件下及び塩基性条件下でＰＤＡにより官能化して、約３～５重量％のグラフト化されたＰＤＡを含有する、ＰＣＬ－ｇ－ＰＤＡ共重合体を得た。ｉｎ ｖｉｔｒｏでの細胞障害性アッセイは、インプラントＰＣＬ－ｇ－ＰＤＡがマウス線維芽細胞及び網膜細胞に対して非細胞毒性であることを示した。さらに、インプラントは生理的条件下では１１０日を超えても分解されなかったが、加速条件下では分解され、ＰＣＬ－ｇ－ＰＤＡインプラントがゆっくり分解する能力があることを証明した。Ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、ＰＣＬ－ｇ－ＰＤＡインプラントは、１５５日間、非水溶性デキサメタゾン（ＤＬ＝３０％ｗ／ｗ）の持続的な一定かつ完全な放出（ゼロ次速度論）を示した。対照的に、ＰＣＬ－ｇ－ＰＤＡインプラントはバースト効果を示し、続いて、水溶性シプロフロキサシン塩酸塩（ＤＬ＝３０％ｗ／ｗ）の１２５日間の徐放を示し、５００日後には完全に放出されると推定される。すべての場合において、ＰＣＬ－ｇ－ＰＤＡインプラントの放出の速度論はＰＣＬインプラントと比較して遅く、したがって、グラフト化されたＰＤＡの量が少ない場合でも、ＰＤＡがインプラント内に薬物を保持する能力があることを示した。さらには、ＰＣＬ及びＰＣＬ－ｇ－ＰＤＡインプラントは、市販のＰＬＧＡベースのインプラント（Ｏｚｕｒｄｅｘ（商標））と比較して、デキサメタゾンの放出時間が長いことが示された。
【0018】
したがって、本発明によれば、数ヶ月にわたる持続的な薬物送達を提供することができ、微小環境媒体の変化を避け、断片化を回避するように分解が遅い、新しい硝子体内インプラントが提供される。一実施形態では、前記持続的薬物送達は、少なくとも２か月間、又は少なくとも３か月間、又は少なくとも６か月間、又は少なくとも１２か月間、又は少なくとも１８か月間、又は少なくとも２４か月間、又は少なくとも３６か月間、提供される。インプラントは、ポリ（ε－カプロラクトン）（ＰＣＬ）とポリドーパミン３（ＰＤＡ）とでできている。ＰＣＬは、生体適合性のある、疎水性のＦＤＡに承認されたポリマーである。加水分解によってゆっくりと分解され、長期にわたる放出期間に及ぶ。メラニンは、網膜細胞に位置しており、生物学的機能に関与する４。ＰＤＡは、おそらくはメラニンと同じ特性、とりわけ薬物結合特性を示す、生体適合性のある５、合成のメラニン様ポリマーである。本発明者らは、両方のポリマーを組み合わせると、生体適合性又は忍容性が改善され、微小環境の変化が限定された状態で徐放がもたらされることを発見した。
【0019】
したがって、一実施形態では、本発明は、ポリ（ε－カプロラクトン）（ＰＣＬ）とポリドーパミン（ＰＤＡ）とからなる新規共重合体を提供する。別の実施形態では、ポリ（ε－カプロラクトン）（ＰＣＬ）とポリドーパミン（ＰＤＡ）とからなる新規共重合体は、グラフト共重合体（ＰＣＬ－ｇ－ＰＤＡ）である。
【0020】
本明細書で用いられるＰＣＬという用語は、ポリ（ε－カプロラクトン）を意味する。一実施形態では、ＰＣＬは、１０００ｇ／モル～２０００００ｇ／モルの範囲の分子量を有する。別の実施形態では、ＰＣＬは、１００００ｇ／モル～１０００００ｇ／モルの範囲の分子量を有する。
【0021】
本明細書で用いられるＰＤＡという用語はポリドーパミンを意味する。
【0022】
グラフト共重合体（又はグラフトポリマー）という用語は、１つの複合材料（例えば、ＰＣＬ）の直鎖状又は分岐した骨格と、別の複合材料（例えば、ＰＤＡ）のランダムに分布した分岐とを備えた、セグメント化された共重合体を意味する。一実施形態では、ＰＣＬ骨格は直鎖状である。
【0023】
一実施形態では、本発明によるＰＣＬ－ｇ－ＰＤＡ共重合体は、１０００ｇ／モル～２０００００ｇ／モル；又は、１００００ｇ／モル～１０００００ｇ／モルの範囲の分子量のＰＣＬを含む。
【0024】
ＰＤＡとの重合反応の前に、ＰＣＬは、例えば求電子置換によって化学修飾されて、ハロゲン化、例えば、ヨウ素化されたＰＣＬが得られる６。したがって、一実施形態では、本発明による共重合体は、１０００ｇ／モル～１０００００ｇ／モル；又は、２５００ｇ／モル～５００００ｇ／モルの範囲の分子量、及び０．１～５０モル％；又は、１～２０モル％の範囲のヨウ素化ε－カプロラクトン単位のモル百分率を有するハロゲン化ＰＣＬを使用して得られる。「ハロゲン化」という用語は、当業者に知られている通常の意味を有する。一態様では、ＰＣＬは、臭素化、塩素化、又はヨウ素化されている。
【0025】
別の実施形態では、本発明のＰＤＡ－ｇ－ＰＣＬは、０．１～５０重量％、又は１～２０重量％、又は１～１５重量％、又は１～１０重量％、又は約５重量％ＰＤＡの範囲のＰＤＡ質量含有量を有する。
【0026】
ｗｔ％（又は重量％）という用語は、ポリマー化学の当業者にとって通常の意味を有する。好ましくは、重量％は、グラフト共重合体の全質量に対する質量を意味する。特に明記しない限り、本発明のグラフト共重合体のＰＤＡ含有量の重量％は、例えば本明細書に記載されるように、精製後に計算され、ＴＧ分析によって測定される。
【0027】
別の実施形態では、本発明によるグラフト共重合体は、１０００ｇ／モル～２０００００ｇ／モルの分子量を有するＰＣＬ骨格と、０．１～５０重量％の質量含有量を有するＰＤＡのランダム分岐からなる。
【0028】
別の実施形態では、本発明によるグラフト共重合体は、１０００ｇ／モル～２０００００ｇ／モルの分子量を有するＰＣＬ骨格と、１～２０重量％の質量含有量を有するＰＤＡのランダム分岐からなる。
【0029】
別の実施形態では、本発明によるグラフト共重合体は、１０００ｇ／モル～２０００００ｇ／モルの分子量を有するＰＣＬ骨格と、１～１０重量％の質量含有量を有するＰＤＡのランダム分岐からなる。
【0030】
別の実施形態では、本発明によるグラフト共重合体は、１０００ｇ／モル～２０００００ｇ／モルの分子量を有するＰＣＬ骨格と、約５重量％の質量含有量を有するＰＤＡのランダム分岐からなる。
【0031】
別の実施形態では、本発明によるグラフト共重合体は、１００００ｇ／モル～１０００００ｇ／モルの分子量を有するＰＣＬ骨格と、０．１～５０重量％の質量含有量を有するＰＤＡのランダム分岐からなる。
【0032】
別の実施形態では、本発明によるグラフト共重合体は、１００００ｇ／モル～１０００００ｇ／モルの分子量を有するＰＣＬ骨格と、１～２０重量％の質量含有量を有するＰＤＡのランダム分岐からなる。
【0033】
別の実施形態では、本発明によるグラフト共重合体は、１００００ｇ／モル～１０００００ｇ／モルの分子量を有するＰＣＬ骨格と、１～１０重量％の質量含有量を有するＰＤＡのランダム分岐からなる。
【0034】
別の実施形態では、本発明によるグラフト共重合体は、１００００ｇ／モル～１０００００ｇ／モルの分子量を有するＰＣＬ骨格と、約５重量％の質量含有量を有するＰＤＡのランダム分岐からなる。
【0035】
別の実施形態では、本発明によるグラフト共重合体は、１５０００ｇ／モル～１５００００ｇ／モルの分子量を有するＰＣＬ骨格と、約３重量％、又は５重量％の質量含有量を有するＰＤＡのランダム分岐からなる。
【0036】
さらに別の実施形態では、本発明は、式（Ｉ）のポリマーを提供する：
ＨＯ－［－（ＣＨ２）４－ＣＨ（ＰＤＡ）－Ｃ（Ｏ）－Ｏ－］ｒ－［－（ＣＨ２）５－Ｃ（Ｏ）－Ｏ－］ｐ－Ｈ （Ｉ）
式中、ｐ＝２３～１５８０及びｒ＝１～３９５；並びに、ＰＤＡは、最大５重量％；又は約３～５重量％、又は約３重量％若しくは５重量％存在する。
ＨＯ－［－（ＣＨ２）４－ＣＨ（ＰＤＡ）－Ｃ（Ｏ）－Ｏ－］ｒ－［－（ＣＨ２）５－Ｃ（Ｏ）－Ｏ－］ｐ－Ｈ （Ｉ）
式中、ｐ＝２３～１５８０及びｒ＝１～３９５；並びに、ＰＤＡは、最大５重量％；又は約３～５重量％、又は約３重量％若しくは５重量％存在する。
【0037】
別の実施形態では、本発明は、本グラフト共重合体を製造するための方法を提供する。一実施形態では、ＰＣＬ骨格は、最初に化学修飾、例えばヨウ素化され、続いて適切なＰＤＡ前駆体と反応して、本発明による共重合体を与える。ポリマー化学の当業者に知られている任意の適切なＰＤＡ前駆体を使用することができる。一実施形態では、ＰＤＡ前駆体はドーパミン塩酸塩である。重合は、当業者に知られており、添付の実施例にさらに開示されている条件に従って行われる。一実施形態では、重合は酸化条件下及び塩基性条件下で行われ、ＰＤＡでグラフト化されたＰＣＬ（ＰＣＬ－ｇ－ＰＤＡ）を得て７、その後さらに精製される。
【0038】
したがって、本発明は、０．１～５０モル％；又は、１～２０モル％の範囲のヨウ素化ＰＣＬ単位のモル百分率を有するＰＣＬをＰＤＡ前駆体、例えばドーパミン塩酸塩と反応させることを特徴とする、本発明のＰＣＬ－ｇ－ＰＤＡ共重合体を製造するための方法を提供する。一態様では、この方法は、酸化条件下及び塩基性条件下、かつ臭化銅（Ｉ）の存在下、不活性雰囲気下、約７０℃で行われる。このようにして得られたグラフト共重合体は精製される。精製は、当業者に知られている方法に従って、及び／又は添付の実施例に記載されている方法に従って行うことができる。一実施形態では、精製は沈殿によって、好ましくはメタノールからの沈殿によって行われる。沈殿ステップは数回、好ましくは最大３回まで繰り返すことができる。さらに別の実施形態では、精製はメタノールからの沈殿によって行われ、続いて冷メタノールからＰＣＬ－ｇ－ＰＤＡを２回粉砕する。
【0039】
一実施形態では、本発明のＰＣＬ－ｇ－ＰＤＡ共重合体を製造するための方法は、添付の実施例に開示されるとおり、又はスキーム１及び２に開示されるとおりであり、そこに開示される特定の出発物質、中間体、及び反応条件を使用する。
【0040】
別の実施形態では、本発明は、本明細書に開示される方法、特にスキーム１及び２に開示される方法を使用することによって得られるＰＣＬ－ｇ－ＰＤＡ共重合体を開示する。
【0041】
ヨウ素化ＰＣＬは、当業者に知られている方法、例えば、６に記載されている方法を使用して得ることができる。一実施形態では、ヨウ素化ＰＣＬは、スキーム１及び添付の実施例に開示される方法に従って得られる。さらに別の実施形態では、本発明は、後修飾による前記ＰＣＬの官能化を提供する。本発明による好ましい実施形態では、高分子量、すなわち４５０００ｇ／モルを上回る分子量を有するＰＣＬがヨウ素化される。このような高分子量のＰＣＬの使用は、インプラントがより柔軟で脆くないという意味で、合成の実現可能性と得られるインプラントの良好な機械的特性とを組み合わせた分解性固体調剤の開発に有利である。
【0042】
本発明によるＰＣＬ－ｇ－ＰＤＡ共重合体は貴重な薬学的特性を有する。特に、それらは安定性であり、耐容性が高く、薬学的活性成分の徐放に適していることがわかっている。
【0043】
したがって、別の実施形態では、本発明は、薬学的調製物における、例えば薬学的有効成分の担体として使用するための本共重合体を提供する。一態様では、本発明によれば、前記薬学的調製物はインプラントである。別の態様では、前記インプラントは、例えば硝子体内インプラントとしての眼内での使用に適している。別の態様では、前記インプラントは、活性成分と一緒に、例えばＰＣＬ又はＰＬＡ又はＰＬＧＡなどの別のポリマーをさらに含むことができる。さらに別の態様では、硝子体内インプラントは、本共重合体と適切な活性成分とのみからなる。
【0044】
本明細書で用いられる薬学的有効成分という用語は、臨床的に意味のある薬理的活性を有する任意の分子を意味する。一実施形態では、薬学的有効成分は、リピンスキーのルール・オブ・ファイブによって定義される、小分子である。別の実施形態では、薬学的有効成分は、例えば、緑内障、白内障、加齢黄斑変性症、糖尿病性網膜症、及びブドウ膜炎などの眼疾患の治療に承認されている薬物である。別の実施形態では、薬学的有効成分は、ガンシクロビル、デキサメタゾン、フルオシノロンアセトニド、及びシクロスポリンＡからなる群より選択される。
【0045】
本発明によれば、薬学的有効成分は、インプラント中に１０重量％以上、又は１０～６０重量％、又は１０～３０重量％の量で存在する。
【0046】
別の実施形態では、本発明は、例えば、眼疾患の治療のためのインプラントなどの医薬の調製のため；又は、薬物の硝子体内投与のための本共重合体の使用を提供する。一態様では、このような投与は、本明細書で定義されるように一定期間にわたる徐放である。
【0047】
別の実施形態では、本発明は、適切な薬学的有効成分又は承認された薬物をロードした、本発明の共重合体を含むインプラントを、このような治療を必要とする患者の眼に配置することによる、眼疾患を治療するための方法を提供する。
【0048】
