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特表2023-552621抗ＬＡＧ－３のモノクローナル抗体、その抗原結合性断片及びその使用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-12-18
(54)【発明の名称】抗ＬＡＧ－３のモノクローナル抗体、その抗原結合性断片及びその使用
(51)【国際特許分類】
C12N 15/13 20060101AFI20231211BHJP
C07K 16/28 20060101ALI20231211BHJP
C07K 16/46 20060101ALI20231211BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20231211BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20231211BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20231211BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20231211BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20231211BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20231211BHJP
A61P 35/02 20060101ALI20231211BHJP
A61P 17/06 20060101ALI20231211BHJP
A61P 1/04 20060101ALI20231211BHJP
A61P 19/02 20060101ALI20231211BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20231211BHJP
A61P 1/16 20060101ALI20231211BHJP
A61P 37/02 20060101ALI20231211BHJP
A61P 25/00 20060101ALI20231211BHJP
A61P 37/06 20060101ALI20231211BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20231211BHJP
【ＦＩ】
C12N15/13
C07K16/28 ZNA
C07K16/46
C12N15/63 Z
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
A61K39/395 N
A61P35/00
A61P35/02
A61P17/06
A61P1/04
A61P19/02
A61P29/00 101
A61P1/16
A61P37/02
A61P25/00
A61P37/06
A61P43/00 121
A61K39/395 T
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023535502
(86)(22)【出願日】2021-11-29
(85)【翻訳文提出日】2023-06-09
(86)【国際出願番号】 CN2021133941
(87)【国際公開番号】W WO2022121720
(87)【国際公開日】2022-06-16
(31)【優先権主張番号】202011436581.5
(32)【優先日】2020-12-10
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】512320009
【氏名又は名称】北京東方百泰生物科技股▲ふん▼有限公司
【住所又は居所原語表記】Ｒｏｏｍ ４０６，Ｂｕｉｌｄｉｎｇ １，Ｎｏ．２ Ｒｏｎｇｊｉｎｇ Ｅａｓｔ Ｒｏａｄ，Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｅｃｏｎｏｍｉｃ－Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ａｒｅａ，Ｂｅｉｊｉｎｇ １００１７６，ＣＨＩＮＡ
(71)【出願人】
【識別番号】517058510
【氏名又は名称】北京精益泰翔技▲術▼▲発▼展有限公司
【住所又は居所原語表記】Ｒｏｏｍ ０１－１０１，Ｆｌｏｏｒ １，Ｂｕｉｌｄｉｎｇ １，Ｎｏ．２ Ｒｏｎｇｊｉｎｇ Ｅａｓｔ Ｒｏａｄ， Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｅｃｏｎｏｍｉｃ－Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ａｒｅａ Ｂｅｉｊｉｎｇ １００１７６，Ｃｈｉｎａ
(74)【代理人】
【識別番号】100158920
【弁理士】
【氏名又は名称】上野 英樹
(72)【発明者】
【氏名】バイ，イー
(72)【発明者】
【氏名】シュウ，ジェンジェ
(72)【発明者】
【氏名】リュー，シ
【テーマコード（参考）】
4B065
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B065AA01X
4B065AA72X
4B065AA90X
4B065AA92Y
4B065AA94Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA25
4B065CA44
4C085AA14
4C085AA16
4C085BB01
4C085BB36
4C085CC23
4C085EE01
4C085EE03
4H045AA11
4H045AA30
4H045DA76
4H045EA28
4H045FA74
(57)【要約】
生物医学技術の分野に関し、具体的には、抗ＬＡＧ－３のモノクローナル抗体、その抗原結合性断片及びその使用を提供し、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片は、Ａ－１、Ａ－２、Ａ－３、Ａ－４から選択されるいずれか１つである。提供されるモノクローナル抗体は、ＬＡＧ－３と特異的に結合でき、親和性が高く、且つ非常に良い生物学的活性を有し、複数種類のがん症又は免疫疾患の治療に使用でき、がんには、白血病、肺がん、胃がん、食道がん、卵巣がん、頭頸部がん、黒色腫、腎がん、乳がん、結腸直腸がん、肝臓がん、膵臓がん、又は膀胱がんが含まれ、免疫疾患には、乾癬、クローン病、リウマチ性関節炎、原発性胆汁性肝硬変、全身性紅斑性狼瘡、多発性硬化症、潰瘍性結腸炎、及び自己免疫性肝炎が含まれる。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含むモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片であって、前記重鎖可変領域は、それぞれＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３で表される３つの重鎖相補性決定領域を含み、前記軽鎖可変領域は、それぞれＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３で表される３つの軽鎖相補性決定領域を含み、前記モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片は、Ａ－１～Ａ－４から選択されるいずれか１つであることを特徴とする抗ＬＡＧ－３のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片。Ａ－１：前記重鎖相補性決定領域ＨＣＤＲ１は配列番号１に示されるアミノ酸配列を含み、前記重鎖相補性決定領域ＨＣＤＲ２は配列番号２に示されるアミノ酸配列を含み、前記重鎖相補性決定領域ＨＣＤＲ３は配列番号３に示されるアミノ酸配列を含み、前記軽鎖相補性決定領域ＬＣＤＲ１は配列番号４に示されるアミノ酸配列を含み、前記軽鎖相補性決定領域ＬＣＤＲ２は配列番号５に示されるアミノ酸配列を含み、前記軽鎖相補性決定領域ＬＣＤＲ３は配列番号６に示されるアミノ酸配列を含む。
Ａ－２：前記重鎖相補性決定領域ＨＣＤＲ１は配列番号１に示されるアミノ酸配列を含み、前記重鎖相補性決定領域ＨＣＤＲ２は配列番号２に示されるアミノ酸配列を含み、前記重鎖相補性決定領域ＨＣＤＲ３は配列番号３に示されるアミノ酸配列を含み、前記軽鎖相補性決定領域ＬＣＤＲ１は配列番号４に示されるアミノ酸配列を含み、前記軽鎖相補性決定領域ＬＣＤＲ２は配列番号７に示されるアミノ酸配列を含み、前記軽鎖相補性決定領域ＬＣＤＲ３は配列番号８に示されるアミノ酸配列を含む。
Ａ－３：前記重鎖相補性決定領域ＨＣＤＲ１は配列番号９に示されるアミノ酸配列を含み、前記重鎖相補性決定領域ＨＣＤＲ２は配列番号１０に示されるアミノ酸配列を含み、前記重鎖相補性決定領域ＨＣＤＲ３は配列番号１１に示されるアミノ酸配列を含み、前記軽鎖相補性決定領域ＬＣＤＲ１は配列番号１２に示されるアミノ酸配列を含み、前記軽鎖相補性決定領域ＬＣＤＲ２は配列番号１３に示されるアミノ酸配列を含み、前記軽鎖相補性決定領域ＬＣＤＲ３は配列番号１４に示されるアミノ酸配列を含む。
Ａ－４：前記重鎖相補性決定領域ＨＣＤＲ１は配列番号１５に示されるアミノ酸配列を含み、前記重鎖相補性決定領域ＨＣＤＲ２は配列番号１６に示されるアミノ酸配列を含み、前記重鎖相補性決定領域ＨＣＤＲ３は配列番号１７に示されるアミノ酸配列を含み、前記軽鎖相補性決定領域ＬＣＤＲ１は配列番号１８に示されるアミノ酸配列を含み、前記軽鎖相補性決定領域ＬＣＤＲ２は配列番号１９に示されるアミノ酸配列を含み、前記軽鎖相補性決定領域ＬＣＤＲ３は配列番号２０に示されるアミノ酸配列を含む。
【請求項2】
前記モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片は、マウス由来抗体分子であり、前記マウス由来抗体分子は、ＭＡ－１～ＭＡ－４から選択されるいずれか１つであり、好ましくは、前記マウス由来抗体分子はＭＡ－１である、
ことを特徴とする請求項１に記載の抗ＬＡＧ－３のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片。
ＭＡ－１：前記重鎖可変領域は配列番号２１に示されるアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域は配列番号２２に示されるアミノ酸配列を含む。
ＭＡ－２：前記重鎖可変領域は配列番号２１に示されるアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域は配列番号２３に示されるアミノ酸配列を含む。
ＭＡ－３：前記重鎖可変領域は配列番号２４に示されるアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域は配列番号２５に示されるアミノ酸配列を含む。
ＭＡ－４：前記重鎖可変領域は配列番号２６に示されるアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域は配列番号２７に示されるアミノ酸配列を含む。
【請求項3】
前記マウス由来抗体分子は、重鎖定常領域及び軽鎖定常領域をさらに含み、前記重鎖定常領域は、マウスのＩｇＧ１型、ＩｇＧ２ａ型、ＩｇＧ２ｂ型、ＩｇＧ３型のうちの１つであり、前記ＩｇＧ１型の重鎖定常領域アミノ酸配列は配列番号２９に示され、前記ＩｇＧ２ａ型の重鎖定常領域アミノ酸配列は配列番号３０に示され、前記ＩｇＧ２ｂ型の重鎖定常領域アミノ酸配列は配列番号３１に示され、前記ＩｇＧ３型の重鎖定常領域アミノ酸配列は配列番号３２に示され、前記軽鎖定常領域は、アミノ酸配列が配列番号２８に示されるマウス由来Ｃｋ鎖であり、好ましくは、前記重鎖定常領域は、マウスのＩｇＧ１型である、
ことを特徴とする請求項２に記載の抗ＬＡＧ－３のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片。
【請求項4】
前記モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片はキメラ抗体分子であり、前記キメラ抗体分子は、前記マウス由来抗体分子の重鎖可変領域、前記マウス由来抗体分子の軽鎖可変領域、及びヒト由来抗体定常領域を含み、前記ヒト由来抗体定常領域は、ヒト由来抗体重鎖定常領域及びヒト由来抗体軽鎖定常領域を含み、前記ヒト由来抗体重鎖定常領域は、ヒトのＩｇＧ１型、ＩｇＧ２型又はＩｇＧ４型のうちの１つであり、前記ＩｇＧ１型の重鎖定常領域アミノ酸配列は配列番号３９に示され、前記ＩｇＧ２型の重鎖定常領域アミノ酸配列は配列番号４０に示され、前記ＩｇＧ４型の重鎖定常領域アミノ酸配列は配列番号４１に示され、前記ヒト由来抗体軽鎖定常領域は、アミノ酸配列が配列番号４２に示されるヒトのＣｋ鎖であり、好ましくは、前記ヒト由来抗体重鎖定常領域は、ヒトのＩｇＧ４型である、
ことを特徴とする請求項２に記載の抗ＬＡＧ－３のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片。
【請求項5】
前記モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片はヒト化抗体分子であり、前記ヒト化抗体分子は、ＨＡ－１～ＨＡ－５から選択されるいずれか１つであり、好ましくは、前記ヒト化抗体分子は、ＨＡ－１である、
ことを特徴とする請求項１に記載の抗ＬＡＧ－３のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片。
ＨＡ－１：前記重鎖可変領域は配列番号３３に示されるアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域は配列番号３４に示されるアミノ酸配列を含む。
ＨＡ－２：前記重鎖可変領域は配列番号３３に示されるアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域は配列番号３５に示されるアミノ酸配列を含む。
ＨＡ－３：前記重鎖可変領域は配列番号３６に示されるアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域は配列番号３５に示されるアミノ酸配列を含む。
ＨＡ－４：前記重鎖可変領域は配列番号３６に示されるアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域は配列番号３４に示されるアミノ酸配列を含む。
ＨＡ－５：前記重鎖可変領域は配列番号３７に示されるアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域は配列番号３８に示されるアミノ酸配列を含む。
【請求項6】
