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特表2023-552663安定したレンチウイルスパッケージング細胞株およびその作成方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-12-18
(54)【発明の名称】安定したレンチウイルスパッケージング細胞株およびその作成方法
(51)【国際特許分類】
C12N 5/10 20060101AFI20231211BHJP
C12N 15/49 20060101ALN20231211BHJP
【ＦＩ】
C12N5/10
C12N15/49 ZNA
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023557474
(86)(22)【出願日】2021-11-16
(85)【翻訳文提出日】2023-07-31
(86)【国際出願番号】 CN2021130967
(87)【国際公開番号】W WO2022116815
(87)【国際公開日】2022-06-09
(31)【優先権主張番号】202011403323.7
(32)【優先日】2020-12-04
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】522322815
【氏名又は名称】イミュノファーム テクノロジー カンパニー リミテッド
(71)【出願人】
【識別番号】523209841
【氏名又は名称】北京▲藝▼妙医▲療▼科技有限公司
【氏名又は名称原語表記】ＢＥＩＪＩＮＧ ＹＩＭＩＡＯＹＩＬＩＡＯ ＣＯ．， ＬＴＤ．
(74)【代理人】
【識別番号】100115255
【弁理士】
【氏名又は名称】辻丸 光一郎
(74)【代理人】
【識別番号】100201732
【弁理士】
【氏名又は名称】松縄 正登
(74)【代理人】
【識別番号】100154081
【弁理士】
【氏名又は名称】伊佐治 創
(74)【代理人】
【識別番号】100227019
【弁理士】
【氏名又は名称】安 修央
(72)【発明者】
【氏名】▲齊▼ 菲菲
(72)【発明者】
【氏名】▲魯▼ ▲薪▼安
(72)【発明者】
【氏名】何 霆
(72)【発明者】
【氏名】ダン ツウェイイン
【テーマコード（参考）】
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B065AA90X
4B065AB01
4B065AC20
4B065BA01
4B065BA02
4B065BA23
4B065BB04
4B065CA60
(57)【要約】
本発明は、安定したレンチウイルスパッケージング細胞株およびその作成方法を提供する。
前記安定したレンチウイルスパッケージング細胞株は、ｐＰｕｒｏ．ｃｏＴｅｔＲプラスミド、ｐＶＳＶＧプラスミドおよびｐＧａｇＰｏｌ－ＲＲＥ－ＮＥＳ－ｃＩＮＴプラスミドからなるパッケージングプラスミド群を含み、前記ｐＰｕｒｏ．ｃｏＴｅｔＲプラスミドがＣｏＴｅｔＲ遺伝子を含み、前記ｐＶＳＶＧプラスミドがＶＳＶＧ遺伝子を含み、前記ｐＧａｇＰｏｌ－ＲＲＥ－ＮＥＳ－ｃＩＮＴプラスミドがＧａｇＰｏｌ遺伝子およびＲｅｖ遺伝子を含む。前記安定したレンチウイルスパッケージング細胞株は、継代、ウイルス生産、および遺伝遺伝子コピー数の面で比較的安定しており、前記安定したレンチウイルスパッケージング細胞株を用いて生産されたレンチウイルスは力価が高く、不純物の含量が低い。
前記安定したレンチウイルスパッケージング細胞株は、ｐＰｕｒｏ．ｃｏＴｅｔＲプラスミド、ｐＶＳＶＧプラスミドおよびｐＧａｇＰｏｌ－ＲＲＥ－ＮＥＳ－ｃＩＮＴプラスミドからなるパッケージングプラスミド群を含み、前記ｐＰｕｒｏ．ｃｏＴｅｔＲプラスミドがＣｏＴｅｔＲ遺伝子を含み、前記ｐＶＳＶＧプラスミドがＶＳＶＧ遺伝子を含み、前記ｐＧａｇＰｏｌ－ＲＲＥ－ＮＥＳ－ｃＩＮＴプラスミドがＧａｇＰｏｌ遺伝子およびＲｅｖ遺伝子を含む。前記安定したレンチウイルスパッケージング細胞株は、継代、ウイルス生産、および遺伝遺伝子コピー数の面で比較的安定しており、前記安定したレンチウイルスパッケージング細胞株を用いて生産されたレンチウイルスは力価が高く、不純物の含量が低い。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ｐＰｕｒｏ．ｃｏＴｅｔＲプラスミド、ｐＶＳＶＧプラスミドおよびｐＧａｇＰｏｌ－ＲＲＥ－ＮＥＳ－ｃＩＮＴプラスミドからなるパッケージングプラスミドセットを含み、前記ｐＰｕｒｏ．ｃｏＴｅｔＲプラスミドがＣｏＴｅｔＲ遺伝子を含み、前記ｐＶＳＶＧプラスミドがＶＳＶＧ遺伝子を含み、前記ｐＧａｇＰｏｌ－ＲＲＥ－ＮＥＳ－ｃＩＮＴプラスミドがＧａｇＰｏｌ遺伝子およびＲｅｖ遺伝子を含むことを特徴とする安定したレンチウイルスパッケージング細胞株。
【請求項2】
前記ｐＰｕｒｏ．ｃｏＴｅｔＲプラスミドが、ＣＭＶプロモーターと、キメライントロンと、ＳＶ４０プロモーターと、ピューロマイシン耐性遺伝子と、ポリアデニル化シグナルと、をさらに含み、前記ｐＶＳＶＧプラスミドが、ＣＭＶプロモーターおよび２つのテトラサイクリンオペレーターからなるハイブリッドプロモーターと、ＳＶ４０プロモーターと、ブレオマイシン耐性遺伝子と、ポリアデニル化シグナルと、をさらに含み、
前記ｐＧａｇＰｏｌ－ＲＲＥ－ＮＥＳ－ｃＩＮＴプラスミドが、ＣＭＶプロモーターおよび２つのテトラサイクリンオペレーターからなるハイブリッドプロモーターと、キメライントロンと、ＳＶ４０プロモーターと、ハイグロマイシン耐性遺伝子と、ｃＰＰＴ／ＣＴＳエレメントと、ＲＲＥエレメントと、ポリアデニル化シグナルと、をさらに含む、請求項１に記載の安定したレンチウイルスパッケージング細胞株。
【請求項3】
前記ＣｏＴｅｔＲ遺伝子が配列番号１に示す配列を有し、前記ＶＳＶＧ遺伝子が配列番号２に示す配列を有し、前記ＧａｇＰｏｌ遺伝子およびＲｅｖ遺伝子が、それぞれ、配列番号３および配列番号４に示す配列を有する、請求項１または２に記載の安定したレンチウイルスパッケージング細胞株。
【請求項4】
前記ｐＰｕｒｏ．ｃｏＴｅｔＲプラスミドが配列番号５に示す配列を有し、前記ｐＶＳＶＧプラスミドが配列番号６に示す配列を有し、前記ｐＧａｇＰｏｌ－ＲＲＥ－ＮＥＳ－ｃＩＮＴプラスミドが配列番号７に示す配列を有する、請求項１～３のいずれか一項に記載の安定したレンチウイルスパッケージング細胞株。
【請求項5】
前記細胞株が、ＨＥＫ２９３細胞株、ＨＥＫ２９３－Ｔ細胞株、ＨＥＫ２９３－ＳＦ細胞株、ＴＥ６７１細胞株、ＨＴ１０８０細胞株およびＨｅＬａ細胞株からなる群より選択される１つであり、好ましくは、前記細胞株がＨＥＫ２９３細胞株である、請求項１～４のいずれか一項に記載の安定したレンチウイルスパッケージング細胞株。
【請求項6】
（１）ｐＰｕｒｏ．ｃｏＴｅｔＲプラスミド、ｐＶＳＶＧプラスミド、およびｐＧａｇＰｏｌ－ＲＲＥ－ＮＥＳ－ｃＩＮＴプラスミドをそれぞれ酵素消化により直線化する工程と、（２）直線化した前記ｐＰｕｒｏ．ｃｏＴｅｔＲプラスミドと前記ｐＶＳＶＧプラスミドを細胞に同時トランスフェクションし、スクリーニング用の第１の抗生物質を添加して、第１の陽性モノクローナル細胞を得る工程と、
（３）直線化した前記ｐＧａｇＰｏｌ－ＲＲＥ－ＮＥＳ－ｃＩＮＴプラスミドを第１の陽性モノクローナル細胞にトランスフェクションし、スクリーニング用の第２の抗生物質を添加して、第２の陽性モノクローナル細胞、すなわち、安定したレンチウイルスパッケージング細胞株を得る工程と、を含む、
請求項１～５のいずれか一項に記載の安定したレンチウイルスパッケージング細胞株を作成する方法。
【請求項7】
前記工程（２）において、直線化した前記ｐＰｕｒｏ．ｃｏＴｅｔＲプラスミドおよび前記ｐＶＳＶＧプラスミドを細胞に同時トランスフェクションする間に、ポリエチレンイミンをさらに添加し、ポリエチレンイミンと前記２つのプラスミドの質量比が、ポリエチレンイミン：（ｐＰｕｒｏ．ｃｏＴｅｔＲプラスミド＋ｐＶＳＶＧプラスミド）＝（１～８）：１であり、
好ましくは、ポリエチレンイミンと前記２つのプラスミドの質量比が、ポリエチレンイミン：（ｐＰｕｒｏ．ｃｏＴｅｔＲプラスミド＋ｐＶＳＶＧプラスミド）＝（２～５）：１であり、
より好ましくは、ポリエチレンイミンと前記２つのプラスミドの質量比がポリエチレンイミン：（ｐＰｕｒｏ．ｃｏＴｅｔＲプラスミド＋ｐＶＳＶＧプラスミド）＝４：１であり、および／または
前記工程（３）において、直線化した前記ｐＧａｇＰｏｌ－ＲＲＥ－ＮＥＳ－ｃＩＮＴプラスミドを第１の陽性モノクローナル細胞にトランスフェクションする間に、ポリエチレンイミンをさらに添加し、
ポリエチレンイミンと前記ｐＧａｇＰｏｌ－ＲＲＥ－ＮＥＳ－ｃＩＮＴプラスミドの質量比は（１～８）：１であり、
好ましくは、ポリエチレンイミンと前記ｐＧａｇＰｏｌ－ＲＲＥ－ＮＥＳ－ｃＩＮＴプラスミドの質量比が（２～５）：１であり、
より好ましくは、ポリエチレンイミンと前記ｐＧａｇＰｏｌ－ＲＲＥ－ＮＥＳ－ｃＩＮＴプラスミドの質量比が４：１である、請求項６に記載の方法。
【請求項8】
前記工程（２）において、前記ｐＰｕｒｏ．ｃｏＴｅｔＲプラスミドおよび前記ｐＶＳＶＧプラスミドの使用量は、いずれも、細胞あたり（０．２～１．０）μｇ／１０６であり、好ましくは、前記ｐＰｕｒｏ．ｃｏＴｅｔＲプラスミドおよび前記ｐＶＳＶＧプラスミドの使用量は、いずれも、細胞あたり（０．４～０．９）μｇ／１０６であり、
より好ましくは、前記ｐＰｕｒｏ．ｃｏＴｅｔＲプラスミドおよび前記ｐＶＳＶＧプラスミドの使用量は、いずれも、細胞あたり０．８μｇ／１０６であり、および／または
前記工程（３）において、前記ｐＧａｇＰｏｌ－ＲＲＥ－ＮＥＳ－ｃＩＮＴプラスミドの使用量は、第１陽性モノクローナル細胞あたり（０．２～１．０）μｇ／１０６であり、
好ましくは、前記ｐＧａｇＰｏｌ－ＲＲＥ－ＮＥＳ－ｃＩＮＴプラスミドの使用量は、第１陽性モノクローナル細胞あたり（０．４～０．９）μｇ／１０６であり、
より好ましくは、前記ｐＧａｇＰｏｌ－ＲＲＥ－ＮＥＳ－ｃＩＮＴプラスミドの使用量は、０．８μｇ／１０６第１陽性モノクローナル細胞である、請求項６または７に記載の方法。
【請求項9】
前記工程（２）において、前記第１の抗生物質はピューロマイシンおよびブレオマイシンの組合せであり、使用量がそれぞれ、１～５μｇ／ｍＬおよび３００～５００μｇ／ｍＬであり、より好ましくは、使用量がそれぞれ、２μｇ／ｍＬおよび４００μｇ／ｍＬであり、および／または前記工程（３）において、前記第２の抗生物質はピューロマイシン、ブレオマイシンおよびハイグロマイシンの組合せであり、使用量がそれぞれ、１～５μｇ／ｍＬ、３００～５００μｇ／ｍＬおよび３００～５００μｇ／ｍＬであり、より好ましくは、使用量がそれぞれ、２μｇ／ｍＬ、４００μｇ／ｍＬおよび４００μｇ／ｍＬである、請求項６～８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項10】
請求項１～５のいずれか一項に記載の安定したレンチウイルスパッケージング細胞株に標的プラスミドをトランスフェクションする、レンチウイルスの生産方法。
【請求項11】