ＰＣＬ－ｇ－ＰＤＡの一般合成
本発明のＰＣＬ－ｇ－ＰＤＡ共重合体は、以下の一般的な反応スキームを使用して得ることができる。第１のステップでは、ヨウ素によるＰＣＬの後修飾により、ヨウ素化したＰＣＬが得られる。ＰＣＬの官能化の後修飾方法は、Ｎｏｔｔｅｌｅｔらの研究６に基づいている。該方法は、スキーム１に記載されている２段階のワンポット反応で構成される。第１のステップは、ＬＤＡの存在下でのＰＣＬのアニオン活性化であり、第２のステップはヨウ素の求電子置換である。
スキーム１：ヨウ素化ＰＣＬ（ＰＣＬ－Ｉ）の合成スキーム。ここで、ｎ＝４３～１７５５；ｐ＝２３～１５８０、及びｑ＝２～３９５である。
本発明のＰＣＬ－ｇ－ＰＤＡ共重合体は、以下の一般的な反応スキームを使用して得ることができる。第１のステップでは、ヨウ素によるＰＣＬの後修飾により、ヨウ素化したＰＣＬが得られる。ＰＣＬの官能化の後修飾方法は、Ｎｏｔｔｅｌｅｔらの研究６に基づいている。該方法は、スキーム１に記載されている２段階のワンポット反応で構成される。第１のステップは、ＬＤＡの存在下でのＰＣＬのアニオン活性化であり、第２のステップはヨウ素の求電子置換である。
【0049】
市販のＰＣＬから出発して、さまざまな分子量及び共重合体質量をターゲットにして一連のヨウ素化したＰＣＬを調製し、ＳＥＣ及び１Ｈ ＮＭＲによって特性評価した。結果を表１にまとめる。
【0050】
【表1】
【0051】
第２のステップでは、Ｃｈｏら７から適用された条件に基づいて、以下の反応スキーム２に従ってＰＣＬ－ｇ－ＰＤＡを得る。
スキーム2：PCL-g-PDAの合成。ここで、p=23～1580;q=2～395、及びr=1～395である
【0052】
簡単に説明すると、ＤＭＳＯ、炭酸ナトリウム、ＢＰＯ、及びＰＭＤＥＴＡを含むシュレンクフラスコに室温でドーパミンを導入した。炭酸ナトリウムは、塩基性条件を得るために用いられる。ＢＰＯは、連鎖重合を誘発するラジカル開始剤としてよく用いられる有機過酸化物であり、ＰＤＭＥＴＡ（ＰＭＤＴＡとも呼ばれる）は、金属カチオンと結合して錯体を形成することができる三座配位子である。これらすべての成分を導入した後すぐに（１分未満で）、溶液は白から黒に変わり、ドーパミンの酸化重合が示唆された。一方、ＰＣＬ－Ｉを室温でＤＭＳＯに可溶化した。溶液を４時間撹拌した。ＰＣＬ－Ｉマクロ開始剤溶液を最初の溶液に移し、臭化銅（Ｉ）を加えた。臭化銅（Ｉ）は、配位子に結合する金属剤であり、ＡＴＲＰと同様に、ＰＣＬ－Ｉ休眠マクロ開始剤を活性化して、ドーパミンモノマー又はすでに成長したＰＤＡと結合したフリーラジカルＰＣＬの生成を可能にする。溶液を７０℃で４８時間加熱し、次に液体窒素に浸すことによって冷却した。溶媒の大部分を蒸発によって除去し、次に溶液をメタノール中で沈殿させて、最終的な共重合体を収集した。沈殿中にメタノールが黒色へと変化したことは、ＤＭＳＯ溶液中に非グラフト化ＰＤＡが存在すること、及び非グラフト化ＰＤＡ化合物がメタノール中でさらに可溶化されたことを示唆している。
【0053】
したがって、別の実施形態では、本発明は、ＰＣＬ－ｇ－ＰＤＡを製造するための方法を提供し、前記方法は、出発物質、中間体、反応相手、及び本明細書のスキーム１及び２に記載される条件を含めた、反応順序を含む。
【0054】
材料及び方法
化学薬品及び材料
ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）、トルエン、ジエチルエーテル、メタノール、ジクロロメタン（ＤＣＭ）、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、ポリ（ε－カプロラクトン）（ＰＣＬ）、ヨウ素、塩酸（ＨＣｌ、３７％）、リチウムジイソプロピルアミド（ＬＤＡ）、チオ硫酸ナトリウム、ベンゼンジメタノール、ε－カプロラクトン（εＣＬ）、オクタン酸第一スズ（Ｓｎ（Ｏｃｔ）２）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ドーパミン塩酸塩、過酸化ベンゾイル（ＢＰＯ）、臭化銅（Ｉ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’，Ｎ’’－ペンタメチルジエチレントリアミン（ＰＭＤＥＴＡ）、及びシプロフロキサシン塩酸塩（ＣＩＰ．ＨＣｌ）は、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社から購入した。塩化アンモニウム、ポリソルベート２０（Ｔｗｅｅｎ２０）はＡｃｒｏｓ Ｏｒｇａｎｉｃｓ社から購入した。炭酸ナトリウムはＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社から購入した。デキサメタゾン（ＤＥＸ）は、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ又はＴＣＩ社のいずれかから購入した。
化学薬品及び材料
ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）、トルエン、ジエチルエーテル、メタノール、ジクロロメタン（ＤＣＭ）、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、ポリ（ε－カプロラクトン）（ＰＣＬ）、ヨウ素、塩酸（ＨＣｌ、３７％）、リチウムジイソプロピルアミド（ＬＤＡ）、チオ硫酸ナトリウム、ベンゼンジメタノール、ε－カプロラクトン（εＣＬ）、オクタン酸第一スズ（Ｓｎ（Ｏｃｔ）２）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ドーパミン塩酸塩、過酸化ベンゾイル（ＢＰＯ）、臭化銅（Ｉ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’，Ｎ’’－ペンタメチルジエチレントリアミン（ＰＭＤＥＴＡ）、及びシプロフロキサシン塩酸塩（ＣＩＰ．ＨＣｌ）は、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社から購入した。塩化アンモニウム、ポリソルベート２０（Ｔｗｅｅｎ２０）はＡｃｒｏｓ Ｏｒｇａｎｉｃｓ社から購入した。炭酸ナトリウムはＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社から購入した。デキサメタゾン（ＤＥＸ）は、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ又はＴＣＩ社のいずれかから購入した。
【0055】
特徴づけ
核磁気共鳴（ＮＭＲ）
プロトン核磁気共鳴分光法（１Ｈ－ＮＭＲ）を行い、ＣＤＣｌ３又はＤＭＳＯ－ｄ６中でＢｒｕｋｅｒ ＡＭＸ－４００ＭＨｚ分光計を使用して、ヨウ素化ＰＣＬについてのポリマーの官能化率を決定した。拡散秩序分光法ＮＭＲ（ＤＯＳＹ ＮＭＲ）を行い、試料に含まれる種の個別の拡散係数を強調し、残留遊離種の存在を判定した。試料濃度は５～１５ｍｇ／ｍＬであった。
核磁気共鳴（ＮＭＲ）
プロトン核磁気共鳴分光法（１Ｈ－ＮＭＲ）を行い、ＣＤＣｌ３又はＤＭＳＯ－ｄ６中でＢｒｕｋｅｒ ＡＭＸ－４００ＭＨｚ分光計を使用して、ヨウ素化ＰＣＬについてのポリマーの官能化率を決定した。拡散秩序分光法ＮＭＲ（ＤＯＳＹ ＮＭＲ）を行い、試料に含まれる種の個別の拡散係数を強調し、残留遊離種の存在を判定した。試料濃度は５～１５ｍｇ／ｍＬであった。
【0056】
サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）
ＳＥＣ ＴＨＦ：試料（５ｍｇ／ｍｌ）を０．４５μｍのＰＴＦＥ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅフィルタに通して濾過し、ＲＩＤ－２０Ａ屈折率信号検出器、ＳＰＤ－２０Ａ ＵＶ／ＶＩＳ検出器、ＰＬｇｅｌ ＭＩＸＥＤ－Ｃガードカラム（Ａｇｉｌｅｎｔ社、５μｍ、５０×７．５ｍｍ）、及び２つのＰＬｇｅｌ ＭＩＸＥＤ－Ｃカラム（Ａｇｉｌｅｎｔ社、５μｍ、３００×７．５ｍｍ）を備えたＳｈｉｍａｄｚｕ社（日本）の装置を使用して分析した。移動相は、流量１．０ｍＬ．ｍｉｎ－１のＴＨＦであった。注入量は１００μＬであった。平均分子量及び分散度（Ｄ）は、標準としてポリスチレン（ＰＳ）を使用して計算した。
ＳＥＣ ＴＨＦ：試料（５ｍｇ／ｍｌ）を０．４５μｍのＰＴＦＥ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅフィルタに通して濾過し、ＲＩＤ－２０Ａ屈折率信号検出器、ＳＰＤ－２０Ａ ＵＶ／ＶＩＳ検出器、ＰＬｇｅｌ ＭＩＸＥＤ－Ｃガードカラム（Ａｇｉｌｅｎｔ社、５μｍ、５０×７．５ｍｍ）、及び２つのＰＬｇｅｌ ＭＩＸＥＤ－Ｃカラム（Ａｇｉｌｅｎｔ社、５μｍ、３００×７．５ｍｍ）を備えたＳｈｉｍａｄｚｕ社（日本）の装置を使用して分析した。移動相は、流量１．０ｍＬ．ｍｉｎ－１のＴＨＦであった。注入量は１００μＬであった。平均分子量及び分散度（Ｄ）は、標準としてポリスチレン（ＰＳ）を使用して計算した。
【0057】
ＳＥＣ ＤＭＳＯ：ＰＣＬ－ｇ－ＰＤＡ共重合体（１ｍｇ／ｍＬ）を０．４５μｍのＰＴＦＥ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅフィルタに通して濾過し、Ｗａｔｅｒｓ４１０示差屈折計、Ｗａｔｅｒｓ２９９６フォトダイオードアレイ検出器、Ｐｏｌａｒｇｅｌ－Ｍガードカラム（Ａｇｉｌｅｎｔ社、５０×７．５ｍｍ）、及び２つのＰｏｌａｒｇｅｌ－Ｍカラム（Ａｇｉｌｅｎｔ社、３００×７．５ｍｍ）を備えたＷａｔｅｒｓ５１５ＨＰＬＣ装置を使用して分析した。移動相は流量１．０ｍＬ／分のＤＭＳＯであった。注入量は５０μＬであった。ＰＤＡ含有量の定量化は、２５４～４００ｎｍの範囲で選択された特定の波長における、ＰＤＡを含む共重合体とオリゴＰＤＡ自体との間の面積比によって決定した。
【0058】
上記ＳＥＣ法の両方において、ＰＣＬ－ｇ－ＰＤＡ共重合体を分析する場合、記載される条件下でＤＭＦを移動相として使用することもできる。
【0059】
熱重量分析（ＴＧＡ）
共重合体（０．１～１０ｍｇ）の熱分解を、熱重量分析器（ＴＧＡ Ｑ５００ ｖ２０．１３ ｂｕｉｌｄ ３９）を使用して研究した。試料を窒素雰囲気下、２０℃／分で３０℃から７００℃まで加熱した。
共重合体（０．１～１０ｍｇ）の熱分解を、熱重量分析器（ＴＧＡ Ｑ５００ ｖ２０．１３ ｂｕｉｌｄ ３９）を使用して研究した。試料を窒素雰囲気下、２０℃／分で３０℃から７００℃まで加熱した。
【0060】
示差走査熱量測定（ＤＳＣ）
各共重合体の試料（１～１０ｍｇ）をアルミニウムの鍋に入れた。Ｍｅｔｔｌｅｒ Ｔｏｌｅｄｏ ＤＳＣ ３を使用して、試料を１０℃／分で－８０℃から３００℃まで加熱した。各試料のガラス転移温度と融解温度を、最初の加熱サイクル中に決定した。融解エンタルピーを使用して、結晶性ＰＣＬについて、基準値ΔＨ＝１３９，５Ｊ／ｇを使用して結晶化度（χ）を計算した８。
各共重合体の試料（１～１０ｍｇ）をアルミニウムの鍋に入れた。Ｍｅｔｔｌｅｒ Ｔｏｌｅｄｏ ＤＳＣ ３を使用して、試料を１０℃／分で－８０℃から３００℃まで加熱した。各試料のガラス転移温度と融解温度を、最初の加熱サイクル中に決定した。融解エンタルピーを使用して、結晶性ＰＣＬについて、基準値ΔＨ＝１３９，５Ｊ／ｇを使用して結晶化度（χ）を計算した８。
【0061】
高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）
試料を０．４５μｍのＰＴＦＥ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅフィルタに通して濾過し、ＳＰＤ－Ｍ２０Ａダイオードアレイ検出器、及びＨＰＬＣ Ｃ１８カラム（Ｋｉｎｅｔｅｘ社、２．６μｍ、１００Ａ、１００×４．６ｍｍ）を備えたＳｈｉｍａｄｚｕ社（日本）の装置を使用して分析した。薬物の検出には、ＤＥＸの検出には４０％ＡＣＮ（０．１％ＴＦＡ）＋６０％Ｈ２Ｏ（０．１％ＴＦＡ）、ＣＩＰの検出には１３％ＡＣＮ（０．１％ＴＦＡ）＋８７％Ｈ２Ｏ（０．１％ＴＦＡ）で、アイソクラティックモードを適用した。検出後、１００％ＡＣＮになるまで直線勾配を使用してカラムを洗浄した。流量は１．０ｍＬ／分であった。