前記ヒト化抗体分子は、重鎖定常領域及び軽鎖定常領域をさらに含み、前記重鎖定常領域は、ヒトのＩｇＧ１型、ＩｇＧ２型又はＩｇＧ４型のうちの１つであり、前記ＩｇＧ１型の重鎖定常領域アミノ酸配列は配列番号３９に示され、前記ＩｇＧ２型の重鎖定常領域アミノ酸配列は配列番号４０に示され、前記ＩｇＧ４型の重鎖定常領域アミノ酸配列は配列番号４１に示され、前記軽鎖定常領域は、アミノ酸配列が配列番号４２に示されるヒトのＣｋ鎖であり、好ましくは、前記重鎖定常領域は、ヒトのＩｇＧ４型である、
ことを特徴とする請求項５に記載の抗ＬＡＧ－３のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片。
【請求項7】
前記ヒト化抗体分子は、全長抗体又は抗体断片であり、前記ヒト化抗体分子は、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）２、Ｆｖ又はＳｃＦｖのうちの一種又は数種の組合せを含む、ことを特徴とする請求項５に記載の抗ＬＡＧ－３のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片。
【請求項8】
請求項１～７のいずれか１項に記載の抗ＬＡＧ－３のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を含む、ことを特徴とするポリペプチド又はタンパク質。
【請求項9】
請求項１～７のいずれか１項に記載の抗ＬＡＧ－３のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片のアミノ酸配列をコードする、ことを特徴とするポリヌクレオチド配列又は組合せ。
【請求項10】
請求項９に記載のポリヌクレオチド配列又は組合せを含む、ことを特徴とする組換えＤＮＡ発現ベクター。
【請求項11】
請求項１０に記載の組換えＤＮＡ発現ベクターをトランスフェクションする宿主細胞であって、前記宿主細胞は、原核細胞、酵母細胞、昆虫細胞又は哺乳動物細胞を含み、好ましくは、前記宿主細胞は、哺乳動物細胞であり、前記哺乳動物細胞は、ＨＥＫ２９３Ｅ細胞、ＣＨＯ細胞又はＮＳ０細胞である、
ことを特徴とする宿主細胞。
【請求項12】
請求項１～７のいずれか１項に記載の抗ＬＡＧ－３のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を含む、ことを特徴とする医薬又は医薬組成物。
【請求項13】
請求項１～７のいずれか１項に記載の抗ＬＡＧ－３のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片の、がん治療用薬又は免疫疾患用薬の製造における使用であって、好ましくは、前記がんには、白血病、肺がん、胃がん、食道がん、卵巣がん、頭頸部がん、黒色腫、腎がん、乳がん、結腸直腸がん、肝臓がん、膵臓がん、又は膀胱がんが含まれ、
前記免疫疾患には、乾癬、クローン病、リウマチ性関節炎、原発性胆汁性肝硬変、全身性紅斑性狼瘡、多発性硬化症、潰瘍性結腸炎、及び自己免疫性肝炎が含まれる、
抗ＬＡＧ－３のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片の、がん治療用薬又は免疫疾患用薬の製造における使用。
【請求項14】
請求項１～７のいずれか１項に記載の抗ＬＡＧ－３のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片と抗ＰＤ－１モノクローナル抗体との組み合わせの、がん治療用薬又は免疫疾患用薬の製造における使用。
【請求項15】
前記抗ＰＤ－１モノクローナル抗体は、ＤＦＰＤ１－９、ＤＦＰＤ１－１０、ＤＦＰＤ１－１１、ＤＦＰＤ１－１２、ＤＦＰＤ１－１３、Ｎｉｖｏｌｕｍａｂ、Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ、トリパリマブ（Ｔｏｒｉｐａｌｉｍａｂ）、シンチリマブ（Ｓｉｎｔｉｌｉｍａｂ）、チスレリズマブ（Ｔｉｓｌｅｌｉｚｕｍａｂ）、カムレリズマブ（Ｃａｍｒｅｌｉｚｕｍａｂ）、ペンプリマブ（Ｐｅｎｐｕｌｉｍａｂ）又はジンベレリマブ（Ｚｉｍｂｅｒｅｌｉｍａｂ）から選択される、ことを特徴とする請求項１４に記載の使用。
【請求項16】
前記抗ＰＤ－１モノクローナル抗体は、配列番号４５に示される軽鎖可変領域及び配列番号４３に示される重鎖可変領域を含むＤＦＰＤ１－１０である、ことを特徴とする請求項１５に記載の使用。
【請求項17】
前記抗ＰＤ－１モノクローナル抗体は、Ｎｉｖｏｌｕｍａｂである、ことを特徴とする請求項１５に記載の使用。
【請求項18】
前記がんは、白血病、肺がん、胃がん、食道がん、卵巣がん、頭頸部がん、黒色腫、腎がん、乳がん、結腸直腸がん、肝臓がん、膵臓がん、又は膀胱がんから選択され、前記免疫疾患には、乾癬、クローン病、リウマチ性関節炎、原発性胆汁性肝硬変、全身性紅斑性狼瘡、多発性硬化症、潰瘍性結腸炎、及び自己免疫性肝炎が含まれる、ことを特徴とする請求項１５に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【0001】
本願は、２０２０年１２月１０日に提出された中国特許出願２０２０１１４３６５８１．５の優先権を主張し、その内容の全てが参照によって本願に組み込まれる。
【技術分野】
【0002】
本発明は、生物医学技術の分野に関し、特に、抗ＬＡＧ－３のモノクローナル抗体、その抗原結合性断片及びその使用に関する。
【背景技術】
【0003】
免疫療法は、現在最もホットな話題のがん治療法であり、がん治療の三次革命とも呼ばれている。いわゆる「がん免疫治療」とは、ヒト体自身の免疫系を利用して、がん細胞を攻撃する治療方法である。免疫系とがん細胞との拮抗は、長期にわたる動的な過程であり、正面勝負をするだけでなく、互いに交わる。健康な身体の免疫細胞は、がん細胞を発見して殺すことができるが、様々な先天及び後天の要因に誘導され、免疫系は、絶対的な優位性を失い、さらにはがん細胞に「扇動」されて、がんの発生及び進行に役立つ。標的薬は、その正確性が原因で大きな期待が寄せられていたが、がん細胞の変わりやすさ及び複雑さのせいで、がん細胞に薬剤耐性が生じやすく、正確性も役に立たなくなりやすい。そのため、ＣＴＬＡ－４及びＰＤ－１が発見されてから、免疫チェックポイント阻害によるがんの治療は、徐々に研究の焦点となっている。
【0004】
免疫抗がん療法の登場に伴い、ＬＡＧ－３は、かなりの可能性のある免疫チェックポイント受容体として次第に認識されており、報道によれば、ＬＡＧ－３は、調節性Ｔ細胞の活性を促進すること及びＴ細胞の活性化と増殖を低く調節することにおいて重要な役割を果たす（Ｗｏｒｋｍａｎ ＣＪら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００５；１７４：６８８－６９５）。ＬＡＧ－３（Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ－ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｇｅｎｅ ３）は、ＣＤ２２３とも呼ばれ、当該遺伝子は、８つのエクソンを含み、エクソンは、ヒトの１２番染色体（マウスの６番染色体）に位置し、免疫グロブリンスーパーファミリに属し、細胞外領域、膜貫通領域及び細胞質領域これら３つの部分からなり、４９８個のアミノ酸から構成されるＩ型膜貫通タンパク質をコードする。ＬＡＧ－３は、活性化されたＮＫ細胞、Ｔ細胞などの免疫細胞表面で広く発現し、リンパ細胞機能をマイナス方向に制御することができ、且つ、腫瘍及び自己免疫性疾患の両方において重要な役割を果たすことが一部の研究によって証明されている。
【0005】
臨床前の研究から次のことが分かる。ＬＡＧ－３を阻害することは、Ｔ細胞に細胞毒性を再回復させることができ、それにより、腫瘍の成長を制限し、さらに腫瘍に対する殺傷効果を強化し、また、ＬＡＧ－３を阻害することは、Ｔ細胞を調節して免疫反応を阻害する機能を低下させることもでき、そのため、ＬＡＧ－３は、Ｔ細胞の機能を調節できる免疫チェックポイント受容体であり、ＬＡＧ－３を阻害することは、患者、特にＬＡＧ－３を発現する免疫細胞が腫瘍に含まれている患者により多くの利点をもたらすようにするのに役立ち、このため、ＬＡＧ－３は、他の免疫チェックポイントタンパク質よりも魅力的な標的であると考えられている。現在、免疫チェックポイントの二世代標的において、ＬＡＧ－３は、臨床データが多く、創薬可能性が比較的確定されている標的である。ＬＡＧ－３存在の上記重要性に鑑み、中国国内外の腫瘍又は他の免疫疾患患者のニーズを満たすために、高い生物学的活性を有する抗ＬＡＧ－３のモノクローナル抗体を開発することが急務となっている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
本発明は、国内の市場のニーズを満たすために、免疫ライブラリーのスクリーニングにより、ＬＡＧ－３と特異的に結合することができ、且つ高い生物学的活性を有する抗ＬＡＧ－３のモノクローナル抗体又は抗原結合性断片を得る。
【課題を解決するための手段】
【0007】
本発明の具体的な技術案は、下記のとおりである。
本発明は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む抗ＬＡＧ－３のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を提供し、前記重鎖可変領域は、それぞれＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３で表される３つの重鎖相補性決定領域を含み、前記軽鎖可変領域は、それぞれＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３で表される３つの軽鎖相補性決定領域を含み、前記モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片は、Ａ－１～Ａ－４から選択されるいずれか１つであり、
Ａ－１：前記重鎖相補性決定領域ＨＣＤＲ１は配列番号１に示されるアミノ酸配列を含み、前記重鎖相補性決定領域ＨＣＤＲ２は配列番号２に示されるアミノ酸配列を含み、前記重鎖相補性決定領域ＨＣＤＲ３は配列番号３に示されるアミノ酸配列を含み、前記軽鎖相補性決定領域ＬＣＤＲ１は配列番号４に示されるアミノ酸配列を含み、前記軽鎖相補性決定領域ＬＣＤＲ２は配列番号５に示されるアミノ酸配列を含み、前記軽鎖相補性決定領域ＬＣＤＲ３は配列番号６に示されるアミノ酸配列を含み、
Ａ－２：前記重鎖相補性決定領域ＨＣＤＲ１は配列番号１に示されるアミノ酸配列を含み、前記重鎖相補性決定領域ＨＣＤＲ２は配列番号２に示されるアミノ酸配列を含み、前記重鎖相補性決定領域ＨＣＤＲ３は配列番号３に示されるアミノ酸配列を含み、前記軽鎖相補性決定領域ＬＣＤＲ１は配列番号４に示されるアミノ酸配列を含み、前記軽鎖相補性決定領域ＬＣＤＲ２は配列番号７に示されるアミノ酸配列を含み、前記軽鎖相補性決定領域ＬＣＤＲ３は配列番号８に示されるアミノ酸配列を含み、
Ａ－３：前記重鎖相補性決定領域ＨＣＤＲ１は配列番号９に示されるアミノ酸配列を含み、前記重鎖相補性決定領域ＨＣＤＲ２は配列番号１０に示されるアミノ酸配列を含み、前記重鎖相補性決定領域ＨＣＤＲ３は配列番号１１に示されるアミノ酸配列を含み、前記軽鎖相補性決定領域ＬＣＤＲ１は配列番号１２に示されるアミノ酸配列を含み、前記軽鎖相補性決定領域ＬＣＤＲ２は配列番号１３に示されるアミノ酸配列を含み、前記軽鎖相補性決定領域ＬＣＤＲ３は配列番号１４に示されるアミノ酸配列を含み、
Ａ－４：前記重鎖相補性決定領域ＨＣＤＲ１は配列番号１５に示されるアミノ酸配列を含み、前記重鎖相補性決定領域ＨＣＤＲ２は配列番号１６に示されるアミノ酸配列を含み、前記重鎖相補性決定領域ＨＣＤＲ３は配列番号１７に示されるアミノ酸配列を含み、前記軽鎖相補性決定領域ＬＣＤＲ１は配列番号１８に示されるアミノ酸配列を含み、前記軽鎖相補性決定領域ＬＣＤＲ２は配列番号１９に示されるアミノ酸配列を含み、前記軽鎖相補性決定領域ＬＣＤＲ３は配列番号２０に示されるアミノ酸配列を含む。
本発明は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む抗ＬＡＧ－３のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を提供し、前記重鎖可変領域は、それぞれＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３で表される３つの重鎖相補性決定領域を含み、前記軽鎖可変領域は、それぞれＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３で表される３つの軽鎖相補性決定領域を含み、前記モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片は、Ａ－１～Ａ－４から選択されるいずれか１つであり、
Ａ－１：前記重鎖相補性決定領域ＨＣＤＲ１は配列番号１に示されるアミノ酸配列を含み、前記重鎖相補性決定領域ＨＣＤＲ２は配列番号２に示されるアミノ酸配列を含み、前記重鎖相補性決定領域ＨＣＤＲ３は配列番号３に示されるアミノ酸配列を含み、前記軽鎖相補性決定領域ＬＣＤＲ１は配列番号４に示されるアミノ酸配列を含み、前記軽鎖相補性決定領域ＬＣＤＲ２は配列番号５に示されるアミノ酸配列を含み、前記軽鎖相補性決定領域ＬＣＤＲ３は配列番号６に示されるアミノ酸配列を含み、
Ａ－２：前記重鎖相補性決定領域ＨＣＤＲ１は配列番号１に示されるアミノ酸配列を含み、前記重鎖相補性決定領域ＨＣＤＲ２は配列番号２に示されるアミノ酸配列を含み、前記重鎖相補性決定領域ＨＣＤＲ３は配列番号３に示されるアミノ酸配列を含み、前記軽鎖相補性決定領域ＬＣＤＲ１は配列番号４に示されるアミノ酸配列を含み、前記軽鎖相補性決定領域ＬＣＤＲ２は配列番号７に示されるアミノ酸配列を含み、前記軽鎖相補性決定領域ＬＣＤＲ３は配列番号８に示されるアミノ酸配列を含み、
Ａ－３：前記重鎖相補性決定領域ＨＣＤＲ１は配列番号９に示されるアミノ酸配列を含み、前記重鎖相補性決定領域ＨＣＤＲ２は配列番号１０に示されるアミノ酸配列を含み、前記重鎖相補性決定領域ＨＣＤＲ３は配列番号１１に示されるアミノ酸配列を含み、前記軽鎖相補性決定領域ＬＣＤＲ１は配列番号１２に示されるアミノ酸配列を含み、前記軽鎖相補性決定領域ＬＣＤＲ２は配列番号１３に示されるアミノ酸配列を含み、前記軽鎖相補性決定領域ＬＣＤＲ３は配列番号１４に示されるアミノ酸配列を含み、
Ａ－４：前記重鎖相補性決定領域ＨＣＤＲ１は配列番号１５に示されるアミノ酸配列を含み、前記重鎖相補性決定領域ＨＣＤＲ２は配列番号１６に示されるアミノ酸配列を含み、前記重鎖相補性決定領域ＨＣＤＲ３は配列番号１７に示されるアミノ酸配列を含み、前記軽鎖相補性決定領域ＬＣＤＲ１は配列番号１８に示されるアミノ酸配列を含み、前記軽鎖相補性決定領域ＬＣＤＲ２は配列番号１９に示されるアミノ酸配列を含み、前記軽鎖相補性決定領域ＬＣＤＲ３は配列番号２０に示されるアミノ酸配列を含む。
【0008】