前記安定したレンチウイルスパッケージング細胞株に前記標的プラスミドをトランスフェクションする工程と、次いで誘導剤を添加して前記安定したレンチウイルスパッケージング細胞株を誘導してレンチウイルスを生産する工程と、
を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項12】
前記標的プラスミドを前記安定レンチウイルスパッケージング細胞株にトランスフェクションする間にポリエチレンイミンをさらに添加し、ポリエチレンイミンと前記標的プラスミドの質量比が、ポリエチレンイミン：標的プラスミド＝（１～８）：１であり、
好ましくは、ポリエチレンイミンと前記標的プラスミドの質量比が、ポリエチレンイミン：標的プラスミド＝（２～５）：１であり、
より好ましくは、ポリエチレンイミンと前記標的プラスミドの質量比が、ポリエチレンイミン：標的プラスミド＝４：１である、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項13】
前記標的プラスミドの使用量が、安定レンチウイルスパッケージング細胞株あたり（０．２～０．８）μｇ／１０６であり、好ましくは、前記標的プラスミドの使用量が、安定レンチウイルスパッケージング細胞株あたり（０．３～０．５）μｇ／１０６であり、
より好ましくは、前記標的プラスミドの使用量が、安定レンチウイルスパッケージング細胞株あたり０．４μｇ／１０６である、請求項１０～１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項14】
前記誘導剤がドキシサイクリンであり、好ましくは、トランスフェクションの２０～３０時間後に前記誘導剤を添加し、より好ましくは、トランスフェクションの２４時間後に前記誘導剤を添加し、
好ましくは、前記誘導剤を濃度１～５μｇ／ｍＬで添加し、より好ましくは、前記誘導剤を濃度２μｇ／ｍＬで添加する、請求項１０～１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項15】
前記レンチウイルスの生産中に増強剤をさらに添加してレンチウイルス発現レベルを増加させ、前記増強剤が酪酸ナトリウムであり、
好ましくは、前記増強剤を濃度５～１５ｍＭで添加し、より好ましくは、前記増強剤を濃度１０ｍＭで添加し、
好ましくは、トランスフェクションの２０～３０時間後に前記増強剤を添加し、より好ましくは、トランスフェクションの２４時間後に増強剤を添加し、
好ましくは、増強剤添加の６～８時間後に増強剤を交換し、および／または
４５～５０時間で前記レンチウイルスを収集し、好ましくは、４８時間で前記レンチウイルスを収集する、請求項１０～１４のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、免疫学および分子生物学の分野、特に細胞療法の分野に属する。特に、本発明は、安定したレンチウイルスパッケージング細胞株およびその作成方法に関する。
【背景技術】
【0002】
遺伝子治療用ベクターであるレンチウイルスは、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）などを含む。他のレトロウイルスベクターとは異なり、レンチウイルスベクターは、分裂細胞および非分裂細胞の両方に感染することができる。レンチウイルスは、心筋細胞、腫瘍細胞、ニューロン細胞、幹細胞、肝細胞、および内皮細胞などの様々なタイプの細胞に感染することができる。レンチウイルスは、より低いレベルの免疫応答を誘発しながら、より大きな外来断片を収容し、標的遺伝子の安定した発現を実現することができるため、良好な遺伝子治療有効性を提供する。したがって、レンチウイルスは、より広い適用可能性を有する。
【0003】
レンチウイルスは、現在、パッケージングプラスミドおよび発現プラスミドを細胞に一過性トランスフェクションすることによって生成されることがほとんどである。しかしながら、既存の作成プロセスによって生成されるレンチウイルスは、力価が低く、不純物残基が過剰であり、バッチ間のウイルス収量が不安定である。したがって、不純物含量が低く力価が高いレンチウイルスの生産を可能にする安定したレンチウイルスパッケージング細胞株を構築する必要性が残っている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0004】
そのため、本発明の目的は、安定したレンチウイルスパッケージング細胞株およびその作成方法を提供することである。前記安定したレンチウイルスパッケージング細胞株は、継代、ウイルス生産、および遺伝遺伝子のコピー数の面で比較的安定している。また、前記安定したレンチウイルスパッケージング細胞株を用いて生産されたレンチウイルスは力価が高く、不純物の含量が低い。
【課題を解決するための手段】
【0005】
上記の目的を実現するために、本発明の一態様の安定したレンチウイルスパッケージング細胞株は、ｐＰｕｒｏ．ｃｏＴｅｔＲプラスミド、ｐＶＳＶＧプラスミドおよびｐＧａｇＰｏｌ－ＲＲＥ－ＮＥＳ－ｃＩＮＴプラスミドからなるパッケージングプラスミドセットを含む。
【0006】
前記ｐＰｕｒｏ．ｃｏＴｅｔＲプラスミドはＣｏＴｅｔＲ遺伝子を含み、前記ｐＶＳＶＧプラスミドはＶＳＶＧ遺伝子を含み、前記ｐＧａｇＰｏｌ－ＲＲＥ－ＮＥＳ－ｃＩＮＴプラスミドはＧａｇＰｏｌ遺伝子およびＲｅｖ遺伝子を含む。
【0007】
本発明の好ましい実施形態では、前記ｐＰｕｒｏ．ｃｏＴｅｔＲプラスミドは、ＣＭＶプロモーターと、キメライントロンと、ＳＶ４０プロモーターと、ピューロマイシン耐性遺伝子と、ポリアデニル化シグナルと、をさらに含む。
【0008】
前記ｐＶＳＶＧプラスミドは、ＣＭＶプロモーターおよび２つのテトラサイクリンオペレーターからなるハイブリッドプロモーターと、ＳＶ４０プロモーターと、ブレオマイシン耐性遺伝子と、ポリアデニル化シグナルと、をさらに含む。
【0009】
前記ｐＧａｇＰｏｌ－ＲＲＥ－ＮＥＳ－ｃＩＮＴプラスミドは、ＣＭＶプロモーターおよび２つのテトラサイクリンオペレーターからなるハイブリッドプロモーターと、キメライントロンと、ＳＶ４０プロモーターと、ハイグロマイシン耐性遺伝子と、ｃＰＰＴ／ＣＴＳエレメントと、ＲＲＥエレメントと、ポリアデニル化シグナルと、をさらに含む。
【0010】
本発明の好ましい実施形態において、前記ＣｏＴｅｔＲ遺伝子は配列番号１に示す配列を有し、前記ＶＳＶＧ遺伝子は配列番号２に示す配列を有し、前記ＧａｇＰｏｌ遺伝子およびＲｅｖ遺伝子は、それぞれ、配列番号３および配列番号４に示す配列を有する。
【0011】
本発明の好ましい実施形態において、前記ｐＰｕｒｏ．ｃｏＴｅｔＲプラスミドは配列番号５に示す配列を有し、前記ｐＶＳＶＧプラスミドは配列番号６に示す配列を有し、前記ｐＧａｇＰｏｌ－ＲＲＥ－ＮＥＳ－ｃＩＮＴプラスミドは配列番号７に示す配列を有する。
【0012】
本発明の好ましい実施形態において、前記細胞株は、ＨＥＫ２９３細胞株、ＨＥＫ２９３－Ｔ細胞株、ＨＥＫ２９３－ＳＦ細胞株、ＴＥ６７１細胞株、ＨＴ１０８０細胞株およびＨｅＬａ細胞株からなる群より選択される１つである。
【0013】
好ましくは、前記細胞株はＨＥＫ２９３細胞株である。
【0014】
同じ発明概念に基づいて、本発明の別の態様の安定したレンチウイルスパッケージング細胞株を作成する方法は、
（１）ｐＰｕｒｏ．ｃｏＴｅｔＲプラスミド、ｐＶＳＶＧプラスミド、およびｐＧａｇＰｏｌ－ＲＲＥ－ＮＥＳ－ｃＩＮＴプラスミドをそれぞれ酵素消化により直線化する工程と、
（２）直線化した前記ｐＰｕｒｏ．ｃｏＴｅｔＲプラスミドと前記ｐＶＳＶＧプラスミドを細胞に同時トランスフェクションし、スクリーニング用の第１の抗生物質を添加して、第１の陽性モノクローナル細胞を得る工程と、
（３）直線化した前記ｐＧａｇＰｏｌ－ＲＲＥ－ＮＥＳ－ｃＩＮＴプラスミドを第１の陽性モノクローナル細胞にトランスフェクションし、スクリーニング用の第２の抗生物質を添加して、第２の陽性モノクローナル細胞、すなわち、安定したレンチウイルスパッケージング細胞株を得る工程と、を含む。
（１）ｐＰｕｒｏ．ｃｏＴｅｔＲプラスミド、ｐＶＳＶＧプラスミド、およびｐＧａｇＰｏｌ－ＲＲＥ－ＮＥＳ－ｃＩＮＴプラスミドをそれぞれ酵素消化により直線化する工程と、
（２）直線化した前記ｐＰｕｒｏ．ｃｏＴｅｔＲプラスミドと前記ｐＶＳＶＧプラスミドを細胞に同時トランスフェクションし、スクリーニング用の第１の抗生物質を添加して、第１の陽性モノクローナル細胞を得る工程と、
（３）直線化した前記ｐＧａｇＰｏｌ－ＲＲＥ－ＮＥＳ－ｃＩＮＴプラスミドを第１の陽性モノクローナル細胞にトランスフェクションし、スクリーニング用の第２の抗生物質を添加して、第２の陽性モノクローナル細胞、すなわち、安定したレンチウイルスパッケージング細胞株を得る工程と、を含む。
【0015】
本発明の好ましい実施形態では、前記工程（２）において、直線化した前記ｐＰｕｒｏ．ｃｏＴｅｔＲプラスミドおよび前記ｐＶＳＶＧプラスミドを細胞に同時トランスフェクションする間に、ポリエチレンイミンをさらに添加する。
ポリエチレンイミンと前記２つのプラスミドの質量比が、ポリエチレンイミン：（ｐＰｕｒｏ．ｃｏＴｅｔＲプラスミド＋ｐＶＳＶＧプラスミド）＝（１～８）：１であり、
好ましくは、ポリエチレンイミンと前記２つのプラスミドの質量比が、ポリエチレンイミン：（ｐＰｕｒｏ．ｃｏＴｅｔＲプラスミド＋ｐＶＳＶＧプラスミド）＝（２～５）：１であり、
より好ましくは、ポリエチレンイミンと前記２つのプラスミドの質量比がポリエチレンイミン：（ｐＰｕｒｏ．ｃｏＴｅｔＲプラスミド＋ｐＶＳＶＧプラスミド）＝４：１であり、および／または
前記工程（３）において、直線化した前記ｐＧａｇＰｏｌ－ＲＲＥ－ＮＥＳ－ｃＩＮＴプラスミドを第１の陽性モノクローナル細胞にトランスフェクションする間に、ポリエチレンイミンをさらに添加し、
ポリエチレンイミンと前記ｐＧａｇＰｏｌ－ＲＲＥ－ＮＥＳ－ｃＩＮＴプラスミドの質量比は（１～８）：１であり、
好ましくは、ポリエチレンイミンと前記ｐＧａｇＰｏｌ－ＲＲＥ－ＮＥＳ－ｃＩＮＴプラスミドの質量比が（２～５）：１であり、
より好ましくは、ポリエチレンイミンと前記ｐＧａｇＰｏｌ－ＲＲＥ－ＮＥＳ－ｃＩＮＴプラスミドの質量比が４：１である。
ポリエチレンイミンと前記２つのプラスミドの質量比が、ポリエチレンイミン：（ｐＰｕｒｏ．ｃｏＴｅｔＲプラスミド＋ｐＶＳＶＧプラスミド）＝（１～８）：１であり、
好ましくは、ポリエチレンイミンと前記２つのプラスミドの質量比が、ポリエチレンイミン：（ｐＰｕｒｏ．ｃｏＴｅｔＲプラスミド＋ｐＶＳＶＧプラスミド）＝（２～５）：１であり、
より好ましくは、ポリエチレンイミンと前記２つのプラスミドの質量比がポリエチレンイミン：（ｐＰｕｒｏ．ｃｏＴｅｔＲプラスミド＋ｐＶＳＶＧプラスミド）＝４：１であり、および／または
前記工程（３）において、直線化した前記ｐＧａｇＰｏｌ－ＲＲＥ－ＮＥＳ－ｃＩＮＴプラスミドを第１の陽性モノクローナル細胞にトランスフェクションする間に、ポリエチレンイミンをさらに添加し、
ポリエチレンイミンと前記ｐＧａｇＰｏｌ－ＲＲＥ－ＮＥＳ－ｃＩＮＴプラスミドの質量比は（１～８）：１であり、
好ましくは、ポリエチレンイミンと前記ｐＧａｇＰｏｌ－ＲＲＥ－ＮＥＳ－ｃＩＮＴプラスミドの質量比が（２～５）：１であり、