試料を０．４５μｍのＰＴＦＥ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅフィルタに通して濾過し、ＳＰＤ－Ｍ２０Ａダイオードアレイ検出器、及びＨＰＬＣ Ｃ１８カラム（Ｋｉｎｅｔｅｘ社、２．６μｍ、１００Ａ、１００×４．６ｍｍ）を備えたＳｈｉｍａｄｚｕ社（日本）の装置を使用して分析した。薬物の検出には、ＤＥＸの検出には４０％ＡＣＮ（０．１％ＴＦＡ）＋６０％Ｈ２Ｏ（０．１％ＴＦＡ）、ＣＩＰの検出には１３％ＡＣＮ（０．１％ＴＦＡ）＋８７％Ｈ２Ｏ（０．１％ＴＦＡ）で、アイソクラティックモードを適用した。検出後、１００％ＡＣＮになるまで直線勾配を使用してカラムを洗浄した。流量は１．０ｍＬ／分であった。
【0062】
第ＩＩ章： （ＰＣＬ－ｇ－ＰＤＡ）－ｂ－ＰＥＧ－ｂ－（ＰＣＬ－ｇ－ＰＤＡ）
本発明によるｉｎ－ｓｉｔｕゲル化システムの手法は、第Ｉ章で得られた知識に基づいて、（ＰＣＬ－ｇ－ＰＤＡ）－ｂ－ＰＥＧ－ｂ－（ＰＣＬ－ｇ－ＰＤＡ）型の両親媒性のグラフト化共重合体を提供する。最初に、両親媒性のトリブロックＰＣＬ－ｂ－ＰＥＧ－ｂ－ＰＣＬをさまざまなＰＥＧ及びＰＣＬ鎖長で合成し、水中、生理的温度でｉｎ－ｓｉｔｕ形成ゲルを生成した。一実施形態では、ＰＥＧは最大２００００ｇ／モルの分子量を有する。別の実施形態では、ＰＥＧは１０００～４６００ｇ／モルの分子量を有する。さらに別の実施形態では、０．３０～２．１３の範囲のＥＧ／ＣＬ比及び４３００～９４００ｇ／モルの分子量を得るために、ＰＥＧとＰＣＬの鎖長は異なるが、各ＰＣＬで同じ鎖長を有するトリブロック共重合体が提供される。さらに別の実施形態では、２つのＰＣＬ鎖は８４６～２１００ｇ／モルの間の分子量を有し、ＰＥＧ鎖は１０００～４６００ｇ／モルの間の分子量を有する。さらに別の実施形態では、２つのＰＣＬ鎖は８５５又は８９０ｇ／モルの分子量を有し、ＰＥＧ鎖は２０００ｇ／モルの分子量を有する。これら２つの特定のＰＣＬ－ｂ－ＰＥＧ－ｂ－ＰＣＬは、室温で良好なゲル化能力を示した。
本発明によるｉｎ－ｓｉｔｕゲル化システムの手法は、第Ｉ章で得られた知識に基づいて、（ＰＣＬ－ｇ－ＰＤＡ）－ｂ－ＰＥＧ－ｂ－（ＰＣＬ－ｇ－ＰＤＡ）型の両親媒性のグラフト化共重合体を提供する。最初に、両親媒性のトリブロックＰＣＬ－ｂ－ＰＥＧ－ｂ－ＰＣＬをさまざまなＰＥＧ及びＰＣＬ鎖長で合成し、水中、生理的温度でｉｎ－ｓｉｔｕ形成ゲルを生成した。一実施形態では、ＰＥＧは最大２００００ｇ／モルの分子量を有する。別の実施形態では、ＰＥＧは１０００～４６００ｇ／モルの分子量を有する。さらに別の実施形態では、０．３０～２．１３の範囲のＥＧ／ＣＬ比及び４３００～９４００ｇ／モルの分子量を得るために、ＰＥＧとＰＣＬの鎖長は異なるが、各ＰＣＬで同じ鎖長を有するトリブロック共重合体が提供される。さらに別の実施形態では、２つのＰＣＬ鎖は８４６～２１００ｇ／モルの間の分子量を有し、ＰＥＧ鎖は１０００～４６００ｇ／モルの間の分子量を有する。さらに別の実施形態では、２つのＰＣＬ鎖は８５５又は８９０ｇ／モルの分子量を有し、ＰＥＧ鎖は２０００ｇ／モルの分子量を有する。これら２つの特定のＰＣＬ－ｂ－ＰＥＧ－ｂ－ＰＣＬは、室温で良好なゲル化能力を示した。
【0063】
８５５－２０００－８５５（ｇ／モル）の分布を有するＰＣＬ－ｂ－ＰＥＧ－ｂ－ＰＣＬを求電子置換によってヨウ素を介して官能化して、（ＰＣＬ－Ｉ）－ｂ－ＰＥＧ－ｂ－（ＰＣＬ－Ｉ）を得、これをＡＴＲＰ様の酸化条件下及び塩基性条件下でＰＤＡによってさらに官能化した。未加工の（ＰＣＬ－ｇ－ＰＤＡ）－ｂ－ＰＥＧ－ｂ－（ＰＣＬ－ｇ－ＰＤＡ）は、幾らかの遊離（非グラフト化）ＰＤＡを含む、約４０重量％のＰＤＡを含んでいた。
【0064】
（ＰＣＬ－ｇ－ＰＤＡ）－ｂ－ＰＥＧ－ｂ－（ＰＣＬ－ｇ－ＰＤＡ）の一般合成
本発明による（ＰＣＬ－ｇ－ＰＤＡ）－ｂ－ＰＥＧ－ｂ－（ＰＣＬ－ｇ－ＰＤＡ）型（第ＩＩ章）の共重合体（本明細書では「Ｔ－ＰＤＡ」とも称される）は、以下の一般反応スキーム３～５に基づいて合成することができる。
スキーム３：PCL-b-PEG-b-PCL(m=22～455、n=3～568)の合成
本発明による（ＰＣＬ－ｇ－ＰＤＡ）－ｂ－ＰＥＧ－ｂ－（ＰＣＬ－ｇ－ＰＤＡ）型（第ＩＩ章）の共重合体（本明細書では「Ｔ－ＰＤＡ」とも称される）は、以下の一般反応スキーム３～５に基づいて合成することができる。
【0065】
トリブロック共重合体ＰＣＬ－ｂ－ＰＥＧ－ｂ－ＰＣＬ（本明細書では「Ｔ」とも称される）は、開始剤として市販のＰＥＧ－ジオール（スキーム３）を使用し、触媒としてＳｎ（Ｏｃｔ）２を使用して、無水トルエン中でのε－ＣＬの開環重合（ＲＯＰ）によって合成される。溶液を１００℃で２４時間撹拌し、冷ジエチルエーテル中で沈殿させ、濾過し、真空下で乾燥させる。
【0066】
ヨウ素によるＰＣＬの官能基化につながる重合後の修飾は、Ｎｏｔｔｅｌｅｔら６によって記載された研究に基づいており、第Ｉ章に提示した方法と同様である。該方法は、スキーム４に記載されている２段階のワンポット反応で構成される。
スキーム４：(PCL-I)-b-PEG-b-(PCL-I)(m=22～455;n=3～568;p=3～397及びq=1～170)の合成
【0067】
第１のステップは、ＬＤＡの存在下でのＰＣＬ骨格の最も求電子性の高いプロトンのアニオン活性化であり、第２のステップはヨウ素による求電子置換である。得られる（ＰＣＬ－Ｉ）－ｂ－ＰＥＧ－ｂ－（ＰＣＬ－Ｉ）型のポリマーは、本明細書では「Ｔ－Ｉ」とも称される。
【0068】
最後に、ＰＤＡによるＴ－Ｉの官能基化を、第Ｉ章に記載した条件と同様の条件で行った。反応スキームがスキーム５に示されており、詳細な条件も実施例９に記載されている。
スキーム５：(PCL-g-PDA)-b-PEG-b-(PCL-g-PDA)(「T-PDA」;p=3～397;m=1～170及びr=1～170)の合成
【0069】
精製のために、Ｔ－ＰＤＡを含むＤＭＳＯの溶液を冷ジエチルエーテル中で沈殿させたが、Ｔ－ＰＤＡが底に付着し、生成物の回収は複雑であった。第２のステップでは、Ｔ－ＰＤＡを含むＤＭＳＯの溶液を透析バッグに導入し、ＤＭＳＯを水と交換してＴ－ＰＤＡを回収した。さらなる分析用にＴ－ＰＤＡを回収するために、この段階では優先的な精製方法として透析を維持した。ＰＤＡを含むＴポリマー（Ｔ－ＰＤＡ）は新しいタイプの共重合体であり、本発明の一実施形態である。
【0070】
したがって、一実施形態では、本発明は、（ＰＣＬ－ｇ－ＰＤＡ）－ｂ－ＰＥＧ－ｂ－（ＰＣＬ－ｇ－ＰＤＡ）型のグラフト化された共重合体を与えるために、２つのＰＣＬ－ｇ－ＰＤＡ鎖がＰＥＧ鎖に結合している、本明細書（第Ｉ章）で定義されるＰＣＬ－ｇ－ＰＤＡ共重合体を提供する。一態様では、ＰＥＧ鎖は本明細書で定義される分子量を有し、２つのＰＣＬ－ｇ－ＰＤＡ鎖の両方が同じ分子量を有する。
【0071】
別の実施形態では、本発明は、式（ＩＩ）の、本明細書で定義されるＴ－ＰＤＡ型のポリマーを提供する：
［式中、
ｐは３～３９７であり、
ｒは１～１７０であり、
ｍは１～１７０である］。
ｐは３～３９７であり、
ｒは１～１７０であり、
ｍは１～１７０である］。
【0072】
本発明はまた、新しいＴ－ＰＤＡポリマーを製造するための方法も提供する。一実施形態では、本発明は、Ｔ－ＰＤＡ型のポリマーを製造するための方法を提供し、前記方法は、出発物質、中間体、反応相手、及び本明細書のスキーム３～５に記載される条件を含めた、反応順序を含む。
【0073】
別の実施形態では、本発明はまた、本明細書のスキーム３～５による反応順序（出発物質、中間体、及び条件）を使用した場合に得られるＴ－ＰＤＡポリマーも提供する。
【0074】
本発明による、例えば式（ＩＩ）のＴ－ＰＤＡ共重合体は、貴重な薬学的特性を有する。特に、それらは安定性であり、耐容性が高く、薬学的活性成分の徐放に適していることがわかっている。
【0075】
したがって、一実施形態では、本発明は、薬学的調製物における、例えば薬学的有効成分の担体として使用するための本明細書で定義される、例えば式（ＩＩ）のＴ－ＰＤＡ共重合体を提供する。一態様では、本発明によれば、前記薬学的調製物は、ｉｎ ｓｉｔｕでのゲル化によって形成されたデポーである。別の態様では、前記ｉｎ ｓｉｔｕで形成されたデポーは、例えば硝子体内注射用など、眼内での使用に適している。さらに別の態様では、この薬学的調製物は、眼内注射時に、前記薬学的有効成分を徐放するためのｉｎ ｓｉｔｕゲル化デポーを形成する。さらに別の態様では、本発明によれば、前記薬学的調製物は、水溶液、又は例えばヒスチジンバッファー溶液などの適切なバッファーであり、Ｔ－ＰＤＡ共重合体を薬学的有効成分とともに含み、共溶媒としてＰＥＧ、好ましくは本明細書で定義されるＰＥＧ４００をさらに含む。
【0076】
Ｔ－ＰＤＡ共重合体に関連して用いられる薬学的有効成分という用語は、臨床的に意味のある薬理的活性を有する任意の分子、好ましくは抗体を意味する。本明細書では「抗体」という用語は、最も広い意味で用いられ、限定はしないが、それらが所望の抗原結合活性を呈する限り、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、及び抗体断片を含めた、さまざまな抗体のクラス又は構造を包含する。一実施形態では、抗体は、モノクローナル、単一特異性若しくは二重特異性抗体、又はその抗原結合断片である。一実施形態では、抗体はヒト抗体又はヒト化抗体である。別の実施形態では、抗体は、眼疾患を治療するために使用することができる前述の抗体のいずれかである。さらに別の実施形態では、抗体は、ＩＮＮファリシマブを有する分子である。
【0077】
本発明によれば、薬学的有効成分は、デポー中に最大４５重量％；又は５～４５重量％；又は１５～４５重量％、又は２０～４５重量％の量で存在し、ここで重量％はＴ－ＰＤＡに対するものである。
【0078】
別の実施形態では、本発明は、医薬の調製のための、例えば式（ＩＩ）の、本発明のＴ－ＰＤＡ共重合体の使用を提供する。一態様では、このような医薬は、眼疾患の治療用；又は、薬物の硝子体内投与用である。
【0079】
別の実施形態では、本発明は、適切な薬学的有効成分又は承認された薬物をロードした、本発明のＴ－ＰＤＡ共重合体を含む薬学的調製物を、このような治療を必要とする患者の眼に注入することによる、眼疾患を治療するための方法を提供する。一態様では、注入は硝子体内注射である。
【0080】
別の実施形態では、ＰＣＬ－ｂ－ＰＥＧ－ｂ－ＰＣＬ及び／又は（ＰＣＬ－ｇ－ＰＤＡ）－ｂ－ＰＥＧ－ｂ－（ＰＣＬ－ｇ－ＰＤＡ）とモノクローナル抗体（ｍＡｂ）とを含む水性製剤が提供される。一態様では、この製剤は、可溶性共溶媒、好ましくはＰＥＧ４００をさらに含む。さらに別の態様では、本発明は、溶媒としてヒスチジンバッファー（ＨＢＳ）及びＰＥＧ４００（比ＨＢＳ：ＰＥＧ４００＝１：１又は１：２）で構成され、５～１５、好ましくは５又は１０重量％のＰＣＬ－ｂ－ＰＥＧ－ｂ－ＰＣＬ又は（ＰＣＬ－ｇ－ＰＤＡ）－ｂ－ＰＥＧ－ｂ－（ＰＣＬ－ｇ－ＰＤＡ）を含み、４０ｍｇ／ｍＬのｍＡｂがロードされている、製剤を提供する。一態様では、これらの製剤は３０Ｇ針を通して注射可能である。ｍＡｂの安定性研究は、（ＰＣＬ－ｇ－ＰＤＡ）－ｂ－ＰＥＧ－ｂ－（ＰＣＬ－ｇ－ＰＤＡ）が、３０日間変性を引き起こすことなく、ｍＡｂと相互作用する能力を示した。Ｉｎ ｖｉｔｒｏでは、これらの製剤は、溶媒交換プロセスによって、ｉｎ－ｓｉｔｕゲル化デポーを形成した。
【0081】
本明細書、とりわけ第ＩＩ章の実施形態で用いられる「ＰＥＧ」という用語は、ポリ（エチレングリコール）を意味する。本発明によれば、異なる分子量のＰＥＧを使用することができる。一実施形態では、ＰＥＧは、最大２００００ｇ／モルの分子量を有する。別の実施形態では、ＰＥＧは、４００；又は１０００；又は１４５０；又は２０００；又は４６００；又は１００００；又は２００００ｇ／モルの分子量を有する。
【0082】
特に第ＩＩ章では、各ポリマーの分子量はインデックス番号で記述される。例えば、１０００ｇ／モルのＰＥＧはＰＥＧ１０００と定義され、２０００ｇ／モルのＰＣＬはＰＣＬ２０００と定義される。本明細書全体にわたり、例えば１０００ｇ／モルのＰＥＧ及び２０００ｇ／モルの各ＰＣＬを有するＰＣＬ－ｂ－ＰＥＧ－ｂ－ＰＣＬ型の共重合体は、１０００－２０００－１０００と表すこともできる。
【0083】
明示的に言及されていない限り、第Ｉ章で定義された用語は、第ＩＩ章で定義された実施形態に関連して用いられる場合には同じ意味を有する。
【0084】
材料及び方法