本発明にて提供される上記抗ＬＡＧ－３のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片は、ＬＡＧ－３と特異的に結合することができ、結合活性がよりよく、ＬＡＧ－３を遮断すると、ＬＡＧ－３のＴ細胞に対する阻害作用を逆転することができ、Ｔ細胞の活性を増強し、調節性Ｔ細胞の数を減らし、Ｔ細胞免疫応答の感度を向上させることもでき、それにより、免疫疾患又はがん疾患を治療するために用いられる。
【0009】
さらに、前記モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片は、マウス由来抗体分子であり、前記マウス由来抗体分子は、ＭＡ－１～ＭＡ－４から選択されるいずれか１つであり、
ＭＡ－１：前記重鎖可変領域は配列番号２１に示されるアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域は配列番号２２に示されるアミノ酸配列を含み、
ＭＡ－２む。前記重鎖可変領域は配列番号２１に示されるアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域は配列番号２３に示されるアミノ酸配列を含み、
ＭＡ－３む。前記重鎖可変領域は配列番号２４に示されるアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域は配列番号２５に示されるアミノ酸配列を含み、
ＭＡ－４む。前記重鎖可変領域は配列番号２６に示されるアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域は配列番号２７に示されるアミノ酸配列を含み、
好ましくは、前記マウス由来抗体分子はＭＡ－１である。
ＭＡ－１：前記重鎖可変領域は配列番号２１に示されるアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域は配列番号２２に示されるアミノ酸配列を含み、
ＭＡ－２む。前記重鎖可変領域は配列番号２１に示されるアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域は配列番号２３に示されるアミノ酸配列を含み、
ＭＡ－３む。前記重鎖可変領域は配列番号２４に示されるアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域は配列番号２５に示されるアミノ酸配列を含み、
ＭＡ－４む。前記重鎖可変領域は配列番号２６に示されるアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域は配列番号２７に示されるアミノ酸配列を含み、
好ましくは、前記マウス由来抗体分子はＭＡ－１である。
【0010】
本発明では、マウス免疫用のＬＡＧ－３抗原でマウスを免疫させることにより、免疫方法を最適化し、ファージディスプレイライブラリーを作成し、上記親和性が高く、活性が良く且つ安定的なマウス由来抗体分子をスクリーニングして、大量の細胞レベル実験の検証により、他の３つのマウス由来抗体分子に比べ、ＭＡ－１がより高い生物学的活性を有することが発見され、そのため、本発明では、ＭＡ－１を選択することが好ましい。
【0011】
さらに、前記マウス由来抗体分子は、重鎖定常領域及び軽鎖定常領域をさらに含み、前記重鎖定常領域は、マウスのＩｇＧ１型、ＩｇＧ２ａ型、ＩｇＧ２ｂ型、ＩｇＧ３型のうちの１つであり、前記ＩｇＧ１型の重鎖定常領域アミノ酸配列は配列番号２９に示され、前記ＩｇＧ２ａ型の重鎖定常領域アミノ酸配列は配列番号３０に示され、前記ＩｇＧ２ｂ型の重鎖定常領域アミノ酸配列は配列番号３１に示され、前記ＩｇＧ３型の重鎖定常領域アミノ酸配列は配列番号３２に示され、前記軽鎖定常領域は、アミノ酸配列が配列番号２８に示されるマウス由来Ｃｋ鎖であり、
好ましくは、前記重鎖定常領域は、マウスのＩｇＧ１型である。
好ましくは、前記重鎖定常領域は、マウスのＩｇＧ１型である。
【0012】
さらに、前記モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片はキメラ抗体分子であり、前記キメラ抗体分子は、前記マウス由来抗体分子の重鎖可変領域、前記マウス由来抗体分子の軽鎖可変領域、及びヒト由来抗体定常領域を含み、前記ヒト由来抗体定常領域は、ヒト由来抗体重鎖定常領域及びヒト由来抗体軽鎖定常領域を含み、前記ヒト由来抗体重鎖定常領域は、ヒトのＩｇＧ１型、ＩｇＧ２型又はＩｇＧ４型のうちの１つであり、前記ＩｇＧ１型の重鎖定常領域アミノ酸配列は配列番号３９に示され、前記ＩｇＧ２型の重鎖定常領域アミノ酸配列は配列番号４０に示され、前記ＩｇＧ４型の重鎖定常領域アミノ酸配列は配列番号４１に示され、前記ヒト由来抗体軽鎖定常領域は、アミノ酸配列が配列番号４２に示されるヒトのＣｋ鎖であり、
好ましくは、前記ヒト由来抗体重鎖定常領域は、ヒトのＩｇＧ４型である。
好ましくは、前記ヒト由来抗体重鎖定常領域は、ヒトのＩｇＧ４型である。
【0013】
キメラ抗体分子は、マウス由来抗体分子の可変領域配列及びヒト由来抗体定常領域を含み、キメラ抗体分子の設計は、本発明の定常領域がヒト化された後にＣＤＲの機能が変化しないことを検証するために用いられ、ヒト化抗体分子のさらなる研究開発のために基礎を提供する。
【0014】
さらに、前記モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片は、ＨＡ－１～ＨＡ－５から選択されるいずれか１つであるヒト化抗体分子であり、
ＨＡ－１：前記重鎖可変領域は配列番号３３に示されるアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域は配列番号３４に示されるアミノ酸配列を含み、
ＨＡ－２：前記重鎖可変領域は配列番号３３に示されるアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域は配列番号３５に示されるアミノ酸配列を含み、
ＨＡ－３：前記重鎖可変領域は配列番号３６に示されるアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域は配列番号３５に示されるアミノ酸配列を含み、
ＨＡ－４：前記重鎖可変領域は配列番号３６に示されるアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域は配列番号３４に示されるアミノ酸配列を含み、
ＨＡ－５：前記重鎖可変領域は配列番号３７に示されるアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域は配列番号３８に示されるアミノ酸配列を含み、
好ましくは、前記ヒト化抗体分子は、ＨＡ－１である。
ＨＡ－１：前記重鎖可変領域は配列番号３３に示されるアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域は配列番号３４に示されるアミノ酸配列を含み、
ＨＡ－２：前記重鎖可変領域は配列番号３３に示されるアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域は配列番号３５に示されるアミノ酸配列を含み、
ＨＡ－３：前記重鎖可変領域は配列番号３６に示されるアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域は配列番号３５に示されるアミノ酸配列を含み、
ＨＡ－４：前記重鎖可変領域は配列番号３６に示されるアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域は配列番号３４に示されるアミノ酸配列を含み、
ＨＡ－５：前記重鎖可変領域は配列番号３７に示されるアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域は配列番号３８に示されるアミノ酸配列を含み、
好ましくは、前記ヒト化抗体分子は、ＨＡ－１である。
【0015】
本発明は、ヒト化とスクリーニングによりヒト化抗体分子を取得し、体内と体外での実験検証により、本発明にて提供される５種類のヒト化抗体分子のうち、ＨＡ－１が、活性が高く、薬効が最も顕著であることが発見され、そのため、本発明では、ＨＡ－１が好ましい。
【0016】
さらに、前記ヒト化抗体分子は、重鎖定常領域及び軽鎖定常領域をさらに含み、前記重鎖定常領域は、ヒトのＩｇＧ１型、ＩｇＧ２型又はＩｇＧ４型のうちの１つであり、前記ＩｇＧ１型の重鎖定常領域アミノ酸配列は配列番号３９に示され、前記ＩｇＧ２型の重鎖定常領域アミノ酸配列は配列番号４０に示され、前記ＩｇＧ４型の重鎖定常領域アミノ酸配列は配列番号４１に示され、前記軽鎖定常領域は、アミノ酸配列が配列番号４２に示されるヒトのＣｋ鎖であり、
好ましくは、前記重鎖定常領域は、ヒトのＩｇＧ４型である。
好ましくは、前記重鎖定常領域は、ヒトのＩｇＧ４型である。
【0017】
さらに、前記ヒト化抗体分子は、全長抗体又は抗体断片であり、前記ヒト化抗体分子は、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）２、Ｆｖ又はＳｃＦｖのうちの一種又は数種の組合せを含む。
【0018】
本発明は、前記抗ＬＡＧ－３のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を含むポリペプチド又はタンパク質をさらに提供する。
【0019】
本発明は、前記抗ＬＡＧ－３のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片のアミノ酸配列をコードする、ポリヌクレオチド配列又は組合せをさらに提供する。
【0020】
本発明は、前記ポリヌクレオチド配列又は組合せを含む組換えＤＮＡ発現ベクターをさらに提供する。
【0021】
本発明は、前記組換えＤＮＡ発現ベクターをトランスフェクションする宿主細胞をさらに提供し、前記宿主細胞は、原核細胞、酵母細胞、昆虫細胞又は哺乳動物細胞を含み、
好ましくは、前記宿主細胞は、哺乳動物細胞であり、前記哺乳動物細胞は、ＨＥＫ２９３Ｅ細胞、ＣＨＯ細胞又はＮＳ０細胞である。
好ましくは、前記宿主細胞は、哺乳動物細胞であり、前記哺乳動物細胞は、ＨＥＫ２９３Ｅ細胞、ＣＨＯ細胞又はＮＳ０細胞である。
【0022】
本発明は、前記抗ＬＡＧ－３のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を含む医薬又は医薬組成物をさらに提供する。
【0023】
本発明は、前記抗ＬＡＧ－３のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片の、がん治療用薬又は免疫疾患用薬の製造における使用をさらに提供し、
好ましくは、前記がんには、白血病、肺がん、胃がん、食道がん、卵巣がん、頭頸部がん、黒色腫、腎がん、乳がん、結腸直腸がん、肝臓がん、膵臓がん、又は膀胱がんが含まれ、
前記免疫疾患には、乾癬、クローン病、リウマチ性関節炎、原発性胆汁性肝硬変、全身性紅斑性狼瘡、多発性硬化症、潰瘍性結腸炎、及び自己免疫性肝炎が含まれる。
好ましくは、前記がんには、白血病、肺がん、胃がん、食道がん、卵巣がん、頭頸部がん、黒色腫、腎がん、乳がん、結腸直腸がん、肝臓がん、膵臓がん、又は膀胱がんが含まれ、
前記免疫疾患には、乾癬、クローン病、リウマチ性関節炎、原発性胆汁性肝硬変、全身性紅斑性狼瘡、多発性硬化症、潰瘍性結腸炎、及び自己免疫性肝炎が含まれる。
【0024】
本発明は、前記抗ＬＡＧ－３のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片と抗ＰＤ－１モノクローナル抗体との組み合わせの、がん治療用薬又は免疫疾患用薬の製造における使用をさらに提供する。
【0025】
さらに、前記抗ＰＤ－１モノクローナル抗体には、ＤＦＰＤ１－９、ＤＦＰＤ１－１０、ＤＦＰＤ１－１１、ＤＦＰＤ１－１２、ＤＦＰＤ１－１３、Ｎｉｖｏｌｕｍａｂ、Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ、トリパリマブ（Ｔｏｒｉｐａｌｉｍａｂ）、シンチリマブ（Ｓｉｎｔｉｌｉｍａｂ）、チスレリズマブ（Ｔｉｓｌｅｌｉｚｕｍａｂ）、カムレリズマブ（Ｃａｍｒｅｌｉｚｕｍａｂ）、ペンプリマブ（Ｐｅｎｐｕｌｉｍａｂ）又はジンベレリマブ（Ｚｉｍｂｅｒｅｌｉｍａｂ）が含まれる。
【0026】
好ましくは、前記抗ＰＤ－１モノクローナル抗体は、配列番号４５に示される軽鎖可変領域及び配列番号４３に示される重鎖可変領域を含むＤＦＰＤ１－１０である。
【0027】
好ましくは、前記抗ＰＤ－１モノクローナル抗体は、Ｎｉｖｏｌｕｍａｂである。
【0028】
好ましくは、前記がんは、白血病、肺がん、胃がん、食道がん、卵巣がん、頭頸部がん、黒色腫、腎がん、乳がん、結腸直腸がん、肝臓がん、膵臓がん、又は膀胱がんから選択され、前記免疫疾患には、乾癬、クローン病、リウマチ性関節炎、原発性胆汁性肝硬変、全身性紅斑性狼瘡、多発性硬化症、潰瘍性結腸炎、及び自己免疫性肝炎が含まれる。
【発明の効果】
【0029】
本発明の有益な効果は、次のとおりである。本発明にて提供される抗ＬＡＧ－３のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片は、ＬＡＧ－３と特異的に結合でき、親和性が高く、且つ非常に良い生物学的活性を有し、複数種類のがん症又は免疫疾患の治療に使用でき、がんには、白血病、肺がん、胃がん、食道がん、卵巣がん、頭頸部がん、黒色腫、腎がん、乳がん、結腸直腸がん、肝臓がん、膵臓がん、又は膀胱がんが含まれるが、これらに限定されず、免疫疾患には、乾癬、クローン病、リウマチ性関節炎、原発性胆汁性肝硬変、全身性紅斑性狼瘡、多発性硬化症、潰瘍性結腸炎、及び自己免疫性肝炎が含まれるが、これらに限定されない。
【図面の簡単な説明】
【0030】
【図1】本発明の実施例２における、ｐＳｃＦｖ－Ｄｉｓｂ－ＨＳベクターのプラスミドマップである。
【図2】本発明の実施例３における、勾配希釈ＥＬＩＳＡ抗ＬＡＧ－３ファージモノクローナル抗体の相対的な親和性を比較した図である。
【図3】本発明の実施例５における、ベクターｐＴＳＥのマップある。
【図4】本発明の実施例５における、マウス由来抗体分子の変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動図である。
【図5】本発明の実施例６における、マウス由来抗体のＬＡＧ－３との結合能力の比較図である。
【図6】本発明の実施例７における、混合リンパ細胞反応においてマウス由来抗体のサイトカインＩＬ－２に対する分泌状況図である。
【図7】本発明の実施例１２における、ヒト化抗体分子の変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動図である。
【図8】本発明の実施例１５における、ヒト化抗体分子のＬＡＧ－３との結合能力の比較図である。
【図9】本発明の実施例１６における、混合リンパ細胞反応（ＭＬＲ）テストにおける抗ＬＡＧ－３ヒト化抗体分子活性を示す。
【図10】本発明の実施例１７における、抗ＬＡＧ－３モノクローナル抗体のマウス体内ＭＣ３８結腸直腸がんに対する阻害試験の効果図である。