より好ましくは、ポリエチレンイミンと前記ｐＧａｇＰｏｌ－ＲＲＥ－ＮＥＳ－ｃＩＮＴプラスミドの質量比が４：１である。
【0016】
本発明の好ましい実施形態では、前記工程（２）において、前記ｐＰｕｒｏ．ｃｏＴｅｔＲプラスミドおよび前記ｐＶＳＶＧプラスミドの使用量は、いずれも、細胞あたり（０．２～１．０）μｇ／１０６であり、
好ましくは、前記ｐＰｕｒｏ．ｃｏＴｅｔＲプラスミドおよび前記ｐＶＳＶＧプラスミドの使用量は、いずれも、細胞あたり（０．４～０．９）μｇ／１０６であり、
より好ましくは、前記ｐＰｕｒｏ．ｃｏＴｅｔＲプラスミドおよび前記ｐＶＳＶＧプラスミドの使用量は、いずれも、細胞あたり０．８μｇ／１０６であり、および／または
前記工程（３）において、前記ｐＧａｇＰｏｌ－ＲＲＥ－ＮＥＳ－ｃＩＮＴプラスミドの使用量は、第１陽性モノクローナル細胞あたり（０．２～１．０）μｇ／１０６であり、
好ましくは、前記ｐＧａｇＰｏｌ－ＲＲＥ－ＮＥＳ－ｃＩＮＴプラスミドの使用量は、第１陽性モノクローナル細胞あたり（０．４～０．９）μｇ／１０６であり、
より好ましくは、前記ｐＧａｇＰｏｌ－ＲＲＥ－ＮＥＳ－ｃＩＮＴプラスミドの使用量は、０．８μｇ／１０６第１陽性モノクローナル細胞である。
好ましくは、前記ｐＰｕｒｏ．ｃｏＴｅｔＲプラスミドおよび前記ｐＶＳＶＧプラスミドの使用量は、いずれも、細胞あたり（０．４～０．９）μｇ／１０６であり、
より好ましくは、前記ｐＰｕｒｏ．ｃｏＴｅｔＲプラスミドおよび前記ｐＶＳＶＧプラスミドの使用量は、いずれも、細胞あたり０．８μｇ／１０６であり、および／または
前記工程（３）において、前記ｐＧａｇＰｏｌ－ＲＲＥ－ＮＥＳ－ｃＩＮＴプラスミドの使用量は、第１陽性モノクローナル細胞あたり（０．２～１．０）μｇ／１０６であり、
好ましくは、前記ｐＧａｇＰｏｌ－ＲＲＥ－ＮＥＳ－ｃＩＮＴプラスミドの使用量は、第１陽性モノクローナル細胞あたり（０．４～０．９）μｇ／１０６であり、
より好ましくは、前記ｐＧａｇＰｏｌ－ＲＲＥ－ＮＥＳ－ｃＩＮＴプラスミドの使用量は、０．８μｇ／１０６第１陽性モノクローナル細胞である。
【0017】
本発明の好ましい実施形態では、前記工程（２）において、前記第１の抗生物質はピューロマイシンおよびブレオマイシンの組合せであり、使用量がそれぞれ、１～５μｇ／ｍＬおよび３００～５００μｇ／ｍＬであり、より好ましくは、使用量がそれぞれ、２μｇ／ｍＬおよび４００μｇ／ｍＬであり、および／または
前記工程（３）において、前記第２の抗生物質はピューロマイシン、ブレオマイシンおよびハイグロマイシンの組合せであり、使用量がそれぞれ、１～５μｇ／ｍＬ、３００～５００μｇ／ｍＬおよび３００～５００μｇ／ｍＬであり、より好ましくは、使用量がそれぞれ、２μｇ／ｍＬ、４００μｇ／ｍＬおよび４００μｇ／ｍＬである。
前記工程（３）において、前記第２の抗生物質はピューロマイシン、ブレオマイシンおよびハイグロマイシンの組合せであり、使用量がそれぞれ、１～５μｇ／ｍＬ、３００～５００μｇ／ｍＬおよび３００～５００μｇ／ｍＬであり、より好ましくは、使用量がそれぞれ、２μｇ／ｍＬ、４００μｇ／ｍＬおよび４００μｇ／ｍＬである。
【0018】
同じ発明概念に基づいて、本発明の別の態様のレンチウイルスの生産方法は、前記レンチウイルスパッケージング細胞株に標的プラスミドをトランスフェクションする。
【0019】
本発明の好ましい実施形態において、前記レンチウイルスの生産方法は、
前記安定したレンチウイルスパッケージング細胞株に前記標的プラスミドをトランスフェクションする工程と、次いで
誘導剤を添加して前記安定したレンチウイルスパッケージング細胞株を誘導してレンチウイルスを生産する工程と、
を含む。
前記安定したレンチウイルスパッケージング細胞株に前記標的プラスミドをトランスフェクションする工程と、次いで
誘導剤を添加して前記安定したレンチウイルスパッケージング細胞株を誘導してレンチウイルスを生産する工程と、
を含む。
【0020】
本発明の好ましい実施形態において、前記標的プラスミドを前記安定レンチウイルスパッケージング細胞株にトランスフェクションする間にポリエチレンイミンをさらに添加し、
ポリエチレンイミンと前記標的プラスミドの質量比が、ポリエチレンイミン：標的プラスミド＝（１～８）：１であり、
好ましくは、ポリエチレンイミンと前記標的プラスミドの質量比が、ポリエチレンイミン：標的プラスミド＝（２～５）：１であり、
より好ましくは、ポリエチレンイミンと前記標的プラスミドの質量比が、ポリエチレンイミン：標的プラスミド＝４：１である。
ポリエチレンイミンと前記標的プラスミドの質量比が、ポリエチレンイミン：標的プラスミド＝（１～８）：１であり、
好ましくは、ポリエチレンイミンと前記標的プラスミドの質量比が、ポリエチレンイミン：標的プラスミド＝（２～５）：１であり、
より好ましくは、ポリエチレンイミンと前記標的プラスミドの質量比が、ポリエチレンイミン：標的プラスミド＝４：１である。
【0021】
本発明の好ましい実施形態では、前記標的プラスミドの使用量が、安定レンチウイルスパッケージング細胞株あたり（０．２～０．８）μｇ／１０６であり、
好ましくは、前記標的プラスミドの使用量が、安定レンチウイルスパッケージング細胞株あたり（０．３～０．５）μｇ／１０６であり、
より好ましくは、前記標的プラスミドの使用量が、安定レンチウイルスパッケージング細胞株あたり０．４μｇ／１０６である。
好ましくは、前記標的プラスミドの使用量が、安定レンチウイルスパッケージング細胞株あたり（０．３～０．５）μｇ／１０６であり、
より好ましくは、前記標的プラスミドの使用量が、安定レンチウイルスパッケージング細胞株あたり０．４μｇ／１０６である。
【0022】
本発明の好ましい態様において、前記誘導剤がドキシサイクリンであり、
好ましくは、トランスフェクションの２０～３０時間後に前記誘導剤を添加し、より好ましくは、トランスフェクションの２４時間後に前記誘導剤を添加し、
好ましくは、前記誘導剤を濃度１～５μｇ／ｍＬで添加し、より好ましくは、前記誘導剤を濃度２μｇ／ｍＬで添加する。
好ましくは、トランスフェクションの２０～３０時間後に前記誘導剤を添加し、より好ましくは、トランスフェクションの２４時間後に前記誘導剤を添加し、
好ましくは、前記誘導剤を濃度１～５μｇ／ｍＬで添加し、より好ましくは、前記誘導剤を濃度２μｇ／ｍＬで添加する。
【0023】
本発明の好ましい実施形態では、 前記レンチウイルスの生産中に増強剤をさらに添加してレンチウイルス発現レベルを増加させ、
前記増強剤が酪酸ナトリウムであり、
好ましくは、前記増強剤を濃度５～１５ｍＭで添加し、より好ましくは前記増強剤を濃度１０ｍＭで添加し、
好ましくは、トランスフェクションの２０～３０時間後に前記増強剤を添加し、より好ましくは、トランスフェクションの２４時間後に増強剤を添加し、
好ましくは、増強剤添加の６～８時間後に増強剤を交換し、および／または
４５～５０時間で前記レンチウイルスを収集し、好ましくは、４８時間で前記レンチウイルスを収集する。
前記増強剤が酪酸ナトリウムであり、
好ましくは、前記増強剤を濃度５～１５ｍＭで添加し、より好ましくは前記増強剤を濃度１０ｍＭで添加し、
好ましくは、トランスフェクションの２０～３０時間後に前記増強剤を添加し、より好ましくは、トランスフェクションの２４時間後に増強剤を添加し、
好ましくは、増強剤添加の６～８時間後に増強剤を交換し、および／または
４５～５０時間で前記レンチウイルスを収集し、好ましくは、４８時間で前記レンチウイルスを収集する。
【図面の簡単な説明】
【0024】
【図1】図１は、パッケージング細胞株のプラスミドマップを示し、図１ａはｐＰｕｒｏ．ｃｏＴｅｔＲプラスミドのプラスミドマップ、図１ｂはｐＶＳＶＧプラスミドのプラスミドマップ、および図１ｃはｐＧａｇＰｏｌ－ＲＲＥ－ＮＥＳ－ｃＩＮＴプラスミドのプラスミドマップである。
【図2】図２は、半定量的ＰＣＲによって同定されたモノクローナル細胞クローン１、５、６、７、１４、１７、１８、１９、２３、２４、２６、２７、２８、３１、３２および３３のＣｏＴｅｔＲ遺伝子、ＶＳＶＧ遺伝子およびＧａｇＰｏｌ遺伝子のアガロースゲル電気泳動チャートを示す。
【発明を実施するための形態】
【0025】
特に断らない限り、本明細書の１つまたは複数の例において使用される技術用語または科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって理解される一般的な意味を有するものとする。
【0026】
以下の実施例で使用される実験方法は、特に明記しない限り従来の方法である。以下の実施例で使用される培養培地、試薬材料およびキットは、特に明記しない限り、全て市販の製品である。
【0027】
本明細書で使用される抗生物質（ピューロマイシン、ブレオマイシンおよびハイグロマイシン）、誘導剤（ドキシサイクリン）および増強剤（酪酸ナトリウム）の濃度はすべて、培養培地中のそれらの最終濃度を指す。例えば、添加する酪酸ナトリウムの濃度が５～１５ｍＭであることは、培養培地中の酪酸ナトリウムの最終濃度が５～１５ｍＭであることを意味する。
【0028】
レンチウイルスベクター系は、レンチウイルスを主鎖として開発され、パッケージング構造とベクター構造を含む。レンチウイルスパッケージング系は、一般に、レンチウイルスパッケージングプラスミドおよびレンチウイルス発現プラスミドの２つの部分からなる。前記レンチウイルスパッケージングプラスミドは、ウイルスタンパク質をコードする塩基配列からなる。前記レンチウイルス発現プラスミドは、長い末端反復と、パッケージングシグナルと、パッケージング、トランスフェクションおよび安定した組み込みに必要な他の遺伝子情報とを含む。前記パッケージングプラスミドおよび前記発現プラスミドを細胞に同時トランスフェクションする。前記ウイルスを細胞中にパッケージングし、細胞外培地中に分泌して、宿主細胞に感染させるために使用することができるウイルス粒子を生産する。
【0029】
ほとんどの場合、既存のレンチウイルスは、パッケージングプラスミドおよび発現プラスミドをセルファクトリーで培養された２９３細胞または２９３Ｔ細胞に一過性トランスフェクションすることによって生産される。前記パッケージングプラスミドは、長い末端反復と、パッケージングシグナルと、パッケージング、トランスフェクションおよび安定した組み込みに必要な他の遺伝子情報とを含み、前記発現プラスミドは標的遺伝子を含む。
【0030】
２９３細胞の一過性トランスフェクションによるレンチウイルスの大規模生産は実行可能であり、良好な展望を示す。しかしながら、一過性トランスフェクションは、生産プロセスにおいてさらに最適化される必要がある。主な障害は、トランスフェクションプロセスが大量のプラスミドＤＮＡを必要とするため、コストが高くなり、スケールアップが困難で、ウイルスの生産の持続が不可能であることである。一過性トランスフェクションによって生産される、過剰な残留不純物（特に、宿主細胞タンパク質およびＤＮＡ残基）を含有するウイルスは、その後の精製プロセスにおいてさらなる困難が生じ、またバッチ間のウイルス収量が不安定になることによって、下流プロセスの配置の不確実性をもたらす。したがって、ウイルスのパッケージングに必要なベクターエレメントを宿主細胞のゲノムに安定的に組み込むことができ、遺伝的に安定していて大量生産に便利であり、それ故に持続可能なウイルス生産を確実なものとすることができる、安定したレンチウイルスパッケージング細胞株を構築する必要がある。