ＰＣＬ－ｇ－ＰＤＡ共重合体及びそれに基づくインプラント（第Ｉ章）の調製のために本明細書で言及した材料の多くは、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社から購入した、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ、Ｍｎ ４００又は１０００又は１４５０又は２０００又は４６００又は１００００又は２００００ｇ／モル）、トルエン、オクタン酸第一スズ（Ｓｎ（Ｏｃｔ）２）、ε－カプロラクトン（ε－ＣＬ）、及びジエチルエーテルを加えることにより、この第ＩＩ章のトリブロック共重合体の調製にも使用することができる。ＰＥＧは、ＰＥＧのトルエン溶液の共沸蒸留によって乾燥し、ε－ＣＬは水素化カルシウム（ＣａＨ２）で４８時間室温で乾燥し、使用前に減圧下で蒸留した。ＰＥＧ、ε－ＣＬ、及びＳｎ（Ｏｃｔ）２はアルゴン雰囲気下で保管した。
ＰＣＬ－ｇ－ＰＤＡ共重合体及びそれに基づくインプラント（第Ｉ章）の調製のために本明細書で言及した材料の多くは、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社から購入した、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ、Ｍｎ ４００又は１０００又は１４５０又は２０００又は４６００又は１００００又は２００００ｇ／モル）、トルエン、オクタン酸第一スズ（Ｓｎ（Ｏｃｔ）２）、ε－カプロラクトン（ε－ＣＬ）、及びジエチルエーテルを加えることにより、この第ＩＩ章のトリブロック共重合体の調製にも使用することができる。ＰＥＧは、ＰＥＧのトルエン溶液の共沸蒸留によって乾燥し、ε－ＣＬは水素化カルシウム（ＣａＨ２）で４８時間室温で乾燥し、使用前に減圧下で蒸留した。ＰＥＧ、ε－ＣＬ、及びＳｎ（Ｏｃｔ）２はアルゴン雰囲気下で保管した。
【0085】
特徴づけ
核磁気共鳴分光法（ＮＭＲ分光法）、移動相としてＴＨＦを使用するサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）、熱重量分析（ＴＧＡ）法、及び機器は、第Ｉ章で説明したものと同様である。
核磁気共鳴分光法（ＮＭＲ分光法）、移動相としてＴＨＦを使用するサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）、熱重量分析（ＴＧＡ）法、及び機器は、第Ｉ章で説明したものと同様である。
【0086】
移動相としてＤＭＦを使用するサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）
ポリマーの数平均及び重量平均モル質量（それぞれ、Ｍｎ及びＭｗ）並びに分散度（Ｄ、Ｍｗ／Ｍｎ）は、ＳＥＣによって決定した。試料（５ｍｇ／ｍｌ）を０．４５μｍのＰＴＦＥ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅフィルタに通して濾過し、ＳＰＤ－２０Ａ ＵＶ／ＶＩＳ検出器及びＰＬｇｅｌ ＭＩＸＥＤ－Ｃガードカラム（Ａｇｉｌｅｎｔ社、５μｍ、５０×７．５ｍｍ）に連結したＲＩＤ－２０Ａ屈折率信号検出器、並びに２つのＰＬｇｅｌ ＭＩＸＥＤ－Ｃカラム（Ａｇｉｌｅｎｔ社、５μｍ、３００×７．５ｍｍ）を備えたＳｈｉｍａｄｚｕ社（日本）の装置を使用して分析した。移動相はＤＭＦ＋０．１％ＬｉＢｒであった。流量は１．０ｍＬ．ｍｉｎ－１であり、注入量は１００μＬであった。平均分子量及び分散度（Ｄ）は、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）標準を使用した較正に従って表した。
ポリマーの数平均及び重量平均モル質量（それぞれ、Ｍｎ及びＭｗ）並びに分散度（Ｄ、Ｍｗ／Ｍｎ）は、ＳＥＣによって決定した。試料（５ｍｇ／ｍｌ）を０．４５μｍのＰＴＦＥ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅフィルタに通して濾過し、ＳＰＤ－２０Ａ ＵＶ／ＶＩＳ検出器及びＰＬｇｅｌ ＭＩＸＥＤ－Ｃガードカラム（Ａｇｉｌｅｎｔ社、５μｍ、５０×７．５ｍｍ）に連結したＲＩＤ－２０Ａ屈折率信号検出器、並びに２つのＰＬｇｅｌ ＭＩＸＥＤ－Ｃカラム（Ａｇｉｌｅｎｔ社、５μｍ、３００×７．５ｍｍ）を備えたＳｈｉｍａｄｚｕ社（日本）の装置を使用して分析した。移動相はＤＭＦ＋０．１％ＬｉＢｒであった。流量は１．０ｍＬ．ｍｉｎ－１であり、注入量は１００μＬであった。平均分子量及び分散度（Ｄ）は、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）標準を使用した較正に従って表した。
【0087】
水性サイズ排除クロマトグラフィー（水性ＳＥＣ）
試料（１ｍｇ／ｍｌ）を０．２０μｍのＲＣ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅフィルタに通して濾過し、ＳＰＤ－４０ ＵＶ／ＶＩＳ検出器及びＢｉｏｂａｓｉｃ ＳＥＣ３００ガードカラム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、５μｍ、２０×８ｍｍ）に連結したＲＩＤ－２０Ａ屈折率信号検出器、並びに１つのＢｉｏｂａｓｉｃ ＳＥＣ３００カラム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、５μｍ、１５０×７．８ｍｍ）を備えたＳｈｉｍａｄｚｕ社（日本）の装置を使用して分析した。移動相は、ＨＫ２ＰＯ４／ＫＨ２ＰＯ４（０．１ Ｍ、ｐＨ＝７）から構成される水性バッファー溶液であった。流量は０．８０ｍＬ．ｍｉｎ－１であり、注入量は１００μＬであった。
試料（１ｍｇ／ｍｌ）を０．２０μｍのＲＣ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅフィルタに通して濾過し、ＳＰＤ－４０ ＵＶ／ＶＩＳ検出器及びＢｉｏｂａｓｉｃ ＳＥＣ３００ガードカラム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、５μｍ、２０×８ｍｍ）に連結したＲＩＤ－２０Ａ屈折率信号検出器、並びに１つのＢｉｏｂａｓｉｃ ＳＥＣ３００カラム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、５μｍ、１５０×７．８ｍｍ）を備えたＳｈｉｍａｄｚｕ社（日本）の装置を使用して分析した。移動相は、ＨＫ２ＰＯ４／ＫＨ２ＰＯ４（０．１ Ｍ、ｐＨ＝７）から構成される水性バッファー溶液であった。流量は０．８０ｍＬ．ｍｉｎ－１であり、注入量は１００μＬであった。
【0088】
圧縮測定による注射可能性試験
注射可能性試験は、圧縮モードで５００Ｎキャプタを備えたＩｎｓｔｒｏｎ３３４４を使用して実施した。この研究では、サイズ２７Ｇ－３０Ｇの皮下注射針（Ｓｔｅｒｉｃａｎ（登録商標）、特異的適応用、Ｂ．Ｂｒａｕｎ社、ドイツ国）及び１ｍＬの使い捨て注射器（Ｏｍｎｉｆｉｘ（登録商標）－Ｆルアー、Ｂ．Ｂｒａｕｎ社、ドイツ国）を使用した。注射器に１ｍＬの溶液を満たし、その後皮下注射針を取り付けた。注入速度は０．５又は１ｍｍ／秒に設定し、注入量は、プランジャーの変位６ｍｍに相当する、１００μＬであった。周辺媒体は空気であった。
注射可能性試験は、圧縮モードで５００Ｎキャプタを備えたＩｎｓｔｒｏｎ３３４４を使用して実施した。この研究では、サイズ２７Ｇ－３０Ｇの皮下注射針（Ｓｔｅｒｉｃａｎ（登録商標）、特異的適応用、Ｂ．Ｂｒａｕｎ社、ドイツ国）及び１ｍＬの使い捨て注射器（Ｏｍｎｉｆｉｘ（登録商標）－Ｆルアー、Ｂ．Ｂｒａｕｎ社、ドイツ国）を使用した。注射器に１ｍＬの溶液を満たし、その後皮下注射針を取り付けた。注入速度は０．５又は１ｍｍ／秒に設定し、注入量は、プランジャーの変位６ｍｍに相当する、１００μＬであった。周辺媒体は空気であった。
【0089】
参考文献
（１） Pascolini, D.; Mariotti, S. P. Global Estimates of Visual Impairment: 2010. Br J Ophthalmol 2012, 96 (5), 614-618. https://doi.org/10.1136/bjophthalmol-2011-300539.
（２） Yasin, M. N.; Svirskis, D.; Seyfoddin, A.; Rupenthal, I. D. Implants for Drug Delivery to the Posterior Segment of the Eye: A Focus on Stimuli-Responsive and Tunable Release Systems. Journal of controlled release: official journal of the Controlled Release Society 2014, 196, 208-221. https:与について考慮される可能性がある。しかしながら、この問題は、14.09.030.
（３） Liebscher, J.; Mrowczynski, R.; Scheidt, H. A.; Filip, C.; Hadade, N. D.; Turcu, R.; Bende, A.; Beck, S. Structure of Polydopamine: A Never-Ending Story? Langmuir: the ACS journal of surfaces and colloids 2013, 29 (33), 10539-10548. https://doi.org/10.1021/la4020288.
（４） Rimpelae, A.-K.; Reinisalo, M.; Hellinen, L.; Grazhdankin, E.; Kidron, H.; Urtti, A.; Del Amo, E. M. Implications of Melanin Binding in Ocular Drug Delivery. Advanced drug delivery reviews 2018, 126, 23-43. https://doi.org/10.1016/j.addr.2017.12.008.
（５） Liu, X.; Cao, J.; Li, H.; Li, J.; Jin, Q.; Ren, K.; Ji, J. Mussel-Inspired Polydopamine: A Biocompatible and Ultrastable Coating for Nanoparticles in Vivo. ACS nano 2013, 7 (10), 9384-9395. https://doi.org/10.1021/nn404117j.
（６） Nottelet, B.; Coudane, J.; Vert, M. Synthesis of an X-Ray Opaque Biodegradable Copolyester by Chemical Modification of Poly (ε-Caprolactone). Biomaterials 2006, 27 (28), 4948-4954. https://doi.org/10.1016/j.biomaterials.2006.05.032.
（７） Cho, J. H.; Shanmuganathan, K.; Ellison, C. J. Bioinspired Catecholic Copolymers for Antifouling Surface Coatings. ACS applied materials & interfaces 2013, 5 (9), 3794-3802. https://doi.org/10.1021/am400455p.
（８） Pitt, C. G.; Chasalow, F. I.; Hibionada, Y. M.; Klimas, D. M.; Schindler, A. Aliphatic Polyesters. I. The Degradation of Poly(ε-Caprolactone) in Vivo. J. Appl. Polym. Sci. 1981, 26 (11), 3779-3787. https://doi.org/10.1002/app.1981.070261124.
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（８） Pitt, C. G.; Chasalow, F. I.; Hibionada, Y. M.; Klimas, D. M.; Schindler, A. Aliphatic Polyesters. I. The Degradation of Poly(ε-Caprolactone) in Vivo. J. Appl. Polym. Sci. 1981, 26 (11), 3779-3787. https://doi.org/10.1002/app.1981.070261124.