【図11】本発明の実施例１８における、抗ＬＡＧ－３モノクローナル抗体ＨＡ－１タンパク質分子の熱安定性の評価図である。
【図12】本発明の実施例２２における、抗ＬＡＧ－３モノクローナル抗体と抗ＰＤ－１モノクローナル抗体との組合せの、ＭＣ３８結腸直腸がんモデルへの適用における腫瘍体積成長のグラフである。
【図13】本発明の実施例２２における、抗ＬＡＧ－３モノクローナル抗体と抗ＰＤ－１モノクローナル抗体との組合せの、ＭＣ３８結腸直腸がんモデルへの適用における腫瘍重量の柱状グラフである。
【発明を実施するための形態】
【0031】
本発明の理解をより容易にするために、実施例について説明する前に、本発明の一部の技術用語及び科学用語について下記のように説明する。
【0032】
本明細書に使用される「ＬＡＧ－３」という用語は、リンパ細胞活性化因子３をいい、ここのＬＡＧ－３は、活性化されたＴ細胞、ＮＫ細胞及びＢ細胞表面上の二量体が発現するＬＡＧ－３（例えば、当分野で知られているＣＤ２２３）並びにヒト血清から発見されたＬＡＧ－３の可溶性形態を含むが、これらに限定されず、本明細書では、いずれもＬＡＧ－３と呼ばれる。
【0033】
本明細書に使用される「抗体」という用語は、完全抗体及びそのいずれかの抗原結合性断片を含み、抗体には、マウス由来抗体、ヒト化抗体、二重特異性抗体又はキメラ抗体が含まれ、抗体は、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）２、Ｆｖ又はＳｃＦｖ（一本鎖抗体）であってもよく、抗体は、天然に存在する抗体であっても、変更（例えば、突然変異、欠失、置換等）された抗体であってもよい。
【0034】
本明細書に使用される「可変領域」及び「定常領域」という用語は、抗体重鎖及び軽鎖のＮセグメントに近い配列領域が可変領域（Ｖ領域）であり、Ｃセグメントに近い残りのアミノ酸配列は比較的安定して、定常領域（Ｃ領域）であり、可変領域は３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）及び４つのフレーム領域（ＦＲ）を含み、各軽鎖可変領域及び重鎖可変領域は、いずれも３つのＣＤＲ領域及び４つのＦＲ領域からなり、重鎖の３つのＣＤＲ領域は、それぞれＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３で表され、軽鎖の３つのＣＤＲ領域は、それぞれＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３で表される。
【0035】
本明細書に使用される「マウス由来抗体分子」という用語は、ＬＡＧ－３抗原をマウスに免疫注射した後に得られた抗体に由来するものである。
【0036】
本明細書に使用される「キメラ抗体分子」という用語は、マウス由来抗体の可変領域とヒト由来抗体の定常領域とを融合してなる抗体であり、マウス由来抗体によりヒトの体内に誘発される免疫応答反応を軽減することができるものである。キメラ抗体は、ＤＮＡ組換え技術を利用して、マウス由来モノクローナル抗体の軽、重鎖可変領域遺伝子をヒト抗体の定常領域を含む発現ベクターに挿入するものであり、このように発現された抗体分子において、軽、重鎖の可変領域は、マウス由来であり、定常領域はヒト由来であり、抗体分子全体の２／３近くがヒト由来である。このように生成された抗体は、抗原と特異的に結合する親抗体の能力を維持しながら、マウス由来抗体の免疫原性を低下させる。
【0037】
本明細書に使用される「ヒト化抗体分子」という用語は、ヒト由来抗体にマウス由来モノクローナル抗体の抗原結合特異性を取得させるとともに、その異種性を低下させるために、ヒト由来抗体ＣＤＲの代わりに、マウス由来モノクローナル抗体のＣＤＲをヒト由来抗体可変領域に移植したものである。
【0038】
「ＣＨＯ細胞」という用語は、中国ハムスター卵巣細胞（ｃｈｉｎｅｓｅ ｈａｍｓｔｅｒ ｏｖａｒｙ ｃｅｌｌ）であり、「ＨＥＫ２９３Ｅ細胞」という用語は、ヒト胎児腎臓細胞２９３Ｅ細胞（ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｋｉｄｎｅｙ ２９３Ｅ ｃｅｌｌ）であり、「ＮＳ０細胞」という用語は、マウスＮＳ０胸腺腫細胞である。
【0039】
以下では、以下の実施例を参照して、本発明についてさらに詳細に説明する。
【0040】
実施例１
本発明の実施例１は、抗ＬＡＧ－３のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を提供し、具体的には重鎖可変領及び軽鎖可変領域を含み、重鎖可変領域は、それぞれＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３で表される３つの重鎖相補性決定領域を含み、軽鎖可変領域はそれぞれＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３で表される３つの軽鎖相補性決定領域を含み、モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片は、以下から選択されるいずれか１つである。
本発明の実施例１は、抗ＬＡＧ－３のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を提供し、具体的には重鎖可変領及び軽鎖可変領域を含み、重鎖可変領域は、それぞれＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３で表される３つの重鎖相補性決定領域を含み、軽鎖可変領域はそれぞれＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３で表される３つの軽鎖相補性決定領域を含み、モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片は、以下から選択されるいずれか１つである。
【表1】
【0041】
実施例２ マウス由来抗体分子のスクリーニング
本発明は、ＬＡＧ－３抗原でマウスを免疫し、免疫方法を最適化し、ファージディスプレイライブラリーを作成し、具体的には、ファージディスプレイライブラリーの構築とスクリーニング同定は、下記のとおりである。
本発明は、ＬＡＧ－３抗原でマウスを免疫し、免疫方法を最適化し、ファージディスプレイライブラリーを作成し、具体的には、ファージディスプレイライブラリーの構築とスクリーニング同定は、下記のとおりである。
【0042】
ステップ１：ＬＡＧ－３抗原でのマウスの免疫
１、実験動物
種族：ＢＡＬＢ／ｃ、雌、マウス、
体重：１８～２０ｇ、
実験動物の供給業者：北京華阜康生物科技股フン有限公司。
２、免疫において、マウスを免疫し、免疫抗原はヒトＬＡＧ－３（南京金斯瑞生物科技有限公司の合成遺伝子、当社は、ベクターを構築し、発現して精製する）である。
１、実験動物
種族：ＢＡＬＢ／ｃ、雌、マウス、
体重：１８～２０ｇ、
実験動物の供給業者：北京華阜康生物科技股フン有限公司。
２、免疫において、マウスを免疫し、免疫抗原はヒトＬＡＧ－３（南京金斯瑞生物科技有限公司の合成遺伝子、当社は、ベクターを構築し、発現して精製する）である。
【0043】
ステップ２：ファージ抗体ライブラリーの構築
力価の高いマウス脾細胞を取り、Ｔｒｉｚｏｌ試薬（Ａｍｂｉｏｎから購入、製品番号：１５５９６０２６）を利用して、マウス脾細胞中の総ＲＮＡ、ＲＴ－ＰＣＲを抽出してｃＤＮＡを取得し、ｃＤＮＡをテンプレートとして、縮重プライマー（使用される縮重プライマーの参考文献：Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２３３（２０００）１６７～１７７）を用いてＰＣＲ増幅を行い、それにより、免疫マウス抗体重鎖可変領域遺伝子ライブラリー（ＶＨ）及び軽鎖可変領域遺伝子ライブラリー（ＶＬ）を取得し、軽、重鎖はそれぞれ二重切断され、同様にステップ分けて切断処理されたベクターに連結されて、ｐＳｃＦｖ－Ｄｉｓｂ－ＨＳ－ＶＨ－ＶＬ遺伝子ライブラリーを構築し、ＰｓｃＦｖ－ＤｉｓＢ－ＨＳベクターは、一連の遺伝子クローニングの方法を用いて、ベクターであるｐＣｏｍｂ３ベクター（中国プラスミドベクター菌株細胞株遺伝子寄託センターから購入）を、ファージ一本鎖抗体ライブラリーの構築及び発現に使用するように改造したものである。改造後のベクターを、ｐＳｃＦｖ－Ｄｉｓｂ－ＨＳベクターと命名し、取得したプラスミドマップは、図１に示されるとおりであり、このベクターを基に、マウス免疫ファージ抗体ライブラリーを構築した。
力価の高いマウス脾細胞を取り、Ｔｒｉｚｏｌ試薬（Ａｍｂｉｏｎから購入、製品番号：１５５９６０２６）を利用して、マウス脾細胞中の総ＲＮＡ、ＲＴ－ＰＣＲを抽出してｃＤＮＡを取得し、ｃＤＮＡをテンプレートとして、縮重プライマー（使用される縮重プライマーの参考文献：Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２３３（２０００）１６７～１７７）を用いてＰＣＲ増幅を行い、それにより、免疫マウス抗体重鎖可変領域遺伝子ライブラリー（ＶＨ）及び軽鎖可変領域遺伝子ライブラリー（ＶＬ）を取得し、軽、重鎖はそれぞれ二重切断され、同様にステップ分けて切断処理されたベクターに連結されて、ｐＳｃＦｖ－Ｄｉｓｂ－ＨＳ－ＶＨ－ＶＬ遺伝子ライブラリーを構築し、ＰｓｃＦｖ－ＤｉｓＢ－ＨＳベクターは、一連の遺伝子クローニングの方法を用いて、ベクターであるｐＣｏｍｂ３ベクター（中国プラスミドベクター菌株細胞株遺伝子寄託センターから購入）を、ファージ一本鎖抗体ライブラリーの構築及び発現に使用するように改造したものである。改造後のベクターを、ｐＳｃＦｖ－Ｄｉｓｂ－ＨＳベクターと命名し、取得したプラスミドマップは、図１に示されるとおりであり、このベクターを基に、マウス免疫ファージ抗体ライブラリーを構築した。
【0044】
ステップ３：ＬＡＧ－３を抗原として免疫管を５μｇ／５００μＬ／管の量でコーティングし、４℃で一晩コーティングし、続いて、４％の脱脂粉乳／ＰＢＳＴを使用して免疫管及び免疫ファージ抗体ライブラリーをそれぞれブロッキングし、室温で１ｈブロッキングした。ブロッキングした後の免疫ファージ抗体ライブラリーを免疫管に加えて抗原抗体結合を行い、ファージ投入量は約１０９～１０１２個であり、室温で１ｈ反応した後、ＰＢＳＴ－ＰＢＳを使用して結合しなかったファージを洗浄し、０．１ＭのｐＨが２．２であるＧｌｙｃｉｎｅ－ＨＣｌで溶出し、最後に１．５ＭのｐＨが８．８であるＴｒｉｓ－ＨＣｌを使用して溶出されたファージ抗体溶液をｐＨ７．０程度まで中和した。
【0045】
ステップ４：上記中和後のファージを１０ｍｌの対数期に成長したＴＧ１菌液に感染させ、３７℃のインキュベーター３０ｍｉｎ静置し、菌液の一部をとって勾配希釈を行って、２ＹＴＡＧプレートに塗り、ファージ生成量の計算に使用された。残りの菌液を遠心分離して上澄みを捨て、菌体沈殿物を少量の培地に再懸濁し、吸引した後に２ＹＴＡＧの大きいプレートに塗って、次回のスクリーニングに備えた。
【0046】
ステップ５：上記感染後にプレートに塗った菌体を大きいプレートから掻き取り、２ＹＴＡＧ液体培地に接種し、対数期まで揺らした後、Ｍ１３ＫＯ７ヘルパーファージを加えて重複感染し、２８℃の条件で、２２０ｒｐｍで一晩培養して、ファージを製造し、ＰＥＧ／ＮａＣｌを沈殿して精製されたファージを次回のスクリーニングに使用して、ファージライブラリリッチスクリーニングを計１回行った。
【0047】
ステップ６：ＬＡＧ－３ファージ一本鎖抗体陽性クローンのスクリーニングであって、スクリーニングを１回行った後、良好に分離されたモノクローナルコロニーを選別して、２ＹＴＡＧ液体培地が加えられた９６ウェルのディープウェルプレートに接種し、３７℃、２２０ｒｐｍの条件で、対数増殖期まで培養し、ウェル当たり約１０１０のヘルパーファージＭ１３ＫＯ７を加え、３７℃の温度条件で、３０ｍｉｎ静置感染した。４０００ｒｐｍで、１５ｍｉｎ遠心分離して、上澄みを捨て、菌体を２ＹＴＡＫで再懸濁して沈殿し、２８℃、２２０ｒｐｍの条件で一晩培養した。４０００ｒｐｍ、４℃の条件で、１５ｍｉｎ遠心分離した後、増幅後のファージ上澄みを吸引してＥＬＩＳＡ同定を行い、最後にスクリーニングして、４つの親和性の高い抗ＬＡＧ－３のマウス由来抗体分子を取得し、それぞれＭＡ－１、ＭＡ－２、ＭＡ－３及びＭＡ－４と命名し、上記得られたモノクローナル抗体に対して遺伝子配列決定を行って、正確な抗体配列と決定し、配列決定したところ、上記スクリーニングで得た４つのモノクローナル抗体の配列は次のとおりである。
【表2】
【0048】
具体的に、配列番号２１（ＭＡ－１及びＭＡ－２の重鎖可変領域のアミノ酸配列）：
配列番号２２（ＭＡ－１の軽鎖可変領域のアミノ酸配列）：
配列番号２３（ＭＡ－２の軽鎖可変領域のアミノ酸配列）：
配列番号２４（ＭＡ－３の重鎖可変領域のアミノ酸配列）：
配列番号２５（ＭＡ－３の軽鎖可変領域のアミノ酸配列）：
配列番号２６（ＭＡ－４の重鎖可変領域のアミノ酸配列）：
配列番号２７（ＭＡ－４の軽鎖可変領域のアミノ酸配列）：
【化1】
【化2】
【化3】
【化4】
【化5】
【化6】
【化7】
【0049】
実施例３ 勾配希釈ＥＬＩＳＡによる抗ＬＡＧ－３ファージモノクローナル抗体の親和性の比較
実施例２で得られた４つのマウス由来抗体分子（ＭＡ－１、ＭＡ－２、ＭＡ－３及びＭＡ－４）に対してモノクローナルファージのディスプレイ及び精製を行い、その後、ファージ勾配希釈ＥＬＩＳＡ実験を行って親和性を同定し、対照抗体として特許ＣＮ１０５９９２５９５Ａの抗ＬＡＧ－３のモノクローナル抗体を選択し、具体的な方法は下記のとおりである。
実施例２で得られた４つのマウス由来抗体分子（ＭＡ－１、ＭＡ－２、ＭＡ－３及びＭＡ－４）に対してモノクローナルファージのディスプレイ及び精製を行い、その後、ファージ勾配希釈ＥＬＩＳＡ実験を行って親和性を同定し、対照抗体として特許ＣＮ１０５９９２５９５Ａの抗ＬＡＧ－３のモノクローナル抗体を選択し、具体的な方法は下記のとおりである。
【0050】
ｐＨ９．６の炭酸塩緩衝液を使用して、１００ｎｇ／ウェル／１００μｌでＬＡＧ－３をコーティングし、４℃の温度条件で一晩コーティングし、ＰＢＳＴで３回洗浄し、実施例２のスクリーニングで得られた４つのファージモノクローナル抗体を、それぞれＰＢＳＴで３倍に勾配希釈し、希釈した後のサンプルをウェル当たり１００μｌ加えて室温で１時間静置した。ＰＢＳＴでＥＬＩＳＡプレートを洗浄し、ＰＢＳＴで希釈した後のＨＲＰ－ａｎｔｉ－Ｍ１３モノクローナル抗体をＥＬＩＳＡプレートに加え、室温で１ｈ置いた。ＴＭＢ発色キットを室温で１０分間発色させ、２ＭのＨ２ＳＯ４で終了させた後、４５０ｎｍ／６３０ｎｍで数値を読み取って、対応するＥＣ５０値を計算し、具体的なデータは、次のとおりである。
【表3】
【0051】
上記データにより、且つ図２に示すように、実施例２でスクリーニングにより得られた４つの異なるマウス由来抗体分子は、いずれもＬＡＧ－３と結合することができ、本発明にて提供されるモノクローナル抗体は、いずれもＬＡＧ－３との高い親和性を有する。