【0031】
本発明の目的は、懸濁細胞（特に２９３細胞）の大量生産を実現する安定したレンチウイルスパッケージング細胞株を構築することにより、不純物の含量が低く力価が高いレンチウイルスを得ることである。
【0032】
上記の目的を実現するために、本発明の一態様の安定したレンチウイルスパッケージング細胞株は、ｐＰｕｒｏ．ｃｏＴｅｔＲプラスミド、ｐＶＳＶＧプラスミドおよびｐＧａｇＰｏｌ－ＲＲＥ－ＮＥＳ－ｃＩＮＴプラスミドからなるパッケージングプラスミドセットを含む。
【0033】
前記ｐＰｕｒｏ．ｃｏＴｅｔＲプラスミドはＣｏＴｅｔＲ遺伝子を含み、前記ｐＶＳＶＧプラスミドはＶＳＶＧ遺伝子を含み、前記ｐＧａｇＰｏｌ－ＲＲＥ－ＮＥＳ－ｃＩＮＴプラスミドはＧａｇＰｏｌ遺伝子およびＲｅｖ遺伝子を含む。
【0034】
先行技術において知られているように、レンチウイルスを生産する方法は、パッケージングプラスミドおよび発現プラスミドを細胞（例えば、２９３細胞または２９３Ｔ細胞）に同時トランスフェクションする工程を含む。この方法の主な欠点は、力価の低いレンチウイルスが生産され、不純物の含量が高く、バッチ間のウイルス収量が不安定であるということである。本発明の方法は、最初にパッケージングプラスミドを細胞株にトランスフェクションして安定したレンチウイルスパッケージング細胞株を得る工程、すなわち、ｐＰｕｒｏ．ｃｏＴｅｔＲプラスミド、ｐＶＳＶＧプラスミドおよびｐＧａｇＰｏｌ－ＲＲＥ－ＮＥＳ－ｃＩＮＴプラスミドを細胞株にトランスフェクションして安定したレンチウイルスパッケージング細胞株を得る工程と、その後、標的プラスミドを前記安定したレンチウイルスパッケージング細胞株にトランスフェクションして、不純物の含量が低く力価が高いレンチウイルスを生産する工程を含む。
【0035】
本発明に従って構築された安定したレンチウイルスパッケージング細胞株に対し、継代安定性、ウイルス生産安定性およびコピー数安定性を含む安定性について研究した。実験結果によると、本明細書で構築した安定したレンチウイルスパッケージング細胞株は、選択圧の非存在下（抗生物質の添加なし）で世代から世代へ安定的に継承し９７％以上の生存率を有することができたことから、構築された細胞が、選択圧の非存在下で３０世代以上にわたって安定的に継承され得ることを示唆している。抗生物質なしで継承された細胞は、正常に継承され、レンチウイルスを生産する能力を有し、安定したＧａｇＰｏｌ遺伝子、Ｒｅｖ遺伝子およびＶＳＶＧ遺伝子のコピー数を持つことができる。言い換えれば、本明細書において構築される安定したレンチウイルスパッケージング細胞株は、継代、ウイルス生産、および遺伝遺伝子のコピー数に関して安定した状態を維持できる。
【0036】
本発明のｐＰｕｒｏ．ｃｏＴｅｔＲプラスミド、ｐＶＳＶＧプラスミドおよびｐＧａｇＰｏｌ－ＲＲＥ－ＮＥＳ－ｃＩＮＴプラスミドは、いずれも、市販のプラスミド骨格を基礎として用い、標的遺伝子を挿入することにより構築される。例えば、前記ｐＰｕｒｏ．ｃｏＴｅｔＲプラスミドは、ｐＩＲＥＳｐｕｒｏ３プラスミドを基礎として用い、ＣｏＴｅｔＲ遺伝子を挿入することによって構築される。前記ＣｏＴｅｔＲ遺伝子は、コドン最適化ＴｅｔＲ（テトラサイクリンリプレッサー）遺伝子であり、配列番号１に示す配列を有する。前記ｐＶＳＶＧプラスミドは、ｐｃＤＮＡ４プラスミドを基礎として用い、ＶＳＶＧ（水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質）遺伝子を挿入することによって構築される。前記ＶＳＶＧ遺伝子は、配列番号２に示す配列を有する。前記ｐＧａｇＰｏｌ－ＲＲＥ－ＮＥＳ－ｃＩＮＴプラスミドは、基礎としてｐｃＤＮＡ５プラスミドを用い、ＧａｇＰｏｌ遺伝子（ここで、Ｇａｇ遺伝子はウイルスカプシドタンパク質をコードし、Ｐｏｌ遺伝子はウイルス逆転写酵素および遺伝子インテグラーゼをコードする）および（ウイルス粒子タンパク質発現の調節因子をコードする）Ｒｅｖ遺伝子を挿入することによって構築される。前記ＧａｇＰｏｌ遺伝子および前記Ｒｅｖ遺伝子は、それぞれ配列番号３および４に示す配列を有する。
【0037】
図１ａに示すように、前記ｐＰｕｒｏ．ｃｏＴｅｔＲプラスミドは、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターと、（タンパク質発現量を増大させる）キメライントロンと、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーターと、ピューロマイシン耐性遺伝子（ＰｕｒｏＲ）と、ポリアデニル化シグナルと、をさらに含む。前記ＳＶ４０プロモーターは、ピューロマイシン耐性遺伝子の発現に必要である。前記ｐＰｕｒｏ．ｃｏＴｅｔＲプラスミドは、ピューロマイシン耐性遺伝子を含む。ピューロマイシンでスクリーニングした後、ほとんど全ての生存細胞がＣｏＴｅｔＲ遺伝子を安定して発現するため、官能基クローンについて多数の細胞をスクリーニングする必要がない。前記ｐＰｕｒｏ．ｃｏＴｅｔＲプラスミドを使用する場合、前記抗生物質は、全発現カセットにわたって選択圧を及ぼす。したがって、高用量の抗生物質は、高レベルのＣｏＴｅｔＲ遺伝子を発現する細胞を選択する。この選択圧によってもまた、前記ＣｏＴｅｔＲ遺伝子の発現の安定を確実に維持できる。前記ｐＰｕｒｏ．ｃｏＴｅｔＲプラスミドは、配列番号５に示す配列を有する。
【0038】
図１ｂに示すように、前記ｐＶＳＶＧプラスミドは、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターおよび２つのテトラサイクリンオペレーター（ＴｅｔＯ２）からなるハイブリッドプロモーターと、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーターと、ブレオマイシン抵抗性遺伝子（ＺｅｏＲ）と、ポリアデニル化シグナルと、をさらに含む。前記ＳＶ４０プロモーターは、ブレオマイシン耐性遺伝子の発現に必要である。前記ｐＶＳＶＧプラスミドは、配列番号６に示す配列を有する。
【0039】
図１ｃに示すように、前記ｐＧａｇＰｏｌ－ＲＲＥ－ＮＥＳ－ｃＩＮＴプラスミドは、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターおよび２つのテトラサイクリンオペレーター（ＴｅｔＯ２）からなるハイブリッドプロモーターと、キメライントロンと、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーターと、ハイグロマイシン耐性遺伝子（ＨｙｇｒｏＲ）と、ｃＰＰＴ／ＣＴＳエレメントと、ＲＲＥエレメントと、ポリアデニル化シグナルと、をさらに含む。前記ＳＶ４０プロモーターは、ハイグロマイシン耐性遺伝子の発現に必要である。前記ｐＧａｇＰｏｌ－ＲＲＥ－ＮＥＳ－ｃＩＮＴプラスミドは、配列番号７に示す配列を有する。
【0040】
前記ｐＧａｇＰｏｌ－ＲＲＥ－ＮＥＳ－ｃＩＮＴプラスミドは、核から細胞質へのＲＮＡ転写物の輸送を調節するレトロウイルス排出エレメントであるヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ｒｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）を含む。
【0041】
前記ｐＧａｇＰｏｌ－ＲＲＥ－ＮＥＳ－ｃＩＮＴプラスミドは、シス作用エレメント、すなわち中央ポリプリン領域（ｃＰＰＴ）および中央終止配列（ＣＴＳ）を含む。前記ｃＰＰＴ／ＣＴＳ塩基配列は、ベクター組み込みおよび形質導入効率を改善することができるＨＩＶ１のｃＰＰＴ／ＣＴＳであり得る。
【0042】
前記ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターおよび２つのテトラサイクリンオペレーター（ＴｅｔＯ２）とからなるハイブリッドプロモーターは、２つのＴｅｔＯ２オペレーター配列を前記ＣＭＶプロモーターに挿入してテトラサイクリンにプロモーターを調節する機能を付与することを意味する。前記ＴｅｔＯ２配列は、１９ヌクレオチド基配列（５’－ＴＣＣＣＴＡＴＣＡＧＴＧＡＴＡＧＡＧＡ－３’）の２個のコピーからなる。
【0043】
同じ発明概念に基づいて、本発明の別の態様の安定したレンチウイルスパッケージング細胞株を作成する方法は、
（１）ｐＰｕｒｏ．ｃｏＴｅｔＲプラスミド、ｐＶＳＶＧプラスミド、およびｐＧａｇＰｏｌ－ＲＲＥ－ＮＥＳ－ｃＩＮＴプラスミドをそれぞれ酵素消化により直線化する工程と、
（２）直線化した前記ｐＰｕｒｏ．ｃｏＴｅｔＲプラスミドと前記ｐＶＳＶＧプラスミドを細胞に同時トランスフェクションし、スクリーニング用の第１の抗生物質を添加して、第１の陽性モノクローナル細胞を得る工程と、
（３）直線化した前記ｐＧａｇＰｏｌ－ＲＲＥ－ＮＥＳ－ｃＩＮＴプラスミドを第１の陽性モノクローナル細胞にトランスフェクションし、スクリーニング用の第２の抗生物質を添加して、第２の陽性モノクローナル細胞、すなわち、安定したレンチウイルスパッケージング細胞株を得る工程と、を含む。
（１）ｐＰｕｒｏ．ｃｏＴｅｔＲプラスミド、ｐＶＳＶＧプラスミド、およびｐＧａｇＰｏｌ－ＲＲＥ－ＮＥＳ－ｃＩＮＴプラスミドをそれぞれ酵素消化により直線化する工程と、
（２）直線化した前記ｐＰｕｒｏ．ｃｏＴｅｔＲプラスミドと前記ｐＶＳＶＧプラスミドを細胞に同時トランスフェクションし、スクリーニング用の第１の抗生物質を添加して、第１の陽性モノクローナル細胞を得る工程と、
（３）直線化した前記ｐＧａｇＰｏｌ－ＲＲＥ－ＮＥＳ－ｃＩＮＴプラスミドを第１の陽性モノクローナル細胞にトランスフェクションし、スクリーニング用の第２の抗生物質を添加して、第２の陽性モノクローナル細胞、すなわち、安定したレンチウイルスパッケージング細胞株を得る工程と、を含む。
【0044】
本発明のｐＰｕｒｏ．ｃｏＴｅｔＲプラスミドおよびｐＶＳＶＧプラスミドは、それぞれ、ピューロマイシン耐性遺伝子およびブレオマイシン耐性遺伝子を含むため、第１の陽性クローン細胞のスクリーニングプロセスの間にピューロマイシンおよびブレオマイシンを添加して耐性スクリーニングを行う。一方、前記ｐＧａｇＰｏｌ－ＲＲＥ－ＮＥＳ－ｃＩＮＴプラスミドはハイグロマイシン耐性遺伝子を含むため、第２の陽性クローン細胞のスクリーニングプロセスの間にピューロマイシン、ブレオマイシン、およびハイグロマイシンを添加して耐性スクリーニングを行う。さらに、２つのトランスフェクションプロセスの間にポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を添加してトランスフェクション効率を改善する必要があり、ＰＥＩおよび各プラスミドの量を制御することによって、本発明の安定したレンチウイルスパッケージング細胞株を得ることができる。
【0045】
同じ発明概念に基づいて、本発明の別の態様のレンチウイルスの生産方法は、標的プラスミド（標的遺伝子を含む発現プラスミド）を前記レンチウイルスパッケージング細胞株にトランスフェクションする。
【0046】