【0090】
全体として、本発明は、生体適合性のある分解性合成共重合体を使用した、低侵襲性の長時間作用型眼内送達の課題に応えるための新しいＰＤＡベースの生体材料を提供する。これは、小分子の長期送達に適したＰＤＡベースのインプラントと、生物製剤の製剤化に有望なＰＤＡベースの注入可能なｉｎ ｓｉｔｕゲル化システムを提供する。次に、本発明を以下の実施例によってさらに説明するが、これらは決して本発明の範囲を限定することを意味するものではない。
【実施例】
【0091】
実施例１．開始剤及び前駆体の合成
ジエチレングリコールビス（２－ブロモイソブチラート）の合成
典型的な実験では、ジエチレングリコール（１ｇ、９．４２ミリモル）、トリエチルアミン（３．９４ｍＬ、２８．３ミリモル）、及び乾燥ＴＨＦ（４０ｍＬ）を乾燥三口丸底フラスコに加え、氷浴中に置いた。次に、臭化イソブチリル（３．４９ｍＬ、２８．３ミリモル）を、滴下漏斗を通してフラスコにゆっくりと加えた。無水状態を保持するために、塩化カルシウムを充填したガードチューブを設置した。溶液を一晩、撹拌しつつ放置した。溶液を珪藻土で濾過し、ＴＨＦを蒸発させることによって濃縮した。粗生成物を水とジクロロメタンとの混合物に溶解した。分液漏斗を使用してジクロロメタンで３回洗浄することにより、溶液から生成物を抽出した。ＭｇＳＯ４粉末を使用して有機相を乾燥させ、濾過し、減圧下で乾燥させた。溶媒として酢酸エチル：ヘプタン（３０：７０）の混合物を使用し、シリカで濾過することによって、生成物を精製した。画分を収集し、減圧下で蒸発させた。純粋な画分を集め、さらなる使用のために４℃で保存した。
収率：１００モル％
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ = 4.28 (t, R-CH2-O-CO), 3.73 (t, O-CH2-R), 1.89 (s, R-CH3)
ジエチレングリコールビス（２－ブロモイソブチラート）の合成
典型的な実験では、ジエチレングリコール（１ｇ、９．４２ミリモル）、トリエチルアミン（３．９４ｍＬ、２８．３ミリモル）、及び乾燥ＴＨＦ（４０ｍＬ）を乾燥三口丸底フラスコに加え、氷浴中に置いた。次に、臭化イソブチリル（３．４９ｍＬ、２８．３ミリモル）を、滴下漏斗を通してフラスコにゆっくりと加えた。無水状態を保持するために、塩化カルシウムを充填したガードチューブを設置した。溶液を一晩、撹拌しつつ放置した。溶液を珪藻土で濾過し、ＴＨＦを蒸発させることによって濃縮した。粗生成物を水とジクロロメタンとの混合物に溶解した。分液漏斗を使用してジクロロメタンで３回洗浄することにより、溶液から生成物を抽出した。ＭｇＳＯ４粉末を使用して有機相を乾燥させ、濾過し、減圧下で乾燥させた。溶媒として酢酸エチル：ヘプタン（３０：７０）の混合物を使用し、シリカで濾過することによって、生成物を精製した。画分を収集し、減圧下で蒸発させた。純粋な画分を集め、さらなる使用のために４℃で保存した。
収率：１００モル％
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ = 4.28 (t, R-CH2-O-CO), 3.73 (t, O-CH2-R), 1.89 (s, R-CH3)
【0092】
ＰＤＡオリゴマーの合成
典型的な実験では、ドーパミン塩酸塩（１．５ｇ、７．９１ミリモル）、ＰＭＤＥＴＡ（１３０μＬ、０．６３ミリモル）、Ｎａ２ＣＯ３（４０２．０ｍｇ）、ＢＰＯ（１．９２ｇ、７．９１ミリモル）、及びＤＭＳＯ（７６ｍＬ）を加えた。溶液を、撹拌及びアルゴン流下で４時間放置した。次に、３回の凍結-ポンプ融解サイクル（freeze-pump thaw cycles）によって酸素を除去した。ジエチレングリコールビス（２－ブロモイソブチラート）（０．１３ｇ、０．３２ミリモル）及び臭化銅（Ｉ）（０．０９ｍｇ、０．６３ミリモル）を加えた。次いで、フラスコを７０℃の油浴に浸し、激しく撹拌しつつ４８時間、反応を行った。液体窒素浴中で冷却することにより反応を停止させた。次いで、ＤＭＳＯを真空下７０℃で蒸発させることによって、溶液を濃縮した。最後に、ポリマーを沈殿させ、濾過し、真空下で乾燥させた。
収率：１７重量％
1H NMR (600 MHz, DMSOd6): δ = 6.30-7.00 ppm (m, PDA)
典型的な実験では、ドーパミン塩酸塩（１．５ｇ、７．９１ミリモル）、ＰＭＤＥＴＡ（１３０μＬ、０．６３ミリモル）、Ｎａ２ＣＯ３（４０２．０ｍｇ）、ＢＰＯ（１．９２ｇ、７．９１ミリモル）、及びＤＭＳＯ（７６ｍＬ）を加えた。溶液を、撹拌及びアルゴン流下で４時間放置した。次に、３回の凍結-ポンプ融解サイクル（freeze-pump thaw cycles）によって酸素を除去した。ジエチレングリコールビス（２－ブロモイソブチラート）（０．１３ｇ、０．３２ミリモル）及び臭化銅（Ｉ）（０．０９ｍｇ、０．６３ミリモル）を加えた。次いで、フラスコを７０℃の油浴に浸し、激しく撹拌しつつ４８時間、反応を行った。液体窒素浴中で冷却することにより反応を停止させた。次いで、ＤＭＳＯを真空下７０℃で蒸発させることによって、溶液を濃縮した。最後に、ポリマーを沈殿させ、濾過し、真空下で乾燥させた。
収率：１７重量％
1H NMR (600 MHz, DMSOd6): δ = 6.30-7.00 ppm (m, PDA)
【0093】
ヨウ素化ポリ（ε－カプロラクトン）の合成
ＰＣＬ骨格は、ＬＤＡを使用してアニオン的に活性化され、求電子置換後にヨウ素によって修飾された。この合成では、ＰＣＬ（３ｇ、Ｍｎ，ＳＥＣ，ＴＨＦ，＝６５０００ｇ／モル、２６．３ミリモルのＣＬ単位）及び無水ＴＨＦ（３００ｍＬ）を乾燥円錐形反応器に導入し、ＰＣＬが完全に溶解するまでアルゴン雰囲気下に置いた。次いで、アルゴン下でＬＤＡ（１３．１６ｍＬ、εＣＬ単位に対して１当量、２６．３ミリモル）を添加する前に、溶液を液体窒素／エタノール混合物に浸すことによって溶液を－５０℃に冷却した。３０分間の反応後、最少量の無水ＴＨＦ中のヨウ素（６．６８ｇ、εＣＬ単位に対して１当量 ２６．３ミリモル）の溶液を、隔壁を通してシリンジで注入し、混合物を撹拌及びアルゴン雰囲気下で－５０℃に保った。３０分後、ＮＨ４Ｃｌ（ａｑ）の水溶液（２Ｍ、２００ｍＬ）を加えることによって反応を停止し、温度を０℃に上げた後、ＨＣｌ（ａｑ）（３７％）を加えて、中性ｐＨに達した。分液漏斗中、ジクロロメタン（３×２００ｍＬ）で３回洗浄することにより、溶液からポリマーを抽出した。有機相を収集し、Ｎａ２Ｓ２Ｏ３溶液（３×１００ｍＬ、過剰）で３回洗浄し、ＭｇＳＯ４粉末を使用して乾燥させ、濾過し、ロータリーエバポレーターを使用して減圧下で濃縮した。ポリマーを冷メタノール中で沈殿させ、濾過し、減圧下で乾燥させた。
ＰＣＬ骨格は、ＬＤＡを使用してアニオン的に活性化され、求電子置換後にヨウ素によって修飾された。この合成では、ＰＣＬ（３ｇ、Ｍｎ，ＳＥＣ，ＴＨＦ，＝６５０００ｇ／モル、２６．３ミリモルのＣＬ単位）及び無水ＴＨＦ（３００ｍＬ）を乾燥円錐形反応器に導入し、ＰＣＬが完全に溶解するまでアルゴン雰囲気下に置いた。次いで、アルゴン下でＬＤＡ（１３．１６ｍＬ、εＣＬ単位に対して１当量、２６．３ミリモル）を添加する前に、溶液を液体窒素／エタノール混合物に浸すことによって溶液を－５０℃に冷却した。３０分間の反応後、最少量の無水ＴＨＦ中のヨウ素（６．６８ｇ、εＣＬ単位に対して１当量 ２６．３ミリモル）の溶液を、隔壁を通してシリンジで注入し、混合物を撹拌及びアルゴン雰囲気下で－５０℃に保った。３０分後、ＮＨ４Ｃｌ（ａｑ）の水溶液（２Ｍ、２００ｍＬ）を加えることによって反応を停止し、温度を０℃に上げた後、ＨＣｌ（ａｑ）（３７％）を加えて、中性ｐＨに達した。分液漏斗中、ジクロロメタン（３×２００ｍＬ）で３回洗浄することにより、溶液からポリマーを抽出した。有機相を収集し、Ｎａ２Ｓ２Ｏ３溶液（３×１００ｍＬ、過剰）で３回洗浄し、ＭｇＳＯ４粉末を使用して乾燥させ、濾過し、ロータリーエバポレーターを使用して減圧下で濃縮した。ポリマーを冷メタノール中で沈殿させ、濾過し、減圧下で乾燥させた。
【0094】
特徴づけ：
－ ＣＤＣＬ３中での１Ｈ ＮＭＲ：官能化率の決定（図１）：
－ 1H NMR (CDCl3, 300 MHz, ppm): 4.30 (m, R-CHI-CO), 4.05 (t, R-CH2-O-CO), 2.30 (t, R-CH2-CO-O), 2.00 (t, R-CH2-CHI), 1.64 (m, R-CH2-C-CO), 1.38 (m, R-CH2-R)
－ ＴＨＦ中でのＳＥＣ：数平均分子量の決定（図２）。
－ ＣＤＣＬ３中での１Ｈ ＮＭＲ：官能化率の決定（図１）：
－ 1H NMR (CDCl3, 300 MHz, ppm): 4.30 (m, R-CHI-CO), 4.05 (t, R-CH2-O-CO), 2.30 (t, R-CH2-CO-O), 2.00 (t, R-CH2-CHI), 1.64 (m, R-CH2-C-CO), 1.38 (m, R-CH2-R)
－ ＴＨＦ中でのＳＥＣ：数平均分子量の決定（図２）。
【0095】
結果：
置換度は、ヨウ素の隣接プロトンに対応する４．３０ｐｐｍの共鳴ピークと、非置換メチレン基に対応する４．０５ｐｐｍの共鳴ピークの積分値を比較することによって計算した（図１、表２）。
置換度は、ヨウ素の隣接プロトンに対応する４．３０ｐｐｍの共鳴ピークと、非置換メチレン基に対応する４．０５ｐｐｍの共鳴ピークの積分値を比較することによって計算した（図１、表２）。
【0096】
【表2】
【0097】
実施例２：ＰＣＬ－グラフト－ＰＤＡの合成
典型的には、シュレンクフラスコＡに、ヨウ素化ＰＣＬ（１．５ｇ、１．１８ミリモルのヨウ素化ＣＬ単位）及びＤＭＳＯ（２０ｍＬ）を加えた。シュレンクフラスコＢに、ドーパミン－ＨＣｌ（５．６２ｇ、ヨウ素化ＣＬ単位に対して２５当量、２９．６ミリモル）、ＰＭＤＥＴＡ（３７０μＬ、ヨウ素化ＣＬ単位に対して１．５当量、１．７８ミリモル）、Ｎａ２ＣＯ３（３００．０ｍｇ）、ＢＰＯ（７．１８ｇ、ヨウ素化ＣＬ単位に対して２５当量、２９．６ミリモル）、及びＤＭＳＯ（３７ｍＬ）を加えた。溶液を撹拌及びアルゴン流下で４時間放置した。次に、３回の凍結-ポンプ融解サイクルによって酸素を除去した。ヨウ素化ＰＣＬ溶液をフラスコＢに移し、臭化銅（Ｉ）（２５５ｍｇ、ヨウ素化ＣＬに対して１．５当量、１．７８ミリモル）を加えた。次いで、フラスコを不活性雰囲気下で７０℃の油浴に浸し、４８時間激しく撹拌した。液体窒素浴中で冷却することにより反応を停止させた。ＤＭＳＯを真空下１１０℃で蒸発させることによって、溶液を濃縮した。共重合体をメタノール中で沈殿させ、濾過し、真空下で乾燥させた。
典型的には、シュレンクフラスコＡに、ヨウ素化ＰＣＬ（１．５ｇ、１．１８ミリモルのヨウ素化ＣＬ単位）及びＤＭＳＯ（２０ｍＬ）を加えた。シュレンクフラスコＢに、ドーパミン－ＨＣｌ（５．６２ｇ、ヨウ素化ＣＬ単位に対して２５当量、２９．６ミリモル）、ＰＭＤＥＴＡ（３７０μＬ、ヨウ素化ＣＬ単位に対して１．５当量、１．７８ミリモル）、Ｎａ２ＣＯ３（３００．０ｍｇ）、ＢＰＯ（７．１８ｇ、ヨウ素化ＣＬ単位に対して２５当量、２９．６ミリモル）、及びＤＭＳＯ（３７ｍＬ）を加えた。溶液を撹拌及びアルゴン流下で４時間放置した。次に、３回の凍結-ポンプ融解サイクルによって酸素を除去した。ヨウ素化ＰＣＬ溶液をフラスコＢに移し、臭化銅（Ｉ）（２５５ｍｇ、ヨウ素化ＣＬに対して１．５当量、１．７８ミリモル）を加えた。次いで、フラスコを不活性雰囲気下で７０℃の油浴に浸し、４８時間激しく撹拌した。液体窒素浴中で冷却することにより反応を停止させた。ＤＭＳＯを真空下１１０℃で蒸発させることによって、溶液を濃縮した。共重合体をメタノール中で沈殿させ、濾過し、真空下で乾燥させた。