【0052】
実施例４
本発明の実施例４では、実施例２を基に、マウス由来抗体分子は重鎖定常領域及び軽鎖定常領域をさらに含むとさらに限定し、重鎖定常領域は、マウスのＩｇＧ１型、ＩｇＧ２ａ型、ＩｇＧ２ｂ型、ＩｇＧ３型のうちの１つであり、ＩｇＧ１型の重鎖定常領域アミノ酸配列は配列番号２９に示され、ＩｇＧ２ａ型の重鎖定常領域アミノ酸配列は配列番号３０に示され、ＩｇＧ２ｂ型の重鎖定常領域アミノ酸配列は配列番号３１に示され、ＩｇＧ３型の重鎖定常領域アミノ酸配列は配列番号３２に示され、軽鎖定常領域は、アミノ酸配列が配列番号２８に示されるマウス由来Ｃｋ鎖であり、具体的な配列は下記のとおりである。
本発明の実施例４では、実施例２を基に、マウス由来抗体分子は重鎖定常領域及び軽鎖定常領域をさらに含むとさらに限定し、重鎖定常領域は、マウスのＩｇＧ１型、ＩｇＧ２ａ型、ＩｇＧ２ｂ型、ＩｇＧ３型のうちの１つであり、ＩｇＧ１型の重鎖定常領域アミノ酸配列は配列番号２９に示され、ＩｇＧ２ａ型の重鎖定常領域アミノ酸配列は配列番号３０に示され、ＩｇＧ２ｂ型の重鎖定常領域アミノ酸配列は配列番号３１に示され、ＩｇＧ３型の重鎖定常領域アミノ酸配列は配列番号３２に示され、軽鎖定常領域は、アミノ酸配列が配列番号２８に示されるマウス由来Ｃｋ鎖であり、具体的な配列は下記のとおりである。
【0053】
配列番号２８（マウス由来Ｃｋ鎖の軽鎖定常領域配列）：
配列番号２９（マウスのＩｇＧ１型の重鎖定常領域配列）：
配列番号３０（マウスのＩｇＧ２ａ型の重鎖定常領域配列）：
配列番号３１（マウスのＩｇＧ２ｂ型の重鎖定常領域配列）：
配列番号３２（マウスのＩｇＧ３型の重鎖定常領域配列）：
【化8】
【化9】
【化10】
【化11】
【化12】
【0054】
実施例５ 抗ＬＡＧ－３マウス由来抗体分子の製造
本発明の実施例５では、実施例４を基に好ましくはマウス由来抗体分子の重鎖定常領域はマウスのＩｇＧ１型であると限定し、ＩｇＧ１型は配列番号２９に示されるアミノ酸配列を含み、軽鎖定常領域はマウス由来Ｃｋ鎖であり、マウス由来Ｃｋ鎖は配列番号２８に示されるアミノ酸配列を含む。抗体の製造方法は、具体的には、下記のとおりである。
本発明の実施例５では、実施例４を基に好ましくはマウス由来抗体分子の重鎖定常領域はマウスのＩｇＧ１型であると限定し、ＩｇＧ１型は配列番号２９に示されるアミノ酸配列を含み、軽鎖定常領域はマウス由来Ｃｋ鎖であり、マウス由来Ｃｋ鎖は配列番号２８に示されるアミノ酸配列を含む。抗体の製造方法は、具体的には、下記のとおりである。
【0055】
１、実施例２でスクリーニングして得られた４つのモノクローナル抗体の重鎖ＶＨ及び軽鎖ＶＬのコード遺伝子をそれぞれ重鎖及び軽鎖の定常領域を含む遺伝子のベクターｐＴＳＥにクローニングし（図３に示すように）、好ましくは、重鎖定常領域はマウスのＩｇＧ１型である定常領域（アミノ酸配列は、配列番号２９に示される）であり、軽鎖定常領域はマウス由来Ｃｋ鎖（アミノ酸配列は、配列番号２８に示される）であり、ｐＴＳＥベクター構造は、図３に示されるようである（ｐＴＳＥベクター製造プロセスは、ＣＮ１０３５２５８６８Ａの明細書第３ページの第［００１９］段参照）。
【0056】
２、ＨＥＫ２９３Ｅ細胞（中国医学科学院基礎医学研究所から購入、製品番号はＧＮＨｕ４３）を一過性にトランスフェクションして、抗体を発現し、ＡＫＴＡ機器を使用してｐｒｏｔｅｉｎ Ａ親和性カラムで精製して、４つのモノクローナル抗体を取得するとともに、ＢＣＡキット（北京匯天東方科技有限公司から購入、製品番号：ＢＣＡ００２０）を使用してタンパク濃度度測定を行った後、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによりタンパク質のサイズを同定し、結果は図４に示すとおりであり、左側から右側の順に非還元ＭＡ－１、ＭＡ－２、ＭＡ－３及びＭＡ－４及びタンパク質の分子量Ｍａｒｋｅｒ１、Ｍａｒｋｅｒ２、並びに還元ＭＡ－１、ＭＡ－２、ＭＡ－３及びＭＡ－４マウス由来抗ＬＡＧ－３モノクローナル抗体であり、バンド当たりの分子量サイズは理論と一致した。
【0057】
実施例６ マウス由来抗体とＬＡＧ－３との結合実験
ｐＨ９．６の炭酸塩緩衝液を使用してＬＡＧ－３を１００ｎｇ／ウェル／１００μｌでコーティングし、４℃の温度条件で、一晩コーティングした。３００μｌ／ウェルのＰＢＳＴで５回洗浄し、続いて、１％のＢＳＡ－ＰＢＳＴを加えて、３７℃の温度条件で、１ｈブロッキングし、異なる希釈濃度のＭＡ－１、ＭＡ－２、ＭＡ－３及びＭＡ－４マウス由来抗体を加え、４種類の完全抗体の初期最高濃度はいずれも５μｇ／ｍｌであり、それぞれ３倍に希釈した後、抗体ごとに１２個の勾配を作り、３７℃の温度条件で、１ｈインキュベートした。３００μｌ／ウェルのＰＢＳＴで５回洗浄し、続いて、１％のＢＳＡ－ＰＢＳＴを使用して１：１００００に希釈したＡｎｔｉ－Ｍｏｕｓｅ Ｆｃ－ＨＲＰを加え、３７℃の温度条件で、１ｈインキュベートした。ＴＭＢ発色キットを１００μｌ／ウェルで、室温で、８ｍｉｎ発色させ、その後、２ＭのＨ２ＳＯ４を用いて発色を終了した。４５０ｎｍ／６３０ｎｍで読み取って、対応するＥＣ５０値を計算し、具体的なデータは次のとおりである。
ｐＨ９．６の炭酸塩緩衝液を使用してＬＡＧ－３を１００ｎｇ／ウェル／１００μｌでコーティングし、４℃の温度条件で、一晩コーティングした。３００μｌ／ウェルのＰＢＳＴで５回洗浄し、続いて、１％のＢＳＡ－ＰＢＳＴを加えて、３７℃の温度条件で、１ｈブロッキングし、異なる希釈濃度のＭＡ－１、ＭＡ－２、ＭＡ－３及びＭＡ－４マウス由来抗体を加え、４種類の完全抗体の初期最高濃度はいずれも５μｇ／ｍｌであり、それぞれ３倍に希釈した後、抗体ごとに１２個の勾配を作り、３７℃の温度条件で、１ｈインキュベートした。３００μｌ／ウェルのＰＢＳＴで５回洗浄し、続いて、１％のＢＳＡ－ＰＢＳＴを使用して１：１００００に希釈したＡｎｔｉ－Ｍｏｕｓｅ Ｆｃ－ＨＲＰを加え、３７℃の温度条件で、１ｈインキュベートした。ＴＭＢ発色キットを１００μｌ／ウェルで、室温で、８ｍｉｎ発色させ、その後、２ＭのＨ２ＳＯ４を用いて発色を終了した。４５０ｎｍ／６３０ｎｍで読み取って、対応するＥＣ５０値を計算し、具体的なデータは次のとおりである。
【表4】
【0058】
上記データにより、及び図５に示すように、スクリーニングで得られた４つの異なるマウス由来抗体は、いずれもＬＡＧ－３と結合でき、さらに、この４つのマウス由来抗体分子のうち、ＭＡ－１のＥＣ５０値が最も低く、これは、ＬＡＧ－３との結合能力が最もよく、親和性が最も高いことを示す。
【0059】
実施例７ 混合リンパ細胞反応において、マウス由来抗体のサイトカインＩＬ－２分泌量に対する影響
密度勾配遠心分離法にしたがって新鮮な末梢血ＰＢＭＣを分離し、電磁ビーズでＣＤ１４＋Ｔ細胞を選別し、２０ｎｇ／ｍＬのＧＭ－ＣＳＦ及び１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－４の培地を使用してＣＤ１４＋Ｔ細胞を培養し、２日毎に液体交換し、７～１０日で樹状ＤＣ細胞に誘導した。ＤＣを使用する２日前に、２５ｎｇ／ｍＬのＴＮＦ－αを加えてＤＣを成熟ＤＣ細胞に誘導し、成熟ＤＣ細胞を回収し、細胞密度が１ｘ１０５個／ｍＬの細胞懸濁液に調製した。新鮮な末梢血ＰＢＭＣから電磁ビーズでＣＤ４＋Ｔ細胞を選別して、カウントし、細胞密度が１ｘ１０６個／ｍＬの細胞懸濁液に製造した。ＣＤ４＋Ｔ細胞及びＤＣ細胞を、それぞれ１００μＬとって、１０：１の比で９６ウェルプレートに加えた。
密度勾配遠心分離法にしたがって新鮮な末梢血ＰＢＭＣを分離し、電磁ビーズでＣＤ１４＋Ｔ細胞を選別し、２０ｎｇ／ｍＬのＧＭ－ＣＳＦ及び１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－４の培地を使用してＣＤ１４＋Ｔ細胞を培養し、２日毎に液体交換し、７～１０日で樹状ＤＣ細胞に誘導した。ＤＣを使用する２日前に、２５ｎｇ／ｍＬのＴＮＦ－αを加えてＤＣを成熟ＤＣ細胞に誘導し、成熟ＤＣ細胞を回収し、細胞密度が１ｘ１０５個／ｍＬの細胞懸濁液に調製した。新鮮な末梢血ＰＢＭＣから電磁ビーズでＣＤ４＋Ｔ細胞を選別して、カウントし、細胞密度が１ｘ１０６個／ｍＬの細胞懸濁液に製造した。ＣＤ４＋Ｔ細胞及びＤＣ細胞を、それぞれ１００μＬとって、１０：１の比で９６ウェルプレートに加えた。
【0060】
実施例５で製造したＭＡ－１、ＭＡ－２、ＭＡ－３及びＭＡ－４マウス由来抗体をそれぞれ４倍に勾配希釈し、抗体あたりに６個の勾配を設定し、それぞれ５０μｌを取って９６ウェルプレートに加えて、５日培養した後、ＩＬ－２の濃度を検出し、４５０ｎｍで読み取って、対応するＥＣ５０値を計算し、具体的なデータは次のとおりである。
【表5】
【0061】
上記データにより、及び図６に示すように、本発明のスクリーニングで得られた４つのマウス由来抗体分子は、いずれも良い活性を有し、さらに、上記データにより、さらに、本発明のスクリーニングで得られた４つのモノクローナル抗体のうち、ＭＡ－１のＥＣ５０値が最も低いため、その活性が最もよいという結論を得ることもでき、そのため、本発明は、マウス由来抗体分子ＭＡ－１に対してヒト化処理を行うことができる。
【0062】
実施例８
本発明の実施例８は、モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片はキメラ抗体分子であるとさらに限定し、キメラ抗体分子は、実施例２におけるマウス由来抗体分子の重鎖可変領域、マウス由来抗体分子の軽鎖可変領域及びヒト由来抗体定常領域を含み、ヒト由来抗体定常領域は、ヒト由来抗体重鎖定常領域及びヒト由来抗体軽鎖定常領域を含み、ヒト由来抗体重鎖定常領域は、ヒトのＩｇＧ１型、ＩｇＧ２型又はＩｇＧ４型のうちの１つであり、ＩｇＧ１型の重鎖定常領域アミノ酸配列は配列番号３９に示され、ＩｇＧ２型の重鎖定常領域アミノ酸配列は配列番号４０に示され、ＩｇＧ４型の重鎖定常領域アミノ酸配列は配列番号４１に示され、ヒト由来抗体軽鎖定常領域は、アミノ酸配列が配列番号４２に示されるヒトのＣｋ鎖である。
本発明の実施例８は、モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片はキメラ抗体分子であるとさらに限定し、キメラ抗体分子は、実施例２におけるマウス由来抗体分子の重鎖可変領域、マウス由来抗体分子の軽鎖可変領域及びヒト由来抗体定常領域を含み、ヒト由来抗体定常領域は、ヒト由来抗体重鎖定常領域及びヒト由来抗体軽鎖定常領域を含み、ヒト由来抗体重鎖定常領域は、ヒトのＩｇＧ１型、ＩｇＧ２型又はＩｇＧ４型のうちの１つであり、ＩｇＧ１型の重鎖定常領域アミノ酸配列は配列番号３９に示され、ＩｇＧ２型の重鎖定常領域アミノ酸配列は配列番号４０に示され、ＩｇＧ４型の重鎖定常領域アミノ酸配列は配列番号４１に示され、ヒト由来抗体軽鎖定常領域は、アミノ酸配列が配列番号４２に示されるヒトのＣｋ鎖である。
【0063】
配列番号３９（ヒトのＩｇＧ１型の重鎖定常領域アミノ酸配列）：
配列番号４０（ヒトのＩｇＧ２型の重鎖定常領域アミノ酸配列）：
配列番号４１（ヒトのＩｇＧ４型の重鎖定常領域アミノ酸配列）：
配列番号４２（ヒトのＣｋ鎖の軽鎖定常領域アミノ酸配列）：
【化13】
【化14】
【化15】
【化16】
【0064】
実施例９ キメラ抗体分子抗体の製造
本発明の実施例９は、実施例８を基に、キメラ抗体分子の重鎖定常領域は、ヒトのＩｇＧ４型であるとさらに限定し、ＩｇＧ４型の重鎖定常領域アミノ酸配列は配列番号４１に示され、キメラ抗体の軽鎖定常領域は、アミノ酸配列が配列番号４２に示されるヒトのＣｋ鎖である。
本発明の実施例９は、実施例８を基に、キメラ抗体分子の重鎖定常領域は、ヒトのＩｇＧ４型であるとさらに限定し、ＩｇＧ４型の重鎖定常領域アミノ酸配列は配列番号４１に示され、キメラ抗体の軽鎖定常領域は、アミノ酸配列が配列番号４２に示されるヒトのＣｋ鎖である。
【0065】
具体的な製造方法は、下記のとおりである。
実施例２で免疫ファージ抗体ライブラリーのスクリーニングにより得られた抗体分子ＭＡ－１の重鎖可変領域ＶＨ（配列番号２１）及び軽鎖可変領域ＶＬ遺伝子（配列番号２２）は、マウス由来配列をそのままにし、それぞれ重鎖定常領域及び軽鎖定常領域遺伝子を含むベクターｐＴＳＥ（図３に示すように）にクローニングされ、重鎖定常領域は、ヒトのＩｇＧ４型（アミノ酸配列は配列番号４１に示される）であり、軽鎖定常領域は、ヒトのＣｋ鎖（アミノ酸配列は配列番号４２に示される）である。ＨＥＫ２９３Ｅ細胞（中国医学科学院基礎医学研究所から購入、製品番号はＧＮＨｕ４３）を一過性にトランスフェクションして、抗体発現を行って、キメラ抗体ＣＡ－１を得た。
実施例２で免疫ファージ抗体ライブラリーのスクリーニングにより得られた抗体分子ＭＡ－１の重鎖可変領域ＶＨ（配列番号２１）及び軽鎖可変領域ＶＬ遺伝子（配列番号２２）は、マウス由来配列をそのままにし、それぞれ重鎖定常領域及び軽鎖定常領域遺伝子を含むベクターｐＴＳＥ（図３に示すように）にクローニングされ、重鎖定常領域は、ヒトのＩｇＧ４型（アミノ酸配列は配列番号４１に示される）であり、軽鎖定常領域は、ヒトのＣｋ鎖（アミノ酸配列は配列番号４２に示される）である。ＨＥＫ２９３Ｅ細胞（中国医学科学院基礎医学研究所から購入、製品番号はＧＮＨｕ４３）を一過性にトランスフェクションして、抗体発現を行って、キメラ抗体ＣＡ－１を得た。
【0066】
実施例１０ マウス由来抗体分子ＭＡ－１に対するヒト化
まず、実施例２におけるマウス由来抗体分子ＭＡ－１の配列のヒト抗体生殖系列データベース（ｖ－ｂａｓｅ）との比較を使用して、相同性の高いヒト抗体の軽、重鎖生殖系列を探して候補配列とし、その後、マウス由来抗体分子ＭＡ－１のＣＤＲの配列をヒト由来候補配列に移植して、相同性モデリングを行った。その後、３次元構造シミュレーションにより、ＣＤＲループ構造の維持に重要な役割を果たし得る肝心なフレームアミノ酸残基を計算し、それによりヒト化抗体の回復突然変異を設計した。設計済みの回復突然変異を含むヒト化抗体の軽、重鎖可変領域は、それぞれ南京金斯瑞生物科技有限公司により最適化と合成され、その後、一過性発現ベクターに連結され、ヒト化で得られた軽重鎖組合せを分析して、ヒト化抗体分子：ＨＡ－１、ＨＡ－２、ＨＡ－３、ＨＡ－４、ＨＡ－５を得、上記スクリーニングで得られた５個のモノクローナル抗体配列は次のとおりである。
まず、実施例２におけるマウス由来抗体分子ＭＡ－１の配列のヒト抗体生殖系列データベース（ｖ－ｂａｓｅ）との比較を使用して、相同性の高いヒト抗体の軽、重鎖生殖系列を探して候補配列とし、その後、マウス由来抗体分子ＭＡ－１のＣＤＲの配列をヒト由来候補配列に移植して、相同性モデリングを行った。その後、３次元構造シミュレーションにより、ＣＤＲループ構造の維持に重要な役割を果たし得る肝心なフレームアミノ酸残基を計算し、それによりヒト化抗体の回復突然変異を設計した。設計済みの回復突然変異を含むヒト化抗体の軽、重鎖可変領域は、それぞれ南京金斯瑞生物科技有限公司により最適化と合成され、その後、一過性発現ベクターに連結され、ヒト化で得られた軽重鎖組合せを分析して、ヒト化抗体分子：ＨＡ－１、ＨＡ－２、ＨＡ－３、ＨＡ－４、ＨＡ－５を得、上記スクリーニングで得られた５個のモノクローナル抗体配列は次のとおりである。