本発明の好ましい実施形態において、前記レンチウイルスの生産方法は、
前記標的プラスミドを前記安定したレンチウイルスパッケージング細胞株にトランスフェクションする工程と、次いで
誘導剤を添加して前記安定したレンチウイルスパッケージング細胞株を誘導してレンチウイルスを生産する工程と、
を含む。
前記標的プラスミドを前記安定したレンチウイルスパッケージング細胞株にトランスフェクションする工程と、次いで
誘導剤を添加して前記安定したレンチウイルスパッケージング細胞株を誘導してレンチウイルスを生産する工程と、
を含む。
【0047】
本発明の安定したレンチウイルスパッケージング細胞株は誘導系である。前記レンチウイルスの生産中に、ドキシサイクリン（ｄｏｘ）を添加してウイルス生産を誘導する必要があり、ウイルス生産プロセスの間に酪酸ナトリウムを添加することで、レンチウイルスの収率を増加させることができることがわかった。本発明はまた、標的プラスミドを安定したレンチウイルスパッケージング細胞株にトランスフェクションしてウイルス生産を誘導する条件を最適化する。最適条件は、標的プラスミドの量が細胞あたり０．４μｇ／１０６であり、ＰＥＩの量と標的プラスミドの量の比が４：１であり、酪酸ナトリウムの濃度が１０ｍＭであり、酪酸ナトリウムを添加する時間がトランスフェクションの２４時間後であり、酪酸ナトリウムを交換する時間が酪酸ナトリウム添加の６～８時間後であり、ｄｏｘを添加する時間が２４時間であり、ｄｏｘの濃度が２μｇ／ｍＬであり、レンチウイルスを収集する時間が４８時間である。先行技術における４つのプラスミドによる一過性トランスフェクションによってレンチウイルスを生産する方法において、ドキシサイクリン（ｄｏｘ）および酪酸ナトリウムを添加する必要はない。
【0048】
本発明において、前記標的プラスミドは限定されない。必要に応じて、様々な標的プラスミドをトランスフェクションに使用することができる。好ましくは、前記標的プラスミドはＣＡＲ発現プラスミドである。
【0049】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞免疫療法は養子免疫細胞療法であり、腫瘍特異的抗原を認識することができるｓｃＦｖ断片が遺伝子操作され、ＣＤ２８、４－１ＢＢなどのＴ細胞の活性化に関与する分子からなる膜貫通セグメントと融合し、その後、前記遺伝子セグメントが、レンチウイルスまたはレトロウイルス遺伝子形質導入によって患者の末梢血から抽出されたＴ細胞にトランスフェクションされ、遺伝子改変Ｔ細胞が患者に再注入された後、発現されたＣＡＲ受容体を使用して腫瘍細胞の表面上の分子に結合させ、それによって内部シグナルを生成してＴ細胞を活性化し、腫瘍細胞を迅速に死滅させる。前記ＣＡＲ－Ｔ細胞は、抗体の認識特異性、ならびにＴ細胞の殺傷効果および記憶機能を統合している。したがって、ＭＨＣに拘束されることなく腫瘍抗原を認識することができ、天然Ｔ細胞よりも広範囲の標的を認識することができる。実際の必要性に基づいて、再発性／難治性ＣＤ１９陽性非ホジキンリンパ腫の治療のために、ＣＡＲ発現プラスミドを前記安定したレンチウイルスパッケージング細胞株にトランスフェクションすることができる。ＣＡＲの設計およびベクター構築については、（順次連結される）シグナルペプチド、細胞外結合領域、任意のヒンジ領域、膜貫通領域および細胞内シグナル領域を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を設計し、ベクター（ＩＭ１９プラスミドなど）を構築する、中国特許出願第２０１５１０３２４５５８号明細書の公報（特に実施例１および２）を参照することができる。
【0050】
本発明では、細胞生存率、ウイルス力価ＶＰ（Ｐ２４）、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）残基、およびバッチ間のウイルス力価安定性に関して、ＣＡＲ発現プラスミドの前記安定したレンチウイルスパッケージング細胞株へのトランスフェクションと、先行技術で公知の４つのプラスミドの一過性トランスフェクション（すなわち、ｐＰｕｒｏ．ｃｏＴｅｔＲプラスミド、ｐＶＳＶＧプラスミド、ｐＧａｇＰｏｌ－ＲＲＥ－ＮＥＳ－ｃＩＮＴプラスミド、およびＣＡＲ発現プラスミドを２９３細胞に同時トランスフェクションする）とを比較する。実験結果から、本明細書において構築される安定したレンチウイルスパッケージング細胞株は、ウイルス力価ＶＰ含量が高く、バッチ間のウイルス収量が安定しており、下流の精製プロセスに有利であることが分かる。
【0051】
さらに、細胞生存率、ウイルス力価ＶＰ、および宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）残基に関して、ＣＡＲ発現プラスミドをトランスフェクションした前記安定したレンチウイルスパッケージング細胞株と、先行技術において公知の４つのプラスミドを一過的にトランスフェクションした２９３細胞とを、スケールアッププロセスで比較する。実験結果から、トランスフェクション後の前記安定したレンチウイルスパッケージング細胞株は、細胞生存率が高く、生産されたウイルス中の宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）残基が少なく、ウイルス力価ＶＰが高いため、大規模ウイルス生産に使用することができることが分かる。
【0052】
ウイルス力価ＶＰ（Ｐ２４）におけるＶＰはウイルス力価を測定する方法であるウイルス粒子数（ＶＰ）法を指し、ＯＤ２６０を使用してウイルス粒子の数を検出する。Ｐ２４はウイルスカプシドタンパク質、すなわちＰ２４タンパク質を指す。ウイルス力価は、Ｐ２４タンパク質を測定することによって検出される。
【0053】
上記の開示から明らかなように、本発明は、安定したレンチウイルスパッケージング細胞株およびその作成方法を提供する。前記安定したレンチウイルスパッケージング細胞株は、継代、ウイルス生産、および遺伝遺伝子のコピー数の面で比較的安定しており、前記安定したレンチウイルスパッケージング細胞株は、大規模ウイルス生産における使用に適している。４つのプラスミドを一過的にトランスフェクションされた２９３細胞と比較して、前記安定したレンチウイルスパッケージング細胞株は、細胞生存率が高く、ウイルス力価ＶＰ含量が高く、宿主細胞タンパク質残基が少なく、バッチ間のウイルス収量が安定しており、下流の精製プロセスに有利である。
【実施例】
【0054】
本発明によって提供される技術的解決策を、特定の具体例に関連して以下でさらに説明する。以下の実施例は、本発明を説明するためにのみ使用され、本発明の保護範囲を制限するものではない。
【0055】
［実施例１］ ｐＰｕｒｏ．ｃｏＴｅｔＲプラスミド、ｐＶＳＶＧプラスミドおよびｐＧａｇＰｏｌ－ＲＲＥ－ＮＥＳ－ｃＩＮＴプラスミドの構築
【0056】
この実施例において構築された安定したレンチウイルスパッケージング細胞株は、（ＣｏＴｅｔＲ遺伝子を含む）ｐＰｕｒｏ．ｃｏＴｅｔＲ、（ＶＳＶＧ遺伝子を含む）ｐＶＳＶＧ、および（ＧａｇＰｏｌ遺伝子およびＲｅｖ遺伝子を含む）ｐＧａｇＰｏｌ－ＲＲＥ－ＮＥＳ－ｃＩＮＴの３つのプラスミドからなり、これらはそれぞれ、図１ａ、図１ｂおよび図１ｃに示すプラスミドマップを有する。
【0057】
ｐＰｕｒｏ－ｃｏＴｅｔＲｎベクターの構築
ＴｅｔＲ－ＷＦ－１Ｆ／ＴｅｔＲ－１Ｒ－リンカーをプライマーとして、ｐＩＲＥＳｐｕｒｏ３（タカラバイオ株式会社、カタログ番号：６３１６１９）を鋳型として用いてＩＮＴ断片（２３０ｂｐ）を得、ＴｅｔＲ－２Ｆ－リンカー／ＴｅｔＲ－２Ｒ－リンカーをプライマーとして、ｃｏＴｅｔＲを（配列番号１に示す塩基配列を有する）鋳型として用いてＴｅｃｏＴｅｔＲ断片（６２４ｂｐ）を得、ＴｅｔＲ－３Ｆ－リンカー／ＴｅｔＲ－ＷＦ－３Ｒをプライマーとして、ｐｃＤＮＡ４（Ｔｈｅｒｍｏ社、カタログ番号：Ｖ１０２０２０）を鋳型として用いてＰＡ＋Ｆ１ｏｒｉ＋ＳＶ４０プロモーター断片（１０４２ｂｐ）を得た。次いで、ブリッジＰＣＲによって、前記プライマーＴｅｔＲ－ＷＦ－１Ｆ／ＴｅｔＲ－２Ｒ－リンカーを使用して断片ＴＮＴ＋ｃｏＴｅｔＲを得、前記プライマーＴｅｔＲ－ＷＦ－１Ｆ／ＴｅｔＲ－ＷＦ－３Ｒを使用して完全長断片ＴＮＴ＋ｃｏＴｅｔＲ＋ＰＡ＋Ｆ１ｏｒｉ＋ＳＶ４０プロモーターを得た。
ＴｅｔＲ－ＷＦ－１Ｆ／ＴｅｔＲ－１Ｒ－リンカーをプライマーとして、ｐＩＲＥＳｐｕｒｏ３（タカラバイオ株式会社、カタログ番号：６３１６１９）を鋳型として用いてＩＮＴ断片（２３０ｂｐ）を得、ＴｅｔＲ－２Ｆ－リンカー／ＴｅｔＲ－２Ｒ－リンカーをプライマーとして、ｃｏＴｅｔＲを（配列番号１に示す塩基配列を有する）鋳型として用いてＴｅｃｏＴｅｔＲ断片（６２４ｂｐ）を得、ＴｅｔＲ－３Ｆ－リンカー／ＴｅｔＲ－ＷＦ－３Ｒをプライマーとして、ｐｃＤＮＡ４（Ｔｈｅｒｍｏ社、カタログ番号：Ｖ１０２０２０）を鋳型として用いてＰＡ＋Ｆ１ｏｒｉ＋ＳＶ４０プロモーター断片（１０４２ｂｐ）を得た。次いで、ブリッジＰＣＲによって、前記プライマーＴｅｔＲ－ＷＦ－１Ｆ／ＴｅｔＲ－２Ｒ－リンカーを使用して断片ＴＮＴ＋ｃｏＴｅｔＲを得、前記プライマーＴｅｔＲ－ＷＦ－１Ｆ／ＴｅｔＲ－ＷＦ－３Ｒを使用して完全長断片ＴＮＴ＋ｃｏＴｅｔＲ＋ＰＡ＋Ｆ１ｏｒｉ＋ＳＶ４０プロモーターを得た。
【0058】
上記で作成した完全長断片を、シームレスクローニング法によりｐＩＲＥＳｐｕｒｏ３ベクターのＨｉｎｄＩＩＩ部位に挿入し、コンピテントｓｔｂｌ３（フルゴールド、カタログ番号：ＣＤ５２１）に形質転換した。正しい挿入を確認するための配列決定を行った後、プラスミドをＥｎｄｏＦｒｅｅ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｄｉ Ｋｉｔ（ＣＷＢｉｏ社、カタログ番号：ｃｗ２１０５ｓ）で抽出した。構築された標的プラスミドを、パッケージング細胞株を構築するその後の実験において使用した。
【0059】
【表1】
【0060】
ｐＶＳＶＧベクターの構築
ＶＳＶＧ－ＷＦ－Ｆ／ＶＳＶＧ－ＷＦ－Ｒをプライマーとし、（配列番号８に示す配列を有する）ＶＳ－ＳＣを鋳型としてＶＳＶＧ断片（１５３６ｂｐ）を得た。上記で作成した断片を、シームレスクローニング法によってｐｃＤＮＡ４ベクターのＸｈｏＩ部位に挿入し、コンピテントｓｔｂｌ３に形質転換した。正しい挿入を確認するための配列決定を行った後、プラスミドをＥｎｄｏＦｒｅｅ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｄｉ Ｋｉｔ（ＣＷＢｉｏ社から入手可能）を用いて抽出した。構築された標的プラスミドを、パッケージング細胞株を構築するその後の実験において使用した。
ＶＳＶＧ－ＷＦ－Ｆ／ＶＳＶＧ－ＷＦ－Ｒをプライマーとし、（配列番号８に示す配列を有する）ＶＳ－ＳＣを鋳型としてＶＳＶＧ断片（１５３６ｂｐ）を得た。上記で作成した断片を、シームレスクローニング法によってｐｃＤＮＡ４ベクターのＸｈｏＩ部位に挿入し、コンピテントｓｔｂｌ３に形質転換した。正しい挿入を確認するための配列決定を行った後、プラスミドをＥｎｄｏＦｒｅｅ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｄｉ Ｋｉｔ（ＣＷＢｉｏ社から入手可能）を用いて抽出した。構築された標的プラスミドを、パッケージング細胞株を構築するその後の実験において使用した。