【0098】
特徴づけ：
－ ＤＭＳＯ－ｄ６中での１Ｈ ＮＭＲ：グラフト共重合体の化学修飾及び純度のハイライト（図３）。
－ ＤＭＳＯ－ｄ６中でのＤＯＳＹ ＮＭＲ：４．５８ｐｐｍのピークによるグラフト化の確認（図４）。
－ ＤＭＳＯ中でのＳＥＣ（λ＝３５０ｎｍにおけるＵＶ）：共重合体中のＰＤＡの存在の確認（図５）。
－ ＴＧＡ：ＰＤＡ含有量の定量化（図６）。
－ ＤＳＣ：共重合体の融解温度の決定（図７）。
－ ＤＭＳＯ－ｄ６中での１Ｈ ＮＭＲ：グラフト共重合体の化学修飾及び純度のハイライト（図３）。
－ ＤＭＳＯ－ｄ６中でのＤＯＳＹ ＮＭＲ：４．５８ｐｐｍのピークによるグラフト化の確認（図４）。
－ ＤＭＳＯ中でのＳＥＣ（λ＝３５０ｎｍにおけるＵＶ）：共重合体中のＰＤＡの存在の確認（図５）。
－ ＴＧＡ：ＰＤＡ含有量の定量化（図６）。
－ ＤＳＣ：共重合体の融解温度の決定（図７）。
【0099】
結果：
１Ｈ ＮＭＲでは、４．５８、１．９０及び１．８０ｐｐｍのピークは、ＰＣＬへのグラフト化（図４）から生じる、塩基性条件下でのヨウ素化ＰＣＬ修飾の特徴である（図３）。ＵＶ－ＳＥＣ分析では、ＰＣＬ－ｇ－ＰＤＡ共重合体及びＰＤＡは、２５４ｎｍ～４５０ｎｍを吸収する（図５）。残留ノイズを回避するため、波長として３５０ｎｍを選択した。ピーク強度はＰＤＡ含有量に比例する。ＰＤＡ含有量もまた、ＴＧＡ分析によって測定した（図６）。ＰＣＬ－ｇ－ＰＤＡの融解温度は、ＤＳＣ分析による最初の加熱ランプで測定して、４９℃である（図７）。結果の概要は、以下の表３にも示されている。
１Ｈ ＮＭＲでは、４．５８、１．９０及び１．８０ｐｐｍのピークは、ＰＣＬへのグラフト化（図４）から生じる、塩基性条件下でのヨウ素化ＰＣＬ修飾の特徴である（図３）。ＵＶ－ＳＥＣ分析では、ＰＣＬ－ｇ－ＰＤＡ共重合体及びＰＤＡは、２５４ｎｍ～４５０ｎｍを吸収する（図５）。残留ノイズを回避するため、波長として３５０ｎｍを選択した。ピーク強度はＰＤＡ含有量に比例する。ＰＤＡ含有量もまた、ＴＧＡ分析によって測定した（図６）。ＰＣＬ－ｇ－ＰＤＡの融解温度は、ＤＳＣ分析による最初の加熱ランプで測定して、４９℃である（図７）。結果の概要は、以下の表３にも示されている。
【0100】
【表3】
【0101】
ＴＧＡによるＰＤＡ含有量の定量化は、本明細書に記載される装置を使用した、ＰＣＬ、ＰＣＬ－ｇ－ＰＤＡ、及びオリゴ－ＰＤＡの６００℃での残留質量に基づく。次に、ＰＤＡ含有量は次式を使用して計算される：
【0102】
３回精製したＰＣＬ－ｇ－ＰＤＡ共重合体中のＰＤＡの割合は約３重量％であった。
【0103】
別の精製方法には、冷メタノールからの粉砕が含まれる：メタノールからの沈殿による最初の精製ステップの後、共重合体は冷メタノールからの粉砕によってさらに精製することができる。より具体的には、３００ｍｇの共重合体をファルコンチューブに入れる。４５ｍＬの冷メタノールを加え、ポリマー粉末を数分間粉砕した後、遠心分離（０℃、５０００ｒｐｍ、１５分間）で回収する。このステップは乾燥前にもう一回繰り返される。（粉砕ステップ収率＝５０％）。
【0104】
本明細書、とりわけ表３に開示されたデータは、粉砕を含まず、メタノールからの沈殿のみを含んでいた。
【0105】
実施例３：薬物がロードされたインプラントの調製
実施例２で得られた、ＰＣＬ（Ｍｎ約６００００ｇ／モル）又はＰＣＬ－ｇ－ＰＤＡ（１００～５００ｍｇ）、及び適量のＤＥＸ又はＣＩＰ．ＨＣｌ（最終重量の１０％及び３０％に相当）をＤＭＳＯ（５～３０ｍＬ）中に分散させて完全に混合した。ＤＭＳＯを減圧下１１０℃で除去して、共重合体／薬物の薄膜を得た。膜を粉砕し、得られた粉末をＴｅｆｌｏｎシート上に堆積させた。粉末を１３０℃、４トンで１５分間加圧した（図８参照）。
実施例２で得られた、ＰＣＬ（Ｍｎ約６００００ｇ／モル）又はＰＣＬ－ｇ－ＰＤＡ（１００～５００ｍｇ）、及び適量のＤＥＸ又はＣＩＰ．ＨＣｌ（最終重量の１０％及び３０％に相当）をＤＭＳＯ（５～３０ｍＬ）中に分散させて完全に混合した。ＤＭＳＯを減圧下１１０℃で除去して、共重合体／薬物の薄膜を得た。膜を粉砕し、得られた粉末をＴｅｆｌｏｎシート上に堆積させた。粉末を１３０℃、４トンで１５分間加圧した（図８参照）。
【0106】
実施例４：Ｉｎ ｖｉｔｒｏでの放出の研究
ＰＣＬ及び実施例３で得られたＰＣＬ－ｇ－ＰＤＡ膜からの薬物の放出を、０．０５％ｖ／ｖのＴｗｅｅｎ ２０を含有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）中、３７℃で一定の軌道振盪（１００ｒｐｍ）下で評価した。典型的には、１０ｍｇの薬物／共重合体膜を、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含有する２０ｍＬのリン酸緩衝液に３７℃で浸した。特定の時点で、放出媒体全体を除去し、２０ｍＬの新しい緩衝液と置き換えた。移動相としてアセトニトリル／ＴＦＡ（１０００／１）及び水／ＴＦＡ（１０００／１）（１０：９０から、４０：６０）の比率を使用して、薬物の最大吸光波長（２００～４００ｎｍの範囲）でＵＶ検出を使用するＨＰＬＣによって、収集した試料を分析した。
ＰＣＬ及び実施例３で得られたＰＣＬ－ｇ－ＰＤＡ膜からの薬物の放出を、０．０５％ｖ／ｖのＴｗｅｅｎ ２０を含有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）中、３７℃で一定の軌道振盪（１００ｒｐｍ）下で評価した。典型的には、１０ｍｇの薬物／共重合体膜を、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含有する２０ｍＬのリン酸緩衝液に３７℃で浸した。特定の時点で、放出媒体全体を除去し、２０ｍＬの新しい緩衝液と置き換えた。移動相としてアセトニトリル／ＴＦＡ（１０００／１）及び水／ＴＦＡ（１０００／１）（１０：９０から、４０：６０）の比率を使用して、薬物の最大吸光波長（２００～４００ｎｍの範囲）でＵＶ検出を使用するＨＰＬＣによって、収集した試料を分析した。
【0107】
結果：
薬物放出動態は、共重合体中のＰＤＡの存在、薬物の選択、及び薬物のパーセンテージの関数として変化する。共重合体中のＰＤＡ含有量は、ＴＧ分析によって１重量％～２０重量％の間と推定される。デキサメタゾン及びシプロフロキサシン塩酸塩の両方の放出動態は、ＰＣＬをロードした膜と比較してＰＣＬ－ｇ－ＰＤＡ膜では遅くなり、インプラント内のＰＤＡ部分の割合に従って調節される。（図９Ａ及び９Ｂ）。
薬物放出動態は、共重合体中のＰＤＡの存在、薬物の選択、及び薬物のパーセンテージの関数として変化する。共重合体中のＰＤＡ含有量は、ＴＧ分析によって１重量％～２０重量％の間と推定される。デキサメタゾン及びシプロフロキサシン塩酸塩の両方の放出動態は、ＰＣＬをロードした膜と比較してＰＣＬ－ｇ－ＰＤＡ膜では遅くなり、インプラント内のＰＤＡ部分の割合に従って調節される。（図９Ａ及び９Ｂ）。
【0108】
実施例５：生物学的（細胞障害性）研究
線維芽細胞
ＰＣＬ－ｇ－ＰＤＡ膜の細胞障害性を、マウス線維芽細胞株Ｌ９２９（ＮＣＴＣクローン９２９、ＥＣＡＣＣ８５０１１４２５）で分析した。Ｌ９２９細胞を、１ｍＭのＬ－グルタミン、５％ｖ／ｖのウシ胎仔血清、及び１００Ｕ／ｍＬのペニシリン及びストレプトマイシン１００μｇ／ｍＬを添加した４．５ｇ／ＬのＤ－グルコースのＤＭＥＭ中で、加湿５％ＣＯ２下、３７℃で培養した。０．２５％のジブチルジチオカルバミン酸亜鉛（ＺＤＢＣ）を含むポリウレタン膜（秦野研究所、ＦＤＳＣ、バッチＢ－１７３Ｋ）を陽性標準物質（ＲＭ）として使用し、高密度ポリエチレン膜（秦野研究所、ＦＤＳＣ、バッチＣ－１６１）を陰性ＲＭとして使用した。細胞を２４ウェルプレートに６００００細胞／ウェルの密度で播種し、３７℃で一晩インキュベートした。ＰＣＬ及びＰＣＬ－ｇ－ＰＤＡ膜（直径６ｍｍ、厚さ０．５ｍｍ未満）を除染するために、各面に２５４ｎｍで２分間照射した。膜をウェルに加え、細胞とともに２４時間インキュベートした。膜を除去し、培地を５００μＬのＰｒｅｓｔｏＢｌｕｅ（登録商標）（ＰＢ）溶液（培地中１０％）と交換し、３０分間インキュベートした。ＰＢアッセイは蛍光（λｅｘ＝５５８ｎｍ、λｅｍ＝５９３ｎｍ）を使用して実施した。各実験を３回繰り返して実施した。メタノール中で精製されたＰＣＬ－ｇ－ＰＤＡ共重合体は、２４時間のインキュベート後の細胞の生存を可能にする（図１０）。
線維芽細胞
ＰＣＬ－ｇ－ＰＤＡ膜の細胞障害性を、マウス線維芽細胞株Ｌ９２９（ＮＣＴＣクローン９２９、ＥＣＡＣＣ８５０１１４２５）で分析した。Ｌ９２９細胞を、１ｍＭのＬ－グルタミン、５％ｖ／ｖのウシ胎仔血清、及び１００Ｕ／ｍＬのペニシリン及びストレプトマイシン１００μｇ／ｍＬを添加した４．５ｇ／ＬのＤ－グルコースのＤＭＥＭ中で、加湿５％ＣＯ２下、３７℃で培養した。０．２５％のジブチルジチオカルバミン酸亜鉛（ＺＤＢＣ）を含むポリウレタン膜（秦野研究所、ＦＤＳＣ、バッチＢ－１７３Ｋ）を陽性標準物質（ＲＭ）として使用し、高密度ポリエチレン膜（秦野研究所、ＦＤＳＣ、バッチＣ－１６１）を陰性ＲＭとして使用した。細胞を２４ウェルプレートに６００００細胞／ウェルの密度で播種し、３７℃で一晩インキュベートした。ＰＣＬ及びＰＣＬ－ｇ－ＰＤＡ膜（直径６ｍｍ、厚さ０．５ｍｍ未満）を除染するために、各面に２５４ｎｍで２分間照射した。膜をウェルに加え、細胞とともに２４時間インキュベートした。膜を除去し、培地を５００μＬのＰｒｅｓｔｏＢｌｕｅ（登録商標）（ＰＢ）溶液（培地中１０％）と交換し、３０分間インキュベートした。ＰＢアッセイは蛍光（λｅｘ＝５５８ｎｍ、λｅｍ＝５９３ｎｍ）を使用して実施した。各実験を３回繰り返して実施した。メタノール中で精製されたＰＣＬ－ｇ－ＰＤＡ共重合体は、２４時間のインキュベート後の細胞の生存を可能にする（図１０）。
【0109】
ヒト網膜細胞
ＰＣＬ及びＰＣＬ－ｇ－ＰＤＡ膜の細胞障害性を、ヒト網膜上皮細胞株であるＡＲＰＥ－１９（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ－２３０２）で分析した（図１１）。ＡＲＰＥ－１９細胞を、１０％ｖ／ｖウシ胎仔血清を添加したダルベッコ改変イーグル培地／栄養混合物Ｆ－１２（ＤＭＥＭ：Ｆ－１２、ＡＴＣＣ３０－２００６）中、加湿５％ＣＯ２下、３７℃で培養した。０．１％ジエチルジチオカルバミド酸亜鉛（ＺＤＥＣ）を含むポリウレタン膜（日本所在の食品薬品安全センター秦野研究所、バッチＡ－２０２Ｋ）を陽性標準物質（ＲＭ）として使用し、高密度ポリエチレン膜（日本所在の食品薬品安全センター秦野研究所、バッチＣ－１４１）を陰性ＲＭとして使用した。細胞を２４ウェルプレートに２００００細胞／ウェルの密度で播種し、加湿５％ＣＯ２下、３７℃で一晩インキュベートした。ＰＣＬ及びＰＣＬ－ｇ－ＰＤＡ膜並びにＲＭ対照（直径７ｍｍ、厚さ０．５ｍｍ未満）を、汚染除去のために各面に２回、λ＝２５４ｎｍで２分間照射した。膜をウェルに加え、細胞とともに４８時間インキュベートした。膜を除去し、培地をＰｒｅｓｔｏＢｌｕｅ（登録商標）（ＰＢ）溶液（細胞培地中１０％））と交換し、３０分間インキュベートした。ＰＢアッセイは蛍光（λｅｘ＝５５８ｎｍ、λｅｍ＝５９３ｎｍ）を使用して実施した。各実験を４回繰り返して実施した。