【表6】
【0067】
具体的に、配列番号３３（ＨＡ－１及びＨＡ－２の重鎖可変領域のアミノ酸配列）：
配列番号３４（ＨＡ－１及びＨＡ－４の軽鎖可変領域のアミノ酸配列）：
配列番号３５（ＨＡ－２及びＨＡ－３の軽鎖可変領域のアミノ酸配列）：
配列番号３６（ＨＡ－３及びＨＡ－４の重鎖可変領域のアミノ酸配列）：
配列番号３７（ＨＡ－５の重鎖可変領域のアミノ酸配列）：
配列番号３８（ＨＡ－５の軽鎖可変領域のアミノ酸配列）：
【化17】
【化18】
【化19】
【化20】
【化21】
【化22】
【0068】
実施例１１
本発明の実施例１１は、実施例１０を基に、ヒト化抗体分子は、重鎖定常領域及び軽鎖定常領域をさらに含むとさらに限定し、重鎖定常領域は、ヒトのＩｇＧ１型、ＩｇＧ２型又はＩｇＧ４型のうちの１つであり、ＩｇＧ１型の重鎖定常領域アミノ酸配列は配列番号３９に示され、ＩｇＧ２型の重鎖定常領域アミノ酸配列は配列番号４０に示され、ＩｇＧ４型の重鎖定常領域アミノ酸配列は配列番号４１に示され、軽鎖定常領域は、アミノ酸配列が配列番号４２に示されるヒトのＣｋ鎖である。
本発明の実施例１１は、実施例１０を基に、ヒト化抗体分子は、重鎖定常領域及び軽鎖定常領域をさらに含むとさらに限定し、重鎖定常領域は、ヒトのＩｇＧ１型、ＩｇＧ２型又はＩｇＧ４型のうちの１つであり、ＩｇＧ１型の重鎖定常領域アミノ酸配列は配列番号３９に示され、ＩｇＧ２型の重鎖定常領域アミノ酸配列は配列番号４０に示され、ＩｇＧ４型の重鎖定常領域アミノ酸配列は配列番号４１に示され、軽鎖定常領域は、アミノ酸配列が配列番号４２に示されるヒトのＣｋ鎖である。
【0069】
実施例１２ ヒト化抗体分子の製造
本発明の実施例１２は、実施例１１を基に、ヒト化抗体分子の重鎖定常領域は、ヒトのＩｇＧ４型であるとさらに限定し、ＩｇＧ４型の重鎖定常領域アミノ酸配列は配列番号４１に示され、軽鎖定常領域は、アミノ酸配列が配列番号４２に示されるヒトのＣｋ鎖である。
本発明の実施例１２は、実施例１１を基に、ヒト化抗体分子の重鎖定常領域は、ヒトのＩｇＧ４型であるとさらに限定し、ＩｇＧ４型の重鎖定常領域アミノ酸配列は配列番号４１に示され、軽鎖定常領域は、アミノ酸配列が配列番号４２に示されるヒトのＣｋ鎖である。
【0070】
上記実施例１０において、ヒト化で得られた５個のヒト化抗体分子の重鎖ＶＨ及び軽鎖ＶＬのコード遺伝子をそれぞれ重鎖定常領域及び軽鎖定常領域遺伝子を含むベクターｐＴＳＥ（図３に示すように）にクローニングし、重鎖定常領域は、ヒトのＩｇＧ４型（アミノ酸配列は配列番号４１に示される）であり、軽鎖定常領域はＣｋ鎖（アミノ酸配列は配列番号４２に示される）である。
【0071】
キメラ抗体ＣＡ－１及びヒト化抗体をＨＥＫ２９３Ｅ細胞（中国医学科学院基礎医学研究所から購入、製品番号はＧＮＨｕ４３）に一過性にトランスフェクションし、抗体発現を行って、ＡＫＴＡ機器を使用してｐｒｏｔｅｉｎ Ａ親和性カラムにより精製して、モノクローナル抗体を取得するとともに、ＢＣＡキット（北京匯天東方科技有限公司から購入、製品番号：ＢＣＡ００２０）を使用してタンパク質濃度測定を行い、その後、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによりタンパク質サイズを同定し、結果は図７に示すとおりであり、左側から右側の順に非還元タンパク質分子量Ｍａｒｋｅｒ１、ＨＡ－１、ＨＡ－２、ＨＡ－３、ＨＡ－４、ＨＡ－５、実施例９で製造したキメラ抗体ＣＡ－１、並びにコア特許ＣＮ１０５９９２５９５Ａにて提供される抗ＬＡＧ－３モノクローナル抗体及び還元タンパク質分子量Ｍａｒｋｅｒ２、ＨＡ－１、ＨＡ－２、ＨＡ－３、ＨＡ－４、ＨＡ－５、キメラ抗体ＣＡ－１、並びにコア特許ＣＮ１０５９９２５９５Ａにて提供される抗ＬＡＧ－３モノクローナル抗体であり、バンド当たりの分子量サイズは理論と一致した。
【0072】
実施例１３
本発明の実施例１３は、上記実施例を基に、ヒト化抗体分子は、全長抗体又は抗体断片であり、ヒト化抗体分子は、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）２、Ｆｖ又はＳｃＦｖのうちの一種又は数種の組合せを含むとさらに限定した。
本発明の実施例１３は、上記実施例を基に、ヒト化抗体分子は、全長抗体又は抗体断片であり、ヒト化抗体分子は、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）２、Ｆｖ又はＳｃＦｖのうちの一種又は数種の組合せを含むとさらに限定した。
【0073】
実施例１４
本発明の実施例１４は、上記実施例を基に、下記の解決手段をさらに限定した。
ポリペプチド又はタンパク質をさらに限定し、ポリペプチド又は前記タンパク質は、上記いずれか１つの実施例に限定される抗ＬＡＧ－３のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を含む。
本発明の実施例１４は、上記実施例を基に、下記の解決手段をさらに限定した。
ポリペプチド又はタンパク質をさらに限定し、ポリペプチド又は前記タンパク質は、上記いずれか１つの実施例に限定される抗ＬＡＧ－３のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を含む。
【0074】
ポリヌクレオチド配列又は組合せをさらに限定し、ポリヌクレオチド配列又は組合せは、上記いずれか１つの実施例に限定される抗ＬＡＧ－３のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片のアミノ酸配列をコードする。
【0075】
組換えＤＮＡ発現ベクターをさらに限定し、組換えＤＮＡ発現ベクターは、上記ポリヌクレオチド配列又は組合せを含む。
【0076】
上記限定された組換えＤＮＡ発現ベクターをトランスフェクションする宿主細胞をさらに限定し、宿主細胞は、原核細胞、酵母細胞、昆虫細胞又は哺乳動物細胞を含み、
好ましくは、宿主細胞は、哺乳動物細胞であり、哺乳動物細胞は、ＨＥＫ２９３Ｅ細胞、ＣＨＯ細胞又はＮＳ０細胞である。
好ましくは、宿主細胞は、哺乳動物細胞であり、哺乳動物細胞は、ＨＥＫ２９３Ｅ細胞、ＣＨＯ細胞又はＮＳ０細胞である。
【0077】
医薬又は医薬組成物をさらに限定し、医薬又は医薬組成物は、上記いずれか１つの実施例に限定される抗ＬＡＧ－３のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を含む。
【0078】
本発明は、抗ＬＡＧ－３のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片の、がん治療用薬又は免疫疾患用薬の製造における使用をさらに提供し、
好ましくは、がんには、白血病、肺がん、胃がん、食道がん、卵巣がん、頭頸部がん、黒色腫、腎がん、乳がん、結腸直腸がん、肝臓がん、膵臓がん、又は膀胱がんが含まれるが、これらに限定されず、免疫疾患には、乾癬、クローン病、リウマチ性関節炎、原発性胆汁性肝硬変、全身性紅斑性狼瘡、多発性硬化症、潰瘍性結腸炎、及び自己免疫性肝炎が含まれるが、これらに限定されない。
好ましくは、がんには、白血病、肺がん、胃がん、食道がん、卵巣がん、頭頸部がん、黒色腫、腎がん、乳がん、結腸直腸がん、肝臓がん、膵臓がん、又は膀胱がんが含まれるが、これらに限定されず、免疫疾患には、乾癬、クローン病、リウマチ性関節炎、原発性胆汁性肝硬変、全身性紅斑性狼瘡、多発性硬化症、潰瘍性結腸炎、及び自己免疫性肝炎が含まれるが、これらに限定されない。
【0079】
実施例１５ ヒト化抗体分子とＬＡＧ－３との結合実験
ｐＨ９．６の炭酸塩緩衝液を使用してＬＡＧ－３を１００ｎｇ／ウェル／１００μｌでコーティングし、４℃の温度条件で、一晩コーティングした。３００μｌ／ウェルのＰＢＳＴで５回洗浄し、続いて１％のＢＳＡ－ＰＢＳを加えて、３７℃の温度条件で、２ｈブロッキングし、異なる希釈濃度のヒト化抗体ＨＡ－１、ＨＡ－２、ＨＡ－３、ＨＡ－４、ＨＡ－５と、実施例９で製造したキメラ抗体ＣＡ－１と、特許ＣＮ１０５９９２５９５Ａの抗ＬＡＧ－３抗体とを加え、７個の抗体の初期最高濃度は、いずれも５μｇ／ｍｌであり、それぞれ５倍に希釈した後、抗体あたりに８個の勾配を作り、３７℃の温度条件で、１ｈインキュベートした。３００μｌ／ウェルのＰＢＳＴで５回洗浄し、続いて１％のＢＳＡ－ＰＢＳを使用して１：１００００で希釈したＡｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ Ｆｃ－ＨＲＰを加え、３７℃の温度条件で、１ｈインキュベートした。ＴＭＢ発色キットを１００μｌ／ウェルで、室温で、８ｍｉｎ発色させ、その後、２ＭのＨ２ＳＯ４で発色を終了した。４５０ｎｍ／６３０ｎｍで読み取って、対応するＥＣ５０値を計算し、具体的なデータは次のとおりである。
ｐＨ９．６の炭酸塩緩衝液を使用してＬＡＧ－３を１００ｎｇ／ウェル／１００μｌでコーティングし、４℃の温度条件で、一晩コーティングした。３００μｌ／ウェルのＰＢＳＴで５回洗浄し、続いて１％のＢＳＡ－ＰＢＳを加えて、３７℃の温度条件で、２ｈブロッキングし、異なる希釈濃度のヒト化抗体ＨＡ－１、ＨＡ－２、ＨＡ－３、ＨＡ－４、ＨＡ－５と、実施例９で製造したキメラ抗体ＣＡ－１と、特許ＣＮ１０５９９２５９５Ａの抗ＬＡＧ－３抗体とを加え、７個の抗体の初期最高濃度は、いずれも５μｇ／ｍｌであり、それぞれ５倍に希釈した後、抗体あたりに８個の勾配を作り、３７℃の温度条件で、１ｈインキュベートした。３００μｌ／ウェルのＰＢＳＴで５回洗浄し、続いて１％のＢＳＡ－ＰＢＳを使用して１：１００００で希釈したＡｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ Ｆｃ－ＨＲＰを加え、３７℃の温度条件で、１ｈインキュベートした。ＴＭＢ発色キットを１００μｌ／ウェルで、室温で、８ｍｉｎ発色させ、その後、２ＭのＨ２ＳＯ４で発色を終了した。４５０ｎｍ／６３０ｎｍで読み取って、対応するＥＣ５０値を計算し、具体的なデータは次のとおりである。
【表7】
【0080】
上記データ及び実験結果により、且つ図８に示すように、５個の異なるヒト化抗体分子は、いずれもＬＡＧ－３と結合でき、本発明にて提供される５個の異なるモノクローナル抗体のＥＣ５０値は、いずれも特許ＣＮ１０５９９２５９５Ａの抗ＬＡＧ－３抗体より明らかに低く、本発明にて提供されるモノクローナル抗体は、ＬＡＧ－３との結合能力が強く、親和性が高く、さらに、図８及び上記データから次のようなことが分かり、さらに５個の異なるモノクローナル抗体のうち、ＨＡ－１のＥＣ５０値が最も低く、これは、ＬＡＧ－３との結合能力が最もよく、親和性が最も高いことを説明し、また、ＨＡ－１のＥＣ５０値がキメラ抗体ＣＡ－１に類似し、これは、ヒト化された後のＨＡ－１は、マウス由来親抗体ＭＡ－１のＬＡＧ－３との高い親和性を維持し、親和性が低下しなかったことを示す。
【0081】
実施例１６ 混合リンパ細胞反応（ＭＬＲ）で抗ＬＡＧ－３ヒト化抗体分子の活性をテスト
密度勾配遠心分離法にしたがって新鮮な末梢血ＰＢＭＣを分離し、電磁ビーズでＣＤ１４＋Ｔ細胞を選別し、２０ｎｇ／ｍｌのＧＭ－ＣＳＦ及び１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－４の培地を使用してＣＤ１４＋Ｔ細胞を培養し、２日毎に液体交換し、７～１０日で樹状ＤＣ細胞に誘導した。ＤＣを使用する２日前に、２５ｎｇ／ｍＬのＴＮＦ－αを加えてＤＣを成熟ＤＣ細胞に誘導し、成熟ＤＣ細胞を回収し、細胞密度が１×１０５個／ｍＬの細胞懸濁液に調製した。新鮮なＰＭＢＣから電磁ビーズでＣＤ１４＋Ｔ細胞を選別して、カウントし、細胞密度が１×１０６個／ｍＬの細胞懸濁液を製造した。ＣＤ１４＋Ｔ細胞及びＤＣ細胞をそれぞれ１００μＬとって、１０：１の比で９６ウェルプレートに加えた。
密度勾配遠心分離法にしたがって新鮮な末梢血ＰＢＭＣを分離し、電磁ビーズでＣＤ１４＋Ｔ細胞を選別し、２０ｎｇ／ｍｌのＧＭ－ＣＳＦ及び１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－４の培地を使用してＣＤ１４＋Ｔ細胞を培養し、２日毎に液体交換し、７～１０日で樹状ＤＣ細胞に誘導した。ＤＣを使用する２日前に、２５ｎｇ／ｍＬのＴＮＦ－αを加えてＤＣを成熟ＤＣ細胞に誘導し、成熟ＤＣ細胞を回収し、細胞密度が１×１０５個／ｍＬの細胞懸濁液に調製した。新鮮なＰＭＢＣから電磁ビーズでＣＤ１４＋Ｔ細胞を選別して、カウントし、細胞密度が１×１０６個／ｍＬの細胞懸濁液を製造した。ＣＤ１４＋Ｔ細胞及びＤＣ細胞をそれぞれ１００μＬとって、１０：１の比で９６ウェルプレートに加えた。
【0082】
実施例１２で製造した５個の抗ＬＡＧ－３ヒト化抗体分子、実施例９で製造したキメラ抗体ＣＡ－１及び特許ＣＮ１０５９９２５９５Ａにて提供される抗ＬＡＧ－３抗体を陽性対照として、それぞれ４倍に勾配希釈し、抗体当たり８個の勾配を作り、それぞれ５０μＬを取って９６ウェルプレートに加え、５日後、ＣＣＫ８でＣＤ１４＋Ｔ細胞増殖をテストし、４５０ｎｍ／６３０ｎｍで読み取って、対応するＥＣ５０値を計算し、具体的なデータは次のとおりである。
【表8】
【0083】
上記データにより、及び図９に示すように、本発明のスクリーニングで得られた５個の異なる抗ＬＡＧ－３抗体のＥＣ５０値は、いずれも特許ＣＮ１０５９９２５９５Ａにて提供される抗ＬＡＧ－３の抗体より明らかに低く、これは、本発明にて提供される抗ＬＡＧ－３抗体の活性がいずれも高いことを説明し、また、本発明のスクリーニングで得られた５個のモノクローナル抗体のうち、抗ＬＡＧ－３完全抗体ＨＡ－１のＥＣ５０値が最も低く、これは、その活性が最も高いことを説明し、さらに、図９からさらに分かるように、キメラ抗体ＣＡ－１の親和性は、抗ＬＡＧ－３抗体ＨＡ－１のＥＣ５０値に近く、これは、ヒト化抗体ＨＡ－１は、マウス由来親抗体ＭＡ－１の生物学的活性をそのままに維持し、生物学的活性が低下しなかったことを示す。
【0084】
実施例１７ 抗ＬＡＧ－３モノクローナル抗体ＨＡ－１のマウス体内ＭＣ３８結腸直腸がんに対する阻害試験
１、実験動物：
種族：Ｍｕｓ Ｍｕｓｃｕｌｕｓ、ＮＣＧ、マウス、
週齢：６～８週、
実験動物の供給業者：江蘇集粋薬康生物科技有限公司。
１、実験動物：
種族：Ｍｕｓ Ｍｕｓｃｕｌｕｓ、ＮＣＧ、マウス、
週齢：６～８週、
実験動物の供給業者：江蘇集粋薬康生物科技有限公司。
【0085】
２、細胞培養において、ＭＣ３８腫瘍細胞（普如汀生物技術（北京）有限公司（Ｂｉｏｖｅｃｔｏｒ ＮＴＣＣ Ｉｎｃ．）から購入、製品番号：ＮＴＣＣ－ＭＣ３８）を使用した。不活化された１０％ウシ胎児血清（ＥｘＣｅｌｌ Ｂｉｏ、製品番号：ＦＮＤ５００）、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン及び２ｍＭのグルタミンを含有するＤＭＥＭ培地（サーモフィッシャーサイエンティフィック（中国）有限公司（Ｇｉｂｃｏ）から購入、製品番号：１０５６６－０１６）を使用して、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーター中で腫瘍細胞を培養し、３～４日おきに細胞が満杯に成長した後、フラスコを分けて続代させ、対数増殖期にある腫瘍細胞を体内腫瘍の接種に使用した。