【0061】
【表2】
【0062】
ｐＧａｇＰｏｌ－ＲＲＥ－ＮＥＳ－ｃＩＮＴベクターの構築
ｐＧａｇＰｏｌ－ＸｈｏＩ－ＷＦ／ｐＧａｇＰｏｌ－ＸｈｏＩ－ＷＲをプライマーとして、（配列番号９に示す配列を有する）ＭＤＫ－ＳＣを鋳型として用いて、ＧａｇＰｏｌ断片（４３０７ｂｐ）を得た。上記で作成した断片を、シームレスクローニング法によりｐｃＤＮＡ５ベクター（Ｔｈｅｒｍｏ社、カタログ番号：Ｖ１０３３２０）のＸｈｏＩ部位に挿入し、コンピテントｓｔｂｌ３に形質転換した。正しい挿入を確認するための配列決定を行った後、プラスミドをＥｎｄｏＦｒｅｅ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｄｉ Ｋｉｔ（ＣＷＢｉｏ社から入手可能）を用いて抽出した。構築された標的プラスミドｐＧａｇＰｏｌを、その後のベクター構築に使用した。
ｐＧａｇＰｏｌ－ＸｈｏＩ－ＷＦ／ｐＧａｇＰｏｌ－ＸｈｏＩ－ＷＲをプライマーとして、（配列番号９に示す配列を有する）ＭＤＫ－ＳＣを鋳型として用いて、ＧａｇＰｏｌ断片（４３０７ｂｐ）を得た。上記で作成した断片を、シームレスクローニング法によりｐｃＤＮＡ５ベクター（Ｔｈｅｒｍｏ社、カタログ番号：Ｖ１０３３２０）のＸｈｏＩ部位に挿入し、コンピテントｓｔｂｌ３に形質転換した。正しい挿入を確認するための配列決定を行った後、プラスミドをＥｎｄｏＦｒｅｅ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｄｉ Ｋｉｔ（ＣＷＢｉｏ社から入手可能）を用いて抽出した。構築された標的プラスミドｐＧａｇＰｏｌを、その後のベクター構築に使用した。
【0063】
ｐＧａｇＰｏｌ－ＲＥＶ－Ｘｂａ Ｉ－ＷＦ／ｐＧａｇＰｏｌ－ＲＥＶ－Ｘｂａ Ｉ－ＷＲをプライマーとして、（配列番号１０に示す配列を有するｐｓＰＡＸ２ベクターとしても知られる）ＡＸを鋳型として用いて、ＲＲＥ－ＮＥＳ断片（１７０５ｂｐ）を得た。上記で作成した断片を、シームレスクローニング法によりｐＧａｇＰｏｌベクターのＸｂａＩ部位に挿入し、コンピテントｓｔｂｌ３に形質転換した。正しい挿入を確認するための配列決定を行った後、プラスミドをＥｎｄｏＦｒｅｅ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｄｉ Ｋｉｔ（ＣＷＢｉｏ社）を用いて抽出した。構築された標的プラスミドｐＧａｇＰｏｌ－ＲＲＥ－ＮＥＳを、その後のベクター構築に使用した。
【0064】
ｐＧａｇＰｏｌ－ＲＮ－ｃＩＮＴ－Ｎｏｔ Ｉ－ＱＦ／ｐＧａｇＰｏｌ－ＩＮＴ－Ｎｏｔ Ｉ－ＷＲをプライマーとして、ＡＸを鋳型として用い、ｃＩＮＴ断片（１１２２ｂｐ）を得た。上記で作成した断片を、シームレスクローニング法によりｐＧａｇＰｏｌ－ＲＲＥ－ＮＥＳベクターのＮｏｔ Ｉ部位に挿入し、コンピテントｓｔｂｌ３に形質転換した。正しい挿入を確認するための配列決定を行った後、プラスミドをＥｎｄｏＦｒｅｅ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｄｉ Ｋｉｔ（ＣＷＢｉｏ社から入手可能）を用いて抽出した。構築された標的プラスミドｐＧａｇＰｏｌ－ＲＲＥ－ＮＥＳ－ｃＩＮＴを、その後のベクター構築に使用した。
【0065】
【表3】
【0066】
［実施例２］ 安定したレンチウイルスパッケージング細胞株の作成
【0067】
実施例１で構築した３つのプラスミドを、Ｆｓｐ Ｉ（Ｔｈｅｒｍｏ社、カタログ番号：ＦＤ１２２４）での消化によって直線化し、次いで脱リン酸化して、２９３細胞にトランスフェクションした。
【0068】
直線化ｐＰｕｒｏ．ｃｏＴｅｔＲプラスミドおよび直線化ｐＶＳＶＧプラスミドを２９３懸濁細胞にＰＥＩ（ポリエチレンイミン）を用いて同時トランスフェクションした（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ社、カタログ番号：２３９６６）。トランスフェクションにおけるｐＰｕｒｏ．ｃｏＴｅｔＲおよびｐＶＳＶＧプラスミドの使用量を、いずれも、細胞あたり０．８μｇ／１０６とし、ＰＥＩ量と（ｐＰｕｒｏ．ｃｏＴｅｔＲプラスミド量＋ｐＶＳＶＧプラスミド量）の比を４：１とした。２μｇ／ｍＬのＰｕｒｏ（ピューロマイシン）（ＩｎＶｉｖｏｇｅｎ社、カタログ番号：ａｎｔ－ｐｒ－１）および４００μｇ／ｍＬのＺｅｏ（ブレオマイシン）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カタログ番号：Ｒ２５００１）の２つの抗生物質を２週間使用することによって加圧選抜を行い、安定してトランスフェクションされた薬物耐性陽性の細胞プール、すなわちポリクローナルＰＶ細胞を得た。前記ポリクローナルＰＶ細胞を、９６ウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ社、カタログ番号：１６７００８）上に、制限希釈により、ウェルあたり２００μＬの密度で播種した。次いで、細胞を顕微鏡下で観察した。単一細胞のみを有するウェルを選択し、標識し、インキュベーター中で約２０～３０日間培養した。
【0069】
９６ウェルプレート中で生存したモノクローナル細胞を増幅し、４８ウェルプレート、２４ウェルプレート、１２ウェルプレート、６ウェルプレートおよび振盪フラスコＥ１２５中でそれぞれ培養した。前記ＰＶモノクローナル細胞を採取してＲＮＡを抽出した。ｃＤＮＡへの逆転写後、半定量的ＰＣＲを実施して、標的遺伝子ＣｏＴｅｔＲおよびＶＳＶＧの存在を同定した。β－アクチンを内部参照遺伝子として使用した。
【0070】
ＰＥＩ（ポリエチレンイミン）を用いて、直線化プラスミドｐＧａｇＰｏｌ－ＲＲＥ－ＮＥＳ－ｃＩＮＴを正しいと同定されたＰＶモノクローナル細胞にトランスフェクションした。トランスフェクションにおけるｐＧａｇＰｏｌ－ＲＲＥ－ＮＥＳ－ｃＩＮＴプラスミドの使用量を、第１陽性モノクローナル細胞あたり０．８μｇ／１０６とし、ＰＥＩ量とｐＧａｇＰｏｌ－ＲＲＥ－ＮＥＳ－ｃＩＮＴプラスミド量の比を４：１とした。２μｇ／ｍＬのＰｕｒｏ（ピューロマイシン）、４００μｇ／ｍＬのＺｅｏ（ブレオマイシン）、４００μｇ／ｍＬのＨＹＧ（ハイグロマイシン）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カタログ番号：１０６８７０１０）の３つの抗生物質を２週間使用することによって加圧選抜を行い、安定してトランスフェクションされた薬物耐性陽性の細胞プール、すなわちポリクローナルＰＶ細胞を得た。前記ポリクローナルＰＶ細胞を、９６ウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ社、カタログ番号：１６７００８）上に、制限希釈により、ウェルあたり２００μＬの密度で播種した。次いで、細胞を顕微鏡下で観察した。単一細胞のみを有するウェルを選択し、標識し、インキュベーター中で約２０～３０日間培養した。９６ウェルプレート中で生存したモノクローナル細胞は、クローン１、クローン５、クローン６、クローン７、クローン１４、クローン１７、クローン１８、クローン１９、クローン２３、クローン２４、クローン２６、クローン２７、クローン２８、クローン３１、クローン３２およびクローン３３として番号付けされた。
【0071】
［実施例３］ 半定量的ＰＣＲによる安定したパッケージング細胞株の同定
【0072】
９６ウェルプレート中で生存したモノクローナル細胞を増幅し、４８ウェルプレート、２４ウェルプレート、１２ウェルプレート、６ウェルプレートおよび振盪フラスコＥ１２５中でそれぞれ培養した。前記ＰＶＧＲモノクローナル細胞を採取してＲＮＡを抽出した。ｃＤＮＡへの逆転写後、半定量的ＰＣＲを実施して、標的遺伝子ＣｏＴｅｔＲ、ＶＳＶＧおよびＧａｇＰｏｌの存在を同定した。β－アクチンを内部参照遺伝子として使用した。具体的な工程は以下の通りである。
【0073】
実験の１日前に、ＰＶＧＲモノクローナル細胞を１ウェル当たり３×１０５細胞／ｍＬで１２ウェルプレートに播種し、１ｍＬのＳＭＭ２９３ＴＩ（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ社、カタログ番号：Ｍ２９３ＴＩ）および０．１％のＦ６８（Ｇｉｂｃｏ社、カタログ番号：２４０４０－０３２）を含む培地中で培養した。２μｇ／ｍＬのｄｏｘ（ドキシサイクリン）（Ｓｉｇｍａ社、カタログ番号：Ｄ９８９１）を２日目に添加し、細胞を３日目に回収してＲＮＡ抽出を行った。ＲＮＡを、ＴＲＩｚｏｌ（商標）試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標）、カタログ番号１５５９６０２６）を使用して、製造業者の説明書に記載の方法により抽出した。
【0074】
２μｇの抽出ＲＮＡを、それぞれ、製造業者の説明書に従って、第１鎖ｃＤＮＡ合成キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標）、カタログ番号：Ｋ１６１２）を用いてｃＤＮＡに逆転写した。
【0075】
２μｇの逆転写ｃＤＮＡをそれぞれ使用し、ＰＣＲによって標的遺伝子ＣｏＴｅｔＲ、ＶＳＶＧおよびＧａｇＰｏｌをそれぞれ増幅した。内部参照遺伝子としてβ‐アクチンを用い、アガロースゲル電気泳動を行った。ＰＣＲによる標的遺伝子の増幅のためのシステムは、１０μＬの２×ｐｈａｎｔａ Ｍａｘマスターミックス（Ｎａｎｊｉｎｇ Ｖａｚｙｍｅ社、カタログ番号：Ｐ５１５－０２）、１μＬのフォワードプライマー、１μＬのリバースプライマー、７μＬのｄｄＨ２Ｏ、および１μＬのｃＤＮＡ鋳型を含む。ＰＣＲ反応プログラムは、９５℃で１０分間と、９５℃で３０秒間、５６℃で３０秒間、７２℃で３０秒間、７２℃で１０分間の３０サイクルである。半定量的ＰＣＲのためのプライマーは以下の通りである：
ＣｏＴｅｔＲフォワードプライマー：
５’－ａｔｃｃａｃｔｔｔｇｃｃｔｔｔｃｔｃｔｃｃａｃａｇａｔｇｔｃｔａｇｇｃｔｇｇａｃａａｇｔｃｃａａ－３’
ＣｏＴｅｔＲリバースプライマー：
５’－ａｔｇｇｃｔｇｇｃａａｃｔａｇａａｇｇｃａｃａｇｔｃａｇｃｔｇｃｃｇｃｔｔｔｃｇｃａｃｔｔｇａ－３’
ＶＳＶＧフォワードプライマー：５’－ｃｃｇｃｔｃｇａｇａｔｇａａｇｔｇｃｃｔｔｔｔｇｔａｃｔｔ－３’
ＶＳＶＧリバースプライマー：５’－ｔｇｃａｔｔｔｔｃｃｇｔｔｇａｔｇａａｃ－３’
ＧａｇＰｏｌフォワードプライマー：５’－ｃｃｇｇｃｃａｔａａａｇｃａａｇａｇｔｔ－３’
ＧａｇＰｏｌリバースプライマー：５’－ｃｃｇｃａｇａｔｔｔｃｔａｔｇａｇｔａｔ－３’
β－アクチンフォワードプライマー：５’－ＣＴＣＣＡＴＣＣＴＧＧＣＣＴＣＧＣＴＧＴ－３’
β－アクチンリバースプライマー：５’－ＧＣＴＧＴＣＡＣＣＴＴＣＡＣＣＧＴＴＣＣ－３’
ＣｏＴｅｔＲフォワードプライマー：
５’－ａｔｃｃａｃｔｔｔｇｃｃｔｔｔｃｔｃｔｃｃａｃａｇａｔｇｔｃｔａｇｇｃｔｇｇａｃａａｇｔｃｃａａ－３’
ＣｏＴｅｔＲリバースプライマー：
５’－ａｔｇｇｃｔｇｇｃａａｃｔａｇａａｇｇｃａｃａｇｔｃａｇｃｔｇｃｃｇｃｔｔｔｃｇｃａｃｔｔｇａ－３’
ＶＳＶＧフォワードプライマー：５’－ｃｃｇｃｔｃｇａｇａｔｇａａｇｔｇｃｃｔｔｔｔｇｔａｃｔｔ－３’