ＰＣＬ及びＰＣＬ－ｇ－ＰＤＡ膜の細胞障害性を、ヒト網膜上皮細胞株であるＡＲＰＥ－１９（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ－２３０２）で分析した（図１１）。ＡＲＰＥ－１９細胞を、１０％ｖ／ｖウシ胎仔血清を添加したダルベッコ改変イーグル培地／栄養混合物Ｆ－１２（ＤＭＥＭ：Ｆ－１２、ＡＴＣＣ３０－２００６）中、加湿５％ＣＯ２下、３７℃で培養した。０．１％ジエチルジチオカルバミド酸亜鉛（ＺＤＥＣ）を含むポリウレタン膜（日本所在の食品薬品安全センター秦野研究所、バッチＡ－２０２Ｋ）を陽性標準物質（ＲＭ）として使用し、高密度ポリエチレン膜（日本所在の食品薬品安全センター秦野研究所、バッチＣ－１４１）を陰性ＲＭとして使用した。細胞を２４ウェルプレートに２００００細胞／ウェルの密度で播種し、加湿５％ＣＯ２下、３７℃で一晩インキュベートした。ＰＣＬ及びＰＣＬ－ｇ－ＰＤＡ膜並びにＲＭ対照（直径７ｍｍ、厚さ０．５ｍｍ未満）を、汚染除去のために各面に２回、λ＝２５４ｎｍで２分間照射した。膜をウェルに加え、細胞とともに４８時間インキュベートした。膜を除去し、培地をＰｒｅｓｔｏＢｌｕｅ（登録商標）（ＰＢ）溶液（細胞培地中１０％））と交換し、３０分間インキュベートした。ＰＢアッセイは蛍光（λｅｘ＝５５８ｎｍ、λｅｍ＝５９３ｎｍ）を使用して実施した。各実験を４回繰り返して実施した。
【0110】
細胞生存率のパーセンテージは、次の式（１）を使用して計算した：
【0111】
実施例６：ｉｎ ｖｉｔｒｏでの分解
分解の動態を、標準条件（ｐＨ＝７．４のＰＢＳ）及び加速条件（ｐＨ＝１のＨＣｌ水溶液（２Ｍ））下、３７℃で７５日間、ポリマー膜上でｉｎ ｖｉｔｒｏで研究した。ＩＳＯ－１０９９３－１３に従って、膜をインプラント（寸法＝１０×４ｍｍ、厚さ＝０．３～０．５ｍｍ）へと切断し、重量を量り（１５ｍｇ、ｗｄｒｙ，ｔ０）、０．７５ｍＬの培地に撹拌しつつ浸漬した。所定の時点で、インプラントを媒体から取り出し、水で洗浄し、拭き取り、重量を測定して湿潤質量（ｗｗｅ，ｔ）を決定し、次いで、減圧下で一定質量になるまで乾燥させて乾燥質量（ｗｄｒｙ，ｔｘ）を決定した。これらの実験を３回繰り返して実施した。水の取り込みは式（２）から計算し、残りの重量は式（３）から計算し、残りの分子量は式（４）から計算した。ｐＨは、２０℃でｐＨメータを使用して評価した。
分解の動態を、標準条件（ｐＨ＝７．４のＰＢＳ）及び加速条件（ｐＨ＝１のＨＣｌ水溶液（２Ｍ））下、３７℃で７５日間、ポリマー膜上でｉｎ ｖｉｔｒｏで研究した。ＩＳＯ－１０９９３－１３に従って、膜をインプラント（寸法＝１０×４ｍｍ、厚さ＝０．３～０．５ｍｍ）へと切断し、重量を量り（１５ｍｇ、ｗｄｒｙ，ｔ０）、０．７５ｍＬの培地に撹拌しつつ浸漬した。所定の時点で、インプラントを媒体から取り出し、水で洗浄し、拭き取り、重量を測定して湿潤質量（ｗｗｅ，ｔ）を決定し、次いで、減圧下で一定質量になるまで乾燥させて乾燥質量（ｗｄｒｙ，ｔｘ）を決定した。これらの実験を３回繰り返して実施した。水の取り込みは式（２）から計算し、残りの重量は式（３）から計算し、残りの分子量は式（４）から計算した。ｐＨは、２０℃でｐＨメータを使用して評価した。
【0112】
結果：
ｐＨ＝７．４では、ＰＣＬ－ｇ－ＰＤＡインプラントは、その初期質量（図１２）、分子量（図１３）、及び形状（図１４）を、水を取り込むことなく（図１５）保持し、ｐＨは１１０日間安定したままである（図１６）。ｐＨ＝１では、ＰＣＬ－ｇ－ＰＤＡインプラントは、その初期質量（図１７）及び分子量（図１８）を直ちに失い、壊れて脆くなった（図１９）。ＰＣＬ－ｇ－ＰＤＡインプラントは、分解性であり、局所ｐＨ値が変化することなく、標準条件下、ｉｎ ｖｉｔｒｏで極めてゆっくりと分解すると予想される。
ｐＨ＝７．４では、ＰＣＬ－ｇ－ＰＤＡインプラントは、その初期質量（図１２）、分子量（図１３）、及び形状（図１４）を、水を取り込むことなく（図１５）保持し、ｐＨは１１０日間安定したままである（図１６）。ｐＨ＝１では、ＰＣＬ－ｇ－ＰＤＡインプラントは、その初期質量（図１７）及び分子量（図１８）を直ちに失い、壊れて脆くなった（図１９）。ＰＣＬ－ｇ－ＰＤＡインプラントは、分解性であり、局所ｐＨ値が変化することなく、標準条件下、ｉｎ ｖｉｔｒｏで極めてゆっくりと分解すると予想される。
【0113】
実施例７：ＰＣＬ－ｂ－ＰＥＧ－ｂ－ＰＣＬ（「Ｔ」）の合成
乾燥したシュレンクフラスコ内で、ＰＥＧ（５．０ｇ、２．５ミリモル、Ｍｎ＝２０００ｇ／モル）を、アルゴン雰囲気下、５５ｍＬの乾燥トルエンに可溶化した。次いで、Ｓｎ（Ｏｃｔ）２（０．２０ｇ、０．５ミリモル）及びε－ＣＬモノマー（４．９９ｇ、４３．８ミリモル、１７．５当量）を、依然として不活性雰囲気下で添加した。水及び酸素を３回の凍結-ポンプ融解サイクルによって除去した。反応は、アルゴン流下及び強撹拌下、１００℃で２４時間実施した。数滴のＨＣｌ溶液（メタノール中、０．１Ｍ）を添加することにより、反応を停止させた。生成物を冷ジエチルエーテル中で沈殿させ、濾過し、減圧下で乾燥させた。
乾燥したシュレンクフラスコ内で、ＰＥＧ（５．０ｇ、２．５ミリモル、Ｍｎ＝２０００ｇ／モル）を、アルゴン雰囲気下、５５ｍＬの乾燥トルエンに可溶化した。次いで、Ｓｎ（Ｏｃｔ）２（０．２０ｇ、０．５ミリモル）及びε－ＣＬモノマー（４．９９ｇ、４３．８ミリモル、１７．５当量）を、依然として不活性雰囲気下で添加した。水及び酸素を３回の凍結-ポンプ融解サイクルによって除去した。反応は、アルゴン流下及び強撹拌下、１００℃で２４時間実施した。数滴のＨＣｌ溶液（メタノール中、０．１Ｍ）を添加することにより、反応を停止させた。生成物を冷ジエチルエーテル中で沈殿させ、濾過し、減圧下で乾燥させた。
【0114】
トリブロック共重合体の分子量を次の式（５）～（８）に従って計算した：
【0115】
エチレングリコール単位の分子量は４４ｇ／モル、ε－カプロラクトン単位の分子量は１１４ｇ／モルである。
【0116】
変換率は、精製後のＮＭＲによって得られるＤＰＣＬを理論値と比較することによって算出する。収率（η）は、得られたポリマーの質量を、ＮＭＲによって算出された変換率を考慮して得られたポリマーの理論質量値と比較することによって算出する。
変換：８６％
収率：９３％
1H NMR (600 MHz, DMSOd6): δ = 3.99 (t, R-CH2-O-CO), 3.5 (m, R-CH2-O), 2.27 (t, R-CH2-CO-O), 1.54 (m, R-CH2-CH2-CO), 1.30 (m, R-CH2-R)
ＳＥＣ（ＴＨＦ、ＲＩ、ＰＳ）：Ｍｎ＝６１４３ｇ／モル、Ｄ＝１．０９
ＳＥＣ（ＤＭＦ、ＲＩ、ＰＥＧ）：Ｍｎ＝３５２９ｇ／モル、Ｄ＝１．０７
収率：９３％
1H NMR (600 MHz, DMSOd6): δ = 3.99 (t, R-CH2-O-CO), 3.5 (m, R-CH2-O), 2.27 (t, R-CH2-CO-O), 1.54 (m, R-CH2-CH2-CO), 1.30 (m, R-CH2-R)
ＳＥＣ（ＴＨＦ、ＲＩ、ＰＳ）：Ｍｎ＝６１４３ｇ／モル、Ｄ＝１．０９
ＳＥＣ（ＤＭＦ、ＲＩ、ＰＥＧ）：Ｍｎ＝３５２９ｇ／モル、Ｄ＝１．０７
【0117】
上述の方法と同様に、次のＰＣＬ－ｂ－ＰＥＧ－ｂ－ＰＣＬポリマーを合成した（表４参照）。表４において、１０００ｇ／モルのＰＥＧと２０００ｇ／モルのＰＣＬからなるＰＣＬ－ｂ－ＰＥＧ－ｂ－ＰＣＬ型のポリマーは、「１０００－２０００－１０００」と定義される。さらには、ＰＣＬ－ｂ－ＰＥＧ－ｂ－ＰＣＬ共重合体は、本明細書では「Ｔ」と指定される。
【0118】
【表4】
【0119】
実施例８：ヨウ素化（ＰＣＬ－Ｉ）－ｂ－ＰＥＧ－ｂ－（ＰＣＬ－Ｉ）（「Ｔ－Ｉ」）の合成
典型的な実験では、実施例７から得られたポリマー、例えば表４の登録番号５のＰＣＬ－ｂ－ＰＥＧ－ｂ－ＰＣＬ（４ｇ、Ｍｎ，ＮＭＲ＝３７１０ｇ／モル、１．０８ミリモル、１６．２ミリモルのＣＬ単位）と、無水ＴＨＦ（２００ｍＬ）とを乾燥円錐形反応器に導入し、完全に溶解するまでアルゴン流下に置いた。次いで、アルゴン下でＬＤＡ（８．０９ｍＬ、１６．２ミリモル）を添加する前に、溶液を液体窒素／エタノール混合物に浸すことによって溶液を－５０℃に冷却した。３０分間の反応後、最少量の無水ＴＨＦ中のヨウ素（４．１０ｇ、１．６２ミリモル）の溶液を、隔壁を通してシリンジで注入し、混合物を撹拌及びアルゴン雰囲気下で－５０℃に保った。３０分後、ＮＨ４Ｃｌの水溶液（２Ｍ、２００ｍＬ）を加えることによって反応を停止し、温度を０℃に上げた後、ＨＣｌ（ａｑ）（３７％）を加えて、中性ｐＨに達した。次いで、分液漏斗内でジクロロメタン（３×２００ｍＬ）で３回洗浄することにより、溶液からポリマーを抽出した。有機相を収集し、Ｎａ２Ｓ２Ｏ３溶液（０．３Ｍ、３×１００ｍＬ）で３回洗浄し、ＭｇＳＯ４粉末を使用して乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮した。ポリマーを冷ジエチルエーテル中で沈殿させ、濾過し、減圧下で乾燥させた。
置換：２３モル％
収率：５０重量％
1H NMR (600 MHz, DMSOd6): δ = 4.44 (m, R-CHI-CO-O), 3.99 (t, R-CH2-O-CO), 3.50 (m, R-CH2-O), 2.27 (t, R-CH2-CO-O), 1.87 (m, R-CH2-CHI), 1.54 (m, R-CH2-CH2-CO), 1.30 (m, R-CH2-R)
ＳＥＣ（ＴＨＦ、ＲＩ、ＰＳ）：Ｍｎ＝５７６０ｇ／モル、Ｄ＝１．２８
ＳＥＣ（ＤＭＦ、ＲＩ、ＰＥＧ）：Ｍｎ＝３５００ｇ／モル、Ｄ＝１．２４
典型的な実験では、実施例７から得られたポリマー、例えば表４の登録番号５のＰＣＬ－ｂ－ＰＥＧ－ｂ－ＰＣＬ（４ｇ、Ｍｎ，ＮＭＲ＝３７１０ｇ／モル、１．０８ミリモル、１６．２ミリモルのＣＬ単位）と、無水ＴＨＦ（２００ｍＬ）とを乾燥円錐形反応器に導入し、完全に溶解するまでアルゴン流下に置いた。次いで、アルゴン下でＬＤＡ（８．０９ｍＬ、１６．２ミリモル）を添加する前に、溶液を液体窒素／エタノール混合物に浸すことによって溶液を－５０℃に冷却した。３０分間の反応後、最少量の無水ＴＨＦ中のヨウ素（４．１０ｇ、１．６２ミリモル）の溶液を、隔壁を通してシリンジで注入し、混合物を撹拌及びアルゴン雰囲気下で－５０℃に保った。３０分後、ＮＨ４Ｃｌの水溶液（２Ｍ、２００ｍＬ）を加えることによって反応を停止し、温度を０℃に上げた後、ＨＣｌ（ａｑ）（３７％）を加えて、中性ｐＨに達した。次いで、分液漏斗内でジクロロメタン（３×２００ｍＬ）で３回洗浄することにより、溶液からポリマーを抽出した。有機相を収集し、Ｎａ２Ｓ２Ｏ３溶液（０．３Ｍ、３×１００ｍＬ）で３回洗浄し、ＭｇＳＯ４粉末を使用して乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮した。ポリマーを冷ジエチルエーテル中で沈殿させ、濾過し、減圧下で乾燥させた。
置換：２３モル％
収率：５０重量％
1H NMR (600 MHz, DMSOd6): δ = 4.44 (m, R-CHI-CO-O), 3.99 (t, R-CH2-O-CO), 3.50 (m, R-CH2-O), 2.27 (t, R-CH2-CO-O), 1.87 (m, R-CH2-CHI), 1.54 (m, R-CH2-CH2-CO), 1.30 (m, R-CH2-R)
ＳＥＣ（ＴＨＦ、ＲＩ、ＰＳ）：Ｍｎ＝５７６０ｇ／モル、Ｄ＝１．２８
ＳＥＣ（ＤＭＦ、ＲＩ、ＰＥＧ）：Ｍｎ＝３５００ｇ／モル、Ｄ＝１．２４
【0120】
実施例９：（ＰＣＬ－ｇ－ＰＤＡ）－ｂ－ＰＥＧ－ｂ－（ＰＣＬ－ｇ－ＰＤＡ）（「Ｔ－ＰＤＡ」）の合成