【0086】
３、腫瘍細胞の接種と群分けにおいて、ＰＢＳで再懸濁したＭＣ３８腫瘍細胞は、濃度が１．０×１０７／ｍｌであり、実験動物の右側の胸部側面皮下に１００μＬ／匹で接種し、腫瘍が６１ｍｍ３程度に成長したとき、群分けして投薬し、１群当たり８匹で計３つの群あり、それぞれ溶媒対照群、ＨＡ－１（１０ｍｇ／ｋｇ，ｉ．ｐ．，ｂｉｗ×３ｗ）、ＨＡ－１（３０ｍｇ／ｋｇ，ｉ．ｐ．，ｂｉｗ×３ｗ）である。
【0087】
４、検出指標において、毎週、ノギスを使用して、腫瘍体積に対して測定を２回行い、腫瘍の長径及び短径を測定し、その体積計算式は、体積＝０．５×長径×短径２であり、腫瘍体積の変化と投薬時間との関係を記録し、実験結果は、図１０に示すとおりである。
【0088】
図１０のデータから分かるように、抗ＬＡＧ－３モノクローナル抗体ＨＡ－１は、腫瘍の成長を阻害することができ、且つ、用量依存性反応が示された。
【0089】
実施例１８ 抗ＬＡＧ－３モノクローナル抗体ＨＡ－１のタンパク質分子の熱安定性の評価
抗ＬＡＧ－３モノクローナル抗体ＨＡ－１のタンパク質分子を限外濾過してＰＢＳバッファ系に液体を変え、１２０００ｒｐｍ、４℃の条件で、５ｍｉｎ遠心分離し、多機能タンパク質熱安定性分析システム（Ｕｎｃｈａｉｎｅｄ Ｌａｂｓから購入）を使用して、抗ＬＡＧ－３モノクローナル抗体ＨＡ－１のタンパク質分子の熱安定性を評価した。温度変化（２５℃から始まり、０．３℃／ｍｉｎの昇温速度で９５℃まで昇温する）に伴うタンパク質内因性蛍光を監視することにより、タンパク質配座の変化を検出し、それによりタンパク質溶解温度Ｔｍを決定し、タンパク質配座の安定性を評価した。サンプルに凝集が発生すると、散乱光波に干渉が発生し、散乱光信号が増加し、静的光の散乱によりタンパク質のコロイド安定性（Ｔａｇｇで特徴付けられる）を測定し、結果は、下表及び図１１に示すとおりである。
抗ＬＡＧ－３モノクローナル抗体ＨＡ－１のタンパク質分子を限外濾過してＰＢＳバッファ系に液体を変え、１２０００ｒｐｍ、４℃の条件で、５ｍｉｎ遠心分離し、多機能タンパク質熱安定性分析システム（Ｕｎｃｈａｉｎｅｄ Ｌａｂｓから購入）を使用して、抗ＬＡＧ－３モノクローナル抗体ＨＡ－１のタンパク質分子の熱安定性を評価した。温度変化（２５℃から始まり、０．３℃／ｍｉｎの昇温速度で９５℃まで昇温する）に伴うタンパク質内因性蛍光を監視することにより、タンパク質配座の変化を検出し、それによりタンパク質溶解温度Ｔｍを決定し、タンパク質配座の安定性を評価した。サンプルに凝集が発生すると、散乱光波に干渉が発生し、散乱光信号が増加し、静的光の散乱によりタンパク質のコロイド安定性（Ｔａｇｇで特徴付けられる）を測定し、結果は、下表及び図１１に示すとおりである。
【表9】
【0090】
上表及び図１１から分かるように、抗ＬＡＧ－３モノクローナル抗体ＨＡ－１のタンパク質分子の温度は、６６．６℃であり、平均Ｔａｇｇは６８．０℃であり、よい配座安定性及びコロイド安定性を示した。
【0091】
実施例１９
本発明の実施例１９は、上記実施例を基に、下記の解決手段をさらに限定した。
本発明は、抗ＬＡＧ－３のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片と抗ＰＤ－１モノクローナル抗体との組み合わせの、がん治療用薬又は免疫疾患用薬の製造における使用をさらに提供する。
本発明の実施例１９は、上記実施例を基に、下記の解決手段をさらに限定した。
本発明は、抗ＬＡＧ－３のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片と抗ＰＤ－１モノクローナル抗体との組み合わせの、がん治療用薬又は免疫疾患用薬の製造における使用をさらに提供する。
【0092】
さらに、抗ＰＤ－１モノクローナル抗体は、ＤＦＰＤ１－９、ＤＦＰＤ１－１０、ＤＦＰＤ１－１１、ＤＦＰＤ１－１２、ＤＦＰＤ１－１３、Ｎｉｖｏｌｕｍａｂ、Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ、トリパリマブ（Ｔｏｒｉｐａｌｉｍａｂ）、シンチリマブ（Ｓｉｎｔｉｌｉｍａｂ）、チスレリズマブ（Ｔｉｓｌｅｌｉｚｕｍａｂ）、カムレリズマブ（Ｃａｍｒｅｌｉｚｕｍａｂ）、ペンプリマブ（Ｐｅｎｐｕｌｉｍａｂ）又はジンベレリマブ（Ｚｉｍｂｅｒｅｌｉｍａｂ）から選択される。
【0093】
ここで、Ｎｉｖｏｌｕｍａｂ、Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ、トリパリマブ（Ｔｏｒｉｐａｌｉｍａｂ）、シンチリマブ（Ｓｉｎｔｉｌｉｍａｂ）、チスレリズマブ（Ｔｉｓｌｅｌｉｚｕｍａｂ）、カムレリズマブ（Ｃａｍｒｅｌｉｚｕｍａｂ）、ペンプリマブ（Ｐｅｎｐｕｌｉｍａｂ）又はジンベレリマブ（Ｚｉｍｂｅｒｅｌｉｍａｂ）は、いずれも市販されている製品である。
【0094】
ここで、ＤＦＰＤ１－９、ＤＦＰＤ１－１０、ＤＦＰＤ１－１１、ＤＦＰＤ１－１２、ＤＦＰＤ１－１３は、出願番号がＣＮ２０１５１０３１２９１０．８である特許にて提供される抗ＰＤ－１のモノクローナル抗体であり、ＤＦＰＤ１－９は配列番号４４に示される軽鎖可変領域及び配列番号４３に示される重鎖可変領域を含み、ＤＦＰＤ１－１０は、配列番号４５に示される軽鎖可変領域及び配列番号４３に示される重鎖可変領域を含み、ＤＦＰＤ１－１１は配列番号４４に示される軽鎖可変領域及び配列番号４６に示される重鎖可変領域を含み、ＤＦＰＤ１－１２は配列番号４４に示される軽鎖可変領域及び配列番号４７に示される重鎖可変領域を含み、ＤＦＰＤ１－１３は、配列番号４５に示される軽鎖可変領域及び配列番号４６に示される重鎖可変領域を含み、具体的な配列は、下記のとおりである。
【0095】
配列番号４３、配列は次のとおりである。
配列番号４４、配列は次のとおりである。
配列番号４５、配列は次のとおりである。
配列番号４６、配列は次のとおりである。
配列番号４７、配列は次のとおりである。
【化23】
【化24】
【化25】
【化26】
【化27】
【0096】
また、抗ＰＤ－１モノクローナル抗体は、重鎖定常領域及び軽鎖定常領域をさらに含み、重鎖定常領域及び軽鎖定常領域の配列は、出願番号がＣＮ２０１５１０３１２９１０．８である特許にて提供される抗ＰＤ－１のモノクローナル抗体の重鎖定常領域及び軽鎖定常領域と同じである。
【0097】
さらに、がんは、白血病、肺がん、胃がん、食道がん、卵巣がん、頭頸部がん、黒色腫、腎がん、乳がん、結腸直腸がん、肝臓がん、膵臓がん、又は膀胱がんから選択され、免疫疾患には、乾癬、クローン病、リウマチ性関節炎、原発性胆汁性肝硬変、全身性紅斑性狼瘡、多発性硬化症、潰瘍性結腸炎、及び自己免疫性肝炎が含まれる。
【0098】
実施例２０
本発明の実施例２０は、実施例１９の基に、抗ＰＤ－１モノクローナル抗体は、配列番号４５に示される軽鎖可変領域及び配列番号４３に示される重鎖可変領域を含むＤＦＰＤ１－１０であるとさらに限定した。
本発明の実施例２０は、実施例１９の基に、抗ＰＤ－１モノクローナル抗体は、配列番号４５に示される軽鎖可変領域及び配列番号４３に示される重鎖可変領域を含むＤＦＰＤ１－１０であるとさらに限定した。
【0099】
実施例２１
本発明の実施例２１は、実施例１９の基に、抗ＰＤ－１モノクローナル抗体は、Ｎｉｖｏｌｕｍａｂであるとさらに限定した。
本発明の実施例２１は、実施例１９の基に、抗ＰＤ－１モノクローナル抗体は、Ｎｉｖｏｌｕｍａｂであるとさらに限定した。
【0100】
実施例２２ 抗ＬＡＧ－３モノクローナル抗体と抗ＰＤ－１モノクローナル抗体とを組み合わせてＭＣ３８結腸直腸がんモデルの体内薬効実験に適用する
１、試験用薬
（１）上記実施例１０にて提供される抗ＬＡＧ－３のモノクローナル抗体ＨＡ－１は、番号がＪＹ０３であり、
供給会社：北京東方百泰生物科技股フン有限公司、
数：１１ｍＬ／管、４．９ｍｇ／ｍＬ、計７管、
（２）実施例２０にて提供される抗ＰＤ－１モノクローナル抗体はＤＦＰＤ１－１０であり、実験中の番号がＪＹ０３４であり、
供給会社：北京東方百泰生物科技股フン有限公司、
数：１０ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、３瓶、計３００ｍｇ、
（３）Ｏｐｄｉｖｏ（Ｎｉｖｏｌｕｍａｂ）
メーカ：百時美施貴宝
数：１００ｍｇ／１０ｍｌ、１管。
１、試験用薬
（１）上記実施例１０にて提供される抗ＬＡＧ－３のモノクローナル抗体ＨＡ－１は、番号がＪＹ０３であり、
供給会社：北京東方百泰生物科技股フン有限公司、
数：１１ｍＬ／管、４．９ｍｇ／ｍＬ、計７管、
（２）実施例２０にて提供される抗ＰＤ－１モノクローナル抗体はＤＦＰＤ１－１０であり、実験中の番号がＪＹ０３４であり、
供給会社：北京東方百泰生物科技股フン有限公司、
数：１０ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、３瓶、計３００ｍｇ、
（３）Ｏｐｄｉｖｏ（Ｎｉｖｏｌｕｍａｂ）
メーカ：百時美施貴宝
数：１００ｍｇ／１０ｍｌ、１管。
【0101】
２、実験動物
種族：ＭｕｓＭｕｓｃｕｌｕｓ，Ｂ６／ＪＧｐｔ－Ｐｄｃｄ１ｅｍ１Ｃｉｎ（ｈＰＤＣＤ１）Ｌａｇ３ｅｍ１Ｃｉｎ（ｈＬＡＧ３）／Ｇｐｔ
性別：雌
週齢：６～８週
体重：１８～２２ｇ
数：７５匹
実験動物の供給業者：江蘇集粋薬康生物科技有限公司
生産ライセンス番号：ＳＣＸＫ（蘇）２０１８－０００８
種族：ＭｕｓＭｕｓｃｕｌｕｓ，Ｂ６／ＪＧｐｔ－Ｐｄｃｄ１ｅｍ１Ｃｉｎ（ｈＰＤＣＤ１）Ｌａｇ３ｅｍ１Ｃｉｎ（ｈＬＡＧ３）／Ｇｐｔ
性別：雌
週齢：６～８週
体重：１８～２２ｇ
数：７５匹
実験動物の供給業者：江蘇集粋薬康生物科技有限公司
生産ライセンス番号：ＳＣＸＫ（蘇）２０１８－０００８
【0102】
３、実験方法
（１）細胞培養
不活化された１０％ウシ胎児血清、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、及び２ｍＭグルタミンのＤＭＥＭを含有する培地を使用して、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーターでＭＣ３８腫瘍細胞を培養し、３～４日おきに細胞が満杯に成長した後、フラスコを分けて続代させ、対数増殖期にある腫瘍細胞を体内腫瘍の接種に使用した。
（２）腫瘍細胞の接種と群分け
ＰＢＳで再懸濁したＭＣ３８腫瘍細胞は、濃度が１×１０７／ｍＬであり、それを実験動物の右側の胸部側面皮下に１×１０６／１００μＬ／匹で接種し、腫瘍が５０ｍｍ３程度まで成長したとき、群分けして投薬し（当日をＰＧ－Ｄ０と記録する）、１群当たり１０匹で計８つの群ある。
（３）マウスの体重の測定及び実験指標
毎週、ノギスを使用して、腫瘍体積に対して測定を２～３回行い、電子天秤でマウスの体重を秤量して、腫瘍の長径及び短径を測定し、その体積の計算式は、体積＝０．５×長径×短径２である。腫瘍体積に応じてＴ／Ｃ値を計算し、ここで、Ｔは、被検物処理群の腫瘍体積（ＲＴＶ）に対する平均値であり、Ｃは、対照群の腫瘍体積（ＲＴＶ）に対する平均値であり、ＲＴＶは、投薬した後と投薬する前との腫瘍体積の比である。腫瘍成長阻害率ＴＧＩＴＶ（％）＝（１－Ｔ／Ｃ）×１００％である。
（１）細胞培養
不活化された１０％ウシ胎児血清、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、及び２ｍＭグルタミンのＤＭＥＭを含有する培地を使用して、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーターでＭＣ３８腫瘍細胞を培養し、３～４日おきに細胞が満杯に成長した後、フラスコを分けて続代させ、対数増殖期にある腫瘍細胞を体内腫瘍の接種に使用した。
（２）腫瘍細胞の接種と群分け
ＰＢＳで再懸濁したＭＣ３８腫瘍細胞は、濃度が１×１０７／ｍＬであり、それを実験動物の右側の胸部側面皮下に１×１０６／１００μＬ／匹で接種し、腫瘍が５０ｍｍ３程度まで成長したとき、群分けして投薬し（当日をＰＧ－Ｄ０と記録する）、１群当たり１０匹で計８つの群ある。
（３）マウスの体重の測定及び実験指標
毎週、ノギスを使用して、腫瘍体積に対して測定を２～３回行い、電子天秤でマウスの体重を秤量して、腫瘍の長径及び短径を測定し、その体積の計算式は、体積＝０．５×長径×短径２である。腫瘍体積に応じてＴ／Ｃ値を計算し、ここで、Ｔは、被検物処理群の腫瘍体積（ＲＴＶ）に対する平均値であり、Ｃは、対照群の腫瘍体積（ＲＴＶ）に対する平均値であり、ＲＴＶは、投薬した後と投薬する前との腫瘍体積の比である。腫瘍成長阻害率ＴＧＩＴＶ（％）＝（１－Ｔ／Ｃ）×１００％である。
【0103】
実験が終了すると、動物を安楽死させ、腫瘍を剥離して秤量し整然と配置して撮影し、腫瘍重量阻害率ＴＧＩＴＷ（％）を計算し、公式は（１－Ｔ／Ｃ）×１００％であり、ここで、Ｔ／Ｃ＝治療群ＴＷ平均値／対照群ＴＷ平均値である。
【0104】
原則として、評価基準は、Ｔ／Ｃ（％）＞４０％であると無効にし、Ｔ／Ｃ（％）≦４０％であり、且つ統計学的処理Ｐ＜０．０５であると有効にする。
４、投薬計画
注：＊は、各群投薬容積であり、動物体重に応じて１０μＬ／ｇで投薬し、体重が１５～２０％低減すると投薬量を調節でき、ｉ．ｐ．は、腹腔注射を示し、ｂｉｗｘ３ｗｋｓは、毎週２回、３週間投薬して、合計６回投薬することを示し、＃は、ＪＹ０３を２回目に投薬するときから投薬し始め、実際の投薬回数は、３週間で合計５回であることを示す。
４、投薬計画
【表10】
【0105】
５、統計学的分析
ＩＢＭ ＳＰＳＳ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ ２２．０統計学ソフトウェアを適用し、Ｏｎｅ－Ｗａｙ ＡＮＯＶＡ検定を適用して、腫瘍体積、腫瘍重量に対して群間統計学的分析を行い、ｐ＜０．０５は、有意差があると考えられる。
ＩＢＭ ＳＰＳＳ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ ２２．０統計学ソフトウェアを適用し、Ｏｎｅ－Ｗａｙ ＡＮＯＶＡ検定を適用して、腫瘍体積、腫瘍重量に対して群間統計学的分析を行い、ｐ＜０．０５は、有意差があると考えられる。
【0106】
６、データ結果は、次のとおりである。
（１）腫瘍成長の阻害結果
注：各群に対してＯｎｅ－Ｗａｙ ＡＮＯＶＡ単一因子分散分析を行い、ＬＳＤ（ｌｅａｓｔ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ）を用いて事後多重比較を行い、ａ．は、平均±標準誤差を示し、ｂ．は、Ｖｅｈｉｃｌｅ群との比較を示し、ｃ．は、Ｏｐｄｉｖｏ群との比較を示し、ｄ．は、ＪＹ０３群との比較を示し、ｅ．は、ＪＹ０３＋ＪＹ０３４群との比較を示し、ｆ．は、ＪＹ０３＋Ｏｐｄｉｖｏ群との比較を示す。ＪＹ０３４治療群間の比較は、いずれも統計学的差異（ｐ＞０．０５）を示していない。ここで、ＪＹ０３４群、Ｏｐｄｉｖｏ群、ＪＹ０３＋ＪＹ０３４群及びＪＹ０３＋Ｏｐｄｉｖｏ群には、それぞれ、腫瘍が完全になくなったマウスが３匹、５匹、１匹、４匹ある。