ＶＳＶＧリバースプライマー：５’－ｔｇｃａｔｔｔｔｃｃｇｔｔｇａｔｇａａｃ－３’
ＧａｇＰｏｌフォワードプライマー：５’－ｃｃｇｇｃｃａｔａａａｇｃａａｇａｇｔｔ－３’
ＧａｇＰｏｌリバースプライマー：５’－ｃｃｇｃａｇａｔｔｔｃｔａｔｇａｇｔａｔ－３’
β－アクチンフォワードプライマー：５’－ＣＴＣＣＡＴＣＣＴＧＧＣＣＴＣＧＣＴＧＴ－３’
β－アクチンリバースプライマー：５’－ＧＣＴＧＴＣＡＣＣＴＴＣＡＣＣＧＴＴＣＣ－３’
【0076】
実験結果を図２に示す。図２に示すように、クローン１、クローン１８、クローン１９、クローン２３、クローン２８、クローン３１、クローン３２およびクローン３３はすべて、標的断片ＣｏＴｅｔＲ、ＶＳＶＧおよびＧａｇＰｏｌを含む。
【0077】
［実施例４］ 標的プラスミド（ＣＡＲ発現プラスミド）の構築
【0078】
４．１ ＣＡＲ分子のヌクレオチド配列の作成
【0079】
本実施例のＣＡＲ分子は、シグナルペプチド、細胞外結合領域、任意のヒンジ領域、膜貫通領域、および細胞内シグナル領域を含む。抗ＣＤ１９キメラ抗原受容体（ここでは抗ＣＤ１９ｓｃＦｖ－Ｓ０と名付ける。Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２００９ Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ；３２（７）：６８９－７０２に記載のマウス由来のｓｃＦｖ－Ｓ０を参照）の抗原結合領域のヌクレオチド配列に基づいて、ヒト化操作により、前記細胞外結合領域のヌクレオチド配列を得た。ＣＡＲ分子のヌクレオチド配列を作成する工程について具体的に説明する。
【0080】
まず、プライマーを設計する。本実施例で使用したプライマーの塩基配列を以下に列挙する：
１－１：５’－ＡＴＧＣＴＴＣＴＣＣＴＧＧＴＧＡＣＡＡＧ－３’
１－２：５’－ＴＧＧＧＡＴＣＡＧＧＡＧＧＡＡＴＧＣＴＧ－３’
２－１：５’－ＴＡＣＡＴＣＴＧＧＧＣＧＣＣＣＴＴＧＧＣＣＧＧ－３’
２－２：５’－ＧＧＡＧＣＧＡＴＡＧＧＣＴＧＣＧＡＡＧＴＣＧＣＧ－３’
３－１：５’－ＡＧＡＧＴＧＡＡＧＴＴＣＡＧＣＡＧＧＡＧＣＧ－３’
３－２：５’－ＴＴＡＧＣＧＡＧＧＧＧＧＣＡＧＧＧＣＣＴ－３’
４－１：５’－ＡＴＧＣＴＴＣＴＣＣＴＧＧＴＧＡＣＡＡＧＣＣ－３’
４－２：５’－ＴＧＡＧＧＡＧＡＣＧＧＴＧＡＣＴＧＡＧＧＴＴＣＣＴＴＧＧ－３’
５－１：５’－ＧＣＧＧＣＣＧＣＡＡＴＴＧＡＡＧＴＴＡＴＧＴＡ－３’
５－２：５’－ＴＴＡＧＣＧＡＧＧＧＧＧＣＡＧＧＧＣＣＴＧＣ－３’
６－１：５’－ＣＴＡＧＡＣＴＡＧＴＡＴＧＣＴＴＣＴＣＣＴＧＧＴＧＡＣＡＡＧＣＣ－３’
６－２：５’－ＣＧＡＣＧＣＧＴＴＴＡＧＣＧＡＧＧＧＧＧＣＡＧＧＧＣＣＴＧＣ－３’
１－１：５’－ＡＴＧＣＴＴＣＴＣＣＴＧＧＴＧＡＣＡＡＧ－３’
１－２：５’－ＴＧＧＧＡＴＣＡＧＧＡＧＧＡＡＴＧＣＴＧ－３’
２－１：５’－ＴＡＣＡＴＣＴＧＧＧＣＧＣＣＣＴＴＧＧＣＣＧＧ－３’
２－２：５’－ＧＧＡＧＣＧＡＴＡＧＧＣＴＧＣＧＡＡＧＴＣＧＣＧ－３’
３－１：５’－ＡＧＡＧＴＧＡＡＧＴＴＣＡＧＣＡＧＧＡＧＣＧ－３’
３－２：５’－ＴＴＡＧＣＧＡＧＧＧＧＧＣＡＧＧＧＣＣＴ－３’
４－１：５’－ＡＴＧＣＴＴＣＴＣＣＴＧＧＴＧＡＣＡＡＧＣＣ－３’
４－２：５’－ＴＧＡＧＧＡＧＡＣＧＧＴＧＡＣＴＧＡＧＧＴＴＣＣＴＴＧＧ－３’
５－１：５’－ＧＣＧＧＣＣＧＣＡＡＴＴＧＡＡＧＴＴＡＴＧＴＡ－３’
５－２：５’－ＴＴＡＧＣＧＡＧＧＧＧＧＣＡＧＧＧＣＣＴＧＣ－３’
６－１：５’－ＣＴＡＧＡＣＴＡＧＴＡＴＧＣＴＴＣＴＣＣＴＧＧＴＧＡＣＡＡＧＣＣ－３’
６－２：５’－ＣＧＡＣＧＣＧＴＴＴＡＧＣＧＡＧＧＧＧＧＣＡＧＧＧＣＣＴＧＣ－３’
【0081】
ヒトｃＤＮＡライブラリーを鋳型として、１－１および１－２、２－１および２－２、３－１および３－２をそれぞれプライマーとして使用し、ＧＭＣＳＦ、（２つの部分が連結されている）ＣＤ２８－ＴＭ＋ＣＤ２８－シグナルおよびＣＤ３ζ－シグナルである対応するＣＡＲ分子をＰＣＲによってクローニングした。架橋プライマー４－１および４－２を用いてＧＭＣＳＦ＋ｓｃＦｖ断片を得、架橋プライマー５－１および５－２を用いてＣＤ２８－ＴＭ＋ＣＤ２８－シグナル＋ＣＤ３ζ－シグナル断片を得、架橋プライマー６－１および６－２を用いて完全なＣＡＲ分子のヌクレオチド配列を得た。消化部位はＳｐｅＩおよびＭｌｕＩであった。
【0082】
４．２ ＣＡＲ分子の核酸配列を含むウイルスベクターの構築
【0083】
上記で作成したＣＡＲ分子のヌクレオチド配列を、ＳｐｅＩ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ社）およびＭｌｕＩ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ社）で二重消化し、Ｔ４リガーゼ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ社）と連結し、レンチウイルスＩＭ１９ベクターのＳｐｅＩ－ＭｌｕＩ部位に挿入し、コンピテント大腸菌（ＤＨ５α）に形質転換した。正しい挿入を確認するための配列決定後、プラスミド精製キット（ＯｒｉＧｅｎｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）でプラスミドを抽出し、精製した。構築された標的プラスミド（ＣＡＲ発現プラスミド）を、その後のウイルス生産実験に使用した。
【0084】
［実施例５］ 安定したパッケージング細胞株によるウイルス生産の検証
【0085】
この実施例では、正しいと同定されたＰＶＧＲモノクローナル細胞をウイルス生産について検証した。すなわち、ウイルス生産の検証のために、実施例４で構築した標的プラスミドを実施例３のＰＶＧＲモノクローナル細胞に一過性トランスフェクションした。具体的な工程は以下の通りである。
【0086】
実験の前日にＰＶＧＲモノクローナル細胞を１２ウェルプレートに１ウェル当たり８×１０５細胞／ｍＬの密度で播種し、１ｍＬのＳＭＭ２９３ ＴＩおよび０．１％のＦ６８を含む培地中で培養した。標的プラスミドを２日目のトランスフェクションに使用した。トランスフェクションの２４時間後に、誘導剤ｄｏｘ（ドキシサイクリン）を最終濃度２μｇ／ｍＬで添加した。トランスフェクションの４８時間後にウイルスを回収し、３０００ｒｐｍで４℃で２０分間遠心分離した。Ｊｕｒｋａｔ細胞をウイルスに感染させ、４８時間後にフローサイトメトリーで分析してウイルス力価（ＴＵ／ｍＬ）を計算した。実験の結果、クローン１、クローン１８、クローン１９、クローン２３、クローン２８、クローン３１、クローン３２、クローン３３はいずれもウイルス生産能を有し、クローン３１は最も高いウイルス力価である２．６８Ｅ＋０６（すなわち２．６８×１０６）ＴＵ／ｍＬを示した（図３参照）。クローン３１を、その後の実験において試験細胞として選択した。
【0087】
［実施例６］ 標的プラスミドを用いた安定したパッケージング細胞株のトランスフェクションおよびウイルス生産の誘導のための条件を最適化する実験
【0088】
比較的高いウイルス力価を有するモノクローナルクローン３１細胞を、さらなる研究のために選択した。１０ｍＬのクローン３１細胞を振とうフラスコＥ１２５（コーニング社、カタログ番号４３１１４５）にそれぞれ８×１０５細胞／ｍＬの密度で播種し、１０ｍＬのＳＭＭ２９３ ＴＩを含む培地で培養した。実験計画法（ＤＯＥ）を使用した。まず、スクリーニング設計実験を用いた。因子には、プラスミド（標的プラスミド）の量、ＰＥＩ（ポリエチレンイミン）の量、酪酸ナトリウムの濃度、酪酸ナトリウムの添加時間、酪酸ナトリウムを交換する時間、ｄｏｘ（ドキシサイクリン）の添加時間、添加されるｄｏｘ（ドキシサイクリン）の濃度、およびレンチウイルスを収集する時間が含まれる。曲率と因子の効果を決定した。次に、中央複合設計を用いて、最適実験スキームを決定した。トランスフェクションの４８時間後にウイルスを回収し、３０００ｒｐｍで４℃で２０分間遠心分離して、ウイルス力価ＴＵを決定した。
【0089】
最後に、最適な実験スキームは、プラスミド（標的プラスミド）の量が細胞あたり０．４μｇ／１０６であり、ＰＥＩ（ポリエチレンイミン）の量とプラスミド（標的プラスミド）の量の比が４：１であり、酪酸ナトリウムの濃度（シグマ社、カタログ番号：Ｂ５８８７）が１０ｍＭであり、酪酸ナトリウムを添加する時間がトランスフェクションの２４時間後であり、酪酸ナトリウムを交換する時間が酪酸ナトリウム添加の６～８時間後であり、ｄｏｘ（ドキシサイクリン）を添加する時間が２４時間であり、添加されたｄｏｘ（ドキシサイクリン）の濃度が２μｇ／ｍＬであり、ウイルスを収集する時間が４８時間であると結論付けることができる。Ｊｕｒｋａｔ細胞を、採取したウイルスに感染させた。４８時間後、細胞をフローサイトメトリーによって分析して、ウイルス力価を計算した。振盪フラスコＥ１２５におけるクローン３１の最終最適化ウイルス力価は４Ｅ＋０６（すなわち、４×１０６）ＴＵ／ｍＬである（図４参照）。
【0090】
［実施例７］ 安定したパッケージング細胞株の継代安定性、ウイルス生産安定性、コピー数安定性の検証
【0091】
安定したレンチウイルスパッケージング細胞株クローン３１をさらに使用して、継代安定性、ウイルス生産安定性およびコピー数安定性を含む安定性研究を行った。
【0092】
７．１ 継代安定性
【0093】
クローン３１モノクローナル細胞を、抗生物質を含むＥ１２５振盪フラスコ中および抗生物質を含まないＥ１２５振盪フラスコ中で継代し、毎回、体積１０ｍＬで培養した。細胞数および生存率をそれぞれ計算した。特に、クローン３１細胞を、Ｅ１２５振盪フラスコ（コーニング社、カタログ番号４３１１４５）に、それぞれ８×１０５細胞／ｍＬおよび体積１０ｍＬで播種した。１０ｍＬのＳＭＭ２９３ ＴＩ培地（抗生物質なし）、および１０ｍＬのＳＭＭ２９３ ＴＩ＋０．６μｇ／ｍＬのＰｕｒｏ＋５０μｇ／ｍＬのＺｅｏ＋５０μｇ／ｍＬ Ｈｙｇをそれぞれ使用した。細胞を２日に１回継代した。細胞数および生存率をそれぞれ計算した。継代安定性を観察した。
【0094】
実験により、抗生物質を添加しなかった場合（選択圧の非存在下）のクローン３１モノクローナル細胞の細胞数は抗生物質を添加した場合と著しく異ならず、抗生物質を添加しなかった場合（選択圧の非存在下）、クローン３１モノクローナル細胞は安定して継代され、９７％以上の生存率を有し、選択圧の非存在下で３０世代以上安定して継代され得ることが示された（図５参照）。
【0095】
７．２ ウイルス収量安定性
【0096】
抗生物質を添加したクローン３１モノクローナル細胞のウイルス収量安定性および抗生物質を添加しなかったクローン３１モノクローナル細胞のウイルス収量安定性を調べた。抗生物質を添加した場合および添加しなかった場合について、数世代毎に（実施例４で構築した）標的プラスミドをクローン３１にトランスフェクションし、ウイルス力価を測定した。特に、実験の前日に、クローン３１細胞を、それぞれ１．４×１０６細胞／ｍＬおよび体積１０ｍＬで、Ｅ１２５振盪フラスコ（コーニング、カタログ番号４３１１４５）に播種した。１０ｍＬのＳＭＭ２９３ ＴＩ培地（抗生物質を含まない）、および１０ｍＬのＳＭＭ２９３ ＴＩ＋０．６μｇ／ｍＬのＰｕｒｏ（ピューロマイシン）＋５０μｇ／ｍＬのＺｅｏ（ブレオマイシン）＋５０μｇ／ｍＬのＨｙｇ（ハイグロマイシン）をそれぞれ使用した。２日目に、（実施例４で構築した）標的プラスミドを細胞にトランスフェクションした。トランスフェクションを数世代毎に実施して、ウイルス生産を検証した。