典型的な実験では、実施例８から得られたヨウ素化ポリマー、例えば（ＰＣＬ－Ｉ）－ｂ－ＰＥＧ－ｂ－（ＰＣＬ－Ｉ）（１．５ｇ、１．０７ミリモルのヨウ素化したＣＬ単位）を、最初のシュレンクフラスコ（シュレンクフラスコＡ）内でＤＭＳＯ（２０ｍＬ）と混合する。第２のシュレンクフラスコ（シュレンクフラスコＢ）に、ドーパミン塩酸塩（５．０９ｇ、ヨウ素化したＣＬ単位に対して２５当量、２６．８ミリモル）、ＰＭＤＥＴＡ（３４０μＬ、ヨウ素化したＣＬ単位に対して１．５当量、２６．８ミリモル）、Ｎａ２ＣＯ３（３００．０ｍｇ）、ＢＰＯ（６．４９ｇ、ヨウ素化したＣＬ単位に対して２５当量、２６．８ミリモル）、及びＤＭＳＯ（３７ｍＬ）を加えた。溶液を撹拌及びアルゴン流下で４時間放置した。次に、３回の凍結-ポンプ融解サイクルによって酸素を除去した。ヨウ素化したＰＣＬ溶液をフラスコＢに移し、臭化銅（Ｉ）（０．２３ｇ、ヨウ素化したＣＬに対して１．５当量、１．６１ミリモル）を加えた。次いで、フラスコを７０℃の油浴に浸し、４８時間、激しく撹拌した。液体窒素浴中で冷却することにより反応を停止させた。ＤＭＳＯを真空下７０℃で蒸発させることによって、溶液を濃縮した。ポリマーを水中で透析し、凍結乾燥した。
ＰＤＡ：３８～４９重量％
1H NMR (600 MHz, DMSOd6): δ= 4.57 (m, R-CH(PDA)-CO), 3.99 (t, R-CH2-O-CO), 3.5 (m, R-CH2-O), 2.27 (t, R-CH2-CO-O), 1.96 (m, R-CH2-CH(PDA)), 1.84 (m, R-CH2-CH(PDA)), 1.54 (m, R-CH2-CH2-CO), 1.30 (m, R-CH2-R)
ＳＥＣ（ＤＭＦ、ＲＩ、ＰＥＧ）：Ｍｎ＝３０００ｇ／モル、Ｄ＝１．２４
典型的な実験では、実施例８から得られたヨウ素化ポリマー、例えば（ＰＣＬ－Ｉ）－ｂ－ＰＥＧ－ｂ－（ＰＣＬ－Ｉ）（１．５ｇ、１．０７ミリモルのヨウ素化したＣＬ単位）を、最初のシュレンクフラスコ（シュレンクフラスコＡ）内でＤＭＳＯ（２０ｍＬ）と混合する。第２のシュレンクフラスコ（シュレンクフラスコＢ）に、ドーパミン塩酸塩（５．０９ｇ、ヨウ素化したＣＬ単位に対して２５当量、２６．８ミリモル）、ＰＭＤＥＴＡ（３４０μＬ、ヨウ素化したＣＬ単位に対して１．５当量、２６．８ミリモル）、Ｎａ２ＣＯ３（３００．０ｍｇ）、ＢＰＯ（６．４９ｇ、ヨウ素化したＣＬ単位に対して２５当量、２６．８ミリモル）、及びＤＭＳＯ（３７ｍＬ）を加えた。溶液を撹拌及びアルゴン流下で４時間放置した。次に、３回の凍結-ポンプ融解サイクルによって酸素を除去した。ヨウ素化したＰＣＬ溶液をフラスコＢに移し、臭化銅（Ｉ）（０．２３ｇ、ヨウ素化したＣＬに対して１．５当量、１．６１ミリモル）を加えた。次いで、フラスコを７０℃の油浴に浸し、４８時間、激しく撹拌した。液体窒素浴中で冷却することにより反応を停止させた。ＤＭＳＯを真空下７０℃で蒸発させることによって、溶液を濃縮した。ポリマーを水中で透析し、凍結乾燥した。
ＰＤＡ：３８～４９重量％
1H NMR (600 MHz, DMSOd6): δ= 4.57 (m, R-CH(PDA)-CO), 3.99 (t, R-CH2-O-CO), 3.5 (m, R-CH2-O), 2.27 (t, R-CH2-CO-O), 1.96 (m, R-CH2-CH(PDA)), 1.84 (m, R-CH2-CH(PDA)), 1.54 (m, R-CH2-CH2-CO), 1.30 (m, R-CH2-R)
ＳＥＣ（ＤＭＦ、ＲＩ、ＰＥＧ）：Ｍｎ＝３０００ｇ／モル、Ｄ＝１．２４
【0121】
ＮＭＲスペクトルでは、ヨウ素によるＰＣＬの官能基化からの特徴的なシグナルである４．４４ｐｐｍ及び１．８７ｐｐｍのピークの消失（実施例８参照）は、ドーパミンの導入及び重合後にポリマーの化学的環境が変化したことを示している。さらには、４．５７ｐｐｍ、１．９６ｐｐｍ、及び１．８４ｐｐｍにおけるピークの出現も、この化学的環境の変化を裏付けている。対応する１Ｈ－ＮＭＲスペクトル、すなわち表４の登録番号５によるポリマーＴに基づくＴ－Ｉ及びＴ－ＰＤＡが、図２０に示されている。化学シフトの変化がＰＣＬ骨格へのＰＤＡ側鎖の効果的なグラフト化に起因する可能性があることを確認するために、拡散秩序ＮＭＲ分光法（ＤＯＳＹ ＮＭＲ）分析を実施した。４．５７ｐｐｍ、１．９６ｐｐｍ、及び１．８４ｐｐｍのピークは、Ｔに起因するピークと同じ拡散係数（Ｄ＝－６．０２＊１０－１１ｍ２．ｓ－１）を示し、ＰＣＬ鎖上へのＰＤＡのグラフト化が証明された（図２１）。
【0122】
４５０ｎｍでのＵＶ検出を使用して、ＤＭＦ中でのＳＥＣによって、このＴ－ＰＤＡの分子量をさらに分析した。以前の共重合体はＴＨＦ中でのＳＥＣによって分析されたが、ＰＤＡを含む共重合体はＴＨＦに溶解しないことに留意することが重要である。
【0123】
ＰＤＡ含有量は、実施例２で説明したＴＧＡ法に従って、次の修正式を使用して定量化される：
【0124】
ＰＤＡの割合は３８重量％である。この高い値は、ＮＭＲで検出されたピークの強度と一致する、共重合体中の遊離のＰＤＡ及びグラフト化されたＰＤＡの質量を含んでいる（図２０及び２１）。グラフト化されたＰＤＡと遊離オリゴ－ＰＤＡのそれぞれの割合は不明である。
【0125】
実施例１０：タンパク質の安定性
ｍＡｂの安定性は、ＨＢＳ：ＰＥＧ４００ １：１（ｖ／ｖ）中、５％（ｗ／ｖ）の共重合体（Ｔ又はＴ－ＰＤＡ）で構成される製剤で評価した。製剤は、４０ｍｇ／ｍｌ（高用量（ＨＤ））のｍＡｂ又は１３ｍｇ／ｍｌ（低用量（ＬＤ））のｍＡｂのいずれかを含む。この実施例では、製剤は、製剤Ｘ－Ｙとして定義され、ここで、Ｘは共重合体（Ｔ、Ｔ－ＰＤＡ、Ｔ／Ｔ－ＰＤＡ）を指す文字であり、ＹはｍＡｂ用量（ＬＤ，ＨＤ）を指す数字である。本明細書で用いられる「Ｔ」ポリマーは、実施例７の表４の登録番号６を指し、得られるＴ－ＰＤＡは、実施例９に記載の方法で入手できる。各製剤について、ＳＥＣの特性パラメータの推移が図２２に示されている。製剤について表５に詳細が示されている。
ｍＡｂの安定性は、ＨＢＳ：ＰＥＧ４００ １：１（ｖ／ｖ）中、５％（ｗ／ｖ）の共重合体（Ｔ又はＴ－ＰＤＡ）で構成される製剤で評価した。製剤は、４０ｍｇ／ｍｌ（高用量（ＨＤ））のｍＡｂ又は１３ｍｇ／ｍｌ（低用量（ＬＤ））のｍＡｂのいずれかを含む。この実施例では、製剤は、製剤Ｘ－Ｙとして定義され、ここで、Ｘは共重合体（Ｔ、Ｔ－ＰＤＡ、Ｔ／Ｔ－ＰＤＡ）を指す文字であり、ＹはｍＡｂ用量（ＬＤ，ＨＤ）を指す数字である。本明細書で用いられる「Ｔ」ポリマーは、実施例７の表４の登録番号６を指し、得られるＴ－ＰＤＡは、実施例９に記載の方法で入手できる。各製剤について、ＳＥＣの特性パラメータの推移が図２２に示されている。製剤について表５に詳細が示されている。
【0126】
【表5】
【0127】
製剤Ｔ－ＨＤについては、試料の溶液は共重合体の白色粉末の存在に起因して白色であったが、移動相の添加後に透明に変化した。０日目及び３日目では、２８０ｎｍでの吸光度、相対波長比、および相対ＡＵＣは、ほぼ一定であった。その後、３日目から、ｍＡｂの強度と相対ＡＵＣは徐々に減少したが、相対波長比は一定のままであった。これらの結果は、検出されるｍＡｂの量を減少させる、ｍＡｂと共重合体との相互作用を示唆しており、これは製剤化前の研究の結果と一致している。
【0128】
製剤Ｔ／Ｔ－ＰＤＡ－ＨＤについては、試料の溶液は黒く、移動相の添加後に不鮮明にぼやけた。０日目から３０日目まで、検出されたｍＡｂの吸光度及び相対ＡＵＣは徐々に減少したが、相対波長比は一定のままであり、ｍＡｂと共重合体との相互作用が示唆された。Ｔ／Ｔ－ＰＤＡ－ＨＤの０日目の吸光度は、Ｔ－ＨＤの製剤と比較して、２で除算されており、ＴとＴ－ＰＤＡとの混合物に対するｍＡｂの初期相互作用がより強いことを示していることに留意されたい。さらに、０日目から３０日目までに検出されたｍＡｂの量の減少は、製剤Ｔ－ＨＤ（６３％のｍＡｂ検出損失）よりも製剤Ｔ／Ｔ－ＰＤＡ－ＨＤ（９３％のｍＡｂ検出損失）の方が大きかった。
【0129】
製剤Ｔ－ＰＤＡ－ＨＤについては、吸光度は２８０ｎｍで約５％であったが、２５４ｎｍでは０日目の波長比を計算するには十分ではなかった。その後、３日目から３０日目まで、ｍＡｂは検出されなかった。これは、ｍＡｂとＴ－ＰＤＡとの間の強力な相互作用を示唆している。製剤化前の安定性研究に関しては、共重合体の存在下でｍＡｂの漸進的な減少が観察されたことが示された。これらの結果は、ＰＤＡベースの共重合体がｍＡｂに対して強い親和性を示すことを裏付けている。
【0130】
結果として、ＳＥＣ－ＵＶスペクトルの比較は、試験した製剤、すなわち、ＨＢＳ：ＰＥＧ４００（１：１）及び１０％（ｗ／ｖ）の共重合体（Ｔ、Ｔ／Ｔ－ＰＤＡ、及びＴ－ＰＤＡ）から構成される３つの製剤は、ｍＡｂを変性させることなく、ｍＡｂと相互作用したことを実証している。Ｔ－ＰＤＡの存在下でｍＡｂの量の最大の減少が観察され、ＰＤＡに対するｍＡｂの高い親和性が証明された。
【0131】
実施例１１：デポーのｉｎ－ｓｉｔｕ形成
製剤Ｔ－ＨＤ、Ｔ／Ｔ－ＰＤＡ－ＨＤ、及びＴ－ＰＤＡ－ＨＤに基づいたｉｎ－ｓｉｔｕでのデポーの形成及び挙動が、それぞれ、図２３－Ａ、図２３－Ｂ、及び図２３－Ｃに示されている。それぞれのＬＤ製剤は同様に見えた。実施例で用いられる名称（例えば、Ｔ－ＨＤ）は、実施例１０で確立されたとおりである。
製剤Ｔ－ＨＤ、Ｔ／Ｔ－ＰＤＡ－ＨＤ、及びＴ－ＰＤＡ－ＨＤに基づいたｉｎ－ｓｉｔｕでのデポーの形成及び挙動が、それぞれ、図２３－Ａ、図２３－Ｂ、及び図２３－Ｃに示されている。それぞれのＬＤ製剤は同様に見えた。実施例で用いられる名称（例えば、Ｔ－ＨＤ）は、実施例１０で確立されたとおりである。
【0132】
注射直後（０日目）、バイアルの底でのｉｎ－ｓｉｔｕでのデポーの形成を観察することができる。製剤Ｔは、ＰＥＧ４００がＰＢＳ中に拡散する溶媒交換の機構に起因して、３日目にゲル状の沈殿した白い塊を形成した。その凝集体は５日目から３０日目にかけて、より小さくなったように見えた。製剤Ｔ／Ｔ－ＰＤＡは、３日目に、より小さく（Ｔの量が少ないことに起因）、黒い（Ｔ－ＰＤＡに起因）塊が形成され、外観は３０日目まで同様のままであった。おそらくはＰＤＡベースの不純物（例えば、追加のピークに対応する、ＳＥＣ－ＵＶで検出されたもの）の放出に起因して、放出媒体のわずかな着色が観察された。製剤Ｔ－ＰＤＡは、３日目に一部が底部に付着した薄膜を形成したが、その外観は３０日目まで同様のままであった。製剤Ｔ／Ｔ－ＰＤＡ及びＴ－ＰＤＡによって誘発される媒体の着色は、眼への投与について考慮される可能性がある。しかしながら、この問題は、使用するＴ－ＰＤＡポリマーのさらなる精製ステップを導入することによって解決できるように思われ、この実施例で実証される原理の全体的な証明には影響を及ぼさない。
【0133】
生理的条件下で行われたｍＡｂの予備的なｉｎ ｖｉｔｒｏでの放出は、Ｔ－ＰＤＡがｍＡｂと強い相互作用する能力を示した。共重合体と結合していないｍＡｂは、バースト効果で３日前に放出されたが、一方、結合したｍＡｂは３０日以内に放出されずに残ったことが示されている。Ｔ製剤は、放出されたｍＡｂの安定性に有利であったが、一方、Ｔ－ＰＤＡベースの製剤は、３７℃、放出媒体中でｍＡｂの一部を不安定にする傾向があった。
【0134】
結論として、本実施例は、Ｔ－ＰＤＡが、モノクローナル抗体又はその断片（例えば３０Ｇ針と考えられる）のＩＶＴ投与のための注射可能性、及び特に４℃での保存中のこのような抗体の安定性の観点から、興味深い視点を提供していることを実証している。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9A】
【図9B】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22A】
【図22B】
【図22C】
【図23A】
【図23B】
【図23C】
【国際調査報告】