（１）腫瘍成長の阻害結果
【表11】
【0107】
（２）腫瘍重量
注：各群に対してＯｎｅ－Ｗａｙ ＡＮＯＶＡ単一因子分散分析を行い、ＬＳＤ（ｌｅａｓｔ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ）を用いて事後多重比較を行い、ａ．は、平均±標準誤差であり、ｂ．は、Ｖｅｈｉｃｌｅ群との比較を示し、ｃ．は、Ｏｐｄｉｖｏ群との比較を示し、ｄ．は、ＪＹ０３群との比較を示し、ｅ．は、ＪＹ０３＋ＪＹ０３４群との比較を示し、ｆ．は、ＪＹ０３＋Ｏｐｄｉｖｏ群との比較を示す。
【表12】
【0108】
上記をまとめると、上記データにより、並びに図１２及び１３に示すように、被検薬ＪＹ０３群、ＪＹ０３４群、Ｏｐｄｉｖｏ群、ＪＹ０３＋ＪＹ０３４群及びＪＹ０３＋Ｏｐｄｉｖｏ群は、いずれも、ＰＤ－１及びＬＡＧ３両標的のヒト化結腸直腸がんＭＣ３８モデルの治療に対して明確な抗腫瘍効果をもたらし、ここで、ＪＹ０３＋ＪＹ０３４群の腫瘍に対する阻害効果は、単一薬ＪＹ０３群及び単一薬ＪＹ０３４群より明らかに強く、ＪＹ０３＋Ｏｐｄｉｖｏ群の腫瘍に対する阻害効果は、単一薬ＪＹ０３群及び単一薬Ｏｐｄｉｖｏ群より明らかに強く、そのため、抗ＬＡＧ－３モノクローナル抗体は、抗ＰＤ－１モノクローナル抗体の腫瘍に対する阻害作用を向上させることができることを説明でき、また、各群で動物耐性は良好であり、明らかな有害反応は見られなかった。
【0109】
本発明は、上記最適な実施形態に限定されるものではなく、誰でも本発明の示唆の下で他の様々な形式の製品を得ることができるが、その形状又は構造にいかなる変更を加えても、本願と同一又は近似する技術的解決手段を有するものは、いずれも本発明の保護範囲内に含まれる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【手続補正書】
【提出日】2023-06-15
【手続補正1】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0006】
本発明は、市場のニーズを満たすために、免疫ライブラリーのスクリーニングにより、ＬＡＧ－３と特異的に結合することができ、且つ高い生物学的活性を有する抗ＬＡＧ－３のモノクローナル抗体又は抗原結合性断片を得る。
【手続補正2】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含むモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片であって、前記重鎖可変領域は、それぞれＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３で表される３つの重鎖相補性決定領域を含み、前記軽鎖可変領域は、それぞれＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３で表される３つの軽鎖相補性決定領域を含み、前記モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片は、Ａ－１～Ａ－４から選択されるいずれか１つであることを特徴とする抗ＬＡＧ－３のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片。Ａ－１：前記重鎖相補性決定領域ＨＣＤＲ１は配列番号１に示されるアミノ酸配列を含み、前記重鎖相補性決定領域ＨＣＤＲ２は配列番号２に示されるアミノ酸配列を含み、前記重鎖相補性決定領域ＨＣＤＲ３は配列番号３に示されるアミノ酸配列を含み、前記軽鎖相補性決定領域ＬＣＤＲ１は配列番号４に示されるアミノ酸配列を含み、前記軽鎖相補性決定領域ＬＣＤＲ２は配列番号５に示されるアミノ酸配列を含み、前記軽鎖相補性決定領域ＬＣＤＲ３は配列番号６に示されるアミノ酸配列を含む。
Ａ－２：前記重鎖相補性決定領域ＨＣＤＲ１は配列番号１に示されるアミノ酸配列を含み、前記重鎖相補性決定領域ＨＣＤＲ２は配列番号２に示されるアミノ酸配列を含み、前記重鎖相補性決定領域ＨＣＤＲ３は配列番号３に示されるアミノ酸配列を含み、前記軽鎖相補性決定領域ＬＣＤＲ１は配列番号４に示されるアミノ酸配列を含み、前記軽鎖相補性決定領域ＬＣＤＲ２は配列番号７に示されるアミノ酸配列を含み、前記軽鎖相補性決定領域ＬＣＤＲ３は配列番号８に示されるアミノ酸配列を含む。
Ａ－３：前記重鎖相補性決定領域ＨＣＤＲ１は配列番号９に示されるアミノ酸配列を含み、前記重鎖相補性決定領域ＨＣＤＲ２は配列番号１０に示されるアミノ酸配列を含み、前記重鎖相補性決定領域ＨＣＤＲ３は配列番号１１に示されるアミノ酸配列を含み、前記軽鎖相補性決定領域ＬＣＤＲ１は配列番号１２に示されるアミノ酸配列を含み、前記軽鎖相補性決定領域ＬＣＤＲ２は配列番号１３に示されるアミノ酸配列を含み、前記軽鎖相補性決定領域ＬＣＤＲ３は配列番号１４に示されるアミノ酸配列を含む。
Ａ－４：前記重鎖相補性決定領域ＨＣＤＲ１は配列番号１５に示されるアミノ酸配列を含み、前記重鎖相補性決定領域ＨＣＤＲ２は配列番号１６に示されるアミノ酸配列を含み、前記重鎖相補性決定領域ＨＣＤＲ３は配列番号１７に示されるアミノ酸配列を含み、前記軽鎖相補性決定領域ＬＣＤＲ１は配列番号１８に示されるアミノ酸配列を含み、前記軽鎖相補性決定領域ＬＣＤＲ２は配列番号１９に示されるアミノ酸配列を含み、前記軽鎖相補性決定領域ＬＣＤＲ３は配列番号２０に示されるアミノ酸配列を含む。
【請求項2】
前記モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片は、マウス由来抗体分子であり、前記マウス由来抗体分子は、ＭＡ－１～ＭＡ－４から選択されるいずれか１つである、ことを特徴とする請求項１に記載の抗ＬＡＧ－３のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片。
ＭＡ－１：前記重鎖可変領域は配列番号２１に示されるアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域は配列番号２２に示されるアミノ酸配列を含む。
ＭＡ－２：前記重鎖可変領域は配列番号２１に示されるアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域は配列番号２３に示されるアミノ酸配列を含む。
ＭＡ－３：前記重鎖可変領域は配列番号２４に示されるアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域は配列番号２５に示されるアミノ酸配列を含む。
ＭＡ－４：前記重鎖可変領域は配列番号２６に示されるアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域は配列番号２７に示されるアミノ酸配列を含む。
【請求項3】
前記マウス由来抗体分子は、重鎖定常領域及び軽鎖定常領域をさらに含み、前記重鎖定常領域は、マウスのＩｇＧ１型、ＩｇＧ２ａ型、ＩｇＧ２ｂ型、ＩｇＧ３型のうちの１つであり、前記ＩｇＧ１型の重鎖定常領域アミノ酸配列は配列番号２９に示され、前記ＩｇＧ２ａ型の重鎖定常領域アミノ酸配列は配列番号３０に示され、前記ＩｇＧ２ｂ型の重鎖定常領域アミノ酸配列は配列番号３１に示され、前記ＩｇＧ３型の重鎖定常領域アミノ酸配列は配列番号３２に示され、前記軽鎖定常領域は、アミノ酸配列が配列番号２８に示されるマウス由来Ｃｋ鎖である、ことを特徴とする請求項２に記載の抗ＬＡＧ－３のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片。
【請求項4】
前記モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片はキメラ抗体分子であり、前記キメラ抗体分子は、前記マウス由来抗体分子の重鎖可変領域、前記マウス由来抗体分子の軽鎖可変領域、及びヒト由来抗体定常領域を含み、前記ヒト由来抗体定常領域は、ヒト由来抗体重鎖定常領域及びヒト由来抗体軽鎖定常領域を含み、前記ヒト由来抗体重鎖定常領域は、ヒトのＩｇＧ１型、ＩｇＧ２型又はＩｇＧ４型のうちの１つであり、前記ＩｇＧ１型の重鎖定常領域アミノ酸配列は配列番号３９に示され、前記ＩｇＧ２型の重鎖定常領域アミノ酸配列は配列番号４０に示され、前記ＩｇＧ４型の重鎖定常領域アミノ酸配列は配列番号４１に示され、前記ヒト由来抗体軽鎖定常領域は、アミノ酸配列が配列番号４２に示されるヒトのＣｋ鎖である、ことを特徴とする請求項２に記載の抗ＬＡＧ－３のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片。
【請求項5】
前記モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片はヒト化抗体分子であり、前記ヒト化抗体分子は、ＨＡ－１～ＨＡ－５から選択されるいずれか１つである、ことを特徴とする請求項１に記載の抗ＬＡＧ－３のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片。
ＨＡ－１：前記重鎖可変領域は配列番号３３に示されるアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域は配列番号３４に示されるアミノ酸配列を含む。
ＨＡ－２：前記重鎖可変領域は配列番号３３に示されるアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域は配列番号３５に示されるアミノ酸配列を含む。
ＨＡ－３：前記重鎖可変領域は配列番号３６に示されるアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域は配列番号３５に示されるアミノ酸配列を含む。
ＨＡ－４：前記重鎖可変領域は配列番号３６に示されるアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域は配列番号３４に示されるアミノ酸配列を含む。
ＨＡ－５：前記重鎖可変領域は配列番号３７に示されるアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域は配列番号３８に示されるアミノ酸配列を含む。
【請求項6】
前記ヒト化抗体分子は、重鎖定常領域及び軽鎖定常領域をさらに含み、前記重鎖定常領域は、ヒトのＩｇＧ１型、ＩｇＧ２型又はＩｇＧ４型のうちの１つであり、前記ＩｇＧ１型の重鎖定常領域アミノ酸配列は配列番号３９に示され、前記ＩｇＧ２型の重鎖定常領域アミノ酸配列は配列番号４０に示され、前記ＩｇＧ４型の重鎖定常領域アミノ酸配列は配列番号４１に示され、前記軽鎖定常領域は、アミノ酸配列が配列番号４２に示されるヒトのＣｋ鎖である、ことを特徴とする請求項５に記載の抗ＬＡＧ－３のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片。
【請求項7】
前記ヒト化抗体分子は、全長抗体又は抗体断片であり、前記ヒト化抗体分子は、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）２、Ｆｖ又はＳｃＦｖのうちの一種又は数種の組合せを含む、ことを特徴とする請求項５に記載の抗ＬＡＧ－３のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片。
【請求項8】
請求項１～７のいずれか１項に記載の抗ＬＡＧ－３のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を含む、ことを特徴とするポリペプチド或いはタンパク質、又は医薬。
【請求項9】
請求項１～７のいずれか１項に記載の抗ＬＡＧ－３のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片のアミノ酸配列をコードする、ことを特徴とするポリヌクレオチド。
【請求項10】
請求項９に記載のポリヌクレオチドを含む、ことを特徴とする組換えＤＮＡ発現ベクター。
【請求項11】
請求項１０に記載の組換えＤＮＡ発現ベクターをトランスフェクションする宿主細胞であって、前記宿主細胞は、原核細胞、酵母細胞、昆虫細胞又は哺乳動物細胞を含み、好ましくは、前記宿主細胞は、哺乳動物細胞であり、前記哺乳動物細胞は、ＨＥＫ２９３Ｅ細胞、ＣＨＯ細胞又はＮＳ０細胞である、
ことを特徴とする宿主細胞。
【請求項12】
請求項１～７のいずれか１項に記載の抗ＬＡＧ－３のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片の、がん治療用薬又は免疫疾患用薬の製造における使用であって、好ましくは、前記がんには、白血病、肺がん、胃がん、食道がん、卵巣がん、頭頸部がん、黒色腫、腎がん、乳がん、結腸直腸がん、肝臓がん、膵臓がん、又は膀胱がんが含まれ、
前記免疫疾患には、乾癬、クローン病、リウマチ性関節炎、原発性胆汁性肝硬変、全身性紅斑性狼瘡、多発性硬化症、潰瘍性結腸炎、及び自己免疫性肝炎が含まれる、
抗ＬＡＧ－３のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片の、がん治療用薬又は免疫疾患用薬の製造における使用。
【請求項13】
請求項１～７のいずれか１項に記載の抗ＬＡＧ－３のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片と抗ＰＤ－１モノクローナル抗体との組み合わせの、がん治療用薬又は免疫疾患用薬の製造における使用。
【請求項14】
前記抗ＰＤ－１モノクローナル抗体は、ＤＦＰＤ１－９、ＤＦＰＤ１－１０、ＤＦＰＤ１－１１、ＤＦＰＤ１－１２、ＤＦＰＤ１－１３、Ｎｉｖｏｌｕｍａｂ、Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ、トリパリマブ（Ｔｏｒｉｐａｌｉｍａｂ）、シンチリマブ（Ｓｉｎｔｉｌｉｍａｂ）、チスレリズマブ（Ｔｉｓｌｅｌｉｚｕｍａｂ）、カムレリズマブ（Ｃａｍｒｅｌｉｚｕｍａｂ）、ペンプリマブ（Ｐｅｎｐｕｌｉｍａｂ）又はジンベレリマブ（Ｚｉｍｂｅｒｅｌｉｍａｂ）から選択される、ことを特徴とする請求項１３に記載の使用。
【請求項15】
前記抗ＰＤ－１モノクローナル抗体は、配列番号４５に示される軽鎖可変領域及び配列番号４３に示される重鎖可変領域を含むＤＦＰＤ１－１０である、ことを特徴とする請求項１４に記載の使用。
【請求項16】
前記がんは、白血病、肺がん、胃がん、食道がん、卵巣がん、頭頸部がん、黒色腫、腎がん、乳がん、結腸直腸がん、肝臓がん、膵臓がん、又は膀胱がんから選択され、前記免疫疾患には、乾癬、クローン病、リウマチ性関節炎、原発性胆汁性肝硬変、全身性紅斑性狼瘡、多発性硬化症、潰瘍性結腸炎、及び自己免疫性肝炎が含まれる、ことを特徴とする請求項１４に記載の使用。
【国際調査報告】