【0097】
実験結果によると、抗生物質を添加しなかった場合に細胞はウイルスを生産する能力を有し、継代された細胞は、抗生物質を添加せずに正常に遺伝することができることを示した（図６参照）。
【0098】
７．３ コピー数安定性
【0099】
抗生物質を添加した場合および添加しなかった場合のクローン３１モノクローナル細胞について、数世代毎にコピー数の安定性を検証した。細胞ゲノム抽出キット（ＴＩＡＮＧＥＮ ＢＩＯＴＥＣＨ（ＢＥＩＪＩＮＧ）社、カタログ番号：ＤＰ３０４－０３）を用いて、抗生物質を添加した場合および添加しなかった場合のクローン３１モノクローナル細胞のゲノムＤＮＡを抽出し、次いで、Ｔａｑｍａｎ－ｑＰＣＲ法により、クローン３１モノクローナル細胞のゲノム中のＧａｇＰｏｌ、ＲｅｖおよびＶＳＶＧのコピー数を増幅した。特に、クローン３１細胞をＥ１２５振盪フラスコ（コーニング社、カタログ番号４３１１４５）に、それぞれ８×１０５細胞／ｍＬおよび体積１０ｍＬで接種した。１０ｍＬのＳＭＭ２９３ ＴＩ培地（抗生物質なし）、および１０ｍＬのＳＭＭ２９３ ＴＩ＋０．６μｇ／ｍＬのＰｕｒｏ（ピューロマイシン）＋５０μｇ／ｍＬのＺｅｏ（ブレオマイシン）＋５０μｇ／ｍＬのＨｙｇ（ハイグロマイシン）をそれぞれ使用した。細胞ゲノムＤＮＡを数世代毎に抽出した。細胞ゲノム抽出キット（ＴＩＡＮＧＥＮ ＢＩＯＴＥＣＨ（ＢＥＩＪＩＮＧ）社、カタログ番号：ＤＰ３０４－０３）を用いてゲノムＤＮＡの抽出用に２×１０６細胞／ｍＬを採取した。操作の詳細については、キットの製造元の取扱説明書を参照のこと。細胞ゲノムＤＮＡをｑＰＣＲ用に約５ｎｇ／μＬに希釈した。Ｔａｑｍａｎ－ｑＰＣＲプローブ法は、以下の操作ステップを含む。３つの標準プラスミドＤＮＡを、それぞれ１×１０６コピー／μＬ、１×１０５コピー／μＬ、１×１０４コピー／μＬ、１×１０３コピー／μＬ、および１×１０２コピー／μＬに核酸希釈剤を用いて希釈する。３つの遺伝子ＧａｇＰｏｌ、ＲｅｖおよびＶＳＶＧをそれぞれ増幅した。標準生成物のコピー数の対数を横座標とし、ＣＴ値を縦座標とすることにより、３つの標準曲線をプロットした。ｑＰＣＲ反応系（タカラバイオ株式会社、カタログ番号：ＲＲ３９０Ａ）は、１０μＬの２×Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ（プローブｑＰＣＲ）、０．４μＬのＦプライマー（１０μｍｏｌ／Ｌ）、０．４μＬのＲプライマー（１０μｍｏｌ／Ｌ）、０．４μＬのＴａｑＭａｎプローブ（５μｍｏｌ／Ｌ）、０．４μＬのＲＯＸ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｄｙｅ ＩＩ（５０×）、２μＬの鋳型、６．４μＬのｄｄＨ２Ｏを含む。ＦプライマーおよびＲプライマーは、以下に列挙する通りである。
（１）ＶＳＶＧ遺伝子のｑＰＣＲプライマー：
ＶＳＶＧ－ｑ－Ｆ：５’－ＡＡＧＡＡＡＣＣＴＧＧＡＧＣＡＡＡＡＴＣＡＧＡ－３’
ＶＳＶＧ－ｑ－Ｒ：５’－ＣＣＴＧＧＧＴＴＴＴＴＡＧＧＡＧＣＡＡＧＡＴＡＧ－３’
ＶＳＶＧ－Ｔａｑｍａｎプローブ：５’－ＦＡＭ－ＣＧＧＧＴＣＴＴＣＣＡＡＴＣＴＣＴＣＣＡＧＴＧＧＡＴＣＴ－ＴＡＭＲＡ－３’
（２）ＧａｇＰｏｌ遺伝子のｑＰＣＲプライマー：
ＧａｇＰｏｌ－ｑ－Ｆ：５’－ＧＣＡＧＴＴＣＡＴＧＴＡＧＣＣＡＧＴＧＧＡＴＡＴ－３’
ＧａｇＰｏｌ－ｑ－Ｒ：５’－ＴＧＧＴＧＡＡＡＴＴＧＣＴＧＣＣＡＴＴＧ－３’
ＧａｇＰｏｌ－Ｔａｑｍａｎプローブ：５’－ＦＡＭ－ＣＡＧＡＧＡＣＡＧＧＧＣＡＡＧＡＡＡＣＡＧＣＡＴＡＣＴＴＣＣ－ＴＡＭＲＡ－３’
（３）Ｒｅｖ遺伝子のｑＰＣＲプライマー：
Ｒｅｖ－ｑ－Ｆ：５’－ＣＣＴＴＧＧＡＡＴＧＣＴＡＧＴＴＧＧＡＧＴＡＡＴＡＡ－３’
Ｒｅｖ－ｑ－Ｒ：５’－ＴＧＴＴＡＡＴＴＴＣＴＣＴＧＴＣＣＣＡＣＴＣＣＡＴ－３’
Ｒｅｖ－Ｔａｑｍａｎプローブ：５’－ＦＡＭ－ＴＣＴＣＴＧＧＡＡＣＡＧＡＴＴＴＧＧＡＡＴＣＡＣＡＣＧＡＣＣ－ＴＡＭＲＡ－３’
（１）ＶＳＶＧ遺伝子のｑＰＣＲプライマー：
ＶＳＶＧ－ｑ－Ｆ：５’－ＡＡＧＡＡＡＣＣＴＧＧＡＧＣＡＡＡＡＴＣＡＧＡ－３’
ＶＳＶＧ－ｑ－Ｒ：５’－ＣＣＴＧＧＧＴＴＴＴＴＡＧＧＡＧＣＡＡＧＡＴＡＧ－３’
ＶＳＶＧ－Ｔａｑｍａｎプローブ：５’－ＦＡＭ－ＣＧＧＧＴＣＴＴＣＣＡＡＴＣＴＣＴＣＣＡＧＴＧＧＡＴＣＴ－ＴＡＭＲＡ－３’
（２）ＧａｇＰｏｌ遺伝子のｑＰＣＲプライマー：
ＧａｇＰｏｌ－ｑ－Ｆ：５’－ＧＣＡＧＴＴＣＡＴＧＴＡＧＣＣＡＧＴＧＧＡＴＡＴ－３’
ＧａｇＰｏｌ－ｑ－Ｒ：５’－ＴＧＧＴＧＡＡＡＴＴＧＣＴＧＣＣＡＴＴＧ－３’
ＧａｇＰｏｌ－Ｔａｑｍａｎプローブ：５’－ＦＡＭ－ＣＡＧＡＧＡＣＡＧＧＧＣＡＡＧＡＡＡＣＡＧＣＡＴＡＣＴＴＣＣ－ＴＡＭＲＡ－３’
（３）Ｒｅｖ遺伝子のｑＰＣＲプライマー：
Ｒｅｖ－ｑ－Ｆ：５’－ＣＣＴＴＧＧＡＡＴＧＣＴＡＧＴＴＧＧＡＧＴＡＡＴＡＡ－３’
Ｒｅｖ－ｑ－Ｒ：５’－ＴＧＴＴＡＡＴＴＴＣＴＣＴＧＴＣＣＣＡＣＴＣＣＡＴ－３’
Ｒｅｖ－Ｔａｑｍａｎプローブ：５’－ＦＡＭ－ＴＣＴＣＴＧＧＡＡＣＡＧＡＴＴＴＧＧＡＡＴＣＡＣＡＣＧＡＣＣ－ＴＡＭＲＡ－３’
【0100】
ｑＰＣＲ反応の手順は、９５℃で３０秒間と、９５℃で５秒間、５５℃で１５秒間、７２℃で３５秒間の４０サイクルであった。得られたＣＴ値を検量線に入れてコピー数を算出し、質量に基づいて各細胞のコピー数を算出した。
【0101】
クローン３１に対するＶＳＶＧ遺伝子のコピー数を図７ａに、クローン３１に対するＧａｇＰｏｌ遺伝子のコピー数を図７ｂに、クローン３１に対するＲｅｖ遺伝子のコピー数を図７ｃに示す。実験結果は、クローン３１モノクローナル細胞におけるＧａｇＰｏｌ、ＲｅｖおよびＶＳＶＧ遺伝子のコピー数が比較的安定していることを示した。
【0102】
［実施例８］ 安定したパッケージング細胞株とトランスフェクション後の２９３細胞との比較
【0103】
クローン３１モノクローナル細胞および２９３細胞のトランスフェクションを行い、比較した。各バッチが３つの並行群を含む、３つのバッチを作成した。最適条件下でクローン３１モノクローナル細胞のトランスフェクションを行って誘導し、一過性トランスフェクション条件下（ＰＥＩ量：プラスミド量＝４：１）で２９３細胞のトランスフェクションを行って、トランスフェクションの比較をした。具体的には、２９３細胞およびクローン３１細胞を、それぞれ８×１０５細胞／ｍＬおよび体積１０ｍＬでＥ１２５振盪フラスコ（コーニング、カタログ番号：４３１１４５）に播種した。１０ｍＬのＳＭＭ２９３ ＴＩ＋０．１％のＦ６８培地を使用した。細胞を３つのＥ１２５振盪フラスコ、すなわち３つの群に並行して播種した。クローン３１モノクローナル細胞のトランスフェクションを行い、最適化条件下で誘導した。実験スキームは、プラスミドの量が細胞あたり０．４μｇ／１０６であり、ＰＥＩ（ポリエチレンイミン）量とプラスミド量の比が４：１であり、酪酸ナトリウムの濃度が１０ｍＭであり、酪酸ナトリウムを添加する時間がトランスフェクションの２４時間後であり、酪酸ナトリウムを交換する時間が酪酸ナトリウム添加の６～８時間後であり、ｄｏｘ（ドキシサイクリン）を添加する時間が２４時間であり、添加されたｄｏｘ（ドキシサイクリン）の濃度が２μｇ／ｍＬであり、ウイルスを収集する時間が４８時間であった。
【0104】
前記２９３細胞の一過性トランスフェクションのための条件は、実施例１で構築したｐＰｕｒｏ．ｃｏＴｅｔＲプラスミド、ｐＶＳＶＧプラスミドおよびｐＧａｇＰｏｌ－ＲＲＥ－ＮＥＳ－ｃＩＮＴプラスミドと実施例４で構築した標的プラスミドを２９３細胞に同時トランスフェクションすることを含む。例えば、プラスミドの総量が０．８μｇ～１．０μｇ／１０６細胞の範囲である限り、一過性トランスフェクション用の一定の範囲内のプラスミドの量は、ウイルス力価にほとんど影響を及ぼさない。本実施例では、トランスフェクションした細胞を、ｐＰｕｒｏ．ｃｏＴｅｔＲプラスミド、ｐＶＳＶＧプラスミド、ｐＧａｇＰｏｌ－ＲＲＥ－ＮＥＳ－ｃＩＮＴプラスミドおよび標的プラスミドの質量比を１：１：１：２とし、総プラスミド量を細胞あたり０．８μｇ／１０６（すなわち、ｐＰｕｒｏ．ｃｏＴｅｔＲプラスミドを細胞あたり０．１６μｇ／１０６、ｐＶＳＶＧプラスミドを細胞あたり０．１６μｇ／１０６、ｐＧａｇＰｏｌ－ＲＲＥ－ＮＥＳ－ｃＩＮＴプラスミドを細胞あたり０．１６μｇ／１０６、および標的プラスミドを０．３２μｇ／１０６細胞）とし、ならびにＰＥＩ（ポリエチレンイミン）量とプラスミド（Ｐｕｒｏ．ｃｏＴｅｔＲプラスミド＋ｐＶＳＶＧプラスミド＋ｐＧａｇＰｏｌ－ＲＲＥ－ＮＥＳ－ｃＩＮＴプラスミド＋標的プラスミド）量の比を４：１として比較した。ウイルス力価安定性およびウイルス力価ＶＰ（Ｐ２４）を、トランスフェクション後のバッチ処理間で比較した（図８および９参照）。
【0105】
図８の実験結果から分かるように、クローン３１モノクローナル細胞は２９３細胞よりもバッチ間ウイルス力価安定性が良好であり、図９の実験結果から分かるように、クローン３１モノクローナル細胞は２９３細胞よりもウイルス力価ＶＰ（Ｐ２４）がはるかに高く、クローン３１モノクローナル細胞は、ウイルス力価ＶＰ（Ｐ２４）含量が高かった。
【0106】
［実施例９］ 安定したパッケージング細胞株のスケールアップ処理
【0107】
クローン３１モノクローナル細胞を、Ｅ１２５からＥ１０００振盪フラスコ（コーニング社、カタログ番号：４３１１４７）にスケールアップし、次いで、（実施例４で構築した）標的プラスミドをクローン３１モノクローナル細胞にトランスフェクションしてウイルス生産を検証した。一方、コントロールとして２９３細胞のトランスフェクションを行い、クローン３１モノクローナル細胞および２９３細胞のトランスフェクションを行う条件は、実施例８に記載したものと同じとした。トランスフェクションされた細胞を、それらの細胞生存率、ウイルス力価ＶＰ（タカラバイオ株式会社、カタログ番号：６３２２００）およびＨＣＰ（宿主細胞タンパク質）（Ｃｙｇｎｕｓ社、カタログ番号：Ｆ６５０）残基の面で比較した（図１０参照）。
【0108】
図１０ａの実験結果から、クローン３１モノクローナル細胞がトランスフェクションの２４時間後および４８時間後において２９３細胞よりも細胞生存率が高いことが分かり、図１０ｂの実験結果から、クローン３１モノクローナル細胞が２９３細胞の３分の１のＨＣＰ（宿主細胞タンパク質）残基を有すること、すなわち２９３細胞よりもＨＣＰ（宿主細胞タンパク質）残基が少ないことが分かり、図１０ｃの実験結果から、クローン３１モノクローナル細胞のウイルス力価ＶＰ（Ｐ２４）が２９３細胞のウイルス力価ＶＰ（Ｐ２４）の１０～２０倍であること、すなわちクローン３１モノクローナル細胞のウイルス力価ＶＰ（Ｐ２４）含量が高いことが分かる。
【図1a】
【図1b】
【図1c】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【配列表】
【国際調査報告】